(57)【要約】新規耐糖能異常改善薬、および生活習慣病治療薬、特に抗糖尿病薬の提供、並びにそれらのスクリーニング法の提供。  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、および生活習慣病治療薬、特に抗糖尿病薬。ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと既知ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドとを用いた新規ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法。ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役Ｇタンパク質の共発現系を用いたＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法。
2004084944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とする血糖調節薬。
【請求項２】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、請求項１に記載の血糖調節薬。
【請求項３】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬。
【請求項４】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬が、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、又はその改変体である、請求項３に記載の耐糖能異常改善薬。
【請求項５】
生活習慣病治療薬である請求項３又は４に記載の耐糖能異常改善薬。
【請求項６】
糖尿病治療薬である請求項３又は４に記載の耐糖能異常改善薬。
【請求項７】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、請求項３〜６のいずれか記載の耐糖能異常改善薬。
【請求項８】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験物質を接触させ、該ＧＰＣＲ又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法。
【請求項９】
被験物質の存在下及び非存在下で、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、又はリガンドが結合し得るそれらのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該ＧＰＣＲ又は該フラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１０】
既知リガンドがＳＰＣである請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法。
【請求項１２】
反応系が、
（ｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、（ｉｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのＣ末端側にＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、（ｉｉｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、（ｉｖ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
既知リガンドの共存下で実施される、請求項１１又は１２に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
既知リガンドがＳＰＣであることを特徴とする請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、請求項８〜１４のいずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項８〜１５のいずれかに記載の方法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とするインスリン分泌調節薬。
【請求項１７】
請求項８〜１５のいずれかに記載の方法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬。
【請求項１８】
生活習慣病治療薬である請求項１７記載の耐糖能異常改善薬。
【請求項１９】
糖尿病治療薬である請求項１７記載の耐糖能異常改善薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドの新規医薬用途に関する。より詳細には、本発明はインスリン分泌調節のためのＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドの使用、例えば、耐糖能異常改善及び糖尿病などの生活習慣病の治療のためのＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬の使用に関する。本発明はまた、上記疾患の治療薬となり得る新規なＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  糖尿病はその病態から１型と２型に分類される。すなわち、１型は膵臓におけるインスリン分泌機能不全に基づく病態であり、２型はインスリン感受性組織におけるインスリン抵抗性と膵臓におけるインスリン分泌異常が主たる病態である。近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特に２型糖尿病患者の増加が著しい。
血糖調節において膵臓は中心的役割をはたすと考えられている。主要な血糖調節ホルモンであるインスリンは膵臓のランゲルハンス島のβ細胞から分泌される。β細胞は食後などに一過的に上昇する血糖に応答して迅速に必要量のインスリンを分泌する。筋肉、脂肪等の末梢組織では膵臓から分泌されたインスリンに応答して糖を取り込むことにより、上昇した血糖の調節を行っている。さらに、肝臓ではインスリンに応答して糖新生が抑制され、血糖の調節が行われている。このようなサイクルに破綻が生じることにより糖尿病が発症すると考えられている。事実、１型糖尿病の多くは、膵臓が自己免疫的に破壊されインスリン分泌不全になることにより血糖コントロールが不能になるものであり、２型糖尿病ではインスリン分泌における第一相の分泌不良が高血糖を招来することが知られている。
上述のような観点から、膵臓におけるインスリン分泌の促進は糖尿病病態の改善効果に大きく貢献すると考えられる。このような作用機序を持つ薬剤としては、現在のところスルホニルウレア剤などが上市されているが、血糖値に応じたインスリン分泌調節作用がないため、血糖が低下してもなおインスリン分泌促進効果が持続して低血糖に陥り、昏睡、さらには死亡を招く危険性がある。現在、血糖値に応じたインスリン分泌促進効果が得られるというような特徴をもつ安全な薬剤は上市されておらず、このような薬剤の開発が望まれている。
ところで、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）は、スフィンゴリン脂質の一種であり、細胞増殖、平滑筋収縮、創傷治癒等多彩な生理活性が知られている（米国特許第５３７４６１６号明細書；国際公開第９７／１１７０６号パンフレット；Ｙａｎ，Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５８２，８１−８８（２００２））。最近になって、ＳＰＣがＧ蛋白質結合受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＧＰＣＲ）のリガンド（アゴニスト）であることがわかった。該受容体としては、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４、ＴＤＡＧ８、及びＧＰＲ１２等が知られている（Ｙａｎ，Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５８２，８１−８８（２００２）；Ｄｅｇｍａｒ  Ｍｅｙｅｒ  ｚｕ  Ｈｅｉｎｇｄｏｒｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５８２，１７８−１８９（２００２）；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２３（３），９０７−９１４）。しかしながら、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４、ＴＤＡＧ８もしくはＧＰＲ１２等の受容体、又は該受容体のリガンドであるＳＰＣと、糖代謝制御との関係はこれまで全く知られていなかった。
【発明の開示】
したがって、本発明の目的は、糖代謝調節作用を有する化合物およびそのスクリーニング方法を提供することであり、それらを用いた耐糖能異常の改善方法、糖尿病を初めとする生活習慣病の治療薬を提供することである。
本発明者らは上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、正常人の膵臓ランゲルハンス氏島において発現局在する因子を同定した。すなわち、本発明者らは正常人の膵臓ランゲルハンス氏島に発現する遺伝子と正常状態のその他の諸組織に発現する遺伝子を比較することにより、正常人の膵臓ランゲルハンス氏島において発現局在する遺伝子を同定した。次に、該遺伝子がコードする蛋白質を調べたところ、スフィンゴシルホスホリルコリン（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；以下ＳＰＣと称する。）のレセプター、すなわちＳＰＣ活性化ＧＰＣＲである、ＯＧＲ１及びＧＰＲ４であることがわかった。
本発明者らは、次に、ＯＧＲ１及びＧＰＲ４等のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを介したシグナル伝達が膵臓におけるインスリン分泌に関与しているか否か、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのリガンド、すなわちＳＰＣが膵臓を介した抗糖尿病作用を発揮するか否かを検討した。その結果、ＳＰＣを食餌性肥満糖尿病モデルマウスへ投与したところ、ＳＰＣは糖負荷による血糖値の上昇に応じて一過的にインスリン分泌を促進し、顕著な耐糖能異常改善作用を示すことを見出した。
これらの結果は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの生理的リガンドであるＳＰＣのみならず、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有するあらゆる化合物、すなわちＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬が耐糖能異常改善作用及び糖尿病を含む生活習慣病の治療活性を有することを示している。
次に、本発明者らは、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はその発現細胞、および公知のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを用いて新規ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング系を構築し、本発明を完成するに至った。
本発明は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とする血糖調節薬、詳細には、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬に関する。すなわち、
〔１〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とする血糖調節薬、
