(57)【要約】本発明は、以下の（Ｅ１）〜（Ｅ３）の特徴を有する脱活性化した（ｅｘｐｉｒｅｄ）樹状細胞を提供する；（Ｅ１）自然免疫刺激剤及び永続的免疫活性化剤の作用により成熟型に移行しない；（Ｅ２）未成熟ＤＣと同様の形状を有する；（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する。また、本発明は、下記の特徴を有する永続的に活性化された樹状細胞を提供する；（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；（Ｍ２−４）ＣＤ８０，ＣＤ８３及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１種の発現量が高い。
2004063363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ｅ１）〜（Ｅ３）の特徴を有する脱活性化した（ｅｘｐｉｒｅｄ）樹状細胞：
（Ｅ１）自然免疫刺激剤及び永続的免疫活性化剤の作用により成熟型に移行しない；
（Ｅ２）未成熟ＤＣと同様の形状を有する；および
（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する。
【請求項２】
前記樹状細胞がヒトの樹状細胞である請求項１に記載の脱活性化した樹状細胞。
【請求項３】
下記の特徴を有する請求項２に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ１’）ＬＰＳ及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用により成熟型に移行しない；
（Ｅ２）未成熟樹状細胞と同様の形状を有する；および
（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する。
【請求項４】
さらに下記の特徴を有する請求項３に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ４）ＣＤ８０の発現量が未成熟ＤＣと同等程度である；及び／又は
（Ｅ５）ＣＤ８３の発現量が未成熟ＤＣと同等程度である。
【請求項５】
さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する請求項４に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ６）マイクロビーズに対する食作用活性が未成熟樹状細胞と同程度である；
（Ｅ７）ＭＨＣクラスＩを高発現する；
（Ｅ８）抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞を活性化しない；および
（Ｅ９）未成熟ＤＣよりも低いＴＬＲ４／ＭＤ２発現を示す。
【請求項６】
下記の特徴を有する永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；
（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；
（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；および
（Ｍ２−４）ＣＤ８０，ＣＤ８３及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１種の発現量が高い。
【請求項７】
前記樹状細胞がヒト由来の細胞であって、下記の特徴を有する請求項６に記載の永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；
（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；
（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；および
（Ｍ２−４’）ＣＤ８０及びＣＤ８３の発現量が高い。
【請求項８】
さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する請求項７に記載のヒトの永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−５）ＦｃγＲの発現量が低い（ＦｃγＲｌｏｗ）；
（Ｍ２−６）ＭＨＣ−Ｉの発現量が高い（ＭＨＣ−Ｉｈｉｇｈ）；
（Ｍ２−７）ＭＨＣ−ＩＩの発現量が高い（ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ）；及び
（Ｍ２−８）ＩＬ−１２ｐ４０の発現量が高い。
【請求項９】
未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）に導く工程、該Ｍ１ＤＣを永続的活性化剤の非存在下で培養する工程を含む脱活性化された樹状細胞（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）の調製方法。
【請求項１０】
未成熟樹状細胞を永続的活性化剤とともに処理する工程を含む、永続的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）の調製方法。
【請求項１１】
未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）に導く工程、該Ｍ１ＤＣを永続的活性化剤の存在下で培養する工程を含む永続的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）の調製方法。
【請求項１２】
未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で処理することを特徴とする一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）の調製方法。
【請求項１３】
請求項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、請求項１０又は１１に記載の方法により調製されたヒトＭ２ＤＣを有効成分とする、抗ガン剤
【請求項１４】
請求項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、請求項１０又は１１に記載の方法により調製されたＭ２ＤＣを有効成分とする、抗病原体剤。
【請求項１５】
請求項１〜５に記載の脱活性化樹状細胞または請求項９に記載の方法により得られた脱活性化樹状細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
【請求項１６】
請求項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、請求項１０又は１１に記載の方法により調製されたヒトＭ２Ｄをヒトガン患者に投与することを特徴とするガンの治療方法。
【請求項１７】
ヒト移植ドナー由来の請求項２〜５に記載のヒト脱活性化樹状細胞または請求項９に記載の方法により得られたヒト脱活性化樹状細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した移植方法。
【請求項１８】
前記臓器ないし器官が骨髄細胞である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、脱活性化した樹状細胞、樹状細胞の一時的または永続的成熟方法、これらの樹状細胞を用いた抗ガン剤及び免疫抑制剤、さらにガンの治療方法及び臓器ないし器官の移植方法に関する。
なお、本明細書において、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を「ＤＣ」と略すことがある。
【背景技術】  樹状細胞（ＤＣ）は、自然免疫と適応性免疫との間の重要な媒介物質である。炎症に焦点を合わせると、自然免疫に関係するエンドトキシンまたは炎症性サイトカインは、未成熟ＤＣの成熟ＤＣへの分化を誘導する。後者は、適応性免疫の主要なエフェクターである、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を効率的に刺激する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，２４５−２５２（１９９８）；Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．＆  Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｅｌｌ  １０６，２５５−２５８（２００１））。また、活性型Ｔ細胞上に存在するＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）によるＣＤ４０を介する未成熟ＤＣへの刺激は、ＤＣ成熟のためのシグナルを与える。しかしながら、ＤＣ成熟に関する様々な因子の相対的な重要性は、依然として不明瞭なままである。骨髄からの未成熟ＤＣ調製について記載されるオリジナルの誘発プロトコル通りに、単に細胞のピペティングあるいは再プレーティングするだけでも成熟が引き起こされた（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１，９２７−９３６（２０００）；Ｇａｌｌｕｃｃｉ，Ｓ．，Ｌｏｌｋｅｍａ，Ｍ．＆  Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５，１２４９−１２５５（１９９９））。
本発明に関連する公知文献として、さらに参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）１〜２２が挙げられる。
しかしながら、これらの公知文献は、ＤＣの成熟過程の全体像を明らかにするものではない。
【図面の簡単な説明】  図１：成熟時における骨髄性ＤＣのＣＤ８６発現の時間経過
ａ、Ｃ５７ＢＬ／６骨髄細胞に由来する未成熟ＤＣ（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ＤＣ）は、抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）またはＴＮＦαと共に培養され、次いで８時間および２４時間後フローサイトメトリーを用いてに解析された。細胞を抗−ＣＤ１１ｃ−ＦＩＴＣ、抗−ＣＤ８６−ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）およびヨウ化プロピウム（ＰＩ）で染色した。これらの事象は、ＣＤ１１ｃ＋およびＰＩｌｏｗにおいてゲートされた（ｇａｔｅｄ）。ｂ、ＬＰＳ刺激の６時間後、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを磁気選別によって分離し、ＬＰＳまたは抗−ＣＤ４０  ｍＡｂの存在下あるいは非存在下において、２４時間培養した。細胞を抗−ＣＤ８６−ＰＥおよびＰＩで染色し、ＰＩｌｏｗ集団上でゲートされた。生存率は８５．３％（培地コントロール）、８５．８％（ＬＰＳ）および８９．７％（抗−ＣＤ４０）であった。ｃ、２次刺激後の２つの異なるＤＣ集団によるＣＤ８６発現のパターン。未成熟ＤＣを、それぞれ、ＬＰＳまたは抗−ＣＤ４０  ｍＡｂを用いて４８時間刺激し、次いでそれぞれＬＰＳまたは抗−ＣＤ４０  ｍＡｂを用いてさらに２４時間再刺激し。これらのデータは、類似した結果を有する３回以上の独立した実験の代表である。
