(57)【要約】本発明の目的は、熱安定性に加え、且つ基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法を提供することである。本発明では、自然界より目的のニトリルヒドラターゼを発現する新規な微生物を探索し、該微生物菌体およびその菌体処理物を製造に用いるとともに、該遺伝子をクローニングし、異種微生物で発現する組換え微生物を作製した。本発明によれば、高温条件下、および高濃度のニトリル化合物あるいは高濃度のアミド化合物の存在下の反応においてもニトリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く変換することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項２】
下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするαサブユニット遺伝子を含有する塩基配列と、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするβサブユニット遺伝子を含有する塩基配列との組み合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡとの組合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。
【請求項４】
配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ，またはそのアミノ酸配列中の１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており且つニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号：３の塩基配列の１３２５−１６６３位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズし且つニトリルヒドラターゼ活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。
【請求項８】
配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする遺伝子を含有するＤＮＡ。
【請求項９】
該ＤＮＡが、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）種由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）およびその変異体のいずれかの微生物。
【請求項１４】
請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。
【請求項１５】
ジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項１６】
請求項１４または請求項１５に記載のいずれかの製造方法により培養された微生物から取得された、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物。
【請求項１７】
下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項１８】
下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかの蛋白質。
（Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。
（Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１９】
下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかの蛋白質。
（Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。
（Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。
【請求項２０】
少なくとも、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるαサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたものと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列であるβサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたもののいずれか一方、または両方を含有することを特徴とする蛋白質。
【請求項２１】
下記の理化学的性質を有する蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物に、ニトリル化合物に作用させ該ニトリル化合物から誘導されるアミド化合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【請求項２２】
請求項１から請求項１１のいずれかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物のいずれかを、培地において培養して得た蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、自然界より新たに単離した微生物を由来とする新規なニトリルヒドラターゼの酵素触媒作用により、ニトリル化合物からアミド化合物を製造する技術に関する。
【背景技術】  ニトリル化合物のニトリル基を水和してアミド基に変換し対応するアミド化合物を製造する技術においては、従来の銅触媒による化学的な方法にかえて、微生物の酵素を触媒として用いる方法が主流となってきている。そのような酵素は一般にニトリルヒドラターゼと呼ばれるが、初めての報告以来、多数の酵素が様々な微生物より発見されている。例えば、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．４４  ｐ．２２５１−２２５２，１９８０）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開平０５−１０３６８１）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属（特開昭６１−２８２０８９）、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属（特開平０５−０３０９８３）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属（特開平０５−２３６９７５）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属（特開平０５−１６１４９６）、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属（特開平０５−１６１４９５）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属（特開平０５−０３０９８２）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開昭５４−１２９１９０、後にロドコッカス属と判明）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（特開昭５８−８６０９３）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属（特開平０５−０３０９８４）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（特開平０５−２３６９７６）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（特開昭５１−８６１８６、特開平７−２５５４９４）、フザリウム属（特開平０１−０８６８８９）、ロドコッッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属（特開昭６３−１３７６８８、特開平０２−２２７０６９、特開２００２−３６９６９７、特開平２−４７０）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属（特開平０５−２３６９７７）、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属（特開平８−５６６８４）等が挙げられる。これらの酵素はそのアミノ酸配列の多様性に基づき、その理化学的性質も多様であり、各種目的に沿って研究が進められて来た。理化学的性質の中でも、熱、あるいはアミド化合物およびニトリル化合物等への安定性に関する解明が進んでいる例としては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株に関する文献（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１９６  ｐ．５８１−５８９，１９９１．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．４０  ｐ．１８９−１９５，１９９３．）、シュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ＪＣＭ３０９５株に関する文献（特開平８−１８７０９２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．８３  ｐ．４７４−４７７，１９９７）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＢＲ４４９株に関する文献（ＷＯ  ９９／５５７１９．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏ��ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．７７−７９  Ｐ．６７１−６７９，１９９９．）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＲＡＰｃ８株に関する文献（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２６  ｐ．３６８−３７３，２０００．Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  Ｖｏｌ．２  ｐ．３４７−３５７，１９９８）、バチルス・パリダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｌｉｄｕｓ）Ｄａｃ５２１株に関する文献（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．１４３１  ｐ．２４９−２６０，１９９９）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）ＳＣ−Ｊ０５−１株に関する文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０  ２２０−２２６，１９９８）が挙げられる。
一方、これらユニークなニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造する際には、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストが重要な問題であり、すでに工業レベルで培養法の確立した宿主を用いて生産を行うことが望ましい。そこで、遺伝子工学の手法によりニトリルヒドラターゼを大量に発現させることを目的として、遺伝子のクローニングする試みが検討されている。例えば、シュードモナス属（特開平３−２５１１８４）、ロドコッカス属（特開平２−１１９７７８、特開平４−２１１３７９、特開平０９−００９７３、特開平０７−０９９９８０、特開２００１−０６９９７８）、リゾビウム属（特開平６−２５２９６）、クレブシエラ属（特開平６−３０３９７１）、アクロモバクター属（特開平０８−２６６２７７）、シュードノカルディア属（特開平９−２７５９７８）、バチルス属（特開平０９−２４８１８８）等を挙げることができる。
【発明の開示】
酵素の理化学的性質としては熱安定性や基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼが望ましく、その目的の報告もあるが、皮応に用いる酵素の実施形態、ニトリル化合物の種類によりそれらの絶対値は変動することもあり、すべてを兼ね備えた酵素は見出されていない。また、今後の進化工学等を用いた理化学的性質の改良の題材としても、今までにない起源であり多様な酵素の開発が望まれる。
進化工学を用いた理化学的性質の改良に遺伝子のクローニングと発現が必要なのは言うまでもなく、上述のアミド化合物製造における酵素の生産にかかわるコスト的な制約からも培養法の確立された宿主を用いた遺伝子組換え菌の作製が望まれる。
すなわち、本発明の目的は、熱や高濃度化合物に対する安定性の高いニトリルヒドラターゼを自然界より単離し、該酵素の生産方法および該酵素を用いたニトリル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法を提供することである。さらにその酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列を提供し、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該組換えプラスミドを含む形質転換菌株、該形質転換菌株を用いた該酵素の産生方法および該形質転換菌株を用いたニトリル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法を提供することである。また、該組み換え体のニトリルヒドラターゼ酵素をより活性化する作用を持つタンパク質のアミノ酸配列及び遺伝子配列も提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、埼玉県の温泉近傍にある土壌よりニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物として、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）を見出した。なお、ジオバチルス属の微生物がニトリルヒドラターゼを有し、ニトリルヒドラターゼ活性を示すことはこれまで知られておらず、さらに本微生物の培養に通常用いる６５℃という温度は、従来のニトリルヒドラターゼを持つ好熱菌の通常の培養温度（４５℃〜６０℃）を越えるものである。
また、該微生物よりニトリルヒドラターゼ酵素を精製し、そのニトリルヒドラターゼ活性が熱や高濃度のニトリル化合物及び、アミド化合物に対して高い安定性を兼ね備えることを示した。また、精製した酵素の各サブユニットのＮ末端のアミノ酸配列をもとに該微生物の染色体ＤＮＡよりニトリルヒドラターゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らかにした結果、既存のニトリルヒドラターゼとの相同性は非常に低いことが判明した。また、その遺伝子下流に存在する活性化タンパク質と推定される遺伝子配列を同時に発現することにより、該酵素を大量に発現する遺伝子組換え菌株を作出することにも成功し、本発明を成すに至った。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
（１）  下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
（２）  下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするαサブユニット遺伝子を含有する塩基配列と、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするβサブユニット遺伝子を含有する塩基配列との組み合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）  下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡとの組合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。
（４）  配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ，またはそのアミノ酸配列中の１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており且つニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする（１）〜（３）の何れかに記載のＤＮＡ。
（５）  配列表の配列番号：３の塩基配列の１３２５−１６６３位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズし且つニトリルヒドラターゼ活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする（１）〜（３）の何れかに記載のＤＮＡ。
（６）  配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。
