(57)【要約】本発明により、骨細胞や軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞等の細胞を、クローニングリング等の仕切り中に播種してその細胞の組織を形成し、組織を形成する細胞を更に旋回培養することにより、細胞の三次元構造体を作製する方法が提供された。本発明により作製された細胞の三次元構造体は、人口軟骨、人工骨の新たな材料として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨細胞又は軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞の初代培養細胞の懸濁溶液を、該細胞が流れ出すことを防ぐことができる仕切りの中に播種し、該懸濁溶液を静置して該細胞を沈降させることによって該細胞から構成される組織を形成し、更に該組織を形成する該細胞を酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系において培養することより作製された、細胞の三次元構造体。
【請求項２】
前記骨細胞又は軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞が生体から単離された細胞であることを特徴とする、請求項１記載の細胞の三次元構造体。
【請求項３】
前記細胞の酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系が旋回培養である、請求項１記載の細胞の三次元構造体。
【請求項４】
前記旋回培養を１０ｒｐｍから１０００ｒｐｍの旋回速度の下で行うことを特徴とする、請求項３記載の細胞の三次元構造体。
【請求項５】
前記旋回培養を３０ｒｐｍから２００ｒｐｍの旋回速度の下で行うことを特徴とする、請求項４記載の細胞の三次元構造体。
【請求項６】
前記細胞の三次元構造体中の細胞が分化型の細胞又は分化傾向にある細胞であることを特徴とする、請求項１記載の細胞の三次元構造体。
【請求項７】
骨細胞又は軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞の初代培養細胞の懸濁溶液を、該細胞が流れ出すことを防ぐことができる仕切りの中に播種し、該懸濁溶液を静置して該細胞を沈降させることによって該細胞から構成される組織を形成し、更に該組織を形成する該細胞を酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系において培養することよりなる、細胞の三次元構造体を作製する方法。
【請求項８】
骨細胞又は軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞の初代培養細胞の懸濁溶液を、該細胞が流れ出すことを防ぐことができる仕切りの中に播種し、該懸濁溶液を静置して該細胞を沈降させることによって該細胞から構成される組織を形成し、更に該組織を形成する該細胞を酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系において培養することよりなる、細胞の分化を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．本発明の技術分野
本発明は、骨細胞や軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞等の細胞を、クローニングリング等の仕切り中に播種してその細胞から構成される組織を形成し、組織を形成する細胞を更に旋回培養することにより作製された細胞の三次元構造体、及びその作製方法に関する。
２．技術背景
事故、老化、あるいは疾患による骨や軟骨組織の損傷は、人間の運動機能に著しい障害をもたらす。特に、特に、関節障害は高齢者の多くに発症し、生活への影響も大きいことから、高齢者社会を目前に控えた今日では大きな社会問題にもなっている。関節には歩行や日常生活によって常に摩擦が生じているが、関節内の摩擦が関節を摺り減らすことなく機能するのは、含水平の高い組織集合体である軟骨組織が摩擦の発生部位に存在するからである。軟骨組織を構成する軟骨組織は、低栄養要求性の細胞であり、その部位には血管や神経が存在しない。そのため、事故、老化、何らかの疾患によって軟骨組織に損傷が生じた場合、軟骨組織の組織再生能は低く、人々の連動機能に著しい障害をもたらす。
そこで、セラミックスやステンレスなどの金属による人工関節の置換術が行われているが、これらの冶具の平均寿命は１０年程度と短く、高齢者にとって手術のやりなおしといった想像を絶する難問題を避けて通ることができない現状がある。またこれらの人工関節は、金属、セラミックス、プラスチックス等により巧みに構築された構造をゆするために、長時間の使用による緩みや感染、イオン溶出等の様々な問題が生じている。
近年、人工物によって作製した人口軟骨の限界の開発が明らかになるにつれて、細胞を用いた組織再構築型の人工軟骨の開発が期待されている。即ち、患者から単離した骨・軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞を生体外で人工的に培養することが試みられている。軟骨、関節軟骨は他の臓器に比べてその構造がシンプルなために、臨床で使用可能なものの完成は間近であると考えられてきた。しかしながら、実際に軟骨細胞を生体内から搾取した場合、繊維芽細胞様細胞と同様のフェノタイプに形質転換してしまう。そのために、形質転換した細胞を用いて培養軟骨、培養関節を作製しても正常な軟骨組織である硝子軟骨の短期間での再生は難しく、臨床応用という観点で培養軟骨の開発は未だ多くの問題が残っている。
