(57)【要約】本発明は、劇症Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来の遺伝子、該遺伝子を利用した複製効率の高いＨＣＶレプリコンＲＮＡ及び該レプリコンＲＮＡを導入したＨＣＶレプリコン複製細胞に関する。本発明のＨＣＶレプリコンＲＮＡ及びＨＣＶレプリコン複製細胞を用いれば、ＨＣＶタンパク質を持続的に大量生産することができる。
2005028652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクをコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクのうちＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパクをコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の３’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクのうちＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂをコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸。
（ａ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の３’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項記載の核酸からなる遺伝子。
【請求項９】
請求項８記載の遺伝子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むＲＮＡ
（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むＲＮＡ
【請求項１１】
さらにＩＲＥＳ配列を含む、請求項１０記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１２】
さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、請求項１１記載のレプリコンＲＮＡ。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡ。
（ａ）配列番号７又は８に示される塩基配列を含むＲＮＡ
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ自律複製能を有するＲＮＡ
【請求項１４】
請求項１０乃至１３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより、レプリコン複製細胞を作製する方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１３のいずれか１項記載のレプリコンＲＮＡを細胞に導入することにより作製された、レプリコン複製細胞。
【請求項１６】
細胞が、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞である、請求項１５記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１７】
細胞が、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞である、請求項１５又は１６記載のレプリコン複製細胞。
【請求項１８】
被験物質の存在下で、請求項１５乃至１７のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１９】
請求項１５乃至１７のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法。
【請求項２０】
複製効率の増大が、レプリコン複製細胞に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍の増大である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１５乃至１７のいずれか１項記載のレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、劇症Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来の核酸、遺伝子、ならびに該遺伝子を利用したＨＣＶレプリコン及びレプリコン複製細胞に関する。
【背景技術】  ウイルス研究及び抗ウイルス薬の研究開発にはウイルスを効率よく増幅できる実験系が必要不可欠である。さらに、培養細胞によりウイルスを増幅させる系、あるいは培養細胞によりウイルスの増殖を評価する系があれば、ウイルス研究及び抗ウイルス薬の研究開発は飛躍的に進歩する。
Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）は、フラビウイルス科に属する、一本鎖の（＋）鎖センスＲＮＡをゲノムとするウイルスで、Ｃ型肝炎の原因となることが知られている。近年の研究により、Ｃ型肝炎ウイルスは遺伝子型又は血清型により多数の型に分類されることがわかってきた。現在主流のＨＣＶ遺伝子型の分類法である、ＳｉｍｍｏｎｄｓらによるＨＣＶ株の塩基配列を用いた系統解析法によると、ＨＣＶは遺伝子型１ａ、遺伝子型１ｂ、遺伝子型２ａ、遺伝子型２ｂ、遺伝子型３ａ、及び遺伝子型３ｂの６タイプに分類され、さらにそれらの各タイプがいくつかのサブタイプに分類される（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｒｉｇｙ（１９９４）１０，ｐ  １３２１−１３２４）。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている（Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）２４４，ｐ３５９−３６２；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９２）ｐ３３４−３３９；Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，（１９９２）７３  ｐ６７３−６７９；Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｒｏｇｙ，（１９９２）１６，２９３−２９９）。
Ｃ型肝炎に対する現在の主な治療は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−αとプリン−ヌクレオシド誘導体であるリバビリンとの併用療法により行われている。しかしながら、これらの治療を行っても、全治療者の約６０％に治療効果が認められるだけであり、効果が出た患者も治療を中止すると半分以上が再燃する。インターフェロンの治療効果は、ＨＣＶの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型１ｂに対しては効果が低く、遺伝子型２ａに対してはより効果が高いと言われている（Ｍｏｒｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（１９９２）１８３，３３４−３４２）。
工業国において罹患率が高く、最終的に深刻な結果を招き、かつ、現在原因療法が存在しないＣ型肝炎に対して、効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要な課題である。それゆえ、ＨＣＶ特異的な化学療法やワクチン療法の発展、及び抗ＨＣＶ薬の開発が切望されている。抗ＨＣＶ薬開発のターゲットとしては、ＨＣＶの複製抑制やＨＣＶの細胞感染の抑制が考えられる。
