(57)【要約】癌細胞の抗癌剤に対する感受性マーカー、およびを癌細胞の抗癌剤に対する感受性を予測する方法を提供する。癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子から発現される、ｍＲＮＡまたはポリペプチドが癌細胞の抗癌剤に対する感受性マーカーとなり得る。発現される、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを測定することによって癌細胞の抗癌剤に対する感受性を測定できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を有するガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子から発現される、癌細胞の抗癌剤感受性マーカーとして使用するＳＡＴ−ＩｍＲＮＡ。
【請求項２】
癌細胞の抗癌剤感受性マーカーとして使用する配列番号２のアミノ酸配列を有するガングリオシドＧＭ３合成酵素。
【請求項３】
癌細胞の抗癌剤に対する感受性を試験する方法であって、癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子の発現量を測定することを含む方法。
【請求項４】
（１）抗癌剤に対する癌細胞の感受性と、癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子発現量との相関関係を求めておき、
（２）患者の癌細胞のＳＡＴ−Ｉ発現量をインビトロで測定し、
（３）（１）の相関関係と（２）の発現量から抗癌剤に対する患者の癌細胞の感受性を求める、
ことを含む抗癌剤の選定方法。
【請求項５】
癌が肺癌である請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
肺癌が非小細胞肺癌である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を、該遺伝子から発現されるｍＲＮＡ量を測定することによって測定する請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
ｍＲＮＡ発現量をノーザンブロット法で測定する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載のｍＲＮＡ発現量を測定するために用いる、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ若しくはその断片、またはそれらに対応するＲＮＡよりなるプローブ。
【請求項１０】
ガングリオシドＧＭ３合成酵素遺伝子の発現量を、該遺伝子から発現されるタンパク質を測定することによって測定する請求項３または４に記載の方法。
【請求項１１】
発現量をウェスタンブロット法で測定する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のタンパク質発現量を測定するために用いる、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体。
【請求項１３】
抗癌剤がエトポシド、アドリアマイシン、シスプラチン、ヴィンクリスチン、パクリタキセルよりなる群から選択される請求項３または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌細胞の抗癌剤に対する感受性試験方法に関するものである。さらに詳しくはガングリオシオＧＭ３合成酵素の遺伝子の発現レベルを指標にした、抗癌剤に対する癌細胞の感受性試験に関するものである。
【背景技術】  今日、種々の癌に対して多数の抗癌剤が開発されている。抗癌剤はその効果に患者の腫瘍の特性や個人差があるため、治療効果を見ながら試行錯誤的に使用されているのが現状である。その結果、効果のない抗癌剤の投与による無駄な治療が行われる上、薬剤の副作用による苦痛を患者に与えている場合もある。化学療法開始前に、癌細胞が薬剤に対して感受性か否かの識別が可能となれば、治療方針を立てる上で非常に有益である。
最近、わが国の肺癌死が胃癌を追い越して第一位となっている（１９９８年度部位別癌死亡率では肺癌死亡率：１７．９％）。今後もこの肺癌死亡率の増加傾向が続き、２０１５年では２０００年死亡数の約２倍になると予測されている。肺癌に関わる医療費の低減の課題は重要である。
肺癌の診断は症状や検診で胸部Ｘ腺写真、ＣＴ、造影レントゲン、ＣＴ（コンピューター断層写真）ＭＲＩ、内視鏡検査、気管支ファイバースコープ、生検組織診、細胞診、客痰細胞診などが行われる。これで肺癌であるかどうか、肺癌であるとするとどのくらい進行しているかが判定される。
具体的には肺の原発腫瘍の広がり（Ｔ）、リンパ節転移（Ｎ）、遠隔転移（Ｎ）のそれぞれについて点数をつけその組み合せでＩ期からＩＶ期のステージが決められる。一般的にはＩ期からＩＩＩ期の一部までが手術の対象となるが、それ以降の期のものは放射線と抗癌剤を使用する化学療法が主体と治療となる。
抗癌剤はとしてはシスプラチン、ビノレルビン、マイトマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン等が幾つかの組み合わせで使用されている。上述のように患者に副作用による苦痛のみを与え、効果のない抗癌剤の投与を避けるために癌細胞が薬剤に対して感受性か否かの識別が可能となれば、治療方針を立てる上で非常に有益である。抗癌剤が癌細胞に対して有効であるかどうかを判断するためには、マーカーとなる物質があれば非常に便利である。
