(57)【要約】本発明者らは、遺伝子プロモーター上のＣｐＧアイランドを含む領域を標的とした合成短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がヒト細胞において標的とする領域内あるいはその近傍のＣｐＧを特異的にメチル化を誘導することを明らかにした。プロモーターのメチル化はその下流にコードされる遺伝子の発現を転写レベルで抑制する。本発明はｓｉＲＮＡを用いたＤＮＡメチル化誘導方法およびｓｉＲＮＡによるプロモーターのメチル化を介して遺伝子発現を抑制する方法を提供する。また、このｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡを発現するベクターを含むＤＮＡメチル化誘導剤または遺伝子発現抑制剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内のＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡを含むＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項２】
哺乳動物細胞内のＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡを備えた発現ベクターを含むＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項３】
ｄｓＲＮＡが３０塩基以下である、請求項１または２記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項４】
ｄｓＲＮＡが３０塩基以上５千塩基である、請求項１または２記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項５】
ｄｓＲＮＡがヘアピン構造を有する、請求項１〜４のいずれか記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項６】
ベクターにはさらにＤｉｃｅｒがコードされている、請求項２記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項７】
プロモーターの下流に機能的に連結されたエクソン−イントロン−エクソンカセットが備えられ、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがイントロン内に挿入されている、請求項２記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項８】
エクソン−イントロン−エクソンカセットが免疫グロブリン遺伝子由来である、請求項７記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項９】
発現ベクターにおいて、ｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩ系のプロモーターに機能的に連結されている、請求項２〜７のいずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１０】
ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターがｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターのいずれかである、請求項９記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１１】
ＰｏｌＩＩ系プロモーターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ・プロモーターのいずれかである、請求項１０記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１２】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項２〜１１のいずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１３】
ウイルス発現ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスのいずれかである、請求項２〜１２のずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１４】
発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター配列）を有するプロモーターに機能的に連結された、請求項２〜１３のずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか記載のメチル化誘導剤を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、ＤＮＡメチル化方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５記載のＤＮＡメチル化方法。
【請求項１７】
哺乳動物細胞内の遺伝子プロモーターのＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡを含む、遺伝子発現抑制剤。
【請求項１８】
哺乳動物細胞内の遺伝子プロモーターのＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡをコードした発現ベクターを含む、遺伝子発現抑制剤。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡが複数種であり、各種類のｄｓＲＮＡがＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む異なる部位を標的とする、請求項１７または１８記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２０】
ｄｓＲＮＡが３０塩基以下である、請求項１７〜１９のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２１】
ｄｓＲＮＡが３０塩基以上５千塩基である、請求項１７〜１９のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２２】
ｄｓＲＮＡがヘアピン構造を有する、請求項１７〜２１のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２３】
ベクターにはさらにＤｉｃｅｒがコードされている、請求項１８記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２４】
プロモーターの下流に機能的に連結されたエクソン−イントロン−エクソンカセットが備えられ、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがイントロン内に挿入されている、請求項１８記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２５】
エクソン−イントロン−エクソンカセットが免疫グロブリン遺伝子由来である、請求項１８記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２６】
発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩ系のプロモーターに機能的に連結されている、請求項１８〜２５のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２７】
ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターがｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターのいずれかである、請求項２６記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２８】
ＰｏｌＩＩ系プロモーターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ・プロモーターのいずれかである、請求項２６記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２９】
発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項１８〜２８のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３０】
ウイルス発現ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスのいずれかである、請求項２９記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３１】
発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター配列）を有するプロモーターに機能的に連結された、請求項１８〜３０のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３２】
遺伝子はその発現が疾患に関連する疾患関連遺伝子である、請求項１７〜３１記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３３】
疾患が腫瘍である、請求項３２記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３４】
遺伝子がｅｒｂＢ２である、請求項３３記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項３５】
請求項３４記載の遺伝子発現抑制剤を有効成分とする、細胞増殖抑制剤。
【請求項３６】
請求項１８〜３４のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤を細胞に導入する工程を含む、遺伝子発現抑制方法。
【請求項３７】
さらに遺伝子のコーディング領域を標的とするｄｓＲＮＡを細胞に導入する工程を含む、請求項３６記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項３８】
哺乳動物細胞が、ヒトである、請求項３６または３７記載の遺伝子発現抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はｄｓＲＮＡを利用してＤＮＡ上のＣｐＧ配列をメチル化する方法、およびｄｓＲＮＡを含むメチル化誘導剤に関する。さらに本発明はｄｓＲＮＡを利用してプロモーター領域のＣｐＧ配列のメチル化誘導を介して遺伝子発現を抑制する方法およびｄｓＲＮＡを含む遺伝子発現抑制剤に関する。
【背景技術】  二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、動物および植物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した転写後遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｆｉｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１（１９９８）：Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２，１１０−１１９（２００１）：Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，＆  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２，２２５−２３２（２００２））。この系では、ＲＮアーゼＩＩＩ  Ｄｉｃｅｒによって短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が生じ、ＲＮＡｉにより誘導されたサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み入れられる（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３，３１９１−３１９７（１９９９）：Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３−２９６（２０００）：Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １０１，２５−３３（２０００）：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，３６３−３６６（２００１）：Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００（２００１））。このｓｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体は細胞の細胞質におけるｍＲＮＡの分解を促進する（Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３，３１９１−３１９７（１９９９）：Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３−２９６（２０００）：Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１）：Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．，＆  Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，２０５６−２０６０（２００２）：Ｚｅｎｇ，Ｙ．，＆  Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．ＲＮＡ，８，８５５−８６０（２００２）：Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７（２００３））。ｄｓＲＮＡが植物において配列特異的なＤＮＡメチル化を誘導しうること、および遺伝子発現を転写レベルで調節しうることも知られている（Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒ，Ｔ．，＆  Ｗａｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．ＲＮＡ  ６，５５−６５（２０００）：Ｍｅｔｔｅ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９，５１９４−２０１（２０００）：Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，Ｈ．，＆  Ｆａｇａｒｄ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７，２９−３５（２００１）：Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１１，７４７−７５７（２００１）：Ａｕｆｓａｔｚ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１６４９９−１６５０６（２００２）：Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，４６７１−４７６９（２００２）：Ａｕｆｓａｔｚ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，６８３２−６８４１（２００２））。つまり、植物では、長いｄｓＲＮＡおよび短いｄｓＲＮＡが配列特異的なＤＮＡメチル化、すなわちＲＮＡ依存性ＤＮＡメチル化（ＲｄＤＭ）を誘導しうる。さらに、導入遺伝子も配列特異的ＤＮＡメチル化を誘導しうる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，Ｈ．，＆  Ｆａｇａｒｄ，Ｍ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１７，２９−３５（２００１）：Ｍｏｒｅｌ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０，１５９１−１５９４（２０００）：Ｂｅｃｌｉｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２，６８４−６８８（２００２））。これらの系の役割はＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスに対する防御系であると考えられている。しかし、このような機構が哺乳動物細胞にも存在するか否かについては疑問があった。また、これと関連したＲＭＤＭまたは導入遺伝子を介した防御系がヒト細胞に存在するか否かについてはまだ検討の必要がある。