最近まで、ＨＣＶを細胞培養系で増やすこと、ＨＣＶを培養細胞に感染させることは困難であり、また、ＨＣＶに感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしかいなかったため、ＨＣＶの複製機構や感染機構の研究は困難であった。しかし、最近ＨＣＶ由来の自律複製能を有するＲＮＡとして、ＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンが作製されたこと（特開２００１−１７１８７号公報；Ｌｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，１１０−１１３；Ｂｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）２９０，１９７２−１９７４；Ｆｒｉｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）７５，１２０４７−１２０５７；Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（２００２）７６  ２９９７−３００６；）により、培養細胞を用いてＨＣＶの複製機構を解析することが可能となった。これらのＨＣＶサブゲノムＲＮＡレプリコンは、遺伝子型１ｂに属するＣｏｎ１というクローンのＨＣＶゲノムＲＮＡの５’非翻訳領域中のＨＣＶ  ＩＲＥＳの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン耐性遺伝子、及びその下流に連結したＥＭＣＶ−ＩＲＥＳによって置換したものである。このＲＮＡレプリコンは、ヒト肝癌細胞Ｈｕｈ７に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、Ｈｕｈ７細胞内で自律複製することが証明されている。このＲＮＡレプリコンシステムを用いたＨＣＶの複製評価系は抗ＨＣＶ薬の開発の強力なツールになると考えられる。
遺伝子型が異なるＨＣＶではコードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムＲＮＡレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムＲＮＡレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて様々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、及び抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。
現在培養細胞内でレプリコンとして複製ができたクローンは数株しかない。また、慢性肝炎からクローニングされチンパンジーに感染性が確認できたクローンが必ずしもレプリコンとして複製できるわけではない（Ｌｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９）２８５，１１０−１１３）。すなわち、複製効率がよく、かつ高確率でＨＣＶレプリコンを作製できるＨＣＶ株を選択する方法は未だ見出されておらず、こうしたＨＣＶ株の選択方法を確立すれば、ＨＣＶ治療薬の研究開発は飛躍的に前進すると考えられる。
ＨＣＶに関しては、現在ワクチンが開発されていない。その原因の一つは、安定して、大量にワクチンとなりうるＨＣＶ関連タンパク質を、生体内で存在する型で産生できないことにある。前述のＨＣＶレプリコン細胞において、ＨＣＶ関連タンパク質が発現していることから（特開２００１−１７１８７号公報）、このＨＣＶレプリコン細胞を利用することが可能と考えられる。しかしながら、工業的にワクチンを製造するためには、大量培養が可能な細胞を用いる必要がある。この観点から、現在ＨＣＶ  ＲＮＡレプリコン複製細胞として唯一樹立されているＨｕｈ７はワクチン製造には適していないと考えられる。ワクチン製造に適した細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞のように浮遊培養系で超大量培養が可能な細胞が考えられる。また、前述のように、ＨＣＶは遺伝子型により配列が異なるため、ワクチンについても遺伝子型ごとに製造することが必要になる。つまり、ワクチン製造に適した細胞を用いて、各種遺伝子型のＨＣＶ  ＲＮＡレプリコン細胞を作製することが必要となる。一方、Ｈｕｈ７細胞はＨＣＶの感染に対する感受性が確認できていないという点でも、ＨＣＶが自律的に感染複製する細胞培養系の樹立には向いていないと考えられる。したがって、他の肝癌細胞を用いてＨＣＶが自律的に感染複製する細胞培養系を樹立することが必要と考えられる。
さらに、様々な種類の細胞間でＨＣＶ  ＲＮＡレプリコンの複製機構の差異を比較することにより、ＨＣＶの複製に必要な細胞性因子の同定が可能となり、新たな抗ＨＣＶ治療薬のターゲットが発見できると考えられる。
【発明の開示】
本発明は、高確率で複製効率の良いＨＣＶレプリコンＲＮＡ、及びＨＣＶタンパク質を持続的に大量生産可能なＨＣＶレプリコン細胞の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、劇症Ｃ型肝炎患者のＨＣＶ株ＪＦＨ２．１あるいはＪＦＨ２．２に由来するレプリコンを用いれば、高確率で複製効率の良いレプリコン複製細胞が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリヌクレオチドからなる核酸を提供する。
（ａ）配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクをコードするポリヌクレオチド
（但し、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
本発明はまた、前記核酸を構成する下記（１）〜（６）の核酸も提供する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクのうちＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパクをコードするポリヌクレオチド
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号４で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の３’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶタンパクのうちＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパクをコードするポリヌクレオチド
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドからなる核酸：
（ａ）配列番号６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＣＶ遺伝子の３’非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド
（但し、上記（１）〜（６）のいずれについても、核酸がＤＮＡの場合、配列表の塩基記号「ｕ」は「ｔ」に読み替えるものとする）
本発明はまた、前記各核酸からなる遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチドも提供する。
本発明はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡも提供する。
（ａ）配列番号１、配列番号３及び配列番号４に示される塩基配列を含むＲＮＡ
（ｂ）配列番号２、配列番号５及び配列番号６に示される塩基配列を含むＲＮＡ
また、前記レプリコンＲＮＡは、さらにＩＲＥＳ配列や、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでいてもよい。
本発明はまた、以下の（ａ）又は（ｂ）のＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡも提供する。
（ａ）配列番号７又は８に示される塩基配列を含むＲＮＡ
（ｂ）前記（ａ）記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ自律複製能を有するＲＮＡ
本発明はまた、前記レプリコンＲＮＡを適当な細胞に導入することにより、レプリコン複製細胞を作製する方法と、該方法によって作製されたレプリコン複製細胞も提供する。該レプリコン複製細胞に用いられる細胞としては、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞が挙げられ、より具体的には、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞が挙げられる。
本発明はまた、被験物質の存在下で、前記レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法も提供する。
本発明はまた、前記レプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うことを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡの複製効率を増大させる方法も提供する。該方法において、複製効率は、レプリコン複製細胞に導入されたレプリコンＲＮＡの複製効率と比較して、少なくとも２倍増大していることが好ましい。
