(57)【要約】熱ショックタンパク質又は熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターと磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤。この治療剤は、従来の温熱治療剤に比べ、各種の悪性腫瘍に対して高い治療効果を示す。
2004087208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショックタンパク質と磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤。
【請求項２】
熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターと磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤。
【請求項３】
磁性微粒子が、表面に悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した磁性微粒子である、請求項１又は２に記載の温熱治療剤。
【請求項４】
磁性微粒子がマグネタイトである、請求項１又は２に記載の温熱治療剤。
【請求項５】
マグネタイトがカチオン性リポソームで被覆されたマグネタイトである、請求項４に記載の温熱治療剤。
【請求項６】
熱ショックタンパク質がＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ１１０及びｇｐ９６から選択された１つ以上の熱ショックタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の温熱治療剤。
【請求項７】
熱ショックタンパク質がＨＳＰ７０である、請求項６に記載の温熱治療剤。
【請求項８】
熱ショックタンパク質又は熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターと磁性微粒子とを一緒に又は別々に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の温熱治療剤。
【請求項９】
熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターがｐＣＭＶｈｙｇｒｏ．ｈｓｐ７０である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の温熱治療剤。
【請求項１０】
悪性腫瘍の温熱療法における熱ショックタンパク質の使用。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質を悪性腫瘍に投与した後、該悪性腫瘍を温熱治療することを含む、悪性腫瘍の温熱治療方法。
【請求項１２】
悪性腫瘍の温熱治療における熱ショックタンパク質遺伝子の使用。
【請求項１３】
熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターを悪性腫瘍に注入して熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現した後、該悪性腫瘍組織を温熱治療することを含む、悪性腫瘍の温熱治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、悪性腫瘍の温熱治療剤、さらに詳しくは、熱ショックタンパク質と磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤に関する。
【背景技術】  これまで悪性腫瘍を治療するために、外科療法、放射線療法、抗ガン剤による化学療法が主として用いられてきた。診断技術や臨床技術も大きく進歩し悪性腫瘍の治療は不可能ではなくなってきている。
しかし、現在でも死亡原因に占める悪性腫瘍の割合は３割を越えており、悪性腫瘍に対する新しい治療法の開発が求められている。そのため新たな治療法として遺伝子療法、免疫療法、温熱療法などの方法の開発も始まっている。
上記した悪性腫瘍の新たな治療法の中で、温熱療法は、古代ギリシャから行われてきた古い治療法で、悪性腫瘍細胞が正常細胞に比べて熱に弱いという性質を利用した治療法である。温熱療法として広く用いられているのは、悪性腫瘍の組織がある部位を全体的に加温し、熱に弱い悪性腫瘍細胞を殺す方法である。
悪性腫瘍の温熱療法として、内部発熱体として磁性微粒子を用い、この磁性微粒子を電磁波により加熱する方法が知られている。悪性腫瘍組織の均一な加温による治療効果の向上のため、磁性微粒子として磁性マグネタイトを用いること、および、悪性腫瘍細胞へのマグネタイトの取り込み効率を高めるため、悪性腫瘍細胞の表面が負に帯電していることから、正の電荷をもった脂質膜（リポソーム）でマグネタイトを被覆することによりマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を作り、これを用いることが知られている（新海ら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ  Ｏｎｃｏｌ．，１０，１６８−１７７（１９９４）および新海ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，１２５−１３７（１９９４））。
