(57)【要約】要約なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、患者の生体内に存在する標的分子の抗原タンパク質のアミノ酸配列を、当該モノクローナル抗体製剤投与前に予め解析することにより投与対象患者を選別することよりなる、当該モノクローナル抗体製剤の奏功性を向上させる方法。
【請求項２】
モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、▲１▼患者生体試料中の標的分子の遺伝子を分離・解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のアミノ酸配列を予測し、▲２▼その配列を予め決定された当該モノクローナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較することによって患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定し、ついで▲３▼当該判定結果に基づいて奏効性が期待される投与対象患者を選別する工程を含んでなる、請求項１記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項３】
予測された標的タンパク質のアミノ酸配列と参照配列の比較に際し、モノクローナル抗体の当該予測された配列を有するペプチドもしくは発現タンパク質との結合性、及び／または当該モノクローナル抗体の生物学的活性を指標とするものである、請求項１または請求項２記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項４】
前記投与対象患者生体試料中の標的分子に関し、モノクローナル抗体が認識する抗原エピトープ部分のアミノ酸配列に多様性が存在する場合であって、モノクローナル抗体との反応性において参照配列として共通する普遍性ある配列を指標とし得る、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項５】
モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を抗原として認識する抗体である、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の外被糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３領域に対する抗体である、請求項５に記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項７】
ＨＩＶ−１の参照配列が、ＩＧＰＡＲＡＦ（配列番号５）、ＩＧＰＧＲＳＦ（配列番号６）、ＩＧＰＧＲＡＬ（配列番号７）、ＩＧＰＧＲＴＦ（配列番号８）、ＩＧＰＧＲＡＩ（配列番号９）、ＶＧＰＧＲＡＬ（配列番号１０）及びＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号１１）より選択され得るものである、請求項５または請求項６記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、医薬品に係る分野に属する。詳細には、モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させるための、当該抗体が認識する抗原を有する患者を選別するために実施される方法に関する。
【背景技術】  近年、モノクローナル抗体の臨床応用として、モノクローナル抗体製剤投与による治療が展開されている。モノクローナル抗体製剤は、生体内の抗原と反応し有効性を示すため、当該抗原の発現量を予め検査し投与対象を選別すれば、モノクローナル抗体の奏効性を向上させ得る。また、モノクローナル抗体は極めて特異性が高いため、安全性と有効性に優れる一方で、抗原エピトープ部分のアミノ酸配列に多様性が存在する場合には抗体との反応性が低下し、有効性に影響を及ぼす可能性が危惧される。このため、モノクローナル抗体製剤を医薬品として用いる場合、患者体内での抗原の発現量のみならず、抗原の多様性を確認し投与対象者を選択することは、当該抗体製剤の奏効性を向上させるために有用な手段と考えられる。
