(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤。  
【請求項３】
請求項２に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも１つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造される免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用医薬品。
【請求項５】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも１つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造される免疫機能調整剤の、アレルギー予防および／又は治療用医薬品の製造のための使用。
【請求項６】
請求項２に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および／又は治療用組成物の製造のための使用。
【請求項７】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含むIL-12産生促進剤の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法で製造したIL-12産生促進剤。
【請求項９】
請求項８に記載のIL-12産生促進剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用組成物。
【請求項１０】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも１つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造されるIL-12産生促進剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用医薬品。
【請求項１１】
ラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも１つの乳酸菌をpH 3.5〜pH 4.5の培地で培養する工程を含む方法によって製造されるIL-12産生促進剤の、アレルギー予防および／又は治療用医薬品の製造のための使用。
【請求項１２】
請求項８に記載のIL-12産生促進剤の、アレルギー予防および／又は治療用組成物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の免疫調節活性を高めるための培養方法、および該培養方法を用いた免疫機能調整剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患はここ数十年で急激な増加が認められ、現在、少なくとも人口のおよそ1/5程度が何らかのアレルギー疾患に罹患していると考えられている。現在のアレルギー治療薬の多くは対症療法的なものであり、罹患患者数の増大や長期使用に伴う副作用の点からも、より効果的な治療法が望まれている（非特許文献１）。近年、二重盲検プラセボ試験において乳酸菌の一種であるLactobacillus rhamnosus GG株（Lactobacillus  rhamnosus ATCC 53103株）の投与がハイリスク児におけるアトピー疾患の発症を約半分に抑制することが示されており（非特許文献２）、乳酸菌の使用は副作用を伴わずアレルギーを予防および／または治療するための手軽で有効な方法であると言える。このような乳酸菌の効果は、その1つの理由としてマクロファージや樹状細胞などの自然免疫を担当する細胞に取り込まれた際に、IL-12 (p70) （以降、IL-12ともいう）の産生を誘導することに起因している（非特許文献３）。【０００３】
IL-12(p70)は未分化T細胞をI型のヘルパーT細胞（以降、Th1細胞ともいう）に分化するのを促進し、Th1/Th2バランスをTh1側にシフトさせる（非特許文献３）。II型のヘルパーT細胞（以降、Th2細胞ともいう）側に偏ったTh1/Th2バランスはアレルギー発症の原因と一つとなる抗原特異的なIgEの産生を誘導するため、自然免疫担当細胞からIL-12の産生を誘導しTh1/Th2バランスを改善する活性は菌株のアレルギー改善効果を評価する上で重要な指標の1つとなる。このような乳酸菌の免疫調節活性は同属同種の菌でも株により大きく異なっており、高い免疫調節活性を有するプロバイオティクス菌株のスクリーニングやその応用研究が精力的に行われている（非特許文献４）。このような研究の結果、これまでに各種の乳酸菌を用いたアレルギー予防および／または治療剤が提案されている。しかしながら、例えば特許文献１に開示された乳酸菌（Lactobacillus paracasei ＫＷ3110株）については、18種100株以上の乳酸菌の中からIL-12産生促進効果およびTh1/Th2バランス改善効果が高い菌株をスクリーニングしているが、その菌体の培養条件が免疫調節活性に与える影響は全く検討されていない。【０００４】
乳酸菌の菌株により作用やその活性の程度が異なること、またその有効成分を検討した報告は多々あるが、菌の培養条件によって免疫調節活性が異なるという報告例はわずか2報である。Hallerらは、ヒト末梢血単球からのTNF-αの産生誘導効果は、対数増殖期より定常期の菌体の方が高いことを報告している（非特許文献５）。一方、in vivoにおいてもLactobacillus属乳酸菌の培養期によりTh1/Th2バランスの誘導する活性が異なることが報告されている。Massenらは、乳酸菌の免疫調節活性を検討するために、対数増殖期と定常期にある菌体をマウスに経口投与し、Th1/Th2バランスを血中のIgG2a/IgG1比を測定することで検討した。その結果、定常期の菌体は対数増殖期にある菌体よりもTh2反応を誘導したことを報告している(非特許文献６)。しかし、これらの報告は菌体の培養期により免疫調整活性が異なるという現象を示したのみで、培養時間のみが重要なのか、その他の環境要因が影響しているのかは全く検討されていない。菌体の培養条件が免疫調節活性に及ぼす影響を検討する事は、より免疫調節活性の高い菌体を製造するための工業生産を行う際の製造プロセスの決定に重要であると言えるが、現在までにこのような検討はされていない。このように既存の乳酸菌を用いて、目的とするアレルギー予防および／または治療剤、またはアレルギー予防および／または治療用食品組成物を調製する方法には未だ改良の余地が多く残されているのが現状である。【０００５】
