(57)【要約】本発明は、可塑剤の測定・定量や濃縮に際し、感度の良い、交叉反応性の少ない、妨害物質の影響を受けにくい、溶媒による影響を受けにくい等の有用な性質を付加した、可塑剤に対する結合能を有する蛋白質を提供する。具体的には、抗原としての可塑剤に対する親和性、抗原結合能、交叉反応性、抗原抗体反応妨害物質耐性、酵素発色反応妨害物質耐性、溶媒耐性等の種々の性質を遺伝子組換え技術により向上させた改変蛋白質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）又は（ｂ）の蛋白質又はその塩：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、配列番号２５で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号２７で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項２】
以下（ａ１）〜（ａ４）、（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかの蛋白質又はその塩：
（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ４）配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋自質；
（ｂ３）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ４）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質。
【請求項３】
以下（ａ）又は（ｂ）の蛋白質又はその塩：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、若しくはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、若しくはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、
【請求項４】
可塑剤が、式（１）：
2004092370.tif 000029
［式中、Ｒ１はｏ−フェニレン、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって、各々、Ｈ、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖アルキル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいシクロヘキシルを意味する］で表される可塑剤である、請求項２又は３記載の蛋白質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の蛋白質を遺伝子組換えする方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法により得られた蛋白質又はその塩。
【請求項７】
請求項１〜４及び６のいずれか１項記載の蛋白質の部分ペプチド又はその塩。
【請求項８】
請求項１〜４及び６のいずれか１項記載の蛋白質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１〜４及び６のいずれか１項記載の蛋白質又はその部分ペプチド或いはそれらの塩を産生せしめ、これを採取することを特徴とする、請求項１〜４及び６のいずれか１項記載の蛋白質又はその部分ペプチド或いはそれらの塩の製造法。
【請求項１２】
以下（ａ）及び（ｂ）が連結してなる複合体：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、配列番号２５で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号２７で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項１３】
請求項１２記載の複合体を使用することを特徴とする、該複合体に結合する可塑剤を同定する方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の複合体を使用することを特徴とする、可塑剤の測定又は定量方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の複合体を含む、可塑剤の測定又は定量用キット。
【請求項１６】
請求項１２記載の複合体を使用することを特徴とする、可塑剤の濃縮方法。
【請求項１７】
請求項１２記載の複合体を含む、可塑剤の濃縮用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗可塑剤抗体、該抗体の遺伝子、該可塑剤に対する結合能を有する蛋白質の製造法、可塑剤の測定又は定量方法、可塑剤の濃縮方法等に関する。
【背景技術】  近年、環境中、例えば河川水又は下水中に存在する可塑剤等の環境汚染物質による環境汚染が問題となっている。従って環境中の環境汚染物質やその分解物を測定、分析して、その結果を環境保全に役立たせることが必要となる。このような測定、分析法として、幾つかの優れた方法が知られている（例えば、国際公開第ＷＯ９９／４３７９９号パンフレット及び特開２００１−４１９５８号公報を参照）。
【発明の開示】
本発明は、可塑剤に対する抗体の遺伝子を取得し、元の抗体が持つ抗原に対する親和性、抗原結合能、交叉反応性、抗原抗体反応妨害物質耐性、酵素発色反応妨害物質耐性、溶媒耐性等の種々の性質を遺伝子操作の改変技術により作出することにより得られた改変蛋白質に、可塑剤の測定・定量や濃縮に際し、感度の良い、交叉反応性の少ない、妨害物質の影響を受けにくい、溶媒による影響を受けにくい等の有用な性質を付加した可塑剤に対する結合能を有する蛋白質を作製し利用しようとするものである。
ここに、可塑剤としては、例えば、
式（１）：
2004092370.tif 000002
［式中、Ｒ１はｏ−フェニレン又はテトラメチレン、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって、各々、Ｈ、炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖（含ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、ｉｓｏ−）のアルキル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいシクロヘキシルを意味する。］で表される可塑剤（ＰＰ）［例、ＢＢＰ（フタル酸ブチルベンジル）、ＤＢＰ（フタル酸ジブチル）、ＤＣＨＰ（フタル酸ジシクロヘキシル）、ＤＥＰ（フタル酸ジエチル）、ＤＥＨＰ（フタル酸ジ（２−エチルヘキシル））、ＤＥＨＡ（アジピン酸ジエチルヘキシル）、ＤＨＰ（フタル酸ジヘキシル）、ＤＰＰ（フタル酸ジ−ｎ−ペンチル）、ＤＰｒＰ（フタル酸ジプロピル）、ＤＭＰ（フタル酸ジメチル）、ＤｎＯＰ（フタル酸ジノルマルオクチル）、ＤＩＮＰ（フタル酸ジイソノニル）、ＤＮＰ（フタル酸ジノニル）、ＤＩＤＰ（フタル酸ジイソデシル）、ＤＯＡ（アジピン酸ジオクチル）、ＤＩＮＡ（アジピン酸ジイソノニル）など］が挙げられる。
「炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル」としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、２−エチルヘキシル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシルなどが挙げられる。上記「炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル」の「直鎖又は分岐鎖のアルキル」としては、なかでも炭素数１〜１２のアルキルが好ましく、炭素数６〜１０のアルキルがより好ましい。
別の局面では、「炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル」は、炭素数１〜２０の置換されていてもよいアルキルでありうる。上記「炭素数１〜２０の置換されていてもよいアルキル」の「アルキル」としては、例えば、上記「炭素数１〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル」の「アルキル」と同様のものが挙げられるが、なかでも炭素数１〜１２のアルキルが好ましく、炭素数４〜８のアルキルがより好ましい。
「炭素数１〜２０の置換されていてもよいアルキル」、「置換されていてもよいシクロヘキシル」及び「置換されていてもよいベンジル」の置換基としては、例えば、炭素数１〜８のアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルなど）、炭素数２〜８のアルケニル（例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニルなど）、炭素数２〜８のアルキニル（例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニルなど）などが挙げられる。
上記「炭素数１〜８のアルキル」としては、なかでも炭素数１〜６のアルキルが好ましく、炭素数１〜４のアルキルがより好ましい。上記「炭素数２〜８のアルケニル」としては、なかでも炭素数２〜６のアルケニルが好ましく、炭素数２〜４のアルケニルがより好ましい。上記「炭素数２〜８のアルキニル」としては、なかでも炭素数２〜６のアルキニルが好ましく、炭素数２〜４のアルキニルがより好ましい。なお、「炭素数１〜２０の置換されていてもよいアルキル」、「置換されていてもよいシクロヘキシル」、「置換されていてもよいベンジル」の置換基の数は、特に制限されないが、例えば１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個でありうる。
また、可塑剤の他の例として、ＤＯＺ（アゼライン酸ジオクチル）、ＥＳＢＯ（エポキシ化大豆油）、ＴＯＴＭ（トリメット酸トリオクチル）、ＤＢＳ（セバシン酸ジブチル）、ＤＯＳ（セバシン酸ジオクチル）、ＴＣＰ（リン酸トリクレシル）、ＡＴＢＣ（アセチルクエン酸トリブチル）なども挙げることができる。
本発明者らは、親和性を向上させることにより感度良く測定可能等の有用な性質を付加した、抗可塑剤に対する結合能を有する蛋白質の取得につき鋭意検討したところ、その遺伝子もしくは改変遺伝子を含有する形質転換体を作製し、可塑剤に対する結合能を有する蛋白質を効率よく産生させることができることを見出し、さらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）以下（ａ）又は（ｂ）の蛋白質又はその塩：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、配列番号２５で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号２７で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（２）以下（ａ１）〜（ａ４）、（ｂ１）〜（ｂ４）のいずれかの蛋白質又はその塩：
（ａ１）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ２）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ３）配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ａ４）配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ１）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ２）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ３）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質；