今までにペレット培養と呼ばれる方法、すなわち細胞懸濁液を試験管の中に入れて遠心力を加え、軟骨細胞の凝集塊を形成することによって、軟骨細胞の分化状態を脱分化型に変換できる方法が報告されてきた。この方法は分化の制御という観点で優れているが、数ミリメートル程度の凝集塊しか形成できないという問題点があり、その大きさや形状を制御することはできなかった。また、これまでの方法では細胞が増殖する足場となる培養担体（ｓｃａｆｆｏｌｄ）が必要であったが、その様な培養担体は異物であるために生体に有害な効果を及ぼす懸念があった。
発明の概要
そこで、上記のペレット培養の欠点を補うべく、大きさや形状を制御することができ、かつ培養担体を必要とせずに構築することを可能とし、人工軟骨、人工骨の材料と適した性質を有する、細胞の三次元構造体を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記課題を解決するべく、骨細胞や軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞等の細胞を、クローニングリング等の仕切り中に播種してその細胞から構成される組織を形成し、組織を形成する細胞を更に旋回培養することにより、細胞の三次元構造体を作製することが可能となった。本発明により作製された細胞の三次元構造体は、人工軟骨、人工骨の材料として有用である。
以下、本発明を詳しく説明するが、これら好適形態の詳細な説明及び実施例は、本発明の有効範囲を限定または制限することを何ら意味するものではない。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明により得られた分化した軟骨組織の作成の様子を示す写真である。
図２は、本発明の方法により形成された組織の形態を示す写真である。
図３は、三次元構造体の形質を、ＨＥ染色、サフラニン−Ｏ、アルシアンブルー、トルイジンブルーを用いて検討した結果を示す写真である。
図４は、旋回培養した細胞と静置培養した細胞において、細胞死の比較を行った写真である。
図５は、細胞培養の方法による遺伝子発現量（ｍＲＮＡの発現量）の差を、ＲＴ−ＰＣＲ法により比較した写真である。
発明の詳細な説明
本発明の「細胞の三次元構造体」とは、培養担体を必要とせずに、細胞のみで一定の三次元構造を構成していることを特徴とする、細胞の構造体である。従来の凝集塊においては球状のものしか作製することができなかったが、本発明の三次元構造体は鋳型として働く仕切りの形状・大きさを変えることにより、任意の形状・大きさとすることが可能である。本発明によれば、下記の実施例で示すように、１ｃｍオーダーの大きさを有する、分化した軟骨細胞のシートを形成することも可能である。培養担体を必要としない点においても、形状や大きさの点においても、本発明の細胞の三次元構造体は従来の細胞凝集塊とは大きく異なっている。
なお、本発明の原料として用いられる細胞は、骨細胞又は軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞の初代培養細胞である。該細胞の由来は動物であれば特に限定されないが、哺乳類が好ましく、霊長類が最も好ましい。
本発明において「骨細胞又は軟骨細胞」には、組織学的かつ遺伝子学的に正常な骨細胞又は軟骨細胞のみならず、疾患等により病変した骨細胞や軟骨細胞も含まれる。また、上記の骨細胞又は軟骨細胞には、骨細胞、軟骨細胞のほか、骨芽細胞、骨膜細胞、破骨細胞、および軟骨芽細胞も含まれる。本発明において「未分化細胞」とは本技術分野における一般的な意味に解されるが、具体的には、分化・増殖能力を有する未分化の細胞を意味する。その例として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、神経幹細胞および肝臓幹細胞等を挙げることができるが、特に、胚性幹細胞および間葉系幹細胞を用いることは好ましい。これらの未分化幹細胞は初代培養細胞であることが必要である。
前記細胞は、培養細胞株ではなく、生体から細胞を好適に用いることができる。なお、生体は患者自身であってもよいし、他人であってもよいし、あるいは、異種動物であってもよい。これらの細胞は、常法に従って結合組織等を除去して調製することが好ましい。また、単離した細胞は一次培養を行い、予め増殖させてから用いてもよい。
本発明の方法では、骨・軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞等の細胞を採取して該細胞の継代培養を行う。その後に、細胞分化を可能とする分化培地に懸濁して細胞懸濁液を調製する。この際の細胞懸濁液の細胞濃度は特に限定されるものではないが、１×１０２ｃｅｌｌｓ／μｌから１×１０１０ｃｅｌｌｓ／μｌであり、好ましくは１×１０３ｃｅｌｌｓ／μｌから６×１０９ｃｅｌｌｓ／μｌであり、特に好ましくは３×１０３ｃｅｌｌｓ／μｌから６×１０８ｃｅｌｌｓ／μｌの範囲内である。
