(57)【要約】本発明は、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する遺伝子を有するウイルスベクターを疾患部位に投与する工程を含む、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法に関する。また本発明は、該ベクターを含む、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物に関する。ウイルスベクターの局所投与を介してＦＧＦ２のシグナル伝達を阻害することにより、炎症性骨破壊における炎症と骨破壊の両方を同時に抑制することに成功した。本発明は、これまで治療が困難であった関節リウマチ等の炎症性骨疾患に対する、疾患特異的かつ効果的な治療方法、および治療組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法であって、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクターを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
ベクターが一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性ＦＧＦ受容体、ｓｐｒｏｕｔｙ−２、およびｓｐｒｅｄからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該疾患が関節リウマチである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物であって、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項７】
ベクターが一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性ＦＧＦ受容体、ｓｐｒｏｕｔｙ−２、およびｓｐｒｅｄからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
該疾患が関節リウマチである、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、線維芽細胞増殖因子−２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２：ＦＧＦ２）の機能制御、及びその細胞内信号伝達系の遮断により骨破壊を伴う炎症性疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、特に関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）の治療に有用である。
【背景技術】  これまでの世界的医学研究によりＲＡに対する種々の治療戦略および疾患修飾性抗リウマチ剤（ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｔｔｇ  ａｎｔｉ−ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ｄｒｕｇｓ：ＤＭＡＲＤｓ）が開発されてきた。ＲＡ治療に関する従来の主要な技術（ＲＡ治療戦略）を以下に列挙する。これらはＲＡに対する生物学的作用薬を用いた治療及びその治療戦略である。
▲１▼腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）制御による治療法
可溶性ＴＮＦ受容体（Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１４１−１４７（１９９７）；Ｂａｔｈｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５８６−１５９３（２０００））または抗ＴＮＦ−α抗体（Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５８：Ｉ５６−Ｉ６０（１９９９）；Ｌｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２（２０００）；Ｍａｉｎｉ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５４：１９３２−１９３９（１９９９））を用いてＴＮＦ−αの機能制御によりＲＡを治療する抗サイトカイン療法である。
▲２▼インターロイキン−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１：ＩＬ−１）制御による治療法
ＩＬ−１レセプターアンタゴニストを用いてＩＬ−１の機能制御によりＲＡを治療する抗サイトカイン療法である（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４６：６１４−６２４（２００２））。
▲３▼ＩＬ−６制御による治療法
抗ＩＬ−６受容体モノクローナル抗体を用いてＩＬ−６の機能制御によりＲＡを治療する抗サイトカイン療法である（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５９：Ｉ２１−Ｉ２７（２０００））。
▲４▼ＶＥＧＦ機能制御による治療法
可溶性ＶＥＧＦ受容体（Ｍｉｏｔｌａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０：１１９５−２０５（２０００））または抗ＶＥＧＦ抗体（Ｌｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５９２２−７（２０００）；Ｓｏｎｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１：５６２−８（２００１））を用いてＶＥＧＦの機能を阻害することによってＲＡを治療する抗サイトカイン療法である。
しかし、これらの従来技術には幾つか問題点が存在する。主要な問題点としては、例えば最終的に骨関節破壊を免れることは困難であることが挙げられる。すなわち、従来の治療法及び薬剤では滑膜炎抑制に基づく自他覚症状の緩和という面においては治療効果が認められるものの、骨関節破壊の直接的抑制効果に乏しく、炎症抑制に起因すると考えられる骨破壊進展遅延作用を認めるのみで最終的に骨関節破壊を免れることは困難である。また、キメラ型中和抗体を用いた治療法においては、中和抗体に対するヒト抗キメラ抗体産生に伴う効果の減弱が認められ、臨床的にはメソトレキセートなどの免疫抑制剤との併用を余儀なくされる。更に、炎症性サイトカインを標的とした抗サイトカイン療法および生物学的作用薬の全身投与法においては非罹患諸臓器に与える影響の面で種々の予期せぬ副作用を来たす可能性が十分考えられる。
【発明の開示】
本発明は、ＦＧＦ２の機能を阻害、またはその細胞内信号伝達系を遮断することによる、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法を提供する。また本発明は、ＦＧＦ２の機能を阻害、またはその細胞内信号伝達系を遮断する蛋白質をコードするベクターを含む、該疾患の治療組成物を提供する。