モノクローナル抗体製剤の投与対象者を検査し選択する例として、現在市販されている、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（Ｔｒａｓｔｕｍａｂ）に係る適用例が挙げられる。Ｔｒａｓｔｕｍａｂは、乳がん患者の約２０〜３０％で過剰発現しているＨＥＲ２タンパク質に対する抗体である。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体投与対象者選択のための臨床検査として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子のＤＮＡ増幅を目的としたサザンブロット法もしくはＦｕｒｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）法、ＨＥＲ２ｍＲＮＡの過剰発現を検索するためのノーザンブロット法、もしくはｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）法、またはＨＥＲ２タンパク質の過剰発現を検索するためのウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、もしくは免疫組織化学法などが試みられている。これらの検査により、ＴｒａｓｔｕｍａｂのＨＥＲ２過剰発現症例の奏効率が向上しており、このことは、モノクローナル抗体製剤による治療において、対象者を予め選択することが奏効性を向上させるために有用であることを示している（例えば、日本臨床（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ）６０巻３号（２００２））。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
一方、エピトープ部分のアミノ酸配列に多様性が存在して、このため抗原抗体反応の親和性に変化が生じる場合には、抗原の多様性に伴う抗体製剤の奏効性の低下が予測され、これを予知することは臨床的観点から意義は大きい。そのためには、Ｔｒａｓｔｕｍａｂで実施されるような抗原タンパク質の発現量を調べるだけの検査では不十分であり、新たな検査法が必要である。その理由は、タンパク質として高発現している抗原であって量的には検出され得る場合であっても、当該モノクローナル抗体のエピトープを有する野生型の中にエピトープのアミノ酸配列が変異し反応性が低下した変異体が多数存在する場合には、不適合と判定される必要があるからである。従って、抗原のエピトープ部分に多様性が存在する場合には、アミノ酸配列の異なる個々のエピトープに対する抗体の反応性の程度を抗原抗体反応により直接確認することが要求される。しかしながら、生体内の微量な抗原の中からエピトープ部分のアミノ酸配列が異なる分子を分別し、当該抗体で捕捉し検出する方法は、高い感度を必要とし、また抗原の発現量と抗体の反応性とを区別して検出するのが困難などの問題点がある。
以上の観点から、モノクローナル抗体の認識するエピトープ部分のアミノ酸配列に多様性が認められるタンパク質を抗原とするモノクローナル抗体製剤では、製剤の投与対象者選別のため、高感度かつ迅速に検査する方法の開発が必要とされる。
（その解決方法）
本発明は、モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、患者の生体内に存在する標的分子の抗原タンパク質のアミノ酸配列を、当該モノクローナル抗体製剤投与前に予め解析することにより投与対象患者を選別することよりなる、当該モノクローナル抗体製剤の奏功性を向上させる方法に関する。
本発明はまた、上記方法において、▲１▼患者生体試料中の標的分子の遺伝子を分離・解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のアミノ酸配列を予測し、▲２▼その配列を予め決定された当該モノクローナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較することによって患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定し、ついで▲３▼当該判定結果に基づいて奏効性が期待される投与対象患者を選別する工程を含んでなる、モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法に関する。