本発明はまた、前記レプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得し、取得した複製レプリコンＲＮＡを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞を作製する工程を１回以上行うこと、及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコンＲＮＡを取得することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法も提供する。
さらに、本発明は前記方法によって製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについて、レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコンＲＮＡとの間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、及び複製効率を増大させようとするレプリコンＲＮＡにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入することを含む、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法も提供する。
本発明の新規ＨＣＶ  ＲＮＡ遺伝子を利用すれば、高確率で複製効率の良いレプリコンＲＮＡとレプリコン複製細胞を得ることができる。このレプリコン複製細胞は、ＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用することができる。さらに該レプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】  図１は、プラスミドＤＮＡ  ｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２の構造（上段）、ならびにプラスミドＤＮＡ  ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１、及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２の構造（下段）を示す。
図２は、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２トランスフェクション細胞のコロニー形成を示す写真である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−３２９０８２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
１．本発明に係るＨＣＶ由来の核酸、遺伝子及びレプリコンＲＮＡ
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムは、約９６００ヌクレオチドからなる（＋）鎖の一本鎖ＲＮＡである。このゲノムＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲとも表記する）からなる。その構造領域にはＨＣＶの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
このようなＨＣＶの構造タンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、及びＥ２）と非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）は、翻訳領域から一続きのポリプロテインとして翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、ＨＣＶのウイルスタンパク質）のうち、Ｃｏｒｅはコアタンパク質であり、Ｅ１及びＥ２はエンベロープタンパク質であり、非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質である。また、ＮＳ２はメタロプロテアーゼ活性、ＮＳ３はセリンプロテアーゼ活性（Ｎ末端側の３分の１）とヘリカーゼ活性（Ｃ末端側の３分の２）を有することが知られている。さらに、ＮＳ４ＡはＮＳ３のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性を有することも報告されている。
本発明者らは、ＨＣＶの一般的な遺伝子型の分類ではなく、劇症肝炎患者から分離したＨＣＶというクライテリアで選別したＨＣＶゲノム用いて、高確率で複製効率が極めて良く、さらにはＨｕｈ７細胞などの細胞で自律的に複製することが可能なＲＮＡを構築した。
本明細書では、自律複製能を有しており天然のＨＣＶウイルスゲノムを政変して作製されたＲＮＡを、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」と呼ぶ。
本明細書中において、「遺伝子」とは核酸のうち「生命活動に関わる特定の機能や情報を担う核酸」を意味し、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含むものとする。また、核酸及び遺伝子は１本鎖（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等）であっても２本鎖であってもよく、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。さらに部分的に修飾されていても、誘導体であってもよい。なお、便宜上、配列表の塩基配列はＲＮＡで示すが、当該遺伝子がＤＮＡである場合、塩基記号「Ｕ」は「Ｔ」に読み替えるものとする。
本発明において、「劇症肝炎」とは、肝炎のうち症状発現後８週間以内にＩＩ度以上の脳症とプロトロンビン時間４０％以下を呈したものを意味し、１０日以内に脳症の出現する急性型と、それ以後に脳症の出現する亜急性型に分けられる。「劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルス」とは、この「劇症肝炎」症状を呈した患者から分離したＨＣＶのことを意味する。本発明において、「劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルス」あるいは「劇症株のＨＣＶ」には、天然由来のＨＣＶゲノムＲＮＡを有するウイルスだけでなく、天然由来のＨＣＶゲノム配列に人為的な改変を加えたゲノムＲＮＡを有するウイルスも包含する。劇症株のＨＣＶの具体例としては、ＪＦＨ−１株（特開２００２−１７１９７８号）、ならびにＪＦＨ−２．１株及びＪＦＨ−２．２株等のウイルスが挙げられる。
本願明細書において、「５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ又は５’ＵＴＲ）」、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、「Ｃｏｒｅタンパク質をコードする配列（Ｃｏｒｅ領域又はＣ領域）」、「Ｅ１タンパク質をコードする配列（Ｅ１領域）」、「Ｅ２タンパク質をコードする配列（Ｅ２領域）」、「Ｎ２タンパク質をコードする配列（ＮＳ２領域）」、「ＮＳ３タンパク質をコードする配列（ＮＳ３領域）」、「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ａ領域）」、「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ４Ｂ領域）」、「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ａ領域）」、「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列（ＮＳ５Ｂ領域）」、及び「３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ又は３’ＵＴＲ）」、ならびにその他の特定の領域若しくは部位は、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスであるＪＦＨ−２．１及びＪＦＨ−２．２株のゲノム全領域をコードする全長ゲノムＲＮＡあるいはその部分ゲノムＲＮＡ（ＪＦＨ−２．１及びＪＦＨ−２．２クローン）の塩基配列（それぞれ、配列番号１〜６）を含むポリヌクレオチドを基準として、定めるものとする。
