(57)【要約】特定の癌細胞において発現するＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βの塩基配列、又はその一部のポリペプチドを基に作製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉを用いて、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されるｍＲＮＡの翻訳を抑制する。また、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉなどの発現抑制物質を有効成分とする発現抑制剤は、癌の治療剤として有効である。
2004046356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示される塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とすることを特徴とするＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法。
【請求項５】
アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉを用いることを特徴とする請求項４記載のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法。
【請求項６】
アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉのいずれかをコードするＤＮＡを用いることを特徴とする請求項４記載のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法。
【請求項７】
ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とすることを特徴とするＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質。
【請求項８】
アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉであることを特徴とする請求項７記載のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質。
【請求項９】
アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉのいずれかをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項７記載のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質。
【請求項１０】
請求項７に記載の発現抑制物質を有効成分とすることを特徴とするＰＤＧＦ受容体αの発現抑制剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現抑制剤を含有することを特徴とする癌の治療剤。
【請求項１２】
請求項１０に記載の発現抑制剤を用いることを特徴とする癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
関連文献とのクロスリファレンス
本願は、２００２年１１月１５日に出願した特願２００２−３３２１４２号に基づく優先権を主張する。その文献をこの明細書中に援用する。
【技術分野】  本発明は、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β又はその一部を有するポリヌクレオチド、並びにＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とするＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法、発現抑制物質、及び発現抑制剤、並びに癌の治療剤に関する。
【背景技術】  血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、細胞の増殖や発生・分化、創傷治癒、さらには癌悪性化や動脈硬化などにおいて重要な役割を果たしている。したがって、ＰＤＧＦシグナルを制御することはこれら疾患の治療薬となることが期待されている。実際には、治療薬としてＰＤＧＦの発現抑制剤（例えば、特開平１０−５９８５０号公報参照）や、ＰＤＧＦとＰＤＧＦ受容体αとの結合阻害剤（例えば、特表平８−５０００１０号公報参照）や、ＰＤＧＦ受容体αのチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、特表２００２−５１４２２８号公報参照）が提案されている。
しかしながら、これらの抑制剤や阻害剤は癌特異的なＰＤＧＦシグナルだけではなく、正常なＰＤＧＦシグナルにも影響を与える恐れがある。そこで、本発明は癌細胞に特異的なＰＤＧＦシグナルだけを選択的に抑制できる発現抑制方法に用いるためのポリヌクレオチド、発現抑制物質、発現抑制剤、及び癌の治療剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列、又はその一部を有することを特徴とする。配列番号２に示される塩基配列の一部を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列、又はその一部を有することを特徴とする。
ここで、「ＰＤＧＦ受容体α遺伝子」とは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ０２６５８０及びＡＣ０２５０１３に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモログをいう。
さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチドであってもよい。
これらのポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡのいずれであってもよい。また、１個若しくは数個の塩基の欠失、置換、若しくは付加等の遺伝的多型（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）をもち、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列を有するポリペプチドも本発明の範囲内であるが、同等の機能をもつものが好ましく、Ｅ２Ｆ−１により転写調節されるものが特に好ましい。