ガングリオシドは、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）ファミリーの総称であり、ＧＭ３はその生合成経路における最初のガングリオシド分子であるＧＭ３はヒトを含む哺乳動物の種々の細胞に広く発現していることから、その生理機能および病態生理学的意義が注目されてきた。
ガングリオシドの発現と癌の悪性度や機能との関連については、以前より多くの研究者の興味の対象であった。癌の転移能に関して細胞膜が非常に重要な役割をもっていることが示されたのは、高転移性細胞の膜小胞を低転移性細胞の膜に融合させると、転移能の形質が転換されるというものであった（Ｐｏｓｔｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，ＧＬ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，３９９−４０３，１９８０）。
ガングリオシドと細胞の癌化や腫瘍形成能に関しても多数報告されている。その中でも興味深いのは、ウイルス感染による細胞の形質転換によってガングリオシドの発現パターンが変化することである（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，ＷＴ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５９，２５４−２６１，１９６８；Ｙｏｇｅｅｓｗａｒａｎ，Ｇ．，Ｓｈｅｉｎｉｎ，Ｒ．，Ｗｈｅｒｒｅｔｔ，ＪＲ．ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，ＲＫ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４７，５１４６−５１４８，１９７２）。腫瘍原性ＤＮＡウイルスであるＳＶ４０やポリオーマウイルスによる形質転換で一般にＧＭ３などの糖鎖の短いガングリオシドが増加する。これは糖転移活性の変化による糖鎖不全あるいは単純化として理解されている。
一方、自然に形質転換した細胞、あるいはヘパトーマ細胞では糖鎖の単純化の傾向はみられていない（Ｄｎｉｓｔｒｉａｎ，ＡＭ．，Ｓｋｉｐｓｋｉ，ＶＰ．，Ｂａｒｃｌａｙ，Ｍ．，Ｅｓｓｎｅｒ，ＥＳ．ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋ，ＣＣ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６４，３６７−３７５，１９７５）。このようにガングリオシドと癌細胞の転移や浸潤、癌化能に関して統一された見解は見出されていない。ガングリオシドの発現と癌の悪性度や機能との関連については、以前より多くの研究者の興味の対象であるが、ガングリオシドと癌細胞の転移や浸潤、癌化能に関して統一された見解は見出されていない。
【発明の開示】
以上のことから、癌細胞の抗癌剤に対する感受性診断マーカーとして有効で、且つ一般的に応用可能な遺伝子が求められており、さらにはそのマーカーを用いた精度の高い抗癌剤感受性試験方法の開発が急がれている。
本発明者らは癌細胞の抗癌剤に対する感受性の程度により特定の遺伝子の発現量が変化することを見いだし、本発明に至った。この試験方法で患者の細胞が抗癌剤感受性かどうか容易に判定でき、患者に投与すべき抗癌剤種が選択できる可能性を見出し患者に適した抗癌剤の選択することにより副作用を低減できると考え鋭意研究を行った。
本発明者らはガングリオシド発現と癌の悪性度の関連性を新たな視点から検討することを目的として、１９９８年にクローニングされたガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子（Ｉｓｈｉｉ，Ａ．，Ｏｈｔａ，Ｍ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ｋ．，Ｓａｋｏｅ，Ｋ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｉｎｏｋｕｃｈｉ，Ｊ．，Ｓａｎａｉ，Ｙ．ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，Ｍ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７，３１６５２−３１６５５，１９９８）（配列番号１）の発現レベルを種々のヒト癌細胞について調べた。その結果ＳＡＴ−Ｉ遺伝子の発現レベルには個々の癌細胞で大きな差があることを発見した。本発明に用いる酵素遺伝子は、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）をガングリオシドＧＭ３に合成する酵素（配列番号２）の遺伝子（ＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子）である。
さらに本発明者はＧＭ３合成酵素遺伝子（ＳＡＴ−Ｉ遺伝子）の発現レベルは癌細胞の抗癌剤に対する感受性と明らかな相関性を示すことを発見し、これらの知見に基いて本発明を完成させた。
即ち、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子から発現される、癌細胞の抗癌剤感受性マーカーとして使用するＳＡＴ−ＩｍＲＮＡに関する。