遺伝子プロモーターにおけるＤＮＡメチル化は、特定の遺伝子の発現を調節し、これにより腫瘍の生成および発生を誘導するといった重要な機能を果たしている（Ｌｉ，Ｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３，６６２−６７３（２００２）：Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１，５４２７−５４４０（２００２））。ＤＮＡメチル化に関与するＭｅＣＰ２、ＭＢＤおよびＤＭＮＴファミリーなどの多くのタンパク質がヒト細胞で同定され、その特徴が詳細に分析されているが、腫瘍の生成または発生時において、それらが特定の遺伝子の特定の標的ＣｐＧ部位にいかにして、あるいは何によって導かれるか、さらにＤＮＡメチル化がいかにして誘導されるかは不明なままである。合成ｓｉＲＮＡおよびｔＲＮＡベクターベースのｓｉＲＮＡは基本的には細胞質中に局在し、ｓｉＲＮＡを介したｍＲＮＡ分解は細胞質中で起こる。可能性の一つとして、ｓｉＲＮＡ−タンパク質集団のわずかな割合が核へと輸送されることが考えられる。また、細胞分裂時には核膜が消失するため、ｓｉＲＮＡが細胞分裂時にゲノムＤＮＡに到達するという可能性も考えられる。
【発明の開示】
本発明者らは、合成性の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とベクターベースのｓｉＲＮＡの両方がヒト細胞において配列特異的ＤＮＡメチル化を誘導することを示した。Ｅ−カドヘリンプロモーターのＣｐＧアイランドを標的とする合成ｓｉＲＮＡ（Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ）は、ＭＣＦ−７細胞において顕著にＤＮＡメチル化を誘導した。その結果、これらのｓｉＲＮＡはＥ−カドヘリン遺伝子の発現を転写レベルで抑制した。さらに、特異的ｓｉＲＮＡによるＤＮＭＴ１の破壊により、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを介したＤＮＡメチル化は消失した。さらに、ｅｒｂＢ２プロモーター領域を標的とするベクターベースのｓｉＲＮＡも、ＭＣＦ−７細胞におけるＤＮＡメチル化および転写性遺伝子サイレンシングを誘導した。すなわち、目的遺伝子のプロモーターのＣｐＧアイランドを標的とするｓｉＲＮＡは、ヒト細胞においてＤＮＭＴ１依存的なＤＮＡメチル化を介した転写レベルでの遺伝子サイレンシングを誘導することができ、新たなタイプの遺伝子治療薬等とな得る。すなわち、本発明はこれら知見に基づくものであり、具体的には、以下の通りである。
〔１〕  哺乳動物細胞内のＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡを含むＤＮＡメチル化誘導剤。
〔２〕  哺乳動物細胞内のＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡを備えた発現ベクターを含むＤＮＡメチル化誘導剤。
〔３〕  ｄｓＲＮＡが３０塩基以下である、上記〔１〕または〔２〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔４〕  ｄｓＲＮＡが３０塩基以上５千塩基である、上記〔１〕または〔２〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔５〕  ｄｓＲＮＡがヘアピン構造を有する、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔６〕  ベクターにはさらにＤｉｃｅｒがコードされている、上記〔２〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔７〕  プロモーターの下流に機能的に連結されたエクソン−イントロン−エクソンカセットが備えられ、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがイントロン内に挿入されている、上記〔２〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔８〕  エクソン−イントロン−エクソンカセットが免疫グロブリン遺伝子由来である、上記〔７〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔９〕  発現ベクターにおいて、ｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩ系のプロモーターに機能的に連結されている、上記〔２〕〜〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１０〕  ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターがｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターのいずれかである、上記〔９〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１１〕  ＰｏｌＩＩ系プロモーターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ・プロモーターのいずれかである、上記〔１０〕記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１２〕  発現ベクターがウイルス発現ベクターである、上記〔２〕〜〔１１〕のいずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１３〕  ウイルス発現ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスのいずれかである、上記〔２〕〜〔１２〕のずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１４〕  発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター配列）を有するプロモーターに機能的に連結された、上記〔２〕〜〔１３〕のずれかに記載のＤＮＡメチル化誘導剤。
〔１５〕  上記〔１〕〜〔１４〕のいずれか記載のメチル化誘導剤を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、ＤＮＡメチル化方法。
〔１６〕  哺乳動物がヒトである、上記〔１５〕記載のＤＮＡメチル化方法。
〔１７〕  哺乳動物細胞内の遺伝子プロモーターのＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡを含む、遺伝子発現抑制剤。
〔１８〕  哺乳動物細胞内の遺伝子プロモーターのＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡをコードした発現ベクターを含む、遺伝子発現抑制剤。
〔１９〕  ｄｓＲＮＡが複数種であり、各種類のｄｓＲＮＡがＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む異なる部位を標的とする、上記〔１７〕または〔１８〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２０〕  ｄｓＲＮＡが３０塩基以下である、上記〔１７〕〜〔１９〕のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２１〕  ｄｓＲＮＡが３０塩基以上５千塩基である、上記〔１７〕〜〔１９〕のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２２〕  ｄｓＲＮＡがヘアピン構造を有する、上記〔１７〕〜〔２１〕のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２３〕  ベクターにはさらにＤｉｃｅｒがコードされている、上記〔１８〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２４〕  プロモーターの下流に機能的に連結されたエクソン−イントロン−エクソンカセットが備えられ、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがイントロン内に挿入されている、上記〔１８〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２５〕  エクソン−イントロン−エクソンカセットが免疫グロブリン遺伝子由来である、上記〔１８〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２６〕  発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがｐｏｌＩＩ系またはｐｏｌＩ系のプロモーターに機能的に連結されている、上記〔１８〕〜〔２５〕のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２７〕  ＰｏｌＩＩＩ系プロモーターがｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターのいずれかである、上記〔２６〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２８〕  ＰｏｌＩＩ系プロモーターがＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲ・プロモーターのいずれかである、上記〔２６〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔２９〕  発現ベクターがウイルス発現ベクターである、上記〔１８〕〜〔２８〕のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３０〕  ウイルス発現ベクターがレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスのいずれかである、上記〔２９〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３１〕  発現ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡがＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター配列）を有するプロモーターに機能的に連結された、上記〔１８〕〜〔３０〕のいずれかに記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３２〕  遺伝子はその発現が疾患に関連する疾患関連遺伝子である、上記〔１７〕〜〔３１〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３３〕  疾患が腫瘍である、上記〔３２〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３４〕  遺伝子がｅｒｂＢ２である、上記〔３３〕記載の遺伝子発現抑制剤。
〔３５〕  上記〔３４〕記載の遺伝子発現抑制剤を有効成分とする、細胞増殖抑制剤。
〔３６〕  上記〔１８〕〜〔３４〕のいずれか記載の遺伝子発現抑制剤を細胞に導入する工程を含む、遺伝子発現抑制方法。
〔３７〕  さらに遺伝子のコーディング領域を標的とするｄｓＲＮＡを細胞に導入する工程を含む、上記〔３６〕記載の遺伝子発現抑制方法。
〔３８〕  哺乳動物細胞が、ヒトである、上記〔３６〕または〔３７〕記載の遺伝子発現抑制方法。
本発明の第一の実施形態により、哺乳動物細胞内においてｄｓＲＮＡを用いて配列特異的にＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列をメチル化するメチル化誘導剤が提供される。本発明のメチル化誘導剤は、哺乳動物細胞内のＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡまたはこれをコードするベクターが含まれる。
本発明の「ＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ」としては、メチル化を誘導したいＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列を任意に選択することができる。メチル化は生体内の種々の生物活性を調節する機能を有する。一例とすれば、プロモーター領域のＣｐＧなどがメチル化されると、その下流の遺伝子発現が抑制される。したがって、本発明では、哺乳動物遺伝子のプロモータ領域のＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列を好適に選択することができる。なお、ＣｐＮＧにおけるＮは、Ａ，Ｇ，Ｃ，またはＴのいずれかである。
