(57)【要約】本発明は活性のあるリボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、インビボまたはエクスビボにおいて、広い範囲の組織に所望のリボザイムを発現させるための遺伝子治療ベクターとして適している。本発明のベクターは、癌やその他の疾患における遺伝子治療ベクターとして有用である。
2004067752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒作用をもつＲＮＡをコードするパラミクソウイルスベクター。
【請求項２】
該ＲＮＡの鎖長が５０ヌクレオチド以上であることを特徴とする、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項３】
該ＲＮＡの鎖長が６０ヌクレオチド以上であることを特徴とする、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項４】
該ＲＮＡがハンマーヘッドリボザイムである、請求項１に記載のパラミクソウイルスベクター。
【請求項５】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１に記載のウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、触媒作用を持つＲＮＡをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関する。
【背景技術】  リボザイムなどの触媒作用をもつ低分子ＲＮＡは真核生物の遺伝子発現を押さえるために用いられており、近年はヒトへの遺伝子治療への適用も注目されている。ハンマーヘッド型リボザイムはおもに細胞質で活性があるとされ、効率良く細胞質へ輸送されるかが成功の鍵を握っている（Ｋｏｓｅｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（３），１８６８−７７；Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６（５），１８８６−９１）。しかし既存のベクターは主に核内で発現されるものが多く、そのため発現したリボザイムの核外への輸送の効率が大きなハードルの一つとなっている。
【発明の開示】
本発明は、触媒作用を持つＲＮＡをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用を提供することを課題とする。
本発明者らは、ウイルスの転写および複製においてＤＮＡフェーズを持たないパラミクソウイルスは、細胞質で遺伝子発現が行われるため、潜在的にはリボザイムに適したベクターとなる可能性があると考えた。しかし、これまでパラミクソウイルスベクターでリボザイムを発現させた例はなく、活性のあるリボザイムが細胞内で転写され機能できるかは知られていない。そこで本発明者らは、活性のあるリボザイムを発現できるパラミクソウイルスベクターを開発するため、センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターにリボザイムをコードする遺伝子を組み込み、ベクターを細胞に感染させてその効果を検証した。ターゲットとして大腸ガンではおもに変異が多いとされるＫ−ｒａｓを選んだ。Ｒａｓタンパク質は細胞内のシグナル伝達を担うＧタンパク質の一つで、１２番目のアミノ酸がバリンに置き換わると細胞をガン化させる効果を持つことが示されており、この１２番目の変異を含む領域をターゲットとしたリボザイムの実験例いくつか報告されている（Ｆｕｎａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（３），４９５−５００；Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（３），３７３−８３；Ｔｓｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２５３（２），３６８−７３；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２３），２０４１−５０）。本発明においては、既に報告例のあるＫ−ｒａｓリボザイムの他に認識部位の長さが異なるリボザイムをデザインし、効果をみた。その結果、リボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターの感染により細胞内のＫ−ｒａｓの発現を有意に抑制することができた。また、リボザイムの鎖長を５０ヌクレオチド以上とすることにより、それより短いリボザイムに比べ、ベクターから発現させたときのリボザイムの効果を著しく高めることが可能であることを見いだした。リボザイムの鎖長を６０ヌクレオチド以上とすることにより、ベクター導入によるリボザイムの活性はさらに上昇し、鎖長を７０ヌクレオチド以上とすることによりさらに高まった。
このように本発明は、活性を持つリボザイムをパラミクソウイルスベクターから発現させることに初めて成功し、ベクターに搭載するリボザイムの鎖長を調節することにより、パラミクソウイルスベクターから発現されるリボザイムを活性を高めることができることを示した。パラミクソウイルスは極めて広い組織に感染できることから、リボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターを用いることにより、これまでのベクターでは導入が困難であった組織や細胞に対してもリボザイムによる遺伝子治療が可能になる。例えば種々のガンに対し、本発明のリボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターを用いて癌遺伝子などの発現を阻害することによる遺伝子治療が可能となる。このように、リボザイムを発現するパラミクソウイルスベクターは、様々な臨床場面での適用が想定される。
本発明は、リボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明、特に、同一の独立項（他の項に記載の発明に包含されない発明に関する項）を引用する項（従属項）に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、
（１）触媒作用をもつＲＮＡをコードするパラミクソウイルスベクター、
（２）該ＲＮＡの鎖長が５０ヌクレオチド以上であることを特徴とする、（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（３）該ＲＮＡの鎖長が６０ヌクレオチド以上であることを特徴とする、（１）に記載のパラミクソウイルスベクター、
（４）該ＲＮＡがハンマーヘッドリボザイムである、（１）から（３）のいずれかに記載のパラミクソウイルスベクター、
（５）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、（１）から（４）のいずれかに記載のウイルスベクター、に関する。
本発明において組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、その両端が自然の状態と同じようには連結されていない。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換え蛋白質は、蛋白質をコードする組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成させることができる。組み換え蛋白質は、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した蛋白質および人工的に合成された蛋白質が含まれる。