モノクローナル抗体製剤が認識する抗原エピトープのアミノ酸配列の多様性により、抗体の抗原に対する結合の親和性は変化する。エピトープ領域に遺伝子多型を示す抗原の場合、免疫化学的検出法などによって直接的にモノクローナル抗体の結合性を測定する方法に代わり、患者の体内で発現している抗原の多様性を塩基配列から解析し、その抗原と当該抗体の結合性を予測することが可能であると本願発明者らは考えた。そして、エピトープのアミノ酸配列と抗原抗体の反応性に相関が認められるモノクローナル抗体について、予めその相関性に関するデータを取得しておき、そのデータと患者由来の抗原エピトープ領域の塩基配列とを比較することによって投与対象者を効率的に選択し得る本願発明の方法を発明した。
これらの方法は、ＰＣＲ法および塩基配列解析技術の進歩により、高感度かつ汎用的に実施可能であり、変異体が混在するＤＮＡをクローニングせずに直接解析を行うことも可能である。従って、発現タンパク質抗原とモノクローナル抗体との結合親和性を実際に測定することなく、エピトープ領域をコードする塩基配列を調べるのみで、モノクローナル抗体製剤の奏効性を予測することが可能となった。
（従来技術より有効な効果）
本願発明により、モノクローナル抗体製剤の投与に際し、標的の発現タンパク質抗原と当該モノクローナル抗体との結合親和性を実際に抗原を単離調製して測定することなく、予め抗原のエピトープ領域をコードする塩基配列を調べ、予め決定された当該モノクローナル抗体の認識するアミノ酸配列（参照配列）と比較することによって、患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定して投与対象患者を選別することにより、総合的に当該モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上せしめる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、モノクローナル抗体の認識する部位を調べるため、ＫＤ−２４７により中和されることが確認されている実験室株ＨＩＶ−１（ＭＮ株）のＰＮＤ領域の合成ペプチドＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹを基に、１残基ずつ削除した合成ペプチドに対するＫＤ−２４７の結合性を示すグラフである。
図２は、モノクローナル抗体の認識するアミノ酸配列の幅広さを調べるため、ＫＤ−２４７により中和されることが確認されている実験室株ＨＩＶ−１（ＭＮ株）のＰＮＤ領域の合成ペプチドＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹを基に、当該合成ペプチドのＮ末端側のＩからＣ末端側のＹまでを順に天然に存在する他の１９種類のアミノ酸残基に１残基ずつ置換した場合（図２ａ〜図２ｊにそれぞれ示す）の合成ペプチドに対するＫＤ−２４７の結合性を示すグラフである。図２ａ〜図２ｊにおいて斜線の棒グラフはアミノ酸残基を変化させない場合の値を示す。
図３は、モノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列を発現タンパク質で調べるため、患者由来のＨＩＶ−１遺伝子よりＶ３領域を増幅し発現させたタンパク質のＶ３領域中央部分のアミノ酸配列に対するＫＤ−２４７の結合性を、ＭＮ株由来の遺伝子を基に発現させたタンパク質との結合性を１００％とした相対結合活性で示すグラフである。各配列での平均値を横棒で示した。図３中、１〜３３は、Ｖ３領域中央部分に以下の配列を含む発現タンパク質である。１：ＩＡＰＧＲＡＦ；２：ＩＡＰＧＲＡＬ；３：ＩＡＰＧＳＡＦ；４：ＩＧＬＧＲＡＦ；５：ＩＧＰＡＲＡＦ；６：ＩＧＰＧＧＡＦ；７：ＩＧＰＧＫＡＦ；８：ＩＧＰＧＲＡＦ；９：ＩＧＰＧＲＡＩ；１０：ＩＧＰＧＲＡＬ；１１：ＩＧＰＧＲＡＳ；１２：ＩＧＰＧＲＡＶ；１３：ＩＧＰＧＲＡＷ；１４：ＩＧＰＧＲＡＹ；１５：ＩＧＰＧＲＰＦ；１６：ＩＧＰＧＲＲＦ；１７：ＩＧＰＧＲＳＦ；１８：ＩＧＰＧＲＳＶ；１９：ＩＧＰＧＲＴＦ；２０：ＩＧＰＧＲＴＬ；２１：ＩＧＰＧＲＴＶ；２２：ＩＧＰＧＲＶＦ；２３：ＩＧＰＧＲＶＹ；２４：ＩＧＰＧＳＡＦ；２５：ＩＧＳＧＲＡＦ；２６：ＬＧＰＧＧＡＦ；２７：ＬＧＰＧＲＡＦ；２８：ＭＧＰＧＧＡＦ；２９：ＭＧＰＧＫＡＦ；３０：ＭＧＰＧＲＡＦ；３１：ＭＧＰＧＲＶＹ；３２：ＶＧＰＧＲＡＬ；３３：ＶＧＰＧＲＡＶ。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の方法において、モノクローナル抗体製剤投与の適合性を判定し、奏功性が期待される投与対象患者を選別するに際して、患者由来の標的分子のアミノ酸配列を、予め決定しておいた「参照配列」と比較することが必須である。