(57)【要約】本発明は、顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤、および顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項３】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項４】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項５】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
【請求項６】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項５記載の予防及び／または治療剤。
【請求項７】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項８】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組識破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項９】
ＣＸＣＲ４阻害剤がＡＭＤ−３１００またはその誘導体である請求項８記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１０】
組織破壊を伴う疾患が神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患および肺疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１１】
神経疾患が脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１２】
循環器系疾患が閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１３】
肝臓疾患がＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１４】
膵臓疾患が糖尿病、膵炎のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１５】
消化管系疾患がクローン病、潰瘍性大腸炎のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１６】
腎臓疾患がＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１７】
皮膚疾患が褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１８】
肺疾患が肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核または喘息である請求項１０記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１９】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２０】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２２】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２３】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、請求項１９〜２２のいずれか１項に薬剤。
【請求項２４】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項２３記載の薬剤。
【請求項２５】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２６】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２７】
ＣＸＣＲ４阻害剤がＡＭＤ−３１００である請求項２６記載の薬剤。
【請求項２８】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
【請求項２９】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
【請求項３０】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
【請求項３１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
【請求項３２】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
【請求項３３】
（ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
【請求項３４】
組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤の製造のための顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの使用。
【請求項３５】
組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤の製造のための顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、以下Ｇ−ＣＳＦと記述）活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤、およびＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤に関する。
【背景技術】  Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球前駆細胞を増殖または分化させ、また成熟好中球を活性化するポリペプチドである。Ｇ−ＣＳＦは主として、骨髄移植、癌の化学療法による好中球減少症、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、先天性・特発性好中球減少症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症等における好中球増加促進に使われている［池田康夫編、「症例に学ぶＧ−ＣＳＦの臨床」、医薬ジャーナル社、大阪、１９９９年２月、ｐ．６４−９２］。近年、Ｇ−ＣＳＦが末梢血中の幹細胞を増加させることが報告されている［池田康夫編、「症例に学ぶＧ−ＣＳＦの臨床」、医薬ジャーナル社、大阪、１９９９年２月、ｐ．１３９−１６８］。幹細胞としては、造血幹細胞、体性幹細胞（組織性幹細胞）等が知られている。
Ｇ−ＣＳＦにより末梢血に移入される造血系の幹細胞には各種のサブタイプが含まれることが示されている［Ｂｌｏｏｄ，８４，２７９５−２８０１（１９９４）］。幹細胞の骨髄から末梢血への移入には、Ｇ−ＣＳＦを含む造血因子、細胞接着分子、ケモカイン、メタロプロテアーゼ等が相互に関与している［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３０，９７３−９８１（２００２）］。Ｇ−ＣＳＦによる幹細胞の骨髄から末梢血への移入には、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４とそのリガンドであるＣＸＣＬ１２（別名ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １、ＳＤＦ−１）が関与していると考えられており、Ｇ−ＣＳＦ以外にもシクロフォスファミドも同等の生理活性を有している［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１１，１８７−１９６（２００３）］。
またケモカインＣＸＣＲ４阻害剤のＡＭＤ−３１００（米国特許第５６１２４７８号）も、骨髄から末梢血へ造血幹細胞を移入させる作用を有することが知られている［アメリカン・ソサエティー・オブ・ヘマトロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、フィラデルフィア、米国、２００２年６月６日−１０日］。
造血幹細胞を末梢血中に動員する方法の一つとして顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与する方法が知られている［Ｂｌｏｏｄ，９０，９０３−９０８（１９９７）］。
また、Ｇ−ＣＳＦによりヒト末梢血中に動員される細胞から分離されたＣＤ３４陽性細胞を心筋梗塞モデルに移植すると血管新生が起こり、心機能が改善することが報告されている［Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７，４３０−４３６（２００１）、ＷＯ２００１／９４４２０］。
また、心筋梗塞を起す前にマウスにＧ−ＣＳＦとｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）を投与すると、梗塞部位で心筋と血管の再生が起こることから、Ｇ−ＣＳＦにより造血幹細胞が末梢血中に流れ出て梗塞心筋を再生すると考えられている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１０３４４−１０３４９（２００１）］。
ＣｏｒｔｉらはマウスにＧ−ＣＳＦとＳＣＦを投与することで骨髄由来のニューロンが脳内で増加することを報告している［Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１７７（２），４４３−４５２（２００２）］。
さらにヒトでもＧ−ＣＳＦ投与により末梢血中に動員させた細胞を移植することでレシピエントの肝臓、消化管上皮、皮膚［Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４６，７３８−７４６（２００２）］ならびに口腔上皮［Ｌａｎｃｅｔ，３６１，１０８４−１０８８（２００３）］にドナー由来の細胞が検出されている。
しかし、造血系以外の組織に関しては、Ｇ−ＣＳＦ投与により動員されるどのような幹細胞により組織の分化が起こるかは明らかにされていない。また血球系や循環器系以外ではＧ−ＣＳＦ投与やＧ−ＣＳＦで動員された幹細胞の移植により疾患が治療できるのかどうかについても明らかにされていない。
肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＣＯＰＤと記載）、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核、喘息等はいずれも肺の組織破壊を伴う重篤な疾患である。特に肺気腫及びＣＯＰＤでは肺胞の破壊が顕著である（工藤翔二、呼吸器疾患の治療と看護、南江堂、２００２年３月出版、及び池田康夫編、症例に学ぶＧ−ＣＳＦの臨床、医薬ジャーナル社、大阪、１９９９年２月、ｐ．６４−９２）。肺気腫、慢性気管支炎及びＣＯＰＤは気管支、細気管支または肺胞に炎症性の病変が生じる病気であり、肺胞の破壊が進行すると呼吸困難を生じる。現在のところ肺の組織破壊に対する十分な治療方法は無く、有効性の高い予防薬、治療薬及び治療方法の開発が望まれている。
レチノイン酸は、胎児期の肺の成熟に関与していることが知られている。エラスターゼで肺胞を破壊したラットにレチノイン酸を投与したところ、肺胞が修復されることが報告されている［Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３，６７５−６７７（１９９７）］。レチノイン酸誘導体のＲＯ４４４７５３［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，２１８２−２１９２（１９８８）］についても、同様に肺気腫の治療効果が報告されている［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６５（８），Ａ８２５（２００２）］。しかしながら、肺胞の破壊を伴う疾患の治療にレチノイン酸を使用した例は、種々報告されているが、いずれも高い効果は得られていない。
