(57)【要約】脱脂卵黄から糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法であって、（ａ）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、（ｂ）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、（ｃ）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖類アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、（ｄ）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱脂卵黄から糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法であって、（ａ）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、（ｂ）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、（ｃ）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、（ｄ）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項２】
脱脂卵黄が鳥類の卵の卵黄を有機溶媒で脱脂処理することにより得られたものである請求の範囲第１項記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項３】
糖鎖アスパラギン誘導体が１１〜５糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第１項記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項４】
糖鎖アスパラギン誘導体が１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第３項記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項５】
糖鎖アスパラギン誘導体が１１〜９糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第４項記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項６】
糖鎖アスパラギン誘導体が１１糖鎖アスパラギン誘導体である請求の範囲第５項記載の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
【請求項７】
脂溶性の保護基がカーボネート含有基あるいはアシル基である請求の範囲第１項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【請求項８】
脂溶性の保護基がカーボネート含有基である請求の範囲第７項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【請求項９】
脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基あるいはＢｏｃ基である請求の範囲第１項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【請求項１０】
脂溶性の保護基がＦｍｏｃ基である請求の範囲第９項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【請求項１１】
（ｂ）で得られる糖鎖アスパラギン混合物に含まれる糖鎖アスパラギンを予め加水分解して一部糖残基を切断しておく請求の範囲第１項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【請求項１２】
（ｃ）で得られる糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を予め加水分解して一部糖残基を切断しておく請求の範囲第１項記載の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】  近年、核酸（ＤＮＡ）、タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、糖鎖分子が注目されてきている。ヒトの体は、約６０兆個の細胞から成っている一大細胞社会であり、全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。例えば、ＡＢＯ式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、細胞社会を成り立たせる要となっている。細胞社会の乱れは、癌、慢性疾患、感染症、老化などにつながる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。また、コレラ菌やインフルエンザウイルスなどは、ある特定の糖鎖を認識し結合することにより、細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖は単糖の配列、結合様式・部位、鎖の長さ・分岐様式、全体の高次構造などの多様性から、核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。従って、その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多様である。糖鎖は、研究の重要性を認識されながらも、その構造の複雑さや多様性により、核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
一方、脱脂卵黄より糖鎖アスパラギンが得られることは知られている（例えば特許文献１参照）。特許文献１によると、脱脂卵黄にアーモンドまたは杏種子を添加することにより従来よりも大量に糖鎖アスパラギンを得ている。しかし、この方法で得られる糖鎖アスパラギンは純度が９５％や９２％であり、純粋な糖鎖アスパラギンを単離しているとはいえない。また、収量も脱脂卵黄１００ｋｇからダイシアリルオリゴ糖（１１糖ジシアリルオリゴ糖）を２９．５ｇあるいは２７．２ｇとなっている。
また、鶏卵の可溶画分より抽出される糖ペプチド（ＳＧＰ：シアリルグリコペプチド）より糖鎖アスパラギンが得られることも知られている。このＳＧＰは、１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端に、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖のアスパラギン残基が結合した化合物である。しかし、ＳＧＰは、たとえば、瀬古ら〔ビオケミカ  ビオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）第１３３５巻、第２３頁（１９９７）〕の方法によれば、鶏卵黄１個から約８ｍｇしか得られないことが示されている。
〔特許文献１〕国際公開ＷＯ９６／０２２５５号公報（請求項８及び請求項１０）
本発明の目的は、医薬品開発等の分野において有用な種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる、糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、以下の発明に係る。