悪性腫瘍の温熱療法は、それが非侵襲的な治療法であるために注目を集めているが、この温熱療法も、その単独使用では、種々の悪性腫瘍を完全に治療するのは困難である場合が多い。
したがって、種々の悪性腫瘍をより効果的に治療できる改良された温熱療法が求められている。
【発明の開示】
本発明は、悪性腫瘍の温熱療法、特に、磁性微粒子を使用する悪性腫瘍の温熱療法において、熱ショックタンパク質を用いると、その治療効果が飛躍的に改善することを見出すことにより達成されたものである。
したがって、本発明は、熱ショックタンパク質と磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤である。
また、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質遺伝子を悪性腫瘍細胞内で発現させたものであっても、上記と同様な効果が得られることが知見された。
したがって、さらに、本発明は、熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターと磁性微粒子とを含む悪性腫瘍の温熱治療剤である。
本発明の温熱治療剤は、熱ショックタンパク質と磁性微粒子とを、あるいは、熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターと磁性微粒子とを、一緒に含んでも、別々に含んでいても良い。
本発明に用いる熱ショックタンパク質は、本発明の効果を奏するものであれば特に限定されないが、好ましくは、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ１１０、ｇｐ９６から選択された１つ以上の熱ショックタンパク質であり、特に好ましくは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６である。
また、本発明に用いる熱ショックタンパク質の製造法は特に限定されず、該熱ショックタンパク質は、天然由来のもの、遺伝子組換えによるもの、化学合成によるものなどを含む。
本発明に用いる磁性微粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく使用でき、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックあるいはパーマロイなどの強磁性金属等を例示できる。
なお、前記磁性微粒子は、５μｍ以下、特に１μｍ以下の粒径であることが望ましい。
本発明に用いる磁性微粒子として好ましいのは、正の電荷をもった脂質膜（リポソーム）を利用して、これで磁性マグネタイトを被覆することにより調製したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）である。悪性腫瘍細胞の表面が負に帯電していることから、ＭＣＬは、悪性腫瘍細胞に選択的に集中する。ＭＣＬは、これを悪性腫瘍に直接注入すると、エンドサイトーシスによって悪性腫瘍細胞内に取り込まれることが確認された。
また、本発明に用いる磁性微粒子として好ましいのは、表面に悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した磁性微粒子である。抗体を結合した磁性微粒子は、悪性腫瘍細胞の付近に選択的に集中するので、悪性腫瘍細胞以外を過熱することなく温熱療法を行うことができる。
本発明の治療剤に使用する熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターは、熱ショックタンパク質遺伝子を適当な調節遺伝子とともに、プラスミドやウィルス等のベクターに発現可能なように組み込むことによって得られる。
本発明は、悪性腫瘍の温熱療法における熱ショックタンパク質の使用にも関する。すなわち、本発明は、熱ショックタンパク質を悪性腫瘍に投与した後、該悪性腫瘍を温熱治療することを含む、悪性腫瘍の温熱治療法、特に、熱ショックタンパク質と磁性微粒子とを悪性腫瘍に投与した後、該悪性腫瘍を電磁場におくことを含む、悪性腫瘍の温熱治療方法である。熱ショックタンパク質と磁性微粒子とは、同時にまたは時間をおいて、悪性腫瘍に投与することができるが、同時に投与するのが望ましい。熱ショックタンパク質と磁性微粒子は、悪性腫瘍組織およびその近傍に投与するのが望ましい。
本発明は、さらに、悪性腫瘍の温熱治療における熱ショックタンパク質遺伝子の使用に関する。すなわち、熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショック遺伝子を組み込んだベクターを悪性腫瘍に注入して悪性腫瘍内で熱ショックタンパク質を発現させた後、悪性腫瘍を温熱治療にすることを含む悪性腫瘍の温熱治療法、特に、本発明は、熱ショックタンパク質を悪性腫瘍細胞内で発現できるように熱ショックタンパク質遺伝子を組み込んだベクターを悪性腫瘍に注入して悪性腫瘍細胞内で熱ショックタンパク質を発現させ、次いで、磁性微粒子を該悪性腫瘍に投与した後、該悪性腫瘍を電磁場におくことを含む、悪性腫瘍の温熱治療方法である。磁性微粒子の悪性腫瘍への投与は、悪性腫瘍細胞内で熱ショックタンパク質が十分に発現した後に行うのが好ましい。
