(57)【要約】本発明の目的は、タンパク質またはペプチドの生物活性を阻害せずに高封入率で封入でき、完全に生分解性で安全なタンパク質またはペプチドの徐放製剤を提供することである。本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド共存下で、ｐＨ６以下の溶液中で架橋、ハイドロゲル化することを特徴とするヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法に関連する。本発明により、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらの効率な当該ゲル内への封入、および徐放が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ６．４以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする、ヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項２】
以下の工程を含む、ヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法：
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、ヒドラジド基を導入する工程、
（ｂ）上記ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体をｐＨ６．４以下の溶液中で架橋する工程。
【請求項３】
以下の工程を含む、ヒアルロン酸ゲルの製造方法：
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、式（Ｉ）：
2004050712.tif 000008
（式中、Ｘ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−、または−Ｏ−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ１は、−Ｙ１−Ｒ２−Ｙ２−ＮＨＮＨ２であり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ２は、単結合、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｙ２は、単結合、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、
（ｂ）上記ヒアルロン酸誘導体をｐＨ６．４以下で化学架橋する工程。
【請求項４】
ヒドラジド基の、ヒアルロン酸誘導体中のグルクロン酸当たりの導入率が３モル％以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
架橋剤中に含まれる、ヒドラジド基と反応する化合物官能基が、導入されたヒドラジド基に対して４０モル％以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により作製された、ヒアルロン酸ゲル。
【請求項７】
上記ヒアルロン酸ゲルがハイドロゲルである、請求項６に記載のヒアルロン酸誘導体ゲル。
【請求項８】
タンパク質又はペプチド存在下で、ｐＨ６．４以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする薬物徐放担体の製造方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、薬物徐放担体の製造方法：
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、ヒドラジド基に変換することにより、ヒドラジド基を導入する工程、
（ｂ）上記ヒドラジド基導入されたヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド存在下、ｐＨ６．４以下の溶液中で架橋する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、薬物徐放担体の製造方法：
（ａ）ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、ヒドラジド基に変換することにより、式（Ｉ）：
2004050712.tif 000009
（式中、Ｘ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−、または−Ｏ−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｒ２ａ、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｘ１は、−Ｙ１−Ｒ２−Ｙ２−ＮＨＮＨ２であり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ２は、単結合、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｙ２は、単結合、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を合成する工程、
（ｂ）上記ヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド存在下、ｐＨ６．４以下で化学架橋する工程。
【請求項１１】
ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たりのヒドラジド基の導入率が３モル％以上であることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
架橋剤中に含まれる、ヒドラジド基と反応する化合物官能基が、導入されたヒドラジド基に対して４０％モル以下であることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法により作製された、薬物徐放担体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の薬物徐放担体を含む、薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、タンパク質またはペプチドを徐放するヒアルロン酸ハイドロゲル薬物徐放担体に関する。
【背景技術】  近年、薬効を持つタンパク質、ペプチドの製剤が盛んに実用化されているが、一般にこうした薬物は血中半減期が短く、またその大部分が頻回投与の注射剤であるため、薬剤投与における患者の負担は過大なものとなっている。したがって、できるだけ少量で薬効を発揮させ且つ投与回数も少なくできる、タンパク質またはペプチド薬剤の実用的な徐放型製剤が望まれている。
