(57)【要約】単糖残基、オリゴ糖残基あるいは単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を２０〜８０モル％含むことを特徴とする糖鎖化合物合成用糖鎖含有ポリマー。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を２０〜８０モル％含み、前記リンカーは（メタ）アクリル酸残基以外の繰り返し単位に結合されることを特徴とする糖鎖含有水溶性ポリマー化合物。
【請求項２】
単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を２０〜８０モル％含み、前記リンカーは（メタ）アクリル酸残基以外の繰り返し単位に結合されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
水溶性ポリマーが、（メタ）アクリル酸２０〜８０モル％とアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類及び脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体８０〜２０モル％の共重合体である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程により開裂される請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
前記リンカーが、一般式（Ｉ）
2004099271.tif 000058
（式中、Ｒ１は単糖残基もしくはオリゴ糖残基を示し、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基又はラクトース残基である請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ２がペンチレン基である請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
前記リンカーが一般式（ＩＩ）
2004099271.tif 000059
（式中、Ｒ３は単糖残基もしくはオリゴ糖残基を示し、Ｒ４は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ５はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＹはＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３がグルコース残基またはラクトース残基である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーが一般式（ＩＩＩ）
2004099271.tif 000060
（式中、Ｒ６は単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ７はメチレン基２〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ８はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＺおよびＷはそれぞれ独立してＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ６がＮ−アセチルグルコサミン残基である請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチド残基がアミノ酸残基２〜３０個よりなる請求項２記載の化合物。
【請求項１３】
リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、特定の加水分解酵素によって開裂可能な結合である請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
特定の加水分解酵素が、セラミドグリカナーゼ又はα−キモトリプシンである請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
特定の加水分解酵素が、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合しているアミノ酸残基或いはペプチド残基中に開裂部位を含まないプロテアーゼである請求項１３記載の化合物。
【請求項１６】
単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が連結される選択的に開裂可能な結合を含むリンカーが一般式（ＩＶ）
2004099271.tif 000061
（式中、Ｒ９はメチレン基１〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ９は水溶性ポリマー化合物と結合する。Ｒ１０は特定のプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基を示し、Ｒ１０は単糖残基あるいはオリゴ糖残基と結合する。）で表された基であり、単糖残基あるいはオリゴ糖残基はグリコシド結合により直接又は二価の連結基を介してＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒ残基の側鎖官能基あるいはペプチド残基中の前記アミノ酸残基の側鎖官能基に結合している請求項１５記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ９が一般式（Ｖ）
2004099271.tif 000062
（式中、ＡはＯ、ＣＨ２、Ｃ＝ＯまたはＮＨを示し、かつＡを介して水溶性ポリマーの側鎖と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基である請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
側鎖官能基に結合した二価の連結基がメチレン基１〜２０個分の長さを有する基である請求項１６または１７記載の化合物。
【請求項１９】
側鎖官能基に結合した二価の連結基が一般式（ＶＩ）
2004099271.tif 000063
（式中、ＢはＯ、ＮＨまたはＣ＝Ｏを示し、かつＢを介してアミノ酸残基の側鎖官能基と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基である請求項１６〜１８のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物からなる糖鎖化合物合成用水溶性高分子プライマー。
【請求項２１】
一般式（ＶＩＩ）
2004099271.tif 000064
（式中、Ｒ１１は単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ１２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示す）で表される（メタ）アクリルアミド誘導体と（メタ）アクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを、（メタ）アクリル酸が全ビニル系共重合体中２０〜８０モル％になるように共重合することを特徴とする糖鎖含有水溶性ポリマー化合物の製造方法。
【請求項２２】
Ｒ１１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基またはラクトース残基である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ１２がペンチレン基である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
ビニル系単量体がアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれる請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
糖鎖化合物を製造する方法であって、
（工程１）請求項１あるいは２に記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物に糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該ポリマー化合物に転移させる工程、
（工程２）必要に応じて工程１を２回以上繰り返して糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性ポリマー化合物から糖鎖を遊離させる工程、を含むことを特徴とする糖鎖化合物を製造する方法。
【請求項２６】
糖鎖化合物を製造する方法であって
（工程１）請求項８記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物に糖ヌクレオチドの存在下に転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該水溶性ポリマー化合物に転移させる工程、
（工程２）必要に応じて工程１を２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長した水溶性ポリマー化合物に、セラミドの存在下、セラミドグリカナーゼを作用させ、該水溶性ポリマー化合物より、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程、を含むことを特徴とする糖鎖化合物を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糖鎖製造に有用な糖鎖含有水溶性ポリマー化合物またはその製造方法、該化合物を用いた糖鎖の製造方法並びに該化合物からなる糖鎖化合物合成用の水溶性高分子プライマーに関する。
【背景技術】  糖は核酸や蛋白質と並んで生体を構成する主要な成分であるが、核酸や蛋白質と比べ、その構造あるいは機能はあまりよく理解されていない。糖は、通常糖鎖と呼ばれる重合体を形成し、さらにそれらが蛋白質や脂質と結合して糖蛋白質、糖脂質あるいはプロテオグリカンと総称される極めて複雑な複合分子を形成している。さらに、核酸あるいは蛋白質がその構成単位であるヌクレオチドあるいはアミノ酸が直線的に結合した高分子であるのに対して、糖鎖は分子内に複数の分岐点があるばかりでなく、その構成単位である単糖の結合様式も多様であるため、その構造は核酸や蛋白質と比較にならないほど複雑である。これら構造の複雑さは、この分野の研究を遅らせている大きな原因の一つとなっている。
しかし、近年糖鎖が細胞認識、免疫、分化、受精、老化、ガン化などに関与することが徐々にわかってくるにつれて、非常に注目される研究分野となってきた。このような現状より、天然の構造を有する糖鎖や新規な糖鎖を合成する試みが盛んになされている。核酸や蛋白質については自動合成技術が確立されており、このことにより、この分野の研究が著しく進歩したことは誰もが認めるところであり、糖鎖についても、その自動合成技術の確立は切望されている。
これまでに糖鎖の自動合成を試みたいくつかの報告があり、その手法は大きく分けて２つある。１つは化学合成によるものであるが、糖残基と糖残基を立体選択的に結合させる方法が十分確立されておらず、さらに保護基を結合させたり、あるいは脱離させたりと工程が煩雑であるという問題がある。もう１つは酵素合成によるものであり、保護基を必要とせず、また糖残基と糖残基を立体選択的に結合させることができるので化学合成に比べ、非常に有利であり、近年いくつかの方法が提案されるようになってきた。これには、最近各種糖転移酵素の遺伝子が単離され、遺伝子組換え技術による糖転移酵素の大量生産が可能になってきたという背景がある。また、自動合成では通常反応開始点となる糖残基を特定の担体上に特定の条件で開裂することのできるリンカーを介して結合されたもの（プライマーとも呼ばれる）が出発物質として用いられる。リンカーの種類によって製造される糖鎖化合物は異なり、オリゴ糖、配糖体、糖ペプチド、糖脂質など種々の形で担体より遊離される。
糖転移酵素を用いた糖鎖の自動合成の例としては、Ｕ．Ｚｅｈａｖｉらがアミノエチル基あるいはアミノヘキシル基を結合させたポリアクリルアミドゲルを固相担体とした糖転移酵素による固相合成を報告している（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２４，２３（１９８３）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２２８，２５５（１９９２）参照）。この方法は、適当な単糖を４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドとした後、上記担体のアミノ基と結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖伸長反応を行ない、その後光分解により伸長させた糖鎖をオリゴ糖として遊離させるというものである。しかし、糖転移酵素による糖転移収率は低く、１０％にも満たない。これまで糖転移酵素は固相担体上に結合させた糖あるいはオリゴ糖とはあまり反応せず、糖鎖伸長反応を効率よく行うことは困難であるとされてきたが、Ｕ．Ｚｅｈａｖｉらは４−カルボキシ−２−ニトロベンジルグリコシドと固相担体との間をヘキサメチレン基やオクタメチレン基など鎖長の長いリンカーで結合させることにより、糖転移収率を最大５１％まで向上したと報告している（例えば、Ｒｅａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．，２２，１７１（１９９４）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２６５，１６１（１９９４）参照）。しかしながら、この方法においても収率的には十分なレベルとは言えない。
その他の例として、Ｃ．−Ｈ．Ｗｏｎｇらはアミノ化シリカに下記式
2004099271.tif 000002
（式中、Ａｃはアセチル基、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用し伸長させた糖鎖を糖ペプチドの形で切り出す方法を報告している（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１１３６（１９９４）参照）。しかしながら、糖転移酵素による糖鎖伸長反応の収率は５５〜６５％であり、十分なものとは言えない。
また、Ｃ．−Ｈ．Ｗｏｎｇらは、固相担体であるアミノ化シリカに結合させる基を下記式
2004099271.tif 000003
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に改良し、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、ヒドラジン分解により糖鎖を遊離させる方法を報告しており、酵素による糖転移反応をほぼ定量的に行うことができたとも報告している（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，１１３１５（１９９４）参照）。この方法によれば、伸長した糖鎖は６−カルボヒドラジドヘキサノール配糖体として遊離される。
Ｍ．Ｍｅｌｄａｌらは、ジアミノ化ポリエチレングリコールのモノおよびジアクリロイル化体の重合体ゲルに、下記式
2004099271.tif 000004
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、トリフロロ酢酸により糖鎖を糖ペプチドとして遊離させる方法を報告しており、糖転移反応もほぼ定量的に進行したと報告している（例えば、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８４９（１９９４）参照）。この方法で得られる糖ペプチドのペプチド鎖はＡｓｎ（アスパラギン）−Ｇｌｙ（グリシン）であり、Ｃ末側のグリシン残基はグリシンアミド残基となっており、通常の糖ペプチドとは異なる。さらに、Ｃ．−Ｈ．Ｗｏｎｇらは、アミノ化シリカを固相担体として下記式
2004099271.tif 000005
（式中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を示す）の基を導入したものをプライマーとし、これにＦｍｏｃ−アミノ酸およびＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（βＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨを用いてペプチド鎖を伸長させ、次いでペプチド鎖上の保護基を脱離させ、その後上述のＮ−アセチルグルコサミン残基に糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させ、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムで処理することにより固相担体上で合成した糖ペプチドを遊離させる方法を報告している（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９，８７６６（１９９７）参照）。得られた糖ペプチドの最初に固相担体に導入したアミノ酸に対する収率は１０％以下であり、十分なものとは言えない。
Ｔ．ＮｏｒｂｅｒｇらはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（アマシャムファルマシア社製）に下記式
2004099271.tif 000006
に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、臭素あるいはアンモニア／硼酸アンモニウムにより伸長させた糖鎖を遊離させる方法を報告している（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３１９，８０（１９９９）参照）。酵素による糖転移反応は定量的に進行しており、収率的には問題はないが、プライマーを製造に高価な３，４−ジエトキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオンを用いており、経済的ではない。上述したこれらの方法は、必ずしも糖転移反応の収率が十分でないことや不溶性担体上で糖鎖伸長反応を行うため、固定化糖転移酵素を利用できないという欠点がある。遺伝子組換えにより糖転移酵素の大量生産が可能になってきたとはいえ、まだまだ非常に高価であり、繰り返して使用できる固定化糖転移酵素の利用が望まれる。固定化糖転移酵素を利用するためには、不溶性担体ではなく、水溶性担体上で糖鎖伸長反応を行う必要がある。
Ｓ．Ｒｏｔｈらは、以下のような方法を開示している（例えば、特表平５−５００９０５号公報参照）。まず、糖転移酵素の糖受容体を固相担体に結合させ、これをアフィニティ吸着体とし、この糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体に結合させる。次いで、この糖転移酵素が結合したアフィニティ吸着体をこの糖転移酵素が糖供与体として利用できる糖ヌクレオチドを含む溶液と接触させることにより、糖転移酵素をアフィニティ吸着体から遊離させるとともに糖受容体に糖残基を一つ伸長させる。さらに、この糖残基が一つ伸長した糖受容体と結合することのできる糖転移酵素を含む組織抽出液を接触させ、同様のことを繰り返し所望の糖鎖を固相担体上に合成するというものである。しかしながら、この方法の有用性を示す具体的なデータは示されておらず、得られた糖鎖を固相担体から遊離させる方法も開示されていない。
水溶性担体上で糖鎖伸長を行う方法としては、Ｃ．−Ｈ．Ｗｏｎｇらは、アクリルアミド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体のアクリルアミド残基に下記式
2004099271.tif 000007
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）の基を結合させた水溶性のポリマーをプライマーとし、糖転移酵素により糖鎖を伸長させた後、硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）により遊離させる方法を報告している（例えば、Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３４３，６７５（２００１）参照）。このときの共重合体プライマー中に含まれるアクリル酸の割合は４％であり、本発明のプライマーとは異なる。この方法によれば、酵素による糖転移反応は８０〜９０％の収率で進行し、伸長した糖鎖はｐ−ホルミルフェノール配糖体として遊離される。しかしながら、この方法では遊離させたｐ−ホルミルフェノール配糖体を精製するためには、有機溶媒を必要とするカラムクロマトグラフィーが必要であること、得られるｐ−ホルミルフェノール配糖体が必ずしも安定ではないという欠点を有している。
本発明者らはポリアクリルアミド中のアミド態窒素原子の５個に１個の割合で、下記式
2004099271.tif 000008
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、水素化分解により伸長させた糖鎖をオリゴ糖として遊離させる方法を報告している（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３５，５６５７（１９９４）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０５，４４３（１９９８））参照）。
さらに、本発明者らがポリアクリルアミドのアミド態窒素原子に、下記式
2004099271.tif 000009
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基を結合させたものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、α−キモトリプシンの加水分解作用を利用して伸長させた糖鎖を６−アミノヘキサノール配糖体として遊離させる方法を報告している（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６，９４９３（１９９５）；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，３０５，４４３（１９９８）参照）。
これらの方法では、いずれも遊離の酵素を用いて効率よく糖鎖化合物を合成できることを報告しているが、後述するように固定化酵素を用いたときは必ずしも十分効率的とは言えない。また、本発明者らはポリアクリルアミドのアミド態窒素に適当な長さのリンカーおよび特定のプロテアーゼの開裂部位を含むアミノ酸残基あるいはペプチド残基を介して、前記プロテアーゼの開裂部位を含まず、かつその側鎖官能基に糖鎖伸長開始点となる単糖残基が結合しているペプチド残基、例えば下記式
2004099271.tif 000010
（式中、Ａｃはアセチル基を示す）に示した基、が結合したものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、前記プロテアーゼの加水分解作用を利用して伸長させた糖鎖を糖ペプチドとして遊離させる方法を開示している（例えば、特開２００１−２２０３９９号公報参照）。
また、本発明者らは水溶性ポリマーの側鎖に一般式（ＶＩＩＩ）
2004099271.tif 000011
（式中、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立して、Ｈまたは単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ１５は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ１６は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す）が結合したものをプライマーとし、糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させた後、セラミドの存在下、セラミドグリカナーゼを作用させることにより、該糖鎖含有ポリマーから複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させ、スフィンゴ糖脂質として遊離させる方法を開示している（例えば、特開平１０−２５１２８７号公報参照）。
これらのなかでは、水溶性ポリマーとしてポリアクリルアミドの場合が具体的に例示されているが、アクリル酸が含まれる場合は例示されていない。また、水溶性ポリマーとしてポリアクリルアミドの場合、固定化糖転移酵素を用いて糖転移反応を行った際、後述するように必ずしも十分効率的とは言えない。また、後者のプライマーにおいては、糖転移反応後、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去するためにゲルろ過クロマトグラフィーや限外ろ過を行ったとき、プライマーの回収率が必ずしも十分とは言えない。
本発明の主な目的は、各種糖鎖化合物の自動合成に適したプライマーとして有用な化合物、該化合物を用いた糖鎖の製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは前記問題点を解決するために鋭意検討した結果、（メタ）アクリル酸系残基（アクリル酸もしくはその塩およびメタクリル酸もしくはその塩から選ばれる）を２０〜８０モル％含む水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して単糖残基、オリゴ残基、あるいは単糖残基もしくはオリゴ糖残基が結合したペプチドを結合させることにより、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
１．単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を２０〜８０モル％含み、前記リンカーは（メタ）アクリル酸残基以外の繰り返し単位に結合されることを特徴とする糖鎖含有水溶性ポリマー化合物。
２．単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を２０〜８０モル％含み、前記リンカーは（メタ）アクリル酸残基以外の繰り返し単位に結合されることを特徴とする項１に記載の化合物。
３．水溶性ポリマーが、（メタ）アクリル酸２０〜８０モル％とアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類および脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体８０〜２０モル％の共重合体である項１または２記載の化合物。
４．リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、水素化分解あるいは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化工程により開裂される項１〜３のいずれかに記載の化合物。
５．前記リンカーが、一般式（Ｉ）
2004099271.tif 000012
（式中、Ｒ１は単糖残基もしくはオリゴ糖残基を示し、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である項１〜４のいずれかに記載の化合物。
６．Ｒ１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基又はラクトース残基である項５記載の化合物。
７．Ｒ２がペンチレン基である項５または６に記載の化合物。
８．前記リンカーが一般式（ＩＩ）
2004099271.tif 000013
（式中、Ｒ３は単糖残基もしくはオリゴ糖残基を示し、Ｒ４は炭素数６〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ５はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＹはＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である項１〜７のいずれかに記載の化合物。
９．Ｒ３がグルコース残基またはラクトース残基である項８記載の化合物。
１０．前記リンカーが一般式（ＩＩＩ）
2004099271.tif 000014
（式中、Ｒ６は単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ７はメチレン基２〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ８はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＺおよびＷはそれぞれ独立してＯ、ＳまたはＮＨを示す。）で表される基である項１〜９のいずれかに記載の化合物。
１１．Ｒ６がＮ−アセチルグルコサミン残基である項１０記載の化合物。
１２．前記ペプチド残基がアミノ酸残基２〜３０個よりなる項２記載の化合物。
１３．リンカーに含まれる選択的に開裂可能な結合が、特定の加水分解酵素によって開裂可能な結合である項１〜１２のいずれかに記載の化合物。
１４．特定の加水分解酵素が、セラミドグリカナーゼ又はα−キモトリプシンである項１３記載の化合物。
１５．特定の加水分解酵素が、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合しているアミノ酸残基或いはペプチド残基中に開裂部位を含まないプロテアーゼである項１３記載の化合物。
１６．単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が連結される選択的に開裂可能な結合を含むリンカーが一般式（ＩＶ）
2004099271.tif 000015
（式中、Ｒ９はメチレン基１〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ９は水溶性ポリマー化合物と結合する。Ｒ１０は特定のプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基を示し、Ｒ１０は単糖残基あるいはオリゴ糖残基と結合する。）で表された基であり、単糖残基あるいはオリゴ糖残基はグリコシド結合により直接又は二価の連結基を介してＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒ残基の側鎖官能基あるいはペプチド残基中の前記アミノ酸残基の側鎖官能基に結合している項１５記載の化合物。
１７．Ｒ９が一般式（Ｖ）
2004099271.tif 000016
（式中、ＡはＯ、ＣＨ２、Ｃ＝ＯまたはＮＨを示し、かつＡを介して水溶性ポリマーの側鎖と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基である項１６記載の化合物。
１８．側鎖官能基に結合した二価の連結基がメチレン基１〜２０個分の長さを有する基である項１６または１７記載の化合物。
１９．側鎖官能基に結合した二価の連結基が一般式（ＶＩ）
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（式中、ＢはＯ、ＮＨまたはＣ＝Ｏを示し、かつＢを介してアミノ酸残基の側鎖官能基と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基である項１６〜１８のいずれかに記載の化合物。
２０．項１〜１９のいずれかに記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物からなる糖鎖化合物合成用水溶性高分子プライマー。
２１．一般式（ＶＩＩ）
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（式中、Ｒ１１は単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示し、Ｒ１２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示す）で表される（メタ）アクリルアミド誘導体と（メタ）アクリル酸と少なくとも１種類のビニル系単量体とを、（メタ）アクリル酸が全ビニル系共重合体中２０〜８０モル％になるように共重合することを特徴とする糖鎖含有水溶性ポリマー化合物の製造方法。
２２．Ｒ１１がＮ−アセチルグルコサミン残基、グルコース残基またはラクトース残基である項２１記載の方法。
２３．Ｒ１２がペンチレン基である項２２記載の方法。
２４．ビニル系単量体がアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン酸、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれる項２１記載の方法。
２５．糖鎖化合物を製造する方法であって、
（工程１）項１あるいは２に記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物に糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該ポリマー化合物に転移させる工程、
（工程２）必要に応じて工程１を２回以上繰り返して糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した水溶性ポリマー化合物から糖鎖を遊離させる工程、を含むことを特徴とする糖鎖化合物を製造する方法。
２６．糖鎖化合物を製造する方法であって
