(57)【要約】本発明は、ネマデクチンを、糖が付加し得るＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンとして得るためにネマデクチンアグリコン生合成遺伝子群の改変を行い、Ｃ−１３ヒドロキシルネマデクチンを生産する生産株を作製する。更にまた、エバーメクチンの配糖化およびオレアンドロース生合成に関与するａｖｃＢＩ−ＢＶＩＩＩ遺伝子群を導入して、Ｃ−１３グリコシルネマデクチン生産株を作製する。このように、分子遺伝学的手法によって作製した生産株によりＣ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３位が配糖化されたネマデクチンを効率的に取得することができ、その生物活性の改善が期待できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する菌株。
【請求項２】
Ｃ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する菌株がストレプトマイセス・シアネオグリセウム・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ  ａｔｔＢＲ４：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９４）である請求の範囲第１項記載の菌株。
【請求項３】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する菌株。
【請求項４】
Ｃ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する菌株がストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９５）である請求の範囲第３項記載の菌株。
【請求項５】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＣ−１３位水酸化ネマデクチンを生産蓄積させ、該培養物よりＣ−１３位水酸化ネマデクチンを採取することを特徴とするＣ−１３位水酸化ネマデクチンの製造法。
【請求項６】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＣ−１３位配糖化ネマデクチンを生産蓄積させ、該培養物よりＣ−１３位配糖化ネマデクチンを採取することを特徴とするＣ−１３位配糖化ネマデクチンの製造法。
【請求項７】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する微生物。
【請求項８】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する請求の範囲第７項記載の微生物の製造法。
【請求項９】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する微生物。
【請求項１０】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する請求の範囲第９項記載の微生物の製造法。
【請求項１１】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ネマデクチンアグリコン生合成遺伝子群ｎｅｍＡ３−４オペロンのＫＳ１０をコードする領域にバイオマイシン耐性遺伝子を挿入したネマデクチン非生産性の菌株（ＫＳ１０挿入変位株）。
【請求項１２】
ネマデクチン非生産性の菌株が、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９３）である請求の範囲第１１項記載の菌株。
【請求項１３】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、上記ＫＳ１０挿入変位株にストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群ａｖｅＡ３−４を保有し、ＮｅｍＡ１−２及びＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる菌株。
【請求項１４】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ＮｅｍＡ１−２およびＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる微生物でストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチン生合成遺伝子群の制御遺伝子ａｖｅＲを保有する菌株。
【請求項１５】
ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ＮｅｍＡ１−２及びＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる微生物でストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチン生合成遺伝子群の制御遺伝子ａｖｅＲ及びエバーメクチン配糖化およびオレアンドロース生合成遺伝子群ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩを保有する菌株。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】産業上の利用分野
本発明はストレプトマイセス属に属するネマデクチン生産能を有する菌株、該菌株を用いるネマデクチンの製造法に関し、更に詳しくはネマデクチン生産能を有するストレプトマイセス属に属する微生物を用いるＣ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３グリコシルネマデクチンの製造法及びストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属する菌株に関する。
［従来の技術］
ベンゾフラン環骨格を有する一連の化合物は優れた抗寄生虫・抗昆虫活性を有し、エバーメクチンやミルベマイシンが実用化されている。ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲネスが生産するベンゾフラン環骨格を有するネマデクチンはα、β、γおよびδの４種の成分が存在し、そのＣ−１３位には下記の構造で表されるように置換基が存在せず飽和している。
2004111230.tif 000002
ネマデクチンα      Ｒ１＝Ｈ      Ｒ２＝ＣＨ（ＣＨ３）２
β      Ｒ１＝Ｈ      Ｒ２＝ＣＨ３
γ      Ｒ１＝ＣＨ３  Ｒ２＝ＣＨ３
δ      Ｒ１＝ＣＨ３  Ｒ２＝ＣＨ（ＣＨ３）２
ネマデクチンのＣ−１３位が飽和する理由はネマデクチンアグリコン部分の生成に関与するネマデクチンポリケチド合成酵素（ネマデクチンＰＫＳ）のモジュール７がＫＳ−ＡＴ−ＤＨ−ＥＲ−ＫＲ−ＡＣＰという構成をしている為めである。飽和したＣ−１３位について化学合成的に立体選択的修飾をもたらすことは構造上困難であり、下記構造のエバーメクチンのように糖付加による抗昆虫・抗寄生虫活性の上昇への期待がもてるにもかかわらず、化学合成による誘導体の製造はなされていなかった。
2004111230.tif 000003
上記のように、化学合成ではネマデクチンのＣ−１３位に立体選択的に水酸基を導入することやその水酸基を配糖化することは困難とされていた構造を、本発明者らは、鋭意研究の結果、分子遺伝学的手法によってＣ−１３グリコシルネマデクチン生産菌を作製することにより立体選択的に配糖化されたネマデクチンを効率的に取得することに成功した。
本発明はこのような知見に基いて完成されたものであり、その目的は分子遺伝学的手法によってＣ−１３グリコシルネマデクチン生産菌を作製し、立体選択的に配糖化されたネマデクチンを効率的に取得することができ、その生物活性の改善を期待し得る、ストレプトマイセス属に属するネマデクチン生産能を有する菌株を提供するものである。
本発明の他の目的は、ネマデクチンを生産するストレプトマイセス属に属する微生物に、ネマデクチン類似化合物を生産する微生物のＤＮＡを導入してＣ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３グリコシルネマデクチンを生産蓄積させ採取するネマデクチンの製造法を提供するものである。
【発明の開示】
