(57)【要約】基板（１０１）に流路（１０３）を形成し、流路（１０３）の一部に、分離部（１０７）を設ける。分離部（１０７）には、多数の柱状体が形成され、表面に特定物質に対して特異的相互作用をする被吸着物質が固定化された被吸着物質層が形成されている。試料を流路（１０３）に導入すると、特定物質が被吸着物質層に吸着し、他の成分から分離される。流路（１０３）内をバッファーで洗浄後、流路（１０３）に脱離液を流して特定物質を被吸着物質層から脱着させ、回収する。
2004051231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、該基材に設けられた試料が流れる流路と、該流路に設けられ、前記試料中の特定物質を分離する分離部と、該分離部に設けられ、前記流路よりも幅狭の微細流路と、を含み、前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項２】
基材と、該基材に設けられた試料が流れる流路と、該流路に設けられ、前記試料中の特定物質を分離する分離部と、該分離部に設けられた突起部と、を含み、前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載の分離装置において、前記分離部および前記流路に電極が設けられ、前記電極間に電圧を付与する電圧付与手段をさらに備えることを特徴とする分離装置。
【請求項４】
請求の範囲第１項乃至第３項いずれかに記載の分離装置において、前記分離部に突起部が設けられ、該突起部に電極が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項５】
請求の範囲第１項乃至第４項いずれかに記載の分離装置において、前記特定物質と前記被吸着物質との組み合わせが、抗原と抗体、酵素と基質、酵素と基質誘導体、酵素と阻害剤、糖とレクチン、ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ、タンパク質と核酸、金属とタンパク質またはリガンドとレセプター、のいずれかの組み合わせであることを特徴とする分離装置。
【請求項６】
請求の範囲第１項乃至第５項いずれかに記載の分離装置において、前記被吸着物質がスペーサーを介して前記基材の表面に備えられたことを特徴とする分離装置。
【請求項７】
基材に設けられた流路と、該流路に設けられた分離部と、該分離部に設けられ、前記流路よりも幅狭の微細流路と、を含む分離装置の分離部に、分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印加しながら、
前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、前記分離部に吸着させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入し、前記分離対象物質を脱離させ、回収するステップと、
を行うことを特徴とする分離方法。
【請求項８】
基材に設けられた流路と、該流路に設けられた分離部と、該分離部に設けられた突起部と、を含む分離装置の分離部に、分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印加しながら、
前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、前記分離部に吸着させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、
前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入し、前記分離対象物質を脱離させ、回収するステップと、
を行うことを特徴とする分離方法。
【請求項９】
生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、
前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、
前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、
乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、
前記分離手段は、請求の範囲第１項乃至第６項いずれかに記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、分離装置、分離方法、および質量分析システムに関し、特に物質間の特異的相互作用を利用した分離装置に関する。
【背景技術】  アフィニティークロマトグラフィーは、不溶性の担体に分離、精製を目的とする物質に対する特異的相互作用を有する物質を固定化して親和性吸着体を作製し、これをカラムに充填して試料溶液中の目的物質を親和性吸着体に吸着させて分離するクロマトグラフィーである。アフィニティークロマトグラフィーは、物質間の特異的相互作用を利用して成分を分離するため、特に生体由来物質の分離、精製に有用な方法である。
しかし、カラムに充填して行うアフィニティークロマトグラフィーは、微量の試料の分離を効率よく行う設計という面では必ずしも適しているとはいえなかった。
一方、生体由来物質の分離、分析機能をチップ上に備えたマイクロチップの研究開発が活発に行われている。これらのマイクロチップには、微細加工技術を用いて微細な分離用流路等が設けられており、極めて少量の試料をマイクロチップに導入し、分離を行うことができるようになっている。
こうしたマイクロチップを活用する技術において、アフィニティークロマトグラフィーの技術を導入する試みが提案されている（特許文献１）。この装置においては、流路中にビーズ等を担体とする親和性吸着体の充填領域が設けられており、流路に目的成分を含む試料を流すと、目的成分が親和性吸着体に吸着されるようになっている。ところが、このような構成では、従来のカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー同様、親和性吸着体の充填率が高い場合、親和性吸着体同士が充分に離間して存在することができず、親和性吸着体の表面全体が目的物質との吸着に関与することができず、分離効率が低下するという課題があった。
また、特許文献１に記載の装置では、チャネルの壁を不溶性の担体とすることができる旨記載されているが、壁のみを用いる場合表面積が小さく、充分な親和性吸着体を備えようとすると、チャネルの長さが大きくなってしまっていた。
さらに、目的の物質を親和性吸着体に吸着させた後、親和性吸着体から脱着させて回収する必要があるが、この際に高濃度の塩溶液や有機溶媒を含む溶液を用いるため、目的の物質がタンパク質等の高次構造を有する物質である場合、立体構造の不可逆的な変性や、失活などが生じるという課題があった。
特許文献１  特表２００２−５０２５９７号公報
【発明の開示】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、特異的相互作用を用いて試料中の特定物質を効率よく分離する装置または方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、微量の特定物質を効率よく分離し、回収する小型の分離装置を提供することにある。また、本発明のさらに別の目的は、特定物質を吸着させた後簡易な方法で脱着させ、高い活性を維持した状態で回収する分離装置または分離方法を提供することにある。また、本発明のさらにまた別の目的は、生体試料に適用可能な質量分析システムを提供することにある。
本発明によれば、基材と、該基材に設けられた試料が流れる流路と、該流路に設けられ、前記試料中の特定物質を分離する分離部と、該分離部に設けられ、前記流路よりも幅狭の微細流路と、を含み、前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装置が提供される。
本発明において、「選択的に吸着または結合する」とは、被検物質のみが検出物質と吸着または結合し、試料中に含まれる他の物質は吸着または結合しないことをいう。吸着または結合の様式に制限はなく、物理的な相互作用であっても、化学的な相互作用であってもよい。また、選択的な吸着または結合のことを、以下適宜「特異的相互作用」と呼ぶ。
本発明に係る分離装置は、分離部においてアフィニティークロマトグラフィーの原理を利用して試料中の特定物質の分離を行う装置である。本発明に係る分離装置では、基材に形成された流路に分離部が設けられた構成となっているため、特定物質を含む試料を流路に導入すると、分離部に形成された被吸着物質の層に選択的に吸着または結合させることができる。このため、簡便な操作により特定物質の分離を行うことができる。
