(57)【要約】イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）に由来し、下記の性質を有する新規エステラーゼ。（１）作用、基質特異性：３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する。（２）作用至適温度：３７℃（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＨ７以上１０以下（４）温度安定性：４３℃で９７％安定（５）阻害、活性化及び安定化：ナトリウムイオン及びカリウムイオンで活性化、ストロンチウムイオン、鉄イオン（２価）及びパルミチン酸メチルエステルで阻害（６）分子量：約４６５００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、約４１０００Ｄａ（ゲルろ過法による）（７）等電点：ｐＩ  ４（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法による）本発明は、麦類種子の全粒粉や出穂直後から成熟するまでの間の成熟途上の麦類種子の粉砕物中のグルタミン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アルギニン等の遊離アミノ酸含量を高めた食品素材、並びに、その製造法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）に由来し、下記の性質を有する新規エステラーゼ。
（１）作用、基質特異性：３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解
して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する。
（２）作用至適温度：３７℃
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＨ７以上１０以下
（４）温度安定性：４３℃で９７％安定
（５）阻害、活性化及び安定化：ナトリウムイオン及びカリウムイオンで活性化、ストロンチウムイオン、鉄イオン（２価）及びパルミチン酸メチルエステルで阻害
（６）分子量：約４６５００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、約４１０００Ｄａ（ゲルろ過法による）
（７）等電点：ｐＩ  ４（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法による）
【請求項２】
３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する物質の生産能を有するイデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）。
【請求項３】
イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）を培地に培養し、培養物から請求項１記載の性質を有するエステラーゼを採取することを特徴とする新規エステラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規エステラーゼ、その生産菌及び製造法に関する。この酵素は、青枯病菌の病原性発現を抑制する作用を有する。
【背景技術】  農作物に甚大な被害をもたらす青枯病は、難防除の病害として知られている。青枯病の防除方法については、これまでは原因菌である青枯病菌を抗生物質などにより死滅させる（岡山県農業総合センター農業試験場研究報告、１９号、ｐ．２９−３５（２００１−１２））か、耐病性品種を台木とすることで生育を抑制する（日本植物病理学会報、６３巻、２号、ｐ．８３−８８（１９９７−４））ことを目的とした技術が主たるものである。
しかしながら、抗生物質などを用いる方法は、病原菌に対して生残するためのストレスを与えてしまうことにより、それを打破する耐性菌が出現するという問題がある。一方、耐病性品種を台木とする方法は、大変な手間と時間を要するため、大規模栽培では嫌われる傾向がある。
ところで、一般式（Ｉ）
2004083420.tif 000002
で示される３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルは、青枯病菌において、病原性発現の制御因子として機能することが判明している（Ｆｌａｖｉｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｃｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ａ．．，ａｎｄ  Ｄｅｎｎｙ，Ｔ．Ｐ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６，２５１−２５９）。それ故、青枯病菌が作物へ侵入し、増殖するに伴い、該化合物の濃度が高くなり、病原性が発現することになる。
そのため、上記化合物は青枯病に効果的な農薬の前駆物質としての利用が期待され、この化合物を分解する酵素活性は、青枯病を抑制するための新たな育種法に応用可能と想定される。
しかしながら、この化合物を分解する反応、例えば一般式（ＩＩ）
2004083420.tif 000003
で示される３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールに加水分解する方法としては、これまで一般的な脂肪酸エステルに用いられるアルカリ加水分解などの化学的な方法しかなく、強アルカリを使用するなど強い反応条件で行わなければならなかった。
もしも、この反応を触媒する酵素活性が見出されれば、化学的方法とは異なる穏和な反応条件で３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解することができ、また、他の脂肪酸が混在する場合においても、適当な酵素活性を利用すれば、酵素の基質特異性を活用して３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルだけを選択的に加水分解することも可能となる。しかし、これまで３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解する酵素活性は報告例がなかった。
