(57)【要約】本発明は、成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の、虚血または動脈硬化に起因する疾患治療への使用方法である。
2004084967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の、虚血または動脈硬化に起因する疾患治療への使用方法。
【請求項２】
胚性幹細胞または胚性幹細胞から形成された胚様体が、成長因子低減マトリゲルＴＭの２層間で培養された、請求項１記載の使用方法。
【請求項３】
マトリゲルＴＭが、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、４型コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから選ばれる請求項１または２記載の使用方法。
【請求項４】
成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞または胚性幹細胞から形成された胚様体を患者に投与することからなる、血管新生による虚血性疾患または動脈硬化の治療方法。
【請求項５】
胚性幹細胞または胚性幹細胞から形成された胚様体が、成長因子低減マトリゲルＴＭの２層間で培養されたものである、請求項４記載の治療方法。
【請求項６】
マトリゲルＴＭが、ラミニン、４型コラーゲン、エンタクチンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカンから選ばれる請求項４または５記載の治療方法。
【請求項７】
成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）を含む虚血または動脈硬化に起因する疾患の治療剤。
【請求項８】
成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の虚血または動脈硬化に起因する疾患の治療剤を製造する用途。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の治療剤である。
【背景技術】  ＤＥ−Ａ  １９８４３２３４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ心疾患モデルとしての、胚性幹細胞あるいは癌細胞の分化により作られた胚様体から分化した心臓細胞を開示している。
本発明の開示
本発明は、成長因子低減マトリゲルＴＭ上で培養した、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の、虚血または動脈硬化に起因する疾患治療への使用方法である。
また、本発明は、上記胚性幹細胞または胚性幹細胞から形成された胚様体を患者に投与することからなる、血管新生による虚血性疾患または動脈硬化の治療方法である。  さらに、上記胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）を含む虚血または動脈硬化に起因する疾患の治療剤である。  さらに、上記胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）または胚性幹細胞から形成された胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ）の虚血または動脈硬化に起因する疾患の治療剤を製造する用途である。
発明の詳細な説明
胚性幹（ＥＳ）細胞は自己再生する多能性前駆細胞であり、多彩な組織への幅広い開発可能性を有する。
これより最近、死亡率の高い疾患に対するその治療可能性に注目が集まっている。
今回我々は、ＥＳ細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）層支持のもと、血管特異的分化をなすことを示した。
マウスのＥＳ細胞を胚様体（ＥＢｓ）として２日間培養し、次いで１０％ＦＢＳ含有培地を有する成長因子を除いたマトリゲルの２層間に置いた。
血管新生惹起成長因子の刺激なしに、マトリゲル層中にて５日間培養した後、ＥＢｓ周囲に血管の発生が認められ、ＰＥＣＡＭ−１あるいはＤｉＩ−アセチル化ＬＤＬ等の汎内皮細胞マーカーにより確認された。
１０日目に、発生した血管はより分化した、樹状に枝分かれした形態を示した。一方マトリゲル層のものとは対照的に、成長因子を除いたゼラチンあるいはフィブロネクチン層上で培養されたＥＢｓは、ＥＢｓ周囲に血管特異的分化を示さず、むしろ数種類細胞の混合集団を示した。
結論として、本モデル系は、ＥＳ細胞からの血管特異的分化をなし得るものである。
これらの知見は、初期の血管発達における特定の成長因子の役割を試験するだけではなく、虚血や動脈硬化などの心脈管系疾患における血管特異的組織再生に重要な関わりを持つ。
ＤＥ−１９８４３２３４号公報は胚性幹細胞の医療用途については開示していない。
本発明は、ＥＳ細胞から誘導された胚様体が、成長因子を除いた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分であるマトリゲルの支持のもと、血管特異的分化をなし得ることを示した。  このシステムは、血管形成や血管新生にあたりＶＥＧＦやＦＧＦなど特定の成長因子を必要としないのに対し、従来は、血管新生因子であるＶＥＧＦの刺激により、内皮特異的受容体ＦＬＫを発現した一部のＥＳ細胞の集団が脈管細胞になり得たことが報告されている。  本発明者らの知見は、初期の血管発達における特定の成長因子の役割を試験するだけでなく、虚血や動脈硬化などの心脈管系疾患における血管特異的組織再生に重要な関わりを持つ。
本発明においては、胚性幹細胞または胚性幹細胞から形成された胚様体が、成長因子低減マトリゲルＴＭの２層間で培養されることが好ましい。
また、マトリゲルＴＭが、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、４型コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）およびヘパラン硫酸プロテオグリカンより選ばれることが好ましい。
