(57)【要約】本発明は、癌の評価方法であって、以下のステップ：  （ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、  （ｂ）表１〜８に示される遺伝子の中の少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること  を含む前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）表１〜８に示される遺伝子から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
【請求項２】
癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）ＰＳＭＢ８遺伝子、ＲＡＬＧＤＳ遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子、ＲＰＳ１４遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子、ＴＮＦＳＦ１０遺伝子、ＮＲ０Ｂ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＢＦ５３０５３５遺伝子、ＭＲＰＬ２４遺伝子、ＱＰＲＴ遺伝子、ＶＮＮ１遺伝子及びＩＲＳ２遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
【請求項３】
癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）ＰＺＰ遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ５遺伝子、ＴＮＦＳＦ１４遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子及びＩＧＦＢＰ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子の発現量を測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
【請求項４】
癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、又はＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現量を、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いて測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
【請求項５】
癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、又はＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子の発現量を、内部標準遺伝子として１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
【請求項６】
癌の評価が、転移の有無又は再発の有無の予測である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
癌が肝細胞癌である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現量の測定が、配列番号２ｎ−１及び２ｎ（ｎは１〜１１４の整数を表わす）で示される塩基配列からなるプライマーの組合せを少なくとも１組用いて遺伝子を増幅することにより行なわれるものである請求項２又は３記載の方法。
【請求項９】
遺伝子の発現量の測定が、ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを用いて、遺伝子を増幅することにより行われるものである請求項４又は５記載の方法。
【請求項１０】
配列番号２ｎ−１及び２ｎ（ｎは１〜１１４の整数を表わす）で示される塩基配列からなるプライマーの組合せを少なくとも１組含むプライマーセット。
【請求項１１】
ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを含むプライマーセット。
【請求項１２】
表１〜８に示されるいずれかの遺伝子を含む、癌の評価用キット。
【請求項１３】
ＲＡＬＧＤＳ遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子、ＴＮＦＳＦ１０遺伝子及びＱＰＲＴ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を含む、癌の評価用キット。
【請求項１４】
ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を含む、癌の評価用キット。
【請求項１５】
さらに請求項１０又は１１記載のプライマーセットを含む、請求項１２〜１４のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、肝細胞癌に関連する遺伝子、特に肝細胞癌の再発に関連する遺伝子に関する。
【背景技術】  肝細胞癌のほとんどは、ウイルス性肝炎による慢性肝炎から発症する。その原因ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスとＢ型肝炎ウイルスである。いずれも持続感染すると治療法はなく、肝硬変、肝細胞癌発症の恐怖と立ち向かうほかない。インターフェロンが肝炎治療薬として使用されているが、有効例はわずか３０％であり、必ずしも十分な治療薬とはいえない。特に慢性肝炎ではほとんど有効例を見ないのが現状である。しかし、たとえウイルスが排除できなくとも、病態の進展を抑えることができれば、肝硬変や肝細胞癌の予防につながるため、病態の進展因子を分子レベルで明らかにすることが重要となる。
一方、一度肝細胞癌が発生すると、外科的根治術がなされても、残肝再発は高頻度に出現する。肝癌の術後５年生存率は全国集計で５１％であり、肝切除後１年で約２５％、２年で５０％、５年では８０％の症例で再発が起こることが報告されている。こうなると、残肝組織は正常肝組織とはいえず、すでに肝細胞癌再発の芽が存在するとも考えられる。現在、再発危険因子として、腫瘍最大径、個数、門脈腫瘍栓、術前ＡＦＰ値、肝内転移、肝硬変の有無などが報告されている。しかし、肝細胞癌再発の予測および予防法を開発するには、これら危険因子にも関連する、再発の有無を決定する因子を分子レベルでとらえる必要がある。この分子レベルの因子は、再発だけでなく、肝細胞癌発症や病態の進展そのものにも関わる因子であると考えられる。近年、ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析により、病態を遺伝子全体の発現パターンの違いにより、より詳細に分類できるようになってきた。これまで癌の分類には主に組織学的、免疫学的手法が用いられてきたが、同じ型に分類された癌でも臨床経過、治療効果が症例によって異なっている。これらを詳細に分類できる手法があれば、個々に応じた治療が可能となる。ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現解析は、このような癌の予後を知る上で、強力な方法と考える。
今までに、肝細胞癌に関わるＤＮＡマイクロアレイ解析では、
（ｉ）癌部、非癌部間において、どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？（Ｓｈｉｒｏｔａ  Ｙ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，Ｈｏｎｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１；３３：８３２−８４０、Ｘｕ  Ｘ，Ｈｕａｎｇ  Ｊ，Ｘｕ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｌｅｖｅｌ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｏｓｅ  ｏｆ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｎｏｎｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：１５０８９−１５０９４）