本発明のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法は、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とすることを特徴とする。ここで、「ｍＲＮＡ」とは、転写されてできたｈｎＲＮＡからイントロン部分が除去され、エキソン部分が結合して形成されたＲＮＡをいう。また、「ｍＲＮＡを標的とする」とは、直接的又は間接的に、特異的に該ｍＲＮＡから、そのコードされるタンパク質を生成しないようにすることをいう。なお、「タンパク質の発現」とは、ＤＮＡ上の遺伝情報がｍＲＮＡから正確に翻訳されてタンパク質を産生することを意味する。
本発明のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法は、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉを用いた方法であってもよい。
ここで、「ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のアンチセンスヌクレオチド」とは、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に対し相補的なヌクレオチドをいい、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡであってもよく、ヌクレオチドが修飾されていてもよい。上記アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、対象となる遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列に対し相補的なＲＮＡ又はＤＮＡをいい、細胞内での遺伝情報の発現を遮断し、目的とするタンパク質への産生を特異的に抑制するために用いられる。
「リボザイム」とは、酵素活性をもつＲＮＡの総称であり、生物由来のＲＮＡを特異的に切断する酵素をいう。細胞内に取り込まれると標的ＲＮＡ配列を切断する機能を有する。その結果として標的ＲＮＡからのタンパク質の発現が抑制される。標的ＲＮＡ配列に対する特異性が高いため、タンパク質の発現抑制物質としては好ましい。リボザイムには、ハンマーヘッド型リボザイムや、ヘアピン型リボザイム（ｈａｉｒｐｉｎ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）などが含まれる。
「マキシザイム」とは、一般的にＷＯ９９／４６３８８号公報の明細書に記載のように、二量体の構造を形成するＲＮＡ分子であって、例えば、その２本のＲＮＡ分子が、正常細胞におけるｍＲＮＡを認識しないで、癌細胞に特異的なｍＲＮＡを認識するようにマキシザイムを構成することにより、癌細胞に特異的なｍＲＮＡのみを切断することができる。
「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と称される現象を誘導する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を利用した方法をいう。「ＲＮＡ干渉と称される現象」とは、上記二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると標的となる遺伝子の発現が抑制される現象であり、現在、ホストの内在する機構により２１〜２３塩基対に短く切断され、短く切断されたＲＮＡ分子はホストの遺伝子から転写されるｍＲＮＡを認識して配列特異的に分解し、その結果としてホストの遺伝子がコードするタンパク質の発現を特異的に抑制するためとされている。
本発明のＰＤＧＦ受容体αの発現抑制方法は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉのいずれかをコードするＤＮＡを用いた方法であってもよい。
本発明にかかるＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質は、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とすることを特徴とする。それは、例えば、発現抑制物質が該ｍＲＮＡに結合したり、該ｍＲＮＡを分解したりすることによるが、発現抑制物質が間接的に、他の物質を該ｍＲＮＡに結合させたり、他の物質により該ｍＲＮＡを分解したりしてもよい。なお、「ＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質」とは、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子からのＰＤＧＦ受容体αタンパク質の産生を抑制する物質をいう。
本発明にかかるＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質としては、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉなどを具体的に挙げることができる。
本発明にかかるＰＤＧＦ受容体αの発現抑制物質としては、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉのいずれかをコードするＤＮＡなどを具体的に挙げることができる。
本発明にかかるＰＤＧＦ受容体αの発現抑制剤は、前記発現抑制物質を有効成分とすることを特徴とする。
本発明にかかる癌の治療薬は、前記発現抑制剤を含有することを特徴とする。
本発明にかかる癌の治療方法は、前記発現抑制剤を含有することを特徴とする。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の実施例２において、ＲＴ−ＰＣＲを用いて調べたＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β〜４の発現パターンを示す図である。
図２は、リボザイムにおける構造を示す図である。
図３は、マキシザイムにおける構造を示す図である。
