(57)【要約】ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＫＩ−１３６６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを採取する。得られたＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃまたはそれらの組成物はアゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有することから、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減、耐性克服に有用であり、医薬品として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2005023788.tif 000014
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ａ。
【請求項２】
下記式［ＩＩ］
2005023788.tif 000015
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｂ。
【請求項３】
下記式［ＩＩＩ］
2005023788.tif 000016
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｃ。
【請求項４】
特に下記式［Ｉ］
2005023788.tif 000017
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、及び特に下記式［ＩＩ］
2005023788.tif 000018
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｂ、並びに特に下記［ＩＩＩ］
2005023788.tif 000019
で表されるＦＫＩ−１３６６物質ＣからなるＦＫＩ−１３６６粗製物。
【請求項５】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ａを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ａを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ａの製造法。
【請求項６】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ｂを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ｂを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ｂの製造法。
【請求項７】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ｃを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ｃを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ｃの製造法。
【請求項８】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６粗製物の製造法。
【請求項９】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有するボーベリア・エスピー  ＦＫＩ−１３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）である請求の範囲８に従うＦＫＩ−１３６６粗製物の製造法。
【請求項１０】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）。
【請求項１１】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、請求項１に従うＦＫＩ−１３６６物質Ａを生産する能力を有する微生物。
【請求項１２】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、請求項２に従うＦＫＩ−１３６６物質Ｂを生産する能力を有する微生物。
【請求項１３】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、請求項３に従うＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物。
【請求項１４】
ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有するボーベリア・エスピー  ＦＫＩ−１３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）である請求の範囲４に従うＦＫＩ−１３６６粗製物を生産する能力を有する微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する新規ＦＫＩ−１３６６物質およびその製造法に関する。本発明において、ＦＫＩ−１３６６物質とはＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃを総称したものである。
【背景技術】    真菌感染症の治療に用いられるアゾール系化合物としては、１−［２−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）−２−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（一般名：ミコナゾール、シグマ社製、米国）、２，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−α，α−ｂｉｓ（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（一般名：フルコナゾール、アイシーエヌファーマスーティカルズ社製、米国）、および（±）−１−ｓｅｃ−ｂｕｔｙｌ−４−［ｐ−［４−［ｐ−［［（２Ｒ，４Ｓ）−２−（２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−２−（１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｍｅｔｈｙｌ）−１，３−ｄｉｏｘｏｌａｎ−４−ｙｌ］ｍｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］−Δ２−１，２，４−ｔｒｉａｚｏｌｉｎ−５−ｏｎｅ（一般名：イトラコナゾール、協和発酵社製、日本）等が知られている。
これらの化合物は、真菌感染症の疾患に用いられているポリエン系の（１Ｒ，３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，９Ｒ、１１Ｒ，１５Ｓ，１６Ｒ，１７Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｅ，２５Ｅ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３５Ｓ，３６Ｓ，３７Ｓ−３３−（３−ａｍｉｎｏ−３，６−ｄｉｄｅｏｘｙ−ｂ−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｏｘｙ）−１，３，５，６，９，１１，１７，３７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏｘｙ−１５，１６，１８−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−１３−ｏｘｏ−１４，３９−ｄｉｏｘａｂｉｃｙｃｌｏ［３３．３．１］ｎｏｎａｔｒｉａｃｏｎｔａ−１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１−ｈｅｐｔａｅｎｅ−３６−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（一般名：アムホテリシン  Ｂ、シグマ社製、米国）等と比較して安全性が高く、最も高頻度に使用されている薬剤である（Ａｎａｉｓｓｉｅ  Ｅ．Ｊ．ら、クリニカル  インフェクシアス  ディジーズ、２３巻、９６４−９７２、１９９６年）。
