(57)【要約】サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病を診断できる（特に２型糖尿病の発症前において、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか否かを診断でき、２型糖尿病の早期発見を可能とする）、２型糖尿病の診断方法を提供することを目的とし、本発明の２型糖尿病の診断方法は、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする。
2004040301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする２型糖尿病の診断方法。
【請求項２】
前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする請求項１記載の診断方法。
【請求項３】
前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量に基づいて測定することを特徴とする請求項１記載の診断方法。
【請求項４】
前記被験者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが、健常者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルよりも減少しているときに、前記被験者が将来２型糖尿病を発症する可能性がある又は前記被験者が現在２型糖尿病を発症している可能性があると診断することを特徴とする請求項１記載の診断方法。
【請求項５】
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
【請求項６】
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
【請求項７】
２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、前記動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として、前記候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定することを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【請求項９】
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、２型糖尿病の診断方法及び診断用キット、並びに２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】  糖尿病の患者数は、世界規模で増加の一途をたどっており、２０１０年度には２億人を越えると予想されている。糖尿病はその病因に基づいて大きく１型と２型とに分類されるが、糖尿病の患者のほとんどが２型糖尿病の患者によって占められており、その克服は人類の大きな課題の一つといえる。
１型糖尿病は、膵臓ランゲルハンス島が炎症を起こしてβ細胞によるインスリン分泌能が著しく低下するもので、インスリンを補充しなくては生存できないインスリン依存型の病像を呈する。
２型糖尿病は、それ以外の原因でインスリンの作用不足が現れて高血糖になるもので、肥満、過食、運動不足、ストレス等の環境因子の関与が大きく、中年以降の比較的高齢の肥満者に発症しやすい。２型糖尿病では、一般的にはインスリン非依存型の病像を呈し、食事療法と運動療法が治療の基本となる。食事療法、運動療法の次の段階として薬物療法が行われ、それでも治療が困難な場合にはインスリン療法が行われる。
糖尿病の初発時期には、多飲、多尿、夜尿等の症状が見られるが、これらの初発症状を自覚する患者は少なく、患者の多くは、合併症に伴う症状が現れるまで自覚できないため、糖尿病がいつの間にか発症していて、それを発見した時には合併症が出現しており、治療が極めて困難となる場合が多い。したがって、糖尿病の克服には、早期発見・早期治療が極めて重要であるが、１型糖尿病に比べて２型糖尿病の発症過程は未だ不明な点が多いため、早期発見・早期治療が困難となる場合がある。
そこで、２型糖尿病の発症過程を明らかにするために、様々な遺伝学的アプローチが行われており、最近、糖尿病患者におけるＳＮＰｓ解析やハプロタイプ解析によって遺伝子に先天的な塩基配列の異常が存在することが明らかになりつつある。例えば、塩基配列の異常により、糖尿病罹患率の変動（Ａｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｄ．ら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２０００．２６（１）ｐ．７６−８０；Ｙｅｎ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７．２４１（２）ｐ．２７０−４）、膵臓β細胞の機能低下（Ｍａｅｃｈｌｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｃ．Ｂ．Ｗｏｌｌｈｅｉｍ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１４（６８６５）ｐ．８０７−１２；Ｂｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．ａｎｄ  Ｋ．Ｓ．Ｐｏｌｏｎｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１．４１４（６８６５）ｐ．７８８−９１）、さらには薬剤感受性の変化（Ｕｍｅｋａｗａ，Ｔ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９．４８（１）ｐ．１１７−２０；Ｈｏｆｆｓｔｅｄｔ，Ｊ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９９．４８（１）ｐ．２０３−５）等をきたすことが報告されている。しかし、２型糖尿病の原因となる遺伝子は完全には同定されておらず、２型糖尿病の発症過程には未だ不明な点が多い。
その他の遺伝学的なアプローチとして、遺伝子の発現解析が行われている。遺伝子の発現解析は、遺伝子の発現状態（表現型）を解析するものであり、遺伝子の先天的な異常（遺伝子型）を解析するＳＮＰｓ解析等と本質的に異なるものであって、遺伝因子及び環境因子を加味した患者の現状を把握できる点で有利である。
しかしながら、これまでの遺伝子の発現解析は、肝臓、骨格筋、脂肪、膵臓等、インスリンの主要標的臓器における糖代謝、脂質代謝等に関連する遺伝子の発現の変化を調べるために行われてきたため、これを臨床応用して２型糖尿病の診断を行うことは困難である。すなわち、インスリンの主要標的臓器を対象とする場合には、検体のサンプリングが困難であるため、遺伝子の発現解析に基づいて２型糖尿病の診断を行うことは困難である。
【発明の開示】
そこで、本発明は、第一に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病を診断できる（特に２型糖尿病の発症前において、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか否かを診断でき、２型糖尿病の早期発見を可能とする）、２型糖尿病の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の２型糖尿病の診断方法及び診断用キット、並びに２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
