(57)【要約】この出願の発明は、女王蜂の誘導補助因子としての機能を有し、また動物の生体防御系の向上（免疫力の賦活効果）を実現することのできるローヤルゼリーペプチドおよびこれを含有する組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
女王蜂分化誘導補助因子としての機能および動物の免疫力賦活因子としての機能の少なくともいずれかの機能活性を有することを特徴とするローヤルゼリーペプチド。
【請求項２】
請求項１のローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を有する発現カセットを備えた発現ベクター。
【請求項３】
請求項２の発現ベクターによって、形質転換された形質転換細胞。
【請求項４】
請求項３の形質転換細胞から産生されるローヤルゼリーペプチド。
【請求項５】
請求項１または４のローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する組成物であって、ミツバチの女王蜂分化誘導補助効果を向上させる機能および動物の免疫力賦活効果を向上させる機能の少なくともいずれかの機能を有することを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５の組成物をミツバチの幼虫に投与することにより、幼虫の成長を促進し、女王蜂への分化を誘導させることを特徴とするミツバチの女王蜂への誘導方法。
【請求項７】
請求項５の組成物を動物に投与することにより、動物の免疫力賦活効果を向上させることを特徴とする動物の免疫力賦活方法。
【請求項８】
請求項１のローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を導入した非ヒト生物の初期胚、受精卵および胚幹細胞いずれかを個体発生して得られる非ヒト生物およびその子孫生物であって、体細胞染色体中に上記遺伝子を保有し、ローヤルゼリーペプチドを発現することを特徴とするトランスジェニック生物。
【請求項９】
非ヒト生物が、植物または動物のいずれかであることを特徴とする請求項８の非ヒト生物。
【請求項１０】
動物が、昆虫類であることを特徴とする請求項９の非ヒト生物。
【請求項１１】
昆虫類が、カイコであることを特徴とする請求項１０の非ヒト生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、ローヤルゼリーペプチドおよびこれを含有する組成物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、女王蜂の誘導補助因子としての機能を有し、また動物の生体防御系の向上（免疫力の賦活効果）を実現することのできるローヤルゼリーペプチドおよびこれを含有する組成物に関するものである。
【背景技術】  ミツバチの生産物として、蜂蜜やローヤルゼリーがよく知られている。特にローヤルゼリーは、そのほとんどが糖質である蜂蜜とは異なり、三大栄養素であるタンパク質、糖質、脂質をはじめ、各種ビタミン、ミネラル等をバランスよく、しかも豊富に含んでいる。ローヤルゼリーは、女王蜂への誘導効果だけでなく、ヒトを含む動物に対して、疲労回復、アレルギー、感染症や癌等に有効であるといったさまざまな効果を有しているとされている。
そのため、ローヤルゼリーをミツバチの幼虫に人為的に与え、この幼虫を女王蜂へ分化誘導させることが考慮されている。これにより、女王蜂の室内人工飼育が可能となり、計画的にミツバチ生産することが期待できるが、このような女王蜂の室内人工飼育は困難であることが実情である。
また、一方、ヒトにおいては、多くの食品分野等で注目されているため、健康食品の一種として活用されている。しかしながら、上記のようなローヤルゼリーの幅広い効果は、明確に科学的な立証がなされているとはいえないのが実情である。
そこで、係る問題を解決するため、ローヤルゼリーに関する研究が盛んに行なわれている。第１には、女王蜂の室内人工飼育を実現するために、女王蜂への分化導方法が提案されている（特開平５−７６２５３号公報）。上記のとおりミツバチにおけるローヤルゼリーの効果として、ミツバチの幼虫を女王蜂へ分化誘導する作用を有することが知られているが、この作用を有する蛋白性物質を抽出および精製し、ミツバチの幼虫に与えることにより、効率よく幼虫を女王蜂に分化誘導することができる。この提案の方法により、ミツバチの女王蜂の室内人工飼育が可能となり、計画的にミツバチ生産を行うことができるとしている。
一方、第２には、ローヤルゼリーが有する幅広い効能を解明するための研究も多くなされている。たとえば、ローヤルゼリーを構成する成分であるタンパク質やペプチド等を同定し、それぞれを機能解析することが行なわれている。たとえば、主要タンパク質１〜５（ＭＪＲ１〜５）の報告がなされており、特にＭＪＲ３は、免疫応答を促進することが開示されている（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７３，ｐ２０２９−２０４５，２００３）。また、アピシンが細胞の成長を促進する等の可能性を示唆している報告もあり（米倉正実、ミツバチ科学、１９巻、１号、１５−２２頁、１９９８年およびＹｏｎｅｋｕｒａ，Ｍ．，Ｎｅｗ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄ．，４１（１），ｐ１−８，１９９９）、ロイヤリシンが抗菌性を有することが開示されている報告（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（１９），ｐ１１３３３−７，１９９０）等もある。また、最近では、ローヤルゼリーの構成成分の一つとしてアピシミンが同定された（Ｂｉｌｉｋｏｖａ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５２８，ｐ１２５−１２９，２００２）。
しかしながら、女王蜂への分化誘導方法として例示した、上記特許文献１提案の方法の場合では、この提案で用いられている分化誘導因子をローヤルゼリーから抽出することは、有機溶媒や限外濾過等の煩雑な手順を行う必要があるという問題があった。
また、現在、同定されているローヤルゼリーに含まれる機能性物質は、上記のＭＪＲ１〜５、アピシン、ロイヤリシンおよびアピシミンのみであり、その機能性について詳細に解明されていないのが現状である。特に、最近発見されたアピシミンについては、どのような生理作用等の機能を有しているのか、その機能性については全く解明されていない。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、女王蜂への分化誘導補助因子としての機能を有し、また動物の生体防御系の向上（免疫力の賦活効果）を実現することのできるローヤルゼリーペプチドおよびこれを含有する組成物を提供することを課題としている。
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、以下の（１）から（１１）の発明を提供する。
（１）女王蜂分化誘導補助因子としての機能および動物の免疫力賦活因子としての機能の少なくともいずれかの機能活性を有することを特徴とするローヤルゼリーペプチド。
（２）上記（１）のローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を有する発現カセットを備えた発現ベクター。
（３）上記（２）の発現ベクターによって、形質転換された形質転換細胞。
（４）上記（３）の形質転換細胞から産生されるローヤルゼリーペプチド。
（５）上記（１）または（４）のローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する組成物であって、ミツバチの女王蜂誘導補助効果を向上させる機能および動物の免疫力賦活効果を向上させる機能の少なくともいずれかの機能を有することを特徴とする組成物。
（６）上記（５）の組成物をミツバチの幼虫に投与することにより、幼虫の成長を促進し、女王蜂への分化を誘導させることを特徴とするミツバチの女王蜂への誘導方法。
（７）上記（５）の組成物を動物に投与することにより、動物の免疫力賦活効果を向上させることを特徴とする動物の免疫力賦活方法。
（８）上記（１）のローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を導入した非ヒト生物の初期胚、受精卵および胚幹細胞いずれかを個体発生して得られる非ヒト生物およびその子孫生物であって、体細胞染色体中に上記遺伝子を保有し、ローヤルゼリーペプチドを発現することを特徴とするトランスジェニック生物。
（９）非ヒト生物が、植物または動物のいずれかであることを特徴とする（８）の非ヒト生物。
（１０）動物が、昆虫類であることを特徴とする（９）の非ヒト生物。
