(57)【要約】本発明は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を有効成分とする癌治療薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を有効成分とする癌治療薬。
【請求項２】
血管内皮細胞由来の抗原が、血管内皮細胞、その細胞内成分、その細胞破砕液又はその細胞膜小胞である請求項１記載の癌治療薬。
【請求項３】
癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞の癌治療薬製造のための使用。
【請求項４】
血管内皮細胞由来の抗原が、血管内皮細胞、その細胞内成分、その細胞破砕液又はその細胞小胞である請求項３記載の使用。
【請求項５】
癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を投与することを特徴とする癌の治療法。
【請求項６】
血管内皮細胞由来の抗原が、血管内皮細胞、その細胞内成分、その細胞破砕液又はその細胞小胞である請求項５記載の治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲットにした癌免疫療法に関する。
【背景技術】  癌の治療法には外科的療法、化学療法、放射線療法などがあり、それぞれに特徴を有しており、それらの特性を考慮して、最も有効な癌治療法が選択されている。外科療法は一定の大きさ以上の癌に対しては、有効な方法であるが、手術という侵襲は患者にとって極めて負担が大きく、また脳腫瘍のように摘出が困難な部位の場合や、数ミリといった小さな癌は発見そのものが困難なことなどが、外科療法の限界となっている。化学療法は、主に注射又は経口投与という方法によるため、方法としては患者への負担が軽く、また血液を介して、抗癌剤が運搬されるため、小さな腫瘍への適応も可能である。しかしながら、抗癌剤は基本的には細胞毒であり、その副作用は極めて重篤であり、使用量、使用期間の制限によって充分な効果が得られないことが多い。放射線療法は目的とする部位に選択的に放射線を当てることが困難であり、また近傍の正常細胞にも影響を与えるという問題点を有している。
前述のとおり、これらの治療法は一長一短であることから、多くの場合、単独で行われるものではく、有効に併用され、癌治療が行われている。しかしながら、依然、癌は我が国の死因の第一位であり、新規な癌治療法の確立は急務な課題である。
さて、これら３つの癌治療法とは異なり、４つめの方法として、生体が本来有している異物排除のシステムである「免疫」によって、癌を排除しようという「癌免疫療法」がある。初期の癌免疫療法は癌細胞断片や癌特異抗原をアジュバンドなどとともに癌ワクチンとして投与し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化し、癌を排除しようというものであるが、癌細胞自身は、本来、自己の細胞が変化したものであり、極めて抗原性が乏しく、癌免疫療法の成果はほとんど得られていなかった。
近年、樹状細胞の役割が明らかとなり、新規な癌免疫療法のブレークスルーとして注目されている。樹状細胞は、生体内において最も強力な抗原提示能を有する細胞である。そこでｅｘ  ｖｉｖｏの系で、癌細胞断片や癌特異抗原を樹状細胞にパルスし、本樹状細胞を生体内に戻すことによって、樹状細胞がＣＴＬを活性化し、癌免疫により癌が排除されるというものである。樹状細胞を用いた癌免疫療法は動物実験にとどまらず、ヒトにおける臨床結果でも成功例が報告されており、その可能性と有効性は新規癌治療法として注目されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６，ｐ．２９１８（１９９６）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３，ｐ．７（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ，８４，ｐ．３０５４（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９５，ｐ．１４１（１９９８）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５，ｐ．１１０１（１９９７）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７，ｐ．１０１９（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ，９３，ｐ．７８０（１９９９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８３，ｐ．１１８３（１９９９）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１８５，ｐ．１１０１（１９９７））。
【発明の開示】
本発明の目的は、樹状細胞の機能を利用した新たな癌免疫療法を提供することにある。
