(57)【要約】本発明の目的は、１個ずつの細胞レベルで細胞毎に任意の部位に電気刺激を付与することを可能にする細胞の電気刺激方法を提供することである。本発明によれば、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針を細胞表面に設置することを含む、細胞の局所的電気刺激方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針を細胞表面に設置することを含む、細胞の局所的電気刺激方法。
【請求項２】
５０〜５００ｎｍの直径を有する針を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項３】
５μｍ以下の長さを有する針を使用する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項４】
カーボンナノチューブから成る針を使用する、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針の移動を制御するための駆動手段を有する、請求項１から５の何れかに記載の方法で使用するための細胞の電気刺激装置。
【請求項６】
５０〜５００ｎｍの直径を有する針を使用する、請求項５に記載の電気刺激装置。
【請求項７】
（ａ）細胞を所定の場所に保持するための細胞保持手段；（ｂ）電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針に連結された該針の移動を制御するための駆動手段；及び（ｃ）細胞保持手段内に保持された細胞を観察するための顕微鏡を有する、請求項１から５の何れかに記載の方法で使用するための細胞の電気刺激装置。
【請求項８】
５０〜５００ｎｍの直径を有する針を使用する、請求項７に記載の電気刺激装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞の局所を電気的に刺激する方法及びそれに用いるための細胞の電気刺激装置に関するものである。
【背景技術】  生体の細胞を培養しながら細胞に刺激を与えるために細胞刺激電極が用いられる。しかし、従来の細胞刺激電極には、金や白金などが用いられており、細胞を集団で刺激することがなされていた。細胞１個の刺激も可能ではあるが、細胞の特定部位のみに刺激を加えることは不可能である。
【発明の開示】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、１個ずつの細胞レベルで細胞毎に所望の電気的刺激を付与すること、更に１個の細胞で任意の局所部位に所望の電気的刺激を付与することを可能にする細胞の電気刺激方法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために検討した結果、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針の先端を細胞のある部位の表面に置くことによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針を細胞表面に設置することを含む、細胞の局所的電気刺激方法が提供される。
好ましくは、５０〜５００ｎｍの直径を有する針を使用することができ、５μｍ以下の長さを有する針を使用することができる。好ましくは、カーボンナノチューブから成る針を使用することができる。
本発明の別の側面によれば、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針の移動を制御するための駆動手段を有する、上記した本発明の方法で使用するための細胞の電気刺激装置が提供される。
好ましくは、（ａ）細胞を所定の場所に保持するための細胞保持手段；（ｂ）電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針に連結された該針の移動を制御するための駆動手段；及び（ｃ）細胞保持手段内に保持された細胞を観察するための顕微鏡を有する、上記した本発明の方法で使用するための細胞の電気刺激装置が提供される。
本発明の電気刺激装置では、好ましくは５０〜５００ｎｍの直径を有する針を使用することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の方法の概要を示す。図１において、１はカンチレバー、２は針、３は細胞、４は細胞核、５はシャーレ、６は細胞保持手段、９は駆動手段、１０は電位制御手段を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の方法においては、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針を細胞の特定部位の表面に置くことによって、細胞の任意の局所部位を電気的に刺激する。
本発明は、細胞の電気刺激のために非常に細い針（光学的分解能を超えるくらいの針）を使用することを特徴とするが、具体的には、３μｍ以下の直径を有する針を使用することができる。本発明で使用する針は、その帯電性などの電気的性質をコントロールしやすい針であることが好ましい。本発明では、針を細胞の表面に置いた後に針の電荷を制御することによって、細胞を所望の通りに電気的に刺激することができる。本発明では、細胞集団の中でさらに任意の狙った細胞に任意の電気的刺激を与えることができる。
