(57)【要約】本発明は、血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタであって、前記血液試料を流すための流路と、前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部とを規定し、血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物を前記流路内に備える本体を含み、前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、フィルタに関する。
2004097393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタであって、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部とを備え、
前記流路内には血球成分の通過を妨げるように複数の構造物が配置されており、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、フィルタ。
【請求項２】
前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項３】
前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項４】
前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項５】
前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項６】
前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項７】
前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項８】
前記構造物は、柱状の形状を有する、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項９】
前記構造物は、円柱状の形状を有する、請求項８に記載のフィルタ。
【請求項１０】
前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項１１】
前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項１２】
血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタ領域を備えたバイオセンサであって、
基板と、
前記基板に支持された測定系と、
前記測定系またはその近傍の前記基板上に支持された酸化還元酵素を含む試薬系と、
前記基板と組み合わされるカバーであって、それにより前記基板との間に、前記血液試料から血球成分を除去するためのフィルタ領域と、前記測定系および前記試薬系を収容する反応領域と、前記フィルタ領域と連結し前記反応領域に試料を導入するための試料導入路とを規定する、カバーとを含み、
前記フィルタ領域は、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部であって、前記試料導入路と連結した開口部と、
前記流路内に血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物とによって規定され、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、バイオセンサ。
【請求項１３】
前記測定系に、少なくとも一対の電極を含む電極系を含む、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】
前記構造物は、柱状の形状を有する、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】
前記構造物は、円柱状の形状を有する、請求項２０に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】
前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２３】
前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、化学、生化学、医学などの分野における臨床試験、特にポイントオブケア検査、または家庭などで使用する、血液成分を分離するためのフィルタおよびそのようなフィルタを備えたバイオセンサに関する。
【背景技術】  血液中の成分を測定する生化学検査は各種の診断、観察に広く利用され、臨床検査として重要な検査法となっている。各種の生化学検査装置が開発され多数の検体や多数の検査項目が分析されている。このような検査において、血液中の特定の成分、特に血球成分は、測定値に高いバックグランドを生じるか、または測定装置の性能を妨害するため、サンプル中の血球成分の除去が望まれる。また、検査装置は、多くの場合、少量のサンプル量での測定が可能であることが望ましい。
血球成分の除去は、しばしば、一般的なフィルタ材を使用して行われる。例えば、電気化学センサの血液試料導入路に一般的なフィルタ材（例えば、グラスファイバー、セルロースなどの親水性繊維で構成される不織布、またはパルプ、濾紙など）を組み入れた、フィルタ一体型センサチップに関する技術がある（例えば、米国特許公開第２００２／０１４８７２６号公報を参照）。
しかしながら、このような一般的なフィルタ材を使用したフィルタでは、相当量の血漿成分がフィルタ材に吸収されてしまうために、濾過後に残るサンプルの量がかなり減少してしまう。そのため、濾過後に十分な量のサンプルを得るには、多量の血液が必要である。
このようなフィルタ材の問題に対処するべく、少量の血液で血球成分の除去を行う装置が開発されている。例えば、米国特許第６，３１９，７１９号明細書に開示される血球成分分離構造物では、毛管現象によりサンプルを経路内に導入し、経路内部に配置した多数の欠けた月または弾丸の形をした障害物を利用して血球成分を分離している。
しかしながら、このような毛管現象と経路内部の障害物とを利用した血球成分分離構造物でも、必要な血液量に関しては、未だ改善の余地がある。現在、チップタイプの血糖センサに使用されるサンプル容量は約０．３〜４μｌであるが、上記米国特許第６，３１９，７１９号の血球成分分離構造物は、血液の濾過を行うために、２０〜５０μｌのサンプル容量を必要とする。したがって、血球を分離せずに血糖センサでの検査を行う場合に比べて、未だに多量のサンプルが必要とされる。
また、血糖センサの代表的な大きさが幅６ｍｍ、長さ１０ｍｍであるが、上記米国特許第６，３１９，７１９号の血球成分分離構造物では、血球移動遅延の効果で血球濾過を行っているため、流路長を長くとる必要があり、流路である毛管経路の幅が２〜５ｍｍ、長さが７０ｍｍ程度必要となる。そのためデバイスのサイズが大きく、チップタイプの血糖センサと一体化して使用することが困難であるという問題がある。
さらに、血液中に含まれる赤血球の割合は、５割近くにもなるが、このように分離すべき成分が全体の５割近くをも占めるという血液の性質は、血液中の血球成分の分離において、フィルタが目詰まりを起こしやすいという特有の課題を提示する。
【発明の開示】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、必要とされるサンプル量が極力少なく、チップタイプのバイオセンサに適用し得る程度に小さなサイズの血液成分分離用フィルタ、およびそのようなフィルタと一体化したバイオセンサを提供することを目的とする。さらに、血球成分によるフィルタの目詰まりを効果的に防止するフィルタおよびそのようなフィルタと一体化したバイオセンサを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタを提供し、このフィルタは、
上記血液試料を流すための流路と、
上記流路の一端に上記血液試料を導入するための開口部と、
上記流路の他端に濾過された上記血液試料を排出するための開口部とを備え、上記流路内には血球成分の通過を妨げるように複数の構造物が配置されている。さらに、上記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、上記複数の構造物および上記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ上記流路内に規定する。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティが、少なくとも２つ上記流路内に規定されている。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの奥行きは、上記キャビティの開口部の幅よりも大きい。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの形状は、ほぼ直方体である。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記構造物は、柱状の形状を有する。
本発明のフィルタのさらに好ましい実施形態では、上記構造物は、円柱状の形状を有する。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記血液試料は、毛管作用により上記流路内に導入される。
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記構造物および上記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている。
本発明は、さらに別の局面において、血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタ領域を備えたバイオセンサを提供する。このバイオセンサは、
基板と、
上記基板に支持された測定系と、
上記測定系またはその近傍の上記基板上に支持された酸化還元酵素を含む試薬系と、
上記基板と組み合わされるカバーであって、それにより上記基板との間に、上記血液試料から血球成分を除去するためのフィルタ領域と、上記測定系および上記試薬系を収容する反応領域と、上記フィルタ領域と連結し上記反応領域に試料を導入するための試料導入路とを規定する、カバーとを含み、
上記フィルタ領域は、
上記血液試料を流すための流路と、
