(57)【要約】本発明は、酢酸菌由来の温度耐性に関与する新規な遺伝子、該遺伝子を用いて微生物、特に酢酸菌の温度耐性を向上させる方法、及び温度耐性が向上した酢酸菌を用いて、より高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供する。本発明において、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、通常は増殖できない温度条件下でも生育を可能にさせる機能を有する遺伝子を取得する方法によって、グルコンアセトバクター属に属する実用酢酸菌から、温度耐性に関与する新規な遺伝子をクローニングした。また、該遺伝子を酢酸菌に導入してなる形質転換株においては、顕著に温度耐性が向上し、エタノール存在下で該形質転換株を通気撹拌培養した場合に、最終到達酢酸濃度を顕著に向上させることが可能となった。
2004053122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＣＳ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＣＳをコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（ａ）、又は（ｂ）に示すＤＮＡである上記２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列又はその一部を有するプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
上記２、又は３に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、温度耐性が増強された微生物。
【請求項５】
微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする上記４に記載の微生物。
【請求項６】
上記４、又は５に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して高い培養温度でも該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項７】
少なくとも上記２、又は３に記載のＤＮＡを含んだ組換えプラスミドｐＵＣＧＣＳ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１７）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、微生物に由来する温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）及びグルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】  工業的な食酢製造においては、微生物による酢酸発酵が利用されている。このような微生物はアルコール酸化能を有し、一般に酢酸菌と呼ばれる。酢酸菌の中でも特に、アセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌は、工業的な酢酸発酵に広く利用されている。
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換されるが、その結果、、そのまま酢酸が培地中に蓄積することになる。その際、多量の発酵熱が発生し、その結果、そのまま放置した場合は、発酵液の温度が上昇することになる。酢酸菌の発酵温度は通常３０℃前後が適温であるので、発酵液の温度を上昇させないよう、発酵液を冷却する必要があるが、その結果、冷却のためのエネルギーがかかることになる。そのため、酢酸発酵においては、より高い温度でも増殖能力や発酵能力が低下しないこと、すなわち温度耐性の強い酢酸菌を開発することが求められており、その一手段として、温度耐性を持った酢酸菌を自然界からスクリーニングすることによって温度耐性酢酸菌を検索する試みがなされていた（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、酢酸菌の温度耐性遺伝子に関する知見は殆ど無く、酢酸菌の温度耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な温度耐性遺伝子を取得し、また取得した温度耐性遺伝子を用いて、より強い温度耐性を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【特許文献１】  特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献２】  特願２００３−３５０２６５明細書
【非特許文献１】  「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４４巻、ｐ．２９０１−２９０６、１９８０年
【非特許文献２】  「トレンズ・イン・ジェネティックス（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、５巻、ｐ．１８５−１８９、１９８９年
【非特許文献３】  「アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、５５巻、ｐ．１７１−１７６、１９８９年
【非特許文献４】  「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、５２巻、ｐ．３１２５−３１２９、１９８８年
【非特許文献５】  「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、４９巻、ｐ．２０９１−２０９７、１９８５年
【非特許文献６】  「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、５８巻、ｐ．９７４−９７５、１９９４年
【非特許文献７】  「セルロース（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）」、ｐ．１５３−１５８、１９８９年
【非特許文献８】  「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」、１７５巻、６８５７−６８６６、１９９３年
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、従来より酢酸菌の温度耐性を遺伝子レベルで解明し、高い温度耐性を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。しかし、温度耐性にすぐれた酢酸菌が開発されれば、従来よりも高温度で酢酸発酵が行なわれ、冷却コストの軽減が可能になることから、本発明者は、再度、酢酸菌の温度耐性の向上を遺伝子レベルで解明することとした。
そして本発明者は、各方面から検討した結果、温度耐性を実用レベルで向上させうる機能を有するタンパク質をコードする新規な温度耐性遺伝子を取得し、また取得した温度耐性遺伝子を用いて、より強い温度耐性を有する酢酸菌を育種することが重要であるとの観点にたち、酢酸菌に属する微生物由来の温度耐性に関与する新規な温度耐性向上遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を用いて微生物の温度耐性を向上させる方法、特に酢酸菌に属する微生物の温度耐性を向上させる方法、さらに温度耐性が向上した酢酸菌を用いて、食酢を効率よく製造する方法を提供することを新規技術課題として新たに設定した。
【課題を解決するための手段】
本発明者は、高温度下においても増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な温度耐性に関与する遺伝子が存在するとの仮説を立てた。そして、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の温度耐性を向上させることができ、効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
前記従来技術における温度耐性遺伝子の取得方法は、温度非感受性の変異株をスクリーニングする方法が一般的であった。
しかし、本発明者は、この方法では産業上有用な温度耐性遺伝子を見出すことは困難であると考え、他の取得方法を検討した。その結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブラリーを酢酸菌に形質転換することにより、通常は寒天培地上において３７℃程度でしか生育できない株を、３８℃の温度下でも生育可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって取得する方法を開発した。
