(57)【要約】キャスペース−１によりＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）が切断されて分解することおよびその切断認識部位を見出したことに基づいて、ＸＩＰの分解阻害、より具体的にはキャスペース−１によるＸＩＰの分解阻害、ＸＩＰの分解に基づく疾患の予防および／または治療、Ｂ型肝炎ウイルスの複製および／または転写の阻害、Ｂ型肝炎の予防および／または治療、並びにＢ型肝炎ウイルスによる肝癌の予防および／または治療のための手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項２】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製および／または転写の阻害剤。
【請求項３】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とする、抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）剤。
【請求項４】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とする、Ｂ型肝炎の予防剤および／または治療剤。
【請求項５】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とする、肝癌の予防剤および／または治療剤。
【請求項６】
配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項７】
配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するペプチド。
【請求項８】
請求の範囲第６項または第７項に記載のペプチドを含んでなるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）分解阻害剤。
【請求項９】
請求の範囲第６項または第７項に記載のペプチドを含んでなり、キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害することを特徴とするＸＩＰ分解阻害剤。
【請求項１０】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項１２】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製および／または転写の阻害剤。
【請求項１３】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなる抗Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）剤。
【請求項１４】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなるＢ型肝炎の予防剤および／または治療剤。
【請求項１５】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を含んでなる肝癌の予防剤および／または治療剤。
【請求項１６】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）を阻害する工程を含むＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解阻害方法。
【請求項１７】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の切断を阻害する工程を含むＸＩＰの分解阻害方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１６項または第１７項に記載の阻害方法を用いることを特徴とするＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解に基づく疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１６項または第１７項に記載の阻害方法を用いることを特徴とするＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製および／または転写の阻害方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１６項または第１７項に記載の阻害方法を用いることを特徴とするＢ型肝炎の予防方法および／または治療方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１６項または第１７項に記載の阻害方法を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および／または治療方法。
【請求項２２】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を用いることを特徴とするＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解に基づく疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項２３】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を用いることを特徴とするＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製および／または転写の阻害方法。
【請求項２４】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を用いることを特徴とするＢ型肝炎の予防方法および／または治療方法。
【請求項２５】
請求の範囲第８項または第９項に記載の阻害剤を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および／または治療方法。
【請求項２６】
Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＸＩＰの切断を可能にする条件下、Ｃａｓｐａｓｅ−１および／またはＸＩＰを化合物と接触させ、ついでＸＩＰの分解を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、該化合物がＸＩＰの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項２７】
Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）の分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＸＩＰの切断を可能にする条件下、Ｃａｓｐａｓｅ−１および／またはＸＩＰを化合物と接触させ、ついでＸＩＰ量またはＸＩＰ分解物量の存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、該化合物がＸＩＰの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項２８】
請求の範囲第２６項または第２７項に記載の同定方法により同定された化合物。
【請求項２９】
キャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）、Ｃａｓｐａｓｅ−１をコードするポリヌクレオチドおよびＣａｓｐａｓｅ−１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（ＸＩＰ）、ＸＩＰをコードするポリヌクレオチドおよびＸＩＰをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｘ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＸＩＰと略称することがある）の分解阻害、より具体的にはキャスペース−１（Ｃａｓｐａｓｅ−１）によるＸＩＰの分解阻害、ＸＩＰの分解に基づく疾患の予防および／または治療、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＢＶと略称することがある）の複製および／または転写の阻害、Ｂ型肝炎の予防および／または治療、並びにＨＢＶに起因する肝癌の予防および／または治療のための手段に関する。