（１１）昆虫類が、カイコであることを特徴とする（１０）の非ヒト生物。
そして、以上のとおりのこの出願の発明によって、次の効果を得ることができる。
上記（１）記載の発明のローヤルゼリーペプチドによれば、ミツバチの幼虫を女王蜂へ人為的に誘導補助することができ、また動物の免疫力を賦活することができる。
上記（２）記載の発明の発現ベクターによれば、ローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を有する発現ベクターとすることにより、保存性および取り扱い性が向上する。
上記（３）記載の発明の形質転換細胞によれば、安定、かつ、簡便にローヤルゼリーペプチドを発現させることができる。
上記（４）記載の発明のローヤルゼリーペプチドによれば、上記（１）記載の発明と同様の効果が得られ、しかも、このローヤルゼリーペプチドは、投与対象の動物と同じ由来とする形質転換細胞から産生させることができるため、免疫原生を抑制することができる。
上記（５）記載の発明の組成物によれば、上記（１）または（４）記載の発明の効果に加え、各種の薬理成分等と混合、また糖衣加工やカプセル封入体等の加工等を施すことにより、ローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する組成物を摂取しやすくすることができる。
上記（６）記載の発明の女王蜂への誘導方法によれば、女王蜂の室内人工飼育が可能となり、計画的にミツバチ生産を行うことを実現することができる。
上記（７）記載の発明の動物の免疫力賦活方法によれば、投与されたヒトを含む動物の免疫防御系の働きを向上させることが可能となる。
上記（８）記載の発明のトランスジェニック生物によれば、高生産性、耐病性、耐熱性、耐寒性等の多くの生理機能がより活性化および増強化された生物を得ることができる。
上記（９）記載の発明の非ヒト生物によれば、上記（８）記載の発明と同様の効果が得られ、より高い効果が得られることを可能とする。
上記（１０）記載の発明の非ヒト生物によれば、上記（８）および（９）記載の発明と同様の効果が得られ、さらに高い効果が得られることを可能とする。
上記（１１）記載の発明の非ヒト生物によれば、カイコは、飼育方法をはじめとする知見が豊富なため、より効果的にローヤルゼリーペプチドの効果を有するトランスジェニック生物として得ることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ローヤルゼリー粉末からローヤルゼリーペプチドを抽出するプロトコールの概略を例示した図である。
図２は、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドの高速液体クロマトグラフィー溶出パターンとそのピーク時（矢印箇所）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析をそれぞれ例示した図である。
図３は、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドのＮ末端におけるアミノ酸を例示した図である。
図４は、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドの塩基配列とそのアミノ酸を例示した図である。
図５は、セイヨウミツバチのゲノムＤＮＡをサザンブロット法により解析した結果を示した写真図である。
図６は、働きバチのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをノーザンブロット法により解析した結果を示した写真図である。
図７は、この出願の発明のローヤルゼリーペプチド遺伝子の構築の際に使用したフラグメント１から８の塩基配列を例示した図である。
図８は、組換えローヤルゼリーペプチドの高速液体クロマトグラフィー溶出パターンとそのピーク時（水平バー）におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果をそれぞれ例示した図である。
図９は、マウス脾臓由来のリンパ球細胞の増殖に及ぼす組換えローヤルゼリーペプチドの効果を例示した図である。
図１０は、抗ローヤルゼリーペプチド抗体を用いて、ローヤルゼリーペプチドの合成器官が下咽頭腺であることを示した写真図である。
発明の実施のための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。
この出願のローヤルゼリーペプチドは、ミツバチが生産するローヤルゼリーの成分の一つであり、「アピシミン」として報告され（Ｂｉｌｉｋｏｖａ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５２８，ｐ１２５−１２９，２００２）、これをコードする遺伝子の配列についても開示されている（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＱ１６５８６、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ３４０９６０）。しかしながら、その機能に関しては解明されていないため、この出願の発明は、発明者らの鋭意研究の結果に基づいてなされたものである。すなわち、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドは、ミツバチの幼虫に投与することにより、その幼虫を女王蜂へと分化誘導する女王蜂分化誘導補助因子としての機能を有し、また、ヒトを含む動物に投与することにより、その動物の免疫力を向上させる免疫力賦活因子としての機能をも有することを解明したことに基づいていてなされたものである。これにより、ミツバチの幼虫を女王蜂へ人為的に誘導することもでき、また動物の免疫力を簡便に向上させ、感染症等の病気に対する抵抗力および回復力を強くすることも可能となる。
従来のようにローヤルゼリーから、有機溶媒を用いた抽出や限外濾過等の公知の抽出方法や精製方法によって、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドを製造することもできるが、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドは、遺伝子工学的な方法を用いて製造することができるため、好ましい。具体的には、たとえば、ローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＱ１６５８６、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ３４０９６０等）を有した発現カセットを備えた発現ベクターを大腸菌や酵母、植物細胞、動物細胞等に公知の方法である、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法等に従い導入することによって、大量、かつ、簡便に製造することができる。しかも、この形質転換された大腸菌や酵母、植物細胞、動物細胞等の菌体・細胞から回収したローヤルゼリーペプチドは高純度で収率良く、精製することができる。さらに、この発現カセットに、たとえば、６×ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、β−ガラクトシターゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｃ−ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等をコードする配列をタグ配列として含ませることにより、精製しやすくなる。
この出願の発明における「発現ベクター」は、ローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を有する発現カセットをベースベクター内に挿入結合することによって作製することができる。したがって、発現カセットは、ベースベクターの任意のクローニングサイトに対応した制限酵素配列を有することが好ましい。「ベースベクター」は、たとえば動物細胞用ベクター、昆虫細胞用ベクター、酵母用ベクター、大腸菌用ベクター、また酵母・大腸菌等といった複数種用のシャトルベクター等の種々のベースベクターがあるが、これらベースベクターは宿主細胞や目的に応じて適宜に選択することができる。また、適当な宿主細胞で外来タンパク質を発現させるための既存のベクターＤＮＡを一部改変して使用することもできる。たとえば、宿主細胞として大腸菌等の微生物を利用する場合には、オリジン、プロモータ、ターミネータ等を有するｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩやｐＥＴ系システム等が使用することができる。
