(57)【要約】種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法を提供する。  本発明の免疫原は、所望の抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、１又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む。折り畳み因子の作用により、融合蛋白質に含まれる抗原蛋白は正しい立体構造を有し、可溶性蛋白として得られる。また、その抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうことを防ぐことができる。さらに、単独の抗原蛋白に比べて、動物において一層高い免疫応答が引き起こされる。折り畳み因子の例として、シャペロニンとＰＰＩａｓｅが挙げられる。
2004092221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の抗原蛋白に対する免疫応答を誘導するための免疫原であって、前記抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、１又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む免疫原。
【請求項２】
前記折り畳み因子が複数のシャペロニンサブユニットにより構成されるシャペロニンであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の免疫原。
【請求項３】
前記シャペロニンサブユニットの一部又は全部は、互いにペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の免疫原。
【請求項４】
前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニットのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲第２項又は第３項に記載の免疫原。
【請求項５】
前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニット同士の間に連結されていることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項に記載の免疫原。
【請求項６】
前記シャペロニンサブユニットと前記抗原蛋白との間に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第２項乃至第５項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項７】
前記シャペロニンサブユニット同士の連結部に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする請求の範囲第３項乃至第６項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項８】
前記シャペロニンサブユニットは、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする請求の範囲第２項乃至第７項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項９】
前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニットが形成するシャペロニンリングの内部に格納されていることを特徴とする請求の範囲第２項乃至第８項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項１０】
前記シャペロニンリングは、５〜１０個のシャペロニンサブユニットから構成されることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の免疫原。
【請求項１１】
２個のシャペロニンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合していることを特徴とする請求の範囲第９項又は第１０項に記載の免疫原。
【請求項１２】
前記折り畳み因子がフォルダーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の免疫原。
【請求項１３】
前記抗原蛋白が前記フォルダーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の免疫原。
【請求項１４】
前記フォルダーゼがＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求の範囲第１２項又は第１３項に記載の免疫原。
【請求項１５】
前記ＰＰＩａｓｅが大腸菌又は古細菌に由来することを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の免疫原。
【請求項１６】
前記抗原蛋白は、セロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１５項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項１７】
前記融合蛋白質は、セロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの全長又は６残基以上の部分蛋白質を含有することを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の免疫原。
【請求項１８】
前記抗原蛋白の全長又は一部をコードする遺伝子と前記折り畳み因子又はそのサブユニットをコードする遺伝子とを含有する融合遺伝子を転写・翻訳することにより製造されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１７項のいずれかに記載の免疫原。
【請求項１９】
前記抗原蛋白の一部をコードする遺伝子は、該抗原蛋白の６残基以上の部分蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の免疫原。
【請求項２０】
請求の範囲第１項乃至第１９項のいずれかに記載の免疫原とアジュバントとを混合してなる免疫用組成物。
【請求項２１】
請求の範囲第１項乃至第１９項のいずれかに記載の免疫原をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
【請求項２２】
請求の範囲第２０項に記載の免疫用組成物をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法に関し、さらに詳細には、所望の抗原蛋白と折り畳み因子とを融合させた融合蛋白質を含む免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法に関する。本発明の免疫原によれば、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる。
【背景技術】  バイオテクノロジーの発展に伴い、抗体の重要性はますます高くなってきている。例えば、抗体の特異的な抗原抗体反応を利用した技術として、エンザイムイムノアッセイやラジオイムノアッセイ法等の各種免疫測定法、さらに蛋白質の有効な精製手段であるアフィニティークロマトグラフィーがよく用いられている。抗体は、抗原蛋白を免疫原として動物に接種して免疫反応を起こさせ、動物に抗体を産生させることによって作製されている。最近では、生体試料から抗原蛋白を精製するのではなく、遺伝子組換え技術によって抗原蛋白をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を有する組換え体によって抗原蛋白を発現させて抗原蛋白を得ることもよく行われている。
しかし、このようにして取得した抗原蛋白を免疫原に用いても、目的の抗体が得られない場合がある。例えば、以下の場合が挙げられる。
（ａ）抗原蛋白が宿主細胞にとって有毒な蛋白であるためにその抗原蛋白を産生すべき組換え体が死滅し、免疫原として充分な蛋白量を確保することが非常に困難な場合。
（ｂ）宿主細胞内で抗原蛋白が正しい立体構造をとることができず、異常型蛋白としてしか得られない場合。
（ｃ）抗原蛋白が疎水性アミノ酸を多く含む不溶性蛋白のため、このままでは免疫原として充分な免疫応答を引き起こせない場合。
（ｄ）免疫原として使用した抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうため、充分な免疫応答を引き起こせない場合。
このような問題を解決する方法として、抗原決定基と考えられる部位を人工的に合成した、いわゆるペプチド抗原の利用や、蛋白質に脂質を付加修飾することにより免疫原性を高め充分な免疫応答を引き起こす試み等がなされている。しかし、上記全ての問題を同時に解決する方法は開発されていない（例えば、国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット参照）。とりわけ免疫原として使用した抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまう場合を解決する試みはなされていないのが現状である。
本発明は、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる免疫原及び免疫用組成物、並びにそれらを使用する抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、鋭意検討の結果、抗原蛋白と折り畳み因子とが融合した融合蛋白質を免疫原として使用すると、以下の効果が得られることを見出した。
（ａ）抗原蛋白が宿主細胞にとって有毒な蛋白質であっても、所望する抗原蛋白を産生すべき組換え体が死滅することを防ぐことができる。したがって、免疫原として充分量の抗原蛋白を容易に確保することができる。
（ｂ）抗原蛋白がより正しい立体構造をとりやすくなるので、より正しい免疫応答を引き起こすことができる。
（ｃ）抗原蛋白が疎水性アミノ酸を多く含むものであり、単独では不溶性となる場合でも、融合蛋白質とすることにより可溶性となる。したがって、免疫原として充分な免疫応答を引き起こすことができる。
（ｄ）その抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されてしまうことを防ぐことができ、充分な免疫応答を引き起こすことができる。
（ｅ）単独の抗原蛋白に比べて、動物において一層高い免疫応答が引き起こされる。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）  所望の抗原蛋白に対する免疫応答を誘導するための免疫原であって、前記抗原蛋白の全長又は一部と、折り畳み因子又はそのサブユニットが、１又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む免疫原。
（２）  前記折り畳み因子が複数のシャペロニンサブユニットにより構成されるシャペロニンであることを特徴とする（１）に記載の免疫原。
（３）  前記シャペロニンサブユニットの一部又は全部は、互いにペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする（２）に記載の免疫原。
（４）  前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニットのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする（２）又は（３）に記載の免疫原。
（５）  前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニット同士の間に連結されていることを特徴とする（３）又は（４）に記載の免疫原。
（６）  前記シャペロニンサブユニットと前記抗原蛋白との間に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする（２）乃至（５）のいずれかに記載の免疫原。
（７）  前記シャペロニンサブユニット同士の連結部に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を有することを特徴とする（３）乃至（６）のいずれかに記載の免疫原。
（８）  前記シャペロニンサブユニットは、バクテリア、古細菌又は真核生物に由来することを特徴とする（２）乃至（７）のいずれかに記載の免疫原。
（９）  前記抗原蛋白は、前記シャペロニンサブユニットが形成するシャペロニンリングの内部に格納されていることを特徴とする（２）乃至（８）のいずれかに記載の免疫原。
（１０）  前記シャペロニンリングは、５〜１０個のシャペロニンサブユニットから構成されることを特徴とする（９）に記載の免疫原。
（１１）  ２個のシャペロニンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合していることを特徴とする（９）又は（１０）に記載の免疫原。
（１２）  前記折り畳み因子がフォルダーゼであることを特徴とする（１）に記載の免疫原。
（１３）  前記抗原蛋白が前記フォルダーゼのＮ末端及び／又はＣ末端に連結されていることを特徴とする（１２）に記載の免疫原。
（１４）  前記フォルダーゼがＰＰＩａｓｅであることを特徴とする（１２）又は（１３）に記載の免疫原。
（１５）  前記ＰＰＩａｓｅが大腸菌又は古細菌に由来することを特徴とする（１４）に記載の免疫原。
（１６）  前記抗原蛋白は、セロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲであることを特徴とする（１）乃至（１５）のいずれかに記載の免疫原。