上記流路の一端に上記血液試料を導入するための開口部と、
上記流路の他端に濾過された上記血液試料を排出するための開口部であって、上記試料導入路と連結した開口部と、
上記流路内に血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物とによって規定され、
上記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
上記複数の構造物および上記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ上記流路内に規定する。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記測定系に、少なくとも一対の電極を含む電極系を含む。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティが少なくとも２つ上記流路内に規定されている。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの奥行きは、上記キャビティの開口部の幅よりも大きい。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの形状は、ほぼ直方体である。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記構造物は、柱状の形状を有する。
本発明のバイオセンサのさらに好ましい実施形態では、上記構造物は、円柱状の形状を有する。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記血液試料は、毛管作用により上記流路内に導入される。
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記構造物および上記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている。
本明細書中で使用される「血球」または「血球成分」という用語は、当該分野で認識されている通常の意味で使用され、血液中の赤血球、白血球、および血小板を意味する。しかしながら、検査目的やデバイス設計における諸々の状況等に応じて、測定結果の正確性に対して特に影響を及ぼし得るものとして、主に、赤血球のみ、もしくは白血球のみ、または赤血球および白血球のみを「血球」または「血球成分」として考慮する場合もあり得る。
本明細書中で使用される「血漿」または「血漿成分」という用語は、当該分野で認識されている通常の意味で使用され、血液中の血球成分を除いた成分（主に液状成分を構成する血清およびフィブリノーゲン）のことを意味する。なお、「血球」として血小板を特に考慮しない場合には、血小板を血漿または血漿成分に含める（「血球」の他の成分についても同様）。
本発明により、微量サンプル量で、小さな形状で、短時間で血球と血漿を分離する事が可能なフィルタとそれを用いたバイオセンサが提供される。
また、本発明のフィルタの一実施形態では、毛管作用により血液サンプルを流路内に導入することもでき、その場合、従来のフィルタ材を使用したもののように、サンプル液を流すためにシリンジなどで圧力をかける必要もない。
また、従来のフィルタ材を使用した場合、繊維などによってできる孔の大きさは正確に決定できない（平均値としてしか把握できない）が、本発明のフィルタでは、スリットの大きさが正確に決定し得るため、スリット幅を適切に調節することによって、異なるサイズの分子の中から所望のサイズのものを比較的容易に選別することが可能である。
また、本発明のフィルタおよびそのようなフィルタを組み込んだバイオセンサは、半導体加工技術を利用して作製することにより、大量の均質な装置をまとめて作製することができる。
典型的には、本発明により、幅５ｍｍ、長さ９ｍｍ、高さ２．５ｍｍ程度の極小のフィルタ組込型バイオセンサが提供され、このバイオセンサにより、３０ｎＬ程度の極微量の血液を血漿と血球とに分離し、血漿中のグルコース濃度などを測定することが可能となる。しかしながら、本発明の技術的範囲は、このような実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、本発明の一実施形態に係る、血液中の血球と血漿とを分離する血液成分分離フィルタ１の模式的な上面図であり、図１Ｂは、その斜視図である。
図２Ａは、本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１を図１Ｂ中に示した切断線に沿って切断した断面の斜視図であり、図２Ｂは、図２Ａに示すフィルタ１の流路内部の拡大上面図である。
図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図である。
図４Ａは、採取した血液から血球を分離するためのフィルタと、血糖値のような検査項目の分析のためのバイオセンサとが一体化した本発明のバイオセンサ２の構成を示す模式的な上面図であり、図４Ｂはその斜視図である。
図５Ａは、本発明のフィルタ１により血液を濾過したときの試料導入前の状態を示す図であり、図５Ｂは、試料導入後の状態を示す図である。
図６は、本発明のバイオセンサ２によるグルコースの応答値変化を示す図である。
図７は、本発明のバイオセンサ２によるコレステロールの応答値変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  図１は、本発明の一実施形態に係る、血液中の血球と血漿とを分離する血液成分分離フィルタ１の模式的な上面図（図１Ａ）および斜視図（図１Ｂ）である。
図１Ａおよび図１Ｂを参照して、本発明の血液成分分離フィルタ１は、基板１１とカバー１２とを含む。基板１１上には流路用の溝が予め形成されており、カバー１２が張り合わされることによって、流路１８と、流路１８の両端の試料導入口１４および試料排出口１５とが規定される。フィルタ１はさらに、流路１８上に血球を塞き止めるための複数の構造物１９を備える。
この実施形態では、微細な構造物１９がフィルタ流路１８内に複数並べられている。構造物１９の形状は、好ましくは柱状であり、最も好ましくは円柱状である。これらの構造物１９は、血球を通過させないように、互いに適切な間隔をおいて流路１９内に配置される。典型的には、このような柱状構造物１９は、基板１１を反応性イオンエッチングなどの半導体加工技術により加工することによって作製することができる。このように構成されたフィルタ１に血液サンプルを通すことにより、血液中の血漿と血球とを分離することができる。なお、上記の例では、基板１１をエッチングにより彫り込むことによって流路１８および構造物１９を形成したが、構造物１９のみをエッチングにより作製した基板１１の両脇にスペーサを配置し、その上にカバー１２を張り合わせることによって流路１８を形成してもよい。
図１に示すように、フィルタ１において、流路１８上の柱状構造物１９が形成された部分であるフィルタ領域１１０をはさんで両側（試料導入口側および試料排出口側）にそれぞれ、血球を含む血液用の液溜１６および血漿用の液溜１７が規定される。
本発明の血液成分分離フィルタ１の好適な実施形態では、ヘマトクリット値が４０から６０である血液を試料として用い、その試料を毛管現象により試料導入口１４から流路１８内へ導入する。なお、ヘマトクリット値とは、血球が血液のなかで占める容積の割合を示し、通常は赤血球の容積の割合を示す。導入された血液成分のうち、血球は多数形成させた柱状構造物１９で塞き止められ、残りの血漿が試料排出口１５側の血漿用の液溜１７へと通過する。このようにして、シリンジポンプなどを使用せずに、簡単に血液中の血球を血漿成分から分離することができる。なお、血液導入時、及び導入後の血球は溶血されていない。
図２Ａは、本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１を図１Ｂ中に示した切断線に沿って切断した断面の斜視図である。但し、図２Ａでは、見やすさのために、カバー１２を基板１１から離して示し、さらに柱状構造物１９の数や配置は簡略化している。図中の矢印は試料が進入する方向を示す。
図２Ｂは、図２Ａに示すフィルタ１の流路内部の拡大上面図である。矢印は試料が進入する方向を示す。図２Ｂに示すように、１つの柱状構造物１９は、隣り合う他の柱状構造物との間でスリット１０１、および流路１８の内壁との間でスリット１０３を規定する。
構造物１９は、血漿成分のみ通過させ、血球を通過させないために、スリット１０１およびスリット１０３が最適な幅になるように、流路１８内に配置される。構造物１９はさらに、図示されるように、流路１８の内壁とともに血球を収容するための血球溜として機能するキャビティ１０４を流路１８内に形成するように、折り返し部分を有して流路１８内に配置される。以下、これらの構成について、さらに詳しく説明する。
以下の説明では、１つの柱状構造物と隣り合う他の柱状構造物との間で規定されるスリット１０１の幅をαとし、柱状構造物１９と隣接する流路１８の内壁との間で規定されるスリット１０３の幅を、γと定義する。また、柱状構造物１９と流路１８の内壁から形成されるキャビティ１０４の入口１０２の幅を、βと定義する。
まず、幅αは、本発明のフィルタ１に、血球を塞き止めるが血漿成分は通過させるフィルタとしての機能を付与させるように設定される。赤血球は扁平なディスク形状を有しており、その平均的な厚さは約２μｍ、そして直径が約８μｍ程度である。また、白血球は、直径が約６〜約２５μｍの不定形の球状分子である。したがって、血球を塞き止め、血漿が流れやすくするには、約２μｍ以下にすることが好ましい。また、αを約０．１μｍより小さくすると、液体の表面張力などの作用により、血漿成分でさえもスリット１０２を通過しにくくなってしまうため、αは約０．１μｍ以上とすることが好ましい。これらを実際に試験した結果を、表１に示す。
2004097393.tif 000003
2004097393.tif 000004
αについてのこれらの最適値は、柱状構造物１９と流路１８内壁との間の幅γについても同様に当てはまる。柱状構造物間のスリット１０１の幅αおよび柱状構造物と流路の内壁との間のスリット１０３の幅γを、上記のように設定することにより、血漿は通過するが血球は通過さない、血球分離フィルタが作製され得る。