１．  脱脂卵黄から糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法であって、（ａ）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、（ｂ）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、（ｃ）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、（ｄ）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、を含む糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
２．  脱脂卵黄が鳥類の卵の卵黄を有機溶媒で脱脂処理することにより得られたものである上記の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
３．  糖鎖アスパラギン誘導体が１１〜５糖鎖アスパラギン誘導体である上記の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
４．  脂溶性の保護基がカーボネート含有基、アシル基、アリル基、Ｆｍｏｃ基あるいはＢｏｃ基である上記の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法。
５．（ｂ）で得られる糖鎖アスパラギン混合物に含まれる糖鎖アスパラギンを予め加水分解して一部糖残基を切断しておく上記の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
６．（ｃ）で得られる糖鎖アスパラギン誘導体混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を予め加水分解して一部糖残基を切断しておく上記の糖鎖スパラギン誘導体の製造方法。
本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、卵黄、たとえば、鳥類卵黄から得られる脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を得、次にペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギンの混合物を得、次いでこの混合物に含まれる当該糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入（結合）して糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混合物を各糖鎖アスパラギン誘導体に分離することを大きな特徴とする。なお、本明細書において、「糖鎖アスパラギン」とはアスパラギンが結合した状態の糖鎖をいう。また、「アスパラギン結合型糖鎖」とはタンパク質のポリペプチド中のアスパラギン（Ａｓｎ）の酸アミノ基に、還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミンがＮ−グリコシド結合した糖鎖群であって、Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ（β１−４）ＧｌｃＮａｃを母核とする糖鎖群をいう。「糖鎖アスパラギン誘導体」とはアスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖アスパラギンをいう。また、化合物の構造式中、「ＡｃＨＮ」はアセトアミド基を示す。
本発明の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法は、具体的には、
（ａ）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、ならびに
（ｂ）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、ならびに
（ｃ）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、ならびに
（ｄ）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程、
を含むものである。
以下、本発明の脱脂卵黄から糖鎖アスパラギン誘導体を得る製造方法を具体的に説明する。
本発明に使用される脱脂卵黄とは、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類の卵の卵黄（ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ハトなどの卵黄が好ましい。特に卵黄内に含まれる人型糖鎖アスパラギン、特に人型２分岐糖鎖アスパラギンの量からニワトリがよい。）を有機溶媒で脱脂処理したものがよい。このとき、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ジエチルエーテル等が好ましい。
（ａ）工程としては、上記脱脂卵黄をタンパク質分解酵素によりタンパク質を切断し、脱脂卵黄に含まれる糖鎖ペプチド（糖鎖アスパラギンペプチド）の混合物を得る。このとき、使用するタンパク質分解酵素としては、例えば、プロナーゼ（和光純薬社製）、オリエンターゼ（ＨＢＩ社製）等、一般のものを使用することができる。
また、糖鎖ペプチドの混合物より糖鎖ペプチド以外の成分を公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた精製法に従って除去することが好ましい。
（ｂ）工程としては、（ａ）工程で得られた糖鎖ペプチドの混合物をペプチド分解酵素によりペプチドを分解し、糖鎖ペプチドに含まれる糖鎖アスパラギンの混合物を得る。このとき、使用するペプチド分解酵素としては、例えば、アクチナーゼ等、一般のものを使用することができる。
また、糖鎖アスパラギンの混合物より糖鎖アスパラギン以外の成分を公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを用いた各種クロマトグラフィーや、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた精製法に従って除去することが好ましい。
また、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖アスパラギンを加水分解して一部糖残基を予め切断しておくのが好ましい。加水分解する方法としては酸を使用する方法あるいは酵素を使用する方法等がある。
前記酸としては特に限定するものではなく、たとえば、塩酸、硫酸、硝酸、トリフルオロ酢酸などの無機酸および有機酸、陽イオン交換樹脂、不溶性の固体試薬（シリカゲル等）などを使用することができる。また、酵素としては、糖加水分解酵素が好適であり、エンド型、エキソ型いずれの反応様式の酵素も使用することができる。かかる酵素としては特に限定されるものではなく、当該活性を有するものであれば、市販の酵素、新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。
酵素反応は公知の条件に従えば良く、その際、反応の進行を薄層クロマトグラフィーで追跡し、化合物がもっとも多く得られるところで反応を適宜停止させればよい。