（１７）  前記融合蛋白質は、セロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの全長又は６残基以上の部分蛋白質を含有することを特徴とする（１６）に記載の免疫原。
（１８）  前記抗原蛋白の全長又は一部をコードする遺伝子と前記折り畳み因子又はそのサブユニットをコードする遺伝子とを含有する融合遺伝子を転写・翻訳することにより製造されることを特徴とする（１）乃至（１７）のいずれかに記載の免疫原。
（１９）  前記抗原蛋白の一部をコードする遺伝子は、該抗原蛋白の６残基以上の部分蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１８）に記載の免疫原。
（２０）  （１）乃至（１９）のいずれかに記載の免疫原とアジュバントとを混合してなる免疫用組成物。
（２１）  （１）乃至（１９）のいずれかに記載の免疫原をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
（２２）  （２０）に記載の免疫用組成物をヒトを除く動物に免疫し、該動物から抗原蛋白に特異的な抗体を採取することを特徴とする抗体の製造方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、シャペロニン−抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの組み合わせの第１の例を示す図である。
図２は、シャペロニン−抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの組み合わせの第２の例を示す図である。
図３は、シャペロニン−抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの組み合わせの第３の例を示す図である。
図４は、シャペロニン−抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの組み合わせの第４の例を示す図である。
図５は、シャペロニン−抗原蛋白複合体における抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの組み合わせの第５の例を示す図である。
図６は、ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７の構成を表す図である。
図７は、ベクターｐＴＦ（ＴＣＰβ）８の構成を表す図である。
図８は、ベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の構成を表す図である。
図９は、大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）の立体構造を模式的に表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の免疫原は、抗原蛋白の全長又は一部と折り畳み因子又はそのサブユニットが１又は複数のペプチド結合を介して連結された融合蛋白質を含む。
ここで折り畳み因子とは、ポリペプチドの折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）を助ける一連の蛋白質をいう。折り畳み因子は、分子シャペロンとフォルダーゼに大別される。
分子シャペロンの多くは、細胞に熱ショック等のストレスを与えることによりその発現が誘導される。分子シャペロンは、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下で蛋白質の折り畳みを支援したり、蛋白質の構造安定化に貢献したりする作用を有する。分子シャペロンの例としては、シャペロニンに属するもの、Ｈｓｐ７０システムに属するもの、スモールヒートショックプロテインに属するもの、Ｈｓｐ９０に属するもの、プレフォルディン（Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ）に属するもの等が挙げられる。本発明の免疫原においては、折り畳み因子としていずれの分子シャペロンも適用可能である。以下、本発明の免疫原に適用可能な各分子シャペロンについて説明する。
まず、シャペロニンについて説明する。シャペロニンは分子量が約６０ｋＤａのサブユニット（シャペロニンサブユニット）複数個から構成される複合体である。シャペロニンは、バクテリア、古細菌、真核生物等の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
シャペロニンはグループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、コシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａの蛋白質の環状複合体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌に見られ、それらの構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グループ１型のコシャペロニンに相当する蛋白質も現在のところ見つかっていない。（Ｇｕｐｔａ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５、１−、１９９５年）。本発明の免疫原においては、いずれのシャペロニンも使用可能である。例えば、グループ１型のシャペロニンとしては大腸菌のＧｒｏＥＬ、グループ２型のシャペロニンとしては古細菌由来のＴＣＰを使用することができる。
代表的なシャペロニンは、５〜１０個のシャペロニンサブユニットが環状に連なったリング状の複合体（シャペロニンリング）を２個有する、合計１０〜２０個のシャペロニンサブユニットからなる複合体である。そして、これら２個のシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合して、２層のリング構造を形成する。シャペロニンは、該リング構造の内部にポリペプチドや変性した蛋白質を格納し、ＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸の消費をともなって蛋白質の折り畳み反応を促進する。一方、１個のシャペロニンリングのみを有し、１層のリング構造を有するシャペロニン（シングルリングシャペロニン）も知られている。シングルリングシャペロニンは一部の生物で見つかっている他、アミノ酸置換等の蛋白工学的手法によって人工的に作ることができる。本発明の免疫原が上記した（ａ）〜（ｄ）の作用を有する要因の一つは、抗原蛋白がシャペロニンの内部に格納されていることであると考えられる。
大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬは、図９に示すように、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。１層のシャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状蛋白質１つが充分に納まる空間を有する。シャペロニンはこのキャビティ内部に、ポリペプチドや変性した蛋白質を一時的に格納し、その折り畳み構造形成を助け、構造を安定化させる機能をもつ。
種々の細胞由来のシャペロニンの立体構造が近年、Ｘ線結晶構造解析によって詳細に明らかにされつつある。隣接するシャペロニンサブユニット間及びシャペロニンリング間の相互作用により形成されるシャペロニンの構造は、非共有結合的な相互作用、例えばアミノ酸間の疎水的相互作用や静電相互作用等によって保持されている。また、シャペロニンサブユニットのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっており、特に大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬは、Ｃ末端の少なくとも２３アミノ酸残基がフレキシビリティの高い構造を示すことがわかっている。
また、シャペロニンが高濃度（１ｍｇ／ｍＬ以上）であり、かつＭｇ−ＡＴＰが存在する場合、シャペロニンはリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し、繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ、Ｊ．Ｄ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４、５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２８３９９−２８４０７）。
本発明の免疫原において、シャペロニンは、シャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングがリング面を介して非共有結合的に会合した２層リング構造を形成しているか、又は、シャペロニンリングがリング面又は側面を介して非共有結合的に会合し、繊維状構造を形成していることが好ましい。ただし、シングルリングシャペロニンも使用可能である。
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子組換え手法により大腸菌等の宿主細胞内で生産されることができる。例えば宿主細胞が大腸菌の場合は、その細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。さらに、大腸菌の細胞質可溶性画分に発現したシャペロニンの精製品を電子顕微鏡観察することによって、大腸菌によって生産された異種生物由来のシャペロニンが自己集合し、２層リング構造の複合体を形成することが確認されている。
本発明の免疫原で用いられるシャペロニンの由来は、バクテリア、古細菌及び真核生物のいずれであってもよい。また、シャペロニンは天然から採取したものの他、遺伝子組換え手法によって適宜の宿主細胞内で発現させて生産したものでもよい。また、シャペロニンのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体を使用することも可能である。例えば、シャペロニンリングの内部に収納された抗原蛋白を早く放出したい場合には、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体を使用することもできる。
次に、Ｈｓｐ７０システムに属する分子シャペロンについて説明する。Ｈｓｐ７０システムに属する分子シャペロンと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原は不可逆的な凝集形成を抑制され免疫原として好適である。
Ｈｓｐ７０システムに属する代表的な蛋白質は、大腸菌由来のＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥである。また、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥのホモログは生物種を問わず幅広く存在している。大腸菌のＤｎａＫ／ＤｎａＪ／ＧｒｐＥ系のタンパク質フォールディングシステムはよく研究されている。提案されている反応メカニズムとしては、リボゾームで生合成された新生ポリペプチドがＤｎａＫと結合し、ＡＴＰ存在下でさらにＤｎａＪが結合することで、不可逆的な凝集形成が抑制される。さらにＧｒｐＥに依存したヌクレオチドの解離に伴い、新生ポリペプチドも解離され、シャペロニンのフォールディングシステムに受け渡されるというものである（Ｆｉｎｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＭＡＲＣＥＬ  ＤＥＫＫＥＲ，ＩＮＣ、１９９８）。本発明の免疫原においては、これら大腸菌由来のＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥ並びにこれらと同じ働きをするホモログであれば使用可能である。
次に、スモールヒートショックプロテインに属する分子シャペロンについて説明する。スモールヒートショックプロテインはシャペロニンのリング構造のような複雑で高次の会合体でない、単純な会合体を形成する。そして、スモールヒートショックプロテインと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原蛋白は会合体に巻き込まれて保護される。その結果、免疫原として使用した場合でも、抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されることがなく、より確実に免疫応答を誘導することができる。スモールヒートショックプロテインは、分子量約１５〜３０ｋＤａのサブユニットが、２４〜３２個程度集まって巨大な分子構造をとり、分子シャペロン活性を有することが報告されている（Ｊａｋｏｂ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１５１７−、１９９３年）。例えば、スモールヒートショックプロテインのひとつであるＨｓｐ２５はサブユニット１６個またはそれ以上が会合ししている（Ｅｈｒｎｓｐｅｒｇｅｒ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２７４，Ｎｏ．２１，ｐｐ．１４８６７−１４８７４）。また、これらと相同性の高い領域をそのＣ末端領域に有するクリスタリンもまた、スモールヒートショックタンパク質と同様の性質を有している。そして、抗原蛋白とこれらのスモールヒートショックタンパク質を融合蛋白質とすることにより、本発明の免疫原に適用可能である。
