(57)【要約】本発明は、酢酸菌の増殖促進に関与する新規な遺伝子、及び該遺伝子を含む微生物、特に酢酸菌の増殖促進機能を向上させる方法、さらに増殖促進機能が向上した酢酸菌を用いて、高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項２】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項３】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列を含むＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のＤＮＡからのコピー数が細胞内において増幅されていることを特徴とする増殖促進機能が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌である請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、酢酸耐性微生物に関し、より具体的には、微生物に由来する増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数を増幅した微生物、及びこれらの微生物を用いて食酢を製造する方法に関する。
【背景技術】  酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
特に、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期と呼ばれる期間は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向が認められている。
そのため、酢酸発酵においては、より高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短くすることが求められており、その一手段として、発酵液中にＰＱＱ（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸）を添加して増殖を促進し、いわゆる増殖誘導期を短縮する方法が開示されている（例えば、特開昭６１−５８５８４号公報参照）。
しかし、ＰＱＱを大量に入手することは難しく、かつ、高価であるため、工業的な規模での実施には経済的ではないと考えられていた。そこで、酢酸菌の高濃度酢酸存在下での増殖（酢酸耐性）を促進して、いわゆる増殖誘導期を短縮できる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（増殖促進遺伝子）をクローニングし、その増殖促進遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良する努力がなされてきた。
しかし、これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子は分離されたことがなく、このような実情から，酢酸菌の高濃度酢酸存在下での増殖（酢酸耐性）を実用レベルで促進し，増殖誘導期を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖促進機能を有する遺伝子の分離、及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖機能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【発明の開示】
本発明は、実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）を向上させ、いわゆる誘導期を短縮させ得るタンパク質をコードする新規な増殖促進機能を有する遺伝子を分離し、この増殖促進機能を有する遺伝子を用いて優れた増殖促進機能を有する酢酸菌を育種し、またこの酢酸菌を用いて高酢酸濃度の食酢を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子が存在するとの仮説を立て、この遺伝子の単離を試みたところ、かかる新規な遺伝子を単離することに成功した。またこの増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を利用することによって、微生物の増殖促進機能及び酢酸耐性を向上させることができ、さらには従来得ることのできなかった高濃度の酢酸を含有する新規食酢を効率的に製造することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（８）である。
（１）下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質
（２）下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を含み、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質
（３）下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列を含むＤＮＡ
（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列番号１に示された塩基配列のうち、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）上記（２）又は（３）のＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）上記（４）の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（６）上記（２）又は（３）のＤＮＡからのコピー数が細胞内において増幅されていることを特徴とする増殖促進機能が増強された微生物。
上記微生物としては、例えばアセトバクター属又はグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が挙げられる。
（７）上記（６）の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（８）上記（７）の食酢製造法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【図面の簡単な説明】  図１は、グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＳ１０、ｏｍｐＡを含む）の制限酵素地図等の概略図である。
図２は、グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸含有培地での培養経過を示す図である。
図３は、グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能に関与する遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
図４は、ｐＧＩ１８の構築図及び制限酵素地図を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年６月２６日に出願された日本国特許出願第２００３−１８３０４７号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
１．増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離
本発明者らは、酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を単離する方法を開発し、そのような機能を有する遺伝子の単離を試みた。この単離方法においては、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを用いて酢酸菌を形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下で増殖に４日を必要とする該酢酸菌を、同培地上で３日で増殖可能である酢酸菌株をスクリーニングすることによって、酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を単離する。
この方法を、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌に適用したところ、実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）を向上させて増殖誘導期を短縮させる増殖促進機能を向上させうる新規な増殖促進機能を有する遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。
得られた酢酸耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で見出されているｏｍｐＡ遺伝子やカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）のｏｍｐＡ遺伝子などによって生産される一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のｏｍｐＡ遺伝子であると推定された。
また、大腸菌のｏｍｐＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３６％の、またカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）のｏｍｐＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３０％の相同性であり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の微生物のｏｍｐＡ遺伝子とはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（以下、タンパク質ＯＭＰＡともいう）をコードする新規遺伝子（以下、ｏｍｐＡ遺伝子ともいう）であることが確認された。
