(57)【要約】本発明は、軟骨腫や軟骨肉腫の予後を向上させるための、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を含む、新規な軟骨腫・軟骨肉腫治療剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を含む、軟骨腫・軟骨肉腫治療剤。
【請求項２】
物質が副甲状腺ホルモン関連ペプチド受容体に対するアンタゴニストである、請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体である、請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体断片及び／又はその修飾物である請求項１記載の治療剤。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３又は４記載の治療剤。
【請求項６】
抗体がヒト型化又はキメラ化されたものである、請求項３又は４記載の治療剤。
【請求項７】
ヒト型化抗体がヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体である、請求項６記載の治療剤。
【請求項８】
副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を投与することにより、軟骨腫・軟骨肉腫細胞にアポトーシスを誘起する方法。
【請求項９】
物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＰＴＨｒＰ））とその受容体との結合を阻害する物質を含む、軟骨腫・軟骨肉腫治療剤に関する。
【背景技術】  副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下「ＰＴＨｒＰ」という。）は、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症において、腫瘍細胞が産生する液性因子として発見されたペプチドで、破骨細胞の骨吸収や腎尿細管でのカルシウム再吸収を促進することにより、腫瘍性の高カルシウム血症（Ｈｕｍｏｒａｌ  ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉａ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ、以下「ＨＨＭ」という。）を惹起する。
ＰＴＨｒＰは、様々な腫瘍組織で産生されるほか、皮膚、中枢神経、子宮、胎盤、授乳中の乳腺、甲状腺、副甲状腺、副腎、肝、腎、膀胱をはじめ、胎児から成人に至る、種々の正常組織でも産生されることが報告されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
ＰＴＨｒＰは、細胞の分化・増殖の制御、平滑筋の弛緩、経胎盤カルシウム輸送の促進、アポトーシスの促進等の生理的作用を有し、ＨＨＭに代表される高カルシウム血症や低リン血症等の臨床症状を引き起こす。こうしたＰＴＨｒＰの作用は、主に骨と腎に存在するＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体にＰＴＨｒＰが結合し、複数の細胞内シグナル伝達系を活性化することによって発揮される。
一方、発明者らはＰＴＨｒＰは前肥大期から肥大期にかけての軟骨細胞の分化を抑制することを既に報告している。この軟骨細胞の分化調節には、ＰＴＨｒＰの細胞内シグナル伝達とインディアンヘッジホッグ間のフィードバックの関与が示唆されているが、ＰＴＨｒＰが骨形成に影響を及ぼすメカニズムについては未だわかっていない（例えば、非特許文献３及び４参照）。
脊椎動物の骨格を形成する骨の多くは、内軟骨性骨形成と呼ばれる骨化プロセスによってつくられる。内軟骨性骨形成では、増殖した軟骨細胞が、分化を続けながら骨が形成されやすい環境をつくり上げ、最終的に自身は死滅して骨に置き換わる。この内軟骨性骨形成における軟骨細胞の死滅のメカニズムとして、アポトーシスが提唱されている（例えば、非特許文献５及び６参照）。
アポトーシスは、いくつかの細胞系では、細胞死抑制因子Ｂｃｌ−２と細胞死誘導因子Ｂａｘの発現比率によって制御されている。つまり、細胞内におけるＢａｘとＢｃｌ−２の比率によって、その細胞が生きるか死ぬかが決定される。最近、軟骨細胞の成熟を制御するシグナル経路で、Ｂｃｌ−２遺伝子がＰＴＨｒＰ遺伝子の下流に位置し、ＰＴＨｒＰがＢｃｌ−２の発現を増加させることがわかってきた（例えば、非特許文献７参照）。
ところで、軟骨肉腫細胞では、ＰＴＨｒＰとＢｃｌ−２の発現がともに高いことが報告されている（例えば、非特許文献８及び９参照）。軟骨肉腫は、軟骨形成性の悪性腫瘍で、骨肉腫に次いで２番目に多い骨腫瘍であるが、化学療法や放射線療法に対する応答が悪いため、専ら外科的切除により治療されている。しかし、軟骨肉腫の予後は、グレードＩやＩＩの場合は比較的良い（５年生存率６５％）ものの、グレードＩＩＩの間葉性脱分化軟骨肉腫では良くない。それゆえ、軟骨肉腫の予後をより向上させる新たな治療方法が望まれている。
一方、ＰＴＨｒＰに対する抗体（以下「抗ＰＴＨｒＰ抗体」と言う。）が、ＰＴＨｒＰに起因するＨＨＭや悪液質の治療に有用であること（例えば、特許文献１及び非特許文献１０参照）や、癌の骨転移の進展を抑制することが既に知られている。しかしながら、軟骨腫や軟骨肉腫等に対しては、ＰＴＨｒＰの影響はほとんど解明されていないばかりか、これまで軟骨腫や軟骨肉腫の治療にＰＴＨｒＰや抗ＰＴＨｒＰ抗体を利用したという報告もない。
【特許文献１】  特開平１１−８００２５号公報
【非特許文献１】  Ｂｕｒｔｉｓ，Ｗ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９２；３８：ｐ２１７１−２１８３
【非特許文献２】  Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．＆  Ｂｒｏａｄｕｓ，Ａ．Ｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９９１；７１：ｐ１４１０−１４１４
【非特許文献３】  Ｎａｋａｓｅ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；１１６：ｐ２７７−２８４
【非特許文献４】  Ｓｕｄａ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．１９９７；３：ｐ２２９−２３１
【非特許文献５】  Ｆａｍｕｍ  Ｃ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１９８９；１８６：ｐ３４６−３５８
【非特許文献６】  Ｌｅｗｉｎｓｏｎ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．１９９２；２３３：ｐ５０４−５１４
【非特許文献７】  Ａｍｌｉｎｇ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７；１３６：ｐ２０５−２１３
【非特許文献８】  Ａｍｌｉｎｇ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｒｈ．Ｄｔｓｃｈ．Ｇｅｓ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８；８２：ｐ１６０−１６９
【非特許文献９】  Ｂｏｖｅｅ  Ｊ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；８０：ｐ１９２５−１９３４
【非特許文献１０】  Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ｂｏｎｅ  ＆  Ｍｉｎｅ．Ｒｅｓ．１９９３；８：ｐ８４９−８６０
【発明の開示】
本発明は、軟骨腫や軟骨肉腫の予後を向上させるための、新規な軟骨腫・軟骨肉腫治療剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＰＴＨｒＰを阻害して軟骨肉腫細胞におけるＢｃｌ−２の発現を減少させれば、当該細胞のアポトーシスが誘起され、軟骨肉腫の治療が可能になると考えた。そして、ＰＴＨｒＰとその受容体との結合を阻害する物質を利用することにより、軟骨腫及び軟骨肉腫を効果的に抑制し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供する。
（１）  副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を含む、軟骨腫・軟骨肉腫治療剤。
（２）  物質が副甲状腺ホルモン関連ペプチド受容体に対するアンタゴニストである、上記（１）記載の治療剤。
（３）  物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体である、上記（１）記載の治療剤。
（４）  物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体断片及び／又はその修飾物である上記（１）記載の治療剤。
（５）  抗体がモノクローナル抗体である、上記（３）又は（４）記載の治療剤。
（６）  抗体がヒト型化又はキメラ化されたものである、上記（３）又は（４）記載の治療剤。
（７）  ヒト型化抗体がヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体（ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１として、１９９６年８月１５日付で、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されている）が産生するヒト型化抗体）である、上記（６）記載の治療剤。
（８）  副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を投与することにより、軟骨腫・軟骨肉腫細胞にアポトーシスを誘起する方法。
（９）  物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体である、上記（８）記載の方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．軟骨腫・軟骨肉腫治療剤
本発明は、副甲状腺ホルモン関連ペプチド（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＰＴＨｒＰ）とその受容体（ＰＴＨｒＰ受容体）との結合を阻害する物質を有効成分として含む、軟骨腫・軟骨肉腫治療剤を提供する。
本明細書中において、「軟骨腫・軟骨肉腫」とは、軟骨形成性の良性又は悪性の腫瘍を意味する。「軟骨腫（ｃｈｏｎｄｒｏｍａ）」とは、軟骨に分化する中胚葉細胞から生じる良性腫瘍で、骨の髄腔から発生する内軟骨腫、軟部組織内に発生してその下の骨あるいは骨膜とは連絡をもたない骨外性軟骨腫、骨膜や骨膜の結合組織から発生する骨膜性軟骨腫、及び傍骨性軟骨腫等が含まれる。また、「軟骨肉腫（ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ）」とは、軟骨細胞に由来する悪性腫瘍で、骨の中心部に発生する中心性軟骨肉腫、骨軟骨腫の軟骨キャップから発生する末梢性軟骨肉腫、及び軟骨分化能を有する未分化間葉系細胞由来の軟骨肉腫等が含まれる。軟骨肉腫の中には軟骨腫から移行するものもあり、従ってその境界が明らかでない場合もあるため、本明細書中ではこれらを一括して「軟骨腫・軟骨腫瘍」と呼ぶこととする。
本明細書中において、「ＰＴＨｒＰ受容体」とは、例えば特表平６−５０６５９８号公報に記載されているような、ＰＴＨｒＰと結合する受容体を意味し、標的器官上（例えば、骨や腎臓）に存在するＰＴＨｒＰ受容体か否かを問わない。
また、「ＰＴＨｒＰとＰＴＨｒＰ受容体との結合を阻害する物質」とは、ＰＴＨｒＰに結合することにより、ＰＴＨｒＰがＰＴＨｒＰ受容体と結合することを阻害する物質、及び、ＰＴＨｒＰ受容体に結合することにより、ＰＴＨｒＰがＰＴＨｒＰ受容体と結合することを阻害する物質のいずれか一方又は両方を意味する。前者に該当する物質としては、例えば抗ＰＴＨｒＰ抗体が、また、後者に該当する物質としては、例えばＰＴＨｒＰ受容体に対するアンタゴニスト（ＰＴＨｒＰアンタゴニストともいう）が挙げられる。
前記「抗ＰＴＨｒＰ抗体」は、ＰＴＨｒＰに結合して組織分解を抑制する効果を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）及び形状を問わない。該抗ＰＴＨｒＰ抗体としては、例えばヒト型化抗体、ヒト抗体（ＷＯ９６／３３７３５号公報）、キメラ抗体（特開平４−２２８０８９号公報）、マウス抗体（例えば、ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１によって産生される抗体（＃２３−５７−１３７−１抗体））等が挙げられる。なお、抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、本発明の目的のためにはモノクローナル抗体がより好ましい。
また、前記「ＰＴＨｒＰアンタゴニスト」は、一般にはポリペプチド又は低分子物質であるが、これらに限定されるものではない。該ＰＴＨｒＰアンタゴニストとしては、例えば、特開平７−１６５７９０号公報、特表平５−５０９０９８号公報、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）１９９５，１６（６）１０３１−１０３７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ａｐｒ．２８１９９２，３１（１６）４０２６−４０３３等に記載の、ＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有するポリペプチドが挙げられる。これらのポリペプチドにおいて少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、付加、挿入されたポリペプチドも、同等のＰＴＨｒＰアンタゴニスト活性を有する限り、本発明のＰＴＨｒＰアンタゴニストに含まれる。
以下、本発明の「ＰＴＨｒＰとＰＴＨｒＰ受容体との結合を阻害する物質」の好適な例として抗ＰＴＨｒＰ抗体について説明する。
１−１  抗ＰＴＨｒＰ抗体
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。特に、本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。
前記哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものが含まれる。これらの抗体は、ＰＴＨｒＰと結合することにより、ＰＴＨｒＰがＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体に結合することを阻害してＰＴＨｒＰのシグナル伝達を遮断し、ＰＴＨｒＰの生物学的活性を阻害することができる。
このような抗体の好適な例として、例えばハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１により産生される＃２３−５７−１３７−１抗体等を挙げることができる。
なお、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１は、ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ＃２３−５７−１３７−１として、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、１９９６年８月１５日付で、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
１−２  抗体産生ハイブリドーマ
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、常法に従い、例えば以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＨｒＰを感作抗原としてマウス等の動物を免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＰＴＨｒＰは、Ｓｕｖａ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３７，８９３に開示されたＰＴＨｒＰ遺伝子／アミノ酸配列を基に作製することができる。すなわち、ＰＴＨｒＰをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から目的のＰＴＨｒＰタンパク質を公知の方法で精製する。
感作抗原としては、前記ＰＴＨｒＰタンパク質のほか、ＰＴＨｒＰのＮ末端の３４個のペプチドを、化学合成して用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されず、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ歯類の動物（例えばマウス、ラット、ハムスター等）、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原による動物の免疫は、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する方法が挙げられる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当に希釈、懸濁した後、所望により、通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合・乳化したものを、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時には適当な担体を使用してもよい。
