(57)【要約】取り扱いが容易であって、十分な滅菌処理が行え、及びその上に細胞層を構築するための基材として良好に機能する羊膜由来医用材料を提供する。（ｉ）基底膜の少なくとも一部を残して、羊膜から上皮層を除去し、その後（ｉｉ）残存する基底膜が、使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持する条件で乾燥させる。
2004078225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性状（１）〜（３）を備える、羊膜由来医用材料：
（１）乾燥状態である；
（２）上皮層を有しない；及び
（３）使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持した基底膜を有する。
【請求項２】
さらに以下の性状（４）を備えることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の羊膜由来医用材料：
（４）実質的に酸素との接触がない状態で容器に収納されている。
【請求項３】
前記実質的に酸素との接触がない状態が、容器内が真空にされた又は窒素置換された状態である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の羊膜由来医用材料。
【請求項４】
前記細胞が角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、又は口腔粘膜上皮細胞である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の羊膜由来医用材料。
【請求項５】
以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、羊膜由来医用材料の作製方法：
（ｉ）基底膜の少なくとも一部を残して、羊膜から上皮層を除去するステップ；及び
（ｉｉ）残存する基底膜が、使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持する条件で、ステップ（ｉ）によって得られる上皮非含有羊膜を乾燥させるステップ。
【請求項６】
前記ステップ（ｉｉ）が、凍結乾燥処理により実施される、請求の範囲第５項に記載の羊膜由来医用材料の作製方法。
【請求項７】
更に以下のステップ（ｉｉｉ）を含む、請求の範囲第５項又は第６項に記載の羊膜由来医用材料の作製方法：
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）によって得られる乾燥体を、実質的に酸素との接触がない状態となるように容器に収納するステップ。
【請求項８】
前記実質的に酸素との接触がない状態が、容器内が真空にされた又は窒素置換された状態である、請求の範囲第７項に記載の羊膜由来医用材料の作製方法。
【請求項９】
以下のステップを含む、角膜上皮様シートの作製方法：
請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の医用材料上で角膜上皮細胞を培養するステップ。
【請求項１０】
以下のステップ（ａ）及び（ｂ）を含む、角膜上皮様シートの作製方法：
（ａ）請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の医用材料上で角膜上皮細胞、又は角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞を培養するステップ；及び
（ｂ）前記細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ。
【請求項１１】
前記ステップ（ａ）が支持細胞の共存下で実施される、請求の範囲第１０項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
【請求項１２】
前記ステップ（ａ）が、支持細胞の共存下であって、且つ該支持細胞と前記医用材料との間に該支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態で実施される、請求の範囲第１０項に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）で培養される細胞が口腔粘膜上皮細胞である、請求の範囲第１０項〜第１２項のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
【請求項１４】
以下のステップ（Ａ）〜（Ｃ）を含む、角膜内皮様シートの作製方法：
（Ａ）採取した角膜内皮細胞を培養して増殖させるステップ；
（Ｂ）増殖した角膜内皮細胞を回収して細胞浮遊液を作製するステップ；及び
（Ｃ）前記細胞浮遊液を、請求の範囲第１〜４のいずれかに記載の医用材料上に播種し、培養するステップ。
【請求項１５】
前記ステップ（Ｂ）の後に以下のステップ（Ｂ−１）が実施される、請求の範囲第１４項に記載の角膜内皮様シートの作製方法：
（Ｂ−１）遠心処理によって前記細胞浮遊液の細胞密度を高めるステップ。
【請求項１６】
前記ステップ（Ｃ）において、細胞浮遊液を播種した後に遠心処理する、ことを特徴とする請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の角膜内皮様シートの作製方法。
【請求項１７】
前記ステップ（Ｃ）が以下のステップ（Ｃ−１）〜（Ｃ−５）を含む、請求の範囲第１４項又は第１５項に記載の角膜内皮様シートの作製方法：
（Ｃ−１）培養容器内に、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器を留置するステップ；
（Ｃ−２）前記容器の前記底面上に請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の医用材料を載置するステップ；
（Ｃ−３）前記細胞浮遊液を前記医用材料上に播種するステップ；
（Ｃ−４）遠心処理するステップ；及び
（Ｃ−５）培養するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は羊膜由来の医用材料及びその使用に関する。本発明の医用材料は例えば、創傷補填材、創傷保護材、創傷治癒材、癒着防止材、人工組織などに利用することができ、具体的には移植用上皮（例えば角膜上皮）や移植用内皮（例えば角膜内皮）の作製に利用できる。
【背景技術】  細胞培養技術の発展や医療技術の進歩などを背景として、本来の機能を発揮できなくなった組織を再建（再生）しようとする試みが様々な組織をターゲットとして行われている。例えば、適当な基材の上に皮膚表皮や角膜上皮をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構築させ、これを移植用組識として利用する試みがある。このような移植用組織の構築に用いられる基材には、生体に対する高い親和性（及び低免疫原性）や、その上に目的とする細胞が良好に接着し、そして増殖すること等の特性が要求される。従来、このような特性を備える材料として羊膜が広く利用されてきた。羊膜は胎仔を羊水とともに包み込む膜であって免疫原性が低いことから、移植片を作製する材料として特に好ましいものであると考えられている。羊膜は概略してコラーゲンからなる実質層に基底膜を介して上皮層が形成された構造を有する。前述のように羊膜は免疫原性が低いものではあるが、更なる免疫原性の低下を図るため、及びその上に細胞層を構築させて移植用組織を構築する場合には羊膜由来の細胞の混入を防止する必要があるため、上皮層を除去した上で使用することが好ましいと考えられている（特開平５−５６９８７号公報を参照）。
【発明の開示】
上皮層を除去した羊膜の調製は例えば以下のようにして行われている。まず、採取した羊膜を洗浄等し、余分な付着物を取り除き、その後、上皮層を剥がす。このようにして得られた上皮非含有羊膜は、調製直後に使用される場合を除き、使用時まで冷蔵又は凍結保存される。従って、使用前における十分な温度管理が要求され、その取り扱い（特に運搬の際）には特別の注意を必要とするものであった。また、生体に移植される材料であることから使用前に十分な滅菌処理を施す必要があるが、本発明者らの検討したところでは冷蔵状態又は凍結状態にある上皮非含有羊膜にγ線または電子線処理等を行えば溶液の変色等が観察され、必要とされる滅菌処理に耐えられるものではなかった。
本発明は、以上の課題に鑑みてなされたものであってその主たる目的は、取り扱いが容易であって、十分な滅菌処理が行え、及びその上に細胞層を構築するための基材として良好に機能する羊膜由来医用材料を提供することである。
本発明者らは羊膜の基底膜に注目し、細胞層を構築するための基材として好適な医用材料とするためには、基底膜を残存させるとともにその構造を維持させることが重要であると考えた。また、取り扱いの面から使用前においては乾燥した形態であることが最も好ましいと考えた。以上の考えを下に本発明者らは、羊膜を出発原料として上記目的を達成し得る医用材料の構築を試みた。まず、基底膜の少なくとも一部が残存するように羊膜の上皮を除去した。続いて、真空凍結乾燥によって水分を除去し、乾燥状態の羊膜（上皮非含有羊膜）とした。得られた上皮非含有羊膜の特性を調べるために、当該羊膜を基材として細胞層の構築を試みた。その結果、角膜上皮細胞を用いたモデル系において、当該羊膜上への細胞の良好な接着及び増殖、更には重層化が観察された。そして、最終的に得られた細胞層（角膜上皮様シート）を移植片として移植実験を行ったところ、生体への移植片の確実な生着、及び良好な角膜再建効果が確認された。本発明は以上の成果に基づきなされたものであって、以下の各構成を提供する。
