(57)【要約】改良した細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５／ＭＰＣ細胞株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２３）を使用した、ヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の生物学的活性測定方法に関する。この株は、ｃ−Ｍｅｔを発現しうる肝細胞株であって、かつ該細胞に対して生理学的に許容しうる濃度のヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の添加により、ｈＨＧＦを添加しないときの２倍以上のｃ−Ｍｅｔの発現能を有する肝細胞株である。またこの肝細胞株を使用するヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の生物学的分析方法は、無血清培地中で肝細胞株を培養し、該培地中にヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を添加する系によるヒト由来ＨＧＦ力価の測定法からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２３で特定される肝細胞株（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５／ＭＰＣ細胞株）。
【請求項２】
ｃ−Ｍｅｔを発現しうる肝細胞株であって、かつ該細胞に対して生理学的に許容しうる濃度のヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の添加により、ｈＨＧＦを添加しないときの２倍以上のｃ−Ｍｅｔの発現能を有する肝細胞株。
【請求項３】
請求の範囲第１項又は第２項で特定される肝細胞株を使用するヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の生物学的分析方法。
【請求項４】
無血清培地中で肝細胞株を培養し、該培地中にヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を添加する系によるヒト由来ＨＧＦ力価の測定法からなる請求の範囲第３項に記載の分析方法。
【請求項５】
ヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）が、遺伝子組み換え産物である請求の範囲第３項又は第４項に記載の分析方法。
【請求項６】
請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項の分析方法に使用する試薬、及び該試薬を含む分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）（以下、単に「ＨＧＦ」と称する）の生物学的分析方法に関する。さらに詳しくは、特定の適合性を備えた細胞株を使用することを特徴とするヒト由来ＨＧＦ（以下「ｈＨＧＦ」と称する）の生物学的分析方法に関する。別の本発明は、この特定の適合性を備えた細胞株自体に関する。【０００２】  本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号：特願２００３−１８６９１４からの優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】  ＨＧＦは肝実質細胞の増殖活性を有するタンパク質であり、種々の動物種においてその存在が知られており、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されている。
ｈＨＧＦは、大工原らにより劇症肝炎患者血漿より見出され（特許文献１）、その後、喜多村らによりｈＨＧＦタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）配列が明らかにされた（特許文献２）。さらにこのｃＤＮＡを用いたｈＨＧＦタンパク質の生産方法及び形質転換体が報告されるにいたり（特許文献３）、ｈＨＧＦタンパク質の大量生産が可能となり医薬品としての応用が期待されている。【０００４】  ｈＨＧＦは糖タンパク質の一種であり、分子量は非還元状態では約８０〜９０ＫＤａ、還元状態では約５２〜５６ＫＤａのαサブユニット（重鎖）と約３０〜３６ＫＤａのβサブユニット（軽鎖）からなるヘテロダイマーである。ｈＨＧＦは、肝細胞増殖因子としての活性のほか、スキャッター因子（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ；ＳＦ）活性、腎臓尿細管上皮細胞増殖因子活性、損傷組織修復因子活性、血管内皮細胞増殖因子活性など多様な生物活性を有しており、肝臓疾患治療薬、腎臓疾患治療薬、脳神経障害治療剤、育毛促進剤、創傷治療薬、抗腫瘍治療薬などの医薬としての開発が期待されている。【０００５】  ｈＨＧＦの医薬品としての開発のために、ｈＨＧＦ活性の力価検定方法の確定が必要である。そのために、ｈＨＧＦによるヒト肝癌細胞への増殖応答性を利用した生物学的活性測定法が提案されている（特許文献４）。ヒト肝癌細胞としては、ヒト由来株化細胞株ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８０２４）（以下単に「ＡＴＣＣ株」と称する）及びヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンク（資源番号：ＪＣＲＢ０４０６）のＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（以下、単に「ＨＳ株」と称する）が公知であり、分譲を受けることも可能である。上記ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ株）は、ヒト肝臓の２次癌部位の初代培養を行い、立ち上ってきたクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に馴化させてライン化した細胞株である（非特許文献１）。ヒト以外での肝実質細胞を使った測定系としては、豚由来の細胞等を使用する有用な系の報告もある。
【特許文献１】特開昭６３−２２５２６号公開公報
【特許文献２】特開平３−７２８８３号公開公報
【特許文献３】特開平３−２８５６９３号公開公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ００−７２８７３号パンフレット
【非特許文献１】Ｓ．Ａｆｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．５０，２１２４−２１２８，１９７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の課題は、ｈＨＧＦの活性測定方法に関し、ｈＨＧＦのヒト肝癌細胞への増殖応答性を利用し、確実で再現性ある生物学的活性測定法を確立し、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、前記ＡＴＣＣ株の保有する性質について種々検討を重ねた結果、改良した細胞株により測定値に確実性が確保され、しかも細胞株の保存安定性にもすぐれ増殖応答性の再現性に優れた株を取得することに成功し、本発明を完成した。【０００８】  つまり、本発明は以下よりなる；
１．受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２３で特定される肝細胞株（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５／ＭＰＣ細胞株）。
２．ｃ−Ｍｅｔを発現しうる肝細胞株であって、かつ該細胞に対して生理学的に許容しうる濃度のヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の添加により、ｈＨＧＦを添加しないときの２倍以上のｃ−Ｍｅｔの発現能を有する肝細胞株。
３．前項１又は２で特定される肝細胞株を使用するヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の生物学的分析方法。
４．無血清培地中で肝細胞株を培養し、該培地中にヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）を添加する系によるヒト由来ＨＧＦ力価の測定法からなる前項３に記載の分析方法。
５．ヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）が、遺伝子組み換え産物である前項３又は４に記載の分析方法。
６．前項３〜５のいずれか１の分析方法に使用する試薬、及び該試薬を含む分析キット。
【発明の効果】
【０００９】  本発明のＭＰＣ株を使用すると、効果的にＨＧＦの生物活性を定量的に測定することが可能となり、より効果的にＨＧＦの医薬品としての開発を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】［図１］ＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株のｒｈＨＧＦに対する増殖応答性を示す図である。（実験例２）
［図２］ＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αに対する増殖応答性を示す図である。（実験例３）
［図３］ＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株におけるＨＧＦレセプターｍＲＮＡの発現変化を示す図である。（実験例４）
［図４］抗ｈＨＧＦ抗体によるＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ依存細胞増殖応答の中和を示す図である。（実験例５）
