(57)【要約】本発明は、志賀毒素に対する高い抗体価の抗体を効率的に製造する方法に関し、具体的には、（１）志賀毒素のＢサブユニットを架橋する工程、および（２）志賀毒素のＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる抗体の製造方法および該方法により得られる抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）志賀毒素のＢサブユニットを架橋する工程、および（２）志賀毒素のＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる抗体の製造方法。
【請求項２】
前記動物がＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ１０．Ｄ２マウスまたはＤＢＡ／２マウスである請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
経粘膜免疫が鼻粘膜を通して行なわれる請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
（１）志賀毒素のＢサブユニットを架橋する工程、および（２）志賀毒素のＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる免疫グロブリンＡ抗体の製造方法。
【請求項５】
（１）志賀毒素のＢサブユニットを架橋する工程、および（２）志賀毒素のＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる抗体の製造方法により得られる抗体。
【請求項６】
前記動物としてＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ１０．Ｄ２マウスまたはＤＢＡ／２マウスを用いて得られる請求の範囲第５項記載の抗体。
【請求項７】
経粘膜免疫が鼻粘膜を通して行なわれることにより得られる請求の範囲第５項記載の抗体。
【請求項８】
（１）志賀毒素のＢサブユニットを架橋する工程、および（２）志賀毒素のＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる抗体の製造方法により得られる免疫グロブリンＡ抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は抗体の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、志賀毒素（以下、Ｓｔｘと略称する）に対する抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  Ｓｔｘは、別名ベロ毒素ＶＴとも呼ばれ、Ｏ１５７：Ｈ７に代表される病原性大腸菌から産生される外毒素であり病原因子である（たとえば、ナタロ  ジェーピー（Ｎａｔａｒｏ  ＪＰ）およびカパー  ジェービー（Ｋａｐｅｒ  ＪＢ）、「クリニカル  マイクロバイオロジー  レビューズ（ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＲＥＶＩＥＷＳ）」、１９９８年、第１１巻、ｐ．１４２〜２０１参照）。二つのタイプのＳｔｘ、すなわちＳｔｘ１およびＳｔｘ２が、溶血性尿毒症症候群や中枢神経系症状のような生命に危険をおよぼす重篤な合併症などに関連していることが知られている（たとえば、カルダーウッド  エスビー（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ  ＳＢ）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＡＣＡＤＥＭＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ  ＯＦ  ＡＭＥＲＩＣＡ）」、１９８７年、第８４巻、ｐ．４３６４〜４３６８、タカオ  ティー（Ｔａｋａｏ  Ｔ）ら、「マイクロバイアル  パソジェネシス（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、１９８８年、第５巻、ｐ．３５７〜３６９およびジャクソン  エムピー（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＭＰ）ら、「エフイーエムエス  マイクロバイオロジー  レターズ（ＦＥＭＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＬＥＴＴＥＲＳ）」、１９８７年、第４４巻、ｐ．１０９〜１１４参照）。Ｓｔｘは、細胞毒性サブユニット（Ａサブユニット）と、細胞表面の糖鎖リガンドに結合するサブユニット（Ｂサブユニット）五量体とから構成される。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２のＢサブユニット五量体は、糖脂質であるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３，Ｇａｌ（α１−４）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ（β１−１）Ｃｅｒ）によって提示されているような糖鎖リガンドを認識する（たとえば、リングウッド  シーエー（Ｌｉｎｇｗｏｏｄ  ＣＡ）、「トレンズ  イン  マイクロバイオロジー（ＴＲＥＮＤＳ  ＩＮ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ）」、１９９６年、第４巻、ｐ．１４７〜１５３参照）。このような糖鎖構造を有するＳｔｘの受容体としてＣＤ７７が知られており、このＣＤ７７は、ヒトでは２次リンパ濾胞中の胚中心のＢ細胞上に発現している（たとえば、マクロスキー  エヌ（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ  Ｎ）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イムノロジー（ＥＵＲＯＰＥＡＮ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」、１９９９年、第２９巻、ｐ．３２３６〜３２４４参照）。【０００３】  胚中心は、Ｂ細胞の分化過程で非常に重要である。すなわち体細胞突然変異と免疫グロブリンのＨ鎖のクラススイッチの両方が胚中心でおこる（たとえば、マーティン  エー（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００２年、第４１５巻、ｐ．８０２〜８０６参照）。したがって、抗原が胚中心で分化過程にあるＢ細胞であるセントロブラストに対する毒性を有する場合、その抗原に対する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）や免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）にクラススイッチした結合親和性の高い抗体の産生が妨害される可能性がある。この懸念は、セン��ロブラストに対応している（すなわち、細胞表面のマーカータンパク質の発現から、分化段階がセントロブラストに相当する）とされるバーキットリンパ腫細胞（たとえば、マーティン  エー（Ｍａｒｔｉｎ  Ａ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００２年、第４１５巻、ｐ．８０２〜８０６およびトゥスカノ  ジェーエム（Ｔｕｓｃａｎｏ  ＪＭ）ら、「ブラッド」、１９９６年、第８８巻、ｐ．