しかしながら、上記のようにスリットの幅を設定したとしても、スリット１０１およびスリット１０３には、血液サンプルを流すにつれて血球が進入し「目詰まり」が発生する。目詰まりが発生すると、血漿でさえフィルタを通過し得なくなるため、血漿の分離効率が低下する。本発明のフィルタ１では、この現象を緩和するために、柱状構造物の配置を、図１および図２に示すように流路内の限られたスペース内で折り返し構造とした。
柱状構造物１９を、流路１８内で折り返しに配置することにより、柱状構造物１９を流路１８内で直線的に並べた場合に比べて、血漿成分が通過するスリットの数を増加させることができる。さらに、流路１８内壁と柱状構造物１９の配列とによって、流路１８内にキャビティ１０４が形成され、このキャビティ１０４が、血球を収容する血球溜の役割を果たし、試料導入口側の液溜め１６に血球が蓄積することを緩和することができる。結果として、スリットの目詰まりを抑制し、濾過効率を増大させ得る。
このようにして、短時間でより多くの血漿成分がスリットを通過することができ、デバイスサイズを大きくすることなく、効率的に血液成分の分離を行うことができる。
構造物１９の折り返し構造と流路１８の内壁とによってできるキャビティ１０４の入口１０２の幅βは、赤血球の厚さが約２μｍであることを考えると、約２μｍ以上に設定することが好ましい。幅βが小さすぎると、赤血球が入口１０２を通過し得なくなってしまう。なお、赤血球の厚さは、性差や個人差があるため、最適なβの最小値は、目的に応じて変化し得る。
また、幅βを大きくすればする程、キャビティ内部に留まる液成分の割合が大きくなるため液成分の回収率を低下させてしまうことから、幅βは大きすぎない方が効率的である。最適なβの最大値は、目的に応じて当業者が適宜決定し得るが、血球がキャビティ１０４内に一列に並ぶような状態が最も良好な血球分離効率を与えるため（データ示さず）、幅βは、赤血球の直径とほぼ同じ大きさである１０μｍ程度またはそれ以下であることが好ましい。幅βの最大値は、約８μｍ以下であることが最も好ましい。
したがって、βは、約２μｍ以上約１０μｍ以下であることが好ましく、約２μｍ以上約８μｍ以下であることが最も好ましい。しかしながら、最適なβの最大値は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る。
キャビティ１０４の深さ（または奥行き）は大きいほど、血漿の濾過効率は良いが、キャビティ１０４の大きさは、フィルタ１本体または流路１８の大きさによって必然的に限定されるため、所望のフィルタのサイズに応じて、適宜最適な奥行きを決定する。典型的には、例えば、１０ｍｍ程度の長さのチップ（フィルタ本体）に対して、２ｍｍ程度の深さのキャビティを作製することが可能であるが、これに限定されない。
キャビティ１０４の形状は、典型的には、図１または図２に示されるようなほぼ直方体の形状であるが、これに限定されない。図３は、柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図である。図３Ａ〜図３Ｃは、それぞれキャビティ１０４部分を上から見たものである。図３中の矢印は、サンプル液の流れる方向を示す。
図３Ａは、図１および図２に示すものと同様のほぼ直方体の形状をしたキャビティを示すが、各柱状構造物の断面が円形である（各構造物が円柱状である）点で、図１および図２に示すものとは異なる。
図３Ｂおよび図３Ｃは、図３Ａと同様に円柱状の構造物１９を折り返しに配置したものであるが、配置の形状が図３Ａのものとは異なる。図３Ｂに示すようにキャビティの入口をオープン形状にすると、血球がキャビティ内に入り込みやすく、また入口付近での血球の滞留を防止することに役立つ。図３Ｃは、キャビティの入口の形状は、図１、図２、および図３Ａに示すものと同様であるが、キャビティの底部が円形になっている点で異なる。
このようにキャビティの形状としては、様々なものが可能であり、ここに例示したものに限定されない。
濾過効率は、流路１８の限られた空間内で構造物１９の配列の折り返し回数を多くすることにより、さらに向上させることができる。典型的には、流路幅を１．５ｍｍとすると、幅１０μｍのほぼ直方体のキャビティを１０μｍ間隔で７５０回繰り返した配置をとることができるが、これより多く繰り返してもよいし、少なくてもよい。
また、幅α、βおよびγは、被験者の血球のサイズによっても変化させてもよい。例えば、通常、男性と女性とでは、赤血球のサイズが異なる（女性の赤血球のほうがより小さい）ため、女性の血液サンプルを使用する場合には、上記の代表的な値より小さいものを使用することもできる。
本発明のフィルタを用いる濾過に必要なサンプル量は、流路の深さ、構造物の配置などに依存して変化し得るため、当業者はフィルタの大きさなどにより適宜最適な量を決定し得る。本発明のフィルタでは、従来技術にみられたようなフィルタ材による吸収はない。また、本発明のフィルタでは、血球移動遅延の効果で濾過を行っているのではないことから、フィルタのサイズを小さくすることができる。したがって、サンプル量を従来よりも少量にすることが可能である。
本発明のフィルタの濾過効率は、柱状構造物の配置、キャビティの形状、キャビティ内部の容積などに依存するため、これらを適宜最適化することが必要である。
柱状構造物は断面形状が四角や丸等、どのような形状であっても構わない。しかしながら、赤血球膜の破壊（溶血）をできるだけ防止するためには、柱状構造物は滑らかな表面を有する（例えば、断面が円形である）ことが好ましい。
柱状構造物および流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、エポキシ樹脂などの、血液が凝固しにくい材料で構成されるか、またはそのような材料で表面が被覆されていることが好ましい。あるいは、血液の凝固を促進するＣａの含有量が少ない、ＳｉＯ２などの純度の高いガラス層を用いて作製され得る。
流路１８内部またはキャビティ１０４内部の高さ（または、厚さ）は、任意であり得るが、現在の製造技術のレベルを考慮すると、１００μｍ程度以下であることが現実的である。しかしながら、技術水準の変化に応じて、それ以上の厚さ（高さ）もあり得る。
また、本発明のフィルタは、半導体加工技術で基板上に作製したものに限定されず、例えば、プラスチック成型技術などでも同様に作製し得る。
本発明はまた、上記のようなフィルタを備えたバイオセンサを提供する。
図４は、採取した血液から血球を分離するためのフィルタと、血糖値のような検査項目の分析のためのバイオセンサとが一体化した本発明のバイオセンサ２の構成を示す。図４Ａは、バイオセンサ２の模式的な上面図であり、図４Ｂは、その斜視図である。
図４Ａおよび図４Ｂを参照して、本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２は、基板２１と、基板２１に重ね合わされたカバー２２と、基板２１とカバー２２とによって規定される流路２８とを備えている。バイオセンサ２はさらに、上記流路２８の一端に形成された試料を導入するための試料導入口２４と、他端に形成された流路から空気を逃がすための空気逃がし口２５とを備える。
バイオセンサ２はさらに、流路２８上に形成された、複数の柱状構造物２９を備えるフィルタ領域２１０と、そのフィルタ領域２１０の上流に血球成分を含む血液サンプルが滞留するための液溜２６と、そのフィルタ領域２１０の下流に作用極２０５、対極２０６、および反応領域２１１に試料が到達したことを検出するための液導入検知電極２１２を収容した反応領域２１１とを備え、さらに上記フィルタ領域２１０と上記反応領域２１１との間に、それらを連結する試料導入路２７とを備える。作用極２０５上には、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）およびメディエータ（例えば、シアン化鉄イオンのような金属錯体）を含む試薬２０７が配置されている。上記流路２８および柱状構造物２９は、反応性イオンエッチングのような半導体加工技術を用いることにより、基板２１上に形成し得る。
バイオセンサ２はさらに、作用極２０５と一体的に連結したリード２０８、対極２０６と一体的に連結したリード２０９、および液導入検知電極２１２と一体的に連結したリード２１３を備える。これらの電極（２０５，２０６，２１２）およびリード（２０８，２０９，２１３）は、カバー２２の基板２１と対向する面上に、スパッタ蒸着などの方法により形成され得る。
このように構成された本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２は、フィルタを備えていない従来のバイオセンサと同様のサイズにすることが可能であり、微量サンプル量で、正確に、短時間に、血糖値などの分析が可能である。
以下、実施例を用いて、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されない。
【実施例１】  ・作製したフィルタを用いた血液成分の分離
本発明に基づくフィルタをシリコン基板上に作製し、血液成分の分離を観察した。以下、図１および図２を参照して説明する。
５ｍｍ×９ｍｍ×０．５ｍｍの大きさのシリコン基板１１を用いて、反応性イオンエッチングにより、流路１８、および複数の柱状構造物１９を上記基板１１のほぼ中央に複数の折り返し部分を有するように構築した。さらに、柱状構造物１９およびシリコン基板１１の表面に、熱酸化により酸化被膜（図示せず）を形成した。この基板１１上に、シリコーン樹脂製のカバー１２を密着して張り合わせることにより、本発明のフィルタ１を作製した。
このようにして作製したフィルタ１は、流路１８の幅１．５ｍｍ、高さ３０μｍ、長さ９ｍｍを有していた。また、多数の柱状構造物１９の折り返しと流路１８内壁とによってできるキャビティ１０４は、ほぼ直方体の形状であり、その深さ（奥行き）は２ｍｍ、キャビティ入口の幅βは１０μｍであった。また、柱状構造物１９の各々は、２μｍ×２μｍの正方形の断面を有し、４μｍのピッチで２μｍの幅のスリット１０１および１０３を形成するように配置された。また、折り返しは、２０μｍのピッチで流路の長手方向に対して垂直方向に７５０回繰り返された。
なお、上記酸化被膜の形成には、熱酸化による方法以外に、減圧ＣＶＤ（化学的気相成長）、プラズマＣＶＤ、常圧ＣＶＤなどを使用し得る。
上記のように作製された本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１の評価手順は、以下の通りであった。最初に、作製したフィルタ１を顕微鏡のステージに載せ、そのフィルタ１の流路の一端にある試料導入口１４に試料としての血液を滴下し、液体の流れを顕微鏡ビデオ撮影によって記録した。液体が移動する様子を図５に示す。
