(57)【要約】本発明の転写因子活性化制御方法は、アダプター蛋白質３ＢＰ２の発現量を制御し、またはその変異蛋白質を発現させることによって、細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に制御する方法である。本発明の方法によれば、特定の転写因子の活性を制御する場合に、他の転写因子の活性化との関係で複数の活性制御方法の中から目的に応じて所望の方法を選択することができる。また、本発明は炎症性疾患、免疫疾患、悪性疾患など様々な疾患に対する治療法・治療薬の開発に利用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アダプター蛋白質３ＢＰ２の発現量を制御し、またはその変異蛋白質を発現させることによって、細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に制御する方法。
【請求項２】
Ｔ細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に亢進または抑制することを特徴とする請求項１記載の転写因子活性制御方法。
【請求項３】
３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させ、又はその発現を抑制することによって、３ＢＰ２蛋白質の発現量を制御することを特徴とする請求項１記載の転写因子活性制御方法。
【請求項４】
３ＢＰ２蛋白質の第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、及び第４８６番目のアルギニンの一つ又は複数を他のアミノ酸残基に改変した変異蛋白質を発現させることを特徴とする請求項１記載の転写因子活性制御方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の転写因子活性制御方法に用いられ、３ＢＰ２遺伝子またはその改変遺伝子を発現するよう構築された発現ベクター、あるいは、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡを発現するよう構築された発現ベクターを含む転写因子活性制御剤。
【請求項６】
請求項５記載の転写因子活性制御剤を含む遺伝子治療薬。
【請求項７】
３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えることによって、細胞内のＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性を抑制する方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法に用いられ、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡを発現するよう構築された発現ベクターを含むＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性抑制剤。
【請求項９】
転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１またはＮＦ−κＢの活性を制御する制御剤の候補物質として、３ＢＰ２蛋白質の第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、又は第４８６番目のアルギニンを含む領域に結合する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項９記載のスクリーニング方法によって得られた物質からなる転写因子活性制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アダプター蛋白質３ＢＰ２（ＳＨ３ＢＰ２）の活性化作用を利用した転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性化制御方法、及び同方法に使用する転写因子活性制御剤などに関するものである。本発明は、特に、炎症・免疫関連疾患の治療、抗がん剤や抗ウイルス薬の開発などに有用な技術を提供するものである。
【背景技術】  アダプター蛋白質は、細胞表面の受容体と細胞内のエフェクターとを「接続する」分子であり、自らは酵素活性を持たないが、分子間相互作用に必要なドメインを複数持ち、特定の細胞内シグナルを適切な場所で、適切なタイミングでＯＮ／ＯＦＦする分子スイッチとして機能することが知られている。
アダプター蛋白質３ＢＰ２（以下、単に「３ＢＰ２」ともいう）は、元来、非受容体型チロシンキナーゼｃ−Ａｂｌのプロリンに富む領域に会合する蛋白質としてｃＤＮＡがクローニングされた（Ｒｅｎ，Ｒ．，Ｍａｙｅｒ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，１１５７−１１６１頁）。ヒトでは血液・免疫・骨細胞に発現が認められ、希な骨疾患であるケルビン症や先天性の発達異常の原因遺伝子である可能性が報告されている。
