(57)【要約】標的抗原を高感度に検出することができる方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、（ａ）標的抗原と１種又は２種以上の抗体とを反応させ、標的抗原と抗体とを含む抗原抗体複合体を形成させる工程、（ｂ）工程（ａ）を行う前、行う際又は行った後に、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸の５’末端を、抗体に結合させる工程、（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）を行った後に、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、かつ抗原抗体複合体の形成を維持できる温度下において、一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程、及び（ｄ）工程（ｃ）を行った後に、抗原抗体複合体を構成する抗体に結合した一本鎖核酸の自己伸長を検出する工程、を含む標的抗原の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む、標的抗原の検出方法。
（ａ）標的抗原と１種又は２種以上の抗体とを反応させ、前記標的抗原と前記抗体とを含む抗原抗体複合体を形成させる工程
（ｂ）前記工程（ａ）を行う前、行う際又は行った後に、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000007
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸の５’末端を、前記抗体に結合させる工程
（ｃ）前記工程（ａ）及び（ｂ）を行った後に、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、かつ前記抗原抗体複合体の形成を維持できる温度下において、前記一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程
（ｄ）前記工程（ｃ）を行った後に、前記抗原抗体複合体を構成する前記抗体に結合した前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する工程
【請求項２】
前記工程（ｃ）で使用する前記ＤＮＡポリメラーゼが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属若しくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼ、又はバクテリオファージに由来するＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｃ）で使用する前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を有しないＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）において使用する前記デオキシヌクレオシド三リン酸が、標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を含み、
前記工程（ｄ）において、前記一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた前記標識化デオキシアデノシン三リン酸、前記標識化デオキシチミジン三リン酸又は前記標識化デオキシウリジン三リン酸を検出することにより、前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｄ）において、核酸の二重らせん構造にインターカレーションできる標識物質と前記一本鎖核酸とを反応させ、前記一本鎖核酸の分子内二重らせん構造にインターカレーションした前記標識物質を検出することにより、前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、アビジン又はその誘導体とビオチン又はその誘導体との結合を介して結合させる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体と前記抗体との結合を介して結合させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、共有結合を介して結合させる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
標的抗原に対する抗体と、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000008
2004111232.tif 000009
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸とを含む、標的抗原の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、標的抗原の検出方法及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  細胞又は組織内の生体内タンパク質、感染微生物等の異物を検出する方法として、抗原抗体反応を利用した方法が用いられている。この方法には、抗原と抗原を認識する標識化抗体とを反応させて抗原を検出する直接法と、抗原と抗原を認識する抗体（一次抗体）とを反応させた後、一次抗体を認識する標識化抗体（二次抗体）を反応させて抗原を検出する間接法とがあり、一般的に間接法が高感度とされている。【０００３】  ポストゲノム時代に入り、細胞又は組織内の微量なタンパク質の発現や、狂牛病に代表される微量な抗原を高感度に検出することができる技術の開発の必要性が高まっている。【０００４】  抗原の検出感度は、用いる抗原と抗体とが同一であれば、標識物質一分子が発するシグナルの強さ及び抗体に結合した標識物質の数によって決まる。したがって、微量な抗原を検出するには、シグナルの強い標識物質を抗体へ結合させるか、又は多量の標識物質を抗体へ結合させる必要がある。【０００５】  シグナルの強い標識物質としてはラジオアイソトープが挙げられるが、ラジオアイソトープは放射線を発生するので特別な設備を必要とする、有効期間が短い等の理由により汎用性に欠ける。また、ラジオアイソトープを用いる場合、細胞標本又は組織標本の直接観察は不可能である。【０００６】  多量の標識化合物を抗体へ結合させる方法の一つとして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を抗原抗体反応へ応用する免疫ＰＣＲ法（Ｉｍｍｕｍｏ−ＰＣＲ）（非特許文献１参照）が知られている。この方法は、抗体とビオチン化ＤＮＡとを、プロテインＡとアビジンとのキメラタンパク質を介して結合させた後、抗原と抗体とを反応させ、抗体に結合させたＤＮＡを１組以上のプライマーを用いて増幅させ、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により検出することにより、抗原を検出する方法である。したがって、この方法は、細胞又は組織に存在する微量な抗原を細胞又は組織から抽出して試験管内で検出する際には非常に有効である。しかし、この方法では、抗原の存在を明らかにすることはできるものの、抗原の細胞又は組織中での分布を明らかにすることはできない。【０００７】  免疫ＰＣＲ法を細胞又は組織中の抗原の検出へ応用するために改良されたインサイチュー免疫ＰＣＲ法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｍｍｕｍｏ−ＰＣＲ）（非特許文献２参照）は、インサイチューＰＣＲ法（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ）（非特許文献３参照）で用いられる特殊な装置を必要とするとともに、ＤＮＡ断片を増幅した後にインサイチューハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行うことを必要とするため、操作が煩雑である。また、ＰＣＲに必要な長さのビオチン化ＤＮＡを細胞又は組織中へ十分浸透させられない可能性がある。さらに、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片は抗原から遊離しているため、抗原の細胞又は組織内の分布を正確に明らかにすることはできない。【０００８】  多量の標識化合物を抗体へ結合させる最も実用的な方法として、チラミドシグナル増感法（非特許文献４参照）が知られている。この方法は、チラミド（Ｔｙｒａｍｉｄｅ）化合物が、過酸化水素の存在下において、ペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の触媒作用によりラジカル化され、その近傍にある芳香属化合物と非特異的に共有結合する性質を利用し、抗原とペルオキシダーゼを結合させた抗体とを反応させた後、標識物質に結合したチラミドをペルオキシダーゼの周辺にある組織やブロッキング剤に含まれるアミノ酸等の芳香属化合物と共有結合させることにより集積させて増感する方法である。チラミドシグナル増感法はペルオキシダーゼでチラミドをラジカル化させることが肝要であり、ラジカルの寿命は短いために、シグナル／ノイズ比の制御が非常に難しい。【０００９】  一方、オリゴヌクレオチドを標識する標識する方法として、３’末端側に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列（ここで、ＸとＹはアデニンとチミン若しくはウラシル、又はグアニンとシトシンの組合せからなり、ｎは１以上の整数を表す）を有するオリゴヌクレオチドを、前記繰り返し配列を構成するヌクレオチドの標識体及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損したＤＮＡポリメラーゼを用いて前記繰り返し配列を付加伸長させる方法が知られている（特許文献１）。この方法は、３’末端側に（ＸＹ）ｎで表される繰り返し配列を有するオリゴヌクレオチドの自己伸長により生成される伸長部分に標識化ヌクレオチドを取り込ませ、オリゴヌクレオチドを標識する方法である。
【特許文献１】特開平１１−７５８８０号公報
【非特許文献１】Ｓａｎｏ，Ｔ．等，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１９９２年，第２５８巻，ｐ．１２０−１２２
【非特許文献２】Ｃａｏ，Ｐ．等，「Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ」，２０００年，第３５６巻，ｐ．１００２−１００３
【非特許文献３】Ｎｕｏｖｏ，ＧＪ．，「ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．」，１９９５年，第４巻，Ｓ１５１−Ｓ１６７