（７）  配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。
（８）  配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする遺伝子を含有するＤＮＡ。
（９）  該ＤＮＡが、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来である（１）〜（８）の何れかに記載のＤＮＡ。
（１０）  該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）種由来である（１）〜（８）の何れかに記載のＤＮＡ。
（１１）  該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）由来である（１）〜（８）の何れかに記載のＤＮＡ。
（１２）  （１）から（１１）の何れかに記載のＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター。
（１３）  （１）から（１１）の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）およびその変異体のいずれかの微生物。
（１４）  （１）から（１１）の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。
（１５）  ジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
（１６）  （１４）または（１５）に記載のいずれかの製造方法により培養された微生物から取得された、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物。
（１７）  下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
（１８）  下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかの蛋白質。
（Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。
（Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
（１９）  下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかの蛋白質。
（Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。
（Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。
（２０）  少なくとも、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるαサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたものと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列であるβサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたもののいずれか一方、または両方を含有することを特徴とする蛋白質。
（２１）  下記の理化学的性質を有する蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物に、ニトリル化合物に作用させ該ニトリル化合物から誘導されるアミド化合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
（２２）  （１）から（１１）の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物のいずれかを、培地において培養して得た蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
（ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
（ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。
（ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである
サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００
サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００
（ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。
（ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。
（ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  Ｑ−６）株のニトリルヒドラターゼβサブユニット、αサブユニット及び下流遺伝子群の遺伝子構成及び制限酵素地図を示す。コロニーハイブリダイゼーションで取得した断片（Ｈｉｎ２．３）及び、大腸菌での発現に用いた断片（βα、βα１、βα１２）の位置を示した。
【発明を実施するための最良の形態】  先ず本発明のニトリルヒドラターゼを説明する。本発明において、ニトリルヒドラターゼ活性を有するとは、アセトニトリルではアセトアミド、ｎ−プロピオニトリルではｎ−プロピオアミド、アクリロニトリルではアクリルアミドのように、ニトリル化合物に水分子を付加させて、アミド化合物に変換する活性を有することである。また、生成した化合物は液体クロマトグラフィーで分取した後、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）、赤外吸収スペクトル（ＩＲ）および核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）等を用いて同定する。
本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を測定するに際しては、例えば、０．１重量％のニトリル化合物溶液（０．０５Ｍ−リン酸バッファーｐＨ７．７）１ｍｌにニトリルヒドラターゼ酵素溶液１０μｌを加え、反応温度２７℃から６０℃にて１分から６０分間保温後、０．１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止し、反応液の一部を液体クロマトグラフィーにて分析し、アミド化合物の生成の有無を検定することができる。
本発明において基質となるニトリル化合物とは、例えば、アセトニトリル、ｎ−プロピオニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ヘキサンニトリル等の脂肪族ニトリル化合物、２−クロロプロピオニトリル等のハロゲン原子を含むニトリル化合物、アクリロニトリル、クロトノニトリル、メタクリロニトリル等の不飽和結合を含む脂肪族ニトリル化合物、ラクトニトリル、マンデロニトリル等のヒドロキシニトリル化合物、２−フェニルグリシノニトリル等のアミノニトリル化合物、ベンゾニトリル、シアノピリジン等の芳香族ニトリル化合物、マロノニトリル、スクシノニトリル、アジポニトリル等のジニトリル化合物等およびトリニトリル化合物を挙げることができる。
本発明のニトリルヒドラターゼの基質特異性は、上述の測定条件において、基質を各種変更してそれぞれの基質に対しニトリルヒドラターゼ活性を有するか否かを測定することにより判断することができる。基質特異性が広ければ、製造できる対応するアミド化合物の種類も増え、好ましいが、本酵素は少なくとも、アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質とすることができる。
本発明のニトリルヒドラターゼは、還元型ＳＤＳ（ソディウムードデシルーサルフェイト）−ポリアクリルアミド電気泳動法により、分子量２５０００±２０００と分子量２８０００±２０００の二つのサブユニットがクマシーブリリアントブルーによる染色によって検出され、前者をαサブユニット、後者をβサブユニットと呼ぶ。
本発明のニトリルヒドラターゼは、活性測定に先立ち、有機酸等の安定化剤を含まない水溶液中の状態で７０℃で３０分間加熱処理した後も、加熱前の活性の３５％の活性を保持することができる。
また、高濃度のニトリル基質は化学的に酵素を失活させることが報告されているが、本発明のニトリルヒドラターゼは６重量％のアクリロニトリルを基質として用いても、そのような現象が観察されない。
さらに、高濃度の反応産物であるアミド化合物が反応を阻害することが報告され，高濃度な反応産物を得る際に大きな問題となるが、本発明のニトリルヒドラターゼは３５重量％のアクリルアミドを活性測定溶液に加えても、基質であるアクリロニトリル濃度の減少が有意にみられ、活性を保持する。
また、本発明としては上記（１８）に記載のものが例示される。すなわち、本発明のニトリルヒドラターゼとしては、配列表の配列番号：１に示される２０５個のアミノ酸の配列により示されるαサブユニットおよび配列表の配列番号：２に示される２２６個のアミノ酸の配列により示されるβサブユニットにより構成されることが好ましい例として挙げられる。この二つのサブニット以外にも、金属や他のペプチド等を含有してもよい。金属としては、特に鉄やコバルトを含有することが多い。さらに、このサブユニットのどちらか一方を含有する蛋白質でもよい。また、個々のサブユニットのアミノ酸配列としては、他のサブユットと複合体を形成してニトリルヒドラターゼ活性を有する限り、アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有していてもよく、宿主の種類により、翻訳後に修飾を受けることも当然予想される。特に、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいてはシステイン残基が翻訳後、システインスルフィン酸またはシステインスルフェン酸に修飾されることが多い。該アミノ酸配列のうちの１〜３０個アミノ酸が置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。なお、このような置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ酵素は、公知の部位特異的変異導入法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により、塩基配列の対応する部位に置換、欠失、または挿入を導入せしめたＤＮＡを用い、後述の通り、宿主微生物に導入し発現させることにより得ることができ、熱安定性や有機溶媒耐性の向上や基質特異性の変化等の産業上望ましい性質を付加した変異酵素を作出する試みも可能である。かかる技術水準に鑑み、それらがニトリルヒドラターゼ活性を有している場合は本発明に包含されるものとする。
また、本発明としては上記（１９）に記載のものが例示されるが、これは本発明のＤＮＡの説明において詳細に説明する。
上記のような理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼは、例えば、ジオバチルス属に属する微生物を培養することにより取得することができる。本発明において使用される微生物は、ジオバチルス属に属し、ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生物であれば、いかなるものでもよい。ジオバチルス属に属する微生物としては、ジオバチルス・カルドキシロシリティカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）、ジオバチルス・カウストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、ジオバチルス・リツアニカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｔｕａｎｉｃｕｓ）、ジオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ジオバチルス・サブテラネウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）、ジオバチルス・サーモカテヌラタス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ）、ジオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、ジオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、ジオバチルス・トエビー（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｏｅｂｉｉ）、ジオバチルス・ユゼネンシス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｚｅｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。また、ジオバチルス属由来の微生物に特に限定されるものではなく、他の微生物株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子も含まれる。そのような微生物株としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シノリゾビウム（ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属等が挙げられる。具体的には、本発明では下記の手法でスクリーニングを行った。まず、様々な場所で採取した土壌を少量とって、水または生理食塩水をいれた試験管内に入れて、２日から１４日の間、６５℃の振とう培養器の中で振とう培養する。この培養液の一部を取り、汎用的な微生物生育用培地、例えばグリセロール、ポリペプトン、酵母エキス等を主成分とした液体培地に入れ、６５℃の培養温度にて、１日から７日間程度の間培養する。これによ��得られる培養液の一部を、前述の微生物生育用培地成分を含む寒天平板培地に広げて６５℃でさらに培養しコロニーを形成させることによって、微生物を単離することができる。このようにして得られた微生物を、前記培地成分にさらにｎ−バレロニトリル等のニトリル化合物あるいはメタクリルアミド等のアミド化合物を加えた液体培地を入れた試験管あるいはフラスコを用い適当な期間、例えば約１２時間から７日程度の間、６５℃の培養温度で振とう培養することによって増殖させ、上記のニトリルヒドラターゼ活性測常法に基づいて、目的の微生物を選択する。そのような微生物の代表的菌株の同定を１６ＳｒＲＮＡ及び下記の生化学的性質から行った所、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）であることが判明し、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  Ｑ−６）の名称で、独立行政法人産業技術総合研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３５１（受理日平成１５年５月１６日）として寄託され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８としてブタペスト条約に基づく寄託へ移管された（受領日平成１６年３月１１日）。様々な特許・文献調査を行ったが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスに属する微生物に関して、ニトリルヒドラターゼ活性を有する事に関しては何の記載もなかった。この事からジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株は新菌株と認められる。また、この新菌株の変異体、即ち、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より誘導された突然変異体、細胞融合株および遺伝子組み換え株を用いてもアミド化合物の製造が可能である。なお、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の性質は下記のとおりである。
（ａ）形態的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）培地  ６０℃
１．細胞の形および大きさ
形：桿菌
大きさ：０．８×２．０〜３．０μｍ
２．細胞の多形性の有無：−
３．運動性の有無：＋
鞭毛の着生状態：周毛
４．胞子の有無：−
胞子の部位：端立
（ｂ）培養的性質
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）培地  ６０℃
１．色：クリーム色
２．光沢：＋
３．色素生産：−
培養条件：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ＵＫ）培地  ６０℃
１．表面発育の有無：−
２．培地の混濁の有無：＋
培養条件：ゼラチン穿刺培養  ６０℃
１．生育状態：＋
２．ゼラチン液化：＋
培養条件：リトマス・ミルク  ６０℃
１．凝固：−
２．液化：−
（ｃ）生理学的性質
１．グラム染色：不定
