(57)【要約】本発明により、ＥＣＡＴ４が強制発現されたＥＳ細胞が提供される。ＥＣＡＴ４を強制発現したＥＳ細胞は、フィーダー細胞やＬＩＦの非存在下でも培養することができる。さらに、本発明は、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列、ＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４プロモーター領域およびそれらの用途も提供する。ＥＣＡＴ４のＥＳ細胞の自己複製促進転写因子としての機能が明確に示されたため、これらはＥＳ細胞の研究および開発において極めて有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＣＡＴ４からなる胚性幹（ＥＳ）細胞の自己複製決定因子。
【請求項２】
ＥＣＡＴ４がマウスＥＣＡＴ４、ヒトＥＣＡＴ４またはサルＥＣＡＴ４である請求項１記載のＥＳ細胞の自己複製決定因子。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載されるＤＮＡを含むサルＥＣＡＴ４遺伝子：
（ａ）配列番号１０で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１０で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＳ細胞の自己複製決定因子としての能力を有するＤＮＡ。
【請求項４】
ＥＣＡＴ４が強制発現された哺乳動物幹細胞。
【請求項５】
幹細胞がＥＳ細胞である、請求項４記載の哺乳動物幹細胞。
【請求項６】
ＥＣＡＴ４がマウスＥＣＡＴ４、ヒトＥＣＡＴ４またはサルＥＣＡＴ４である、請求項４または請求項５記載の細胞。
【請求項７】
配列番号８、配列番号９または配列番号１０で示されるポリヌクレオチドの塩基配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる細胞分化促進剤。
【請求項９】
ＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１０】
配列番号７で示される塩基配列の一部または全部を含むことを特徴とする請求項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１１】
配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有する請求項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１２】
配列番号１５で示される塩基配列の一部であり、且つ配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有する請求項１１記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１３】
配列番号１５で示される塩基配列を含有する請求項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１４】
配列番号１４で示される塩基配列の一部であり、且つ配列番号１５で示される塩基配列を含有する請求項１３記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１５】
請求項１０〜請求項１４のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする請求項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１６】
請求項１０〜請求項１４のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする請求項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー。
【請求項１７】
請求項９〜請求項１６いずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーを含有することを特徴とするＥＣＡＴ４プロモーター領域。
【請求項１８】
ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列。
【請求項１９】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１８記載のコンセンサス配列：
（ａ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ。
【請求項２０】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１８記載のコンセンサス配列：
（ａ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項９〜請求項１６のいずれか記載のエンハンサー、請求項１７記載のプロモーター領域または請求項１８〜請求項２０のいずれか記載のコンセンサス配列を含有することを特徴とする組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項２３】
下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する作用を有する物質のスクリーニング方法：
（ａ）請求項９〜請求項１６のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーまたは請求項１７記載のＥＣＡＴ４プロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで形質転換した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の活性を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する被験物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＥＣＡＴ４が強制発現された哺乳動物細胞、ＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列およびそれらの用途に関する。
【背景技術】  哺乳類胞胚の内部細胞集団に由来する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は急速かつ無期限に成長し、同時に多能性、つまり多種類の型の細胞に分化する能力を保持する。ＥＳ細胞のこのような性質は対称的自己複製により維持されており、これによって細胞分裂時には２個の同一な幹細胞の娘細胞が生じる。この２種類の性質から、ＥＳ細胞を用いて組織や細胞を作り出して治療に用いようとする、新たな再生医療の可能性が注目されている。しかしながらヒトＥＳ細胞は、ＥＳ細胞の産生のためにヒト胚を破壊しなければならないため、倫理問題も孕んでいる。
このような倫理問題を避ける解決法の一つは、多能性細胞を体細胞や他の細胞から直接産生することである。この目標に到る最初のステップは、多能性細胞において特異的に機能し、細胞の特性を決定するマスター遺伝子の同定である。
これまでにＳＴＡＴ３およびＯｃｔ３／４の２種類の転写因子が、マウスＥＳ細胞が自己複製をおこなうために重要であることが判明しているが（Ｂｕｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６５，１３１−４３．、Ｎｉｗａ，（２００１）．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  ２６，１３７−４８．）、マスター遺伝子の要件を満たすものは見出されていない。
ＳＴＡＴ３は白血病抑制因子（ＬＩＦ）により活性化されるが、このＬＩＦは多能性維持に不可欠なサイトカインの一種である（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６，６８８−９０．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６，６８４−７．）。活性化されたＳＴＡＴ３は、ＬＩＦ非存在下でも単独で自己複製を支持する（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １８，４２６１−９．）。遺伝子ターゲッティング実験によっても、ＥＳ細胞の自己複製に対するＳＴＡＴ３の重要性が示されている（Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，２８４６−５１．）。しかしながらＳＴＡＴ３の発現は広範囲の細胞型に認められ、一部の細胞では逆に分化を誘導する（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １５，３６５１−８．）。
ＥＳ細胞の自己複製に対する鍵と考えられているもう一つの転写因子Ｏｃｔ３／４はＰＯＵファミリーの転写因子であり、ＥＳ細胞、外胚葉や原始的胚細胞などの多能性細胞中で発現する。マウスＯｃｔ３／４遺伝子を破壊すると、初期胚が着床後まもなく死亡する結果が得られ、Ｏｃｔ３／４を欠く胞胚の内部細胞塊は多能性を持たず、トロフォブラスト系統にのみ分化する。Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．はこれをＥＳ細胞において確認し、Ｏｃｔ３／４を抑制することでトロフォブラストへの自立的分化が生じることを示した（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４，３７２−６．）。これらのデータをその特異的な発現パターンと併せると、Ｏｃｔ３／４が多能性細胞に対するマスター遺伝子である可能性が考えられる。
しかしながら、外因性プロモーターより恒常的にＯｃｔ３／４を発現しているＥＳ細胞は、それでも自己複製のためにＬＩＦを必要としており、適切量のＯｃｔ３／４発現が見られる場合ですら、ＬＩＦの除去の結果として原始内胚葉への分化が生じる（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４，３７２−６．）。
【発明の開示】
本発明は、ＥＣＡＴ４を強制発現させた細胞、ＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列、およびこれらの用途を提供することを目的とする。
ＥＳ細胞にとって主要な自己複製決定因子の転写または機能を活性化することで、ＥＳ細胞培養の効率性と経済性の向上が期待できる。また、該因子の転写または機能を抑制することにより、ＥＳ細胞を特定の機能細胞へ分化誘導する際に未分化細胞を確実になくすことが期待できるため、臨床応用する際、懸念されている未分化細胞由来の腫瘍細胞（テラトーマ）出現の危険性を回避することができる。
従ってＥＳ細胞にとって主要な自己複製決定因子を見出し、該因子の転写あるいは機能を調節するエンハンサーなどは、ＥＳ細胞の分化誘導能または分化抑制能を有する物質の探索や、ＥＳ細胞の研究・開発に極めて有用である。
本発明者は、既に、ＥＳ細胞の特異的発現遺伝子としてＥＣＡＴ４遺伝子を見出している。そして、鋭意ＥＣＡＴ４遺伝子を検討した結果、ＥＳ細胞のマウスＥＣＡＴ４遺伝子を標的破壊すると、自然な分化を起こして高レベルの内胚葉マーカーを発現する胚体外内胚葉系列となることを確認した。ＥＣＡＴ４欠損胚盤胞は着床後まもなく死亡し、ＥＣＡＴ４欠損胚盤胞の内部細胞塊はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ほとんど増殖しなかった。また、ＥＳ細胞にＥＣＡＴ４遺伝子を強制発現させたＥＳ細胞は、ＬＩＦ非存在下で培養を行っても未分化状態が維持されるという知見を得たため、ＥＣＡＴ４がＥＳ細胞にとって主要な自己複製決定因子であることを見出した。
更に本発明者は、ＥＣＡＴエンハンサーおよびＥＣＡＴ４が結合するコンセンサス配列を同定した。また、ＥＣＡＴ４タンパクが結合するＥＣＡＴ４コンセンサス配列がマウスのＧＡＴＡ６遺伝子の５’−フランキング領域の転写開始サイトの４ｋｂ上流に存在していること、マウスおよびヒトのＧＡＴＡ６遺伝子の遺伝子配列においてこの領域が良く保存されていることを確認した。
本発明は、これらの知見に基づき完成するに至ったものである。
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
項１．ＥＣＡＴ４からなる胚性幹（ＥＳ）細胞の自己複製決定因子、
項２．ＥＣＡＴ４がマウスＥＣＡＴ４、ヒトＥＣＡＴ４またはサルＥＣＡＴ４である項１記載のＥＳ細胞の自己複製決定因子、
項３．以下の（ａ）または（ｂ）に記載されるＤＮＡを含むサルＥＣＡＴ４遺伝子：
（ａ）配列番号１０で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１０で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＳ細胞の自己複製決定因子としての能力を有するＤＮＡ、
項４．ＥＣＡＴ４が強制発現された哺乳動物幹細胞、
項５．幹細胞がＥＳ細胞である、項４記載の哺乳動物幹細胞、
項６．ＥＣＡＴ４がマウスＥＣＡＴ４、ヒトＥＣＡＴ４またはサルＥＣＡＴ４である、項４または項５記載の細胞、
項７．配列番号８、配列番号９または配列番号１０で示されるポリヌクレオチドの塩基配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
項８．項７記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる細胞分化促進剤、