１３５９〜１３６４参照）にＳｔｘを作用させた場合に、プログラム細胞死（アポトーシス）を誘導するとの報告によって支持され、さらにＢサブユニットを単独で作用させた場合にも、プログラム細胞死（アポトーシス）を誘導するとの報告もなされている（たとえば、マンジェニー  エム（Ｍａｎｇｅｎｅｙ  Ｍ）ら、「キャンサー  リサーチ（ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）」、１９９３年、第５３巻、ｐ．５３１４〜５３１９、タガ  エス（Ｔａｇａ  Ｓ）ら、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年、第９０巻、ｐ．２７５７〜２７６７およびマーカト  ピー（Ｍａｒｃａｔｏ  Ｐ）ら、「インフェクション  アンド  イミュニティー（ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ）」、２００２年、第７０巻、ｐ．１２７９〜１２８６参照）。さらに、人の扁桃由来のＢ細胞であってＩｇＧやＩｇＡの産生に運命づけられている細胞集団がＳｔｘの毒性に対して高い感受性を示すことが試験管内の実験で報告されている（たとえば、コーヘン  エー（Ｃｏｈｅｎ  Ａ）ら、「インターナショナル  イムノロジー（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」、１９９０年、第２巻、ｐ．１〜８参照）。したがって、Ｓｔｘに対する抗体を作製することは困難であると考えられていた。【０００４】  一方、我々はジゴキシゲニン標識したＳｔｘ１の組み換え型Ｂサブユニット（以下、Ｓｔｘ１の組み換え型Ｂサブユニットを「Ｓｔｘ１Ｂ」と略称する）を用いて、マウスの胚中心のＢ細胞がＳｔｘに対する結合部位をもたないことを直接示した（たとえば、今井康之ら、「イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００２年、第１０５巻、ｐ．５０９〜５１４参照）。この実験で用いたジゴキシゲニン標識Ｓｔｘ１Ｂをバーキットリンパ腫細胞に添加し、遠心洗浄によって未反応のＳｔｘ１Ｂを除去したのち、ＦＩＴＣ標識抗ジゴキシゲニン抗体を細胞に添加することによりＳｔｘ１Ｂの存在を検出したところ、ヒトのバーキットリンパ腫細胞株が強く染色された（たとえば、宮下さゆりら、「グリココンジュゲート  ジャーナル（ＧＬＹＣＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ）」、１９９９年、第１６巻、ｐ．６９７〜７０５参照）。これらの結果は、Ｓｔｘに対して高い親和性をもち、クラススイッチを経た抗体を、マウスの実験系で作ることが可能であることを示唆している。しかし、Ｓｔｘ１Ｂはマウスに対して免疫原性が弱く、厳格な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の拘束を受けていることが報告されている（たとえば、バスト  ディージェー（Ｂａｓｔ  ＤＪ）ら、「インフェクション  アンド  イミュニティー」、１９９７年、第６５巻、ｐ．２９７８〜２９８２参照）。【０００５】  このような理由から、Ｓｔｘに対する抗体の作製は、これまで課題とされてきた。【０００６】  本発明はかかる従来の問題点を解決し、Ｓｔｘに対する抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００７】  前記従来技術に鑑みて鋭意研究した結果、ＳｔｘのＢサブユニットの分子間架橋が、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）における免疫原性を劇的に改善することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】  すなわち、本発明は、（１）ＳｔｘのＢサブユニットを架橋する工程、および（２）ＳｔｘのＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる抗体の製造方法に関する。
【０００９】  前記方法において、動物がＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ１０．Ｄ２マウスまたはＤＢＡ／２マウスであることが好ましい。
【００１０】  前記方法において、経粘膜免疫は鼻粘膜を通して行なわれることが好ましい。
【００１１】  また、本発明は、前記方法により得られる抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】［図１］架橋または未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウス由来の血清ＩｇＧ（ａ）およびＩｇＡ（ｂ）、糞抽出液中のＩｇＡ（ｃ）ならびに鼻洗浄液中ＩｇＡ（ｄ）のＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示すグラフである。
［図２］架橋または未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウス由来の血清ＩｇＡ（ａ）および鼻洗浄液中ＩｇＡ（ｂ）の、Ｓｔｘ１Ｂ特異的結合を示すグラフである。
［図３］未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウス由来の血清ＩｇＧのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。
［図４］未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウス由来の血清ＩｇＧのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。
［図５］未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウス由来の血清ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明のＳｔｘに対する抗体の製造方法は、（１）ＳｔｘのＢサブユニットを架橋する工程、および（２）ＳｔｘのＢサブユニットに対し、粘膜外免疫によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる動物を、（１）で得られる架橋Ｂサブユニットを用いて経粘膜免疫する工程からなる。【００１４】  本明細書において、ＳｔｘのＢサブユニット（以下、「Ｂサブユニット」と略称する）とは、Ｓｔｘ１もしくはＳｔｘ２の遺伝子をもとに遺伝子組み換えで作製したＢサブユニット、または天然のＳｔｘ１もしくはＳｔｘ２から分離精製したＢサブユニットを意味する。Ｂサブユニットの具体例としては、たとえば、Ｓｔｘ１のＢサブユニットの配列（ＴＰＤＣＶＴＧＫＶＥＹＴＫＹＮＤＤＤＴＦＴＶＫＶＧＤＫＥＬＦＴＮＲＷＮＬＱＳＬＬＬＳＡＱＩＴＧＭＴＶＴＩＫＴＮＡＣＨＮＧＧＧＦＳＥＶＩＦＲ：配列番号１）を有する天然のＳｔｘ１のＢサブユニットもしくは公知の組み換え型Ｓｔｘ１Ｂ（前述の宮下さゆりら、「グリココンジュゲート  ジャーナル（ＧＬＹＣＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ）」、１９９９年、第１６巻、ｐ．６９７〜７０５）、またはＳｔｘ２のＢサブユニットの配列（ＭＫＫＭＦＭＡＶＬＦＡＬＡＳＶＮＡＭＡＡＤＣＡＫＧＫＩＥＦＳＫＹＮＥＤＤＴＦＴＶＫＶＤＧＫＥＹＷＴＳＲＷＮＬＱＰＬＬＱＳＡＱＬＴＧＭＴＶＴＩＫＳＳＴＣＥＳＧＳＧＦＡＥＶＱＦＮＮＤ：配列番号２）を有する天然のＳｔｘ２のＢサブユニットもしくは該配列の一部で糖鎖結合活性のあるものなどを挙げることができ、たとえ数個のアミノ酸の置換、欠失または付加があったとしても、宿主細胞の表面に発現した糖鎖リガンドへの結合に関与し、それ自体に毒性がない限り、Ｂサブユニットとして使用することができる。しかしながら、Ｂサブユニットの単量体は動物において免疫原性が低いため、抗体治療に応用する可能性をもった高親和性のＩｇＡクラスの抗体を作るには、Ｂサブユニット同士を架橋することによって、Ｂサブユニットの免疫原性を高めることが非常に重要である。