(57)【要約】ＰＣＲ法による食品または食品原材料中の特定植物属を定量する方法であって、（ｉ）検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料との混合比が予め判っている補正用サンプルを用意し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、（ｉｉ）被検対象とする食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプルを調製し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、（ｉｉｉ）該ゲノムＤＮＡとプライマーとで定量的ＰＣＲ法を実施すること、（ｉｖ）補正用サンプルで検出される補正標準値を用いて補正して、被検サンプル中に含まれる特定植物原料の量を算出することを含む上記方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲ法による食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を定量する方法であって、
検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料とを予め定めた比率で混合した補正用サンプルを用意し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、
被検対象である食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプルを調製し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、
検出対象である特定植物属由来の試料を検出するためのプライマーセット、および標準植物試料を検出するためのプライマーセットを用いて各サンプルから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして定量的ＰＣＲ法を実施すること、
補正標準値として、補正用サンプルについて上記定量的ＰＣＲ法によって標準植物由来ＤＮＡのコピー数／特定植物属由来ＤＮＡのコピー数の値を求めること、ならびに
被検サンプルについて上記定量的ＰＣＲ法によって特定植物属由来ＤＮＡのコピー数／標準植物由来ＤＮＡのコピー数の値を求め、これを上記補正標準値を用いて補正して、食品または食品原材料中に含まれる特定植物属の植物の量を算出すること、
を含む上記方法。
【請求項２】
定量的ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リアルタイムＰＣＲ法が、５’末端に発光色素および３’末端に消光剤を有している、ＰＣＲプライマーセットの各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡの部位の内側にハイブリダイズするプローブを用いて、発光量に基づいてＤＮＡを定量する方法であって、ここで、プローブの５’末端の発光色素はその３’末端の消光剤によってその発光が抑制されているが、ＰＣＲ反応においてＴａｑポリメラーゼによってプライマーからＤＮＡが伸長されると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により上記プローブが分解され、発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
標準植物が、畑地雑草および食用作物以外の植物種に属するものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
標準植物が、スターチスである請求項４記載の方法。
【請求項６】
検出対象の特定植物属が、ソバ、落花生、小麦または大豆属である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
標準植物がスターチスであり、スターチス検出用プライマーセットが、配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、スターチス検出用プローブが、配列番号５９記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２または３記載の方法。
【請求項８】
検出対象の特定植物属がソバ属であり、ソバ属検出用プライマーセットが、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、ソバ属検出用プローブが、配列番号６４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２または３記載の方法。
【請求項９】
検出対象の特定植物属が落花生属であり、落花生属検出用プライマーセットが、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットであり、落花生属検出用プローブが、配列番号３４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２または３記載の方法。
【請求項１０】
配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるスターチス検出用プライマーセット。
【請求項１１】
配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセット。
【請求項１２】
配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検出用プライマーセット。
【請求項１３】
食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、標準植物試料検出用プライマーセットを含む、上記キット。
【請求項１４】
標準植物試料検出用プローブをさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
標準植物がスターチスであり、スターチス検出用プライマーセットが、配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、請求項１３または１４記載のキット。
【請求項１６】
配列番号５９からなる配列を有する、スターチス検出用プローブをさらに含む、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
検出対象の特定植物属検出用プライマーセットをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１８】
検出対象の特定植物属がソバ属であり、その検出用プライマーセットが、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項１９】
配列番号６４からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
検出対象の特定植物属が落花生属であり、その検出用プライマーセットが、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、請求項１３〜１６のいずれか１項記載のキット。
【請求項２１】
配列番号３４からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
標準植物試料としてスターチス試料をさらに含む、請求項１５記載のキット。
【請求項２３】
標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属がソバ属であり、スターチスおよびソバについての検量線を作製するための、スターチスの増幅標的配列を含むＤＮＡとソバの増幅標的配列を含むＤＮＡとを連結して含む検量線作製用プラスミドをさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項２４】
標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属が落花生属であり、スターチスおよび落花生についての検量線を作製するための、スターチスの増幅標的配列を含むＤＮＡと落花生の増幅標的配列を含むＤＮＡとを連結して含む検量線作製用プラスミドをさらに含む、請求項１３記載のキット。
【請求項２５】
食品または食品原材料中のソバ属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセットを含む、上記キット。
【請求項２６】
配列番号６４からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
食品または食品原材料中の落花生属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検出用プライマーセットを含む、上記キット。
【請求項２８】
配列番号３４からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、請求項２７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、食品または食品原材料中に含まれる特定植物属の定量的検出方法に関する。
【背景技術】  ２００２年４月より、日本において、アレルギーの原因となる特定原材料について製品への表示制度が開始された。したがって、食品については特定原材料として、小麦、ソバ、落花生、乳および卵の５品目について下記の条件に沿って表示が義務づけられた［（「厚生労働省ホームページ：アレルギー物質を含む食品に関する表示について」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／ｔｏｐｉｃｓ／０１０３／ｔｐ０３２９−２ｂ．ｈｔｍｌ））、（「食品衛生学雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇｉｅｎｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＳＨＯＫＵＨＩＮ  ＥＩＳＥＩＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ）），（日本），社団法人  日本食品衛生学会，２００２年，第４３巻，第４号，ｐ．ｊ−２６９−ｊ−２７１」）］。これに伴い、厚生労働省からは、特定原材料について、一次スクリーニング用のポリクローナル抗体による定量ＥＬＩＳＡ法ならびに確定試験用の定性ＰＣＲ法（小麦、ソバ、落花生）およびウェスタンブロット法（乳、卵）の試験が通知されている。一次スクリーニングのＥＬＩＳＡ法については２種のＥＬＩＳＡキットのうちのいずれかの定量値が１０ｐｐｍ以上（特定原材料の総タンパク質量／最終製品重量に換算）である試料は陽性であると判断され、さらに、製造記録の確認、ＰＣＲ法（小麦、ソバ、落花生）またはウェスタンブロット法（乳、卵）による定性試験での確認が行われることになる［（厚生労働省ホームページ：「アレルギー物質を含む食品の検査方法について」（食発第１１０６００１号）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｈｏｕｒｅｉ．ｍｈｌｗ．ｇｏ．ｊｐ／￣ｈｏｕｒｅｉ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔ＿ｄｏｃｆｒａｍｅ．ｃｇｉ？ＭＯＤＥ＝ｔｓｕｃｈｉ＆ＤＭＯＤＥ＝ＣＯＮＴＥＮＴＳ＆ＳＭＯＤＥ＝ＮＯＲＭＡＬ＆ＫＥＹＷＯＲＤ＝＆ＥＦＳＮＯ＝４６４２））］。
一般に、ＥＬＩＳＡ法は非常に高感度のタンパク質検出法であり、当該方法は当技術分野においては慣用技術となっている。しかしながら、ポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法では交差反応性が比較的高く、非特異的なタンパク質を検出する可能性があるため（石川栄治監訳：エンザイムイムノアッセイ（１９８９））、偽陽性の判定が出る可能性がある。偽陽性について検定するためには、他の方法で再確認することを要する。
また、ＥＬＩＳＡ法は、高感度である一方で、測定におけるダイナミックレンジが狭い。測定におけるダイナミックレンジが狭いということは、未知の濃度の試料を正確に測定するためには、何段階かに希釈した検液を用意して、検量線の範囲内に収まる検液の測定結果を選択する必要が生じる可能性がある。さらに、通常ＥＬＩＳＡによる測定では、被検対象とする試料毎の抽出効率やＥＬＩＳＡ反応の阻害などの影響に対する補正が考慮されておらず、特に食品のような多岐に渡る加工処理および混入物が推定される試料等を測定して定量値を出す場合には注意が必要である。
さらに、例えば、市販のソバタンパク質検出用ＥＬＩＳＡの検出感度は、キット付属の検量線用標準ソバタンパク質検液で１ｎｇ／ｍｌ（２０〜４００倍希釈してＥＬＩＳＡに供したとすると、特定原材料の総タンパク質量／最終製品重量に換算すると０．０２〜０．１ｐｐｍ）と高感度である［（「食品衛生学雑誌（Ｊｏｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇｉｅｎｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＳＨＯＫＵＨＩＮ  ＥＩＳＥＩＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ）），（日本），社団法人  日本食品衛生学会，２００２年，第４３巻，第４号，ｐ．ｊ−２７５−ｊ−２７７」、（「食品衛生学雑誌（Ｊｏｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇｉｅｎｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＳＨＯＫＵＨＩＮ  ＥＩＳＥＩＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ）），（日本），社団法人  日本食品衛生学会，２００２年，第４３巻，第４号，ｐ．ｊ−２７７−ｊ−２７９」、（日本ハム株式会社ＦＡＳＴ  ＫＩＴ（Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ）シリーズ  エライザ  そば−ＥＬＩＳＡ  ＢＵＣＫＷＨＥＡＴ−＜＜取扱い説明書＞＞）、（株式会社森永生科学研究所  モリナガ  そば  測定キット  取扱い説明書）］。しかしながら、例えばソバの総タンパク質量／試料重量に換算してこのレベルの濃度となるソバ粉を含む試料から２ｇをサンプリングした場合、検出対象の特定原材料の粒径がかなり細かくないと、試料からはソバ粉の粒をサンプリングできない恐れもあり得る。
一方、混入したソバを検出するためのＰＣＲ法として現在知られているものは、感度がソバＤＮＡ量として約５ｐｇであり、小麦中にソバを添加した試料では約１０ｐｐｍのソバが検出できるが、この公知の方法では定量分析はできない［（「食品衛生学雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇｉｅｎｉｃｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＳＨＯＫＵＨＩＮ  ＥＩＳＥＩＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ）），（日本），社団法人  日本食品衛生学会，２００２年，第４３巻，第４号，ｐ．ｊ−２８０−ｊ−２８２」、（「（社）日本食品衛生学会第８４回学術講演会  講演要旨集」，（日本），社団法人  日本食品衛生学会，２００２年，ｐ．１０４））。
また、本発明者らは、特定植物属の存在を検出するための方法として、１ｐｐｍ以上（ＤＮＡ／ＤＮＡ）の感度で検出可能なＩＴＳ配列を標的とした定性ＰＣＲ法を開発し、２００２年９月２７日付けで日本国特許出願（出願番号：特２００２−２８４２２２）をしたが、当該方法では定量分析はできない。
遺伝子組換え作物のＰＣＲによる定量法として、遺伝子組換えとうもろこしに特有の遺伝子配列のコピー数を測定し、別途測定したとうもろこしに固有の内在性遺伝子配列のコピー数で補正を行い、とうもろこし原料中の遺伝子組換えとうもろこし原料の量を測定するものがある［（「ジャーナル  オブ  エーオーエーシー  インターナショナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ）」，（米国），エーオーエーシー  インターナショナル（ＡＯＡＣ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ），２００２年，第８５巻，第５号，ｐ．１０７７−１０８９）］。
詳しくは、まず純粋な遺伝子組換えとうもろこしの代表的な品種を使用して、その種子から抽出したＤＮＡの「組換えＤＮＡ配列のコピー数／内在性遺伝子配列のコピー数」の値（内標比）を求める。次に、未知試料の「組換えＤＮＡ配列のコピー数／内在性遺伝配列のコピー数」の値を求め、これに内標比の逆数と１００を乗じて遺伝子組換えとうもろこしの混入率を測定するものである。この方法では、種々の品種のとうもろこしでコピー数が同じであり、かつ共通な塩基配列を持つ内在性遺伝子を内部標準として用いているため、とうもろこしならとうもろこしというように同じ植物種からなる試料中での組換え体の含有量を定量することには適している。
しかしながら、様々な生物種や無生物の原料からなる混合物中に存在するアレルギーの原因となる特定原材料の量を測定することを考えた場合、様々な生物種のＤＮＡの中から内部標準として用いることのできる内在性配列を見出すことは困難であり、さらには無生物の様にＤＮＡの無いものからそれを見出すことは不可能である。
【発明の開示】
そこで、食品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出方法として、より欠点の少ない方法を開発することを試みた。すなわち、被検対象とする試料毎の抽出効率や検出反応の阻害などの影響に対する補正が可能であり、ＥＬＩＳＡ法よりダイナミックレンジが広く、かつ食品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出に十分な特異性および感度を有する定量方法の開発を目的として、本発明を検討した。
すなわち、被検対象とする試料毎の抽出効率や検出反応の阻害などの影響を考慮するために標準植物由来の試料（標準植物試料）を用いて補正すること、検出のダイナミックレンジが公知のＥＬＩＳＡ法に比べて広いこと、ならびに十分な特異性および感度を有することを特徴とする、定量的ＰＣＲ検出法の確立を鋭意検討し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、
１．  ＰＣＲ法による食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を定量する方法であって、
検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料とを予め定めた比率で混合した補正用サンプルを用意し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、
被検対象である食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプルを調製し、該サンプルからゲノムＤＮＡを抽出すること、
