(57)【要約】本発明は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供する。具体的には、採取された、場合により液体窒素を用いて直ちに凍結された生物学的サンプルを、ＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製し、得られた懸濁物からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡを逆転写しｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅されたｃＤＮＡを検出する、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法であって、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法。
【請求項２】
採取された生物学的サンプルが、凍結されている、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
【請求項４】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第１項〜第３項いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項〜第４項いずれか１項記載の方法に加えて、下記工程：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法。
【請求項６】
腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、請求の範囲第１項〜第５項いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキット。
【請求項８】
さらに、採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む、請求の範囲第７項記載のキット。
【請求項９】
ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、請求の範囲第７項又は第８項記載のキット。
【請求項１０】
生物学的サンプルが、糞便である、請求の範囲第７項〜第９項いずれか１項記載のキット。
【請求項１１】
さらに、下記手段：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出キット。
【請求項１２】
腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、請求の範囲第７項〜第１１項いずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とする、生物学的サンプルからＲＮＡを抽出する工程を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に関する。
【背景技術】  大腸癌による死亡者が、増加している。大腸癌による死亡者は、全ての癌による死亡者のうち男性においては第４番目、女性においては第２番目に多い癌である（１９９９年度癌死統計）。また、２０１５年の癌患者推計では、男女とも似に第一位になると推計されており、二次的な予防を含めた総合的な大腸癌対策が求められており、癌の集団検診は、最も効果的な方法の一つである。
癌の集団検診（ｍａｓｓ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）のためには、簡便かつ非侵襲性の検出方法であることが重要である。現在利用することができる唯一の非侵襲性の方法は、潜血の有無を調べる糞便検査、すなわち便潜血検査であり、大腸癌の集団検診の標準方法として広く用いられている。
しかし、便潜血検査は、糞便中にヘモグロビンが現れることが腫瘍に特異的なものではないことから、感度及び特異度が低く（感度３０〜９０％、特異度７０〜９８％）、そのため偽陰性や偽陽性が少なからず存在するという欠点がある。
また、大腸癌の診断には、免疫学的便潜血法によるスクリーニングの後か、又は同時に、全大腸内視鏡検査又は注腸検査とＳ状結腸内視鏡検査とが組み合わせて用いられており、多大な時間と労力がかかるという欠点がある。
便潜血検査の代替法としては、糞便中のＫ−ｒａｓ、ｐ−５３、ＡＰＣ遺伝子変異やマイクロサテライト不安定性を検出する等のＤＮＡを用いた方法が報告されている（シドランスキー等著（Ｄ．Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５６巻、１９９２年４月３日、第１０２頁〜第１０５頁；ドン等著（Ｓ．Ｍ．Ｄｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、第９３巻、第１１号、２００１年６月１１日、第８５８頁〜第８６５頁；トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第３４６巻、第５号、２００２年１月３１日、第３１１頁〜第３２０頁；トラベルソ等著（Ｇ．Ｔｒａｖｅｒｓｏ，ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ランセット（Ｔｈｅ  Ｌｎｃｅｔ）、第３５９巻、２００２年２月２日、第４０３頁〜第４０４頁）。
これらのＤＮＡを用いる方法は、非侵襲的で癌細胞の直接的変化を捉えることができる方法であり、特異度が高いという特徴を有し、将来性豊かな方法と考えられるが、従来技術である便潜血検査と比べると感度が低く、また、時間と労力もかなりかかるという欠点がある。