（ｂ４）配列番号２７で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質、
（３）以下（ａ）又は（ｂ）の蛋白質又はその塩：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、若しくはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、若しくはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（４）可塑剤が、式（１）：
2004092370.tif 000003
［式中、Ｒ１はｏ−フェニレン、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なって、各々、Ｈ、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖（含ｓｅｃ−、ｔｅｒｔ−、ｉｓｏ−）アルキル、置換されていてもよいベンジル又は置換されていてもよいシクロヘキシルを意味する。］で表される可塑剤である、上記（２）又は（３）の蛋白質、
（５）上記（１）〜（４）のいずれかの蛋白質を遺伝子組換えする方法、
（６）上記（５）の方法により得られた蛋白質又はその塩、
（７）上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかの蛋白質の部分ペプチド又はその塩、
（８）上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかの蛋白質又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（９）上記（８）のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（１０）上記（９）の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１１）上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかの蛋白質又はその部分ペプチド或いはそれらの塩を産生せしめ、これを採取することを特徴とする、上記（１）〜（４）及び（６）のいずれかの蛋白質又はその部分ペプチド或いはそれらの塩の製造法、
（１２）以下（ａ）及び（ｂ）が連結してなる複合体：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列、配列番号２５で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号２７で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、
（１３）上記（１２）の複合体を使用することを特徴とする、該複合体に結合する可塑剤を同定する方法、
（１４）上記（１２）の複合体を使用することを特徴とする、可塑剤の測定又は定量方法、
（１５）上記（１２）の複合体を含む、可塑剤の測定又は定量用キット、
（１６）上記（１２）の複合体を使用することを特徴とする、可塑剤の濃縮方法、
（１７）上記（１２）の複合体を含む、可塑剤の濃縮用キット、
などである。
【図面の簡単な説明】  図１は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−１５０）重鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図２は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−１５０）軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図３は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−１５０）重鎖及び軽鎖を有する単鎖抗体遺伝子のアガロースゲル電気泳動を示す。
図４は、抗可塑剤抗体（ＤＦ−３４）重鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図５は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−３４）軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
図６は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−１５０、ＤＨ−３４）重鎖の塩基配列及びアミノ酸配列の比較を示す。
図７は、抗可塑剤抗体（ＤＨ−１５０、ＤＨ−３４）軽鎖の塩基配列及びアミノ酸配列の比較を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列、配列番号２５で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表わされるアミノ酸配列、配列番号２７で表されるアミノ酸配列、若しくはこれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質を提供する。
一実施態様では、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、上記（ａ１）及び（ａ２）の蛋白質、並びに、（ａ５）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列が、可塑剤に対する他の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号２５で表されるアミノ酸配列）に含まれる同じ種類の１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列と交換されているアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質、或いはこのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質でありうる。（ａ５）の蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、（ａ５）の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ｂ）の蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質が挙げられる。
別の実施態様では、配列番号２５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、上記（ａ３）及び（ａ４）の蛋白質、並びに、（ａ６）配列番号２５で表されるアミノ酸配列のうち、１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列が、可塑剤に対する他の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列）に含まれる同じ種類の１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列と交換されているアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質、或いはこのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質でありうる。（ａ６）の蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、（ａ６）の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ｂ）の蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質が挙げられる。
上記（ａ５）、（ａ６）における特定領域としては、相補性決定領域１、相補性決定領域２、相補性決定領域３（以下、必要に応じてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と省略）、フレームワーク領域１、フレームワーク領域２、フレームワーク領域３、フレームワーク領域４（以下、必要に応じてＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４と省略）が挙げられる。上記（ａ５）、（ａ６）では、交換の対象となるアミノ酸配列は、好ましくは、同じ種類の特定領域のアミノ酸配列である。また、交換される特定領域の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個である。アミノ酸配列の交換は、自体公知の方法によって行なうことができる。具体的には、各領域のＮ、Ｃ両末端に対応するプライマーに対し交換する領域に対応した部分を繋いだようなプライマーを設計し、このプライマーを用いて断片をＰＣＲにて増幅した後、改めて交換した組合せでＰＣＲを行なえばよい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、具体的には、以下の通りである：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２で表されるアミノ酸配列における３１番目から３５番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２で表されるアミノ酸配列における５０番目から６６番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２で表されるアミノ酸配列における９９番目から１１０番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｖ）ＦＲ１（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番目から３０番目までのアミノ酸残基）；
（ｖ）ＦＲ２（配列番号２で表されるアミノ酸配列における３６番目から４９番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉ）ＦＲ３（配列番号２で表されるアミノ酸配列における６７番目から９８番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉｉ）ＦＲ４（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１１１番目から１２１番目までのアミノ酸残基）。
また、配列番号２５で表されるアミノ酸配列においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、具体的には、以下の通りである：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における３１番目から３６番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における５１番目から６６番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における９９番目から１０５番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｖ）ＦＲ１（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における１番目から３０番目までのアミノ酸残基）；