本発明において、ｏｍｐＡ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株において、顕著に酢酸耐性が向上した（実施例３参照）。さらに、この形質転換体をエタノール存在下で通気培養した場合には、その酢酸発酵能、特に増殖促進機能が著しく向上し、高濃度酢酸存在下での増殖促進（酢酸耐性）が向上して、誘導期の短縮や増殖速度の向上、増殖可能な酢酸濃度の向上などが確認された（実施例２〜４参照）。従って、ｏｍｐＡ遺伝子が確かに増殖促進機能を有するタンパク質を有するタンパク質をコードし、該タンパク質の機能を発揮するように発現していることが確認できた。以上から、本発明者は、このｏｍｐＡ遺伝子のコピー数を増幅させた微生物を用いることにより、高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できると考えた。
２．本発明のＤＮＡ及びタンパク質
本発明のＤＮＡは、酢酸菌に由来するｏｍｐＡ遺伝子及び該遺伝子の調節配列をコードするものであり、また酢酸耐性を向上させる機能及び増殖促進機能を有するタンパク質をコードしていると推定される（配列番号２）。
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８４年２月２３日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託されている）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により取得することができる。
次に、ｏｍｐＡ遺伝子を単離するために、上述のように得られた染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）を温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で，１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。
染色体ＤＮＡから染色体ＤＮＡライブラリーを作製する方法は当技術分野で公知であり（例えばショットガン法）、上述した方法に限定されるものではない。
得られた組換えベクターを用いて、通常は寒天培地上で１％濃度の酢酸の存在下では増殖に４日を必要とする酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  Ｎｏ．１０２３）株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９８３年６月２７日付（原寄託）で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託されている）を形質転換し、その後１％酢酸含有寒天培地に塗布し、３日間培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することでｏｍｐＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、その内、塩基番号１８０〜１３７６からなる塩基配列はコード領域であり、配列番号２に示すタンパク質をコードするものである。
配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：配列番号１の塩基番号１８０〜１３７６に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のｏｍｐＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３６％の、またカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）のｏｍｐＡ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで３０％の相同性を示し、タンパク質ＯＭＰＡをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも４０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
本発明のＤＮＡは、該ＤＮＡがコードするｏｍｐＡ遺伝子の塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）によって、又は該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。そのようなプライマー又はプローブとしての機能を有する、ｏｍｐＡ遺伝子の一部の配列から作製されたＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。具体的には、限定されるものではないが、配列番号３及び４に示す配列からなるＤＮＡは、本発明においてプライマーとして使用することができる。ここで「プライマー又はプローブとしての機能を有する」とは、プライマー又はプローブとして使用することが可能な塩基配列の長さ、塩基配列の塩基組成などを有することを意味し，このようなプライマー又はプローブとして機能するＤＮＡの設計は当業者には周知である。
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
また、本発明のＯＭＰＡタンパク質は、上記ＤＮＡによりコードされるものであり、具体的には配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むものである。配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、増殖促進機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、逆位等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明のタンパク質に含まれる。上記のような変異アミノ酸配列を含む増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することがてきる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、公知の突然変異処理によっても取得することができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のＤＮＡの変異型であって、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするものを合成することもできる。なお、ＤＮＡ、すなわち遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば、Ｍｕｔａｎ−Ｋ（タカラバイオ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（タカラバイオ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはＣｈｅｎ  Ｋ，ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ．１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：５６１８−５６２２を、またＤＮＡシャッフリングについてはＳｔｅｍｍｅｒ  Ｗ．Ｐ．１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１及びＳｔｅｍｍｅｒ  Ｗ．Ｐ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１０７４７−１０７５１を参照されたい。
ここで、本発明において「増殖促進機能」とは、酢酸の存在下における微生物の増殖を促進する機能を指し、より具体的には酢酸存在下での増殖速度が速いことや、菌体の生育量が多いこと、また、増殖あるいは酢酸発酵が可能な酢酸濃度の上限が高いことを意味し、酢酸耐性を増強する機能ともいえる。上述のようにして変異を導入した遺伝子が増殖促進機能を有するタンパク質をコードするか否かは、実施例で示されるように酢酸を含有する培地での生育の有無を判別することにより確認することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基配列番号１８０〜１３７６からなる塩基配列と相補的な塩基配列の一部からなるＤＮＡ、又は塩基配列番号１８０〜１３７６からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなり得る塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一の、すなわち増殖促進機能を保持するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有する核酸同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
３．本発明の酢酸耐性微生物（増殖促進機能が増強された微生物）
本発明のＤＮＡは、増殖促進機能を有するタンパク質ＯＭＰＡをコードするため、本発明のＤＮＡを利用して、酢酸存在下における増殖促進機能が増強された、すなわち酢酸耐性が増強された微生物を作製することができる。
微生物における増殖促進機能の増強は、例えば、組換えベクターにｏｍｐＡ遺伝子を連結し、該ベクターを用いて微生物を形質転換することによって、該遺伝子の細胞内でのコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子と微生物中で効率よく機能するプロモーター配列とを連結した組換えベクターを用いて該微生物を形質転換することによって、該遺伝子からのコピー数を増幅して発現を増強することにより行うことができる。
本発明の組換えベクターは、前項「２．本発明のＤＮＡ及びタンパク質」に記載したＯＭＰＡタンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、本発明の組換えベクターを用いてｏｍｐＡ遺伝子が発現し得るように宿主を形質転換することにより得ることができる。
組換えベクターとしては、宿主で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドを使用することができる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＥＴ１６ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを用いて形質転換体を作製することもできる。
