(57)【要約】本発明は、イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスを有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用の組成物、またはそのような用途の飲食品に関する。本発明によれば、エストロゲン製剤を使用した場合に起こりうる副作用の問題を回避しつつ、骨密度減少の抑制または予防をすることができる。
2004089359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソキサントフモールを有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用組成物。
【請求項２】
イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用組成物。
【請求項３】
異性化ホップエキスが、エタノール系溶媒による抽出により得られたキサントフモール含有ホップエキスを、異性化することによって得られるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
異性化が、ホップエキスを、アルカリ性の水中において加熱還流することによって行われる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
医薬組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
骨粗鬆症の予防、治療または改善用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
イソキサントフモールを有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用飲食品。
【請求項８】
イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用飲食品。
【請求項９】
異性化ホップエキスが、エタノール系溶媒による抽出により得られたキサントフモール含有ホップエキスを、異性化することによって得られるものである、請求項８に記載の飲食品。
【請求項１０】
異性化が、ホップエキスを、アルカリ性の水中において加熱還流することによって行われる、請求項９に記載の飲食品。
【請求項１１】
健康食品、機能性食品、特定保健用食品、または病者用食品である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項１２】
骨粗鬆症の予防、治療または改善用である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項１３】
飲料の形態である、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項１４】
非ホップ飲料である、請求項１３に記載の飲食品。
【請求項１５】
茶飲料である、請求項１４に記載の飲食品。
【請求項１６】
乳飲料である、請求項１４に記載の飲食品。
【請求項１７】
ヨーグルトである、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項１８】
成人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．００３〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重となる量でイソキサントフモールを含んでなる、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項１９】
１回当たりのイソキサントフモール摂取量が、０．２〜３０ｍｇとなる量でイソキサントフモールを含んでなる、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の飲食品。
【請求項２０】
成人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．００３〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重となる量でイソキサントフモールを有効成分として含んでなる、非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２１】
１回当たりのイソキサントフモール摂取量が、０．２〜３０ｍｇとなる量でイソキサントフモールを有効成分として含んでなる、非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２２】
成人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．００３〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重となる量で、イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、有効成分として含んでなる、非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２３】
１回当たりのイソキサントフモール摂取量が、０．２〜３０ｍｇとなる量で、イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、有効成分として含んでなる、非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２４】
茶飲料である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２５】
乳飲料である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２６】
ヨーグルトである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の非穀物−ホップ発酵型の飲食品。
【請求項２７】
有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の有効成分を、哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、哺乳動物の骨密度減少を抑制または予防する方法。
【請求項２８】
有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の有効成分を、哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、骨粗鬆症を予防、治療または改善する方法。
【請求項２９】
骨密度減少の抑制または予防用組成物を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有効成分の使用。
【請求項３０】
骨粗鬆症の予防、治療または改善用組成物を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有効成分の使用。
【発明の詳細な説明】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、骨密度減少の抑制または予防用組成物、および飲食品に関する。さらに詳しくは、本発明は、骨粗鬆症の予防、治療または改善用組成物、および骨粗鬆症の予防、治療または改善用の飲食品に関する。
【背景技術】  骨粗鬆症は、低骨量と骨組織の微細構造の破綻とによって特徴づけられる疾患であり、骨の脆弱性亢進と骨折危険率の増大に結びつく疾患である。骨粗鬆症は世界中で大きな健康問題となっており更年期女性の３人に１人、高齢者の多くが男女とも罹患している。骨粗鬆症による骨折は、例えば日本国において「寝たきり」となる原因の第３位であり、医療費の増加を招く原因の一つにもなる。また、高齢化社会の進展に伴い、その患者数はさらに増加するものと考えられる。このため、骨粗鬆症を予防、治療または改善するための医薬の開発はきわめて重要であるといえる。
４０歳代以降に徐々に進行する骨量減少の要因は、加齢に伴って腸管からのカルシウム吸収性が低下するためであり、また体内ビタミンＤ３量の低下によりカルシウムに関するホメオスタシスを保つために副甲状腺ホルモンの分泌が亢進するためと推定される。中でも女性の場合には、骨形成を促進し、かつ、骨吸収を抑制していた女性ホルモンが更年期に減少し、その結果、急激な骨量減少がもたらされることが多い。
現在までのところ、臨床的に使用されている骨粗鬆症治療製剤としては、例えば、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤、エストロゲン製剤、イプリフラボン製剤、ビタミンＫ２製剤、タンパク同化ステロイド製剤、およびビスホスフォネート製剤が知られている。このうちエストロゲン製剤は、閉経後骨粗鬆症の予防または治療に有効であることが知られているが、不正出血、乳がんや子宮ガンの発生リスクを上昇させるなど副作用が伴うことが知られている。
薬剤による骨粗鬆症の治療は、長期間にわたることが多く、投与の長期化による副作用の発現など種々の問題が無視できない。このため、現在までのところ、薬剤による骨粗鬆症の治療は、根本的な治療を目的としたものではなく、疾病の進行を抑制するなどの対症療法によるものである。
また、骨粗鬆症に関しては予防的な措置を講じることは極めて重要であると考えられている。しかしながら、薬剤投与による日常的な骨粗鬆症の予防は、経済性、安全性の面から実現されるには至っていない。
したがって、安全性に優れ、日常的に使用可能な骨粗鬆症の予防または治療剤が望まれている。この場合、食経験のある食品から、骨粗鬆症の予防または治療効果のある成分を見出すことは、安全性の面からも望ましいといえる。
一方、薬物投与療法以外の骨粗鬆症の予防のためには、カルシウムをはじめとする種々の栄養素の適切な摂取と同時に過剰なアルコール摂取の制限、禁煙、運動などの生活習慣の改善が提言されている。薬物は、生体にとって異物であり、副作用を念頭においた治療が必要であることからも、非薬物的な治療法は有効である。中でも、日々摂取する食事による療法は重要であると考えられており、骨粗鬆症の予防、治療または改善に効果のある優れた食品の開発が望まれている。