Ｔ細胞では上記３ＢＰ２の過剰発現により転写因子ＮＦ−ＡＴおよびＡＰ−１の活性化が誘導されることが報告されている（Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｍ．，Ｔａｒｔａｒｅ−Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｓ．，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．，Ｒｏｔｔａｐｅｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ，Ａ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．９，５９５−６０５頁）。さらに、上記３ＢＰ２が感作されたマスト細胞の脱顆粒を正に制御する因子であることを、本発明者は文献（Ｓａｄａ，Ｋ．，Ｍｉａｈ，Ｓ．Ｍ．Ｓ．，Ｍａｅｎｏ，Ｋ．，Ｋｙｏ，Ｓ．，Ｑｕ，Ｘ．，ａｎｄ  Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｈ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００，２１３８−２１４４頁）において既に報告した。
【発明の開示】
本発明者は、上記アダプター蛋白質３ＢＰ２に着目し、特に同蛋白質の発現と複数の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性化との関係について詳細な解析を行い、得られた知見をもとにこれら転写因子の新たな活性化制御法を確立したいと考えた。これら転写因子、とりわけＮＦ−κＢは多彩な生理作用と標的遺伝子とを有することから、その活性化制御法は、後述のように遺伝子治療などへの応用も可能であり、アレルギー疾患や慢性炎症性疾患など種々の疾患に対する臨床応用が期待できるものである。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、アダプター蛋白質３ＢＰ２の活性化作用を利用した転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性化制御方法、及び同方法に使用する転写因子活性制御剤などを提供することにある。
本発明者は、上記の課題に鑑み研究解析を進めた結果、（１）３ＢＰ２のＴ細胞での過剰発現が転写因子ＮＦ−ＡＴとＡＰ−１のみならずＮＦ−κＢの活性化を引き起こすこと、（２）３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化にはそれぞれ異なるドメインが関与すること、（３）３ＢＰ２はＴ細胞の活性化過程において転写因子ＡＰ−１とＮＦ−κＢの活性化に必須であること、さらに、（４）３ＢＰ２のノックダウンはＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性を顕著に抑制すること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、医学上・産業上有用な方法および物として、下記Ａ）〜Ｊ）の発明を含むものである。
Ａ）  アダプター蛋白質３ＢＰ２の発現量を制御し、またはその変異蛋白質を発現させることによって、細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に制御する方法。
Ｂ）  Ｔ細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に亢進または抑制することを特徴とする上記Ａ）記載の転写因子活性制御方法。
Ｃ）  ３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させ、又はその発現を抑制することによって、３ＢＰ２蛋白質の発現量を制御することを特徴とする上記Ａ）記載の転写因子活性制御方法。
Ｄ）  ３ＢＰ２蛋白質の第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、及び第４８６番目のアルギニンの一つ又は複数を他のアミノ酸残基に改変した変異蛋白質を発現させることを特徴とする上記Ａ）記載の転写因子活性制御方法。
Ｅ）  上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載の転写因子活性制御方法に用いられ、３ＢＰ２遺伝子またはその改変遺伝子を発現するよう構築された発現ベクター、あるいは、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）を発現するよう構築された発現ベクターを含む転写因子活性制御剤。
Ｆ）  上記Ｅ）記載の転写因子活性制御剤を含む遺伝子治療薬。