本発明の「部位」には、ＣｐＧまたはＣｐＮＧが少なくとも一つ含まれていればよく、好ましくは複数のＣｐＧが含まれたＣｐＧアイランドなどを選択することができる。複数のＣｐＧが含まれる部位を標的とすることにより、複数のメチル基を部位内に誘導することができ、その結果、メチル化による生物的な効果を一層高めることができる。
「標的としたｄｓＲＮＡ」とは、上記ＣｐＧまたはＣｐＮＧを含む部位の二本鎖ＤＮＡと互いに相補するｄｓＲＮＡを意味する。より具体的には、二本鎖ＤＮＡは互いに相補する＋鎖と−鎖から構成されるが、上記ＣｐＧを含む部位の＋鎖、−鎖にそれぞれ相補する一本鎖ＲＮＡが互いに対合して構成された二本鎖ＲＮＡを意味する。また、「標的とした」とは、好ましくは、メチル基を導入したいＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列を有する部位のニ本鎖ＤＮＡにそれぞれ相補したＲＮＡ鎖が対合して構成されるｄｓＲＮＡである。しかし、本実施例で示したとおり、メチル基の導入はｄｓＲＮＡが対応している部位の近傍のＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列にも生じることから、「標的としたｄｓＲＮＡ」には、上記「ＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧ配列を含む部位」と直接対応しているｄｓＲＮＡのみならず、メチル基を導入したい部位とはずれた位置のＤＮＡ配列に相補したｄｓＲＮＡも含めることができる。このメチル基を導入したい部位ＤＮＡ配列と、ｄｓＲＮＡとの位置ずれは、例えば、５０〜６０塩基程度とすることができる。つまり、メチル基を導入したいＣｐＧまたはＣｐＮＧを含む部位から５０〜６０塩基程度離れた位置に相補し得るｄｓＲＮＡを用いても、ターゲットとなるＣｐＧまたはＣｐＮＧをメチル化することができる。なお、後に詳述するが、標的となるＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間の対応関係（相補性）は完全である必要なく、ｄｓＲＮＡのいずれか一方の鎖または双方鎖それぞれに相補しない塩基があってもよい。
本発明における「ｄｓＲＮＡ（二重鎖ＲＮＡ）」としては、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｅｎｃｅ、ＲＮＡ干渉）用として使用し得るｄｓＲＮＡの構成を用いることができる。本願発明者らは、近年、広く用いられるようなったＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞のＤＮＡメチル化を誘導することを見出し、これを哺乳動物のＤＮＡメチル化剤として開発したためである。したがって、現在、哺乳動物細胞におけるＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡとしては、人工的合成されたｄｓＲＮＡそのもの、あるいは発現ベクターにより哺乳動物細胞内に発現させたｄｓＲＮＡの双方が用いられているが、本発明におけるメチル化誘導剤も、これら双方を用いることができる。
ｄｓＲＮＡを人工的に合成し、哺乳動物細胞に導入する場合には、長鎖ｄｓＲＮＡによる哺乳動物細胞への細胞毒性を考慮する必要がある。そのため、人工的に合成したｄｓＲＮＡ（以下「合成ｄｓＲＮＡ」という）を用いる場合には、ｄｓＲＮＡは短鎖とすることがよい。短鎖ｄｓＲＮＡの長さとしては、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができる。
また、発現ベクターから生成させるｄｓＲＮＡ（以下「ベクターベースのｄｓＲＮＡ」等として表現する場合がある）も、細胞毒性を考慮して、短鎖とすることがよいが、発現の段階では長鎖であっても、その後直ちに切断されて短鎖を生成し得る構成とすることにより、長鎖を発現させることもできる。また、細胞毒性は長鎖のｄｓＲＮＡが細胞質内に侵入した際にそれを排除するために働く酵素による作用である。したがって、直接ｄｓＲＮＡをゲノムＤＮＡが存在する核内で発現させる場合には、必ずしも、短鎖である必要はなく、長鎖のｄｓＲＮＡを用いることができる。したがって、ベクターベースのｄｓＲＮＡの場合には、その長さは、例えば、１５−５万塩基対、好ましくは、２１−１万塩基対、より好ましくは、３０塩基対から５千塩基対とすることができる。上記短鎖ｄｓＲＮＡは、特定のＣｐＧまたはＣｐＮＧをターゲットとしてメチル化する目的に好適であり、一方、長鎖ｄｓＲＮＡは、広範囲なＤＮＡ上のＣｐＧまたはＣｐＮＧをメチル化する目的に好適となる。
発現ベクターから長鎖のｄｓＲＮＡを発現させ、その後直ちに切断されて短鎖を生成し得る構成例としては、長鎖ｄｓＲＮＡと同時に長鎖ｄｓＲＮＡを短鎖に切断し得る酵素、例えば、Ｄｉｃｅｒを発現させる構成を挙げることができる。すなわち、発現ベクターに長鎖ｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡとＤｉｃｅｒ遺伝子とを搭載させる。そして、これらを細胞内で共に発現させ、長鎖ｄｓＲＮＡが発現すると直ちに、Ｄｉｃｅｒにより切断され、短鎖ｄｓＲＮＡを生成させることができる。より具体的な構成については、実施例を参照して構築することができる。
また、発現ベクターを用いて直接ｄｓＲＮＡをゲノムＤＮＡが存在する核内で発現させる構成としては、エクソン−イントロン−エクソンを備えた発現カセット中のイントロン内にｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡを挿入させる例を挙げることができる。真核生物においてイントロンは、核内でＲＮＡ先駆体からプロセッシングにより切りだされる。したがって、上記エクソン−イントロン−エクソンを備えた発現カセットが哺乳動物細胞において発現すると、核内でＲＮＡ先駆体からイントロン部分は切り出され、イントロン部分に挿入されたｄｓＲＮＡは、細胞質の酵素などを活性化することなく、ゲノムＤＮＡ上の標的部位のメチル化を誘導する。実際に、後述する実施例にて、エクソン−イントロン−エクソンを備えた発現カセットを用いることにより、長鎖ｄｓＲＮＡを発現させても細胞毒性を誘発せず、ＤＮＡのメチル化が誘導されることを確認している。
エクソン−イントロン−エクソンを備えた発現カセットは、その発現により細胞に負の影響を与えず、また本発明の目的であるＤＮＡメチル化の障害とならないものであれば、いかなる遺伝子由来であってもよい。本発明において使用し得る「エクソン−イントロン−エクソン」ユニットの例をあげれば、Ｃｄｋインヒビターｐ１６遺伝子、Ｂｃ１２遺伝子などが挙げられ、好適な例としては、免疫グロブリン由来のエクソン−イントロン−エクソンユニットである。また、エクソン−イントロン−エクソンユニットは、エクソン間に挟まれるイントロンを一つ備えていればよく、例えば、エクソン−（イントロン−エクソン−イントロン）ｎ−エクソン（ここで、ｎは１以上の整数）というように、複数のイントロンを備えたものを用いることもできる。そして、イントロン毎に異なるＤＮＡ部位を標的としたｄｓＲＮＡをコードさせ、異なる部位のメチル化ともに誘導することもできる。
ｄｓＲＮＡの構造は、人工合成ｄｓＲＮＡ、ベクターより発現させたｄｓＲＮＡのいずれも、両端に断端を備えた構造であっても、一端にループを備えたヘアピン構造（または別の言葉として、「ステムループ構造」と表現する場合がある）を有するものであってもよい。
両端に断端を備えたｄｓＲＮＡの末端構造は、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、ｓｉＲＮＡとして報告されたような３’末端側が突出している構造だけでなく（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４−４９８（２００１）、Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，９７４２−９７４７（２００１））、ＤＮＡのメチル化を誘導し得る限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。また、突出する塩基数は、上記報告がある２，３塩基に限定されず、ＲＮＡｉ効果を誘導し得る塩基数とすることができる。例えば、この塩基数としては、１〜８塩基、好適には、２〜４塩基とすることができる。
ヘアピン構造を備えたｄｓＲＮＡとは、二重鎖ＲＮＡの一方の端部がリンカーＲＮＡなどにより接続されたステムスープ構造を備えたｄｓＲＮＡをいう。なお、ヘアピン型ｄｓＲＮＡの場合におけるｄｓＲＮＡの鎖長は、二重鎖ＲＮＡ部分（ステム部分）を基準とする。したがって、上述したように二重鎖ＲＮＡ部分（ステム部分）長さとして、合成ｄｓＲＮＡであれば、例えば、１５〜４９塩基対、好適には１５〜３５塩基対、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることができ、ベクターベースのｄｓＲＮＡの場合には、その長さは、例えば、１５−５万塩基対、好ましくは、２１−１万塩基対、より好ましくは、３０塩基対から５千塩基対とすることができる。
また、リンカーの長さはステム部分の対合に支障のない長さであれば特に限定はない。例えば、ステムの対合の安定化およびステム部分をコードしているＤＮＡ間での組換えを抑制するために、リンカー部分にクロバーリーフｔＲＮＡ構造を用いてもよい。また、リンカーの長さがステムの対合に支障を与える長さであっても、例えば、リンカー部分にイントロンを包含させ、前駆ＲＮＡから成熟ＲＮＡにプロセッシングされる際にイントロンが切り出されて、ステム部分が対合するような構成をとってもよい。
ｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分をセンスＲＮＡ鎖に備えたものであってもよい。不対合部分はｄｓＲＮＡ形成に支障がない範囲およびメチル化誘導に障害とならない範囲で設けることができる。
なお上記「バルジ」は、好ましくは１乃至２塩基の不対合塩基からなり、バルジの数はｄｓＲＮＡの長さに応じて異なる。例えば、３０塩基程度のｄｓＲＮＡであれば、二重鎖ＲＮＡ領域中のセンスＲＮＡ鎖に例えば１乃至７個、好ましくは１乃至５個程度とする。また、上記「ミスマッチ」の数もまた、ｄｓＲＮＡの長さに応じて異なる。例えば、３０塩基程度のｄｓＲＮＡであれば二重鎖ＲＮＡ領域中のセンスＲＮＡ鎖に、例えば１乃至７個、好ましくは１乃至５個程度とする。また、ｄｓＲＮＡに、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよく、双方含まれる場合には、例えば、合わせて１乃至７個、好ましくは合わせて１乃至５個程度とする。
上述したようにベクターベースのｄｓＲＮＡの構造は、両端に断端を備えた構造、ヘアピン形のいずれであってもよい。両端に断端を備えたｄｓＲＮＡをベクターから発現させる場合には、ベクターにおいて、ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖（なお、本書では一方の鎖を「センスＲＮＡ鎖」と他方の鎖を「アンチセンスＲＮＡ鎖」という）をコードした各ＤＮＡをタンデムに配置し、これらの上流にそれぞれプロモーターを設け、さらに下流にターミネーターを配置する。このような構成を備えたベクターを細胞に導入することにより、それぞれのＲＮＡ鎖が細胞内で発現され、これらがアニーリングしてｄｓＲＮＡが生成される。
一方、ヘアピン型ｄｓＲＮＡを発現するベクターでは、アンチセンス鎖をコードしたＤＮＡとセンス鎖をコードしたＤＮＡとを逆向きに配置し、さらにこれらＤＮＡをリンカーＲＮＡをコードしたＤＮＡ（リンカーＤＮＡ）により接続したユニットを構築する。その際、センスＲＮＡ鎖−ループ−アンチセンスＲＮＡ鎖の配列順が好ましい。そして、このユニットの一端にプロモーターを連結することにより、ヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。なお、ヘアピン型ｄｓＲＮＡ発現ベクターにおいて、リンカーＤＮＡの長さ、配列には特に限定はないが、ｓｉＲＮＡの生成を阻害するようなターミネーション配列などでなく、および上述したように成熟ＲＮＡまで生成された際にステム部分の対合に支障のないリンカーの長さ、配列であればよい。一例としては、上述したｔＲＮＡをコードしたＤＮＡなどをリンカーＤＮＡなどに用いることができる。
これらｄｓＲＮＡを発現させるためのプロモーターとして、ｐｏｌＩＩ系、ｐｏｌＩＩＩ系を好適に用いることができる。このｐｏｌＩＩＩ系のプロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、５ＳｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ  ＲＮＡプロモーター、Ｈ１  ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。なお、上記Ｕ６プロモーターはＲＮＡの３‘末端に４塩基のウリジン塩基を付加するが、この３’末端の突出はアンチセンスコードＤＮＡおよびセンスコードＤＮＡの先頭配列としてＡを０、１、２、３または４塩基備えることにより、最終的に生成されるｓｉＲＮＡ３’末端の突出を自在に４、３、２、１，０塩基にすることができる。なお、他のプロモーターを用いた場合にも、同様に末端の突出塩基数を自在に変更することは可能である。
また、ｐｏｌＩＩＩ系のプロモーターを用いた場合には、短いＲＮＡのみを発現させ適切に転写を終結させるために、さらにセンスコードＤＮＡ、アンチセンスコードＤＮＡの３’末端にターミネーターを備えることが好ましい。ターミネーターは、プロモーターの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、Ｔ（チミン）塩基またはＡ（アデニン）塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができるが、特にＴ（チミン）塩基が４つ以上連続した配列が好まれる。