【非特許文献４】Ｓｔｒａｐｐｅ，ＰＭ．等，「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」，１９９７年，第６７巻，ｐ．１０３−１１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は、標的抗原を高感度に検出することができる方法及びキットを提供することを目的とする。【００１１】  また、本発明は、標的抗原が細胞表面抗原又は細胞内抗原である場合、標的抗原を高感度に検出することができるとともに、標的抗原の細胞内分布を検出することができる方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  上記目的を達成するために、本発明は、以下の方法及びキットを提供する。【００１３】（１）下記工程（ａ）〜（ｄ）を含む、標的抗原の検出方法。
（ａ）標的抗原と１種又は２種以上の抗体とを反応させ、前記標的抗原と前記抗体とを含む抗原抗体複合体を形成させる工程
（ｂ）前記工程（ａ）を行う前、行う際又は行った後に、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000002
2004111232.tif 000003
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸の５’末端を、前記抗体に結合させる工程
（ｃ）前記工程（ａ）及び（ｂ）を行った後に、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、かつ前記抗原抗体複合体の形成を維持できる温度下において、前記一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程
（ｄ）前記工程（ｃ）を行った後に、前記抗原抗体複合体を構成する前記抗体に結合した前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する工程【００１４】（２）前記工程（ｃ）で使用する前記ＤＮＡポリメラーゼが、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属若しくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼ、又はバクテリオファージに由来するＤＮＡポリメラーゼである、前記（１）記載の方法。【００１５】（３）前記工程（ｃ）で使用する前記ＤＮＡポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を有しないＤＮＡポリメラーゼである、前記（１）記載の方法。【００１６】（４）前記工程（ｃ）において使用する前記デオキシヌクレオシド三リン酸が、標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を含み、
前記工程（ｄ）において、前記一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた前記標識化デオキシアデノシン三リン酸、前記標識化デオキシチミジン三リン酸又は前記標識化デオキシウリジン三リン酸を検出することにより、前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する、前記（１）記載の方法。【００１７】（５）前記工程（ｄ）において、核酸の二重らせん構造にインターカレーションできる標識物質と前記一本鎖核酸とを反応させ、前記一本鎖核酸の分子内二重らせん構造にインターカレーションした前記標識物質を検出することにより、前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する、前記（１）記載の方法。【００１８】（６）前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、アビジン又はその誘導体とビオチン又はその誘導体との結合を介して結合させる、前記（１）記載の方法。【００１９】（７）前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体と前記抗体との結合を介して結合させる、前記（１）記載の方法。【００２０】（８）前記工程（ｂ）において、前記一本鎖核酸の５’末端と前記抗体とを、共有結合を介して結合させる、前記（１）記載の方法。【００２１】（９）標的抗原に対する抗体と、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000004
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸とを含む、標的抗原の検出用キット。
【発明の効果】
【００２２】  本発明の方法及びキットによれば、標的抗原を高感度に検出することができる。また、標的抗原が細胞表面抗原又は細胞内抗原である場合、標的抗原を高感度に検出することができるとともに、標的抗原の細胞内分布を検出することができる。【００２３】  本発明の方法及びキットによれば、一本鎖核酸の自己伸長の程度を調節することにより、抗原の検出感度を自在に調節することができる。【００２４】  本発明の方法及びキットによれば、多検体について標的抗原の有無を同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】  本発明に係る標的抗原の検出方法は、工程（ａ）〜（ｄ）を含む限り、その他の工程を含むことができる。
以下、工程（ａ）〜（ｄ）について詳細に説明する。【００２６】〔工程（ａ）〕
工程（ａ）は、標的抗原と１種又は２種以上の抗体とを反応させ、前記標的抗原と前記抗体とを含む抗原抗体複合体を形成させる工程である。【００２７】  標的抗原は、抗原抗体反応を生じさせることができる限り特に限定されるものではなく、免疫原性を有する抗原（完全抗原）であってもよいし、免疫原性を有しない抗原（不完全抗原）であってもよい。標的抗原としては、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、糖鎖、核酸、脂質等が挙げられる。具体的には、細胞、血液、尿等から抽出されたタンパク質、ペプチド、ホルモン、糖鎖、核酸、脂質等のうち、特定のものを標的抗原として選択することができる。また、各種環境の土壌、水等から抽出したタンパク質、ペプチド、ホルモン、糖鎖、核酸、脂質等のうち、特定のものを標的抗原として選択することができる。さらに、細胞の表面又は内部に含まれるタンパク質、ペプチド、ホルモン、糖鎖、核酸、脂質等のうち、特定のものを標的抗原として選択することができる。【００２８】  本発明によれば、標的抗原の種類に関わらず、標的抗原の有無を高感度に検出することができる。標的抗原が細胞表面抗原又は細胞内抗原である場合、細胞表面抗原又は細胞内抗原の有無を高感度に検出することができるとともに、細胞表面抗原又は細胞内抗原の細胞内分布を検出することができる。なお、細胞表面抗原又は細胞内抗原は、生体を構成していない細胞（例えば、ヒトを含む哺乳動物、昆虫、植物等から採取した細胞又はその培養細胞）の表面又は内部に含まれる抗原である。【００２９】  細胞表面抗原は特に限定されるものではないが、その具体例としては、ＣＤ抗原、ウイルスレセプター、ホルモンレセプター、細胞接着分子等が挙げられる。細胞内抗原は特に限定されるものではないが、その具体例としては、ミトコンドリア構成タンパク質、ゴルジ体構成タンパク質、核構成タンパク質、ウイルス抗原等が挙げられる。【００３０】  標的抗原と反応させる抗体としては、少なくとも、標的抗原に対する１種又は２種以上の抗体が使用されるが、これに加えて、一次抗体に対する１種又は２種以上の二次抗体、・・・、ｋ次抗体に対する１種又は２種以上の（ｋ＋１）次抗体を使用することができる。すなわち、標的抗原と抗体との抗原抗体反応により形成される抗原抗体複合体は、少なくとも、標的抗原と標的抗原に対する一次抗体とを含むが、これに加えて、一次抗体に対する二次抗体、・・・・・、ｋ次抗体に対する（ｋ＋１）次抗体を含むことができる。なお、ｋは１以上の整数を表す。【００３１】  標的抗原と反応させる抗体としては、通常、標的抗原に対する１種又は２種以上の一次抗体を単独で使用するか、あるいは、標的抗原に対する１種又は２種以上の一次抗体と一次抗体に対する１種又は２種以上の二次抗体とを組み合わせて使用する。標的抗原の検出感度を向上させる点からは、標的抗原に対する１種又は２種以上の一次抗体と一次抗体に対する１種又は２種以上の二次抗体とを組み合わせて使用することが好ましい。【００３２】  抗体は、目的の反応性（例えば、標的抗原に対する反応性、一次抗体に対する反応性）を有する限り、抗体の断片であってもよく、抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、いずれのクラスのものであってもよい。【００３３】  抗体は、常法に従って作製することができる。また、市販の抗体を使用することができる。【００３４】  抗原抗体反応は、常法に従って行うことができ、その反応条件は特に限定されるものではない。抗原抗体反応は、例えば、以下の反応条件に従って行うことができる。【００３５】  反応温度は、通常４〜５０℃、好ましくは４〜４２℃、さらに好ましくは２０〜４０℃である。【００３６】  反応時間は、通常５分間〜２４時間、好ましくは１０分間〜１６時間、さらに好ましくは３０分間〜１２０分間である。【００３７】  反応溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液等を使用することができる。【００３８】  標的抗原と反応させる抗体の量は、標的抗原１モルに対して通常３〜１００モル、好ましくは５〜５０モル、さらに好ましくは５〜２０モルである。【００３９】  標的抗原と抗体とを反応させる際、抗原抗体反応が妨げられない限り、夾雑物が存在していてもよい。【００４０】  抗原抗体反応は、通常、プラスチック、ガラス、ナイロン膜、セルロース膜等の固相上で行われる。【００４１】  抗原抗体反応を行う前に、標的抗原又は抗体を予め固相に結合させておいてもよい。これにより、抗原抗体複合体を形成していない抗体（以下「未反応の抗体」という場合がある。）を容易かつ効率的に除去することができる。未反応の抗体の除去は、工程（ａ）を行った後から工程（ｄ）を行う前までのいずれかの時点で行うことが好ましく、工程（ａ）を行った後から工程（ｂ）を行う前のいずれかの時点で行うことがさらに好ましい。工程（ａ）を行った後から工程（ｂ）を行う前のいずれかの時点で未反応の抗体の除去することにより、未反応の抗体と一本鎖核酸との結合を防止することができる。【００４２】  標的抗原又は抗体を固定できる固相としては、例えば、プラスチック、ガラス、ナイロン膜、セルロース膜等が挙げられる。【００４３】  標的抗原又は抗体の固相への固定は常法に従って行うことができ、例えば、イオン結合、共有結合等を介して固定することができる。【００４４】  固相の洗浄液は、抗原抗体複合体の形成を維持できる限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝化生理食塩水、Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝化生理食塩水等が挙げられる。【００４５】  標的抗原が細胞表面抗原又は細胞内抗原である場合、抗原抗体反応を行う前に、細胞をＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤で処理して細胞膜を脱脂することにより、抗体の細胞透過性を向上させることが好ましい。また、細胞がパラフィン封入細胞である場合、トリプシン又はプロテアーゼ処理、あるいはマイクロウェーブ処理により抗原を露出させることが好ましい。【００４６】〔工程（ｂ）〕