図５Ａは、試料導入前のフィルタ１の様子を示す。図５Ｂは、試料導入後のフィルタ１の様子を示す。図５の写真において、矢印は血液が移動する方向を示す。それぞれの写真は、左側の黒い部分がフィルタ領域１１０、右側の明るい部分がフィルタ領域１１０を通過したサンプルの液溜１７を示している。血液は毛管現象により写真の左から右へと移動する。
血液が試料導入口１４から導入されると同時にフィルタ１の試料導入口１４側の液溜１６に血液が充填され、続けてフィルタ領域１１０内に充填された。
図５Ｂに示すように、試料導入後、ろ過された透明な血漿はフィルタ領域１１０から下流側の液溜１７へと流れ出した。写真の明るい部分に見える境界線は、血液から血球が分離され、血漿のみを含むサンプル液の最前線の境界である。血液導入から血漿ろ過完了までに要した時間は、平均してわずか２５秒以内であった。このようにして効率的に血液中の血球と血漿を分離する事が可能となった。
【実施例２】  ・本発明のバイオセンサ２の作製
図４Ａおよび図４Ｂを参照して説明する。基板２１は、信越シリコン社製シリコン基板（Ｐ型、１００面、直径１００ｍｍ、厚さ５２５μｍ、抵抗率１０〜２０Ω・ｃｍ）を使用した。その基板２１上に、反応性イオンエッチングなどの半導体加工技術によって、流路２８、および複数の柱状構造物２９を多数の折り返しを有するような配置において作製した。次に、シリコン基板２１表面に熱酸化することによって絶縁膜を成膜した。
他方、樹脂製シートからなるカバー２２の一方の面上に作用極２０５、対極２０６、および液導入検知電極２１２、ならびにリード２０８、２０９および２１３をスパッタ蒸着することによって作製した。次いで、作用極２０５上に、試薬２０７としてグルコースオキシダーゼおよびメディエータ（例えば、シアン化鉄イオンのような金属錯体）をシリンジによるディスペンス法により配置した。このカバー２２を、上記電極（２０５，２０６，２１２）が形成された面が対向するように基板２１に加圧熱圧着によって貼り合わせた。これにより、試料用流路２８、その流路の一端に試料導入用の試料導入口２４、他端に空気を逃がすための空気抜き口２５が規定される。
上記電極（２０５，２０６、２１２）および試薬２０７が配置された領域（反応領域）２１１内で血漿内の測定対象物が測定される。具体的には、作用極２０５上に設けた試薬２０７が血液導入とともに融解して、試薬２０７中の酵素が血液中のグルコースと反応する。作用極２０５と対極２０６間に０．５Ｖの電圧を印加して、これらの電極間に流れる電流を計測して、所定の時間（例えば３０秒）経過後の電流値からグルコース値を算出する。
上記方法で得られたバイオセンサ２は、長さ１１ｍｍ、幅５ｍｍ、高さ２．５ｍｍであり、流路２８のサイズは幅１．５ｍｍ、長さ７．０ｍｍ、高さ３０μｍである。必要とされるサンプル量は３１．５ｎｌ未満となる。このように、本発明によれば、サンプル量が従来の血液成分分離フィルタを用いる場合より少なくなるフィルタ一体型バイオセンサ２が提供される。
【実施例３】  ・グルコース濃度の測定
図６は血液中のグルコース濃度８７〜６４８ｍｇ／ｄｌにおけるバイオセンサ感度を比較したものである。同図において黒三角は標準液を、黒四角は本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２での、黒菱形は比較例としてフィルタを備えていないバイオセンサでの計測データを示す。
グルコース濃度の異なる血液の調製は、血液（ヘマトクリット値：４４）にグルコース溶液を、８７〜６４８ｍｇ／ｄｌの範囲で添加することで行った。標準液は、リン酸緩衝生理食塩水にグルコースを溶解したものを使用した。
バイオセンサ２は、実施例２に示すように作製した。また、比較例のフィルタを備えていないバイオセンサは、必要とされるサンプル量６００ｎｌのものを使用した。
電流値は試料導入口２４から血液を導入し、２５秒後に作用極２０５のリード２０８と対極２０６のリード２０９に０．５Ｖの電圧を印加した。その５秒後に計測を行った。
フィルタありの本発明のデバイス２での応答は、フィルタなしのデバイスの応答よりも約２０パーセント応答値が上昇し、グルコース標準液の応答値により近づいた。このことから感度が向上した事が分かる。
【実施例４】  ・コレステロール濃度の測定
図７は血液中のコレステロール濃度１１３〜２８８ｍｇ／ｄｌにおけるバイオセンサ応答を比較したものである。同図において黒菱形は本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２であり、黒四角は比較例としてのフィルタを備えていないバイオセンサである。
コレステロールの異なる血液は、全血を遠心分離で血漿を取り除いた後、高コレステロール値をもつ標準血清（セラクリア−ＬＰ  異常域、アズウェル製）を添加することで作製した。なお、本実施の形態では試薬としてコレステロールエステラーゼを用いた。
図７に示されるように、フィルタを付けていないバイオセンサでは血球が妨害物質として作用し、コレステロール濃度に比例した電流値が得られず、測定不能となったが、フィルタを付けたバイオセンサ２の場合は、コレステロール濃度に依存した値が測定された。このことからフィルタ付のデバイス２を使用することにより、はじめて正確な測定が可能となった事が分かる。
なお、実施例３および４において、酵素電極方式に基づく測定を例示したが、測定手段が酵素電極方式以外のものを用いても良い。そのような一例として、酵素比色方式がある。
【産業上の利用可能性】  このように、本発明に係る血球と血漿の分離フィルタは、バイオセンサやＤＮＡ診断等の臨床検査の前処理デバイスとして有用である。
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月3日(2004.9.3)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】（補正後）血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタであって、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部とを備え、
前記流路内には血球成分の通過を妨げるように、円柱状の形状を有する複数の構造物が配置されており、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、フィルタ。
【請求項２】前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項３】前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項４】前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項５】前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項６】前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項７】前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項８】（削除）
【請求項９】（削除）
【請求項１０】前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項１１】前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項１２】血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタ領域を備えたバイオセンサであって、
基板と、
前記基板に支持された測定系と、
前記測定系またはその近傍の前記基板上に支持された酸化還元酵素を含む試薬系と、
前記基板と組み合わされるカバーであって、それにより前記基板との間に、前記血液試料から血球成分を除去するためのフィルタ領域と、前記測定系および前記試薬系を収容する反応領域と、前記フィルタ領域と連結し前記反応領域に試料を導入するための試料導入路とを規定する、カバーとを含み、
前記フィルタ領域は、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部であって、前記試料導入路と連結した開口部と、
前記流路内に血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物とによって規定され、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、バイオセンサ。
【請求項１３】前記測定系に、少なくとも一対の電極を含む電極系を含む、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】前記構造物は、柱状の形状を有する、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】前記構造物は、円柱状の形状を有する、請求項２０に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２３】前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項２４】（追加）前記キャビティの奥行き方向と幅方向とに平行な断面の形状は、当該キャビティの底部においてほぼ円形であることを特徴とする、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項２５】（追加）前記複数の構造物は、前記キャビティを形成するように折り返し構造で、前記流路の幅全体にわたって配置されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項２６】（追加）前記スリットは、前記構造物と、前記流路の幅を規定する当該流路の内壁との間にも形成されている、請求項２５に記載のフィルタ。




【手続補正書】
【提出日】平成17年3月25日(2005.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタであって、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部とを備え、
前記流路内には血球成分の通過を妨げるように、円柱状の形状を有する複数の構造物が配置されており、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、フィルタ。
【請求項２】
