(57)【要約】接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備し、該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性微粒子を保持させて磁性化した第２の細胞を播種し、前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に誘導し、該磁気誘導によって得られた細胞配置状態で前記第１の細胞及び第２の細胞を培養するようにする。この細胞培養方法によれば、細胞シートをシート毎に調製した後、温度を変化させ剥離し単層シートを積層することなく細胞を重層することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養方法であって、
接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備する準備工程と、
該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性化した第２の細胞を播種する播種工程と、
前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に引き付ける磁気誘導工程と、
該磁気誘導工程によって得られた細胞配置状態で前記第１の細胞及び第２の細胞を培養する培養工程、
とを備える、細胞培養方法。
【請求項２】
前記第２の細胞は、単層化あるいは重層化された状態で播種される、第１項に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記準備工程は、前記第１の細胞を単層化あるいは重層化された細胞シートが形成されるまで培養する培養工程を含む、第１項または第２項に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記準備工程は、磁性化した第１の細胞を磁力によって培養基材の培養面に引き付ける磁気誘導工程を備える、第１項〜第３項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記第１の細胞及び第２の細胞を培養する培養基材は、プレート状体、管状体、中空部を有する外皮状体、柱状体、皿状体及び球状体のいずれかである、第１項〜第４項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記培養基材の培養面は細胞非接着性である、第１項〜第５項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記第１の細胞と第２の細胞とは、異なる種類の細胞の組み合わせとなっている、第１項〜第６項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記第１の細胞と第２の細胞とは、肝実質細胞と血管内皮細胞、線維芽細胞と上皮細胞、平滑筋細胞と血管内皮細胞、角膜実質細胞と角膜上皮細胞、角膜実質細胞と角膜内皮細胞の組合せのいずれかである、第１項〜第７項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記培養工程で得られた細胞培養体を培養基材から解放する解放工程を備える、第１項〜第８項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
細胞培養体の回収工程を備える、第１項〜第９項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
細胞培養方法であって、
接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備する準備工程と、
該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性化した第２の細胞を播種する播種工程と、
前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に引き付ける磁気誘導工程と、
を備える、細胞培養方法。
【請求項１２】
前記第の細胞は、単層化あるいは重層化された状態で播種される、第１１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
さらに、前記磁気誘導工程により得られた細胞配置状態で前記第１の細胞と前記第２の細胞とを結合材料によって一体化する一体化工程を備える、第１１項または第１２項に記載の細胞培養方法。
【請求項１４】
前記結合材料がゲル化材料であって、該ゲル化材料のゲル化によって前記第１の細胞と前記第２の細胞とを一体化する１３項に記載の細胞培養方法。
【請求項１５】
第１項〜第１４項のいずれかに記載の細胞培養方法によって得られる、三次元形状を有する培養組織。
【請求項１６】
培養組織であって、
細胞の重層体を有し、当該細胞重層体の少なくとも一部に磁性化された細胞を備える、培養組織。
【請求項１７】
前記細胞重層体は、異なる種類の細胞が重層されている、第１６項記載の培養組織。
【請求項１８】
前記細胞重層体は、肝実質細胞と血管内皮細胞、線維芽細胞と上皮細胞、平滑筋細胞と血管内皮細胞、角膜実質細胞と角膜上皮細胞、及び角膜実質細胞と角膜内皮細胞のいずれかの組み合わせで異なる種類の細胞が重層されている、第１６項又は第１７項に記載の培養組織。
【請求項１９】
略シート状の培養組織である、第１６項〜第１８項のいずれかに記載の培養組織。
【請求項２０】
管状の培養組織である、第１６項〜第１８項のいずれかに記載の培養組織。
【請求項２１】
球状面の一部あるいは全体を構成する培養組織である、第１６項〜第１８項のいずれかに記載の培養組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞培養方法及び培養組織に関する。
【背景技術】  近年、組織工学の発展に伴って、多くの培養組織がインビトロで再構築されるようになってきている。例えば、表皮細胞などの単一細胞によって二次元的に構成された比較的単純な組織構造を有する培養組織や、ゲルやスポンジなどの足場（スキャフォールド：Ｓｃａｆｆｏｌｄ）に軟骨細胞や線維芽細胞を保持させた培養軟骨や培養真皮などの三次元的な培養組織が知られている。
しかしながら、複雑な構造と機能を有する臓器、すなわち、心臓や肝臓、腎臓、脳などを組織工学の技術によって構築することは、未だ多くの課題が残されており、種々の研究が盛んに行われている。血管や臓器は多種類の細胞で構成されており、これらをインビトロで構築するためには、多種類の細胞をそれぞれの細胞に最適な位置に配置する必要がある。ところが、インビトロ環境においては異種類の細胞間における細胞間接着が起きないことが指摘されており、十分な機能発現が生じないことが開示されている（「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１９９９；４５：ｐ．３５５−３６２（米国））。一方、温度感応性ポリマーを敷設した培養容器を用いて、細胞を密に培養して細胞シートを形成した後、酵素処理することなく環境温度を変化させることによって回収し、異なる細胞種の細胞シートを重ねることで三次元培養組織を構築することが一つの方法として案出されている（「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」２００２；６２：ｐ．４６４−４７０（米国））。
【発明の開示】
上記温度感応性ポリマーを用いた細胞シートの重層化では、単層シートを調製した後、温度を変化させることによって剥離し、単層シートを積層する必要があり、非常に煩雑であり、多様な３次元培養組織の構築方法としては作業性に劣る。また、温度変化による細胞シートの回収は時間と手間が掛かるとともに、単層状態の細胞シートの取り扱いが困難である。さらに、三次元培養組織の構築にあたっては、細胞接着とともにその位置決めも重要な要素である。
本発明は、上述した課題に鑑みてなされたものであり、細胞シートをシート毎に調製し、剥離し、積層することなく細胞を重層化できる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。また、温度を大きく変えることなく細胞を重層化できる細胞培養方法を提供することを一つの目的とする。さらに、三次元形状の培養組織を簡易に構築できる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。さらにまた新規な培養組織を提供することを目的の一つとする。
