(57)【要約】腎性糖尿病に関与する新規グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ、その遺伝子、及びそれらの変異体、及び、それらの利用を提供するものである。本発明のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ及びその遺伝子は、腎性糖尿病に関与するグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ及びその遺伝子であり、該タンパク質及び遺伝子は、腎臓で高発現し、腎でのグルコース再吸収において、より大きな寄与を果たす新規タンパク質及びその遺伝子からなる。本発明は、該タンパク質及び遺伝子の変異体、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体を包含する。更に、本発明は、本発明の遺伝子を染色体上で欠損させたモデル非ヒト動物、腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニング方法、該遺伝子や抗体を用いたグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能や腎疾患の診断方法や本発明の遺伝子を組織細胞に導入して該組織細胞のトランスポータ機能を調節する方法も包含する。
2004055184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ））配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチド
【請求項４】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３記載のＤＮＡを、発現ベクターに組込み、該組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して発現することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドの製造法。
【請求項７】
請求項４又は５記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項８】
抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体。
【請求項９】
抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを動物組織細胞に導入することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法。
【請求項１１】
物組織細胞が、ラット腎臓の組織細胞、ブタ腎臓由来上皮細胞、イヌ腎臓由来上皮細胞、又はフクロネズミ腎臓由来上皮細胞であることを特徴とする請求項１０記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法。
【請求項１２】
動物組織細胞が、ヒト胎児腎臓の形質転換細胞株ＨＥＫ２９３であることを特徴とする請求項１０記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか記載の方法により製造されたことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞。
【請求項１４】
請求項１３記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞を用いて、被研物質のグルコース輸送機能への影響を測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能調節活性を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
配列表の配列番号２に示されるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とする腎におけるグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項１６】
グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１５記載の腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の腎におけるグルコース及び／又はフルクトース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるグルコース再吸収能を測定・評価することを特徴とするグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用プローブ。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ。
【請求項２０】
請求項７〜９のいずれか記載の抗体及び／又は請求項１８記載の診断用プローブを用意することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用薬剤。
【請求項２１】
被検組織から試料を得、該試料における請求項１記載の遺伝子の発現を測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の遺伝子の発現の測定を、請求項１８記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用プローブ、或いは請求項１９記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法。
【請求項２３】
被検組織から試料を取得、培養し、該試料における遺伝子の発現により生成される請求項４記載のポリペプチドを、測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法。
【請求項２４】
請求項２３記載のポリペプチドの測定を、請求項７〜９のいずれか記載の抗体を用いて行うことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断が、腎疾患におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の測定であることを特徴とする腎疾患の診断方法。
【請求項２６】
動物組織細胞に、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法。
【請求項２７】
動物組織細胞における請求項１記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法。
【請求項２８】
動物組織細胞における請求項１記載のＤＮＡの発現の抑制が、請求項１記載のＤＮＡ塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部を動物組織細胞に導入することにより行われることを特徴とする動物組織細胞グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法。
【請求項２９】
動物組織細胞が、動物腎細胞であることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか記載の動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ、その遺伝子、その変異体、及びそれらの利用に関する。
【背景技術】  ヒトの腎臓は２つ合わせても体重のわずか０．５％に過ぎないが、心拍出量の約２０％、即ち毎分１〜１．２Ｌもの血液が流れ込んでいる。その血漿流量の約２０％、即ち毎分１２０ｍＬ（１日２００Ｌ）が糸球体で濾過され原尿となるが、その９９％は尿細管で再吸収され、残りの１．５〜２Ｌが１日の尿量となる。腎臓は機能単位であるネフロンとそれを取りまく血管系から構成されている。ネフロンは糸球体に始まり、近位尿細管、中間部尿細管（ヘンレループ細脚）、遠位尿細管を経て集合管系に至る。それぞれの分節は異なった機能と形態を有し、協同的に尿の濃縮・生成に関与している。特に、近位尿細管を構成する細胞では管腔側刷子縁膜の発達により表面積が大きいため、原尿中の水や電解質の他低分子性の栄養物質を再吸収したり、血液中の薬物や異物を分泌する際に効率的な形態となっている（月刊薬事  Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．３，ｐｐ２９−３４，２００１、月刊薬事  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．４，ｐｐ１１３−１２０，２０００）。