この発現ベクターを導入する際に利用する細菌や細胞（受容体）は、ローヤルゼリーペプチドを安定に発現することのできるものであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、大腸菌や酵母類、各種植物細胞、各種動物細胞等を使用することができる。このように形質転換の対象とする細胞の種類を任意に選択および使用することができるため、ローヤルゼリーペプチドの投与の対象となるヒトを含めた動物の由来に合わせて、形質転換する細胞の由来や種類を適宜に選択することにより、免疫原生を抑制することができる。
また、この出願の発明は、上記の特徴を有するローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有する組成物を提供する。すなわち、この組成物は、ミツバチの幼虫を女王蜂へと分化誘導する機能を有し、また、ヒトを含む動物の免疫力を向上させる機能を有している。この組成物は、薬理成分あるいは食品成分等と混合、加工することにより、投与あるいは摂取しやすい、製剤や機能性食品とすることができる。食品成分の一種である各種ビタミン類や各種ミネラル分等の生体にとって有益、かつ、この出願のローヤルゼリーペプチドの効果を維持することのできる物質であれば、特に限定されずに混合、加工することができる。
なお、「薬理成分」とは、一般に薬剤製造に利用される各種の担体であり、担体は薬剤の種類や注射や経口等の投与形態等に応じて、適宜に選択できる。たとえば、懸濁剤やシロップ剤等のような経口液体状の薬剤は、水、シュクロース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油や大豆油等の油類、その他、防腐剤、ペパーミント等の各種フレーバー類等を使用して製造することができる。また、散剤や丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュクロース等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、マグネシウムステアレート等の潤沢剤、また各種結合剤や表面活性剤、可塑剤等を用いて製剤化することができる。
上記組成物を、ミツバチの幼虫に餌等として、摂取させることにより、人為的に女王蜂へと分化誘導することができる。その結果、従来困難であった、女王蜂の室内人工飼育が可能となり、計画的にミツバチを生産し、ローヤルゼリーや蜂蜜等を効率よく取得することを実現することができる。また、ヒトを含む動物に上記組成物を投与、あるいは、摂取させることにより、免疫力が活性および増強させることができ、その結果、各種病気に対する抵抗力および回復力が高まり、健康を維持することを期待することができる。
さらにこの出願の発明は、ローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を導入した非ヒトのトランスジェニック生物を提供する。このトランスジェニック生物は、生物の初期胚、受精卵および胚幹細胞（ＥＳ細胞）いずれかを個体発生させて得られる非ヒト生物およびその子孫生物であり、体細胞染色体中に上記のローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子配列を保有し、ローヤルゼリーペプチドを発現することを特徴としている。このトランスジェニック生物は、まず動物の場合は、たとえば、公知のトランスジェニック動物作製法（たとえば、Ｇｏｒｄｏｎ，ＪＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，ｐ７３８０−７３８４，１９８０）に従って作製することができる。すなわち、機能遺伝子（この出願におけるローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子）を初期胚、受精卵および胚幹細胞等の分化全能性細胞に導入して、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に外来性の機能遺伝子が組み込まれた個体を選別して、目的とするトランスジェニック動物を作製することができる。
この「機能遺伝子の導入」とは、外来性の機能遺伝子を上記の形質転換動物作製法により、機能遺伝子を染色体ゲノム中に導入する。また、公知である標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法）（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ１２８８−１２９２，１９８９）を利用すれば、内在性の機能遺伝子と置換させることによって外来性の機能遺伝子を導入することもできる。なお、外来性の機能遺伝子は、その生物の染色体ゲノムに元来存在しない遺伝子であり、他の生物種由来の遺伝子やＰＣＲ等で作製した合成遺伝子等である。
なお、ＥＳ細胞は、マウス、ラット、ウサギ、サル等にて確立されており、また、ブタ等においては、ＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）細胞が確立されているため、対象の動物種とすることができる。
植物の場合は、アグロバクテリウムツメファシエンスの感染時に起こるＴｉプラスミド中のｔ−ＤＮＡの植物細胞への移行と染色体組込みをを利用した方法（特に、双子葉植物において好適）やプロトプラストへのエレクトロポレーション法等によるＤＮＡの直接導入法（特にイネ等の単子葉植物に好適）等を利用することにより、機能遺伝子（ローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子）を導入することができる。
上記のようなトランスジェニック動物、あるいは植物により、耐病性、耐候性、耐寒性、耐熱性等、種々の機能が増強された生物を得ることができ、さらにイネ等の作物である植物においては、その生産性の向上を期待することができ、家畜や農作物に活用することができる。
さらにまた、トランスジェニック動物における動物が、昆虫類であることが好ましく、昆虫類が、飼育方法等の知見が豊富に蓄積されているカイコであることが、効率性の高さや扱い易さ等の観点からさらに好ましい。
以下に実施例を示し、さらに詳しく、この出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。
【実施例】［実施例１］：ローヤルゼリーペプチドの抽出
乾燥粉末状のローヤルゼリーから、図１に例示した抽出手段により、目的とするローヤルゼリーペプチドを含む粗画分を抽出した。すなわち、乾燥粉末状のローヤルゼリーを冷却したアセトンにて洗浄し、その溶液を２５００×ｇにて３０分間遠心処理を行なった。沈殿物を回収し、８０％エタノールで洗浄し、１００００×ｇにて２０分間の遠心処理を行なった。再び、沈殿物を回収し、２％のＮａＣｌを用いて抽出操作を行ない、１００００×ｇにて２０分間の遠心処理を行ない、結晶化操作（ＭＷＣＯ：５００）を行なうことにより、目的とするローヤルゼリーペプチドを含んだ粗画分を得た。
［実施例２］：ローヤルゼリーペプチドの単離
実施例１で得たアピシミンの粗画分を、高速液体クロマトグラフィーにより、アセトニトリル濃度９６％を用いて溶出するピークが、単一のローヤルゼリーペプチドとして単離した。
図２は、ローヤルゼリーペプチドの高速液体クロマトグラフィーにおける溶出パターンを示したものである。図２に示したとおり、ローヤルゼリーペプチドを含んだ粗画分をＴＳＫ−ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓによる逆相高速液体クロマトグラフィーで示している矢印箇所（ピーク）を、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分析した結果、単一のローヤルゼリーペプチドとして単離（６．２ｋＤａ）することができた。
［実施例３］：ローヤルゼリーペプチドの部分的なアミノ酸配列の決定
実施例２で単離したローヤルゼリーペプチドの一次構造を全自動タンパク質一次構造分析装置（プロテインシークエンサー）（Ｇ−１０００Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋｒｄ社製）にて分析し、公知技術のエドマン分解法によるＮ−末端側からのアミノ酸配列の決定を行なった。その結果、図３に例示したとおり、Ｎ末端側から第４７番目のアミノ酸が不明の５４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を決定することができた（配列番号１４および配列番号１５）。