項９．ＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１０．配列番号７で示される塩基配列の一部または全部を含むことを特徴とする項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１１．配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有する項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１２．配列番号１５で示される塩基配列の一部であり、且つ配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有する項１１記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１３．配列番号１５で示される塩基配列を含有する項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１４．配列番号１４で示される塩基配列の一部であり、且つ配列番号１５で示される塩基配列を含有する項１３記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１５．項１０〜項１４のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１６．項１０〜項１４のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とする項９記載のＥＣＡＴ４エンハンサー、
項１７．項９〜項１６いずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーを含有することを特徴とするＥＣＡＴ４プロモーター領域、
項１８．ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列、
項１９．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とする項１８記載のコンセンサス配列：
（ａ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
項２０．以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とする項１８記載のコンセンサス配列：
（ａ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
項２１．項９〜項１６のいずれか記載のエンハンサー、項１７記載のプロモーター領域または項１８〜項２０のいずれか記載のコンセンサス配列を含有することを特徴とする組換えベクター、
項２２．項２１記載の組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、
項２３．下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する作用を有する物質のスクリーニング方法：
（ａ）項９〜項１６のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーまたは項１７記載のＥＣＡＴ４プロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで形質転換した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の活性を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する被験物質を選択する工程、
項２４．ＥＣＡＴ４遺伝子を挿入したｐＣＡＧ−ＩＰベクターを導入したＥＳ細胞
項２５．項２４記載のＥＳ細胞を注入して得られた遺伝子改変動物。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＥＣＡＴ４の同定を示すものである。
（Ａ）マウスＮｋｘ２．３、マウスＥＣＡＴ４およびそのヒト相同蛋白と考えられるＦＬＪ１２５８１の比較。（Ｂ）マウスＥＣＡＴ４、Ｏｃｔ３／４およびＮＡＴ１の発現プロファイルを示すＲＴ−ＰＣＲ分析。１．未分化ＭＧ１．１９  ＥＳ細胞；２．分化したＭＧ１．１９  ＥＳ細胞；３．未分化ＲＦ８  ＥＳ細胞（ＲＴ−マイナス対照）；４．未分化ＲＦ８  ＥＳ細胞；５．分化したＭＧ１．１９  ＥＳ細胞；６．脳；７．心臓；８．腎臓；９．精巣；１０．脾臓；１１．筋肉；１２．肺；１３．胃；１４．卵巣；１５．胸腺；１６．肝臓；１７．皮膚。（Ｃ）ＲＦ８、Ｊ１、ＣＧＲ８およびＭＧ１．１９  ＥＳ細胞系列でのＥＣＡＴ４発現を示すウエスタンブロット分析。未分化状態に保った（Ｕ）、あるいは５日間にわたりＲＡを用いて処理した（Ｄ）ＥＳ細胞からの抽出液を解析した。ウエスタンブロットの実施は抗ＥＣＡＴ４血清または抗ＣＤＫ４抗体を用いて行った。
図２は、マウスＥＣＡＴ４遺伝子の標的破壊を示すものである。
（Ａ）マウスＥＣＡＴ４遺伝子、ターゲティングベクター、および相同組換え後の遺伝子構造。サザンブロットに用いたプローブと制限酵素の位置を示す。矢印はＰＣＲ分析用のプライマーを示す。（Ｂ）３’−プローブを用いたサザンブロットにより、野生型遺伝子座から１１ｋｂのバンド、β−ｇｅｏ標的遺伝子座から１５．４ｋｂのバンド、そしてｈｙｇｒ標的遺伝子座から７．３ｋｂのバンドが生じた。（Ｃ）ＰＣＲにより、野生型遺伝子座から３．２ｋｂのバンド、β−ｇｅｏ標的遺伝子座から８．５ｋｂのバンド、そしてｈｙｇｒ標的遺伝子座から４．２ｋｂのバンドが生じた。（Ｄ）ノーザンブロットによりノックアウト細胞にはＥＣＡＴ４の転写物が存在しないことが確認された。
図３は、ＥＣＡＴ４欠損ＥＳ細胞の分析を示すものである。
（Ａ）ＳＴＯ支持細胞上で育成した野生型ＲＦ８細胞の形態（上）。ＳＴＯ支持細胞上で育成したＥＣＡＴ４細胞（中央）、および支持細胞なしで育成したＥＣＡＴ４欠損細胞（下）。（Ｂ）生育曲線。（Ｃ）マーカー遺伝子に対するノーザンブロット分析。（Ｄ）マーカー遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲ分析。
図４は、着床前胚の分析を示すものである。
（Ａ）野生型メスとヘテロ接合オスから得た８細胞期の胚と胚盤胞を、Ｘ−ｇａｌを用いて染色した。（Ｂ）ヘテロ接合交雑により得た胚盤胞を、ＥＳ細胞培地を用いてゼラチンコートしたシャーレ上で育成した。１０日後に形態を記録し、ＰＣＲにより遺伝子型を決定した。
図５は、構成プロモーターからのＥＣＡＴ４の強制発現を示すものである。
（Ａ）親プラスミドまたはＣＡＧ−ＥＣＡＴ４を形質転換させたＭＧ１．１９細胞におけるＥＣＡＴ４、Ｏｃｔ３／４およびＮＡＴ１の発現レベルを示すＰＣＲ−ＲＴ分析。細胞はＬＩＦ存在下または非存在下で育成した。（Ｂ）ウエスタンブロットにより外因性ＥＣＡＴ４の構成的発現が確認された。（Ｃ）ＬＩＦ存在下（上）または非存在下（下）条件で生育した対照（左）およびＣＡＧ−ＥＣＡＴ４発現細胞（右）の形態。（Ｄ）細胞の増殖速度
図６は、ＥＣＡＴ４の転写調節を示すものである。
ＳＥＬＥＸにより得られたＥＣＡＴ４結合に対するコンセンサスシーケンスを示すシーケンスロゴ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，１９９０）。シーケンスロゴの生成はＷｅｂＬｏｇｏ（ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｑｌｏｇｏ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉ）を用いて行った。（Ｂ）マウスおよびヒトＧＡＴＡ−６の５’調節領域に見られるＥＣＡＴ４コンセンサスシーケンス。この領域を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子を構築した。
図７は、マウスＥＣＡＴ４遺伝子のエンハンサー領域解析に関する。
（Ａ）マウスＥＣＡＴ４遺伝子構造と、エンハンサー解析に用いたＤＮＡ断片。（Ｂ）エンハンサー解析に用いたレポーター遺伝子構造。チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、ルシフェラーゼｃＤＮＡ、ポリＡ付加配列からなるレポーター遺伝子の３’端に図７Ａの各遺伝子断片を挿入した。
図８は、マウスＥＣＡＴ４遺伝子のエンハンサー領域解析に関する。
（Ａ）エンハンサー解析に用いた断片の領域（左）と、その断片の活性を示した（右）。
（Ｂ）マウスＥＣＡＴ４遺伝子のエンハンサー領域（−４７３７／−４３８７の領域）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）および当該分野における慣用記号に従う。
本発明の「ＥＳ細胞の自己複製決定因子」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等が分化せずに同一細胞を複製するという自己複製能に関与するマスター遺伝子のことである。このＥＳ細胞の自己複製決定因子はＥＳ細胞等の自己複製能を有する細胞のマーカーとして利用することができ、この因子の発現を調べることにより、調べた細胞が自己複製能を有しているか、あるいはＥＳ細胞であるかどうかの検査をすることができる。この因子を強制発現させることにより、フィーダー細胞非存在下でかつＬＩＦなどのサイトカイン非存在下でＥＳ細胞の持つ全能性を維持したまま安全に細胞の増殖性を保つことができる。これにより、ＥＳ細胞培養の効率性と経済性の向上が期待できる。また臨床応用する際に懸念されているフィーダー細胞由来の内在性ウイルス等、感染性物質混入のリスクがなくなるため、安全性向上が期待できる。
また、ＥＳ細胞を特定の機能細胞へ分化誘導する際には、相同組換え、アンチセンスやＲＮＡｉ（ＲＮＡインヒビター）等の既知の方法（多比良和誠編  遺伝子の機能阻害実験法  羊土社、２００１）を用いてこのＥＳ細胞の自己複製決定因子の発現を抑制することにより、未分化細胞を従来より確実になくすことが期侍できる。これにより、臨床応用する際、懸念されている未分化細胞由来の腫瘍細胞（テラトーマ）出現の危険性を回避することで更に安全性向上が期待できる。
本発明の「ＥＣＡＴ４」とは、天然型ＥＣＡＴ４または遺伝子組換型ＥＣＡＴ４であり、哺乳動物由来のものであればよい。例えば、マウスＥＣＡＴ４、ラットＥＣＡＴ４、サルＥＣＡＴ４やヒトＥＣＡＴ４などを挙げることができる。
また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号：４〜１０、１４〜１９）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、機能（活性）が同等であることを限度として、あるいはタンパク質をコードする遺伝子の場合には生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログ）、誘導体および変異体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される。これら同族体（ホモログ）、誘導体および変異体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、具体的には、ストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：４〜１０のいずれかで示される特定塩基配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
なお、ストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に示されるように、複合体或いはプローブと結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖並びに該鎖と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
また、前記の特定塩基配列（配列番号：４〜１０、１４〜１９）の同族体（ホモログ）をコードする遺伝子、例えばヒト遺伝子に対応する他生物種の遺伝子は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０：５８７３−５８７７，１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得し、そのアクセッション番号をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力して得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、選抜することができる。なお、上記遺伝子またはＤＮＡは機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソンまたはイントロンを含むことができる。
本明細書において「ＥＣＡＴ４遺伝子」または「ＥＣＡＴ４のＤＮＡ」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定塩基配列で示されるＥＣＡＴ４遺伝子（ＤＮＡ）（配列番号：８〜１０）、それらの同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：９に記載のヒトＥＣＡＴ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９３５７６）、配列番号：８に記載のマウスＥＣＡＴ４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０９３５７４）、配列番号：１０に記載のサルＥＣＡＴ４遺伝子、およびラットホモログなどが包含される。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：１〜３）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その断片、同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