［１］  以下の性状（１）〜（３）を備える、羊膜由来医用材料：
（１）乾燥状態である；
（２）上皮層を有しない；及び
（３）使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持した基底膜を有する。
［２］  さらに以下の性状（４）を備えることを特徴とする、［１］に記載の羊膜由来医用材料：
（４）実質的に酸素との接触がない状態で容器に収納されている。
［３］  前記実質的に酸素との接触がない状態が、容器内が真空にされた又は窒素置換された状態である、［１］又は［２］に記載の羊膜由来医用材料。
［４］  前記細胞が角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、又は口腔粘膜上皮細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の羊膜由来医用材料。
［５］  以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、羊膜由来医用材料の作製方法：
（ｉ）基底膜の少なくとも一部を残して、羊膜から上皮層を除去するステップ；及び
（ｉｉ）残存する基底膜が、使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持する条件で、ステップ（ｉ）によって得られる上皮非含有羊膜を乾燥させるステップ。
［６］  前記ステップ（ｉｉ）が、凍結乾燥処理により実施される、［５］に記載の羊膜由来医用材料の作製方法。
［７］  更に以下のステップ（ｉｉｉ）を含む、［５］又は［６］に記載の羊膜由来医用材料の作製方法：
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）によって得られる乾燥体を、実質的に酸素との接触がない状態となるように容器に収納するステップ。
［８］  前記実質的に酸素との接触がない状態が、容器内が真空にされた又は窒素置換された状態である、［７］に記載の羊膜由来医用材料の作製方法。
［９］  以下のステップを含む、角膜上皮様シートの作製方法：
［１］〜［４］のいずれかに記載の医用材料上で角膜上皮細胞を培養するステップ。
［１０］  以下のステップ（ａ）及び（ｂ）を含む、角膜上皮様シートの作製方法：
（ａ）［１］〜［４］のいずれかに記載の医用材料上で角膜上皮細胞、又は角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞を培養するステップ；及び
（ｂ）前記細胞が増殖して重層化した後、最表層を空気に接触させるステップ
［１１］  前記ステップ（ａ）が支持細胞の共存下で実施される、［１０］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１２］  前記ステップ（ａ）が、支持細胞の共存下であって、且つ該支持細胞と前記医用材料との間に該支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜が存在した状態で実施される、［１０］に記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１３］  前記ステップ（ａ）で培養される細胞が口腔粘膜上皮細胞である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の角膜上皮様シートの作製方法。
［１４］  以下のステップ（Ａ）〜（Ｃ）を含む、角膜内皮様シートの作製方法：
（Ａ）採取した角膜内皮細胞を培養して増殖させるステップ；
（Ｂ）増殖した角膜内皮細胞を回収して細胞浮遊液を作製するステップ；及び
（Ｃ）前記細胞浮遊液を、［１］〜［４］のいずれかに記載の医用材料上に播種し、培養するステップ。
［１５］  前記ステップ（Ｂ）の後に以下のステップ（Ｂ−１）が実施される、［１４］に記載の角膜内皮様シートの作製方法：
（Ｂ−１）遠心処理によって前記細胞浮遊液の細胞密度を高めるステップ。
［１６］  前記ステップ（Ｃ）において、細胞浮遊液を播種した後に遠心処理する、ことを特徴とする［１４］又は［１５］に記載の角膜内皮様シートの作製方法。
［１７］  前記ステップ（Ｃ）が以下のステップ（Ｃ−１）〜（Ｃ−５）を含む、［１４］又は［１５］に記載の角膜内皮様シートの作製方法：
（Ｃ−１）培養容器内に、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器を留置するステップ；
（Ｃ−２）前記容器の前記底面上に［１］〜［４］のいずれかに記載の医用材料を載置するステップ；
（Ｃ−３）前記細胞浮遊液を前記医用材料上に播種するステップ；
（Ｃ−４）遠心処理するステップ；及び
（Ｃ−５）培養するステップ。
特に記載のない限り、本明細書において「角膜上皮細胞」とは角膜上皮細胞層に含まれる細胞を包括した表現として使用され、即ち角膜上皮幹細胞をも含む。同様に「角膜内皮細胞」とは角膜内皮細胞層に含まれる細胞を包括した表現として使用され、即ち角膜内皮幹細胞をも含む。また、本明細書において「角膜上皮様シート」とは、角膜上皮に類似する特徴を有し、角膜上皮の代替として移植に供され得る細胞層を意味する用語として使用される。同様に「角膜上皮移植用シート」とは、角膜上皮に類似する特徴を有する細胞層を備え、角膜上皮の再建のために移植に供され得る組成物を意味する用語として使用される。一方、「角膜内皮様シート」とは、角膜内皮に類似する特徴を有し、角膜内皮の代替として移植に供され得る細胞層を意味する用語として使用される。同様に「角膜内皮移植用シート」とは、角膜内皮に類似する特徴を有する細胞層を備え、角膜内皮の再建のために移植に供され得る組成物を意味する用語として使用される。
【図面の簡単な説明】  図１は、走査型電子顕微鏡による羊膜像を示す図である。Ａは正常な状態（上皮処理を行っていない状態）の羊膜表面の像、Ｂは上皮掻爬処理（０．０２％ＥＤＴＡ溶液）後の羊膜表面の像である。Ａでは多角形の羊膜上皮が観察される。一方、Ｂでは羊膜上皮が認められず、上皮が完全に除去されていることが確認される。
図２は、凍結乾燥羊膜の表面分析結果をまとめた表である。表中の＋は陽性、−は陰性を表す。ＡＭ（−）ＦＤγｒａｙ：実施例５の方法で得られた乾燥羊膜、ＡＭ（＋）：採取した後に洗浄のみを行ったサンプル、ＡＭ（−）：上皮の除去は行い、凍結乾燥処理は行わないサンプル、ＡＭ（−）ｄｉｓｐａｓｅ：上皮の除去をディスパーゼ処理によって行い、乾燥処理は行わないサンプル、ＡＭ（−）ＦＤ：上皮の除去及び凍結乾燥処理は行い、滅菌処理は行わないサンプル、ＡＭ（−）γｒａｙ：上皮の除去を行った後、凍結乾燥処理をせずに滅菌処理を行ったサンプル。
図３は、羊膜上に口腔粘膜上皮細胞を培養する際の器具等の状態を模式的に示した断面図である。ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ１内にｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ２が静置され、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ１底面には３Ｔ３細胞層５が形成される。また、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ２の底面上に羊膜３が静置され、その上に角膜上皮細胞４が培養される状態が示される。符号６は培地である。
図４は、凍結乾燥羊膜上に形成された角膜上皮細胞層を示す図（ＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）染色像）である。
図５は、術前の眼表面の状態を観察した図（上欄）、及び角膜上皮移植用シートを移植後２日経過した時点の眼表面の状態（フルオレセイン染色像）を示す図（下欄）である。フルオレセインで染色された部分（矢示）は斜線で示される。眼表面（移植部）はフルオレセインに染色されず、移植片が眼表面に生着していることがわかる。また、移植片の周囲は全周にわたってフルオレセインの染色性が認められる。
図６は、角膜上皮移植用シートを移植後７日経過した時点の眼表面の状態を示す図（上欄は直接観察した図、下欄はフルオレセイン染色像）である。移植片が透明性を維持しているのがわかる（上欄）。フルオレセインで染色された部分（矢示）は斜線で示される。染色性を示す領域は僅かであり、移植片が眼表面に残存しており、しかも移植後２日経過した時点よりも周囲に伸展していることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の第１の局面は羊膜由来医用材料に関し、以下の性状（１）〜（３）を備えることを特徴とする。
（１）乾燥状態である。
（２）上皮層を有しない。
（３）使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持した基底膜を有する。
本発明の医用材料は第１に羊膜由来であることを特徴とする。「羊膜由来」とは広く羊膜を出発原料として得られたものであることを意味する。免疫原性の観点から、本発明の医用材料はヒト羊膜由来であることが好ましい。ヒト羊膜は子宮と胎盤の最表層を覆う膜であって、コラーゲンに富む実質組織上に基底膜、上皮層が形成されて構成される。
本発明の医用材料は（１）の性状を備えることによりその取り扱いが容易となる。具体的には常温（例えば約１０℃〜約３５℃）などでも保存することが可能となる。即ち、使用前において冷凍ないし冷蔵環境下で管理する必要がなくなりその取り扱い（保存、運搬など）が容易となる。但し、以上の記載は、本発明の医用材料を低温で保存できないことを意味するものではなく、必要に応じて冷凍ないし冷蔵保存に供してもよい。