なお、ローヤルゼリーペプチドの分子質量を測定も行った（図示せず）。この測定には、質量分析計であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳシステムＶｏｙａｇｅｒ  ＲＰ（登録商標）（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いた。測定は、５０％アセトアニトリルに飽和させたα−ｃｙｎａｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（α−ＣＨＣＡ）を陽イオン化マトリックスとして用い、分子量マーカーであるＣａｌｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ２（ＡＣＴＨ（７−３８ｃｌｉｐ）、ｉｎｓｕｌｉｎ（ｂｏｖｉｎｅ））と０．１％ＴＦＡに溶解したペプチドをプレート上で混合して、風乾させた後レーザー照射を行なって、分子質量を得た。
［実施例４］：ローヤルゼリーペプチドをコードするｃＤＮＡ全長の決定
＜１＞ミツバチの飼育方法
セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｌａ）（盛岡市、藤原養蜂場から供与）の下咽頭腺（ローヤルゼリーのタンパク質産生器官）から、公知の方法（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等）に従い、ポリＡ＋ＲＮＡを抽出した。
なお、このセイヨウミツバチは、セイヨウミツバチ用巣箱（可動式巣枠）を用いて、岩手大学農学部付属植物園内で野外飼育した。秋期の花密が不足する時期には、食用の砂糖と水（１：１の割合）とを混合した餌を与えた。また、害敵であるミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏｒａ  ｊａｃｏｂｓｏｎｉ）の対策に、防ダニ剤のアピスタン（三菱化学社製）を用いた。冬期は、群生維持のため巣箱を発泡スチロールで囲った。さらに、羽化直後の働きバチの胸部にエナメル塗料でマーキングして、これを指標として下咽頭腺の発達が盛んである６から１０日齢の働きバチ（育児蜂）を採集して用いた。
＜２＞下咽頭腺の摘出
働きバチを氷上で冷麻酔し頭部を集め、頭部から全蜂用生理食塩水（０．０２％（ｗ／ｖ）のＫＣｌ、２．０２％（ｗ／ｖ）のＣａＣｌ２、０．４％（ｗ／ｖ）のサッカロース、０．９％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ）中で、下咽頭腺を摘出した。
＜３＞Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調整
（ａ）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用い、添付されているプロトコールに従い下咽頭腺５３ｍｇからＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、エタノール沈殿後に滅菌水２００μｌに溶解した。そして、その一部を分光光度計で波長Ａ２６０を測定し濃度を算出した。
（ｂ）ｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡの単離
得られたＴｏｔａｌ  ＲＮＡの５００μｇから、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（宝酒造社製）を使用して、添付されているプロトコールに従いＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離した。このＰｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡの濃度測定には、上記（ａ）と同様の方法で行なった。
＜４＞Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）を利用したローヤルゼリーペプチドのクローニング
（ａ）ｃＤＮＡの合成
Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、添付のプロトコールに従いＲＡＣＥ法を実施した。上記＜３＞（ａ）および（ｂ）により得られたｐｏｌｙ  Ａ＋ＲＮＡ  １μｇを、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＴＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴ（３０）Ｎ−１Ｎ）とともに滅菌水中で７０℃、１０分間反応させた後、氷上で急冷した。この反応液を１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、１００ｕｎｉｔｓのＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を含むＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μｌ中で７２℃、１時間反応させ、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
さらに、反応液を１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、Ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（２４ｕｎｉｔｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ、０．８ｕｎｉｔｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ、１ｕｎｉｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ）を含むＳｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭ  β−ＮＡＤ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）８０μｌ中で１６℃、１．５時間反応させた。反応後、１０ｕｎｉｔｓのＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、１６℃で４５分間反応させて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
この２本鎖ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）にて抽出し、さらにクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。この抽出液を、１／２量の４Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍量のエタノールにて、ｃＤＮＡを沈殿させ、８０％エタノールで洗浄した。
（ｂ）アダプター結合
２本鎖ｃＤＮＡの沈殿物を滅菌水に溶解し、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｏｒおよび１ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを含むＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｈ７．８）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、５％  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ（ＭＷ：８０００））１０μｌ中で１６℃、終夜反応させた。このアダプターを結合させたｃＤＮＡをＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で５０倍希釈したものを鋳型として３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥを行なった。
（ｃ）３’ＲＡＣＥ
ローヤルゼリーペプチドのアミノ酸配列のＮ末端部分に対応する塩基配列を推定し、これを基に配列番号１に示した、３’ＲＡＣＥに用いるｄｅｇｅｎｅｒａｔｅセンスプライマー（ＡＡＲＡＣＮＷＳＮＡＴＨＷＳＮＧＴＮＡＡＲＧＧＮＧＡＲＷＳＮＡＡＹＧＴＮＧの３７塩基であり、以下プライマー１とする）を設計し、日本遺伝子研究所にて合成した。なお、このプライマー中の「Ａ」はアデニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアニン、「Ｔ」はチミンおよび「Ｉ」はイノシンをそれぞれ示している。また、「Ｒ」はアデニンまたはグアニン、「Ｗ」はアデニンまたはチミン、「Ｓ」はシトシンまたはグアニン、「Ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「Ｙ」はシトシンまたはチミンを示している。
