(57)【要約】ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子であるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１の各遺伝子の発現を抑制することにより、各種癌細胞においてアポトーシスが誘導され、細胞増殖の抑制が引き起こされることが明らかとなった。ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子の発現もしくはＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の機能を抑制する化合物は、アポトーシス誘導効果を有するものと考えられる。
2004100990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物が、ＲｅｃＱＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
二本鎖ＲＮＡが、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子のｍＲＮＡにおける連続する任意の２０〜３０塩基と相同な配列からなるセンスＲＮＡおよび該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである、請求項２に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡを有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
【請求項６】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの化合物である、請求項６に記載のアポトーシス誘導剤。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリータンパク質変異体
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
【請求項８】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子が、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子のいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項９】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の塩基配列が配列番号：６〜３０のいずれかに記載の塩基配列である、請求項１〜７のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１０】
ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一方の鎖が配列番号：１〜５、３１〜４０、４３〜６９のいずれかに記載の塩基配列からなる、請求項２〜４のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌剤。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１４】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質の活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１６】
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子が、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１または６に記載のアポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法。
（ａ）請求項１２〜１６のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングする工程、
（ｂ）該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤、並びに、該アポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子は大腸菌のような原核生物から、ヒトを含む高等真核生物にまで広く存在し、進化の過程で保存され多細胞化にともなって多様化した遺伝子である。大腸菌におけるＲｅｃＱ遺伝子がＲｅｃＱファミリー遺伝子の最初の発見であり、接合組換え、ＵＶ傷害修復ＲｅｃＦ経路ではたらく遺伝子として同定され（非特許文献１参照）、誤った組換えを抑制する機能をもつことが示されている（非特許文献２参照）。出芽酵母ではＳＧＳ１遺伝子が、分裂酵母ではＲｑｈ１遺伝子がそれぞれ唯一のＲｅｃＱホモログとして知られ、何れも組換えに対して主に抑制的に作用し、ゲノムの安定化に重要な役割を果たしている（非特許文献３および４参照）。一方高等真核生物では複数のＲｅｃＱホモログが存在し、ヒトでは本発明者らが同定したＲＴＳ遺伝子（非特許文献５、特許文献１および２参照）とＲｅｃＱＬ５遺伝子（非特許文献５、特許文献３参照）を含め５つのＲｅｃＱファミリー遺伝子、ＲｅｃＱＬ１（非特許文献６参照）、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳ、そしてＲｅｃＱＬ５遺伝子が知られている。これらのうちＢＬＭ、ＷＲＮ、そしてＲＴＳ遺伝子はそれぞれブルーム症候群（非特許文献７参照）、ウエルナー症候群（非特許文献８参照）、ロスモンド−トムソン症候群（非特許文献９参照）の原因遺伝子であり、これらは何れも細胞のゲノム安定性に重要な働きをしている。
ウエルナー症候群の患者由来の線維芽細胞やリンパ球系細胞株では、ゲノム不安定性を示す染色体の転座や欠失が高頻度で起こることが報告されている（非特許文献１０参照）。ブルーム症候群の患者由来の細胞では、染色体の切断や姉妹染色分体交換（ＳＣＥ）が高頻度に見られる（非特許文献１１参照）。またロスモンド−トムソン症候群の患者由来のリンパ球においては２番染色体や８番染色体のトリソミーが高頻度で認められる（非特許文献１２参照）。これらの事実は、これら３つの遺伝病の原因遺伝子がそれぞれコードするＷＲＮヘリカーゼ、ＢＬＭヘリカーゼ、そしてＲＴＳヘリカーゼが細胞のゲノム安定化に重要な役割を果たしていることを示す。
ウエルナー症候群の患者由来のリンパ球系細胞株では、健常人由来の細胞株と比較してテロメア長の異常が認められる（非特許文献１３参照）。また健常人由来のリンパ球系細胞株を継代し続けると、１５％程度の割合で不死化するのに対し、ウエルナー症候群の患者由来の細胞株では細胞の不死化が認められなかった（非特許文献１４参照）。これらの事実はＷＲＮヘリカーゼがテロメアの構造維持に働き、リンパ球系細胞株の不死化（癌化）に必須であることを示す。
ＷＲＮヘリカーゼはＤＮＡ傷害剤に応答して核内でフォーカスを形成し、ＷＲＮ結合タンパク質の一つで一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＲＰＡ、および組換え修復因子ＲＡＤ５１のフォーカスと局在が一致することから、相同組換えを介した修復反応に関与することが示唆されている（非特許文献１５参照）。またＷＲＮヘリカーゼはＤＮＡ依存性タンパクキナーゼ複合体（ＤＮＡ−ＰＫ）およびフラップエンドヌクレアーゼ１（ＦＥＮ−１）と結合することが知られている。ＷＲＮヘリカーゼはＤＮＡ−ＰＫと結合することにより非相同末端結合修復経路においてＤＮＡ二重鎖切断末端のプロセシングに重要な役割を果たす（非特許文献１６参照）。一方、ＷＲＮヘリカーゼはＦＥＮ−１に結合して活性化し、オカザキフラグメント（Ｏｋａｚａｋｉ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）をプロセシングしながら、相同組換えによる複製フォークの再構築を正確に行う場を提供すると考えられている（非特許文献１７参照）。以上の知見は、ＷＲＮヘリカーゼがＤＮＡ複製期におけるＤＮＡ修復に重要な役割を果たすことを示唆する。
ＢＬＭヘリカーゼは核内に見られる特異的な構造体ＰＭＬ  ｂｏｄｙに局在し、トポイソメラーゼＩＩＩと結合する（非特許文献１８参照）。またテロメア維持にも働くと考えられており、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を巻き戻す活性をもつ（非特許文献１９参照）。またＨｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｃｔｉｏｎをほどきＲａｄ５１タンパク質と相互作用することが報告されている（非特許文献２０参照）。これらの知見からＢＬＭヘリカーゼも他のＤＮＡ代謝酵素と協調的に働き、ＤＮＡ組換え修復やテロメア維持に重要な役割を果たすと考えられる。
ヒトの５つのＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー、ＲｅｃＱ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ５のうち、制止期にある細胞ではＲｅｃＱ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳはほとんど発現しておらず、一方ウイルスで形質転換し、増殖が促進された細胞株で高発現している（非特許文献２１参照）。また制止期の細胞に発癌のプロモーターであるＴＰＡを添加すると細胞分裂の誘導にともなってＲｅｃＱ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳの発現が誘導される（非特許文献２１参照）。これらの知見はＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリーの細胞増殖における重要性を示唆している。
以上を総合すると、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリーは細胞のゲノムを修復し（ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳ）、一方テロメアの構造維持にも関与しており（ＢＬＭ、ＷＲＮ）、またある種の細胞の不死化に重要な役割を果たし（ＷＲＮ）、さらに細胞分裂にともなって発現が誘導される（ＲｅｃＱ１、ＢＬＭ、ＷＲＮ、ＲＴＳ）ことから、制癌の標的として有望な分子であると考えられる。
また腫瘍細胞においてＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリーの発現が著しく高いことが見出され、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現の抑制を指標とした、腫瘍の増殖を抑制する化合物のスクリーニング方法が知られている（特許文献４参照）。また、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現を抑制する化合物は癌細胞の増殖を抑制する、という可能性が示唆されている（特許文献４参照）。
しかしながら、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現の抑制と癌細胞特異的なアポトーシスの誘導との関係は、全く報告されておらず、この関係を示唆する知見も皆無であった。
【特許文献１】特願平９−２００３８７号
【特許文献２】特願平１１−１１２１８号
【特許文献３】特願平１０−８１４９２号
【特許文献４】特開２０００−１６６６００号
【非特許文献１】Ｎａｋａｙａｍａ  Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｒ，Ｉｒｉｎｏ  Ｎ，Ｎａｋａｙａｍａ  Ｙ，Ｈａｎａｗａｌｔ  ＰＣ著、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅｌｅｓｓ  ｄｅａｔｈ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎ（ｒｅｃＱ１）ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｔｈｅ  ＲｅｃＦ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．」、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、１９８４年、Ｖｏｌ．１９５、ｐ．４７４−４８０．
【非特許文献２】Ｈａｎａｄａ  Ｋ，Ｕｋｉｔａ  Ｔ，Ｋｏｈｎｏ  Ｙ，Ｓａｉｔｏ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｊ，Ｉｋｅｄａ  Ｈ著、「ＲｅｃＱ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｉｓ  ａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．、１９９７年、Ｖｏｌ．９４、ｐ．３８６０−３８６５
【非特許文献３】Ｍｙｕｎｇ  Ｋ，Ｄａｔｔａ  Ａ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，Ｋｏｌｏｄｎｅｒ  ＲＤ著、「ＳＧＳ１，ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ＢＬＭ  ａｎｄ  ＷＲＮ，ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、２００１年、Ｖｏｌ．２７、ｐ．１１３−１１６
【非特許文献４】Ｄｏｅ  ＣＬ，Ｄｉｘｏｎ  Ｊ，Ｏｓｍａｎ  Ｆ，Ｗｈｉｔｂｙ  ＭＣ著、「Ｐａｒｔｉａｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｒｑｈ１（−）ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｈｏｌｌｉｄａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ．」、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２０００年、Ｖｏｌ．１９、ｐ．２７５１−２７６２
【非特許文献５】Ｋｉｔａｏ  Ｓ，Ｏｈｓｕｇｉ  Ｉ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ａ著、「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｅｃＱ  ｆａｍｉｌｙ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．、１９９８年、Ｖｏｌ．５４、ｐ．４４３−４５２