検出対象である特定植物属由来の試料を検出するためのプライマーセット、および標準植物試料を検出するためのプライマーセットを用いて各サンプルから抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして定量的ＰＣＲ法を実施すること、
補正標準値として、補正用サンプルについて上記定量的ＰＣＲ法によって標準植物由来ＤＮＡのコピー数／特定植物属由来ＤＮＡのコピー数の値を求めること、ならびに
被検サンプルについて上記定量的ＰＣＲ法によって特定植物属由来ＤＮＡのコピー数／標準植物由来ＤＮＡのコピー数の値を求め、これを上記補正標準値を用いて補正して、食品または食品原材料中に含まれる特定植物属の植物の量を算出すること、
を含む上記方法；
２．  定量的ＰＣＲ法がリアルタイムＰＣＲ法である、上記１記載の方法；
３．  リアルタイムＰＣＲ法が、５’末端に発光色素および３’末端に消光剤を有している、ＰＣＲプライマーセットの各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするゲノムＤＮＡの部位の内側にハイブリダイズするプローブを用いて、発光量に基づいてＤＮＡを定量する方法であって、ここで、プローブの５’末端の発光色素はその３’末端の消光剤によってその発光が抑制されているが、ＰＣＲ反応においてＴａｑポリメラーゼによってプライマーからＤＮＡが伸長されると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により上記プローブが分解され、発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする、上記２記載の方法；
４．  標準植物が、畑地雑草および食用作物以外の植物種に属するものである、上記１〜３のいずれかに記載の方法；
５．  標準植物が、スターチスである上記４記載の方法；
６．  検出対象の特定植物属が、ソバ、落花生、小麦または大豆属である、上記１〜５のいずれかに記載の方法；
７．  標準植物がスターチスであり、スターチス検出用プライマーセットが、配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、スターチス検出用プローブが、配列番号５９記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記２または３記載の方法；
８．  検出対象の特定植物属がソバ属であり、ソバ属検出用プライマーセットが、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットであり、ソバ属検出用プローブが、配列番号６４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記２または３記載の方法；
９．検出対象の特定植物属が落花生属であり、落花生属検出用プライマーセットが、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットであり、落花生属検出用プローブが、配列番号３４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドである、上記２または３記載の方法；
１０．  配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるスターチス検出用プライマーセット；
１１．  配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセット。
１２．  配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載のいずれかの配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検出用プライマーセット；
１３．  食品または食品原材料中の特定植物属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、標準植物試料検出用プライマーセットを含む、上記キット；
１４．  標準植物試料検出用プローブをさらに含む、上記１３記載のキット；
１５．  標準植物がスターチスであり、スターチス検出用プライマーセットが、配列番号５７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号５８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、上記１３または１４記載のキット；
１６．  配列番号５９からなる配列を有する、スターチス検出用プローブをさらに含む、上記１５記載のキット；
１７．  検出対象の特定植物属検出用プライマーセットをさらに含む、上記１３〜１６のいずれかに記載のキット；
１８．  検出対象の特定植物属がソバ属であり、その検出用プライマーセットが、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、上記１３〜１６のいずれかに記載のキット；
１９．  配列番号６４からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、上記１８記載のキット；
２０．  検出対象の特定植物属が落花生属であり、その検出用プライマーセットが、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるセットである、上記１３〜１６のいずれかに記載のキット；
２１．  配列番号３４からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、上記２０記載のキット；
２２．  標準植物試料としてスターチス試料をさらに含む、上記１５記載のキット；
２３．  標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属がソバ属であり、スターチスおよびソバについての検量線を作製するための、スターチスの増幅標的配列を含むＤＮＡとソバの増幅標的配列を含むＤＮＡとを連結して含む検量線作製用プラスミドをさらに含む、上記１３記載のキット；
２４．  標準植物がスターチスであり、かつ、検出対象の特定植物属が落花生属であり、スターチスおよび落花生についての検量線を作製するための、スターチスの増幅標的配列を含むＤＮＡと落花生の増幅標的配列を含むＤＮＡとを連結して含む検量線作製用プラスミドをさらに含む、上記１３記載のキット；
２５．食品または食品原材料中のソバ属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなるソバ属検出用プライマーセットを含む、上記キット；
２６．  配列番号６４からなる配列を有するソバ属検出用プローブをさらに含む、上記２５記載のキット；
２７．  食品または食品原材料中の落花生属に属する植物を検出するための方法に用いるためのキットであって、配列番号２１記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２６、６５または６６記載の配列を有するオリゴヌクレオチドとからなる落花生属検出用プライマーセットを含む、上記キット；ならびに
２８．  配列番号３４からなる配列を有する落花生属検出用プローブをさらに含む、上記２７記載のキット；
に関する。
本発明の方法、すなわち、被検対象とする試料毎のＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害などの影響に対する補正の方法として、外部からＤＮＡを標準として添加して反応溶液中のＰＣＲ反応の阻害などの影響に対する補正を行うのではなく、外部から精製ＤＮＡ以外の標準植物試料を添加したサンプルから検出対象の特定植物属（本明細書中、「検出対象の特定植物属」とは、定量対象の特定植物属をも包含する）由来のＤＮＡと標準植物由来のＤＮＡを同時に抽出して定量的ＰＣＲ法を行うという方法は、本明細書において初めて開示されるものである。かかる方法により、標準植物試料と検出対象の特定植物属由来の試料との間で、ＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害等の影響が均一な条件で測定できるため、非常に信頼度の高い定量が可能である。また、ＤＮＡ抽出効率、ＰＣＲ反応の阻害等の影響、さらには被検対象とする試料中のＤＮＡ含有量の違いに対しても補正が可能であるという、有利な効果を本発明の方法は有している。さらに、ＰＣＲ法による定量分析は、偽陽性が出た場合に、そのＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ配列の解析に供することにより、確実に偽陽性を除外することができるという点から、産業上利用性に優れているといえる。したがって、本発明は、食品または食品原材料中に含まれるアレルギーの原因となる特定植物属に属する植物の定量的検出に有用である。
したがって、本発明の方法において、標準植物試料として用いるスターチス検出用プライマーセット、および特定植物属としてのソバ属または落花生属検出用のプライマーセットも本発明に包含し、さらに、これらのプライマーセットと組合わせて、リアルタイムＰＣＲ法による検出に用いるためのプローブも本発明に包含される。また、標準植物試料を検出するためのプライマーセット、および検出対象の特定植物属に属する植物を検出するためのプライマーセットのいずれかまたは両方を含む、本発明の方法の実施に用いるためのキットも本発明の範囲に含まれる。かかるキットは、上記プローブを含んでいてもよい。さらには、標準植物試料を含んでいてもよく、標準植物としてはスターチスが好ましく、その試料としてはスターチス植物体の乾燥粉末が好ましいが、特に種子の乾燥粉末が好ましい。さらには、該キットに含まれるプライマーセットが増幅し得る、標準植物試料の配列を含むＤＮＡと検出対象の特定植物属の配列を含むＤＮＡとを連結して含む、標準植物試料と特定植物属についての検量線を作成するための検量線作成用プラスミドが、上記キットに含まれていてもよい。
本明細書において、所定の植物もしくは植物属（その属に属する、即ち含まれる植物を指す場合も含む）、またはこれらに由来する試料の「検出用プライマー」または「検出するためのプライマー」とは、ＰＣＲ法において、所定の植物または植物属に属する植物のゲノムＤＮＡの一部を特異的に増幅するためのオリゴヌクレオチドからなるプライマーをいう。ＰＣＲ法に用いるためのフォワードプライマーとリバースプライマーの２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマー対を、本明細書においては「プライマーセット」と称する場合がある。
本発明のプライマーは、各植物属を定量するための定量的ＰＣＲ法に用いることができるものであるが、各植物属の非定量的（即ち、定性）検出に用いることもできるものであることは言うまでもない。本発明のプライマーを用いると、検出対象とする植物属に属するあらゆる植物種を検出することができ、本発明のプライマーおよびプライマーセットは、定量的および非定量的ＰＣＲにおいて有利である。
本明細書中、「検出」という用語は、定性および定量的検出の両方を包含する。
本発明においては、検出対象である特定植物属由来のＤＮＡを特異的に増幅させるためのプライマーを設計する。すなわち、４５Ｓ  ｒＲＮＡ前駆体遺伝子配列中で特定植物属に共通する塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマーであって、該核酸分子とハイブリダイズしたときに３’末端が特定植物属のＩＴＳ−１配列中の塩基と相補的に結合するプライマー（Ａ）またはＩＴＳ−２配列中の塩基と相補的に結合するプライマー（Ｂ）を１種以上使用したＰＣＲの後、特定植物属のＩＴＳ−１またはＩＴＳ−２配列の少なくとも一部を含むＰＣＲ増幅産物の存在を指標として特定植物属の存在を検出することができるプライマーを設計する。
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、２つのＤＮＡ断片が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズすることを意味する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，９．４７−９．６２及び１１．４５−１１．６１）。より具体的には、例えば以下の式で求められるＴｍ値を基準としてハイブリダイゼーション（例えば約３．０×ＳＳＣまたは２．０×ＳＳＣ、３０℃または３７℃）を行った後、ハイブリダイゼーションの条件よりストリンジェンシーの高い条件での洗浄（例えば約２．０×ＳＳＣ、３０℃、３７℃、４０℃、４４℃もしくは４８℃以上、または１．０×ＳＳＣもしくは０．５×ＳＳＣ、３７℃以上など）を行うことを意味する。ハイブリダイズする塩基配列などに応じて適宜ハイブリダイゼーションおよび洗浄に適切な「ストリンジェントな条件」を選択することは、当技術分野では周知技術である。なお、本明細書中、単に「ハイブリダイズする」と記載する場合も、特に条件等を言及しているものを除き、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを意味する。
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
また、本明細書でいう「属」とは、その属に属する植物全部を含むもの、または属に属する植物の中から選んだ幾つかの種を含むものを意味する。
本発明に用いるプライマーセットは、４５Ｓ  ｒＲＮＡ前駆体遺伝子配列中の、特定植物属内で共通している塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマー対であって、該プライマー対のうち少なくとも一方のプライマーは、該核酸分子とハイブリダイズしたときに３’末端が特定植物属のＩＴＳ−１配列中の塩基と相補的に結合するプライマー（Ａ）またはＩＴＳ−２配列中の塩基と相補的に結合するプライマー（Ｂ）であることが重要である。ここで、プライマー（Ａ）はＩＴＳ−１と５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダイズするもの及びＩＴＳ−１とＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダイズするものをも含む。同様に、プライマー（Ｂ）はＩＴＳ−２と５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダイズするもの及びＩＴＳ−２とＬＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子配列との境界を含む領域にハイブリダイズするものをも含む。プライマー（Ａ）及び（Ｂ）は少なくとも１５個の塩基からなるものが好ましく、より好ましくは１５から３０個の塩基からなる。ＩＴＳ−１配列及びＩＴＳ−２配列は種に特異的な配列を多く含んでいるので、４５Ｓ  ｒＲＮＡ前駆体遺伝子配列中の、特定植物属内で共通している塩基配列を有する核酸分子として、ＩＴＳ−１またはＩＴＳ−２配列中の、特定植物属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列を有する核酸分子を好適に選択することにより、特定種類の植物属内で共通し、かつ該属に特異性を持つプライマー（Ａ）または（Ｂ）を得ることができる。また、プライマー（Ａ）または（Ｂ）を１個または２個以上使用してもよく、２個以上使用する場合には、さらに特定種類の植物属に対する特異性が高くなる。
また、別の態様としては、プライマー（Ａ）と、特定植物属のＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ−２及びＬＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子が連続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマー（Ｃ）とを使用する。あるいはプライマー（Ａ）と、特定植物属のＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子及びＩＴＳ−１が連続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマー（Ｅ）とを使用する。さらに、別の態様としては、プライマー（Ｂ）と、特定植物属のＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ−１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子及びＩＴＳ−２が連続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマー（Ｄ）とを使用する。あるいはプライマー（Ｂ）と、特定植物属のＩＴＳ−２及びＬＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子に連続して結合した配列の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマー（Ｆ）とを使用する。ここで、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は保存性が高く、大多数の植物に共通な配列を多く含んでいる。それ故、プライマー（Ｃ）として、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマーであって、該核酸分子とハイブリダイズしたときに３’末端が５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列中の塩基配列と相補的に結合するプライマーを好適に選択することにより、またはプライマー（Ｄ）として、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマーであって、該核酸分子とハイブリダイズしたときに３’末端が５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列中の塩基配列と相補的に結合するプライマーを好適に選択することにより、該プライマーは種々の植物に対して共通して使用することも可能である。これらのプライマーを固定し、ＩＴＳ−１またはＩＴＳ−２領域から検出したい特定植物属内で共通し、かつ該属に特異的なプライマーを選択することによって、該特定植物属に属する植物の混入を高感度で検出するためのプライマーを容易に設計することができる。プライマー（Ｃ）〜（Ｆ）は少なくとも１５個の塩基からなるものが好ましく、より好ましくは１５から３０個の塩基からなる。
これらプライマーを設計するに当たっては、例えば「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで」（タンパク質・核酸・酵素  臨時増刊号１９９６年  共立出版株式会社）や「バイオ実験イラストレイテッド３本当に増えるＰＣＲ：細胞工学別紙  目で見る実験ノートシリーズ」（中山広樹著１９９６年  株式会社秀潤社）、「ＰＣＲテクノロジー−ＤＮＡ増幅の原理と応用−」（Ｈｅｎｒｙ  Ａ  Ｅｒｌｉｃｈ編、加藤邦之進監修  宝酒造株式会社）等に基づいて設計すればよいが、未加工品からの検出の場合には、ＤＮＡが分解している可能性が少ないので、７００塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーであってもよく、加工食品からの検出の場合には、ＤＮＡが分解して短くなっている可能性が考えられ、このような観点から２００塩基以内の増幅産物を得ることができるプライマーが高い感度を得ることができるという点から好ましい。