本発明者らは、ネマデクチンを化学合成的に修飾可能な、特に糖が付加しうるＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンとして得るためにネマデクチンアグリコン生合成遺伝子群の改変を行い、ネマデクチンＰＫＳとエバーメクチンポリケチド合成酵素（エバーメクチンＰＫＳ）とのハイブリッドポリケチド合成酵素（ハイブリッドＰＫＳ）を形成することによりＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンを生産する菌株を作製した。そして、エバーメクチンＰＫＳの転写調節に関与するａｖｅＲ遺伝子を導入してエバーメクチンＰＫＳ遺伝子の転写を促進させるとともにＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンの生産性を向上させた。
なお、本菌株は、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲとして、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基ずき日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託した。受託日は平成１５年６月６日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９５である。
さらにまた、エバーメクチンの配糖化及びオレアンドロース生合成に関与するａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ遺伝子群を導入した菌株を作製し、Ｃ−１３グリコシルネマデクチン生産株を作製した。
なお、本菌株は、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ  ａｔｔＢＲ４：：ａｖｅＢ１−ＢＶＩＩＩとして、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基ずき日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託した。受託日は平成１５年６月６日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９４である。
本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属する菌株を培地で培養し、培養物中にＣ−１３グリコシルネマデクチンを生産蓄積させ、該培養物よりＣ−１３グリコシルネマデクチンを採取するＣ−１３グリコシルネマデクチンの製造法である。また、本発明は、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３グリコシルネマデクチン生産能を有する菌株である。
以上のごとく、ネマデクチンを生産するストレプトマイセス属に属する微生物に、ネマデクチン類似化合物を生産する微生物のＤＮＡを導入してＣ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３グリコシルネマデクチンを生産蓄積せしめたという報告は未だ知られていない。
従って、本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する菌株を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する菌株を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＣ−１３位水酸化ネマデクチンを生産蓄積させ、該培養物よりＣ−１３位水酸化ネマデクチンを採取するＣ−１３位水酸化ネマデクチンの製造法を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、Ｃ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する微生物を培地で培養し、培養物中にＣ−１３位配糖化ネマデクチンを生産蓄積させ、該培養物よりＣ−１３位配糖化ネマデクチンを採取するＣ−１３位配糖化ネマデクチンの製造法を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位水酸化ネマデクチン生産能を有する微生物及びその製造法を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群を保有するＣ−１３位配糖化ネマデクチン生産能を有する微生物及びその製造法を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ネマデクチンアグリコン生合成遺伝子群ｎｅｍＡ３−４オペロンのＫＳ１０をコードする領域にバイオマイシン耐性遺伝子を挿入したネマデクチン非生産性の菌株（ＫＳ１０挿入変位株）を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、上記ＫＳ１０挿入変位株にストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチンアグリコン生合成遺伝子群ａｖｅＡ３−４を保有し、ＮｅｍＡ１−２及びＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる微生物を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ＮｅｍＡ１−２及びＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる微生物でストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチン生合成遺伝子群の制御遺伝子ａｖｅＲを保有する菌株を提供するものである。
更に本発明はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスに属し、ＮｅｍＡ１−２及びＡＶＥＳ３−４とのハイブリッドＰＫＳを形成しうる微生物でストレプトマイセス・アベルミチリスのエバーメクチン生合成遺伝子群の制御遺伝子ａｖｅＲ及びエバーメクチン配糖化およびオレアンドロース生合成遺伝子群ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩを保有する菌株を提供するものである。
【図面の簡単な説明】    第１図はネマデクチンＰＫＳモジュール１０のＫＳ領域を含む３．０ｋｂ断片の制限酵素地図であり、矢印は転写方向を示す。
第２図はネマデクチンＫＳ１０領域のＳａｌＩ部位ｖｐｈ挿入断片の制限酵素地図であり、矢印は転写方向を示す。
第３図はＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
第４図はＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
第５図はＣ−１３グリコシルネマデクチンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
第６図はＣ−１３グリコシルネマデクチンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】    以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はけっしてこれのみに限定されるものではない。
【実施例１】ネマデクチンＰＫＳ、ＫＳ１０領域にバイオマイシン耐性遺伝子（ｖｉｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｖｐｈ）を挿入したストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ＮＲＲＬ  １５７７３の取得
（１）ネマデクチンＰＫＳ、ＫＳ１０をコードするＤＮＡ断片のサブクローニング
ネマデクチンアグリコン合成酵素遺伝子を含むコスミドＤＮＡのうち、モジュール１０のＫＳドメイン（ＮＥＭ−ＫＳ１０）をコードするＤＮＡを含むコスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社製、日本国）で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、ＫＳ１０領域を含有する３．０ｋｂのＤＮＡ断片をジーンクリーンＩＩキット（バイオ１０１社製、米国）を用いて分離・精製した。また、プラスミドｐＵＣ１９（宝酒造社製、日本国）は、ＢａｍＨＩで消化した後、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（宝酒造社製、日本国）で脱リン酸化した。ＮＥＭ−ＫＳ１０を含む３．０ｋｂ断片とｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ消化物、各々約０．１μｇをＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製、日本国）を用いて、１６℃で１６時間反応することで連結させた。