このように免疫し、血清中の抗体レベルが所望のレベルまで上昇するのを確認した後、当該動物から免疫細胞を採取して、これを細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、一般に哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。このミエローマ細胞としては、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下、通常の栄養培養液中にて実施される。該融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により、融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加して使用してもよい。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。一般には、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とすることが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞の所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００−６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合すればよい。これにより、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、ここに適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養して選択を行う。このＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を用いて、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
上述のように、ヒト以外の動物をＰＴＨｒＰで免疫してハイブリドーマを得る方法のほか、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＨｒＰに感作させ、得られた感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させて、ＰＴＨｒＰ結合活性を有するヒト抗体産生ハイブリドーマを得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物にＰＴＨｒＰを投与して抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＨｒＰに対するヒト抗体を取得してもよい（国際公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することも可能である。
これらのハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水から得る方法等が採用できる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
１−３  組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、ハイブリドーマからクローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込み、これを宿主に導入して産生させた、組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＰＴＨｒＰ抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＰＴＨｒＰ抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等で調製した全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して行うことができる。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることにより、目的とするｍＲＮＡを直接調製することもできる。
次に、得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成及び増幅は、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等により行うことができる。
さらに、得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。こうして作製した組換えベクターを大腸菌等に導入し、生成するコロニーから所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗ＰＴＨｒＰ抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られたら、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターに組み込む。
この際、前記抗体遺伝子は、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで適切に発現されるよう、発現ベクターに組み込まれなくてはならない。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、目的とする抗体遺伝子が発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを、別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖及びＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
組換え型抗体の産生には、上述した宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、乳汁中に固有に産生される蛋白質（ヤギβカゼイン等）をコードする遺伝子に抗体遺伝子を挿入し、融合遺伝子を調製する。この抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁からは、所望の抗体を得ることができる。このとき、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適当なホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
１−４  改変抗体（キメラ抗体、ヒト型化抗体）
本発明では、さらに上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、以下の方法を用いて製造することができる。
本発明に有用なキメラ抗体は、前記のようにして得られた抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、発現させることによって得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものを意味する。該ヒト型化抗体は、一般的な遺伝子組換え手法（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）に基づいて作製することができる。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により増幅する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結して発現ベクターに組み込み、宿主に導入して、発現させることにより、所望のヒト型化抗体を得ることができる（ＥＰ  ２３９４００号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
前記ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものを選択する。必要に応じて、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域は適宜修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物に由来する抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域及びＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の抑制剤の有効成分として有用である。
本発明に使用できるヒト型化抗体としては、ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体が挙げられる。ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体は、マウス由来の＃２３−５７−１３７−１抗体の相補性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ−ＢＡＮＫ，Ｄｅｆｔｏｓ  Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来の３つのＦＲ断片（ＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３）及びヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ）由来のＦＲ断片（ＦＲ４）に連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体Ｓ３１６７９（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  ＡＭら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）のフレームワーク領域と連結し、抗原結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸残基を一部置換したものである。
なお、ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＬ鎖又はＨ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌は、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、１９９６年８月１５日付で、Ｈ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２９として、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドを有する大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３０として、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されている。
１−５  抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、ＰＴＨｒＰに結合し、ＰＴＨｒＰの活性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。該断片は、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理して生成させるか、又は、該抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製する（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
前記ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、及びＬ鎖又はＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列の全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型として調製される。すなわち、該配列の両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるよう規定されたプライマー対を用いて増幅することにより得られる。
こうして、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。そして、この宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
また、前記抗体の断片も、同様にしてその遺伝子を取得し、これにより形質転換された宿主から産生させることができる。本発明における「抗体」には、これらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。こうした抗体の修飾方法は、この分野においてすでに確立されている。該抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗ＰＴＨｒＰ抗体等を挙げることができる。本発明における「抗体」には、これらの抗体修飾物も包含される。
１−６  組換え型抗体又は改変抗体の発現及び産生
組換え型抗体又は改変抗体の発現及び産生は、前記のようにして構築した抗体遺伝子を公知の方法により発現させて、取得することができる。そのような発現系としては、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。
真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞等の動物細胞等が挙げられる。また、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
大腸菌の場合、目的とする遺伝子の導入・発現のためのベクターとして、例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴｒｃＨｉｓ，ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ等）、λファージ等が用いられる。
大腸菌内での、当該遺伝子の発現のためには、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させなければならない。該プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合であれば、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を用いればよい。該ペリプラズムに産生された抗体は、分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
その他、発現ベクターは、必要に応じて、選択マーカーを含むことができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子や、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等を挙げることができる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
哺乳類細胞の場合、目的とする遺伝子の導入・発現のためのベクターとしては、ＳＶ  ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等由来のものを用いることができる。
宿主細胞内での抗体遺伝子の発現のためには、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させなければならない。該プロモーター／エンハンサーとしては、例えばヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ  ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）等の哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
前記ＳＶ  ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
発現ベクターは、必要に応じて、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
形質転換された宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで培養して、目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従って行えばよい。例えば、培養液としては、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、必要であれば、これに牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用してもよい。
１−７  抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し、均一な抗体として精製する。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。このようなカラムとしては、例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムである、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を必要に応じて使用することができる。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
１−８  抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）、リガンドレセプター結合阻害活性（Ｈａｒａｄａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）５，６８１−６９０）の測定には公知の手段を使用することができる。