一方、乾燥状態であることにより、その使用に影響を与えることなく効果的な滅菌処理を行うことが可能となる。また、乾燥状態であるため経時的な劣化は極めて少なく、長期間に亘ってその品質を高い状態に維持できる。
本発明が備える（２）の性状は免疫原性の低下に寄与する。即ち、羊膜は本来、免疫原性の低い材料であるが、上皮層が完全に除去されることで免疫原性が更に低下する。一方、上皮層を有しないという性状は、本発明の医用材料上に目的とする細胞層を良好に構築させることを可能とする点で重要である。上皮層が残存した状態の羊膜を基材としてその上に特定の細胞を播種して細胞層の構築を行おうとすれば、播種した細胞の増殖が羊膜上皮細胞によって阻害される。上皮層を完全に除去した羊膜とすることで、このような羊膜上皮細胞による増殖阻害の惧れがなくなる。このように上皮を有しないという特徴によって本発明の医用材料は、目的とする細胞層の構築に好適な基材として機能する。
本発明の医用材料は（３）の性状を備えることにより、目的の細胞層を構築するための基材として好適に使用することができる材料となる。上皮を完全に除去した後自然乾燥させた羊膜、即ち実質層のみからなる自然乾燥羊膜では一般に、基底膜成分が分解されているため、その上に細胞を播種した場合に当該細胞が良好に接着しない。ところが、本発明の医用材料では基底膜を残存させ且つその構造を高度に保持させているから、基底膜に含まれる接着因子によってその上に播種された細胞が良好に接着し、その結果、細胞の増殖及び重層化が生ずる。
尚、（３）の性状における「使用時に」とは、本発明の医用材料を適当な溶液（滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、適当な培地など）に浸漬して乾燥状態から復元させたときのことをいう。
基底膜の有無については、基底膜に特徴的な構成成分であるコラーゲンＩＶ（α１、α２、及びα５）、コラーゲンＶＩＩ、ラミニン５などの存在を調べることによって確認することができる。即ち、本発明の医用材料では復元させたときにこれらの成分の少なくとも一つ、好ましくは複数、更には全てが検出される。尚、コラーゲンＩＶなどの検出は、これらに特異的な抗体を用いた免疫染色法によって実施され得る。
本発明の医用材料上で増殖される細胞としては例えば、上皮細胞（角膜上皮細胞、皮膚上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（角膜内皮細胞など）を挙げることができる。尚、口腔粘膜上皮細胞とは例えば、歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の粘膜上皮細胞、口蓋部の粘膜上皮細胞、頬部の粘膜上皮細胞などである。
以上のように、本発明の羊膜由来医用材料は移植を前提とした細胞層（組織）を構築することに極めて有用な材料である。
本発明の医用材料は、実施的に酸素との接触がない状態で容器に収納されて提供されることが好ましい。かかる形態では酸素による品質の劣化がなく、長期間に亘って高い品質を維持することができる。「実質的に酸素との接触がない状態」とは、容器内に酸素が実質的に存在しない状態をいい、具体的には容器内を真空にした状態や容器内に窒素を充填した（窒素置換した）状態を例示できる。「容器」は本発明の医用材料の収納に適したものであれば特に限定されず例えば、可塑性の合成樹脂からなる袋状又はチューブ状のもの（二枚のシートを重ね合わせて周縁部をシーリングさせたものであってもよい）、或はガラスなどの無機材料からなるビン状のものなどを本発明の容器として使用することができる。
以上の本発明の医用材料は例えば、以下の方法（本発明の第２の局面）により作製される。
本発明の第２の局面は、羊膜由来医用材料の作製方法に関し、以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含むことを特徴とする。
（ｉ）基底膜の少なくとも一部を残して、羊膜から上皮層を除去するステップ。
（ｉｉ）残存する基底膜が、使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持する条件で、ステップ（ｉ）によって得られる上皮非含有羊膜を乾燥させるステップ。
ステップ（ｉ）では上皮層を除去するが、このときに基底膜も併せて除去するのではなく、その少なくとも一部を残存させる。このような処理は例えば、セルスクレイパー、ピンセット等を用いて上皮層を掻爬することにより行われる。好ましくは、ＥＤＴＡやタンパク分解酵素などによって予め上皮層を構成する細胞相互の接着を緩めた上で、セルスクレイパーなどによる掻爬を実施する。但し、このような前処理（ＥＤＴＡなどによる処理）は実質層への上皮層の接着を介在する基底膜の構造を破壊しない条件で実施されることが好ましい。例えばディスパーゼを用いて一般的な条件（例えば、ディスパーゼを１．２ＩＵとなるように添加し、３７℃で１時間反応させる条件）で処理すれば上皮層のみならず基底膜も大きくダメージを受ける。このような前処理を行った場合には本来の機能を保持した基底膜を残存させることができない。本発明のステップ（ｉ）において重要な点は、基底膜の少なくとも一部をその本来の機能を保持させた状態で残存させつつ上皮層を完全に除去することにある。例えばＥＤＴＡによる前処理（例えば、ＥＤＴＡを０．０２％〜０．１％となるように添加し、４℃〜３７℃で１時間〜４時間反応させる条件）によれば基底膜に対する影響は極めて少ない。
ステップ（ｉ）で使用される羊膜は好ましくはヒト羊膜である。ヒト羊膜は例えば、分娩時に後産として得られるヒト胎仔膜、胎盤などから採取することができる。具体的には、分娩直後に得られるヒト胎仔膜、胎盤及び臍帯からなる一体物を処理・精製することによりヒト羊膜を調製することができる。このようなヒト羊膜の調製方法は、特開平５−５６９８７号に記載される方法などの公知の方法を採用できる。すなわち、分娩時に得られる胎仔膜より羊膜を剥離し、超音波洗浄等の物理的処理及び酵素処理などにより残存組織を除去し、適宜洗浄工程を経てヒト羊膜を調製することができる。このように調製したヒト羊膜は、ステップ（ｉ）の直前まで凍結して保存しておくことができる。ヒト羊膜の凍結は、例えば−８０℃、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）とグリセロールとを体積比で等量混合した液中で行うことができる。凍結保存することにより操作性が向上することは勿論のこと、抗原性が低下することも期待できる。
ステップ（ｉ）に続いて実施されるステップ（ｉｉ）では、ステップ（ｉ）によって得られる上皮非含有羊膜を、残存する基底膜が使用時にその上で細胞の接着及び増殖が可能な構造を保持する条件下で乾燥処理する。このような条件下で処理し得る限りにおいて乾燥処理の方法は限定されないが、好ましくは凍結乾燥処理が採用される。凍結乾燥処理では一般に、沸点が約−２０℃（１０７Ｐａ、０．８Ｔｏｒｒ）〜約−５０℃（４Ｐａ、０．０３Ｔｏｒｒ）となるような低い気圧環境（真空）において、凍結固化状態の試料（例えば約−４０℃で凍結させたもの）から昇華によって水分が除去される。凍結乾燥処理によれば内部からも均一に脱水でき、また高い乾燥度が実現されることから本来の機能及び形態を高度に保持したままで乾燥させることができる。また、凍結乾燥処理は、１．処理中の劣化が少ない、２．無菌化が容易にできる、３．復元性に優れた乾燥体が得られる、４．保存性に優れた乾燥体が得られる、などの特徴を有する。
凍結乾燥処理は、真空室、冷却・加熱装置、排気装置（コールドトラップ及び真空ポンプ）を備えた凍結乾燥機によって行うことができる。数多くの凍結乾燥装置が市販されており、本発明のステップ（ｉｉ）ではこれらの中から任意に選択したものを用いることができる。尚、処理条件は、使用する装置に添付の使用説明書に基づいて設定することができる。その際には乾燥処理に供する試料の大きさ、乾燥度などを考慮することができる。乾燥度は例えば水分活性（ＡＷ）が０．５より小さくなるように設定できる。
以上のステップ（ｉｉ）の後に以下のステップ（ｉｉｉ）を実施することが好ましい。
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）によって得られる乾燥体を、実質的に酸素との接触がない状態となるように容器に収納するステップ。
このステップ（ｉｉｉ）を行えば、酸素から実質的に遮断された状態にパッケージされた上皮非含有羊膜の乾燥体が得られる。これにより長期の保存が可能な羊膜由来医用材料となる。
ステップ（ｉｉｉ）は例えば、ステップ（ｉｉ）によって得られた乾燥体を適当な容器内に収納した後、容器内を真空にすること、又は容器内を窒素置換することによって行うことができる。或は、容器内に脱酸素剤を同封することによっても行うことができる。尚、容器としては例えば、可塑性の合成樹脂からなる袋状又はチューブ状のもの（二枚のシートを重ね合わせて周縁部をシーリングさせたものであってもよい）、或はガラスなどの無機材料からなるビン状のものなどを使用することができる。
本発明の他の局面は、本発明の第１の局面で提供される羊膜由来医用材料の利用方法に関し、その一態様は角膜上皮様シートの作製方法である。この態様では羊膜由来医用材料上に角膜上皮細胞、又は角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞（以下、これらをまとめて「角膜上皮用細胞」という）が培養される。角膜上皮細胞は適当なドナーの角膜から取得される。利用可能な場合にはレシピエント自身の角膜上皮細胞を用いることが好ましい。移植に供した際に免疫拒絶反応の惧れが無い角膜上皮様シートの作製が可能となり、これにより免疫拒絶反応を伴わない移植術が可能となるからである。レシピエント自身の角膜上皮細胞が入手できないか或は入手が困難な場合にはレシピエント以外の角膜上皮細胞を用いることもできるが、この際には免疫適合性を考慮してドナーを選択することが好ましい。