従って本明細書において「ＥＣＡＴ４タンパク質」または単に「ＥＣＡＴ４」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号：１〜３）で示されるＥＣＡＴ４およびそれらの同族体、変異体、誘導体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するヒトＥＣＡＴ４、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するマウスＥＣＡＴ４、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有するサルＥＣＡＴ４、およびそれらのラットホモログなどが包含される。
以下、本発明の具体的な内容を説明する。
（１）ＥＣＡＴ４が強制発現された哺乳動物幹細胞
本発明の「ＥＣＡＴ４が強制発現された哺乳動物幹細胞」とは、哺乳動物細胞にＥＣＡＴ４を強制発現させることによって得られる細胞のことである。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、マウスやラット等の哺乳動物の組織・臓器等由来の細胞であって、個体から取り出した初代細胞であっても、または培養細胞であっても、哺乳動物由来の細胞であればよい。哺乳動物細胞とは、例えば、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）やマウスＥＳ細胞、サルＥＳ細胞やヒトＥＳ細胞であり、より好ましくはＬＩＦ非存在下では分化するマウスＥＳ細胞、サルＥＳ細胞やヒトＥＳ細胞等の胚性幹細胞であるが、これらに限定されるものではない。
ＥＣＡＴ４を強制発現させるには、例えば、ＥＣＡＴ４遺伝子を含む発現ベクターを細胞に導入すれば良く、発現ベクターの導入方法としては、具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法、マイクロインジェクション法等の公知の方法が挙げられる。
ＥＣＡＴ４遺伝子を含む発現ベクターは、通常の遺伝子工学的手法に基づいて作製することができる。ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。また、マーカータンパクとＥＣＡＴ４の融合タンパクをコードする遺伝子を有しているものであってもよい。
ここで「マーカー遺伝子」とは、遺伝子学的解析に役立つ表現型のはっきりした遺伝子のことであり、遺伝子導入すると発現を直接観察できるものである。例えば、ＧＦＰやＧＦＰの変異体であるＣＦＰやＹＦＰなどの蛍光タンパク質の遺伝子を挙げることができるが、これに限らず、細胞内に遺伝子導入して発現させることにより、生きた細胞のままで遺伝子が導入されたことが確認できるものであれば全て、本発明のマーカー遺伝子の範疇に含まれる。なお、マーカータンパクとはマーカー遺伝子にコードされるタンパクである。
このようなマーカー遺伝子を付加したベクターを導入することにより、ＥＣＡＴ４を発現する細胞を簡便に検出することができる。更に、このような遺伝子を導入したＥＳ細胞を使用することにより、ＥＣＡＴ４を発現する幹細胞のみを選別できるため、ＥＳ細胞を機能細胞に分化させる際に未分化の細胞と分化した細胞とを選別できるマーカーとしても利用することができる。これにより、テラトーマ形成の危険が懸念される未分化な細胞を生体に移植する危険を回避することができる。
更に、ＥＣＡＴ４遺伝子を含む発現ベクターをコンディショナルな遺伝子発現制御システムを利用して作製することもできる。例えばテトラサイクリンの共存下では導入した目的遺伝子が発現し、非共存下では発現しない強制発現システムを挙げることができる（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４，３７２−６．）。これらのベクターを導入した細胞は培養条件によってＥＣＡＴ４発現細胞をスイッチオン／オフできるため、ＥＳ細胞の間はＥＣＡＴ４を安定に強制発現させ、分化誘導する際には発現をシャット・オフすることで、分化を効率よく誘導することができると考えられ、様々な用途に利用することができる。
なお、ＥＣＡＴ４遺伝子を含む発現ベクターは、一定条件下で消失する性質を有するベクターであってもよい。具体的には、例えば、ｐＣＡＧ−ＩＰベクターなどを挙げることができる。このような性質を有するＥＣＡＴ４発現ベクターを導入したＥＳ細胞は、トランスジェニックマウスなどの遺伝子改変動物を作製するのに非常に有用である。当該ベクターを導入したＥＳ細胞は、一定条件下でベクター自体が細胞から消失するため、ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒなど細胞内にベクターが残る方法を用いてＥＣＡＴ４の発現量を制御するよりも、簡便かつ確実に遺伝子改変動物を作製することができる。
例えば、ＥＣＡＴ４遺伝子を含むｐＣＡＧ−ＩＰベクターを用いて作製したＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞は、ＬＩＦやフィーダー細胞の非存在下で培養することが可能であるため、ＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞に所望の標的遺伝子を発現、ノックアウト、ノックダウンまたはノックインさせるための他のベクターを導入する操作は非常に容易である。
ここで遺伝子改変動物とは、標定遺伝子を過剰発現、ノックアウト、ノックダウンまたはノックインさせた動物のことである。遺伝子改変動物は公知の方法で作製することができ、動物は哺乳動物であればよく、例えばマウス、ラットなどを挙げることができる。
（２）本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＣＡＴ４遺伝子の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するものであり、ＥＣＡＴ４遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するものであればよく、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどが含まれる。
ここで、実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、ＥＣＡＴ４遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、ＥＣＡＴ４遺伝子の塩基配列のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。具体的には、配列番号：８〜１０のいずれかに記載の塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、上記各配列番号に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づき、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。
また、正鎖側のポリヌクレオチドには、ＥＣＡＴ４遺伝子の塩基配列、またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜１０００個程度、好ましくは１５〜５００個程度、更に好ましくは１６〜３０個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＣＡＴ４遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは該ＲＮＡとの相互作用を介してＥＣＡＴ４遺伝子の発現を調節・制御することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＥＣＡＴ４の発現を調節・制御するのに有用であり、前述のように未分化細胞を従来より確実になくしたりするうえで有用である。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどは、好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，８巻，２４７頁または３９５頁，１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適合した付加された形態で供与されてもよい。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明のスクリーニング方法を用いて調べることができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、前述のように２本鎖であってもよく、ＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡに結合し、該ＲＮＡを破壊またはその機能を抑制するものである。すなわち、ＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ等も本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドの利用につき詳述すれば、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接標的の培養細胞あるいは組織などに投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法により実施できる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組込むことにより、細胞に投与することもできる。これらの場合も、投与量、投与方法は細胞の種類、細胞数などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
アンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、細胞内でセンス鎖ｍＲＮＡに結合して、目的遺伝子の発現、即ちＥＣＡＴ４の発現を制御することができ、かくしてＥＣＡＴ４の機能（活性）を制御することができる。
アンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接培養細胞に投与する方法において、用いられるアンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学修飾体は、好ましくは１０〜１０００塩基、さらに好ましくは１５〜５００塩基、最も好ましくは１６〜３０塩基の長さを有するものとすればよい。その投与に当たり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化（試薬化）され得る。
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムに本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
本発明の細胞分化促進剤は、上述したアンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学修飾体、これらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。本発明の細胞分化促進剤は、試薬または医薬として用いることができる。該組成物の投与形態などは、標的細胞または組織に応じて適宜決定できる。本発明の医薬または試薬は、例えば本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームなど）とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、上記本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、目的により適宜調節することができる。通常、ＥＣＡＴ４遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、約０．００１μｇ−１００ｍｇ、好ましくは約０．００１μｇ−１０ｍｇを数日ないし数カ月に１回添加／投与される量とすればよい。例えば１０ｃｍシャーレの場合は、本発明アンチセンスヌクレオチドを０．０００１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１μｇ〜１０ｍｇを数日ないし数カ月に１回添加すればよい。