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。またリボザイムをコードする核酸をそのリボザイムの遺伝子という。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質またはリボザイムをコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質またはリボザイムを適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸またはリボザイムをコードする核酸をセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。パラミクソウイルスにおいては、ウイルスゲノム中の遺伝子はアンチセンスにコードされている。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、触媒作用を持つＲＮＡ（リボザイム）を発現可能にコードしている。すなわち、本発明のパラミクソウイルスベクターは、ウイルスゲノムの３’リーダー配列と５’テーラー配列の間に、リボザイムＲＮＡのアンチセンス配列を含んでいる。
本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウィルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウィルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウィルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、具体的にはセンダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウィルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウィルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウィルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウィルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウィルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
本発明においてベクターとは、核酸を細胞に導入する担体である。パラミクソウイルスベクターとは、パラミクソウイルスに由来する、核酸を細胞に導入する担体である。上記のように、ＳｅＶなどのパラミクソウィルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない。このため染色体異常による癌化や不死化などの安全面における問題が生じない。パラミクソウィルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、ＳｅＶを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。これにより、２つ以上のリボザイムを同一ベクターから発現させることができる。
また、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７）。更に特筆すべき利点として以下の２点、すなわち「高感染性」及び「高発現量」を挙げることができる。ＳｅＶベクターは細胞膜蛋白や脂質糖鎖のシアル酸に結合して感染するが、このシアル酸はほとんどの細胞で発現しており、このことが感染スペクトルを広くする、則ち高感染性に繋がっている。ＳｅＶのレプリコンをベースにした複製型ベクターは放出されたウイルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。また、細胞質のみでの転写・複製という特徴的な発現機構であることから、搭載遺伝子の発現量が非常に高いことが示されている（Ｍｏｒｉｙａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２５（１）１０５−１１１（１９９８）；ＷＯ００／７００７０）。更に、エンベロープ遺伝子を欠失して非伝播性にしたＳｅＶベクターの回収にも成功しており（ＷＯ００／７００７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））、「高感染性」及び「高発現量」を維持して、「安全性」をさらに高めるための改良が進行している。
センダイウイルスのこれらの特徴は、ＳｅＶを初めとするパラミクソウィルスベクターは有効な遺伝子治療用および遺伝子導入用ベクターであり、リボザイムのインビボまたはエクスビボでの発現を目的とした遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。パラミクソウィルスベクターに治療用（または解析用）のリボザイムをコードする遺伝子を搭載して局所投与することで、リボザイムの局所的な高い発現が可能となり、治療効果の確実性とともに副作用の軽減が期待される。このような効果は、一過的に強発現が誘導される、ＳｅＶを初めとするパラミクソウィルスベクターだからこそ、より有効であると考えられる。
パラミクソウイルスベクターは、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡを含んでいる。ゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、該核酸が複製して娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡを言う。パラミクソウイルスは一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであるので、このようなＲＮＡは搭載遺伝子をアンチセンスとしてコードしている。一般にパラミクソウィルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）−介在配列（Ｉ配列）−転写開始配列（Ｓ配列）が存在し、これにより各遺伝子が別々のシストロンとして転写される。本発明のベクターに含まれるゲノムＲＮＡは、該ＲＮＡにコードされる遺伝子群の発現およびＲＮＡ自身の自律的な複製に必要なウイルス蛋白質であるＮ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、およびＬ（ラージ）をアンチセンスにコードしている。また該ＲＮＡは、ウイルス粒子の形成に必要なＭ（マトリックス）蛋白質をコードしていてもよい。さらに該ＲＮＡは、ウイルス粒子の感染に必要なエンベロープ蛋白質をコードしていてもよい。パラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質としては、細胞膜融合を起こす蛋白質であるＦ（フュージョン）蛋白質および細胞への接着に必要なＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）蛋白質が挙げられる。但し、ある種の細胞では感染にＨＮ蛋白質は必要なく（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２（４）：９７８−９８２（１９８５））、Ｆ蛋白質のみで感染が成立する。また、Ｆ蛋白質および／またはＨＮ蛋白質以外のウイルスエンベロープ蛋白質をコードさせてもよい。