【背景技術】  キャスペース−１は広く組織に分布するシステインプロテアーゼであり、炎症性サイトカインの産生やアポトーシスの誘導に関与する。細胞質内では不活性体（プロ体）として存在し、細胞内外の刺激により活性体へと変換される。最近、Ｄ型肝炎ウイルスの感染と、キャスペース−１の発現量との相関が報告されている（非特許文献１）。
肝炎を引き起こす肝炎ウイルスはＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型の５つのゲノムタイプに類別される。最近では、Ｆ型やＧ型の存在も知られるようになってきている。
Ｂ型肝炎ウイルスは、急性肝炎および慢性肝炎を引き起こす（非特許文献２）。さらに、慢性的なＨＢＶ感染による慢性Ｂ型肝炎は肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）へ進展することが知られている（非特許文献３）。肝細胞癌は、原発性肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）の中で最も多く見られる癌であり、肝癌の約９割を占める。Ｂ型肝炎の肝細胞癌への進展のメカニズムには、ＨＢＶ遺伝子由来の蛋白質、例えばＢ型肝炎ウイルスｘ蛋白質（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＨＢｘと略称することがある）の関与が報告されている。
ＨＢｘは、ＤＮＡ結合領域を持たないが、転写因子と相互作用することにより、様々なウイルスプロモーターや細胞のプロモーターのトランス作用因子として働く（非特許文献４）。すなわち、ＨＢｘはこれらプロモーターの転写活性を促進する。具体的には、ＨＢｘが、ＨＢＶ由来の遺伝子の発現を増強し、ＨＢＶの複製を促進することが報告されている（非特許文献５）。また、ＨＢｘが、細胞増殖に関する細胞内情報伝達経路を活性化することが知られている。このようにＨＢｘは、遺伝子の転写調節等の作用により、肝臓の発癌に関与すると考えられる（非特許文献４）。
一方、ＸＩＰは、ＨＢｘと結合する因子として肝細胞癌由来のｃＤＮＡライブラリーから発見され、ＨＢｘのＨＢＶ複製促進作用を抑制することが報告されている（非特許文献６）。
以下に本明細書で引用した文献を列記する。
非特許文献１：ジアン（Ｊｉａｎｇ  Ｙ．）ら、「Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｇａｎ  Ｚａｎｇ  Ｂｉｎｇ  Ｚａ  Ｚｈｉ．」、２００１年、第９巻、増刊：ｐ．９−１１。
非特許文献２：シーガー（Ｓｅｅｇｅｒ  Ｃ．）ら、「マイクロバイオロジー  アンド  モレキュラーバイオロジーレビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２０００年、第６４巻、ｐ．５１−６８。
非特許文献３：ビースレイ（Ｂｅａｓｌｅｙ  ＲＰ．）ら、「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）」、１９８１年、第２巻、ｐ．１１２９−１１３３。
非特許文献４：ラブ（Ｒａｂｅ  Ｃ．）ら、「ダイジェスティブ  ディジージィズ（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、２００１年、第１９巻、ｐ．２７９−２８７。
非特許文献５：ゼンミン（Ｚｈｅｎｍｉｎｇ  Ｘｕ  ＴＳ）ら、「ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第７６巻、ｐ．２５７９−２５８４。
非特許文献６：メレガリ（Ｍｅｌｅｇａｒｉ  Ｍ．）ら、「ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第７２巻、ｐ．１７３７−１７４３。
非特許文献７：ウルマー（Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
非特許文献８：「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、１９７５年。
非特許文献９：「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（米国）、インターサイエンス、１９９６年。
【発明の開示】
本発明においては、キャスペース−１と相互作用する蛋白質を見出し、キャスペース−１による当該蛋白質の分解に基づく疾患の予防手段および／または治療手段を提供すべく種々の検討を重ねた。
そして、キャスペース−１がＸＩＰと相互作用することをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。さらに、キャスペース−１によりＸＩＰが切断され分解されることを実験的に明らかにし、キャスペース−１によるＸＩＰの切断部位を見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とする、ＸＩＰの分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
また、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とする、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とする、抗ＨＢＶ剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とする、Ｂ型肝炎の予防剤および／または治療剤に関する。
また、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とする、肝癌の予防剤および／または治療剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるペプチドに関する。
さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に記載のアミノ酸配列を含有するペプチドに関する。
また、本発明の一態様は、上記ペプチドを含んでなるＸＩＰ分解阻害剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記ペプチドを含んでなり、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害することを特徴とするＸＩＰ分解阻害剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる医薬組成物に関する。
また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなるＸＩＰの分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなるＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる抗ＨＢＶ剤に関する。
また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなるＢ型肝炎の予防剤および／または治療剤に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を含んでなる肝癌の予防剤および／または治療剤に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、キャスペース−１を阻害する工程を含むＸＩＰの分解阻害方法に関する。
また、本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を阻害する工程を含むＸＩＰの分解阻害方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とするＸＩＰの分解に基づく疾患の予防方法および／または治療方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とするＨＢＶの複製および／または転写の阻害方法に関する。
