(57)【要約】３００〜３００００の繰り返し単位を有するヒアルロン酸と特定構造および特定の分子量を有するポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物であって、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対してポリアルキレンオキシド誘導体の含有量が５〜１００当量である化合物及び該化合物からなるハイドロゲル。
2005010080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物であって、
2005010080.tif 000004
（Ｒ２はＮＨ，Ｏ、Ｒ３はＨ，ＣＨ３、Ｒ４はＣ２Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、Ｒ５はＨ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ４Ｈ９、のいずれかである。またｌは３００〜３０，０００、ｍは３〜１４０までの整数である。）
ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し、Ｒ１の内のポリアルキレンオキシド誘導体残基を５〜１００当量含有する化合物。
【請求項２】
請求項１記載の化合物からなるハイドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物に関する。更に詳しくは、ヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる温度応答性ハイドロゲルに関する。
【背景技術】  近年、大きく損傷したりまたは失われた生体組織と臓器の治療法の１つとして、細胞の分化、増殖能を利用し元の生体組織及び臓器に再構築する技術である再生医療の研究が活発になってきている。軟骨再生もそのひとつであり、下記の様に積極的な検討が行われている。
（１）コラーゲンを用いた基材を足場とした軟骨再生（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１７，１５５−１６２（１９９６））
（２）不溶性ベンジルエステル化ヒアルロン酸を用いた細胞培養基材（米国特許第５９３９３２３号明細書、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４２：２，１７２−８１（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４６：３，３３７−３４６（１９９９）、Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．１８：５．７７３−３８０（２０００）））
（３）架橋ヒアルロン酸体を用いた軟骨細胞培養基材（Ｊ．Ｏｒｔｈｏ．Ｒｅｓ．１７，２０５−２１３（１９９９））
（４）ポリ乳酸、ポリグリコール酸を用いた組織再生基材（特表平１０−５１３３８６号公報）
しかし前述の例は、細胞採取する際及び体内にインプラントする際に２度の切開手術が必要であり患者の負担が非常に大きい。この課題を解決するために、今後内視鏡手術が増えると考えられ、内視鏡手術に適した人工材料の開発が非常に重要となってくる。求められる人工材料の特性として、１）形状を自在にコントロールできる（患部に直接注入できる）、２）細胞、成長因子を容易に埋包できるなどが考えられ、温度応答性ハイドロゲルはこの条件に非常に適した材料であるので、再生医療においてメリットが大きいと考えられる。
温度応答性ハイドロゲルとは、水環境下において、ある温度以下では水和し、ある温度以上では脱水和することにより体積変化を引き起こすＬｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＣＳＴ）タイプと、逆にある温度以上で水和することにより体積変化を引き起こすＵｐｐｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＵＣＳＴ）タイプに分類することが出来る。これら２つのタイプのうちでは、応答の速さ等の面に優れるＬＣＳＴの性質を有するタイプのハイドロゲルの方がドラッグデリバリーシステムにおいて、好ましく使用されている。ＬＣＳＴの性質を有するタイプのハイドロゲルは、例えば、ある温度以下では高分子と水との相互作用が優先するために水溶液中に均一に溶解しているが、ある温度以上になると水和よりも高分子の凝集の方が優勢になるために脱水和して、水溶液が白濁、ついには沈殿するポリマーである。即ち水−高分子系においてＬＣＳＴの性質を有するポリマーを主成分とし、該ポリマーを何らかの方法で３次元架橋することによって温度応答性ハイドロゲルを得ることが出来る。
水−高分子系においてＬＣＳＴの性質を有するポリマーとしては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等のＮ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）等の含窒素環状ポリマー、ポリ（Ｎ−アクリロイル−Ｌ−プロリン）等のビニル基含有アミノ酸とそのエステル類、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（プロピレングリコール）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸−ポリエチレンオキシド共重合体が知られている。これらのポリマーの中で、転移がシャープであり、相転移温度が生体系への応用に適するポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）共重合体が代表的であり、共重合成分による相転移温度の制御、相転移温度の改善、相転移メカニズムの解明の各観点から盛んに研究が展開されている。