（ｉｉ）癌組織の分化度において、どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？（Ｓｈｉｒｏｔａ  Ｙ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，Ｈｏｎｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ，ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００１；３３：８３２−８４０、Ｏｋａｂｅ  Ｈ，Ｓａｔｏｈ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．２００１；６１：２１２９−２１３７）
（ｉｉｉ）Ｂ型肝炎由来の肝細胞癌と、Ｃ型肝炎由来の肝細胞癌とでは、どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？（Ｏｋａｂｅ  Ｈ，Ｓａｔｏｈ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ，２００１；６１：２１２９−２１３７）
（ｉｖ）肝細胞癌血管浸潤の有無により、どのような遺伝子に発現の違いが見られるか？（Ｏｋａｂｅ  Ｈ，Ｓａｔｏｈ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｃｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．２００１；６１：２１２９−２１３７）
（ｖ）多結節性肝細胞癌のクローン解析を行い、肝内転移癌に共通して見られる遺伝子の発現変化は何か？（Ｃｈｅｕｎｇ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｇｕａｎ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｌｏｎａｌｉｔｙ  ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｎｏｄｕｌａｒ  ｔｕｍｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．２００２；６２：４７１１−４７２１）
などが明らかにされている。しかしながら、再発に関与する遺伝子に関しては、飯塚ら（Ｉｉｚｕｋａ  Ｎ，Ｏｋａ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ−Ｏｋａｂｅ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｆｔｅｒ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００３；３６１：９２３−９２９）の癌組織での解析にとどまる。残肝組織を反映する非癌部肝組織での解析は、未だなされていない。
【発明の開示】
本発明は、肝細胞癌に関連する遺伝子、特に癌の再発を予知する遺伝子を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、肝細胞癌の再発を起こした症例と再発のなかった症例から遺伝子発現のプロファイルを検討した結果、肝細胞癌に関連する遺伝子を同定することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）癌の評価方法であって、以下のステップ：
（ａ）検体からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを採取し、
（ｂ）表１〜８に示される遺伝子の中の少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定し、
（ｃ）前記測定結果を指標として癌を評価すること
を含む前記方法。
本発明においては、表１〜８に示される遺伝子のうち、例えばＰＳＭＢ８遺伝子、ＲＡＬＧＤＳ遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子、ＲＰＳ１４遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子、ＴＮＦＳＦ１０遺伝子、ＮＲ０Ｂ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＢＦ５３０５３５遺伝子、ＭＲＰＬ２４遺伝子、ＱＰＲＴ遺伝子、ＶＮＮ１遺伝子及びＩＲＳ２遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を用いることができる。あるいは、表１〜８に示される遺伝子のうち、例えば、ＰＺＰ遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ５遺伝子、ＴＮＦＳＦ１４遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子及びＩＧＦＢＰ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子を用いることができる。
また、内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いて測定する際には、表１〜８に示される遺伝子のうち、ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、又はＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子を用いることもできる。
さらにまた、内部標準遺伝子として１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて測定する際には、表１〜８に示される遺伝子のうち、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、又はＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットに含まれる各遺伝子を用いることもできる。
癌の評価は、転移の有無又は再発の有無を予測するというものである。また、癌としては、例えば肝細胞癌が挙げられる。
遺伝子の発現量の測定は、配列番号２ｎ−１及び２ｎ（ｎは１〜１１４の整数を表わす）で示される塩基配列からなるプライマーの組合せを少なくとも１組用いて、遺伝子を増幅することにより行なうことができる。あるいは、遺伝子の発現量の測定は、ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを用いて、遺伝子を増幅することにより行うことができる。
（２）配列番号２ｎ−１及び２ｎ（ｎは１〜１１４の整数を表わす）で示される塩基配列からなるプライマーの組合せを少なくとも１組含むプライマーセット。
（３）ＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子を増幅するためのプライマーの組合せを含むプライマーセット。
（４）表１〜８に示されるいずれかの遺伝子を含む、癌の評価用キット。
上記示される遺伝子としては、例えばＲＡＬＧＤＳ遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子、ＴＮＦＳＦ１０遺伝子及びＱＰＲＴ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子が挙げられる。
または、上記示される遺伝子としては、例えばＶＮＮ１遺伝子及びＭＲＰＬ２４遺伝子からなる遺伝子セット、ＰＲＯＤＨ遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子及びＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子からなる遺伝子セット、ＶＮＮ１遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子及びＲＡＬＧＤＳ遺伝子からなる遺伝子セット、並びにＬＭＮＡ遺伝子、ＬＴＢＰ２遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子及びＰＺＰ遺伝子からなる遺伝子セットからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子セットに含まれる各遺伝子が挙げられる。
また、本発明のキットには前記プライマーセットを含めることができる。
