(57)【要約】本発明は、培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害徃リンパ球の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法。
【請求項２】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、インタ−ロイキン−２レセプターを高発現するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下での細胞傷害性リンパ球の製造方法と比較して、拡大培養率が高い方法である請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞傷害性リンパ球が、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、細胞傷害活性が増強されたもしくは高い細胞傷害活性が維持されたものである請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物が固相に固定化されてなるものである請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
固相が細胞培養用器材または細胞培養用担体である請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞培養用器材がシャーレ、フラスコまたはバッグであり、細胞培養用担体がビーズ、メンブレンまたはスライドガラスである請求項７記載の方法。
【請求項９】
細胞傷害性リンパ球がリンフォカイン活性化キラー細胞である請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜８で表されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）である請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
フィブロネクチンのフラグメントが、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号９〜２０および２５で表されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドである請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養用器材中で行なう請求項１記載の方法であって、
（ａ）培養開始時の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および／または
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞の濃度が、１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、
の条件を満たす方法。
【請求項１４】
細胞培養液を希釈する工程を要しない請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞傷害性リンパ球の誘導、維持及び拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう請求項１記載の方法であって、少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程、培地の交換工程もしくは細胞培養用器材の交換工程を包含し、かつ少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程直後、培地の交換工程直後もしくは細胞培養用器材の交換工程直後の培養条件が、
（ｃ）細胞培養液中の細胞の濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、または
（ｄ）細胞培養液中の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、
の条件を満たす方法。
【請求項１６】
細胞傷害性リンパ球の誘導、維持及び拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう請求項１記載の方法であって、少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程、培地の交換工程もしくは細胞培養用器材の交換工程を包含し、かつ少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程直後、培地の交換工程直後もしくは細胞培養用器材の交換工程直後の培地中における血清および血漿の総含有濃度が培養開始時と同じか、もしくは培養開始時よりも低減されている請求項１記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球。
【請求項１８】
請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法により得られる細胞傷害性リンパ球を有効成分として含有する医薬。
【請求項１９】
フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有し、かつ血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満であることを特徴とする細胞傷害性リンパ球培養用培地。
【請求項２０】
細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む請求項１〜１６いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
外来遺伝子をレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスを用いて導入する請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列（ｘ）、またはアミノ酸配列（ｘ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｙ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｙ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｘ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものである、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項２２のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２４】
（１）配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（２）配列番号２６に記載の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加した塩基配列からなり、かつＤＮＡ（１）にコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または（３）配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ（１）にコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなる請求項２３記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、医療分野において有用な、細胞傷害性リンパ球を取得する方法に関する。
【背景技術】  生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。
Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔ＴＣ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体〔ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称することもある〕クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原ペプチドおよびＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原ペプチドが自己由来のものなのか、あるいは、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。
近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特に免疫機能が正常なヒト由来のリンパ球から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で誘導した後、もしくは誘導を行わず、リンパ球を拡大培養し、患者へ移入する養子免疫療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルにおいて養子免疫療法がウイルス感染および腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されている（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．著，１９９２年発行，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ及びＲｅｕｓｓｅｒ  Ｐ．他３名，Ｂｌｏｏｄ，１９９１年，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．５，Ｐ１３７３〜１３８０）。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。
上記のような養子免疫療法において、治療効果を得るためには一定量以上の細胞数の細胞傷害性リンパ球を投与する必要がある。すなわち、ｅｘ  ｖｉｖｏでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。
ＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持および増強するためには、ＣＴＬについて抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、通常、この方法では最終的に得られるＣＴＬ数が減少し、十分な細胞数が得られない。
疾病の治療に有効なＴ細胞を調製する方法としては、例えば、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）を用いる養子免疫療法（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．他，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８７年，Ｖｏｌ．３１６，Ｎｏ．１５，Ｐ８８９〜８９７）、高濃度のインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて誘導した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子免疫療法（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ．Ａ．他，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８８年，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２５，Ｐ１６７６〜１６８０およびＨｏ  Ｍ．他９名，Ｂｌｏｏｄ，１９９３年，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．８，Ｐ２０９３〜２１０１）が知られている。
次に、抗原特異的なＣＴＬの調製に関しては、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌ  Ｓ．Ａ．他４名，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１４６，Ｎｏ．８，Ｐ２７９５〜２８０４）、あるいは抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２を用いて、それぞれＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｐ．Ｄ．他１名，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９０年，Ｖｏｌ．１２８，Ｎｏ．２，Ｐ１８９〜２０１）が報告されている。
さらに、国際公開第９６／０６９２９号パンフレットにはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬおよびＴＨを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供可能であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増加させることが特徴である。
また、国際公開第９７／３２９７０号パンフレットには改変ＲＥＭ法が開示されており、当該方法はＰＢＭＣとは区別されるＴ細胞刺激成分を発現する分裂していない哺乳動物細胞株をフィーダ細胞として使用し、ＰＢＭＣの使用量を低減させる方法である。
リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）は、リンパ球を含む末梢血液（末梢血白血球）や臍帯血、組織液等にＩＬ−２を加えて、数日間試験管内で培養することにより得られる細胞傷害活性を持つ機能的細胞集団である。この際、抗ＣＤ３抗体を加えて培養することにより、さらにＬＡＫ細胞の増殖は加速する。このようにして得られたＬＡＫ細胞は非特異的にさまざまながん細胞やその他のターゲットに対して傷害活性を有する。ＬＡＫ細胞も上記ＣＴＬと同様に、養子免疫療法に使用される。
上記のとおり、細胞傷害性リンパ球、例えばＣＴＬ、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ等を取得する工程においてはＩＬ−２の利用を欠かすことができない。ＩＬ−２が細胞表面のインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）に結合することにより細胞はさらに活性化される。また、ＩＬ−２Ｒはリンパ球の活性化マーカーとして知られている。これらの点において、細胞表面のＩＬ−２Ｒの発現を上昇させることは重要である。また、ＣＴＬの誘導においては、抗原による刺激に供されたＣＴＬの前駆細胞がＣＴＬとして誘導される効率を向上させること、すなわち、誘導後の細胞群におけるＣＤ８陽性細胞の割合（比率）を向上させることが重要である。
またこれらリンパ球を体外において拡大培養する際には通常血清または血漿が５容量％から２０容量％添加される。この血清・血漿はリンパ球等の細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養する際に必要とされる成分であるが、血清・血漿は非自己動物（ヒト・ウシ等）の血液をその由来とするため各種ウイルス感染等の危険性が排除できない。また、現在の検出技術では検出することが出来ないようなウイルス・病原性微生物の存在を完全否定することは不可能である。
この観点から、近年、患者由来の血清・血漿（自己血清・血漿）の使用が進められている。しかし、培養に必要な量の血清・血漿を確保するために患者自身の血液を多量に採取することは、患者への肉体的負担が大きく、生命の危険につながる可能性もある。この危険を回避するため、少量の血清・血漿を用いて、治療に必要なリンパ球を得る拡大培養を行うと必然的に低濃度血清・血漿での培養となる。一般にリンパ球等の細胞は低血清・低血漿条件における培養では増殖が不安定となり治療に必要な量の細胞が得られない。さらに、上述の肉体的負担および感染の危険性を回避するためには無血清培養が強く求められるが、このような培養条件ではほとんどの細胞が増殖しなくなる。
このため、低血清・無血清（低血漿・無血漿）でのリンパ球拡大培養方法が強く求められている。
無血清（無血漿）条件下でのリンパ球拡大培養方法が確立されれば、血清・血漿のロット間の差を排除でき、患者血清・血漿に由来する負要因（免疫抑制成分等）を排除することが出来ることから、この系の確立によって得られる利益は計り知れない。
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する。）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する。）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、Ｄｅａｎｅ  Ｆ．Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ  ＩＮＣ．，Ｐ１〜８、Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．他８名，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１およびＨａｎｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．他５名，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６）。
【発明の開示】
本発明の目的は、安全性が高く、医療への使用に適した、細胞傷害活性を高いレベルで保持した細胞傷害性リンパ球を取得する方法を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法に関する。本発明の第１の発明で製造される細胞傷害性リンパ球としては、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、インターロイキン−２レセプターを高発現する細胞傷害性リンパ球が例示される。また、本発明の第１の発明で製造される細胞傷害性リンパ球としては、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、ＣＤ８陽性細胞を高比率で含有する細胞傷害性リンパ球が例示される。また、本発明の第１の発明で製造される細胞傷害性リンパ球としては、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下での細胞傷害性リンパ球の製造方法により製造されたものと比較して、拡大培養率が高い細胞傷害性リンパ球が例示される。また、本発明の第１の発明で製造される細胞傷害性リンパ球としては、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に製造されたものと比較して、細胞傷害活性が増強されたもしくは高い細胞傷害活性が維持された細胞傷害性リンパ球が例示される。
本発明の第１の発明において、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の使用については、これらが固相に固定化されて使用されることが例示される。ここで固相としては細胞培養用器材または細胞培養用担体が例示される。細胞培養用器材としては、シャーレ、フラスコまたはバッグが例示され、細胞培養用担体としては、ビーズ、メンブレンまたはスライドガラスが例示される。
本発明の第１の発明において、細胞傷害性リンパ球としては、リンフォカイン活性化キラー細胞が例示される。
本発明の第１の発明において、フィブロネクチンのフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜８で表されるいずれかのアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。フィブロネクチンのフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが例示される。また、フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号９〜２０および２５で表されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１つのポリペプチドが例示される。
本発明の第１の発明において、当該製造方法を細胞培養用器材中で行う場合の一態様として、
（ａ）培養開始時の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、および／または
（ｂ）培養開始時の培地中の細胞の濃度が、１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、
の条件を満たすことが例示される。
また、このような製造方法としては、細胞培養液を希釈する工程を要しない方法が例示される。
本発明の第１の発明において、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持及び拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう場合、例えば、少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程、培地の交換工程もしくは細胞培養用器材の交換工程を包含し、かつ少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程直後、培地の交換工程直後もしくは細胞培養用器材の交換工程直後の培養条件が、
（ｃ）細胞培養液中の細胞の濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、もしくは
（ｄ）細胞培養液中の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である、
の条件を満たすことが例示される。
本発明の第１の発明の製造方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持及び拡大培養の少なくともいずれか１つを、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で行なう場合、特に限定はないが、例えば、少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程、培地の交換工程もしくは細胞培養用器材の交換工程を包含し、かつ少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程直後、培地の交換工程直後もしくは細胞培養用器材の交換工程直後の培地中における血清および血漿の総含有濃度が培養開始時と同じか、もしくは培養開始時よりも低減されていることが例示される。
本発明の第１の発明において、細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む方法が例示される。ここで外来遺伝子の導入としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスを用いて導入することが例示される。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球に関する。
本発明の第３の発明は本発明の第１の発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球を有効成分として含有する医薬に関する。
本発明の第４の発明は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有し、かつ血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満であることを特徴とする細胞傷害性リンパ球培養用培地に関する。
本発明により、安全性が高く、患者への負担が軽減された細胞傷害性リンパ球の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  第１図は、フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持又は拡大培養方法において、フィブロネクチン及び／又はフィブロネクチンフラグメントの存在下に細胞傷害性リンパ球を調製することにより、培地中の血清や血漿の含有量を低減または除去しても、高い拡大培養率で充分な細胞傷害活性を有し、ＩＬ−２Ｒの発現量が高く、さらにＣＤ８陽性細胞の比率が高い細胞傷害性リンパ球が得られることを見出し、完成するに至ったものである。
なお、本明細書において細胞傷害性リンパ球の製造とは、当該細胞の誘導（活性化）、維持、拡大培養の各工程、もしくはこれらを組み合わせた工程を包含する操作を指す。また、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造を、細胞傷害性リンパ球の培養とも称する。
以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明に使用されるフィブロネクチン、およびそのフラグメント
本明細書中に記載のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。
なお、フィブロネクチンは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるフィブロネクチンとしては、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアントも使用することができる。例えば、血漿由来のフィブロネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のフィブロネクチンも本発明に使用することができる。