そこで本発明は、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解する酵素、その生産菌及び製造法を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、土壌から分離した微生物が上記酵素、エステラーゼの生産能を有することを見出し、係る知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）に由来し、下記の性質を有する新規エステラーゼである。
（１）作用、基質特異性：３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する。
（２）作用至適温度：３７℃
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＨ７以上１０以下
（４）温度安定性：４３℃で９７％安定
（５）阻害、活性化及び安定化：ナトリウムイオン及びカリウムイオンで活性化、ストロンチウムイオン、鉄イオン（２価）及びパルミチン酸メチルエステルで阻害
（６）分子量：約４６５００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、約４１０００Ｄａ（ゲルろ過法による）
（７）等電点：ｐＩ  ４（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法による）
請求項２記載の本発明は、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する物質の生産能を有するイデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）である。
また、請求項３記載の本発明は、イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）を培地に培養し、培養物から請求項１記載の性質を有するエステラーゼを採取することを特徴とする新規エステラーゼの製造法である。
本発明により、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解する酵素、その生産菌及び製造法が提供される。
３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルは、青枯病菌における病原性発現の制御因子として機能していることから、該化合物を加水分解する本発明の新規エステラーゼは、青枯病を効果的に抑制するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に係る新規エステラーゼは、前記した性質を有しており、分子量の値から単一サブユニットからなるモノマー酵素である。この酵素は、イデオネラ  エスピー（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ  ｓｐ）  ０−００３株を培地で培養することにより得られる。新規エステラーゼ生産菌であるイデオネラ  エスピー  ０−００３株は、本発明者らによって愛知県で採取した土壌から分離したものである。すなわち、本菌は３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを単一炭素源とする分離用培地を用いて単離された。
本菌は、１６Ｓ  ｒＤＮＡの全塩基配列を解析することによりイデオネラ属に属する微生物であると同定された。その結果は以下の通りである。
１６Ｓ  ｒＤＮＡの１１５８ｂｐの塩基配列を決定し、ＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、イデオネラ属と高い相同性を示し、イデオネラ  エスピー．Ｂ５１３株（イネ由来株）などと９９％、イデオネラ  デクロラタンス（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ  ｄｅｃｈｌｏｒａｔａｎｓ）と９８％の相同性が認められた。
以上の結果から、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルに対する高い加水分解活性を有する微生物として土壌より分離された本菌は、イデオネラ  エスピー（Ｉｄｅｏｎｅｌｌａ  ｓｐ）であると同定された。
本菌の菌学的性質は以下の通りである。
ニッスイ標準培地（日水製薬製）上では、３０〜４３℃で良好な生育を示し、白色のコロニーを形成する。ＬＢ培地上でも生育するが、やや生育が劣る。３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを単一炭素源とする寒天培地上では、４３℃で生育する。パルミチン酸メチルエステル、メタノールを単一炭素源とする寒天培地上での生育は悪い。
本菌は、新菌種と認められ、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２４８から移管）である。本発明においては、本菌を自然に、もしくは人工的手段によって変異させて得られる変異株であっても、目的とするエステラーゼを生産する能力を有する限り、使用できる。
なお、本発明に係る新規酵素の生産菌としては、本菌の他、本菌から単離した酵素遺伝子を各種宿主ベクター系に導入した遺伝子操作微生物あるいは植物を利用することも可能である。
請求項１に記載の酵素としては、上記の微生物などを培地等にて培養して得られる培養物をそのまま、又は該培養物から回収した上清、あるいは菌体等もしくはそれらの処理物を粗酵素として使用できる。
菌体処理物としては、菌体の破砕物、菌体を破砕して得た無細胞抽出物、アセトン、トルエンなどで処理した菌体などがある。これらの他、菌体等から分離された粗酵素又は精製酵素、固定化処理された菌体や酵素などが本発明に使用できる酵素の例として挙げられる。