このプライマー１は、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度となるように希釈して使用した。３’ＲＡＣＥ反応は、上記の（ＩＶ）（ｂ）でアダプター結合したｃＤＮＡを鋳型として、プライマー１、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｄａｐｔｏｒと特異的に結合するＡＰ１  ｐｒｉｍｅｒおよびＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いた。１０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌ  ＡＰ１  ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌプライマー１および２．５ｕｎｉｔｓのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）を含むＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μｌ中にアダプター結合
したｃＤＮＡを加えて、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ９７００、ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、次の条件のもとでＰＣＲ反応を行なった。すなわち、（１）９５℃、１０分間（熱処理）、（２）９４℃、１分間（熱変性）、（３）７２℃、１分間（アニーリング）、（４）７２℃、１分間（伸長）を３サイクル行い、以降ステップ（３）のアニーリング温度を６８℃、６４℃、６０℃、５６℃と下げ、各３サイクル行なった。そして、最後にアニーリング温度を５２℃にし、２５サイクル反応させ、７２℃で７分間の伸長反応を加えた。
なお、図には示していないが、アガロース電気泳動を行なうことにより、このＰＣＲ産物の確認も行なっている。
（ｄ）ＰＣＲ産物のサブクローニング
上記＜４＞（ｃ）により得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定するため、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲ産物のサブクローニングを行なった。概要としては、Ｔａｑポリメラーゼの活性を利用して、ＰＣＲ産物の３’末端にアデニンを付加させ、このＰＣＲ産物を、１個のチミンが突出しているプラスミドベクターｐＣＲ２．１に挿入結合した。
ＰＣＲ産物は、既存の方法であるアガロースゲル電気泳動を行なった後、ＵＶトランスイルミネーター（ＡＥ−６９９１ＣＸ、ＡＴＴＯ社製）上で波長３１２ｎｍにて、可視化され、目的のＰＣＲ産物のバンド部分を切り出して、ＤＮＡ回収用フィルター付き遠心チューブであるＳＵＰＲＥＣ−０１（登録商標）（宝酒造社製）を用いて、ＰＣＲ産物を回収した。
回収されたＰＣＲ産物の一部（３．５μｌ）を、６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＮａＣｌ、１００μｇ／／ｍｌ  ＢＳＡ、７ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００μＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｅ、４．０  ｗｅｉｓｓ  ｕｎｉｔｓ  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅおよび５０ｎｇのｐＣＲ２．１プラスミドベクターを含む溶液１０μｌ中で、１４℃で一晩反応させ、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１プラスミドベクターに連結させた。このベクターをＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに添付のコンピテントセル（ＩＮＶ−αＦ’Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｅｌｌ）を形質転換させた後、Ｘ−Ｇａｌとカナマイシンを塗布したＬＢアガープレートに接種・塗布し、３７℃、一晩培養して、カラーセレクションを行なった。
そして、白いコロニーを選択して、インサートチェックを行なった。すなわち、コロニーを爪楊枝等で突き、４ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、４ｐｍｏｌ  ＡＰ１  ｐｒｉｍｅｒ、４０ｐｍｏｌプライマー１および１ｕｎｉｔのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）を含むＰＣＲ反応液２０μｌ中に挿入して爪楊枝先端に付着したコロニーを洗浄した。そして、上記＜４＞（ｃ）と同様の条件でＰＣＲ反応を行い、電気泳動にて泳動パターンを確認した。
この結果から、予想される分子量のＰＣＲ産物が含まれていることが確認できたコロニーを、２×ＹＴ  Ｂｒｏｔｈ（１％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌ、１．６％（Ｗ／Ｖ）トリプトン、１％（Ｗ／Ｖ）ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）中に植菌し、３７℃、２０５ｒｐｍで８時間振盪培養を行った。
（ｅ）プラスミド抽出
２×ＹＴ  Ｂｒｏｔｈで培養した大腸菌から、１ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いて、添付のプロトコールに準じて、磁性ビーズにＤＮＡを吸着させることでプラスミドを抽出した。
（ｆ）ＤＮＡシークエンス
上記＜４＞（ｅ）によって得られたプラスミド１．５μｇとＴｅｘａｓ−Ｒｅｄで標識されたＭ１３（−２０）リバースプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｐｒｅ−ｍｉｘｅｄ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と滅菌水を混合し、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各塩基を含む溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に加え、次の条件の下でシークエンス反応を２５サイクル行なった。すなわち、（１）９５℃、３分間（熱処理）、（２）９５℃、１分間（熱変性）、（３）５０℃、４５秒間（アニーリング）、（４）７２℃、１分３０秒間（伸長）、（５）７２℃、１分間（伸長反応）、で反応を行なった。この反応液に２×ローディングダイを添加してアスピレーターで濃縮したものを、３μｌづつＤＮＡオートシークエンサー（ＳＱ−５５００、日立製作所社製）にロードして、塩基配列の解析を行なった。
（ｇ）５’ＲＡＣＥ
３’ＲＡＣＥにより得られたローヤルゼリーペプチドの塩基配列情報を基にして、５’ＲＡＣＥ用のＧｅｎｅＳｐｅｃｉｆｉｃアンチセンスプライマーを２種類設計し、作製した。すなわち、この２種類のプライマーは、３’ＲＡＣＥにより得られた配列と一部重複領域を有するように設計したプライマー２（配列番号２）および３’末端側の塩基配列を基にｃＤＮＡ全長の塩基配列の取得を意図したプライマー３（配列番号３）である。
なお、５’ＲＡＣＥの方法および条件は、上記（ＩＶ）（ｃ）の例示の３’ＲＡＣＥと同一の方法および条件で行なった。ただし、プライマー１をプライマー２、または、プライマー３に換えて、５’ＲＡＣＥの反応を行なった。得られたＰＣＲ産物は、上記＜４＞（ｄ）から（ｆ）と同一の方法で、サブクローニングおよび塩基配列の解析を行なった。
上記＜４＞（ｃ）および（ｇ）に示した３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥにより、図４に例示したように、ローヤルゼリーペプチドの全長ｃＤＮＡの塩基配列を決定した（配列番号１６および配列番号１７）。これに伴い、実施例３の時点では未同定だった第４７番目のアミノ酸が、ロイシンであることが判明した。なお、図中において、イタリック体は「シグナル配列」、矢印は「開始点」、＊印は「終止コドン」、下線は「図３のＮ末端アミノ酸配列と同一箇所」、□は「ポリアデニレーションシグナル」をそれぞれ示している。
上記の結果から、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドは、アピシミン（Ｂｉｌｉｋｏｖａ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５２８，ｐ１２５−１２９，２００２）であることが確認された。