図４は、本発明の実施例１において、−１３９５から＋３１２までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。なお、図中の「＋」は−１３９５から＋３１２までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを１００ｎｇ導入した結果を示し、「−」は、−１３９５から＋３１２までの塩基配列を含まないレポーターコンストラクトを１００ｎｇ導入した結果を示す。
図５は、本発明の実施例１において、−５１７から＋１４４５までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。
図６は、本発明の実施例１において、転写開始点を欠失した様々な長さのｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示す図である。
図７は、基本転写因子により転写されるＰＤＧＦＲαのｍＲＮＡと、Ｅ２Ｆ−１により転写されるＰＤＧＦＲαのｍＲＮＡの概略を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  癌細胞においては、ほとんどの場合、ＲＢタンパク質などの癌抑制タンパク質が関与するシグナル伝達経路に異常が起きていることが知られている。例えば、ＲＢタンパク質の上流で働くサイクリンＤ１の過剰発現は、増殖因子に対する感受性を亢進させることにより、癌細胞の悪性化に寄与すると考えられている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養系では、サイクリンＤ１を過剰発現させた細胞株にＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；繊維芽細胞増殖因子）を加えることにより、その細胞は悪性化する。本願発明者は、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；血小板由来増殖因子）も同様の働きをする、即ちサイクリンＤ１を過剰発現させた細胞株を悪性化させることを見いだした。
サイクリンＤ１−ＲＢ経路の下流には、転写因子Ｅ２Ｆ−１が存在し、ＦＧＦ受容体の発現を亢進することにより、ＦＧＦに対する感受性を亢進させる。実施例で詳細に後述するように、Ｅ２Ｆ−１はＰＤＧＦ受容体αの発現も亢進するが、本願発明者は、従来知られているプロモーターに作用するのではなく、従来のイントロン１中に新たなＥ２Ｆ−１によって制御される新規プロモーター領域を見いだし、その新規プロモーターによって転写される際に用いられる新規エキソン１βを同定した。
このように、Ｅ２Ｆ−１とＰＤＧＦが関与する癌の悪性化において、これらの因子のターゲットの一つは、ＰＤＧＦ受容体αのエキソン１βを有するｍＲＮＡであることが明らかになった。従って、このエキソン１βを有する転写産物からのＰＤＧＦ受容体αの産生を特異的に阻害することにより、癌細胞の悪性化につながるシグナル経路を断つことができ、癌細胞の増殖を抑制できる。なお、サイクリンＤ１−Ｅ２Ｆ−１経路に限らず、癌細胞の増殖が、エキソン１βを有するｍＲＮＡを過剰に転写させることにより、ＰＤＧＦ受容体αと共同して癌の悪性化をひきおこす因子によるのであれば、その癌細胞の増殖阻害に本発明を適用できる。
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
配列番号２に示されるヒトＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βの塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列情報に基づき、ｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーなどのヒト遺伝子ライブラリーから調製することができる。また、マウス、ラット、ニワトリ、ブタ、イヌ、サルなどヒト以外の生物種由来のＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βもＥ２Ｆ−１によって転写制御されることで特定されるが、例えば、ヒトＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βとのハイブリダイゼーションや、従来のイントロン１中の配列のうち新たなエキソンを調べることなどによっても同定でき、これらも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
ここで、「ヒトＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β」とは、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んで構成されているエキソンをいい、「ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β」とは、配列番号２に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んで構成されているエキソン及びヒト以外の生物種においてそれに対応するエキソンをいう。
ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βは、ｍＲＮＡ上の非翻訳領域であるため、ヒト以外の生物種において、必ずしも塩基配列のレベルで高い相同性を有する必要はなく、特定の細胞種で転写されるという機能的な面は保存されている必要があり、例えば、Ｅ２Ｆ−１によって転写が制御されるというもう一方のエキソン１に見られない特徴を必要とする。
図１に示すように、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡは、特定の癌細胞にしか検出されない。従って、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とした発現抑制方法、並びに本発明のポリヌクレオチド、発現抑制物質、及び発現抑制剤などは、特定の癌細胞（例えば、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０やヒト食道癌細胞ＴＴｎなどを具体的に挙げることができる。）を攻撃するための癌の治療方法や癌の治療剤として有用である。