本明細書において「参照配列」とは、投与しようとするモノクローナル抗体製剤の主成分であるモノクローナル抗体が認識し結合することのできる抗原のエピトープ領域のアミノ酸配列をいう。かかるエピトープ領域のアミノ酸配列を「参照配列」として決定した後、当該モノクローナル抗体の有効性（中和活性など）と「参照配列」との相関を調べることができる。また、エピトープ領域のアミノ酸配列に多様性が認められる場合（たとえば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１））には、当該エピトープ領域の多様なアミノ酸配列に共通する普遍性ある配列を「参照配列」として決定する。
このようにモノクローナル抗体製剤の主成分であるモノクローナル抗体が認識・結合するエピトープ領域のアミノ酸配列を予め決定しておき、当該モノクローナル抗体が有効性を発揮できるアミノ酸配列を「参照配列」として決定しておくことにより、かかる「参照配列」との比較による当該モノクローナル抗体製剤投与適合性の判断が可能となる。
本発明を実施するため、▲１▼モノクローナル抗体が認識するエピトープ部分のアミノ酸配列（参照配列）の解析、▲２▼患者の生体試料中に存在する標的分子のエピトープ部分を含む領域の塩基配列の分析、▲３▼抗原タンパク質のアミノ酸配列の多様性とモノクローナル抗体の薬効との相関データの取得などを予め実施する必要がある。
すなわち具体的には以下の工程を経る。当該モノクローナル抗体が認識する典型的な抗原について、タンパク質を構成するペプチド断片に対する当該モノクローナル抗体の結合性を調べ、エピトープ部分を同定する。当該ペプチド断片の作製は、抗原タンパク質のタンパク質分解酵素による消化物、既知のアミノ酸配列情報に基づくペプチド断片の化学合成等により可能となる。また、当該ペプチド断片とモノクローナル抗体との反応性を解析する方法として、ＥＬＩＳＡ法やドットブロット法等による免疫化学的な方法、及び表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いた方法等が挙げられる。なお、生体内に存在する抗原としては、外来性のウイルス、細菌、毒素、内在性のがん特異的抗原や疾患関連分子等が考慮され得る。
患者生体内に存在する抗原タンパク質中の当該エピトープ領域の塩基配列を求めるため、エピトープ領域周辺に位置し且つアミノ酸配列に変異がほとんど認められない領域を選択し、当該領域の塩基配列を基に核酸増幅反応のためのプライマーを設計する。当該抗原のエピトープ領域の塩基配列を解析するため、血液、組織等を生体試料として、ＲＮＡより逆転写酵素を用いて得られるｃＤＮＡもしくはＤＮＡを鋳型とし、当該プライマーを用いたＰＣＲ法によりエピトープ領域を増幅する。増幅されたＤＮＡは、直接又はクローニング操作を経た後に、ＤＮＡ解析装置等を用い塩基配列を解析する。
エピトープ領域に種々のアミノ酸配列を有する抗原に対する当該モノクローナル抗体の反応性は、上述の方法により得られたエピトープ領域を含むＤＮＡをクローニングし、大腸菌などを用いて発現させたタンパク質に対する当該モノクローナル抗体の結合性を測定することにより可能である。さらに、当該エピトープ領域のアミノ酸配列と当該モノクローナル抗体の有効性の相関は、抗原結合活性のみならず、抗ウイルス活性、抗腫瘍効果などを指標として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏ試験により確認される。例えば、患者由来のウイルスをクローン化し、当該エピトープ領域の塩基配列よりアミノ酸配列を求めるとともに、ウイルス中和活性を測定し、エピトープ領域のアミノ酸配列と有効性の相関を示すデータが取得可能である。
抗原に多様性が存在する代表的な例として、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）が例示される。ＨＩＶ−１の主要中和決定基（ＰＮＤ）は、外被糖蛋白質ｇｐ１２０の第３可変領域（Ｖ３領域）の中央部分に位置している。本願発明者らは、ＰＮＤに対するヒト化モノクローナル抗体を作製し、臨床応用を目的にこれを製剤化した。当該モノクローナル抗体は、当該抗体のエピトープ部分が位置するＰＮＤ領域のアミノ酸配列の変異により、ＨＩＶ−１に対する中和活性、すなわち抗原との結合性に影響を受けた。従って、当該抗体の臨床応用では、エピトープ部分のアミノ酸配列を解析し、投与対象者を選択することが奏効性の向上につながると予測された。