具体的には、ＪＦＨ−２．１クローンについては、配列番号１、３及び４で示される塩基配列に対して特定のＨＣＶのＲＮＡ配列をアラインメントしたときに、配列番号３で示される塩基配列がそのＲＮＡの「５’非翻訳領域」、配列番号１に示される塩基配列が「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」であり、同塩基番号１〜１８９３の配列が「ＮＳ３タンパク質をコードする配列」、塩基番号１８９４〜２０５５の配列が「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列」、同塩基番号２０５６〜２８３８の配列が「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号２８３９〜４２３６の配列が「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列」、塩基番号４２７３〜６０１２の配列が「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、配列番号４で示される塩基配列が「３’非翻訳領域」である。
ＪＦＨ−２．２クローンについては、配列番号２、５及び６で示される塩基配列に対して特定のＨＣＶのＲＮＡ配列をアラインメントしたときに、配列番号５で示される塩基配列がそのＲＮＡの「５’非翻訳領域」、配列番号２に示される塩基配列が「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」であり、同塩基番号１〜１８９３の配列が「ＮＳ３タンパク質をコードする配列」、塩基番号１８９４〜２０５５の配列が「ＮＳ４Ａタンパク質をコードする配列」、同塩基番号２０５６〜２８３８の配列が「ＮＳ４Ｂタンパク質をコードする配列」、同塩基番号２８３９〜４２３６の配列が「ＮＳ５Ａタンパク質をコードする配列」、塩基番号４２７３〜６０１２の配列が「ＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」、配列番号６で示される塩基配列が「３’非翻訳領域」である。
本発明にかかる遺伝子には、前記した配列番号１乃至６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに加えて、該遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレチドも、それが前記した所望のタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、６×ＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムによりなる）存在下、６０℃でハイブリダイゼーション後、０．１％ＳＤＳを含む  １×ＳＳＣにて、６８℃条件下で洗浄するような条件をである。ハイブリダイゼーション法としては、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることができ、これらの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２０００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓの記載に準じて行うことができる。
本発明の核酸又は遺伝子は、それらが前記した所望のタンパク質をコードする限り、その配列内にギャップ、付加、欠失、置換等が存在していてもよい。具体的には、配列番号１乃至６で示される塩基配列において、１又は複数個の塩基、つまり、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであっても、それらが所望のタンパク質をコードする限り：
すなわち、配列番号１又は２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはＨＣＶタンパクのうちＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂタンパクをコードするものであり、配列番号３又は５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはＨＣＶ遺伝子の５’非翻訳領域をコードするものであり、配列番号４又は６で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドはＨＣＶ遺伝子の３’非翻訳領域をコードするものである限り、本発明の核酸あるいは遺伝子に含まれる（「塩基配列を含むポリヌクレオチド」は、「塩基配列を含む塩基配列」とも表示することがある）。
さらに上記の「特定のＨＣＶ」はＪＦＨ−２．１株、ＪＦＨ−２．２株に限定されず、それらの誘導体であるウイルス株も包含される。
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡの一つの実施形態は、劇症肝炎由来のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、５’非翻訳領域と、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列と、３’非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レプリコンＲＮＡである。このレプリコンＲＮＡは、さらに１つのＩＲＥＳ配列を含んでもよく、これにさらに１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでよい。またさらにこのレプリコンＲＮＡは、ＪＦＨ２．１及びＪＦＨ２．２以外のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上の、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、又はＮＳ５Ｂタンパク質以外のウイルスタンパク質をコードする配列を含んでいてもよい。
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡの別の好適な実施形態は、配列番号３で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、配列番号１で示されるＨＣＶのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号４で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含むポリヌクレオチド：あるいは、配列番号５で示される塩基配列からなる５’非翻訳領域と、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子と、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列と、配列番号２で示されるＨＣＶのゲノムＲＮＡ上のＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする塩基配列と、配列番号６で示される塩基配列からなる３’非翻訳領域とを含むポリヌクレオチドからなる、レプリコンＲＮＡである。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、好ましくは、最も５’側に配列番号３又は５のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を、最も３’側に配列番号４又は６のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子は、ＩＲＥＳ配列の上流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結されてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入されてもよい。
本発明に係るレプリコンＲＮＡは、より好ましくは、配列番号３又は５のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の５’非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子と、ＩＲＥＳ配列と、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とをこの順番で有し、さらに最も３’側に劇症肝炎患者由来のＨＣＶのゲノムＲＮＡ上の３’非翻訳領域を有する。