本発明における発現抑制方法としては、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを標的とするものであって、例えばＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡに結合し、翻訳を抑制してＰＤＧＦ受容体αの発現を抑制する方法や、上記ｍＲＮＡを分解又は切断してＰＤＧＦ受容体αの発現を抑制する方法であってもよい。以下にアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉなどの発現抑制物質を用いた発現抑制方法について例を挙げて説明する。
（１）アンチセンスヌクレオチドの調製
本発明の発現抑制方法に用いるアンチセンスヌクレオチドとしては、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βに対応する部分の塩基配列又はその一部に相補的な塩基配列を含むアンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡを具体的に例示することができる。また、１５〜３０の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
本発明のアンチセンスヌクレオチドは、構造上、その配列の位置、長さ、修飾化、ミスマッチの存在等には制限されるものではない。上記修飾したアンチセンスヌクレオチドとしては、体内又は細胞内においてアンチセンスヌクレオチドを安定化させるために、ホスホジエステル結合のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子又はメチル基に修飾したアンチセンスヌクレオチドや、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）で修飾したアンチセンスヌクレオチドを具体的に例示することができる。
本発明のアンチセンスＤＮＡは、Ｓ１ヌクレアーゼなどのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、プライマー・エクステンション法によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成できる。また、アンチセンス鎖の一部をプライマーとしてＰＣＲを行うことにより、アンチセンス鎖だけを合成することができる。また、ＤＮＡ合成機を用いることなどによって、人工的に合成してもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成もアンチセンスＤＮＡに準じるが、人工的に合成するのが最も好ましい。
一方、本発明のアンチセンスＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ合成機や固相合成法などにより容易に合成することができる。その後、ＨＰＬＣを用いてＮＨ３ＯＨ／ＥｔＯＨで溶出することにより、目的のＲＮＡを単離することができる。
本発明のアンチセンスＲＮＡは、このように人工的に合成してもよいが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識するプロモーター配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ−３’：配列番号３）の下流に、アンチセンスＲＮＡに対応するＤＮＡ配列をもつ２重鎖ＤＮＡを挿入したベクターを作製し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系によって合成してもよい。
また、アンチセンスＲＮＡに対応するＤＮＡを組み込んだウイルスベクター又はプラスミドなどの発現ベクターを用いてアンチセンスＲＮＡを細胞内で発現させてもよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどであってもよい。
（２）リボザイムを挿入したプラスミドの調製
リボザイムは、図２に示すように、標的のｍＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列（リボザイムの５’末端部分と３’末端部分の塩基配列を示す。）と、触媒活性部位（○印で示した塩基）を有する２４の塩基配列とを有する。リボザイムの５’末端部分と３’末端部分の塩基配列が標的のｍＲＮＡの塩基配列と特異的に結合すると、ｍＲＮＡ上にあるＮＵＸ配列（Ｎは任意の塩基であって、Ｘはａ、ｕ、ｃのいずれかの塩基を意味する。）で切断して標的のｍＲＮＡを分解させることができる。すなわち、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βに対応する部分の塩基配列を基にリボザイムを合成して細胞内に投与すれば、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを特異的に切断することができると考えられる。
従って、本発明の発現抑制物質であるリボザイムは、配列番号２に示されるヒトＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βの塩基配列から、ＮＵＸ配列に対応する配列を選択してその配列を含む１５〜２０の塩基配列に相補的な塩基配列と、触媒活性部位（○印で示した塩基）を有する２４の塩基配列とを含むようにすればよい。ＮＵＸ配列に対応する配列としては、例えば、配列番号２に示される３４〜３６番目のＧＴＣや、７５〜７７番目のＧＴＣや、７８〜８０番目のＧＴＣや、８１〜８３番目のＧＴＣや、１７２〜１７４番目のＧＴＣや、２６７〜２６９番目のＧＴＣを挙げることができる。なお、上記リボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイムや、ヘアピン型リボザイム（ｈａｉｒｐｉｎ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）であってもよい。
実際の合成方法は、人工合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、発現ベクターによる細胞内合成などがあり、（１）のアンチセンスＲＮＡの場合と同様なので、ここでは説明は省略する。
（３）マキシザイムの設計及び調製