図１ａにおいて、ｃｏｎｔｒｏｌ（未成熟ＤＣ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０（８ｈｒｓ：未成熟ＤＣとＭ２ＤＣタイプ２の混合物）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０（２４ｈｒｓ：Ｍ２ＤＣタイプ２）。ＬＰＳ（８ｈｒｓ：Ｍ１ＤＣ）、ＬＰＳ（２４ｈｒｓ：Ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）、ＴＮＦα（８ｈｒｓ：未成熟ＤＣ（ｍａｊｏｒ）とＭ２ＤＣタイプ２（ｍｉｎｏｒ）の混合物）、ＴＮＦα（２４ｈｒｓ：未成熟ＤＣとＭ２ＤＣタイプ２の混合物）である。
図１ｂにおいて、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ＋（抗−ＣＤ４０ｍＡｂとＬＰＳ無し、２４ｈｒｓ）並びにＣＤ１１ｃ＋ＤＣ＋ＬＰＳ（２４ｈｒｓ）で脱活性化ＤＣが得られ、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ＋抗−ＣＤ４０ｍＡｂ（２４ｈｒｓ）でＭ２ＤＣタイプ１が得られた。
図１ｃにおいて、左欄は、ＬＰＳの４８時間刺激後の脱活性化ＤＣは、ａｎｔｉ−ＣＤ４０及びＬＰＳを作用させても脱活性化ＤＣのままであることを示し、右欄は、ａｎｔｉ−ＣＤ４０の４８時間刺激後のＭ２ＤＣ（タイプ１）は、ａｎｔｉ−ＣＤ４０及びＬＰＳを作用させてもＭ２ＤＣのままであることを示す。
図２：成熟時における骨髄性ＤＣの表現型的分析
ａ、４種類の異なるＤＣサブタイプの細胞形態学：未成熟ＤＣ（刺激されていない）、Ｍ１ＤＣ（ＬＰＳと共に６時間培養）、脱活性化ＤＣ（ＬＰＳと共に２４時間培養）およびＭ２ＤＣ（抗−ＣＤ４０  ｍＡｂと共に２４時間培養）。ｂ、ＬＰＳもしくはＣＤ４０刺激後６時間もしくは２４時間における、（Ｂ６×Ｃ３Ｈ）Ｆ１マウス由来の未成熟ＤＣのＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｋ）、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｈ−２Ａｋ）およびＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩの発現パターン。ｃ、未成熟ＤＣ（白色のプロフィール（ｗｈｉｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ））もしくは脱活性化ＤＣ（灰色のプロフィール（ｇｒａｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ））のＴＬＲ４／ＭＤ２の発現レベルにおける差異。ｄ、未成熟ＤＣ、脱活性化ＤＣおよびＭ２ＤＣの食作用能力。ＦＩＴＣ標識ビーズを、８時間共培養にかけた。これらのデータは、類似する結果を有する独立する３回の実験の代表である。
図２ｂにおいて、ＬＰＳ  ６ｈ（Ｍ１ＤＣ）、ＬＰＳ  ２４ｈ（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０（６ｈ：未成熟ＤＣとＭ２ＤＣタイプ１の混合物）、ａｎｔｉ−ＣＤ４０（２４ｈｒｓ：Ｍ２ＤＣタイプ１）である。
図３：ＤＣサブユニットのサイトカイン産生プロフィール。
未成熟ＤＣ、Ｍ１ＤＣ、脱活性化ＤＣおよびＭ２ＤＣ（タイプ２）、もしくはＬＰＳおよび抗−ＣＤ４０  ｍＡｂで連続的に刺激されたＭ２ＤＣ（タイプ１）を細胞分類によって精製した。ａ、未成熟ＤＣ（１）、Ｍ１ＤＣ（２）、Ｍ２ＤＣ（３）、および脱活性化ＤＣ（４）のＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（“Ｍ”は分子マーカーを示す）。ｂ、４つの異なるＤＣサブセット（未成熟ＤＣ（１）、Ｍ１ＤＣ（２）、Ｍ２ＤＣ（タイプ２；３）、および脱活性化ＤＣ（４））ならびにＬＰＳおよび抗−ＣＤ４０  ｍＡｂで連続的に刺激されたＭ２ＤＣ（タイプ１；（５））におけるＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルの、リアルタイム定量的ＰＣＲによるＲＴ−ＰＣＲ分析。コピー数は、β−アクチンに対して標準化された。これらの結果は、類似する結果を有する独立する３回以上の実験の代表である。
図４：ＤＣサブセット機能的分析
ａ、Ｆ５マウス由来の未反応ＣＤ８＋Ｔ細胞を、数種類の異なる濃度のＮＰ３６６−３７４を適用させた以下のＤＣサブセットと共に４８時間共培養した：未成熟ＤＣ（黒色のプロフィール（ｂｌａｃｋ  ｐｒｏｆｉｌｅ））、脱活性化ＤＣ（灰色のプロフィール（ｇｒａｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ））、Ｍ２ＤＣ（白色のプロフィール（ｗｈｉｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ））。このデータは、類似する結果を有する４つの独立する実験の代表である。ｂ、ＯＶＡ２５７−２６４／Ｋｂ特異的Ｔ細胞クローン（４Ｇ３）を、脱活性化ＤＣおよびＯＶＡ２５７−２６４（１０μＭ）と共に４８時間共培養し、次いでペプチド適用されたＭＭＣ処理済Ｂ６脾臓細胞（滴定濃度）と共にさらに２４時間培養し、その応答を測定した。これらのデータは、類似する結果を有する独立する２回の実験の代表である。
図５：生体内におけるＤＣの分化および成熟
ａ、ＬＰＳ刺激された未成熟ＤＣをＣＦＤＡ−ＳＥで標識し、ＤＯ．１１．１０マウスへ注射（ＯＶＡ３２３−３３９有りまたは無し）した。４８時間後、リンパ節（ＬＮｓ）および脾臓（ＳＰＬ）中のＤＣを抗−８６抗体で染色した。ＣＦＳＥ陽性細胞を分析した。これらの結果は、類似する結果を有する独立する３回の実験の代表である。ｂ、未成熟ＤＣを、ペプチドグリカンＩＩＩ型、ＣｐＧ  ＯＤＮもしくは壊死細胞派生物、ＬＰＳ、または抗−ＣＤ４０  ｍＡｂで刺激した。そのＤＣを、刺激の６時間（白色のプロフィール（ｗｈｉｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ））および４８時間（灰色のプロフィール（ｇｒａｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ））後、ＣＤ８６について染色した。これらのデータは、類似する結果を有する独立する２回の実験の代表である。ｃ、骨髄性ＤＣ成熟のモデル。ＴＬＲを介して微生物シグナルによって刺激された未成熟ＤＣは、直ぐに、ＭＨＣクラスＩＩおよび副刺激分子を発現するＭ１ＤＣへと変化する。Ｍ１ＤＣは、ＣＤ４０Ｌを有するＴｈ細胞と結合し、ＣＤ４０からシグナルを受けてＭ２ＤＣへ連続的にシフトし、成熟表現型を維持する。ＣＤ４０の刺激が無い場合、Ｍ１ＤＣは、ダウンレギュレーションされたＭＨＣクラスＩＩおよび副刺激分子を有する脱活性化ＤＣへと成長する。
図６は、ＩＬ−１０及び抗ＣＤ−４０抗体の効果と作用時間についての結果を示す。
図７は、誘導方法によるサイトカイン分泌の評価（ＥＬＩＳＡ法）を示す。
図８は、生体内キラーＴ細胞（ＣＴＬ）誘導能の評価を示す。
図９は、未成熟ＤＣと脱活性化ＤＣの相違を示す。
図１０は、単核球由来のヒト未成熟ＤＣをピシバニール（ＯＫ４３２）、抗−ＣＤ４０抗体、抗ＩＬ−１０抗体で刺激した結果を示す。図１０中、点線は、抗体を加えていないネガティブコントロールを示す。
【発明の開示】
本発明は、ＤＣの成熟過程に関する新たな知見を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、免疫抑制機能を有する脱活性化した樹状細胞、免疫機能を永続的に活性化した成熟ＤＣ（Ｍ２ＤＣ；ｍａｔｕｒｅ  ２  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）及びその調製方法、並びに免疫賦活機能を有する一時的に活性化された成熟ＤＣ（Ｍ１ＤＣ；ｍａｔｕｒｅ  １  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の調製方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、免疫抑制剤、抗ガン剤、ガンの治療方法及び拒絶反応が抑制された臓器、器官の移植方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記のようなピペティングおよび再プレーティングを行わずに、エンドトキシン（ＬＰＳ）、抗−ＣＤ４０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＣＤ１５４の代替物）、ＴＮＦα（前炎症サイトカインの例）、ピシバニール（ＯＫ４３２）などの自然免疫刺激剤を用いて、未成熟ＤＣ（ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の成熟を評価した。
本発明者は、自然免疫刺激剤によって誘導される、脱活性化ＤＣについて記載する。この脱活性化ＤＣは、高レベルなＭＨＣクラスＩ発現、ＩＬ−１０産生、および別の方法で成熟を誘導する刺激に対する非反応性を除いて、多くの点で未成熟ＤＣに類似している。このような脱活性化ＤＣは、未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を刺激することができない。むしろ、脱活性化ＤＣはＣＴＬクローンにおいてアナジーを誘導し、免疫抑制作用を有する。ＣＤ４０を介する刺激は、脱活性化表現型へのＬＰＳ誘導型移行を阻害し、結果的にＬＰＳ刺激後の初期段階においてみられる表現型とは異なる成熟表現型の獲得、即ちＭ２ＤＣへの移行をもたらした。
本発明者はまた、未成熟ＤＣが自然免疫刺激剤による刺激を受けた後に、所属リンパ節に移行して、ここで活性型ヘルパーＴ細胞と相互作用することによって、成熟表現型の維持がもたらされることを観察した。これらのデータに基づいて、本発明者は、免疫調節に関係するＤＣ成熟の新たな概念を提唱する。ＤＣ成熟過程の詳細を明らかにしたのは本発明者が初めてである。
すなわち、本発明は、以下の発明に関する。
１．以下の（Ｅ１）〜（Ｅ３）の特徴を有する脱活性化した（ｅｘｐｉｒｅｄ）樹状細胞：
（Ｅ１）自然免疫刺激剤及び永続的免疫活性化剤の作用により成熟型に移行しない；
（Ｅ２）未成熟ＤＣと同様の形状を有する；および
（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する。
２．前記樹状細胞がヒトの樹状細胞である項１に記載の脱活性化した樹状細胞。
３．下記の特徴を有する項２に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ１’）ＬＰＳ及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用により成熟型に移行しない；
（Ｅ２）未成熟樹状細胞と同様の形状を有する；および
（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する；