【特許文献１】特許第3585487号公報
【非特許文献１】赤星光輝, 玉利真由美, 白川太郎、「アレルギー疾患における最近 の話題」、最新医学、58(2)、pp.7-14(2003)
【非特許文献２】Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Kero P, Koskinen P,  Isolauri E, “Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial.”, Lancet, 357(9262), pp.1076-1079 (2001)
【非特許文献３】Cross ML, Gill HS, “Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies?”, International Archives of Allergy and Immunology, 125, pp.112-119 (2001)
【非特許文献４】Lee J, Ametani A, Enomoto A, Sato Y, Motoshima H, Ike F, Kaminogawa S, “Screening for the immunopotentiating activity of food microorganisms and enhancement of the immune response by Bifidobacterium adolescentis M101-4.”, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 57(12), pp.2127-2132（1993）
【非特許文献５】Haller D, Bode C, Hammes P, “Cytokine secretion by stimulated monocytes depends on the growth phase and heat treatment of bacteria: a comparative study between lactic acid bacteria and invasive pathogens.”, Microbiology and Immunology, 43(10), pp.925-935 (1999)
【非特許文献６】Maassen CB, Boersma WJA, van Holten-Neelen C, Claassen E, Laman JD, “Growth phase of orally administered Lactobacillus strains differentially affects IgG1/IgG2a ratio for soluble antigens: implications for vaccine development.”, Vaccine、21(21-22), pp.2751-2757 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
すなわち、本発明の課題は、乳酸菌の免疫調整機能を高める培養方法および該培養方法を用いた免疫調整機能剤の製造方法を見出す事である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するためになされたものである。本発明者らは、すでに国際出願WO2006/093022にて、Lactobacillus gasseri属乳酸菌であるLactobacillus gasseri OLL2809（以降、L. gasseri OLL2809ともいう）株がアレルギーの予防や治療を始めとする免疫機能調整活性を有する事を報告しているが、さらに、乳酸菌の培養条件がマウス脾細胞からのIL-12 (p70)産生誘導活性に及ぼす影響を鋭意検討した。その結果、前記乳酸菌の免疫機能調整活性に関係する因子として、特に培養液のpHが大きく関与することを見出した。また、Lactobacillus gasseriのみならず、Lactobacillus amylovorus（以降、L. amylovorusともいう）およびLactobacillus crispatus（以降、L. crispatusともいう）など他の乳酸菌についても培養液のpHが免疫機能調整効果に関係する事も見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は、
[１]  乳酸菌をpH 3.5〜pH 5.0の培地で培養する工程を含む、乳酸菌を含む免疫機能調整剤の製造方法、
[２]前記乳酸菌がIL-12産生促進効果を有する乳酸菌である、[１]に記載の免疫機能調整剤の製造方法。 [３]  前記乳酸菌がラクトバチルス属である、前記[１]〜[２]のいずれか１つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、
[４]  前記乳酸菌がラクトバチルス・ガセリＯＬＬ２８０９菌株（Lactobacillus gasseri OLL2809、受託番号NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126Tおよ{びLactobacillus crispatus JCM 1185Tから選ばれる乳酸菌のうち少なくとも１つである、前記[１]〜[３]のいずれか１つに記載の免疫機能調整剤の製造方法、
[５]  前記[１]〜[４]のいずれか１つに記載の製造方法で製造した免疫機能調整剤、
[６]  前記[５]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用飲食品、