薬効を持つタンパク質またはペプチドの徐放製剤は、製剤調製時、あるいは徐放中のタンパク質またはペプチドの変性、凝集による回収率低下が大きな問題である。ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等の生分解性高分子を基材にした徐放製剤も試みられているが、基材の疎水性、乾燥工程、ｐＨの低下に起因するタンパク質の変性、凝集が認められる（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．第８８巻、第１６６−１７３頁、１９９９年、およびＪ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  第１５巻、第６９９−７１３頁、１９９８年）。こうした問題が低減される親水性のハイドロゲルを基材に用いた徐放製剤も報告されているが実用化には至っていない。この原因は、タンパク質またはペプチドの封入率、回収率、および製剤に用いる基材の安全性の全てを実用化レベルで実現することが困難なためである。安全性の面からは、徐放基材として、非抗原性、非変異原性、無毒性、生分解性を併せ持つ素材でなければならない。
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である（式（ＩＩ））。
2004050712.tif 000002
ヒアルロン酸は、化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な医用生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）である。近年、微生物による高分子量ヒアルロン酸の大量生産が可能となり、変形性軟骨治療薬、化粧品等の分野でも実用化されている。
ヒアルロン酸を基材に用いた架橋方法、ヒアルロン酸ゲルからのタンパク質やペプチド薬物の徐放も多数報告されている。ヒアルロン酸を化学架橋でゲル化させる方法としては、カルボジイミド法（国際公開第９４／０２５１７号パンフレット）、ジビニルスルフォン法（特開昭６１−１３８６０１号公報）、グリシジルエーテル法（特開平５−１４０２０１号公報）、等が知られている。一般に、ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入する際、架橋後にタンパク質またはペプチドを導入する方法では、ヒアルロン酸とタンパク質またはペプチドとの相溶性、静電反発等の問題でその導入率は低い。一方でタンパク質またはペプチド存在下で、ｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を行うと高封入率でタンパク質またはペプチドを担持させられる利点がある。こうしたｉｎ  ｓｉｔｕ架橋により、ヒアルロン酸ゲル中にタンパク質またはペプチドを封入、徐放させることも報告されている（例えば、米国特許第５８２７９３７号明細書）が、こうした方法を用いてタンパク質またはペプチド存在下でヒアルロン酸をｉｎ  ｓｉｔｕ架橋すると、封入したタンパク質またはペプチドの回収率が低い点に問題がある。ヒドラジド基（ＨＺ）を導入したヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）をＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）からなる架橋剤で架橋する方法（国際公開９５／１５１６８号パンフレット、および国際公開第００／４４８０８号パンフレット）が報告されているが、生理条件下でのｉｎ  ｓｉｔｕ架橋を目的としているため、ｐＨ７．４−８．５で架橋反応を行っている。本発明者らによる検討では、この方法で得られるヒアルロン酸誘導体ゲルからの、タンパク質またはペプチドの回収率は低い。この原因は、架橋反応中にタンパク質またはペプチドの一部（主にアミノ基）が架橋剤と反応し、タンパク質が架橋してしまう点にある。
またゲル中に残った変性したタンパク質またはペプチドは、生物活性が低下しており、むしろ抗原性発現の原因になる等の問題がある。
封入した薬物が高回収率で放出されることは、医薬品として必須の条件であるが、タンパク質またはペプチドを反応させずにヒアルロン酸を化学架橋、ゲル化させる方法は知られていない。
一方、高回収率でタンパク質ペプチドを封入する方法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を基材に不飽和官能基を求核付加反応で架橋する報告もあるが（国際公開第００／４４８０８号パンフレット）、生分解性でないＰＥＧ断片が残存する問題がある。
【発明の開示】
上述したとおり、タンパク質またはペプチド存在下でその生物活性を維持したままｉｎ  ｓｉｔｕでヒアルロン酸を効率的に化学架橋する方法、高回収率を得られるヒアルロン酸の架橋方法、およびそのような方法により高封入率で製造され、高回収率を得られる、タンパク質またはペプチド徐放製剤は知られていない。
本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸（ＨＡ）にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を、ヒドラジド基と反応する官能基が、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して４０モル％以下の架橋剤量を用い、タンパク質またはペプチド共存下で、ｐＨ６．４以下の溶液中で架橋、ハイドロゲル化することで、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらを効率よく封入できることを見出し本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらをｉｎ  ｓｉｔｕ架橋し、ハイドロゲル中に封入したタンパク質またはペプチド徐放製剤に関するものであり、本発明の一つの側面によれば、ｐＨ６．４以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とするヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法が提供される。
ここで、ヒアルロン酸におけるヒドラジド基の導入は、特に限定はされるものではないが、好ましくは、ヒアルロン酸の少なくとも１以上のカルボキシル基を、置換ヒドラジド基、置換アミド基、またはエステル基に変換することにより、導入される。
ここで、置換ヒドラジド基または置換アミド基の置換基は、ヒドラジド基を有する置換基であれば特に限定されないが、例えば、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ヒドラジド基を有するポリアルキレンオキサイド基、ヒドラジド基を有するポリペプチド基、およびヒドラジド基を有するポリエステル基等が挙げられる。