本発明のパラミクソウイルスベクターは、例えばパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質からなる複合体、すなわちリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であってよい。ＲＮＰは、例えば所望のトランスフェクション試薬と組み合わせて細胞に導入することができる。このようなＲＮＰは、具体的にはパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡ、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質を含む複合体である。ＲＮＰは細胞内に導入されると、ウイルス蛋白質の働きによりゲノムＲＮＡからウイルス蛋白質をコードするシストロンが転写されると共に、ゲノム自身が複製され娘ＲＮＰが形成される。ゲノムＲＮＡの複製は、該ＲＮＡのコピー数の増加をＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼーション等により検出することにより確認することができる。
また本発明のパラミクソウイルスベクターは、好ましくはパラミクソウイルスのウイルス粒子である。ウイルス粒子とは、ウイルス蛋白質の働きにより細胞から放出される、核酸を含む微小粒子を言う。パラミクソウイルスのウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡとウイルス蛋白質を含む上記ＲＮＰが細胞膜由来の脂質膜（エンベロープという）に含まれた構造をしている。ウイルス粒子は、感染性を示すものであってよい。感染性とは、パラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の核酸を導入することのできる能力を言う。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、あるいは複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
例えばパラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、Ｎ遺伝子は″ＮＰ″とも表記される。
レスピロウィルス属      ＮＰ    Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    ＨＮ    −      Ｌ
ルブラウィルス属        ＮＰ    Ｐ／Ｖ        Ｍ    Ｆ    ＨＮ  （ＳＨ）  Ｌ
モービリウィルス属      ＮＰ    Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    Ｈ      −      Ｌ
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、Ｎ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
これらのウイルス蛋白質のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子は６つではないが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般にＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自立的にＲＮＡゲノムから遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは複製能を有するウイルスベクターとなる。リボザイムをコードする遺伝子は、後述するように、このゲノム中の３’リーダー配列と５’テーラー配列の間の、蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが不活化または欠失したパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子、ＨＮ遺伝子、Ｍ遺伝子、およびそれらの２つまたは３つの組み合わせが挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５、ＷＯ００／７００７０、ＷＯ０３／０２５５７０；Ｌｉ，Ｈ．−Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１４）６５６４−６５６９（２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムが元来コードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的として感染するベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また本発明のベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウィルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを作製することもできる。
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。
本発明のベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターのゲノム中に、リボザイムをコードするＲＮＡを有する。本発明において「リボザイム」とは、触媒作用を有するＲＮＡを言う（Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９８１，２７：４８７−４９６；小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０）。触媒作用に制限はなく、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の切断と連結、鋳型を使ったＲＮＡ複製、ＲＮＡのアミノアシル化、ｔＲＮＡから５’水酸基へのアミノ酸転移、自己リン酸化、ヌクレオチド合成、ペプチド結合形成などが挙げられるが、特に重要なのはＲＮＡ切断活性である。本発明においてベクターに搭載させるリボザイムは所望のタイプであってよく、例えば、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、デルタ肝炎ウイルスリボザイム、リボヌクレアーゼＰのＲＮＡサブユニット、グループＩ及びグループＩＩイントロン、およびそれらの改変体などであってよい。ここで改変とは、核酸配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を意味する。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化系を用いて天然のリボザイムを改変し、活性の高い改変リボザイムを得る方法が知られている（Ｊｏｙｃｅ．１９９２．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｐｐ．３５３−３７２．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．）。またリボザイムは２量体で機能するものであってもよい。