そこで本発明者は、腫瘍組織は、正常組織に比べて増殖率が大きく、栄養の供給、及び老廃物の排除のパイプとしての血管新生が不可欠であることに着目し、まず血管内皮細胞を癌細胞培養上清を含有する培地で培養し、得られた血管内皮細胞由来の抗原で樹状細胞を刺激すれば、腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲットにした癌免疫療法薬として有用な樹状細胞が得られることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を有効成分とする癌治療薬を提供するものである。
また、本発明は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞の、癌治療薬製造のための使用を提供するものである。
さらに、本発明は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を投与することを特徴とする癌の治療法を提供するものである。
本発明の癌治療薬は、腫瘍細胞自体をターゲットとするのではなく、腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲットとした癌免疫療法である。従って、従来の癌免疫療法に比べて以下の点で優れている。
（１）腫瘍組織を構成する細胞は癌細胞：血管内皮細胞＝１００〜１０００：１であり、これは１つの血管内皮細胞が１００〜１０００個の癌細胞を支えていることを意味している。従って１つの血管内皮細胞の死は１００〜１０００個の癌細胞の死が予想される。従って血管内皮細胞をターゲットにした場合、癌細胞をターゲットにした場合の１００〜１０００倍効率が良い。
（２）従来の癌免疫療法では、原発癌の場合、肝癌なら肝癌、肺癌なら肺癌と癌種によって異なった細胞を免疫しなければ効果が期待できない。しかし、血管内皮細胞をターゲットとした場合、肝癌であれ肺癌であれ血管内皮細胞を抗原とするため、癌細胞の影響を受けた血管内皮細胞という点から、これらは癌種によらず共通の性質を有し、共通の抗原を発現していることから、いかなる癌種にも有効である。
（３）生体内で血管新生が盛んに行われている部位は、成人において腫瘍組織以外では創傷治癒部位のみであり、癌血管内皮細胞をターゲットとした場合、腫瘍への選択性が極めて高く、副作用が少ない。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｂ１６癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞のマウス肺癌に対する治療効果（肺重量）を示す図である。図中、ＮｏｎｅはＢ１６のみ投与群を；Ｎｏｎｅ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣはＢ１６及び何もパルスしていない樹状細胞投与群を；ＢＡＥＣ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣはＢＡＥＣをパルスした樹状細胞投与群を；Ｂ１６  ＣＭ−ＢＡＥＣ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣはＢ１６と、Ｂ１６の培養上清で培養したＢＡＥＣをパルスした樹状細胞を投与した群を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の癌治療薬の有効成分である樹状細胞は、腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲットとする。そのため、樹状細胞を刺激するための血管内皮細胞は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養したものを用いる。
用いる癌細胞は、ヒト癌細胞であるのが好ましいが、癌細胞の種類は限定されない。癌細胞の例としては、胃癌、肝臓癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍などの固形癌の細胞が挙げられる。癌細胞の培養条件は、特に制限されず、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、Ｍ１９９等の培地中、３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件下行うのが好ましい。なお培地には、抗生物質、炭酸水素ナトリウム、非必須アミノ酸等を添加することもできる。癌細胞の培養上清の採取は、例えば５００〜１５００ｒｐｍ、２〜１０分間遠心分離や、フィルターろ過することにより得られる。
血管内皮細胞としては、種は特に限定されず、ヒト、ウシ、マウスなどの血管内皮細胞が用いられる。例えば、ヒト由来であれば、臍帯静脈、臍帯動脈、大動脈、肺動脈、新生児包皮、成人皮膚等の血管の内皮細胞が用いられる。当該血管内皮細胞の培養は、前記癌細胞培養上清を含有する培地で行われる。ここで、培地中への癌細胞培養上清の添加量は、１０〜１００ｖ／ｖ％、特に２０〜１００ｖ／ｖ％が好ましい。血管内皮細胞培養のための培地は特に制限されず、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、Ｍ１９９等の培地、さらに癌細胞培養上清以外に血管内皮細胞増殖因子、ヘパリン、抗生物質等が添加されていてもよい。血管内皮細胞の培養条件は、特に制限されず、３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件下で２〜４日間行うのが好ましい。