（１）被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする２型糖尿病の診断方法。
（２）前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（３）前記発現レベルを、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（４）前記被験者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが、健常者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルよりも減少しているときに、前記被験者が将来２型糖尿病を発症する可能性がある又は前記被験者が現在２型糖尿病を発症している可能性があると診断することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（５）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
（６）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病診断用キット。
（７）２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、前記動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として、前記候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定することを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（８）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（９）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化を示す図である。
図２は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの耐糖能変化を示す図である。
図３は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球におけるＩＲ（図３Ａ）、ＳＨＩＰ２（図３Ｂ）、ＰＰＡＲγ（図３Ｃ）、ＣＡＰＮ１０（図３Ｄ）及びＩＲＳ−１（図３Ｅ）のｍＲＮＡ発現解析結果を示す図であり、図中、白（□）はＬＥＴＯラットの結果を、黒（■）はＯＬＥＴＦラットの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の２型糖尿病の診断方法は、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行うことを特徴とする。
被験者の血液から白血球を採取する方法は特に限定されるものではなく、例えば、血液中の赤血球を選択的に溶解させた後、遠心分離することによって白血球を採取できる。白血球には、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単球のいずれもが含まれ、検体として用いる白血球は、これらのうちの１種類であってもよいし、２種類以上の混合物であってもよい。
ＣＡＰＮ１０遺伝子は、ＣＡＰＮ１０（Ｃａｌｐａｉｎ１０，カルパイン１０）をコードする遺伝子である。ＣＡＰＮ１０は、組織非特異的に発現しているシステインプロテアーゼである。ＣＡＰＮ１０は、カルパインが通常有しているカルシウム結合ドメインを有しておらず、代わりにＴドメインを有している（Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｙ．ら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ，２０００．２６（２）ｐ．１６３−７５）。ＣＡＰＮ１０の機能としては、例えば、ＩＲＳ−１の分解に関わっている（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，１９９３．１９６（２）ｐ．７６７−７２）、Ａキナーゼ系に組み込まれており、脂肪細胞の分化に関わっている（Ｐａｔｅｌ，Ｙ．Ｍ．ａｎｄ  Ｍ．Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９９９．９６（４）ｐ．１２７９−８４）、プロテインキナーゼＣを加水分解する（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１９８７．２２０（２）ｐ．２７１−７）等が知られている。
ＩＲＳ−１遺伝子は、ＩＲＳ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１，インスリンレセプター基質−１）をコードする遺伝子である。ＩＲＳ−１は、インスリン作用機構に関与するタンパク質である。すなわち、インスリンが細胞表面のインスリンレセプターに結合すると、インスリンレセプターに結合したＩＲＳ−１をはじめとする各種タンパク質が次々と活性化して、その信号が伝達され、その信号によってトランスポーター（ＧＬＵＴ４）が活性化して、ブドウ糖を細胞外から細胞内へと移送する。
ＣＡＰＮ１０遺伝子の塩基配列には、多型、アイソフォーム等によって被験者間で相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＣＡＰＮ１０をコードする限り、ＣＡＰＮ１０遺伝子に含まれる。ＩＲＳ−１遺伝子についても同様である。
「ＣＡＰＮ１０遺伝子の発現レベル」には、ＣＡＰＮ１０遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。同様に、「ＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル」には、ＩＲＳ−１遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質への翻訳レベルが含まれる。したがって、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、検体におけるＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量に基づいて測定することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド、あるいは非天然型ヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は通常１５〜１００塩基、好ましくは１８〜４０塩基であり、ポリヌクレオチドの塩基長は通常２００〜３０００塩基、好ましくは５００〜１０００塩基である。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡのうち、ｃＤＳを含む領域を選択し、当該領域にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列を設計する。