また、分離部に流路よりも幅狭の微細流路を形成することにより、分離部表面の被吸着物質に接近し、相互作用することができる特定物質の分子数を増加させることができる。よって、特定物質を効率よく分離することが可能である。
本発明に係る分離装置はマイクロチップ上でアフィニティークロマトグラフィーを行うことができるため、μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ：マイクロトータル・アナリティカル・システム）に組み込むことも可能となる。たとえば、分離部により分離された試料を試料乾燥部に連通する構成とすることにより、分離した試料を乾燥させて回収し、また質量分析等に供することが可能となる。
本発明によれば、基材と、該基材に設けられた試料が流れる流路と、該流路に設けられ、前記試料中の特定物質を分離する分離部と、該分離部に設けられた突起部と、を含み、前記分離部に前記特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることを特徴とする分離装置が提供される。
本発明に係る分離装置では、分離部に突起部が形成されているため、分離部表面の被吸着物質に接近し、相互作用することができる特定物質の分子数を増加させることができる。また、突起部の形状および配置を調節することにより、分離部における試料通過経路の幅を調節することができる。したがって、分離部の形状を特定物質の分子サイズに応じて最適化することができるため、担体粒子を流路に充填する従来の方法に比べて分離効率を向上させることができる。
本発明の分離装置において、前記分離部および前記流路に電極が設けられ、前記電極間に電圧を付与する電圧付与手段をさらに備える構成とすることができる。
また、本発明の分離装置において、前記分離部に突起部が設けられ、該突起部に電極が形成されている構成とすることができる。こうすることにより、帯電した特定物質をより一層効率よく分離部に誘導することが可能となる。また、分離部において被吸着物質に選択的に吸着または結合した特定物質を脱着させる際にも、電極に付与する電位の正負を制御すれば脱着が容易となるため、流路に流す脱離用溶液の塩濃度、有機溶媒濃度等を低減することができる。したがって、特定物質がタンパク質等である場合にも、失活や変性を抑制することができる。
本発明の分離装置において、前記特定物質と前記被吸着物質との組み合わせは、抗原と抗体、酵素と基質、酵素と基質誘導体、酵素と阻害剤、糖とレクチン、ＤＮＡとＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ、タンパク質と核酸、金属とタンパク質またはリガンドとレセプターのいずれかの組み合わせとすることができる。こうすることにより、生体試料中から特定物質を分離することができる。このとき、本発明に係る分離装置は、基材に流路が形成された構成であり、微量の試料の分離にも適した構成であるため、確実に分離を行うことができる。
本発明の分離装置において、前記被吸着物質がスペーサーを介して前記基材の表面に備えられた構成とすることができる。スペーサーを設けることにより、被吸着物質と基板との間に好適な空間が形成されるため、特定物質の吸着または結合を効率よく形成させることができる。また、スペーサーを親水性分子とすることにより、分離部の表面が親水性のグラフト鎖で被覆されることになるため、分離部表面への特定物質以外の不要成分の非特異的な吸着を抑制することができる。
本発明によれば、基材に設けられた流路と、該流路に設けられた分離部と該分離部に設けられ、前記流路よりも幅狭の微細流路と、を含む分離装置の分離部に、分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印加しながら、前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し前記分離部に吸着させるステップと、前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入し、前記分離対象物質を脱離させ、回収するステップと、を行うことを特徴とする分離方法が提供される。
また、本発明によれば、基材に設けられた流路と、該流路に設けられた分離部と、該分離部に設けられた突起部と、を含む分離装置の分離部に、分離対象物質に選択的に吸着または結合する被吸着物質と異なる符号の電圧を印加しながら、前記流路に前記被吸着物質を含む液体を導入し、前記分離部に吸着させるステップと、前記流路に前記分離対象物質を含む試料を導入し、前記被吸着物質に選択的に吸着または結合させるステップと、前記流路に前記分離対象物質を前記被吸着物質から脱離させる脱離液を導入し、前記分離対象物質を脱離させ、回収するステップと、を行うことを特徴とする分離方法が提供される。
本発明に係る分離方法によれば、分離部に電圧を印加しながら被吸着物質の吸着、試料の導入、および試料中の特定物質の脱離と回収を行うことにより、被吸着物質をカップリング剤等を用いて基材に固定化することなく、簡便かつ確実に特定物質の分離を行うことが可能となる。たとえば、被吸着物質がマイナスに帯電している場合、分離部にプラスの電位を付与することにより、被吸着物質を分離部に吸着させることができる。
本発明によれば、生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、を備え、前記分離手段は、前記分離装置を含むことを特徴とする質量分析システムが提供される。ここで生体試料は、生体から抽出したものであってもよく、合成したものであってもよい。
なお、以上の構成要素の任意の組み合わせや、本発明の構成要素や表現を方法、装置の間で相互に置換したものもまた、本発明の態様として有効である。
以上説明したように本発明によれば、基材に設けられた流路と、流路に設けられた分離部と、分離部に設けられ、流路よりも幅狭の微細流路と、を含み、分離部に試料中の特定物質と選択的に吸着または結合する被吸着物質の層が形成されていることにより、特異的相互作用を用いて試料中の特定物質を効率よく分離する装置または方法が実現される。また、本発明によれば、微量の特定物質を効率よく分離し、回収する小型の分離装置が実現される。また、本発明によれば、特定物質を吸着させた後簡易な方法で脱着させ、高い活性を維持した状態で回収する分離装置または分離方法が実現される。また、本発明によれば、生体試料に適用可能な質量分析システムが実現される。
【図面の簡単な説明】  上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
図１は、本実施形態に係る分離装置の構成を示す上面図である。
図２は、図１の分離装置の分離領域の構成を示す図である。
図３は、図１の分離装置の分離部の構成を示す斜視図である。
図４は、図１の分離装置の表面の構成を説明するための図である。
図５は、図１の分離装置の柱状体表面の構成を説明するための図である。
図６は、本実施形態に係る分離装置の構成を示す図である。
図７は、図６の分離装置の液溜めの構成を説明するための図である。
図８は、図７の液溜めのＢ−Ｂ’方向の構成を説明するための図である。
図９は、本実施形態に係る分離装置の分離部の構成を示す図である。
図１０は、図１の分離装置の分離部の構成を示す図である。
図１１は、質量分析装置の構成を示す概略図である。
図１２は、本実施形態に係る分離装置の構成を示す図である。
図１３は、図１２の分離装置の乾燥部の構成を示す図である。
図１４は、本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である。
図１５は、本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である。
図１６は、本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である。
図１７は、本実施形態に係る分離装置の作製方法を示す工程断面図である。
図１８は、分離装置の他の例を示す図である。
図１９は、分離装置の他の例を示す図である。
図２０は、図１８に示した分離装置のサンプル定量管の近傍の拡大図である。
図２１は、図１９に示した分離装置の詳細図である。
図２２は、本実施形態の分離装置を含む質量分析システムのブロック図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、好ましい実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
（第一の実施形態）
図１は、本実施形態に係る分離装置１００の上面図である。分離装置１００においては、基板１０１上に流路１０３が設けられ、流路１０３の一部に分離部１０７を含む分離領域１１３が形成されている。また、流路１０３の両端はそれぞれ試料導入部１４５および液溜め１４７に連通している。