（ｃ）工程としては、（ｂ）工程で得られた糖鎖アスパラギンを含む混合物を用い、それに含まれる糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基の導入を行う。当該保護基としては特に限定されるものではなく、たとえば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート（Ａｌｌｏｃ）基等のカーボネート含有基、アセチル（Ａｃ）基等のアシル基、アリル基、ベンジル基等の保護基を使用することができる。合成の効率および次工程の分離精製の効率を考慮すると、好ましくは、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基やｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、アリルオキシカーボネート基等のカーボネート含有基、アセチル基等のアシル基がよい。また、得られた糖鎖アスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチドの合成に使用できるという観点から、当該保護基としては、ペプチド合成に広く用いられるＦｍｏｃ基またはＢｏｃ基が好ましく、なかでもＦｍｏｃ基はシアル酸など比較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効であることからより好ましい。また、保護基の導入は公知の方法（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）に従って行えばよい。
たとえば、Ｆｍｏｃ基を用いる場合、糖鎖アスパラギンを含む混合物に対しアセトン或いはＤＭＦを適量加えた後、さらに９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミヂルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、２５℃にてアスパラギン残基へのＦｍｏｃ基の結合反応を行うことにより、当該糖鎖アスパラギンのアスパラギン残基にＦｍｏｃ基を導入することができる。
以上の操作により、脂溶性の保護基が導入された糖鎖アスパラギン誘導体の混合物が得られる。
（ｄ）工程としては、（ｃ）工程で得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物を公知のクロマトグラフィー、特に分取型のクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体に分離する。なお、かかる工程においては、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物を直接使用することができるが、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得るという観点から、さらに当該混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解に供し、一部糖残基を予め切断して得られる糖鎖アスパラギン誘導体の混合物を使用してもよい。なお、糖残基の切断の程度は前記同様である。また、加水分解は前記と同様にして行うことができる。
各糖鎖アスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、適宜、公知のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うことができる。
たとえば、得られた糖鎖アスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製後、ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣにおいて用い得るカラムとしては逆相系のカラムが好適であり、たとえば、ＯＤＳ、Ｐｈｅｎｙｌ系、ニトリル系や、陰イオン交換系のカラム、具体的には、たとえば、ファルマシア社製モノＱカラム、イヤトロン社製イアトロビーズカラムなどが利用可能である。分離条件等は適宜、公知の条件を参照して調整すればよい。以上の操作により、糖鎖アスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
上記で得られる糖鎖アスパラギン誘導体としては、例えば１１〜５糖鎖アスパラギン誘導体、好ましくは１１〜７糖鎖アスパラギン誘導体、更に好ましくは１１〜９糖鎖アスパラギン誘導体、特に好ましくは下記式で示される１１糖鎖アスパラギン誘導体を挙げることができる。なお、式中のＰｒｏｔは保護基を示す。
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さらに、分離された糖鎖アスパラギン誘導体を加水分解することにより、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。たとえば、糖鎖アスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる糖鎖アスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖アスパラギン誘導体を大まかに分離し、次いで加水分解、たとえば、糖加水分解酵素を用いて加水分解することにより所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。なお、加水分解は前記と同様にして行うことができる。特に、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、糖残基の切断様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
このように、各糖鎖アスパラギン誘導体を得た後、さらに各種糖加水分解酵素等を用いて当該誘導体を加水分解し、糖鎖の非還元末端の糖残基を除去することにより、たとえば、糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖アスパラギン誘導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。また、種々の糖加水分解酵素を用い、加水分解する順番やその種類を変えることで、より多くの種類の糖鎖アスパラギン誘導体を製造することができる。
また本発明は、種々の単離された糖鎖アスパラギンを大量に得ることができる糖鎖アスパラギンの製造方法を提供する。当該方法は、前記糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法に従う糖鎖アスパラギン誘導体の製造工程に続き、さらに、得られた糖鎖アスパラギン誘導体から保護基を除去する工程を含むものである。
糖鎖アスパラギン誘導体からの保護基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）。たとえば、保護基がＦｍｏｃ基である場合、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、糖鎖アスパラギン誘導体にモルフォリンを加えて反応を行うことによりＦｍｏｃ基を除去することができる。また、Ｂｏｃ基は弱酸を反応させることで除去することができる。保護基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製することにより、糖鎖アスパラギンを得てもよい。
また、保護基がベンジル基である場合、ベンジル基の除去は、公知の方法に従って行うことができる（たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  ＩＮＣ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１，ＩＳＢＮ  ０−４７１−６２３０１−６を参照）。