［図５］抗ｈＨＧＦ抗体（ＭＰＣ社製）によるＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ依存細胞増殖応答の中和を示す図である。（実験例５）
［図６］抗ｈＨＧＦ抗体によるＭＰＣ株のｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α依存細胞増殖応答への効果を示す図である。（実験例５）
［図７］ＡＴＣＣ株培養コンディション培地によるＭＰＣ株の細胞増殖応答を示す図である。（実験例６）
［図８］ＡＴＣＣ株培養コンディション培地によるＭＰＣ株の細胞増殖応答を示す図である。（実験例７）
［図９］抗ｈＨＧＦ抗体によるＭＰＣ株のＡＴＣＣ株培養コンディション培地への効果を示す図である。（実験例８）
［図１０−１］ＭＰＣ株によるＨＧＦの生物活性の測定結果（Ｌｏｔ．００１）。（実験例９）
［図１０−２］ＭＰＣ株によるＨＧＦの生物活性の測定結果（Ｌｏｔ．００２）。（実験例９）
［図１０−３］ＭＰＣ株によるＨＧＦの生物活性の測定結果（Ｌｏｔ．００３）。（実験例９）
［図１０−４］ＭＰＣ株によるＨＧＦの生物活性の測定結果（Ｌｏｔ．００４）。（実験例９）
［図１０−５］ＭＰＣ株によるＨＧＦの生物活性の測定結果（Ｌｏｔ．００５）。（実験例９）
発明を実施する為の最良の形態【００１１】  ＨＧＦは、上記説明したとおり、肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）であり、本発明におけるＨＧＦの生物学的分析方法とは、ＨＧＦの生物活性、即ち肝実質細胞増殖活性を測定する方法をいう。具体的には、肝実質細胞が増殖しない条件下で、ＨＧＦを添加することにより肝実質細胞が増殖した場合におけるＨＧＦの添加量と肝実質細胞の増殖を調べることにより、ＨＧＦの生物活性を測定することができる。【００１２】  本発明のヒト由来肝実質細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）の生物活性の測定に適する細胞は、ＨＧＦ添加の有無にのみ基づいて増殖能を有するか否かを分析しうる性質を有する細胞であることが必要とされる。また、ヒト由来肝実質細胞の増殖能を分析するものであるから、分析に使用する細胞も、「ヒト由来」であること及び「肝実質細胞由来」であることが望ましい。
本発明者らは、上記条件を有するｈＨＧＦの生物学的分析方法に適当な細胞を選択したところ、肝細胞株（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５／ＭＰＣ細胞株）（以下単に「本発明株」又は「ＭＰＣ株」と称する）を取得することができた（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２３）。
以下、本発明株の由来、増殖特性等について説明し、さらに本発明株を用いた生物学的分析方法についても説明する。【００１３】（本発明株の性状）
（由来種）
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ株）は、ヒト肝臓の２次癌部位の初代培養を行い、立ち上ってきたクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に馴化させてライン化した細胞株である（非特許文献１）。
細胞の由来種は、アイソザイムの解析等、公知の方法により確認することができる。例えば、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ社のＡｕｔｈｅｎｔｉＫｉｔＴＭを使用してアイソザイム解析を行うことにより確認することができる。アイソザイム解析の結果から、本発明株はヒト由来細胞であることが確認された。【００１４】（由来臓器）
本発明株が肝臓由来であることは、例えば以下の様な解析を行うことで推察することができる。
Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤ）アイソザイムは、その存在量比について、肝臓では、ＬＤ５、ＬＤ４，３、ＬＤ２，１の順番に多いことが既に報告されている（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ，３６，１８９−２１９，１９６９）。ＭＰＣ株、ＡＴＣＣ株についてこのＬＤアイソザイムの存在量解析を行うと、両細胞株ともＬＤ１アイソザイムが他のタイプのアイソザイムよりも量的に少なく、肝臓でのＬＤアイソザイム存在パターンと同様であることが確認された。
更に、例えばＧｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社により開発された遺伝子発現データベース及び解析ツールからなるシステムソフトウェア（以下、単に「ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ（商品名）」と称する）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製のＧｅｎｅＣｈｉｐＲと解析ソフトウェアＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ｖｅｒ５．０（以下、単に「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ」と称する）を使って、肝臓組織及び細胞株での遺伝子発現を解析することにより、発現遺伝子の相互間比較を行うことができる。この解析により、ＭＰＣ株ではＬＤ  Ａサブユニット及びＬＤ  ＢサブユニットのｍＲＮＡの発現傾向が肝臓での発現傾向と一致していることが確認された。【００１５】  肝臓に特異的に発現している肝臓マーカー遺伝子を上記と同様のシステムによって選び出し、本発明株について、それらの遺伝子発現の有無についても確認することができる。下記の遺伝子は本発明株で発現を確認することができた肝臓マーカー遺伝子である。
（１）チトクロームｐ−４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０（Ｐ−４５０  ＨＦＬａ））
（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ００４０８，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ：１７５９＿ｆ＿ａｔ）
（２）ヨードサイロニン  デヨージナーゼ（Ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ  ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ）
（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｓ４８２２０，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ：３１９６６＿ａｔ）
（３）インター−α−トリプシンインヒビター（Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）
（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０７１７３，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ：３６５８４＿ａｔ）
（４）カルボキシペプチダーゼＮ  小サブユニット（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｎ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）
（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１４３２９，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ：３５９５３＿ａｔ）
（５）ＨＧＦ活性化因子様タンパク質（ＨＧＦ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ４９７４２，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＤ：７４２＿ａｔ）
これらの内、（２）（３）及び（４）は、ＡＴＣＣ株、ＨＳ株又はヒト肝癌由来ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＢ  ８０６５）（以下、単に「ＨｅｐＧ２細胞」と称する）でも発現している肝臓マーカー遺伝子である。
以上の解析から本発明株は肝臓由来細胞である可能性が高いと結論された。【００１６】（培養）
本発明株の好適な培養培地として、１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭ（１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地が例示される。１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭは、例えばシグマ社製のＤ−ＭＥＭに硫酸ゲンタマイシンなどの抗生物質、炭酸水素ナトリウムを添加し、適量の精製水で溶解後、定溶し、メンブレンフィルターで濾過滅菌し、この溶液に例えば５６℃で２０分の非働化処理した牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加して調製することができる。このように調製した培地は、５％ＣＯ２を含む湿潤条件下のＣＯ２インキュベーター内で７から８のｐＨとなる。