工程（ｂ）は、前記工程（ａ）を行う前、行う際又は行った後に、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000005
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸の５’末端を、前記抗体に結合させる工程である。【００４７】  一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）において、「５’」は一本鎖核酸の５’末端を表し、「３’」は一本鎖核酸の３’末端を表す。【００４８】  一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）において、ｎで表される整数は２以上、好ましくは４以上、さらに好ましくは７以上である。ｎで表される整数が大きくなるほど、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される塩基配列からなる一本鎖核酸の自己伸長を効率よく開始させることができる。【００４９】  一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）において、ｎで表される整数の上限は特に限定されるものではないが、通常５０、好ましくは２５、さらに好ましくは１５である。ｎで表される整数が大きくなるほど、一本鎖核酸の合成に要する費用が高くなるとともに収率が下がること、及びｎで表される整数が大きくなるほど、細胞浸透性が悪くなることを考慮して、ｎで表される整数の上限は、上記範囲に設定することが好ましい。【００５０】  一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）において、Ｚで表される塩基配列及びその塩基数は特に限定されるものではない。Ｚで表される塩基配列の塩基数は、通常２〜５０塩基、好ましくは５〜３０塩基、さらに好ましくは１０〜２５塩基である。なお、本明細書において、「塩基配列」という用語は、２個以上の塩基からなるものの他、１個の塩基からなるものも含む意味で使用される。【００５１】  一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表される一本鎖核酸の自己伸長は以下のように進行する。以下の説明において、アデニンとチミン及び／又はウラシルとの繰り返し配列を「ＸＹ配列」といい、ＸＹ配列には、例えば、５’−（ＸＹ）ｔ−３’、５’−（ＹＸ）ｔ−３’、５’−（ＸＹ）ｔ−Ｘ−３’、５’−Ｙ−（ＸＹ）ｔ−３’等が含まれる。なお、ｔは１以上の整数を表す。【００５２】  一本鎖核酸の３’末端を含むＸＹ配列（以下「３’末端ＸＹ配列」という。）が、３’末端ＸＹ配列の５’側に位置するＸＹ配列にアニーリングする（自己アニーリングによる分子内二本鎖の形成）。そして、３’末端ＸＹ配列がプライマーとしての役割を果たすとともに、３’末端ＸＹ配列がアニーリングしたＸＹ配列の５’側に位置する塩基配列が鋳型としての役割を果たし、ＤＮＡポリメラーゼの作用により３’末端ＸＹ配列の３’末端に相補的塩基配列が付加される（自己プライミングによる自己伸長）。【００５３】  一本鎖核酸の３’末端に付加される塩基配列（一本鎖核酸の伸長部分）が長いほど、工程（ｄ）において一本鎖核酸の自己伸長の検出感度が向上する。したがって、一本鎖核酸が、自己アニーリングによる分子内二本鎖の形成と、自己プライミングによる自己伸長と、分子内二本鎖の融解とを繰り返すことができることが好ましい。一本鎖核酸が、これらを繰り返すためには、一本鎖核酸の３’末端に付加される塩基配列がＸＹ配列である（すなわち、一本鎖核酸の自己伸長の後も一本鎖核酸の塩基配列が一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される）ことが必要である。【００５４】  一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される一本鎖核酸の場合、工程（ｃ）で使用するデオキシヌクレオシド三リン酸に、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リ��酸及びデオキシウリジン三リン酸以外の種類のデオキシヌクレオシド三リン酸が含まれているか否かに関わらず、一本鎖核酸の３’末端に付加される塩基配列はＸＹ配列である。【００５５】  一般式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される一本鎖核酸の場合、一本鎖核酸の３’末端に付加される塩基配列がＸＹ配列であるためには、自己プライミングによる自己伸長の際、Ｚで表される塩基配列を鋳型とした伸長反応が進行しないか、又はＺで表される塩基配列を鋳型として伸長する塩基配列がＸＹ配列であることが必要である。【００５６】  例えば、工程（ｃ）で使用するデオキシヌクレオシド三リン酸が、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とから構成され、他種のデオキシヌクレオシド三リン酸を含まない場合、Ｚで表される塩基配列がその３’末端側にグアニン及び／又はシトシンのみからなる塩基配列を含めば、Ｚで表される塩基配列の３’側からＺで表される塩基配列の方向へ進行してきた伸長反応は、Ｚで表される塩基配列の３’末端で停止するので、Ｚで表される塩基配列を鋳型とした伸長反応は進行しない。【００５７】  Ｚで表される塩基配列がその３’末端にグアニン及び／又はシトシンのみからなる塩基配列を含まなければ、グアニン及び／又はシトシンのみからなる塩基配列が含まれる位置まで伸長反応が進行するが、Ｚで表される塩基配列の３’末端からグアニン及び／又はシトシンのみからなる塩基配列が含まれる位置までの塩基配列がＸＹ配列であれば、Ｚで表される塩基配列を鋳型として伸長する塩基配列はＸＹ配列である。【００５８】  Ｚで表される塩基配列がＸＹ配列を含む場合、３’末端ＸＹ配列がＺで表される塩基配列にアニーリングし、Ｚで表される塩基配列を鋳型とした伸長反応が進行する場合がある。この場合、Ｚで表される塩基配列に含まれるＸＹ配列の５’末端にグアニン及び／又はシトシンのみからなる塩基配列が隣接していれば、Ｚで表される塩基配列を鋳型として伸長する塩基配列はＸＹ配列である。【００５９】  一本鎖核酸の５’末端を結合させる抗体は、工程（ａ）で使用する抗体のうち、いずれの抗体であってもよい。一本鎖核酸の５’末端を結合させる抗体としては、例えば、標的抗原に対する１種又は２種以上の一次抗体、一次抗体に対する１種又は２種以上の二次抗体等が挙げられる。【００６０】  一本鎖核酸の５’末端を抗体に結合させる方法は特に限定されるものではなく、その具体例としては、特定物質間の特異的相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合）等を利用した方法が挙げられる。これらの方法によって核酸と抗体とを結合させることができるように、常法に従って抗体及び／又は核酸に適当な化学修飾を施すことができる。【００６１】  特定物質間の特異的相互作用としては、例えば、アビジン又はその誘導体（例えば、ストレプトアビジン、エクストラアビジン（ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ）、ニュートロアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ））／ビオチン又はその誘導体（例えば、イミノビオチン、カルボビオチン、ビオチンヒドラジド）；ＩｇＧのＦｃフラグメント／プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体（例えば、プロテインＡとＧとの融合タンパク質であるプロテインＡ／Ｇ（ピアス社製）、抗体との結合に寄与しない領域を除いた改変体であるプロテインＧ’（シグマ社製））；ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＤのκ軽鎖／プロテインＬ又はそれらの誘導体（例えば、プロテインＬとＡとの融合タンパク質であるプロテインＬＡ（シグマ社製））；マルトース結合タンパク質／マルトース；ポリヒスチジンペプチド／ニッケル、コバルト等の金属イオン；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン；カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド；ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ；核酸／相補的核酸；受容体タンパク質／リガンド；酵素／基質の特異的相互作用が挙げられ、好ましい特異的相互作用としては、アビジン又はその誘導体／ビオチン又はその誘導体；ＩｇＧのＦｃフラグメント／プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体の特異的相互作用が挙げられる。【００６２】  物質ａ及びｂ間の特異的相互作用を利用する場合、例えば、物質ａ（例えばビオチン又はその誘導体）を核酸の５’末端に結合させるとともに、物質ｂ（例えばアビジン又はその誘導体）を抗体の抗原認識部位以外の部位に結合させる。物質ｂを核酸の５’末端に結合させるとともに、物質ａを抗体の抗原認識部位以外の部位に結合させてもよい。そして、物質ａと物質ｂとを結合させることにより、核酸と抗体とを結合させることができる。但し、ＩｇＧのＦｃフラグメント／プロテインＡ又はプロテインＧの特異的相互作用のように、抗体自体が物質ａ又は物質ｂである場合、物質ａ又は物質ｂを抗体に結合させる必要はない。【００６３】  １分子の物質ｂに対して複数分子の物質ａが結合できる場合（例えば、物質ａがビオチン又はその誘導体であり、物質ｂがアビジン又はその誘導体である場合）、物質ａを核酸及び抗体の両方に結合させることもできる。そして、核酸に結合させた物質ａと、抗体に結合させた物質ａとを、物質ｂを介して結合させることにより、核酸と抗体とを結合させることができる。【００６４】  特異的相互作用を生じる物質は常法に従って核酸及び／又は抗体に結合させることができる。【００６５】  例えば、核酸の５’末端に導入したアミノ基と、プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体が有するカルボキシル基と反応させることにより、ペプチド結合を介して、プロテインＡ、プロテインＧ又はそれらの誘導体を核酸に結合させることができる。【００６６】  また、ビオチンアミダイドを用いて核酸を合成することにより核酸の５’末端にビオチンを導入することができる。【００６７】  また、スクシンイミジルビオチンと抗体が有する一級アミン基とを反応させることにより、アミド結合を介して、ビオチンを抗体に結合させることができる。【００６８】  また、還元した抗体（スルフヒドリル基を有する）とマレイミド活性化アビジンとを反応させることにより、マレイミドとスルフヒドリル基との結合を介して、アビジンを抗体に結合させることができる。【００６９】  また、核酸の５’末端に導入したアミノ基と、アビジン又はそれらの誘導体が有するカルボキシル基と反応させることにより、ペプチド結合を介して、アビジン又はそれらの誘導体を核酸に結合させることができる。