前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項３】
前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項４】
前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項５】
前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項６】
前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項７】
前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項８】
前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項９】
前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン（登録商標）、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項１０】
血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタ領域を備えたバイオセンサであって、
基板と、
前記基板に支持された測定系と、
前記測定系またはその近傍の前記基板上に支持された酸化還元酵素を含む試薬系と、
前記基板と組み合わされるカバーであって、それにより前記基板との間に、前記血液試料から血球成分を除去するためのフィルタ領域と、前記測定系および前記試薬系を収容する反応領域と、前記フィルタ領域と連結し前記反応領域に試料を導入するための試料導入路とを規定する、カバーとを含み、
前記フィルタ領域は、
前記血液試料を流すための流路と、
前記流路の一端に前記血液試料を導入するための開口部と、
前記流路の他端に濾過された前記血液試料を排出するための開口部であって、前記試料導入路と連結した開口部と、
前記流路内に血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物とによって規定され、
前記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
前記複数の構造物および前記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ前記流路内に規定する、バイオセンサ。
【請求項１１】
前記測定系に、少なくとも一対の電極を含む電極系を含む、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記キャビティが少なくとも２つ前記流路内に規定されている、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記キャビティの奥行きは、前記キャビティの開口部の幅よりも大きい、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記キャビティの形状は、ほぼ直方体である、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
前記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１７】
前記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１８】
前記構造物は、柱状の形状を有する、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項１９】
前記構造物は、円柱状の形状を有する、請求項１８に記載のバイオセンサ。
【請求項２０】
前記血液試料は、毛管作用により前記流路内に導入される、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項２１】
前記構造物および前記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン（登録商標）、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている、請求項１０に記載のバイオセンサ。
【請求項２２】
前記キャビティの奥行き方向と幅方向とに平行な断面の形状は、当該キャビティの底部においてほぼ円形であることを特徴とする、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項２３】
前記複数の構造物は、前記キャビティを形成するように折り返し構造で、前記流路の幅全体にわたって配置されている、請求項１に記載のフィルタ。
【請求項２４】
前記スリットは、前記構造物と、前記流路の幅を規定する当該流路の内壁との間にも形成されている、請求項２３に記載のフィルタ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学、生化学、医学などの分野における臨床試験、特にポイントオブケア検査、または家庭などで使用する、血液成分を分離するためのフィルタおよびそのようなフィルタを備えたバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中の成分を測定する生化学検査は各種の診断、観察に広く利用され、臨床検査として重要な検査法となっている。各種の生化学検査装置が開発され多数の検体や多数の検査項目が分析されている。このような検査において、血液中の特定の成分、特に血球成分は、測定値に高いバックグランドを生じるか、または測定装置の性能を妨害するため、サンプル中の血球成分の除去が望まれる。また、検査装置は、多くの場合、少量のサンプル量での測定が可能であることが望ましい。
【０００３】
血球成分の除去は、しばしば、一般的なフィルタ材を使用して行われる。例えば、電気化学センサの血液試料導入路に一般的なフィルタ材（例えば、グラスファイバー、セルロースなどの親水性繊維で構成される不織布、またはパルプ、濾紙など）を組み入れた、フィルタ一体型センサチップに関する技術がある（例えば、米国特許出願公開第２００２／０１４８７２６号公報（特許文献１）を参照）。
【０００４】
しかしながら、このような一般的なフィルタ材を使用したフィルタでは、相当量の血漿成分がフィルタ材に吸収されてしまうために、濾過後に残るサンプルの量がかなり減少してしまう。そのため、濾過後に十分な量のサンプルを得るには、多量の血液が必要である。
【０００５】
このようなフィルタ材の問題に対処するべく、少量の血液で血球成分の除去を行う装置が開発されている。例えば、米国特許第６，３１９，７１９号明細書（特許文献２）に開示される血球成分分離構造物では、毛管現象によりサンプルを経路内に導入し、経路内部に配置した多数の欠けた月または弾丸の形をした障害物を利用して血球成分を分離している。
【０００６】
しかしながら、このような毛管現象と経路内部の障害物とを利用した血球成分分離構造物でも、必要な血液量に関しては、未だ改善の余地がある。現在、チップタイプの血糖センサに使用されるサンプル容量は約０．３〜４μｌであるが、上記特許文献２の血球成分分離構造物は、血液の濾過を行うために、２０〜５０μｌのサンプル容量を必要とする。したがって、血球を分離せずに血糖センサでの検査を行う場合に比べて、未だに多量のサンプルが必要とされる。
【０００７】
また、血糖センサの代表的な大きさが幅６ｍｍ、長さ１０ｍｍであるが、上記特許文献２の血球成分分離構造物では、血球移動遅延の効果で血球濾過を行っているため、流路長を長くとる必要があり、流路である毛管経路の幅が２〜５ｍｍ、長さが７０ｍｍ程度必要となる。そのためデバイスのサイズが大きく、チップタイプの血糖センサと一体化して使用することが困難であるという問題がある。
【０００８】
さらに、血液中に含まれる赤血球の割合は、５割近くにもなるが、このように分離すべき成分が全体の５割近くをも占めるという血液の性質は、血液中の血球成分の分離において、フィルタが目詰まりを起こしやすいという特有の課題を提示する。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１４８７２６号公報
【特許文献２】米国特許第６，３１９，７１９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、必要とされるサンプル量が極力少なく、チップタイプのバイオセンサに適用し得る程度に小さなサイズの血液成分分離用フィルタ、およびそのようなフィルタと一体化したバイオセンサを提供することを目的とする。さらに、血球成分によるフィルタの目詰まりを効果的に防止するフィルタおよびそのようなフィルタと一体化したバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明は、血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタを提供し、このフィルタは、
上記血液試料を流すための流路と、
上記流路の一端に上記血液試料を導入するための開口部と、
上記流路の他端に濾過された上記血液試料を排出するための開口部とを備え、上記流路内には血球成分の通過を妨げるように複数の構造物が配置されている。さらに、上記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、上記複数の構造物および上記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ上記流路内に規定する。
【００１１】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティが、少なくとも２つ上記流路内に規定されている。
【００１２】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの奥行きは、上記キャビティの開口部の幅よりも大きい。
【００１３】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。
【００１４】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記キャビティの形状は、ほぼ直方体である。
【００１５】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である。
