(57)【要約】正規直交化配列群の設計方法、正規直交化配列である核酸群の製造方法およびそれにより得られた核酸を提供する。正規直交化配列群の設計方法であって、最初、または予め無作為に塩基配列を複数作出することと、それらの融解温度の平均値を求めることと、その平均値±１σに相当する温度範囲で制限される閾値を基に候補配列を得ることと、独立して反応する配列であるか否かを指標に得られた候補配列から正規直交化配列群を得ることとを具備する正規直交化配列群の設計方法。
2004092376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正規直交化配列群の設計方法であって、
（１）無作為に作出された複数のランダム配列から、それらの配列の融解温度の平均値を求めることと、
（２）前記（１）で求めた平均値を基に閾値を決定し、この閾値と、無作為に作出されたランダム配列の融解温度とを比較することと、
（３）前記（２）の比較の結果から、前記閾値により制限される一定範囲内の融解温度を有する塩基配列のみを選択して、候補配列群を得ることと、
（４）前記（３）で得られた候補配列群に含まれる夫々の塩基配列について、独立して反応する配列であるか否かを確認すること、
（５）前記（４）の確認の結果を基に、独立して反応しないと判定された配列を前記候補配列群から排除することにより、正規直交化配列群を形成することと、
を具備する正規直交化配列群の設計方法。
【請求項２】
正規直交化配列群の設計方法であって、前記（４）に記載の確認することが、前記（３）で得られた候補配列群に含まれる配列について、
（Ａ）各配列における自己相補配列の存在、および／または
（Ｂ）各配列の二次構造の安定性の程度、並びに
（Ｃ）複数の配列の間でのクロスハイブリダイゼーションの存在、
を解析することにより行われる方法。
【請求項３】
正規直交化配列群の設計方法であって、前記（５）の独立して反応しないとの判定が、
（ａ）１の配列における自己相補配列が存在すること、
（ｂ）１の配列の二次構造の安定性の程度が高いこと、および
（ｃ）複数の配列の間にクロスハイブリダイゼーションが存在すること、
の少なくとも何れか１に該当する場合に下されることを具備する請求項１または２の何れか１項に記載の方法。
【請求項４】
正規直交化配列群の設計方法であって、前記（４）に記載の確認することが、
（Ａ）各配列における自己相補配列の存在、
（Ｂ）各配列の二次構造の安定性の程度、および
（Ｃ）複数の配列の間でのクロスハイブリダイゼーションの存在、
の順番で行われ、且つ（Ａ）から（Ｃ）の何れかの段階で、
（ａ）１の配列における自己相補配列が存在すること、
（ｂ）１の配列の二次構造の安定性の程度が高いこと、および
（ｃ）複数の配列の間にクロスハイブリダイゼーションが存在すること、
に該当する結果が得られた時点で、それ以降の解析は行わずに、そのような結果の得られたランダム配列を当該前記候補配列群から排除する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記（１）に記載の複数のランダム配列からなる第１の粗配列群と、前記（２）における比較に用いられるランダム配列からなる第２の粗配列群は、異なる群である請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記（１）に記載の複数のランダム配列と、前記（２）における比較に用いられるランダム配列は、何れも長さが等しい配列である請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記（１）に記載の複数のランダム配列からなる第１の粗配列群と、前記（２）における比較に用いられるランダム配列からなる第２の粗配列群が等しい請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記閾値で制限される範囲が、各長さにおけるＴｍの分布を正規分布と見た場合の±１σに相当する温度範囲である請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記（４）における独立して反応する配列であるか否かを確認することが、前記（３）で得られた候補配列群に含まれる塩基配列について行われると同時に、それと対になる相補鎖についても、本来対になるべきでない他の全ての配列に対して独立して反応する配列であるか否かを確認することを具備する請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
デジタルコンピュータにおいて実行される正規直交化配列群の設計方法であって、
（１）演算手段により、複数のランダム配列についての融解温度の平均値が算出され、閾値が設定されることと、
（２）比較手段により、前記（１）で設定された閾値と、ランダム配列の融解温度とが比較されることと、
（３）前記（２）の比較の結果から、選択手段により、当該閾値により制限される一定範囲に入る配列のみが選択されて、それによって候補配列群を与えることと、
（４）判定手段により、前記（３）で与えられた候補配列群に含まれる塩基配列について、夫々が独立して反応する配列であるか否かが判定され、その結果から、独立して反応しないと判定された配列が前記候補配列群から排除され、正規直交化配列群が形成されることと、
を具備する正規直交化配列群の設計方法。
【請求項１１】
デジタルコンピュータにおいて実行される正規直交化配列群の設計方法であって、
（１）塩基配列無作為作出手段によってランダム配列が与えられることと、
（２）前記（１）により与えられたランダム配列の融解温度が、演算手段によって与えられ、その融解温度が記憶手段に記憶されることと、
（３）前記（１）と前記（２）の繰り返しにより与えられた複数の融解温度を基に、演算手段によって融解温度の平均値が与えられることと、
（４）前記（３）により与えられた融解温度の平均値を基に演算手段が閾値を与え、比較手段が、閾値の温度と、塩基配列無作為作出手段によって与えられるランダム配列の融解温度とを比較することと、
（５）前記（４）の比較の結果を基に、当該閾値により制限される範囲内に融解温度を有する塩基配列を、候補配列として記憶手段が記憶することと、
（６）前記（５）において記憶された候補配列群について、判定手段が以下の（Ａ）から（Ｃ）の事項についての判定を行うこと；
（Ａ）自己相補配列を有する配列であるか否か、および／または
（Ｂ）二次構造の安定性の程度の高低、並びに
（Ｃ）クロスハイブリダイゼーションを有する配列であるか否か、
（７）前記（６）の判定の結果を基に、選択手段が選択するべき配列を選択することによって、正規直交化配列群を設計することと、
を具備する方法。
【請求項１２】
前記（１）における塩基配列無作為作出手段によるランダム配列の付与が、乱数の発生と、予め決められた対応付けに従って当該発生された乱数から塩基への置き換えを行うことにより達成される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか１項に記載の方法によって設計された正規直交化配列群に含まれる塩基配列を基に、当該塩基配列を有する核酸を少なくとも２種類以上合成することを具備する正規直交化配列である核酸群の製造方法。
【請求項１４】
複数種類の配列を組み合わせて使用するための請求項１３に記載の製造方法により製造された核酸。
【請求項１５】
前記核酸がペプチド核酸であることを特徴とする請求項１４に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、正規直交化配列群の設計方法、正規直交化配列である核酸群の製造方法およびそれにより得られた核酸に関する。
【背景技術】  核酸の配列設計技術は、大まかに２つに分けることができる。１つはゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの配列をターゲットとし、その中から検出に最適な配列を選択する設計方法である。もう１つはＤＮＡコンピューティング（例えば、特表２００１−５１５６１４を参照されたい）の研究の中で考えられた、熱的性質の揃った人工配列を設計する技術である。前者はゲノムやｍＲＮＡなどの特定の遺伝子を検出するために使用される核酸の設計技術であり、目的とする特定の遺伝子にハイブリダイズする配列に制限して設計が行われる。そのような制限の中で、例えば、ＰＣＲ用のプライマーならば融解温度（Ｔｍ値）が類似し、電気泳動などで識別可能な数百塩基程度の長さだけ離れた、互いに相補的でない配列が選択される。このような設計技術の発明としては、ＵＳＰ５５５６７４９、特許第３０５５９４２号、特開２００１−２５８５６８、特開２００１−２５８５７６、ＵＳＰ６２５１５８８、ＷＯ００／４６３６３などがある。
特にＷＯ００／４６３６３はプローブやプライマーの熱特性だけでなく、遺伝子特異性を向上するために対象生物の他の既知遺伝子のタプル情報を用いて特異性を評価し、ハミング距離を調べてミスマッチで反応しないかを確かめている。一方、後者の人工配列設計技術は、遺伝子の検出を対象としているわけではないので配列設計には自由度があるが、多くの種類の配列を設計する必要がある。
例えばＡｄｌｅｍａｎは、ハミルトン経路を解くために、７つの頂点に対応する配列を設計し、それら頂点を結ぶ１４本の有向辺を表すＤＮＡで頂点のＤＮＡを連結することで解を求めた（Ａｄｌｅｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１０２１−２４（１９９４）を参照されたい）。この方法では、２１種類の２０ｍｅｒの核酸が反応に使用された。しかしながら、Ａｄｌｅｍａｎが解いたのは７頂点の大変小さいハミルトン経路問題であって現実的な大きさの問題ではない。ＤＮＡコンピューティングが電子コンピュータより高速に計算できると考えられるのは数百頂点のハミルトン経路問題である。これを解くには、はるかに多くの数百種類のＤＮＡ配列を設計する必要がある。もしこれらのＤＮＡの配列のうち、頂点を表すＤＮＡのＴｍ値が均一でなければ、特定の頂点の連結が進みやすくなる。また、ある有向辺のＤＮＡが２次構造をとってしまうならば、その経路が反応に使われなくなり、計算誤差を生むことになる。