ホップは、ヨーロッパ原産のクワ科多年草（学名：Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｌｕｓ）であり、一般的には、その毬果（雌花が成熟したもの）をホップと呼んでいる。ホップは、ビールの苦味、香りづけに用いられることで有名であり、長く人々が摂取してきている。この苦昧および香りは、ホップのルプリン部分（毬果の内苞の根元に形成される黄色の顆粒）よりもたらされる。ホップは、民間薬としても用いられており、鎮静効果、入眠および安眠効果、食欲増進、健胃作用、および利尿作用などの生理効果が知られている。
ホップ成分であるフムロン類やキサントフモールについては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験によって骨吸収抑制作用を有していることが示されている（特開平７−３３０５９４号公報、特開平７−２８５８５６号公報、およびＢｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１（１），１５８−１５９（１９９７））。また、ビール摂取によって骨密度の減少が抑制され、これがホップ由来の活性であることも報告されている（形山幹生ら、「骨粗鬆症モデルラットにおけるビールの骨密度減少抑制効果」、第５６回日本栄養・食糧学会大会  講演要旨集（社団法人日本栄養・食糧学会）、平成１４年（２００２年）６月２０日発行、３２６頁、３１−１０ｐ）。
ホップにエストロゲン活性があることは以前から知られている（例えばＭｕｎｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９５，８４５（１９５３））。また１９９９年になって、ホップから女性ホルモン活性物質として８−プレニルナリンゲニンが単離されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８３（６），２２４９−２２５２（１９９９））。したがって、その活性に基づき、８−プレニルナリンゲニン含量を著しく高めたホップ濃縮物を閉経後骨粗鬆症の予防または治療に利用することも考えられるが、エストロゲン製剤の場合と同様に副作用を生じるリスクがある。
ホップ成分の異性化物としては、例えばイソフムロン類（イソα酸類）、イソキサントフモールが知られている。これらは、ビール製造の過程（麦汁煮沸工程中）において、添加されたホップ成分が異性化されることによってビール中に生じる。因みに、ビール中のイソキサントフモール含有量は、０．０４〜３．４ｍｇ／Ｌであるとの報告がある（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ８３２（１９９９）ｐ９７−１０７）。同様にビール中のイソフムロン類の含有量は、最も含有量の多いと思われるタイプのビール（Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｅｘｔｒａ  Ｓｔｏｕｔ：Ｇｕｉｎｅｓｓ  Ｍａｌａｙｓｉｓａ  Ｂｅｒｈａｄ社製：出典Ｂｒａｕｉｎｄｕｓｔｒｉｅ）で約６０ｍｇ／Ｌであるとの報告がある。
ＷＯ０１／７６６１４には、植物由来の成長因子産生増強物質を含む食品および飲料等が開示されており、この成長因子産生増強物質としてイソキサントフモールが挙げられている。またこの成長因子産生増強物質が、肝細胞増強因子（ＨＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）の産生増強作用を有し、肝障害、胃腸障害、肺炎、糖尿病等の疾患の治療用途へ利用可能なことも開示されている。
しかしながら、イソキサントフモールの骨粗鬆症改善作用に関しては本発明者らの知る限り、何も知られていない。イソフムロン類は、前記特開平７−３３０５９４号公報において、フムロン類と併記して有効成分として挙げられているが、ここにはイソフムロン類が骨吸収抑制作用を有するとの具体的証拠は一切示されていない。
［発明の概要］
本発明者らは、今般、ビール等に含まれる異性化されたホップ由来成分が、骨密度減少を抑制もしくは予防する優れた効果を有することを見出した。この効果は、骨粗鬆症の予防、治療または改善に有効であると考えられるものであった。またこの効果がイソキサントフモールに基づくものであって、イソキサントフモールの効果はその類似化合物であるキサントフモールの効果に比べてより優れていることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
よって本発明は、骨粗鬆症を予防、治療または改善するために用いられる組成物および飲食品であって、優れた安全性と活性を有するもの提供をその目的とする。
本発明による骨密度減少の抑制または予防用組成物は、イソキサントフモールを有効成分として含んでなる。また本発明によるこの組成物は、イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、有効成分として含んでなるものであってもよい。
本発明による骨粗鬆症の予防、治療または改善用組成物は、イソキサントフモールを有効成分として含んでなる。
また本発明による骨粗鬆症の予防、治療または改善用組成物は、イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを有効成分として含んでなる。
本発明による骨密度減少の抑制もしくは予防用の飲食品は、イソキサントフモール、またはイソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを含んでなるものである。
本発明による非穀物−ホップ発酵型の飲食品は、成人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．００３〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重となる量でイソキサントフモールを有効成分として含んでなるものである。
本発明の別の態様によれば、本発明による非穀物−ホップ発酵型の飲食品は、１回当たりのイソキサントフモール摂取量が、０．２〜３０ｍｇとなる量でイソキサントフモールを有効成分として含んでなるものである。
本発明による組成物または飲食品の有効成分は、骨密度減少を抑制または予防する優れた効果を有するものであり、さらに骨密度を増大させる効果を示すことも期待される。この有効成分は、長年飲食品として飲用されてきたビール等に含まれている。したがって、本発明による組成物または飲食品は、患者または骨粗鬆症の予防を望む者が長期間にわたって服用または喫食しても副作用がほとんどなく、安全性に優れている。また、本発明による組成物または飲食品は、目的とする効果が期待される用量の１０００倍以上の用量の場合であっても、幼若ラットに対してエストロゲン作用が見られない。このため、本発明によれば、エストロゲン製剤の場合のようなエストロゲン作用を介した副作用、例えば、不正出血、乳がんや子宮ガンの発生リスクの上昇を回避しつつ、骨粗鬆症の予防、治療または改善に関する優れた効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例の試験２の結果を示すグラフである。グラフは、ＭＣＦ−７細胞の増殖を指標とする、イソキサントフモールおよび８−プレニルナリンゲニンのエストロゲン活性を示す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、８ＰＮは８−プレニルナリンゲニン、およびＥ２は１７β−エストラジオールを表す。
図２は、実施例の試験３−ａの結果を示すグラフである。グラフは、幼若ラットに対するイソキサントフモールおよび８−プレニルナリンゲニンのｉｎ  ｖｉｖｏエストロゲン作用を調べた結果を表す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、８ＰＮは８−プレニルナリンゲニン、およびＥ２は１７β−エストラジオールを表す。また＊はＰ＜０．０５および＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図３は、実施例の試験３−ｂの結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモール、８−プレニルナリンゲニン、およびビールのｉｎ  ｖｉｖｏエストロゲン作用を調べた結果を表す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、および８ＰＮは８−プレニルナリンゲニンを表す。また＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図４は、実施例の試験３−ｂの結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモール、およびビールのｉｎ  ｖｉｖｏエストロゲン作用を調べた結果を表す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、およびＥ２は１７β−エストラジオールを表す。また＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図５は、実施例の試験４の結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモール、８−プレニルナリンゲニン、およびビールの骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、および８ＰＮは８−プレニルナリンゲニンを表す。また＊はＰ＜０．０５および＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図６は、実施例の試験４の結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモール、キサントフモール、イソα酸およびビールの骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。図中、ＩＸＨはイソキサントフモール、ＸＮＴはキサントフモール、αはイソα酸含有ホップエキス、およびＥ２は１７β−エストラジオールを表す。また＊はＰ＜０．０５および＊＊＊はＰ＜０．００１を意味する。