次に、プレフォルディンに属する分子シャペロンについて説明する。プレフォルディンもスモールヒートショックプロテインと同様に単純な会合体を形成する。そして、プレフォルディンと抗原蛋白を複合体とすれば、該抗原蛋白は会合体に巻き込まれて保護される。その結果、免疫原として使用した場合でも、抗原蛋白が接種動物の血中で速やかに分解されることがなく、より確実に免疫応答を誘導することができる。プレフォルディンは、真核生物のチューブリンのタンパク質折り畳みに関与する因子として見いだされた分子シャペロンであり（Ｌｏｐｅｚ、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１３５，２１９−、２００１年）、６量体を形成し、インビトロでは、変性したタンパク質と相互作用するシャペロン活性を有することが知られている（Ｓｉｅｇｅｒｔ，Ｃｅｌｌ  １０３，６２１−、２０００年）。そして、抗原蛋白とプレフォルディンを融合蛋白質とすることにより、本発明の免疫原に適用可能である。
次に、別の折り畳み因子であるフォルダーゼについて説明する。フォルダーゼは酵素的に働く折り畳み因子である。フォルダーゼと抗原蛋白を融合した融合蛋白質は、該抗原蛋白がより正しい立体構造をとりやすくなるので、免疫原として好適である。フォルダーゼの例としては、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、ＰＰＩａｓｅと略記する。）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ等が挙げられる。ＰＰＩａｓｅは蛋白質の折り畳みにおけるプロリルペプチド結合の異性化反応を触媒する酵素である。また、プロテインジスルフィドイソメラーゼはジスルフィド結合の形成を促進する作用を有する酵素である。本発明の免疫原においては使用する折り畳み因子に特に制限はないが、ＰＰＩａｓｅを使用することがより好ましい。
ＰＰＩａｓｅはその阻害剤に対する感受性から、ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ型（ＦＫＢＰ型）、シクロフィリン型、及びパーブリン型の３種類に分類される。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは免疫阻害剤の１つであるＦＫ５０６により活性が阻害されるＰＰＩａｓｅ及びそのホモログである。シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅは、免疫阻害剤シクロスポリンに対して感受性を持つＰＰＩａｓｅ又はそのホモログである。一方、パーブリン型ＰＰＩａｓｅは、いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さず、ジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）によりその活性が阻害されるものである。これら３種類のＰＰＩａｓｅは、アミノ酸一次配列上の相同性はほとんどないことが知られている。本発明の免疫原においては、上記した全ての型のＰＰＩａｓｅが使用可能である。
さらに、一部のＰＰＩａｓｅは、本来の活性であるプロリルペプチド結合の異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）のみならず分子シャペロン活性をも有する。ここで分子シャペロン活性とは、変性した蛋白質を元の天然型にリフォールディングさせる活性、又は変性した蛋白質の不可逆的な凝集を抑制する活性をいう。このＰＰＩａｓｅが有する分子シャペロン活性は、その活性発現のためにＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を要求しない点で、分子シャペロンが有する分子シャペロン活性と異なる。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅは分子シャペロン活性を有さない通常のＰＰＩａｓｅに比べて蛋白質をより確実に折り畳むことができるので、本発明の免疫原に使用するためにはさらに好適である。
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが挙げられる。すなわち、古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性とＡＴＰ非依存的な分子シャペロン活性の両方を有するので、抗原蛋白との融合蛋白質とすることにより、該抗原蛋白はより確実に正常型の立体構造をとりやすくなる。古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプと分子量が２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプに分類される。本発明の免疫原においては両方のタイプが使用可能であるが、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅはより強い分子シャペロン活性を有するので、本発明の免疫原には特に好適である。さらに、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは分子量が小さいので、遺伝子組み換え手法により抗原との融合蛋白質を宿主細胞内で発現させる場合に有利である。なお、上記した分子量の幅はこれまで見いだされている古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子量幅であり、本発明の免疫原に使用するための古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、この分子量幅に限定されず、実質的に同じグループに属するものであればいずれであってもよい。
本発明の免疫原に使用するための古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの由来となる古細菌としては特に限定はない。例えば、ショートタイプのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの由来としては、好熱性及又は超好熱性古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ等が挙げられる。さらに、常温性古細菌であるＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ  ５、８２１−、２０００）。また、ロングタイプのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの由来としては、好熱性又は超好熱性古細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、  Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ等が挙げられる。さらに、常温性好塩菌であるＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ等が挙げられる（Ｍａｒｕｙａｍａ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ  ５、８２１−、２０００年）。
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの他のタイプについて説明する。ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにはトリガーファクタータイプ、ＦｋｐＡタイプ、ＦＫＢＰ５２タイプがある。また、シクロフィリン型ＰＰＩａｓｅにはＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅがある。さらに、パーブリン型ＰＰＩａｓｅにはＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅがある。
トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅはほとんど全てのバクテリアのゲノム上でその遺伝子が見つかっている。トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅの由来の例としては、大腸菌、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ等が挙げられる。
ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅは、いずれも大腸菌をはじめとするグラム陰性バクテリアのペリプラズム領域に存在しているＰＰＩａｓｅである。ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ及びＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅの由来の例としては、大腸菌、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ等が挙げられる。また、これらのバクテリア由来のものだけでなく、それらと同じグループに属し、実質的に同等の活性を有するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。例えば、酵母等の真核生物のゲノムでもそのホモログの遺伝子が見つかっている。
ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、いずれも真核生物中に見いだされるＰＰＩａｓｅである。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅは、約５２ｋＤａ程度のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであり、ｐ５９又はＨＳＰ５６等とも呼ばれている。またＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは４０ｋＤａ程度の分子量を持つ。ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅの由来としては特に限定されず、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット等の真核生物が挙げられる。また本発明の免疫原で用いられるＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ及びＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅは、真核生物由来のものだけでなく実質的に同じ物と認められるグループに属するものであれば、いずれの生物由来のＰＰＩａｓｅであってもよい。
なお、上記したＰＰＩａｓｅはその全長だけでなく、同様の活性を保持する部分ペプチドも使用可能である。例えば、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ＦＫ５０６との結合に関与するＦＫＢＰドメインとＩＦ（Ｉｎｓｅｒｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｐ）ドメインを有しており、これらのドメインが分子シャペロン活性を司っている。したがって、これらのドメインを有する部分ペプチドでＰＰＩａｓｅ活性を有するものであれば、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして使用可能である。また、ロングタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、上記のＦＫＢＰドメインとＩＦドメインの他に、Ｃ末端ドメインも分子シャペロン活性を司っている。したがって、これらのドメインを有する部分ペプチドでＰＰＩａｓｅ活性を有するものであれば、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして使用可能である。また、分子シャペロン活性を有しないＰＰＩａｓｅ、例えばヒトＦＫＢＰ１２に、上記の古細菌由来ＰＰＩａｓｅのＩＦドメインやＣ末端ドメインを蛋白工学的手法によって導入すれば、分子シャペロン活性を有するキメラＰＰＩａｓｅを作製することができる。
次に、本発明の免疫原に含まれる融合蛋白質について説明する。上記のとおり、該融合蛋白質は抗原蛋白の全長又は一部と折り畳み因子の融合蛋白質である。
まず、折り畳み因子がシャペロニンである場合について説明する。シャペロニンは複数のシャペロニンサブユニットの複合体であるが、本発明の免疫原に使用される融合蛋白質においては、抗原蛋白がシャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結されている。抗原蛋白が連結される位置としては、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端のいずれでもよい。シャペロニンサブユニット同士が連結されたシャペロニンサブユニット連結体に抗原蛋白が連結される場合は、連結体のＮ末端、Ｃ末端、連結体のシャペロニンサブユニット間のいずれでもよい。また抗原蛋白が複数の場合は、これらの部位から選択される複数の部位に連結すればよい。特に、抗原蛋白がシャペロニンリングのキャビティ内に確実に納まるように、抗原蛋白の連結部位を選択することが望ましい。
例えば、抗原蛋白が、天然においてホモ又はヘテロの形態で２量体又はそれ以上の四次構造を形成するものである場合には、抗原蛋白を構成する１種又は２種のサブユニットが、互いに連結したシャペロニンサブユニットのＮ末端及びＣ末端にペプチド結合を介して連結されることが好ましい。例えば、抗原蛋白が２量体を形成することにより抗原性を発現するものであり、８個のシャペロニンサブユニットから構成される古細菌由来シャペロニンとの複合体を免疫原とする場合は、シャペロニンサブユニットを８個連結した８量体シャペロニン（シャペロニンサブユニット８回連結体）のＮ末端及びＣ末端に、抗原蛋白のそれぞれのサブユニットをペプチド結合を介して連結すればよい。このようにすると、シャペロニンリング内の極めて近接した領域にそれぞれのサブユニットが存在するため、２量体からなる四次構造を形成しやすく、安定した抗原性の発現が可能となる。