上述の目的の少なくとも一つを達成するために、本発明は、以下の手法を採用した。すなわち、本発明によれば、細胞培養方法であって、接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備する準備工程と、該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性化した第２の細胞を播種する播種工程と、前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に引き付ける磁気誘導工程と、該磁気誘導工程によって得られた細胞配置状態で前記第１の細胞及び第２の細胞を培養する培養工程、を備える、方法が提供される。また、細胞培養方法であって、接着依存性細胞であって単層化あるいは重層化された第１の細胞を培養基材の培養面に準備する準備工程と、該第１の細胞に対して、接着依存性細胞であって磁性化した第２の細胞を播種する播種工程と、前記第２の細胞を磁力によって前記第１の細胞に対して所定位置に引き付ける磁気誘導工程と、を備える、細胞培養方法も提供される。
これらのいずれかの細胞培養方法においては、前記第２の細胞は、単層化あるいは重層化された状態で播種されることが好ましい態様であり、前記準備工程は、前記第１の細胞を単層化あるいは重層化された細胞シートが形成されるまで培養する培養工程を含むことも好ましい態様である。さらに、前記準備工程は、磁性化した第１の細胞を磁力によって培養基材の培養面に引き付ける磁気誘導工程を備えることが好ましい態様であり、前記第１の細胞及び第２の細胞を培養する培養基材は、プレート状体、管状体、中空部を有する外皮状体、柱状体、皿状体及び球状体のいずれかであることも好ましい態様である。さらに、前記培養基材の培養面は細胞非接着性であることが好ましい。さらにまた、前記第１の細胞と第２の細胞とは、異なる種類の細胞の組み合わせとすることができ、特に、前記第１の細胞と前記第２の細胞とは、肝実質細胞と血管内皮細胞、線維芽細胞と上皮細胞、平滑筋細胞と血管内皮細胞、角膜実質細胞と角膜上皮細胞、角膜実質細胞と角膜内皮細胞の組合せのいずれかとすることができる。
これらの培養方法においては、前記磁気誘導工程あるいは前記培養工程で得られた細胞培養体を培養基材から解放する解放工程を備えることができ、また、得られた細胞培養体の回収工程を備えることもできる。
また、本発明によれば、培養組織であって、細胞の重層体を有し、当該細胞重層体の少なくとも一部に磁性化された細胞を備える、培養組織が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、磁性微粒子封入正電荷リポソーム（ＭＰＣＬ）の一例を示す。
図２は、抗体が固定化された磁性微粒子封入リポソーム（ＡＭＬ）の一例を示す。
図３は、本発明の細胞培養方法の一例を示す。
図４は、本発明の細胞培養方法の他の一例を示す。
図５は、本発明の培養方法により得られる三次元培養組織の各種形態を示し、図５（ａ）は単一種類の細胞が重層化したシート状の培養組織を示し、図５（ｂ）は、異種類の細胞が重層化したシート状の培養組織を示し、図５（ｃ）は、異種類の細胞が重層化した管状の培養組織を示し、図５（ｄ）は、異種類の細胞が重層化した円形皿状の培養組織を示す。
図６は、実施例１の概略を示し、肝実質細胞と磁性化した肝非実質細胞（ヒト血管内皮細胞）とを磁力を作用させた状態で共培養して培養肝組織の構築工程を示す。
図７は、ＨＡＥＣｓの細胞内鉄濃度測定結果を示す。
図８は、ＨＡＥＣｓの生細胞数の測定結果を示す。
図９は、各種培養系でのアルブミン分泌量の経時変化のグラフを示す。
図１０は、実施例２の概略を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の細胞培養方法について説明し、さらに、培養組織について説明する。なお、本発明の細胞培養方法は、少なくとも第１の細胞と第２の細胞とを重層化する培養方法であるが、さらに、第３以降の細胞を播種して培養することや、第３以降の細胞シートを積層（重層化）することも包含されている。第３以降の細胞も第２の細胞に準じて培養される。したがって、以下の説明においては、第３以降の細胞を培養し、組織化することも包含される。
本発明の一つの形態である細胞培養方法によれば、単層化あるいは重層化された第１の細胞に対して磁性化した第２の細胞を播種し、当該第２の細胞を第１の細胞に対して所定位置に磁力で引き付けるよう磁気誘導する。さらに、この後、そのまま第１の細胞及び第２の細胞を培養することができる。つまり、磁力によって第１の細胞に対して第２の細胞を配置するとともに第２の細胞を所定の位置にアラインメントし重層化する。さらに重層化された細胞群を培養することでこれらの細胞は相互に接着される。このため、細胞シートをシート毎に調製し、剥離し、積層することなく細胞を重層化することができる。また、温度を大きく変化させることなく細胞を重層化することができる。また、磁力によって所定位置に細胞を引き付けするような磁気誘導によれば、所望の位置に第２の細胞を配置できるため、所望の重層構造の構築が可能である。このため、三次元形状の培養組織を簡易に構築することができる。また、この培養組織によれば、磁力を作用させることで所望の三次元形状の培養組織の構築及び保持が容易となっている。また、磁力による移送等や固定が可能となっている。
本発明の細胞培養方法においては、培養しようとする細胞は、いずれも接着依存性細胞である。接着依存性細胞は、培養面に直接又は間接的に接着したあとその接着面積を広げていき、その後細胞分裂する細胞であって、足場依存性細胞ともいう。接着依存性細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の動物細胞が挙げられる。温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞（角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上皮細胞などを含む）、内皮細胞（血管内皮細胞、角膜内皮細胞などを含む）、線維芽細胞、実質細胞（肝実質細胞、角膜実質細胞などを含む）、血管平滑筋細胞などの平滑筋細胞を含む筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、骨膜由来細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞のほか、胚性幹細胞（ＥＳＣ）や間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの幹細胞や接着依存性のガン細胞が挙げられる。
本培養方法においては、重層化される細胞の由来生物（同種、異種、同一個体）は特に限定しない。異種生物であっても、細胞レベルにおいて共培養することは可能であり、また、このようにして得られる培養組織は用途を有している。なお、ここでいう同種及び異種とは、それぞれ、細胞の由来（移植時におけるドナーとレシピエントなど）に基づく同種（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）及び異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）を意味している。また、これらの細胞は、同じ種類の細胞でも異なる種類の細胞であってもよい。なお、ここでいう同種類および異種類とは、既に説明した同種（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）や異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）を示すのではなく、同じ種類（Ｓａｍｅ  Ｔｙｐｅ）や異なる種類（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔｙｐｅ）の細胞であることを示している。以上のことから、本発明においては、例えば、第１の細胞と第２の細胞との組み合わせには、同種動物の同種類の細胞、同種動物の異種類の細胞、異種動物の同種類の細胞、異種動物の異種類の細胞、同一個体の同種類の細胞、同一個体の異なる種類の細胞の組み合わせを含めることができる。
