(57)【要約】以下の（１）〜（７）の工程を含む方法によって作出されるラン科に属する半数体植物を提供する。（１）ラン科植物から花粉を採取する工程（２）採取した花粉の核を不活化する工程（３）核を不活化した花粉をラン科植物の柱頭に付着させる工程（４）花粉を柱頭に付着させたラン科植物を栽培し、果実を発達させる工程（５）果実を採取し、果実から種子を採取する工程（６）採取した種子から植物体を生育させる工程（７）生育させた植物体の中から染色体数が半減している個体を選択する工程  この半数体植物により、ラン科のＦ１品種の作出が容易になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラン科に属する半数体植物。
【請求項２】
以下の（１）〜（７）の工程を含む方法によって作出される請求項１記載のラン科に属する半数体植物。
（１）ラン科植物から花粉を採取する工程
（２）採取した花粉の核を不活化する工程
（３）核を不活化した花粉をラン科植物の柱頭に付着させる工程
（４）花粉を柱頭に付着させたラン科植物を栽培し、果実を発達させる工程
（５）果実を採取し、果実から種子を採取する工程
（６）採取した種子から植物体を生育させる工程
（７）生育させた植物体の中から染色体数が半減している個体を選択する工程
【請求項３】
花粉を採取するラン科植物が、コチョウラン又はシランである請求項２記載のラン科に属する半数体植物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項記載のラン科に属する半数体植物の染色体を倍加して得られるラン科に属する半数体倍加系統の植物。
【請求項５】
請求項４記載のラン科に属する半数体倍化系統の植物を片親又は両親とする交配によって得られるラン科に属するＦ１植物。
【請求項６】
以下の（１）〜（７）の工程を含むラン科に属する半数体植物の作出方法。
（１）ラン科植物から花粉を採取する工程
（２）採取した花粉の核を不活化する工程
（３）核を不活化した花粉をラン科植物の柱頭に付着させる工程
（４）花粉を柱頭に付着させたラン科植物を栽培し、果実を発達させる工程
（５）果実を採取し、果実から種子を採取する工程
（６）採取した種子から植物体を生育させる工程
（７）生育させた植物体の中から染色体数が半減している個体を選択する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ラン科に属する半数体植物、この半数体植物から得られる半数体倍加系統の植物、及びこの半数体倍加系統の植物から得られるＦ１植物、並びにラン科に属する半数体植物の作出方法に関する。
【背景技術】  コチョウランは、わが国において営利的に生産されるランの中で最も重要なランである。現在のコチョウランにおいて、主として用いられている種子繁殖性品種は、白の大輪品種に限られている。近年、市場の要求が多様化して、白の大輪以外の花色や花型を持つコチョウランが強く望まれるようになったが、白色以外の遺伝様式は複雑で、後代に様々な花色が出現するため、白色以外の種子繁殖性の品種は未だ得られていない。また、上述したコチョウランの品種は、集団選抜法もしくは循環選抜法によって育成されたため、園芸品種としては雑駁であり、また、元ととなった素材の範囲が狭かったことやより均一な品種が求められるようになったために、近交弱勢による生育障害も近年問題となってきた。
種子繁殖性品種の欠点を解決することを目的として、微細繁殖方法の確立に伴い、栄養繁殖性の白色をはじめとした様々な色の品種の導入が試みられている。しかし、培養変異の発生が大きな問題となることが徐々にわかり、栄養繁殖性の品種はなかなか普及しない状態にある。
コチョウランをはじめとするラン科植物において、種子繁殖性のＦ１品種を作出できれば、斉一でしかも生育も旺盛な品種を得ることができ、栄養繁殖苗に伏在する培養変異に関する問題も回避できる。また、コチョウランでは、１株から一度に２０万粒以上の極微細な種子を得ることができるので、１０Ｌ程度の空間に、わが国で数年間消費されるコチョウランの在庫をＦ１種子として蓄えることが可能となり、在庫管理の手間も栄養繁殖性品種に比べ大幅に軽減される。
種子繁殖性のＦ１品種の作出には、遺伝的に固定された純系の作出が必要であり、また、純系は半数体を誘導し、その染色体を倍加することにより、短期間で効率的に得ることができる。従って、ラン科植物のＦ１品種の作出には、まずラン科植物における半数体の作出法の確立が必要である。