（工程１）項８記載の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物に糖ヌクレオチドの存在下に転移酵素を作用させることにより、糖ヌクレオチドより、糖残基を該水溶性ポリマー化合物に転移させる工程、
（工程２）必要に応じて工程１を２回以上繰り返して、糖鎖を伸長させる工程、
（工程３）必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する工程、および、
（工程４）工程１〜工程３を複数回、繰り返した後、複数の糖残基が転移して伸長した水溶性ポリマー化合物に、セラミドの存在下、セラミドグリカナーゼを作用させ、該水溶性ポリマー化合物より、複数の糖残基が伸長したオリゴ糖残基をセラミドに転移させる工程、を含むことを特徴とする糖鎖化合物を製造する方法。
本発明の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物を、糖鎖化合物合成用水溶性高分子プライマー（以下、単に「プライマー」と略すことがある）として用いることにより、種々の糖鎖化合物を効率よく合成でき、自動合成にも適用することができる。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の糖鎖含有水溶性ポリマー化合物（以下、「糖鎖含有ポリマー」と略すことがある）は、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を単量体として２０〜８０モル％、好ましくは３０〜７０モル％、より好ましくは４０〜６０モル％含むものである。
即ち、本発明の水溶性ポリマーは、２０〜８０モル％の以下の（メタ）アクリル酸残基（カルボキシル基の塩を含む）を有する：
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（式中Ｍは、水素原子、アルカリ金属（Ｎａ，Ｌｉ，Ｋ）、１／２アルカリ土類金属（１／２Ｃａ，１／２Ｍｇ，１／２Ｂａ）、アンモニウムなどを示す。）
ここで、糖鎖は、当該（メタ）アクリル酸残基以外の単量体に由来する繰り返し単位、例えば
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の構造を有する繰り返し単位に結合される。
好ましい１つの実施形態において、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）は、エステル結合（ＣＯＯ）、アミド結合（ＣＯＮＨ）、チオエステル結合（ＣＯＳ）を介してアクリル酸またはメタクリル酸由来の繰り返し単位と結合され、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）と単糖残基（ｍｏｎｏ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）またはオリゴ糖残基（ｏｌｉｇｏ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、グリコシド結合により結合される。
単糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンなどが例示されるが、これらに限定されない。
オリゴ糖としては、上記の単糖が、２〜１０個連結されたものを包含し、例えば、ラクトース、キトビオース、Ｎ−アセチルラクトサミン、α２，３−シアリルラクトース、３−β−ガラクトシル−（６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｎ−アセチルガラクトサミン等が挙げられる。オリゴ糖は直鎖状であっても良く、１つの糖残基が２つの糖残基と結合した枝分かれ構造を有していても良い。
また、本発明の糖鎖含有ポリマーは、単糖残基（ｍｏｎｏ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）またはオリゴ糖残基（ｏｌｉｇｏ−ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）が結合したアミノ酸残基（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）或いはペプチド残基（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）が選択的に開裂可能な結合を含むリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介し水溶性ポリマーの側鎖に結合したポリマーであって、該水溶性ポリマー中に（メタ）アクリル酸残基を単量体として２０〜８０モル％含む糖鎖含有ポリマーである。該ポリマーは、以下のような部分構造を含み得る：
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さらに、これらの中には、前記糖鎖含有ポリマーに糖転移酵素を作用させて、糖鎖を伸長させた糖鎖含有ポリマーであっても、さらに糖転移酵素により糖鎖の伸長の可能性のあるものは全て含まれる。
水溶性ポリマーの（メタ）アクリル酸（２０〜８０モル％）以外の単量体としては、特に制限されるものではないが、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類からなる群から選ばれた１種または２種以上のビニル系単量体の重合体などが好適に用いられる。これらのうち、単糖、オリゴ糖等の糖鎖は、好ましくはアクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類にリンカー及び必要に応じてアミノ酸残基或いはペプチド残基を介して結合され得る。
なお、アクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸ヒドロキシエチルなどのアクリル酸ヒドロキシアルキルエステル類、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどのアクリル酸ジメチルアミノアルキルエステル類、メタクリル酸ヒドロキシエチルなどのメタクリル酸ヒドロキシアルキルエステル類、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどのジメチルアミノアルキルエステル類は、水溶性が高いので、多量（例えば７０モル％以上）に使用してもよいが、他のアクリル酸エステル類、他のメタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類は、ポリマー全体として、水溶性になる量で使用することができる。アクリルアミド類、メタクリルアミド類、アクリル酸ヒドロキシエチルなどのアクリル酸ヒドロキシアルキルエステル類、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどのアクリル酸ジメチルアミノアルキルエステル類、メタクリル酸ヒドロキシエチルなどのメタクリル酸ヒドロキシアルキルエステル類、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどのジメチルアミノアルキルエステル類は、（メタ）アクリル酸（２０〜８０モル％）と糖鎖含有モノマーの合計量を除く割合で使用できる。
前記アクリルアミド類としては、例えばアクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−インプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類が好適に用いられる。
前記メタクリルアミド類としては、例えばメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが好適に用いられる。
前記アクリル酸エステル類としては、例えばアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
前記メタクリル酸エステル類としては、例えばメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが好適に用いられる。
前記スチレン類としては、例えばスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが好適に用いられる。
前記脂肪酸ビニルエステル類としては、例えば酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが好適に用いられる。
選択的に開裂可能な結合は、開裂後遊離されてくる糖鎖化合物、例えばオリゴ糖、糖ペプチド、スフィンゴ糖脂質、オリゴ糖配糖体を分解することなく開裂することのできる結合であれば、特に制限はなく、ペプチドやオリゴヌクレオチドなどの固相合成で用いられているリンカー内に含まれる結合のいくつかを利用することができる。例えば、弱酸性あるいは弱アルカリ性で開裂できる結合、水素化分解反応により開裂できる結合、光反応により開裂できる結合あるいは酵素により開裂できる結合などが挙げられる。さらに好ましくは、水素化分解、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化、プロテアーゼによる加水分解、セラミドグリカナーゼの転移反応などが挙げられる。
水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して結合した単糖残基あるいはオリゴ糖残基としては特に制限はなく、例えば一般式（Ｉ）（式中、Ｒ１は単糖もしくはオリゴ糖残基、Ｒ２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基、ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表される基、一般式（ＩＩ）（式中、Ｒ３は単糖もしくはオリゴ糖残基を示し、Ｒ４は炭素数６〜２０のアルキル基又はアルケニル基を示し、Ｒ５はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、ＹはＯ、ＳまたはＮＨを示す）で表される基、一般式（ＩＩＩ）（式中、Ｒ６は単糖残基或いはオリゴ糖残基を示し、Ｒ７はメチレン基２〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ８はメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｚ及びＷはそれぞれ独立してＯ、Ｓ又はＮＨを示す）で表される基などを挙げることができる。
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（一般式（Ｉ）では、Ｒ１−Ｏ−以外の部分が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーであり、一般式（ＩＩ）では、Ｒ３−Ｏ−以外の部分が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーであり、一般式（ＩＩＩ）では、Ｒ６−Ｏ−以外の部分が選択的に開裂可能な結合を含むリンカーである）。
ここで、メチレン基４〜２０個分（好ましくは４〜１８個分、より好ましくは６〜１２個分）の長さを有する二価の連結基、メチレン基５〜１９個分（好ましくは５〜１５個分、より好ましくは５〜１１個分）の長さを有する二価の連結基、メチレン基２〜２０個分（好ましくは４〜１８個分、より好ましくは６〜１２個分）の長さを有する二価の連結基は、全てがメチレン残基で構成されていてもよく、メチレン残基がエーテル結合で連結された基（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ１−；ｎ１は１〜６の整数）であっても良い（但し、全体としての長さがメチレン基４〜２０個分、メチレン基５〜１９個分、或いはメチレン基２〜２０個分であり、Ｏは、メチレン基１個分の長さとする）。本明細書中の他の二価の連結基についても上記と同様に理解される。
Ｒ１の単糖残基あるいはオリゴ糖残基としては、特に制限はなく、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、キシロース残基、ラクトース残基、Ｎ−アセチルラクトサミン残基、キトビオース残基などが例示される。
Ｒ２のメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基としては、特に制限はなく、例えばＣ４〜Ｃ２０のアルキレン基などを用いることができる。Ｃ４〜Ｃ２０のアルキレン基としては、ブチレン基、ペンチレン基、ヘプチレン基、ドデシレン基などが例示される。
Ｒ３の単糖もしくはオリゴ糖残基としては、特に制限はなく、例えば、グルコース残基またはラクトース残基などが例示され、さらに好ましくはβ−グルコース残基またはβ−ラクトース残基である。
Ｒ４の炭素数６〜２０のアルキル基としては、特に制限はなく、例えばヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル基などの直鎖又は分枝を有するＣ６〜Ｃ２０（好ましくはＣ８〜Ｃ１８）のアルキル基が例示され、Ｃ６〜Ｃ２０のアルケニル基も特に制限はないが、シス−９−オクタデセニル基などの直鎖又は分枝を有するＣ６〜Ｃ２０（好ましくはＣ８〜Ｃ１８）のアルケニル基が例示される。
Ｒ５のメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基としては、特に制限はく、例えばＣ５〜Ｃ１９のアルキレン基などを用いることができる。Ｃ５〜Ｃ１９のアルキレン基としては、ペンチレン基、ヘプチレン基、ノニレン基、ヘプタデシレン基などが例示される。
Ｒ６の単糖残基あるいはオリゴ糖残基としては、特に制限はなく、例えば、グルコース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、キシロース残基、ラクトース残基、Ｎ−アセチルラクトサミン残基、キトビオース残基などが例示され、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が好ましい。
Ｒ７のメチレン基２〜２０個分の長さを有する二価の連結基としては、特に制限はなく、例えば、Ｃ２〜Ｃ２０（好ましくはＣ４〜Ｃ１８）のアルキレン基などを用いることができる。Ｃ２〜Ｃ２０のアルキレン基としては、エチレン基、ブチレン基、ヘキレン基、ドデシレン基、オクタデシレン基などが例示される。
Ｒ８のメチレン基５〜１９個分の長さを有する二価の連結基としては、特に制限はなく、例えば、Ｃ５〜Ｃ１９（好ましくはＣ５〜Ｃ１５）のアルキレン基などを用いることができる。Ｃ５〜Ｃ１９のアルキレン基としては、ペンチレン基、ヘプチレン基、ウンデシレン基、ヘプタデシレン基などが例示される。
水溶性ポリマーの側鎖に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し結合した単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したペプチド残基としては、特に制限はないが、アミノ酸残基２〜３０個からなる単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したペプチド残基が好ましく、アミノ酸残基４〜２０個からなる単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したペプチド残基がさらに好ましく、構成するアミノ酸残基は分子内にアミノ基とカルボキシル基を有するものであれば特に制限はなく、Ｇｌｙ（グリシン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｔｙｒ（チロシン）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｙｓ（リジン）、Ａｒｇ（アルギニン）、Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｃｙｓ（システイン）、Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（トレオニン）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｇｌｎ（グルタミン）あるいはＰｒｏ（プロリン）残基などのα−アミノ酸残基あるいはβ−Ａｌａ残基のようなβ−アミノ酸残基などが例示される。また、アミノ酸残基はＤ体、Ｌ体いずれでもよいが、Ｌ体の方が好ましい。
結合している単糖残基あるいはオリゴ糖残基は、特に制限はなく、ガラクトース残基、マンノース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、グルコース残基、キシロース残基、シアル酸残基、Ｎ−アセチルラクトサミン残基、ラクトース残基、キトビオース残基、α２，３−シアリルラクトサミン、３−β−ガラクトシル−（６−β−Ｎ−アセチルグルコサミニル）−Ｎ−アセチルガラクトサミンなどが例示され、これら単糖残基あるいはオリゴ糖残基はα結合、β結合いずれの結合様式で結合していても構わない。ここでシアル酸とはノイラミン酸のアシル誘導体の総称であり、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸などが含まれる。
本発明の好ましいリンカーとしては、一般式（ＩＶ）
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（式中、Ｒ９はメチレン基１〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示し、Ｒ１０は特定のプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基を示す）で表された基例示できる。
単糖残基あるいはオリゴ糖が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａｓｐ，Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸を含む残基が例示され、これらアミノ酸の側鎖官能基と糖残基は直接又は二価の連結基を介して結合することができる。
Ｒ９のメチレン基１〜２０個分の長さを有する二価の連結基としては、特に制限はないが、上記一般式（Ｖ）
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（式中、ＡはＯ、ＣＨ２、Ｃ＝ＯまたはＮＨを示し、かつＡを介して水溶性ポリマーの側鎖と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基などを挙げることができ、具体的には下記に示すようなものが例示される。
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Ｒ１０の特定のプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基としては、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基中に開裂する部位が含まれないプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基であれば、特に制限はないが、例えば特定のプロテアーゼがα−キモトリプシンのときにはフェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなどの芳香族アミノ酸残基、プロリン特異的プロテアーゼのときにはプロリン残基、リジン特異的プロテアーゼのときにはリジン残基、グルタミン酸特異的プロテアーゼのときはグルタミン酸残基、トリプシンのときはアルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸残基、ファクターＸａのときはＩｌｅ（イソロイシン）−Ｇｌｕ（グルタミン酸）またはＡｓｐ（アスパラギン酸）−Ｇｌｙ（グリシン）−Ａｒｇ（アルギニン）残基、エンテロキナーゼのときはＡｓｐ（アスパラギン酸）−Ａｓｐ（アスパラギン酸）−Ａｓｐ（アスパラギン酸）−Ａｓｐ（アスパラギン酸）−Ｌｙｓ（リジン）残基などが挙げられ、単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基の種類に応じて、適宜選択することができる。
側鎖官能基に二価の連結基を介してグリコシド結合により単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基としては、二価の連結基を介してグルコシド結合で単糖残基又はオリゴ糖残基を結合させることのできる側鎖官能基を有するものであれば特に制限はないが、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ残基が好ましい。
二価の連結基としては、アミノ酸残基と単糖残基を結合させることのできるものであれば特に制限はなく、メチレン基１〜２０個分の長さを有しているものが好ましく、さらに上記一般式（ＶＩ）
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（式中、ＢはＯ、ＮＨまたはＣ＝Ｏを示し、かつＢを介してアミノ酸残基の側鎖官能基と結合しており、ｎは１〜１８の整数を示す）で表される基が好ましい。具体的には、下記に示されるようなものが例示される。
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好ましい１つの実施形態において、本発明の糖鎖含有ポリマーは側鎖官能基を有し、（ｉ）側鎖官能基に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介して単糖残基、オリゴ糖残基あるいは単糖残基もしくはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が結合している重合性ビニル系単量体と（ｉｉ）（メタ）アクリル酸と（ｉｉｉ）少なくとも１種類の他のビニル系単量体とを共重合することにより製造することができる３種以上のモノマーの共重合体である。そのときの（メタ）アクリル酸の全ビニル系共重合体中に占める割合は２０〜８０モル％であり、好ましくは４０〜６０モル％である。また、側鎖官能基を有し、側鎖官能基に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し、単糖残基、オリゴ糖残基あるいは単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が結合している重合性ビニル系単量体の全単量体に占める割合には、特に制限はないが、０．１〜５０モル％が好ましく、さらに１〜２５モル％が好ましい。
側鎖官能基を有し、側鎖官能基に選択的に開裂可能な結合を含むリンカーを介し、単糖残基、オリゴ糖残基あるいは単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したアミノ酸残基或いはペプチド残基が結合している重合性ビニル系単量体としては、例えば一般式（ＶＩＩ）（式中、Ｒ１１は単糖残基あるいはオリゴ糖残基、Ｒ１２はメチレン基４〜２０個分の長さを有する二価の連結基を示す）で表されるアクリルアミド誘導体、一般式（ＩＸ）（式中、Ｒ１７は炭素数６〜２０の直鎖又は分枝を有するアルキル基またはアルケニル基を示し、ｎは５〜１９の整数を示す）で表されるアクリルアミド誘導体、一般式（Ｘ）（式中、Ｒ１８は炭素数２〜２０のアルキレン基、Ｒ１９は炭素数５〜１９のアルキレン基を示す）で表されるアクリルアミド誘導体、あるいは一般式（ＸＩ）（式中、Ｒ２０は炭素数１〜１８のアルキレン基を示し、Ｒ２１は特定のプロテアーゼにより開裂できる部位を有するアミノ酸残基あるいはペプチド残基を示し、Ｒ２２はその残基中に直接又は二価の連結基を介してグリコシド結合により単糖残基あるいはオリゴ糖残基が結合したＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ，Ｇｌｎ、Ａｓｐ，Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ残基またはこれらアミノ酸残基を含むペプチド残基を示す）で表されるアクリルアミド誘導体などが例示される。
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なお、上記の一般式（ＶＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）で表されるアクリルアミド誘導体に代えて、対応するメタクリルアミド誘導体を使用することも可能である。対応するメタクリルアミド誘導体は、下記のアクリルアミド誘導体の製造法において、アクリルアミド部分をメタクリルアミドに代えた以外は同一の化合物を使用して、同様に製造することができる。
前記共重合はラジカル重合、カチオン重合、アニオン重合などの手法を用いることにより行うことができ、中でもペルオキソ二硫酸アンモニウムなどを触媒とするラジカル重合がより好適に用いることができる。
前記ビニル系単量体としては、例えばアクリルアミド類、メタクリルアミド類、メタクリル酸、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、スチレン類、脂肪酸ビニルエステル類などが挙げられる。
アクリルアミド類としては、アクリルアミドやＮ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミド類などが例示される。
メタクリルアミド類としては、例えばメタクリルアミド、Ｎ−メチルメタクリルアミドやＮ−イソプロピルメタクリルアミドなどのＮ−アルキルメタクリルアミド類などが例示される。
アクリル酸エステル類としてはアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
メタクリル酸エステル類としてはメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ジメチルアミノエチルなどが例示される。
スチレン類としてはスチレン、ｐ−ヒドロキシスチレンなどが例示される。
脂肪酸ビニルエステル類としては酢酸ビニル、酪酸ビニルなどが例示される。
共重合体の一般的な分子量は約１００００〜約１０００００００であり、好ましくは２００００〜５００００００、より好ましくは５００００〜２００００００である。
前記、一般式（ＶＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）で表されるアクリルアミド誘導体は、通常用いられている各種有機合成化学的な手法により合成することができる。
上記一般式（ＶＩＩ）で表されるアクリルアミド誘導体は、例えば、一般式（ＸＩＩ）（式中、Ｒ２３、Ｒ２４、およびＲ２５はそれぞれ独立して、アシル型保護基，エーテル型保護基あるいはアシル型保護基および／またはエーテル型保護基で水酸基が保護された単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示す）で表される糖オキサゾリン誘導体や一般式（ＸＩＩＩ）（式中、Ｘ１はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＯＣ（ＮＨ）ＣＣｌ３、Ｒ２６はＮＨＣＯＣＨ３またはＯＲ３０で表される基、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９およびＲ３０はそれぞれ独立して、アシル型保護基，エーテル型保護基あるいはアシル型保護基および／またはエーテル型保護基で水酸基が保護された単糖残基あるいはオリゴ糖残基を示す）で表されるハロゲン化糖あるいはトリクロロアセトイミデート誘導体とｐ−ニトロベンジルアルコールとを適当な触媒存在下で縮合させた後、ニトロ基を還元してアミノ基へと変換する。その後、一般式（ＸＩＶ）（式中、ｎは４〜２０の整数を示す）で表されるω−アミノ脂肪酸と塩化アクリロイルとの縮合により得られる一般式（ＸＶ）（式中、ｎは４〜２０の整数を示す）で表されるアクリルアミド誘導体と上記化合物とを適当な縮合剤存在下、縮合させることにより得られ得る。
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上記一般式（ＩＸ）で表されるアクリルアミド誘導体は、例えば、一般式（ＸＶＩ）（式中、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７はそれぞれ独立してアシル型保護基またはエーテル型保護基を示し、Ｘ２はＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＯＣ（ＮＨ）ＣＣｌ３を示す）で表される活性化ラクトースと一般式（ＸＶＩＩ）（式中、Ｒ３８は炭素数６〜２０のアルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ３９は保護基を示す）で表されるセリン誘導体とを適当な触媒存在下、縮合反応させた後、セリン残基部分のアミノ基の保護基を除去し、一般式（ＸＶＩＩＩ）（式中、Ｙ１はＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒを示し、ｎは５〜９の整数を示す）で表されるアクリルアミド誘導体と縮合反応させ、さらにラクトース部分の保護基を除去することにより得られる。
2004099271.tif 000030
上記一般式（Ｘ）で表されるアクリルアミド誘導体は、一般式（ＸＩＸ）（式中、Ｒ４０、Ｒ４１、およびＲ４２はそれぞれ独立して、アシル型保護基あるいはエーテル型保護基を示す）で表される糖オキサゾリン誘導体と一般式（ＸＸ）（式中、Ｒ４３は炭素数２〜２０のアルキレン基を示し、Ｒ４４は保護基を示す）で表されるフェニルアラニン誘導体を適当な触媒存在下に縮合させた後、保護基を除去し、一般式（ＸＸＩ）（式中、Ｒ４５は炭素数５〜１９のアルキレン基を示し、Ｙ２はＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒを示す）で表されるアクリルアミド誘導体と反応させ、さらに糖部分の保護基を除去することにより得られる
2004099271.tif 000031
上記一般式（ＸＩ）で表されるアクリルアミド誘導体は、ペプチド自動合成装置を利用して合成することができる。ここでは、プロテアーゼがα−キモトリプシンであり、Ｒ２１が芳香族アミノ酸残基であり、Ｒ２２が芳香族アミノ酸を含まない任意のペプチド残基であり、その残基中にＯＨ基あるいは酸アミド基にグリコシド結合により単糖残基が結合したセリン残基、トレオニン残基、グルタミン残基またはアスパラギン残基を含むペプチド残基、あるいは側鎖官能基に二価の連結基を介してグリコシド結合により単糖残基が結合したアミノ酸残基を含むペプチド残基である場合について述べる。まず、適当な固相担体上でアミノ酸を伸長させ、芳香族アミノ酸残基を含まない任意のペプチドであり、その残基中にＯＨ基あるいは酸アミド基にグリコシド結合により単糖残基が結合したセリン残基、トレオニン残基、グルタミン残基またはアスパラギン残基を含むペプチド残基、あるいは側鎖官能基に二価の連結基を介してグリコシド結合により任意の単糖残基が結合したアミノ酸残基を含むペプチドを固相担体上で合成する。そして、アミノ基が一般式（ＸＸＩＩ）（式中、Ｒ４６は炭素数１〜１８のアルキレン基を示す）で表される基でアシル化された芳香族アミノ酸誘導体を用いてペプチド鎖を伸長させた後、適当な方法で固相担体より伸長させたペプチドの遊離およびペプチド鎖あるいは単糖残基上の保護基を脱離させることにより得ることができる。
2004099271.tif 000032
ＯＨ基あるいは酸アミド基にグリコシド結合により単糖残基が結合したセリン残基、トレオニン残基、グルタミン残基またはアスパラギン残基を含むペプチド残基、あるいは側鎖官能基に二価の連結基を介してグリコシド結合により単糖残基が結合したアミノ酸残基を導入するときは、通常のＮ−保護アミノ酸の代わりに、水酸基が適当な保護基で保護された単糖残基がＯＨ基あるいは酸アミド基あるいは二価の連結基を介して側鎖官能基にグリコシド結合で結合した相当するＮ−保護アミノ酸を用いることにより導入することができる。アミノ基が上記一般式（ＸＸＩＩ）でアシル化された芳香族アミノ酸も通常のＮ−保護アミノ酸と同様の方法で導入することができる。
水酸基が適当な保護基で保護された単糖残基がＯＨ基あるいは酸アミド基にグリコシド結合により結合したセリン残基、トレオニン残基、グルタミン残基またはアスパラギン残基および側鎖官能基に二価の連結基を介して水酸基が適当な保護基で保護された単糖残基がグリコシド結合で結合したＮ−保護アミノ酸は、一般的な有機合成化学的手法で得ることができる。また、単糖残基が結合したＮ−保護アミノ酸のうちのいくつかのもの、例えばＦｍｏｃ−Ａｓｎ（ＧｌｃＮＡｃ（Ａｃ）３−β−Ｄ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄ）−ＯＨやＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ＧａｌＮＡｃ（Ａｃ）３−α−Ｄ）−ＯＨなどは既に市販されており、これらを利用することもできる。
アミノ基が上記一般式（ＸＸＩＩ）で表される基でアシル化された重合性芳香族アミノ酸誘導体は、一般的な有機合成化学的な手法で合成することができる。芳香族アミノ酸残基がフェニルアラニンであるときを例に挙げると、フェニルアラニンエチルエステルにω−アクリロイルアミノ脂肪酸を縮合後、エチルエステルを加水分解することにより得ることができる。フェニルアラニンエチルエステルとω−アクリロイルアミノ脂肪酸との縮合は、フェニルアラニンエチルエステルとω−アクリロイルアミノ脂肪酸とを縮合させることができる方法であれば特に制限はなく、通常ペプチド結合形成に用いられる縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボジイミダゾール、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン、ジフェニルホスホリルアジドなどの存在下両者を接触させることにより縮合させることができる。