本発明はまた、癌細胞の抗癌剤感受性マーカーとして使用する配列番号２のアミノ酸配列を有するガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）ポリペプチドに関する。
本発明はまた、癌細胞の抗癌剤感受性を試験する方法であって、癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子の発現量を測定することを含む方法に関する。癌細胞の抗癌剤感受性は癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子の発現量と相関関係があるのでＳＡＴ−Ｉ遺伝子の発現量を測定することにより癌細胞の抗癌剤感受性を測定できる。癌細胞は生物寄託センターや医用細胞保存機関より入手できる。
本発明はまた、
（１）抗癌剤に対する癌細胞の感受性と、癌細胞のガングリオシドＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子発現量との相関関係を求めておき、
（２）患者の癌細胞のＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量をインビトロで測定し、
（３）（１）の相関関係と（２）の発現量から抗癌剤に対する患者の癌細胞の感受性を求める、
ことを含む抗癌剤の選定方法に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は５種のヒト非小細胞肺癌におけるＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量の比較を示す電気泳動図（上）および棒グラフ（下）である。
図２は抗癌剤処理による肺癌細胞の生存率の試験結果を示す棒グラフである。
図３はヒト肺癌におけるＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量と抗癌剤処理による癌細胞生存率の相関関係を示す相関図である。
【発明を実施するための最良の形態】  対象となる癌種としては肺癌（非小細胞肺癌、および小細胞肺癌）、食道癌、乳癌、胃癌、肝癌、頭頸癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳腫瘍、睾丸腫瘍があげられる。
患者から癌細胞を得る場合には、吸引生検、挟みとり生検、察過生検、細胞診用生検、内視鏡生検、細針吸引生検、針生検、経気管支的肺生検等の生検（バイオプシー）により、或いは、患者の排出する喀痰から、または外科手術の際に得ることができる。
ＳＡＴ−Ｉ遺伝子の発現量は癌細胞の該遺伝子から発現されるＳＡＴ−ＩｍＲＮＡまたはＳＡＴ−Ｉタンパク質を測定することによっておこなうことができる。検出方法はＳＡＴ−ＩのｍＲＮＡあるいはタンパク質を検出、および抗癌剤感受性・耐性細胞間での発現量の比較が可能であれば特に限定されるものではない。
ガングリオシドＧＭ３合成遺伝子の発現量は、ＳＡＴ−ＩｍＲＮＡを、典型的にはノーザンブロット法によって測定することによって測定できる。
ノーザンブロット法は当業者に周知の技術である。ノーザンブロット法では細胞からＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出し、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を電気泳動して、そのパターンをフィルターに移しとり、アイソトープ等で標識した特異的な標識プローブとハイブリダイゼーションをさせることで、標本中のｍＲＮＡの存在と量を解析する。
ハイブリダイゼーションにおける検出のためのプローブとしては、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが使用される。ノーザンブロット法により、ｍＲＮＡを特異的に検出しようとする場合は、そのｍＲＮＡ自体に相補的配列をもつ一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡをプローブとして使用する。用いるプローブの鎖長は比較的任意であり、２０〜４０塩基程度の合成オリゴヌクレオチドや、数百から１ｋｂｐの長さのＤＮＡまたはＲＮＡプローブが使用できる。合成するＤＮＡ配列は比較的短いＤＮＡプローブの場合、検出しようとする遺伝子の特異的な配列部分を利用する。遺伝子の相同性を確認するツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ）を用いることで検出しようとする遺伝子特有の配列を検索することが可能である。
ハイブリダイゼーションに用いるプローブの標識方法には大きく分けて放射能標識と非放射能標識の２種がある。放射能標識オリゴヌクレオチドの作製は、おもに３２Ｐ標識したヌクレオチドをもとにＰＣＲ法で合成することが出来る。ただしこの方法は、放射性廃棄物処理の問題があり、簡便ではない。非放射能標識では、プローブ分子内に特殊な修飾基を付加したものを利用し、付加した修飾基を蛍光や化学発光、発色によって検出する。この非放射能標識方法を用いた核酸の検出法の検出感度も放射能標識の方法の感度も大きな差は無くなってきているので、比較的安全であり、この非放射能標識方法を使用することが望ましい。非放射能標識の例としてジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識やビオチンと（ストレプト）アビジンを使うビオチン標識や蛍光を発するＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）分子等をＤＮＡに共有結合させて標識させる方法も適用できる。