ｐｏｌＩＩ系プロモーターとしては、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、β−アクチンプロモーター、γ−グロブリンプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを挙げることができる。これら、ｐｏｌＩＩ系は、ある程度長さを有するｄｓＲＮＡ発現に好適である。また、ｐｏｌＩＩ系を用いて短いｄｓＲＮＡを生成させる場合には、例えばリボザイムなどのＲＮＡをセルフプロセッシングにより切断し得る手段をさらに用いることがよい。このようにＲＮＡをセルフプロセッシングにより切断し得る手段を併用することにより、ｐｏｌＩＩ系プロモーターから発現されたある程度長さを備えたＲＮＡ鎖を短めて、目的のアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡを生成させることができる。ＰｏｌＩＩ系プロモーターの直後にステムループ配列を挿入し、その後ろにｐｏｌｙＡ付加シグナルをいれて、ステムループＲＮＡを生成させることもできる。このようなリボザイムを用いてアンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡを生成するためのユニットの構築は、例えば、ＷＯ０３／０４６１８６を参照して実施することができる。なお、セルフプロセッシング機能を有するリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、テトラヒメナ由来のリボザイムなどを挙げることができる（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ  ｎ．，Ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．１２７１−１２７９（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ  ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．１１３０２−１１３０６（１９９３）、ＢＩＯ  ｍｅｄｉｃａ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ．８９−９４（１９９２）、Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐｐ．８５−９０（１９９２））。
また、上記プロモーターとして、誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイミングでｓｉＲＮＡを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモーターとしては、ＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター配列）を付加しテトラサイクリンで誘導可能なｔＲＮＡプロモーターやＵ６プロモーター（Ｏｈｋａｗａ，Ｊ．＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１，５７７−５８５（２０００）、図１２）等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいはＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いて、組織特異的にｄｓＲＮＡの発現を誘導し、組織特異的にその組織内のＤＮＡのメチル化を誘導してもよい。Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いたｄｓＲＮＡ発現システムの構築は、上述したＷＯ０３／０４６１８６を参照して実施することができる。
本発明における「ベクター」は、導入したい細胞などにより任意に選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Ｙ．Ｎｉｉｔｓｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：１３８５−１３９５（１９９８））、これらに限定されるものではない。また、ウイルスベクターではなく、ダンベル型ＤＮＡ（Ｚａｎｔａ  Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｃａｒｒｙ  ＤＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９９  Ｊａｎ  ５；９６（１）：９１−６）、ヌクレアーゼ耐性を持つような修飾ＤＮＡ、またはｎａｋｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄもまた好適に用いることができる（Ｌｉｕ  Ｆ，Ｈｕａｎｇ  Ｌ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  ｉｔｓ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００１  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；３（６）：５６９−７６）。
また、ベクターベースのｄｓＲＮＡは、それぞれのＲＮＡ鎖が同一のベクター上から発現される必要はなく、異なるベクターからそれぞれアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現し得るように構成してもよい。
本発明の第二の実施形態として、ＤＮＡメチル化方法が提供される。本発明のメチル化方法は、上述したＤＮＡメチル化誘導剤であるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを発現するベクターを哺乳動物細胞に導入する工程が含まれる。
哺乳動物細胞は、ヒト、サル、イヌ、マウス、ラット、ウサギなど特に限定はない。こうした哺乳動物細胞へのｄｓＲＮＡの導入方法、ベクターの導入方法もまた特に限定はない。例えば、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５２，ｐ．４５６（１９７３））、エレクトロポーレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１３１１（１９８７））、リポフェクション法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｎｕｔｒ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．１７５（１９８９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，ｐ．３４，Ｍａｒｃｈ（１９  ９４））、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１９，ｐ．７９１（１９８６））、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，Ｖｏｌ．３，ｐ．２７１７（１９８４））、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏ  ｌ．８５，ｐ．８５０２（１９８８））、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１２，ｐ．８７１１（１９８４））等を用いることができる。また簡便には、実施例に示した市販のキットを用いてｄｓＲＮＡまたはベクターを導入してもよい。
また、メチル化されたか否かの確認試験は、実施例に示すメチル化特異的ＰＣＲ解析法や、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析法により実施することができる。これら解析方法の具体的な操作は実施例に記載されている。長鎖ｄｓＲＮＡを用いた場合、細胞毒性があるか否かは実施例に、詳細に示したようにｅｌｆα活性を基に測定することができる。
上記ＤＮＡメチル化誘導剤が導入された細胞では、配列特異的にＤＮＡがメチル化される。ここで配列特異的とは、ｄｓＲＮＡが標的とした部位のＣｐＧまたはＣｐＮＧをメチル化することを意味する。このｄｓＲＮＡによるＤＮＡメチル化には、ヒストンＨ３のメチル化およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１が関与することが実施例より示唆されている。
ＤＮＡメチル化は種々の生物活性をコントロールする一機構である。したがって、上記ＤＮＡメチル化誘導剤およびＤＮＡメチル化誘導方法は、メチル化により調節が行われている生物内の機構解明に役立ち得る。
本発明の第三の実施形態として、遺伝子発現抑制剤およびこれを用いた遺伝子発現方法が提供される。
ＤＮＡメチル化は遺伝子の発現を調節する一機構である。すなわち、遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドがメチル化されると、ＤＮＡの構造が変化して遺伝子の発現が抑制される。したがって、上記メチル化誘導剤を応用して、遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドをメチル化することにより、遺伝子発現を抑制することができる。ここで、本発明の遺伝子発現抑制剤による遺伝子抑制は、ｓｉＲＮＡのようなｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を抑制するものではなく、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写を抑制する。したがって、本発明の遺伝子抑制剤は転写レベルのサイレンシング（または、転写段階での遺伝子ノックダウン）を誘導することができる。
上記メチル化誘導剤を遺伝子発現抑制剤として応用する場合には、哺乳動物細胞内の遺伝子プロモーターのＣｐＧまたはＣｐＮＧ（Ｎは、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇのいずれか）を含む部位を標的としたｄｓＲＮＡを構築、またはこれをコードしたベクターを構築する。さらに、遺伝子抑制剤の場合には、メチル化の程度が高いほど、効果的に遺伝子の発現を抑制することができる。したがって、標的とする部位は、一箇所ではなく、複数箇所とすることが好ましい。複数箇所を標的とする場合には、上述したメチル化誘導剤のなかでも、上述したベクターベースの長鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、長鎖ｄｓＲＮＡとＤｉｃｅｒを共に発現させるシステムやエキソン−イントロン−エキソンのイントロンにｄｓＲＮＡをコードしたＤＮＡが挿入されたシステムによるｄｓＲＮＡ）や、短鎖ｄｓＲＮＡであっても異なる部位を標的とした複数のｄｓＲＮＡを混合して用いることが好ましい。
上述したように、本発明の遺伝子抑制剤は転写段階の発現を抑制する。したがって、遺伝子発現をより強力に抑制する場合には、本発明の遺伝子抑制剤に加えて、ＲＮＡｉ用ｄｓＲＮＡを併用してもよい。すなわち、遺伝子プロモーターのＣｐＧアイランドを標的としたｄｓＲＮＡと、コーディング領域を標的としたｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とを組合せて、遺伝子発現抑制剤を作製してもよい。このように本発明の遺伝子発現抑制剤にｓｉＲＮＡを組合せることにより、本発明の遺伝子発現抑制剤により、転写レベルの遺伝子発現が抑制され、仮に転写されたｍＲＮＡあったとしても、これをｓｉＲＮＡによって翻訳されることを抑制することができる。したがって、本発明の遺伝子発現抑制剤に同じターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡを組み合わせることより、強力な遺伝子ノックダウン剤を作製することができる。
本発明により抑制させる遺伝子は特に限定はなく、プロモーター領域にＣｐＧまたはＣｐＮＧを備えたものであれば、選択し得る。ここで発現抑制の標的となる「遺伝子」として、特定の表現型おいてその発現が亢進している遺伝子を選択した場合には、上記遺伝子抑制剤により、当該遺伝子プロモーターのメチル化を介して、その発現が抑制される。したがって、遺伝子として特定表現型に関連した遺伝子を選択することにより、本発明の遺伝子抑制剤は当該特定の表現型の解析用の試薬、ノックダウン動物を作製するツールとして生化学の研究分野において大いに有益となる。
また、上記「遺伝子」として、疾患においてその発現が亢進している遺伝子を選択した場合には、上記遺伝子抑制剤により、その疾患に関連した遺伝子プロモーターのメチル化を介して、その発現が抑制される。実際に、遺伝子として、腫瘍形成に関連する遺伝子、一例としてｅｒｂＢを選択し、このｅｒｂＢプロモーター上のＣｐＧアイランドを標的としたｄｓＲＮＡをがん細胞に導入した結果、ｅｒｂＢの発現の抑制を介してがん細胞の増殖を抑制することができた。したがって、標的遺伝子が癌関連遺伝子である遺伝子抑制剤は、癌などの疾患の研究試薬あるいは医療分野では癌治療薬として利用し得る。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｓｉＲＮＡによるＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化を示す図および写真である。ａ、Ｅ−カドヘリンプロモーター上のｓｉＲＮＡの標的部位を示す図である。各部位（１〜１０）はＣｐＧ配列を１つまたは２つ含む。ＨｐａＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｃＩまたはＨｈａＩは、ＣｐＧメチル化感受性制限酵素である。ｂ、ＰＣＲに基づくメチル化アッセイを用いたｓｉＲＮＡによるＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化の検出結果を示す写真である。ＣｐＧ部位を標的とするｓｉＲＮＡはいずれもプロモーターのＤＮＡメチル化を誘導した。ＧＡＰＤＨはＨｐａＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｃＩ、ＨｈａＩで消化されない対照遺伝子である。ＧＡＰＤＨ遺伝子断片の増幅レベルは各試料ともほぼ同一であり、実験誤差の限界範囲内に収まることは明らかである。ｃ、メチル化阻害剤である５−ａｚａ存在下または非存在下でのＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化の相対レベルを示す図である。ｓｉＲＮＡによるＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化はＰＣＲに基づくメチル化アッセイによって検出した。バンド強度はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いた濃度測定によって分析した。
図２は、Ｅ−カドヘリンプロモーターのＣｐＧ部位を標的とするＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの効果を示す図である。ａ、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを含む細胞におけるＥ−カドヘリンｍＲＮＡの相対レベルを示す。各細胞のトータルＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡのレベルをＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して標準化した。ｂ、５−ａｚａの存在下または非存在下でのＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを含む細胞におけるＥ−カドヘリンｍＲＮＡの相対レベルを示す。各細胞のトータルＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析により分析した。ｃ、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを含む細胞におけるＥ−カドヘリンの相対レベルを示す。各細胞内のＥ−カドヘリンは特異抗体を用いたウエスタンブロット分析によって検出した。各細胞におけるＥ−カドヘリンの相対レベルはＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いた濃度測定によって分析した。