図７は、実施例の試験５の結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモールを添加した麦茶の骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。図中、０ｍｇ／Ｌはイソキサントフモールを添加していない麦茶を表し、２ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、および５０ｍｇ／Ｌはイソキサントフモールを添加した麦茶であって、それぞれのイソキサントフモール濃度を表し、Ｅ２は１７β−エストラジオールを表す。また、水を投与したコントロール群に対して＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、および＊＊＊はｐ＜０．００１であることを意味し、またイソキサントフモールを添加していない麦茶に対して、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１であることを意味する。
図８は、実施例の試験５の結果を示すグラフである。グラフは、卵巣摘出ラットに対するイソキサントフモールを添加した緑茶の骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。図中、０ｍｇ／Ｌはイソキサントフモールを添加していない緑茶を表し、１０ｍｇ／Ｌはイソキサントフモールを添加した緑茶であってそのイソキサントフモール濃度が１０ｍｇ／Ｌであることを表し、Ｅ２は１７β−エストラジオールを表す。また、水を投与したコントロール群に対して＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、および＊＊＊はｐ＜０．００１であることを意味し、またイソキサントフモールを添加していない緑茶に対して、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１であることを意味する。
［発明の具体的説明］
イソキサントフモール
本発明による組成物および飲食品は、前記したように、有効成分としてイソキサントフモール、またはイソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを含んでなる。
イソキサントフモールは、市販のキサントフモール（例えば、Ａｐｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社より入手可能）、またはホップより精製される高純度のキサントフモールを、異性化することによって得ることができるものである。
ホップからのキサントフモールの精製は、例えば下記のようにして行うことができる。乾燥ホップをエタノール抽出し、ろ過後ろ液を減圧濃縮する。次いで、得られた濃縮物に、ヘキサンと８５％エタノール水溶液を用いた液−液分配処理を行って、エタノール水溶液層を分取し、この層を減圧下で濃縮する。得られた濃縮物をクロロホルム：ヘキサン（５：２）に溶解させ、シリカゲル系カラムに通して、得られる画分の内から、キサントフモール溶出画分を分取する。分取された画分の溶出液を減圧濃縮し、ヘキサンおよび酢酸エチルを用いた再結晶法を繰り返すことによって、精製キサントフモールを得ることができる。
キサントフモールの異性化は、キサントフモールを、アルカリまたは酸化マグネシウムの存在下において加熱するか、またはその他の公知の方法にキサントフモールを付すことによって行うことができる。
異性化処理の具体例を挙げると、キサントフモールをエタノール等のアルコール性溶媒に溶解した後、ここに弱アルカリ性の水を加えて、その存在下において加熱（例えば、９２〜９３℃程度）して還流することによって、キサントフモールを熱異性化して、イソキサントフモールとすることができる。異性化処理により得られたイソキサントフモールは、必要に応じて、公知の方法（例えば、ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥等）により濃縮したり、精製したりすることができる。
異性化ホップエキス
本発明において、異性化ホップエキスとは、ホップから抽出処理等により得られるキサントフモール含有ホップエキスを異性化することによって得られるホップエキスを意味する。すなわち、異性化ホップエキスは、基本的には、ホップのルプリン部に由来する抽出物（ホップエキス）を得、これを積極的に異性化することによって得られるものである。
ホップエキスは、例えば毬花やその圧縮物をそのままもしくは粉砕した後、抽出操作に供することによって、調製することができる。
抽出操作としては、例えば、ビール醸造に用いられるホップエキスの調製法として用いられる、エタノール溶媒による抽出法が挙げられる。また該抽出操作としては、その他の一般に用いられるホップ抽出法を採用してもよい。例えば、（１）溶媒中にホップの毬花、その粉砕物などを冷浸、温浸等によって浸漬する方法；（２）加温し攪拌しながら抽出を行い、濾過して抽出液を得る方法；または（３）パーコレーション法等も、前記抽出操作において適用することができる。
これら抽出操作によって得られた粗抽出物は、必要に応じて、ろ過または遠心分離に付すことによって固形物を除去することができる。得られた液は、これをそのままホップエキスとして用いてもよいが、そこに含まれる溶媒を留去して一部を濃縮または乾燥させた後、用いてもよい。また、濃縮または乾燥後に得られた抽出物は、さらに非溶解性溶媒を用いて洗浄して精製してもよく、またこれをさらに適当な溶剤に溶解もしくは懸濁させてもよい。さらに本発明においては、得られたホップエキス（液体）を、減圧乾燥、凍結乾燥等の慣用の手段によって、ホップ抽出エキス乾燥物として、これを使用してもよい。
前記抽出において使用可能な溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール等の炭素数１〜４の低級アルコール；酢酸エチルエステル等の低級アルキルエステル；エチレングリコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのグリコール類；エチルエーテル、アセトン、酢酸等の極性溶媒；ベンゼンやヘキサン等の炭化水素；エチルエーテルや石油エーテルなどのエーテル類等の非極性溶媒の公知の有機溶媒が挙げられる。これら溶媒は、２種以上を組み合わせてもよい。
本発明の一つの好ましい態様によれば、エタノール、水などの溶媒を用いてキサントフモールを含む抽出液を得、該抽出液を超臨界二酸化炭素抽出法に付して、そこに含まれるα酸、およびβ酸画分を除去することによって、キサントフモールをより多く含むホップエキスを得ることができる。この場合、必要に応じて、前記ホップエキスから不溶物をろ過によって除去したり、減圧等により濃縮して溶媒を乾固させてもよい。
このようにして得られたホップエキスは、キサントフモールを少なくとも含有するものである。このとき、得られたホップエキスが、キサントフモールに加えその異性化物であるイソキサントフモールを極少量含む場合がある。このような場合、このホップエキス（非異性化ホップエキス）を本発明においてそのまま使用してもよい。しかしながら、通常は、このホップエキスをさらに異性化することによって、異性化ホップエキスを得、これを本発明において使用する。
ホップエキスの異性化は、ホップエキスを、アルカリまたは酸化マグネシウムの存在下において加熱するか、またはその他の公知の方法にホップエキスを付すことによって行うことができる。これにより、ホップエキス中のキサントフモールはイソキサントフモールに変換される。
異性化処理の具体例を挙げると、キサントフモールを含むホップエキスを、エタノール等のアルコール性溶媒に溶解した後、ここに弱アルカリ性の水を加えて、その存在下において加熱（例えば、９２〜９３℃程度）して還流することによって、ホップエキスを熱異性化して、イソキサントフモールを含む異性化ホップエキスを得ることができる。得られた異性化ホップエキスは、必要に応じて、公知の方法（例えば、ろ過、減圧濃縮、凍結乾燥等）により濃縮したり、精製したりしてもよい。なお、前記異性化処理において使用する弱アルカリ性（例えば、ｐＨ８．５〜９．５）の水として、例えば、飲料用アルカリイオン水などのような市販の水（例えば、ボトルドウォーター）を使用することが、安全性の観点からは望ましい。市販の飲料の水であれば、摂取されてきた経験が充分にあるなど、安全性が高い。また、ビール醸造の麦汁煮沸過程で熱異性化されて生成する反応様式と前記異性化処理は本質的に同等であるので、飲食品を提供する観点からは安全性が高い。
したがって、本発明の一つの好ましい態様によれば、異性化ホップエキスは、エタノール系溶媒による抽出により得られたキサントフモール含有ホップエキスを、異性化することによって得られるものである。より好ましくは、このとき異性化は、ホップエキスを、アルカリ性の水中において加熱還流することによって行われる。ここでエタノール系溶媒とは、主としてエタノールまたはエタノールと水とからなる溶媒などをいう。
本発明においては、前記異性化処理により得られた異性化ホップエキスを組成物または飲食品の製造に直接使用しても良いが、好ましくは、その中の有効成分をさらに高濃度で含有する分画物を入手してこれを使用する。
したがって本発明の好ましい態様によれば、本発明による組成物または飲食品の有効成分として使用する異性化ホップエキスは、ホップエキスを単に異性化して得られるものよりもさらに高いイソキサントフモール濃度を有するものであることができる。
本発明においては、種々の方法で抽出された市販のホップエキスを入手して、これを異性化して異性化ホップエキスとして使用してもよいが、市販されている異性化ホップエキスをそのまま使用してもよい。
また前記したイソキサントフモールを高濃度に含む異性化ホップエキスは、ホップより抽出されたホップエキスを異性化して得られる通常の異性化ホップエキスを、慣用の方法にしたがって、濃縮したり、イソキサントフモールを添加したり、またはイソキサントフモール以外の成分を除去したりすることによって、容易に得ることができる。
また市販のホップエキスとして、例えば、ホップ毬花粉砕物をエタノール抽出した後、超臨界点炭酸抽出法により分画し、キサントフモール含有量を高めてなるホップエキス（例えば、Ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｈｏｐ  ｐｒｏｄｕｃｔ（商品名）、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社より入手可能）、および、キサントフモールが約８０％含まれる製品（Ｘａｎｔｈｏ−ｐｕｒｅ（商品名）、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社より入手可能）が存在する。これらを異性化することによって、イソキサントフモールを高濃度に含む異性化ホップエキスを製造することができる。
なお、これらのエキスより、さらに有効成分を高濃度に含有する分画物を前記等の方法も含めて濃縮して得ることができることは言うまでもない。
