(57)【要約】遺伝子治療を行った際の目的タンパク質の血中濃度をより高感度にモニターでき、かつ、標識ペプチドが生理作用を持たずに多くの動物で免疫原性がない、遺伝子治療用ベクターが開示されている。遺伝子治療用ベクターは、哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持ち、哺乳類細胞内で前記融合タンパク質を生産させることができる遺伝子治療用ベクター。
【請求項２】
前記グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域は、前記目的タンパク質領域のＣ末端に結合される請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記目的タンパク質が、サイトカイン若しくはサイトカインに免疫グロブリンの定常領域を付加した融合タンパク質、成長因子、ホルモン若しくは細胞接着因子又はこれらのレセプターである請求項１又は２記載のベクター。
【請求項４】
前記サイトカイン又はそのレセプターが、インターフェロン及びそのレセプター、ＣＴＬＡ４、インターロイキン及びそのレセプターから成る群から選ばれる請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子治療用ベクターの有効量を、前記目的タンパク質の体内又は培養哺乳動物細胞内発現が望まれる哺乳動物又は培養哺乳動物細胞に投与することを含む、遺伝子治療方法。
【請求項６】
前記遺伝子治療用ベクターを、哺乳動物に投与する請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子治療用ベクターの、遺伝子治療用薬剤の製造のための使用。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物又は培養哺乳動物細胞から採取された被検試料中の、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域を免疫測定することを含む、前記遺伝子治療用ベクターの発現により体内又は培養細胞内で生産された前記目的タンパク質の定量方法。
【請求項９】
前記被検試料が、前記遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物から採取されたものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記被検試料が、血液試料である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドから成る、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤。
【請求項１２】
グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドから成る、哺乳動物体内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤。
【請求項１３】
哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質を、標識剤としてのグルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、体内又は培養細胞内で生産される目的ペプチドを、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドで標識することを含む、体内又は培養細胞内で生産されるタンパク質の標識方法。
【請求項１４】
哺乳動物体内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質を、標識剤としてのグルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、体内で生産される目的ペプチドを、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドで標識することを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドの、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞において外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤としての使用。
【請求項１６】
グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドの、哺乳動物体内において外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体内又は培養細胞内で生産された目的タンパク質を簡便に定量することができる、生体内で目的タンパク質を生産するための遺伝子治療用ベクターに関する。
【背景技術】  患者の体内で目的のタンパク質を生産させる遺伝子治療を行った際、目的のタンパク質の血中濃度はその蛋白のＥＬＩＳＡ法など、測定法が確立している場合は可能であるが、確立していない場合は濃度測定ができない。そこで、標識蛋白を用いて、その蛋白濃度を測定するアッセイ法が実用化され販売されている。しかし、この測定感度は低く、遺伝子治療における血中濃度測定として確立した方法はない。文献（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｕｐｕｓ  ｗｉｔｈ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＩＦＮ−γＲ／Ｆｃ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｊｕｌｙ  ２０００，ｖｏｌｕｍｅ  １０６，Ｎｕｍｂｅｒ  ２  ｐ２０７−２１５）では目的のタンパク質を測定せずに影響を受けるタンパク質を定量化して間接的に目的のタンパク質の発現を証明している。これは血中濃度測定の難しさを示していると考えられる。
【発明の開示】