例えば、１００個の細胞を用意し、針を個々の細胞の真上から細胞に突き刺し、針の電位を針に連結された電位制御手段により制御することにより、該細胞に所望の電気的刺激を与えることができる。このように針を１個の細胞に接触させて電気的に刺激する操作を繰り返すことによって、異なる細胞にそれぞれ所望の電気的刺激を与えることができる。従って、本発明の方法によれば、薬剤スクリーニングや生体分子間相互作用の網羅的解析を、従来のように９６穴プレートや３８４穴プレート等を用いてウエル毎に行なうのではなく、一細胞レベルで行なうことが可能になる。また、１個の培養神経細胞のある特異的な部位（例えば、樹状突起）に注目して、その中の特定部位に電気刺激を与えることができる。神経細胞がシナプスを介して受ける入力刺激に近い電気刺激を空間的分解能を高めながら与えることができる。
本発明で用いる針の材料は、上記した性質を有するものであれば特に限定されないが、例えば、カーボンナノチューブなどが挙げられる。カーボンナノチューブは、グラファイトの一層（グラフィン）を丸めた円筒形の形状を有し、１００％炭素原子から構成される微小な結晶である。近年、ナノテクノロジーが脚光を浴び、このカーボンナノチューブも多方面から注目されている。カーボンナノチューブを使用する研究例には、液晶、プラズマディスプレイに代わり、ナノチューブを電子銃に使用する画面の開発、燃料電池および太陽電池への応用、または水素貯蔵材料などが挙げられる。これらは、カーボンナノチューブ自体が有する微小さ、その立体構造から得られる量子物性、ならびに純粋に炭素からのみなるという各種の特徴の組み合わせから、従来とは異なるユニークな性質を有するためである。カーボンナノチューブはまた、純粋に炭素のみからなり、カーボンブラックなどと異なり不純物をほとんど含有しない。また、成形時および／または使用時に高温下に曝されても、変化しないという特徴をも有する。
現在、Ｍｕｌｔｉ  ｗａｌｌカーボンナノチューブとしては、直径が５０〜１００ｎｍ程度で、長さが３μｍ以上のものが入手可能であり、本発明ではこのようなカーボンナノチューブを使用することが好ましい。本発明では、３μｍ以下、例えば、５００ｎｍ以下の直径を有する針を使用する。
本発明では、上記したような３μｍ以下の直径を有する針を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）のカンチレバーの先に装着し、電気的接続を行なうことができる。ここで言う電気的接続とは、針の電荷を正又は負に制御するための電気的接続のことを言う。電気的接続は、電位制御手段と針を電線などで接続することにより行なうことができる。本発明で用いる電位制御手段は、針の電荷を制御できるものであれば特に限定されずない。また、このカンチレバーは、顕微鏡の画像処理と連動させて、目的の細胞の間や部位の間を移動させることにより、所望の電気的刺激を目的の細胞のみに与えることができる。本発明の好ましい態様では、針は常に垂直方向を向き、高い精度で針先位置をコントロールすることができる。上記した針の移動は、針の移動を制御するための駆動手段により行なうことができる。即ち、本発明によれば、電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針の移動を制御するための駆動手段を有する細胞の電気刺激装置が提供される。さらに具体的には、本発明の細胞の電気刺激装置は、（ａ）細胞を所定の場所に保持するための細胞保持手段；（ｂ）電位制御手段に連結された３μｍ以下の直径を有する針、及び該針に連結された該針の移動を制御するための駆動手段；及び（ｃ）細胞保持手段内に保持された細胞を観察するための顕微鏡から構成することができる。
以下、本発明の実施態様の一例を図面を参照して説明する。
図１に本発明の方法の概要を示す。図１は、駆動手段９に接続されたカンチレバー１に装着された針２が、細胞３の真上の位置から細胞表面に接触する様子を上下方向の矢印を用いて示す。細胞３はシャーレ５の内部で培養されており、シャーレ５は細胞保持手段６の上に設置されている。また、シャーレ５の内部の細胞の生えている基板は、電流が流れるように透明電極から構成されている。針２の表面の電荷は、針２に電気的に接続されている電位制御手段１０によって制御されている。電気刺激を与えるべき目的の細胞３の真上の位置から針２は、駆動手段９によって真下に降下して細胞３に接触する。細胞３上で針２は、電位制御手段１０によって表面の電荷を制御され、それにより細胞３に所望の電気的刺激が付与される。細胞に電気的刺激を与えた後、針は細胞表面から引き上げられる。以後、異なる細胞に上記の操作を繰り返すことにより、所望の細胞に所望の電気的刺激を与えることができる。上記した針２の移動は全て駆動手段９により制御されている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】  培養シャーレ内で培養している神経細胞に対して、図１に記載の装置を用いて電気的刺激を与えた。
神経細胞としてはＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質クロム親和性細胞種より単離された神経系クローン細胞）を用いた。培地は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）を用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行なった。
図１に記載の装置で使用した針は、直径５０ｎｍ及び長さ３μｍを有するカーボンナノチューブから成る針である。
先ず、針を神経細胞の表面に接触させて、電気刺激（１０Ｈｚパルス）を、１０秒間与え続けた。電気刺激中に刺激部位から拡がる緊張性脱分極が認められた。
【産業上の利用可能性】  本発明により、顕微鏡視野内の任意の細胞の任意の微小部位に電気的刺激を与える方法を提供することが可能になった。
【図１】
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【国際調査報告】
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