そこで、まず当該抗体と結合可能な抗原の存在を確認するために、以下のような手順により、エピトープ部分のアミノ酸配列と当該抗体との結合性の相関性を調べ、当該モノクローナル抗体が認識し有効性が期待されるアミノ酸配列を参照配列として決定した。
▲１▼ＰＮＤ領域の配列から成る合成ペプチド断片を用い当該モノクローナル抗体が認識するエピトープ配列を確認した。
▲２▼患者由来のウイルスより、Ｖ３領域の遺伝子を増幅後クローニングし、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させた。このＶ３領域の発現タンパク質に対する当該モノクローナル抗体の結合性を調べ、エピトープ部分のアミノ酸配列と抗体の結合性との相関を調べた。
▲３▼上述の結果から、当該抗体の参照配列の候補を選択した。
▲４▼当該モノクローナル抗体のＨＩＶ−１に対する中和活性を調べ、上述の参照配列と中和活性に相関性のあることを確認した。
▲５▼患者血漿または末梢血単核細胞よりＨＩＶ−１  Ｖ３領域の遺伝子を増幅し、塩基配列を解析した。その結果から推定されたアミノ酸配列を上述の参照配列と比較し、対象患者に対する当該抗体の適合性を予測した。
かかる知見に基づき、患者の体内で発現している抗原の多様性を塩基配列から解析し、その抗原と当該抗体の結合性を予測することが可能であることが明らかになった。臨床での使用に当たり、例えば標的分子がＨＩＶ−１の場合、以下のような手順により、患者血漿を検体として当該モノクローナル抗体製剤の投与対象者を選択する方法が提供される。
血漿中のＨＩＶ−１  ＲＮＡを、逆転写酵素を用いてＤＮＡに変換し、Ｖ３領域の核酸増幅反応を行なう。増幅したＤＮＡ断片を、直接またはクローニングを実施した後に塩基配列を解析する。この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を求め、予め選定されたモノクローナル抗体製剤中の当該モノクローナル抗体が認識し得るアミノ酸配列の参照配列と比較する。参照配列の決定は、前述のような、ペプチドまたは発現タンパク質への結合性やＨＩＶ−１中和活性の測定結果より決定される。また、臨床試験により患者由来のＨＩＶ−１におけるＰＮＤ領域のアミノ酸配列と当該モノクローナル抗体製剤の有効性の関係を解析することにより、より詳細な参照配列のデータが得られる。
以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
【実施例１】合成ペプチドを用いた抗ＨＩＶモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列の解析
ＰＮＤ領域に対するヒト化モノクローナル抗体であるＫＤ−２４７が認識するアミノ酸配列を、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＶ３領域の中央部分に由来する合成ペプチドを用いて調べた。ペプチドを、Ｐｅｐｓｃａｎ法（Ｇｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３９９８−４００２，（１９８４））により合成し、それらのペプチドに対するＫＤ−２４７の結合活性を酵素抗体測定法により確かめた。ＫＤ−２４７が認識する最短のアミノ酸配列を調べるため、ＫＤ−２４７により中和可能な実験室株ＨＩＶ−１（ＭＮ株）のＶ３領域中央部分のアミノ酸配列である、ＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹを有する１０アミノ酸残基のペプチド、及びそのアミノ酸残基を、４アミノ酸残基まで１残基ずつ削除した以下のペプチドを合成した：ＩＨＩＧＰＧＲＡＦ、ＨＩＧＰＧＲＡＦＹ、ＩＨＩＧＰＧＲＡ、ＨＩＧＰＧＲＡＦ、ＩＧＰＧＲＡＦＹ、ＩＨＩＧＰＧＲ、ＨＩＧＰＧＲＡ、ＩＧＰＧＲＡＦ、ＧＰＧＲＡＦＹ、ＩＨＩＧＰＧ、ＨＩＧＰＧＲ、ＩＧＰＧＲＡ、ＧＰＧＲＡＦ、ＰＧＲＡＦＹ、ＩＨＩＧＰ、ＨＩＧＰＧ、ＩＧＰＧＲ、ＧＰＧＲＡ、ＰＧＲＡＦ、ＧＲＡＦＹ、ＩＨＩＧ、ＨＩＧＰ、ＩＧＰＧ、ＧＰＧＲ、ＰＧＲＡ、ＧＲＡＦ、ＲＡＦＹ。
合成ペプチドが結合しているポリエチレン製のロッドを、２％ウシ血清アルブミン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水中でプレコーティングを実施した後、２μｇ／ｍｌのＫＤ−２４７と反応させた。ペプチドに結合したＫＤ−２４７を、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトκ抗体及び基質を用いて測定した。図１に示す通り、ＫＤ−２４７が反応する最短のアミノ酸配列は、ＩＧＰＧＲであった。
