(57)【要約】ｍ−カルパインまたはμ−カルパインが、膵臓β細胞において糖代謝関連遺伝子の発現に関与する転写因子ネットワークを形成する、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）、ヘパトサイトヌクレアーファクター１α（ＨＮＦ−１α）およびインシュリンプロモーターファクター１（ＩＰＦ−１）を分解することを見出し、これら転写因子の分解方法；分解阻害方法；分解阻害剤；これらが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤および産生促進方法；これら転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法；カルパインによるこれら転写因子分解を阻害する化合物の同定方法；該同定方法で得られた化合物；さらにカルパイン、これら転写因子、これら転写因子をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムの存在下、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。
【請求項２】
カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の転写因子分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。
【請求項３】
カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。
【請求項４】
糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の分解方法。
【請求項５】
カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を共存させることを特徴とする、ＨＮＦ−４αの分解方法。
【請求項６】
カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとヘパトサイトヌクレアーファクター１α（ＨＮＦ−１α）を共存させることを特徴とする、ＨＮＦ−１αの分解方法。
【請求項７】
カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとインシュリンプロモーターファクター１（ＩＰＦ−１）を共存させることを特徴とする、ＩＰＦ−１の分解方法。
【請求項８】
カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項９】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１０】
カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１１】
少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む生体外試料をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１２】
少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している細胞をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１３】
細胞が哺乳動物に担持されている細胞である請求の範囲第１２項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１４】
哺乳動物に担持されている細胞が膵臓β細胞である請求の範囲第１３項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１５】
カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる１つ以上の物質である請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１６】
カルパインインヒビターが、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ、４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ２ＣｌまたはＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯである請求の範囲第１５項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１７】
カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１８】
カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する３つ以上のアミノ酸残基からなり、且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第１１項から第１４項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項１９】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位がＬｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−ＭｅｔおよびＶａｌ−Ａｒｇからなる群より選ばれるものである請求の範囲第１８項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項２０】
カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである請求の範囲第８項から第１９項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項２１】
糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第８項から第２０項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。
【請求項２２】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするヘパトサイトヌクレアーファクター４αの分解阻害方法。
【請求項２３】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするヘパトサイトヌクレアーファクター１αの分解阻害方法。
【請求項２４】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするインシュリンプロモーターファクター１の分解阻害方法。
【請求項２５】
カルパインを活性成分として有効量含んでなる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。
【請求項２６】
カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである請求の範囲第２５項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。
【請求項２７】
糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第２５項または第２６項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。
【請求項２８】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるヘパトサイトヌクレアーファクター４αの分解剤。
【請求項２９】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるヘパトサイトヌクレアーファクター１αの分解剤。
【請求項３０】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるインシュリンプロモーターファクター１の分解剤。
【請求項３１】
カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３２】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３３】
カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３４】
カルパイン活性を阻害する物質を活性成分として有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３５】
カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる１つ以上の物質である請求の範囲第３４項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３６】
カルパインインヒビターが、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ、４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ２ＣｌまたはＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯである請求の範囲第３５項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３７】
カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第３４項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤。
【請求項３８】
カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する３つ以上のアミノ酸残基からなり且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである請求の範囲第３４項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項３９】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位がＬｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−ＭｅｔおよびＶａｌ−Ａｒｇからなる群より選ばれるものである請求の範囲第３８項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項４０】
カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである請求の範囲第３１項から第３９項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。
【請求項４１】
糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第３１項から第４０項のいずれか１項に記載の分解阻害剤。
【請求項４２】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α分解阻害剤。
【請求項４３】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター１α分解阻害剤。
【請求項４４】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、インシュリンプロモーターファクター１分解阻害剤。
【請求項４５】
糖代謝関連遺伝子の転写因子をカルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項４６】
カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである請求の範囲第４５項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項４７】
ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの転写因子をｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項４８】
糖代謝関連遺伝子がインシュリン遺伝子またはグルコーストランスポーター２遺伝子である請求の範囲第４５項から第４７項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。
【請求項４９】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項５０】
カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである請求の範囲第４９項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項５１】
ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項５２】
糖代謝関連遺伝子がインシュリン遺伝子またはグルコーストランスポーター２遺伝子である請求の範囲第４９項から第５１項のいずれか１項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項５３】
カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法。
【請求項５４】
カルシウム濃度によりヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法。
【請求項５５】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項５６】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。
【請求項５７】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。
【請求項５８】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項５９】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６０】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６１】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６２】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６３】
請求の範囲第８項から第２４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項６４】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。
【請求項６５】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。
【請求項６６】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。
【請求項６７】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６８】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項６９】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７０】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７１】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法。
【請求項７２】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項７３】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤。
【請求項７４】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤。
【請求項７５】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤。
【請求項７６】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項７７】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項７８】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項７９】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項８０】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項８１】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤。
【請求項８２】
請求の範囲第３１項から第４４項のいずれか１項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項８３】
請求の範囲第２３項に記載の分解阻害方法を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項８４】
請求の範囲第４３項に記載の分解阻害剤を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および／または治療方法。
【請求項８５】
請求の範囲第４３項に記載の分解阻害剤を有効量含んでなる、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止剤および／または治療剤。
【請求項８６】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子切断を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインによる該転写因子の分解を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項８７】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子の切断を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子量または該転写因子分解物量を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項８８】