【００７０】  特異的相互作用を生じる物質を核酸及び／又は抗体に結合させる時点は、工程（ｂ）を行う前である限り特に限定されるものではないが、工程（ａ）を行う際又は行った後に工程（ｂ）を行う場合には、工程（ａ）を行う前であることが好ましい。【００７１】  共有結合の形成を利用する場合、核酸又は抗体が有する官能基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成できる官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、スルフヒドリル基、アルデヒド基等が挙げられる。【００７２】  核酸又は抗体への所望の官能基の導入は、核酸又は抗体が有する官能基と反応できる架橋剤を使用して行うことができる。架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル（４−イオードアセチル）アミノベンゾエート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４−ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド（ｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ｄｉｔｈｉｏ−ｂｉｓ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）、６−ヒドラジノニコチミド（６−ｈｙｄｒａｚｉｎｏｎｉｃｏｔｉｍｉｄｅ）（ＨＹＮＩＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）（ＭＢＣ）等の多官能性試薬が挙げられる。【００７３】  例えば、抗体が有するカルボキシル基を利用する場合、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、核酸が有するアミノ基と反応させることにより、抗体と核酸とをアミド結合させることができる。また、抗体が有するアミノ基を利用する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、核酸が有するアミノ基と反応させることにより、抗体と核酸とをアミド結合させることができる。【００７４】  工程（ｂ）を行う時点は、工程（ａ）を行う前、行う際又は行った後のいずれの時点であってもよいが、特定物質間の特異的相互作用を利用する場合には、工程（ａ）を行う際又は行った後であることが好ましく、共有結合を利用する場合には、工程（ａ）を行う前であることが好ましい。【００７５】  抗体に結合していない一本鎖核酸（以下「未反応の一本鎖核酸」という場合がある。）、又は未反応の抗体に結合した一本鎖核酸が存在する場合には、これらの一本鎖核酸を工程（ｄ）を行う前に除去することが好ましく、工程（ｃ）を行う前に除去することがさらに好ましい。工程（ｃ）を行う前に除去することにより、抗原抗体複合体を構成する抗体に結合した一本鎖核酸の自己伸長を効率よく開始及び進行させることができる。【００７６】〔工程（ｃ）〕
工程（ｃ）は、前記工程（ａ）及び（ｂ）を行った後に、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下、かつ前記抗原抗体複合体の形成を維持できる温度条件下において、前記一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる工程である。【００７７】  デオキシヌクレオシド三リン酸は、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含む限り、その他の種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸等）を含んでいても含んでいなくてもよい。【００７８】  デオキシヌクレオシド三リン酸の濃度は特に限定されるものではないが、通常５０μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１００〜７５０μＭ、さらに好ましくは２００〜５００μＭである。【００７９】  デオキシヌクレオシド三リン酸は、標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を含むことができる。この場合、工程（ｄ）において、一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を検出することにより、一本鎖核酸の自己伸長を検出することができる。【００８０】  標識デオキシヌクレオシド三リン酸と未標識デオキシヌクレオシド三リン酸との混合比率は特に限定されるものではないが、通常１：１０〜１：８００、好ましくは１：２０〜１：６４０、さらに好ましくは１：４０〜１：１６０である。【００８１】  一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる際に使用する溶媒は、抗原抗体複合体の形成を維持できるとともに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害しない限り特に限定されるものではなく、その具体例としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、トリシン緩衝液等が挙げられる。これらの溶媒は、酵素反応に必要な二価陽イオン、好ましくはマグネシウムイオンを含み、必要に応じて血清アルブミン、グリセロール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等を含むことができる。これらの物質は、ＤＮＡポリメラーゼの酸化防止等の活性保護作用を有する。【００８２】  一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる際の温度は、抗原抗体複合体の形成を維持できる限り特に限定されるものではないが、通常４〜７５℃、好ましくは２０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４５℃である。【００８３】  一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼを作用させる時間は、一本鎖核酸の３’末端に十分の長さの塩基配列を付加できる限り特に限定されるものではないが、通常３０分間〜２４時間、好ましくは１〜８時間、さらに好ましくは２〜５時間である。【００８４】  一本鎖核酸に作用させるＤＮＡポリメラーゼ量は一本鎖核酸の３’末端に十分の長さの塩基配列を付加できる限り特に限定されるものではないが、一本鎖核酸１ｎｍｏｌｅ／０．１ｍＬに対して通常１〜５０Ｕ、好ましくは２〜２５Ｕ、さらに好ましくは５〜２０Ｕである。【００８５】  ＤＮＡポリメラーゼは、抗原抗体複合体の形成を維持できる温度条件において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮できる限り特に限定されるものではない。ＤＮＡポリメラーゼは、抗原抗体複合体の形成を維持できる温度条件において、一本鎖核酸の３’末端に十分の長さの塩基配列を付加できるようなＤＮＡポリメラーゼ活性を有することが好ましい。「十分の長さ」とは、通常１，０００〜５０，０００塩基、好ましくは２，０００〜５０，０００塩基、さらに好ましくは５，０００〜５０，０００塩基を意味し、ＤＮＡポリメラーゼは、十分の長さの塩基配列を通常３０分間〜１２時間、好ましくは３０分間〜６時間、さらに好ましくは３０分間〜２時間で付加できるようなＤＮＡポリメラーゼ活性を有することが好ましい。【００８６】  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する限り、天然に存在するものであってもよいし、天然に存在するものに改変を加えたものであってもよい。【００８７】  抗原抗体複合体の形成を維持できる温度条件において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮することができるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属等の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージに由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。【００８８】  エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物としては、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エシェリキア・フェルグソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）等が挙げられ、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント等が挙げられる。【００８９】  バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物としては、例えば、バチラス・スティーロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチラス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）等が挙げられ、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００９０】  サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、例えば、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス・９°  Ｎ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅＮ−７）等が挙げられ、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＤＮＡポリメラーゼ、９ｄｅｇｒｅｅ  ＮｍＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００９１】  テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の微生物としては、例えば、テルムス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、テルムス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）等が挙げられ、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００９２】  ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物としては、例えば、ピロコッカス・フィルオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）等が挙げられ、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｐｆｕポリメラーゼ等が挙げられる。【００９３】  サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の微生物としては、例えば、サーモトガ・マリティーマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）等が挙げられ、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の微生物に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｕｌｔｍａポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）等が挙げられる。【００９４】  バクテリオファージに由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。【００９５】  好ましいＤＮＡポリメラーゼとしては、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチラス・スティーロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・９°  Ｎ−７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅＮ−７）等に由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。【００９６】  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を有しないことが好ましく、両方を有しないことがさらに好ましい。その理由は２つあり、１つは、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）等に由来するＤＮＡポリメラーゼは、鋳型及びプライマーの非存在下でもＤＮＡ合成を行うが（Ｈａｎａｋｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３８，１１３−１１８（１９９７）；Ｏｇａｔａ，Ｎ．等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，４６５２−４６５６（１９９８））、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた、それらの改変ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型及びプライマー非存在下ではＤＮＡ合成を行わない（Ｈａｎａｋｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４４，２１０−２１９（１９９８）；Ｈａｎａｋｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４４，２１０−２１９（１９９８））からであり、もう１つは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を有するＤＮＡポリメラーゼはアデニンとチミンとの繰り返し配列からなるＤＮＡを消化する（Ｈａｎａｋｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４４，２１０−２１９（１９９８））からである。【００９７】  ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を欠損するＤＮＡポリメラーゼは、これらの活性を担うドメインを欠失させることにより作製することができる。所定のドメインの欠失は、部���特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより行うことができる。また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の一方又は両方を欠損する市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することができる。【００９８】  抗原抗体複合体の形成を維持できる温度条件下において、一本鎖核酸は、自己アニーリングによる分子内二本鎖の形成と、分子内二本鎖の融解とを繰り返しているので、一本鎖核酸にＤＮＡポリメラーゼが作用すると、自己プライミングによる自己伸長が開始及び進行する。【００９９】〔工程（ｄ）〕
工程（ｄ）は、前記工程（ｃ）を行った後に、前記抗原抗体複合体を構成する前記抗体に結合した前記一本鎖核酸の自己伸長を検出する工程である。【０１００】  工程（ａ）〜（ｃ）を行うことにより、抗原抗体複合体の形成が維持された状態のまま、一本鎖核酸が自己伸長する。したがって、工程（ｄ）において、抗原抗体複合体を構成する抗体に結合した一本鎖核酸の自己伸長を検出することにより、抗原抗体複合体を検出することができる。標的抗原が存在する場合には抗原抗体複合体が形成され、標的抗原が存在しない場合には抗原抗体複合体が形成されないので、抗原抗体複合体を検出することにより、標的抗原を検出することができる。【０１０１】  抗原抗体複合体を構成する抗体に結合した一本鎖核酸とともに、未反応の抗体に結合した一本鎖核酸、又は未反応の一本鎖核酸が存在する場合には、工程（ｄ）を行う前に、これらの一本鎖核酸を除去することが好ましい。これにより、抗原抗体複合体を構成する抗体に結合した一本鎖核酸の自己伸長の検出精度を向上させることができる。【０１０２】  未反応の抗体に結合した一本鎖核酸、又は未反応の一本鎖核酸は、工程（ａ）を行う前に予め標的抗原又は抗体を固相に固定しておき、工程（ｄ）を行う前に、固相を洗浄することにより除去することができる。【０１０３】  一本鎖核酸の自己伸長の検出方法は特に限定されるものではない。一本鎖核酸の自己伸長は、例えば、以下の方法に従って検出することができる。
工程（ｃ）において使用するデオキシヌクレオシド三リン酸が、標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を含む場合、工程（ｄ）において、一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた標識化デオキシアデノシン三リン酸、標識化デオキシチミジン三リン酸又は標識化デオキシウリジン三リン酸を検出することにより、一本鎖核酸の自己伸長を検出することができる。【０１０４】  一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた標識化デオキシヌクレオシド三リン酸を検出する前に、一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれずに残存する標識化デオキシヌクレオシド三リン酸（以下「未反応の標識化デオキシヌクレオシド三リン酸」という場合がある。）を除去することが好ましい。これにより、一本鎖核酸の伸長部分に取り込まれた標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の検出精度を向上させることができる。【０１０５】  未反応の標識化デオキシヌクレオシド三リン酸は、工程（ａ）を行う前に予め標的抗原又は抗体を固相に固定しておき、工程（ｃ）を行った後に固相を洗浄することにより除去することができる。【０１０６】  標識化デオキシヌクレオシド三リン酸が有する標識物質は特に限定されるものではなく、その具体例としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光物質；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ジゴキシゲニン；ビオチン；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステルの化学発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質；３２Ｐ、３５Ｓ等のアイソトープ等が挙げられ、好ましい標識物質としては、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光色素；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ジゴキシゲニン；ビオチン等が挙げられる。【０１０７】  また、工程（ｄ）において、核酸の二重らせん構造にインターカレーションできる標識物質と一本鎖核酸とを反応させ、一本鎖核酸の分子内二重らせん構造にインターカレーションした標識物質を検出することにより、一本鎖核酸の自己伸長を検出することができる。なお、一本鎖核酸は、自己アニーリングにより分子内二本鎖を形成するので、標識物質は分子内二本鎖を形成している一本鎖核酸にインターカレーションすることができる。【０１０８】  核酸の二重らせん構造にインターカレーションできる標識物質は特に限定されるものではなく、その具体例としては、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、プロピジウムヨーダイド、等の蛍光物質が挙げられる。ＤＡＰＩは、アデニン及びチミンの割合が大きい塩基配列に優先的にインターカレーションできる点で好ましい。【０１０９】  本発明に係る標的抗原の検出用キットは、標的抗原に対する抗体と、一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）：
2004111232.tif 000006
［式中、Ｘはアデニン、チミン又はウラシルを表し、Ｘがアデニンを表すときＹはチミン又はウラシルを表し、Ｘがチミン又はウラシルを表すときＹはアデニンを表し、Ｚは任意の塩基配列を表し、ｎは２以上の整数を表す。］
のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸とを含む限り、その他の要素を含むことができる。【０１１０】  その他の要素としては、例えば、デオキシアデノシン三リン酸とデオキシチミジン三リン酸及び／又はデオキシウリジン三リン酸とを含むデオキシヌクレオシド三リン酸、標識物質、ＤＮＡポリメラーゼ、固相、反応溶媒、核酸又は抗体を化学修飾するための試薬等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を含むことができる。【０１１１】  標的抗原と一般式（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれかで表される塩基配列からなる一本鎖核酸とは、結合した状態でキットに含まれていてもよいし、結合していない状態でキットに含まれていてもよい。また、結合できるように化学修飾された状態でキットに含まれていてもよいし、結合できるように化学修飾されていない状態でキットに含まれていてもよい。【０１１２】  本発明に係る標的抗原の検出方法及び検出用キットにおいて、標的抗原がタンパク質である場合、抗体の代わりに、標的タンパク質に特異的に結合できるその他の物質（以下「その他の結合性物質」という。）を使用することができる。【０１１３】  標的タンパク質／その他の結合性物質の組み合わせとしては、例えば、アビジン又はその誘導体（例えば、ストレプトアビジン、エクストラアビジン（ＥｘｔｒａＡｖｉｄｉｎ）、ニュートロアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ））／ビオチン又はその誘導体（例えば、イミノビオチン、カルボビオチン、ビオチンヒドラジド）；抗体又はその断片／プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ又はそれらの誘導体（例えば、プロテインＡとＧとの融合タンパク質であるプロテインＡ／Ｇ（ピアス社製）、抗体との結合に寄与しない領域を除いた改変体であるプロテインＧ’（シグマ社製）、プロテインＬとＡとの融合タンパク質であるプロテインＬＡ（シグマ社製））；受容体タンパク質／リガンド（例えば、ホルモン受容体／環境ホルモン、Ｆａｓ受容体／Ｆａｓリガンド）；酵素／基質；マルトース結合タンパク質／マルトース；ポリヒスチジンペプチド／ニッケル、コバルト等の金属イオン；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン；カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド；ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ；Ｆ−アクチン／ファロトキシン；デオキシリボヌクレアーゼ／Ｇ−アクチン等が挙げられる。【０１１４】  その他の結合性物質を使用する場合、工程（ａ）〜（ｃ）を行うことにより、標的タンパク質と上記結合性物質とを含む複合体の形成が維持された状態のまま、一本鎖核酸が自己伸長する。したがって、工程（ｄ）において、上記複合体を構成する上記結合性物質に結合した一本鎖核酸の自己伸長を検出することにより、上記複合体を検出することができる。標的タンパク質が存在する場合には上記複合体が形成され、標的タンパク質が存在しない場合には上記複合体が形成されないので、上記複合体を検出することにより、標的タンパク質を検出することができる。
【実施例】
【０１１５】  以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。
〔実施例１〕アビジン化抗体の調製
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．６）で５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗マウスＩｇＧヤギＩｇＧ（ジャクソンイムノリサーチ社製）に、０．１ｍＬの２−メルカプトエチラミン塩酸塩溶液（１０ｇ／Ｌの２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｌａｍｉｎｅ・ＨＣｌ，０．１ＭのＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐａｔｅ，５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．６）を加え、３７℃で９０分間処理した。【０１１６】  室温まで冷却した後、還元ＩｇＧを２−メルカプトエチラミン塩酸塩と分離するために、１．１ｍＬの反応液をポリアクリルアミド脱塩カラムに通した後、マレイミド標識用バッファー（０．１ＭのＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐａｔｅ，５ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ７．６）で溶出させた。【０１１７】  還元ＩｇＧをアビジン化するために、１．９ｍｇ／ｍＬの還元ＩｇＧと５ｍｇ／ｍＬのマレイミド活性化ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ピアス社製）とを１ｍＬずつ等量混合し、室温で３時間反応させた。
未反応のアビジンとＥＤＴＡとを除去するために、分子量１０，０００の物質を透過させる透析膜へ反応液を封入し、ＰＢＳを用いて４℃で一晩透析することにより、アビジン化抗体を得た。【０１１８】〔実施例２〕オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）結合化抗体の調製
５’末端にアミノ基を導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）０．５ｍｇを１ｍｏｌｅ／Ｌのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）０．５ｍＬに溶解し、次いで、１ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（ピアス社製）を添加し、室温で１時間混和した。【０１１９】  マレイミド標識化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）を精製するために、反応液をデキストラン脱塩カラムに通した後、マレイミド標識化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）を１ｍＬのマレイミド標識用バッファーで溶出させた。【０１２０】  マレイミド標識化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）と、実施例１で調製した１．９ｍｇ／ｍＬの還元ＩｇＧとを１ｍＬずつ等量混合し、４℃で一晩反応させた。【０１２１】  未反応のマレイミド標識化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）とＥＤＴＡとを除去するために、分子量１０，０００の物質を透過させる透析膜へ反応液を封入し、ＰＢＳを用いて４℃で一晩透析することにより、オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）結合化抗体を得た。【０１２２】〔実施例３〕オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による標識効率の比較
５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）をＴＢＳＴ（２５ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．１％のＢＳＡ，０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）に溶解し、１ｐＭ、１０ｐＭ及び１００ｐＭのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）溶液を調製した。【０１２３】  それぞれのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）溶液を０．１ｍＬ／ウェルでアビジン固相化９６ウェルプレート（ピアス社製）に滴下し（Ｎ＝４）、室温で３０分間静置した。【０１２４】  ウェルをＴＢＳＴで５回洗浄して未反応のオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）を除去し、次いで、５Ｕ／１００μＬの酵素、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２．５μＭのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ，ロシュ社製）を含む酵素溶液を各酵素添付のバッファーで調製し、５０μＬ／ウェルを滴下した。【０１２５】  酵素反応に用いた酵素は、
（１）ＢｓｔポリメラーゼＬａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ社製，バチラス・スティーロサーモフィラス由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）（以下「Ｂｓｔ−ＬＦ」という。）
（２）△Ｔｔｈポリメラーゼ（東洋紡社製，テルムス・サーモフィルス由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）
（３）Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｅｘｏ−）（ＮＥＢ社製，エシェリキア・コリ由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）（以下「ＫＦ−」という。）
（４）Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製，エシェリキア・コリ由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性有り）（以下「ＫＦ」という。）
（５）ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡社製，サーモコッカス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性有り）
（６）Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラテジーン社製，ピロコッカス・フィルオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性有り）
（７）Ｓｔｏｆｆｅｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製，テルムス・アクアティカス由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）（以下「ＳＦ」という。）
（８）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ（ＮＥＢ社製，サーモコッカス・９°  Ｎ−７由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）