【非特許文献６】Ｓｅｋｉ，Ｍ．，Ｍｉｙａｚａｗａ，Ｈ．，Ｔａｄａ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｊ．，Ｙａｍａｏｋａ，Ｔ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，Ｓ．，Ｏｚａｗａ，Ｋ．，Ｅｋｉ，Ｔ．，Ｎｏｇａｍｉ，Ｍ．，，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｋ．，ら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  Ｑ１  ｗｈｉｃｈ  ｈａｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｒｅｃ  Ｑ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ａｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １２ｐ１２．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９４年、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．２２、ｐ．４５６６−４５７３
【非特許文献７】Ｅｌｌｉｓ  ＮＡ，Ｇｒｏｄｅｎ  Ｊ，Ｙｅ  ＴＺ，Ｓｔｒａｕｇｈｅｎ  Ｊ，Ｌｅｎｎｏｎ  ＤＪ，Ｃｉｏｃｃｉ  Ｓ，Ｐｒｏｙｔｃｈｅｖａ  Ｍ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｊ著、「Ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｍ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ＲｅｃＱ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ．」、Ｃｅｌｌ、１９９５年、Ｖｏｌ．８３、ｐ．６５５−６６６
【非特許文献８】Ｙｕ  ＣＥ，Ｏｓｈｉｍａ  Ｊ，Ｆｕ  ＹＨ，Ｗｉｊｓｍａｎ  ＥＭ，Ｈｉｓａｍａ  Ｆ，Ａｌｉｓｃｈ  Ｒ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ  Ｓ，Ｎａｋｕｒａ  Ｊ，Ｍｉｋｉ  Ｔ，Ｏｕａｉｓ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎ  ＧＭ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ  Ｊ，Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＧＤ著、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｇｅｎｅ．」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年、Ｖｏｌ．２７２、ｐ．２５８−２６２
【非特許文献９】Ｋｉｔａｏ  Ｓ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ａ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＷ，Ｓｍｉｔｈｓｏｎ  ＷＡ，Ｌｉｎｄｏｒ  ＮＭ，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ著、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＲＥＣＱＬ４  ｃａｕｓｅ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  Ｒｏｔｈｍｕｎｄ−Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９９年、Ｖｏｌ．２２、ｐ．８２−８４
【非特許文献１０】Ｇｏｔｏ  Ｍ著、「Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ａｇｅｉｎｇ．」、Ｍｅｃｈ．Ａｇｅｉｎｇ  Ｄｅｖ．、１９９７年、Ｖｏｌ．９８、ｐ．２３９−２５４
【非特許文献１１】Ｅｌｌｉｓ  ＮＡ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｊ著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｍ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．」、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９６年、Ｖｏｌ．５、ｐ．１４５７−１４６３
【非特許文献１２】Ｌｉｎｄｏｒ  ＮＭ，Ｄｅｖｒｉｅｓ  ＥＭ，Ｍｉｃｈｅｌｓ  ＶＶ，Ｓｃｈａｄ  ＣＲ，Ｊａｌａｌ  ＳＭ，Ｄｏｎｏｖａｎ  ＫＭ，Ｓｍｉｔｈｓｏｎ  ＷＡ，Ｋｖｏｌｓ  ＬＫ，Ｔｈｉｂｏｄｅａｕ  ＳＮ，Ｄｅｗａｌｄ  ＧＷ著、「Ｒｏｔｈｍｕｎｄ−Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｓｉｂｌｉｎｇｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｓａｉｃｉｓｍ．」、Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９６年、Ｖｏｌ．４９、ｐ．１２４−１２９
【非特許文献１３】Ｔａｈａｒａ  Ｈ，Ｔｏｋｕｔａｋｅ  Ｙ，Ｍａｅｄａ  Ｓ，Ｋａｔａｏｋａ  Ｈ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，Ｓａｔｏｈ  Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｔ，Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｍ，Ｉｄｅ  Ｔ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｍ著、「Ａｂｎｏｒｍａｌ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９７年、Ｖｏｌ．１５、ｐ．１９１１−１９２０
【非特許文献１４】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ，Ｉｄｅ  Ｔ，Ｇｏｔｏ  Ｍ著、「Ｉｎｃｏｒｒｅｃｔ  ｕｓ  ｏｆ″ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ″ｆｏｒ  Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ．」、Ｖｉｒｏｌ．、１９９９年、Ｖｏｌ．７３、ｐ．９６９０−９６９１
【非特許文献１５】Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ，Ｈｅｏ  ＳＪ，Ｇｏｔｏ  Ｍ，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ  Ｙ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ａ著、「Ｗｅｒｎｅｒ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｒｅｌｏｃａｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆｏｃｉ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ＲＰＡ  ａｎｄ  Ｒａｄ５１．」、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．、２００１年、Ｖｏｌ．６、ｐ．４２１−４３０
【非特許文献１６】Ｙａｎｎｏｎｅ  ＳＭ，Ｒｏｙ  Ｓ，Ｃｈａｎ  ＤＷ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＢ，Ｈｕａｎｇ  Ｓ，Ｃａｍｐｉｓｉ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  ＤＪ著、「Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００１年、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．３８２４２−３８２４８
【非特許文献１７】Ｂｒｏｓｈ  ＲＭ  Ｊｒ，ｖｏｎ  Ｋｏｂｂｅ  Ｃ，Ｓｏｍｍｅｒｓ  ＪＡ，Ｋａｒｍａｋａｒ  Ｐ，Ｏｐｒｅｓｋｏ  ＰＬ，Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋｉ  Ｊ，Ｄｉａｎｏｖａ  Ｉ，Ｄｉａｎｏｖ  ＧＬ，Ｂｏｈｒ  ＶＡ著、「Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｆｌａｐ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  １  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｉｔｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．」、ＥＭＢＯ  Ｊ．、２００１年、Ｖｏｌ．２０、ｐ．５７９１−５８０１
【非特許文献１８】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＦＢ，Ｌｏｍｂａｒｄ  ＤＢ，Ｎｅｆｆ  ＮＦ，Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ＭＡ，Ｄｅｗｏｌｆ  Ｗ，Ｅｌｌｉｓ  ＮＡ，Ｍａｒｃｉｎｉａｋ  ＲＡ，Ｙｉｎ  Ｙ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ  Ｒ，Ｇｕａｒｅｎｔｅ  Ｌ著、「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｍ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩａｌｐｈａ  ｉｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｅｉｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００年、Ｖｏｌ．６０、ｐ．１１６２−１１６７
【非特許文献１９】Ｍｏｈａｇｈｅｇｈ  Ｐ，Ｋａｒｏｗ  ＪＫ，Ｂｒｏｓｈ  Ｊｒ  ＲＭ  Ｊｒ，Ｂｏｈｒ  ＶＡ，Ｈｉｃｋｓｏｎ  ＩＤ著、「Ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｍ’ｓ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ＤＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ．」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００１年、Ｖｏｌ．２９、ｐ．２８４３−２８４９
【非特許文献２０】Ｗｕ  Ｌ，Ｄａｖｉｅｓ  ＳＬ，Ｌｅｖｉｔｔ  ＮＣ，Ｈｉｃｋｓｏｎ  ＩＤ著、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＢＬＭ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＲＡＤ５１．」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００１年、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．１９３７５−１９３８１
【非特許文献２１】Ｋａｗａｂｅ，Ｔ．，Ｔｓｕｙａｍａ，Ｎ．，Ｋｉｔａｏ，Ｓ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ａ．，Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ，Ｍ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．，Ａｎｎｏ，Ｋ．，Ｓａｔｏ，Ｔ．，Ｍｉｔｓｕｉ，Ｙ．，Ｓｅｋｉ，Ｍ．，Ｅｎｏｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｇｏｔｏ，Ｍ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｎ．Ａ，，Ｉｄｅ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．著、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＲｅｃＱ  ｆａｍｉｌｙ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．、２０００年、Ｖｏｌ．１９、Ｎｏ．４１、ｐ．４７６４−４７７２．
【発明の開示】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤を提供することにある。さらに、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった。ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子は、腫瘍細胞系（例えば癌細胞など）において発現が上昇していることが知られている。本発明者らは、ヒトのＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子の発現抑制効果を有するｓｉＲＮＡを用いて、各ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子の発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。その結果、本発明者らは、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子であるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１の各遺伝子の発現を抑制することにより、各種癌細胞においてアポトーシスが誘導され、細胞増殖の抑制が引き起こされることを初めて見出した。一方、これらの効果は正常細胞であるヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞株では認められなかった。また、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡによって、担癌ヌードマウスにおけるインビボでの腫瘍増殖が、目立った有害作用を伴わずに阻害されることを見出した。