本発明によれば、異種類の細胞の場合であっても磁力による作用によって両者を良好に接着することができる。同種類の細胞の場合には、心筋組織や皮膚組織（上皮層）のように単一細胞を重層化することでその機能が大きく発現される組織を構築するのに好ましく、殊に通常の培養操作では容易に重層化しない細胞種において特に効果的である。異種類の細胞の場合には、複数の種類の細胞が相互的に作用して機能を達成する肝臓や腎臓、あるいは血管などの器官に好ましい。異種類の細胞によって、心筋や皮膚などを器官として構築することもできる。
異種類の細胞を用いる例としては、例えば、第１の細胞を肝実質細胞とし、第２の細胞を血管内皮細胞とすることができる。この組み合わせは肝臓組織として好ましい。また、第１の細胞を線維芽細胞とし第２の細胞を上皮細胞とすることができ、当該組み合わせは皮膚組織として好ましく、第１の細胞を平滑筋細胞とし第２の細胞を血管内皮細胞とすることができ、当該組み合わせは管状の血管組織として好ましい（管状体の内表面を培養面とする場合の順序である）。なお、血管組織は、第１の細胞を血管内皮細胞とし第２の細胞を平滑筋細胞とし第３の細胞を線維芽細胞とすることもできる（管状体の外表面を培養面とする場合の順序である。）。さらに、第１の細胞を角膜実質細胞とし、第２の細胞を角膜上皮細胞、または角膜内皮細胞とすることができ、当該組み合わせは角膜組織として好ましい。この場合、第３の細胞として、角膜上皮細胞、または角膜内皮細胞を選択すれば、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、角膜内皮細胞を順に重層化することができ、当該組み合わせは角膜組織として更に好ましい。なお、これらの具体的な組み合わせを含む各種の異種類の細胞の重層構造においては、第１の細胞、第２の細胞及び第３以降の細胞の順序は限定するものではない。組織や部位に応じ、また、培養基材の形態により適宜変更することができる。例えば、上述の管状の血管組織を構築する場合には、管状体（円柱状体を含む）を利用することが好ましく、角膜組織を構築する場合には、皿状体、殊に円形皿状体を利用することが好ましい。
（準備工程）
本発明の第１の細胞の準備工程においては、単層化あるいは重層化された第１の細胞が培養基材の培養面に準備される。単層化及び重層化は、単層シートおよび重層シートを包含するが、必ずしも第１の細胞が単層シートあるいは重層シートが形成されるまで培養されていることを要しない。細胞シートが形成されていなくても、磁力によって培養面の所定部位に誘導され集積されて単層状あるいは重層状となった細胞集積体であってもよい。したがって、例えば、後述するように、分散状態（細胞懸濁液）の磁性化された第１の細胞が培養基材の培養面に磁力によって誘導されることにより、おおよそ単層化あるいは重層化されて培養面に準備されていてもよい。なお、細胞集積体及び細胞シートの形状は特に限定しない。第１の細胞を集積させたあるいは培養する培養基材の培養表面の形状に対応する各種形態を採ることができる。
第１の細胞は、細胞が付着され培養される培養面を有する培養基材を用いて保持、集積あるいは培養される。培養基材は、重層化させる細胞体の基層となる第１の細胞層の形状を規定するものではあるが、第１の細胞層の平面的形態は、最終的には磁力を作用させる領域によって決定される。本発明方法によって得られる培養組織は、目的に応じて最終的に培養基材から分離される。当該培養基材は、各種形態のものを用いることができるが、三次元形状の培養組織の構築には、プレート状体、管状体、柱状体、中空部を有する外皮状体、皿状体及び球状体を用いることが好ましい。プレート状体の場合、各種平面形状の細胞シートの重層化に適しており、管状体の場合、その内表面及び／又は外表面を培養面として用いることで管状の培養組織を得ることができる。また、管状の培養組織は、柱状体の外表面を利用することによっても得ることができる。なお、培養基材として柱状体を利用する場合には、それ自身が磁石である柱状体を用いることができる。さらに、中空部を有する外皮状体の場合、その内表面及び／又は外表面を培養面として用いることで外皮状（袋状）の培養組織を得ることができる。なお、培養基材として管状体を用いる場合、第１の準備工程においては、当該外表面あるいは内表面に対応した管状の細胞集積体あるいは細胞シートが得られ、外皮状体を用いる場合には、外皮状の細胞集積体あるいはシートが得られることになる。皿状体の場合、培養基材の凹表面及び／又は凸表面を培養面として用いることで皿状の培養組織を得ることができる。一方、培養基材を球状体とした場合、球状体自体または球状体の中心を磁石とすることで、第１細胞および第２細胞を球状表面に引き付けることができ、マイクロキャリア培養法によってサイトカインやタンパク質を効率よく抽出することができる。この場合、培養基材から細胞は分離されることなく、細胞基材とともに培養に供されることとなる。
本発明で用いる培養基材の培養面は、細胞非接着性であることが好ましい。ここで、「細胞非接着性の培養面」とは、細胞接着依存性の細胞が接着しない又は接着しにくい性質の培養面であればどのようなものでもよく、ポリスチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエステルなどを材質とする培養容器の底面（メンブレンでもよい）や、アガロース、寒天、ゼラチン、コラーゲン、フィブリンなどでコーティングされた培養基材の培養面（メンブレンでもよい）や、陽性荷電した培養基材の培養面などが挙げられる。細胞非接着性の培養面を有する培養基材としては、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ社の超低接着性プレート（商品名）やセルシード社のハイドロセル（Ｈｙｄｒｏ  Ｃｅｌｌ：商品名）などが挙げられる。なお、接着しにくい性質の培養面とは、磁力を除去したときに磁性化された細胞が軽く培養基材を振れば培養面から離れる程度の接着性を持つ培養面をいう。
細胞非接着性の培養面を有する培養基材を用いる場合、第１の細胞を磁性化させて培養面に磁力で引き付けるよう磁気誘導しておくことによって、培養基材の培養面に第１の細胞を付着させて培養することができるとともに、最終的に培養基材から培養組織を分離させようとするとき、磁力の作用を弱めるか除去するだけで、培養面から培養組織を解放し分離させることができる。このため、酵素や温度感応性ポリマー等を使用することなく培養組織を回収することができる。結果として、温度を変化させることなく培養組織を容易に回収できるとともに、その後の取り扱いが容易となる。
（播種工程）
本発明の播種工程では、磁性化した第２の細胞を第１の細胞に対して供給する。細胞を磁性化するには、例えば、磁性微粒子を細胞に保持させる方法を採用することができる。このような磁性化工程は、例えば、磁性微粒子と細胞とを一定期間接触させる工程とすることができる。第２の細胞を磁性化する磁性微粒子は、細胞に保持されると共に保持されることで細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよいが、例えば、マグネタイトなどの磁性微粒子をリポソームで封入した磁性微粒子封入正電荷リポソーム（ＭＰＣＬ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）や抗体を固定化したリポソームで封入した磁性微粒子封入リポソーム（ＡＭＬ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍａｇｎｅｔｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を構成する磁性微粒子であってもよいし、第一化学製品社のＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）内の磁性マイクロビーズやベリタス社の磁性ナノパーティクル（商品名ＥａｓｙＳｅｐ）などであってもよい。これらの磁性微粒子のうち、ＭＰＣＬやＡＭＬのようにリポソームを含む磁性微粒子は、リポソームの存在によって細胞内に取り込まれるので一つの細胞が多くの磁性微粒子を取り込むことができ、これにより、磁力によって培養基材の培養面方向（第１の細胞方向）に引き付けられるように磁気誘導可能となる程度に磁性を容易に持つことができるため、好ましい。