また、非放射能標識プローブの簡便な作製法として、ＰＣＲ操作時に標識ヌクレオチドを５’末端に付加する方法も利用できる。標識物質としては、ビオチンやジゴキシゲニン化が挙げられる。オリゴヌクレオチドプローブは、均一なものを比較的大量に作製できる利点があるが、感度の点で問題が残されている。プローブ末端以外の部分に標識を入れる場合、ニックトランスレーション法による標識ＤＮＡの合成方法も利用可能である。
ｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子をノーザンブロット法で検出する場合には、その検出用プローブは１本鎖である必要がある。１本鎖ＤＮＡプローブの作製にはオリゴヌクレオチドの使用、ランダムＰＣＲなどがあるが、一本鎖プローブとしては、ＲＮＡプローブを利用する方法が感度が高く好ましい。ＲＮＡプローブはＴ７やＳｐ６等のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列の上流にクローニングしてあるＤＮＡ配列を鋳型として、アンチセンスＲＮＡを合成する。この時、標識されたヌクレオチドを基質とすることで、標識されたＲＮＡプローブを作製することが出来る。
癌細胞を培養する培地（ＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭ，シグマ社製）には１０％の子牛血清とペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質が含まれている。細胞は通常、５％ＣＯ２存在下のインキュベーター内で１０ｃｍディッシュに培養する。培養温度は通常３７℃である。
１０ｃｍディッシュに細胞をコンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））で３回洗浄する。Ｔｒｉｚｏｌ（ＲＮＡ抽出用フェノール性試薬、ギゾゴ社製）を１ｍｌを加え、室温で２分間静置した後、スクレイプして１．５ｍｌのチューブに回収する。ピペッティングにより細胞を完全に溶解した後、室温で１０分間インキュベートする。クロロホルムを２００μｌ加え３０秒間懸濁した後、２分間静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、１５分間遠心し、相分離を行う。上層を新しい１．５ｍｌチューブに移し、等量（５００μｌ）の冷イソプロパノールを加えて１０秒間懸濁した後、１０分間静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、１０分間遠心してＲＮＡを析出させる。上清をデカントして７０％エタノール−ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水を１ｍｌ加え、軽く懸濁して洗浄し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、５分間遠心した後、デカントして塩を取り除く。このチューブをデシケータで乾燥させ、完全に水分を除去した後、ＤＥＰＣ処理水２０μｌでＲＮＡを溶解する。保存は−８０℃で行う。
全ＲＮＡはｍＲＮＡまで精製することが望ましいが全ＲＮＡのままでも分析することができる。ホルムアミドとホルマリンの溶液にいれて５５℃で変性させてからホルマリン入りのアガロースゲルで電気泳動する。その後ゲルを１５〜２０ｘＳＳＣという高塩溶液でニトロセルロースまたはナイロンフィルターにトランスファーする。全ＲＮＡがフィルターについた後、ニトロセルロースの場合は８０℃で２時間くらい真空オーブンで処理し、全ＲＮＡを固定化する。ナイロン膜の場合には紫外線をしばらくあてて架橋を作るなどして固定する。次にこのフィルター上のＳＡＴ−ＩｍＲＮＡを同定するためにＳＡＴ−ＩｃＤＮＡ由来のプローブを作製する。一本鎖にしたプローブとフィルターを特定の条件で接触させると相補性のあるものは結合する。ここでプローブに放射性物質でラベルしておけば結合したＳＡＴ−ＩｍＲＮＡだけを検出できる。ハイブリダイゼーションの条件としては５〜６ｘＳＳＣ、温度６５℃（ホルムアミド存在下では４２℃）とする。
ｍＲＮＡの測定はＲＴ−ＰＣＲ法によっても行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲは、まずＲＮＡを逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、次にこのｃＤＮＡを出発材料として特定のプライマーセットと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行い、目的のＲＮＡの存在をそのｃＤＮＡの増幅という形で、検出定量化する方法である。
ガングリオシドＧＭ３合成遺伝子の発現量を、該遺伝子から発現されるタンパク質を、典型的にはウエスタンブロット法を用いて測定することによって測定することができる。