近年、幹細胞の移植実験の結果、肺胞は頻繁に幹細胞から新たに作られていることが明らかとなってきた［Ｃｅｌｌ，１０５，３６９−３７７（２００１）］。
肝硬変を中心とする慢性肝疾患は３０歳から６４歳までの年令層の死因順位の４位を占めている。また、死因順位の第１位である悪性新生物（癌）の中に肝硬変などの肝疾患を原因とする肝癌による死亡者が男性で２万２千９百人（肺癌、胃癌に次いで３位）、女性で９千４百人（胃癌、肺癌、結腸癌に次いで４位）も含まれている。肝炎の主要な原因である肝炎ウイルスの感染者はＢ型肝炎の場合１５０万人、Ｃ型肝炎の場合は２５０万人存在する。これらウイルス性肝炎に対しては抗ウイルス薬としてインターフェロンが投与されているが、肝硬変への移行を完全に止めることはできない。また、厚生省の調査では、現在約２２０万人もの人々が毎日清酒にして５合以上も飲みつづけているといわれている。これら問題飲酒者の中から脂肪肝、アルコール性肝炎、肝硬変などの肝臓病患者が多数発症している。ウイルス性アルコール性を合わせると年間約３０万人の人が新たに肝硬変を発症している。しかし現在、肝硬変を治療する方法は全く存在しない。最近、アルコール性肝炎のモデルとなりうる四塩化炭素肝障害モデルに対して骨髄細胞を移植することで、肝の線維の消失と肝実質細胞の再生により肝機能が改善することが報告された（第２回再生医療学会、神戸、２００３年３月１１日〜１２日）。
透析患者数は現在１７万人近くとなり、腎不全を根治するための腎臓再生薬は極めて大きな医療ニーズとなっているが現在、腎臓移植以外に有効な治療法は全く存在しない。最近、骨髄細胞から腎糸球体や腎尿細管上皮が新生することが報告され、骨髄の幹細胞から腎臓の組織が新たに新生されることが明らかになってきた［Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，６２，１２８５−１２９０（２００２）］。
【発明の開示】
本発明の目的は、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／もしくは治療剤、またはＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織中から多分化能幹細胞を末梢血に動員する薬剤を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（３５）に関する。
（１）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
（２）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１）記載の予防及び／または治療剤。
（３）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである上記（１）記載の予防及び／または治療剤。
（４）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである上記（１）記載の予防及び／または治療剤。
（５）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
（６）  化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、上記（５）項に記載の予防及び／または治療剤。
（７）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々に、または（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
（８）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々に、または（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
（９）  ＣＸＣＲ４阻害剤がＡＭＤ−３１００またはその誘導体である上記（８）記載の予防及び／または治療剤。
（１０）  組織破壊を伴う疾患が神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患および肺疾患からなる群から選ばれる疾患である、上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
（１１）  神経疾患が脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１２）  循環器系疾患が閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１３）  肝臓疾患がＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１４）  膵臓疾患が糖尿病、膵炎のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１５）  消化管系疾患がクローン病、潰瘍性大腸炎のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１６）  腎臓疾患がＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１７）  皮膚疾患が褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍のいずれかである上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１８）  肺疾患が肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核または喘息である上記（１０）記載の予防及び／または治療剤。
（１９）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
（２０）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記（１９）記載の薬剤。
（２１）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである上記（１９）記載の薬剤。
（２２）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである上記（１９）記載の薬剤。
（２３）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、上記（１９）〜（２２）のいずれか１項に薬剤。
（２４）  化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、上記（２３）記載の薬剤。
（２５）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々に、または（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
（２６）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々に、または（ａ）と（ｂ）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
（２７）  ＣＸＣＲ４阻害剤がＡＭＤ−３１００である上記（２６）記載の薬剤。
（２８）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
（２９）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
（３０）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療方法。
（３１）  顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
（３２）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
（３３）  （ａ）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（ｂ）ＣＸＣＲ４阻害剤とを、同時に、または時間をおいて別々に投与することを特徴とする、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する方法。
（３４）  組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤の製造のための顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの使用。
（３５）  組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤の製造のための顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドの使用。
１．組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤
本発明において、組織破壊を伴う疾患としては、神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患、肺疾患などがあげられる。
神経疾患としては、脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病などがあげられる。
循環器系疾患としては、閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患などがあげられる。
肝臓疾患としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全などがあげられる。
膵臓疾患としては、糖尿病、膵炎などがあげられる。
消化管系疾患としては、クローン病、潰瘍性大腸炎などがあげられる。
腎臓疾患としては、ＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全などがあげられる。
皮膚疾患としては、褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍などがあげられる。
肺疾患としては、肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核、喘息などがあげられる。
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド等があげられる。
具体的には、ナルトグラスチム（商品名ノイアップ、協和発酵工業製）、フィルグラスチム（商品名グラン、三共製；商品名Ｇｒａｎｕｌｏｋｉｎｅ、ホフマン・ラ・ロシュ製；商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、アムジェン製）、レノグラスチム（商品名ノイトロジン、中外製薬製；商品名Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ、アベンティス製）、ペグフィルグラスチム（商品名Ｎｅｕｌａｓｔａ、アムジェン製）、サルグラモスチム（商品名Ｌｅｕｋｉｎｅ、シェーリング製）等があげられる。
また、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）によって、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦとのアミノ酸配列の相同性を検索した際に、好ましくは６０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドがあげられる。配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が置換し、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの具体例を表１に示す。
2004100972.tif 000002
2004100972.tif 000003
またＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドは、化学修飾されていてもよい。