以上のことからＤＮＡコンピューティングの反応のためには、（１）Ｔｍ値がほぼ揃った、（２）２次構造をとることがない、（３）互いにクロスハイブリダイゼーションしにくい、配列を備えた核酸セットを設計する必要がある。このための設計法としては、特許３１８５８５３号があるが、特定の反応に用いることを意図しており汎用性に乏しい。
遺伝子検出技術は、上に述べたように遺伝子の配列にハイブリダイズするという制限を守りながら、いかに誤りなく検出するかということを目指している。ところが、最近注目されているＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、一塩基多型を検出するときには遺伝子の特定の塩基を必ず含む位置でプローブやプライマーを設計する必要があるのでその配列によっては検出が困難になることがある。また、ＳＮＰはヒト遺伝子の場合数百塩基に１つの割合で存在すると言われるので、検出に必要な個数を全て別々の反応溶液で行うとコストが見合わなかった。
この課題を解決するために、蛍光識別ビーズを使ったＩｌｌｕｍｉｎａ社のＢｅａｄＡｒｒａｙＴＭ（登録商標）や、Ｃｏｒｎｅｌｌ大学のＢａｒａｎｙらが実験しているＬＤＲ−ジップコード法などのマルチプレックスＳＮＰ検出法が提案されている。
また、遺伝子やタンパクに目印のタグ配列をつけ、マイクロアレイに当該タグ配列に相補的な配列を固定しておくことで汎用な検出を目指す、「ユニバーサルチップ」と呼ばれるマイクロアレイＧｅｎＦｌｅｘＴＭ  Ｔａｇ  ＡｒｒａｙがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から発売されている。
これらの方法では、タグやジップコードと呼ばれる人工配列を遺伝子特異的なプロープ配列の末端に付与し、プローブ側で遺伝子を検出した後に、人工配列を共通プライマーで増幅することによって、定量的な検出を行っている。また、目的は異なるがＬｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社はＭｅｇａｃｌｏｎｅＴＭというクローニングシステムを提供している。この方法ではビーズ毎に異なるタグ配列をつけておくことにより、クローニングをより効率よく行う方法である。
以上の技術の中で利用されるタグやジップコード配列は次の特許は、ＢａｒａｎｙらはＷＯ０１／７９５４８で示されるようなＴｍ値やクロスハイブリダイゼーション特性を考慮した４塩基の配列セットを選び、それらの組み合わせによりジップコード配列を生成する技術に基づく。一方、Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社はＵＳＰ５，６３５，４００にあるように、３〜６塩基を単位としてクロスハイブリダイゼーションが起きにくい配列基本セットを作り、それらの組み合わせにより２４塩基程度のタグ配列を生成している。基本配列を組み合わせて設計する方法には、核酸の長さが、設計の基となった基本配列の整数倍に限定される欠点がある。即ち、それらの方法では、２３ｍｅｒや、２９ｍｅｒなどの素数長でありながら有用な熱化学的性質をもつ配列群を生成することができなかった。
これに対してＥＰ７９９８９７では、長さを限定せず、８塩基以上連続して同一の配列をもたないなどの基準に従い生成した配列をセットに追加する方法を提案している。
ところが、いずれの方法も、理論上Ｔｍ値のばらつきやクロスハイブリダイゼーションの問題がない配列だと考えられるだけで、実験によるそれらの配列の性能の完全な検証は行われていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の目的は、正規直交化配列群の設計方法、正規直交化配列である核酸群の製造方法およびそれにより得られた核酸を提供することである。
特に、そのような配列群およびそのような核酸群は、そこに含まれる夫々の塩基配列または核酸の融解温度がほぼ均一であり、互いにクロスハイブリダイゼーションを起こし難く、その二次構造が安定ではない。
【課題を解決するための手段】  本発明は、上記の目的を達成するための手段として、以下の方法を提供する。
即ち、正規直交化配列群の設計方法であって、最初、または予め無作為に塩基配列を複数作出することと、それらの融解温度の平均値を求めることと、その平均値の±ｔ℃で制限される閾値を基に候補配列を得ることと、独立して反応する配列であるか否かを指標に得られた候補配列から正規直交化配列群を得ることとを具備する正規直交化配列群の設計方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の態様において使用され得るデジタルコンピュータの１例を示すブロック図であるである。
図２は、本発明の１態様である設計方法の１例を示すフローチャートである。
図３は、本発明の１態様である設計方法の１例を示すフローチャートである。
図４は、本発明の１態様である設計方法の１例を示すフローチャートである。
図５は、本発明の１態様である設計方法の１例を示すフローチャートである。
図６は、本発明の１態様である設計方法の一部を示すフローチャートである。
図７は、本発明の１態様である設計方法の一部を示すフローチャートである。
図８は、自己相補性を検討するための方法の１例を示す図である。
図９は、自己相補性を検討するための方法の１例を示す図である。
図１０は、自己相補性を検討するための方法の１例を示す図である。
図１１は、クロスハイブリダイゼーションの存在を確認するための方法の１例を示す図である。
図１２は、クロスハイブリダイゼーションの存在を確認するための方法の１例を示す図である。
図１３は、候補配列の作出方法の更なる例を示す図である。
図１４は、正規直交化配列のリスト（１）である。
図１５は、正規直交化配列のリスト（２）；（１）の続きである。
図１６は、正規直交化配列のリスト（３）；（２）の続きである。
図１７は、正規直交化配列のリスト（４）；（３）の続きである。
図１８は、正規直交化配列のリスト（５）；（４）の続きである。
図１９は、正規直交化配列のリスト（６）；（５）の続きである。
図２０は、正規直交化配列のリスト（７）；（６）の続きである。
図２１は、正規直交化配列のリスト（８）；（７）の続きである。
図２２は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（１）である。
図２３は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（２）；（１）の続きである。
図２４は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（３）；（２）の続きである。
図２５は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（４）；（３）の続きである。
図２６は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（５）；（４）の続きである。
図２７は、マイクロアレイによる検証用正規直交化配列（６）；（５）の続きである。
図２８は、実施例２におけるバッチ１に関する結果を示すグラフである。
図２９は、実施例２におけるバッチ２に関する検証結果を示すグラフである。
図３０は、実施例２におけるバッチ３に関する検証結果を示すグラフである。
図３１は、実施例２におけるバッチ４に関する検証結果を示すグラフである。
図３２は、実施例２におけるバッチ５に関する検証結果を示すグラフである。
図３３は、実施例２におけるバッチ６に関する検証結果を示すグラフである。
図３４は、実施例２におけるバッチ７に関する検証結果を示すグラフである。
図３５は、実施例２におけるバッチ８に関する検証結果を示すグラフである。
図３６は、実施例２におけるバッチ９に関する検証結果を示すグラフである。
図３７は、実施例２におけるバッチ１０に関する検証結果を示すグラフである。
図３８は、実施例２におけるバッチ１１に関する検証結果を示すグラフである。
図３９は、実施例２におけるバッチ１２に関する検証結果を示すグラフである。
図４０は、実施例２におけるバッチ１３に関する検証結果を示すグラフである。
図４１は、実施例２におけるバッチ１４に関する検証結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  １．用語の説明
ここで使用される「正規直交化配列」における「正規」の語は、複数の配列において熱的性質の正規性を維持すること、即ち、融解温度が一定の範囲内で揃っていることを示す。熱的性質の正規性を維持することによって、例えば、多くの配列を纏めて使用して反応を行うことが有利に実行される。「正規直交化配列」における「直交化」の語は、配列に直交性を持たせることであり、１つの直交化配列群に含まれる全ての配列は、夫々独立して反応する、即ち、１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。言い換えれば、１つの直交化配列群に含まれる配列は、配列間でのクロスハイブリダイゼーションや、自己配列内での望まないハイブリダイゼーションが従来よりも生じ難いか、生じない。
ここで使用される「核酸」の語は、塩基配列で表される核酸および核酸類似物であればよい。そのような核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびペプチド核酸である。