本発明の糖鎖化合物製造方法の第１工程では、糖鎖含有水溶性ポリマー化合物に糖ヌクレオチドの存在下に糖転移酵素と接触させることにより、糖ヌクレオチドより糖残基を該糖鎖含有ポリマーに転移させる。
糖ヌクレオチドより糖鎖含有ポリマーへの糖の転移は、通常糖鎖含有ポリマーと糖ヌクレオチドとを含む中性の緩衝液中で、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で、１〜１２０時間、好ましくは２〜７２時間、糖転移酵素と接触させることにより行われる。糖ヌクレオチドは、糖鎖含有ポリマー１当量に対し、約１当量から過剰量使用するのが好ましい。
また、反応液中には必要に応じて金属塩を添加してもよい。添加できる金属イオンとしては、例えば、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛などがあり、通常塩化物等の形で添加することができる。
本発明で用いる糖転移酵素は、糖ヌクレオチド類を糖供与体として利用できるものであればよく、特に限定されない。このような酵素としてＬｅｌｏｉｒ経路の糖転移酵素類を挙げることができる。例えば、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、キシロース転移酵素、グルクロン酸転移酵素などが挙げられる。なお、これらの酵素は遊離酵素であっても、固定化酵素であっても構わないが、固定化酵素が好ましい。
本発明で用いる糖ヌクレオチド類は、上記酵素が利用できるものであれば特に限定されない。例えば、ウリジン−５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン、ウリジン−５’−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン、ウリジン−５’−ジリン酸グルクロン酸、ウリジン−５’−ジリン酸キシロース、グアノシン−５’−ジリン酸フコース、グアノシン−５’−ジリン酸マンノース、シチジン−５’−モノリン酸−Ｎ−アセチルノイラミン酸およびこれらのナトリウム塩などが挙げられる。
本発明のオリゴ糖製造方法の第２工程では、工程１を必要に応じて２回以上繰り返して、複数の糖残基を転移させることにより、糖鎖を伸長させる。
本発明のオリゴ糖製造方法の第３工程では、必要に応じて、副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類を除去する。副生したヌクレオチド類や未反応の糖ヌクレオチド類などを除去する方法は、糖鎖含有ポリマーとヌクレオチド類および糖ヌクレオチド類などとを分離できる方法であれば特に限定されない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析、限外ろ過などにより除去することができる。
本発明のオリゴ糖製造方法の第４工程では、工程１〜工程３を複数回繰り返した後、複数の糖残基が転移して糖鎖が伸長した糖鎖含有ポリマーから糖鎖化合物を遊離させる。本発明の糖鎖含有ポリマーより、糖鎖の伸長した糖鎖化合物を遊離させる方法としては、糖鎖の伸長した糖鎖化合物を分解することなく、遊離させることのできる方法であれば、特に制限はなく、例えば、弱酸性あるいは弱アルカリ性での分解、水素化分解反応、光反応あるいは酵素による分解反応などが挙げられ、さらに好ましくは、水素化分解、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノベンゾキノンによる酸化、プロテアーゼによる加水分解、セラミドグリカナーゼによる転移反応などが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１  ２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリンの合成
２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６．０ｇを１，２−ジクロロエタン４０ｍｌに溶かし、ここにトリメチルシリルトリフロロメタンスルホン酸３．２ｍｌを加え、５０℃で７時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却した後、トリエチルアミン１０．８ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；トルエン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝１００：２００：１）で目的物を分離し、目的物を５．０ｇ得た。
参考例２  ｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１で得た２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン２．８ｇをジクロロエタン４０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール１０．４ｇとＤ−カンファー−１０−スルホン酸０．２ｇを加え、８０℃で２時間撹拌しながら反応させた。反応後、室温まで冷却し、トリエチルアミン４．０ｍｌを加えた。反応液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：酢酸エチル：メタノール＝２００：４０：５）で目的物を分離し、目的物を３．７ｇ得た。
参考例３  ６−アクリロイルアミノカプロン酸の合成
６−アミノカプロン酸１０．０ｇを１．２７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６０ｍｌに溶解し、塩化アクリロイル７．８ｍｌを２０ｍｌのテトラヒドロフランに溶かしたものを氷冷下で滴下した。このとき、ｐＨ８〜９になるように４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて調整した。滴下後、徐々に室温に戻しながら２時間撹拌した。次いで、反応液に１Ｎ塩酸をｐＨ３になるまで加えた後、酢酸エチルで生成物を抽出した。抽出液を水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣を少量の酢酸エチルに溶かし、ヘキサンで再結晶し、目的物９．６ｇを得た。
参考例４  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例２で得たｐ−ニトロベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド１．６ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウム２．１ｇおよび１０％パラジウム−炭素１７０ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥後、硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４４ｍｌで溶かし、ここに参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸０．６ｇを加えた。さらに、トリエチルアミン０．４６ｍｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩６５ｍｇを０℃で撹拌しながら加えた。撹拌しながら室温まで戻し、２２時間反応させた。反応液にクロロホルム６０ｍｌを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶夜、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水の順で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝３０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
実施例１  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例４で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６６０ｍｇをメタノール７０ｍｌに溶解し、ここにナトリウムメトキシド５０ｍｇを加え、室温で撹拌しながら１５時間反応させた。反応後、Ｈ＋型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル社製）をｐＨ７になるまで加えた。イオン交換樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を５２０ｍｇ得た。
実施例２  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、糖鎖含有ポリマーＡ）の合成
実施例１で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド６１．７ｍｇ、アクリル酸１８．０ｍｇ、アクリルアミド６２．２ｍｇをジメチルスルホキシド：蒸留水＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶解し、アスピレーターで十分に脱気した後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（以下、ＴＥＭＥＤと略する）１１．６μｌと過硫酸アンモニウム８．６ｍｇを加え、室温で２４時間撹拌し重合させた。反応後、反応液に蒸留水２ｍｌを加え、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（アマシャムファルマシア社製）を用いたカラムクロマトグラフィー（溶出液：５０ｍＭ酢酸アンモニウム）により目的物を分離した。得られた目的物画分を凍結乾燥し、目的物１３８ｍｇを得た。
実施例３  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、糖鎖含有ポリマーＢ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
実施例４  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、糖鎖含有ポリマーＣ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミド２６．７ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
実施例５  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、糖鎖含有ポリマーＤ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミド８．９ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
参考例５  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド共重合体（共重合比１：９、糖鎖含有ポリマーＥ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド８０．０ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３８ｍｇを得た。
参考例６  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸共重合体（共重合比１：９、糖鎖含有ポリマーＦ）の合成
アクリルアミドを用いずに、アクリル酸８１．１ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１３９ｍｇを得た。
実施例６  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、糖鎖含有ポリマーＧ）の合成
アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを９９．０ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１７４ｍｇを得た。
実施例７  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、糖鎖含有ポリマーＨ）の合成
アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを７０．７ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１６４ｍｇを得た。
実施例８  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：６：３、糖鎖含有ポリマーＩ）の合成
アクリル酸５４．０ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを４２．４ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５４ｍｇを得た。
実施例９  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：８：１、糖鎖含有ポリマーＪ）の合成
アクリル酸７２．１ｍｇ、アクリルアミドの代わりにＮ−イソプロピルアクリルアミドを１４．１ｍｇ用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１４４ｍｇを得た。
参考例７  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：９、糖鎖含有ポリマーＫ）の合成
アクリル酸を用いずに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１２７．３ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１８３ｍｇを得た。
参考例８  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド共重合体（共重合比１：５：４、糖鎖含有ポリマーＬ）の合成
アクリル酸を用いずに、アクリルアミド４４．４ｍｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド５６．６ｍｇを用いる以外は実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５８ｍｇを得た。
参考例９  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素の調製
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）０．５ｇをとり、１ｍＭ塩酸１００ｍｌを３回に分けて洗浄した。これにβ１，４−ガラクトース転移酵素（東洋紡績社製）１０Ｕ、牛血清由来アルブミン（以下ＢＳＡと略する）３０ｍｇ、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース（以下ＵＤＰ−Ｇａｌと略する）１ｍＭ、Ｎ−アセチルグルコサミン５ｍＭ、塩化マンガン２５ｍＭおよびＮａＣｌ０．５Ｍを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加え、４℃で一晩穏やかに振とうした。固定化β１，４−ガラクトース転移酵素をガラスフィルターでろ別し、β１，４−ガラクトース転移酵素を除いた上記緩衝液５ｍｌで洗浄した。０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加え、担体中の未反応の活性化基をブロックした。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄し、固定化β１，４−ガラクトース転移酵素をＵＤＰ−Ｇａｌ１ｍＭおよび塩化マンガン５ｍＭを含む２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、４℃で保存した。得られた固定化酵素の活性は１．５Ｕ／ｍｌであった。
実施例１０  β１，４−ガラクトース転移酵素による各種糖鎖含有ポリマーへのガラクトース転移