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡのさらに好ましい１つの実施形態は、配列番号７又は８で示される塩基配列からなるＲＮＡからなるレプリコンＲＮＡである。さらに、配列番号７又は８で表される塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸をも含む。さらに、この配列番号７又は８で示される塩基配列において、１乃至複数個の塩基、つまり１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個、最も好ましくは１〜数個（２〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるレプリコンＲＮＡであって、かつ、自律複製能を有するＲＮＡも、好適な実施形態として本発明の範囲に含まれる。本発明において「自律複製能を有する」とは、レプリコンＲＮＡを細胞中に導入したときに、そのレプリコンＲＮＡが細胞内でそのレプリコンＲＮＡ自身の全長を複製することができることを意味する。限定するものではないが、この自律複製能は、例えば、レプリコンＲＮＡをＨｕｈ７細胞中にトランスフェクションし、Ｈｕｈ７細胞を培養し、得られる培養物中の細胞から抽出したＲＮＡについて、導入したレプリコンＲＮＡを特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションを行ってレプリコンＲＮＡの存在を検出することにより、確認することができる。自律複製能を確認するための具体的な操作は、本明細書の実施例に記載されたコロニー形成能の測定、ＨＣＶタンパク質の発現確認、レプリコンＲＮＡの検出等の記載に従って行うことができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡには、上記したような配列の他に、レプリコンＲＮＡを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含むＲＮＡを含んでもよい。外来遺伝子は、５’非翻訳領域の下流に連結してもよいし、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の上流又は下流に連結してもよいし、「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」の中に挿入してもよい。外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、導入された細胞内で翻訳される際に、該外来遺伝子にコードされたタンパク質を発現することができる。従って外来遺伝子を含むレプリコンＲＮＡは、遺伝子治療などの、特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合にも、好適に使用することができる。
本発明において「選択マーカー遺伝子」とは、その遺伝子が発現された細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子、アデニリルトランスフェラーゼ遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましい。但し本発明における選択マーカー遺伝子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において「リポーター遺伝子」とは、その遺伝子発現の指標となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。リポーター遺伝子の一般的な例としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、トランスポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、大腸菌由来のβグルクロニダーゼ若しくはβガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、クラゲ由来のイクリオン遺伝子、分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子等が挙げられる。但し、本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、レプリコンＲＮＡ中にどちらか一方のみが含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。
本発明における「ＩＲＥＳ配列」とは、ＲＮＡの内部にリボソームを結合させて翻訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。本発明におけるＩＲＥＳ配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）、ＦＭＤＶ  ＩＲＥＳ、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ、等が挙げられるが、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、及びＨＣＶ  ＩＲＥＳがより好ましく、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳが最も好ましい。
また本発明に係るレプリコンＲＮＡには、さらにリボザイムを含んでいてもよい。リボザイムは、５’側のレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、又は外来遺伝子と、それより３’側のＩＲＥＳ配列、及び「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」とを連結するように挿入し、リボザイムの自己切断活性により両者が切断されて分離するようにすることができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡにおいては、上述したような選択マーカー遺伝子、リポーター遺伝子、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスのゲノムＲＮＡ上のウイルスタンパク質をコードする配列、及び外来遺伝子等が、レプリコンＲＮＡから正しい読み枠で翻訳されるように連結される。それらの配列のうち、タンパク質をコードする配列は、劇症肝炎患者由来のＣ型肝炎ウイルスの「ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコードする配列」から翻訳されるポリタンパク質とともに融合タンパク質として発現させた後で、プロテアーゼによって各タンパク質へと分離するように、プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
２．本発明に係るレプリコンＲＮＡの作製
本発明に係るＨＣＶレプリコンＲＮＡは、当業者に公知である任意の遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。限定するものではないが、ＨＣＶレプリコンＲＮＡは、例えば、以下のような方法で作製することができる。
まず、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及びＮＳ５Ｂタンパク質（配列番号１又は２）と３’非翻訳領域（配列番号４又は６）のＲＮＡに対応するＤＮＡとを、常法によりクローニングベクターに挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。一方、５’非翻訳領域（配列番号３又は５）はＲＮＡプロモーターの下流に挿入して、ＤＮＡクローンを作製する。ここで、「ＲＮＡに対応するＤＮＡ」とは、当該ＲＮＡの塩基配列のＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に置き換えた塩基配列からなるＤＮＡを意味する。前記ＲＮＡプロモーターは、プラスミドクローン中に含まれるものであることが好ましい。好適なＲＮＡプロモーターとしては、限定するものではないが、Ｔ７  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ＳＰ３  ＲＮＡプロモーターが挙げられ、Ｔ７  ＲＮＡプロモーターが特に好ましい。
次に、作製した５’非翻訳領域ＤＮＡクローンについて、例えば、５’非翻訳領域の下流に、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を挿入し、その下流にＩＲＥＳ配列を挿入する。さらに、ＩＲＥＳ配列の下流に配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号４又は６で示される塩基配列からなるＤＮＡをこの順で連結する。