ＦＧＦ２は細胞の分化および発生に重要な役割を果たす増殖因子である（Ｋｌａｎｓｂｒｕｎ，Ｍ．，１９８９，Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．１：２０７−２３５；Ｍａｓｏｎ，Ｉ．，１９９４，Ｃｅｌｌ  ７８：５４７−５５２；Ｂｉｋｆａｌｖｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１８：２６−４５）。ＦＧＦ２はＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）を介して正常の発生過程および組織再生に重要な役割を果たしている他、癌増殖および炎症などにも関与する（Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｃ．ａｎｄ  Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ，Ｄ，１９９２，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１１５−１６５；Ｋｌｅｉｎ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  Ｓｕｐｐｌ．７９：１５９−１９２；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４５７−４６５）。また、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、表皮細胞などの細胞増殖を促進し、血管新生、骨・軟骨形成、および創傷治癒などにおける調節因子としても作用する（Ｍａｒｉｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊｏｉｎｔ  Ｂｏｎｅ  Ｓｐｉｎｅ  ６７：１５０−１５６；Ｂｏｙｃｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：８３−９４；Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｍ．１９９６，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．７：３１１−３２５；Ｃｈｉｋａｚｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１４４４−３１４５０；Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１６８：４５０−４５７；Ｃｏｌｌｏｎ−Ｏｓｄｏｂｙ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．１７：１８５９−１８７１）。ＦＧＦ２は、ＦＧＦＲ１  ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３  ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４に結合することが知られている（Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１５２９２−１５２９７）。ＦＧＦ２がＦＧＦＲに結合すると、ＦＧＦＲのチロシンリン酸化活性により下流のシグナル分子がリン酸化され、Ｒａｓ、Ｒａｆ−１、ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫへとシグナルが伝達される。本発明者らは、このシグナル伝達を阻害する遺伝子を発現するベクターによりシグナル伝達を阻害する遺伝子治療を、炎症性骨疾患に対して適用することを考えた。
そこで本発明者らは、ＦＧＦ２の機能を阻害する分泌型ＦＧＦ受容体、並びにＦＧＦ２の細胞内信号伝達系を遮断するｓｐｒｏｕｔｙ−２およびｓｐｒｅｄをコードするウイルスベクターを作製し、ＲＡモデルラットの疾患関節に投与する遺伝子治療を行なった。その結果、これらのうちいずれのベクターの投与においても関節の炎症が有意に抑制され、さらに該ベクターを投与した関節では、骨量の減少が緩和され、有意な治療効果を認めた。このように、ＦＧＦ２の機能阻害またはその細胞内信号伝達系を遮断する蛋白質を発現するベクターを骨疾患部位に局所投与することによって、疾患部位の炎症を抑えると同時に骨破壊も抑制し、症状を有意に改善することに成功した。ＲＡなどの骨破壊を伴う炎症性疾患においては、これまで効果的な治療方法がなかったが、本発明の方法に従った遺伝子治療により、患部の炎症と骨破壊を同時に抑制できる新しい治療が可能となった。ベクターを患部に局所投与すれば、全身投与における副作用を回避することができ、さらにベクターからのシグナル伝達阻害因子の発現により、長期間にわたって治療効果を持続することが可能である。
すなわち本発明は、ＦＧＦ２の機能阻害またはその細胞内信号伝達系の遮断により骨破壊を伴う炎症性疾患を治療する方法、および該治療に用いる医薬組成物に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、より具体的には、
（１）骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法であって、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクターを投与する工程を含む方法、
（２）ベクターが一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターである、（１）に記載の方法、
（３）一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（２）に記載の方法、
（４）該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性ＦＧＦ受容体、ｓｐｒｏｕｔｙ−２、およびｓｐｒｅｄからなる群より選択される、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）該疾患が関節リウマチである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物であって、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物、
（７）ベクターが一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターである、（６）に記載の組成物、
（８）一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（７）に記載の組成物、
（９）該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性ＦＧＦ受容体、ｓｐｒｏｕｔｙ−２、およびｓｐｒｅｄからなる群より選択される、（６）から（８）のいずれかに記載の組成物、
（１０）該疾患が関節リウマチである、（６）から（９）のいずれかに記載の組成物、に関する。
本発明は、骨疾患における炎症と骨破壊の一元的治療に対して、ＦＧＦ２の機能制御、及びその細胞内信号伝達系の遮断によりＲＡを治療する方法を提供する。つまり、本発明者らは、ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼ系を介した一連のＦＧＦ２シグナル伝達系の細胞外および／または細胞内における阻害を治療戦略として提供した。ＦＧＦ２シグナル伝達系を阻害する因子をコードするベクターを患部に投与することにより、患部の炎症と骨破壊とを同時に抑制することができる。ＦＧＦ２はその受容体（ＦＧＦＲ）に結合すると二量体を形成し、チロシンの自己リン酸化が誘導され活性化される。活性化したＦＧＦＲチロシンキナーゼはＳｒｃキナーゼ、ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）等の酵素の他、Ｓｈｃ、ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ２（ＦＲＳ２）などのアダプター蛋白質のチロシンをリン酸化する。リン酸化されたＳｈｃおよびＦＲＳ２はＧｒｂ２と結合し、Ｓｏｓを細胞膜へリクルートし、ＳｏｓによってＲａｓが活性化される。活性型ＲａｓはＲａｆ−１キナーゼと結合し、ＭＡＰＫキナーゼを活性化、さらにＭＡＰキナーゼが活性化される。ＦＲＳ２にはＳＨＰ２というチロシンホスファターゼが結合する。ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達とは、上記に示したＦＧＦ２からＭＡＰＫに至るシグナル伝達である。このシグナル伝達の阻害とは、例えばＦＧＦ２から、ＦＧＦ受容体１、Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびＭＡＰキナーゼへと至るシグナル伝達の１つまたはそれ以上の所望のポイントを阻害することである。例えばＦＧＦ２、ＦＧＦ受容体１、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、ＦＲＳ２、ＳＨＰ２、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＡＰＫＫ、およびＭＡＰＫの活性（他のシグナル分子との相互作用またはリン酸化活性など）を阻害することであってよい。また、各シグナル分子の発現（転写、翻訳、またはｍＲＮＡ・蛋白質の安定性など）を阻害することであってよい。
ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸としては、例えばこのシグナル伝達に関与する分子に対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）効果を有するＲＮＡ、リボザイム、または抗体などが挙げられる。アンチセンス核酸としては、シグナル分子をコードする遺伝子のセンス鎖の連続した１３ヌクレオチド以上、好ましくは１４ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１５ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２０ヌクレオチド以上に対するアンチセンス配列を含む核酸が挙げられる。例えば、初期転写配列中のエクソン−イントロン境界、イントロン−エクソン境界、翻訳開始コドンを含む領域、または成熟ｍＲＮＡ中の蛋白質コード配列に対するアンチセンス配列を含む核酸などが好ましい。また、リボザイムとしては、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断するＲＮＡ切断型リボザイムを利用できる。たとえば、ハンマーヘッド型リボザイム（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．５０：２４５−２５４）およびヘアピン型のリボザイム（Ｈａｍｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２９９−３０４，ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２５４，６７８）が、塩基配列特異的な切断作用を有することが知られている。これらのリボザイムは、アンチセンス配列がハイブリダイズするポリヌクレオチドの特定の位置を、その触媒作用によって切断することができる。またシグナル伝達を阻害する抗体としては、シグナル分子の活性に重要なドメイン、例えばリン酸化部位または他のシグナル分子との相互作用部位に結合する抗体が用いられる。
また、本発明においてさらに好ましい態様では、ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質成分をベクターから発現させる。好ましい手段としては、大きく、▲１▼可溶性ＦＧＦ受容体遺伝子を用いたシグナル伝達の阻害、▲２▼細胞内シグナル伝達系（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼ系）を阻害する遺伝子を用いた阻害の二通りが挙げられる。発明の実施形態として具体的に以下に述べる。
１．可溶性ＦＧＦ受容体遺伝子を用いた遺伝子治療
現在までの諸家の研究により、滑膜組織においてはＦＧＦ受容体１から受容体４が、破骨細胞においては受容体１のみが発現していること、また、破骨細胞の分化および生物学的機能発現においてＦＧＦ受容体１−ＭＡＰＫ（ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰＫ）を介したシグナル伝達が重要であることが報告されている。本発明の好ましい態様では、ヒト可溶性ＦＧＦ受容体（ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈｓＦＧＦＲ）遺伝子をベクターにより直接的に滑膜組織に導入する遺伝子治療法によりＦＧＦ２を細胞外で機能阻害する。可溶性ＦＧＦ受容体とは、ＦＧＦ受容体の細胞外ドメインにあるＦＧＦ２結合ドメインを含む蛋白質であって、細胞で発現させることにより細胞外に分泌される蛋白質である。分泌蛋白質をコードする核酸は、ＦＧＦ受容体遺伝子の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをコードする核酸を欠失させることにより得られる。細胞外に分泌された可溶性ＦＧＦ受容体は、ＦＧＦ２と結合し、ＦＧＦ２と内因性ＦＧＦＲ−１との結合と干渉することによりＦＧＦ２のシグナル伝達を阻害する。可溶性ＦＧＦ受容体遺伝子を組み込んだベクターを骨破壊部位に投与することにより、炎症と骨破壊を抑制する顕著な効果が得られる。可溶性ＦＧＦ受容体としては、ＦＧＦ２と結合するＦＧＦ受容体のＦＧＦ２結合部位を含む分泌型蛋白質であればよく、天然の蛋白質および遺伝子組み換えにより人為的に作り出した蛋白質が含まれる。具体的には、例えばＦＧＦＲ１ａ  ＩＩＩｂ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０１５８５０，ＮＰ＿０５６９３４，ＡＡＢ１９５０２，Ｉｓａｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１９０６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４６２７−４６３４）、ＦＧＦＲ１ｂ（ＩＩＩｂ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０２３１０６，ＮＰ＿０７５５９４，ＡＡＢ１９５０２，Ｉｓａｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１９０６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４６２７−４６３４）、ＦＧＦＲ１ａ（ＩＩＩｃ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０１５８５０，ＮＰ＿０５６９３４，ＡＡＢ１９５０２，Ｉｓａｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１９０６）、ＦＧＦＲ１ｂ（ＩＩＩｃ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０２３１０６，ＮＰ＿０７５５９４，ＡＡＢ１９５０２，Ｉｓａｃｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１９０６）、ＦＧＦＲ２（ＩＩＩｃ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＭ＿０２２９６２，ＮＰ＿０７５２５１，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：４６２７−４６３４）、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｃ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ２２６０７，Ｋｅｅｇａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０９５−１０９９）、ＦＧＦＲ４（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＡＢ２５７８８，Ｒｏｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８���５３８８−５３９４）の細胞外ドメインを含む分泌型蛋白質が挙げられる。特に好ましくは、スプライシングバリアントとして自然界に存在し、なおかつＦＧＦ−２の天然のインヒビターとしての作用を有するＦＧＦＲ１  ＩＩＩａ、およびヒト線維芽細胞増殖因子受容体分泌型（ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦｒ）ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍ）などが挙げられる。例えばＦＧＦｒ分泌型遺伝子の塩基配列（配列番号：１）はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ３４１８８、アミノ酸配列（配列番号：２）はｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ＡＡＡ３５８３９に示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（９），４７２８−４７３６（１９９０））。