本発明により、肝細胞癌の再発を予知するために有用な遺伝子が提供される。この遺伝子の発現亢進状態を解析することで、癌を評価することができる。特に、本発明の遺伝子を用いることにより、肝細胞癌の再発を予知することができ、得られた予知情報はその後の治療方針に有用である。また、これらの遺伝子および遺伝子産物を用いて、再発予防の治療法を開発することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、全遺伝子発現プロファイルより作製したサンプル系統樹を示す図である。サンプル間の発現様式の類似性で遺伝子が再配列され、さらに全遺伝子の発現様式の類似性から、サンプルが再配列されて、近縁関係が系統樹として示される。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、肝細胞癌切除後の長期間のフォローアップ臨床データから、予後不良の症例群（例えば１年以内に再発して２年以内に死亡する症例群）と、予後良好の症例群（例えば４年以上再発がない症例群）とに分け、切除した肝組織に発現する遺伝子群の特徴から、予後を不良にする遺伝子又は予後を良好にする遺伝子（例えば再発促進に関わる遺伝子と再発抑制に関わる遺伝子）を同定することを特徴とする。本発明は、臨床データをもとにして、原因ウイルス別にＢ型肝細胞癌症例とＣ型肝細胞癌症例とに分け、各々非癌部の組織及び癌部の組織から、予後の相関関係を有する遺伝子を同定するというものである。
本発明の遺伝子は、どの症例の、どの病態のときの、どの遺伝子を調べると、遺伝子と病態との相関関係がわかるのかについて、実際に患者から採取した組織と病態との相関関係を解析することによって、明らかにされたものである。
１．被検サンプルの分類
被検サンプルは、肝癌手術後の経過を観察し、再発早期群と遅延群とに分類する。
再発早期群とは、切除術後、一定期間内に再発してその後死亡する症例群を意味する。再発までの期間としては特に限定されるものではないが、例えば１年以内又は２年以内を例示することができる。死亡するまでの期間も特に限定されるものではないが、例えば、再発から１年以内、２年以内又は３年以内などが挙げられる。遅延群とは、一定期間以上（例えば３年以上、好ましくは４年以上）再発がない症例群を意味する。
実際には５１症例のｓｔａｇｅＩおよびｓｔａｇｅＩＩの肝細胞癌手術症例を対象とした。その内訳は、Ｂ型肝細胞癌症例が１６例、Ｃ型肝細胞癌症例が３５例を含む。これらのフォローアップ臨床データをもとに、再発早期群としてＢ型肝細胞癌症例から２例、Ｃ型肝細胞癌症例から３例を、再発遅延群としてＢ型肝細胞癌症例から２例、Ｃ型肝細胞癌症例から３例を選んだ。これら１０例の非癌部および癌部組織のＲＮＡについて、以下の発現プロファイル解析を行った。
２．遺伝子の解析
前記の通り分類された群の肝組織からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、各群間のマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイルを比較する。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、市販の試薬（例えばトリゾール）を用いることにより行うことができる。発現プロファイルの検出は、例えばマイクロアレイ（アフィメトリクス社）を用いる。
さらに、本発明は、癌部のほか非癌部の組織において変動する遺伝子を解析することができる。ここで、非癌部とは、肝細胞癌切除術時に含まれる肝組織であって、癌細胞が含まれていない部分を意味する。但し、「非癌部」は必ずしも正常肝組織であるとは限らず、慢性肝炎（Ｂ型肝炎やＣ型肝炎）又は肝硬変を呈する組織も含まれる。例えば、このような組織がほとんどであるＢ型肝細胞癌症例やＣ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子を解析の対象とすることができる。慢性肝炎又は肝硬変を呈する組織の場合は、壊死炎症反応や肝再生結節、脱落肝細胞を補う繊維化などが観察され、中には肝細胞癌発生に向けて予備軍となりうる細胞も存在する。従って非癌部組織にこそ予後と関係する遺伝子発現が存在すると考えられ、その遺伝子発現を指標として（例えば、遺伝子発現の変動を解析することで）、予後（例えば再発）を予知することができる。
遺伝子発現の変動と表現型（再発、早期進行等）との相関関係から、癌を評価するための遺伝子を同定する。癌の評価とは、癌の病態や進行度に関する評価を意味し、転移の有無、再発の有無などを予測することが挙げられる。
本発明では、特に再発に関連して発現が促進又は抑制される遺伝子を提供する。再発とは、原発病巣に対する治療が完了したと判断された後に、新たな癌と考えられる病巣が肝内に出現することをいう。
３．遺伝子の評価
同定された遺伝子について、病態進展を抑える因子として使えるか、病態モデル細胞や動物で、評価する。すなわち、（１）予後のわかっている残りの肝細胞癌症例について遺伝子発現定量解析を行い、予後と相関するか否かを検討する。
（２）肝細胞癌培養細胞株に遺伝子導入して発現させ、その細胞増殖性、悪性度の変化を、軟寒天培地下でのコロニー形成能やヌードマウスでの腫瘍形成能で評価する。（３）慢性肝炎患者より樹立した肝細胞培養株を用いて、遺伝子導入し発現させ、その細胞増殖性、悪性転換を、上記（２）の方法と同様の方法で評価する。（４）肝細胞癌発癌モデル動物の肝臓に遺伝子導入して発現させ、肝発癌までの経過で評価する。
上記（１）において、遺伝子発現の定量解析は、例えばリアルタイムＰＣＲにより行う。すなわち、上記のように作製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに市販の逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＰＣＲ試薬は市販のものを用いることができ、ＰＣＲの条件も市販のプロトコールにしたがってよい。例えば、予備加熱を９５℃、１０分行ったのち、９５℃１５秒に続けて６０℃（または６５℃）、６０秒を４０サイクルという条件である。対象とする内部標準遺伝子としては、例えば、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ）、β−Ａｃｔｉｎ、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ、ＨＰＲＴ１（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １）、Ｂ２Ｍ（ｂｅｔａ−２  ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ１３ａ、ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ４等のハウスキーピング遺伝子を用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。解析方法は発現量の絶対的定量解析または相対的定量解析が採用されるが、好ましくは絶対的定量解析である。ここで、発現量の絶対的定量とは、検量線が最適となる閾値線（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅ）を決定し、各サンプルの閾値ＰＣＲサイクル数、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を求めることにより得られるものであり、発現量の相対的発現量は、標的遺伝子のＣｔ値から内部標準遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ）のＣｔ値を差し引いたΔＣｔ値で表されるものである。線形発現量の評価には、（２（−ΔＣｔ））の計算式で計算したものを用いることができる。
検量線を作成する場合には、標準試料の系列希釈を行って同時に測定したもの（同じ反応溶液を使って、同じプレートに入れ、同時期に測定したもの）を用いてよい。
検量線より絶対発現量を換算できる場合は、標的遺伝子および内部標準遺伝子の絶対発現量を求めて、サンプルごとに標的遺伝子発現量／内部標準遺伝子発現量の比を算出することにより、評価に用いることができる。
再発遅延群および再発早期群のマイクロアレイの結果から遺伝子を選択して、上記の方法を用いて得られたリアルタイムＰＣＲの結果がマイクロアレイの結果と一致する遺伝子のうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子を、たとえば非癌部発現亢進遺伝子と同定することができる。