ここで使用される「塩基配列」および「配列」の語は共に、特定の核酸を構成する塩基の並びを示すものである。従って、本明細書において、「配列」を「設計」するということは、必ずしもそのような配列からなる核酸を実際に合成する必要はなく、シミュレーションなどの手段を利用して配列を作出し、目的とする配列群を与えることである。例えば、与えられた配列群は、紙面およびディスプレイなどに出力された形態で提供されたり、媒体に記録された形態で提供され得る。またそのような配列は、核酸に反映されて実際に合成された核酸としても提供される。本明細書中では「塩基配列」と「配列」は交換可能に使用され得る。
ここで、「核酸」の「合成」とは、設計された配列を基に、特定の配列を含む核酸または核酸類似物を実際に合成することを示す。
２．正規直交化配列群の設計方法
本発明の１態様に従うと、そこに含まれる全ての塩基配列が互いに正規直交化配列である正規直交化配列群を設計する方法が提供される。その概要は次の通りである。まず、何れのフィルターによっても選別を行っていない粗配列として、無作為な配列からなるランダム配列を作出する。平均値を求めるのに適した数量だけのランダム配列を作り、これらの融解温度（以下、Ｔｍ値と記す）の平均値を求める。次に、前記粗配列および／または新たに作出した粗配列であるランダム配列のＴｍ値と閾値とを比較する。そのＴｍの平均値±１σに相当する温度範囲を閾値とする。閾値で制限される一定範囲に含まれるＴｍ値を有する粗配列を選別して、候補塩基配列群を得る。ここで、Ｔｍの平均値「±１σに相当する温度範囲」とは、以下に説明する通りである。Ｔｍ分布はほぼ正規分布を示し、標準正規分布への変換を行った後、１σに相当する幅を持つ温度の範囲をＴｍ範囲とすることが望ましい。これにより、全体のおよそ１／３がＴｍ条件をクリアすることが可能である。例えば、２５ｍｅｒの場合、およそ±２℃が±１σに相当する。また、厳密な１σの値を用いなくても、それに近い値、例えば小数第一位を四捨五入した値などで十分である。このようにして、熱的性質の正規性を確立した候補塩基配列群が得られた。
続いて、候補塩基配列群に含まれる夫々の配列が、それぞれが独立して反応する配列であるか否かを検討して直交化を行う。これは、候補塩基配列群に含まれる各塩基配列の性質および／または構造を解析すればよい。性質および／または構造を解析することにより、１配列内での反応や１群に含まれる配列間での反応が低い、またはそのような反応性のない配列のみで構成されるように候補塩基配列群に含まれる配列を選別する。
以上の操作によって正規直交化配列群が得られる。このような本発明に従う正規直交化配列群の設計方法によれば、実際に核酸を合成せずとも、互いに正規直交化配列である複数の配列からなる正規直交化配列群を設計することが可能である。また、このような本発明に従う方法によれば、より多くの配列を含む正規直交化配列群を短時間に設計することが可能である。以下に更に本発明の態様を説明する。
本発明に従って、無作為に塩基配列を作出する手段は、例えば、それ自体公知の乱数関数、乱数表および乱数発生装置などを利用してよい。乱数を利用する場合には、例えば、数値に予め塩基を対応させておき、乱数関数、乱数表または乱数発生装置により発生された数値を塩基に置き換えればよい。
数値への塩基の対応付けは実施者が任意に行ってよい。例えば、乱数の発生は整数、小数、２進数、８進数、１６進数などで行われればよく、また、これらは乱数関数のプログラム上での呼び出し方に依存してよい。例えば、より効率的な方法は、２桁の２進数（０、１、２、３）で乱数を発生させ、４つの塩基に対応させる方法である。また、発生させた１乱数を１塩基に対応させるという方法が望ましい方法の１つである。このような方法で発生された配列は、４つの配列が均等に含まれ、Ｔｍ値も比較的そろったものになる。
また、ランダム配列の生成毎にＴｍ値を算出することを繰り返して行い、ランダム配列生成の終了した後に、得られた全てのＴｍ値を基に平均値を算出しても、全てのランダム配列の生成後に、それらの配列のＴｍ値を算出して平均値を求めてもよい。あるいは、ランダム配列の生成毎にＴｍ値を算出し、新たなランダム配列の生成毎の平均値を求め、平均値が十分に収束したところで平均値としてもよい。
このように無作為に作出された複数の塩基配列を、便宜上、第１の粗配列群とする。第１の粗配列群に含まれる夫々の配列のＴｍ値の求め方は、当該塩基配列に含まれるＧＣ量や塩基配列の長さなどから、理論的または経験的に行えばよい。例えば、それ自身公知のＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を利用してＴｍ値を求めてもよく、或いは塩基配列により示される核酸のＴｍ値を測定した実験データ、その累積データおよび／または経験則などに基づいて、目的とする塩基配列のＴｍ値を求めればよい。
第１の粗配列群に含まれる塩基配列の長さは、全て等しいことが好ましいが、必ずしも等しい長さでなくてもよく、また予め実施者が特定した範囲で異なる長さとしてもよい。無作為に作出される塩基配列の長さは、実施者が任意に選択しても、使用目的に応じて長さを決定してもよい。
次に、得られた夫々の塩基配列のＴｍ値から第１の粗配列群のＴｍの平均値を算出する。当該平均値を得るための第１の粗配列群に含まれる配列の数、即ち、第１の粗配列群の大きさは、例えば、約１０００以上であり、好ましくは約１００００以上であり、より好ましくは約１０００００以上である。粗配列群の大きさは大きければ大きいほど平均値は収束する。しかしながら、大きくすればするほど計算時間が必要となる。例えば、１００個で平均値を求めた場合、生成された配列が十分にランダムであるならば、収束する値にかなり近い値となる。従って、Ｔｍの計算精度から考えて（即ち、小数点１桁程度）、１０００個の平均値で十分であり、１００００個以上ならほぼ収束し終わると考えられる。しかしながら、１０００００個以上の発生でも、Ｐｅｎｔｉｕｍ  ３８００ＭＨｚ、の場合なら、１分以下程度と、ほとんど時間はかからないので、最初に１回だけ行えばいいことを考慮すれば、１０００００個以上行ってもよいだろう。
次に、当該Ｔｍの平均値を中央値として、その前後１σに相当する温度幅を持つ領域を閾値とし、一定範囲を設定する。続いて、この平均値±１σに相当する温度範囲で制限される範囲に含まれるＴｍ値を有する配列からなる候補配列群を得る。候補配列群を得るためには、粗配列群に含まれる無作為に作出された塩基配列のＴｍ値と、閾値とを比較し、平均値±１σに相当する温度範囲の範囲に入る配列を選択すればよい。或いは、平均値±１σに相当する温度範囲の範囲に入らない配列を除外して群を作ればよい。
候補配列群を得るために用いられる粗配列群は、Ｔｍの平均値を求めるために用いた第１の粗配列群であってもよく、第１の粗配列群の一部の配列からなる第２の粗配列群であってもよく、または第１の粗配列群に無作為に作出された更なる配列を追加してなる第２の粗配列群であっても、或いは全く新たに無作為に作出された配列からなる第２の粗配列群であってもよい。ここでは便宜上「粗配列群」の語を用い、複数の粗配列を示したが、候補配列群を得るために用いる無作為に作出される配列は、実質的な群が形成されずに使用されてもよい。例えば、作出と同時に、Ｔｍ値が算出されてもよく、また更に得られたＴｍ値が閾値と比較されてもよい。
第２の粗配列群に含まれる塩基配列の長さは、全て等しいことが好ましいが、必ずしも等しい長さでなくてもよく、また予め実施者が特定した範囲で異なる長さとしてもよい。無作為に作出される塩基配列の長さは、実施者が任意に選択しても、使用目的に応じて長さを決定してもよい。
また、約Ｘ１塩基〜約Ｘ２塩基、好ましくは約Ｙ１塩基〜約Ｙ２塩基の短い粗配列を作出し、これを組み合わせて得られる長い配列についても後述するような手段によって独立性を検討し、直交化を達成すればよい。これに限定するものではないが、例えば、約５塩基〜約１０塩基であっても、好ましくは約１０塩基〜２０塩基であってもよい。また、短い配列を組み合わせて長い配列を作るのなら、考えられる全ての配列を生成することが望ましい。そこで、現実的な時間で全配列が生成可能であるだろうと思われる２０塩基を上限とした。また、あまり短い配列では、長い配列を作成するときに多くの連結部位が出現し、結局は長い配列を生成してからクロスハイブリを調べるのと同じことになってしまうので、下限として５塩基を採用した。極端に言えば、１塩基を連結していくとき、それは長い配列を乱数などで生成していくことと同じである。
次に、得られた候補配列群に含まれる全ての配列について、それらの配列の性質および／または構造を解析する。その結果から、候補配列群に含まれる夫々の塩基配列について、独立して反応する配列である否かを確認し、目的とする正規直交化配列群を得る。本発明の態様に従うと、独立して反応する配列であるか否かを確認するためには、以下の（Ａ）から（Ｃ）の少なくとも１を解析すればよい：
（Ａ）配列における自己相補配列の存在、
（Ｂ）配列の二次構造の安定性の程度、および
（Ｃ）複数の配列の間でのクロスハイブリダイゼーションの存在。
この解析の結果、以下の（ａ）から（ｃ）の何れか１に該当する場合には、その配列を候補配列群から除外する；
（ａ）１の配列中に自己相補配列が存在する、
（ｂ）１の配列の二次構造の安定性の程度が高い、
（ｃ）複数の配列の間にクロスハイブリダイゼーションが存在する。
各配列における自己相補配列の存在の確認は、候補配列群に含まれる夫々の配列について、その塩基配列を基に行うことが可能である。ここで、「自己相補配列」が「存在」するとは、１つの配列中に、互いに相補的な部分が１組以上存在することをいう。また、自己相補配列であると判定するために基準となる塩基数は、実施者が任意に決定すればよい。例えば、１つの塩基配列中に、２塩基長以上の相補的部分が存在した場合に自己相補配列が存在すると判定してもよく、或いは、３塩基以上、４塩基以上、５塩基以上、６塩基以上・・・、またはＸ塩基以上の連続する塩基とそれに相補的な塩基配列が含まれる場合に自己相補配列が存在すると判定してもよい。ここで「ｘ」は２以上の整数である。また、このような塩基数は、使用目的に応じて選択されてもよい。