しかしながら最近、これらアゾール系抗真菌剤の長期間または反復投与による耐性菌の出現が問題となっており、安全性が高く、耐性菌の出現頻度の低い薬剤の開発が社会的急務とされている。
また、これまでの抗真菌剤の薬剤開発は、真菌に対し直接、殺菌または静菌的に作用する薬剤の開発が主流であり、既存の抗真菌剤の活性を増強させるという観点からの医薬品の創製は行われていない。
【発明の開示】
ＨＩＶ感染や血液疾患など、免疫力の低下を伴う疾患では易感染状態が惹起され、日和見感染症として真菌感染症の発生頻度が増加する。またこれら免疫力低下を伴う疾患の多くは重篤で治療期間も長期にわたる。このため、真菌感染症の化学療法も長期間におよぶ場合が多く、現在最も高頻度に使用されているアゾール系抗真菌剤は薬剤耐性の誘導が極めて起こりやすい状態と考えられる。
アゾール系抗真菌剤に対する耐性機構としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおいて標的酵素であるＰ−４５０  １４−α−デメチラーゼの過剰発現やアミノ酸変異による薬剤との親和性の低下（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｈ．ら、アンチミクロビアル・エイジェント  アンド  ケモセラピー、３６巻、２６０２−２６１０頁、１９９２年；Ｓａｎｇｌａｒｄ  Ｄ．ら、アンチミクロビアル・エイジェント  アンド  ケモセラピー、４２巻、２４１−２５３頁、１９９８年）、ＭＳＦ（Ｍａｊｏｒ  Ｆａｃｉｌｉａｔｏｒ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）やＡＢＣ（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）などの多剤排出トランスポータによる細胞内薬剤濃度の低下（Ｆｌｉｎｇ  Ｍ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２２７巻、３１８−３２９頁、１９９１年；Ｓａｎｇｌａｒｄ  Ｄ．ら、ミクロビオロジー、１４３巻、４０５−４１６、１９９７年）が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ＭＤＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）遺伝子であるＰＤＲ１６、ＰＤＲ１７により脂質代謝を変化させ、アゾール系化合物に対する耐性を獲得していることなどが報告されている（Ｈ．Ｂａｒｔ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈａｚｅｌら、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー、２７４巻、１９３４−１９４１、１９９９年）。
これらのことから、アゾール系抗真菌剤の活性を上昇させる薬剤は、抗真菌剤の投与量を減量させ、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、骨格と作用の異なる薬剤を併用することにより、アゾール系抗真菌剤に対する耐性株に対しても有効となることが期待される。かかる実情において、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する薬剤を提供することは、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症やアゾール耐性真菌感染症の治療上有用であると考えられる。
本発明の目的は、現在実用化されている抗真菌剤の活性増強作用を有し、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減化を可能にした抗真菌活性増強作用を有するＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃで総称されるＦＫＩ−１３６６物質およびその製造法を提供するものである。
上記の目的を実現するために、本発明者らは、微生物の産生する代謝産物について種々研究を続けた結果、新たに土壌から分離したＦＫＩ−１３６６菌株の培養液中に、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する物質が生産されることを見い出した。次いで、該培養物から活性物質を分離、精製した結果、後記の式［Ｉ］、［ＩＩ］および［ＩＩＩ］で表される化学構造を有する物質をそれぞれ見い出した。これらの式［Ｉ］、［ＩＩ］および［ＩＩＩ］で表される物質は従来まったく知られていないことから、本物質をそれぞれＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃと称することにした。
本発明は、かかる知見にもとづいて完成されたものであって、下記式［Ｉ］
2005023788.tif 000002
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ａを提供するものである。
本発明は、更に下記式［ＩＩ］
2005023788.tif 000003
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｂを提供するものである。
本発明は、更にまた下記式［ＩＩＩ］
2005023788.tif 000004
で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｃを提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ａを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ａを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ａの製造法を提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ｂを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ｂを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ｂの製造法を提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ｃを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ｃを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６物質Ｃの製造法を提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを採取することを特徴とするＦＫＩ−１３６６粗製物およびそれの製造法を提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｂおよび／またはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物がボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）であるＦＫＩ−１３６６粗製物の製造法を提供するものである。