（ｖ）ＦＲ２（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における３７番目から５０番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉ）ＦＲ３（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における６７番目から９８番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉｉ）ＦＲ４（配列番号２５で表されるアミノ酸配列における１０６番目から１１６番目までのアミノ酸残基）。
また、別の実施態様では、上記（ａ）の蛋白質は、例えば、配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列、又は上記（ａ５）若しくは（ａ６）の蛋白質のアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（ｂ）の蛋白質のアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質でありうる。
一実施態様では、配列番号４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、上記（ｂ１）及び（ｂ２）の蛋白質、並びに、（ｂ５）配列番号４で表されるアミノ酸配列のうち、１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列が、可塑剤に対する他の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号２７で表されるアミノ酸配列）に含まれる同じ種類の１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列と交換されているアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質、或いはこのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質でありうる。（ｂ５）の蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、（ｂ５）の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）の蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質が挙げられる。
別の実施態様では、配列番号２７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、上記（ｂ３）及び（ｂ４）の蛋白質、並びに、（ｂ６）配列番号２７で表されるアミノ酸配列のうち、１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列が、可塑剤に対する他の抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号４で表されるアミノ酸配列）に含まれる同じ種類の１以上の特定領域に相当するアミノ酸配列と交換されているアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質、或いはこのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する（又は、からなる）蛋白質でありうる。（ｂ６）の蛋白質のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質としては、例えば、（ｂ６）の蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）の蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質が挙げられる。
上記（ｂ５）、（ｂ６）における特定領域としては、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４が挙げられる。上記（ｂ５）、（ｂ６）では、交換の対象となるアミノ酸配列は、好ましくは、同じ種類の特定領域のアミノ酸配列である。また、交換される特定領域の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個である。アミノ酸配列の交換は、自体公知の方法によって行なうことができる。具体的には、各領域のＮ、Ｃ両末端に対応するプライマーに対し交換する領域に対応した部分を繋いだようなプライマーを設計し、このプライマーを用いて断片をＰＣＲにて増幅した後、改めて交換した組合せでＰＣＲを行なえばよい。
配列番号４で表されるアミノ酸配列においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、具体的には、以下の通りである：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号４で表されるアミノ酸配列における２４番目から３４番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号４で表されるアミノ酸配列における５０番目から５６番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号４で表されるアミノ酸配列における８９番目から９６番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｖ）ＦＲ１（配列番号４で表されるアミノ酸配列における１番目から２３番目までのアミノ酸残基）；
（ｖ）ＦＲ２（配列番号４で表されるアミノ酸配列における３５番目から４９番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉ）ＦＲ３（配列番号４で表されるアミノ酸配列における５７番目から８８番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉｉ）ＦＲ４（配列番号４で表されるアミノ酸配列における９７番目から１０６番目までのアミノ酸残基）。
また、配列番号２７で表されるアミノ酸配列においてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当する領域は、具体的には、以下の通りである：
（ｉ）ＣＤＲ１（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における２４番目から３５番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉ）ＣＤＲ２（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における５１番目から５７番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における９０番目から９８番目までのアミノ酸残基）；
（ｉｖ）ＦＲ１（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における１番目から２３番目までのアミノ酸残基）；
（ｖ）ＦＲ２（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における３６番目から５０番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉ）ＦＲ３（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における５８番目から８９番目までのアミノ酸残基）；
（ｖｉｉ）ＦＲ４（配列番号２７で表されるアミノ酸配列における９９番目から１０８番目までのアミノ酸残基）。
また、別の実施態様では、上記（ｂ）の蛋白質は、例えば、配列番号４又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列、又は上記（ｂ５）若しくは（ｂ６）の蛋白質のアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）の蛋白質のアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質と複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する蛋白質でありうる。
本発明において、任意の配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数としては、１若しくは２個以上であれば特に限定されないが、例えば１〜８０個、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜９個程度、さらにより好ましくは１〜５個、最も好ましくは数個（１又は２個）でありうる。
本発明において、アミノ酸の置換としては、特定のアミノ酸が他の任意のアミノ酸で置換される限り特に限定されないが、例えば、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と同様の性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と同じグループに属する他のアミノ酸により置換される。一方、「非保存的アミノ酸置換」とは、特定のアミノ酸を、そのアミノ酸の側鎖と異なる性質の側鎖を有するアミノ酸で置換することをいう。具体的には、非保存的アミノ酸置換では、特定のアミノ酸は、そのアミノ酸と異なるグループに属する他のアミノ酸により置換される。同様の性質の側鎖を有するアミノ酸のグループは、当該分野で公知である。例えば、このようなアミノ酸のグループとしては、塩基性（即ち、正に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性（即ち、負に荷電している）側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性（即ち、荷電していない）側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。また、中性側鎖を有するアミノ酸は、さらに、極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、及び非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）に分類することもできる。また、他のグループとして、例えば、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、水酸基（アルコール性水酸基、フェノール性水酸基）を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン）なども挙げることができる。
また、任意の配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列としては、任意の配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列に対して、例えば約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらにより好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