本発明においてベクターに搭載させるのに特に好ましいリボザイムはハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイムである。ハンマーヘッドリボザイムは、天然においてはウイロイドなどから単離されており（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２３：３４９−３５３；Ｇ．Ａ．Ｐｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６，２３１：１５７７−１５８０）、もともとは三つのループと三つのヘリックスを持つ金槌構造を有し、シスに作用するが、触媒活性を有するＲＮＡ部分と標的ＲＮＡとを切り離すことによりトランスで作用させることができる。このようなリボザイムは例えば一つのループとヘリックスをもち、ターゲットとなる配列と擬似的にループをとる（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  Ｒｉｂｏｚｙｍｅ．Ｉｎ：Ｓｃａｎｌｏｎ，ＫＪ．，ａｎｄ  Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ，Ｍ．ｅｄ．Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  ＵＮＩＴ４），Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９８；３−１４）。ハンマーヘッドリボザイムは構造が十分明らかになっているリボザイムであり、タバコリングスポットウイルスのリボザイムは、ＮＵＨ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，またはＵ；Ｈ＝Ａ，Ｃ，またはＵ）の塩基配列の３’側を特異的に切断する（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５，１９８８）。従って、標的とする所望のＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を含む部位を特異的に切断するリボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５，１９８８；小泉誠および大塚栄子，蛋白質核酸酵素，３５：２１９１，１９９０；Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７０５９，１９８９）。
また、ヘアピンリボザイムも本発明の目的のために有用である。ヘアピンリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．ＫｉｋｕｃｈｉおよびＮ．Ｓａｓａｋｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１，１９９２；菊池洋，化学と生物  ３０：１１２，１９９２）。
本発明においてベクターに搭載するリボザイムの鎖長は、好ましくは５０ヌクレオチド以上、より好ましくは５５ヌクレオチド以上、より好ましくは６０ヌクレオチド以上、より好ましくは６５ヌクレオチド以上、より好ましくは７０ヌクレオチド以上、より好ましくは７５ヌクレオチド以上である。ここでリボザイムの鎖長とは、ベクターから転写されるリボザイムのＲＮＡ分子のヌクレオチド数である。鎖長が短いリボザイムは、標的認識配列の長さを長くすることにより鎖長を長くすることが好ましい。例えば４５塩基以内または４０塩基以内の長さでも活性を示すリボザイムにおいて、標的認識配列の長さを調節することによりパラミクソウイルスベクターから高活性のリボザイムを発現させることができることも本発明の特徴の１つである。
ＲＮＡ切断活性を持つリボザイムは一般に、触媒活性に必須の配列と、標的ＲＮＡの認識に必要な標的認識配列を含んでいる。ハンマーヘッドリボザイムの触媒に必要な配列は、例えば５’−１Ｃ２Ｕ３Ｇ４Ａ５Ｎ６Ｇ７Ａ８Ｎ９Ｎ１０Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３Ｎ１４Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ２０Ｇ２１Ａ２２Ａ２３Ａ２４Ｎ−３’（配列番号：３８）が挙げられるがこれに限定されない。ここでＮはＧ，Ａ，Ｕ，またはＣであり、５’−８Ｎ９Ｎ１０Ｎ１１Ｎ−３’と５’−１６Ｎ１７Ｎ１８Ｎ１９Ｎ−３’は互いに相補的な配列にして塩基対を形成できるようにする。１２Ｎ１３Ｎ１４Ｎ１５Ｎの４塩基はループを形成させることが好ましい。ここは４塩基でなくとも、２〜７塩基（すなわちＮ２〜７）程度、例えば３〜５塩基（すなわちＮ３〜５）程度でもよい。２３Ａ２４Ｎは標的認識配列と重なっており、２４Ｎは標的部位である上記のＮＵＨのＮと相補的な塩基にする。より具体的な配列は実施例に示されている。この両端に標的認識配列を付加する。標的認識配列とは、具体的には標的ＲＮＡと相補的な配列からなる部分である。本発明においてリボザイムは、標的認識部位が好ましくは２０ヌクレオチド以上、より好ましくは２５ヌクレオチド以上、より好ましくは３０ヌクレオチド以上、より好ましくは３５ヌクレオチド以上、より好ましくは４０ヌクレオチド以上、より好ましくは４５ヌクレオチド以上である。ここで標的認識部位が複数に分断されている場合は、それらを足しあわせたヌクレオチド数で数える。例えばハンマーヘッドリボザイムでは一般に標的認識部位がリボザイムＲＮＡの両端に存在するので、両端にある標的ＲＮＡと相補的な塩基数の合計で数える。それぞれの側に、少なくとも７塩基、好ましくは８塩基以上、より好ましくは９塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１５塩基以上、標的ＲＮＡと相補的な連続した配列を付加することが好ましい。
リボザイムをコードする核酸の挿入位置は、例えばゲノムの３’リーダー配列と５’テーラー配列の間の蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えば３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域にリボザイムをコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，４８２２−４８３０，１９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に１つのＥ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介してリボザイムをコードする２またはそれ以上の核酸をタンデムに並べて挿入することができる。あるいは、ＩＲＥＳを介して目的の遺伝子を挿入してもよい。