本発明における悪性腫瘍には、あらゆる種類の悪性腫瘍が含まれ得るが、例えば、悪性黒色腫等の皮膚ガン、肺ガン、大腸ガン、乳ガン、脳腫瘍、悪性組織球腫、骨肉腫、肝ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、食道ガン、膀胱ガン、肺ガン、卵巣ガン、子宮ガン、胃ガンがあげられ、特に、悪性黒色腫、肝ガン、前立腺ガン、大腸ガンがあげられる。
本発明の治療法で使用する電磁場としては、高周波磁場を用いることが好ましく、特に、周波数が１ＫＨｚ〜１０ＭＨｚの電磁波による高周波磁場であることが好ましい。１ＫＨｚより高い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、磁気ヒステリシス加熱の効率が高いからであり、１０ＭＨｚより低い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、誘導電流による生体の発熱を生起させることなく磁性微粒子を加熱することができるからである。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１に記載したｒｍＨＳＰ７０を使用する温熱免疫療法の実験の流れを示す。
図２は、実施例１において、ＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−γ産生能をアッセイした結果を示す。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理後の脾臓細胞集団がＩＦＮ−γを分泌する能力をＥＬＩＳＰＯＴアッセイで評価した。ＨＳＰ７０を投与し、磁場照射（温熱処理）したマウスからの脾臓細胞：○；磁場照射（温熱処理）したマウス：△；＊ｐ＜０．０１である。
図３は、実施例１における、磁場照射中の腫瘍（○）および直腸内（●）の温度変化を示す。データ点及びバーは、５匹のマウスの平均値及びＳＤを示す。
図４は、実施例１における、ｒｍＨＳＰ７０の投与と温熱療法の組合せによる腫瘍体積の変化を示す。Ａ群：ＭＣＬ注入後、温熱処理なし；Ｂ群：ＭＣＬ注入後、温熱処理あり；Ｃ群：ｒｍＨＳＰ７０を８０μｇ投与後、温熱処理なし；Ｄ群：ＭＣＬと２０μｇのｒｍＨＳＰ７０を投与後、温熱処理あり；Ｅ群：ＭＣＬと８０μｇのｒｍＨＳＰ７０を投与後、温熱処理あり。
図５は、実施例１における温熱療法後９０日間の担癌マウスの生存率を示す。Ａ群（ｎ＝１０）：■；Ｂ群（ｎ＝１０）：□；Ｃ群（ｎ＝１０）：●；Ｄ群（ｎ＝１０）：○；Ｅ群（ｎ＝１０）：△。
図６は、実施例１における、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する脾臓細胞の細胞毒性活性を示す。脾臓細胞は、温熱治療の２週間後にＥ群のマウス（○）およびナイーブマウス（●）からのものであった。エフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比は、１００：１〜２５：１であった。データポイントおよびバーは、３つの独立した実験の平均値およびＳＤを示す。
図７は、実施例２で使用したプラスミドの構造を示す。
図８は、実施例２における、ｈｓｐ７０遺伝子を用いる温熱免疫療法の実験の流れを示す。
図９は、実施例２における、ｈｓｐ７０遺伝子の投与と温熱療法の組合せによる抗腫瘍効果を示す。ＭＣＬの注入後、温熱治療なし：（Ｆ）；ＭＣＬの投与後、温熱治療：（Ｇ）；ｈｓｐ７０投与：（Ｈ）；ｎｕｌｌおよびＭＣＬ投与後、温熱治療：（Ｉ）；ｈｓｐ７０とＭＣＬの投与後、温熱処理（Ｊ）。
図１０は、実施例２における温熱療法後９０日間の担癌マウスの生存率を示す。Ｆ（無治療）群（ｎ＝１０）：■；Ｂ（温熱）群（ｎ＝１０）：□；Ｃ（ｈｓｐ７０）群（ｎ＝１０）：●；Ｄ（ｎｕｌｌ＋温熱）群（ｎ＝１０）：○；Ｅ（ｈｓｐ７０＋温熱）群（ｎ＝１０）：△。
図１１は、実施例２における、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する脾臓細胞の細胞毒性活性を示す。脾臓細胞は、温熱治療の２週間後にＪ群のマウス（○）およびナイーブマウス（●）からのものであった。エフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比は、１００：１〜２５：１であった。データポイントおよびバーは、３つの独立した実験の平均値およびＳＤを示す。