なお、流路１０３の上面を被覆部材により被覆してもよい。流路１０３の上面に被覆部材を設けることにより、試料液体の乾燥が抑制される。また、試料中の成分がタンパク質等高次構造を有する物質である場合、表面が親水性の被覆部材を用い、流路１０３内を密閉することにより、気液界面においてこの成分が不可逆的に変性することが抑制される。
図２は、分離装置１００における分離領域１１３の拡大図である。図２（ａ）は上面図、図２（ｂ）は図２（ａ）のＡ−Ａ’方向の断面図である。分離部１０７においては、流路１０３中に柱状体１０５が等間隔で規則正しく形成されており、柱状体１０５間の間隙を液体が流れる。柱状体１０５の表面には、図４において後述するように被吸着物質層が形成されているため、試料液体中の特定成分が柱状体１０５表面において非吸着物質と選択的に吸着または結合することが可能である。
図３は、分離部１０７における基板１０１の構成を示す斜視図である。図３において、Ｗは流路１０３の幅、Ｄは流路１０３の深さを示し、φは柱状体１０５の直径、ｄは柱状体１０５の高さ、ｐは隣接する柱状体１０５間の平均間隔を示す。これらの各寸法は、たとえば図３に示された範囲とすることができる。また、分離目的の分子の直径をＲとした場合、Ｒとｐ、Ｄ、またはｄとについては次の条件を満たすことが好ましい。こうすることにより、分離部１０７に導入された試料中の特定物質Ａ’が効率よく壁面に接触し、分離される。
ｐ：０．５Ｒ≦ｐ≦５０Ｒ
Ｄ：５Ｒ≦Ｄ≦５０Ｒ
ｄ：Ｒ≦ｄ≦５０Ｒ
図４は、基板１０１の表面の構成を説明するための図である。基板１０１には、被吸着物質層１０９が形成されている。すなわち、被吸着物質は基板１０１の表面に固定化されている。
また図５は、柱状体１０５表面を例に、被吸着物質層１０９に被吸着物質Ａが固定化されている様子を説明する図である。図５（ａ）では、柱状体１０５の表面に低分子物質が被吸着物質Ａとして固定化されている。このような柱状体１０５に特定物質Ａ’を含む試料液体が導入されると、図５（ｂ）に示すように、試料液体中の特定物質Ａ’が被吸着物質Ａに選択的に吸着または結合し、複合体を形成する。したがって、分離装置１００では、被吸着物質Ａに対する特異的相互作用を有する特定物質Ａ’のみを選択的に被吸着物質層１０９に吸着させ、試料中の他の成分から分離することができる。
分離装置１００において、基板１０１の材料としてシリコンを用いる。また、シリコンにかえて、たとえば石英等のガラス、プラスチック材料等を用いてもよい。プラスチック材料として、たとえばシリコン樹脂、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）等の熱可塑性樹脂や、エポキシ樹脂などの熱硬化性樹脂等が挙げられる。このような材料は成形加工が容易なため、乾燥装置の製造コストを抑えることができる。
柱状体１０５は、たとえば、基板１０１を所定のパターン形状にエッチングすることにより形成することができるが、その作製方法には特に制限はない。また、図２の柱状体１０５は円柱であるが、円柱、擬円柱等の擬円柱に限らず、円錐、楕円錘等の錐体；三角柱、四角柱等の多角柱；その他の断面形状を有する柱体；等としてもよい。
被吸着物質層１０９に備える被吸着物質Ａと特定物質Ａ’は、選択的に吸着または結合する組み合わせから選択される。このような組み合わせとして、たとえば、
（ａ）リガンドとレセプター、
（ｂ）抗原と抗体、
（ｃ）酵素と基質、酵素と基質誘導体、または酵素と阻害剤、
（ｄ）糖とレクチン、
（ｅ）ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）とＲＮＡ（リボ核酸）、またはＤＮＡとＤＮＡ、
（ｆ）タンパク質と核酸
（ｇ）金属とタンパク質
の組み合わせを用いることができる。それぞれの組み合わせにおいて、任意の一方が特定物質となり、他方が被吸着物質となる。
（ａ）の場合、ステロイドなどのホルモン、神経伝達物質などの生理活性物質、薬物、その他の血中因子、インシュリンレセプターなどの細胞膜レセプター、あるいは上記レセプターに対して親和性を有するタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、または低分子物質など、を用いることができる。
（ｂ）の場合、抗原は、いわゆるハプテンなどの低分子物質であっても、タンパク質などの高分子物質であってもよい。抗原の例として、たとえば、ＨＣＶ抗原や、ＣＥＡ、ＰＳＡなどの腫瘍マーカー、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、異常プリオン、アルツハイマー症に特有のタンパク質等を用いることができる。
（ｃ）の場合、たとえばインフルエンザウイルスであるノイラミニザーゼとその阻害剤候補、ＨＩＶウイルスの逆転写酵素とその阻害剤候補、またはＨＩＶプロテアーゼとその阻害剤候補等の組み合わせとすることができる。
（ｄ）の場合、たとえばＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンと小麦胚レクチン、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）とＣｏｎＡレセプター糖タンパク質等の組み合わせを用いることができる。
（ｅ）の場合、変異したＤＮＡと、変異したＤＮＡに対する相補的ＤＮＡなどを用いることができる。
（ｆ）の場合、たとえばＤＮＡ結合タンパク質とＤＮＡなどの組み合わせを用いることができる。
また、（ｇ）の場合、たとえばニッケルとヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）などの組み合わせを用いることができる。
なお、流路１０３の上部に被覆部材を設ける場合、その材料としては、たとえば基板１０１と同様の材料の中から選択することができる。基板１０１と同種の材料を用いてもよいし、異なる材料としてもよい。
次に、分離装置１００を用いた特定物質Ａ’の分離方法について説明する。
図１にもどり、特定物質Ａ’を含む試料液体を試料導入部１４５に注入し、毛細管効果あるいはポンプを用いた圧入などにより流路１０３に展開させる。試料液体の流速は、たとえば１０ｎｌ／ｍｉｎ以上１００μｌ／ｍｉｎ以下とする。すると、図５を用いて前述したように、分離部１０７において被吸着物質Ａに対する特異的相互作用を有する特定物質Ａ’のみが選択的に被吸着物質層１０９に吸着する。吸着しなかった成分は、溶媒または分散媒である液体とともに液溜め１４７に導かれる。
次に、試料導入部１４５から流路１０３洗浄用の緩衝液等を流し、流路１０３に滞留する特定物質Ａ’以外の成分を除去する。このとき、特定物質Ａ’と被吸着物質Ａとは特異的相互作用により吸着または結合しているため、これらが解離することはない。
流路１０３を洗浄した後、特定物質Ａ’を被吸着物質Ａから脱着させる。脱着方法として、たとえば０．１ｍｏｌ／ｌ以上１ｍｏｌ／ｌ以下のＮａＣｌ溶液を試料導入部１４５から流路１０３に導入する方法を用いることができる。また、被吸着物質Ａと特定物質Ａ’とが抗原と抗体であるような場合には、被吸着物質Ａに対する特異的相互作用を有し、被吸着物質Ａに対する結合定数が特定物質Ａ’よりも大きい物質を競争阻害剤として流路１０３に導入し、特定物質Ａ’を脱着させることもできる。脱着した特定物質Ａ’は、液溜め１４７に導かれ、回収される。
以上のように、分離装置１００は流路１０３に分離部１０７が形成されているため、試料が微量である場合にも流路１０３に導入することにより特定物質Ａ’を分離し、回収することが可能である。カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーに比べ、操作は簡便である。また、分離装置１００は使い捨てのチップであるため、分離装置１００の洗浄操作が不要であり、確実に分離を行うことができる。
次に、分離装置１００の製造方法について説明する。
基板１０１上への流路溝１０３および柱状体１０５の形成は、基板１０１を所定のパターン形状にエッチング等を行うことができるが、その作製方法には特に制限はない。
図１５、図１６、および図１７はその一例を示す工程断面図である。各分図において、中央が上面図であり、左右の図が断面図となっている。この方法では、微細加工用レジストのカリックスアレーンを用いた電子線リソグラフィ技術を利用して柱状体１０５を形成する。カリックスアレーンの分子構造の一例を以下に示す。カリックスアレーンは電子線露光用のレジストとして用いられ、ナノ加工用のレジストとして好適に利用することができる。
2004051231.tif 000003