「角膜上皮細胞様細胞への分化能を有する細胞」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養によって、或は移植後に生体内において角膜上皮様細胞層を構築することができる細胞を意味する。ここでの「角膜上皮様細胞層」とは、角膜上皮として機能するために必要とされる種々の性状（例えば、高い透明性を有することや、最上層の細胞が角化していないこと、バリア機能を備えることなど）を備える細胞層のことをいう。
本発明者らは口腔粘膜上皮細胞がこのような角膜上皮細胞様細胞への分化能を有することを確認している（ＰＣＴ／ＪＰ０２／１１８５７を参照）。口腔粘膜上皮には幹細胞の存在が示唆されており、上皮様細胞層を形成する細胞へと分化誘導を行い易いと考えられる。また、口腔粘膜上皮細胞を用いることは、採取が容易なこと、多量の細胞を採取可能なこと、更には両眼性の患者を処置する場合においても自己の細胞を用いて移植材料を調製できること等の利点を有する。特に、角膜上皮細胞を採取不可能な患者に対して、自己の細胞由来の移植材料を適用できるという利点は、臨床上極めて重要な拒絶反応の問題を大幅に解消するものと期待される。
口腔粘膜上皮細胞としては歯根部に存在する細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）、口唇部の細胞、口蓋部の細胞、頬部の細胞などが用いられる。中でも口腔内縁粘膜上皮細胞はその増殖能が高く、また抗原性が低いことから、これを用いることが特に好ましい。口腔粘膜上皮細胞は、目的とする細胞が存在する場所をメスなどで切除したり、掻爬したりすることにより採取することができる。口腔内縁粘膜上皮細胞にあっては、抜歯に付着している口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離し、得られた組織片より採取することができる。尚、結合組織などの不純物を除去するためにディスパーゼやトリプシンなどの酵素による処理やフィルター処理を施すことが好ましい。
本発明によって作製される角膜上皮様シートが移植される患者以外の口腔より採取した口腔粘膜上皮細胞を用いることもできるが、免疫拒絶反応を考慮すれば、患者自身の口腔より口腔粘膜上皮細胞を採取し、培養に供することが好ましい。
角膜上皮用細胞は、本発明の羊膜由来医用材料上で培養される。即ち、採取した角膜上皮用細胞を羊膜由来医用材料上に播種し、適当な培養条件下で培養する。角膜上皮用細胞を例えば、細胞密度が約１×１０３個／ｃｍ２以上、好ましくは約１×１０３個／ｃｍ２〜約１×１０７個／ｃｍ２、更に好ましくは約１×１０４個／ｃｍ２〜約１×１０６個／ｃｍ２となるように羊膜由来医用材料上に播種することができる。
角膜上皮用細胞の培養は支持細胞の存在下で行うことが好ましい。支持細胞はｆｅｅｄｅｒ細胞とも呼ばれ、培養液中に成長因子等などを供給する。支持細胞との共存下で培養することにより、角膜上皮用細胞の増殖効率の向上を期待できる。支持細胞には例えば、３Ｔ３細胞（スイスマウス３Ｔ３細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ２細胞など）などを用いることができる。中でも、増殖効率、取り扱いの容易さなどの観点からマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を支持細胞として用いることが好ましい。
支持細胞を予めマイトマイシンＣなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって角膜上皮用細胞の増殖が阻害されることを防止し、角膜上皮用細胞の増殖効率を上昇させるためである。このような不活性化は放射線処理などによっても行うことができる。
角膜上皮用細胞の培養を支持細胞の共存下で行う場合には、支持細胞とコラーゲン層との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を存在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって、培養時に羊膜由来医用材料側（即ち、角膜上皮用細胞側）に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られる角膜上皮様シート内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のない角膜上皮様シートの作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
隔離膜としては、支持細胞が通過できないポアサイズを有する公知のものを適宜選択して使用することができる。例えばポリカーボネート製、ポアサイズが約０．４μｍ〜３．０μｍの膜を用いることができる。隔離膜の材質は特に限定されず、ポリカーボネートの他、ポリエステルなどであってもよい。このような隔離膜は市販されており、容易に入手することができる。
隔離膜を用いた場合の培養方法の例として以下の方法を挙げることができる。まず、シャーレ等の容器（第１の容器）に不活性化した支持細胞を播種して培養することにより、容器表面に支持細胞層を形成させる。次に、隔離膜で底面を形成した第２の容器を、第１の容器内に設置する。この際、第２の容器の底面が培養液中となるように第２の容器の位置を調整する。続いて、第２の容器の底面、即ち隔離膜上に羊膜由来医用材料を載置する。そして、羊膜由来医用材料上に角膜上皮用細胞を播種し、培養する。
第２の容器の底面に予め羊膜由来医用材料を載置しておき（載置後に乾燥処理を行ってもよい。）、この第２の容器を、支持細胞を播種した第１の容器内に設置し、そして羊膜由来医用材料上に角膜上皮用細胞を播種し、培養を行ってもよい。
支持細胞の細胞密度は、例えば約１×１０２個／ｃｍ２以上、好ましくは約１×１０２個／ｃｍ２〜約１×１０７個／ｃｍ２、更に好ましくは約１×１０３個／ｃｍ２〜約１×１０５個／ｃｍ２とすることができる。角膜上皮用細胞数との対比でいえば、使用する支持細胞数を、例えば角膜上皮用細胞数に対して１／１０３倍〜１×１０２倍、好ましくは１／１０２〜１倍となるような条件で培養を行うことができる。支持細胞数が少ないと角膜上皮用細胞の増殖率が低下し、少なすぎる場合には良好な角膜上皮用細胞の重層化が得られない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には却って角膜上皮用細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。
角膜上皮用細胞を培養する際に用いられる培養液は、当該細胞を増殖させ、重層化できるものであれば特に限定されない。例えば、上皮細胞の成長に通常用いられるＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）とハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉｕｍ）とを所定割合で混ぜ、ＦＢＳ、成長因子、抗生物質等を添加した培地を使用することができる。具体例としては、ＦＢＳ（１０％）、インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、及びペニシリン−ストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ）を添加した、ＤＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地（混合体積比１：１）が挙げられる。また、トリヨードサイロニン（例えば、２ｎＭ）、グルタミン（例えば、４ｍＭ）、トランスフェリン（例えば、５ｍｇ／ｍｌ）、アデニン（例えば、０．１８ｍＭ）、及び／又はハイドロコルチゾン（例えば、０．４ｍｇ／ｍｌ）を更に添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２混合培地を用いることもできる。
羊膜由来医用材料上で角膜上皮用細胞を培養すること（ステップ（ａ））によって、羊膜由来医用材料上で角膜上皮用細胞が増殖し、重層化する。続いて、細胞層を形成する細胞の分化、及びバリア機能の誘導のために、重層化した細胞層の表層を空気に接触させるステップ（ステップ（ｂ））が行われる。このステップのことを本明細書ではエア−リフティング（Ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ）とも呼ぶ。
このステップ（ｂ）は、培養液の一部をスポイト、ピペットなどを用いて一時的に除去することにより培養液表面を低下させ、これにより細胞層の最表層を一時的に培養液外に露出させることによって行うことができる。又は、細胞層を羊膜由来医用材料ごと持ち上げて、最表層を培養液表面から一時的に露出させることにより行うこともできる。更には、チューブなどを用いて空気を培養液中に送り込み、細胞層の最上層に空気を接触させることにより当該ステップを実施してもよい。操作の容易さの観点から、培養液表面を低下させて細胞層の最表層を露出させる方法により行うことが好ましい。
ステップ（ｂ）を行う時間、即ち重層化した細胞層の最表層を空気に接触させる時間は、細胞の状態や培養条件などによって変動するが、例えば３日〜３週間程度であり、好ましくは５日〜２週間、更に好ましくは約１週間である。