近位尿細管上皮細胞の血液側側底膜と管腔側刷子縁膜には、このように多様な物質の再吸収と分泌を媒介するトランスポータ（輸送体）が局在し、方向選択的な物質輸送を可能とするネットワークが形成されている（ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ，１１，２２−２５，１９９６、生体の科学、５０，２６８−２７３，１９９９）。この数年間に、グルコースの腎排泄調節を司るグルコーストランスポータの遺伝子のクローニングと、構造・機能解析が著しく進展し、腎臓において、糸球体で尿中へ移行したグルコースが、再吸収されて血液中へ戻される機構が分子レベルで明らかにされつつある。
即ち、血中グルコースは腎糸球体で濾過され、尿細管で再吸収を受ける。この機構により正常血糖時には、グルコースは１００％再吸収され循環血中に戻る。
そこで、グルコースやアミノ酸等の水溶性分子やイオンは、リン脂質二重層からなる生体膜を速やかに通過することができないために、一般的には、細胞膜や膜小器官にはこれらの分子を特異的に輸送するための輸送タンパク質が存在する。このような細胞内外の物質輸送を行う膜タンパク質が、トランスポータであるが、トランスポータは、体内に取りこまれた薬物、栄養物等が各組織に移動する過程や、各組織に蓄積した老廃物の排出に関与している（特開２００２−１７１９８０号公報）。腎臓においては、近位尿細管上皮細胞の血液側側底膜と管腔側刷子縁膜に、多様な物質の再吸収と分泌を媒介するトランスポータ（輸送タンパク質）が局在し、細胞内外に形成された膜電位差やＰＨ勾配等の環境特性を巧みに利用した方向選択的な物質輸送を可能とするネットワークが形成されている（ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ，１１，２２−２５，１９９６、生体の科学，５０，２６８−２７３，１９９９）。
脊椎動物のグルコーストランスポータは、大きく２種類に分けられる。１つは促進グルコーストランスポータ（ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＧＬＵＴ）とよばれるもので、細胞内外のグルコース濃度勾配にしたがって輸送を行う促進拡散型の輸送担体である。このタンパク質はさらに８つのアイソフォームが存在し、分子量約５０，０００の１２回膜貫通型タンパク質である（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５，５９１−６０８，１９９３、ＴＩＢＳ  ２３，４７６−４８１，１９９８、特開２００２−２１８９８１号公報）。基本的に、すべての細胞は少なくとも１つのタイプのＧＬＵＴを発現させ、それによって必要なグルコースを細胞外から得ている。もう１つは、Ｎａ＋／グルコーストランスポータ（Ｎａ＋−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＳＧＬＴ）で、Ｎａイオンと共役することでグルコースを濃度勾配に逆らって輸送する能動輸送担体であり、分子量約７５，０００の１４回膜貫通型タンパク質である。
このタンパク質は小腸と腎臓の管腔（ｌｕｍｅｎ）側に面した上皮細胞の頂端側細胞膜（ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に存在し、細胞内外のＮａ＋の電気化学ポテンシャルの勾配を利用してグルコースを細胞内へ取り込む能動輸送を行っている（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７４，９９３−１０２６，１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６，（５Ｐｔ１），Ｇ１２５１−１２５９，１９９９、特開２００２−２１８９８１号公報）。ＳＧＬＴによって上皮細胞内に取り込まれたグルコースとＮａ＋は、側底膜（ｂａｓｏ−ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に存在するＧＬＵＴ−２とＮａ＋−Ｋ＋ポンプの働きで血中へ放出される。
哺乳類のＳＧＬＴは、輸送特性によって更に、ＳＧＬＴ−１とＳＧＬＴ−２の二つのタイプに分類される。ＳＧＬＴ−１は、糖１分子あたり２個のＮａ＋イオンを輸送し、グルコースとガラクトースに対して高い親和性を持ち、小腸と腎臓で発現している。一方、ＳＧＬＴ−２は糖１分子あたり１個のＮａ＋イオンを輸送し、グルコースに対する親和性は低く、ガラクトースは運ばない。このタンパク質は腎臓で発現しているが、小腸での発現は確認されていない。更に、ＳＧＬＴ−１とＳＧＬＴ−２は腎臓の異なる場所で機能している。糸球体で尿中へ移行したグルコースは、その多くが、まず近位尿細管のＳＧＬＴ−２で再吸収され、更に遠位尿細管のＳＧＬＴ−１で完全に再吸収され血液中へ戻される。これに対して、食物中のグルコースは総て、小腸のＳＧＬＴ−１で体内へ吸収されている。
このように、腎臓にはグルコーストランスポータＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２が発現しており、糸球体で濾過されたグルコースの尿細管上皮細胞内への再吸収過程は、これら２種類のトランスポータによって媒介されると考えられている。
一方で、腎性糖尿病とされる、血漿中のグルコースの濃度が正常域（１７０ｍｇ／ｄＬ以下）であるのに、明らかな糖尿の見られる状態がある。糸球体を通過したグルコースが尿細管で再吸収され得る最大速度（ＴｍＧで表す）は正常人では毎分３５０ｍｇであるが、これが異常に低い場合が最も多い。その結果、血漿中のグルコース濃度の高低に関係なく尿中のグルコース濃度が異常に高くなる。この現象は、近位尿細管の異常、即ち先天的あるいは後天的ファコンニ症候群のときやフロリジン注射の後などにも見られる。もう一つの腎性糖尿病の原因としては、グルコースのみかけ上の閾値が低下しているが閾値の平均値とＴｍＧとの両者がまったく正常という場合もある。この場合に見られるグルコースの尿中への異常な排泄増加は、グルコースの血漿濃度が低いときのみに存在する。そして、最大閾値を越えた血漿レベルでのグルコースの排泄はかえって正常である（医学大辞典  第１８版，ｐｐ１０５９〜１０６０，南山堂，１９９８年、生化学辞典  第２版，ｐｐ６７３，東京化学同人，１９９０年）。
腎性糖尿病は、腎臓におけるグルコース再吸収不全によると考えられており、かかるグルコース再吸収不全は、腎臓において糸球体で濾過されたグルコースの尿細管上皮細胞内への再吸収過程を媒介していると考えられている既知の２種類のトランスポータ、即ち、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２の先天性或いは後天性の欠損に起因すると考えられている。しかしながら、未だ原因遺伝子については同定されておらず、該既知のＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２遺伝子とそれ以外の未知のトランスポータ遺伝子の先天的或いは後天的欠損によって引き起こされると考えられてきた。
また、腎疾患を、標的或いは回避することを目的とした医薬品の開発は、腎疾患時における薬物療法をより有効かつ安全に実施するために重要であるが、今までの腎疾患の原因の解明に対する技術的な研究基盤が乏しいために、有効な成功例がないのが現状である。
本発明の課題は、腎において発現し、腎でのグルコース再吸収に関与する新規グルコーストランスポータ、その遺伝子、及びそれらの変異体、更にはそれらの利用を提供することにある。
腎性糖尿病は、腎臓におけるグルコース再吸収不全によるものであり、かかる不全は既知のグルコーストランスポータ遺伝子ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２の先天性或いは後天性の欠損に起因すると考えられていたが、その原因遺伝子については、同定されないできた。本発明者は、この未同定の遺伝子について、鋭意探索の結果、既知のＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２グルコーストランスポータ遺伝子とは別の腎臓で高発現する遺伝子を見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明のグルコーストランスポータは、既知のＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２よりも高い発現量を有し、腎でのグルコース再吸収において、より大きな寄与を果たすとともに、グルコースを特異的に認識するという特性を有する。本発明のグルコーストランスポータを、「グルコーストランスポータＮａＧＬＴ１」と命名した。更に、検討した結果、本発明のＮａＧＬＴ１は、Ｎａ＋依存的なフルクトーストランスポータ機能を有することを見い出した。
