(57)【要約】霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を生育させ、出生に至った仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジから霊長類動物の造血系細胞を得る、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化法、霊長類動物の造血系細胞の製法、該製法により得られる造血系細胞、並びに霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植する、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製法。本発明により、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の治療のための手段の開発が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を生育させ、出生に至った仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジから霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法。
【請求項２】
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む、前記請求項１記載の分化方法。
【請求項３】
ステップ（Ｉ）において、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持する、前記請求項２記載の分化方法。
【請求項４】
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジより、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップを含む、霊長類動物の造血系細胞の製造方法。
【請求項５】
前記請求項４記載の製造方法により得られる造血系細胞。
【請求項６】
霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させることを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、霊長類動物の造血系細胞、分化細胞等の供給のための技術に関する。より詳しくは、本発明は、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法、該分化方法により得られる造血系細胞、及び霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法に関する。
【背景技術】  再生不良性白血病等の疾患の患者に対して、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植等に代表される造血幹細胞移植を行ない、患者の体内において、血液細胞を産生させることが行なわれている。
しかしながら、前記造血幹細胞移植においては、移植対象の患者に適合する造血幹細胞の安定供給が困難であること、造血幹細胞の採取の際、ドナーに体力的又は肉体的にダメージを与える場合があること等の欠点がある。
そこで、造血幹細胞の安定供給を図るため、ブタ胎仔に経子宮的にヒト造血幹細胞に移植し、ブタ体内で造血前駆細胞を増幅させることが試みられている〔中内啓光、他１名、“３．ヒト血液キメラブタの樹立とその応用”、「第１１７回日本医学会シンポジウム記録集  幹細胞と細胞療法−［ＩＩＩ］組織・器官幹細胞：臨床応用への基盤開発（２）  ２０００年８月４日〜６日開催、ｐ９９−１０６［ｏｎｌｉｎｅ］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄ．ｏｒ．ｊｐ／ｊａｍｓ／ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ／ｋｉｒｏｋｕ／１１７／ｐｄｆ／１１７０９９．ｐｄｆ＞〕。
一方、機能障害を有する組織や臓器の機能回復、修復、再生等を目的とする再生医療への応用のため、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）の分化について、イン・ビトロでの研究が行なわれている。
胚性幹細胞から血液細胞へのイン・ビトロでの分化の試みの例として、造血幹細胞の自己再生に関連するホメオティックセレクター遺伝子であるＨｏｘＢ４を導入したマウスＥＳ細胞から、最終造血幹細胞の表現型を示す細胞へ分化させること〔マイケル  カイバ（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｙｂａ）ら、Ｃｅｌｌ、第１０９巻、２００２年４月５日発行、ｐ２９−３７〕、ＯＰ９ストロマ細胞を利用して、マウスＥＳ細胞から、造血前駆細胞と推定される細胞へ分化させること〔仲野徹著、“５．胚性幹細胞からの血液細胞への分化”、横田崇ら編、実験医学  増刊「幹細胞研究の最前線と再生医療への応用  発生・分化メカニズムの解明、そして臨床へ」２００１年９月２５日発行、第１９巻、第１５号、ｐ１９６６−１９７１；仲野徹（Ｔｏｒｕ  Ｎａｋａｎｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６５巻、１９９４年８月１９日、ｐ１０９８−１１０１〕、アカゲザルＥＳ細胞を、マウスＳ１７ストロマ細胞上で培養して、造血前駆細胞に分化させること〔フェイ  リ（Ｆｅｉ  Ｌｉ）ら、Ｂｌｏｏｄ、第９８巻、２００１年７月１５日発行、ｐ３３５−３４２〕、マウスＥＳ細胞から造血前駆細胞へ分化させること〔ブリット  エム．ヨハンソン（Ｂｒｉｔｔ  Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、第１号、１９９５年１月発行、ｐ１４１−１５１〕が挙げられる。
また、前記フェイ  リらの文献には、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）存在下で、アカゲザルＥＳ細胞を培養することにより、ＢＭＰ−４非存在下の場合に比べ、造血前駆細胞の分化が１５倍に増加することが開示されている。さらに、前記ブリット  エム．ヨハンソンらの文献には、ＢＭＰ−４存在下で、マウスＥＳ細胞を培養することにより、ＢＭＰ−４非存在下の場合に比べ、造血前駆細胞の分化が増加することが開示されている。
しかしながら、一般的に、発生の初期に出現する細胞（神経細胞、心筋細胞、胎児造血細胞等）については、イン・ビトロでの分化に比べ、造血幹細胞、肝細胞、膵臓β細胞等の発生の後期に「場」誘導的に出現する細胞は、前記ＥＳ細胞からの分化が困難であるという欠点がある。
また、前記マイケル  カイバらの文献に記載の分化方法では、ＨｏｘＢ４遺伝子を導入したＥＳ細胞が用いられるため、得られた造血幹細胞の適用範囲が限定される場合があるという欠点がある。
さらに、前記仲野徹著の文献〔５．胚性幹細胞からの血液細胞への分化〕及び前記仲野徹らの文献〔Ｓｃｉｅｎｃｅ〕に記載の分化方法では、ＯＰ９ストロマ細胞が用いるのが特徴であるが、実際には、卵黄嚢造血（一次造血）が再現されるにとどまるものと考えられ、造血系を再構築しうる造血幹細胞の分化の誘導は困難であるという欠点がある。
【発明の開示】
本発明は、１つの側面では、霊長類の造血系細胞を安定に供給すること、霊長類動物の胚性幹細胞への外来遺伝子の導入等の遺伝子工学的操作を行なうことなく、該霊長類動物の胚性幹細胞を造血系細胞に分化させること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の胚性幹細胞からの造血系細胞への分化方法に関する。また、本発明は、他の側面では、霊長類の造血系細胞を安定に供給すること、霊長類の造血系細胞を大量に供給すること、霊長類動物の輸血用血小板を安定に供給すること、霊長類動物の移植用のＣＤ３４＋細胞を安定に供給すること等の少なくとも１つを可能にする、霊長類動物の造血系細胞の製造方法に関する。さらに、本発明は、別の側面では、前記製造方法により得られた造血系細胞に関する。また、本発明は、さらに別の側面では、霊長類の造血系細胞を安定に供給することができる、キメラヒツジの作製方法に関する。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕  霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を生育させ、出生に至った仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジから霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法、
〔２〕  （Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む、前記〔１〕記載の分化方法、
〔３〕  ステップ（Ｉ）において、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持する、前記〔２〕記載の分化方法、
〔４〕  （Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジより、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップを含む、霊長類動物の造血系細胞の製造方法、
〔５〕  前記〔４〕記載の製造方法により得られる造血系細胞、並びに
〔６〕  霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させることを特徴とする、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法、
に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を示す。パネル（Ａ）は、未分化胚性幹細胞を示し、スケールバーは、１００μｍを示す。パネル（Ｂ）は、ＯＰ９細胞上ＢＭＰ−４の存在下での培養時の細胞のシェーマを示す。パネル（Ｃ）は、胚性幹細胞を、造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を示し、スケールバーは、１００μｍを示す。