化学修飾の方法としては、例えばＷＯ００／５１６２６に記載の方法等があげられ、例えばポリアルキレングリコールで修飾、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾したＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドが包含される。
本発明のＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する医薬は、治療剤として単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与等があげられる。
投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、ドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。
錠剤等の固形製剤の製造には、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、注射剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤はＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等があげられる。Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
２．顆粒球コロニー刺激因子と別の薬剤との併用
本発明に用いられるＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドは、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤と併用することによってその作用を増強させることができる。
レチノイン酸誘導体としては、レチノイン酸受容体に結合する化合物であればいかなるものでもよいが、具体的にはパルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール等のレチノイン酸誘導体、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン等のプロビタミンＡ等を挙げることができる。また、モトレチナイド（商品名Ｔａｓｍａｄｅｒｍ、ホフマン・ラ・ロシュ製、ＵＳ４１０５６８１参照）、ＷＯ０２／０４４３９に記載の化合物、タザロテン（商品名Ｔａｚｏｒａｃ、Ａｌｌｅｒｇａｎ社、ＥＰ２８４２８８参照）、ＡＧＮ−１９４３１０及びＡＧＮ−１９５１８３（Ａｌｌｅｒｇａｎ製、ＷＯ９７／０９２９７参照）、ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ＴｏｐｉＣａｒｅ（商品名Ａｖｉｔａ、Ｍｙｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、ＵＡＢ−３０（ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２０５２５２−５９−１、ＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ製）等があげられる。
ＣＸＣＲ４阻害剤としてはＡＭＤ−３１００等があげられる。
本発明で用いられるＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドと、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤は、これらそれぞれの有効成分を含有するように製剤化したものであれば、単剤（合剤）としてでも複数の製剤の組み合わせとしてでも使用または投与することができる。複数の製剤の組み合わせとして使用する際には、同時にまたは時間をおいて別々に使用または投与することができる。なお、これら製剤は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、またはドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等の形態として用いることができる。
本発明で用いられるＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドと、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤との好ましい用量比（重量／重量）は、使用するレチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤との組み合わせ、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤の効力等に応じて適宜調整すればよいが、具体的には例えば１／５００００（顆粒球コロニー刺激因子／レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤）〜１００／１、好ましくは１／１００００〜２０／１、さらに好ましくは１／１０００〜１０／１の間の比で用いられる。
複数の製剤の組み合わせとして投与する際には、例えば（ａ）Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを含有する第一成分と、（ｂ）レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤を含有する第二成分とを、それぞれ上記のように別途製剤化し、キットとして作製しておき、このキットを用いてそれぞれの成分を同時にまたは時間をおいて、同一対象に対して同一経路または異なった経路で投与することもできる。
該キットとしては、例えば保存する際に外部の温度や光による内容物である成分の変性、容器からの化学成分の溶出等がみられない容器であれば材質、形状等は特に限定されない２つ以上の容器（例えばバイアル、バッグ等）と内容物からなり、内容物である上記第一成分と第二成分が別々の経路（例えばチューブ等）または同一の経路を介して投与可能な形態を有するものが用いられる。具体的には、錠剤、注射剤、吸入剤等のキットがあげられる。
前記の製剤は、それぞれの有効成分の他に製剤学的に許容される希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、水、生理食塩水、植物油可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いて常法により製造することができる。
錠剤の製造にあたっては、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤はＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体としては、例えば乳糖、グリセリン等が挙げられる。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドでは通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤では通常成人１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
３．多分化能幹細胞を末梢血に動員する薬剤
上記１または２に記載した組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤は、末梢血中に多分化能幹細胞を動員し、動員された多分化能幹細胞により障害組織を再生することができる。
４．本発明の薬剤を用いて疾患を治療する方法
本発明の組織破壊を伴う疾患の治療剤を用いて疾患を治療する方法としては、上記１にあるように本発明の治療剤を患者に直接投与することにより、障害部位を修復させる方法、上記３の薬剤で末梢血中に動員された多分化能幹細胞を回収したのち、回収した多分化能幹細胞をそのまま、または生体外で目的の細胞もしくは組織に分化させた後、障害部位に移植する方法など、いずれの方法を用いることもできる。
多分化能幹細胞、または分化させた細胞を治療に用いる場合、多分化能幹細胞または分化させた細胞をヘモネティックス社のヘモライト２プラスなどを用いて生理食塩水により洗浄し、用いる機器は完全閉鎖系で培養細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能なものがあげられ、培養、分化に用いたサイトカインなどの物質を限りなく１００％除去できるものが好ましい。これにより回収された多分化能幹細胞または分化させた細胞は、通常の点適法で静脈中に注入するか、患部に直接注入することにより、治療に用いることができる。
５．本発明の組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤の評価方法
（１）脳・神経系組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が、脳・神経系組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、例えば以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、マウス、ラットまたはサルなどの実験動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減、新生した脳・神経系の細胞を同定することにより脳・神経系組織の破壊を伴う疾患に有効であることを確認する。実験動物は、虚血、６−ｈｙｄｒｏｘｙｄｏｐａｍｉｎｅ（６−ＯＨＤＡ）投与またはカイニン酸投与等の方法により、脳に傷害を与えた動物が好ましい。本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤の投与経路としては、皮下投与をあげることができる。
例えば、脳内で新生した神経系の細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により脳に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した神経系の細胞はＧＦＰの蛍光強度を測定することにより同定することができる。
（２）肝臓組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が肝臓組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、例えば以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の組織の破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、肝細胞破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減や、肝臓での細胞の新生促進により肝臓組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを確認する。肝細胞破壊を伴う疾患を示すモデル動物として、主として四塩化炭素エラスターゼを腹腔注射するモデル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００２年、１６１巻、ｐ．２００３−２０１０）や、肝部分切除モデル（Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．１９３１年、１２巻、ｐ．１８６−２０２）等を用いることができる。また肝臓の破壊病態を有する遺伝子改変動物として、Ｆｕｍａｒｙｌａｃｅｔａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＦＡＨ）欠損マウス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０００年、６巻、ｐ．１２２９−１２３４）等を用いることができる。
肝細胞破壊の評価には、血漿・血清中のＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ビリルビン、γ−ＧＴＰの濃度測定等でおこなうことができる。