４．さらに下記の特徴を有する項３に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ４）ＣＤ８０の発現量が未成熟ＤＣと同等程度である；及び／又は
（Ｅ５）ＣＤ８３の発現量が未成熟ＤＣと同等程度である。
５．さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する項４に記載のヒトの脱活性化した樹状細胞：
（Ｅ６）マイクロビーズに対する食作用活性が未成熟樹状細胞と同程度である；
（Ｅ７）ＭＨＣクラスＩを高発現する；
（Ｅ８）抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞を活性化しない；および
（Ｅ９）未成熟ＤＣよりも低いＴＬＲ４／ＭＤ２発現を示す。
６．下記の特徴を有する永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；
（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；
（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；および
（Ｍ２−４）ＣＤ８０，ＣＤ８３及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１種の発現量が高い。
７．前記樹状細胞がヒト由来の細胞であって、下記の特徴を有する項６に記載の永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；
（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；
（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；および
（Ｍ２−４’）ＣＤ８０及びＣＤ８３の発現量が高い。
８．さらに下記の特徴の少なくとも１つを有する項７に記載のヒトの永続的に活性化された樹状細胞：
（Ｍ２−５）ＦｃγＲの発現量が低い（ＦｃγＲｌｏｗ）；
（Ｍ２−６）ＭＨＣ−Ｉの発現量が高い（ＭＨＣ−Ｉｈｉｇｈ）；
（Ｍ２−７）ＭＨＣ−ＩＩの発現量が高い（ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ）；及び
（Ｍ２−８）ＩＬ−１２ｐ４０の発現量が高い。
９．未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）に導く工程、該Ｍ１ＤＣを永続的活性化剤の非存在下で培養する工程を含む脱活性化された樹状細胞（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）の調製方法。
１０．未成熟樹状細胞を永続的活性化剤とともに処理する工程を含む、永続的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）の調製方法。
１１．未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で活性化して一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）に導く工程、該Ｍ１ＤＣを永続的活性化剤の存在下で培養する工程を含む永続的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）の調製方法。
１２．未成熟樹状細胞を自然免疫刺激剤で処理することを特徴とする一時的に活性化された成熟樹状細胞（Ｍ１ＤＣ）の調製方法。
１３．項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、項１０又は１１に記載の方法により調製されたヒトＭ２ＤＣを有効成分とする、抗ガン剤
１４．項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、項１０又は１１に記載の方法により調製されたＭ２ＤＣを有効成分とする、抗病原体剤。
１５．項１〜５に記載の脱活性化樹状細胞または項９に記載の方法により得られた脱活性化樹状細胞を有効成分とする免疫抑制剤。
１６．項７または８に記載のヒトの永続活性化成熟樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）或いは、項１０又は１１に記載の方法により調製されたヒトＭ２Ｄをヒトガン患者に投与することを特徴とするガンの治療方法。
１７．ヒト移植ドナー由来の項２〜５に記載のヒト脱活性化樹状細胞または項９に記載の方法により得られたヒト脱活性化樹状細胞をヒトのレシピエントに導入し、次いで、ヒト移植ドナーの臓器ないし器官をヒトのレシピエントに導入することを包含する拒絶反応を抑制した移植方法。
１８．前記臓器ないし器官が骨髄細胞である項１７に記載の方法。
ＤＣの供給源としては、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サル等の哺乳動物が好ましく例示され、より好ましくはヒトが例示される。
本発明では、未成熟ＤＣが以下の３種のいずれかの経路で変換される。
経路１：未成熟ＤＣ  →  Ｍ１ＤＣ  →  脱活性化ＤＣ（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）
経路１Ａ（ヒトＤＣ）：未成熟ＤＣ  →  脱活性化ＤＣ（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）
経路２：未成熟ＤＣ  →  Ｍ１ＤＣ  →  Ｍ２ＤＣ（タイプ１）
経路３：未成熟ＤＣ  →  Ｍ２ＤＣ（タイプ２）
経路１Ａ（ヒトＤＣ）：未成熟ＤＣ  →  脱活性化ＤＣ（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）
経路１、２において、未成熟ＤＣからＭ１ＤＣへは、自然免疫刺激剤ないしｄａｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌにより誘導される。
経路１Ａにおいて、ヒト未成熟ＤＣをＬＰＳで刺激すると、ＩＬ−１０を産生する脱活性化ＤＣに移行するが、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６が急激に上昇し、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０を高発現するＭ１ＤＣに相当する明確な活性化ＤＣが見られない。従って、ヒトＤＣでは、経路１のようにＭ１ＤＣ（但し、ＣＤ８０、ＣＤ８３またはＣＤ８６などの表面抗原並びにＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−１０の発現の低度は弱い）を経由して脱活性化ＤＣに移行する経路１と明確なＭ１ＤＣ表現型を示すことなく脱活性化ＤＣに移行する経路１Ａのいずれかにより脱活性化ＤＣに移行すると考えられる。
自然免疫刺激剤は、未成熟ＤＣからＭ１ＤＣへの成熟化を誘導するものであれば特に限定されず、エンドトキシン（ＬＰＳ）、ＣｐＧなどが例示される。自然免疫刺激剤には、ＬＰＳ，ＣｐＧ、ペプチドグリカン、壊死細胞成分等のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ）に結合し、活性化シグナルを誘導するものが包含される。さらに好ましい自然免疫刺激剤としてＬＰＳ，ＣＰＧなどが挙げられる。
経路２において、Ｍ１ＤＣからＭ２ＤＣタイプ１（ｍａｔｕｒｅ  ２  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  １）への誘導及び経路３において、未成熟ＤＣからＭ２ＤＣ（タイプ１）への誘導は、永続的活性化剤により実施することができる。
経路１において、Ｍ１ＤＣから脱活性化ＤＣへの移行は、特別な物質は必要なく、通常の培養液中（但し、永続的活性化剤は含まない）で５〜１００時間程度培養することで、行うことができる。当該培養を自然免疫刺激剤の存在下に行っても、同様に５〜１００時間程度培養することで、Ｍ１ＤＣから脱活性化ＤＣへの移行が行われる。
未成熟ＤＣは、骨髄細胞や、未成熟ＤＣになり得る幹細胞を適切な誘導剤を用いて誘導して調製してもよいし、或いは脾臓から直接未成熟ＤＣを得ることもできる。たとえば骨髄細胞にＧＭ−ＣＳＦを作用させることで、未成熟ＤＣに導くことが可能である。また、血液から単球などの未成熟ＤＣになり得る細胞を分離して使用することもできる。未成熟ＤＣ、脱活性化ＤＣ、Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣ（タイプ１，タイプ２）の分離は、例えば蛍光標識又は染色を行った後、セルソーターにより行うことができる。具体的には、マウスＤＣでは、脱活性化ＤＣとＭ２ＤＣの、ＣＤ８６で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができ、ヒトＤＣでは、脱活性化ＤＣとＭ２ＤＣの、ＣＤ８０またはＣＤ８３で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。
未成熟ＤＣとＭ１ＤＣについても同様にＣＤ８０、ＣＤ８３又はＣＤ８６で染色後に細胞分離装置（セルソーター）により分離することができる。
さらに、マウス脱活性化ＤＣはＬＰＳで刺激４８時間後のＣＤ８６−ｌｏｗをセルソーターで分離精製することができ、ヒト脱活性化ＤＣはＬＰＳで刺激４８時間後のＣＤ８０−ｌｏｗもしくはＣＤ８０−ｌｏｗかつＣＤ８６−ｈｉｇｈをセルソーターで分離精製することができる。
永続的活性化剤は、未成熟ＤＣまたはＭ１ＤＣから永続的に活性化された成熟ＤＣ（Ｍ２ＤＣ）に導くことができる活性化剤であれば特に限定されず、例えばＤＣのＣＤ４０に結合してＤＣを活性化する抗ＣＤ４０抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現したヘルパーＴ細胞、ＩＬ−１０の作用をブロックする抗ＩＬ−１０抗体または抗ＩＬ−１０受容体抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）、ピシバニール（ＯＫ４３２）、ＴＮＦαなどが例示され、好ましくは抗ＣＤ４０モノクローナル抗体、抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体が例示される。ヒトＤＣに関してはピシバニール（ＯＫ４３２）と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が好ましく使用できる。
Ｍ１ＤＣは、自らが分泌するＩＬ−１０により、脱活性化ＤＣに移行するが、抗ＩＬ−１０抗体や他の永続的活性化剤（例えば抗ＣＤ４０ｍＡｂ）があればＭ２ＤＣに移行する。
本発明により、初めて脱活性化ＤＣ及びＭ２ＤＣが提供される。
脱活性化ＤＣのキャラクタリゼーション
脱活性化ＤＣは、以下に示すような１以上の性質を有している。
（Ｅ１）自然免疫刺激剤及び永続的免疫活性化剤の作用により成熟型に移行しない
