(57)【要約】本発明は、ＤＮＡマイクロアレイを利用して変異又は多型の解析を行う場合に試料となる核酸分子が、配列に関してヘテロ中（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ／ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）である場合であっても、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットからのシグナルがプローブと標的核酸との間の完全にマッチしたものなのか、又は不完全にマッチしたものなのかを同定する手段を提供することを課題とする。本発明は、完全マッチプローブの候補と、完全にマッチする核酸のみからなる試料を用いて得られたシグナル値を、生データより差し引くことにより非特異的ハイブリダイゼーションに起因するシグナル分の補正を行い、その補正シグナル値が一定値以上である場合に、完全マッチに由来するシグナルと同定することを特徴とする。
2005001125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも１塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも１の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（１）；
各スポットにおいて形成されたハイブリッドからのシグナルを測定するステップ（２）；
所定のシグナル値（閾値Ａ）以下の低強度シグナルを発するハイブリッド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（３）；
別の所定のシグナル値（閾値Ｂ）以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第１完全マッチプローブ候補と判定するステップ（４）；及び
前記の不完全マッチプローブ候補と第１完全マッチプローブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプローブと判定し、更に前記第１完全マッチプローブを第１完全マッチプローブと判定するステップ（５）；
を含む、変異又は多型の判定方法。
【請求項２】
前記のステップ（３）において不完全マッチプローブ候補を判定できない場合、及び／又は前記のステップ（４）において完全マッチプローブ候補を判定できない場合に、前記ステップ（１）及び／又は（２）において接触及び／又は測定する条件を当初の条件から変更してから再度、前記ステップ（１）乃至（５）からなる方法を実施することを含む、請求項１に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項３】
前記ステップ（５）の後に、
前記第１完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値Ｃ）以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブ候補と同定するステップ（６）；
前記第２完全マッチプローブ候補を含むハイブリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（ａ）、及び（ｂ）を行うステップ（７）：
前記第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（ａ）；及び
前記ステップ（ａ）で求めたシグナル値を、前記ステップ（１）で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイブリッドに由来するシグナルについての第１補正シグナル値を求めるステップ（ｂ）；
前記補正ステップ（ｂ）における第１補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第２完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（ｂ）における当該第１補正シグナル値が、閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブではないと同定するステップ（８）
を更に含む、請求項１又は２に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項４】
前記ステップ（４）において閾値Ｂ以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（５）において第１完全マッチプローブが判定されている場合に、
前記ステップ（８）の後で、当該複数個のプローブであって、当該第１完全マッチプローブ以外のプローブ（第２完全マッチプローブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（ａ）及び（ｂ）を行うステップ（９）
（但し、このステップにおいては、
当該複数個ある第２完全マッチプローブ候補の中で第ｎ−１番目（ｎは２以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイブリッド中に含まれるプローブに対しては、
当該第ｎ−１番目に大きいシグナルを発するハイブリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第ｎ補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第ｎ補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定し；
当該測定されたシグナル値を、第１補正用核酸から第ｎ−１補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第ｎ補正シグナル値を求め；そして
当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第ｎ完全マッチプローブと判定し、又は当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを完全マッチプローブではないと同定する
（但し、第ｎ完全マッチプローブの判定前に、閾値Ｃ未満の強度の第ｍ補正シグナル値（ｍは、１以上、ｎ未満の整数）を有するハイブリッドがｘ個（ｘは０以上の整数）ある場合には、上記第ｎ完全マッチプローブを、第（ｎ−ｘ）完全マッチプローブと判定する））
を更に含む、請求項３に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項５】
前記の補正ステップ（ｂ）の後、且つ前記ステップ（８）の前に、
予め求めておいた、前記のプローブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（ｃ）
を更に含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項６】
前記プローブセット中の全プローブが、標的核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの配列に対するものである、請求項１乃至５の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項７】
前記プローブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなる、請求項１乃至５の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項８】
センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプローブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出た場合に、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプローブとは同定しないことを特徴とする、請求項７に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項９】
センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないことを特徴とする、請求項１乃至８の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１０】
前記の閾値Ａが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値Ｂが、シグナルの絶対値であることを特徴とする、請求項１乃至９の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１１】
前記の閾値Ａ及びＣが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値Ｂが、シグナルの絶対値であることを特徴とする、請求項３乃至９の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１２】
前記の閾値Ａ、Ｂ、及びＣを、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて異なる値とすることを特徴とする請求項３乃至１１の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１３】
前記の閾値Ａが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して１５％以下の大きさであることを特徴とする請求項１０乃至１２の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１４】
前記の閾値Ａが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して１０％以下の大きさであることを特徴とする請求項１０乃至１３の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１５】
前記の閾値Ｃが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して２０％以上の大きさであることを特徴とする請求項１０乃至１４の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１６】
前記のプローブセットが、２以上のプローブサブセットの集合からなり、各プローブサブセットが、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮したオーバーラッピングプローブからなることを特徴とする請求項１乃至１５の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【請求項１７】
ＳＮＰのタイピングのための、請求項１乃至１５の何れか一項に記載の多型の判定方法。
【請求項１８】
前記のＳＮＰのタイピングが、完全マッチプローブと判定する判定順位を上位から二つまでとすることを特徴とする請求項１７に記載のＳＮＰタイピングのための多型の判定方法。
【請求項１９】
前記の標的核酸が、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２である事を特徴とする、請求項１乃至１８の何れか一項に記載の変異又は多型の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、マイクロアレイによる変異解析における変異及び多型の判定方法に関する。
【背景技術】  遺伝子の突然変異情報の解析、疾病の予知や診断、ウイルスのタイピング等を行う遺伝子診断に関する技術が近年大幅に進歩している。例えば、正常な遺伝子配列又は既知の突然変異を有する遺伝子配列のそれぞれに相補的なＤＮＡプローブを予め用意しておき、ここに、試料ＤＮＡを各種プローブにそれぞれ別個にハイブリダイズさせ、これらのハイブリッド量を検出・比較することにより、試料ＤＮＡ中の変異の有無を判断する方法が、遺伝子診断法として行われている。
ハイブリッドの検出には、例えば試料ＤＮＡに検出可能な標識を施し、その標識を検出することで間接的にＤＮＡ量を検出する方法がとられている。一般にこのような標識には、蛍光や放射性同位体、化学発光等が用いられている。
また、このようなＤＮＡの持つ相補性を利用したハイブリダイズ反応をベースとし、数百個乃至数万個のＤＮＡプローブを格子状に２次元的に配列させ、試料溶液中のＤＮＡをこのアレイ上でハイブリダイズさせることで、複数の遺伝子の情報を一括して検出するＤＮＡマイクロアレイと呼ばれるシステムが普及し始めている。
ＤＮＡマイクロアレイにおいては複数の遺伝子の状態を同時に解析することが可能であり、通常は遺伝子の発現解析等に利用されることが多いが、遺伝子の突然変異やＳＮＰ（一塩基変異多型）の定性的な解析にも利用されはじめている。
例えば、米国特許第５，２０２，２３１号明細書には、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＢＨ）法と呼ばれる、ＤＮＡマイクロアレイを利用した塩基配列決定法が記載されている。
ＳＢＨ法においては、ある長さについて可能なオリゴヌクレオチドの塩基配列をアレイ上に固相化して並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される、完全に相補的なハイブリッドを検出することによって配列を決定するものである。
また、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６）、２７４巻、ｐｐ．６１０−６１４は、プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションは、完全にマッチする場合と、１塩基のミスマッチを含む場合とではハイブリダイズ強度が異なることを示し、更にシグナル強度の差異が生じることを利用した配列判定方法を開示している。
一般に、ＳＢＨに限らず、オリゴヌクレオチドと検体ＤＮＡとの間の相補性を調べる場合には、１種類のプローブによってハイブリッドの有無を検査することは困難である。なぜならば、ハイブリッドの安定性はその配列によって影響を受けるために、完全に相補的であると判断できる、絶対的なシグナル値が存在しないからである。そのため、上記文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ）に記載の方法では、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の中心部分に、標的配列と１塩基ミスマッチを生じる塩基を配置した配列を用意し、これを用いて完全マッチと１塩基ミスマッチに由来するシグナルの強度を比較して、完全マッチの有無が判定されている。
ＤＮＡマイクロアレイを利用して変異解析を行う場合に試料となる核酸分子は、配列に関してヘテロである場合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓな場合、及びｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓな場合）がある。例えば、哺乳類の細胞には、父系の配列と母系の配列とが存在しているから２種類の配列種が存在する場合がある。また、癌細胞の場合のように配列の多様性がある場合には、更に多くの種類の配列が混在することが考えられる。従ってこのようなヘテロな核酸分子を含む試料の変異解析を行う場合には、単純に完全マッチと不完全マッチとを区別するだけでは、変異に関する十分な知見が得られることにはならない。また、複数種類の完全マッチが、異なる量比で混在する場合には、比較的シグナル強度の弱いものが、完全マッチのものなのか、それとも不完全マッチのものなのかを判定することは、シグナル値からは直接的には判断できないと考えられる。