さらに、糖鎖アスパラギンからのアスパラギン残基の除去は、公知の方法に従って行うことができる。たとえば、糖鎖アスパラギンを無水ヒドラジンと反応させた後、アセチル化することによりアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。また、糖鎖アスパラギンを塩基性水溶液で加熱還流後、アセチル化することによってもアスパラギン残基を除去して糖鎖を得ることができる。アスパラギン残基除去後、所望により適宜、公知の方法、たとえば、ゲル濾過カラム、イオン交換カラムなどを使用する各種クロマトグラフィーや、ＨＰＬＣによる分離という方法によって精製してもよい。
このように、本発明によれば、所望の糖鎖構造を有する糖鎖アスパラギン誘導体、糖鎖アスパラギンおよび糖鎖（以下、３つ併せて糖鎖類という場合がある）を安価かつ効率的に大量に製造することができる。
かかる糖鎖類は医薬品開発等の分野において非常に有用である。たとえば、医薬品開発における応用例としては、たとえば、ガンのワクチン合成があげられる。細胞がガン化すると体内にはなかった糖鎖が発現することが知られている。また、当該糖鎖を化学的に合成し、ワクチンとして個体に投与すると、ガンの増殖が抑制されることも知られている。そこで、本発明により所望の糖鎖類を製造することができれば、ガンの治療に有効なワクチンの合成を行うことが可能である。また、本発明により得られる糖鎖類を、さらに化学的な反応および糖転移酵素による反応などを組み合わせて新たな糖残基を結合させて誘導体化し、新規なワクチンの合成を行うことも可能である。
また、たとえば、糖タンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、その赤血球増殖能により貧血の治療薬として使われているが、このＥＰＯは糖鎖が結合していないと活性がでないことが判明している。このように、タンパク質には糖鎖の結合によって生理活性を発現するものがあるので、たとえば、糖鎖を結合させることができない大腸菌発現系によりタンパク質のみを大量に調製し、次いで所望の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより生理活性の発現を付与したり、また、任意のタンパク質に種々の糖鎖構造を有する、本発明により製造した糖鎖を導入することにより、新たな生理活性を有する新規な糖タンパク質を合成することも可能である。
また、天然の糖タンパク質に存在する糖鎖を本発明により製造した糖鎖と置換することにより新たな生理活性を付与することも可能である。糖タンパク質が有する糖鎖を本発明により得られた糖鎖と置換する技術としては、たとえば、Ｐ．Ｓｅａｒｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ｈ．Ｗｏｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，ｖｏｌ２９１，ｐ２３４４  〜２３５０に記載の方法をあげることができる。すなわち、糖タンバク質をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）で処理してタンパク質表面のアスパラギン残基にはＮ−アセチルグルコサミン残基が１つだけ結合した状態にする。次いで、本発明により得られた糖鎖アスパラギン中の所望の糖鎖をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｍ）を用いて、前記Ｎ−アセチルグルコサミン残基に結合させるという方法があげられる。また、ｔＲＮＡにＮ−アセチルグルコサミンを結合させておいて、大腸菌などの発現系を利用してＮ−アセチルグルコサミン残基を有する糖タンパク質を合成後、本発明により得られた糖鎖アスパラギン中の所望の糖鎖をＥｎｄｏ−Ｍを用いて導入することも可能である。
また、現在、糖タンパク質を治療薬として利用する際の問題として、投与された糖タンパク質の代謝速度が速いことがあげられる。これは、糖タンパク質の糖鎖末端に存在するシアル酸が生体内で除去されると直ちに当該糖タンパク質が肝臓により代謝されることによる。そのため、ある程度の量の糖タンパク質を投与する必要がある。そこで、本発明により糖鎖の末端に除去されにくいシアル酸を新たに組み込んだ糖鎖を製造し、対象タンパク質に当該糖鎖をＥｎｄｏ−Ｍを利用して導入すれば、生体内での糖タンパク質の代謝速度を制御することが可能となり、投与する糖タンパク質の量を低くすることも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を挙げて説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  エタノール（ＥｔＯＨ）６７ｍｌを撹拌しているところに、卵黄１個を割り入れた。約５時間撹拌した後ろ過を行い、さらにＥｔＯＨ３０ｍｌで洗浄を行った。得られた結晶に、再度ＥｔＯＨ８３ｍｌを加え１晩撹拌を行った後ろ過を行いＥｔＯＨ３０ｍｌで洗浄後、結晶を乾燥させると脱脂卵黄（Ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅｄ  Ｅｇｇ  Ｙｏｌｋ）が約３ｇ得られた。
（ａ）このものを、りん酸緩衝液（ｐＨ＝７．０，３０ｍｌ）に溶解させた後、ＮａＮ３（１０ｍｇ）を加えた。さらに、オリエンターゼＯＮＳ（ＨＢＩ社製、１．０ｇ）を加え５０℃で約２４時間静置させた。反応の終了をＴＬＣにて確認した後、反応液をセライトにて濾過した。濾液を濃縮により減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，２．５×１００ｃｍ，Ｈ２Ｏ）で精製した。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行った。
（ｂ）得られた残留物（約４３０ｍｇ）に、トリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（ｐＨ＝７．５，４３ｍｌ）、ＮａＮ３（２１ｍｇ）を加え、溶解させた。このものに、アクチナーゼＥ（４３ｍｇ）を加え１２時間おきにｐＨをチェックしながら２４時間静置させた。２４時間後、反応液に再度アクチナーゼＥ２１．５ｍｇを加え、再びｐＨをチェックしながら約４８時間反応させた。反応の終了をＴＬＣで確認した後、セライトろ過を行い、濾液を濃縮で減じ、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，２．５×１００ｃｍ，Ｈ２Ｏ）で精製した。目的とする糖が含まれるフラクションを集めて濃縮、次いで凍結乾燥を行った。
（ｃ）得られた残留物（約１２０ｍｇ）を、水１．５ｍｌに溶かし、重炭酸ナトリウム２６ｍｇを加えた。ここに、Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ〔Ｎ−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ〕６８ｍｇを溶かしたジメチルホルムアミド２．５ｍｌを加え、室温で２時間反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、エバポレーターを用いて濃縮した。残渣に、水１５ｍｌ、ジエチルエーテル２５ｍｌを加えて１０分間撹拌した後、分液操作を行った。さらに水層を、ジエチルエーテル１５ｍｌで洗浄した後、濃縮、凍結乾燥を行った。このものを、ＯＤＳカラム（ワコーゲル１００Ｃ１８）を用い、グラディエントをかけ精製した。糖鎖が含まれている画分を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。