[７]  前記[５]に記載の免疫機能調整剤を含有するアレルギー予防および／又は治療用医薬品、
[８]  前記[５]に記載の免疫機能調整剤の、アレルギー予防および／又は治療用医薬品もしくはアレルギー予防および／又は治療用飲食品の製造のための使用、
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
後述する実施例において示されるとおり、本発明に含まれる乳酸菌の培養方法により、乳酸菌の免疫調節活性を高める事が可能となった。また、該方法で培養した乳酸菌を利用した、高い活性を有する免疫機能調整剤の製造を実現した。これによって、アレルギー予防および／または治療などに有効な、免疫調節活性の高い飲食品や医薬品を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】培養時間によるL. gasseri OLL2809の生育およびIL-12産生促進効果の経時変化を示すグラフである。黒丸（●）はOD660、棒はマウス脾細胞の培養液上清のIL-12 (p70) (pg/mL)を示す。IL-12のデータは平均値±標準偏差（n=3）で示す。NT：not tested。
【図２】培地および培地成分がL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果に及ぼす影響を示すグラフである。MRS、GAMまたはGAM培地にグルコースを添加した培地でのL. gasseri OLL2809の生育（A）、培養18時間後の菌体のIL-12産生促進効果(B)およびIL-12産生促進効果（IL-12 (p70) (pg/mL)）の平均値と培養18時間後のpHの相関図（C）を示す。 (A)において、黒丸（●）：MRS培地、黒三角（▲）：GAM培地、黒四角（■）：GAM培地 + グルコース (終濃度（培養前の培地における最終調整濃度）5g/L)、白丸（○）：GAM培地 + グルコース(終濃度10g/L)、白三角（△）：GAM培地 +グルコース(終濃度20g/L)。(B)において、横軸の数字は培地中のグルコース濃度（終濃度、g/L)を示す。 また(B)については、平均値±標準偏差（n=3）を示す。＊：p < 0.05（Studentの反復測定t検定）、＃：p < 0.05（Dunnet検定）。
【図３】pHを制御したL. gasseri OLL2809の培養（A：生菌数(log cfu/mL)、B：pH）およびIL-12産生促進効果(C)の経時変化を示すグラフである。(A)および(B)において、黒丸（●）: 設定pH 4、黒三角（▲）: 設定pH 5、黒四角（■）: 設定pH 6を示す。
【図４】MRS培地へのCaCO3の添加がL. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185TのIL-12産生促進効果に及ぼす影響を示すグラフである。平均値±標準偏差（n=3）を示す。＊：p < 0.05（Studentの反復測定t検定）。
【図５】異なるpHの緩衝液中でインキュベートしたL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果の変化を示すグラフである。「加熱」は加熱処理サンプル、「非加熱」は非加熱サンプルを示す。ControlはMRS培地で18時間、静置培養し、75℃で60分間加熱処理したL. gasseri OLL2809の凍結乾燥菌末を示す。平均値±標準偏差（n=3）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。【００１２】
本発明は、乳酸菌を有効成分として含有する免疫機能調整剤の製造方法に関するものである。本発明の製造方法には、乳酸菌のもつ免疫機能調整活性を効率よく得るための乳酸菌の培養方法が含まれる。本発明者らは、各種乳酸菌（L. gasseri、L. amylovorusおよびL. crispatus）について、各種培養条件における免疫機能調整活性をマウス由来脾臓細胞からのIL-12産生促進効果を指標に検討した。その結果、前記乳酸菌の免疫機能調整活性に関係する因子として、特に培養液のpHが大きく関与することを見出した。したがって、本発明の製造方法を使用することで食物アレルギーを含めた各種のアレルギーの予防および／または治療に有効な、新たなアレルギー予防および／または治療剤、またはこれを含有するアレルギー予防および／または治療用食品組成物を提供することが可能になった。【００１３】
乳酸菌とはブドウ糖を資化して対糖収率で50%以上の乳酸を生産する菌の総称で、生理学的性質としてグラム陽性菌の球菌または桿菌で、運動性なし、胞子形成能なし、カタラーゼ陰性などの特徴を有している。乳酸菌は植物の表皮、哺乳動物の腸管、海洋、土壌、発酵食品など様々な環境から分離され、漬け物や醤油などの発酵食品においては味やテクスチャーの形成に寄与するのみならず、乳酸やバクテリオシン等の抗菌性物質産生能を有していることから、古来より発酵乳等を介して世界各地で食されてきた。また、哺乳動物の腸管では宿主に種々の生理的影響を与えていることも周知の事実であり、極めて安全性の高い微生物と言える。乳酸菌は現在までに、Lactococcus属、Lactobacillus属、Leuconostoc属、 Pediococcus属、Streptococcus 属、Wissella属、Tetragenococcus属、Oenococcus属、Enterococcus属、Vagococcus属、Carnobacterium属の11属に分類されている。本発明の免疫機能調整剤の製造方法には、これらの乳酸菌を用いる事ができる。好適な例としてLactobacillus gasseri OLL2809株（受託番号：NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tを挙げることができるが、これらの例に限定されない。【００１４】
本発明の製造方法においては、前記乳酸菌を、培地に摂取し、一定範囲のpHにて培養を行う。培養方法としては、バッチ培養、回分培養、流加培養、連続培養、嫌気培養、通気培養、振とう培養、静置培養、攪拌培養、試験管培養、タンク培養、フラスコ培養、ファーメンター培養、ジャーファーメンター培養などいずれの方法でも培養することもできる。【００１５】