酵素の使用にあたっては、酵素を適当な担体に固定化して使用することにより、反応終了後の反応液からの酵素の分離・回収が容易になると共に、酵素の再利用も可能となる。担体としては、ポリアクリルアミド、ヒドロキシアパタイトなどが用いられる。
本発明においては、これら菌体培養物、微生物菌体及び菌体処理物などの粗酵素や精製酵素を通常１種類用いるが、所望により同様な能力を有するものを２種以上混合して用いることも可能である。
上記微生物を培養するための培地としては、通常この微生物が生育しうるものであればいずれのものでも使用できる。好適な培地としては、ニッスイ標準培地（日水製薬製）、ＳＣＤ培地（日本製薬製）などがあり、これらの培地で良好な生育を示す。また、高い酵素活性を得るために、例えば３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステル、パルミチン酸メチルエステルなどの脂肪酸エステル骨格を持つ化合物などを培地に添加し、酵素産生の誘導物質として利用することも有効である。
培養は常法に従って行えばよく、例えばｐＨ４〜１０、好ましくは６〜８、温度１５〜５０℃、好ましくは３０〜４５℃の範囲にて、好気的に６〜９６時間、好ましくは１２〜３０時間培養する。また、静置培養にて同様に培養することで高い酵素活性を得ることができる場合がある。
培養終了後、培養物から酵素を分離、採取し、精製する場合は、一般的な方法に従えばよく、例えば培養物から遠心分離などの固−液分離手段によって取得した上清、もしくは菌体を破砕処理して得た無細胞抽出物あるいはアセトン、トルエン等の溶媒による抽出物などから、濃縮、濾過、クロマトグラフ法等の常法により精製することができる。
本発明に係るエステラーゼは、以下に示す性質を有している。
（１）作用、基質特異性：３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解して３−ヒドロキシパルミチン酸とメタノールを生成する。
なお、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルの検出は、Ｓｔａｂｉｌｗａｘ−ＤＡ，３０ｍ×０．５３ｍｍ×０．２５μｍをカラムとして用いるガスクロマトグラフィーにより行うことができ、該エステルの加水分解により生成する３−ヒドロキシパルミチン酸は、同じガスクロマトグラフィーにより検出できる。
（２）作用至適温度：本酵素の作用至適温度は３７℃である。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：ｐＨ７以上１０以下である。
（４）温度安定性：４３℃で９７％が安定であり、５０℃では５４％が、６０℃では３８％が安定である。
（５）阻害、活性化及び安定化：ナトリウムイオン及びカリウムイオンで活性化され、ストロンチウムイオン、鉄イオン（２価）及びパルミチン酸メチルエステルで阻害される。
（６）分子量：約４６５００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）、約４１０００Ｄａ（ゲルろ過法による）
（７）等電点：ｐＩ  ４（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法による）
以下において、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例１】酵母エキス２．５ｇ／Ｌ、ペプトン５．０ｇ／Ｌ、ブドウ糖１．０ｇ／Ｌを含む培地２００ｍＬを５００ｍＬ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２５分間加熱滅菌した後、イデオネラ  エスピー  ０−００１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６０）を接種し、４３℃で２０時間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離して培養上清を得、これを粗酵素とした。酵素の精製には、７０％の硫安分画を行った。
試験例１
実施例１と同様に菌体を培養して得られた培養物を、遠心分離にて培養上清と菌体を得た。０．５ｍｇの３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２００μＬに上記培養上清あるいは菌体を懸濁させ、４３℃で１２時間反応させた。
反応終了後、反応液にジクロロメタン５００μＬを加え、３−ヒドロキシパルミチン酸を抽出した。抽出液をガスクロマトグラフィー（Ｓｔａｂｉｌｗａｘ−ＤＡ，３０ｍ×０．５３ｍｍ×０．２５μｍ）で３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルの分解活性を測定した。結果を表１に示す。
2004083420.tif 000004
試験例２
実施例１と同様にして０．５ｍｇのパルミチン酸メチルエステルあるいは３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルに対し反応及び分析を行い、分解活性をそれぞれ測定した。結果を表２に示す。
2004083420.tif 000005
表から明らかなように、３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルの加水分解活性は、パルミチン酸メチルエステルに対するよりも約５倍高い。このことから、本発明の酵素活性は３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルに選択的であることがわかる。
【産業上の利用可能性】  本発明により３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルを加水分解する酵素が提供される。この３−ヒドロキシパルミチン酸メチルエステルは、青枯病菌における病原性発現の制御因子として機能していることから、該化合物を加水分解する本酵素は、青枯病を効果的に抑制するために有用である。
【国際調査報告】
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