相同性の程度（％）は、自体公知の方法によって決定することができる。例えば、相同性の程度（％）は、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を採用しているＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を初期設定で使用することによって決定することができる。また、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０．８７：２２６４−２２６８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３−５８７７）を採用しているＢＬＡＳＴプログラムを用いてもよい。例えば、蛋白質の相同性を比較する場合、ＸＢＬＡＳＴプログラムを初期設定で使用することによって、相同性の程度（％）を決定することができる。さらに、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズムを採用しているＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）（ＧＣＧ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅの一部）を用いてもよい。ＡＬＩＧＮプログラムを用いてアミノ酸配列を比較する際の設定としては、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ，ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１２，ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝４が挙げられる。また、塩基配列の相同性の程度（％）を決定する場合にも同様に、これらのプログラムを用いることができる。
「複合体を形成したときに可塑剤に対して結合する」とは、複合体が可塑剤に対して反応性を有することを意味する。可塑剤としては、例えば、上述したものが挙げられる。複合体が可塑剤に対して結合能を有するか否かは、自体公知の方法若しくはそれに準じる方法によって決定することができる。なお、本発明の複合体は、上記可塑剤のいずれかに対する結合能を有すればよい。
配列番号２又は配列番号２５で表されるアミノ酸配列、配列番号４又は配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、並びに（ａ５）、（ａ６）、（ｂ５）、（ｂ６）の蛋白質に１以上のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加を導入することにより、可塑剤に対する結合能や交叉反応性が変化した蛋白質を得ることができる。１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加される領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４からなる群より選択される任意の１以上の領域でありうる。
本発明の部分ペプチドとしては、上記（ａ）又は（ｂ）の蛋白質の一部を構成するペプチドであれば特に限定されないが、例えば、上記（ａ）又は上記（ｂ）の蛋白質のアミノ酸配列において、少なくとも６個以上、好ましくは少なくとも８個以上、より好ましくは少なくとも１０個以上、さらにより好ましくは少なくとも１２個以上、最も好ましくは少なくとも１５個以上の連続するアミノ酸からなるペプチドが用いられる。また、本発明の部分ペプチドとして、上記（ａ）の蛋白質、又は上記（ｂ）の蛋白質のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４に相当するアミノ酸配列を有する（又は、からなる）部分ペプチドを用いることもできる。
本発明のタンパク質又はその部分ペプチドの塩としては、自体公知の塩、例えば、酸付加塩などを用いることができる。酸付加塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明において「複合体」としては、上記（ａ）の蛋白質と上記（ｂ）の蛋白質とが連結している限り特に限定されないが、例えば、上記（ａ）の蛋白質と上記（ｂ）の蛋白質とがリンカーを介して又は介さずに共有結合している複合体が挙げられる。また、複合体は、上記蛋白質、部分ペプチドと同様に塩の形態（好ましくは、酸付加塩）で用いることもできる。
上記（ａ）の蛋白質と上記（ｂ）の蛋白質とを融合させるために用いられるリンカーとしては、当該分野で公知のものを用いることができ特に限定されないが、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）の繰り返し配列（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５））、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号６）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号７）、ＧＳＴＳＧＫＰＳＥＧＫＧ（配列番号８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９）等のペプチドなどをリンカーとして用いることができる（例えば、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ，Ｄ．Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｊ．ＭｃＧｕｉｒｅ，ａｎｄ  Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ．Ｉｎ″Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ″Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｎ，ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｃｈｉｓｗｅｌｌ．ｐ．２５３−２６８，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６）参照）。上記（ａ）の蛋白質と上記（ｂ）の蛋白質とがリンカーを介して又は介さずに共有結合している複合体は、例えば、上記（ａ）の蛋白質と上記（ｂ）の蛋白質を別々に調製した後、これら蛋白質をそれぞれリンカーに共有結合させることにより、又はリンカーを介さずに直接共有結合させることによって得ることができる。しかし、この方法では複合体を得るために、上記（ａ）の蛋白質及び上記（ｂ）の蛋白質の調製後にさらに両者を連結する工程を必要とするため煩雑である。また、共有結合部位が異なるものが複数得られるおそれがあり、再現性等の観点から好ましい単一な複合体を調製しにくいという問題もある。従って、本発明の複合体としては、例えば、上記（ａ）の蛋白質及び上記（ｂ）の蛋白質がペプチドリンカーを介してアミド結合することにより又は直接アミド結合することにより融合している単鎖抗体が好ましい。単鎖抗体は、上記（ａ）の蛋白質をコードする塩基配列と、ペプチドリンカーをコードする塩基配列と（リンカーを介してアミド結合している単鎖抗体を得る場合）、上記（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列とを読み枠を合わせて含む発現ベクターを含有する形質転換体から容易に調製できるため有用である。なお、ペプチドリンカーをコードする塩基配列は、上記（ａ）及び（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列と読み枠を合わせたときに終止コドンを含まないものであれば特に限定されない。
ペプチドリンカーは、当該分野で公知の方法により適宜選択することができる。具体的には、ペプチドリンカーとしては、１個以上のアミノ酸残基からなる任意の長さのペプチドを用いることができるが、例えば１０個以上のアミノ酸残基からなるペプチドが用いられる。
本発明はまた、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、前述した本発明の蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。
具体的には、本発明のポリヌクレオチドとしては、上記（ａ）の蛋白質をコードする塩基配列（例えば、配列番号１で表される塩基配列）、上記（ｂ）の蛋白質をコードする塩基配列（例えば、配列番号３で表される塩基配列）、上記単鎖抗体をコードする塩基配列が挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドとして、本発明の蛋白質を遺伝子組換えして得られた蛋白質をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることもできる。
上述した本発明のポリヌクレオチドは、本明細書の開示に基づき公知の方法を用いて得ることができる。例えば、限定されるわけではないが、本発明のポリヌクレオチドは、抗可塑剤モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより得ることができる。抗体蛋白のＮ末端アミノ酸配列を決定し、ついで、このアミノ酸配列より推定した塩基配列を持つプライマーを作成し、抗体産生ハイブリドーマより公知の方法によりｍＲＮＡを調製し、それを基に逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成後、本明細書に開示された抗可塑剤モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域のアミノ酸配列又は塩基配列に基づき、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを選択的に得ることが可能である。このような方法は周知であり、当業者は本明細書の開示に基づいて、本発明のポリヌクレオチドを容易に単離することが可能である。これらの方法の具体的操作方法としては、例えば、たとえば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などが挙げられる。また、ｍＲＮＡの抽出はアマシャム社のＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ精製キットの操作説明書に記載の方法で、ｃＤＮＡの合成や５’−ＲＡＣＥ法はクロンテック社のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥキットの操作説明書に記載の方法なども挙げられる。
一実施態様では、本発明の複合体は組換え抗体（その断片をも含む）であり得る。組換え抗体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）の作製方法などについては、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（ｅｄ．ｂｙ  Ｆ．Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ＵＳＡ），１９９９）の第２章に、組換え抗体断片（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の作製方法、ハイブリドーマ細胞（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ）からの抗体遺伝子のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ）方法、抗体遺伝子ライブラリー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）の作製方法、遺伝子ライブラリーからの組換え抗体の選択（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）方法、抗体の遺伝子操作（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）方法などが記載されており、これらの方法により組換え抗体の作製が可能である。