ここでは、基板１０１として面方位が（１００）のシリコン基板を用いる。まず、図１５（ａ）に示すように、基板１０１上にシリコン酸化膜１８５、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト１８３をこの順で形成する。シリコン酸化膜１８５、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト１８３の膜厚は、それぞれ４０ｎｍ、５５ｎｍとする。次に、電子ビーム（ＥＢ）を用い、柱状体１０５となる領域を露光する。現像はキシレンを用いて行い、イソプロピルアルコールによりリンスする。この工程により、図１５（ｂ）に示すように、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト１８３がパターニングされる。
つづいて全面にポジフォトレジスト１５５を塗布する（図１５（ｃ））。膜厚は１．８μｍとする。その後、流路１０３となる領域が露光するようにマスク露光をし、現像を行う（図１６（ａ））。
次に、シリコン酸化膜１８５をＣＦ４、ＣＨＦ３の混合ガスを用いてＲＩＥエッチングする。エッチング後の膜厚を３５ｎｍとする（図１６（ｂ））。レジストをアセトン、アルコール、水の混合液を用いた有機洗浄により除去した後、酸化プラズマ処理をする（図１６（ｃ））。つづいて、基板１０１をＨＢｒガスを用いてＥＣＲエッチングする。エッチング後のシリコン基板の膜厚を４００ｎｍとする（図１７（ａ））。つづいてＢＨＦバッファードフッ酸でウェットエッチングを行い、シリコン酸化膜を除去する（図１７（ｂ））。以上により、基板１０１上に流路１０３および柱状体１０５が形成される。
ここで、図１７（ｂ）の工程に次いで、基板１０１表面の親水化を行うことが好ましい。基板１０１表面を親水化することにより、流路１０３や柱状体１０５に試料液体が円滑に導入される。特に、柱状体１０５により流路が微細化した分離部１０７においては、流路の表面を親水化することにより、試料液体の毛管現象による導入が促進され、分離効率が向上するため好ましい。
そこで、図１７（ｂ）の工程の後、基板１０１を炉に入れてシリコン熱酸化膜１８７を形成する（図１７（ｃ））。このとき、酸化膜の膜厚が３０ｎｍとなるように熱処理条件を選択する。シリコン熱酸化膜１８７を形成することにより、分離装置内に液体を導入する際の困難を解消することができる。その後、被覆１８９で静電接合を行い、シーリングして分離装置を完成する（図１７（ｄ））。
なお、基板１０１にプラスチック材料を用いる場合、エッチングやエンボス成形等の金型を用いたプレス成形、射出成形、光硬化による形成等、基板１０１の材料の種類に適した公知の方法で行うことができる。
基板１０１にプラスチック材料を用いる場合にも、基板１０１表面の親水化を行うことが好ましい。基板１０１表面を親水化することにより、流路１０３や柱状体１０５に試料液体が円滑に導入される。特に、柱状体１０５により流路１０３が微細化した分離部１０７においては、流路１０３の表面を親水化することにより、試料液体の毛管現象による導入が促進され、乾燥効率が向上するため好ましい。
親水性を付与するための表面処理としては、たとえば、親水基をもつカップリング剤を流路１０３の側壁に塗布することができる。親水基をもつカップリング剤としては、たとえばアミノ基を有するシランカップリング剤が挙げられ、具体的にはＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン等が例示される。これらのカップリング剤は、スピンコート法、スプレー法、ディップ法、気相法等により塗布することができる。
また、流路壁に試料の分子が粘着するのを防ぐために、流路１０３に付着防止処理を行うことができる。付着防止処理としては、たとえば、細胞壁を構成するリン脂質に類似した構造を有する物質を流路１０３の側壁に塗布することができる。このような処理により、試料がタンパク質等の生体成分である場合、成分の変性を防ぐことができると共に、流路１０３における特定の成分の非特異吸着を抑制することができ、回収率を向上することができる。親水性処理および付着防止処理としては、たとえば、リピジュア（登録商標、日本油脂社製）を用いることができる。この場合、リピジュア（登録商標）を０．５ｗｔ％となるようにＴＢＥバッファー等の緩衝液に溶解させ、この溶液で流路１０３内を満たし、数分間放置することによって流路１０３の内壁を処理することができる。この後、溶液をエアガン等で吹き飛ばして流路１０３を乾燥させる。付着防止処理の他の例としては、たとえばフッ素樹脂を流路１０３の側壁に塗布することができる。
次に、分離部１０７における基板１０１表面への被吸着物質の固定化方法として、たとえば、物理的吸着法、共有結合法、などの方法を用いることができる。
物理的吸着法を用いる場合、たとえば被吸着物質の単分子膜を作製し、分離部１０７における基板１０１の表面に吸着させることができる。
また、共有結合法を用いる場合、基板１０１表面に表面改質を施し反応性の官能基や活性基を導入し、被吸着物質を含む溶液と基板１０１とを接触させ、基板１０１表面に被吸着物質を結合させることができる。基板１０１の表面改質方法は、目的に応じ適宜選択することができるが、たとえば、プラズマ処理や、イオンビームによる処理、電子線処理、などを用いることができる。このとき、基板１０１の表面にスペーサー分子を固定化し、スペーサー分子と被吸着物質とを結合させることもできる。スペーサー分子の固定化方法については後述する。
また、石英系ガラス製などの基板１０１を用いる場合、この表面に被吸着物質Ａを化学的に結合させるために、シランカップリング剤などのカップリング剤を用いることができる。カップリング剤を用いる場合、柱状体１０５の表面にカップリング剤を塗布した後、カップリング剤のもつ有機官能基と被吸着物質Ａとを結合させる。このとき、たとえば被吸着物質Ａのチオール基や、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸基等を利用することができる。たとえば、リガンドのカルボキシル基を用いる場合、リガンドの基板１０１の固定化は以下のようにして行うことができる。基板１０１を、−ＮＨ２基を有するシランカップリング剤の水溶液に浸漬する。シランカップリング剤の濃度は、たとえば０．１％以上２．０％以下とする。シランカップリング剤により表面処理された基板１０１に、たとえばカルボジイミド法など、縮合試薬を用いた方法によりリガンドを固定化する。なお、固定化の際には必要に応じて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの活性化剤を併用してもよい。シランカップリング剤の−ＮＨ２基と、リガンドのカルボキシル基とが結合する。こうして、リガンドが固定化された層を被吸着物質層１０９とする分離部１０７が得られる。
また、別の固定化方法として、被吸着物質Ａを予めビオチン化する方法がある。ビオチン化しておけば、基板１０１にアビジンまたはストレプトアビジンを固定化し、ビオチンとアビジンとの相互作用により特定物質を選択的に吸着させることができる。このとき、アビジンとビオチンとの間の結合定数は通常の抗原抗体間の結合定数等に比べて顕著に大きいため、ビオチン化した被吸着物質Ａが基板１０１に固定化されたアビジン等から脱離しない条件で被吸着物質Ａから特定物質Ａ’を脱離させ、回収することができる。
基板１０１への被吸着物質の固定密度は、特定物質が被吸着物質と結合できる程度に十分に密であることが好ましい。こうすることにより、試料中に含まれる他の物質が、基板１０１表面に非特異的に吸着または結合することを抑制することができる。また特に、たとえば被吸着物質Ａが低分子物質で特定物質Ａ’がかさ高い構造の高分子物質である場合、立体障害により特定物質Ａ’が被吸着物質Ａに吸着または結合することができなくなることがないような固定密度とすることが好ましい。
さらに、被吸着物質層１０９の形成方法として、被吸着物質を固定化する方法にかわり、分子インプリンティング法を用いて、特定物質が結合できる鋳型ポリマー層を基板１０１表面に設けることもできる。分子インプリンティング法では、目的分子にあわせてテーラーメイド的にそれを認識する高分子材料を一段階で合成する方法で、具体的には以下のようにして行う。まず、目的分子を鋳型として、機能性モノマーを共有結合または非共有結合により結合させ、鋳型分子−機能性ポリマー複合体を形成させる。ここで、機能性モノマーとして鋳型分子と結合可能な官能基と、ビニル基などの重合可能な基を有する２官能性以上のモノマーを用いることができる。次に、鋳型分子−機能性モノマー複合体を含む溶液に、架橋剤と重合開始剤を加え、分離部１０７の壁面にて重合反応を行う。そして、鋳型分子を、たとえば酵素分解などにより、重合したポリマーから分解除去する。すると、得られたポリマーには、鋳型分子との特異的結合部位が形成される。