本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ  Ａ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。また、フィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６（ＮＰ＿００２０１７）に開示されている。
本発明において、フィブロネクチンフラグメントとしては、例えば、ＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１１（配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）、およびＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）（第１図参照）や、前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。
さらにフィブロネクチンのフラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２７１（配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列）、Ｃ−ＣＳ１（配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列）、またはＣＨ−２９６Ｎａ（配列表の配列番号２５で表されるアミノ酸配列）より選択されるポリペプチドが例示される。なお、ＣＨ−２９６Ｎａについては本願において初めて作製されたポリペプチドである。
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６Ｎａ、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６ＮａはＶＬＡ−４に結合する活性を有するＣＳ−１を有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６およびＣＨ−２９６Ｎａはヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。なお、ＣＨ−２９６Ｎａは血漿由来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメインからＣＳ−１までを含むポリペプチドである。すなわち、ＣＨ−２９６ＮａはＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２０２６（ＮＰ＿００２０１７）に開示されているフィブロネクチンのアミノ酸配列の１２７０番目のプロリンから２０１６番目のスレオニンまでを含むポリペプチドより、１６３１番目のアスパラギンから１７２０番目のスレオニンにわたる領域（ＥＤ−Ａ）が欠失したポリペプチドである。
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列表の配列番号１５で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９０（配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号１７で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列表の配列番号１８で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。
また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、後述の製造例に記載のＨ−２７５−Ｃｙｓの製造方法に準じて上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントをコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、それを使用して、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメント等を構成するポリペプチドのアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、比較対照であるポリペプチドが、天然由来のフィブロネクチンフラグメントの有する、（ｉ）細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性の増強又は維持機能、（ｉｉ）ＩＬ−２Ｒの発現量の増強機能、（ｉｉｉ）ＣＤ８陽性細胞の比率向上機能、または（ｉｖ）細胞傷害性リンパ球の拡大培養率の向上機能の少なくともいずれかの機能を有することをいう。前記機能は後述の実施例に記載の方法に準じて適宜確認することができる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適である。細胞接着活性およびヘパリン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することができる。
アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。
なお、フィブロネクチンについても、上記のフラグメントと同様、そのポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、少なくとも前記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの機能を有するポリペプチドを、本発明において使用することができる。
本明細書中に記載のフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より製造することもできる。例えば、上記のＨ−２７１（配列番号１０）、Ｈ−２９６（配列番号１１）、ＣＨ−２７１（配列番号１２）、ＣＨ−２９６（配列番号１３）の各フラグメントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されている。また、ＣＨ−２９６Ｎａ（配列番号２５）とその製造方法については後述の（３）ＣＨ−２９６Ｎａについて、および実施例に記載されている。また、上記のＣ−２７４（配列番号９）フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１４）フラグメントは日本特許第３１０４１７８号明細書に記載された方法により得ることができる。上記ＣＨＶ−８９（配列番号１５）、ＣＨＶ−９０（配列番号１６）、ＣＨＶ−１７９（配列番号１８）の各フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１（配列番号１９）フラグメントは国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載された方法に準じて得ることができる。ＣＨＶ−９２（配列番号１７）フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書および国際公開第９７／１８３１８号パンフレットを参照し、それらの文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。
これらのフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法により改変することにより製造することができる；
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年１月３０日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５（Ｃ−２７４をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８８年６月１７日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９０年３月５日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７３（ＣＨ−２９６Ｎａをコードするプラスミド；寄託日  ２００４年７月２３日）
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）。
フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製して使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。また、フィブロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメント、さらに好適には前記のようにして得られる組換えフィブロネクチンフラグメントを使用することができる。さらに、後述するリンパ球の拡大培養率の向上、拡大培養されたリンパ球におけるＩＬ−２Ｒの発現量の上昇、および拡大培養されたリンパ球集団中のＣＤ８陽性細胞の比率の向上、細胞傷害活性の上昇等の効果を示すことができるフィブロネクチンフラグメントが特に好適に使用できる。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。
なお、本発明のフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列において、天然由来のフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列部分は、本発明の所望の効果の発現を阻害しない限り任意であり、特に限定されるものではない。
（２）本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法
以下、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法について具体的に説明する。本発明の方法は、培地中における血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なう細胞傷害性リンパ球の製造方法である。
本明細書において細胞傷害性リンパ球とは細胞傷害性リンパ球を含有する細胞群を意味する。なお、狭義には前記細胞群に含有されている細胞傷害性リンパ球のみを示すことがある。また、本発明において細胞傷害性リンパ球の製造とは、本発明の細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞からの細胞傷害活性を有するリンパ球への誘導、細胞傷害性リンパ球の維持、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞を用いた細胞傷害性リンパ球の拡大培養のいずれをも包含するものである。本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整することにより、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持または拡大培養が行なわれることになる。
本発明の細胞傷害性リンパ球としては、特に限定するものではないが、例えば細胞傷害活性を有する、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ細胞等が挙げられる。
本発明において、細胞傷害性リンパ球になり得る、すなわち、該リンパ球への分化能を有する前駆細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、ナイーブ細胞、メモリー細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。また、血球系細胞であれば本発明において前駆細胞として使用できる。これらの細胞は生体から採取されたものをそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。なお、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物から選択される有効成分の存在下に細胞傷害性リンパ球を製造することを１つの大きな特徴とする。なお、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、細胞傷害性リンパ球の培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において行われる。すなわち、細胞傷害性リンパ球の製造工程の一部に前記工程を含むものであれば本発明に包含される。
さらに、従来の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法では、培地中に５〜２０容量％の血清・血漿の添加が必要であったのに対し、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、これら血清および血漿の培地中の総含有濃度を０容量％以上５容量％未満とすることを特徴とする。血清および血漿の培地中の総含有濃度は、好適には０容量％以上４容量％以下、特に好適には０容量％以上３容量％以下とすることができる。本発明の特に好適な態様においては、培地中に血清・血漿を全く添加することなく、十分な細胞傷害性リンパ球の製造を行うことができ、安全面や患者への負担を軽減させる点で非常に有用な方法である。また、本発明において、使用する血清・血漿の使用量をさらに低減させたい場合は、培養途中において血清・血漿の使用量を段階的に低減させることができる。すなわち、培養開始時の血清・血漿濃度に対して、後述する細胞培養液の希釈、培地交換もしくは細胞培養用器材の交換の際に使用される新たな培地中の血清・血漿濃度を低減させるもしくは添加しないことで、血清・血漿の使用量を通常より低減させることができる。よって、本発明によれば、少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程、培地の交換工程もしくは細胞培養用器材の交換工程を包含し、かつ少なくとも１回の、細胞培養液の希釈工程直後、培地の交換工程直後もしくは細胞培養用器材の交換工程直後の培地中における血清および血漿の総含有濃度が培養開始時と同じか、もしくは培養開始時よりも低減されている細胞傷害性リンパ球の製造方法が提供される。
なお、血清又は血漿の由来としては、自己（使用する細胞傷害性リンパ球の前駆細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（使用する細胞傷害性リンパ球の前駆細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。
本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の製造、すなわち、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養は、通常、本発明の前記有効成分の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。
例えば、本発明の方法において、細胞傷害性リンパ球の誘導もしくは拡大培養を意図する場合、本発明において使用される培養開始時の細胞（細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞）数としては、特に限定はないが、例えば１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法において使用される培地には血清および血漿の総含有濃度を除いては特に限定はなく、細胞傷害性リンパ球、その前駆細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、下記実施例３４〜３８および４５〜５２に記載のとおり、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のリンパ球を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれのものも使用することができるが、好適には得られるリンパ球の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
また、抗ＣＤ３抗体をさらに含有する培地中で細胞傷害性リンパ球になり得る前駆細胞を培養することもできる。抗ＣＤ３抗体の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。抗ＣＤ３抗体はリンパ球上のレセプターを活性化する目的で添加することができる。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
なお、本発明の有効成分を含め、上記成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。なお、ビーズへの固定化としては、下記実施例６１および６２に記載のとおりに行うことができ、製造されたビーズは下記実施例６３および６４に記載のとおりに使用することができる。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。
例えば、フィブロネクチンのフラグメントの固定化は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法により実施することができる。
前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法により細胞傷害性リンパ球を得た後、該リンパ球と固相とを分離するのみで、有効成分等と該リンパ球とを容易に分離することができ、該リンパ球への有効成分等の混入を防ぐことができる。
さらに、国際公開第０２／１４４８１号パンフレットに記載された、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞の誘導に有効な酸性多糖、酸性オリゴ糖、酸性単糖およびそれらの塩からなる群より選択される化合物や、下記（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を前記成分と共に用いてもよい。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質
前記ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、例えばＣＤ４４リガンドおよび／または抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、例えば成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。さらに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質としては、例えば各種リン酸化酵素および脱リン酸化酵素の阻害剤又は活性化剤が挙げられる。これらの成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。また、これらの成分は培地中に溶解して共存させる他、前記のような適切な固相に固定化して使用してもよい。
なお、上記の各種物質は単独で、もしくは２種以上混合して用いることができる。
本発明において前記有効成分の存在下とは、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持または拡大培養を行なう際に、前記有効成分がその機能を発揮し得る状態で存在することをいい、その存在状態は特に限定されるものではない。例えば、有効成分を使用する培地に溶解させる場合、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．０００１〜１００００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．００１〜１００００μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．００５〜５０００μｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍＬである。
本発明の製造方法によって得られた細胞傷害性リンパ球についてＩＬ−２Ｒの発現量を測定すると、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なった細胞傷害性リンパ球に比較して有意なＩＬ−２Ｒ発現量の増加が認められる。ここで、ＩＬ−２Ｒ発現量は公知の方法、例えば、抗ＩＬ−２Ｒ抗体を使用して測定することができる。
上記のように、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球はＩＬ−２Ｒの発現量が増加している。ＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞表面に発現する活性化マーカーであり、この分子の発現に伴い、サイトカイン産生、細胞傷害活性、増殖活性等が活性化される。よって、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は高い機能を有する細胞群である。
また、本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は、ＩＬ−２Ｒの発現量が増加していることから、培地中に添加されたＩＬ−２、あるいは細胞傷害性リンパ球の前駆細胞、リンパ球自体もしくは共存するその他の細胞が産生したＩＬ−２による刺激に対する感受性が向上している。このため、ＩＬ−２の少ない環境下（例えば体内等）でも自ら活性化することができる。
さらに、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球では、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものに比べてＣＤ８マーカーを有する（ＣＤ８陽性）細胞の存在する比率が高い。このことは、例えば、１．ＣＤ８陽性細胞はインターフェロン−γ等のサイトカインを産生して、免疫賦活を引き起こし、ヘルパーＴ細胞バランスをＴｈ１系にする、２．ＣＤ８陽性細胞は細胞性免疫担当細胞であり、ウィルスや腫瘍細胞等の異物を効率よく排除することができる、３．ＣＤ８陽性細胞を得る場合は、従来はマグネットビーズやフローサイトメーターでＣＤ８陽性細胞を精製していたが、本発明の方法では培養しながらＣＤ８陽性細胞をエンリッチにすることができる、４．ＣＤ８陽性細胞比が多いことから、ＣＴＬを誘導する際の前駆細胞としての使用に適している、５．ＣＤ８陽性細胞比の少ない細胞集団からでも、ＣＤ８陽性細胞比率を高めながら培養することができる、等の利点がある。よって、本発明の方法は細胞傷害性リンパ球の調製において極めて有用である。
なお、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球におけるＣＤ８陽性細胞の比率は、特に限定するものではないが、例えば抗ＣＤ８抗体を使用して測定することができる。
また、本発明の方法により調製された細胞傷害性リンパ球は培養後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを増殖させても、従来観察されたような高い細胞傷害活性が維持されているという性質を有している。すなわち、該細胞傷害性リンパ球は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下に誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを行なったものと比べて、細胞傷害活性が高く維持される。従って、培養された細胞傷害性リンパ球をクローン化することにより、安定した細胞傷害活性を有するリンパ球として維持することもできる。また、誘導された細胞傷害性リンパ球に抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させ、拡大培養することができる。この細胞傷害性リンパ球の維持、拡大培養には、特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。
上記の細胞傷害性リンパ球の維持とは、細胞傷害性リンパ球を細胞傷害活性を保ったままで維持することをいう。その際の培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を適用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は前記と同様である。
本発明の方法における細胞傷害性リンパ球の維持および拡大培養は、本発明の有効成分、すなわちフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下、培地中における血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地中で細胞傷害性リンパ球をそれぞれ継続培養および拡大培養することを１つの大きな特徴とする。拡大培養によれば、細胞傷害性リンパ球の有する細胞傷害活性を維持させた状態でその細胞数を増加させることができる。すなわち、本発明の方法は、１つの態様として、細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を提供する。
本発明の方法により得られる細胞傷害性リンパ球は所望の標的細胞を認識する能力を有しており、例えば標的となる細胞を、その細胞傷害活性により破壊する。この細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を、細胞傷害性リンパ球により破壊された標的細胞に由来する放射活性や蛍光強度を測定することによって評価できる。また、細胞傷害性リンパ球や標的細胞より特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えば細胞傷害性リンパ球を細胞傷害性リンパ球特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させた後に第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）分析することにより細胞傷害性リンパ球の細胞傷害活性を評価することができる。