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、温度耐性を実用レベルで増強させる機能を有する新規な温度耐性遺伝子をコードするＤＮＡをクローニングすることにはじめて成功した。
得られた温度耐性遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋにおいてホモロジー検索をした結果、根粒菌などで見出されているセラミド−グルコシルトランスフェラーゼと称される一群のタンパク質と相同性を示しており、酢酸菌のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であると推定された。
しかし、取得された酢酸菌のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、根粒菌などの他の微生物で見出されている既知のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子とは相同性が極めて低かったことから、他のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子とはある程度似ているものの酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＧＣＳということもある）をコードする新規遺伝子であることを見出した。
さらに、エタノール存在下で該形質転換株を通気培養した場合に、温度耐性が顕著に向上すること、最終到達酢酸濃度が顕著に向上することなどを見出し、更に該タンパク質のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子のＤＮＡの塩基配列の決定にも成功し、本発明を完成するに至った。
【図面の簡単な説明】    図１
制限酵素ＳａｌＩとＫｐｎＩを用いてクローニングされたグルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＧ１）の制限酵素地図とＧＣＳ遺伝子の位置、及びｐＧＣＳ、ｐＧＣＳ１への挿入断片の概略図。
図２
ＧＣＳ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸発酵経過を示す図面。
図３
ＧＣＳ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の酢酸発酵経過を示す図面。
図４
ＧＣＳ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図５
プライマー１を示す。
図６
プライマー２を示す。
図７
本温度耐性遺伝子の塩基配列（配列番号１）を示す。
図８
ｐＧＩ１８の構築図。
図９
ＰＧＩ１８の塩基配列（配列番号５）を示す。
図１０
同上続きを示す。
図１１
同上続きを示す。
図１２
プライマーＡを示す。
図１３
プライマーＢを示す。
すなわち本発明は、下記の（１）〜（１０）を実施態様の例として提供するものである。
（１）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＧＣＳ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（２）下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする新規遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質。
（３）下記の（ａ）、又は（ｂ）に示すＤＮＡである上記（２）に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列又はその一部を有するプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡの細胞内のコピー数が増幅されたことにより、温度耐性が増強された微生物。
（５）微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする上記（４）に記載の微生物。
（６）上記（４）、又は（５）に記載の微生物のうち、アルコール酸化能を有するものを、アルコールを含有する培地で培養して高い培養温度でも該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（７）少なくとも上記（２）、又は（３）に記載のＤＮＡを含んだ組換えプラスミドｐＵＣＧＣＳ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２１７）。
（８）少なくとも配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片（ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片）、又はそのコーディング領域（塩基番号７３−１２５１）を含むＰＣＲ増幅断片を、（７）のように大腸菌ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅではなく、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８（例えば、特許文献２参照）にそれぞれ挿入してなる組換えプラスミドｐＧ１、又はｐＧＣＳ。
（９）組換えプラスミドｐＧ１、又はｐＧＣＳをアセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に導入してなる形質転換体。
（１０）組換えプラスミドｐＧ１、又はｐＧＣＳをアセトバクター・アルトアセチゲネス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ）ＭＨ−２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）に導入してなる形質転換体。
本発明によれば、微生物に対して、温度に対する耐性を付与し、増強することができる、そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、温度に対する耐性が顕著に向上し、高温下においても酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、温度耐性を向上させる機能を有する配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調整要素、及び該遺伝子の構造部分を含む。更に詳細には、本発明は温度耐性遺伝子に関するものであって、本温度耐性遺伝子は、温度耐性及び／又は温度耐性向上に関与する遺伝子を指し、更に具体的には、少なくとも（ｉ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡ、又は（ｉｉ）それに含まれ、ＧＣＳタンパク質をコードする遺伝子（ＧＣＳ遺伝子）の塩基配列、から選ばれる少なくともひとつを包含するものである。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法で調製することができる。例えば、本明細書において具体的な塩基配列で示されたＤＮＡは、酢酸菌のゲノムを出発原料として用いて、例えば、ショットガン・クローニング法によって調製することができる。その際、断片化された各染色体ＤＮＡは、その長さ等に応じて、プラスミドベクター又はファージ等の適当なクローニングベクターに連結し、これを用いてエレクトロポレーション法等の適当な方法によって酢酸菌等の適当な宿主細胞を形質転換し、該断片化各染色体ＤＮＡをクローニングする為の、クローンライブラリーを調製することができる。
更に、化学分解法（マキサム−ギルバート法）及びジデオキシ法等の公知の方法に従って、かかるクローンライブラリーから得られる断片化各染色体ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
或いは、本明細書に記載された本発明ＤＮＡの塩基配列又はアミノ酸配列の情報に基づき、当業者の周知の化学合成、又は本発明のプライマーを使用したＰＣＲ法により増幅して調製することもできる。
