(57)【要約】ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原、特に腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードする発現ベクターを含む組成物であり、インターフェロンガンマをコードする発現ベクターを含むことが好ましい。具体的には、例えばＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原としてＮＹ−ＥＳＯ−１等の癌／精巣抗原を、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識される抗原、特に腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原としてＨＥＲ−２／ｎｅｕ等あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１，ＭＡＧＥ，ＳＡＧＥ等の癌／精巣抗原等を挙げることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードする発現ベクターを含む組成物。
【請求項２】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＳＥＲＥＸ法により同定される分子である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＳＥＲＥＸ法により同定される癌／精巣抗原である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＡＧＥから選ばれた一種である、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１ないし４記載の組成物。
【請求項６】
腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原が癌／精巣抗原である、請求項１ないし４記載の組成物。
【請求項７】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原が癌／精巣抗原であり、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原である、請求項１ないし５記載の組成物。
【請求項８】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原と腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原とがいずれも癌／精巣抗原である、請求項１ないし４及び請求項６記載の組成物。
【請求項９】
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原がＮＹ−ＥＳＯ−１であり、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１ないし８記載の組成物。
【請求項１０】
両抗原をコードするポリヌクレオチドが各々、異なる発現ベクターに含まれる、請求項１〜９いずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
両抗原をコードする発現ベクターが同一の担体粒子上に固定された、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
両抗原をコードする発現ベクターとインターフェロンガンマをコードする発現ベクターが同一の担体粒子上に固定された、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物を含むワクチン。
【請求項１４】
遺伝子銃を用いて投与される、請求項１３記載のワクチン。
【請求項１５】
癌の予防および／または治療のための請求項１３または１４記載のワクチン。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物において腫瘍特異的免疫を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体内において腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンに関する。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードする発現ベクターを含むポリヌクレオチドワクチンに関する。ここでＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原は好ましくは、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法により同定された癌／精巣抗原である。腫瘍免疫を発現させるためのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化を確実に達成するにはインターフェロンガンマをコードする発現ベクターを同時に投与することが好ましい。腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原は好ましくは、一つまたは複数の癌種において高い発現率を示し、ヒトを含む哺乳動物の主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原クラスＩ分子のタイプと好ましい適合性を示して結合する抗原部位を含む抗原である。また、これに限定されるわけではないが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードする発現ベクター、さらにインターフェロンガンマをコードする発現ベクターは、好ましくは同じ細胞で発現され、提示されることを可能とするように同一の担体粒子等の上に固定され、細胞内へ投与されるものである。
【背景技術】  ここ１０余年来、日本における死亡原因では癌が第一位を占めており、手術、放射線および化学療法と共に免疫療法も第４の治療法として期待されている。免疫療法は生体内の免疫応答のシステムを利用した治療法である。免疫応答の誘起と制御はＢリンパ球、Ｔリンパ球、抗体、および、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用により行われる。まず、外来抗原はＡＰＣによるプロセシングを受け、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合され、ヘルパーＴ細胞に提示される。ヘルパーＴ細胞によりＭＨＣに結合した外来抗原が認識されることにより、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化も促す。分泌された抗体および活性化されたキラーＴ細胞により抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。