従って、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子であるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１遺伝子は非常に優れた副作用の少ない制癌剤のターゲット分子と考えられる。即ち、上記ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子の発現もしくはＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の機能を抑制する化合物は、アポトーシス誘導効果を有するものと考えられ、該化合物は副作用の少ない抗癌剤となるものと大いに期待される。例えば、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のｍＲＮＡ配列に基づいたｓｉＲＮＡ等のＲｅｃＱヘリカーゼファミリータンパク質の発現もしくは活性を抑制する化合物は副作用の少ない制癌剤として期待できる。
また、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を指標とすることにより、アポトーシス誘導剤のスクリーニングが可能である。
即ち、本発明は、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤、および癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
〔１〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対する（癌細胞特異的）アポトーシス誘導剤、
〔２〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物が、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡである、〔１〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔３〕    二本鎖ＲＮＡが、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子のｍＲＮＡにおける連続する任意の２０〜３０塩基と相同な配列からなるセンスＲＮＡおよび該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである、〔２〕に記載のアポトージス誘導剤、
〔４〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡを有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤、
〔５〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の（ａ）または（ｂ）である、〔１〕に記載のアポトーシス誘導剤、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
〔６〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤、
〔７〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの化合物である、〔６〕に記載のアポトーシス誘導剤、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリータンパク質変異体
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
〔８〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子が、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子のいずれかである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤、
〔９〕    ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の塩基配列が配列番号：６〜３０のいずれかに記載の塩基配列である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤、
〔１０〕  ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一方の鎖が配列番号：１〜５、３１〜４０、４３〜６９のいずれかに記載の塩基配列からなる、〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤、
〔１１〕  〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌剤、
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法（癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法）、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する工程
（ｃ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物を選択する工程
〔１３〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法（癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法）、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１４〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法（癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法）、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１５〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法（癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法）、
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質の活性を測定する工程、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該タンパク質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１６〕  ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子が、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子である、〔１２〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法、
〔１７〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、〔１〕または〔６〕に記載のアポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法、
（ａ）〔１２〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングする工程、
（ｂ）該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程
を、提供するものである。なお、上記ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子は、好ましくは、ヒトＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子である。
本発明者らによって、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞（腫瘍細胞）においてアポトーシスが誘導されることが初めて見出された。従って、本発明はまず、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、アポトーシス誘導剤を提供する。本発明のアポトーシス誘導剤は、特に癌細胞に対して選択的にアポトーシス誘導作用を有する。即ち、本発明の好ましい態様においては、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現もしくは該遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする癌細胞選択的（特異的）なアポトーシス誘導作用を有する薬剤を提供する。
アポトーシスとは一般的に、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死を言う。アポトーシスの形態としては、例えば、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝集等が挙げられる。従って、本発明におけるアポトーシス誘導作用とは、例えば、細胞において上記のアポトーシスの形態を誘導する作用を指すが、必ずしも、上記の形態の誘導のみに限定されるものではない。当業者においては、細胞のアポトーシス誘導が起こっているか否かについて、適宜、判断することが可能である。
本発明の、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤は、例えば、アポトーシス誘導作用を機序とする抗癌剤（制癌剤）となるものと考えられる。
ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子（以下、単に「ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子」と記載する場合あり）としては、より具体的には、ＲｅｃＱ１遺伝子、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、ＲＴＳ遺伝子、ＲｅｃＱ５遺伝子等を挙げることができる。これら各遺伝子の塩基配列に関する情報は、当業者においては、公共の遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。上記遺伝子のＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号の一例を以下に示す。
ＲｅｃＱ１遺伝子：ＮＭ＿００２９０７（配列番号：６）、ＮＭ＿０３２９４１（配列番号：７）、ＢＣ００１０５２（配列番号：８）、Ｄ３７９８４（配列番号：９）、Ｌ３６１４０（配列番号：１０）
ＷＲＮ遺伝子：ＮＭ＿０００５５３（配列番号：１１）、ＡＦ０９１２１４（配列番号：１２）、Ｌ７６９３７（配列番号：１３）、ＡＬ８３３５７２（配列番号：１４）
ＢＬＭ遺伝子：Ｕ３９８１７（配列番号：１５）、ＮＭ＿００００５７（配列番号：１６）、ＢＣ０３４４８０（配列番号：１７）
ＲＴＳ遺伝子：ＮＭ＿００４２６０（配列番号：１８）、ＡＢ００６５３２（配列番号：１９）、ＢＣ０２０４９６（配列番号：２０）、ＢＣ０１１６０２（配列番号：２１）、ＢＣ０１３２７７（配列番号：２２）
ＲｅｃＱ５遺伝子：ＮＭ＿００４２５９（配列番号：２３）、ＡＫ０７５０８４（配列番号：２４）、ＡＢ００６５３３（配列番号：２５）、ＡＢ０４２８２５（配列番号：２６）、ＡＢ０４２８２４（配列番号：２７）、ＡＢ０４２８２３（配列番号：２８）、ＡＦ１３５１８３（配列番号：２９）、ＢＣ０１６９１１（配列番号：３０）
また、本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列についても、当業者においては、例えば、上記のアクセッション番号を基に、容易に取得することができる。本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例として、ＲｅｃＱ１遺伝子、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、ＲＴＳ遺伝子、ＲｅｃＱ５遺伝子のそれぞれの遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列表に示す（ＲｅｃＱ１タンパク質を配列番号：７０に、ＷＲＮタンパク質を配列番号：７１に、ＢＬＭタンパク質を配列番号：７２に、ＲＴＳタンパク質を配列番号：７３に、ＲｅｃＱ５タンパク質を配列番号：７４に示す）。
通常、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子は、塩基配列中の多型の有無等により、同一の遺伝子であっても複数のアクセッション番号が付与されている場合がある。この「多型」とは、一塩基の置換、欠失、挿入変異からなる一塩基多型（ＳＮＰｓ）に限定されず、連続する数塩基の置換、欠失、挿入変異も含まれる。従って、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の塩基配列としては、必ずしも上記のアクセッション番号によって取得される配列に限定されない。同様に、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、配列番号：７０〜７４に記載されたアミノ酸配列に特に限定されない。即ち、本発明の上記タンパク質は、配列番号：７０〜７４に記載されたアミノ酸配列に限定されず、該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸残基が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：７０〜７４のいずれかに記載されたタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。