前記血管内皮細胞由来の抗原としては、当該血管内皮細胞自体でもよいが、血管内皮細胞内成分（例えばＴｏｔａｌ  ＲＮＡ等）、血管内皮細胞破砕液又は血管内皮細胞膜小胞を用いてもよい。当該細胞内成分、細胞破砕液や膜小胞は、調製が容易であり、かつ樹状細胞に対する刺激効率が高いのでより好ましい。
細胞破砕液は、例えば凍結（−１６０℃）と融解（３７℃）を４〜６回繰り返したものを低速度で遠心（４００ｒｐｍ，１０分間）することにより調製することができる。また、膜小胞は、例えばＤＭＥＭに１００ｍＭパラホルムアルデヒド、２ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加えたもので３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件下で一晩処理し、次に１５０ｇで５分間遠心し、続いてその上清を４℃において３０分間３００００ｇの遠心により調製することができる。細胞内成分、例えばＴｏｔａｌ  ＲＮＡは常法により調製することができる。
樹状細胞としては、ヒト由来の樹状細胞、特に投与しようとする患者自身由来の樹状細胞又は患者とＭＨＣ適合のヒト由来の樹状細胞を用いるのが好ましい。樹状細胞は、例えば非特許文献８，９等に記載の方法により、骨髄細胞、臍帯血由来細胞、末梢血単核細胞などから分化誘導させることにより得ることができる。末梢血単核細胞から樹状細胞を分化誘導するには、例えばＧＭ−ＣＳＦ（１０−１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−４（５０−５００ＩＵ／ｍＬ）を加えた培地で、５〜１０日間培養するのが好ましい。
樹状細胞を前記血管内皮細胞由来の抗原で刺激するには、例えば樹状細胞の懸濁液に当該内皮血管細胞由来抗原を添加し、４〜２４時間インキュベートすることにより行われる。また抗原刺激がより効率的に行われるよう、カチオニックリポソーム等を併用することが好ましい。さらに樹状細胞と血管内皮細胞の細胞融合法によって、樹状細胞に血管内皮細胞抗原を提示させても構わない。また、血管内皮細胞のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを樹状細胞に導入させ、抗原を提示させてもよい。当該抗原の添加量は、樹状細胞１×１０６個あたり蛋白濃度として０．０１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．１〜１００μｇ／ｍＬが好ましい。
かくして得られた樹状細胞は、生体内で癌組織の血管内皮細胞特異抗原を提示し、腫瘍組織血管内皮細胞への細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、腫瘍組織の血管内皮細胞が攻撃され、腫瘍組織内の血管が破綻し、腫瘍はその栄養供給路を絶たれ、腫瘍が退縮することから、癌治療薬として有用である。
得られた樹状細胞を含む細胞懸濁液は、ヒトに癌治療薬として投与することから、細胞増殖性を無くしておくのが好ましい。より安全に利用するため加熱処理、放射線処理、あるいはマイトマイシンＣ処理など、癌治療薬としての機能を残しつつ、癌細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる。例えば、Ｘ線照射を利用する場合、Ｘ線照射器の管球の下に樹状細胞を含むフラスコを置き、総放射線量１０００〜３３００Ｒａｄで照射する。マイトマイシンＣ処理法は、例えば、樹状細胞を１〜３×１０７個細胞／ｍＬの密度で懸濁し、細胞浮遊液１ｍＬあたりマイトマイシンＣ２５〜５０μｇの比で添加して、３７℃、３０〜６０分間保温処理する。熱による細胞処理方法は、例えば、生細胞濃度を１×１０７個／ｍＬに調製した細胞懸濁液を入れた遠心管を５０〜６５℃で２０分間加熱処理を行うことで調製しうる。
本発明の癌治療薬の対象となる癌は、特に制限されないが固形癌が好ましく、例えば胃癌、肝臓癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌、膀胱癌、子宮頚部癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍等が挙げられる。本発明の樹状細胞の投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等により異なり、一概に決定できないが、現在行われている細胞ワクチン療法で注入されるのと同程度の量が患者に投与されればよい。本発明の樹状細胞は、患者本人に使用することもできるが、骨髄バンク、臍帯血バンクの発達により、ＭＨＣ適合の同種の多数の患者に投与することができる。
【実施例】  次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【実施例１】Ａ．方法