本発明は、また、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１及びその遺伝子の変異体、及び該グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１に特異的に結合する抗体を包含する。更に本発明は、本発明のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子機能を染色体上で欠損させた腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物及び該モデル非ヒト動物を用いた腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニング、更には、本発明の遺伝子や抗体を用いたグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能や腎疾患の診断方法やそのための診断薬を包含するものである。また、本発明は、アンチセンス鎖ＤＮＡ等を用いて、本発明の遺伝子の発現を制御し、動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を調節する方法も包含するものである。
【発明の開示】
すなわち具体的には本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなることを特徴とするＤＮＡ（請求項１）や、請求項１記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項２）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチド（請求項３）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド（請求項４）や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチド（請求項５）や、請求項１〜３記載のＤＮＡを、発現ベクターに組込み、該組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して発現することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドの製造法（請求項６）や、請求項４又は５記載のポリペプチドを用いて誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合することを特徴とする抗体（請求項７）や、抗体が、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項８）や、抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項９）からなる。
また本発明は、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを動物組織細胞に導入することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法（請求項１０）や、物組織細胞が、ラット腎臓の組織細胞、ブタ腎臓由来上皮細胞、イヌ腎臓由来上皮細胞、又はフクロネズミ腎臓由来上皮細胞であることを特徴とする請求項１０記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法（請求項１１）や、動物組織細胞が、ヒト胎児腎臓の形質転換細胞株ＨＥＫ２９３であることを特徴とする請求項１０記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞の製造法（請求項１２）や、請求項１０〜１２のいずれか記載の方法により製造されたことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞（請求項１３）や、請求項１３記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する動物組織細胞を用いて、被研物質のグルコース輸送機能への影響を測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能調節活性を有する物質のスクリーニング方法（請求項１４）や、配列表の配列番号２に示されるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とする腎におけるグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物（請求項１５）や、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号１に示されるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現する遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項１５記載の腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物（請求項１６）や、請求項１５又は１６記載の腎におけるグルコース及び／又はフルクトース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるグルコース再吸収能を測定・評価することを特徴とするグルコース再吸収能不全に起因する腎性糖尿病予防・治療薬のスクリーニング方法（請求項１７）や、請求項１記載の塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部からなるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用プローブ（請求項１８）や、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡの少なくとも１つ以上を固定化させたことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップ（請求項１９）からなる。
さらに本発明は、請求項７〜９のいずれか記載の抗体及び／又は請求項１８記載の診断用プローブを用意することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用薬剤（請求項２０）や、被検組織から試料を得、該試料における請求項１記載の遺伝子の発現を測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法（請求項２１）や、請求項２１記載の遺伝子の発現の測定を、請求項１８記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用プローブ、或いは請求項１９記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップを用いて行うことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法（請求項２２）や、被検組織から試料を取得、培養し、該試料における遺伝子の発現により生成される請求項４記載のポリペプチドを測定することを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法（請求項２３）や、請求項２３記載のポリペプチドの測定を、請求項７〜９のいずれか記載の抗体を用いて行うことを特徴とするグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断方法（請求項２４）や、請求項２１〜２４のいずれか記載のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断が、腎疾患におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の測定であることを特徴とする腎疾患の診断方法（請求項２５）や、動物組織細胞に、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを導入することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法（請求項２６）や、動物組織細胞における請求項１記載のＤＮＡの発現を抑制することを特徴とする動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法（請求項２７）や、動物組織細胞における請求項１記載のＤＮＡの発現の抑制が、請求項１記載のＤＮＡ塩基配列のアンチセンス鎖の全部又は一部を動物組織細胞に導入することにより行われることを特徴とする動物組織細胞グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法（請求項２８）や、動物組織細胞が、動物腎細胞であることを特徴とする請求項２６〜２８のいずれか記載の動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節方法（請求項２９）からなる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明の実施例において、Ａは本発明のＮａＧＬＴ１の塩基配列及びアミノ酸配列を、Ｂは本発明のＮａＧＬＴ１のアミノ酸配列のハイドロパシープロット（疎水性分析）を示す図である。