本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子として、好ましくは、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子を好適に示すことができる。また、本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子は特に制限されるものではないが、通常、動物由来であり、より好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。
本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現を抑制する化合物としては、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子に対してＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡ干渉）効果を有する二本鎖ＲＮＡを好適に挙げることができる。一般的にＲＮＡｉとは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡおよびこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象を言う。ＲＮＡｉ機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、ＤＩＣＥＲといわれる酵素（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖ＲＮＡと接触し、二本鎖ＲＮＡがｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡまたはｓｉＲＮＡと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡには、このｓｉＲＮＡも含まれる。さらに、本発明の二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡもまた、本発明に含まれる。即ち本発明は、本発明の二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）を提供する。本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、通常、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製することができる。より具体的には、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
ＲＮＡｉのために使用されるＲＮＡは、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
本発明のＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡは、通常、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子のｍＲＮＡにおける連続する任意のＲＮＡ領域と相同な配列からなるセンスＲＮＡ、および該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである。上記「連続する任意のＲＮＡ領域」の長さは、通常２０〜３０塩基であり、好ましくは２１〜２３塩基である。しかしながら、そのままの長さではＲＮＡｉ効果を有さないような長鎖のＲＮＡであっても、細胞においてＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖ＲＮＡの長さは、特に制限されない。また、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子のｍＲＮＡの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖ＲＮＡを、例えば、予めＤＩＣＥＲで分解させ、その分解産物を本発明のアポトーシス誘導剤として利用することが可能である。この分解産物には、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）が含まれることが期待される。この方法によれば、ＲＮＡｉ効果を有することが期待されるｍＲＮＡ上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、ＲＮＡｉ効果を有するＲｅｃＱヘリカーゼｍＲＮＡ上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果が高いことが知られており、本発明の二本鎖ＲＮＡは、末端に数塩基のオーバーハングを有することが望ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さは特に制限されないが、好ましくは、２塩基のオーバーハングである。本発明においては例えば、ＴＴ（チミンが２個）、ＵＵ（ウラシルが２個）、その他の塩基のオーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡ（最も好ましくは１９塩基の二本鎖ＲＮＡと２塩基（ＴＴ）のオーバーハングを有する分子）を好適に用いることができる。本発明の二本鎖ＲＮＡには、このようにオーバーハングを形成する塩基がＤＮＡであるような分子も含まれる。
本発明の上記「ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ」は、当業者においては、該二本鎖ＲＮＡの標的となるＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の塩基配列は、上述のように公共の遺伝子データベースから容易に取得することがてきる。一例を示せば、配列番号：６〜３０のいずれかに記載の塩基配列を基に、本発明の二本鎖ＲＮＡを作製することができる。即ち、配列番号：６〜３０のいずれかに記載の塩基配列を基に、該配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、容易に行い得ることである。
また、本発明の二本鎖ＲＮＡの基となる遺伝子（標的遺伝子）の配列は、必ずしも遺伝子全長の塩基配列が判明している必要はない。選択すべき任意の連続するＲＮＡ領域（例えば、２０〜３０塩基）が判明していればよい。従って、ＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）等のようにｍＲＮＡの一部は判明しているが、全長が判明していない遺伝子断片からも、該断片の塩基配列を基に本発明の二本鎖ＲＮＡを作製することが可能である。以下に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、ヒトＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子と高い相同性を示したＥＳＴ配列のアクセッションナンバーを、各遺伝子名ごとに分けて記載する。但し、これらは多数存在するＥＳＴ配列のうちの一例に過ぎず、当業者においては、適切なＥＳＴ断片に関する情報を公共のデータベースから容易に取得することができる。
（ａ）ＲｅｃＱ１遺伝子：ＢＱ４３６７４３、ＡＵ１３０５０３、ＢＩ７５６１４３、ＢＱ９６２２１５．１｜ＢＱ９６２２１５、ＡＵ１１７５５７、ＢＱ０４９３７０、ＡＵ１２９３８７、ＢＱ８８２６７５、ＢＭ０１５３５７、ＢＧ３９２５４６、ＡＵ１３１００６、ＢＵ１９００８９、ＢＥ８７０１９５、ＢＭ７８６０４０、ＢＱ１８２９４３、ＡＵ１３８１５６、ＡＷ６２９７３７、ＣＡ４８９７２４、ＢＦ０３１４９４、ＡＡ２５８０５０、ＡＷ１４９４５８、ＢＧ１１３４７０、ＢＧ１７７９４４、ＡＶ７１８０９４、ＢＱ９５２３３３、ＢＱ６４７３４６、ＡＵ１２７８９７、ＡＡ８３００３５、ＢＱ２１５０７２、ＢＥ７０８５７８、ＢＭ４６７５９５、ＡＬ０４２３７５、ＡＡ２９８９２７、ＢＵ８５８６８０、ＣＢ１５８０１７、ＡＡ２９８８３５、ＢＧ５３６１７３、ＡＵ２８０７２４、ＢＵ１９４２９６、ＢＩ０９０８５８、ＢＧ１１８９４７、ＡＡ０７０９４３、ＢＧ５３０７２０、ＢＧ５２９４９２、ＡＷ５０５２１０、ＡＷ６７３１３１、ＢＥ８８８２９９、ＢＥ７９４３９２、ＣＡ３９４２５８、Ｚ３３４３９、ＢＸ０９３２３４、ＡＡ２９８９５１、ＡＡ４５９７７２、ＢＧ５４２２６９、ＢＦ３４４３２５、ＢＱ３５９６２９、ＣＡ３９６８３２、ＡＡ６７００４２、ＢＦ０６１７９７、ＡＩ６５２０５３、ＣＢ３０６５６６、ＣＢ１５５９６９、ＢＵ１６０７９０、ＢＭ２６３８５７、ＡＷ３３８７１９、ＡＩ８７２６０７、ＡＩ５６０１３９、ＣＡ４５００６６、ＣＡ３１０８３０、ＢＱ７７６６９１、ＢＭ９８０３６８、ＢＭ９７６６１５、ＢＦ４３６３５８、ＢＥ５０２８５１、ＡＷ８６４５６７、ＡＷ０５７６２９、ＡＩ６８５９４４、ＡＩ６７１５５８、ＡＩ６３６５１２、ＡＩ４７８３２０、ＡＩ４７４２１３、ＡＩ４３４８１２、ＡＩ２２３２９４、ＡＡ９６９３２６、ＡＡ９３９１７５、ＡＡ８８９３５７、ＡＡ８０４４５９、ＡＡ４５６５８５、ＡＡ２８７５５７、ＢＭ１５１２１９、ＡＩ２６１３２７、ＡＷ７７９５１９、ＡＷ８６７６４７、Ｔ７１９４１、ＢＩ５５９８１０、ＡＷ１８２５３１、ＢＥ２４６５２１、ＣＡ４５０２９９、ＣＡ３１１０１０、ＡＷ６７２７８８
（ｂ）ＷＲＮ遺伝子：ＡＷ９６５０９９、ＡＬ７０７５１０、ＡＬ７０９８３２、ＢＭ７８５８０３、ＢＧ７１４３２２、ＢＭ５５２３８１、ＢＦ１０３８４０、ＢＱ３０５６１３、Ｔ３９１２５、ＢＧ９９２９４８、ＢＱ３０５４０７、ＢＵ６３３３２２、ＣＢ１５６８６４、ＡＡ３４４２０１、ＡＡ３７３１５７、Ｗ４０３９３、ＡＡ２８７９８５、ＡＡ１９３２９６、ＡＡ１９３２８６、ＢＭ７２１７２１、Ｒ５８８７９、ＡＷ０１６５４８、ＡＩ２０３４９８、Ｈ８０４６１、ＡＡ８３５７８４、ＢＱ３５４５８５、Ｎ６４０５１、ＡＩ０２５６６９、ＡＷ１０２６８３、ＢＵ６８３７５８、ＡＡ９０５６３３、ＢＥ９３９９２９、ＡＩ４５７７１６、ＢＥ７８７９８５、ＡＡ７７８９２４、ＢＧ９４１８５０、ＢＱ７７４６１１
（ｃ）ＢＬＭ遺伝子：ＡＬ５５６８２３、ＡＬ５５６８５３、ＢＭ４５１９０３、ＢＩ０９１６０１、ＢＧ１９９１７９、ＢＩ０９１７７２、ＢＱ２３０２６２、ＢＧ７７２９７５、ＢＧ８７５９１７、ＢＭ５４２４６１、ＢＭ０４０９９３、ＢＥ６１８５０４、ＢＭ０４１６６１、ＢＧ５７４６６９、ＢＩ６６７０７１、ＢＥ５３８０９２、ＢＧ７２１５９６、ＡＷ５０２８９０、ＢＭ８０４１５７、ＣＢ２４３４３５、ＡＬ１２０８５８、ＢＸ１０６８０２、ＢＥ８８９５６０、ＢＱ３１６４３２、ＢＥ９６３５４９、ＡＩ３９４６０１、ＢＧ３９７４７７、ＢＧ７５６２６２、ＢＸ２８３８３９、ＡＩ０９７１８４、ＡＷ５０３８２９、ＡＷ４０４６５７、ＢＥ５３５９５０、ＡＡ７４７８３２、ＡＩ５９０５９９、ＡＷ５０４７０４、ＡＩ１１４８２０、ＡＡ９０４４８８、ＢＧ５３１５９３、ＢＥ２４５８０２、ＢＵ５８８７３６、ＢＱ３５９３０４、ＡＡ９７４７５６、ＢＥ７７８４８６、ＢＭ１５１８９２、ＡＡ７６９３３６、ＢＧ１９２５５４、ＢＧ１８７３２９、ＡＷ５７５５９５、ＡＡ２１４５４９、ＡＡ４８０２０９、ＡＩ４２３８７５、ＡＷ１７３１３９、ＡＩ６３０５２１、ＣＡ４８８９９４、ＡＡ８６２８０３、ＢＥ９４００５５、ＢＵ４３１３２１、ＡＡ２４９７３７、ＢＭ１５０６２８、ＡＷ１３８８１２、ＡＡ９０３５０４、ＢＥ２４５６６６、ＢＧ２１０８０６、ＢＧ１８５９１９、ＢＧ１８２９５５、Ｈ５３７６３、ＢＧ２１７６６１、ＡＡ８８７８１８、ＡＡ６４３１７７
（ｄ）ＲＴＳ遺伝子：ＡＬ５６１０２０、ＢＵ９０２９７１、ＣＡ４５４９９８、ＢＭ５５７６４３、ＢＵ９４４５７６、ＢＱ０６５０２７、ＢＱ６４９５７７、ＢＧ８２４６２８、ＢＱ０７２０１６、ＡＬ５８２３２６、ＢＵ１７３３５７、ＢＵ９０２９６９、ＢＥ５６０８４５、ＢＧ３８８１０２、ＢＧ３３７７５０、ＣＡ４８９２７２、ＢＭ７６３３７６、ＢＱ６４６６４７、ＢＵ９５７４４２、ＢＧ７５７０７４、ＢＥ５１４０６３、ＢＵ１７１５３０、ＢＱ２１８０７５、ＢＥ５１３５１９、ＢＥ３７９４８８、ＢＥ５１３７０９、ＢＱ６６８３５１、ＢＧ３３８１１４、ＢＱ８８３５３３、ＢＭ７２４５０３、ＢＭ８４９４１５、ＢＥ２９５９５１、ＢＩ４５７０５８、ＢＧ３９８２０９、ＢＭ６７９７２９、ＢＭ７９４１６７、ＢＭ８５３２５２、ＢＭ４６１５８４、ＢＥ４６６４０２、ＢＥ２８１２９３、ＢＥ３７８８４６、ＢＱ２１５８７９、ＢＭ８４７７８１、ＢＥ９０６７０１、ＢＸ１１６１５９、ＢＥ３４９６３４、ＢＧ３３７９１８、Ｈ１６８７９、ＢＧ３３９３７９、ＡＷ２３６５２７、ＢＭ８５４４９９、ＡＩ８５８２５５、ＢＧ９５４６６８、ＢＦ５１３１５０、ＢＭ１４４４６０、ＢＭ１４４５３７、ＡＩ８８６３８５、ＡＩ５９０７７６、ＢＭ８４８９３８、ＡＩ７６５１４９、ＣＡ４４９５７７、ＢＭ７６３６０７、ＡＡ７６８０４８、ＡＡ５９５２３９、ＢＵ７２９４５９、ＢＭ７０２９８３、ＡＩ８７２３３４、ＡＡ４０１１４６、ＢＦ９０９６０３、ＢＥ７９００２２、ＡＡ９８４９２７、ＢＭ７９６０１６、ＢＦ９３５８８２、Ｈ１６７７０、ＡＩ４７１２６２、ＡＡ６２７８５０、ＢＧ９９１５１３、ＢＦ８００２６９、ＢＸ０９５８５１、ＢＱ５７６０６９、ＢＧ０５９９７９、ＢＦ０００４９３、ＡＩ３４１０５０、ＡＩ２０６１２９、ＢＥ２４３５８９、ＡＷ３０４７６８、ＢＦ１１５６２８、ＢＥ８６９０８０、ＡＩ３６５１６７、ＢＱ６５１７１７、ＡＡ６２０４４６、ＢＧ８２２９５３、ＡＬ０４２１９３
（ｅ）ＲｅｃＱ５遺伝子：ＢＵ１８７４０６、ＢＩ９１６２５６、ＢＱ９５４２７５、ＢＱ９３２６５６、ＢＱ９２４９３１、ＢＧ７６２５６６、ＡＬ５２５３５１、ＢＱ３１６２６３、ＢＧ４２４８８８、ＢＧ７２１８００、ＢＱ０４９３３７、ＢＱ０６１２０５、ＢＱ０５９１９６、ＢＭ４４９６１２、ＢＭ４６９３６６、ＢＸ０９９９５３、ＣＢ２７０７２６、ＢＧ７６３２５４、ＢＵ４３１７４０、ＢＱ３７５１５３、ＢＦ９８２１７０、ＡＩ５６７０００、ＡＩ６７１９４０、ＣＢ１５５２１５、ＡＡ１５５８８２、ＢＩ７７２１９８、ＡＷ３６８８８２、ＢＱ３２２８６３、ＡＩ３１０２２９、ＢＦ８９６７１０、ＢＦ８９６７０９、ＢＦ１８２８５６、ＡＬ６００８５０、ＢＩ１９８３６４、ＢＩ２０００６６、ＡＡ１５５８３５、ＢＥ３１４２１６、ＢＥ３１３５７２、ＢＥ２６３１３４、ＢＥ２６１４５６、ＡＩ３６３２７５、ＡＩ２１８４６９、ＢＱ３１６２５６、ＡＷ６０５９３２、ＢＩ１１６４８３
即ち、本発明の好ましい態様においては、配列番号：６〜３０のいずれかに記載の遺伝子もしくは上記各ＥＳＴに対応するｍＲＮＡにおける、連続するＲＮＡ領域を一方の鎖とするＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ、を含むアポトーシス誘導剤を提供する。