以上の本発明の方法により、羊膜由来医用材料上に角膜上皮用細胞由来の細胞が重層化してなる細胞層（角膜上皮様シート）が形成される。この角膜上皮様シートは、培養基質として用いられる羊膜由来医用材料とともに、角膜を損傷、欠損等した患者に対する移植材料（角膜上皮の代替）として用いることができる。この場合、羊膜由来医用材料層が眼球側となるように角膜上皮欠損部に移植される。移植の際には、手術用縫合糸を用いて移植片を周囲の組織と固定し、生着を促すことが好ましい。また、移植後、治療用コンタクトレンズで移植部表面を一時的に被覆して保護することが好ましい。
尚、羊膜由来医用材料の一部を除去したもの、又は全部を除去したもの（即ち、細胞層のみ）を移植片として用いることもできる。羊膜由来医用材料の除去は、ＥＤＴＡ等による化学処理、タンパク分解酵素等による酵素処理、ピンセット等による掻爬などの物理的処理などによって行うことができる。
以上の方法によれば、角膜上皮用細胞由来の細胞が重層化した、角膜上皮様の細胞層（角膜上皮様シート）が作製されるが、本発明の方法を、当該細胞層が羊膜由来医用材料上に形成されてなる角膜移植用の移植材料（角膜上皮移植用シート）を提供するものと見ることもできる。即ち、本発明の方法は、このような構造を有する角膜上皮移植用シートの作製方法として用いることができるものでもある。
角膜上皮用細胞として口腔粘膜上皮細胞を用いた場合には、角膜上皮様シートにおいて口腔粘膜上皮細胞由来の細胞が重層化していることとなる。口腔粘膜上皮由来の細胞であることは、角膜上皮様シートを構成する細胞において、口腔粘膜上皮細胞特異的なケラチン４、又はケラチン１３が発現していることを指標として確認することができる。又は、ケラチン３を発現していることを指標とすることもできる。このケラチン３は、角膜特異的ケラチンの一つと知られているが、口腔粘膜上皮細胞においても発現していることが確認されている。尚、この角膜特異的ケラチンであるケラチン３を発現している点において、口腔粘膜上皮細胞を角膜上皮移植用の組成物を作製する材料として用いることは好ましいといえる。
一方、口腔粘膜上皮細胞特異的な遺伝子の発現を調べることによっても、細胞層を形成する細胞が口腔粘膜上皮細胞由来であることを確認することができる。
本発明で提供される角膜上皮様シートは、好ましくは、以下の性状ないしは特性のいくつかを備えるものである。特に好ましくは、以下の全ての性状ないしは特性を備えるものである。
（１）最上層の細胞が角化していない。これは、角膜上皮が備える特徴の一つである。この特徴が認められることにより、本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。尚、角化とは別名角質化とも呼ばれ、細胞内にケラチンを生じ、核等の細胞内小器官が失われる現象をいう。細胞が角化しているか否かは例えば、細胞の扁平化や核の有無を指標として確認することができる。
（２）最上層の細胞が扁平形状である。すなわち角膜形成用細胞由来の細胞層が、略円柱形状の細胞からなる層の上に扁平形状の細胞からなる層が形成された構造を有する。扁平形状の細胞が最上層を覆うことにより細胞間の気密性が高まり、下のバリア機能が奏されると考えられる。角膜上皮においても最上層の細胞は扁平形状である。この特徴が認められることにより本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。
（３）バリア機能を備える。バリア機能とは、表層からの液体、気体などの浸潤や、表層を介した液体の放散などを防止する機能をいう。かかるバリア機能を有することにより、移植後にその表面に水分（涙）を保持することができ、また必要以上の水分が放散することを防止することができる。角膜はバリア機能を備えることによりその表面に水分を保持でき、これによって瞬目に耐えることができるという機能を発揮する。したがってバリア機能を備えることは角膜用移植材料に求められる重要な一つの特性である。この特徴が認められることにより本発明の角膜上皮様シートは角膜上皮に類似し、角膜上皮と同様の機能を発揮することが期待される。バリア機能を備えるか否かは例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）等の標識物質を含む溶液の浸潤の程度によって調べることができる。
本発明の羊膜由来医用材料の他の利用態様は角膜内皮様シートの作製方法に関する。この態様では、羊膜由来医用材料上に角膜内皮細胞を培養することにより角膜内皮様細胞層が構築される。具体的には以下の手順に従って角膜内皮様シートの作製が行われる。
＜１＞角膜内皮細胞の採取、及び増殖
角膜内皮細胞はレシピエント自身又は適当なドナーの角膜から常法で採取される。例えば、角膜組織のデスメ膜と内皮細胞層を角膜実質から剥離した後、培養皿に移し、ディスパーゼなどで処理する。これによって角膜内皮細胞はデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞はピペッティングなどによって脱落させることができる。デスメ膜を除去した後、角膜内皮細胞が成育できる適当な培養液中で角膜内皮細胞を培養する。培養液としては例えば市販のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）にＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ｂ−ＦＧＦ（ｂａｓｉｃ−ｆｉｂｌｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ｉｎｓｕｌｉｎ、及びペニシリン、ストレプトマイシンなどの抗生物質を適宜添加したものを使用することができる。培養容器（培養皿）にはその表面にＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、又はウシ内皮細胞の細胞外マトリックスなどをコーティングしてあるものを使用することが好ましい。角膜内皮細胞の培養容器表面への接着が促され、良好な増殖が行われるからである。
角膜内皮細胞を培養する際の温度条件は角膜内皮細胞が成育する限りにおいて特に限定されないが例えば、約２５℃〜約４５℃、増殖効率を考慮すれば好ましくは約３０℃〜約４０℃、更に好ましくは約３７℃である。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが例えば７〜１４日間である。
ここで、利用可能な場合にはレシピエント自身の角膜内皮細胞を用いることが好ましい。移植に供した際に免疫拒絶反応の惧れが無い角膜内皮様シートの作製が可能となり、これにより免疫拒絶反応を伴わない移植術が可能となるからである。レシピエント自身の角膜内皮細胞が入手できないか或は入手が困難な場合にはレシピエント以外の角膜内皮細胞を用いることもできるが、この場合には免疫適合性を考慮してドナーを選択することが好ましい。
＜２＞継代培養、細胞浮遊液の作製
培養に供された角膜内皮細胞が増殖した後に継代培養を行うことができる。好ましくはサブコンフルエントないしコンフルエントになった時点で継代培養を行う。継代培養は次のように行うことができる。まずｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ等で処理することによって細胞を培養容器表面から剥がし、次いで細胞を回収する。回収した細胞に培養液を加えて細胞浮遊液とする。細胞を回収する際、或は回収後に遠心処理を行うことが好ましい。かかる遠心処理によって細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。尚、ここでの遠心処理の条件としては例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができる。
細胞浮遊液は上記の初期培養と同様に培養容器に播種され、培養に供される。継代培養は上記の初期培養と同様の培養条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば７〜２１日間である。以上の継代培養は必要に応じて複数回行うことができる。継代培養を繰り返すことにより細胞数を増加でき、また細胞密度の高い細胞浮遊液を調製することができる。最終的に約５×１０５細胞／ｍｌ〜２０×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を有する細胞浮遊液を調製することが好ましい。
＜３＞細胞浮遊液の播種、培養
細胞浮遊液は羊膜由来医用材料上に播種され、培養に供される。この際、一般的には、最終的に作製される角膜内皮様シートにおいて所望の細胞密度の細胞層が形成されるように、播種する細胞数が調整される。具体的には細胞密度が約２，０００〜約４，０００細胞／ｍｍ２の細胞層が形成されるように、例えば１ｍｍ２あたり約３，０００個〜約７，５００個、好ましくは約５，０００個〜７，５００個の細胞を播種する。培養は上記の初期培養などと同様の条件で行うことができる。培養時間は使用する細胞の状態などによっても異なるが、例えば３〜２１日間である。
羊膜由来医用材料において、上皮を除去して表出した面側（即ち、基底膜側）に角膜内皮細胞を播種することが好ましい。この面側にはＩＶ型コラーゲンが多量に含まれており、播種された角膜内皮細胞の接着、増殖を良好に行うことができると考えられるからである。