また、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とするＢ型肝炎の予防方法および／または治療方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害方法を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および／または治療方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とするＸＩＰの分解に基づく疾患の予防方法および／または治療方法に関する。
また、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とするＨＢＶの複製および／または転写の阻害方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とするＢ型肝炎の予防方法および／または治療方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記分解阻害剤を用いることを特徴とする肝癌の予防方法および／または治療方法に関する。
また、本発明の一態様は、ＸＩＰの分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を可能にする条件下、キャスペース−１および／またはＸＩＰを化合物と接触させ、ついでＸＩＰの分解を検出することができるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、該シグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、該化合物がＸＩＰの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ＸＩＰの分解阻害剤の同定方法であって、キャスペース−１によるＸＩＰの切断を可能にする条件下、キャスペース−１および／またはＸＩＰを化合物と接触させ、ついでＸＩＰ量またはＸＩＰ分解物量の存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、該化合物がＸＩＰの分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
さらにまた、本発明の一態様は、上記同定方法により同定された化合物に関する。
また、本発明の一態様は、キャスペース−１、キャスペース−１をコードするポリヌクレオチドおよびキャスペース−１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、ＸＩＰ、ＸＩＰをコードするポリヌクレオチドおよびＸＩＰをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＸＩＰ（配列番号１）のキャスペース−１による切断認識部位を示す図である。アミノ酸配列は１文字表記し、切断部位は「／」で示した。
第２図は、キャスペース−１（ＣＡＳＰ１）とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用をインシリコで予測した結果を示す図である。キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の間でローカルアライメントを行い、高いスコア（ｓｃｏｒｅ）を示した領域を図示した。アミノ酸配列は１文字表記した。（実施例１）
第３図は、キャスペース−１が、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とＸＩＰ（配列番号１）の融合蛋白質（ＧＳＴ−ＸＩＰ）を切断したが、ＧＳＴは切断しなかったことを示す図である。図中の「＋」および「−」はそれぞれ、キャスペース−１の有無を示す。各矢印は、図示したように、ＧＳＴ−ＸＩＰまたはＧＳＴを示す。矢頭は、ＧＳＴ−ＸＩＰがキャスペース−１により切断され分解されて生じた断片を示す。（実施例２）
第４図は、ＧＳＴとＸＩＰ（配列番号１）の融合蛋白質（ＧＳＴ−ＸＩＰ）がキャスペース−１により切断されて生じる高分子量側の断片および／または低分子量側の断片が、ＸＩＰ変異体とＧＳＴの融合蛋白質〔ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ３９Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ５８Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ７０Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ）〕がキャスペース−１により切断されて生じた断片中に見出されたことを示す図である。また、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ）の断片には、上記断片を示す２つのバンド以外に、別な断片を示すバンドが検出された。このバンドは、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ，Ｄ８０Ａ）の断片には検出されなかった。図中の「＋」および「−」はそれぞれ、キャスペース−１の有無を示す。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第２００３−０４５７１１号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により通常に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されていると見なす。
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示に過ぎず、本発明を何ら限定しない。
本発明においては、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）が相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号公報記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、キャスペース−１がＸＩＰ（配列番号１）を切断し分解することを初めて明らかにした。
ＸＩＰ（配列番号１）のアミノ酸配列において、キャスペース−１による切断認識配列は、ＨＬＥＤ／Ｔ（配列番号２）、ＬＣＴＤ／Ｓ（配列番号３）、ＴＬＳＤ／Ｅ（配列番号４）、ＬＴＳＤ／ＰＴＤ／Ｉ（配列番号５）、ＬＥＳＤ／Ｎ（配列番号６）およびＱＫＨＤ／Ｇ（配列番号７）であると予想された（図１参照）。ここで、アミノ酸配列は１文字表記により記載した。アミノ酸配列中の「／」は切断部位を表わす。また、キャスペース−１による切断認識配列とは、キャスペース−１により認識される配列であって切断される部位を含む配列を意味する。
ＸＩＰ（配列番号１）は、ＨＢｘと結合してそのＨＢＶ複製促進作用を抑制することが知られている（非特許文献６）。ＨＢｘは、ＨＢＶ複製促進作用の他に、様々なウイルスプロモーターや細胞のプロモーターの転写活性を促進すること、および細胞増殖に係わる細胞内情報伝達経路を活性化することが知られている。これらから、ＸＩＰ（配列番号１）は、ＨＢｘに結合してその作用を抑制することにより、ウイルス、例えばＨＢＶの複製および／または転写や、細胞の異常な増殖を抑制する防御因子であると考えられる。
発明者らは、キャスペース−１によりＸＩＰ（配列番号１）が切断されて分解し、その結果、ＨＢｘの作用の抑制が解除され、それによりウイルス、例えばＨＢＶの複製および／または転写や、細胞の異常な増殖が引き起こされると考えた。例えば、Ｂ型肝炎の発症および進行、並びに肝癌への進展のメカニズムにおいて、キャスペース−１がＸＩＰ（配列番号１）を分解して切断することにより、ＸＩＰ（配列番号１）のＨＢＶ複製抑制作用が解除されるという経路が存在すると考えられる。
したがって、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することにより、例えば、ＨＢｘの作用の抑制が可能になり、その結果ＨＢＶの複製および／または転写や細胞の異常な増殖の抑制が可能になる。さらには、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患の予防および／または治療が可能になる。具体的には、例えば、Ｂ型肝炎の発症および進行、並びに肝癌への進展を阻害することが可能になる。