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインと該転写因子の結合を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインと該転写因子の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項８９】
カルパインが、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインである請求の範囲第８６項から第８８項のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項９０】
糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである請求の範囲第８６項から第８９項のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項９１】
請求の範囲第８６項から第９０項のいずれか１項に記載の同定方法で同定された化合物。
【請求項９２】
カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、カルパインにより分解される糖代謝関連遺伝子の転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キット。
【請求項９３】
カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つ、並びにヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１およびこれらいずれかをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。
【請求項９４】
カルパインが、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインである請求の範囲第９２項または第９３項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解剤、分解阻害方法および分解阻害剤に関する。より詳しくは、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４α、以下ＨＮＦ−４αと略称する。）、ヘパトサイトヌクレアーファクター１α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  １α、以下ＨＮＦ−１αと略称する。）およびインシュリンプロモーターファクター１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  １、以下ＩＰＦ−１と略称する。）の分解方法、分解剤、分解阻害方法および分解阻害剤に関する。より具体的にはカルパイン（ｃａｌｐａｉｎ）、好ましくはｍ−カルパインまたはμ−カルパインを用いることを特徴とするＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１の分解方法および分解剤に関する。また、カルパイン、好ましくはｍ−カルパインまたはμ−カルパインによるＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１の分解阻害方法および分解阻害剤に関する。さらに、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１のうちの少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法および産生促進剤に関する。また、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１のうちの少なくとも１つの分解に起因する疾患、例えば糖尿病の防止方法および／または治療方法並びに防止剤および／または治療剤に関する。さらに、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１のカルパインによる分解を阻害する化合物の同定方法および該同定方法により同定された化合物に関する。また、カルパイン、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１α、ＩＰＦ−１、これらのいずれかをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】  カルパイン（ＥＣ  ３．４．２２．１７）は、カルシウム依存性システインプロテアーゼであり、蛋白質を限定的に切断してその構造や機能を変化させる酵素である。カルパインには、構造的特徴、組織局在およびカルシウム要求性などによって分類される多くのアイソザイムが知られており、これらからなるスーパーファミリーを構成している。
ｍ−カルパインは、カルパインスーパーファミリーの１つであり、カルパイン２とも呼ばれ、多くの組織で発現している（非特許文献１）。ｍ−カルパインは１ｍＭ程度のカルシウム濃度で活性化され、酵素活性を発現する。
μ−カルパインは、カルパイン１とも呼ばれ、ｍ−カルパインと同様に多くの組織で発現している（非特許文献１および２）。μ−カルパインは、ｍ−カルパインと比較してカルシウム要求性が低く、数十μＭ程度のカルシウム濃度で活性化され、その酵素活性を発現する。
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインにより分解される蛋白質としては、ｐ５３やレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）など多くの転写因子が報告されている（非特許文献３〜５）。カルパインにより分解される蛋白質には、カルパインによって優先的に切断されるアミノ酸モチーフが存在する（非特許文献６）。例えば、ロイシン残基（Ｌｅｕ）またはバリン残基（Ｖａｌ）などの疎水性アミノ酸残基に続く、チロシン残基（Ｔｙｒ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）またはアルギニン残基（Ａｒｇ）とそれに続くアミノ酸残基との間で切断される。現在、いくつかのカルパイン阻害剤が市販されているが、このような切断モチーフを含むアミノ酸配列からなるペプチドＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯがｍ−カルパインの競合阻害剤として知られている（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、非特許文献７）。またＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯは、μ−カルパインの競合阻害剤として知られている（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社、非特許文献８）。その他、不可逆的カルパイン阻害剤であるＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ（非特許文献９）、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ（非特許文献１０）およびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−クロロメチルケトン（Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）（非特許文献１１）、可逆的カルパイン阻害剤である４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ（非特許文献１２）などが市販されている（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）。
カルパインは細胞機能の調節に関与しているため、カルパインの活性制御の不全やその遺伝子の欠損などにより種々の疾患が引き起こされる。例えば、いくつかの糖尿病モデル動物では組織のカルパイン活性が亢進している（非特許文献１３および１４）。カルパイン阻害剤により膵島におけるグルコースに対するインシュリン分泌応答が増強されたことから、インシュリンの分泌と作用の調節へのカルパインの関与が示唆されている（非特許文献１５）。また、カルパイン１０遺伝子の変異と２型糖尿病罹患率との間の関連性が指摘されている（非特許文献１６および１７）。
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインについては、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、脳卒中および白内障に関与していることが示唆されている（非特許文献２）。
一方、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１はいずれも転写因子としての機能を有し、種々の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーに結合し、当該遺伝子の転写を活性化することが知られている。これらは例えば、膵臓のβ細胞において転写因子ネットワークを形成し（非特許文献１８）、グルコーストランスポーター２（以下ＧＬＵＴ２と略称することもある。）、インシュリンおよびグルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御すると考えられる。
ＨＮＦ−４αは核内レセプターであり、膵臓のβ細胞、肝臓、腎臓および小腸で発現し、コレステロール、脂肪酸およびグルコースなどの代謝や肝臓の発生および分化に関与する物質をコードする種々の遺伝子の転写因子であることが知られている。ＨＮＦ−４αは、膵臓のβ細胞における上記転写因子ネットワークにおいて、特にＨＮＦ−１αのポジティブレギュレーターとして機能し、インシュリン、ＧＬＵＴ２およびグルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御する（非特許文献１８〜２３）。従来、ＨＮＦ−４αのインシュリン遺伝子発現に対する作用は、ＨＮＦ−１αレベルの上昇を介した間接的なものであると考えられてきた。しかし、ＨＮＦ−４αが、インシュリン遺伝子プロモーター内で新規に見出されたシスエレメント（ｃｉｓ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、直接的にその発現を調節することが報告された（非特許文献２４）。
ＨＮＦ−４α遺伝子については、遺伝性２型糖尿病ＭＯＤＹ１（Ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  １）の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献２５および２６）。
さらに、ＨＮＦ−４α結合部位に自然変異を有するヒト遺伝子が、今までに複数同定されている。プロモーター内のＨＮＦ−４α結合部位に変異を有する変異体が見出されている遺伝子の１つは、上述のＨＮＦ−１αをコードする遺伝子である。ＨＮＦ−１αプロモーターにおけるＨＮＦ−４α結合部位の変異によりＨＮＦ−４αがプロモーターに結合せず、その結果ＨＮＦ−１αの発現が低減し、遺伝性２型糖尿声ＭＯＤＹ３が惹起される（非特許文献２７）。
かかる遺伝子としてはその他に、血液凝固に関与する因子である第ＶＩＩ因子および第ＩＸ因子をそれぞれコードする遺伝子が挙げられる。第ＩＸ因子遺伝子のプロモーターにおけるＨＮＦ−４α結合部位の変異は血友病の原因となる（非特許文献２８および２９）。また、第ＶＩＩ因子遺伝子のプロモーターにおけるＨＮＦ−４α結合部位の変異は重症第ＶＩＩ因子欠損症（ｓｅｖｅｒｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）の患者で認められている（非特許文献３０）。
ＨＮＦ−１αはトランスクリプションファクター１（ＴＣＦ−１）とも呼ばれ、膵臓のβ細胞、肝臓および腎臓などで発現し、多くの肝特異的遺伝子、例えばアルブミン、フィブリノーゲンやα１アンチトリプシンなどの遺伝子発現を調節していることが知られている。ＨＮＦ−１αは、膵臓のβ細胞における上記転写因子ネットワークにおいて、ＩＰＦ−１やＨＮＦ−４αの転写を制御している（非特許文献２１）。また、ＨＮＦ−１αが、ＧＬＵＴ２およびインシュリンなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることを示唆するデータが開示されている（非特許文献２２）。例えば、ＨＮＦ−１αはＧＬＵＴ２遺伝子のプロモーター領域に結合してその転写活性を亢進した（非特許文献２２）。また、ＨＮＦ−１αはインシュリン遺伝子のプロモーターのＡ３領域に結合してその転写活性を亢進した（非特許文献３１）。その他、ドミナントネガティブ体のＨＮＦ−１αが膵臓β細胞株でインシュリン分泌を低下させたことが報告されている（非特許文献３２）。
ＨＮＦ−１α遺伝子については、遺伝性２型糖尿病ＭＯＤＹ３（Ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  ３）の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献３３）。
ＨＮＦ−１αはまた、肝細胞腺腫（ｌｉｖｅｒ  ａｄｅｎｏｍａ）との関連も指摘されている。例えば、アミノ変異によるＨＮＦ−１αの不活性化が肝細胞腺腫の原因となることが示された（非特許文献３４）。また、ＨＮＦ−１αのノックアウトマウスにおいて肝細胞の異常増殖による著しい肝肥大が認められた（非特許文献３５）。肝細胞腺腫は肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）へ形質転換する危険性を有する腫瘍なので、ＨＮＦ−１αの不活性化は肝細胞腺腫、ひいては肝細胞癌を誘発すると考えられる。
ＩＰＦ−１はパンクレアス・デュオディナムホメオボックス１（Ｐａｎｃｒｅａｓ／ｄｕｏｄｅｎｕｍ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １；ＰＤＸ−１）などとも呼ばれ、膵臓のβ細胞およびδ細胞で発現している。ＨＮＦ−４αのプロモーター領域Ｐ２にはＩＰＦ−１結合部位が存在し、その変異が糖尿病の発症と相関することが報告されている（非特許文献３６）。また、ＩＰＦ−１がＧＬＵＴ２（非特許文献３７）、インシュリン（非特許文献３８）、およびグルコキナーゼ（非特許文献３９）などの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることを示唆するデータが開示されている。ＧＬＵＴ２遺伝子にはＩＰＦ−１が直接作用してその発現に関与する（非特許文献３７）。
ＩＰＦ−１遺伝子については、遺伝性２型糖尿病ＭＯＤＹ４（Ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ  ４）の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献４０）。
以下に、本明細書で引用した文献を列記する。
特許文献１：国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット。
非特許文献１：反町洋之、「生化学」２０００年、第７２巻、第１１号、ｐ．１２９７−１３１５。
非特許文献２：Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，「ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２００１年，第７巻，ｐ．３５５−３６２。
非特許文献３：Ｍａｔｓｕｓｉｍａ−Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９６年，第２２５巻，ｐ．９４６−９５１。
非特許文献４：Ｐａｒｉａｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９７年，第１７巻，ｐ．２８０６−２８１５。
非特許文献５：Ｗａｔｔ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ，，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」１９９３年，第２１巻，ｐ．５０９２−５１００。
非特許文献６：Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９８４年，第２５９巻，ｐ．１２４８９−１２４９４。
非特許文献７：Ｒａｖｉｄ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２０００年，第２７５巻，ｐ．３５８４０−３５８４７。
非特許文献８：Ｄｅｂｉａｓｉ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」１９９９年，第７３巻，ｐ．６９５−７０１。
非特許文献９：Ｄｕｔｔ，ｐ．ｅｔ  ａｌ．，「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ」１９９８年，第４３６巻，ｐ．３６７−３７１。
非特許文献１０：Ｅｓｓｅｒ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，「Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ」１９９４年，第３７巻，ｐ．２３６−２４７。
非特許文献１１：Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９８６年，第９９巻，ｐ．１７３−１７９。
非特許文献１２：Ｎａｔｈ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」２０００年，第２７４巻，ｐ．１６−２１。
非特許文献１３：Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１９８３年，第２４４巻，第３号，ｐ．Ｃ１７５−１８１。
非特許文献１４：Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ」１９８９年，第３６巻，第６号，ｐ．８３３−８４４。
非特許文献１５：Ｓｒｅｅｍａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｓ」２００１年，第５０巻，ｐ．２０１３−２０２０。