羊膜由来医用材料上での角膜内皮細胞の培養は例えば次のようにして行うことができる。まず、培養液を通過可能なポアサイズの膜からなる底面を有する容器（以下、「カルチャーインサート」ともいう）を底面を下にして培養容器内に留置する。続いて、カルチャーインサートの底面上（カルチャーインサート内側）に羊膜由来医用材料を載置する。そして、羊膜由来医用材料上に細胞浮遊液を播種し、培養する。尚、カルチャーインサートの底面に予め羊膜由来医用材料を載置しておくこともできる。即ち、例えばカルチャーインサートの底面に羊膜由来医用材料を載置し（載置後に乾燥処理を行ってもよい）、このカルチャーインサートを培養容器内に設置し、その後細胞浮遊液の播種、培養を行ってもよい。
カルチャーインサートの底面に使用できる膜の例としてはポリカーボネート製、ポアサイズが約０．４μｍ〜３．０μｍの膜を挙げることができる。この他、ポリエステル製の膜などを使用することもできる。このような膜は市販されており容易に入手することができる。
カルチャーインサート内に細胞浮遊液を播種した後に遠心処理を行うことができる。これにより羊膜由来医用材料上の細胞密度を高めることができる。また、羊膜由来医用材料表面への細胞の接着も良好なものとなる。さらに、細胞密度の偏りが小さくなるといった効果も得られる。尚、ここでの遠心処理の条件としては例えば、５００ｒｐｍ（３０ｇ）〜１，０００ｒｐｍ（７０ｇ）、１〜１０分を挙げることができる。
以上のようにして培養を行うことにより、羊膜由来医用材料上に角膜内皮由来の細胞からなる細胞層が形成された角膜内皮様のシートが形成される。この角膜内皮様シートは角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑、円錐角膜の治療における移植材料（角膜内皮の代替）として用いることができる。尚、羊膜由来医用材料の一部を除去したもの又は全部を除去したもの（即ち、細胞層のみ）を移植片として用いることもできる。この羊膜由来医用材料の除去はＥＤＴＡ等による化学処理、タンパク分解酵素等による酵素処理、ピンセット等による掻爬などの物理的処理などによって行うことができる。
角膜内皮細胞の培養（初期培養、継代培養、及び羊膜由来医用材料上での培養を含む）を支持細胞の共存下で行うことができる。支持細胞との共存下で培養することにより、角膜内皮細胞の増殖効率の向上、分化促進などの効果が期待できる。支持細胞には例えば、１０Ｔ１／２線維芽細胞（Ｈｙｌｄａｈｌ  Ｌ：Ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｏｒｎｅａｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．６６：３４３−３５１，１９８４．）、３Ｔ３細胞（スイスマウス３Ｔ３細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、３Ｔ３Ｊ２細胞など）、角膜実質細胞などを用いることができる。
支持細胞の共存下で角膜内皮細胞の培養を行う場合には、角膜内皮細胞と支持細胞との間に支持細胞が通過できないポアサイズの隔離膜を介在させることが好ましい。この隔離膜の利用によって培養時に角膜内皮細胞側に支持細胞が侵入することを防止できる。その結果、最終的に得られる角膜内皮様シート内に支持細胞が混在するおそれが無くなる。このことは、支持細胞による免疫拒絶の問題のない角膜内皮様シートの作製が可能になることを意味し、臨床上極めて有意義である。
支持細胞を使用する場合には、支持細胞を予めマイトマイシンＣなどを用いて不活性化しておくことが好ましい。支持細胞自体が増殖することによって角膜内皮細胞の増殖が阻害されることを防止するためである。このような不活性化は放射線処理などによっても行うことができる。
隔離膜としては上記のカルチャーインサートに使用される膜と同様のものを採用することができる。即ち、例えばポリカーボネート、ポリエステルなどからなりポアサイズが約０．４μｍ〜３．０μｍの膜を用いることができる。
支持細胞の細胞密度は例えば、約１×１０２個／ｃｍ２以上、好ましくは約１×１０２個／ｃｍ２〜約１×１０７個／ｃｍ２、更に好ましくは約１×１０３個／ｃｍ２〜約１×１０５個／ｃｍ２とすることができる。支持細胞数が少ないと角膜内皮細胞の増殖率が低下することが考えられ好ましくない。一方、支持細胞数が多すぎる場合には却って角膜内皮細胞の増殖率を低下させることとなり好ましくない。
以上の方法によって作製された角膜内皮様シートを移植する方法としては、全層トレパネーション法及び深層角膜切除法を例示することができる。前者の方法はトレパンを用いて一旦角膜全層を採取し、角膜内皮細胞層を本発明の角膜内皮様シートで置き換えた後にレシピエントに戻す方法であって、具体的には次のように行うことができる。まず、レシピエント（ホスト）の角膜をトレパンにて全層切開し、角膜の一部（又は全部）をボタン状に採取する。次に採取された角膜片からデスメ膜、及び角膜内皮細胞層を剥離する。露出された角膜実質上に本発明の角膜内皮様シートを接着させる。この際、羊膜由来医用材料が実質側となるようにする。その後、角膜片をレシピエントに戻し、縫合糸を用いて固定する。
他方、深層角膜切除法は角膜全層を摘出するのではなく角膜深層部のみを切除するものであって、レシピエントへの負担がより少ない方法と考えられる。具体的には次のように行うことができる。まず、レシピエントの角膜実質の一部を剥離し、角膜実質深層の一部とデスメ膜及び内皮細胞層の一部を切除する。尚、内皮細胞層のみ、又は内皮細胞層及びデスメ膜のみを剥離切除してもよい。傷害されたレシピエント角膜内皮細胞だけを剥離しても良い。次に、本発明の角膜内皮様シートをスパーテルなどを用いて切除部に挿入する。必要に応じて前房内に空気を注入して移植片の固定を行う。
尚、移植した角膜内皮様シートが生体における角膜内皮細胞層と同様にバリアー機能、ポンプ機能を発揮するか否かは例えば、移植後の角膜厚の変化、浮腫の発生を調べることによって確認することができる。
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明する。
＜実施例１＞  羊膜の採取
全身的合併症のない帝王切開予定の妊婦に対して事前に産婦人科医とともに十分なインフォームドコンセントを行った後、手術室で帝王切開時に羊膜を採取した。操作は清潔に気をつけ、手術操作に準じて手洗いの後に専用ガウンを装用した。分娩前に清潔な羊膜採取用のバットと洗浄用の生理食塩水を準備した。分娩後に胎盤組織をバットに移し、用手的に羊膜組織を胎盤より剥離した。羊膜と胎盤との癒着が強い部分はハサミで切除した。
＜実施例２＞  羊膜の処理
羊膜処理の過程は（１）洗浄、（２）トリミング、（３）保存の順で行った。すべての過程において、操作は清潔なドラフト内で行うのが望ましく、使用する容器や器具もすべて滅菌されたものを使用し、シャーレ等は滅菌された使い捨て（ディスポーザブル）タイプのものを使用した。採取した羊膜に付着した血液成分を生理食塩水にて洗浄しながら除去し、さらに十分量の生理食塩水（０．００５％  ｏｆｌｏｘａｃｉｎ添加）にて洗浄した。続いて、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ＩＵ）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で合計３回洗浄した。次に、羊膜をシャーレ内に移し、ハサミを用いて約４×３ｃｍ程度のサイズに分割した。分割後、形状や厚さなどを基準に状態のよい羊膜を選別した。
＜実施例３＞  羊膜の保存
２ｃｃの滅菌クライオチューブに１ｃｃずつ保存液を入れ、そこに採取、洗浄して選別された羊膜を１枚ずついれラベルした後、−８０℃のディープフリーザーに保存した。保存液には５０％滅菌済みグリセロールｉｎ  ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’Ｓ  Ｍｏｄｏｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）を使用した。保存された羊膜の使用期限は３ヶ月とし、期限が過ぎれば焼却処分した。尚、このような保存処理を行わずに、以下の上皮処理を実施してもよい。
＜実施例４＞  羊膜上皮の処理
−８０℃で保存していた羊膜を室温で解凍した後、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ＩＵ）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した。洗浄後の羊膜を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ社）に浸し（１００ｍｍ培養皿）、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、１時間反応させた。反応後、羊膜を十分量のＰＢＳで２回洗浄し、実体顕微鏡下、ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ（Ｎｕｎｃ社  ＵＳＡ）を用いて用手的に上皮を掻爬（除去）した。尚、この処理方法によって一層の羊膜上皮が完全に除去掻爬されたことを光学的及び電子顕微鏡的操作（走査型電子顕微鏡）で確認した（図１）。尚、図１は走査型電子顕微鏡による羊膜像である。Ａは正常な状態（上皮処理を行っていない状態）の羊膜表面の像、Ｂは上皮掻爬処理（０．０２％ＥＤＴＡ溶液）後の羊膜表面の像である。
＜実施例５＞  凍結乾燥羊膜の作製
上皮を除去した羊膜を一組の滅菌済みプラスチックフレームで挟持した後、クリップで固定した。フレームごと−８０℃のディープフリーザー内に移し、羊膜が凍結したのを確認した後、真空凍結乾燥機（Ｙａｍａｔｏ，ＮＥＯＣＯＯＬ）を用いて凍結乾燥処理（−１１０℃、約１時間）を行った。使用説明書に従い、十分な乾燥体が得られるように条件設定した。凍結乾燥処理後の羊膜をフレームから外し、外側がポリアミドナイロン、内側がポリエチレンからなる二層構造の袋に移し、家庭用真空パック器（フレームノバ、マジックパック）を用いて真空包装した。このようにして得られた真空パック状態の羊膜にγ線を照射して（約２５ｋＧｙ）滅菌した。滅菌処理後の羊膜を真空パック状態のまま使用直前まで常温保存した。尚、保存開始から１２ヶ月経過した時点においても凍結乾燥直後の状態を維持していた。以降の実験は１ヶ月常温保存した乾燥羊膜を使用して行った。