細胞を６穴ディッシュに培養し、界面活性剤（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含んだタンパク質抽出バッファー（１０ｍＭトリス−塩酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭエチレンジアミン４酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ））にて抽出し、氷上にて１０分間超音波粉砕を行い、１５，０００ｒｐｍで、３０分間遠心分離操作により上清を回収する。
ウエスタンブロット法はタンパク質をＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分画し、ニトロセルロースフィルターに移し、これを抗体を用いて検出する方法である。タンパク質はポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースの薄膜のような適当なフィルターへトランスファーする。フィルターへ付着したタンパク質はＳＡＴ−Ｉタンパク質の抗体をプローブとすることによって同定できる。抗体検出には例えばペルオキシダーゼ結合二次抗体法を用いる。ゲルからフィルターへのトランスファーは多くの場合エレクトロブロッティングによって行う。すなわち、電気泳動によりタンパク質を展開したゲルとフィルターを密着させフィルターを陽極側にゲル側を陰極にして一定時間電流を流す。こうするとタンパク質はゲルからフィルターに転写される。数時間後この膜を取出しＳＡＴ−Ｉタンパク質に特異的に結合する抗体を反応させ更にその後その抗体を染め出す。
抗体を作製する方法はよく知られている。ＳＡＴ−Ｉタンパク質またはその断片を使用して抗体を誘導する。ウサギ、ラット、およびマウスといったような動物を、例えば１００μｇのタンパク質およびフロイントアジュバンドを含むエマルジョンの腹腔内注射および／または皮内注射により免疫する。例えば固体表面に吸着させたタンパク質を使用するＥＬＩＳＡ検定により抗体を検出することができる。高い力価を得るためにブースター注射が例えば約２週間の間隔で数回必要である。抗体は上述の方法によるポリクローナル抗体のほかモノクローナル抗体（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）も用いることができる。
また蛋白質の検出法として細胞を粉砕せずに蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡による観察および画像処理、フローサイトメトリーによる計測、さらにエバネッセント光などを用いた検出方法が可能である。
蛍光標示式細胞分取器（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ，ＦＡＣＳ）は細胞を抗体で蛍光標識し、その蛍光強度によって細胞を分取する装置であり、本装置を用いた実験方法はフローサイトメトリーという。細胞に例えば抗ＧＭ３合成酵素を作用させ次いで抗ＧＭ３合成酵素と反応するＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識した抗体を作用させる。この細胞をＦＡＣＳにかけ蛍光強度の強さを測定することによりＧＭ３合成酵素が高発現しているか否か判定できる。
抗癌剤は、なんら限定されるものではない。肺癌の場合、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ヴィンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）を含むが新規な抗癌剤が開発されればその抗癌剤に対しても適用可能である。
本診断システムによると、抗癌剤の副作用を最小限に最大の治療効果を予測することができる、個々の癌患者のテーラーメード癌治療戦略のシステムを提供できることが期待される。
以下に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実施例によりなんら限定されるものでない。
【実施例１】肺癌細胞のＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量の測定（１）
ヒト非小細胞肺癌のＧＭ３合成酵素（ＳＡＴ−Ｉ）遺伝子の発現量を比較する目的で，５種のヒト非小細胞肺癌（ＬＣＳＣ＃１、ＬＣＳＣ＃２、Ｌｕ９９Ｂ、ＬＫ−２、Ａ５４９（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄａｃ．ｔｏｈｏｋｕ．ａｃ．ｊｐ／ｄｅｐ／ｃｃｒ／）より入手））細胞を用いた。細胞は１０％子牛血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養を用いて５％ＣＯ２存在下のインキュベーター内で３７℃で培養した。ＲＮＡの抽出は以下のように行った。１０ｃｍディッシュに細胞をコンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））で３回培養した。Ｔｒｉｚｏｌ（ＲＮＡ抽出用フェノール性試薬、ギブゴ社製）を１ｍｌ加え、室温で２分間静置した後、スクレイプして１．５ｍｌのチューブに回収した。ピペッティングにより細胞を完全に溶解した後、室温で１０分間インキュベートした。クロロホルムを２００μｌ加え３０秒間懸濁した後、２分間静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、１５分間遠心し、相分離を行った。上層を新しい１．５ｍｌチューブに移し、等量（５００μｌ）の冷イソプロパノールを加えて１０秒間懸濁した後、１０分間静置し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、１０分間遠心してＲＮＡを沈殿させた。上清をデカントして７０％エタノール−ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水を１ｍｌ加え、軽く懸濁して洗浄し、４℃、１２，０００ｒｐｍで、５分間遠心した後、デカントして塩を取り除いた。このチューブをデシケータで乾燥させ、完全に水分を除去した後、ＤＥＰＣ処理水２０μｌでＲＮＡを溶解した。この方法を用いて抽出したＲＮＡについてノーザンブロット法によりＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量を確認した。