Ｇ）  ３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えることによって、細胞内のＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性を抑制する方法。
Ｈ）  上記Ｇ）記載の方法に用いられ、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡを発現するよう構築された発現ベクターを含むＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性抑制剤。
Ｉ）  転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１またはＮＦ−κＢの活性を制御する制御剤の候補物質として、３ＢＰ２蛋白質の第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、又は第４８６番目のアルギニンを含む領域に結合する物質をスクリーニングする方法。
Ｊ）  上記Ｉ）記載のスクリーニング方法によって得られた物質からなる転写因子活性制御剤。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の実施例に使用した野生型３ＢＰ２蛋白質とその各種変異蛋白質の構造を模式的に示す図である。
図２は、３ＢＰ２を過剰発現させることで細胞内の転写因子の活性がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
図３は、種々の３ＢＰ２変異蛋白質を発現させ、３ＢＰ２による転写因子の活性化がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
図４は、図３と同様、種々の３ＢＰ２変異蛋白質を発現させ、３ＢＰ２による転写因子の活性化がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
図５は、本発明の実施例に使用した３ＢＰ２のｓｉＲＮＡの構造を模式的に示す図である。
図６は、上記３ＢＰ２のｓｉＲＮＡを発現させた細胞内の３ＢＰ２蛋白発現量をウエスタンブロット法にて解析した結果を示す図である。
図７は、上記３ＢＰ２のｓｉＲＮＡを細胞に発現させ、Ｔ細胞抗原受容体を介する転写因子活性化プロセスにおける３ＢＰ２の役割について解析した結果を示すグラフである。
図８は、上記３ＢＰ２のｓｉＲＮＡを細胞に発現させ、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性について解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
（１）  本発明の転写因子活性制御方法
本発明の転写因子活性制御方法は、前述のとおり、アダプター蛋白質３ＢＰ２の発現量を制御し、またはその変異蛋白質を発現させることによって、細胞内の転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に制御する方法である。
３ＢＰ２の発現量を制御する方法としては、大別して、目的細胞（標的細胞）に３ＢＰ２遺伝子を過剰発現させる方法と、反対に内因性の３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制（ノックダウン）する方法の２つが挙げられる。そして、後述の実施例に示すように、３ＢＰ２を過剰発現させると、ＮＦ−ＡＴおよびＡＰ−１のみならず、ＮＦ−κＢも活性化され（図２参照）、即ちこれら３つの転写因子とも活性化される一方、ｓｉＲＮＡによって３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制すると、ＮＦ−ＡＴの活性に大きな変化は観察されなかったが、２つの転写因子ＡＰ−１およびＮＦ−κＢについてはその活性低下が観察された（図７参照）。
さらに、３ＢＰ２蛋白質の第１７４番目のチロシン、第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、及び第４８６番目のアルギニンにそれぞれ点変異を導入した変異蛋白質を発現させ、上記３つの転写因子の活性が野生型に比してどのように変化するか調べたところ、詳細は後述するが、（１）第１８３番目のチロシンを置換した変異体では野生型に比してＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢすべての転写因子の活性化が低下し、（２）第４４６番目のチロシンを置換すると転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１の活性化は野生型に比して低下が見られるが、ＮＦ−κＢの活性化にはあまり影響がなく、また、（３）第４８６番目のアルギニンを置換すると転写因子ＮＦ−ＡＴの活性化のみ低下した。この結果から、３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化にはそれぞれ異なるドメインが関与するものと考えられる。