非特許文献１６：Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２０００年，第２６巻，ｐ．１６３−１７５。
非特許文献１７：Ｂａｉｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ」２０００年，第１０６巻，ｐ．Ｒ６９−７３。
非特許文献１８：Ｓｈｉｈ，Ｄ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」２００１年，第９８巻，ｐ．１４１８９−１４１９１。
非特許文献１９：「ＢＩＯ  Ｃｌｉｎｉｃａ」２００２年，第１７巻，ｐ．４１０−４１４。
非特許文献２０：Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」１９９７年，第９４巻，ｐ．１３２０９−１３２１４。
非特許文献２１：Ｓｈｉｈ，Ｄ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」２００１年，第５０巻，ｐ．２４７２−２４８０。
非特許文献２２：Ｂａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」２００２年，第５１巻，ｐ．１４０９−１４１８。
非特許文献２３：Ｃａｈ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２００１年，第３３巻，第２号，ｐ．５９−６３。
非特許文献２４：Ｂａｒｔｏｏｖ−Ｓｈｉｆｍａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」２００２年，第２７７巻，第２９号，ｐ．２５９１４−２５９１９。
非特許文献２５：Ｒｙｆｆｅｌ，Ｇ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」２００１年，第２７巻，ｐ．１１−２９。
非特許文献２６：「臨床病理」２００１年、第４９巻、第２号、ｐ．１６１−１６４。
非特許文献２７：Ｇｒａｇｎｏｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」１９９７年，第４６巻，ｐ．１６４８−１６５１。
非特許文献２８：Ｓｌａｄｅｋ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ」２００１年，ｐ．３０９−３６１  Ｅｄｓ．ＴＢ  Ｂｕｒｒｉｓ  ＆  ＥＲＢ  ＭｃＣａｂｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ。
非特許文献２９：Ｍａｒｌｅｎｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ」１９９２年，第８９巻，ｐ．６３００−６３０３。
非特許文献３０：Ｃａｒｅｗ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「ＢＬＯＯＤ」２０００年，第１５巻，ｐ．４３７０−４３７２。
非特許文献３１：Ｏｋｉｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」１９９９年，第２６３巻，ｐ．５６６−５６９。
非特許文献３２：Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，「ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ」１９９８年，第１７巻，第２２号，ｐ．６７０１−６７１３。
非特許文献３３：Ｙａｍａｇａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ」１９９６年，第３８４巻，ｐ．４５５−４５７。
非特許文献３４：Ｂｌｕｔｅａｕ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２００２年，第３２巻，ｐ．３１２−３１５。
非特許文献３５：Ｐｏｎｔｏｇｌｉｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｅｌｌ」１９９６年，第８４巻，ｐ．５７５−５８５。
非特許文献３６：Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，，「Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２００１年，第１０巻，第１９号，ｐ．２０８９−２０９７。
非特許文献３７：Ｗａｅｂｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」１９９６年，第１０巻，ｐ．１３２７−１３３４。
非特許文献３８：Ｏｈｌｓｓｏｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，「ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ」１９９３年，第１２巻，ｐ．４２５１−４２５９。
非特許文献３９：Ｗａｔａｄａ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」１９９６年，第４５巻，ｐ．１４７８−１４８８。
非特許文献４０：Ｓｔｏｆｆｅｒｓ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」１９９７年，第１７巻，ｐ．１３８−１４１。
非特許文献４１：Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９８３年，第２１９巻，ｐ．６６６−６７１。
非特許文献４２：「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、１９７５年。
非特許文献４３：「ペプチド合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（米国）、インターサイエンス、１９９６年。
非特許文献４４：Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｉａｂｅｔｅｓ」２０００年，第４９巻，ｐ．１８４０−１８４８。
非特許文献４５：Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」２０００牟，第５巻，ｐ．２６９−２７３。
【発明の開示】
本発明においては、カルパインと相互作用する蛋白質を見出し、カルパインによる当該蛋白質の分解に起因する疾患の防止手段および／または治療手段を提供すべく種々の検討を重ねた。その結果、カルパインが転写因子の１つであるＨＮＦ−４αと相互作用することをインシリコで予測し、さらにカルパインによるＨＮＦ−４αの分解を実験的に証明した。さらに、ＨＮＦ−４αと膵臓β細胞において転写因子ネットワークを形成するＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１がカルパインにより分解されることを見出して、本発明を完成した。
すなわち本発明の一態様は、カルシウムの存在下、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。
また本発明の一態様は、カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の転写因子分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、前記いずれかの分解方法に関する。
また本発明の一態様は、カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）を共存させることを特徴とする、ＨＮＦ−４αの分解方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとヘパトサイトヌクレアーファクター１α（ＨＮＦ−１α）を共存させることを特徴とする、ＨＮＦ−１αの分解方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルシウムの存在下、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインとインシュリンプロモーターファクター１（ＩＰＦ−１）を共存させることを特徴とする、ＩＰＦ−１の分解方法に関する。
また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む生体外試料をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している細胞をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、細胞が哺乳動物に担持されている細胞である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、哺乳動物に担持されている細胞が膵臓β細胞である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる１つ以上の物質である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインインヒビターが、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ、４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ２ＣｌまたはＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する３つ以上のアミノ酸残基からなり、且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位がＬｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−ＭｅｔおよびＶａｌ−Ａｒｇからなる群より選ばれるものである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするヘパトサイトヌクレアーファクター４αの分解阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはＡｔ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするヘパトサイトヌクレアーファクター１αの分解阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とするインシュリンプロモーターファクター１の分解阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインを活性成分として有効量含んでなる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。
また本発明の一態様は、カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。
さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるヘパトサイトヌクレアーファクター４αの分解剤に関する。
また本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるヘパトサイトヌクレアーファクター１αの分解剤に関する。
さらに本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを活性成分として有効量含んでなるインシュリンプロモーターファクター１の分解剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質を活性成分として有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる１つ以上の物質である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパインインヒビターが、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ、４−フルオロフェニルスルホニル（Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ２ＣｌまたはＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号１から３のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する３つ以上のアミノ酸残基からなり且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位がＬｅｕ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｍｅｔ、Ｌｅｕ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−ＭｅｔおよびＶａｌ−Ａｒｇからなる群より選ばれるものである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである、前記いずれかの分解阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α分解阻害剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター１α分解阻害剤に関する。
また本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインの活性を阻害することを特徴とする、インシュリンプロモーターファクター１分解阻害剤に関する。
さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子をカルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。
また本発明の一態様は、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの転写因子をｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。
さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子がインシュリン遺伝子またはグルコーストランスポーター２遺伝子である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
また本発明の一態様は、カルパインがｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
さらに本発明の一態様は、ｍ−カルパインおよび／またはμ−カルパインによるヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子がインシュリン遺伝子またはグルコーストランスポーター２遺伝子である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
また本発明の一態様は、カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルシウム濃度によりヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクタ−１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つの分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インシュリン遺伝子および／またはグルコーストランスポーター２遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および／または治療剤に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。
また本発明の一態様は、前記分解阻害方法を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および／または治療方法に関する。
さらに本発明の一態様は、前記分解阻害剤を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および／または治療方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記分解阻害剤を有効量含んでなる、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止剤および／または治療剤に関する。
また本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子切断を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインによる該転写因子の分解を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子の切断を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子量または該転写因子分解物量を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインと該転写因子の結合を可能にする条件下、カルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインと該転写因子の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。
また本発明の一態様は、カルパインが、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインである前記いずれかの同定方法に関する。
さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１から選ばれる少なくとも１つである前記いずれかの同定方法に関する。
さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの同定方法で同定された化合物に関する。
また本発明の一態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、カルパインにより分解される糖代謝関連遺伝子の転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。