図２は、移植後に得られたヒツジ胎仔において、サルβ２−ミクログロブリンを検出した結果を示す図である。図中、パネル（Ａ）は、胎仔肝臓、パネル（Ｂ）は、骨髄の結果を示す。
図３は、ヒツジに対してヒトＳＣＦを投与した前後の末梢血又は骨髄におけるサルβ２−ミクログロブリンを検出した結果を示す図である。上段パネルは、ＰＣＲの結果、下段パネルは、サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。図中、Ｍは、分子量マーカー、レーン１〜３は、陰性対照（水）、レーン４は、ヒツジＤＮＡ単独、レーン５〜１０は、それぞれ、０．０００１％（細胞数）、０．００１％（細胞数）、０．０１％（細胞数）、０．１％（細胞数）、１％（細胞数）及び１０％（細胞数）  サルＤＮＡ、レーン１１は、サルＤＮＡ単独、レーン１２は、試料無し、レーン１３〜レーン１７は、それぞれ、ヒトＳＣＦ投与前、投与６日目、投与後１日、投与後３日及び投与後４０日の末梢血由来試料、レーン１８〜２２は、それぞれ、ヒトＳＣＦ投与前、投与６日目、投与後１日、投与後３日及び投与後４０日の骨髄由来試料を示す。サルには作用するがヒツジには作用しないヒトＳＣＦの投与によって，該ヒツジの末梢血および骨髄血中にサルの細胞が出現したことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導条件で処理し、得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植することにより、出生後のヒツジが、本質的にサル由来の造血系細胞を産生するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
本発明は、１つの側面では、霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法に関する。
なお、以下、本明細書においては、ヒツジを用いる場合について、説明するが、本発明においては、他の非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ、ウマ、サル等）でも同様に実施することができる。他の非ヒト哺乳動物を用いることによっても、少なくとも１％のキメラ率でキメラ非ヒト哺乳動物を製造することができ、造血系細胞を製造することができる。
本発明の霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、ついで、生まれたヒツジから霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする方法である。
本発明の霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞への分化方法は、より好ましくは、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を生育させ、出生に至った仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジから霊長類動物の造血系細胞を得ることを特徴とする方法である。
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件（以下、造血系分化誘導条件ともいう）で維持することに１つの大きな特徴がある。
本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持するため、未分化胚性幹細胞をそのまま移植した場合には、該未分化胚性幹細胞から造血系細胞への分化が実質的に起こらないにもかかわらず、本発明の分化方法によれば、驚くべく、該霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞に分化させることができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞が、前記造血系分化誘導条件に維持されるため、該霊長類動物の胚性幹細胞は、ヒツジ胎仔へ移植された際、該ヒツジ胎仔〔厳密には、出生後においては、出生した仔ヒツジ（以下、本明細書においては、「出生仔ヒツジ」とも表記する）〕の体内環境をより有効に利用して、分化することができるという優れた効果を発揮する。
さらに、本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を造血系細胞に分化させるために、該霊長類動物の胚性幹細胞に、分化を惹起する外来遺伝子（例えば、ホメオティックセレクター遺伝子）の導入等の遺伝子工学的操作を施すことが実質的に要求されない点で有利である。したがって、本発明の分化方法は、高度な技術や高価な機械、試薬等を必要とせず、移植用の細胞、組織の供給等に有用である。
また、本発明の分化方法は、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられることにも１つの大きな特徴がある。
本発明の分化方法は、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類動物の胚性幹細胞を前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、驚くべく、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞に分化させることができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の分化方法によれば、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類動物とのキメラ率が高くなるという優れた効果を得ることができる。したがって、本発明の分化方法によれば、より効率よく、ヒツジ体内で、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を得ることができるという優れた効果が発揮される。
さらに、本発明の分化方法によれば、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられているため、移植した細胞に対する免疫寛容が得られ、出生後に、該霊長類動物の胚性幹細胞を、さらに追加移植することができるという優れた特徴を有する。したがって、本発明の分化方法によれば、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植することにも１つの大きな特徴がある。
本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植するため、霊長類動物に由来する造血系細胞を、効率よく、安定して供給することができる。さらに、本発明の分化方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持して得られた細胞を、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔に移植するため、ヒツジに対しては作用しない霊長類のサイトカインにより、移植された霊長類動物の胚性幹細胞又は本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を選択的に刺激することができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明によれば、霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。さらに、本発明の分化方法においては、造血系分化誘導条件下に、６日〜８日間、好ましくは、６日間維持した細胞を用いることにより、驚くべく、高効率でキメラ動物を得ることができ、驚くべく高いキメラ率を達成することができるという優れた効果を発揮する。
本明細書において、「霊長類動物」とは、ヒト、サル等をいう。前記サルとしては、例えば、カニクイザル、アカゲザル、ニホンザル、マーモセット等が挙げられる。
本明細書において、「胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）」とは、多分化能と自己複製能とを有する未分化細胞をいう。
本発明の分化方法に用いられる霊長類動物の胚性幹細胞としては、具体的には、例えば、ＣＭＫ６細胞等が挙げられる。
かかる胚性幹細胞は、例えば、フィーダー細胞として、マウス胚線維芽細胞等の細胞であって、分裂増殖を停止させた細胞を用い、ＥＳ細胞用培地で培養することにより維持及び供給されうる。
前記ＥＳ細胞用培地としては、胚性幹細胞の種類により、該胚性幹細胞に適した培地であればよい。具体的には、例えば、カニクイザル由来胚性幹細胞株ＣＭＫ６の場合、２００ｍｌあたりの組成として、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １６３ｍｌと、ウシ胎仔血清  ３０ｍｌ（最終濃度１５％）と、Ｌ−グルタミン  ２ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）と、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  ２ｍｌと、非必須アミノ酸溶液  ２ｍｌと、２−メルカプトエタノール  １ｍｌ（最終濃度０．１ｍＭ）とを含む培地が挙げられる。
前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖は、胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在等の条件に培養することにより行なわれうる。
また、前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖のための培養条件としては、胚性幹細胞の種類により異なるが、例えば、５体積％  ＣＯ２の気相で、３６〜３８℃、好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
前記胚性幹細胞の未分化状態の維持及び増殖のために用いられる前記フィーダー細胞は、細胞の種類により異なるが、例えば、Ｄ１０培地（１０体積％  ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地）等で維持、増殖等を行なうことができる。
前記フィーダー細胞の培養条件は、細胞の種類により異なるが、例えば、５体積％  ＣＯ２の気相で、３６〜３８℃、好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