ＭＰＣＬは、図１に一例を示すようにマグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に正電荷脂質を備えた構造を持つ。多くの細胞は負電荷を有しているため正電荷を持つＭＰＣＬと結合しやすく、またＭＰＣＬはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。このため、本発明において磁性微粒子としてＭＰＣＬを採用すれば、種々の細胞の培養に適用することができる。ＭＰＣＬは、例えばＪｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第８７巻第１１７９〜１１８３頁（１９９６年）に記載されたマグネタイト封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ，Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の製造方法を参照して調製すればよい。細胞の磁性化工程でＭＰＣＬを採用するときには、ＭＰＣＬを１細胞当り磁性微粒子として１〜１５０ｐｇ、特に２０〜１５０ｐｇ使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とＭＰＣＬとの接触を開始してから０．５〜８時間後、特に３〜５時間後に次工程へ進むことが好ましい。
ＡＭＬは、図２に一例を示すように、マグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に抗体を備えた構造を持つ。抗体としては培養しようとする特定の細胞に特異的に結合するものを選択する。抗体と特異的に結合する部位を持つ細胞はＡＭＬの抗体と結合しやすく、またＡＭＬはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。ＡＭＬは、例えばＪ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊｐｎ．第３４巻第６６〜７２頁（２００１年）に記載された方法を参照して調製すればよい。磁性化工程でＡＭＬを採用するときには、ＡＭＬを１細胞当り磁性微粒子として１〜１５０ｐｇ、特に２０〜１５０ｐｇ使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とＡＭＬとの接触を開始してから０．５〜８時間後、特に３〜５時間後に次工程へ進むことが好ましい。
本発明の播種工程では、細胞種や目的とする培養組織の大きさなどによって適宜播種密度などを設定すればよいが、１×１０３〜１×１０６個／ｃｍ２の範囲で播種密度を設定するのが一般的である。
なお、播種する第２の細胞は磁性化されていればよく、播種する時点における細胞形態は、図３に示すように、分散状であってもよいし、図４に示すように、単層化あるいは重層化された状態であってもよい。さらには、単層化細胞シートであっても重層化細胞シートであってもよい。分散状の磁性化細胞は、上記した磁性微粒子と第２の細胞とを一定期間接触させることで得ることができる。単層化あるいは重層化された磁性化細胞（それぞれのシート状体を含む。以下、同様である。）は、一旦磁性化した第２の細胞を、適当な培養基材の培養面に播種し、磁性化細胞を磁力で培養面に引き付けるよう磁気誘導しながら培養することで得ることができる。また、第２の細胞を単層又は重層構造のシート状体に培養した後に磁性微粒子と接触させることによっても、単層化あるいは重層化された磁性化細胞を容易に得ることができる。第２の細胞を単層とするかあるいは重層構造とするかは必要に応じて選択し、それに応じた培地組成などの培養条件を採用すればよい。なお、第２の細胞の単層化細胞シートあるいは重層化細胞シートは、第１の細胞が準備された培養基材の培養面の三次元形態に一致する形態である必要はない。細胞シートは単層化細胞シートであれ重層化細胞シートであれ、十分な可撓性を有しているとともに、当該細胞シートは磁力によって培養面に引き付けられるため、一般的な平面のシート状体であれば、培養面が曲面を有していても、その培養面に十分に追従することができる。また、第２の細胞の単層化細胞シートあるいは重層化細胞シートは２枚以上を順次重層化するように供給することもできるし、予め重層化した状態のものを供給することもできる。
磁性化された第２の細胞を第１の細胞に供給する方法は、特に限定せず、分散状態の細胞であれば、通常の細胞懸濁液と同じように取り扱うことができるが、図４に示すように、好ましくは、磁性化された第２の細胞を磁力で保持して第１の細胞上にまで移送し、その後、その磁力を除去することで、第１の細胞に播種する。こうすることで、容易にかつ確実に第２の細胞を目的の箇所（第１の細胞上の所定位置）まで移送することができる。特に、磁性化された第２の細胞が単層化あるいは重層化されている脆弱なシート状体の場合には、取り扱いが容易であるとともに、その層形態を容易に維持して、また、その平面形態を容易に維持して移送することができる。したがって、磁力による移送あるいは播種は、第２の細胞へのダメージを有効に回避することができるとともに、所望の重層形態を得るのに有効な方法である。また、第１の細胞の所定位置に第２の細胞を播種できるため、第１の細胞の保持状態、集積状態あるいは層形態を乱すことなく第２の細胞を播種できることになる。したがって、第１の細胞へのダメージも回避できる移送及び播種方法であるといえる。なお、磁力による移送に当たっては，後述する回収工程に用いる懸架用支持膜を用いることができる。なお、磁性化した第１、第２および第３の細胞を並行して培養することによって単層細胞シートあるいは重層細胞シートを作製した後、磁力によって容器上方から順次細胞シートを磁力源に磁気誘導して引き付けた上重層することによっても、本発明における培養組織を作製することができる。
（磁気誘導工程）
本発明の磁気誘導工程では、磁性化した細胞を所望の位置に引き付けうる磁力を作用可能に磁気誘導すればよい。培養面に細胞を引き付けるよう磁力を作用させるには、培養面を介して細胞培養側でない側（培養面を挟んで細胞と対向する側）に磁石を設置することによる磁気誘導形態を採用することができる。プレート状の培養基材の表面を培養面とする場合、裏面側に磁石を配置できる。また、管状体の培養基材であって、その外表面（外周面）を培養面とする場合、管状体内部に磁石を設置できる。
例えば、磁性化した細胞を培養基材の培養面の反対側に設定した磁石により培養面に引き付ける場合、磁性微粒子の種類、磁性微粒子が細胞に取り込まれた量、培養基材の培養面の材質、培養面の厚さなどに基づいて適宜磁力を決定する。なお、本磁気誘導工程では、磁力により細胞を所定位置に引き付けて配置するのに付随して、磁力により細胞を所定位置に移動させることもできる。
本磁気誘導工程では、磁力により第１の細胞に対して所望の位置に第２の細胞を引き付けて［誘導し］配置することができる。このため所望の重層構造を構築でき、結果として所望の三次元構造を構築できる。
第１の細胞に対して第２の細胞を引き付ける位置は、少なくとも第１の細胞群（細胞集積体あるいは細胞シート）と一部が重複するような位置であればよい。当該重複部位にて第１の細胞と第２の細胞とは接触し、培養等によって細胞同士が結合し、重層化が可能となるからである。したがって、第２の細胞は、第１の細胞群の全体に重層化する必要はなく、部分的であってもよい。
なお、前記準備工程において、第１の細胞を培養面に対して細胞集積体あるいは細胞シートなどの形態で準備するのにあたり、磁性微粒子を保持させることなどにより予め磁性化した第１の細胞を磁力によって培養基材の培養面に引き付ける磁気誘導工程を実施することもできる。すなわち、第２の細胞を磁性化したのと同様に、第１の細胞を磁性化し、当該磁性化された第１の細胞を培養基材の培養面に保持、集積あるいは培養することもできる。かかる磁気誘導工程を実施して第１の細胞を保持、集積しあるいはシート化することにより、簡易にかつ短期間で単層化されたあるいは重層化された第１の細胞を準備することができる。また、細胞非接着性の培養面を有する培養基材を使用した場合には、培養組織を構築した後、磁力を解放することによって、培養組織を培養基材から容易に解放することができる。
（培養工程）