なお、前述のように、被吸着物質Ａを化学的に結合させる場合、図１０に示すように、基板１０１と被吸着物質Ａとの間に、適宜、スペーサー１１９を設けることもできる。スペーサー１１９とは、特定物質Ａ’と被吸着物質Ａとの選択的な吸着または結合が立体障害なしに進行するように、被吸着物質Ａを基板１０１から離すため、基板１０１と被吸着物質Ａとの間に挿入させる化合物のことをいう。こうすることにより、図１０（ａ）および図１０（ｂ）のように、被吸着物質Ａと特定物質Ａ’との吸着または結合が容易となる。また、スペーサー１１９に親水性の分子を用いることにより、基板１０１表面への目的外成分の非選択的な吸着を抑制することができる。スペーサー１１９の鎖長は比較的短いことが好ましい。また、活性基を有するものが好ましい。被吸着物質Ａの固定化操作がより簡便になるからである。活性基は、被吸着物質Ａとの反応性を有する官能基であれば特に制限はない。なお、スペーサー１１９に活性基がない場合は、縮合試薬等を用いてスペーサー１１９の官能基と被吸着物質Ａとを結合させる。たとえば、被吸着物質Ａのチオール基や、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸基等を利用することができる。
スペーサー１１９は、アフィニティークロマトグラフィーやＳＰＲ法などで用いられる分子を適宜選択することができるが、たとえば、ヘキサメチレンジアミン（ＨＭＤＡ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧ）や、鎖長の短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、デキストランまたはその誘導体、などを用いることができる。
さらに、基板１０１表面に被吸着物質Ａが固定化された構成にかわり、分子インプリンティング法により、特定物質Ａ’が結合できる鋳型ポリマー層が設けられた構成とすることもできる。
（第二の実施形態）
本実施形態は、第一の実施形態に記載の分離装置において、分離部１０７が隔壁によって隔てられた複数の細分化流路となっている構成である。図９は、本実施形態に係る分離装置１００の分離領域１１３の構成を示す図である。図９（ａ）は上面図、図９（ｂ）は図９（ａ）のＣ−Ｃ’方向の断面図である。分離部１５３においては、流路１０３中に隔壁１５１が等間隔で規則正しく形成されており、隔壁１５１間の間隙を液体が流れる。すなわち、流路１０３より幅狭の流路が形成されており、これらの微細流路が分離用流路１４９となる。そして、分離用流路１４９の表面には、第一の実施形態と同様に、被吸着物質層１０９が形成されているため、試料液体中の特定物質Ａ’が分離用流路１４９において非吸着物質Ａと選択的に吸着または結合することが可能である。
図９の分離領域１１３は、第一の実施形態と同様にして作製することができる。
（第三の実施形態）
本実施形態は、第一の実施形態に記載の分離装置１００において、分離部１０７に設けられた柱状体１０５の内部に電極が設けられており、これらの電極に電位を付与する態様である。分離部１０７の内部に電極を形成する方法としての一例は以下の通りである。図１４は、本実施形態に係る分離装置の製造方法を示す工程断面図である。まず、電極の装着部分を含む金型１７３を用意する（図１４（ａ））。そして、金型１７３に電極１７５を設置する（図１４（ｂ））。電極１７５に用いる材料は、たとえばＡｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ａｌ、Ｃｕなどとする。次に、金型１７３上に被覆用金型１７９をセットして電極１７５を固定し、基板１０１となる樹脂１７７を金型１７３内に射出し、成形する（図１４（ｃ））。樹脂１７７として、たとえばＰＭＭＡを用いる。
そして、成形された樹脂１７７を金型１７３および被覆用金型１７９から外すと、流路１０３の形成された基板１０１が得られる（図１４（ｄ））。基板１０１の裏面の電極１７５表面の不純物をアッシングにより除去し、電極１７５材料金属を露出させる。必要に応じて、基板１０１の底面に金属膜を蒸着等により形成し、これを配線１８１とする（図１４（ｅ））。以上のようにして、流路１０３中に電極１７５を柱状体１０５とする分離部１０７が形成される。こうして形成された電極または配線１８１は、外部電源（不図示）に接続され、電圧を印加することができるようになっている。なお、上記工程の後、流路１０３の全面に絶縁膜を形成してもよい。このとき、絶縁膜の厚さは、たとえば１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下とする。
なお、分離装置１００（図１）において、試料導入部１４５および液溜め１４７についても同様の方法あるいは第四の実施形態に記載の方法で電極を形成しておけば、電極を基板１０１の下面等を導通させて外部電源（不図示）に接続し、試料導入部１４５と分離部１０７との間、分離部１０７と液溜め１４７との間、および試料導入部１４５と液溜め１４７との間、にそれぞれ電圧を付与することが可能となる。
このような構成とすると、試料中の目的成分の分離をより一層確実に効率よく行うことができる。たとえば、特定物質Ａ’がタンパク質であって、そのタンパク質の等電点よりも低ｐＨの緩衝液に溶解された試料から分離を行う場合、試料導入部１４５を正極、分離部１０７を負極として通電すると、正に帯電したタンパク質が効率よく分離部１０７に導かれ、被吸着物質層１０９に選択的に吸着する。流路１０３中の他の成分を除去した後、今度は分離部１０７を正極、液溜め１４７を負極として通電すれば、被吸着物質層１０９に保持されていたタンパク質の脱離および液溜め１４７への誘導が促進される。なお、被吸着物質層１０９に保持されていたタンパク質を脱離させる際には、交流電場を付与することにより、タンパク質分子の運動性が増し、さらに脱離が促進される。
このため、特定物質Ａ’と被吸着物質Ａとを脱離させるために流路１０３に流す溶離液の塩濃度や有機溶媒濃度を低減することができる。したがって、特定物質Ａ’がタンパク質等の高次構造を有する物質である場合にも、立体構造の不可逆的な変性や、失活などを抑制することができる。
さらに、柱状体１０５を電極として電位を付与することにより、被吸着物質Ａを基板１０１に固定化する操作が不要となる場合がある。たとえば、被吸着物質Ａをタンパク質とし、これに対するレセプターが特定物質Ａ’であって、タンパク質がマイナスに帯電しているｐＨ条件でリガンドが帯電していないかあるいはプラスに帯電している場合、以下のようにして特定物質Ａ’の分離を行うことができる。
まず、流路１０３に被吸着物質Ａすなわちタンパク質の溶液を導入する。このとき、タンパク質はマイナスに帯電しているため、柱状体１０５を正極として静電界を付与する。すると、タンパク質は静電相互作用により柱状体１０５表面にタンパク質が吸着する。柱状体１０５に静電界を付与しながら、流路１０３中の余分なタンパク質をバッファーにより洗い流した後、流路１０３にリガンドを含む試料を導入する。すると、タンパク質表面にリガンドが吸着するため、他の成分から分離される。そして、第一の実施形態等と同様にして、流路１０３を洗浄後、塩溶液等を流すことにより、リガンドがタンパク質から脱着し、回収される。このとき、電界を付与したままリガンドを脱離させるため、タンパク質は柱状体１０５表面に吸着された状態が維持される。
以上のように、柱状体１０５に電極を形成することにより、被吸着物質Ａをカップリング剤等を用いて固定化する工程が不要となるため、より簡便に分離を行うことが可能となる。なお、タンパク質がプラスに帯電しており、リガンドが帯電していないかあるいはマイナスに帯電している場合にも、柱状体１０５にマイナスの電位を付与することにより、同様にしてリガンドを分離することができる。
（第四の実施形態）
図６は、本実施形態に係る分離装置１７１の構成を示す図である。分離装置１７１においては、基板１２１上に分離用流路１３１が形成され、これと交差するように投入用流路１２９および回収用流路１３５が形成されている。投入用流路１２９、分離用流路１３１および回収用流路１３５には、それぞれその両端に液溜め１２５ａ、１２５ｂ、１２３ａ、１２３ｂ、１２７ａ、１２７ｂが形成されている。各々の液溜めには電極が設けられており、これを用いて例えば分離用流路１３１の両端に電圧を付与することができる。また、分離用流路１３１には、分離部１０７が設けられている。分離部１０７の構成は、第一〜第三の実施形態のいずれに記載の構成としてもよい。
ここで、電極が設けられた液溜めの構造について、図７および図８を参照して説明する。図７は、図１における液溜め１２３ａ付近の拡大図である。また図８は、図７におけるＢ−Ｂ’断面図である。分離用流路１３１および液溜め１２３ａが設けられた基板１２１上には、緩衝液等を注入できるようにするための開口部１３９が設けられた被覆１３７が配設される。また被覆１３７の上には、外部電源に接続することができるように電導路１４１が設けられる。さらに図８に示されるように、電極板１４３が液溜め１２３ａの壁面と電導路１４１とに沿うように配設させる。電極板１４３と電導路１４１とは圧着され、電気的に接続される。なお、その他の液溜めについても上記と同様な構造を有する。それぞれの液溜めに形成された電極板１４３は、基板１０１の下面等を導通させて外部電源（不図示）に接続すると、電圧が印加可能となる。