さらに本発明の一態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つ、並びにヘパトサイトヌクレアーファクター４α、ヘパトサイトヌクレアーファクター１αおよびインシュリンプロモーターファクター１およびこれらいずれかをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
さらにまた本発明の一態様は、カルパインが、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインである前記試薬キットに関する。
【図面の簡単な説明】  第１図はｍ−カルパインまたはμ−カルパインによるＨＮＦ−４α（配列番号１）の切断認識部位を示す。アミノ酸配列は１文字表記し、切断認識部位は下線で示した。
第２図はｍ−カルパインまたはμ−カルパインによるＨＮＦ−１α（配列番号２）の切断認識部位を示す。アミノ酸配列は１文字表記し、切断認識部位は下線で示した。
第３図はｍ−カルパインまたはμ−カルパインによるＩＰＦ−１（配列番号３）の切断認識部位を示す。アミノ酸配列は１文字表記し、切断認識部位は下線で示した。
第４図はｍ−カルパインとＨＮＦ−４αの相互作用をインシリコで予測した結果を示す。第４図Ａはヒトｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４α（配列番号１）とのローカルアライメントの結果、高いスコアを示した領域を表示した。第４図Ｂはウサギｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４α（配列番号１）とのローカルアライメントの結果、高いスコアを示した領域を表示した。アミノ酸配列は１文字表記した。
第５図はウサギｍ−カルパインがインビトロでヒトＨＮＦ−４αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。第５図Ａおよび第５図Ｂはそれぞれ、抗ＨＮＦ−４α抗体および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。図中の＋および−は各組成の有無を示す。矢頭はＨＮＦ−４αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第６図はヒトｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４αが細胞内で結合したことを説明する。レーン１はｍ−カルパイン（ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加）とＨＮＦ−４α（Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ付加）を共発現させた細胞試料、レーン２はｍ−カルパイン（ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加）のみを発現させた細胞試料である。第６図Ａおよび第６図Ｂはそれぞれ、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いたウエスタンブロッティング（Ｂｌｏｔ）の結果を示す。図中、ＩＰは抗ＨＮＦ−４α抗体を用いて免疫沈降を行なったことを、ｌｙｓａｔｅは免疫沈降していない細胞試料を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第７図はヒトｍ−カルパインがインビトロでヒトＨＮＦ−４αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒトｍ−カルパインとカルパインスモールサブユニット１とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒトｍ−カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセートおよびライセート無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラットｍ−カルバインを用いた。図中の＋および−はカルシウムの有無を示している。図は抗ＨＮＦ−４α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、矢頭はＨＮＦ−４αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第８図はヒトμ−カルパインがインビトロでヒトＨＮＦ−４αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。図中の＋および−はカルシウムの有無を示している。陽性対照としてウサギｍ−カルパインおよびラットｍ−カルパインを用いた。図は抗ＨＮＦ−４α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、矢頭はＨＮＦ−４αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第９図はイオノフォアの添加により細胞内でＨＮＦ−４αが分解されたことを説明する。第９図Ａおよび第９図Ｂはそれぞれ、核画分および細胞質画分におけるＨＮＦ−４αの分解を示す。図は抗ＨＮＦ−４α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、矢頭はＨＮＦ−４αの分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１０図はヒトμ−カルパイン、ウサギｍ−カルパインおよびラットｍ−カルパインが、インビトロでヒトＨＮＦ−１αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。対照は、カルパイン無添加の試料を表わす。図中の＋および−はカルシウムの有無を示している。上図および下図はそれぞれ、抗Ｏｍｎｉ／Ｍ２１抗体および抗ＨＮＦ−１α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、矢頭はＨＮＦ−１αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１１図はヒトｍ−カルパインがインビトロでヒトＨＮＦ−１αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒトｍ−カルパインとカルパインスモールサブユニット１とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒトｍ−カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセート（図中ではコントロールｓｆ−９細胞ライセートと表示。）およびライセート無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラットｍ−カルパインを用いた。図中の＋および−はカルシウムの有無を示している。図は抗ＨＮＦ−１α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、矢頭はＨＮＦ−１αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１２図はイオノフォアの添加により細胞内でＨＮＦ−１αが分解されたことを説明する。図は抗ＨＮＦ−１α抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、アスタリスク（＊）はＨＮＦ−１αの分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１３図はヒトμ−カルパイン、ウサギｍ−カルパインおよびラットｍ−カルパインが、インビトロでヒトＩＰＦ−１をカルシウム存在下で分解したことを説明する。対照は、カルパイン無添加の試料を表わす。図中の＋および−はカルシウムの有無を示す。第１３図Ａおよび第１３図Ｂはそれぞれ、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体および抗ＩＰＦ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。矢頭およびアスタリスク（＊）はそれぞれ、ＩＰＦ−１のバンドおよびカルパインによるＩＰＦ−１の分解物を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１４図はヒトｍ−カルパインがインビトロでヒトＩＰＦ−１をカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒトｍ−カルパインとカルパインスモールサブユニット１とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒトｍ−カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセート（図中ではコントロールｓｆ−９細胞ライセートと表示。）およびライセート無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラットｍ−カルパインを用いた。図中の十および−はカルシウムの有無を示している。図は抗ＩＰＦ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果である。矢頭およびアスタリスク（＊）はそれぞれ、ＩＰＦ−１のバンドおよびカルパインによるＩＰＦ−１の分解物を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
第１５図はイオノフォアの添加により細胞内でＩＰＦ−１が分解されたことを説明する。図は抗ＩＰＦ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、アスタリスク（＊）はＩＰＦ−１の分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第２００２−２５４９７３号、同第２００３−９６３７０号、同第２００３−９６３７１号および同第２００３−９６３７２号からの優先権を請求するものである。
本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。
以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。
本発明においては、ｍ−カルパインとＨＮＦ−４αが相互作用することを特許文献１記載の方法に従ってインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で予測した。さらに実験的に、ｍ−カルパインがＨＮＦ−４αと結合すること、およびｍ−カルパインがＨＮＦ−４αを分解することを初めて明らかにした。また、ｍ−カルパインと同じくカルパインスーパーファミリーに属するμ−カルパインが同様にＨＮＦ−４αを分解することを見出した。ｍ−カルパインがＨＮＦ−４αと結合してこれを分解すること、およびμ−カルパインがＨＮＦ−４αを分解することから、μ−カルパインもＨＮＦ−４αに結合すると考えられる。
さらに、ＨＮＦ−４αと同様、糖代謝関連遺伝子の転写因子として作用するＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１がｍ−カルパインおよびμ−カルパインのいずれによっても分解されることを見出した。
カルパインによる切断認識部位のアミノ酸モチーフから、ＨＮＦ−４α（配列番号１）はｍ−カルパインまたはμ−カルパインにより、下記４箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第１図）：アミノ酸配列第７９番目のバリン（Ｖ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くリジン（Ｋ）との間；第２１１番目のロイシン（Ｌ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くアラニン（Ａ）との間；第３０２番目のロイシン（Ｌ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くセリン（Ｓ）との間；および第３８４番目のロイシン（Ｌ）に続くメチオニン（Ｍ）とそれに続くグルタミン（Ｑ）との間。
ＨＮＦ−１α（配列番号２）はｍ−カルパインまたはμ−カルパインにより、下記９箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第２図）：アミノ酸配列第１６２番目のロイシン（Ｌ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くトレオニン（Ｔ）との間；第１６７番目のバリン（Ｖ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くリジン（Ｋ）との間；第２６２番目のバリン（Ｖ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くバリン（Ｖ）との間；第２６４番目のバリン（Ｖ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くアスパラギン（Ｎ）との間；第３２０番目のバリン（Ｖ）に続くアルギニン（Ｒ）とそれに続くアミノ酸残基（不確定であるが、チロシンであるという報告がある）との間；第４１１番目のバリン（Ｖ）に続くメチオニン（Ｍ）とそれに続くトレオニン（Ｔ）との間；第４７６番目のロイシン（Ｌ）に続くメチオニン（Ｍ）とそれに続くプロリン（Ｐ）との間；第５０２番目のロイシン（Ｌ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くセリン（Ｓ）との間；および第５９７番目のロイシン（Ｌ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くグルタミン（Ｑ）との間。
ＩＰＦ−１（配列番号３）はｍ−カルパインまたはμ−カルパインにより、下記３箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第３図）：アミノ酸配列第１３番目のロイシン（Ｌ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くリジン（Ｋ）との間；第３６番目のロイシン（Ｌ）に続くチロシン（Ｙ）とそれに続くメチオニン（Ｍ）との間；および第１８１番目のバリン（Ｖ）に続くメチオニン（Ｍ）とそれに続くロイシン（Ｌ）との間。
本明細書においては、アミノ酸を１文字表記または３文字表記することがある。また、ペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを意味し、オリゴマーとも称する単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドなどの短鎖ペプチド、並びに単離された若しくは合成の完全長ポリペプチドや単離された若しくは合成の完全長蛋白質などの長鎖ペプチドを包含する。
このように本発明においては、転写因子としての機能を有するＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１が、カルパインにより分解されることを明らかにした。ＨＮＦ−４αは、コレステロール、脂肪酸およびグルコースの代謝や血液凝固などの様々な機能に関与する物質をコードする種々の遺伝子発現を調節している。ＨＮＦ−１αは、多くの肝特異的遺伝子、例えばアルブミン、フィブリノーゲンやα１アンチトリプシンなどの遺伝子発現を調節している。また、ＩＰＦ−１は、ＧＬＵＴ２、インシュリンおよびグルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることが報告されている。転写因子の分解による減少は、それが作用する遺伝子の発現を低減させ、ひいては該遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患に繋がる生体機能の異常を引き起こす。したがって、これら転写因子がそれぞれ作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および治療が、カルパインによる該転写因子の分解を阻害することにより可能になる。
ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１は、それら機能の１つにおいて、膵臓β細胞における転写因子ネットワークを形成し、糖代謝関連遺伝子発現に関与していることが知られている。糖代謝関連遺伝子とは、生体において糖代謝（糖吸収、糖輸送および糖分解など）を調節している物質をコードする遺伝子のことであり、例えばインシュリン、グルコキナーゼ、ＧＬＵＴ２などが挙げられる。これら糖代謝関連遺伝子の発現に係わる転写因子の減少や機能欠損は、膵臓β細胞において転写因子ネットワークの破綻を招き、その結果糖代謝異常を引き起こして糖尿病などの疾患の原因になると考えられる。
糖代謝関連遺伝子の転写因子の減少や機能欠損の原因の１つとして、例えばその分解が挙げられる。糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害することにより、該転写因子の減少や機能欠損に起因する疾患、あるいは該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および／または治療が可能になる。
これら知見により達成した本発明の１態様は、カルパインを用いることを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法および分解剤に関する。
糖代謝関連遺伝子の発現に係わる転写因子としては、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１が例示できる。本発明に係る分解方法を適用し得る糖代謝関連遺伝子の転写因子はこれら具体例に限らず、カルパインにより分解されるものである限りにおいて、何れにも適用可能である。カルパインによる分解の検出は、カルパインと転写因子とをカルシウム存在下で接触させた後にウエスタンブロット法などの公知方法を使用して実施可能である。
カルパインはカルパインスーパーファミリーに属するプロテアーゼを全て包含する。カルパインスーパーファミリーに属するプロテアーゼとしては、ｍ−カルパイン、μ−カルパイン、カルパイン３、カルパイン５、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２およびカルパイン１３などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはｍ−カルパインまたはμ−カルパインである。μ−カルパインはｍ−カルパインと比較してカルシウム要求性が低く、より低濃度のカルシウムで活性化される。そのため、μ−カルパインはｍ−カルパインと比較してカルシウム濃度上昇により活性化され易く、生体内で主に作用している可能性が考えられることから、より好ましくはμ−カルパインである。これら各プロテアーゼを使用するときは、これらを単独で用いてもよいし、２つ以上を組合せて用いることもできる。またカルパインは、１種類の蛋白質を特異的に分解するものに限らず、複数の蛋白質、例えば複数の転写因子の分解に関与するものであってもよい。