上述のようにＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子には、同一の遺伝子であっても種々の多型が含まれている場合がある。当業者においては、配列番号：６〜３０のいずれかに記載の配列もしくは上記のＥＳＴ配列に対し、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子に関する公共の多型データベースからの情報を加味し、ＲＮＡｉ効果を有することが期待されるＲＮＡの配列を適宜設計することができる。このようなＲＮＡを含むアポトーシス誘導剤もまた本発明に含まれる。また、当業者においては、複数種作製された本発明の二本鎖ＲＮＡから、最適なＲＮＡｉ効果を有するＲＮＡを適宜選択してアポトーシス誘導剤とすることも可能である。
本発明の上記「ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡ」の具体例として、図１または図２中に記載された二本鎖ＲＮＡを好適に示すことができる。また、図３または配列表に記載の塩基配列を二本鎖ＲＮＡの一方の鎖とするｓｉＲＮＡ分子（配列番号：１〜５、３１〜４０、４３〜６９のいずれかに記載の塩基配列と、その相補鎖からなるｓｉＲＮＡ分子）を挙げることができる。即ち本発明の一つの態様としては、ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一方の鎖が配列番号：１〜５、３１〜４０、４３〜６９のいずれかに記載の塩基配列からなるｓｉＲＮＡ分子（配列番号：１〜５、３１〜４０、４３〜６９のいずれかに記載の塩基配列と、その相補鎖からなるｓｉＲＮＡ分子）を有効成分として含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明の好ましい態様としては、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の（ａ）または（ｂ）である、アポトーシス誘導剤を提供する。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
本発明における「核酸」とはＲＮＡまたはＤＮＡを意味する。特定の内在性遺伝子の発現を阻害（抑制）する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上著、新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、１９９３年、ｐ．３１９−３４７）。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用によりＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現を阻害してもよい。一つの態様としては、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。また臨床応用を考慮する場合、使用されるアンチセンス核酸は、通常、合成オリゴマーであり、ヌクレアーゼ分解に対する感受性を減らし、且つアンチセンス核酸としての活性を維持するために、リン酸エステル結合部のＯ（酸素）をＳ（硫黄）に置換したＳオリゴ（ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド）の利用が一般に知られている。このＳオリゴは現在ではアンチセンス薬として、直接患部に注入される臨床試験が行なわれている。本発明においてもこのＳオリゴを好適に使用することができる。アンチセンス核酸の配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。
また、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在し、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計も可能である。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５、２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、１９８８年、２２８、２２８．）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムが作出できる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８８年、２３９，２８５．、小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、１９９０年、３５，２１９１．、Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら著、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９８９年、１７，７０５９．）。
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ，ＪＭ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６年、３２３，３４９．）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．＆  Ｓａｓａｋｉ，Ｎ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９９１，１９，６７５１．、菊池洋，化学と生物，１９９２，３０，１１２．）。このように、リボザイムを用いて本発明におけるＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
さらに本発明は、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質（本明細書では、「ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質」と略記する場合あり）の機能（活性）を抑制する化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤に関する。
本発明のＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質には、該タンパク質のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の変異タンパク質もしくはホモログタンパク質であって、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで「機能的に同等なタンパク質」とは、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質における活性と同様の活性を備えたタンパク質である。あるいはＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質を、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すことができる。
本発明の好ましい態様においては、ＤＮＡヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質の機能（活性）を抑制する化合物が、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の化合物である、アポトーシス誘導剤を提供する。これらの化合物は、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の機能もしくは活性を阻害する（低下させる）ことにより、細胞、特に癌細胞に対してアポトーシス誘導作用を有するものと考えられる。
（ａ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリータンパク質変異体
（ｂ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
（ｃ）ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
上記（ａ）において「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼタンパク質変異体」とは、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質変異体を指す。例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリータンパク質のヘリカーゼドメインにおいて特に良く保存されている７つのヘリカーゼモチーフのうち、モチーフＩ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ）中に見られるリジン残基をアラニンやメチオニンに置換した変異体は、ＡＴＰ分解活性をもたないことが知られている。この変異体はドミナントネガティブ変異体として機能すると考えられている。従って、本発明のドミナントネガティブ変異体の具体例としては、上記のモチーフＩ中のリジン残基が置換した変異体を挙げることができる。
また上記（ｂ）のＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然もしくは組換えＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させたリコンビナントであるＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質若しくはその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
本発明の抗体は、本発明のＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質に結合し得るものであれば特に制限されず、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物等も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質の他に該タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とは通常、タンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。本発明の抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
ＲｅｃＱヘリカーゼファミリータンパク質と結合することが既に知られている化合物として、例えば、ＲｅｃＱ１ヘリカーゼ、ＷＲＮヘリカーゼ、ＢＬＭヘリカーゼ、ＲＴＳヘリカーゼ、ＲｅｃＱ５ヘリカーゼに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を挙げることができる。
本発明のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能（活性）を抑制する化合物は、天然または人工の化合物のいずれであってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得・単離可能な化合物である。例えば、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、糖などの単一化合物、あるいは、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等もしくは該抽出物から単離精製される化合物を挙げることができる。
ＲｅｃＱヘリカーゼファミリータンパク質の機能（活性）を阻害することが既に知られている化合物として例えば、ＷＲＮヘリカーゼおよびＢＬＭヘリカーゼに対する阻害作用を有するｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ  Ａ、ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ（Ｂｒｏｓｈ，Ｒ．Ｍ．Ｊｒ，Ｋａｒｏｗ，Ｊ．Ｋ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．Ｊ．，Ｓｈａｗ，Ｎ．Ｄ．，Ｈｉｃｋｓｏｎ，Ｉ．Ｄ．＆  Ｂｏｈｒ，Ｖ．Ａ．Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｍ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２４２０−２４３０．２０００）、ＷＲＮヘリカーゼおよびＢＬＭヘリカーゼに対する阻害作用を有する３，６，９−ｔｒｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ｌｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｅｓｚｋａ，Ａ．Ｐ．，Ｂｒｏｓｈ，Ｒ．Ｍ．Ｊｒ，Ｂｏｈｒ，Ｖ．Ａ．，Ｎｅｉｄｌｅ，Ｓ．＆  Ｈｉｃｋｓｏｎ，Ｉ．Ｄ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｍ’ｓ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｈｅｌｉｃａｓｅｓ  ｂｙ  Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０，１５１９４−１５２０２．２００１）、大腸菌ＲｅｃＱヘリカーゼに対する阻害作用を有するＮ−ｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｓｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸ（Ｗｕ，Ｘ．＆  Ｍａｉｚｅｌｓ，Ｎ．Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲｅｃＱ  ｈｅｌｉｃａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９，１７６５−１７７１．２００１）等を挙げることができる。
さらに、本発明は、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物のスクリーニング方法（癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のスクリーニング方法）を提供する。該方法によってスクリーニングされる化合物は、アポトーシス誘導作用を有するものと期待される。