次いで、上記で作製したＤＮＡクローンを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。ＲＮＡ合成は、５’非翻訳領域及びＩＲＥＳ配列から、常法により開始させることができる。鋳型ＤＮＡがプラスミドクローンの場合には、そのプラスミドクローンから、ＲＮＡプロモーターの下流に連結された上記ＤＮＡ領域を制限酵素によって切り出し、そのＤＮＡ断片を鋳型として用いてＲＮＡを合成することもできる。なお、好ましくは合成されるＲＮＡの３’末端がウイルスゲノムＲＮＡの３’非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが好ましい。このようにして合成されたＲＮＡが、本発明に係るレプリコンＲＮＡである。
３．本発明に関わるＨＣＶのレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞の作製
上記のようにして作製されたレプリコンＲＮＡを、レプリコンＲＮＡを複製させるべき細胞に導入することにより、レプリコンＲＮＡが持続的に複製される細胞を得ることができる。本明細書では、レプリコンＲＮＡが持続的に増幅される細胞を「レプリコン複製細胞」と称する。
レプリコンＲＮＡを導入する細胞としては、継代培養することが可能な細胞であれば任意の細胞を用いることができるが、真核細胞であることが好ましく、ヒト肝由来細胞、ヒト子宮頸由来細胞、又はヒト胎児腎由来細胞であることがより好ましく、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＩＭＹ−Ｎ９細胞、ＨｅＬａ細胞、又は２９３細胞であることがさらに好ましい。これらの細胞は、市販のものを利用してもよいし、細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、任意の細胞（例えば、癌細胞又は幹細胞）から株化した細胞を使用してもよい。
前記細胞は、ワクチン製造のようにＨＣＶタンパクの大量製造を目的とする場合には、大量培養が可能な細胞を用いることが望ましい。そのような観点からは、Ｈｕｈ７細胞以外の細胞であることが好ましい。
レプリコンＲＮＡの細胞内への導入は、当業者には公知の任意の技術を使用して行うことができる。そのような導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、パーティクルガン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥセファロース法等が挙げられるが、エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
レプリコンＲＮＡは、目的のレプリコンＲＮＡを単独で導入してもよいし、他の核酸と混合させたものを導入してもよい。導入するＲＮＡ量を一定にしてレプリコンＲＮＡの量を変化させたい場合には、目的のレプリコンＲＮＡを、導入する細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、細胞内導入に用いればよい。細胞内導入に用いるレプリコンＲＮＡの量は、使用する導入法に応じて決めればよいが、好ましくは１ピコグラム〜１００マイクログラム、より好ましくは１０ピコグラム〜１０マイクログラムの量を使用する。
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを用いる場合には、そのレプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、選択することができる。具体的には、例えば、そのようなレプリコンＲＮＡの細胞内導入処理を施した細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現により選択可能となる培地において培養すればよい。
一例として、レプリコンＲＮＡにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝子として含まれる場合には、そのレプリコンＲＮＡを用いて細胞内導入処理した細胞を培養ディッシュに播種し、１６〜２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を０．０５ミリグラム／ミリリットル〜３．０ミリグラム／ミリリットルの濃度で添加し、その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続し、播種時から好ましくは１０日間〜４０日間、より好ましくは１４日間〜２８日間培養した後にクリスタルバイオレットで生存細胞を染色することにより、レプリコンＲＮＡが導入され持続的に複製されている細胞を、コロニーとして選択することができる。
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。こうして得られる目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製される細胞クローンを、本明細書では「レプリコン複製細胞クローン」と称する。
樹立した細胞クローンについては、導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されているレプリコンＲＮＡの検出、導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの有無の確認、及びＨＣＶタンパク質の発現の確認を行って、実際に目的のレプリコンＲＮＡが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
導入されたレプリコンＲＮＡから該細胞クローン中で複製されたレプリコンＲＮＡ（本明細書中では、以下便宜的に、「複製レプリコンＲＮＡ」と称する）の検出は、当業者には公知の任意のＲＮＡ検出法に従って行えばよいが、例えば、細胞クローンから抽出したトータルＲＮＡについて、導入されたレプリコンＲＮＡに対して特異的なＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダイゼーション法を実施することにより検出することができる。
また導入されたレプリコンＲＮＡ中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノムＤＮＡへの組み込みの確認は、限定するものではないが、例えば、細胞クローンから抽出した宿主ゲノムＤＮＡについて該選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅するＰＣＲを行い、その増幅産物の有無を確認することによって行うことができる。増幅産物が確認された細胞クローンでは、宿主ゲノム中に選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み込まれていると判断されることから、レプリコンＲＮＡ自体は該細胞内で持続的に複製されていない可能性がある。この場合、レプリコンＲＮＡが持続的に複製されているか否かを、次に示すＨＣＶタンパク質の発現の確認実験によって、確認することができる。
ＨＣＶタンパク質の発現の確認は、例えば、導入されたレプリコンＲＮＡから発現されるべきＨＣＶタンパク質に対する抗体を、細胞クローンから抽出したタンパク質と反応させることによって行うことができる。この方法は、当業者には公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、具体的には、例えば、細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブロッティングし、それに対して抗ＨＣＶタンパク質抗体（例えば、抗ＮＳ３特異的抗体、又はＣ型肝炎患者から採取した抗血清）を反応させ、さらにその抗ＨＣＶタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。細胞クローンから抽出したタンパク質中からＨＣＶタンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、ＨＣＶ由来のレプリコンＲＮＡが持続的に複製してＨＣＶタンパク質を発現しているものと判断することができる。
以上のようにして、目的のレプリコンＲＮＡを持続的に複製していることが確認された細胞クローン（レプリコン複製細胞クローン）を得ることができる。また本発明においては、このレプリコン複製細胞から、例えばＲＮＡを抽出しその中からレプリコンＲＮＡを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任意の方法により、レプリコンＲＮＡを取得することができる。本発明はそのようなレプリコンＲＮＡの製造方法をも提供する。さらに本発明に係るレプリコン複製細胞は、ＨＣＶタンパク質を製造するために好適に使用することができる。レプリコン複製細胞からのＨＣＶタンパク質の製造は、当業者であれば常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を取得することができる。