（ｈ）Ｌａ  Ｔａｑポリメラーゼを使用したＰＣＲ反応に塩基配列の確認
３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥに用いたＴａｑポリメラーゼのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないため、４４０塩基に１回の割合で、読み誤りが生じる可能性がる。そのため、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＬＡ−Ｔａｑ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ反応を行い、読み謝りの可能性を極力減らし、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドの塩基配列を確認した（図示せず）。
なお、反応は、２０ｎｍｏｌ  ｄＮＴＰ、１２５ｎｍｏｌ  ＭｇＣｌ２、１０ｐｍｏｌ  ＡＰ１  ｐｒｉｍｅｒ、１００ｐｍｏｌ  プライマー３および２．５ｕｎｉｔｓ  ＬＡ−Ｔａｑを含む反応掖５０μｌ中に、アダプター結合ｃＤＮＡを鋳型として加えたものを、（１）９４℃、３０秒間（熱変性）、（２）５０℃、３０秒間（アニーリング）、（３）７２℃、１分３０秒間（伸長）、（５）７２℃、１分間（伸長反応）を２５サイクル行ない、上記＜４＞（ｆ）と同様にＤＮＡシークエンサーを用いて塩基配列の確認を行なった。
（ｉ）コンピュータによる解析
相同性の検索は、ＢＬＡＳＴを利用した。開始コドンの位置の推定は、ＯＲＦ  Ｆｉｎｄｅｒを利用した。
［実施例５］：ローヤルゼリーペプチド（アピシミン）遺伝子の解析
＜１＞サザンブロット法
セイヨウミツバチのゲノムＤＮＡを用いて、公知の方法であるサザンブロット法を利用して、ローヤルゼリーペプチドの遺伝子の解析を行なった。
その結果、図５に例示したように、ローヤルゼリーペプチド（アピシミン）の遺伝子は、２つのイントロンを有するｃｌａｓｓ  ＩＩ遺伝子の特徴を示し、ハプロイドゲノムあたり１コピーであることを判断することができた。
なお、図中のレーン「ＢａｍＨ  Ｉ」は制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ処理したサンプル、レーン「Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ」は制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ処理したサンプル、「Ｐｓｔ  Ｉ」は制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ処理したサンプル、「Ｘｈｏ  Ｉ」は制限酵素ＸｈｏＩ処理したサンプルをそれぞれ示している。
＜２＞ノーザンブロット法
また、ノーザンブロット法により、セイヨウミツバチの日齢（ステージ）および器官とローヤルゼリーペプチドの遺伝子発現との関係を解析した。その結果、図６に例示したように、働きバチにおいても育児蜂から採餌蜂へと分化した下咽頭腺で強く発現していることを確認した。
なお、レーン１から６は、羽化後７日の働きバチ（育児蜂）から１０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出したものであり、それぞれ頭部、胸部、腹部、脳、下咽頭腺および大顎腺を示している。また、レーン７は羽化後０日の下咽頭腺、レーン８は羽化後７日の下咽頭腺、レーン９は羽化後３０日の働きバチ（採餌蜂）の下咽頭腺からそれぞれ抽出した１０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡである。
［実施例６］：ローヤルゼリーペプチド（アピシミン）の発現システム
公知の方法（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等）に従い、この出願のローヤルゼリーペプチドの遺伝子を大腸菌に導入して、大量発現系を構築し、組換えローヤルゼリーペプチドとして発現を行った。
＜１＞ローヤルゼリーペプチド遺伝子の構築
本実施例に用いたローヤルゼリーペプチド遺伝子は、大腸菌の使用頻度の高いコドンを参考に塩基配列を設計し、これを基に図７に例示したとおりのオリゴヌクレオチド（フラグメント１から８）を作製し、ＰＣＲ反応によって得られたものである。作製した上記オリゴヌクレオチドは、センス側およびアンチセンス側の各４種類（計８種類）であり、アニーリングする部分１０塩基分をオーバーラップするよう設計したものである。
なお、フラグメント１は配列番号４、フラグメント２は配列番号５、フラグメント３は配列番号６、フラグメント４は配列番号７、フラグメント５は配列番号８、フラグメント６は配列番号９、フラグメント７は配列番号１０、フラグメント８は配列番号１１としてそれぞれ例示した。
具体的な方法としては、フラグメント２から７（それぞれ５０ｐｍｏｌ）とＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（１０Ｕ／２０μｌ）を含む反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ）とを３７℃、３０分間反応させることにより、５’末端のリン酸化を行なった。反応後のサンプルを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）で抽出し、エタノール沈殿にて回収した。次に、各フラグメントを混合し、アニーリング反応を行なった。アニーリングには、フラグメント１および８（それぞれ１０ｐｍｏｌ）と上記リン酸化処理を行なったフラグメント２から７（それぞれ１０ｐｍｏｌ）とを含む反応液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  １ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を混合し、このサンプルをサーマルサイクラーにセットし反応を行なった。この反応の条件プログラムは、９５℃で５分間の熱変性を行ない、次に９０分間で２５℃に下がるようにプログラム設定してアニーリング反応を行なった。この反応により２本鎖ＤＮＡが作製され、これを鋳型ＤＮＡとして、ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、前記の鋳型ＤＮＡ（１μｌ）、センスプライマーとアンチセンスプライマー（各０．４μＭ）を含む反応液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％  ｇｅｌａｔｉｎ、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５Ｕ／５０μｌ  Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ）で行なった。なお、センスプライマーとしては、ＬＩＣ−ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１２）を、アンチセンスプライマーとしては、ＬＩＣ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１３）をそれぞれ使用し、これらプライマーそれぞれには、発現ベクターに特異的な配列を付加している。
上記のＰＣＲ反応によって、得られたＰＣＲ産物は、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてサブクローニングを行ない、得られたプラスミドの塩基配列にミスセンスがないことをＤＮＡシークエンサーを用いて確認した（図示せず）。
＜２＞発現ベクターの作製
本実施例における発現ベクターは、Ｓ−Ｔａｇ、Ｈｉｓ−Ｔａｇを含むチオレドキシンの融合タンパク質を発現するＬｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｇ（ＬＩＣ）ＶｅｃｔｏｒのｐＥＴ３２Ｘａ／ＬＩＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用し、添付のプロトコールに従って作製したものである。上記（Ｉ）にて得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、Ｓｕｐｒｅｃ−０１（登録商標）で精製してエタノール沈殿で回収した。ＰＣＲ産物のＬＩＣサイトの形成は、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、ＰＣＲ産物の３’末端からグアニン塩基（Ｇ）の直前まで削った。すなわち、ＰＣＲ産物（０．２ｐｍｏｌ）とＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１Ｕ／２０μｌ）を含む反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．５）、１０１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  β−ＭＥ、５ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ｄＧＴＰ）を混合し、２２℃で１時間アニーリング反応を行なった。この反応液１μｌをコンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に公知の方法で形質転換し、形質転換した大腸菌株に目的とするローヤルゼリーペプチドをコードする遺伝子の有無を、コロニーＰＣＲで確認した。