本発明の目的は、遺伝子治療を行った際の目的タンパク質の血中濃度を高感度にモニターでき、標識に起因する不所望の生理作用や抗原抗体反応がほとんど引き起こされない、遺伝子治療用ベクターを提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子治療により体内で生産させるべき目的タンパク質と、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだベクターで遺伝子治療を行うことにより、上記グルカゴンペプチドを標識として目的タンパク質の血中濃度を高感度に測定することができ、かつ、標識ペプチドに起因する不所望な生理作用の発現や免疫反応の誘起がほとんどないことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、哺乳類細胞用発現ベクターに、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域と、体内で生産させるべき目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸を組み込んだ構造を持ち、哺乳類細胞内で前記融合タンパク質を生産させることができる遺伝子治療用ベクターを提供する。また、本発明は、上記本発明の遺伝子治療用ベクターの有効量を、前記目的タンパク質の体内又は細胞内発現が望まれる哺乳動物又は培養哺乳動物細胞に投与することを含む、遺伝子治療方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の遺伝子治療用ベクターの、遺伝子治療用薬剤の製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の遺伝子治療用ベクターを投与された哺乳動物又は培養哺乳動物細胞から採取された被検試料中の、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド領域を免疫測定することを含む、前記遺伝子治療用ベクターの発現により体内又は培養哺乳動物細胞内で生産された前記目的タンパク質の定量方法を提供する。さらに、本発明は、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドから成る、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤を提供する。さらに、本発明は、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞において、外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質を、標識剤としてのグルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドとの融合タンパク質として発現させることにより、体内又は培養細胞内で生産される目的ペプチドを、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドで標識することを含む、体内又は培養細胞内で生産されるタンパク質の標識方法を提供する。さらに、本発明は、グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチドの、哺乳動物体内又は培養哺乳動物細胞内において外部から投与された発現ベクターの発現により生産される目的タンパク質の標識剤としての使用を提供する。
本発明により、標識ペプチドは生理作用を持つことなく、目的タンパク質の血中濃度を高感度に測定することを可能にする遺伝子治療用ベクターが初めて提供された。グルカゴンのＣ端側１９−２９は、それ自体生理作用を有さず、各種哺乳動物においてよく保存されているので、免疫反応を実質的に誘起せず、それでいて市販の免疫測定キットを用いて高感度に免疫測定することにより定量することが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図２は、図１の続きを示す図である。
図３は、図２の続きを示す図である。
図４は、実施例１〜５で用いた哺乳動物用発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳの遺伝子地図である。
図５は、実施例１における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
図６は、実施例１において測定された、本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行った場合の目的タンパク質の血中濃度並びに本発明のベクターを用いて遺伝子治療を行った場合及びグルカゴン由来標識ペプチドを融合していない目的タンパク質をコードする核酸を挿入したベクターを用いて遺伝子治療を行った場合の血糖値の経時変化を示す図である。
図７は、実施例２で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図８は、図７の続きを示す図である。
図９は、図８の続きを示す図である。
図１０は、実施例２における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
図１１は、実施例２及び比較例２における、ラットの移植心臓の生着日数を示す図である。
図１２は、実施例３で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図１３は、図１２の続きを示す図である。
図１４は、図１３の続きを示す図である。
図１５は、比較例３で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図１６は、図１５の続きを示す図である。
図１７は、実施例３における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
図１８は、実施例３及び比較例３における、ラットの心筋炎病変部位の面積率を示す図である。
図１９は、実施例４で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図２０は、図１９の続きを示す図である。
図２１は、図２０の続きを示す図である。
図２２は、実施例４における、遺伝子治療用ベクターの投与後の日数と、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との関係を示す図である。