また、同書第４章には、組換え抗体の製造方法も記載されておりｉｎ  ｖｉｔｒｏではウサギＲｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅでの発現が、原核生物（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ）では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＣｙｔｏｐｌａｓｍ、ｐｅｒｉｐｌａｓｍのｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ｐｅｒｉｐｌａｓｍのｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙや、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓでの発現が、真核生物（Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）では、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ等の酵母、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａなどのカビ、昆虫細胞ではＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ、ｍｙｅｌｏｍａ、ＣＨＯ、ＣＯＳ等の動物細胞、タバコなどのｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ植物、ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ動物などでの発現方法が記載されており、これらにより形質転換体の作製が可能である。
さらに、同書第４章には、組換え抗体の精製方法も記載されており、まず、物理的な方法、例えば、組換え生物の遠心分離による集菌、超音波などによる細胞破砕、機械的な磨砕や酵素的な溶菌で目的物を分離する。次にイオン交換クロマトグラフィー、ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙなどを組み合わせて精製する。特にａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｒｔｏｇｒａｐｈｙは効率的な方法であり、抗原認識特異性を活用したａｎｔｉｇｅｎ−ａｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓや、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａやｐｒｏｔｅｉｎ  ＧなどのＦｃ部位やＦａｂ’部位への結合を利用したａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔｈｏｄや、そのような部位を持たないｓｃＦｖの場合にｔａｇと言われる小さなペプチド断片を持った融合抗体として発現させ、このｔａｇに特異的なａｆｆｉｎｉｔｙカラムを使用する方法（例Ｈｉｓ−ｔａｇ、ｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇなど）などにより精製することにより製造することが可能である。
まず、抗可塑剤モノクローナル抗体産生細胞のｃＤＮＡライブラリーを構築し、保存性の高い免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の定常領域や可変領域のＮ末端配列等をコードするｃＤＮＡをプローブに用いて、当該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして抗可塑剤モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡの単離を行うことができる。これらの方法の具体的操作方法としては、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、また、本明細書の記載の配列に基づき、周知の技術を用いて化学的に合成してもよい。
本発明の蛋白質を遺伝子組換えする方法としては、自体公知の方法が挙げられ、例えば、その蛋白質をコードする塩基配列を変換する方法を用いることができる。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法やＧｕｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。クローン化された抗体蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、又は所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。本発明の抗体蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明の抗体蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
組換え抗体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）の作製方法
組換え抗体としては、種々の形態のものが作製できるが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／￣ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に記載のものはその例であり、例えば、Ｆａｂ’  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｆ（ａｂ’）ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｆｖ）、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｃＦＶ（χ−ｓｃＦｖ）、ｔａｎｄｅｍ  ｓｃＦＶ（ｓｃＦｖ）２、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−（ｓｃＦｖ）２、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｃＦｖ、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｄｓＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｂ）、ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒｉａｂｏｄｙ、ＣＬ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ１−ＣＬ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、ＣＨ３−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｃ−ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ  ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｉｇ−ｓｃＦｖ  ｆｕｓｉｏｎｓ、ｌｅｕｃｉｎｅ−ｚｉｐｐｅｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒｓ、ｈｅｌｉｘ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒｓ、４  ｈｅｌｉｘ−ｂｕｎｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｓｃＦｖ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｓｃＦｖ、ｉｎｔｒａｂｏｄｙなどが組換え抗体として作製可能である。
また、変異処理を施した抗体遺伝子のシャッフリング（Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により、目的の有用な性質を有する抗体を選択する方法も本発明の範囲内に入る。
組換え抗体の発現系
組換え抗体の発現系としては、効率よく組換え抗体を発現できる系であればどのような発現系でもよいが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／￣ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に纏められているように、例えば、ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓでは、Ｆｖ、ｓｃＦｖやｓｃＦｖ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ、ｂｉｖａｌｅｎｔ及びｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ又はＦａｂ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓなどの発現が、Ｉｎｓｅｃｔ  ｃｅｌｌｓでは、ｓｃＦＶやＦａｂなどの発現が、Ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌｓでは、Ｆｖ、ｓｃＦｖやＦａｂなどの発現が、Ｐｌａｎｔｓ  ｃｅｌｌｓでは、ｓｃＦｖの発現が知られており、このように種々の発現系が使用可能である。
ｃＤＮＡライブラリーの作製法
ｃＤＮＡライブラリーの作製法としては、効率よくｃＤＮＡライブラリーを作製できる方法であればどのような方法でも良いが、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１，ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／￣ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に述べられているファージディスプレイ法も、その一つである。
組換え抗体の選択方法
作製したライブラリーから、目的の組換え抗体を選択する方法としては、Ｒｏｌａｎｄ  ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎのＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＨＯＭＥ  ＰＡＧＥ（ｈｔｔｐ：／／ａｘｉｍｔ１．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／￣ｒｅｋ／ＡＥＰ．ｈｔｍｌ、２００２年２月２５日）に記載のプロトコール、「ファージミドライブラリーからの組換え抗体の単離法」や、「ｆｄファージライブラリーからのペプチドの単離法」などの方法も、選択方法として使用可能である。
ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）は、目的によりそのまま、又は、所望により切断、又は他のポリヌクレオチドの付加などして使用することができる。例えば、ＤＮＡは、その末端に翻訳開始コドンＡＴＧを有していてもよい。このような改変は、自体公知の方法により、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等により行なうことができる。
このようにして得られたＤＮＡを、プロモーター、翻訳開始コドン、適当なシグナル配列等を自体公知の方法でベクターに組込むことにより、組換えベクターを製造することができる。該ベクターやプロモーターや宿主菌株としては、たとえば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第３版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）のＡｐｐｅｎｄｉｘ３に記載のベクター、プロモーターやエシェリヒア属菌株等が挙げられる。
ベクターとしては、上記以外に、大腸菌由来のプラスミド（ｐＥＴ−２７６，ｐＣＡＮＴＡＢ−５Ｅ，ｐＵＣ１９，ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ．）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージ，Ｍ１３Ｋ０７などのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでも良い。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が動物細胞である場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなど、宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（以下ＡｍｐＲと略称する場合がある）、カナマイシン耐性遺伝子（以下ＫｍＲと略称する場合がある）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（以下ＣｍＲと略称する場合がある）等が挙げられる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の抗体蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｐｈｏＡ・シグナル配列、ｏｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明の抗体蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オズ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、６０巻、１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、（ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻、４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ），ＴＧ−１，ＪＭ１０９などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２４巻，２５５（１９８３）］，２０７−２１［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）］などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２，シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞又はＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ビボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる［前田ら，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）］。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻、１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６巻，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。このようにして、抗体蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
さらに、このようにして得られた形質転換体を培養することにより、本発明の蛋白質を生成せしめ、これを採取することにより本発明の蛋白質を製造することができる。
培養に用いられる培地としては、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培地に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスティープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）］が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸やイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）］や、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地［Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）］が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞又は昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻、５０１（１９５２）］，ＤＭＥＭ培地［ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻、３９６（１９５９）］，ＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｅｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９巻，５１９（１９６７）］，１９９培地［プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティー・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）］などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明の抗体蛋白質を生成せしめることができる。
このようにして得られた培養物から、目的とする本発明の抗体蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法により行うことができる。本発明の抗体蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により抗体蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に抗体蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる抗体蛋白質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これら公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などを用いて分離精製できる。
本発明の複合体、蛋白質、部分ペプチド及び／又はそれらの塩は、自体公知の蛋白質の合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによって製造することができる。蛋白質の合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。即ち、本発明の蛋白質を構成する部分ペプチド若しくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、精製物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の蛋白質を製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチドシンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
▲２▼Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザペプチド（Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
▲４▼矢島治明及び榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の蛋白質を精製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
以上のようにして得られた本発明の複合体及び／又は蛋白質は、可塑剤を定量的に測定する際の試薬として使用したり、種々の担体に固定化することにより可塑剤を濃縮するためのアフィニティーカラムの製造などに利用することができる。また、本発明の複合体及び／又は蛋白質に結合（即ち、交叉反応）する可塑剤を同定することにより、本発明の複合体及び／又は蛋白質の適用範囲を拡大することができる。さらに、本発明は、本発明の複合体及び／又は蛋白質を含む、可塑剤の測定又は定量用キット、可塑剤の濃縮用キットを提供する。
なお、上記キットでは、１種類の本発明の複合体及び／又は蛋白質のみを含んでいてもよいが、種類の異なる複数の本発明の複合体及び／又は蛋白質を含むことができる。例えば、交叉反応性の異なる複数の複合体を含むキットを使用することによって特定の可塑剤を特異的に測定・定量することができる。
本発明の複合体及び／又は蛋白質による可塑剤の測定法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０，４１９−４３９（１９８０））、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）等の一般に抗原の検出に使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。感度、簡便性等の観点からＥＬＩＳＡ法が汎用される。
また、本発明の複合体及び／又は蛋白質の固定化用担体としては、例えば、マイクロプレート（例、９６ウェルマイクロプレート、２４ウェルマイクロプレート、１９２ウェルマイクロプレート、３８４ウェルマイクロプレートなど）、試験管（例、ガラス試験管、プラスチック試験管）、ガラス粒子、ポリスチレン粒子、修飾ポリスチレン粒子、ポリビニル粒子、ラテックス（例、ポリスチレン・ラテックス）、ニトロセルロース膜、臭化シアン活性化濾紙、ＤＢＭ活性化濾紙、粒状固相（例、セファロース、セファデックス、アガロース、セルロース、セファクリルなど）、鉄含有ポリカーボネート膜、マグネット含有ビーズなどが挙げられる。
本発明の複合体及び／又は蛋白質を担体に担持させるには、自体公知の方法〔例、上記「エンザイムイムノアッセイ」第２６８〜２９６頁、「アフィニティークロマトグラフィーハンドブック」（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社（１９９８年１２月２０日発行））〕などで担持できる。