これら知見に基づいて達成した本発明の一態様は、ＸＩＰ分解阻害剤に関する。上記ＸＩＰ分解阻害剤は好ましくは、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することを特徴とする。
ここでＸＩＰ（配列番号１）の分解とは、ＸＩＰ（配列番号１）のペプチド結合がそのアミノ酸配列のある箇所で切断され、その結果、ＸＩＰ（配列番号１）が断片化されることをいう。また、阻害剤とは、ある機能に対して阻害効果を奏する化合物（後述する例として競合阻害効果を有するペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）あるいは該化合物を含む組成物をいう。すなわち、ＸＩＰ分解阻害剤とは、ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する効果を奏する化合物あるいは該化合物を含む組成物を意味する。
本発明に係る分解阻害剤は、ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物、好ましくはキャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害する化合物を含んでなる。より好ましくは、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を特異的に阻害する化合物を含んでなる。キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を特異的に阻害する化合物とは、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を強く阻害するが、キャスペース−１による他の蛋白質の切断を阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。
このような化合物として、キャスペース−１の酵素活性を阻害する化合物や、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用を阻害する化合物等が挙げられる。ここで、「キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用」とは、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的にはＸＩＰ（配列番号１）が切断されて分解されることをいう。上記「ある様式」には、例えば結合、接触あるいは近接等が含まれるが、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれの様式であってもよい。
キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用を阻害する化合物として、具体的には例えば、両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを例示できる。特に、キャスペース−１の基質となるＸＩＰ（配列番号１）由来のかかるペプチドは、両蛋白質の相互作用を競合的に阻害し、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害できるため有用である。このようなペプチドは、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したペプチドから、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害するペプチドを選択することにより取得できる。選択は、後述するような、ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物の同定方法を利用して実施可能である。ここでペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むもの、例えば、ポリペプチドまたはオリゴペプチド等を意味する。
このようなペプチドとして、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断認識配列からなるペプチドが好適である。具体的には、ＨＬＥＤ／Ｔ（配列番号２）、ＬＣＴＤ／Ｓ（配列番号３）、ＴＬＳＤ／Ｅ（配列番号４）、ＬＴＳＤ／ＰＴＤ／Ｉ（配列番号５）、ＬＥＳＤ／Ｎ（配列番号６）およびＱＫＨＤ／Ｇ（配列番号７）等を例示できる。
キャスペース−１が少なくとも、ＸＩＰ（配列番号１）の第２５、７０、８０番目の各アスパラギン酸（Ｄ）のＣ末端側を切断することを実験的に明らかにしたことから、ＸＩＰ（配列番号１）のアミノ酸配列中のこれら各アスパラギン酸を含む部分配列からなるペプチドがさらに好適である。ＸＩＰ（配列番号１）の第２５番目のアスパラギン酸（Ｄ）を含むペプチドとしてＬＣＴＤ／Ｓ（配列番号３）、第７０番目のアスパラギン酸（Ｄ）を含むペプチドとしてＬＥＳＤ／Ｎ（配列番号６）、また第８０番目のアスパラギン酸（Ｄ）を含むペプチドとしてＱＫＨＤ／Ｇ（配列番号７）を例示できる。
さらに、配列番号２から７のいずれか１つまたは２つ以上のアミノ酸配列を含むペプチドも、同様にＸＩＰ分解阻害剤の有効成分として使用できる。ＸＩＰ分解阻害剤に使用できるこのようなペプチドの範囲にＸＩＰ（配列番号１）自体は含まれない。また、上記ペプチドに１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異が導入されたペプチドも、上記阻害剤の有効成分として使用できる。配列番号２から７のいずれか１つまたは２つ以上のアミノ酸配列を含むペプチド、あるいは上記のような変異が導入されたペプチドは、さらにキャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害するペプチドが好ましい。変異が導入されたペプチドは天然に存在するペプチドであってよく、また変異を導入したペプチドであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献７）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
上記ペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献８および９）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等を挙げることができる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換体を得る。該形質転換体を培養し、得られる培養物から目的とするペプチドを回収することにより、ペプチドの製造が可能である。
ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物として、その他に、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）を認識する抗体であって、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害する抗体を例示できる。このような抗体は、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）自体、またはこれらの断片ペプチド、好ましくはこれらが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、自体公知の抗体作製法により取得できる。
ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物として、さらに、後述する同定方法により得られた化合物、好ましくは低分子量化合物を挙げることができる。
本発明の一態様は、ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。ＸＩＰ（配列番号１）の分解を阻害する化合物の同定方法は、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）、これらをコードする各遺伝子、該遺伝子を組込んだベクター、該ベクターを導入されてなる形質転換体、あるいは該遺伝子を発現している細胞等を単独でまたは組み合わせて用い、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。