また、さらなる便潜血検査の代替法として、遺伝子発現をより直接的に検出するために、糞便中のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）等のｍＲＮＡを検出する方法も開発されている（デビッドソン等著（Ｌ．Ａ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）、カーシノジェネシス（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、第１９巻、第２号、１９９８年、第２５３頁〜第２５７頁；アレキサンダー及びライハット等著（Ｒ．Ｊ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｒａｉｃｈｔ）、ダイジェスティブ・デジージス・アンド・サイエンス（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第４３巻、第１２号、１９９８年、第２６５２頁〜第２６５８頁；ヤマオ等著（Ｔ．Ｙａｍａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、第１１４巻、第６号、１９９８年、第１１９８頁〜第１２０５頁）。
しかし、上記のＲＮＡを用いる方法によっても、少量の糞便から簡便かつ効率的にＲＮＡを抽出することができず、便潜血法を超える感度を得ることができなかった。
ＰＣＲ法を逆転写酵素反応（ＲＴ）と組み合わせることによって、ＲＮＡを定性的に、また定量的に検出する方法が知られている。このＲＴ−ＰＣＲ法は、微量分子を検出することができる感度の高さで、ノーザンブロット法に優り、また、手技の速さや容易さでｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に優るものである。
しかし、ＲＮＡは、ＤＮＡに比べて不安定であり、かつ、全ての生物学的試料中に普遍的に存在し、極めて安定であるＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）による分解の危険性に常にさらされていることから、ＲＴ−ＰＣＲ法においても、ＲＮＡの精製過程及び精製後においても、ＲＮａｓｅが混入しないように厳密な管理が要求される。
したがって、糞便という生物学的に極めて粗製の試料からＲＮＡを抽出する際には、ＲＮａｓｅの影響を排除するために、予め細胞画分を分離する工程が必要とされていた。
したがって、極めて多量の微生物に由来する膨大な量のＲＮａｓｅが存在する糞便中から直接ＲＮＡを検出することは、不可能であり、少なくとも微生物等に由来する外因性ＲＮａｓｅ除去のために細胞画分の分離は、必須であると考えられていた。
しかし、本発明者は、驚くべきことに、場合により凍結した生物学的試料をＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下に均質化することによって、上記課題を解決することができることを発見し、本発明を完成させた。
【発明の開示】
したがって、本発明の目的は、従来の便潜血検査を超える感度及び特異度を有する非侵襲的かつ簡便な大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法を提供することにある。
本発明は、下記工程：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する工程、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製方法であって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する工程を含まないことを特徴とする方法である。
ここで、該採取された生物学的サンプルは、凍結されていることが好ましい。
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記方法である。
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記の方法である。
また、本発明は、上記の方法の工程に加えて、下記工程：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する工程、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る工程、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する工程、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する工程
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法である。
また、本発明は、下記手段：
ａ）採取された生物学的サンプルをＲＮＡ分解酵素阻害剤の存在下で均質化し、懸濁物を調製する手段、
を含む大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出方法に用いるＲＮＡを抽出するための試料の調製のためのキットであって、
生物学的サンプルから細胞成分を分離する手段を含まないことを特徴とするキットである。
また、本発明のキットは、好ましくは、該採取された生物学的サンプルを凍結する手段を含む。
また、本発明は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤が、チオシアン酸グアニジンである、上記のキットである。
また、本発明は、生物学的サンプルが、糞便である、上記のキットである。
また、本発明は、さらに、下記手段：
ｂ）得られたＲＮＡを抽出するための試料から、ＲＮＡを抽出する手段、
ｃ）抽出されたＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを得る手段、
ｄ）得られたｃＤＮＡを増幅する手段、及び
ｅ）増幅されたｃＤＮＡを検出する手段
