(57)【要約】本発明はＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤および前記阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬ならびにそれを用いた治療法に関する。本発明によれば免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患、例えば肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等を治療しうる薬剤等を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項２】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である請求項第１項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項３】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのＮ末端フラグメントである請求項第１項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項４】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（Ａ）で示されるペプチドを含むペプチドである請求項第１項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（Ａ）ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ
【請求項５】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（Ｂ）で示されるペプチドを含むペプチドである請求項第１項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（Ｂ）ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
【請求項６】
免疫担当細胞が、ＮＫＴ細胞である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項７】
ＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γ産生を阻害するものである請求項第６項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項８】
ＮＫＴ細胞のＭＩＰ−２産生を阻害するものである請求項第６項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項９】
ＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を阻害するものである請求項第６項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１０】
免疫担当細胞が、好中球である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１１】
免疫担当細胞が、Ｔ細胞である請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１２】
Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である請求項第１１項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１３】
Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介細胞障害を阻害するものである請求項第１項ないし第１２項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１４】
好中球媒介細胞障害を阻害するものである請求項第１項ないし第１２項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
【請求項１５】
請求項第１項ないし第１４項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
【請求項１６】
免疫担当細胞が、ＮＫＴ細胞、好中球、Ｔ細胞から選ばれる免疫担当細胞の１種以上である請求項第１５項記載の疾患の治療薬。
【請求項１７】
免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、肝炎、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症から選ばれる疾患である請求項第１５項または第１６項記載の疾患の治療薬。
【請求項１８】
請求項第１項ないし第１４項の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
【請求項１９】
肝障害が、ウイルス性肝炎または薬物性肝炎である請求項第１８項記載の肝障害の治療薬。
【請求項２０】
肝障害が、自己免疫性肝炎である請求項第１８項記載の肝障害の治療薬。
【請求項２１】
肝細胞の壊死を抑制するものである請求項第１８項ないし第２０項の何れかの項記載の肝障害の治療薬。
【請求項２２】
免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、請求項第１５項ないし第１７項の何れかの項記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
【請求項２３】
肝障害患者に、請求項第１８項ないし第２１項の何れかの項記載の肝障害の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤およびその用途に関する。
【背景技術】  Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球等の免疫担当細胞は、体内の免疫系等に関与するものである。
しかし、これら免疫担当細胞が異常に活性化することにより、種々の疾患、例えば、肝障害（Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０００，Ｊａｎ  ３；１９１（１）：１０５−１４、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，２００１，Ａｕｇ；３５（２）：２１７−２４、Ｔｉｅｇｓ  Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９２  Ｊｕｌ；９０（１）：１９６−２０３）、喘息（Ａｋｂａｒｉ  Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００３，Ｍａｙ；９（５）：５８２−８、Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ．，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，Ｎｏｖ；１２６（３）：１７９−８４、Ｃｏｒｒｉｇａｎ  ＣＪ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００；７８：３９−４９）、関節炎（Ｃｈｉｂａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２００３，Ｏｃｔ；７１（１０）：５４４７−５５、Ｎｕｒｉｅｖａ  ＲＩ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００３，Ｍａｒ；１１１（５）：７０１−６、Ｔａｙｌｏｒ  ＰＣ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００３，Ｊｕｎ；３（３）：３２３−８．）、糖尿病（Ｈｏｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００１，Ｓｅｐ；７（９）：１０５２−６、Ｈａｈｎ  ＨＪ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．，１９９３，Ｄｅｃ；９（４）：３２３−８）、狼瘡（Ｚｅｎｇ  Ｄ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３  Ｏｃｔ；１１２（８）：１２１１−２２、Ｏｌｉｖｅ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．．１９９３；１０（１）：２９−６３）、多発性硬化症（Ｓｉｎｇｈ  ＡＫ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００１，Ｄｅｃ  １７；１９４（１２）：１８０１−１１、Ｍａａｔｔａ  ＪＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，Ｏｃｔ  １；９０（２）：１６２−７５、Ｍｉｌｉｃｉ  ＡＪ．，ｗｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９８，Ｏｃｔ；７８（１０）：１２３９−４４）、動脈硬化（Ｔｕｐｉｎ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００４，Ｆｅｂ  ２；１９９（３）：４１７−２２）、肺線維症（Ｋｅａｎｅ  ＭＰ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，Ｍａｙ  １；１６２（９）：５５１１−８、Ｈｕ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，Ｎｏｖ；５４（５）：４１４−２２）等の疾患が引き起こされることが示唆されている。