【００１５】  前記Ｂサブユニットを架橋するために用いる架橋剤としては、タンパク質のアミノ基同士を架橋するもの、アミノ基とカルボキシル基とを縮合するもの、ＳＨ基同士を架橋するもの、ＳＨ基とアミノ基とを架橋するものなどを、常法にしたがって用いることができる。タンパク質のアミノ基同士を架橋するものとしては、たとえばジスクシニミジルグルタレート（ＤＳＧ）が挙げられる。アミノ基とカルボキシル基とを縮合するものとしては、たとえば１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が挙げられる。ＳＨ基同士を架橋するものとしては、たとえばＢｉｓ−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）が挙げられる。ＳＨ基とアミノ基とを架橋するものとしては、たとえばＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が挙げられる。また、本発明の方法に用いる「架橋Ｂサブユニット」は、前記架橋剤によって架橋されたＢサブユニットを意味する。抗原性を損なうような大幅な立体構造の変化を生じることがなく、タンパク質の変性条件下でも解離しないように、架橋Ｂサブユニットは５量体以上であることが好ましく、１��量体以上であることがより好ましい。本発明の方法に使用される架橋Ｂサブユニットは、必ずしも単一の多量体である必要はなく、様々な重合度の多量体の混合物であってもよい。たとえ、そのような混合物中に単量体が一部残存していたとしても、単量体が構成要素として主要とならない限り本発明に使用することができる。【００１６】  免疫に用いる動物（ヒトを除く）としては、ＳｔｘのＢサブユニットに対して、粘膜外免疫（ＳｔｘのＢサブユニットおよび通常のフロイントアジュバントを用いる皮下、皮内または筋肉内免疫）によって血清中の抗体価として免疫応答が確認できる系統のものを用いることができる。【００１７】  抗体価は、特異的吸光度が０．１ＯＤ以上を示すサンプルの最大希釈度と定義される。「血清中の抗体価として免疫応答が確認できる」とは、免疫を行なった動物の血清を１０００倍希釈した際に、特異的吸光度が０．５ＯＤを越える場合をいう。なお、特異的吸光度は、サンプル中の抗体とＳｔｘのＢサブユニットとの特異的結合を、酵素標識二次抗体などを用いることにより、酵素反応の結果生じた生成物の呈色を吸光度として測定し（測定値Ａ）、測定値Ａから標準値を減ずることにより得られる値である。具体的には、抗体を含有し得るサンプルをマウスから得た場合、特異的吸光度は、以下のようにして算出することができる：
（ｉ）抗体を含有し得るサンプルを、ＳｔｘのＢサブユニットでコートしたウェルに添加してＳｔｘのＢサブユニットと反応させる。ウェルを洗浄したのち、該抗体に対するウサギ抗マウス抗体を添加して反応させる。ウェルを洗浄したのち、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたヤギ抗ウサギ抗体を反応させる。ウェルを洗浄したのち、ＨＲＰの基質である２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）および過酸化水素をウェルに添加して反応させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する（測定値Ａ）；
（ｉｉ）別途、ＳｔｘのＢサブユニットでコートしていないウェルに、前記と同量のサンプルを添加して静置する。ウェルを洗浄したのち、該抗体に対するウサギ抗マウス抗体を添加して反応させる。ウェルを洗浄したのち、ＨＲＰで標識されたヤギ抗ウサギ抗体を反応させる。ウェルを洗浄したのち、ＡＢＴＳおよび過酸化水素をウェルに添加して静置し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定する（標準値）；ついで
（ｉｉｉ）測定値Ａから標準値を減じて得られる値を、特異的吸光度とする。【００１８】  ＳｔｘのＢサブユニットの粘膜外免疫で免疫応答が起こらない系統は、その主要組織適合遺伝子複合体がＳｔｘのＢサブユニット由来の抗原ペプチドを提示することができない可能性がある。したがって、Ｔ細胞からのヘルパー効果が期待できず、抗原の架橋によってヘルパー効果の効率を上昇させようとする本発明の方法の効果を得ることができない。使用し得る動物の具体例としては、たとえば、主要組織適合遺伝子複合体がＨ−２ｄであってＨ−２ｂではないマウスを用いることができる。そのようなマウスとしては、たとえばＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｂ１０．Ｄ２マウス、ＤＢＡ／２マウス、Ｄ１．ＣマウスまたはＮＺＷ−Ｈ−２ｄマウスなどが挙げられる。【００１９】  Ｓｔｘに対する抗体を製造するために、動物の免疫は、架橋Ｂサブユニットを含有する抗原溶液を用いる経粘膜投与により実施する。経粘膜投与は通常の方法によって実施することができ、経粘膜投与としては、たとえば経口投与（胃内投与）、経鼻投与、経直腸投与または経気道投与などが挙げられる。抗原溶液の調製は常法により適宜実施することができる。たとえば、架橋Ｂサブユニットを過度に変性させず、かつ動物に毒性のない塩溶液（たとえばリン酸緩衝生理食塩水または生理食塩水など）に、架橋Ｂサブユニットを抗原として、およびコレラトキシンを粘膜アジュバントとして溶解させることにより、抗原溶液を調製することができる。たとえばマウスへの胃内投与の場合には、過度の胃酸を中和するために、たとえば、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液２５０μＬ当たり５０μｇ〜１０００μｇの架橋Ｂサブユニットおよびコレラトキシン５μｇ〜１０μｇを溶解することによって抗原溶液を調製し、該抗原溶液２５０μＬを胃ゾンデを用いて直接マウスの胃に注入することによって実施することができる。なお、マウス一匹当たりの架橋Ｂサブユニットおよびコレラトキシンの全体量は、それぞれ５０μｇ〜１０００μｇおよび５μｇ〜１０μｇが好ましく、投与に用いる０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液の液量は１００μＬ〜５００μＬの範囲が好ましい。たとえばマウスへの経鼻投与の場合には、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水または生理食塩水１５μＬ当たり４０μｇ〜２００μｇの架橋Ｂサブユニットおよびコレラトキシン１μｇ〜５μｇを溶解することによって抗原溶液を調製し、片鼻当たり該抗原溶液７．５μＬを麻酔状態のマウスの鼻腔に滴下し（マウス一匹当たり該抗原溶液１５μＬ）、マウスに自然に吸引させることによって実施することができる。なお、マウス一匹当たりの架橋Ｂサブユニットおよびコレラトキシンの全体量は、それぞれ４０μｇ〜２００μｇおよび１μｇ〜５μｇが好ましく、投与に用いる溶液の量は、片鼻当たり２μＬ〜７．５μＬ（マウス一匹当たり４μＬ〜１５μＬ）が好ましい。このように、架橋Ｂサブユニットで動物を経粘膜免疫することにより、Ｓｔｘに特異的な抗体（たとえばＩｇＧおよびＩｇＡ）を産生可能なＢリンパ球の数を増加させることができる。免疫終了後は常法により抗体を採取することができ、採取した抗体は常法により精製してもよい。【００２０】  また、Ｓｔｘに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを製造してもよい。ハイブリドーマは、たとえば、以下のようにして得ることができる。