現在までに、ラン科植物の胚ならびに、同科の異種間もしくは異属間の交雑後代に半数体が偶発的に生じた事例は報告されているが（非特許文献１、２、３、４、５及び６参照）、再現性をもって半数体のラン科植物の作出に成功した例はない。
ラン科植物以外では、現在半数体を得る方法として、葯培養、小胞子培養、未受精胚珠培養、偽受精胚珠培養等が報告されている。このうち偽受精胚珠培養では、既に、ペチュニア（非特許文献７参照）、メロン（非特許文献８参照）、ニンジン（非特許文献９参照）、タバコ（非特許文献１０参照）、カーネーション（特許文献１参照）、キウイフルーツ（非特許文献１１参照）、バラ（非特許文献１２参照）、リンゴ（非特許文献１３参照）、ブラックベリー（非特許文献１４参照）、などにおいて半数体の作出に成功した事例が報告されている。しかし、偽受精胚珠培養を利用してラン科植物の半数体の作出を試みようとした例はなく、当然のことながら半数体植物の作出に成功したという報告もない。
コチョウランにおいて偽受精胚珠培養が今まで試みられなかった理由としては、コチョウランを含むラン科植物の雌性配偶子の完成時期や受精の時期が一般的な植物と大きく異なっていることが挙げられる。即ち、被子植物における胚のう形成は胚珠内で行われ、ラン科以外の植物では開花時に胚珠は既に完成しているが、コチョウランを含むほとんどのラン科植物では胚珠は開花時には全く未分化の状態である。コチョウランでは、受粉後約５６日後に胚珠が完成する。また、ラン科以外の植物では、受粉後数時間から２日以内に受精するものが多いが、コチョウランでは受精までの期間が長く、受粉約９０日後に受精を完了する。このように、コチョウランの雌性配偶子の形成は受粉後に始めて開始されるものであり、受精も受粉後異例とも言える長期間を経て完了する。従って、ラン科植物においては、偽受精胚珠培養により半数体を作出できるかどうかは全く予想できなかった。
〔特許文献１〕  特開平８−１２６４４４号公報
〔非特許文献１〕  前川（１９７１）原色日本のラン  日本ラン科植物図譜  ｐｐ３１６−３１７，誠文堂新光社（東京都千代田区）
〔非特許文献２〕  Ｈａｇｅｒｕｐ，Ｏ．（１９４４）Ｏｎ  ｆｅｒｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ，ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ  ａｎｄ  ｈａｐｌｏｉｄｙ  ｉｎＯｒｃｈｉｓｍａｃｕｌａｔｕｓ  Ｌ．ｓｅｎｓ．ｌａｔ．Ｄａｎｓｋ  Ｂｏｔａｎｉｓｋ  Ａｒｋｉｖ．１１：１−２５
〔非特許文献３〕  Ｍａｈｅｓｗａｒｉ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ（１９５０）Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．Ｉｎｄｉａ  １９：２４９−２５０．
〔非特許文献４〕  Ｋｕｓａｎｏ，Ｓ．（１９１５）Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ａｇｒｉｃ．Ｕｎｉｖ．Ｔｏｋｙｏ  ６：７−１２０．
〔非特許文献５〕  Ａｍｏｒｅ，Ｔ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｋａｍｅｍｏｔｏ，Ｈ．，（１９９１）Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍ．Ｌｉｎｄｌｅｙａｎａ  ６（２）：１１７−１２０
〔非特許文献６〕  Ｍｉｄｕｎｏ，Ｔ．，（１９４０）Ｃｙｔｏｌｏｇｉａ  ２：１５６−１８５．
〔非特許文献７〕  Ｒａｑｕｉｎ，Ｃ．（１９８５）Ｚ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｚｕｃｈｇｔ．９４：１６６−１６９．
〔非特許文献８〕  Ｓａｕｔｏｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｄｕｍａｓ  ｄｅ  Ｖａｕｌｘ，Ｒ．（１９８７）Ａｇｒｏｎｏｍｉｅ  ７：１４１−１４８．
〔非特許文献９〕  Ｒｏｄｅ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄｕｍａｓ  ｄｅ  Ｖａｌｕｘ，Ｒ．（１９８７）．Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，３０５：２２５−２２９．
