(57)【要約】Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、ハンチントン病、脳梗塞、頭部外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害、網膜神経障害等の神経変性疾患の予防または治療に用いうる新規な神経栄養因子産生促進剤を提供する。
2004035053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩を有効成分として含有する神経栄養因子産生促進剤。
【請求項２】
神経変性疾患の予防または治療のためにヒトまたは動物に投与される請求の範囲第１項記載の神経栄養因子産生促進剤。
【請求項３】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、ハンチントン病、脳梗塞、頭部外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害である、請求の範囲第２項記載の神経栄養因子産生促進剤。
【請求項４】
神経栄養因子がニューロトロフィンである、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の神経栄養因子産生促進剤。
【請求項５】
神経変性疾患の予防剤または治療剤の製造のための、Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の使用。
【請求項６】
神経栄養因子産生促進剤の製造のための、Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の使用。
【請求項７】
Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の有効量を投与し、神経変性疾患を予防または治療する方法。
【請求項８】
Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の有効量を投与し、神経栄養因子産生を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】本発明は、神経変性疾患等の予防または治療に有用である新規な神経栄養因子産生促進剤に関する。
【背景技術】  中枢および末梢神経系には、無数の神経細胞が存在し神経情報を伝達している。しかし、神経細胞は、出生の前後で分裂を停止するため、一度損傷を受けると再生されることは困難である。このように神経細胞は同じ細胞が一生機能を担うため、その分化、軸策の伸長、シナプスの形成、生存・機能維持に様々な栄養因子が大きな役割を果たしていると考えられている。これらの神経栄養因子の中で比較的研究がよく進み、代表的なものとしてニューロトロフィンファミリーがあり、それらには神経成長因子（以下、「ＮＧＦ」という）、脳由来神経栄養因子（以下、「ＢＤＮＦ」という）、ニューロトロフィン−３（以下、「ＮＴ−３」という）、ＮＴ−４／５，ＮＴ−６などが報告されている。ニューロトロフィン以外には最近、グリア細胞由来神経栄養因子（以下、「ＧＤＮＦ」という）が同定され、神経栄養因子として重要な役割を果たしていると考えられているが、その詳細は解っていない。
一方、社会の高齢化が進むにつれてアルツハイマー病やパーキンソン病のような神経変性疾患の患者が増加している。これらの疾患は難治性かつ進行性であり、根本的な治療法は確立されていない。そこで、神経栄養因子を神経変性疾患の治療に応用することが考えられている。しかし、神経栄養因子はタンパク質であるため血中で分解されやすいうえに、脳・血液関門を通過できず、末梢投与による脳での効果は期待できない。さらに、脳に直接注入することは倫理的、技術的に限界がある。そこで、末梢から投与して、脳においてこれらの因子の発現を増加させるような化合物が見つかれば、治療薬として活用できる可能性が考えられる（例えば、特許文献１または２を参照）。
特許文献１：ＷＯ９９／６２８７９（特表２００２−５１６９０３）
特許文献２：ＷＯ９９／６２８８１（特表２００２−５１６９０５）
最近、免疫抑制剤が脳虚血や外傷による脳障害を抑制することが報告されている。免疫抑制剤の細胞内結合タンパクであるイムノフィリンは免疫組織ばかりでなく中枢神経系にも豊富に存在し、神経細胞において中枢神経保護効果を媒介することが報告されている。しかし、免疫抑制作用は、神経保護を目的とするイムノフィリンリガンドの応用にはむしろ不利益をもたらす。そこで、免疫抑制作用を有さない神経保護物質の創製が望まれる。
【発明の開示】
本発明者らは、免疫抑制剤であるタクロリムス（図１−Ａ）がその結合タンパクと相互作用する構造に着目し、その部分構造を化学構造的に安定化させたＮ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸（図１−Ｂ）（以下、「ＡＰＡ」という）について神経保護作用を検討し、ＡＰＡが優れた神経栄養因子産生促進効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の特徴を有するものである。
（１）Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する神経栄養因子産生促進剤。
（２）神経変性疾患の予防または治療のためにヒトまたは動物に投与される（１）記載の神経栄養因子産生促進剤。