２．硝酸塩の還元：−
２．脱窒反応：−
３．ＭＲテスト：−
４．ＶＰテスト：−
５．インドールの生成：−
６．硫化水素の生成：−
７．デンプンの加水分解：−
８．クエン酸の利用
Ｋｏｓｅｒ：−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ：−
９．無機窒素源の利用
硝酸塩：−
アンモニウム塩：＋
１０．色素の生成：−
１１．ウレアーゼ活性：−
１２．オキシダーゼ：＋
１３．カタラーゼ：＋
１４．生育の範囲
ｐＨ：５．５〜８．０
温度：４５℃〜７２℃
１５．酸素に対する態度：通性嫌気性
１６．Ｏ−Ｆテスト：−／−
（ｄ）糖類からの酸産生／ガス産生
１．Ｌ−アラビノース  −／−
２．Ｄ−キシロース  ＋／−
３．Ｄ−グルコース  ＋／−
４．Ｄ−マンノース  ＋／−
５．Ｄ−フルクトース  ＋／−
６．Ｄ−ガラクトース  −／−
７．マルトース  ＋／−
８．サークロース  ＋／−
９．ラクトース  −／−
１０．トレハロース  ＋／−
１１．Ｄ−ソルビトール  −／−
１２．Ｄ−マンニトール  ＋／−
１３．イノシトール  −／−
１４．グリセリン  −／−
（ｅ）その他の性質
１．β−ガラクトシターゼ活性：−
２．アルギニンジヒドロラーゼ活性：−
３．リジンデカルボキシラーゼ活性：−
４．トリプトファンデアミナーゼ活性：−
５．ゼラチナーゼ活性：＋
本発明方法において使用する微生物の培養方法は、一般的な微生物培養方法に準じて行われ、固体培養または液体培養いずれも可能である。バチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）は、通性嫌気性の微生物である為、通常の通性嫌気性微生物と同様な培養条件で培養することができる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、４０℃〜７５℃の範囲である。培地のｐＨは、例えば、４〜９をあげることができる。特に、バチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  Ｑ−６）の場合、４５℃〜７２℃、好ましくは、５５℃〜７０℃の範囲の培養温度で、５〜８の培地ｐＨをあげることができる。培養時間は、種々の条件によって異なるが、通常、約１日〜約７日間程度が好ましい。一方、培地としては、一般的な微生物に用いる通常の炭素源、窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いる。炭素源として、グリセロール、グルコース、シュークロース、糖密、有機酸、動植物油等が使用できる。窒素源として、酵母エキス、ペプトン、麦芽エキス、肉エキス、尿素、硝酸ナトリウム等が挙げられる。有機ないし無機塩として、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸２水素１カリウム、リン酸水素２カリウム等を用いられる。本発明方法においては、使用する微生物が持つニトリルヒドラターゼ活性を高めるために、ｎ−バレロニトリル、イソバレロニトリル、クロトノニトリル等のニトリル化合物、メタクリルアミド等のアミド化合物を培地に添加するのが好ましい。添加量として、例えば、培地１１に対して、０．０１ｇ〜１０ｇの範囲の適量を添加すると良い。また、好ましくはＦｅイオンあるいはＣｏイオンは０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよい。
本発明の酵素のアミノ酸配列情報を取得するためには、本件発明の酵素を精製後、還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により各サブユニットを分離後、ゲルより各バンドを切り出し、タンパク質シークエンサーによりアミノ酸配列の一部を決定することができる。
さらに本発明は、ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡに関するものである。具体的には、配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位を含むＤＮＡと配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位を含むＤＮＡが例示され、各々がαサブユニットとβサブユニットをコードするが、これに限定されるものではなく、この塩基配列を含むＤＮＡであればよい。またこれらの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであっても、ニトリルヒドラターゼ活性を有する限り、本発明に包含される。すなわち、これらのＤＮＡを用いて本発明のニトリルヒドラターゼを発現することができる。ストリンジェントな条件下としては、例えばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）が例示される。ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、例えば、前述のストリンジェントな条件下、配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位を含むＤＮＡとまたは配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位を含むＤＮＡにおける相補的な塩基配列の任意の、通常は少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、以下の方法によって得ることができる。本明細書において、特に記載がない限り当該分野で公知である遺伝子組換え技術、組み換えタンパク質の生産技術、分析法が採用される。
本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡは、本願明細書において開示される塩基配列、またはアミノ酸配列、場合によれば前記した精製酵素から決定したアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、本発明のニトリルヒドラターゼを含有する微生物、例えばサーモグルコシデシウスＱ−６株から取得することができる。アミノ酸配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の染色体ＤＮＡを制限酵素により消化したＤＮＡ断片をファージやプラスミドに導入し、宿主を形質転換して得られるライブラリーから、プラークハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーションなどにより本発明のニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡを得ることもできる。また、オリゴヌクレオチドをプローブとせず、前記した精製酵素から決定した両サブユニットのＮ末端のアミノ酸配列情報等にしたがってプライマーを作製し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子の一部をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）により増幅したものをプローブとして、同様の過程により取得することもできる。得られたＤＮＡは、プラスミドベクター、たとえばｐＵＣ１１８に挿入しクローニングし、ジデオキシ・ターミネーター法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７，１９７７）等の周知の方法により塩基配列の決定を行うことができる。このようにして調製された遺伝子は、該遺伝子を用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を上記にて記載の活性測常法を用いることにより、ニトリルヒドラターゼをコードするＤＮＡであることを確認することができる。
さらに本発明は、上記のＤＮＡがベクターに連結されていることを特徴とする組換えベクターを提供する。
本発明における組換えベクターとは、宿主微生物に適したプロモーター領域の下流に、上記方法で得られたＤＮＡの５’末端側が機能し得るように連結して、必要に応じてその下流に転写終結配列を挿入し、適切な発現用ベクターに組み込み調製することができる。
適切な発現ベクターとしては、宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限されない。また、染色体に遺伝子挿入が可能な宿主であれば、該宿主における自律複製可能な領域を有する必要はない。例えば、宿主として大腸菌を用いるのであれば、強力なプロモーター、たとえば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７，ＰＬやピルビン酸オキシダーゼ遺伝子のプロモーター（特許公報第２５７９５０６号）などを含むｐＵＣ系、ｐＧＥＸ系、ｐＥＴ系、ｐＴ７系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＫＫ系、ｐＢＳ系、ｐＢＣ系、ｐＣＡＬ系などを含む、通常大腸菌で使用される任意のベクターから選択できる。また、αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々のプロモーターより独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通のプロモーターによりポリシストロンとして発現されてもよい。さらには、独立のシストロンの場合、各々のサブユニット遺伝子が別のベクター上にあっても良い。
さらに本発明においては上記のニトリルヒドラターゼの組換えベクターに、本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子の下流にある遺伝子を発現するＤＮＡを組み込むことにより，ニトリルヒドラターゼの活性がより上昇することを見出し、このようなベクターも提供する。具体的には、上記と同様に発現に必要なプロモーターや転写終結因子等を含むプラスミドベクターを用い、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されていてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されていてもよい。同様に、各々の遺伝子が別のベクター上にあってもよい。
それゆえ、本発明は、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。具体的には、配列表の配列番号：３の塩基配列の１３２５−１６６３位が例示されるが、これに限定されるものではなく、この塩基配列を含むＤＮＡであればよい。またこれらの配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡであり、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する限り、本発明に包含される。すなわち、これらのＤＮＡを用いて本発明のニトリルヒドラターゼをより活性化することができる。ストリンジェントな条件下としては、例えばＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、マニュアル記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ  ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）が例示される。ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、例えば、前述のストリンジェントな条件下、配列表の配列番号：３の塩基配列の１３２５−１６６３位を含むＤＮＡにおける相補的な塩基配列のうち、任意の、通常は少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、特に好ましくは少なくとも１００個の連続した塩基配列を検出試料として、これにハイブリダイズするＤＮＡが例示される。また、本発明のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質は、配列表の配列番号：４に示される１１２個のアミノ酸の配列により示される蛋白質であるが、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する能力を有する限り、アミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を有していてもよく、宿主の種類により、翻訳後に修飾を受けることも当然予想される。該アミノ酸配列のうちの１〜２５個アミノ酸が置換、欠失、挿入、または翻訳後修飾されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個である。
また、本発明は、上記のＤＮＡが宿主細胞に導入され、形質転換せしめられたことを特徴とする形質転換体を提供する。
形質転換体は、上記方法にて作成した発現ベクターを用い、宿主細胞を形質転換することにより、取得することができる。宿主細胞としては、微生物、哺乳類細胞、および植物細胞などが含まれるが、微生物を利用することが好ましい。微生物の例としては後述の実施例のように大腸菌が挙げられるが、特にそれに限定されることなく、バチルス属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ロドコッカス属、放線菌や酵母などが例示される。
宿主微生物への遺伝子の導入法としては、たとえば、形質転換、形質導入、接合伝達、またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で周知の任意の常法によって、好ましい宿主に導入することができる。
さらに本発明であるニトリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の製造方法としては、前述の通り、該ニトリルヒドラターゼを生産し得る微生物、例えば、ジオバチルス属の微生物、特に好ましくは、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の培養物から公知の精製方法を適宜組み合わせて該酵素を取得することができるが、さらに、上述の通り、ニトリルヒドラターゼの遺伝子を用い形質転換された形質転換体から取得することもできる。
該酵素を取得するにあたり、ジオバチルス属の微生物の培養方法は前述のとおりであるが、上記形質転換体は、通常これらの微生物が資化可能な栄養源を含む培地で培養することが好ましく、例えば、酵素や抗生物質などを生産する通常の方法で培養することができる。培養は、通常、液体培養でも固体培養でもよい。例えば、グルコース、シュークロース等の炭水化物；ソルビトール、グリセロール等のアルコール；クエン酸、酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれらの混合物；酵母エキス、肉エキス、硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源；リン酸塩、マグネシウム、鉄、コバルト、マンガン、カリウム等の無機栄養源；およびビオチン、チアミン等のビタミン類を適宜混合した培地が用いられる。より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオンあるいはＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよい。培養条件は、通常、好気条件下で行うことが好ましい。培養温度は、宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限はないが、通常、５℃〜８０℃、好ましくは２０〜７０℃、さらに好ましくは２５〜４２℃で行うことが例示される。また、培養途中のｐＨは宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はないが、通常、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５〜８、さらに好ましくはｐＨ６〜７で行うことが例示される。