〔２〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、〔１〕に記載の血糖調節薬、
〔３〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、
〔４〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬が、スフリンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）、又はその改変体である、〔３〕に記載の耐糖能異常改善薬、
〔５〕  生活習慣病治療薬である〔３〕又は〔４〕に記載の耐糖能異常改善薬、
〔６〕  糖尿病治療薬である〔３〕又は〔４〕に記載の耐糖能異常改善薬、
〔７〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、〔３〕〜〔６〕のいずれか記載の耐糖能異常改善薬、
別の本発明は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法に関する。すなわち、
〔８〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験物質を接触させ、該ＧＰＣＲ又は該フラグメントに結合する化合物を選択することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法、
〔９〕  被験物質の存在下及び非存在下で、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、又はリガンドが結合し得るそれらのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該ＧＰＣＲ又は該フラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法、
〔１０〕  既知リガンドがＳＰＣである〔９〕記載のスクリーニング方法、
〔１１〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、又はリガンドが結合し得るそのフラグメントが、それらが包埋された脂質二重層の形態で提供される、〔８〕〜〔１０〕のいずれか記載のスクリーニング方法。
また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲは三量体ＧＴＰ結合タンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）であり、共役するＧＴＰタンパク質αサブユニット（Ｇα）についても幾らかの知見が得られている。従って、本発明は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層及び共役するＧαを含んでなる反応系において、該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は共役Ｇタンパク質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法を提供する。すなわち、
〔１２〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットを含んでなる反応系において、該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応又は該Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法、
〔１３〕  上記反応系が、（ｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、（ｉｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのＣ末端側にＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが融合したポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、（ｉｉｉ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞、（ｉｖ）ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、それらの細胞のホモジネート又はそれらの細胞由来の膜画分である、〔１２〕記載のスクリーニング方法、
〔１４〕  上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でＧＴＰアナログを添加し、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットとＧＴＰアナログとの結合を両条件下で比較することを含む、〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１５〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが、アデニル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むものである、〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１６〕  上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でＡＴＰを添加し、アデニル酸シクラーゼ活性を両条件下で比較することを含む、〔１５〕記載の方法、
〔１７〕  上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞におけるｃＡＭＰ量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、〔１５〕記載の方法、
〔１８〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに共役し得るＧ蛋白質のαサブユニットが、ホスホリパーゼＣβと相互作用する領域を含むものである、〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔１９〕  上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下でホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸を添加し、ホスホリパーゼＣβ活性を両条件下で比較することを含む、〔１８〕記載のスクリーニング方法、
〔２０〕  上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における細胞内カルシウムイオンの量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、〔１８〕記載のスクリーニング方法、
〔２１〕  ｃＡＭＰ応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベクターをさらに含む上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における該リポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、〔１５〕記載のスクリーニング方法、
〔２２〕  ＴＰＡ応答エレメントを含むプロモーター領域の制御下にあるリポーター遺伝子を含む発現ベクターをさらに含む上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における該リポーター遺伝子の発現量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、〔１８〕記載のスクリーニング方法、
〔２３〕  上記（ｉ）〜（ｉｖ）の細胞における、リン酸化されたＥＲＫ  ＭＡＰキナーゼの量を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを含む、〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔２４〕  上記反応系に、被験物質の存在下及び非存在下で［３Ｈ］チミジンを添加し、細胞内への［３Ｈ］チミジン取り込み量を両条件下で比較することを含む、〔１３〕記載のスクリーニング方法、
〔２５〕  既知リガンドの共存下で実施される、〔１２〕〜〔２４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔２６〕  既知リガンドがＳＰＣである、〔２５〕記載のスクリーニング方法、
〔２７〕  ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２である、〔８〕〜〔２６〕のいずれか記載のスクリーニング方法、
さらに別の本発明は、上記のいずれかのスクリーニング方法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とする医薬品を提供する。すなわち、
〔２８〕  〔８〕〜〔２７〕のいずれかに記載の方法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを有効成分とするインスリン分泌調節薬、
〔２９〕  〔８〕〜〔２７〕のいずれかに記載の方法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする耐糖能異常改善薬、
〔３０〕  生活習慣病治療薬である〔２９〕記載の耐糖能異常改善薬、
〔３１〕  糖尿病治療薬である〔３０〕記載の耐糖能異常改善薬、
本発明のさらなる特徴及び本発明の利点について、以下の「発明の実施の形態」においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】  図１は、マウスの糖負荷後１３５分の血糖値を示す図である。すなわち、ＤＩＯ群に生理食塩水を投与した群（左カラム）；ＤＩＯ群にＳＰＣを投与した群（中央カラム）；正常群に生理食塩水群を投与した群（右カラム）について、それぞれ血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示した。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書において、「ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ」とは、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）がリガンド（アゴニスト）となって活性化され、かつ膵臓ランゲルハンス氏島において有意に発現しているＧＰＣＲを表し、具体的にはＯＧＲ１、ＧＰＲ４及びＧＰＲ１２が挙げられる。ＯＧＲ１、ＧＰＲ４及びＧＰＲ１２のアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列はそれぞれ公知であり、例えばヒトＯＧＲ１の配列はＧｅｎｅＢａｎｋに受託番号：Ｕ４８４０５として登録されている（配列番号：１および２）。またヒトＧＰＲ４の配列はＧｅｎＢａｎｋに受託番号：ＮＭ＿００５２８２として登録されている（配列番号：３および４）。また、ヒトＧＰＲ１２の配列はＧｅｎｂａｎｋに受託番号：ＮＭ＿００５２８８として登録されている（配列番号：７および８）。
ここで前記「有意に発現している」とは、他の組織における発現量と比較して、膵臓ランゲルハンス氏島における発現量が、約１．５倍以上であることを表す。
本発明において「ＯＧＲ１」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のＯＧＲ１の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えＯＧＲ１、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。