また、本発明の免疫学的濃縮方法においては、大量の検体を、免疫吸着体カラムを通過させたり、免疫吸着体粒子と混合したりすることにより、抗原抗体反応を利用して、目的の環境ホルモン、その分解物又はそれらの混合物を、免疫吸着体に捕捉させ、ついで、ｐＨの変更（ｐＨ２．５〜３に下げる、ｐＨ１１．５に上げるなど）、イオン強度の変更（１Ｍ  ＮａＣｌなど）、極性の変更（１０％ジオキサン、５０％エチレングリコール、３Ｍカオトロピック塩（ＳＣＮ−、ＣＣｌ３ＣＯＯ−、Ｉ−）など）、蛋白変性剤（８Ｍ尿素、６Ｍ塩酸グアニジンなど）の添加や、電気泳動による解離など公知の方法で溶出させることにより、免疫学的に夾雑物の少ない目的物質を、数千から数万倍もの高倍率に濃縮できる。
これにより、環境中に極く微量しか存在しない環境ホルモン、その分解物又はそれらの混合物を、溶媒抽出法や固層抽出法などの従来の濃縮方法と比較して、はるかに高倍率に濃縮することができ、しかも定量を妨害する夾雑物等の含量の少ない濃縮液を得ることができる。
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ  ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ  ：相補的デオキシリボ核酸
ａ，Ａ  ：アデニン
ｔ，Ｔ  ：チミン
ｇ，Ｇ  ：グアニン
ｃ，Ｃ  ：シトシン
ｉ，Ｉ  ：ヒポキサンチン（イノシン）
ＲＮＡ  ：リボ核酸
ｍＲＮＡ  ：メッセンジャーリボ核酸
アミノ酸の略記
３文字  ：１文字：日本名
Ｇｌｙ  ：  Ｇ  ：グリシン
Ａｌａ  ：  Ａ  ：アラニン
Ｖａｌ  ：  Ｖ  ：バリン
Ｌｅｕ  ：  Ｌ  ：ロイシン
Ｉｌｅ  ：  Ｉ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ  ：  Ｓ  ：セリン
Ｔｈｒ  ：  Ｔ  ：スレオニン
Ｃｙｓ  ：  Ｃ  ：システイン
Ｍｅｔ  ：  Ｍ  ：メチオニン
Ｇｌｕ  ：  Ｅ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ  ：  Ｄ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ  ：  Ｋ  ：リジン
Ａｒｇ  ：  Ｒ  ：アルギニン
Ｈｉｓ  ：  Ｈ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ  ：  Ｆ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ  ：  Ｙ  ：チロシン
Ｔｒｐ  ：  Ｗ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ  ：  Ｐ  ：プロリン
Ａｓｎ  ：  Ｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ  ：  Ｑ  ：グルタミン
Ａｓｘ  ：  Ｂ  ：Ａｓｎ＋Ａｓｐ
Ｇｌｘ  ：  Ｚ  ：Ｇｌｎ＋Ｇｌｕ
【実施例】  以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［材料］
抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）産生ハイブリドーマ
抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）（アイソタイプγ２ａ，κ）を産生するハイブリドーマ株、ＤＨ−１５０は、Ｇｏｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．；「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓ」，Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＳＥＢ２０００），Ｐｒｏｇｒａｍ／Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ｐ．１１９（２０００）に発表した手順により作製した。本細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ハイブリドーマ用培地）（Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６４，１７１−１７７（１９９８）参照）を用いて継代培養した。
抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＦ−３４）産生ハイブリドーマ
抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＦ−３４）を産生するハイブリドーマ株、ＤＦ−３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６３５）は、国際公開第ＷＯ９９／４３７９９号パンフレットに記載されている。本細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ハイブリドーマ用培地）を用いて継代培養した。
プライマー
ｃＤＮＡの合成及びＰＣＲに用いたプライマーは、クラボウ又はエスペックオリゴサービスに化学合成とカートリッジ精製を依頼した。各プライマーの塩基配列を表１に示す。
2004092370.tif 000004
［実施例１］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）ＶＨ遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ株ＤＨ−１５０（１ｘ１０７個）から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。本ＲＮＡ（４．２μｇ）にγ２ａ鎖特異的プライマー（Ｇ２ａ−ＣＨ−１）又はκ鎖特異的プライマー（Ｋ−ＣＨ−１）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１μＬ）を添加し、添付の緩衝液中（２５μＬ）、４２℃で５０分間インキュベートした。７０℃で１５分間インキュベートして酵素を失活させた後、粗反応液をＧｌａｓｓＭＡＸ  ｓｐｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、ＶＨ又はＶＬ遺伝子を含むｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（ＶＨ−ｃＤＮＡ及びＶＬ−ｃＤＮＡ）をそれぞれ得た。ついでＶＨ−ｃＤＮＡを鋳型に用いる５’−ＲＡＣＥ［５’ＲＡＣＥ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］によりＶＨドメインの遺伝子断片を得た。すなわちｃＤＮＡ溶液（１０μＬ）にデオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）（５ｎｍｏｌ）、ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）（１μＬ）を加え、ＴｄＴ緩衝液（２５μＬ）中、３７℃で１０分間反応させた。ついで、ポリＣ配列とγ２ａ鎖定常部に相補的なプライマー（各々ＡＡＰ、Ｇ２ａ−ＣＨ−２）（各２０ｐｍｏｌ）及びＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）（１Ｕ）を用いてＥｘ−Ｔａｑ緩衝液（４０μＬ）中でＰＣＲ［９５℃、１分間；６４℃、１分間；７２℃、２分間（３５サイクル）、次いで７２℃、１０分間］を行った。さらに、本ＰＣＲ反応液の１０００倍希釈液（１０μＬ）を鋳型として、プライマーＡＵＡＰ及びＧ２ａ−ＣＨ−３−ＸｍａＩ（各５０ｐｍｏｌ）とＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を用いるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（液量１００μＬ）を同上の反応条件で行った。得られた粗反応液を低融点アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ；ＢＭＡ）（２％）を用いる電気泳動（ＴＡＥ緩衝液；５０Ｖ）に付して、約８００ｂｐのバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて回収し、目的のＶＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＶＨ−ＤＮＡ）を得た。
［実施例２］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）ＶＬ遺伝子のクローニング
上記のＶＬ−ｃＤＮＡ（１０００倍希釈液１０μＬ）を鋳型として、既報のマウス可変部遺伝子クローニング用のプライマーＭＫＶ−１〜１１（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９（１９９１）参照）のいずれかとＫ−ＣＨ−３−ＸｍａＩ（各５０ｐｍｏｌ）を組み合わせるＰＣＲを試みた。本ＰＣＲ［９５℃、１分間；５０℃、１分間；７２℃、３分間（３５サイクル）、次いで７２℃、１０分間］にはＰｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（３Ｕ）を用い、Ｐｆｕ緩衝液中（１００μＬ）で反応を行った。粗反応液の一部をアガロース電気泳動に付したところ、ＭＫＶ−９プライマーを用いる時に予想されるサイズ（約４００ｂｐ）のバンドが明瞭に観察された。そこで、残りの反応液を上記の方法で精製し、目的のＶＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＶＬ−ＤＮＡ）を得た。
［実施例３］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）ＶＨ及びＶＬ遺伝子のサブクローニング
上述のＶＨ−ＤＮＡ及びＶＬ−ＤＮＡ（計算値各１．５μｇ）にそれぞれＸｍａ  Ｉ（４０Ｕ）を加え、３７℃で一夜インキュベートした。反応液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩ）抽出したのちエタノール沈殿を行い、得られた沈殿にＳａｌ  Ｉ（４０Ｕ）を加えて再び３７℃で一夜インキュベートした。反応液をＰＣＩ抽出／エタノール沈殿に付したのち、上記のように低融点アガロースを用いる電気泳動に付して目的の遺伝子断片を精製した。これらＤＮＡ（０．１μｇ）を、同様にＸｍａ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩベクター（０．２５μｇ）と混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（１６００Ｕ）を加えて１６℃で一夜インキュベートした。反応液をＰＣＩ抽出／エタノール沈殿に付して精製し、得られる組換えプラスミドをＸＬ１−Ｂｌｕｅ  Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ−ｇｒａｄｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ法によりトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション液をアンピシリンを含む２ｘＹＴ−ａｇａｒプレートに塗布して３７℃で一夜インキュベートした。得られた形質転換体クローン（ＶＨ−ＤＮＡ、ＶＬ−ＤＮＡ各々について４クローンずつ）を任意に選択してアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地（１０ｍＬ）中で培養し、１５％グリセロール混合液としたのち−８０℃で保存した。