＜実施例６＞  凍結乾燥羊膜の表面分析
実施例５で得られた乾燥羊膜において、上皮を除去した側の表面に基底膜が残存し、かつその構造が保持されていることを確認するために、以下の手順で免疫学的分析を行った。まず、乾燥羊膜をＰＢＳに浸漬して復元し、適当な大きさに切除してＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄに凍結包埋した。その後クライオスタットにて薄切りし、スライド切片を作製した。スライド切片をＰＢＳで洗浄した後、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）でブロッキングを行い非特異的な抗体反応を抑制した。その後、１次抗体を室温で１時間反応させた。１次抗体には、コラーゲンＩ〜Ｖ及びＶＩＩ、エンタクチン、フィブロネクチン、並びにラミニン５に対してそれぞれ特異的に結合する抗体（コスモバイオ社製）を使用した。反応終了後、ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有のＰＢＳにて１５分、３回の条件で洗浄し、続いて蛍光標識化抗体（２次抗体）を室温で１時間反応させた。次に、ＰＢＳにて１５分、３回の条件で洗浄し、封入した後コンフォーカルマイクロスコープにて組織を観察した。対照群として、採取した後に洗浄のみを行ったサンプル（ＡＭ（＋））、上皮の除去は行い、凍結乾燥処理は行わないサンプル（ＡＭ（−））、上皮の除去をディスパーゼ処理（３７℃、１時間）によって行い、乾燥処理は行わないサンプル（ＡＭ（−）ｄｉｓｐａｓｅ）、上皮の除去及び凍結乾燥処理は行い、滅菌処理は行わないサンプル（ＡＭ（−）ＦＤ）、上皮の除去を行った後、凍結乾燥処理をせずに滅菌処理を行ったサンプル（ＡＭ（−）γｒａｙ）を用意し、各サンプルについて上記と同様の方法で１次抗体反応及び２次抗体反応を行った。免疫学的分析の結果をまとめた表を図２に示す。表中の＋は陽性、−は陰性を表す。尚、実施例５の方法で得られた乾燥羊膜（上皮の除去、凍結乾燥処理、及び滅菌処理を行ったもの）はＡＭ（−）ＦＤγｒａｙ）と表される。
この表に示されるように、上皮を除去したサンプル（ＡＭ（−））では基底膜に特徴的な成分であるコラーゲンＩＶ（α２及びα５）、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩ、及びラミニン５が検出された。また、上皮処理後に凍結乾燥処理を行ったサンプル（ＡＭ（−）ＦＤ）、及びさらに滅菌処理を行ったサンプル（ＡＭ（−）ＦＤγｒａｙ）においても同様にこれらの成分が検出された。この結果から実施例４の方法による上皮除去処理を採用したことで、基底膜を残存させた状態で上皮を除去できたことがわかる。また、上皮除去後に凍結乾燥処理を行っても基底膜が残存した状態を維持することができ、さらに滅菌処理を行っても残存する基底膜はほとんどダメージを受けないことがわかる。一方、上皮の除去をディスパーゼによって行ったサンプル（ＡＭ（−）ｄｉｓｐａｓｅ）では、これらの基底膜に特徴的な成分は検出されなかった。このことは、ディスパーゼ処理によって基底膜が破壊されたことを示すものと考えられる。
以上の分析結果から、上記の方法で調製された乾燥羊膜は、本来の構造を保持した基底膜を有することが確認された。
＜実施例７＞  角膜上皮細胞の回収
６週令日本白色家兎より採取した角膜を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭに浸漬し、結膜、角膜内皮等不要な組織を切除した。その後、組織をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、１．２Ｕ／ｍｌディスパーゼ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に３７℃で１時間浸漬した。処理後の組織を取り出し、０．０２％ＥＤＴＡに室温で２分間、続いてリン酸緩衝液に室温で２分間浸漬してディスパーゼ活性を停止させた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ中で角膜上皮細胞を掻爬した後、遠心処理により角膜上皮細胞を濃縮、回収した。
＜実施例８＞  共培養細胞の調製
共培養の細胞（支持細胞）として、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「３Ｔ３細胞」と略称する）を使用した。事前に培養して７５Ｆフラスコ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）でコンフルエントになった３Ｔ３細胞を０．０５％マイトマイシンＣ溶液に２時間浸漬させ、３Ｔ３の増殖活性を抑えた。続いてリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で数回洗浄してマイトマイシンＣを除去した。細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理した後、ピペッティングして細胞懸濁液（３Ｔ３細胞懸濁液）とした。
＜実施例９＞  角膜上皮様シートの形成
実施例５で得られた凍結乾燥羊膜を、充分に復元するまで室温でＰＢＳに浸漬させた。このようにして調製した羊膜を基質として、角膜上皮細胞と３Ｔ３細胞とを以下の手順で共培養した。培養器具としては６ｗｅｌｌのｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（培養皿）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社，ＮＹ）とｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ（培養挿入容器）（ポリカーボネート製、平均ポアサイズ３．０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社，ＮＹ）を用いた。
まず、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ上に約１×１０４個／ｃｍ２の細胞密度となるように３Ｔ３細胞懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。また、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ上に基底膜側（上皮が存在していた側）を上にして羊膜を貼り付け、室温で１０分間乾燥させた。その後、羊膜を貼り付けたｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ上に約１×１０５個／ｃｍ２の細胞密度となるように角膜上皮細胞懸濁液を播種した。
以上の操作後、図３に示すように、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔをｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ内に設置し、３Ｔ３細胞と角膜上皮細胞を同じ培地中で培養した。尚、図３は培養中の状態を示した模式断面図である。ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ１内にｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ２が静置され、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ１底面には３Ｔ３細胞層５が形成される。また、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ２の底面上に羊膜３が静置され、その上に角膜上皮細胞が培養される状態が示される。符号６は培地である。
培地には、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２混合培地（混合体積比１：１）に、１０％ＦＢＳ，インシュリン（５ｍｇ／ｍｌ）、コレラトキシン（０．１ｎＭ）、ペニシリンストレプトマイシン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ヒトリコンビナント上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したものを使用した。
上記の培地中で３週間培養した（Ｓｕｂｍｅｒｇｅ）。その後、粘膜上皮を分化誘導すべく、いわゆるＡｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ法を用いて１週間培養した。Ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ法とは、培地の液面を、羊膜上に形成された角膜上皮細胞由来の細胞層面までにし、当該細胞層の表面を空気中に暴露する方法である。Ｓｕｂｍｅｒｇｅ中は隔日で培地を交換し、ａｉｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ後は毎日培地交換して培養を行った。
＜実施例１０＞  角膜上皮様シートの組織学的特性の検証