化合物の同定方法に使用するキャスペース−１およびＸＩＰ（配列番号１）は、一般的に知られている化学合成法や遺伝子工学的手法により取得できる。すなわち、これらは、化学合成産物、無細胞系合成産物、またはこれらを発現している若しくは発現させた細胞自体、あるいは該細胞や生体試料から調製した産物のいずれでもよく、これら産物からさらに精製された産物であってもよい。また、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばキャスペース−１の蛋白質分解酵素活性やＸＩＰ（配列番号１）の酵素基質としての性質に影響がなければ、Ｎ末端側やＣ末端側に標識物質が付加されていてもよい。標識物質としては、別の蛋白質やポリペプチド、例えばＧＳＴ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、ビオチン、放射性同位体等が例示できる。これら標識物質は、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）の精製または検出を容易に実施できる。また、これら標識物質は、例えば、キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）との相互作用の検出に利用可能である。
上記同定方法は、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を可能にする条件を選択し、当該条件下でキャスペース−１および／またはＸＩＰ（配列番号１）を調べようとする化合物（被検化合物）と接触させ、ついでＸＩＰ（配列番号１）の分解を検出できるシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより実施できる。キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を可能にする条件は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）のいずれの条件であってもよい。例えば、キャスペース−１およびＸＩＰ（配列番号１）を共発現させた細胞を用いることもできる。キャスペース−１および／またはＸＩＰ（配列番号１）と被検化合物の接触は、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の反応前に行ってもよいし、当該反応に共存させることにより行ってもよい。ここでシグナルとは、それ自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得る物質を指し、マーカーとはその物質の物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得る物質を指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等、公知のシグナルが利用できる。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、ＸＩＰ（配列番号１）の分解は、ＸＩＰ量またはＸＩＰ分解物量の存在若しくは不存在および／または変化の検出により測定できる。ＸＩＰ量またはＸＩＰ分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法等を用いて実施できる。
被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはキャスペース−１やＸＩＰ（配列番号１）の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。あるいは、ＸＩＰ（配列番号１）のキャスペース−１による切断認識部位のペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
上記ペプチドおよび上記同定方法で得られた化合物も、本発明の範囲に含まれる。上記ペプチドおよび／または上記化合物を、単独でまたは２つ以上を組み合わせて、本発明に係るＸＩＰ分解阻害剤を製造できる。例えば２つ以上のペプチドを組み合わせて製造したＸＩＰ分解阻害剤は、ＸＩＰ（配列番号１）におけるキャスペース−１による数箇所の切断を阻害できるため、ＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害において高い効果が得られる場合がある。これらペプチドおよび化合物は、その他、試薬として利用できる。例えばＸＩＰ（配列番号１）やＨＢｘ等の、Ｂ型肝炎の発症、進行、および肝癌への進展のメカニズムへの関与を分子レベルで研究するために有用である。
上記ペプチドおよび／または上記化合物を含むＸＩＰ分解阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。かかる医薬組成物も本発明の範囲に包含される。
本発明の一態様は、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することを特徴とする、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤に関する。キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断の阻害は、例えば、キャスペース−１の作用を阻害すること、あるいは、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用を阻害することにより達成できる。キャスペース−１の作用の阻害は、例えば、キャスペース−１の酵素活性を阻害することにより実施できる。キャスペース−１の酵素活性を阻害することは、該活性を阻害し得る化合物を本発明に係る同定方法を利用して取得し、該化合物を利用して行うことができる。また、公知のキャスペース−１の酵素活性阻害剤を使用して実施することもできる。キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用の阻害は、例えば、本発明に係るペプチドおよび／または上記同定方法により得られた化合物を用いて実施可能である。すなわち、上記予防剤および／または治療剤として、上記化合物および上記ペプチドのうち少なくとも１つを含んでなる予防剤および／または治療剤を例示できる。
ＸＩＰ（配列番号１）が、ＨＢｘによるＨＢＶの複製および転写の抑制に関与していることから、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患としては、Ｂ型肝炎が挙げられる。キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することにより、ＨＢｘによるＨＢＶの複製および転写を抑制することが可能になり、さらにＢ型肝炎の予防および／または治療が可能になる。また、Ｂ型肝炎から進展する肝癌の予防および／または治療も、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することにより可能である。これらから、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することを特徴とする、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤、並びに抗Ｂ型肝炎ウイルス剤も本発明の範囲に包含される。また、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断を阻害することを特徴とする、Ｂ型肝炎の予防剤および／または治療剤、並びに肝癌の予防剤および／または治療剤も、同様に本発明に包含される。具体的には、上記化合物および上記ペプチドのうち少なくとも１つを含んでなる阻害剤並びに予防剤および／または治療剤を例示できる。
さらに、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患の予防剤および／または治療剤の有効成分として、本発明に係るＸＩＰ分解阻害剤を利用できる。上記ＸＩＰ分解阻害剤はまた、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤、並びに抗Ｂ型肝炎ウイルス剤の有効成分として使用できる。また、上記ＸＩＰ分解阻害剤は、Ｂ型肝炎の発症および進行、並びに肝癌に対する予防剤および／または治療剤の有効成分として好適である。