本発明株は、好気性の条件下で約３７℃の至適培養温度で培養することができ、−８０℃以下での凍結法で保管することができる。保管の際は、保管保護剤の添加が好ましく、例えばＤＩＡ−ＩＡＴＲＯＮ社製のセルバンカー（ＺＣＢ−１０１）を使用することができる。特に長期保存する場合は、液体窒素（−１９６℃）で保存することが望ましい。凍結した細胞は３７℃で急速融解し、例えば上記培養培地にて１回遠心洗浄後、培養条件と同一条件下で培養することにより復元することができる。【００１７】（増殖特性）
本発明株は、無血清培地条件下では増殖しないという特徴を有する。一方、本発明株は、各種増殖因子、特にｈＨＧＦ、遺伝子組換ｈＨＧＦ（ｒｈＨＧＦ）に対する増殖応答性の特異性の保持が最大の特徴として挙げられる。【００１８】  本発明株及びＡＴＣＣ株について、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加した系及び無添加の系で、各細胞の増殖形態を観察した。その結果、本発明株はｒｈＨＧＦ無添加の系ではほとんど増殖せず、細胞は丸い形態のままであったのに対し、ｒｈＨＧＦを添加すると培養容器に張り付くようになり、増殖応答を示すようになった。一方、ＡＴＣＣ株は無添加の系でも高い増殖性を示し、ｒｈＨＧＦの添加はＡＴＣＣ株の増殖にほとんど影響なかった。
上記解析結果により、本発明株の増殖特性は次のように確認された。
（１）本発明株は、無血清培地のみでは増殖しない。
（２）本発明株は、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると増殖するようになる。
（３）ＡＴＣＣ株は、無血清培地でも増殖する。
上記解析より、本発明株とＡＴＣＣ株では、ｒｈＨＧＦに対する増殖応答性が大きく異なることが確認された。【００１９】  次に、本発明株及びＡＴＣＣ株について、生理学的に許容しうる濃度のｈＨＧＦの添加によるＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）のｍＲＮＡの発現変動を解析した。ｍＲＮＡの発現は、通常の方法により解析することができ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐＲと解析ソフトウェアを用いて解析することができる。本発明における生理学的に許容しうる濃度とは、細胞が１×１００〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度に対して、ｈＨＧＦが１×１０−６〜１×１０６ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１×１０−４〜１×１０４ｎｇ／ｍＬの濃度をいう。【００２０】  その結果、本発明株及びＡＴＣＣ株のいずれもＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）を発現することが確認された。無血清培地条件では、本発明株及びＡＴＣＣ株でのｃ−Ｍｅｔの発現量は、シグナル値でそれぞれ４３、４０とほぼ同じレベルであった。しかし、ＡＴＣＣ株の培養条件にｒｈＨＧＦを１００ｎｇ／ｍＬ添加したときのシグナル値は５５で、無血清培地条件下に比べて１．４倍程度しか上昇しなかったのに対し、本発明株ではシグナル値が１２７となり、無血清培地条件下の３．０倍にまで上昇した。【００２１】（細胞増殖特性の特異性）
本発明株は無血清培地では増殖しない。しかし、無血清培地に上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、腫瘍増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＧＦ−α）又はＨＧＦの各増殖因子を添加することにより、増殖するようになる。この増殖応答性について定量解析を行うと、無血清培地に各種増殖因子を１．９×１０−１１ｍｏｌ／Ｌから３．３×１０−８ｍｏｌ／Ｌの範囲で添加して培養した際に、本発明株は増殖因子無添加時に比べて２倍以上の増殖能を示す結果となった。本解析より本発明株の増殖特性は次のように確認された。
（１）無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると、本発明株は増殖することが定量的に確認される。
（２）無血清培地にｒｈＥＧＦ又はｒｈＴＧＦ−αを添加すると、本発明株は増殖する。
（３）ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αによる本発明株の増殖は、濃度依存的である。
（４）本発明株は、ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αに反応するが、ｒｈＨＧＦの添加により最も高い増殖能を示した。
以上の解析結果から、本発明株は各種増殖因子の濃度依存的に増殖するが、特にｒｈＨＧＦに対して高い増殖能を有する細胞株であることが確認された。【００２２】  次にｒｈＨＧＦを添加した無血清培地に、ｈＨＧＦに対する特異的抗体（抗ｈＨＧＦ抗体、例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のものを使用することができる）を添加し、本発明株のｒｈＨＧＦ依存性の細胞増殖応答を中和させることができるか否かを検討した。その結果、抗ｈＨＧＦ抗体の存在により、細胞増殖応答を中和させることが確認された。
同様に、ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α依存性の細胞増殖応答を抗ｈＨＧＦ抗体で中和可能か否かを検討した。その結果、細胞増殖応答を中和しないことが確認された。
以上より、無血清培地へのｒｈＨＧＦ添加による本発明株の増殖はｒｈＨＧＦタンパク質そのものが持つ生理活性作用を特異的に反映している現象であると結論できた。
かくして、本発明のＭＰＣ株は、無血清培地では増殖能を示さず、ｈＨＧＦの存在下で増殖能を示し、ｈＨＧＦの生物学的分析に有用であることが示唆された。【００２３】（本発明株を用いた生物学的分析方法）
上記本発明株の増殖特性を利用して、本発明株をｈＨＧＦ添加の系及び無添加の系で培養することによりｈＨＧＦの生物学的分析を行うことができる。
具体的には、生物学的分析は次のようにすることができる。
本発明株の細胞を前培養後に回収し、無血清培地を用いて遠心分離等により細胞を洗浄し、該無血清培地で適当な密度の細胞数となるように細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液にｈＨＧＦを添加し、細胞の増殖を調べることによる。
前培養は、牛胎児血清を含む細胞増殖に好適な培地を用いることができる。具体的には、１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭを用いて、ＭＰＣ株細胞が１×１０２〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ密度となるように細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液を培養容器に播種し、インキュベーターで２４〜９６時間程度培養する。培養は、温度条件３７±２℃、ＣＯ２濃度条件３〜７％に設定したＣＯ２インキューベーターを用いて行うことができる。培養容器は、市販の培養容器を使用することができ、例えば径１０ｃｍのディッシュを使用することができる。上記前培養の途中で培養液を適宜交換し、培養を継続しても良い。【００２４】  前培養終了後、例えば滅菌したＰＢＳ（−）で細胞表面を洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを使用する等、通常の方法で細胞を剥離し、回収した細胞を例えば遠心分離により集め、無血清培地に細胞を懸濁し、同様の操作により細胞を数回洗浄した後、無血清培地を用いて１×１０２〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ密度となるように細胞懸濁液を調製し、試験に使用する培養容器に細胞を播種することができる。具体的には、無血清培地として０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭを使用することができる。また、培養容器は、例えば９６穴プレートを使用することができるが、特にこれに限定されるものではない。【００２５】  上記細胞を播種した培養容器に、ｈＨＧＦ検体を加え、上記ＣＯ２インキューベーターで１２〜９６時間程度培養、好ましくは１８〜２４時間培養し、培養後の細胞増殖度を測定することによりｈＨＧＦの生物活性を測定することができる。ｈＨＧＦ検体は、細胞の播種と同時に加えても良いし、細胞の培養容器播種前に加えても良い。
細胞の増殖度は、公知の方法に従って測定することができ、特に限定されるものではないが、例えば顕微鏡観察法、３Ｈ−チミジンの取込み測定法、ＬＤＨ（Ｌａｃａｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）法、ＭＴＴ（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）法、ＸＴＴ（２，３−ｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−５−［（ｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）法、ＷＳＴ−８（２−［２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ］−３−［４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ］−５−［２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ法などが挙げられ、好ましくは３Ｈ−チミジンの取込みを測定する方法により定量的に測定することができる。