第２図は、本発明の実施例において、Ａは本発明のラット細胞におけるＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を、Ｂは本発明のラット細胞におけるＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡをＰＣＲにより検出したことを示す写真である。
第３図は、本発明の実施例における、本発明のＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡをＰＣＲにより検出し、それぞれのｍＲＮＡについて腎臓内での発現分布を示す写真である。なお、図中の＋は逆転写酵素を含む条件で、−は逆転写酵素を含まない条件でＲＴ−ＰＣＲを行ったものをそれぞれ示す。
第４図は、本発明の実施例における、本発明のＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２  ｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲによって定量解析したことを示す図である。
第５図は、本発明の実施例における、本発明のＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡをインビトロ合成し、注入した卵母細胞と、水注入卵母細胞における各種糖類蓄積を示す図である。
第６図は、本発明の実施例において、Ａは本発明のＮａＧＬＴ１発現卵母細胞における［１４Ｃ］αＭｅＧｌｃ蓄積量とαＭｅＧｌｃ自身の依存関係を、ＢはＡのデータを用いたＨｉｌｌプロットを、Ｃは［１４Ｃ］αＭｅＧｌｃ蓄積量と細胞外Ｎａ＋イオン濃度の依存関係を、ＤはＣのデータを用いたＨｉｌｌプロットを示す図である。
第７図は、本発明の実施例における、本発明のＮａＧＬＴ１発現卵母細胞及び水注入卵母細胞における、［１４Ｃ］αＭｅＧｌｃ蓄積に対する各種糖類の影響を示す図である。
第８図は、本発明の実施例における、ラット腎臓膜部位（腎粗膜、刷子縁膜、及び側底膜）におけるＮａＧＬＴ１タンパク質の細胞内局在を、イムノブロットにより解析した結果を示す写真である。
第９図は、本発明の実施例におけるＮａＧＬＴ１が媒介するＨＥＫ２９３細胞によるフルクトースの取込みについて、（Ａ）は、糖類似体を含む緩衝液とともに１５分間、３７℃でインキュベーションしたＨＥＫ２９３細胞について、（Ｂ）は、ＮａＧＬＴ１  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞による［１４Ｃ］フルクトースの取込みについて、示したグラフである。
第１０図は、本発明の実施例における腎臓刷子縁膜小胞によるフルクトースの取込みについて、（Ａ）は、マンニトール及びＨＥＰＥＳに懸濁した膜小胞を、マンニトール及びＨＥＰＥＳを含む基質混合液とともに、２５℃でインキュベーションした取込みについて、（Ｂ）は、フルクトースのＮａ＋依存性の取込みを、インキュベーション緩衝液中、各種濃度における取込みについて、示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】（本発明の遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド及びその抗体）
本発明は、腎性糖尿病の原因に関与するグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１及びその原因遺伝子、更にはそれらの変異体からなる。
本発明の腎性糖尿病の原因に関与するグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１ｃＤＮＡは、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有する。また、該ｃＤＮＡによって、コードされるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１タンパク質は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる。本発明において取得された新規遺伝子であるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１のｃＤＮＡは、２，１７３の塩基対からなり、その翻訳領域（１１１〜１５６２番目）には、４８４個のアミノ酸残基からなるポリペプチドがコードされている。
本発明のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１は、疎水性解析の結果からは、１１回膜貫通型の糖タンパク質であることが確認された。本発明の該グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１は、腎臓において高発現するグルコース及び／又はフルクトーストランスポータであり、他の単糖類は認識せずグルコース及び／又はフルクトースを特異的に認識する。腎臓におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１の発現量は、既知のグルコーストランスポータＳＧＬＴ１やＳＧＬＴ２よりも高く、腎性糖尿病の原因と考えられている腎臓でのグルコースの再吸収に大きな寄与を果たしているものである。
本発明の遺伝子としては、前記配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列、更には、該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、及び、次の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを有するポリペプチド、を含むものである。
本発明において、種々のＤＮＡ配列の変異は、周知の遺伝子工学的遺伝子変異手段によって、行うことができる。
なお、上記本発明の塩基配列において、「塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
更に、本発明は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、該配列表の配列番号に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを含むものである。本発明のポリペプチドを取得するには、公知の遺伝子工学の技術を用いて取得することができる。即ち、本発明の遺伝子を適宜公知の発現ベクターに組込み、該組換えベクターを宿主細胞に導入し、発現することによって取得することができる。
（本発明のポリペプチドによって誘導される抗体の利用）
更に、本発明は、本発明のポリペプチドによって誘導され、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む。該抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を挙げることができる。該抗体の作製は、本発明のポリペプチドを抗原として、常法により作製することができる。本発明の抗体は、本発明のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドとの抗原抗体反応により、本発明遺伝子の腎組織細胞等における発現の有無の検出に利用することができ、該遺伝子に関わる腎疾患の診断に利用することができる。本発明の抗体を用いた免疫学的測定には、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等公知の免疫学的測定法を用いることができる。
（本発明のＤＮＡを導入したヒト組織細胞の利用）
本発明のＤＮＡを、ヒト組織細胞に導入して、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を有するポリペプチドを発現するヒト組織細胞を製造することができる。該ヒト組織細胞としては、本来ＮａＧｌＴ１が強く発現している腎臓の組織細胞を用いることが好ましく、該腎臓の組織細胞の具体例としては、ヒト胎児腎臓の形質転換細胞株ＨＥＫ２９３を挙げることができる。また、本発明の遺伝子を導入する動物組織細胞としては、ラットの腎臓の組織細胞や、ブタ腎臓由来上皮細胞  ＬＬＣ−ＰＫ１、イヌ腎臓由来上皮細胞  ＭＤＣＫ、フクロネズミ腎臓由来上皮細胞  ＯＫのいずれかの細胞を用いることもできる。本発明のＤＮＡをヒト組織細胞に導入するには、トランスフェクション法等、適宜の遺伝子導入法を用いることができる。
（本発明の遺伝子及び該遺伝子によってコードされるポリペプチドの利用）
本発明において、ヒト腎細胞からクローニングしたＮａＧｌＴ１の新規遺伝子は、該塩基配列のアンチセンス鎖を用いることにより、診断用プローブとして、腎組織細胞のグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断に用いることができる。また、該診断用プローブや前記本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断薬として、及び該診断薬を装備した診断用キットとして利用することができる。