２．細胞内シグナル伝達系の阻害による治療
ｓｐｒｏｕｔｙ−２およびｓｐｒｏｕｔｙ関連Ｒａｓシグナル抑制因子であるｓｐｒｅｄはＲａｓに結合し、Ｒａｆのリン酸化と活性化を妨害してＭＡＰキナーゼの活性化を抑制することでＦＧＦ受容体と上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）受容体の生理作用を調節している。このｓｐｒｏｕｔｙ−２またはｓｐｒｅｄ遺伝子を遺伝子治療により滑膜組織および／または周囲の骨格筋に導入、局所で発現させることによりＦＧＦ２分子を介した滑膜炎症ならびに破骨細胞性骨吸収を抑制し治療効果を発揮する。ｓｐｒｏｕｔｙ  ２［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］の塩基配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００５８４２およびＮＰ＿００５８３３に、Ｓｐｒｅｄ−２［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］の塩基配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０６３４９６およびＢＡＢ６２８４９、ヒトＳｐｒｅｄ−２はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿１８１７８４およびＮＰ＿８６１４４９に示されている（Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９２（２），２５３−２６３（１９９８）；Ｇｌｉｅｎｋｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９６（１），９１−９９（２０００）；Ｌｉｍ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４２），３２８３７−３２８４５（２０００）；Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（８），５８６６−５８７５（２００１）；Ｙｕｓｏｆｆ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（５），３１９５−３２０１（２００２）；Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（９），６０４１−６０４６（２００２）；Ｗａｋｉｏｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１２（６８４７），６４７−６５１（２００１））。また、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫを介したＦＧＦシグナル伝達系のアンタゴニストとして作用するＳｅｆ（ｓｉｍｉｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｆｇｆ  ｇｅｎｅｓ）を用いることができる（Ｆｕｒｔｈａｕｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２００２，４（２）：１７０−４）。また、ｆｇｆ８、ｆｇｆ３、ｓｐｒｏｕｔｙ４なども利用し得る。
Ｓｅｆ（ｓｉｍｉｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｆｇｆ  ｇｅｎｅｓ）（ＩＬ１７ＲＬＭ，ＦＬＪ３５７５５，ＩＬ−１７ＲＤとも称す）遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０１７５６３の５２３から２３０７番目、Ｓｅｆのアミノ酸配列は、ＮＰ＿０６００３３に例示されている（Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０），２２６５−２２７０（２００３）；Ｙａｎｇ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３５），３３２３２−３３２３８（２００３）；Ｋｏｖａｌｅｎｋｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１６），１４０８７−１４０９１（２００３）；Ｆｕｒｔｈａｕｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（２），１７０−１７４（２００２）；Ｔｓａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ，Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４（２），１６５−１６９（２００２））。ＦＧＦ８（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ８）遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０３３１６５の２３７から７８２番目、ＦＧＦ８（成熟蛋白質）のアミノ酸配列は、ＮＰ＿１４９３５５の２３から２０４番目に例示されている（Ｇｎａｎａｐｒａｇａｓａｍ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８，１４３２−１４３８（２００３）；Ｇｎａｎａｐｒａｇａｓａｍ，Ｖ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，５０６９−５０８０（２００２）；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４６，１０１６−１０２１（２００１）；Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７，１４２５−１４３４（１９９６））。ＦＧＦ３（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ３）遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００５２４７の５４３から１２０８番目、ＦＧＦ３（成熟蛋白質）のアミノ酸配列は、ＮＰ＿００５２３８の１８から２３９番目に例示されている（Ｋｏｎｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１８），１５９６２−１５９７０（２００２）；Ｇａｌｄｅｍａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２３），１７３６４−１７３７３（２０００）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１（４），１１３３−１１４２（１９９１））。ｓｐｒｏｕｔｙ４（ｓｐｒｙ４とも称される）遺伝子の塩基配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０３０９６４の１８８から１１５３番目、ｓｐｒｏｕｔｙ４のアミノ酸配列は、ＮＰ＿１１２２２６に例示されている（Ｓａｓａｋｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（５），４２７−４３２（２００３）；Ｌｅｅｋｓｍａ，Ｏ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９（１０），２５４６−２５５６（２００２））。
また、上記した可溶性ＦＧＦＲ、およびＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質は、天然のアミノ酸を改変された蛋白質、例えば自然界に存在するバリアントおよび他の哺乳動物のカウンターパートを用いることができる。具体的には、天然の可溶性ＦＧＦＲまたはＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、天然の可溶性ＦＧＦＲまたはＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質と７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ配列を含む蛋白質、ならびに天然の可溶性ＦＧＦＲまたはＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のコード領域の一部または全部を含む核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質は本発明において好適に用いることができる。例えば可溶性ＦＧＦＲであれば、ＦＧＦ２と結合する活性を有している分泌蛋白質であるかぎり所望の変異を有していてもよい。またｓｐｒｏｕｔｙ２またはＳｐｒｅｄの変異体であれば、Ｒａｆのリン酸化を阻害する活性を持つものであるかぎり本発明において利用することができる。