抗原を発現する細胞のＴ細胞による排除は主に、１）体液性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により特異的Ｂ細胞クローンの増殖・分化が刺激され抗体が産生され、抗体が抗原の認識と排除に働く）、２）特異的細胞性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により抗原特異的に反応する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導され、直接標的に作用する）、および、３）非特異的細胞性免疫（活性化ヘルパーＴ細胞により非特異的なナチュラルキラー細胞や活性化マクロファージ等が誘導されて働く）に分類することができる。以上のようにＴ細胞が中心的な役割を果たして、標的となる抗原を認識し免疫応答が動員される。
腫瘍拒絶においても、先天性および自己由来の腫瘍細胞、または、その断片誘導体を用いた適当な免疫化により宿主細胞において抗腫瘍免疫応答が誘導されることが古くから知られている（Ｌ．Ｇｒｏｓｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：３２６−３３３（１９４３）；Ｅ．Ｊ．Ｆｏｌｅｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：８３５−８３７（１９５３）；Ｒ．Ｔ．Ｐｒｅｈｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｍａｌｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１８：７６９−７７８（１９５７）；Ｇ．Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０：１５６１−１５７２（１９８０）；Ｌ．Ｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：８０−１０６（１９６２）；Ａ．Ｇｌｏｂｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．３２：１２２９−１２４３（１９６４））。このような抗腫瘍免疫システムにおけるＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の役割が注目されている（Ｒ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：８９−１５５（１９８４）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８））。特異的に免疫化されたマウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて腫瘍標的細胞を破壊することができ（Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３１：７７−１２４（１９８０））、免疫化されたドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の受身的な転移（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）は感受性マウスに腫瘍移植に対する抵抗性を与える（Ｒ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：８９−１５５（１９８４）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｃ．Ｊ．Ｍ．Ｍｅｌｉｅｆ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１４３−１７５（１９９２））ことが報告されている。さらに、抗ＣＤ８＋抗体は予め免疫化されたマウスの腫瘍移植に対する抵抗性を消失させる（Ｅ．Ｎａｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ａ．Ｕｅｎａｋａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：３４５−３５５（１９８５）；Ｘ．Ｇ．Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３８５−３３９０（１９９８）；Ｙ．Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：２２１９−２２２３（１９９４））ことも知られている。ここ十年で、マウスおよびヒトの腫瘍細胞由来でＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドが明らかにされてきた（Ｔ．Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７−３６８（１９９４）；Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−２８７（１９９９））。
腫瘍抗原、即ち腫瘍細胞上の標的分子には、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される腫瘍ペプチドで細胞性免疫の主役であるＣＤ８＋ＣＴＬの標的である分子（腫瘍拒絶抗原）、および、腫瘍細胞膜に発現する腫瘍関連抗原と呼ばれる体液性免疫（抗体）の標的となる分子の２つの形態が存在する。Ｔリンパ球に認識されるヒト腫瘍抗原が遺伝子レベルで明らかにされて以来、種々のヒト腫瘍拒絶抗原が見出されている。メラノーマにおいて、腫瘍拒絶抗原を用いた特異免疫療法としてのワクチン療法による明らかな抗腫瘍効果も認められている。更に、サイトカインを併用しての免疫療法効果の増強や、抗原ペプチドをパルスした樹状細胞、または、抗原遺伝子を導入した樹状細胞の応用も試みられており、最近ではＤＮＡワクチンも試みられている。