本発明のより好ましい態様によれば、本発明による組成物または飲食品の有効成分として使用する異性化ホップエキスは、イソキサントフモールを、０．００５〜９０重量％含有してなるものであり、さらに好ましくは、８〜９０重量％含有してなるものである。
また、飲食品において、飲食品の製造工程に加熱工程等のキサントフモールを異性化する工程がある場合には、前述したホップエキス、好ましくは通常のホップエキスに比べてキサントフモール含有量を高めたホップエキスを、飲食品の当該加熱工程前に加えておくことによって、最終製品中にイソキサントフモールを含有させてもよい。このような飲食品の代表的な例として、ビール、発泡酒等を挙げることができる。ビール、発泡酒では、麦汁煮沸工程で上記ホップエキスを添加することにより、最終製品中にイソキサントフモールを含有させることができる。キサントフモール含有量を高めたホップエキスをこのような形で使用すれば、ビールの苦味成分であるイソフムロン類の濃度を必要以上に高めることなく（すなわち過度の苦味を与えることなく）、イソキサントフモールを高濃度に含有した製品を製造できる。もちろんこのような異性化工程がある場合でも、前述のように、精製イソキサントフモール、或いは、キサントフモール含有量を高めたホップエキス（例、Ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｈｏｐ  ｐｒｏｄｕｃｔ（商品名）、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社より入手可能）、さらにキサントフモールが約８０％含まれる製品（Ｘａｎｔｈｏ−ｐｕｒｅ（商品名）、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社より入手可能）等を異性化してなるイソキサントフモールを高濃度に含む異性化ホップエキスを、製造工程または最終製品に添加する態様を除外するものではない。
用途
卵巣摘出した動物およびヒトにおいては、破骨細胞の活性化、および骨吸収の増加が認められる。しかしながら、通常、女性ホルモンを加えることによりこれらに伴う骨量の減少は見られなくなる。このような作用がどのようにして発現するかはまだ明らかではないが、骨吸収に関与するサイトカインＩＬ１、ＩＬ６、ＴＧＦβ、プロスタグランジンＥなどが複雑に関与していると考えられている。また、女性ホルモンの欠乏によって、骨吸収が亢進することに加え、小腸からのカルシウム吸収が抑制されることも骨量減少の原因と考えられる。
さらに、女性ホルモンは核内レセプターと結合することによってその活性を発現するが、近年、α、βの２つのタイプのレセプターが存在することが明らかとなっている。近年、ある器官には女性ホルモンとして作用するが、別の組織に対しては拮抗的に作用する薬剤（ＳＥＲＭ）の開発が進んでおり、副作用の少ない薬剤として期待が寄せられている。このように器官によって作用が異なるメカニズムを２種類のレセプタータイプから説明することが検討されている。
閉経性の骨粗鬆症の発症メカニズムは複雑多岐にわたり、いまだ解明されていない部分も多く、エストロゲンアゴニスト活性のみから閉経後骨粗鬆症の予防、治療の有効性を説明するのは限界がある。事実、例えば日本国においては、その副作用からエストロゲンアゴニスト活性がない製剤が主として臨床的に使用されている。
後記する卵巣摘出ラットを用いた実施例の試験４に示すように、イソキサントフモールは、卵巣からのエストロゲン分泌が遮断されることによる骨密度低下を有意に改善した。このことから、イソキサントフモールは、破骨細胞に直接的または間接的に作用して骨吸収を抑制している可能性が推測される。一方、実施例の試験２に示すようにイソキサントフモールにはｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験においてエストロゲン活性を有することが明かになっているが、幼若ラットにおいては卵巣摘出ラットで認められた骨密度減少改善作用が発現する１０００倍以上の投与量においても、子宮肥大作用が認められなかった（後述する実施例の試験３参照）。このことから、イソキサントフモールは、女性ホルモンである１７β−エストラジオールとは異なる機構、すなわちエストロゲンレセプターとの相互作用はあるものの、子宮よりも骨組織への選択性が高いものと推測される。
したがって、従来のエストロゲン製剤による薬物療法の場合には、不正出血、乳がんや子宮ガンの発生リスクの上昇などの副作用が懸念されるのに対して、本発明による有効成分を用いた場合には、前記副作用を回避しつつ、骨粗鬆症を予防、治療、または改善することができる。
したがって、本発明による組成物または飲食品は、骨密度減少の抑制、改善もしくは予防を目的として使用することができる。可能であれば、本発明による組成物または飲食品を、骨密度を増大させるために使用してもよい。よって、本発明による組成物または食品は、骨粗鬆症の予防、治療または改善に用いることができる。
ここで「骨密度」とは、対象となる哺乳動物の骨における、一定容積当たりのカルシウム等のミネラル量のことをいい、慣用の方法により測定することができる。そのような慣用の方法としては、Ｘ線を用いる方法（例えば、ＤＸＡ法、ＭＤ法、ｐＱＣＴ法）および超音波を用いる方法（例えば、ＱＵＳ法）が挙げられる。本発明においては、例えば、後述する実施例の試験４にしたがって測定することができる。
本発明によれば、有効量のイソキサントフモールまたはイソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、哺乳動物の骨密度減少を抑制または予防する方法が提供される。また本発明によれば、予防、治療または改善上の有効量のイソキサントフモールまたは異性化ホップエキスを、哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、骨粗鬆症を予防、治療または改善する方法が提供される。ここで「有効量」は、後述するようなイソキサントフモールの投与量にしたがって選択することができる。
本発明の別の態様によれば、骨密度減少の抑制もしくは予防用組成物を製造するための、イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスの使用が提供される。また本発明のさらに別の態様によれば、骨粗鬆症の予防、治療または改善用組成物を製造するための、イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスの使用が提供される。
組成物および飲食品
本発明による組成物は、イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスを有効成分として含んでなるものである。
ここで「有効成分として含んでなる」とは、所望する剤型に応じた薬学上許容されうる担体を含んでいてもよいことは当然として、併用可能な他の薬剤を含有する場合も包含する意味である。
本発明による組成物は、経口投与または非経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容されうる担体とともに製剤化することができる。
薬学上許容されうる担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられ、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等を担体として使用することができる。
併用可能な他の薬剤としては、例えば、アミノ酸、抗生物質、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤、エストロゲン製剤、イプリフラボン製剤、ビタミンＫ２製剤、タンパク同化ステロイド製剤、およびビスホスフォネート製剤などが挙げられる。
製剤は、例えば下記のようにして製造することができる。
経口剤は、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）、または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を有効成分に添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性もしくは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）、ゼラチン、プルランなどを用いることができる。
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社（米国）製）、ＨＣＯ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に、水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）または油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁または乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、または賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加して混合し、粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性もしくは油性のゲル剤、または軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などをさらに含んでいてもよい。
坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造できる。この場合、油性または水性基剤を使用することができる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド（例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製））、中級脂肪酸（例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製））、または植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
本発明による飲食品は、本発明による有効成分を有効量含有してなるものである。