肝臓で新生した肝細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により肝臓に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した肝臓の細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
（３）膵臓組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が膵臓組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、以下の方法により確認する。
上記した本発明の組織の破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、膵細胞破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減や、膵臓での細胞の新生促進により膵臓組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを確認することができる。
膵β細胞破壊を伴う疾患を示すモデル動物として、主としてストレプトゾトシンを腹腔注射するモデル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９６９年、４８巻、ｐ．２１２９−２１３９）、部分膵切除モデル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９８３年、７１巻、ｐ．１５４４−１５５３）等が知られている。膵β細胞破壊病態を有する自然発症動物として、ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ）マウス（Ｅｘｐ．Ａｎｉｍａｌ、１９８０年、２９巻、ｐ．１−１３）や、ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇ（ＢＢ）ラット（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８２年、３１巻（Ｓｕｐｐｌ．１）、ｐ．７−１３）等が知られている。
膵β細胞破壊に対する症状の改善は、血漿・血清中のインシュリンや糖等の濃度測定、糖負荷試験時の耐糖能等でおこなうことができる。また、体重変化、食事量、尿糖濃度測定等により、疾患と関連した変化をとらえることでも、判定が可能である。
膵臓で新生した膵細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により膵臓に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した膵臓の細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
（４）腎臓組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が腎臓組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、例えば以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の組織の破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、腎細胞破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減や、腎臓での細胞の新生促進により腎臓組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを確認する。腎臓破壊モデルとしては各種腎炎モデルが好ましい。腎炎に類似した病態を示すモデル動物として、抗Ｔｈｙ−１抗体を静脈注射することによって惹起される抗Ｔｈｙ−１腎炎モデル（腎と透析１９９１年臨時増刊号  腎疾患モデル、東京医学社）や、糸球体基底膜に対する抗体で惹起する馬杉腎炎モデル（腎と透析１９９１年臨時増刊号腎疾患モデル、東京医学社）等、腎不全に類似した病態を示すモデル動物としてｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を腹腔注射するモデル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９９年、５５巻、ｐ．８９０−８９８）等が知られている。
腎細胞破壊に対する症状の改善は、尿蛋白排泄量測定等で評価することができる。
腎臓で新生した腎細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により腎臓に傷害を与えた後に本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した腎臓の細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
（５）肺組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が肺組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、例えば以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、肺細胞破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減や、肺での細胞の新生促進により肺組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを確認する。肺破壊モデルとしては肺気腫類似モデルが好ましい。肺気腫に類似した病態を示すモデル動物として、主としてエラスターゼを含むタンパク質分解酵素を肺に注入したモデル［エンバイロンメンタル・リサーチ（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８４年、第３３巻、ｐ．４５４−４７２］や、タバコの喫煙モデル［チェスト（Ｃｈｅｓｔ）、２００２年、第１２１巻、付録、ｐ．１８８Ｓ−１９１Ｓ］等が知られている。肺の組織破壊病態を有する遺伝子改変動物としては、インターロイキン１３のトランスジェニックマウス［ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、２０００年、第１０６巻、ｐ．１０８１−１０９３］、腫瘍壊死因子−αのトランスジェニックマウス［アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー：ラング・セルラー・モレキュラー・フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、２００１年、第２８０巻、ｐ．Ｌ３９−Ｌ４９）等が知られている。
肺細胞破壊に対する症状の改善は、肺の切片の組織像の解析、肺の湿重量や容積の測定等で評価する。肺の切片の組織像の解析は、例えば平均２点間距離や肺胞面積の測定等を用いて行うことができる。平均２点間距離（ｍｅａｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  ｌｅｎｇｔｈ）は、肺の切片標本の顕微鏡像に一定の長さの格子を引き、直線と交わる肺胞壁とその隣り合って直線と交わる肺胞壁の間の距離を計測し、その平均値から求めることができる。また、非侵襲的な測定法として、肺のレントゲン線写真、Ｘ線コンピュータ断層撮影法（Ｘ線ＣＴ）、磁気共鳴断層診断（ＭＲＩ）等があげられる。直接的ではないが、体重や呼吸機能の測定、運動量や一定時間内の移動距離の測定、運動負荷試験、血液酸素分圧測定、肺胞のエラスチン分解産物であるデスモシンの尿中及び血中濃度測定等により、疾患と関連した変化をとらえることによっても肺の組織破壊を評価することができる。
肺で新生した細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により肺に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した肺細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
（６）骨格筋組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が骨格筋組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、骨格筋破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減や、骨格筋の細胞の新生促進により骨格筋組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを評価する。骨格筋の組織破壊に類似した病態を示すモデル動物として、主としてカルディオトキシン等の筋毒性のあるヘビ毒や塩酸ブピバカイン等の局所麻酔剤を骨格筋に注入するモデル［医学のあゆみ、１９９６年、１７９巻、ｐ．２７６−２８０］等が知られている。骨格筋の破壊病態を有する遺伝子改変動物としてジストロフィン欠損ｍｄｘマウス［神経  進歩、２００１年、４５巻、ｐ．５４−６２］等が知られている。
骨格筋組織の破壊に対する症状の改善は、骨格筋繊維の径および数、筋の繊維化および脂肪化を指標に形態観察を行うことで評価が可能である。また、非浸潤的な測定法として筋肉コンピュータ断層撮影法（筋肉ＣＴ）、磁気共鳴断層診断（ＭＲＩ）等があげられる。直接的ではないが、血清クレアチンキナーゼ（ＣＫ）値測定等により、疾患と関連した変化をとらえることでも判定が可能である。
骨格筋で新生した細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により骨格筋に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新たに再生・新生した骨格筋の細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
（７）皮膚組織
本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が皮膚組織の破壊を伴う疾患の治療に利用できることは、以下の方法により確認することができる。
上述の本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を、皮膚破壊モデル動物に投与し、破壊に伴う症状の軽減、皮膚の細胞の新生促進により皮膚組織の破壊を伴う疾患の治療に有効であることを評価する。皮膚組織の破壊に類似した病態を示すモデル動物として、主として遺伝的糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）や遺伝的肥満マウス（ｏｂ／ｏｂ）、ステロイド処置マウス、肝障害ラット等の難治性モデル動物に対する皮膚全層欠損創や熱傷創、虚血性潰瘍（褥傷）あるいは感染創を人工的に作成する皮膚創傷モデル［蛋白  核酸  酵素、２０００年、４５巻、ｐ．１１４５−１１５１］等が知られている。
皮膚組織の傷害に対する症状の改善は、創傷面積の測定、皮膚開烈張力の測定、滲出液量の測定、浸潤白血球数の測定、血管新生量の測定、肉芽中の細胞数やコラーゲン産生量の測定等で行うことができる。
皮膚で新生した細胞は以下の方法により検出することができる。
あらかじめ致死量の放射線を照射した後にＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウス由来の骨髄を移植した骨髄キメラ・マウスを準備し、該骨髄キメラ・マウスに上述した方法により皮膚に傷害を与えた後に、本発明の組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を投与する。新生した皮膚の細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
６．多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤の評価方法
本発明の多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤の評価は以下のようにして行うことができる。