〔非特許文献１０〕  Ｋａｔｏｈ，Ｎ．，Ｈａｇｉｍｏｒｉ，Ｍ．ａｎｄ  Ｉｗａｉ，Ｓ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０（２）：１３０−１３７．
〔非特許文献１１〕  Ｐａｎｄｅｙ，Ｋ．Ｋ．，Ｐｒｚｙｗａｒａ，Ｌ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．（１９９０）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ５１：１−９．
〔非特許文献１２〕  Ｍｅｙｎｅｔ，Ｊ．，Ｂａｒｒａｄｅ，Ｒ．，Ｄｕｃｌｏｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｉａｄｏｕｓ，Ｒ．（１９９４）Ａｇｒｏｎｏｍｉｅ  ２：１６９−１７５．
〔非特許文献１３〕  Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｘ．ａｎｄ  Ｌｅｓｐｉｎａｓｓｅ，Ｙ．（１９９１）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ５４：１０１−１０９．
〔非特許文献１４〕  Ｎａｅｓｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｓｗａｒｔｚ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂａｕｃｈａｎ，Ｇ．Ｒ．（１９９８）Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  ９９：５７−７３．
上述のように、ラン科植物のＦ１品種は、様々な面で既存の品種に優れている。本発明は、このようなラン科植物のＦ１品種の作出に必要な半数体植物を作出する手段を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、不活性化した花粉による刺激によっても、胚のう形成が誘発され、半数体のコチョウランが得られることを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
即ち、本発明は、ラン科に属する半数体植物である。
また、本発明は、上記のラン科に属する半数体植物の染色体を倍加して得られるラン科に属する半数体倍加系統の植物である。
更に、本発明は、上記のラン科に属する半数体倍化系統の植物を片親又は両親とする交配によって得られるラン科に属するＦ１植物である。
更に、本発明は、以下の（１）〜（７）の工程を含むラン科に属する半数体植物の作出方法である。
（１）ラン科植物から花粉を採取する工程
（２）採取した花粉の核を不活化する工程
（３）核を不活化した花粉をラン科植物の柱頭に付着させる工程
（４）花粉を柱頭に付着させたラン科植物を栽培し、果実を発達させる工程
（５）果実を採取し、果実から種子を採取する工程
（６）採取した種子から植物体を生育させる工程
（７）生育させた植物体の中から染色体数が半減している個体を選択する工程
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物には、ラン科に属する半数体植物が含まれる。ここでいう「植物」は、あらゆる生育段階における植物を意味し、例えば、成熟した植物のほか、そのような植物へ生育する過程の未成熟な植物、あるいは、そのような未成熟な植物へ分化可能な植物組織、細胞及び種子などを包含する。
本発明のラン科に属する半数体植物は、例えば、以下の（１）〜（７）の工程を含む方法によって作出することができるが、この方法以外の方法によって作出されたラン科植物も半数体である限り、本発明に含まれる。
工程（１）は、ラン科植物から花粉を採取する工程である。使用するラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）植物は特に限定されないが、コチョウラン又はシラン（Ｂｌｅｔｉｌｌａｓｔｒｉａｔａ）を使用するのが好ましい。なお、ここでいう「コチョウラン」は、１）ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）属の種とそれらの交配種、２）ドルチス（Ｄｏｒｉｔｉｓ）属（この属は１属１種）のドルチス・プルケリマ（Ｄｏｒｉｔｉｓｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、３）ファレノプシス属とドルチス属のの人工交配属であるドリテノプシス（Ｄｏｒｉｔａｅｎｏｐｓｉｓ）属の交配種などを含む。花粉の採取は、一般的な偽受精胚珠培養と同様に行うことができるが、ラン科植物の場合、花粉は花粉塊として存在するので、通常、花粉は花粉塊として採取する。