また、本発明においては、本発明の酵素を用いて、ニトリル化合物を製造することができる。この発明において、前述の酵素を用いるに際しては、本発明の酵素の作用を阻害しないかぎり、特別に精製程度等は限定されず、精製された本発明の酵素の他、その酵素含有物を用いてもよく、さらには、その酵素を生産する微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された形質転換体等を使用してもよい。微生物や形質転換体等を使用する場合には、菌体を利用してもよく、菌体としては、生菌体、もしくはアセトンやトルエン等の溶媒処理または凍結乾燥等の処理を施して、化合物の透過性を増した菌体を使用することができる。場合によっては、菌体破砕物や菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよい。該酵素を含有する菌体処理物の作成方法を例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を必要に応じてリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次いで超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉砕処理、あるいはリゾチームやプロテアーゼ等の細胞壁溶解酵素による処理などの菌体破砕処理を適宜組み合わせて、菌体内から該酵素を抽出し、粗製のニトリルヒドラターゼ含有液を得ることができる。この粗製の酵素含有液を、必要により、公知のタンパク質、酵素などの単離、精製手段を用いることにより、さらに精製することができる。例えば、粗製の酵素含有液に、アセトン、エタノールなどの有機溶媒を加えて分別沈殿せしめるか、硫安などを加えて塩析せしめるかして、水溶液からニトリルヒドラターゼを含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例示される。またさらに、陰イオン交換、陽イオン交換、ゲル濾過、抗体やキレートを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製することができる。勿論、酵素や菌体、酵素を含有する菌体処理物等は、公知の方法により、カラムにおいて充填されていてもよく、担体に固定化されていてもよく、特に菌体の場合はポリアクリルアミドゲル等の高分子中に抱埋してもよい。菌体または菌体処理物を水またはリン酸緩衝液等の緩衝液等の水性水溶液に懸濁し、これにニトリル化合物を加えることにより、反応を進行させる。使用する菌体もしくは菌体処理物の濃度は、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、０．１重量％〜１０重量％である。反応温度の上限は、好ましくは９０℃、さらに好ましくは８５℃、一層好ましくは７０℃を、反応温度の下限は、例えば１℃、好ましくは４℃、さらに好ましくは１０℃を、反応ｐＨは、例えば、５〜１０、好ましくは、６〜８を、反応時間は、例えば、１分間〜７２時間を挙げることができる。また、ニトリル化合物を徐々に滴下することによって、アミド化合物を高濃度に生成蓄積させることもできる。反応液からのアミド化合物を回収するには、菌体や菌体処理物等をろ過や遠心分離等で取り除いた後、晶析などの手法で取り出す方法等がある。
【実施例】  以下に、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：菌体分離
埼玉県の温泉近傍で採取した土壌を少量（約１ｇ）とって、生理食塩水を５ｍｌ入れた試験管内に入れて、３日間、６５℃の振とう培養器の中で振とう培養した。この培養液の一部（０．５ｍｌ）を取り、グルコース１．０重量％、ポリペプトン０．５重量％、イーストエキストラクト０．３重量％からなる培地（ｐＨ７．０）に加え、２日間６５℃で往復振とう培養した。これにより得られる培養液の一部（０．１ｍｌ）を、前述の培地成分を含む寒天平板培地に広げて６５℃でさらに２日間培養しコロニーを形成させることによって、微生物を単離した。単離した微生物を、上記と同組成の培地に０．１重量％のｎ−バレロニトリルを添加した液体培地に接種した後、６５℃で２４時間培養することにより、ニトリル資化性の高い微生物を有する培養液を得た。この培養液１ｍｌを９ｍｌの１．１重量％のアクリロニトリル溶液（０．０５Ｍ−リン酸バッファーｐＨ７．７）に加えて、反応温度２７℃にて反応を開始した。１０分後、１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止した。反応液の一部を液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析し、アクリルアミド生成の有無を検定することによって、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物をスクリーニングした。このようにしてニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生物としてジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株を得た。
（液体クロマトグラフィー分析条件）
本体：ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｄ−７０００（日立社製）
カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス社製）
長さ；２００ｍｍ
カラム温度；３５℃
流量；１ｍｌ／ｍｉｎ
サンプル注入量；１０μｌ
溶液：０．１ｗｔ％リン酸水溶液
実施例２：菌体培養の生育上限温度
実施例１により得られたジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株を、実施例１で使用した培地成分を含む寒天平板培地に塗布し、複数の異なる温度で培養を行い、菌体の生育状況を調べた。その結果を表１に示す。ジオバチルス・サーモグルコシデシウス  Ｑ−６株は、７０℃までは通常の増殖を示し、７２℃でも生育が可能であった。
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実施例３：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中のニトリルヒドラターゼ活性の測定とその温度依存性
グリセロール０．２重量％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、リン酸水素２カリウム０．１重量％、ポリペプトン０．１重量％、酵母エキス０．１重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、ｎ−バレロニトリル０．１重量％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２重量％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００３重量％、塩化コバルト６水和物０．０００２％を含む滅菌済培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに入れたものにあらかじめ同培地で培養したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の培養液１ｍｌを植菌した。これを６５℃で１日間、２００ｓｔｒｏｋｅ／ｍｉｎで回転振とう培養し、菌体培養液を得た。このジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体培養液３００ｍｌから遠心分離（１００００×ｇ，１５分）によって菌体を集め、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄後、同緩衝液５０ｍｌに懸濁した。こうして調製した菌体懸濁液について、上述の方法で、５分間反応し、ニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を測定した。酵素活性の単位（ユニット）を、１分間に１μｍｏｌのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めると、２７℃における湿菌体重量当たりのニトリルヒドラターゼ活性（Ｕ／ｍｇ）は９．３７Ｕ／ｍｇであった。さらに１０℃において、５Ｕ／ｍｌになるように０．５重量％のアクリロニトリルを含む菌体懸濁液を調製し、この菌体懸濁液を用いて、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃の条件で同様にニトリルヒドラターゼ活性を求め、表２に示した。その結果、菌体を反応に用いた時の至適温度は６０℃近傍にあり、高温域において特に高い活性を示した。
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実施例４：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中のニトリルヒドラターゼの熱安定性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中にあるニトリルヒドラターゼの活性の熱安定性を調べるために、実施例３の培養法で得た菌体を１０Ｕ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、３０分、所定温度での保温処理を行い、残存活性を測定した。０．５ｍｌの１重量％アクリロニトリル溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に０．５ｍｌの保温処理後の菌体液を加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。５分後、１００μＬの１規定塩酸を加えることにより反応を停止した。保存処理前の活性に対する保存処理後の活性を算出し、保存処理前の活性を基準（１００）とした換算値として表３に示す。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の菌体中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるといえ、７０℃という高温下においても８０％以上の活性を保持することができ、８０℃の高温下においても３０％以上の活性を保持することが出来る。
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実施例５：各種ニトリル化合物を基質とした反応
下記表４に記載している各種ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換させるニトリルヒドラターゼ活性について調べた。９ｍｌの１．１％ニトリル溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に１ｍｌ菌体懸濁液を加えて、反応温度３０℃にて反応を開始した。１０分後、１ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止した。ＨＰＬＣによる分析条件は実施例１と同様であるが、溶液を１０ｗｔ％アセトニトリルを含む蒸留水とした。その結果、表４に記載したすべてのニトリル化合物を基質としてニトリルヒドラターゼ活性を有していた。
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実施例６以降に記載のジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼαサブユニット（ＯＲＦ２）、βサブユニット（ＯＲＦ１）及びニトリルヒドラターゼ活性化因子（ＯＲＦ３）のアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに至った本発明の流れを以下に要約した。
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を培養して得られた菌体を破砕後、硫酸アンモニウムによる沈殿、陰イオン交換カラムロマトグラフィー、ＤＥＡＥカラム、ハイドロキシアパタイトカラムに供し、ゲルろ過クロマトグラフィー、透析を行い、ニトリルヒドラターゼ酵素を精製した。
精製したニトリルヒドラターゼのαサブユニット及びβサブユニットのＮ末約３０残基のアミノ酸配列を決定し、該菌の属に基づくアミノ酸のコドン使用を考慮して遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として縮重ＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を取得した。増幅されたＤＮＡ断片をクローニングし、挿入断片の塩基配列を決定した。該塩基配列より推定されるアミノ酸配列と、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットのＮ末端アミノ酸配列を比較し、クローニングされた配列がニトリルヒドラターゼをコードしていることを確認した。
その結果、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株において、５’末端側上流よりニトリルヒドラターゼ遺伝子はβサブユニット、αサブユニットの順に隣接して存在することが明らかになった。
公知の様々ニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流遺伝子における相同性の高い配列から、遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、該菌体から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型として縮重ＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡ断片を取得した。得られた該菌のαサブユニット部分の増幅ＤＮＡ断片をクローニングし塩基配列を決定した。
以上より取得されたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットを適当な発現ベクターに導入した。構築した発現プラスミドを用いて、適当な宿主菌を形質転換した。宿主の例としては、ロドコッカス属、コリネ属、大腸菌などが挙げられる。好ましくはアミダーゼを有していない宿主が良い。更に、得られた形質転換体を培養して得た菌体とアクリロニトリルを水性媒体中で接触させることによりアクリルアミドが生成することを確認し、その生成効率及びニトリルヒドラターゼ活性を比較した。
次に、上記より得られたＤＮＡ断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを行い、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットの下流遺伝子を含む周辺遺伝子をクローニングした。
下流遺伝子をニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットと共発現させ、ニトリルヒドラターゼ活性を比較した。その結果、下流遺伝子がニトリルヒドラターゼ活性を顕著に上昇させる活性化に関与する遺伝子であることを見出した。
実施例６：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来ニトリルヒドラターゼ酵素の精製
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を培養し、種々のカラムに供することでニトリルヒドラターゼ活性画分を精製した。
クロマトグラフィーにおけるニトリルヒドラターゼ活性画分の測定方法は以下のように行った。ＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）により希釈した各画分の溶出液に１重量％のアクリロニトリルを添加して２７℃で１分間反応させた。１Ｎ  ＨＣｌを１０液量％反応液に添加することにより反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例１に記載のＨＰＬＣ分析法により測定した。
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来ニトリルヒドラターゼ酵素を精製するために、まず０．１重量％のｎ−バレロニトリルを含有するＶ／Ｆ培地（グリセロール０．２重量％、クエン酸３ナトリウム２水和物０．２重量％、リン酸２水素カリウム０．１重量％、リン酸水素２カリウム０．１重量％、ポリペプトン０．１重量％、酵母エキス０．１重量％、塩化ナトリウム０．１重量％、ｎ−バレロニトリル０．１重量％、硫酸マグネシウム７水和物０．０２重量％、硫酸鉄（ＩＩ）７水和物０．００３重量％、塩化コバルト６水和物０．０００２重量％）にジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を植菌し、６５℃で２４時間培養した。培養には、９６穴２ｍｌの深底プレート（ＣＯＳＴＡＲ社）を用いた。培養終了後、８０００ｇ、１０分間の遠心分離により集菌し、得られた湿菌体３ｇを２０ｍＬのＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）に再懸濁した。菌体を冷却下で超音波破砕機を用いて破砕し、菌体破砕液に硫酸アンモニウム（３０％飽和濃度）を加えて４℃で３０分間緩やかに攪拌し、２００００ｇ、１０分間の遠心分離を行い、上清を得た。遠心上清液に硫酸アンモニウム（７０％飽和濃度）加え４℃で３０分間緩やかに攪拌した後、２００００ｇ、１０分間の遠心分離により得られた沈殿物を９ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）に再溶解し、１Ｌの同液中において４℃で２４時間透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンセス社；ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ（カラム体積５ｍＬ×５本））に供した。展開液はＨＥＰＥＳバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２）を用い、塩化カリウム濃度を０．０Ｍから０．５Ｍまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。その画分をアパタイトカラムクロマトグラフィー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製；ＣＨＴ２−Ｉ（カラム体積２ｍＬ））に供した。０．０１Ｍリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．２）を展開液とし、リン酸カリウムを０．０１Ｍから０．３Ｍまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、ニトリルヒドラターゼ活性を含む画分を得た。その画分を０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．２）を展開液としたゲルろ過クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンセス社；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０）に供し、ニトリルヒドラターゼ活性画分を取得した。こうして得られたゲルろ過クロマトグラフィーのニトリルヒドラターゼ活性画分を用いて以下の実施例を行った。