上記の細胞懸濁液を、クローニングリング等の該細胞が流れ出すことを防ぐことができる仕切りの中に播種する。なお本明細書において「該細胞が流れ出すことを防ぐことができる仕切り」とは、懸濁液中に含まれる細胞が流れだすことを防ぎ、よって、該細胞を一定の面積範囲内に保持することを可能とする仕切りを意味する。下記の実施例においては直径１０ｍｍのクローニングリングを用いているが、それに限定されるものではなく、目的とする効果を達成することができる限り、種々の形状や大きさの仕切りを用いることが可能である。よって、かかる仕切りは、ある意味で、本発明の三次元構造体の形状を決定する鋳型として働くものである。その様な仕切りを用いることにより、懸濁液中の細胞は広範囲に流れだすことがなく、静置することにより該細胞は沈降し、細胞から構成される組織が形成される。なおここで形成される「組織」は、細胞の分化・未分化を問わずに、一定量以上の細胞の集合体である。静置する期間は一般的には数時間から数日であるが、その期間は特に限定されるものではなく、懸濁液中の細胞が沈降して組織を形成するのに充分な時間であればよい。なお本発明において、この仕切りの形状・大きさを工夫することによって、望みの形状・大きさの細胞三次元構造体を得ることが可能であり、この点で本発明の細胞の三次元構造体は有利である。
上記で述べた組織を形成する細胞を、酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系において更に培養する。「酸素と栄養の拡散効果を高めるような流れが存在する培養系」の例として、例えば、旋回培養などを挙げることができる。かかる方法を採用することによって、細胞の生育に必要な酸素と栄養が組織を構成している細胞の全体に行き渡り、細胞の三次元構造体が形成されるまで培養を継続することが可能となる。旋回培養を行う際の旋回速度は特に限定されるものではないが、好ましくは１０ｒｐｍから１０００ｒｐｍであり、更に好ましくは３０ｒｐｍから２００ｒｐｍである。旋回を行わないで静置して培養を行うと中心部の細胞が壊死するという知見もあり、本発明を行う際に目的とする細胞に適切である旋回速度を検討することが望ましい。また本発明の一態様として、細胞を間欠的な圧力および流れの場で培養することもまた可能である。
ここで使用される培地は特に限定されるものではなく、培養する細胞に合わせて本技術分野で汎用されている培地を適宜選択することができる。その例として、ＭＥＭ，α−ＭＥＭ，ＤＭＥＭ，ＲＰＭＩ，ｃＲＤＦ，ＥＲＤＦ，Ｆ１２，ＭＣＤＢ１３１，Ｆ１２／ＤＭＥＭ及びＷＥ等の培地を挙げることができる。また上記の培地には、ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ），Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）等の抗生物質、ＴＧＦβ，ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ等の増殖因子、ＢＭＰ、インシュリン、デキサメサゾン、プロリン、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、トランスフェリン、セリン、レチノイン酸、アスコルビン酸、Ｎａβグリセロフォスフェイトあるいは等を適宜添加してもよい。
更に、数日間から数週間旋回培養をすることにより、細胞は三次元構造体を形成する。培養の期間は特に限定されるものではなく、細胞が一定以上の生存率を有している限り、必要な三次元構造体が形成されるまで培養を行うことができる。培養条件は用いる細胞に合わせて適宜選択するが、一般的には３〜１０％二酸化炭素の存在下、３０℃〜４０℃で培養することが好ましく、４〜６％二酸化炭素の存在下、３４℃〜３８℃で培養することは特に好ましい。従来のペレット培養等において得られる凝集塊の大きさは数μｍから数ｍｍ程度であるが、本発明の方法により、下記の実施例において、厚さが数ｍｍ、直径が１ｃｍ強もの大きさの三次元構造体を得ることに成功している。
また、下記の実施例によると、本発明により得られた三次元構造体中の細胞の大部分は生存している細胞であり、かつ分化型の表現型を有していた。図１は、本発明により得られた細胞の再分化を示す写真である。なお本明細書において、「分化型の細胞」とは本技術分野における一般的な意味に解されるものであり、具体的には分化してその細胞に特異的な形質、例えば骨細胞又は軟骨細胞としての形質、を発現している細胞を意味するものである。また本明細書において、「分化傾向にある細胞」とは、完全は分化型ではないが、分化型の細胞に特異的な形質の少なくとも一部分を発現し、そのために未分化細胞はない形質を有する細胞を意味するものである。
よって、分化型の表現型を有する細胞よりなる本発明の三次元構造体は、人工軟骨、人工骨等に適している。また他の観点において本発明は、細胞の分化を促進する方法をも提供するものである。本発明において、未分化型の細胞が分化型に変化する理由はまだ判明していないが、クローニングリング等の仕切り中で細胞を沈殿させることにより高密度の細胞組織が得られ、その細胞間でいわゆるオートクライン的な細胞間相互作用が起こり、それにより細胞の分化型への変換が誘導されているという可能性が考えられる。