図１２は、実施例２における、ｉｎ  ｖｉｖｏ温熱治療の２４時間後の誘導型ＨＳＰ７０の濃度を示す。腫瘍における誘導型ＨＳＰ７０濃度をＥＬＩＳＡ法により決定した。無治療群（白色バー）；温熱群（灰色バー）；ｒｍＨＳＰ７０（８０μｇ）＋温熱群（点バー）；ｈｓｐ７０遺伝子＋温熱群（黒色バー）。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で使用する、表面に悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した磁性微粒子は、たとえば、特開平３−１２８３３１号公報に記載されている方法、すなわち、磁性微粒子に二官能性架橋剤を結合させた後、これに悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を反応させることにより製造できる。
前記悪性腫瘍細胞に選択的に結合する抗体としては、例えば、肺癌に対するモノクロナール抗体（ＨＢ４Ｃ５）、大腸癌に対するモノクロナール抗体（１７−１Ａ）、乳癌に対するモノクロナール抗体（Ｈ１５Ｆ２）等を使用することができる。
前記磁性微粒子が、強磁性金属である場合には、前記強磁性金属に酸化処理を施して表面に酸化被膜を形成した後、二官能性架橋剤を結合させることが有利である。
前記二官能性架橋剤を結合させる方法としては、例えば、磁性微粒子にγ−アミノプロピルトリエトキシシランおよびグルタルアルデヒドを順に結合させる方法、ビニルアルデヒドおよびアクリルアルデヒドを順に結合させる方法、あるいはアミノシランおよびポリエチレングリコールを順に結合させる方法等を使用することが有利である。
本発明で使用する熱ショックタンパク質は、原核生物、真核生物と広範囲に存在し、細胞内全タンパク質の約５％を占めている分子シャペロンタンパク質である。熱ショックタンパク質は、その名前の通り、熱などのストレスによって高発現し、細胞内タンパク質に占める割合も１５％まで上昇する。このように多く細胞内で発現している熱ショックタンパク質の働きは多様である。
本発明者は、熱ショックタンパク質が“抗原の運び手”として働き、悪性腫瘍細胞を加温することによって細胞表面のＭＨＣクラス１の発現量が増えることを確認している。
【実施例１】１  実験材料と実験方法
１−１  悪性腫瘍細胞と実験動物
悪性腫瘍細胞はマウス悪性黒色腫Ｂ１６メラノーマ細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）を用いた。この細胞は、１０％仔牛血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウム、０．１μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で、３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気の二酸化炭素インキュベーターで培養した。
マウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６メス、４週齢のものを使用した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）。
１−２  担癌マウス作製方法
Ｂ１６メラノーマ細胞２×１０６個を５０μｌのリン酸バッファー（ＰＢＳ、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）に懸濁させた。細胞懸濁液をマウス右大腿部の皮内に２９Ｇのシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて移植した。
１−３  マグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）の作製方法
磁性微粒子として、粒径１０ｎｍのマグネタイト（戸田工業製）を用いた。マグネタイトを水で十分に洗浄して余分なイオン成分を取り除き、超音波処理を行うことにより水に分散したマグネタイトコロイド溶液にした。リン脂質として、ＴＭＡＧ（Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタマートクロリド）（相互薬工製）、ＤＬＰＣ（ジラウロイルホスファチジルコリン）（Ｓｉｇｍａ製）、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）（Ｓｉｇｍａ製）をモル比１：２：２（ＴＭＡＧ：ＤＬＰＣ：ＤＯＰＥ）でクロロホルムに溶かし、この溶液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータで溶媒を除去し、フラスコの内壁にリン脂質膜を作製した。このリン脂質膜に上記の方法で作成したマグネタイトコロイド溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌを加えボルテックス撹拌しながらリン脂質膜を膨潤させた。膨潤させたリン脂質膜とマグネタイトに１５分間の超音波処理を施し（２８Ｗ）、その後、１０倍濃度の生理食塩水を加え、生理食塩水中に分散している状態にした。さらに超音波処理を１５分間行い（２８Ｗ）、マグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を得た。
１−４  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＨＳＰ７０タンパク質による免疫賦活（加温方法と腫瘍移植）