図３は、ＤＮＭＴ１ノックダウン細胞における、Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とするＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの効果を示す図および写真である。ａ、ＤＮＭＴ−１−ｓｉＲＮＡまたは変異型ＤＮＭＴ−１−ｓｉＲＮＡの配列を示す図である。下線を付した文字はＤＮＭＴ−１−ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの変異を表す。ｂ、ＭＣＦ−７細胞におけるＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡ存在下または非存在下でのＤＮＭＴ−１  ｍＲＮＡレベルを示す写真である。ＤＮＭＴ−１  ｍＲＮＡレベルはＲＴ−ＰＣＲ分析により検出した。ｃ、ＭＣＦ−７細胞における、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡおよびＤＮＭＴ−１−ｓｉＲＮＡ存在下または非存在下でのＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化のレベルを示す図である。ｓｉＲＮＡによるＥ−カドヘリンプロモーターのＤＮＡメチル化はＰＣＲに基づくメチル化アッセイによって検出した。バンド強度はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いた濃度測定によって分析した。ｄ、ＭＣＦ−７細胞における、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡおよびＤＮＭＴ−１−ｓｉＲＮＡ存在下または非存在下でのＥ−カドヘリンｍＲＮＡレベルを示す図である。各細胞のトータルＲＮＡを特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ分析によって分析した。
図４は、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡによるｅｒｂＢ２プロモーターのＤＮＡメチル化を示す図および写真である。ａ、ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とするｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡベクターの構成を示す図である。ｅｒｂＢ２プロモーター上のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの５種類の標的ＣｐＧ部位を選択した。ｂ、ノーザンブロット分析によるｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡから発現されたｓｉＲＮＡの検出結果を示す写真である。ｅｒｂＢ２プロモーター上のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞においてすべてのｓｉＲＮＡが検出された。ｃ、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡによりｅｒｂＢ２プロモーターのＤＮＡメチル化が誘導された結果を示す写真である。ｓｉＲＮＡによるｅｒｂＢ２プロモーターのＤＮＡメチル化はＰＣＲに基づくメチル化アッセイにより検出した。バンド強度はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラムを用いた濃度測定によって分析した。ｄ、ｅｒｂＢ２プロモーター（部位１−５）を標的とするｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現した細胞におけるｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡの相対レベルおよび、コーディング領域（部位６）を標的とするｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを加えた際のｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡの相対レベルを示す図である。各細胞のトータルＲＮＡを特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ分析によって分析した。ｅ、ｔＲＮＡ−ｄｓＲＮＡを発現した細胞の増殖速度を示す図である。増殖速度は方法の項に記載した通りに決定した。
図５は、ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とする若干長いｓｈＲＮＡ（ステム長として２９〜１００ｎｔ）単独又は共にＤｉｃｅｒを発現するｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを導入したＭＣＦ−７細胞でのｅｒｂＢ２ｍＲＮＡの相対レベルを示すグラフである。各細胞のトータルＲＮＡを特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ分析によって分析した。
図６は、長鎖ｈＲＮＡまたは長鎖ｈＲＮＡとともにＤｉｃｅｒを発現し得るｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡベクター等をＭＣＦ−７細胞に導入した際におけるＰＫＲ活性化の有無をｅｌＦ２αのリン酸化レベルに基づき解析した結果を示すグラフである。
図７はＭＣＦ−７細胞にＥ−カドヘリンプロモーターを標的とするｓｉＲＮＡを導入した際の配列特異的なメチル化を検出した結果を示す図である。部位１または部位３に対するｓｉＲＮＡを導入した場合（＋）、導入していない場合（−）において、部位１または３内でメチル化された配列をボックスを斜線で塗りつぶして示した。メチル化のターゲット配列はＣｐＧ配列だけでなく、ＣｐＮＧ配列も含まれていた。部位３ｓｉＲＮＡの有無においても同様の傾向が見られた。配列特異的なメチル化の検出は、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析により行った。
図８はｓｉＲＮＡによるメチル化は正常なヒト乳腺細胞でも誘導されることを検出した結果を示す図である。配列特異的なメチル化の検出は、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析により行った。
図９は、ＭＣＦ−７細胞にＥ−カドヘリンプロモーターを標的とするｓｉＲＮＡを導入した際のメチル化される範囲を検出した結果を示し、標的とする領域の周囲のＣｐＧもメチル化することが検出されたことを示す図である。部位３に対するｓｉＲＮＡは部位２の領域もメチル化した。配列特異的なメチル化の検出は、上記と同様にｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析により行った。
図１０は、ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とするｓｈＲＮＡを発現するベクター（ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡおよびＵ６−ｓｈＲＮＡ）を用いて配列特異的なメチル化を誘導した結果を示す図である。
図１１は、ＤＮＭＴ１またはＨＭＴのメチルトランスフェラーゼをｓｉＲＮＡで発現抑制した場合における、Ｅ−カドヘンリンプロモーターを標的としたｓｉＲＮＡによるメチル化誘導への影響を解析した結果を示す図である。Ａ、ＤＮＭＴ１プロモーターを標的としたｓｉＲＮＡ存在下または非存在下におけるＥ−カドヘンリンプロモーターを標的としたｓｉＲＮＡによる配列特異的メチル化の違いを解析した結果を示す。Ｂ、ＨＭＴプロモーターを標的としたｓｉＲＮＡ存在下または非存在下におけるＥ−カドヘンリンプロモーターを標的としたｓｉＲＮＡによる配列特異的メチル化の違いを解析した結果を示す。配列特異的なメチル化の検出は、上記と同様にｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析により行った。
図１２は、核内に長鎖のｄｓＲＮＡを局在させることを目的として構築されたｄｓＲＮＡ発現ベクター（ｐＳＶ−ＢＧＩ）の構成を示す図である。このベクターはＰｏｌ  ＩＩプロモーターを備え、このプロモーターから発現するベータグロブリンのイントロン部位に長鎖のｄｓＲＮＡをコードする遺伝子が挿入されている。イントロンは核内でプロセシングされるため、イントロンに挿入された長鎖のｄｓＲＮＡは核内に放出される。
図１３は、ｔＲＮＡプロモーター若しくはＵ６プロモーターを備えた長鎖ｄｓＲＮＡ発現ベクターまたは核内長鎖ｄｓＲＮＡ発現用ｐＳＶ−ＢＧＩベクターにより、ｅｒｂＢ２プロモーターにおけるメチル化誘導を行った結果を示す図である。
図１４は、ｔＲＮＡプロモーター若しくはＵ６プロモーターを備えた長鎖ｄｓＲＮＡ発現ベクターまたは核内長鎖ｄｓＲＮＡ発現用ｐＳＶ−ＢＧＩベクターが導入されたＭＣＦ−７細胞におけるｅｒｂＢ２発現をタンパク質レベルで比較した結果を示すグラフである。
図１５は、各長鎖ｄｓＲＮＡを発現するベクターにおける細胞毒性を検討した結果を示す。細胞毒性として、各ベクターが細胞に導入された後のＰＫＲ活性化の有無をｅｌＦ２αのリン酸化レベルに基づき解析した。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明をこれら実施例により限定するものではない。
なお、以下に説明する各実施例において、「ｓｉＲＮＡ」とは単に短いｄｓＲＮＡを指し、ＲＮＡ干渉用として使用されているような短いｄｓＲＮＡをＤＮＡのメチル化誘導に用いた。よって、特に断りがないかぎり、本明細書においてｓｉＲＮＡはＤＮＡメチル化誘導用の短鎖ｄｓＲＮＡを意味する。
実施例１：  合成ｓｉＲＮＡによる哺乳動物細胞におけるＤＮＡメチル化
合成ｓｉＲＮＡが哺乳動物細胞におけるＤＮＡメチル化を誘導しうるか否かを検証するために、本発明者らはＥ−カドヘリンプロモーターのＣｐＧアイランドを標的とするｓｉＲＮＡ（Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ）を合成した。
複数の腫瘍細胞系でＥ−カドヘリンがそのプロモーターの異常なメチル化によってサイレンシングされることが報告されている（Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，９８２１−９８２６（１９９６）：Ｇｒａｆｆ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２２３２２−２２３２９（１９９７）：Ｃｏｒｎ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６，４２４３−４２４８（２０００））。ＭＣＦ−７細胞ではＥ−カドヘリンプロモーター内のＣｐＧ部位がメチル化されていないため、本発明者らはＭＣＦ−７細胞を本研究に用いた。対照には、Ｅ−カドヘリンプロモーター内のＣｐＧ部位がメチル化されているＨＬ−６０細胞を用いた（Ｃｏｒｎ，Ｐ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６，４２４３−４２４８（２０００））。Ｅ−カドヘリンプロモーター内の１０個のＣｐＧ部位（部位１〜１０）をｓｉＲＮＡの標的として用いた（図１ａ）。
Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とするｓｉＲＮＡ（Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ）およびＤＭＮＴ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（ＤＭＮＴ１−ｓｉＲＮＡ）は、日本バイオサービス（ＪＢｉｏＳ）社（埼玉、日本）にて合成された。Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの標的配列は、以下の通りである：
2004076663.tif 000002
続いて、これらの標的部位に対する２５塩基のｓｉＲＮＡを作製するために、それぞれの合成センスＲＮＡ鎖と合成アンチセンスＲＮＡ鎖を標準的な方法（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００（２００１））によってアニーリングさせた。
ＭＣＦ−７細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。このＭＣＦ−７細胞に上記各Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ（２００ｎＭ）をＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造者のプロトコールに従って導入した。ｓｉＲＮＡ導入後の細胞を培養し、９６時間後に全ＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。
続いて、ＰＣＲを用いたメチル化解析を行った。具体的には、上記回収したゲノムＤＮＡをメチル化感受性酵素（ＨｐａＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｃＩおよびＨｈａＩ；図１ａ）を用い製造者のプロトコールに従った条件下で消化した。酵素による消化の後に、５０ｎｇのＤＮＡを以下のプロモーターを用いたＰＣＲによってＥ−カドヘリンプロモーターの領域を増幅した：Ｅ−カドヘリン順方向（（配列番号：２９）５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡ−３’）および逆方向（（配列番号：３０）５’−ＡＧＡ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡ−３’）プライマー、またはｅｒｂＢ２順方向（（配列番号：３１）５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡ−３’）および逆方向（（配列番号：３２）５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＴ−３’）プライマー。
この解析の原理は、プロモーターのＣｐＧアイランドがメチル化されていない場合には、上記メチル化感受性酵素はその部位を消化し、ＤＮＡの増幅は起こらないと考えられる（Ｑｉａｎ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３，１４７５−１４８２（１９９８））。この原理に基づき、本解析では増幅産物の検出に基づいて、プロモーターのＣｐＧアイランドメチル化が検出されることになる。