このＤＮＡ連結反応物１０μｌと大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（日本ジーン社製、日本国）を接触させることにより、形質転換を行った。形質転換株の選択には、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（和光純薬社製、日本国）を含有した２０ｍｌのＬＢ寒天培地を用い、０．１ｍｏｌ／Ｌイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液、２％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ、ナカライテスク社製、日本国）のジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製、日本国）溶液を、あらかじめ各々５０μｌ塗布しておいた。組換えプラスミドを保持する形質転換株のコロニーは、β−ガラクトシダーゼ活性を失っているため、Ｘ−ｇａｌを分解できず、白色を呈する。この白コロニーをエーゼで拾い、１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間、振盪培養後、アルカリ法にて菌体からプラスミドを抽出・精製した。得られた組換えプラスミドの一部を制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、３．０ｋｂのＤＮＡ断片がｐＵＣ１９に挿入されているプラスミドｐＵＣ１９：：ＮＥＭ−ＫＳ１０が得られていることを確認した。
（２）ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ＮＲＲＬ  １５７７３由来ＢａｍＨＩ  ３．０ｋｂ  ＤＮＡ断片の末端配列の決定
はじめにサイクルシークエンス反応の鋳型ＤＮＡの調製を行なった。実施例１−（１）で得た組換えプラスミドｐＵＣ１９：：ＮＥＭ−ＫＳ１０に、ＥｘｐａｎｄＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｒｏｃｈ社製、米国）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、配列番号１に記載の５’−ＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧ−３’の塩基配列を有する合成ＤＮＡ、配列番号２に記載の５’−ＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡ−３’の塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーセットとして添加し、ＥｘｐａｎｄＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈ社製、米国）を加えた後、９６℃で５分間処理した後、９６℃で３０秒間、７０℃で３分間の反応を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。反応終了後、エキソヌクレアーゼＩ（アマシャムファルマシアバイオテック社製、米国）及びアルカリフォスファターゼ（アマシャムファルマシアバイオテック社製、米国）を加え、３７℃で１５分間反応させた後、８０℃で１０分間処理して両酵素を失活させた。両酵素を失活させた後、これを鋳型ＤＮＡとしてＩＲ標識プライマー（アロカ社製、日本国）及びＴｈｅｒｍｏ  ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテック社製、米国）を添加し、サイクルシークエンス反応を行った。反応終了後、反応停止液を加え、混合し試料溶液とした。
この試料溶液を９０℃、２分間加熱し、氷冷した後、シーケンス電気泳動を行った。電気泳動装置はＤＮＡシーケンサーＭｏｄｅｌ  ４０００シリーズ（ＬＩ−ＣＯＲ社製、米国）を使用し、電気泳動後のイメージの解析はＢａｓｅ  Ｉｍａｇｅ  ＩＲ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．３０のＩｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１０で行った。得られた各ＤＮＡ断片の塩基配列をもとに、そのアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴ検索を行った結果、一端はＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ａｖｅＡ４と相同性の高い配列、反対側の末端にはＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのｒｅｄｕｃｔａｓｅと相同性の高い配列が見いだされた。これらの塩基配列から、ＢａｍＨＩ断片のネマデクチンＰＫＳ遺伝子の転写方向を確認した（第１図参照）。
（３）ＮＥＭ−ＫＳ１０領域へのバイオマイシン耐性遺伝子（ｖｉｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｖｐｈ）の挿入
ｐＵＣ１９：：ＮＥＭ−ＫＳ１０を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、ＫＳ１０領域を含有する３．０ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（東洋紡社製、日本国）をＢａｍＨＩで消化して得た約３．０ｋｂのＤＮＡ断片０．１μｇとＮＥＭ−ＫＳ１０を含むＢａｍＨＩ断片０．１μｇを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製、日本国）を用いて、１６℃で１６時間反応することで連結させた。このＤＮＡ連結反応物１０μｌと大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルを接触させることにより形質転換を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋にＮＥＭ−ＫＳ１０断片を連結した組換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋：：ＮＥＭ−ＫＳ１０を得た。さらに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋：：ＮＥＭ−ＫＳ１０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製、日本国）及びＳｓｔＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、米国）で消化し、アガロースゲル電気泳動して得た約３．０ｋｂのＮＥＭ−ＫＳ１０を含有するＤＮＡ断片と、プラスミドｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｓｔＩで制限酵素消化した約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を各々０．１μｇずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて、１６℃で１６時間反応することで連結させた。このＤＮＡ連結反応物１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行い、ｐＵＣ１９−Ｂｇｌ（ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトの両端ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの外側にＢｇｌＩＩ切断配列ＡＧＡＴＣＴを挿入させたもの）にＮＥＭ−ＫＳ１０断片を連結した組換えプラスミドｐＵＣ１９−Ｂｇｌ：：ＮＥＭ−ＫＳ１０を得た。