薬剤により誘導された細胞をＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）を構成的に発現する同系統のトランスジェニック・マウスより採取するか、薬剤により動員された細胞を採取し、該細胞にレトロウイルスベクターを用いてＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）等の細胞標識可能な遺伝子を導入した後、静脈内または脳室内に投与する。新生した細胞はＧＦＰの蛍光により同定することができる。
以下、参考例及び試験例により、本発明の予防及び／または治療剤の効果をより具体的に説明する。
参考例１．  Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド投与による末梢血中の単核球の増加
雄性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット９週齢（日本チャールス・リバー）３匹に、ナルトグラスチム（協和発酵工業製、製品名；ノイアップ）を１００μｇ／ｋｇで、５日間連続で皮下投与し、投与開始後６日目に腹大動脈より末梢血を取得し、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７  Ａｎｉｍａｌ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社製）による密度勾配遠心法により単核球画分を濃縮し、細胞数を測定した。その結果、（２．３２±０．１６）×１０６細胞／ｍＬ（平均値±標準誤差）から（４．２９±０．９３）×１０６細胞／ｍＬ（平均値±標準誤差）に単核球が増加した。この中には、幹細胞が含有されていた。
参考例２．  Ｇ−ＣＳＦ投与により末梢血中に動員された細胞の性質
（１）Ｇ−ＣＳＦ投与により動員された末梢血中に動員される細胞のＸ線照射マウスへの移植
Ｇ−ＣＳＦを投与することにより末梢血中に動員される細胞を、マウス個体に移植することにより、その性質を明らかにした。
全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統のＦ４）の１０週齢の個体をＦ群３匹、Ｇ群１匹に分け、それぞれ別々に以下の薬剤を投与した。Ｆ群に対しては５日間連続で毎日１匹あたり、ナルトグラスチム（協和発酵工業社製：製品名ノイアップ）を１０μｇ皮下注射した。
Ｇ群に対しては、５日間連続で毎日１匹あたり、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を２００μｌ皮下注射した。
最後に薬剤を投与した翌日、Ｆ群、Ｇ群それぞれ別々にマウスをジエチルエーテルを用いて麻酔し、眼静脈より末梢血を採取し、予めヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）を分注したチューブに回収し、１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。また、Ｇ群に関しては大腿骨を摘出し、大腿骨に付着している筋肉をはさみで切除して大腿骨全体を露出させた後、両端をはさみで切断し、テルモ製２７Ｇの針を装着しＰＢＳを含有した注射針の先端を大腿骨の膝関節側に断端に差し込み、試験管の中にＰＢＳを吹き出すことにより骨髄細胞を採取し、その後１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。
このように採取した末梢血または骨髄細胞を以下のようにして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より注入して移植をおこなった。
まず移植を受けるＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）は８週齢のものを用意し、尾静脈注射を受ける前日に、あらかじめＸ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて１２Ｇｙの線量のＸ線を照射しておいた。これらのマウスをＨ群、Ｉ群、Ｊ群、Ｋ群に分け、Ｈ群にはＦ群由来のマウス末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植し、Ｉ群にはＧ群由来のマウス末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植し、Ｊ群にはＧ群由来の骨髄細胞を１匹あたり３．０×１０６を尾静脈より移植し、Ｋ群は移植の処置を施さなかった。
その結果、Ｉ群およびＫ群では移植後７日から１０日以内にすべてが死亡した。一方、Ｈ群およびＪ群では移植後８週齢経過しても生存していた。しかしながら、骨髄移植を施したＪ群のマウスの中には、毛が抜け皮膚がただれたり、頭を傾けて歩行し歩き方がぎこちないという外見上および行動上の異常が見られた。Ｇ−ＣＳＦを投与したマウス末梢血を移植したＨ群では、外見上および行動上の異常はみられなかった。
本結果は、Ｇ−ＣＳＦ投与によりマウス末梢血中には皮膚などの組織に分化する能力を有する幹細胞が動員されることを示している。
（２）細胞移植を受けたマウスの解剖
（１）で得られたＨ群のマウスを解剖し、灌流固定をおこない各臓器を摘出した。
具体的には、まずネンブタール（大日本製薬社製）の腹腔内注射により麻酔し、７０％エタノールで全身をぬらし、太ももの皮膚をつまみあげ膝から大腿部の根元までハサミで切開して大腿動脈および静脈を露出させ、絹製縫合糸（夏目製作所社製）で結紮した後、結紮部位の末端側から太ももを切断した。そこから脛骨を摘出し、脛骨に付着している筋肉をはさみで切除して脛骨全体を露出させた後、両端をはさみで切断し、テルモ製２３Ｇの針を装着しＰＢＳを含有した注射針の先端を脛骨の膝関節側に断端に差し込み、試験管の中にＰＢＳを吹き出すことにより骨髄細胞を採取した。
一方、マウスの方は開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍｌ流し、全身を灌流させた。この時、心臓から溢れ出る血液を取得し、あらかじめヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）１００ｕｎｉｔｓを分注したチューブに入れ末梢血として回収した。
ＰＢＳを全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍｌ流し、固定をおこなった。
その後、まず気管をつけたまま肺を摘出し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）を含有したテルモ製サーフロー留置針（２０Ｇ）付属のカテーテルを装着した２０ｍｌシリンジを気管から挿入し、カテーテルの先と気管を絹製縫合糸（夏目製作所社製）で結合し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ溶液１０ｍｌを気管を通し肺に注入した。注入後、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
また、残りの臓器についても個体から摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
上記操作過程で取得した末梢血細胞は、等量の０．９％ＮａＣｌを加えて希釈し、ＮｙｃｏＰｒｅｐ１．０７７Ａｎｉｍａｌ（第一化学薬品社製）１．４ｍｌの上に重層し、室温で６００×ｇ、３０分間遠心分離した。界面の単核球浮遊液の層を回収し、１ｍｌのＰＢＳを加えて混和し、室温で４００×ｇ、１５分間遠心分離し、上清を除き、沈殿している単核球をＰＢＳ０．５ｍｌで懸濁し、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞数の割合を測定した。その結果、末梢血単核球中におけるＧＦＰ陽性細胞の割合は、９０．３％であった。
骨髄細胞についても、同様にＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＧＦＰ陽性細胞の割合を測定したところ、８７．３％がＧＦＰ陽性細胞で占められていた。
また、各臓器から摘出して作成した凍結切片をＺｅｉｓｓ社製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した結果、肺、心臓、肝臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓、脾臓、腎臓、気管など、ほぼすべての全身の臓器で、ＧＦＰ陽性細胞が多く存在することを確認した。特に、脳では、嗅球、脈絡叢などの部分でＧＦＰ陽性細胞が多く観察された。本結果は、Ｇ−ＣＳＦ投与によるマウス末梢血中に動員された幹細胞が全身の様々な組識の修復に働くことを示している。
（３）免疫染色によるＧＦＰ陽性細胞の性質の同定
（２）で作成した凍結切片については、以下のようにして種々の抗体で染色し、ＧＦＰ陽性細胞の性質を調べた。
まず、種々の臓器の組織片に対して、抗サイトケラチン抗体による免疫染色をおこなった。サイトケラチンは上皮系細胞のマーカーである。
皮膚を摘出して作成した凍結切片の乗せたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドガラスを洗った。その後、終濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に１５分間浸した。ＰＢＳで１回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］と室温で１５分間反応させた。更にＰＢＳで２回洗った後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，Ｃｌｏｎｅｓ  ＡＥ１／ＡＥ３］（ＤＡＫＯ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで５０倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）］（生化学工業社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、Ｚｅｉｓｓ製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した。ＧＦＰ陽性細胞でかつサイトケラチン陽性細胞が観察されたことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、皮膚に生着し上皮系細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗サイトケラチン抗体を用いて、大腸の凍結切片に対して同様の染色をおこない、蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつサイトケラチン陽性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、大腸に生着し上皮系細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗サイトケラチン抗体と血球系細胞のマーカーであるＣＤ４５に対する抗体とを用いて、小腸の凍結切片に対しても同様の染色をおこなった。蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、小腸にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
次に、種々の臓器に対して、抗ＣＤ４５抗体による免疫染色をおこなった。
肺を摘出して作成した凍結切片をのせたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行うことにより洗った後、ＤＡＫＯ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（１）液（ＤＡＫＯ社製）に室温１０分間浸し、ＰＢＳで２回洗った後、ＤＡＫＯ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（２）液（ＤＡＫＯ社製）に室温１０分間浸し、再度ＰＢＳで２回洗った。