その一つの態様は、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を指標とする方法である。通常、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合物は、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の機能を阻害する効果を有することが期待される。
本発明の上記方法においては、まず、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物を接触させる。ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドは、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドの精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはアフィニティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用いる被検化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
本方法においては、次いで、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合を検出する。ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合は、例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドに結合した被検化合物に付された標識によって検出することができる。また、細胞内または細胞外に発現しているＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質またはその部分ペプチドへの被検化合物の結合により生じる該タンパク質の活性の変化を指標として検出することも可能である。
本方法においては、次いで、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する被検化合物を選択する。
本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、糖などの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、人工作出化合物等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のスクリーニング方法の別の態様においては、まずＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。上記「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を発現する細胞」としては、内因性のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子を発現している細胞、または外来性のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子が導入され、該遺伝子を発現している細胞を利用することができる。外来性のＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子が発現した細胞は、通常、該遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。この発現ベクターは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。本発明のスクリーニング方法には、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子を発現する細胞として例えば、ＭＣＦ７（乳癌）、Ａ５４９（肺癌）、Ｕ２０Ｓ（骨肉腫）、Ｃ３３Ａ（子宮頚癌）、ＨＴ１０８０（繊維肉腫）、ＰＡ−１（卵巣の奇形癌）、Ｔｅｒａ２（胎生期癌）、Ｔ２４（膀胱癌）、Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）、Ｍｏｌｔ４（急性リンパ芽球性白血病）、Ａ１７２（神経膠芽細胞腫）、ＨｅＬａ（子宮頚癌）、ＨｅｐＧ２（肝癌）、Ｕ２５１（膠芽細胞腫）、ＵＡＣＣ６２（黒色腫）、Ｃａｋｉ−１（腎癌）、ＫＰ４（膵癌）、ＭＫＮ４５（胃癌）、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）等の各種腫瘍細胞を好適に使用することができる。
ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子を発現する細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
次いで本方法においては、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の発現レベルを測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子を発現する細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって、該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、ＲｅｃＱヘリカーゼファミリー遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより、該タンパク質の発現を検出し、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。例えば、上記の本発明の抗体を利用することも可能である。
本方法においては更に、被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、癌細胞においてアポトーシスを誘導する作用を有することが期待される。さらに、該化合物は、アポトーシス誘導を作用機序とする制癌剤（抗癌剤）となることが期待される。
本発明の方法の更に別の態様においては、本発明のＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現量を低下させるような化合物を、レポーター遺伝子を利用してスクリーニングする方法である。
本方法においては、まず、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「機能的に結合した」とは、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限されず、例えば、ＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等が挙げられる。「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」として、例えば、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するベクターが導入された細胞等が挙げられる。上記ベクターは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのＤＮＡ構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを添加したものを挙げることができる。
本方法における「接触」は、「ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該ＤＮＡを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができるが、これらの方法に限定されない。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより接触を行うことも可能である。
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物となる。
本発明の方法の別の態様においては、本発明のＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を指標として化合物をスクリーニングする方法である。
本方法においては、まずＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。次いで、該タンパク質の活性を測定する。該タンパク質の活性としては、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ＤＮＡ依存性ＡＴＰ分解活性等を挙げることができる。ヘリカーゼ活性とは、一般的に二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ解きほぐす活性を言う。このＤＮＡヘリカーゼ活性は、当業者においては公知の方法によって測定することが可能である。例えば、Ｍ１３ファージの一本鎖環状ＤＮＡに、放射線標識した相補的なオリゴＤＮＡをアニーリングさせて部分的に二本鎖構造をとったものを基質とし、ＡＴＰ及びマグネシウムイオン存在下で酵素と反応させ、次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはアガロースゲル電気泳動にて、反応産物を一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとに分離し、ラジオオートグラフィーにて検出する方法を挙げることができる。また、別の方法としては、ユーロピウムとＱｃｙ７でそれぞれ標識した互いに相補的な一本鎖ＤＮＡをアニーリングさせて二本鎖ＤＮＡとしたものを基質とし、ＡＴＰ及びマグネシウムイオン存在下で酵素と反応させ、次いでヘリカーゼ活性により二本鎖ＤＮＡから遊離したユーロピウム標識一本鎖ＤＮＡの蛍光を測定する方法が挙げられる。これら以外にも、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｓｓａｙ、Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｓｓａｙ、ＤＥＬＦＩＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｓｓａｙ（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｇ．，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．＆  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３，３１−３７．２００１）等がある。
また、上記ＤＮＡ依存性ＡＴＰ分解活性については、当業者においては公知の方法によって測定することが可能である。例えば、ＡＴＰを基質とし、プラスミドＤＮＡ或いはサケ精子ＤＮＡと、マグネシウムイオン存在下で酵素と反応させ、ＡＴＰをＡＤＰに分解するときに生じる無機リン酸をマラカイトグリーン法にて発色定量する方法等が挙げられる。
次いで、被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、ＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質の活性を低下させる化合物を選択する。上記方法に使用するＲｅｃＱヘリカーゼタンパク質は、変異を含まない全長タンパク質であることが好ましいが、該タンパク質と同等の活性を有するものであれば、一部のアミノ酸配列が置換および／あるいは欠失されたタンパク質であってもよい。
なお、上記スクリーニング方法におけるＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子は、ＷＲＮ遺伝子、ＢＬＭ遺伝子、またはＲｅｃＱ１遺伝子であることが好ましい。
また本発明は、本発明の癌細胞に対する（癌細胞特異的）アポトーシス誘導剤を有効成分として含有する抗癌剤（癌治療のための医薬組成物）を提供する。
さらに本発明は、アポトーシス誘導剤を医薬組成物として製造する方法を提供する。本方法においてはまず、本発明の上記スクリーニング方法によって、癌細胞に対するアポトーシス誘導剤のための候補化合物を選択する。次いで、選択された化合物を薬学上許容される担体と混合する。これら薬学上許容される担体として、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。
本発明の薬剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて上記担体を添加することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子によってコードされるタンパク質を発現するＤＮＡ、ＲｅｃＱＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を抑制するアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡを生体内に投与する場合、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。また、ＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子を抑制する合成アンチセンス核酸や合成ｓｉＲＮＡを生体内に投与する場合、リポソーム、高分子ミセル、カチオン性キャリアなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ法およびｅｘ  ｖｉｖｏ法を挙げることができる。
本発明には、アポトーシス誘導作用を有する上記の医薬組成物も含まれる。
本発明の薬剤または医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例にて用いたｓｉＲＮＡの塩基配列、またそれ以外に非常に強い遺伝子発現抑制が認められたｓｉＲＮＡの塩基配列を記載した図である。
図２は、図１の続きの図である。
図３は、実施例にて用いたＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭの高い遺伝子発現抑制能を示したｓｉＲＮＡの塩基配列を記載した図である。ＴＴはＤＮＡでオーバーハング領域、その他はＲＮＡで相補鎖と二重鎖を形成しているｓｉＲＮＡを示す。