【００１６】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される。
【００１７】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記構造物は、柱状の形状を有する。
【００１８】
本発明のフィルタのさらに好ましい実施形態では、上記構造物は、円柱状の形状を有する。
【００１９】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記血液試料は、毛管作用により上記流路内に導入される。
【００２０】
本発明のフィルタの好ましい実施形態では、上記構造物および上記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン（登録商標）、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている。
【００２１】
本発明は、さらに別の局面において、血球成分を含む血液試料を濾過するためのフィルタ領域を備えたバイオセンサを提供する。このバイオセンサは、
基板と、
上記基板に支持された測定系と、
上記測定系またはその近傍の上記基板上に支持された酸化還元酵素を含む試薬系と、
上記基板と組み合わされるカバーであって、それにより上記基板との間に、上記血液試料から血球成分を除去するためのフィルタ領域と、上記測定系および上記試薬系を収容する反応領域と、上記フィルタ領域と連結し上記反応領域に試料を導入するための試料導入路とを規定する、カバーとを含み、
上記フィルタ領域は、
上記血液試料を流すための流路と、
上記流路の一端に上記血液試料を導入するための開口部と、
上記流路の他端に濾過された上記血液試料を排出するための開口部であって、上記試料導入路と連結した開口部と、
上記流路内に血球成分の通過を妨げるように配置された複数の構造物とによって規定され、
上記構造物の各々は、隣接する流路の内壁または隣接する他の構造物との間で血球成分が通過できないようなスリットを形成するように間隔をおいて配置され、
上記複数の構造物および上記流路の内壁は、血球成分を収容するための血球溜として機能するキャビティを少なくとも１つ上記流路内に規定する。
【００２２】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記測定系に、少なくとも一対の電極を含む電極系を含む。
【００２３】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティが少なくとも２つ上記流路内に規定されている。
【００２４】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの奥行きは、上記キャビティの開口部の幅よりも大きい。
【００２５】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの開口部の幅は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲である。
【００２６】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記キャビティの形状は、ほぼ直方体である。
【００２７】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記スリットの幅は、約０．１μｍ〜約２μｍの範囲である。
【００２８】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記流路は、基板と、スペーサと、当該スペーサを介して当該基板に張り合わされるカバーとから形成される。
【００２９】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記構造物は、柱状の形状を有する。
【００３０】
本発明のバイオセンサのさらに好ましい実施形態では、上記構造物は、円柱状の形状を有する。
【００３１】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記血液試料は、毛管作用により上記流路内に導入される。
【００３２】
本発明のバイオセンサの好ましい実施形態では、上記構造物および上記流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン（登録商標）、もしくはエポキシ樹脂で構成されているか、またはこれらのいずれかで表面が被覆されている。
【００３３】
本明細書中で使用される「血球」または「血球成分」という用語は、当該分野で認識されている通常の意味で使用され、血液中の赤血球、白血球、および血小板を意味する。しかしながら、検査目的やデバイス設計における諸々の状況等に応じて、測定結果の正確性に対して特に影響を及ぼし得るものとして、主に、赤血球のみ、もしくは白血球のみ、または赤血球および白血球のみを「血球」または「血球成分」として考慮する場合もあり得る。
【００３４】
本明細書中で使用される「血漿」または「血漿成分」という用語は、当該分野で認識されている通常の意味で使用され、血液中の血球成分を除いた成分（主に液状成分を構成する血清およびフィブリノーゲン）のことを意味する。なお、「血球」として血小板を特に考慮しない場合には、血小板を血漿または血漿成分に含める（「血球」の他の成分についても同様）。
【００３５】
本発明により、微量サンプル量で、小さな形状で、短時間で血球と血漿を分離する事が可能なフィルタとそれを用いたバイオセンサが提供される。
【００３６】
また、本発明のフィルタの一実施形態では、毛管作用により血液サンプルを流路内に導入することもでき、その場合、従来のフィルタ材を使用したもののように、サンプル液を流すためにシリンジなどで圧力をかける必要もない。
【００３７】
また、従来のフィルタ材を使用した場合、繊維などによってできる孔の大きさは正確に決定できない（平均値としてしか把握できない）が、本発明のフィルタでは、スリットの大きさが正確に決定し得るため、スリット幅を適切に調節することによって、異なるサイズの分子の中から所望のサイズのものを比較的容易に選別することが可能である。
【００３８】
また、本発明のフィルタおよびそのようなフィルタを組み込んだバイオセンサは、半導体加工技術を利用して作製することにより、大量の均質な装置をまとめて作製することができる。
【００３９】
典型的には、本発明により、幅５ｍｍ、長さ９ｍｍ、高さ２．５ｍｍ程度の極小のフィルタ組込型バイオセンサが提供され、このバイオセンサにより、３０ｎＬ程度の極微量の血液を血漿と血球とに分離し、血漿中のグルコース濃度などを測定することが可能となる。しかしながら、本発明の技術的範囲は、このような実施形態に限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
図１は、本発明の一実施形態に係る、血液中の血球と血漿とを分離する血液成分分離フィルタ１の模式的な上面図（図１Ａ）および斜視図（図１Ｂ）である。
【００４１】
図１Ａおよび図１Ｂを参照して、本発明の血液成分分離フィルタ１は、基板１１とカバー１２とを含む。基板１１上には流路用の溝が予め形成されており、カバー１２が張り合わされることによって、流路１８と、流路１８の両端の試料導入口１４および試料排出口１５とが規定される。フィルタ１はさらに、流路１８上に血球を塞き止めるための複数の構造物１９を備える。
【００４２】
この実施形態では、微細な構造物１９がフィルタ流路１８内に複数並べられている。構造物１９の形状は、好ましくは柱状であり、最も好ましくは円柱状である。これらの構造物１９は、血球を通過させないように、互いに適切な間隔をおいて流路１８内に配置される。典型的には、このような柱状構造物１９は、基板１１を反応性イオンエッチングなどの半導体加工技術により加工することによって作製することができる。このように構成されたフィルタ１に血液サンプルを通すことにより、血液中の血漿と血球とを分離することができる。なお、上記の例では、基板１１をエッチングにより彫り込むことによって流路１８および構造物１９を形成したが、構造物１９のみをエッチングにより作製した基板１１の両脇にスペーサを配置し、その上にカバー１２を張り合わせることによって流路１８を形成してもよい。
【００４３】
図１に示すように、フィルタ１において、流路１８上の柱状構造物１９が形成された部分であるフィルタ領域１１０をはさんで両側（試料導入口側および試料排出口側）にそれぞれ、血球を含む血液用の液溜１６および血漿用の液溜１７が規定される。
【００４４】
本発明の血液成分分離フィルタ１の好適な実施形態では、ヘマトクリット値が４０から６０である血液を試料として用い、その試料を毛管現象により試料導入口１４から流路１８内へ導入する。なお、ヘマトクリット値とは、血球が血液のなかで占める容積の割合を示し、通常は赤血球の容積の割合を示す。導入された血液成分のうち、血球は多数形成させた柱状構造物１９で塞き止められ、残りの血漿が試料排出口１５側の血漿用の液溜１７へと通過する。このようにして、シリンジポンプなどを使用せずに、簡単に血液中の血球を血漿成分から分離することができる。なお、血液導入時、及び導入後の血球は溶血されていない。
【００４５】
図２Ａは、本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１を図１Ｂ中に示した切断線に沿って切断した断面の斜視図である。但し、図２Ａでは、見やすさのために、カバー１２を基板１１から離して示し、さらに柱状構造物１９の数や配置は簡略化している。図中の矢印は試料が進入する方向を示す。
【００４６】
図２Ｂは、図２Ａに示すフィルタ１の流路内部の拡大上面図である。矢印は試料が進入する方向を示す。図２Ｂに示すように、１つの柱状構造物１９は、隣り合う他の柱状構造物との間でスリット１０１、および流路１８の内壁との間でスリット１０３を規定する。
【００４７】
構造物１９は、血漿成分のみ通過させ、血球を通過させないために、スリット１０１およびスリット１０３が最適な幅になるように、流路１８内に配置される。構造物１９はさらに、図示されるように、流路１８の内壁とともに血球を収容するための血球溜として機能するキャビティ１０４を流路１８内に形成するように、折り返し部分を有して流路１８内に配置される。以下、これらの構成について、さらに詳しく説明する。
【００４８】