例えば、本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡを取得する。染色体ＤＮＡの取得は、例えば特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により行なうことができる。
次に、得られた染色体ＤＮＡから温度耐性を向上させる遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。すなわち、まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の染色体ＤＮＡ断片混合物を得る。制限酵素としては、幅広い種類の酵素が使用でき、使用する酵素に応じて切断反応時間などを調節し、切断の程度を調節する。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。なお、後記実施例ではＳａｌＩとＫｐｎＩを用いた。
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素ＳａｌＩとＫｐｎＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えば、ＳａｌＩとＫｐｎＩを、温度３７℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
切断開裂されたベクターＤＮＡを、染色体ＤＮＡ断片混合物と混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを作用させて、目的の組換えＤＮＡ（ＤＮＡライブラリー）を得ることができる。なお、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの作用条件としては、例えば、温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間とすることができる。
得られた組換えＤＮＡを用いて、通常は寒天培地上で３７℃でしか増殖することのできない酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  Ｎｏ．１０２３）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）を形質転換し、３８℃で培養する。生じたコロニーを液体培地に接種して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することで温度耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、塩基番号７３〜１２５１からなる塩基配列はコーディング領域である。
配列番号１に示す塩基配列及び配列番号２に示すアミノ酸配列（図４：塩基番号７３〜１２５１に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいて、ホモロジー検索をしたところ、アミノ酸配列レベルでメソリゾビウム・ロッティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子と４１％、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子とも３９％の相同性を有することが分かったが、いずれも４０％程度の低い相同性であり、これらのタンパク質をコードする遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。また、上記のセラミド−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、温度耐性と関係していることは全く知られていない。
また、本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌のゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
本発明の温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の温度耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたタンパク質をコードするものであっても良い。
このような温度耐性を増強する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加又は逆位されるように塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体間、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から上記のタンパク質をコードするＤＮＡを得ることが可能である。
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号７３〜１２５１からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、温度耐性を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６０℃で洗浄が行なわれる条件などが挙げられる。
温度耐性を増強する機能を有することの確認は、例えば、後述の実施例で説明するように、通常は寒天培地上で３７℃程度でしか増殖することができないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に目的のＤＮＡを形質転換し、３８℃で増殖可能かどうかを調べることにより行なうことができる。
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、温度耐性が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属である。
アセトバクター属細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  Ｎｏ．１０２３）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ３２８８）株、アセトバクター・アセチＩＦＯ３２８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ＩＦＯ３２８３）株が例示される。
また、グルコンアセトバクター属細菌としては、例えば、グルコンアセトバクター・ユウロパエウスＤＳＭ６１６０（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  ＤＳＭ６１６０）、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）が挙げられ、具体的には例えば、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１として寄託）が例示される。
温度耐性の増強は、例えば温度耐性遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率良く機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば酢酸菌のアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、非特許文献８参照）、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても、温度耐性を増強することができる。
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
マルチコピーベクターとしては、プラスミド、トランスポゾン等が挙げられる。プラスミドとしては、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献３参照）、ｐＧＩ１８（例えば、特許文献２参照）、ｐＵＦ１０６（例えば、非特許文献７参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献１参照）などが挙げられる。また、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献４参照）も用いることができる。トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシウム法（例えば、非特許文献５参照）、エレクトロポレーション法（例えば非特許文献６参照）等によって行なうことができる。