複数の配列の間でクロスハイブリダイゼーションが存在するか否かを確認するためには、当該候補配列群に含まれる複数の配列の間に、少なくとも部分的な相補性が存在するか否かを確認すればよい。クロスハイブリダイゼーションの存在を判定するための基礎になる塩基長は、自己相補配列と同様に実施者が決定してよい。
各配列の二次構造の安定性の程度は、例えば、各々の配列が核酸として存在する場合に、それがどのような二次構造を取り得るかを理論的にまたは経験的データに基づいて導き出し、それを基に程度の高低を判定することが可能である。例えば、分子内２次構造自由エネルギー計算など、それ自身公知の手段を用いて、各配列の二次構造の安定性の程度を算出し、その結果と実施者が予め定めた閾値とを比較することによって、安定性の程度の高低を判定すればよい。
上記の３つの項目、即ち、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）についての解析は、３つの項目全てを順不同で行ってもよい。または、（Ａ）または（Ｂ）の何れかと、（Ｃ）とを組み合わせて順不同で行ってもよい。（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の全てを行う場合には、効率を考えると（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順番で行い、（ａ）、（ｃ）および（ｂ）の何れかの結果に該当した時点で候補配列群より排除することが好ましい。
例えば、候補配列群に含まれる配列が、比較的短い配列、例えば、４０ｍｅｒから３０ｍｅｒ以下である場合は、当該（Ａ）と（Ｃ）についての解析を行うことが好ましい。一方、候補配列群に含まれる配列が、比較的長い配列である場合、例えば、３０ｍｅｒから４０ｍｅｒ以上である場合には、（Ａ）と（Ｂ）についての解析を行うことが好ましい。しかしながら、何れの場合も（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の解析を全て行ってもよい。
また、正規直交化配列群として得られた配列を、２以上で連結して使用する可能性のある場合、連結により生じる配列（以下、連結配列と称す）についても少なくとも（Ａ）、（Ｂ）および／または（Ｃ）の３つの項目を解析することが望ましい。候補配列群に含まれる配列についての解析の後に、連結配列の解析を行う場合は、例えば、（Ａ）および／または（Ｂ）および／または（Ｃ）について解析すればよい。
また、最終的に得られた正規直交化配列を使用する際に、相補鎖を使用することが必要である場合、例えば、ハイブリダイゼーションやＰＣＲなどの反応を行う場合には、候補配列群に含まれる配列の相補鎖についても同様にクロスハイブリダイゼーションについての解析を行うことが好ましい。その場合、相補鎖についても上述の記載と同様に（Ａ）、（Ｂ）および／または（Ｃ）の項目を解析すればよい。
無作為に発生させた塩基配列のＴｍの平均値の度数分布は正規分布に従う。従って、一定の温度範囲で見つかる候補配列の数は、範囲の中心が平均温度に一致する時に一番多い。従って、人為的にあるＴｍ値を設定し、それに近づくように複数の核酸を設計するよりも、本発明に従うように無作為に作出した配列について平均温度を算出する方が、より多くの、即ち、最大の候補配列群を得ることができる。即ち、Ｔｍ値をどのようなアルゴリズムで計算したとしても、本発明に従えば、結果として得られる母集団（即ち、粗配列群）および候補配列群は、従来の手段に比べてより多くの候補を含む集団、言い換えれば、より大きな集団として得ることが可能である。
また更に、最も大きな母集団を作った後に、融解温度の平均値±１σに相当する温度範囲の閾値を基に、一定範囲に含まれるか否かによって集団を絞り込むことにより、もっとも効率よく候補を絞り込むことができる。即ち、最初に計算量の少なくて済むＴｍ値計算で配列を選択し、多くの計算時間を必要とするクロスハイブリダイゼーション特性の計算や２次構造計算を続いて行うので、無駄な計算を行わずに済み、結果として短い計算時間で目的とする正規直交化配列群を得ることが可能となる。
３．デジタルコンピュータにおける実行
（ｉ）正規直交化配列群の設計方法
また、本発明に従う、正規直交化配列群の設計方法は、デジタルコンピュータにおいて実行されてもよい。例えば、デジタルコンピュータを利用する正規直交化配列群の設計方法は、（１）演算手段により、複数のランダム配列についての融解温度の平均値が算出され、閾値が設定されることと、（２）比較手段により、前記（１）で設定された閾値と、ランダム配列の融解温度とが比較されることと、（３）前記（２）の比較の結果から、選択手段により、当該閾値により制限される一定範囲に入る配列のみが選択されて、それによって候補配列群を与えることと、（４）判定手段により、前記（３）で与えられた候補配列群に含まれる塩基配列について、夫々が独立して反応する配列であるか否かが判定され、その結果から、独立して反応しないと判定された配列が前記候補配列群から排除され、正規直交化配列群が形成されることと、を具備すればよい。
また或いは、デジタルコンピュータを利用する正規直交化配列群の設計方法は、（１）塩基配列無作為作出手段によってランダム配列が与えられることと、（２）前記（１）により与えられたランダム配列の融解温度が、演算手段によって与えられ、その融解温度が記憶手段に記憶されることと、（３）前記（１）と前記（２）の繰り返しにより与えられた複数の融解温度を基に、演算手段によって融解温度の平均値が与えられることと、（４）前記（３）により与えられた融解温度の平均値を基に演算手段が閾値を与え、比較手段が、閾値の温度と、塩基配列無作為作出手段によって与えられるランダム配列の融解温度とを比較することと、（５）前記（４）の比較の結果を基に、当該閾値により制限される範囲内に融解温度を有する塩基配列を、候補配列として記憶手段が記憶することと、（６）前記（５）において記憶された候補配列群について、判定手段が以下の（Ａ）から（Ｃ）の事項についての判定を行うこと；（Ａ）自己相補配列を有する配列であるか否か、および／または（Ｂ）二次構造の安定性の程度の高低、並びに（Ｃ）クロスハイブリダイゼーションを有する配列であるか否か；（７）前記（６）の判定の結果を基に、選択手段が選択するべき配列を選択することによって、正規直交化配列群を設計することと、を具備すればよい。
また、設計された正規直交化配列群は、それを表示するためのプリンターおよびディスプレイなどの出力手段により出力されてもよく、また、着脱可能な媒体に記録されて提供されてもよい。
（ｉｉ）デジタルコンピュータ
本発明に従う設計方法を実行するために使用され得るデジタルコンピュータの例を図１に示す。本発明に従って使用され得るデジタルコンピュータ１は、少なくとも、ＣＰＵなどの処理部２、プログラムおよびテーブル並びに処理結果などの情報を記録するための補助記憶装置３、並びに情報を入力するためのキーボードおよびマウス等の入力部４、情報を外部に出力するための出力部５を具備し、それらは互いに接続されていればよい。また、それ自身公知の一般的な何れのデジタルコンピュータを利用してもよい。
補助記憶装置３には、当該デジタルコンピュータに正規直交化配列群の設計方法を実行させるためのプログラム、例えば、ランダム配列を生成させるためのプログラム、並びに独立して反応する配列であるか否かを確認するためのプログラム、例えば、自己相補配列の存在を確認するためのプログラム、クロスハイブリダイゼーションの存在を確認するためのプログラム、および分子内二次構造自由エネルギーの計算を行ってエネルギーの高低を判定するためのプログラムなどが格納される。また、当該補助記憶装置３には、乱数と塩基を対応付けるためのテーブル、および独立して反応する配列であるか否かを判定するために数値と判定結果を対応付けるためのテーブルなど、所望に応じた情報が格納されてもよい。
当該デジタルコンピュータの補助記憶装置３には、例えばＴｍの平均値を算出するためのプログラム、ランダム配列作出のためのプログラムや、乱数と塩基を対応付けるテーブル、自己相補配列の判定を検出ためのプログラム、クロスハイブリダイゼーションの存在を判定するためのプログラム、分子内の二次構造の安定性の程度を判定するためのプログラムなどが、所望に応じたファイル毎に格納されてもよい。
上述した演算手段、比較手段、選択手段、記憶手段および判定手段、並びに塩基配列無作為作出手段による処理は、当該処理部２において、補助記憶装置３に予め記録されたプログラムおよび必要な情報に基づいて行われてよい。
また、所望に応じて、当該デジタルコンピュータは、情報を一時的に格納するためのＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ  ａｃｃｅｓｓ  ｍｅｍｏｒｙ）を具備してもよく、プログラム等に基づく前記ＣＰＵの指示に従って画像データを生成する画像処理部などを更に具備してもよい。
（ｉｉｉ）処理手順
図２に示したフローチャートを用いて、デジタルコンピュータによる正規直交化配列群の設計方法の大まかな手続の流れの例を説明する。
（２ａ）オペレーターの入力部１５への入力により、本装置に対して設計開始の指示が出される。このときオペレーターは反応の条件に関する情報を入力してもよい。これらの情報は一旦補助記憶装置３またはＲＡＭに格納されてもよい。
（２ｂ）オペレータにより開始の指示が出されると、処理部２は、予め設定され補助記憶装置３に記憶されたランダム配列作出のためのプログラムに従って、塩基配列無作為作出手段に対してランダム配列を作出するように指示する。更に、処理部２は、演算手段に対して、予め設定され補助記憶装置３に記憶されたランダム配列のＴｍの平均値を算出するためのプログラムに従って、Ｔｍの平均値を算出し、それを基に閾値を与え、これを補助記憶装置３またはＲＡＭに格納するように指示する。