ウリジン−５’−ジホスホガラクトース１０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、α−ラクトアルブミン０．２６ｍｇ／ｍｌを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに参考例９で得た固定化β１，４−ガラクトース転移酵素１ｍｌ、実施例２〜９および参考例５〜８で得た糖鎖含有ポリマーＡ〜Ｌをそれぞれ２０ｍｇ加え、３７℃で２４時間反応させた。反応液を遠心分離して得られた上清より、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（溶出液：蒸留水）で生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物１９ｍｇを得た。生成物をそれぞれ１ｍｇとり、蒸留水：エタノール＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶かし、ここに１０％パラジウム−炭素１ｍｇを加え、常圧下水素ガスにより室温で２４時間接触還元した。触媒をろ別した後、ろ液を限外ろ過ユニットウルトラフリーＭＣ（分画分子量１０，０００、ミリポア社製）でろ過し、通過液画分として遊離させたオリゴ糖を集めた。通過液画分を凍結乾燥し、得られた固形分を定法に従い、ピリジルアミノ化し、ＨＰＬＣにてＮ−アセチルラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンの存在比を分析することにより、糖転移収率を求めた。その結果、ガラクトースの転移がいずれも定量的に進行していることを確認した。
参考例１０  固定化α２，３−シアル酸転移酵素の調製
ＮＨＳ活性化セファロース（アマシャムファルマシア社製）０．５ｇをとり、１ｍＭ塩酸１００ｍｌを３回に分けて洗浄した。これにブタ肝臓由来α２，３−シアル酸転移酵素１Ｕ、ＢＳＡ３０ｍｇ、シチジン−５’−ジホスフェート１ｍＭを含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌを加え、４℃で一晩、穏やかに振とうした。固定化α２，３−シアル酸転移酵素をガラスフィルターでろ別し、α２，３−シアル酸転移酵素を除く上記緩衝液５ｍｌで洗浄した。０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを加え、担体中の未反応の活性化基をブロックし、さらに洗浄した後、α２，３−シアル酸転移酵素をシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略する）１ｍＭを含む２５ｍＭカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸漬し、４℃で保存した。得られた固定化酵素の活性は１１０ｍＵ／ｍｌであった。
実施例１１  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による各種糖鎖含有ポリマーへのシアル酸転移
参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．０５ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌに実施例１０で得たガラクトシル化された糖鎖含有ポリマーＡ〜Ｌをそれぞれ６．５ｍｇ（糖鎖含有ポリマーＡ〜Ｆ）、８．０ｍｇ、７．５ｍｇ、７．１ｍｇ、６．７ｍｇ、８．４ｍｇ、７．３ｍｇ（Ｎ−アセチルラクトサミン残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物をそれぞれ６．０ｍｇ（糖鎖含有ポリマーＡ〜Ｆ）、７．５ｍｇ、７．０ｍｇ、６．５ｍｇ、６．２ｍｇ、７．８ｍｇ、６．８ｍｇ得た。生成物をそれぞれ１ｍｇとり、実施例１０と同様にして糖転移収率を求めた。
2004099271.tif 000033
ＧＭ：ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）アミノ−ベンジル−２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド
ＡＡ：アクリル酸
ＡＡｍ：アクリルアミド
ＮＩＰＡＭ：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
参考例１１  ｐ−ニトロベンジル−４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
１−ブロモ−４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラピラノシルシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド５．０ｇをジクロロエタン５０ｍｌに溶解し、ここにｐ−ニトロベンジルアルコール２３．５ｇとモレキュラーシーブス４Åを５．０ｇ加え０℃で撹拌した。窒素気流下で銀トリフレートを２．９ｇ加えで徐々に室温に戻しながら１２時間撹拌しながら反応させた。反応液をクロロホルムで希釈してセライトパッド上で濾過したのち、ろ液を飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。ろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：メタノール＝５０：１）で目的物を分離し、目的物を５．６ｇ得た。
参考例１２  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１１で得たｐ−ニトロベンジル−４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシ３．０ｇをメタノール５０ｍｌに溶解し、ここにギ酸アンモニウムを１．８ｇおよび１０％パラジウム−炭素を２００ｍｇを加えた。室温で５分間撹拌した後、触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をクロロホルムで溶解した。蒸留水で有機層を洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別した後、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロエタン：Ｎ，Ｎ，−ジメチルホルムアミド＝１０：１の混合溶媒４０ｍｌで溶かし、ここに参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸を０．８５ｇ加えた。続いてトリエチルアミン６３４μｌと１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩８７０ｍｇを加えて氷冷から室温に戻しながら２２時間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈し、１Ｎ硫酸および飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧下で濃縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィー（溶出液；クロロホルム：エタノール＝２０：１）で目的物を分離し、目的物を１．１ｇ得た。
実施例１２  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−４−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１２で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクトピラノシル−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルコピラノシド１．０ｇをメタノール１０ｍＬに溶解させた。そこにナトリウムメトキシド２４ｍｇを加え室温で１５時間撹拌した。反応終了後、反応液をイオン交換樹脂ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８（Ｈ＋）で中和した。樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮し、目的物を６５０ｍｇ得た。
実施例１３  ｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：５、糖鎖含有ポリマーＭ）の合成
実施例１２で得たｐ−Ｎ−（６−アクリロイルアミノヘキサノイル）−ベンジル−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−グルコピラノシド７６．８ｍｇ、アクリル酸３６．０ｍｇ、アクリルアミド４４．４ｍｇを用いて、実施例２と同様の方法で共重合し、目的物１５１ｍｇを得た。
実施例１４  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＭへのシアル酸転移
参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．３ｍｌ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４を含む５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに実施例１３で得た糖鎖含有ポリマーＭを６．３ｍｇ（ラクトース残基で５μｍｏｌｅに相当）加え、３０℃で２４時間振とうしながら反応させた。反応後、遠心分離することにより反応液を上清として得た後、実施例１０と同様の方法で生成物を分離し、生成物を５ｍｇ得た。生成物を１ｍｇとり、実施例１０と同様にして、シアル酸転移反応の収率を求めたところ、８８％であった。
参考例１３  Ｎ−（６−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニンエチルエステルの合成
フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩１．１５ｇと参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸１．１１ｇをジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略する）１５ｍｌに溶解し、氷冷下撹拌しながらジフェニルホスホリルアジド１．６５ｇを溶かしたＤＭＦ１５ｍｌを加え、さらにトリエチルアミン１．１１ｇを溶かしたＤＭＦ１５ｍｌを滴下した。氷冷下４時間反応させた後、室温で２４時間反応させた。反応後、ベンゼン：酢酸エチル＝１：１の混合溶媒４５０ｍｌを加え５％塩酸、水、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水の順に有機層を洗浄した。無水硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させた後、減圧濃縮し、残渣をベンゼンで再結晶し、目的物１．３５ｇを得た。
参考例１４  Ｎ−（６−アクリロイルアミノカプロイル）のフェニルアラニンの合成
１Ｎ水酸化ナトリウムを含むメタノール５０ｍｌ中に参考例１３で得たＮ−（６−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニンエチルエステル０．７２ｇを加え、室温で４時間撹拌した。反応後、Ｈ＋型陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（ダウケミカル社製）を加え中和した後、ろ過によりイオン交換樹脂を除き、ろ液を減圧乾固し、目的物０．６５ｇを得た。
参考例１５  ４−ペンテニル−３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミン
参考例１で得た２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン３．３ｇと４−ペンテン−１−オール１．７ｇを１，２−ジクロロエタン４０ｍｌに溶解し、７０℃に保ちながらＣＳＡをｐＨ２〜３になるまで加えた。３０分間反応させた後、室温まで冷却し、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機溶媒層を無水硫酸マグネシウムで一晩乾燥させた。セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（移動相：クロロホルム）で目的物２．５ｇを単離した。
参考例１６  ４−Ｏ−（３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミニル）酪酸
過マンガン酸カリウム１．９５ｇを１７％酢酸水溶液３５ｍｌに溶解し、参考例１５で得た４−ペンテニル−３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミン１．６ｇにさらに氷酢酸３５ｍｌに溶解させたものを氷冷下撹拌しながら滴下し、３時間反応させた。反応後、反応液に酢酸エチル３００ｍｌを加え、さらに硫酸ナトリウム３．１６ｇと１Ｍ塩酸３５ｍｌを加えて氷冷下撹拌した。有機層を分離し、飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加え乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ過により除去し、ろ液を減圧濃縮し目的物１．５ｇを得た。
参考例１７  Ｎ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ−ε−（４−Ｏ−（３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミニル）ブタノイル）リジンの合成
参考例１６で得た４−Ｏ−（３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミニル）酪酸０．４３ｇをクロロホルム２０ｍｌに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．１２ｇを加え、氷冷下ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２１ｇを加えて一晩撹拌した。撹拌後、反応液をろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジメトキシメタン１０ｍｌに溶解し、ここにＮ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）リジン０．３７ｇを溶解させたジメトキシメタン１０ｍｌを加え、室温で１時間撹拌した。水１００ｍｌを加え、生じた沈殿を水、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸、水の順に洗浄した。乾燥後、エタノールより再結晶し目的物０．５６ｇを得た。Ｎ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ−ε−（４−Ｏ−（３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミニル）ブタノイル）リジンは下記構造式（式中、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000034
参考例１８  アクリルアミド誘導体Ａの合成
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）をプレロードした２−クロロトリチル樹脂０．４４ｇ（樹脂１ｇあたりＳｅｒ残基が０．２３ｍｍｏｌ結合）を糖鎖含有ポリマーとして、ＡＢＩ社製Ａ４３３型ペプチドシンセサイザーを用い、以下に挙げるＮ−保護アミノ酸を各々１．０ｍｍｏｌ、Ｆｍｏｃ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法で順次縮合し、目的のアクリルアミド誘導体を固相担体上に合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（βＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、参考例１４で得たＮ−（６−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニン。５０％トリフロロ酢酸、１％１，２−エタンジチオール、１％チオアニソール、５％フェノールを含むジクロロメタン中室温で１時間反応させることによりペプチド残基上の保護基を脱離させるとともに固相担体上からアクリルアミド誘導体を遊離させた。樹脂を濾別し、減圧濃縮後酢酸エチル−クロロホルム混合溶媒（１：１）で希釈し、水で有機層を洗浄した。ＨＰＬＣにより（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  ２０ｍｍ×２５０ｍｍ、移動相：Ａ：Ｂ＝１００：０（０分）〜５０：５０（６０分）、Ａ：０．１％トリフロロ酢酸水溶液、Ｂ：０．１％トリフロロ酢酸アセトニトリル溶液、流速；９．０ｍｌ／分）アクリルアミド誘導体を精製した。アクリルアミド画分を凍結乾燥し、得られた固体にナトリウムメトキシド２．２ｍｇを含むメタノール３０ｍｌを加え、室温下２時間撹拌した。Ｈ＋型陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（ダウケミカル社製）を加え中和した後、ろ過によりイオン交換樹脂を除き、ろ液を減圧乾固し、目的物であるアクリルアミド誘導体Ａを９６ｍｇ得た。得られたアクリルアミド誘導体Ａは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000035