本明細書において、造血系細胞としては、例えば、造血幹細胞及び該造血幹細胞から分化してできる細胞群、すなわち、赤芽球、骨髄球、巨核球系、リンパ球等の性質を有する細胞が挙げられ、具体的には、赤芽球、骨髄球等が挙げられる。
本発明において、造血系細胞の分化誘導に適した条件、すなわち、造血系分化誘導条件とは、例えば、ＩＶ型コラーゲンの存在下に培養する条件、α−最小必須培地（α−ＭＥＭ）等の存在下に培養する条件、造血系分化に適したフィーダー細胞上で培養する条件、胚葉体作成後、ディッシュに接着させる条件等の種々の条件及びこれらのいずれかの組み合わせの条件等が挙げられる。
本発明において、「霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞」は、造血コロニー形成能及び造血系の表面マーカーの発現を評価した場合、いずれも陰性あるいは弱陽性となる分化段階の細胞である。かかる細胞は、いわゆる中胚葉細胞若しくは該中胚葉細胞の状態、性質等に近い細胞であってもよい。具体的には、カニクイザル由来胚性幹細胞株ＣＭＫ６を造血系細胞の分化誘導に適した条件で約６日間維持して得られた細胞等が挙げられる。
前記造血コロニー形成能は、例えば、後述のコロニーアッセイ等により評価されうる。
前記表面マーカーとしては、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇＭ、ＣＤ１９、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）、ＣＤ３１、ＨＬＡ−ＡＢＣ、β２−ミクログロブリン等が挙げられる。
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられるフィーダー細胞としては、マクロファージ刺激因子を欠損したストロマ細胞株が挙げられ、例えば、マクロファージ刺激因子を欠損したマウス骨髄細胞株、マクロファージ刺激因子を欠損したマウス卵黄嚢細胞株等をマイトマイシンＣ処理又はＸ線処理して得られた細胞等が挙げられる。前記マクロファージ刺激因子を欠損したストロマ細胞株としては、ＯＰ９細胞株、前記マウス骨髄細胞株としては、Ｓ１７細胞株〔コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８７年発行、第１３８巻、ｐ１０８２−１０８７〕、前記マウス卵黄嚢細胞株としては、Ｃ１６６細胞株〔ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．、１９９６年発行、第３２巻、ｐ２９２−２９９〕等が挙げられる。
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられる前記フィーダー細胞は、マクロファージ刺激因子を欠損したストロマ細胞株を、例えば、α−ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）等が入った、ゼラチンコートした培養容器に播種すること等により作製されうる。フィーダー細胞は、培養容器を隙間無く覆う程度まで播種すればよい。
前記フィーダー細胞の培養条件は、用いられる細胞の種類により異なるが、ストロマ細胞株ＯＰ９細胞の場合、例えば、５％  ＣＯ２の気相で、好ましくは、３６〜３８℃、特に好ましくは、３７℃で維持すること等が挙げられる。
造血系分化誘導条件に維持する際に用いられるフィーダー細胞は、具体的には、ＯＰ９細胞をフィーダー細胞として用いる場合、
−  ＯＰ９細胞用培地｛例えば、１２５０ｍｌあたりの組成：α−ＭＥＭ〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製、カタログ番号：１２０００−０２２〕  ９８０ｍｌ、ウシ胎仔血清  ２５０ｍｌ（最終濃度２０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  １０ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液  １０ｍｌ｝で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養し、
−  培養液内で接着してコンフルエント又はその直前まで生育した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、
−  洗浄後のディッシュ上の細胞をトリプシンにて処理し、
−  前記ＯＰ９細胞用培地を添加して、細胞を含む培地を回収し、
−  得られた細胞を、前記ＯＰ細胞用培地に、１：４〜１：５で継代し、
−  ３７℃、５％  ＣＯ２条件下に、コンフルエントになるまで培養し、
−  得られた細胞を、マイトマイシンＣで不活化させ、
−  得られた細胞（例えば、１×１０５細胞／ｍｌ）を、ゼラチンコートした培養ディッシュ上、前記ＯＰ９細胞用培地に播種し、培養すること
により得られうる。
本発明に用いられる妊娠ヒツジは、安全性、例えば、流産を予防する観点から、妊娠後４０日以上、好ましくは、５０日以上、より好ましくは、６０日以上であり、免疫拒絶を減少させ、移植細胞の生着率を十分に得る観点から、妊娠後８５日以下、好ましくは、７５日以下、より好ましくは、６０日以下であることが望ましい。したがって、子宮内の胎仔は、妊娠５０〜７０日であることが望ましい。
本発明の分化方法としては、より具体的には、
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、
を含む方法が挙げられる。
前記ステップ（Ｉ）において、霊長類動物の胚性幹細胞は、より分化させる観点から、密度が高くなるように播種することが望ましい。
前記ステップ（Ｉ）において、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞に応じた培地で培養されることが望ましい。
なお、培養中、培地は、適宜交換すればよい。
また、前記ステップ（Ｉ）において、フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞は、５％  ＣＯ２の気相で、好ましくは、３６〜３８℃、特に好ましくは、３７℃で維持することが望ましい。
具体的には、例えば、カニクイザル胚性幹細胞株ＣＭＫ６の場合、分化用培地〔１００ｍｌあたりの組成：ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）  ８４ｍｌ、８％  ウマ血清  ８ｍｌ、８％  ウシ胎仔血清  ８ｍｌ、５×１０−６Ｍ  ヒドロコルチゾン  ０．１８μｇ、ＢＭＰ−４  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６  １μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド２μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ  ２００Ｕ（２Ｕ／ｍｌ）〕  ５ｍｌに懸濁し、得られた細胞懸濁液を、フィーダー細胞上に  ５×１０５細胞に対し、適切量の細胞播種し、その後、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で６日間培養する条件が挙げられる。
なお、前記ステップ（Ｉ）を行なうことにより得られた細胞は、前記「霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞」に該当する。
なお、より高効率でキメラヒツジを得る観点、より高いキメラ率を得る観点等から、前記ステップ（Ｉ）においては、胚性幹細胞、例えば、カニクイザル胚性幹細胞株ＣＭＫ６等は、６日〜８日、好ましくは６日間、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持することが望ましい。また、これにより、胚性幹細胞から造血系細胞への分化を驚くべく高効率で、より迅速に行なうことが可能になる。
ステップ（Ｉ）において、より効率よく造血系細胞を得る観点から、好ましくは、前記造血系分化誘導条件に加え、骨形成タンパク質−４の存在下、フィーダー細胞上、白血病阻害因子非存在下に霊長類動物の胚性幹細胞を維持することが望ましい。
前記ステップ（Ｉ）を行なうことにより得られた細胞を、ついで、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させる〔ステップ（ＩＩ）〕。
移植に用いられる細胞は、トリプシンで処理し、例えば、０．１％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩水溶液）に、生着率、キメラ率等を向上させる観点から、例えば、１×１０６細胞以上、好ましくは、１×１０６細胞〜１×１０９細胞、好ましくは、１×１０７細胞〜１×１０９細胞となるように懸濁することにより調製されうる。
ステップ（ＩＩ）において、胎仔への細胞の移植は、例えば、肝臓内（または、より厳密には肝実質内）、腹腔内、心臓内、臍帯内等に移植用細胞を穿刺注入すること等により行なわれうる。
移植手術は、例えば、
−  妊娠約６０日目の妊娠ヒツジを、予め移植の１週間〜１０日前に、移植時における飼育環境に慣れさせ、
−  ヒツジ母体を麻酔し、
−  ヒツジを施術するに適切な体位に固定し、
−  清潔操作で、移植箇所への移植用細胞の移植を容易にするように、種々の手術、例えば、腹腔内又は肝実質内に細胞を移植する場合、下腹部正中切開で開腹後、子宮母体腹腔外に翻転させること
等により行なわれうる。
細胞を子宮内胎仔へ移植する方法には、例えば、ヒツジの子宮筋層を切開し、温存したまま露出させた卵膜内にヒツジ胎仔を追い込み、透明な卵膜を通して直視下に胎仔移植部位に移植用細胞を穿刺注入し、子宮筋層、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹すればよい。または、子宮を切開せずに，子宮壁上から超音波ガイド下、ヒツジ胎仔の移植部位に、移植用細胞を穿刺注入し、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹すればよい。
ステップ（ＩＩ）において、移植手術の施術後、妊娠ヒツジは、出生までの間、例えば、通常の飼育と同様の条件下、飼育される。