また、エステル基としては、ヒドラジド基を有するエステル基であれば特に限定されないが、例えば、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキルエステル基、ヒドラジド基を有する直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキルエステル基、ヒドラジド基を有するポリアルキレンオキサイドエステル基、ヒドラジド基を有するポリペプチドを含むエステル基、およびヒドラジド基を有するポリエステル基等が挙げられる。
さらに、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体は、特に限定されるものではないが、好ましくは式（Ｉ）：
2004050712.tif 000003
（式中、Ｘ０は、−Ｎ（−Ｒ１）−、または−Ｏ−であり、
Ｒ１は、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｘ１は、−Ｙ１−Ｒ２−Ｙ２−ＮＨＮＨ２であり、
Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５、およびＲａ６は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルケニルカルボニル基、直鎖または分枝Ｃ１−６アルキニルカルボニル基、または−ＳＯ２ＯＨであり、
Ｙ１は、単結合、−Ｎ（−Ｒ３）ＣＯ−、−Ｎ（−Ｒ３）−、−ＣＯ−、または−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ２は、単結合、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキレン基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基であり、
Ｙ２は、単結合、−Ｎ（−Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯ−、または、−ＣＨ２ＣＯ−であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素原子、直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキル基、直鎖または分枝Ｃ１−１０ヒドロキシアルキル基、ポリアルキレンオキサイド基、ポリペプチド基、ポリエステル基である。）
で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体である。
さらに、式（Ｉ）において、Ｘ０は、好ましくは−Ｎ（−Ｒ１）−であり、Ｒ１は、好ましくは水素原子であり、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５、およびＲａ６は、好ましくは水素原子であり、Ｙ１は、好ましくは単結合、または、−ＣＯ−であり、Ｒ２は、好ましくは直鎖または分枝Ｃ１−１０アルキレン基であり、Ｙ２は、好ましくは、単結合、または、−ＣＯ−であり、Ｒ３は、好ましくは水素原子であり、Ｒ４は、好ましくは水素原子である。
また式（Ｉ）中、ポリアルキレンオキサイド基とは、−（ＣＨ（−Ｒ）ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＯＨ（式中、Ｒは水素原子、またはＣ１−５アルキル基）で示される基であり、好ましくは、ポリエチレンオキサイド基、ポリプロピレンオキサイド基であり、また好ましくはｎは、１−２０の整数である。またポリペプチド基は、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸１−２０個からなるものである。またポリエステル基は、特に限定されるものではないが、好ましくはポリグリコール酸基、ポリ乳酸基である。
本願発明の別の側面によれば、上記の方法により作製された、ヒアルロン酸ゲルが提供される。該ヒアルロン酸ゲルは、特に限定されるものではないが、ハイドロゲルであることが望ましい。
本願発明のさらに別の側面によれば、タンパク質又はペプチド存在下で、ｐＨ６．４以下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋することを特徴とする薬物徐放担体の製造方法が提供される。
該薬物徐放担体の製造方法は、好ましくは上記式（Ｉ）（Ｘ０、Ｘ１、Ｒａ２、Ｒａ３、Ｒａ４、Ｒａ５およびＲａ６については、上述のとおりである。）で示される繰り返し構造を、少なくとも１以上分子内に有するヒアルロン酸誘導体を、合成する工程、および、該ヒアルロン酸誘導体を、タンパク質またはペプチド存在下、ｐＨ６．４以下で化学架橋する工程、を含むものである。
本願発明のさらに別の側面によれば、上記の方法により作製された薬物徐放担体が提供され、さらに該薬物徐放担体を含む薬剤組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｐＨ４．８でゲル化した際の、ＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）による回収ＥＰＯの変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートである。
図２は、ＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）を１０％としてゲル化した際の、ｐＨ値による回収ＥＰＯの変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定結果である。
図３は、ＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）を１０％としてゲル化した際の、ｐＨ値によるＥＰＯ回収率の変化を示す、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の測定結果である。
図４は、ｐＨ４．８でゲル化した際の、ＨＺ基の導入率、およびＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）によるＥＰＯ回収率の変化を示すグラフである。
図５は、ＨＺ基の導入率、およびＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）によるＥＰＯ回収率の変化を示すグラフである。
図６は、ＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ基）が１０モル％の際の、ｐＨ値によるＥＰＯ回収率の変化を示すプロットである。
図７は、ｐＨ４．８、ＮＨＳ基の存在比（対  ＨＺ値）を２０％としてゲル化した際の、１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でのＥＰＯ累積放出率の経時変化を示すグラフである