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその温度耐性を増強すると、酢酸の生産効率を増大させることができる。
（３）食酢製造方法
本発明の食酢の製造方法は、温度耐性遺伝子のコピー数が増幅されたことにより温度耐性が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の細菌でありアルコール酸化能を有する微生物を、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法である。
この方法は、従来の酢酸菌による発酵方法と同様に行なえば良い。アルコールを含有する培地とは、エタノール等のアルコールと、炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であり、いわゆる酢酸発酵の際に用いられる培地と同様の組成のものを使用することができる。必要に応じて、使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸等を用いることができる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の常法に従って、好気的条件下で行なうことができる。培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、通常は３０℃とすることができる。培地のｐＨは通常２．５〜７．０の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種の酸、塩基、緩衝液等によって適宜調整することができる。
このように、本発明においては、アルコールを含有する培地で培養して該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることができ、通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を生成蓄積せしめることができる。
（４）本発明の実施様態
本発明に係るＯＲＦ（配列番号１において、配列番号７３〜１２５１：ＧＣＳ遺伝子）又はそれを含有する温度耐性遺伝子（配列番号１）の一部を大腸菌ベクター（マルチコピーベクター）ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入してなる組換えプラスミドｐＵＣＧＣＳは、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ８２１７として寄託されているので、本発明に係る遺伝子のＤＮＡは容易に入手することができ、当業者であれば本発明の実施は容易である。そして、所望するのであれば、この組換えプラスミドを用いて、本発明に係るＯＲＦ又はそれを含有する温度耐性遺伝子を、酢酸菌で自律複製可能なベクターに乗せ換え、これを酢酸菌に導入し、該酢酸菌を培養することにより、高温度条件下においても酢酸発酵を行なうことができ、冷却コストを低減させることができる。
さらに、上記したようにそしてまた後記する実施例からも明らかなように、温度耐性増強遺伝子源の寄託、該遺伝子の塩基配列、それに対応するタンパク質のアミノ酸配列、ＰＣＲ様態、プラスミドベクター、組換えプラスミドの作製、宿主菌の寄託、その他が明らかにされており、いずれも入手ないし操作、処理が容易に行なえるので、実施例を参考にして各操作、処理を行なえば、目的とする温度耐性形質転換体を得ることができ、これを使用することにより、高温度条件下においても、酢酸を製造することができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの温度耐性遺伝子のクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０〜３３６時間振とう培養を行なった。培養終了後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、特開昭６０−９４８９号公報に開示された方法により、染色体ＤＮＡを調製した。
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡ及び大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を、制限酵素ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（ＴａｋａＲａ  ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２、タカラバイオ社製）を用いて連結してアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
（２）温度耐性遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４の染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は寒天培地上で生育温度３７℃程度までしか増殖できないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に形質転換した。その後、形質転換されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＹＰＧ寒天培地で、３８℃にて４日間培養した。
次に、生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。その結果、図１に示すように、約１．６ｋｂｐのＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片がクローン化されたプラスミドを回収できた。このプラスミドを、ｐＧ１と命名した。
このようにして、通常は寒天培地上で３７℃程度までしか増殖出来ないアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、３８℃でも増殖可能にする温度耐性増強遺伝子断片を取得した。
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
上記のクローン化されたＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を、ｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＫｐｎＩ切断部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法によって決定した。なお、塩基配列の決定は、ＤＮＡ２本鎖の両方の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
その結果、配列表の配列番号１記載の塩基配列が決定された。配列表の配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号７３〜１２５１にかけて、配列表の配列番号２記載のアミノ酸３９３個からなるアミノ酸配列をコードするオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）の存在が確認された。
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の温度耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での温度耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例１のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の温度耐性増強遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献３参照）を制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入してｐＧＣＳを作製した。ｐＧＣＳに挿入された増幅断片の概略を、図１に示した。この増幅断片は、ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片（温度耐性向上遺伝子：その塩基配列を配列番号１に示す）内に含まれ、塩基番号７３〜１２５１のコーディング領域（ＯＲＦ）の上流及び下流領域の一部を包含するものである。