また本発明に係るレプリコン複製細胞が、外来遺伝子を含有するレプリコンＲＮＡを持続的に複製している場合には、そのレプリコン複製細胞を用いて外来遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて取得することができる。具体的には、例えば、レプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物（培養細胞及び培養培地を含む）から常法によりタンパク質を採取し、さらにそのタンパク質から、目的のタンパク質に対する抗体を用いた検出等により外来遺伝子にコードされたタンパク質を選択的に取得することができる。
４．本発明に関わるＨＣＶのレプリコンＲＮＡへの複製効率を増大させる突然変異の導入
本発明に係るレプリコン複製細胞において複製され生成されたレプリコンＲＮＡ（複製レプリコンＲＮＡ）には、複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ずる。このような突然変異は適合変異であると思われる。
本発明では、このことを利用して、本発明に係るレプリコンＲＮＡに複製効率を向上させる突然変異を高頻度で導入することができる。
具体的には、第１のレプリコン複製細胞（好ましくは本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製するという工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行うことにより、レプリコン複製細胞中で、レプリコンＲＮＡに複製効率を増大させる突然変異を高頻度に導入することができる。
複製レプリコンＲＮＡを再導入する細胞としては、任意の細胞を用いることができるが、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の細胞であることが好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ生物種由来の同じ組織由来の細胞であることがより好ましく、最初にレプリコンＲＮＡを導入した細胞と同じ細胞株の細胞であることがさらにより好ましい。
従って、本発明では、上記の方法を用いて、複製効率を増大させる突然変異を導入したレプリコンＲＮＡを製造することができる。すなわち、まず第１のレプリコン複製細胞（本発明に係るレプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞）から、第１の複製レプリコンＲＮＡを抽出等により取得し、さらにこの第１の複製レプリコンＲＮＡをさらに別の細胞に再導入して第２のレプリコン複製細胞を作製する工程を、１回以上、好ましくは１〜１０回、より好ましくは１〜５回、さらに好ましくは１〜２回反復的に行った後、この反復工程の最後に得られる最終的なレプリコン複製細胞から、複製レプリコンＲＮＡを抽出等によって取得することにより、複製効率が増大したレプリコンＲＮＡを製造することができる。
本発明では、以上のような方法により、レプリコンＲＮＡの複製効率を少なくとも２倍、好ましくは１０〜１００倍、より好ましくは１００〜１００００倍に増大させることができる。
このような方法で製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡについては、逆転写ＰＣＲによってｃＤＮＡを得てそれを塩基配列決定に供するなどの公知の方法により、塩基配列を決定することが好ましい。さらに、決定された塩基配列又はそれにコードされるアミノ酸配列を、最初に細胞に導入されたレプリコンＲＮＡの塩基配列と比較することにより、適合変異を同定することができる。複製効率を増大させる適合変異としては、特に、レプリコンＲＮＡにコードされたウイルスタンパク質のアミノ酸を変異させる非同義置換が好ましい。
また本発明は、そのようにして同定した適合変異を、レプリコンＲＮＡに常法により導入することで、複製効率が増大したＣ型肝炎ウイルスのレプリコンＲＮＡを製造する方法も提供する。
以上のようにして製造された複製効率が増大したレプリコンＲＮＡはレプリコンＲＮＡを大量に製造するために使用することができる。
本発明に係るレプリコンＲＮＡの複製効率は、当業者に公知の方法、例えば次のような方法に従って決定することができる。
例えば、Ｈｕｈ７細胞に０．０００１、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１．０マイクログラムの量のレプリコンＲＮＡをトランスフェクションして、前述の実験手法と同様の方法でＧ４１８による選択培養を２１日間行った後にコロニー形成数（コロニー数）を測定する。導入したＲＮＡ量とコロニー形成数とを比較して容量依存的にコロニー形成が増加するレプリコンＲＮＡ導入量の範囲を決定し、その範囲内でのコロニー形成数を、導入したＲＮＡ量で除算して得られる値を、１マイクログラムあたりのコロニー形成率とする。この計算式は、以下のとおりである。コロニー形成率［（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ；ＣＦＵ）／マイクログラム］＝コロニー形成数［個］／導入したＲＮＡ量［マイクログラム］
こうして算出されたコロニー形成率を、導入したレプリコンＲＮＡの複製効率を示す値とする。すなわち、コロニー形成率が高いほど、そのレプリコンＲＮＡの複製効率は高い。
またレプリコンＲＮＡの複製効率は、形成されたコロニー１個あたりの導入したレプリコンＲＮＡのコピー数で示されるコロニー形成能で表すこともできる。すなわち、以下のような計算式に従って算出することができる。コロニー形成能＝導入したレプリコンＲＮＡのコピー数［コピー］／コロニー形成数［個］
５．本発明の他の実施形態
本発明に係るレプリコンＲＮＡ複製細胞は、例えばＣ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用することもできる。具体的には、例えば、被験物質の存在下でレプリコン複製細胞を培養し、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製を検出し、その被験物質がレプリコンＲＮＡの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、Ｃ型肝炎ウイルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができる。この場合、得られる培養物中のレプリコンＲＮＡの複製の検出は、レプリコンＲＮＡ複製細胞から抽出したＲＮＡ中のレプリコンＲＮＡの量又は有無を検出することによるものであってもよいし、培養物中又は該培養物に含まれるレプリコンＲＮＡ複製細胞中のタンパク質に含まれるＨＣＶタンパク質の量又は有無を検出するものであってもよい。
このような試験系は、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のために使用することができる。具体的には、以下のような例が挙げられる。
（１）ＨＣＶの増殖を抑制する物質の探索
ＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
（２）細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質（例えば、単離精製された酵素）等が挙げられる。
（３）ＨＣＶに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばＨＣＶウイルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るレプリコン複製細胞を使用することができる。
（４）ＨＣＶウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
（５）Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
本発明を、以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。
【実施例１】  レプリコンＲＮＡの作製