本発明で使用される抗ＰＴＨｒＰ抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、ＰＴＨｒＰ（１−３４）をコーティングしたプレートに、抗ＰＴＨｒＰ抗体を含む試料、例えば、抗ＰＴＨｒＰ抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸等の酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
本発明で使用される抗体の活性を確認するには、抗ＰＴＨｒＰ抗体の中和活性を測定する。
１−９  投与方法及び製剤
本発明の抗ＰＴＨｒＰ抗体を有効成分として含有する軟骨腫・軟骨肉腫治療剤は、経口、非経口投与のいずれも可能であるが、非経口投与であることが好ましい。具体的には、経肺剤型（例えばネフライザー等の器具を用いた経肺投与剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が好適な剤型として挙げられる。注射剤型の例としては、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等が挙げられ、これにより全身又は局部的に投与することができる。こうした投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することもできる。
本発明の治療剤の有効投与量は、通常、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．０１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で選ばれる。しかしながら、本発明の抗ＰＴＨｒＰ抗体を含有する軟骨腫・軟骨肉腫治療剤は、これらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤を投与する対象となる疾患は、軟骨腫、軟骨肉腫であるが、当該疾患には他の疾患に合併あるいは併発されたものも含まれる。
本発明の治療剤は、軟骨腫・軟骨肉腫細胞の分化及びアポトーシスを誘起し、これにより、当該細胞を死に至らしめ、軟骨腫・軟骨肉腫を抑制する。
本発明の治療剤を投与する時期は、上記疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず、予防的投与であっても維持的投与であってもよい。
本発明の抗ＰＴＨｒＰ抗体を有効成分として含有する治療剤は、常法に従って製剤化することができ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体及び医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗ＰＴＨｒＰ抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
２．軟骨腫・軟骨肉腫細胞にアポトーシスを誘起する方法
本発明はまた、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を投与することにより、軟骨腫・軟骨肉腫細胞にアポトーシスを誘起する方法を提供する。
本明細書中において、「アポトーシス」とは、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を意味する。アポトーシスは、形態学的には細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞質の凝集による、細胞の萎縮を特徴とし、細胞の内容物の放出は伴わない。この点で、アポトーシスは細胞の内容物の放出を伴うネクローシス（壊死）とは明確に区別される。
本発明者の方法において、上記「副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質」は抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体が好ましい。該抗体には、その断片及び／又はその修飾物も含まれ、抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。さらに、ヒトの軟骨腫・軟骨肉腫細胞に用いる場合であれば、該抗体はヒト型化あるいはキメラ化されていることが好ましい。このような抗体の好適な例としては、例えば、ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体が挙げられる。本発明の方法により、軟骨腫・軟骨肉腫細胞にアポトーシスが誘起されるメカニズムは明らかではないが、カスパーゼ−３の活性化、及び／又は、アポトーシスに密接に関連するＢｃｌ−２／Ｂａｘの発現制御が介在することが推測される。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３３４０８１号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの細胞生存能力に対する効果を示すグラフである。
図２は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理細胞の生存能力に対するカスパーゼ−３阻害剤（ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）の効果を示すグラフである。
図３は、ウェスタンブロッティングの結果を示す。ａ）ＰＡＲＰ、ｂ）プロカスパーゼ−３、ｃ）Ｂｃｌ−２、ｄ）Ｂａｘ、ｅ）コラーゲン  ｔｙｐｅ  Ｘ、ｆ）β−アクチン；各列はそれぞれ左からａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ濃度０，１０，３０，５０，１００，２００μｇ／ｍｌである。
図４は、抗コラーゲンｔｙｐｅ  Ｘ抗体を用いた免疫細胞化学の結果を示す。
Ａ：未処理、Ｂ：１０μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理、Ｃ：１００μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理、Ｄ−Ｆ：２００μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理（Ａ−Ｄ：２００倍、Ｅ：４００倍）
図５は、ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。Ａ：未処理、Ｂ：１０μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理、Ｃ：１００μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理、Ｄ−Ｆ：２００μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理（Ａ−Ｄ：２００倍、Ｅ：４００倍、Ｆ：６００倍）
図６は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理及び未処理細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（縦軸はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ濃度）。
図７は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理及び未処理細胞におけるＤＮＡフラグメントアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例及び参考例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例等にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕抗ＰＴＨｒＰ抗体の軟骨肉腫細胞（ＨＴＢ−９４）に対する効果
１．試験方法
１．１  細胞の培養
ヒト軟骨肉腫細胞ＨＴＢ−９４（ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン（いずれも、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、５％ＣＯ２湿潤条件下、３７℃で培養し増殖させた。
１．２  ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体の調製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４：ＰＴＨｒＰの１−３４アミノ酸配列からなるペプチド）に対するマウスモノクローナル抗体（以下、「ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ」という）は、ハイブリドーマ＃＃２３−５７−１３７−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１、特開平１１−０９２５００号公報）より調製した。なお、ハイブリドーマ作製の概略を参考例１に記載する。
１．３  細胞の生存能力
ＨＴＢ−９４細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  ｉｎ  １００μＬ）はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（０，１０，１００，ｏｒ  ２００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地で、２日間インキュベートし、細胞の生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｍ（宝酒造）により評価した。すなわち、生存細胞によるテトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）の還元率をＯＤ４５０の増加から求め、細胞生存数の指標とした。
同様にして、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ添加２時間前にカスパーゼ−３阻害剤  ＤＥＶＯ−ＣＨＯ（２０μＭ（Ｃａｌｖｉｏｃｈｅｍ））で処理した細胞についても、その生存能力を評価した。
１．４  ウェスタンブロッティング
ＨＴＢ−９４細胞はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（０，１０，３０，５０，１００，２００μｇ／ｍｌ）で２日間処理した。但し、以下のコラーゲンｔｙｐｅ−Ｘに関する実験では、細胞はさらに５日間（計７日間）ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂで処理した。上記細胞の全細胞溶解物（タンパクとして５０μｇ）を、１２％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にブロッティングした。ブロッキングした膜は、１／１００に希釈した抗プロカスパーゼ−３抗体（和光純薬）、抗ＰＡＲＰ抗体、抗Ｂｃｌ−２抗体、抗Ｂａｘ抗体（ともに、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及び抗コラーゲンｔｙｐｅ  Ｘ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、並びに１／１０００に希釈したペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベートした。
なお、ＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は細胞内生存に重要な酵素であり、カスパーゼ−３はこのＰＡＲＰの切断を起こす。上記抗ＰＡＲＰ抗体は、１１６ｋＤａ及び８５ＤａのＰＡＲＰフラグメントを認識するが、２５ｋＤａのフラグメントは認識しない抗体である。また、プロカスパーゼ−３はカスパーゼ活性をもたない不活性なカスパーゼである。
検出は、ＥＣＬウェスタンブロティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行った。各ブロットは、さらに抗β−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて、ＥＣＬで再検出した。結果を図３に示す。
１．５  免疫細胞化学
１）抗コラーゲン  ｔｙｐｅ  Ｘ抗体を用いた分析
免疫細胞化学は、ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  ＳＡＢ−ＰＯ  ｋｉｔ（ニチレイ）を用いて、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ法により行った。すなわち、ＨＴＢ−９４細胞はチャンバースライド上で５０％コンフルエントになるまで培養し、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（０，１０，１００，ｏｒ  ２００μｇ／ｍｌ）で処理してさらに７日間培養した。次いで、細胞は３％Ｈ２Ｏ２メタノール中に移して、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄後、バックグラウンドを最小にするため、同種由来の１０％正常血清（二次抗体）を含むＰＢＳでブロックし、抗コラーゲンｔｙｐｅ  Ｘ抗体（一次抗体）とともに室温で２時間インキュベートした。細胞はＰＢＳで洗浄後、湿潤チャンバー内にて室温で、２０分間、二次抗体とともにインキュベートし、同様の条件下で、２０分間、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ニチレイ）とともにインキュベートした。最後に、３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて発色反応を行った。細胞はヘマトキシリンで対比染色し、２００倍及び４００倍の倍率で顕微鏡観察を行った。結果を図４に示す。
２）ＴＵＮＥＬ染色
Ａｐｏｐｔａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてＴＵＮＥＬ染色を行った。すなわち、ＨＴＢ−９４細胞（０，１０，１００，ｏｒ  ２００μｇ／ｍｌ）をａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂで２日間の処理後、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールで２０分間処理し、末端ヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）バッファー中、室温で１５分間平衡化した。次いで、細胞をＴｄＴ反応混合物（ＴｄＴ溶液＋ジオキシゲニン−１１−ｄＵＤＰ及びｄＡＴＰ）とともに３７℃、６０分間インキュベートし、さらにペルオキシダーゼ結合抗ジオキシゲニン抗体とともに、室温で、３０分間インキュベートした。細胞はＤＡＢで染色後、マイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、２００倍、４００倍及び６００倍の倍率で顕微鏡観察を行った。結果を図５に示す。
１．６  ＲＴ−ＰＣＲ
ＨＴＢ−９４細胞（対照、及び１００μｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ２日間処理）からＩＳＯＧＥＮを用いて全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、全ＲＮＡ２μｇを含む混合物より、（ｄＴ）１２−１８プライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）２００ｕｎｉｔｓを用いて３７℃、６０分間かけて合成した。
ｃＤＮＡのＰＣＲは、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及び以下のヒトＢｃｌ−２、Ｂａｘ、Ｉｈｈ、ＣｏｌＸ（α１）、及びβ−アクチン増幅用プライマー（各１２．５ｐｍｏｌ）を用いて行った。
2004045643.tif 000002
2004045643.tif 000003
増幅は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ  ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（宝酒造）を用いて、９４℃、０．５分；５５℃、０．５分；７２℃、０．５分を各３０サイクル、最終伸長反応：７２℃、７分間の条件で行った。
得られたＰＣＲ産物（１０μＬ）は、４％アガロースゲル中で電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して観察した。結果を図６に示す。
１．７  ＤＮＡフラグメントアッセイ
ＨＴＢ−９４細胞（１×１０７）は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（０，１０，及び２００μｇ／ｍｌ）で２日間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、Ａｐｏｐｌａｄｄｅｒ  Ｅｘキット（宝酒造）を用いてＤＮＡを単離した。つまり、細胞を溶解バッファーで溶解させてＤＮＡを単離し、有機溶媒で抽出後、エタノール沈澱させた。沈澱したＤＮＡは遠心（１２，０００ｇ，１０ｍｉｎ）後、８０％エタノールで洗浄し、３０μｌのＴＥバッファーに溶かした。各サンプル（１０μｌ）を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。結果を図７に示す。
２．試験結果
２．１  細胞生存能力