以下の説明では、１つの柱状構造物と隣り合う他の柱状構造物との間で規定されるスリット１０１の幅をαとし、柱状構造物１９と隣接する流路１８の内壁との間で規定されるスリット１０３の幅を、γと定義する。また、柱状構造物１９と流路１８の内壁から形成されるキャビティ１０４の入口１０２の幅を、βと定義する。
【００４９】
まず、幅αは、本発明のフィルタ１に、血球を塞き止めるが血漿成分は通過させるフィルタとしての機能を付与させるように設定される。赤血球は扁平なディスク形状を有しており、その平均的な厚さは約２μｍ、そして直径が約８μｍ程度である。また、白血球は、直径が約６〜約２５μｍの不定形の球状分子である。したがって、血球を塞き止め、血漿が流れやすくするには、約２μｍ以下にすることが好ましい。また、αを約０．１μｍより小さくすると、液体の表面張力などの作用により、血漿成分でさえもスリット１０２を通過しにくくなってしまうため、αは約０．１μｍ以上とすることが好ましい。これらを実際に試験した結果を、表１に示す。
【００５０】
【表１】
2004097393.tif 000012
【００５１】
αについてのこれらの最適値は、柱状構造物１９と流路１８内壁との間の幅γについても同様に当てはまる。柱状構造物間のスリット１０１の幅αおよび柱状構造物と流路の内壁との間のスリット１０３の幅γを、上記のように設定することにより、血漿は通過するが血球は通過さない、血球分離フィルタが作製され得る。
【００５２】
しかしながら、上記のようにスリットの幅を設定したとしても、スリット１０１およびスリット１０３には、血液サンプルを流すにつれて血球が進入し「目詰まり」が発生する。目詰まりが発生すると、血漿でさえフィルタを通過し得なくなるため、血漿の分離効率が低下する。本発明のフィルタ１では、この現象を緩和するために、柱状構造物の配置を、図１および図２に示すように流路内の限られたスペース内で折り返し構造とした。
【００５３】
柱状構造物１９を、流路１８内で折り返しに配置することにより、柱状構造物１９を流路１８内で直線的に並べた場合に比べて、血漿成分が通過するスリットの数を増加させることができる。さらに、流路１８内壁と柱状構造物１９の配列とによって、流路１８内にキャビティ１０４が形成され、このキャビティ１０４が、血球を収容する血球溜の役割を果たし、試料導入口側の液溜１６に血球が蓄積することを緩和することができる。結果として、スリットの目詰まりを抑制し、濾過効率を増大させ得る。
【００５４】
このようにして、短時間でより多くの血漿成分がスリットを通過することができ、デバイスサイズを大きくすることなく、効率的に血液成分の分離を行うことができる。
【００５５】
構造物１９の折り返し構造と流路１８の内壁とによってできるキャビティ１０４の入口１０２の幅βは、赤血球の厚さが約２μｍであることを考えると、約２μｍ以上に設定することが好ましい。幅βが小さすぎると、赤血球が入口１０２を通過し得なくなってしまう。なお、赤血球の厚さは、性差や個人差があるため、最適なβの最小値は、目的に応じて変化し得る。
【００５６】
また、幅βを大きくすればする程、キャビティ内部に留まる液成分の割合が大きくなるため液成分の回収率を低下させてしまうことから、幅βは大きすぎない方が効率的である。最適なβの最大値は、目的に応じて当業者が適宜決定し得るが、血球がキャビティ１０４内に一列に並ぶような状態が最も良好な血球分離効率を与えるため（データ示さず）、幅βは、赤血球の直径とほぼ同じ大きさである１０μｍ程度またはそれ以下であることが好ましい。幅βの最大値は、約８μｍ以下であることが最も好ましい。
【００５７】
したがって、βは、約２μｍ以上約１０μｍ以下であることが好ましく、約２μｍ以上約８μｍ以下であることが最も好ましい。しかしながら、最適なβの最大値は、目的に応じて当業者が適宜決定し得る。
【００５８】
キャビティ１０４の深さ（または奥行き）は大きいほど、血漿の濾過効率は良いが、キャビティ１０４の大きさは、フィルタ１本体または流路１８の大きさによって必然的に限定されるため、所望のフィルタのサイズに応じて、適宜最適な奥行きを決定する。典型的には、例えば、１０ｍｍ程度の長さのチップ（フィルタ本体）に対して、２ｍｍ程度の深さのキャビティを作製することが可能であるが、これに限定されない。
【００５９】
キャビティ１０４の形状は、典型的には、図１または図２に示されるようなほぼ直方体の形状であるが、これに限定されない。図３は、柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図である。図３Ａ〜図３Ｃは、それぞれキャビティ１０４部分を上から見たものである。図３中の矢印は、サンプル液の流れる方向を示す。
【００６０】
図３Ａは、図１および図２に示すものと同様のほぼ直方体の形状をしたキャビティを示すが、各柱状構造物の断面が円形である（各構造物が円柱状である）点で、図１および図２に示すものとは異なる。
【００６１】
図３Ｂおよび図３Ｃは、図３Ａと同様に円柱状の構造物１９を折り返しに配置したものであるが、配置の形状が図３Ａのものとは異なる。図３Ｂに示すようにキャビティの入口をオープン形状にすると、血球がキャビティ内に入り込みやすく、また入口付近での血球の滞留を防止することに役立つ。図３Ｃは、キャビティの入口の形状は、図１、図２、および図３Ａに示すものと同様であるが、キャビティの底部が円形になっている点で異なる。
【００６２】
このようにキャビティの形状としては、様々なものが可能であり、ここに例示したものに限定されない。
【００６３】
濾過効率は、流路１８の限られた空間内で構造物１９の配列の折り返し回数を多くすることにより、さらに向上させることができる。典型的には、流路幅を１．５ｍｍとすると、幅１０μｍのほぼ直方体のキャビティを１０μｍ間隔で７５０回繰り返した配置をとることができるが、これより多く繰り返してもよいし、少なくてもよい。
【００６４】
また、幅α、βおよびγは、被験者の血球のサイズによっても変化させてもよい。例えば、通常、男性と女性とでは、赤血球のサイズが異なる（女性の赤血球のほうがより小さい）ため、女性の血液サンプルを使用する場合には、上記の代表的な値より小さいものを使用することもできる。
【００６５】
本発明のフィルタを用いる濾過に必要なサンプル量は、流路の深さ、構造物の配置などに依存して変化し得るため、当業者はフィルタの大きさなどにより適宜最適な量を決定し得る。本発明のフィルタでは、従来技術にみられたようなフィルタ材による吸収はない。また、本発明のフィルタでは、血球移動遅延の効果で濾過を行っているのではないことから、フィルタのサイズを小さくすることができる。したがって、サンプル量を従来よりも少量にすることが可能である。
【００６６】
本発明のフィルタの濾過効率は、柱状構造物の配置、キャビティの形状、キャビティ内部の容積などに依存するため、これらを適宜最適化することが必要である。
【００６７】
柱状構造物は断面形状が四角や丸等、どのような形状であっても構わない。しかしながら、赤血球膜の破壊（溶血）をできるだけ防止するためには、柱状構造物は滑らかな表面を有する（例えば、断面が円形である）ことが好ましい。
【００６８】
柱状構造物および流路の内壁は、シリコーン樹脂、テフロン（登録商標）、エポキシ樹脂などの、血液が凝固しにくい材料で構成されるか、またはそのような材料で表面が被覆されていることが好ましい。あるいは、血液の凝固を促進するＣａの含有量が少ない、ＳｉＯ2などの純度の高いガラス層を用いて作製され得る。
【００６９】
流路１８内部またはキャビティ１０４内部の高さ（または、厚さ）は、任意であり得るが、現在の製造技術のレベルを考慮すると、１００μｍ程度以下であることが現実的である。しかしながら、技術水準の変化に応じて、それ以上の厚さ（高さ）もあり得る。
【００７０】
また、本発明のフィルタは、半導体加工技術で基板上に作製したものに限定されず、例えば、プラスチック成型技術などでも同様に作製し得る。
【００７１】
本発明はまた、上記のようなフィルタを備えたバイオセンサを提供する。
【００７２】
図４は、採取した血液から血球を分離するためのフィルタと、血糖値のような検査項目の分析のためのバイオセンサとが一体化した本発明のバイオセンサ２の構成を示す。図４Ａは、バイオセンサ２の模式的な上面図であり、図４Ｂは、その斜視図である。
【００７３】
図４Ａおよび図４Ｂを参照して、本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２は、基板２１と、基板２１に重ね合わされたカバー２２と、基板２１とカバー２２とによって規定される流路２８とを備えている。バイオセンサ２はさらに、上記流路２８の一端に形成された試料を導入するための試料導入口２４と、他端に形成された流路から空気を逃がすための空気逃がし口２５とを備える。
【００７４】
バイオセンサ２はさらに、流路２８上に形成された、複数の柱状構造物２９を備えるフィルタ領域２１０と、そのフィルタ領域２１０の上流に血球成分を含む血液サンプルが滞留するための液溜２６と、そのフィルタ領域２１０の下流に作用極２０５、対極２０６、および反応領域２１１に試料が到達したことを検出するための液導入検知電極２１２を収容した反応領域２１１とを備え、さらに上記フィルタ領域２１０と上記反応領域２１１との間に、それらを連結する試料導入路２７とを備える。作用極２０５上には、酵素（例えば、グルコースオキシダーゼ）およびメディエータ（例えば、シアン化鉄イオンのような金属錯体）を含む試薬２０７が配置されている。上記流路２８および柱状構造物２９は、反応性イオンエッチングのような半導体加工技術を用いることにより、基板２１上に形成し得る。
【００７５】
バイオセンサ２はさらに、作用極２０５と一体的に連結したリード２０８、対極２０６と一体的に連結したリード２０９、および液導入検知電極２１２と一体的に連結したリード２１３を備える。これらの電極（２０５，２０６，２１２）およびリード（２０８，２０９，２１３）は、カバー２２の基板２１と対向する面上に、スパッタ蒸着などの方法により形成され得る。
【００７６】
このように構成された本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２は、フィルタを備えていない従来のバイオセンサと同様のサイズにすることが可能であり、微量サンプル量で、正確に、短時間に、血糖値などの分析が可能である。
【００７７】
以下、実施例を用いて、本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されない。
【００７８】
（実施例１）
・作製したフィルタを用いた血液成分の分離