また、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計することもできる。設計したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドについては、実際にプライマーやプローブとして利用して、目的とする核酸にハイブリダイズするか否かを確認することが好ましい。ヒトのＣＡＰＮ１０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、ヒトのＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。配列番号１記載のｃＤＮＡのうち、２４〜２０２４番目の塩基からなる領域がＣＤＳ領域であり、配列番号２記載のｃＤＮＡのうち、１０２１〜４７４９番目の塩基からなる領域がＣＤＳ領域である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用する場合には、５’末端側に制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プローブとして利用する場合には、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験者の血液から採取した白血球から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ）反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ）二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。
ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合には、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等の市販の装置を利用して、遺伝子増幅過程をリアルタイムでモニターリングすることにより、ＰＣＲ増幅断片のより定量的な解析を行うことができる。
ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等を利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「その断片」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。「ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１のいずれの部分と反応する場合も含まれる。ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片は、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１には反応するが、白血球に含まれる他のタンパク質には反応しないことが好ましい。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
免疫用抗原としては、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の一部又は全部を利用することができる。免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）ＤＮＡ組換え技術を用いて、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードするｃＤＮＡ（例えば、ＣＡＰＮ１０については配列番号１、ＩＲＳ−１については配列番号２記載の塩基配列からなるｃＤＮＡ）を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を利用することができる。
ポリクローナル抗体の作製に当たっては、まず、免疫用抗原を用いてラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。インスリンシグナル伝達制御タンパク質に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。
モノクローナル抗体の作製に当たっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫した後、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。次いで、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等によりハイブリドーマのクローニングを行い、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用できる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植した後、腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の精製が必要とされる場合には、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を用いて、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の発現量を定量する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を捕捉した後、捕捉されたＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１を、固相担体に固定化した抗体とはＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量することができる。
また、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の存在量の測定は、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性を測定することによって行うこともできる。ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性は、例えば、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定することができる。
２型糖尿病は緩徐に進行する病気であるため、高血糖、糖尿等の明らかな２型糖尿病の症状が現れる前（すなわち２型糖尿病の発症前）においても２型糖尿病が緩徐に進行している可能性がある。
本発明の２型糖尿病の診断方法では、２型糖尿病の進行に伴って、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルと異なる変化を示すことを利用し、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標として２型糖尿病の診断を行う。すなわち、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、２型糖尿病の進行に伴って正常発現レベルよりも減少するので、被験者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが、健常者の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルよりも減少しているときには、被験者が将来２型糖尿病を発症する可能性がある又は被験者が現在２型糖尿病を発症している可能性があると診断することができる。本発明の２型糖尿病の診断方法において、被験者からのサンプリングが必要となる組織は血液であり、血液は他の組織に比べてサンプリングが容易であるので、２型糖尿病の診断を簡易に行うことができる。