工程（２）は、採取した花粉の核を不活化する工程である。花粉の核を不活化する方法は特に限定されないが、軟Ｘ線照射によって行うのが好ましい。Ｘ線照射量は特に限定されないが、１０〜２００ＫＲが好ましく、５０〜１００ＫＲが更に好ましい。
工程（３）は、核を不活化した花粉をラン科植物の柱頭に付着させる工程である。花粉を付着させるラン科植物は、通常は、花粉を採取した植物と同一の植物であるが、異なる植物としてもよい。柱頭への花粉の付着は、一般的な偽受精胚珠培養と同様に行うことができる。
工程（４）は、花粉を柱頭に付着させたラン科植物を栽培し、果実を発達させる工程である。ここでの栽培は特別な方法を用いる必要はなく、一般的なラン科植物と同様に行うことができる。通常、花粉を柱頭に付着させてから、軟Ｘ線を照射した花粉を交配した花では、１２０〜２００日程度で、種子を採取できる程度に果実が発達する。
工程（５）は、果実を採取し、果実から種子を採取する工程である。果実の採取及び種子の採取は、一般的なラン科植物と同様に行うことができる。
工程（６）は、採取した種子から植物体を生育させる工程である。植物体への生育は、一般的なラン科植物と同様に行うことができる。
工程（７）は、生育させた植物体の中から染色体数が半減している個体を選択する工程である。染色体が半減しているかどうかは、染色体を顕微鏡等で観察することにより判断してもよいが、フローサイトメトリーを利用することが好ましい。
材料として用いたラン科植物（工程（４）で花粉を付着させる植物）が２倍体（２ｎ）の場合は、以上の（１）〜（７）の工程により半数体（ｎ）の植物が得られる。しかし、ラン科植物の品種の中には２倍体（２ｎ）ではなく、４倍体（４ｎ）として存在するもある。このような４倍体の植物を材料として用いた場合、得られる植物は半数体ではなく、２倍体である。このような場合には、再度（１）〜（７）の工程を繰り返すことにより、半数体の植物を得ることができる。
本発明の植物には、上述した半数体の植物のほか、半数体の植物の染色体を常法（例えば、コルヒチン処理など）に従って倍加することにより得られる半数体倍加系統の植物や、この半数体倍加系統の植物を片親又は両親とする交配によって得られるＦ１植物も含まれる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、４倍体のコチョウランのフローサイトメトリーによる検定結果を示す図である。
第２図は、２倍体のコチョウランのフローサイトメトリーによる検定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】  供試材料には、Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ  Ｗｈｉｔｅ  Ｄｒｅａｍ″Ｆｏｒｅｓ″を２０株用いた。白色の大輪コチョウラン品種のそのほとんどがそうであるように、本実施例で用いたコチョウラン品種″Ｆｏｒｅｓｔ″も４倍体である。組織培養により増殖した苗を、１９９９年１０月に杉皮バークを用いて４．５寸の素焼き鉢に１個体ずつ植え込んだ。さらその外側に５寸の素焼き鉢を重ね、水管理を容易にした。栽培は年間を通して、最高気温を２３−２９度の範囲に、また最低気温は１８度以上に設定した冷暖房付きの空調温室において行った。光は寒冷紗により７０％遮光し、葉焼けを防いだ。潅水頻度は天候に影響されるが、概ね２から４日に一度、鉢底から水が流れ出すまで、十分に潅水した。肥料は１ヶ月に一度液肥を与えた。組織培養によって増やした株は遺伝的に均一であるので、処理間の比較をする場合に、より精緻な実験を行うことが可能となる。
２００２年２月１０日から２月２０日の間に開花を始めた１６株を実験に用いた。交配は同年３月１３日に行った。１６株を３グループに分けて、交配の際に花粉を不活化させるために行う軟Ｘ線の線量が、半数体の作出の可否とその頻度に及ぼす影響について検討した。