本発明は更にまた、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物を提供するものであり、更に、該微生物はボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）、およびその変異株を提供するものである。
前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］または［ＩＩＩ］で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する能力を有する微生物（以下「ＦＫＩ−１３６６物質生産菌」と称する）は、ボーベリア属に属するが、本発明の物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。本発明のＦＫＩ−１３６６物質を生産するために使用される菌株の好ましい一例としては、例えば本発明者らによって土壌より新たに分離されたボーベリア  エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６菌株が挙げられる。本菌株の菌学的性状を示すと以下の通りである。
（１）形態的特徴
本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、麦芽汁寒天培地、コーンミール寒天培地、三浦寒天培地などで良好に生育し、各種寒天培地で分生子の着生は良好であった。
三浦寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有しており、分生子形成器官は気菌糸より直立あるいは短い枝（２．８〜４．３×１．８〜２．８μｍ）から生じ、単独もしくはクラスターを形成する。分生子形成器官の基部は亜球形あるいはフラスコ状に膨らんで、大きさは３．３〜５．６×２．０〜３．３μｍとなる。先端は細く伸長し、分生子形成に伴いジグザグ状になり、長さ５〜１２μｍとなる。分生子は分生子形成器官の小突起上に出芽形成され、球形から亜球形で、無色で大きさ１．８〜３．０×１．８〜２．６μｍである。また、気菌糸には棍棒状あるいは不規則に分岐した厚膜胞子が観察される。
（２）各種培地上での培養性状
本菌株を各種寒天培地上で２５℃、１４日間培養した場合の肉眼的観察結果は下記の通りである。
2005023788.tif 000005
2005023788.tif 000006
（３）生理的性状
１）最適生育条件
本菌株の最適生育条件は、ｐＨ３．４〜７．９、温度１３．２〜３０．５℃である。
２）生育の範囲
本菌株の生育範囲は、ｐＨ２．４〜９．８、温度７．４〜３２．４℃である。
３）好気性、嫌気性の区別
好気性
上記ＦＫＩ−１３６６株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属に属する一菌株と同定し、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６と命名した。なお、本菌株は、ボーベリア・エスピー  ＦＫＩ−１８６６（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＫＩ−１３６６）として、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ，３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］に所在の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］に寄託されている。寄託日は平成１５年（２００３）８月２７日、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９である。
本発明で使用されるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂ、およびＦＫＩ−１３６６物質Ｃの生産菌としては、前述のボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）ＦＫＩ−１３６６菌株があげられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異しやすく、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−アミノプリンなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実である。それ故、このような人工的変異株は勿論、細胞融合株、遺伝子操作株を含め、ボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属し、前記式［Ｉ］で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、式［ＩＩ］で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｂ、または式［ＩＩＩ］で表されるＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する菌株は、すべて本発明に使用することができる。
本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを製造するに当たっては、先ずボーベリア・エスピー（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．）に属するＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃ生産菌を適当な培地に培養することにより行われる。上記ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃ生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が用いられる。
上記の同化し得る炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実油、コーン・スティープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類等が単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩等の重金属塩類やビタミン類、その他本ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの生産に好適なものが適宜添加される。
培養するに当たり、発泡が激しいときには、必要に応じて動物油、植物油、シリコン等、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物と同様に通気攪拌培養するのが好ましい。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者とも同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。