ＨＳＰ７０タンパク質を悪性腫瘍細胞に投与し、磁場照射を行ってから、Ｃ５７Ｂｌ／６の皮内に移植した。
タンパク質は組替えマウスＨＳＰ７０（ｒｍＨＳＰ７０、ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を使用した。磁場を照射する装置はトランジスタインバーター（ＬＧＨ−１００−０５；第一高周波工業製）と縦型コイル（内径７ｃｍ、長さ７ｃｍ）を使用した。磁場照射は細胞塊がコイルの中心にくるようにして行った。温度は交番磁場に影響されない光ファイバー温度計（ＦＸ−９０３０；安立計器）を用いて測定した。Ｂ１６メラノーマ細胞を１００ｍｍのディッシュに４×１０６個ずつ播種し、細胞が接着した後、ＭＣＬを培地に加えた（１００ｐｇ／細胞）。さらに１２時間後、遠心してペレット状に集めた。ここでｒｍＨＳＰ７０群の細胞には、ＰＢＳに溶解したＨＳＰ７０タンパク質を加えた（８０μｇ／１×１０７細胞）。コントロール群には同量のＰＢＳを加えた。
磁場照射を開始して細胞塊の温度が４３℃に達したら、磁場照射装置の出力を調整し、細胞塊の温度を４３℃に保った。磁場処理は３０分間とした。
磁場照射終了後、Ｂ１６メラノーマ細胞１×１０７個を上清と一緒にマウスの皮下に移植した。
１−５  脾臓細胞のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生能評価
ｅｘ  ｖｉｖｏでＢ１６メラノーマ細胞を加温し、移植したマウスの脾臓細胞のＩＦＮ−γ産生能をＥＬＩＳＰＯＴ法で測定した。測定にはマウスインターフェロン−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を用いた。
抗ＩＦＮ−γ抗体ｉ（ＡＮ１８；１５μｇ／ｍｌ）を親水性混合セルロースエステル膜装着プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）に１００μｌずつ入れコートした。４℃で一夜放置でした。ＰＢＳで洗浄し、５％ＢＳＡ入りのＰＢＳでブロッキングした（２時間，３７℃）。ブロッキング終了後、マウスの脾臓細胞（１．０×１０５個）を入れた。脾臓細胞は、移植から２週間後にマウスから脾臓を取り出し、Ｍｅｄｉａｍａｃｈｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）を使用し、細胞を分離した。その後０．７５％ＮＨ４Ｃｌを用いて溶血し、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ製）に懸濁させ細胞浮遊液（５．０×１０５個／ｍｌ）にした。これを３７℃で４０時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、抗ＩＦＮ−γ抗体ｉｉ（Ｒ４−６Ａ２；１μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ入れ、２時間室温で培養した。ＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼを１００μｌ加え１時間室温で培養した。培養後、基質（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；Ｍｏｓｓ）を１００μｌ加え１時間培養し、スポットが確認できたら水道水を入れ、反応をストップした。プレートが乾燥したら実体顕微鏡（ＳＺＨ１０；オリンパス製）を用いてスポット数を数えた。
１−６  ＭＣＬ投与と高周波磁場照射
ＭＣＬ（２０ｍｇ／ｍｌ）は腫瘍内に０．１ｍｌ注入した。ＭＣＬ注入は２６Ｇシリンジ（テルモ製）を用いて直接、腫瘍部分に注入した。注入スピードは０．２ｍｌ／ｈとした。
磁場を照射する装置はトランジスタインバーター（ＬＧＨ−１００−０５；第一高周波工業製）と横型コイル（内径７ｃｍ、長さ７ｃｍ）を使用した。磁場照射は麻酔下のマウスの腫瘍部分がコイルの中心にくるようにした。磁場照射中の腫瘍表面と直腸内の温度は交番磁場に影響されない光ファイバー温度計（ＦＸ−９０３０；安立計器製）を用いて測定した。腫瘍表面の温度が４３℃に達したら、磁場照射装置の出力を調整し、その温度を４３℃に保った。磁場処理は３０分間とした。
１−７  ＨＳＰ７０タンパク質との併用
タンパク質として、組換えマウスＨＳＰ７０（ｒｍＨＳＰ７０、Ｂｉｏ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を使用した。マウス１匹分のタンパク質を２０μｌのＰＢＳに溶解し、ＭＣＬ（２０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌと混合し、２６Ｇシリンジを用いて直接、腫瘍部分に注入した。注入スピードは０．２４ｍｌ／ｈとした。
１−８  治療スキーム
腫瘍組織移植の後、実験動物を５グループに分けた。Ａ群は、ＭＣＬ投与のみで高周波磁場は照射しなかった（無治療群）。Ｂ群は、ＭＣＬ投与後に高周波場を照射した（温熱群）。Ｃ群は、１匹あたりｒｍＨＳＰ７０タンパク質を８０μｇずつ投与した（ＨＳＰ投与群）。Ｄ群は、１匹あたり２０μｇのｒｍＨＳＰ７０タンパク質とＭＣＬを投与し、高周波磁場を照射した（ＨＳＰ（２０μｇ）＋温熱群）。Ｅ群は、１匹あたり８０μｇのｒｍＨＳＰ７０タンパク質とＭＣＬを投与し、高周波磁場を照射した（ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群）。どのグループも腫瘍部分の直径が平均６ｍｍに達した時点で治療を開始した。実験の流れを図１に示す。