マキシザイムは、図３に示すように、二量体の構造を形成するＲＮＡ分子からなり、両方のＲＮＡ分子には標的ＲＮＡを特異的に認識するセンサー部位（図中にＸ・・・Ｘの部分を示し、Ｘは任意の塩基を意味する。なお、上段のＸと下段のＸはそれぞれ相補性の塩基を意味する。）と、触媒活性部位（図中において二重鎖を形成しない部分を示す。）と、標的ＲＮＡを含むｍＲＮＡ上にあるＮＵＸ配列（Ｎは任意の塩基であって、ＸはＡ、Ｕ、Ｃのいずれかの塩基を意味する。図中においてはＧＵＣ配列の部分を示す。）及びその上流（図中においてはＧＵＣ配列の部分の上流を示す。）又は下流（図中においてはＧＵＣ配列の部分の下流を示す。）を認識する部位を有する。マキシザイムのセンサー部位が標的ＲＮＡを特異的に認識して結合し、また、マキシザイムのもう一方の部分が標的ＲＮＡを含むｍＲＮＡ上にあるＮＵＸ配列の上流及び下流を特異的に認識して結合すると、標的ＲＮＡを含むｍＲＮＡ上にあるＮＵＸ配列を切断して標的のｍＲＮＡを特異的に分解することができる。すなわち、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βに対応する部分の塩基配列を基にマキシザイムを合成して細胞内に投与すれば、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡを特異的に切断することができると考えられる。
例えば、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βを標的ＲＮＡとして、その標的ＲＮＡに相補的な塩基配列をセンサー部位とする。また、標的ＲＮＡの下流に存在するＮＵＸ配列をＰＤＧＦ受容体αのｍＲＮＡから選択して、ＮＵＸ配列の上流と下流の配列に相補的な塩基配列を決定する。ＮＵＸ配列は、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βのｍＲＮＡ上のものであってもよい。これらの情報から、マキシザイムの各ＲＮＡ分子をＲＮＡ合成機に合成することにより、マキシザイムを作製することができる。なお、図中のＸの領域は１又は数個の増減があってもよい。
実際の合成方法は、人工合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成、発現ベクターによる細胞内合成などがあり、（１）のアンチセンスＲＮＡの場合と同様なので、ここでは説明は省略する。ただし、マキシザイムは２分子のＲＮＡを用いるため、発現ベクターを用いて細胞内で発現させる場合、２分子のＲＮＡを一つのベクターに組み込んでも、二つのベクターに別々に組み込んでも構わない。
（４）ＲＮＡｉの調製
目的の遺伝子に対応する二重鎖ＲＮＡが生体内に導入されると、対応するｍＲＮＡが分解するという報告がある（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１，２３５−２３８、Ｆｉｒｅ，Ａ．（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５，３５８−３６３、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０）。従って、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β、又はその一部を有するｍＲＮＡに対応する二重鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を細胞内又は生体内に導入すれば、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のｍＲＮＡのうちエキソン１βを含むｍＲＮＡが分解されると考えられる。
本発明の発現抑制物質であるＲＮＡｉは以下のように調製することができる。ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βのセンス鎖、又はその一部の塩基配列に対応するＲＮＡと、そのＲＮＡに相補的なＲＮＡとを、ＲＮＡ合成機を用いて人工的に合成することができる。また、ＨｉＳｃｒｉｂｅ  ＲＮＡｉ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで合成してもよい。
その他、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β又はその一部を正と負の両方向にクローニングしたウイルスベクター又はプラスミドなどの発現ベクターをそれぞれ細胞内に導入し、ＤＮＡの両鎖を細胞内で発現させることによって、細胞内でＲＮＡｉができるようにし、標的のｍＲＮＡを分解させるようにしてもよい。また、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β又はその一部に対応する二重鎖の各鎖のＤＮＡ配列を融合した配列を持つＤＮＡ、すなわち、センス鎖のＤＮＡの３’末端とアンチセンス鎖のＤＮＡの５’末端を融合させた配列を持つＤＮＡ、又は相補的なＤＮＡの３’末端とセンス鎖のＤＮＡの５’末端を融合させた配列を持つＤＮＡを発現ベクターに組み込んだものを用いてもよい。上記ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターなどであってもよい。なお、これらのＲＮＡｉは３０ベース以内のものが望ましく、２１ベースが最も望ましい。
（５）発現抑制物質の導入
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養系において発現抑制物質を細胞内へ導入する際、調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、ＲＮＡｉなどの発現抑制物質を、対象の癌細胞に対し、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等を用いる。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う発現抑制剤の個体への導入方法としては、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、ＲＮＡｉなどの発現抑制物質を有効成分とする発現抑制剤を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、導入対象の癌細胞の近傍に直接投与するか、発現抑制剤によっては非経口、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に投与する方法であってもよい。この場合発現抑制剤は、使用する部位又は目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤又は基剤をさらに含有してもよい。