さらに、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法の特徴として、低細胞数から培養を開始することが可能である。養子免疫療法を行うためには大量のリンパ球が必要となるが、患者から大量のリンパ球を取得することは困難である。また、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、使用する細胞数に応じた適切な培養面積の細胞培養用器材の選択や、適切な培地量での培養が必要となる。すなわち、通常は細胞培養用器材における培養面積〔すなわち、培地に接触している器材表面部分の面積（ｃｍ２）〕に対する細胞量（個数）は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以上、細胞濃度は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の高密度で培養が開始され、これ以下の細胞量条件では、拡大培養率〔拡大培養前の細胞数に対する拡大培養後の細胞数の比（拡大培養後の細胞数／拡大培養前の細胞数）〕が非常に低くなり、大量の細胞傷害性リンパ球を得るまでに長期の培養期間を要する。よって、一般的には、例えば、小さな細胞培養用器材を用いて培養を開始した後、段階的に大きなスケールの細胞培養用器材を使用する、もしくは細胞培養用器材の数を増やして希釈操作を繰り返す等の方法により、大量のリンパ球を製造するのが現状である。このように、通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養では、複数の培養系を必要とする。
本発明の方法により、少量の細胞量より開始された場合でも細胞培養用器材の大きさに関わらず、高い拡大培養率で培養を行うことができる。よって、従来のような面倒な細胞培養用器材や細胞培養液の交換、細胞培養液の希釈操作は不要となる。すなわち、本発明の方法によれば、１つの細胞培養用器材を用いた培養操作により、換言すれば、１つの培養系により、充分な細胞傷害性リンパ球の拡大培養を行なうことができる。よって、本発明の方法により、細胞培養液を希釈する工程を要しない細胞傷害性リンパ球の製造方法を実現することができる。特に、本発明の方法でＬＡＫ細胞を拡大培養する場合、大容量の細胞培養用器材にＬＡＫ細胞となり得る前駆細胞と培地を添加し、それ以降はＩＬ−２を添加するのみでＬＡＫ細胞の拡大培養を行うことが可能である。簡便な操作で大量のＬＡＫ細胞を得ることができる点において、本発明は非常に有用である。この際、使用する本発明の有効成分としては、より高い拡大培養率を得るという観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメントが使用できる。このように、本発明の方法によれば、短時間に必要量の細胞傷害性リンパ球を得ることができる。
例えば、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを、本発明の有効成分の存在下、培地を含む細胞培養用器材中で低細胞数から開始する場合、培養開始時において、下記（ａ）および（ｂ）から選択される条件を満たす低濃度もしくは低密度の細胞量を使用して行うことができる。
（ａ）使用する細胞培養用器材における培養面積に対する細胞量の比率が、好適には１ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、特に好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。
（ｂ）培地中の細胞の濃度が、好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、特に好適には１×１０２ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。
なお、ここで細胞量とは、細胞傷害性リンパ球および／または前駆細胞の個数をいう。
また、本発明の方法においては、細胞培養液の希釈操作の工程を要しない、細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養の少なくともいずれか１つを１つの培養系で行なう方法が例示される。
さらに本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法の特徴として、高細胞数での培養を行うことも可能となる。すなわち、細胞傷害性リンパ球の製造を培地を含む細胞培養用器材中で行なう方法であって、培養途中に、少なくとも１回の、細胞培養液を新鮮な培地で希釈する工程、培地を交換する工程、もしくは細胞培養用器材を交換する工程を包含する場合、これらの工程直後の培養条件を高濃度（例えば、細胞培養液中の細胞の濃度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）もしくは高密度（例えば、細胞培養液中の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好適には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、さらに好適には１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）に設定した場合においても、本発明の方法は従来法と比較して、良好な拡大培養率を実現することができる。通常の細胞傷害性リンパ球の拡大培養においては、培養開始時は細胞数を比較的高濃度もしくは高密度に設定されることが多いが、細胞の増殖率が上がってくると細胞培養液中の細胞濃度や細胞培養用器材中の細胞密度が低く設定される。本発明の高細胞数での培養とは、このような培養途中における細胞濃度や細胞密度の設定時において細胞培養液中の細胞の濃度が、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、もしくは細胞培養液中の細胞数と細胞培養用器材における培養面積との比率が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２という高濃度又は高密度な条件に設定される細胞傷害性リンパ球の製造をいう。なお、ここでいう細胞培養液を新鮮な培地で希釈する工程直後、培地を交換する工程直後、もしくは細胞培養用器材を交換する工程直後とは、培養開始時を包含するものではない。
このような高細胞数での培養が実施できる利点としては、使用する培地、血清・血漿等の培地添加物、細胞培養用器材、労力および培養スペースの削減が挙げられる。養子免疫療法では大量のリンパ球を必要とするため、使用される培地や細胞培養用器材が非常に多く必要となり、それに伴って大規模な培養スペースや多くの人員も必要となる。これらは養子免疫療法が普及する上で大きな課題となるものである。従って、本発明の方法はこのような課題を解決することができることから施設の設営、運営上、非常に有意義な発明である。
前述したとおり、本発明の方法は、低濃度もしくは低密度での細胞培養、高濃度もしくは高密度での細胞培養のいずれにも適用可能な方法であることから、本発明の方法を用いることにより、培養状況に応じてさまざまな細胞濃度もしくは細胞密度での細胞傷害性リンパ球の製造が可能となる。
また、本発明の方法においては、適切なフィーダ細胞と共培養することもできる。細胞傷害性リンパ球をフィーダ細胞と共培養する場合には、細胞傷害性リンパ球、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。当該培地としては、市販の培地が使用できる。
本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗ＣＤ３抗体と協同して細胞傷害性リンパ球を刺激し、Ｔ細胞レセプターを活性化するものであれば特に限定はない。本発明には、例えば、ＰＢＭＣやエプスタイン−バールウィルスによって形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は公知の方法に従って決定すればよく、例えば、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが好適である。
特に好ましい態様においては、フィーダ細胞として、非ウィルス感染細胞、例えば、ＥＢＶ−Ｂ細胞以外のものが使用される。これにより、拡大培養された細胞傷害性リンパ球中にＥＢＶ−Ｂ細胞が混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のような細胞傷害性リンパ球を利用した医療の安全性を高めることが可能となる。
また、本発明の方法においては、適切な抗原提示細胞と共培養することもできる。抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドを付加し、その表面に抗原ペプチドを提示させることにより調製することができる〔例えば、ベンドナレク  Ｍ．Ａ．ら（Ｂｅｎｄｎａｒｅｋ  Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）を参照〕。また、抗原提示能を有する細胞が抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）する能力を有している場合には、当該細胞に抗原を負荷することにより、抗原が細胞内に取り込まれてプロセッシングを受け、断片化された抗原ペプチドが細胞表面に提示される。なお、抗原ペプチドを抗原提示能を有する細胞に付加する場合、使用される抗原提示細胞、誘導しようとする細胞傷害性リンパ球のＭＨＣ拘束性に合致する抗原ペプチドまたはＭＨＣ非拘束性の抗原ペプチドが使用される。
なお、本発明において使用される抗原は特に限定されるものではなく、例えば、細菌、ウィルスなどの外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）などの内存性抗原等が挙げられる。
本発明においては、抗原提示細胞は非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、例えばＸ線等の放射線照射またはマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行えばよい。
本発明の製造方法によりＬＡＫ細胞を製造する場合、前記有効成分の存在下、ＩＬ−２とともにＬＡＫ細胞となり得る前駆細胞をインキュベートすることにより実施される。ＬＡＫ細胞となり得る前駆細胞としては、特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、臍帯血単核球、造血幹細胞、これらの細胞を含有する血液成分等が挙げられる。
また、ＬＡＫ細胞を培養するための一般的な条件は、上記の培地を使用する点を除いては、公知の条件〔例えば、細胞工学、Ｖｏｌ．１４、Ｎｏ．２、ｐ２２３〜２２７、（１９９５年）；細胞培養、１７、（６）、ｐ１９２〜１９５、（１９９１年）；ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ、Ｖｏｌ．３５６、ｐ８０２〜８０７、（２０００）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １７，ＵＮＩＴ７．７を参照〕に従えばよい。培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件下で培養することができる。この培養は通常、２〜１５日程度実施される。また、適当な時間間隔で細胞培養液を希釈する工程、培地を交換する工程もしくは細胞培養用器材を交換する工程を行っても良い。
上記のＬＡＫ細胞の誘導、維持、拡大培養と同様に、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に培養することにより、ＣＴＬ、ＴＩＬについても高い細胞傷害活性を有する細胞群を調製することができる。本発明においては、これらの細胞の活性化操作においてフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を共存させ、かつ培地中における血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を使用する他には特に限定はなく、前記細胞の培養、活性化に適した培地を使用して実施することができる。フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の使用量、添加方法等については前記方法に準じて適切なものを選択すればよい。
なお、本発明の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法については、前記有効成分が、当該方法に使用される培養系に存在しており、さらに培地中の血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満であれば特に限定は無く、上記以外の従来の細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法において、その培養系に前記有効成分を存在させて、さらに培地中の血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満であれば本発明に包含される。
本発明の方法により製造される細胞傷害性リンパ球を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ等のウィルス、細菌、カビが原因となる感染性疾患が例示される。また、後述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造される細胞傷害性リンパ球は骨髄移植や放射線照射後の感染症予防を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。
本発明の別の態様として、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物を有効成分として含有し、かつ培地中における血清及び血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である細胞傷害性リンパ球培養用培地が提供される。当該培地は、さらにその他の任意の成分、たとえば、公知の細胞培養に用いられる培地成分、タンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。なお、当該培地は、本発明の有効成分、および培地中の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満となるように自己又は非自己の血清や血漿を用い、公知の方法に準じて製造することができる。当該培地中の本発明の有効成分等の含有量は、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではなく、例えば、本発明の方法に使用される前記培地中の有効成分等の含有量に準じて、所望により、適宜、決定することができる。本発明の培地の一態様としては、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物が固定化された細胞培養用担体を含有する培地、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物が固定化された細胞培養用器材に封入して提供される培地が包含される。
上記の細胞傷害性リンパ球の製造方法を用いて得られたリンパ球含有培養物中には、通常、ヘルパーＴ細胞等の細胞傷害性リンパ球以外の細胞も混在している。しかしながら、本発明により得られたリンパ球含有培養物中には細胞傷害活性を保持するリンパ球が多く含まれているため、該培養物から遠心分離等により該培養物中の細胞を回収し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球としてそのまま使用することができる。しかも、前記有効成分等を細胞培養用器材等に固定化しておけば、得られた細胞傷害性リンパ球における該成分等の混入の心配はない。
また、さらに該培養物から公知の方法により、細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団（あるいは培養物）を分離し、本発明の方法により得られた細胞傷害性リンパ球として使用することもできる。すなわち、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法は、当該方法により得られた培養物から細胞傷害性リンパ球を高含有する細胞集団を選択する工程を含むことができる。
細胞傷害性リンパ球を高含有する該細胞集団の選択方法については特に限定はないが、例えば培養物から所望の細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ８抗体を結合させた細胞培養用器材もしくは担体を用いて目的の細胞のみを選択的に回収する方法や、フローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。前記担体としては磁気ビーズやカラムが例示される。また、培養物から所望の細胞以外の細胞を吸着除去することにより、目的の細胞を高含有する細胞集団を得ることもできる。例えば、ヘルパーＴ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ４抗体を使用し、当該リンパ球培養物からヘルパーＴ細胞を除去することができる。この工程にはフローサイトメーターを用いることもできる。
さらに本発明は、上記の本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法で得られた、細胞傷害性リンパ球を提供する。当該リンパ球は高い細胞傷害活性を有しており、長期間にわたる継続培養や拡大培養を行っても細胞傷害活性の低下が少ないという性質を有する。また、本発明は、当該リンパ球を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。特に、当該リンパ球を含有する前記治療剤は養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適した細胞傷害活性を有するリンパ球が、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該リンパ球を有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。なお、治療剤における本発明のリンパ球の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法においては、当該リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、細胞傷害性リンパ球に外来遺伝子を導入する工程をさらに含む細胞傷害性リンパ球の製造方法を提供する。なお、「外来」とは、遺伝子導入対象のリンパ球に対して外来であることをいう。
本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法、特に細胞傷害性リンパ球の拡大培養方法を行うことにより、培養されるリンパ球の増殖能が増強される。よって、本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、細胞傷害性リンパ球の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記リンパ球の誘導、維持および／または拡大培養のいずれかの工程と同時に、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはシミアンウイルスが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
レトロウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における、細胞傷害性リンパ球の製造工程、例えば、拡大培養の工程において遺伝子導入を行なうのに好適である。
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡや直鎖状ＤＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。
本発明において細胞傷害性リンパ球に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のリンパ球の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。
本発明の方法によれば、例えば、がん等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して該リンパ球に薬剤耐性を付与することができる。そのような細胞傷害性リンパ球を用いれば、養子免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子を細胞傷害性リンパ球に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のリンパ球を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。
（３）ＣＨ−２９６Ｎａについて
本発明においては、配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列（ｘ）（ＣＨ−２９６Ｎａ）、またはアミノ酸配列（ｘ）において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加もしくは置換したアミノ酸配列（ｙ）を有するポリペプチドであって、アミノ酸配列（ｙ）を有するポリペプチドがアミノ酸配列（ｘ）を有するポリペプチドと同等な機能を有するものである、新規なポリペプチド、およびこれをコードする核酸も提供される。当該核酸としては、（１）配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ＣＨ−２９６Ｎａをコードする核酸）、（２）配列番号２６に記載の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加した塩基配列からなり、かつＤＮＡ（１）にコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、または（３）配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＮＡ（１）にコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡからなる核酸が例示される。
なお、本明細書において、前記新規なポリペプチドを本発明のポリペプチドと称し、これをコードする核酸を本発明の核酸と称することがある。
以下、本発明のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドの製造方法について説明する。
本発明のポリペプチドは、前述のような細胞傷害性リンパ球の製造において所望の機能〔前記（ｉ）〜（ｉｖ）の機能〕のいずれかを有するものであれば、上記アミノ酸配列において１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加の１以上が生じた配列のものも本発明のポリペプチドに含まれる。ＣＨ−２９６Ｎａ以外の本発明のポリペプチドとしては、好適には配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列に１〜２０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜１０個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、該ポリペプチドの作製法は前記の通りである。
本発明のポリペプチドをコードする配列表の配列番号２６で表される核酸は血漿由来のヒトフィブロネクチンをコードするｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行い、ＣＨ−２９６ＮａをコードするＤＮＡ断片として取得することができる。この際に使用されるプライマーとしては、特に限定はないが、例えば配列表の配列番号２７、２８に記載されるＰｒｉｍｅｒ  ＣＨ−２９６Ｎａｌ、ＰｒｉｍｅｒＣＨ−２９６Ｎａ２を使用することができる。また、当該核酸としては、前述のＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌）のプラスミドと、ネイティブの血漿由来のフィブロネクチンの細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在する配列（第１図におけるＩＩＩ型繰り返し配列の１１）を有するＤＮＡ断片を適当な制限酵素サイトを用いて結合することにより取得することができる。
また、本発明の核酸としては、配列表の配列番号２６で表される核酸の塩基配列において、１ないし複数個の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものも含まれる。例えば配列表の配列番号２６に記載の塩基配列から１〜６０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、より好適には１〜３０塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたもの、さらに好適には１〜１５塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加のいずれか１以上が生じたものが例示される。なお、塩基の置換等は、核酸にコードされるポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであってもよい。その詳細、塩基の置換等の方法については前記のアミノ酸の置換等に関する記載に準ずる。