【００２１】  免疫したマウスの脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板もしくは腸管粘膜固有層から分離したリンパ球または鼻粘膜付随リンパ組織から分離したリンパ球とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール法で融合し、ＨＡＴ選択により融合細胞を選択する。ついで、融合細胞をクローニングしてモノクローンを得ることにより、Ｓｔｘ特異抗体を産生するハイブリドーマを作製する。【００２２】  前記ハイブリドーマからＳｔｘ特異抗体を得る方法としては、たとえば、無血清培地でハイブリドーマを培養し、培養上清を得ることによって抗体を取得する方法が挙げられる。あるいは、適切な系統のマウスの腹腔内でハイブリドーマを増殖させたのちに腹水を採取することにより、腹水中に産生された抗体を取得することもできる。得られた抗体は、硫酸アンモニウムによる沈澱および陰イオン交換法、または抗体のサブクラスによってはプロテインＡもしくはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーを利用して、精製してもよい。【００２３】  つぎに、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２４】［使用した材料］
マウス：ＳＰＦの６週令雌のＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂ１０．Ｄ２、ＤＢＡ／２、およびＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスを日本エスエルシー（株）より購入した。【００２５】  試薬：ウサギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）、ウサギ抗マウスＩｇＡ（α鎖特異的）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）（サウスサンフランシスコ、カルフォルニア州）より、グルタルアルデヒド（２５％水溶液）をナカライテスク社（京都）より、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｔｗｅｅｎ２０およびグリシンを和光純薬（大阪）より、アジ化ナトリウムを関東化学（東京）より購入した。コレラトキシン（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ，ｔｙｐｅ  Ｉｎａｂａ  ５６９Ｂ、ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ不含）をカルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（サンディエゴ、カルフォルニア州）より、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）をディフコ（ＤＩＦＣＯ）（デトロイト、ミシガン州）より、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、アプロチニン、ケタミンおよびキシラジンをシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）より購入した。【００２６】製造例１  組み換え型Ｂサブユニット（Ｓｔｘ１Ｂ）の製造
Ｓｔｘ１Ｂの発現は、「基礎生化学実験法第５巻脂質・糖質・複合糖質（株式会社東京化学同人、日本生化学会編、２０００年１２月８日、ｐｐ．２９７〜３００）の記載にしたがって実施した。すなわち、Ｓｔｘの部分的ＤＮＡ断片（Ａサブユニットのカルボキシル末端の１６アミノ酸に対応する領域ならびにＢサブユニットの遺伝子全体およびその下流の７８ｂｐを含むＤＮＡ断片：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｌ０４５３９の塩基配列４０８４〜４４９１（配列番号３））を、大腸菌発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムファルマシアバイオテク）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ部位に組み込み、得られたプラスミドで大腸菌ＪＭ１０５を形質転換させた。形質転換体のコロニーを釣菌して２ｍＬのＬＢ培地に懸濁し、３７℃で１４〜１６時間予備培養を実施した。予備培養液０．２〜２ｍＬをアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地２Ｌに接種し、３７℃で５時間培養した。ついで該培地にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるよう添加して２７℃で４時間培養することにより、Ｓｔｘ１Ｂの発現を誘導した。【００２７】  つぎに、培養物を８０００×ｇ、４℃で１分間遠心して集菌し、カルシウム／マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（以下、「カルシウム／マグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水」を「ＰＢＳ」と略称する）で遠心洗浄した。菌体を、０．１ｍｇ／ｍＬのポリミキシンＢを含むＰＢＳ６０ｍＬに懸濁して氷上で３０分間静置したのち、懸濁液を１００００×ｇで１０分間遠心して上清（ペリプラズム抽出液）を回収した。ペリプラズム抽出液に硫酸アンモニウムを添加して８０％飽和硫酸アンモニウムとし、上清中のタンパク質を沈殿させた。沈澱を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に溶解し、排除分子量３，５００のスペクトラ／ポア３メンブレン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ３  ｍｅｍｂｒａｎｅ）（スペクトラム  ラボラトリーズ製（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ランチョー  ドミンゲズ（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）、カルフォルニア州）に注入し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に対して透析した。ついで、透析内液を遠心して不溶物を除いた試料溶液を、陰イオンカラムであるＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ（アマシャムファルマシアバイオテク）にＦＰＬＣシステムを用いて注入した。試料溶液に含まれるタンパク質は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に溶解したＮａＣｌの濃度勾配（０〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ）によって溶出した。溶出液中のタンパク質をトリシン−ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって分離し、Ｓｔｘ１Ｂが含まれる分子量６，８００〜７，２００Ｄａの画分をプールした。該画分を、セントリプレップ３（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）、ビバリー、マサチューセッツ州）にて濃縮したのち、２５ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析した。透析後、２５ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で平衡化したポリバッファー  イクスチェンジャー９４（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ９４）（ファルマシア）のカラム（１×２０ｃｍ）に透析��液を注入し、ついで、純水で８倍希釈しＨＣｌでｐＨ４．０に調整したポリバッファー７４でタンパク質を溶出した。溶出液のｐＨが５．６近辺でＳｔｘ１Ｂが溶出された。溶出液に硫酸アンモニウムを添加して８０％飽和硫酸アンモニウムとし、上清中のタンパク質を沈殿させた。沈澱をＰＢＳに対して透析したものを、以下、Ｓｔｘ１Ｂの標品として用いた。このようにして精製したＳｔｘ１Ｂは、トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により、単一のバンドを与えた。タンパク質濃度は、ビーシーエー  プロテイン  アッセイキット（ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙｋｉｔ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）製、ロックフォード、イリノイ州）を用いて定量した。【００２８】製造例２  架橋Ｓｔｘ１Ｂの製造