脱活性化ＤＣは、自然免疫刺激剤により活性化され、Ｍ１ＤＣとなった後、永続的免疫活性化剤の作用を受けることなく脱活性化ＤＣへ移行したものである。いったん脱活性化ＤＣへ移行すると、さらに自然免疫刺激剤及び永続的免疫活性化剤を作用させても脱活性化ＤＣのままである。
（Ｅ２）未成熟ＤＣと同様の形状を有する
脱活性化ＤＣは、とげ状の突起を有さず、形態的に未成熟ＤＣと同様な外観を有する。
（Ｅ３）ＩＬ−１０を発現する
脱活性化ＤＣは、ＩＬ−１０を発現、分泌する。未成熟ＤＣは、ＩＬ−１０を意味のある程度に発現せず、Ｍ１ＤＣはＩＬ−１０を高発現するが、Ｍ１ＤＣから移行した脱活性化ＤＣはＩＬ−１０の発現量がＭ１ＤＣよりも明らかに低下し、Ｍ１ＤＣの１／２以下、例えばＭ１ＤＣの１／３〜１／１００程度の発現量を有する。
また、ヒト未成熟ＤＣにＬＰＳを作用させて得られた脱活性化ＤＣは、同様に弱いＩＬ−１０発現を示す。
（Ｅ４〜Ｅ５）ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６の発現量が低い（ＣＤ８０ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ／ＣＤ８６ｌｏｗ）
マウス由来のＤＣでは、活性化ＤＣ（Ｍ１ＤＣ、Ｍ２ＤＣ）においてＣＤ８６発現量が未成熟ＤＣよりも明らかに高く、脱活性化ＤＣは未成熟ＤＣと同等程度の低いＣＤ８６発現量を有する（ＣＤ８６ｌｏｗ）。
一方、ヒト由来のＤＣでは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３の緩やかな発現量の変化を経て未成熟ＤＣから低発現量の脱活性化ＤＣ（ＣＤ８０ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ）に変化する。
（Ｅ６）マイクロビーズに対する食作用活性が未成熟ＤＣと同程度である；
活性化ＤＣ（Ｍ１ＤＣ、Ｍ２ＤＣ）ではマイクロビーズに対する食作用活性が非常に低いが、脱活性化ＤＣに移行するとマイクロビーズに対する高い食作用活性を有する。
（Ｅ７）ＭＨＣクラスＩＩの発現量が低い
未成熟ＤＣと同様にＭＨＣクラスＩＩの発現レベルが低く、ＭＨＣクラスＩＩの発現量が高い活性化ＤＣ（Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣ）と区別可能である。
（Ｅ８）抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞を活性化しない；
Ｍ２ＤＣは抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導（活性化）するが、脱活性化ＤＣは抗原ペプチドの存在下で未反応Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導（活性化）せず、むしろＴ細胞アナジーを誘導する。
（Ｅ９）未成熟ＤＣよりも低いＴＬＲ４／ＭＤ２発現を示す
ＴＬＲ４／ＭＤ２発現が低いと、これ以上ＬＰＳが作用しなくなることが予測される。
Ｍ２ＤＣのキャラクタリゼーション
Ｍ２ＤＣは、以下に示すような１以上の性質を有している。
（Ｍ２−１）突き出た樹状突起を有し、凝集クラスターを形成する；
図２ａに示されるように、Ｍ２ＤＣは突き出た樹状突起及び凝集クラスターを形成する。活性化ＤＣ（Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣ）は、樹状突起を有し、Ｍ２ＤＣはＭ１ＤＣよりも樹状突起の数が多い
（Ｍ２−２）未反応の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する能力を有する；
例えばＯＶＡ蛋白を取り込ませたＭ２ＤＣでマウスを免疫すると、マウスに移入した標的細胞のうちＯＶＡ抗原を持つものが特異的に排除されることから、Ｍ２ＤＣによりＯＶＡペプチド特異的なＣＴＬが活性化されることが明らかにされた。
（Ｍ２−３）抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の作用に対しその性質が安定している；
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の存在下で培養すると未成熟ＤＣとＭ１ＤＣはＭ２ＤＣに変化するが、Ｍ２ＤＣは変化しない。
（Ｍ２−４）ＣＤ８０，ＣＤ８３及びＣＤ８６からなる群から選択される少なくとも１種の発現量が高い
例えばＯＫ４３２と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体でヒト未成熟ＤＣを処理して得られたヒトＭ２ＤＣでは、ＣＤ８０及びＣＤ８３の発現量が著明に増加する（ＭＦＩで約１００倍、図１０）。従って、ＣＤ８０，ＣＤ８３がヒトＭ２ＤＣを特定する重要な指標になる。一方、マウスＭ２ＤＣでは、ＣＤ８６が重要な指標になり、マウスＭ２ＤＣでは、ＣＤ８６の発現量が高く、マウス脱活性化ＤＣで低い。
（Ｍ２−５）ＦｃγＲの発現量が低い（ＦｃγＲｌｏｗ）
図２ｂに示されるように、ＬＰＳ２４時間で処理されたＭ１ＤＣはＦｃγＲの発現量が高いが、抗ＣＤ４０ｍＡｂで２４時間処理されたＭ２ＤＣはＦｃγＲの発現量が低い（ＦｃγＲｌｏｗ）。
（Ｍ２−６）ＭＨＣ−Ｉの発現量が高い（ＭＨＣ−Ｉｈｉｇｈ）
ＭＨＣ−Ｉの発現量は未成熟ＤＣで低く、Ｍ２ＤＣで区別可能な程度に高い。
（Ｍ２−７）ＭＨＣ−ＩＩの発現量が高い（ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ）
ＭＨＣ−ＩＩの発現量は、Ｍ２ＤＣで高く（ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ）、未成熟ＤＣでは低い。
（Ｍ２−８）ＩＬ−１２ｐ４０の分泌（発現）量が高い
Ｍ２ＤＣは、Ｍ１ＤＣと同様にＩＬ−１２ｐ４０の発現量が高く、強力な免疫活性化能を有している。
本明細書において、脱活性化ＤＣが「未成熟ＤＣと同様の形状を有する」とは、具体的には、図２ａに示されるように脱活性化ＤＣは集塊をほとんど或いは全く形成せず、球形、楕円型、菱形等の形状を有する付着細胞であり、とげ状の樹状形状及びクラスター形成が少ないことを意味する。このとげ状の樹状形状およびクラスター形成の程度は、ＣＤ８６（マウス）或いはＣＤ８０／ＣＤ８３（ヒト）の発現量と比例していると考えられる。
マウス、ヒト以外の哺乳動物細胞に関しては、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３の少なくとも１種の発現量が変化する。
また「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが低い（ＣＤ８６ｌｏｗ／ＣＤ８３ｌｏｗ／ＣＤ８０ｌｏｗ）」とは、色素物質（例えばフィコエリトリン）または蛍光物質（ＦＩＴＣなど）等のマーカーを結合した抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用し、脱活性化ＤＣと反応させると、コントロール（脱活性化ＤＣのみを用い、マーカー結合抗ＣＤ８６抗体／抗ＣＤ８３抗体／抗ＣＤ８０抗体を使用しない）に比べて１０倍以下（通常１〜１０倍、特に３〜８倍程度）の吸光度または蛍光強度を有することを意味する。なお、「ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが高い（ＣＤ８６ｈｉｇｈ／ＣＤ８３ｈｉｇｈ／ＣＤ８０ｈｉｇｈ）」Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣでは、脱活性化ＤＣに対し１５〜１００倍程度、特に５０〜１００倍程度（コントロールに対し５０〜８００倍程度、特に２００〜５００倍程度）の吸光度または蛍光強度を有する。ＣＤ８０−ｈｉｇｈ／ＣＤ８３−ｈｉｇｈ／ＣＤ８６−ｈｉｇｈとはＣＤ８０−ｌｏｗ／ＣＤ８３−ｌｏｗ／ＣＤ８６−ｌｏｗと比べて３〜１００倍程度、好ましくは１０〜８０倍程度、特に２０〜６０倍程度の吸光度または蛍光強度を示すものを指す。
本発明の脱活性化ＤＣは、未成熟ＤＣと同様の形状を有し、ＣＤ８６／ＣＤ８３／ＣＤ８０の発現レベルが低い点並びにマイクロビーズに対する食作用を有する点でも未成熟ＤＣに類似するが、以下の点で、未成熟ＤＣと異なっている：
（ｉ）ＬＰＳなどの自然免疫刺激剤および抗ＣＤ４０  ｍＡｂなどの永続的活性化剤を作用させても成熟ＤＣ（Ｍ１ＤＣまたはＭ２ＤＣ）に移行しない；
（ｉｉ）ＩＬ−１０、ＩＬ−６及びＴＮＦαの発現レベルが未成熟ＤＣよりも高く、これらを放出する。特に免疫抑制性のＩＬ−１０の産生は重要と考えられる。
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体）を高発現する
（ｉｖ）未反応Ｔ細胞を活性化しない；
（ｖ）ＴＬＲ４／ＭＤ２が、未成熟ＤＣよりも低い。
未成熟ＤＣ、脱活性化ＤＣ、Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣの表面抗原の相違を以下の表に示す。
2004063363.tif 000003
なお、脱活性化ＤＣは、塊を形成しない楕円型の付着細胞であり、樹状突起のクラスターが少なく、未成熟ＤＣと類似した外観を呈するが、Ｍ１ＤＣ、Ｍ２ＤＣは集塊を形成し突起が出現する点で、これらは明瞭に区別できる。また、Ｍ２ＤＣはＭ１ＤＣよりも突起の数が多い。
未成熟ＤＣは、ＣＤ８０／ＣＤ８３／ＣＤ８６の発現量が低いので、レシピエントに導入された場合にキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞のアナジーを誘導する可能性があるが、未成熟ＤＣはレシピエント内で活性化されて成熟ＤＣ（Ｍ１ＤＣ，Ｍ２ＤＣなど）になって、免疫系を賦活する可能性が高い。
一方、脱活性化ＤＣは再び成熟ＤＣに戻ることはなく、安定している。従って、ドナーの脱活性化ＤＣをレシピエントに予め投与するとドナー移植片を拒絶可能なレシピエントのキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞の両方にアナジー（ａｎｅｒｇｙ）誘発し、次にドナーの臓器ないし器官等を移植した場合に、拒絶反応を抑制することが可能となる。例えば臓器移植や骨髄移植の場合、一般的に６種類のＨＬＡのうち、５種ないし６種の型が一致している必要があるが、ドナーの脱活性化ＤＣを予めレシピエントに投与しておくことで、ＨＬＡの適合性の低いドナーの臓器ないし骨髄をレシピエントに移植することができるようになるため、臓器移植や骨髄移植が容易に行えるようになる。
本発明の脱活性化ＤＣが免疫拒絶を抑制することは、ＭＬＣ法（ｍｉｘｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）により確認することが可能である。具体的には、ドナーとレシピエント（脱活性化ＤＣ投与前）の脾臓組織の一部を取り出し、該組織の脾臓細胞を混合培養したとき、Ｔ細胞数が増加するが、レシピエントにドナー由来の脱活性化ＤＣを投与してレシピエントのキラーＴ細胞、及び任意にヘルパーＴ細胞のアナジーを誘発し、次にＭＬＣ法を行った場合にはＴ細胞数が増加しないことから、ドナー由来の脱活性化ＤＣがレシピエントの免疫拒絶を抑制することが確認できる。データは示さないが、本発明者は、ドナー由来の脱活性化ＤＣをレシピエントに投与後に、ドナーの骨髄をレシピエントに移植すると、ＭＬＣ反応が起こらなかったことを確認している。