図６に戻り、この装置を使って試料の分離を行う方法について説明する。まず特定物質Ａ’を含む試料を液溜め１２５ａ、もしくは液溜め１２５ｂに注入する。液溜め１２５ａに注入した場合は、液溜め１２５ｂの方向へ試料が流れるように電圧を印加し、液溜め１２５ｂに注入した場合は、液溜め１２５ａの方向へ試料が流れるように電圧を印加する。これにより、試料は投入用流路１２９へと流入し、結果的に投入用流路１２９の全体を満たす。この時、分離用流路１３１上では、試料は投入用流路１２９との交点にのみ存在し、投入用流路１２９の幅程度の狭いバンドを形成している。
次に、液溜め１２５ａ、液溜め１２５ｂの間への電圧印加をやめ、液溜め１２３ａと液溜め１２３ｂの間に、試料が液溜め１２３ｂの方向へ流れるように電圧を印加する。これにより試料は分離用流路１３１を通過することになる。分離用流路１３１中に設けられた分離部１０７において、特定物質Ａ’のみが被吸着物質Ａと特異的に相互作用し、他の成分は液溜め１２３ｂへと排出される。第一、第二の実施形態と同様にして分離用流路１３１を洗浄した後、液溜め１２３ａ、液溜め１２３ｂ間への電圧印加をやめ、代わりに液溜め１２７ａ、液溜め１２７ｂの間に電圧を印加する。すると分離用流路１３１中と、回収用流路１３５の交差点に存在するバンドは、回収用流路１３５に流れこむ。液溜め１２７ａ、液溜め１２７ｂ間への電圧印加を一定時間の後に停止すると、液溜め１２７ａまたは液溜め１２７ｂに、分離されたバンドに含まれる特定物質Ａ’が回収される。
以上の手順により、特定物質Ａ’が分離される。分離装置１７１は、分離用流路１３１に加えて投入用流路１２９、回収用流路１３５を備えるため、不要な成分と特定物質Ａ’とを異なる液溜めに導くことができる。このため、液溜めに残存する不要成分の特定物質Ａ’への混入が抑制され、分離効率がより一層向上する。
また、液溜め１２５ａまたは液溜め１２５ｂに反応試薬を導入することにより、回収用流路１３５中に誘導された特定物質Ａ’に対し、酵素反応や検出用の発色反応等、種々の反応を施すことが可能となる。
（第五の実施形態）
本実施形態は、目的成分の分離および濃縮、乾燥を行い、また乾燥した試料を質量分析測定に供する際の質量分析用基板として利用可能な分離装置に関する。図１２は、本実施形態に係る分離装置１６５の構成を示す図である。分離装置１６５は、第三の実施形態に記載の分離装置１００を基本構成とする。分離装置１００における基板１０１が分離装置１６５における基板１３３に、流路１０３が第一の流路１５７にそれぞれ対応した構成となっており、第一の流路１５７に第一の流路１５７より幅狭の第二の流路１５９が連通している。第二の流路１５９の末端に乾燥部１６１が設けられている。第一の流路１５７および第二の流路１５９の上面には被覆１６３が設けられており、試料導入部１４５、液溜め１４７、および乾燥部１６１の上面が開口部となっている。さらに、第三の実施形態と同様に、試料導入部１４５、液溜め１４７、第一の流路１５７および乾燥部１６１の表面には金属膜（不図示）が設けられており、これらの間に電圧を付与することができる。
また、図１３は、分離装置１６５における乾燥部１６１の構成を示す図である。図１３（ａ）が上面図、図１３（ｂ）は図１３（ａ）のＤ−Ｄ’方向の断面図である。図１３に示されるように、乾燥部１６１には複数の柱状体１６７が備えられている。また、乾燥部１６１の底面には乾燥を促進させるためのヒーター１６９が設けられている。
分離装置１６５の使用方法は以下の通りである。すなわち、まず、特定物質Ａ’を含む試料液体を、試料導入部１４５から注入し、毛細管効果あるいはポンプを用いた圧入などにより第一の流路１５７に展開させる。すると、分離部１０７において被吸着物質Ａに対する特異的相互作用を有する特定物質Ａ’のみが選択的に被吸着物質層１０９に吸着する。このとき、試料導入部１４５を正極、分離部１０７を負極として通電すると、特定物質Ａ’の分離部１０７への誘導が促進され、好ましい。被吸着物質Ａに吸着しなかった成分は、溶媒または分散媒である液体とともに液溜め１４７に導かれ、排出される。
次に、試料導入部１４５から流路１０３洗浄用の緩衝液等を流して洗浄し、第一の流路１５７に滞留する特定物質Ａ’以外の成分を除去する。このとき、特定物質Ａ’と被吸着物質Ａとは特異的相互作用により吸着または結合しているため、これらが解離することはない。
その後、特定物質Ａ’を第一および第二の実施形態と同様にして、被吸着物質Ａから脱着させる。このとき、分離部１０７を正極、乾燥部１６１を負極として通電するともに、乾燥部１６１をヒーター１６９によりたとえば３０℃以上７０℃以下に加熱すると、解離した特定物質Ａ’を含む液体が第二の流路１５９を経由して乾燥部１６１に導かれ、乾燥部１６１において速やかに乾燥する。乾燥部１６１には複数の柱状体１６７が設けられており、毛細管現象により効率よく第二の流路１５９中の液体が導入されるとともに、すみやかに乾燥が進行する。またこのとき、第二の流路１５９は第一の流路１５７より幅狭となっているため、第一の流路１５７から第二の流路１５９へと効率よく液体が導入される。
以上により、分離部１０７で分離された特定物質Ａ’が乾燥部１６１で乾燥され、回収される。
また、特定物質Ａ’を乾燥部１６１で乾燥させる際にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）のマトリックスと混合することにより、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用の試料が得られる。ここで、本実施形態で用いる質量分析装置について簡単に説明する。図１１は、質量分析装置の構成を示す概略図である。図１１において、試料台上に乾燥試料が設置される。そして、真空下で乾燥試料に波長３３７ｎｍの窒素ガスレーザーが照射される。すると、乾燥試料はマトリックスとともに蒸発する。試料台は電極となっており、電圧を印加することにより、気化した試料は真空中を飛行し、リフレクター検知器、リフレクター、およびリニアー検知器を含む検出部において検出される。
したがって、分離装置１６５中の液体を完全に乾燥させた後、分離装置１６５をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置の真空槽に設置し、これを試料台としてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを行うことが可能である。ここで、乾燥部１６１の表面には金属膜が形成されており、外部電源に接続可能な構成となっているため、試料台として電位を付与することが可能となっている。
このように、分離装置１６５を用いることにより、複数の成分を含む試料中から特定物質Ａ’のみを分離し、さらに乾燥して回収することができる。そして、乾燥した特定物質Ａ’を、分離装置１６５ごとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳに供することができる。したがって、目的とする成分の抽出、乾燥、および構造解析を一枚の分離装置１６５上で行うことができるため、プロテオーム解析等にも有用である。
なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用のマトリックスは、測定対象物質に応じて適宜選択されるが、たとえば、シナピン酸、α−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、２，５−ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、２，５−ＤＨＢおよびＤＨＢｓ（５−メトキシサリチル酸）の混合物、ＨＡＢＡ（２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸）、３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシピコリン酸）、ジスラノール、ＴＨＡＰ（２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン）、ＩＡＡ（トランス−３−インドールアクリル酸）、ピコリン酸、ニコチン酸等を用いることができる。
（第六の実施形態）
本実施形態は、第一の実施形態に記載の分離装置１００を用いて抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ（ヒスチジンタグ）抗体を用いてＨｉｓ−Ｔａｇを導入したＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の精製を行う方法に関する。