ステップ（ＩＩ）で得られたヒツジ胎仔、すなわち、厳密には、出生仔ヒツジが、本質的に霊長類に由来する造血系細胞を産生していることは、ヒツジ胎仔（すなわち、厳密には、出生後には、出生仔ヒツジ）より、適切な組織、例えば、肝臓、骨髄等の組織を採取し、初代培養用の細胞を得、得られた細胞について、（１）  造血コロニーアッセイを行なうこと、（２）  前記（１）で形成された造血コロニーについて、霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子の発現を調べることにより、評価されうる。
前記（１）の造血コロニーアッセイは、例えば、
ｉ）  ヒツジ胎仔（すなわち、厳密には、出生後には、出生仔ヒツジ）より、肝臓の組織生検、骨髄等の組織を得、
ｉｉ）  得られた組織について、トリプシン処理、ＤＮａｓｅＩ処理、溶解処理等の組織に応じた適切な処理を行ない、細胞を得、
ｉｉｉ）  得られた細胞を、２重量％  ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）−ＩＭＤＭに懸濁して、細胞浮遊液を得、
ｉｖ）  得られた細胞浮遊液と、メチルセルロース培地｛例えば、商品名：ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ＋〔ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、カタログ番号：ＳＴ−０４４３５〕等｝とを混合して、攪拌し、
ｖ）  ついで、得られた細胞を含む培地を、ディッシュに注入し、３７℃、５体積％  ＣＯ２の条件下で１４日間培養する
ことにより行なわれる。
また、前記（２）の霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子の発現は、造血コロニーアッセイで形成されたコロニーから、慣用の方法でＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡについて、例えば、霊長類動物に特異的なマーカー遺伝子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション、特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ等により、該遺伝子を検出することにより、評価されうる。または、造血コロニーを、霊長類動物に特異的な抗原に対する抗体で免疫染色することによって評価してもよい。
なお、本発明の分化方法においては、前記ステップ（ＩＩ）で得られたヒツジ胎仔、すなわち、より厳密には、出生仔ヒツジに、ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植してもよい。出生仔ヒツジに、ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植することにより、霊長類の造血系細胞を、効率よく、安定に供給することができる。
また、本発明の分化方法においては、前記ステップ（ＩＩ）で得られた出生仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカイン等を投与してもよい。前記サイトカインを仔ヒツジに投与することにより、当該出生仔ヒツジの体内において、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞の増殖を選択的に刺激することが可能になる。
前記サイトカインとしては、幹細胞因子（ＳＣＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、オンコステインＭ（ＯＳＭ）、ｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ケモカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン等及びこれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。
本発明の分化方法においては、造血系細胞の分化誘導に適した条件下に、６日〜８日間、好ましくは、６日間維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、生育させ、出生にいたった仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与することにより、驚くべく、高いキメラ率を達成するという優れた効果を発揮する。
本発明の分化方法により得られる霊長類動物の造血系細胞の評価は、例えば、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４（幹細胞マーカー）、ＣＤ１３（骨髄球マーカー）、ＣＤ１４（骨髄球マーカー）、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ（巨核球系マーカー）、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ４（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ８（Ｔ細胞マーカー）、ｓＩｇＭ（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）等の発現の有無を指標とすることにより行なわれうる。
本発明の分化方法は、霊長類動物の造血系細胞の製造に用いられうる。
本発明は、他の側面では、霊長類動物の造血系細胞の製造方法に関する。
本発明の霊長類動物の造血系細胞の製造方法は、
（Ｉ）マクロファージコロニー刺激因子を欠損したストロマ細胞株をフィーダー細胞とし、該フィーダー細胞上、霊長類動物の胚性幹細胞を維持するステップ、
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）で得られた霊長類動物由来の細胞を、妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、該胎仔を出生にいたるまで生育させるステップ、及び
（ＩＩＩ）前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔、すなわち、より厳密には、仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させて得られたヒツジより、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離するステップ
を含む方法である。
本発明の製造方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系分化誘導条件で維持することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法によれば、霊長類動物の胚性幹細胞を、前記造血系分化誘導条件に維持するため、未分化胚性幹細胞をそのまま移植した場合には、該未分化胚性幹細胞から造血系細胞への分化が実質的に起こらないにもかかわらず、驚くべく、該霊長類動物の胚性幹細胞から造血系細胞を製造することができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の分化方法においては、霊長類動物の胚性幹細胞が、ヒツジ胎仔へ移植された際、該胚性幹細胞に、該ヒツジ胎仔（すなわち、厳密には、出生後においては、出生仔ヒツジ）の体内環境をより有効に利用させることができるため、霊長類動物の造血系細胞を安定に供給することができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の製造方法は、妊娠ヒツジの子宮内のヒツジ胎仔が用いられることにも１つの大きな特徴がある。
本発明の製造方法は、前記ヒツジ胎仔が用いられているため、霊長類とのキメラ率が高くなり、それにより、霊長類動物の胚性幹細胞から、霊長類動物の造血系細胞を霊長類の造血系細胞を大量に供給することができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明の製造方法によれば、前記ステップ（Ｉ）において、胚性幹細胞、例えば、カニクイザル胚性幹細胞株ＣＭＫ６等を、６日〜８日、好ましくは６日間、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持することにより、胚性幹細胞から造血系細胞への分化を驚くべく高効率で、より迅速に行なうことが可能になる。
さらに、本発明の製造方法によれば、霊長類胚性幹細胞を、出生仔ヒツジに、追加的に移植することができ、また、ヒツジに対しては作用しない霊長類のサイトカインにより、移植された霊長類胚性幹細胞又は本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を選択的に刺激することができるため、本質的に霊長類動物に由来する造血系細胞を、より効率よく、安定して供給することができる。
また、本発明の製造方法によれば、輸血用血小板、移植用ＣＤ３４＋細胞を、安定して供給することができる。
本発明の製造方法における前記ステップ（Ｉ）及びステップ（ＩＩ）は、本発明の分化方法におけるステップ（Ｉ）及びステップ（ＩＩ）と同様である。
前記ステップ（ＩＩＩ）においては、前記ステップ（ＩＩ）で出生した胎仔、すなわち、仔ヒツジより、該霊長類動物の胚性幹細胞から分化した霊長類動物の造血系細胞を分離する。
ステップ（ＩＩＩ）においては、ヒツジ胎仔、すなわち、仔ヒツジは、キメラ率の観点から、出生後、１年以内の個体であることが望ましい。
また、前記ステップ（ＩＩＩ）においては、出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的な前記サイトカイン等を投与し、さらに該仔ヒツジを生育させることが好ましい。
さらに、前記分化方法の場合と同様に、霊長類の造血系細胞を、効率よく、安定に供給する観点から、前記ステップ（ＩＩ）で出生したヒツジ胎仔、すなわち、出生仔ヒツジに、ステップ（Ｉ）で得られた細胞をさらに移植してもよい。
ステップ（ＩＩＩ）において、霊長類動物の造血系細胞の分離は、例えば、
１）  上記のようにして得られたヒツジから、肝臓、骨髄、血液（末梢血、臍帯血）、胸腺、脾臓等を採取し、
２）  得られた器官から、適切な手法により、細胞群を得、
３）  得られた細胞群から、霊長類動物に由来する造血系細胞を分離すること
等により得られうる。
前記ステップ３）においては、例えば、霊長類動物に特異的なマーカー又は該マーカーに対する抗体等を用いたフローサイトメトリー、免疫ビーズを用いる方法等が行なわれる。