参考例１９  アクリルアミド誘導体Ｂの合成
参考例１８と同様にして、以下に挙げるＮ−保護アミノ酸を各々１．０ｍｍｏｌ、Ｆｍｏｃ／ＤＣＣ／ＨＯＢｔ法で順次縮合し、目的のアクリルアミド誘導体を固相担体上に合成した。Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、参考例１７で得たＮ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｎ−ε−（４−Ｏ−（３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミニル）ブタノイル）リジン、参考例１４で得たＮ−（６−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニン。参考例１８と同様の方法でペプチド残基上の保護基を脱離、固相担体上からの目的物であるアクリルアミド誘導体の遊離、さらには精製を行い、目的物であるアクリルアミド誘導体Ｂを９７ｍｇ得た。得られたアクリルアミド誘導体Ｂは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000036
実施例１５  アクリルアミド誘導体Ａ−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：６、糖鎖含有ポリマーＮ）の合成
参考例１８で得たアクリルアミド誘導体Ａ６０ｍｇをジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略する）２ｍｌに溶解させ、これにアクリル酸１４．４ｍｇ、アクリルアミド２１．３ｍｇを水１ｍｌに溶かしたものを加えた。続いて、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン７．５μｌ、過硫酸アンモニウム４．５ｍｇを加え、５０℃で２４時間共重合させた。反応溶液は減圧濃縮し、ＤＭＳＯを留去してからセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；１０ｍＭ酢酸アンモニウム）で分離し、目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物である糖鎖含有ポリマーＮを９０ｍｇ得た。得られたポリマー中の糖ペプチドが結合したアクリルアミド誘導体Ａ残基は下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有し、その含有率は約９モル％であった。
2004099271.tif 000037
実施例１６  アクリルアミド誘導体Ｂ−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：４：６、糖鎖含有ポリマーＯ）の合成
参考例１８で得たアクリルアミド誘導体Ａ６０ｍｇの代わりに、参考例１９で得たアクリルアミド誘導体Ｂ６１ｍｇを用いて、実施例１５と同様の反応を行い、目的物である糖鎖含有ポリマーＯを９１ｍｇ得た。得られたポリマー中のネオ糖ペプチドが結合したアクリルアミド誘導体Ｂ残基は下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有し、その含有率は９モル％であった。
2004099271.tif 000038
参考例２０  アクリルアミド誘導体Ａ−アクリルアミド共重合体（共重合比１：１０、糖鎖含有ポリマーＰ）の合成
アクリル酸１４．４ｍｇ、アクリルアミド２１．３ｍｇの代わりに、アクリルアミド３５．５ｍｇを用いて、実施例１５と同様の反応を行い、目的物である糖鎖含有ポリマーＰを９０ｍｇ得た。得られたポリマー中の糖ペプチドが結合したアクリルアミド誘導体Ａ残基の含有率は９モル％であった。
参考例２１  アクリルアミド誘導体Ｂ−アクリルアミド共重合体（共重合比１：１０、糖鎖含有ポリマーＱ）の合成
アクリル酸１４．４ｍｇ、アクリルアミド２１．３ｍｇの代わりに、アクリルアミド３５．５ｍｇを、参考例１８で得たアクリルアミド誘導体Ａ６０ｍｇの代わりに、参考例１９で得たアクリルアミド誘導体Ｂ６１ｍｇを用いて、実施例１５と同様の反応を行い、目的物である糖鎖含有ポリマーＱを９１ｍｇ得た。
実施例１７  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＮへのガラクトースの転移とα−キモトリプシンによる糖鎖含有ポリマーＮからの糖ペプチドの遊離
ＵＤＰ−Ｇａｌ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに、参考例９で得た固定化β１，４−ガラクトース転移酵素１ｍｌ、実施例１５で得た糖鎖含有ポリマーＮ３８ｍｇを加え、３７℃で４８時間反応させた。反応後、反応液からセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；１０ｍＭ酢酸アンモニウム）により生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物３６ｍｇを得た。得られた生成物１０ｍｇ、α−キモトリプシン０．３ｍｇを８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ塩化カルシウム含有）２ｍｌに溶かし、４０℃で２４時間反応させ、糖鎖含有ポリマーより糖鎖の伸長した糖ペプチドを遊離させた。反応液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相：１０ｍＭ酢酸アンモニウム）により生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより糖鎖の伸長した糖ペプチド６ｍｇを得た。得られた糖ペプチドのＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、糖ペプチドが下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有することを確認し、ガラクトース転移反応が定量的に進行していることを確認した。
2004099271.tif 000039
実施例１８  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＯへのガラクトースの転移α−キモトリプシンによる糖鎖含有ポリマーＯからのネオ糖ペプチドの遊離
実施例１５で得た糖鎖含有ポリマーＮ３８ｍｇの代わりに、実施例１６で得た糖鎖含有ポリマーＯ３９ｍｇを用い、実施例１７と同様の反応を行い、生成物３７ｍｇを得た。得られた生成物１０ｍｇを用いて、実施例１７と同様の方法を用い、糖鎖含有ポリマーから糖鎖が伸長したネオ糖ペプチドを遊離させた。得られたネオ糖ペプチドのＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ネオ糖ペプチドが下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有することを確認し、ガラクトース転移反応が定量的に進行していることを確認した。
2004099271.tif 000040
参考例２２  β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＰへのガラクトースの転移
実施例１５で得た糖鎖含有ポリマーＮ３８ｍｇの代わりに、参考例２０で得た糖鎖含有ポリマーＰ３８ｍｇを用い、実施例１７と同様の反応を行い、生成物３６ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ガラクトースが転移した生成物であることを確認した。ガラクトースが転移したポリマー中の糖ペプチドが結合したアクリルアミド誘導体Ａ残基は下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000041
参考例２３  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＱへのガラクトースの転移
実施例１５で得た糖鎖含有ポリマーＮ３８ｍｇの代わりに、参考例２１で得た糖鎖含有ポリマーＱ３９ｍｇを用い、実施例１７と同様の反応を行い、生成物３７ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ガラクトースが転移した生成物であることを確認した。ガラクトースが転移したポリマー中の糖ペプチドが結合したアクリルアミド誘導体Ｂ残基は下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000042
実施例１９  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＮおよびＰへのシアル酸転移
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ−５４を含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素を１．０ｍｌ、実施例１７で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＮ２１ｍｇあるいは参考例２２で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＰ２１ｍｇを加え、３７℃で１８時間反応させた。反応後、反応液からセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相：１０ｍＭ酢酸アンモニウム）により生成物を分離し、凍結乾燥することにより生成物をそれぞれ１７ｍｇ得た。得られた生成物１０ｍｇを用いて、実施例１７と同様な方法で糖鎖含有ポリマーから糖鎖が伸長した糖ペプチドを遊離させた。遊離した糖ペプチドのＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルからシアル酸転移反応の反応率を比較した。その結果、糖鎖含有ポリマーＮの反応率が約８０％であったのに対して、糖鎖含有ポリマーＰは約５０％であり、糖鎖含有ポリマーＮの方が反応性に優れていることがわかった。
実施例２０  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＯおよびＱへのシアル酸転移
実施例１７で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＮ２１ｍｇあるいは参考例２０で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＰ２１ｍｇの代わりに、実施例１８で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＯ２２ｍｇあるいは参考例２３で得たガラクトースが転移した糖鎖含有ポリマーＱ２２ｍｇを用いて、実施例１９と同様の反応を行い、生成物をそれぞれ１８ｍｇ得た。得られた生成物０ｍｇを用いて、実施例１７と同様の方法で糖鎖含有ポリマーから糖鎖が伸長したネオ糖ペプチドを遊離させた。遊離したネオ糖ペプチドのＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、そのスペクトルからシアル酸転移反応の反応率を比較した。その結果、糖鎖含有ポリマーＯの反応率が約８０％であったのに対して、糖鎖含有ポリマーＱは約６０％であり、糖鎖含有ポリマーＯの方が反応性に優れていることがわかった。
実施例２１  固定化α２，３−シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＮへのシアル酸転移とα−キモトリプシンによる糖鎖含有ポリマーＮからの糖ペプチドの遊離
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素を１．０ｍｌの代わりに、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ１００ｍＭ、参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素を１．５ｍｌを用い、実施例１９と同様の反応を２４時間行い、生成物１７ｍｇを得た。実施例１７と同様な方法で糖鎖含有ポリマーから糖鎖が伸長した糖ペプチドを遊離させ、得られた糖ペプチドのＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、糖ペプチドが下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有することを確認し、シアル酸転移反応がほぼ定量的に進行していることを確認した。
2004099271.tif 000043
参考例２４  Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノ−１−ヘキサノールの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニン１１．９６ｇと６−アミノ−１−ヘキサノール５．２ｇをベンゼン：エタノール＝１：１の混合溶媒４０ｍｌに溶解し、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（以下ＥＥＤＱと略する）９．９ｇを加えて、室温で２４時間撹拌した。反応後、反応液を減圧乾固し、残渣をベンゼンで再結晶し、目的物１３．６ｇを得た。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノ−１−ヘキサノールは下記構造式を有する。
2004099271.tif 000044
参考例２５  Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例１で得た２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン２．９６ｇと参考例２４で得たＮ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノ−１−ヘキサノール７．１７ｇをジクロロエタン３５ｍｌに溶解させ、７０℃に保ちながらＤ−カンファー−１０−スルホン酸（以下、ＣＳＡと略する）をｐＨ２〜３になるまで加えた。３０分間反応させた後、室温まで冷却し、反応液をクロロホルムで希釈して飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機溶媒層を無水硫酸マグネシウムで一晩乾燥させた。セライトろ過により硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（移動相；クロロホルム）で目的物２．３７ｇを単離した。Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
2004099271.tif 000045
参考例２６  Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例２５で得たＮ−（ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド１．５ｇをメタノール４０ｍｌに溶かし、１０％パラジウム−炭素１５０ｍｇを加えて、水素気流下、５０℃で２時間撹拌した。触媒をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣と参考例３で得た６−アクリロイアミノカプロン酸０．４２ｇをエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒に溶解し、ＥＥＤＱ０．５５ｇを加えて室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をエタノールで再結晶し、目的物１．２ｇを得た。Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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参考例２７  Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