その後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｂｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４５（ＬＣＡ、Ｌｙ５）］（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで１００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで終濃度５μｇ／ｍｌとなるように希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、肺に生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗ＣＤ４５抗体を用いて、肝臓の凍結切片に対して同様の染色をおこない、蛍光顕微鏡下で観察したところ、ＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、肝臓にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
抗ＣＤ４５抗体を用いて、心臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓の凍結切片に対しても同様の染色をおこなった。蛍光顕微鏡下で観察したところ、それぞれの組織においてＧＦＰ陽性細胞でかつＣＤ４５陰性細胞が観察された。
このことから、移植に用いたＧ−ＣＳＦにより動員された末梢血中の細胞には、心臓、脳、胃、皮膚、小腸、大腸、骨格筋、膵臓にも生着し血球系以外の細胞に分化する能力を持つ幹細胞が含まれることを示している。
試験例１  Ｘ線照射マウスに対するＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの腸管上皮に対する治癒効果
Ｘ線を照射されたマウスは、腸管上皮や骨髄等での細胞新生が起こらない（ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｃａｎｃｅｒ、２００３年、３巻、ｐ．１１７−１２９）。そこで、腸管上皮破壊モデルとしてＸ線照射マウスを作製し、ナルトグラスチムにより末梢血に動員された細胞が修復に寄与するかどうか確認した。
（１）ナルトグラスチム投与により末梢血中に動員された細胞のＸ線照射マウスへの移植
全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれた、ＧＦＰ蛋白質発現マウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統）の８週齢の個体に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、ナルトグラスチム１０μｇ皮下注射した。ナルトグラスチムとしては、ノイアップ１００（協和醗酵工業製）を濃度１００μｇ／ｍＬとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）に溶解して使用した。
最後にナルトグラスチムを投与した翌日、ジエチルエーテルを用いてマウスを麻酔し、眼静脈より末梢血を採取し、予めヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）を分注したチューブに回収し、１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。
こうして採取した末梢血を、以下のようにして尾静脈より注入して移植をおこなった。
まず、移植をうけるＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）は８週齢のものを用意し、移植の前日に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて１２Ｇｙの線量のＸ線を照射した。翌日、このマウスに対し、採取した末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植した。その後、最低４週間経過して生存しているか確認し、キメラマウス（以下、末梢血キメラマウスと呼ぶ）を作製した。
（２）末梢血キメラマウスにおける腸管上皮細胞でのＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド動員末梢血由来細胞の新生
（１）で作製した末梢血キメラマウスを解剖し、灌流固定をおこない小腸および大腸を摘出した。具体的には、まず末梢血キメラマウスにネンブタール（大日本製薬社製）を腹腔内注射して麻酔し、開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍＬ流し、全身を灌流させた。ＰＢＳを全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍＬ流し、固定をおこなった。
その後、固定したマウスから小腸、大腸を摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
こうして作成した小腸および大腸の凍結切片に対し、以下のようにして抗サイトケラチン抗体による免疫染色をおこなった。サイトケラチンは上皮系細胞のマーカーである。
凍結切片の乗せたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った。その後、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に１５分間浸した。ＰＢＳで１回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］と室温で１５分間反応させた。更にＰＢＳで２回洗った後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，Ｃｌｏｎｅｓ  ＡＥ１／ＡＥ３］（ＤＡＫＯ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで５０倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［Ｃｙ３−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）］（生化学工業社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、Ｚｅｉｓｓ製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつサイトケラチン陽性である細胞が観察された。したがって、移植に用いたナルトグラスチムにより末梢血中へ動員された細胞から、Ｘ線照射によって破壊された小腸および大腸において、それぞれの組織の上皮系細胞に新生したことを確認した。
試験例２  四塩化炭素投与モデルマウスに対するＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの肝臓に対する治癒効果
四塩化炭素投与により肝臓を破壊したモデルマウスを用いて、ナルトグラスチムにより末梢血に動員された細胞が肝細胞に新生するかどうかを以下のようにして調べた。
まず試験例１（１）と同様に、ナルトグラスチム動員末梢血をＸ線照射したマウスに尾静脈注入したマウス（末梢血キメラマウス）を作製した。この末梢血キメラマウスに対し、四塩化炭素（Ｗａｋｏ社製）を２ｍＬ／ｋｇとなるように腹腔内投与した。なお、四塩化炭素はＭｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を溶媒として、四塩化炭素とＭｉｎｅｒａｌ  Ｏｉｌの容量比が２：３となるように調製した。
腹腔内投与して２週間経過した後、このマウスに対し試験例１（２）で示した方法と同様の方法で灌流固定をおこない、肝臓を摘出した。その後、固定したマウスから肝臓を摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作製した。
こうして作製した肝臓の凍結切片に対し、以下のようにして抗アルブミン抗体による免疫染色をおこなった。アルブミンは肝実質細胞のマーカーである。
肝臓を摘出して作製した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ］（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで２００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ＧＦＰ陽性でかつアルブミン陽性であり、形態的にも肝実質細胞と同様の細胞が観察された。すなわち、ナルトグラスチムにより末梢血中へ動員された細胞は、四塩化炭素によって破壊された肝臓において、肝実質細胞に新生したことが確認された。
試験例３  カルディオトキシン投与モデルマウスに対するＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの骨格筋に対する治療効果
カルディオトキシン投与により骨格筋を破壊したモデルマウスを用いて、ナルトグラスチムにより末梢血に動員された細胞が骨格筋繊維に新生するかどうかを以下のようにして調べた。
まず、試験例１（１）と同様に、ナルトグラスチム動員末梢血をＸ線照射したマウスに尾静脈注入したマウス（末梢血キメラマウス）を作製した。この末梢血キメラマウスの前脛骨筋にカルディオトキシンを２５−５０μＬ筋肉内投与した。なおカルディオトキシン（Ｌａｔｏｘａｎ社製）は濃度１μＭとなるようにＰＢＳに溶解して使用した。
次に、筋肉内投与して４週間経過した後、マウスから前脛骨筋を摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作製した。
こうして作製した前脛骨筋の凍結切片に対し、以下のようにして抗Ｄｅｓｍｉｎ抗体による免疫染色をおこなった。Ｄｅｓｍｉｎは骨格筋繊維のマーカーである。
前脛骨筋を摘出して作成した凍結切片の乗せたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った。その後、終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に１５分間浸した。ＰＢＳで１回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］と室温で１５分間反応させた。更にＰＢＳで２回洗った後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−Ｄｅｓｍｉｎ  Ｄｅｌｉｐｉｄｉｚｅｄ，Ｗｈｏｌｅ  Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ  Ｄ８２８１］（Ｓｉｇｍａ社製）を、１．９５％ブタ血清を含むＰＢＳで４０倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつＤｅｓｍｉｎ陽性であり、形態的にも骨格筋と判定できる骨格筋繊維が観察された。すなわち、ナルトグラスチムにより末梢血中へ動員された細胞は、カルディオトキシンによって破壊された骨格筋組織中において、骨格筋繊維に新生したことが確認された。
試験例４  皮膚創傷モデルマウスに対するＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの治療効果
常法［バイオロジカル  アンド  ファーマシューティカル  ブレトンＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）１９９６年、１９巻、ｐ．５３０−５３５］に従い、雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ  Ｊｃｌ  ６週齢（日本クレア）２匹をネンブタール（大日本製薬製）腹腔内投与により麻酔し、背側体毛を除毛後、直径４ｍｍの生検トレパン（カイ  インダストリーズ）を用いて皮膚全層切除創を作製した。