＜３＞組換えタンパク質の発現および精製
上記＜２＞によって得られた、ローヤルゼリーペプチド遺伝子が導入された大腸菌株をＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ３ｍｌに植菌し、３７℃で一晩の前培養を行なった。前培養後、この培養液２ｍｌを前培養で用いた培養液と同一の培養液ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  ２００ｍｌに加え、３７℃で２時間の培養を行なった。そして、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で３時間培養し、遺伝子発現の誘導を行なった。その後、菌体はＰＭＳＦ（最終濃度０．６２５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ中でポリトロン型ホモジナイザー（ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ  Ｔ８、ＩＫＡ）を用いて抽出し、２５０００×ｇ、２０分間で遠心分離を行なって上清を回収し抽出画分を得た。この抽出画分から融合タンパク質（すなわち、ローヤルゼリーペプチドを含む）の精製は、この融合タンパク質に付加されているＨｉｓ−Ｔａｇを利用して行なった。具体的には、Ｈｉｓ−Ｔａｇと結合するＮｉイオンを固定化された樹脂による金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製を行なった。アフィニティー樹脂は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用し、バッチ法で精製した。ＰＢＳで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅに抽出画分を加え、低温条件下で穏やかに混合して樹脂に結合させた。次に、７００×ｇ、３分間で遠心分離を行なって上清を除去しＰＢＳで樹脂を洗浄し、さらに樹脂と非特異的に結合しているタンパク質を溶出するため、０．０５Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＰＢＳを加えて樹脂を洗浄した。続いて、０．５Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＰＢＳを加えて低温条件下で穏やかに混合し、目的とする融合タンパク質を溶出した。そして、溶出した融合タンパク質を７００×ｇで３分間の遠心分離を行って上清を回収し、この上清を限外濾過（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−４  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ、ＭＷＣＯ  １００００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で酵素処理用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に置換した。そして、融合タンパク質１ｍｇ当たり、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｓ）５μｇを加え、３７℃で２４時間の消化反応させた。
上記のとおり消化させた反応液は、逆相クロマトグラフィー用カラム（ＲＥＳＯＵＲＣＲ  ＲＰＣ  ３ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を接続した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで精製した。０．１％ＴＦＡで平衡化したカラムにサンプルを注入し、流速１ｍｌ／ｍｉｎ．で０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの濃度勾配で溶出させた。検出には、紫外分光光度計検出器で波長２１５ｎｍにおける吸光度を測定し、その吸光度の変化をレコーダーに記録した。
結果は、図８に例示したとおりであった。また、図中の水平バーのピークを、トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、目的とするローヤルゼリーペプチドが単離されたことを確認した。
［実施例７］：ローヤルゼリーペプチド（アピシミン）の機能解析
＜１＞女王蜂への分化誘導効果
実施例６で得られたローヤルゼリーペプチドを用いて、機能解析を行なった。具体的には、既存のミツバチ人工飼育方法に従って、ミツバチを飼育した。その際に、人工餌料中に１頭あたり５００ｎｇの前記のローヤルゼリーペプチドを添加して与えた。一方、対照区としてはローヤルゼリーペプチドの代わりに、ウシ血清アルブミンを使用した。
結果は、表１に示したとおりである。幼虫から成虫化率は２０％程であったが、ローヤルゼリーペプチドを摂取させた幼虫の内、中間体を出現させることができた。このことから、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドは、女王蜂への分化誘導における補助的な機能を有する因子であることが考えられる。
2005030951.tif 000002
＜２＞免疫賦活試験
（ａ）実験動物と培地組成
実験動物は、ＩＣＲ系マウス（雌、日本ＳＬＣ）を用いた。
また、培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地（日水製薬社製）を使用し、５％ＣＯ２、３７℃、湿潤の条件下で培養した。
（ｂ）細胞浮遊液の調整
細胞浮遊液の調整は、以下のステップで行なった。
すなわち、ジエチルエーテルで麻酔したマウスを頚椎脱臼して固定した後、解剖用ハサミとピンセットを用いて脾臓を摘出して、ＰＢＳ（−）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）を１０ｍｌ入れたディッシュへ移した。ディッシュ内で、脾臓をホモゲナイズし、これを金属メッシュを用いて５０ｍｌチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）内へろ過して細胞液として調整した。これを１１００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離を行い、トリス塩化アンモニウム溶液（０．１４Ｍ  塩化アンモニウム、１．７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６５））を５ｍｌ加えて、５分間のインキュベーをした。この操作を２回繰り返して、赤血球を除去した。
次いで、洗浄のためのＰＢＳ（−）を３０ｍｌ加えて、１１００ｒｐｍ、１０分間で遠心分離を２回繰り返し、上清を取り除いた。そして、上記（ａ）のＲＰＭＩ培地４０ｍｌを加え、フラスコに移して、ＣＯ２インキュベーター（和研薬社製）内で、３７℃、２時間でインキュベートし、フラスコ内の上清を新しいチューブに移したものをリンパ細胞浮遊液とした。
調整した上記のリンパ細胞浮遊液は、０．４％トリパンブルー溶液で染色し、プルケルチュク血球計算板を用いて細胞数を計測し、細胞数が１×１０６細胞／ｍｌとなるよう培地で調整したものを、免疫の活性試験に用いた。
（ｃ）免疫賦活試験
上記＜２＞（ｂ）で調整したリンパ細胞浮遊液を９６穴マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に１００μｌづつ入れ、リンパ細胞浮遊液の最終濃度が１％となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で細胞液を溶解し、各ウェルに１１μｌ添加した。これと同時に、免疫細胞（本実施例の場合は、リンパ球細胞）の代謝活性による還元量を測定することができるａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ（登録商標）（和光純薬工業社製）を１０μｌづつ各ウェルに添加し、１２時間ごとに４日間、波長５９０−６２０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダー（ナルジュヌンクインターナショナル社製）で吸光度の変化を測定し、リンパ球に対する各画分および単離化合物の影響を解析した。