を含む、大腸癌診断のための腫瘍マーカーの検出キットである。
また、本発明は、腫瘍マーカーが、ＣＯＸ−２である、上記のキットである。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例２の電気泳動結果である。レーン１は、アレキサンダーらの方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン２は、本発明の方法でヒト糞便から抽出された全ＲＮＡである。レーン３は、ヒト大腸癌組織から抽出された全ＲＮＡである。レーンＭは、分子量マーカーである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のＲＮＡ分解酵素阻害剤としては、チオシアン酸グアニジン、アイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎｅ）、ウルトラスペックＩＩ（登録商標）（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ＩＩ）等が挙げられる。
本発明の生物学的サンプルとしては、動植物組織、体液、排泄物等を挙げることができ、好ましくは、糞便、より好ましくは、ヒトの糞便である。
本発明の生物学的サンプルは、そのままか、又は場合により凍結して用いることができる。
凍結方法は、任意の従来技術を用いることができ、好ましくは、液体窒素を用いる方法である。凍結温度は、保存温度は、−１〜−１９６℃、好ましくは、−２０〜−１９６℃、好ましくは、−７５〜−１９６℃、より好ましくは、−１１０〜−１９６℃、最も好ましくは−１９６℃である。
凍結されたサンプルは、冷凍保存してもよい。保存温度は、−７５〜−１９６℃、好ましくは、−１１０〜−１９６℃、より好ましくは−１９６℃である。保存期間は、１日〜１０年、好ましくは、１日〜３年、より好ましくは、１日〜１年である。
本発明で用いられる腫瘍マーカーとしては、ＣＯＸ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ｃ−ｍｅｔ、ＣＤ４４変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＦ−１、Ｗｎｔ−２、ブラディオン（Ｂｒａｄｅｉｏｎ）、ＳＫＰ２、ＫＰＣ−１、ＫＰＣ−２、ＰＲＬ−３、アンギオゲニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、Ｓｎａｉｌ、Ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎ等が挙げられるが、好ましくは、ＣＯＸ−２である。
上記工程ｃ）〜ｅ）は、ＲＴ−ＰＣＲ法と呼ばれるものであり、例えば、関谷剛男等編、ＰＣＲ法最前線、１９９７年、共立出版、第１８７頁〜第１９６頁の記載にしたがって行うことができる。
懸濁物からのＲＮＡの抽出は、従来公知の方法を用いることができ、例えば、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ）やＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような市販のキットを用いることができる。
本発明で逆転写とは、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することをいう。逆転写反応は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、ＲＮａｓｅ阻害剤及び逆転写酵素を含む溶液を用いて行われる。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質や界面活性剤等を添加することもできる。
逆転写に続いて行われるｃＤＮＡの増幅は、通常、ＰＣＲが用いられる。ＰＣＲの反応液は、通常、バッファー、ＭｇＣｌ２やＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類、及び耐熱性ポリメラーゼを含む。上記塩類は、適宜、他の塩類に変更して試用することができる。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク質、ジメチルスルホキシドや界面活性剤等を添加することもできる。
ｃＤＮＡの増幅は、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）やＩＣＡＮ法（特開２００１−１３６９６５）を用いることもできる。
本発明でプライマーとは、ｃＤＮＡ合成や核酸増幅の際の合成開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、日本鎖も使用することができる。プライマーが二本鎖である場合には、増幅反応に先立ち、一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法にしたがって合成することができ、また、生物から単離することもできる。
逆転写反応に使用する逆転写酵素は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することができる酵素を意味する。逆転写酵素としては、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）やＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等のレトロウイルス由来の逆転写酵素や、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）等のマウスのレトロウイルス由来の逆転写酵素があるが、これらに限定されるものではない。
ＰＣＲに用いる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