個体に投与する発現抑制剤としては、発現抑制物質が細胞内に取り込まれやすいように調製されているものが好ましい。例えば、前記アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、ＲＮＡｉをコードするＤＮＡをウイルスベクターに組み込んだ発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで適当な細胞株に感染させ、ウイルスを産生し、そのウイルスを注射（ｉｎｊｅｃｔ）して感染させる方法であってもよい。ウイルスベクターとしては、細胞内で発現するアデノウイルスベクターや、レトロウイルスベクターを用いてもよい。
また、前記発現ベクターをリポソームの中に入れて癌細胞と融合されることによって、プラスミドを細胞内に導入させてもよい。また、ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａの商品名）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションを行ってもよい。この場合、発現抑制剤は、患部に直接注射しても、静脈注射してもよい。
また、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、ＲＮＡｉなどのＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法により細胞内に導入されやすいＨＩＶのＴＡＴなどのペプチドと結合させたＲＮＡアプタマーを発現抑制剤として注射してもよい。
対象の癌細胞としては、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０やヒト食道癌細胞ＴＴｎを具体的に例示することができるが、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されるｍＲＮＡが確認できる癌細胞であれば、どのようなものでもよい。
（６）発現抑制物質による発現抑制の評価
前記（５）記載の方法により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された特定の癌細胞に発現抑制物質を導入したものと、導入していないものについて、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されたｍＲＮＡの量を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。その他、ノザン・ブロッティング法などによりＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されたｍＲＮＡの量を評価する方法であってもよい。この結果を用いて、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されたｍＲＮＡの翻訳をより有効に抑制することができるアンチセンスヌクレオチドが見出せる。
上記はｉｎ  ｖｉｔｒｏによる実験であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験においても評価することが可能である。
ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価方法としては、以下の方法を具体的に例示することができる。正常マウスに前記特定の癌細胞を皮下注射し、一定期間をおいて腫瘍を拡大させ、その後、（５）の導入方法により前記調製した発現抑制剤を１〜数回投与する。投与後、発現抑制剤を導入したマウスと、導入していないマウスとの癌の大きさや生存率を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。
以下、本発明の実施例について詳細に述べる。
【実施例１】  本実施例では、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子において、転写因子Ｅ２Ｆ−１により制御されている新規エキソンを同定した。
まず、本願発明者は、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞がＰＤＧＦの添加によって、足場に非依存的に増殖することを見いだした。そこで、これらの細胞株において、ＰＤＧＦ受容体α（ＰＤＧＦＲ−α）の発現を調べたところ、ＰＤＧＦ受容体αの発現は上昇し、これが転写レベルでの制御であることが明らかになった。
サイクリンＤ１は、細胞周期依存的にｐＲｂのリン酸化を介して転写因子Ｅ２Ｆ−１を活性化するため、この上昇が、Ｅ２Ｆ−１によるヒトＰＤＧＦ受容体αのプロモーターの調節のためであるかどうか調べた。転写開始点の−１３９５から＋３１２までの配列（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌ．３０，２２４−２３２，１９９５に報告されている転写開始点をもとに塩基の番号付けをした。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ５０００１Ｓ０１参照）からなるプロモーター領域を、ｐＧＬ３ルシフェラーゼベクターを用いてルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローニングし、サイクリンＤ１を過剰発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、Ｅ２Ｆ−１の発現ベクターと共にトランスフェクションによって導入した。２４−７２時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイを行い、上記プロモーターによる転写活性を調べた。ポジティブ・コントロールとしては、ｍＦＧＦＲ−１のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを用いた。その結果、ｍＦＧＦＲ−１プロモーターの転写活性は上昇するものの、ＰＤＧＦ受容体αのプロモーターの転写活性は上昇しなかった（図４）。従って、従来知られていたＰＤＧＦ受容体αのプロモーターは、サイクリンＤ１を過剰発現させたマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＰＤＧＦ受容体αの発現の上昇に関与していないことがわかった。