さらに、本発明は、（ｉ）ＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、（ｉｉｉ）ＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、（ｉｖ）前記リボザイムを含有してなる医薬、（ｖ）前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができる。ＥＣＡＴ４またはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができる二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなど試薬または治療剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、ＥＣＡＴ４をコードするポリヌクレオチド配列を基に設計して製造することができる。リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、ＥＣＡＴ４をコードするポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部をＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。ＥＣＡＴ４をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記の試薬または医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記試薬または医薬として使用する。
（３）本発明のＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４プロモーター領域、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列、組換えベクターおよび形質転換細胞
本発明の「ＥＣＡＴ４エンハンサー」とは、ＥＣＡＴ４の転写を促進する塩基配列のことである。本発明のＥＣＡＴ４エンハンサーを含むＥＣＡＴ４プロモーター領域を用いれば、ＥＣＡＴ４遺伝子の転写などを効率的に行うことができる。
本発明のＥＣＡＴ４エンハンサーは、（ｉ）配列番号７で示される塩基配列の一部または全部を含むことを特徴とするＥＣＡＴ４エンハンサー、（ｉｉ）配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有するＥＣＡＴ４エンハンサー、（ｉｉｉ）配列番号１５で示される塩基配列の一部であり、且つ配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９で示される塩基配列を含有するＥＣＡＴ４エンハンサー（ｉｖ）配列番号１５で示される塩基配列を含有するＥＣＡＴ４エンハンサー、（ｖ）配列番号１４で示される塩基配列の一部であり、配列番号１５で示される塩基配列を含有するＥＣＡＴ４エンハンサー、（ｖｉ）前記（ｉ）〜（ｖ）のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含み、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とするＥＣＡＴ４エンハンサー、（ｖｉｉ）前記（ｉ）〜（ｖ）のいずれか記載のＥＣＡＴ４エンハンサーの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４遺伝子の転写を促進する能力を有することを特徴とするＥＣＡＴ４エンハンサーである。
なお、（ｉ）の具体例としては、例えば、図８（Ｂ）で示される塩基配列の−４７３７位から−４６１１位の領域（配列番号１５において第１位から第１２７位の領域）のＤＮＡを含有するＥＣＡＴ４エンハンサー、および図８（Ｂ）で示される塩基配列の−４４９７位から−４３８７位の領域（配列番号１５において第２４１位から第３５１位の領域）のＤＮＡを含有するＥＣＡＴ４エンハンサーを挙げることができる。
本発明において「プロモーター領域」とは、調節遺伝子の一種で、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域である。細胞型特異的もしくは組織特異的な制御を受けるプロモーター要素、または外来性のシグナルもしくは因子（例えば、転写活性化タンパク質）によって誘導されるプロモーター依存的遺伝子発現を引き起こすために十分なプロモーター要素を含んでいてもよい。
本発明の「ＥＣＡＴ４プロモーター領域」は、前述の本発明ＥＣＡＴ４エンハンサーを含んでいるものであり、ＥＣＡＴ４のプロモーター活性を有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。具体的には、例えば、配列番号１４に示される塩基配列の一部または全部からなるＤＮＡなどを挙げることができる。
本発明の「ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列」とは、ＥＣＡＴ４が遺伝子に結合して転写制御作用を示す際に、ＥＣＡＴ４が認識する部位の遺伝子配列である。
本発明のＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列としては、
（ｉ）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とするＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列：
（ａ）配列番号４で示される塩基配列を含有する配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号４で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載されるＤＮＡを含むことを特徴とするＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列：
（ａ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｃ）配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、且つＥＣＡＴ４と結合する能力を有するＤＮＡ、
（ｉｉｉ）前述（ｉ）または（ｉｉ）記載の配列の一部を含有することを特徴とするＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列、
を挙げることができる。ここで、「１個もしくは複数個の塩基」とは、好ましくは１〜３個の塩基であり、更に好ましくは１〜２個の塩基である。また（ｉｉｉ）における「配列の一部」とは、例えば、配列番号５、配列番号６または配列番号１６で示される塩基配列の５’側末端から数塩基〜１０塩基のＤＮＡ、あるいは３’側末端から数塩基〜１０塩基のＤＮＡを挙げることができるが、これに限定されない。
本発明のＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列およびＥＣＡＴ４プロモーター領域は、ヒトまたは他の哺乳動物の細胞（例えば、ヒトリンパ球細胞、マウス線維芽細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織等に由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明のＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列およびＥＣＡＴ４プロモーター領域の調製方法としては、例えば、化学合成法、ＰＣＲあるいはハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
化学合成法を用いて調製する場合、ＤＮＡ自動合成機、例えばＤＮＡ合成機モデル３８０Ａ（ＡＢＩ社製）等を用いることができる。
次に、ＰＣＲを用いて本発明のＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域を調製する方法について説明する。鋳型とするゲノムライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等に記載されている方法に準じてヒト、マウス等の哺乳動物の組織から調製することができる。また、ヒトゲノムＤＮＡ（クローンテック製）等の市販のゲノムＤＮＡや、ヒトゲノムウォーカーキット（クローンテック製）等の市販ゲノムライブラリーを用いることができる。次いで、増幅させるプロモーターに対応したプライマーを用いてＰＣＲを行う。尚、前記プライマーは、配列番号７、配列番号１４または配列番号１５で示される塩基配列に基づいて適宜設計することができ、また、その５’末端側に、制限酵素認識配列等を付加してもよい。前記のようにして増幅されたＤＮＡは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすることができる。具体的には例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴＡクローニングキットに含まれるプラスミドベクターやＳｔｒａｔａｇｅｎｅ製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどのプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法などにより分析することができる。
次に、ハイブリダイゼーション法を用いて調製する方法について説明する。
まず、プローブに用いるＤＮＡを標識する。プローブに用いるＤＮＡとしては、調製しようとするエンハンサー、プロモーター領域等の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡ、例えば、配列番号４〜７、および配列番号１４〜１９のいずれかで示される塩基配列もしくはその連続した一部の塩基配列からなるＤＮＡであってその鎖長が１６塩基以上１６０塩基以下であるＤＮＡ、前記ＤＮＡの塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下にハイブリダイズするＤＮＡ等を挙げることができる。
プローブに用いる前記ＤＮＡは、例えば、化学合成法、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション法等、前述した通常のＤＮＡの調製方法によって得ることができる。なお、プローブに用いる前記ＤＮＡは、それ自身がＥＣＡＴ４をコードする遺伝子の転写を制御する能力を有していても良い。
プローブに用いる前記ＤＮＡを放射性同位元素により標識するには、例えば、ベーリンガー製、宝酒造製のＲａｎｄｏｍ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等を用いることができ、通常のＰＣＲ反応組成中のｄＣＴＰを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いる前記ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ反応を行うことにより、標識を行うこともできる。また、プローブに用いるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には例えば、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｉｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）等を用いることができる。プローブをハイブリダイズさせるＤＮＡライブラリーとしては、例えば、マウスなどのげっ歯類等の動物由来のゲノムＤＮＡライブラリー等を使用することができる。当該ＤＮＡライブラリーには、市販のゲノムＤＮＡライブラリーを用いることもできるし、また「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓや「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＩＳＢＮ０−４７１−５０３３８−Ｘ等に記載される通常のライブラリー作製法に従い、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のλ  ＦＩＸ  ＩＩ、λ  ＥＭＢＬ３、λ  ＥＭＢＬ４、λ  ＤＡＳＨ  ＩＩ等のλベクターを用い、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）等をｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングに用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、これを用いることもできる。
ハイブリダイゼーション方法としては、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションをあげることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択するとよい。例えば、使用されるライブラリーがプラスミドベクターで構築されたライブラリーである場合には、コロニーハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換細胞を取得し、得られた形質転換細胞を希釈して寒天培地にまき、コロニーが現れるまで３７℃で培養を行う。また、使用されるライブラリーがファージベクターで構築されたライブラリーである場合には、プラークハイブリダイゼーションを行うことができる。具体的にはまず、宿主微生物とライブラリーのファージを感染可能な条件下で混合した後さらに軟寒天培地と混合し、これを寒天培地上にまく。その後プラークが現れるまで３７℃で培養を行う。より具体的には、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）２．６０から２．６５等に記載されている方法に準じて、ＮＺＹ寒天培地に寒天培地１ｍｍ２当り０．１〜１．０ｐｆｕの密度で、約９．０×１０５ｐｆｕのファージライブラリーを広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。