また、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるヘルパー作用を増大させる方法も多数、試みられている（Ｄ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８）；Ｒ．Ｆ．Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６９−２７６（２００１））。従来の方法は３つに分類することができる。１つは、例えば抗原のハプテン化（Ｙ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７４：１２６９−１２７３（１９８５））、または、抗原に異種免疫原性ペプチドを直接連結させる方法（Ｒ．Ｗ．Ｃｈｅｓｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｓｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄｓ．Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．８４７−８７４；Ｊ．Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１５５８−１５６５（２００１））等の免疫抗原自体の修飾である。第２の方法は、腫瘍抗原と、腫瘍抗原をコードするウイルスベクター（Ｍ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：４６８５−４６９２（１９９５））等の強いヘルパー決定基を持つ分子との共免疫化による方法である（Ｒ．Ｒｏｍｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５１３３−５１３７（１９９８）；Ｎ．Ｃａｓａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１７８０−１７８９（２００１））。最後の方法は、ＣＤ４０リガンド（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４７４−４７８（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４７８−４８０（１９９８）；Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３９３：４８０−４８３（１９９８））、および、ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルパー機能およびＡＰＣのＣＤ４＋Ｔ細胞との相互反応を調節するその他の刺激性または共刺激性シグナル（Ａ．Ｐｏｒｇａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１０７５−１０８２（１９９８））等の分子シグナルの発見に基づく方法であり、この発見によりＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を増大させる方法が提供されると考えられている。
一方、抗体は従来、抗腫瘍エフェクター機能に関しては大した役割を有さないと考えられていたが、腫瘍抗原が細胞性免疫および体液性免疫の両方を含む強い完全な免疫応答を誘導することも明らかになってきている（例えば、Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６２５−６３０（２０００）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２１９８−１２２０３（２０００）など）。腫瘍に対するワクチンとなり得る腫瘍関連抗原を同定する方法として、近年Ｍ．Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７））によりＳＥＲＥＸと呼ばれる方法が開発された。該方法は、ヒト血清を用いてヒト腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリーの検索を行うものであり、インターネットには、ＳＥＲＥＸ法により同定された遺伝子がＳＥＲＥＸデータベースとして１８００種を超えて登録されている（ｗｗｗ．ｌｉｃｒ．ｏｒｇ／ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌ）。
しかし、同定された抗原ペプチドやＤＮＡによりいかに効率良く腫瘍特異免疫を誘導し、腫瘍を完治させるためにどのようなアジュバントやＡＰＣを用いるべきか、腫瘍の免疫系からの逃避にどのように対処するかといった多数の問題についての解決は未だなされていない。
ところで、ＣＴＬの定量的／定性的な増幅におけるヘルパーＴ細胞の必要性が良く報告されているが、それらにより認識される抗原分子の性質、および、抗腫瘍免疫応答に対する機能的影響については未だにほとんど知られていない（Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：６５−７０（１９９７）；Ｒ．Ｆ．Ｗａｎｇ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６９−２７６（２００１）；Ｃ．Ｆａｙｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０６９−４０７３（１９９１）；Ｍ．Ｓｈｉｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１５４９−１５５６（１９９４）；Ｋ．Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２３５７−２３６８（１９９８）；Ｆ．Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２（１９９８）；Ｙ．Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５００５−５０１１（１９９６）；Ｔ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：６１７−６２７（１９９９）；Ｄ．Ｒ．Ｓｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５６２−５６５（２０００）；Ａ．Ｆｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１４５−１５０（２０００）；Ｃ．Ｎ．Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：３９０２−３９１２（２０００）；Ｆ．Ｆａｌｌａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５４９５−５５０１（２０００）；Ａ．Ｌ．Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１０７１−３３９０（１９９９）；Ａ．Ｌ．Ｍａｒｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：６０４７−６０５５（２０００））。最近提案されているヘルパーＴ細胞、ＣＴＬおよびＡＰＣ間の連続的な細胞間相互作用では、抗腫瘍免疫応答に関係するヘルパーＴ細胞が、広い範囲にわたる多様な抗原を認識する可能性が示唆されている（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８−４８０（１９９８）；Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０−４８３（１９９８）；Ｚ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：５４１−５５０（２０００））。