（９）Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ社製，サーモコッカス・リトラリス由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性有り）である。【０１２６】  それぞれの反応バッファー組成は、Ｂｓｔ−ＬＦ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ及びＶｅｎｔポリメラーゼについては、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．８）、１０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭの硫安、２ｍＭの硫化マグネシウム及び０．１％のトリトン系界面活性剤であり、△Ｔｔｈポリメラーゼ及びＳＦについては、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８．９）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、８０ｍＭの塩化カリウム、０．１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のトリトン系界面活性剤及び０．５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンであり、ＫＦ−及びＫＦについては、１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム及び７．５ｍＭのジチオスレイトールであり、ＫＯＤポリメラーゼについては、１２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの塩化カリウム、６ｍＭの硫安、０．１％のトリトン系界面活性剤及び１０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンである。【０１２７】  酵素反応を３７℃で３時間行った後、ＴＢＳＴでウェルを５回洗浄した。ＴＢＳＴで５０ｍＵ／ｍＬの濃度に調整したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片（ロシュ社製）を５０μＬ／ウェル滴下し、３７℃で３０分間静置した後、ウェルをＴＢＳＴで５回洗浄した。発色反応は、テトラメチルベンジジン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，シグマ社製）溶液を３０μＬ／ウェル滴下し、暗室中、室温で１０分間行った。２規定の硫酸を７０μＬ／ウェル滴下して発色反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１２８】  結果を図１に示す。図１に示すように、ＫＦ−及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼを用いた場合、固相化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）が１ｐＭ以上であれば、オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の伸長部分に取り込まれたジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを有意に検出できた。また、Ｂｓｔ−ＬＦ、ＫＦ及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼを用いた場合、固相化オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）が１０ｐＭ以上であれば、オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の伸長部分に取り込まれたジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを有意に検出できた。【０１２９】〔実施例４〕オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による標識効率と標識ｄＵＴＰ濃度との関係
５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）をＴＢＳＴで溶解して１０ｐＭ溶液を調製し、アビジン固相化９６ウェルプレートに０．１ｍＬ／ウェル滴下した。室温３０分間静置した後、ウェルをＴＢＳＴで５回洗浄して未反応のオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）を除去した。【０１３０】  次いで、５Ｕ／１００μＬのＫＦ−又はＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ又は１２．５μＭのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを含む酵素溶液を各酵素添付のバッファーで調製し、５０μＬ／ウェル滴下した（Ｎ＝４）。【０１３１】  酵素反応のために、プレートを３７℃又は６０℃で３時間静置した後、ウェルをＴＢＳＴで５回洗浄した。
以下、実施例３と同様の処理を行った後、吸光度を測定した。【０１３２】  結果を図２に示す。図２に示すように、ＫＦ−は３７℃において、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼは６０℃において、ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの濃度がｄＴＴＰ：標識ｄＵＴＰ＝１６０：１であっても、ｄＴＴＰ：標識ｄＵＴＰ＝１０：１のときと遜色なく、オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の伸長部分に取り込まれたジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを有意に検出できた。【０１３３】〔実施例５〕３７℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出
３％ホルマリンで室温１０分間処理した後、０．５％トリトン系界面活性剤を含むＰＢＳで室温５分間処理したＶｅｒｏ細胞を、一次抗体を用いて３７℃で１時間処理し、次いで、二次抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。一次抗体として、ＰＢＳで５００倍希釈した抗ゴルジ蛋白５８Ｋマウスモノクローナル抗体（シグマ社製）を用い、二次抗体として、ＰＢＳで１，０００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清（ジャクソンイムノリサーチ社製）を用いた。【０１３４】  次いで、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度に調整したストレプトアビジン（和光純薬工業社製）を用いて３７℃で３０分間処理し、最後に、ＰＢＳで１０ｎＭの濃度に調整した５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）を用いて３７℃で３０分間処理した。【０１３５】  酵素反応に用いた酵素は、
（１）Ｂｓｔ−ＬＦ
（２）△Ｔｔｈポリメラーゼ
（３）ＫＦ−
（４）ＳＦ
（５）Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ
（６）Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ（ＮＥＢ社製，サーモコッカス・リトラリス由来，５’→３’エキソヌクレアーゼ活性無し，３’→５’エキソヌクレアーゼ活性無し）である。【０１３６】  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼの反応バッファー組成は、Ｂｓｔ−ＬＦのものと同一である。【０１３７】  酵素反応は、それぞれのバッファーに５Ｕ／１００μＬの酵素、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．０１ｍＭのローダミン標識ｄＵＴＰ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ−５−ｄＵＴＰ、ロシュ社製）を含む溶液を用いて、３７℃で３時間保温して行った。それぞれの処理の間に、５分間の振盪によるＰＢＳ洗浄を３回行った。顕微鏡観察は、励起フィルター：５２０〜５５０ｎｍ、蛍光フィルター：＞５８０ｎｍ、６０倍油浸対物レンズで実施した。【０１３８】  結果を図３に示す。図３に示すように、Ｂｓｔ−ＬＦ又はＫＦ−を用いた場合、ローダミン（赤色）による顕著な染色が認められた。【０１３９】〔実施例６〕６０℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出
酵素反応を６０℃で３時間保温して行った点以外は、実施例５と同様に処理した。
結果を図４に示す。図４に示すように、Ｂｓｔ−ＬＦ、ＫＦ−、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒポリメラーゼ又はＶｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼを用いた場合、ローダミン（赤色）による顕著な染色が認められた。【０１４０】〔実施例７〕７４℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出
酵素反応を７４℃で３時間保温して行った点以外は、実施例５と同様に処理した。
結果を図５に示す。図５に示すように、Ｂｓｔ−ＬＦ又はＫＦ−を用いた場合、ローダミン（赤色）による顕著な染色が認められた。【０１４１】〔実施例８〕ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いた細胞内抗原の検出
実施例５の方法に従い、酵素反応を、５Ｕ／１００μＬのＫＦ−、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰを含む溶液を用いて３７℃で３時間保温して行った。細胞は、抗原抗体反応を行っていない対照細胞とともに、ＰＢＳで３ｎＭの濃度に調整したＤＡＰＩで染色した。顕微鏡観察は、励起フィルター：３３０〜３８５ｎｍ、蛍光フィルター：＞４２０ｎｍ、６０倍油浸対物レンズで実施した。【０１４２】  結果を図６に示す。図６に示すように、対照細胞では核のみ染色されたが、オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長反応を行った細胞では核近傍にＤＡＰＩ被染色核酸が観察され、それはゴルジ体の分布と一致した。【０１４３】〔実施例９〕酵素反応時間依存シグナル増幅
３％ホルマリンを用いて室温で１０分間処理した後、０．５％トリトン系界面活性剤を含むＰＢＳを用いて室温で１０分間処理したＶｅｒｏ細胞を、一次抗体を用いて３７℃で１時間処理し、次いで、二次抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。一次抗体として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４，０００倍に希釈した抗ＧＭ１３０マウスモノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）を用い、二次抗体として、ＰＢＳＴで５００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清を用いた。【０１４４】  次いで、ＰＢＳＴで２μｇ／ｍＬの濃度に調整したストレプトアビジンを用いて室温で３０分間処理し、最後に、ＰＢＳＴで１μＭの濃度に調整した５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）を用いて室温で３０分間処理した。それぞれの処理の間に、５分間の振盪によるＰＢＳＴ洗浄を３回行った。【０１４５】  酵素反応は、５Ｕ／１００μＬのＫＦ−、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２．５μＭのローダミン標識ｄＵＴＰを含む溶液（１０ｍＭのトリス塩酸，ｐＨ７．５，５ｍＭの塩化マグネシウム，７．５ｍＭのジチオスレイトール）を用いて３７℃で１、２又は４時間保温して行った。顕微鏡観察は、励起フィルター：５２０〜５５０ｎｍ、蛍光フィルター：＞５８０ｎｍ、６０倍油浸対物レンズで実施した。【０１４６】  結果を図７に示す。図７に示すように、細胞核周囲（ゴルジ体）のシグナル（ローダミン（赤色）による染色）が酵素反応時間依存的に増強された。【０１４７】〔実施例１０〕酵素反応時間依存シグナル増幅