次いで、前記のいずれのハイブリダイゼーション法を用いた場合も、前述の培養を行った寒天培地の表面にメンブレンフィルターをのせ、プラスミドを保有する形質転換細胞やファージを当該メンブレンフィルターに転写する。このメンブレンフィルターをアルカリ処理した後、中和処理し、次いで、ＤＮＡを当該フィルターに固定する処理を行う。より具体的には例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）等に記載の通常の方法に準じて、前記寒天培地の上にニトロセルロースフィルター又はナイロンフィルター等、例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンフィルターに吸着させる。次に、当該フィルターをアルカリ溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｎ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させてファージＤＮＡをフィルター上に溶出させた後、中和溶液（１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス塩酸、ｐＨ７．５）に約５分間浸す処理を行う。当該フィルターを洗浄溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭトリス塩酸）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間ベーキングすることによりファージＤＮＡをフィルターに固定する。このように調製されたフィルターと、前記プローブとを用いてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションを行う際の試薬及び温度条件は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編「ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５）ＩＳＢＮ  ０−９４７９４６−１８−７、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社１９８９年）、または、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）等の記載の方法に準じて行うことができる。例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液を、前記のようにして作製したフィルター１ｃｍ２当り５０〜２００μＬの割合で準備し、当該溶液に前記フィルターを浸して４２〜６８℃で１〜４時間、好ましくは、４５℃で２時間保温する。次いで、例えば、４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム、４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍＬの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液、好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳおよび１００μｇ／ｍＬの変性Ｃａｌｆ−ｔｈｙｍｕｓ  ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液と、前述の方法で調製して得られたプローブ（フィルター１ｃｍ２当り１．０×１０４〜２．０×１０６ｃｐｍ相当量）とを混合した溶液をフィルター１ｃｍ２当り５０〜２００μＬの割合で準備し、当該溶液にフィルターを浸し４２〜６８℃で４〜２０時間、好ましくは、４５℃で１６時間保温しハイブリダイゼーション反応を行う。当該ハイブリダイゼーション反応後、フィルターを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム、１．５〜３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および０．１〜１．０％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ等を含む４２〜６８℃の洗浄溶液等、好ましくは、３００ｍＭの塩化ナトリウム、３０ｍＭのクエン酸ナトリウム、および１％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳを含む５５℃の洗浄溶液で、１０〜６０分間のフィルター洗浄を１〜４回、好ましくは１５分間の洗浄を２回行う。さらに、フィルターを２×ＳＳＣ溶液（３００ｍＭ塩化ナトリウム、および３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。）で軽くすすいだのち乾燥させる。このフィルターを、例えば、オートラジオグラフィーなどに供してフィルター上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのフィルター上の位置を検出する。検出されたＤＮＡのフィルター上の位置に相当するクローンをもとの寒天培地上で特定しこれを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離することができる。具体的には例えば、フィルターをイメージングプレート（富士フィルム）に４時間露光させ、次いで当該プレートをＢＡＳ２０００（富士フィルム）を用いて解析し、シグナルを検出する。フィルターの作製に用いた寒天培地のうち、シグナルが検出された位置に相当する部分を約５ｍｍ角にくり抜き、これを約５００μＬのＳＭバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、０．１Ｍ塩化ナトリウム、７ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．０１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチンを含む。）に２〜１６時間、好ましくは３時間浸してファージ粒子を溶出させる。得られたファージ粒子溶出液をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５に記載の方法に準じて寒天培地に広げ、３７℃で６〜１０時間培養する。この寒天培地を用いて前述の方法と同様の方法でファージＤＮＡをフィルターに固定し、このフィルターと前述のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う。フィルターの作製に用いた寒天培地のうちの、シグナルが検出された位置に相当する部分からファージ粒子を溶出し、これを寒天培地に広げ、前述の方法と同様にフィルターを作製し、ハイブリダイゼーションを行う。このようなファージクローンの特定と純化を繰り返すことにより、用いたプローブとハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを含むファージクローンが得られる。前述のようなハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行うことにより得られたクローンの保有するＤＮＡは、ＤＮＡ調製や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ＋、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＫＳ−  等にサブクローニングして、プラスミドＤＮＡを調製し、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ著、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７），７４，５４６３−５４６７等に記載されるダイデオキシターミネーティング法を用いてその塩基配列を決定することができる。塩基配列分析に用いる試料の調製は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）１３．１５等に記載されているプライマーエクステンション法に準じて行うことができる。また、ファージクローンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）２．６０から２．６５等に記載の方法に準じてＮＺＹＭ液体培地で増幅し、ファージ液を調製して、これから例えば、Ｌａｍｂｄａ−ＴＲＡＰＰＬＵＳ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）等を用いてファージクローンＤＮＡを抽出し、当該ＤＮＡを鋳型として、例えば、前述のプライマーエクステンション法により塩基配列分析用の試料を調製し、塩基配列を分析することもできる。このようにして得られるＤＮＡのＥＣＡＴ４遺伝子の転写を制御する能力を後述のようにして確認することもできる。尚、本願において「転写を制御する能力」とは、例えば、プロモーター領域の下流に位置する遺伝子の転写を開始および／または促進させる活性等を意味する（以下、プロモーター活性と記すこともある。）。
本発明のＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列およびＥＣＡＴ４プロモーター領域は、配列番号４〜７および配列番号１４〜１９のいずれかで示される塩基配列を含む配列に変異を導入することによって作製しても良い。具体的には、例えば、Ａ．Ｇｒｅｅｎｅｒ，Ｍ．Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（１９９４）７，３２−３４等に記載される方法を用いてランダムに変異を導入することによって取得することができ、Ｗ．Ｋｒａｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８４）１２，９４４１もしくはＷ．Ｋｒａｍｅｒ，Ｈ．Ｊ．Ｆｒｉｔｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３５０等に記載のギャップド・デュープレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法、またはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．ｏｆ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２，４８８もしくはＴ．Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ，ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４，３６７等に記載のクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法を用いて部位特異的に変異を導入することによって取得することができる。あるいは、配列番号１５で示される塩基配列を含むＥＣＡＴ４プロモーター領域等のうち１ヶ所ないし数カ所の部分塩基配列を、他のプロモーターのＤＮＡの一部と入れ換えたキメラＤＮＡを作製することによって取得することができ、例えば、Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８４）２８，３５１、Ｃ．Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ（１９８５）３３，１０３等に記載された方法を用いることができる。
前記の種々の方法で調製される本発明プロモーター領域を、通常の方法、例えば、「田村隆明著（羊土社刊）、新転写制御のメカニズム（２０００年）」３３〜４０頁、「野村慎太郎、渡辺俊樹監修著（秀潤社刊）、脱アイソトープ実験プロトコール（１９９８年）」等に記載された方法に準じて、プロモーター活性を維持したまま、その一部分の塩基を欠失させて得られる（即ち、適当な制限酵素を用いて切り出すことにより調製される）ＤＮＡも本発明プロモーター領域として使用することができる。得られたＤＮＡのＥＣＡＴ４遺伝子の転写を制御する能力は後述する方法により確認することができる。
本発明組換えベクターの調製において、本発明ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域（以下、本明細書において「ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域」という）を挿入するための組換えベクターとしては、所望の細胞内で機能可能な組換えベクターであれば良い。本発明のＥＣＡＴエンハンサーを用いる場合は、公知の適切なプロモーターを機能可能な形に連結することができる。なお、本発明組換えベクターは、当該組換えベクターが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、前記組換えベクターにおいて、本発明エンハンサー／プロモーター領域および所望の遺伝子が組換えベクター上で機能可能な形で連結されるような位置、例えば当該エンハンサー／プロモーター領域を挿入する部位の下流に遺伝子挿入部位がさらに有ると、所望の遺伝子を細胞内で発現させるための組換えベクターの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明エンハンサー／プロモーター領域を有する組換えベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。当該組換えベクターとして具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９（宝酒造製）など］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）等が挙げられる。
