(57)【要約】本発明は、転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを生体内で徐放させ、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨・軟骨再生を可能にするインプラントに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入したアデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含む生体適合性材料からなるインプラント。
【請求項２】
骨・軟骨誘導性転写因子が、Ｃｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ及びＳｏｘ−９からなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
骨・軟骨誘導性転写因子がＣｂｆａ１である、請求項１に記載のインプラント。
【請求項４】
生体適合性材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれるいずれかである、請求項１〜３項のいずれか１項に記載のインプラント。
【請求項５】
生体適合性材料がβ−ＴＣＰである、請求項４に記載のインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、転写因子を利用したインプラントに関する。より詳しくは、転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを生体内で徐放させ、転写因子活性を持続的に発現させることにより、良好な骨・軟骨再生を可能にするインプラントに関する。
【背景技術】  骨は再生能力の限られた組織であり、その修復には自家骨の再移植や人工インプラントによる置換・補充が必要となる。しかし、自家骨の使用は患者の負担が大きく、その採取量にも限界がある。また、人工インプラントには、生体骨に匹敵するだけの強度や機械的特性、生体適合性が期待できないという問題がある。
これに対し、生体から取り出した自己の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養・組織化して限りなく生体に近い組織を再構築し、これを再び生体内に戻すという再生医療の研究が進められている。この研究が実現すれば、それは損傷組織に対する最も理想的な治療方法となる。
再生医療においては、生体外で細胞をより早く目的の組織に増殖・分化させること、また移植組織を速やかに欠損部に融合・組織化させることが、重要な問題となる。これを解決する方法として、細胞の分化誘導をつかさどるサイトカイン（液性因子）を直接細胞に導入するいくつかの技術が知られている。たとえば、ＴＧＦ−β１を含浸させたコラーゲンスポンジ上で骨髄細胞等を培養する技術（特開２００１−３１６２８５号）、ｂＦＧＦを含有するコラーゲン−軟骨細胞複合体による軟骨組織再生治療材（特開平８−３１９９号）等が公知である。しかし、増殖因子そのものを細胞に添加する方法では、添加した増殖因子が速やかに拡散してしまうため、増殖因子活性の十分な持続が望めないという問題がある。一方、リポフェクション法により増殖因子の遺伝子を細胞に導入する方法も試みられているが、この方法は樹立細胞株ではある程度の成功をおさめても、初代培養細胞に対しては殆ど０に近い導入効率しか得られていない。
最近、骨芽細胞の分化には転写因子、特にｒｕｎｔ型及びＨｅｌｉｘ−Ｌｏｏｐ−Ｈｅｌｉｘ（ＨＬＨ）型の転写因子が重要な意味を持つことが、多くの研究者により明らかにされてきた。例えばｒｕｎｔ型転写因子としては、Ｐｅｂｐ２ａｌｐｈａＡ（Ｐｅｂｐ２αＡ）／Ｃｂｆａ１、ＨＬＨ型転写因子としては、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、Ｉｄ−１、Ｉ−ｍｆａ等が骨芽細胞分化に重要な意味を持つことが報告されている（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，ｐ７５５−７６４；Ａｃａｍｐｏｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，ｐ３７９５−３８０９；Ｔｒｉｂｉｏｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，ｐ５６９９−５７１１；Ｓａｔｏｋａｔａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４，ｐ３９１−３９５；Ｃｓｅｒｊｅｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，ｐ１０９９−１１１０；Ｎｇ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３，ｐ１０８−１２１）。
そして、発明者らは、この転写因子（Ｃｂｆａ１）遺伝子を導入した骨芽細胞をβ−ＴＣＰ等の生分解性材料を足場として培養、組織化し（Ｈ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．Ｕｅｍｕｒａ，（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．１３  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，ｐ５４３ａ；Ｔｏｓｈｉｍａｓａ  Ｕｅｍｕｒａ，Ｈｉｒｏｋｏ  Ｋｏｊｉｍａ，（２００２）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．６，ｐ１１２９）、生体に移植することで、良好な骨・軟骨組織再生が可能になることを報告している（国際公開第０３／０１１３４３号）。この方法は、効率の良い骨・軟骨再生を可能にするという点においては非常に優れた技術である。しかし、患者体内からの細胞の単離、生体外での組織構築、生体内への再移植という工程は、現実の臨床適用においては決して容易ではない。