（３）神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、ハンチントン病、脳梗塞、頭部外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害である、（２）記載の神経栄養因子産生促進剤。
（４）神経栄養因子がニューロトロフィンである、（１）〜（３）のいずれかに記載の神経栄養因子産生促進剤。
（５）神経変性疾患の予防剤または治療剤の製造のための、Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の使用。
（６）神経栄養因子産生促進剤の製造のための、Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の使用。
（７）Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の有効量を投与し、神経変性疾患を予防または治療する方法。
（８）Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸またはその医薬として許容される塩の有効量を投与し、神経栄養因子産生を促進する方法。
ここで、「神経栄養因子」とは、前記した通り、ＮＧＦのように、神経細胞の生存維持、神経分化促進などの生理作用を有するタンパク質の総称であり、具体的には、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６を含むニューロトロフィンファミリー、更に、ＧＤＮＦ、グリア成長因子（ＧＧＦ２）、中枢神経系成長因子（ＡＦ−１）等を意味する。
「神経栄養因子産生促進剤」とは、インビボあるいはインビトロで神経細胞に接触させた場合、その細胞からの神経栄養因子の産生（合成）を誘導または促進する作用を示す薬剤を意味する。
「ニューロトロフィン」とは、生体では、神経成長の標的となる細胞、あるいは標的に向かって伸長している細胞から分泌される神経栄養因子、または自己分泌や傍分泌により神経（ニューロン）の成長、分化、生存を助けて、神経回路（シナプス）を形成させる神経栄養因子を意味し、具体的には、前記した通り、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＮＴ−６が現在知られており、アミノ酸配列の相同性も高い類似構造のタンパク質群である。
「神経変性疾患」とは、中枢あるいは末梢神経系の神経細胞の脱落、壊死を伴う疾患の総称であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、ハンチントン病、脳梗塞、頭部外傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症がその代表例である。また、糖尿病性あるいは薬物誘発性の末梢神経障害または網膜神経障害も、本発明に於ける神経変性疾患の概念に含まれる。
「医薬として許容される塩」とは、慣用の無毒性の塩であって、具体的には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）のような金属塩、無機酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸またはスルホン酸付加塩（例えば、蟻酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性または酸性アミノ酸（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩を挙げることができる。
次に、本発明の神経栄養因子産生促進剤の製剤化および投与量について説明する。本発明の神経栄養因子産生促進剤は、カプセル剤、マイクロカプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉末、トローチ剤、丸剤、軟膏、坐剤、注射剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤、液剤、腸溶コーティング剤、噴霧剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤等の慣用の医薬製剤の形で、経口、非経口（静脈内、腹腔内、皮下および筋肉内注射を含む）または外用（局所）投与（直腸、経皮、点眼および経鼻投与を含む）することができる。
上記の医薬製剤は、賦形剤（例えば、スクロース、デンプン、マンニット、ソルビット、ラクトース、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、スクロース、デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルデンプン、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等）、滑択剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、エアロシル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等）、矯味剤（例えば、クエン酸、メントール、グリシン、オレンジ末等）、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、安定化剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等）、懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等）、分散剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、希釈剤（例えば水等）、基材ワックス（例えば、カカオバター、白色ワセリン、ポリエチレングリコール等）のような製剤化に慣用の有機または無機の各種担体を用いる常法によって製造することができる。