上述の観点から、プライマー（Ｃ）または（Ｄ）は配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマーであることが好ましい。５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ほぼ全域にわたって植物間で相同性が高いため、どこの領域にハイブリダイズするプライマーであっても使用することができるが、配列番号１は特に高い相同性を有する領域であるため、前記プライマーが好ましい。さらに好ましくは、配列番号１の位置１１〜６３の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るプライマーである。このようなプライマー（Ｃ）としては、配列番号２〜４で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号１にハイブリダイズする）。また、このようなプライマー（Ｄ）としては、配列番号５〜７で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号１の相補鎖にハイブリダイズする）。前記プライマーは、標的とする核酸分子と特異的にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが必要であり、またハイブリダイズしたプライマーがプライマーとして機能し、伸長反応が起きるには３’末端の塩基が標的とするＤＮＡ配列部分と相補的な塩基となっている必要がある。従って、このような要件を満たしていれば、前記プライマーは、配列番号２〜７で表される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。
ＩＴＳ−１やＩＴＳ−２配列中の、特定植物属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列は、検出対象である特定植物属および他の植物属の種々の植物のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列をＧｅｎＢａｎｋから取得し、アライメントを行い、該特定植物属に共通し、かつ該属に特異性の高い領域を探すことによって特定することができる。さらに、この特定した領域の中から、特に該特定植物属とその近縁種と考えられる植物との特異性が確保できる塩基を３’末端の塩基に設定して、プライマー配列を選定することができる。
例えば、特定植物属がソバ属の場合、ソバ属のＩＴＳ−１配列中の、ソバ属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列としては、市販ソバの大多数がＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（普通ソバ）であることや実際の市販ソバの配列がＧｅｎＢａｎｋのＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（普通ソバ）配列と合致したことにより、Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの配列から選択すればよく、具体的には、配列番号８、９または１０で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号８の位置１１〜６１の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号９の位置１１〜６７の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列を挙げることができる。また、配列番号１０は、特にソバ属の一部であるＦ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（普通ソバ）、Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ（ダッタンソバ）、Ｆ．ｈｏｍｏｔｒｏｐｉｃｕｍ、Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍを特異的に検出したいプライマーを選ぶ領域として有用である。
ソバ属のプライマー（Ａ）としては、配列番号１１〜１６で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号１１〜１４は配列番号８の相補鎖に、配列番号１５及び１６は配列番号９に、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする）。また、前記プライマーは配列番号１１〜１６で表される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、ＩＴＳ−２配列中で、ソバ属に共通し、かつ該属に特異的な塩基配列としては、配列番号３６または３７で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。これらは、特にソバ属の一部であるＦ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（普通ソバ）、Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ（だったんソバ）、Ｆ．ｈｏｍｏｔｒｏｐｉｃｕｍ、Ｆ．ｃｙｍｏｓｕｍを特異的に検出したい際のプライマーを選ぶ領域として有用である。そして、プライマーの組み合わせとしては、配列番号１１〜１４のいずれかと、配列番号１５、１６または配列番号２〜４とのいずれかとの組み合わせが好ましい。
特定植物属が落花生属の場合、市販落花生の大多数がＡｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａであるが、実際の市販落花生の配列がＧｅｎＢａｎｋのＡ．ｃｏｒｒｅｎｔｉｎａ、Ａ．ｖｉｌｌｏｓａの配列と合致したことにより、落花生属のＩＴＳ−１配列中の、落花生属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列としては、Ａ．ｖｉｌｌｏｓａの配列から選択すればよく、具体的には、配列番号１７〜２０で表される塩基配列またはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号１７の位置１１〜６２の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号１８の位置１１〜４７の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号１９の位置１１〜５０の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号２０の位置１１〜５８の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列である。
落花生属のプライマー（Ａ）としては、配列番号２１〜３１、６５および６６で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号２１〜２３は配列番号１７の相補鎖に、配列番号２４および２５は配列番号１８の相補鎖に、配列番号３０および３１は配列番号２０の相補鎖に、配列番号２６〜２９、６５および６６は配列番号１９に、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする）。また、前記プライマーは、上記のとおりそれぞれの相手側の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであれば、配列番号２１〜３１、６５および６６で表される塩基配列のうちの１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有するものであってもよい。また、落花生属のＩＴＳ−２配列中の、落花生属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列としては、配列番号３８で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号３８の位置１１〜４７の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列である。さらに、落花生属のプライマー（Ｂ）としては、配列番号３９で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号３８にストリンジェントな条件でハイブリダイズする）。また、前記プライマーは配列番号３９で表される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。そして、プライマーの組み合わせとしては、配列番号２１、２４または２５と配列番号２〜４のいずれかとの組み合わせ、配列番号２１、２４または２５と配列番号３９との組み合わせ、または配列番号３９と配列番号５〜７のいずれかとの組み合わせ、または配列番号２１〜２３、３０および３１のいずれかと配列番号２６〜２９、６５および６６のいずれかとの組合わせが好ましいが、配列番号２１、２４、および２５のいずれかと配列番号２〜４のいずれかとの組み合わせ、または、配列番号２１と配列番号２６、６５および６６のいずれかとの組合わせがより好ましい。
特定植物属が小麦属の場合、小麦属のＩＴＳ−２配列中の、小麦属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列として、配列番号４０〜４２で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号４０の位置１１〜５０の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号４１の位置１１〜４７の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号４２の位置１１〜４７の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列である。
小麦属のプライマー（Ｂ）としては、配列番号４３〜４５で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号４３は配列番号４０の相補鎖に、配列番号４４は配列番号４１に、配列番号４５は配列番号４２に、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする）。また、前記プライマーは配列番号４３〜４５で表される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。そして、プライマーの組み合わせとしては、配列番号４３と配列番号４４および４５の１個以上との組み合わせが好ましい。
特定植物属が大豆属の場合、大豆属のＩＴＳ−２配列中の、大豆属内で共通し、かつ該属に特異的な塩基配列として、配列番号４６、４７または４８で表される塩基配列あるいはそれらの相補鎖の塩基配列を挙げることができる。好ましくは、配列番号４６の位置１１〜４８の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号４７の位置１１〜５５の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列、配列番号４８の位置１１〜５２の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列である。
大豆属のプライマー（Ｂ）としては、配列番号４９〜５６で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい（配列番号４９は配列番号４６の相補鎖に、配列番号５０〜６５は配列番号４７に、配列番号５６は配列番号４８に、それぞれストリンジェントな条件でハイブリダイズする）。また、前記プライマーは配列番号４９〜５６で表される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドであってもよい。そして、プライマーの組み合わせとしては、配列番号４９と配列番号５０〜５６の１個以上との組み合わせが好ましい。
これらプライマーの設計や、設計したプライマーの評価にあたっては、ＰＣＲシミュレーションを利用しても良い。
例えば、ソバ属を検出するプライマーの設計においては、食用ソバ（普通ソバ、ダッタンソバ）を含むソバ属の植物２１配列に共通かつ特異性の高い領域をＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列部分から見出し、さらに他の植物との特異性が確保できる塩基を３’末端の塩基に設定して配列を選定する。ただし、ソバ属の場合ＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列部分においては、種ごとに塩基の欠落部分や欠落塩基数に違いがあるため、ソバ属の植物２１配列すべてから同じサイズの増幅産物を得るためには、さらに選別する必要がある。同じサイズの増幅産物を得ることができれば、容易にソバ属の存在を検出することができる。ソバ属では、特にプライマー（Ａ）とプライマー（Ｃ）、または２個のプライマー（Ａ）を選定することによって、ソバ属の植物２１配列すべてから同じサイズの増幅産物を得ることがシミュレーションで確認できる。これにより、サイズによって非特異産物との識別が容易にできるプライマーを設計することができる。
本発明においては、上記プライマーを用いて、ＰＣＲ法により検出対象である特定植物属に属する植物を検出する。または、定量的ＰＣＲ法により該植物を定量する。
ＰＣＲに当たっては、例えばＳａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０−１３５４（１９８５）や植物細胞工学別冊、植物のＰＣＲ実験プロトコール、島本功・佐々木卓治監修（１９９５年）等に記載されている通常の方法に基づき、変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度と時間、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の種類と濃度、ｄＮＴＰ濃度、プライマー濃度、塩化マグネシウム濃度、鋳型ＤＮＡ量等の条件を適宜、変更し最良のものを選択する。
また、ＰＣＲ増幅で使用するプライマーとテンプレートＤＮＡのアニーリング温度を、ＨＹＢ  ＳｉｍｕｌａｔｏｒＴＭ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）やＰｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販ソフトで算出した該プライマーのＴｍ値よりも高い温度、好ましくはＴｍ値＋１０〜＋３℃に設定してＰＣＲ増幅を行い、次いでアニーリング温度を該プライマーのＴｍ値近傍、好ましくはＴｍ値＋７〜±０℃の温度に設定してＰＣＲ増幅を行うこともできる。
定量的ＰＣＲ法としては、リアルタイムＰＣＲ法を用いる定量方法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法としては、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）法、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ法などの蛍光プローブ（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅ）法、モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ）法、およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）プローブ法などが挙げられるが、これらに限定はされない。種々の方法が最近精力的に開発されており、当業者であれば、任意の方法を実施することができる。この場合のプローブの設計に当たっては、増幅標的配列に対するＰＣＲプライマーがハイブリダイズする部位の内側に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る配列から選択する。
特に、上記の通り設計された特定植物特異的なプライマーセットと、５’末端に発光色素および３’末端に消光剤を有している、増幅標的配列に対するＰＣＲプライマーセットの各オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位の内側に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブとを用いて発光量に基づいてＤＮＡを定量する方法であって、該プローブの５’末端の発光色素は３’末端の消光剤によってその発光が抑制されているが、ＰＣＲ反応においてＴａｑポリメラーゼによってプライマーからＤＮＡが伸長されると、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により上記プローブが分解され、発光色素と消光剤とが解離して発光を生じることを特徴とする方法が好ましい。また、プローブ配列全体が上記ＰＣＲプライマーがハイブリダイズする部位の内側に存在する必要はなく、設計したプローブの３’末端側の塩基とプローブがハイブリダイズする鎖の逆鎖に設計したプライマーの３’末端側の塩基とが１〜１０、または１〜５塩基重複していてもよい。また、プローブ配列は、検出対象である特定植物属に共通な配列を有する部分から選択することがより好ましい。上記プローブには、ＴａｑＭａｎプローブ（商標）が好ましい。ＴａｑＭａｎプローブの設計方法は、当技術分野では公知である（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア簡易操作ガイドＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアＴａｑＭａｎプローブ検索のための簡易操作ガイド：Ｒｅｖ．Ｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐ／ｗｅｂｓｉｔｅ／ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｃｔｌｇｐａｇｅ．ｊｓｐ？ＭＯＤＥＬＣＤ＝１９７７５＆ＰＬＣＤ＝１７６８９＆ＢＵＣＤ＝１３１などを参照のこと）。本明細書中においては、所定の植物または植物属の植物の定量的ＰＣＲに用いることができるプローブを、所定の植物または植物属の植物の「検出用プローブ」と称する。即ち、本明細書中、検出用プローブとは、各植物属に対する検出用プライマーセットと組合わせて、該プローブを用いることにより、該植物属に属する植物を検出することができるプローブを指す。ここで、検出とは、前述の通り定性および定量的検出の両方を包含し、かかるプローブは、定量的検出にも有利であることは当然理解されるであろう。
該プローブに用いる発光色素としては、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴおよびＦＩＴＣなどが知られているが、これらに限定はされない。また、消光剤としてはＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌなど、および非蛍光性消光剤も知られているが、やはり、これらに限定はされない。