発明を実施するための好ましい形態
以下、本発明を更に具体的に説明する。
本発明の薬物徐放担体の製造法は、タンパク質またはペプチド共存下の溶液中でヒアルロン酸にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体を化学架橋、ハイドロゲル化することを特徴とする。
本発明の薬物徐放担体は、以下のような優れた特徴を有している。
１．生分解性、生体に対する安全性を付与できる。
２．タンパク質の変性を防ぐことができる。
化学架橋とは、共有結合による、分子間または分子内架橋を含むものであり、同時に分子間および分子内架橋を有する場合もある。
本発明の薬物徐放担体は、ヒアルロン酸（ＨＡ）にヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体をタンパク質またはペプチド共存下で架橋することを特徴とする。架橋時のｐＨは、アミノ基に対するＨＺとの選択的反応性、タンパク質の変性等を考慮し、ｐＨ３．０〜ｐＨ６．４が好ましい。さらに好ましくは、ｐＨ３．５〜ｐＨ６．２、特に好ましくはｐＨ４．０〜６．０である。
一般的にタンパク質やペプチドのアミノ基のｐＫａ（−ＮＨ３＋  →  −ＮＨ２）は、９程度であるのに対し、ヒドラジド基（ＨＺ）の場合は、３程度である。これらの官能基が、スクシンイミジルエステル、アルデヒド基、ビニルスルフォン基等の求核的に反応しうる官能基と反応するには、反応点である窒素原子の不対電子が脱プロトン化されている必要がある。よって、架橋時のｐＨ、および導入されたヒドラジド基に対する架橋剤の量比を調製することで、架橋剤とヒドラジド基およびアミノ基との反応性を制御できると考えられる。
また、いかに架橋剤とヒドラジド基との選択的反応が進行しても、余剰の架橋剤が存在すれば反応性の低いアミノ基とも反応してしまう。そこで、本薬物徐放担体において、ヒドラジド基と反応する架橋剤中の官能基は、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して４０モル％以下であることが好ましく、さらに好ましくは２０モル％以下、特に好ましくは１０モル％以下である。
また、本薬物徐放担体において、その架橋剤中のヒドラジド基と反応する化合物官能基は、ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基に対して通常、０．１モル％以上であり、好ましくは１モル％以上であり、特に好ましくは３モル％以上である。
本発明でいう化学反応性を有するヒドラジド基とは、一般にアミノ基、ヒドラジド基の定量化に用いられるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）法で定量されるＨＺ基を言う。
架橋剤としては、ヒドラジド基と求核的または求電子的に反応しうる官能基を２以上有するものであれば特に限定されないが、例えば、スクシンイミジルオキシカルボニル基、イミドエステル基などの反応性の高いエステル基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、アリルハライド基、カルボジイミド基、スルホニルクロライド基、スルフォニルフルオライド基、アルデヒド基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、イミダゾリルカルボニル基、ビニルスルホン基、酸無水物、４−ニトロフェニルフォルメート基、エポキシド基、アルキルホスフェート基、カーボネート基、アクリルアジド基、フェニルアジド基等の官能基を同一分子内に２つ以上持つ分子が挙げられる。当該架橋剤の例には、ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ジスクシンイミジルグルタレート、ジスクシンイミジルタルトレート、エチレングリコールビス［スクシンイミジルスクシネート］などが含まれる。
さらに、架橋剤は水中で用いることができるように、水溶性を付与する置換基、例えば、スルホン酸基、ホスホン酸基などで置換されていてもよい。
ヒアルロン酸へのヒドラジド基の導入は当業者に公知の方法で行うことができ、ヒアルロン酸のカルボキシル基と２価のヒドラジド含有化合物（ジヒドラジド化合物）を、縮合剤を用いて縮合させることにより合成することができる。ジヒドラジド化合物としては、コハク酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジドが挙げられる。また、縮合剤としては、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが挙げられる。例えば、ヒアルロン酸のカルボン酸とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で縮合させ、ヒドラジド基で修飾されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を合成することが可能である。
ゲル調製液中の化学反応性を有するヒドラジド基のヒアルロン酸への導入率は特に限定されないが、流動性のないゲルを得るためにＨＡのグルクロン酸当たり３モル％以上、好ましくは５モル％以上である。
ヒアルロン酸誘導体と薬理作用を持つタンパク質またはペプチドとからなるハイドロゲルの調製方法としては、例えば、ヒアルロン酸誘導体とタンパク質またはペプチドを酢酸バッファーやリン酸緩衝生理食塩水等に溶解した後、ここに架橋剤を加えて均一分散させ室温等で約２時間反応させればよい。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、どのようにして得られたヒアルロン酸でもよく、動物組織から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。さらに、加水分解処理など、ヒアルロン酸にさらなる処理を行ってもよい。本発明のヒアルロン酸には、様々な方法で修飾された修飾ヒアルロン酸や、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩なども含有される。ヒアルロン酸はカルボキシル基とハイドロキシル基が修飾されることが多いが、本発明において修飾ヒアルロン酸はどの部分が修飾されていてもよい。修飾ヒアルロン酸は特に限定されず、どのような修飾がされていてもよいが、例えば、硫酸化されたヒアルロン酸（国際公開第９５／２５７５１号パンフレット）、Ｎ−硫酸化されたヒアルロン酸（国際公開９８／４５３３５号パンフレット）、エステル化されたヒアルロン酸（欧州特許出願公開第０２１６４５３、国際公開第９８／０８８７６号パンフレット、欧州特許出願公開第０３４１７４５号明細書）、過沃素酸酸化されたヒアルロン酸、アミド修飾されたヒアルロン酸などを挙げることができる。