分離装置１００において、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を分離部１０７の表面に固定化し、被吸着物質層１０９を形成する。固定化には、たとえば第一の実施例と同様の方法や、あるいはアフィニティークロマトグラフィー用の抗体の固定化に関する公知の方法を用いる。
具体的には、たとえば分離部１０７を、−ＮＨ２基を有するシランカップリング剤を用いて表面処理する。次に、分離部１０７にスペーサーを結合させる。スペーサーとして、たとえばＥＧＤＥ（エチレングリコールジグリシジルエーテル）を用いる。スペーサーの結合は、たとえばｐＨ１１のＮａＯＨ溶液に大過剰のＥＧＤＥを加え、たとえば３０℃にて攪拌する。この溶液を分離部１０７に滴下し、たとえば２４時間反応させる。その後、スペーサーの末端のエポキシ基を用いて、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を固定化する。このとき、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体のアルカリ溶液を、スペーサーの設けられた分離部１０７に滴下し、静置する。そして、分離部を洗浄すると、分離部１０７に抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体が固定化された分離装置１００が得られる。
得られた分離装置１００の試料導入部１４５に、大腸菌中で発現させたＨｉｓ−Ｔａｇ付加ＧＦＰを含む抽出物を導入する。すると、Ｈｉｓ−Ｔａｇを付加されたＧＦＰのみが選択的に抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体と相互作用し、被吸着物質層１０９に吸着される。流路１０３を洗浄後、分離部１０７を観察すると、ＧＦＰが吸着している領域は緑色の蛍光を発するため、目視で容易に確認することができる。
こうして分離されたＨｉｓ−Ｔａｇ付加ＧＦＰを第一の実施形態と同様にして被吸着物質層１０９から脱着させることにより、液溜め１４７からＨｉｓ−Ｔａｇ付加ＧＦＰを回収することができる。
なお、本実施形態においては、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体を用いたが、Ｈｉｓ−Ｔａｇ結合性のニッケルカラムと同様にして、分離部１０７にニトリロ３酢酸などを固定化してもよい。また、本実施形態の精製方法は、第二〜第五の実施形態に記載の分離装置の構成にも適用可能である。
（第七の実施形態）
本実施形態は、第一の実施形態に記載の分離装置１００を用いて金属に対して特異的相互作用を有する物質を分離する方法に関する。
このような分離装置は以下のようにして作製する。すなわち、図１７（ｃ）の工程に続き、基板１０１全面にレジスト膜を設け、分離部１０７となる領域のみを露出させるレジストパターンを形成する。このレジストパターンをマスクとして基板全面に金属膜を形成する。金属膜の材料は、たとえばＰｔ、Ａｕ等水中で安定しうる物質とする。また金属膜の形成は、たとえば蒸着等により行う。そして、シリコン熱酸化膜１８７を溶解せずレジストマスクを溶解する剥離液を用いてレジストを除去すれば、分離部１０７表面に金属膜が形成される。
得られた分離装置１００に金属結合性物質を含む試料を導入することにより、金属結合性物質を効率よく分離することができる。
なお、水溶液中で不安定な金属、たとえばＦｅ、Ｃｕ、Ａｇ、Ａｌ、Ｎｉ、Ｕ、Ｇｅ等に対して特異的相互作用する物質を分離したい場合には、これらのイオンをキレートするキレート剤やキレートタンパク質、クラウンエーテルを用い、これらにキレートさせた状態で分離部１０７の表面に固定化する態様とすることができる。このときの固定化は、第一の実施形態と同様にして行うことができる。また、本実施形態の分離方法は、第二〜第五の実施形態に記載の分離装置の構成にも適用可能である。
（第八の実施形態）
本実施形態は、第一の実施形態に記載の分離装置１００において、レクチンを被吸着物質Ａとして用い、試料中の特定の糖鎖を分離する方法に関する。レクチンとして、たとえばＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）を用いる。レクチンは、単糖ではマンノースおよびグルコースに特異的なレクチンであり、また、高マンノース型の糖鎖を有する糖タンパク質や、多糖類に対する親和性を有する。
分離装置１００において、ＣｏｎＡを分離部１０７の表面に固定化し、被吸着物質層１０９を形成する。固定化には、たとえば第一の実施例と同様の方法や、あるいはアフィニティークロマトグラフィー用の固定化レクチンに関する公知の作製方法を用いる。
具体的には、たとえば分離部１０７を、−ＮＨ２基を有するシランカップリング剤を用いて表面処理する。次に、分離部１０７にスペーサーを結合させる。スペーサーとして、たとえばＥＧＤＥ（エチレングリコールジグリシジルエーテル）を用いる。スペーサーの結合は、たとえばｐＨ１１のＮａＯＨ溶液に大過剰のＥＧＤＥを加え、たとえば３０℃にて攪拌する。この溶液を分離部１０７に滴下し、たとえば２４時間反応させる。その後、スペーサーの末端のエポキシ基を用いて、レクチンを固定化する。このとき、たとえば−ＳＨ基、−ＯＨ基、−ＮＨ２を含むレクチンのアルカリ溶液を、スペーサーの設けられた分離部１０７に滴下する。
得られた分離装置１００を用いることにより、高マンノース型の糖鎖を有する糖タンパク質または多糖類の有無を簡便に高精度、高感度で分離し、回収することが可能である。分離装置１００の分離部１０７には、レクチンと基板１０１表面との間にスペーサーが設けられているため、レクチンと糖鎖との特異的相互作用が容易になる。したがって、より効率よく分離を行うことができる。なお、本実施形態の分離方法は、第二〜第五の実施形態に記載の分離装置の構成にも適用可能である。
以上、本発明を実施形態に基づき説明した。これらの実施形態は例示であり、各構成要素や各製造工程の組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
たとえば、本実施形態に係る分離装置を次のように構成することもできる。図１８は、毛細管現象を利用して試料を移動させる方式の分離装置の構成を示す図である。毛細管現象を利用することにより、電力、圧力等の外力の印加が不要で駆動のためのエネルギーが不要となる。図１８において、基板５５０に設けられた分離用流路５４０には、第一の実施形態に記載の分離部（不図示）が形成されている。分離用流路５４０の一端には空気穴５６０が設けられ、他端には分離時にバッファーを注入するためのバッファー注入口５１０が設けられている。分離用流路５４０は、バッファー注入口５１０、空気穴５６０以外の部分では密閉されている。分離用流路５４０の起始部には、サンプル定量管５３０がつながっており、サンプル定量管５３０の他方の端は、サンプル注入口５２０が設けられている。
図２０は、サンプル定量管５３０の近傍を拡大して示したものである。サンプル定量管５３０内部、サンプル保持部５０３、およびバッファー導入部５０４には、親水性の吸収領域が設けられる。また分離用流路５４０への導入口付近にも吸収領域５０６が設けられる。サンプル定量管５３０とサンプル保持部５０３との間には、一時停止スリット５０２が設けられている。一時停止スリット５０２は疎水性領域とすることができる。各吸収領域の間は、一時停止スリット５０５および５０７で隔てられている。サンプル保持部５０３の空隙体積は、サンプル定量管５３０の空隙体積と一時停止スリット５０２の体積の和にほぼ等しい。一時停止スリット５０５の幅は、一時停止スリット５０２の幅よりも狭い。ここで、サンプル定量管５３０は、親水性の機能を有し、試料の導入部としての機能が果たせるように構成される。
次に、図１８の装置を用いた分離操作の手順について説明する。まず、サンプル注入口５２０にサンプルを徐々に注入しサンプル定量管５３０を満たす。この時、水面が盛り上がらないようにする。サンプル定量管５３０がサンプルで満たされた後、サンプルは一時停止スリット５０２に徐々にしみ出してゆく。一時停止スリット５０２にしみだしたサンプルが、サンプル保持部５０３の表面に到達すると、一時停止スリット５０２およびサンプル定量管５３０の内部のサンプルは、さらに毛細管効果の大きい、サンプル保持部５０３へとすべて吸い取られる。ここで、各吸収領域は、親水性材料の選択により、親水性の度合いが異なるように形成され、サンプル保持部５０３は、サンプル定量管５３０よりも大きい毛細管効果を有する。サンプル保持部５０３へのサンプル充填の間は、一時停止スリット５０５、５０７が存在するため、サンプルがバッファー導入部５０４に流れ込むことは無い。