ここで「有効成分を有効量含有してなる」とは、個々の飲食品を通常喫食される量摂取した結果に、後述するような範囲で有効成分が摂取されるような量で有効成分を含有することをいう。本発明による飲食品には、本発明による有効成分をそのまままたは上記のような組成物の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明による飲食品は、本発明による有効成分または前述するホップの粉砕物もしくは抽出物をそのまままたは異性化して、飲食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等をそれらにさらに配合して調製したもの、または、一般の飲食品へ添加したものであってもよい。
本発明において、「飲食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が摂取可能なものであれば特に制限はなく、その形態も液状、半液体状または固体状のいずれのものであってもよい。このため飲食品には、例えば飲料の形態も包含される。また飲食品には、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品のような分類のものも包含される。さらに「飲食品」は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用される場合には、飼料を含む意味で用いることができる。
本発明における有効成分は、骨量減少抑制または予防作用を有する。このため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品、好適には、カルシウム、マグネシウム等のミネラル類、ビタミンＫ等のビタミン類を１種以上含有する食品等に、本発明の有効成分を配合することによって、骨粗鬆症の発症の予防、治療および改善、並びに骨粗鬆症予備群の骨粗鬆症への移行防止といった機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。
よって、本発明による飲食品は、骨密度を高めることもしくはその低下防止を希望する消費者に適した飲食品、または、骨の健康が気になる消費者に適した飲食品、すなわち所謂、特定保健用食品、として提供することができる。なお、ここでいう特定保健用食品とは、骨密度減少の抑制もしくは予防を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から、各国において法上の何らかの制限を受けることがある飲食品をいう。
飲食品の具体例としては、飯類、麺類、パン類およびパスタ類等の炭水化物含有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジュース、清涼飲料水、乳飲料、茶飲料、機能性飲料、栄養補助飲料、ノンアルコールビール等の各種飲料；ビール、発泡酒等のアルコール飲料；卵を用いた加工品、魚介類（イカ、タコ、貝、ウナギなど）や畜肉（レバー等の臓物を含む）の加工品（珍味類を含む）などが挙げられる。
好ましくは、飲食品は、非穀物−ホップ発酵型の飲食品である。ここで「非穀物−ホップ発酵型の飲食品」とは、少なくともホップと穀物とを原料として発酵を行うことによって得られる発酵成分（例えばビール、発泡酒）を含有しない飲食品をいう。すなわち、非穀物−ホップ発酵型の飲食品とは、ビールおよび発泡酒のような原料としてホップを含む発酵飲料以外の飲食品をいう。飲食品として非穀物−ホップ発酵型のものを使用して、これに、イソキサントフモールを有効量添加することにより、骨の健康の回復、維持または増進を図ることができる。
本発明の一つのより好ましい態様によれば、飲食品としては、茶飲料、乳飲料、ヨーグルトが挙げられる。本発明の別の一つの好ましい態様によれば、飲食品は、飲料である。
ここで茶飲料とは、ツバキ科の常緑樹である茶樹の葉（茶葉）、または茶樹以外の植物の葉もしくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、発酵茶、半発酵茶および不発酵茶のいずれも包含される。茶飲料の具体例としては、日本茶（例えば、緑茶、麦茶）、紅茶、ハーブ茶（例えば、ジャスミン茶）、中国茶（例えば、中国緑茶、烏龍茶）、ほうじ茶等が挙げられる。
ここで乳飲料とは、生乳、牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主原料とした飲料をいい、牛乳等そのもの材料とするものの他に、例えば、栄養素強化乳、フレーバー添加乳、加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含される。
またヨーグルトには、ハードタイプ、ソフトタイプ、ドリンクタイプのいずれのものも包含され、さらにヨーグルトを原料とする加工ヨーグルト製品も包含される。
本発明による有効成分またはホップの粉砕物もしくは抽出物を異性化したものを、一般食品の原料に添加配合して食品とする場合は、後述するように、有効成分もしくはホップの苦みが飲食品の味に影響しない範囲で用いるか、または苦味がマスクされるような工夫をすることが好ましい。
また、ビール、ノンアルコールビール、発泡酒などのようなホップ由来の飲食品には、一般的に、本発明における有効成分が既に一定量以上含まれていることがある。すなわち、このような公知のイソキサントフモール含有飲食品は、単にホップ成分を添加したものでなく、ホップ成分が異性化される工程を経て製造された飲食品である。このような飲食品の場合、これらをそのまま本発明による飲食品として使用することができるが、さらに、これら飲食品に、イソキサントフモールもしくはそれを含むエキス、または異性化ホップエキスを配合することによって、所望の効果をさらに増強することができ、または有効摂取量を低減させることができる。
公知のイソキサントフモール含有飲食品の例としては、ビールが挙げられる。ビール中におけるイソキサントフモール含有量は、前記したように例えば０．０４〜３．４ｍｇ／Ｌであるが、ビール中には、その苦昧成分であるイソフムロン類やエストロゲン活性を有する８−プレニルナリンゲニンも含有されている。例えば、ビール中における８−プレニルナリンゲニンの含有量は、イソキサントフモール含有量の６分の１〜１３３分の１と広い幅があることが知られている（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ８３２，９７−１０７  １９９９）。
本発明による飲食品においては、精製したイソキサントフモールを用いるよりは、ホップエキスを異性化させた形で用いることがコスト的な問題からは有利であると考えられる。
また、飲食品中に異性化ホップエキスを使用する場合には、イソフムロン類等により生ずる苦味による官能的な点も考慮することが望ましい。この場合、キサントフモール含有量を高めたホップエキスまたはイソキサントフモール含有量を高めた異性化ホップエキスを用いて、イソキサントフモールに対するイソフムロン類の飲食品中における含有量を相対的に低くすることが好ましい。あるいは、苦味成分をマスクした上で、ホップ、ホップエキス、または異性化ホップエキスの添加量を増加させてもよい。
なお、飲食品においても、コスト的な問題がほとんど無いのであれば、精製イソキサントフモールを食品の製造工程または最終製品中に添加してもよいし、または、製造工程中に異性化反応をもたらす工程がある場合には該工程前に精製キサントフモールを添加しておいてもよい。
本発明による組成物または飲食品は、人類が飲食品として長年摂取してきたホップ抽出成分またはその誘導物であることから、毒性も低く、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。
本発明による組成物を、投与する哺乳動物の骨密度の増大またはその骨密度減少の抑制、改善もしくは予防を目的として用いる場合（好ましくは、骨粗鬆症の予防、治療または改善を目的として用いる場合）、その投与量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人一人あたり、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０２〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、非経口的に摂取する場合は０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で１日１回または数回の投与単位に分割して投与することができる。
異性化ホップエキスを有効成分として用いた場合には、成人一人あたりの摂取量が、イソキサントフモール量として５ｍｇ／ｋｇ体重・日（成人１人１日あたり３００ｍｇの範囲の摂取量）以下の範囲、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ体重・日以下の範囲となるように投与することができる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明による組成物は、成人一人あたりのイソキサントフモール摂取量が、０．００３〜５ｍｇ／ｋｇ体重・日の範囲（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．２〜３００ｍｇの範囲）となるような量のイソキサントフモールを含んでなる。より好ましくは、前記イソキサントフモール摂取量の下限値は、成人一人あたりの摂取量として、０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重・日（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量として０．８ｍｇ）以上であり、さらに好ましくは、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重・日（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量として１．２ｍｇ）以上である。
本発明の好ましい態様によれば、本発明による飲食品は、成人一人あたりのイソキサントフモール摂取量が、０．００３〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重・日の範囲（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりのイソキサントフモール摂取量が０．２〜３０ｍｇの範囲）となるような量のイソキサントフモールを含んでなる。より好ましくは、前記イソキサントフモール摂取量の下限値は、成人一人あたりの摂取量として、０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重・日（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量として０．８ｍｇ）以上であり、さらに好ましくは、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重・日（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量として１．２ｍｇ）以上である。