また、本発明において「ＧＰＲ４」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のＧＰＲ４の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えＧＰＲ４、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。
また、本発明において「ＧＰＲ１２」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のＧＰＲ１２の他、それらの自然もしくは人工の突然変異体、それらをコードするＤＮＡを含む組換え細胞から製造される組換えＧＰＲ１２、それらの機能的フラグメントの全てを包含する意味で使用される。
「ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド」とは、特にことわらない限り、生理的リガンドであるスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）だけでなく、アゴニスト（即ち、レセプターの生理的リガンド結合部位に結合して、リガンド様の活性を示す物質）やアンタゴニスト（レセプターの生理的リガンド結合部位に結合するが、リガンド様の活性を示さない物質）及びインバースアゴニスト（レセプターのいずれかの部位に結合してそのコンフォメーションを変化させ、レセプターを不活性化する物質）をも包含するものとする。例えば、Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＬＰＣ）は、ＧＰＲ４と結合することが知られているアゴニストである［Ｙａｎ，Ｘｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５８２，８１−８８（２００２）］。
「ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬」とは、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに結合して該レセプターの活性を促進する物質の総称として用いられ、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの生理的リガンドであるＳＰＣやそれらの改変体の他、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対するアゴニスト活性を有する公知及び新規のあらゆる化合物を包含する。好ましくは、該作動薬はＳＰＣ、又はＳＰＣの改変体を表す。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの生理的リガンドであるＳＰＣは、以下の式（１）：
2004084944.tif 000003
で表されるリン酸エステル化合物である。
ＳＰＣの改変体とは、式（１）で表される化合物の水酸基、アミノ基および／またはトリメチルアミノ基が、水酸基、メルカプト基、カルボニル基、チオカルボニル基、アミノ基、炭素数１〜４のアルキルアミノ基、炭素数１〜４のジアルキルアミノ基および炭素数１〜４のトリアルキルアミノ基から選択されるいずれかの基で置換され、かつＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬としての活性を維持している化合物を表す。また、式（１）で表される化合物の１−テトラデセニル基が任意の位置に１もしくは２個の二重結合を有する炭素数１２〜１８の直鎖アルケニル基に置換され、かつＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬としての活性を維持している化合物もまた、ＳＰＣ改変体の範疇に含まれる。これらの改変箇所は１箇所であっても複数箇所であってもよい。
また、ＬＰＣは、以下の式（２）：
2004084944.tif 000004
で表されるリン酸エステル化合物である。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬は、投与された動物において、血糖値の上昇に応答して一過的にインスリン分泌を促進して血糖値を低下させるが、血糖値の低下後にはインスリン分泌作用が低下するので、低血糖を引き起こすことがなく、安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬として有効である。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド又はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬は、医薬上許容される担体とともに経口的もしくは非経口的投与に適した剤形に製剤化される。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドもしくはＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を溶解させた液剤、有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドもしくはＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。ここで「有効量」とは、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を耐糖能異常患者、糖尿病患者または他の生活習慣病患者の治療のために使用する場合にそれぞれの疾患を改善させるのに十分な量をいう。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
当該ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド又はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬の製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド又はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬、および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド又はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬を有効成分とする本発明の製剤の投与量は、有効成分の種類、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを、例えば、成人１日あたり約０．０１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ投与することができる。
本発明はまた、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング系及びそれを用いた当該リガンドのスクリーニング方法を提供する。
本発明において、被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。被験物質は好ましくは分子量２００〜２０００の化合物であり、更に好ましくは分子量３００〜８００の化合物である。
本発明の、スクリーニング方法の第一の態様は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに被験物質を接触させる工程、及び該レセプター又はそのフラグメントに結合する化合物を選択する工程を含む。被験物質との結合活性は、例えば、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はそのフラグメントを発現する細胞膜画分をチップ上に固定し、該チップ上に被験物質溶液をロードして、表面プラズモン共鳴法により被験物質の膜への結合及び解離を測定し、結合及び解離の速度あるいは結合量から、被験物質とＳＰＣ活性化ＧＰＣＲとの親和性を算出することにより導かれる。
本発明のスクリーニング方法の第二の態様は、被験物質の存在下及び非存在下で、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はリガンドが結合し得るそのフラグメントに既知リガンドを接触させ、該レセプター又はそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性を両条件下で比較することを含む。既知リガンドとしては、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの生理的リガンドであるＳＰＣ等を用いることができる。ＳＰＣを既知リガンドとして用いた場合、例えばＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対する結合活性が、ＳＰＣよりも強い被験物質をＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬候補物質として選択することができる。該候補物質がＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬であることは、以下に述べるＧ蛋白質を用いるスクリーニング方法等により確認することができる。
上記のいずれの態様においても、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はそのフラグメントは、それらの発現細胞、該細胞の細胞膜画分、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態で提供され得る。ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの発現細胞としては、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞等が挙げられる。また、アフィニティーカラムとしては、抗ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ抗体カラム、既知リガンドを用いたカラム、また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲが組換えタンパク質として提供される場合、ＨｉｓタグやＧＳＴタグと特異的親和性を有する金属キレートもしくはグルタチオンカラムを用いることができる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲまたはそのフラグメントと既知リガンドとの結合活性の検出する方法としては、例えば、既知リガンド量を検出する方法、または既知リガンドを標識して、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲまたはそのフラグメントに結合した標識量を測定する方法が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２６１−２６７（２０００））。