本発明の方法によれば、培養担体（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を必要とせず、細胞のみで三次元構造体を構築することが可能である。これまで開発されてきた人工軟骨、人工骨の作製方法においては、繊維状あるいはスポンジ状の培養担体に細胞を播種し、そのような培養担体をいわば「足場」として培養を行う必要があった。しかし、その様な培養担体は生体にとって異物であるために、種々の培養担体中の有害な物質が溶け出したり、異物として免疫反応を起こしたりという不都合があった。よって、その様な培養担体を必要とせずに細胞のみでｃｍオーダーの三次元構造体を得ることを可能とする本発明の意義は極めて大きい。
【実施例】  ウシ正常膝関節軟骨から軟骨細胞を０．２％コラーゲナーゼ溶液を用いて抽出し、１０％のウシ胎児血清を含むＦ１２培地を用いて初代継代を行った。その後１：４の比で継代培養を繰り返した後に、分化培養を用いて３．０×１０７ｃｅｌｌｓ／４００μｌの濃度に細胞懸濁液を調整し、クローニングリングの中に播種した（７５ｍｍφＴｒａｎｓｗｅｌｌ），８時間後クローニンリングを取り除き、２日間静置した後、７０ｒｐｍの旋回流れの存在下で、４日おきに培地交換を行いながら、軟骨細胞を２週間培養し、形態を染色により確認した。
継代培養によって充分な増殖能を獲得した脱分化型の軟骨細胞を、高密度に播種した後、旋回流れの存在下に２週間培養したところ、直径８．１ｍｍの３次元構造体が形成された（図２）。図２は、本発明により形成された組織の形態を示すの写真である。また、図３において細胞の種々の形質を確認した。図３において、図３ＡはＨＥ染色の結果、図３Ｂはサフラニン−Ｏによる検討の結果、図３Ｃはアルシアンブルーを用いた検討の結果、図３Ｄはトルイジンブルーを用いた検討の結果をそれぞれ示す。ＨＥ染色により核と細胞質を確認することができた。サフラニン−Ｏを用いてプロテオグリカンの同定、アルシアンブルーを用いて酸性粘液多糖類の同定を行ったところ、ペレット培養と同程度の発現が観察できた。またトルイジンブルーを用いて酸性ムコ多糖類の同定を行ったところ、ベレット培養と同程度の発現の観察が得られた。また、軟骨小胞も確認できた。
このことより、形成されたシート状の３次元構造体は遠心操作で得られたペレット培養と同程度のものであると考えられた。またｃａｌｅｉｎ−ＡＭとＰＩ溶液の二重染色による壊死の判定を行ったところ、若干の死細胞の存在が認められたものの、大部分の細胞は生きていることがわかった（図４）。図４において、図４Ａは旋回流れの存在下培養させた細胞を、図４Ｂは静置させて培養させた細胞を、それぞれ示す。なお緑色に染まった細胞は生細胞であり、赤色に染まった細胞は死んだ細胞である。また、図４においてバーは２００μｍである。また同様に高密度に播種した後、静置した状態で２週間培養したものは、３次元構造体を形成するものの、中心部が壊死していたことから、旋回培養の有為性も示唆された。ペレット培養においては、３次元凝集塊の軟骨細胞は分化型の表現型を有することが報告されているので、研究において実施した高密度培養による軟骨細胞の３次元榊構造体の形成技術は、今後再生軟骨を構築するための基盤技術として有益な手法になると考えられた。
また正常ウシ膝軟骨細胞の４継代目の細胞を旋回培養して形成した３次元構造体を３週間に亘って培養したところ，旋回培養の条件下で培養したものはピンセットで掴むとプレート状の形状を維持したのに対し，流れのない静的な条件下で培養したものはその形状を維持できないことがわかった。これらの結果は，旋回培養によって３次元構造体の力学的な性質が向上したことを意味しているものと考えられた。
更に、細胞培養の方法により遺伝子発現に差が生じるか、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量の比較を行った結果を示す。図５において、左側が三次元構造体を旋回培養したもの（Ｒｏｔ）、中央がペレット培養をしたもの（Ｐｅｌ）、右側がモノレイヤー培養をしたもの（Ｍ）の写真である。それぞれのサンプルにおいて、コントロールであるグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現量を揃え、アグレカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）とＴｙｐｅ１コラーゲン、Ｔｙｐｅ２コラーゲンのｍＲＮＡの発現を観察した。その結果、分化型の軟骨組織で多く発現しているアグレカンとＴｙｐｅ２コラーゲンの発現量は、旋回培養を行うと、従来の培養手法で作製したペレットと同程度以上であることが確認された。なおＴｙｐｅ１コラーゲンの発現量については、二次元培養であるモノレイヤーよりも抑えられていた。
本発明により、骨細胞や軟骨細胞、若しくは未分化幹細胞等の細胞を、クローニングリング等の仕切り中に播種してその細胞の組織を形成し、組織を形成する細胞を更に旋回培養することにより作製された、細胞の三次元構造体が提供された。本発明により作製された細胞の三次元構造体は、人工軟骨、人工骨の材料として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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