培養温度は、本ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの生産菌が本ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は２０〜３０度、好ましくは２７度前後で培養するのが良い。培養ｐＨは、通常は５〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は条件によってもことなるが、通常は４〜７日程度である。
このようにして得られた本ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃは、培養菌体および培養濾液に存在する。培養物から目的とするＦＫＩ−１６３３物質Ａ、ＦＫＩ−１６３３物質ＢまたはＦＫＩ−１６３３物質Ｃを採取するには、全培養液をアセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒で留去後、続いて残渣を酢酸エチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。
上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを分離、精製することができる。
次に、本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの理化学的性状について述べる。
ＦＫＩ−１３６６物質Ａ
（１）性状    ：白色粉末、
（２）分子量  ：７６９（高速原子衝撃質量分析による）、
（３）分子式  ：Ｃ４４Ｈ５５Ｏ９Ｎ３、
（４）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋９．０（Ｃ＝０．１、メタノール）、
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとおりであり、２１３ｎｍ（ε＝２６０００）付近に極大吸収を示す、
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示すとおりであり、２９６６、２８７５、１７４３、１６６２、１４５６、１２６１、１２０３、１１０５ｃｍ−１に特徴的な吸収帯を有する、
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第３図に示すとおりである、
（８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第４図に示すとおりである、
（９）溶媒に対する溶解性：ＤＭＳＯ、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに可溶、水、ｎ−ヘキサンに不溶、
（１０）呈色反応：リンモリブデン酸に陽性、
（１１）酸性、中性、塩基性の区別：中性物質
以上、ＦＫＩ−１３６６物質Ａの各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−１３６６物質Ａは下記式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
2005023788.tif 000007
ＦＫＩ−１３６６物質Ｂ
（１）性状    ：白色粉末、
（２）分子量  ：７３５（高速原子衝撃質量分析による）、
（３）分子式  ：Ｃ４１Ｈ５７Ｏ９Ｎ３、
（４）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋１８．４（Ｃ＝０．１、メタノール）、
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとおりであり、２０８ｎｍ（ε＝３０５００）付近に特徴的な吸収極大を示す、
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第６図に示すとおりであり、２９６４、２８７３、１７４３、１６６４、１４５６、１２６１、１２０１、１１０１ｃｍ−１に特徴的な吸収帯を有する、
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第７図に示すとおりである、
（８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第８図に示すとおりである、
（９）溶媒に対する溶解性：ＤＭＳＯ、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに可溶、水、ｎ−ヘキサンに不溶、
（１０）呈色反応：リンモリブデン酸に陽性、
（１１）酸性、中性、塩基性の区別：中性物質。
以上、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂの各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−１３６６物質Ｂは下記式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2005023788.tif 000008
ＦＫＩ−１３６６物質Ｃ
（１）性状    ：白色粉末、
（２）分子量  ：７９７（高速原子衝撃質量分析による）、
（３）分子式  ：Ｃ４６Ｈ５９Ｏ９Ｎ３、
（４）比旋光度：［α］Ｄ２６＝＋３１．４（Ｃ＝０．１、メタノール）、
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは、第９図に示すとおりであり、２０８ｎｍ（ε＝１１２００）付近に特徴的な吸収極大を示す、
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは、第１０図に示すとおりであり、２９６２、２８７３、１７４３、１６６２、１４８４、１２６１、１２０３、１１０１ｃｍ−１に特徴的な吸収帯を有する、
（７）プロトン核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトルメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第１１図に示すとおりである、
（８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル：Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定した核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中で測定）は、第１２図に示すとおりである、
（９）溶媒に対する溶解性：ＤＭＳＯ、メタノール、クロロホルム、酢酸エチルに可溶、水、ｎ−ヘキサンに不溶、
（１０）呈色反応：リンモリブデン酸に陽性、
（１１）酸性、中性、塩基性の区別：中性物質。
以上、ＦＫＩ−１３６６物質Ｃの各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本ＦＫＩ−１３６６物質Ｃは下記式［ＩＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2005023788.tif 000009
上記したように、本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまで報告されておらず、それ故、ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂ、およびＦＫＩ−１３６６物質Ｃは新規物質であると決定した。
次に、本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃのアゾール系抗真菌剤の活性増強作用について以下に述べる。