【発明の開示】
本発明は、整形外科領域及び歯科領域における、より簡便かつ安全な骨・軟骨再生の手段を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、β−ＴＣＰやハイドロキシアパタイト等の生体適合性材料を用いて生体内で転写因子の遺伝子導入用ウイルスベクターを徐放させる方法を見出した。そして、この方法によれば、低濃度のウイルスベクターでも転写因子の遺伝子を導入した細胞を移植する方法と同等の骨・軟骨再生が可能になることを実証し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入したアデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含む生体適合性材料からなる骨・軟骨再生用インプラントに関する。
本発明のインプラントにおいて、骨・軟骨誘導性転写因子としては、例えば、Ｃｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ及びＳｏｘ−９から選ばれる１種又は２種以上を利用することができる。なかでも、Ｃｂｆａ１が好ましい。
また、本発明のインプラントにおいて、生体適合性材料としては、例えば、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体から選ばれるいずれかを利用することができる。なかでも、β−ＴＣＰが好ましい。
本発明によれば、生体内で骨・軟骨再生を促す転写因子活性が長期的に発現され、損傷を受けた骨・軟骨の良好な再生が可能になる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を組み込んだウイルスベクターを含む生体適合性材料からなるインプラントに関する。該インプラントは、歯槽骨再生や大腿骨再生など、歯科領域及び整形外科領域における骨・軟骨再生に用いられる。
１．転写因子
本発明に用いられる転写因子は、未分化の細胞を骨及び／又は軟骨に分化誘導する、骨・軟骨誘導性の転写因子であり、例えばＣｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、Ｓｏｘ−９が挙げられる。Ｃｂｆａ１は１９９３年京都大学の小川らによってクローニングされ、大阪大学の小守らにより間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化誘導するのに必要不可欠であることが確認された転写因子である（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，７５５−７６４）。このＣｂｆａ１には２つのアイソフォーム、ｔｉｌ−１とｐｅｂｐ２αＡが存在する。Ｄｌｘ−５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ（Ｄｌｌ）遺伝子の相同遺伝子で、軟骨骨膜や内膜の骨化に関わる転写因子である（Ａｃａｍｐｏｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，３７９５−３８０９）。Ｂａｐｘ１は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂａｇｐｉｐｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ遺伝子の相同遺伝子で、特に脊髄における間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化に関わっており、Ｃｂｆａ１遺伝子の調節遺伝子の１つと考えられている（Ｔｒｉｂｉｏｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，５６９９−５７１１）。Ｍｓｘ２は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ（Ｍｓｈ）遺伝子の相同遺伝子で頭蓋骨の骨化に関わっており、Ｃｂｆａ１遺伝子の調節遺伝子の１つと考えられている（Ｓａｔｏｋａｔａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４，３９１−３９５）。Ｓｃｌｅｒａｘｉｓは、間葉系幹細胞から軟骨細胞や結合組織への分化誘導に関わる転写因子である（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，１０９９−１１１０）。Ｓｏｘ−９は、軟骨で発現しており、ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ等の軟骨分化に関わる遺伝子の発現調節をしている（Ｎｇ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３，１０８−１２１）。
本発明で用いられる転写因子の由来は特に限定されないが、移植の対象となる哺乳動物に由来する転写因子を用いることが好ましい。したがって、ヒトを対象とした骨・軟骨再生においては、ヒト由来の転写因子を用いることが好ましく、マウスを対象とした骨・軟骨再生においては、マウス由来の転写因子を用いることが好ましい。