なお、対照実験として、Ｅ−カドヘリンプロモーターの完全なゲノムＤＮＡを、Ｅ−カドヘリンプロモーターを切断しうるＰｓｔＩ、ならびにこれらのプロモーターを切断できないＨｉｎｄＩＩＩによって消化処理した。不完全消化の可能性を除外するために、すべての試料を各酵素により２回の独立した実験で消化処理した。２回ずつの消化物のそれぞれからのＰＣＲ増幅を少なくとも２回繰り返した。ＰＣＲ反応時のオーバーサイクルを防止するために、未消化テンプレートおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化したテンプレート（何らシグナルを生じない）を用いてｃｙｃｌｅ  ｃｕｒｖｅ  ｎｕｍｂｅｒ法を行うことにより、各プライマーセットに対するサイクル数を決定した。
Ｅ−カドヘリンに対する特異的プライマーは以下の通りである。
2004076663.tif 000003
2004076663.tif 000004
ＧＡＰＤＨを対照遺伝子とし、この遺伝子を消化できないＨｐａＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｃＩ、ＨｈａＩ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化処理した後に、断片ＤＮＡを特異的な順方向（（配列番号：６３）５’−ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ−３’）および逆方向プライマー（（配列番号：６４）５’−ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＧＧＣ−３’）を用いるＰＣＲにより増幅した。増幅された部分的ＧＡＰＤＨ遺伝子のレベルは各試料ともほぼ同一であり、実験誤差の限界範囲内に収まることが判明した。
図１ｂに示した通り、個別のＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ（部位１〜１０）およびすべてのＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの混合物を含むＭＣＦ−７細胞系でメチル化ＤＮＡが観察された。さらに、ＤＮＡメチル化阻害薬である５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ａｚａ）の存在下では、すべてのＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの混合物を含むＭＣＦ−７細胞におけるメチル化ＤＮＡレベルは低下した（図１ｃ）。これらの結果は、Ｅ−カドヘリンプロモーター内のＣｐＧ部位を標的とするｓｉＲＮＡが配列特異的なＤＮＡメチル化を誘導し得ることを示唆する。
実施例２：Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡによるＤＮＡメチル化とＥ−カドヘリン遺伝子の発現との相関
次に、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡによるＤＮＡメチル化がＥ−カドヘリン遺伝子の発現と相関するかを検討するために、本発明者らはＥ−カドヘリンプロモーターに対する特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。
ＩＳＯＧＥＮ（商標）（ニッポンジーン、富山、日本）を用い、製造者のプロトコールに従って全ＲＮＡをＭＧＦ−７細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラ）を用い、以下のプライマーを用いて行った：
Ｅ−カドヘリン順方向（（配列番号：２１）５’−ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ−３’）および下流（（配列番号：２２）５’−ＧＡＧ  ＣＡＡ  ＴＴＣ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＧＡＴ  ＴＣＣ  ＡＧＡ−３’）プライマー、
対照のＧＡＰＤＨ順方向（（配列番号：２７）５’−ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ−３’）および逆方向（（配列番号：２８）５’−ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡ−３’）プライマー。
上記プライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上での電気泳動によって分析した。
図２ａに示した通り、個別のＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞系におけるＥ−カドヘリンｍＲＮＡレベルは、野生型（ＷＴ）ＭＣＦ−７細胞におけるレベルよりも約３０％から約７０％までに低下した。
これに対して、すべてのＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの混合物を含むＭＣＦ−７細胞におけるＥ−カドヘリンｍＲＮＡレベルは、個々のｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞よりも有意に低く、このことから相加効果が明らかに示された（図中「ｓｉｔｅ１−１０」のカラム）。重要なことに、５−アザ−２’−ｄＣによる処理は、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの作用をほぼ完全に消失させた（図２ｂ）。
Ｅ−カドヘリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてＥ−カドヘリンタンパク質のレベルを確認した。
ウエスタンブロット分析については既に報告している方法に従って行った（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３９３，２８４−２８９（１９９８）：Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，１９５−２００（２０００））。Ｅ−カドヘリンプロモーターを標的とする種々のＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを標的とする種々のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの有無別にＭＣＦ−７細胞を回収した。全タンパク質（各２０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミドゲル）により分離し、ポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（フナコシ、東京、日本）にエレクトロブロッティングにより転写した。免疫複合体は、Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびアクチン（ＵＢＩ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により可視化した。Ｅ−カドヘリンの相対レベルをアクチンレベルを基に標準化した。
図２ｃに示すように、上記Ｅ−カドヘリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロット分析により、Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡと同様のタンパク質レベルの低下が確認された。これら結果より、明らかにＥ−カドヘリンプロモーターを標的とするｓｉＲＮＡは転写レベルでの遺伝子サイレンサーとして作用した。その上、Ｅ−カドヘリン遺伝子のプロモーター内のｓｉＲＮＡによるＤＮＡメチル化は、相加的な様式で遺伝子発現レベルと逆相関することが明らかになった。
実施例３：ヒト細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＤＮＡメチル化におけるＤＮＭＴの関与
一般に、哺乳動物細胞におけるＤＮＡメチル化はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）によって起こることが知られている（Ｂｅｓｔｏｒ，Ｔ．Ｈ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，２３９５−２４０２（２０００））。このため、ＤＮＭＴがヒト細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＤＮＡメチル化に関与するか否かを確かめるために、本発明者らはＤＭＮＴ  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを用いてＤＮＭＴ遺伝子の発現を抑制することを試みた。ＤＮＭＴ１はヒト細胞における主要なＤＮＡメチルトランスフェラーゼの一つとして作用するため（Ｒｈｅｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，５５２−５５６（２００２）：Ｒｏｂｅｒｔ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３３，６１−６５（２００３））、本発明者らはＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡ（Ｒｏｂｅｒｔ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３３，６１−６５（２００３））を標的とするｓｉＲＮＡを合成した（図３ａ）。対照として、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方に４つの点変異を有する変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを用いた。
ＤＭＮＴ１−ｓｉＲＮＡおよび変異型ＤＭＮＴ１−ｓｉＲＮＡの配列は図３ａに示した（配列番号：６５−６８）。これらｓｉＲＮＡを作製するために、それぞれの合成センスＲＮＡ鎖と合成アンチセンスＲＮＡ鎖を標準的な方法（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００（２００１））によってアニーリングさせた。
上記ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡまたは変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡ（各２００ｎＭ）を実施例２と同様にＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を用いてＭＣＦ−７細胞に導入した。導入９６時間後にＩＳＯＧＥＮ（商標）（ニッポンジーン、富山、日本）を用いてトータルＲＮＡを回収し、ＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて調べた。
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラ）を用い、以下のプライマーを用いて行った：  ＤＮＭＴ１順方向（（配列番号：２５）５’−ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  Ａ−３’）および逆方向（（配列番号：２６）５’−ＣＴＣ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ−３’）プライマー。または対照実験はＧＡＰＤＨ順方向（（配列番号：２７）５’−ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ−３’）および逆方向（（配列番号：２８）５’−ＴＧＧ  ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡ−３’）プライマーを用いて同様の操作を行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルを用いた電気泳動により解析した。
図３ｂに示した通り、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞におけるＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡレベルはＷＴ−ＭＣＦ−７細胞と比べて有意に低かったが、変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞では野生型ＭＣＦ−７細胞と同程度のＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡが検出された。
ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを導入したＭＣＦ−７細胞におけるＤＮＭＴ−１のタンパク質レベルについても、ＤＮＭＴ１に対する特異抗体を用いたウエスタンブロット分析により確認した。ここでは結果を図として示さないが、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡの導入によりＤＮＭＴ−１のタンパク質レベルもｍＲＮＡと同様の低下が確認された。
次に、ＤＮＭＴ−１遺伝子発現の低下が、ｓｉＲＮＡを介したＤＮＡメチル化に影響を与えるか否かを検討するために、上記Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ（部位１〜１０）の混合物を、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞に導入した。ｓｉＲＮＡの導入はＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を用いて行い、導入９６時間経過後に全ＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲンムＤＮＡを用いて実施例１に示したＰＣＲを用いたメチル化解析方法により、Ｅ−カドヘリンプロモーター領域のメチル化レベルを解析した。
図３ｃに示した通り、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞におけるＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡによるＤＮＡメチル化のレベルは、ＷＴ  ＭＣＦ−７細胞または変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞のいずれよりも有意に低かった。したがって、明らかに、ＤＮＭＴ１はヒト細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＤＮＡメチル化のために必要である。