Ｓｔｘ１Ｂの架橋を以下に述べる方法で行なった。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（１．５ｍｇ）を１．１ｍＬのＰＢＳに溶解した。この溶液を撹拌しているところへ、グルタルアルデヒド（０．２％ＰＢＳ溶液）を５０μＬ（１滴）ずつ、８秒間隔で３分かけて添加した。２０℃で１時間撹拌しながら反応させた。反応停止のため、５５０μＬの１Ｍグリシン含有ＰＢＳ溶液を加え、さらに１時間保温した。この溶液を排除分子量３，５００のスペクトラ／ポア３メンブレン（スペクトラム  ラボラトリーズ製、ランチョー  ドミンゲズ、カルフォルニア州）に注入し、ＰＢＳ１Ｌに対し４℃で４時間の透析を、透析外液を交換して３回実施した。透析終了後、セントリコン  ワイエム−３（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３）（ミリポア製（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて、タンパク質濃度で３ｍｇ／ｍＬとなるまで濃縮し、架橋Ｓｔｘ１Ｂとして実験に用いた。【００２９】実施例１（分泌型ＩｇＡ抗体の製造）
（免疫）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例２で得られた架橋Ｓｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００３０】（血清の調製）
最終免疫の７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を個体別にマイクロ遠心チューブに入れた。ついで、マイクロ遠心チューブを密栓して２０℃で２時間放置し、血清が分離した段階で遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。上清を分離して新しいマイクロ遠心チューブに移し、再度遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）して得られた上清を血清とした。【００３１】（鼻洗浄液の調製）
各マウスに対し、１０μＬのＰＢＳをマイクロピペットで片鼻ずつ鼻孔に導入し、ただちに液体を吸い上げた。この操作を片方の鼻孔ごとに２回行ない、サンプルをマウスごとにプールした。充分な量を確保するため、最終免疫の６、７および８日後に採取した鼻洗浄液をマウスごとにプールしサンプルとした。【００３２】（糞抽出液の調製）
最終免疫の６日後に新鮮な糞をマウスごとに採取し、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．３μＭアプロチニンおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に、糞の湿重量で１００ｍｇ／ｍＬとなるように加え、４℃で３０分間ボルテックスミキサーを用いて激しく撹拌した。糞の懸濁液を１５，０００回転１０分間４℃で遠心分離し、その上清を再度１５，０００回転１０分間４℃で遠心分離した。得られた上清を糞抽出液とした。【００３３】比較例１
（免疫）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００３４】（血清の調製）
最終免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００３５】（鼻洗浄液の調製）
各マウスの鼻洗浄液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００３６】（糞抽出液の調製）
各マウスの糞抽出液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００３７】試験例１
Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体量を測定するために、各サンプルを用いて下記ＥＬＩＳＡを行なった。なお、実施例１および比較例１で得られた血清および鼻洗浄液は、０．１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて希釈したものをサンプルとした。糞抽出液は、１％ＢＳＡおよび１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）を用いて希釈したものをサンプルとした。【００３８】（ＥＬＩＳＡ）
平底の９６穴ＥＩＡ／ＲＩＡプレート（コスター９０１８（Ｃｏｓｔａｒ９０１８）、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）製、ニューヨーク州）の各穴に１００μＬのＳｔｘ１Ｂ（５μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液）を添加した。対照として、Ｓｔｘ１Ｂを添加しない穴を設けた。４℃で一晩保温後、各穴を２５０μＬのＰＢＳにて３回洗浄し、２００μＬの１％ＢＳＡを含むＰＢＳを加え２０℃で３時間保温することで、非特異的な吸着部位をブロックした。ブロッキングののち、各穴を２５０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。希釈した各サンプル１００μＬをＳｔｘ１Ｂでコートしたプレートにそれぞれ添加し、２０℃で１時間保温後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）２５０μＬで３回洗浄した。Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体をクラス（イソタイプ）別に検出するために、０．１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで１：１０００に希釈した１００μＬのウサギ抗マウスＩｇＧまたは１００μＬのウサギ抗マウスＩｇＡを添加し、２０℃で１時間保温した。ついで、各穴を２５０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。つぎに、０．１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨＲＰ−標準ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１００μＬ加え、２０℃で１時間保温した。ついで、各穴を２５０μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。酵素発色基質として、０．０３４％過酸化水素を加えた０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解した１ｍＭ  ＡＢＴＳを１００μＬ添加した。２０℃で２０分間反応を行なった後、プレートリーダー（スペクトラリーダーズ（ＳＰＥＣＴＲＡ  Ｒｅａｄｅｒｓ）；テカン（ＴＥＣＡＮ）製、ザルツブルグ、オーストリア）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定した。特異的吸光度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）は、各サンプルについてＳｔｘ１Ｂでコートしたウェルでの吸光度からコートしていないウェルでの吸光度を引いた値とした。抗体価は、特異的吸光度が０．１ＯＤ以上を示すサンプルの最大希釈度と定義される。【００３９】（結果）