シャペロニンと抗原蛋白の複合体（以下、「シャペロニン−抗原蛋白複合体」と呼ぶ。）における、融合蛋白質とシャペロニンサブユニットの組み合わせの例を、シャペロニンサブユニットの数が８個の例をもって図１〜５を参考にしながら順に説明する。図中、白丸はシャペロニンサブユニット、黒丸は抗原蛋白、実線はペプチド結合である。第１の例は、シャペロニン−抗原蛋白複合体が融合蛋白質のみで構成される場合である。図１にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図１（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット８連結体が連結されている融合蛋白質で構成されている。図１（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット８連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質で構成されている。図１（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット４連結体が連結された融合蛋白質２個で構成されている。図１（ｄ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット２連結体が連結された融合蛋白質４個で構成されている。図１（ｅ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白に１個のシャペロニンサブユニットが連結された融合蛋白質８個で構成されている。
第２の例は、シャペロニン−抗原蛋白複合体が融合蛋白質と単独のシャペロニンサブユニットから構成される場合である。ここで単独のシャペロニンサブユニットとは、他の分子が共有結合で連結されていないシャペロニンサブユニット、すなわちシャペロニンサブユニットモノマーのことをいう。図２にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図２（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白と１個のシャペロニンサブユニットからなる融合蛋白質と、単独のシャペロニンサブユニット７個で構成されている。図２（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット４連結体が連結された融合蛋白質と、単独のシャペロニンサブユニット３個で構成されている。図２（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット２連結体が連結された融合蛋白質２個と、単独のシャペロニンサブユニット２個で構成されている。図２（ｄ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白に１個のシャペロニンサブユニットが連結された融合蛋白質、２個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット２連結体のＮ末端とＣ末端に連結された融合蛋白質、１個の抗原蛋白にシャペロニンサブユニット３連結体が連結された融合蛋白質、及び単独のシャペロニンサブユニット２個で構成されている。
第３の例は、シャペロニン−抗原蛋白複合体が融合蛋白質とシャペロニンサブユニット連結体から構成される場合である。図３にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図３（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白と１個のシャペロニンサブユニットからなる融合蛋白質と、シャペロニンサブユニット７回連結体で構成されている。図３（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白と１個のシャペロニンサブユニットからなる融合蛋白質、シャペロニンサブユニット３回連結体、及びシャペロニンサブユニット４回連結体で構成されている。図３（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット５連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質、及びシャペロニンサブユニット３連結体で構成されている。図３（ｄ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット２連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット４連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質、及びシャペロニンサブユニット２回連結体で構成されている。
第４の例は、シャペロニン−抗原蛋白複合体が融合蛋白質、単独のシャペロニンサブユニット、及びシャペロニンサブユニット連結体で構成されるシャペロニン−抗原蛋白複合体である。図４にいくつかの例の概念図を示す。すなわち、図４（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白と１個のシャペロニンサブユニットからなる。融合蛋白質、１個の単独のシャペロニンサブユニット、及び１個のシャペロニンサブユニット６回連結体で構成されている。図４（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、１個の抗原蛋白と１個のシャペロニンサブユニットからなる融合蛋白質、２個の単独のシャペロニンサブユニット、１個のシャペロニンサブユニット２回連結体、及び１個のシャペロニンサブユニット３回連結体でされている。図４（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット５連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質、１個の単独のシャペロニンサブユニット、及び１個のシャペロニンサブユニット２回連結体で構成されている。図４（ｄ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、２個の抗原蛋白がシャペロニンサブユニット２連結体のＮ末端とＣ末端に連結されている融合蛋白質が２個、２個の単独のシャペロニンサブユニット、及び１個のシャペロニンサブユニット２回連結体で構成されている。
さらに、抗原蛋白がシャペロニンサブユニット連結体のシャペロニンサブユニット間に連結されている場合を第５の例として、図５にいくつかの例の概念図を示す。図５（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、図１（ａ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体の変形例である。図５（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、図２（ｂ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体の変形例である。図５（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、図３（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体の変形例である。図５（ｄ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体は、図４（ｃ）に示されるシャペロニン−抗原蛋白複合体の変形例である。
また、シャペロニン−抗原蛋白複合体においては、シャペロニンサブユニットと抗原蛋白との間やシャペロニンサブユニット同士の連結部に蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列を設けてもよい。すなわち、この場合のシャペロニンと抗原蛋白の融合蛋白質においては、抗原蛋白とシャペロニンサブユニットが複数のペプチド結合を介して連結される。この場合、動物に接種されたシャペロニン−抗原蛋白複合体は、生体内の蛋白質分解酵素によって、まず、シャペロニンサブユニット同士の結合部位が攻撃されてそのリング構造が徐々に破壊され、その次に、抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの結合部位が攻撃されて抗原蛋白が放出される。すなわち、抗原蛋白自身への蛋白質分解酵素の攻撃は最後となるため、該抗原蛋白の免疫原性の発揮を延長させることができる。蛋白質分解酵素の切断アミノ酸配列としては特に限定されず、例えば、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、プラスミン、キモトリプシン等の蛋白質分解酵素の認識部位が挙げられる。
次に、融合蛋白質の折り畳み因子がフォルダーゼである場合について説明する。ＰＰＩａｓｅ等のフォルダーゼは単量体であるので、抗原蛋白の結合部位はそのＮ末端及び／又はＣ末端である。したがって、フォルダーゼのＣ末端及び／又はＮ末端に所望の抗原蛋白を連結して融合蛋白質を形成すればよい。
また、シャペロニン以外の分子シャペロンについても抗原蛋白との融合蛋白とすることにより免疫原として使用可能である。
なお、本発明の免疫原においては、融合蛋白質は必ずしも抗原蛋白の全長を含む必要はなく、抗原蛋白の一部と折り畳み因子を連結したものでもよい。すなわち、その抗原蛋白の一部によって抗原蛋白の全長と同等の免疫応答を誘導することができる場合は、抗原蛋白の一部と折り畳み因子の融合蛋白質によって本発明の免疫原を構成することができる。例えば、抗原蛋白の特定の抗原決定基に対する抗体を取得するために本発明の免疫原を使用する場合は、その抗原決定基を含む抗原蛋白の一部と折り畳み因子を連結した融合蛋白質によって本発明の免疫原を構成すればよい。例えば、抗原蛋白の一部としては、その抗原蛋白のアミノ酸配列のうち６残基以上を含むことが好ましい。
なお、本発明の免疫原に含まれる所望の抗原蛋白としては特に限定はなく、抗原性を有する蛋白質であれば全て適用可能である。特に好適な抗原蛋白としては、例えば、宿主細胞に有毒な抗原蛋白、精製方法が確立されていない抗原蛋白、非常に変性しやすい抗原蛋白、その他組換え体を作製することが困難な抗原蛋白、組換え体内で合成すると間違った立体構造をとってしまう抗原蛋白が挙げられる。すなわち、これらの蛋白質はそのままでは免疫原として使用することが困難であるが、折り畳み因子との融合蛋白質とすることにより免疫原として使用可能となる。
次に、本発明の免疫原の製造方法について説明する。本発明の免疫原は、抗原蛋白と折り畳み因子の融合蛋白質を含むものである。該融合蛋白質を製造する方法としては、抗原蛋白をコードする遺伝子と折り畳み因子をコードする遺伝子を連結させた融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を適宜の宿主細胞内で発現させることによって融合蛋白質を合成することが挙げられる。例えば、該融合遺伝子をプラスミドベクターに組込み、該組換えプラスミドベクターを宿主細胞に導入して組換え体を作製する。そして該組換え体を培養して該融合遺伝子を発現させ、組換え体抽出物から融合蛋白質を得ることができる。なお、折り畳み因子がシャペロニンの場合は、抗原蛋白とシャペロニンサブユニットの融合蛋白質の他に、単独のシャペロニンサブユニット及び／又はシャペロニンサブユニット連結体が必要な場合がある。これらの場合は、例えば、単独のシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び／又はシャペロニン連結体をコードする遺伝子を宿主細胞内で別途発現させればよい。例えば、プラスミドベクターにこれらの遺伝子を組込んで宿主細胞に導入することができる。なお、前記融合遺伝子と、単独のシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び／又はシャペロニン連結体をコードする遺伝子は、同一のプラスミドベクター上にポリシストロニックに連結してもよいし、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミド上にそれぞれに導入して、同一の宿主内で共発現させてもよい。さらに、単独のシャペロニンサブユニットは天然に存在するものなので、宿主細胞のゲノムＤＮＡ上のシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子から転写・翻訳させて、宿主細胞由来のシャペロニンサブユニットを供給してもよい。さらに、融合遺伝子、単独のシャペロニンサブユニット、シャペロニンサブユニット連結体をそれぞれ別の宿主細胞で発現させて、別々に精製した後に混合してもよい。どのような抗原蛋白でもシャペロニンと融合した融合蛋白質とすれば、シャペロニン−抗原蛋白複合体を形成することができる。
なお、一般に、宿主細胞に外来遺伝子を導入して発現させる際は、外来遺伝子のサイズが大きすぎる場合には宿主細胞に過度の負担がかかり、外来遺伝子の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンサブユニット８個でリングを構成する古細菌由来シャペロニンの場合、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子を８個連結した遺伝子に抗原蛋白をコードする遺伝子を連結した融合遺伝子を発現させようとすると、宿主細胞の種類によっては効率的な発現ができないことがある。したがって、本発明の免疫原を構成する融合蛋白質においても、大量生産の観点ではそのサイズはできるだけ小さい方がよい。そのためには、例えば、抗原蛋白の全長ではなくその一部を折り畳み因子との融合蛋白質とすることが挙げられる。さらに折り畳み因子がシャペロニンである場合は、融合蛋白質に含まれるシャペロニンサブユニットの数を調節することにより、融合蛋白質のサイズをより小さくすることができる。