さらに、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞において、Ｅ−カドヘリン発現に対するＥ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡの影響についても検討した。具体的には、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡ（またはその変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡ）が導入されたＭＣＦ−７細胞にさらに、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡを導入した。これらｓｉ−ＲＮＡの導入方法は上記実施例１等と同様にキットを用いて行った。Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡ導入９６時間後にＭＣＦ−７細胞よりトータルＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲによりＥ−カドヘリンｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、実施例２に記載の方法に従って行った。
図３ｄに示した通り、Ｅ−カドヘリン−プロモーターを標的とするｓｉＲＮＡは、ＤＮＭＴ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ（ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡ）を含むＭＣＦ−７細胞におけるＥ−カドヘリン遺伝子発現を変化させなかった。これに対して、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡは、変異型ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡを含むＭＣＦ−７細胞におけるＥ−カドヘリン遺伝子の発現を低下させた。これらの結果は、ＤＮＭＴ１−ｓｉＲＮＡによるＤＮＡメチル化の阻害が、Ｅ−カドヘリン−ｓｉＲＮＡによる転写レベルでの遺伝子サイレンシングに影響を及ぼすことを示している。
実施例４：ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターを用いたｅｒｂＢ２遺伝子発現抑制
ｅｒｂＢ２遺伝子はＭＣＦ−７細胞などのいくつかの腫瘍細胞系で過剰発現される上、メチル化されていないことが知られている。一方、ｅｒｂＢ２遺伝子は、種々の正常細胞系でプロモーターのメチル化によってサイレンス化される（Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１６９，１５５−１６４（２００１））。そこで、ｓｉＲＮＡによりＤＮＡメチル化を制御することによる将来の遺伝子治療を念頭に置いて、本発明者らは上記ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターを構築した。
本発明者らはすでに、ｔＲＮＡｖａｌにより生じたｓｈＲＮＡが、ヒト細胞においてｓｉＲＮＡを介した遺伝子サイレンシングを誘導することを示している（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７（２００３））。そのためｅｒｂＢ２プロモーターを標的とするｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築には、ｐＰＵＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ，ＵＳＡ）を骨格としＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にｔＲＮＡｖａｌ用のヒト遺伝子の化学合成プロモーターを備えたｐＰＵＲ−ｔＲＮＡプラスミドを用いた（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７（２００３））。また、ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とするｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの標的配列としては、ｅｒｂＢ２プロモーター内部の５種類のＣｐＵアイランド（部位１〜５）を選択した。標的配列（部位１〜５）は以下の通りである：
2004076663.tif 000005
上記ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とし、ループモチーフを備えたｄｓＲＮＡをコードする化学合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲにより二本鎖配列として合成した。ＳａｃＩおよびＫｐｎＩによる消化後に、断片を上記ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡ中、ｔＲＮＡ遺伝子プロモーターの下流にクローニングした。
続いて、ＭＣＦ−７細胞内において、これらのｓｈＲＮＡ発現プラスミドから目的とするｓｈＲＮＡが生成されるかの確認実験を行った。ｓｈＲＮＡ発現プラスミドを実施例１の方法と同様にＭＣＦ−７細胞に一時的に導入した。導入７２時間後にトータルＲＮＡを回収し、ノーザンブロット分析を行った。その結果、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞ではｓｈＲＮＡを生成する適切なプロセシングが起こったことを確認した（図４ｂ）。発現ベクターを用いてｓｈＲＮＡが細胞内で生成されることが確認されたことから、続いて、これら発現ベクターを用いて、ｅｒｂＢ２プロモーターへのメチル化誘導を行った。
上記各発現ベクターを用いて生成されるｓｈＲＮＡによってｅｒｂＢ２プロモーター内部のＤＮＡメチル化レベルが変化するか解析した。この解析には、実施例２に示したＰＣＲに基づくメチル化解析方法を用いた。具体的には、各ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ発現ベクターをＥｆｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｄｄｅｌｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、添付の製造者のプロトコールに従ってＭＣＦ−７細胞に導入した。導入９６時間後に細胞よりゲノムＤＮＡを回収し、ｅｒｂＢ２プロモーター上のメチル化レベルを解析した。
ゲノムＤＮＡ（５００ｎｇ）をメチル化感受性酵素、ＨｐａＩおよびＨｈａＩで消化した（図４ａ）。消化の後に、５０ｎｇのＤＮＡを以下のプロモーターを用いるＰＣＲによって増幅した：ｅｒｂＢ２順方向（（配列番号：３１）５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡ−３’）および逆方向（（配列番号：３２）５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  ＴＴＴ−３’）プライマー。対照実験として、ｅｒｂＢ２プロモーターの完全なゲノムＤＮＡを、ｅｒｂＢ２プロモーターを切断しうるＰｓｔＩ、ならびにこれらのプロモーターを切断できないＨｉｎｄＩＩＩによって消化処理した。
実施例１と同様に不完全消化の可能性を除外するために、すべての試料を各酵素により２回の独立した実験で消化処理した。２回ずつの消化物のそれぞれからのＰＣＲ増幅を少なくとも２回繰り返した。ＰＣＲ反応時のオーバーサイクルを防止するために、未消化テンプレートおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化したテンプレート（何らシグナルを生じない）を用いてｃｙｃｌｅ  ｃｕｒｖｅ  ｎｕｍｂｅｒ法を行うことにより、各プライマーセットに対するサイクル数を決定した。ｅａｒｂＢ２プロモーターに対する特異的プライマーは以下の通りである。
2004076663.tif 000006
2004076663.tif 000007
ＧＡＩＰＤＨを対照遺伝子として、この遺伝子を消化できないＨｐａＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｃＩ、ＨｈａＩ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化処理した後に、断片ＤＮＡを特異的な順方向（（配列番号：６３）５’−ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＴ−３’）および逆方向プライマー（（配列番号：６４）５’−ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＧＧＣ−３’）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。増幅された部分的ＤＡＰＤＨ遺伝子のレベルは各試料ともほぼ同一であり、実験誤差の限界範囲内に収まることが判明した。
図４ｃに示した通り、ｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡまたはすべてのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡの混合物（部位１〜５）を発現したＭＣＦ−７細胞において、ｅｒｂＢ２プロモーター内部のＤＮＡメチル化が例外なく観察された。Ｕ６プロモーターにより生じさせたｓｈＲＮＡの場合も同様の結果が得られ（非提示データ）、このことから、ベクターベースのｓｉＲＮＡがヒト細胞においても配列特異的なＤＮＡメチル化を誘導しうることが示された。
次に、ベクターベースのｓｉＲＮＡがｅｒｂＢ２遺伝子の発現を抑制したか否かについて検討するために、本発明者らはｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。ＲＴ−ＰＣＲは、ｅｒｂＢ２順方向（（配列番号：２３）５’−ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＧ  ＴＧＣ  ＣＧＣ−３’）および逆方向（（配列番号：２４）５’−ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  Ｃ−３’）プライマーを用いたことを除いて、実施例２と同様に実施した。
図４ｄに示した通り、個別のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現した各細胞におけるｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡレベルはＷＴ  ＭＣＦ−７細胞におけるレベルよりも部分的に低下した。以前に観察された通り（図２ａ）、すべてのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（部位１〜５）を発現した細胞におけるｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡレベルは、ＷＴ  ＭＣＦ−７細胞またはいずれかの個々のｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞におけるレベルと比較して有意に低く、このことはベクターベースのｓｈＲＮＡによる転写レベルでの抑制による相加性を示している。このため、哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡによるプロモーターのメチル化による転写調節は、本研究の２つの例によって本発明者が示したように、一般的な機構である可能性が示唆された。
上記すべてのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（部位１〜５）に加えて、ｅｒｂＢ２遺伝子コード領域を標的としたｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（部位６）を加えて、同様にＭＣＦ−７細胞へのトランスフェクションおよびＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、図４ｄに示すように、さらに効率よく標的遺伝子の発現が抑制された。
さらに、ｅｒｂＢ２遺伝子プロモーターを標的としたｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡを発現する細胞の表現型を検討するために、本発明者らはさまざまな細胞系の増殖速度を分析した。各細胞系の増殖速度は、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用い、製造者の指示に従って測定した（Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｈ．，＆  Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，７００−７０７（２００３））。
図４ｅに示した通り、すべてのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（部位１〜５）を発現したＭＣＦ−７細胞は、野生型ＭＣＦ−７細胞よりも有意に増殖が緩徐であった。これらの結果から、すべてのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡ（部位１〜５）を発現するＭＣＦ−７細胞の増殖速度の低下は、この細胞におけるｅｒｂＢ２  ｍＲＮＡレベルの低下と相関することが示された。このため、ｅｒｂＢ２遺伝子プロモーターを標的とする本発明者らのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡには細胞増殖抑制剤、とりわけ癌などの新生物を抑制するための治療薬としての有用性が示唆された。
なお、本実施例で示したヘアピン（ステムループ）型ＲＮＡ分子を発現する発現ベクターを構築する際には、完成したベクターの配列を確認するために、シークエンスが行われるが、ステムループ形が固い構造を形成しているためにシークエンスが読み難いという問題がある。そのため、ステム配列のセンス鎖に１￣１０箇所のミスマッチ配列やバルジを導入したステムループＲＮＡ分子のようなシークエンスし易い構造に改変しても、ＤＮＡのメチル化やＲＮＡｉを介した標的遺伝子の発現抑制効果は完全相補型のステムループ形ＲＮＡ分子と比較して同等の活性が見られる（データ図示せず）。
実施例５：長鎖ｈＲＮＡおよびＤｉｃｅｒ遺伝子の同時発現システム
動物細胞では、長鎖（３０塩基以上）ヘアピン（あるいはステムループ）形ＲＮＡ分子（「長鎖ｈＲＮＡ」）を発現させるとＰＫＲが活性化され、非特異的な翻訳抑制がおこる。そのため、ｈＲＮＡを用いてＲＮＡｉ効果を誘導するためには３０塩基以下のステムループ形ＲＮＡ分子を作製しなければならない。一方、ＲＮＡｉ効果は標的遺伝子の配列に依存するために、効果的な標的配列を決定するために多くのｓｈＲＮＡを作製しなければならない。
