(57)【要約】本発明は、試料中の糖化蛋白質、例えばヘモグロビンＡ１ｃを測定する方法に関する。本発明の方法は、前記試料を一定量のフルクトシルアミンの存在下でフルクトシルアミン酸化触媒と接触させ、前記触媒により酸化されたフルクトシルアミンの量を測定することにより、前記糖化蛋白質の量を測定することを特徴とする。フルクトシルアミン酸化触媒としては、イミダゾール基を有する分子、フルクトシルアミン酸化酵素等を用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の糖化蛋白質を測定する方法であって、前記試料を一定量のフルクトシルアミンの存在下でフルクトシルアミン酸化触媒と接触させ、前記触媒により酸化されたフルクトシルアミンの量を測定することにより、前記糖化蛋白質の量を測定することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１において、フルクトシルアミン酸化触媒がイミダゾール基を有する分子であることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項３】
請求項１において、フルクトシルアミン酸化触媒がフルクトシルアミン酸化酵素であることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項４】
請求項１から３において、フルクトシルアミン酸化触媒がフルクトシルバリンに選択的であることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項５】
請求項１から４において、フルクトシルアミンの量を測定する工程が、フルクトシルアミンの酸化に伴って還元された電子受容体の量を分光学的に測定することにより行われることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項６】
請求項１から４において、フルクトシルアミンの量を測定する工程が、フルクトシルアミンの酸化に伴って還元された電子受容体の量を電極を用いて電気化学的に測定することにより行われることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項７】
請求項１から６において、糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特色とする糖化蛋白質の測定方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施するための糖化蛋白質測定キット。
【請求項９】
フルクトシルアミン酸化触媒およびフルクトシルアミンを含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の方法を実施するための糖化蛋白質測定キット。
【請求項１０】
糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃである、請求項８または９に記載の測定キット。
【請求項１１】
請求項１から４ならびに６に記載の方法を実施するための糖化蛋白質測定用センサー。
【請求項１２】
請求項１から４ならびに６に記載の方法を実施するためのヘモグロビンＡ１ｃ測定用センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は臨床検査の分野で糖尿病診断のマーカとして利用されている糖化蛋白質ならびにヘモグロビンＡ１ｃの測定方法に関する。より詳細には、本発明は、糖化蛋白質およびヘモグロビンＡ１ｃがフルクトシルアミン酸化触媒によるフルクトシルアミンの酸化反応を拮抗的に阻害することに基づいて、糖化蛋白質ならびにヘモグロビンＡ１ｃの定量を行う方法に関する。さらに、本発明は本発明の方法に基づき構築された糖化蛋白質ならびにヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットならびにセンサーに関する。
【背景技術】  蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基はグルコースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。血中においては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン（グリコヘモグロビン；ＨｂＡ１ｃ）を生ずることが知られている。糖尿病患者では健常人に比べてヘモグロビンに対するＨｂＡ１ｃの存在比率が高いこと、およびＨｂＡ１ｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃ血中濃度は糖尿病の診断および糖尿病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験において極めて重要である。