さらに配列番号２６に記載の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、本発明のポリペプチドと同等な機能、すなわち前述の細胞傷害性リンパ球の製造における前記（ｉ）〜（ｉｖ）の少なくともいずれかの機能を有するポリペプチドをコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。上記「ストリンジェントな条件」とは特に限定されず、配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイズさせるＤＮＡに応じて、ハイブリダイゼーション時の、好ましくはさらに洗浄時の温度および塩濃度を適宜決定することにより設定し得るが、ストリンジェントな条件としては、例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版〔サンプルーク（ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）社発行〕等の文献に記載の条件が挙げられる。
具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％ＳＤＳと５×デンハルト〔Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕と１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡとを含む溶液中、５０℃、好ましくは６５℃で保温する条件が例示される。前記の温度は用いるＤＮＡのＴｍ値が既知である場合は、その値より５〜１２℃低い温度としてもよい。さらに、非特異的にハイブリダイズしたＤＮＡを洗浄により除去するステップ、ここで、より精度を高める観点から、より低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件および／またはより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、２５℃以上、よりストリンジェントには、３７℃以上、さらにストリンジェントには、４２℃以上、よりさらにストリンジェントには、５０℃以上等の条件下で洗浄を行なう、という条件等を追加してもよい。
より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた本発明に包含される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミドが、低下したストリンジェンシーを生じる）、塩濃度、または温度の操作によって行われる。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍＬサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中での３７℃での一晩インキュベーション；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さらに、より低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）で行うことができる。
上記の条件は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬を添加および／または置換することによって改変することができる。代表的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販の製品処方物が挙げられる。また、この改変に応じて、上記のハイブリダイゼーション条件の他の要素の改変が必要な場合もある。
一方、このようにして得られた核酸を用いて、配列表の配列番号２５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを遺伝子工学的に取得することができる。すなわち、当該核酸を適切な発現用ベクター、特に限定はないが、例えばｐＥＴベクターやｐＣｏｌｄベクター等に挿入し、公知の方法により、当該ポリペプチドを、例えば、大腸菌等で発現させることにより取得することができる。
【実施例】  以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
製造例１  フィブロネクチンフラグメントの調製
（１）フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２７１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４）より、米国特許第５，１９８，４２３号明細書に記載の方法により調製した。
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６はそれぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）を用い、これを上記の明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−２７４は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５）を用い、これを米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  Ｃ−ＣＳ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＳ２５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３）を用い、日本特許３１０４１７８号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−１７９は、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ８９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１７９（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３）を用い、日本特許２７２９７１２号明細書に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。
また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−９０は日本特許２７２９７１２号明細書に記載の方法で調製した。すなわち、当該明細書に記載の操作によってプラスミドｐＣＨＶ９０を構築したうえ、該プラスミドを保有する形質転換体を培養し、該培養物よりＣＨＶ−９０を調製した。
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント  ＣＨＶ−１８１は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載の方法で、ＣＨＶ−１８１をコードするＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＣＨＶ１８１）を構築した後、該プラスミドを導入された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１８１）を培養し、該培養物より、上記のＣＨＶ−１７９と同様の方法で調製した。
（２）ＣＨＶ−９２の調製
上記のポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現させるためのプラスミド  ｐＣＨＶ１８１について、ＣＨＶ−１８１をコードする領域中のＩＩＩ−１３領域をコードする領域を欠失したプラスミドＣＨＶ９２を構築した。欠失操作は日本特許２７２９７１２号明細書に記載の、プラスミドｐＣＨＶ１７９からのＩＩＩ−１４コード領域の欠失操作に準じて行った。
上記のプラスミドｐＣＨＶ９２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ９２）を培養し、該培養物より日本特許第２７２９７１２号明細書に記載のＣＨＶ−８９ポリペプチドの精製方法に準じて精製操作を行い、精製ＣＨＶ−９２標品を得た。
（３）Ｈ−２７５−Ｃｙｓの調製
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓを発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００）よりプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号２１に塩基配列を示すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号２２に塩基配列を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲを行い、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインをコードする約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＰＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）とライゲーションすることにより、プラスミドｐＲＨ１を構築した。
プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ１〔グーライェプ  Ｊ．ら（Ｇｈｒａｙｅｂ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第３巻、第１０号、第２４３７〜２４４２頁（１９８４）〕をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社製）とで消化し、リポプロティンターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ドメインをコードするＤＮＡ断片およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ１−Ｔを得た。
このプラスミドｐＲＨ１−Ｔを鋳型とし、配列表の配列番号２３に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ａと配列表の配列番号２４に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ｓとを用いたＰＣＲ反応の後、回収した増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で消化し、さらに該ＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせた。こうして得られた環状ＤＮＡをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．３ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＲＨ１−ＴをＳｐｅＩとＳｃａＩ（タカラバイオ社製）とで消化して得られる２．５ｋｂのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、プラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓを得た。該プラスミドには、前記のＨ−２７１のＮ末端側にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒの４アミノ酸が付加され、さらにＣ末端にＣｙｓが付加されたポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓがコードされている。
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓは以下の方法により調製した。上記のプラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＲＨ−Ｃｙｓ）を１２０ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で１晩培養した。培養液より回収した菌体を４０ｍＬの破砕用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を精製用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（ファルマシア社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、０〜１ＭＮａＣｌ濃度勾配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、Ｈ−２７５−Ｃｙｓの分子量に相当する画分を集めて精製Ｈ−２７５−Ｃｙｓ標品を得た。
［実施例１］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ）培養系における拡大培養率の測定
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層して５００×ｇで２０分間遠心分離した。中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）／１０％ＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社製）からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＬＡＫ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレートまたは１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１ｍＬ（２４穴プレートの場合）または２ｍＬ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）ずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を終濃度１０μｇ／ｍＬ（２４穴プレートの場合）または２５μｇ／ｍＬ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）となるように添加した。対照として、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＸＶＩＶＯ２０培地（Ｂｉｏ  ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で１回洗浄し各実験に供した。
（３）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０（以下１％ＸＶＩＶＯ２０と略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＸＶＩＶＯ２０を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜１％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養を継続し、２〜３日毎に培養開始４日目と同様に適宜１％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈し終濃度３００〜５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目または１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表１に示す。
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表１に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例２］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
０．５％または１％ＸＶＩＶＯ２０に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む０．５％または１％ＸＶＩＶＯ２０を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜０．５％または１％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始９日目には実施例１−（２）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコ（ただし、固定化に用いる抗ヒトＣＤ３抗体の濃度は０．５μｇ／ｍＬとした）に適宜０．５％または１％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１２日目に再度適宜０．５％または１％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表２に示す。
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表２に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、低濃度の血清を含んだ培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例３］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（１）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＬＡＫ細胞を１％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）を用いて固定した後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１００μＬのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）抗体（ともにＤＡＫＯ社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表３に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
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表３に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例４］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（１）で調製した２×１０５ｃｅｌｌｓのＬＡＫ細胞を１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて固定した後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１％ＢＳＡを含む１００μＬのＰＢＳ中に懸濁し、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１もしくはＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ともにＤＡＫＯ社製）を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに懸濁した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅを用いたフローサイトメトリーに供し、ＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表４に示す。
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表４に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例５］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
血清を含まないＸＶＩＶＯ２０（以下０％ＸＶＩＶＯ２０と略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む０％ＸＶＩＶＯ２０を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜０％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養を継続し、２〜３日毎に培養開始４日目と同様に適宜０％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈し終濃度３００〜５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目または１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表５に示す。
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表５に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは血清を含まない培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例６］  無血清培地でのＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
０％ＸＶＩＶＯ２０に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＯ％ＸＶＩＶＯ２０を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には適宜０％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始９日目には実施例１−（２）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコ（ただし、固定化に用いる抗ヒトＣＤ３抗体の濃度は０．５μｇ／ｍＬとした）に適宜０％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１２日目に再度適宜０％ＸＶＩＶＯ２０を用いて希釈した培養液を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表６に示す。
2005019450.tif 000007
表６に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、血清を含まない培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例７］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例６−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表７に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000008
表７に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち血清を含まない培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例８］  無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例５−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＡＩＭ  Ｖ培地（インビトロジェン社製、以下０％ＡＩＭ  Ｖと略す）に変更した。結果を表８に示す。
2005019450.tif 000009
表８に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。またこの効果は無血清培養用の基本培地を変えても発揮される。このことから各フィブロネクチンフラグメントは血清を含まない培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例９］  無血清培地でのＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導・培養／希釈操作なしでの培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
ＸＶＩＶＯ２０（血清を含まない）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、ＸＶＩＶＯ２０（血清を含まない）  ４ｍＬを加え（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、さらに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目、４日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、培養開始後７日目以降２〜３日毎に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。この間培養液の希釈操作は全く行わなかった。
培養開始後１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率を算出した。結果を表９に示す。
2005019450.tif 000010
表９に示されるように、低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、誘導途中の細胞の希釈操作を必要とすることなしに培養開始後１５日目に高い拡大培養率が得られた。これに対して対照群では培養開始１５日目でもほとんど増殖しなかった。すなわち無血清培地を用いて低細胞数からＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、全く希釈操作を必要とすることなく、高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１０］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導（低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導・培養／希釈操作なしでの培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例９−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表１０に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000011