参考例２６で得たＮ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド５９０ｍｇをＴＨＦ：メタノール＝１：１の混合溶媒２０ｍｌに溶解し、ナトリウムメトキシド１６．９ｍｇを加えて、室温で２４時間撹拌した。Ｈ＋型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ−８（ダウケミカル社製）をｐＨ７になるまで加えた。イオン交換樹脂をろ別し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒で再結晶し、目的物４１３ｍｇを得た。Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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実施例２２  Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：２；７、糖鎖含有ポリマーＲ）の合成
参考例２７で得たＮ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド７９．３ｍｇ、アクリル酸１８．０ｍｇ、アクリルアミド６２．２ｍｇをＤＭＳＯ：水＝３：１の混合溶媒１ｍｌに溶かした。続いて、ＴＥＭＥＤ１１．６μｌ、過硫酸アンモニウム８．６ｍｇを加え、室温で２４時間共重合させた。反応溶液は減圧濃縮し、ＤＭＳＯを留去してからセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；１０ｍＭ酢酸アンモニウム）で分離し、目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物１６０ｍｇを得た。得られたポリマー中のＮ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド残基は、下記構造式を有する。
参考例２８  Ｎ−（６’−アクリロイルアミノカプロイル）フェニルアラニル−６−アミノヘキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド−アクリルアミド共重合体（共重合比１：９、糖鎖含有ポリマーＳ）の合成
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アクリル酸１８．０ｍｇ、アクリルアミド６２．２ｍｇの代わりに、アクリルアミド８０．０ｍｇを用いて、実施例２２と同様に反応を行い、目的物１６０ｍｇを得た。
実施例２３  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＲへのガラクトースの転移
ＵＤＰ−Ｇａｌ２０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに、参考例９で得た固定化β１，４−ガラクトース転移酵素０．５ｍｌ、
実施例２２で得た糖鎖含有ポリマーＲ１３．５ｍｇを加え、３７℃で２４時間反応させた。反応後、遠心分離により固定化β１，４−ガラクトース転移酵素を除き、得られた反応液からセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；５ｍＭギ酸アンモニウム）により生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物１１ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ガラクトースが定量的に転移していることを確認した。
参考例２９  固定化β１，４−ガラクトース転移酵素による糖鎖含有ポリマーＳへのガラクトースの転移
実施例２２で得た糖鎖含有ポリマーＲ１３．５ｍｇの代わりに、参考例２８で得た糖鎖含有ポリマーＳ１３．５ｍｇを用いて、実施例２３と同様の反応を行い、生成物１１ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ガラクトースが定量的に転移していることを確認した。
参考例３０  固定化α２，６−シアル酸転移酵素の調製
α２，３シアル酸転移酵素１Ｕの代わりに、ラット肝臓由来α２，６−シアル酸転移酵素１Ｕを用い、参考例１０と同様の方法で目的物を調製し、４℃で保存した。得られた固定化酵素の活性は１２０ｍＵ／ｍｌであった。
実施例２４  固定化α２，６−シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＲ及びＳへのシアル酸の転移
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ２５ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌに、参考例３０で得た固定化α２，６−シアル酸転移酵素０．５ｍｌと実施例２３で得たガラクースが転移した糖鎖含有ポリマーＲ７．５ｍｇあるいは参考例２９で得たガラクースが転移した糖鎖含有ポリマーＳ７．５ｍｇを加え、３７℃で２４時間反応させた。実施例２３と同等の方法で生成物６ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、シアル酸転移反応の反応率を比較した。その結果、糖鎖含有ポリマーＲでは定量的に反応が進んでいたのに対して、糖鎖含有ポリマーＳは７０％しか反応が進行していなかった。
実施例２５  α−キモトリプシンによる糖鎖含有ポリマーＲからの糖鎖の切り出し
実施例２４で得たシアル酸が転移した糖鎖含有ポリマーＲ５ｍｇ、α−キモトリプシン０．６ｍｇを８０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ塩化カルシウム含有）２ｍｌに溶かし、４０℃で２４時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；５０ｍＭギ酸アンモニウム）により生成物画分を分離し、凍結乾燥することにより生成物２ｍｇを得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、生成物が下記構造式を有することを確認した。
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参考例３１  Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリン１２ｇをエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒１２０ｍｌに溶解させた後、ＥＥＤＱ１３．６ｇおよびオクチルアミン１１．１ｍｌを加えて室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、トルエンで再結晶し、目的物１２．６４ｇを得た。Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは下記構造式を有する。
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参考例３２  Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドの合成
よく乾燥させた参考例３１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇをジクロロエタン８ｍｌに溶解させ、活性化させたモレキュラーシーブ４Ａ８．０ｇと２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチルラクトシルブロミド１２．０ｇを加えた。氷冷下、トリフルオロメタンスルホン酸銀４．４０ｇを加え、徐々に室温に戻しながら、窒素気流下で一晩撹拌した。反応液をセライトでろ過し、ろ液を飽和食塩水で２回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥後、硫酸マグネシウムをろ別し、ろ液を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相、トルエン：酢酸エチル＝５：１）にて目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧濃縮し、目的物５．３２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミドは、下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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参考例３３  Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドの合成
参考例３２で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルセリンオクチルアミド４．０ｇをメタノール６０ｍｌに溶解させ、５％パラジウム−炭素を触媒とし、室温下常圧で接触還元を行った。反応後触媒をろ別し、反応液を減圧濃縮し、目的物３．４２ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシルセリンオクチルアミドは、下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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参考例３４  Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
参考例３で得た６−アクリロイルアミノカプロン酸２７８ｍｇとＥＥＤＱ３７１ｍｇをエタノール：ベンゼン＝１：１の混合溶媒４０ｍｌに加え、十分溶解させ、参考例３３で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシルセリンオクチルアミド１．１４ｇを加え、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（移動相、クロロホルム：メタノール＝１００：１）により目的物を分離した。目的物を含む溶出画分を減圧濃縮し、目的物１．０６ｇを得た。Ｏ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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参考例３５  Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドの合成
参考例３４で得たＯ−（２，３，６，２’，３’，４’，６’−ヘプタ−Ｏ−アセチル）ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド４００ｍｇをテトラヒドロフラン：メタノール＝１：１の混合溶媒に溶解させ、ナトリウムメトキシド８．４９ｍｇを加え、室温で２時間撹拌した。Ｈ＋型の陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ（ダウケミカル社製）を加えて中和した。ろ過によりイオン交換樹脂を除き、ろ液を減圧濃縮し、エタノールで再結晶し、目的物２７０ｍｇを得た。Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミドは、下記構造式を有する。
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実施例２６  Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリル酸−アクリルアミド共重合体（共重合比１：２：７、糖鎖含有ポリマーＴ）の合成
参考例３５で得たＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド７０．８ｍｇ、アクリル酸１４．４ｍｇ、アクリルアミド４９．８ｍｇをＤＭＳＯ：水＝１：１の混合溶媒に溶解し、ＴＥＭＥＤ１２μｌと過硫酸アンモニウム７．６７ｍｇを加え、５０℃で一晩重合させた。目的物を蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーで精製した。目的物の溶出画分を凍結乾燥し、目的物１１７ｍｇを得た。得られたポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式を有する。
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参考例３６  Ｏ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド−アクリルアミド共重合体（共重合比１：９、糖鎖含有ポリマーＵ）の合成
アクリル酸１４．４ｍｇ、アクリルアミド４９．８ｍｇの代わりに、アクリルアミド６４．０ｍｇを用いて，実施例２６と同様の反応を行い、目的物１０５ｍｇを得た。
実施例２７  固定化α２，３シアル酸転移酵素による糖鎖含有ポリマーＴおよびＵへのシアル酸の転移
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに、参考例１０で得た固定化α２，３−シアル酸転移酵素０．５ｍｌ、実施例２８で得た糖鎖含有ポリマーＴ１３．５ｍｇあるいは糖鎖含有ポリマーＵ１６．４ｍｇを加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応後、遠心分離により固定化α２，３−シアル酸転移酵素を除き、得られた反応液からセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；５０ｍＭギ酸アンモニウム）により生成物を分離し、凍結乾燥することにより生成物をそれぞれ１４ｍｇ、１２ｍｇ得た。得られた生成物のＨ−ＮＭＲスペクトルを測定し、シアル酸転移反応の反応率を比較した。その結果、糖鎖含有ポリマーＴでは反応率約９０％であったのに対して、糖鎖含有ポリマーＵでは約７０％であった。シアル酸が転移したポリマー中のＯ−ラクトシル−Ｎ−（６−アクリロイルアミノ）カプロイルセリンオクチルアミド残基は、下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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実施例２８  ゲルろ過クロマトグラフィーによる糖鎖含有ポリマーの回収率の比較
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ５０ｍＭ、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．０ｍｌに実施例２７で得たシアル酸が転移した糖鎖含有ポリマーＳあるいはＴ１０ｍｇを溶解した。この溶液から糖鎖含有ポリマーをセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー（移動相；５０ｍＭギ酸アンモニウム）により回収し、回収率の比較を行った。その結果、糖鎖含有ポリマーＳの回収率が８７％であったのに対して、糖鎖含有ポリマーＴは７７％であり、糖鎖含有ポリマーＳの方が優れていた。
実施例２９  糖鎖含有ポリマーからセラミドグリカナーゼによるＮ−ステアロイルスフィンゴシンへの糖鎖の転移
実施例２７で得たシアル酸が転移した糖鎖含有ポリマー１０ｍｇ、Ｎ−ステアロイルスフィンゴシン２５ｍｇ、トリトンＣＦ−５４を２０ｕｌ含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに、ヒル由来セラミドグリカナーゼ０．０１Ｕを添加し、３７℃で１７時間反応させた。反応後クロロホルム：メタノール：水＝６０：３０：５で平衡化したセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーにより生成物を分離した。生成物を含む溶出画分を減圧乾固し、生成物６ｍｇを得た。ＨＰＬＣによる分析より生成物が１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンであることを確認した。１−Ｏ−（Ｎ−アセチルノイラミニル−α−（２→３））ラクトシル−Ｎ−ステアロイルスフィンゴシンは下記構造式（式中、Ａｃはアセチル基を示す）を有する。
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【産業上の利用可能性】  本発明の糖鎖合成用糖鎖含有ポリマーを用いることにより、各種糖鎖化合物、例えば、オリゴ糖、糖ペプチド、糖脂質、配糖体を容易に効率よく合成することができ、得られる糖鎖化合物には様々の生理活性があり、医薬品などへの応用が期待される。
【国際調査報告】
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