本発明の神経栄養因子産生促進剤の投与量は、所望の治療（または予防）効果を生じるに足りる量であればよく、例えば経口または非経口投与で０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。本発明の神経栄養因子産生促進剤は通常、単位投与量０．１ｍｇ／個体〜１０００ｍｇ／個体、好ましくは５ｍｇ／個体〜５００ｍｇ／個体を１日当たり１〜４回投与することができる。しかしながら、上記の投与量は患者の年齢、体重、症状または投与法によって適宜増減してもよい。
【実施例】  以下、試験例および実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例１（正常マウス脳における神経栄養因子の発現に及ぼすＡＰＡの効果）
試験方法：  ５週齢のｄｄｙ系雄性マウス（日本エルエルシー）を次の３群（各群９匹）に分け試験を行った。
１群（コントロール）  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をマウス腹腔内に１日１回７日間投与した。
２群  ＰＢＳに溶解したＡＰＡ（０．７５ｍｇ／ｋｇ）をマウス腹腔内に１日１回７日間投与した。
３群  ＰＢＳに溶解したＡＰＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ）をマウス腹腔内に１日１回７日間投与した。
いずれの群も、最終投与２４時間後に断頭し大脳皮質と線条体を取り出した。
エンザイムアッセイ（ＥＩＡ）法用サンプルの調製：  摘出した大脳皮質と線条体の重量を測定し、アポロチニン（８０ＴＩＵ／Ｌ）を加えたホモゲナイジングバッファー（１Ｍ塩酸ナトリウム、２％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を重量の１９倍容量加え、ソニケーションを３０回行った。４℃で遠心分離（１００，０００ｇ×３０分）し、上清を分取し、同量のクロロホルムを加え、よく攪拌して遠心分離（２０，０００ｇ×１０分）した。上清を分取し、ＥＩＡ法用のサンプルとした（使用時まで−２０℃で冷凍保存した。）。
ＥＩＡ法による神経栄養因子の測定：  ＮＧＦの場合は、古川らの方法｛ジャーナル  オブ  ニューロケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４０，７３４−７４４（１９８３）｝によるＥＩＡ法を、ＧＤＮＦの場合は、新田らの方法｛Ｍｉｚｕｎｏら編集による「Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」（２００２）の第４６３から４６７頁｝によるＥＩＡ法を、それぞれ用いて、各サンプル中の神経栄養因子濃度を測定した。得られた値を２０倍することによって、各脳部位での神経栄養因子含量とした。
試験結果：  ＡＰＡを７日間連続腹腔投与したマウスは、コントロールのマウスに比べて行動異常、脱毛あるいは体重減少は観察されなかった。線条体におけるＮＧＦ発現量は、ＡＰＡ投与により、コントロールに比べ顕著な差はなかったが（図２−Ｂ）、大脳皮質におけるそれは、ＡＰＡ投与により用量依存的に増加する傾向が観察された（図２−Ａ）。一方、ＧＤＮＦ発現量は、大脳皮質においては、ＡＰＡ投与により、コントロールに比べ顕著な差はなかったが（図３−Ａ）、線条体においては、コントロールに比べＡＰＡ０．７５ｍｇ／ｋｇ投与により６６．０％の増加が観察された（図３−Ｂ）。
試験例２（パーキンソン病モデルマウスにおける神経栄養因子産生促進を介したＡＰＡの神経保護効果）
試験方法：  ５週齢のｄｄｙ系雄性マウス（日本エルエルシー）を次の４群（各群９匹）に分け試験を行った。マウスにペントバルビタール麻酔下で開頭せずに頭皮膚を介してマイクロシリンジの針先を右脳の線条体に挿入し、０．０５％アスコルビン酸を含む生理食塩水に溶解した６−ハイドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ、シグマ社）１１．５μｇ／μＬを１μＬ注入した。
１群  （コントロール）  アスコルビン酸のみを含む生理食塩水を注入して線条体に破壊を行わなかった。その後、ＰＢＳのみをマウス腹腔内に１日１回７日間投与した。
２群  ６−ＯＨＤＡによって線条体を破壊した日からマウス腹腔内に１日１回７日間ＰＢＳを投与した。
３群  ６−ＯＨＤＡによって線条体を破壊した日からマウス腹腔内に１日１回７日間ＰＢＳに溶解したＡＰＡ（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
４群  ６−ＯＨＤＡによって線条体を破壊した日からマウス腹腔内に１日１回７日間ＰＢＳに溶解したＡＰＡ（７．５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
いずれの群も、最終投与２４時間後に断頭し大脳皮質を取り出した。
ドーパミン作動性神経の機能評価：  上記各群のパーキンソン病モデルマウスを透明の円柱型容器（ガラス製、直径９ｃｍ−高さ１２ｃｍ）内で１０分間自由に探索させた後、メタンフェタミン（大日本製薬、１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、投与後１０〜２０分までの回転数を計数した。この試験では右側線条体を破壊しているため右方向の回転運動（片側回転運動）が観察された。