上記プローブの長さとしては、１３〜３０塩基長が好ましく、特に１３〜２５塩基長が好ましい。また、短い塩基長でもＴｍ値が高く維持できるように、３’末端の消光剤にさらに、ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｎ）を標識したプローブを使用することが、より好ましい。具体的には、ソバ属の場合のプローブとしては配列番号６４で表わされるオリゴヌクレオチドを例示することができる。落花生属のプローブとしては、プライマーに配列番号２４と２５のいずれかと配列番号２〜４のいずれかとを組み合わせる場合には配列番号３２または３３で表される塩基配列の相補鎖の塩基配列に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましく、また、プライマーに配列番号２１〜２３のいずれかと配列番号２６〜２９、６５および６６のいずれかとを組み合わせる場合には、配列番号３４で表されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。さらにプライマーに配列番号３０、３１のいずれかと配列番号２６〜２９のいずれかとを組み合わせる場合には、配列番号３４で表されるオリゴヌクレオチドに加え、配列番号３５で表される塩基配列あるいはその相補鎖の塩基配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましい。特に好ましい組合せは、プライマーに配列番号２１と配列番号２６、６５および６６のいずれかとを組合わせる場合には、プローブとしては配列番号３４で表されるオリゴヌクレオチドを用いることが良い。
かかるプローブは、設計した配列のオリゴヌクレオチドを合成した後、市販のキットを使用して作製することも可能であり、またカスタムオーダーにて委託作製も可能であり、当技術分野では多数委託先が知られている（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏ．ｊｐ）など）。
本発明の定量方法は、検出（特に定量）対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料とを予め定めた比率で混合した補正用サンプルと、被検対象とする食品または食品原材料に既知量の標準植物試料を添加した被検サンプルとを用い、これらのサンプルから同一の手法でゲノムＤＮＡを抽出し、同一の条件で定量的ＰＣＲ法を行うことにより、補正用サンプルについて標準植物由来ＤＮＡのコピー数（Ｌｏ）／特定植物属由来ＤＮＡのコピー数（Ｆｏ）の値を補正標準値として求め、被検サンプルについて特定植物属由来ＤＮＡのコピー数（Ｆｓ）／標準植物由来ＤＮＡのコピー数（Ｌｓ）の値を求め、これを上記補正標準値を用いて補正して、食品または食品原材料（１ｇ）中に含まれる特定植物属の植物の量（μｇ）を以下の式によって算出する。
特定植物属の植物の量ｐｐｍ（μｇ／ｇ）＝Ｆｓ／Ｌｓ×Ｌｏ／Ｆｏ×１，０００，０００
したがって、該方法では、被検対象とする食品や食品原材料ごとのＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害等の影響、さらには被検対象とする試料中のＤＮＡ含有量の違いに対しても補正が可能である。かかる方法によって、例えば塩等のＤＮＡを含有していない食品原材料や当該原材料を含む食品中の特定植物属に属する植物を適切に定量検出することも可能である。
さらに、偽陽性か否かの判断をする必要がある場合には、ＰＣＲ終了後の反応液中に含まれるＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を解析することにより、厳密に調べることができる。
本発明に用いる標準植物試料は、種々の成分によるＤＮＡ抽出効率への影響がなるべく均質であることが望ましいことから、検出対象である特定植物属に類似の状態のものであることが好ましい。また、検査に供する食品または食品原材料中に混入する可能性のない植物種に由来するものが好ましい。また、栽培過程で、畑地雑草が食用作物に混入する可能性を排除することが極めて困難であり、微量の雑草由来の物質が食用作物中に混入しているとの現状に鑑みて、かかる畑地雑草として認知されている植物種以外の植物種を標準植物試料とすることが好ましい。すなわち、標準植物試料の選定に当たっては、食品または食品原材料に使用する植物が混入する恐れがなく、かつ食品または食品原材料中に混入する恐れがないものを選定する必要がある。
該畑地雑草としては、様々な畑地雑草が知られているが、主には、イネ科、タケ亜科、ガマ科、カヤツリグサ科、キク科、タデ科、ツユクサ科、トクサ科、クワ科、スベリヒユ科、ナデシコ科、アカザ科、マメ科、カタバミ科、トウダイグサ科、セリ科、ヒルガオ科、シソ科、オオバコ科、ナス科、ウリ科などが挙げられる。詳細には、日本雑草学会のホームページ等の記載を参照されたい。
また、例えば市販されている種子等、一度に大量に均一の材料を入手可能でき、それを保存しておけるものが、標準植物試料としてさらに好ましい。
さらに、標準植物試料は植物のいかなる組織（種子、葉、根茎など）に由来するものでもよいが、検出対象がソバ、小麦および落花生等の種子に由来するものであれば、同様の種子に由来するものであることが好ましい。このような観点から言えば、例えば、すいか、パパイヤ、メロン等を含まない食品について検査する場合には、皮や果肉により外界と隔離された果肉の中に数多くの種子が存在する、すいか、パパイヤ、メロン等の植物種が好ましい。また、種子が外界とは隔離されていなくとも、食用作物として栽培されていない植物種であれば好ましい。このような条件を考慮すると、本発明に用いる標準植物試料としては、上記条件を満たすものであれば特に限定はされないが、ネモフィラ（ハゼリソウ科）、グロキシニア（イワタバコ科）およびスターチス由来のものが挙げられ、スターチス（イソマツ科）の種子が特に好ましい。
標準植物試料としては、ＤＮＡ抽出阻害活性またはＰＣＲ反応阻害活性を有する成分の含量が高いものは、ＤＮＡ抽出効率、ならびに定量的ＰＣＲ法の感度および／または精度等の観点から、避けた方が好ましい。
本明細書中の実施例には、標準植物試料としてスターチスの種子を用いた例を挙げている。上述のように畑地雑草は食用作物に混入する恐れが高く、標準植物試料としては不適切であるため、畑地雑草として日本雑草学会のホームページ（ｈｔｔｐ／／ｗｓｓｊ．ａｃ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）に挙げられている８６０種類の植物全部の科名を調べ、その中にない科に属する植物としてスターチスが選択された。スターチスのＩＴＳ−１配列を特異的に検出するプライマーを用いて、一般的な食品原材料である市販の小麦粉５種類、コーングリッツ５種類、カラシ３種類についてスターチスの混入の有無を試験したが、いずれにおいても全く検出されなかったことから、スターチスは、本発明における標準植物試料として好適であると推定された。
尚、スターチスの代わりに、畑地雑草を数多く含むイネ科の中の米を標準植物試料として用いることが好ましくないことを本発明者らは確認している。これは、畑地雑草であるイネ科植物が原材料植物の収穫の際等に、収穫物に混入するためであると考えられる。
標準植物試料として選択した植物材料（例えばスターチスの種子）を粉砕したものを検出対象である特定植物属由来の試料として選択した植物（例えばソバ）の粉砕物と予め定めた比率で混合して補正用サンプルを用意する。これとは別に、上記と同様の標準植物試料の粉砕物を被検対象である食品または食品原材料に添加して被検サンプルを調製する。なお、上記粉砕工程においては、他の食品原材料や、特に検出対象とする特定植物属由来の試料と標準植物試料とが、お互いに混入しないように、十分に配慮することが重要であり、粉砕に使用する器具等の洗浄等に万全を期すべきである。なお、上記補正用および被検サンプルを調製するに当たっては、補正用サンプル中の特定植物由来の試料の量と被検サンプル中の食品または食品原材料の試料の量はほぼ同じ量とすることが好ましく、また、補正用サンプル中の標準植物試料の量と被検サンプル中の標準試料由来の試料の量はほぼ同じ量とすることが好ましい。
次に、これらサンプルからＤＮＡを抽出する。このＤＮＡの抽出は、種々の公知の方法によって行うことができ、市販のキットまたはプレパックカラムを用いることもできる。例えば、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＨａｎｄｂｏｏｋやＵｓｅｒ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを用いればよい。
そして、抽出されたＤＮＡを定量的ＰＣＲ法に供する。定量分析のためのＰＣＲ技術は、種々のものが公知であるが、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標）を用いるリアルタイムＰＣＲ定量法が簡便かつ有利であろう。
標準植物試料の検出（定量的検出も含む）用のプライマーは、標準植物試料のＤＮＡに特異的な増幅をもたらすプライマーであることが好ましい。さらには、検出対象である特定植物属由来の試料と標準植物試料を予め定めた比率で混合した補正用サンプルから抽出したゲノムＤＮＡに対して定量的ＰＣＲ法を行った時の標準植物由来のＤＮＡのコピー数が、特定植物属由来のＤＮＡのコピー数とかけ離れておらず、両者のコピー数の差が１００倍以内、好ましくは１０倍以内になるプライマーであることが、前述のＬｏ／Ｆｏ比が安定するため好ましい。
例えば、スターチスを標準植物試料とする場合、スターチスのプライマーは、そのＩＴＳ−１配列の一部に由来する以下の配列：
2004101794.tif 000002
からなるプライマーを用いることができ、さらに、スターチス検出用のＴａｑＭａｎプローブとしては、前述した如く、増幅標的配列に対するＰＣＲプライマーがハイブリダイズする部位の内側にハイブリダイズするものであればよく、例えば、ＩＴＳ−１配列の一部に由来する以下の配列：
2004101794.tif 000003
を有するプローブに蛍光色素を標識してＴａｑＭａｎプローブとして用いることができる。
リアルタイムＰＣＲ定量法により、補正用サンプルおよび被検サンプルの標準植物由来のＤＮＡのコピー数と検出対象の特定植物属由来のＤＮＡのコピー数を、検量線から算出する。
この検量線の作製は、当業者であれば種々の方法により容易に実施できる。標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的ＰＣＲ法による増幅標的配列を含む既知の長さのＤＮＡをテンプレートとして用いて定量的ＰＣＲ法を実施して検量線を作製することができる。
さらには、標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的ＰＣＲ法による増幅標的配列を含む検量線用のプラスミドを作製し、これをテンプレートに用いることにより、より再現性が高く、誤差の少ない検量線を作製することができる。検出対象とする特定植物属由来の試料の増幅標的配列を含むＤＮＡと、標準植物試料の増幅標的配列を含むＤＮＡとを１つのプラスミドベクターに挿入した検量線用プラスミドを作製する。該プラスミドを、大腸菌等で増幅させることにより、検量線用のテンプレートを得ることができる。
例えば、標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての定量的ＰＣＲ法による増幅標的配列を、アウタープライマーとブリッジプライマーを用いるＪａｙａｒａｍａｎ  Ｋ．らの方法（１９９２．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２−３９８）を用いて連結することができる。
１つのプラスミド中に標準植物試料および検出対象の特定植物属由来の試料についての増幅標的配列を含有させることにより、希釈による両配列の濃度の誤差を低減させることができる。また、短いプラスミドＤＮＡ分子を用いることによっても、希釈の誤差を低減させ得る。
検量線用テンプレートは、その塩基長が既知であるものを使うため、重量濃度と塩基長より検量線用テンプレート溶液中に含まれるコピー数が決定できる。このコピー数に照らして、被検サンプル中に含まれるコピー数を算定する。
こうした本発明の定量的ＰＣＲ検出法の考え方は、検出対象である特定の原料が畜産製品等の動物に由来するものである場合、および特定の原料が微生物に由来するものである場合にも適用することは可能であり、検出対象である特定の原料が畜産製品等の動物に由来するものである場合は動物由来の原材料を標準試料とすることが好ましく、特定の原料が微生物に由来するものである場合は、微生物由来の原材料を標準試料とすることが好ましい。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００３−１３９５１３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、白花ソバについてＰＣＲの感度を調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図１Ｂは、ダッタンソバについてＰＣＲの感度を調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図２は、ソバＰＣＲの特異性を調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図３は、スターチスＰＣＲの特異性を、他の植物種子について調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図４は、スターチスＰＣＲの特異性を、種々の食品原材料について調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図５Ａは、ソバＤＮＡの定量的ＰＣＲ法の結果である。ソバＤＮＡ５００ｐｇ、小麦、落花生、ダイズ、トウモロコシ、カラシ、胡椒、米はそれぞれＤＮＡ５０ｎｇについて定量的ＰＣＲ法を行ったが、ソバ以外では、定量検出域では検出されず、ソバのみが特異的に定量可能であることを確認した。
図５Ｂは、ソバＤＮＡの定量的ＰＣＲ法の結果である。ソバはＤＮＡ５００ｐｇ、スターチスＤＮＡ５０ｎｇについて定量的ＰＣＲ法を行ったが、スターチスでは定量検出域では検出されないことを確認した。
図６は、ソバＤＮＡの定量的ＰＣＲ法の結果である。ソバカズラＤＮＡについて定量的ＰＣＲ法を行い、ソバカズラは、ＤＮＡ５０ｎｇをテンプレートにした場合においても、検量線用プラスミド１０コピーのテンプレートの場合に対して増幅速度が明らかに遅く、かつＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅにもかかることはなく、定量検出域では検出されず、ソバのみが特異的に定量可能であることを確認した。
図７は、検量線用プラスミドを用いてソバＤＮＡの定量的ＰＣＲ法を行った結果である。
図８は、図７の結果から得られたグラフである。
図９は、スターチスＤＮＡの定量的ＰＣＲ法の結果である。スターチスはＤＮＡ５００ｐｇをテンプレートとしてＰＣＲを行った。小麦、落花生、ダイズ、トウモロコシ、カラシ、胡椒、米、ソバカズラはそれぞれＤＮＡ５０ｎｇについて定量的ＰＣＲ法を行ったが、定量検出域では検出されず、スターチスのみが特異的に定量可能であることを確認した。
図１０は、検量線用プラスミドを用いてスターチスＤＮＡの定量的ＰＣＲ法を行った結果である。
図１１は、図１０の結果から得られたグラフである。
図１２は、落花生ＰＣＲの特異性を、種々の食品原材料について調べた結果である。ＰＣＲ後、２％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドで染色し、蛍光イメージアナライザーで解析した。
図１３は、落花生ＤＮＡの定量的ＰＣＲ法の結果である。落花生ＤＮＡ５００ｆｇ、小麦、ソバ、ダイズ、トウモロコシ、リンゴ、アズキ、スターチスはそれぞれＤＮＡ５０ｎｇについて定量的ＰＣＲ法を行ったが、落花生以外では、定量検出域では検出されず、落花生のみが特異的に定量可能であることを確認した。
図１４は、落花生ＤＮＡを用いて落花生ＤＮＡの定量的ＰＣＲ法を行った結果である。
図１５は、図１４の結果から得られたグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】Ａ．ＤＮＡ抽出に用いた植物試料
（１）ソバの種子：
タカノ株式会社より販売されている白花ソバ（普通ソバＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ：２倍体）、ダッタンソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ：２倍体）の種子を用いた。
（２）小麦、落花生、大豆、とうもろこし、カラシ、スターチスの種子と白胡椒、米（玄米）：
市販品を用いた。
（３）小麦、大豆、とうもろこし、カラシ、ソバカズラの葉：
市販品の種子から発芽させた葉を用いた。
Ｂ．ＤＮＡ抽出
（１）ソバの種子、白胡椒からのＤＮＡ抽出
ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＨａｎｄｂｏｏｋやＵｓｅｒ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料１ｇを１５ｍｌ容チューブに入れ、４ｍｌのＣａｒｌｓｏｎ  Ｌｙｓｉｓバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２％  ＣＴＡＢ、１．４Ｍ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ＃６０００、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、８μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌの２−メルカプトエタノール、８０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ））を加え、混合した後、７４℃で２０分間保温した。室温に戻した後、これに５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、良く混合した後、遠心分離により水層を回収した。この水層に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、良く混合した後、遠心分離により水層を回収した。再度、この水層に等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加え、良く混合した後、遠心分離により水層を回収した。
得られた水層の１／２量をとり、イソプロパノール沈殿により沈殿物を回収した。沈殿物は５００μｌのバッファーＱＢＴに溶解し、予め１ｍｌのバッファーＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、５ｍｌのバッファーＱＢＴ、続いて２ｍｌのバッファーＱＣでカラムを洗浄した。最終的に１．７ｍｌのバッファーＱＦで溶出し、イソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を４０μｌの滅菌超純水に溶解した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