上記の融合遺伝子等を導入する宿主細胞としては特に限定はなく、例えば、バクテリア等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等を使用することができる。より好適には、大腸菌等のバクテリアを宿主細胞に使用すれば、組換え体の増殖が他の宿主細胞に比べて格段に速く、融合蛋白質等を大量に生産することができる。大腸菌の場合は、融合蛋白質は細胞質へ発現されてもよいし、ペリプラズム領域へ分泌発現されてもよい。ペリプラズム領域に折り畳み因子と抗原蛋白との融合蛋白質を分泌発現させる場合は、該融合蛋白質の５’末端に分泌シグナル配列領域を設ける必要がある。該分泌シグナル配列によって、融合蛋白質はペリプラズム領域に分泌発現される。
また、本来的に細胞内では膜に存在する折り畳み因子を用いれば、融合蛋白質の発現量がさらに向上することがある。そのような折り畳み因子の例として、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであるＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅや、パーブリン型ＰＰＩａｓｅであるＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ等が挙げられる。これらのＰＰＩａｓｅは、元々は生体内においてグラム陰性菌のペリプラズム領域に存在しているものである。したがって、抗原蛋白が膜蛋白質などの場合、本来これらのタンパク質は細胞質外に発現している蛋白質であるため、上記ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅやＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅとの融合蛋白質として発現させれば、その発現量が向上させるのに好適である。
その他の宿主細胞を用いる場合においても、その細胞質に融合蛋白質を発現させてもよいし、細胞外に分泌発現させてもよい。この際、宿主細胞と発現ベクターの組み合わせには、より好適なものを選ぶ必要がある。例えば、ほ乳類細胞系において融合蛋白質を発現する場合、発現ベクターのプロモーターは、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターであることが好ましい。
プラスミドベクターを宿主細胞に導入する方法としては特に限定はなく、公知の種々の方法を用いることがでる。例えば、トランスフェクションとしてリン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。
一方、宿主細胞を用いることなく、バクテリアまたは真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）にて、融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることも可能である。
次に、本発明の免疫原を構成する融合蛋白質を精製する方法について説明する。融合蛋白質を精製する方法は特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、抗原蛋白とシャペロニンの融合蛋白質の場合には、以下の方法等が挙げられる。すなわち、組換え体内で融合蛋白質を発現させた後、該組換え体を回収して破砕し、細胞抽出液を回収する。細胞抽出液中の融合蛋白質を硫安塩析で回収したのち、適当な緩衝液に溶解し、イオン交換クロマトグラフィーや疎水性クロマトグラフィー等によって該融合蛋白質を回収する。これを限外濾過によって濃縮したのち、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウムと５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲル濾過をおこない、排出限界値直後のフラクションを回収することにより該融合蛋白質を精製することができる。融合蛋白質のＮ末端又はＣ末端に６−１０個のヒスチジン（「ヒスチジンタグ」と呼ばれる）を連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合蛋白質の精製はより簡便で効率的となる。また用いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又はアフィニティークロマトグラフィーを行うことによっても迅速・簡便に精製することができる。ただし、リング構造を形成した融合蛋白質のみを回収するには、イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過を組み合わせることが好ましい。シャペロニンが耐熱性のものである場合には、宿主からの抽出液を６０〜８０℃で加熱処理することによって宿主由来の夾雑蛋白質の大部分を沈殿させて除去することができ、融合蛋白質の精製をより簡略化することができる。このとき、抗原蛋白自身が耐熱性を有していなくても、該融合蛋白質はシャペロニンの内部に保持されているので変性することはない。
上記のいずれの方法によっても、得られた融合蛋白質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察することができる。所望の抗原蛋白がシャペロニンリングの内部に収納されていると、外径約１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。融合蛋白質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことで、リング構造をもつ融合蛋白質を効率的に回収できる。
目的とする抗原蛋白が膜結合性蛋白質又は膜貫通性蛋白質である場合には、融合蛋白質を精製した後、疎水性アルキル基がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）である非イオン性界面活性剤を作用させると、ミセルの直径がほぼ生体膜に相当し、シャペロニン内部で正しい構造を形成しやすい。上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４００、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
シャペロニン−抗原蛋白複合体が、融合蛋白質だけでなく、単独のシャペロニンサブユニットやシャペロニンサブユニット連結体を含む場合は、それぞれを別々の宿主細胞で発現させて、別々に精製してから混合する方法によってもシャペロニン−抗原蛋白複合体を得ることができる。
本発明の免疫原は、そのまま動物に接種しても高い免疫応答を誘導することができるが、アジュバントと混合して免疫用組成物とすることで、さらに免疫原性を高めることができる。すなわち、該免疫用組成物を用いることにより、より高効率で抗体を産生させることができる。アジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、アルミニウムアジュバント、百日咳菌アジュバント等が挙げられる。
次に、本発明の免疫原を使用することによる抗体の製造方法について説明する。
本発明の免疫原を使用して動物に免疫する方法としては、通常公知の免疫法を用いることができる。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等の動物に、本発明の免疫原を静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内に注射等の手段で投与することで、動物を目的の抗原蛋白で免疫しうる。
ポリクローナル抗体を製造する場合には、上記の方法で本発明の免疫原を動物に投与し、該動物の血液を採取し血清を得る。そして、この血清からポリクローナル抗体を取得することができる。血清からポリクローナル抗体を精製する方法としては、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
一方、モノクローナル抗体を製造する場合は、まず、抗体産生細胞（脾臓細胞）と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマの集団を作製する。そして該ハイブリドーマの集団から目的の抗原蛋白と結合する抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングし、目的とする抗体を産生する単一クローンを分離する。この方法は細胞融合法と呼ばれ、現在では日常的にこの方法によりモノクローナル抗体の製造が行われている（富山朔二、安東民衛編「単クローン抗体実験マニュアル」、講談社発行、１９８７）。
さらに詳細には、本発明の免疫原を上記手段で免疫の対象となる動物に投与して免疫することにより、モノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば、免疫後の脾臓細胞を得ることができる。さらにこの免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリドーマを作製し、所望する抗原決定基を認識する抗体を産生するクローンを選択し、このクローンを培養することにより目的とするモノクローナル抗体を製造することができる。この免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細胞としては、既に公知のものを適宜選択して用いることができ、例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１、ＭＰＣ１１−４５、６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等が挙げられる。
上記の免疫細胞とこれらの骨髄腫細胞との細胞融合は、例えば、ケーラーとミルシュタインの方法（Ｋｏｅｈｌｅｒ、Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５（１９７５））等の通常公知の方法に準じて行うことができる。より具体的には、この細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等の通常公知の融合促進剤の存在下において、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で行われ、ハイブリドーマの集団が調製される。
ハイブリドーマの集団からの所望のハイブリドーマの分離は、例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）培地等の通常の選別用培地でハイブリドーマを培養することにより行うことができる。すなわち、この選別用培地において目的とするハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに充分な時間をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行う。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナル抗体の検索及び単一クローン化に供することができる。
得られたハイブリドーマの中から目的とするモノクローナル抗体産生株を検索するには、例えば、ＥＬＩＳＡ法、プラーク法、スポット法、凝集反応法、オクタロニー法、ＲＩＡ法等の一般的な検索法を用いることができる。
ハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。
ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を採取するには、ハイブリドーマを常法に従って培養して、その培養上清から得る方法や、このハイブリドーマに適合性が認められる動物に投与して増殖させ、その腹水から得る方法等を用いることができる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、さらに塩析、ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー等の通常の手段により精製することができる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、免疫した融合蛋白質が有する抗原決定基を特異的に認識するモノクローナル抗体である。
一方近年は、抗体産生細胞（脾臓細胞）から抗体遺伝子をクローニングすることによりモノクローナル抗体を生産する技術が開発されている。例えば、遺伝子組換え技術により、抗体産生細胞から抗体をコードする遺伝子でファージを形質転換し、ファージ表面に目的の抗体を発現させて所望の抗体の遺伝子を簡便にスクリーニングするファージディスプレイ法が挙げられる。
ファージディスプレイ法で目的とするモノクローナル抗体を作製する場合には、特開平７−５０２１６７号公報に開示されている方法を用いることができる。すなわち上記の融合蛋白質で免疫した動物の抗体産生細胞からｍＲＮＡを分離し、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をはさむ部分に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法でＦａｂに相当する部分を増幅し、ファージミッドベクターに組み込んで多様性を高度に保持した抗体ライブラリーを作製することができる。ヘルパーファージの存在下にＦａｂを発現させ、免疫抗原を用いて特異Ｆａｂ産生クローンを濃縮及び選別し、目的Ｆａｂを大腸菌で大量に発現させる。免疫学的活性を充分に検索した後、Ｆｃ部分を含んだ発現ベクターに組込み、培養細胞に完全型ＩｇＧを発現させることができる。