以上の方法で培養した結果、培養開始から約２０日経過した時点で、角膜上皮に類似した細胞層が形成された（図４）。細胞層では、正常角膜上皮と同様に４〜５層に細胞が重層化していることがわかる。この細胞層の羊膜側には比較的円柱形をした基底細胞類似の細胞群が存在していた。また、最表層の細胞は扁平型を呈していたが核を有しており、皮膚とは異なりその表面は角化していなかった。このように、羊膜上に角膜上皮類似の細胞層（角膜上皮様層）が形成されていることが確認された。
以上の方法により作製された、羊膜上に角膜上皮様細胞層が形成された移植用シート（以下、「角膜上皮移植用シート」ともいう）を用いて以下の移植実験を行った。
＜実施例１１＞  移植実験
まず、角膜上皮細胞の採取を行った白色家兎に対し、輪部より４ｍｍ外側からクレセントナイフを用いて角膜および結膜上皮を１００μｍの厚さですべて除去した。この操作により角膜上皮幹細胞を含む上皮細胞が存在しなくなるため、人為的な眼表面幹細胞疲弊症が再現されると考えることができる。尚、移植前の眼表面を観察した（図５上欄）。
次に、角膜上皮移植用シートを輪部よりやや内側の領域に移植した。移植の際には１０−０ナイロン糸を用いて周囲の組織に縫合した。移植後、移植片の上に治療用ソフトコンタクトレンズを縫着した。術後、抗生剤およびステロイド眼軟膏を２回／日塗布した。移植後の時点で、眼表面は、移植前の角膜上皮移植用シートと同様の透明性を示していた。
移植術を施した眼表面を、移植後２日及び移植後７日経過した時点でそれぞれ観察した。移植後２日経過した時点では、移植された角膜上皮移植用シートは透明性を維持しており、また、フルオレセイン染色にて眼表面に欠損なく残存していることが確認された（図５下欄）。また、移植片はフルオレセイン染色性を示さず、従って角膜上皮移植用シートは、角膜上皮同様のバリア機能を備えていることが確認された。さらに、フルオレセイン染色にて移植片の周囲は全周に渡ってフルオレセインの染色性が認められたことから、移植部に存在する組織は周囲の残存結膜上皮のコンタミネーションではないことが確認された。尚、角膜上皮は細胞同士がタイトな接着構造で結合しているため、その表面よりフルオレセインの色素が浸潤せず、フルオレセイン染色において染色性を示さない。一方、細胞間の接着が緩んだり、細胞自体が剥離してバリア機能が障害されたときには、フルオレセイン色素の浸潤が生じて組織を染色する。したがって、フルオレセイン染色による染色性を調べることにより、移植した角膜上皮移植用シートが角膜上皮同様のバリア機能を備えるか否かを確認できる。
移植後７日経過した時点では、移植された角膜上皮移植用シートが眼表面に残存していることが確認され、しかも移植後２日経過した時点の状態と比較して周囲へと伸展し、眼表面全体を被覆していた（図６下欄）。尚、図６に示されるように移植片はフルオレセイン染色性を示さず、角膜上皮に必要とされるバリア機能を維持していることが確認された。また、透明性も維持されていた（図６上欄）。
以上の結果から、乾燥羊膜を用いて作製した角膜上皮移植用シートが眼表面に生着、伸展し、術後長期間に渡って透明性を維持することが確認された。即ち、上述の方法により作製される角膜上皮移植用シートは、角膜上皮の代替として良好に機能する細胞層を含み、角膜の損傷、欠損などの場合に眼表面を再建するための移植材料として好適に利用できるものであることが確認された。
＜実施例１２＞  口腔粘膜上皮細胞を用いた角膜上皮様シートの作製
ドナーの抜歯に付着されている口腔粘膜上皮をエナメルセメント移行部より分離する。尚、一連の操作は、滅菌済みの器具を使用してできるだけ滅菌的に行うことが好ましい。
採取した口腔粘膜上皮を５０ＩＵ／ｍｌのペニシリンストレプトマイシン、ゲンタシンを含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に３０分、室温の条件で２回浸漬する。その後、組織を１．２Ｕディスパーゼ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に１時間、３７℃の条件で浸漬し、続いて０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社）で３０分間、浸漬処理して細胞を分離する。酵素活性は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭに浸漬させることにより停止させる。その後、６０μｍのｃｅｌｌ  ｆｉｌｔｅｒで余分な組織を除去することにより、口腔粘膜上皮細胞（口腔内縁粘膜上皮細胞）を単離する。このようにして得られた口腔粘膜上皮細胞を用い、実施例８及び９に示した方法と同様の方法で角膜上皮様細胞層を形成させる。
＜実施例１３＞  角膜内皮様シートの作製
（１３−１）ヒト角膜内皮細胞の採取、初期培養
ドナー角膜組織からデスメ膜と内皮細胞層を実質より鑷子にて剥離した後、３５ｍｍ培養皿に留置し、カルシウムを含まないＰＢＳで２倍希釈したディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）１ｍｌ（最終濃度１．２Ｕ／ｍｌ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で６０分間処理する。この処理にて角膜内皮細胞の多くはデスメ膜より脱落する。デスメ膜に残存している角膜内皮細胞を脱落させるためにピペッティング処理を行う。次にデスメ膜を除去し、角膜内皮細胞を１５ｃｃの遠心チューブへ移する。培養液を加えて全液量５ｍｌとした後、１，０００ｒｐｍ、７０ｇ、３分の条件で遠心する。培養液にはＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に１０％ＦＢＳ（大日本製薬株式会社製）、ｂ−ＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２ｎｇ／ｍｌ、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（ナカライ社製）を添加したものを使用することができる。上澄み液を除去した後、培養液を加えて約１ｍｌの細胞浮遊液とする。この細胞浮遊液をＩＶ型コラーゲンコートされた２４穴培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養する。以後、４８時間ごとに培養液を交換する。
（１３−２）内皮細胞の継代培養
培養された細胞がコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）となった時点で培養液を除去し、カルシウムを含まないＰＢＳ  １ｍｌを用いて細胞を３回洗浄する。洗浄後、０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡを２００μｌ加え３７℃、５％ＣＯ２の条件で３分間静置する。この処理によって培養皿の底に接着した内皮細胞が浮遊する。培養液５ｍｌを加えた後、１５ｃｃ遠心チューブに細胞浮遊液を移し、１，０００ｒｐｍ、７０ｇ、３分の条件で遠心処理する。上澄み液を除去した後、培養液を加えて約２ｍｌの細胞浮遊液とする。この細胞浮遊液をＩＶ型コラーゲンコートされた３５ｍｍ培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養する。以後、４８時間ごとに培養液を交換する。細胞がコンフルエントとなった時点で上記と同様の操作を行い、必要な細胞数が得られるまで継代を繰り返す。
（１３−３）角膜内皮様シートの作製
継代培養された細胞を０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡにて処理した後、細胞数をカウントする。次いで遠心処理して上澄み液を除去した後、細胞密度が約２．０×１０６個／ｍｌとなるように培養液を添加する。得られた細胞浮遊液を用いて角膜内皮細胞層を以下の手順で作製する。培養器具としては６穴培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＮＹ）とカルチャーインサート（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ：培養挿入容器、ポリカーボネート製、平均ポアサイズ３．０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、ＮＹ）を用いることができる。培養液は上記で使用したものと同じものを用いることができる。
まず、培養皿内にカルチャーインサートを留置する。次に、実施例５で得られた乾燥羊膜をＰＢＳで復元したものをカルチャーインサート内（底面上）に、上皮が存在していた側を上にして伸展させ敷く。続いて、羊膜上に約５，０００個／ｍｍ２となるように細胞浮遊液を播種する。その後、培養皿を１，０００ｒｐｍ、７０ｇ、３分の条件で遠心する。遠心後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養する。これにより、単層の細胞層が構築される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、取り扱いが容易で且つ必要とされる滅菌処理にも充分に耐えることが可能な羊膜由来医用材料が提供される。本発明の医用材料では上皮が除去されていることから極めて免疫原性が低くなるとともに、基底膜については本来の構造を高度に維持した状態で少なくとも一部が残存していることから、細胞層を構築するための基材として良好に機能する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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