なおここで、イソキサントフモール摂取量の下限値である、成人一人あたりの摂取量としての０．００３ｍｇ／ｋｇ体重・日（（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量としての０．２ｍｇ）は、後述する実施例の実験４および実験５において、効果の確認されたイソキサントフモール濃度２ｍｇ／Ｌの被験試薬を１０ｍｌ／ｋｇ投与した場合に相当し、詳しくは、この投与量をラットとヒトの体表面積の比から換算して得られた値である。またこの投与量をラットの体重当たりの値に換算して得られた値は成人一人あたりの摂取量では０．０２ｍｇ／ｋｇ体重・日（（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量は１．２ｍｇ）である。
また飲食品の場合のイソキサントフモール摂取量の上限値が、成人一人あたりの摂取量として０．５ｍｇ／ｋｇ体重・日（（体重６０ｋｇの成人１人１日あたりの摂取量として３０ｍｇ）以下であるとしたのは、イソキサントフモールの溶解度および食経験を考慮したものであり、それ以上の値であっても、骨密度減少の抑制効果が否定されるものではない。したがって、可能であれば、前記上限値以上の量のイソキサントフモールを含む飲食品であってもよい。
本発明の一つの好ましい態様によれば、飲食品は、１回当たりのイソキサントフモール摂取量が、０．２〜３０ｍｇ、より好ましくは０．８〜３０ｍｇ、さらに好ましくは１．２〜３０ｍｇとなる量でイソキサントフモールを含んでなるものである。
ここで「１回当たりのイソキサントフモール摂取量」とは、ヒトが１回当たり喫食行動において摂取する飲食品中に含まれるイソキサントフモール量をいう。したがって、ヒトが１回の喫食行動で摂取することを想定した飲食品がある場合には、「１回当たりのイソキサントフモール摂取量」は、そのような飲食品中に含まれるイソキサントフモール量に相当する。
ヒトが１回の喫食行動で摂取することを想定した飲食品の形態は、飲食品の摂取が予想される対象者の体重、年齢、性別、体力、健康状態等の身体的要因や、摂取が予想される環境または気候等を考慮することにより適宜設定することができる。例えば、そのような飲食品の形態としては、１００〜５００ｍｌ（好ましくは１００〜３５０ｍｌ）の範囲の量の単位で容器に封入された飲料が挙げられる。
１回で摂取することを想定した飲食品の形態が、１００ｍｌのボトル入り飲料である場合には、その１００ｍｌの飲料には、前記イソキサントフモール摂取量（０．２〜３０ｍｇ）に相当する量のイソキサントフモールが含まれることになる。したがって、この飲料のイソキサントフモール濃度は、２〜３００ｍｇ／Ｌの範囲となる。同様に、１回で摂取することを想定した飲食品の形態が、３５０ｍｌのボトル入り飲料である場合には、その３５０ｍｌの飲料には、前記イソキサントフモール摂取量（０．２〜３０ｍｇ）に相当する量のイソキサントフモールが含まれることになり、この飲料のイソキサントフモール濃度は、０．５７〜８５．７ｍｇ／Ｌの範囲となる。
さらに具体例を挙げて説明すると、このような飲食品の形態について、１００ｍｌ、２００ｍｌおよび３５０ｍｌの各容量単位のボトル入り飲料中のイソキサントフモール濃度は下記表Ａの通りである。
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上記表を利用するかまたは換算して、飲料のイソキサントフモール濃度を設定することによって、所望する容量単位を１回に摂取することを想定した飲料を、容易に調製することができる。
【実施例】  本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例：
例Ａ：  イソキサントフモールの精製
ビール（キリンラガービール（商品名）、キリンビール株式会社（日本国）製）（以下において「ビール」と略す）、およびキサントフモールを多く含む粉末状のホップエキス（Ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（商品名）およびＸａｎｔｈｏ−ｐｕｒｅ（商品名）、ともにＨｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製）からのイソキサントフモールの精製例を以下に示す。
ビールからの精製
ビール１０００ｍｌを脱気し、その８００ｍｌを１０００ｍｌのジエチルエーテルを用いて抽出した。ジエチルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。その後、酢酸エチル２０ｍｌを加え、再度、無水硫酸ナトリウムで脱水し、約１ｍｌまで減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，１０ｇ）を用いて分画した。カラムは３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを用いて洗浄した後、６０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを用いて溶出した。溶出画分を減圧乾固し、メタノール３ｍｌに溶解させ、さらに蒸留水３ｍｌを加え、これをＨＰＬＣによりさらに精製した。ＨＰＬＣの条件は下記の通りであった：
移動層：  ４５％アセトニトリル、および５５％蒸留水、
カラム：  ＹＭＣ−ＯＤＳ−ＡＱ  ２５×２５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、
ガードカラム：  ＹＭＣ−ＯＤＳ−ＡＱ  ２５×５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、
流速：  １０ｍｌ／分、注入量３ｍｌ、
検出器波長：  ＵＶ２９０ｎｍ。
精製されたイソキサントフモールの純度を、ＨＰＬＣ分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定によって確認した。純度確認のためのＨＰＬＣの条件は、下記の通りであった：
移動層：  Ａ液（アセトニトリル）、Ｂ液（蒸留水）、およびＡ液２０％〜１００％によるグラジエント溶出、
カラム：  ＹＭＣ−ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  ４．６×２５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、
流速：  １ｍｌ／分、注入量５μｌ、
検出器波長：  ＵＶ２９０ｎｍ。
このＨＰＬＣ分析によって、イソキサントフモールの純度が９８％以上であることが確認された。
精製されたイソキサントフモール１ｍｇを８００ｍｌの重メタノールに溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル装置（ＪＮＭ−Ａ４００（日本電子社製））を用いて１Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。
このＮＭＲ測定よって、単離精製されたイソキサントフモールの化学シフトは文献で報告されている値と一致し、単一組成であることが確認された。
ホップエキスからの精製１
ホップエキス（Ｘａｎｔｈｏｈｕｍｏｌ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ（商品名））１ｇを水１Ｌに加え、これをオートクレーブにて１００℃で１２０分間煮沸して、異性化した。室温に冷ました後、上清をろ紙を用いてろ過して、ろ液を得た。次いで、ろ液８００ｍｌを１０００ｍｌのジエチルエーテルを用いて抽出した。ジエチルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮した。その後、酢酸エチル２０ｍｌを加え、再度、無水硫酸ナトリウムで脱水し、約１ｍｌまで減圧濃縮した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，１０ｇ）を用いて分画した。カラムは３０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを用いて洗浄した後、６０％酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを用いて溶出した。溶出画分を減圧乾固し、メタノール３ｍｌに溶解させ、さらに蒸留水３ｍｌを加え、これをＨＰＬＣによりさらに精製した。ＨＰＬＣの条件は下記の通りであった：
移動層：  ４５％アセトニトリル、および５５％蒸留水、
カラム：  ＹＭＣ−ＯＤＳ−ＡＱ  ２５×２５０ｍｍ、
ガードカラム：  ＹＭＣ−ＯＤＳ−ＡＱ  ５０×２５ｍｍ、
流速：  １０ｍｌ／分、注入量３ｍｌ、
検出器波長：  ＵＶ２９０ｎｍ。
精製されたイソキサントフモールの純度を、前記したビールからの精製の場合と同様にして、ＨＰＬＣ分析および核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル測定によって確認した。
ＨＰＬＣ分析によって、イソキサントフモールの純度が９８％以上であることが確認された。
ＮＭＲ測定よって、単離精製されたイソキサントフモールの化学シフトは文献で報告されている値と一致し、単一組成であることが確認された。
ホップエキスからの精製２
ホップエキス（Ｘａｎｔｈｏ−ｐｕｒｅ（商品名））２．５ｇを、５０ｍｌのエタノールに溶解し、ここに５０ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液および蒸留水を加え５００ｍｌにメスアップした。これを、沸騰水浴中で１時間煮沸し異性化した後、室温に冷まし、ここに１２Ｎの塩酸を４５ｍｌ添加した。次いで、得られた溶液を、冷却後グラスウールフィルターにて吸引ろ過した。ろ取物に１．２Ｌのエーテルおよび０．８ｍｌの蒸留水を加えて、液液分配抽出を２回行って、得られたエーテル層を減圧乾固した。これに少量の酢酸エチルおよびヘキサンを加えて、再結晶を繰り返し、純度９８％以上のイソキサントフモールを得た。
例Ｂ：  ホップエキスの異性化