上記のように発現亢進遺伝子と同定される遺伝子は、同定する際の実験条件によって、例えば用いる内部標準遺伝子、プライマー配列、アニーリング温度などによって、種々のものを選択することができる。また、各種の統計方法（例えば、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）を用いて、再発までの期間と相関する遺伝子を選別することもできる。
本発明の遺伝子の全長配列は、以下のようにして得ることができる。すなわち、ＤＮＡデータベースより検索し、既知の配列情報として得ることができる。あるいは、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーションスクリーニングにより単離する。
本発明において、再発が早期になかった症例（再発遅延）において発現が亢進される遺伝子としては、表１〜表４に示されるものがあり、再発が早期にあった症例において発現が亢進される遺伝子としては、表５〜８に示されるものがある。
表１：Ｂ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子（２４）
表２：Ｃ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子（１０）
表３：Ｂ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、癌部において発現亢進する遺伝子（１３７）
表４：Ｃ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、癌部において発現亢進する遺伝子（１０４）
表５：Ｂ型肝細胞癌症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子（４８）
表６：Ｃ型肝細胞癌症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子（１２）
表７：Ｂ型肝細胞癌症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子（７５）
表８：Ｃ型肝細胞癌症例の再発早期群で、癌部において発現亢進する遺伝子（３８）
2005021745.tif 000002
2005021745.tif 000003
2005021745.tif 000004
2005021745.tif 000005
2005021745.tif 000006
2005021745.tif 000007
2005021745.tif 000008
2005021745.tif 000009
2005021745.tif 000010
2005021745.tif 000011
2005021745.tif 000012
ただし、表５中、「ＣＴＨ」と「ＡＬ３５４８７２」は同じタンパク質をコードする遺伝子である。
上記遺伝子は、単独で、又は適宜組み合わせて癌の評価用キットに含めることができる。遺伝子を組み合わせて遺伝子セットとしては、例えば、表１６（後述）を挙げることができる。上記遺伝子はその一部の配列であってもよい。これらの遺伝子は、表に記載の遺伝子発現を検出するためのプローブとして使用することができる。
また、本発明のキットには、遺伝子増幅用プライマー、緩衝液、ポリメラーゼ等を含めてもよい。
遺伝子増幅用プライマーは、各遺伝子配列のＤＮＡ配列およびｍＲＮＡ配列をデータベースより得、特にｖａｒｉａｎｔの有無、エキソンイントロン構造を含めた情報も得るようにして、翻訳領域に当たる部分で共通な配列をターゲットとする。なるべく片側プライマーは隣接エキソンにまたがるようにして、ｍＲＮＡだけが検出されるように設計する。あるいは、ｗｅｂ  ｓｏｆｔｗａｒｅ「Ｐｒｉｍｅｒ３」（ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてプライマーの設計候補を得、さらにＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）ｓｅａｒｃｈでホモロジー検索を行い、類似配列へのミスアニーリングをさけるようなプライマーを選択する。
好ましいプライマーの配列番号を一般式２ｎ−１及び２ｎ（ｎは１〜１１４の整数を表わす）に示す。本発明においては、２ｎ−１により示されるプライマーと２ｎにより示されるプライマーとを１組のセットとして用いることができる。例えば、ｎを１とすると、配列番号１と配列番号２のプライマーを１組のプライマーセットを、ｎを２とすると、配列番号３と配列番号４のプライマーのセットを使用することができる。特に好ましいプライマーは、ｎが２、４、７、９、１７で示される場合である。
その他、上記（１）において、遺伝子発現の定量解析をイムノドットブロットや免疫染色等で行うことも可能である。イムノドットブロットや免疫染色は、表１〜８に示した遺伝子の発現産物に対する抗体を用い、定法にしたがって行うことができる。その際、市販されている抗体を利用しても良いし、マウス、ラット、ウサギ等の動物に免疫することで得られる抗体を利用しても良い。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【実施例１】    肝細胞癌症例中の発現亢進遺伝子の検出
以下のように、Ｂ型およびＣ型肝細胞癌症例のヒト肝組織を用いて、肝細胞癌再発抑制分子の同定を遺伝子レベルで進めた。
肝細胞癌術後の再発機構を知り、再発の有無を予測できる遺伝子を決めるため、再発時期の異なる症例を用いて遺伝子発現プロファイル解析を行った。ＴＮＭ分類でｓｔａｇｅＩ、ＩＩの５１症例を対象とした。術後４年以上再発のない５例と、術後１年以内に再発した５例を選び、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイで発現解析を行なった。
凍結保存した組織にＴＲＩｚｏｌ  ｒｅｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を加えて、ポリトロンにてホモジネートした。ホモジネート液にクロロホルムを加えてよく混和し遠心した。遠心後、上層を回収し、イソプロパノールを等量加えて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ沈殿を遠心にて回収した。
Ｂ型肝細胞癌症例（原因ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである肝細胞癌症例）の再発早期群２例の非癌部と癌部、再発遅延群２例の非癌部と癌部、Ｃ型肝細胞癌症例（原因ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである肝細胞癌症例）の再発早期群３例の非癌部と癌部、再発遅延群３例の非癌部と癌部、合計８群に分け、発現解析を行った。
各サンプル群につき１５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用意し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに基づいて、ビオチン標識ｃＲＮＡを合成した。Ｔ７−（ｄｔ）２４プライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、１時間反応させ第一鎖ｃＤＮＡを合成した。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈを加え１６℃２時間反応させ、最後にＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを加えて二本鎖ｃＤＮＡを合成した。クリーンアップを行った後、ＢｉｏＡｒｒａｙ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，ＣＡ）を用いて、３７℃４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写し、ビオチン標識ｃＲＮＡを合成した。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌに基づき、ハイブリダイゼーションプローブ溶液を作製し、プレハイブリダイゼーションを４５℃４５分間行ったＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，ＣＡ；２２２８３個のヒト遺伝子が含まれている）に加え、ハイブリダイゼーションを４５℃１６時間行った。その後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，ＣＡ）を用いて洗浄した後、ストレプトアビジンフィコエリスリンとビオチン化抗ストレプトアビジンにて染色を行った。その後、ＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ，ＣＡ）にてスキャンを行った。