該移植される臓器ないし器官等としては、心臓、肝臓、腎臓、肺、小腸、膵臓等の臓器、さらに骨髄が例示される。
さらに、脱活性化ＤＣは移植拒絶の抑制だけでなく、アレルギー、自己免疫疾患の治療剤としても有効である。
Ｍ２ＤＣは、経路２と経路３のいずれかにより未成熟ＤＣから調製することが可能であり、経路２により調製されたＭ２ＤＣ（タイプ１）は経路３により調製されたＭ２ＤＣ（タイプ２）よりもＩＬ−１２（特にＩＬ−１２Ｐ４０）の発現量が有意に大きい点で、両者は異なっている。従って、Ｍ２ＤＣ（タイプ１）はより免疫増強効果が強いと考えられる。
不安定なＭ１ＤＣとは異なり、Ｍ２ＤＣは安定であって脱活性化ＤＣに移行しない。従って、例えばガン患者から得た未成熟ＤＣ（骨随細胞、血液細胞などから誘導されたものを含む）を経路２または３に従いＭ２ＤＣに誘導し（タイプ１はより有効）、このＭ２ＤＣをガン患者に戻すことにより、ガン患者のキラーＴ細胞及びヘルパーＴ細胞を活性化し、それによりガンの転移の予防及びガンの治療を行うことが可能になる。さらに、各種病原体（Ａ型、Ｂ型ないしＣ型肝炎ウイルス、エイズウイルス、インフルエンザウイルス等）に対する抗病原体剤としても有効である。病原体は、病原体由来のペプチドさえあれば、その種類を問わない。
治療対象となるガンとしては、特に制限はなく、例えば、頭頸部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、悪性リンパ種、白血病、子宮頸癌、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。
本発明者は、本明細書において、自然免疫刺激剤による刺激後の未成熟ＤＣの急速な成熟およびそれに続く脱活性化（ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ）について記載した。脱活性化したＤＣ（ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）は、高レベルなＭＨＣクラスＩ発現および大量のＩＬ−１０／ＴＮＦα産生、それ以上の活性化を受けないことを除いて、未成熟ＤＣに似ている。このような脱活性化ＤＣは、未反応のＣＴＬを刺激することができず、むしろＣＴＬクローンにおいてアナジーを誘導した。ＣＤ４０、ＩＬ−１０などを介する永続的活性化剤による刺激は、脱活性化表現型へのＬＰＳ誘導型移行を阻害し、結果的に自然免疫刺激剤による刺激後の初期段階においてみられる表現型（Ｍ１ＤＣ）とは異なる成熟表現型（Ｍ２ＤＣ）の獲得をもたらした。このことはまた、生体内においても観察された。
これらの結果は、免疫調節への新たな手段を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例に従って説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】（Ｉ）新規ＤＣサブセットの検出
マウス由来のＤＣ成熟を時間をおって観察し、本発明者は、ＬＰＳ刺激の８時間後ほとんど全てのＤＣがＣＤ８６発現の急速な増加を伴って応答することを見出した。これとは対照的に、抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ刺激およびＴＮＦα刺激は、ＣＤ８６ｈｉｇｈ集団のより緩やかな増加を誘導した。興味深いことに、ＣＤ８６の初期の急速なアップレギュレーションにも関わらず、多数のＣＤ８６ｌｏｗ細胞が、ＬＰＳ刺激の２４時間後に依然として存在していた（図１ａ）。私達は、ＬＰＳ刺激型ＤＣにおけるＣＤ８６ｌｏｗ集団がＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６ｈｉｇｈ集団に由来する否かを試験するために、ＬＰＳ刺激の６時間後、磁気選別、それに続く完全洗浄、そしてＬＰＳもしくは抗−ＣＤ４０  ｍＡｂを用いる２４時間のインキュベーションによって、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＤＣから精製した。このように準備されたＣＤ１１ｃ＋細胞のほとんど全てが、その細胞表面上で高レベルな（ピークには達していなかったが）ＣＤ８６を発現していた。二次培養物中にＬＰＳが存在するか否かに関わらず、ほとんどのＣＤ１１ｃ＋細胞がＣＤ８６の高密度な表面発現を消失した。しかしながら興味深いことに、二次培養物中における抗−ＣＤ４０  ｍＡｂの存在下においては、多数のＣＤ１１ｃ＋細胞が依然としてとしてＣＤ８６ｈｉｇｈであった（図１ｂ）。培養中に観察される細胞数の変化が微々たるものであったことを考慮すると、この観察の説明として、ＬＰＳ刺激後２４時間以内にＣＤ８６ｈｉｇｈＤＣが大量細胞死した可能性を引き合いに出すことは困難である。従って、ＬＰＳがＤＣ上のＣＤ８６の急速なアップレギュレーションおよびそれに続くダウンレギュレーションを２４時間以内に引き起こした可能性が高い。
次に、２種類のＤＣ表現型（すなわち、抗−ＣＤ４０  ｍＡｂによってアップレギュレーションされるＣＤ８６またはＬＰＳによってダウンレギュレーションされるＣＤ８６）の安定性を検証した。そこで、これら２種類のＤＣサブタイプを、ＬＰＳまたは抗−ＣＤ４０  ｍＡｂによって２次刺激した。しかしながら、どちらの表現型も再び変化することはなかった（図１ｃ）。これらのデータは以下の４つの結論を与える。
（１）  ＬＰＳは骨髄性ＤＣの一時的かつ不安定な成熟を誘導する。
（２）  その後、ＬＰＳ刺激はＣＤ８６ｌｏｗ表現型を有する安定なＤＣ集団を産生する。
（３）  ＣＤ４０刺激は、ＣＤ８６のＬＰＳ誘導型ダウンレギュレーションを阻害する効果を発揮する。
（４）  抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ誘導型ＣＤ８６ｈｉｇｈＤＣは、比較的安定な表現型のＤＣである。
上記のデータに基づいて、本発明者は、マウス骨髄性ＤＣの成熟を４つのカテゴリーに分類した：
（１）  未成熟ＤＣ：
新しく分化されて刺激を受けていないＣＤ８６ｌｏｗ表現型。
（２）  第１段階の成熟ＤＣ（Ｍ１ＤＣ）：
ＬＰＳ刺激後、初期の一時的なＣＤ８６ｈｉｇｈ表現型。
（３）  第２段階の成熟ＤＣ（Ｍ２ＤＣ）：
抗−ＣＤ４０刺激後の安定なＣＤ８６ｈｉｇｈ表現型。
（４）  脱活性化ＤＣ：
ＬＰＳ刺激後、後期におけるＣＤ８６ｌｏｗ表現型。
これら４種類のＤＣ表現型の形態学的評価によって、樹状形状およびクラスター形成がＣＤ８６発現と相互関係にあることが明らかになった。凝集されたＭ１ＤＣが外見上とげ状（ｓｐｉｎｙ）であるのに対し、脱活性化ＤＣにおいては、樹状突起の減少を伴ってこれらのクラスターが減少し、視覚的に未成熟ＤＣを思わせる外見を有していた。Ｍ２ＤＣもまた、突出た樹状突起を有する凝集クラスター（ｓｏｌｉｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ）を形成した（図２ａ）。ＬＰＳ刺激の４８時間後には、ほとんど全てのＣＤ８６ｈｉｇｈ表現型Ｍ１ＤＣがＣＤ８６ｌｏｗ脱活性化ＤＣ表現型を獲得していたが、その集団の中でも少数のＣＤ８６ｈｉｇｈＤＣが依然として残存していた。
（ＩＩ）ＤＣサブセットの表現型の相違
次に、未成熟ＤＣおよび脱活性化ＤＣがＣＤ８６発現および形態学の両方において非常に類似しているように思われたので、それらの間の相違点を捜した。抗−ＣＤ４０  ｍＡｂを用いる刺激の６時間後のＤＣ（未成熟ＤＣ）とＬＰＳを用いる刺激の２４時間後のＤＣ（脱活性化ＤＣ）との間の表面マーカー発現の比較によって、ＭＨＣクラスＩの発現レベルが両者を識別するマーカーを表すことが実証された（図２ｂ）。さらに、Ｍ１ＤＣおよびＭ２ＤＣは、ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩの発現レベルによって識別された。さらに、本発明者は、脱活性化ＤＣのＬＰＳに対する非反応性に基づいて、ＬＰＳレセプター（ＴＬＲ４／ＭＤ２）がこれらの細胞においてダウンモジュレーションされるという仮説を立てた（Ｎｏｍｕｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，３４７６−３４７９（２０００））。予測した通り、未成熟ＤＣは、脱活性化ＤＣよりも高いＴＬＲ４／ＭＤ２発現を示した（図２ｃ）。また、ＦＩＴＣ標識化マイクロビーズを使用して、脱活性化ＤＣの食作用活性を試験した（図２ｄ）。一般的に、活性型ＤＣは抗原を捕捉することができないと考えられている（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，４７９−４８８（１９９３））。しかしながら、脱活性化ＤＣは、すでに活性化されているにもかかわらず、未成熟ＤＣと同じくらい効率的にビーズを捕捉した。対照的に、Ｍ２ＤＣ集団における細胞のほとんどが、マイクロビーズを捕捉し得なかった。
４つのＤＣサブタイプ間の相違点をさらに同定するために、分類された細胞のサイトカインＲＮａｓｅプロテクションアッセイを行った。ＬＰＳ刺激型ＤＣ（Ｍ１ＤＣおよび脱活性化ＤＣ）２つのサブセットは、非常に良く似たサイトカインｍＲＮＡパターンを示した。脱活性化ＤＣにおいて、ＩＬ−１およびＩＬ−６はアップレギュレーションされたが、ＩＬ−１２ｐ４０シグナルは弱かった。対照的に、Ｍ２ＤＣは、全く異なるパターン（すなわちＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６のアップレギュレーション、反対にＩＬ−１およびＩＬ−１Ｒａのダウンレギュレーション）を有した（図３ａ）。サイトカイン産生をより正確に比較するために、４つのＤＣサブセットおよびＬＰＳに次いで抗−ＣＤ４０  ｍＡｂで連続的に刺激されたＤＣのＩＬ−６およびＩＬ−１０ならびにＴＮＦαのｍＲＮＡの相対的コピー数を、リアルタイム定量的ＰＣＲによって測定した。ＬＰＳ刺激の後、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦαは、Ｍ１ＤＣにおいてアップレギュレーションされ、次いで脱活性化ＤＣにおいてわずかにダウンレギュレーションされたのに対して、Ｍ２ＤＣにおけるＩＬ−６のアップレギュレーションはほとんど検出されず、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の低レベルな発現が検出された（図３ｂ）。抗−ＣＤ４０を用いた刺激によってＭ１ＤＣから誘導されたＣＤ８６ｈｉｇｈ成熟ＤＣは、Ｍ２ＤＣに対してほとんど同じサイトカインプロフィールを示し、抗−ＣＤ４０刺激が主にＭ１ＤＣからＭ２ＤＣへのシフトを媒介するという概念が支持された。これらの異なるサイトカイン産生プロフィールは、４種類のＤＣサブセットを明瞭に区別する。
Ｍ２ＤＣおよび脱活性化ＤＣによるＭＨＣクラスＩ発現のレベルは非常に似ているので、本発明者は、異なるＤＣサブセットのＣＴＬ活性化の能力を比較した。Ｆ５トランスジェニックマウス由来の未反応ＣＤ８＋Ｔ細胞（ここで、このＴ細胞はインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）３６６−３７４特異的Ｄｈ−特異的抗原レセプターを保有する）を、数種類の濃度のＮＰペプチドを加えた３種類のＤＣサブセット（すなわち、未成熟ＤＣ、Ｍ２ＤＣおよび脱活性化ＤＣ）と共に培養した。本発明者は、Ｍ１ＤＣの表現型が暫定的であるので、Ｍ１ＤＣが機能的アッセイにおける使用に適していないと考えた。未成熟および脱活性化ＤＣが未反応Ｔ細胞を活性化し得ないということが見出されたのに対して、Ｍ２ＤＣは、１００ｐＭ以上のＮＰ３６６−３７４濃度でＣＴＬを活性化した（図４ａ）。