前記「霊長類動物に特異的なマーカー」としては、例えば、霊長類に交叉し、ヒツジに交叉しないマーカーであればよく、ＨＬＡ−ＡＢＣ、β２−ミクログロブリン、ＣＤ４５等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られる霊長類動物の造血系細胞の評価は、前記分化方法と同様に、例えば、ＣＤ４５、ＴＥＲ１１９、α４−インテグリン、ＶＥ−カドヘリン、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１、ＣＤ３４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ｓＩｇＭ、ＣＤ１９等の発現の有無を指標とすることにより行なわれうる。
また、本発明は、別の側面では、本発明の製造方法により得られた霊長類動物の造血系細胞に関する。
かかる造血系細胞は、特に限定されないが、例えば、血管新生療法用の移植材料等の用途が期待され、心筋梗塞等の虚血性疾患への応用が可能となる。
本発明の造血系細胞は、具体的には、前記したように、造血幹細胞及び該造血幹細胞から分化してできる細胞群、すなわち、赤芽球、骨髄球、巨核球系、リンパ球等の性質を有する細胞等であり、具体的には、赤芽球、骨髄球等である。
本発明の造血系細胞は、本質的に霊長類動物に由来する細胞であり、製造時に外来遺伝子が導入されていない細胞であるため、霊長類動物への移植等に好適である。
本発明の造血系細胞を、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の部位に移植することにより、治療効果を発揮させることができる。したがって、本発明は、別の側面では、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の部位に、本発明の造血経細胞を治療上有効量供給することを特徴とする、造血系の構築あるいは造血細胞の作用を必要とする疾患の治療方法に関する。さらに別の側面では、本発明は、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患の治療のための本発明の造血系細胞の使用に関する。
前記造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患としては、特に限定されないが、例えば、再生不良性貧血、白血病、免疫不全症、心筋梗塞等の虚血性心疾患、閉塞性動脈硬化症、バージャー病等が挙げられる。
前記「治療上有効量」とは、造血系の構築を行なう、あるいは造血細胞の効果を認めるに十分な量であればよく、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の程度；個体の体重、年齢、体力；造血系の構築の進行度等に応じ、適宜設定されうる。
本発明の造血系細胞は、例えば、穿刺注入等により、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の部位に供給してもよく、必要に応じて、外科的手術等を施してもよい。
前記治療効果は、適切な手段（例えば、ファイバースコープ、超音波、ＣＴ、ＭＲＩによる観察、血管造影法、血清中の疾患特異的マーカー測定等）により、前記疾患の症状の改善又は前記状態の改善が言い出されることを指標として評価されうる。
また、本発明は、別の側面では、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患の治療用の医薬の製造のための本発明の造血系細胞の使用に関する。
本発明の分化方法と同様の操作により、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジを作製することができる。したがって、本発明は、さらに別の側面では、霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法に関する。
本発明の霊長類動物の造血系細胞を生産するキメラヒツジの作製方法は、霊長類動物の胚性幹細胞を、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、出生した仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与し、さらに該仔ヒツジを生育させることを１つの大きな特徴とする。造血系細胞の分化誘導に適した条件下に、６日〜８日間、好ましくは、６日間維持し、得られた細胞を妊娠ヒツジの子宮内の胎仔に移植し、生育させ、出生に至った仔ヒツジに、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与することにより、驚くべく、高効率でキメラヒツジを得ることができるという優れた効果を発揮する。
本発明のキメラヒツジの作製方法によれば、霊長類の造血系細胞をより安定に供給することができるキメラヒツジを得ることができる。
本発明のキメラヒツジの作製方法により得られたキメラヒツジは、免疫学的に寛容な状態で、本質的に霊長類動物に由来する細胞を有しているため、該キメラヒツジには、造血系細胞の分化誘導に適した条件で維持し、得られた細胞をさらに移植することができる。また、本発明のキメラヒツジの作製方法により得られたキメラヒツジは、霊長類動物に特異的なサイトカインを投与することにより、体内において、本質的に霊長類に由来する造血系細胞への分化を選択的に刺激することができる。
以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例によりなんら限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は、特に明記がない場合は、重量％を示すものとする。また、ＣＯ２、Ｏ２及びＮ２における「％」表記は、体積％を示すものとする。
【実施例１】サル胚性幹細胞の培養
（１）フィーダー細胞の作製
継代５回までのマウス胚線維芽細胞ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１（日本クレア社供給）を、最終濃度  １０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含むＤ１０培地〔組成：１０％  ＦＣＳ、ＤＭＥＭ〕で２〜４時間培養することにより、細胞の分裂増殖を停止させて、不活化させた。ついで、マイトマイシンＣを含む培地を除去した。処理後の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ処理（０．０５％  トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）して、細胞浮遊液を得、ついで、細胞浮遊液を遠心分離して細胞を得た。
ついで、得られた細胞をＤ１０培地に懸濁し、ゼラチンコートした６ｃｍ培養ディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ〕に１×１０６個となるように播種した。ディッシュに接着するまで培養して得られた細胞を、フィーダー細胞として用いた。
（２）カニクイザル由来ＥＳ細胞株ＣＭＫ６の培養
前記実施例１（１）のフィーダー細胞の培養物より、Ｄ１０培地を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水で、該フィーダー細胞を洗浄した。
ついで、凍結保存されていたカニクイザル由来ＥＳ細胞ＣＭＫ６を、ＥＳ細胞用培地〔２００ｍｌあたりの組成：ＤＭＥＭ−Ｆ１２〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製〕  １６３ｍｌ、ウシ胎仔血清  ３０ｍｌ（最終濃度１５％）、Ｌ−グルタミン  ２ｍｌ（最終濃度２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  ２ｍｌ、非必須アミノ酸溶液〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製〕  ２ｍｌ、２−メルカプトエタノール  １ｍｌ（最終濃度０．１ｍＭ）〕  ５ｍｌに懸濁した。得られた細胞懸濁液を、前記フィーダー細胞上に、播種した。なお、培養は、３７℃、５％  ＣＯ２条件のインキュベーター内で行なった。また、ＥＳ細胞用培地は、２日に１回交換した。
７日間培養後、古い培地を吸引して、除去し、細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。ついで、ディッシュ上の細胞に、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩水溶液）  １ｍｌを添加し、該細胞を３７℃で３〜４分間培養した。その後、常温下でディッシュの底を軽く叩き、細胞のコロニーを剥離させた。
ついで、前記細胞のコロニーから、前記ＥＳ細胞用培地を用いて、５ｍｌピペットによるピペッティングで未分化な細胞のコロニーを回収した。回収された細胞を前記ＥＳ細胞用培地に懸濁し、得られた細胞懸濁液  ５ｍｌを、６ｃｍディッシュ上のフィーダー細胞に播種した。その後、コロニーの大きさに応じ、２〜４日毎に継代した。
得られた未分化ＥＳ細胞を、ヒツジ胎仔への移植に用いた。また、かかる未分化ＥＳ細胞を、以下の造血系分化誘導に用いた。
【実施例２】サル胚性幹細胞の造血系分化誘導
（１）フィーダー細胞の作製
マクロファージコロニー刺激因子の機能不全マウスである（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ）Ｆ２−ｏｐ／ｏｐマウスの新生仔頭蓋冠より作製されたストロマ細胞株で、前脂肪細胞株であるＯＰ９細胞を、ＯＰ９細胞用培地｛１２５０ｍｌあたりの組成：α−ＭＥＭ〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製、カタログ番号：１２０００−０２２〕  ９８０ｍｌ、ウシ胎仔血清  ２５０ｍｌ（最終濃度２０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）  １０ｍｌ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン溶液  １０ｍｌ｝で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。その後、培養液内で接着してコンフルエント又はその直前まで生育した細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄した。ついで、洗浄後のディッシュ上の細胞に、０．１％  トリプシン−ＥＤＴＡ（２ｍｌ／１０ｃｍディッシュ）を添加し、インキュベーターで５分間保温した。