また、マルチコピーベクター又はトランスポゾンなどを用いて目的のＤＮＡを宿主に導入することもでき、本発明においてはそのようなマルチコピーベクター又はトランスポゾンも本発明の組換えベクターに含まれるものとする。マルチコピーベクターとしては、ｐＵＦ１０６（例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，１９８９，１５３−１５８参照）、ｐＭＶ２４（例えば、Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，５５：１７１−１７６参照）、ｐＧＩ１８（例えば、特願２００３−３５０２６５号明細書；実施例３参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，５２：３１２５−３１２９参照）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡがコードする遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
また、染色体ＤＮＡ上のｏｍｐＡ遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置き換えるには、相同組換え用のベクターを構築し、該ベクターを用いて微生物の染色体に相同組換えを起こすようにすればよい。そのようなプロモーター配列としては、例えば、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列が挙げられる。相同組換えを行うためのベクターの構築に関しては当業者に周知である。このようにして微生物における内因性ｏｍｐＡ遺伝子を強力なプロモーターの制御下に配置することによって、該ｏｍｐＡ遺伝子からのコピー数が増幅され、発現が増強される。
形質転換に使用する微生物としては、導入されるＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌、乳酸菌等）、酵母やアスペルギルス属などの真菌が挙げられる。本発明においては、その増殖促進機能を増強するという目的から、微生物としては酢酸菌を使用することが好ましい。酢酸菌の中でも、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する細菌が好ましい。
アセトバクター属に属する細菌として、例えば、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシーズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ＩＦＯ３２８３）株を用いることができる。
また、グルコンアセトバクター属に属する細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＤＳＭ６１６０）株、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を用いることができる。
酢酸菌を含む細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（例えば、Ｆｕｋａｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，４９：２０９１−２０９７参照）、エレクトロポレーション法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０，８７：８１３０−８１３４参照）等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す微生物を選択する。
本発明の好ましい実施形態において、形質転換体は、少なくとも配列番号１に示す塩基配列を有する核酸を含む組換えベクターであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＵＦ１０６に当該核酸を挿入した組換えベクターｐＯＭＰＡ１を、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）株に導入することにより、また、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８に当該核酸を挿入した組換えベクターｐＯＭＰＡ２を、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ３２８８）株に導入することにより、得られる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその増殖促進機能を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
４．食酢製造法
前項「３．本発明の酢酸耐性微生物」に記載のようにして作製される、増殖促進機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより増殖促進機能が選択的に増強された微生物（酢酸菌）であってアルコール酸化能を有するものは、酢酸存在下においても増殖し、さらに酢酸を生産することが可能であるため、食酢の製造に利用することができる。従って、ｏｍｐＡ遺伝子の発現コピー数が増幅された微生物をアルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえばよく、特に限定されたものではない。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
炭素源としては、グルコースやスクロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常培養は１〜２１日間行う。
ｏｍｐＡ遺伝子のコピー数を増幅させた微生物の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。また、微生物の増殖速度が向上するため、その酢酸生産速度が向上することになる。
本発明によれば、微生物に対して、増殖促進機能を付与し増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、増殖誘導期が顕著に短縮して、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。このようにして育種された微生物（酢酸菌）は、高濃度酢酸を含有する食酢の製造に有用である。
【実施例】  以下，実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有する遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を６％酢酸及び４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に記載の染色体ＤＮＡ調製法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要であることが知られるアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に形質転換し、１％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃にて３日間培養した。３日で生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約２．３ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ１０と命名した。
このようにして通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要とするアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、１％酢酸含有寒天培地において３日間で増殖を可能にする増殖促進機能を有する遺伝子断片を取得した。
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に示す塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。このようにして得られた遺伝子をｏｍｐＡと命名した。
配列番号１に示す塩基配列中には、塩基番号１８０から１３７６にかけて、配列番号２に示す３９９個のアミノ酸（図３）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
〔実施例２〕グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での誘導期の短縮効果
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
実施例１に従ってクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来のｏｍｐＡ遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＵＦ１０６（例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ，１９８９，１５３−１５８参照）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＯＭＰＡ１を作製した。ｐＯＭＰＡ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示す。図１はＳａｕ３ＡＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＳ１０）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置，及びｐＯＭＰＡ１への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣ−３’：配列番号３）及びプライマー２（５’−ＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧ−３’：配列番号４）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記のＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃１５秒、６０℃３０秒、及び６８℃１分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＯＭＰＡ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、Ｗｏｎｇ，ＨＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：８１３０−８１３４参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上に３日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）形質転換株の酢酸発酵試験