ベクターに搭載するリボザイムの発現レベルは、その遺伝子の上流（マイナス鎖（ネガティブ鎖）の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上のリボザイムをコードする外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、マイナス鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、リボザイムの高い発現が得られることが有利と考えられるため、リボザイムをコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、マイナス鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス蛋白質遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間、または３’から２番目と３番目のウイルス蛋白質遺伝子の間に挿入してもよい。典型的なパラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子、３番目の遺伝子はＭ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をマイナス鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
リボザイムをコードするＲＮＡは、パラミクソウイルスゲノム中でＳ配列とＥ配列に挟まれるように配置される。ベクターからリボザイムが転写される場合、Ｓ配列から転写が開始されＥ配列で転写が終結するため、転写されるリボザイムは、本来のリボザイム活性に必要な配列の両端に余分な配列が付加される。パラミクソウイルスベクターにリボザイムをコードする核酸を組み込んだときに生じるこの余分な配列をここではスペーサーと呼ぶ。スペーサーは具体的には、パラミクソウイルスベクターから転写されたリボザイムの両端に付加されている、リボザイムの標的の認識および触媒活性には関与しない配列である（但し３’に付加されるポリＡテールは無視する）。スペーサーは、Ｓ配列およびＥ配列の一部、およびリボザイムをベクターに組み込んだときのリンカーの配列などが含まれ得る。実施例に示されるように、リボザイムの両端にスペーサーが付加されてもリボザイムの活性は維持されることが示された。リボザイムの両端のスペーサーの鎖長は両端を合わせて１０塩基以上、さらには２０塩基以上、より長くは２５塩基以上、より長くは３０塩基以上、より長くは３５塩基以上含むことができる（ポリＡは計算に入れない）。しかし、リボザイムの両端のスペーサーの鎖長は両端を合わせて１００塩基以下、より好ましくは８０塩基以下、より好ましくは７０塩基以下、より好ましくは６０塩基以下、より好ましくは５０塩基以下にする。両端のスペーサーの鎖長は、それぞれ５０塩基以内とすることが好ましい。
リボザイムをコードする核酸をゲノムに挿入するときに付加するＳ配列としては、例えばパラミクソウイルスの所望のＳ配列を用いることができるが、センダイウイルスベクターであれば、３’−ＵＣＣＣＷＶＵＵＷＣ−５’（Ｗ＝ＡまたはＣ；Ｖ＝Ａ，Ｃ，またはＧ）（配列番号：１）の配列を好適に用いることができる。特に３’−ＵＣＣＣＡＧＵＵＵＣ−５’（配列番号：２）、３’−ＵＣＣＣＡＣＵＵＡＣ−５’（配列番号：３）、および３’−ＵＣＣＣＡＣＵＵＵＣ−５’（配列番号：４）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするＤＮＡ配列で表すとそれぞれ５’−ＡＧＧＧＴＣＡＡＡＧ−３’（配列番号：５）、５’−ＡＧＧＧＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号：６）、および５’−ＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：７）である。センダイウイルスベクターのＥ配列としては、例えば３’−ＡＵＵＣＵＵＵＵＵ−５’（配列番号：８）（プラス鎖をコードするＤＮＡでは５’−ＴＡＡＧＡＡＡＡＡ−３’（配列番号：９））が好ましい。Ｉ配列は、例えば任意の３塩基であってよく、具体的には３’−ＧＡＡ−５’（プラス鎖ＤＮＡでは５’−ＣＴＴ−３’）を用いればよい。
本発明のベクターを細胞に感染させることにより、ベクターからリボザイムを転写させることができる。例えばリボザイムとして細胞で発現する遺伝子の転写産物を切断する活性を有するリボザイムをコードさせておけば、これを細胞に感染させる工程により標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。標的遺伝子の転写産物に対する切断活性を持つリボザイムをコードする本発明のベクターは、該標的遺伝子を発現する細胞にｍｏｉ＝１０で感染させた場合に、リボザイムをコードしない対照ベクターを同じｍｏｉで感染させた場合に比べ、標的遺伝子の発現レベルを好ましくは７０％以下に、より好ましくは７５％以下に、さらに好ましくは６０％以下に低下させる能力を有する。
本発明のベクターはインビボで投与できる治療用ウイルスベクターとして有用である。本発明のベクターは宿主染色体に組み込まれないため安全であり、通常、リボザイムを数日〜数週間以上にわたって発現可能であるため、種々の疾患または傷害の治療のために適用される。本発明のベクターを治療用として局所投与すれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ（臨床応用）での局所的な高発現を期待できる。特に、リボザイムは癌の遺伝子治療における潜在的に有用なツールである（Ｈ．Ｋｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，１９９５，６８：２４７−２６７；Ａ．Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１９９７，４：３２９−３３７）。また癌に対する適用以外にも、さまざまな用途が想定される。例えば、ＡＩＤＳなどを含む感染症に対する予防および治療において、リボザイムをコードする本発明のベクターを用いた遺伝子治療が想定される（Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１９９９，１（３）：３１６−２２；Ｌｅｗｉｎ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，Ｗ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，７（５）：２２１−８；Ｇａｕｇｈａｎ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９９，１４４５（１）：１−２０）。
本発明のベクターを製造するには、哺乳動物細胞においてパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡを含むＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、本発明のパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりマイナス鎖ゲノム（ネガティブ鎖とも言う。ウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはプラス鎖（ポジティブ鎖とも言う。ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖。）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはプラス鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。また、転写産物の３’端は自己切断により正確に末端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。