ｖｐｈはプラスミドｐＵＣ１９：：ｖｐｈを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製、日本国）及びＰｓｔＩ（宝酒造社製、日本国）で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、ｖｐｈを含む１．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製することによって得た。このｖｐｈを含む１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片はＢＫＬ  ｋｉｔ（宝酒造社製、日本国）を用いて３７℃で１５分間反応することでＤＮＡ末端の平滑化を行った。ｐＵＣ１９−Ｂｇｌ：：ＮＥＭ−ＫＳ１０を制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製：日本国）で消化した後、ＢＫＬ  ｋｉｔを用いてＳａｌＩ切断部位の平滑末端化を行った。平滑末端化した断片と上記の平滑末端化したｖｐｈ１．７ｋｂのＤＮＡ断片と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いてＤＮＡの連結を行なった。このＤＮＡ連結反応物１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＫＳ１０領域内にｖｐｈを挿入した組換えプラスミドｐＵＣ１９−Ｂｇｌ：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈを得た（第２図参照）。なお、形質転換体の選択には５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５０μｇ／ｍｌのツベラクチノマイシンＮ含有のＬＢ培地を用いた。
ｐＵＣ１９−Ｂｇｌ：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈを制限酵素ＢｇｌＩＩ（宝酒造社製、日本国）で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、ＫＳ１０−ｖｐｈ領域を含有する４．７ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。放線菌用ベクタープラスミドｐＧＭ１６０を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、６．８ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。さらに、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）を用いてＤＮＡ５’末端の脱リン酸化を行った。このｐＧＭ１６０  ＢａｍＨＩ消化物とＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈ領域を含有する４．７ｋｂのＤＮＡ断片を各々０．１μｇずつ混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いてＤＮＡの連結を行った。このＤＮＡ連結反応物１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、組換えプラスミドｐＧＭ１６０：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈを得た。なお、形質転換体の選択には５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５０μｇ／ｍｌのツベラクチノマイシンＮ含有のＬＢ培地を用いた。ｐＧＭ１６０：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈを用いて大腸菌ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０の形質転換を行った。なお、形質転換体の選択には３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（和光純薬社製、日本国）、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１５０μｇ／ｍｌのツベラクチノマイシンＮ含有のＬＢ培地を用いた。大腸菌ＧＭ２９２９  ｈｓｄＳ：：Ｔｎ１０の形質転換体から非メチル化プラスミドＤＮＡ  ｐＧＭ１６０：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈを調製した。
（４）ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ＮＲＲＬ  １５７７３からのプロトプラストの調製
凍結（−３０℃）保存してあるストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスの胞子懸濁液を５０ｍｌの３０％ｗ／ｖショ糖、０．５％ｗ／ｖグリシン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＹＥＭＥ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ）に移植し、ロータリーシェーカーで３０℃、４８時間培養した。菌体を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集め、２０ｍｌのＰ１０培地を加えよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を洗浄した。洗浄した菌体に１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム含有のＰ１０培地を加えて懸濁し、３０℃で３０分間保温してプロトプラストを生じさせた。１０ｍｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、プロトプラスト懸濁液を綿栓フイルターに通しリゾチームで未消化の菌糸を除去した。綿栓フィルターを通過したプロトプラスト懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。上清を除き１０ｍｌのＰ１０培地でよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心しプロトプラストを沈澱させた。再度Ｐ１０培地を１０ｍｌ加え、プロトプラストを懸濁、遠心してプロトプラストを洗浄した。得られた洗浄プロトプラストを５ｍｌのＰ１０培地に懸濁し、０．１ｍｌずつ滅菌したエッペンドルフチューブに分注した後、−８０℃で保存した。
（５）染色体上のネマデクチンＰＫＳ、ＫＳ１０領域にバイオマイシン耐性遺伝子（ｖｉｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ｖｐｈ）を挿入した遺伝子交換体の作成
実施例１−（３）で得た組換えプラスミドｐＧＭ１６０：：ＮＥＭ−ＫＳ１０−ｖｐｈ約１μｇと実施例１−（４）で得たストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスのおよそ５×１０８個のプロトプラストを滅菌したエッペンドルフチューブに入れ、直ちに５００μｌの２５％ポリエチレングリコールＭＷ１０００溶液（２．５％ショ糖、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸、ｐＨ８．０）を加えて混合し、室温で１分間放置した。次に、４５０μｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、その１００μｌずつをＲ２ＹＥ寒天培地上にのせ、２．５ｍｌの軟寒天培地とともに塗り広げた。３０℃で２０時間培養した後、２００ｇ／ｍｌのチオストレプトン（シグマ社製、米国）含有の軟寒天培地２．５ｍｌを重層した。３０℃で５日間培養し、チオストレプトンに耐性な形質転換体を得た。