治療効果を評価するため、腫瘍体積の計測を治療開始から３日おきに行った。
腫瘍体積（ｃｍ３）は、
（長径ｃｍ）×（短径ｃｍ）２×０．５
の計算式により算出した。
１−９  脾臓細胞による細胞傷害活性測定
治療開始から２週間後に脾臓を摘出し、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱併用群のマウス脾臓細胞をエフェクター細胞として細胞傷害活性の測定を行った。コントロールとしてナイーブマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６、７週齢のメス）の脾臓を用いた。脾臓から、Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）を使用し、細胞を分離した。その後０．７５％ＮＨ４Ｃｌを用いて溶血し、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ製）に懸濁させ細胞浮遊液にした。ターゲット細胞として、Ｂ１６メラノーマ細胞（１×１０６個／ｍｌ）を用いた。エフェクター細胞（５０μｌ）とターゲット細胞（５０μｌ）を同時に９６穴プレートに播種し、５００ｒｐｍで４分間遠心した。４時間、二酸化炭素インキュベーターで培養したのち、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥＴＭ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｇｅｍａ製）を用いて、ＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）を指標として、ターゲット細胞中の死細胞の割合を計算した。計算式は以下の通りである。
細胞毒性（％）＝（エフェクターとターゲット細胞を混合した蛍光強度）÷（全てのターゲット細胞をリシスバッファーで溶解した蛍光強度）×１００
なお、全てのターゲット細胞を溶解するために、キットに含まれるリシスバッファーを用いた。
１−１０  統計分析方法
治療開始から３０日後の腫瘍体積を比較し、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて有意性を評価した。生存率の有意性はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線のログランク検定によって評価した。
２  実験結果
２−１  ＨＳＰ７０タンパク質と温熱処理を併用したＢ１６メラノーマ細胞による免疫の活性化
ＥＬＩＳＰＯＴ法は免疫細胞が産生する抗体分子やサイトカインを染色しここの細胞レベルで検出する技術である。今回、サイトカインの一つであるＩＦＮ−γをＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）の指標として測定を行った。そこでＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて脾臓内リンパ球のＩＦＮ−γ産生能を測定することにより免疫が活性化されるか実験を行った。
ｅｘ  ｖｉｖｏ実験を行ってから２週間後のマウスの脾臓細胞を取りだしＥＬＩＳＰＯＴを行った。脾臓細胞１×１０５個あたりのスポット数を図２に示した。
ＨＳＰ７０を投与し温熱処理を行った場合、温熱処理だけと比べ、スポット数は多く（ｐ＜０．００５）、より多くの脾臓細胞がＩＦＮ−γを産生していることが確認された。つまり、ＨＳＰ７０を温熱処理した細胞と混ぜることにより、免疫を活性化することが分かった。
２−１  ＭＣＬを用いた温熱治療
ＭＣＬ投与直後に磁場を照射した。磁場照射中の腫瘍表面と直腸内の温度変化を図３に示した。腫瘍表面の温度は、磁場照射開始から２分後には４３℃に達した。その後、装置の出力を操作することによって３０分間、正確に４３℃で腫瘍を加温することができた。装置の出力を切ると腫瘍表面の温度は３８℃まで下がった。これに対して直腸内の温度は磁場照射中でもほとんど上昇せず、正常な値のままであった。
これらのことから、ＭＣＬを直接腫瘍に注入することによって腫瘍部分が特異的に加温されることが確認された。また、発熱量は装置の出力を調節することによって制御できた。
２−３  ＨＳＰ７０タンパク質と温熱治療の併用による抗腫瘍効果
図４に治療開始からの腫瘍体積変化を示した。無治療群では腫瘍体積は増え続けた。一方、温熱群、ＨＳＰ投与群、ＨＳＰ（２０μｇ）＋温熱群では１週間程度は腫瘍の増大は抑制されていたが、１週間以降の腫瘍体積は増え続け、３０日後の腫瘍体積では無治療群と有意な差は得られなかった。