本発明の製造方法に用いる乳酸菌培養用の培地としては、乳酸菌の培地に通常用いられる培地が使用される。すなわち主炭素源のほか窒素源、無機物その他の栄養素を程良く含有する培地ならばいずれの培地も使用可能である。炭素源としてはラクトース、グルコース、スクロース、フラクトース、澱粉加水分解物、廃糖蜜などが使用菌の資化性に応じて使用できる。窒素源としてはカゼインの加水分解物、ホエイタンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物等の有機窒素含有物が使用できる。ほかに増殖促進剤として肉エキス、魚肉エキス、酵母エキス等が用いられる。市販の培地としては、例えばLactobacilli MRS Broth（ベクトンディッキンソン）、GAM培地（日水製薬）等、あるいはさらに上述の成分を添加したものを培地として用いる事もできるが、これらの例に限定されない。【００１６】
乳酸菌の培養は嫌気条件下で行うことが望ましいが、通常用いられる液体静置培養などによる微好気条件下でもよい。嫌気培養には炭素ガス又は不活性ガス（窒素など）の通気下で培養する方法などの公知の手法を単独あるいは複数を組み合わせて適用することができるが、他の方法でもかまわない。培養温度は一般に20〜40℃が好ましいが、菌が生育する温度であれば他の温度条件でもよい。培養時間は通常10〜24時間が好ましいが、菌が生育することができる時間であれば、他の培養時間であってもよい。【００１７】
菌体増殖の最適pHは菌株によっても異なるが、多くの乳酸菌では大まかには5.5〜7.0の範囲（James JA, Lee BH, “Cultural conditions for production of glucoamylase from Lactobacillus amylovorus ATCC 33621.”, J Appl Bacteriol、79(5), pp. 499-505(1995)、Pettersson, H-E., “Studies on batch production of bacterial concentrates from mixed species lactic starters.” Applied Microbiology. 1975. 29(2): 133-140.）であり、通常、工業生産においては最大の菌体量を得るために最適pHで中和培養する方法が行われている。しかしながら、効率よくIL-12産生促進効果の高い菌体を工業的に培養するための培養条件は、菌体量を効率よく得るための培養条件と異なっている事が考えられ、検討する必要があった。【００１８】
本発明の製造方法において、乳酸菌培養中の培地のpHは3.5〜5.5、好ましくは3.5〜5.0、さらに好ましくは4.5以下、例えば、3.5〜4.5、3.5〜4.4、3.8〜4.4、4.0〜4.5、3.5〜4.0等に維持することが好ましいが、
乳酸菌の免疫機能調整活性を高められるのであれば他のpH条件でもよい。また、培養前あるいは培養中に通常用いられる酸、塩基、緩衝剤、炭酸ガスなどの添加剤を適宜培地に添加して、培地のpHを調整してもかまわない。また本発明の製造方法におけるpH調整は、乳酸菌が自ら産生する酸を利用することもでき、乳酸菌の酸産生を調整するためにグルコースなどの栄養成分を培地に強化してもよい。【００１９】
本発明の製造方法におけるpH調整は、培養工程を通じて一定となるよう調整してもよく、または培養工程の途中でpHを変更してもよい。例えば、乳酸菌の菌体量の増加に適切なpHで培養し、菌体量が増加した後に、乳酸菌の免疫機能調整活性を高めるのに適切なpHに変更して培養してもよい。工業的培養として中和培養を行う場合、一般的には、例えば、pH5.5〜7程度に調整することが多い。本発明の製造方法は、乳酸菌をこのようなpHで培養した後、本発明の乳酸菌の免疫機能調整活性を高めるのに適切なpHとなるよう、pHを変更して培養をすることができる。【００２０】
さらに上記の培養方法で培養した乳酸菌をそのままもしくは洗浄、濃縮、破砕、乾燥、発酵または加熱等の処理を加えて、本発明の免疫機能調整剤を完成させる。【００２１】
本発明の免疫機能調整剤は、上記培養方法で得た乳酸菌を種々の状態で含むことができ、例えば乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物（菌体、培養上清液（培地成分を含む））、乳酸菌発酵物（乳酸菌飲料、酸乳、ヨーグルト等）、乳酸菌処理物、等として使用することができる。【００２２】
本発明の免疫機能調整剤としては培養終了後の乳酸菌培養液をそのまま、あるいは濃縮して濃縮物とするほか、濃縮物をさらに乾燥して使用できる。この菌体濃度は特に限定されないが、濃縮液で4×1010個／g以上、乾燥物で5×1011個／g以上とするのが好ましい。【００２３】
本発明の免疫機能調整剤は、上記培養方法で得た上記乳酸菌をそのまま含んでもよく、または乳酸菌に何らかの処理を施した乳酸菌処理物として含んでもよい。本発明に用いられる乳酸菌処理物としては、例えば乳酸菌、乳酸菌含有物、発酵乳の濃縮物、ペースト化物、乾燥物（噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物から選ばれる少なくともひとつ）、液状物、希釈物、破砕物等が挙げられる。また、乳酸菌としては生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体等が適宜使用可能である。殺菌すなわち加熱殺菌処理、放射線殺菌処理、または破砕処理等を施した死菌体であってもよい。粉ミルクなど生物学的規格を有する医薬品および／または飲食品においても添加することも可能であり、医薬品および／または飲食品の形態などによらず様々な医薬品および／または飲食品に応用できる。【００２４】