実施例７：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分におけるニトリルヒドラターゼの反応温度依存性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））について、表５に示した反応温度でニトリル化合物をアミド化合物に変換させるニトリルヒドラターゼ活性を測定した。１ｍＬの０．５重量％アクリロニトリル溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）にニトリルヒドラターゼ活性画分溶液を加えて、各温度にて攪拌しながら反応を開始した。２分後、１００μＬの１Ｎ  塩酸を加えることにより反応を停止した。酵素活性の単位（ユニット）は、１分間に１μｍｏｌのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めて、酵素重量当たりの水和活性（Ｕ／ｍｇ）を表５に示した。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分におけるニトリルヒドラターゼの活性は６０度という高温まで、反応温度の上昇に伴い上昇している。最適温度は菌体を反応に用いた時と同様に６０℃近傍にあると考えられ、７０度という高温下においても大変高いニトリルヒドラターゼ活性を示している。
2004108942.tif 000006
実施例８：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼの熱安定性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼの活性の熱安定性を調べるために、ニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を３０分、所定温度での保温処理を行い、残存活性を測定した。１ｍＬの０．５重量％アクリロニトリル溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に保温処理後のニトリルヒドラターゼ溶液を５μｌ加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。２分後、１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止した。保存処理前の活性に対する保存処理後の活性（残存活性）を算出し、保存処理前の活性を基準（１００）とした換算値として表６に示す。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高温下においても安定に保持されるといえ、６０℃という高温下においても６０％以上の活性を保持することができ、７０℃の高温下においても３５％以上の活性を保持することができる。
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実施例９：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼのアクリロニトリル濃度依存性と濃度耐性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼに関して、基質であるアクリロニトリル濃度への依存性と耐性を調べるために、４μｌのニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を各種重量％のアクリロニトリルを含む５ｍｌ溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）に加えて、２７℃にて攪拌しながら反応を開始した。５分、１０分、２０分、４０分後に１ｍｌずつを取り出し、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止し、生成したアクリルアミドの濃度をＨＰＬＣにより定量し、表７に示した。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、高いアクリロニトリル濃度においても安定に保持されるといえる。６％という高濃度のアクリロニトリル溶液中において４０分反応させても、より低いアクリロニトリル濃度の場合に比べての活性の低下は観察されず、逆に基質濃度の上昇に伴って活性は上昇した。
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実施例１０：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼのアクリルアミド濃度耐性
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼに関して、生成物であるアクリルアミドによる阻害を調べるために、１０μｌのニトリルヒドラターゼ活性画分溶液（３．２ｍｇ／ｍＬ、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５））を０．５重量％アクリロニトリルと３５重量％アクリルアミドを含む溶液（０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５）の１ｍｌに対して加え、２７℃にて攪拌しながら１０分間反応を行い、反応後の液中のアクリロニトリル濃度をＨＰＬＣで定量したところ、すべてのアクリロニトリルがアクリルアミドに変換されていた。この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より精製したニトリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中のニトリルヒドラターゼの酵素活性は、３５％という高いアクリルアミド濃度においても活性が保持されるといえる。
実施例１１：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼβサブユニット及びαサブユニット部分の遺伝子のクローニング
（１）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ酵素の確認及びＮ末アミノ酸配列決定
実施例６により得られたゲルろ過クロマトグラフィーでのニトリルヒドラターゼ活性画分溶出液を還元条件下において還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による蛋白質染色を行い、脱色した結果、約２５Ｋダルトン及び約２８Ｋダルトンの分子量を有する２本の主要なバンドが確認された。この２本の主要な精製蛋白質を、ブロッティング装置（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いてＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に転写し、ＣＢＢ染色し、目的の２本のバンドが吸着している部分をＰＶＤＦ膜から切り出した。次に、全自動タンパク質一次構造分析装置ＰＰＳＱ−２３Ａ（島津製作所）を用いて２種類の蛋白質のＮ末端アミノ酸配列を解読した。その結果、分子量２５Ｋダルトンの蛋白質のＮ末アミノ酸配列は、配列表の配列番号：２３に記載の配列であり、分子量２８Ｋダルトンの蛋白質のＮ末アミノ酸配列は、配列表の配列番号：２４に記載の配列であった。
既知のニトリルヒドラターゼ酵素のアミノ酸配列と比較した結果、２５Ｋダルトンのポリペプチド鎖がニトリルヒドラターゼαサブユニット、２８Ｋダルトンのポリペプチド鎖がニトリルヒドラターゼβサブユニットと低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。
（２）Ｎ末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーの合成
上記で解読した２種類の蛋白質のＮ末端のアミノ酸配列から、該菌属のコドン使用に基づいて縮重ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを以下の１２種類合成した。配列表の配列番号：５に記載のプライマー１（αＦ１）、配列表の配列番号：６に記載のプライマー２（αＦ２）、配列表の配列番号：７に記載のプライマー３（αＦ３）、配列表の配列番号：８に記載のプライマー４（αＲ１）、配列表の配列番号：９に記載のプライマー５（αＲ２）、配列表の配列番号：１０に記載のプライマー６（αＲ３）、配列表の配列番号：１１に記載のプライマー７（βＦ１）、配列表の配列番号：１２に記載のプライマー８（βＦ２）、配列表の配列番号：１３に記載のプライマー９（βＦ３）、配列表の配列番号：１４に記載のプライマー１０（βＲ１）、配列表の配列番号：１５に記載のプライマー１１（βＲ２）、配列表の配列番号：１６に記載のプライマー１２（βＲ３）である。尚、ｙはｃまたはｔを表し、ｒはａまたはｇを表し、ｍはａまたはｃを表し、ｋはｇまたはｔを表し、ｓはｃまたはｇを表し、ｗはａまたはｔを表し、ｄはａ、ｇまたはｔを表し、ｎは、ａ、ｃ、ｇまたはｔを表している。また、αサブユニット及びβサブユニットをコードする遺伝子の染色体上での位置を考慮し、プライマーを作成した。
（３）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株より染色体ＤＮＡの抽出及び縮重ＰＣＲ
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株を実施例６と同様の方法により培養、回収し、ＱＩＡＧＥＮ社のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（５００／Ｇ）キットを用いて菌体から染色体ＤＮＡを抽出した。ＴＥ溶液に溶解させたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ０．１μｇを鋳型として縮重ＰＣＲを行った。縮重ＰＣＲは、配列表の配列番号：５から１０に記載のプライマー１から６と、配列表の配列番号：１１から１６に記載のプライマー７から１２の組み合わせ３６通りを行った。１００ｐｍｏｌのプライマー２種類を各々、５ＵのＴａｋａｒａ社のＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びバッファーを含む全量１００μｌの反応液を用い、縮重ＰＣＲを行いＤＮＡ断片の増幅を試みた。反応条件は以下の通りである。９６℃、３分の熱変性後、９６℃、３０秒熱変性、４２℃、３０秒アニーリング、７２℃、１分３０秒伸長反応を３５サイクル行った後、７２℃、５分間伸長反応をさせ、４℃にて保冷した。各々のＰＣＲ産物を１重量％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡの増幅の確認を行ったところ、配列表の配列番号：９に記載のプライマー５（αＲ２）と配列表の配列番号：１１に記載のプライマー７（βＦ１）の組み合わせ及び配列表の配列番号：９に記載のプライマー５（αＲ２）と配列表の配列番号：１２に記載のプライマー８（βＦ２）の組み合わせで行ったＰＣＲの場合のみ、約７００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
（４）縮重ＰＣＲ産物のクローニング及び増幅ＤＮＡ断片の塩基配列解読
増幅されたＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてライゲーションした。Ｅｘ  ＴａｑによるＰＣＲの結果、３’末端にＡが１塩基付加される性質を利用している。ライゲーション反応後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％ＮａＣｌ、２．０重量％Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ（ｐＨ７．５））にて３７℃で一晩培養し、アンピシリンにて形質転換体を選択した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて培養した形質転換体から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、約７００ｂｐのインサート配列を、ベクター上にあるＳＰ６及びＴ７プロモーターの配列をプライマーとして用いて塩基配列を解読した。
その結果、増幅ＤＮＡ断片内に６８１ｂｐのオープンリーディングフレーム（以後ＯＲＦ１と呼称）が確認された。ＯＲＦ１の翻訳停止コドンと次のオープンリーディングフレーム（以後ＯＲＦ２と呼称）の翻訳開始コドンＡＴＧの間は１３ｂｐであった。ＯＲＦ１の塩基配列より推定されるＮ末端側２５個のアミノ酸配列と上記にて精製した２８Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端側の２５個のアミノ酸配列は全く一致しており、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列の１番目から２５番目までの配列に相当している。ＯＲＦ１のアミノ酸配列は、既知のニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列と低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニットは２２６アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性を有する蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、高い方から順に、クレブシエラ属ＭＣ１２６０９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと４３％、アグロバクテリウム属のニトリルヒドラターゼβサブユニットと４２％、ロドシュードモナス属ＣＧＡ００９株ニトリルヒドラターゼβサブユニットと４０％と非常に低い。また、ジオバチルス属と近縁の属であるバチルス属由来の蛋白質とのアミノ酸の一致度も、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＢＲ４４９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと３５．０％、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ  ＳＣ−Ｊ０５−１株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと３４．５％と極めて低かった。一方、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＢＲ４４９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ  ＳＣ−Ｊ０５−１株のニトリルヒドラターゼβサブユニットは８５．６％という高い一致度を有している。また、ＯＲＦ２の塩基配列より推定されるＮ末端のアミノ酸配列と上記にて精製した２５Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端のアミノ酸配列は全く一致した。
以上より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株では、５’末端側上流より２８Ｋダルトンのニトリルヒドラターゼβサブユニットをコードする遺伝子、２５Ｋダルトンのニトリルヒドラターゼαサブユニットをコードする遺伝子がこの順番で隣接して存在していることが判明した。
（５）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株ニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の遺伝子のクローニング
上記にて得られたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット部分の遺伝子の周辺遺伝子及びαサブユニット部分の遺伝子をクローニングするために、縮重ＰＣＲを行った。既知のニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流に位置する遺伝子を参考にして、以下の縮重ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマー以下２種類を作成した。配列表の配列番号：１７に記載のプライマー１３（ｐＲ１）、配列表の配列番号：１８に記載のプライマー１４（ｐＲ２）である。