（ｄ）この残留物をＨＰＬＣ分取カラムにて精製した（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｒ＆Ｄ  ＯＤＳ，Ｄ−ＯＤＳ−５−Ａ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝２０／８０，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２７４ｎｍ）。約１５分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでＯＤＳカラムにて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシアロＦｍｏｃ糖鎖誘導体が、約１３．３ｍｇ得られた。
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得られた化合物の１Ｈ−ＮＭＲデータは以下のとおりである。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
８．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），７．５３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｆｍｏｃ），５．２３（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．０４（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ４’−Ｈ１），４．８６（１Ｈ，ｓ，Ｍａｎ３−Ｈ１），４．７０〜４．６６（ｍ，ＧｌｃＮＡｃ２−Ｈ１  ＧｌｃＮＡｃ５，５’−Ｈ１），４．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，Ｇａｌ６，６’−Ｈ１），４．４４（１Ｈ，ｄ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３４（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ３−Ｈ２），４．２９，（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４’−Ｈ２），４．２０（１Ｈ，ｂｄ，Ｍａｎ４−Ｈ２），２．７７（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ｅｑ），２．８０（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６２（１Ｈ，ｂｄｄ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１４（１８Ｈ，ｓ×６，−Ａｃ），１．８０（２Ｈ，ｄｄ，ＮｅｕＡｃ７，７’−Ｈ３ａｘ）
実施例２〔ジシアロ糖鎖−Ｂｏｃ誘導体（１１糖）〕
（ｂ）までは、実施例１と同様に行った。
（ｃ）得られた残留物（約１２０ｍｇ）を、０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．１ｍｌに溶解させた。ここに、（Ｂｏｃ）２Ｏ（４ｍｌ，東京化成社製）を加え、室温で２時間反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、ジクロロメタン２．５ｍｌを加えて分液を行った。水層をさらにジクロロメタン２．５ｍｌで洗浄した後、４０ｍＭ  ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整する。水層を濃縮後、ＯＤＳカラムにて精製を行う（グラジエント  Ｈ２Ｏ  １００％  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９９／１  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９５／５  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９０／１０）。目的のジシアロ糖鎖Ｂｏｃ誘導体が含まれている画分（ＨＰＬＣにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。
（ｄ）この残留物をＨＰＬＣにて単離・精製を行った。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝５／９５，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２１５ｎｍ）。約１１分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシアロ糖鎖Ｂｏｃ誘導体が、約１０．０ｍｇ得られた。
2004070046.tif 000004
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ  ５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．６１−４．７１（ｍ，３Ｈ），４．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３０−４．４０（ｂｓ，１Ｈ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．３１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１５．６，Ｊｂ＝４．４，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝２．８，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．６０−２．７５（ｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３，２．１２，２．１１（ｅａｃｈｓ，１８Ｈ，Ａｃｘ６），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．０，Ｊｂ＝１２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．４８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）．
実施例３〔ジシアロ−糖鎖Ａｃ誘導体（１１糖）〕
（ｂ）までは、実施例１と同様に行った。
（ｃ）得られた残留物（約１２０ｍｇ）を、精製水１ｍｌに溶解させた。このものにＫ２ＣＯ３（７２ｍｇ）を加え、さらに無水酢酸（９９ｍｌ）を加え約２時間撹拌した。室温で２時間反応させた後、原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、ジクロロメタン２．５ｍｌを加えて分液を行った。水層をさらにジクロロメタン２．５ｍｌで洗浄した後、ｓａｔ．ＮａＨＣＯ３ａｑ．にて、ｐＨ＝７．０に調整した。水層を濃縮後、ＯＤＳカラムにて精製を行った（グラジエント  Ｈ２Ｏ  １００％  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９９／１  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９５／５）。目的のジシアロ糖鎖Ａｃ誘導体が含まれている画分（ＨＰＬＣにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。