前記ディッシュに、前記ＯＰ９細胞用培地を添加し、細胞を含む培地を５０ｍｌコニカルチューブに回収した。回収された細胞を含む培地を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞を、前記ＯＰ９細胞用培地に、１：４〜１：５（約２．５×１０５細胞〜４×１０５細胞で播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下に、コンフルエントになるまで培養した。
得られた細胞を、１０ｃｍディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製）上、最終濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含む前記ＯＰ９細胞用培地  １０ｍｌで２〜４時間培養することにより、細胞の分裂増殖を停止させて、不活化させた。ついで、マイトマイシンＣを含む培地を除去した。処理後の細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄した。洗浄後の細胞をトリプシン・ＥＤＴＡ処理（０．０５％  トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）して、細胞浮遊液を得、ついで、細胞浮遊液を遠心分離して細胞を得た。
得られた細胞を、ゼラチンコートした６ｃｍ培養ディッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ〕上、前記ＯＰ９細胞用培地  に、１：２（培地あたり約１×１０５細胞／ｍｌ）で播種した。以上のように準備した細胞を、以下の造血系分化誘導培養におけるフィーダー細胞として用いた。
（２）造血系分化誘導培養
前記実施例１で、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ  １ｍｌに回収されたカニクイザル由来ＥＳ細胞株ＣＭＫ６株を、分化用培地〔１００ｍｌあたりの組成：ＩＭＤＭ  ８４ｍｌ、８％  ウマ血清  ８ｍｌ、８％  ウシ胎仔血清  ８ｍｌ、５×１０−６Ｍ  ヒドロコルチゾン  ０．１８μｇ、ＢＭＰ−４  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６  １μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ  ２μｇ（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ．３リガンド  ２μｇ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＰＯ  ２００Ｕ（最終濃度２Ｕ／ｍｌ）〕  ５ｍｌに懸濁し、得られた細胞懸濁液を、前記実施例２（１）で得られた造血系分化誘導培養におけるフィーダー細胞上に１：３で播種した。
その後、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で６日間培養した。なお、培養中、培地を適宜交換した。得られた細胞を（図１）、造血系分化誘導処理細胞として、以下の移植等に用いた。
（３）移植細胞の準備
前記実施例２（２）で得られた造血系分化誘導処理細胞のディッシュから、培地を吸引除去し、ディッシュに、０．２５％  トリプシン／ＨＢＳＳ  １ｍｌを添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下、４分間培養した。
ついで、スクレーパー〔商品名：ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ−Ｍ、スミロン（ＳＵＭＩＬＯＮ）社製〕で、フィーダー細胞上の細胞を、フィーダー細胞ごと、前記分化用培地  ２０ｍｌの入った５０ｍｌ容コニカルチューブに回収し、８００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。
上清を吸引除去し、細胞を、前記分化用培地  ２０ｍｌの入った５０ｍｌ容コニカルチューブに懸濁し、細胞浮遊液を得た。
移植直前に、前記細胞浮遊液を、８００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を吸引除去し、ついで、得られた細胞に、０．１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳ  ２０ｍｌを添加し、懸濁して、８００ｒｐｍで４分間遠心分離することにより、洗浄した。
その後、上清を吸引除去し、細胞（１×１０７〜１×１０８個）を、０．１％ＢＳＡ／ＨＢＳＳ  ０．４ｍｌに懸濁した。得られた懸濁液を、１．５ｍｌ  アシストチューブに入れ、移植するまで氷上で保存した。
【実施例３】ヒツジ子宮内細胞移植
実験用ヒツジ取り扱い業者ジャパンラムから購入した妊娠ヒツジを使用した。妊娠約６０日目に移植を予定し、移植の１週間〜１０日前に、移植時における飼育環境に慣れさせた。また、腹部超音波検査による胎仔の確認を行なった。
ヒツジ母体を、ケタミン筋注（１５ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。ヒツジを、手術台上に仰向けに寝かせ、四肢を固定後、経口気管内挿管し、自発呼吸のもとＯ２／空気／ハロセンで全身麻酔下に手術を行なった。
手術は、清潔操作で行なった。下腹部正中切開で開腹後、子宮を腹腔内に翻転させた。
移植用細胞の注入場所は、胎仔のＩ）腹腔内及びＩＩ）肝実質内の二通りとした。
細胞移植法は、Ｉ）子宮切開法、ＩＩ）超音波ガイド法の二通りとした。子宮切開法の場合、ヒツジの子宮筋層を切開し、温存したまま露出させた卵膜内にヒツジ胎仔を追い込み、透明な卵膜を通して直視下に胎仔腹腔内に２３Ｇ針で、移植用細胞（１×１０６〜１×１０８細胞）を穿刺注入し、子宮筋層、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹した。また、超音波ガイド法の場合、子宮を切開せず、子宮壁上から超音波ガイド下、ヒツジ胎仔肝実質内に２５Ｇカテラン針で、移植用細胞（１×１０７〜１×１０８細胞）を穿刺注入し、腹膜筋層、皮膚を層々に縫合閉腹した。
手術終了後、抗生物質（マイシリン・ゾル）を筋肉内注射した。ついで、抜管し、ヒツジの麻酔覚醒を確認した。
子宮切開法および超音波ガイド法による妊娠継続率は、それぞれ４０％（４／１０）および８０％（８／１０）であり、超音波ガイド法で高い妊娠継続率が得られた。
【実施例４】ヒツジ胎仔からの試料採取
移植後１ヶ月目の胎仔について、母体全身麻酔下に帝王切開で取り出して解剖し、造血組織を含む全身組織を試料として採取した。
具体的には、左右の子宮に２頭〔移植胎仔（尾切）、対照胎仔〕ずつ、計４頭の胎仔を妊娠している母体より、以下のような手順で、組織の採取及び処理を同時に行なった。
ヒツジ母体に、経口挿管により、自発呼吸、Ｏ２／空気／ハロセンで麻酔導入を開始した。１５分後、母体を帝王切開し、片側子宮の胎仔２頭を取り出し、組織を採取し、処理した。なお、細胞を移植した胎仔（移植胎仔）の体重は、９５０ｇであり、対照胎仔の体重は、１０４０ｇであった。
ついで、臍帯が母体とつながった状態で、臍帯静脈血（臍帯血試料）と臍帯動脈血（末梢血試料）とを採血した。ここで、採血量は、移植胎仔の臍帯血試料について１０ｍｌ、移植胎仔の末梢血試料について２０ｍｌ、対照胎仔の臍帯血試料について２０ｍｌ、対照胎仔の末梢血試料について２０ｍｌとした。
臍帯を切離し、ついで、臍帯静脈に、６Ｇアトムチューブでカニューレ挿入した。臍帯動脈について、カニューレ挿入ができなかったため、切離断端を開放とした。
臍帯静脈側のカニューレに還流液（冷ラクテック５００ｍｌ）をつなぎ、点滴にて還流を開始した。臍帯動脈側を脱血路として血液の流出が無くなるまで（全１０００ｍｌ程度）還流を行なった。
移植胎仔及び対照胎仔それぞれについて、開腹し、部分肝、大腿骨を初代培養用試料として清潔操作で採取した。また、臓器を摘出した。摘出された臓器を、氷上のシャーレに分けて置いた。
採取した組織を以下に示す。
内胚葉系組織
１．肝（胆管、肝実質、肝動脈、門脈領域を含む）
２．膵頭部（膵管、膵実質）
３．胸腺
４．甲状腺
５．肺（気管支、肺胞）
６．小腸
７．大網（臓側腹膜）
外胚葉系組織
８．大脳
９．脊髄
１０．皮膚（付属器；毛、汗腺、脂腺）
１１．尾部切断創（皮膚）
中胚葉系組織
１２．脂肪（結合組織）
１３．軟骨（骨端軟骨）
１４．骨髄
１５．リンパ節
１６．骨格筋
１７．心筋
１８．大動脈
１９．脾臓
２０．腎臓
２１．生殖腺
なお、初代培養用に下記試料を採取した。
２２．末梢血（臍帯動脈血）
２３．臍帯血（臍帯静脈血）
２４．骨髄（還流後）
２５．肝（還流後）
採取した組織から５ｍｍ×５ｍｍ×３ｍｍの組織標本を、各３検体ずつ切り出した。そのうち２検体は、４％  緩衝パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／８％スクロースの入った１５ｍｌサンプル瓶へ入れ、一晩固定を行なった。かかる試料を、４％  ＰＦＡ固定試料とした。
なお、骨髄試料については、脱灰を行なった。
また、前記４％  ＰＦＡ固定試料の１検体を、順に、５０％  エタノール、６０％  エタノール、７０％  エタノール、８０％  エタノール、９０％  エタノールで１〜２時間維持し、１００％  エタノールで１〜２時間維持し、さらに、１００％  エタノールで１〜２時間維持し、さらに１００％  エタノールで１晩維持することにより脱水し、ベンゼンに浸漬（３０分間×２回）させ、ついで、パラフィンに浸漬（４５分間×２回）させることにより、４％  ＰＦＡ固定後パラフィン包埋切片試料を得た。
前記４％  ＰＦＡ固定試料のもう１検体は、クリオモルド１号（Ｔｉｓｓｕｅｔｅｋ，Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）に設置し包埋凍結させた。前記包埋凍結は、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅｔｅｋ）で包埋し、液体窒素で凍結させることにより行なった。かかる試料を、固定後凍結切片用の標本とした。