（２ｃ）２ｂで閾値が与えられると、処理部２は、予め設定され補助記憶装置３に記憶されたランダム配列作出のためのプログラムに従って、ランダム配列生成手段に対して、２ｂで与えられた閾値により制限される範囲のＴｍを有するランダム配列を選別するように指示する。条件に適合する選別されたランダム配列は、候補配列として一旦ＲＡＭに格納される。
（２ｄ）候補配列が生成されると、ＣＰＵ３は、予め設定され補助記憶装置３に記憶された自己相補配列の存在を確認するためのプログラムに従って、生成されたランダム配列における自己相補配列の存在の有無を判定するように指示する。自己相補配列の存在しないランダム配列は、候補配列として一旦補助記憶装置３またはＲＡＭに格納される。２ｃと２ｄは充分な数のランダム配列または候補配列が得られるまで、繰り返して実行される。
（２ｅ）充分な数のランダム配列および／または候補配列が生成されると、次に処理部２は、予め設定され補助記憶装置３に記憶されたクロスハイブリダイゼージョンの存在を確認するためのプログラムに従って、判定手段に対して、補助記憶装置３またはＲＡＭに格納された候補配列におけるクロスハイブリダイゼーションの存在の有無を判定するように指示し、更に、クロスハイブリダイゼーションが存在しないランダム配列を、候補配列として補助記憶装置３またはＲＡＭに格納するように指示する。
（２ｆ）次に、処理部２は、予め設定され補助記憶装置３に記憶された分子内二次構造自由エネルギーの計算を行ってエネルギーの高低を判定するためのプログラムに従って、判定手段に対して、補助記憶装置３またはＲＡＭに格納された候補配列における分子内二次構造自由エネルギーの計算を行い、予め設定され補助記憶装置３に記憶されたエネルギーとその高低を対応付ける判定基準となるテーブルに従って、高低を判定するように指示し、更に、分子内二次構造自由エネルギーの低いランダム配列は、選別され候補配列として補助記憶装置３またはＲＡＭに格納されるように指示する。
（２ｇ）処理部２は、当該プログラムに従って、２ｃから２ｆの手続を経て、最終的に選別され残った候補配列を正規直交化配列群、即ち、正規直交化配列の集合を所望の出力手段から出力するように指示をする。
（２ｈ）２ｇにおいて出力手段から正規直交化配列群が出力され、本方法は終了する。
上述では、２ａにおいてオペレーターが入力する反応条件に関する情報は、ランダム配列の長さ、ランダム配列の数、候補配列の数、核酸の種類、自己相補配列の有無を判定するための判定基準、クロスハイブリダイゼーションの存在を判定するための判定基準、および／または分子内二次構造自由エネルギーの高低を判定するための判定基準などの情報であってよく、またはその他の条件などの情報であってよい。或いは、これらの情報は、２ａにおいてオペレーターにより入力されるのではなく、予め補助記憶装置３に記憶された種々のプログラムに含まれてもよく、または幾つかの条件を組み合わせて選択できるように条件を纏めて対応付けられたテーブルとして格納されていてもよい。
上述した例では、２ｂにおいてランダム配列を生成する毎に２ｄにおける自己相補配列を排除し、２ｂと２ｄを繰り返すという方法を示したが、２ｂにおける所望の数のランダム配列を全て作出した後に、２ｄに進んでもよい。また、２ｄの後に、必要に応じて２ｂに戻ってもよい。
また、図３の例に示すように手続をしてもよい。即ち、設計を開始（３ａ）し、Ｔｍの平均値の算出（３ｂ）の後、ランダム配列を生成（３ｃ）し、自己相補配列を排除（３ｄ）し、更にクロスハイブリダイゼーションをチェック（３ｅ）する。以上の３ａから３ｅまでは、図２に示し上述した処理手順により行い、分子内二次構造自由エネルギーに関する検討を行わずに正規直交配列の集合を与えて（３ｆ）、終了（３ｇ）してもよい。このような方法は、得ようとする正規直交配列の配列が短い場合に特に有用であり、設計時間が短縮できる。
また、図４に示す例のように手続をしてもよい。即ち、設計を開始（４ａ）し、Ｔｍの平均値の算出（４ｂ）の後、ランダム配列の生成（４ｃ）し、自己相補配列の排除を行わずに、クロスハイブリダイゼーションをチェック（４ｄ）をし、次に分子内二次構造自由エネルギーに関する検討行い（４ｅ）を行い、正規直交配列の集合を与えて（４ｆ）、終了（４ｇ）してもよい。各々の処理は上述した処理と同様に行えばよい。
また、図５に示す例では、設計を開始（５ａ）し、Ｔｍの平均値の算出（５ｂ）の後、ランダム配列の生成（５ｃ）した後に、自己相補配列の排除（５ｄ）と、クロスハイブリダイゼーションのチェック（５ｅ）と、分子内二次構造自由エネルギーに関する検討（５ｆ）とを、実施者の所望に応じて順不同で行い、正規直交配列の集合を与えて（５ｇ）、終了（５ｈ）してもよい。
また、図２から図５の何れに示す例においても、所望に応じて、例えば、候補配列の数が予め定めた数よりも少なくなった場合などに、ランダム配列の生成に戻り処理を行ってもよい。
また、上述の何れの例においても、２ｃ、３ｃ、４ｃおよび５ｃ（以下、単にｃと記す）では、２〜５ｂ（以下、端にｂと記す）の平均値を基に閾値が与えられた後、当該閾値により制限される範囲のＴｍを有するか否かで選別され、候補破裂が与えられる。例えば、図６に示すように、乱数が発生（６ｃ１）され、粗配列を得た後に、Ｔｍ値による選別（６ｃ２）が行われる。しかしながら、この手続は、図７に示すように、乱数が発生（７ｃ１）された後に、予め定めたＧＣ％フィルターによる選別（７ｃ２）を行い、その後にＴｍ値による選別（７ｃ２）を行ってもよい。ＧＣ％フィルターはランダム配列に含まれるＧＣの％がある範囲、例えば、４０％〜７０％にある配列以外は除外すればよい。即ち、無作為に作出されたランダム配列のＴｍ値を求める前に、配列に含まれる塩基ＧＣの％によってランダム配列を選別すればよい。その後、Ｔｍ値による選別（７ｃ３）を行う。このような手続を行うことにより、設計時間の短縮を行うことが可能である。
また、乱数を発生させてランダム配列を得て、それをＴｍ値で選別して候補配列を得て、それに更なる選別を行うことによって正規直交化配列を得る場合、乱数により得られる数値と塩基との対応付が１対１であれば、所望する全ての選別を終了した後に、数値から塩基への置換が行われて、最終的に正規直交化配列を得てもよい。即ち、あらかじめ、どの値をどの塩基に対応させるかを決めておきさえすれば、どの段階で塩基に置き換えてもよい。但し、Ｔｍ値およびｄＧ値などは、塩基の配列に対して意味をなすものであるので、必ず対応関係が必要になる点を考慮することが重要である。
以上の方法は、本発明の１態様についての幾つかの例を示したものであるから、本発明に従う方法は、上記の例に種々の変更を行ってもよく、本発明に従う限り、更なる手続を追加しても、省略を行ってもよい。
４．基本セット
以下に、本発明に従う正規直交化配列群の設計方法を実行するための基本セットとなる設計計算の例を説明する。この設計計算は、デジタルコンピュータにおける設計においても、またそれ以外の設計において使用することが可能である。
（１）融解温度の平均値（即ち、中心融解温度）の算出
正規直交化配列を設計する場合、その配列の長さは最終的に得ようとする核酸やその使用目的（例えば、どのような反応を行うかなど）、合成コストおよび／またはどの程度の種類の配列が必要かなどを参考に決定すればよい。
例えば、ＤＮＡコンピューティングに本発明に従う正規直交化配列を使用する場合に、１つの正規直交化配列群に１つの計算要素（例えば、ハミルトン経路問題の場合には都市）を表現させ、それらを用いて計算反応を行うことを考える。
その場合に、正規直交化配列からなる核酸自身を、磁性ビーズに固定した相補配列の核酸でアフィニティーセパレーションで分離したり、正規直交化配列からなる核酸自身をＰＣＲプライマーに用いて検出および／または増幅反応したりすることを考えるならば、計算要素に対応する核酸、例えば、ＤＮＡの長さは、プライマーに適する１５ｍｅｒから３０ｍｅｒであればよいことが自ずと分かる。
粗配列であるランダム配列を生成し、生成されたそれぞれのランダム配列のＴｍ値を計算し、それを記録することをデジタルコンピュータに実行させるためのプログラムを作成してもよい。このときデータとして残すのは少なくともＴｍ値だけでよい。Ｔｍ値の計算アルゴリズムは、後に候補配列を生成するときに用いるのと同様の計算式を用いてよい。例えば、サンタルチアのパラメーター（Ｊ．ＳｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ．“Ａｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，ｄｕｍｂｂｅｌｌ，ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６０−１４６５，（１９９８））を利用して計算してもよい。また、この計算では、Ｔｍ値だけでなく計算元の配列も出力しておいて、後のＴｍ値計算に補助的に用いてもよい。総数で１００００個程度を計算し、平均値を求める。この平均値周りでＴｍ値を制限して候補を生成すると、もっとも多くの候補配列が生成できる。
（２）ランダム配列の生成と候補配列の選別
上記の（１）で決めたＴｍ値を基に閾値を設定し、その範囲内のＴｍ値を有する無作為な候補配列を得る。例えば、乱数を発生し、塩基に置換することにより粗配列であるランダム配列を作出し、そのＴｍ値を求め、閾値と比較し、閾値の範囲内の融解温度を有する配列を選択し、候補配列として群を作ればよい。
それ自身公知のＴｍ値を得るための手段として、Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法を使用してよい。この方法では、隣接塩基の関係によりＴｍ値が定まる。或いは、ＧＣ含量から計算しても、近似的にＴｍ値は計算できる。