キサントフモールを約８０％含む市販のホップエキス（Ｘａｎｔｈｏ−ｐｕｒｅ（商品名））１８ｇを、２Ｌのエタノールに溶解し、ここにｐＨ８．５〜９．５の弱アルカリ性のボトルドウォーター（アルカリイオンの水（商品名）、キリンビバレッジ社製）１８Ｌを加えた。これを９２〜９３℃において２時間、還流下で熱異性化した。次いで、不溶物をろ紙にてろ過した後、ろ液を減圧濃縮し、凍結した。これを凍結乾燥することによって、粉末状の異性化ホップエキス約１８ｇを得た。この粉末状異性化ホップエキスは、イソキサントフモールを約７０％含有するものであった。
なお、前記例Ａの「ホップエキスからの精製２」の欄と同様にして精製を行うことによって、純度９８％以上のイソキサントフモールを得ることができた。
例Ｃ：  製剤の調製
下記成分を細かく粉末にし、均一な混合物になるように充分攪拌した後、これを０．２ｇずつプルランカプセルまたはゼラチンカプセルに充填して、カプセル製剤を調製した。
例Ｂで得られた異性化ホップエキス        ２０ｇ
コーンスターチ                      １８８０ｇ
ナタネ硬化油                          １００ｇ
例Ｄ：  飲食品の調製（イソキサントフモール含有飲料の調製）
市販の麦茶用の麦４０ｇに、２Ｌの沸騰した湯を加えた後、これを５分間煮沸して麦茶を抽出した。ここにそれぞれ２ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、および５０ｍｇ／Ｌの濃度となるようにイソキサントフモールを添加して、イソキサントフモール含有麦茶飲料を調製した。ここでイソキサントフモールは、前記例Ａの「ホップエキスからの精製２」において得られたものを使用した。
同様にして、市販の緑茶葉５０ｇに、２Ｌの沸騰した湯を加えた後、これを５分間煮沸して緑茶を抽出した。ここに１０ｍｇ／Ｌの濃度となるようにイソキサントフモールを添加して、イソキサントフモール含有緑茶飲料を調製した。
評価試験：
試験１：  ビール中のエストロゲン活性成分の特定
１−ａ）  エストロゲン活性の測定法
被検物質のエストロゲン活性を、エストロゲン感受性ヒト乳癌由来ＭＣＦ−７細胞の細胞増殖を指標として測定した。使用した細胞株は、エストロゲンレセプターを発現しており、エストロゲン様物質の存在下では細胞増殖の亢進が認められるものであった。したがって、この細胞株の細胞増殖をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（同仁化学研究所製）を用いて測定することによって、エストロゲン活性を測定した。
該Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ＫｉｔによるＭＣＦ−７細胞の細胞増殖の測定は、細胞内に取り込まれたＷＳＴ−１試薬［２−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム，モノナトリウム塩（２−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）］から生じるフォルマザンを、マイクロプレートリーダー（ＳＯＦ  Ｔｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製））を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することによって行った。
より具体的には、Ｄｅｘｔｒａｎ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｃｈａｒｃｏａｌ（Ｓｉｇｍａ社製）に内因性ステロイドを吸着させて除去した牛胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ社製）を１０％含み、さらにペニシリンおよびストレプトマイシン（それぞれ１００００単位、１ｍｇ／ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社製）、および、１μｇ／ｍｌインスリン（ヒト組換え体２７．５ＵＳＰ  ｕｎｉｔ／ｍｇ：（Ｓｉｇｍａ社製））を含むＤＭＥＭ培地を用いて、ＭＣＦ−７細胞を３日間前培養した。このＭＣＦ−７細胞の濃度８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、これを９６ウエルプレート上に１００μｌ／ウエルで播種した。培養１日後、ジメチルスルホキシドに溶解した被検物質０．１％（ｖ／ｖ）を含む培地によってウェル内の培地を交換し、さらに培養を続けた。培養４日目に再度被検物質を含む新しい培地でウェル内培地を交換し、培養７日目にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて細胞増殖を測定した。
なお、陽性対照物質としては、最も強力な内因性エストロゲンである１７β−エストラジオール（Ｓｉｇｍａ社製）のジメチルスルホキシド溶液を用いた。
１−ｂ）  ビール中のエストロゲン活性成分の探索
ビールを脱気し、ＥＮＶＩ−１８カラム（１０ｇ、６０ｍｌ、Ｓｕｐｅｌｃｏ社製）に供し、２０％、５０％、８０％メタノール水溶液、およびメタノール各１８０ｍｌで順次溶出した。
各画分のエストロゲン活性を前記方法にしたがって測定したところ、８０％メタノールおよびメタノールの各溶出画分に活性が確認された。
８０％メタノール、およびメタノールの各溶出画分を併せて減圧乾固しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｋｉｅｓｅｌ  ｇｅｌ  ６０，１０ｇ  Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：７、１：４の混合溶媒、酢酸エチルの順に段階的に溶出した。
得られた各画分のエストロゲン活性を測定したところ、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：７、１：４画分に活性が確認された。
これら活性が確認された画分を減圧乾固し、メタノールに溶解してＨＰＬＣによる分画に供した。ＨＰＬＣの条件は下記の通りであった：
移動層：  Ａ液（アセトニトリル）、Ｂ液（蒸留水）、Ａ液４０％〜１００％によるリニアグラジエント溶出、
カラム：  ＹＭＣ−ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  １０×２５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、
ガードカラム：  ＹＭＣ−ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  １０×３０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、
流速：  ２．５ｍｌ／分、注入量８０ｕｌ、
検出器波長：  ＵＶ２９０ｎｍ。
ＨＰＬＣによって２分間ごとにフラクションを採取し、各フラクションのエストロゲン活性を前記方法にしたがって測定した。
結果は下記の通りであった。
保持時間１４分〜１６分において得られたフラクション（Ｆｒ８）と、保持時間１８分〜２０分において得られたフラクション（Ｆｒ１０）とにそれぞれエストロゲン活性があることが認められた。
この内、Ｆｒ８に含まれる物質の質量（ＭＳ）スペクトル測定を、質量分析計（ＤＸ３０３  日本電子社製）を用いてＥＩ−ＭＳの手法にしたがって行なったところ、ｍ／ｚ３５４にイオンが観測された。これはイソキサントフモールの標準スペクトルパターンと一致するものであった。さらに、Ｆｒ８の５ｍｇを６００μｌの重ジメチルスルホキシドに溶解し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル装置（ＵＮＩＴＹ  ｐｌｕｓ  ５００型（バリアン社製））を用いて１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、およびＮＯＥＳＹ−１Ｄの測定を行ったところ、Ｆｒ８の活性成分がイソキサントフモールであることが確認された。
またＦｒ１０について、ＨＰＬＣ質量（ＭＳ）スペクトル分析を行った。
分析装置はＨＰＬＣ（ＨＰ１１００（アジレント社製））にトリプルステージ型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）（Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ（マイクロマス社製））を接続して用いた。このときのＨＰＬＣ条件は下記の通りであった：
移動層：  Ａ液（アセトニトリル）、Ｂ液（蒸留水）、およびＡ液５５％〜９０％によるリニアグラジエント溶出、
カラム：  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｃ１８  ２．０×１５０ｍｍ（株式会社資生堂製）、
流速：  ０．２ｍｌ／分、注入量５μｌ。
また質量分析計の条件は、イオン化をエレクトロスプレーイオン化方式（ＥＳＩ−）とし、プリカーサーイオン３３８．３、プロダクトイオン２１８．８、Ｃｏｎｅ電圧８０Ｖ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎエネルギー２０ｅＶとした。
測定の結果、Ｆｒ１０には８−プレニルナリンゲニンが高濃度に含まれていることが確認された。
１−ｃ）  ビール中のイソキサントフモールおよび８−プレニルナリンゲニンの分析
ビール１ｍｌを、ジエチルエーテル５ｍｌを用いて２回抽出して、窒素乾固した。これを、内部標準として２．４−ジヒドロカルコンを４０ｐｐｂ含む５０％メタノール水溶液に溶解し、分析試料とした。
分析装置はＨＰＬＣ（ＨＰ１１００（アジレント社製））にトリプルステージ型質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）（Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ（マイクロマス社製））を接続して用いた。このときのＨＰＬＣ条件は下記の通りであった：
移動層：  Ａ液（アセトニトリル）、Ｂ液（蒸留水）、およびＡ液５５％〜９０％によるリニアグラジエント溶出、
カラム：  Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｃｋ  Ｃ１８  ２．０×１５０ｍｍ、
流速：  ０．２ｍｌ／分、注入量５μｌ。