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は特に限定されず、いかなる分子量のヒアルロン酸でも使用することが可能であるが、通常５０００〜３５０万ダルトン、好ましくは１万〜２００万ダルトンのヒアルロン酸を用いることができる。
薬効を持つタンパク質またはペプチドとしては特に限定されないが、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニューロトロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＦＧ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー等が挙げられる。
本発明の方法は、Ｇ−ＣＳＦのように分子中にメルカプト基が存在するようなタンパク質でも、タンパク質中のメルカプト基を反応させずにヒアルロン酸を架橋できる点で優れている。
本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、特に限定されないが、例えば、ハイドロゲルまたはオルガノゲルであってもよく、好ましくはハイドロゲルである。
本発明の徐放担体は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】ＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルの調製
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
逆相カラムによる高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、Ｗａｔｅｒｓ６００Ｓコントローラ、７１７ｐｌｕｓオートサンプラー、４８６紫外光吸収測定器（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、以下の測定条件より行った。
カラム：Ｃ４（粒子径  ５μｍ、サイズ  ４．６×２５０ｍｍ、ＶＹＤＡＣ製）
移動相Ａ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝４００／１００／１、
移動相Ｂ：水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸＝１００／４００／１
流速：１ｍＬ／分
移動相Ａ／Ｂ＝６５／３５〜０／１００のグラジエント溶出
カラム温度：室温付近
サンプル温度：４℃
検出波長：ＵＶ  ２８０ｎｍ
解析ソフト：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ｖｅｒ．３．２１
トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基の定量は、「学会出版センター  生物化学実験法１２  蛋白質の化学修飾＜上＞  初版」３７ページに記載の方法（ＴＮＢＳ法）に従った。ただし、ＴＮＢＳ溶液は０．５Ｍに調製し、ヒドラジド基を定量するために５００ｎｍの吸光度を測定した。
実施例１：ヒドラジド基（ＨＺ）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
〔実施例１−１〕
分子量２．５×１０４ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）５００ｍｇを１．０％濃度で蒸留水に溶解し、塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０モル比になるよう添加し、塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール水溶液、蒸留水で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）を得た。ＴＮＢＳ法で定量したところ、１０．０％であった。
〔実施例１−２〕
実施例１−１でＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０モル比の替わりにＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：１：４０モル比になるよう添加したこと以外は実施例１−１と同様の方法でヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を調製した。ＴＮＢＳ法で求めたＨＺ化率は２３．７％であった。
〔実施例１−３〕
実施例１−１でＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０モル比の替わりにＨＡ：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：５：４０モル比になるよう添加したこと以外は実施例１−１と同様の方法でヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を調製した。ＴＮＢＳ法で求めたＨＺ化率は３９．１％（ロット１）、４０．７％（ロット２）であった。
実施例２：ＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲル調製
（実施例２−１）
実施例１−１のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）（ＭＷ２５ＫＤ、ＴＮＢＳ法で求めたＨＺ化率は１０．０％）１１１．０１ｍｇを０．８８８ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液０．６４０ｍＬに対して、１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．０８０ｍＬを添加、混合し、均一溶液とした。更に８．７４ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を０．０８０ｍＬを加えて均一溶液とした。これを０．１００ｍＬずつ取り分け、架橋剤としてＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ＰＩＥＲＣＥ製）をヒドラジド基に対して、ＢＳ３／ＨＺ＝０．５、０．２、０．１、０．０５、および０、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対してＢＳ３に含まれるスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が１００、４０、２０、１０、および０モル％になるように０．７２５、０．２９０、０．１４５、０．０７２、および０ｍｇずつ１００ｍｇ／ｍＬの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で２時間反応させてＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