本発明に係るＸＩＰ分解阻害剤、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤、並びにＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患、例えばＢ型肝炎や肝癌の予防剤および／または治療剤は、好ましくは、適当な医薬上許容される担体（医薬用担体）を含む。医薬用担体は、製剤の剤形に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。例えば、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられるが、これらに限らない。これらは、剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組み合わせて使用できる。さらに、所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤等を適宜含むこともできる。
本発明に係るＸＩＰ分解阻害剤、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害剤、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤、並びにＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患、例えばＢ型肝炎や肝癌の予防剤および／または治療剤に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験によりこれら用量を変更できる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。また、治療に必要な他の化合物または医薬を一緒に処方してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。
剤形としては、各種の投与形態が治療目的に応じて選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロースおよびマンニトール等の賦形剤、澱粉およびアルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレートおよびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、およびグリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトールおよびフラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、および油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、上記有効成分を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば上記有効成分、油成分（大豆油、ゴマ油およびオリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、および乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトールおよび果糖等）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば上記有効成分を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、上記有効成分の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
本発明の一態様はまた、ＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法に関する。本発明に係るＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法は、例えば、キャスペース−１の作用を阻害することにより実施できる。あるいは、ＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法は、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用を阻害することにより達成できる。キャスペース−１の作用の阻害、およびキャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用の阻害は、上記したように実施可能である。
本発明に係るＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法を用いることにより、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患の予防方法および／または治療方法を実施できる。ＸＩＰ（配列番号１）がＨＢｘによるＨＢＶの複製および転写を抑制することから、上記ＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法を用いて、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害方法を達成できる。さらに、上記ＸＩＰ（配列番号１）の分解阻害方法を用いることにより、Ｂ型肝炎およびＢ型肝炎に起因する肝癌の予防方法および／または治療方法を実施できる。
このような阻害方法並びに予防方法および／または治療方法はまた、上記ＸＩＰ分解阻害剤を用いて実施可能である。例えば、上記予防方法および／または治療方法は、ＸＩＰ（配列番号１）の分解に基づく疾患の罹患患者に上記ＸＩＰ分解阻害剤を投与することにより達成できる。
上記阻害方法並びに疾患の予防方法および／または治療方法も、本発明の範囲に包含される。
本発明の一態様は、さらに試薬キットに関する。本発明の試薬キットは、キャスペース−１、キャスペース−１をコードするポリヌクレオチドおよびキャスペース−１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、ＸＩＰ（配列番号１）、ＸＩＰ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドおよびＸＩＰ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなる。上記キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
キャスペース−１およびＸＩＰ（配列番号１）は、上記のように、一般的に知られている化学合成法や遺伝子工学的手法により取得できる。
キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。キャスペース−１またはＸＩＰ（配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、上記ポリヌクレオチドを適当な発現ＤＮＡベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
上記キットは、ＸＩＰ（配列番号１）の分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】（キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）の相互作用のインシリコでの探索）
キャスペース−１と相互作用する蛋白質を、国際公開第０１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従ってインシリコで予測した。まず、キャスペース−１のアミノ酸配列をある長さのペプチドに分解し、各ペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索した。ついで、得られた蛋白質とキャスペース−１との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアが高い蛋白質をキャスペース−１と相互作用すると予測した。