図２３は、実施例４及び比較例４における、ラットの心筋炎病変部位の面積率を示す図である。
図２４は、実施例５で作製した遺伝子治療用ベクターに挿入された、挿入核酸断片の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列と共に示す図である。
図２５は、実施例５における、グルカゴン由来標識ペプチドを測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度と、ヒトインターロイキン８を測定することにより測定された目的タンパク質の血中濃度との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のベクターにより、目的タンパク質と融合されて発現される、「グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド」とは、グルカゴンのＣ末端から数えて１９番目から２９番目までの合計１１個のアミノ酸から成るペプチドを意味する。すなわち、このペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドである。この「グルカゴンのＣ端側１９−２９アミノ酸ペプチド」は、目的タンパク質の標識として用いられるので、以下、便宜的に「グルカゴン由来標識ペプチド」と呼ぶことがある。
本発明のベクターには、グルカゴン由来標識ペプチド領域と、目的タンパク質領域との融合タンパク質をコードする核酸が組み込まれている。
本発明に用いられる哺乳類細胞用発現ベクターは、遺伝子治療の分野において周知であり、哺乳類細胞用発現ベクターであれば限定されない。本発明の特徴は、目的タンパク質の標識としてのグルカゴン由来標識ペプチド領域を、目的タンパク質と融合させて発現させる点にあり、哺乳類細胞用発現ベクターは、何ら限定されるものではなく、遺伝子治療の分野で用いられている公知のいずれの哺乳類細胞用発現ベクターをも用いることができる。プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよいが、安全性の観点からプラスミドベクターが好ましい。種々の哺乳類細胞用発現ベクターが周知であり、また、市販されており、これらの周知又は市販のベクターを好ましく用いることができる。周知又は市販ベクターの例として、ｐＣＡＧＧＳ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆａｃｔａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ，Ｇｅｎｅ  １９９１  Ｄｅｃ．１５，１０８（２）ｐ１９３−Ｐ１９９．、遺伝子地図を図４に、その塩基配列を配列表の配列番号３に示す）、プロメガ社のｐＣＩベクター、ｐＳＩベクター及びｐＴＡＲＧＥＴベクター並びにインビトロジェン社のｐｃＤＮＡ５／ＴＯ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
遺伝子治療により体内で生産させようとする目的タンパク質は、何ら限定されるものではなく、インターフェロン、インターロイキン及びＣＴＬＡ４のような種々のサイトカイン、成長因子、インスリン等のホルモン及び細胞接着因子等並びにこれらのレセプターを例示することができる。また、任意の抗原タンパク質を体内で生産させ、遺伝子ワクチンとすることもできる。また、目的タンパク質自体が融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｆｃレセプターとの結合が求められる所望のサイトカインの一端に、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）を融合し、Ｆｃレセプターとの結合性を高めたものを目的タンパク質とすることもできる（下記実施例１〜４参照）。ＩｇＧのＦｃ領域をコードする核酸の塩基配列は、周知であり、例えば、ヒトのＩｇＧ  Ｆｃ領域をコードする核酸の塩基配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ０２０８２３等に記載されており、ラットのＩｇＧ  Ｆｃ領域をコードする核酸の塩基配列は本願の図１ないし図３等に示されている。
本発明のベクターは、目的タンパク質と、上記標識ペプチドとの融合タンパク質をコードする核酸を、哺乳類細胞用発現ベクターのクローニングサイトに挿入することにより得られる。なお、標識ペプチドは、目的タンパク質の一端、特にＣ末端に融合させることが好ましい。
遺伝子治療は、本発明の遺伝子治療用ベクターを、哺乳動物に投与することにより行うことができる。投与経路は、静脈注射や筋肉内注射のような非経口投与が好ましい。ベクターの投与量は、目的タンパク質の性質や治療すべき疾患の種類及び程度等に応じて適宜設定することができるが、体重１ｋｇ当りのベクターの投与量は、通常、１ｍｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは２ｍｇ〜４ｍｇ程度である。製剤としては、例えば、遺伝子治療用ベクターをリンゲル液に溶解した溶液を注射液として用いることができる。これに医薬製剤の分野で周知の注射剤用添加剤を添加することも可能である。あるいは、本発明の遺伝子治療用ベクターは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に投与することもできる。すなわち、患者のリンパ球や骨髄細胞等の細胞を体外に取り出して培養し、培養細胞に遺伝子ベクターを投与し、目的タンパク質の生産能を獲得した細胞を再び患者に戻す遺伝子治療があるが、本発明の遺伝子治療用ベクターは、このような培養哺乳動物細胞に投与することもできる。あるいは、遺伝子治療用ベクターの治療効果をインビトロで調べるため等の実験において培養される哺乳動物細胞に投与することもできる。