本明細書中において、前記Ｃｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、Ｓｏｘ−９等の骨・軟骨誘導性転写因子には、そのすべてのオーソログを含むものとする。ここで「オーソログ（Ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とはオーソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）のことであり、進化的に同じ起源をもち構造と機能が類似した異なる種の遺伝子を意味する。これらの遺伝子の塩基配列は既に公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースよりその情報を入手することができる。例えば、マウス骨芽細胞由来Ｃｂｆａ１遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０１０２８４、ＡＦ００５９３６等としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、ヒトＣｂｆａ１の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＨ００５４９８、ＮＭ００４３４８、Ｌ４０９９２等として、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。その他、ヒトＤｌｘ−５はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ０２３４９３として、ヒトＢａｐｘ１はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１８９として、ヒトＭｓｘ２はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ３１７７１として、ヒトＳｃｌｅｒａｘｉｓはＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＫ０００２８０として、ヒトＳｏｘ−９はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｚ４６６２９として、それぞれＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
本発明で用いられる骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子は、上記配列情報を利用して常法により調製することができる。すなわち、骨芽細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを抽出し、公知の配列を基に作製したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により目的とする転写因子のｃＤＮＡを増幅する。
２．ウイルスベクターの作製
前記アデノウイルス又はレトロウイルスベクターは、周知の方法に基づいて調製することができる。例えばアデノウイルスベクターは、Ｍｉｙａｋｅらの方法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１３２０−１３２４，（１９９３））に基づいて調製することができる。ベクターはまた、市販のキット、例えばＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）等を用いて作製してもよい。このキットは、Ｐ１ファージのＣｒｅリコンビナーゼとその認識配列であるｌｏｘＰを用いた発現制御系（Ｋａｎｅｇａｅ  Ｙ．  ｅｔ．  ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３８１６）による組換えアデノウイルスベクター作製用キットで、目的の転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイルスベクターを簡便に作製することができる。なお、アデノウイルス感染のｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、１０以上、好ましくは５０〜２００、より好ましくは１００前後（８０〜１２０程度）である。
３．生体適合性材料
本発明で用いられる生体適合性材料とは、生体内に適用可能な材料であれば特に限定されず、例えば、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸等を挙げることができる。これらの材料は１種類であってもよいし、あるいは２種以上を組み合わせた複合体であってもよい。
前記生体適合性材料は、ウイルスベクターの吸着が可能なように、有効吸着表面積が大きい多孔性（または微粒子の集合体）であることが望ましい。なお、本明細書中において「多孔（性）」とは、気孔率が少なくとも３０％以上であることを意味するものとする。本発明の生体適合性材料において気孔の大きさは特に限定されないが、直径５０μｍ〜５００μｍ程度であることが好ましい。一方、骨のような硬組織用インプラントでは、初期強度も重要となる。セラミックス多孔体ではハイドロキシアパタイトやβ−ＴＣＰは強度が高く、本発明の生体適合性材料として好ましい。さらに、生体適合性材料は骨再生後に生体内で分解吸収されることがより好ましい。
β−ＴＣＰはある程度の強度を有する生分解性セラミックス多孔体という点で、本発明にかかる生体適合性材料として特に好ましい。多孔性β−ＴＣＰの圧縮強度は３Ｍパスカル程度で、生体骨（海綿骨で７Ｍパスカル程度）よりは弱いものの、臨床使用には十分な強度といえる。さらに、β−ＴＣＰは生体内で徐々に分解してカルシウムイオンとリン酸イオンを放出し、骨芽細胞によるハイドロキシアパタイト合成が容易な環境を実現する。すなわち、β−ＴＣＰから放出されたカルシウムイオンとリン酸イオンを利用して、周囲の骨芽細胞によるハイドロキシアパタイト合成が可能になる。合成されたハイドロキシアパタイトは骨の構成成分として、やがて硬い骨へと置換していく。実際、本発明のように転写因子の遺伝子を導入したウイルスベクターを吸着させ、周囲が骨をつくるのに適した環境であれば、β−ＴＣＰの分解部位にハイドロキシアパタイトを主成分とした新生骨が容易に構成される。つまり、β−ＴＣＰはウィルスデリバリーの担体や骨形成の足場としてだけでなく、それ自体が骨新生を積極的に促進させる機能を有する。
４．生体適合性材料へのベクターの組み込み