【図面の簡単な説明】  図１のＡは、１日目における胚様体を示した図である。
図１のＢは、７日目における成長因子低減マトリゲル上の胚様体を示した図である。
図１のＣは、胚様体が汎内皮細胞マーカーに対し陽性であったことを示した図である。
図１のＤは、ゼラチン層上で培養された胚様体を示した図である。
図１のＥは、フィブロネクチン層上で培養された胚様体を示した図である。
図２のＡは、マトリゲル層上で培養された胚様体を示した図である。
図２のＢは、マトリゲルの２層間で培養された胚様体を示した図である。
図２のＣは、図２のＢを高倍率拡大したものである。
【実施例】  本発明について実施例によりさらに詳しく説明するが、これらには限定されない。
試験素材および方法
細胞培養
未分化のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を、１０％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、１％２−メルカプトエタノールおよび０．１％白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加したＤＭＥＭ培地中に保持した。
ＥＳ細胞をハンギング・ドロップ法（８００細胞／滴）にて２日間培養し、それぞれの滴ごとに胚様体（ＥＢｓ）に成長させた。
次いでそれぞれの胚様体を、ＬＩＦを除いた分化用培地中でさらに３日間培養し、成長因子低減マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社）、１％ゼラチンあるいはフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ社）等のそれぞれの層で被膜された培養皿上に植え付けた。
三次元培養のため、胚様体はマトリゲルの二層間に置かれた。
胚様体から発生した血管を、７日間毎日、顕微鏡で観察した。
全ての胚様体培養実験期間を通じ、ＶＥＧＦやＦＧＦなどの血管新生因子は加えなかった。
マトリゲルＴＭ
マトリゲルＴＭは可溶性の基底膜ゲルであり、室温で純粋な再構成基底膜を形成することができる。
成長因子低減マトリゲル・マトリックスの主要成分は、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、４型コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）およびヘパラン硫酸プロテオグリカンである。
標準的なマトリゲルとは異なり、このマトリゲル・マトリックスは、ＴＧＦ−βやＩＧＦなどの成長因子をごくわずかな量を含む。
免疫組織化学
マトリゲル層上で培養された胚様体は、４℃、２％パラホルムアルデヒドにより固定され、以下の抗体により染色された。
一次抗体は、ラットの抗マウス血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）（ｃｌｏｎｅ  ＭＥＣ１３．３，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）である。
二次抗体は、Ａｌｅｘｓａ  ４８８が結合したヤギの抗ラットＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）である。
結果
図１および図２は本発明の実施例の結果を示す。図１は３ヶの異なる試験（Ｎ＝８）のデータであり、マトリゲル上のＥＢｓは血管形成を示していることを示す。図２は３ヶの異なる試験（Ｎ＝８）のデータであり、ＥＢｓからの血管形成により強調されたマトリゲル３層を示す。
マトリゲル上でＥＳ細胞から誘導された胚様体は、血管形成を示した。
ＥＳ細胞から誘導された胚様体は、内胚葉性、外胚葉性そして中胚葉性由来の３つすべての、一次胚葉細胞派生物に分化し得る。
従って胚様体は分化細胞の混合集団である。
興味深いことに、成長因子低減マトリゲル上で培養した胚様体は、７日目に、胚様体辺縁に樹状形成した血管を示した（図１Ｂ）が、胚様体にこのような構造は１日目には観察されなかった（図１Ａ）。
５日目の胚様体への免疫蛍光染色は、これらの血管様構造が汎内皮細胞マーカーＰＥＣＡＭ−１に対し陽性であった（図１Ｃ）。
ゼラチンあるいはフィブロネクチン層上の胚様体は、全く血管形成を示さなかった。
マトリゲル層と対照的に、ゼラチン層（図１Ｄ）あるいはフィブロネクチン層（図１Ｅ）上で培養した胚様体は、７日目に、血管形成を示さなかった。
これら層上の胚様体三次元構造は形態変化を始め、培養皿上で細胞タイプ混合集団が成長した。
いくつかの細胞コロニーは、脈動する心筋細胞であることが確認された。
マトリゲルの三次元層は、胚様体からの血管形成を促進した。
本発明者らは、マトリゲルの三次元層が、胚様体からの血管形成に影響を与えるのかどうかについて検討した。
１層マトリゲル上の胚様体（図２Ａ）とは異なり、マトリゲル２層間の胚様体は、枝分かれし、十分な内皮が発生している、より明瞭な血管構造を示した（図２ＢおよびＣ）。
図２Ｃは、図２Ｂを高倍率拡大したものである。
結論
これらの知見は、ＥＳ細胞から誘導された胚様体が、成長因子を除いた細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分であるマトリゲルの支持のもと、血管特異的分化をなし得ることを示した。
このシステムは、血管形成や血管新生にあたりＶＥＧＦやＦＧＦなど特定の成長因子を必要としないのに対し、従来は、血管新生因子であるＶＥＧＦの刺激により、内皮特異的受容体ＦＬＫを発現した一部のＥＳ細胞の集団が脈管細胞になり得たことが報告されている。
本発明者らの知見は、初期の血管発達における特定の成長因子の役割を試験するだけでなく、虚血や動脈硬化などの心脈管系疾患における血管特異的組織再生に重要な関わりを持つ。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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