（２）小麦、大豆、とうもろこし、カラシ、スターチスの種子と米（玄米）からのＤＮＡ抽出
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料２ｇを５０ｍｌ容チューブに入れ、１０ｍｌのバッファーＡＰ１、２０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加えて混合し、６５℃で１５分間保温した後、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清のうち４ｍｌを１５ｍｌ容チューブに回収し、そこに１．８ｍｌのバッファーＡＰ２を加えて、氷中で１０分間放置した後、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに供し、約３，０００×ｇで５分間遠心分離した。得られたパス液のうち５ｍｌを５０ｍｌ容チューブに回収し、そこに７．５ｍｌのバッファーＡＰ３／Ｅを加えて混合した後、ＤＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに供し、約３，０００×ｇで５分間遠心分離してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。その後、Ｃｏｌｕｍｎに１２ｍｌのバッファーＡＷを加え、約３，０００×ｇで５分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄、再度１２ｍｌのバッファーＡＷを加え、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄した。最終的に６５℃で予め保温しておいた１ｍｌのバッファーＡＥをＣｏｌｕｍｎに加え、１０分間放置後に約３，０００×ｇで５分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎからＤＮＡを溶出した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
（３）落花生の種子からのＤＮＡ抽出：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＨａｎｄｂｏｏｋとＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ２  ｉｎ  １  Ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔとＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ２  ｉｎ  １を組合わせて用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料１ｇを１５ｍｌ容チューブに入れ、１０ｍｌのバッファーＧ２、１００μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）、１０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合した後、５０℃で１時間保温した。その後、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清液を得た。得られた上清液を、予め１ｍｌのバッファーＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇに供してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。その後、４ｍｌのバッファーＱＣでＣｏｌｕｍｎを洗浄し、予め５０℃に加温してある１ｍｌのバッファーＱＦで溶出させた。溶出液に４容量のバッファーＮＴ２を加えて混合した後、二本のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｃｏｌｕｍｎに一回に６５０μｌずつ供し、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。これを全液量処理するまで繰り返した。その後、Ｃｏｌｕｍｎに６００μｌのバッファーＮＴ３を加え、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄、再度６００μｌのバッファーＮＴ３を加え、最高速度で１分間遠心分離して、Ｃｏｌｕｍｎに残っているバッファーＮＴ３を完全に除去した。最終的に１００μｌのバッファーＮＥをＣｏｌｕｍｎに加え、最高速度で１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎから溶出し、イソプロパノール沈澱により回収した沈澱物を５０μｌの滅菌超純水に溶解した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
（４）小麦、大豆、とうもろこし、カラシ、ソバカズラの葉からのＤＮＡ抽出：
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行なった。
細かく粉砕した試料０．５ｇを１５ｍｌ容チューブに入れ、３ｍｌのバッファーＡＰ１、３０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合した後、６５℃で１５分間保温した。その後、これに９７５μｌのバッファーＡＰ２を加えて、氷中で１０分間放置し、遠心分離によりその上清液を得た。得られた上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心分離によりＣｏｌｕｍｎのパス液を得た。このパス液に０．５容量のバッファーＡＰ３、１容量のエタノールを加えて混合した後、二本のＤＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに一回に６５０μｌずつ供し、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。これを、全液量処理するまで繰り返した。その後、Ｃｏｌｕｍｎに５００μｌのバッファーＡＷを加え、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄、再度５００μｌのバッファーＡＷをＣｏｌｕｍｎに加え、最高速度で１分間遠心分離して、Ｃｏｌｕｍｎに残っているバッファーＡＷを完全に除去した。最終的に６５℃で予め保温しておいた１２０μｌのバッファーＡＥをＣｏｌｕｍｎに加え、約６，０００×ｇで１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎから溶出した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
Ｃ．ソバのＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の一部を検出するＰＣＲ
（１）ソバ属検出用プライマー：
プライマー配列には、ソバ属に属する植物のＧｅｎＢａｎｋに登録されている以下の２１配列中のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に共通な配列を用いた。
１：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍ（ＡＢ０００３４２）
２：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｕｒｏｐｈｙｌｌｕｍ（ＡＢ０００３４１）
３：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ（ｓｕｂ＃ｓｐｅｃｉｅｓ：ｐｏｔａｎｉｎｉ）（ＡＢ０００３４０）
４：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｔａｔａｒｉｃｕｍ（ＡＢ０００３３９）
５：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｓｔａｔｉｃｅ（ＡＢ０００３３８）
６：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｓｔａｔｉｃｅ（ＡＢ０００３３７）
７：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｐｌｅｉｏｒａｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３３６）
８：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｌｉｎｅａｒｅ（ＡＢ０００３３５）
９：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｌｅｐｔｏｐｏｄｕｍ（ＡＢ０００３３４）
１０：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｈｏｍｏｔｒｏｐｉｃｕｍ（ＡＢ０００３３３）
１１：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｇｒａｃｉｌｉｐｅｓ（ＡＢ０００３３２）
１２：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ａｎｃｅｓｔｒａｌｉｓ（ＡＢ０００３３１）
１３：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＡＢ０００３３０）
１４：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２９）
１５：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２８）
１６：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２７）
１７：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２６）
１８：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２５）
１９：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃｙｍｏｓｕｍ（ＡＢ０００３２４）
２０：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃａｐｉｌｌａｔｕｍ（ＡＢ０００３２３）
２１：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｃａｌｌｉａｎｔｈｕｍ（ＡＢ０００３２２）
そして、下記配列のオリゴＤＮＡプライマー（株式会社ＱＩＡＧＥＮ社製ＯＰＣ精製品）を合成して、ソバＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の一部を検出するＰＣＲ（以下、ソバＰＣＲとする）用プライマーとして使用した。
2004101794.tif 000004
（２）ソバ属検出用プライマーの特異性（ＰＣＲシミュレーション）：
ＰＣＲシミュレーションソフトＡｍｐｌｉｆｙ  １．０（Ｂｉｌｌ  Ｅｎｇｅｌｓ）により、ソバ属に属する植物の２１配列、ソバ以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の８配列（落花生、小麦、大豆、クルミ、松茸、桃、リンゴ、オレンジ）、食品原材料としてよく使われている植物の４配列（とうもろこし、米、胡椒、カラシ）、ソバ近縁種の植物の２７配列から、ソバ検出用プライマーでＰＣＲ増幅産物が得られるシミュレーション結果となるかを確認した。ここでいうソバ近縁種の植物とは、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている普通ソバＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの塩基配列（ＡＢ０００３３０）のＩＴＳ−１配列部分をＢＬＡＳＴホモロジー検索に供して、Ｓｃｏｒｅ  ６０ｂｉｔｓ以上となったソバ属以外の植物のことである。今回は、さらにその植物が属する属の中で最もＳｃｏｒｅが高い値となった種の配列を、その属の代表の配列として選定した。なお、ＰＣＲシミュレーションはそれら配列のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列の領域に対して行った。シミュレーションに用いた配列のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒならびに、シミュレーション結果を表１Ａ〜１Ｃに示す。表１Ａ〜１Ｃの省略文字、記号は以下に示す通りである：
黒星印：標的サイズ付近（±１０ｂｐ）のＰＣＲ増幅産物が得られると予想されたもの
Ｗ値：ＰＣＲ増幅産物の得られる可能性
得られる可能性が高い…Ｗ６＞Ｗ５＞Ｗ４＞Ｗ３＞Ｗ２…得られる可能性が低い
数値（ｂｐ）：ＰＣＲ増幅産物のサイズ（ｂｐ）
Ａｍｐｌｉｆｙで得られた値から２を引いた値
−：ＰＣＲ増幅産物なしと予想されたもの
2004101794.tif 000005
2004101794.tif 000006
2004101794.tif 000007
シミュレーションの結果、表１Ａ〜１Ｃに示す通り、ソバ属の２１配列からは標的とした１０１ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物が得られることが予想された。また、ソバ属以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の８配列（落花生、小麦、大豆、クルミ、松茸、桃、リンゴ、オレンジ）、食品原材料としてよく使われている植物の４配列（とうもろこし、米、胡椒、カラシ）、ソバ近縁種の植物の２７配列からは、標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られないことが予想された。
（３）ソバＰＣＲ：
ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲ  バッファーｗｉｔｈ  ３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００μＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）に、配列番号１４と配列番号１５のプライマーをそれぞれ終濃度で０．５μＭずつ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００により、９５℃，１５分（酵素活性化）の後、９５℃，１分（変性）、６６℃，２分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを４５回繰り返した後、７２℃，４分（最終伸長）として反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２％アガロースゲル電気泳動に供して、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社製の蛍光イメージアナライザーＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ５９５により解析した。その結果を図１Ａ、１Ｂと図２に示す。図１Ａ、１Ｂと図２の省略文字、記号などは以下に示す通りである：
Ｍ  ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ
（−）  ：  鋳型ＤＮＡ未添加
数字  ：  添加した鋳型ＤＮＡ量
矢印  ：  標的のＰＣＲ増幅産物のバンド（約１０１ｂｐ）。
なお、抽出した植物ＤＮＡがＰＣＲ増幅可能なレベルの純度であることは、植物ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した（データ省略）。
（４）ソバＰＣＲの感度と特異性：
ソバＰＣＲの結果、図１Ａ、１Ｂに示す通り、白花ソバ（普通ソバ）とダッタンソバＤＮＡ  ５００〜５０ｆｇから標的としたソバＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列から予想される約１０１ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物が得られた。５００〜５０ｆｇのソバＤＮＡを検出できる感度とは、ある試料から抽出したＤＮＡ５０ｎｇを鋳型としてＰＣＲを行った場合、その試料ＤＮＡ中に含まれる１０〜１ｐｐｍのソバＤＮＡを検出できるレベルの感度に相当する。
ソバＰＣＲの結果、図２に示す通り、小麦の葉、落花生の種子、大豆の葉、とうもろこしの葉、カラシの葉、白胡椒、米ＤＮＡ５０ｎｇからは標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られなかった。サケ精子ＤＮＡからも同様にＰＣＲ増幅産物は得られないことを確認した（データ省略）。さらに、図２に示す通り、ソバ近縁種の一つであるソバカズラの葉ＤＮＡについては、５０〜５ｎｇでは非常に薄いながら標的サイズのＰＣＲ増幅産物が得られたものの、５００ｐｇ以下では標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られなかった。５００ｐｇ以下のソバカズラＤＮＡを偽陽性で検出しない特異性とは、ある試料から抽出したＤＮＡ５０ｎｇを鋳型としてＰＣＲした場合、その試料ＤＮＡ中に１％以下のソバカズラＤＮＡが存在していたとしても、それが偽陽性として検出されないレベルの特異性に相当する。また、ＰＣＲ条件を変更することで、ソバカズラＤＮＡ５０〜５ｎｇからも標的サイズの産物が得られなくなる可能性もある。
（５）ソバＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析：
上記で得られた白花ソバＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、配列番号１４と配列番号１５のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークエンスにより解析した。得られた塩基配列を、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている普通ソバＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍの塩基配列（ＡＢ０００３３０）と比較し、白花ソバＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている普通ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の塩基配列（ＡＢ０００３３０）の標的とした部分と１００％合致することを確認した。このことから、上記プライマーを用いたＰＣＲにより、ソバＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の一部の配列を増幅、検出していることが立証された。