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図５）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図６）に示す）を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ法のサイクルは、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分を１サイクルとして、３０サイクルとした。
このｐＧＣＳをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献６参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で、培養温度を３８℃で培養することにより選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、温度耐性遺伝子（ＧＣＳ遺伝子）を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（実施例３）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の温度耐性遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
（１）形質転換株の温度耐性
実施例２で得られたプラスミドｐＧＣＳを有するアンピシリン耐性の形質転換株について、培養温度を変化させたＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、２Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−２Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１ＬのＹＰＧ培地にて、４００ｒｐｍ、０．２ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の培地中の酢酸濃度と、各株の生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養温度は初めに３０℃で、次に３３℃で酢酸濃度約３％まで発酵させ、更に３６℃まで上げて酢酸濃度を３％まで発酵させ、その後、温度を２℃ずつ上げて酢酸発酵を実施した。酢酸濃度が３％に達した際は、約１００ｍｌの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った１００ｍｌに対して酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌになるように９００ｍｌのＹＰＧ培地を添加し、温度を上記のように変更の後、再び酢酸発酵を開始させた。
その結果、図２に示すように、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では３７℃までしか増殖せず、酢酸発酵が行なわれないのに対して、形質転換株では３８℃でも増殖して酢酸発酵が可能であり、更に４０℃においても増殖が認められる結果が得られ、ＧＣＳ遺伝子の温度耐性増強機能が確認できた。
（実施例４）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の温度耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での温度耐性の増強
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記実施例１のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）由来の温度耐性増強遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅した。酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８（例えば、特許文献２参照）を制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したｐＧＣＳ１を作製した。ｐＧＣＳ１に挿入された増幅断片の概略を、図１に示した。この増幅断片は、ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片（温度耐性向上遺伝子：その塩基配列を配列番号１に示す）内に含まれ、塩基番号７３〜１２５１のコーディング領域（ＯＲＦ）の上流及び下流領域の一部を包含するものである。
ＰＣＲ法は次のようにして実施した。すなわち、鋳型として上記酢酸菌由来のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号３（図５）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号４（図６）に示す）を用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。
（ＰＣＲ条件）
ＰＣＲ法のサイクルは、９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分を１サイクルとして、３０サイクルとした。
このｐＧＣＳ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献６参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で、培養温度を３８℃で培養することにより選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株は、定法によりプラスミドを抽出して解析し、ＧＣＳ遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
なお、酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８は、図８に示した手順にて作製した。
すなわち、このベクターｐＧＩ１８は、プラスミドｐＧＩ１とｐＵＣ１８とから作製した。先ず、プラスミドｐＧＩ１を作製した。
即ち、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）を、６％酢酸と４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン含有）中で、３０℃にて２４０時間から３３６時間振とう培養した。得られた菌体について水酸化ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムを用いて溶菌後、フェノール処理し、更にエタノールによりプラスミドＤＮＡを精製した。
得られたプラスミドＤＮＡを、各種制限酵素（タカラバイオ社製）で切断し（３７℃、酵素濃度１ユニット／ｍｌ）、得られたＤＮＡ断片の塩基対長をアガロースゲル電気泳動により求めた。
得られたプラスミドＤＮＡはＨｉｎｃＩＩで３カ所、また、ＳｆｉＩで１カ所の認識部位を有する環状二本鎖ＤＮＡプラスミドであり、プラスミド全体の長さは約３１００塩基対（ｂｐ）であった。また、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を有していなかった。得られたプラスミドＤＮＡをプラスミドｐＧＩ１と命名し、ベクターｐＧＩ１８の作製に用いた（図８）。
上記で得られたプラスミドｐＧＩ１を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法によって増幅し、ＡａｔＩＩで切断した。
ＰＣＲ法は、次のようにして実施した。すなわち、実施例１で調製したプラスミドｐＧＩ１を鋳型として、プライマーとしてＡａｔＩＩ認識部位を有するプライマーＡ及びプライマーＢを用い、下記する条件にて、ＰＣＲ法を実施した。プライマーＡ及びプライマーＢの塩基配列は、それぞれ配列表の配列番号６（図１２）及び配列番号７（図１３）に示す通りである。
ＰＣＲの条件は、９４℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３分を１サイクルとして、３０サイクルとした。