結果を図１に示す。図１は、架橋Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで経鼻免疫したマウスより得られたサンプル、および未架橋Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで経鼻免疫したマウスより得られたサンプルに関する、血清ＩｇＧのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ａ）、血清ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ｂ）、糞抽出液中のＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ｃ）ならびに鼻洗浄液中ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ｄ）を示す。抗体とＳｔｘ１Ｂとの結合は、各サンプル（横軸）のＯＤ４０５における特異的吸光度（縦軸：図１の（ａ）、（ｂ）および（ｃ））、または各サンプル（横軸）の抗体価（縦軸：図１の（ｄ））で表示した。なお、各個体からのデータについては、（ａ）では血清１：１０，０００希釈、（ｂ）では血清１：２００希釈、（ｃ）では糞抽出液１：２希釈における特異的吸光度で個体別に表示した。また（ｄ）では、２を底とする抗体価の対数で個体別に表示した。【００４０】  Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＧレベル（Ｐ＜０．０２；スチューデントｔ検定（以下、「ｔ検定」と称する））およびＩｇＡレベル（Ｐ＜０．０１；ｔ検定）は、架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したマウスで有意に高かった（（ａ）および（ｂ））。未架橋のＳｔｘ１Ｂを抗原とした場合、Ｓｔｘ１Ｂ特異的な糞中ＩｇＡを誘導することができなかったが、架橋Ｓｔｘ１Ｂを抗原として免疫したマウスで有意（Ｐ＜０．０５；ウェルシュ（Ｗｅｌｃｈ）検定）に認められた（（ｃ））。さらに、鼻洗浄液中のＳｔｘ１Ｂ特異的なＩｇＡの抗体価は、架橋Ｓｔｘ１Ｂを用いることで有意（Ｐ＜０．０１；マン−ウィットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定（以下、「Ｕ検定」と称する）に上昇した（（ｄ））。（ｄ）において、架橋Ｓｔｘ１Ｂの場合、抗体価の中央値が１：１０２４であるのに対して、未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫した場合１：６４であり、すなわち架橋による増強効果は１６倍であった。【００４１】実施例２（Ｓｔｘ１Ｂの架橋による免疫原性の増強のＨ−２依存性）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例２で得られた架橋Ｓｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００４２】（血清の調製）
最終免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。
（鼻洗浄液の調製）
各マウスの鼻洗浄液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００４３】比較例２
（免疫）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００４４】（血清の調製）
免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００４５】（鼻洗浄液の調製）
各マウスの鼻洗浄液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００４６】比較例３
（免疫）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例２で得られた架橋Ｓｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００４７】（血清の調製）
最終免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００４８】（鼻洗浄液の調製）
各マウスの鼻洗浄液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００４９】比較例４
（免疫）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４）をケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。マウスを０日、７日、１４日および２４日目に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）を投与することで経鼻免疫した。【００５０】（血清の調製）
免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００５１】（鼻洗浄液の調製）
各マウスの鼻洗浄液を、実施例１と同じ手順で調製した。【００５２】試験例２
Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体（ＩｇＡ）量を測定するために、各サンプルを用いて試験例１と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。なお、実施例２および比較例２〜４で得られた血清および鼻洗浄液は、０．１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて希釈したものをサンプルとした。【００５３】（結果）
結果を図２に示す。図２は、架橋Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで経鼻免疫したマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウス）より得られたサンプル、および未架橋Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで経鼻免疫したマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウス）より得られたサンプルに関する、血清ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ａ）および鼻洗浄液中ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合（ｂ）を示す。抗体とＳｔｘ１Ｂとの結合は、各サンプル（横軸）の２を底とする抗体価の対数（縦軸）で表示した。【００５４】  血清中のＩｇＡの抗体価は、ＢＡＬＢ／ｃマウスではＳｔｘ１Ｂの架橋によって有意（Ｐ＜０．０５；Ｕ検定）に上昇した（（ａ））。一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、未架橋Ｓｔｘ１Ｂ免疫群で一個体のみ例外的に応答を示したが、架橋によって免疫原性の上昇は認められなかった。