これまでに、種々の菌株からアマドリ化合物に対して作用する酵素、フルクトシルアミン酸化酵素が単離されており、これらの酵素を用いて糖化アルブミンやＨｂＡ１ｃなどの糖化蛋白質の加水分解産物を分析しうることが示唆されている（特開昭６１−２６８１７８、特開昭６１−２８０２９７、特開平３−１５５７８０、特開平５−１９２１９３、特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７２、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１），１０３−１１０，１９８９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（２），３３３−３３８，１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），２７２９７−２７３０２，１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１２），４４８７−４４８９，１９９５、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（３），４８７−４９１，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１），２１８−２２４，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（５１），３２８０３−３２８０９，１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６），３４３７−３４４３，１９９７）。
また、フルクトシルアミンを酸化する触媒作用を有する種々の合成高分子が合成されており、これらの触媒を用いて糖化アルブミンやＨｂＡ１ｃなどの糖化蛋白質の加水分解産物を分析しうることが示唆されている（ＷＯ０１／９０７３５  ＷＯ０２／２２６９８）、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ４３５，１５１−１５６，２００１）。
しかし、これまでに報告されているフルクトシルアミン酸化触媒は、加水分解されていない糖化蛋白質を基質として酸化することはできない。このため、まず糖化蛋白質の加水分解を行い、その結果生じる低分子量化した糖化ペプチドあるいはフルクトシルアミンをフルクトシルアミン酸化触媒を用いて酸化することにより、糖化蛋白質を測定していた。したがって、当該技術分野においては、糖化蛋白質を分解せずに測定する方法が望まれていた。
本発明は糖化蛋白質ならびにヘモグロビンＡ１ｃを加水分解せずにその濃度を測定する新規な糖化蛋白質の測定方法を提供することを目的とする。より詳細には本発明は臨床検査などの分野で利用される糖化蛋白質、特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）や糖化アルブミンの測定方法、ならびにその方法に基づき構築される測定用試薬ならびにセンサーを提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は、糖化蛋白質がフルクトシルアミン酸化触媒によるフルクトシルアミン酸化反応を拮抗的に阻害しうることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、試料中の糖化蛋白質を測定する方法であって、前記試料を一定量のフルクトシルアミンの存在下でフルクトシルアミン酸化触媒と接触させ、前記触媒により酸化されたフルクトシルアミンの量を測定することにより、前記糖化蛋白質の量を測定することを特徴とする方法を提供する。本発明にしたがえば、糖化蛋白質を加水分解することなく、糖化蛋白質によるフルクトシルアミン酸化触媒の拮抗阻害を指標として糖化蛋白質を測定することが可能となる。
本明細書において、「フルクトシルアミン酸化触媒」とは、フルクトシルアミンの酸化反応を触媒し、かつその反応が糖化蛋白質の存在下で濃度依存的に阻害される触媒を表す。フルクトシルアミン酸化触媒の例としては、フルクトシルアミン酸化酵素、および電子受容体の存在下でフルクトシルアミンの酸化を触媒するポリマー、例えばイミダゾール基含有ポリマーが挙げられる。
好ましい態様においては、本発明は上記記載のフルクトシルアミン酸化触媒がイミダゾール基を有する分子であることを特色とする糖化蛋白質の測定方法を提供する。また好ましい態様においては、本発明は上記記載のフルクトシルアミン酸化触媒がフルクトシルアミン酸化酵素であることを特色とする糖化蛋白質の測定方法を提供する。より好ましくは、フルクトシルアミン酸化触媒はフルクトシルバリンに選択的である。
好ましくは、本発明の方法において、フルクトシルアミンの量を測定する工程は、フルクトシルアミンの酸化に伴って還元された電子受容体の量を分光学的に測定することにより行われる。また好ましくは、本発明の方法において、フルクトシルアミンの量を測定する工程は、フルクトシルアミンの酸化に伴って還元された電子受容体の量を電極を用いて電気化学的に測定することにより行われる。