以上の結果より、上記プライマーを用いたソバＰＣＲにより、ソバ属に属する植物全般のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、高感度かつ、特異的に検出できることが明らかとなった。本プライマーを、ソバＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列のコピー数を定量するＰＣＲ（以下、ソバ配列の定量的ＰＣＲ法とする）に用いることとした。
Ｄ．スターチスＩＴＳ−１配列の一部を検出するＰＣＲ（補正用）
次に、補正に用いる標準植物試料のＰＣＲによる検出について検討した。
本実施例においては、日本雑草学会の畑地雑草のリストにはない種子植物であって、種子の入手が容易であるスターチスを標準植物試料として用いた。
（１）スターチス検出用プライマー：
ＧｅｎＢａｎｋに登録されているスターチスのＤＮＡ配列（ＡＪ２２２８６０）を基に、下記配列のスターチスＩＴＳ−１配列の一部を検出するＰＣＲ（以下、スターチスＰＣＲとする）用プライマーを設計し、オリゴＤＮＡプライマー（株式会社ＱＩＡＧＥＮ社製ＯＰＣ精製品）を合成した。
2004101794.tif 000008
2004101794.tif 000009
（２）スターチスＰＣＲ：
上記プライマーをそれぞれ終濃度で０．２μＭずつ用いたこと以外は、基本的に上記実施例１．Ｃ．（３）と同じ方法で行った。その結果を図３と図４に示す。
なお、抽出した植物ＤＮＡがＰＣＲ増幅可能なレベルの純度であることは、植物ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した（データ省略）。
（３）スターチスＰＣＲの特異性：
スターチスＰＣＲの結果、図３に示す通り、スターチスの種子ＤＮＡ５０ｎｇから標的としたスターチスＩＴＳ−１配列から予想される約１０１ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物が得られた。また、白花ソバ、ダッタンソバの種子、小麦の種子、落花生の種子、大豆の種子、とうもろこしの種子、カラシの種子、白胡椒、米、ソバカズラの葉ＤＮＡ５０ｎｇからは標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られなかった。サケ精子ＤＮＡからも同様にＰＣＲ増幅産物は得られないことを確認した（データ省略）。
したがって、上記スターチスＤＮＡ検出用のプライマーは、スターチスＤＮＡに対する特異性を有していると推測される。
（４）食品原材料へのスターチス混入の有無の評価：
次に、スターチスが標準植物試料として適切であることを確認する。すなわち、食品または食品原材料中に混入していないことを確認するため、スターチスＰＣＲを行った。
スターチスＰＣＲの結果、図４に示す通り、５種類の小麦粉、５種類のコーングリッツ、３種類のカラシの種子ＤＮＡ  ５０ｎｇからは標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られなかった。
（５）スターチスへのソバ混入の有無の評価：
スターチスの種子の試料中に、ソバが混入していないか否かを確認するために、後述の通りに確立したソバ配列の定量的ＰＣＲ法で確認した。ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の結果、スターチスの種子ＤＮＡからは増幅を示す蛍光シグナルの立上がりはみられず、混入は認められないことを確認した（データ省略）。
（６）スターチスＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析：
上記で得られたスターチスＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、配列番号５７と配列番号５８のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークエンスにより解析した。なお、得られた塩基配列を、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているスターチスＬｉｍｏｎｉｕｍ  ｓｉｎｕａｔｕｍの塩基配列（ＡＪ２２２８６０）と比較し、スターチスＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているスターチスＬｉｍｏｎｉｕｍ  ｓｉｎｕａｔｕｍの塩基配列（ＡＪ２２２８６０）の標的とした部分と１００％合致することが確認された。スターチスＰＣＲにより、標的とした、スターチスＩＴＳ−１の一部の配列を増幅、検出していることが確認できた。
以上の結果より、スターチスは、食品原材料との相互混入がなく、補正用の標準植物試料として適切であることが示唆された。そこで、配列番号５７と配列番号５８のプライマーを、スターチスＩＴＳ−１配列のコピー数を定量するＰＣＲ（以下、スターチス配列の定量的ＰＣＲ法とする）に用いることとした。
Ｅ．定量解析に用いる検量線用プラスミドの作製
（１）ソバとスターチスＰＣＲの標的ＤＮＡ配列の連結ＰＣＲと連結ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析：
ソバ標的増幅産物とスターチス標的増幅産物をＰＣＲ法により連結し、ＴＡクローニングベクターに導入して大腸菌に形質転換して増幅させることにより、ソバとスターチスのコピー数を定量解析するための検量線用プラスミドを作製した。
まず、下記配列のオリゴＤＮＡプライマー（株式会社ＱＩＡＧＥＮ社製ＯＰＣ精製品）を合成してプライマーとして使用した。これらのプライマーは、上述のソバとスターチスＰＣＲに用いたソバおよびスターチスのプライマー部位を含んでいる。
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Ｊａｙａｒａｍａｎ  Ｋら（１９９２．Ａ  ＰＣＲ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｏｎｌｙ  Ｏｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｎｄｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３９２−３９８）の方法を参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔを用いて以下の方法により、連結プラスミドを作製した。
２５μｌの２×ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有ＰＣＲバッファー、４００μＭ  各ｄＮＴＰ）に、さらにｄＮＴＰを終濃度で５００μＭとなるように加え、配列番号６０と配列番号６３をアウタープライマーとしてそれぞれ終濃度で１．０μＭずつ、配列番号６１と配列番号６２をブリッジプライマーとしてそれぞれ終濃度で２５ｎＭずつ加え、さらに、鋳型ＤＮＡとして実施例１．Ｃ．（４）で得られたソバＰＣＲの標的ＤＮＡ配列を持つＰＣＲ増幅産物と実施例１．Ｄ．（３）で得られたスターチスＰＣＲの標的ＤＮＡ配列を持つＰＣＲ増幅産物を加え、最終的に滅菌超純水で５０μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブに入れ、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製のサーマルサイクラーＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅにより、９５℃，１５分（酵素活性化）の後、９５℃，１分（変性）、４０℃，１分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを１５回繰り返し、さらに９５℃，１分（変性）、６６℃，１分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを３０回繰り返して反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２％アガロースゲル電気泳動に供して、アマシャムバイオサイエンス株式会社製の蛍光イメージアナライザーＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ５９５により解析した。なお、得られたＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、配列番号６０と配列番号６３のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークエンスにより解析した。
連結ＰＣＲの結果、予想された約２２０ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた（データ省略）。塩基配列解析の結果、このＰＣＲ増幅産物には、ソバとスターチスＰＣＲの標的ＤＮＡ配列とが含まれていることが確認できた（データ省略）。
（２）連結ＰＣＲ増幅産物のプラスミドへの導入と導入ＤＮＡ断片の塩基配列解析：
上記で得られたＰＣＲ増幅産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＶｅｃｔｏｒにＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（ＤＨ５α））に形質転換した。コロニーＰＣＲならびに塩基配列解析によりソバとスターチスＰＣＲの標的ＤＮＡ配列が含まれていることが確認できた約２２０ｂｐの導入断片を持つ形質転換体をＬＢ培地で液体培養して、菌体からＱＩＡＧＥＮ社製のＱＩＡＧＥＮ  Ｈｉ  Ｓｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔを用いてプラスミドを抽出、精製した。なお、精製したプラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列は、プラスミド上にある配列のプライマーを用いた両鎖シークエンスにより解析した結果、意図した通り、形質転換体のプラスミドに導入されたＤＮＡ断片の塩基配列には、ソバとスターチスＰＣＲの標的ＤＮＡ配列が含まれていることが確認できた（データ省略）。
（３）検量線用プラスミドの希釈系列の調製：
プラスミドの長さと、上記で抽出、精製したプラスミドの吸光値（Ａｂｓ．２６０ｎｍ）から、プラスミドの分子数（コピー数）を計算した。５ｎｇ／μｌのサケ精子ＤＮＡ（和光純薬社製デオキシリボ核酸ナトリウム  サケ精巣製  繊維状を滅菌超純水に溶解したもの）でプラスミドを希釈して、１０９〜１０１コピー／２．５μｌの検量線用プラスミド希釈系列を作製した。これを、ソバとスターチス配列の定量的ＰＣＲ法の検量線作成に用いることとした。
Ｆ．ソバ配列のコピー数を定量するＰＣＲ
（１）ソバ配列の検出用ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：
下記配列のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ株式会社製  リポーター色素ＦＡＭ）を合成して、ソバ配列の検出用プローブとして使用した。なお、プローブ配列には、ソバ属に属する植物のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている２１配列に共通な配列を用いた。
2004101794.tif 000011
（２）ソバ配列の定量的ＰＣＲ法：
ＱＩＡＧＥＮ社製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、配列番号１４と配列番号１５のプライマーを終濃度でそれぞれ０．２μＭずつと、配列番号６４のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．２μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした溶液を９６穴ＰＣＲプレートに分注した。なお、検量線用としては、鋳型ＤＮＡの代わりに、検量線用プラスミドＤＮＡの希釈系列を加えた溶液を分注した。分注した９６穴ＰＣＲプレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ７７００にセットし、５０℃，２分、９５℃，１５分の後、９５℃，１分（変性）、６６℃，２分（アニーリング）、７２℃，１分（伸長）のサイクルを４５回繰り返して反応させた。反応は全て同一試料を２ウェル並行で行なった。反応終了後、伸長ステップにおける蛍光データを解析した。なお、ベースラインは、始めに０−１サイクルに設定して蛍光の立ち上がりの始まるサイクルを確認して、そのサイクルよりも前の範囲で適宜設定した。また、閾値ライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）の設定は、Ｋｕｒｉｂａｒａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｉｚｅ  ａｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ８５：１０７７−１０８９に記載の方法に従って行なった。その結果を図５ＡおよびＢ、図６、図７と図８に示す。
なお、抽出した植物ＤＮＡがＰＣＲ増幅可能なレベルの純度であることは、植物クロロプラストＤＮＡの一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した（データ省略）。
（３）ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の特異性：
ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図５ＡおよびＢに示す通り、白花ソバの種子ＤＮＡから増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりが確認された。一方、小麦の葉、落花生の種子、大豆の葉、とうもろこしの葉、カラシの葉、白胡椒、米、スターチスの種子ＤＮＡ５０ｎｇからは増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。サケ精子ＤＮＡからも増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。（データ省略）なお、図６に示す通り、ソバカズラの葉ＤＮＡ５０ｎｇで増幅シグナルの立ち上がりはみられたものの、その立ち上がりは検量線の１０ｃｏｐｙよりも遅い立ち上がりサイクル数（Ｃｔ値）、かつＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅにかからなかった。
この特異性は、ある試料にスターチスを添加したものから抽出したＤＮＡ５０ｎｇを鋳型としてＰＣＲを行った場合、その試料が１００％食用ではない雑草の一種のソバカズラ（ソバ近縁種）であったとしても、それが偽陽性として定量されないレベルに相当する。
（４）ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の定量性と感度：
ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図７と図８に示す通り、１０８〜１０１コピーの検量線用プラスミドで、相関係数０．９９９、かつ傾き−３．５０４の検量線を引くことができる定量性と感度を確認できた。また、白花ソバＤＮＡ５０ｆｇからも増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみられる感度を確認でき、さらには白花ソバＤＮＡ５ｎｇ〜５０ｆｇのＣｔ値をプロットすると、この範囲でも相関のある直線を引くことができる定量性を確認できた（データ省略）。
以上の結果より、配列番号１４と配列番号１５のプライマー、配列番号６４のプローブを用いたソバ配列の定量的ＰＣＲ法により、ソバ属に属する植物全般のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を高感度かつ特異的に検出し、そのコピー数を定量できることが明らかとなった。本ソバ配列の定量的ＰＣＲ法と次に示す補正用のスターチス配列の定量的ＰＣＲ法と組合わせて、ソバの混入量測定に用いることとした。
Ｇ．スターチス配列のコピー数を定量するＰＣＲ
（１）スターチス配列の検出用ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：
下記配列のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ株式会社製  リポーター色素ＦＡＭ）を合成して、スターチス配列の検出用プローブとして使用した。
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（２）スターチス配列の定量的ＰＣＲ法と解析：
配列番号５７と配列番号５８のプライマーをそれぞれ終濃度で０．２μＭずつ用いたこと、配列番号５９のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．２μＭ用いたこと以外は、基本的に実施例１．のＦ．（２）と同じ方法で行なった。その結果を図９、図１０と図１１に示す。
（３）スターチス配列の定量的ＰＣＲ法の特異性：
スターチス配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図９に示す通り、スターチスの種子ＤＮＡから増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみられた。一方、白花ソバとダッタンソバの種子、小麦の種子、落花生の種子、大豆の種子、とうもろこしの種子、カラシの種子、白胡椒、米、ソバカズラの葉ＤＮＡ５０ｎｇからは増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみられなかった。サケ精子ＤＮＡからも増幅を示す蛍光シグナルの立上がりはみられなかった（データ省略）。
（４）スターチス配列の定量的ＰＣＲ法の定量性：
スターチス配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図１０と図１１に示す通り、１０８〜１０１コピーの検量線用プラスミドで、相関係数０．９９９、かつ傾き−３．３８６の検量線を引くことができる定量性を確認できた。
以上の結果より、配列番号５７と配列番号５８のプライマー、配列番号５９のプローブを用いたスターチス配列の定量的ＰＣＲ法により、スターチスのＩＴＳ−１配列を特異的に検出し、そのコピー数を定量できることが明らかとなった。補正用の本スターチス配列の定量的ＰＣＲ法と実施例１．Ｆ．に示したソバ配列の定量的ＰＣＲ法と組合わせて、ソバの混入量測定に用いることとした。
【実施例２】Ａ．標準としたスターチスと、各種ソバ粉、擬似混入試料の作製に用いたソバ、米、小麦
（１）スターチス：
サカタのタネより販売されている切花用エキセレントライトブルー（単一ロット品）を用いた。
（２）ソバ：
タカノ株式会社より販売されている白花ソバ（普通ソバＦａｇｏｐｙｒｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ：２倍体）のソバ粉、ダッタンソバ（Ｆ．ｔａｔａｒｉｃｕｍ：２倍体）のソバ粉、高嶺ルビー（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ：２倍体）のソバ粉、グレートルビー（Ｆ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ：４倍体）のソバ粉を用いた。なお、擬似混入試料の作製には、白花ソバ粉を用いた。