被験者と健常者との間で、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを比較する際には、複数の健常者（健常者群）の発現レベルを測定し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験者の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。
健常者群は、複数の健常者を任意に選別して構成することができるが、被験者と同年齢又は同世代である健常者から構成することが好ましい。年齢差がＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルに与える影響をできるだけ排除するためである。
本発明の２型糖尿病診断用キットは、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする。
本発明の２型糖尿病診断用キットを利用すれば、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定することにより、２型糖尿病の診断を行うことができる。
本発明の２型糖尿病診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
本発明の２型糖尿病診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。また、本発明の２型糖尿病診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
本発明の２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法は、２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、前記動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として、前記候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定することを特徴とする。
白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルは、２型糖尿病の進行に伴って正常発現レベルよりも減少するので、２型糖尿病モデル動物の白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を有する物質を選択することによって、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法において、２型糖尿病モデル動物からのサンプリングが必要となる組織は血液であり、血液は他の組織に比べてサンプリングが容易であるので、候補物質が糖尿病予防・治療効果を有するか否かを簡易に判定することができる。
「ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果」には、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを正常発現レベルに戻す効果及び正常発現レベルに近づける効果のいずれもが含まれ、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１遺伝子の転写・翻訳、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の活性発現等のいかなるステップに対して奏される効果も含まれる。
本発明のスクリーニング方法においては、２型糖尿病モデル動物として、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少している動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ等）を使用する。このような動物は、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか又は現在糖尿病を発症している可能性がある動物である。
候補物質を投与するモデル動物としては、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを人為的に減少させたトランスジェニック動物を利用することもできる。トランスジェニック動物におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの減少には、ＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが減少している状態、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１の分解が亢進された状態のいずれもが含まれる。
本発明のスクリーニング方法においては、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルの変化が、将来又は現在における２型糖尿病発症の可能性の指標となることを利用し、２型糖尿病モデル動物に候補物質を投与した後、当該動物の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベル改善効果を指標として候補物質の糖尿病予防・治療効果の判定を行う。すなわち、候補物質を投与した後の発現レベルが、正常発現レベルに戻ったか否か、又は正常発現レベルに近づいたか否かを指標として、候補物質の２型糖尿病予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングする。正常発現レベルは、複数の健常動物の発現レベルを測定し、その値の分布から決定することが好ましい。
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットは、検体におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＣＡＰＮ１０又はＩＲＳ−１に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする。
本発明のスクリーニング用キットを利用すれば、被験者の血液から採取した白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子又はＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを測定することにより、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニングを行うことができる。