ＨＴＢ−９４細胞の生存能力はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの濃度依存的に阻害された（図１）。また、カスパーゼ−３の特異的阻害剤である、ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、このａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの効果を阻害した。細胞の生存能力は、カスパーゼ−３処理しない細胞よりも、処理した細胞でより高かった。なお、図中、各濃度における生存細胞数は、対照（未処理）に対する％で示した。
２．２  ウェスタンブロッティング
ａ）ＰＡＲＰの８５ｋＤａのフラグメントは、Ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理したＨＴＢ−９４細胞では濃度依存的に増加したが、未処理の細胞では確認されなかった。いずれの細胞でも低分子量のフラグメントがわずかに確認されたが、これらはＰＡＲＰの自然分解物と思われた。
ｂ）プロカスパーゼ−３（３５ｋＤａ）も検出されたが、高濃度のａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（１００及び２００μｇ／ｍｌ）処理細胞では減少していた。これは、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理により、プロカスパーゼ−３が切断され、活性なヘテロダイマーになるためと思われる。
ｃ）Ｂｃｌ−２は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの濃度が増加するにつれて減少した。
ｄ）Ｂａｘは、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの濃度が増加するにつれて増加した。
ｅ）コラーゲンｔｙｐｅ  Ｘは、Ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理細胞では未処理の細胞よりも多く、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ  ５０μｇ／ｍｌ濃度で最大であった。
ｆ）β−アクチンは、いずれの細胞でも発現量にほとんど違いがなかった。
２．３  免疫細胞化学
１）抗コラーゲンｔｙｐｅ  Ｘ抗体を用いた分析
染色されたＨＴＢ−９４細胞の割合はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂの濃度依存的に増加した。Ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ（特に、高濃度）で処理した細胞では、丸く肥大した細胞が多くみられた（図４）。軟骨細胞は分化が進むにつれて肥大し、この肥大した軟骨細胞ではコラーゲンｔｙｐｅ  Ｘの発現が高いことが多数報告されている。従って、上記の結果は、ＨＴＢ−９４細胞の分化がａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理によって促進されたことを示す。
２）ＴＵＮＥＬ染色
茶色に染色されたＨＴＢ−９４細胞は、アポトーシスを起こした細胞である。その出現頻度は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ濃度依存的に増加した。また、Ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理後の細胞では、細胞の収縮と丸まりといった形態的変化も認められた（図５）。この形態的変化はアポトーシスに特徴的なものである。従って、上記の結果は、ＨＴＢ−９４細胞のアポトーシスがａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理によって促進されたことを示す。
２．４  ＲＴ−ＰＣＲ
Ｂｃｌ−２の発現量はａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理によって減少したのに対し、Ｂａｘとコラーゲンｔｙｐｅ  ＩＩの発現量は増加した。コラーゲンｔｙｐｅ  ＩＩとβ−アクチンの発現量に変化はなかった。
２．５  ＤＮＡフラグメントアッセイ
１０μｇ／ｍｌ及び２００μｇ／ｍｌのａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理した細胞では、アポトーシスに特異的なＤＮＡのヌクレオソーム内フラグメント化が観察された。一方、未処理の細胞ではフラグメント化は観察されなかった。
３．考察
以上の結果より、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂ処理によってＨＴＢ−９４細胞の分化及びアポトーシスが誘起されることが実証された。この効果は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂが軟骨腫・軟骨肉腫の治療剤として有用でありうることを強く支持するものである。
アポトーシスでは、活性化されたカスパーゼ−３が、ＰＡＲＰのような細胞維持に重要なタンパクを切断し、細胞を死に至らしめることが報告されている。すなわち、上記結果は、ａｎｔｉ−ＰＴＨｒＰ  ＭｏＡｂがＢｃｌ−２／Ｂａｘ及びカスパーゼ−３介在性のアポトーシスを誘起して、ＨＴＢ−９４細胞の増殖を阻害することを示唆するものである。
〔参考例１〕抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃２３−５７−１５４及び＃２３−５７−１３７−１は、以下の通り作製した（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．８，８４９−８６０，１９９３）。なお、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）のアミノ酸配列を配列番号７５に示す。
免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３４）（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ製）とキャリアータンパクであるサイログロブリンをカルボジイミド（Ｄｏｊｉｎｎ）を用いて結合した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３４）を透析し、タンパク濃度として２μｇ／ｍｌとなるように調製した後、フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）と１：１で混合し、エマルジョン作製後、１６匹の雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり１００μｇを１１回免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバントを使用した。
免疫したマウスの血清中の抗体価の測定は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清と１２５Ｉ標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリアータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）を動物あたり５０μｇを最終免疫した。
最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１を５０％ポリエチレングリコール４０００を用いる常法に従って細胞融合した。細胞融合した細胞を２×１０４／ウェルの細胞数で８５枚の９６穴プレートに蒔き込んだ。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。
ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡＴ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩＡ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択することにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハイブリドーマを回収し、１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にＯＰＩ−ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を添加した培地に懸濁し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施した。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン＃２３−５７−１５４及び＃２３−５７−１３７−１を得た。
なお、前述したように、ハイブリドーマクローン＃２３−５７−１３７−１は、ｍｏｕｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＃２３−５７−１３７−１として、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、１９９６年８月１５日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３１としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
〔参考例２〕ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクローナル抗体＃２３−５７−１３７−１の可変領域をコードするＤＮＡを次の様にしてクローニングした。
（１）ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１からのｍＲＮＡをＱｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて調製した。ハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１の細胞を抽出バッファーで完全にホモジナイズし、キット添付の処方に従い、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｓｐｕｎ  ＣｏｌｕｍｎにてｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲＮＡ沈殿物を溶出バッファーに溶解した。
（２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のｃＤＮＡの作製及び増幅
（ｉ）＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５’−ＲＡＣＥ法には５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記のようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨＣ２プライマー１０ｐｍｏｌｅを加え、逆転写酵素と５２℃、３０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。
６Ｎ  ＮａＯＨでＲＮＡを加水分解（６５℃、３０分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで３７℃で６時間、室温で１６時間反応することにより、合成したｃＤＮＡの５’末端にＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒ（配列番号４２）を連結した。これを鋳型としてＰＣＲにより増幅するためのプライマーとしてＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）及びＭＨＣ−Ｇ１プライマー（配列番号３）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８，１９９１）を使用した。
ＰＣＲ溶液は、その５０μｌ中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造）、１０ｐｍｏｌｅのＡｎｃｈｏｒプライマー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ４８０Ｊ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。
（ｉｉ）＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃＤＮＡのクローニング
ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２，１９８８；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７，２９１９−２９３２，１９８９）により行った。５’−ＲＡＣＥ法には５’−Ａｍｐｌｉ  Ｆｉｎｄｅｒ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用い、操作は添付の処方に従った。ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーは、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを加え、逆転写酵素と５２℃、３０分間反応させることによりｃＤＮＡへの逆転写を行った。６Ｎ  ＮａＯＨでＲＮＡを加水分解（６５℃、３０分間）した後、エタノール沈殿によりｃＤＮＡを精製した。合成したｃＤＮＡの５’末端に前記Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＡｎｃｈｏｒをＴ４ＲＮＡリガーゼで３７℃で６時間、室温で１６時間反応させることにより連結した。
マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からＰＣＲプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて合成した。ＰＣＲ溶液は、その１００μｌ中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、１．５Ｍｍ  ＭｇＣｌ２、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）、５０ｐｍｏｌｅのＡｎｃｈｏｒプライマー（配列番号２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）及びＡｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  Ａｎｃｈｏｒを連結したｃＤＮＡの反応混合物１μｌを含有する。この溶液に５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｍｏｄｅｌ４８０Ｊ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３５回行った。
（３）ＰＣＲ生成物の精製及び断片化
前記のようにしてＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を、３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域として約５５０ｂｐ長、Ｌ鎖Ｖ領域として約５５０ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）により３７℃で１時間消化し、次いで制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
こうして、５’−末端にＥｃｏＲＩ認識配列を有し、３’−末端にＸｍａＩ認識配列を有するマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＸｍａＩ  ＤＮＡ断片と、ＥｃｏＲＩ及びＸｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターとを、ＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造）を用い、添付の処方に従い１６℃で１時間反応させ連結した。次に１０μｌの上記連結混合物を大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、この細胞を氷上で１５分間、４２℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。次いで３００μｌのＳＯＣ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を加え３７℃にて３０分間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、２０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地又は２ｘＹＴ寒天培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）上にこの大腸菌をまき、３７℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
この形質転換体を１００μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地又は２×ＹＴ培地２ｍｌで３７℃にて一夜培養し、菌体画分からプラスミド抽出機ＰＩ−１００Σ（クラボウ）又はＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、塩基配列の決定を行った。
（４）マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