また、本発明組換えベクターの調製において、本発明のＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を挿入するための組換えベクターとしては、所望の細胞内で機能可能な組換えベクターであれば良く、当該組換えベクターが導入された細胞を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。また、前記組換えベクターにおいて、本発明のコンセンサス配列および所望の遺伝子が組換えベクター上で機能可能な形で連結されるような位置、例えば当該コンセンサス配列を挿入する部位の下流に適切なプロモーターおよび遺伝子挿入部位がさらに有ると、所望の遺伝子を細胞内で発現させるための組換えベクターの構築等に好ましく利用できる。ここで遺伝子挿入部位とは、例えば、遺伝子工学的手法で通常用いられる制限酵素が特異的に認識切断可能な塩基配列であり、本発明のＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を有する組換えベクター上に唯一存在する種類の制限酵素認識配列が好ましい。当該組換えベクターとして具体的には、例えば、ｐＵＣ系プラスミド［ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９（宝酒造製）など］、ｐＳＣ１０１系プラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）等が挙げられる
さらにＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の活性、またはＥＣＡＴ４とＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列の結合を調べるためには、ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域またはＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列の下流に検出可能な構造遺伝子を連結すればよい。エンハンサー／プロモーター領域またはコンセンサス配列の下流に連結される構造遺伝子としては、種々のレポーター遺伝子が用いられる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子の他に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が汎用されているが、他のいかなる構造遺伝子であっても、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。上記構造遺伝子をベクターに組み込むには、ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域またはＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列の下流に存在する適当な制限酵素切断部位に、上記構造遺伝子が正しく転写される方向に連結すればよい。例えば、ｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（プロメガ社）などの市販のベクターを用いることもできる。
上記組換えベクターにより形質転換する宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，マウス繊維芽細胞３Ｔ３−Ｌ１，ヒト肝臓ガン細胞ＨｅｐＧ２（以下、ＨｅｐＧ２細胞と略記）、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ−６３（以下、ＭＧ−６３細胞と略記）、ヒトＦＬ細胞、白色脂肪細胞、卵細胞、ＥＳ細胞（Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．とＫａｕｆｍａｎ，Ｋ．Ｈ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９２，１５４）などが用いられる。好ましくは哺乳動物由来の組織幹細胞またはＥＳ細胞であり、特に好ましくは、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞などを挙げることができる。
これらの細胞への形質転換の方法としては、リン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６）、エレクトロポレーション法（石崎ら（１９８６）細胞工学，５，５７７）、マイクロインジェクション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが用いられる。より具体的には、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。上記形質転換体は、特定の化合物の存在下に培養し、培養物中の遺伝子産物の量を測定し比較することにより、該化合物のプロモーター活性のコントロール能を知ることができる。該形質転換体の培養はそれ自体公知の方法で行なう。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。
本発明の組換えベクターがＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４のプロモーター領域を含有するＤＮＡであれば、上記の形質転換体を用いることによって、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御（活性化／抑制）する化合物をスクリーニングすることが可能である。また、本発明の組換えベクターがＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を含有するＤＮＡであれば、上記の形質転換体を用いることによって、ＥＣＡＴ４と該コンセンサス配列の結合を制御（活性化／抑制）する化合物のスクリーニングに用いることが可能である。
（４）ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御（活性化／抑制）する物質をスクリーニングする方法、およびＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を用いたスクリーニング方法
本発明のＥＣＡＴ４遺伝子、ＥＣＡＴ４エンハンサー、ＥＣＡＴ４プロモーター領域、またはＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を利用することにより、ＥＣＡＴ４の発現を制御（活性化／抑制）する物質、あるいはＥＣＡＴ４の機能を制御（活性化／抑制）する物質をスクリーニングすることができる。
例えば、ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の塩基配列にルシフェラーゼ遺伝子を結合したキメラ遺伝子を細胞（例えば、ＥＳ細胞など）に導入することで、ＥＣＡＴ４の発現を活性化または抑制する物質をスクリーニングすることができる。また同様に、ＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列を含むプロモーター遺伝子とレポーター遺伝子とのキメラ遺伝子を細胞（例えば、ＥＳ細胞など）に導入することで、ＥＣＡＴ４による転写活性化または転写抑制に影響を及ぼす物質、あるいはＥＣＡＴ４と同様の活性を有する物質をスクリーニングすることができる。更に、公知のＢｉｎｄｉｎｇアッセイ、例えばＳＰＡ法（アマシャムファルマシア社）を用いたＢｉｎｄｉｎｇアッセイなどで、ＥＣＡＴ４と本発明のコンセンサス配列の結合を阻害する物質を探索することも可能である。
本発明のＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する物質のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものが例示される：
（ａ）ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させたＤＮＡで形質転換した細胞と被験物質とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の活性を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における活性と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＥＣＡＴ４エンハンサーまたはＥＣＡＴ４プロモーター領域の活性を制御する被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、前述（３）に記載の本発明の形質転換体が、有用である。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（本発明のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
また本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅しない培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
実施例に示すように、ＥＣＡＴ４を強制発現させた細胞は、ＬＩＦやファーダー細胞非存在下でもＥＳ細胞の持つ全能性を維持するため、ＥＳ細胞の自己複製能に関与するマスター遺伝子であると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、このＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の転写能を指標として、その活性を制御（活性化／抑制）する物質を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、ＥＳ細胞の培養維持に有効な候補物質、またはＥＳ細胞を分化させるのに有効な候補物質を提供することができる。ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の転写能を活性化する候補物質はＥＳ細胞の培養維持に有用であり、抑制する物質はＥＳ細胞を分化させるのに有用であると考えられる。
より具体的には、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の活性が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のそのレベルに比して変動（高くなる／低くなる）場合に、選択することができる。
ＥＣＡＴ４エンハンサー／プロモーター領域の活性の定量は、前述のように、ＥＣＡＴ４遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによって実施できる。測定方法としては、例えば、Ｂｒａｓｉｅｒ，Ａ．Ｒ．ら（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．７，１１１６−１１２２の記載に準じた方法により、ルシフェラーゼ活性を測定することなどがあげられる。
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、前述（３）に記載のように、ルシフェラーゼ遺伝子のほか、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。
【実施例】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。
【実施例１】ＥＣＡＴ４の同定
多能性細胞の主要な転写因子の候補を同定するために、ここではＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより開発されたデジタルディフェレンシャルディスプレイを実施した。この方法により、各種細胞および組織に由来する発現シーケンスタグ（ＥＳＴ）ライブラリ中におけるそれぞれの遺伝子の発現頻度を比較することが可能である。今回比較したのは、マウスＥＳ細胞に由来するＥＳＴライブラリ（２７７０５クローン）と各種体細胞組織および器官に由来するＥＳＴライブラリ（１３２８８３５クローン）であった。
（１）デジタルディフェレンシャルディスプレイ
本発明ではＤｉｇｉｔａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ，ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｕｎｉｇｅｎｅ／ｄｄｄ／ｃｇｉ）を用いて、ＥＳ細胞および他の組織に由来するｃＤＮＡライブラリー中の遺伝子発現を分析した。ＥＳ細胞由来のＥＳＴライブラリーは＃２７４および２２０であった（合計２７７０５エントリー）。各種体細胞組織を代表して用いたライブラリーは＃４６７、３１８、１９８、４０８、２３９、４００、４５３、１０９、１６、５２３、１６１、４８３、２５８、２６４、４１９、５２９、３２７、４１１、４１７、４１８、３９９、１９６、２７１、２５５、４９５、１０１、９８、３５１、４１６、３２１、２５１、４１２、３７９、５４９、３２９、２６５、４４９、３２８、５１６、３２０、４３６、４２７、２９７、３６６、３９０、３１５、２２８、２７７、２９２、２８４、２８５および３０であった（合計１３２８８３５エントリー）。