本発明のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、本発明の２型糖尿病の診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、モデル動物等を含むことができる。
【実施例】  以下に実施例を示し、本発明について具体的に説明する。
１．ＯＬＥＴＦラットにおける糖尿病発症過程
１．１  実験材料及び実験方法
１．１．１  使用動物
実験動物として、大塚製薬（株）徳島研究所で系統維持されている、雄性のＯＬＥＴＦ（Ｏｔｓｕｋａ−Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ−Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ−Ｆａｔｔｙ）ラット及びＬＥＴＯ（Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ−Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ−Ｏｔｓｕｋａ）ラットを使用した。ＯＬＥＴＦラットは、２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）に類似した症状を示す自然発症糖尿病モデル動物であり（Ｋａｗａｎｏ，Ｋ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ，１９９４．２４  Ｓｕｐｐｌ  ｐ．Ｓ３１７−２０）、ＬＥＴＯラットは、糖尿病を全く発症しないコントロール動物である。このように、確実に糖尿病を発症するモデル動物と、全く糖尿病を発症しないモデル動物とを使用することにより、糖尿病の発症前及び発症後における遺伝子の発現状態を解析できるというメリットがある。ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットは、４週齢で大塚製薬（株）徳島研究所より供与された。
ラットは、人工照明による明暗環境下（明期７：００〜２１：００、暗期２１：００〜７：００）、一定温度（２２℃±０．５℃）、相対湿度（５８％）の動物実験室内で飼育し、固形飼料及び水を自由に摂取させた。
１．１．２  実験手順
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラット（ｎ＝５〜６）において、生後５週齢より実験終了時（２４週齢）まで体重を測定した。また、サンプリングの前週に糖負荷試験を行った。
１．１．３  糖負荷試験（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ，ＧＴＴ）
糖負荷試験（以下「ＧＴＴ」という。）は、Ｈｏｔｔａらの方法（Ｈｏｔｔａ，Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１９９６．１２８９（１）ｐ．１４５−９）を使用した。
すなわち、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの糖耐能の変化をみるために、５週齢及び２３週齢の時点で、ラットを２１：００より１２時間絶食し、１ｇ／ｋｇ  ＢＷのグルコース溶液を、２７Ｇシリンジを使用して腹腔内投与した。１時間後、尾静脈より採取し、血糖値を測定した。
１．１．４  血糖値測定法
血糖値は、グルコースＢテストワコーを使用して、グルコースオキシダーゼ法により測定した（Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，１９６９．２２（２）ｐ．１５８−６１）。
すなわち、尾静脈よりサンプリングした血液を、氷上に１５〜２０分間静置した後、４℃の条件下、１００００ｒｐｍで２分間遠心分離した。遠心上清２０μＬを生理食塩水で３倍に希釈した後、２０μＬをグルコースＢテストワコーの発色試験液１ｍＬと混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、５０５ｎｍの吸光度を測定した。
１．１．５  使用試薬
グルコースＢテストワコーは和光純薬（株）より購入し、グルコースその他の試薬は市販特級品を使用した。
１．１．６  統計学的処理及び検定法
測定値は全て平均値±標準偏差で示してある。群間の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔによる両側検定を行い、有意差を検定した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなし、ｐ＜０．０５を★で、ｐ＜０．０１を★★で示した。
１．２  実験結果
１．２．１  ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化
５週齢から２４週齢までのＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの体重変化を図１に示す。なお、図１中、−●−はＯＬＥＴＦラットの体重変化を示し、−〇−はＬＥＴＯラットの体重変化を示す。
図１に示すように、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間に、５週齢の段階では有意な体重差は観察されなかったが、６週齢目から顕著な体重差が表れ始め、ＯＬＥＴＦラットの方が有意に重かった。週齢が進むに従って体重差は顕著になっていった。
１．２．２  ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの耐糖能変化
ＧＴＴの結果を図２に示す。なお、図２中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
図２に示すように、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間に、５週齢では有意な耐糖能の差は観察されず、両群の血糖値はいずれも２００ｍｇ／ｄＬを下回り、両群ともに耐糖能障害は観察されなかった。また、２３週齢になると、実験に使用した６匹のＯＬＥＴＦラットのうち、４匹の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを越え、ＬＥＴＯラットに比べて有意に耐糖能が悪化していた。
１．３  考察
体重変化に関しては、６週齢より有意差が検出された。ＯＬＥＴＦラットに関する論文（Ｉｓｈｉｄａ，Ｋ．ら，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，１９９６．４５（１０）ｐ．１２８８−９５）においても、顕著な体重差が観察されることが報告されているので、本実験において、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットがともに順調に発育したものと考えられる。
ＧＴＴの結果より、５週齢の耐糖能は、ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの間でそれほど変わらないが、２３週齢においては、ＯＬＥＴＦラットの耐糖能が顕著に悪化していた。１ｇ／ｋｇ  ＢＷグルコースを腹腔内投与した場合、１時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬを越えていれば、糖尿病の症状であると考えられるので、本実験では、２３週齢において６匹のＯＬＥＴＦラットのうち４匹が糖尿病の症状を示したこととなる。