データ解析は、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ｖｅｒ．５．０（ＳｌｉｃｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ，ＣＡ）を用いて行った。ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ後、内在性定量用コントロール遺伝子ＢｉｏＢのシグナルを検出限界（細胞あたり数コピーに相当する）として参考にし、１００以上の輝度をもち、なおかつ、シグナルフラッグが最低１チップでもｐｒｅｓｅｎｔの遺伝子を対象とした。７４４４遺伝子が対象となり、非癌部では再発早期群／遅延群間で２．５倍以上差のある遺伝子を同定した。癌部では３倍以上差のある遺伝子を同定した。
その結果、絞り込んだ７４４４遺伝子で、再発なし／ありの非癌部間で２．５倍以上差のある遺伝子は、ｕｐ３４個とｄｏｗｎ５８個、癌部間で３倍以上差のある遺伝子は、ｕｐ２１５個とｄｏｗｎ１１０個であった。これらの中でＢ型／Ｃ型共通に再発なしで発現亢進する遺伝子は、非癌部で０個、癌部で２６個であった。一方、Ｂ型／Ｃ型共通に再発ありで発現亢進する遺伝子は、非癌部で２個、癌部で３個であった。また、癌部／非癌部共通に発現亢進する遺伝子があり、再発なしで５個、再発ありで１０個であった。（表９）。
なお、表９において合計が４０１となっているが、これはＧＬＵＬの重複が特別なものであるため４０２ではなく４０１である。
2005021745.tif 000013
表９の結果より、再発予後の違いは、非癌部より癌部のほうに遺伝子発現変化が大きく、Ｃ型肝細胞癌症例よりはＢ型肝細胞癌症例の方が遺伝子発現の差が大きいと言える。また、原因ウイルスとは無関係に共通して再発予後に関わる遺伝子が、見つかる場合があるが、意外に少ない。発癌と同様、再発も原因ウイルス別に異なる機構が関与していると考えられる。
サンプル系統樹解析では、全遺伝子の発現プロファイルから、まず非癌部と癌部に分かれ、各々非癌部と癌部は、再発予後ではなく、原因ウイルスによる近縁関係が観察された（図１）。図１において、各試験群を示す「ＢＮｂａｄ」、「ＢＮｇｏｏｄ」などの表記において、第１番目のアルファベットはウイルスの種類を示し、「Ｂ」はＢ型肝炎ウイルス、「Ｃ」はＣ型肝炎ウイルスを意味する。第２番目のアルファベットの「Ｎ」は非癌部、「Ｔ」は癌部を意味する。そして「ｂａｄ」は再発早期、「ｇｏｏｄ」は再発遅延を意味する。
このことは、再発予後に影響する遺伝子発現は、限られた遺伝子の発現変化でもたらされるものと考えられる。
以上のことから、再発の機構解明や有無を予測できる候補遺伝子が見出された（表１〜８）。
【実施例２】    Ｃ型肝細胞癌症例における各群の遺伝子の再発期間と発現量の相関の検討
以下のとおり、Ｃ型肝細胞癌症例のうち、再発遅延群と再発早期群各々の非癌部において発現亢進する遺伝子について、再発までの期間と発現量との相関を検討した。
遺伝子発現プロファイル解析に用いたＣ型肝細胞癌症例６例を含め、計２２例の非癌部のサンプルを対象とした。各症例の臨床病理学的知見と再発までの期間（再発なしの期間）を表１０Ａに示す。
2005021745.tif 000014
また、追跡調査により表１０Ａに示す症例を変更又は更新し、さらに、本実施例の対象として症例を追加した計３５例についての、臨床病理学的知見と再発までの期間（再発なしの期間）を表１０Ｂに示す。
2005021745.tif 000015
表２における再発遅延群の非癌部において発現亢進する遺伝子（ＣＮｇｏｏｄ）の９個、及び表６における再発早期群の非癌部において発現亢進する遺伝子（ＣＮｂａｄ）の１２個の、合計２１個の遺伝子に関して、再発期間と発現量との関係を検討した。
まず、各症例非癌部肝組織から、上記実施例１と同様の方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中に混在するＤＮＡの影響を除去するため、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ  ＳＨＵＺＯ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で３７℃、２０分処理した後、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅｇｅｎｔで再精製した。１０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて２５ｕｎｉｔのＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ＴＡＫＡＲＡ）と２５０ｐｍｏｌの９−ｍｅｒランダムプライマーを含む１００μｌの反応液により逆転写反応を行った。
リアルタイムＰＣＲには、合成ｃＤＮＡを各々０．２５〜５０ｎｇ相当ずつ用いて行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の２５μｌの反応溶液を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、予備加熱を９５℃、１０分行ったのち、９５℃１５秒に続けて６０℃（または６５℃）、６０秒を４０ないし４５サイクルという条件でＰＣＲを行った。
各サンプルの内部標準遺伝子として、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて相対的定量解析、および一部は絶対的定量解析を行った。標準試料の系列希釈を行って同時に測定したものを検量線作成に用いた。検量線が最適となる閾値線（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅ）を決定し、各サンプルの閾値ＰＣＲサイクル数、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値を求めた。標的遺伝子のＣｔ値からＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡのＣｔ値を差し引いたΔＣｔ値を求め、これをその標的遺伝子の相対的発現量とした。さらに、２（−ΔＣｔ）の計算式で計算したものを、線形発現量の評価に用いた。
一方、検量線より絶対発現量を換算できる遺伝子については、標的遺伝子および内部標準遺伝子の絶対発現量を求め、サンプルごとに標的遺伝子発現量／内部標準遺伝子発現量の比を算出して評価に用いた。測定はすべてｄｕｐｌｉｃａｔｅで行った。
表１１Ａ、表１１Ｂ、表１２Ａおよび表１２Ｂにおいて、「マイクロアレイと一致」とは、マイクロアレイ解析に用いた６例（表１０Ａ又はＢの症例番号５９、１８、６、１４、１５、４４）の定量ＰＣＲの結果から、再発遅延群（症例番号５９、１８、６）と早期群（症例番号１４、１５、４４）との比を求め、１．５以上であったものが、実施例１のマイクロアレイの結果と一致としたことを意味し、一致したものについて「○」を付した。なお、上記比は１．５以上、好ましくは２以上であることが好ましい。「○」に隣接するかっこ内の数字は比の値（３例の平均値の比）を示す。「マイクロアレイと一致」の欄の「×」はマイクロアレイの結果と不一致なものを示す。「××」は、マイクロアレイの結果とは逆相関したものを示す。
表１１Ａ、表１１Ｂ、表１２Ａおよび表１２Ｂにおいて、「相関」とは、２２症例又は再発月数が確定している３１症例の遺伝子発現量と再発までの期間との間で、相関を意味し、有意に相関を示した場合に○あるいはｒ値を示し、さらにｐ値を記載した。
表１１Ｂおよび表１２Ｂにおいて、「２群間の有意差」の欄に、２４ヶ月以内再発１９症例と４０ヶ月以上再発のない６症例（表１１Ｂ、表１２Ｂ「２群間の有意差」欄上段）もしくは５８ヶ月以上再発のない４症例（表１１Ｂ、表１２Ｂ「２群間の有意差」欄下段）との間で、有意に発現量の違いのあったものについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）を示した。