更に、本発明のＤＮＡを、少なくとも１つ以上デバイス上に固定して、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の診断用マイクロアレイ又はＤＮＡチップとして利用することができる。該マイクロアレイ及びＤＮＡチップには、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータの他の遺伝子等を合わせて固定し、診断に用いることができる。また、腎組織細胞における本発明の遺伝子の発現の状態を測定するには、ＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンブロッティング法等、公知の遺伝子の測定法を適宜用いることができる。本発明の診断法を用いて、腎組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１の遺伝子の発現の有無や発現の強度を測定することにより、ヒト腎臓における遺伝子疾患を検出することができる。
（本発明の遺伝子を用いたグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節）
ヒト組織細胞における本発明の遺伝子の発現の制御により、ヒト組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節を行うことができる。ヒト組織細胞における遺伝子の発現の制御は、ヒト組織細胞への本発明遺伝子の導入や、本発明遺伝子に対するアンチセンス鎖の導入による本発明遺伝子の発現抑制によって行うことができる。ヒト組織細胞への本発明遺伝子の導入方法としては、トランスフェクション法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。アンチセンス鎖のヒト組織細胞への導入には、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、腎組織等のヒト組織細胞へ直接投与することができる。また、必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、リポソーム及び高分子担体等と共に投与することができる。
腎臓等のヒト組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節により、腎臓等における遺伝子疾患の予防・治療が可能となる。
（本発明の遺伝子欠損モデル非ヒト動物及びその利用）
本発明の、腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物とは、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損することにより、腎臓におけるグルコース及び／又はフルクトース再吸収不全のような腎性糖尿病を発症する非ヒト動物をいう。本発明における非ヒト動物としては、ラット、マウス、モルモット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができ、本発明の腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニングに用いるモデル非ヒト動物としては、マウス、ラットが特に有利に利用することができるが、これらに限定されるものではない。
本発明のＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製は、公知の遺伝子欠損モデル非ヒト動物の作製方法を用いて作製することができる。以下に、ＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物の作製方法を、ＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスを例にとって説明する。
ＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちホモ接合体変異マウス（−／−）は、例えば、ラット腎臓から構築したラット遺伝子ライブラリーより得られた遺伝子断片を用いて、ＮａＧＬＴ１遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＮａＧＬＴ１遺伝子の一部又は全部を、例えばｌａｃ−Ｚ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子で置換し、必要に応じて、５′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入してターゲッティングベクターを作製し、この作製されたターゲッティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｘ−ｇａｌによる染色あるいはＧ４１８やガンシクロビル（ＧＡＮＣ）等の抗生物質に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択する。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。
上記組換えＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体変異マウス（＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体変異マウスをインタークロスさせることによって、ホモ接合体変異マウス（−／−）を得ることができる。そして、かかるホモ接合体変異マウスにＮａＧＬＴ１遺伝子が欠損しているかどうかを確認する方法としては、例えば、このマウスのＮａＧＬＴ１遺伝子の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
本発明における、腎臓におけるグルコース再吸収不全に起因する腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニングは、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１遺伝子機能の染色体上での欠損により、腎臓におけるグルコース及び／又はフルクトース再吸収不全のような腎性糖尿病を発症する非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官における及び／又はフルクトースグルコース再吸収能を測定・評価することにより行う。
上記のように、腎臓におけるグルコース及び／又はフルクトース再吸収不全に起因する腎性糖尿病の予防・治療薬のスクリーニングをする際、野生型非ヒト動物及び／又はＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を用いて、グルコース及び／又はフルクトース再吸収不全に起因する腎性糖尿病を発症するモデル非ヒト動物の場合と比較・評価することが好ましく、野生型非ヒト動物としては、上記ＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができ、ＮａＧＬＴ１遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物は、文献（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７，６１３２−６１３７，２０００）記載の方法等によって作製することができる。ＮａＧＬＴ１遺伝子機能欠損型と、それらの同腹の野生型は、個体レベルで正確な比較実験・評価（解析）等を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。
（本発明の遺伝子を用いたグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節）
動物組織細胞、特に腎臓における組織細胞における本発明の遺伝子の発現の制御により、動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節を行うことができる。動物組織細胞における遺伝子の発現の制御は、動物組織細胞への本発明遺伝子の導入や、本発明遺伝子に対するアンチセンス鎖並びにｓｉＲＮＡの導入による本発明遺伝子の発現抑制によって行うことができる。動物組織細胞への本発明遺伝子の導入方法としては、トランスフェクション法等の公知の遺伝子導入法を用いることができる。アンチセンス鎖の動物組織細胞への導入には、この分野で通常用いられる方法を用いることができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、腎組織等の動物組織細胞へ直接投与することができる。また、必要に応じて薬学的に許容される細胞内導入試薬、例えば、リポフェクチン試薬、リポフェクトアミン試薬、ＤＯＴＡＰ試薬、Ｔｆｘ試薬、リポソーム及び高分子担体等と共に投与することができる。