生体適合性材料へのベクターの組み込み方法は特に限定されないが、できる限り均一に組み込まれることが好ましい。ベクターは前記生体適合性材料に化学的に結合されていてもよいし、単に物理的に吸着されているだけでもよい。例えば、β−ＴＣＰの場合であれば、ベクターを含む溶液（培地）に浸漬させることにより、β−ＴＣＰ中にベクターを均一に吸着させることができる。必要であれば、ベクターを含む溶液が生体適合性材料内に十分いきわたるよう、適宜減圧してもよい。例えば、１×１０８〜１０９ｐｆｕ／ｍｌの濃度のウイルスベクター液を血清の含有されていない適当な溶媒（例えば、生理食塩水等）又は培地で希釈し、そこに生体適合性材料からなるブロックを浸漬する。１００〜１５０ｍｍＨｇに減圧してブロック内を脱気し、ブロック内にウイルスベクター液を十分浸透させる。
ベクターを吸着させた生体適合性材料は、好ましくは数時間以内に生体内に移植する。本発明の生体適合性材料は、生体内に埋入あるいは注入されると、骨再生に必要とされる期間にわたり、徐々に転写因子の遺伝子を導入したウイルスベクターを放出する。かくして、良好な骨再生が可能となる。
５．その他
本発明のインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。また、本発明のインプラントは他の材料と混合して用いても良い。例えば、ウイルスを吸着させたβ−ＴＣＰの顆粒をハイドロキシアパタイトの顆粒と混合して骨補填剤として使用することができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、骨・軟骨組織及び足場材料のほか、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子、骨形成タンパク質、Ｓｔ、Ｍｇ、Ｃａ及びＣＯ３等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。
本発明のインプラントは、骨親和性が高く、生体適用後すみやかに生体骨と一体化し、骨欠損部の再生を可能にする。
【図面の簡単な説明】  図１は、ラット背上皮皮下移植実験の方法を示した模式図である。
図２は、ラット背上皮皮下移植実験におけるヘマトキシリン／エオジン染色像（移植後３週目、背上皮皮下）を示す写真である。
図３は、ラット大腿骨欠損部位移植実験の方法を示す模式図である。
図４は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後２週目、β−ＴＣＰブロック）を示す写真である。
図５は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後６週目、β−ＴＣＰブロック）を示す写真である。
図６は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後３週目、ＨＡブロック）を示す写真である。
図７は、ラット大腿骨欠損部位移植後のβ−ＴＣＰブロックとＨＡブロックのヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後３週目）を示す写真である。
図８は、ラット大腿骨欠損部位移植後のウィルス吸着ブロックとウィルス感染細胞吸着ブロックのヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後８週目、β−ＴＣＰブロック）を示す写真である。
図９は、ラット背上皮皮下移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後２０日および８週目、ＯＰＬＡコンポジット）を示す写真である。
図１０は、ラット背上皮皮下移植実験におけるオステオカルシン免疫染色像（移植後２０日目、ＯＰＬＡコンポジット）を示す写真である。
図１１は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後１０日および２０日目、ＯＰＬＡコンポジット）を示す写真である。
図１２は、ラット大腿骨欠損部位移植実験におけるヘマトキシリン−エオジン染色像（移植後３週目、ＯＰＬＡコンポジット）を示す写真である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−３５５５０５号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】実施例１：生体適合性材料を担体としたウイルスベクターの徐放研究（１）β−ＴＣＰブロックおよびＨＡブロック
１．アデノウイルスベクターの作製
マウスの骨芽細胞から単離したＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＣｂｆａ１のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０１０２８４：配列番号１）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによりｃｂｆａ１  ｃＤＮＡを増幅して得た。
2005035014.tif 000003
Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡはＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐＣＲ  ＩＩ−ＴＯＰＯ）にクローニングして大量調製した。Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡを制限酵素のＳｐｅＩとＥｃｏＲＶで切り出し、平滑末端化した後、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  ｋｉｔ（宝酒造，６１５１）を用いてコスミドベクターｐＡｘＣＡＬＮＬｗのＳｗａＩサイトに挿入し、Ｋｉｔの説明書に従って組換えアデノウイルスを作製した。作製したウイルスの力価は、約１０１１ＰＦＵ／ｍｌの値を示し、感染効率は非常に高いことが確認された。
２．骨芽細胞の採取及び培養方法
Ｒａｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｏｓｔｅｏｂｒａｓｔ（ＲＢＭＯ）は、６週齢のＦｉｓｈｅｒラット（雄）の大腿骨よりＭａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓらの方法（Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．，Ｓｏｄｅｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｅｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｈ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２５４，３１７−３３０）に従って採取した。細胞は、１５％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｆ−９４２３）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，１５２４０−０６２）添加ＭＥＭ培地（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，２１４−４２）で約１週間培養した。その後２日間  １０ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５μｇ／ｍｌ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅを添加した上記の培地で培養した。
３．ラット生体内移植実験
３．１  ラット背上皮皮下移植実験
Ｃｂｆａ１とＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）にβ−ＴＣＰブロック（Ｏｌｙｍｐｕｓ，２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）を３時間浸漬した。ＲＢＭＯをトリプシン処理して剥がした後、細胞濃度を１００万個／ｍｌに調整して減圧下（１００ｍＨｇ）でブロックに吸着した。ラットの背上皮皮下にウイルス吸着ブロックあるいは未処理のブロックを移植した。３週間後に摘出したブロックをヘマトキシリン／エオジン染色して観察した。図１にラット背上皮皮下移植実験の概要を示す。
３．２  ラット大腿骨欠損部位移植実験
１）Ｃｂｆａ１とＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）にβ−ＴＣＰブロック（Ｏｌｙｍｐｕｓ，２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）、あるいはハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ブロック（インターポア、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）を３時間浸漬した。ラットの大腿骨にドリルで２．５ｍｍ立方の穴を開けて欠損部位を作製し、そこにブロックを移植した。数週間後に摘出したウイルス吸着ブロックあるいは未処理のブロックをヘマトキシリン／エオジン染色して観察した。
２）Ｃｂｆａ１とＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウイルス混合液（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）にβ−ＴＣＰブロック（Ｏｌｙｍｐｕｓ，２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）、あるいはハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ブロック（インターポア、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍ）を３時間浸漬した。ＲＢＭＯをトリプシン処理して剥がした後、細胞濃度を１００万個／ｍｌに調整して減圧下（１００ｍＨｇ）でブロックに吸着した。ラットの大腿骨にドリルで２．５ｍｍ立方の穴を開けて欠損部位を作製し、そこにウイルス吸着ブロックあるいは未処理のブロックを移植した。数週間後に摘出したブロックをヘマトキシリン／エオジン染色して観察した。図３にラット大腿骨欠損部位移植実験の概要を示す。
４．組織切片作製、染色法
摘出したブロックを４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，０．０５％  ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅでマイクロウェーブ固定し、翌日１０％  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で約１週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。５μｍの厚さの切片を作製し、脱パラフィン後、ヘマトキシリン続いてエオジンで染色した。
結果：
１．ラット背上皮皮下移植実験結果
図２に、背上皮皮下移植３週間後のヘマトキシリン／エオジン染色結果を示す。ウィルス吸着ブロックの方はブロックの中心部分で（図２右上、右下）骨が再生されている様子が観察できた。一方未処理のブロックの方では骨芽細胞様細胞は観察されるが骨化は進行していなかった（図２左下）。
２．ラット大腿骨欠損部位移植実験結果
１）β−ＴＣＰブロック（移植後２週間）
図４に、β−ＴＣＰブロック大腿骨欠損部位移植２週間後のヘマトキシリン／エオジン染色結果を示す。Ｃｂｆａ１遺伝子組み換えウイルス吸着ブロックの方が、ブロックのポアの溶解が進行しており、ポアの周囲の骨化も進行していることが観察された（図４左下、右下）。骨芽細胞を添加した方は添加していないものに比べて、若干ブロックの溶解及び骨化が進んでいるように見えた（図４右下）。Ｃｂｆａ１遺伝子組み換えウイルスを吸着することで、骨再生を迅速に誘導できることが確認された。
２）β−ＴＣＰブロック（移植後６週間）