結果は、図９に示したとおりである。ローヤルゼリーペプチドを添加していない場合と添加した場合とを比較することにより、この出願の発明のローヤルゼリーペプチドの効果が顕著に現れていることが確認することができた。
図中の黒菱形は無添加のコントロール、黒丸はポジティブコントロールのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を３μｇ／ｍｌ添加したもの、黒四角は組換えローヤルゼリーペプチドを３μｇ／ｍｌ添加したもの、黒三角は組換えローヤルゼリーペプチドを６μｇ／ｍｌ添加したものをそれぞれ示している。
［実施例８］：抗ローヤルゼリーペプチド抗体を用いた女王蜂への分化誘導の阻止
＜１＞抗ローヤルゼリーペプチド抗体の作製
図３および図４に例示した、ローヤルゼリーペプチドのアミノ酸配列（配列番号１４〜配列番号１７）に基づいて、２４番から３５番のアミノ酸配列を利用し、抗原となり得るペプチド「ＣＳＩＶＳＧＡＮＶＳＡＶＬ」を合成した。この合成ペプチドを抗原として、通常の方法で抗体作製をするため、ウサギ２羽（品種：ＪＷクリーン）に１ｍｇ／回を投与して、免疫感作実験を行なった。この免疫感作実験開始５週から７週間に、追加免疫を実施しながら試料採血し、ＥＬＩＳＡで抗体価を調査しながら最終的に全血採血し、この血清を次の実験に供した。
＜２＞抗原ペプチドを用いたＡｆｆｉｎｉｔｙ精製法
２０ｍｌの血清の４０％硫安沈殿物を、２０ｍＭリン酸と１５０ｍＭＮａＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７・４）で透析し、０．４５μｍのフィルターでろ過し、精製用サンプルとした。
ＨＮＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ  担体約２ｍｌに抗原ペプチド約１０ｍｇを結合させて、Ａｆｆｉｎｉｔｙカラムを作製した。平衡化Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭＮａＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ７．４））を流し、サンプルをアプライして、カラム内を２時間平衡化Ｂｕｆｆｅｒで循環し、その後ベースラインに戻るまで平衡化Ｂｕｆｆｅｒを流した。溶出Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍｌクエン酸−ＮａＯＨ、（ｐＨ３．０））で血清中の抗体を溶出した。
吸光度２８０ｎｍで溶出ピークを回収し、ＰＢＳ（−）で透析して０・４５μｍのフィルターでろ過し後に、６ｍｌの精製物を得ることができた。総タンパク質量は３５５μｇであった。
＜３＞精製抗体を用いたウェスタンブロツティング
内勤働きバチから下咽頭線を摘出し、そのタンパク質試料をトリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、分離後のゲルは、セミドライ式プロティング法でＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜は、ブロッキング剤として５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔに一晩浸漬してブロッキング処理を行なった。次に、ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、上記＜２＞にて得られた精製抗体を抗体希釈液（１％  ｇｅｌａｔｉｎ／ＴＢＳ−Ｔ）で１００倍希釈して、一次抗体反応としてこの抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸漬し、室温で１時間反応させた。その後、ＴＢＳ−Ｔで再度洗浄し、二次抗体反応として、抗体希釈液で２０００倍希釈した２次抗体（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  標識抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ）と室温で１時間反応させた。検出は、ＥＣＬ（登録商標）を用いて化学発光させ、シグナルをＸ線フィルムに露光させた。
結果は、図１０に示したとおりであった。この図１０に示したように、内勤働きバチからの下咽頭腺におけるタンパク質試料と、作製した抗体（抗ローヤルゼリーペプチド抗体）におけるシグナルバンドが、分子量５５００付近で観察された。すなわち、ローヤルゼリーペプチドの合成器官が、下咽頭腺であることが確認でき、またこの結果は、作製した抗体がローヤルゼリーペプチドに反応するものであることを明らかにすることができた。
＜４＞女王蜂への分化誘導効果を阻止するローヤルゼリーペプチド精製抗体一
上記＜１＞〜＜３＞で得られた精製抗体を用いて、既存のミツバチ人工飼育法に従って、ミツバチを飼育した。ここでは、人工飼料中のローヤルゼリー抽出画分区（ローヤルゼリーから分子量１００〜１００００の抽出画分を５０ｍｇ／７ｍｌに調整したもの）をポジティプコントロールとし、対照区には牛血清アルブミン（５０ｍｇ／７ｍｌ）を使用した。ローヤルゼリーペプチドの抗体区としては、ポジティブコントロールとしたローヤルゼリーから分子量１００〜１００００の抽出画分５０ｍｇを７ｍｌに調整し、これに抗体２０μｇ添加したものを使用した。結果は、表２に示した。
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この表２に示したように、対照区では幼虫からの成虫化率は１３％程度、ローヤルゼリー抽出画分区では１７％程度、ローヤルゼリーペプチド抗体区では２９％であった。それぞれの成虫化したものの内、対照区では、中間体と働きバチの出現は５０％であった。ポジティブコントロールのローヤルゼリー抽出画分区では、２５％が女王蜂で、７５％が中間体となり働きバチはまったく出現しなかった。ローヤルゼリーペプチド抗体区では、女王蜂の出現は観察されず、中間体が８６％で働きバチの出現も１４％となった。
この結果は、ローヤルゼリー抽出画分の０．０４％（２０μｇ÷５０ｍｇ）のような低濃度のローヤルゼリーペプチド抗体を人工飼料中に添加することで、女王蜂誘導を阻止する効果があることを示している。したがって、この結果によって、ローヤルゼリーペプチドが女王蜂への分化誘導における補助的な機能を有する因子であることを改めて確認できた。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、女王蜂の誘導補助因子としての機能を有し、また動物の生体防御系の向上（免疫力の賦活効果）を実現することのできるローヤルゼリーペプチドおよびこれを含有する組成物が提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年10月14日(2005.10.14)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】削除
【請求項２】削除
【請求項３】削除
【請求項４】削除
【請求項５】ミツバチの女王蜂分化誘導補助効果を向上させる機能を有するローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有することを特徴とするミツバチの女王蜂分化誘導用組成物。
【請求項６】薬理成分および食品成分の少なくともいずれかの成分を、さらに含有させてなる請求項５の組成物。
【請求項７】動物の免疫力賦活効果を向上させる機能を有するローヤルゼリーペプチドを有効成分として含有することを特徴とする免疫力賦活用組成物。
【請求項８】薬理成分および食品成分の少なくともいずれかの成分を、さらに含有させてなる請求項７の組成物。
【請求項９】請求項５または６の組成物をミツバチの幼虫に投与することにより、幼虫の成長を促進し、女王蜂への分化を誘導させることを特徴とするミツバチの女王蜂への誘導方法。
【請求項１０】請求項７または８の組成物を動物に投与することにより、動物の免疫力賦活効果を向上させることを特徴とする動物の免疫力賦活方法。
【請求項１１】削除
【請求項１２】動物が、哺乳類である請求項１０の動物の免疫力賦活方法。
【請求項１３】哺乳類が、ヒトである請求項１２の動物の免疫力賦活方法。




【国際調査報告】
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