【発明の開示】
本発明は斯かる問題点に鑑みてなされたものであり、解析しようとする試料中に、プローブと標的配列との完全マッチが複数種類存在するような場合であっても、完全マッチのハイブリッドを確実に同定することを可能にする手段を提供するものである。
即ち本発明の、核酸の変異及び多型の判定方法は、以下のような構成をとる。
（ｉ）本発明の変異又は多型の判定方法は、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも１塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも１の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（１）；
各スポットにおいて形成されたハイブリッドからのシグナルを測定するステップ（２）；
所定のシグナル値（閾値Ａ）以下の低強度シグナルを発するハイブリッド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（３）；
別の所定のシグナル値（閾値Ｂ）以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第１完全マッチプローブ候補と判定するステップ（４）；及び
前記の不完全マッチプローブ候補と第１完全マッチプローブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプローブと判定し、更に前記第１完全マッチプローブを第１完全マッチプローブと判定するステップ（５）；
を含むことを特徴とする。
（ｉｉ）上記（ｉ）の変異又は多型の判定方法においては、前記のステップ（３）において不完全マッチプローブ候補を判定できない場合、及び／又は前記のステップ（４）において完全マッチプローブ候補を判定できない場合に、前記ステップ（１）及び／又は（２）において接触及び／又は測定する条件を当初の条件から変更してから再度、前記ステップ（１）乃至（５）からなる方法を実施することを含むことができる。
（ｉｉｉ）上記（ｉ）又は（ｉｉ）の変異又は多型の判定方法にておいては、前記ステップ（５）の後に、
前記第１完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値Ｃ）以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブ候補と同定するステップ（６）；
前記第２完全マッチプローブ候補を含むハイブリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（ａ）、及び（ｂ）を行うステップ（７）：
前記第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（ａ）；及び
前記ステップ（ａ）で求めたシグナル値を、前記ステップ（１）で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイブリッドに由来するシグナルについての第１補正シグナル値を求めるステップ（ｂ）；
前記補正ステップ（ｂ）における第１補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第２完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（ｂ）における当該第１補正シグナル値が、閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブではないと同定するステップ（８）
を更に含めることができる。
（ｉｖ）上記の（ｉｉｉ）の変異又は多型の判定方法においては、前記ステップ（４）において閾値Ｂ以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（５）において第１完全マッチプローブが判定されている場合に、
前記ステップ（８）の後で、当該複数個のプローブであって、当該第１完全マッチプローブ以外のプローブ（第２完全マッチプローブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（ａ）及び（ｂ）を行うステップ（９）
（但し、このステップにおいては、
当該複数個ある第２完全マッチプローブ候補の中で第ｎ−１番目（ｎは２以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイブリッド中に含まれるプローブに対しては、
当該第ｎ−１番目に大きいシグナルを発するハイブリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第ｎ補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第ｎ補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定し；
当該測定されたシグナル値を、第１補正用核酸から第ｎ−１補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第ｎ補正シグナル値を求め；そして
当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第ｎ完全マッチプローブと判定し、又は当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを完全マッチプローブではないと同定する
（但し、第ｎ完全マッチプローブの判定前に、閾値Ｃ未満の強度の第ｍ補正シグナル値（ｍは、１以上、ｎ未満の整数）を有するハイブリッドがｘ個（ｘは０以上の整数）ある場合には、上記第ｎ完全マッチプローブを、第（ｎ−ｘ）完全マッチプローブと判定する））
を更に含めることができる。
（ｖ）前記（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の変異又は多型の判定方法においては、前記の補正ステップ（ｂ）の後、且つ前記ステップ（８）の前に、
予め求めておいた、前記のプローブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（ｃ）を更に含めることができる。
（ｖｉ）  上記の（ｉ）乃至（ｖ）の何れの変異又は多型の判定方法においても、前記プローブセット中の全プローブが、標的核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの配列に対するものとすることができる。
（ｖｉｉ）  また上記の（ｉ）乃至（ｖ）の何れの変異又は多型の判定方法においても、前記プローブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなるものとすることができる。
（ｖｉｉｉ）  上記（ｖｉｉ）の変異又は多型の判定方法においては、センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプローブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出た場合に、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプローブとは同定しないこととしてもよい。
（ｉｘ）  上記（ｉ）乃至（ｖｉｉ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないこととしてもよい。