以上の実験結果から、３ＢＰ２の発現量を制御し、またはその変異蛋白質を発現させることによって、少なくとも以下のような方法で上記３つの転写因子の活性を制御することが可能である。
例えば転写因子ＮＦ−κＢを活性化する場合、ＮＦ−κＢのみを活性化したいときは第４４６番目のチロシンを置換した変異蛋白質を発現させ、ＡＰ−１も活性化したいときは第４８６番目のアルギニンを置換した変異蛋白質を発現させ、上記３つの転写因子とも活性化したいときは野生型の３ＢＰ２蛋白質を細胞内発現させるといった具合に、複数のＮＦ−κＢ活性化方法の中から目的に応じて所望の方法を選択できる。同様に、転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１の活性を制御する場合も、他の転写因子の活性化との関係で複数の活性制御方法の中から目的に応じて所望の方法を選択できる。このように、本発明によれば、３ＢＰ２の活性化作用を利用して、転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性を選択的に制御することが可能である（本発明において「選択的に制御する」とは、このように目的に応じて所望の方法を選択して制御することを意味する）。
また、本発明によれば、ｓｉＲＮＡ等によって３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えることで、ＮＦ−ＡＴの活性は大きく変えることなく、ＡＰ−１とＮＦ−κＢの活性を抑制する、といった転写因子の活性制御方法も可能である。
３ＢＰ２またはその変異蛋白質を目的細胞に過剰発現させる方法としては公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。例えば後述の実施例では、３ＢＰ２またはその変異蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列が挿入された発現ベクターを通常の方法にしたがい細胞にトランスフェクションすることで同蛋白質を一過性過剰発現させた。
内因性の３ＢＰ２遺伝子の発現を抑制する方法についても特に限定されるものではなく、ｓｉＲＮＡによる発現抑制法のほかに、ジーンターゲッティング法など公知の遺伝子破壊法を使用してもよい。尚、後述の実施例では、図５に示される構造のｓｉＲＮＡを設計し、実際に発現ベクターを用いて同ｓｉＲＮＡを細胞内発現させることで３ＢＰ２蛋白質の発現を抑制したが（図６参照）、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑制するｓｉＲＮＡとしてはこのｓｉＲＮＡに限定されるものではなく、３ＢＰ２遺伝子配列をもとに公知の方法により３ＢＰ２蛋白発現を抑制し得る他の配列のｓｉＲＮＡを設計することが可能である。また、本発明の方法において、必ずしも３ＢＰ２蛋白質の発現を完全に抑制する必要はなく、細胞内の３ＢＰ２蛋白発現量を実質的に低下させるものであればよい。
上述の、３ＢＰ２またはその変異蛋白質をコードする遺伝子配列が挿入された発現ベクター、および、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡを発現するよう構築された発現ベクターは、本発明の転写因子活性制御方法に使用する転写因子活性制御剤として利用できる。発現ベクターには、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができ、目的細胞内で機能するプロモーター（ｓｉＲＮＡの場合はＲＮＡプロモーター）を発現させる配列の上流に組み入れたものを使用すればよい。
目的細胞（標的細胞）としてはＴ細胞やマスト細胞、あるいは他の免疫系細胞、悪性細胞、ウイルス感染細胞などを例示することができるが、これに限定されるものではなく、上記３つの転写因子の何れかを発現する細胞であればよい。また、細胞はヒト由来のものであってもマウスその他の動物由来のものであってもよい。例えば治療薬開発において本発明を利用する場合は、マウスその他の動物細胞に対しては基礎研究段階および動物実験段階での利用が可能であり、ヒト細胞に対しては基礎研究段階、治験段階、さらに実際の治療段階での利用が可能である。
発現ベクター等を用いて目的細胞内に発現させる３ＢＰ２蛋白質、その変異蛋白質およびこれらの蛋白質をコードするｃＤＮＡ等の遺伝子についても、ヒト由来のものに限らず、マウスその他の動物由来のものであってもよい。図１には、マウス由来の３ＢＰ２蛋白質の模式的構造が示される（最上段の野生型「ＷＴ」）。また、マウス由来の３ＢＰ２蛋白質のアミノ酸配列およびその遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列はＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅｓのアクセッション番号Ｌ１４５４３などに開示されており、ヒト由来の３ＢＰ２蛋白質のアミノ酸配列およびその遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列は同データベースのアクセッション番号ＡＦ０００９３６およびＵ５６３８６などに開示されている。