Ｒ２ＹＥ寒天培地表面に生育したチオストレプトンに耐性の形質転換体を無菌的にかきとり、ホモジナイザーで菌糸を切断し、ＹＭＳ寒天培地に塗り広げた。３７℃で４日間培養し、胞子が着生したものをマスタープレートとしてツベラクチノマイシンＮ含有ＹＭＳ寒天培地にレプリカした。３０℃で２日間培養し、ツベラクチノマイシンに耐性のコロニーを選択し、それぞれをＹＭＳ寒天培地上に塗布した。これを３０℃で５日間培養して胞子が着生したものをマスタープレートとし、２０μｇ／ｍｌチオストレプトン含有ＹＭＳ寒天培地にレプリカして３０℃で２日間培養した。ツベラクチノマイシンに耐性、チオストレプトンに感受性となった株を選択し、染色体上のネマデクチンＰＫＳ、ＫＳ１０領域にｖｐｈが挿入したことをＳｏｕｔｈｅｒｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法で確認するとともにネマデクチンを生産しないことを確認した。得られたそれぞれの菌株はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｅｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ  ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ）とした。
なお、本菌株は、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｙａｎｏｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｎｏｎｃｙａｎｏｇｅｎｕｓ）ΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈとして、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基ずき日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託した。受託日は平成１５年６月６日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−８３９３である。
（６）ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子ａｖｅＡ３−４の取得
ストレプトマイセス・エバーミチリスの染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、低融点アガロースゲル電気泳動した後、ａｖｅＡ３−４全体を含有する配列番号３に記載の３９９１２ｂｐのＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、フェノール抽出、フェノールクロロホルム抽出、アルコール沈澱することにより分離・精製した。また、染色体組込み型ベクタープラスミドｐＴＧ１ｉｎｔ−ｃｏｓを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、５．２ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。このＥｃｏＲＩ消化したｐＴＧ１ｉｎｔ−ｃｏｓをａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）を用いてＤＮＡ５’末端の脱リン酸化を行った後、約０．５μｇをａｖｅＡ３−４全体を含有する３９９１２ｂｐのＤＮＡ断片約２μｇと混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（宝酒造社製、日本国）のＩ液およびＩＩ液を用いて、２５℃で１０分間反応することで連結させた。
このＤＮＡ連結反応物をアルコール沈澱後、ＤＮＡを２μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。これをＲｅａｄｙＴｏＧｏ  Ｌａｍｂｄａ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテック社製、米国）のＰａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔに加え、さらに２３μｌの滅菌水を加え室温で２時間放置した後、０．５ｍｌのファージ希釈緩衝液（ＳＭ緩衝液）および３０μｌのクロロホルムを加え、転倒混和した。次いで、１３２００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を新たな滅菌エッペンドルフチューブに移し、ラムダファージパッケージング溶液を得た。
（７）エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子ａｖｅＡ３−４を保有する大腸菌ＢＬ２１  ｒｅｃＡ欠損株の取得
実施例１−（６）で得たラムダファージパッケージング溶液を用いて大腸菌ＢＬ２１  ｒｅｃＡ欠損株を宿主としてトランスダクションを行った。宿主大腸菌ＢＬ２１  ｒｅｃＡ欠損株をＬＢ培地を用いて、３７℃、一晩振盪培養したものを０．４％麦芽糖添加ＬＢ培地に１％となるように加え、３７℃、３時間振盪培養した。遠心分離により菌体を回収し、１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液を用いて洗浄した。さらに遠心分離により菌体を回収し、適量の１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液に懸濁して宿主菌液を得た。この宿主菌液と実施例１−（６）で得たラムダファージパッケージング溶液をエッペンドルフチューブ内で１：１の割合で混合し、室温で３０分間静置した。その後、ＬＢ培地を加え、３０℃で１．５時間振盪したものをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＡ培地上に塗布し、３０℃で一晩培養した。カナマイシン耐性のコロニーを９６穴テストプレートにライブラリーとして培養し、その中から配列番号４に記載の合成ＤＮＡとハイブリダイズするコスミドＤＮＡを保有するクローンを選択した。エバーメクチンアグリコン合成酵素遺伝子ａｖｅＡ３−４を保有する組換えプラスミドＤＮＡは、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地を用いて一晩培養した菌体から常法にしたがってアルカリ法で精製した。
【実施例２】ネマデクチンＰＫＳモジュール１０ｖｐｈ挿入変位株へのエバーメクチン生合成遺伝子群ａｖｅＡ３−４の導入
実施例１−（５）で得たネマデクチンＰＫＳモジュール１０領域ｖｐｈ挿入株の胞子懸濁液を５０ｍｌの３０％ｗ／ｖショ糖、０．５％ｗ／ｖグリシン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＹＥＭＥ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ）に移植し、ロータリーシェーカーで３０℃、４８時間培養した。菌体を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集め、２０ｍｌのＰ１０培地を加えよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を洗浄した。洗浄した菌体に１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム含有のＰ１０培地を加えて懸濁し、３０℃で３０分間保温してプロトプラストを生じさせた。１０ｍｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、プロトプラスト懸濁液を綿栓フィルターに通しリゾチームで未消化の菌糸を除去した。綿栓フィルターを通過したプロトプラスト懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。上清を除き１０ｍｌのＰ１０培地でよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心しプロトプラストを沈澱させた。再度Ｐ１０培地を１０ｍｌ加え、プロトプラストを懸濁、遠心してプロトプラストを洗浄した。得られた洗浄プロトプラストを５ｍｌのＰ１０培地に懸濁し、０．１ｍｌずつ滅菌したエッペンドルフチューブに分注した後、−８０℃で保存した。
このプロトプラストに実施例１−（７）で作製したｐＴＧ１ｉｎｔ−ｃｏｓ：：ａｖｅＡ３−４約１μｇを加え、直ちに５００μｌの２５％ポリエチレングリコールＭＷ１０００溶液（２．５％ショ糖、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸、ｐＨ８．０）を加えて混合し、室温で１分間放置した。次に、４５０μｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、その１００μｌずつをＲ２ＹＥ寒天培地上にのせ、２．５ｍｌの軟寒天培地とともに塗り広げた。３０℃で２０時間培養した後、１００μｇ／ｍｌのネオマイシン（シグマ社製、米国）含有の軟寒天培地２．５ｍｌを重層した。３０℃で５日間培養し、ネオマイシンに耐性な形質転換体を得た。Ｒ２ＹＥ寒天培地表面に生育したネオマイシンに耐性の形質転換体を無菌的に２μｇ／ｍｌネオマイシン含有ＹＭＳ寒天培地に塗り広げた。得られたそれぞれの菌株はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ株とした。