次いで、脱活性化ＤＣがＴ細胞アナジーを誘導し得るか否かを試験した。
ＯＶＡ２５７−２６４（オボアルブミン（ＯＶＡ）由来のペプチド）に特異的なＴ細胞クローン（４Ｇ３）は、脱活性化ＤＣおよびＯＶＡ２５７−２６４と共に４８時間培養され、次いでＢ６脾臓細胞および種々の濃度のＯＶＡ２５７−２６４と共に再び培養された。これらの４Ｇ３細胞は、ＣｏｎＡ培養上清にはなお応答し得たものの、いずれの試験濃度のＯＶＡ２５７−２６４にももはや応答しなかった。このことは、脱活性化ＤＣがアナジーを誘導し得ること示している。
（ＩＩＩ）ＤＣ成熟の新規モデル
これらのデータに基づいて、本発明者は、ＣＤ４０を介するシグナル伝達の非存在下ではＭ１ＤＣから脱活性化ＤＣへ至り、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体によりＣＤ４０を介するシグナルを受けると、安定な成熟型（Ｍ２ＤＣ）へと分化するというモデルを提案する（図５ｃ）。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の代わりに抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体を使用しても、同様に安定な成熟型（Ｍ２ＤＣ）へと分化する。その結果、ＣＤ４０刺激は、ＣＴＬの寛容化に反して活性化するための選択において極めて重要な役割を果たすことが判明した。一方で、ミコバクテリアの熱ショックタンパク質７０がＣＤ４０を介して単球誘導型ＤＣを刺激することが報告されていることから、未成熟ＤＣがＣＤ４０刺激を介して直接的にＭ２ＤＣへとシフトする経路が存在し得ることを無視することはできない（Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，９７１−９８３（２００１））。このモデルによって、すでに出版された報告（Ｓｔｏｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１９７３−１８７６（２００２）；Ｉｎｇｕｌｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，２２４７−２２５２（２００２）；Ｌｅｅ，Ｂ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，６９３−７０４（２００２））を参考にして、生体内における以下のシナリオが予測される。炎症に焦点を置くと、未成熟ＤＣは、抗原を捕捉し、ＴＬＲもしくは前炎症リンフォカインレセプターを介してＭ１ＤＣへの分化を引き起こすシグナルを受け取る。Ｍ１ＤＣは、それらがヘルパーＴ細胞表面上でのＣＤ４０Ｌ発現を誘導する所属リンパ節へ迅速に移動する。この一連の事象は、一般的に２４時間以内、特に１２時間以内に成し遂げられる。従って、活性型ヘルパーＴ細胞はＣＤ４０を介してシグナルをＭ１ＤＣに与え、その結果、脱活性化ＤＣへの最終的変化が起こる前に、ＣＴＬを活性化し得るＭ２ＤＣへの分化が生じる。ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の相互作用が失敗すると、ＣＴＬを寛容化する脱活性化ＤＣへの移行が誘導される（図５ｃ）。生体内でこれを確かめるために、ＬＰＳによって誘導されたＣＦＤＡ−ＳＥ標識化ＣＤ１１ｃ＋Ｍ１ＤＣにＯＶＡ３２３−３３６（これは、ＤＯ１１．１０マウスにおいてヘルパーＴ細胞を活性化する）を加えて、ＤＯ１１．１０マウスに接種した。２日後、所属リンパ節および脾臓内のＣＦＳＥ陽性細胞についてＣＤ８６発現を分析した。リンパ節においてＯＶＡ３２３−３３６を加えたＤＣのみがＣＤ８６を高レベルで発現したのに対して、脾臓におけるほとんどのＤＣは、ＯＶＡペプチドの存在の有無に関わらず、未成熟／脱活性化表現型のＤＣであった（図５ａ）。それゆえ、Ｍ１ＤＣは、特にリンパ節において、ヘルパーＴ細胞と相互作用した後Ｍ２ＤＣへ進行すると考えられる。
最後に、本発明者は、Ｍ１ＤＣの脱活性化が一般的な現象であるか否かを調べた。ペプチドグリカン（ＴＬＲ２リガンド）、ＣｐＧ  ＯＤＮ（ＴＲＬ９リガンド）、および壊死細胞（内因性活性化因子で、自己物質に由来する天然のアジュバンドの形状であると考えられている；Ｇａｌｌｕｃｃｉ，Ｓ．，Ｌｏｌｋｅｍａ，Ｍ．＆  Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｐ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５，１２４９−１２５５（１９９９））を未成熟ＤＣと共に６もしくは４８時間培養した。抗−ＣＤ４０  ｍＡｂは、４８時間後にＤＣ上でＣＤ８６の高レベルな発現を誘導したが、６時間後には誘導しなかった（図１に示されるのと同様に）。それとは対照的に、ペプチドグリカン、ＣｐＧ  ＯＤＮ、および壊死細胞は、６時間後に強いＣＤ８６発現を誘導したが、４８時間後にはほとんどの細胞において明らかに発現されず、ＬＰＳ刺激型ＤＣの場合も同様であった（図５ｂ）。これらのデータは、ここに提唱した成熟モデルがＤＣ成熟の主要な生理学的経路であることを示す。
（ＩＶ）考察
本発明の新たな成熟ＤＣモデルは、いくつかの長年の疑問を解決し得る。第１に、なぜＤＣを誘導する全ての試薬のうち抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ（もしくはＣＤ１５４）のみがＣＴＬ活性化を顕著に特徴付けるのかである（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４７４−４７８（１９９８）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４７８−４８０（１９９８）；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４８０−４８３（１９９８））。本発明者は、ＣＴＬ誘導におけるＣＤ４０刺激の本当の役割は成熟ＤＣ表現型の継続的な安定性の維持であると考えている。実際、ＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体およびＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の発現が、ＬＰＳ刺激後それぞれ約８時間および２４時間で検出された（未発表の研究）。Ｍ１ＤＣ表現型は初期段階において短時間だけ存在しているので、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の発現レベルはこの段階ではＣＴＬ活性化に必要とされるレベルにまで達することができない。脱活性化ＤＣもまた、十分なレベルのＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体の保持にも関わらず、ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＩＬ−１２をほとんど発現しないために、ＣＴＬ活性化能力を有さない。ＣＤ４０刺激の２４時間後ないしピシバニール＋ＣＤ４０刺激の４８時間後に達成されるＭ２ＤＣのみが、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体をＣＴＬに提示することができた。総合すると、Ｍ１ＤＣおよびＭ２ＤＣの主な役割は、それぞれヘルパーＴ細胞およびＣＴＬ（もしくはヘルパーＴ細胞）を活性化することである可能性がある。
第２に、「未成熟ＤＣは単独でＣＴＬ寛容化を誘導することができるのか？」である。本発明者は、脱活性化ＤＣが未成熟ＤＣと機能的にほぼ同一である寛容誘発ＤＣの候補となり得ることを表現型的および機能的に同定した。未成熟ＤＣは寛容を生じる効果を発揮し得ると信じられている（Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４，７６９−７７９（２００１）；Ｈｕｇｕｅｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６，１６９−１８１（２００２）；Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１２１３−１２２２（２００１）；Ｌｉｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，１０９１−１０９７（２００２））。しかしながら、Ａｌｂｅｒｔら（Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，１０１０−１０１７（２００１））は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の交差寛容化の誘導にＤＣ成熟が必要であることを実証した。さらに、ＤＣのＣＤ４０刺激は、交差寛容化ではなく交差活性化の結果を決定づけた。本発明者のモデルは、おそらくこれらの研究を説明する。さらに、脱活性化ＤＣは、免疫応答を減少させる能力（ＩＬ−１０産生を含む）に帰因する様々な特徴を有している。従って、このサブセットは、抗原特異的免疫応答の調節に有用であり得る。
最後に、エンドトキシン寛容のメカニズムは何であるかについて説明する。エンドトキシン寛容（Ｇｒｅｉｓｍａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２４，９８３−１０００（１９６６））（エンドトキシン（ＬＰＳを含む）への継続的な暴露によって誘導される）は、おそらく、ＣＤ４０を介する刺激の非存在下で起こる急速な表現型の変化（Ｍ１ＤＣから脱活性化ＤＣへの）によって説明される。この概念は、脱活性化ＤＣにおけるＴＬＲ４／ＭＤ２のより低レベルな発現（図２ｂ）によって、部分的に支持される。さらに、いくつかの他の報告（Ｗｙｓｏｃｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，７５０４−７５１３（２００１）；Ａｌｖｅｓ−Ｒｏｓａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８，２２１−２２８（２００２））（ＩＬ−１２産生が実験的エンドトキシン寛容の間に抑制されること、およびＩＬ−１βがエンドトキシン寛容に関係していること）で述べられている研究はまた、脱活性化ＤＣのサイトカインプロフィールによっても説明される。同様に、大量壊死および重篤な感染（たとえば、エンドトキシンショック）においては、非常に多くのＭ１ＤＣが存在するため、ヘルパーＴ細胞が全てのＭ１ＤＣをＭ２ＤＣへと分化させることはできない。これらは、結果的に、脱活性化ＤＣの増加およびそれに対応する免疫不全の現象をもたらす。総じて、ここで定義されるＤＣサブセットは、免疫応答の調節に深く関係していると結論づけられる。
【実施例２】（Ｉ）骨髄性ＤＣの調製