ｈＨＧＦの生物活性、即ち力価の解析は、公知の統計解析方法により行うことができる。【００２６】  具体的には、以下の実施例に示すように、本発明株を用いてｈＨＧＦの生物学的分析を行うことができる。その結果、ｈＨＧＦ標準物質の本発明株に対する５０％反応濃度は、７．０〜１１．８ｎｇ／ｍＬ、平均９．７ｎｇ／ｍＬｄであることが確認された。さらに、再現性試験により本発明株を用いてＨＧＦの生物活性試験を行った結果、安定性及び再現性に優れたものであることが確認された。
【実施例】
【００２７】  本発明の細胞株の特性及び生物学的分析方法をより具体的に理解するために、以下に実施例をもって説明するが、これらは最良の態様の一例を示すものであって、本発明を何ら限定するものでもない。【００２８】（実施例１）細胞の培養
本発明のＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株は、ともに１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭ（１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）の培地を用いて培養した。【００２９】１）培養用試薬
ａ）培地：
Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）１０ｇ、硫酸ゲンタマイシン（シグマ社製）０．０５ｇ、炭酸水素ナトリウム（シグマ社製）３．７ｇを精製水１０００ｍＬに定溶し、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ，ミリポア社）で濾過滅菌し、この溶液に非働化（５６℃で、２０分処理）した牛胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社）を１１２ｍＬ添加して調製した。
ｂ）緩衝液：ＰＢＳ（−）
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（大日本製薬社製）を通常の方法に従い調製し、１２０℃、２０分で高圧滅菌処理した。
ｃ）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液
Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×）はシグマ社製のものを使用した。【００３０】２）無血清培地用試薬
ａ）無血清培地：０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭ
（０．５％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）
Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社製）１０ｇ、ウシアルブミン（第Ｖ分画）（シグマ社製）５ｇ、硫酸ゲンタマイシン（シグマ社製）０．０５ｇ、炭酸水素ナトリウム（シグマ社製）３．７ｇを精製水１０００ｍＬに定溶し、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ，ミリポア社）で濾過滅菌して調製した。
ｂ）緩衝液：ＰＢＳ（−）
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（大日本製薬社製）を通常の方法に従い調製し、１２０℃、２０分で高圧滅菌処理した。
ｃ）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液
Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×）はシグマ社製のものを使用した。【００３１】３）継代培養
直径１０ｃｍの培養ディッシュで培養を行った。
培養ディッシュに接着した細胞を５ｍＬのＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ液〔４ｍＬ  ＰＢＳ（−）と１ｍＬ  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×）〕を加えて、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーター中で静置した。細胞を５０ｍＬの遠心管に回収し、遠心（１０００ｒｐｍ×５分間、室温）と５ｍＬの１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭによる再懸濁を２回繰り返し、細胞を洗浄した。細胞数計測器で細胞数を計測し、１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭで適切な細胞濃度に調製した。別の培養ディッシュに細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーター中で培養した。【００３２】４）無血清培地による細胞の洗浄と懸濁
ＭＰＣ株又はＡＴＣＣ株の細胞を、１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭを用いて８０％コンフルエントまで前培養し、前記細胞の継代と同様に処理して５０ｍＬの遠心管に細胞を回収した。細胞懸濁液の遠心（１０００ｒｐｍ×５分間、室温）と５ｍＬの無血清培地での再懸濁を５回繰り返し、細胞をよく洗浄した。【００３３】５）ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の調製
ａ）１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭを用いて８０％コンフルエントまで前培養したＡＴＣＣ株の細胞の１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分を、前記無血清培地での細胞の洗浄と懸濁の方法に従って、無血清培地で洗浄・再懸濁した。
ｂ）細胞数計測器で細胞数を計測し、無血清培地を用いて、細胞濃度が１．１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。
ｃ）１０ｃｍの培養ディッシュに、前記細胞懸濁液を１８ｍＬを播種した。その結果、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ディッシュとなる。
ｄ）播種した細胞を３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで４８時間培養をした。
ｅ）培養上清を５０ｍＬの遠心管に回収し、１０００ｒｐｍで５分間室温で遠心し、沈殿物を除いて上清を集めた。
この操作を繰り返し、最後の遠心の上清を１００％ＡＴＣＣ株培養のコンディション培地として回収し、４℃で保存した。【００３４】６）９６穴プレート培養細胞への３Ｈ−チミジン（［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）のパルス
ａ）３Ｈ−チミジンはＡｍｅｒｓｈａｍ社製で、比活性２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１．０ｍＣｉ／ｍＬを使用した。３Ｈ−チミジンを、無血清培地を使って２０倍希釈し、５０μＣｉ／ｍＬとした。
ｂ）５０μＣｉ／ｍＬの３Ｈ−チミジンを、細胞培養を行っている９６穴プレートに２０μｌ／ｗｅｌｌ分注した。
ｃ）３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで、更に３．５時間インキュベートした。【００３５】７）９６穴プレートから細胞のハーベストとトリチウムβ線の計測
ａ）３Ｈ−チミジンでパルスラベルした９６穴プレートをインキュベーターから取り出し、培養上清を１２０μｌ／ｗｅｌｌ除去し、ＰＢＳ（−）を１２０μｌ／ｗｅｌｌ加え、さらに培養上清を１２０μｌ／ｗｅｌｌ除去した。
ｂ）６６．７％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（１×）を１５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで、更に０．５時間インキュベートした。
ｃ）セルハーベスター（ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ  ９６Ｒ  ＭＡＣＨ  ＩＩＩ  Ｍ、ＴＯＭＴＥＣ社）で細胞をハーベストした。
ｄ）細胞をハーベストしたフィルターマット（Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ）を、電子レンジを用いて１．５分間乾燥させ、乾燥させたフィルターマットに固形シンチレーター（ＭｅｌｔｉＬｅｘＴＭＡ（Ｍｅｌｔ−ｏｎ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏｒ  Ｓｈｅｅｔｓ、Ｗａｌｌａｃ社製）をのせ、ホットプレート上でシンチレーターを溶かした。
ｅ）フィルターマット上で溶けたシンチレーターを空冷によって再び固まらせた後、フィルターマットをシンチレーションカウンター１４５０  ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｗａｌｌａｃ社）で、１分間、トリチウムβ線のカウントを計測した。このカウントが細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジンの量であり、細胞の増殖の程度を示す。【００３６】（実験例１）ＨＧＦレセプターの発現解析
本発明のＭＰＣ株がＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）を発現しているか否かを解析した。
１）材料
ＭＰＣ株及び対照細胞としてＡＴＣＣ株を用いた。
２）解析