例えば、ＧＣ含量を４０％〜７０％の範囲に収まるように制限しながらランダム配列を発生し、発生されたランダム配列について、例えばＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法によってＴｍ値を計算してもよい。更に、計算されたＴｍ値と閾値を比較し、その結果、所定の範囲に収まるものを候補配列として出力する。また、例えば、ランダムに配列を発生させるために、それ自身公知のメルセンヌのツイスター（Ｍｅｒｓｅｎｎｅ  Ｔｗｉｓｔｅｒ；例えば、Ｗｅｂ上からダウンロードすることが可能である
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｈ．ｋｅｉｏ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍａｔｕｍｏｔｏ／ｍｔ．ｈｔｍｌ）など高性能な擬似乱数関数を用いてもよい。
（３）自己相補配列の排除
Ｔｍ値が一定範囲に収まった候補配列が、自己相補的な、例えば制限酵素の認識配列のようなパリンドロミック配列（一般的には、回文配列とも称す）を持つ場合は、分子内構造をとる。パリンドロミック配列であることは、容易に調べることが可能であるので、自己相補性の確認に好ましく使用される。候補配列群の中にパリンドロミック配列を含む配列が合った場合、候補配列群から排除する。
更なる自己相補性を確認する手段を以下に説明する。例えば、配列の塩基数が奇数ならば、核酸配列の５’端塩基から中央塩基までと、中央塩基から３’端塩基までの配列を比較し、例えば、６塩基以上連続して配列が相補的な場合は、即ち、マッチする場合は、自己相補性を有すると判定する。
例えば、２５塩基の配列を設計する場合を考える。図８を参照されたい。例えば、１つのランダム配列が「ａｔｇｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇｃａｔｇｃａ」であるとする。この配列を次のような２つの部分に分ける。１３塩基目の中央配列を境に５’端から１３塩基目までを部分配列Ａとし、１４塩基目から２５塩基目の３’端までの部分配列Ｂとする。この部分配列Ａを６塩基ずつ１塩基ずらしながら読みとると、このような２５塩基の場合には６種類が得られる。読み取られた１単位には６塩基含まれ、これを６タプルと呼ぶことにする。
残りの半分の５’端から１４塩基目から２５塩基目までの配列は、まず、５’と３’の向きを変え、この中に前述した６種類の６タプルと相補的な配列がないことを１塩基ずつずらしながら調べる。ここで６タプルと完全にマッチする配列があった場合には、そのランダム配列は、自己相補的な配列だと判断する。このタプルの長さは、６タプルに限定するものではない。即ち、どのような基準で自己相補だと判定するかによって、この値は変えてもよい。
上記の例では、６塩基連続してマッチする配列があるか否かで自己相補性を判定した。しかしながら、本発明はこの条件に限定するものではなく、６塩基以外の数、例えば、３、４、５、７、８、９若しくは１０塩基連続またはそれ以上の連続マッチがあるか否かで判定してもよい。或いは、他の条件、例えば、対照する配列の長さに占める相補塩基の割合を閾値としてもよい。即ち、予め一定の条件を設定しておき、それを閾値として自己相補的な配列を排除すればよい。
以上の方法を、自己相補性の判定方法の第１の例とすると、以下のような第２および第３の方法も同様に自己相補性を判定するために用いることが可能である。
図９に第２の例を示す。まず、上述のように１つの配列を２つの部分、部分配列ＡとＢに分ける。これを、末端から中央までずらしながら対照し、相補配列が何個連続するか、または相補配列が何個あるか、或いは相補性の割合の大きさにより自己相補性を判定してもよい。
次に、図１０に第３の方法を示す。まず、上述の第１および第２の方法のように１つの配列を部分配列ＡとＢに分ける。続いて、部分配列Ｂを相補配列に変換する。これを第２の方法と同様に１塩基ずつずらして、相同配列が何個連続するか、または相同配列が何個あるか、或いは相同性の割合の大きさにより自己相補性を判定すればよい。このような第３の方法は、上述の第１および第２の方法のように、部分配列Ａとの塩基の相補性をチェックするのでなく、塩基の同一性をチェックするものである。従って、このように処理を行えば、デジタルコンピュータを用いて本方法を実施する場合のプログラムがより短く記述できる。
（４）クロスハイブリダイゼーションチェック
次に、クロスハイブリダイゼージョンの存在の有無を確認する方法について説明する。
例えば、上述の（３）までの計算を全て行った場合、それにより得られる配列は、無作為に作出され、Ｔｍ値が一定範囲に揃い、且つ分子内構造をとりにくい配列群である。次に、複数の配列間でのクロスハイブリダイゼーションの少ない配列の集合を形成するために更なる計算を行う。
クロスハイブリダイゼーションのチェックは、将来的に本発明の設計方法により得られた正規直交化配列を用いて行おうとする反応において、その相補鎖も用いられる場合には、候補配列の相補鎖もチェックの対象として考慮する必要がある。ここでは、１つの例として各候補配列の相補鎖も考慮し、完全な相補鎖以外の配列間では、クロスハイブリダイゼーションが生じないように設計する場合について述べる。この計算では、どんな条件を満たしたときにクロスハイブリダイゼーションと判断するかも重要である。
１つの例として、３０塩基以下の正規直交化配列を計算するときにはバルジやループを形成しないと考え、複数の配列の間に、
（ｉ）６塩基以上の連続したマッチがある
（ｉｉ）対照した配列の長さのうち、６０％以上がマッチしている
という条件の何れかに当て嵌まる場合に、その配列は、クロスハイブリダイゼーションしていると判定することにする。この判定条件を用いて、クロスハイブリダイゼーションの検証方法の１例を図１１に示す。対象となる候補配列の例として、夫々２５塩基の配列ＰとＱを示す。上記の条件では６塩基以上の連続したマッチがないことが条件なので、対照する配列の重なりは６塩基から始める（図１１ａ）。次に７塩基の重なりを比較する（図１１ｂ）。次に８塩基の重なりを比較する（図１１ｃ）。このように、２つの配列を１塩基ずつずらしていき、重なり部分の長さを増やして２５塩基全てが重なるまで比較を行う。またその後、当該比較を行いながら、同じ方向へ更にずらしていき（図１１ｄ、図１１ｅ）、Ｐの５’端とＱの３’端とが６塩基重なるまでずらし、当該比較を行う。このような比較によって２つの配列におけるクロスハイブリダイゼーションの状態が把握できる。
例えば、図１１の（ｂ）と（ｃ）の場合は、夫々７塩基と８塩基が重なった状態であり、両者ともにそのうちの連続した２つの塩基が相補的である。
また、図１１の（ｄ）は２２塩基が重なった状態である。そのうちの６個の塩基対が相補的であり、且つそれぞれは２個の塩基の連続のマッチである。この配列Ｐと配列Ｑの場合は、（ｄ）の状態が、最も多くの部分が相補的である。更にこの場合の全長に対する相補部位の割合は６÷２２＝０．２７程度であり、これは６０％を下回る数値である。従って、上述の（ｉｉ）の条件である、「対照した配列の長さのうち、６０％以上がマッチしている」には該当せず、クロスハイブリダイゼーションしているとは判定されない。
このように重なり部分を順番にずらしていき、全ての対照の状態のうち、上述の条件（ｉ）および／または（ｉｉ）を満たすクロスハイブリダイゼーションが１つでも存在すればその時点で試したランダム配列は候補配列から除かれる。
次に、配列Ｒと配列Ｓの２種類の配列と、それらの相補配列からなる４つの配列の間のクロスハイブリダイゼーションの存在を検証する例を図１２に示す。図中、配列Ｒの相補鎖は「Ｒ」の文字の上部に線を付して示した。また、配列Ｓの相補鎖は「Ｓ」の文字の上部に線を付して示した。明細書の記載では、配列Ｒの相補鎖を「“Ｒ”」、配列Ｓの相補鎖を「“Ｓ”」と記す。全ての組み合わせを考えると（Ｒ，Ｓ）、（Ｒ，“Ｓ”）、（“Ｒ”，Ｓ）、（“Ｒ”，“Ｓ”）の４通りである。しかしながら、これら全てを検証する必要はない。即ち、Ｒと“Ｒ”、Ｓと“Ｓ”は相補的な関係にあるのでＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃペアも相補鎖に変換した場合では単にＴ−Ａ、Ｃ−Ｇペアになり、相補鎖に変換した場合の５’→３’への向きの変更も、同様に対照する二本の鎖とも反対になる。従って、（Ｒ，Ｓ）と（“Ｒ”，“Ｓ”）、（Ｒ，“Ｓ”）と（“Ｒ”，Ｓ）についての結果は同じ、即ち、相補鎖数およびパターンとも等しいクロスハイブリダイゼーション状況を示す。このような例を図１２に示す。この例では、Ｒが「ａｔｔｇｃｃｇ」、“Ｒ”が「ｃｇｇｃａａｔ」、Ｓが「ｇｔｃｃａａｔ」、“Ｓ”が「ａｔｔｇｇａｃ」であり、夫々７塩基の例である。左から、（Ｒ，Ｓ）、（Ｒ，“Ｓ”）、（“Ｒ”，Ｓ）、（“Ｒ”，“Ｓ”）を示し、夫々の括弧書きの下方に、各々の組み合わせにおける全ての対応パターンを示した。図１２に示す通り（Ｒ，Ｓ）と（“Ｒ”，“Ｓ”）、（Ｒ，“Ｓ”）と（“Ｒ”，Ｓ）は、比較した結果が等しい。このように、相補鎖についてのクロスハイブリダイゼーションの検証は（Ｒ，Ｓ）および（Ｒ，“Ｓ”）のみでよい。
以上の方法で、すでに、相補鎖を含まない候補配列についてのクロスハイブリダイゼーションの存在の確認を行った後で、クロスハイブリダイゼーションが存在しないと判定された配列群に対して、更にそれらの相補鎖との間のクロスハイブリダイゼーションの存在を検証してもよい。或いは、相補鎖を含まない候補配列についてのクロスハイブリダイゼーションの存在の確認と共に相補鎖についても同時に検証してもよい。また、クロスハイブリダイゼーションの検証を全ての配列について総当たりで行ってもよい。