各花序の基部に位置する開花後約３週間の花を、１花序に付き１つずつ用いた。１花には２つの花粉塊が存在するが、これらすべてを注意深く花から取り出し、プラスティックシャーレに入れた。なお、本実施例において使用した温室は防虫網が張られていることと、本邦にはコチョウランを積極的に受粉させる媒介生物が特に見当らないので、袋がけによる目的外の花粉の侵入を防ぐ必要は無い。
集めた花粉塊に対する軟Ｘ線処理は、０ＫＲ（無処理区）、５０ＫＲ、１００ＫＲの３区で行った。また、供試株数は０ＫＲ区では４株、５０ＫＲ区には６株、１００ＫＲ区にも６株を供試した。
軟Ｘ線照射装置は、秋田県立大学生物資源科学部に設置されている『照射用軟Ｘ線発生装置』（型式ＯＭ−１００ＲＥ）、株式会社オーミック（東京渋谷区）製を用いた。５０ＫＲ区では電圧８０ＫＶｐ、電流４ｍＡ、線源から１５０ｍｍの条件で２３分５６秒処理を行った。１００ＫＲ区では照射時間のみを変え４７分５３秒間照射した。両区では１分間につき２０．８８Ｇｙが照射される。
処理後直ちに花粉塊を温室に運び込み、交配を行った。１花につき２個の花粉塊をピンセットで注意深く柱頭に置いた。柱頭は粘着物質で覆われているので容易に花粉塊が付着する。１株に付き１つの花を交配した。なお、無処理区も温室で花粉塊を採取後、処理区の花粉塊と同様に室内に持ち込み約１時間放置した後、温室に移して交配に用いた。
交配した花は、花粉塊の軟Ｘ線処理の有無に関わらず１日後にしおれ始め、２日後には完全にしおれた。しかし、交配した１６花のすべてで果実の発達が認められた。
交配１８０日から２００日後の間の３回にわけて、１回につき２−４果を収穫し、中の種子を播種した。なお、０ＫＲ区では３果、５０ＫＲ区では４果を、１００ＫＲ区では任意に選んだ３果を培養に供試した。
通常、大輪のコチョウランの自殖した果実では、果実が裂開するまで１０ヶ月程度かかるが、１００ＫＲ区の６つの果実の内１果は交配６ヶ月後に裂開した。これは、果実内の有胚種子の数が少なかった為と想像出来る。
収穫した果実の最大径と果実長に処理間で顕著な差は認められなかった。収穫した果実は、クリーンベンチ内で有効塩素濃度を１％含むＮａＯＣｌ水溶液によって殺菌したのち、滅菌水で５回すすいだ。滅菌した果実は、滅菌済みの濾紙上において、果皮の一部を切り取り開口部を作り、そこから中の種子を取り出した。取り出した種子塊は糸状の組織とともに、径９ｃｍのプラスティックシャーレ入れた２０ｍＬの固形のＮＤＭ培地（表１）上に置床した。置床したのみでは糸状の組織が培地と接しないので、滅菌水を約５ｍＬ程度滴下し、さらにピンセットで培地に圧着した。
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播種直後の顕微鏡による観察では０ＫＲ区（非照射区）の種子は、９割以上の種子が胚を持つ有胚種子であった。５０ＫＲ区ならびに１００ＫＲ区の種子をプラスティックシャーレの蓋をとおして観察したが、糸状組織に覆われていることと水が反射して観察しにくいこともあり、有胚種子は観察できなかった。なお、非照射区では約１，０００個の有胚種子を１シャーレに播種した。一方、５０ＫＲならび１００ＫＲ照射区では１つの果実の種子を、均等に６つのシャーレに播種した。播種したシャーレは２５度、約１０μｍｏｌ／ｃｍ−２／ｓ−１の弱光下で培養を行なった。非照射の花粉を用いた非照射区では約３週間後には肉眼でも多くの緑色のプロトコームが確認できた。照射区では約４週間後から、１シャーレに０−５個の非照射区に比べると小さなプロトコームを観察した。
培養開始３ヶ月後のプロトコーム数を表２に示す。
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非照射区では、９６．３％の種子が有胚種子であり、発芽率も９０％を超えており、１シャーレ当り８００個以上のプロトコームが観察された。培養開始３ヶ月後の果実当りのプロトコーム数は照射線量の影響を受け、１００ＫＲ区は５０ＫＲ区の約半数の６４．３個であった。なお、緑色を保っていたプロトコームは、ＮＤＭ培地に移植した。
培養開始３ヶ月後には、一部のプロトコームは植物体に成長した。培養開始１２ヶ月後には多数の植物体が得られたが、これらの植物体の中から一部を任意に選び、その倍数性を、倍数性検定機（Ｐｌｏｉｄｙ  ａｎａｌｙｚｅｒ、ドイツ、Ｐａｒｔｅｃ社製（型番ＰＡ））を用いてフローサイトメトリーにより検定した（表３）。