尚、前述した３ＢＰ２の変異蛋白質について、点変異を導入した位置、すなわち、第１７４番目のチロシン、第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、及び第４８６番目のアルギニンは、マウス由来３ＢＰ２のアミノ酸配列上のものであり、各位置を示す数字はヒト由来３ＢＰ２等では対応する位置の数字に置き換えて解釈するものとする。
上記第１７４番目、第１８３番目、第４４６番目の３つのチロシンがチロシンキナーゼＳｙｋ・Ｌｙｎ・Ｂｔｋのリン酸化部位であることは本発明者が見出したものであり、上記第４８６番目のアルギニンを含むＳＨ２領域が他の分子と会合して高親和性ＩｇＥ受容体を介する脱顆粒経路を正に制御することも本発明者が見出したものである。今回の解析結果は、これらの部位が３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化においてそれぞれ異なる役割を有すること、換言すれば、３ＢＰ２は部位により異なる転写因子活性化機能を持つ分子スイッチであることを明らかにしたものである。
尚、本発明の方法において、目的細胞に３ＢＰ２の変異蛋白質を発現させるときは、少なくとも上記４つの部位の何れか一箇所のアミノ酸が改変された変異蛋白質であればよく、上記４つの部位のうち複数のアミノ酸が改変された変異蛋白質であってもよいし、上記４つの部位の何れかの改変に加えてさらに３ＢＰ２蛋白質の他のアミノ酸が改変された変異蛋白質であってもよい。また、本発明は目的細胞にこのような複数の種類の３ＢＰ２変異蛋白質を共発現させるものであってもよい。
（２）  本発明の利用分野（有用性）
上述した本発明の転写因子活性制御方法、及び同方法に使用する転写因子活性制御剤は、上記３つの転写因子、とりわけＮＦ−κＢが多彩な生理作用と標的遺伝子を有することから、以下に説明するように様々な分野での利用が期待できる。
〔Ａ〕  様々な疾患に対する臨床への応用
ＮＦ−κＢの標的遺伝子として、免疫グロブリンκＬ鎖、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−１、Ｉ１−６、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＤＳウイルス−ＬＴＲ、ＳＶ−４０ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ｐ５３、ｃ−ｍｙｃ、Ｒａｓ、Ｉ−ＣＡＭ，Ｖ−ＣＡＭ，Ｅ−セクレチン等がこれまで報告されており、免疫応答、炎症反応、ウイルス感染、がん化及びがん抑制、生体防御機構での細胞接着、分化誘導、抗アポトーシス等において重要な役割を有することが知られている。また、転写因子ＡＰ−１活性と免疫応答、がん化との関連についても報告されている。
本発明はこれら転写因子ＮＦ−κＢとＡＰ−１の活性化を選択的に制御し得ることから、様々なタイプのＮＦ−κＢ活性化剤およびその阻害剤、ＡＰ−１活性化剤およびその阻害剤として利用することができ、さらに以下の様々な疾患に対する臨床応用が可能である。
まず、炎症性疾患の治療薬（抗炎症薬）・治療法の開発に本発明は有用である。例えば、Ｉ−ＣＡＭ、Ｖ−ＣＡＭ、Ｅ−セクレチン産生制御による白血球走化性の制御を介したアレルギー疾患の治療、アトピー性皮膚炎の改善、炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８の産生制御を介したリウマチ等の慢性炎症性疾患の治療に有用である。
また、本発明は、破骨細胞の活性制御を介した骨粗鬆症・関節症の治療法・治療薬の開発、自己免疫疾患の治療法・治療薬の開発、その既知薬剤による副作用の改善、悪性疾患の治療法・治療薬（抗がん剤）の開発、アポトーシスの制御と分化療法への応用、Ｔ細胞に感染するＨＩＶウイルス等に対する抗ウイルス薬の開発などに利用可能である。
例えば、本発明の転写因子活性制御剤、すなわち、３ＢＰ２遺伝子またはその改変遺伝子を発現する発現ベクター、あるいは、３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えるｓｉＲＮＡを発現する発現ベクターは、上述のように、ＮＦ−κＢ活性化剤またはその阻害剤、ＡＰ−１活性化剤またはその阻害剤として利用することができるが、さらに上記列挙した炎症性疾患、免疫疾患、悪性疾患など各疾患の遺伝子治療法・遺伝子治療薬に利用することも可能である。遺伝子治療法・遺伝子治療薬への具体的適用、目的細胞（標的細胞）への遺伝子治療薬の導入方法等については、公知の方法に従って行えばよい。遺伝子治療に開発されているベクターや、特に発現部位を特定出来るようなプロモーターを持つベクターに３ＢＰ２遺伝子またはその改変遺伝子、あるいは３ＢＰ２のｓｉＲＮＡ発現配列を組み込み、適当な溶媒に溶かして注射薬や点滴薬として、あるいは内用薬として錠剤などに製造することが可能である。静脈注射や点滴などの方法により臨床投与あるいはその研究段階として実験動物へ投与することも可能である。