既知リガンドの標識方法としては、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ等の放射性同位元素で標識する方法等が挙げられる。具体的には、コリン部分のＮ−メチル基の水素原子が３Ｈで、Ｎ−メチル基の炭素原子が１４Ｃで、またはリン原子が３２ＰでそれぞれラベルされたＳＰＣ又はＬＰＣを用いることができ、例えば、［Ｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ］ｃｈｏｌｉｎｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ＳＰＣ、［Ｍｅｔｈｙｌ−１４Ｃ］ｃｈｏｌｉｎｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ＳＰＣ、又は３２Ｐ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ＳＰＣが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７３，ｖｏｌ．２０，１６５９−１６６７；）。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲは、ある種の三量体Ｇ蛋白質と共役して細胞内にシグナルを伝達する。従って、本発明はまた、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層と、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧ蛋白質（特にＧαサブユニット）とを用いたＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＧαにおけるＧＴＰ・ＧＤＰ交換反応または共役するＧ蛋白質の細胞刺激活性を指標として行われる。Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を指標とする場合、共役させるＧαの態様に応じて、エフェクターの選択や活性測定方法等の具体的な手順が決定されるが、通常、アデニル酸シクラーゼと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｉファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えばｃＡＭＰ量を測定することにより、ホスホリパーゼＣβと相互作用する領域を含むＧα（具体的にはＧｑファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域を含む）を用いる場合には例えば細胞内カルシウムイオンの量を測定することにより、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドをスクリーニングすることができる。  また、Ｇαの供給源として該Ｇαを含む三量体Ｇ蛋白質（Ｇαβγ）を内因的に発現する動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ１．２細胞等）を用いる場合、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲによって活性化されたＧαβγはＧαとＧβγに解離するが、遊離のＧβγはホスホリパーゼＣβに相互作用して細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させ得るので、共役するＧαのファミリーに関係なく細胞内カルシウムイオンを指標にしてリガンドスクリーニングを行うことも可能である。
ここで、「ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ」とは、ヒト及び他の哺乳動物由来のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、及びそれらのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するタンパク質をいう。
具体的には、ヒト及び他の哺乳動物由来の「ＯＧＲ１」、「ＧＰＲ４」、「ＧＰＲ１２」及びそれらのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該ＧαのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するタンパク質を挙げることができる。
前記「ＯＧＲ１」は、ＯＧＲ１、又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の膜含有画分から、抗ＯＧＲ１抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＯＧＲ１のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗ＯＧＲ１抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、ＧＦＰ等の蛍光物質とＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの融合蛋白質を発現させることにより、ＧＦＰ陽性細胞、すなわちＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがトランスフェクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，２６１−２６７（２０００））。また、ＯＧＲ１のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はＯＧＲ１の特性を変化させない範囲で、ＯＧＲ１に適宜変異を導入することができる。
また、前記「ＧＰＲ４」は、ＧＰＲ４、又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の膜含有画分から、抗ＧＰＲ４抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＧＰＲ４のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗ＧＰＲ４抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、ＧＦＰ等の蛍光物質とＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの融合蛋白質を発現させることにより、ＧＦＰ陽性細胞、すなわちＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがトランスフェクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，２６１−２６７（２０００））。また、ＧＰＲ４のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はＧＰＲ４の特性を変化させない範囲で、ＧＰＲ４に適宜変異を導入することができる。
また、前記「ＧＰＲ１２」は、ＧＰＲ１２、又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の膜含有画分から、抗ＧＰＲ１２抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは、当該細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ＧＰＲ１２のｃＤＮＡクローンをプローブとして単離されるＤＮＡクローンを適当な発現ベクター中にクローニングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗ＧＰＲ１２抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、ＧＦＰ等の蛍光物質とＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの融合蛋白質を発現させることにより、ＧＦＰ陽性細胞、すなわちＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがトランスフェクトされた細胞のみを選択してスクリーニングに用いることも可能である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，２６１−２６７（２０００））。また、ＧＰＲ１２のｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。しかしながら、リガンド結合ドメインは高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者はＧＰＲ１２の特性を変化させない範囲で、ＧＰＲ１２に適宜変異を導入することができる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを保持する脂質二重層膜の由来は、当該レセプターが本来の立体構造をとることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。また、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαは、少なくとも該ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を有することが必要である。例えば、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαがＧｉファミリーに属する場合（Ｇｉα）には、用いるＧαはＧｉαのＧＰＣＲ結合領域を少なくとも有し、Ｇｉαのグアニンヌクレオチド結合領域もしくは他のファミリーに属するＧα由来のグアニンヌクレオチド結合領域を有するものである。ＧαのＸ線結晶構造解析の結果等から、ＧＰＣＲとの結合にはＣ末端の約５アミノ酸程度の配列が重要であり、一方、グアニンヌクレオチド結合領域は、ｒａｓ蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（Ｎ末端側から、Ｐボックス、Ｇ’ボックス、Ｇボックス、Ｇ″ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内のαＥヘリックスの先頭及びαＦヘリックスなど）であることが明らかになっている。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対する生理的リガンド又はアゴニストが該レセプターに結合すると、該レセプターのＧα活性化ドメインとＧαのＧＰＣＲ結合領域とが相互作用してＧαのコンフォメーション変化を生じ、グアニンヌクレオチド結合領域からＧＤＰが解離して速やかにＧＴＰを結合する。一方、インバースアゴニストが結合すると、レセプターのコンフォメーション変化によりＧα活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型のＧα−ＧＴＰレベルが減少する。ここで、ＧＴＰの代わりに３５Ｓ標識したＧＴＰγＳなどのＧαのＧＴＰａｓｅ活性によって加水分解を受けないＧＴＰアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのアゴニスト又はインバースアゴニストをスクリーニングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質はアゴニストであり、放射活性が減少すればインバースアゴニストである。
あるいは、ＧαへのＧＴＰアナログの結合を表面プラズモン共鳴法等を用いてモニタリングすることによってもスクリーニングが可能である。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのリガンドの活性は、共役するＧαのエフェクターへの作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに加えて、さらにエフェクターを含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、共役するＧαは該エフェクターと相互作用するための領域をさらに含む必要がある。当該領域はそのＧα本来のエフェクター相互作用領域であってもよいし、異なるファミリーに属するＧαのエフェクター相互作用領域であってもよい。例えばＧｉαに対しては異なるファミリーに属するＧαとしてＧｑα、Ｇｓα、Ｇ１２α等が挙げられ、Ｇｑαに対しては異なるファミリーに属するＧαとしてＧｉα、Ｇｓα、Ｇ１２α等が挙げられる。異なるファミリーに属するＧα（例えばＧｑα）のエフェクター相互作用領域を含むＧα（例えばＧｉα）キメラの最も簡便な例としては、ＧｑαのＣ末端の約５アミノ酸程度を、ＧｉαのＣ末端配列で置換したもの（Ｇｑｉα）が挙げられる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαがＧｉαのエフェクター相互作用領域を含む場合、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられる。一方、共役ＧαがＧｑαのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。尚、共役ＧαがＧｓαのエフェクター相互作用領域を含む場合は、エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを含む脂質二重層膜が用いられ、Ｇｉαの場合とは逆に、アデニル酸シクラーゼ活性の促進作用を指標としてリガンド活性が評価される。
エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼ（以下、ＡＣともいう）を含むスクリーニング系においては、Ｇαのエフェクターへの作用は、ＡＣ活性を直接測定することにより評価することができる。ＡＣ活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ＡＣを含む膜画分にＡＴＰを添加し、生成するｃＡＭＰ量を、抗ｃＡＭＰ抗体を用いてＲＩ（１２５Ｉ）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（ＦＩＴＣ、ローダミン等）等で標識したｃＡＭＰとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ＡＣを含む膜画分に［α−３２Ｐ］ＡＴＰを添加し、生成する［３２Ｐ］ｃＡＭＰをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法が挙げられるが、これに限定されない。ＧαがＧｉαの場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が増加すれば被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのインバースアゴニストであり、活性が減少すればアゴニストである。一方、ＧαがＧｓαの場合、被験物質の存在下及び非存在下でＡＣ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＡＣ活性が減少すれば被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのインバースアゴニストであり、活性が増加すればアゴニストである。
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、ＧαのＡＣへの作用は、細胞内のｃＡＭＰ量を測定するか、あるいは細胞を［３Ｈ］アデニンで標識し、生成した［３Ｈ］ｃＡＭＰの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内ｃＡＭＰ量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＣＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された動物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内ｃＡＭＰ量を評価するというものである。
従って、ＧαがＧｉαの場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのインバースアゴニストであり、減少すればアゴニストである。一方、ＧαがＧｓαの場合、被験物質の存在下で細胞内ｃＡＭＰ（もしくはＣＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのインバースアゴニストであり、増加すればアゴニストである。
一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβ（以下、ＰＬＣβともいう）を含むスクリーニング系（即ち、ＧαがＧｑαであるか又はＧｑαのエフェクター相互作用領域を含むキメラ蛋白質（キメラＧｑα）の場合）においては、該Ｇｑα又はキメラＧｑαのエフェクターへの作用は、ＰＬＣβ活性を直接測定することにより評価することができる。ＰＬＣβ活性は、例えば、３Ｈ標識したホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸をＰＬＣβ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下でＰＬＣβ活性を測定・比較し、被験物質存在下でＰＬＣβ活性が増加すれば該被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのアゴニストであり、活性が減少すればインバースアゴニストである。
スクリーニング系として無傷真核生物細胞を用いる場合は、Ｇｑα又はキメラＧｑαのＰＬＣβへの作用は、細胞に［３Ｈ］イノシトールを添加し、生成した［３Ｈ］イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内のＣａ２＋量を測定したりすることによっても評価することができる。細胞内Ｃａ２＋量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏｒ−３、Ｃａｌｃｉｕｍ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、ＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）システムが挙げられる。
別の態様として、Ｃａ２＋によりアップレギュレートされるＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答エレメント（ＴＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｃａ２＋量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＴＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ２＋量を評価するというものである。
従って、被験物質の存在下で細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＴＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのアゴニストであり、減少すればインバースアゴニストである。
上記のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役Ｇαとを用いたＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドのスクリーニング方法を、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対する既知リガンド、例えば、ＳＰＣ等の共存下で行えば、さらにＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対するニュートラルアンタゴニストを容易に選抜することができる。
また、別の態様として、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ依存的な種々の生理作用を指標として、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドをスクリーニングすることも可能である。該生理作用としては、ＭＡＰキナーゼの一種であるＥＲＫの活性化が挙げられる。具体的には、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの存在下に、被験物質がＥＲＫのリン酸化を促進するか否かを、リン酸化ＥＲＫ量をウェスタンブロッティング等で検出することによって測定する方法（Ｋａｂａｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７，１２１０９−１２１１４（２０００））が挙げられる。
また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＧＰＲ４である場合、ＧＰＲ４依存的なＤＮＡ合成促進活性（細胞増殖促進活性）を測定することによって、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＯＧＲ１である場合、ＯＧＲ１依存的なＤＮＡ合成抑制活性（細胞増殖抑制活性）を測定することによって、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＧＰＲ１２である場合、ＧＰＲ１２依存的な細胞増殖促進活性（ＤＮＡ合成促進活性）を測定することによって、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドをスクリーニングする方法が挙げられる。
具体的には、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの存在下に、［３Ｈ］チミジン取り込み量、もしくはＭＴＴ（（３−４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）の還元反応を測定することができる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（４４），ｐ４１３２５−ｐ４１３３５（２００１））。
また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲがＧＰＲ４の場合、血清応答エレメント（Ｓｅｒｕｍ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；ＳＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、Ｇ蛋白質の細胞刺激活性を評価する方法もある（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，２７３，７９０６−７９１０，（１９９９）；Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５，７８７−７９４（１９９９））。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、ＳＲＥを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核生物細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られる抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の方法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ｃａ２＋量を評価するというものである。従って、ＳＲＥ制御下にあるリポーター遺伝子の量が増加すれば、該被験物質はＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのアゴニストであり、減少すればインバースアゴニストである。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層膜、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の好ましい一実施態様は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターと、共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域を少なくとも含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターとでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
「ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ」は、ヒト及び他の哺乳動物由来のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ、あるいは該レセプターのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限はない。ヒトＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ  ｃＤＮＡのコーディング領域の他、ウシ、ブタ、サル、マウス、ラット等のヒト以外の哺乳動物由来のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ等が例示され、これらは、哺乳動物の膵臓、もしくは腎臓、肺の細胞由来のｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、ヒトＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのｃＤＮＡクローンをプローブとして単離され得る。また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲは、ヒトＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのｃＤＮＡクローンを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。
具体的には、ヒト及び他の哺乳動物由来の「ＯＧＲ１をコードするＤＮＡ」、ヒト及び他の哺乳動物由来の「ＧＰＲ４をコードするＤＮＡ」、ヒト及び他の哺乳動物由来の「ＧＰＲ１２をコードするＤＮＡ」、又はこれらのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、天然ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと同じリガンド−レセプター相互作用を示し、且つ共役するＧαを活性化して該サブユニットのＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが挙げられる。
Ｇαとしては、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するものであれば特に制限はない。Ｇαの各遺伝子は公知であり、容易に入手可能である。ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαを含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも共役ＧαのＧＰＣＲとの結合に関与する領域をコードする配列と、任意のＧαのグアニンヌクレオチドとの結合に関与する領域をコードする配列を有することが必要である。上述の通り、ＧαのＸ線結晶構造解析の結果から、ＧＰＣＲ結合領域及びグアニンヌクレオチド結合領域はよく知られており、当業者は、所望によりＧαのコーディング配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。
Ｇαのエフェクターへの作用を指標とするスクリーニング系においては、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαをコードするＤＮＡは、所望のエフェクターと相互作用するための領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む必要がある。エフェクターとしてアデニル酸シクラーゼを用いる場合は、該ＤＮＡはＧｉα（例えば、Ｇαｉ２）もしくはＧｓα（例えば、Ｇαｓ２）のエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４及びＧＰＲ１２はＧｉαのエフェクター相互作用領域を用いることができる。
一方、エフェクターとしてホスホリパーゼＣβを用いる場合には、該ＤＮＡはＧｑα（例えば、Ｇα１６）のエフェクター相互作用領域をコードするヌクレオチド配列を含む。各Ｇα遺伝子は公知であり、それらのエフェクター相互作用領域もよく知られている。従って、当業者は、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、容易にキメラＧα蛋白質をコードするＤＮＡを構築することもできる。当該キメラ蛋白質（例えば、Ｇｑｉα）をコードするＤＮＡの最も簡便な例としては、ＧｑαのｃＤＮＡのＣ末端の約５アミノ酸をコードする配列を、ＰＣＲ等の公知の手法を用いてＧｉαのＣ末端配列をコードするＤＮＡ配列に置換したものが挙げられる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαをコードするＤＮＡは、宿主真核生物細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、宿主真核生物細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター、バキュロウイルス由来ポリヘドリンプロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来細胞の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモーターに加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネーター領域の間にコーディングＤＮＡを挿入し得るように、適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを１箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現ベクターは、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。
本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしてはプラスミドベクターの他、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウイルスベクター等も挙げられる。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡと、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαをコードするＤＮＡは、２つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共トランスフェクトされてもよいし、あるいは、１つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに挿入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。
宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等の哺乳動物細胞、あるいは昆虫細胞であれば特に制限はない。具体的には、ＣＯＰ、Ｌ、Ｃ１２７、Ｓｐ２／０、ＮＳ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＳＴ２等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯ等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ３、ＣＯＳ７、ＣＶ１、Ｖｅｒｏ等のサル由来細胞、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ１０Ａ等のヒト由来細胞、およびＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ等の昆虫由来細胞などが例示される。
宿主細胞への遺伝子導入は、真核生物細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫細胞培養用培地等を用いて培養することができる。培地のｐＨは約６〜約８であるのが好ましく、培養温度は、通常約２７〜約４０℃である。
上記のようにして得られる、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαをコードするＤＮＡを導入された真核生物細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートや、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約１，０００×ｇ程度で遠心して上清を回収した後、約１００，０００×ｇ程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。
例えば、ＧＴＰγＳ結合アッセイや、エフェクターの活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内ｃＡＭＰ量（もしくはｃＡＭＰ応答性リポーターの発現量）や細胞内Ｃａ２＋量（もしくはＣａ２＋応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は無傷真核生物細胞である。
尚、リガンド活性の評価を、ｃＡＭＰ応答性リポーター（エフェクターがアデニル酸シクラーゼの場合）もしくはＣａ２＋応答性リポーター（エフェクターがホスホリパーゼＣβの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核生物細胞は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）またはＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ）を含むプロモーター領域の下流にリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。ＣＲＥはｃＡＭＰの存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＧＴＣＡを含む配列が挙げられるが、ｃＡＭＰ応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。一方、ＴＲＥはＣａ２＋の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列としてＴＧＡＣＴＣＡを含む配列が挙げられるが、Ｃａ２＋応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、挿入または付加を含む配列であってもよい。ＣＲＥ又はＴＲＥを含むプロモーター配列としては、上記のようなウイルスプロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いて、あるいはＰＣＲ等を利用して、該プロモーター配列の下流にＣＲＥまたはＴＲＥ配列を挿入することができる。ＣＲＥ又はＴＲＥの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出・定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。リポーター遺伝子の下流にはターミネーター配列が配置されることがより好ましい。このようなＣＲＥ（又はＴＲＥ）−リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクター又はウイルスベクターを使用することができる。血清応答エレメント（ＳＲＥ）の制御下にあるリポーター遺伝子含む発現ベクターについても、上記と同様に調製することができる。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層膜、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系の別の好ましい実施態様は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのＣ末端側に、共役ＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが連結した融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主真核生物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。前記融合蛋白質を用いるスクリーニングについては、公開特許公報：特開２００３−２１０１９２を参照して行えばよい。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαのＧＰＣＲ結合領域及び任意のＧαのグアニンヌクレオチド結合領域を含むポリペプチドをコードするＤＮＡは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらのＤＮＡ配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲとＧαとの融合蛋白質をコードするＤＮＡを構築することができる。簡潔にいえば、ＰＣＲ等を用いてＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡの終始コドンを除去したものに、ＧαをコードするＤＮＡを読み枠が合うように、即ちインフレームに、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする。この際、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲのＣ末の一部を欠失させたり、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲとＧαとの間にＨｉｓタグ等のリンカー配列を挿入したりしてもよい。