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その結果、５０、１００ＫＲのいずれの区においても約半数の個体は、供試材料のＰ．Ｗｈｉｔｅ  Ｄｒｅａｍ″Ｆｏｒｅｓｔ″の約半数のＤＮＡ含量を示す２倍体であった。また、５０ＫＲ区では約１／４の個体は供試材料と同じＤＮＡ含量の４倍体であった。また、１／４の個体では、検定の際に用いる根端の組織が微細なために、充分な検定材料が得られず、倍数性検定機におけるＤＮＡピークが不明瞭であり判定が出来なかった。これらの個体については、試験管内でさらに個体を大きくして充分な太さの根端が得られ次第、再検定を行う予定である。
なお、４倍体及び２倍体の個体のフローサイトメトリーによる検定結果をそれぞれ図１及び図２に示す。２倍体（図２）では、４倍体（図１）の１／２の蛍光強度の位置にピーク（矢印で示す）が現れる。
試験管内においてプロトコームやプロトコームから２次的にプロトコームを生じたプロトコーム様体塊は、幼植物体を得るためにさらに移植を重ねる予定である。
【実施例２】  シラン（Ｂｌｅｔｉｌｌａｓｔｒｉａｔａ  Ｒｅｉｃｈｂ．）を実験材料に用いた。２００２年４月に０、５０、１００、１５０ＫＲの軟Ｘ線を照射した花粉を各区１４−１６果ずつ交配した。交配から６ヶ月後に、各照射区における着果の状態を観察した。この結果を表４に示す。
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表４に示すように、１５０ＫＲの軟Ｘ線を照射した花粉を用いた交配では果実が得られなかった。
着果した５０ＫＲ区及び１００ＫＲ区の植物から果実を採取し、播種した。果実は切り取ってから、水で軽く洗浄した後、有効塩素１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で１０分間殺菌した。その後、蒸留水ですすいだ。殺菌した果実をクリーンベンチ内において無菌的に剃刀で切り開き、種子を培地に播種した。培地はＮＤＭ培地を使用した。
播種後２週間間隔で１２週間観察した。５０ＫＲ区では１４系統中１１系統が発芽し、１００ＫＲ区では１５系統中１１系統が発芽した。観察が終了した時点で、得られた個体を試験管のＮＤＭ培地に移植した。植物が第３葉を展開した時点で、フローサイトメーター（パルテック社製、Ｐｌｏｉｄｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＡ））を用いて、倍数性を計測した。クリーンベンチ内で無菌的に約３〜４ｍｍ角の大きさに第３葉を切り取り、氷冷したＣｙｓｔａｉｎ  ＵＶ植物ＤＮＡ分析試薬キット（Ｐａｒｔｅｃ社）のＣｙｓｔａｉｎ  ＵＶ  ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｐ  Ｎｕｃｌｅｉ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａ液）内で刻んだ。核の懸濁液を３０μｍのＣｅｌｌ  Ｔｒｉｃｓフィルターを通し、残滓を除去した。濾液にＣｙｓｔａｉｎ  ＵＶ植物ＤＮＡ分析キットのＣｙｓｔａｉｎ  ＵＶ  ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｐ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂ液）を濾液の４倍量以上加えて、核のＤＮＡを染色した。染色した試料のＤＮＡ含量は、水銀高圧ランプを備えたフローサイトメーターを用いて測定した。
倍数性の計測結果を表５に示す。
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表５に示すように、５０ＫＲ区では得られた個体のうち半分が半数体だった。また１００ＫＲ区においても、得られた個体の１／４が半数体であった。
以上の結果から、シランにおける偽受精胚珠培養においてもコチョウランと同様に効率的にかつ安定的に半数体が得られることが判明した。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００２−２９６９４５号の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ラン科植物のＦ１品種の作出に必要な半数体植物が得られるようになる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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