しかし、現状においては生体内にインプラント可能な生体吸収性を示す温度応答性ハイドロゲルは殆ど無く、既存のものとしてポリ（エチレングリコール）／ポリ（プロピレングリコール）（ＴＩＳＳＵＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  Ｖｏｌ  ８，Ｎｏ  ４，７０９（２００２））、ポリ乳酸−ポリグリコール酸−ポリエチレンオキシド共重合体（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ．，７２，２０３（２００１））しかない。しかしこれらポリマーは合成高分子であるため、生体マトリックス材料と比較すると生体親和性が低い等の問題が考えられる。そこで、生体マトリックス材料に温度応答性を付与できれば、生体吸収性及び生体親和性に優れた理想的な温度応答性ハイドロゲルが得られると予想される。生体マトリックス材料に温度応答性を付与する試みとして、キトサン（国際公開ＷＯ  ０１／３６０００号明細書）、ヒアルロン酸（国際公開ＷＯ  ９９／２４０７０号明細書）の例が挙げられるが、相転移温度が高く生体内での利用が困難であると考えられるものや、追試において相転移現象を確認できない等問題がある。
【発明の開示】
本発明の主な目的は、生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイドロゲルを提供することにある。更に詳しくは、多様な応答温度領域に対応できる温度応答性ハイドロゲルを提供する。
本発明は以下の通りである。
１．下記一般式で表されるヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物であって、
2005010080.tif 000003
（Ｒ２はＮＨ，Ｏ、Ｒ３はＨ，ＣＨ３、Ｒ４はＣ２Ｈ４，ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、Ｒ５はＨ，ＣＨ３，Ｃ２Ｈ５，Ｃ４Ｈ９、のいずれかである。またｌは３００〜３０，０００、ｍは３〜１４０までの整数である。）
ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量ポリアルキレンオキシド誘導体残基の含有量が５〜１００当量であるハイドロゲル。
【図面の簡単な説明】  図１は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン１０当量導入した化合物の相転移挙動図。
図２は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン５０当量導入した化合物の相転移挙動図。
図３は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン１００当量導入した化合物の相転移挙動図。
図４は、ヒアルロン酸ナトリウムの相転移挙動図。
図５は、ヒアルロン酸プロピルエステルの相転移挙動図。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
本発明で使用されているヒアルロン酸は、動物組織から抽出したもの、または発酵法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用する菌株はストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産能を有する微生物であり、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（特開昭６３−１２３３９２号公報）、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（特開平２−２３４６８９号公報）が挙げられる。これらの変異株を用いて培養、精製されたものを用いる。またヒアルロン酸の分子量は、約１×１０５〜１×１０７ダルトンのものが好ましい。なお本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する。
本発明で使用されているポリアルキレンオキシドは、１）ポリプロピレングリコール、あるいは２）ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体が好ましい。ヒアルロン酸にアミド結合により導入する場合には、１−アミノポリプロピレングリコールメトキシド、１−アミノポリプロピレングリコールエトキシド、１−アミノポリプロピレングリコールプロポキシド、１−アミノポリプロピレングリコールブトキシド、１−アミノポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）メトキシド、１−アミノポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）エトキシド、１−アミノポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）プロポキシド、１−アミノポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）ブトキシドなど末端にアミノ基を有する化合物が挙げられる。また、ヒアルロン酸にエステル結合により導入する場合には、１−クロロポリプロピレングリコールメトキシド、１−クロロポリプロピレングリコールエトキシド、１−クロロポリプロピレングリコールプロポキシド、１−クロロポリプロピレングリコールブトキシド、１−クロロポリ（ポピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）メトキシド、１−クロロポリ（ポピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）エトキシド、１−クロロポリ（ポピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）プロポキシド、１−クロロポリ（ポピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）ブトキシド、１−ブロモポリプロピレングリコールメトキシド、１−ブロモポリプロピレングリコールエトキシド、１−ブロモポリプロピレングリコールプロポキシド、１−ブロモポリプロピレングリコールブトキシド、１−ブロモポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