遺伝子治療において、体内に導入されたベクターにより上記目的タンパク質とグルカゴン由来標識ペプチドとの融合タンパク質が生産される。あるいは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを投与する場合には、該培養細胞内で上記目的タンパク質とグルカゴン由来標識ペプチドとの融合タンパク質が生産される。目的タンパク質は、標識ペプチドと融合しているので、目的タンパク質の濃度は、グルカゴン由来標識ペプチドの濃度を測定することにより測定することができる。なお、本発明で用いられるグルカゴン由来標識ペプチドを免疫測定するキット（グルカゴン由来標識ペプチドを抗原として得られる抗体を含む）が市販されている（第一ラジオアイソトープ研究所製膵グルカゴンＲＩＡキット等）ので、このような市販の免疫測定用キットを用いて容易に測定することができる。
グルカゴン由来標識ペプチドを定量する被検試料は、本発明の遺伝子治療用ベクターを投与された個体由来の各種体液や組織等又はそれらの希釈物であり、好ましくは、全血、血清若しくは血漿又はそれらの希釈物のような血液試料である。あるいは、インビトロで培養されている哺乳動物細胞に遺伝子治療用ベクターを投与する場合には、培養細胞のホモジネートや培養上清等である。
実施例１、比較例１
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇｃｃｃａｇａａａｃｔｇｔｇ−３’と５’−ｔｃａａｃｃａｃｔｇｃａｃａａａａｔｃｔｔｇｇｇｃｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｇｔｇｇｇａｇａｇａｃｔ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、さらにそのＰＣＲ産物を３００倍希釈したものを鋳型として、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇｃｃｃａｇａａａｃｔｇｔｇ−３’と５’−ｇａｇａｇａｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｇｔａｔｔｃａｔｃａａｃｃａｃｔｇｃａｃａａａａｔｃｔｔｇｇｇｃ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、増幅産物を、ＥｃｏＲＩを用いて上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのクローニングサイトに組み込んだ。これにより、ＳｗａＩとＮｏｔＩの制限酵素部位の入ったｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ−ｇｌｕ１９−２９（免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域をコードする領域の下流に、グルカゴン由来標識ペプチドをコードする領域が結合された核酸断片がｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入されたもの）が得られた。
次に、ラット心筋炎の心臓のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇａｔｔｃｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｃｃｔｇａｔｇ−３’と５’−ｇｃａｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃａｔｃａｔｇｇａｇａａａ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を、先に作成したｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ−ｇｌｕ１９−２９にＳｗａＩとＮｏｔＩを用いて組み込んだ。
これにより、上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に、配列表の配列番号２に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するＤＮＡ断片が挿入された、本発明のベクターを作製した（実施例１）。なお、配列番号２を他の情報と共に図１ないし図３に示す。図１ないし図３に示されるように、挿入した核酸断片は、両端にＥｃｏＲＩ部位を有し、インターフェロンγレセプター（ＩＦＮγＲ）タンパク質と、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域の融合タンパク質をコードする領域の下流に、グルカゴン由来標識ペプチドをコードする領域が結合されたもの（ＩＮＦγＲ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９）である。
グルカゴン由来標識ペプチドを含まないプラスミドベクター（比較例１）と、上記のように作成したグルカゴン由来標識ペプチドを含む本発明のプラスミドペクター（実施例１）を、それぞれ７匹のラットの尾静脈から急速静脈注射し、遺伝子治療を行った。注射液の組成は、一匹あたり８００μｇのプラスミドを２０ｍｌのリンゲル液に溶解したものであった。注射後、経時的に血液を採取し、採血して得た１〜１０μｌの血漿を１００〜１０００倍希釈し、市販のＲＩＡキット（第一ラジオアイソトープ研究所製膵グルカゴンＲＩＡキット等）を用いて、該キットの添付文書に従ってグルカゴン由来標識ペプチドの濃度、ひいては、目的タンパク質（本実施例では、ＩＦＮγＲ／ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質）の濃度を測定した。すなわち、ＲＩＡは、具体的には次のようにして行なった。アッセイ用緩衝液４００μｌに標準グルカゴン溶液あるいは希釈した被検血漿を２００μｌ加え、さらにグルカゴン−１２５Ｉ溶液を１００μｌ、グルカゴン抗血清溶液を１００μｌ加え、４℃、４８時間放置した。その後、第二抗体を１００μｌ、グルカゴンＲＩＡ用沈殿安定剤４００μｌを加え４℃、３０分間放置し、遠心分離（２０００ｘｇ３０分間、４℃）後、上清除去後計数率を測定し濃度を求めた。
図５は血中濃度の測定結果である。実施例１では、静脈注射後１日目２８７０±１０６２ｎｇ／ｍｌ（平均±標準偏差）、３日目１４４０±３３４ｎｇ／ｍｌ、７日目１１２０±４３３ｎｇ／ｍｌ、１６日目２８１±１６２ｎｇ／ｍｌ、との結果が得られ、全例で測定可能であった。一方、グルカゴンペプチドを含まないプラスミドペクターでの遺伝子治療（比較例１）では同様な検査ですべて感度以下であった。