１細胞あたり６μｇのＲＮＡをホルムアルデヒド変性アガロースゲル中に泳動後、ナイロン膜に転写し、ジゴキシゲニン標識したヒトＳＡＴ−Ｉ遺伝子のＲＮＡプローブをハイブリダイズさせることで各細胞のＳＡＴ−Ｉ遺伝子ｍＲＮＡの発現量を確認した。
プローブは以下のようにして作製した。ヒト白血病細胞ＨＬ６０のＲＮＡを抽出し、以下の配列のプライマー：
2004099407.tif 000002
を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プローブ用ＳＡＴ−Ｉ遺伝子断片を増幅させた。ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にライゲーションして大腸菌（ＸＬ−１  ｂｌｕｅ）にトランスフォームし、精製した。このプローブ用ＳＡＴ−Ｉ遺伝子断片挿入プラスミドを制限酵素ＥｃｏＯ１０９Ｉを用いて切断し，Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）とＤＩＧ標識されたモノヌクレオチド混合液（Ｒｏｃｈｅ社製）を作用させ，ＲＮＡプローブを作成した（配列番号５）。
その結果、１種のＳＡＴ−Ｉ遺伝子高発現株Ａ５４９、２種の中発現株ＬＣＳＣ＃１、ＬＣＳＣ＃２、２種の低発現株Ｌｕ９９Ｂ、ＬＫ−２に分類された（図１）。泳動したＲＮＡの量は、２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡのメチレンブルー染色により確認した。ＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量を相対的に比較した結果、Ａ５４９（腺癌）が最もＳＡＴ−Ｉ遺伝子を高発現しており、ＬＣＳＣ＃１（腺癌）、ＬＣＳＣ＃２（腺癌）の２種は中程度の発現量であり、Ｌｕ９９Ｂ（大細胞癌）、ＬＫ−２（扁平上皮癌）の２種は低発現であった。
【実施例２】抗癌剤感受性試験（１）
次にこれらの細胞について抗癌剤感受性（抵抗性）の検討を行った。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるエトポシド、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であるアドリアマイシン、微小管機能阻害剤であるヴィンクリスチンおよびＤＮＡ生合成阻害物質であるシスプラチン存在下、２４時間後の各種肺癌細胞の生存率について細胞毒性測定用試薬Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）を用いて測定したところ、測定したすべての薬剤においてＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量に依存した薬剤抵抗性を示した（図２に各薬剤処理による肺癌細胞の５０％生存率（ＩＣ５０値）を示した）。
５種のヒト非小細胞肺癌を９６穴プラスチックプレートに１穴あたり１０，０００個／１００μｌで播種し、２４時間培養後、エトポシド（１，１０，１００，５００μＭ）、アドリアマイシン（０．１，１，１０，５０，１００μＭ）、ヴィンクリスチン（１，１０，１００，５００，１０００μＭ）、シスプラチン（１，１０，１００，５００，１０００μＭ）を上記の濃度系列で投与した。さらに２４時間培養後、細胞毒性測定用試薬Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所製）１０μｌを各穴に添加し、３時間後の培地の吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。結果を図２に示す、ＳＡＴ−Ｉ遺伝子を高発現しているＡ５４９（腺癌）が抗癌剤エトポシド、アドリアマイシン、ヴィンクリスチン、シスプラチンに対して高い抵抗性を示し、ＬＣＳＣ＃１（腺癌）、ＬＣＳＣ＃２（腺癌）の２種は中程度の抵抗性、Ｌｕ９９Ｂ（大細胞癌）、ＬＫ−２（扁平上皮癌）の２種は高感受性を示した。ＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量と抗癌剤エトポシド、アドリアマイシン、ヴィンクリスチン、シスプラチンに対する抵抗性に正の相関関係が認められる。
【実施例３】肺癌細胞のＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量の測定（２）
下記の１６種のヒト肺がん細胞株についてＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。