）メトキシド、１−ブロモポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）エトキシド、１−ブロモポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）プロポキシド、１−ブロモポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）ブトキシド、１−ヨードポリプロピレングリコールメトキシド、１−ヨードポリプロピレングリコールエトキシド、１−ヨードポリプロピレングリコールプロポキシド、１−ヨードポリプロピレングリコールブトキシド、１−ヨードポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）メトキシド、１−ヨードポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）エトキシド、１−ヨードポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）プロポキシド、１−ヨードポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）ブトキシドなど末端にハロゲン基を有する化合物が挙げられる。
上記のポリアルキレンオキシド誘導体の分子量は、２００〜６，０００のものが好ましい。２００以下であるとヒアルロン酸との反応生成物が温度応答性を示さない。また、６，０００以上であると沈殿物が生じハイドロゲルを形成しない。
ポリ（プロピレングリコール）およぴポリ（エチレングリコール）からなる共重合体を用いる場合は、ポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）の共重合比が１／９９〜９９．９／０．１のものが好ましい。さらに好ましくは２０／８０〜９９．９／０．１のものが好ましい。この範囲外であるとヒアルロン酸との反応生成物は温度応答性を示さない。
ポリアルキレンオキシド誘導体の含有量は、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し５〜１００当量が好ましい。５当量以下であるとヒアルロン酸との反応生成物は温度応答性を示さない。
ヒアルロン酸とポリアルキレンオキシド誘導体の典型的な反応方法は、以下の２通りが挙げられる。
（Ｉ）アミド結合
ヒアルロン酸ナトリムをテトラヒドロフラン／水  混合溶媒に溶解し、１−アミノポリアルキレンオキシドを加える。０．１Ｍ  ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加しｐＨ６．８に調整した後、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）を添加する。終夜攪拌後、透析により精製、凍結乾燥を行い、目的物を得る。
（ＩＩ）エステル結合
ヒアルロン酸−テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩をＮ−メチルピロリドンに溶解し、１−ブロモポリアルキレンオキシドを加える。３７℃で６０時間攪拌した後、塩化ナトリムを加え３０分間放置する。その後アセトンで再沈殿を行い、目的物を得る。
【実施例】  以下の実施例により、本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本実施例に使用したヒアルロン酸ナトリウムはストレプトコッカス属由来の平均分子量が１，０００，０００のヒアルロン酸ナトリウムであり、これはｌ＝３，５００に相当する。その他の試薬についてはテトラヒドロフラン、０．１Ｍ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）、１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド、ヨウ化プロピル、Ｎ−メチルピロリドンは和光純薬工業（株）製、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７（ポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）の共重合比が３９／６、概略分子量が２，０００）はハンツマン・コーポレーション製を使用した。
［実施例１］
ヒアルロン酸ナトリウム１００ｍｇをテトラヒドロフラン／水＝３／２（ｖ／ｖ）４０ｍｌに溶解した。この溶液に、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７  １２０ｍｇ（０．００００６ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し１０当量）を加え、更に０．１Ｍ  ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、ｐＨ６．８に調整した。１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１２ｍｇ（０．００００６６ｍｏｌ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）１０ｍｇ（０．００００６６ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水＝３／２  １０ｍｌに溶解し、反応系に添加し、終夜攪拌を行った。攪拌後、透析精製を行い、凍結乾燥し目的の化合物を得た。確認は１ＨＮＭＲ（日本電子  ＪＮＭ−ａｌｐｈａ４００）により行い、目的物の生成を確認した。
凍結乾燥品３０ｍｇをイオン交換水９７０ｍｇに溶解し、濃度３ｗｔ％のハイドロゲルを調整した。このハイドロゲルの相転移挙動を調べるために、Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ  ＲＦＩＩＩ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、１０〜５０℃の温度領域で複素弾性率、粘度の測定を行った。その結果を図１に示す（Ｇ：複素弾性率、Ｅｔａ：粘度を表す）。３０℃より、複素弾性率、粘度の上昇が確認され５０℃で飽和に達した（すなわちゾルからゲルへの転移を表す）。つまり、３０〜５０℃で温度相転移が起こったことが明らかとなった。