上記において述べたＳＥＲＥＸ法によりヒトおよびマウス腫瘍における体液性免疫応答の分析が大幅に進められている（Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７）；Ｅ，Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６２５−６３０（２０００）；Ｅ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２１９８−１２２０３（２０００）；Ｕ．Ｓａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１８１０−１１８１３（１９９５）；Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１６３−１１６７（１９９８）；Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，（２０００）ｉｎ  ″Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ″，ｅｄ．Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）ｐｐ．５５７−５７０；Ｔ．Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８：８４５−８５１（２０００））。ＳＥＲＥＸ法により同定された遺伝子の多くが完全に配列決定した場合に野生型と同じ配列、即ちアミノ酸置換等を有さないことが報告されている（Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１１６３−１１６７（１９９８）；Ｙ．−Ｔ．Ｃｈｅｎ，（２０００）ｉｎ  ″Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ″，ｅｄ．Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）ｐｐ．５５７−５７０）。従って、これらの分子は変異により免疫原性を示すものではなく、また幾つかのＳＥＲＥＸ抗原は普通の組織において腫瘍における限定的な発現（例えば、癌／精巣抗原およびメラニン細胞分化抗原等）を示すが、ほとんどのＳＥＲＥＸ同定抗原は普遍的に発現されている。しかしながら、これらの野生型分子に対して高い力価を有する抗体が関連または非関連癌患者の血清試料中で、健常者と比べてより多く見つかっている。現在のところ、これらの腫瘍産物の増幅された発現が体液性免疫を誘起する免疫原刺激であるとされている。これらの分子の全てがＩｇＧクラスの抗体により検出されるので、これらの野生型分子のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による認識が考えられる。上記知見を勘案し、本発明者らは腫瘍細胞の免疫原性野生型分子がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化することにより腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを増幅させることができるか、即ち抗腫瘍免疫応答に関与することを明らかにした（Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（２５）：１４５７１−１４５７６（２００１））。
ＤＮＡワクチンに関しては、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡの筋肉内投与により体液性および細胞性免疫応答の両方が誘発されることが証明されている。ＤＮＡワクチンが免疫応答を誘発する正確な機構は現在のところ不明であるが（Ｐａｒｄｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５−１６９（１９９５）参照）、その有効性は、体液性および細胞性免疫の誘発により示される。この結果は、ＤＮＡワクチンの投与後にｎａｋｅｄ  ＤＮＡが発現され、そのペプチド産物がＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ蛋白質と共に抗原として提示されることを示す。
ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターがＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と結合したウイルスまたは細菌等の由来の外来ペプチドを抗原として認識することにより、各種リンホカイン産生および細胞増殖等の反応を促し、ペプチドが由来するウイルスまたは細菌等に感染した細胞を殺すことが知られている。これらの抗原ペプチドは、その病原体中での存在場所や機能に関係なくＡＰＣまたは他の細胞が細胞内に取込み、処理した断片である。人工的にＣＴＬ応答を生じさせるためには、細胞内で蛋白質抗原を産生させる複製ベクターを用いる（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：１５３（１９９０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６（１９９１）；Ａ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４７９（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２６７９（１９９２））か、または、細胞質ゾル中にペプチドを導入する方法（Ｆ．Ｒ．Ｃａｒｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：８７３（１９９０）；Ｄ．Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２３５７（１９９２））が知られている。
また、ｎａｋｅｄポリヌクレオチドをワクチンとして脊椎動物に接種する方法が検討されている（ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）。マウス腹腔内、静脈内または筋肉内に投与された塩化カルシウム沈殿ＤＮＡが発現され得ることが公知である（Ｎ．Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ａｎｄ  Ｌ．Ｒｅｓｈｅｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９５５１−９５５５（１９８６））。マウスにおいて、ＤＮＡ発現ベクターを筋肉内注射することにより筋肉細胞に該ベクターが取込まれ、細胞内で該ベクターの発現が起こることが示された（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５（１９９１））。この場合、該ベクターはエピソームとして維持され、複製はされなかった。ラット、魚および霊長類の骨格筋、並びに、ラット心筋への注射後には永続性の発現が観察された（Ｈ．Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２９０：７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３（１９９２））。また、ＡＰＣ表面のＢ７およびＭＨＣのエピトープの提示が、腫瘍除去の際のＣＴＬ活性化において同程度の役割を果たすことが報告されている（Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１１１７−１１１９（１９９３））。この際に、ＡＰＣ表面のＭＨＣ分子がＴ細胞レセプターにエピトープの提示を行うと、同じＡＰＣ表面上に発現されているＢ７がＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８に結合し、第２のシグナルとして作用する。その結果、ＡＰＣを壊すＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させるシグナルを発するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が急速に分裂する。
ＤＮＡによる免疫化のためには、ＤＮＡの筋肉内投与の形態を必ずしも取る必要はなく、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで被覆した金粒子をマウスの皮膚に投与することによりマウスで抗ＢＧＨ抗体が産生されることがＴａｎｇらにより示された（Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４（１９９２））。また、皮膚以外にもジェット注射器を使用して生きている動物の筋肉組織、脂肪組織および乳腺組織等をトランスフェクトすることができることが報告されている（Ｆｕｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０５：３６５−３６８（１９９２））。核酸を生体内へ導入し得る種々の方法が総説（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））としても発表されている。ＷＯ９３／１７７０６には、動物にウイルスに対するワクチン摂取する方法として、担体粒子を遺伝子構築物で被覆し、被覆した粒子を動物の細胞内に投与する方法が記載されている。ヘルペスウイルスに対するＤＮＡ免疫化（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７（１９９３））等が報告されている。また、ＤＮＡワクチン、並びに、その製造法および投与法等については米国特許第４，９４５，０５０号、第５，０３６，００６号、第５，５８９，４６６号、および、ＷＯ９４／１６７３７等にも記載されている。
【発明の開示】
本発明の目的は、腫瘍に対するより有効な免疫療法を提供することであり、早期癌の根治療法、術後の癌の再発または転移の抑制療法、および腫瘍が発見されながらも手術が不可能で放射線および化学療法も有効でない患者に対する治療法を提供することである。
本発明は、腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンに関するものであり、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードする発現ベクターおよび好ましくはインターフェロンガンマをコードする発現ベクターをポリヌクレオチドワクチンとして用いることにより腫瘍特異免疫を誘導することができるという発見に基づくものである。従って、本発明はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞より認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原さらに好ましくはインターフェロンガンマをコードする発現ベクターを含む組成物に関する。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原は好ましくはＳＥＲＥＸ法により見つけられた分子であり、さらに好ましくは普通の組織において腫瘍における限定的な発現を示すＳＥＲＥＸ抗原であり、特に癌／精巣抗原として分類されているＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４などが挙げられる。本発明者はすでに、ＳＥＲＥＸ抗原と腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原とを同時に提示することにより腫瘍特異免疫を強力に誘導できることを示した（Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８（２５）：１４５７１（２００１））が、一方ではＳＥＲＥＸ抗原のみの提示の場合にはむしろＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性を抑制する結果として腫瘍特異免疫を抑制すること、およびその抑制はインターフェロンガンマの同時発現によって阻止されることを発見した（特願２００２−２５４９６７、Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００（１９）：１０９０２（２００３））。
従って、これに限定されるわけではないが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原、さらに好ましくはインターフェロンガンマは好ましくは同じ細胞で発現され、提示されることを可能とするようにそれらをコードする発現ベクターは同一の担体粒子上に固定され、細胞内へ投与されるものである。
本明細書中に記載の「ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原」とは、成熟したヘルパーＴ細胞、および、その前駆体細胞上に発現する糖タンパク質ＣＤ４＋のエピトープとなる部分を含むポリペプチドを指す。Ｔ細胞受容体がＭＨＣクラスＩＩにより提示された抗原を認識する際に、ＣＤ４はＭＨＣクラスＩＩのβ２ドメインに結合し、Ｔ細胞の抗原認識能を高め、細胞内にシグナル伝達し、増殖やサイトカインの分泌を促進する働きを持つ分子である。本発明では、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に認識される分子のうち特にＳＥＲＥＸ法により同定される分子である。これらに限定されるわけではないが、例えば癌／精巣抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４や熱ショックタンパク質であるＤｎａＪ−ｌｉｋｅ  ２、ＤＮＡリガーゼ１、ガレクチン１および、ｐｏｌｙ（Ａ）結合タンパク質、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘキサメチレン−ビス−アストアミド誘導性タンパク質、ヒトレチノイン酸応答性蛋白質（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ肝炎デルタ抗原反応蛋白質Ａ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ；ＤＩＰＡ）、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ２０６４４  ｆｉｓクローンＫＡＴ０２５８８（ＦＬＪ２０６４４ｆｉｓ）等を挙げることができる。ＳＥＲＥＸ法により同定される分子のほとんどは、健常者にも普遍的に発現している野生型分子であるが、健常な組織に対する無用な免疫応答を回避するためには腫瘍に限定的に発現するＳＥＲＥＸ同定分子が好ましく、例えば癌／精巣抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１やＭＡＧＥ−Ａ４は特に好ましい。