これに対し、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群では３０日後まで腫瘍の増大は抑えられ、１０匹中２匹では完全に腫瘍がなくなった。また、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群の３０日後の腫瘍体積は他の４群すべてと有意な差が得られた。ＨＳＰ（２０μｇ）＋温熱群では腫瘍の増大は抑えられなかったが、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群では腫瘍の増大が抑えられていることから、ＨＳＰ７０タンパク質の投与量に依存して抗腫瘍効果が得られていることが分かる。
２−４  ＨＳＰ７０タンパク質と温熱治療の併用による生存期間の延長
図５に治療開始からの生存率の変化を示した。無治療群、温熱群、ＨＳＰ投与群、ＨＳＰ（２０μｇ）＋温熱群では５０日までに全て死亡した。それに対してＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群では５０日後でも５０％のマウスが生存していた。また、腫瘍が完全に治癒した２匹のマウスは９０日後でも生存しており、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群と無治療群、温熱群と比べて生存率において有意な差があった。腫瘍体積と同様にＨＳＰ７０タンパク質の投与量に依存して生存期間の延長が見られた。
２−５  抗腫瘍免疫の獲得
治療開始から２週間後、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群のマウスに抗腫瘍免疫が獲得されているか調べるために脾臓細胞のＢ１６メラノーマ細胞に対する細胞傷害性を測定した。結果を図６に示す。ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群の脾臓細胞はナイーブマウスよりも高い細胞傷害活性を示した。これらのことからＨＳＰ７０タンパク質と温熱療法を併用することによってＢ１６メラノーマ細胞に対する獲得免疫が賦活されていることが分かった。
実施例２  ｈｓｐ７０遺伝子を用いた温熱免疫療法
１  実験材料と実験方法
１−１  悪性腫瘍細胞と実験動物
悪性腫瘍細胞はマウス悪性黒色腫Ｂ１６メラノーマ細胞（Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）を用いた。培養は実施例１の１−１と同様の方法で行った。マウスはＣ５７Ｂｌ／６メス、４週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）を使用した。
担ガンマウスの作製は実施例１−２と同様の方法で行った。
１−２  遺伝子導入
プラスミドｐＣＭＶｈｙｇｒｏ．ｈｓｐ７０はＣＭＶプロモーターの下流にヒト誘導型ｈｓｐ７０ｃＤＮＡを持つ。ｐＣＭＶｈｙｇｒｏはＸｂａＩ、ＫｐｎＩサイトでブラントエンドライゲーションによりｈｓｐ７０ｃＤＮＡを取り除くことで得られた（図７）。
カチオニックリポソーム法により遺伝子導入を行った。ＭＣＬと同じ組成の脂質を用いてコニカルチューブ内で溶媒を除去し脂質膜を作製した。これにＰＢＳとプラスミド２０μｇを加えボルテックスし、最終濃度を０．２ｍｇ／ｍｌとなるように遺伝子懸濁液を調製した。この遺伝子懸濁液を２０μｌずつ５カ所から１匹あたり２０μｇの遺伝子を腫瘍に直接し、注入した。注入スピードは０．２ｍｌ／ｈとした。
１−３  ＭＣＬ投与と高周波磁場照射
ＭＣＬは実施例１の１−３と同様の方法で作製した。遺伝子導入を行った群は遺伝子導入の１日後にＭＣＬを投与した。ＭＣＬの投与方法、高周波磁場照射は実施例１の１−４と同様の方法で行った。
１−４  治療スキーム
腫瘍組織移植の後、実験動物を５グループに分けた。Ｆ群は、ＭＣＬ投与のみで高周波磁場は照射しなかった（無治療群）。Ｇ群はＭＣＬ投与後に高周波磁場を照射した（温熱群）。Ｈ群はｐＣＭＶｈｙｇｒｏ．ｈｓｐ７０を投与した（ｈｓｐ群）。Ｉ群はｐＣＭＶｈｙｇｒｏの導入とＭＣＬによる温熱治療を行った（ｎｕｌｌ＋温熱群）。Ｊ群はｐＣＭＶｈｙｇｒｏ．ｈｓｐ７０の導入とＭＣＬによる温熱治療を行った（ｈｓｐ＋温熱群）。どのグループも腫瘍部分の直径が平均６ｍｍに達した時、治療を開始した。治療効果を評価するため腫瘍体積の計測を治療開始から３日おきに行った。腫瘍体積の測定は実施例１の１−６と同様の方法で行った。図８に実験の流れを示した。
１−５  腫瘍における誘導型ＨＳＰ７０タンパク質の染色
腫瘍部分の直径が平均６ｍｍに達した時に、プラスミドｐＣＭＶｈｙｇｒｏ．ｈｓｐ７０を上記１−２の方法で遺伝子導入した。遺伝子導入から２４時間後、心臓からＰＢＳを環流する方法で脱血し、腫瘍を取りだした。腫瘍は摘出後すぐにＯ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラ精機製）に入れ、液体窒素で凍結した。組織を厚さ４μｍにスライスし、アセトンで５分間、固定した。凍結した切片は誘導型ＨＳＰ７０に特異的に結合する抗ＨＳＰ７０抗体（ｃｌｏｎｅ：Ｋ−２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で３７℃で６０分間培養した。次にビオチン化した２次抗体と培養し（３７℃，３０分）、続いてＦＩＴＣラベルをした抗体とさらに培養を行った（３７℃，３０分）。標本は蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。