さらに本発明は上記記載の糖化蛋白質がヘモグロビンＡ１ｃであることを特色とする糖化蛋白質の測定方法を提供する。
また本発明は上記記載の原理に基づく糖化蛋白質測定キットを提供する。好ましくは、このキットは、フルクトシルアミン酸化触媒およびフルクトシルアミンを含む。本発明はまた上記記載の原理に基づくヘモグロビンＡ１ｃ測定キットを提供する。
さらに本発明は上記記載の原理に基づく糖化蛋白質測定用センサーを提供する。本発明はまた、上記記載の原理に基づくヘモグロビンＡ１ｃ測定用センサーを提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は実施例２で構築したセンサーシステムである。
図２は実施例２で構築したセンサーシステムに、ＨｂＡ１ｃ試料を添加したときの定常電流値の減少を示す。
図３は実施例２で示したセンサーにフルクトシルバリン存在下でさまざまな蛋白質やＨｂＡ１ｃを添加したときの、定常電流値の減少の各々の試料濃度依存性を示す。
図４は実施例２で作成したセンサーシステムを用いたＨｂＡ１ｃを計測した結果である。
図５は実施例５で作成したセンサーシステムを用いたＨｂＡ１ｃを計測した結果である。
発明の詳細な説明
本発明の糖化蛋白質の測定方法は、糖化蛋白質がフルクトシルアミン酸化触媒によるフルクトシルアミン酸化反応を拮抗的に阻害しうるという発見に基づく。すなわち、糖化蛋白質を含む試料を一定量のフルクトシルアミンの存在下でフルクトシルアミン酸化触媒と接触させると、フルクトシルアミン酸化触媒により酸化されるフルクトシルアミンの量は、糖化蛋白質の濃度に依存して変化する。したがって、酸化されたフルクトシルアミンの量または酸化速度を測定することにより、試料中の糖化蛋白質の濃度を決定することができる。
フルクトシルアミン酸化触媒としては、たとえばイミダゾール基を有する合成高分子あるいはフルクトシルアミン酸化酵素を用いることができるが、フルクトシルアミンの酸化活性があり、かつ糖化蛋白質による拮抗阻害を受ける触媒であれば限定されるものではない。たとえば、イミダゾールに限らず、一般塩基触媒の機能を果たす官能基、たとえばピリジンを含むビピリジルを含むモノマーを用いて重合されたポリマーを用いることができる。
本発明の方法はＨｂＡ１ｃの測定に特に有用である。ＨｂＡ１ｃはその分子内にフルクトシルバリン部分を有しており、フルクトシルバリンに選択的なフルクトシルアミン酸化触媒に対して拮抗的に作用するため、本発明の方法にしたがってこれを特異的に定量することができる。このような触媒としては、たとえばイミダゾール基を有する合成高分子を重合時にフルクトシルバリンを鋳型として存在させることにより合成した触媒ポリマー、あるいはフルクトシルバリンに選択的なフルクトシルアミン酸化酵素を用いることができるが、フルクトシルバリンの酸化活性があり、かつＨｂＡ１ｃによる拮抗阻害を受ける触媒であれば限定されるものではない。たとえば、フルクトシルバリンに限らず、類似体であるメチルバリンを鋳型として合成されたイミダゾール基を有する触媒ポリマーも触媒として用いることができる。
本発明における糖化蛋白質の測定は、フルクトシルアミン酸化触媒によるフルクトシルアミンの酸化にともなって還元される電子受容体の量あるいは還元速度を計測することによって容易に行うことができる。例えば、一定量のフルクトシルアミン酸化触媒およびフルクトシルアミン、ならびに電子受容体を含む溶液に試料を加え、フルクトシルアミンの酸化にともなって還元される電子受容体の量あるいは還元速度を測定し、試料の非存在下における電子受容体の量あるいは還元速度と比較することにより、試料中の糖化蛋白質の測定を行うことができる。電子受容体の測定方法としては、電子受容体の還元状態の特徴的なスペクトルに基づき分光学的手法により計測する方法、あるいは還元状態の電子受容体を電極上で再酸化することに基づき得られる電流を計測することによる電気化学的手法などを用いることができる。
電子受容体としてフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）とジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いて、基質としてフルクトシルバリンを用いたとき、時間とともにフルクトシルバリンが酸化され、ＰＭＳを介してＤＣＩＰが還元され退色していくことが観測される。このＤＣＩＰの退色の速度は存在するフルクトシルバリンの濃度に比例する。したがって、例えば、ＨｂＡ１ｃが存在するときには、フルクトシルバリンの酸化が拮抗的に阻害され、結果としてＤＣＩＰの退色速度が減少する。この退色速度の減少の割合を指標にＨｂＡ１ｃの濃度を測定することができる。すなわち、本発明の方法にしたがえば、電子受容体としてＰＭＳとＤＣＩＰの存在下で未知濃度のＨｂＡ１ｃを１０ｎＭ以下の感度で定量できる。さらに種々の人工電子受容体を利用してもよい。電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体などを用いることができる。