例えばリボザイムをコードする組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず両端にクローニングのための制限酵素サイトを有するリボザイムをコードするＤＮＡを合成する。ウイルスゲノム上に挿入された後のリボザイムとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が配置されるように、合成ＤＮＡ中にＥ−Ｉ−Ｓ配列を含めるようにする。合成ＤＮＡの長さは、最終的な挿入断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列は、例えば挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウィルスのマイナス鎖のＳ配列、Ｉ配列、およびＥ配列、好ましくはそれぞれ５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１０）、５’−ＡＡＧ−３’、および５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：１１）が用いられる。この断片をウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡに挿入する。例えばゲノム上のウイルス蛋白質をコードするＯＲＦとその上流のＳ配列の間に挿入し、リボザイムの両側のウイルス蛋白質遺伝子のＯＲＦとの間に、それぞれＥ−Ｉ−Ｓ配列が１つずつ配置されるようにする。
例えば、組み換えセンダイウィルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、リボザイムのセンス鎖の３’側にＥ−Ｉ−Ｓ配列が連結した２本鎖ＤＮＡを合成する。これをゲノムのセンス鎖コードするｃＤＮＡの所望のＳ配列のすぐ３’側に挿入する。例えばプラス鎖ゲノムをコードするｃＤＮＡにおいて、所望のウイルス蛋白質遺伝子のコード配列とこれを転写するＳ配列の間に予め制限酵素部位を作っておき、ここにリボザイム−Ｅ−Ｉ−Ｓ配列をコードするＤＮＡを制限酵素部位を利用して挿入することができる（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６（１−２），３３−８）。具体的には、例えばＰ遺伝子とＭ遺伝子の間にあるＳ配列とＭ遺伝子のＯＲＦとの間に挿入することで、高いウイルス生産量を得ることが可能となる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウィルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダーペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウィルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
具体的な手順は、（ａ）パラミクソウィルスゲノムＲＮＡ（マイナス鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）該細胞またはその培養上清から該ゲノムＲＮＡを含む複合体を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡはＮ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そしてＭ、ＨＮ、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドやウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えばこの遺伝子を細胞の染色体に、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできるが、これらのウイルスの混入を招くため好ましくない。
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．５×１０５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ  Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ  Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウィルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウィルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は２：１：２とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られたウイルス溶液（培養上清）を適宜希釈して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウィルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによってエンベロープ遺伝子欠損型のウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆  Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、サル腎由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、そのエンベロープを有する感染性ウィルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ蛋白質を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：１２）で連結し、Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：１３，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：１４］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：１５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：１６］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦを得る。外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位に挿入する。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％  ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦに外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６（１９８６））をＭＯＩ  ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に６：２：１：２：２：２とすることができる。例えば、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、およびＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；ＷＯ００／７００７０，Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，５６９−５７９（１９９６））を、それぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬのＣｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ  ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ  ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウィルス遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