体重変化及びＧＴＴの結果より、ＯＬＥＴＦラットが週齢を経るに従い、顕著にＬＥＴＯラットと異なる発育を示し、糖尿病の症状を示すことが確かめられた。
２．ＯＬＥＴＦラットにおける糖尿病関連遺伝子の発現解析
２．１  実験材料及び実験方法
２．１．１  使用動物
前章で耐糖能を測定したＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを次の週（６週齢及び２４週齢）に使用した。特に、２４週齢のＯＬＥＴＦラットは、１ｇ／ｋｇＢＷグルコース投与後、１時間後の血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上であった個体を使用した。
２．１．２  実験手順
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを６週齢（非糖尿病状態）、２４週齢（糖尿病状態）で２１：００より１２時間絶食させた後、全血液をサンプリングし、脱血後、肝臓及び筋肉をサンプリングした。血液（白血球）、肝臓及び筋肉よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、インスリンレセプター（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＩＲ」という）、ＳＨ２含有イノシトール−５−ホスファターゼ（ＳＨ２−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、以下「ＳＨＩＰ２」という）、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ、以下「ＰＰＡＲγ」という）、カルパイン１０（Ｃａｌｐａｉｎ１０、以下「ＣＡＰＮ１０」という）、インスリンレセプター基質−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１、以下「ＩＲＳ−１」という）の白血球、肝臓及び筋肉における、ＯＬＥＴＦラットとＬＥＴＯラットとの発現量の相対的な違いについて解析した。
２．１．３  血液、肝臓及び筋肉のサンプリング
ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットを６週齢（非糖尿病状態）、２４週齢（糖尿病状態）に２１：００より１２時間絶食させた。体重測定後、ラットをエーテルガスにより麻酔して開腹し、腹部大静脈よりヘパリンナトリウム（１０００Ｕ／ｍＬ）を、２７Ｇシリンジを使用して注入した。この時、ラット全血量を体重の１３分の１と仮定し、添付文章に基づき、必要なヘパリンナトリウムの量を概算し、概算値の２倍量のヘパリンナトリウムを注入した。
注入後、予め０．５％ＥＤＴＡ／生理食塩水溶液を０．５ｍＬ分取しておいたファルコンチューブを大動脈の下にあてがい、大動脈を切断して採血した。得られた血液サンプルは、すぐに白血球からのＲＮＡ抽出操作を行った。同時に門脈より生理食塩水を灌流させ、肝臓及び筋肉を脱血した後に摘出した。肝臓及び筋肉は摘出後、速やかに液体窒素に浸し、−８０℃で保存した。
２．１．４  白血球からのＲＮＡ抽出
２．１．３で得た血液サンプルからのＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓを使用してスピンカラム法により行った。同キットに添付されているプロトコールに沿ってＲＮＡを抽出した後、ＤＥＰＣ水に溶解させ、核酸濃度及び純度を測定し、−８０℃でストックした。
なお、６週齢の時点で、ＲＮＡ水溶液中にＤＮＡがキャリーオーバーしていることが分かったので、２４週齢時のＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｄｎａｓｅ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｓｅｔを併用して行った。
２．１．５  肝臓及び筋肉からのＲＮＡ抽出
２．１．３で得た肝臓及び筋肉ストックに液体窒素をかけながら、ハンマーで砕いた。液体窒素をかけた乳鉢に移し、液体窒素をかけながらすりつぶした。粉末状にした肝臓及び筋肉サンプルより、インビトロジェンのＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して、同試薬に添付されているプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＤＥＰＣ水に溶解させ、核酸濃度及び純度を測定し、−８０℃ストックした。
２．１．６  一本鎖ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇにｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８  ｐｒｉｍｅｒ（５００μｇ／ｍＬ）を０．２μｇ加え、０．１％ＤＥＰＣ水で１１．５μＬとし、７０℃で１０分間、熱変性後、氷中に静置した。その後、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２］、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｄＮＴＰｓ（各０．５ｍＭ）、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０Ｕ）、及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１００Ｕ）を加え、全量を２０μＬとし、４２℃で６０分間反応させた。その後、９４℃で５分間、インキュベートして反応を停止させ、ｃＤＮＡ試料とした。なお、ｃＤＮＡ試料は−２０℃で保存した。
２．１．７  プライマーの設定
Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋより、ＩＲ［Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ａ．Ｌ．Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１９９０．４（２）ｐ．２３５−４４］、ＳＨＩＰ２［Ｋｕｄｏ，Ｍ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ，２０００．７５（１）ｐ．１７２−７］、ＰＰＡＲγ［Ｇｕａｒｄｉｏｌａ−Ｄｉａｚ，Ｈ．Ｍ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，１９９９．２７４（３３）ｐ．２３３６８−７７］、ＣＡＰＮ１０［Ｍａ，Ｈ．ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００１．２７６（３０）ｐ．２８５２５−３１］、ＩＲＳ−１［Ｎａｔｕｒｅ  １９９１  Ｊｕｌ  ４；３５２（６３３０）ｐ．７３−７］、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）［Ｔｓｏ，Ｊ．Ｙ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８５．１３（７）ｐ．２４８５−５０２］のラットのｃＤＮＡ配列を抽出し、次のプライマーを設計した。