培養工程では、磁気誘導工程で得られた細胞配置状態で第１の細胞及び第２の細胞を培養する。これにより、第１および第２の細胞から細胞外マトリクスが産生され、細胞間の接着が強固に行われる。磁気誘導工程によって得られた細胞の配置［磁気誘導］状態を維持するには、培養工程においても磁力を継続的に作用させるよう磁気誘導することが好ましい。第１の細胞は既に接触阻害する程度まで培養されている場合において、本培養工程では実質的に第２の細胞が増殖するように培養することになる。第１の細胞がそこまで培養されていない場合あるいは単に第１の細胞が保持ないし集積されたのみであり増殖可能あるいは細胞外マトリックスが未形成等の場合には、本培養工程においては、実質的に第１の細胞と第２の細胞とを増殖させることもある。第１の細胞は培養面に準備された層の形態で増殖し、第２の細胞は、第１の細胞層に磁力で引き付けられた［誘導された］部位に重層化するように増殖する。
本培養工程では、第１及び第２の細胞の培養条件やどのような増殖状態が得られるまで培養するか等、特に限定しないが、目的にあった状態となるまで培養することができる。第１の細胞及び第２の細胞は、それぞれ単層を構成してもよいし、多数層を構成していてもよい。
本培養方法によれば、重層化すべき細胞を磁力によって任意位置に配置し接着できるため、所望の三次元形状を備える培養組織とすることができる。また、同種類あるいは異種類の細胞を所望の状態に重層化することで本来の組織形態に容易に近似させることができ、細胞が機能するのに適した環境を構築できるため、優れた培養組織とすることができる。
さらに、本培養方法においては、既に説明したように、第３以降の細胞を重層化することもできる。第３以降の細胞は、より下位の細胞（例えば、第３の細胞においては第１及び／又は第２の細胞を意味する。）に対して所定位置に磁力で引き付けるよう磁気誘導することで近接あるいは接触した位置に配置でき、これらの細胞同士を容易に接着することができる。したがって、第１の細胞に対して第３の細胞を接触等させ、接着することもできる。第３以降の細胞においても、第１及び第２の細胞と同様に、細胞接着依存性であることが好ましい。細胞形態は、分散状であっても、単層化されていても重層化されていてもよい（シート状体も含む）。また、磁性微粒子等を用いて磁性化し磁力による誘導を利用して配置し培養することができる。
なお、本培養工程では、培養対象となる細胞の種類によって液体培地の種類を適宜選定することができる。例えば、周知のＤＭＥＭやα−ＭＥＭ、Ｍ１９９培地などを選定してもよい。また、ＥＧＦやＦＧＦに代表される成長因子等の添加因子を適宜添加してもよい。
（回収工程）
本発明の細胞培養方法は、所定状態に達した細胞を磁力によって回収する回収工程を含んでいてもよい。回収工程では、培養基材に懸架用支持膜を入れ該支持膜に所定状態に達した培養組織を磁力を利用して付着させて引き上げることにより回収してもよい。ここで懸架用支持膜とは、所定状態に達した培養組織をほぼそのまま懸架できるものであればいずれのものでもよく、編物、織布、不織布、紙、樹脂シートなどが挙げられる。たとえば、滅菌ガーゼ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布のほか、ＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）やＰＴＦＥ膜（ポリテトラフルオロエチレン膜）等の親水性膜（表面を親水性処理したものを含む）や、シリコーンゴムなどの柔軟性のある高分子材料やポリグリコール酸、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーや寒天培地やコラーゲンゲル、ゼラチンゲル、フィブリンゲル、アルギン酸ゲル、ポリＮ−イソピルアクリルアミドゲルなどのハイドロゲルなどをシート状にしたものなどが挙げられる。また、磁力としては通電・遮電により励磁・消磁を制御可能な電磁石の磁力を用いてもよい。こうすれば、所定状態に達した培養組織を回収する作業を自動化しやすいばかりでなく、その後細胞を移動したりパッケージングしたりする作業も自動化しやすいため便利である。なお、既に述べたように、培養組織の回収に先だって培養面に作用させていた磁力を除去あるいは弱めることで培養組織を培養面から開放することができる。培養組織は、磁力による他、懸架用支持膜に懸架させた状態のものをピンセットで把持したり、口径を広くしたピペットで吸引したりすることなどによっても回収することができる。
本発明の細胞培養方法においては、培養工程を省略することもできる。すなわち、上記磁気誘導工程において、第２の細胞を第１の細胞に対して所定位置に磁力で引き付けることによって、第１の細胞および第２の細胞を培養しなくても、第１の細胞と第２の細胞とを重層化した状態でおおよそ一体化された重層組織を得ることもできる。この方法によれば、簡易に重層組織を得ることができる。例えば、第２の細胞が単層化されたあるいは重層化されたシート状体で第１の細胞に対して供給（播種）された場合においては、磁力によって細胞を所定位置に引き付けるよう磁気誘導することによって容易に第１の細胞に対して第２の細胞を一体化できる。第２の細胞が２枚以上のシート状体で供給されたときにはなおさらである。
培養工程を行うことなく磁気誘導工程のみによって第１の細胞と第２の細胞とを接着した場合、その接着強度は細胞の種類や第２の細胞の播種形態により異なる。第２の細胞がシート状体等であって、接着強度が比較的高く、全体の重層組織の強度も高い場合には、培養面から磁力を除去することによって、細胞培養体を培養面から解放し回収することができる。
一方、磁気誘導工程のみによって重層化した第１の細胞と第２の細胞との接着強度が低い、あるいは全体強度が低い細胞培養体の場合には、前記磁気誘導工程によって得られた細胞配置状態で前記第１の細胞と前記第２の細胞とを結合材料で結合して一体化する一体化工程を行った上で、細胞培養体を回収することができる。結合材料によって一体化することで、細胞培養体は強度が向上して、それらの一体構造を崩壊させることなく培養面から解放し回収することができる。結合材料としては、生体親和性のあるゲル化材料を用いることが好ましく、例えば、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、フィブリン、アルギン酸、ポリビニルアルコールハイドロゲルなどを単独であるいは２種以上を混合して用いることができる。ゲル化材料を用いる場合、細胞の結合及び一体化はゲル化材料がゲル化することによって達成される。ゲル化材料を用いることで、結合しようとする細胞を容易に包理できるため、細胞の一体性を向上させることができ解放および回収時の取り扱いが容易になる。なお、磁気誘導工程で得られた細胞配置状態で一体化するには、当該磁気誘導工程において用いた磁力の作用をそのまま維持した状態でゲル化させるなどして結合材料による結合力を作用させることもできる。  磁力の作用を維持して一体化させることで、細胞の誘導固定状態が維持されるため、第１及び第２細胞を所望の位置に確実に配置したまま、固定することができる。一体化後は、磁力を取り除いた後、すなわち、磁石を取り除いた後に、細胞培養体を培養面から回収することができる。
なお、上記した一体化工程は、培養工程を行った細胞培養体についても適用することで、強度が高く取り扱いの容易な細胞培養体を得ることができるとともに容易に培養面から回収できるようになる。また、上記一体化工程は、磁気誘導工程後培養工程を実施することで細胞の培養面への接着性が高まってしまう場合や細胞非接着性でない培養面で培養した場合において細胞培養体の培養面からの回収を容易化できる。
本培養方法によって得られる培養組織は、細胞の重層体を有し、当該重層体の少なくとも一部に磁性化された細胞を備える、培養組織となっている。好ましくは、本培養組織は、ほとんどすべての細胞が磁性化されている。また、本培養組織は、本発明の細胞培養方法に適用可能な細胞の組み合わせから構成されることができる。本培養組織は、磁性化された細胞を有することにより、培養組織の移送や固定等を磁力によって行うことができる。また、さらなる三次元構造体の構築を当該培養組織の有する磁力に基づいて実施することも可能となる。したがって、使い勝手のよい培養組織を提供できる。本発明の培養組織によれば、略シート状の培養組織の他、管状体の培養組織、球状面の一部あるいは全体を構成する培養組織を提供することができる。球状面の一部を構成する培養組織としては、例えば、角膜組織のような皿状体、円形皿状体を例示でき、球状面の全体を構成する培養組織としては、マイクロキャリア培養法等に適用される球状の培養基材の表面に形成された培養組織を例示できる。