（ｘ）  上記（ｉ）乃至（ｉｘ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値Ａが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値Ｂが、シグナルの絶対値とすることができる。
（ｘｉ）  上記（ｉｉｉ）乃至（ｉｘ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値Ａ及びＣが、シグナルの絶対値若しくは相対値、又は両方であり、前記の閾値Ｂが、シグナルの絶対値とすることができる。
（ｘｉｉ）  上記（ｉｉｉ）乃至（ｘｉ）の何れかの変異又は多型判定方法においては、前記の閾値Ａ、Ｂ、及びＣを、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれについて異なる値とすることができる。
（ｘｉｉｉ）  上記（ｘ）乃至（ｘｉｉ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値Ａが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して１５％以下の大きさとすることができる。
（ｘｉｖ）  上記（ｘ）乃至（ｘｉｉｉ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値Ａが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して１０％以下の大きさとすることができる。
（ｘｖ）  上記（ｘ）乃至（ｘｉｖ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の閾値Ｃが相対値であり、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して２０％以上の大きさとすることができる。
（ｘｖｉ）  上記（ｉ）乃至（ｘｖ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記のプローブセットは、以上のプローブサブセットの集合からなり、各プローブサブセットは、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮したオーバーラッピングプローブからなることができる。
（ｘｖｉｉ）  上記（ｉ）乃至（ｘｖ）の何れかの変異又は多型の判定方法は、ＳＮＰのタイピングのためとすることができる。
（ｘｖｉｉｉ）  上記（ｘｖｉｉ）のＳＮＰのタイピングは、完全マッチプローブと判定する判定順位を上位から二つまでとすることができる。
（ｘｉｘ）  上記（ｉ）乃至（ｘｖｉｉｉ）の何れかの変異又は多型の判定方法においては、前記の標的核酸を、Ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２とすることができる。
【図面の簡単な説明】  図１  この図は、本発明の変異判定方法を実施するために使用したＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの配置を示す図である
図２  この図は、プローブセット（アンチセンス鎖側）が固相化されているＤＮＡマイクロアレイに標的核酸（Ｋ−ｒａｓ遺伝子第１２コドンをＰＣＲで増幅したもの）を接触させ、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットにおいて形成されたハイブリッドに由来するシグナルを測定したものを示すものである。
図３  この図は、図２におけるシグナル値を相対値で表したものである。
図４  この図は、第１補正用核酸とプローブセット（アンチセンス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。
図５  この図は、第１補正シグナルを相対値で表したものである（アンチセンス鎖側）。
図６  この図は、第１補正シグナルを、第２完全マッチプローブ候補のシグナル値に対する相対値で表したものである（アンチセンス鎖側）。
図７  この図は、第２補正用核酸と、プローブセット（アンチセンス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。
図８  この図は、第２補正シグナル値を相対値で表したものである。
図９  この図は、プローブセット（センス鎖側）が固相化されているＤＮＡマイクロアレイに標的核酸（Ｋ−ｒａｓ遺伝子第１２コドンをＰＣＲで増幅したもの）を接触させ、ＤＮＡマイクロアレイ上の各スポットにおいて形成されたハイブリッドに由来するシグナルを測定したものを示すものである。
図１０  この図は、図９におけるシグナル値を相対値で表したものである。
図１１  この図は、第１補正用核酸とプローブセット（センス鎖側）を接触させた場合のシグナル測定値を相対値で表したものである。
図１２  この図は、第１補正シグナルを相対値で表したものである（センス鎖側）。
図１３  この図は、第１補正シグナルを、第２完全マッチプローブ候補のシグナル値に対する相対値で表したものである（センス鎖側）。
図１４  この図は、本発明の変異又は多型判定方法における手順をフローチャートにしたものである。
【発明を実施するための最良の形態】      （定義）
本願明細書においては、以下の用語を以下に定義した意味において用いる。
「核酸」とは、ＤＮＡ、人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＲＮＡ、ＰＮＡ、人工ヌクレオチドを含むＰＮＡの何れをも意味する。
「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。
「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出・測定可能な信号であって、蛍光、放射能、化学発光等が含まれる。
以下においては、本発明の実施態様についての、構成、実施方法、効果等について、適宜、図を参照しながら説明する。
本発明の変異及び多型の判定方法は、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも１塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも１の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させ、当該プローブセット中の各プローブと試料核酸とのハイブリッドからのシグナルを検出し、そのシグナル強度を比較することにより標的核酸中の配列を決定する方法において用いられるものである。本発明の変異及び多型の判定方法においては、標的核酸に対して完全にマッチする完全マッチプローブと、標的核酸に対して少なくとも１塩基のミスマッチを生じる塩基を含み、それ以外の塩基は当該完全マッチプローブと同一である少なくとも１の不完全マッチプローブとからなるプローブセットを固相担体に固相化したものに、標識済試料核酸を接触させるステップ（１）；各スポットにおいて形成されたハイブリッドからのシグナルを測定するステップ（２）；所定のシグナル値（閾値Ａ）以下の低強度シグナルを発するハイブリッド中のプローブを不完全マッチプローブ候補と判定するステップ（３）；別の所定のシグナル値（閾値Ｂ）以上のシグナルの中で最高強度のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第１完全マッチプローブ候補と判定するステップ（４）；及び前記の不完全マッチプローブ候補と第１完全マッチプローブ候補とがともに存在する場合に、前記不完全マッチプローブ候補を不完全マッチプローブと判定し、更に前記第１完全マッチプローブを第１完全マッチプローブと判定するステップ（５）を行う。これら一連のステップを行うのは、すでに述べたように、完全マッチのハイブリッドが形成された場合に発する絶対的なシグナル値というものがないため、完全マッチと考えられる場合と、不完全マッチと考えられる場合との相対的関係によりハイブリッドの形成条件の妥当性の判断を行う必要性があるためである。