また、上述した各疾患の治療法・治療薬の開発において、本発明は基礎研究段階、動物実験段階、治験段階、実際の治療段階でそれぞれ利用可能であるが、基礎研究段階で使用する場合は転写因子活性化剤、転写因子阻害剤といった研究用試薬としての利用が可能である。この場合、酵素や緩衝液などと組み合わせてキットとして利用してもよい。
〔Ｂ〕  ＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性抑制方法への利用
後述の実施例に示すように、ｓｉＲＮＡを細胞内に導入して３ＢＰ２蛋白質の発現を抑制すると、サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性が抑制され、特にＩＬ−８のプロモーター活性が強く抑制された（図８参照）。
このように、３ＢＰ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡを導入して３ＢＰ２蛋白質の発現を抑えることによって、細胞内のＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性を抑制することができ、同ｓｉＲＮＡを発現するよう構築された発現ベクターは、ＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性抑制剤として利用することができる。
〔Ｃ〕  創薬ターゲットのスクリーニング方法
前述のように、点変異を導入した種々の３ＢＰ２変異蛋白質を発現させ、３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化がどのように変化するか調べたところ、変異を導入した部位によってこれら転写因子の活性化の変化に違いが見られた。このことは、これらの部位が３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化においてそれぞれ異なる役割を有することを示すものであるが、この知見を薬剤の候補分子（創薬ターゲット）のスクリーニングに利用することが可能である。
具体的には、点変異を生じさせた部位である、３ＢＰ２蛋白質の第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、又は第４８６番目のアルギニンを含む領域に結合する物質（低分子化合物など）をスクリーニングする方法が挙げられる。これら何れかの領域に結合する分子は、３ＢＰ２蛋白質の転写因子活性化作用を調節する転写因子活性制御剤の候補分子であり、例えば、３ＢＰ２蛋白質とチロシンキナーゼまたは他の分子との結合を阻害し、３ＢＰ２蛋白質の特定の転写因子に対する活性化作用を抑制・阻害する物質や、あるいは反対に、３ＢＰ２蛋白質の特定の転写因子に対する活性化作用を亢進する物質等である可能性がある。このような物質は、前述した各疾患の治療薬や診断薬として利用可能であり、そのスクリーニング方法も本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング方法としては、物質間の結合の有無や解離の有無、リン酸化の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば、試験管内反応系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ）において、３ＢＰ２蛋白質の部分ペプチド（第１８３番目のチロシン、第４４６番目のチロシン、又は第４８６番目のアルギニンを含む領域）と、同領域に結合することが知られているキナーゼ等の分子とを発現させ、両分子の結合を阻害する分子あるいはリン酸化を阻害する分子を候補分子の中からＥＬＩＳＡ法等によって検出するスクリーニング方法などが挙げられる。
尚、上記のスクリーニング方法において、３ＢＰ２蛋白質の部分ペプチドを作製する際、野生型のアミノ酸を一部改変したり、Ｈｉｓ等のタグによって標識したり、蛍光蛋白質（ＧＦＰ・ルシフェラーゼ等）または他のタンパク質と融合させたり、リン酸化などの修飾を施してもよい。
勿論、本発明のスクリーニング方法は、上記の方法に限定されるものではなく、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍでのスクリーニングではなく、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行ってもよい。
そのほか、（１）３ＢＰ２蛋白質の部分ペプチドをカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法や、（２）免疫沈降−免疫ブロット法を用いて３ＢＰ２蛋白質の部分ペプチドと同部分に結合することが知られているキナーゼ等の分子との結合を阻害する物質を検索する方法など、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を本発明のスクリーニング方法に適用可能である。