試験に用いたプライマー配列（センス鎖（順）、アンチセンス鎖（逆））を表１１Ａ、表１１Ｂ、表１２Ａおよび表１２Ｂに示す（配列番号１〜８８）。
Ｃ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子候補（ＣＮｇｏｏｄ）の９個を解析した結果を表１１Ａ及び表１１Ｂに示す。表１１Ａは、表１０Ａに示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いて表１１Ａに示す条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000016
その結果、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は８個であり、そのうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子は４個（ＲＡＬＧＤＳ、ＧＢＰ１、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２、ＴＮＦＳＦ１０）であった。
同様に、表１１Ｂは、表１０Ｂに示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて表１１Ｂに示す遺伝子１０個を、表中の条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000017
その結果、発現亢進する遺伝子候補９個のうち、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子に用いたときには、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は９個全てであり、そのうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子は５個であった。さらに、上記候補遺伝子９個のうち、１８ｓｒＲＮＡを内部標準遺伝子に用いたときにも、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は９個全てであり、そのうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子は８個であった。
再発遅延群と早期再発群の２群間有意差検定を行った結果、有意に差のあった遺伝子は、標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いたときは３個であり、１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いたときは５個であった。
次に、Ｃ型肝細胞癌症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子候補（ＣＮｂａｄ）の１２個を解析した結果を表１２Ａ及び表１２Ｂに示す。表１２Ａは、表１０Ａに示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いて表１２Ａに示す条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000018
その結果、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は、７個であったが、有意に再発までの期間との相関を示した遺伝子はなかった。しかし、ＱＰＲＴ遺伝子は、有意に逆の相関を示した。従ってこの遺伝子を、再発遅延群において、非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。
同様に、表１２Ｂは、表１０Ｂに示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨまたは１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて表１２Ｂに示す条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000019
その結果、発現亢進する遺伝子候補１２個のうち、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いたときには、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は１個であった。しかし、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いたときには、ＭＡＦＢ遺伝子、ＭＲＰＬ２４遺伝子、ＶＮＮ１遺伝子、ＩＲＳ２遺伝子は、有意に逆の相関を示した。また、内部標準遺伝子に１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いたときにはＮＲ０Ｂ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＢＦ５３０５３５遺伝子、ＭＲＰＬ２４遺伝子、ＱＰＲＴ遺伝子、ＶＮＮ１遺伝子、ＩＲＳ２遺伝子は、有意に逆の相関を示した。従って、これらの遺伝子を、再発遅延群において、非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。
以上のように種々の条件で検討することにより、Ｃ型肝細胞癌症例において再発を予測する非癌部発現遺伝子として、ＰＳＭＢ８遺伝子、ＲＡＬＧＤＳ遺伝子、ＧＢＰ１遺伝子、ＲＰＳ１４遺伝子、ＣＸＣＬ９遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子、ＴＮＦＳＦ１０遺伝子、ＮＲ０Ｂ２遺伝子、ＭＡＦＢ遺伝子、ＢＦ５３０５３５遺伝子、ＭＲＰＬ２４遺伝子、ＱＰＲＴ遺伝子、ＶＮＮ１遺伝子及びＩＲＳ２遺伝子という１５個の遺伝子が同定された。上記遺伝子名の内容を以下に示す。
ＰＳＭＢ８遺伝子（ＬＭＰ７遺伝子ともいう）：ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ，ｂｅｔａ  ｔｙｐｅ，８の遺伝子
ＲＡＬＧＤＳ遺伝子：ｒａｌ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒの遺伝子
ＧＢＰ１遺伝子：ｇｕａｎｙｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １の遺伝子
ＲＰＳ１４遺伝子：：ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１４の遺伝子
ＣＸＣＬ９遺伝子：ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  ９の遺伝子
ＤＫＦＺｐ５６４Ｆ２１２遺伝子：ドイツゲノムプロジェクトで見いだされた発現遺伝子で、遺伝子産物が同定されておらず、機能予測もできていない遺伝子
ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子：ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，ｆａｍｉｌｙ  １，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｂ，ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １の遺伝子
ＴＮＦＳＦ１０：ＴＮＦ（ｌｉｇａｎｄ）ｓｕｐｅｒ  ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  １０の略で、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）の遺伝子
ＮＲ０Ｂ２遺伝子：ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ０，ｇｒｏｕｐ  Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ  ２の遺伝子
ＭＡＦＢ遺伝子：ｖ−ｍａｆ  ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂの遺伝子
ＢＦ５３０５３５遺伝子：遺伝子産物が同定されておらず、機能予測もできていない遺伝子
ＭＲＰＬ２４遺伝子：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ２４の遺伝子