ステップ（３）における閾値Ａは、絶対値である場合には、測定条件下において非特異的なシグナル強度と考えられる値とすることができる。この値は、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであるが、経験的に定めることができるものであり、その値は当業者らには自明である。また、閾値Ａを相対値で表す場合には、最高強度のシグナルに対して１５％以下、好ましくは１０％以下の大きさとする。最高強度に対してこのレベルのシグナル値を有するものであれば、不完全マッチハイブリッドに由来するものである確率が高い。一方、ステップ（４）における閾値Ｂは、測定条件下において非特異的なシグナル強度と比較して有意に大きい値であり、閾値Ａと同様に、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであって、経験的に定めることができるものである。その値は当業者らには自明である。標的核酸が配列に関して均質である場合には通常、一つの最大ピークが測定されるのに対し、標的核酸に複数の配列種が混在する場合には、比較的強度の強いシグナルが複数測定される。
ステップ（３）において不完全マッチハイブリッドに由来すると考えられるものがあること、及びステップ（４）において非特異的なシグナル強度とは有意に異なる大きさのピークが少なくとも１つあることが判定できれば、これらの相対的関係から、ハイブリダイゼーションが適切な条件で行われたと推定することができ、よって、ステップ（５）において不完全マッチプローブと完全マッチプローブとを同定することが可能となる。一つの最大ピークが測定された場合には、そのピークを、そして複数測定された場合には、その中で最高強度を発するハイブリッド中のプローブを、第１完全マッチプローブと同定することができる。ここで、前記のステップ（３）において不完全マッチプローブ候補を判定できない場合、及び／又は前記のステップ（４）において完全マッチプローブ候補を判定できない場合には、前記ステップ（１）及び／又は（２）において接触及び／又は測定する条件が不適切であったと考えられるから、この条件を当初の条件から変更し、再度前記ステップ（１）乃至（５）からなる方法を実施して、完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブの判定を行う。判定ができれば、変更後の条件が適切であったといえる。
本発明の変異及び多型の判定方法は、上述の変異又は多型の判定方法において、更に、
前記ステップ（５）の後に、
前記第１完全マッチプローブ以外のプローブであって、所定の値（閾値Ｃ）以上のシグナル強度の中で最大のシグナルを発するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブ候補と同定するステップ（６）；
前記第２完全マッチプローブ候補を含むハイブリッド中のシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（ａ）、及び（ｂ）を行うステップ（７）：
前記第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（ａ）；及び
前記ステップ（ａ）で求めたシグナル値を、前記ステップ（１）で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイブリッドに由来するシグナルについての第１補正シグナル値を求めるステップ（ｂ）；
前記補正ステップ（ｂ）における第１補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第２完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（ｂ）における当該第１補正シグナル値が、閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブではないと同定するステップ（８）
を更に含むことができる。
閾値Ｃは、絶対値とすることも、最高強度のシグナル値に対する相対値とすることも可能であるが、最高強度のシグナルに対する相対値を用いた方が、下記のシグナル補正ステップにおいて、シグナルの補正を行いやすくなり、また閾値の設定がより煩雑でなくなる。ここで変換する相対値としては、最高強度を１００としたときの相対値を百分率で表すものであることが好ましい。
ステップ（６）においては、前記第１完全マッチプローブを含むハイブリッド以外のハイブリッド中のプローブであって、所定の値（閾値Ｃ）以上のシグナル強度を有するシグナルを発するハイブリッドを完全マッチプローブ候補と同定することが行われる。ここで、閾値Ｃは、閾値Ａ及びＢと同様に、使用する標的核酸の種類、調製方法、及び使用するプローブの配列等の諸条件によって変動させるべきものであって、経験的に定めることができるものであり、その値は当業者らには自明である。具体的な値としては、閾値Ｃは相対値で表すと、第１完全マッチプローブを含むハイブリッドに由来するシグナル強度に対して２０％以上の大きさとすることができる。
ステップ（７）においては、前記第２完全マッチプローブ候補を含むハイブリッドからのシグナルについて、下記のシグナル補正ステップ（ａ）、及び（ｂ）が行われる。
ここで補正ステップは、
前記第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定するステップ（ａ）を行い；そして
前記ステップ（ａ）で求めたシグナル値を、前記ステップ（１）で測定したシグナル値から差し引いて、各ハイブリッドに由来するシグナルについての第１補正シグナル値を求めるステップ（ｂ）を行うものである。
上記の補正ステップ（ａ）において、第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸とのハイブリダイゼーションを行わせるのは、標的核酸中に複数の完全マッチが含まれる可能性がある場合に、測定シグナルに比較的シグナル強度が強いものの、それが不完全マッチによるものなのか、それとも標的核酸試料中に少量の割合で含まれるその他の完全マッチによるものなのかが不明のことがあるが、それを明確にするためである。第１完全マッチプローブと完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸とのハイブリダイゼーションの場合であっても、当該完全マッチプローブは、補正用核酸と非特異的なハイブリダイゼーションを行うことにより、ある一定のシグナルを発生することがある。そのため、この非特異的ハイブリダイゼーションに由来するシグナル値を補正ステップ（ａ）において求めておき、次のステップ（ｂ）において、すでに求めたシグナル値から差し引いて、各ハイブリッドに由来するシグナルについての補正シグナル値を求める。このようなステップを経ることにより得られた補正シグナル値は、各プローブが非特異的にハイブリダイズすることにより生じたハイブリッドが発するシグナル分を差し引いたものとなり、特異的なハイブリダイゼーションのみに起因したシグナル値となる。