そこで、長鎖ｈＲＮＡ（２５〜５００塩基）とＤｉｃｅｒ遺伝子を同時発現するシステムを考案した。具体的には、ＰｏｌＩＩプロモーターの下流にＤｉｃｅｒ遺伝子を接続したＤｉｃｅｒ発現カセットと、ｐｏｌＩＩＩプロモーターの下流に短いステムループ型ＲＮＡ分子をコードしたＤＮＡを接続したｈＲＮＡ発現カセットとをベクター上に搭載して、これを細胞に導入した。先ずはｅｒｂＢ２遺伝子コーディング領域を標的とした長鎖ｈＲＮＡとＤｉｃｅｒ遺伝子を同時に発現させると、従来のｈＲＮＡに比べて発現抑制効果の上昇が確認された（図５）。
また、この系でＰＫＲの活性化が生じるか否かをＰＫＲ活性化の指標となるｅｌＦ２αのリン酸化に基づき解析した。具体的には、リン酸化型ｅＩＦ２アルファを特異的に認識する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、内在性コントロールのβアクチンに対するリン酸化型ｅＩＦ２アルファの相対量をＮＩＨｉｍａｇｅプログラムにより解析した。
その結果、ｅｌＦ２αのリン酸化はほとんど見られなかったことから（図６）、この系ではＰＫＲ活性化はほとんど誘導されないことが確認された。
本システムでは、細胞内でＤｉｃｅｒが発現され、同時に発現した長鎖ステムループ形ＲＮＡが速やかにｓｉＲＮＡにプロセッシングされることが示唆された。また、ステム配列のセンス鎖に１〜１００箇所にミスマッチ配列（Ｇ−Ｔペアなど）やバルジ（２−１０塩基）を導入することで、より効果的にＰＫＲの活性化を回避し得る。
実施例６：ｓｉＲＮＡによる配列特異的なメチル化の確認
上記実施例までに合成ｓｉＲＮＡやｓｉＲＮＡ発現ベクターから発現するｓｉＲＮＡが、配列特異的にターゲットとなる遺伝子プロモーター領域をメチル化することをメチル化特異的ＰＣＲによって解析した。本実施例では、ｓｉＲＮＡによって引き起こされたメチル化を配列レベルで確認することができるｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシング解析により解析した。本解析に用いるｂｉｓｕｌｆｉｔｅ試薬はメチル化されていないシトシン塩基をウラシル塩基に変換するが、一方のメチル化されたシトシン塩基はウラシルに変換することができない。したがって、ｓｉＲＮＡ等が導入された細胞から回収されたＤＮＡをｂｉｓｕｌｆｉｔｅ試薬で反応させた後、配列をシークエンスし、ウラシル塩基への置換の有無を確認することによりシトシンがメチル化されているか否かを確認することができる。Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ試薬による操作は、具体的には、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社，ＵＳＡ）を用いて行った。
具体的には、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターを標的とした合成ｓｉＲＮＡ（ｓｉｔｅ１−１０の各ｓｉＲＮＡ）を実施例１と同様にそれぞれヒト乳ガン細胞（ＭＣＦ−７細胞）にＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）を用いて導入し、導入９６時間後にゲノムＤＮＡを回収した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社，ＵＳＡ）を用いて、このゲノムＤＮＡにｂｉｓｕｌｆｉｔｅ試薬を作用させた。その後、プロモーターＤＮＡをｂｉｓｕｌｆｉｔｅ試薬で反応させた後にＰＣＲにて増幅した。増幅したプロモーターＤＮＡをＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＵＳＡ）によってプラスミドベクターに組み込んだ。組み込んだプラスミドベクターを大腸菌に導入してクローニングを行った。クローン化した個々のプラスミドをシークエンスすることでメチル化状態の頻度をモニターした。
結果の一部を図７に示す（メチル化状態を調べる際に大腸菌クローンを１０個適当にピックアップしてプラスミドのシークエンスを行い、メチル化されたものを斜線で示している）。Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターを標的とした合成ｓｉＲＮＡ（各ｓｉｔｅ１−１０）、これら各部位は個別に導入した）は配列特異的にＣｐＧ配列をメチル化することが示された。またＣｐＧ配列以外に若干ではあるがＣｐＮＧ配列（ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）もメチル化されることもわかった。このｓｉＲＮＡによるメチル化はＭＣＦ−７細胞のようなガン細胞だけでなく、正常乳腺細胞を用いた同様の実験でも観察された（図８）。さらにこれらのｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの配列が結合する領域だけをメチル化するのではなく、その近傍にも影響（メチル化）することが明らかになった（図９）。
以上のことから、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシングアッセイを用いた実験によりＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターを標的とした合成ｓｉＲＮＡが配列特異的にメチル化を誘導することが確認された。
また、ｔＲＮＡプロモーターを用いたｓｉＲＮＡ発現ベクターによるｅｒｂＢ２プロモーターのＤＮＡメチル化についてもｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシングアッセイを用いて部位特異的であるかを検討した。  なお、発現ベクターの導入およびゲノムＤＮＡの回収については、上記実施例に示した通り行った。
ｂｉｓｕｌｆｉｔｅシークエンシングアッセイを行った結果、合成ｓｉＲＮＡ同様にｔＲＮＡプロモーターから発現されるｓｉＲＮＡも配列特異的にメチル化誘導を引き起こすことが示された（図１０Ａ）。同様の結果は、Ｕ６プロモーターから発現するｓｉＲＮＡも配列特異的にメチル化誘導を引き起こすことがわかった（図１０Ｂ）。
実施例７：ｓｉＲＮＡによるメチル化誘導の機構の検討
植物や分裂酵母においてｓｉＲＮＡは、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化を引き起こすことが知られている（Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｃａｏ  Ｘ，Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ＳＥ．ＡＲＧＯＮＡＵＴＥ４  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３  Ｊａｎ  ３１；２９９（５６０７）：７１６−９、Ｖｏｌｐｅ  ＴＡ，Ｋｉｄｎｅｒ  Ｃ，Ｈａｌｌ  ＩＭ，Ｔｅｎｇ  Ｇ，Ｇｒｅｗａｌ  ＳＩ，Ｍａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ  ＲＡ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｌｙｓｉｎｅ−９  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２  Ｓｅｐ  １３；２９７（５５８８）：１８３３−７）
そこで、動物細胞においても上記のＥ−ＣａｄｈｅｒｉｎやｅｒｂＢ２プロモーターを標的としたｓｉＲＮＡがヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化を誘導するかを検討した。
Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターの標的部位１から１０に対するｓｉＲＮＡをミクスチャーでＭＣＦ−７細胞に導入して、９６時間後に細胞を回収後、１％ホルムアルデヒドで処理したのちにＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで溶解してメチル化ヒストンＨ３  Ｌｙｓ９の抗体で８時間緩やかに混和した。その混合物にプロテインセファロースＡを作用させ、ＰＵＬＬ  ＤＯＷＮを行った。２００μｌ  ｏｆ  １％  ＳＤＳ，０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３の溶液で溶出後、ホルムアルデヒドでクロスリンクさせた。Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎプロモーターに特異的なプライマーを用いてＰＣＲさせ電気泳動後バンドをエチジウムブロマイド染色で検出した。
上記メチル化ヒストンＨ３  Ｌｙｓ９の抗体を用いたクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）の実験から配列特異的にヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化を誘導することが明らかになった（図１１）。またヒストンメチルトランスフェラーゼ（Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＭＴ）をｓｉＲＮＡ（センス：ｔａｔｇｇａａｔａｔｔａｔｃｔｔｇｔａａａ（配列番号：６９）、アンチセンス：ｔｔｔａｃａａｇａｔａａｔａｔｔｃｃａｔａ（配列番号：７０））により発現抑制した場合、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化やＣｐＧ配列のメチル化レベルの顕著な低下が見られた（図１１）。一方、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ１）をｓｉＲＮＡにより発現抑制した場合ではＣｐＧ配列のメチル化レベルの顕著な低下は見られたが、ヒストンＨ３のＬｙｓ９のメチル化は正常に引き起こされることがわかった（図１１）。これらの結果は、ｓｉＲＮＡがヒストンＨ３におけるＬｙｓ９をしてＥ−カドヘリンプロモーター領域のＣｐＧ配列のメチル化を引き起こすことを示唆している。
実施例８：動物細胞における長鎖ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉
本実験から合成ｓｉＲＮＡおよびｔＲＮＡプロモーターやＵ６プロモーターから発現するｓｉＲＮＡが、配列特異的にＣｐＧ配列やＣｐＮＧ配列のメチル化誘導を介して、転写レベルで標的遺伝子の発現を抑制することがわかった。しかしながら、今回用いたｓｉＲＮＡの長さは２１塩基から３０塩基であり、この場合は部分的なメチル化誘導しか期待できず、その結果として転写レベルでの標的遺伝子発現も部分的にしか抑制できない。一般に遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧアイランドは約１ｋｂｐ程度の長さから数ｋｂｐの長さを有しており、効率よく転写レベルでの標的遺伝子発現を抑制するには、この領域をカバーする多種類のｓｉＲＮＡが必要とされる。しかし多種類の合成ｓｉＲＮＡやｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することは、効率が良いとはいえない。
一方、長鎖のｄｓＲＮＡは、一般的にインターフェロンのシグナル経路を活性化して非特異的な遺伝子発現抑制を促進してしまう。しかしながら核内に局在させる長鎖のｄｓＲＮＡは、このインターフェロンシグナル経路を活性化しないことが報告された。
そこで、我々は核内に長鎖のｄｓＲＮＡを局在させる方法としてＰｏｌ  ＩＩプロモーターから発現するベータグロブリンのイントロン部位に長鎖のｄｓＲＮＡをコードする遺伝子を挿入することを考案した（図１２）。このベクターから発現する転写産物は、イントロンが核内でプロセシングされることで長鎖のｄｓＲＮＡが放出される。このｄｓＲＮＡは、内在性のＤｉｃｅｒ様のリボヌクレアーゼＩＩＩによって２１−２５塩基の短いＲＮＡにプロセシングされる。
実際に、ｅｒｂＢ２プロモーターを標的とした５００塩基のｄｓＲＮＡをコードする遺伝子を、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターから発現するベータグロブリンのイントロン部位に挿入したベクター（ｐＳＶ−ＢＧＩ）、またｔＲＮＡプロモーター発現ベクターやＵ６プロモーター発現ベクターの下流に挿入したベクターを構築した。それぞれのベクターをＭＣＦ−７細胞に導入し、導入９６時間後にゲノムＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡ上のｅｒｂＢ２プロモーター領域のメチル化を実施例４の方法に従って解析した。
その結果、ｔＲＮＡプロモーターやＵ６プロモーターと比べてｐＳＶ−ＢＧＩは効率よくかつ広範囲をメチル化誘導した（図１３）。
また、ｅｒｂＢ２タンパク質を特異的に認識する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、内在性コントロールのβアクチンに対するリン酸化型ｅＩＦ２アルファの相対量をＮＩＨｉｍａｇｅプログラムにより解析した。その結果、上記メチル化の結果に伴って、ｅｒｂＢ２遺伝子の発現も顕著に抑制された（図１４）。
一方、それぞれのベクターを導入したことによる細胞毒性を検討した。ｄｓＲＮＡの細胞毒性は、ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＫＲ）によるｅＩＦ２アルファのリン酸化のレベルで評価することができる。そのため、リン酸化型ｅＩＦ２アルファを特異的に認識する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、内在性コントロールのβアクチンに対するリン酸化型ｅＩＦ２アルファの相対量をＮＩＨｉｍａｇｅプログラムにより解析した。
その結果、ｔＲＮＡプロモーター発現ベクターやＵ６プロモーター発現ベクターは細胞毒性を示したのに対して、ｐＳＶ−ＢＧＩは細胞毒性を示さなかった（図１５）。以上からＰｏｌ  ＩＩプロモーターから発現するベータグロブリンのイントロン部位に長鎖のｄｓＲＮＡを挿入したベクター（ｐＳＶ−ＢＧＩ）は、効率よくかつ広範囲にメチル化を誘導して、転写レベルで遺伝子サイレンシングを引き起こすことが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
本発明者らは合成ｓｉＲＮＡおよびベクターベースのｓｉＲＮＡがヒト細胞において配列特異的かつＤＮＭＴ１依存的なＲＭＤＭを誘導しうることを初めて示した。その結果として、これらのｓｉＲＮＡは配列特異的な遺伝子サイレンシングを転写レベルで制御することができる。
本発明により、コグネイトｍＲＮＡの破壊のみによるのではなく、転写レベルでも哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現レベルをｓｉＲＮＡによって制御することが可能であり、本発明者らのｔＲＮＡ−ｓｈＲＮＡは治療薬として有用な可能性があると考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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