L. gasseri OLL2809は健常人の糞便から単離された273株のLactobacillus属乳酸菌から、in vitroにおいてマウス脾細胞からIL-12産生を強く誘導し、Th1/Th2バランスを改善することを特徴としてスクリーニングされた株である。また、本菌株をアレルギーモデルマウスに経口投与すると、脾細胞のIL-12産生を誘導し、脾細胞および腸間膜リンパ節細胞のIL-4産生を抑制し、Th1/Th2バランスを改善することで、血清中の抗原特異的IgEを抑制する（Sashihara T, Sueki N, Ikegami S, “An analysis of the effectiveness of heat-killed lactic acid bacteria in alleviating allergic diseases.”, Journal of Dairy Science, 89, pp.2846-2855 (2006)、および国際出願WO2006/093022）。このようなことから、IL-12産生を強く誘導する菌株はアレルギー改善効果が高い菌株であると言える。【００２５】
本発明者らは、Lactobacillus gasseri OLL2809株を独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
（２）連絡先：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8
電話番号0438-20-5580
（３）受託番号：NITE BP-72
（４）識別のための表示：Lactobacillus gasseri OLL2809
（５）寄託日：平成17年（2005年）2月1日
（６）ブタペスト条約に基づく寄託への移管日：2006年1月18日【００２６】
Lactobacillus gasseri OLL2809株（受託番号：NITE BP-72）は、グラム陽性桿菌であり、Lactobacilli MRS Agar, Difco上でのコロニー形態は円形、淡黄色、扁平状である。生理学的特徴としては、ホモ乳酸発酵形式、45℃での発育性、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース、シュクロース、セロビオース、ラクトース、トレハロースに対する発酵性を有する。菌体増殖においては培養中の培地のpHは6.0〜7.0に維持することが好ましい。【００２７】
本発明の製造方法は、後述の実施例でIL-12産生促進効果の上昇が認められた、Lactobacillus gasseri OLL2809（受託番号：NITE BP-72）、Lactobacillus amylovorus JCM 1126TおよびLactobacillus crispatus JCM 1185Tのみならず、前述の他の乳酸菌についても適用が可能であり、従来の製造方法に比べて高い免疫機能調整活性を有する乳酸菌を得る事が可能である。【００２８】
IL-12は未分化T細胞をTh1細胞に分化するのを促進し、Th1/Th2バランスをTh1側にシフトさせる（Cross ML, Gill HS, “Can immunoregulatory lactic acid bacteria be used as dietary supplements to limit allergies? ”, International Archives of Allergy and Immunology, 125, pp.112-119 (2001)）。Th2側に偏ったTh1/Th2バランスはアレルギー発症の原因と一つとなる抗原特異的なIgEの産生を誘導するため、自然免疫担当細胞からIL-12の産生を誘導しTh1/Th2バランスを改善する活性は菌株のアレルギー改善効果を評価する上で重要な指標の1つとなる。本発明において、免疫機能調整活性はIL-12産生促進効果を含む。【００２９】
本発明の免疫機能調整剤は、単独、または医薬品や食品に通常使用されうる他の成分と混合して投与し、あるいは他の抗アレルギー活性を有する化合物や微生物等と併用することにより、ヒトおよび動物におけるアレルギー予防、およびアレルギー症状の軽減（治療）に有効である。アレルギー予防および／または治療に使用できる。アトピー性皮膚炎やアレルギー性鼻炎などのアレルギー疾患は、Th1/Th2バランスがTh2側に偏っていることが原因の１つであることが明らかになっている（Hopkin JM, “The rise of atopy and links to infection.”, Allergy, 57 Suppl 72, pp.5-9(2002)、およびPrescott SL, Macaubas C, Smallacombe T, Holt BJ, Sly PD, Holt PG, “Development of allergen-specific T-cell memory in atopic and normal children.”, Lancet, 353(9148), pp.196-200(1999)、およびShirakawa T, Enomoto T, Shimazu S, Hopkin JM, “The inverse association between tuberculin responses and atopic disorder.”, Science, 275(5296), pp.77-79(1997)）。本発明の製造方法に含まれる培養方法は乳酸菌のIL-12の産生能をさらに高める効果がある。IL-12は、樹状細胞から産生され、Th1細胞への分化をする働きを有するため、このようにして得られた乳酸菌は高い免疫機能調整効果を持つ事が期待でき、免疫機能調整剤として使用することが可能である。アレルギーの種類は特に限定されないが、例えば花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、アナフィラキシー反応、薬物アレルギー、じんましん、血清病、溶血性貧血、接触性皮膚炎、重症筋無力症、グッドパスチェア症候群、糸球体腎炎等を挙げることができる。アレルゲンも特に限定されないが、例えば食品（小麦、大麦、オーツ麦、ライ麦、そば、卵、乳、チーズ、落花生、米、トウモロコシ、アワ、キビ、ヒエ、大豆、じゃがいも、やまいも、にんにく、たまねぎ、ニンジン、パセリ、セロリ、トマト、オレンジ、もも、りんご、キウイフルーツ、メロン、イチゴ、バナナ、くるみ、ゴマ、まつたけ、あわび、いか、いくら、えび、かに、さけ、さば、アジ、イワシ、タラ、イカ、タコ、ホタテ、牛肉、鶏肉、豚肉、ゼラチン等）、動物（イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハト等やその皮膚、体毛、糞、羽毛等）、昆虫（蛾、ユスリカ、スズメバチなど、およびこれら昆虫の分泌物、鱗粉）、ダニ、寄生虫（アニサキス、回虫など）、草木（スギ、ヒノキ、ブタクサ、イネ科植物、ヨモギ、ウルシ、ハンノキ等やその花粉、樹液等）、かび、ほこり、ハウスダスト、ゴム、金属、化学物質、医薬品、等を挙げることができる。【００３０】