２匹中の１匹は切除創作製日（以下０日と記載する）からナルトグラスチム１０μｇ／ｂｏｄｙを１日１回、５日間皮内に反復投与し、他の１匹にはナルトグラスチムの代わりにＰＢＳを投与した。ナルトグラスチム（協和発酵工業製）は濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解して使用した。切除創作成後、経日的に創傷面積を測定し創傷治癒程度を求めた。創傷面積の測定は、背部中央に作成した２個所の切除創をデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  ＣＯＯＬＰＩＸ９９０）で撮影後、画像解析ソフト（ＮＩＨイメージ）を用いて計測した。表２に創傷面積（ｍｍ２）と、０日の創傷面積を１００％とした場合の創傷面積の割合を創傷面積率（％）として示す。
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表２に示すようにナルトグラスチム投与マウスではＰＢＳ投与マウスと比較して創傷面積および創傷面積率の低下の促進、すなわち皮膚再生促進効果が認められた。
試験例５  ラット肺胞破壊モデルでの評価（１）
雄性ＳＤラット９週齢（日本チャールス・リバー）に、ブタ膵エラスターゼ（以下エラスターゼと記載する、比活性１３５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ製）を生理食塩水（大塚製薬製）で７０ｕｎｉｔｓ／ｍＬに希釈し、５００μＬを気管内投与した。エラスターゼの１ｕｎｉｔは１ｍｇのエラスチンをｐＨ８．８、３７℃の条件下、２０分間で分解する活性である。２週間後、各群の平均体重がほぼ等しくなるように、１群１０匹で群分けを行った。フィルグラスチムはグラン注射液Ｍ３００（麒麟麦酒製）を、濃度が２０μｇ／ｍＬとなるよう生理食塩水に溶解して使用した。フィルグラスチム投与群には、エラスターゼ投与後３週間目から、フィルグラスチムを１００μｇ／ｋｇを１日１回、５日間皮内に反復投与した。エラスターゼ投与群には、エラスターゼ投与後は、何も投与しなかった。生理食塩水投与群には、エラスターゼの代わりに生理食塩水を投与し、その後は何も投与しなかった。エラスターゼ投与５週間後に肺を摘出し、気道内に２５ｃｍＨ２Ｏに加圧したホルマリンを注入して固定した後に、切片で肺胞の破壊程度を測定した。平均２点間距離（ｍｅａｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ  ｌｅｎｇｔｈ）は、肺切片の顕微鏡写真上に、１．３２５μｍの格子線を縦横にそれぞれ５本引き、線上に交差する肺胞壁を測定した後に、格子線の全長を交差した肺胞壁数で除して求めた［エンバイロンメンタル・リサーチ（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８７年、４２巻、ｐ．３４０−３５２］。
図１に平均２点間距離を平均値±標準誤差（ＳＥ）によって示した。図１が示すようにエラスターゼ投与により、平均２点間距離の延長、すなわち肺胞壁破壊が見られた。フィルグラスチム投与群において、平均２点間距離の短縮、すなわち肺胞壁破壊の１６％の回復が観察できた。
試験例６  ラット肺胞破壊モデルでの評価（２）
試験例５と同様にエラスターゼ処置により肺胞破壊したラットに、ナルトグラスチムを投与して、肺胞の破壊変化を測定した。
ナルトグラスチムはノイアップ２５０（協和醗酵工業製）を、濃度が４０μｇ／ｍＬとなるよう生理食塩水に溶解して使用した。ナルトグラスチム投与群には、エラスターゼ投与後３週間目から、ナルトグラスチム２００μｇ／ｋｇを１日１回、５日間皮下に反復投与し、その後、１週間に３回の投与を５週間行なった。エラスターゼ投与群には、エラスターゼ投与後は何も投与しなかった。生理食塩水投与群には、エラスターゼのかわりに生理食塩水を投与し、その後は何も投与しなかった。エラスターゼ投与８週間後に肺を摘出し、試験例５の方法に従って解析した。
図２は平均２点間距離を平均値＋標準誤差（ＳＥ）によって示したものである。図２が示すようにエラスターゼ投与により、平均２点間距離の延長、すなわち肺胞壁破壊が見られた。ナルトグラスチム投与群において、平均２点間距離の短縮、すなわち肺胞壁破壊の３５％の回復が観察できた。
試験例７  ラット肺胞破壊モデルでの評価（３）
試験例５と同様にエラスターゼ処置により肺胞破壊したラットに、全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（以下、レチノイン酸と記載）、またはナルトグラスチムとレチノイン酸を投与して、肺胞の破壊変化を測定した。レチノイン酸（シグマアルドリッチ製）は、３ｍｇ／ｍＬになるようにコーンオイル（和光純薬工業製）に懸濁して使用した。ナルトグラスチムはノイアップ１００（協和醗酵工業製）を、濃度が２０μｇ／ｍＬとなるよう、生理食塩水に溶解して使用した。エラスターゼ投与後３週間目からナルトグラスチムを５日間、１００μｇ／ｋｇを１日１回皮内に反復投与した。レチノイン酸は、エラスターゼ投与後３週間目から３週間、１日１回、３ｍｇ／ｋｇで反復経口投与した。レチノイン酸のみを投与した群（レチノイン酸投与群）およびレチノイン酸とナルトグラスチムを両方投与した群（レチノイン酸／ナルトグラスチム投与群）を設けた。エラスターゼ投与群には、エラスターゼを投与後は、何も投与しなかった。生理食塩水投与群には、エラスターゼの代わりに生理食塩水を投与し、その後は何も投与しなかった。エラスターゼ投与５週間後に肺を摘出し、試験例５の方法に従って解析した。図３は平均２点間距離を平均値±標準誤差（ＳＥ）によって示したものである。
図３が示すようにレチノイン酸群において、１４％の平均２点間距離の短縮、すなわち破壊された肺胞壁の回復が見られた。レチノイン酸／ナルトグラスチム群では、破壊された肺胞壁の強い回復が見られた。
試験例８  ｄｂ／ｄｂマウスに対するナルトグラスチムの治癒効果
ｄｂ／ｄｂマウスは、ｄｂ遺伝子の単一劣性変異マウスであり、肥満・過食・高インスリン血症など顕著な糖尿病症状を自然発症する２型糖尿病モデルマウスとして知られている（ジョスリン糖尿病学、１９９５年、ｐ．３１７−３４９）。ｄｂ／ｄｂマウスは生後４〜５週齢頃より肥満が始まり、体重の増加に伴い血糖値は上昇するので、高血糖状態から全身の臓器に炎症などの組織破壊を引き起こしていると推測される。そこで、ｄｂ／ｄｂマウスにＸ線を照射し、ナルトグラスチムにより末梢血に動員された細胞が組織修復に寄与しているかどうか確認した。
（１）Ｘ線照射ｄｂ／ｄｂマウスへの骨髄細胞の移植
まず、ナルトグラスチムにより末梢血に動員された細胞を移植する前に、骨髄細胞の移植をおこなった。
ｄｂ／ｄｂマウスとしては、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（日本クレア社）の６週齢の雌の個体を用い、移植の前日に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて１２Ｇｙの線量のＸ線を照射した。翌日、このマウスに対し、全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統）の８週齢の個体の骨髄から単離した細胞３×１０６個を尾静脈より移植した。
移植して４週間経過後、マウスを解剖して灌流固定をおこない、各臓器を摘出した。
具体的には、まずネンブタール（大日本製薬社製）を腹腔内注射して麻酔し、開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍＬ流し、全身を灌流させた。ＰＢＳを全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍＬ流し、固定をおこなった。
その後、固定したマウスから各臓器を摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角のブロックに切断し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
こうして作成した各臓器の凍結切片に対し、種々の抗体による免疫染色をおこなった。
その結果、肝臓の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつアルブミン抗体陽性である細胞が観察された。また、膵臓の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつインスリン抗体陽性である細胞が、心筋の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつザルコーマα−アクチン抗体陽性細胞がそれぞれ観察された。また、脳の切片に対しては、ニューロン様の形態を有するＧＦＰ陽性細胞および、プルキンエ細胞特有の樹状形態を有するＧＦＰ陽性細胞が観察された。
すなわち、Ｘ線照射されたｄｂ／ｄｂマウスに移植するという実験系において、骨髄細胞が肝実質細胞、膵β細胞、心筋細胞、ニューロン、プルキンエ細胞に新生したことを確認した。
（２）ナルトグラスチム投与により末梢血中に動員された細胞の、Ｘ線照射ｄｂ／ｄｂマウスへの移植
次に、ナルトグラスチム投与により末梢血中に動員された細胞を、（１）と同様の方法によりＸ線照射したｄｂ／ｄｂマウスに移植した。
まず、全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統）の８週齢の個体に対し、５日間連続で毎日１匹あたり、ナルトグラスチム１０μｇ皮下注射した。ナルトグラスチムとしては、ノイアップ１００（協和醗酵工業製）を濃度１００μｇ／ｍＬとなるよう、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ｐＨ７．４）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）に溶解して使用した。
最後にナルトグラスチムを投与した翌日、ジエチルエーテルを用いてマウスを麻酔し、眼静脈より末梢血を採取し、予めヘパリンナトリウム（武田薬品工業社製）を分注したチューブに回収し、１００μｍセル・ストレイナー（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を通過させておいた。
こうして採取した末梢血を、以下のようにしてｄｂ／ｄｂマウスに尾静脈より注入して移植をおこなった。
まず、移植をうけるｄｂ／ｄｂマウスはＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（日本クレア社）の６週齢の雌の個体とし、移植の前日に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて９．５Ｇｙの線量のＸ線を照射した。翌日、このマウスに対し、採取した末梢血を１匹あたり３００μｌ尾静脈より移植した。
移植して４週間経過後、（１）に示したのと同様の方法でマウスを解剖して灌流固定をおこない、各臓器を摘出し包埋して凍結切片を作製した。
こうして作製した各臓器の凍結切片に対し、種々の抗体による免疫染色をおこなった。
その結果、肝臓の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつアルブミン抗体陽性である細胞が観察された。また、膵臓の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつインスリン抗体陽性である細胞が、心筋の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつザルコーマα−アクチン抗体陽性細胞が、小腸および胃の切片に対しては、ＧＦＰ陽性でかつサイトケラチン抗体陽性細胞がそれぞれ観察された。また、脳の切片に対しては、ニューロン様の形態を示しＮｅｕＮ抗体陽性でかつＧＦＰ陽性細胞が観察された。更に肺の切片に対しては、肺胞上皮細胞に位置するＧＦＰ陽性細胞が観察された。
すなわち、Ｘ線照射されたｄｂ／ｄｂマウスに移植するという実験系において、ナルトグラスチムにより末梢血中へ動員された細胞が肝実質細胞、膵β細胞、心筋細胞、小腸上皮細胞、胃上皮細胞、ニューロン、肺胞上皮細胞に新生したことを確認した。
試験例９  骨髄キメラマウスに対するナルトグラスチムの効果
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス６週齢（日本クレア）および雌性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウス６週齢（日本クレア）に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて９．５Ｇｙの線量のＸ線を照射した。翌日、このマウスに対し、雄性ＧＦＰ蛋白質発現トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｘ１２９系統）６−８週齢の骨髄から単離した３ｘ１０６個の細胞を尾静脈より移植した。