［実施例４］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）ＶＨ及びＶＬ遺伝子の塩基配列の決定
上記の形質転換クローンをアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地（１０ｍＬ）中で培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドを抽出した。その一部（０．５又は１．０μｇ）に、シークエンシング用プライマー（ＫＳ−ｂａｃｋ又はＫＳ−ｆｏｒ；各１．８ｐｍｏｌ）を加え、Ｄｕａｌ  ＣｙＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰＣＲ反応を行った。本ＰＣＲでは、９５℃、２０秒間；５５℃、１５秒間；７０℃、６０秒間のサイクルを３５回繰り返した。反応液をエタノール沈殿に付して増幅したＤＮＡを回収し、本キットに添付されたｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ（４μＬ）に溶解し、Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ  Ｔｏｗｅｒ  ＤＮＡシークエンサー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて電気泳動（６％ポリアクリルアミドゲル；ＴＢＥ緩衝液；１５００Ｖ；２００分間）を行った。得られた塩基配列データから、ＶＨ−ＤＮＡ、ＶＬ−ＤＮＡ各々について４クローン間のコンセンサス配列を得た。このようにして得られた塩基配列並びに推定されるアミノ酸配列を図１、２（各々ＶＨ及びＶＬ）に示す。この結果から、ＶＨ及びＶＬのサブグループは、Ｋａｂａｔの分類（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９１参照）に基づいて、各々ＩＩＩ（Ｄ）、Ｖと決定した。また、Ｋａｂａｔのデータベース（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９１参照）との比較から、ＶＨ及びＶＬにおける相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）（抗原と直接相互作用し、親和力や特異性の発現に重要な役割を果たすアミノ酸配列）を特定した（図１、２）。
［実施例５］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＨ−１５０）ｓｃＦｖ遺伝子の構築
上記の遺伝子塩基配列の結果に基づいてＶＨ、ＶＬ遺伝子それぞれの５’末端、３’末端に特異的なプライマー（ＤＨ−１５０−ＶＨ−５、ＤＨ−１５０−ＶＨ−３、ＤＨ−１５０−ＶＬ−５、ＤＨ−１５０−ＶＬ−３）（表１）を設計し、実施例１で得られたｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。なお、ＤＨ−１５０−ＶＨ−５プライマーにはＮｃｏ  Ｉ認識配列を、ＤＨ−１５０−ＶＨ−３プライマーにはＳａｌ  Ｉ認識配列及びＦＬＡＧ配列を導入した。また、ＤＨ−１５０−ＶＨ−３、ＤＨ−１５０−ＶＬ−５の両プライマーには、ＶＨとＶＬを連結するためのリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号５）をコードする塩基配列を付加した。先のｃＤＮＡ溶液の１：１０００希釈液（１μＬ）にＤＨ−１５０−ＶＨ−５及びＤＨ−１５０−ＶＨ−３プライマー（ＶＨの増幅）又は、ＤＨ−１５０−ＶＬ−５及びＤＨ−１５０−ＶＬ−３プライマー（ＶＬの増幅）（各３０ｐｍｏｌ）並びにＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を添加し、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（１００μＬ）中でＰＣＲ［９５℃、１分間；５０℃、１分間；７２℃、３分間（３５サイクル）、次いで７２℃、１０分間］を行った。得られた粗反応液を上記の低融点アガロースを用いる電気泳動に付して、約４００ｂｐのバンドをＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて回収し、目的のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子断片を得た。引き続き、これら（各々２００ｎｇ）を混合してＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．６５Ｕ）を加え、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（２５μＬ）中でｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ［９５℃、１分間；５５℃、１分間；７２℃、３分間（１０サイクル）、次いで７２℃、１０分間］を行い、ｓｃＦｖ遺伝子を構築した。さらに本反応液の一部（５μＬ）にＤＨ−１５０−ＶＨ−５、ＤＨ−１５０−ＶＬ−３プライマー（各１００ｐｍｏｌ）、Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ）を添加し、同条件（ただし反応液１００μＬ）で２５サイクルのＰＣＲを行ってｓｃＦｖ遺伝子を増幅した。得られた粗反応液を低融点アガロースによる電気泳動に付して、約８００ｂｐのバンドを回収し、５’ＶＨ−リンカー−ＶＬ３’の配列を有する目的のｓｃＦｖ遺伝子を得た（図３）。
［実施例６］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＦ−３４）ＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニング、サブクローニングおよび塩基配列の決定
ハイブリドーマ株ＤＦ−３４（１ｘ１０７個）から、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。本ＲＮＡ（４μｇ）にγ１鎖特異的プライマー（Ｇ１−ＣＨ−１）又はκ鎖特異的プライマー（Ｋ−ＣＨ−１）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１μＬ）を添加し、添付の緩衝液中（２５μＬ）、４２℃で５０ｍｉｎインキュベートした。７０℃で１５ｍｉｎインキュベートして酵素を失活させたのち粗反応液をＧｌａｓｓＭＡＸ  ｓｐｉｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、ＶＨ又はＶＬ遺伝子を含むｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（ＶＨ−ｃＤＮＡ及びＶＬ−ｃＤＮＡ）をそれぞれ得た。以下、実施例１の手順に従ってＶＨ−ｃＤＮＡを鋳型に用いる５’−ＲＡＣＥを行い、目的のＶＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＶＨ−ＤＮＡ）を得た。その一方で、上記のＶＬ−ｃＤＮＡを鋳型として、実施例２に準じてプライマー１１種（ＭＫＶ１〜１１）（Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９（１９９１）参照）のいずれかとＫ−ＣＨ−３−ＸｍａＩ（各５０ｐｍｏｌ）を組み合わせるＰＣＲを試みた。粗反応液の一部をアガロース電気泳動に付したところ、プライマーＭＫＶ−５を用いる時に予想されるサイズ（約４００ｂｐ）のバンドが明瞭に観察された。そこで、残りの反応液を上記の方法で精製し、目的のＶＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＶＬ−ＤＮＡ）を得た。
これらＶＨ−ＤＮＡ及びＶＬ−ＤＮＡ（各１．５μｇ）を実施例３に従ってｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩベクターにサブクローニングし、形質転換クローンを得た。これらのクローンをアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地（１０ｍＬ）中で培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドを抽出した。その一部（０．５又は１．０μｇ）を用いて実施例４に従ってＶＨ−ＤＮＡ及びＶＬ−ＤＮＡの塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。その結果を図４、５（各々ＶＨ及びＶＬ）に示す。この結果から、ＣＤＲのアミノ酸配列を決定し、またＶＨ及びＶＬのサブグループを各々ＶＨ＝Ｉ（Ａ）、ＶＬ＝ＩＶと同定した。
なお、ＤＦ−３４抗体とＤＨ−１５０抗体のシークエンスデータを比較したところ、図６、７（各々ＶＨ及びＶＬ）に示されるように両抗体の相同性は小さいことが判明した。
［実施例７］  抗ＤＥＨＰ抗体（ＤＦ−３４）ｓｃＦｖ遺伝子の構築
上記の遺伝子塩基配列の結果に基づいてＶＨ、ＶＬ遺伝子それぞれの５’末端、３’末端に特異的なプライマー（ＤＦ−３４−ＶＨ−５、ＤＦ−３４−ＶＨ−３、ＤＦ−３４−ＶＬ−５、ＤＦ−３４−ＶＬ−３）（表１）を設計し、実施例６で得られたｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型として、実施例５に準じてＰＣＲを行った。なお、ＤＦ−３４−ＶＨ−５プライマーにはＮｃｏ  Ｉ認識配列を、ＤＦ−３４−ＶＬ−３プライマーにはＳａｌ  Ｉ認識配列及びＦＬＡＧ配列を導入した。また、ＤＦ−３４−ＶＨ−３、ＤＦ−３４−ＶＬ−５の両プライマーには、ＶＨとＶＬを連結するためのリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする塩基配列を付加した。得られたＶＨおよびＶＬ遺伝子フラグメント（各々２００ｎｇ）をｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲに付し、粗反応液を低融点アガロースによる電気泳動に付して、約８００ｂｐのバンドを回収し、目的のｓｃＦｖ遺伝子断片を得た。
【産業上の利用可能性】  本発明により、抗可塑剤抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする遺伝子のアミノ酸配列及び塩基配列が明らかとなった。本発明によって抗可塑剤抗体由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする遺伝子を遺伝的に改変することが可能となる。例えば、改変遺伝子を宿主細胞内で発現させることにより、可塑剤の測定・定量・濃縮において、より好ましい性質を持った、可塑剤に結合能を有する蛋白質を大量に得ることが可能となった。また、この改変抗体遺伝子を有する組換え微生物等を使用することにより、組換え蛋白質を効率よく生産することも可能となった。さらに、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列にランダムな変異を導入してミュータントｓｃＦｖのライブラリーを構築し、このライブラリー中から、可塑剤に対する親和性が元の抗体よりも大きい変異体を選択することにより、可塑剤に対する親和性が向上した組換え蛋白質を得ることが可能となった。以上により、性能の優れた酵素免疫測定法キットや抗体アフィニティーカラムをより安価に作製することが可能となった。
本出願は、２００３年４月１５日に日本で出願された特願２００３−１１０８７７を基礎としており、その内容は本明細書中に援用される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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