本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解剤は、カルパインをその活性成分として有効量含んでなる。
本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法は、カルパインと該転写因子を共存させることを特徴とする。
カルパインはカルシウム依存性プロテアーゼであるため、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の共存はカルシウム存在下で行なうことが好ましい。カルシウム濃度は、カルパインのカルシウム要求性を考慮し、カルパインを活性化してそれらの酵素活性を誘発できる濃度を用いる。例えば、ｍ−カルパインを活性化するためには、好ましくは約１ｍＭ以上のカルシウム濃度が好適である。μ−カルパインを活性化するためには、好ましくは約１０μＭ以上、より好ましくは約２０μＭ以上、さらに好ましくは約３０μＭ以上のカルシウム濃度が好適である。また、カルパインによるＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１の分解はカルシウム依存性であったことから、カルシウム濃度を調節することによりカルパインによるこれら糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を所望の程度に調節することができる。かかるカルシウム濃度の調節を特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法も本発明の範囲に包含される。また、カルパインと転写因子の１つまたは２つ以上とを少なくとも含んでなり、カルパインと該転写因子とを共存させることを特徴とする該転写因子の分解系の構築およびその利用も、本発明において可能である。
糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法および分解系は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。より具体的には、カルパインと転写因子を、例えば試験管内やマルチウエルプレート内で、カルシウムの存在下で共存させて分解させる分解方法および分解系が例示できる。あるいは、カルパインと転写因子を共発現させた細胞を用いた分解方法および分解系を例示できる。発現に用いる細胞は、蛋白質の発現のために一般的に使用されている細胞を使用可能である。これら蛋白質の発現は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実現することができる。かかる細胞を用いた分解方法および分解系において、細胞内カルシウム濃度を調節する、例えばカルパインが活性化する濃度に調節するためには、イオノフォアの使用が好適である。イオノフォアは、Ａ２３１８７など公知のものを用いることができる。また、非ヒト動物にカルパインをコードする遺伝子、さらに糖代謝関連遺伝子の転写因子をコードする各遺伝子を自体公知の遺伝子工学的手法を用いて導入することにより、非ヒト動物における該転写因子の分解方法および分解系を提供することが可能である。
本発明において使用するカルパインおよび糖代謝関連遺伝子の転写因子は、これらの１つまたは２つ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、これら蛋白質は、それらのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質やペプチドなどを、直接的にまたはリンカーペプチドなどを介して間接的に、遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との相互作用およびこれら蛋白質の機能、例えばカルパインと該転写因子の接触、カルパインの酵素活性および転写因子の機能などが阻害されないような標識化が望ましい。標識物質としては、例えば酵素類（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼなど）、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇなど）、蛍光蛋白質類〔グリーン蛍光蛋白質、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）など〕、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片、またはビオチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは放射性同位元素による標識も可能である。標識化するとき、１種類の標識物質を付加してもよいし複数を組合せて付加することもできる。これら標識物質自体またはその機能を測定することにより、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を検出することが可能である。遺伝子導入に用いるカルパインおよび転写因子をそれぞれコードする遺伝子は、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。これら遺伝子を適当な発現ベクターＤＮＡ、例えば細菌プラスミド由来のベクターなどに自体公知の遺伝子工学的手法で導入し、上記各遺伝子を含有するベクターを得て、遺伝子導入に利用することができる。遺伝子導入は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて実施可能である。
糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解剤、分解方法および分解系は、該転写因子の機能解明や該転写因子が関与する転写因子ネットワークについての研究、および該転写因子の分解に起因する疾患、例えば糖尿病における該転写因子やカルパインの関与についての分子レベルでの研究などに有用である。また、当該分解方法および分解系を用いて、当該転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法を構築することも可能である。
本発明の別の１態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤および阻害方法に関する。当該阻害剤および阻害方法は、カルパイン活性を阻害すること、またはカルパインによる当該転写因子の切断を阻害すること、あるいはカルパインと当該転写因子の結合を阻害することを特徴とする。
カルパイン活性の阻害またはカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断の阻害は例えば、カルパインの酵素活性を阻害することにより実施できる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤は、１態様において、カルパイン活性を阻害する物質の少なくとも１つを活性成分として有効量含んでなる。また、本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害方法は、１態様において、カルパイン活性を阻害する物質の少なくとも１つを用いることを特徴とする。本発明に係る阻害剤および阻害方法を適用する対象物としては、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む対象物、例えば少なくともこれらを含む生体外試料が挙げられる。転写因子としては、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１が好ましく例示でき、これらのうち少なくとも１つとカルパインとを含む生体外試料が対象物としてより好ましい。また、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している細胞、例えば膵臓β細胞など、並びにかかる細胞を担持している哺乳動物なども当該対象物に含まれる。
カルパイン活性を阻害する効果を有する物質としては、拮抗阻害効果を有するペプチド類、抗体および低分子化合物などが例示できる。具体的には、カルパインインヒビターとして知られているＮ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＣＨＯ、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＣＨ２Ｆ、Ｍｕ−Ｖａｌ−ＨＰｈ−ＣＨ２Ｆ、４−フルオロフェニルスルホニル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＣＨ２ＣｌまたはＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＣＨＯなどが例示できる。抗体としては、カルパインまたは糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識して結合する抗体であって、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する抗体が挙げられる。かかる抗体としてさらに好ましくは、当該転写因子の機能、例えば転写因子活性を阻害しないものが好適である。抗体は、カルパインまたは当該転写因子自体、これら由来の部分ペプチド、あるいはこれらが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを抗庫として自体公知の抗体作製法により得ることができる。低分子化合物としては、カルパインの酵素活性を阻害する化合物、好ましくは該酵素活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。かかる化合物は、例えば、本発明に係る分解方法または分解系を利用して、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害するものを同定することにより得ることができる。カルパインを特異的に阻害するとは、カルパインを強く阻害するが、他の酵素は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断の阻害はまた、カルパインと該転写因子との結合を阻害することにより実施できる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子分解の阻害剤は、１態様において、カルパインと該転写因子との結合を阻害する物質の少なくとも１つを活性成分として有効量含んでなる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子分解の阻害方法は、１態様において、カルパインと該転写因子との結合を阻害する物質の少なくとも１つを用いることを特徴とする。カルパインと当該転写因子との結合の阻害は、例えば両蛋白質が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて実施可能である。かかるペプチドとして、当該転写因子のアミノ酸配列においてカルパインにより切断される部位、すなわち切断部認識位のアミノ酸配列を含むペプチドが例示できる。例えば、ｍ−カルパインまたはμ−カルパインの切断認識部位のアミノ酸配列は、ＬＹ、ＬＭ、ＬＲ、ＶＹ、ＶＭまたはＶＲであると考えられる。このような切断認識部位のアミノ酸配列を少なくとも１つ含むペプチドが好ましい。かかるペプチドは、カルパインによる当該転写因子分解を競合的に阻害すると考えられる。より好ましくは、当該転写因子のアミノ酸配列、例えば配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列のうちの連続する３つ以上のアミノ酸残基からなり、且つカルパインの切断認識部位のアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。
カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合の阻害はまた、カルパインと該転写因子の結合部位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて実施可能である。具体的には、ｍ−カルパインの基質となるＨＮＦ−４α由来のかかるペプチド、例えばペプチドＹＫＬＬＰＧ（配列番号５、実施例１および第４図を参照）または該ペプチドを含むペプチドは、両蛋白質の相互作用を競合的に阻害すると考えられる。
上記ペプチドは、カルパインまたは糖代謝関連遺伝子の転写因子のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、カルパインによる該転写因子の切断および／またはカルパインと該転写因子の結合を阻害するものを選択することにより得ることができる。
このように特定されたペプチドに１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入などの変異を導入したものも、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の結合を阻害する限りにおいて、本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したペプチドは、さらにカルパインによる当該転写因子の切断を阻害するものが好ましい。変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入などの変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献４１）を利用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性など）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸など）の間での相互置換は容易に想定される。
カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害し得るペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基などを、例えばアミド化修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。特に、ペプチドと他の蛋白質との結合を安定化し、ペプチドを解離し難くするために通常よく使用される修飾、例えばＣ末端のアルデヒド化またはＮ末端のアセチル化などの修飾は、カルパインと当該転写因子の結合を阻害するペプチドの有効性を高めるために有用である。
上記ペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、公知文献に記載の方法（非特許文献４２および非特許文献４３）が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。
本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤は、その１態様において、該転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなる。このとき、当該転写因子分解の阻害剤は、１種類の転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなる阻害剤であることができる。また、各転写因子に対するかかる阻害物質を複数組合せて含有する阻害剤であることもできる。より具体的には、例えばＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αまたはＩＰＦ−１αとカルパインとの結合阻害物質、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αまたはＩＰＦ−１αのカルパインによる切断阻害物質、カルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを活性成分として有効量含有してなることが好ましい。
本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害方法は、その１態様において、該転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを用いることを特徴とする。このとき、当該転写因子分解の阻害方法においては、１種類の転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを用いることができ、また、各転写因子に対するかかる阻害物質を複数組合せて用いることもできる。より具体的には、例えばＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αまたはＩＰＦ−１αとカルパインとの結合阻害物質、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αまたはＩＰＦ−１αのカルパインによる切断阻害物質、カルパイン活性阻害物質の少なくとも１つを用いることが好ましい。
本発明のまた別の１態様は、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法に関する。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法は、それらをコードする遺伝子の発現に係る転写因子のカルパインによる分解を調節して、該遺伝子の遺伝子産物の産生を調節することを特徴とする。
糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法の１態様は、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法であり、該遺伝子発現に係る転写因子のカルパインによる分解を阻害することを特徴とする。当該産生促進方法は具体的には、当該転写因子の分解阻害剤または当該転写因子の分解阻害方法を使用することにより達成できる。上記分解阻害剤を含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤も本発明の範囲に包含される。
糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法の別の１態様としては、カルシウム濃度を調節して該因子の発現に係る転写因子の分解程度を所望の程度に調節することにより、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生を調節する方法が挙げられる。カルシウム濃度を高濃度にしてカルパインを活性化させることにより糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子を分解することができるため、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の産生を低下させることができる。カルシウム濃度を低濃度にしてカルパインの酵素活性を減弱させることにより、該転写因子の分解を阻害することができるため、当該遺伝子産物の産生を促進することができる。
糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物としては、例えば、該転写因子の結合部位をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子の遺伝子産物が挙げられる。具体的には、ＨＮＦ−４αが作用する遺伝子として、ＨＮＦ−４α結合部位をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子、例えばインシュリン遺伝子、ＨＮＦ−１α遺伝子、血液凝固第ＶＩＩ因子遺伝子、および血液凝固第ＩＸ因子遺伝子などが挙げられる。ＨＮＦ−１αが作用する遺伝子として、ＨＮＦ−１α結合部位をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子、例えば、インシュリン遺伝子、ＧＬＵＴ２遺伝子、ＨＮＦ−４α遺伝子およびＩＰＦ−１遺伝子などが挙げられる。ＩＰＦ−１が作用する遺伝子として、ＩＰＦ−１結合部位をプロモーターまたはエンハンサー内に有する遺伝子、例えば、ＧＬＵＴ２遺伝子などが挙げられる。
本発明のさらに別の１態様は、糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤、並びに当該疾患の防止方法および／または治療方法に関する。当該疾患の防止剤および／または治療剤は、上記分解阻害剤を含んでなる。当該疾患の防止方法および／または治療方法は、上記分解阻害剤または上記分解阻害方法を使用することにより達成できる。
糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患としては、例えば該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患が挙げられる。例えばＨＮＦ−４αはインシュリン遺伝子に作用し該遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。ＨＮＦ−１αはインシュリン遺伝子およびＧＬＵＴ２遺伝子に作用し、これら遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、ＨＮＦ−１αとＨＮＦ−４αは互いの遺伝子に転写因子として作用し、その遺伝子産物産生を促進することにより、さらにインシュリン遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、ＩＰＦ−１は、ＧＬＵＴ２遺伝子に作用し遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、ＩＰＦ−１はＨＮＦ−４αに転写因子として作用してその発現を促進するため、ＨＮＦ−４αの産生促進を介してインシュリン遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。
糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患として具体的には、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患、例えばインシュリンやＧＬＵＴ２の減少に起因する疾患などが例示できる。より具体的には、糖代謝異常による疾患、例えば糖尿病などが挙げられる。
実際、マウスの膵臓ランゲルハンス島にカルパイン阻害剤を暴露させるとグルコース刺激によるインシュリン分泌が増加することが報告されている（非特許文献１５）。しかし、この報告においては、カルパインと糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子との関連については開示されていない。また、膵島においては、高血糖状態が持続すると細胞内カルシウム濃度が上昇し、グルコース刺激性インシュリン分泌の脱感作が起こる（非特許文献４４）。
本発明における知見とこれら情報から、長期の高血糖による細胞内カルシウム濃度の上昇によりカルパインが活性化され、その結果糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子が分解されるために、膵臓β細胞での転写因子ネットワークが破綻して糖代謝の異常が起き、ひいては２型糖尿病と同様の病態が誘発されるというカスケードが存在すると考えられる。
したがって本発明によれば、上記カスケードにおいてカルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解を阻害できるため、糖代謝の正常化を図り、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患、例えば糖尿病を防止および／または治療可能である。
ＨＮＦ−４αは、糖代謝関連遺伝子以外の遺伝子にも転写因子として作用することが知られている。例えば、ＨＮＦ−４α結合部位が血液凝固第ＶＩＩ因子遺伝子または第ＩＸ因子遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー部位に存在することが知られている。このことから、これら各遺伝子の遺伝子産物欠乏に起因する出血性疾患、例えば血友病や重症第ＶＩＩ因子欠損症がＨＮＦ−４α分解により引き起こされると考えられ、これら疾患の防止および／または治療に本発明に係る分解阻害剤または分解阻害方法が有用である。
ＨＮＦ−１αは、その不活化が肝細胞腺腫の原因となることが報告されている（非特許文献３４）。このことから、肝細胞腺腫ひいてはそれが形質転換した肝細胞癌がＨＮＦ−１α分解により引き起こされると考えられ、これら疾患の防止および／または治療に本発明に係る分解阻害剤または分解阻害方法が有用である。
本発明のまた別の１態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。また、本発明に係る分解系または分解方法を利用して、該同定方法を実施可能である。被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはカルパインおよび糖代謝関連遺伝子の転写因子の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物などが挙げられる。あるいは、当該転写因子のカルパインによる切断認識部位のペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物なども被検化合物として好適である。
具体的には、カルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の切断を可能にする条件を選択し、当該条件下でカルパインおよび／または該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子の分解を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する化合物を同定できる。カルパインによる転写因子の切断を可能にする条件としては、例えばカルパインを活性化する濃度のカルシウムの存在下であることが挙げられる。また、該条件はインビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、カルパインと当該転写因子を共発現させた細胞を用いることもできる。カルパインおよび／または当該転写因子と被検化合物の接触は、カルパインによる当該転写因子の分解反応の前に行なってもよいし、分解反応に共存させることにより行なってもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカーとはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子など、または検出用のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇなど、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれを用いることもできる。これらシグナルまたはマーカーは、単独で使用してもよく、２つ以上を組合せて用いてもよい。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。簡便には、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解は、該転写因子または該転写因子分解物量の存在若しくは不存在および／または変化の測定により検出できる。当該転写因子量または当該転写因子分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング法などを用いて実施できる。あるいは、当該転写因子の分解の検出は、当該転写因子活性の存在若しくは不存在および／または変化の測定により行なうことができる。具体的には、例えば、インシュリン遺伝子に作用する転写因子であるときには、該転写因子とカルパインとを発現している細胞に、インシュリン遺伝子のプロモーター領域をその上流に組み込んだレポーター遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、被検化合物とこの細胞を接触させた場合のレポーター遺伝子の発現量を、当該被検化合物と接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することにより、所望の化合物の同定を行なうことができる。ＧＬＵＴ２遺伝子に作用する転写因子であるときには、該転写因子とカルパインとを発現している細胞に、ＧＬＵＴ２遺伝子のプロモーター領域をその上流に組み込んだレポーター遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、同様に化合物の同定を実施できる。これら具体例に限らず、カルパインにより分解される転写因子が作用する遺伝子のプロモーター領域を組込んだレポーター遺伝子を用いて、化合物の同定が可能である。
その他、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の結合を可能にする条件を選択し、当該条件下でカルパインおよび／または転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する化合物を同定できる。カルパインと当該転写因子の結合の検出は、自体公知の検出方法、例えばウェスタンブロッティング法などを用いて実施できる。
かかる同定方法で得られた化合物は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤あるいは該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤として利用可能である。当該転写因子の分解阻害剤または該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。医薬組成物の調製において、これら阻害剤および促進剤は、単独で使用することもできるし、複数を組合せて使用することも可能である。
本発明に係る医薬組成物は、通常は１種または２種以上の医薬用担体を用いて製造することが好ましい。医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製することもできる。
本発明に係る医薬組成物は、糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤として使用することができる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用することができる。
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて用量を変更することができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。腫瘍疾患に用いる場合は、腫瘍に注射などにより直接投与することが好ましい。
投与形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリンなどの包接体、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ＰＥＧなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
本発明のさらに別の１態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチド、カルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つと、糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１つとを含んでなる試薬キットに関する。試薬キットに含まれる転写因子としては好ましくは、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１が例示できる。当該転写因子は複数種類を組合せて試薬キットに含有させることもできる。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用可能である。
また、上記ペプチドおよび上記同定方法で得られた化合物からなる試薬およびこれらを含む試薬キットも本発明の範囲に包含される。
試薬キットは、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、これらの検出剤、反応希釈液、緩衝液、洗浄剤および反応停止液など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
これら試薬および試薬キットは、例えば糖代謝関連遺伝子の転写因子ネットワークについての研究および該転写因子の機能不全や分解に起因する疾患、例えば糖尿病における該転写因子やカルパインの関与についての分子シベルでの研究などに有用である。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】（ｍ−カルパインと相互作用する蛋白質のインシリコでの探索）
ｍ−カルパインと相互作用する蛋白質を、特許文献１記載の方法に従って予測した。まず、ｍ−カルパインのアミノ酸配列をある長さのペプチドに分解し、各ペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持つた蛋白質をデータベース中で検索した。ついで、得られた蛋白質とｍ−カルパインとの間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをｍ−カルパインと相互作用すると予測した。
解析の結果、ｍ−カルパイン由来の６アミノ酸残基からなるペプチドＦＫＬＰＰＧ（配列番号４）と相同性のあるペプチドＹＫＬＬＰＧ（配列番号５）が、肝遺伝子の発現を制御することが知られている核転写因子の一つであるＨＮＦ−４αのアミノ酸配列中に存在することが分かった（第４図ＡおよびＢ）。第４図Ａはヒトｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４αとのローカルアライメントの結果を、第４図Ｂはウサギｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４αとのローカルアライメントの結果を示す。ここにおいて、アミノ酸配列は１文字表記するものである。この結果から、ＨＮＦ−４αはｍ−カルパインと相互作用する蛋白質であると予測された。なお、ウサギｍ−カルパインについてＮＣＢＩデータベースに登録された配列情報には、ヒトｍ−カルパインの２７９番目のアミノ酸残基以降の配列に相当する領域しか記載がないが、この領域での同一性は９４％であることから、２７８番目以前のアミノ酸配列についてもウサギｍ−カルパインはヒトｍ−カルパインとほぼ同等と考えられる。
【実施例２】（ウサギｍ−カルパインによるヒトＨＮＦ−４αの分解）
ＨＮＦ−４αのｍ−カルパインによる分解を、ウサギｍ−カルパインを用いたインビトロ分解試験で検討した。
＜材料＞
ＨＮＦ−４α発現プラスミドを以下のように構築した。まず、ヒトＨＮＦ−４α  ｃＤＮＡを、ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により獲得した。ＰＣＲエラーと思われる塩基置換はＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＳＴＡＲＡＴＡＧＥＮＥ社）により修正した。その後、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇおよびＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＥｃｏＲＩサイトで組込み、ＨＮＦ−４α発現プラスミドを構築した。クローニングしたＨＮＦ−４α  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＸＰ＿００９５１４（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ。）と同一であった。なお、アクセッション番号ＸＰ＿００９５１４は、２００３年よりＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのアクセッション番号Ｐ４１２３５に変更されている。
ＨＮＦ−４α発現プラスミドを用い、インビトロでのＨＮＦ−４α蛋白質の合成を、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して行なった。すなわち、ＨＮＦ−４α発現プラスミドとＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを混合し、メチオニン存在下で３０℃にて１．５時間インキュベーションしてＨＮＦ−４αを合成した。
＜方法＞