腎臓等の動物組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能の調節により、腎性糖尿病等における遺伝子疾患の予防・治療が可能となる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】（グルコース及び／又はフルクトーストランスポータＮａＧＬＴ１のｃＤＮＡクローニング）
ラット腎臓より、塩化セシウム密度勾配遠心法により全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製した。精製したｍＲＮＡは、ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてラット腎ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーから、無作為に１，０００遺伝子を取り出し、ベクタープライマー（Ｔ３プライマー；５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’）を用いてシークエンスを行った。なお、ＮａＧＬＴ１の全長シークエンスについては、下記の表１に記載のとおりプライマー（配列表の配列番号３〜１２）を設計し（Ｐｒｏｌｉｇｏ社に合成依頼）、ＲＩＳＡ−３８４（島津社製）を用いたチェーンターミネーター法により解読を行い、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０（ＳＯＦＴＷＡＲＥ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ社製、東京）を用いて配列表を作成した。実際のシークエンスは、ＲＩＳＡ−３８４システムにより行った（島津ジェノミックリサーチ（株）に委託解析）。
2004055184.tif 000003
得られた遺伝子配列情報について、ＧａｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＰＤＢの各データベースに登録されている遺伝子配列との相同性解析をＢＬＡＳＴにより行い既知群と未知群に分けた。未知遺伝子約２００種は、ｍＲＮＡをｍＣａｐ  ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてインビトロ合成し、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた輸送実験を行った。その結果、代謝抵抗性のα−メチル−Ｄ−グルコピラノシド（αＭｅＧｌｃ）を特異的に輸送するクローン（ＮａＧＬＴ１）を同定した（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッションナンバー：ＡＢ０８９８０２）。単離されたＮａＧＬＴ１  ｃＤＮＡは２，１７３塩基対からなり（配列番号１）、その翻訳領域（１１１〜１５６２番目）には４８４個のアミノ酸残基からなるタンパク質（配列番号２）がコードされていた（第１図Ａ）。疎水性解析の結果から、ＮａＧＬＴ１は１１回膜貫通型の糖タンパク質であることが推測された（第１図Ｂ）。
（ノーザンブロット法及びＲＴ−ＰＣＲによるＮａＧＬＴ１の発現分布の解析）
ストリンジェントな条件下［５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．４）、５×デンハルト溶液、０．２％のＳＤＳ及び１０μｇ／ｍＬのニシン精子由来のＤＮＡ、４２℃］において［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）でＮａＧＬＴ１のｃＤＮＡ（全長）をＰｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて標識し、ラット各臓器からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出し、をブロットしたナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋ｍｅｍｂｒａｎｅ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを行った後、２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）／０．１％のＳＤＳで１０分間室温でブロットメンブレンを２度洗浄し、さらに０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３０分間４２℃で１度洗浄した。洗浄したブロットメンブレンをイメージングプレートに３〜６時間露出し、可視化されたバンドをイメージングプレートリーダで読みとった後、Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅ  ＩＩ（富士フイルム社製）で画像処理を行った（ＢＩＯ−ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＢＡＳ−２０００ＩＩシステム、富士写真フィルム株式会社）。それぞれのバンドに相当する放射線強度は、Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅ  ＩＩ上で数値定量化した。その結果、ＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡは、腎臓の皮質部及び髄質部に多く発現することが認められた（第２図Ａ）。
次に、ＲＴ−ＰＣＲ法で調べるため、ラット各組織（脳、心臓、肺、肝臓、小腸、脾臓、腎臓の皮質部、腎臓の髄質部）からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１μｇの全ＲＮＡを得た後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いて逆転写反応を行った。反応終了後残存ＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｈ（インビトロジェン社製）で分解した。得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＧＡＰＤＨに特異的なプライマー（下記の表２及び配列表の配列番号１３〜２０参照）とＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、９５℃で３分間熱変性させた後、以下のサイクルを３５回繰り返し増幅させた。サイクル：９４℃で１分間の熱変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で１分間の伸長反応により得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースゲル上で分離した後、エチジウムブロマイドで染色、紫外線下で可視化した。その結果、腎臓（皮質部、髄質部）でＮａＧＬＴ１が高発現しており、腎臓以外にも、脳、肺及び肝臓でも検出限界以上の発現が認められた（第２図Ｂ）。
2004055184.tif 000004
（マイクロダイセクション法によるラット腎尿細管分節の単離）
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（７週齢）をネンブタール麻酔下正中開腹し、左腎臓を露出させる。下大動脈の左腎動脈分岐点直前頭部側にて結紮する。下大動静脈を左右分岐点直前頭部側にて結紮し、左腎動脈直下尾部側において血管に小孔を開ける。続いてその小孔よりポリエチレン医療用チューブ（ＰＥ−５０，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を挿入し、１０ｍｌ容量のシリンジを用いて過加圧にならないようにＡ液（１３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭの硫酸マグネシウム、１ｍＭの乳酸カルシウム、２ｍＭの酢酸ナトリウム、５．５ｍＭＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）１０ｍｌで左腎を前灌流する。灌流腎に鬱血等がないことを確認した後、Ｂ液（１ｍｇ／ｍｌのｃｏｌｌａｇｅｎａｇｅ（ｔｙｐｅ  Ｉ，Ｓｉｇｍａ社製）、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍＭのバナジル酸リボヌクレオシドコンプレックス（インビトロジェン社製）含有Ａ液）１０ｍｌで灌流し、すばやく摘出する。
腎皮質から髄質にわたる角度で切断して厚さ１〜１．５ｍｍの腎切片を作る。得られた腎切片を１００％Ｏ２を用いて酸素化しながらＢ液中で３７℃、３０分間の振盪後、氷冷Ａ液で腎切片を洗浄し、シリコナイズした鋭利な針を用いて以下の尿細管各分節をそれぞれの構造的特徴を基に顕微鏡で観察しながら分離する。単離した各ネフロン分節（糸球体、近位曲尿細管、近位直尿細管、髄質ヘンレ太い上行脚、皮質ヘンレ太い上行脚、皮質集合管、髄質外層集合管、髄質内層集合管）を糸球体は２０個、その他の分節は８ｍｍを１サンプルとして、それぞれの分節サンプルからＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡと下記の表３のプライマーセット（配列番号２１〜２９）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（第３図）。その結果、ＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡは他のＳＧＬＴと同様、近位曲尿細管及び近位直尿細管で高発現することが明らかになった（第３図）。