本発明の免疫機能調整剤の医薬品または飲食品への配合量は形態、剤型、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、0.001〜100%(w/w)の含量で配合することができ、好ましくは0.01〜100%(w/w)、さらに好ましくは0.1〜100%(w/w)の含量で配合することができる。【００３１】
本発明の免疫機能調整剤の医薬品または飲食品の一日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、0.1〜10000mg/kg体重を摂取することができ、好ましくは0.1〜1000mg/kg体重、さらに好ましくは0.1〜300mg/kg体重を摂取することができる。【００３２】
本発明の免疫機能調整剤は、医薬品または飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、または特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として直接摂取することにより各種のアレルギーの予防および／または治療をすることが期待される。また、液状、ペースト状、固形、粉末等の形態を問わず、各種食品（牛乳、加工乳、乳飲料、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、アイスクリーム、キャンディ、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品等）に添加し、これを摂取してもよい。
本発明の免疫機能調整剤を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を混合して使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物；バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。本発明の免疫機能調整剤を含有する飲食品の製造において、これらは合成品であっても天然物由来品のいずれでもよく、またはこれらを多く含む食品を原材料として用いてもよい。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。【００３３】
本発明の免疫機能調整剤を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、液剤等による経口投与を挙げることができるが、経管など他の形態であってもよい。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、適当量のカルシウムを含んでいてもよい。さらに適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、アミノ酸、ペプチド類など他の成分を添加してもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。【００３５】
[実施例1]（培養時間がIL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）
L. gasseri OLL2809の培養時間がIL-12産生促進効果に与える影響を以下の試験により検討した。【００３６】
（乳酸菌の培養および凍結乾燥菌末の調製）
L. gasseri OLL2809はLactobacilli MRS Broth（以降MRS培地ともいう、ベクトンディッキンソン）で2回、賦活培養（37℃、18時間）した。MRS培地に賦活化した菌体を1%接種し、37℃で静置培養した。培養開始から一定時間毎（0、3、6、9、12、18、24、30時間後）に培養液をサンプリングした。各時間の培養液のOD660を測定して乳酸菌数の指標とした。また、各時間（0、3、9時間後を除く）の培養液を、遠心分離により集菌後、生理食塩水で2回、滅菌蒸留水で1回洗浄した。培養および集菌・洗菌後、各菌を75℃で60分間加熱して滅菌し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌末（以降、乳酸菌凍結乾燥粉末ともいう）は以下のin vitroでのIL-12産生促進効果試験に用いた。【００３７】
（IL-12産生促進効果試験）
6から10週齢の雄性、BALB/cマウス（各実験でn = 3、 日本エスエルシー）を屠殺し、脾臓を摘出した。赤血球を除去した脾細胞を、10% (vol/vol)ウシ胎児血清 (インタージェン)、100U/mL ペニシリンG (インビトロジェン)、100μg/mL ストレプトマイシン（インビトロジェン）、 2mM L-グルタミン酸（インビトロジェン）、 1mM ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン）、 0.1mM 非必須アミノ酸混合液（インビトロジェン）、 0.05mM 2-メルカプトエタノール (ナカライテスク)を添加したRPMI1640培地（インビトロジェン）に2.5×106/mLとなるように懸濁し、1μg/mLの乳酸菌凍結乾燥粉末の存在下で、5%濃度のCO2インキュベーターで2日間培養した。培養液上清のIL-12 （p70）（pg/mL）をELISA法（BD OptEIATM ELISA set、ベクトンディッキンソン）により測定し、IL-12産生促進効果の評価に用いた。【００３８】
（結果）