１−６  細胞傷害活性測定
ｈｓｐ＋温熱群のマウス脾臓細胞をエフェクター細胞として細胞傷害活性測定を行った。測定方法、細胞傷害活性の計算方法は実施例１の１−７と同様の方法で行った。
１−７  腫瘍内における誘導型ＨＳＰ７０タンパク質量の測定
無治療群、温熱群、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群、ｈｓｐ＋温熱群のマウスの腫瘍における誘導型ＨＳＰ発現量の測定を行った。測定はＨｓｐ７０  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。磁場照射から２４時間後に心臓からＰＢＳを環流する方法で脱血を行い、腫瘍を摘出した。腫瘍はＭｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ）を使用し、細胞に分離した。その後は、キットのプロトコルに従い測定を行った。
１−８  統計分析方法
治療開始から３０日後の腫瘍体積を比較し、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定を用いて有意性を評価した。生存率の有意性はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線をログランク検定によって評価した。
２  実験結果
２−１  腫瘍内でのｈｓｐ７０遺伝子の発現
遺伝子導入してから２４時間後の腫瘍における誘導型ＨＳＰ７０タンパク質をＦＩＴＣにより検出した。ｎｕｌｌ遺伝子導入、無治療の腫瘍内では蛍光は全く観察されず、誘導型ＨＳＰ７０は発現していない。
ｈｓｐ７０遺伝子を導入した腫瘍では蛍光が観察された。Ｂ１６メラノーマ細胞の腫瘍においてリポソーム法によってｈｓｐ７０遺伝子が導入され、誘導型ＨＳＰ７０タンパク質として発現していることが分かった。
２−２  ＭＣＬを用いた温熱治療
ＭＣＬ投与直後に磁場を照射した。磁場照射中の腫瘍表面と直腸内の温度変化は実施例１のＨＳＰ７０タンパク質と温熱療法の併用を行った場合と同様であった。正常組織が過度の加温を受けることなく、ガン組織のみを加温することができた。
２−３  ｈｓｐ７０遺伝子治療と温熱治療の併用による抗腫瘍効果
治療開始からの腫瘍体積の変化を図９に示した。無治療群の腫瘍体積は増え続けた。温熱群、ｈｓｐ群、ｎｕｌｌ＋温熱群でも腫瘍の増大が一時的に抑制されているマウスもいるが、全体として腫瘍体積は増え続け、３０日後の腫瘍体積では無治療群と有意な差は得られなかった。
ｈｓｐ＋温熱群では３０日後まで腫瘍の増大は抑えられ、１０匹中３匹で腫瘍が完全に治癒した。また、ｈｓｐ＋温熱群の３０日後の腫瘍体積は他の４群全てと有意差が得られた。
２−４  ｈｓｐ７０遺伝子治療と温熱治療の併用による生存期間の延長
治療開始からの生存率の変化を図１０に示した。無治療群、温熱群、ｈｓｐ群、ｎｕｌｌ＋温熱群のマウスは全て５０日後までに死亡した。それに対してｈｓｐ＋温熱群では５０日後でも５０％のマウスが生存していた。また完全に腫瘍が治癒した３匹については９０日後でも生存していた。ｈｓｐ＋温熱群は生存率において他の４群に比べて有意な差が得られた。
２−５  抗腫瘍免疫の獲得
治療開始から２週間後、ｈｓｐ＋温熱群のマウスに抗腫瘍免疫が獲得されているかを調べるために脾臓細胞のＢ１６メラノーマ細胞に対する細胞傷害性を測定した。図１１に示したように、ｈｓｐ＋温熱群の脾臓細胞は、ナイーブマウスよりも高い細胞傷害活性を示した。
これらのことから、ｈｓｐ７０遺伝子による遺伝子治療と温熱療法の併用においてＢ１６細胞に対する抗腫瘍免疫が賦活されていることが分かった。
２−６  腫瘍内における誘導型ＨＳＰ７０の発現
無治療群、温熱群、ＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群、ｈｓｐ＋温熱群で、温熱処理から２４時間後に誘導型ＨＳＰ７０タンパク質の発現量の測定を行った（図１２）。
無治療群では、ＨＳＰ７０タンパク質ほとんど発現していなかった。温熱群とＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群では、わずかにＨＳＰ（８０μｇ）＋温熱群の方が多く発現しているが、有意な違いは見られなかった。このことから、温熱処理前に投与したＨＳＰ７０タンパク質が２４時間後にはほとんど残っていないことが分かる。これに対してｈｓｐ＋温熱群では温熱群の２倍の誘導型ＨＳＰ７０があった。これは温熱処理で生き残った細胞が遺伝子を発現しているためだと考えられる。
【産業上の利用の可能性】
本発明の悪性腫瘍の温熱治療剤は、従来の温熱治療剤に比べ、各種の悪性腫瘍に対して高い治療効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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