一方、触媒としてフルクトシルアミン酸化酵素を用いるときには、上記電子受容体の他、酸素を電子受容体として用いることができる。この場合には酸素の減少量・減少速度、あるいは生成する過酸化水素の生成量・生成速度を指標として、該酵素の糖化蛋白質による阻害を計測し、糖化蛋白質濃度を計測することができる。
アッセイキット
別の観点においては、本発明は、本発明の原理を用いた測定方法を含む、ＨｂＡ１ｃあるいは糖化アルブミン等の糖化蛋白質の測定キットを特徴とする。本発明の糖化蛋白質測定キットは、本発明に従うフルクトシルアミン酸化触媒、フルクトシルアミンならびに電子受容体を、少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、フルクトシルアミン酸化触媒とｐＨ６．０〜１０に調整された緩衝液、適当なメディエーター、キャリブレーションカーブ作製のための糖化蛋白質もしくはその誘導体の標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明に従う糖化蛋白質分析キットは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
センサー
別の観点においては、本発明は、糖化アルブミン、ＨｂＡ１ｃ等の糖化蛋白質を計測するためのセンサーを特徴とする。本発明の糖化蛋白質センサーは、フルクトシルアミン酸化触媒によりフルクトシルアミンが酸化されるのにともなって還元されるメディエータを電極上で電気化学的に酸化し、このときの電流値を測定する。糖化蛋白質の存在下では、糖化蛋白質の濃度に依存して酸化反応が拮抗的に阻害されるため、種々の濃度の糖化蛋白質の存在下で電流値を測定して標準曲線を作成し、これをもとに試料中の糖化蛋白質濃度を決定することができる。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にフルクトシルアミン酸化触媒を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーを用いる方法などがあり、これらを組み合わせて用いてもよい。
本発明の測定原理に従い、以下のようにＨｂＡ１ｃ計測用センサーが構築できる。カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極としてフルクトシルアミン酸化触媒を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、メディエーターを含む緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印加し、一定量のフルクトシルアミンおよび試料を加えて電流の増加値を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。
さらにカーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわち、作用電極としてフルクトシルアミン酸化触媒およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有結合法により高分子マトリックスに固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電位を印加し、一定量のフルクトシルアミンおよび試料を加えて電流の増加値を測定する。
いずれの電極を用いる場合にも、種々の濃度の糖化蛋白質の溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中の糖化蛋白質の濃度を求めることができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００２−３１９０４０号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】  １−ビニルイミダゾール１．６ｍｍｏｌ、４−ビニルフェニルボロン酸０．８ｍｍｏｌ、架橋試薬としてエチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）２ｍｍｏｌ、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．０６ｍｍｏｌを混合し、鋳型分子としてフルクトシルバリン０．２ｍｍｏｌを加え、溶媒として５２２μｌのメタノールと１７４μｌの水を加えて、アルゴン置換した後、４５℃で１２時間重合反応を行った。ここで得られたポリマー触媒をＢＩ−ＭＩＰとよぶ。このポリマーを乳鉢にてすりつぶし、ふるいによって粒子径４０μｍのポリマーを調製した。また鋳型分子であるフルクトシルバリンを添加しないで、上記と全く同じ操作を行うことによりコントロールポリマーであるＢＩ−ＣＰを合成した。これらのポリマーをメタノール：酢酸（７：２）で２回、アセトニトリル：酢酸（９：１）で２回、アセトニトリルで１回、メタノールで１回、それぞれ洗浄した。