また、本発明のスクリーニング方法においては、ヒト由来の３ＢＰ２蛋白質のほか、マウスその他の動物由来の３ＢＰ２蛋白質を用いてスクリーニングを行ってもよい。
以下図面を参照して、本発明の実施例について説明する。
〔実施例１：３ＢＰ２はＴ細胞の活性化過程において転写因子ＮＦ−κＢの活性化を引き起こす〕
まず、３ＢＰ２遺伝子を細胞内に導入し、過剰発現させることによって転写因子の活性がどのように変化するかを調べた。細胞にはＪｕｒｋａｔ  ＴＡｇ細胞（ヒトのＴリンパ腫由来の癌細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞にＳＶ４０ウイルスのＴ抗原を発現させた細胞）を使用し、ＦｕＧＥＮＥ  ６試薬を用いて同細胞に（１）マウスの野生型３ＢＰ２遺伝子（ｃＤＮＡ）を含むベクター、（２）ＳＨ２領域のみを発現するベクター、あるいは、（３）ベクターに用いたｐＭＴ３  ｖｅｃｔｏｒのみ、を導入し一過性過剰発現を行い、３ＢＰ２による転写因子の活性化作用をルシフェラーゼアッセイにより調べた。図１は、この実験及び後述の実験に用いた野生型３ＢＰ２蛋白質（ＷＴ）とその各種変異蛋白質の構造を模式的に示す。上記（２）の場合は、図中最下段の部分蛋白質（ＳＨ２）が細胞内に発現する。
上記ルシフェラーゼアッセイは、上記（１）〜（３）の何れかのベクターと共に、転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１またはＮＦ−κＢのレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を細胞にトランスフェクションし、２４時間後、細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性をルミノメーターを用いて解析することで、各場合におけるレポーター遺伝子活性を測定した。その結果を図２のグラフに示す。各実験は抗ＣＤ３抗体（αＣＤ３）による刺激下（＋）および無刺激下（−）で行った。図中、「ＷＴ」は、上記（１）の野生型３ＢＰ２遺伝子を含むベクターを導入したときの結果であり、「ＳＨ２」は、上記（２）のＳＨ２領域のみを発現するベクターを導入したときの結果であり、「ｖｅｃｔｏｒ」は、上記（３）のｐＭＴ３  ｖｅｃｔｏｒのみを導入したときの結果である。同グラフでは、各場合のレポーター遺伝子活性が相対的に示されるが、このグラフに示すように、野生型３ＢＰ２を過剰発現させると、転写因子ＮＦ−ＡＴとＡＰ−１に加えて、ＮＦ−κＢの活性化が引き起こされた。
次に、上記と同様の実験で、点変異を導入した種々の３ＢＰ２変異蛋白質を発現させ、３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化がどのように変化するかを調べた。変異蛋白質は、チロシンキナーゼのリン酸化部位である１７４・１８３・４４６番目のチロシン（Ｙ１７４・Ｙ１８３・Ｙ４４６）を３つともフェニルアラニンに置換したもの（３Ｆ）、ＳＨ２の生理機能を点突然変異により消失させた変異体（４８６番目のアルギニンをリジンに置換したもの：Ｒ４８６Ｋ）、上記３つのチロシンを一つずつフェニルアラニンに置換したもの（Ｙ１７４Ｆ、Ｙ１８３Ｆ、Ｙ４４６Ｆ）を使用した（図１参照）。そして、これら変異蛋白質をそれぞれ細胞に発現させ、上記と同様のルシフェラーゼアッセイにより各転写因子の活性測定を行った。その結果を図３および図４に示す。さらに、これらの実験結果をまとめたものを下記表１に示す。
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表１に示すように、１８３番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異体（Ｙ１８３Ｆ）では野生型（ＷＴ）に比してＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢすべての転写因子の活性化が低下していた。即ち、３ＢＰ２のチロシン１８３はすべての転写因子活性化に重要と考えられる。チロシン４４６はＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１については野生型に比して低下が見られるが、ＮＦ−κＢについてはあまり影響がない。即ち、チロシン４４６はＮＦ−κＢの活性化には必要ないものと考えられる。さらに、Ｒ４８６Ｋの解析結果からは３ＢＰ２のＳＨ２領域はＮＦ−ＡＴの活性化にのみ必要であると考えられる。
以上の結果から、３ＢＰ２による転写因子ＮＦ−ＡＴ・ＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化にはそれぞれ異なるドメインが関与すること、３ＢＰ２は部位により異なる転写因子活性化機能を持つ分子スイッチであることが示された。