サンプル保持部５０３にサンプルが導入された後、バッファー注入口５１０に分離用バッファーを注入する。注入されたバッファーは、バッファー導入部５０４に一時的に充填されて、サンプル保持部５０３との界面が直線状になる。さらにバッファーが充填されると、一時停止スリット５０５にしみだして、サンプル保持部５０３に流入し、さらに、サンプルをひきずりながら、一時停止スリット５０７を超えて分離用流路の方向へと進行する。この際、一時停止スリット５０２の幅が、一時停止スリット５０５、５０７の幅よりも大きいため、一時停止スリット５０２へバッファーが逆流しても、サンプルは既に、サンプル保持部５０３より先に進行しているため、サンプルの逆流はほとんどない。
分離用バッファーは毛細管現象で、分離用流路を空気穴５６０へ向けてさらに進行し、この過程で、サンプルが分離される。分離用バッファーが、空気穴５６０に到達すると、バッファーの流入が停止する。バッファーの流入が停止した段階、もしくは、バッファーが進行中の段階で、サンプルの分離状態を計測する。
上記実施形態は、毛細管現象を用いた分離装置の例であるが、この原理を利用した試料注入の他の例について図１９および図２１を参照して説明する。この装置では、図１８におけるサンプル定量管５３０に代えて、サンプル投入管５７０が設けられている。サンプル投入管５７０の両端には、サンプル注入口５２０と、排出口５８０が設けられている。
この装置を用いた分離手順について説明する。まず、サンプルを、サンプル注入口５２０に投入し、排出口５８０まで満たす。この間に、サンプルは、投入穴５０９を介してサンプル保持部５０３に吸収される。
しかる後に、サンプル注入口５２０に空気を圧入して、サンプルを排出口５８０から排出することによりサンプル投入管５７０の内部のサンプルを払拭、乾燥する。毛細管現象による分離の場合は、上記と同様に、分離用バッファーを注入する。電気泳動による分離の場合は、サンプルの投入以前に、バッファー注入口５１０に相当する液溜め、空気穴５６０に相当する液溜めから泳動用バッファーを導入しておく。広く作られた一時停止スリット５０５、５０７が存在するため、サンプル保持部には、流入しない。
サンプル保持部５０３へのサンプルの保持が終わった段階で、さらに微量の泳動用バッファーを分離用流路の一端の液溜めに加えるか、サンプル保持部５０３の周辺に軽く振動を与えることで、泳動バッファーを連続させ、電圧を印加して分離する。
なお、図２２は本実施形態の分離装置を含む質量分析システムのブロック図である。このシステムは、図２２（ａ）に示すように、試料１００１について、夾雑物をある程度除去する精製１００２、不要成分１００４を除去する分離１００３、分離した試料の前処理１００５、前処理後の試料の乾燥１００６、質量分析による同定１００７、の各ステップを実行する手段を備えている。
ここで、以上の実施形態で説明した分離装置による分離は、分離１００３のステップに対応しており、マイクロチップ１００８上で行われる。また、精製１００２のステップにはたとえば血球等の巨大成分のみを除去するための分離装置等を用いる。前処理１００５では、上述のトリプシン等を用いた低分子化、マトリックスとの混合等を行う。乾燥１００６では、前処理の施された試料を乾燥し、質量分析用乾燥試料を得る。
また、本実施形態に係る分離装置は流路を有しているため、図２２（ｂ）に示すように、精製１００２から乾燥１００６までのステップを一枚のマイクロチップ１００８上で行うこともできる。試料をマイクロチップ１００８上で連続的に処理することにより、微量の成分についても損出が少ない方法で効率よく確実に同定を行うことが可能となる。
このように、図２２に示される試料の処理のうち、適宜選択したステップまたはすべてのステップをマイクロチップ１００８上にて行うことが可能となる。
【実施例】  以下、本発明をＤＮＡとＲＮＡの組み合わせを例にした実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
第一の実施の形態で説明した方法で流路１０３の表面に柱状体１０５が形成された反応装置１００（図１）を製造する。基板１０１は、（１００）面を主面とするシリコン基板により構成する。分離部１０７に、柱状体１０５（図２）を設ける。柱状体１０５は、図１５〜図１７を用いて説明した方法で形成する。ここでは、柱状体１０５の間隔ｐが約２００ｎｍとなるようにする。
次に、柱状体１０５であるシリコンピラーの表面に、カップリング剤を用いて線虫（Ｃ．エレガンス：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のｔｐａ−１遺伝子の一部に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドＡをシリコンピラー表面に固定する。
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ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡは５’末端がＳＨ基により修飾されている。
具体的には、図１において分離部１０７の表面に、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡのチオール基と結合する化合物として、アミノシランの一種であるＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＥＤＡ）を固定する。
このとき、分離部１０７を１：１の濃ＨＣｌ：ＣＨ３ＯＨに約３０分間浸し、蒸留水で洗浄した後、濃Ｈ２ＳＯ４に約３０分間浸する。そして、蒸留水で洗浄した後、脱イオン水中で数分間煮沸させる。つづいて、１％ＥＤＡ（１ｍＭ酢酸水溶液中）等のアミノシランを分離部１０７に導入し、室温で約２０分間反応させる。これにより、分離部１０７の表面にＥＤＡが固定される。その後、蒸留水で残さを洗浄し、不活性ガス雰囲気下にて約１２０℃で３〜４分加熱して乾燥させる。
つづいて、二官能性のクロスリンカーとして、１ｍＭのスクシンイミジル４−（マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）溶液を準備し、少量のＤＭＳＯに溶解させた後、希釈する。分離部１０７をこの希釈溶液に室温で２時間浸し、希釈溶媒で洗浄した後不活性ガス雰囲気下で乾燥する。
これにより、ＳＭＰＢのエステル基がＥＤＡのアミノ基と反応し、分離部１０７表面にマレイミドが露出した状態となる。このような状態で、分離部１０７に、チオール基が付いたアンチセンスオリゴヌクレオチドＡを導入する。こうすると、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡのチオール基と分離部１０７の表面のマレイミドとが反応し、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡが分離部１０７の表面に固定される（たとえばＣｈｒｉｓｅｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９６年、Ｖｏｌ．２４、Ｎｏ．１５、３０３１頁〜３０３９頁）。これにより、流路１０３および柱状体１０５の表面に、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡを固定することができる。
以上の手順により、分離装置１００が得られる。得られた分離装置１００を用いて、ＲＮＡの分離を行う。
線虫から抽出したＲＮＡをハイブリダイゼーション溶液（Ｒａｐｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）と混合する。
試料導入部１４５よりサンプルを導入し、調湿箱内で、７０℃で２時間反応した後、２×ＳＳＣ（標準食塩クエン酸緩衝液）、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）で室温１５分、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃１５分の洗浄を行う。次にＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理水を試料導入部１４５より導入し、液溜め１４７に押し出された液の除去と液溜め１４７の洗浄を行う。そして、８０℃で変性を行い、急冷により分離部１０７に固定化されたＤＮＡとＲＮＡを分けた後、溶液部分を液溜め１４７に回収すると、ｔｐａ−１遺伝子由来のＲＮＡを高率に含有する溶液が得られる。
このように本実施例によれば、ＲＮＡ混合物から特定の配列を持つＲＮＡを良好に分離することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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