図６はプラスミド静脈注射４，８，１２時間後の血糖値及び上記と同様にＲＩＡ測定法で検査した蛋白血中濃度の値である。実施例１では、血中濃度は４時間後２８１５±２３１８ｎｇ／ｍｌ、８時間後６０６１±２７８９ｎｇ／ｍｌ、１２時間後５７５２±２２７０ｎｇ／ｍｌを示し、最大血中濃度を示した８−１２時間後の血糖は、８時間後８９．３±１５．１ｍｇ／ｄｌ（実施例１）ｖｓ８１．８±７．５ｍｇ／ｄｌ（比較例１）、１２時間後６３．５±５．７ｍｇ／ｄｌ（実施例１）ｖｓ７１．４±６．９ｍｇ／ｄｌ（比較例１）と差はなかった。
以上の結果から、本発明のベクターを用いることにより、ベクター投与の数十日後まで、極少量の血漿サンプルから、目的タンパク質の血中濃度を十分測定することが可能であることが明らかになった。
実施例２、比較例２
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇｇｃｔｔｇｔｃｔｔｇｇａｃｔｃｃａｇａｇｇ−３’と５’−ｇｃａｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃａｔｇｇｔｔｃｔｇｇ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を、実施例１記載の方法で作製したｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ−ｇｌｕ１９−２９にＳｗａＩとＮｏｔＩを用いて組み込んだ。
これにより、図７ないし９及び配列番号４に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットＣＴＬＡ４−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９（ラットＣＴＬＡ４コード領域の下流にラットＩｇＧ  Ｆｃコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入された、ラット細胞内でＣＴＬＡ４−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９を発現する組換えベクターが作製された（実施例２）。比較のため、ＣＴＬＡ４コード領域を含まないＩｇＧ−グルカゴン１９−２９コード領域のみを挿入した組換えベクターも作製した（比較例２）。
心臓移植後のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、移植心臓の生着日数も調べた。
結果を図１０及び図１１に示す。図１０に示されるように、実施例２では、ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９蛋白が図７のように推移した。つまり前値は１００倍希釈ではグルカゴンが測定不能であったが、１日目に急激に上昇し、５０００ｎｇ／ｍｌを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した１０５日後まで、１０００ｎｇ／ｍｌを越えるような蛋白濃度を示した。また、図１１に示されるように、実施例２では、１０匹中１匹が１４日目に拒絶されたが、残りの９匹はすべて評価した１０５日まで生着していた。ＣＴＬＡ４を含まないｐＣＡＧＧＳ−ＳＰ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９で治療した群（比較例２）では、５匹中１匹が５日目に、１匹が６日目に、３匹が７日目に拒絶された。これは有意にｐＣＡＧＧＳ−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９治療の有効性を示している。
実施例３、比較例３
ラットのレクチンで刺激した培養脾細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇｇｃａｃｔｃｔｇｇｇｔｇａｃｔｇｃａｇｔｃ−３’と５’−ｇｃａｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｔｇｇｃｃａｔａｇｃｇｇａａａａｇｔｔｇｃｔｔ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を実施例１記載の方法で作製したｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ−ｇｌｕ１９−２９にＳｗａＩとＮｏｔＩを用いて組み込んだ。
これにより、図１２ないし１４及び配列番号５に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９（ラットインターロイキン１３（ＩＬ１３）コード領域の下流にラットＩｇＧ  Ｆｃコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入された、ラット細胞内でＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９を発現する組換えベクターが作製された（実施例３）。比較のため、ＩＬ１３コード領域を含まないＳＰ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９コード領域（配列番号６並びに図１５及び図１６）のみを挿入した組換えベクターも作製した（比較例３）。
自己免疫性心筋炎ラット（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｓｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９０，ｖｏｌｕｍｅ  ５７，ｐ２５０−２６２．）のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、投与１６日後に屠殺、解剖し、心筋炎病変部位の病変面積率も調べた。