【実施例３】ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ株へのａｖｅＲの導入
配列番号５に記載のエバーメクチン生合成遺伝子群の転写制御遺伝子ａｖｅＲを含む制限酵素ＡｇｅＩ  ＤＮＡ断片を連結したベクタープラスミドｐＵＣＢＭ２１：：ａｖｅＲを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動し、ａｖｅＲを含有する３．２７ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。染色体組込み型ベクタープラスミドｐＵＣ１９ａａｄ３”−ｉｎｔΦＣ３１のＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識部位にａｖｅＲ含有３．２７ｋｂ  ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を連結し、大腸菌ＢＬ２１ΔｒｅｃＡを形質転換した。
実施例２で得たストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ株の胞子懸濁液を５０ｍｌの３０％ｗ／ｖショ糖、０．５％ｗ／ｖグリシン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＹＥＭＥ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ）に移植し、ロータリシェーカーで３０℃、４８時間培養した。菌体を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集め、２０ｍｌのＰ１０培地を加えよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を洗浄した。洗浄した菌体に１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム含有のＰ１０培地を加えて懸濁し、３０℃で３０分間保温してプロトプラストを生じさせた。１０ｍｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、プロトプラスト懸濁液を綿栓フィルターに通しリゾチームで未消化の菌糸を除去した。綿栓フィルターを通過したプロトプラスト懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。上清を除き１０ｍｌのＰ１０培地でよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心しプロトプラストを沈澱させた。再度Ｐ１０培地を１０ｍｌ加え、プロトプラストを懸濁、遠心してプロトプラストを洗浄した。得られた洗浄プロトプラストを５ｍｌのＰ１０培地に懸濁し、０．１ｍｌずつ滅菌したエッペンドルフチューブに分注した後、−８０℃で保存した。このプロトプラストに上記で得たプラスミドＤＮＡ  ｐＵＣ１９ａａｄ３”−ｉｎｔΦＣ３１：：ａｖｅＲ約１μｇを加え、直ちに５００μｌの２５％ポリエチレングリコールＭＷ１０００溶液（２．５％ショ糖、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸、ｐＨ８．０）を加えて混合し、室温で１分間放置した。
次に、４５０μｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、その１００μｌずつをＲ２ＹＥ寒天培地上にのせ、２．５ｍｌの軟寒天培地とともに塗り広げた。３０℃で２０時間培養した後、スペクチノマイシン３ｍｇ／ｍｌ含有軟寒天培地２．５ｍｌを重層した。３０℃で５日間培養しスペクチノマイシンに耐性な形質転換体を得た。Ｒ２ＹＥ寒天培地表面に生育したスペクチノマイシンに耐性の形質転換体を無菌的に３００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン含有ＹＭＳ寒天培地に塗り広げた。得られたそれぞれの菌株はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ株とした。
【実施例４】ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ株の培養および生産物の分離・精製
実施例３で得た染色体上ネマデクチンＰＫＳモジュール７ｖｐｈ挿入株にａｖｅＡ３−４およびａｖｅＲを組み込んだ株をネマデクチン種培地に植菌し、３０℃で３日間振盪培養したもの１ｍＬを５００ｍＬ容三角コルベンに分注したネマデクチン生産培地５０ｍＬに加えた。これを２８℃で５日間、１８０ｒｐｍで振盪培養した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、菌体を回収した。得られた菌体をアセトンで懸濁し、室温で１時間攪拌した後、菌体とアセトン層を分取し、アセトン層について溶媒留去した。溶媒乾固した物質に水およびクロロホルムを加え攪拌した後、クロロホルム層を分取し、無水硫酸ナトリウムを加え脱水処理を行った。クロロホルム層の溶媒留去を行い、得られた残留物を粗抽出物とした。粗抽出物をごく少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで平衡化したシリカゲル（シグマ社製、米国）カラムに通塔し、クロロホルムで洗浄した後、２５％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムで洗浄し、Ｃ−１３ヒドロキシルネマデクチンを含まない画分を除去した。次いで、４０％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムで溶出される画分を除去し、５０％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムでＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンを多く含む画分を集めた後、得られた溶出液を減圧乾固して黄色油状の物質を得た。次いで、得られた黄色油状の物質は以下の条件でＨＰＬＣを用いて分離・精製した。
Ｐｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳカラム（ＯＤＳ  ３μｍ、カラムサイズ２０φｍｍ×２５０ｍｍ；センシュー科学社製、日本国）を用い、アセトニトリル５０％、メタノール１８％、水３２％の混合溶媒を移動相、検出２４６ｎｍ、流速８ｍＬ／ｍｉｎで分離した時、保持時間２８分の成分を単離した。得られた化合物は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（第３図参照）データ、及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（第４図参照）データおよびマススペクトルデータ（Ｍ＋１＝６２９）によってその構造を解析し、下記式で表されるＣ−１３ヒドロキシルネマデクチンα（分子式：Ｃ３６Ｈ５２Ｏ９）であることを確認した。
2004111230.tif 000004
【実施例５】ストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来エバーメクチン配糖化遺伝子群ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩの取得