表１０に示されるように、低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、誘導途中の細胞の希釈操作を必要とすることなしに培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち無血清培地を用いて低細胞数からＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、全く希釈操作を必要とすることなく、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１１］  無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例８−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表１１に示す。
2005019450.tif 000012
表１１に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち血清を含まない培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１２］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を１％または５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地（以下、１％ＡＩＭ  Ｖまたは５％ＡＩＭ  Ｖと略す）に変更した。結果を表１２に示す。
2005019450.tif 000013
表１２に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例１３］  種々の低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の効果
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地・ＸＶＩＶＯ１０培地またはＡＩＭ  Ｖ培地（以下それぞれ１％ＸＶＩＶＯ２０・１％ＸＶＩＶＯ１０または１％ＡＩＭ  Ｖと略す）に変更し、各培地における拡大培養率を測定した。結果を表１３に示す。
2005019450.tif 000014
表１３に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。またこの効果は基本培地を変えても発揮される。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだいずれの培地を用いたＬＡＫ細胞培養時にも好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例１４］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地に変更した。結果を表１４に示す。
2005019450.tif 000015
表１４に示されるように、低濃度（０．２％）の血清を含んだ培地（ＸＶＩＶＯ２０）を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例１５］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地または１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０に変更した。結果を表１５に示す。
2005019450.tif 000016
表１５に示されるように、低濃度の血清（０．２％）を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。またこの効果は基本培地を変えても発揮される。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、低濃度の血清を含んだ培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１６］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地または１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表１６に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000017
表１６に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。またこの効果は基本培地を変えても発揮される。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１７］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０．２％もしくは１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地または１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表１７に示す。
2005019450.tif 000018
表１７に示されるように、低血清を含む培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。すなわち低濃度の血清を含む培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１８］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０培地または１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表１８に示す。
2005019450.tif 000019
表１８に示されるように、低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例１９］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例５−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＸＶＩＶＯ１０培地またはＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。結果を表１９に示す。
2005019450.tif 000020
表１９に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。このことから各フィブロネクチンフラグメントは血清を含まない培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例２０］  無血清培地でのＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例６−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＸＶＩＶＯ１０培地に変更した。結果を表２０に示す。
2005019450.tif 000021
表２０に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、血清を含まない培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２１］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例６−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＸＶＩＶＯ１０培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表２１に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000022
表２１に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち血清を含まない培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２２］  無血清培地を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例５−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＸＶＩＶＯ２０またはＸＶＩＶＯ１０またはＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。
結果を表２２に示す。
2005019450.tif 000023
表２２に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。すなわち血清を含まない培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２３］  無血清培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例６−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。ただし、この際使用する培地を血清を含まないＸＶＩＶＯ２０またはＸＶＩＶＯ１０培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表２３に示す。
2005019450.tif 000024
表２３に示されるように、血清を含まない培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または初期中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２４］  低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２Ｒ発現の誘導（低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導・培養／希釈操作なしでの培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０（以下１％ＸＶＩＶＯ２０と省略）に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１−（２）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、１％ＸＶＩＶＯ２０  ４ｍＬを加え（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２または５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）、さらに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（塩野義製薬社製）を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目、３日目、４日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、培養開始後７日目以降２〜３日毎に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。この間培養液の希釈操作は全く行わなかった。培養開始後１６日目に細胞を回収した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。結果を表２４に示す。
2005019450.tif 000025
表２４に示されるように、低細胞数からのＬＡＫ細胞誘導時に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、誘導途中の細胞の希釈操作を必要とすることなしに培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち低血清培地を用いて低細胞数からＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、全く希釈操作を必要とすることなく、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２５］  無血清・低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における細胞傷害活性の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０％から５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ２０または０％から５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地または５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０培地に変更した。
（２）培養したＬＡＫ細胞の細胞傷害活性の測定
実施例２５−（１）で調製した培養後１５日目のＬＡＫの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。細胞株  Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（ドータイト社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。
実施例２５−（１）で調製したＬＡＫ細胞をエフェクター細胞として１×１０６〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５％ｈｕｍａｎ血清を含むＲＰＭＩ（以下５ＨＲＰＭＩと省略）で段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたｃａｌｃｅｉｎ量（蛍光強度）を測定した。ＬＡＫ細胞の細胞傷害活性は以下の式１にしたがって算出した。
式１：
細胞傷害活性（％）＝〔（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−
最小放出量）〕×１００
上式において最小放出量は標的細胞のみ含有するウェルのｃａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのｃａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は標的細胞に界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を終濃度０．０５％となるように加えて細胞を完全破壊した際のｃａｌｃｅｉｎ放出量を示している。結果を表２５に示す。なお、表中、「Ｅ／Ｔ」とはエフェクター細胞と標的細胞の細胞数に基づく比（エフェクター細胞／標的細胞）を表す。
2005019450.tif 000026
表２５に示されるように、血清を含まない培地もしく低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の細胞傷害活性が高い。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。このことから各フィブロネクチンフラグメントは血清を含まない培地または低濃度の血清を含んだ培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例２６］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）−１
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含む培地ＡＩＭ  Ｖに変更した。結果を表２６に示す。
2005019450.tif 000027
表２６に示されるように、低濃度の血清（１％）を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、低濃度の血清を含んだ培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２７］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（繰り返し刺激による拡大培養）−２
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（容器）に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレートまたは１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬ（１２穴プレートの場合）または２ｍＬ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）ずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を終濃度１０μｇ／ｍＬ（１２穴プレートの場合）または２５μｇ／ｍＬ（１２．５ｃｍ２フラスコの場合）となるように添加した。対照として、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＡＩＭ  Ｖ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ＡＩＭ  Ｖに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例２７−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＡＩＭ  Ｖを１ｍＬ／ウェルずつ添加した。培養開始後４日目には培養液を何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に移し、さらに１％ＡＩＭ  Ｖ７ｍＬを添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始７日目には１％ＡＩＭ  Ｖを用いて細胞濃度を２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した培養液の一部を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始９日目には実施例２７−（１）と同様の方法で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコ（ただし、固定化に用いる抗ヒトＣＤ３抗体の濃度は０．５μｇ／ｍＬとした）に１％ＡＩＭ  Ｖを用いて細胞濃度を２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した培養液の一部を移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１２日目に再度適宜１％ＡＩＭ  Ｖを用いて細胞濃度を２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した培養液の一部を何も固定化していない新しいフラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。同条件にてｎ＝３で拡大培養を行い、その平均±標準偏差の各結果を表２７に示す。
2005019450.tif 000028
表２７に示されるように、低濃度の血清（１％）を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し各フィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。これらの拡大培養率は、ＬＡＫ細胞誘導時初期および中期に繰り返し抗ＣＤ３抗体のみを固定化した培養器材を使用した群における拡大培養率よりもはるかに高いものであった。すなわちＬＡＫ細胞誘導初期および中期にフィブロネクチンフラグメントおよび抗ＣＤ３抗体を用いて刺激することにより、低濃度の血清を含んだ培地を用いた場合でも高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２８］  無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地をｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖに変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表２８に示す。
2005019450.tif 000029
表２８に示されるように、血清を含まないＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞後細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例２９］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表２９に示す。
2005019450.tif 000030
表２９に示されるように、低濃度の血清を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養後のＬＡＫ細胞集団におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例３０］  無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地をｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表３０に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000031
表３０に示されるように、血清を含まないＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養後のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち血清を含まない培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例３１］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現の誘導（繰り返し刺激による拡大培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表３１に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000032
表３１に示されるように、低濃度の血清を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例３２］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表３２に示す。
2005019450.tif 000033
表３２に示されるように、低血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含む培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例３３］  無血清・低血清培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における細胞傷害活性の測定
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）または実施例２−（１）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を０％または１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０、ＸＶＩＶＯ２０またはＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）培養したＬＡＫ細胞の細胞傷害活性の測定
実施例２５−（２）と同様の方法で培養後１５日目のＬＡＫの細胞傷害活性を測定した。結果を表３３に示す。
2005019450.tif 000034