得られた融合蛋白質をコードするＤＮＡは、上述のような発現ベクター中に挿入され、宿主真核生物細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核生物細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、レセプターの細胞内第３ループ上のＧα活性化ドメインと共役Ｇαのレセプター結合領域とは、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲに対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、ＧαにおけるＧＤＰ・ＧＴＰ交換反応を促進し得る。従って、Ｇαは恒常的に活性化された状態となる。
レセプター−Ｇα融合蛋白質発現細胞を、Ｇαのエフェクターへの作用を指標にしたスクリーニングに使用する場合において、Ｇαがレセプターと連結していることがエフェクターとの相互作用の妨げとなる場合には、レセプターとＧαとのジャンクション部位に、特異的なプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列（例えば、トロンビン感受性配列等）を導入し、融合蛋白質を膜上に発現させた後に当該プロテアーゼを作用させてレセプターとＧαとを切り離すことができる。
レセプター−Ｇα融合蛋白質発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。
本発明のスクリーニング法のために提供される、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層膜、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系のさらに別の実施態様は、共役Ｇ蛋白質を内因的に発現する宿主動物細胞を、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトすることにより調製される細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。
ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを挿入する発現ベクター、該発現ベクターの宿主細胞への導入法は、上述の通りのものを使用することができる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明のスクリーニング系は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧ蛋白質を内因的に発現する動物細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。このような細胞としては、哺乳動物の膵臓もしくは腎臓、肺由来細胞が好ましく例示される。
本発明のさらに別の態様においては、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲを含む脂質二重層膜、及びＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役するＧαを構成要素として含有するスクリーニング系として、精製したＳＰＣ活性化ＧＰＣＲと共役Ｇα、あるいは精製した該レセプターと共役Ｇαとの融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲは、ヒト又は他の哺乳動物の膵臓もしくは腎臓、肺由来細胞から得られる膜画分から、抗ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。あるいは、該レセプターは、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することもできる。同様に、該レセプターと共役Ｇαとの融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ抗体や、Ｈｉｓ−ｔａｇ、ＧＳＴ−ｔａｇ等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等により精製することができる。
人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、コレステロール（Ｃｈ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）等が挙げられ、これら１種または２種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。
例えば、レセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリポソーム）は、ＰＣ：ＰＩ：Ｃｈ＝１２：１２：１の混合脂質クロロホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロロホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリウム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製したレセプターとＧα、又はレセプター−Ｇα融合蛋白質を、適量添加し、氷中で時々攪拌しながら２０〜３０分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約１００，０００×ｇで３０〜６０分間遠心して沈渣を回収することにより、プロテオリポソームを調製することができる。
上記の本発明のスクリーニング法により選択されるＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬は、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲの生理的リガンドと同様に、耐糖能異常改善作用を示すことは明白であり、従って、これらを適当な添加剤と組み合わせることにより、耐糖能異常改善薬とすることができる。従って、本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜されたＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬と、医薬上許容される担体とを配合させることによる、耐糖能異常改善薬、又は生活習慣病治療薬、特に糖尿病治療薬を提供する。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを溶解させた液剤、有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、肥厚剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。当該ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、ＳＰＣ活性化ＧＰＣＲリガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：正常人の膵臓ランゲルハンス氏島におけるＯＧＲ１及びＧＰＲ４の発現局在
（１）ウサギ由来ポリクローナル抗体の作成
ＯＧＲ１抗原ペプチドとして、アミノ酸配列：ＬＭＨＥＥＶＩＥＤＥＮＱＨＲＶＣ（配列番号：５）の部分ペプチドを公知の方法で合成し、マススペクトル及びＨＰＬＣにより配列を確認した。
公知の方法に従い、以下のスケジュールで動物を免疫し、抗血清からポリクローナル抗体の作成を行った。すなわち、ウサギ（ＫＢＬ  ＪＷ  １１週齢）２匹を用い、飼育１日目にＦＣＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅウサギ（ＫＢＬ  ＪＷ  １１週令）２匹を用い、飼育１日目にＦＣＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ｀ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）に溶解させた抗原ペプチド２００μｇ／匹を腹腔内に注入した。更に、飼育１４、２８、４２、５７、７０、８４日目にＦＣＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ｀ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）に溶解させた抗原ペプチド１００μｇ／匹を腹腔内に注入した。飼育１、４９、６３日に抗体力価確認のための採血を行った。抗体力価の上昇を確認後、飼育７７日目に２０〜３０ｍｌ／匹、飼育９１日目に５０〜７０ｍｌ／匹の採血を行い、抗血清を得て抗原ペプチドを固定したカラムでアフィニティー精製を行い、１次抗体を得た。精製された抗体は０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳに置換し使用まで冷凍保存した。
（２）ウサギ抗体を用いた免疫組織染色
生検組織サンプル（２７歳女性他数名）のパラフィンブロックから４〜５μｍの厚さで組織切片を作成した。スライドサンプルはキシレンで除パラフィンを行い、アルコール処理を経て再度水和させた。その後Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ社）中でオートクレーブ処理による抗原賦活化を行った。以降の操作はＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いた。添付試薬でブロッキング後、上記（１）で作成した１次抗体で４５分インキュベートした。洗浄後、５μｌ／ｍｌに希釈した抗ウサギ２次抗体（ＢＡ−１０００）で３０分インキュベートした。洗浄後Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ−ＡＰ（ＡＫ−５０００）ｒｅａｇｅｎｔを添加し、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ（ＳＫ−５１００）にて発色させた。
結果を表１に示した。表１のとおり、ＯＧＲ１は他組織と比較して膵臓に強く発現していることがわかった。更に、膵臓組織中での発現分布を詳細に検討したところ、腺房などではほとんど発現しておらず、ランゲルハンス島に発現が局在していることが明らかとなった。
またＧＰＲ４抗原ペプチドとしてＲＳＤＶＡＫＡＬＨＮＬＬＲＦＬＡＳＤＫ（配列番号：６）を用い、同様の手法で発現局在を検討した結果、ＧＰＲ４も又、ランゲルハンス氏島に発現局在していることが明らかとなった。
2004084944.tif 000005