ＱＰＲＴ遺伝子：ｑｕｉｎｏｌｉｎａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの遺伝子
ＶＮＮ１遺伝子：ｖａｎｉｎ  １の遺伝子
ＩＲＳ２遺伝子：ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ２の遺伝子
【実施例３】    Ｂ型肝細胞癌症例における各群の遺伝子の再発期間と発現量の相関の検討
以下のとおり、Ｂ型肝細胞癌症例のうち、再発遅延群と再発早期群各々の非癌部において発現亢進する遺伝子について、再発までの期間と発現量との相関を検討した。
遺伝子発現プロファイル解析に用いたＢ型肝細胞癌症例４例を含め、計１６例の非癌部のサンプルを対象とした。各症例の臨床病理学的知見と再発までの期間（再発なしの期間）を表１３に示す。
2005021745.tif 000020
表１における再発遅延群の非癌部において発現亢進する遺伝子（ＢＮｇｏｏｄ）の２４個、及び表５における再発早期群の非癌部において発現亢進する遺伝子（ＢＮｂａｄ）の４７個の、合計７１個の遺伝子に関して、再発期間と発現量との関係を検討した。
まず、各症例非癌部肝組織から、上記実施例１と同様の方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中に混在するＤＮＡの影響を除去するため、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＴＡＫＡＲＡ  ＳＨＵＺＯ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で３７℃、２０分処理した後、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅｇｅｎｔで再精製した。１０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて２５ｕｎｉｔのＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ＴＡＫＡＲＡ）と２５０ｐｍｏｌの９−ｍｅｒランダムプライマーを含む１００μｌの反応液により逆転写反応を行った。
リアルタイムＰＣＲには、合成ｃＤＮＡを各々０．２５−５０ｎｇ相当ずつ用いて行った。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の２５μｌの反応溶液を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、予備加熱を９５℃、１０分行ったのち、９５℃１５秒に続けて６０℃（または６５℃）、６０秒を４０−４５サイクルという条件でＰＣＲを行った。
各サンプルの内部標準遺伝子として、ＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて絶対的定量解析を行った。標準試料の系列希釈を行って同時に測定したものを検量線作成に用いた。
標的遺伝子および内部標準遺伝子の絶対発現量を求め、サンプルごとに標的遺伝子発現量／内部標準遺伝子発現量の比を算出して評価に用いた。測定はすべてｄｕｐｌｉｃａｔｅで行った。
表１４および表１５中の「マイクロアレイと一致」とは、実施例２の記載と同様に、マイクロアレイ解析に用いた４例（表１３の症例番号６７、６０、１３、９）の定量ＰＣＲの結果から、再発遅延群（症例番号６７、６０）と早期群（症例番号１３、９）との比を求め、１．５以上であったものが、実施例１のマイクロアレイの結果と一致することを意味する。上記比が１．５以上、好ましくは２以上のものを○とした。「○」に隣接するかっこ内の数字は比の値を示す。「マイクロアレイと一致」の欄の「×」はマイクロアレイの結果と不一致なものを示す。「××」は、マイクロアレイの結果とは逆相関したものを示す。
表１４および表１５中の「相関」の欄は、再発月数が確定している１０症例の遺伝子発現量と再発までの期間との間で、相関を示したものについてｒ値及びｐ値を記載した。
表１４および表１５中の「２群間の有意差」の欄は、２４ヶ月以内再発６症例と４８ヶ月以上再発のない８症例（表１４、表１５中「２群間の有意差」欄上段）もしくは６０ヶ月以上再発のない６症例（（表１４、表１５中「２群間の有意差」欄下段）との間で、有意に発現量の違いのあったものについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）を示した。
試験に用いたプライマー配列（センス鎖（順）、アンチセンス鎖（逆））を表１４および表１５に示す（配列番号８９〜２２８）。
Ｂ型肝細胞癌症例の再発遅延群で、非癌部において発現亢進する遺伝子候補（ＢＮｇｏｏｄ）の２４個を解析した結果を表１４に示す。表１４は、表１３に示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて表１４に示す条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000021
その結果、発現亢進する遺伝子候補２４個のうち、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子に用いたときには１９個であり、そのうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子はなかった。また、上記遺伝子のうち、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は１８ｓｒＲＮＡを内部標準遺伝子に用いたときには９個であり、そのうち、再発までの期間と相関を示した遺伝子は１個（ＰＺＰ遺伝子）であった。
再発遅延群と早期再発群の２群間有意差検定を行った結果、差のあった遺伝子は、標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いたときは１個（ＭＡＰ３Ｋ５遺伝子）であり、１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いたときは１個（ＴＮＦＳＦ１４遺伝子）であったが、反対に、再発までの期間と逆相関して有意に差のあった遺伝子が１個（ＬＭＮＡ遺伝子）あった。従ってこの遺伝子を、早期再発群において、非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。
次に、Ｂ型肝細胞癌症例の再発早期群で、非癌部において発現亢進する遺伝子候補（ＢＮｂａｄ）の４７個を解析した結果を表１５に示す。表１５は、表１３に示す症例を対象に、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨ又は１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて表１５に示す条件で定量ＰＣＲを行った解析結果を示す。
2005021745.tif 000022
2005021745.tif 000023
その結果、ＧＡＰＤＨを内部標準遺伝子に用いたときには、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は１６個であったが、有意に再発までの期間との相関を示した遺伝子はなかった。しかし、ＩＧＦＢＰ３遺伝子は、２群間有意差検定において有意に逆の相関を示した。従ってこの遺伝子を、再発遅延群において、非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。
また、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標準遺伝子に用いたときには、マイクロアレイの結果と一致した遺伝子は４５個であったが、有意に再発までの期間との相関を示した遺伝子はなかった。しかし、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子は、２群間有意差検定において有意に相関を示した。従ってこの遺伝子を、再発早期群において、非癌部において発現亢進する遺伝子と同定した。
以上より、Ｂ型肝細胞癌症例において再発を予測する非癌部発現遺伝子として、ＰＺＰ遺伝子、ＭＡＰ３Ｋ５遺伝子、ＴＮＦＳＦ１４遺伝子、ＬＭＮＡ遺伝子、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子及びＩＧＦＢＰ３遺伝子という６つの遺伝子が同定された。上記遺伝子の内容を以下に示す。