解析には、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製の解析ソフトウェアＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ｖｅｒ５．０を使用した。解析結果のシグナル値は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＲ全遺伝子の蛍光強度平均値が１００となるように、実際の測定値を標準化して求めた。シグナル値が大きいほど発現量が高いと解釈される。この解析ソフトウェアを使って、対象遺伝子の相補配列と完全に一致する配列を持つ２５塩基の完全プローブのシグナル値と完全プローブの真中１３番目の塩基をミスマッチにしたミスマッチプローブのシグナル値の比較を行い、遺伝子が発現している（″ＰＲＥＳＥＮＴ″）、検出されない（″ＡＢＳＥＮＴ″、ｕｎｄｅｔｅｃｔｅｄ）、又は、その中間（″ＭＡＲＧＩＮＡＬ″）といった３タイプのいずれかに分類判定した。
３）結果
その結果、無血清培地条件下でＭＰＣ株、ＡＴＣＣ株ともにｃ−Ｍｅｔを発現しており、シグナル値はそれぞれ４３及び４０であり、両株ともほぼ同じレベルであった。このことから、ＭＰＣ株、ＡＴＣＣ株ともにＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）を発現していることが確認された。【００３７】（実験例２）ＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株のｒｈＨＧＦ依存性細胞増殖応答の解析と比較
ＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株について、ｃ−Ｍｅｔを発現していることが確認されたので、ｒｈＨＧＦに対する増殖応答性について顕微鏡観察により確認した。ｒｈＨＧＦはＣＨＯ細胞で発現させ、培養上清から精製して得たものを使用した。このｒｈＨＧＦサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で精製後の品質がチェックされている。【００３８】１）処理方法
ａ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュのＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株を、前記無血清培地による細胞の洗浄と懸濁の方法に従い、無血清培地で洗浄と懸濁を行った。無血清培地により細胞濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調整した。
ｂ）１０μｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦを、無血清培地により０ｎｇ／ｍＬ，２０ｎｇ／ｍＬ，２００ｎｇ／ｍＬ（最終濃度の２倍濃度）となるように希釈系列を作製した。
ｃ）６ｍＬの細胞懸濁液（細胞濃度２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）と、６ｍＬの各ｒｈＨＧＦ希釈液を混合し、１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。（細胞密度：１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍディッシュ、ｒｈＨＧＦ最終濃度：０ｎｇ／ｍＬ，１０ｎｇ／ｍＬ，１００ｎｇ／ｍＬ）
ｄ）３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで２４時間インキュベートし、顕微鏡観察を行った。【００３９】２）結果
その結果、ＭＰＣ株では無血清培地条件では丸い形態のまま培養ディッシュに張り付かず、増殖もしなかった（図１Ａ参照）。しかし、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると、ｒｈＨＧＦ濃度１０ｎｇ／ｍＬ，１００ｎｇ／ｍＬと濃度依存的に培養ディッシュに張り付くようになり、増殖応答を示すようになった（図１Ｂ、Ｃ参照）。
一方、ＡＴＣＣ株ではｒｈＨＧＦを含まない無血清培地中でも高い増殖能を示し（図１Ｄ参照）、これに、ｒｈＨＧＦを添加してもＡＴＣＣ株の増殖にはほとんど影響なかった（図１Ｅ、Ｆ参照）。
以上の結果より、次の事柄が確認された。
（１）ＭＰＣ株は、無血清培地だけでは増殖しない。
（２）ＭＰＣ株は、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると増殖するようになる。
（３）ＡＴＣＣ株は、無血清培地でも増殖する。【００４０】（実験例３）ＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α依存性細胞増殖能
ＭＰＣ株が持つ増殖因子に対する応答性の特徴を明らかにする為に、細胞増殖能を３Ｈ−チミジンの取込み量測定によって定量的に解析した。まずｒｈＨＧＦに対する増殖応答性を解析し、次にｒｈＨＧＦ以外の各増殖因子（ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α）に対する応答性と比較した。【００４１】１）材料
ａ）ｒｈＨＧＦは実験例２と同様のものを用いた。
ｂ）ｒｈＥＧＦは、市販の組換えヒト上皮細胞増殖因子〔ｒｈＥＧＦ、大腸菌を宿主として発現させた組換えタンパク質（湧永製薬製）〕を用いた。ｒｈＥＧＦは１００μｇを１ｍＬの２０ｍＭ  ＨＣｌで溶解して１００μｇ／ｍＬとした。これを無血清培地で１０倍希釈し、１０μｇ／ｍＬをストック液とした。
ｃ）ｒｈＴＧＦ−αは、市販の組換えヒトトランスフォーミング増殖因子α〔ｒｈＴＧＦ−α（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）〕を使用した。ｒｈＴＧＦ−αを１０ｍＭ酢酸、０．１％ＢＳＡ液を含む液で溶解し、５００μｇ／ｍＬとした。これを無血清培地で５０倍希釈し、１０μｇ／ｍＬをストック液とした。
ｄ）３Ｈ−チミジン（［ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）
３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、比活性２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：１．０ｍＣｉ／ｍＬ）【００４２】  ｒｈＨＧＦは最終濃度が０，１，２，５，１０，２０，５０，１００，２００，５００，１０００及び２０００ｎｇ／ｍＬとなるようにした。ｒｈＨＧＦの上記の重量濃度をモル濃度に換算すると、ｒｈＨＧＦの最終モル濃度系列は０，９．７×１０−１２，１．９×１０−１１，４．９×１０−１１，９．７×１０−１１，１．９×１０−１０，４．９×１０−１０，９．７×１０−１０，１．９×１０−９，４．９×１０−９，９．７×１０−９及び１．９×１０−８ｍｏｌ／Ｌとなる。
又、ｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αの最終濃度は、何れも０，０．００５，０．０１，０．０２，０．０５，０．１，０．２，０．５，１．０，２．０，５．０，１０．０，２０．０，５０．０，１００及び２００ｎｇ／ｍＬとなるようにした。ｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αの分子量は何れも約６ＫＤａであることから、ｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αの最終モル濃度系列は０，８．３×１０−１３，１．７×１０−１２，３．３×１０−１２，８．３×１０−１２，１．７×１０−１１，３．３×１０−１１，８．３×１０−１１，１．７×１０−１０，３．３×１０−１０，８．３×１０−１０，１．７×１０−９，３．３×１０−９，８．３×１０−９，１．７×１０−８，３．３×１０−８ｍｏｌ／Ｌとなる。【００４３】２）処理方法
ａ）１０μｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αのストック液から、無血清培地を使って上記最終濃度の２倍濃度の希釈系列を作製した。ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αの各２倍濃度系列を９６穴プレートに、１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ｂ）分注した９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で、１．５時間インキュベートした。
ｃ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分のＭＰＣ株を、前記無血清培地による細胞の洗浄と懸濁の方法に従い、洗浄及び懸濁を行った。無血清培地により細胞濃度が７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液をｂ）でインキュベートした９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。細胞密度は、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなり、ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αは上記最終濃度となる。
ｄ）ｃ）で分注した９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、２１時間インキュベートした。
ｅ）各ウェルに１μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう３Ｈ−チミジンを加えてさらに３．５時間インキュベート後、前記９６穴プレート培養細胞をハーベストし、３Ｈ−チミジンの取込みを測定した。【００４４】３）結果