１．発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルスＪＦＨ−２．１株及びＪＦＨ−２．２株のウイルスゲノムの全領域に対応するＤＮＡを、該ウイルス株のゲノム全長ｃＤＮＡを含むＪＦＨ−２．１、及びＪＦＨ−２．２クローンから取得し、Ｔ７ＲＮＡプロモーター配列の合成ＤＮＡをそれぞれのクローンの５’端に付加し、プラスミドｐＵＣ１９プラスミドに挿入した。このようにして構築されたプラスミドＤＮＡを、以下、ｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２と称する。なお、上記ＪＦＨ−２．１、及びＪＦＨ−２．２クローンの作製については、既報（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９））に従った。
このようにして構築したプラスミドＤＮＡｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２の構造を、図１の上段に示す。「Ｔ７」はＴ７ＲＮＡプロモーター、「Ｇ」はＪＦＨ−２．１及びＪＦＨ−２．２の５’端の上流及びＴ７ＲＮＡプロモーター配列の３’端の下流に挿入したｄＧＴＰを示す。「５’ＮＴＲ」から「３’ＮＴＲ」までがＣ型肝炎ウイルスのゲノム全領域に対応するＤＮＡである。
次に、プラスミドＤＮＡｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２の構造領域と非構造領域の一部を、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とも称する）、及びＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ（脳心筋炎ウイルスの内部リボゾーム結合部位）で置換して、プラスミ
ドＤＮＡ  ｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１、及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２をそれぞれ構築した（図１の下段）。この構築手順は、既報（Ｌｅｈｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９））に従った。具体的には、プラスミドｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２を制限酵素ＡｇｅＩ及びＣｌａＩで切断し、その切断部位に、ｐＪＦＨ−２．１、及びｐＪＦＨ−２．２由来の５’ＮＴＲからＣｏｒｅ領域におよぶ配列と発現ベクターｐＲＳＶ５ＮＥＯ由来のネオマイシン耐性遺伝子をＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＡｇｌＩとＰｍｅＩで切断した断片、及びＥＭＣＶ  ＩＲＥＳからＮＳ３領域におよぶ配列をＰＣＲ増幅により結合し制限酵素ＰｍｅＩとＣｌａＩで切断した断片を、挿入し連結した。
２．レプリコンＲＮＡの作製
レプリコンＲＮＡ合成に用いる鋳型ＤＮＡを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２を、それぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断した。次いで、これらのＸｂａＩ切断断片のそれぞれ１０から２０μｇを、Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ２０Ｕ（トータル反応液量５０μｌ）を用いて３０℃で３０分間インキュベートして、さらに処理した。Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅは、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記ＸｂａＩ切断断片をそのまま鋳型として用いてＲＮＡ合成を行うと、ＸｂａＩの認識配列の一部であるＣＵＧＡの４塩基が３’末端に余分に付加されたレプリコンＲＮＡが合成されてしまう。そこで本実施例では、ＸｂａＩ切断断片をＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ＮｕＣｌｅａｓｅで処理することにより、ＸｂａＩ切断断片からＣＵＧＡの４塩基を除去した。この後、ＸｂａＩ切断断片を含むＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  ＮｕＣｌｅａｓｅ処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、ＣＵＧＡの４塩基が除去されたＸｂａＩ切断断片を精製して、これを鋳型ＤＮＡとした。
次に、この鋳型ＤＮＡから、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した。ＲＮＡ合成にはＡｍｂｉｏｎ社のＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを用いた。鋳型ＤＮＡを０．５から１．０μｇ含む反応液２０μｌで、３７℃で３時間から１６時間反応させた。
ＲＮＡ合成終了後、反応溶液にＤＮＡｓｅ（２Ｕ）を添加して、３７℃で１５分間反応させた後、さらに酸性フェノールによるＲＮＡ抽出を行って、鋳型ＤＮＡを除去した。このようにしてｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１、及びｐＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２に由来する上述の鋳型ＤＮＡから合成したＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ）を、それぞれｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２と命名した。これらのレプリコンＲＮＡの塩基配列を、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１については配列番号７及び図１、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２につては配列番号８及び図１に示す。
【実施例２】  レプリコン複製細胞クローンの樹立
実施例１で作製した合成レプリコンＲＮＡ、ｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１、及びｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２のそれぞれについて、レプリコンＲＮＡ０．０１ｎｇ〜１０μｇをＨｕｈ７細胞から抽出したトータル細胞性ＲＮＡと混合して、ＲＮＡ総量が１０μｇとなるように調整した。次いで、その混合ＲＮＡをエレクトロポレーション法によりＨｕｈ７細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったＨｕｈ７細胞を培養ディッシュに播種し、１６時間から２４時間培養した後に、培養ディッシュにＧ４１８（ネオマイシン）を様々な濃度で添加した。その後、週に２回培養液を交換しながら培養を継続した。播種時から２１日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。その結果、図２に示すように、コロニー形成が確認できた。
コロニー形成が認められたｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．１又はｒＳＧＲＥＰ−ＪＦＨ２．２トランスフェクション細胞については、上記の培養２１日後の培養ディッシュからさらに生存細胞のコロニーをクローン化し、培養を継続した。このようなコロニーのクローニングにより、細胞クローンを複数株樹立することができた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明にかかる劇症Ｃ型肝炎患者のＨＣＶ株ＪＦＨ２．１あるいはＪＦＨ２．２に由来する遺伝子を利用することにより、高確率で複製効率の良いＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製することができる。該レプリコンＲＮＡを導入したレプリコン複製細胞は、ＨＣＶ由来のＲＮＡ及びＨＣＶタンパク質を持続的に産生させるための培養系として利用できる。さらに前記レプリコン複製細胞は、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系として利用できる。
【配列表フリーテキスト】配列番号７−人工配列の説明：ＪＦＨ２．１レプリコンＲＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：ＪＦＨ２．２レプリコンＲＮＡ
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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