〔実施例２：ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）の発現によるノックダウン実験〕
まず、ｓｉＲＮＡの設計では、ヒトの３ＢＰ２ｍＲＮＡの開始コドンから１０１１番目の塩基より２１塩基をターゲット配列として選択した。この配列は公知の情報をもとに既知の蛋白質の塩基配列などとの類似性を解析し、本発明者が任意に選択した。このｓｉＲＮＡをベクターを用いて実施例１と同様の方法でＪｕｒｋａｔ  ＴＡｇ細胞に導入し、一過性発現を行った。予想される細胞内でのｓｉＲＮＡの２次構造を図５に示す。理論上はこのような２次構造を持ち、他の細胞内分子との類似性が低い配列であれば、いずれもｓｉＲＮＡとして作用し、３ＢＰ２をノックダウンすることが可能である。
細胞内での３ＢＰ２の蛋白発現量における影響について実際にウエスタンブロット法にて解析した。その結果を図６に示す。実験では、コントロールベクター（ｖｅｃｔｏｒ）と３ＢＰ２のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞を回収し可溶化液に懸濁し、氷冷３０分後に遠心操作を行い、可溶化した上清をＳＤＳサンプリングバッファーと混ぜてサンプルを作製した。次にそのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写後３ＢＰ２・ＪＮＫの抗体（Ａｎｔｉ−３ＢＰ２・Ａｎｔｉ−ＪＮＫ）を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、コントロール蛋白質ＪＮＫが３ＢＰ２のｓｉＲＮＡで影響を受けていないのに対して（下段のパネル）、３ＢＰ２の発現は顕著に低下していた（上段のパネル）。
次に、実施例１と同様の実験で、上記ｓｉＲＮＡをベクターを用いて細胞に発現させ、Ｔ細胞抗原受容体を介する転写因子活性化プロセスにおける３ＢＰ２の役割について解析を行った。その結果を図７のグラフに示す。各実験はαＣＤ３刺激下（αＣＤ３）、ＰＭＡ刺激下（ＰＭＡ）、αＣＤ３およびＰＭＡの刺激下（αＣＤ３＋ＰＭＡ）、または無刺激下（−）で行った。図中、「３ＢＰ２」は、上記ｓｉＲＮＡを細胞に導入したときの結果であり、「ｖｅｃｔｏｒ」は、ベクターのみを導入したときの結果である。同グラフでは、各場合のレポーター遺伝子活性が相対的に示される。
図７のグラフに示すように、無刺激時（−）とＴ細胞活性化時（αＣＤ３＋ＰＭＡ）のＡＰ−１・ＮＦ−κＢの活性化は、３ＢＰ２  ｓｉＲＮＡの発現により抑制されたが、ＮＦ−ＡＴの活性化には影響が見られなかった。このｓｉＲＮＡによるノックダウン実験結果から、３ＢＰ２がＡＰ−１・ＮＦ−κＢ活性化に必須であることが示された。３ＢＰ２は蛋白質発現量の違いによりこれら転写因子の活性化をコントロールしていると考えられることから、３ＢＰ２は閾値を決定する分子としての働きを持っていると考えられる。
さらに、上記と同様の実験で、転写因子により制御されるサイトカインのプロモーター活性について解析を行った。実験では、ＩＬ−２プロモーター領域、ＩＬ−８プロモーター領域それぞれのゲノム配列を発現ベクターに組み込んで、３ＢＰ２のｓｉＲＮＡ、トランスフェクション用の試薬と共にＪｕｒｋａｔ  ＴＡｇ細胞にトランスフェクションを行った。その実験結果を図８に示す。同図に示すように、Ｔ細胞活性化の時（αＣＤ３＋ＰＭＡ）のＩＬ−２およびＩＬ−８のプロモーター活性が、３ＢＰ２  ｓｉＲＮＡの発現により抑制されることが明らかとなった。
ＩＬ−２の標的細胞はＴ細胞やマクロファージであり、臓器移植や白血病治療との関連が知られている。またＩＬ−８は好中球や好塩基球、Ｔ細胞などを標的とし、炎症・リウマチ、悪性腫瘍の転移との関連が知られている。３ＢＰ２のｓｉＲＮＡの効果がＡＰ−１・ＮＦ−κＢのみでありＮＦ−ＡＴへの影響が見られなかったことから、３ＢＰ２の発現制御や機能制御が特定の転写因子のみを標的とした遺伝子治療への適応や、他の転写因子による副作用の少ない遺伝子治療への応用に有効である。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、次に記載する特許請求の範囲内で、様々に変更して実施することができる。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明は、アダプター蛋白質３ＢＰ２の活性化作用を利用した転写因子ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１およびＮＦ−κＢの活性化制御方法、及び同方法に使用する転写因子活性制御剤などに関するものであり、前述したとおり、炎症性疾患、免疫疾患、悪性疾患など様々な疾患に対する治療法・治療薬の開発に利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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