また、先に塩基配列を解読したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット内にＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマー以下２種類を作成した。配列表の配列番号：１９に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）、配列表の配列番号：２０に記載のプライマー１６（Ｑ６ａｂＦ１）である。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ０．１μｇを鋳型として縮重ＰＣＲを行った。縮重ＰＣＲは、アニーリング温度５０度にて、配列表の配列番号：１７、１８に記載のプライマー１３、１４と、配列表の配列番号：１８、１９に記載のプライマー１５、１６の組み合わせ４通りを行った。その結果、配列表の配列番号：１７に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号：１８に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）の組み合わせで行ったＰＣＲで約０．８ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。更に、配列表の配列番号：１６に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号：１９に記載のプライマー１６（Ｑ６ａｂＦ１）の組み合わせで行ったＰＣＲで１．５ｋの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。なお、その他の組み合わせで行ったＰＣＲの場合は、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できなかった。
配列表の配列番号：１６に記載のプライマー１３（ｐＲ１）と配列表の配列番号：１９に記載のプライマー１５（Ｑ６ＡｐｏｓＦ）の組み合わせで行った縮重ＰＣＲにより増幅された０．８ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出し、常法によりＤＮＡを抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へ組み込み、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンにより組換え体を選択した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて形質転換体を培養し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出し、約０．８ｋｂのインサート部分の塩基配列を解読した。その結果、６１８ｂｐのオープンリーディングフレーム（以後ＯＲＦ２と呼称）が確認された。ＯＲＦ２の塩基配列より推定されるＮ末端側２９個のアミノ酸配列と上記にて精製した２５Ｋダルトンのポリペプチド鎖のＮ末端側の２９個のアミノ酸配列は完全に一致しており、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列の１番目から２９番目までの配列に相当する。ＯＲＦ２のアミノ酸配列は、既知のニトリルヒドラターゼαサブユニットのアミノ酸配列と低いながらもホモロジーを示し、該蛋白質をコードすることが示唆された。
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニットは２０５アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中で相同性を有する蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、高い方より順に、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＢＲ４４９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと６６．３％、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ  ＳＣ−Ｊ０５−１株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと６３．９％と低い。一方、好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＢＲ４４９株のニトリルヒドラターゼβサブユニットと好熱菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ  ＳＣ−Ｊ０５−１株のニトリルヒドラターゼβサブユニットは８８．８％が一致し、高い相同性を有している。
実施例１２：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分の発現ベクターへの組み込みと、大腸菌での発現
（１）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分の発現ベクターへの組み込み
上記にて解読した塩基配列をもとに、ニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分をＰＣＲにて増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー以下２種類を作成した。配列表の配列番号：２１に記載のプライマー１７（Ｑ６ａｂ−Ｆ１−Ｔ）、配列表の配列番号：２２に記載のプライマー１８（Ｑ６ＡＢａｌｌ−Ｒ１−ＢｇｌＩＩ−Ｔ）である。配列表の配列番号：２１に記載のプライマー１７は、制限酵素部位ＮｄｅＩの中に、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニットの翻訳開始コドンを設計した。配列表の配列番号：２２に記載のプライマー１８には、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニットの翻訳終止コドンの直下に制限酵素ＢｇｌＩＩサイトを導入した。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号：２１、２２に記載のプライマー１７，１８を各々１００ｐｍｏｌ用いてＰＣＲを行った。Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、全量１００μｌにて９６℃、３分の熱変性の後、９６℃３０秒熱変性、６０℃３０秒アニーリング、７２℃１分３０秒伸長反応の条件でＰＣＲを３０サイクル行った後、７２℃にて５分間伸長反応させた後、４℃に冷却した。ＰＣＲ後の溶液を１．５重量％アガロース電気泳動に供したところ、で約１．３ｋｂのＤＮＡ断片増幅が確認された。この増幅ＤＮＡ産物をアガロースゲルより常法にて抽出し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒへライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。形質転換体より、プラスミドＤＮＡを抽出し、インサート部分の塩基配列を解読し、ＰＣＲによる増幅にエラーのないことを確認した。
次に、このプラスミドをＮｄｅＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、１．５重量％アガロース電気泳動に供し、約１．３ＫｂのインサートＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、常法により抽出した。発現ベクターにはＮｏｖａｇｅｎｅ社のｐＥＴ−２６ｂ（＋）  Ｖｅｃｔｏｒ及びｐＥＴ−２８ａ（＋）  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。この２種類のベクターＤＮＡをＮｄｅＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、１重量％アガロース電気泳動に供し、約５．３ＫｂのＤＮＡ断片を常法により抽出した。これらのインサートとベクターを常法に従いライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性で選択した形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、インサートが導入されたプラスミドを選出した。以上より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット部分がインサートとして導入された発現プラスミドを取得した。これらの完成したプラスミドを、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαと以下呼称する。
（２）大腸菌にて発現させたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼ活性
発現プラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαを用いてＮｏｖａｇｅｎｅ社の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株を形質転換し、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット及びαサブユニットの蛋白質をＴ７プロモーターにより、ポリシストロンとして共発現させた。
各々の発現プラスミドを用いて、Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株のコンピテントセルへの形質転換を行い、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％  ＮａＣｌ、２．０重量％  Ａｇａｒ；ｐＨ７．５）上に形質転換処理後の菌液を撒き、３０℃で一晩培養し、カナマイシンによる選択を行った。この形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地２ｍｌに植菌し、３０℃で一晩２００ｒｐｍにて振とう培養を行った。前培養液を２０μｇ／ｍｌの塩化コバルト六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）及び３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地１０ｍｌに２重量％植菌し、３０℃で約３時間、２００ｒｐｍにてＯＤ６００＝０．５になるまで振とう培養を行い、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、Ｔ７プロモーターからの発現を誘導後、４時間２００ｒｐｍにて振とう培養を行い、菌体を回収した。
この菌体を用いて、２７℃においてニトリル化合物をアミド化合物に変換させるニトリルヒドラターゼ水和活性を測定した。
ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼを発現させた大腸菌の菌体を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５ｍＭのＮａＣｌを含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に再溶解し、ＯＤ＝０．２になるよう希釈し、終濃度０．２重量％アクリロニトリル溶液の反応液を作成した。２７℃にて攪拌しながら反応を行い、３０分後に１００μＬの１規定塩酸を加えることにより反応を停止した。酵素活性の単位（ユニット）は、１分間に１μｍｏｌのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めて、湿菌体重量当たりの水和活性（Ｕ／ｍｇ）を表８に示した。
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この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットを大腸菌にて発現させた場合に、アクリロニトリルをアクリルアミドに転換するニトリルヒドラターゼ活性を有することが判明した。
実施例１３：コロニーハイブリダイゼーションによるジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼ周辺遺伝子の取得
（１）蛍光標識ＤＩＧプローブの作成
配列表の配列番号：２５に記載のジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分のＤＮＡを鋳型に用いて、ロシュ社製のＤＩＧ−ＤＮＡラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。作成方法はロシュ社のＤＩＧマニュアルに従う。
（２）クロモソームサザンハイブリダイゼーション
実施例１１にて調製したジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡを様々な制限酵素を用いて消化し、１重量％アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲル内のＤＮＡを、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャム社）に転写した後、先に調製した蛍光標識ＤＩＧプローブを用い、クロモソームサザンハイブリダイゼーションを行った。ＤＮＡが転写、固定されたメンブレンを１枚に当たり１０ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー（１重量％スキムミルク、０．１重量％Ｎ−ラウロイルザルコシン、０．０２重量％ＳＤＳ、５０重量％ホルムアミドを含有する５×ＳＳＣ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。上記と同様に作成した蛍光標識プローブ１００ｎｇを９５℃で１０分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼーションバッファーに添加し、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のメンブレンを１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣにて室温で２回洗浄した。次に６５℃に加熱した１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を２回行った。続いて１００ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調製済み）で５分間洗浄後、５０ｍｌのブロッキング溶液（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１重量％スキミムルクを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中にて室温で３０分間ブロッキング処理を行った。抗ジゴキシゲニン−ＡＰを７５ｍＵ／ｍｌとなるよう２０ｍｌのブロッキング溶液にて希釈し、室温で３０分間の抗体反応を行った後、１００ｍｌの洗浄バッファー（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中でメンブレンを５回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。２０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）中で５分間平衡化処理を行った後、１０ｍｌの検出バッファーに１００ｍｇ／ｍｌのＮＢＴ（ニトロソブルーテトラゾリウムクロライド）溶液を３４μｌ、５０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ溶液を３５μｌを希釈した発色基質溶液ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト）を作成し、メンブレンが完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを１分から１６時間行った。インキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結果、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより消化される約２．３ｋｂ遺伝子断片の中に、ニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の下流遺伝子が含まれることが明らかになった。
（３）コロニーハイブリダイゼーションによる目的クローンの取得
▲１▼コロニーハイブリダイゼーション用のプラスミドライブラリーの作成