作製された培養組織は、患者の欠損部や病巣部を補綴したり、置換したりする移植用補綴物や、医薬品や化粧品などのスクリーニングや毒性試験に使用する実験用組織等価物として利用することができる。さらに、細胞の産生するサイトカインやタンパク質を抽出・回収するマイクロキャリア培養法に適用することもできるので、単一種類の細胞を培養して抽出する従来の方法に比して、各マイクロキャリアで保持できる細胞数を多くすること（重層化）で産生量を多くしたり、異なる二種類の細胞をマイクロキャリア上で重層化することによって、産生量を多くしたり、単一種類の細胞では産生しえないサイトカインやタンパク質を抽出したりすることが期待される。このことは、後述の図９に示されるように、肝実質細胞単体よりも、肝実質細胞と血管内皮細胞を重層化させた培養組織の方が、アルブミンを多く産生していることからも予測されうる。
なお、図５には、本発明の細胞培養方法によって得られる各種の三次元形状の細胞培養体である培養組織の断面構造を例示する。図５（ａ）には、同一種類の細胞（図中、心筋細胞である。）を重層化して得られた略シート状の培養組織を示す。図５（ｂ）には、異種類の細胞（図中、血管内皮細胞と肝細胞である。）を重層化して得られた略シート状の培養組織を示す。図５（ｃ）には、管状に準備した血管内皮細胞の外周面に平滑筋細胞を重層化して得られた略管状の培養組織を示す。なお、図５（ｃ）に示す培養組織は、管状の培養基材の内表面を培養面として用いて、この培養面に平滑筋細胞を準備し、この平滑筋細胞に対して血管内皮細胞を配置させることによって重層化することによっても得ることができる。また、平滑筋細胞の外周には線維芽細胞を備えるようにすることもできる。図５（ｄ）には、角膜内皮細胞の円形皿状体の上面に、角膜実質細胞、角膜上皮細胞の順に重層化した略円形皿状の培養組織を示す。なお、図５（ｄ）に示す培養組織は、円形皿状の培養基材の内表面を培養面として用いて、この培養面に角膜上皮細胞を準備し、この角膜上皮細胞に対して角膜実質細胞を配置し、この角膜実質細胞に対してさらに角膜内皮細胞を配置させることによって重層化することによっても得ることができる。
【実施例１】  以下、本発明について実施例を用いて具体的に説明するが、これらの実施例は本発明をこれらの実施例に限定することを意図するものではない。以下の実施例１においては、肝実質細胞と血管内皮細胞を用いて培養肝組織を構築した場合について説明する。本実施例の概略を図６に示す。
（１）ラット肝実質細胞の採取
ラットの肝実質細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）は、７〜９週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからｉｎ  ｓｉｔｕコラゲナーゼ環流法により採取した。なお、コラゲナーゼ還流法については、中村敏一．初代培養肝実験法、学会出版センター１９８７；５−１７．及びＳｅｇｌｅｎ  ＰＯ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ  １９７６；１３：２９−８３に一般的な記載がある。本実施例においては、以下の方法で行った。
（コラゲナーゼ環流法）
まず、ジエチルエーテルの吸引とネンブタール腹腔内注入法でラットを麻酔した。次いで、３７℃  ０．０５％オスバン溶液中にラットを浸し、消毒した後、解剖台にラットを固定し、皮膚、腹筋の順に開腹し腹腔を露出させた。まず、腸を、向かって右側に寄せて、門脈を十分に露出させ、門脈の下に縫合糸を通し、ループを作った。縫合糸より下流から門脈に留置針を用いてカニュレーション後、留置針を抜き、外筒のカニューレを肝臓方向に差し込み縫合糸で固定した。なお、カニューレから血液が出てくるので、３０秒ほど脱血させた。
カニューレから、３７℃の前環流液を３０ｍｌ／ｍｉｎで流入し、１分ほどして肝臓が膨らんできたら、肝臓の下にある下大静脈を切断した。下大静脈の切断により、一気に血液が流れ出し脱血された。胸郭部を開き、心臓を露出させた後、切断した下大静脈を鉗子で止めた後、右心房に入る横隔膜下の下大静脈に縫合糸のループをかけ、留置針を用いて、右心房からループをかけた下大静脈にカニューレを通した。さらに、カニューレを肝臓方向に差し込み、縫合糸で固定して、右心房に刺したカニューレから、前環流液を流出させた。流出する前環流液から血が完全に抜けるまで（おおよそ２５分程度まで）前環流液を流し続けた。
前環流液をコラゲナーゼ溶液に換え、コラゲナーゼ溶液を５分間３０ｍｌ／ｍｉｎで流し、その後流速を下げた。コラゲナーゼ処理により肝臓は次第に消化され、肝小葉が浮き上がったようになり、表面からコラゲナーゼ溶液がしみ出してきた。計１０分ほどコラゲナーゼ処理をした後、環流を停止した。その後、肝臓と横隔膜および血管との接合部を切断し、肝臓をピンセットで摘み、はさみで他の組織との接合部を切断して５％ＦＣＳ含有ＭＥＭ溶液を十分入れた１０ｍｍディッシュに移した。はさみで、肝臓を細分し、ディッシュを振り細胞を滲出させた。細胞を十分分散させた後、１００ｍｍ金属メッシュ上に重ねた３枚のガーゼで細胞懸濁液を濾過した。得られた細胞懸濁液を、洗浄用緩衝液を用いて５０×ｇ，１分間の遠心処理を４回行って、肝実質細胞と非肝実質細胞に分離した。当該分離処理において沈降する細胞が肝実質細胞であり、この沈降画分を肝実質細胞として採取した。
得られた細胞は、トリパンブルー生死判別法で生死細胞数をカウントし生細胞率８０％以上の細胞のみ実験に利用した。細胞はタイプＩコラーゲンコートディッシュ（Ａｓａｈｉ  ｔｅｃｈｎｏ  ｇｌａｓｓ）に６×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２で肝実質細胞培養液にて播種培養した。なお、前還流液、コラゲナーゼ溶液、洗浄用緩衝液、肝実質細胞培養液の各組成を以下の表１〜表４に示す。
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2004101774.tif 000004
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（２）ヒト大動脈血管内皮細胞（肝非実質細胞）の採取
肝非実質細胞としてヒト大動脈血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＨＡＥＣｓ，三光純薬製）を用いた。細胞は１〜６継代目の細胞を用いた。継代は、８０％コンフルエント時に行い、細胞数を１／４にして播種した。培地としては、下記の成分を含む、血管内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２，三光純薬の商品名）を用いた。
（配合成分）ハイドロコーチゾン、ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ヘパリン、ＦＢＳ、ｈＥＧＥ、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ
（３）マグネタイト封入正電荷リポソーム（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ；ＭＣＬ）の調製