また、本明細書中の「腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原」とは、腫瘍に関連した抗原、あるいは特定の腫瘍細胞に特異的に発現している抗原を指し、癌と精巣のみに発現する抗原としてＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１など、発癌の過程において変異した遺伝子産物に由来する癌特異的変異抗原としてＣＤＫ４、ＭＵＭ−１、ＣＡＳＰ−８、ｒａｓ、ｂｃｒ−ａｂｌなど、特定組織に限局して発現する組織特異的抗原としてＭＡＲＴ−１、ＴＲＰ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、プロテイナーゼ３など、癌に高発現するタンパク質抗原としてＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＳＡＲＴ１など、ウイルス抗原としてＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ−１などが挙げられる。ここで腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原はその全長タンパク質であっても良いし、免疫原性を示す断片であってもよい。
腫瘍特異性抗原や腫瘍関連抗原は、各種の癌で特徴的な発現を示し、例えばＨｅｒ２／ｎｅｕは乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌などで２０〜３０％の発現率である。また、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、乳癌、卵巣癌、食道癌の２０〜３０％に、ＭＡＧＥ−Ａ４は頭頚部癌、食道癌の５０〜６０％、肺癌の２０％に、ＳＡＧＥは肺癌、食道癌、頭頚部癌の２０％に発現している。従って、これらの癌の治療に供する癌ワクチンに用いる腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原としては上記の高発現抗原が特に好ましい。さらに、ＮＹ−ＥＳＯ−１やＭＡＧＥ−Ａ４など癌／精巣抗原の中には、ＭＨＣクラスＩに結合してＣＤ８＋ＣＴＬを刺激する抗原部位と、ＭＨＣクラスＩＩに結合してＳＥＲＥＸ抗原と同定される抗原部位とを同一分子中に有するものが複数知られており、これらは特に好ましい抗原である。
さらに、ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞を活性化する腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原は本発明によるワクチンが投与される宿主動物のＭＨＣクラスＩに結合して初めてその機能を果たすものであるが、宿主動物がヒトである場合にＣＤ８＋ＣＴＬ細胞の活性化抗原は各人が有するＨＬＡ−ＡまたはＢまたはＣ座のクラスＩ分子に結合しなければならない。ちなみに抗原提示に重要であると考えられているＨＬＡ−Ａ座に関しては２３種類のタイプが知られており、日本人を含むモンゴリアンはＡ２４やＡ２と呼ばれるタイプが多くて７０％以上を占め、北米白人などのコーカシアンはＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ２９など、アフリカンはＡ３０やＡ２が多い。Ｈｅｒ２／ｎｅｕはその分子内にＨＬＡ−Ａ２やＨＬＡ−Ａ２４に結合するエピトープを有することが知られており、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼなどの組織特異的抗原やＭＡＧＥ−３（Ａ３）、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１などの癌／精巣抗原もＡ２に結合するエピトープを有することが知られている。また、チロシナーゼやＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＡＧＥなどの癌／精巣抗原はＡ２４に結合するエピトープを有することが知られている。従って、本発明によるワクチンを宿主動物に接種する際には腫瘍におけるこれらの抗原の発現とともに宿主動物個体のＭＨＣのタイプを調べてそれに合致する抗原を選択することが好ましい。
ここでより具体的には、各抗原についてのＧｅｎｂａｎｋデータベース登録番号を以下に示す。
ＮＹ−ＥＳＯ−１：ＡＪ００３１４９
ＢＡＧＥ１：ＡＦ４９９６４７
ＧＡＧＥ１：ＮＭ＿００１４６８
ＧＡＧＥ２：ＮＭ＿００１４７２
ＧＡＧＥ８：ＮＭ＿０１２１９６
ＳＡＧＥ：ＮＭ＿０１８６６６
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ：Ｍ１１７３０，ＮＭ＿００４４４８，ＮＰ＿００４４３９
ＭＡＧＥ−Ａ３：ＮＭ＿００５３６２
ＭＡＧＥ−Ａ４：ＮＭ＿００２３６２
ＭＡＧＥ−Ａ１２：ＮＭ＿００５３６７
ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ  ２：ＮＭ＿００１５３９，ＮＰ＿００１５３０
ＰＲＡＭＥ：ＮＭ＿００６１１５
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓヘキサメチレン−ビス−アストアミド誘導性タンパク質：ＸＭ＿００８３４８
ヒトレチノイン酸応答性蛋白質：Ｕ５０３８３
ＤＩＰＡ：ＸＭ＿００６５０３
ＦＬＪ２０６４４ｆｉｓ：ＡＫ０００６５１