補正ステップを行った後、前記補正ステップ（ｂ）における第１補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第２完全マッチプローブと同定し、又は前記補正ステップ（ｂ）における補正シグナル値が、閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第１補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを第２完全マッチプローブではないと同定するステップ（８）を行う。第１完全マッチプローブの場合には、それが最強のシグナルを発するハイブリッドに含まれていて、且つ、少なくとも１の不完全マッチが存在することにより相対的に同定することが可能であった。しかし、これらの中間レベルのシグナル強度の場合、即ち、第１完全マッチプローブを含むハイブリッド由来のシグナルよりも弱いが、非特異的シグナル値よりも大きいと考えられるシグナルの場合には、それが標的核酸中に少ない割合で含まれる完全マッチによるものなのか、それともあくまで通常よりも少し高いレベルの非特異的シグナルであるのかを識別する必要が生じる。そしてこの識別は、非特異的ハイブリダイゼーションが比較的高頻度で生じている条件下で測定を行っている場合には、非常に重要である。本発明においては、標的核酸と各完全マッチプローブとの間において生じる非特異的ハイブリダイゼーションに起因するシグナルを差し引いた補正値を用いているから、この補正値が閾値Ｃ以上の相対強度である場合には、そのシグナルを発するハイブリッドには、非特異的なハイブリダイゼーションにも由来せず、またバックグラウンドでもない、完全マッチプローブが含まれると判定することが可能になる。
本発明は上記したとおり、第１完全マッチのみを同定する基本的な方法、測定条件などが適切でなかった場合に、条件の変更を行って再度測定しなおす方法、そして第１完全マッチ以外に、第２完全マッチも同定する方法に関するものとなっている。本発明は更に、「第２完全マッチ、第３完全マッチ、・・・」のように、第１完全マッチ以降の完全マッチ（第１完全マッチよりも低存在率で存在する完全マッチ）が複数個存在する場合にも、これらの全てを順次同定していく方法を提供することができる。
この態様において本発明は、前記ステップ（４）において閾値Ｂ以上のシグナル値を発するスポットが複数個あり、前記ステップ（５）において第１完全マッチプローブが判定されている場合、即ち、第１完全マッチ以降の完全マッチが複数ある場合において適用されるものである。すでに第１完全マッチが同定されていて（即ち、接触の条件が適切であったことが証明されていて）、次に第２完全マッチ以降を同定する場合に適用されるものである。
この態様においては次に、前記ステップ（８）の後で、当該複数個のプローブであって、当該第１完全マッチプローブ以外のプローブ（第２完全マッチプローブ候補）について、そのシグナル強度が大きいものから順に、上記補正ステップ（ａ）及び（ｂ）を行うステップ（９）を行う。このステップ（９）において、第２完全マッチプローブ以降のプローブ（第２完全マッチプローブ候補）については、そのシグナル強度の強いものから順に、適切な補正用核酸との接触を行い、補正シグナルを求め、第２完全マッチ、第３完全マッチ、・・・と同定していくことになる。より具体的には、第２完全マッチプローブの同定には、第２補正用核酸を用いて第２補正シグナル値を求め、第３完全マッチプローブの同定には、第３補正用核酸を用いて第３補正シグナル値を求めていくことを意味する。
しかしながらこの態様においては、第２完全マッチプローブ候補であったものが、非特的結合等によるノイズが特別に大きかったために、第２完全マッチプローブとはならず、当初、シグナルの大きさから言って第３完全マッチプローブとなるはずであったものが、結果的に第２完全マッチプローブと同定されるような場合があるために、完全マッチプローブの名称についての修正が必要となることがある。例えば上記の場合には、当初の第３完全マッチの「３」の部分の数字を適宜調節して、第２完全マッチとする必要がある。これには次の操作を行う。
まず、当該複数個ある第２完全マッチプローブ候補の中で第ｎ−１番目（ｎは２以上、プローブの種類以下の整数）に大きいシグナル値を有するハイブリッドに含まれるプローブに対しては、当該第ｎ−１番目に大きいシグナルを発するハイブリッド中のプローブと完全マッチする配列のみからなる第ｎ補正用核酸を、前記ステップ（１）乃至（６）とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対して接触させて、当該プローブセットが当該第ｎ補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定する。ここでは、複数個ある第２完全マッチプローブ候補をシグナルの強い順に、第１完全マッチプローブの場合の補正方法と本質的に同様の方法により、完全マッチであるかどうかを判定している。また、「ｎは２以上、プローブの種類以下の整数」とあるのは、第２完全マッチプローブで１番目にシグナルの強いものは、２−１＝１であり、第１番目に大きいシグナルとするためである。そして、補正用核酸については、すでに第１補正用核酸が使われているので、それとは区別するために第ｎ（ｎは２以上）補正用核酸とするために、ｎは２以上としている。ｎの上限値については、第２完全マッチプローブ候補の数は最大でプローブの種類と等しい数までであるが、ここで「プローブの種類」とは、一つの変異や多型部分を判定するためのセンス鎖プローブのセット中に含まれるプローブの種類の数、又はアンチセンス鎖プローブのセット中に含まれるプローブの種類の数を示すものである。
次に、当該測定されたシグナル値を、第１補正用核酸から第ｎ−１補正用核酸までをそれぞれ利用して補正を累積的に行ったシグナル値から差し引いて、第ｎ補正シグナル値を求める。ここでは補正用核酸で測定したシグナルを使って補正シグナル値を求めている。例えば、第３完全マッチを同定しようとする場合（即ちｎ＝３の場合）を例にあげると、第３完全マッチプローブの同定に至るまでに、すでに、第１及び第２完全マッチプローブの同定を行っていて、それぞれの同定の工程においては、第１及び第２補正用核酸を利用した補正工程にかけられており、シグナル値がその分だけ累積的に補正されているはずであることを考慮していることになる。
次に、当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ以上のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを、第ｎ完全マッチプローブと判定し、又は当該第ｎ補正シグナル値が、前記の閾値Ｃ未満のシグナル強度である場合に、当該第ｎ補正シグナル値を有するハイブリッド中のプローブを完全マッチプローブではないと同定する。ここでは、閾値と補正シグナル値との比較により、完全マッチプローブ候補が、完全マッチプローブと同定できるのか、そうでないのかを判定している。この工程を経ることにより、最終的に第ｎ完全マッチプローブ候補が、第ｎ完全マッチプローブと認定されることになり、完全マッチプローブ候補となっていたものの一つでも完全マッチプローブではないと同定された場合には、「第ｎ」のｎを適宜補正する必要が生じる。その補正のためには、第ｎ完全マッチプローブの判定前に、閾値Ｃ未満の強度の第ｍ補正シグナル値（ｍは、１以上、ｎ未満の整数）を有するスポットがｘ個（ｘは０以上の整数）あった場合には、上記第ｎ完全マッチプローブを、第（ｎ−ｘ）完全マッチプローブと判定する。これは、例えば第３完全マッチプローブの判定前に行った、第２完全マッチプローブの同定工程において（ｎ＝３の場合）、結果的に第２完全マッチプローブ候補が、完全マッチではないと同定されていた場合には、ｘ＝１であり（即ち閾値Ｃ未満の強度の第２補正シグナル値を有するスポットが１個あった場合）、従ってここで判定しようとしている第３完全マッチプローブとは、最終的には第２完全マッチプローブとして判定すべきであることを意味する（３−１＝２なので）。また、第４完全マッチプローブの判定前に、第２、第３完全マッチプローブの候補が共に完全マッチではないと同定されていた場合には、ｘ＝２であり、ここで判定しようとしている第４完全マッチプローブとは、最終的には第２完全マッチプローブとして判定すべきであることを意味する（４−２＝２なので）。