結果を図1に示す。L. gasseri OLL2809の生育は6から12時間後まで対数増殖し、12時間後以降30時間までOD660に変化が見られずに定常状態であった。IL-12産生促進効果は18時間後まで培養時間に従って増加し、18時間後に最高となったが24時間、30時間と培養時間を長くしても低下しなかった。この結果から、L. gasseri OLL2809をMRS培地で静置培養した場合、IL-12産生促進効果は培養時間によって異なること、即ち生育に従って増加し定常期において活性が維持される事が明らかになった。【００３９】
[実施例2]（培地の種類・成分がIL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）
IL-12産生促進効果が培養する培地によって異なるかを調べるために、以下の試験のように種々の培地または培地に栄養成分を添加した培地で培養したL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果を比較した。【００４０】
（乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製およびIL-12産生促進効果試験）
MRS培地で2回、賦活培養（37℃、18時間）したL. gasseri OLL2809をMRS培地またはGAM培地（日水製薬）に1%接種し、37℃で18時間、静置培養した。培養開始から一定時間毎（0、3、6、9、12、18時間後）に培養液をサンプリングし、各時間の培養液のOD660を測定して乳酸菌数の指標とした。また、培養18時間後の培養液について、pHを測定すると共に、実施例1と同様の方法で乳酸菌凍結乾燥粉末を調製し、マウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。【００４１】
（結果）
結果を図2に示す。GAM培地で培養した菌体（図2B中のGAM）はMRS培地で培養した菌体（図2B中のMRS）と比較して有意に（p < 0.05）低い活性を示した。そこで、これらの培地成分の違いについて種々の検討を行ったところ（データは示さず）、GAM培地のグルコース濃度が低いためであることが明らかになった（MRS培地は終濃度20g/L、GAM培地は終濃度3g/Lのグルコースを含む）。【００４２】
そこで、GAM培地にグルコースを各種濃度（終濃度5、10、20g/L）で添加した培地でL. gasseri OLL2809の培養を行い、得られた菌体について実施例1と同様の方法で処理（集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥）を行い、マウス脾細胞からのIL-12産生促進効果試験を行った。結果を図2B中のGAM＋glucoseに示す。GAM培地にグルコースを添加すると、グルコースの終濃度依存的に生育およびIL-12産生促進効果が増加し（図2A）、グルコースの終濃度が20g/LのGAM培地で培養した菌体は、通常のGAM培地（図2B中のGAM）で培養した菌体と比較して活性は有意に（p < 0.05）増加した。
グルコースの添加がL. gasseri OLL2809の活性にどのように影響するか検討したところ、培養液のpHが活性に影響を及ぼしていることが考えられた。即ち、GAM培地ではグルコースの終濃度が低いためにMRS培地と比較して生育が悪く、また、L. gasseri OLL2809由来の乳酸の生成量が低いために18時間後の培養液pHはMRS培地で4.0であるのに対し、GAM培地では5.5であった。GAM培地にグルコースを添加し、終濃度が3(無添加)、 5、10および20g/Lのグルコース濃度の培地では、菌の生育および乳酸生成量の増加に伴い培養液の培養18時間後のpHはそれぞれ5.5、4.8、4.4および4.3と低下した。そこで、GAM培地でL. gasseri OLL2809を18時間培養した時の培養液pHと菌体のIL-12 産生促進効果の相関を解析したところ、このpH範囲において両者の間に有意な（p < 0.05）負の相関が認められた（図2C、y = -987.01x + 5696.7, n = 4）。一方、グルコースの終濃度と菌体のIL-12 産生促進効果については、このような相関関係は認められなかった。以上から、培養液のpHが菌体のIL-12 産生促進効果に影響を与える事が示唆された。【００４３】
[実施例3]（培養液のpHがIL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）
培養液のpHがL. gasseri OLL2809の活性に及ぼす影響をより詳細に検討するために、中和培養により培養したL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果の経時変化を以下の試験により評価した。【００４４】
（乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製およびIL-12産生促進効果試験）
2 Lのジャーファーメンターを用いて、張り込み培地量 1.5L、撹拌速度 200rpm/min、窒素ガスによる上面通気、培養温度 37℃の条件で、MRS培地（初発pHは約6.4）でL. gasseri OLL2809を培養した。pHはpHコントローラーを用いて4、5または6に設定し、設定値以下に低下しないように10% (wt/wt)の炭酸カリウム溶液を用いて中和培養した。培養開始から6、12、18時間後のL. gasseri OLL2809培養液を実施例1と同様に処理（集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥）して凍結乾燥菌末を得、これについて実施例1と同様の方法でIL-12産生促進効果を検討した。また、培養開始から3、6、9、12、15、18時間後の培養液については生菌数とpHを測定した。【００４５】
（結果）
結果を図3に示す。生菌数は培養液の設定pHによらずほぼ同じ傾向で推移し、培養開始から12時間後以降はいずれの設定pHにおいても定常期に達した。最終的に設定pHが6のものは設定pHが5または4のものに比べて約半分であった（図3A）。一方、培養液のpHは培養開始から6時間後ではpH4と5に設定した培養液で差はなかったが、12時間以降でどの培養液もほぼ設定pHに近づいた（図3B）。