（３）小麦：
市販の農林６１号を用いた。
（４）米：
市販の秋田小町の無農薬玄米を用いた。
Ｂ．標準としたスターチスと、擬似混入試料の作製に用いた米、小麦の粉砕とＤＮＡ抽出
（１）粉砕：
粉砕は、Ｒｅｔｓｃｈ社製の超遠心粉砕機Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｍｉｌｌ  ＺＭ１にロータ（ステンレス鋼製２４本刃）とスクリーン（ステンレス鋼製０．２０ｍｍ）をセットして行った。
（２）粉砕機の洗浄：
試料の粉砕前と後に、粉砕機の試料受け皿、試料蓋、ロータ、スクリーン、とめ具類、治具などの部品は、水洗浄、１０％ブリーチ溶液に浸漬、水洗浄、乾燥して使用した。粉砕機の本体部分は、エアガン洗浄、拭き掃除して使用した。
（３）粉砕機にソバとスターチス汚染がないことの確認：
大量粉砕前に、その試料の一部、あるいはソバやスターチスの混入が無い市販の皮付きとうもろこしを凍結乾燥したものを粉砕して、そこからＤＮＡを抽出し、実施例１．Ｆ．とＧ．に記載のソバ配列やスターチス配列の定量的ＰＣＲ法で、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡから増幅の立ち上がりを示す蛍光シグナルの有無を確認した。蛍光シグナルがなかった場合には汚染がないと判断して、以下の大量粉砕に進んだ。蛍光シグナルがあった場合には汚染があると判断して、粉砕機を再度洗浄し、ソバやスターチスの混入が無いことを確認済みの玄米（１ｋｇ）を当該粉砕機で粉砕した後、洗浄するとともに新品スクリーンに交換を行った後、再度上記ソバやスターチスの混入が無い市販の皮付きとうもろこしを凍結乾燥したものを粉砕し、同様の方法で蛍光シグナルの有無を確認し、粉砕機にソバとスターチスの汚染がないと判断できた上で、以下の大量粉砕に進んだ。
（４）スターチスの大量粉砕と、その粉砕物にソバの混入がないことの確認：
ソバの汚染が無いことを確認した粉砕機で、約１ｋｇのスターチスを粉砕した。粉砕物から２ｇずつ１０点サンプリングして、実施例１．Ｂ．（２）に記載の方法でＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔによりＤＮＡを抽出し、ソバ配列の定量的ＰＣＲ法で、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡから増幅の立ち上がりを示す蛍光シグナルがないことを確認した（データ省略）。これにより、ソバの混入がない、スターチスの粉砕物を確保した。
（５）米、小麦の大量粉砕と、それらの粉砕物にソバとスターチスの汚染がないことの確認：
ソバとスターチスの汚染が無いことを確認した粉砕機で、約５００ｇの米を粉砕した。粉砕物から２ｇずつ５点サンプリングして、実施例１．Ｂ．（２）に記載の方法でＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔによりＤＮＡを抽出し、ソバ配列とスターチス配列の定量的ＰＣＲ法で、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡから増幅の立ち上がりを示す蛍光シグナルがないことを確認した（データ省略）。小麦も同様にして行った。これにより、ソバとスターチスの混入がない、米、小麦の粉砕物を確保した。
Ｃ．擬似混入試料の作製
（１）ソバ粉／米の粉砕物の擬似混入試料：
静防ＯＰ［特殊静防処理］ＰＺタイプ（三方チャック袋）の号数Ｎｏ．６（福助工業株式会社）に、米の粉砕物４５．００ｇをはかり込んだものを６個準備して、Ｎｏ．１〜６の番号を付けた。ソバ粉５．００ｇをＮｏ．１の袋にはかり込み、袋の口を閉じて手で１５分間混合して、１０％のソバ粉を含む米の粉砕物を得た。続いて、この１０％（１００，０００ｐｐｍ）のソバ粉を含む米の粉砕物５．００ｇをＮｏ．２の袋にはかり込み、袋の口を閉じて手で１５分間混合して、１％（１０，０００ｐｐｍ）のソバ粉を含む米の粉砕物を得た。この希釈、混合操作を繰り返し、１００，０００〜１ｐｐｍのソバ粉を含む米の粉砕物を作製した。
（２）ソバ粉／小麦の粉砕物の擬似混入試料：
同様にして、１００，０００〜１ｐｐｍのソバ粉を含む小麦の粉砕物を作製した。
（３）ソバ粉／米と小麦の粉砕物の擬似混入試料：
静防ＯＰ［特殊静防処理］ＰＺタイプ（三方チャック袋）の号数Ｎｏ．５（福助工業株式会社）に、１０ｐｐｍのソバ粉を含む米の粉砕物１２．５ｇと１０ｐｐｍのソバ粉を含む小麦の粉砕物１２．５ｇをはかり込み、袋の口を閉じて手で１５分間混合して、１０ｐｐｍのソバ粉を含む米と小麦の粉砕物を作製した。
Ｄ．ＤＮＡ抽出時の擬似混入試料サンプリングスケールの決定
（１）白花ソバ粉の粒度分布測定：
ソバ粉を球と仮定した時の粒径を求めるため、白花ソバ粉の粒度分布測定（レーザー回折・散乱法・乾式、圧力０．５ｋｇ／ｃｍ２の条件）を行なった。測定は、粉株式会社セイシン企業の粉体測定技術センターに依頼した。結果、白花ソバ粉の累積５０％の粒径（Ｘ５０）は８０．９４１μｍとなった。
（２）白花ソバ粉のカサ密度測定：
ソバ粉の密度（粉の内部にある空壁を含めた密度）を求めるため、白花ソバ粉のカサ密度測定（Ｈｇ法・一定体積のセルにソバ粉を入れた後に水銀でセルを満たす方法）を行った。測定は、粉株式会社セイシン企業の粉体測定技術センターに依頼した。結果、白花ソバ粉のカサ密度（水銀法）は１．１８１ｇ／ｃｍ３となった。
ソバ粉の占める体積＝（セルの体積）−（入れた水銀の体積）
ソバ粉のカサ密度（水銀法）＝（入れたソバ粉の重量）／（ソバ粉の占める体積）
（３）擬似混入試料中のソバ粉粒数の試算とサンプリングスケールの決定：
白花ソバ粉の粒径８０．９４１μｍと密度１．１８１ｇ／ｃｍ３の測定値から、ソバ粉一粒あたりの重さを計算し、種々のソバ粉濃度の擬似混入試料中に存在するソバ粉の粒数を試算した。結果を表２に示す。今回、定量の目標とした混入量１０ｐｐｍのソバを含む擬似混入試料からＤＮＡ抽出のための試料をサンプリングする場合、サンプリングした試料の中に最低でも１００粒程度のソバ粉が入る様にしようとすると、サンプリング量は４ｇ以上必要ということがわかった。ＤＮＡ抽出には５ｇサンプリングすることとした。
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Ｅ．１００％ソバ粉＋スターチス標準、擬似混入試料＋スターチス標準からのＤＮＡ抽出
（１）各種ソバ粉試料：
白花ソバ粉を６点、高値ルビーソバ粉、グレートルビーソバ粉、ダッタンソバ粉をそれぞれ３点サンプリングしてＤＮＡ抽出に用いた。
（２）擬似混入試料：
１００ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／米の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦と米の粉砕物をそれぞれ３点サンプリングして、ＤＮＡ抽出に用いた。
（３）ＤＮＡ抽出：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＨａｎｄｂｏｏｋやＵｓｅｒ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを用い、以下の方法で行った。
試料５ｇとスターチス粉砕物１ｇを５０ｍｌ容チューブに入れ、３０ｍｌのＣａｒｌｓｏｎ  Ｌｙｓｉｓバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、２％  ＣＴＡＢ、１．４Ｍ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ＃６０００、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）、６０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）、７５μｌの２−メルカプトエタノール、６００μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、さらに試料の分散性を高めるためにジルコニアボール（株式会社ニッカトー社製  ＹＴＺボール  φ７ｍｍ）３つを入れてシェーカー（イワキ産業株式会社製  ＫＭ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｖ−ＤＸ）で１０分間以上ダマが無くなるまで混合（ＳＰＥＥＤ  １００）した後、７４℃で２０分間保温した。なお、保温中は５分おきにチューブを手で振って混合した。
３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１５ｍｌ容チューブに上清を４ｍｌとり、５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えて良く混合した。これを、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１５ｍｌ容チューブに上清（水層）をとり、３．５ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加えて良く混合した。これを、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、１５ｍｌ容チューブに上清（水層）をとり、再度クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）抽出と遠心分離を行い、上清（水層）を回収した。上清（水層）のうちの１５０μｌからイソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を１００μｌの滅菌超純水に溶解した後、９００μｌのバッファーＱＢＴを加えたものを、予め１ｍｌのバッファーＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇに供してＤＮＡをカラムに吸着させた。その後、４ｍｌのバッファーＱＣでカラムを洗浄した。最終的に１ｍｌのバッファーＱＦでＤＮＡ溶出し、イソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を４０μｌの滅菌超純水に溶解した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
Ｆ．スターチス標準を添加した１００％ソバ粉から抽出したＤＮＡ中の「スターチス配列のコピー数／ソバ配列のコピー数比」の算出
ソバ配列とスターチス配列の定量的ＰＣＲ法は、実施例１．のＦ．とＧ．に記載の方法で行なった。検量線をもとに、スターチス標準を添加した１００％ソバ粉から抽出したＤＮＡ５０ｎｇ中のソバ配列のコピー数と、スターチス配列のコピー数を定量した。その定量値をもとに、「スターチス配列のコピー数／ソバ配列のコピー数＝Ｌｏ／Ｆｏ比」を算出した。なお、各ソバ粉のＬｏ／Ｆｏ比は、同一サンプルを２ウェル並行で測定し、測定を二回繰り返して得られた比を平均して算出した。
Ｌｏ／Ｆｏ比測定の結果、表３に示す通り、白花ソバ粉２．３６（６点抽出、各点２ウェル測定、測定２回）、高嶺ルビーソバ粉３．２５、グレートルビーソバ粉２．７０、ダッタンソバ粉４．７５（３点抽出、各点２ウェル測定、測定２回）となった。ここで得られた白花ソバ粉のＬｏ／Ｆｏ比と、実施例２．Ｇ．で算出した擬似混入試料の「ソバ配列のコピー数／スターチス配列のコピー数＝Ｆｓ／Ｌｓ比」を用いて、ソバの混入量を求めることとした。なお、各種ソバ粉のＬｏ／Ｆｏ比を測定した時の生データを表４Ａと表４Ｂに示す。
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白花ソバ粉に対して、最も測定値のずれが大きかったダッタンソバ粉でも約２倍であり、本方法はＰＣＲによる定量法としては十分の精度を有していると考えられる。
Ｇ．スターチス標準を添加した擬似混入試料から抽出したＤＮＡ中の「ソバ配列のコピー数／スターチス配列のコピー数比」の算出と、擬似混入試料中のソバ混入量の計算
ソバ配列とスターチス配列の定量的ＰＣＲ法は、実施例１．のＦ．とＧ．に記載の方法で行なった。検量線をもとに、スターチス標準を添加した擬似混入試料から抽出したＤＮＡ５０ｎｇ中のソバ配列のコピー数と、スターチス配列のコピー数を定量した。その定量値をもとに、「ソバ配列のコピー数／スターチス配列のコピー数＝Ｆｓ／Ｌｓ比」を算出した。なお、擬似混入試料のＦｓ／Ｌｓ比は、同一サンプルから３点抽出、各点２ウェルで測定して算出した。ここで算出したＦｓ／Ｌｓ比と、実施例２．Ｆ．で算出したＬｏ／Ｆｏ比を用い、下式により、擬似混入試料（１ｇ）中のソバの混入量（μｇ）を求めた。
ソバの混入量ｐｐｍ（μｇ／ｇ）＝Ｆｓ／Ｌｓ×Ｌｏ／Ｆｏ×１，０００，０００
Ｆｓ／Ｌｓ比測定と混入量算出の結果、表５に示す通り、１００ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／米の粉砕物、１０ｐｐｍ白花ソバ粉／小麦と米の粉砕物について、２回測定した結果ともに妥当な値を得ることができた。なお、各種擬似混入試料のＦｓ／Ｌｓ比を測定した時の生データを表６Ａと表６Ｂに示す。
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【実施例３】Ａ．ＤＮＡ抽出に用いた植物試料
（１）落花生、ソバ（白花ソバ）、スターチスの種子：
実施例１．Ａ．（１）、（２）と同じものを用いた。
（２）小麦、大豆、とうもろこしの葉：
実施例１．Ａ．（３）と同じものを用いた。
（３）小豆、アーモンド、クルミ、マカデミアナッツ、ヘーゼルナッツの種子と、松の実、ヒマワリの種、ケシの実、ごま、リンゴ：
市販品を用いた。
（４）ソバ（白花ソバ）、小豆の葉
市販品の種子から発芽させた葉を用いた。
Ｂ．ＤＮＡ抽出
（１）スターチスの種子からのＤＮＡ抽出
実施例１．Ｂ．（２）と同じ方法で行なった。
（２）落花生、アーモンド、ヘーゼルナッツの種子と、ケシの実、ゴマからのＤＮＡ抽出：
実施例１．Ｂ．（３）と同じ方法で行なった。
（３）ソバ（白花ソバ）、小麦、大豆、とうもろこし、小豆の葉と、リンゴの種子からのＤＮＡ抽出：
実施例１．Ｂ．（４）と同じ方法で行なった。
（４）マカデミアナッツの種子からのＤＮＡ抽出：
ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐを用い、以下の方法で行った。
細かく粉砕した試料１ｇを５０ｍｌ容チューブに入れ、１０ｍｌのバッファーＧ２、２００μｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）、２０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合した後、５０℃で１時間保温した。その後、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清液を得た。さらに上清液の油分や粉末を取り除き、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清液を得た。得られた上清液を、予め１ｍｌのバッファーＱＢＴで平衡化したＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  ２０／Ｇに供してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。その後、４ｍｌのバッファーＱＣでＣｏｌｕｍｎを洗浄し、予め５０℃に加温してある１ｍｌのバッファーＱＦで溶出し、イソプロパノール沈澱により回収した沈澱物を１００μｌの滅菌超純水に溶解した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
（５）クルミの種子と、松の実、ヒマワリの種からのＤＮＡ抽出：
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参考にして、ＱＩＡＧＥＮ社製のＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行なった。
細かく粉砕した試料１ｇを１５ｍｌ容チューブに入れ、１０ｍｌのバッファーＡＰ１、１０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合した後、６５℃で６０分間保温した。その後、約３，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その上清液を得た。これに１．５ｍｌのバッファーＡＰ２を加えて、氷中で１０分間放置し、遠心分離によりその上清液を得た。得られた上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに供し、遠心分離によりＣｏｌｕｍｎのパス液を得た。このパス液に１．５容量のバッファーＡＰ３、１容量のエタノールを加えて混合した後、ＤＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに供し、約１，５００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡをＣｏｌｕｍｎに吸着させた。その後、Ｃｏｌｕｍｎに１０ｍｌのバッファーＡＷを加え、約１，５００×ｇで１分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎを洗浄、再度１０ｍｌのバッファーＡＷをＣｏｌｕｍｎに加え、約１，５００×ｇで１分間遠心分離して、最後に約３，０００×ｇで１０分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎに残っているバッファーＡＷを完全に除去した。最終的に６５℃で予め保温しておいた１ｍｌの滅菌超純水をＣｏｌｕｍｎに加え、５分間静置した後に、約３，０００×ｇで５分間遠心分離してＣｏｌｕｍｎから溶出し、イソプロパノール沈殿により回収した沈殿物を１００μｌの滅菌超純水に溶解した。溶液中のＤＮＡ濃度を測定し、適宜滅菌超純水で希釈したものをＰＣＲの鋳型ＤＮＡ試料とした。
Ｃ．落花生のＩＴＳ−１配列の一部を検出するＰＣＲ
（１）落花生検出用プライマー：
プライマー配列には、落花生属に属する植物のＧｅｎＢａｎｋに登録されている以下の１１配列中のＩＴＳ−１配列に共通な配列を用いた。なお、このうちのＡｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａについては、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＡｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ（ＡＦ１５６６７５）の代わりとして、市販落花生を解析して得た配列も用いた。
１：Ａｒａｃｈｉｓ  ｂａｔｉｚｏｃｏｉ（ＡＦ２０３５５３）
２：Ａｒａｃｈｉｓ  ｃｏｒｒｅｎｔｉｎａ（ＡＦ２０３５５４）
３：Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｅｒｍａｎｎｉｉ（ＡＦ２０３５５６）
４：Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｏｅｈｎｅｉ（ＡＪ３２０３９５）
５：Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ（ＡＦ１５６６７５及び、市販落花生を解析して得た配列）
６：Ａｒａｃｈｉｓ  ｍａｇｎａ（ＡＦ２０３５５５）
７：Ａｒａｃｈｉｓ  ｍａｊｏｒ（ＡＦ２０３５５２）
８：Ａｒａｃｈｉｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＦ２０３５５７）
９：Ａｒａｃｈｉｓ  ｐｉｎｔｏｉ（ＡＦ２０３５５１）
１０：Ａｒａｃｈｉｓ  ｔｒｉｓｅｍｉｎａｔａ（ＡＦ２０４２３３）
１１：Ａｒａｃｈｉｓ  ｖｉｌｌｏｓａ（ＡＦ２０３５５８）
そして、下記配列のオリゴＤＮＡプライマー（株式会社ＱＩＡＧＥＮ社製ＯＰＣ精製品）を合成して、落花生ＩＴＳ−１配列の一部を検出するＰＣＲ（以下、落花生ＰＣＲとする）用プライマーとして使用した。
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（２）落花生検出用プライマーの特異性（ＰＣＲシミュレーション）：
ＰＣＲシミュレーションソフトＡｍｐｌｉｆｙ  １．０（Ｂｉｌｌ  Ｅｎｇｅｌｓ）により、落花生属に属する植物の１１配列、落花生以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の８配列（ソバ、小麦、大豆、クルミ、松茸、桃、リンゴ、オレンジ）、食品原材料としてよく使われている植物の８配列（とうもろこし、米、胡椒、カラシ、ニンジン、椎茸、白菜、かぶ）、マメ科植物の６配列（インゲンマメ、ライマメ、ヒラマメ、ヒヨコマメ、緑豆、小豆）、落花生近縁種の植物の６９配列、スターチスから、落花生検出用プライマーでＰＣＲ増幅産物が得られるシミュレーション結果となるかを確認した。ここでいう落花生近縁種の植物とは、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている落花生Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａの塩基配列（ＡＦ１５６６７５）のＩＴＳ−１配列部分をＢＬＡＳＴホモロジー検索に供して、Ｓｃｏｒｅ  ６０ｂｉｔｓ以上となった落花生属以外の植物のことである。今回は、さらにその植物が属する属の中で最もＳｃｏｒｅが高い値となった種の配列を、その属の代表の配列として選定した。なお、ＰＣＲシミュレーションはそれら配列のＩＴＳ−１〜５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子〜ＩＴＳ−２配列の領域に対して行った。配列番号２１と配列番号６５のプライマーを組み合わせて使用した場合について、シミュレーションに用いた配列のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒならびに、シミュレーション結果を表７Ａ〜７Ｅに代表として示す。表７Ａ〜７Ｅの省略文字、記号は以下に示す通りである：
＊：標的サイズ付近（±１０ｂｐ）のＰＣＲ増幅産物が得られると予想されたもの
Ｗ値：ＰＣＲ増幅産物の得られる可能性
得られる可能性が高い…Ｗ６＞Ｗ５＞Ｗ４＞Ｗ３＞Ｗ２…得られる可能性が低い数値（ｂｐ）：ＰＣＲ増幅産物のサイズ（ｂｐ）
Ａｍｐｌｉｆｙで得られた値から２を引いた値
−：ＰＣＲ増幅産物なしと予想されたもの
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シミュレーションの結果、配列番号２１と配列番号６５のプライマーを組み合わせて使用した場合、表７Ａ〜７Ｃに示す通り、落花生属の１１配列からは標的とした７６ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物が得られることが予想された。また、落花生属以外のアレルギーを起こす恐れのある植物の７配列（ソバ、小麦、大豆、クルミ、松茸、桃、オレンジ）、食品原材料としてよく使われている植物の８配列（とうもろこし、米、胡淑、カラシ、ニンジン、椎茸、白菜、かぶ）、マメ科植物の６配列（インゲンマメ、ライマメ、ヒラマメ、ヒヨコマメ、緑豆、小豆）、落花生近縁種の植物の６９配列、スターチスからは、標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られないことが予想された。なお、リンゴからは、弱いながら標的とは異なるサイズの非特異的なＰＣＲ増幅産物が得られる可能性があると予想されたため、別途、実際のＰＣＲで確認することとした。なお、配列番号２１と配列番号６６に示す配列を有するプライマーを組み合わせて使用した場合、配列番号２１と配列番号２６のプライマーを組み合わせて使用した場合にも、落花生属の配列から標的とするＰＣＲ増幅産物が得られることが予想される結果が得られた。
（３）落花生ＰＣＲ：
ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰＣＲバッファーｗｉｔｈ  ３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４００μＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ）に、プライマーをそれぞれ終濃度で０．２μＭずつ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした反応用溶液を０．２ｍｌマイクロチューブに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００により、９５℃，１５分（酵素活性化）の後、９５℃，３０秒（変性）、６８℃，３０秒（アニーリング、伸長）のサイクルを４５回繰り返した後、７２℃，４分（最終伸長）として反応させた。得られたＰＣＲ反応液をエチジウムブロマイド含有の２％アガロースゲル電気泳動に供して、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社製の蛍光イメージアナライザーＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ５９５により解析した。配列番号２１と配列番号６５とのプライマーを組み合わせて使用した場合の結果を図１２に代表として示す。図１２の省略文字、記号などは以下に示す。
Ｍ  ：  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｍａｒｋｅｒ
（−）  ：  鋳型ＤＮＡ未添加
数字  ：  添加した鋳型ＤＮＡ量
矢印  ：  標的のＰＣＲ増幅産物のバンド（約７６ｂｐ）
なお、抽出した植物ＤＮＡがＰＣＲ増幅可能なレベルの純度であることは、植物ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ＤＮＡやＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子配列の一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した（データ省略）。
（４）落花生ＰＣＲの感度と特異性：
落花生ＰＣＲの結果、図１２に示す通り、落花生ＤＮＡ５００ｆｇから標的とした落花生ＩＴＳ−１配列から予想される約７６ｂｐのサイズのＰＣＲ増幅産物が得られた。５００ｆｇの落花生ＤＮＡを検出できる感度とは、ある試料から抽出したＤＮＡ  ５０ｎｇを鋳型としてＰＣＲした場合、その試料ＤＮＡ中に含まれる１０ｐｐｍのソバＤＮＡを検出できるレベルの感度に相当する。
落花生ＰＣＲの結果、図１２に示す通り、リンゴの種子、小麦の葉、ソバの葉、小豆の葉、大豆の葉、とうもろこしの葉、スターチスの種子ＤＮＡ  ５０ｎｇからは標的サイズのＰＣＲ増幅産物ならびに非特異的なＰＣＲ増幅産物は得られなかった。リンゴについては、ＰＣＲシミュレーションで弱いながら標的とは異なるサイズの非特異的なＰＣＲ増幅産物が得られる可能性があると予想されていたが、問題はないことが確認できた。また、アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカデミアナッツ、クルミの種子、ケシの実、松の実、ヒマワリの種、ゴマ、サケ精子ＤＮＡからも同様にＰＣＲ増幅産物は得られないことを確認した（データ省略）。他にも、配列番号２１と配列番号６６のプライマーを組み合わせて使用した場合、配列番号２１と配列番号２６のプライマーを組み合わせて使用した場合、ともに、同様の感度と特異性を有するという結果を得た（データ省略）。
（５）落花生ＰＣＲ増幅産物の塩基配列解析：
上記配列番号２１と配列番号６５のプライマーを組み合わせて使用した場合に得られた落花生ＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、配列番号２１と配列番号６５のプライマーを用いた両鎖ダイレクトシークエンスにより解析した。得られた塩基配列を、市販落花生Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａの塩基配列と比較し、落花生ＤＮＡ由来のＰＣＲ増幅産物の塩基配列は、市販落花生（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）の塩基配列の標的とした部分と１００％合致することを確認した。（データ省略）このことから、上記プライマーを用いたＰＣＲにより、落花生ＩＴＳ−１の一部の配列を増幅、検出していることが立証された。他にも、配列番号２１と配列番号６６のプライマーを組み合わせて使用した場合、配列番号２１と配列番号２６とのプライマーを組み合わせて使用した場合、ともに、同様に落花生ＩＴＳ−１の一部の配列を増幅、検出しているという結果を得た。（データ省略）
以上の結果より、上記プライマーを用いた落花生ＰＣＲにより、落花生属に属する植物全般のＩＴＳ−１配列を、高感度かつ、特異的に検出できることが明らかとなった。これらプライマーを、落花生ＩＴＳ−１配列のコピー数を定量するＰＣＲ（以下、落花生配列の定量的ＰＣＲ法とする）に用いることとした。
Ｄ．落花生配列のコピー数を定量するＰＣＲ
（１）落花生配列の検出用ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ：
下記配列のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ株式会社製リポーター色素ＦＡＭ）を合成して、落花生配列の検出用プローブとして使用した。なお、プローブ配列には、落花生属に属する植物のＩＴＳ−１配列としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている１１配列、ならびに市販落花生を解析して得た配列に共通な配列を用いた。
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（２）落花生配列の定量的ＰＣＲ法：
ＱＩＡＧＥＮ社製のＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを用い、以下の方法で行った。
１２．５μｌの２×ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに、プライマーを終濃度でそれぞれ０．２μＭずつと、配列番号３４のＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブを終濃度で０．１μＭ、及び鋳型ＤＮＡを加え、最終的に滅菌超純水で２５μｌとした溶液を９６穴ＰＣＲプレートに分注した。分注した９６穴ＰＣＲプレートを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ７７００にセットし、９５℃，１５分の後、９５℃，３０秒（変性）、６８℃，３０秒（アニーリング、伸長）のサイクルを４５回繰り返した後、７２℃，４分（最終伸長）として反応させた。反応は全て同一試料を２ウェル並行で行なった。反応終了後、伸長ステップにおける蛍光データを解析した。なお、ベースラインは、始めに０−１サイクルに設定して蛍光の立ち上がりの始まるサイクルを確認して、そのサイクルよりも前の範囲で適宜設定した。また、閾値ライン（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｌｉｎｅ）の設定は、Ｋｕｒｉｂａｒａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍａｉｚｅ  ａｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ８５：１０７７−１０８９に記載の方法に従って行なった。配列番号２１と配列番号６５とのプライマーを組み合わせて使用した場合の結果を図１３、図１４、図１５に代表として示す。
なお、抽出した植物ＤＮＡがＰＣＲ増幅可能なレベルの純度であることは、植物ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ＤＮＡやＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子配列の一部を増幅するプライマーにより、ＰＣＲ増幅産物が得られることで確認した（データ省略）。
（３）落花生配列の定量的ＰＣＲ法の特異性：
落花生配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図１３に示す通り、落花生の種子ＤＮＡから増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりが確認された。一方、リンゴの種子、小麦の葉、ソバの葉、小豆の葉、大豆の葉、とうもろこしの葉、スターチスの種子ＤＮＡ  ５０ｎｇからは増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。また、アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカデミアナッツ、クルミの種子、ケシの実、松の実、ヒマワリの種、ゴマ、リンゴ、サケ精子ＤＮＡからも増幅を示す蛍光シグナルの立上がりは認められなかった。（データ省略）他にも、配列番号２１と配列番号６６とのプライマーを組み合わせて使用した場合、配列番号２１と配列番号２６と組み合わせて使用した場合、ともに、同様の特異性を有するという結果を得た。（データ省略）
（４）落花生配列の定量的ＰＣＲ法の定量性と感度：
ソバ配列の定量的ＰＣＲ法の結果、図１４と図１５に示す通り、落花生ＤＮＡ５０ｎｇ〜５００ｆｇの範囲で、相関係数０．９９６、かつ傾き−３．９１１の検量線を引くことができる定量性と感度を確認できた。また、落花生ＤＮＡ５０ｆｇからも増幅を示す蛍光シグナルの立ち上がりがみられる感度を確認できた。他にも、配列番号２１と配列番号６６のプライマーを組み合わせて使用した場合、配列番号２１と配列番号２６を組み合わせて使用した場合、ともに、同様の定量性と感度を有するという結果を得た。（データ省略）
以上の結果より、配列番号２１と配列番号６５のプライマー、配列番号３４のプローブを用いた落花生配列の定量的ＰＣＲ法、配列番号２１と配列番号６６とのプライマー、配列番号３４のプローブを用いた落花生配列の定量的ＰＣＲ法、配列番号２１と配列番号２６とのプライマー、配列番号３４のプローブを用いた落花生配列の定量的ＰＣＲ法により、落花生属に属する植物全般のＩＴＳ−１配列を高感度かつ特異的に検出し、さらには落花生の標的配列を含む検量線用プラスミドを構築して検量線を作製すれば、落花生配列のコピー数を定量できることが明らかとなった。本落花生配列の定量的ＰＣＲ法と補正用のスターチス配列の定量的ＰＣＲ法と組合わせて、落花生の混入量測定に用いることができる。
実施例４：加工処理後のサンプル中の定量的ＰＣＲ法の定量性の確認：
さらに、加熱調理した加工品モデルとして、１００ｐｐｍ（以下Ｗ／Ｗ）のソバを含む小麦粉８０ｇに水３５ｇ、塩０．８ｇを加えたドウ（直径６ｃｍ、厚さ１ｍｍ）を作製し、これを、以下の４通りの加熱処理；▲１▼焼く（１６０℃、１０分）、▲２▼揚げる（１８５℃、５秒）、▲３▼蒸す（１００℃、１０分）、▲４▼茹でる（１００℃、１０分）を行なったものについて、スターチス標準試料と混合して、上記と同様、ＤＮＡ抽出を行なった後、配列番号１４記載の配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１５記載の配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および配列番号６４記載の配列を有するプローブを用いて、該加熱後の試料に含まれるソバを定量した。測定された加工品中のソバの定量値をもとに、水分量を加味して、使用した小麦粉中のソバ濃度に換算した結果、▲１▼焼いたもの：１４５ｐｐｍ、▲２▼揚げたもの：５６ｐｐｍ、▲３▼蒸したもの：１９８ｐｐｍ、▲４▼茹でたもの：１４３ｐｐｍであり、十分な定量性が示された。したがって、食品加工において、最も一般的な加熱処理である、焼く、揚げる、蒸すおよび茹でるのいずれの処理においても、本発明の方法による定量は可能であることが示唆され、このことから、これらの他の加工処理によってもその定量性を喪失することはないと考えられる。したがって、本発明の方法は、広範な加工食品に適用可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明の食品または食品原材料中に混入した特定植物属に属する植物を定量するＰＣＲ法によると、食品または食品原材料中における特定植物属の植物の極微量の存在を検出するとともに定量することが可能であることから、ソバ属、落花生属、小麦属及び大豆属等のアレルギー原因となる植物属の植物の混入の有無の検出およびその定量をするのに特に有効である。また、被検対象とする試料毎のＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害などの影響に対する補正の方法として、外部から精製ＤＮＡを標準として添加して反応溶液中のＰＣＲ反応の阻害などの影響に対する補正を行うのではなく、外部から精製ＤＮＡ以外の標準植物試料を添加したサンプルから検出対象の特定植物属由来のＤＮＡと標準植物由来のＤＮＡを同時に抽出して定量的ＰＣＲ法を行うことにより、標準植物試料と検出対象の特定植物属由来の試料との間で、ＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害などの影響が均一な条件で測定できるため、非常に信頼度の高い定量が可能である。また、ＤＮＡ抽出効率やＰＣＲ反応の阻害等の影響、さらには被検対象とする試料中のＤＮＡ含有量の違いに対しても補正が可能であるという、有利な効果を有している。また、例えば塩等のＤＮＡを含有していない食品原材料または当該原材料を含む食品中の特定植物属に属する植物を適切に定量検出することも可能である。
したがって、本発明は、食品または食品原材料中に混入しているアレルギーの原因となる特定植物属に属する植物の定量的検出に有用である。さらに、ＰＣＲ法による定量分析は、偽陽性が出た場合に、そのＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ配列の解析に供することにより、確実に偽陽性を除外することができるという点から、産業上利用性に優れているといえる。
さらに、本定量的ＰＣＲ法によると、ＥＬＩＳＡ法よりダイナミックレンジが広く、かつ食品または食品原材料中に混入した特定の原材料の定量的検出に十分な特異性および感度が高いものとすることができる。また、合成品（プライマー、プローブ）を使用することにより測定結果の再現性が高く、かつ信頼度も高いものとすることができる。
【配列表】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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