残部の１検体は、同じくクリオモルド１号に設置し包埋凍結させた。前記包埋凍結は、ＯＣＴコンパウンドで包埋し、液体窒素で凍結させることにより行なった。かかる試料を、新鮮凍結切片用の標本とした。
残った採取組織から小片をいくつか切り出し、クライオチューブ３本に１つずつ入れ、チューブごと液体窒素で凍結させた。これらの臓器の小片を、ＤＮＡ抽出用又はＲＮＡ抽出用の標本とした。
また、流産、死産若しくは出生後死亡した場合、胎仔を取り出し、末梢血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌ、骨髄〔ヘパリン生食（１０単位／ｍｌ）に採取〕適量、臍帯血（ヘパリン採血）  約２０ｍｌ、肝臓（ヘパリン生食中に採取）約１０ｇを採取した。体表、腹腔内、胸腔内及び脳を剖検し、テラトーマ等の腫瘍形成がないか確認したが、腫瘍形成は認められなかった。なお，出生例においても腫瘍形成は認められていない。
また、出生後に解析を行なった症例では、出生後からおよそ月に１回のペースで末梢血と骨髄を採取した。具体的には、出生後には、末梢血（ヘパリン採血）約２０ｍｌを、最初の数ヶ月間において、２週間毎に採取し、骨髄（ヘパリン生食中に採取）を１ヶ月毎に適量採取した。採取した試料を、無菌コニカルチューブに入れて、室温で振とう保管し、一日以内に有核細胞を分離し、凍結保存した。
肝臓、臍帯血、骨髄、末梢血等の造血系組織や細胞は、溶血法により白血球分画を分離し、ＤＮＡ抽出用又はＲＮＡ抽出用試料、初代培養用試料、ＦＡＣＳ解析用試料として−８０℃または液体窒素中で凍結保存した。
なお、初代培養用試料として、肝臓については、以下のように細胞の単離を行なった。試料を無菌操作下で採取し、該試料を適当に細切し、５０ｍｌ  コニカルチューブに回収し、１％  トリプシン／ＥＤＴＡ／リン酸緩衝化生理食塩水２０ｍｌを添加し、よく懸濁し、３７℃で１０分間振盪させながら培養した。得られた産物に、ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液〔１０ｍｇ  ＤＮａｓｅ  Ｉを１ｍｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解させた溶液〕  ２００μｌを添加し、さらに、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を１００μｌ添加し、３７℃で１０分間培養した。その後、産物を、７０ｍｍ径  ナイロンメッシュ〔ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）社製、商品名：ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）でろ過し、産物と同量のＤ１０培地を添加した。その後、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を吸引除去した。なお、赤血球が混入によりペレットが赤色である場合、該ペレットに、約１０倍量以上のＡＣＫ溶血培地を添加し、１５〜０分間氷上で維持し、ついで、１５００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離した。約４０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水で、ペレットを２回洗浄した。上清を吸引除去し、得られたペレットを、１０６〜１０７細胞／バイアルでセルバンカーに懸濁し、−８０℃又は液体窒素内で凍結保存した。
また、初代培養用試料として、臍帯血、末梢血及び骨髄については、以下のように細胞の単離を行なった。試料を、無菌操作でヘパリン採血と同様な方法で採取し、血液  ３５ｍｌを５０ｍｌ  コニカルチューブに入れ、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。血漿を吸引除去し、ペレットを、５０ｍｌ  コニカルチューブ５本に分注した。ついで、各コニカルチューブに、４０ｍｌ（ペレットの約１０倍量）のＡＣＫ溶血培地を添加し、混和させ、氷上で、１５分間培養した。１５００ｒｐｍで５分間、４℃での遠心分離後、上清を吸引除去した。なお、ペレットが赤色である場合、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を繰り返した。ついで、ペレットに、リン酸緩衝化生理食塩水  ４０ｍｌを添加し、懸濁し、５本のチューブを１本のチューブにまとめ、１５００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離することにより洗浄を行なった。かかる洗浄を、２回行なった。上清を吸引除去し、ペレットを５×１０６細胞／バイアル／ｍｌとなるようにセルバンカーで懸濁し、−８０℃または液体窒素中で凍結保存した。
【実施例５】各組織のサル／ヒツジキメラの解析
前記実施例４で得られた試料から商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔまたは商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、キットに添付の製造者のプロトコールに従い、ＤＮＡを抽出した。
サル由来の細胞を移植したヒツジ胎仔の解析のために、サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、外部プライマー対：
ＣＢ２ＭＧ−２Ｆ：５’−ＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’  （配列番号：１）と
ｈＢ２ＭＧ−５Ｒ：５’−ＧＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧ−３’  （配列番号：２）と
からなるプライマー対、及び
内部プライマー対：
ＣＢ２ＭＧ−２Ｆと
ｈＢ２ＭＧ−３Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡＧ−３’  （配列番号：３）
とからなるプライマー対
を用い、前記ＤＮＡを鋳型として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（外部プライマー対を用いたＰＣＲ後に，内部プライマー対を用いたＰＣＲを行なう二段構えのＰＣＲ法）を行なった。なお、ＰＣＲ条件は、反応液〔組成：Ｈ２Ｏ  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間の反応の後、９５℃で１分間と５８℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部プライマー対を用いた増幅時には、２５サイクル、内部プライマー対を用いた増幅時には、３０サイクルを行ない、７２℃で５分間反応させた後、４℃で維持する条件とした。
また、β−アクチンに対するプライマー対：
Ｃβ１：５’−ＣＡＴＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＣＧＡＣＧＧ−３’  （配列番号：４）と
Ｃβ２：５’−ＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＧＣ−３’  （配列番号：５）と
からなるプライマー対を用い、同様の反応液でＰＣＲ（９５℃で１分間と５４℃１分間と７２℃２分間とを１サイクルとして３０サイクル）を行なった。
なお、定量のために、表１に示す希釈系列の試料を作製し、用いた。
2005019441.tif 000002
ＰＣＲにより生成した産物を、２％  アガロースゲル（０．０１％エチジウムブロマイド含有）による電気泳動に供した。
なお、移植１ヶ月後のヒツジ胎仔の各組織においては、サル由来の細胞を検出できず、下記実施例６で述べる通り、サル胚性幹細胞に対して造血系分化誘導を行った細胞を移植したヒツジの造血前駆細胞においてのみ、サル由来の細胞が検出された。したがって、本法によれば、霊長類胚性幹細胞から造血系細胞への分化に特に適し、他の系統の細胞分化はおこらないと考えられ、造血分化への特異性がすぐれた方法であることが示唆される。
【実施例６】サル／ヒツジ造血キメラの解析
初代培養用に分離した細胞で造血コロニーアッセイを行なった。
凍結保存されていた細胞のクライオチューブを３７℃の恒温槽で溶解し、９ｍｌの２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭを入れた１５ｍｌ  コニカルチューブ中に懸濁し、得られた懸濁液の一部を用いて細胞数を計数した。ついで、懸濁液を、１３００ｒｐｍで４分間遠心分離し、得られたペレットを、２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭで１×１０６細胞／ｍｌとなるように懸濁し、細胞浮遊液を得た。さらに、２％  ＦＢＳ−ＩＭＤＭで１０倍希釈して、１×１０５細胞／ｍｌの細胞浮遊液を調製した。
１４ｍｌのポリスチレン丸底チューブに、メチルセルロース培地（商品名：Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ＋〔ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、カタログ番号：ＳＴ−０４４３５〕）を４ｍｌ入れ、細胞浮遊液を４００μｌ添加し、キャップを閉めてよく振って攪拌した。その後、泡が消えるまで約５分間静置した。
ついで、得られた細胞を含む培地  １．１ｍｌを、１８Ｇ針を付けた２．５ｍｌ  注射器で、３．５ｍｍ  ディッシュの中央に注入し、ディッシュの底に均一に広げた。
培養は、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で行った。コロニーの計数は、培養開始から、１４日目に行なった。
かかる方法では、サル由来の造血前駆細胞とヒツジ由来の造血前駆細胞が同等のコロニー形成能を有しているので，サル由来のコロニー数のコロニー総数に対する比が造血キメラ率を示すことになる。
サル由来のコロニーの同定のために、コロニーを形成している培地からコロニーを取り、各コロニーからＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを鋳型とし、サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対を用いて、ＰＣＲを行ない、サル由来のコロニーを確認した。
サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、外部プライマー対：前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ−５Ｒとからなるプライマー対、及び内部プライマー対：前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ−３Ｒとからなるプライマー対を用い、前記ＤＮＡを鋳型として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、反応液〔組成：Ｈ２Ｏ  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、商品名：Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間の反応の後、９４℃で３０秒間と５７℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部プライマー対を用いた増幅時及び内部プライマー対を用いた増幅時ともに、２５サイクルを行ない、７２℃で５分間反応させた後、４℃で維持する条件とした。得られた産物について、２％  アガロースゲルによる電気泳動により解析した。
その結果、造血系分化誘導サルＥＳ細胞を用いた場合、図２に示されるように、造血系分化誘導処理をしたＥＳ細胞を腹腔内に移植後１ヶ月の個体の胎仔肝臓で約３０％（ｎ＝１）であり、造血系分化誘導処理をしたＥＳ細胞を肝実質内に移植した出生後（移植後３〜６ヶ月）の個体の骨髄で約１％（ｎ＝３）の頻度でサル由来の造血コロニーが検出された。すなわち、ＥＳ細胞を、造血系分化誘導処理し、ヒツジ胎仔に導入することにより、生まれたヒツジは、サル由来の造血系細胞を産生する。一方、未分化のままのサル胚性幹細胞を移植したヒツジでは、移植１ヶ月後の肝臓にサル由来の造血コロニー形成細胞を検出できなかった（ｎ＝２）。したがって、実施例２で述べた胚性幹細胞の造血系分化誘導培養が、サル／ヒツジ造血キメラ作製のために必須であることがわかった。
【実施例７】造血キメラ率に対するサイトカインの効果の検討
組換え型ヒト幹細胞因子〔ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ  （ｒｈＳＣＦ）、１．５ｍｇ／ｍｌ、アムジェン社製ロット番号１５７０１Ｆ４〕  １０００μｇを希釈溶媒〔組成：ＨＢＳＳ中、１０％  ヒツジ自己血清及び０．１Ｕ  ヘパリンナトリウム〕  ５ｍｌで希釈し、得られた希釈物を、０．２２μｍフィルターで濾過し、出生後の骨髄コロニーＰＣＲでサル／ヒツジキメラを認めた個体（ｎ＝２）に対し、６０μｇ／ｋｇ／日となるように、２３Ｇ針付注射器を用いて、１日１回、１８日間腹腔内注射した。
投与対象のヒツジＮｏ：１４１は、生後８１日（移植後１５６日）であり、投与開始時点で体重約１４ｋｇであった。また、投与対象のヒツジＮｏ：１８２は、生後１２日（移植後９４日）であり、投与開始時点で体重約１０ｋｇであった。
投与６日目、最終投与から１日後及び最終投与から３日後のそれぞれにおいて、末梢血及び骨髄を採取した。
各細胞に、ＦＡＣＳ緩衝液〔組成：５％  ウシ胎仔血清、と０．０５％  ＮａＮ３とを含むリン酸緩衝化生理食塩水〕  ３ｍｌを添加して、懸濁し、得られた懸濁物を７０μｍ  メッシュを通した。得られた産物を１５００ｒｐｍ（４９０×ｇ）で、４分間遠心分離し、上清を吸引除去した。その後、得られたペレットに前記ＦＡＣＳ緩衝液  ４５０μｌ添加した。
９６ウェルプレートに、得られた溶液  １５０μｌずつを分注した。なお、前記溶液のうち１５０μｌに前記ＦＡＣＳ緩衝液  ３５０μｌを添加し得られた試料を抗体陰性対照として用いた。
ついで、９６ウェルプレートのウェル中の溶液を１８００ｒｐｍ（７１０×ｇ）で、２分間遠心分離し、上清を除去した。
その後、商品名：ＰＥ−Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４５（ベクトン  ディッキンソン社製、ＢＤカタログ番号：５５７０５９）  ２０μｌと前記ＦＡＣＳ緩衝液  ８０μｌとを、ウェルに添加した。なお、前記ＰＥ−Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４５の代わりに、アイソタイプ対照として、商品名ＰＥ−Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１κ（ベクトン  ディッキンソン社製、カタログ番号：３３８１５Ｘ）を用いた。得られた混合物を、３０分間氷上でインキュベーションした後、１８００ｒｐｍ（７１０×ｇ）で、２分間遠心分離し、上清を除去した。その後、得られたペレットを、前記ＦＡＣＳ緩衝液  １５０μｌで２回洗浄した。
得られたペレットを前記ＦＡＣＳ緩衝液  ３５０μｌで懸濁し、得られた試料をフローサイトメトリーに供した。
その結果、ＣＤ４５＋細胞は見出されなかった。
ついで、末梢血及び骨髄から実施例４の記載と同様に、溶血法により、白血球分画を分離した。得られた試料から、商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及び商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、キットに添付の製造者のプロトコールに従い、ＤＮＡを抽出した。ついで、前記ＤＮＡを鋳型とし、サルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対として、前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ−５Ｒとを外部プライマー対とし、前記ＣＢ２ＭＧ−２ＦとｈＢ２ＭＧ−３Ｒとを内部プライマー対として用いて、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行なった。なお、ＰＣＲ条件は、反応液〔組成：Ｈ２Ｏ  ３０．７５μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液  ５μｌ、ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）  ４μｌ、商品名：Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）  ０．２５μｌ、プライマー（各１０ｐＭ）  各２．５μｌ、試料由来ＤＮＡ（２５０ｎｇ相当量）  ５μｌ〕を用い、９５℃で５分間の反応の後、９５℃で１分間と５８℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとして、外部プライマー対を用いた増幅時には、２５サイクル、内部プライマー対を用いた増幅時には、２５サイクルを行ない、７２℃で５分間反応させた後、４℃で維持する条件とした。ＰＣＲにより生成した産物を、２％アガロースゲル（０．０１％  エチジウムブロマイド含有）による電気泳動に供し観察した。結果を図３の上段パネルに示す。ついで、ゲル上のＤＮＡをＰＶＤＦ膜（アマシャムファルマシア社製）に転写した。得られた膜に対して、配列番号：３に示される塩基配列又は配列番号：４に示される塩基配列を有するプライマーを用いたＰＣＲによって作製されたサルβ２ミクログロブリンのプローブとを用いて、サザンブロットハイブリダイゼーションを行なった。結果を図３の下段パネルに示す。
なお、対照として、下記ＤＮＡ：
ヒツジＤＮＡのみ（図３中、レーン４）、
０．０００１％  サルＤＮＡと９９．９９９９％  ヒツジＤＮＡとの混合物（図３中、レーン５）
０．００１％  サルＤＮＡと９９．９９９％  ヒツジＤＮＡとの混合物（図３中、レーン６）
０．０１％  サルＤＮＡと９９．９９％  ヒツジＤＮＡとの混合物（図３中、レーン７）
０．１％  サルＤＮＡと９９．９％  ヒツジＤＮＡとの混合物（図３中、レーン８）
１％  サルＤＮＡと９９．９％  ヒツジＤＮＡとの混合物（図３中、レーン９）
１０％  サルＤＮＡと９０％  ヒツジＤＮＡと混合物（図３中、レーン１０）及び
サルＤＮＡ単独（図３中、レーン１１）
のそれぞれ  ２５０ｎｇ相当量について、検体試料と同様の条件で同時にＰＣＲを行ない、その産物の電気泳動に用いた。
その結果、図３より、ＳＣＦ投与６日目の末梢血、投与後１日、３日、４０日の骨髄において、サル細胞が約０．０１％の割合で出現したことが示された。
さらに、末梢血及び骨髄のそれぞれから、前記実施例４と同様の手法により、初代培養用試料を調製した。得られた初代培養用試料を、メチルセルロース培地〔ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ＋（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）〕  １４日間培養した。
得られたコロニーを取り、各コロニーからＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、前記と同様のサルβ２−ミクログロブリンに対するプライマー対を用いて、ＰＣＲを行なった。結果を表２に示す。
2005019441.tif 000003
その結果、表２に示されるように、ヒト幹細胞因子投与前の場合と比べて、キメラ率が、少なくとも３〜４倍に上昇することがわかった。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：１は、プライマーＣＢ２ＭＧ−２Ｆの配列である。
配列番号：２は、プライマーｈＢ２ＭＧ−５Ｒの配列である。
配列番号：３は、プライマーｈＢ２ＭＧ−３Ｒの配列である。
配列番号：４は、プライマーＣβ１の配列である。
配列番号：５は、プライマーＣβ２の配列である。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の治療のために用いうる細胞を、大量に供給することが可能になり、造血系の構築若しくは造血細胞の作用を必要とする疾患又は状態の治療のための手段の開発が期待される。
【配列表】
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2005019441.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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