一方、アンピシリン（Ａｍｐ）耐性遺伝子を担うｐＵＣ１８（タカラバイオ社製：２６８６ｂｐ）をＡａｔＩＩで切断し（３７℃、酵素濃度１ユニット／ｍｌ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、上記で得られたプラスミドｐＧＩ１に連結反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた。連結後の反応液を、常法に従い、大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／リットル）プレート上で選択してＡｍｐ耐性の形質転換株を得た。得られた形質転換株よりプラスミドを調製し、その制限酵素切断パターンを解析した。図８に、得られたプラスミドの制限酵素地図を示す。図８中、「ＡａｔＩＩ」及び「ＳｆｉＩ」は、制限酵素認識部位を示す。また、ＭＣＳは、マルチクローニングサイトを、Ａｍｐｒは、アンピシリン耐性遺伝子部位を、括弧内の数字は、ｂｐ単位で示した塩基番号をを示す。更に、中央の「ｐＵＣ１８」「ｐＧＩ１」及び「ｐＧＩ１８」は、プラスミド名を、「２．７ｋｂｐ」、「３．１ｋｂｐ」及び「５．８ｋｂｐ」は、プラスミドの総塩基数を示す。
図８から明らかなように、得られたプラスミドはｐＵＣ１８およびｐＧＩ１のいずれをも含有して、全体の長さは約５８００塩基対（５．８ｋｂｐ）であった。このプラスミドを酢酸菌用ベクターｐＧＩ１８と命名した。
このベクターｐＧＩ１８の塩基配列を配列番号５（図９、図１０、図１１）に示す。
（２）形質転換株の温度耐性
上記のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、培養温度を変化させたＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
具体的には、２Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−２Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１ＬのＹＰＧ培地にて、４００ｒｐｍ、０．２ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、形質転換株と元株の培地中の酢酸濃度と、各株の生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。培養温度は初めに３０℃で、次に３３℃で酢酸濃度約３％まで発酵させ、更に３６℃まで上げて酢酸濃度を３％まで発酵させ、その後、温度を２℃ずつ上げて酢酸発酵を実施した。酢酸濃度が３％に達した際は、約１００ｍｌの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った１００ｍｌに対して酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌになるように９００ｍｌのＹＰＧ培地を添加し、温度を上記のように変更の後、再び酢酸発酵を開始させた。
その結果、図３に示すように、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株では３７℃までしか増殖せず、酢酸発酵が行なわれないのに対して、形質転換株では３８℃でも増殖して酢酸発酵が可能であり、更に４０℃においても増殖が認められる結果が得られ、ＧＣＳ遺伝子の温度耐性増強機能が確認できた。
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の温度耐性遺伝子で形質転換した形質転換株での酢酸発酵試験
（１）アセトバクター・アルトアセトゲネスへの形質転換
（実施例４）のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ１をグルコンアセトバクター・エンタニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｅｎｔａｎｉｉ）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｔｏａｃｅｔｉｇｅｎｅｓ  ＭＨ−２４）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９１）にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献６参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４％の酢酸と４％のエタノールを添加した０．５５％の寒天を含んだＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、温度耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（２）酢酸発酵試験
（１）で得られたプラスミドｐＧＣＳ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５Ｌの原料培地（酢酸７％、エタノール３％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）にて、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行なった。菌体の明らかな増殖が認められ、残留エタノール濃度が２％になった段階で、エタノール含有液（酢酸１％、エタノール５０％、酵母エキス０．２％、グルコース０．２％）を流加し、発酵液のエタノール濃度が２％になるように制御した。この酢酸発酵をさせる方法で、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表１にまとめた。
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表１の結果から、形質転換株の方が、最終到達酸度において顕著にすぐれていることが確認できた。
（３）アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムへの形質転換
（実施例４）のようにして得られたプラスミドｐＧＣＳ１をアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ）の１株であるアセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｉｎｕｍ  ＩＦＯ３２８８）株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献６参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、温度耐性増強遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
（４）酢酸発酵試験
（３）で得られたプラスミドｐＧＣＳ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・ザイリナムＩＦＯ３２８８株と酢酸発酵能を比較した。
具体的には、米糖化液を１７．９％、発酵諸味を３．２％、醸造用アルコールを７．８％、水を７１．１％の割合で混合して作成した原料培地（アルコール濃度７．８％、酢酸濃度０．２６％）を用いて、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）において、３０℃、５００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度７．２％での連続発酵を行なった。酢酸濃度７．２％の連続発酵での原料培地の添加速度を比較し、その結果を表２に示した。また、形質転換株の原料培地添加速度を元株の酢酸濃度７．２％での連続発酵時の原料培地添加速度に合わせた場合の酢酸発酵能を比較し、その結果を表３に示した。
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表２、及び表３の結果から、形質転換株の方が、連続酢酸発酵においても、生産性（原料培地添加速度）と生産酢酸濃度においても顕著にすぐれていることが確認できた。
【発明の効果】
本発明により、温度耐性に関与する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いてより高温条件下での食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高温条件下での食酢を高効率で製造する方法が提供することができた。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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