抗原蛋白としてセロトニンレセプターを用いた本発明の免疫原について、例に挙げて以下に説明する。しかしながら、本発明は、この特定の抗原蛋白に限られるものではない。当業者であればセロトニンレセプターを他の所望の抗原蛋白と置き換えることにより不必要な実験を行うことなく本発明の利点を得ることは容易である。
セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンとも呼ぶ）は、セロトニン作動性神経細胞にて見られる細胞表面レセプターを介してその効果を発揮する、有効な天然に存在する神経伝達物質である。セロトニンは中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢系の両方で哺乳動物の体の機能に重要な役割を演じていることが明らかにされてきている。ＣＮＳでは脳幹を起点とするセロトニン作動性ニューロンが脳及び脊髄の殆どの領域に広がる非常に広汎性の系を形成することが解明されている。このような広汎性の系であることから、セロトニンが、生理学的応答、及びＣＮＳから生ずる疾病の発現、すなわち、睡眠、食餌、痛みの知覚、体温調節、血圧の調節、抑欝、分裂病等の幾つかの行動に関与していると考えられている。
セロトニンは末梢系においても同様に重要な役割を演じている。例えば、多くのセロトニンが胃腸系に見いだされ、セロトニンはこの系において種々の収縮、分泌、及び電気生理作用を仲介する。セロトニンに対して極めて感受性の強いもう一つの例として心血管系が挙げられる。
セロトニンは、細胞表面のレセプターに結合することにより、細胞生理学上の作用を引き起こす。現在、多数のタイプのセロトニンレセプターが存在することが確認されている。セロトニンレセプターとしては、少なくとも４種の主要ファミリー（５−ＨＴ１Ｒ−４Ｒ）が知られており、各ファミリーは薬理学的及び／又は構造的な相違に基づいて分類された８ないし１０のレセプターを含んでいる。各ファミリーは、例えば、５−ＨＴ１ａＲ、５−ＨＴ１ｂＲ、５−ＨＴ１ｃＲ、５−ＨＴ１ｄＲ又は５−ＨＴ１ｅＲと称される１又はそれ以上のタイプからなる。さらには、あるタイプのセロトニンレセプターには、５−ＨＴ１ｄαＲ又は５−ＨＴ１ｄβＲのような種々のサブタイプが知られている。
多数の構造的に分化したセロトニンレセプターの存在は、サブタイプ選択性の薬理学的物質が生成され得る可能性を提供している。個々のレセプターのサブタイプは中枢末梢セロトニン作動性系の異なった部分に特異的な作用を及ぼすよう機能し得ることから、サブタイプ選択性の薬理学的物質を開発することにより、副作用のより少ない、選択性を増した新しい治療物質が得られる。一例として或る血管系において、内皮細胞上の５−ＨＴ１レセプターの刺激は血管拡張を引き起し、一方平滑筋細胞上の５−ＨＴ２レセプターの刺激は血管収縮を引き起こす。いろいろな型のセロトニンレセプターの薬理作用及び臨床的知見は、例えば、グレノン（Ｇｌｅｎｎｏｎ  ＲＡ．）等、ニューロサイエンス・アンド・ビヘイビラル・レビューズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）１４（１）巻：３５ページ（１９９０）に詳述されている。
セロトニンは広い体内分布を示すことから、セロトニン作動性系に影響を及ぼす薬物の開発に大きな関心が持たれている。とりわけ、レセプター特異性アゴニスト及びアンタゴニストは、不安、欝、高血圧、偏頭痛、強迫性疾患、及び、癌の化学療法によって誘発される嘔吐を含む広範囲の疾病の治療薬としての関心がもたれている。セロトニンレセプターに対する抗体は研究上有用であるのみならず、治療薬としてのレセプター特異性アゴニスト及びアンタゴニストのひとつの候補となるものである。
このようなセロトニンレセプターのひとつである５−ＨＴ１ａＲは７回膜貫通性の膜蛋白質であり、現在のところ組換え蛋白質を入手することが難しく、また良い抗体を得がたい抗原蛋白として知られている。
本発明を適用して、折り畳み因子と５−ＨＴ１ａＲとの複合体を作製し免疫原として用いれば、免疫動物において高い免疫反応が引き起こされる。とりわけＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅあるいはシャペロニンと５−ＨＴ１ａＲとの融合蛋白質を作製し、これを免疫原として用いることが好適である。シャペロニンとしては大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬまたは古細菌シャペロニンＴＣＰを用いることが好適である。この場合、抗原蛋白としては、セロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの全長又はその６残基以上の部分蛋白質が用いられる。
いずれの場合にも、５−ＨＴ１ａＲが折り畳み因子との融合蛋白質である場合にのみ特異的な免疫応答が見られることから、本発明の免疫原が５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答の強化に有効であることは明らかである。
本発明はいかなる抗原蛋白であっても、折り畳み因子との融合蛋白質とすることによって、折り畳み因子を用いない対応の抗原蛋白に比べて一層高い免疫応答を引き起こすことができる。
【実施例】  以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
なお以下の実施例においては、分子生物学、蛋白質化学及び免疫学の分野における当業者によく知られ利用可能な多くの技術を用いているが、そのような方法は、必ずしも詳細には記載していない。酵素等の試薬類は市販のものを入手し、供給者のプロトコールに従って使用した。その他の実験手法は、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らのモレキュラー・クローニング：ア  ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨプレス、１９８９年）等に記載の方法を用いた。
（実施例１）大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬと抗原蛋白の複合体からなる免疫原
１．ＧｒｏＥＬとの融合蛋白質を発現するためのベクターの構築
大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬの遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号１に示した。この塩基配列情報を元に配列番号２と３に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。大腸菌ＨＭＳ１７４株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２と３に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、この増幅ＤＮＡ断片の両端には、プライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入されている。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号１に示される塩基配列と一致していた。
一方、互いに相補的な塩基配列をもつ配列番号４と５に示される合成ＤＮＡをアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡを調製した。該２本鎖ＤＮＡは順番に、ＸｂａＩサイト、プレシジョンプロテアーゼ認識部位をコードする塩基配列、ＢｇｌＩＩサイトを有する。この２本鎖ＤＮＡをＸｂａＩとＢｇｌＩＩで処理して回収し、あらかじめＸｂａＩとＢｇｌＩＩで処理したｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に導入し、プラスミドｐＴＲＣ９９−ＰＳを作成した。すなわち、ｐＴＲＣ９９−ＰＳは、ＸｂａＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間にプレシジョンプロテアーゼの切断部位をコードする塩基配列を含む発現用プラスミドである。
次に、増幅ＤＮＡ断片が導入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターを制限酵素ＳｐｅＩとＸｂａＩで処理し、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｂａＩで処理したｐＴＲＣ９９−ＰＳに導入し、ｐＴｒｃＧｒｏＥＬベクターを作製した。
次に、ｐＴｒｃＧｒｏＥＬベクターをＸｂａＩで処理し、再度上記増幅ＤＮＡ断片が導入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターを制限酵素ＳｐｅＩとＸｂａＩで処理することにより得たＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入して、ＧｒｏＥＬ２回連結体を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）２を作製した。さらに同様の操作を繰り返すことにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７を作製した。図６にｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７の構成を示す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７はｔｒｃプロモーターとｒｒｎＢターミネーターを有している。そして、ｔｒｃプロモーターの下流に７個のＧｒｏＥＬ遺伝子がタンデムに並んだＧｒｏＥＬ７回連結体の遺伝子、プレシジョンプロテアーゼの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、及びＦＬＡＧのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。
一方、所望の抗原蛋白としてヒト由来のセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲを選択した。５−ＨＴ１ａＲ遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号６に示した。この塩基配列情報を元に配列番号７と８に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、配列番号７と８に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、５−ＨＴ１ａＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、この増幅ＤＮＡ断片の両端には、プライマーに由来するＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサイトが導入されている。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターにＴＡクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号６に示される塩基配列と一致していた。次いで、この増幅ＤＮＡ断片をあらかじめＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで処理したｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７に導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７・５ＨＴ１ＡＲを作製した。一方、コントロールとして融合蛋白質ではなく５−ＨＴ１ａＲ遺伝子のみを単独で組み込んだ発現ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを作製した。
２．ＧｒｏＥＬ７回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の発現
得られた発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７・５ＨＴ１ＡＲで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を形質転換し、ＧｒｏＥＬ７回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現する組換え体を得た。
得られた組換え体のコロニー２０〜２５個を５００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌ  バクトトリプトン、１５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン）に接種した。２５℃、１１０ｒｐｍで２４時間培養し、培養液を得た。培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を回収した。
得られた菌体をＦＬＡＧ結合緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。この菌体破砕液を、３００００ｒｐｍで１時間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。一方、コントロールとして、ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用して、同様の操作を行った。
大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）７・５ＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。一方、コントロールの発現ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは可溶性画分に抗原蛋白は検出されなかった。ただし、ｐＴＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、５−ＨＴ１ａＲ遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。