［実施例２］
ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７  ６００ｍｇ（０．０００３ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し５０当量）、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）６０ｍｇ（０．０００３３ｍｏｌ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）５０ｍｇ（０．０００３３ｍｏｌ）、濃度１ｗｔ％とした以外は、実施例１と同様。結果を図２に示す。
［実施例３］
ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７  １２００ｍｇ（０．０００６ｍｏｌ）（ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し１００当量）、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）１２０ｍｇ（０．０００６６ｍｏｌ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）１００ｍｇ（０．０００６６ｍｏｌ）、濃度０．５ｗｔ％とした以外は、実施例１と同様、結果を図３に示す。
相転移の温度制御については、実施例１〜３に対応する図１〜３の曲線が立ち上がる温度、つまり相転移開始温度を比較するとヒアルロン酸に導入されるジェファーミン（ポリアルキレンオキシド誘導体）の量が多いほど、低温側にシフトしていることが分かる。つまりジェファーミン（ポリアルキレンオキシド誘導体）の導入量をコントロールすることで、所望の相転移温度を有するヒアルロン酸ハイドロゲルを調製することが可能となる。
その他、使用するポリアルキレンオキシド誘導体の分子量、ヒアルロン酸の分子量によっても相転移温度は変えられるものと考えられる。
再生医療領域においては、このようなハイドロゲルをＩｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｌとして内視鏡手術に応用するという期待がある。Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｌは、体温より低温の領域では液状で細胞や液性因子を簡単に混入でき、体内に注入すると体温によりゲルになることで取扱い性にすぐれたＳｃａｆｆｏｌｄとして期待されている。そのため体温付近で相転移を起こすゲルでないとＩｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｌとしては使用できない。
然しながら、本発明のハイドロゲルは、体温に近い温度で相転移を起こすのでＩｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｌとして使用可能である。
上記のように本発明は、ヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる、生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイドロゲルを提供できる。この温度応答性ハイドロゲルは、内視鏡手術をターゲットとした再生医療における人工材料として有用である。
［比較例１］
ヒアルロン酸ナトリウム１０ｍｇを、水１ｍｌに溶解し、実施例１と同様に相転移挙動の観察を行った。結果を図４に示す。
［比較例２］
国際公開第９９／２４０７０号明細書を参考に追試実験を行った。詳細は以下の通りである。
カラム（Φ１．２×Ｌ２０ｃｍ）にイオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ（登録商標）５０ＷＸ８；Ｔｏｔａｌ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  １．９ｅｑ／ｌ）を充填し、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド水溶液（４８ｇ／１００ｍｌ）を流し置換した。置換後、ｐＨが中性になるまでイオン交換水を流し、次にヒアルロン酸ナトリウム水溶液（２ｇ／１０００ｍｌ）をカラムに通した後凍結乾燥を行い、ヒアルロン酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を得た。
得られたヒアルロン酸テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１ｇをＮ−メチルピロリドン５０ｍｌに溶解し、室温でヨウ化プロピルを０．２０ｇ（０．００１２ｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、３７℃で６０時間攪拌した。攪拌後、塩化ナトリウム１ｇを加え３０分間放置した後、２５０ｍｌのアセトンを加え沈殿物を得た。得られた沈殿物は、アセトン／水＝８０／２０（ｍｌ／ｍｌ）２００ｍｌで洗浄を行い、真空乾燥し目的物を得た。（このとき、硝酸銀を加え、塩化物イオンが除かれていることを確認する）。確認は１ＨＮＭＲ（日本電子  ＪＮＭ−ａｌｐｈａ４００）により行い、目的物の生成（エステル化度５０％）を確認した。相転移挙動については、濃度１５ｗｔ％の条件で実施例１と同様の観察を行った。結果を図５に示す。
比較例１，２のハイドロゲルは共に相転移が確認されなかった。このことからも本発明で得られた生体吸収性及び生体親和性に優れた温度応答性ハイドロゲルは、内視鏡手術をターゲットとした再生医療における人工材料への利用が期待できる。
【産業上の利用可能性】  この温度応答性ハイドロゲルは、内視鏡手術をターゲットとした再生医療における人工材料として有用である。
【図１】
2005010080.tif 000005
【図２】
2005010080.tif 000006
【図３】