更に、新規に報告されたＳＰＣ活性化ＧＰＣＲであるＧＰＲ１２抗原ペプチドとしてＧＣＩＰＳＳＬＡＱＲＡＲＳＰＳＤ（配列番号：９）を用い、同様の手法で発現局在を検討した結果、ＧＰＲ１２も又、ランゲルハンス氏島に発現局在していることが明らかとなった。
2004084944.tif 000006
実施例２：経口糖負荷試験
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３週齢、ＳＰＦ規格、日本クレア）を予備飼育の後、４週齢より高脂肪、高蔗糖含有飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ社）を負荷した（ＤＩＯ群）。正常食コントロールとして同規格のマウスに対して通常飼料（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ社）を与えた（正常群）。高脂肪含有飼料負荷後２０週目に８時間絶食を施し、ＳＰＣ乾燥品（カルビオケム社）を生理食塩水（大塚製薬）に溶解し０．５μｇ／匹で静脈内投与を行った。溶媒対照としては生理食塩水（大塚製薬）を用いた。静脈内投与後速やかに３ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを経口投与した。糖負荷前（０分）、糖負荷後１５、４５、９０および１３５分後に尾部静脈より採血し、以下の方法により血糖値を測定した。
すなわち１０μｌの血液を採取し、０．４Ｎ過塩素酸水溶液１００μｌと混和する。更に０．３７Ｍ炭酸カリウム水溶液５０μｌを添加し、遠心後の上清についてグルコースＣＩＩ・テストワコー（グルコース定量キット、ムタロターゼ・ＧＯＤ法、和光純薬）を用いて血糖値を測定した。
その結果、ＳＰＣ投与ＤＩＯ群の糖負荷後１３５分後の血糖値は、生理食塩水投与ＤＩＯ群と比較して低値を示し、正常群と同等レベルまで低下することがわかった（図１）。この結果から、ＳＰＣの投与により高脂肪食負荷による耐糖能異常は、正常レベルまで改善されたことがわかる。
実施例３：ＯＧＲ１、ＧＰＲ４及びＧＰＲ１２安定発現株の樹立
（１）導入遺伝子ベクターの構築
配列番号：２で表されるＯＧＲ１のコード領域、配列番号：４で表されるＧＰＲ４のコード領域、又は配列番号：８で表されるＧＰＲ１２のコード領域を、ＡｍｐｌｉＴａｑ（パーキンエルマー社）にてＰＣＲ法で増幅する。増幅した遺伝子断片を動物細胞で機能するプロモーター（ｐｃＤＡＮ４／ＨｉｓＭａｘ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））の下流に導入する。
（２）細胞株の樹立
Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２，ｐ２６１〜ｐ２６７，（２０００）又はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．４４，ｐ４１３２５〜ｐ４１３３５に記載された方法で、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４、又はＧＰＲ１２安定発現株を調製することができる。
すなわち、ＭＣＦ１０Ａ（またはＣＨＯ）細胞を１０ｃｍ培養皿に播種し６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記のとおり構築したＯＧＲ１、ＧＰＲ４、又はＧＰＲ１２導入遺伝子を、Ｌｉｐｏｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ社製）と複合体を形成させたのちに培地に添加する。５時間インキュベート後１０％ＦＢＳを含む培地に転換後さらに８時間培養する。その後トリプシンＥＤＴＡで細胞を培養皿から剥離させ、Ｇ４１８と１０％ＦＢＳを含む培地にけん濁し、１０ｃｍ培養皿に播種した。数日後形成されたコロニーを単離し、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４、又はＧＰＲ１２リガンドスクリーニング用安定発現株とする。
実施例４：ＦＬＩＰＲを用いたＯＧＲ１、ＧＰＲ４、ＧＰＲ１２リガンドのスクリーニング
（１）細胞の調製
実施例３で調製したＯＧＲ１、ＧＰＲ４、及びＧＰＲ１２リガンドスクリーニング用安定発現株を９６穴培養皿に播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。
（２）蛍光測定による細胞内カルシウムの定量
上記の処理を施した細胞の培地を除去し、希釈した被験物質（ＤＭＳＯ溶液）と４ｕＭのＦｌｕｏ３ＡＭ（Ｔｅｆｌａｂ．）および２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄを添加し３７℃で６０分培養する。上記の処理を施した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（２．５ｍＭのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、１％ゼラチンを含む）に懸濁する。培養皿をＦＲＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）にて４８８ｎＭ、５４０ｎＭの吸収を定量する。被験物質における蛍光吸収が、被験物質としてＤＭＳＯのみを用いた対照における蛍光吸収よりも大きければ、当該被験物質は、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２リガンドであると決定できる。
実施例５：バインディングアッセイによるスクリーニング
（１）細胞膜画分の調製
実施例３で調製したＯＧＲ１、ＧＰＲ４及びＧＰＲ１２リガンドスクリーニング用安定発現株をフラスコに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収しｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ２−ＭＥ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁する。Ｐｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、２０ストローク）したのち、１０００００ｇで６０分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度ｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁する。この懸濁液を３５％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａの上に重層し４５０００ｇで４５分遠心分離を行う。界面の画分を回収しｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、１０００００ｇで６０分遠心分離を行う。得られた沈殿を２０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し以下のアッセイに用いる。
（２）レセプターバインディングアッセイ
ＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎＧＶＰｌａｔｅ（Ｍｉｒｉｐｏｒｅ）に反応バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２．５ｍＭ酢酸マグネシウム、３．１２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１２５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）に懸濁した［３Ｈ］ＳＰＣと希釈した被験物質（ＤＭＳＯ溶液）とを添加しする。３０℃でインキュベートしたのち上記の手順で調整した膜画分を添加する。３０℃でインキュベートしたのち等量の２０％ＴＣＡを添加し、上清を吸引除去しタンパク質を沈殿させる。１０％ＴＣＡで数回洗浄した後、３７℃で乾燥させた膜をパンチアウトしγカウンターで測定する。被験物質における放射活性が、被験物質としてＤＭＳＯのみを用いた対照における放射活性よりも大きければ、当該被験物質は、ＯＧＲ１、ＧＰＲ４もしくはＧＰＲ１２リガンドであると決定できる。
実施例６：ビアコアを用いたスクリーニング
（１）細胞膜画分の調製
ＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２スクリーニング用安定発現株をフラスコに播種し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を培地中で６０〜７０％コンフルエントになるまで培養する。細胞を回収しｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ２−ＭＥ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．２５Ｍ  ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁する。Ｐｏｔｔｅｒ型ホモジェナイザーでホモジナイズ（４００ｒｐｍ、２０ストローク）したのち、１０００００ｇで６０分遠心分離を行い、得られた沈殿を再度ｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁する。この懸濁液を３５％（ｍａｓｓ／ｖｏｌ）ｓｕｃｒｏｓｅ  ｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ  Ａの上に重層し４５０００ｇで４５分遠心分離を行う。界面の画分を回収しｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し、１０００００ｇで６０分遠心分離を行う。得られた沈殿を２０μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａに懸濁し以下のアッセイに用いる。
（２）ビアコアでの結合測定
文献［Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８  Ｄｅｃ  １５；２６５（２）：３４０−５０．Ｍａｒｋｇｒｅｎ  ＰＯ  ｅｔ  ａｌ．］に記載されている一般的な方法を用いる。上記手順で調整したＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２発現細胞膜画分（例えば１〜１０μｇ）を１０ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４）に溶解し、ビアコアのセンサーチップＣＭ５の表面のマトリックスにカルボキシル基を介して固定化する。
ＨＢＳバッファー（アマシャム  ファルマシア  バオテク株式会社製）をセンサーチップに２０μｌ／分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録する。途中からＨＢＳバッファーに１０ｎＭ〜１０μＭの濃度で溶解した被験物質に切り替えて１分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録する。再び、薬剤を含まないＨＢＳバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変化を記録する。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から被検化合物とＯＧＲ１、ＧＰＲ４又はＧＰＲ１２との親和性を計算する。
【産業上の利用可能性】  本発明のＳＰＣ活性化ＧＰＣＲ作動薬は、一過的な血糖値の上昇に対してインスリン分泌を促進し、血糖値の低下後は、インスリン分泌作用が低下するように働くので、低血糖を引き起こすことなく安全な耐糖能異常改善薬、糖尿病治療薬となり得る。
【配列表フリーテキスト】配列番号５
抗原ペプチド
配列番号６
抗原ペプチド
配列番号９
抗原ペプチド
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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