次に、同蛍光標識ＤＩＧプローブを用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡ１０μｇを１重量％アガロースゲル電気泳動に供し、アガロースゲルから約２．０ｋｂから２．６ｋｂのＤＮＡ断片を含む部分を切り出し、前記と同様の方法でＤＮＡ断片を抽出及び精製した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｐＵＣ１１８プラスミドベクター（Ｔａｋａｒａ社製）のマルチクローニングサイト内にあるＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に導入した。ライゲーションに用いたｐＵＣ１１８プラスミドベクターＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後にフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱による精製を行い、続いてアルカリフォスファターゼ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた５’末端の脱リン酸化処理後に再度フェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱を行い、アガロース電気泳動に供し、アガロースゲルから抽出による再精製を行ったものを使用した。
約２．０ｋｂから２．６ｋｂに断片化されたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株の染色体ＤＮＡをｐＵＣ１１８プラスミドベクターとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位にてライゲーションした溶液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノサイド）及び２重量％Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含有するＬＢ寒天培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％ＮａＣｌ、２．０重量％Ａｇａｒ；ｐＨ７．５）上に撒き、３７℃で一晩培養した。その結果、１枚当たり５０個から５００個の白コロニーが出現しているシャーレを多数枚取得することが出来た。
これらの染色体ＤＮＡのプラスミドライブラリーに対して、先に調製した蛍光標識ＤＩＧプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、目的のニトリルヒドラターゼαサブユニットの下流遺伝子を含むクローンをスクリーニングした。
▲２▼コロニーハイブリダイゼーションによる目的クローンの取得
まず、出現した白コロニー約１０００クローンを、滅菌済み爪楊枝を用いて新しいＬＢ寒天培地にストリークしなおした。この時、メンブレンをハイブリダイズさせるＬＢ寒天培地と、保存用のＬＢ寒天培地に同様にストリークし、３０℃で一晩培養した。
次に、コロニーの生えたシャーレ上にアマシャム社製のナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を静かに置き、１分後端からピンセットを用いてゆっくりと取り除いた。剥がしたメンブレンを、菌体の付着している面を上にして変性溶液（１．５ＭのＮａＣｌを含む０．５ＭのＮａＯＨ水溶液）に７分間浸した後、中和溶液（１．５ＭのＮａＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む０．５Ｍトリス塩酸水溶液；ｐＨ７．２）に３分間浸し、新しい中和溶液に更に３分間浸した。次に、２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ１リットル中にＮａＣｌ８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを含む）にて１回洗浄を行った後、乾いた濾紙上でメンブレンを風乾した。さらに１２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶ照射を行うことによりメンブレン上にＤＮＡの固定を行った。
▲３▼ＤＩＧ抗体による検出及び目的クローンの単離
上記にて処理した、ＤＮＡの固定されたメンブレンを１枚に当たり１０ｍｌのハイブリダイゼーションバッファー（１重量％スキムミルク、０．１重量％Ｎ−ラウロイルザルコシン、０．０２重量％ＳＤＳ、５０重量％ホルムアミドを含有する５×ＳＳＣ）に浸し、４２℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。上記と同様に作成した蛍光標識プローブ１００ｎｇを９５℃で１０分間の煮沸及び急冷処理により熱変性をさせ、プレハイブリゼーションバッファーに添加し、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のメンブレンを１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣにて室温で２回洗浄した。次に６５℃に加熱した１５０ｍｌの０．１重量％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を２回行った。続いて１００ｍｌのマレイン酸バッファー（０．１Ｍマレイン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．５に調整済み）で５分間洗浄後、５０ｍｌのブロッキング溶液（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１重量％スキミムルクを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中にて室温で３０分間ブロッキング処理を行った。抗ジゴキシゲニン−ＡＰを７５ｍＵ／ｍｌとなるよう２０ｍｌのブロッキング溶液にて希釈し、室温で３０分間の抗体反応を行った後、１００ｍｌの洗浄バッファー（０．３重量％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍマレイン酸バッファー；ｐＨ７．５）中でメンブレンを５回洗浄し、結合していない抗体を洗い流した。２０ｍｌの検出バッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）中で５分間平衡化処理を行った後、１０ｍｌの検出バッファーに１００ｍｇ／ｍｌのＮＢＴ溶液を３４μｌ、５０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ溶液を３５μｌを希釈した発色基質溶液ＮＢＴ／ＢＣＩＰを作成し、メンブレンが完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを１分から１６時間行った。インキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。その結果、該メンブレン上の１０００クローンのうち、ポジティブなシグナルを４箇所見いだし、その位置と重なるポジティブクローンを元のシャーレ上で確認した。
（４）ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分の下流遺伝子を含むポジティブクローンの解析
確認されたポジティブクローンをシャーレからアンピシリンを含有するＬＢ液体培地に植菌し、３７℃・２５０ｒｐｍで一晩振とう培養を行い、菌体を遠心により回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後に、１．５重量％アガロース電気泳動に供し、挿入断片の大きさの確認を行ったところ、約２．３ｋｂの大きさであった。また、挿入断片がジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット部分を含むことを、数パターンのＰＣＲ及び、制限酵素による消化パターンにより確認した。
以上より取得された本プラスミドをｐＵＣ１１８−Ｑ６Ｈｉｎ２．３と命名し、挿入断片の全塩基配列を決定した。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼ及び下流遺伝子群の制限酵素地図及び遺伝子構成を図１に記載した。
その結果、挿入断片中に３３９ｂｐの塩基配列からなるオープンリディングフレーム（以下、ＯＲＦ３と呼称する）がニトリルヒドラターゼαサブユニット（ＯＲＦ２）の５’末端側下流に同じ向きに存在することが確認された。ＯＲＦ２の翻訳終止コドンとＯＲＦ３の翻訳開始コドンの間は１２ｂｐであり、ＯＲＦ３の翻訳終止コドンと更に下流に位置するＯＲＦの翻訳開始コドンの間は１４５ｂｐであった。ＯＲＦ３は１１２アミノ酸をコードしており、既存のデーターベース中の以下のタンパク質と大変低いながらも相同性を有していた。既存のデーターベース中で相同性の高い配列とのアミノ酸の一致する割合は、バチルス属ＢＲ４４９株のＰ１２Ｋと３１％、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株のＮｈｈＧと３１％、ロドコッカス・ロドクロウスＪ１株のＮｈｌＥと２１％、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５株のＰ１６と２３％であった。
実施例１４：ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の発現プラスミドの構築
ｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて消化し、脱リン酸化反応を行い、フェノールクロロホルムで抽出することにより、脱リン酸化処理を行った。この消化産物を１重量％アガロース電気泳動に供し、約６．１ＫｂのＤＮＡ断片を常法により抽出した。このＤＮＡ断片には、ｐＥＴベクター及びジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット及びαサブユニットの６０番目のアミノ酸に位置するＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位までが含まれている。
次に、ｐＵＣ１１８−Ｑ６Ｈｉｎ２．３プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、１重量％アガロース電気泳動に供し、約２．３ｋｂのインサートＤＮＡを抽出した。このインサートを、先に抽出した断片とライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性で選択した形質転換体より、インサートＤＮＡを含むプラスミドを選出した。インサートの向きをＰＣＲにより確認することにより、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）及びｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクターにジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３と更に下流域が含まれたプラスミドを取得した。こうして完成したプラスミドを、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα１２及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βα１２と以下呼称する。
次に、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット、βサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の翻訳終止コドンまでを導入し、３種類の蛋白質が共発現するような発現プラスミドを構築した。先に構築したプラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα１２を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、１．５重量％アガロースゲル電気泳動に供し、αサブユニット、βサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の翻訳終止コドンまでを含む１．７ｋｂ遺伝子断片を常法により抽出した。同時に、発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）及びｐＥＴ−２８ａ（＋）を、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、１重量％アガロースゲル電気泳動に供し、５．３ｋｂのベクター部分の遺伝子断片を常法により抽出した。これらのベクターを先に抽出したαサブユニット、βサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の翻訳終止コドンまでを含む１．７ｋｂ遺伝子断片をインサートとして、常法に従いライゲーション反応を行った。この反応の際、ＢｇｌＩＩ制限酵素で消化した末端とＢａｍＨＩ制限酵素で消化した末端が接着される。ライゲーション反応後の溶液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、カナマイシン耐性で選択した形質転換体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、インサートが導入されたプラスミドを選出した。以上より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット、βサブユニット部分及び下流遺伝子ＯＲＦ３がインサートとして導入され、３種類の蛋白質が共発現するような発現プラスミドを取得した。これらの目的のプラスミドを、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα１及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βα１と以下呼称する。
実施例１５：大腸菌にて下流遺伝子を共発現させたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼ活性
発現プラスミドｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βαを用いてＮｏｖａｇｅｎｅ社の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株を形質転換し、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット及びαサブユニットの蛋白質をＴ７プロモーターにより共発現させた。同様に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）−βα１及びｐＥＴ−２８ａ（＋）−βα１を用いてＮｏｖａｇｅｎｅ社の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株を形質転換し、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼβサブユニット、αサブユニット及び下流遺伝子ＯＲＦ３の蛋白質をＴ７プロモーターにより共発現させた。コントロールとして、発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）及びｐＥＴ−２８ａ（＋）を用いてＮｏｖａｇｅｎｅ社の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株を形質転換した形質転換体を用いた。
各々の発現プラスミドを用いて、Ｎｏｖａｇｅｎｅ社製の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ株のコンピテントセルへの形質転換を行い、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地（０．５重量％バクト酵母エキストラクト、１重量％バクトトリプトン、０．５重量％  ＮａＣｌ、２．０重量％  Ａｇａｒ；ｐＨ７．５）上に形質転換処理後の菌液を撒き、３０℃で一晩培養し、カナマイシン耐性による選択を行った。この形質転換体を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地２ｍｌに植菌し、３０℃で一晩２００ｒｐｍにて振とう培養を行った。前培養液を２０μｇ／ｍｌの塩化コバルト六水和物（ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）及び３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地１０ｍｌに２重量％植菌し、３０℃で約３時間、２００ｒｐｍにてＯＤ６００＝０．５になるまで振とう培養を行い、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、Ｔ７プロモーターからの発現を誘導させ、更に約４時間２００ｒｐｍにて振とう培養を行い、菌体を回収した。
このようにして得られたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株由来のニトリルヒドラターゼを発現させた大腸菌の菌体を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５ｍＭのＮａＣｌを含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、ＯＤ＝０．２になるよう希釈し、終濃度０．２重量％アクリロニトリル溶液の反応液を作成した。２７℃にて攪拌しながら反応を行い、１０分後、３０分後に１００μＬの１規定塩酸を加えることにより反応を停止した。酵素活性の単位（ユニット）は、１分間に１μｍｏｌのアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を１ユニット（以下、Ｕと記す）と定めて、湿菌体重量当たりの水和活性（Ｕ／ｍｇ）を表９に示した。