同プログラムによる解析の結果、２０遺伝子がＥＳ細胞においては、体細胞組織と比較して少なくとも２０倍以上の高頻度で発見された。これらの中には、例えばＯｃｔ３／４、ＵＴＦ１（Ｏｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、およびＲｅｘ１（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）などの実験的に同定されたＥＳ細胞特異的マーカー遺伝子が存在しており、この技術の有用性を示している。ノーザンブロット分析により、特徴が知られていない少なくとも９個の遺伝子についてＥＳ細胞に特異的な発現が確認されたが、ここではその中の１個でホメオボックスドメインを有しているものをＥＣＡＴ４と命名した（図１（Ａ））。
ＥＣＡＴ４の転写は未分化ＲＦ８（Ｍｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）およびＭＧ１．１９（Ｇａｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）ＥＳ細胞において認められ（図１（Ｂ））、レチノイン酸により誘導された分化で減少した。成体マウスの１２臓器において、ＥＣＡＴ４転写物は検出できなかった。さらに抗ＥＣＡＴ４ポリクローナル抗体を作成し、ＥＣＡＴ４がＲＦ８、ＭＧ１．１９、Ｊ１（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、およびＣＧＲ８（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の４種類のＥＳ細胞ラインにおいて発現していることを確認した（図１（Ｃ））。レチノイン酸処理を行うと、４種類の系列全てにおいてＥＣＡＴ４の発現が抑制された。これらのデータによって、新しいホメオボックス遺伝子であるＥＣＡＴ４の特異的な発現が、ＥＳ細胞に共通に見られる特性であることが示された。
【実施例２】ＥＣＡＴ４タンパク質と新規なホメオボックス
５’ＲＡＣＥ法により、２１８４塩基からなるＥＣＡＴ４の全長ｃＤＮＡを単離した（図１（Ａ））。そして３０５個のアミノ酸ポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームが同定された。
このＥＣＡＴ４  ｃＤＮＡには比較的長い１０７７塩基の３’非翻訳領域がある。ホモロジー検索により、ＥＣＡＴ４タンパク質はホメオボックスドメインを含むことが明らかになった。系統分析によれば、このＥＣＡＴ４ホメオボックスはＮｋ−２遺伝子ファミリー（Ｈａｒｖｅｙ，１９９６）に最も近いことが示された（図２（Ｂ））。しかしながら、アミノ酸の同一性は４０％未満である。さらにＥＣＡＴ４では、ＮＫ−２ファミリーでは厳密に保存されているチロシンに対応する位置にバリンが存在する。ＮＫ−２ファミリーでは保存されているＴＮドメインおよびＮＫ−２特異的ドメインは、ＥＣＡＴ４には存在しない。これらのデータからＥＣＡＴ４はＮＫ−２ファミリーではないことが示唆される。ＥＣＡＴ４は、Ｏｃｔ３／４、Ｐｅｍ（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）やＥｈｏｘ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）などといった、ＥＳ細胞内で発現する他のホメオボックス遺伝子におけるホメオボックスドメインに対して、低い相同性しか持っていない。ホメオボックス以外にはＥＣＡＴ４蛋白質に既知のドメインは存在しない。したがってＥＣＡＴ４は、既知のサブファミリーのいずれにも属さない、新しいホメオボックス転写因子であると考えられる。
【実施例３】マウスＥＳ細胞中のマウスＥＣＡＴ４遺伝子の標的破壊
（１）マウスＥＣＡＴ４遺伝子の標的破壊
ホメオボックスドメインを持つマウスＥＣＡＴ４遺伝子のエクソン２を、ＩＲＥＳ（内部リボソーム結合部位）−β−ｇｅｏ（βガラクトシダーゼとネオマイシン抵抗性遺伝子の融合体）カセット（Ｍｏｕｎｄｔｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）またはハイグロマイシン抵抗性遺伝子置換するためのターゲティングベクターを作製した。イントロン１を含む４ｋｂ断片とエクソン３からエクソン４までの１．５ｋｂｐ断片をＢＡＣクローンから増幅し、ターゲティングベクターの５’および３’相同領域として用いた（図２（Ａ））。得られたターゲティングベクターを、エレクトロポレーションによりＲＦ８  ＥＳ細胞内に導入した（Ｍｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｇ４１８−抵抗性コロニーからの相同組み替えに関するゲノムＤＮＡのスクリーニングを、サザンブロットにより行った。
β−ｇｅｏ標的ベクターを用いた場合、スクリーニングされた９６個のコロニー中２７個が陽性であることが判明した。ｈｙｇｒベクターを用いた場合には、２７個中８個が陽性であった。相同組み替えの確認はサザンブロットを用いて行った（図２（Ｂ））。
ホモ接合ＥＳ細胞を得るために、本研究ではβ−ｇｅｏベクターを用いて確立されたヘテロ変異細胞に、ｈｙｇｒベクターを導入した。細胞の選別はＬＩＦを用いたＭＥＦ細胞上でハイグロマイシンを用いて行った。スクリーニングされた８３個のうち３４個中に、ｈｙｇｒベクターの相同組み替えが確認された。これらの中で、１１個のクローンがＥＣＡＴ４変異に対してホモ接合であることが、サザンブロット（図２（Ｂ））およびＰＣＲ（図２（Ｃ））の両方により判明した。ノーザンブロット（図２（Ｄ））分析により、ホモ接合細胞内におけるＥＣＡＴ４発現の欠如が確認された。他の２３個のクローンでは、ｈｙｇｒベクターがβ−ｇｅｏカセットを置換していた。
次に、反対のアプローチでホモ接合細胞を作成することを試みた。すなわちハイグロマイシンベクターにより確立されたヘテロ変異細胞にβ−ｇｅｏベクターを導入した。細胞の選別はＬＩＦを発現するＳＮＬ支持細胞上でＧ４１８を用いて行った。スクリーニングされた３９７個のうち１１４個において、β−ｇｅｏベクターの相同組み替えが確認された。これらの中で、６個のクローンがホモ接合であることが判明した。両方の組み合わせによって得られたＥＣＡＴ４欠損細胞は、以下の実施例４および実施例５に示されるような挙動を示した。
（２）相同組み替えに関するＰＣＲスクリーニング
相同組み替えに対する初期スクリーニングはＥｘＴａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲにより行った。６０４７−ｉｎｓＳ１．２および６０４７−ｉｎｔＡＳ１プライマーを用いた特異的増幅により、野生型遺伝子座からは３．２−ｋｂバンドが、β−ｇｅｏベクターの標的遺伝子座からは８．５−ｋｂバンドが、そしてｈｙｇｒベクターの標的遺伝子座からは４．２−ｋｂバンドが得られた。
（３）相同組み替えのスクリーニングに関するサザンブロット分析
相同組み替えの確認はサザンブロット分析を用いて行った。５’サザンブロット分析のためにはゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、０．８％アガロースゲル上で分離し、既出の方法でナイロン膜に転写した（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。５’フランキング領域由来の４７０ｂｐプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、野生型遺伝子座から８．８ｋｂのバンドが、βｇｅｏ標的ベクターを用いた標的遺伝子座から１１．４ｋｂのバンドが、ハイグロマイシンベクターを用いた標的遺伝子座から９．８ｋｂのバンドが生じた。３’サザンブロット分析のためにＳｃａｌを用いて消化を行った。３’フランキング領域由来の１ｋｂプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、野生型遺伝子座から１１ｋｂのバンドが、βｇｅｏ標的ベクターを用いた標的遺伝子座から１５．４ｋｂのバンドが、ハイグロマイシンベクターを用いた標的遺伝子座から７．３ｋｂのバンドが生じた。
（４）マウス遺伝子型の特定
正しく標的されたＥＳ細胞クローンの同定後、３プライマーＰＣＲを用いてマウスの遺伝子型を決定した。一つ目のセンスプライマ６０４７−Ｓ５は野生型遺伝子座を増幅するため、エクソン２をもとに設計した。２つ目のセンスプライマβ−ｇｅｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １は標的化遺伝子座を増幅するため、βｇｅｏカセットをもとに設計した。共通のアンチセンスプライマ６０４７−ｉｎｔＡＳ３は野生型および標的化遺伝子座の両方を増幅するため、イントロン２をもとに設計した。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより野生型遺伝子座から８５０ｂｐの断片が、標的化遺伝子座から６００ｂｐの断片が生じた。ＰＣＲの実施はＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用い、製造元のプロトコルに従い行った。ＰＣＲプログラムは、初期変性（９４℃、２分）、３５サイクル（９４℃  ３０秒、５３℃  ３０秒、６８℃  １分）および最終伸張（６８℃  ７分）であった。
【実施例４】ＥＣＡＴ４ホモ変異ＥＳ細胞の胚体外内胚葉への分化
薬剤選別終了時におけるＥＣＡＴ４欠損細胞のコロニーは、形態学的に野生型およびヘテロ接合ＥＳ細胞の場合と異なっていた。中心の細胞は未分化のようであったが、周辺の細胞は分化していた。ＳＮＬ支持細胞上で組み替えＬＩＦの添加により維持した場合、ほぼ全ての細胞が急速かつ自然に分化し、巨大な円形の細胞になった（図３（Ａ））。支持細胞の存在しない状態で培養を行った場合には、ＥＣＡＴ４欠損細胞はさらに平坦になり、壁側内胚葉に類似した形態を示した。ＥＣＡＴ４欠損細胞の成長速度は非常に阻害されていた（図３（Ｂ））。
ノーザンブロット（図３（Ｃ））およびＲＴ−ＰＣＲ（図３（Ｄ））分析によれば、ＥＣＡＴ４細胞はＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｈｉｎｆ１β、Ｈｉｎｆ４α、Ｃｏｕｐ−ｔｆＩ、Ｃｏｕｐ−ｔｆＩＩ等の原始内胚葉転写因子、ラミニンＢ１、ｄｉｓａｂｌｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２（Ｄａｂ２）、Ｓｐａｒｃ、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）等の壁側内胚葉マーカー、そしてα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、Ｉｎｄｉａｎ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）、トランスサイレチン（Ｔｔｒ）等の臓側内胚葉マーカーを発現していた。しかし、中胚葉マーカーＴ、トロフォブラストマーカーＣｄｘ２、原始外胚葉マーカー線維芽細胞成長因子（Ｆｇｆ）−５、あるいは神経外胚葉マーカーｉｓｌｅｔ−１（Ｉｓｌ１）は増加しなかった。
ＥＣＡＴ４欠損細胞が分化多能性を喪失したことを確認するため、これらの細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入した。ヘテロ変異細胞を注射した場合には、毛皮の色から判断してＥＳ細胞が大きく寄与する複数のキメラマウスが得られた。対照的にＥＣＡＴ４ホモ変異細胞を注射した場合にはキメラマウスは得られず、これらの細胞の多能性が消失したことが確認された。
【実施例５】ＥＣＡＴ４欠損マウスにおける初期胚性致死
ＥＣＡＴ４のｉｎ  ｖｉｖｏ機能を調べるために、β−ｇｅｏベクターを用いて得たＥＣＡＴ４ヘテロ接合ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入した。生殖細胞系の伝搬が、３種類の独立したＥＳクローンより得られた。ＥＣＡＴ４ヘテロ接合マウスは予想されるメンデル比で得られ、全体的な外見は正常であり、繁殖可能であった。着床前の胚をＸ−ｇａｌ染色すると、胚盤胞の内部細胞塊に限定して、β−ｇｅｏ発現が検出された（図４（Ａ））。ヘテロ接合性の交雑はホモ接合性の子孫を全く産生せず、胚性致死であることが示された。
胚が致死となる時期を決定するために、ここでは各種段階におけるヘテロ接合交雑の胚を分析した。７．５ｄｐｃおよびその後では、ホモ接合胚はなかった。およそ１／３の脱落膜が空であったことから、ＥＣＡＴ４欠損胚は着床後すぐに死亡することが示された。対照的に、ホモ接合およびヘテロ接合の胚盤胞はメンデル比により存在することが判明した。しかしながらゼラチンコートしたプレート上で培養した場合には、ＥＣＡＴ４欠損胚盤胞の内部細胞塊は増殖しなかった（図４（Ｂ））。これらのデータから、ＥＣＡＴ４は原始外胚葉（エピブラスト）の自己複製に必須であることが示された。
【実施例６】ＥＣＡＴ４を強制発現したＥＳ細胞の効率的な樹立
（１）ＥＣＡＴ４を強制発現したＥＳ細胞の作製