実施例９と同様にホルマリン固定したＶｅｒｏ細胞を、一次抗体を用いて３７℃で１時間処理し、次いで、二次抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。一次抗体として、ＰＢＳＴで４，０００倍に希釈した抗ＺＯ−１マウスモノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）を用い、二次抗体として、ＰＢＳＴで５００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清を用いた。【０１４８】  次いで、ＰＢＳＴで２μｇ／ｍＬの濃度に調整したストレプトアビジンを用いて室温で３０分間処理し、最後に、ＰＢＳＴで１μＭの濃度に調整した５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）を用いて室温で３０分間処理した。それぞれの処理の間に、５分間の振盪によるＰＢＳＴ洗浄を３回行った。【０１４９】  酵素反応は、５Ｕ／１００μＬのＫＦ−、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰを含む溶液（１０ｍＭのトリス塩酸，ｐＨ７．５，５ｍＭの塩化マグネシウム，７．５ｍＭのジチオスレイトール）を用いて３７℃で１、２又は４時間保温し、５分間の振盪によるＰＢＳＴ洗浄を３回行った。それぞれの細胞は、ＰＢＳで１ｎＭの濃度に調整したＤＡＰＩを用いて室温で５分間染色し、実施例８と同じ条件で顕微鏡観察を行った。【０１５０】  結果を図８に示す。図８に示すように、細胞核周囲（ゴルジ体）のシグナル（ＤＡＰＩによる染色）が酵素反応時間依存的に増強された。【０１５１】〔実施例１１〕抗原検出感度に関する従来法と本発明の方法との比較
実施例５の方法に従って細胞を調製し、一次抗体を用いて３７℃で１時間処理した後、二次抗体を用いて３７℃で３０分間処理した。一次抗体として、ＰＢＳで５００倍希釈した抗ゴルジ５８Ｋ蛋白マウスモノクローナル抗体（シグマ社製）を用い、二次抗体として、ＰＢＳで２００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清（ジャクソンイムノリサーチ社製）を用いた。【０１５２】  従来法では、ＰＢＳで２μｇ／ｍＬの濃度に調製したフルオレセイン標識ストレプトアビジン（シグマ社製）を用いて３７℃で３０分間保温した。本発明の方法では、実施例１の方法に従い、ＫＦ−、フルオレセイン標識ｄＵＴＰを用いて３７℃一晩保温した。顕微鏡観察は、励起フィルター：４７０〜４９０ｎｍ、蛍光フィルター：５１０〜５５０ｎｍ、６０倍油浸対物レンズで実施した。【０１５３】  結果を図９に示す。図９に示すように、本発明の方法では従来法よりもフルオレセインによるシグナルが増強された。【０１５４】〔実施例１２〕抗原検出感度に関する従来法と本発明の方法との比較
実施例９の方法に従って細胞を調製し、３％過酸化水素を含むＰＢＳを用いて室温で１時間処理し、内在性のペルオキシダーゼを不活化した。次いで、一次抗体を用いて３７℃で１時間処理した。一次抗体として、ＰＢＳＴで５００倍から６２，５００倍までの５倍段階希釈列を調整した抗ＺＯ−１マウスモノクローナル抗体を用いた。【０１５５】  本発明の方法では、ローダミン標識ｄＵＴＰの代わりにフルオレセイン標識ｄＵＴＰを用いた以外は、実施例９と同様の条件で処理を行った。【０１５６】  従来法としてシグナル増幅法（ＴＳＡ）及び間接抗体法（ＩＦ）を選択した。ＴＳＡでは、５００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清を二次抗体として用いた以外は、ＴＳＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（パーキンエルマー社製）の添付文書に従って反応を行った。ＩＦでは、ＰＢＳで５０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマ社製）を用いて３７℃１時間処理した。【０１５７】  結果を図１０に示す。なお、図１０中、（Ａ）は本発明の方法での結果、（Ｂ）はＴＳＡでの結果、（Ｃ）はＩＦでの結果、「ＮＣ」は一次抗体を含まない場合（ネガティブコントロール）の結果を示す。【０１５８】  図１０に示すように、本発明の方法では、ＴＳＡに比べて５倍、ＩＦに比べて２５倍薄い一次抗体濃度で細胞同士が接着している細胞膜部位を染色することができた。【０１５９】〔実施例１３〕抗原検出感度に関する従来の酵素免疫測定法と本発明の方法との比較
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ）を５０ｍＭの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に溶解して調製した１，０２４ｎｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまでの２倍段階希釈列を、９６ウェルイムノプレート（マキシソープ、ナルジェヌンク社製）へ２００μＬ滴下した（Ｎ＝３）。【０１６０】  ４℃で一晩静置した後、炭酸バッファーで２回ウェルを洗浄し、０．５％ＢＳＡ加炭酸バッファーを２００μＬ／ウェル滴下し、３７℃で一時間静置した。ＢＳＡ加炭酸バッファーを除去した後、ＰＢＳＴで１，０００倍希釈した抗ＨＢｓマウスモノクローナル抗体（ケミコン社製）を１００μＬ／ウェル滴下し、３７℃で３０分間静置した。【０１６１】  ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳＴで１，０００倍希釈したビオチン標識抗マウス抗体ウサギ免疫血清を１００μＬ／ウェル滴下し、３７℃で３０分間保温した。ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳＴで５００ｎｇ／ｍＬに調製したストレプトアビジンを１００μＬ／ウェル滴下し、室温で３０分間処理した。【０１６２】  ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳＴで０．１μＭの濃度に調整した５’末端にビオチンを導入したオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）（５’−ａｔａｔａｔａｔａｔａｔａｔａ−３’）を１００μＬ／ウェル滴下し、室温で３０分間処理した。ＰＢＳＴでウェルを５回洗浄し、さらにＰＢＳでウェルを２回洗浄した。【０１６３】  次いで、５Ｕ／１００μＬのＫＦ−、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２．５μＭのジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰを含む酵素溶液（１０ｍＭのトリス塩酸，ｐＨ７．５，５ｍＭの塩化マグネシウム，７．５ｍＭのジチオスレイトール）を８０μＬ／ウェル滴下し、３７℃で３時間処理した。【０１６４】  ＰＢＳＴでウェルを５回洗浄した後、ＰＢＳＴで２００ｍＵ／ｍＬの濃度に調整したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ジゴキシゲニンＦａｂ断片を７０μＬ／ウェル滴下し、３７℃で３０分間静置した。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、テトラメチルベンジジン溶液を５０μＬ／ウェル滴下し、暗室中、室温で５分間発色を行った。２規定の硫酸を１００μＬ／ウェル滴下して発色反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１６５】  従来法では、二次抗体として、ＰＢＳＴで５００倍希釈したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）を用い、３７℃で３０分間静置した。ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄した後、テトラメチルベンジジン溶液を５０μＬ／ウェル滴下し、暗室中、室温で５分間発色を行った。２規定の硫酸を１００μＬ／ウェル滴下して発色反応は停止し、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１６６】  結果を図１１に示す。図１１に示すように、本発明の方法では８ｎｇ／ｍＬのＨＢｓを検出することができたが、従来法では１２８ｎｇ／ｍＬ以上のＨＢｓでないと検出することができなかった。
産業上の利用の可能性【０１６７】  本発明によれば、抗原抗体反応を利用して標的抗原を高感度に検出することができる方法及びキットが提供される。【０１６８】  また、本発明によれば、標的抗原が細胞表面抗原又は細胞内抗原である場合、標的抗原を高感度に検出することができるとともに、標的抗原の細胞内分布を検出することができる方法及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】［図１］オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による標識効率に関する各種ＤＮＡポリメラーゼ間の比較結果を示す図である。
［図２］オリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による標識効率と標識ｄＵＴＰ濃度との関係を示す図である。
［図３］３７℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出結果を示す図である。
［図４］６０℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出結果を示す図である。
［図５］７４℃でのオリゴ（ｄＡ−ｄＴ）の自己伸長による細胞内抗原の検出結果を示す図である。
［図６］ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いた核酸染色による細胞内抗原の検出結果を示す図である。
［図７］標識物質によるシグナル（ローダミン（赤色）による染色）が酵素反応時間依存的に増強されたことを示す図である。
［図８］標識物質によるシグナル（ＤＡＰＩによる染色）が酵素反応時間依存的に増強されたことを示す図である。
［図９］抗原検出感度に関する従来法と本発明の方法との比較結果を示す図である。
［図１０］抗原検出感度に関する従来法（シグナル増幅法（ＴＳＡ）及び間接抗体法（ＩＦ））と本発明の方法との比較結果を示す図である。
［図１１］抗原検出感度に関する従来の酵素免疫測定法と本発明による方法との比較結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2004111232.tif 000022
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