ＤＣは前述のようにマウスの骨髄より調製した（Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６９３−１７０２（１９９２））。簡単には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＣｒもしくはＢ６Ｃ３Ｆ１マウス（ＳＬＣ）の骨髄細胞から、特異的な抗体および補体を用いてＴ細胞、Ｂ細胞および顆粒球を除いた後に、１０％ＦＣＳ、４ｎｇ／ｍｌ組み換えマウス顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ）（Ｋｉｒｉｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄにより提供された）および５０μＭ  β−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）中で、２４ウェル培養プレートにて６日間培養した。培養培地は、２日に１回新鮮な培地と交換した。ＤＣの成熟は、５μｇ／ｍｌ  抗−ＣＤ４０  ｍＡｂ（ＮＭ４０−３）、１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）、１μｇ／ｍｌペプチドグリカンＩＩＩ型（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来）（Ｗａｋｏ）、０．１μＭホスホチオエート保護化ＣｐＧ  ＯＤＮ（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１）、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）もしくは凍結および解凍された１×１０５ＣＯＳ−７細胞（壊死細胞として）からの派生物を、各々の培養ウェルへ添加することによって誘導された。
（ＩＩ）フローサイトメトリー
ＤＣを抗−ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ  ｍＡｂ（２．４Ｇ２）で処理し、次いでフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合型の抗−ＣＤ１１ｃ、フィコエリトリン（ＰＥ）結合型の抗ＤＣ８６もしくはＩ−Ａｋ、およびビオチン結合型のハムスター抗−ＩｇＧ、Ｉ−Ｋｋ（ＢＤ  Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ）またはＴＬＲ４／ＭＤ２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色し、ストレプトアビジン−ＰＥを行った。染色された細胞は、ＦＡＣＳｃａｎを用いて得た（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）。
結果を図２ｂに示す。
（ＩＩＩ）食作用アッセイ
ＦＩＴＣ標識された２μｍ樹脂マイクロビーズ（５×１０６）（Ｓｉｇｍａ）を、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて分類された未成熟ＤＣ、Ｍ２ＤＣもしくは脱活性化ＤＣ（１×１０５）と共に、共培養した。８時間インキュベーションした後、各々のＤＣをＦＡＣＳ分析にかけた。
（ＩＶ）ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）
製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、各ＤＣサブセットから細胞の全ＲＮＡを単離した。ｍＣＫ−２ｂプローブセットと共にＲｉｂｏＱｕａｎｔ  ｋｉｔｓ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して、サイトカインｍＲＮＡのレベルをＲＰＡによって検出した。簡単には、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅによって分類された各ＤＣサブセットの全ＲＮＡ（２μｇ）を、５６℃にて１６時間、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ標識化アンチセンスリボプローブにハイブリダイゼーションさせた。ＲＮａｓｅ  Ａおよびプロテイナーゼ  Ｋによって消化した後、保護されたＲＮＡフラグメントを変性シークエンスゲル上で分離し、オートラジオグラフィーを行った。
（Ｖ）ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡ（０．５μｇ）をｃＤＮＡ合成に用いた。逆転写（ＲＴ）は、業者のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ  ＲＴａｓｅおよびｏｌｉｇｏ−（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行われた。総量２０μｌのＲＴ反応混合液のうち１μｌを、各リアルタイムＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  ３  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３＿ｗｗｗ．ｃｇｉ）を使用して設計し、合成した（Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。このプローブを、５’末端でレポーター色素、また３’末端でクエンチング剤を結合させるように改変した。そのオリゴヌクレオチドの配列は、ｍβ−アクチン（順方向：５’−ｇｇｃｃａｇｇｔｃａｔｃａｃｔａｔｔｇｇ−３’（配列番号２）、逆方向：５’−ａｔｇｃｃａｃａｇｇａｔｔｃｃａｔａｃｃ−３’（配列番号３）、プローブ：５’Ｆａｍ−ｔｃａｇｇｇｃａｔｃｇｇａａｃｃｇｃｔｃ−Ｔａｍｒａ３’（配列番号４））、ｍＩＬ−６（順方向：５’−ｃｔｔｃａｃａａｇｔｃｇｇａｇｇｃｔｔａａ−３’（配列番号５）、逆方向：５’−ｃａｇａａｔｔｇｃｃａｔｔｇｃａｃａａｃ−３’（配列番号６）、プローブ：５’Ｆａｍ−ｔｃａｔｔｔｃｃａｃｇａｔｔｔｃｃｃａｇａｇａａｃａ−Ｔａｍｒａ３’（配列番号７））、ｍＩＬ−１０（順方向：５’−ｃｃｔｇｇｇｔｇａｇａａｇｃｔｇａａｇａ−３’（配列番号８）、逆方向：５’−ｇｃｔｃｃａｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｃｔｔａ−３’（配列番号９）、プローブ：５’Ｆａｍ−ａａｔｃｇａｔｇａｃａｇｃｇｃｃｔｃａｇｃｃ−Ｔａｍｒａ３’（配列番号１０））およびＴＮＦα（順方向：５’−ｃｃａｇａｃｃｃｔｃａｃａｃｔｃａｇａｔｃ−３’（配列番号１１）、逆方向：５’−ｃａｃｔｔｇｇｔｇｇｔｔｔｇｃｔａｃｇａ−３’（配列番号１２）、プローブ：５’Ｆａｍ−ａａｔｔｃｇａｇｔｇａｃａａｇｃｃｔｇｔａｇｃｃｃａｃ−Ｔａｍｒａ３’（配列番号１３））、である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して前述された（Ｓｔｏｒｄｅｕｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．２５９  ５５−６４（２００２））ように行った。簡単には、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｙｓａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（２μｌ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、１μｌのハイブリダイゼーションプローブ（４ｐｍｏｌ／μｌ）および適切な濃度の順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、最終体積２０μｌの反応混合液になるようにした。最初の変性工程（９５℃にて１０分間）の後、温度サイクル（９５℃にて０秒、６０℃にて２０秒）を開始した。計４５サイクル行った。各サイクルの終わりに、Ｆ１／Ｆ２を用いてフルオレセインを読み取った。全ての増幅を３回行って、標準曲線からの計算値によって定量した。全ての結果は、β−アクチンに対して標準化した。
（ＶＩ）Ｔ細胞増殖アッセイ
ＲＡＧ−１欠損（Ｃｏｒｂｅｌａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １，２６９−２７６（１９９４））を有するＤｂ制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＮＰ３６６−３７４特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｆ５）に由来する未反応Ｔ細胞を、ナイロンウールカラムを用いて精製した。Ｔ細胞（２×１０５／ウェル）を、各ＤＣサブセット（５×１０５／ウェル）と共に３日間培養した。その応答を３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定した。脱活性化ＤＣのアナジー誘導能力をみるために、Ｋｂ制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）ＯＶＡ２５７−２６４特異的Ｔ細胞クローン（１×１０６／ウェル）（４Ｇ３；Ｓｙｋｕｌｅｖ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１１４８７−１１４９１（１９９４））を、脱活性化ＤＣ（１×１０５／ウェル）と共に、１０μｌ  ＯＶＡ２５７−２６４の存在下で、２４ウェルプレート中で２日間培養した。次いで、４Ｇ３細胞（１×１０５／ウェル）を洗浄し、滴定された（ｔｉｔｔａｔｅｄ）濃度のＯＶＡ２５７−２６４ペプチドと共にマイトマイシンＣで処理した脾臓細胞（２×１０５／ウェル）（抗原提示細胞として）と共に培養した。これらの応答は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定した。
（ＶＩＩ）生体内におけるＤＣ成熟アッセイ
ＯＤ１１．１０マウス（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，１７２０−１７２３（１９９０））の４本の足全てに、１×１０７ＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）標識されかつＬＰＳ刺激されたＤＣ（ＯＶＡ２５７−２６４ペプチド（Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を適用した、またはこれを適用していない）を皮下注射した。注射の２日後、リンパ節および脾臓を、分解能の低いコラゲナーゼを用いて３７℃で３０分間消化した。次いで、ＣＦＳＥ陽性細胞を抗−ＣＤ８６抗体で染色し、前述のように解析した。
【実施例３】１．樹状細胞の表現型の変化は、ＩＬ−１０に強く依存しており、拮抗作用を持つ刺激性抗ＣＤ４０抗体とは作用時期が異なっていた。