試験菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５４８、フルコナゾール耐性Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５５０およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５を用いた。またアゾール系抗真菌剤としては、ミコナゾール（ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）及びフルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）を使用した。
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５４８およびＡＴＣＣ６４５５０株に対するアゾール系抗真菌剤の活性増強作用は、酵母感受性試験法ナショナル  コミティー  フォー  クリニカル  スタンダード（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；ＮＣＣＬＳ）標準法Ｍ２７−Ａに従った。すなわち、接種菌液は各菌株をＹＭ（０．５％イーストエキストラクト、０．５％マルト  エキストラクト、０．５％ペプトン、１％グルコース、１．５％アガー）寒天培地上に塗りひろげ、３５度で３６時間培養することにより生育した直径１ｍｍ以上のコロニーを５個採取し、５ｍｌの生理食塩水に懸濁させた後、さらに生理食塩水で希釈しＭｃＦａｒｌａｎｄ透過度０．５に調整したものを使用した。そして、９６穴プラスチックプレート（米国、コーニング社製、３５９９）にあらかじめＲＰＭＩ１６４０培地７０μｌを添加し、これに終濃度０．０６μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌになるよう調製したミコナゾールまはたフルコナゾール溶液２０μｌを加え、さらに終濃度０．５、１．０および２．０μｇ／ｍｌとなるように調製したＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを１０μｌ添加した後、接種菌液１００μｌを加え、３５度で２４時間静置培養した。２４時間後の６３０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダ（米国、Ｂｉｏ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ．Ｉｎｃ．，Ｅｌｘ８０８）で測定し、各培養条件における各検定菌の成育を５０％に阻害するアゾール系抗真菌剤の濃度（ＩＣ５０）を算出し、ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの無添加時のＩＣ５０値を１．０とした場合の比率を増強活性とした。
また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５に対する増強活性は、分生子形成糸状菌に対する薬剤感受性検査ＮＣＣＬＳ提案法（Ｍ３８−Ｐ）に従った。すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５の接種菌液は、その胞子をＯＤ５３０ｎｍの値が０．０９〜０．１１になるよう生理食塩水に懸濁し、これをさらにＲＰＭＩ１６４０培地で１００倍希釈したものを接種菌液とした。そして、蛍光測定用９６穴プラスチックプレート（米国、コーニング社製、３９０４）にあらかじめＲＰＭＩ１６４０培地７０μｌを添加し、これに終濃度１．０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌになるよう調製したミコナゾールまたはフルコナゾール溶液２０μｌを加え、さらに終濃度２．５、５．０および１０μｇ／ｍｌとなるように調製したＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃを１０μｌ添加した後、接種菌液８０μｌを加えた。これに呈色試薬であるＡｌａｍａｒＢｌｕｅ液（旭ガラス社製、日本国）を２０μｌ添加し、３５度で２４時間静置培養した。２４時間後にＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（日本パーセプティブ社製、日本国）を使用し、励起波長５３０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで蛍光強度を測定し、各培養条件における各検定菌の成育を５０％に阻害するアゾール系抗真菌剤の濃度（ＩＣ５０）を算出し、ＦＫＩ−１３６６物質無添加時のＩＣ５０値を１．０とした場合の比率を増強活性とした。
アゾール系抗真菌剤としてミコナゾール（ｍｉｃｏｎａｚｏｌｅ）を用いた場合の結果を第１表に示した。なお、表中の記号＊はＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５株を用いた場合のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの濃度を示す。
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アゾール系抗真菌剤としてフルコナゾール（ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ）を用いた場合の結果を第２表に示した。なお、表中の記号＊はＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５株を用いた場合のＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢまたはＦＫＩ−１３６６物質Ｃの濃度を示す。
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以上のように、本発明による物質は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５４８株、ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ耐性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５５０株、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５株に対し、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有することから、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減および耐性克服に対し有用である。
【図面の簡単な説明】    第１図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａの紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第２図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａの赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