アミノ酸の置換、欠失、および／または付加においては、改変されるアミノ酸数は、通常１５以内、好ましくは１１以内、より好ましくは９以内、より好ましくは７以内、より好ましくは５以内である。特にアミノ酸を保存的に置換した蛋白質は活性が維持されやすい。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。具体的にはｂｌａｓｔｐプログラムを用いることができる。例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブページにおいてＬｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば天然の可溶性ＦＧＦＲまたはＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。また、ハイブリダイゼーションにおいては、天然の可溶性ＦＧＦＲまたはＦＧＦＲの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のコード配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば５×ＳＳＣ、７％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（１×デンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液中、４８℃、好ましくは５０℃、より好ましくは５２℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温���、より好ましくは６０℃、さらにこの好ましくは６５℃、最も好ましくは６８℃で２×ＳＳＣ中、好ましくは１×ＳＳＣ中、より好ましくは０．５×ＳＳＣ中、より好ましくは０．１×ＳＳＣ中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
上記のシグナル伝達を阻害する核酸または蛋白質の遺伝子を組み込むベクターとしては、ウイルスベクター、およびプラスミドベクター等のｎａｋｅｄ  ＤＮＡ（裸のＤＮＡ）など所望のベクター系を用いることができるが、ウイルスベクターが特に好適である。ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる。これらのウイルスベクターは、遺伝子工学的に組み換えウイルスベクターとして調製することができる。
「組み換え」ウイルスベクターとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるウイルスベクターである。なお、組み換えポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドの両端が自然の状態と同じようには配置していないポリヌクレオチドを言う。より具体的には、例えば人為的にポリヌクレオチド鎖が繋ぎ替えられたり、あるいは新たに生成されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。
組み換えウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１３２０−２４頁；Ｋａｎｅｇａｅら、１９９６、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ、３８巻、１８２−１８８頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、１９９４、４３−５８頁、羊土社；鐘ヶ江ら、１９９４、細胞工学、１３巻、８号、７５７−７６３頁）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５０８−２５１３頁）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（玉寄ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５３２−２５３８頁）なども、公知の方法により調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウイルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。
ウイルスベクターの中でも、本発明において特に好適なベクターは一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターである。一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターとは、一本鎖のネガティブ鎖［すなわち（−）鎖］ＲＮＡをゲノムに有するウイルスまたはその誘導体であって、遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を言う。一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスとしは、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。特に好ましくは、パラミクソウイルス科のウイルスベクター（本明細書においてこれをパラミクソウイルスベクターと言う）が用いられる。本発明者らは、ＦＧＦ２シグナルの阻害因子をコードするパラミクソウイルスベクターの投与が、骨破壊性関節炎の炎症および骨量の減少の両方を顕著に低下させることを実証した。パラミクソウイルスベクターは染色体非組み込み型のＲＮＡウイルスベクターであり、外来遺伝子を一定期間、非常に高いレベルで発現させる特性を持つ。このようなベクターの特性が、本発明の方法における骨破壊性炎症疾患の治療にとって特に好ましい作用を及ぼしたと考えられる。
本発明に用いられ得るパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。本発明においてパラミクソウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明に用いられ得るレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスまたは合成したオリゴヌクレオチド等も、ウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
組み換えネガティブ鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ウイルスゲノムをコードするＤＮＡに適当な転写プロモーターを連結した組み換えＤＮＡを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させ、このＲＮＰを含むウイルス粒子を形成させることにより生成させることができる。具体的には、通常、（ａ）ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに由来するネガティブ鎖一本鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させ、（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調製することができる。ベクターＤＮＡから転写されたＲＮＡはＮＰ、Ｌ、およびＰタンパク質とＲＮＰ複合体を形成し、さらにエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウイルス粒子が形成する。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６；国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む所望のパラミクソウイルスベクターおよびその他の（−）鎖ＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスは発現される蛋白質量が極めて高く、遺伝子導入可能な細胞種も極めて広い。また、特にセンダイウイルス（ＳｅＶ）は霊長類において重篤な有害作用を示さず、本発明においてヒトへの遺伝子治療に好適に用いられる（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７）。