本発明の変異及び多型の判定方法においては更に、前記の補正ステップ（ｂ）の後、且つ前記ステップ（８）の前に、予め求めておいた、前記のプローブセット中の各プローブの固相化量を相対値に変換し、この相対値に基づいて前記補正シグナル値を、当該固相化量に比例する固定化量補正シグナル値とするステップ（ｃ）を更に含めることができる。これは、各プローブの固相担体（例えばＤＮＡマイクロアレイなど）への固相化量の違いが大きい場合に、その差異を補正して、より正確な変異判定を行うことを可能にする。
ここで、担体に固相化されたプローブの量を測定するには、プローブに予め導入しておいた蛍光色素等から発せられるシグナルを定量することにより行うことができる。
本発明の変異及び多型の判定方法においては、前記プローブセット中の全プローブが、標的核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れかの配列に対するものとしてもよいし、又は、前記プローブセット中のプローブが、標的核酸のセンス鎖に対するもの、及びアンチセンス鎖に対するものからなるものとしてもよい。プローブ等の調製コストの点においては、センス鎖又はアンチセンス鎖の何れかを用いる方に利点があるが、センス鎖及びアンチセンス鎖の双方を使用する方が、変異及び多型の判定の確実性にとって好ましいと考えられる。この場合、センス鎖、及びアンチセンス鎖のそれぞれの第一完全マッチプローブが存在し、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれにおいて異なる結果が出たときは、その異なる結果を出したプローブを、センス鎖及びアンチセンス鎖における結果の相違に関わらず、完全マッチプローブとは同定しないことが可能である。更に、センス鎖、又はアンチセンス鎖に第一完全マッチプローブが存在しない場合には、第一完全マッチプローブが存在しない鎖の結果を判定に使用しないことも可能である。このように確実性の高い結果のみを利用して測定結果の信頼性を高めることができる。
より具体的には、前記のプローブセットが、２以上のプローブサブセットの集合からなり、各プローブサブセットが、当該完全マッチプローブ及び当該不完全マッチプローブの両端において塩基配列を伸張するか、又は短縮しだオーバーラッピングプローブからなるものを利用すると、より正確な変異又は多型の判定が可能となる。
本発明の変異又は多型の判定方法は、ＳＮＰのタイピングや、癌遺伝子の変異の判定、例えばＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２を標的核酸として使用することができる。Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２を使用した具体例については、下記の実施例において記載する。
【実施例】  以下においては、より具体的な配列を用いて本発明の変異判定方法を説明する。
図１は、本発明の変異判定方法を実施するために使用したＤＮＡマイクロアレイ上のスポットの配置を示す図である。このマイクロアレイに固相化するプローブとしては、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子の第１２コドンの配列の、センス鎖及びアンチセンス鎖に対するプローブを用いた。図中のスポット１には、配列番号１に示される完全マッチプローブ（センス鎖に対応）を配置し、スポット２乃至７においては、配列番号２乃至７に示される不完全マッチプローブ（センス鎖に対応）を配置した。不完全マッチプローブは、完全マッチプローブにおいてＧＧＴであった配列部分を、それぞれ、ＣＧＴ、ＴＧＴ、ＡＧＴ、ＧＣＴ、ＧＡＴ、及びＧＴＴとしたものである。スポット８乃至１４においては、同様にしてアンチセンス鎖に対する完全マッチプローブ及び不完全マッチプローブ（それぞれ配列番号８乃至１４の配列を有する）を配置した。以下においては、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方における不完全マッチプローブ（配列番号２乃至７）のそれぞれを、ＣＧＴプローブ、ＴＧＴプローブ、ＡＧＴプローブ、ＧＣＴプローブ、ＧＡＴプローブ、及びＧＴＴプローブと呼ぶことがある。これらのプローブ群の設計・合成は、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから入手可能な配列を基にして行った。
各プローブの、ＤＮＡマイクロアレイへの固相化には、当該技術分野で既知の方法により行った。具体的には、ピエゾ素子を利用した微量分注システムによりスポットした。
標識核酸の調製にあたっては、テンプレートとして人体より採取した癌細胞から抽出した核酸を使用した。この抽出核酸、及びＫ−ｒａｓ癌遺伝子プライマー（宝酒造社製、Ｃａｔ＃７１１２；配列番号１５及び１６に示されるもの）をＰＣＲにおいて使用し、５’にＦＩＴＣが標識された標識済標的核酸を調製した。ＰＣＲにより増幅した試料は、８％ＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣ社製）アガロース電気泳動により確認した。増幅した標的核酸約５０μｇを、各プローブが固相化された上記のＤＮＡマイクロアレイに接触させた。
プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションは、次の条件において行った。
ハイブリダイゼーション溶液：３ｘＳＳＰＥ（燐酸ナトリウム緩衝液、技術資料：ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法、細胞工学別冊ゲノムサイエンスシリーズ１秀潤社参照）、１０％（Ｖ／Ｖ）ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に標的核酸を１０％溶液となるように懸濁したもの；
分析器：オリンパス光学社製ＢＸ−５１ＴＦＲに冷却ＣＣＤカメラを接続した実験システム（反応フィルターの周りに、試料溶液駆動と温度制御とを可能にする手段が実装されており、更に蛍光スポットの画像の記録を自動的に行うことができるように設計されたものである）；
操作：直径６ｍｍのマイクロアレイが設置されている専用チャンバーの反応部分に、ハイブリダイゼーション溶液で調製された反応溶液５０μｌを加え、５０℃でハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光画像を撮像し、その画像をハードディスクに保存した。
得られた画像を、変異判解析用にプログラムされた解析ソフトウェアを使用して解析し、画像のシグナルを数値化した。数値化されたシグナルを、以下のようにして更に解析した。
低強度シグナルを規定する閾値Ａとして、シグナルの絶対強度１５の値を設定した。閾値Ａ以下のシグナルを示す、ＣＧＴプローブ、ＴＧＴプローブ及びＡＧＴプローブを、標的核酸に対する非特異的なプローブ、即ち不完全マッチプローブ候補とした（図２参照）。
一方、閾値Ｂとしては、シグナルの絶対強度１００を設定した。最高強度のシグナルを発しているスポットに含まれるＧＧＴプローブを第１完全マッチプローブ候補と判定した（図２参照）。
閾値Ａ以下のプローブ候補、及び閾値Ｂ以上のプローブ候補が共に存在していたから、不完全マッチプローブ候補を、不完全マッチプローブと判定し、更に第１完全マッチプローブ候補を、第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。
次に、閾値Ｃとして、第１完全マッチプローブのシグナル強度に対するシグナル値として２０％を設定した。第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）のシグナル値を１００％とした時の、各プローブのシグナル値の相対値を図３に示した。第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）以外のプローブが固相化されたスポットであって、当該閾値Ｃ以上のシグナル強度を発するスポットに固相化されたプローブであるＧＡＴプローブを第２完全マッチプローブ候補と判定した（図３参照）。