図４は、ヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ１、ＲｅｃＱ５に対するｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞に導入し、７２時間後の各ｍＲＮＡの発現をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。
図５は、ＴＩＧ３細胞にＷＲＮ、ＢＬＭ、およびＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡを導入し、７２時間後のＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のｍＲＮＡの発現をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲにより半定量した結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。
図６は、ＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭに対するｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入し４８時間後の各遺伝子の発現量を半定量ＲＴ−ＰＣＲにより定量した結果を示す図である。ＮＳは非サイレンシングｓｉＲＮＡ処理を示す。
図７は、ｍＲＮＡの発現抑制が認められたＨｅＬａ細胞におけるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ１、ＲｅｃＱ５のタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析した結果を示す写真である。
図８上段は、ヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼのｓｉＲＮＡを、それぞれＨｅＬａ細胞に導入し、４日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイで調べた結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。下段はＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれＴＩＧ３細胞に導入し、４日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイで調べた結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。
図９は、ＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭの各ｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションして９６時間の時点で検出されたＨｅＬａ細胞の生存率を示す図である。非サイレンシングｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたときの細胞数を１００％としたときの細胞数を示す。
図１０は、Ａ５４９細胞にＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入し、７２時間後のＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のｍＲＮＡの発現をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲにより定量した結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。
図１１は、ｍＲＮＡの発現抑制が認められたＡ５４９細胞におけるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析した結果を表す写真である。
図１２は、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれＡ５４９細胞に導入し、４日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイで調べた結果を示すグラフである。ＮＳはコントロールＲＮＡである。
図１３は、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞に導入し４８時間後にアポトーシス誘導の有無をＴＵＮＥＬ法で検討した結果を示す写真である。各図左のグリーンはアポトーシスが誘導された核を、各図右は視野に存在する細胞の核を示す。
図１４は、サイレンシング性ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡの投与によるヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害について示した写真である。ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍（左上の写真）およびＮＳ−ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍（右上の写真）に関する接種３２日後の全体的な腫瘍サイズを示す写真である。下の写真は、マウスから摘出したＡ５４９腫瘍を示す。ＮＳ−ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍（ＮＳ）（上方）、ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡを注入した腫瘍（ＲｅｃＱ１）（下方）。
図１５は、ヌードマウスにおけるＡ５４９腫瘍の増殖に対するＷＲＮ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡの阻害効果の経時的推移について示すグラフである。
図１６は、腫瘍（Ａ５４９）を移植したヌードマウスにｓｉＲＮＡを投与した後、腫瘍切片を作成し、アポトーシス誘導の有無を、ＴＵＮＥＬ法にて検出した写真である。
Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＲｅｃＱ１及びＷＲＮは、それぞれＮＳ  ｓｉＲＮＡ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡ、ＷＲＮ  ｓｉＲＮＡを投与した像である。赤褐色はアポトーシスが誘導された核を、青紫は誘導されていない核を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
〔実施例１〕  細胞培養
ヒト細胞として、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部癌細胞）、Ａ５４９（ヒト肺癌細胞）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌細胞）、ＴＩＧ３（正常二倍体線維芽細胞）、Ｕ２０Ｓ（骨肉腫）、ＨｅｐＧ２（肝癌）、Ｕ２５１（膠芽細胞腫）、ＵＡＣＣ６２（黒色腫）、Ｃａｋｉ−１（腎癌）、ＫＰ４（膵癌）、ＭＫＮ４５（胃癌）、ＬＮＣａＰ（前立腺癌）を使用した。すべてのヒト細胞は１０％牛胎児血清、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍで３７度、５％ＣＯ２条件下で培養した。
〔実施例２〕  ヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼの発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす影響の検討
ヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼそれぞれの発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす影響を検討する目的で、ヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼＷＲＮ、ＢＬＭ、−ＲＴＳ、ＲｅｃＱ１、ＲｅｃＱ５に対するｓｉＲＮＡをＥｌｂａｓｈｅｒらの方法（Ｅｌｂａｓｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８（２００１）．）を用いて設計した。ｓｉＲＮＡの合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社およびＱＩＡＧＥＮ社において行った。
選定したｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの基となった合成配列（小文字の領域は基となったＲｅｃＱ  ＤＮＡファミリー遺伝子のｍＲＮＡと相同部分を表す）、および、非常に強い遺伝子発現抑制が認められたｓｉＲＮＡ配列を図１および図２に示す。なお、配列表にはセンス鎖のみ記載し、対応するアンチセンス鎖は配列表から省略した。
これらｓｉＲＮＡをヒト子宮頸部癌由来ＨｅＬａ細胞、および正常細胞である胎児胚由来の線維芽細胞ＴＩＧ３細胞に導入した。ｓｉＲＮＡの導入においては、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行う２４時間前に、細胞を１〜３×１０４個／ウェルの密度で２４ウエルプレートに播種し、２０−５０％コンフレントの状態でトランスフェクションを行った。各細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、プレーティングから２４時間後に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、方法については製造者のプロトコールに従って行った。ｓｉＲＮＡをトランスフェクション後、４８時間および７２時間の細胞から、それぞれＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。定量的ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＲｅｃＱヘリカーゼ遺伝子群および、β−アクチン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーおよび、ＴａｑＭａｎプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。ＲＴ−ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を使い、そのマニュアルに従い行った。β−アクチンを標準として用いて、定量比較した。
コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入した細胞における各ｍＲＮＡの発現を１００％として、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞における各ｍＲＮＡの発現を比較した。ＮＳ−ｓｉＲＮＡは、５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（配列番号：４１／ｄＴｄＴはＴＴに変換して配列表に記載）および５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ−３’（配列番号：４２／ｄＴｄＴはＴＴに変換して配列表に記載）の２本鎖から形成されたｄｕｐｌｅｘである。
その結果、７２時間培養後のＨｅＬａ細胞においてＷＲＮでは２％、ＢＬＭでは１５％、ＲＴＳでは０％、ＲｅｃＱ１では０％、ＲｅｃＱ５では７％にまでそれぞれのｍＲＮＡを抑制するｓｉＲＮＡを得た（図４）。一方、ＴＩＧ３細胞ではＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｍＲＮＡの発現ｍＲＮＡの発現はそれぞれ１％、０％、９％にまで抑制されており、コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入したＴＩＧ３細胞におけるこれらのｍＲＮＡの発現と比較して顕著に抑制されていた（図５）。
そこでさらに本発明者らは、ヒトの３種類のＲｅｃＱヘリカーゼＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭに対するｓｉＲＮＡを同様に設計し、ＲｅｃＱ１については１４種類、ＷＲＮについては１１種類、ＢＬＭについては７種類選定した。選定された配列には、既に上記した配列も含まれる。これらの選定したｓｉＲＮＡ配列を図３に示す。なお配列表にはセンス鎖のみ記載し、対応するアンチセンス鎖は配列表から省略した。
これらｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に導入した。導入４８時間後のＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭ遺伝子の発現を半定量ＲＴ−ＰＣＲにより定量した。非サイレンシングｓｉＲＮＡを処理したとき（ＮＳ）の遺伝子発現を１００％として、各ｓｉＲＮＡを導入した場合の発現量を比較した。
その結果、ＲｅｃＱ１で１４種類すべて、ＷＲＮ３、４、６、１２で９０％以上の遺伝子抑制効果を示し、ＢＬＭ２、３、４、５、７では８０％以上の遺伝子の発現抑制を示すｓｉＲＮＡが得られた（図６）。
ｍＲＮＡの発現抑制が認められたＨｅＬａ細胞におけるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ１、ＲｅｃＱ５のタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、４８時間および７２時間経過した細胞をそれぞれ回収して、ＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，０．１％ＳＤＳ，１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）にて細胞を破砕した。抽出タンパク質を４−２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜（ＰＶＤＦ膜）に転写した。一次抗体としてＲｅｃＱ１、ＢＬＭに対してはポリクローナル抗体を、ＷＲＮ、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ５に対してはモノクローナル抗体、さらにβ−アクチンに対する抗体（ＩＣＮ）を用いた。二次抗体にはペルオキシダーゼ標識した抗体を使用し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた化学発光により検出した。