2004055184.tif 000005
（ＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡ発現レベルの定量的解析）
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（７週齢）の腎臓由来全ＲＮＡを逆転写し（方法２参照）、得られた１本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＧＡＰＤＨに特異的なプライマー及びＴａｑＭａｎプローブ（表３参照）とＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現量を定量した。なお、標準曲線を求めるため、リアルタイムＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、大腸菌（ＤＨ−５α）に形質転換した。形質転換した大腸菌を一晩ＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクトトリプトン、５ｇのイーストエクストラクト及び１０ｇのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で振盪培養し、ＮａＧＬＴ１、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＧＡＰＤＨそれぞれの増幅産物（表２のプライマーセットで増幅したＰＣＲ断片）をコードしているプラスミドＤＮＡの精製を行った。
それぞれの濃度をＵＶ１２００分光光度計（島津社製）で測定し、既知濃度の対照遺伝子として使用した。ＰＲＩＳＭ  ７７００で得られた結果は、標準曲線を用いて数値化した。なお、内部標準として用いたＧＡＰＤＨ発現量をリアルタイムＰＣＲ各反応内における鋳型ＲＮＡ量の補正に用いた。その結果、ＮａＧＬＴ１  ｍＲＮＡ発現量は、腎皮質及び髄質のいずれにおいても、他のＳＧＬＴと比較して高発現することが示された（第４図）。
（ＮａＧＬＴ１の輸送基質）
アフリカツメガエル卵母細胞（以下卵母細胞と略す）発現系を用いて、ＮａＧＬＴ１の輸送活性について調べた。先ず、種々の糖類の選択性について調べるためインビトロ合成ＮａＧＬＴ１  ＲＮＡを卵母細胞に注入し、２日間１８℃でインキュベートした後実験に供した。放射性標識した単糖類（α−メチル−Ｄ−グルコピラノシド（αＭｅＧｌｃ：代謝抵抗性グルコース）、ガラクトース、フルクトース、マンノース、マンニトール及び２−デオキシグルコース）並びに２糖類（スクロース）を基質として調べた結果、αＭｅＧｌｃ取り込みのみが、陰性対照として同時に調べた水注入卵母細胞と比較して有意に高かった（第５図）。従って、ＮａＧＬＴ１の輸送基質がグルコースであることが明らかになった。
（ＮａＧＬＴ１を介したαＭｅＧｌｃ輸送特性）
ＮａＧＬＴ１  ｃＲＮＡ注入細胞及び水注入卵母細胞の［Ｕ−１４Ｃ］−α−メチル−Ｄ−グルコピラノシド（αＭｅＧｌｃ）、Ｄ−［１−１４Ｃ］ガラクトース、Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］マンノース、Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］フルクトース、［１，２−３Ｈ］−２−デオキシ−グルコース、Ｄ−［１−３Ｈ］マンニトール、［Ｕ−１４Ｃ］スクロースの取り込み活性を測定した。その際、９６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）からなる緩衝液中でインキュベートした。また、細胞外Ｎａ＋濃度依存性を行う場合は、ＮａＣｌの濃度を９．６〜９６ｍＭの間に調製し、９６ｍＭに不足する分を塩化コリンで補うこととし、最終的な浸透圧を一定にした（第６図、第７図）。
次に、ＮａＧＬＴ１発現卵母細胞を用いて、αＭｅＧｌｃ取り込みの濃度依存性について調べた結果、Ｋｍ値は３．７１±０．０９ｍＭを示した（第６図Ａ）。また、ＮａＧＬＴ１を介したαＭｅＧｌｃ取り込みに対する細胞外Ｎａ＋イオン濃度の影響について解析した。はじめに、ｒＮａＧＬＴ１のαＭｅＧｌｃ取り込みに対する細胞外Ｎａ＋の影響は、７μＭのｖａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ添加により膜電位差を無くした状態で、細胞外Ｎａ＋の濃度を０〜９６ｍＭまで変化させ検討した。インビトロ合成ｒＮａＧＬＴ１  ＲＮＡを注入した細胞では細胞外Ｎａ＋濃度依存的にαＭｅＧｌｃ取り込みは増大した。また、ｒＮａＧＬＴ１のαＭｅＧｌｃ取り込みに対する用量依存性、あるいは細胞外Ｎａ＋依存性の検討（第６図Ａ、第６図Ｃ）より、各々のＶｍａｘ値（最大輸送速度）、Ｋｍ値を算出した。それらの値をもとにヒルプロット（横軸に変化させた基質またはイオンの濃度、縦軸にはそれぞれの基質（またはイオン）濃度の時の輸送速度ＶでＶｍａｘを徐したものの対数値をとる。）を行い（第６図Ｂ、第６図Ｄ）、ヒル係数を算出した。その結果、αＭｅＧｌｃ、Ｎａ＋のヒル係数はそれぞれ１．０６、１．００であり、αＭｅＧｌｃとＮａ＋とのカップリング比は１：１であることが示された（第６図）。従ってＮａＧＬＴ１は、細胞外Ｎａ＋イオン濃度依存的に機能するグルコーストランスポータであることが示唆された。
さらに、ＮａＧＬＴ１発現卵母細胞を介する［１４Ｃ］標識αＭｅＧｌｃ取り込みに対する種々阻害剤の影響について調べた結果、非標識αＭｅＧｌｃ、Ｄ−グルコース、２−デオキシグルコース及びフロリジンは極めて強い阻害効果を有していた。フルクトースやフロレチンは弱い阻害効果を有していた。一方、Ｌ−グルコース、３−Ｏ−メチルグルコース、ガラクトース及びマンノースはＮａＧＬＴ１を介したαＭｅＧｌｃ取り込みに対して影響を示さなかった（第７図）。
（抗ＮａＧＬＴ１抗体の作製）
ＮａＧＬＴ１のアミノ酸配列を基に、ｃ末端側のペプチド（Ｈ２Ｎ−ＬＰＬＤＲＫＱＥＫＳＩＮＳＥＧＱ−ＣＯＯＨ）（配列番号３０）をＮ末端側をシステインとして作製した（サワディー・テクノロジー社に合成依頼）。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＣＬ）による分析の結果、合成されたペプチドの純度は９２％であった。続いてヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ社製））を用い、このペプチドとのコンジュゲートを作製した。コンジュゲートは１ｍｌずつ１０本に分注し凍結保存した。
コンジュゲートはＦｒｅｕｎｄ完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）を用いて均一なエマルジョンを作った。雄性日本白色家兎（２ｋｇ）の前免疫血清を採取後、０．２ｍｇ／羽の割合で２週間間隔で免疫した。各免疫時に採血し、ＥＬＩＳＡ法により抗体価の解析を行った。最終的に充分な抗体価が得られた後、全採血して抗血清として凍結保存した。
（イムノブロットによるＮａＧＬＴ１の局在解析）
ペントバルビタール麻酔下Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（２２０〜２３０ｇ）から各組織を取り出し、ホモジネートバッファー（２３０ｍＭのスクロース、５ｍＭのトリス／塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ））でホモジナイズした後、１５分間の３０００ｇでの遠心分離を行った。上清を取り分け、さらに３０分間の２４５００ｇでの遠心分離を行い、沈殿物（粗膜画分）を回収した。ラット腎刷子縁膜及び側底膜の調製はパーコール密度勾配遠心法（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７７３，１１３−１２４，１９８４）に従い同時調製した。膜サンプルはＳＤＳサンプルバッファー（２％のＳＤＳ、１２５ｍＭのトリス、２０％グルセロール）に可溶化しポリアクリルアミド電気泳動（Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８５，１９７０）を行った。