・プライマーセット１（ＩＲ用）
［ＰＣＲ産物の長さ：４０５ｂｐ，アニーリング温度：５６．４℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：３６０１
2004040301.tif 000003
Ｌｏｗｅｒ，２０ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：３９８６
2004040301.tif 000004
・プライマーセット２（ＳＨＩＰ２用）
［ＰＣＲ産物の長さ：３１８ｂｐ，アニーリング温度：５６．５℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：２７８７
2004040301.tif 000005
Ｌｏｗｅｒ，２０ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：３０８５
2004040301.tif 000006
・プライマーセット３（ＰＰＡＲγ用）
［ＰＣＲ産物の長さ：４８４ｂｐ，アニーリング温度：５５．０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：７５６
2004040301.tif 000007
Ｌｏｗｅｒ，２０ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：１２２０
2004040301.tif 000008
・プライマーセット４（ＣＡＰＮ１０用）
［ＰＣＲ産物の長さ：１３６ｂｐ，アニーリング温度：６０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：２８２
2004040301.tif 000009
Ｌｏｗｅｒ，２１ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：４１７
2004040301.tif 000010
・プライマーセット５（ＩＲＳ−１用）
［ＰＣＲ産物の長さ：２９３ｂｐ，アニーリング温度：６０℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：１４２６
2004040301.tif 000011
Ｌｏｗｅｒ，２０ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：１６９９
2004040301.tif 000012
・プライマーセット６（ＧＡＰＤＨ用）
［ＰＣＲ産物の長さ：２９６ｂｐ，アニーリング温度：５８．９℃］
Ｕｐｐｅｒ，２０ｍｅｒ，５’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：６２８
2004040301.tif 000013
Ｌｏｗｅｒ，２０ｍｅｒ，３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ：９０４
2004040301.tif 000014
２．１．８  リアルタイム定量的ＰＣＲ
ＧＡＰＤＨを内部標準としてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ法を行うことにより、各遺伝子のｍＲＮＡ量を定量した。ｃＤＮＡ試料４μＬ、付属の酵素バッファー２５μＬ、センス及びアンチセンスプライマー各１μＬ（各６μＭ）及び滅菌精製水１６μＬからＰＣＲ反応液を調製し、最終容量を５０μＬとした。ＰＣＲはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００を用いて次のサイクルで行った。９５℃で１５秒間の熱変性、６７℃で５秒間のアニーリング及び７２℃で１０秒間の増幅を５０サイクル行い、全てのサンプルは２回測定した。データは標準曲線法を用いて算出し、ＧＡＰＤＨとの相対量として表した。
２．１．９  統計学的処理及び検定法
測定値は全て平均値±標準偏差で示してある。群間の比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔｔ−ｔｅｓｔによる両側検定を行い、有意差を検定した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとみなし、ｐ＜０．０５を★で、ｐ＜０．０１を★★で示した。
２．２  実験結果
２．２．１  ＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットのｍＲＮＡ発現相対量
（ｉ）ＩＲのｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＩＲのｍＲＮＡ発現相対量（％）を表１に示す。また、白血球におけるＩＲのｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ａに示す。なお、図３Ａ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
2004040301.tif 000015
表１及び図３Ａに示すように、６週齢の時点では、白血球、肝臓及び筋肉のいずれの組織においても、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかった。また、２４週齢の時点では、白血球及び筋肉においてＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかったが、肝臓においては、ＯＬＥＴＦラットのｍＲＮＡ発現量がＬＥＴＯラットの発現量よりも有意に減少していた。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球、肝臓及び筋肉のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球及び筋肉のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、肝臓のＩＲのｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｉｉ）ＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球及び肝臓におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表２に示す。なお、筋肉におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は僅かであるため解析不能であった。また、白血球におけるＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｂに示す。なお、図３Ｂ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
2004040301.tif 000016
表２及び図３Ｂに示すように、６週齢及び２４週齢の時点では、白血球及び肝臓のいずれの組織においても、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかった。
したがって、将来２型糖尿病を発症する可能性がある動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球及び肝臓のＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症しいている動物における白血球及び肝臓のＳＨＩＰ２のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。