次に、得られた上清に対して塩析し、沈澱した融合蛋白質を回収した。沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に溶解し、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した。透析後、透析内液をＤＥＡＥ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及びＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（東ソー社）によるアニオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によるゲルろ過によって、融合蛋白質を精製した。これによりＧｒｏＥＬ７回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲとが融合した融合蛋白質を得ることができた。
３．電子顕微鏡観察による融合蛋白質の構造確認
得られたＧｒｏＥＬ７回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の構造を確認するために、以下の手順で透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察を行った。まず、約０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した該融合蛋白質の精製標品１０μＬをカーボン蒸着済み銅メッシュグリッドに固定化し、２％酢酸ウラニル溶液で染色し加速電圧７５ｋＶで観察した。その結果、融合蛋白質はシャペロニン特有のリング構造をとっており、５−ＨＴ１ａＲはＧｒｏＥＬリングの内部に１分子ごとに格納されていることが確認された。すなわち、該融合蛋白質は天然のＧｒｏＥＬと同様にリング構造の複合体を形成していることが確認された。
４．プロテアーゼによる消化
得られた融合蛋白質のＧｒｏＥＬ７回連結体と５−ＨＴ１ａＲとの間に存在するプレシジョンプロテアーゼの認識配列が、プレシジョンプロテアーゼにより認識されるかどうかを検討した。得られた融合蛋白質を２．５Ｍ尿素の存在下でインキュベートした後、５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析後の溶液にプレシジョンプロテアーゼを作用させ、１５℃で一昼夜インキュベーションした。その後、その反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、５−ＨＴ１ａＲに相当するバンドが検出され、プレシジョンプロテアーゼによって融合蛋白質が切断されていた。一方、尿素処理を行わなかった場合は、５−ＨＴ１ａＲに相当するバンドは検出されず、プレシジョンプロテアーゼによって融合蛋白質は切断されていなかった。以上より、融合蛋白質はＧｒｏＥＬと５−ＨＴ１ａＲの複合体を形成しており、そのために５−ＨＴ１ａＲがＧｒｏＥＬによって保護されていると考えられた。
５．免疫原としての評価
得られたＧｒｏＥＬ７回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答を誘導する能力を、以下の手順で評価した。まず、得られた融合蛋白質と不完全フロイントアジュバントを混合して免疫用組成物を調製し、ウサギの皮下に注射した。通常、抗体価は感作後７−１０日に上昇すると考えられているので、免疫応答の強さを評価するために、免疫後３，５，７、１０日目に血清を回収しＥＬＩＳＡ法により分析した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴プレートに５−ＨＴ１ａＲ溶液（Ｅｕｒｏｓｅｃｒｅｅｎ  Ｓ．Ａ．社）を添加し、３０℃にて３時間インキュベーションすることにより、５−ＨＴ１ａＲをプレート上に固定化した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄したのち、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。採取した血清を、０．０５％トゥイーン２０を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で系列希釈した。希釈した血清を５−ＨＴ１ａＲでコーティングしたウエルに加え、室温にて１時間インキュベートした。プレートを、０．０５％トゥイーン２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社）を加え、室温にて１時間インキュベートした。各ウエルに１００μＬのペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ）溶液（ＫＰＬ社）を加え、波長４１０ｎｍにおける吸光度（Ａ４１０）を測定した。血清のＥＬＩＳＡ力価の終点は、対照ウサギの平均値に比べて吸光度の値が２ＳＤ大きい血清希釈となるように設計した。対照実験として、５−ＨＴ１ａＲをウサギに注射し同様の実験を行った。その結果、５−ＨＴ１ａＲとシャペロニンとの融合蛋白を免疫原として用いた場合、５−ＨＴ１ａＲのみを用いた場合に比べて、ウサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表１）。
以上より、５−ＨＴ１ａＲはＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白質にすることによって可溶性となり免疫原として使用可能になること、及びＧｒｏＥＬ７回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質からなる免疫原が、５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答の強化にも有効であることが明らかになった。
2004092221.tif 000003
（実施例２）古細菌シャペロニンＴＣＰと抗原蛋白の複合体からなる免疫原
１．ＴＣＰβ８回連結体との融合蛋白質を発現するためのベクターの構築
超高熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株（ＪＣＭ  Ｎｏ．１１８１６）のシャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）の遺伝子の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号９に示した。この塩基配列情報を元に配列番号１０と１１に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１株（ＪＣＭ  Ｎｏ．１１８１６）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１０と１１に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＴＣＰβ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、この増幅ＤＮＡ断片の両端には、プライマーに由来するＢｇｌＩＩサイトとＢａｍＨＩサイトが導入されている。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターにＴＡクローニングによって導入してｐＴ７（ＴＣＰβ）を作製した。ｐＴ７（ＴＣＰβ）に挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、配列番号９に示される塩基配列と一致していた。次に、ｐＴ７（ＴＣＰβ）を制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで処理し、ＴＣＰβ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片同士をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、反応液を電気泳動によって分離し、ＴＣＰβ遺伝子が同一方向に２個連結した遺伝子（ＴＣＰβ）２遺伝子を回収した。（ＴＣＰβ）２遺伝子をあらかじめＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＫＦ３（タカラバイオ社）に導入し、ｐＫＦ（ＴＣＰβ）２を作製した。同様にして、ｐＫＦ（ＴＣＰβ）２を制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで処理し、（ＴＣＰβ）２遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片同士をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、反応液を電気泳動によって分離し、ＴＣＰβ遺伝子が同一方向に４個連結した（ＴＣＰβ）４遺伝子を回収した。（ＴＣＰβ）４遺伝子をあらかじめＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＫＦ３に導入し、ｐＫＦ（ＴＣＰβ）４を作製した。同様にして、ｐＫＦ（ＴＣＰβ）４を制限酵素ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで処理し、（ＴＣＰβ）４遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片同士をＴ４ＤＮＡリガーゼによって連結し、反応液を電気泳動によって分離し、ＴＣＰβ遺伝子が同一方向に８個連結した（ＴＣＰβ）８遺伝子を回収した。
次に、互いに相補的な塩基配列をもつ配列番号１２と１３に示される合成ＤＮＡをアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡを調製した。該２本鎖ＤＮＡは順番に、ＮｄｅＩサイト、ＢａｍＨＩサイト、トロンビン認識部位をコードする塩基配列、ＢｇｌＩＩサイト、ＸｈｏＩサイト、６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓタグ）をコードする塩基配列、及びＥｃｏＲＩサイトを有する。
上記２本鎖合成ＤＮＡをＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで処理し、あらかじめＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで処理したプラスミドｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入して、プラスミドｐＴＦを作製した。さらに、プラスミドｐＴＦをＢａｍＨＩで処理し、（ＴＣＰβ）８遺伝子を導入してプラスミドｐＴＣＰ８を作製した。図７にｐＴＣＰ８の構成を示す。すなわち、ｐＴＣＰ８はＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを有する。そして、Ｔ７プロモーターの下流に、８個のＴＣＰβ遺伝子がタンデムに並んだＴＣＰβ８回連結体（ＴＣＰβ）８の遺伝子、トロンビンの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、及びＨｉｓタグをコードする塩基配列を含む。
一方、所望の抗原蛋白として実施例１と同様に５−ＨＴ１ａＲを選択した。実施例１で取得した５−ＨＴ１ａＲ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで処理し、あらかじめＢａｍＨＩで処理したｐＴＣＰ８に導入し、ＴＣＰβ８回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現するベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１ＡＲを作製した。すなわち、ｐＴＣＰ８・５ＨＴ１ＡＲによれば、ＴＣＰβ８回連結体がトロンビン切断アミノ酸配列を介して５−ＨＴ１ａＲが連結された融合蛋白質を得ることができる。一方、コントロールとしては実施例１と同様に５−ＨＴ１ａＲ遺伝子のみを単独で組み込んだ発現ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを使用した。
２．ＴＣＰβ８回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の発現
得られた発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１ＡＲで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＴＣＰβ８回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現する組換え体を得た。
得られた組換え体の１０個のコロニーを５００ｍＬの２×ＹＴ培地に接種した。３５℃で培養し、菌濃度がＯＤ６００＝０．６〜１．０になった時点でＩＰＴＧを添加して発現誘導し、さらに１０時間培養した。実施例１と同様にして菌体を回収した。
得られた菌体をＨｉｓタグ結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。この菌体破砕液を、１００００ｒｐｍで１時間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。一方、コントロールとして、ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を使用して、同様の操作を行った。