ＰＺＰ遺伝子：ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ｚｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子
ＭＡＰ３Ｋ５遺伝子：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ５の遺伝子
ＴＮＦＳＦ１４遺伝子：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ｌｉｇａｎｄ）ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  １４の遺伝子
ＬＭＮＡ遺伝子：ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃの遺伝子
ＣＹＰ１Ａ１遺伝子：ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，ｆａｍｉｌｙ  １，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ａ，ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １の遺伝子
ＩＧＦＢＰ３遺伝子：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３の遺伝子
【実施例４】    再発早期群と再発遅延群とを判別するための遺伝子の組合わせの選択
実施例２及び３の結果より得られた、Ｃ型又はＢ型肝細胞癌の再発を予測する非癌部発現遺伝子を複数組み合わせることにより、より正確な再発予測を行うことが可能となる。このような遺伝子のセットは、多種考えられる。前記組合わせの１例を表１６に示す。
2005021745.tif 000024
（１）Ｃ型肝細胞癌の予測
再発２４ヶ月までの早期再発群と、４０ヶ月以上再発のない再発遅延群とを判別するのに、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いて補正する場合はＶＮＮ１及びＭＲＰＬ２４の各遺伝子発現量を調べればよい。あるいは、上記判別を内部標準遺伝子に１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて補正する場合は、ＶＮＮ１、ＣＸＣＬ９、ＧＢＰ１及びＲＡＬＧＤＳの遺伝子セットについての各遺伝子の発現量を調べればよい。上記各遺伝子の発現量を、各遺伝子で求められていた判別関数係数を用いた判別式に代入し、その値を判別に用いる。当該遺伝子群の発現レベルを解析することによる、早期再発群と再発遅延群との分類率は、ＧＡＰＤＨ補正の場合は８８％であり、１８Ｓ  ｒＲＮＡの場合は１００％である。
（２）Ｂ型肝細胞癌の予測
再発２４ヶ月までの早期再発群と、４８ヶ月以上再発のない再発遅延群とを判別するのに、内部標準遺伝子にＧＡＰＤＨを用いて補正する場合はＰＲＯＤＨ、ＬＭＮＡ及びＭＡＰ３Ｋ１２の遺伝子セットについての各遺伝子発現量を調べればよい。あるいは、上記判別を内部標準遺伝子に１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて補正する場合は、ＬＭＮＡ、ＬＴＢＰ２、ＣＯＬ１Ａ２及びＰＺＰの遺伝子セットについての各遺伝子発現量を調べればよい。上記と同様、これらの発現量を判別式に代入し、その値を判別に用いる。当該遺伝子群の発現レベルを解析することによる早期再発群と再発遅延群との分類率は、ＧＡＰＤＨ補正の場合も１８Ｓ  ｒＲＮＡの場合も１００％である。
上記遺伝子の内容を以下に示す。
ＰＲＯＤＨ遺伝子：ｐｒｏｌｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ｏｘｉｄａｓｅ）１の遺伝子
ＬＴＢＰ２遺伝子：ｌａｔｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２の遺伝子
ＣＯＬ１Ａ２遺伝子：ｃｏｌｌａｇｅｎ，ｔｙｐｅ  Ｉ，ａｌｐｈａ  １の遺伝子
ＭＡＰ３Ｋ１２遺伝子：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  １２の遺伝子
【産業上の利用可能性】  患者及び健常人由来の共通遺伝子と原因別特異遺伝子とを同定することで、予後の予測、再発の予測が可能になるため、診断、治療法開発、治療薬選択の戦略（テーラーメード医療）に役立てることができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜２２８：合成ＤＮＡ
【配列表】
2005021745.tif 000025
2005021745.tif 000026
2005021745.tif 000027
2005021745.tif 000028
2005021745.tif 000029
2005021745.tif 000030
2005021745.tif 000031
2005021745.tif 000032
2005021745.tif 000033
2005021745.tif 000034
2005021745.tif 000035
2005021745.tif 000036
2005021745.tif 000037
2005021745.tif 000038
2005021745.tif 000039
2005021745.tif 000040
2005021745.tif 000041
2005021745.tif 000042
2005021745.tif 000043
2005021745.tif 000044
2005021745.tif 000045
2005021745.tif 000046
2005021745.tif 000047
2005021745.tif 000048
2005021745.tif 000049
2005021745.tif 000050
2005021745.tif 000051
2005021745.tif 000052
2005021745.tif 000053
2005021745.tif 000054
2005021745.tif 000055
2005021745.tif 000056
2005021745.tif 000057
2005021745.tif 000058
2005021745.tif 000059
2005021745.tif 000060
2005021745.tif 000061
2005021745.tif 000062
2005021745.tif 000063
2005021745.tif 000064
2005021745.tif 000065
2005021745.tif 000066
2005021745.tif 000067
2005021745.tif 000068
2005021745.tif 000069
2005021745.tif 000070
2005021745.tif 000071
2005021745.tif 000072
2005021745.tif 000073
2005021745.tif 000074
2005021745.tif 000075
2005021745.tif 000076
2005021745.tif 000077
2005021745.tif 000078
2005021745.tif 000079
2005021745.tif 000080
2005021745.tif 000081
2005021745.tif 000082
2005021745.tif 000083
2005021745.tif 000084
2005021745.tif 000085
2005021745.tif 000086
2005021745.tif 000087
2005021745.tif 000088
2005021745.tif 000089
2005021745.tif 000090
2005021745.tif 000091
2005021745.tif 000092
【図１】
2005021745.tif 000093
【国際調査報告】
2005021745.tif 000094
2005021745.tif 000095
2005021745.tif 000096
2005021745.tif 000097
2005021745.tif 000098
2005021745.tif 000099
2005021745.tif 000100
2005021745.tif 000101
2005021745.tif 000102