【実施例２】  カーボンペースト５０ｍｇに対して実施例１で作成したポリマー触媒を２０ｍｇ混合し、カーボンペースト電極に充填した。この電極を１ｍＭ  １−メトキシフェナジンメトスルフェート（ｍＰＭＳ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）の溶液に浸漬し、印加電圧を１００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）とし、基質にフルクトシルバリンを添加したときの応答を観測した。さらにここにＨｂＡ１ｃを添加したときの応答値の変化を観察するセンサーシステムを構築した（図１）。フルクトシルバリンを添加することにより、ポリマー触媒によりフルクトシルバリンが酸化され、それに伴って溶液中のｍＰＭＳが還元される。還元体ｍＰＭＳがカーボンペースト電極に印加された電位により酸化されるため、電流の増加が観察される。この酸化還元反応ならびに電極反応は溶液中のフルクトシルバリン濃度に依存して一定の定常電流値を与える。ここへ一定量のＨｂＡ１ｃを滴下すると、定常電流値が低下する（図２）。これはＨｂＡ１ｃによるポリマー触媒の拮抗的阻害に基づく。さらに定常電流値に達した時点でＨｂＡ１ｃを滴下すると、さらに定常電流値が低下する。すなわち、ＨｂＡ１ｃ濃度に依存して、ポリマー触媒によるフルクトシルバリンの酸化反応が阻害されて電流値が低下することが示された。
【実施例３】  本センサーの選択性を調べることを目的として、本センサーシステムに種々の蛋白質を添加したときのセンサー応答の変化を観察した（図３）。比較対象として用いた蛋白質はＨｂＡ０，牛血清アルブミン、糖化アルブミンである。いずれの蛋白質を加えた場合もある程度の応答の低下がみられたが、これはＨｂＡ１ｃを加えた時の低下と比較して無視しうる程度であった。
【実施例４】  実施例３に基づき、本センサーシステムにおいてみられるフルクトシルバリンへの応答の阻害を指標にＨｂＡ１ｃの計測をおこなった。すなわち、本センサーシステムにおいて、添加するＨｂＡ１ｃ濃度の増加にしたがい、ＨｂＡ１ｃ非存在下でのフルクトシルバリン０．１ｍＭに対する応答電流値が低下する。このフルクトシルバリン０．１ｍＭに対する応答電流値から、種々の蛋白質存在下で観測された非特異的な応答値の低下を差し引き、フルクトシルバリン０．１ｍＭに対する応答電流値とした。この値に対して、種々の濃度のＨｂＡ１ｃ存在下で観測されるフルクトシルバリン０．１ｍＭに対する応答電流値を差し引き、その差のＨｂＡ１ｃ非存在下でのフルクトシルバリン０．１ｍＭに対する応答電流値に対する比を阻害率とした。この阻害率を縦軸にとり、ＨｂＡ１ｃの計測を行なった結果を図４に示す。このように、本センサーを用いて、ＨｂＡ１ｃを変性あるいは加水分解することなく、１０ｎＭの感度で検出することができた。
【実施例５】  作用極として白金電極、対極として白金線、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いるセンサーシステムを用いて、試料中のヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）とヘモグロビンＡｏ（ＨｂＡｏ）との比率を測定した。この測定の原理は、ＨｂＡ１ｃがフルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯＤ）によるフルクトシルバリンの酸化作用を濃度依存的に阻害することに基づく。
ＦＡＯＤ２０ｍＵ、ＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡｏ混合物（ヘモグロビンとして合計０．４７μｍｏｌ）を６００μｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に加え、８℃で３０分間インキュベートした後、作用極に６００ｍＶ  ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの電位を印加し、２５℃で２０分間インキュベートした。次に、０．１ｍｍｏｌのフルクトシルバリンを加え（全量６５０μｌ）、応答電流値（ＩＣ）の測定を行った。増加電流値をＨｂＡ１ｃ濃度に対してプロットした結果を図５に示す。添加している試料であるＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡｏ混合物におけるＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡｏの混合比を種々変化させ、本測定をおこなった。図から明らかなように、本試料中のＨｂＡ１ｃ濃度増加にともない、フルクトシルバリンに対する応答電流値が低下する。この応答電流値の低下を指標として、ＦＡＯＤを用いて０−８００ｎＭのＨｂＡ１ｃを検出することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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