スーパートランスフェクションシステムを用いて、ＥＣＡＴ４のコード領域をｐＣＡＧ−ＩＰベクターに導入し、遺伝子ベクターを構築した。この導入遺伝子ベクターをＭＧ１．１９ＥＳ細胞内にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造元が提供するＥＳ細胞用プロトコルに従って行った。具体的には、ＭＧ１．１９細胞を６ウェルプレート中に播種し（１．２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、２４時間培養後、８μｇの導入遺伝子を４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００と複合体を形成させた後に培地に添加した。翌日、細胞を１００ｍｍシャーレに播種し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選別した。選別は実験を通して継続した。
この導入遺伝子ベクターにおいては単一のＣＡＧプロモーターの下流に目的遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子が連続して存在しており、２つの遺伝子を含んだｍＲＮＡが転写される。両者の間にＩｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅが存在しており、ここからピューロマイシン耐性遺伝子の翻訳が行われる。したがって、ピューロマイシン耐性となった細胞はすべてが目的遺伝子も発現することとなる。実際、この方法を用いて、ＭＧ１．１９細胞内にＥＣＡＴ４を導入し、ピューロマイシン選別した結果、９０％以上の細胞でＥＣＡＴ４の発現が認められた。得られたＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞は、親ベクターをトランスフェクトした対照細胞と比較して、著しく多くのＥＣＡＴ４転写物（図５（Ａ））およびタンパク質（図５（Ｂ））を発現した。
（２）強制発現したＥＳ細胞のＬＩＦ非依存的な自己複製
ＬＩＦの除去後には対照細胞でのＥＣＡＴ４レベルは減少したが、ＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞ではむしろ増加した。ＬＩＦの非存在下で対照細胞は徐々に分化し、平坦化し（図５（Ｃ））、Ｏｃｔ３／４の発現は抑制された（図５（Ａ））、細胞の成長速度もＬＩＦの除去により低下した（図５（Ｄ））。一方、ＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞は、ＬＩＦ除去後においても未分化状態を維持しており（図５（Ｃ））、Ｏｃｔ３／４の発現も持続し（図５（Ａ））、ＬＩＦ除去により生じる成長抑制に対しても抵抗性を示した（図５（Ｄ））。これらのデータより、ＥＣＡＴ４の恒常的発現により、ＬＩＦ非存在下においてもＥＳ細胞の未分化状態が十分に維持されることが示された。
（３）ＥＣＡＴ４発現ベクターの除去と分化全能性の回復
ｐＣＡＧ−ＩＰベクターは染色体外で維持される発現ベクターであり、ピューロマイシンの非存在下で培養を続けると消失することが知られている。これを利用してＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞を１ヶ月間ピューロマイシン非存在下、ＬＩＦ存在下で培養したところ、外来遺伝子の発現の消失をウェスタンブロットにより確認した。この細胞はＬＩＦを除去すると正常細胞と同様に分化した。また、ＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞をブラストシストにマイクロインジェクションしたところキメラマウスができた。したがってＥＣＡＴ４過剰発現細胞はＬＩＦ非存在下で培養しても、ＥＣＡＴ４を除去すれば分化全能性を再獲得できることが確認できた。ＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞はＬＩＦ非存在下においてもＥＳ細胞の未分化状態が十分に維持されるため、このＣＡＧ−ＥＣＡＴ４細胞を遺伝子改変動物の作製に供することにより、遺伝子改変動物の作製がより容易となる。
【実施例７】ＥＣＡＴ４をもちいたＤＮＡ認識配列の同定
ＥＣＡＴ４による転写調節について最初の手がかりを得るため、ここでは試験管内人工進化法（ＳＥＬＥＸ）によるそのＤＮＡ認識配列の決定を目指した。
（１）ＳＥＬＥＸの実施
マルトース結合タンパク質とＥＣＡＴ４からなる融合タンパク質を作製するため、マウスＥＣＡＴ遺伝子のコーディング領域をｐＩＨ１１１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから提供）中に導入し、導入遺伝子ベクター（ｐＩＨ１１１９−ＥＣＡＴ４）を構築した。このプラスミドｐＩＨ１１１９−ＥＣＡＴ４をＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入してＭＢＰ−ＥＣＡＴ４を発現する形質転換体を得た。
３７℃条件で５００ｍｌのＬＢ培地中で培養し、培地のＯ．Ｄ．が０．３に達した時点でＩＰＴＧ（最終濃度５０μＭ）を添加後、３０℃で４時間培養してタンパク質誘導を行った。細胞抽出物は、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社）および０．５ｍｇ／ｍｌのｌｙｓｏｚｙｍｅを含有する５ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で集めた。
次にこの抽出物を２５０μｌのアミロースビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に供し、製品のプロトコルに従って洗浄した。ＳＥＬＥＸは以下のように実施した。二重鎖オリゴヌクレオチドの合成を、１μｇのＳＥＬＥＸ−Ｎ２０−Ｏｌｉｇｏ（配列番号１１）、１μｇのＳＥＬＥＸ−Ｎ２０ＲＶプライマー（配列番号１２）、２．５μｌの１０ｘ  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液、４μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰおよび１４．７μｌの精製水を含む反応液中で行った。混合液の変性を９５℃で５分間行い、アニーリングを５４℃で５分間行った。
Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（３．６μｌ  １ｘ  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液中に０．２２５Ｕ）を混合液に添加し、これを次に２５℃で４０分間インキュベートした。二重鎖ＤＮＡの精製はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により行い、２０μｌの精製水中に再懸濁した。ＤＮＡ−タンパク質結合の実施は、２０μｌのＤＮＡ、３０μｌのＭＢＰ−ＥＣＡＴ４−結合ビーズ、２０μｌｓの５ｘ結合緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＫＣｌ、および５０％グリセロール）および３０μｌの水から成る反応混合液中で、４℃で３０分間行った。ビーズの洗浄は、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．２ｍＭ  ＰＭＳＦを添加した１００μｌの溶解緩衝液を用いて６回行った。
ＤＮＡの精製はフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により行い、２０μｌの精製水中に再懸濁した。この５μｌを用いてＰＣＲ増幅を行ったが、この時の反応液には５μｌの１０ｘＥｘＴａｑ緩衝液、４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの３０μＭ  ＳＥＬＥＸ−Ｎ２０ＦＷプライマー（配列番号１３）、１μｌの３０μＭ  ＳＥＬＥＸ−Ｎ２０ＲＶプライマー、０．２５μＬのＥｘＴａｑポリメラーゼおよび３３．７５μＬの水が含まれていた。増幅産物の精製はＭｉｃｒｏ−ｂｉｏスピンカラム（ＢｉｏＲａｄ）により行い、エタノール沈殿により２０μｌに濃縮し、そのうち半分を次ラウンドに進めた。この手順を５回繰り返して濃縮を行った。
このようにして得られたＭＢＰ−ＥＣＡＴ４融合蛋白質に特異的に結合するオリゴヌクレオチドの最終溶出液中の増幅産物をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結させた。４０個のクローンをランダムに選別し、シーケンス分析を行った。
（２）シーケンス分析
上記のように、本発明者らはＥ．ｃｏｌｉでマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）−ＥＣＡＴ４融合タンパク質を発現させ、それらをアミロース樹脂に結合させた。両端にアダプターシーケンスを持つ２０量体のランダムオリゴヌクレオチドをＭＢＰ−ＥＣＡＴ４結合樹脂に適用し、十分に洗浄した。次に樹脂に結合したＤＮＡを、アダプターシーケンスに対応するプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物を新しいＭＢＰ−ＥＣＡＴ４カラムに適用した。この手順を５回繰り返し、ＭＢＰ−ＥＣＡＴ４融合タンパク質に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを濃縮した。最終反応から得た増幅産物をｐＣＲ２．１ベクター中にサブクローニングしてシーケンス分析を行った。
そして、ランダムに取り上げた３７個のクローンに対するシーケンス分析により、コンセンサスシーケンスである（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｇ）（Ｇ／Ｃ）Ｃ（Ｇ／Ｃ）ＡＴＴＡＮ（Ｇ／Ｃ）が同定された（図６（Ａ）、配列番号４）。
本研究で用いたマーカー遺伝子のフランキングシーケンスを検索することにより、マウスＧＡＴＡ６遺伝子の５’−フランキング領域中、転写開始部位のおよそ４ｋｂ上流に、ＥＣＡＴ４コンセンサスシーケンスが同定された（図６（Ｂ）、配列番号５）。この領域は心臓におけるＧＡＴＡ６の発現に必須であることが知られている（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｕｎ−Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。マウスとヒトのＧＡＴＡ６遺伝子のゲノムシーケンスを比較すると、この領域が高度に保存されていることが判明した。ヒトのシーケンスにもＥＣＡＴ４コンセンサスが含まれていた（図６（Ｂ）、配列番号６）。
【実施例８】ＥＣＡＴ４エンハンサーの同定
マウスＥＣＡＴ４遺伝子がＥＳ細胞で特異的に発現する分子メカニズムを明らかとするために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いたエンハンサー解析を行った。マウスＥＣＡＴ４遺伝子を含む約３５ｋｂのゲノム領域を図７（Ａ）に示す８断片に分け増幅した。これを図７（Ｂ）に示すレポーター遺伝子に挿入した。このレポーター遺伝子をＥＳ細胞に導入し、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。その結果断片Ｄ（配列番号７）のみがＥＳ細胞で転写活性を示した。一方分化細胞であるＮＩＨ３Ｔ３細胞においてはどの断片も転写活性を示さなかった。したがって断片ＤはＥＳ細胞特異的なエンハンサーと考えられた。
ＥＣＡＴ４エンハンサー領域の解析の結果、−６０８６／−２２９２の領域（断片Ｄ、配列番号７）にＥＳ細胞特異的に活性の高い領域が存在したため、この領域をさらに短くし、当該領域のうちどの部分が活性化に関わっているのかを調べたところ、図８（Ａ）に示すように、−４８８６／−３４４４の領域で活性を持ち、その中でも−４７３７／−４３８７の領域でＥＳ細胞特異的に最も活性が高いことがわかった。−４７３７／−４３８７の領域には、図８（Ｂ）に示すように、−４７１０／−４７０３にはＷＮＴシグナルの下流である転写因子ＬＥＦ／ＴＣＦ１の結合配列が存在しており、これを含む−４７３７／−４６１１の領域を欠失させると活性が低下することから、ＥＣＡＴ４の転写活性化にはこの領域が重要であると考えられた。また−４５２４／−４５１６にはＬＩＦシグナルの下流であるＳＴＡＴ３の結合配列が存在し、点変異を入れると活性が低下したことから、やはりＥＣＡＴ４の転写活性に重要であると考えられた。その直後の−４５１５／−４５０８にもＬＥＦ／ＴＣＦ１の結合配列が存在しており、ＥＣＡＴ４の転写調節への関与が示唆された。また−４４９７／−４３８７の領域を欠失させても活性が低下することから、ＥＣＡＴ４の転写活性化にはこの領域も重要であると考えられた。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ＥＣＡＴ４が強制発現されたＥＳ細胞が提供される。さらに、本発明はＥＣＡＴ４のコンセンサス配列、ＥＣＡＴ４エンハンサーおよびそれらの用途も提供する。ＥＣＡＴ４のＥＳ細胞の自己複製促進転写因子としての機能が明確に示されたため、これらはＥＳ細胞の研究および開発において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】配列番号：４に記載の塩基配列はＥＣＡＴ４が認識するコンセンサス配列である。
配列番号：１１に記載の塩基配列はＳＥＬＥＸ−Ｎ２０−Ｏｌｉｇｏである。
配列番号：１２に記載の塩基配列はＳＥＬＥＸ−Ｎ２０ＲＶプライマーである。
配列番号：１３に記載の塩基配列はＳＥＬＥＸ−Ｎ２０ＦＷプライマーである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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