なお、複製性のパラミクソウイルスベクターを個体や細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
本発明の方法によれば、本発明のウイルスベクターは、例えば１×１０５ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０６ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０７ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは１×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは５×１０８ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），６５−７４（１９９０）；ＷＯ００／７００７０）。
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤などとして添加した蛋白質などは除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は試薬として、および医薬として有用である。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、脊髄腔内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。投与されるベクター量は好ましくは約１０５ＣＩＵ／ｍｌから約１０１１ＣＩＵ／ｍｌ、より好ましくは約１０７ＣＩＵ／ｍｌから約１０９ＣＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０８ＣＩＵ／ｍｌから約５×１０８ＣＩＵ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては１回当たりの投与量は２×１０５ＣＩＵ〜２×１０１０ＣＩＵが好ましく、投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、１日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物についても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平均値）で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｋ−ｒａｓを特異的に切断するリボザイムの構造（Ａ）および活性（Ｂ）を示す図および写真である。標的部位の塩基配列およびコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３１および３２、リボザイムの塩基配列を配列番号：３３に示した。
図２は、Ｋ−ｒａｓを特異的に切断するリボザイムをコードするセンダイウイルスベクターの構築スキームを示す図である。ベクターにおいてリボザイムの両端に付加される塩基の配列をそれぞれ配列番号：３５および３６、ＥＩＳ配列を配列番号：３４、ｐＳｅＶ（＋）ＰＭのクローニング部位周辺の塩基配列を配列番号：３７に示した。
図３は、Ｋ−ｒａｓを特異的に切断するリボザイムをコードするセンダイウイルスベクターの活性を示す写真および図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  プラスミドの構築
リボザイムをコードした合成オリゴヌクレオチドを表１に示した。ターゲットはＶ１２変異Ｋ−ｒａｓの１２番目の変異したバリン部位とした。この部位をターゲットしたリボザイムはすでに幾例か報告されており、今回表１で示したＫＲＺａはＴｏｋｕｎａｇａらとＺｈａｎｇら（Ｔｏｋｕｎａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（６），８３３−９；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（２３），２０４１−５０）、ＫＲＺｂ（図１Ａ上段）はＦｕｎａｔｏら（Ｆｕｎａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７（３），４９５−５００）のデザインしたものを参考に作製した。今回はさらに認識部位の長さの異なるＫＲＺｃ、ＫＲＺｄをデザインした。それぞれの配列はＫＲＺａ（ｓｅｎｓｅ：５’−ＣＴＡＧＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣ−３’／配列番号：１７，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＣＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＴＡＧ−３’／配列番号：１８）、ＫＲＺｂ（ｓｅｎｓｅ：５’−ＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＧＧ−３’／配列番号：１９、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＧＧ−３’／配列番号：２０）、ＫＲＺｃ（５’−ＣＴＡＧＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＧＴＡＣ−３’／配列番号：２１、ｓｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＧ−３’／配列番号：２２）、ＫＲＺｄ（ｓｅｎｓｅ：５’−ＣＴＡＧＣＣＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＡＣ−３’／配列番号：２３、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’−ＣＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＴＧＡＧＧ−３’／配列番号：２４）の配列である。それぞれの両端にはＮｈｅＩ部位およびＫｐｎＩ部位を付加した。センス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ等量混合してアニーリングさせ、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（＋）、センダイウイルスのミニゲノムを搭載したｐＡＧ２７０とｐＳｅＶ（＋）ＰＭ（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６（１−２），３３−８）にサブクローニングした（図１Ａ中段）。