マウスの未成熟樹状細胞を、ＬＰＳで刺激して時間経過にともなう副刺激分子ＣＤ８６の発現変化を解析した。樹状細胞上のＣＤ８６分子はＬＰＳ刺激により一時的に発現量が増加するが、その後徐々に低下に転じる（図６上段）。この際、反応の最初からＩＬ−１０の働きをブロックする抗ＩＬ−１０受容体抗体を加えると、３０時間後でも成熟樹状細胞が多く残るようになる（図６中段）。このＩＬ−１０の効果が、一時的に活性化する前に作用するのか、一時的活性化後に起こるのかを確かめるため、ＬＰＳ刺激後８時間で培養液を交換してから抗ＩＬ−１０受容体抗体（ａＩＬ−１０）を加えた。その結果、一時的活性化後にＩＬ−１０の作用をブロックしても脱成熟化を防ぐには至らなかった（図６下段）。従って、ＩＬ−１０は樹状細胞が刺激を受けて一時的に活性化するまでの初期段階で作用することが判明した。また抗ＣＤ４０抗体は、一時的活性化以降に作用しても効果があることが判明した（図１下段）。この結果から、ＩＬ−１０やＣＤ４０を介する刺激を時間的および量的に調節する事で樹状細胞を免疫活性化の表現型に誘導するか、免疫抑制性の表現型に誘導するかの制御がより確実に行えるようになった
２．樹状細胞の機能誘導法によるサイトカイン産生の再評価
樹状細胞を活性型または脱活性型に機能誘導する際、ＬＰＳまたはＣｐＧに抗ＣＤ４０抗体（ａＣＤ４０）または抗ＩＬ−１０抗体を入れて、あるいはその両方を入れて誘導した場合、サイトカイン産生にどのような違いが出るかを明らかにした。活性型はＣＤ８６が高発現のものをフローサイトメーターで分離し、脱活性型はＣＤ８６が低発現のものを同じように分離して培養した。結果、活性型樹状細胞（Ｍ２ＤＣ）では抗ＣＤ４０抗体（ａＣＤ４０）と抗ＩＬ−１０抗体（ａＩＬ−１０）どちらも加えた群はＩＬ−１２ｐ４０の産生が強く、抑制性サイトカインであるＩＬ−１０産生が弱い事から、ＣｐＧ＋抗ＣＤ４０抗体＋抗ＩＬ−１０抗体の組み合わせがＩＬ−１２分泌に最も効果的であった。一時的活性型（Ｍ１ＤＣ）と活性型（Ｍ２ＤＣ）の違いは、Ｍ１がＩＬ−１０とＩＬ−１２の両方を産生するのに対し、Ｍ２はＩＬ−１２のみ産生し、ＩＬ−１０は有意な測定値以下であった。一方脱活性型ＤＣの場合はＩＬ−１２の分泌はみられずＩＬ−１０を少量産生するにとどまった（図７）。
３．活性型（Ｍ２ＤＣ）または抑制型（Ｅｘｐｉｒｅｄ  ＤＣ）樹状細胞の生体内での機能
実験プロトコール：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスの四肢に卵白アルブミン（ＯＶＡ）蛋白抗原を取り込ませた活性型または抑制型樹状細胞を皮下投与する。一週間後にＯＶＡ蛋白抗原を取り込ませてＬＰＳで６時間刺激した樹状細胞をさらに四肢に皮下投与する。さらに一週間後、別のＢ６マウスの脾細胞を異なる蛍光強度で標識し、蛍光強度の強い細胞にＯＶＡペプチド（アミノ酸配列：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）１０μＭをパルスし、蛍光強度の弱い細胞にはＯＶＡ蛋白とは無関係のＮＰペプチド（アミノ酸配列：ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ）をパルスし、これらを１：１で混合して細胞１ｘ１０６個ずつを樹状細胞で免疫したマウスすべてに静脈内投与する。約１０時間後に免疫したマウスの脾臓を取り出し、蛍光標識した細胞をフローサイトメーターで解析する。
樹状細胞誘導プロトコールの変更点：
１の結果を踏まえ、活性型樹状細胞は、未成熟樹状細胞をＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−１０抗体（１０μｇ／ｍｌ）を含有する培養液で３０時間培養し、フローサイトメーターでＣＤ８６高発現の分画を精製したものを使用した。抑制型樹状細胞は、従来通りＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ  ＯＤＮ（０．１μＭ）を含有する培養液で３０時間培養し、フローサイトメーターでＣＤ８６低発現の分画を精製し、使用した。
成績：樹状細胞はＯＶＡ蛋白を取り込んでいるので、マウスはＯＶＡ抗原で免疫されたことになり、免疫が誘導されていれば蛍光強度の強い細胞集団は排除されることになる。まず、実験システムが動いているかを未処置マウスと、蛋白を取り込ませなかった活性型樹状細胞で確かめたところ、どちらも細胞の排除はみられなかった（図８上段）。結果的に１回だけ免疫したことになるＰＢＳ群は、約３０％の抗原特異的排除がみられた（図８下段左）が、活性型樹状細胞を先に免疫しておくと約７０％へと効果が促進された（図８下段右）。一方、先に抑制型樹状細胞を免疫した群では、抗原特異的排除が抑制された（図８下段中）。以上の結果から、活性型および抑制型樹状細胞の生体応用への効果が実証された。
４．未成熟樹状細胞と脱活性型樹状細胞の違いについて。
骨髄樹状細胞をＣＤ１１ｃマグネットビーズで精製し、刺激前のもの（未成熟樹状細胞）とＬＰＳで４８時間刺激したもの（脱活性化樹状細胞）のＣＤ４０の発現を、ＨＭ４０−３抗体による染色で評価した。フローサイトメーターによる解析（図１０）の結果、未成熟樹状細胞もＣＤ４０分子を発現しているものの、脱活性化樹状細胞は蛍光強度にして１０〜２０倍のＣＤ４０分子を発現していた。
実施例４：ヒト活性化樹状細胞誘導
１．誘導法
・  癌患者末梢血より濃度勾配遠心分離法にて単核球を分離する。
・  ２ｘ１０７個の単核球を１０ｍｌの５％ヒトＡＢ血清含培養液に浮遊させた後、１００−ｍｍプラスチックプレート中で２時間静置する。
・  浮遊細胞を除き、１０ｍｌの５％ヒトＡＢ血清含培養液を加えプラスチックプレート付着細胞を５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦと１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４存在下に７日間培養する。
・  培養液を除き、新たにＯＫ４３２（０．１ＫＥ／ｍｌ），抗ＣＤ４０抗体（２．５ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）あるいは抗ＩＬ−１０抗体（１０ｍｉｃｒｏｇｒａｍ／ｍｌ）を含む培養液を加え４８時間培養する。
・  培養終了後細胞を回収し、フローサイトメトリーにより誘導樹状細胞表面マーカーを検討する。
図１０の上段より、無添加（未成熟ＤＣ）、ＯＫ４３２のみ（脱活性化ＤＣ）、ＯＫ４３２／抗ＣＤ４０抗体（Ｍ２ＤＣタイプ１）、ＯＫ４３２／抗ＩＬ−１０抗体（Ｍ２ＤＣタイプ１）、ＯＫ４３２／抗ＣＤ４０抗体／抗ＩＬ−１０抗体（Ｍ２ＤＣタイプ１）添加による誘導樹状細胞。
２．結果
無添加誘導細胞（未成熟ＤＣ）と比較して、ＯＫ４３２添加によりヒトの活性化ＤＣにおいてＣＤ８０，８３，８６およびｃｌａｓｓ  ＩＩすべての発現増加が認められた。さらに抗ＣＤ４０抗体を添加することにより、ＣＤ８０と８３発現が著明に増加した（ＭＦＩで約１００倍）。この発現増加は抗ＩＬ−１０抗体では認められなかった。
ＯＫ４３２＋抗ＣＤ４０抗体の刺激がその他のどの刺激よりも強くＣＤ８０の発現を増強させており、臨床応用を考えた場合、重要であると考えられる。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．Ｎｏｍｕｒａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，３４７６−３４７９（２０００）
２．Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，４７９−４８８（１９９３）
３．Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，９７１−９８３（２００１）
４．Ｓｔｏｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１９７３−１８７６（２００２）
５．Ｉｎｇｕｌｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，２２４７−２２５２（２００２）
６．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，６９３−７０４（２００２）
７．Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４７４−４７８（１９９８）
８．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４７８−４８０（１９９８）
９．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，４８０−４８３（１９９８）
１０．Ｈａｗｉｇｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４，７６９−７７９（２００１）
１１．Ｈｕｇｕｅｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６，１６９−１８１（２００２）
１２．Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，１２１３−１２２２（２００１）
１３．Ｌｉｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，１０９１−１０９７（２００２）
１４．Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２，１０１０−１０１７（２００１）
１５．Ｇｒｅｉｓｍａｎ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２４，９８３−１０００（１９６６）
１６．Ｗｙｓｏｃｋａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，７５０４−７５１３（２００１）
１７．Ａｌｖｅｓ−Ｒｏｓａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８，２２１−２２８（２００２）
１８．Ｉｎａｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６９３−１７０２（１９９２）
１９．Ｓｔｏｒｄｅｕｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．２５９  ５５−６４（２００２）
２０．Ｃｏｒｂｅｌａ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １，２６９−２７６（１９９４）
２１．Ｓｙｋｕｌｅｖ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，１１４８７−１１４９１（１９９４）
２２．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０，１７２０−１７２３（１９９０）
【配列表】
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2004063363.tif 000006
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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