第３図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａのプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第４図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ａの１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第５図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｂの紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第６図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｂの赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
第７図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｂのプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第８図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｂの１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第９図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｃの紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第１０図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｃの赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
第１１図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｃのプロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
第１２図は本発明のＦＫＩ−１３６６物質Ｃの１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】    次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
５００ｍｌ容三角フラスコ１本にＧＰ培地（グルコース２．０％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％、ポリペプトン０．５％、リン酸水素カリウム０．１％、寒天０．１％、ｐＨ６．０）を１００ｍｌ仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたボーベリア・エスピー  ＦＫＩ−１３６６菌株（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｓｐ．ＦＫＩ−１３６６、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４５９）を白金耳にて無菌的に接種し、２７度で７２時間振とう培養した。そして、それを種培養液として、グリセロール３．０％、オートミール２．０％、ドライ  イースト１．０％、リン酸−水素カリウム１．０％、リン酸水素−ナトリウム１．０％、塩化マグネシウム六水和物０．０５％（ｐＨ無調整）を７．５Ｌ容ジャー（丸菱バイオエンジ社製、日本国）２基に各４Ｌ仕込み、蒸気滅菌後、種培養した培養液４０ｍｌを無菌的に移植し、培養温度２７度、回転数２００ｒｐｍ、通気量２．５Ｌ／ｍｉｎで６日間通気攪拌培養した。得られた全培養液に５Ｌのアセトンを加え良く攪拌し、セライトろ過したろ液を減圧濃縮した。これを再び酢酸エチルで抽出後、減圧濃縮して粗製物９．６ｇを得た。
次にこの粗製物４．５ｇを少量のメタノールに溶解し、４０％アセトニトリル水で平衡化したＯＤＳ樹脂（ＯＤＳ−７５１５−１２Ａ、センシュー科学社製、日本国）によるカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は１Ｌの４０％アセトニトリル水、次いで同量の６０％アセトニトリル水、８０％アセトニトリル水、１００％アセトニトリル水で段階溶出し、それぞれ５０ｍｌずつ分取した。ＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃが含まれる８０％アセトニトリル水溶出画分のフラクション５番から２０番を集め、アセトニトリルを留去した後、水層画分を酢酸エチルで抽出し、それを減圧乾固し粗製物１．１ｇを得た。
次にこの粗製物５５６ｍｇを高速液体クロマトグラフィーにより分離精製した。装置はＰＵ−９８０ガリバーシステム（日本分光社製、日本国）を用い、カラムはＰＥＧＡＳＩＫ  ＯＤＳ（２０φ×２５０ｍｍ、センシュー科学社製、日本国）を用い、移動相溶媒は８５％アセトニトリル水を用い、検出はＵＶ２１０ｎｍ、流速６ｍｌ／分で行った。本条件下において保持時間２８分、２９分および４２分であるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃをそれぞれ分取し、各溶出液を減圧濃縮して残った水層を酢酸エチルで抽出することにより、ＦＫＩ−１３６６物質Ａを１５．９ｍｇ、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂを２８．９ｍｇ、およびＦＫＩ−１３６６物質Ｃを６．９ｍｇをそれぞれ得た。さらに、得られたＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃをそれぞれ同じ条件で再分取し、上記と同様にして抽出することにより、最終的にＦＫＩ−１３６６物質Ａが８．６ｍｇ、ＦＫＩ−１３６６物質Ｂが１１．５ｍｇ、およびＦＫＩ−１３６６物質Ｃが３．２ｍｇ得られた。
産業上の利用分野
以上のことから、本発明によるＦＫＩ−１３６６物質Ａ、ＦＫＩ−１３６６物質ＢおよびＦＫＩ−１３６６物質Ｃは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５４８株、ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ耐性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ６４５５０株、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５株に対し、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する。これらのことから、本発明の物質は深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減および耐性克服に有用であり、医薬品として期待される。
【図１】
2005023788.tif 000020
【図２】
2005023788.tif 000021
【図３】
2005023788.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005023788.tif 000026
【図８】
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【図９】
2005023788.tif 000028
【図１０】
2005023788.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
2005023788.tif 000031
【国際調査報告】
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