ＫＤ−２４７が認識するペプチドを構成するアミノ酸残基を置換した場合の反応性の変化を調べるため、ＨＩＶ−１（ＭＮ株）株由来のＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹ配列の各アミノ酸残基を、天然に存在する他の１９種類のアミノ酸残基に置換したペプチドを合成し、上述の方法を用いてＫＤ−２４７との反応性を測定した。図２のように、中央部分のＰＧＲ配列に関し置換可能な他のアミノ酸残基は少なく、特にアルギニン（Ｒ）残基は必須のアミノ酸であることが確認された。その他のアミノ酸残基では、多くの他のアミノ酸残基との置換が可能であった。
以上の結果より、ＫＤ−２４７はＩＧＰＧＲ配列を基本的に認識し、この配列内及び又はその前後のアミノ酸配列に置換が生じた場合にも認識することが可能であることが判明した。
【実施例２】発現タンパク質を用いた抗ＨＩＶモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列の解析
実施例１で明らかになったＫＤ−２４７の認識部位は、短いペプチドと抗体との反応を観測したものであった。抗体の抗原タンパク質との結合性は、結合部分のアミノ酸配列に加えて、立体構造に伴う影響も考慮する必要がある。そのため、Ｖ３領域を含む領域を発現させたタンパク質に対するＫＤ−２４７の結合性を調べた。
先ず、ＨＩＶ−１のＶ３領域を含む遺伝子を、ＨＩＶ−１感染者由来の血漿より得られたＨＩＶ−１  ＲＮＡ遺伝子を基に逆転写酵素を用いて得たｃＤＮＡ、または末梢血単核細胞のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを鋳型として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法により増幅した。第１ＰＣＲに用いたプライマーは、
５’−ＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＧＴ−３’（ＯＡ−４）（配列番号１）及び
５’−ＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡ−３’（ＯＤ−４）（配列番号２）であり、第２ＰＣＲに用いたプライマーは、
５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＣＴＧＣＴＧＴＴＡＡＡＴ−３’（ＥＢ−２）（配列番号３）及び
５’−ＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’（ＥＣ−２）（配列番号４）であった。この増幅ＤＮＡ断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ及びＰｓｔ  Ｉで切断し、ベータガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子を有するベクタープラスミド（ｐＵＥＸ  Ｉ）に挿入した。このベクターをコンピテント細胞に導入し、クローニングを行なった。クローン化ＤＮＡを鋳型にＥＢ−２及びＥＣ−２プライマーを用いてＰＣＲを実施し、増幅ＤＮＡ断片を鋳型として、塩基配列解析装置を用いてＶ３領域の核酸配列を解析し、その核酸配列に基づいてＶ３領域のアミノ酸配列を決定した。
一方、遺伝子配列を解析した各クローン化大腸菌を培養し、次のようにして、Ｖ３領域とベータガラクトシダーゼの融合タンパク質（Ｖ３／β−Ｇａｌ）を得た。先ず、培養した大腸菌を細胞破砕装置で破砕後、遠心分離し、その沈殿を０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解後さらに遠心分離し、封入体を含む沈殿を、８Ｍ尿素を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で溶解しＶ３／β−Ｇａｌを精製した。得られたＶ３／β−Ｇａｌは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現に異常がないことを確認し、次にＶ３／β−Ｇａｌ濃度を合わせるため、ＥＬＩＳＡを行なった。抗β−Ｇａｌ抗体を固相化したプレートを用い、発現させたＶ３／β−Ｇａｌまたは標準品としてのβ−Ｇａｌ市販品を添加した。検出抗体としてペルオキシダーゼ標識抗β−Ｇａｌ抗体を用いた。標準品の結果を基に検量線を作成し、発現Ｖ３／β−Ｇａｌ濃度をβ−Ｇａｌ濃度換算で求めた。