増殖因子を含まない無血清培地中での３Ｈ−チミジンの取込み実測値を１とし、各種増殖因子を添加したときの３Ｈ−チミジンの取込み値の相対値をプロットし、ＭＰＣ株の増殖因子依存の細胞増殖応答を定量的に確認した（図２参照）。【００４５】  ＭＰＣ株は、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると、１．９×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ（２ｎｇ／ｍＬ）から濃度依存的に３Ｈ−チミジン取込み量の上昇を示すようになり、９．７×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）では、１１．２倍の最大取込み量を示した。更に高濃度のｒｈＨＧＦを添加した場合、４．９×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（５００ｎｇ／ｍＬ）までは、安定して１０倍以上の取込み量を示したが、９．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（１０００ｎｇ／ｍＬ）以上になると、逆に取込み量は減少する傾向が見られた。
ｒｈＥＧＦを添加すると、１．７×１０−１２ｍｏｌ／Ｌ（０．０１ｎｇ／ｍＬ）から取込み量が上昇し始め、３．３×１０ｍｏｌ／Ｌ（０．５ｎｇ／ｍＬ）の濃度で８．４倍の最大取込み量を示した。更に高濃度のｒｈＥＧＦを添加すると８．３×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（５０ｎｇ／ｍＬ）まで、６．６〜８．４倍の範囲での変動はあるものの、安定した取込み量を示し、１．７×１０−８ｍｏｌ／Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）以上で減少する傾向が観察された。【００４６】  ｒｈＴＧＦ−αでは、８．３×１０−１２ｍｏｌ／Ｌ（０．０５ｎｇ／ｍＬ）から取込み量が上昇し始め、８．３×１０−１０ｍｏｌ／Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）で、４．８倍の最大取込み量を示した。更に高濃度のｒｈＴＧＦ−αでも安定した取込み量を示し、１．７×１０−８ｍｏｌ／Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）以上でやや減少する傾向が観察された。
ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αの３種の増殖因子に対するＭＰＣ株の増殖応答性を比較すると、無血清培地条件と比較して３倍以上の取込み量を示すのに、ｒｈＨＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αではほぼ同じ位のモル濃度（１０−１１ｍｏｌ／Ｌ）を必要とし、ｒｈＥＧＦはこれより１０倍低いモル濃度（１０−１２ｍｏｌ／Ｌ）を必要とした。また、ＭＰＣ株は９．７×１０−１１ｍｏｌ／Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）から９．７×１０−９ｍｏｌ／Ｌ（１０００ｎｇ／ｍＬ）の範囲で、３種の増殖因子の中で、ｒｈＨＧＦに対して最も高い取込み量を示した。【００４７】  以上の結果より、次の事柄が確認された。
（１）ＭＰＣ株は、無血清培地にｒｈＨＧＦを添加すると増殖することが定量的に再確認された。
（２）ＭＰＣ株は、無血清培地にｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αを添加すると増殖した。
（３）ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αによるＭＰＣ株の増殖は、濃度依存的であった。
（４）ＭＰＣ株は、ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αの中では、ｒｈＨＧＦに対して最も強い増殖応答を示した。【００４８】（実験例４）ｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株におけるＨＧＦレセプター（ｃ−Ｍｅｔ）の発現変動解析
実験例２及び３よりＭＰＣ株とＡＴＣＣ株の間ではｒｈＨＧＦに対する増殖応答性が大きく異なることが確認された。ここでは、ｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株におけるＨＧＦレセプターの発現変動を解析した。
実験材料、方法及び解析は実験例１と同様に行った。
その結果を図３に示した。無血清培地条件で培養したときの発現量はＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株で、各々４３及び４０であったのに対し、ｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株及びＡＴＣＣ株におけるＨＧＦレセプターの発現は各々１２７及び５５であり、ＡＴＣＣ株のシグナル値は１．４倍程度に上昇したのみであったのに対し、ＭＰＣ株のシグナル値は約３倍程度にまで上昇した。【００４９】（実験例５）ＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ依存細胞増殖応答の特異性の解析
実験例２及び３から、ＭＰＣ株はｒｈＨＧＦに対して濃度依存的に強い増殖応答性を示すことがわかった。しかし、この解析実験には、非特異的な増殖の可能性が残る。そこで、その可能性を否定し、ｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株の増殖はｒｈＨＧＦタンパク質そのものが持つ生理活性作用を特異的に反映している現象であることを検証するために、ｈＨＧＦに対して特異的に反応する抗体〔抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製又は、ＭＰＣ社製）〕添加し、ＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α依存細胞増殖応答を中和させることができるかどうかを解析した。【００５０】１）材料
ａ）ｒｈＨＧＦの最終濃度は１００ｎｇ／ｍＬである。また、使用したｒｈＥＧＦ及びｒｈＴＧＦ−αの最終濃度は、５ｎｇ／ｍＬである。使用した抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び、抗ｈＨＧＦ抗体（ＭＰＣ）の最終濃度は０，０．０１，０．０２５，０．１，０．２５，１，２．５，１０，２５及び１００μｇ／ｍＬである。
ｂ）抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、Ｓｆ２１で発現させたｒｈＨＧＦを抗原として使用し、ヤギを免疫して得られたポリクローナル抗体であって、特定の増殖因子又はレセプターと反応しないことが既に確認されているものを使用した。
ｃ）抗ｈＨＧＦ抗体（ＭＰＣ社製）は、ＣＨＯ細胞で発現させたｒｈＨＧＦを抗原として使用し、ウサギを免疫して得られたポリクローナル抗体である。【００５１】２）方法
ａ）１０μｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αのストックから、いずれも最終濃度の４倍になるように無血清培地で希釈した。各成長因子希釈液を９６穴プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ｂ）抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）又は、抗ｈＨＧＦ抗体（ＭＰＣ社製）を、無血清培地で最終濃度の４倍となるように希釈系列を作製した。ａ）で増殖因子を分注した９６穴プレートに、各濃度の抗体を含む培地を５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ｃ）増殖因子及び抗ｈＨＧＦ抗体を分注した９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで、１．５時間インキュベートした。このインキュベーションによって、増殖因子と抗ｈＨＧＦ抗体の反応を進めた。
ｄ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分のＭＰＣ株について、前記無血清培地による洗浄と懸濁を行った。無血清培地を用いて細胞濃度が７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにし、細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液をｂ）で準備した９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。細胞密度は、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであり、ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α及び、抗ｈＨＧＦ抗体濃度は上記最終濃度となる。
ｅ）ｄ）の９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで、２１時間インキュベートした。各ウェルに１μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう３Ｈ−チミジンを加えてさらに３．５時間インキュベート後、前記細胞のハーベストとトリチウムβ線を計測した。【００５２】３）結果
抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製及びＭＰＣ社製）は、ＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ依存細胞増殖応答に対して、その効果を打ち消すように作用した。その結果を図４及び図５に示した。図４及び図５は、抗体濃度を０ｍｇ／ｍＬとしてｒｈＨＧＦのみを添加した時の３Ｈ−チミジン取り込み実測値を１として、各種抗体を添加したときの３Ｈ−チミジンの取込み値の相対値をプロットしたものである。
０．１μｇ／ｍＬ以下の抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）では、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株の増殖をほとんど阻害しなかったが、１μｇ／ｍＬの抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦによるＭＰＣ株の増殖をほぼ完全に阻害し、約０．４μｇ／ｍＬで５０％阻害した（図４参照）。
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製以外の抗ｈＨＧＦ抗体（ＭＰＣ社製）を使用しても、同様にＭＰＣ株のｒｈＨＧＦ依存細胞増殖応答を中和させることができた（図５参照）。
一方、ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−α依存細胞増殖応答に対して抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は中和効果を示さなかった。その結果を図６に示した。１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦによるＭＰＣ株の増殖をほぼ完全に阻害するのに１μｇ／ｍＬの濃度の抗ｈＨＧＦ抗体が必要であった。しかし、同濃度の抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）では、５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ及びＴＧＦ−αによるＭＰＣ株の増殖を阻害しなかった。更に高濃度である１０μｇ／ｍＬの抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）でもまったく阻害しなかった。【００５３】  以上より、ｒｈＨＧＦによるＭＰＣ株の増殖は抗ｈＨＧＦ抗体により阻害されるが、ｒｈＥＧＦ又はｒｈＴＧＦ−αによるＭＰＣ株の増殖は、抗ｈＨＧＦ抗体により阻害されないことが確認された。これらの結果は、抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）がｒｈＨＧＦと特異的に反応した結果、その生理活性を中和したと理解され、ｒｈＨＧＦ添加によるＭＰＣ株の増殖はｒｈＨＧＦタンパク質そのものが持つ生理活性作用を特異的に反映している現象であると結論することができた。【００５４】（実験例６）ＡＴＣＣ株培養のコンディション培地が有するＭＰＣ株に対する増殖効果の解析
実験例１で、ＡＴＣＣ株は無血清培地でも増殖することから、ＡＴＣＣ株は何らかの増殖因子を自ら産生・分泌し、この増殖因子が無血清培地中でのＡＴＣＣ株自身の増殖を促進している（オートクライン増殖）ということが考えられた。そこでＡＴＣＣ株培養コンディション培地を調製し、該コンディション培地にＭＰＣ株の増殖応答を引き起こす活性が有るか無いかを観察した。【００５５】１）顕微鏡観察
ａ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分のＭＰＣ株について、前記無血清培地による洗浄と懸濁を行った。１０ｍＬの前記細胞懸濁液を５ｍＬずつ２分割し、遠心により回収した一方を５ｍＬの無血清培地、もう一方を５ｍＬのＡＴＣＣ株培養のコンディション培地で再懸濁した。
ｂ）無血清培地又はＡＴＣＣ株培養のコンディション培地を用いて細胞濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにし、細胞懸濁液を調製した。
ｃ）０％ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の条件：６ｍＬの無血清培地と６ｍＬの２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの無血清培地に懸濁したＭＰＣ株細胞を混合した。
ｄ）２５％ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の条件：３ｍＬの無血清培地と３ｍＬのＡＴＣＣ株培養コンディション培地、６ｍＬの２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの無血清培地に懸濁したＭＰＣ株細胞を混合した。
ｅ）１００％ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の条件：６ｍＬのＡＴＣＣ株培養コンディション培地と６ｍＬの２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの無血清培地に懸濁したＭＰＣ株細胞を混合した。
ｆ）これら細胞を１０ｃｍの培養ディッシュに播種した。細胞密度は、１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍディッシュとした。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで、培養し、４８時間後の細胞の増殖状態を顕微鏡で観察した。【００５６】２）結果
ＭＰＣ株は無血清培地では増殖しなかった（図７Ａ参照）が、無血清培地にＡＴＣＣ株培養コンディション培地を２５％添加するとＭＰＣ株は増殖し、更にＡＴＣＣ株培養コンディション培地を１００％にすると、２５％の時よりも一層強い増殖応答を示した（図７Ｂ，Ｃ参照）。【００５７】（実験例７）ＡＴＣＣ株培養のコンディション培地が有するＭＰＣ株に対する増殖効果の定量的解析（３Ｈ−チミジンの取込み量測定）
上記実験例６と同様にＡＴＣＣ株培養コンディション培地を調製し、この培地が有するＭＰＣ株の増殖活性を３Ｈ−チミジンの取込み量を測定することで定量解析した。【００５８】１）方法
ａ）１倍のＡＴＣＣ株培養コンディション培地を無血清培地により希釈し、最終希釈率の２倍希釈液を調製した。これを９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌ分注した。該９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで１．５時間インキュベートした。
ｂ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分のＭＰＣ株を、無血清培地を用いて洗浄・懸濁した。
ｃ）１０ｍＬの細胞懸濁液を５ｍＬずつ２分割し、遠心し、回収した細胞の一方を５ｍＬの無血清培地に、もう一方を５ｍＬのＡＴＣＣ株培養コンディション培地に再懸濁した。無血清培地又はＡＴＣＣ株培養コンディション培地により、細胞濃度が７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を調製した。
ｄ）上記ＭＰＣ株懸濁液をそれぞれ１００μｌ／ｗｅｌｌずつａ）の９６穴プレートに分注した。このとき細胞密度は、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなり、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地希釈倍数は、最終的に０，２×１０−４，３×１０−４，１×１０−３，３×１０−３，１×１０−２，３×１０−２，１×１０−１，３×１０−１及び１倍となる。該９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで２１時間インキュベートした。
ｅ）各ウェルに１μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう３Ｈ−チミジンを加えてさらに３．５時間インキュベート後、前記９６穴プレート培養細胞のハーベストとトリチウムβ線の計測を行った。【００５９】２）結果
ＭＰＣ株のＡＴＣＣ株培養コンディション培地による増殖応答を定量的に測定した結果を図８に示した。無血清培地での３Ｈ−チミジンの取込み実測値（３，４３５ｃｐｍ）を１として、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の濃度を上げた時の３Ｈ−チミジンの取込み量値の変化を相対値としてプロットした。
ＭＰＣ株はＡＴＣＣ株培養コンディション培地の濃度依存的に増殖能力が増大し、３％（３×１０−２）希釈で１．９倍、１０％（１×１０−１）希釈で３．３倍の増殖応答を示した。そして、最大の１００％（１倍）原液では、５．１倍の増殖応答を示した。実験例６及び７の結果から、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地には、ＭＰＣ株の増殖応答を促進させる活性があることが確認された。このことは、ＡＴＣＣ株はＭＰＣ株の増殖を促進させる何らかの液性の因子を培地中に分泌すること示唆するものである。【００６０】（実験例８）抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）による、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地のＭＰＣ株細胞増殖活性の中和解析