表３３に示されるように、血清を含まない培地もしくは低濃度の血清を含んだ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期または初期および中期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の細胞傷害活性が高い。またこの効果は基本培地を変えても発揮された。このことから各フィブロネクチンフラグメントは血清を含まない培地または低濃度の血清を含んだ培地を用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３４］  低血清培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いた培養）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ）に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（Ｂａｘｔｅｒ社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを２０ｍＬずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を終濃度４２．５μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各バッグをＰＢＳで２回、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０培地（以下１％ＸＶＩＶＯ１０と略す）で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ＸＶＩＶＯ１０に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例３４−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに１０ｍＬ／バッグずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらの細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＸＶＩＶＯ１０を２０ｍＬ／バッグずつ添加した。培養開始４日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後６日目には１％ＸＶＩＶＯ１０を３０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表３４に示す。
2005019450.tif 000035
表３４に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＸＶＩＶＯ１０）と細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地および細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３５］  低血清培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ）に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ（コーニング社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを６ｍＬずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載の各フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を終濃度４２．５μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＸＶＩＶＯ１０培地（以下１％ＸＶＩＶＯ１０と略す）で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ＸＶＩＶＯ１０に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例３５−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコに３ｍＬ／フラスコずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後１日目または２日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＸＶＩＶＯ１０を７ｍＬ／フラスコずつ添加した。以下抗ＣＤ３抗体±ＣＨ−２９６刺激期間により２つの方法で培養した。（ｉ）培養開始後４日目に培養液をなにも固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移した後、１％ＸＶＩＶＯ１０を２０ｍＬ／バッグずつ添加し終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加、さらに培養開始後６日目に１％ＸＶＩＶＯ１０を３０ｍＬ／バッグずつ添加後、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した（抗ＣＤ３抗体±ＣＨ−２９６刺激期間４日間）。（ｉｉ）培養開始４日目または５日目に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加し、培養開始後６日目に培養液をなにも固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移した後、１％ＸＶＩＶＯ１０を５０ｍＬ／バッグずつ添加、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した（抗ＣＤ３抗体±ＣＨ−２９６刺激期間６日間）。両条件とも培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表３５に示す。
2005019450.tif 000036
表３５に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３６］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ）に実施例３５−（１）と同様に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地（以下１％ＡＩＭ  Ｖと略す）で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％ＡＩＭ  Ｖに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例３６−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコに３ｍＬ／フラスコずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後１日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＡＩＭ  Ｖを７ｍＬ／フラスコずつ添加した。培養開始後４日目には培養液を何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移した後、１％ＡＩＭ  Ｖを２０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始６日目には１％ＡＩＭ  Ｖを３０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表３６に示す。
2005019450.tif 000037
表３６に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３７］  低血清培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例３４−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表３７に示す。
2005019450.tif 000038
表３７に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＸＶＩＶＯ１０）と細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いてのＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用した群においては、培養後のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地および細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを用いたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３８］  低血清培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例３５−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表３８に示す。
2005019450.tif 000039
表３８に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＸＶＩＶＯ１０）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、対照群に比較して培養後のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例３９］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（培養開始時、継代時の濃度）
ＬＡＫ細胞培養系における培養開始時および継代時の細胞濃度が拡大培養率に及ぼす影響を確認した。
培養開始時の細胞濃度として０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを設定した。培養４日目の継代細胞濃度として、０．０２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを設定した。培養７、９および１１日目の継代細胞濃度として、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬおよび０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを設定した。下記表３９−１に上記パターンを示す。
2005019450.tif 000040
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち２４穴細胞培養プレートに抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１ｍＬずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載のフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６）を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＣＨ−２９６を添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗ヒトＣＤ３抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
１％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに細胞濃度パターン１、２および３で培養する区分は０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、細胞濃度パターン４、５および６で培養する区分は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに１ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後２、３日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む１％ＡＩＭ  Ｖを１ｍＬ／ウェルずつ添加した。
培養開始後４日目に細胞濃度パターン１および４で培養する区分は、０．０２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、また細胞濃度パターン２、３、５、６で培養する区分は、０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始後７、９および１１日目には細胞濃度パターン１、２、４および５で培養する区分は、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、また細胞濃度パターン３、６で培養する区分は、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は３連で行った。その平均の各結果を表３９−２に示す。
2005019450.tif 000041
表３９−２に示されるように、培養開始時および継代時において種々の細胞濃度でのＬＡＫ細胞培養において、いずれの細胞濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、諸状況下で変化しうる培養開始時および継代時の細胞濃度に対して、ＣＨ−２９６により刺激することにより、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養できることが示された。
［実施例４０］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（培養開始時、継代時の濃度）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例３９と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表４０に示す。
2005019450.tif 000042
表４０に示されるように、培養開始時および継代時において種々の細胞濃度でのＬＡＫ細胞培養において、いずれの細胞濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち、諸状況下で変化しうる培養開始時および継代時の細胞濃度に対して、ＣＨ−２９６により刺激することにより、明らかにＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例４１］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（高濃度・高密度培養）
ＬＡＫ細胞培養系において、最終培養液量および最終培養面積を極力抑えることができれば、培地、資材および労力を低減することができる。細胞を高濃度、高密度で培養したときの拡大培養率に及ぼす影響を確認した。
継代時の細胞濃度および細胞密度を抑えない区分（普通培養区分）、培養７および１０日目の継代時の細胞濃度を普通培養区分のそれぞれ１．８倍および約６倍にした区分（高濃度培養区分、ただし細胞密度は濃度に比例して同じく１．８倍および約６倍となる）、培養７および１０日目の継代時の細胞濃度を普通培養区分のそれぞれ１．３倍および約２．５倍に、かつ細胞密度をそれぞれ約３．９倍および７．５倍にした区分（高濃度・高密度培養区分）を設定した。下記表４１−１に上記各群での継代時細胞濃度および細胞密度を示す。
2005019450.tif 000043
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレートに抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬずつ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載のフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６）を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＣＨ−２９６を添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗ヒトＣＤ３抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
各培養区分とも１％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に各培養区分とも、０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始後７日目には、普通培養区分は０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、高濃度培養区分は０．１８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。また、高濃度・高密度培養区分は０．１３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大９ｍＬ）、何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始後１０日目には、普通培養区分は０．１５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、高濃度培養区分は０．８９３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。また、高濃度・高密度培養区分は０．３８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大９ｍＬ）、何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始後１１日目には各区分に終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を４１−２に示す。
2005019450.tif 000044
表４１−２に示されるように、普通培養区分あるいは高濃度培養区分あるいは高濃度・高密度培養区分において、いずれの区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、培地、資材および労力を低減することができる高濃度・高密度培養においてＣＨ−２９６による刺激により明らかに拡大培養に対する効果が認められた。
［実施例４２］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（高濃度、高密度培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例４１と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表４２に示す。
2005019450.tif 000045
表４２に示されるように、普通培養区分あるいは高濃度培養区分あるいは高濃度・高密度培養区分において、いずれの区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち、培地、資材および労力を低減することができる高濃度・高密度培養においてＣＨ−２９６による刺激により、明らかにＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例４３］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（血清濃度０％、０．１５％、５％→０．１％）
ＬＡＫ細胞培養において１回に３０ｍＬを採血すると、大体１５ｍＬの血漿が得られる。これを最終１０Ｌまでの培地により培養することを考慮すると、血漿濃度として０．１５％となる。また、５％の血漿濃度から培養を開始すると４日目以降、細胞を継代、希釈するときの培地における血漿濃度は０．１％程度となる。以上を鑑みてＬＡＫ細胞培養系における血清濃度の影響を確認した。
培養開始時にｈｕｍａｎＡＢ血清が０％、０．１５％あるいは５％それぞれ含まれる区分を設定した。各濃度のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に０％、０．１５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分は、最大０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０％あるいは０．１５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに培養液を移した（液量２．５ｍＬ）。５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分は、０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には０％、０．１５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分はそれぞれ同濃度の血清を含むＡＩＭ  Ｖにより０．１１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した（液量最大１２．６ｍＬ）。５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分は、０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより０．１１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した（液量最大１２．６ｍＬ）。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には０％、０．１５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分はそれぞれ同濃度の血清を含むＡＩＭ  Ｖにより０．２２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した（液量最大１２．６ｍＬ）。５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖで培養した区分は、０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した（液量最大１２．６ｍＬ）。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表４３に示す。
2005019450.tif 000046
表４３に示されるように、各血清濃度を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞培養において、いずれの血清濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、３０ｍＬ採血を想定した血清濃度におけるＬＡＫ細胞培養において、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例４４］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（血清濃度３％→１％→０％→０％、３％→１％→０．１％→０％、３％→０．５％→０．２％→０．２％（最終培養液量約半量）、３％→０．５％→０．２％→０．０５％）
実施例４３と同様の観点で３０ｍＬ採血により得られる血漿濃度を考慮してＬＡＫ細胞培養系における血清濃度の影響を確認した。
ｈｕｍａｎＡＢ血清濃度は培養開始時は３％で、培養４日目に１％あるいは０．５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地で細胞を希釈する群、培養７日目に０％、０．１％あるいは０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地で細胞を希釈する群、培養１０日目に０％、０．０５％あるいは０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地で細胞を希釈する群をそれぞれ設定した。下記表４４−１に上記パターンを示す。
2005019450.tif 000047
３％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に血清濃度パターン１および２で培養する区分は、０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。血清濃度パターン３および４で培養する区分は、０．０５８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には血清濃度パターン１で培養する区分は、０．２８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、また血清濃度パターン２で培養する区分は、０．２８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。血清濃度パターン３および４で培養する区分は、０．４８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には血清濃度パターン１および２で培養する区分は、０．５１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。血清濃度パターン３で培養する区分は、０．８３９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．２％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、また血清濃度パターン４で培養する区分は、０．４３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表４４−２に示す。
2005019450.tif 000048
表４４−２に示されるように、各血清濃度を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞培養において、いずれの血清濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、３０ｍＬ採血を想定した血清濃度におけるＬＡＫ細胞培養において、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例４５］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例３６−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。結果を表４５に示す。
2005019450.tif 000049