（１）癌細胞培養上清（癌ＣＭ）の調製
マウス黒色腫Ｂ１６細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件でサブコンフルエント状態まで培養した。新しい培地（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞培養用の培地；以下ＨＵＶＥＣ培地。組成は、Ｍｅｄｉｕｍ１９９：ＲＰＭＩ１６４０＝１：１に混合し、１５％ウシ胎児血清、血管内皮細胞増殖因子（２０μｇ／ｍＬ）、ヘパリン（２５μｇ／ｍＬ）、抗生物質を添加したもの）に交換した。４８時間後、培地を回収し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を０．２２μｍのフィルターにてろ過した。これと等量の新鮮なＨＵＶＥＣ培地とを混合したものを癌細胞の馴らし培地（癌ＣＭ）として使用した。
（２）癌ＣＭ作用血管内皮細胞の調製
上記のＨＵＶＥＣ培地中にヒト臍帯静脈血管内皮細胞を２５００個／ｃｍ２の濃度で播種、３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件で、培養した。翌日、癌ＣＭに培地を交換した。３７℃、５％ＣＯ２，９５％ａｉｒ、飽和水蒸気条件で４８時間培養したものを、癌ＣＭ作用血管内皮細胞とした。
（３）樹状細胞への抗原パルス
培養癌ＣＭ作用血管内皮細胞に膜小胞調製液（ＤＭＥＭ培地に１００ｍＭパラホルムアルデヒド、２ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を溶解）を添加し、３７℃、一夜処理した。
次に上清を１５０×ｇで５分間、遠心し、続いて上清を４℃、３０分間３００００×ｇの遠心し、その沈殿を癌ＣＭ血管内皮細胞の膜小胞とし、樹状細胞へパルスする抗原とした。
また培養癌ＣＭ作用血管内皮細胞を生理食塩水に懸濁し、凍結融解を４回繰り返した細胞破砕液も樹状細胞へパルスする抗原とした。
癌ＣＭ血管内皮細胞の膜小胞又は細胞破砕液とリポフェクチンとを（量比）混合し、脂質濃度として１０μｇ／ｍＬになるように調製し、２０分間室温で放置した。これをマウス樹状細胞株ＤＣ２．４細胞又は骨髄由来初代培養樹状細胞の細胞懸濁液（１×１０６個／ｍＬ）に加え、５時間インキュベートした。リン酸緩衝液で遠心、洗浄後、マイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、３０分間処理した。リン酸緩衝液で２回遠心、洗浄洗し、リン酸緩衝液に再懸濁した。
（４）樹状細胞の投与
上記方法によって調製したＤＣ２．４細胞又は初代培養樹状細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）をＢ５７／ＢＬ６マウスに皮下又は皮内投与した。
（５）癌細胞の投与
ＤＣ２．４細胞又は初代培養樹状細胞投与の一週間後、Ｂ１６Ｆ１０細胞（１×１０６ｃｅｌｌｓ）を尾静脈内注射した。
（６）肺転移数の評価
Ｂ１６Ｆ１０細胞投与一週間後、肺を摘出し、実体顕微鏡により肺に転移したコロニー数を計測した。
Ｂ．結果
各３例の樹状細胞を投与していない群の肺転移数は（９２４，７９９，５５０）であり、樹状細胞を投与した群の肺転移数は（１８４，４１４，０）であった。この結果、本発明の樹状細胞は、癌細胞の肺転移を有意に抑制し、癌治療薬として有用であることが判明した。
【実施例２】Ａ．方法
ウシ大動脈より剥離法により継代培養した血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を用いた。血管内皮細胞の培養は、ＤＭＥＭに１０％ウシ胎児血清を添加したものを培地とした。この血管内皮細胞を実施例１と同様にして細胞破砕液を抗原とした。
その他の操作は実施例１と同様にして、Ｂ１６細胞の培養上清を含有する培地でウシ大動脈由来血管内皮細胞を培養し、得られた細胞の破砕液を抗原として、樹状細胞へパルスした。得られた樹状細胞を実施例１と同様にしてＢ５７／ＢＬ６マウスに投与した。癌細胞投与２週間後、肺を摘出し、肺重量を測定した。
Ｂ．結果
その結果、図１に示すようにＮｏｎｅ群（Ｂ１６のみ投与）、Ｎｏｎｅ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣ群（Ｂ１６及び何もパルスしていない樹状細胞を投与）及びＢＡＥＣ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣ群（Ｂ１６と、ＢＡＥＣをパルスした樹状細胞を投与）は、肺の大部分がＢ１６で黒色になっており、肺重量も増加していた。これに対し、Ｂ１６ＣＭ−ＢＡＥＣ  ｐｕｌｓｅｄ  ＤＣ群（Ｂ１６と、Ｂ１６の培養上清で培養したＢＡＥＣをパルスした樹状細胞を投与）は黒色部がわずかであり、肺重量の増加も抑制されていた。
【図１】
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【国際調査報告】
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