前記のプラスミド中のｃＤＮＡコード領域の塩基配列をＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（ＡＢＩ社Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により決定した。配列決定用プライマーとしてＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造）（配列番号５）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。
こうして得られたハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＭＢＣ１Ｈ０４、Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをＭＢＣ１Ｌ２４と命名した。プラスミドＭＢＣ１Ｈ０４及びＭＢＣ１Ｌ２４に含まれるマウス＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号５７、６５に示す。これらのアミノ酸配列を、Ｈ鎖Ｖ領域の断片については配列番号４６、Ｌ鎖Ｖ領域の断片については配列番号４５に示す。
なお、前記プラスミドＭＢＣ１Ｈ０４及びＭＢＣ１Ｌ２４を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｈ０４）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｌ２４）として、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、１９９６年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｈ０４）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＭＢＣ１Ｌ２４）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２７としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（５）ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体＃２３−５７−１３７−１のＣＤＲの決定
Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）。
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をＫａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領域を表１に示すごとく決定した。
なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号５９〜６１に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号６２〜６４に示した。
2004045643.tif 000004
〔参考例３〕キメラ抗体の構築
（１）キメラ抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムＤＮＡを含む発現ベクターに連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）及び制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの認識配列を有するように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番号８）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を有するように設計した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、５０μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．０７μｇのプラスミドＭＢＣ１Ｈ０４、プライマーとしてＭＢＣ１−ａ及びＭＢＣ１−Ｓ１をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ含む条件で添付緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４３７ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）により３７℃１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。
上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するためプライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側にＢａｍＨＩ認識配列を持つプラスミドをＭＢＣ１Ｈ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉ）ｃＤＮＡタイプのマウス−ヒトキメラＨ鎖の作製のためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコードする配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９４７−９５０，１９８７）並びにＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２（配列番号１０）はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つ、Ｃ領域の５’―側の配列をコードしＡｐａＩ及びＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、５０μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドＭＢＣ１Ｈ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２及びＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを２．５Ｕ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を１％Ｓｅａ  Ｋｅｍ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
得られたＤＮＡ溶液１μｌを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ（宝酒造）により３７℃で１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ  ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用い、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列並びにＫｏｚａｋ配列、３’−側にＡｐａＩ及びＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉｉ）キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡは、以下のようにして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムＤＮＡ（Ｎ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２９，６７１−６７９  １９８２）をコードする発現ベクターＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ−１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムＤＮＡをコードする発現ベクターＲＶ１−ＰＭ１ａ（ＷＯ９２／１９７５９参照）とを導入したＣＨＯ細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲ法でヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡをクローニングし、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正しい配列を持つプラスミドをｐＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡと命名した。
ＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ−１−ｆ上のＳＶ４０プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位、及びＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域との間にあるＥｃｏＲＩ部位を欠失した発現ベクターを作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃＤＮＡの発現ベクターの構築のために使用した。
ｐＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、さらにＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ平滑化断片を調製した。このＨｉｎｄ  ＩＩＩ−ＢａｍＨＩ平滑化断片を、上記のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位及びＥｃｏＲＩ部位が欠失したＤＨＦＲ−△Ｅ−ＲＶｈ−ＰＭ１−ｆをＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＳｍａＩで消化することにより調製した発現ベクターに連結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡを構築した。
ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製したＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃＤＮＡを含み、５’−末端にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列、３’−末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。
プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現ベクターｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。なお、発現ベクターｐＣＯＳ１は、ＨＥＦ−ＰＭｈ−ｇγ１（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩアダプター（宝酒造）を連結することにより構築した。
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するため、プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られたキメラ抗体Ｈ鎖配列を含むＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と命名した。なお、発現ベクターｐＣＨＯ１は、ＤＨＦＲ−△Ｅ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）から、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ消化により抗体遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  Ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造）を連結することにより構築した。
（２）ヒトＬ鎖定常領域の構築
（ｉ）クローニングベクターの作製
ヒトＬ鎖定常領域を含むｐＵＣ１９ベクターを構築するために、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位欠失ｐＵＣ１９ベクターを作製した。ｐＵＣ１９ベクター２μｇを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
回収したＤＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、６ＵのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する５０μｌの反応混合液中で室温にて２０分間反応させ、末端を平滑化させた。反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ベクターＤＮＡをエタノール沈殿により回収した。
回収したベクターＤＮＡを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール−８０００、０．５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含有する反応混合液１０μｌ中で１６℃で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌを大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）１００μｌに加え、氷上で３０分間静置した後、４２℃にて１分間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地５００μｌを加えて、３７℃で１時間インキュベーションした後、Ｘ−ｇａｌとＩＰＴＧを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｇｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にまき、３７℃で一夜培養して形質転換体を得た。
形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２０ｍｌで３７℃一夜培養し、菌体画分からＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付の処方に従ってプラスミドＤＮＡを精製した。精製したプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位が欠失していることを確認したプラスミドをｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩと命名した。
（ｉｉ）ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ−、Ｍｃｇ−  Ｋｅ−  Ｏｚ＋、Ｍｃｇ−  Ｋｅ＋  Ｏｚ−の少なくとも４種類のアイソタイプが知られている（Ｐ．Ｄａｒｉａｖａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，９０７４−９０７８，１９８７）。＃２３−５７−１３７−１マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃｇ＋  Ｋｅ＋  Ｏｚ−（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ５７８１９）（Ｐ．Ｄａｒｉａｖａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，９０７４−９０７８，１９８７）のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示し、＃２３−５７−１３７−１マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はアミノ酸配列で６４．４％、塩基配列で７３．４％であった。
そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の構築をＰＣＲ法を用いて行った。各プライマーの合成は、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて行った。ＨＬＡＭＢ１（配列番号１１）及びＨＬＡＭＢ３（配列番号１３）はセンスＤＮＡ配列を有し、ＨＬＡＭＢ２（配列番号１２）及びＨＬＡＭＢ４（配列番号１４）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、それぞれのプライマーの両端に２０から２３ｂｐの相補的配列を有する。
外部プライマーＨＬＡＭＢＳ（配列番号１５）、ＨＬＡＭＢＲ（配列番号１６）はＨＬＡＭＢ１、ＨＬＡＭＢ４とそれぞれ相同な配列を有しており、またＨＬＡＭＢＳはＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ認識配列を、ＨＬＡＭＢＲはＥｃｏＲＩ認識配列をそれぞれ含んでいる。第一ＰＣＲでＨＬＡＭＢ１−ＨＬＡＭＢ２とＨＬＡＭＢ３−ＨＬＡＭＢ４の反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーＨＬＡＭＢＳ及びＨＬＡＭＢＲを添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を使い、添付の処方に従って行った。第一ＰＣＲでは、５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ１及び０．５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ２と５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）とを含有する１００μｌの反応混合液、あるいは０．５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ３及び５ｐｍｏｌｅのＨＬＡＭＢ４と５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）とを含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行った。