図５に、β−ＴＣＰブロック大腿骨欠損部位移植６週間後のヘマトキシリン／エオジン染色結果を示す。Ｃｂｆａ１遺伝子組み換えウィルス吸着ブロックの方がブロックの溶解が進行しており、また骨化の進行も顕著であった。特に皮質骨部位における迅速な骨再生と、骨髄腔における速やかなブロックの消失が観察された（図５左下、右下）。骨芽細胞を添加した方が、骨・骨髄再生の進行状況から判断して、Ｃｂｆａ１遺伝子の導入効果が若干強く現れることが観察できた（図５右下）。
３）ＨＡブロック（移植後３週間）
図６に、ＨＡブロック大腿骨欠損部位移植６週間後のヘマトキシリン／エオジン染色結果を示す。β−ＴＣＰブロックに比べて本実験で用いたＨＡブロックは、ポアサイズも気孔率も非常に高く、ウイルスの吸着する表面積が小さくなるため、ウィルス吸着の影響が顕著ではない。またＨＡは生分解性材料ではないため、欠損が修復された後も体内に残存し続けると考えられた。
４）β−ＴＣＰブロックとＨＡブロックの比較（移植後３週間）
図７に、移植後３週間で摘出したＨＡブロックとβ−ＴＣＰブロックの骨再生の様子を比較した結果を示す。ＨＡブロックに比べて生分解性のセラミックス材料である多孔性β−ＴＣＰブロックの方が、骨・骨髄再生を促進させることがわかった。効果は特に皮質骨部分で顕著に認められる。β−ＴＣＰブロックの場合、移植後ウィルスが生体内で徐々に拡散されるため、ブロック周囲に存在する骨髄にも影響を与えて骨再生を促すものと考えられた。
５）ウィルス吸着ブロックとウィルス感染細胞吸着ブロックの比較（移植後８週間、β−ＴＣＰブロック）
図８に、移植後８週間で摘出したウィルス吸着ブロックとウィルス感染細胞吸着ブロックの骨再生の様子を比較した結果を示す。ウィルス感染細胞吸着ブロックに比べてウィルス吸着ブロックは、骨髄腔のブロックの溶解、骨髄への置換は若干劣るが、皮質骨部分の骨化の進行は同等、及びそれ以上に早いことが観察された。
考察：
生体適合性材料である多孔性β−ＴＣＰ及びハイドロキシアパタイト（ＨＡ）にＣｂｆａ１のｃＤＮＡを組み込んだウイルスベクターを吸着させ、生体内に移植してＣｂｆａ１遺伝子組み換えウイルスを徐放させることにより、骨・骨髄再生が促進できることが確認された。また、骨・骨髄再生の進行状況から判断して、Ｃｂｆａ１遺伝子導入用ウイルスベクターを吸着させたβ−ＴＣＰブロックは、Ｃｂｆａ１遺伝子を導入した骨芽細胞を吸着させたβ−ＴＣＰブロックと同等の骨再生効果を有すると考えられた。
ＨＡブロックはβ−ＴＣＰブロックに比べてポアサイズも気孔率も非常に高く、結果的にウイルスが吸着する表面積が小さいと考えられる。そのためウイルス吸着の影響がβ−ＴＣＰブロックほど顕著には確認できなかった。しかしながら、ＨＡブロックの染色像で皮質骨の部分に着目すると、ウイルス吸着担体の方がより良好に骨再生が促進されていることがわかる。β−ＴＣＰとは異なり、ＨＡは生分解性材料ではないため、欠損が修復された後も体内に残存し続けるという問題はあるものの、本発明のインプラント材料として使用しうることが確認された。
ラットのようなげっ歯類は一般にアデノウイルスに感染しにくいため、ヒトの十倍以上の濃度を使用する必要があるといわれている。例えば、直接体内へ導入する場合、１０８から１０１０ｐｆｕのウイルスを注射するという（Ｏｋｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）ｖｏｌ  ７０（３）：３２５−３６，Ｔｒｕｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００３），ｖｏｌ  １０（１０）：７５５−７６３，Ｈｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｖｕｌａｔｉｏｎ（２００３），ｖｏｌ  １０７（２１）：２６７７−２６８３）。本実施例では、１０９ｐｆｕ／ｍｌのウイルス液１ｍｌに２ｍｍ立方のブロックを１０〜２０個程度浸漬しているため、体内に導入されるウイルス量は１０９ｐｆｕよりさらに少ない。また、本発明の方法では、注射等による直接導入と異なり、ウイルスはブロックに吸着されているため、生体内移植後に血流に乗って拡散する可能性も低い。すなわち、本試験により、本発明の方法はより低濃度で効果的な骨軟骨再生を可能にすることが確認された。
実施例２：生体適合性材料を担体としたウイルスベクターの徐放研究（２）ＯＰＬＡコンポジット
１．アデノウイルスベクターの作製
マウスの骨芽細胞から単離したＴｏｔａｌ  ＲＮＡからＡＭＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＣｂｆａ１のｃＤＮＡに特異的なプライマーｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号２）とａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ５’−ＴＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＡＴＴＧＡ−３’（配列番号３）を用いてＰＣＲによりＣｂｆａ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ０１０２８４）を増幅し、シークエンスにより配列を確認した。Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡはＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＣＲ  ＩＩ−ＴＯＰＯ，ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして大量調製した。Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡを制限酵素ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶで切り出し、平滑末端化した。
マウスＶＥＧＦのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００９５０５）は、東京工業大学  渡辺氏より供与を受けた。ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡを大量調製し、制限酵素のＥｃｏＲＩで切り出した後、平滑末端化した。Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡあるいはＶＥＧＦ  ｃＤＮＡはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  ｋｉｔ（宝酒造，＃６１５１）を用いてコスミドベクターｐＡｘＣＡＬＮＬｗのＳｗａＩサイトに挿入し、Ｋｉｔの説明書に従って組換えアデノウィルス（Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１）を作製した。作製したウィルスの力価は、それぞれ約１０１１ＰＦＵ／ｍｌ、約２．５×１０９ＰＦＵ／ｍｌと、非常に高い感染効率であった。これらのウィルスはＥ１領域欠失のため、標的細胞内では増殖することはできず、一過性の性質をもつ。また、目的遺伝子の上流にスタッファーをもつため、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ウィルスと共感染のときのみ遺伝子を発現する。Ｃｒｅリコンビナーゼ発現アデノウィルス（Ａｄｖ−ｃｒｅ）はキットに付属されていたものを用いた。
２．ラット生体内移植実験
担体としてＢＤ  ３Ｄ  ＯＰＬＡコンポジット（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、＃３５４６１４、５ｍｍ×３ｍｍ×０．０３９ｃｍ２）を用い、生体内移植実験を行った。ＢＤ  ３Ｄ  ＯＰＬＡ（Ｏｐｅｎ−Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ）コンポジットは、Ｄ、Ｄ−Ｌ、Ｌポリ乳酸から合成された合成ポリマーコンポジットで、高密度懸濁細胞の培養に効率的な多面体構造を有している。
２．１  ラット背上皮皮下移植実験
ＯＰＬＡコンポジットは、Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１とＡｄｖ−ｃｒｅの組換えアデノウィルス混合液（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）に減圧下で脱気しながら２分間浸漬し、その後３時間以上静置した。ウィルス液を吸着させたＯＰＬＡコンポジットはラットの背上皮皮下に移植した。ウィルス吸着ＯＰＬＡコンポジットあるいは未処理のＯＰＬＡコンポジットは数週間後に摘出して解析した。
２．２  ラット大腿骨欠損部位移植実験
骨補填材料として上記ＢＤ  ３Ｄ  ＯＰＬＡコンポジット（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、＃３５４６１４、５ｍｍ×３ｍｍ×０．０３９ｃｍ２）を用いた。滅菌下で四等分したＯＰＬＡコンポジットをＣｂｆａ１（Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１）あるいはＶＥＧＦ（Ａｄｖ−ＶＥＧＦ）とＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子（Ａｄｖ−ｃｒｅ）の組換えアデノウィルス混合液（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）に減圧下で脱気しながら２分間浸漬し、その後３時間以上静置した。ラットの大腿骨に直径２．５ｍｍ、深さ２ｍｍの穴をドリルで開けて欠損部位を作製し、ウィルス液を吸着させたＯＰＬＡコンポジットをそこに移植した。ウィルス吸着ＯＰＬＡコンポジットあるいは未処理のＯＰＬＡコンポジットは数週間後に摘出して解析した。
３．組織切片作製、染色法
摘出したコンポジットを４％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，０．０５％  ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅでマイクロウェーブ固定した後、翌日１０％  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で約１週間脱灰した。脱灰後、エタノールで脱水し、レモゾールで透徹し、パラフィンに包埋した。５μｍの厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、ヘマトキシリン続いてエオジンで染色した。サンプルは光学顕微鏡（ＩＸ−７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察し、ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ｃｆ，ＲＯＰＥＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により取り込んだデジタルイメージはＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。