配列番号６記載の１１０４１ｂｐのＤＮＡ断片、すなわちａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ全体を含有するＤＮＡを連結したｐＵＣ１９：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ全体を含有するＤＮＡ断片を低融点アガロースゲル電気泳動した後、フェノール抽出、フェノールクロロホルム抽出、アルコール沈澱することにより分離・精製した。また、染色体組込み型ベクタープラスミドｐＵＣ１９ｉｎｔＲ４−ｔｓｒを制限酵素ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、１１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。これらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて連結し、このＤＮＡ連結反応物１０μｌを用いて大腸菌ＢＬ２１ΔｒｅｃＡを形質転換し、組換えプラスミドｐＵＣ１９ｉｎｔＲ４−ｔｓｒ：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩを得た。なお、形質転換体の選択には５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有のＬＢ培地を用いた。
【実施例６】ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢｉｎｔＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ株へのストレプトマイセス・エバーミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来エバーメクチン配糖化及びオレアンドロース生合成遺伝子群ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩの導入
実施例３で得たストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ株の胞子懸濁液を５０ｍｌの３０％ｗ／ｖショ糖、０．５％ｗ／ｖグリシン、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＹＥＭＥ培地（５００ｍｌ容三角フラスコ）に移植し、ロータリシェーカーで３０℃、４８時間培養した。菌体を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集め、２０ｍｌのＰ１０培地を加えよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心して菌体を洗浄した。洗浄した菌体に１ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム含有のＰ１０培地を加えて懸濁し、３０℃で３０分間保温してプロトプラストを生じさせた。１０ｍｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、プロトプラスト懸濁液を綿栓フィルターに通しリゾチームで未消化の菌糸を除去した。綿栓フィルターを通過したプロトプラスト懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、プロトプラストを沈澱させた。上清を除き１０ｍｌのＰ１０培地でよく懸濁した後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心しプロトプラストを沈澱させた。再度Ｐ１０培地を１０ｍｌ加え、プロトプラストを懸濁、遠心してプロトプラストを洗浄した。得られた洗浄プロトプラストを５ｍｌのＰ１０培地に懸濁し、０．１ｍｌずつ滅菌したエッペンドルフチューブに分注した後、−８０℃で保存した。このプロトプラストに実施例５で得たプラスミドＤＮＡ  ｐＵＣ１９ｉｎｔＲ４−ｔｓｒ：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ約１μｇを加え、直ちに５００μｌの２５％ポリエチレングリコールＭＷ１０００溶液（２．５％ショ糖、０．０５％ＫＨ２ＰＯ４、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−マレイン酸、ｐＨ８．０）を加えて混合し、室温で１分間放置した。
次に、４５０μｌのＰ１０培地を加えてよく混合した後、その１００μｌずつをＲ２ＹＥ寒天培地上にのせ、２．５ｍｌの軟寒天培地とともに塗り広げた。３０℃で２０時間培養した後、チオストレプトン２００μｇ／ｍｌ含有軟寒天培地２．５ｍｌを重層した。３０℃で５日間培養しチオストレプトンに耐性な形質転換体を得た。Ｒ２ＹＥ寒天培地表面に生育したチオストレプトンに耐性の形質転換体を無菌的に２０μｇ／ｍｌチオストレプトン含有ＹＭＳ寒天培地に塗り広げた。得られたそれぞれの菌株はストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ  ａｔｔＢＲ４：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩとした。
【実施例７】ストレプトマイセス・シアネオグリセウス・サブスピーシーズ・ノンシアノゲナスΔｎｅｍＡ４：：ｖｐｈ  ａｔｔＢＴＧ１：：ａｖｅＡ４−ａｖｅＡ３−ａｖｅＥ  ａｔｔＢφＣ３１：：ａｖｅＲ  ａｔｔＢＲ４：：ａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩ株の培養および生産物の分離・精製
実施例６で得た染色体上ネマデクチンＰＫＳモジュール１０のｖｐｈ挿入株にａｖｅＡ３−４，ａｖｅＲおよびａｖｅＢＩ−ＢＶＩＩＩを組み込んだ株をネマデクチン種培地に植菌し、３０℃で３日間振盪培養したもの１ｍＬを５００ｍＬ容三角コルベンに分注したネマデクチン生産培地５０ｍＬに加えた。これを２８℃で５日間、１８０ｒｐｍで振盪培養した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、菌体を回収した。得られた菌体をアセトンで懸濁し、室温で１時間攪拌した後、菌体とアセトン層を分取し、アセトン層について溶媒留去した。溶媒乾固した物質に水およびクロロホルムを加え攪拌した後、クロロホルム層を分取し、無水硫酸ナトリウムを加え脱水処理を行った。クロロホルム層の溶媒留去を行い、得られた残留物を粗抽出物とした。粗抽出物をごく少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで平衡化したシリカゲル（シグマ社製、米国）カラムに通塔し、クロロホルムで洗浄した後、３０％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムで洗浄し、Ｃ−１３グリコシルネデクチンを含まない画分を除去した。次いで、４０％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムで溶出される画分、５０％ｖ／ｖ酢酸エチル／クロロホルムで溶出される画分を集めた後、得られた溶出液をそれぞれ減圧乾固して黄色油状の物質を得た。次いで、得られた黄色油状の物質をＨＰＬＣを用いて分離・精製した。
カラムはＰｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳ（３μｍ、カラムサイズ２０φ×２５０ｍｍ；センシュー科学社製）を使用し、アセトニトリル・メタノール・水を５５：１８：２７の割合で混合したものを移動層として用いた。流速は６ｍＬ／ｍｉｎに設定し、２４６ｎｍの吸収を指標に、保持時間１２０分の成分を分取した。得られた化合物は１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（第５図参照）データ、及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（第６図参照）データ、マススペクトルデータ（Ｍ＋１＝９１７）によってその構造を解析し、下記式Ｃ−１３グリコシルネマデクチンα（分子式：Ｃ５０Ｈ７６Ｏ１５）であることを確認した。
2004111230.tif 000005
前記の各実施例において使用した各種培地および緩衝液の組成は以下に示す通りである。
ファージ希釈緩衝液（ＳＭ緩衝液）
Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）                １０ｍＭ
塩化ナトリウム                          １００ｍＭ
硫酸マグネシウム７水和物                  １０ｍＭ
サイクルシーケンス反応停止液
ブロモフェノールブルー                      ０．０２％
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）                    ２０ｍＭ
ホルムアミド                              ９５％
ＹＥＭＥ培地