上記のようにして得られたプラスミドｐＯＭＰＡ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株を、シャトルベクターｐＵＦ１０６のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と、その酢酸発酵能について比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地にて、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して酢酸、エタノール及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％、エタノール４％の濃度に調製し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようにエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表１にまとめる。
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表１の結果から、形質転換株の方が、比増殖速度が顕著に高くなり、増殖誘導期が顕著に短縮され、効率的に酢酸発酵を行なえることが確認できる。
〔実施例３〕グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸耐性の増強
（１）酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の作製
ｐＧＩ１８は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の約３．１ｋｂのプラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。
すなわち、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の培養液より、菌体を集菌し、水酸化ナトリウム又はドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
得られたプラスミドは、ＨｉｎｃＩＩで３ヶ所、また、ＳｆｉＩで１ヶ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの認識部位は有していなかった。このプラスミドをｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた。
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。この断片をｐＵＣ１８の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＧＩ１８を作製した（図４）。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。即ち、鋳型としてプラスミドｐＧＩ１を用い、プライマーとして制限酵素ＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ（配列番号６）及びプライマーＢ（配列番号７）を用い、下記のＰＣＲ条件にて、ＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は、９４℃  ３０秒、６０℃  ３０秒、及び６８℃  ３分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
図４に示すように、得られたプラスミドｐＧＩ１８はｐＵＣ１８及びｐＧＩ１のいずれも含有していて、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。
このプラスミドｐＧＩ１８の塩基配列を配列番号５に示す。
（２）アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムへの形質転換
実施例１で取得したアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を（１）で作製した酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、その部位に、増幅したＤＮＡ断片を挿入してプラスミドｐＯＭＰＡ２を作製した。ｐＯＭＰＡ２に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。図１はＳａｕ３ＡＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニ由来の遺伝子断片（ｐＳ１０）の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＯＭＰＡ２への挿入断片を示す。
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣ−３’：配列番号３）及びプライマー２（５’−ＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＡＴＴＣＣＧ−３’：配列番号４）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記のＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、及び６８℃  １分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
このｐＯＭＰＡ２をアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ）の１株であるアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ３２８８）株にエレクトロポレーション法（例えば、Ｗｏｎｇ，ＨＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：８１３０−８１３４参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、酢酸耐性遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（３）形質転換株の酢酸耐性
前記（２）で得られたプラスミドｐＯＭＰＡ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株と比較した。
具体的には、酢酸３％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振盪培養（１５０ｒｐｍ）を行い、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける菌休濃度を測定することで比較した。
その結果、図２に示すように、３％の酢酸添加培地において、形質転換株（白丸で示す）は増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株（黒丸で示す）は増殖できないことが確認でき、増殖促進機能を有する遺伝子の酢酸耐性増強機能が確認できた。
〔実施例４〕グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例３で得られたプラスミドｐＯＭＰＡ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５リッター容量のミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）に、酢酸濃度１％、アルコール濃度４％のＹＰＧ培地を充填し、形質転換株又は元株を０．４％接種し、発酵温度３２℃で、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を開始した。発酵の進行に伴って酢酸濃度が４％に上昇したところで、米糖化液１７．９％、酢酸発酵液３．２％、醸造用アルコール７．８％、及び水７１．１％の割合で混合して調製した原料培地（アルコール濃度７．８％、酢酸濃度０．２６％）の添加を開始し、さらに酢酸濃度が７．２％に上昇するまで発酵した。
そして、酢酸濃度７．２％になったところで、その酢酸濃度を維持できるように原料培地の添加速度を調節しつつ、連続発酵を行なった。
この時の原料培地の添加速度、即ち流量（生産速度に比例する）を形質転換株の場合と元株の場合とで比較し、その結果を表２に示す。
また、形質転換株の流量を元株の酢酸濃度７．２％での連続発酵時の流量とほぼ同等にした場合の酢酸発酵能を比較し、その結果を表３に示す。
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表２の結果から、連続酢酸発酵を行った場合においても、形質転換株の方が元株よりも、生産性（原料培地添加速度）が高く優れていることが分かった。
また、表３の結果から、一定の生産性（原料培地添加速度）で連続酢酸発酵を行った場合は、形質転換株の方がより高い酢酸濃度で連続酢酸発酵が可能であり、酢酸耐性が優れていることが分かった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、増殖促進機能を有する新規な遺伝子が提供される。この遺伝子を用いて、高酢酸濃度存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、増殖誘導期が短縮され、また酢酸耐性が向上した、高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することが可能である。従って、本発明は、高酢酸濃度の食酢を高効率で製造するために有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
配列フリーテキスト
配列番号３、４、６及び７：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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