免疫染色については、５μｍの厚さで切片を作製し、脱パラフィン後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で５分間処理し、続いてＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で処理した。切片をＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で非特異的蛋白質の吸着をブロッキングし、一次抗体のｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と一晩、４℃でインキュベートした。二次抗体のＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｅｉｅｎｃｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加えて一時間インキュベートし、ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて発色させた。その後、ヘマトキシリンで核染色した。サンプルは光学顕微鏡（ＩＸ−７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察し、ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ｃｆ，ＲＯＰＥＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により取り込んだデジタルイメージはＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。
結果：
１．ラット背上皮皮下移植実験結果
図９に、ヘマトキシリン−エオジン染色像の観察結果（移植後２０日および８週目）を示す。Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１ウィルス吸着コンポジットの方は骨が再生されている様子が観察できる（写真右側、矢印）。一方コントロールのコンポジットの方は、皮下の脂肪等の細胞が浸潤してきている様子は観察されるが骨化は進行していない（写真左側、＊印）。
図１０に、オステオカルシン免疫染色像の観察結果（移植後２０日目）を示す。オステオカルシンはポアの表面に接着している細胞で強く発現しており、石灰化が生じている部位でも観察された。オステオカルシンの局在は石灰化が生じており、骨が再生されていることを示している（写真、矢印）。
２．ラット大腿骨欠損部位移植実験結果
図１１に、ヘマトキシリン−エオジン染色像の観察結果（移植後１０日および２０日目）を示す。Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１ウィルス吸着コンポジットの方が、皮質骨の部分の骨再生が進行しており、皮質骨の欠損部位の大きさが小さくなってきている様子が観察された（写真上段）。また移植後２０日目のサンプルでは、移植したコンポジットの溶解および順調な骨再生が観察され、さらに移植したコンポジットと皮質骨の融合が観察できた（写真下段、右側）。一方、ウィルスを吸着していないコンポジット（コントロール）では、移植後１０日目では骨再生がほとんど観察されず、２０日目でもコンポジットと皮質骨との融合も顕著ではない。これらの結果は、Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１ウィルス吸着コンポジットでは、移植期間中に生体内でＡｄｖ−Ｃｂｆａ１が徐々に溶け出して周囲の細胞に働きかけ、活性化することにより迅速な骨再生を誘導できることを示唆する。
図１２に、ヘマトキシリン−エオジン染色像の観察結果（移植後３週目）を示す。Ａｄｖ−Ｃｂｆａ１ウィルスおよびＡｄｖ−ＶＥＧＦウィルス吸着コンポジットでは、移植したコンポジットの溶解が顕著であり、コンポジット内部の骨再生が進行している様子が観察された（写真下段）。特に、皮質骨部位における迅速な骨再生、および移植したコンポジットと皮質骨の融合が観察された（写真下段）。
以上より、本発明の方法はＯＰＬＡコンポジットを徐放性担体として用いた場合にも、効果的な骨軟骨再生を可能にすることが確認された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、より安全かつ簡便な骨・軟骨再生が可能となる。本発明のインプラントは、歯科領域あるいは整形外科領域における安全かつ簡便な骨・軟骨再生手段として利用できる。
【配列表フリーテキスト】配列番号２−人工配列の説明：Ｃｂｆａ１増幅用センスプライマー
配列番号３−人工配列の説明：Ｃｂｆａ１増幅用アンチセンスプライマー
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005035014.tif 000016
【図１１】
2005035014.tif 000017
【図１２】
2005035014.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月4日(2005.8.4)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】骨誘導性転写因子Ｃｂｆａｌの遺伝子を導入したアデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含む生体適合性材料からなるインプラント。
【請求項２】（削除）
【請求項３】（削除）
【請求項４】生体適合性材料が、ハイドロキシアパタイト、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、及びポリグリコール酸、ならびにこれらの２種以上で構成される複合体からなる群より選ばれるいずれかである、請求項１に記載のインプラント。
【請求項５】（削除）
【請求項６】生体適合性材料がハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、またはＤ、Ｄ−Ｌ、及びＬポリ乳酸から合成された合成ポリマーコンポジットからなる多孔体である、請求項４に記載のインプラント。
【請求項７】生体適合性材料がβ−ＴＣＰ多孔体である、請求項６に記載のインプラント。
【請求項８】アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターが生体適合性材料に吸着されている、請求項１、４、６、および７のいずれか１項に記載のインプラント。




【国際調査報告】
2005035014.tif 000019
2005035014.tif 000020
2005035014.tif 000021
2005035014.tif 000022