分子量マーカーには、ＲａｉｎｂｏｗＴＭ  ｃｏｌｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒｓ［ｍｙｏｓｉｎ（２２０，０００），ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｂｅｔａ（９７，４００），ＢＳＡ（６６，０００），ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４６，０００），ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ（３０，０００），ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２１，５００），ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４，３００）］（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用した。泳動の後、ＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｒｏｎＰ、ミリポア社製）にタンパク質をトランスファー後、ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）でリンスした。次に５％のＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔで室温２時間ブロッキングした後、５％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔで希釈した抗血清（１：２０００）と４℃、一晩反応させ、その後ＴＢＳ−Ｔで１５分、３回膜を洗浄した。そしてＥＣＬ化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてＸ線フィルム（富士フイルム社製）に感光させた。その結果、ＮａＧＬＴ１タンパク質は腎臓刷子縁膜に局在することが明らかになった（第８図）。なお、第８図中の左側は、抗ＮａＧＬＴ１抗体のみと反応させた場合、右側は予め抗原ペプチドで処理した抗ＮａＧＬＴ１抗体で反応させた結果をそれぞれ示す。
（ＮａＧＬＴ１が媒介するＨＥＫ２９３細胞によるフルクトースの取込み）
糖類似体を含む緩衝液（０．１ｍＭ、３７ｋＢｑ／ｍｌ）とともに１５分間、３７℃でインキュベーションしたＨＥＫ２９３細胞について、ベクター（白のカラム、０．８μｇ／ウェル）又はｒＮａＧＬＴ１  ｃＤＮＡ（黒のカラム、０．８μｇ／ウェル）のトランスフェクションから２日後に、取込み分析を行った。結果を、第９図（Ａ）に示す。各カラムは３つの単層から得られた平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５という値は、ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞とは有意に異なっていた（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
また、ｒＮａＧＬＴ１  ｃＤＮＡ（０．８μｇ／ウェル）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞による［１４Ｃ］フルクトースの取込みを、インキュベーション緩衝液中、各種濃度（０．１〜２０ｍＭ）について、１５分間、３７℃で分析し、ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にて測定された取込み量を差し引いた。結果を、第９図（Ｂ）に示す。差込み図は、取り込みのＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ  ｐｌｏｔを示す。各ポイントは、３つの単層の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。見かけ上のＫｍ値及びＶｍａｘ値は、３回の個別実験により得られたものである。
（腎臓刷子縁膜小胞によるフルクトースの取込み）
１００ｍＭのマンニトール及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に懸濁した膜小胞（２０μｌ）を、１００ｍＭのマンニトール、２００ｍＭのＮａＣｌ（黒の丸：●）又はＫＣｌ（白の丸：○）、４ｍＭの［１４Ｃ］フルクトース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む基質混合液（２０μｌ）とともに、２５℃でインキュベーションした。結果を、第１０図（Ａ）に示す。それぞれの値は、３回の個別実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。各実験は、５匹のラットから単離した刷子縁膜小胞を用いて行われた。
腎臓刷子縁膜小胞によるフルクトースのＮａ＋依存性の取り込みを、ＮａＣｌの存在下において、各種濃度（０．１〜２０ｍＭ）のインキュベーション緩衝液中で１５秒間、２５℃で分析し、ＮａＣｌをＫＣｌで置換する場合の取込み量を差し引いた。結果を、第１０図（Ｂ）に示す。差込み図は、取り込みのＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ  ｐｌｏｔを示す。各ポイントは、３回の測定の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。見かけ上のＫｍ値及びＶｍａｘ値は、３回の個別実験により得られたものである。
（ｒＮａＧＬＴ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又は腎臓刷子縁膜小胞による［１４Ｃ］フルクトースの取込みに対する、糖類似体フロリジン及びフロレチンの作用）
糖類似体（３０ｍＭ）であるフロリジン（５０μＭ）又はフロレチン（５０μＭ）のいずれかの存在下及び非存在下で、ｒＮａＧＬＴ１でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞による［１４Ｃ］フルクトース（０．１ｍＭ、３７ｋＢｑ／ｍｌ）の取込みを、１５分間、３７℃で測定し、ベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にて測定された取込み量を差し引いた。糖類似体（３０ｍＭ）であるフロリジン（５０μＭ）又はフロレチン（５０μＭ）のいずれかの存在下及び非存在下で、１００ｍＭのマンニトール及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に懸濁した膜小胞（２０μｌ）を、［１４Ｃ］フルクトース（最終的に２ｍＭ、７４ｋＢｑ／ｍｌ）含む基質混合液（２０μｌ）とともに、１５秒間、２５℃でインキュベーションし、ＮａＣｌをＫＣｌで置換する場合の取込み量を差し引いた。Ｎａ＋の非存在とは、ＮａＣｌを塩化コリンで置換するという条件で測定した取り込み量である。結果を、表４に示す。それぞれの値は、３回の個別実験の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５という値は、コントロールの値とは有意に異なっていた（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
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【産業上の利用可能性】  腎性糖尿病は、腎臓におけるグルコース再吸収不全によるものであり、該グルコース再吸収不全はグルコーストランスポータ遺伝子の欠損によると考えられていた。本発明により、従来不明であった遺伝子が取得されたことにより、該遺伝子及び該遺伝子の発現産物であるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータタンパク質を用いて、腎性糖尿病の解明、診断、予防・治療そのための薬剤の開発が可能となった。
例えば、本発明の遺伝子及びペプチド、更には該ペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、例えば、ヒト腎におけるような新たなグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ遺伝子の単離を行うことや、ヒトやラット組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータの発現を測定することが、新規遺伝子の単離やグルコース及び／又はフルクトーストランスポータの機能の診断、腎臓における遺伝子疾患の検出が可能となる。
また、腎組織細胞のような組織細胞への本発明の遺伝子の導入や、本発明の遺伝子のアンチセンス鎖の導入による該遺伝子の発現抑制により、組織細胞におけるグルコース及び／又はフルクトーストランスポータ機能を調節することにより、腎遺伝子疾患の予防・治療を行うことも可能となる。更に、本発明の遺伝子の染色体上での欠損動物を作製することにより、グルコース及び／又はフルクトーストランスポータに着目した腎性糖尿病非ヒトモデル動物を作製することが可能である。該非ヒトモデル動物を用いることにより、腎性糖尿病の予防及び治療のための新規薬剤の開発が可能となる。
【配列表】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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