第二ＰＣＲは、反応液を５０μｌずつ混合し、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。
第三ＰＣＲは、反応液に外部プライマーＨＬＡＭＢＳ及びＨＬＡＭＢＲを各５０ｐｍｏｌｅずつ添加し、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
第三ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ）で電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、添付の処方に従ってゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ＵのＥｃｏＲＩ（宝酒造）を含有する２０μｌの反応混合液中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液８μｌに溶解した。
プラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ０．８μｇを同様にＥｃｏＲＩで消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収した。消化したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５，宝酒造）を含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃、３０分間反応させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿により回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
上記のＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩ  １μｌと先のＰＣＲ産物４μｌをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
上記プラスミドについて、クローニングされたＤＮＡの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定には３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）を用い、プライマーにはＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４及びＭ１３  Ｐｒｉｃｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用いた。その結果、クローニングされたＤＮＡの内部に１２ｂｐの欠失があることが判明した。このＤＮＡを含むプラスミドをＣλΔ／ｐＵＣ１９と命名した。そこで、その部分を補うためのプライマーＨＣＬＭＳ（配列番号１７）、ＨＣＬＭＲ（配列番号１８）を新たに合成し、ＰＣＲで再度正しいＤＮＡの構築を行った。
第一ＰＣＲで欠失ＤＮＡを含むプラスミドＣλΔ／ｐＵＣ１９を鋳型とし、プライマーＨＬＡＭＢＳとＨＣＬＭＲ、ＨＣＬＭＳとＨＬＡＭＢ４で反応を行った。ＰＣＲ産物をそれぞれ精製し、第二ＰＣＲでアセンブリを行った。さらに外部プライマーＨＬＡＭＢＳ及びＨＬＡＭＢ４を添加し、第三ＰＣＲにより全長ＤＮＡを増幅させた。
第一ＰＣＲでは、鋳型としてＣλΔ／ｐＵＣ１９  ０．１μｇ、プライマーＨＬＡＭＢＳ及びＨＣＬＭＲ各５０ｐｍｏｌｅ、あるいはＨＣＬＭＳ及びＨＬＡＭＢ４各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。
ＰＣＲ産物ＨＬＡＭＢＳ−ＨＣＬＭＲ（２３６ｂｐ）、ＨＣＬＭＳ−ＨＬＡＭＢ４（１４７ｂｐ）をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。第二ＰＣＲでは精製ＤＮＡ断片各４０ｎｇ、１ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する２０μｌの反応混合液を用い、２５μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルを５回行った。
第三ＰＣＲでは、第二ＰＣＲ反応液２μｌ、外部プライマーＨＬＡＭＢＳ、ＨＬＡＭＢ４各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層した。ＰＣＲは、９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。第三ＰＣＲ産物である３５７ｂｐのＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片０．１μｇをＥｃｏＲＩで消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩにサブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドについて塩基配列をＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４、Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）にて決定した。欠失のない正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／ｐＵＣ１９とした。
（ｉｉｉ）ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする遺伝子の構築
プラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ（ＷＯ９２／１９７５９）からＬ鎖κ鎖Ｃ領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いてクローニングした。３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて合成した前方プライマーＨＫＡＰＳ（配列番号１９）はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ認識配列を、後方プライマーＨＫＡＰＡ（配列番号２０）はＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。
鋳型となるプラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ  ０．１μｇ、プライマーＨＫＡＰＳ、ＨＫＡＰＡ各５０ｐｍｏｌｅ、５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層した。９４℃にて１分間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間の反応を３０サイクル行った。３６０ｂｐのＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化した後、ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  ΔＨｉｎｄ  ＩＩＩにクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドの塩基配列をＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４、Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造）を用い、３７３Ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社）にて決定した。正しい塩基配列を有していることが確認されたプラスミドをＣκ／ｐＵＣ１９とした。
（３）キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築
キメラ＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。プラスミドＣλ／ｐＵＣ１９、Ｃκ／ｐＵＣ１９のヒト抗体定常領域の直前にあるＨｉｎｄ  ＩＩＩ、ＢｌｎＩ部位に、＃２３−５７−１３７−１  Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによって、それぞれキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域及びＬ鎖λ鎖又はＬ鎖κ鎖定常領域をコードするｐＵＣ１９ベクターを作製した。ＥｃｏＲＩ消化によってキメラ抗体Ｌ鎖遺伝子を切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニングを行った。
すなわち、プラスミドＭＢＣ１Ｌ２４から＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法を用いてクローニングした。各プライマーの合成は、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ社）を用いて行った。後方プライマーＭＢＣＣＨＬ１（配列番号２１）はＨｉｎｄ  ＩＩＩ認識配列とＫｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）を、前方プライマーＭＢＣＣＨＬ３（配列番号２２）はＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．１μｇのＭＢＣ１Ｌ２４、プライマーとしてＭＢＣＣＨＬ１及びＭＢＣＣＨＬ３を各５０ｐｍｏｌｅ、１μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を含有する１００μｌの反応混合液を用い、５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間、７２℃にて２分間の温度サイクルで３０回行った。
４４４ｂｐのＰＣＲ産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。ＰＣＲ産物１μｌをそれぞれ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）及び８ＵのＥｃｏＲＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液８μｌに溶解した。
プラスミドｐＵＣ１９  １μｇを同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５，宝酒造）でＢＡＰ処理した。反応液をフェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したプラスミドｐＵＣ１９  １μｌと先のＰＣＲ産物４μｌをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで３７℃で一夜培養した。菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラスミドをＣＨＬ／ｐＵＣ１９とした。
プラスミドＣλ／ｐＵＣ１９、Ｃκ／ｐＵＣ１９各１μｇをそれぞれ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）及び２ＵのＢｌｎＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した後、３７℃で３０分間ＢＡＰ処理を行った。反応液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
＃２３−５７−１３７−１  Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドＣＨＬ／ｐＵＣ１９から８μｇを同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化した。得られた４０９ｂｐのＤＮＡ断片を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
このＬ鎖Ｖ領域ＤＮＡ４μｌをＢＡＰ処理したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９又はＣκ／ｐＵＣ１９各１μｌにサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地３ｍｌで一夜培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｐＵＣ１９とした。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９及びＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｐＵＣ１９をそれぞれＥｃｏＲＩで消化し、３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、７４３ｂｐのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
発現ベクターとしてプラスミドＨＥＦ−ＰＭ１ｋ−ｇｋ  ２．７μｇをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出、ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。回収したＤＮＡ断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロースゲルで電気泳動し、６５６１ｂｐのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）又はＭＢＣ１Ｌ（κ）ＥｃｏＲＩ断片各３μｌと連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、８ＵのＨｉｎｄ  ＩＩＩ（宝酒造）及び２ＵのＰｖｕＩ（宝酒造）を含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれぞれＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏとした。
（４）ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
キメラ抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。
すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ又はＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてキット添付の処方に従って行った。
（５）ＥＬＩＳＡ
（ｉ）抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％  ＮａＮ３）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ  ＩｇＧ１λ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（ｉｉ）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチド研究所）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。
その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能を有しており、クローニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有することが示された。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴＨｒＰ（１−３４）に対する結合能は変化しないことから、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ鎖を用いて構築した。
（６）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ又はＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノール及びクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収してエレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、３枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）及び５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシド及びデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清添加、リボヌクレオシド及びデオキリボヌクレオシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞破片を除去した。
ＣＨＯ細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定及び高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製キメラ抗体の濃度及び抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