ＥＢＣ−１（Ａ），ＬＣＳＣ＃１（Ｂ），ＬＣＳＣ＃２（Ｂ），Ｌｕ６５（Ｃ），Ｌｕ９９Ｂ（Ｃ），ＬＫ−２（Ａ），Ａ５４９（Ｂ），ＯＢＡ−ＬＫ−１（Ｃ），ＡＢＣ−１（Ｂ），Ｌｕ９９（Ｃ），ＱＧ９０（Ｄ），ＰＣ３（Ｂ），ＰＣ６（Ｄ），ＮＣＩ−Ｈ２２６（Ａ），Ｌｃ１ｓｑ（Ａ），ＮＣＩ−Ｈ２３（Ｂ）（細胞名の末尾括弧内は病理組織分類を示す：（Ａ）扁平上皮がん、（Ｂ）腺がん、（Ｃ）大細胞がん、（Ｄ）小細胞がん）。ＱＧ９０、ＰＣ３、ＰＣ６株については北海道大学井上勝一助教授より供与を受け、それ以外の株は東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄａｃ．ｔｏｈｏｋｕ．ａｃ．ｊｐ／ｄｅｐ／ｃｃｒ／）より入手した。
一本鎖ｃＤＮＡ合成キットＲｅｖｅｒｓｅＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）（東洋紡）を使い、各細胞から抽出したＲＮＡサンプルを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡ合成に際しては、ランダムプライマーあるいはオリゴｄＴプライマーを用いた。キットに添付の方法に従い反応液を調製し、ランダムプライマーを用いた場合は、３０℃１０分、４２℃５０分、９５℃５分の反応を、オリゴｄＴプライマーを用いた場合は、４２℃５０分、９５℃５分の反応をサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ登録商標  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００、アプライドバイオシステムズ社製）により行った。反応終了後、逆転写産物は−３０℃にて保存した。
ＰＣＲ反応は、４００ｎＭ（終濃度）のＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現確認用の順逆両プライマー及びＥｘＴａｑ（宝酒造）を用い、容量１０μｌにて行った。サーマルサイクラーのパラメーターは、全ての反応において、９４℃５分間の後、９４℃３０秒で変性、５５℃３０秒で対合、７２℃１分で伸長のサイクルを３０〜３５回繰返し、更に７２℃５分間伸長反応を続けた後、４℃で静置した。ＰＣＲ産物は、最終反応物の一部を１．５％アガロースゲル電気泳動にて展開し、エチジウムブロマイド染色により、検定した。結果を表１に示す。
【実施例４】抗癌剤感受性試験（２）
実施例３で用いた各種ヒト肺がん細胞の抗癌剤パクリタキセルに対する感受性を測定した。
１０ｃｍ  ｄｉｓｈに各種ヒト肺がん細胞を凍結状態より起こして培養し、最低２回以上継代して細胞の増殖状態を安定させた。この細胞を０．２５％Ｔｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（シグマ）を用いて剥がし、ヘモサイトメーターにより細胞数を測定した。５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地で濃度調製を行い、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μｌずつ播種した（１ｗｅｌｌあたり５×１０３ｃｅｌｌｓ）。一日後、０，０．１，１，１０，１００μＭの濃度で各種抗がん剤を含む培地に交換し、インキュベートした。２２時間後、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学）を１０μｌ／ｗｅｌｌ加え、２時間ＣＯ２インキュベーターで反応させた。マイクロプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。Ｃｅｌｌ  ＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８は細胞増殖または化学物質の細胞毒性試験において、細胞数を測定するキットであり、高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェノニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・１ナトリウム塩）を発色基質として使用する。ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。細胞数と生成するホルマザン量は直線的な比例関係にあるため、このホルマザンの４５０ｎｍの吸光度を測定することで生細胞数を計測することができる。結果を表１に示す。
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図３はヒト肺癌におけるＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量と抗癌剤パクリタキセル処理による癌細胞生存率の相関関係を示す。ＳＡＴ−Ｉ遺伝子発現量と抗癌剤パクリタキセルに対する抵抗性に負の相関関係が認められる。
以上の結果は、癌細胞におけるＳＡＴ−Ｉ遺伝子の発現量が抗癌剤抵抗性（感受性）と密接に関連していることを示すものであり、ＳＡＴ−Ｉ遺伝子の発現量を測定することにより抗癌剤抵抗性（感受性）を予測できることがわかった。この発見が今後の癌診断および癌治療に大きく貢献することを期待される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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