ＥＩＡ法用サンプルの調製とＥＩＡ法による神経栄養因子の測定：  それぞれ、試験例１と同様に行った。
試験結果：  ドーパミン作動性神経の機能評価においては、線条体を破壊しＡＰＡを投与しない群では８６．０±１４．１回の片側回転運動を示したのに対し、線条体破壊後７日間ＡＰＡを０．７５または７．５ｍｇ／ｋｇ投与すると、それぞれ４０．９±１７．３回、４７．１±１３．１回と、片側回転運動が抑制された（図４）。一方、大脳皮質におけるＮＧＦ発現量は、６−ＯＨＤＡを注入すると５０．０％に減少したが、ＡＰＡ０．７５および７．５ｍｇ／ｋｇを投与すると、それぞれ１１．２％および３０．７％の増加が観察された（図５）。また、大脳皮質におけるＧＤＮＦ発現量は、ＡＰＡ０．７５および７．５ｍｇ／ｋｇ投与により、それぞれ７４．９％および２３２．４％の増加が観察された（図６）。
試験例３（脊髄損傷ラットにおける歩行能力向上に及ぼすＡＰＡの効果）
試験方法：  ７週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ系ラット（日本エスエムシー）を次の３群（各群１２〜１７匹）に分けて試験を行った。ラットにペントバルビタールナトリウム（大日本製薬、３５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、背部に正中切開を加え、傍脊柱筋を鈍的に剥離した。第１２胸椎の椎弓を切除後、同部位において鋭利な刃物で左脊髄を切断した。切断５時間後、左後足麻酔の障害が確認できるものについて以下の試験を行った。
１群  脊髄を損傷させていない（第１２胸椎の椎弓切除後、脊髄を切断せずに縫合した）ラットに対して、ＰＢＳを腹腔内に投与した。
２群  脊髄を損傷させたラットに対して、ＰＢＳを腹腔内に投与した。
３群  脊髄を損傷させたラットに対して、ＰＢＳに溶解したＡＰＡ（０．７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与した。
いずれの群も、脊椎損傷日から１日１回２０日間投与を行った。
脊髄損傷ラットの歩行能力の評価方法：  灰色に塗装した箱（縦１ｍ×横１ｍ×高さ３０ｃｍ）にラットを入れ、自由に探索させ、２１−Ｐｏｉｎｔ  Ｂａｓｓｏ−Ｂｅｓｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＢＢＢスケール）に従って２１段階で評価した。
試験結果：  ＢＢＢスケールは、脊髄損傷直後には０まで低下した。２日目まではＡＰＡ投与の効果は観察されなかったが、３日目からはＡＰＡ投与によって歩行能力の程度が増加した。ＡＰＡ投与群では２３日目には、ほぼ損傷前のレベルまで回復した。脊髄損傷群のラットも時間の経過に伴い緩やかに上昇し、１６日目にはスコア１５まで上昇したが、その後、それ以上の回復はなかった（図７）。
本発明の製剤例を以下に示す。
実施例１（カプセル剤）
ＡＰＡ  ５ｍｇ、乳糖  ８０ｍｇ
上記成分を混合し、これを通常の硬ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤とする。
【図面の簡単な説明】第１図：  （Ａ）タクロリムスの構造式である。（Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸の構造式である。
第２図：  （Ａ）マウス大脳皮質におけるＮＧＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。（Ｂ）マウス線条体におけるＮＧＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。
第３図：  （Ａ）マウス大脳皮質におけるＧＤＮＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。（Ｂ）マウス線条体におけるＧＤＮＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。
第４図：  パーキンソン病モデルマウスにおけるドーパミン作動性神経の機能に対するＡＰＡの片側回転運動抑制効果を示す。
第５図：  パーキンソン病モデルマウス大脳皮質におけるＮＧＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。
第６図：  パーキンソン病モデルマウス大脳皮質におけるＧＤＮＦ発現に及ぼすＡＰＡの効果を示す。
第７図：  脊髄損傷ラットにおける歩行能力向上に及ぼすＡＰＡの効果を示す。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ等の神経栄養因子の生合成を誘導、促進させ、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷等の神経変性疾患に有効でありかつ安全な薬剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004035053.tif 000009
【国際調査報告】
2004035053.tif 000010
2004035053.tif 000011
2004035053.tif 000012
2004035053.tif 000013
2004035053.tif 000014
2004035053.tif 000015