磁性微粒子マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）としては、戸田工業株式会社製で粒径１０ｎｍのものを用いた。マグネタイトは脱イオン水での洗浄により余分なイオン成分を十分に除いた後、超音波処理により水に分散する分散マグネタイト液とした。リン脂質は、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（ＴＭＡＧ；Ｎ−（α−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−ａｃｅｔｙｌ）−ｄｉｄｏｄｅｃｙｌ−Ｄ−ｇｕｌｕｔａｍａｔｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（相互薬工社製）、ジラウロイルホスファチジルクロリド（ＤＬＰＣ；Ｄｉｌａｕｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｄｅ）（シグマケミカル社製）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ；Ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（シグマケミカル社製）の３種類を用い、これらをクロロホルムに溶解して、モル比１：２：２（ＴＭＡＧ：ＤＬＰＣ：ＤＯＰＥ）の組成とし、これをナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータで回転させながら吸気し、溶媒を除去し内壁に脂質膜を作製し、この脂質膜に先に示した分散マグネタイト液（１０ｍｇ／ｍｌ）を２ｍｌ加えボルテックス撹拌しながら膜を膨潤させた。膨潤させた膜と磁性微粒子に１５分間超音波処理（２８Ｗ）を施し、その後１０倍濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を加え、ＰＢＳ中に分散させた。さらに超音波処理（２８Ｗ）を１５分間行いＭＣＬを得た。
（４）ＭＣＬのヒト大動脈血管内皮細胞（ＨＡＥＣｓ）に対する毒性
ＨＡＥＣｓを１００ｍｍディッシュに１．５×１０５ｃｅｌｌｓ播種し、ＭＣＬを鉄濃度で１００ｐｇ／ｃｅｌｌとなるように培地に添加し、添加１、２、４、８、２４、４８時間後の生細胞数および細胞内鉄濃度を測定した。細胞内鉄濃度測定結果を図７に示し、生細胞数の測定結果を図８に示す。図７に示すように、マグネタイト濃度１００ｐｇ／ｃｅｌｌでＭＣＬをＨＡＥＣｓに取り込ませたところ、ＭＣＬ添加８時間で細胞内鉄濃度が最大（約６５ｐｇ／ｃｅｌｌ）となった。また、図８に示すように、最大の細胞内鉄濃度でのＭＣＬの細胞増殖は、ＭＣＬを取り込ませていない細胞と変わりはなく、ＭＣＬのＨＡＥＣｓに対する毒性は、当該最大濃度で観察されなかった。
（５）磁石を用いたラット肝実質細胞上でのヒト大動脈血管内皮細胞の培養とアルブミン量の測定
肝実質細胞は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地でタイプＩコラーゲンコート２４穴プレート（アサヒテクノガラス社製）に播種した。培養開始二日後、ＭＣＬをＨＡＥＣｓに取り込ませ、ＨＡＥＣｓの細胞数が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各ウェルに播種した。なお、各ウェルの裏面には直径１ｍｍの磁石（表面磁束密度０．４５Ｔのネオジム磁石）を設置し、ＨＡＥＣｓを各ウェルの底面に引き付けた状態で培養した。コントロールとして、ＭＣＬを取り込ませたＨＡＥＣｓと肝実質細胞とを磁石なしで共培養したものと、ＭＣＬを取り込ませていないＨＡＥＣｓと肝実質細胞とを磁石なしで共培養したものと、肝細胞のみを磁石を用いないで静置培養したものとを用いた。
（分泌アルブミン量の測定）
また、共培養開始一日後、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地、ＥＧＭ−２培地を１：１で混合した培地０．５ｍｌで培地交換した。その後、２４時間ごとに培養上清を採取し、それぞれ−４０℃で冷凍保存し、アルブミン分泌量を測定した。アルブミン測定は、採取した培養上清中のアルブミン量をＥＬＩＳＡ法により測定することにより行った。なお、ＥＬＩＳＡ法としては以下の方法を用いた。
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ用９６ｗｅｌｌプレート（コーニング社製）に１０ｍｇ／ｍｌにＰＢＳで調整した一次抗体（抗ラットアルブミンヤギＩｇＧ分画、カッペル社製）を１００ｍｌ／ｗｅｌｌで添加し乾燥させないようにして４℃で一晩インキュベートした。その後、２００ｍｌ／ｗｅｌｌの洗浄液で３回洗浄した。測定試料を１００ｍｌ／ｗｅｌｌ添加して３７℃、３０分インキュベートした。その後、洗浄液２００ｍｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。洗浄液で調整した二次抗体（抗ラットアルブミン  パーオキシダーゼ結合ウサギＩｇＧ分画、カッペル社製）を２００ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄液２００ｍｌ／ｗｅｌｌで４回洗浄し、基質溶液を２００ｍｌ／ｍｌ添加した。この溶液を、１０〜３０分室温でインキュベート後、反応停止溶液を５０ｍｌ／ｍｌ添加した。分光光度計を用いて波長４９０ｎｍ（対照波長６５５ｎｍ）で吸光度を測定し、上清中アルブミン量を測定した。結果を図９に示す。
図９に示すように、ＭＣＬを取り込ませたＨＡＥＣｓを肝実質細胞上に播種し磁石を用いて共培養した場合（図９中、塗りつぶした丸で示す）が、最大のアルブミン分泌量を示した。さらに８日後にも生産されていることが確認できた。
これに対し、肝実質細胞のみのコントロール（図９中、白抜き三角で示す。）では、培養初期は、共培養系と同程度のアルブミン分泌能を示したが、その後、急激に低下し７日後ではほとんど検出できなくなった。また、ＭＣＬを取り込ませた共培養系でも、磁石を使用しなかった場合（図９中、塗りつぶした三角で示す。）、ＭＣＬを取り込ませていないＨＡＥＣｓを用いた場合（図９中、白抜き丸で示す。）では、ＨＡＥＣｓの肝細胞への自然沈降に伴う接着によって、多少のアルブミン分泌量の向上と延長が見られた。また、これら二つの場合において、アルブミン分泌量の亢進に対する効果は変わらなかった。しかしながら、両者とも磁石を用いて共培養させた群と比較するとそのアルブミン分泌量は少なかった。
なお、ＭＣＬを取り込ませたＨＡＥＣｓを、ペトリパームに播種した肝実質細胞上に播種し磁石（直径１ｍｍ、表面磁束密度０．４５Ｔ）を用いて培養を開始し２日後に細胞の状態を観察し、ＨＡＥＣｓが肝実質細胞上に接着され、肝実質細胞が存在する領域にはＨＡＥＣｓが存在し、肝実質細胞が存在しない領域にはＨＡＥＣｓが存在しないことを確認している。
（６）磁石を用いたラット肝実質細胞上でのヒト大動脈血管内皮細胞の培養と組織染色による観察
肝実質細胞をコラーゲンコート処理したペトリパームに播種した。培養開始二日後、ＭＣＬをＨＡＥＣｓに取り込ませ、肝実質細胞上に播種し、ペトリパームの下に直径３ｍｍの磁石（表面磁束密度４０００Ｔのネオジム磁石）を置き、ユニバーサルシェイカーで１０分間振とうした後、静置培養を行った。その後、磁石を置いたまま２日間培養した。ＭＣＬを取り込ませた細胞を播種して２日後、１０％ホルマリン固定後、組織切片を作製し、ヘマトキシリンとエオシン、抗ラットアルブミン抗体（抗ラットアルブミンウサギＩｇＧ、カッペル社）で染色して培養断面の観察を行った。
組織染色後の断面観察からは、磁石を用いることでＨＡＥＣｓが磁石上に集積していることがわかった。また、培養断面では、肝実質細胞上にＭＣＬを取り込んだＨＡＥＣｓが重層化して接着している様子が確認できた。さらに、肝機能の指標となるアルブミンを抗アルブミン抗体で染色したところ最下層の細胞層が染色されたが、その上の細胞層（ＨＡＥＣｓ層）ではアルブミンにほとんど染まっていなかった。また、磁石が無い場所には、培養断面にＨＡＥＣｓはほとんど見られなかった。これらのことから、磁石を設置し、その磁力により肝実質細胞上にＨＡＥＣｓを配置して培養することで肝実質細胞上にＨＡＥＣｓを重層培養できること、及び肝実質細胞に対する肝非実質細胞ＨＡＥＣｓの重層化により、肝実質細胞によるアルブミン生産が亢進されることがわかった。
【実施例２】  以下の実施例１においては、線維芽細胞と血管平滑筋細胞と血管内皮細胞とを用いて培養血管組織を構築した場合について説明する。本実施例においては、血管内皮細胞を第１の細胞とし、血管平滑筋細胞を第２の細胞とし、線維芽細胞を第３の細胞として血管組織を構築した。本実施例の概略を図１０に示す。
（１）血管内皮細胞
血管内皮細胞には、ヒト大動脈血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＨＡＥＣｓ，三光純薬）を用いた。細胞は２〜４継代目の細胞を用いた。継代は、８０％コンフルエント時に行い、細胞数を１／４にして行った。培地は、０．０４％ハイドロコーチゾン、０．４％ｈＦＧＦ−Ｂ、０．１％ＶＥＧＦ、０．１％Ｒ３−ＩＧＦ−１、０．１％アスコルビン酸、０．１％ヘパリン、２％ＦＢＳ、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ゲンタマイシン／アンフォテリシンを含む、血管内皮細胞用培地（ＥＧＭ−２，三光純薬）を用いた。