2005010080.tif 000007
【図４】
2005010080.tif 000008
【図５】
2005010080.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月1日(2005.6.1)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるヒアルロン酸及びポリアルキレンオキシド誘導体からなる化合物であって、
2005010080.tif 000010
Ｒ１：ＯＨ、ＯＭ（Ｍはアルカリ金属）、ポリプロピレングリコールまたはポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体であるポリアルキレンオキシド誘導体残基。またｌは３００〜３０，０００までの整数である。）
ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し、Ｒ１の内のポリアルキレンオキシド誘導体残基を５〜１００当量含有する化合物。
【手続補正００２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
2005010080.tif 000011
Ｒ１＝ＯＨ、ＯＭ（Ｍはアルカリ金属）、ポリプロピレングリコールまたはポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体であるポリアルキレンオキシド誘導体残基。またｌは３００〜３０，０００までの整数である。
ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量ポリアルキレンオキシド誘導体残基の含有量が５〜１００当量であるハイドロゲル。
【図面の簡単な説明】
図１は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン１０当量導入した化合物の相転移挙動図。
図２は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン５０当量導入した化合物の相転移挙動図。
図３は、ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７をヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対しヒアルロン１００当量導入した化合物の相転移挙動図。
図４は、ヒアルロン酸ナトリウムの相転移挙動図。
図５は、ヒアルロン酸プロピルエステルの相転移挙動図。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳述する。なお、これらの実施例等および説明は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の趣旨に合致する限り他の実施の形態も本発明の範疇に属し得ることは言うまでもない。
本発明で使用されているヒアルロン酸は、動物組織から抽出したもの、または発酵法で製造したものどちらでも使用できる。発酵法で使用する菌株はストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産能を有する微生物であり、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−１０


【手続補正００３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
０（特開昭６３−１２３３９２号公報）、ストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（特開平２−２３４６８９号公報）が挙げられる。これらの変異株を用いて培養、精製されたものを用いる。またヒアルロン酸の分子量は、約１×１０５〜１×１０７のものが好ましい。なお本発明でいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する。
本発明で使用されているポリアルキレンオキシドは、１）ポリプロピレングリコール、あるいは２）ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体である。


【手続補正００４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
上記のポリアルキレンオキシド誘導体の分子量は、２００〜６，０００のものが好ましい。２００以下であるとヒアルロン酸との反応生成物が温度応答性を示さない。また、６，０００以上であると沈殿物が生じハイドロゲルを形成しない。
ポリ（プロピレングリコール）およびポリ（エチレングリコール）からなる共重合体としては、ポリ（プロピレングリコール）／ポリ（エチレングリコール）の共重合比が１／９９〜９９．９／０．１のものが好ましい。さらに好ましくは２０／８０〜９９．９／０．１のものが好ましい。この範囲外であるとヒアルロン酸との反応生成物は温度応答性を示さない。
ポリアルキレンオキシド誘導体の含有量は、ヒアルロン酸のカルボキシル基１００当量に対し５〜１００当量が好ましい。５当量以下であるとヒアルロン酸との反応生成物は温度応答性を示さない。
ヒアルロン酸とポリアルキレンオキシド誘導体の典型的な反応方法は、以下の２通りが挙げられる。
（１）アミド結合
ヒアルロン酸ナトリムをテトラヒドロフラン／水  混合溶媒に溶解し、１−アミノポリアルキレンオキシドを加える。０．１Ｍ  ＨＣｌ／０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加しｐＨ６．８に調整した後、１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）、１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ（ＨＯＢｔ）を添加する。終夜攪拌後、透析により精製、




【国際調査報告】
2005010080.tif 000012
2005010080.tif 000013
2005010080.tif 000014
2005010080.tif 000015