大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。一方、コントロールの発現ベクターｐＴＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは可溶性画分に抗原蛋白は検出されなかった。ただし、ｐＴＨＴ１ＡＲを保持する大腸菌の抽出液サンプルでは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、５−ＨＴ１ａＲ遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、ＴＣＰβ８回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。
得られた上清の一部を、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ５ｍＬ  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にアプライした。次に、上記Ｈｉｓタグ結合緩衝液でカラムを洗浄した後、Ｈｉｓタグ溶出緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール）にて融合蛋白質を溶出させた。この画分を５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液に対して透析を行なった。次に、同じ緩衝液を展開液としてＴＳＫＧｅｌＧ４０００（東ソー社）によるゲルろ過クロマトグラフィーを行い、排除限界値直後のピークし、精製されたＴＣＰβ８回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を得た。
３．電子顕微鏡観察による融合蛋白質の構造確認
得られたＴＣＰβ８回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の構造を確認するために、実施例１と同様にして透過型電子顕微鏡による観察を行った。その結果、融合蛋白質はシャペロニン特有のリング構造をとっており、５−ＨＴ１ａＲはＴＣＰリングの内部に１分子ごとに格納されていることが確認された。すなわち、該融合蛋白質は天然のＴＣＰと同様にリング構造の複合体を形成していることが確認された。
４．プロテアーゼによる消化
得られた融合蛋白質のＴＣＰβ８回連結体とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲのとの間に存在するトロンビンプロテアーゼの認識配列が、トロンビンにより認識されるかどうかを検討した。まず、得られた融合蛋白質を１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でインキュベートした後、５０ｍＭ  Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析後の溶液にトロンビンを作用させ、１５℃で一昼夜インキュベーションした。その後、その反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、５−ＨＴ１ａＲに相当するバンドが検出され、トロンビンによって融合蛋白質が切断されていた。一方、ＥＤＴＡ処理を行わなかった場合は、５−ＨＴ１ａＲに相当するバンドは検出されず、トロンビンによって融合蛋白質は切断されていなかった。以上より、融合蛋白質はＴＣＰと５−ＨＴ１ａＲの複合体を形成しており、そのために５−ＨＴ１ａＲがＴＣＰによって保護されていると考えられた。
５．免疫原としての評価
得られたＴＣＰβ８回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答を誘導する能力を、実施例１と同様にして行った。その結果、５−ＨＴ１ａＲとＴＣＰβ８回連結体との融合蛋白を免疫原として用いた場合、５−ＨＴ１ａＲのみを用いた場合に比べて、ウサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表２）。よって本実施例により作製されたＴＣＰβ８回連結体と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質からなる免疫原が、５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答の強化に有効であることが明らかになった。
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（実施例３）超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）との融合蛋白質を発現するためのベクターの構築
１．ＴｃＦＫＢＰ１８との融合蛋白質を発現するためのベクターの構築
超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）（Ｉｄｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３５７、４６５−、２００１）の塩基配列は既知であり、その配列を配列番号１４に示した。この塩基配列情報を元に配列番号１５と１６に示されるオリゴヌクレオチドを作製した。ＴｃＦＫＢＰ１８を含有するプラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２２２、２４９−、１９９８）を鋳型とし、配列番号１５と１６に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、この増幅ＤＮＡ断片の両端には、プライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入されている。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターにＴＡクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号１４に示される塩基配列と一致していた。
一方、配列番号１７及び１８に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を有している。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、２本鎖のＤＮＡ断片Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２を作成した。Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２はＳｐｅＩサイト、トロンビンの切断アミノ酸配列をコードする塩基配列、ＢａｍＨＩサイト、ＮｄｅＩサイト、およびＥｃｏＲＩサイトを含んでいる。
得られたＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片をＮｃｏＩとＳｐｅＩで、Ｔｈｒｏｍ−Ｆ２断片をＳｐｅＩとＥｃｏＲＩで処理し、それぞれのＤＮＡ断片を回収した。回収したそれぞれのＤＮＡ断片を、あらかじめＮｃｏＩとＥｃｏＲＩにて処理したプラスミドｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子−Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆ２断片の順で導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合蛋白質を発現できるプラスミドＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２を構築した。図８にＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２の構成を示す。すなわち、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２はＴ７プロモーターとＴ７ターミネーターを有している。そして、Ｔ７プロモーターの下流にＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子、トロンビンの認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、及びｐＥＴ２１ｄ由来のマルチクローニングサイトを含む。そして、目的の抗原蛋白の遺伝子をＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２のマルチクローニングサイトに導入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８と抗原蛋白の融合蛋白質を得ることができる。
一方、所望の抗原蛋白として実施例１及び２と同様に５−ＨＴ１ａＲを選択した。ただし、５−ＨＴ１ａＲ遺伝子を取得するためのＰＣＲは、配列番号１９及び２０に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。これにより、５−ＨＴ１ａＲ遺伝子の５’末端にＮｄｅＩサイト、３’末端にＨｉｓタグをコードする塩基配列とＳａｃＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターにＴＡクローニングによって導入し、塩基配列を決定したところ、配列番号６に示される塩基配列と一致していた。次いで、この増幅ＤＮＡ断片をあらかじめＮｄｅＩとＳａｃＩで処理したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２に導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現するベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２・５ＨＴ１ａＲを作製した。
２．ＴｃＦＫＢＰ１８とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の発現
得られた発現ベクターＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ２・５ＨＴ１ａＲで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＴｃＦＫＢＰ１８とセロトニンレセプター５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を発現する組換え体を得た。
得られた組換え体１〜２白金耳を７００ｍＬの２×ＹＴ培地に接種した。３５℃、１１０ｒｐｍで２４時間培養し、培養液を得た。培養液を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、菌体を回収した。得られた菌体をＨｉｓタグ結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｎａ−リン酸緩衝液  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  イミダゾール）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。この菌体破砕液を、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、可溶画分である上清を得た。この上清の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したところ、ＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の分子量に相当する位置にバンドが検出された。さらに、このバンドについて抗セロトニンレセプター抗体（コスモバイオ社）を用いてウエスタンブロッティングを行い、このバンドが５−ＨＴ１ａＲを含んでいることを確認した。
得られた上清の一部を、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ５ｍＬ  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にアプライした。次に、上記Ｈｉｓタグ結合緩衝液でカラムを洗浄した後、Ｈｉｓタグ溶出緩衝液にてＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質を溶出させた。
３．免疫原としての評価
得られたＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質の５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答を誘導する能力を、実施例１と同様にして行った。その結果、ＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲとの融合蛋白を免疫原として用いた場合、５−ＨＴ１ａＲのみを用いた場合に比べて、ウサギにおいて高い免疫反応が引き起こされることが明らかになった（表３）。よって本実施例により作製されたＴｃＦＫＢＰ１８と５−ＨＴ１ａＲの融合蛋白質からなる免疫原が、５−ＨＴ１ａＲに対する免疫応答の強化に有効であることが明らかになった。
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【産業上の利用可能性】  本発明の免疫原によれば、種々の原因により有効な免疫応答を誘導できないとされている抗原蛋白であっても、十分な免疫応答を誘導することができる。したがって、所望の抗原蛋白に対する抗体をより確実に製造することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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