鼻洗浄液中の分泌型ＩｇＡの抗体価は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳｔｘ１Ｂの架橋によって有意（Ｐ＜０．０１；Ｕ検定）に上昇した（（ｂ））。架橋Ｓｔｘ１Ｂの場合、抗体価の中央値が１：１０２４であるのに対して、未処理のＳｔｘ１Ｂで免疫した場合は、１：１６未満であった。増強効果は少なくとも６４倍であった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、粘膜外免疫の場合と異なり、鼻洗浄液中にＳｔｘ１Ｂ特異的なＩｇＡが検出されたが、抗体価は低かった。未架橋Ｓｔｘ１Ｂ免疫群で、血中ＩｇＡが高かった個体が鼻洗浄液においても最も高いＩｇＡ抗体価を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｓｔｘ１Ｂの架橋によって鼻洗浄液中のＩｇＡ抗体価の上昇が認められなかった（（ｂ））。すなわち架橋Ｓｔｘ１Ｂの場合、抗体価の中央値が１：３２であるのに対して、未架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫した場合１：６４であった。また、架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻洗浄液中のＩｇＡ抗体価は１：２５６から１：２０４８と一様に抗体産生の増強が見られたのに対して、架橋Ｓｔｘ１Ｂで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、１：１６未満から１：１２８の範囲に分布し、過半数の個体が抗体価１：３２以下であった。【００５５】参考例１（Ｓｔｘ１Ｂに対する免疫応答のＨ−２拘束性）
本参考例１では、Ｈ−２ｂマウスとしてＣ５７ＢＬ／６（ｎ＝３）を、Ｈ−２ｄマウスとしてＢ１０．Ｄ２（ｎ＝３）およびＤＢＡ／２（ｎ＝１）を、ならびにＨ−２ｂ／ｄマウスとしてＢＤＦ１（ｎ＝３）を用いた。【００５６】  マウスをケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂを抗原として用い、ＰＢＳに溶解した抗原をＣＦＡとともに混合して乳化することにより、エマルジョンを調製した。２０μｇのＳｔｘ１Ｂを含む前記エマルジョン２５μＬずつを各マウスの足蹠皮下に投与（マウス当たり４０μｇ）した。足蹠皮下投与の１０日後に、４０μｇのＳｔｘ１ＢとＩＦＡとのエマルジョン５０μＬを該マウスの腹腔内に投与した。【００５７】（血清の調製）
免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００５８】（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体（ＩｇＧ）量を測定するために、各サンプルを用いて試験例１と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。なお、血清は、１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて１：１０００で希釈したものをサンプルとした。【００５９】（結果）
結果を図３に示す。図３は、未架橋Ｓｔｘ１Ｂを腹腔内投与したマウス（ＤＢＡ／２マウス、Ｂ１０．Ｄ２、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢＤＦ１）の血清に関する、血清ＩｇＧのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。抗体とＳｔｘ１Ｂとの結合は、各Ｈ−２のタイプ（横軸）に対応する特異的吸光度（縦軸）で表示した。【００６０】  すでに報告されているように、Ｈ−２ｄマウス（Ｂ１０．Ｄ２およびＤＢＡ／２）では、Ｓｔｘ１Ｂに対して有意な免疫応答が確認されたが、Ｈ−２ｂマウスは不応答であった。ＭＨＣは共優性であることから、ＢＤＦ１（Ｈ−２ｂ／ｄ）マウスでも充分な免疫応答を期待した。しかし、ＢＤＦ１マウスはＳｔｘ１Ｂに対してむしろ低応答性であった。これらの結果は、未架橋Ｓｔｘ１Ｂが弱い免疫原であり、Ｓｔｘ１Ｂに対する免疫応答が抗原提示細胞上に存在する適切なＭＨＣクラスＩＩ分子の密度に依存していることを示唆する。【００６１】参考例２（Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＧ）
（免疫）
ＤＢＡ／２マウスをケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。０日および７日目（ｎ＝３）、または０日、７日および１４日目（ｎ＝３）に、片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）をマウスに投与することで経鼻免疫した。なお、０日および７日目（ｎ＝２）、または０日、７日および１４日目（ｎ＝２）にコレラトキシン（１μｇ／１５μＬ  ＰＢＳ）をマウスの片鼻に７．５μＬずつ投与したものを対照として用いた。【００６２】（血清の調製）
最終免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００６３】（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体（ＩｇＧ）量を測定するために、各サンプルを用いて試験例１と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。なお、血清は、１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて横軸に示した濃度（％）に希釈したものをサンプルとした。【００６４】（結果）
結果を図４に示す。図４は、Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで２回もしくは３回免疫した３匹のマウスから調製したプール血清、またはコレラトキシンのみで２回もしくは３回免疫した２匹のマウスから調製したプール血清に関する、Ｓｔｘ１Ｂに対する血清ＩｇＧのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。抗体とＳｔｘ１Ｂとの結合は、血清の希釈度（横軸）に対応する特異的吸光度（縦軸）で表示した。ＣＴ共存下Ｓｔｘ１ＢでＤＢＡ／２マウスを１週間隔で３回免疫したマウスでは、血清中にＩｇＧの産生が認められた。一方、ＣＴのみの投与では、Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＧは産生されなかった。２回免疫後の血清にも抗原特異的ＩｇＧが検出されたが、３回免疫後に比べ抗体価が低かった。【００６５】参考例３（Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＡ）
（免疫）
ＤＢＡ／２マウスをケタミン（８０ｍｇ／Ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内投与によって麻酔した。前記製造例１において得られたＳｔｘ１Ｂ（４０μｇ）を抗原として用い、抗原をコレラトキシン（１μｇ）とともにＰＢＳ中で混合して全量を１５μＬとし、抗原溶液とした。０日、７日および１４日目に片鼻７．５μＬの前記抗原溶液（マウス１匹当たり１５μＬ）をマウスに投与することで経鼻免疫した（ｎ＝３）。なお、０日、７日および１４日目にコレラトキシン（１μｇ／１５μＬ  ＰＢＳ）をマウスの片鼻に７．５μＬずつ投与したものを対照として用いた（ｎ＝２）。【００６６】（血清の調製）
最終免疫７日後、眼窩静脈叢採血によって各マウスの血液を採取し、採取した血液を実施例１と同じ手順で処理することにより、血清を調製した。【００６７】（ＥＬＩＳＡ）