増幅されたＤＮＡの検出方法としては、アガロースゲルを用いる電気泳動を用いることができるが、これに限定されるものではない。
また、本発明のキットには、本発明の方法を記載した指示書を含むこともできる。
【実施例１】  以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明を限定するものではない。
浜松医科大学第１内科に精査・治療目的のために入院し、全大腸内視鏡によって大腸癌の存在が確認された患者３０例、及び大腸に腫瘍又は炎症性変化のない（非大腸疾患）患者２２例を対象とした。なお、すべての患者からインフォームドコンセントが得られている。
糞便は、採便後可及的速やかに５ｍｌチューブに約１ｇずつ分取し、液体窒素を用いて凍結させ、−８０℃で保存した。また、比較対照のため、それぞれの試料について免疫学的便潜血検査法により便中のヒトヘモグロビン（Ｈｂ）を測定した。組織は、治療前に受けた内視鏡検査時に癌部と正常部の生検材料を液体窒素で凍結してから−８０℃で保存した。その後、ホモジナイザーとグアニジン塩とフェノールを用いてホモジナイズし、クロロホルムとエタノールで全ＲＮＡを抽出した。
得られたＲＮＡの１μｇをリバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μｌ、和光純薬）を用いて逆転写しｃＤＮＡを得、その一部をＧｅｎｅ  Ｔａｑ（和光純薬）を用いて、ネスティドＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲを、４％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
なお、用いたプライマーは、逆転写では、ランダムプライマーであり、ＰＣＲでは、ＣＥＡについては、Ｇｅｒｈａｒｄ（ＪＪＣＯ、１９９４）に報告されたものであり、ＣＯＸ−２については、独自に設計したものを使用した。ＰＣＲは、第１ラウンドを２０サイクルで、第２ラウンドを２５サイクルで行った。
使用したプライマーを下記に示す。
＜ＣＥＡ＞
2004083856.tif 000002
＜ＣＯＸ−２＞
2004083856.tif 000003
結果
大腸癌３０例（早期癌３例、進行癌２７例）と対照群２２例における糞便からのＲＴ−ＰＣＲによるＣＥＡ、ＣＯＸ−２の検出を試みたところ、以下の結果を得た。
ＣＥＡは、大腸癌３０例中の全例で、対照群２２例中の２１例で検出された。また、両者からＲＴ−ＰＣＲで増幅し得るＲＮＡの抽出が行えることが判明した。
ＣＯＸ−２は、大腸癌３０例中の２７例（盲腸２／２、上行結腸３／５、下行き結腸１／１、Ｓ状結腸７／７、直腸１２／１３、早期癌２／３、進行癌２５／２７）で検出されたが、対照群２２例中では、１例も検出されなかった（感度９０％、特異度１００％）。
免疫学的便潜血検査法では、大腸癌２８例中２３例及び対照群２２例中３例が陽性であった（感度８２．１％、特異度８６．３％）。
ＣＯＸ−２陰性大腸癌３例中では、１例で免疫学的便潜血検査が陽性であり、２例が陰性であった。
免疫学的便潜血検査が陰性の大腸癌５例中３例で、ＣＯＸ−２が検出された。
【実施例２】  ヒト糞便から得られる全ＲＮＡの量及び分子量の分布を、本発明の方法とアレキサンダーの方法（非特許文献６）とで比較した。対象として、ヒトの大腸癌組織から市販のＲＮＡ抽出剤（アイソジェン、和光純薬）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
それぞれの試料から抽出された全ＲＮＡの同一量をアガロースゲル上で電気泳動した。
レーン３（ヒト大腸癌組織由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、２８Ｓ及び１８ＳｒＲＮＡを示す。また、スメア状の部分は、得られた全ＲＮＡ中に種々の高分子ＲＮＡが含まれていることを示す。
レーン２（本発明の方法による糞便由来ＲＮＡ）において認められる２本の主要バンドは、腸内細菌由来の２３Ｓ及び１６ＳｒＲＮＡを示す。また、レーン３と同様にスメア状の部分が認められることから、本願発明の方法によって糞便から得られた全ＲＮＡ中には、種々の高分子ＲＮＡが含まれていると考えられる。
これに対して、レーン１では、いかなるバンドもスメアも全く認められず、試料抽出物中には、高分子ＲＮＡが含まれていないことを示した。
実際に、レーン２のサンプルからはＲＴ−ＰＣＲで目的の産物が得られたが、レーン１のサンプルからは、ＰＣＲ産物は得られなかった。
本研究結果から、本発明の方法によってヒト糞便から抽出されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅が可能であることが明らかとなった。また、ＲＴ−ＰＣＲによる糞便からのＣＯＸ−２の検出は、９０％の感度及び１００％の特異度を有することから、従来技術である免疫学的便潜血法に比べて優れていることが証明された。
また、本発明の方法は、報告されているＡＰＣ、Ｋ−ｒａｓやｐ５３遺伝子変異の検出に比べて、検出に必要とする糞便の量が少なくかつ検出感度が高いことから、検出にかかる時間及び労力を大幅に節約することができる。
従来技術の便潜血法が、病変からの「出血」という一般的かつ間接的な事象を対象とするのに対し、本発明の方法は、発癌マーカーであるＣＯＸ−２発現という特異的かつ直接的な事象を対象とすることから、本発明の方法によって得られたデータは、より品質の高い診断を提供することができる。
したがって、本発明の方法は、特異度及び感度の高い新規大腸癌の非侵襲的スクリーニング方法として臨床的に極めて有用なものである。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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