次に、Ｖ３／β−ＧａｌとＫＤ−２４７の反応性を評価するため、別のＥＬＩＳＡを実施した。抗β−Ｇａｌ抗体をプレートに固相化し、２００ｎｇ／ｍｌのＶ３／β−Ｇａｌと反応させた。捕捉されたＶ３／β−Ｇａｌに対し、１μｇ／ｍｌのＫＤ−２４７を反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。各々のＶ３／β−Ｇａｌに対するＫＤ−２４７の結合性は、プレートごとに設定された陽性対照であるＨＩＶ−１ＭＮ株由来のＶ３／β−Ｇａｌの吸光度を１００％とした相対値で示した。
約１２０種類の患者由来ＨＩＶ−１クローンを用いて解析されたＶ３／β−ＧａｌのＶ３中央部分のアミノ酸配列とＫＤ−２４７との相対結合活性を図３に示した。結合性の相対値の平均が１００％を超えたクローンのＶ３領域中央部分のアミノ酸配列は、ＩＧＰＡＲＡＦ（配列番号５）、ＩＧＰＧＲＳＦ（配列番号６）、ＩＧＰＧＲＡＬ（配列番号７）、ＩＧＰＧＲＴＦ（配列番号８）、ＩＧＰＧＲＡＩ（配列番号９）、ＶＧＰＧＲＡＬ（配列番号１０）、ＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号１１）であった。これらの配列は、ＫＤ−２４７適合性を判定する参照配列の一例として挙げられる。
【実施例３】ＨＩＶ−１のＶ３領域のアミノ酸配列とウイルス中和活性の解析
Ｖ３領域のアミノ酸配列と中和活性の関連を、実験室株及び臨床分離株ＨＩＶ−１を用いて調べた。
ＨＩＶ−１のＶ３領域の核酸配列を、実施例２と同様の方法により求めた。さらに、これらのウイルスと、濃度を変化させたＫＤ−２４７とを３７℃で１時間反応後、フィトヘマグルチニンで活性化した健常人の末梢血単核細胞に接種した。７日間培養後細胞を洗浄し、ＩＬ−２存在下でさらに７日間培養を継続した。培養上清中のＨＩＶ−１  ｐ２４抗原量をＥＬＩＳＡ法により測定し、抗体非存在下で培養した値を１００％とし、添加した抗体濃度によりｐ２４抗原量を５０％（ＩＣ５０）または９０％（ＩＣ９０）低下させるＫＤ−２４７濃度を中和活性として表わした。
表１に示す通り、ＫＤ−２４７の中和活性は、Ｖ３領域中央部分のアミノ酸配列に依存した。すなわち、実施例１及び実施例２でＫＤ−２４７との結合性が確認されたＩＧＰＧＲＡＦ配列をＶ３領域中央部分に有するＨＩＶ−１は、すべてＫＤ−２４７によって中和された。これは、Ｖ３領域中央部分のアミノ酸配列が、そのウイルスに対するＫＤ−２４７の結合活性及び中和活性と相関する事を示している。
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【実施例４】臨床検体のＶ３領域アミノ酸配列の解析とＫＤ−２４７の患者適合性検査
実施例２の方法を用い、患者の血漿または末梢血単核細胞より、ＨＩＶ−１遺伝子を解析した。これを基に、ＨＩＶ−１のＶ３領域のアミノ酸配列を推定し、実施例２で得られたＫＤ−２４７と強く反応するアミノ酸配列を参照配列として比較し、各患者におけるＫＤ−２４７の適合性を検査した。
患者血漿または末梢血単核細胞中のＨＩＶ−１遺伝子より推定されるアミノ酸配列および各患者におけるＫＤ−２４７の患者適合性を表２に示した。点線で囲んだアミノ酸配列を、実施例２で求められた参照配列（配列番号５〜１１）と比較し、一致した場合を適合、不一致の場合を不適合として判定した。
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【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月4日(2005.1.4)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】モノクローナル抗体製剤の奏功性を向上させる方法であって、当該モノクローナル抗体製剤の投与に適合した患者を、患者からの試料中に存在する標的分子の抗原タンパク質のアミノ酸配列を予め解析することによって選別することを含む方法。