本発明において抗原をコードするポリヌクレオチドは、本発明の方法により宿主動物に投与することにより所望の免疫応答を生じさせ得る限り、特に限定されるものではなく、ＤＮＡまたはＲＮＡ等であり得る。本発明の抗原をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが所望の免疫応答を宿主において生じさせることができる限り、そのヌクレオチド配列が配列部位特異的変異誘発法等の公知の手法により（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５参照）人工的に１以上のアミノ酸配列を欠失・置換・挿入・付加されたものでもよい。また、所望の免疫応答を宿主動物において生じさせ得る限り、自然界に存在する変異を有したポリペプチドをコードするものであっても良い。このような天然に存在する変異体は、公知のハイブリダイゼーション技術（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４参照）、および、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４参照）を利用して単離することもできる。
また、抗原蛋白質をコードする遺伝子が知られている場合に、その蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性領域を解析し（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１２２（１９８２））、二次構造を解析し（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６（１９７８））アミノ酸配列中の抗原性領域を推定すること（例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−５４６（１９８５）参照）、そして、推定されたアミノ酸配列のペプチドを合成しその抗原性をＰＥＰＥＳＣＡＮ法（Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）；特表昭６０−５００６８４号公報）等により決定することは当業者が容易に行い得ることである。従って、前記方法に基づき決定されたエピトープ部分を含むペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを化学合成等の手法により製造して本発明の抗原の発現ベクターとして用いることもできる。
本発明において用いられる発現ベクターは、本発明の抗原遺伝子および好ましくはインターフェロンガンマ遺伝子を組込んだ組換えベクターであり、これらの遺伝子を挿入するベクターとしてはプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、および、当分野において従来用いられるその他のベクターを例示することができる。当業者であれば、例えば、ｅｄｉｔ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．、および、上述のＡｕｓｕｂｅｌらにより編集された文献に記載の技術により様々なプラスミドおよびベクターを構築することが可能である。
ここで用いるプロモーター、ターミネーター等の宿主内における発現制御を行う因子は、当業者であれば宿主の種類および目的に応じて公知の制御配列から適宜選択し、抗原遺伝子の上流および／または下流に配置することが可能である。従って、抗原由来の制御配列を用いてもよいし、異種の制御配列を用いることも可能である。また必要であれば、抗生物質耐性マーカー等のマーカーを本発明の発現ベクター中で用いることも可能である。多数の市販のベクターを利用することができるが、本発明において必須ではないポリヌクレオチド配列を除去することが好ましい。インターフェロンガンマ遺伝子の発現ベクターについても同様である。また、本発明で用いるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原をコードするポリヌクレオチド、および、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原をコードするポリヌクレオチドおよびインターフェロンガンマをコードするポリヌクレオチドは、同一細胞内で発現されるよう調節されている限り、各々異なる発現ベクターに含まれていても、１つの発現ベクターから発現されるように構成されていてもよい。
本発明のワクチンは、動物組織内への導入により、本発明の抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を誘導し、所望の免疫応答を誘起するものである。核酸を生体内へ導入する種々の方法が知られており（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））、本発明の抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を誘導し、所望の免疫応答を誘起するものである限り、どのような導入方法を採用することもできる。
本発明の組成物はワクチンとして有用であり、ｎａｋｅｄプラスミドとして使用でき、リポソーム内にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクターおよびＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（例えば、Ｋ．Ａｄｏｌｐｈ″ウイルスゲノム法″ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ（担体）に被覆して用いることができる。これに限定されるわけではないが、好ましくは遺伝子銃等により生体内に導入される金粒子等の担体粒子上に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原および好ましくはインターフェロンガンマを発現させるベクターを付着させた形態のものである。ポリヌクレオチドで担体粒子をコートする技術は公知である（例えば、ＷＯ９３／１７７０６参照）。最終的にポリヌクレオチドは、生体への投与に適する生理的食塩水等の溶液中に調製することができる。また、免疫応答を増幅するために当分野において公知の蛋白質、または、他の担体等のアジュバントと一緒に本発明の組成物を用いてワクチンとしてもよい。その他、プラスミドの細胞内取り込みの助けとなるカルシウムイオン等の薬剤を併用することも可能である。その他、必要に応じトランスフェクションを容易にする医薬的に許容される薬剤を併せて用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドワクチンは、投与された宿主動物中で免疫応答を引き起こす方法であれば、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、本発明の組成物は適当な非経口経路、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、または、ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により宿主動物内において免疫応答を引き起こすのに十分な量で投与される。また、本組成物をｅｘ  ｖｉｖｏでリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法、または、ウイルス感染等を利用して血液細胞、および、骨髄由来細胞（ＡＰＣ等）等に投与して、該細胞を動物に再導入することにより宿主動物を免疫化してもよい。前述の投与方法のうち、加速粒子による遺伝子形質転換技術は米国特許第４，９４５，０５０号にも記載されており、その改良法に基づく装置も市販されている（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。中でも樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）にｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションさせ、体内に戻すことにより、より好ましい結果が得られる。