表４５に示されるように、低濃度（１％）の血清を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血清を含んだ培地を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例４６］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより採血用注射筒にて３０ｍＬ採血を実施後、採血液を５００×ｇ  ２０分間遠心し、自己血漿およびバフィーコート層を回収した。回収したバフィーコート層はＰＢＳで希釈後Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）上に重層して５００×ｇで２０分間遠心分離した。中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取した新鮮分離ＰＢＭＣはトリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。
回収した自己血漿は５６℃３０分非働化後、８００×ｇで３０分間遠心分離し、その上清を非働化自己血漿として使用した（以下自己血漿と略す）。
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ）に実施例３５−（１）と同様に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、ＡＩＭ  Ｖ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（３）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ（以下０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例４６−（１）で調製した新鮮分離ＰＢＭＣを懸濁後、実施例４６−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコに３ｍＬ／フラスコずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後１日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを７ｍＬ／フラスコずつ添加した。培養開始後４日目には培養液を何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグまたはＸ−Ｆｏｌｄバッグ  バクスター社製）に移した後、０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを２０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始６日目には０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを３０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグまたはＸ−Ｆｏｌｄバッグ）に移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表４６に示す。
2005019450.tif 000050
表４６に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの種類によらずＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例４７］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞比率の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例４６−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。培養開始１５日目に実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表４７に示す。
2005019450.tif 000051
表４７に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの種類によらずＬＡＫ細胞集団中のＣＤ８細胞陽性比率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例４８］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ）に実施例３５−（１）と同様に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、ＡＩＭ  Ｖ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ（以下０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例４６−（１）と同様の方法で調製した新鮮分離ＰＢＭＣを懸濁後、実施例４８−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコに３ｍＬ／フラスコずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後１日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを７ｍＬ／フラスコずつ添加した。培養開始後４日目には培養液を何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグ）に移した後、０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを２０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始６日目には０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを３０ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない８５ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグ）に移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
また、同様に４日目まで培養した培養液を何も固定化していない１８０ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに一部（１０ｍＬ中７ｍＬ）移した後、０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを５８ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始６日目には０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを６５ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない１８０ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグ）に移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。この際培養開始１１日目に０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを１３０ｍＬ添加する系も設定した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表４８に示す。
2005019450.tif 000052
表４８に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの培養面積・培養方法・最終培地量によらずＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例４９］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞比率の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例４８−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。培養開始１５日目に実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表４９に示す。
2005019450.tif 000053
表４９に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの培養面積・培養方法・最終培地量によらずＬＡＫ細胞集団中のＣＤ８細胞陽性比率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例５０］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞培養培養系における細胞傷害活性の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例４６−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）培養したＬＡＫ細胞の細胞傷害活性の測定
実施例２５−（２）と同様の方法で培養後１５日目のＬＡＫの細胞傷害活性を測定した。結果を表５０に示す。
2005019450.tif 000054
表５０に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、対照群に比較してＬＡＫ細胞の細胞傷害活性が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例５１］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材（２５ｃｍ２細胞培養用フラスコ）に実施例３５−（１）と同様に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＦＮｆｒを含むＰＢＳを除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、ＡＩＭ  Ｖ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ（以下０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖと略す）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように（ただし、生細胞数の計測はチュルク液（関東化学社製）で実施した。）実施例４６−（１）と同様の方法で調製した新鮮分離ＰＢＭＣを懸濁後、実施例５１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮｆｒ固定化フラスコに３ｍＬ／フラスコずつ細胞懸濁液を入れ、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始後１日目には１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを７ｍＬ／フラスコずつ添加した。培養開始後４日目には培養液を何も固定化していない１８０ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグに一部（１０ｍＬ中７ｍＬ）移した後、０．５％自己血漿ＡＩＭ  Ｖを５８ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始６日目には０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを６５ｍＬ／バッグずつ添加し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始後８日目には培養液の一部を適宜希釈した後、何も固定化していない１８０ｃｍ２細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグ（オプティサイトバッグ）に移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。培養開始１１、１３日目には終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。この際培養開始１１日目に自己血漿を含まないＡＩＭ  Ｖまたは０．５％自己血漿／ＡＩＭ  Ｖを１３０ｍＬ添加する系も設定した。培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。結果を表５１に示す。
2005019450.tif 000055
表５１に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの培養面積・培養方法・最終培地量によらずＬＡＫ細胞の拡大培養率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例５２］  新鮮分離ＰＢＭＣおよび自己血漿含有培地を用いたＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞比率測定（０．５％自己血漿を含むＡＩＭ  Ｖ培地・細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせた培養）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例５１−（２）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。培養開始１５日目に実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表５２に示す。
2005019450.tif 000056
表５２に示されるように、低濃度（０．５％）の自己血漿を含んだ培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて、細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞誘導初期に各フィブロネクチンフラグメントを固定化した細胞培養用フラスコを使用した群においては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグの培養面積・培養方法・最終培地量によらずＬＡＫ細胞集団中のＣＤ８陽性細胞比率が高い。このことから各フィブロネクチンフラグメントは低濃度の血漿を含んだ培地を用いての細胞培養用フラスコおよび細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを組み合わせたＬＡＫ細胞培養時に好適に使用されることが明らかとなった。
［実施例５３］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）発現の誘導
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例１−（３）と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。この際使用する培地を１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖ培地に変更した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現率の測定
実施例３−（２）と同様の方法で、ＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率を測定した。結果を表５３に示す。かかる表ではＩＬ−２Ｒ発現陽性細胞含有率（％）をＩＬ−２Ｒ発現率（％）と表示する。
2005019450.tif 000057
表５３に示されるように、低濃度の血清を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞誘導初期各フィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材を使用した群においては、培養中のＬＡＫ細胞表面上におけるＩＬ−２Ｒ発現率を高く誘導することができた。すなわち低濃度の血清を含んだ培地を用いてＬＡＫ細胞を誘導する際にフィブロネクチンフラグメントを共存させることにより、ＩＬ−２Ｒ発現率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例５４］  レトロネクチン変異体タンパク質の発現（ＣＨ−２９６Ｎａ）
（１）ＣＨ−２９６Ｎａ発現ベクターの構築
配列番号２７、２８の合成ＤＮＡプライマー（それぞれＰｒｉｍｅｒ  ＣＨ−２９６Ｎａ１およびＰｒｉｍｅｒ  ＣＨ−２９６Ｎａ２）を用い、ＣＨ−２９６発現ベクターであるｐＣＨ１０２を鋳型にＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理した。一方、国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例５記載のｐＣｏｌｄ０４から同パンフレットの実施例４の方法に従い調製した翻訳開始コドンのところにＮｄｅＩサイトを有するｐＣｏｌｄ１４ＮＤ２ベクターを作製した。ｐＣｏｌｄ１４ＮＤ２ベクターのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位に前記ＤＮＡ断片を挿入することで、ベクターｐＣｏｌｄ１４ＮＤ２−ＣＨ２９６を得た。次に、フィブロネクチンの細胞結合ドメインの一部からＣ末端までをコードするｃＤＮＡを有するｐＬＦ２４３５ベクターを鋳型に、配列番号２８、２９の合成ＤＮＡプライマー（それぞれＰｒｉｍｅｒ  ＣＨ−２９６Ｎａ２およびＰｒｉｍｅｒ  ＣＨ−２９６Ｎａ３）を用いてＰＣＲ反応を行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理した。こうして得られたＤＮＡ断片をｐＣｏｌｄ１４ＮＤ２−ＣＨ２９６をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理したものとライゲーションすることによりＣＨ−２９６Ｎａ発現用ベクターを作成した。
（２）ＣＨ−２９６Ｎａの発現、精製
上記実施例５４−（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−ＣＨ２９６Ｎａを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍＬのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。全量を３Ｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。なお、この培養の際には、５Ｌ容ミニジャーファーメンター（Ｂｉｏｔｔ社製）を使用し、１５０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝１．０Ｌ／ｍｉｎの条件で行なった。前記培養後、１５℃まで冷却した後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、菌体容量の４倍量の細胞破砕溶液［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。これを２ＬのｂｕｆｆｅｒＡ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ］で透析を行い、その約４０ｍＬを用いてさらにイオン交換クロマトによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１００ｍＬ分のＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ４ｃｍ  ２０ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。３００ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡでカラムを洗浄した後、ｂｕｆｆｅｒＢ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２００ｍＭ  ＮａＣｌ］、ｂｕｆｆｅｒＣ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），３００ｍＭ  ＮａＣｌ］、ｂｕｆｆｅｒＤ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５００ｍＭ  ＮａＣｌ］の各２００ｍＬを用いて順にカラムからの溶出を行い、約１００ｍＬずつ分取し画分１〜６を得た。分取した分画を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供じた結果、分子量約７１ｋＤａの目的タンパク質を多く含むことが分かった画分２、３（約２００ｍＬ）を回収し、２ＬのｂｕｆｆｅｒＡで透析を行なった。
次に、樹脂容積にして５０ｍＬ分のＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムファルマシア社製）をｂｕｆｆｅｒＡで飽和させたカラム（Φ３ｃｍ  １６ｃｍ）を準備し、これに透析後のサンプルをアプライした。カラムを２００ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡで洗浄した後、ｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１４０ｍＭ  ＮａＣｌ］、ｂｕｆｆｅｒＢ、ｂｕｆｆｅｒＣの各１５０ｍＬを用いて順にカラムからの溶出を行い、約１００ｍＬずつ分取し画分１〜５を得た。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供じた結果、目的タンパク質のみを多く含むことが分かった画分１  約１００ｍＬを回収し、２ＬのｂｕｆｆｅｒＦ［５０ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ９．５］で透析を行なった。
その後、セントリコン−１０（ミリポア社製）で約４倍の２５ｍＬまで濃縮を行い、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したところ、分子量約７１ｋＤａの目的タンパク質がほぼ単一バンドで検出され、これをＣＨ−２９６Ｎａとした。その後、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（ピアース社製）を使用して、タンパク質濃度を測定したところ、３．８ｍｇ／ｍＬであった。
［実施例５５］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（血清濃度５％→１％→０％→０％、５％→１％→０．０５％→０．０５％、３％→１％→０．０５％→０．０５％、３％→１％→０．１％→０．０５％、１％→１％→０．１％→０．０５％）
実施例４３と同様の観点で３０ｍＬ採血により得られる血漿濃度を考慮してＬＡＫ細胞培養系における血清濃度の影響を確認した。
ｈｕｍａｎＡＢ血清濃度は培養開始時に５％、３％あるいは１％含有する区分を設定し、以降下記表５４に示すｈｕｍａｎＡＢ血清濃度を含むＡＩＭ  Ｖ培地により希釈する群をそれぞれ設定した。なお、下記表５４に示すように各継代日に継代濃度を変更した区分もそれぞれ設定した。
2005019450.tif 000058
５％、３％あるいは１％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に血清濃度パターン１−１、２−１および３−１で培養する区分は、０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン１−２および２−２で培養する区分は、０．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン３−２および３−３で培養する区分は、０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には血清濃度パターン１−１で培養する区分は、０．３２１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、血清濃度パターン１−２および２−１で培養する区分は、０．３２１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、また血清濃度パターン２−２および３−１で培養する区分は０．３２１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン３−２で培養する区分は０．４１７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン３−３で培養する区分は０．２３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにそれぞれ０．１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖによりそれぞれ希釈し（液量１２．６ｍＬ）、各区分は何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には血清濃度パターン１−１で培養する区分は、０．８７３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにｈｕｍａｎＡＢ血清を含まないＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、血清濃度パターン１−２で培養する区分は０．８４１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン２−１で培養する区分は０．７４６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン２−２および３−１で培養する区分は０．６４３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、血清濃度パターン３−２で培養する区分は１．２１４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖによりそれぞれ希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表５５に示す。