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）                ３ｇ
麦芽エキス（Ｏｘｏｉｄ社製）                ３ｇ
ペプトン  （Ｄｉｆｃｏ社製）                ５ｇ
グルコース                                １０ｇ
ショ糖                                  ３００ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
ｐＨ無調整、１２１℃、１分間高圧蒸気滅菌。
微量元素溶液
塩化第２鉄６水和物                      ２００ｍｇ
塩化亜鉛                                  ４０ｍｇ
塩化第２銅２水和物                        １０ｍｇ
塩化マンガン４水和物                      １０ｍｇ
ホウ酸ナトリウム１０水和物                １０ｍｇ
モリブデン酸アンモニウム４水和物          １０ｍｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
Ｐ１０培地
ショ糖                                  １０３ｇ
硫酸カリウム                                ０．２５ｇ
塩化マグネシウム６水和物                    ２．０３ｇ
微量元素溶液                                ２．０ｍｌ
蒸留水                                  ８００ｍｌ
１２１℃、１５分間の高圧蒸気滅菌後、以下の組成のものを無菌的に加える。
０．５％リン酸１カリウム                  １０ｍｌ
３．６８％塩化カルシウム２水和物        １００ｍｌ
０．２５Ｍ  ＴＥＳ＊（ｐＨ７．２）      １００ｍｌ
＊Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
Ｒ２ＹＥ寒天培地
ショ糖                                  １０３ｇ
硫酸カリウム                                ０．２５ｇ
塩化マグネシウム６水和物                  １０．１２ｇ
グルコース                                １０ｇ
カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）                ０．１ｇ
寒天                                      ２２ｇ
蒸留水                                  ８００ｍｌ
１２１℃、１５分間の高圧蒸気滅菌後、以下の組成のものを無菌的に加える。
微量元素溶液                                ２ｍｌ
０．５％リン酸１カリウム                  １０ｍｌ
３．６８％塩化カルシウム２水和物          ８０ｍｌ
２０％Ｌ−プロリン                        １５ｍｌ
０．２５Ｍ  ＴＥＳ（ｐＨ７．２）        １００ｍｌ
１０％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）        ５０ｍｌ
１Ｍ  水酸化ナトリウム                      ５ｍｌ
軟寒天培地
ショ糖                                  １０３ｇ
塩化マグネシウム６水和物                  １０．１２ｇ
寒天（Ｄｉｆｃｏ社製）                      ６．５ｇ
蒸留水                                  ８２０ｍｌ
１２１℃、１５分間の高圧蒸気滅菌後、以下の組成のものを無菌的に加える。
３．６８％塩化カルシウム２水和物          ８０ｍｌ
０．２５Ｍ  ＴＥＳ＊（ｐＨ７．２）      １００ｍｌ
ＹＭＳ寒天培地
麦芽エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）              １０ｇ
酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）                ４ｇ
可溶性澱粉（Ｄｉｆｃｏ社製）                ４ｇ
寒天                                      ２０ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
２Ｍ水酸化カリウムでｐＨ７．４とした後、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌する。滅菌終了後、塩化マグネシウム、硝酸カルシウムを各々１０ｍＭ、８ｍＭと成るように加える。
ＬＡ培地
トリプトン（Ｏｘｏｉｄ社製）              １０ｇ
酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ社製）                ５ｇ
塩化ナトリウム                              ５ｇ
寒天                                      １５ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
２Ｍ水酸化カリウムでｐＨ７．２とした後、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌する。
ネマデクチン生産菌種培地
グルコース                                １０ｇ
デキストリン                              ２０ｇ
酵母エキス                                  ５ｇ
ＮＺ−アミンＡ                              ５ｇ
炭酸カルシウム                              １ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
ｐＨ無調整、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌する。
ネマデクチン生産培地
グルコース                                ５０ｇ
綿実粉                                    ２５ｇ
炭酸カルシウム                              ７ｇ
蒸留水                                １０００ｍｌ
ｐＨ無調整、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌する。
産業上の利用分野
以上のごとく本発明は、ネマデクチンを生産するストレプトマイセス属に属する微生物に、ネマデクチン類似化合物を生産する微生物のＤＮＡを導入してＣ−１３ヒドロキシルネマデクチン及びＣ−１３グリコシルネマデクチンを生産蓄積せしめて、採取することができる。このように、分子遺伝学的手法によってＣ−１３グリコシルネマデクチン生産菌を作製することで立体選択的に配糖化されたネマデクチンを効率的に取得することができ、抗昆虫・抗寄生虫等の生物活性の改善が期待される。
【配列表】
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2004111230.tif 000032
【図１】
2004111230.tif 000033
【図２】
2004111230.tif 000034
【図３】
2004111230.tif 000035
【図４】
2004111230.tif 000036
【図５】
2004111230.tif 000037
【図６】
2004111230.tif 000038
【国際調査報告】
2004111230.tif 000039
2004111230.tif 000040
2004111230.tif 000041
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