本発明の態様に従う方法において使用されるクロスハイブリダイゼーションが存在すると判定するための条件は、上述した例に限るものではない。上述の例では、（ｉ）と（ｉｉ）の何れかに当て嵌まる場合をクロスハイブリダイゼーションが存在すると判定するとしているが、（ｉ）と（ｉｉ）の両方に当て嵌まる場合にクロスハイブリダイゼーションが存在すると判定してもよい。或いは、（ｉ）の６塩基以上を、２、３、４、５以上と設定しても、７、８、９、１０以上としても、或いはそれ以上の数値以上と設定してもよい。しかしながら、精度と効率から６塩基以上が好ましい。また、設計しようとする正規直交化配列が長い場合には、例えば、例えば７塩基以上、８塩基以上連続することを条件とすることが好ましい。また、ミスマッチ条件に関する場合、例えば、７５塩基以上の場合などは、例えば７塩基以上、８塩基以上連続することを条件とすることが望ましい。
（ｉｉ）の条件は、全ての場合に共通して、対照した配列、即ち、重なりを持たせた配列の６０％と設定するのではなく、重なり部分が１０塩基以上の場合は６０％、１０塩基以下の場合は合計６塩基とするなどのように、対照する重なりの長さで判定基準を変更してもよい。或いは、マッチする塩基の絶対数で、設定する割合を区切って設定してもよい。
また更に、計算機資源が得られるならば、ダイナミックプログラミング法でバルジループなどの複雑な構造も考慮して、より精密なクロスハイブリダイゼーションを検証してもよい。
また、本発明の態様に従う設計方法では、当該方法に具備される何れの工程の途中および合間に、新たなランダム配列を無作為に作出して候補配列群に追加してもよい。そのような場合、クロスハイブリダイゼーションの存在の検証については、例えば、新たなランダム配列を正規直交化配列の集合にある配列と対照し、その新たなランダム配列がクロスハイブリダイゼーションしないかを検証すればよい。
（５）分子内２次構造の自由エネルギーの計算
本発明に従って得られる正規直交化配列を有する核酸は、単独でプライマーやハイブリダイゼーションプローブとして利用される。従って、そのような核酸が、分子内構造を取り易い核酸であれば、反応性が低くなり、ＰＣＲ増幅効率やハイブリダイゼーション効率が悪化する。この反応効率は、２次構造の自由エネルギーが大きいほど大きい。従って、２次構造の自由エネルギーを計算することを、正規直交化配列の選別に活用することが可能である。例えば、この計算には、Ｚｕｃｋｅｒらのダイナミックプログラミング法（「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｄｅ」，ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１−４３，Ｊ．Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ  ＆  Ｂ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ，ｅｄｓ．，ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９９）」を参照されたい）などが利用できる。また、適切な閾値を与えておけば、この段階で配列の取捨選択が可能になる。しかしながら、この段階は計算量が多くて実行が困難な場合もある。また、正規直交化配列自身が短いために安定な構造をとり難い場合もある。これらのような場合などには、２次構造の自由エネルギーの計算を省略してもよい。
（６）基本セットの所要時間
以上の過程の中で、最も時間のかかるのはクロスハイブリダイゼーションチェックである。また、次に時間のかかるのは２次構造の自由エネルギーの計算である。クロスハイブリダイゼーションチェックは総当たりで計算するために正規直交化配列の集合が大きくなるにつれて計算時間がかかり、新たに試される候補配列はすでに集合の要素になっている配列とクロスハイブリダイゼーションを起こす可能性が高い。よって集合は大きくなるにつれて配列の種類の増加が鈍る傾向にある。
Ｔｍ値を制限した候補配列の生成は設計計算の律速段階にならないので、クロスハイブリダイゼーションチェックが完了するまでに、生成した候補配列リストを一括して作成し、クロスハイブリダイゼーションチェック処理をしてもよいし、１個の配列についてクロスハイブリダイゼーションチェックが終わるたびに更なる候補配列を生成してもよい。
極短い正規直交化配列を設計するとき、更なる候補配列を生成したときには既出配列に相補な配列が偶然できてしまうことがある。これを防ぐために、既に生成した配列のリストを作っておき、対照してからクロスハイブリダイゼーションチェックしてもよい。また、この既出配列と対照する段階をクロスハイブリダイゼーションチェックの前に入れてもよい。また、２５ｍｅｒ程度の長い配列になるとＴｍ値の制限をしていても同一な配列が生成する確率は低いので、特にこのような処理をする必要はない。
また、既出配列との対照をせずに済ます方法もある。例えば６塩基の正規直交化配列の設計をするとすれば、全ての配列は４６＝４０９６種類だけである。従って、配列をランダムでなく順に重複の無いように配列生成してもよい。その際には、Ｔｍ値条件を満たさない配列が生成され一部の計算が無駄になってしまったとしても問題にならないだろう。そのような手段を用いる例を図１３に示す。例えば、０から４０９５までの１０進数を順に生成し、それを図１３のような剰余を調べるアルゴリズムにより４進数に変換すればよい。４進数の０をＡ、１をＣ、２をＧ、３をＴに対応するように解釈すれば、１０進数の１は、４進数で０００００１となり、塩基配列ＡＡＡＡＡＣと解釈できる。例えば、このような場合などにおいては、本発明の態様に従う正規直交化配列の設計における、ランダム配列の作出に代わって、このような逐次的な配列の生成手段を利用してもよい。
５．組み合わせた正規直交化配列の設計計算
上に述べたような正規直交化配列は、使用時に複数の配列を組み合わせて連結し、比較的長い核酸断片として使用されてもよい。実際に、例えば、Ａｄｌｅｍａｎの実験では７つの都市に対応するＤＮＡを連結し用いている（Ｌ．Ａｄｌｅｍａｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（１１）：１０２１−１０２４，１９４４）。ここで、正規直交化配列の連結部分には新たな配列ができることに注意しなければならない。よって、先に述べた方法により設計された正規直交化配列を使用する場合には、その連結の形態などに応じて、連結部分において、新たなグロスハイブリダイゼーションが起きないようにする必要がある。そのためには、例えば、正規直交化配列群に含まれる任意の２つの配列を連結してできる連結部分から両側の正規直交化配列の中央塩基までの配列についても、総当たりでクロスハイブリダイゼーションの有無を調べることが好ましい。配列の連結が任意の２配列で起きないならば、クロスハイブリダイゼーションを起こす組み合わせを使用しないようにすればよい。また、任意の２配列で連結が起きるならば、もっとも多くの正規直交化配列が使えるように、クロスハイブリダイゼーションを起こす組み合わせに関わる正規直交化配列を除けばよい。
６．正規直交化配列群および核酸群
本発明の更なる態様に従うと、以上のような本発明に従う方法によって設計された塩基配列群およびその配列を基に合成された核酸が提供される。
本発明の態様に従う方法により与えられた正規直交化配列群は、紙面およびディスプレイなどに出力された形態で提供されたり、媒体に記録された形態で提供されてもよい。またそのような配列は、核酸に反映されてもよい。そのような配列を有する核酸は、核酸合成装置などにより化学的に合成されてもよく、或いは他のそれ自身公知の核酸を合成するための手段によって、合成されてもよい。また、合成されるそのような配列を有する核酸の種類は、実施者の所望に応じて選択すればよい。
本発明の態様に従い提供される核酸は、本発明に従い提供される正規直交化配列群に含まれる配列により示される核酸であればよい。使用する際は、同時に１つの反応系において同じ正規直交化配列群に含まれる複数種類の配列を組み合わせて使用することが必要である。
本発明の態様に従い提供される正規直交化配列群の例を、図１４から図２１に示す。それらは配列番号１から配列番号２６３である。これらの配列は、何れも互いに正規直交化配列の関係にある。従って、これらを全て一度に使用しても、何れの一部分を使用してもよい。また、配列番号２６４から配列番号３７５までの配列も正規直交化配列群の１例である。従って、これらの配列は何れも互いに正規直交化配列の関係にある。従って、これらを全て一度に使用しても、何れの一部分を使用してもよい。
また、更なる本発明の態様に従い提供される正規直交化配列群の例は、配列番号２６４から配列番号３７５の１１２種類である。これらの配列もまた、何れも互いに正規直交化配列の関係にある。従って、これらを全て一度に使用しても、何れの一部分を使用してもよい。
また、配列番号１から配列番号３７５は、当該配列により示される核酸として提供されてもよく、それらの核酸も本発明の範囲内である。
以上のような本発明の態様に従うと、例えば、ＤＮＡチップおよびＤＮＡマイクロアレイなどを代表とする核酸検出用の核酸プローブ固相化基体において使用される核酸検出用のプローブとしての用途、多くの核酸増幅やハイブリダイゼーションなどの反応を並列および／または繰り返して行うＤＮＡコンピューティングなどにおいての用途など、多くの種類の核酸を同時に使用する必要がある場合に有利に使用できる塩基配列群およびその配列を有する核酸を設計および／または製造する方法が提供される。