（ｄ）この残留物をＨＰＬＣにて単離・精製を行った。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝１／９９，７．０ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２１５ｎｍ）。約１１分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシアロ糖鎖Ａｃ誘導体が、約８．５ｍｇ得られた。
2004070046.tif 000005
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ  ５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．６６（ｂｓ，３Ｈ），４．５４−４．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝８．１，Ｊｂ＝４．５），４．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８），４．３１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２５（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１７（ｂｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１５．８，Ｊｂ＝４．３，Ａｓｎ−βＣＨ），２．６５−２．７５（ｍ，３Ｈ，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３，２．１２，２．０８，２．０６（ｅａｃｈｓ，２１Ｈ，Ａｃｘ７），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．１，Ｊｂ＝１２．１，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ）．
実施例４〔ジシアロ糖鎖−Ａｌｌｏｃ誘導体（１１糖）〕
（ｂ）までは、実施例１と同様に行った。
（ｃ）得られた残留物（約１２０ｍｇ）を、０．１Ｎ  ＮａＯＨａｑ．６ｍｌに溶解させた。ここに、（ＡｌｌｙｌＯＣＯ）２Ｏ（５７３ｍｌ，東京化成社製）を加え、室温で１２時間反応させた。原料消失をＴＬＣ（イソプロパノール：１Ｍ  酢酸アンモニウム水溶液＝３：２）で確認後、ジクロロメタン１２ｍｌを加えて分液を行った。水層をさらにジクロロメタン１２ｍｌで洗浄した後、４０ｍＭ  ＨＣｌにてｐＨ＝７．０に調整した。水層を濃縮後、ＯＤＳカラムにて精製を行った（グラジエント  Ｈ２Ｏ  １００％  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９９／１  →  Ｈ２Ｏ／ＡＮ＝９５／５）。目的のジシアロ糖鎖Ａｌｌｏｃ誘導体が含まれている画分（ＨＰＬＣにて確認）を集め、濃縮、ついで凍結乾燥を行った。
（ｄ）この残留物をＨＰＬＣにて単離・精製を行った。（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ，ＳＨ−３４３−５ＡＭ，２０×２５０ｍｍ，ＡＮ／２５ｍＭ  ＡｃＯＮＨ４  ｂｕｆｆｅｒ＝２／９８，７．５ｍｌ／ｍｉｎ．，ｗａｖｅ  ｌｅｎｇｔｈ；２１５ｎｍ）。約１８分後に出てくるメインのピークを分取後、濃縮、次いでゲルカラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ｈ２Ｏ）にて脱塩処理を行った。凍結乾燥すると、目的とするジシアロ糖鎖Ａｌｌｏｃ誘導体が、約８．７ｍｇ得られた。
2004070046.tif 000006
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，３０℃，ＨＯＤ＝４．８１）
δ  ６．０１（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１７．２，Ｊｂ＝１０．４，Ｊｃ＝５．２，−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），５．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．２，−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），５．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１０．４，Ｊｂ＝１．６，−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），５．１９（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４−Ｈ１），５．１２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６，ＧｌｃＮＡｃ１−Ｈ１），５．００（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ４’−Ｈ−１），４．６０−４．７１（ｍ），４．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６），４．３５−４．４５（ｂｍ，１Ｈ，Ａｓｎ−αＣＨ），４．３１（ｓ，１Ｈ，Ｍａｎ３−Ｈ−２），４．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０，Ｍａｎ４−Ｈ−２），４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，Ｍａｎ４−Ｈ−２），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１５．６，Ｊｂ＝４．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．７２（ｂｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝２．４，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ｅｘ），２．６４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊａ＝１５．６，Ｊｂ＝１０．０，Ａｓｎ−βＣＨ），２．１３，２．１２，２．１１，２．０８，２．０５（ｅａｃｈｓ，１８Ｈ，Ａｃｘ６），１．７７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊａ＝１２．４，Ｊｂ＝１２．０，ＮｅｕＡｃ７−Ｈ３ａｘ），１．４８（ｓ，９Ｈ，Ｂｏｃ）．
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、医薬品開発等の分野において有用な種々の単離された糖鎖アスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大量に得ることができる。
【国際調査報告】
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