本発明の宿主動物の種類は、本発明の組成物により腫瘍免疫応答が増強される限り特に限定されるものではないが、特に、マウス、ラット、ウシ、ブタ、並びに、サルおよびヒト等の霊長類を含む哺乳動物が挙げられる。特に霊長類、中でもヒトが本発明の好ましい宿主動物である。
本発明の組成物の投与量は組成物中の成分の宿主における免疫原性に依存するが、一定量の組成物を試験動物に投与し、ＥＬＩＳＡ等の検定法により抗体力価を測定するか、クロム放出測定法等によりＣＴＬ応答を検出するか、または、サイトカイン放出測定法を使用してＴｈ応答を検出して、免疫応答を観察することにより当業者であれば免疫化に必要な適当な量を決定することができる。組成物中の成分の免疫原性が、本発明の発現ベクターで用いる転写および翻訳プロモーター等の制御配列の強さにも依存するものであることが当業者には理解される。そして当業者であれば、使用する発現ベクターの種類に応じ本発明の組成物の投与量を調節することも容易に行い得る。
従って本発明は、臨床において有用な生体内で腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンを提供するものである。より詳細には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原および好ましくはインターフェロンガンマをコードする発現ベクターを含むポリヌクレオチドワクチンおよび使用方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明にかかる組成物の、ＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙの結果を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  続いて実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１  ＮＹ−ＥＳＯ−１に含まれるヘルパーエピトープによるＨＥＲ２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増強効果
［方法］
１）プラスミド
以下の遺伝子を発現用ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んだプラスミドを作製し、大腸菌を用いて発現させ、精製した。それぞれを１μｇ／μｌに調製し、金粒子にコーティングして、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ  Ｓｙｓｔｅｍによる免疫に用いた。
・１４７ＨＥＲ２：ｃ−ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２）のＮ末端から１４７アミノ酸をコードする遺伝子
・ｐ６３（Ｔ）ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ：ＨＥＲ２のＣＴＬエピトープであるＨＥＲ２ｐ６３（Ｔ），ＴＹＬＰＴＮＡＳＬのみをコードする遺伝子
・ＮＹ−ＥＳＯ−１：ＣＴ抗原であるＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする遺伝子
・ｍＩＦＮ−ｇ：マウスインターフェロンガンマをコードする遺伝子
２）実験プロトコール
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに以下の群で２週間隔で２回免疫し（各群４匹）、一週間後に各群２匹をｓａｃｒｉｆｉｃｅし、脾臓よりＣＤ８陽性Ｔ細胞をＭＡＣＳ  ｓｙｓｔｅｍを用いて調製した。ＨＥＲ２ｐ６３（Ｔ）ペプチドをパルスしたＰ１．ＨＴＲ（ＤＢＡ／２マウス由来のｍａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）を標的細胞として、ＩＦＮ−ｇ産生細胞を検出するＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙを行った。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌには、ＨＥＲ２ｐ７８０（ＰＹＶＳＲＬＬＧＩ）ペプチドをパルスしたＰ１．ＨＴＲを用いた。実験は各々２回ずつ行った。
（実験１）
・１４７ＨＥＲ２
・１４７ＨＥＲ２＋ｍＩＦＮ−ｇ
・１４７ＨＥＲ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１
・１４７ＨＥＲ２＋ｍＩＦＮ−ｇ＋ＮＹ−ＥＳＯ−１
（実験２）
・ｐ６３（Ｔ）ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ
・ｐ６３（Ｔ）ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ＋ｍＩＦＮ−ｇ
・ｐ６３（Ｔ）ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ＋ＮＹ−ＥＳＯ−１
・ｐ６３（Ｔ）ｍｉｎｉ  ｇｅｎｅ＋ｍＩＦＮ−ｇ＋ＮＹ−ＥＳＯ−１
［結果］
下表および図１に結果を示す。
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【産業上の利用の可能性】
上記のように、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞により認識される抗原、および腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原または細胞関連抗原の組み合わせ、例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕとＮＹ−ＥＳＯ−１の組み合わせ、さらに好ましくはインターフェロンガンマの同時発現によりＩＦＮ−ｇ産生細胞数が著しく増加し、腫瘍特異的免疫が誘導されたことが明らかである。
【図１】
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【国際調査報告】
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