結果を図１７及び図１８に示す。ＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９蛋白が図１７のように推移した。つまり、１日目に２０００ｎｇ／ｍｌを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した１６日後まで、約８ｎｇ／ｍｌの蛋白濃度を示した。また、図１８に示すように、本発明の遺伝子治療用ベクターであるｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９（ＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９を挿入したベクターｐＣＡＧＧＳ）を投与した群では、ＩＬ１３を含まないｐＣＡＧＧＳ−ＳＰ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９を投与した群に比べて、有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ１３−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９治療の有効性が示された。
実施例４、比較例４
マウスのレクチンで刺激した培養脾細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇｇａａａｔｃｔｇｃｔｇｇｇｇａｃｃｃｔａｃ−３’と５’−ｇｃａｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔｇｇｔｃｔｔｃｃｔｇｇａａｇｔａｇａａｃｔｔ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を実施例１記載の方法で作製したｐＣＡＧＧＳ−ＩｇＧ−ｇｌｕ１９−２９にＳｗａＩとＮｏｔＩを用いて組み込んだ。
これにより、図１９ないし２１及び配列番号７に示す塩基配列（制限酵素部位も含めて示す）を有するラットＩＬ１ＲＡ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９（ラットインターロイキン１レセプターアンタゴニストコード領域の下流にラットＩｇＧ  Ｆｃコード領域、その下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏ  ＲＩ部位に挿入された、ラット細胞内でＩＬ１ＲＡ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９を発現する組換えベクターが作製された（実施例４）。
自己免疫性心筋炎ラット（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｓｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９０，ｖｏｌｕｍｅ  ５７，ｐ２５０−２６２．）のラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、血中濃度を測定した。また、投与１６日後に屠殺、解剖し、心筋炎病変部位の病変面積率も調べた。比較のため、上記比較例３のベクターも投与した（比較例４）。
結果を図２２及び図２３に示す。図２２に示すように、実施例４では、ＩＬ１ＲＡ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９蛋白が図２２のように推移した。つまり、１日目に２０００ｎｇ／ｍｌを越えるような蛋白濃度を示し、その後徐々に低下したが、評価のため屠殺した１６日後まで、約２０ｎｇ／ｍｌの蛋白濃度を示した。また、図２３に示すように、実施例４では比較例４に比べて、有意に心筋炎病変部位の面積が小さく、ｐＣＡＧＧＳ−ＩＬ１ＲＡ−ＩｇＧ−グルカゴン１９−２９治療の有効性が示された。
【実施例５】  ＳｗａＩとＮｏｔＩの制限酵素部位の入ったｐＣＡＧＧＳ−ｇｌｕ１９−２９を作るために、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇａｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｃｇｇｇｔａａａｇｃｃｃａａｇａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｔｇｇｔｔｇ−３’と５’−ｇａｇａｇａｇａｇａａｔｔｃｔｃａｇｇｔａｔｔｃａｔｃａａｃｃａｃｔｇｃａｃａａａａｔｃｔｔｇｇｇｃ−３’のプライマーのみでＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩを用いて、ｐＣＡＧＧＳのクローニングサイトに組み込んだ。
次にＣｏｓ７細胞のｃＤＮＡを鋳型として用い、５’−ｇａｇａａｔｔｃａｔｔｔａａａｔｇａｃｔｔｃｃａａｇｃｔｇｇｃｃｇｔｇｇｃｔ−３’と５’−ｇｃａｇｃａｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇａａｔｔｃｔｃａｇｃｃｃｔｃｔｔｃａａａａａ−３’をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を、先に作成したｐＣＡＧＧＳ−ｇｌｕ１９−２９にＳｗａＩとＮｏｔＩを用いて組み込んだ。
これにより、図２４及び配列番号８に示す塩基配列を有するヒトＩＬ８−グルカゴン１９−２９（ヒトインターロイキン８コード領域の下流にグルカゴン由来標識ペプチドコード領域を結合した核酸断片）が上記した哺乳類細胞用発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＥｃｏＲＩ部位に挿入された、ラット細胞内でＩＬ８−グルカゴン１９−２９を発現する組換えベクターが作製された（実施例５）。
ラットに、実施例１と同様にして組換えベクターを投与し、１日後に採血し、血中濃度を測定した。また、同じ試料中のヒトＩＬ−８の濃度も定量した。ヒトＩＬ−８の定量は、ＢＩＯＳＯＵＲＳＥ社製（Ｎｉｖｅｌｌｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ＩＬ−８  ＥＡＳＩＡキットを用いてそのプロトコールに従って行った。
結果を図２５に示す。図２５に示すごとく、両者のモル濃度はほぼ一致し、グルカゴン１９−２９の標識ペプチドを用いた方法の正確性が証明された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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