IL-12産生促進効果は培養開始から6時間後では培養液の設定pHにより差は認められず、いずれも低い値を示したが、12時間以降では酸性側の設定pHのものほど高い値を示した（図3C）。一方、設定pH 6で培養した時では培養期に関わらずIL-12産生促進効果はどの時間でも低いままであった。以上のことから、培養液のpHによってL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果が異なることが明らかになった。このことから、IL-12産生促進効果は培養液のpHが重要であることが明かになった。【００４６】
[実施例4]（培養液のpHが他の乳酸菌のIL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）
培養液のpHがL. gasseri OLL2809以外の他の乳酸菌のIL-12産生促進効果にも影響を及ぼすかを以下の試験により検討した。【００４７】
（乳酸菌の培養、凍結乾燥菌末の調製およびIL-12産生促進効果試験）
賦活培養（37℃、18時間）したL. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185Tを、MRS培地（CaCO3 0%）またはpH緩衝剤として0.6%のCaCO3を添加したMRS培地（CaCO3 0.6%）に、1%接種し、37℃で18時間、培養した。培養液を実施例1と同様の方法で処理（集菌、洗浄、滅菌、凍結乾燥）した後に、マウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。本培養では、CaCO3の沈殿を防ぐ為に、磁気回転子で70rpm/minの回転速度で撹拌しながら培養した。
なお、これらの菌株名にJCMと記載された菌株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターの微生物材料開発室から入手した基準株である。【００４８】
（結果）
結果を図4に示す。MRS培地のみの場合と比べて、CaCO3を0.6%の濃度で添加したMRS培地では、L. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185Tの培養18時間後の培養液pHはそれぞれ3.8（CaCO3 0%）から4.5 （CaCO3 0.6%）へ、3.9（CaCO3 0%）から4.5（CaCO3 0.6%）へと中性側に緩衝され、生菌数はそれぞれ1.3×109 cfu/mL（CaCO3 0%）から2.3 ×109 cfu/mL（CaCO3 0.6%）、7.3×107 cfu/mL（CaCO3 0%）から1.6×108cfu/mL （CaCO3 0.6%）へと増加した。しかし、L. amylovorus JCM 1126TおよびL. crispatus JCM 1185TともにIL-12産生促進効果はいずれもCaCO3添加によって有意に（p < 0.05）低下した。この結果から、IL-12産生促進効果に培養液のpHが影響を及ぼす現象は、L. gasseri OLL2809のみでなく他の乳酸菌にも共通であることが明らかになった。【００４９】
[実施例5]（培養液pHがIL-12産生促進効果に与える影響の検討試験）
培養液のpHによりL. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果が異なる原因を解明するために、MRS培地で18時間、静置培養する事でIL-12産生促進効果の高い菌体を調製し、さらにこれを加熱処理または非加熱後にpHの異なる緩衝液中に37℃で6時間放置し、その後のIL-12産生促進効果を比較した。【００５０】
（乳酸菌の培養、サンプルの調製およびIL-12産生促進効果試験）
MRS培地で37℃18時間培養したL. gasseri OLL2809を、実施例１と同様の方法で集菌、洗浄し、次いで加熱せずに凍結乾燥した。非加熱の凍結乾燥菌末を4mg/mLとなるように蒸留水に懸濁し、この菌体懸濁液を4mMのMgCl2を含む20mMのクエン酸緩衝液（pH 4、5、6）で1：1に希釈して菌体懸濁液（2mg/mL）を調製した。各菌体懸濁液について、半量を75℃で60分間で加熱処理し（加熱処理サンプル：heated）、残り半量は非加熱のまま（非加熱サンプル：unheated）とした。その後、各サンプルを37℃で6時間、室温にて放置した。Controlとしては、MRS培地中に37℃で18時間培養したL. gasseri OLL2809を、実施例１と同様の方法で集菌、洗浄、滅菌した後に凍結乾燥した凍結乾燥菌末を用いた。各サンプルについて実施例1と同様の方法でマウス脾細胞からのIL-12産生促進効果を測定した。【００５１】
結果を図5に示す。加熱処理後に放置した場合では、どのpHにおいてもControlと比較して差は認められなかった。非加熱の場合、Controlと比較して中性域のpHで放置した菌体ほどIL-12産生促進効果が低下した。この結果から、L. gasseri OLL2809のIL-12産生促進効果は中性域のpHにおいて減少するが、少なくともpH 4で6時間は安定であることが明らかとなった。また、この結果はこれまでの諸条件におけるL. gasseri OLL2809の培養で、培養液のpHが約5以上であるとIL-12 産生促進効果が低かったことと一致し、中性域でのpHにより有効成分が分解（または生合成が阻害）される為であることが考えられた。このIL-12 産生促進効果の低下には酵素等に感受性の高い物質が関与している事が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
免疫調節活性の高い乳酸菌を得ることができるため、これを用いて免疫調節活性を有する飲食品や医薬品を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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