次に、前記第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）の判定とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対してＤＮＡマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第１補正用核酸は、ＤＮＡシークエンサによって塩基配列がＧＧＴを持つことが予めわかっているＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲを行うことにより、５’末端にＦＩＴＣ標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第１補正用核酸とのハイブリダイゼーションの測定値は、図４に示した。この図においては、ＧＧＴプローブのシグナル値を１００％として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図３の相対値から差し引いた値を、図５に示した。
図５においては、ＧＡＴプローブのシグナル値（相対値）が、閾値Ｃの値以上であることから、ＧＡＴプローブを第２完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。
ＧＡＴプローブの次に強いシグナルを発していたスポット中のＧＣＴプローブは、ＧＡＴプローブのシグナルを１００％とした場合に、閾値Ｃ以上のシグナル強度を有しているから（図６参照）、上記と同様の補正を行い、ＧＣＴプローブが完全マッチプローブであるか否かを確認した。
第２完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第２補正用核酸を、第１完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）の判定とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対してＤＮＡマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プローブセットが当該第２補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第２補正用核酸は、ＤＮＡシークエンサによって塩基配列がＧＡＴを持つことが予めわかっているＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲを行うことにより、５’末端にＦＩＴＣ標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第２補正用核酸とのハイブリダイゼーションの測定値は、図７に示した。この図においては、ＧＡＴプローブのシグナル値を１００％として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図６の相対値から差し引いた値を、図８に示した。
図８においては、差し引き後のＧＣＴプローブのシグナル相対値が、閾値Ｃ以上であることから、ＧＣＴプローブを第３完全マッチプローブ（アンチセンス鎖側）と判定した。
以下の工程は、アンチセンス鎖に対するプローブの代わりにセンス鎖に対するプローブを使用する以外は上記と同様にして、行ったものである。
上記と同様に、低強度シグナルを規定する閾値Ａとして、シグナルの絶対強度１５の値を設定した。閾値Ａ以下のシグナルを示す、ＣＧＴプローブ、ＴＧＴプローブ、及びＡＧＴプローブを、標的核酸に対する非特異的なプローブ、即ち不完全マッチプローブ候補とした（図９参照）。
一方、閾値Ｂについては、アンチセンスの場合とは異なり、シグナルの絶対強度９０を設定した。最高強度のシグナルを発しているスポットに含まれるＧＧＴプローブを第１完全マッチプローブ候補と判定した（図９参照）。
閾値Ａ以下のプローブ候補、及び閾値Ｂ以上のプローブ候補が共に存在していたから、不完全マッチプローブ候補と、不完全マッチプローブと判定し、更に第１完全マッチプローブ候補を、第１完全マッチプローブ（センス鎖側）と判定した。
次に、閾値Ｃとして、上記と同様に第１完全マッチプローブ（センス鎖側）のシグナル強度に対するシグナル値として２０％を設定した。第１完全マッチプローブ（センス鎖側）のシグナル値を１００％とした時の、各プローブのシグナル値の相対値を図１０に示した。第１完全マッチプローブ（センス鎖側）以外のプローブが固相化されたスポットであって、当該閾値Ｃ以上のシグナル強度を発するスポットに固相化されたプローブであるＧＡＴプローブを第２完全マッチプローブ候補と判定した（図１０参照）。
次に、前記第１完全マッチプローブ（センス鎖側）と完全マッチする配列のみからなる第１補正用核酸を、第１完全マッチプローブの同定とは別個に、前記プローブセットと同一のプローブセットに対してＤＮＡマイクロアレイの各スポット上で接触させて、当該プローブセットが当該第１補正用核酸のみと接触した場合のシグナルを測定した。第１補正用核酸は、ＤＮＡシークエンサによって塩基配列がＧＧＴを持つことが予めわかっているＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲを行うことにより、５’末端にＦＩＴＣ標識された、標識済コントロール核酸を調製し、これを用いた。第１補正用核酸とのハイブリダイゼーションの測定値は、図１１に示した。この図においては、ＧＧＴプローブのシグナル値を１００％として、これに対する相対値で示してある。この相対値を、図１０の相対値から差し引いた値を、図１２に示した。
図１２においては、ＧＡＴプローブのシグナル値（相対値）が、閾値Ｃの値以上であることから、ＧＡＴプローブを第２完全マッチプローブ（センス鎖側）と判定した。
ＧＡＴプローブの次に強いシグナルを発していたスポット中のＧＣＴプローブは、ＧＡＴプローブのシグナルを１００％とした場合に、閾値Ｃ以上のシグナル強度を有していないから（図１２参照）、完全マッチプローブではないと判定した。従って、ＧＣＴプローブは、アンチセンス鎖に対応するプローブを用いた場合と、センス鎖に対応するプローブを用いた場合とで、結果がことなるから、予めそのような場合は完全マッチとしないという基準を設けておいた場合には、これは完全マッチプローブでないと判定することになる。
以上の結果より、ＧＧＴプローブ及びＧＡＴプローブのみが完全マッチであり、これらの配列に対応した標的核酸が試料中に含まれていたということがわかった。
以上の説明は、基板にプローブを固相化して位置によりプローブの種類を特定するＤＮＡマイクロアレイを例にとって説明したが、複数種類のプローブが識別可能な状態でハイブリダイズ反応の検出を行うことができる構成であれば、本発明を適用することが可能である。具体的には、プローブを基板に固相化したものであれば特に制限はなく、ガラス、シリコンウェハ、各種の多孔質基板、ゲル、マイクロタイタープレートやビーズなどを基材としてプローブを固相化して用いることができる。
産業上の利用性
本発明は、核酸の変異及び多型の解析を行う場合に試料となる核酸分子がその配列に関してヘテロ（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ／ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）である場合であっても、測定したシグナルがプローブとの完全マッチによるものなのか、又は不完全マッチによるものなのかをより確実に判定することができるため、従来の変異及び多型の解析方法と比較して、試料中の核酸配列に関してより正確な情報を得ることを可能にする。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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