〔参考例４〕ヒト型化抗体の構築
（１）ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体Ｓ３１６７９（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  Ａ．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，１９９３）由来のＦＲを有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｈ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧＰ３（配列番号２４）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４とホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３及びＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にて行った。
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３及びＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイクルを３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を４％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（ｉｉ）ヒト型化Ｈ鎖ｃＤＮＡのためのＨ鎖Ｖ領域の構築
ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃＤＮＡと連結するために、上記のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をＰＣＲ法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域のリーダー配列の５’−側をコードする配列とハイブリダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−９５０，１９８７）、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２はＪ領域の３’−側をコードするＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つＣ領域の５’−側の配列をコードしＡｐａＩ及びＳｍａＩ認識配列を有するように設計した。
ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、鋳型ＤＮＡとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ２及びＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４５６ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。精製したＤＮＡをエタノールで沈殿させた後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたＰＣＲ反応混合物をＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで消化することで調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたハイブリドーマ＃２３−５７−１３７−１に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有し、５’−側にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列及びＫｏｚａｋ配列、３’−側にＡｐａＩ及びＳｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９と命名した。
（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構築
ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃＤＮＡの配列を含むプラスミドＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−ｃＤＮＡをＡｐａＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、Ｈ鎖Ｃ領域を含むＤＮＡ断片を回収し、ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドはヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体のＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含み、５’−末端にＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３’−末端にＢａｍＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。
ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＯＳ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１と命名した。
さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラスミドｐＣＨＯ１に導入した。こうして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１と命名した。
（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築
（ｉ）ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製
ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み換えたＬ鎖遺伝子を構築し、ヒト型化のための各領域の評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリッド抗体を作製した。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｃ１とする）及び１０２２ｂｐの断片（ｃ２とする）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断片（ｈ１とする）及び１０２２ｂｐの断片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについてＢＡＰ処理を行った。ＤＮＡをフェノール及びクロロホルムで抽出、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μｌに溶解した。
ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、又はＢａｍＨＩ（宝酒造）８Ｕ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１−ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。
これをヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１−ｃ２のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９を鋳型として用いた。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＨｉｎｄＩＩＩ  １６Ｕ，ＡｆｌＩＩ  ４Ｕを含有する反応混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ２’）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８ｂｐ（ｈａ１’，ｈｄ１’）のＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。
ｈａ１’、ｈｄ１’断片をそれぞれｃ２’断片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９とした。
得られたプラスミドｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９，ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐのＤＮＡ断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。
各ＤＮＡ断片４μｌを前述のＢＡＰ処理したＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製した各プラスミドを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれマウスＦＲ１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。
（ｉｉ）ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作製
ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することによって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作製した。
プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。次に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ  ６Ｕを含有する反応混合液５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
反応液を１．５％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｍ１）及び２３４９ｂｐ（ｍ２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから４９５５ｂｐ（ｈｍ１）及び２３４９ｂｐ（ｈｍ２）の各ＤＮＡ断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液４０μｌに溶解した。
ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  ＰＩａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。
精製した各プラスミドを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ＡｐａＩ（宝酒造）８Ｕ、又はＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
各断片が正しく連結されていれば、ＡｐａＩで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／４９８ｂｐ（ｍ１−ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６／４９８ｂｐ（ｈｍ１−ｍ２）の消化断片が生じることにより、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。
（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖を、ＰＣＲ法によるＣＤＲ−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３８６８（ＧＥＮ−ＢＡＮＫ、Ｄｅｆｔｏｓ  Ｍら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，１９９４）由来のＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、並びにヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ−ＰＤＢ）由来のＦＲ４を有するヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体Ｌ鎖（バージョン”ａ”）の作製のために６個のＰＣＲプライマーを使用した。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配列番号３０）はセンスＤＮＡ配列を有し、そしてＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセンスＤＮＡ配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１ＬＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジーを有する。
ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３及びＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）にて行った。
すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、目的の大きさのＤＮＡ断片の同定をシリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に溶解した。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３及びＭＢＣ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑを含む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ温度サイクルで３０回反応させた。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギニンになっていたため、これをチロシンに修正するための修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３５）を設計し、合成した。ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型ＤＮＡとして０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ断片を３％Ｎｕ  Ｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（ＦＭＣ  Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。
４２１ｂｐ長のＤＮＡ断片を含有するアガロース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
Ｍ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４プライマー及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶプライマーを用いて塩基配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたので、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いＤＮＡ断片を精製した。得られたＰＣＲ反応混合物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン”ａ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号６６に示す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号４７に示す。
バージョン”ｂ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン”ｂ”では４３位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロリンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｆｌＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。
こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含む断片をプラスミドｐＣＯＳ１に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｃ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。バージョン”ｃ”では８４位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。
塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩ及びＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩ及びＡｏｒ５１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｄ”、”ｅ”及び”ｆ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に”ａ”、”ｂ”、”ｃ”バージョンの９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソロイシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ−Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＣＯＳ１，ｈＭＢＣ１Ｌｃλ／ｐＣＯＳ１を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵＣ１９と連結した。
こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＣＯＳ１、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｇ”及び”ｈ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に”ａ”、”ｄ”バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９Ｒ（配列番号３９）及びＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶをプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＭ１３  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４をプライマーとして用いて、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさらにＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｌｎＩで消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片をＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩで消化し、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これらのプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＣＯＳ１及びｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１と命名した。
バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｋ”、”ｌ”、”ｍ”、”ｎ”及び”ｏ”をＰＣＲ法による変異導入を用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配列番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＡｐａＩ及びＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩ及びＢｌｎＩで消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入されたクローンを選択した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドｐＣＯＳ１のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と命名した。バージョン”ｊ”、”ｌ”、”ｍ”及び”ｏ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号６７、６８、６９、７０に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４８、４９、５０、５１に示す。
バージョン”ｐ”、”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”及び”ｔ”は、バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”又は”ｏ”のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョン”ｈ”を、各バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”又は”ｏ”とつなぎ換えることにより作製したものである。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＣＯＳ１中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定を行い、各バージョン”ｉ”、”ｊ”、”ｍ”、”ｌ”及び”ｏ”の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクローンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ”ｐ”、”ｑ”ｓ”ｒ”及び”ｔ”とし、得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，ｒ，ｔ）と命名した。バージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”及び”ｔ”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列番号７１、７２、７３、７４に示す。また、これらの各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５２、５３、５４、５５に示す。
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９にサブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９と命名した。
ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにおける置換アミノ酸の位置を表２に示す。
2004045643.tif 000005
表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋはリジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロイシンを示す。
なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、１９９６年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ  ＢＰ−５６３０としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェクション
ハイブリッド抗体及びヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すなわちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏ、ｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ、又はｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１×１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。
ヒト型化＃２３−５７−１３７−１抗体の一過性発現では、プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＯＳ１とｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＣＯＳ１（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて、前記ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥＬＩＳＡに供した。
また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのハイブリッド抗体又はヒト型化抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従って行った。
（６）ＥＬＩＳＡ
（ｉ）抗体濃度の測定
抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％  ＮａＮ３）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブリッド抗体又はヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体又はヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ  ＩｇＧ１λ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を用いた。
（ｉｉ）抗原結合能の測定
抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のようにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリッド抗体又はヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体又はヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で測定した。
（７）活性確認
（ｉ）ヒト型化Ｈ鎖の評価
ヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”とキメラＬ鎖を組み合わせた抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であった。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバージョン”ａ”で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バージョン”ａ”をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。
（ｉｉ）ハイブリッド抗体の活性
（ｉｉ−ａ）  ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した。これらの結果は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
（ｉｉ−ｂ）ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体
Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認められなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメラ＃２３−５７−１３７−１抗体と同等の結合活性を示した。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示唆する。
（ｉｉｉ）ヒト型化抗体の活性
Ｌ鎖としてバージョン”ａ”から”ｔ”の各々一つを用いたヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。その結果、Ｌ鎖バージョン”ｊ”、”ｌ”、”ｍ”、”ｏ”、”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有するヒト型化抗体はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した。
（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立
ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｍλ／ｐＣＯＳ１又はｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＣＯＳ１あるいはｈＭＢＣ１ＨｃＤＮＡ／ｐＣＨＯ１とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／ｐＣＯＳ１の組み合わせで、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖ＤＮＡにし、フェノール及びクロロホルム抽出後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、エレクトロポレーションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、各プラスミドＤＮＡ  １０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）添加、ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）及び５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８  Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。
樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡大し、ローラーボトルにて２％のＵｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清添加、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭ−α培地を用いて、大量培養を行った。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、０．２μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により細胞破片を除去した。ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、ＰＯＲＯＳプロテインＡカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ  ＬＣ１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定及び高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度及び抗原結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。
〔参考例５〕中和活性の測定
マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ２インキュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８−５細胞を９６穴プレートに１０４細胞／１００μｌ／穴で蒔込み１日間培養し、４ｍＭのＨｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅと１０％牛胎児血清を含むＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌのＨａｍ’Ｓ  Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１ｍＭのイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、ＳＩＧＭＡ）及び１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を加え、３０分間３７℃でインキュベートした。
中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗体又はヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌ及び０．３７μｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び０．０１μｇ／ｍｌの群、又は１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌ及び０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は上記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）の濃度は１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ’Ｓ）付属のＥＩＡバッファー１２０μｌを添加しｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭＰ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ’Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換したバージョン”ｑ”、”ｒ”、”ｓ”、”ｔ”を有するヒト型化抗体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バージョン”ｑ”がもっとも強い中和能を示した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含有する軟骨腫・軟骨肉腫治療剤が提供される。本発明の治療剤は、軟骨腫・軟骨肉腫細胞のアポトーシスを誘起することにより、軟骨腫・軟骨肉腫を抑制する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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