リボザイムを組み込んだｐＡＧ２７０は、５’−ＧＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣ−３’（配列番号：２５）および５’−ＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＧ��−３’（配列番号：２６）をアニーリングさせたものをｐＳｅＶ１８＋（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）のＮｏｔＩ部位にライゲーションし、その後ＮｈｅＩ−ＫｐｎＩで消化してウイルスゲノムの中央部の大半を除去し、その部位にリボザイムをコードする合成ＤＮＡをライゲーションして構築した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリボザイムの活性をみるための基質としてＫ−ｒａｓ  ｃＤＮＡの１−１７１ｂｐの領域をＰＣＲで増幅し、ｐＣＲＩＩ（イビトロジェン）へＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇした（図１Ａ下段）。プライマーの配列は以下の通り：５’−ＡＴＧＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡ−３’（配列番号：２７）および５’−ＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：２８）。
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［実施例２］  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
ＳｅＶなどパラミクソウイルスに特有な配列である転写終結配列、介在配列と転写開始配列がリボザイムの活性に影響するかを調べた。３２ＰラベルされたＲＮＡ基質を調製するため、ｐＣＲＩＩ／Ｋ−ｒａｓ１７１を直鎖状にし、ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで［α−３２Ｐ］ＵＴＰ存在下で転写し、これを８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミド電気泳動で精製した。一方リボザイムは直鎖状にしたプラスミドからＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写した。約５０００ｃｐｍの３２ＰラベルされたＲＮＡ基質と１０μｇリボザイムをｃｌｅａｖａｇｅ用のバッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，および１０ｍＭ  ＤＴＴ）存在下で混合し、３７℃で一晩反応させた。これらを８Ｍ尿素入りの６％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＢＡＳ２０００で解析した。その結果を図１Ｂに示す。パラミクソウイルス特有の配列を含まないリボザイムに比べて少し活性は落ちるものの、ほとんど影響がないと判断した。またＫＲＺａはパラミクソウイルス特有の配列を含むものおよび含まないもの共に活性が低いため、ＳｅＶベクターには搭載しないことにした。
［実施例３］  組み換えＳｅＶベクターの作製
ＳｅＶベクターは基本的に文献（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６（１−２），３３−８）に記した方法で作製した。ｐＡＣ１１６のマルチクローニングサイトを改変しＮｈｅＩ−ＫｐｎＩサイトを導入した。５’−クローニングサイトは、ＮｏｔＩ部位に挟まれた７２ｍｅｒの断片（５’−ＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＧＴＡＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＧＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＣ−３’／配列番号：２９）からなり、ＮｈｅＩ部位、ＫｐｎＩ部位、およびＥＩＳ配列を含む。このＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ部位にリボザイムをコードしたＤＮＡをサブクローニングした。これをＮｏｔＩで切り出し、ｐＳｅＶ（＋）ＰＭ（Ｔｏｋｕｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ８６（１−２），３３−８）のＮｏｔＩサイトにサブクローニングした（図２）。ｐＳｅＶ（＋）ＰＭのＮｏｔＩサイト周辺の配列は、５’−ＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧ−３’（下線部は順にＳ配列、ＮｏｔＩ部位、および開始コドン）（配列番号：３０）である。これをＬＬＣ−ＭＫ２にＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを発現するワクシニアウイルスＶａｃＴ７感染下でトランスフェクションした。三日後、細胞を回収し、凍結−融解を三回繰り返し、ライセートを作製し、これを１０日鶏卵に接種し増幅した。
［実施例４］  ウェスタンブロット
ヒト大腸ガン細胞株であるＳＷ４８０に組み換えＳｅＶをｍｏｉ＝１０で感染させ、二日後細胞を回収した。回収した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファに溶解させ、１００℃で処理した後１０〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）に転写し、ヒトＫ−ｒａｓ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＴＲＥＶＩＧＥＮ）でウェスタンブロットを行った。検出はＥＣＬ−ｐｌｕｓ−（アマシャム）で行い、イメージアナライザーＬＡＳ１０００で解析、定量した（図３）。バンドの濃さをイメージアナライザーで定量し、抗ＧＡＰＤＨ抗体で定量した値で補正を行った。その結果、いずれのリボザイムをコードするセンダイウイルスも、内因性のＫ−ｒａｓの発現を抑制することが判明した。このことからＳｅＶで活性のあるリボザイムの発現が可能であることが分かった。最も短いリボザイムでは効果は少ないが、鎖長の長いリボザイムを搭載するベクターを用いるほど効果が高く、もっとも長い認識部位をもつＫＲＺｃを組み込んだＳｅＶでもっとも効果が高かった。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、リボザイムを発現するパラミクソウイルスベクターが提供された。本発明のベクターは、細胞内の所望の標的遺伝子の発現を抑制することができる。パラミクソウイルスベクターは広い細胞種に遺伝子を導入することができるため、インビボまたはエクスビボにより生体内に投与するための遺伝子治療ベクターとして適している。特に疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制するリボザイムをコードするベクターは、その疾患に対する遺伝子治療に有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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