ウイルスベクターは、野生型ウイルスの誘導体であってもよい。誘導体とは、ウイルスの遺伝子導入能を完全には損なわないように、ベクターが搭載するウイルス遺伝子またはウイルス蛋白質を改変したベクターを言う。このような改変は、ベクターの複製能を破壊したり、あるいは抗原性を減弱化したりするために行い得る。例えばウイルスの伝播に必須の遺伝子を欠損させた複製能欠損型ウイルスベクターを用いることができる。パラミクソウイルスベクターＤＮＡにおいては、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子等を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。このような欠失型ウイルスベクターの製造方法は公知であり、これに従ってまたは順じて製造することができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。ベクターからの外来遺伝子の発現量は、例えば、その遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（国際公開番号ＷＯ０１／１８２２３）。また、ウイルスベクターは、このウイルス以外に由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターであってもよい。このようなエンベロープ蛋白質には、ＶＳＶ−Ｇなどが挙げられる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
またウイルスが持つアクセサリー遺伝子を欠損させてもよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける毒性の低い遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に有用である。
回収したウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーおよび安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９；Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），６５−７４（１９９０））。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。得られたベクターは、骨破壊を伴う炎症性疾患に対する予防剤および治療剤となる。特に上記のベクターは、関節リウマチの予防剤または治療剤として有用である。
ウイルスベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。製造されたウイルスベクターを含む組成物は試薬または医薬として有用である。該組成物は、例えば、破骨細胞形成を抑制するための試薬および医薬として、骨破壊および／または炎症を抑制するための試薬および医薬として、または骨破壊疾患を予防または治療するための医薬として用いられる。
上記のように製造したベクターを骨破壊を伴う炎症性疾患患者の患部に投与することにより、症状を著しく軽減させることができる。ここで「骨破壊を伴う炎症性疾患」とは、骨の破壊、減少、吸収、および／または粗鬆化と炎症とを伴う疾患を言う。このような疾患としては、特に関節リウマチ（ＲＡ）が挙げられる。本発明の方法を用いて、関節リウマチの炎症および骨破壊を抑制することができる。その他にも、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、種々の膠原病に続発する多発性関節炎などの治療も本発明の対象となる。
ＲＡは関節滑膜の持続的な炎症で、その増殖および肥厚の結果、関節軟骨およびその周囲の骨破壊により、関節の変形および骨破壊に到る慢性疾患である。本発明は、ＲＡの滑膜炎および骨破壊の一元的治療に対して、ＦＧＦ２の機能制御、及びその細胞内信号伝達系の遮断によりＲＡを治療する方法を提供する。つまり、本発明者らは、ＦＧＦ２−ＦＧＦ受容体１−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰキナーゼ系を介した一連のＦＧＦ２シグナル伝達系の細胞外及び細胞内阻害をＲＡに対する治療戦略として提供した。
１．ＲＡ滑膜炎の抑制について
ＲＡ滑膜病変の主体は増殖性滑膜炎である。この増殖性滑膜炎において（病的）血管新生という病態生理学的現象に因って形成された新生血管は、▲１▼滑膜組織への栄養分供給路、▲２▼炎症細胞の到達経路、▲３▼破骨細胞前駆細胞の到達経路、▲４▼サイトカインなどの疾患メディエーターの到達経路という面でＲＡ病態形成及び進展、骨破壊において重要である。従って血管新生因子の機能制御によるＲＡ治療戦略は合目的であり、滑膜における血管床の減少に伴って炎症が抑制されるものと考えられる。また、本発明は血管新生因子の中でもＲＡにおける炎症及び骨破壊の特異的増悪因子であるＦＧＦ２の機能制御を標的としていることから、より選択的かつ強力な抗滑膜炎症作用を発揮するものと考えられる。
２．ＲＡ骨破壊の抑制について
先にも述べたように、従来の技術では関節炎症と骨破壊を一元的かつ有効に治療することは困難であった。本発明における標的分子であるＦＧＦ２は、血管新生因子としての生物学的作用のみならず、骨破壊において中心的役割を担う破骨細胞の分化、機能促進因子であることも報告されている。従って、ＦＧＦ２の機能制御により滑膜炎進展の抑制に留まらず、破骨細胞分化および機能を直接的に抑制することが可能であり、ＲＡ治療における究極の目標である滑膜炎症、骨関節破壊という両現象の抑制が可能となる。
３．ドラッグ・デリバリーシステムについて
ＲＡに対して有効とされる蛋白製剤を経口的あるいは経静脈的に全身投与した場合、▲１▼関節滑膜局所への薬剤の到達、▲２▼局所における有効濃度の獲得、▲３▼全身諸臓器における副作用の発現、などの解決すべき重要な問題点が残される。一方、本発明による遺伝子治療法は、ベクターを用い滑膜組織に治療遺伝子を発現させることで、関節局所において有効な遺伝子発現レベルを一定期間持続的に獲得することが可能となる。この遺伝子治療技術を用いることで、蛋白が局所あるいは全身で高濃度になることを避けることが可能である。
４．生物学的創薬技術について
本発明はＦＧＦ２の機能を抑制する遺伝子、またはＦＧＦ２レセプター以降の細胞内シグナル伝達系を遮断する遺伝子が組み込まれたベクターを投与する方法を含む。つまり、細胞内シグナル伝達系における単一酵素の選択的阻害によって、より疾患・病態特異的な治療薬剤の製造及び治療が可能となる。このように本発明によって疾患特異的分子の選択的阻害という理想的な生物学的創薬が可能となる。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、骨破壊性の炎症がある患部に特異的に到達するように、局所注入されるか、あるいは適当なドラッグデリバリーシステムにより患部に到達するように投与されることが好ましい。パラミクソウイルスベクターであれば、投与されるベクターの濃度は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。投与量は、１箇所あたり好ましくは約１０５ｐｆｕから１０１１ｐｆｕ、より好ましくは約１０７ｐｆｕから１０９ｐｆｕ、最も好ましくは約１０８ｐｆｕから１０９ｐｆｕで投与する。複数のベクターを組み合わせて投与する場合には、それぞれを上記の量で投与するとよい。投与は１箇所または複数箇所（２，３，４，５〜１０箇所）に投与してよい。エクスビボ投与の場合は、体外（例えば試験管またはシャーレ内）で患者から取り出した細胞などにベクターを接触させる。ＭＯＩは１〜５００の間で投与することが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００である。その後、細胞を患者に注入する。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、およびサル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての非ヒト哺乳動物が含まれる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｒａｆ阻害薬投与による破骨細胞形成の抑制を示す図である。結果は平均±標準偏差で表した。統計学的解析はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いた。＊：危険率ｐ＜０．０１で有意差ありと判定した。（ｎ＝各８培養群（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｇｒｏｕｐｓ））。
図２は、ｓＦＧＦＲ遺伝子導入によるＡＩＡ治療効果を示す図である。図中、ベクターのインジェクションはｓＦＧＦＲ遺伝子を搭載したＳｅＶをフットパッド投与した時点を示す。結果は平均±標準誤差で表した。統計学的解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用い、＊：危険率ｐ＜０．０１で有意差ありと判定した。
図３は、ｓｐｒｙ２遺伝子導入によるＡＩＡ治療効果を示す図である。図中、ベクターインジェクションはｓｐｒｙ２遺伝子を搭載したＳｅＶをフットパッド投与した時点を示す。結果は平均±標準誤差で表した。統計学的解析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ−ｔｅｓｔを用いた。＃：危険率ｐ＜０．０５、＊：危険率ｐ＜０．０１で有意差ありと判定した。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  培養破骨細胞形成に与えるＲａｆ阻害薬の影響
１．ラット骨髄由来マクロファージの分離培養
ラット骨髄由来マクロファージはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）を用いて分離培養した。８頭のチャールズリバーグレードＬｅｗｉｓラット（６週齢、ＫＢＴオリエンタル、鳥栖、佐賀）を用い、麻酔下に頚椎脱臼により犠牲死させ、頸動脈を切断し脱血した。無菌下に両側の大腿骨及び脛骨の骨幹部を摘出、培養液（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ：α−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ））を骨髄腔に注入し骨髄細胞を採取した。０．７２７％  ＮＨ４Ｃｌ−０．０１７％  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．２）−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）溶液を用いて赤血球を洗浄後、１０％仔牛血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、リコンビナントヒトＭ−ＣＳＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｍ−ＣＳＦ：ｒｈＭ−ＣＳＦ，１０ｎｇ／ｍｌ，ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）含有α−ＭＥＭを用い１８０ｍｌフラスコに５×１０６個撒いた。３日後、ＰＢＳにて洗浄し、０．０５％  ｔｒｙｐｓｉｎｅ／０．０２％  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで接着細胞を剥がし、１８０ｍｌフラスコに１０６個撒いた。３日後、同様の方法で細胞を回収し液体窒素中に保存した。この方法で分離したラット骨髄由来マクロファージをＭ−ＣＳＦ依存ラット骨髄マクロファージ（Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ＭＤＢＭ）と定義した。
２．破骨細胞形成に与えるＲａｆ阻害薬の影響
予め調整した１０％  ＦＢＳ、ｒｈＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ｓＲＡＮＫＬ，５０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ，Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）、及びｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ（ｒｈＦＧＦ−２，１０ｎｇ／ｍｌ，Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）含有α−ＭＥＭを用い、９６穴プレートにＭＤＢＭを５×１０３個／ｗｅｌｌで撒いた。接着後、ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解したＲａｆ阻害薬（Ｒａｆ−１  Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｉ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加した（１０μｌ／ｗｅｌｌ）。コントロール群にはＤＭＳＯのみを同量添加した。３日後に培養液を交換し、再度Ｒａｆ阻害薬を添加した。培養開始より７日目にｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いて酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＴＲＡＰ）染色を施行、ＴＲＡＰ陽性の３核以上を有する多核巨細胞を破骨細胞と定義し形成破骨細胞数を比較検討した。その結果、Ｒａｆ阻害薬投与により濃度依存的に破骨細胞形成が抑制され、いずれの濃度においてもコントロールとの有意差が認められた（図１）。
［実施例２］  ＡＩＡに与えるｓＦＧＦＲ遺伝子導入の影響：  ＦＧＦ−２細胞外遮断
〈方法〉
１．ＡＩＡモデル
ＡＩＡは、結核菌の死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ：ＭＢＤ，Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）１ｍｇを鉱物油（ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ，京都）１００μｌに懸濁し、ラットの尾根部に皮下投与した。
２．ＦＧＦ−２細胞外遮断実験プロトコール
組換えセンダイウイルスベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ：ＳｅＶ）を用いたラットへの直接的遺伝子導入法により炎症局所で標的遺伝子を発現させ、関節炎に与える影響を検討した。具体的には、関節炎の発症を確認し、アジュバント投与後１４日目にＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群（ｎ＝４０足）では可溶型ＦＧＦレセプター遺伝子（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＦＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｓＦＧＦＲ，配列番号：１）搭載ＳｅＶ（ＳｅＶ−ｓＦＧＦＲ）を、対照群のＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群（ｎ＝２８足）ではホタルルシフェラーゼ遺伝子搭載（ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をそれぞれ１０８ｐｆｕ／足でフットパッドに投与した。
３．後肢容積の測定
関節炎による後肢腫脹を定量化する目的でボリュームメーター（ＭＫ−５５０；室町器械、東京）を用いて後肢容積（ｈｉｎｄ  ｐａｗ  ｖｏｌｕｍｅ：ｈｐｖ）を経時的に測定した。