本発明に基づくフィルタをシリコン基板上に作製し、血液成分の分離を観察した。以下、図１および図２を参照して説明する。
【００７９】
５ｍｍ×９ｍｍ×０．５ｍｍの大きさのシリコン基板１１を用いて、反応性イオンエッチングにより、流路１８、および複数の柱状構造物１９を上記基板１１のほぼ中央に複数の折り返し部分を有するように構築した。さらに、柱状構造物１９およびシリコン基板１１の表面に、熱酸化により酸化被膜（図示せず）を形成した。この基板１１上に、シリコーン樹脂製のカバー１２を密着して張り合わせることにより、本発明のフィルタ１を作製した。
【００８０】
このようにして作製したフィルタ１は、流路１８の幅１．５ｍｍ、高さ３０μｍ、長さ９ｍｍを有していた。また、多数の柱状構造物１９の折り返しと流路１８内壁とによってできるキャビティ１０４は、ほぼ直方体の形状であり、その深さ（奥行き）は２ｍｍ、キャビティ入口の幅βは１０μｍであった。また、柱状構造物１９の各々は、２μｍ×２μｍの正方形の断面を有し、４μｍのピッチで２μｍの幅のスリット１０１および１０３を形成するように配置された。また、折り返しは、２０μｍのピッチで流路の長手方向に対して垂直方向に７５０回繰り返された。
【００８１】
なお、上記酸化被膜の形成には、熱酸化による方法以外に、減圧ＣＶＤ（化学的気相成長）、プラズマＣＶＤ、常圧ＣＶＤなどを使用し得る。
【００８２】
上記のように作製された本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１の評価手順は、以下の通りであった。最初に、作製したフィルタ１を顕微鏡のステージに載せ、そのフィルタ１の流路の一端にある試料導入口１４に試料としての血液を滴下し、液体の流れを顕微鏡ビデオ撮影によって記録した。液体が移動する様子を図５に示す。
【００８３】
図５Ａは、試料導入前のフィルタ１の様子を示す。図５Ｂは、試料導入後のフィルタ１の様子を示す。図５の写真において、矢印は血液が移動する方向を示す。それぞれの写真は、左側の黒い部分がフィルタ領域１１０、右側の明るい部分がフィルタ領域１１０を通過したサンプルの液溜１７を示している。血液は毛管現象により写真の左から右へと移動する。
【００８４】
血液が試料導入口１４から導入されると同時にフィルタ１の試料導入口１４側の液溜１６に血液が充填され、続けてフィルタ領域１１０内に充填された。
【００８５】
図５Ｂに示すように、試料導入後、ろ過された透明な血漿はフィルタ領域１１０から下流側の液溜１７へと流れ出した。写真の明るい部分に見える境界線は、血液から血球が分離され、血漿のみを含むサンプル液の最前線の境界である。血液導入から血漿ろ過完了までに要した時間は、平均してわずか２５秒以内であった。このようにして効率的に血液中の血球と血漿を分離する事が可能となった。
【００８６】
（実施例２）
・本発明のバイオセンサ２の作製
図４Ａおよび図４Ｂを参照して説明する。基板２１は、信越シリコン社製シリコン基板（Ｐ型、１００面、直径１００ｍｍ、厚さ５２５μｍ、抵抗率１０〜２０Ω・ｃｍ）を使用した。その基板２１上に、反応性イオンエッチングなどの半導体加工技術によって、流路２８、および複数の柱状構造物２９を多数の折り返しを有するような配置において作製した。次に、シリコン基板２１表面に熱酸化することによって絶縁膜を成膜した。
【００８７】
他方、樹脂製シートからなるカバー２２の一方の面上に作用極２０５、対極２０６、および液導入検知電極２１２、ならびにリード２０８、２０９および２１３をスパッタ蒸着することによって作製した。次いで、作用極２０５上に、試薬２０７としてグルコースオキシダーゼおよびメディエータ（例えば、シアン化鉄イオンのような金属錯体）をシリンジによるディスペンス法により配置した。このカバー２２を、上記電極（２０５，２０６，２１２）が形成された面が対向するように基板２１に加圧熱圧着によって貼り合わせた。これにより、試料用流路２８、その流路の一端に試料導入用の試料導入口２４、他端に空気を逃がすための空気抜き口２５が規定される。
【００８８】
上記電極（２０５，２０６、２１２）および試薬２０７が配置された領域（反応領域）２１１内で血漿内の測定対象物が測定される。具体的には、作用極２０５上に設けた試薬２０７が血液導入とともに融解して、試薬２０７中の酵素が血液中のグルコースと反応する。作用極２０５と対極２０６間に０．５Ｖの電圧を印加して、これらの電極間に流れる電流を計測して、所定の時間（例えば３０秒）経過後の電流値からグルコース値を算出する。
【００８９】
上記方法で得られたバイオセンサ２は、長さ１１ｍｍ、幅５ｍｍ、高さ２．５ｍｍであり、流路２８のサイズは幅１．５ｍｍ、長さ７．０ｍｍ、高さ３０μｍである。必要とされるサンプル量は３１．５ｎｌ未満となる。このように、本発明によれば、サンプル量が従来の血液成分分離フィルタを用いる場合より少なくなるフィルタ一体型バイオセンサ２が提供される。
【００９０】
（実施例３）
・グルコース濃度の測定
図６は血液中のグルコース濃度８７〜６４８ｍｇ／ｄｌにおけるバイオセンサ感度を比較したものである。同図において黒三角は標準液を、黒四角は本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２での、黒菱形は比較例としてフィルタを備えていないバイオセンサでの計測データを示す。
【００９１】
グルコース濃度の異なる血液の調製は、血液（ヘマトクリット値：４４）にグルコース溶液を、８７〜６４８ｍｇ／ｄｌの範囲で添加することで行った。標準液は、リン酸緩衝生理食塩水にグルコースを溶解したものを使用した。
【００９２】
バイオセンサ２は、実施例２に示すように作製した。また、比較例のフィルタを備えていないバイオセンサは、必要とされるサンプル量６００ｎｌのものを使用した。
【００９３】
電流値は試料導入口２４から血液を導入し、２５秒後に作用極２０５のリード２０８と対極２０６のリード２０９に０．５Ｖの電圧を印加した。その５秒後に計測を行った。
【００９４】
フィルタありの本発明のデバイス２での応答は、フィルタなしのデバイスの応答よりも約２０パーセント応答値が上昇し、グルコース標準液の応答値により近づいた。このことから感度が向上した事が分かる。
【００９５】
（実施例４）
・コレステロール濃度の測定
図７は血液中のコレステロール濃度１１３〜２８８ｍｇ／ｄｌにおけるバイオセンサ応答を比較したものである。同図において黒菱形は本発明のフィルタ一体型バイオセンサ２であり、黒四角は比較例としてのフィルタを備えていないバイオセンサである。
【００９６】
コレステロールの異なる血液は、全血を遠心分離で血漿を取り除いた後、高コレステロール値をもつ標準血清（セラクリア−ＬＰ  異常域、アズウェル製）を添加することで作製した。なお、本実施の形態では試薬としてコレステロールエステラーゼを用いた。
【００９７】
図７に示されるように、フィルタを付けていないバイオセンサでは血球が妨害物質として作用し、コレステロール濃度に比例した電流値が得られず、測定不能となったが、フィルタを付けたバイオセンサ２の場合は、コレステロール濃度に依存した値が測定された。このことからフィルタ付のデバイス２を使用することにより、はじめて正確な測定が可能となった事が分かる。
【００９８】
なお、実施例３および４において、酵素電極方式に基づく測定を例示したが、測定手段が酵素電極方式以外のものを用いても良い。そのような一例として、酵素比色方式がある。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
このように、本発明に係る血球と血漿の分離フィルタは、バイオセンサやＤＮＡ診断等の臨床検査の前処理デバイスとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】本発明の一実施形態に係る、血液中の血球と血漿とを分離する血液成分分離フィルタ１の模式的な上面図
【図１Ｂ】図１Ａに示す血液成分分離フィルタ１の斜視図
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る血液成分分離フィルタ１を図１Ｂ中に示した切断線に沿って切断した断面の斜視図
【図２Ｂ】図２Ａに示すフィルタ１の流路内部の拡大上面図
【図３Ａ】柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図
【図３Ｂ】柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図
【図３Ｃ】柱状構造物１９およびそれらの配置のバリエーションを示す模式図
【図４Ａ】採取した血液から血球を分離するためのフィルタと、血糖値のような検査項目の分析のためのバイオセンサとが一体化した本発明のバイオセンサ２の構成を示す模式的な上面図
【図４Ｂ】図４Ａに示すバイオセンサ２の斜視図
【図５Ａ】本発明のフィルタ１により血液を濾過したときの試料導入前の状態を示す図
【図５Ｂ】本発明のフィルタ１により血液を濾過したときの試料導入後の状態を示す図
【図６】本発明のバイオセンサ２によるグルコースの応答値変化を示す図
【図７】本発明のバイオセンサ２によるコレステロールの応答値変化を示す図
【符号の説明】
【０１０１】
１ 血液成分分離フィルタ
２ バイオセンサ
１１，２１ 基板
１２，２２ カバー
１４，２４，２７ 試料導入口
１５ 試料排出口
１６，１７，２６ 液溜
１８，２８ 流路
２７ 試料導入路
１９ 構造物
２５ 空気抜き口
１０１，１０２，１０３ スリット
１０４ キャビティ
１１０，２１０ フィルタ領域
２０５ 作用極
２０６ 対極
２０７ 試薬
２０８，２０９，２１３ リード
２１１ 反応領域
２１２ 液導入検知電極
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2004097393.tif 000013
【図１Ｂ】
2004097393.tif 000014
【図２Ａ】
2004097393.tif 000015
【図２Ｂ】
2004097393.tif 000016
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2004097393.tif 000020
【図４Ｂ】
2004097393.tif 000021
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2004097393.tif 000028
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