質量分析計の条件は、イオン化をエレクトロスプレーイオン化方式（ＥＳＩ−）とし、ＭＲＭモードにて両化合物を一斉定量分析した。定量イオンおよびイオン化条件は、イソキサントフモールについては、プリカーサーイオン３５２．８、プロダクトイオン２３２．８、Ｃｏｎｅ電圧８０Ｖ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎエネルギー１８ｅＶとした。８−プレニルナリンゲニンについては、プリカーサーイオン３３８．３、プロダクトイオン２１８．８、Ｃｏｎｅ電圧８０Ｖ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎエネルギー２０ｅＶとした。
分析の結果、試験に用いたビール中のイソキサントフモール濃度は２．１ｍｇ／Ｌであり、８−プレニルナリンゲニンの濃度は４３μｇ／Ｌであった。
試験２：  インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるエストロゲン活性評価
精製イソキサントフモールおよび化学合成された８−プレニルナリンゲニンのエストロゲン活性を、試験１と同様にして測定した。ただしこのとき、ＭＣＦ−７細胞培養用の培地における被検物質の濃度を次のように設定した。
イソキサントフモールは、該培地中の濃度が、１．０×１０−５、１．０×１０−６、１．０×１０−７、１．０×１０−８、１．０×１０−９、および１．０×１０−１０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。
８−プレニルナリンゲニンは、該培地中の濃度が、１．０×１０−７、１．０×１０−８、１．０×１０−９、１．０×１０−１０、１．０×１０−１１、および１．０×１０−１２ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。
陽性対照としての１７β−エストラジオールは、該培地中の濃度が、６．３×１０−１１、１．６×１０−１１、３．９×１０−１２、１．０×１０−１２、１．０×１０−１３、および１．０×１０−１４ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。
結果は図１に示される通りであった。
イソキサントフモールおよび８−プレニルナリンゲニンはいずれも、エストロゲン活性を示した。これらの活性をエストラジオールと比較したところ、イソキサントフモールの活性は約１０−５倍、８−プレニルナリンゲニンは１０−２倍であった。
試験３：  インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるエストロゲン活性評価
３−ａ）  幼若ラットにおける評価
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるエストロゲン作用について、幼若Ｗｉｓｔａｒ系雌性ラットを用いて評価した。
使用したラットは次のようにして準備した。まず、２０日齢のＷｉｓｔａｒ系雌性ラット（日本チャールスリバー社より入手可能）を各動物の体重差が平均体重の±１０％以内となるよう選別後、１群６匹として無作為に群分けし、水およびＡＩＮ−７６Ａ（日本クレア社製）を自由摂取させ飼育した。
１日間の予備飼育の後、イソキサントフモールまたは８−プレニルナリンゲニンを、１、５、または２５ｍｇ／ｋｇ／日で１日１回、３日間、１０ｍｌ／ｋｇの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。コントロール群としては溶媒（落花生オイル）を同様にして経口投与し、また陽性対照としては１７β−エストラジオールを用い、これを４００μｇ／ｋｇ／日の量で同様にして経口投与した。最終投与の約２４時間後にラットから子宮を摘出し、その重量を秤量することによってｉｎ  ｖｉｖｏにおけるエストロゲン活性を測定した。
結果は図２に示される通りであった。
イソキサントフモールは、エストラジオール、または８−プレニルナリンゲニンとは異なって、幼若ラットに対しｉｎ  ｖｉｖｏエストロゲン活性を有しないか、または極めて微弱な活性を示すに過ぎないことが判明した。
３−ｂ）  卵巣摘出ラットにおける評価
９週齢の雌性ＳＤ系ラット（日本チャールスリバー社より入手可能）の両側卵巣を摘出し、１群６匹として無作為に群分けし、水およびＡＩＮ−７６Ａ（日本クレア社製）を自由摂取させ飼育した。手術翌日より被検物質を１日１回、２８日間、１０ｍｌ／ｋｇの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。
イソキサントフモールについては、ビールに含まれる濃度と同等、５倍、２０倍になるように、イソキサントフモールを０．８％エタノール水溶液に溶解したものをそれぞれ調製し、これらを用いた。コントロール群、偽手術群には、０．８％エタノール水溶液を同様にして経口投与した。陽性対照としては１７β−エストラジオールを用い、これを２μｇ／ｋｇ／日の量で皮下投与した。
結果は図３および図４に示される通りであった。
卵巣摘出群（ＯＶＸ）の子宮重量は偽手術群と比較して有意に低く、イソキサントフモール投与群によっても子宮重量の有意な回復は認められなかった。
試験４：  卵巣摘出後骨粗鬆症における骨密度減少に対する改善効果
９週齢の雌性ＳＤ系ラットの両側卵巣を摘出し、翌日より被検物質を一日１回、２８日間、１０ｍｌ／ｋｇの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。
コントロール群、偽手術群には０．８％エタノール水溶液を同様にして経口投与した。陽性対照としては１７β−エストラジオールを用い、これを４μｇ／ｋｇ／日の量で皮下投与した。
ビール（国産ピルスナービール）は、イソキサントフモールを２．１ｍｇ／Ｌ含有し、また８−プレニルナリンゲニンを４３μｇ／Ｌ含有するものである。ここではこれを一度、凍結乾燥した後に水に溶解することによってエタノールを除去して、これを被検物質として試験に供した。
イソキサントフモールについては、ビールに含まれる濃度と同等、５倍、２０倍になるように、イソキサントフモールを０．８％エタノール水溶液に溶解したものをそれぞれ調製し、これらを用いた。
さらに、ビールにおける骨粗鬆症の予防活性に寄与する主要成分を同定するために、さらに以下の被検液を調製して試験に供した：
・イソα酸を３０％含むホップエキス（Ｉｓｏ−Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社製））を０．８％エタノール水溶液で希釈した希釈液であって、イソα酸濃度がビールと同等濃度（３０ｍｇ／Ｌ）になるよう調製した液、
・８−プレニルナリンゲニンの水希釈液であって、８−プレニルナリンゲニンがビール中に含まれる濃度と同等になるよう希釈した液、および
・イソキサントフモールの異性体であるキサントフモール（Ａｐｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）の水希釈液であって、キサントフモールがビールに含まれるイソキサントフモールと同等濃度（２．１ｍｇ／Ｌ）となるように調製した液。
骨密度の測定は、ラットの大腿骨を採取し、遠位骨端部の海綿骨骨密度をｐＱＣＴ（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）骨密度測定装置（ＸＣＴ−９６０Ａ（ノーランド・ストラテック社製））を用いて特定することにより行なった。
結果は図５および図６に示される通りであった。
卵巣摘出群（ＯＶＸ）の大腿骨における海綿骨骨密度は減少していたが、ビールおよびイソキサントフモール投与により有意に改善された。このような改善は、ビール中のエストロゲン活性寄与率が最も大きいと考えられる８−プレニルナリンゲニンには認められなかった。また、キサントフモールやイソフムロン類を含むイソα酸については、Ｐｉｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙによって骨吸収阻害活性がすでに報告されているが、これらについてもイソキサントフモールのような活性は認められなかった。
前記試験３にもあるように、卵巣摘出ラットにおいては骨密度減少抑制活性を示す用量、および、それよりも２０倍の用量の場合でも、イソキサントフモールは子宮重量増加作用を示さなかった。また、幼若ラットにおいては骨密度減少抑制効果が認められる用量の１２５０倍の投与量においても子宮重量増加作用は認められなかった。
試験５：  イソキサントフモール含有飲料のラット骨密度減少に対する改善効果
９週齢の雌性ＳＤ系ラットの両側卵巣を摘出し、翌日より被検溶液を一日１回２８日間、１０ｍｌ／ｋｇの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。
コントロール群、偽手術群には水を同様にして経口投与した。陽性対照としては、落花生油に溶解した１７β−エストラジオールを用い、これを１０μｇ／ｋｇ／日の量で皮下投与した。
被検溶液としては、前記例Ｄにしたがって、下記のものを用意した：
・前記例Ｄと同様にして抽出された麦茶であってイソキサントフモールを含有していない麦茶、
・イソキサントフモールをそれぞれ２ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、および５０ｍｇ／Ｌの濃度で含有する麦茶、
・前記例Ｄと同様にして抽出された緑茶であってイソキサントフモールを含有していない緑茶、および
・イソキサントフモールを１０ｍｇ／Ｌの濃度で含有する緑茶。
骨密度の測定は前記試験４の場合と同様にして行った。
結果は図７および図８に示される通りであった。
卵巣摘出群（ＯＶＸ）の大腿骨における海綿骨骨密度は、偽手術群と比較して減少していたが、イソキサントフモールを含有する飲料を投与した群の骨密度は水を投与したコントロール群よりも有意に高く、骨密度減少に対する改善効果が認められた。一方、イソキサントフモールを含有しない飲料の場合には、骨密度減少に対する改善効果は認められなかった。
緑茶は、一般的に、骨吸収作用に関わる破骨細胞の活性を抑制することが知られている茶カテキンを多く含むとされてる（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２９２（１），９４−１０１（２００２））。しかしながら、イソキサントフモールを含有しない緑茶飲料の場合には卵巣摘出ラットの骨密度減少抑制効果は認めらなかった。したがって、緑茶の場合でも、イソキサントフモールを添加することによって初めて骨密度減少に対する改善効果が認められた（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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