（ｉｉｉ）ＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量（％）を表３に示す。また、白血球におけるＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｃに示す。なお、図３Ｃ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
2004040301.tif 000017
表３及び図３Ｃに示すように、６週齢の時点では、白血球、肝臓及び筋肉のいずれの組織においても、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかった。また、２４週齢の時点では、白血球及び肝臓においてＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかったが、筋肉においては、ＯＬＥＴＦラットのｍＲＮＡ発現量がＬＥＴＯラットの発現量よりも有意に減少していた。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物であっても、２型糖尿病の発症前における白血球、肝臓及び筋肉のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球及び肝臓のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、筋肉のＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｉｖ）ＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表４に示す。また、白血球におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｄに示す。なお、図３Ｄ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
2004040301.tif 000018
表４及び図３Ｄに示すように、６週齢の時点では、肝臓及び筋肉において、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかったが、白血球においては、ＯＬＥＴＦラットのｍＲＮＡ発現量がＬＥＴＯラットの発現量よりも有意に減少していた。また、２４週齢の時点では、白血球、肝臓及び筋肉のいずれの組織においてもＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出された。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物において、２型糖尿病の発症前における肝臓及び筋肉のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、２型糖尿病の発症前における白血球のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、白血球、肝臓及び筋肉のＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
（ｖ）ＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現相対量
６週齢及び２４週齢のＯＬＥＴＦラット及びＬＥＴＯラットの白血球、肝臓及び筋肉におけるＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現相対量（％）を表５に示す。また、白血球におけるＣＡＰＮ１０のｍＲＮＡ発現相対量（％）を図３Ｅに示す。なお、図３Ｅ中、■はＯＬＥＴＦラットの結果を示し、□はＬＥＴＯラットの結果を示す。
2004040301.tif 000019
表５及び図３Ｅに示すように、６週齢の時点では、肝臓及び筋肉において、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかったが、白血球においては、ＯＬＥＴＦラットのｍＲＮＡ発現量がＬＥＴＯラットの発現量よりも有意に減少していた。また、２４週齢の時点でも、肝臓及び筋肉において、ＬＥＴＯラット及びＯＬＥＴＦラット間に有意差は検出されなかったが、白血球においては、ＯＬＥＴＦラットのｍＲＮＡ発現量がＬＥＴＯラットの発現量よりも有意に減少していた。
したがって、将来２型糖尿病を発症する動物において、２型糖尿病の発症前における肝臓及び筋肉のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差はないと考えられるが、２型糖尿病の発症前における白血球のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。また、２型糖尿病を発症している動物において、肝臓及び筋肉のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物と有意差がないと考えられるが、白血球のＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量は健常動物よりも有意に減少していると考えられる。
２．２．２  遺伝子発現変化のまとめ
将来２型糖尿病を発症する動物（ＯＬＥＴＦラット）において、糖尿病の発症前（６週齢）及び発症後（２４週齢）のいずれの時点においても、白血球のＣＡＰＮ１０及びＩＲＳ−１のｍＲＮＡ発現量が健常動物（ＬＥＴＯラット）よりも減少していたことから、糖尿病の進行に伴って、白血球のＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少することが判明した。
したがって、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、糖尿病の診断を行うことができると考えられる。すなわち、白血球におけるＣＡＰＮ１０遺伝子及びＩＲＳ−１遺伝子の発現レベルが正常発現レベルよりも減少しているときには、将来糖尿病を発症する可能性があるか、あるいは、現在糖尿病を発症している可能性があると診断できると考えられる。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、第一に、サンプリングな容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病を診断できる（特に２型糖尿病の発症前において、将来２型糖尿病を発症する可能性があるか否かを診断でき、２型糖尿病の早期発見を可能とする）、２型糖尿病の診断方法及び診断用キットが提供される。また、本発明によれば、第二に、サンプリングが容易な組織における遺伝子の発現解析によって２型糖尿病予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる、２型糖尿病予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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