Ｓｔｘ１Ｂに対する抗体（ＩｇＡ）量を測定するために、各サンプルを用いて試験例１と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。なお、血清は、１％ＢＳＡ−Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて横軸に示した濃度（％）に希釈したものをサンプルとした。【００６８】（結果）
結果を図５に示す。図５は、Ｓｔｘ１Ｂとコレラトキシンで免疫した３匹のマウスから調製したプール血清、またはコレラトキシンのみで免疫した２匹のマウスから調製したプール血清に関する、Ｓｔｘ１Ｂに対する血清ＩｇＡのＳｔｘ１Ｂ特異的結合を示す。抗体とＳｔｘ１Ｂとの結合は、血清の希釈度（横軸）に対応する特異的吸光度（縦軸）で表示した。ＥＬＩＳＡは各サンプルに対して３組実施し、平均値±標準偏差を表示した。Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＡは、１週間隔で３回ＣＴ共存下Ｓｔｘ１Ｂで免疫すると検出されたが、抗体価が低かった。ＣＴ単独の投与では、Ｓｔｘ１Ｂ特異的な血清中ＩｇＡは検出されなかった。３回免疫後、糞中に分泌型ＩｇＡは検出されなかった（データは示さず）。【００６９】［考察］
Ｓｔｘ１Ｂの低い免疫原性は、胚中心のＢ細胞に対するＳｔｘ１Ｂの有害な作用によるものではない。むしろＳｔｘ１Ｂから生成してＭＨＣクラスＩＩ分子に提示可能なポリペプチド配列が限られているからのようだ。すなわち、Ｓｔｘ１Ｂから生じるいかなるペプチドもＨ−２ｂハプロタイプ（Ｓｔｘ１Ｂ不応答性マウス）のＭＨＣクラスＩＩ分子に提示できない可能性がある。提示可能なペプチドに関するこのような制限は、定量的な効果をもっているようだ。すなわち、応答性マウス（Ｈ−２ｄ）と不応答性マウス（Ｈ−２ｂ）の雑種第一代が低応答性であることが定量的な効果による抗原提示効率で説明できる（図３）。【００７０】  経鼻経路によって粘膜免疫を行ないＨ−２ｄハプロタイプのマウスでＳｔｘ１Ｂに対する免疫応答を有意に誘導することができた。血清中にクラススイッチしたＩｇＧ抗体を認めた。この結果は、Ｓｔｘ１Ｂを免疫原とした場合にも胚中心の機能が保たれていることを示す。ＩｇＧ抗体の誘導が比較的容易であったのに対して、ＩｇＡ抗体産生の誘導はさらに困難であった。ＩｇＡ抗体に関しては、ＯＶＡに対する糞中のＩｇＡ抗体が閉鎖帯毒素を粘膜アジュバントとして用いて検出され（マリナロ  エム（Ｍａｒｉｎａｒｏ  Ｍ）ら、インフェクション  アンド  イミュニティー、１９９９年、第６７巻、ｐ．１２８７〜１２９１）、同じく破傷風トキソイドに対する糞中のＩｇＡ抗体がＩＬ−１２を用いて誘導され（ボヤカ  ピーエヌ（Ｂｏｙａｋａ  ＰＮ）ら、ジャーナル  オブ  イムノロジー、１９９９年、第１６２巻、ｐ．１２２〜１２８）、またインフルエンザウイルスワクチンに対する分泌型ＩｇＡ抗体がＣＴをアジュバントとして誘導されたこと（ホッジ  エルエム（Ｈｏｄｇｅ  ＬＭ）ら、インフェクション  アンド  イミュニティー、２００１年、第６９巻、ｐ．２３２８〜２３３８）が報告されているが、Ｓｔｘ１Ｂについては、血清中に特異的なＩｇＡ抗体は検出できたものの、抗体産生量は少なかった（図５）。さらに、糞中の分泌型ＩｇＡは、未架橋Ｓｔｘ１ＢとＣＴによる経鼻免疫では検出できなかった（図１（ｃ））。これらの結果からも、Ｓｔｘ１Ｂ特異的なＩｇＡ、とくに分泌型のＩｇＡを誘導することの困難さがわかる。Ｓｔｘ１ＢとＣＴによる経口免疫（胃内投与）がＩｇＡ産生により有効ではなかったことを付け加える（データを示さず）。【００７１】  Ｓｔｘ１Ｂの分子間架橋がＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）における免疫原性を劇的に改善した。血清中のＩｇＧおよびＩｇＡレベルの両方が上昇した。また抗体のレベルは高くはないものの、糞中のＩｇＡ抗体も検出可能なレベルとなった。鼻洗浄液については、分子架橋を行なうことによって、未処理のＳｔｘ１Ｂと抗体価で比較して１６倍から６４倍以上の増強効果が認められた。一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）においては、Ｓｔｘ１Ｂの架橋によって免疫原性の増強が見られなかった。【００７２】  経鼻免疫の場合には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでも免疫応答を示した個体が認められた（図２（ｂ））。この結果は、粘膜外免疫の場合とは異なる（図３）。その理由が、粘膜外免疫の場合と粘膜免疫ではＢ細胞集団の性格に違いがあるからなのか、あるいは抗原提示の仕方に違いがあるからなのか、現時点では不明である。しかし、実用的な観点からすると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて鼻洗浄液中にＳｔｘ１Ｂ特異的なＩｇＡ抗体が安定して誘導されているわけではない。一方、分子架橋したＳｔｘ１Ｂを抗原として免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスでは、個体差が少なく一様に高いＩｇＡの抗体価が得られた。この結果は、分子架橋したＳｔｘ１Ｂで免疫したマウスを用いることが、ＩｇＡ産生ハイブリドーマを取得する実現可能な方法であることを示唆する。【００７３】  以上の結果をふまえ、分子架橋によってＳｔｘ１Ｂの免疫原性が改善した理由を以下のように考察する。Ｓｔｘ１ＢはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＩ−ＡｄまたはＩ−Ｅｄ分子に提示可能な限られた数のペプチドを提供できるものとする。Ｂ細胞を含む抗原提示細胞がＳｔｘ１Ｂ分子を取り込んだ場合には、一度には限られた数のペプチドが細胞内で生成するにすぎない。一方、抗原提示細胞（とくに２次応答におけるＢ細胞）が分子間架橋されたＳｔｘ１Ｂの一分子を取り込むと、多数の抗原提示可能なペプチドをエンドソーム内で一度に生じることが可能である。したがって、Ｓｔｘ１Ｂを抗原提示する効率、すなわちヘルパーＴ細胞の誘導効率がＳｔｘ１Ｂの分子間架橋によって大きく改善されたものと考えられる。一方、Ｓｔｘ１Ｂの配列中に抗原提示可能なペプチドが乏しいと考えられるＣ５７ＢＬ／６マウスでは、分子間架橋の効果が得られていないことも、この考え方と合致している。【００７４】  総括すると、Ｓｔｘ１Ｂに対して低いながらも免疫応答を示すＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、分子間架橋したＳｔｘ１Ｂを抗原として粘膜アジュバントのコレラトキシンとともに経鼻免疫することで、安定的に高い抗体価でＳｔｘ１Ｂ特異的な抗体（とくに、分泌型ＩｇＡ抗体）を誘導する方法を確立した。本発明の方法は、Ｓｔｘ１Ｂ特異的なモノクローナル抗体の作製のために極めて有力であると考える。
【産業上の利用可能性】
【００７５】  本発明により、Ｓｔｘに対する抗体の製造方法が提供される。本発明の方法を用いれば、Ｓｔｘに対するＩｇＧ抗体のみならず、Ｓｔｘに対するＩｇＡ抗体を効率的に生産することが可能である。得られた抗体は、経口受動免疫に用いる抗体医薬として有効である。
【図１】
2004104044.tif 000002
【図２】
2004104044.tif 000003
【図３】
2004104044.tif 000004
【図４】
2004104044.tif 000005
【図５】
2004104044.tif 000006
【配列表】
2004104044000001.app
【国際調査報告】
2004104044.tif 000007
2004104044.tif 000008
2004104044.tif 000009
2004104044.tif 000010
2004104044.tif 000011
2004104044.tif 000012