解析の結果、キャスペース−１の部分配列である５アミノ酸残基からなるペプチドＴＳＤＳＴおよびＤＳＱＧＶとそれぞれ相同性のあるペプチドＴＳＤＰＴおよびＤＳＱＧＬが、ＸＩＰ（配列番号１）のアミノ酸配列中に存在することが分かった（図２）。ここにおいて、アミノ酸配列は１文字表記する。さらに、キャスペース−１とＸＩＰ（配列番号１）との間でローカルアライメントを行なった結果、スコアが２０以上に達した領域が４箇所見出された（図２）。この結果から、ＸＩＰ（配列番号１）はキャスペース−１と相互作用する蛋白質であると予測した。
【実施例２】（キャスペース−１によるＸＩＰ切断の解析）
＜材料＞
ヒトＸＩＰ（配列番号１）のｃＤＮＡは、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により獲得した。ヒトＸＩＰ（配列番号１）のｃＤＮＡを、大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ（アマシャム社）へ組込み、ＸＩＰ（配列番号１）の発現プラスミド、ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＸＩＰを構築した。この発現プラスミドを用いて、ＸＩＰ（配列番号１）のＮ末端にＧＳＴ−ｔａｇが付加された融合蛋白質（以下、ＧＳＴ−ＸＩＰと呼称する）を得た。クローニングしたＸＩＰ  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩ蛋白質データベースのアクセッション番号ＮＰ＿００６３９３の配列と同一であった。
＜方法＞
ＧＳＴ−ＸＩＰの作製と精製を次のように行った。まず、ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＸＩＰを保持している大腸菌を対数増殖期（ＯＤ６００＝０．６−０．８）になるまで２５℃で培養した。その後、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭとなるように添加し、さらに２５℃で４時間インキュベーションして発現誘導を行った。集菌後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、溶解用緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）／１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸／１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド）に懸濁後、リゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように加え、氷中に３０分間静置した。ノニデット  Ｐ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）を終濃度１％となるように添加して超音波処理を行った後、遠心分離処理により上清を回収した。この上清から、グルタチオン−セファロース４Ｂを用いてＧＳＴ−ＸＩＰを精製した。精製したＧＳＴ−ＸＩＰは、透析用溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／０．１％  ＣＨＡＰＳ／１０ｍＭ  ＤＴＴ）で透析後、使用時まで−８０℃で保存した。
キャスペース−１  プロテアーゼアッセイは次のように行った。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５、０．１％  ＣＨＡＰＳおよび１０ｍＭ  ＤＴＴを含む反応液中に、キャスペース−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）の存在下または非存在下でＧＳＴ−ＸＩＰを添加し（反応液全量１０μｌ）、３７℃で２時間反応させた。陰性対照として、ＧＳＴ−ＸＩＰの代わりにＧＳＴを用いて同様の反応を行った。反応後、２×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファーを１０μｌ加え、１００℃で２分間熱処理を行い、氷上で２分間放置した。このうち、１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度１０％）で展開し、抗ＧＳＴ抗体（アマシャム社）を用いたウェスタンブロット法にてＧＳＴおよびＧＳＴ−ＸＩＰを検出した。
＜結果＞
キャスペース−１とＧＳＴ−ＸＩＰを反応させた結果、ＧＳＴ−ＸＩＰのバンドの減少とそれに伴う断片の増加が認められた（図３）。一方、ＧＳＴは、キャスペース−１により切断されなかった。このことから、キャスペース−１がＸＩＰ（配列番号１）を切断し分解することが判明した。
【実施例３】  ＸＩＰ（配列番号１）について、キャスペース−１により認識されて切断される部位のアミノ酸配列（切断認識配列）を検討した。キャスペース−１の既知基質における切断認識配列として、下記の配列が知られている：プロインターロイキン−１βのＹＶＨＤ／Ａ（配列番号８）；プロインターロイキン−１８のＬＥＳＤ／Ｎ（配列番号９）；カルパスタチンのＡＬＤＤ／Ｌ（配列番号１０）、ＬＳＳＤ／Ｆ（配列番号１１）およびＡＬＡＤ／Ｓ（配列番号１２）；ＰＩＴＳＬＲＥキナーゼのＹＶＰＤ／Ｓ（配列番号１３）；キャスペース−３のＩＥＴＤ／Ｓ（配列番号１４）；並びにアクチンのＬＶＣＤ／Ｎ（配列番号１５）およびＥＬＰＤ／Ｇ（配列番号１６）。ここで、「／」は切断部位を表わす。これら配列との類似性から、キャスペース−１によるＸＩＰ（配列番号１）の切断認識配列は、ＨＬＥＤ／Ｔ（配列番号２）、ＬＣＴＤ／Ｓ（配列番号３）、ＴＬＳＤ／Ｅ（配列番号４）、ＬＴＳＤ／ＰＴＤ／Ｉ（配列番号５）、ＬＥＳＤ／Ｎ（配列番号６）およびＱＫＨＤ／Ｇ（配列番号７）であると推定できた（図１）。この結果は、ＸＩＰ（配列番号１）がキャスペース−１により分解されることを支持する。
【実施例４】（キャスペース−１によるＸＩＰの切断位置の同定）
＜材料＞
ＸＩＰのアミノ酸配列（配列番号１）中の１箇所あるいは数箇所のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＸＩＰ変異体のＮ末端にＧＳＴ−ｔａｇが付加されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体を発現させる各種ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体発現プラスミドを作製した。これら変異体発現プラスミドの作製は、実施例２で作成したＸＩＰ発現プラスミド、ｐＧＥＸ−４Ｔ−ＸＩＰを鋳型として、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いて行った。
上記ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体発現プラスミドを用いて、下記のＧＳＴ−ＸＩＰ変異体を作製した：ＸＩＰのアミノ酸配列（配列番号１）中の最初のメチオニンから第２５、３９、５８または７０番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体；第２５および７０番目の２箇所のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体；並びに、第２５、７０および８０番目の３箇所のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体。
＜方法＞
各ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体の作製と精製は、上記各ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体発現プラスミドを用いて、実施例２に記載の方法と同じ方法で行った。以下、ＸＩＰの第２５、３９、５８または７０番目のアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に変換した各ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体を、それぞれＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ３９Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ５８Ａ）またはＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ７０Ａ）と呼称する。第２５および７０番目の２箇所のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体をＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ）と呼称する。また、第２５、７０および８０番目の３箇所のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に変換されたＧＳＴ−ＸＩＰ変異体をＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ，Ｄ８０Ａ）と呼称する。
キャスペース−１  プロテアーゼアッセイは、ＧＳＴ−ＸＩＰおよび上記各ＧＳＴ−ＸＩＰ変異体を用いて、実施例２に記載の方法と同じ方法で行った。
＜結果＞
結果を第４図に示す。キャスペース−１  プロテアーゼアッセイの結果、野生型ＸＩＰであるＧＳＴ−ＸＩＰでは、断片が生じたことを示すバンドが２本認められた。この２本のバンドが示す断片のうち高分子量側に位置する断片は、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ３９Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ５８Ａ）で検出されたが、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ７０Ａ）では検出されなかった。一方、低分子量側に位置する断片は、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ３９Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ５８Ａ）、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ７０Ａ）で検出されたが、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ）では検出されなかった。
ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ）を基質としたときには、上記断片以外に新たな別の断片が検出された。この断片は、ＧＳＴ−ＸＩＰ（Ｄ２５Ａ，Ｄ７０Ａ，Ｄ８０Ａ）を基質としたときには検出されなかった。
以上の結果から、キャスペース−１は少なくとも、ＸＩＰ（配列番号１）の第２５、７０、８０番目の各アスパラギン酸（Ｄ）のＣ末端側を切断すると判定できた。
【産業上の利用可能性】  本発明ではキャスペース−１と相互作用する蛋白質ＸＩＰ（配列番号１）を見出した。そして、その相互作用においてキャスペース−１がＸＩＰ（配列番号１）を切断し分解することを初めて明らかにし、その切断認識部位を見出した。ＸＩＰ（配列番号１）は、ＨＢＶ遺伝子由来の蛋白質ＨＢｘの作用を阻害する。ＨＢｘは、ＨＢＶの複製促進作用および転写活性化作用を有し、Ｂ型肝炎の発症、進行および肝癌への進展に関与すると考えられる。これらから、本発明において提供するＸＩＰ分解阻害剤および／またはＸＩＰ分解阻害方法は、ＨＢＶの複製および／または転写の阻害、Ｂ型肝炎の予防および／または治療、並びにＨＢＶによる肝癌の予防および／または治療のために非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】配列番号２：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号３：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号４：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号５：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号６：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号７：キャスペース−１により認識される、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質（配列番号１）の部分配列。
配列番号８：キャスペース−１により認識される、プロインターロイキン−１βの部分配列。
配列番号９：キャスペース−１により認識される、プロインターロイキン−１８の部分配列。
配列番号１０：キャスペース−１により認識される、カルパスタチンの部分配列。
配列番号１１：キャスペース−１により認識される、カルパスタチンの部分配列。
配列番号１２：キャスペース−１により認識される、カルパスタチンの部分配列。
配列番号１３：キャスペース−１により認識される、ＰＩＴＳＬＲＥキナーゼの部分配列。
配列番号１４：キャスペース−１により認識される、キャスペース−３の部分配列。
配列番号１５：キャスペース−１により認識される、アクチンの部分配列。
配列番号１６：キャスペース−１により認識される、アクチンの部分配列。
配列番号１７：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース−１の部分配列。
配列番号１８：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の部分配列。
配列番号１９：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の配列において同一の部分配列。
配列番号２０：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース−１の部分配列。
配列番号２１：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の部分配列。
配列番号２２：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース−１の部分配列。
配列番号２３：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の部分配列。
配列番号２４：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、キャスペース−１の部分配列。
配列番号２５：キャスペース−１とＢ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質とのローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、Ｂ型肝炎ウイルスｘ相互作用蛋白質の部分配列。
【配列表】
2004073742.tif 000002
2004073742.tif 000003
2004073742.tif 000004
2004073742.tif 000005
2004073742.tif 000006
2004073742.tif 000007
2004073742.tif 000008
2004073742.tif 000009
2004073742.tif 000010
【図１】
2004073742.tif 000011
【図２】
2004073742.tif 000012
【図３】
2004073742.tif 000013
【図４】
2004073742.tif 000014
【国際調査報告】
2004073742.tif 000015
2004073742.tif 000016
2004073742.tif 000017
2004073742.tif 000018
2004073742.tif 000019
2004073742.tif 000020
2004073742.tif 000021
2004073742.tif 000022
2004073742.tif 000023
2004073742.tif 000024