実験例３で、ＭＰＣ株は、ｒｈＨＧＦ，ｒｈＥＧＦ，ｒｈＴＧＦ−αに対して増殖応答を示した。そこで、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地にｒｈＨＧＦが主要な活性成分として含まれるのかどうかを検討する為に、ＡＴＣＣ株培養コンディション培地の条件において、抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）による活性中和解析を行った。使用したＡＴＣＣ株培養コンディション培地の最終濃度は７５％とした。【００６１】１）方法
ａ）ＡＴＣＣ株培養コンディション培地を９６穴プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。無血清培地を用いて、抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）が最終濃度の４倍となるように希釈系列を作製し、上記９６穴プレートに５０μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。
ｂ）ａ）で準備した９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで１．５時間インキュベートした。
ｃ）前培養した１０ｃｍ培養ディッシュ２枚分のＭＰＣ株について、前記無血清培地による洗浄と懸濁を行った。尚、最後の懸濁は、無血清培地の代わりにＡＴＣＣ株培養コンディション培地によった。ＡＴＣＣ株培養コンディション培地により、細胞濃度が７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにした細胞懸濁液を調製した。
ｄ）細胞懸濁液をｂ）で準備した９６穴プレートに１００μｌ／ｗｅｌｌずつ分注した。細胞密度は７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなり、抗ｈＨＧＦ抗体濃度は最終濃度０，０．０１，０．０２５，０．１，０．２５，１，２．５，１０，２５及び１００μｇ／ｍＬとなる。
ｅ）上記前記９６穴プレートを３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで２１時間インキュベートした。
ｆ）終濃度１μＣｉ／ｗｅｌｌとなるよう３Ｈ−チミジンを加え、さらにインキュベートした。
ｇ）前記９６穴プレート培養細胞のハーベストとトリチウムβ線の計測を行った。【００６２】２）結果
実験例５の結果、１μｇ／ｍＬの抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）は、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＨＧＦによるＭＰＣ株の増殖をほぼ完全に阻害した（図４参照）。一方、同濃度の抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）では７５％ＡＴＣＣ株培養コンディション培地によるＭＰＣ株の増殖を阻害しなかった（図９参照）。更に高濃度（１０μｇ／ｍＬ）の抗ｈＨＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）でもほとんど阻害しなかった。
このことより、ＡＴＣＣ株の培養コンディション培地中には、ＨＧＦ以外を主成分とする何らかの可溶性増殖因子が存在することが示唆された。又、ＡＴＣＣ株はこの可溶性増殖因子をオートクラインで放出し、自己増殖能を持つ細胞株と考えられた。【００６３】（実験例９）ＨＧＦの生物活性
上記実験例１〜８の結果により、本発明のＭＰＣ株を使用すると、ＨＧＦの生物活性を測定可能であることが示唆された。実際に、ＭＰＣ株を使用して標準物質を対照にＨＧＦの生物活性を測定した。
生産された組換えヒトＨＧＦの複数のロットのうち、純度、夾雑物その他の理化学的分析値に問題が無く、さらに−８０℃で保存し、その条件下で分解と生物学的活性低下の起こらないことを確認した１ロットを標準物質として使用した。【００６４】１）材料
ａ）被験物質
被験物質として、組換えヒトＨＧＦ原薬（Ｌｏｔ：００１，００２，００３，００４及び００５は冷凍（−８０℃保存）及び暗所密封保存したものを使用した。被験物質は以下に示すタンパク質含量約１０ｍｇ／ｍＬの無色澄明な液体である。
（１）名称            ：ＨＧＦ（ヒト肝実質細胞増殖因子）
（２）性状            ：無色澄明の液
（３）純度（逆相ＨＰＬＣ）（％）  ：９８．９，９９．０，９８．９，９８．２，９８．５
（４）分子量          ：約８５０００
（５）タンパク質含量（ｍｇ／ｍＬ）：１０．２，９．２，９．９，１０．３，１０．５
（８）保存条件        ：−８０℃保存、暗所、密封容器【００６５】ｂ）標準物質
（１）名称            ：ＨＧＦ（ヒト肝実質細胞増殖因子）
（２）性状            ：無色澄明の液
（３）ｐＨ７．１
（４）純度（逆相ＨＰＬＣ）（％）  ：９８．９
（５）分子量          ：約８５０００
（６）タンパク質含量（ｍｇ／ｍＬ）：１．９
（７）保存条件        ：−８０℃保存、暗所、密封容器【００６６】２）処理方法
ａ）試験物質
ＨＧＦの最終濃度が、０，１，２，４，８，１６，３１．３，６２．５，１２５，２５０，５００，１０００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。
ｂ）ＭＰＣ株細胞処理
１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭを用いて、ＭＰＣ株細胞が１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ密度となるように細胞懸濁液を調製し、細胞浮遊液を径１０ｃｍのディッシュに１０ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで約７２時間培養後に培養液を除去し、新しい１０％ＦＢＳ／Ｄ−ＭＥＭを１０ｍＬ加えて、さらに約２４時間培養し、前培養とした。
前培養終了後、細胞表面をＰＢＳ（−）で洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ処理にて細胞を剥離した後、遠心管に回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間）により細胞を集めた。上清を除去し、０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭを１０ｍＬ加えピペッティング及び遠心分離（１０００ｒｐｍ×３分間）を３回繰り返し、細胞を洗浄した。洗浄した細胞の細胞数を計数し、０．５％ＢＳＡ／Ｄ−ＭＥＭに浮遊させ、７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ密度の細胞懸濁液を調製した。
ｃ）９６穴プレートへの細胞播種
上記細胞懸濁液を、１００μＬ容量ずつ各ウェルに加えた。ＨＧＦ濃度は１列から１２列の順番に０，１，２，４，８，１６，３１．３，６２．５，１２５，２５０，５００及び１０００ｎｇ／ｍＬとなるようにした。該９６穴プレートを５％ＣＯ２のＣＯ２インキュベーターで約１９時間インキュベートした。
ｄ）終濃度１μＣｉ／ウェルとなるよう３Ｈ−チミジンを加え、５％ＣＯ２、３７℃の条件でさらに３．５時間培養した。
ｅ）インキュベート後、前記９６穴プレート培養細胞をハーベストし、３Ｈ−チミジンの取込みを測定した。【００６７】３）力価（％）の算出
ａ）ＳＡＳ（リリース６．１２，ＴＳレベル００６０）を用いた非線形回帰分析（ＨＧＦの効力検討のためのＳＡＳプログラム）により，以下の値を求めた。
（１）最大飽和活性値（ｃｐｍ／ｗｅｌｌ）＝Ａ
（２）シグモイド曲線の傾き＝Ｂ
（３）最大飽和活性値の１／２を誘導するのに必要なＨＧＦ濃度
（５０％反応濃度，常用対数値）＝Ｃ
（４）最小値＝Ｄ
ｂ）次式にしたがって力価（％）を求めた。
（１）５０％反応濃度（ｎｇ／ｍＬ）＝１０（Ｃ）＝Ｅ
（２）５０％飽和活性（ｃｐｍ／ｗｅｌｌ）＝（Ａ−Ｄ）／１＋ＥＸＰ［Ｂ×〔ＬＯＧ１０（Ｅ）−（Ｃ）〕］＋Ｄ＝Ｆ
（３）比活性（ｃｐｍ／ｎｇ）＝Ｆ／（０．２×Ｅ）＝Ｇ
（４）比活性による力価（％）＝被験物質の比活性Ｇ／対照物質の比活性Ｇ×１００
（５）５０％反応濃度による力価（％）＝
被験物質の５０％反応濃度Ｅ／対照物質の５０％反応濃度Ｅ×１００
（６）最大飽和活性値による力価（％）＝
被験物質の最大飽和活性値Ａ／対照物質の最大飽和活性値Ａ×１００【００６８】４）結果
ＨＧＦ原薬生物活性試験結果を表１に示した。
また、各測定毎に対照物質および被験物質の放射活性測定値（ｃｐｍ／ｗｅｌｌ）を図１０に示した。
以上の結果より、本発明のＭＰＣ株を使用することで、ＨＧＦの生物活性を定量的に測定しうることが確認された。【００６９】［表１］
2005001071.tif 000002
【００７０】（実験例１０）ＨＧＦの生物活性の日差再現性
ＭＰＣ株を用いて標準物質を対照にＨＧＦ（Ｌｏｔ：００１）の生物活性を３回測定したときの再現性を確認した。【００７１】１）材料
被験物質（ＨＧＦ、Ｌｏｔ：００１）及び標準品は、実験例９と同様のものを使用した。
２）処理方法及び力価（％）の算出
実験例９と同様にした。
３）結果
ＨＧＦ原薬生物活性試験結果を表２に示した。その結果、測定の再現性については信頼性が認められ、本発明のＭＰＣ株を使用することで、ＨＧＦの生物活性を測定しうることが確認された。【００７２】［表２］
2005001071.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００７３】  本発明のＭＰＣ株を使用すると、ＨＧＦの生物活性を定量的に測定することが可能となり、より効果的にＨＧＦの医薬品としての開発を行うことができる。
【図１】
2005001071.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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