（実施例２−２）
実施例１−２のヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）、１１２．００ｍｇを０．８９６ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液０．６４０ｍＬに対して、１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．０８０ｍＬを添加、混合し、均一溶液とした。更に８．７４ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を０．０８０ｍＬを加えて均一溶液とした。これを０．１ｍＬずつ取り分け、架橋剤としてＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ＰＩＥＲＣＥ製）をヒドラジド基に対してＢＳ３／ＨＺ＝０．５、０．２、０．１、０．０５、および０、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、ＢＳ３に含まれるスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が、１００、４０、２０、１０、０モル％になるように１．６２９、０．６５２、０．３２６、０．１６３、０ｍｇずつ１００ｍｇ／ｍＬの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で２時間反応させてＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
（実施例２−３）
実施例１−３で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）（ロット１）、３１１．０１ｍｇを２．４８８ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液０．６４０ｍＬに対して、１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．０８０ｍＬを添加、混合し、均一溶液とした。更に８．７４ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を０．０８０ｍＬを加えて均一溶液とした。これを０．１ｍＬずつ取り分け、架橋剤としてＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ＰＩＥＲＣＥ製）をＨＺに対してＢＳ３／ＨＺ＝０．５、０．２、０．１、０．０５、０、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、ＢＳ３に含まれるスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が、１００、４０、２０、１０、０モル％になるように２．５４１、１．０１６、０．５０８、０．２５４、０ｍｇずつ１００ｍｇ／ｍＬの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で２時間反応させてＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
（実施例２−４）
実施例２−３の１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．０８０ｍＬの替わりに１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）０．０８０ｍＬを添加する他は、前述の実施例２−３と同様の方法でＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
（実施例２−５）
実施例２−３の１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．０８０ｍＬの替わりに１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）０．０８０ｍＬを添加する他は、前述の実施例２−３と同様の方法でＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
（実施例２−６）
実施例１−３で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）（ロット２）、８４．３０ｍｇを０．６７４４ｍＬの蒸留水に溶解した。これを０．０４０ｍＬずつ４つに取り分け、それぞれに対して、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．２、６．４、６．６および６．８）を０．００５ｍＬ、及び８．５７ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を０．００５ｍＬを添加、混合し、均一溶液とした。これらに、架橋剤としてＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート、ＰＩＥＲＣＥ製）をヒドラジド基に対してＢＳ３／ＨＺ＝０．０５、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対して、ＢＳ３に含まれるスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が、１０モル％になるように０．１３２ｍｇずつ１００ｍｇ／ｍＬの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で２時間反応させてＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルを得た。
実施例３：ＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルのＥＰＯ回収率測定
（実施例３−１）
実施例２−１〜５で調製したＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルに対して、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．５）０．０２０ｍＬ、ならびにヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ＳＤ、生化学工業製）溶液（１ユニット／ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０、０．０１％ＢＳＡを含む）０．１００ｍＬを添加して、３７℃で２日間、酵素処理を行った。一部のゲルに対しては、更にヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ＳＤ）溶液を追加して、ゲルを完全に分解させた。酵素処理後の溶液０．０３０ｍＬを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１２０ｍＬと混合し、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）測定を行い、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中ＥＰＯ濃度を算出した。添加したＥＰＯ量（０．０８７４ｍｇ／ゲル１個）に対してＲＰ−ＨＰＬＣより求めたＥＰＯ量を回収率として算出した。