インビトロにおける蛋白質分解試験は、合成したＨＮＦ−４αにウサギの筋肉より抽出したｍ−カルパイン（ＰＲＯＴＥＡＳＥ，Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｎｅｕｔｒａｌ，ｃａｌｐａｉｎ，Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃にて１時間インキュベーションすることにより行なった。また、カルシウム非存在下での分解試験を行なうために、６ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の２×ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファー〔４％  ＳＤＳ／１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／２０％  グリセロール／０．０１％  ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）／１０％  β−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）〕を加えて５分間加熱し、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＨＮＦ−４α抗体／ＨＮＦ−４α（Ｃ−１９）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてウェスタンブロッティング法によりＨＮＦ−４αを検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用して行なった。
＜結果＞
第５図ＡおよびＢに示したように、ウサギｍ−カルパインによるＨＮＦ−４αの分解が認められた。一方、ＨＮＦ−４αはカルシウム非存在下またはｍ−カルパイン無添加では分解されなかった。ウサギｍ−カルパインとヒトｍ−カルパインは約９４％の高い相同性を有することから、ヒトｍ−カルパインも同様にＨＮＦ−４αを分解すると考えられる。以上の結果から、ＨＮＦ−４αはｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例３】（ヒトｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４αの結合解析）
ｍ−カルパインとＨＮＦ−４αの結合を、細胞内共発現／免疫沈降法による結合試験により検討した。
＜材料＞
ｍ−カルパイン発現プラスミドの構築は以下のように行なった。まず、カルパイン  ｃＤＮＡを、ヒト肝ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＲＴ−ＰＣＲにより獲得した。ＰＣＲエラーと思われる塩基置換はＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔにより修正した。その後、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミド、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＡＲＡＴＡＧＥＮＥ社）へＳａｌ−Ｉサイトで組込み、ｍ−カルパイン発現プラスミドを構築した。クローニングしたｍ−カルパイン  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＡＡ３５６４５（登録遺伝子名はＣＡＰＮ２。）と、７３番目および７４番目のアミノ酸がメチオニン−アルギニン（ＭＲ）からイソロイシン−グルタミン酸（ＩＥ）に置換されている以外は同一であった。このＩＥへの置換はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（Ｐ１７６５５）においてコンフリクト（Ｃｏｎｆｌｉｃｔ）の記載がある。
ヒトＨＮＦ−４α発現プラスミドは、実施例２で調製したものを用いた。
＜方法＞
まず、ｍ−カルパイン遺伝子とＨＮＦ−４α遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共遺伝子導入した。具体的には、細胞数１．３×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２の存在下で４時間培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、５μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミドまたは陰性対照としてｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓプラスミドを５μｇのｍ−カルパイン発現プラスミドと共に、ＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてトランスフェクションした。２日間培養後、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（−）〔以下、ＰＢＳ（−）と称する。〕で細胞を洗浄し、５００μｌの細胞溶解バッファー〔２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭＥＤＴＡ／１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）〕に懸濁し、氷上で２０分間放置した。その後、４℃にて１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心処理し、その上清を回収して細胞ライセート（ｃｅｌｌｌｙｓａｔｅ）とした。次に、採取したライセートに、０．１％の牛血清アルブミンを含むＴＢＳ（ｐＨ８．０）で前処理したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を１８μｌ添加し、４℃にて２時間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に抗ＨＮＦ−４α抗体／ＨＮＦ−４α（Ｃ−１９）抗体を０．６μｇ添加し、４℃で１時間転倒混和後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを２０μｌ加え、さらに４℃で１時間転倒混和した。その後、遠心処理によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを回収し、５００μｌの洗浄バッファー〔５０ｍＭ  Ｔｒｓｉ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．２％  ノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）〕で３回洗浄した後、３０μｌの２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加えて５分間加熱後、上清を１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用いてウェスタンブロッティング法により結合した蛋白質を検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して行なった。
＜結果＞
第６図Ａに示したように、抗ＨＮＦ−４α抗体による免疫沈降（図中ＩＰと表示）において、ｍ−カルパイン（ＦＬＡＧ−ｔａｇ付加）は、ＨＮＦ−４α（Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ付加）と共発現させた試料（図中レーン１）でのみ共沈した。ＨＮＦ−４α非発現細胞ではｍ−カルパインの共沈降は認められなかった。このことから、この共沈降はアガロースビーズへの非特異的結合によるものではなく、ＨＮＦ−４αとｍ−カルパインの結合を示すものであることが明らかになった。両試料におけるｍ−カルパインの発現が同程度であることは、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体によるウェスタンブロッティングの結果により確認した（第６図Ａのｌｙｓａｔｅ参照）。また、細胞内のＸｐｒｅｓｓ−ＨＮＦ−４αが抗ＨＮＦ−４α抗体により回収されることは、第６図Ｂに示した結果から確認できた。
【実施例４】（ヒトｍ−カルパインによるＨＮＦ−４αの分解）
ヒトｍ−カルパインによるヒトＨＮＦ−４αの分解について検討するために、ヒトｍ−カルパイン発現昆虫細胞ライセートを用いてインビトロ分解試験を実施した。
＜材料＞
ヒトＨＮＦ−４αは、実施例２と同様の方法で、ＨＮＦ−４α発現プラスミドを用いて作製したものを用いた。
ヒトｍ−カルパインは、昆虫細胞で発現させたものを用いた。まず、ヒトｍ−カルパイン  ｃＤＮＡを実施例３と同様に調製した。また、カルパインスモールサブユニット１  ｃＤＮＡ（ｃａｌｐａｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ  １  ｃＤＮＡ）をヒト骨格筋ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより配列を確認した。カルパインスモールサブユニット１  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＮＰ＿００１７４０（登録遺伝子名はＣＡＰＮＳ１。）と同一であった。蛋白質発現はバキュロウイルスを用いた昆虫細胞（夜盗蛾ｓｆ−９細胞）発現系にて行なった。すなわち、各々のｃＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組込み、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｓｆ−９細胞にｍ−カルパインおよびカルパインスモールサブユニット１を共発現させた。これら蛋白質を発現させたｓｆ−９細胞は、冷却したＰＢＳ（−）で洗浄後、凍結融解により破砕した。ついで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを添加し、氷中で超音波処理した後に遠心処理（１５，０００ｒｐｍで３０分間）し、その上清を活性体試料（細胞ライセートと称する。）とした。また、蛋白質非発現ｓｆ−９細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートのｍ−カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献４５）。また、陽性対照としてラットｍ−カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ  ２、ｒａｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いた。
＜方法＞
インビトロ蛋白質分解試験は、ＨＮＦ−４αにｍ−カルパイン、ラットｍ−カルパインまたはカルパイン非発現ｓｆ−９細胞ライセートを添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃にて１時間インキュベーションすることにより行なった。ヒトｍ−カルパインの反応系での最終濃度は、蛋白質を発現させたｓｆ−９細胞ライセートの蛋白質濃度で２．３３ｍｇ／ｍＬとした。ラットｍ−カルパインの反応系での最終濃度は５９ｕｎｉｔ／ｍＬとした。さらに、カルパイン無添加の条件下で、上記同様に分解試験を行なった。また、カルシウム非存在下条件として６ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した試料を作成し、該試料について同様に分解試験を行なった。インキュベーション後の試料は、等容量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加え５分間加熱し、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗ＨＮＦ−４α抗体／ＨＮＦ−４α（Ｃ−１９）抗体を用いたウェスタンブロッティングによりＨＮＦ−４αを検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用した。
＜結果＞
第７図に示すように、ヒトｍ−カルパインによるヒトＨＮＦ−４αの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下、非発現ｓｆ−９細胞ライセートおよびカルパイン無添加ではいずれもＨＮＦ−４αの分解が認められなかった。これらから、ＨＮＦ−４αはヒトｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例５】（ヒトμ−カルパインによるＨＮＦ−４αの分解）
ヒトμ−カルパインによるヒトＨＮＦ−４αの分解試験を、ヒトμ−カルパインを用いてインビトロで実施した。
＜材料＞
ＨＮＦ−４α蛋白質は、実施例２と同様の方法で、ＨＮＦ−４α発現プラスミドを用いて調製したものを用いた。
μ−カルパインは、ヒト赤血球より抽出したもの（Ｃａｌｐａｉｎ  １、ヒトｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いた。
＜方法＞
インビトロ蛋白質分解試験は、ＨＮＦ−４αにμ−カルパインを最終濃度５０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃にて１時間インキュベーションすることにより行なった。対照実験としてウサギｍ−カルパイン（実施例２参照）を最終蛋白質濃度５０μｇ／ｍＬ、またはラットｍ−カルパイン（実施例４参照）を最終濃度５９ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように添加し、上記同様の条件下でインキュベーションした。また、カルシウム非存在下条件として６ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した試料を作成し、該試料について同様に分解試験を行なった。インキュベーション後の試料は、等容量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加え５分間加熱し、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＨＮＦ−４αの検出は、実施例４と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第８図に示したように、ヒトμ−カルパインによるＨＮＦ−４αの分解が認められた。一方、ＨＮＦ−４αはカルシウム非存在下、あるいはμ−カルパイン無添加試料では分解は認められなかった。これらから、ＨＮＦ−４αはμ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが判明した。
【実施例６】（イオノフォア添加によるヒトＨＮＦ−４αの分解）
細胞内におけるＨＮＦ−４αのカルパインによる分解を検討するため、カルシウムイオノフォア添加によるＨＮＦ−４α分解試験を実施した。
＜方法＞
細胞数０．７×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２存在下で２２時間培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、２μｇのＨＮＦ−４α発現プラスミド（実施例２参照）をＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてトランスフェクションした。２日間培養後、イオノフォア  Ａ２３１８７（４−ｂｒｏｍｏ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  Ａ２３１８７、Ｓｉｇｍａ社）を１０μｇ／ｍＬ添加した培地と交換し、３時間培養した。陰性対照群はイオノフォアの代わりにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、３００μｌの低張細胞溶解バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／４２ｍＭ  ＫＣｌ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁した後、氷上で２０分間放置した。細胞をホモジナイザーで破砕後、４℃にて６００ｇで１０分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに２×ＰＢＳ／１％  ノニデットＰ−４０／０．１％  ＳＤＳからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。等容量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱後、その上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＨＮＦ−４αの検出は、実施例４と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第９図ＡおよびＢに示したように、イオノフォア添加によりＨＮＦ−４αの分解が認められた。このことから、ＨＮＦ−４αは、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウム依存性システインプロテアーゼであるカルパインによって分解されたと考えられる。
【実施例７】（カルパインによるヒトＨＮＦ−１αの分解）
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインによるＨＮＦ−１αの分解を、インビトロ蛋白質分解試験で検討した。
＜材料＞
μ−カルパインはヒト由来のもの（実施例５参照）を使用した。ｍ−カルパインはウサギ由来のもの（実施例２参照）およびラット由来のもの（実施例４参照）を使用した。
ヒトＨＮＦ−１αは、ＨＮＦ−１α発現プラスミドを下記のように構築し、該プラスミドを用いて蛋白質の合成を行なうことにより得た。まず、ヒトＨＮＦ−１α  ｃＤＮＡを、ヒト肝ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇおよびＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓにＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩサイトで組込み、ＨＮＦ−１α発現プラスミドを構築した。クローニングしたＨＮＦ−１αｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＮＰ＿０００５３６（登録遺伝子名はＴＣＦ１ｏ）と同一であった。