結果、個々のヘリカーゼタンパク質が各ヘリカーゼに対して特異的な抗体によって検出された。コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入した細胞における発現と比較して、タンパク質レベルにおいてもこれら遺伝子産物の発現が抑制されていることを確認した（７２時間培養の場合）（図７）。
〔実施例３〕  ＨｅＬａ細胞およびＴＩＧ３細胞の生存率
実施例２で選定したヒト５種類のＲｅｃＱヘリカーゼのｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞およびＴＩＧ３細胞に導入し、９６時間後の生細胞数をミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩ＷＳＴ−８の切断に基づく細胞生存度の比色アッセイにより、生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク）を用いて測定した。試薬の添加から３時間後にホルマザン色素の吸光度を４５０ｎｍで測定した。
結果、コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入したＨｅＬａ細胞における生存率を１００％とした場合、ＲＴＳ、ＲｅｃＱ５  ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞の生存率はそれぞれ９６％、９４％で、生存率に大きな影響は認められなかった。一方、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞の生存率はそれぞれ１０％、２８％、５％で、ＨｅＬａ細胞の顕著な生存率の低下が認められた（図８上段）。これに対して、ＴＩＧ３細胞はＮＳ−ｓｉＲＮＡを導入した細胞とほぼ同程度の生存率を示した。ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡを導入した細胞の生存率はそれぞれ８５％、７６％、７８％であり、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡ導入によるＴＩＧ３細胞の顕著な生存率の低下は認められなかった（図８下段）。これらの結果は、ＨｅＬａ細胞の生存率がＷＲＮ、ＢＬＭおよびＲｅｃＱ１の発現抑制によって低下する一方、ＴＩＧ３細胞の生存率には重大な影響はないことを示している。
さらに本発明者らは、新たに設計したＲｅｃＱ１、ＷＲＮ、ＢＬＭに対するｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞に導入し、９６時間後の細胞生存率をＭＴＴアッセイで調べた。ｓｉＲＮＡは図３に示したものを用いた。
結果、コントロールである非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ＮＳ）を処理したときの細胞数を１００％とした場合、ＲｅｃＱ１−９が２０％、ＷＲＮ４が５％、ＢＬＭ２が７％にまで生存率を低下させた（図９）。
〔実施例４〕  ｓｉＲＮＡのＡ５４９細胞増殖に及ぼす影響
上記実施例３でＨｅＬａ細胞の増殖に影響の認められたＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１の３つのｓｉＲＮＡがヒト肺癌由来Ａ５４９細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。Ａ５４９細胞にＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれ導入し７２時間後のＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のｍＲＮＡの発現をＴａｑｍａｎ  ＰＣＲにより定量した。コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入した細胞における各ｍＲＮＡの発現を１００％として、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞における各ｍＲＮＡの発現を比較したところ、ＷＲＮでは８％、ＢＬＭでは２１％、ＲｅｃＱ１では４％にまでそれぞれのｍＲＮＡを抑制することが確認された（図１０）。
また、ｍＲＮＡの発現抑制が認められたＡ５４９細胞におけるＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１のタンパク質の発現をウエスタンブロットにより解析し、コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入した細胞における発現と比較して、タンパク質レベルにおいてもこれら遺伝子産物の発現が抑制されていることを確認した（図１１）。
〔実施例５〕  Ａ５４９細胞の生存率
これらのｓｉＲＮＡをそれぞれＡ５４９細胞に導入し、４日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイで調べた結果、コントロールＲＮＡ（ＮＳ）を導入した細胞における生存率を１００％とした場合、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡを導入した細胞の生存率はそれぞれ３６％、６０％、３２％で、Ａ５４９細胞の顕著な生存率の低下が認められた（図１２）。
〔実施例６〕  ｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞におけるアポトーシス誘導効果
上記ｓｉＲＮＡ導入細胞における生存率の低下がアポトーシスによるものかどうかを調べた。ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡをそれぞれＨｅＬａ細胞に導入し４８時間後に、ｉｎ  ｓｕｉｔｅ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を製造者のプロトコールに従って用いてアポトーシス誘導の有無をＴＵＮＥＬ法で検討した。
結果、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１  ｓｉＲＮＡがそれぞれ導入されたＨｅＬａ細胞では、顕著にアポトーシスの誘導が認められた。一方、コントロールＲＮＡ（ＮＳ）が導入されたＨｅＬａ細胞ではアポトーシスの誘導は認められなかった（図１３）。またＴＩＧ３細胞も同じ条件下で、アポトーシス誘導を示さなかった。
〔実施例７〕  各種細胞におけるアポトーシス誘導効果
ＨｅＬａ細胞に対するＷＲＮ−ｓｉＲＮＡ、ＢＬＭ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡのアポトーシス誘導作用が、腫瘍細胞特異的であるのか、他の腫瘍細胞株でも起こるか否かを明らかにするために、本発明者らは種々の腫瘍に由来する１１種類の腫瘍細胞株（ＨｅＬａ、Ａ５４９（肺癌）、ＭＣＦ７（乳癌）、ＨｅｐＧ２（肝癌）、Ｕ２０Ｓ骨肉腫）、Ｕ２５１（膠芽細胞腫）、ＵＡＣＣ６２（黒色腫）、Ｃａｋｉ−１（腎癌）、ＫＰ４（膵癌）、ＭＫＮ４５（胃癌）およびＬＮＣａＰ（前立腺癌））を用いてｓｉＲＮＡのアポトーシス誘導効果について、実施例６と同様に検討した。結果、いくつかの癌細胞においてアポトーシスを誘導するが、正常細胞にはアポトーシスを誘導しないことを確認した。
なお実施例６および実施例７において、ｓｉＲＮＡのアポトーシス誘導効果について検討した結果を表１にまとめた。
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上記表中、＋＋−はアポトーシス誘導細胞が７０％以上、＋＋は７０〜４０％、＋は４０〜２０％であることを示す。
以上の１１種類の全ての腫瘍細胞株は、ｓｉＲＮＡと腫瘍細胞株の組み合わせによる程度の差はあるものの、３種類のＲｅｃＱヘリカーゼのｓｉＲＮＡに感受性を有していた。トランスフェクション効率を考慮する場合には、個々のｓｉＲＮＡの腫瘍細胞に対する効果を、さらに厳密に評価しなければならないが、強調すべきなのは、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡ、ＢＬＭ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡは、幅広い種類の腫瘍に対して有効であるため優れた抗腫瘍薬候補となる点である。また、ＷＲＮヘリカーゼ、ＢＬＭヘリカーゼおよびＲｅｃＱ１ヘリカーゼは、抗腫瘍薬スクリーニングに用いるツールとしても有望である。
〔実施例８〕  担癌動物モデルにおけるｓｉＲＮＡによる腫瘍紬胞の増殖阻害
本発明者らは、インビトロにおけるＲｅｃＱヘリカーゼｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞の選択的な増殖阻害が、インビボにおける担癌動物モデルでも起こるか否かを検証した。
雄性ＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウスは日本クレア（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ）から購入した。Ａ５４９細胞（５×１０６個／０．１ｍｌ）をヌードマウス（６〜７週齢）の背部に皮下注射し、ｓｉＲＮＡの投与は腫瘍細胞の皮下注射後８日目に開始した。
ヌードマウスの背部に生着させたＡ５４９腫瘍に対するＷＲＮ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡの腫瘍抑制効果の試験を行った（図１４および図１５）。５’−リン酸化型の２５μｇ  ｓｉＲＮＡを５０μｌの生理食塩水中にて５μｇのポリエチレンイミン（分子量１０，０００、Ｗａｋｏ）と混合し、Ａ５４９細胞接種後８日間で形成された固形腫瘍（体積約４０ｍｍ３）の最上部に３日毎（８、１１、１４、１７、２０、２３、２７および３２日目）に皮下注射した。腫瘍体積はノギスによって測定した。楕円体の腫瘍体積を推定するための式は、Ｌ×Ｗ２／２とした。ここでＬは腫瘍の長径であり、Ｗは短径である。多重比較法（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法）を用いることにより、腫瘍体積を統計学的有意性に関して解析した。
その結果、ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡは接種後３２日間にわたりＡ５４９腫瘍の発生を著しく抑制したが、ポリエチレンイミンと同様に混合したＮＳ−ｓｉＲＮＡは効果がなく、Ａ５４９腫瘍の体積は増加した（図１４）。ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡおよびポリエチレンイミンの混合物を投与したマウスは、未処理担癌マウスと比較して体重減少は認められず、この処置に重要な副作用はないことが示された。
これらの結果を受けて、ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡに加えて他のｓｉＲＮＡ、すなわちＷＲＮ−ｓｉＲＮＡのインビボでの有効性を、より多くのマウス（各ｓｉＲＮＡの試験につきＮ＝６）を用いて、腫瘍体積を５０日間にわたって定期的に測定し、その平均腫瘍体積をプロットして検討した。ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡおよびＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡは、図１４に関する説明の通りにポリエチレンイミン担体とともに固体ごとに投与した。この薬物担体およびｓｉＲＮＡ自体の有害作用を調べるために、上記と同様の条件でポリエチレンイミンとＮＳ−ｓｉＲＮＡを懸濁したものを対照として用いた。
図１５は、ＮＳ−ｓｉＲＮＡ（ＰＥＩ／ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して５０日目においてＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡが腫瘍体積の増加を約８０％効率的に阻止し（Ｐ＜０．０１）、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡは約５０％阻止（Ｐ＜０．０５）したことをあきらかにしている。
また、ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡおよび、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡを投与した固形腫瘍組織において、アポトーシスの誘導の有無を検証した。ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡおよび、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡ投与後、２３日目の腫瘍組織を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド固定液で固定後、１０％中性緩衝ホルマリン固定液にて再固定した。５日間固定後、十分に水洗し自動包埋装置にてパラフィン包埋した。その後、約２μｍのパラフィイン切片を作製し、ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を用いてアポトーシスの検出を行なった。その結果、ＮＳ−ｓｉＲＮＡと比較して、ＲｅｃＱ１−ｓｉＲＮＡおよび、ＷＲＮ−ｓｉＲＮＡを投与した固形腫瘍組織において有意にアポトーシス陽性細胞が観察された（図１６）。
【産業上の利用の可能性】
本発明のＲｅｃＱ  ＤＮＡヘリカーゼファミリー遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する化合物は、癌細胞選択的なアポトーシス誘導作用を有する。該化合物を含む医薬は、アポトーシス誘導作用を機序とする副作用の少ない抗癌剤となるものと考えられる。本発明によって、ＲｅｃＱヘリカーゼを標的としたアポトーシス誘導作用を機序とする抗癌剤が初めて提供された。
ある化合物についてアポトーシス誘導作用を有することが分かった場合であっても、正常細胞に対するアポトーシス誘導作用の有無が不明な化合物は、医薬品として使用することは難しい。該化合物が正常細胞においてもアポトーシス誘導作用が見られる場合、副作用の危険を伴うからである。即ち、アポトーシス誘導作用が癌細胞特異的なものでなければ、実際に医薬品として使用することは、通常困難である。本発明の薬剤（化合物）は、アポトーシス誘導作用が癌細胞特異的である点で、非常に実用的かつ実効性の高い薬剤であると言える。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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