2005019450.tif 000059
表５５に示されるように、各血清濃度を含んだＡＩＭ  Ｖ培地を用いてのＬＡＫ細胞培養において、いずれの血清濃度区分、またいずれの継代濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、３０ｍＬ採血を想定した血清濃度におけるＬＡＫ細胞培養において、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例５６］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（ＩＬ−２濃度、１００Ｕ／ｍＬ→１５０Ｕ／ｍＬ→１５０Ｕ／ｍＬ→３００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ→３００Ｕ／ｍＬ→３００Ｕ／ｍＬ→４００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ→５００Ｕ／ｍＬ→５００Ｕ／ｍＬ→５００Ｕ／ｍＬ）
ＬＡＫ細胞培養系におけるＩＬ−２濃度の影響を確認した。
培養開始時および継代時に添加するＩＬ−２濃度を下記表５６−１に示すように設定した。
2005019450.tif 000060
３％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬあるいは１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に各区分とも、０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコにそれぞれ移した。ＩＬ−２濃度パターン１においては終濃度１５０Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン２においては３００Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン３においては５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には各区分とも、０．２６２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。ＩＬ−２濃度パターン１においては終濃度１５０Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン２においては３００Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン３においては５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には各区分とも、０．５８５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。ＩＬ−２濃度パターン１においては終濃度３００Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン２においては４００Ｕ／ｍＬとなるように、ＩＬ−２濃度パターン３においては５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表５６−２に示す。
2005019450.tif 000061
表５６−２に示されるように、継代時に種々のＩＬ−２濃度で培養したＬＡＫ細胞培養において、いずれのＩＬ−２濃度区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、ＩＬ−２濃度を変更しても、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、また、血清濃度も３０ｍＬ採血で総培養液量が１０Ｌであることを想定しており、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例５７］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（ＩＬ−２濃度の検討）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例５６と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表５７に示す。
2005019450.tif 000062
表５７に示されるように、培養開始時、継代時にＩＬ−２濃度を変更したいずれの区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち、ＩＬ−２濃度を変更してもＣＨ−２９６による刺激により、明らかにＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
［実施例５８］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（培養開始初期濃度の検討）
３０ｍＬ採血、最終培養液量約１０Ｌと想定したときのＬＡＫ細胞培養系における培養開始時の細胞初期濃度の拡大培養率に及ぼす影響を確認した。
培養開始初期細胞濃度を０．０８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、０．１６７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬあるいは０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの各区分を設定した。
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレートあるいは６穴細胞培養プレート（ファルコン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬあるいは４．８ｍＬずつそれぞれ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には製造例１に記載のフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６）を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＣＨ−２９６を添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗ヒトＣＤ３抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
３％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．０８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、０．１６７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬあるいは０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣをそれぞれ懸濁後、０．０８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬあるいは０．１６７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始する区分は実施例５８−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化６穴細胞培養プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化６穴細胞培養プレートに７．５ｍＬ／ウェルずつ、また、０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始する区分は実施例５８−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化１２穴細胞培養プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化１２穴細胞培養プレートに３ｍＬ／ウェルずつ、それぞれまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に各区分は、最大０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には０．０８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は、０．２２７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、０．１６７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は０．２７６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、また、０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は０．４６５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量最大１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には０．０８３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は、０．５８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、０．１６７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は０．７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、また、０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養開始した区分は０．７９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表５８に示す。
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表５８に示されるように、いずれの細胞濃度で培養開始した区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、種々の細胞濃度で培養開始してもＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養は３０ｍＬ採血、最終培養液量１０Ｌを想定したものであり、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。さらに、対照群においては培養開始細胞初期濃度により拡大培養率が大きく変動する様子が確認されたが、ＣＨ−２９６により刺激した区分では、培養開始細胞初期濃度に関わらず、安定した拡大培養率が得られた。
［実施例５９］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（刺激期間）
ＬＡＫ細胞培養系における抗ＣＤ３抗体単独あるいは抗ＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６による培養開始時における刺激の日数が拡大培養率に与える影響について確認した。
刺激日数として２日、３日あるいは４日の各区分を設定した。
３％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに各区分とも０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣをそれぞれ懸濁後、実施例４１−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後２日目あるいは３日目にそれぞれ２日刺激の区分、３日刺激の区分を何も固定化していない新しい１２穴培養プレートにそのまま移した。
培養開始後４日目に各区分とも、０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には各区分とも、０．４５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には各区分とも、０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにそれぞれＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表５９に示す。
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表５９に示されるように、培養開始時より種々の刺激期間で培養したＬＡＫ細胞培養において、いずれの刺激期間の区分においても、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激した群において高い拡大培養率が得られた。すなわち、刺激期間を変更しても、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、また、血清濃度も３０ｍＬ採血で総培養液量が１０Ｌであることを想定しており、ＣＨ−２９６で刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例６０］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（ＣＨ−２９６Ｎａ）
ＦＮフラグメントしてＣＨ−２９６Ｎａを用いたときのＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率を測定した。
ＣＨ−２９６Ｎａは細胞培養プレートに固定化する区分とそのまま細胞培養液中に添加する区分を設定した。
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＦＮフラグメントを固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレートに抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬずつそれぞれ添加した。この時、ＦＮフラグメント添加群には実施例５４に記載のフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６Ｎａ）を終濃度２８．６μｇ／ｍＬとなるように添加した。対照として、ＣＨ−２９６Ｎａを添加しない群も設定した。
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗ヒトＣＤ３抗体・ＣＨ−２９６Ｎａを含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。
（２）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
３％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣをそれぞれ懸濁後、実施例６０−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化細胞培養プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６Ｎａ固定化細胞培養プレートに３ｍＬ／ウェルずつまいた。また、ＣＨ−２９６Ｎａを細胞培養液中にそのまま添加する区分においては、抗ヒトＣＤ３抗体固定化細胞培養プレートにまいた細胞に対して、終濃度１μｇ／ｍＬとなるようにＣＨ−２９６Ｎａを添加した。それぞれの区分において終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に、各区分とも０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には各区分とも０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には各区分とも０．９４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、それぞれ０．０５％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表６０に示す。
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表６０に示されるように、対照群（抗ＣＤ３抗体のみによる刺激）と比較してＣＨ−２９６Ｎａを固定化あるいは溶液で添加したいずれの区分においても高い拡大培養率が得られた。すなわち、ＣＨ−２９６Ｎａおよび抗ＣＤ３抗体により刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独で刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養は３０ｍＬ採血、最終培養液量１０Ｌを想定したものであり、ＣＨ−２９６Ｎａで刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６Ｎａの有効性が認められた。
［実施例６１］  ＣＨ−２９６ビーズの作成
ＣＨ−２９６を固定化するためのビーズとして、Ｄｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ（Ｄｙｎａｌ社製）を使用した。２．８×１０８個のＤｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。洗浄したＤｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ  ２．８×１０８個を、ＣＨ−２９６  １４０μｇを含むＰＢＳ  ０．７ｍＬに懸濁し、軽く混合しながら４℃で一晩固定化反応を行った。反応液を除去し、０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ  ０．７ｍＬで３回置換した後、４℃で保存したものをＣＨ−２９６ビーズとした。
また、ＣＨ−２９６を含まずにビーズを同様に処理したものを対照ビーズとした。
［実施例６２］  ＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズの作成
ＣＨ−２９６と抗ヒトＣＤ３抗体とを固定化するためのビーズとして、Ｄｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙを使用した。４×１０８個のＤｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。洗浄したＤｙｎａｂｅａｓ  Ｍ−４５０  Ｅｐｏｘｙ  ４×１０８個を、ＣＨ−２９６  １６０μｇ、抗ヒトＣＤ３抗体３２μｇを含むＰＢＳ  １ｍＬに懸濁し、軽く混合しながら４℃で一晩固定化反応を行った。反応液を除去し、０．１％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ  １ｍＬで３回置換した後、４℃で保存したものをＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズとした。
［実施例６３］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いたＬＡＫ細胞培養系における拡大培養率の測定（ＦＮｆｒ固定化ビーズによる刺激）
細胞培養用担体（ビーズ）に固定化されたフィブロネクチンフラグメント（ＣＨ−２９６）を用いてのＬＡＫ細胞培養に対する効果を確認した。
抗ＣＤ３抗体がビーズに固定化されているＣＤ３ビーズと何も固定化されていない対照ビーズで刺激する区分（ＣＤ３ビーズ区分）、ＣＤ３ビーズとＣＨ−２９６がビーズに固定化されているＣＨ−２９６ビーズにより刺激する区分（ＣＤ３ビーズ＋ＣＨ−２９６ビーズ区分）、抗ＣＤ３抗体とＣＨ−２９６がビーズに固定化されているＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズにより刺激する区分（ＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズ区分）を設定した。
１％のｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖに０．３３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、何も固定化していない１２穴培養プレートに３ｍＬ／ウェルずつまき、ＣＤ３ビーズ区分はＣＤ３ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０  ＣＤ３（ｐａｎＴ）、ベリタス社、ＤＢ１１１１３）を１×１０６個／ウェル、実施例６１で調製した対照ビーズを３．８×１０６個／ウェルとなるように、ＣＤ３ビーズ＋ＣＨ−２９６ビーズ区分はＣＤ３ビーズを１×１０６個／ウェル、実施例６１で調製したＣＨ−２９６ビーズを０．７６×１０６個／ウェルとなるように、また、ＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズ区分は実施例６２で調製したＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズを２．３×１０６個／ウェルとなるように添加した。各ウェルには終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。
培養開始後４日目に各区分とも培養液中に含まれる各ビーズをマグネティックスタンドにより除去したのち、０．０７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始７日目には各区分とも０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖによりそれぞれ希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１０日目には各区分とも０．６８５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１％ｈｕｍａｎＡＢ血清を含むＡＩＭ  Ｖにより希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。各区分において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようＩＬ−２を添加した。
培養開始１５日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較しての拡大培養率として算出した。各実験は２連で行った。その平均の各結果を表６１に示す。
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表６１に示されるように、各ビーズにより刺激したＬＡＫ細胞培養において、ＣＤ３ビーズ区分と比較してＣＤ３ビーズ＋ＣＨ−２９６ビーズ区分およびＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズ区分により刺激した区分において高い拡大培養率が得られた。すなわち、細胞培養用担体としてビーズを用いたＬＡＫ細胞培養において、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体を固定化したビーズにより刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独のビーズで刺激するよりも、明らかに高い拡大培養率でＬＡＫ細胞を誘導・培養することができた。また、このときの培養における細胞は高濃度・高密度であり、ＣＨ−２９６ビーズで刺激することにより、このような条件下においても、明らかに高い拡大培養率であり、ＣＨ−２９６の有効性が認められた。
［実施例６４］  低血清培地（ＡＩＭ  Ｖ）を用いて培養したＬＡＫ細胞集団中におけるＣＤ８陽性細胞含有比率（ＦＮｆｒ固定化ビーズによる刺激）
（１）ＬＡＫ細胞の誘導および培養
実施例６３と同様の方法でＬＡＫ細胞を誘導・培養した。
（２）ＬＡＫ細胞におけるＣＤ８陽性細胞集団含有比率の測定
実施例４−（２）と同様の方法でＣＤ８陽性細胞の含有率を測定した。結果を表６２に示す。
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表６２に示されるように、各ビーズにより刺激したＬＡＫ細胞培養において、ＣＤ３ビーズ区分と比較してＣＤ３ビーズ＋ＣＨ−２９６ビーズ区分およびＣＤ３／ＣＨ−２９６ビーズ区分により刺激した区分において培養中のＬＡＫ細胞中におけるＣＤ８陽性細胞含有率を高く誘導することができた。すなわち、細胞培養用担体としてビーズを用いたＬＡＫ細胞培養において、ＣＨ−２９６および抗ＣＤ３抗体を固定化したビーズにより刺激することで、抗ＣＤ３抗体単独のビーズで刺激するよりも、明らかにＬＡＫ細胞中のＣＤ８陽性細胞の含有率を高くしながらＬＡＫ細胞を誘導・培養することが可能であることが明らかとなった。
【配列表フリーテキスト】
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【産業上の利用可能性】  本発明の細胞傷害性リンパ球の製造方法によれば、無血清・低血清濃度培地を用いた場合でも、拡大培養率が高く、細胞傷害活性が高く維持され、ＩＬ−２Ｒの発現量が有意に上昇し、ＣＤ８陽性細胞の比率が向上した細胞傷害性リンパ球が得られる。当該リンパ球は、例えば、養子免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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