ＨＮＦ−１α発現プラスミドを用い、ＨＮＦ−１α蛋白質の合成を、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してインビトロで行なった。すなわち、ＨＮＦ−１α発現プラスミドとＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを混合し、メチオニン存在下で３０℃にて１．５時間インキュベーションしてＨＮＦ−１αを合成した。合成したＨＮＦ−１αに、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を添加して４℃で１時間転倒混和後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを加え、４℃でさらに１時間転倒混和することにより免疫沈降を行なった。ついで、遠心処理によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを回収し、洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．２％  ノニデットＰ−４０）で３回洗浄した後に、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）でリンスして２０％  スラリーとし、ＨＮＦ−１α試料とした（以下ＨＮＦ−１αスラリーと称する。）。
＜方法＞
インビトロにおける蛋白質分解試験は、ＨＮＦ−１αスラリーにμ−カルパインまたはｍ−カルパインを添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭ  ＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃にて１時間インキュベーションすることにより行なった。各カルパインの反応系での最終濃度は、ヒトμーカルパインは５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ウサギｍ−カルパインは蛋白質濃度として５０μｇ／ｍＬ、およびラットｍ−カルパインは５９ｕｎｉｔ／ｍＬとした。対照実験として、ＨＮＦ−１αスラリーをカルパインを添加せずにカルシウム存在下で同様にインキュベーションした。また、カルシウム非存在下での蛋白質分解試験を行なうために、６ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加えて５分間加熱し、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ領域を認識する抗Ｏｍｎｉ／Ｍ２１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）および抗ＨＮＦ−１α抗体／ＨＮＦ−１α（Ｃ−１９）抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウェスタンブロッティング法によりＨＮＦ−１αを検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して行なった。
＜結果＞
第１０図に示したように、ヒトμ−カルパイン、ウサギｍ−カルパインおよびラットｍ−カルパインによるＨＮＦ−１αのインビトロでの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下またはｍ−カルパイン無添加ではＨＮＦ−１αは分解されなかった。以上の結果から、ＨＮＦ−１αはμ−カルパインおよびｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例８】（ヒトｍ−カルパインによるＨＮＦ−１αの分解）
ヒトｍ−カルパインによるヒトＨＮＦ−１αの分解について検討するために、昆虫細胞で発現させたヒトｍ−カルパインを用いてインビトロ蛋白質分解試験を実施した。
＜材料＞
ヒトＨＮＦ−１αは、実施例７で作製したもの（ＨＮＦ−１αスラリー）を用いた。
ヒトｍ−カルパインは、実施例４に記載の方法により昆虫細胞ｓｆ−９発現系で発現させ、該昆虫細胞ライセートをヒトｍ−カルパインとして用いた。また、蛋白質非発現ｓｆ−９細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートのｍ−カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献４５）。また、陽性対照としてラットｍ−カルパインを用いた。
＜方法＞
インビトロ蛋白質分解試験は、ｍ−カルパインとして、ｍ−カルパインおよびカルパインスモールサブユニット１を共発現させたｓｆ−９細胞のライセートを用いた以外は、実施例７と同様の方法で行なった。これら蛋白質を発現させたｓｆ−９細胞ライセートの反応系における最終濃度は、蛋白質濃度として１．７５ｍｇ／ｍＬとした。ラットｍ−カルパインの反応系での最終濃度は５９ｕｎｉｔ／ｍＬとした。ＨＮＦ−１αの検出は、抗ＨＮＦ−１α抗体／ＨＮＦ−１α（Ｃ−１９）抗体のみを用いた以外は実施例７と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第１１図に示すように、ヒトｍ−カルパインによるヒトＨＮＦ−１αの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下、非発現ｓｆ−９細胞ライセート（図中、コントロールｓｆ−９細胞ライセートと表示）およびカルパイン無添加（図中、対照と表示）ではいずれもＨＮＦ−１αの分解が認められなかった。これらから、ＨＮＦ−１αはヒトｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例９】（イオノフォア添加によるヒトＨＮＦ−１αの分解）
細胞内におけるＨＮＦ−１αのカルパインによる分解を検討するため、カルシウムイオノフォア添加によるＨＮＦ−１α分解試験を実施した。
＜方法＞
細胞数０．８×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２存在下で５時間培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、２μｇのＨＮＦ−１α発現プラスミド（実施例７参照）をＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてトランスフェクションした。２日間培養後、イオノフォア  Ａ２３１８７（Ｓｉｇｍａ社）１０μｇ／ｍＬおよび０．２％  ＤＭＳＯを含有する培地と交換し、４時間培養した。陰性対照群は０．２％  ＤＭＳＯ含有培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、３５０μｌの低張細胞溶解バッファーに懸濁した後、氷上で２０分間放置した。細胞をホモジナイザーで破砕後、４℃にて６００ｇで１０分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに２×ＰＢＳ／１％  ノニデットＰ−４０／０．１％  ＳＤＳからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。細胞画分は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）により蛋白質濃度を測定した。作成した各試料は等容量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱後、その上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＨＮＦ−１αの検出は、実施例８と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第１２図に示したように、イオノフォア添加によりＨＮＦ−１αの分解が認められた。このことから、ＨＮＦ−１αは、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムイオン依存性システインプロテアーゼであるカルパインによって分解されたと考えられる。
【実施例１０】（カルパインによるヒトＩＰＦ−１の分解）
ｍ−カルパインおよびμ−カルパインによるＩＰＦ−１の分解を、インビトロ蛋白質分解試験で検討した。
＜材料＞
μ−カルパインはヒト由来のもの（実施例５参照）を使用した。ｍ−カルパインはウサギ由来のもの（実施例２参照）およびラット由来のもの（実施例４参照）を使用した。
ヒトＩＰＦ−１は、ＩＰＦ−１発現プラスミドを下記のように構築し、該プラスミドを用いて蛋白質の合成を行なうことにより得た。まず、ヒトＩＰＦ−１  ｃＤＮＡを、ヒト肝ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇおよびＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩサイトで組込み、ＩＰＦ−１発現プラスミドを構築した。クローニングしたＩＰＦ−１  ｃＤＮＡのアミノ酸翻訳配列は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＮＰ＿０００２００（登録遺伝子名はＩＰＦｏ）と同一であった。
ＩＰＦ−１発現プラスミドを用い、ＩＰＦ−１蛋白質の合成を、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してインビトロで行なった。すなわち、ＩＰＦ−１発現プラスミドとＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを混合し、メチオニン存在下で３０℃にて１．５時間インキュベーションしてＩＰＦ−１を合成した。
＜方法＞
インビトロにおける蛋白質分解試験は、ＩＰＦ−１にμ−カルパインまたはｍ−カルパインを添加し、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）／１ｍＭＤＴＴ／６ｍＭ  ＣａＣｌ２存在下で３７℃にて１時間インキュベーションすることにより行なった。各カルパインの反応系での最終濃度は、ヒトμ−カルパインは５０ｕｎｉｔ／ｍＬ、ウサギｍ−カルパインは蛋白質濃度として５０μｇ／ｍＬ、およびラットｍ−カルパインは５９ｕｎｉｔ／ｍＬとした。対照実験として、ＩＰＦ−１をカルパインを添加せずにカルシウム存在下で同様にインキュベーションした。また、カルシウム非存在下での蛋白質分解試験を行なうために、６ｍＭ  ＣａＣｌ２の代わりに１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加えて５分間加熱し、５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体および抗ＩＰＦ−１（ＰＤＸ−１）抗体／Ｎ−１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてウェスタンブロッティング法によりＩＰＦ−１を検出した。検出はＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを使用して行なった。
＜結果＞
第１３図ＡおよびＢに示したように、ヒトμ−カルパイン、ウサギｍ−カルパインおよびラットｍ−カルパインによるＩＰＦ−１のインビトロでの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下またはｍ−カルパイン無添加ではＩＰＦ−１は分解されなかった。以上の結果から、ＩＰＦ−１はμ−カルパインおよびｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例１１】（ヒトｍ−カルパインによるＩＰＦ−１の分解）
ヒトｍ−カルパインによるヒトＩＰＦ−１の分解について検討するために、昆虫細胞で発現させたヒトｍ−カルパインを用いてインビトロ蛋白質分解試験を実施した。
＜材料＞
ヒトＩＰＦ−１は、実施例１０で作製したものを用いた。
ヒトｍ−カルパインは、実施例４に記載の方法により昆虫細胞ｓｆ−９発現系で発現させ、該昆虫細胞ライセートをヒトｍ−カルパインとして用いた。また、蛋白質非発現ｓｆ−９細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートのｍ−カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献４５）。また、陽性対照としてラットｍ−カルパインを用いた。
＜方法＞
インビトロ蛋白質分解試験は、ｍ−カルパインとして、ｍ−カルパインおよびカルパインスモールサブユニット１を共発現させたｓｆ−９細胞のライセートを用いた以外は、実施例１０と同様の方法で行なった。これら蛋白質を発現させたｓｆ−９細胞ライセートの反応系における最終濃度は、蛋白質濃度として２．３３ｍｇ／ｍＬとした。ラットｍ−カルパインの反応系での最終濃度は５９ｕｎｉｔ／ｍＬとした。ＩＰＦ−１の検出は、抗ＩＰＦ−１抗体／Ｎ−１８のみを用いた以外は実施例１０と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第１４図に示すように、ヒトｍ−カルパインによるヒトＩＰＦ−１の分解が認められた。一方、カルシウム非存在下、非発現ｓｆ−９細胞ライセート（図中、コントロールｓｆ−９細胞ライセートと表示）およびカルパイン無添加（図中、対照と表示）ではいずれもＩＰＦ−１の分解が認められなかった。これらから、ＩＰＦ−１はヒトｍ−カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。
【実施例１２】（イオノフォア添加によるヒトＩＰＦ−１の分解）
細胞内におけるＩＰＦ−１のカルパインによる分解を検討するため、カルシウムイオノフォア添加によるＩＰＦ−１分解試験を実施した。
＜方法＞
細胞数０．５×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃にて５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後（直径６０ｍｍシャーレ）、２μｇのＩＰＦ−１発現プラスミド（実施例１０参照）をＦｕＧＥＮＥ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてトランスフェクションした。２日間培養後、イオノフォア  Ａ２３１８７（Ｓｉｇｍａ社）１０μｇ／ｍＬを添加した培地と交換し、４時間培養した。陰性対照群は０．２％  ＤＭＳＯ含有培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却したＰＢＳ（−）で洗浄し、３５０μｌの低張細胞溶解バッファーに懸濁した後、氷上で２０分間放置した。細胞をホモジナイザーで破砕後、４℃にて６００ｇで１０分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに２×ＰＢＳ／１％  ノニデットＰ−４０／０．１％  ＳＤＳからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。核画分および細胞画分は、等容量の２×ＳＤＳ  サンプルバッファーを加えて５分間加熱後、５−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＩＰＦ−１の検出は、実施例１０と同様の方法で行なった。
＜結果＞
第１５図に示したように、イオノフォア添加によりＩＰＦ−１の分解が認められた。このことから、ＩＰＦ−１は、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムイオン依存性システインプロテアーゼであるカルパインによって分解されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明においては、転写因子としての作用を有するＨＮＦ−４α、ＨＮＦ−１αおよびＩＰＦ−１が、カルパインにより分解されることを見出したことに基づき、カルパインによるこれら転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤を提供した。これら転写因子は、膵臓のβ細胞において転写因子ネットワークを形成しており、インシュリンやＧＬＵＴ２などの糖代謝関連遺伝子発現に関与していること、および遺伝性２型糖尿病の原因遺伝子であることが知られている。これらから、カルパインの分解による糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子の減少や機能欠損は糖尿病の原因になると考えられる。したがって、本発明において提供する糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子分解阻害剤および／または該転写因子分解阻害方法により、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進、例えばインシュリン遺伝子のインシュリンの産生促進が可能になる。また、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および／または治療が可能になる。具体的には、例えばインシュリンの減少に起因する疾患、より具体的には糖尿病などの防止および／または治療が可能である。このように本発明は、糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子の過剰な分解に起因する疾患の防止および／または治療のために非常に有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号４：ヒトｍ−カルパインまたはウサギｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４α（配列番号１）のローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、ヒトｍ−カルパインまたはウサギｍ−カルパインの部分ペプチド。
配列番号５：ヒトｍ−カルパインまたはウサギｍ−カルパインとヒトＨＮＦ−４α（配列番号１）のローカルアライメントにおいて高いスコアを示す、ヒトＨＮＦ−４α（配列番号１）の部分ペプチド。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004019983.tif 000019
【図１１】
2004019983.tif 000020
【図１２】
2004019983.tif 000021
【図１３】
2004019983.tif 000022
【図１４】
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【図１５】
2004019983.tif 000024
【国際調査報告】
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