（２）血管平滑筋細胞
血管平滑筋細胞には、ヒト大動脈血管平滑筋細胞（ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ；ＳＭＣｓ，三光純薬）を用いた。細胞は２〜４継代目の細胞を用いた。継代は、８０％コンフルエント時に行い、細胞数を１／８にして播種した。培地は、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％インスリン、０．２％ｈＦＧＥ−Ｂ、５％ＦＢＳ、０．１％ＧＡ−１０００を含む、平滑筋細胞用培地（ＳｍＧＭ−２，三光純薬）を用いた。
（３）線維芽細胞
線維芽細胞には、マウス由来ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用い、培地は、ｃＭＥＭに１０％ＦＢＳと１００Ｕ／ｍｌペニシリン／０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸を添加したものを用いた。
（４）培養基材及び磁石
培養基材は、細胞接着性を有する通常の培養ディッシュと２４ウェルプレート超低接着性ディッシュ（Ｃｏａｓｔｏｒ、コースター製）を用いた。通常の培養ディッシュは、各細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞）の継代培養およびＭＣＬの取り込みの際に使用した。一方、超低接着性ディッシュは、血管平滑筋細胞シート（ＳＭＣシート）および線維芽細胞シート（３Ｔ３シート）の作製の際に使用した。この超低接着性ディッシュは、電気的に中性の親水性ゲルがディッシュ表面に結合している。このため疎水性相互作用や電気的相互作用によって表面に吸着するタンパク質やその他生体分子がこのディッシュ表面に吸着できない。つまり、細胞接着因子がディッシュに吸着できず、それに伴う細胞接着を阻害するようになっている。また、これらの細胞シートを培養するのにあたり、直径３０ｍｍ、表面磁束密度０．４５Ｔの円柱状ネオジ磁石（アズワン）を用いた。また、直径３ｍｍ、長さ１０ｍｍ、表面磁束密度０．２８Ｔの棒状のネオジ磁石を血管組織の作製の際に用いた。この棒状ネオジ磁石は、長尺方向の両端がＳ極とＮ極に磁化されている。
（５）血管平滑筋細胞シート（ＳＭＣシート）及び線維芽細胞シート（３Ｔ３シート）の作製
各細胞（血管平滑筋細胞、線維芽細胞）が８０％コンフルエントの状態となった培養ディッシュにおいてセルカウントして細胞数を把握した後、濃度１００ｐｇ／ｃｅｌｌになるようにＭＣＬを培養ディッシュへ添加し４時間インキュベートした。継代培養操作と同じくトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を回収して１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上述したそれぞれの培地で懸濁した。２４ウェルプレート超低接着性ディッシュに１ｗｅｌｌあたりコンフルエントの５倍の細胞数である２×１０６個で播種した。その後、ウェルがネオジ磁石の中心になるように、外径３０ｍｍのネオジ磁石をウェルの下に設置した。１日後、細胞シートとして回収した。磁石を撤去した後、ディッシュの縁を軽くたたき細胞シートを浮き上がらせた。先の口径を広げたピペットで培地ごと細胞シートを回収した。
（６）血管内皮細胞の準備
血管内皮細胞が８０％コンフルエントの状態となった培養ディッシュにおいてセルカウントして細胞数を把握した後、濃度２００ｐｇ／ｃｅｌｌになるようにＭＣＬを培養ディッシュへ添加し４時間インキュベートし細胞を磁性化した。継代培養操作と同じくトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を回収して１０００ｒｐｍで５分間遠心した後、培地で懸濁して細胞濃度を４×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌにした。血管内皮細胞（ＨＡＥＣｓ）の場合、細胞シートを形成させることなく、懸濁細胞のまま次の実験に使用した。
（７）磁気誘導による重層構造の形成
直径３ｍｍ、長さ１０ｍｍの上記棒磁石を内径３ｍｍ、外径５ｍｍ、長さ２０ｍｍのシリコンチューブ内へ入れた。このシリコンチューブの外側に血管内皮細胞（ＨＡＥＣｓ）、血管平滑筋細胞シート（ＳＭＣシート）、線維芽細胞シート（３Ｔ３シート）の順に巻き付けた。図１０に示すように、まず、血管内皮細胞の懸濁液（濃度４×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌ）５００μｌを１０ｃｍφの培養ディッシュに滴下し、直径１５ｍｍほどの水たまりを作った。磁石入りシリコンチューブを水平に転がし、細胞をシリコンチューブ上に均一に接着させた。さらに、作製したＳＭＣシートを別の１０ｃｍφの培養ディッシュ上に広げ、血管内皮細胞が表面に引き付けられた状態の磁石入りシリコンチューブをＳＭＣシート上で転がしてＳＭＣシートを巻きつけた。完全に一周覆うためにＳＭＣシートを３〜４枚巻いた。その上にＳＭＣシートと同様の手順で３Ｔ３シートを３〜４枚巻いた。このようにこれらの細胞を重層化するよう引き付けることで、血管内皮細胞に対して血管平滑筋細胞が接着し、血管平滑筋細胞に線維芽細胞が接着し重層組織を有する血管組織、すなわち細胞培養体（組織構造体）を得ることができた。
（８）コラーゲンゲルによる一体化
ゲル化材料としてコラーゲン（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  １−Ａ（新田ゼラチン））を用いた。氷中でＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  １−Ａと、ＮａＨＣＯ３を加えないＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）に１０％ＦＢＳとペニシリン／ストレプトマイシンを含む培地を１０倍濃縮した溶液と、コラーゲンゲル再構成用緩衝溶液と、を８：１：１で混合しコラーゲンゲル溶液を作った。前記シリコンチューブの外径よりもやや大きい内径（９ｍｍ）を有する２．５ｍｌシリンジ（テルモ）を二カ所切断した円筒（長さ５０ｍｍ）の中に作製した細胞培養体を入れて、さらにこのゲル溶液を流し込み、３０分インキュベートしてゲル化させた。
（９）細胞培養体の回収
ゲル化した後、円筒から細胞培養体をコラーゲンゲルごと取り出し、さらにシリコンチューブから磁石を抜き出した上、細胞培養体からシリコンチューブを抜き出すことにより、コラーゲンゲルで固定化された管状の細胞培養体を回収することができた。得られた細胞培養体の断面構造を顕微鏡で観察したところ、内層から順に血管内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞が一体化した断面構造を確認することができた。
なお、実施例１においては、第１の細胞として肝実質細胞、第２の細胞として大動脈血管内皮細胞を使用しており、実施例２においては、第１の細胞として血管内皮細胞、第２の細胞として血管平滑筋細胞、第３の細胞として線維芽細胞を使用しており、いずれも異なる細胞種による例が示されているが、細胞由来の関係においては、実施例１においてはラット由来とヒト由来の細胞であり、実施例２においては、ヒト由来とマウス由来であり、いずれも異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）で構成されていることも示されている。このように、これらの実施例では異種（Ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）により本発明を説明したが、本発明では、目的に応じて同種（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）や自家（Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ）で重層化される細胞が構成されていてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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