実施例２−３で調製した５つのサンプルについてのＲＰ−ＨＰＬＣの測定結果を図１に示す。標準溶液の測定よりＥＰＯの保持時間は１９．７８９分および２１．４８４分であり、各サンプルにおいてＥＰＯのピークが観測された。また、実施例２−１〜３についての測定結果を表１および図４に示す。この結果は、ヒアルロン酸に導入されたヒドラジド（ＨＺ）基に対して、スクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が１０〜２０％程度となるような条件での架橋反応は、ＥＰＯに大きな影響を与えないことを示している。
実施例２−３〜５の各々で５つずつ調製した計１５個のサンプルのうち、ヒドラジド（ＨＺ）基に対するスクシンイミド（ＮＨＳ）基の存在比が１０モル％となる条件のものについてのＲＰ−ＨＰＬＣの測定結果を図２（クロマトグラム）、表２（数値）、および図５（グラフ）に示す。この結果は、ｐＨ７．４の場合に対してｐＨ６．０およびｐＨ４．８の場合は、ＥＰＯの回収率が有意に向上していることを示している。
（実施例３−２）
実施例２−６で調製したＥＰＯ封入ヒアルロン酸ハイドロゲルに対して、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ６．５）０．０１０ｍＬ、ならびにヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ＳＤ、生化学工業製）溶液（１ユニット／ｍＬ、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ  ６．０、０．０１％ＢＳＡを含む）０．０５０ｍＬを添加して、３７℃で１日間、酵素処理を行った。酵素処理後の溶液０．０３０ｍＬを、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１２０ｍＬと混合し、試料溶液とした。試料溶液は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）測定を行い、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中ＥＰＯ濃度を算出した。添加したＥＰＯ量（０．０４２８ｍｇ／ゲル１個）に対してＲＰ−ＨＰＬＣより求めたＥＰＯ量を回収率として算出した。
実施例２−６で調製した４つのサンプルについてのＲＰ−ＨＰＬＣの測定結果を図３（クロマトグラム）、表３（数値）、および図６（グラフ）に示す。この結果は、ＥＰＯの回収率は架橋反応条件におけるｐＨの変化によって有意に変化すること、該回収率はｐＨ６．０〜６．８付近で大きく変化すること、さらに約ｐＨ６．４以下のｐＨ値が架橋反応の条件として好ましいことを示している。
実施例４：ＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出実験
（実施例４−１）
実施例１−３で調製したヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）（ロット２）、１１７．４４ｍｇを０．９３９５ｍＬの蒸留水に溶解した。この溶液に対して、１Ｍ酢酸水溶液（ｐＨ  ４．８）０．１１７４ｍＬを添加、混合し、均一溶液とした。更に８．５７ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を０．１１７４ｍＬを加えて均一溶液とした。これを０．１ｍＬずつ取り分け、架橋剤としてＢＳ３（ＰＩＥＲＣＥ製）をヒドラジド基に対してＢＳ３／ＨＺ＝０．１、すなわち化学反応性を有するヒドラジド基に対してスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）基が２０モル％になるように０．５２６ｍｇずつ１００ｍｇ／ｍＬの水溶液として添加し、速やかに均一混合した。これを室温で２時間反応させてＥＰＯ封入ＨＡハイドロゲルを得た（ｎ＝４）。
４つのうち、１つのゲルは、実施例３−１と同様の処理を行い、封入されたＥＰＯ量を求めた。３つのゲルは、各々１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍＬを添加して密封し、３７℃の恒温相中で穏やかに振とうすることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物放出実験を行った。３７℃での振とう開始後、１、３、６、２０、４４、１１６、１６４、２１２、２９０、３５７時間に溶出液を０．２ｍＬ採取した。採取後、新たに１５０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）０．２ｍＬを加えて、放出実験を継続した。採取した溶出液を試料溶液として、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）測定を行い、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＰＯ水溶液を標準溶液として、標準溶液と試料溶液のピークエリア比から試料溶液中ＥＰＯ濃度を算出した。放出されたＥＰＯ量を算出し、累積放出量をＥＰＯ封入量に対する累積放出率として算出した。
ＥＰＯの累積放出率（％、平均値±標準偏差、ｎ＝３）を表４（数値）および図７（グラフ）に示す。この結果は、ＥＰＯ封入ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲルからのＥＰＯの徐放期間は約１２日間であり、封入量の８５％が放出されたことを示している。
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【産業上の利用の可能性】
本発明の薬物徐放担体は、タンパク質、ペプチドの生物活性を維持したままこれらをｉｎ  ｓｉｔｕ化学架橋、ヒアルロン酸誘導体ハイドロゲル中に封入でき、優れた回収率でタンパク質、ペプチドの徐放を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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