４．レントゲン学的骨・関節破壊の評価
レントゲン学的骨・関節破壊を検討する目的で、Ｄａｙ２１およびＤａｙ２８でラットを犠牲死させ、下腿の中央部で後肢を切断し軟線撮影（ＣＭＢ−２；ソフテックス社、東京）を施行し、レントゲン学的骨・関節破壊の程度を５段階に分類し評価した。本実施例のレントゲン学的骨・関節破壊指数（Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｅｘ：ＲＩ）は以下の通りである。（０：所見なし、１：軽度の骨萎縮及び軟部陰影の腫脹、２：関節裂隙の狭小化及び中等度の骨萎縮、３：骨・軟骨ビランまたは中等度の関節破壊、４：高度の骨破壊による関節構造の消失）。
〈結果〉
図２Ａに経時的後肢容積を示す。Ｄａｙ２１における後肢容積はＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群が３．０６±０．１、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．９３±０．１１ｍｌ、Ｄａｙ２８においてはＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群が２．８５±０．１、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．２９±０．１２ｍｌであり、いずれの時点においてもｓＦＧＦＲ遺伝子導入によるＦＧＦ−２細胞外シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。
図２ＢにＤａｙ１４からＤａｙ２１における容積変化率を示す。その結果、ＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群が０．１８±０．０７、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が０．８６±０．０９ｍｌであり、ベクター投与後７日における容積変化率においてもＦＧＦ−２細胞外シグナル遮断により有意に抑制された。
図２Ｃにレントゲン学的骨・関節破壊指数を示す。Ｄａｙ２１ではＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群が１．４２±０．２９（ｎ＝１２足）、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が１．９±０．２８（ｎ＝１０足）、Ｄａｙ２８ではＡＩＡ＋ｓＦＧＦＲ群が１．２７±０．１８（ｎ＝２６足）、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．０±０．２１（ｎ＝１４足）であり、Ｄａｙ２８においてＦＧＦ−２細胞外シグナル遮断により骨・関節破壊が有意に抑制された。
［実施例３］  ＡＩＡに与えるｓｐｒｙ２遺伝子導入の影響：  ＦＧＦ−２細胞内シグナル遮断
〈方法〉
１．ＡＩＡモデル
結核菌の死菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ：ＭＢＤ，Ｄｉｆｃｏ）１ｍｇを鉱物油（ＮＡＣＡＬＡＩ  ＴＥＳＱＵＥ）１００μｌに懸濁し、ラットの尾根部に皮下投与した。
２．ＦＧＦ−２細胞内遮断実験プロトコール
組換えセンダイウイルスベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ：ＳｅＶ）を用いたラットへの直接的遺伝子導入法により炎症局所で標的遺伝子を発現させ、関節炎に与える影響を検討した。具体的には、関節炎の発症を確認し、アジュバント投与後１４日目にＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群（ｎ＝３３足）ではｈｕｍａｎ  ｓｐｒｏｕｔｙ２遺伝子（ｓｐｒｙ２；配列番号：３）搭載ＳｅＶ（ＳｅＶ−ｓｐｒｙ２）を、対照群のＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群（ｎ＝３３足）ではホタルルシフェラーゼ遺伝子搭載ＳｅＶ（ＳｅＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）をそれぞれ１０８ｐｆｕ／足でフットパッドに投与した。
３．後肢容積の測定
関節炎による後肢腫脹を定量化する目的でボリュームメーター（ＭＫ−５５０；室町器械）を用いて後肢容積（ｈｉｎｄ  ｐａｗ  ｖｏｌｕｍｅ：ｈｐｖ）を経時的に測定した。
４．レントゲン学的骨・関節破壊の評価
レントゲン学的骨・関節破壊を検討する目的で、Ｄａｙ２１およびＤａｙ２８でラットを犠牲死させ、下腿の中央部で後肢を切断し軟線撮影（ＣＭＢ−２；ソフテックス社）を施行し、レントゲン学的骨・関節破壊の程度を５段階に分類し評価した。本実施例のレントゲン学的骨・関節破壊指数（Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｅｘ：ＲＩ）は以下の通りである。（０：所見なし、１：軽度の骨萎縮及び軟部陰影の腫脹、２：関節裂隙の狭小化及び中等度の骨萎縮、３：骨・軟骨ビランまたは中等度の関節破壊、４：高度の骨破壊による関節構造の消失）。
〈結果〉
図３Ａに経時的後肢容積を示す。Ｄａｙ２１における後肢容積はＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群が３．３３±０．１、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．８５±０．１２ｍｌ、Ｄａｙ２８においてはＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群が３．０７±０．１２、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．３８±０．１６ｍｌであり、いずれの時点においてもｓｐｒｙ２遺伝子導入によるＦＧＦＲ１／Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫを介したＦＧＦ−２細胞内シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。
図３ＢにＤａｙ１４からＤａｙ２１における容積変化率を示す。その結果、ＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群が０．２１±０．０７、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が０．７７±０．０８ｍｌであり、ベクター投与後７日における容積変化率においてもＦＧＦ−２細胞内シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。
図３Ｃにレントゲン学的骨・関節破壊指数を示す。Ｄａｙ２１ではＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群が１．３６±０．２０（ｎ＝１１足）、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が２．２７±０．３３（ｎ＝１１足）、Ｄａｙ２８ではＡＩＡ＋ｓｐｒｙ２群が１．８２±０．１９（ｎ＝２２足）、ＡＩＡ＋ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ群が３．０±０．２８（ｎ＝２２足）であり、いずれの時点においてもＦＧＦ−２細胞内シグナル遮断により骨・関節破壊が有意に抑制された。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、「ＦＧＦ２の機能阻害またはそのシグナル伝達経路の阻害」という概念のもとより疾患特異的かつ有効で更により安全な生物学的創薬が可能となる。また、ＲＡ治療戦略において血管新生因子ＦＧＦ２分子を標的とすることで、関節炎症の抑制のみならず、病期進展の抑制、更に骨破壊に至らないようにする有効な治療法が確立される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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