これらのマウスをナルトグラスチム投与群とコントロール群に分け、次のような処置を施した。ナルトグラスチム投与群では、移植して７日後より、ナルトグラスチム１０μｇ／ｂｏｄｙを１日１回、１４日間連続で皮下に反復投与した。ナルトグラスチムはノイアップ（協和醗酵工業製）を濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解して使用した。一方、コントロール群では、移植して７日後より、ナルトグラスチムの代わりにＰＢＳを１４日間連投した。
骨髄移植して１ヶ月後に、各マウスを解剖して灌流固定をおこない、肝臓、肺および腎臓を摘出した。具体的には、まずネンブタール（大日本製薬社製）の腹腔内注射により麻酔し、開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍｌ流し、全身を灌流させた。その後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍｌ流し、固定をおこなった。その後、まず気管をつけたまま肺を摘出し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）を含有したテルモ製サーフロー留置針（２０Ｇ）付属のカテーテルを装着した２０ｍｌシリンジを気管から挿入し、カテーテルの先と気管を絹製縫合糸（夏目製作所社製）で結合し、ＰＢＳで２倍希釈したＯＣＴ溶液１０ｍｌを気管を通し肺に注入した。注入後、数ｍｍ角くらいのブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。また、肝臓・腎臓についても個体から摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、数ｍｍ角くらいのブロックに切断し、ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ６μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
こうして作成した凍結切片のうち肝臓の切片に対し、以下のようにして抗Ａｌｂｕｍｉｎ抗体による免疫染色をおこなった。Ａｌｂｕｍｉｎは肝実質細胞のマーカーである。肝臓を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回おこなうことにより洗った後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ］（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで２００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
各個体からそれぞれ３０切片を作製して、ＧＦＰ陽性かつＡｌｂｕｍｉｎ陽性細胞数を計測した。図４に単位面積で割ったＧＦＰ陽性かつＡｌｂｕｍｉｎ陽性細胞数を平均値＋標準誤差によって示した。図４が示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてはナルトグラスチム投与により約４．５倍の増加が確認でき、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスにおいてはナルトグラスチム投与により約４．８倍の増加が確認できた。つまり、ナルトグラスチム投与により肝細胞に分化した骨髄由来細胞が増加した。
また、肺および腎臓の凍結切片からも、ＧＦＰ陽性の数を計測した。その結果、ナルトグラスチム投与によりＧＦＰ陽性細胞数が増加していたことを見出した。
【図面の簡単な説明】  図１は、エラスターゼ投与による肺胞の平均２点間距離の変化と、フィルグラスチム投与による作用を示す。縦軸は平均２点間距離（μｍ）を表す。
図２は、エラスターゼ投与による肺胞の平均２点間距離の変化と、ナルトグラスチム投与による作用を示す。縦軸は平均２点間距離（μｍ）を表す。また、＃＃は、Ｐ＜０．０１（エラスターゼ投与群対比、ウィルコクソン順位和検定）を表す。
図３は、エラスターゼ投与による肺胞の平均２点間距離の変化と、レチノイン酸またはレチノイン酸／ナルトグラスチム投与による作用を示す。縦軸は平均２点間距離（μｍ）を表す。また、＃＃は、Ｐ＜０．０１（エラスターゼ投与群対比、ウィルコクソン順位和検定）を表す。
図４は、ナルトグラスチム投与有無による単位面積当たりのＧＦＰ陽性かつＡｌｂｕｍｉｎ陽性の細胞数を示す。縦軸の単位は（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）である。＃は、Ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定）を表す。また、ＷＴ、ｄｂは、それぞれＣ５７ＢＬ／６マウス群、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウス群を表す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：注射剤（ナルトグラスチム）
常法により、次の組成からなる注射剤を調製した。
ナルトグラスチム                    ２５      μｇ
日局ポリソルベート８０                ２．５    ｇ
日局乳糖                              ５      ｍｇ
日局生理食塩液                        ０．５  ｍＬ
実施例２：注射剤（ナルトグラスチムと全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸の単剤）
常法により、次の組成からなる注射剤を調整する。
ナルトグラスチム                    ２５      μｇ
全ｔｒａｎｓ−レチノイン酸            １．０  ｍｇ
日局ポリソルベート８０                ２．５    ｇ
日局乳糖                              ５      ｍｇ
日局生理食塩液                        ０．５  ｍＬ
【産業上の利用可能性】  本発明により、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤が提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月24日(2005.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項３】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項４】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１記載の予防及び／または治療剤。
【請求項５】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
【請求項６】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項５項に記載の予防及び／または治療剤。
【請求項７】
（a）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（b）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（a）と（b）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項８】
（a）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（b）CXCR4阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（a）と（b）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤。
【請求項９】
CXCR4阻害剤がAMD-3100またはその誘導体である請求項８記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１０】
組織破壊を伴う疾患が神経疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患および肺疾患からなる群から選ばれる疾患である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１１】
神経疾患が脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１２】
循環器系疾患が閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１３】
肝臓疾患がB型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１４】
膵臓疾患が糖尿病、膵炎のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１５】
消化管系疾患がクローン病、潰瘍性大腸炎のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１６】
腎臓疾患がＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１７】
皮膚疾患が褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍のいずれかである請求項１０記載の予防および／または治療剤。
【請求項１８】
肺疾患が肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核または喘息である請求項１０記載の予防及び／または治療剤。
【請求項１９】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２０】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２１】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２２】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、配列番号１記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである請求項１９記載の薬剤。
【請求項２３】
顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドが、化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドである、請求項１９〜２２のいずれか１項に薬剤。
【請求項２４】
化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項２３記載の薬剤。
【請求項２５】
（a）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（b）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（a）と（b）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２６】
（a）顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチドと、（b）CXCR4阻害剤とからなり、同時に、時間をおいて別々にまたは（a）と（b）の両方を含有する一つの薬剤として投与するための、組織中から多能性幹細胞を末梢血に動員する薬剤。
【請求項２７】
CXCR4阻害剤がAMD-3100である請求項２６記載の薬剤。
【国際調査報告】
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