そこで、転写因子結合配列検索（ＴＦ  ｓｅａｒｃｈ）により、ヒトＰＤＧＦＲ−α遺伝子のエキソン１下流にＥ２Ｆ−１と結合するコンセンサス配列があるか否かを調べたところ、Ｅ２Ｆ−１が結合すると考えられる配列が、報告された転写開始点の下流約１ｋｂｐ付近に４ヶ所かたまって存在することがわかった。そこで−２９５から＋１４４５までの塩基配列からなるＤＮＡを、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合し、得られたレポーターコンストラクトを用いて前記記載の方法と同様にルシフェラーゼアッセイを行い、Ｅ２Ｆ−１による転写活性を調べた。その結果、この領域の転写活性はＥ２Ｆ−１によって上昇することが確認できた（図５）。さらに、Ｅ２Ｆ−１の転写活性化能を欠失させた変異Ｅ２Ｆ−１（１から３６８までのアミノ酸配列）、あるいは１３２番目のロイシンをグルタミン酸に置換してＤＮＡ結合能を欠失させた変異Ｅ２Ｆ−１では、転写活性が見られないことから、この領域が実際にＥ２Ｆ−１によって制御されていることが示唆された。
しかし、推定されるＥ２Ｆ−１結合サイトは報告されている転写開始点の約１．２ｋｂｐ下流に存在し、このプロモーター活性が従来報告されていた転写開始点に作用するとは考えにくい。そこで、この領域が従来報告されている転写開始点に働いているかどうかを調べるために、この転写開始点を欠失した様々な長さのｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔを作製して、上記の方法と同様にルシフェラーゼアッセイを行い、Ｅ２Ｆ−１による転写活性を調べた。その結果、転写開始点の下流約１ｋｂｐまで欠失させたコンストラクトでもプロモーター活性を有し、さらにＥ２Ｆ−１による転写活性の上昇も見られた。これらのことから、ＰＤＧＦＲ−αのＥ２Ｆ−１で制御されるｍＲＮＡは、新たな転写開始点から発現する可能性が示唆された（図６）。
そこで、Ｅ２Ｆ−１による転写開始点の決定を５’−ＲＡＣＥ法により行った。−２９５から＋１４４５までの塩基配列からなるＤＮＡを、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したレポーターコンストラクトをトランスフェクションによって導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞株からｍＲＮＡを抽出し、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａの商品名）を用い、ルシフェラーゼ遺伝子配列に特異的なプライマー［フォーワードプライマー１（配列番号４：５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＡ−３’）と、リバースプライマー１（配列番号５：５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡＡＴ−３’）を用いてＰＣＲを行なったところ、増幅産物が得られた。そこで、この増幅産物のＤＮＡ配列を調べた結果、従来イントロンだと思われていた領域に、新規エキソンの存在が見出された。このようにして、従来イントロンと思われていた領域に、Ｅ２Ｆ−１によって転写制御される新規エキソンが存在することが明らかになった。
【実施例２】  本実施例では、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βが癌細胞において特異的に発現しているかどうかを確認した。
ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βと既知のエキソン４の配列からプライマー［フォーワードプライマー２（配列番号６：５’−ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＴ−３’）と、リバースプライマー２（配列番号７：５’−ＡＡＣＡＧＣＡＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＣＧ−３’）］を設計し、図１に示される各癌細胞から抽出した全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行った。図１に示されるように、ヒト大腸癌細胞ＳＷ４８０とヒト食道癌細胞ＴＴｎにおいてシグナルが検出された。そこで、これらの増幅バンドを回収し、ＤＮＡ配列を調べた結果、これらのバンドがＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βと既知のエキソン２〜４の配列が連結したヒトＰＤＧＦＲ−αのｍＲＮＡ断片であることがわかり、同時に配列番号１に示される全長３３８ｂｐのエキソン１βの配列を決定した。すなわち、新たに見出されたプロモーター領域はヒトＰＤＧＦＲのｍＲＮＡ２のものであることがわかった（図７）。
【実施例３】  エキソン１βの５’末端のより正確な位置を５’−ＲＡＣＥ法により検討を行った。エキソン１βを含むＰＤＧＦＲ−α  ｍＲＮＡを発現しているヒト骨肉腫細胞ＭＧ−６３からｍＲＮＡを抽出し、５’−Ｆｕｌｌ  ＲＡＣＥ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｔを用い、エキソン１βに特異的なプライマー［フォーワードプライマー２（配列番号６）と、リバースプライマー３（配列番号８：５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＧＧ−３’）］を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより得られた増幅産物のＤＮＡ配列を決定した結果、配列番号２に示される３６３ｂｐの塩基配列が得られ、エキソン１βの５’末端が少なくとも＋１２１０まで伸びていることが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明によると、癌特異的なＰＤＧＦシグナルだけを選択的に抑制できる発現抑制方法に用いられるためのポリヌクレオチド、発現抑制物質、発現抑制剤、及び癌の治療剤を提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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