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この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼαサブユニット及びβサブユニットのみを発現させた場合と、下流遺伝子ＯＲＦ３を共発現させた場合を比較すると、下流遺伝子ＯＲＦ３の存在によりニトリルヒドラターゼ活性が著しく増加したことが分かる。ＯＲＦ３がジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼの酵素活性を著しく上昇させる機能を有することが明らかになった。
実施例１６：大腸菌にて発現させたジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼの熱安定性
活性の熱安定性を調べるために、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）−βαを持ち、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼを発現させた大腸菌液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５ｍＭのＮａＣｌを含むＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５））を３０分間３０，６５，７０度での保温処理を行った。保温処理後、氷上にて冷却し、２７度に保温し温度を一定にした後、反応温度２７度にてニトリルヒドラターゼ活性を測定した。ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼを発現させた大腸菌の菌をＯＤ＝０．２の濁度に懸濁し、終濃度０．５重量％アクリロニトリル溶液の反応液を作成し、２７℃にて攪拌しながら反応を開始し、３０分後に１０液量％の１規定塩酸を加えることにより反応を停止した。３０度での保温処理を行った場合の活性を基準（１００％）とした換算値として表１０に示す。
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この結果より、ジオバチルス・サーモグルコシデシウスＱ−６株のニトリルヒドラターゼを発現させた大腸菌におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、７０度という高温下においても約８割の活性を保持することができ、大腸菌で発現させた場合においても高い耐熱性を有しており、工業的にも大変有用な酵素であるといえる。
【産業上の利用可能性】  本発明の組成物は、熱や高濃度のニトリル、アミド化合物に対して高い安定性を示し、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く変換する効果を有する。本発明の組成物は、高温、および高ニトリル化合物濃度や高アミド化合物濃度下の反応においても、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する分野で好適に利用できる。
【配列表】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月24日(2004.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡ。  （ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。  （ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。  （ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。          サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００          サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００  （ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。  （ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。  （ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【請求項２】下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのＤＮＡ。  （Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするαサブユニット遺伝子を含有する塩基配列と、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするβサブユニット遺伝子を含有する塩基配列との組み合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。  （Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。【請求項３】下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかのＤＮＡ。  （Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡとの組合わせからなることを特徴とするＤＮＡ。  （Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。【請求項４】配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ，またはそのアミノ酸配列中の１若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており且つニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のＤＮＡ。【請求項５】配列表の配列番号：３の塩基配列の１３２５−１６６３位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズし且つニトリルヒドラターゼ活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコードするＤＮＡのいずれかのＤＮＡが、さらに組合されていることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のＤＮＡ。【請求項６】配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。【請求項７】配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子を含有するＤＮＡ。【請求項８】配列表の配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを特徴とする遺伝子を含有するＤＮＡ。【請求項９】該ＤＮＡが、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。【請求項１０】該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）種由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。【請求項１１】該ＤＮＡが、ジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）由来である請求項１〜８の何れかに記載のＤＮＡ。【請求項１２】請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡを組み込んだ組み換えベクター。【請求項１３】請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス・サーモグルコシデシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）Ｑ−６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６５８）およびその変異体のいずれかの微生物。【請求項１４】請求項１〜１１の何れかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。【請求項１５】ジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物を、培地において培養することを特徴とする、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物の製造方法。  （ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。  （ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。  （ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。          サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００          サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００  （ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。  （ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。  （ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【請求項１６】請求項１４または請求項１５に記載のいずれかの製造方法により培養された微生���から取得された、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物。【請求項１７】下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質。  （ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。  （ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。  （ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである。        サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００        サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００  （ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。  （ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。  （ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【請求項１８】下記の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかの蛋白質。  （Ａ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。  （Ｂ）配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を含有するαサブユニットと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列を含有するβサブユニットのいずれか一方、または両方のそれぞれにおいて、１若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠損、付加、翻訳後修飾がなされており、その改変、または改変されていないαサブユニットと、改変、または改変されていないβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。【請求項１９】下記の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかの蛋白質。  （Ｃ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有することを特徴とする蛋白質。（Ｄ）配列表の配列番号：３の塩基配列の６９５−１３１２位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするαサブユニットと、配列表の配列番号：３の塩基配列の１−６８１位の配列を含むＤＮＡ、またはそのＤＮＡに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするＤＮＡのうちのいずれか一方のＤＮＡがコードするβサブユニットとを含有し、且つニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。但し、上記（Ｃ）となる場合を除く。【請求項２０】少なくとも、配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列であるαサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたものと、配列表の配列番号：２記載のアミノ酸配列であるβサブユニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたもののいずれか一方、または両方を含有することを特徴とする蛋白質。【請求項２１】下記の理化学的性質を有する蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物を、ニトリル化合物に作用させ��ニトリル化合物から誘導されるアミド化合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。  （ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。  （ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。  （ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである        サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００        サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００  （ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。  （ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。  （ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。【請求項２２】請求項１から請求項１１のいずれかに記載のＤＮＡにより形質転換された微生物、またはジオバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得る微生物のいずれかを、培地において培養して得た蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物にニトリル化合物を作用させ該ニトリル化合物から誘導されるアミド化合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。  （ａ）ニトリルヒドラターゼ活性を有する。  （ｂ）基質特異性：アクリロニトリル、アジポニトリル、アセトニトリル、イソブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ベンゾニトリル、ヘキサンニトリルを基質として、活性を示す。  （ｃ）分子量：少なくとも下記の２種類のサブユニットから構成されるタンパク質であって、各サブユニットの還元型ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が以下の通りである        サブユニットα  分子量        ２５０００±２０００        サブユニットβ  分子量        ２８０００±２０００  （ｄ）熱安定性：水液中の酵素を７０℃の温度で３０分加熱後に、加熱前の３５％以上の活性を残存する。  （ｅ）６重量％のアクリロニトリルを基質としても、それ以下の基質濃度の時に比べ、活性が減少しない。  （ｆ）３５重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とした活性を有する。


【国際調査報告】
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