ＤＮＡコンピューティングに用いる配列として「正規直交化配列」を利用することは、陶山らが提案している（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｕｙａｍａ，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ３−ＳＡＴ  ｂｙ  ｂｒｅａｄｔｈ  ｆｉｒｓｔ  ｓｅａｒｃｈ”，Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ５ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，９−２０（１９９９））を参照されたい）。Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｕｙａｍａ，（１９９９）において、彼らは、３ＳＡＴ問題という組み合わせ問題を解くために、Ｔｍ値が揃った、互いにクロスハイブリダイゼーションしにくい２２ｍｅｒの配列セットを設計した。しかしながら、通常、このような配列セットを設計しても、互いに連結すると連結部分に新たな配列ができるために、クロスハイブリダイゼーションを完全に避けることはできない。当該文献における陶山の設計法は、連結部分にできる配列もクロスハイブリダイゼーションを起こし難いように設計してしまうことが特徴である。しかし、初めから連結部分を考慮して設計すると、配列設計の制限が厳しくなり、より多くの配列を設計できなくなってしまう。また、ＤＮＡコンピューティングに用途を限らないならば、必ずしも全ての配列を連結しないので、設計した後で改めて連結部分を考慮して配列を選択する方が好ましい。
本発明の態様に従う方法によれば、上記のような従来の設計方法の欠点を改善することも可能であり、広い用途に態様可能な従来に比較して大きな母集団、即ち、正規直交化配列である核酸群を設計することが可能である。
また、本発明の態様に従う方法は、全検証アルゴリズムによる正規直交化配列の設計方法であっても、逐次追加アルゴリズムによる正規直交化配列の設計方法であってもよく、何れの方法も本発明に含まれる。
本発明の態様に従う方法によれば、融解温度（Ｔｍ値）が一定範囲に収まっている、クロスハイブリダイゼーションシグナルが完全マッチのシグナルに比べて１００分の１である、２次構造をとりにくい、正規直交化配列である配列群が設計される。また、それを基に合成された核酸群が提供される。
【実施例】  実施例１．正規直交化配列の設計
２５塩基の正規直交化配列を設計した。設計条件はＴｍ値の中心温度を６０℃とし、±２℃の範囲とした。また、クロスハイブリダイゼーションは連続６塩基以上のマッチがあるか、および／または１０塩基以上で重なりの配列の６０％がマッチしているかで判定した。計算は、ＣＰＵがＰｅｎｔｉｕｍ  ＩＩＩ  ８００ＭＨｚ、ＲＡＭが２Ｇバイト、ＯＳがＬｉｎｕｘ  ｋｅｒｎｅｌ  ２．２．１８の計算機を用い、ｇｃｃにてコンパイルしたプログラムを用いて行った。Ｔｍ値計算は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａのパラメータを用いてＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法によって行った。自己分子内構造の自由エネルギー計算は、Ｚｕｃｋｅｒのアルゴリズムを用いて行った。以上の計算によって、２６３の配列からなる正規直交化配列群が得られた。
得られた正規直交化配列群を図１４から図２１までに、夫々配列番号１から配列番号３４、配列番号３５から配列番号７０、配列番号７１から配列番号１０６、配列番号１０７から配列番号１４２、配列番号１４３から配列番号１７８、配列番号１７９から配列番号２１４、配列番号２１５から配列番号２５０、配列番号２５１から配列番号２６３を示した。配列番号の右には、塩基配列を５’末から３’末方向に記載し、その右にはｄＧを記載し、その右にはＴｍ値を示した。
実施例２．マイクロアレイによる検証実験
（１）配列
上記の実施例１において記載した方法と同様に、更なる配列を１１２種類設計した。これらの配列を図２２から図２７に示した。これらの図の最も左には本明細書において扱う配列に通し番号である配列番号２６４から配列番号３７５までを記載した。次の「ｎａｍｅ」（ネーム）の欄には、本正規直交化配列群における番号であるネーム１からネーム１１２までの番号を記載した。次に、当該１１２種類配列の各配列を左から５’から３’の方向で示した。最も右には以下の検証において用いた夫々の配列を検出するためのプローブ配列を５’から３’の方向で記載した。
また、配列番号３２６は配列番号３２と、配列番号３２８と配列番号２１９、配列番号３４２は配列番号１７５と、配列番号３４３は配列番号２１と、配列番号３７２は配列番号１６６と、配列番号３７３は配列番号２４３と、配列番号３７４は配列番号３７と、配列番号３７５は配列番号２１０と等しい配列である。
（２）マイクロアレイ
８ｘ１４のウェルを具備するプレートを用意する。このプレートの各ウェルの夫々に、ネーム１からネーム１１２を検出するためのプローブ配列を１種類ずつ固相化して、マイクロアレイとした。このようなマイクロアレイを１４枚作製した。
（３）試料の増幅
まず、上記（１）に記載の１１２種類の配列、即ち、ネーム１〜ネーム１１２（配列番号２６４〜配列番号３７５）を、８種類ずつ纏めて１つのバッチとした。各バッチに含まれる配列は次の通りである。
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表１に示されるように、１バッチには、ネーム１、１３、２５、３７、４９、６１、７３および８５が含まれる。２バッチには、ネーム２、１４、２６、３８、５０、６２、７４および８６が含まれる。３バッチには、ネーム３、１５、２７、３９、５１、６３、７５および８７が含まれる。４バッチには、ネーム４、１６、２８、４０、５２、６４、７６および８８が含まれる。同様に、表１に示されるように、残りの１４バッチまでに８種類ずつの配列が含まれる。
全ての配列を１４のバッチに振り分けた後に、バッチ毎に以下のようなＰＣＲ増幅を行った。全てのバッチに共通して使用したプライマーは、５’端をＣｙ３でラベルされた配列「ＧＡＴＴＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＧＴＴ」（配列番号３７６）と、５’端をビオチン化された配列「ＴＴＧＴＧＡＧＧＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣＡＡ」（配列番号３７７）である。ＰＣＲは、各バッチ毎に、ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｉｎｃ．）を用いて以下の表２に記載のプログラムを用いて行った。
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当該ＰＣＲ終了後、１４バッチについて得られた１４のサンプルから、夫々の増幅産物を磁気ビーズにより以下のように抽出した。磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｄｙｎａｌ）を４０μＬ分取し、４００μＬの２×Ｂ＆Ｗ  Ｂｕｆｆｅｒｄで２回洗浄した。洗浄後、得られた磁気ビーズを２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。次に、この懸濁液に対して当該１４のサンプルのうちの１つを２００μＬ加えて室温で３０分間撹拌した。次に、２００μＬの２×Ｂ＆Ｗ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。更に２００μＬのＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。洗浄後の磁気ビーズを回収し、１００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁した。次に、これを９４℃で撹拌しながら１０分間放置し、上澄みだけを素早く回収し、増幅された核酸断片を抽出し回収した。以上の抽出を１４バッチについてのＰＣＲで得られた１４のサンプルについて行い、増幅産物に由来するｓｓＤＮＡを１４種類得た。
これらのｓｓＤＮＡを１サンプル当たり１枚のマイクロアレイの全てのウェルに対して、１ウェル当たり４４μＬずつ添加した。ハイブリダイゼーションを行った後にＧｅｎｅＰｉｘ４０００（Ｌａｓｅｒ／ＰＭＴ＝１００／６５０）を用いてスキャンし、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（製造元）のソフトウェア）を用いたヒストグラム法により、Ｃｙ３に由来する蛍光強度を定量した。
その結果を図２８から図４１に示す。夫々のグラフの横軸には、ウェルの番号を示し、縦軸には蛍光強度を示した。ウェルの番号は、各配列のネームに対応する。
図２８は、当該マイクロアレイに対して、バッチ１の増幅産物に由来するｓｓＤＮＡを添加した後に得られる各ウェルからの蛍光強度を示した。バッチ１に含まれる配列を検出するためのプローブが固相化されたウェルにおいて高い蛍光強度が得られた。同様に、図２９から図４１は、夫々、バッチ２からバッチ１４までの増幅産物に由来するｓｓＤＮＡを当該マイクロアレイに対して添加した後に得られる各ウェルからの蛍光強度を示した。図２９から図４１についても、夫々のバッチに含まれる配列を検出するためのプローブが固相化されたウェルにおいて高い蛍光強度が得られた。これらの結果から、本発明に従う正規直交化配列は、互いにクロスハイブリダイゼーションを生じないことが明らかになった。
【発明の効果】
本発明によって、広い用途に対応し得る多くの候補を含む正規直交化配列群を設計する方法、そのような方法により設計された配列に従って核酸を合成する方法、それにより合成された核酸が提供された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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