【請求項２】▲１▼患者生体試料中の標的分子の遺伝子を分離・解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のアミノ酸配列を予測し、▲２▼その配列を予め決定された当該モノクローナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較することによって患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定し、ついで▲３▼当該判定結果に基づいて奏効性が期待される投与対象患者を選別する工程を含んでなる、請求項１記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項３】予測された標的タンパク質のアミノ酸配列と参照配列の比較に際し、モノクローナル抗体の当該予測された配列を有するペプチドもしくは発現タンパク質との結合性、及び／または当該モノクローナル抗体の生物学的活性を指標とするものである、請求項１または請求項２記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項４】前記投与対象患者の生体試料中の標的分子が、モノクローナル抗体が認識する抗原エピトープ部分のアミノ酸配列において多様性を示す場合であって、モノクローナル抗体との反応性において参照配列として共通する普遍性ある配列を指標とし得る、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項５】モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を抗原として認識する抗体である、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項６】モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の外被糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３領域に対する抗体である、請求項５に記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項７】ＨＩＶ−１の参照配列が、ＩＧＰＡＲＡＦ（配列番号５）、ＩＧＰＧＲＳＦ（配列番号６）、ＩＧＰＧＲＡＬ（配列番号７）、ＩＧＰＧＲＴＦ（配列番号８）、ＩＧＰＧＲＡＩ（配列番号９）、ＶＧＰＧＲＡＬ（配列番号１０）及びＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号１１）より選択され得るものである、請求項５または請求項６記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。
【請求項８】標的抗原分子のエピトープ部分にアミノ酸残基の多様性を有する抗原タンパク質のアミノ酸配列を解析することにより、当該標的抗原分子に対する当該標的抗原分子を認識するモノクローナル抗体の結合性を予測する試験法。
【請求項９】生体試料中の標的抗原分子の抗原タンパク質をコードする遺伝子を分離・解析して得られた核酸配列をタンパク質のアミノ酸配列に変換することを特徴とする請求項８記載の試験法。
【請求項１０】▲１▼生体試料中の標的抗原分子の抗原タンパク質をコードする遺伝子を分離・解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のアミノ酸配列を予測し、ついで▲２▼その配列を、予め決定された当該標的抗原分子に対するモノクローナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較する工程を含んでなる、請求項８または請求項９記載の試験法。
【請求項１１】モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）を抗原として認識する抗体である、請求項８ないし請求項１０のいずれかに記載の試験法。
【請求項１２】モノクローナル抗体の認識部位が、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の外被糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３領域である、請求項１１に記載の試験法。
【請求項１３】ＨＩＶ−１の参照配列が、ＩＧＰＡＲＡＦ（配列番号５）、ＩＧＰＧＲＳＦ（配列番号６）、ＩＧＰＧＲＡＬ（配列番号７）、ＩＧＰＧＲＴＦ（配列番号８）、ＩＧＰＧＲＡＩ（配列番号９）、ＶＧＰＧＲＡＬ（配列番号１０）及びＩＧＰＧＲＡＦ（配列番号１１）より選択され得るものである、請求項１１または請求項１２に記載の試験法。