上記のような免疫担当細胞の活性化等により引き起こされる疾患は、発症のメカニズムが複雑であるため治療が困難であることが多かった。
従って、本発明は上記疾患を治療しうる薬剤を提供することをその課題とする。
【発明の開示】
本出願人らは、先に、骨に多く含まれる酸性のカルシウム結合性の糖蛋白質であるオステオポンチン（以下、「ＯＰＮ」という）またはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体（以下、「ＯＰＮ阻害抗体」という）が、自己免疫疾患、リウマチおよびリウマチ性関節炎の治療（ＷＯ０２／０８１５２２号パンフレットおよびＷＯ０３／０２７１５１号パンフレット）、結核診断剤（特開２００３−２９４７３５号公報）、腱・靱帯の劣化予防剤（特願２００３−３８９５４３号）、間質性肺炎診断剤（特願２００３−１９４９７７号）等として利用しうることを見出し、先に特許出願をしている。
更に本出願人らは、ＯＰＮ阻害抗体の利用を拡大すべく、鋭意研究を行っていたところ、ＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分が前記の免疫担当細胞の活性化に関与していることを見出した。そして、ＯＰＮ阻害抗体でＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分を阻害することにより免疫担当細胞の活性化を抑制することを見出した。
また、このＯＰＮ阻害抗体を利用することで、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患等の治療薬となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を含有する免疫担当細胞活性化阻害剤。
（２）オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である（１）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（３）オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのＮ末端フラグメントである（１）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（４）オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（Ａ）で示されるペプチドを含むペプチドである（１）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（Ａ）ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ
（５）オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（Ｂ）で示されるペプチドを含むペプチドである（１）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（Ｂ）ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
（６）免疫担当細胞が、ＮＫＴ細胞である（１）ないし（５）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（７）ＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γ産生を阻害するものである（６）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（８）ＮＫＴ細胞のＭＩＰ−２産生を阻害するものである（６）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（９）ＮＫＴ細胞のＩＬ−４産生を阻害するものである（６）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１０）免疫担当細胞が、好中球である（１）ないし（５）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１１）免疫担当細胞が、Ｔ細胞である（１）ないし（５）の何れかの項記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１２）Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である（１１）記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１３）Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介細胞障害を阻害するものである（１）ないし（１２）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１４）好中球媒介細胞障害を阻害するものである（１）ないし（１２）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤。
（１５）（１）ないし（１４）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬。
（１６）免疫担当細胞が、ＮＫＴ細胞、好中球、Ｔ細胞から選ばれる免疫担当細胞の１種以上である（１５）記載の疾患の治療薬。
（１７）免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患が、肝炎、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症から選ばれる疾患である（１５）または（１６）記載の疾患の治療薬。
（１８）（１）ないし（１４）の何れかに記載の免疫担当細胞活性化阻害剤を有効成分とする肝障害の治療薬。
（１９）肝障害が、ウイルス性肝炎または薬物性肝炎である（１８）記載の肝障害の治療薬。
（２０）肝障害が、自己免疫性肝炎である（１８）記載の肝障害の治療薬。
（２１）肝細胞の壊死を抑制するものである（１８）ないし（２０）の何れかに記載の肝障害の治療薬。
（２２）免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の患者に、（１５）ないし（１７）の何れかに記載の治療薬を投与することを特徴とする当該疾患の治療方法。
（２３）肝障害患者に、（１８）ないし（２１）の何れかに記載の肝障害の治療薬を投与することを特徴とする肝障害の治療方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、血清中のＡＬＴ値を示す図面である。
図２は、ＨＥ染色した肝炎組織の図面である。
図３は、肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死の細胞数の比率を示す図面である。
図４は、肝炎モデルマウスにおける肝臓内のＯＰＮの発現量を示す図面である。
図５は、肝炎モデルマウスのウエスタンブロットの結果を示す図面である。矢印は、トロンビン切断型ＯＰＮを示している。
図６は、野生型マウスおよびＯＰＮ欠損マウスのＣｏｎＡ投与後の血清中のＡＬＴ値を示す図面である。
図７は、野生型マウスおよびＯＰＮ欠損マウスのＣｏｎＡ投与後の生存率を示す図面である。
図８は、肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を示す図面である（左図は肝臓内白血球中のリンパ球を抗ＮＫ１．１抗体とＴＣＲ抗体とで染色した結果を示す。中央図（Ｒ１）はＮＫ１．１＋ＴＣＲ＋であるＮＫＴ細胞集団画分、右図（Ｒ２）は、ＮＫ１．１−ＴＣＲ＋であるＴ細胞集団画分におけるＯＰＮ発現をＦＡＣＳ解析した結果を示す。）。
図９は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したＮＫＴ細胞およびＴ細胞の細胞培養上清中におけるＯＰＮ量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図面である。
図１０は、肝炎モデルマウスの肝臓内から分離したＮＫＴ細胞およびＴ細胞から抽出したｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅させ、各々の細胞が有するＯＰＮ受容体およびＭＩＰ−２を検出した結果を示す図面である。
図１１は、肝炎モデルマウスおよび野生型マウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型ＯＰＮに対する細胞遊走試験の結果を示す図面である。
図１２は、肝炎モデルマウスから得られた肝浸潤白血球のトロンビン切断型ＯＰＮに対する細胞遊走阻害試験の結果を示す図面である。
図１３は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、Ｍ５抗体およびコントロール抗体投与時のＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合をＦＡＣＳ解析した結果を示す図面である。
図１４は、肝炎モデルマウスの肝臓内における、Ｍ５抗体およびコントロール抗体投与時のＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞数をＦＡＣＳ解析した結果から、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞数を算出した結果を示す図面である。
図１５は、野生型マウスとＯＰＮ欠損マウスにそれぞれＣｏｎＡを投与してから６時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ数を、ＦＡＣＳ解析にて算出した結果を示す図面である。
図１６は、野生型マウスにＣｏｎＡを投与してから２４時間後の肝臓組織を染色した結果を示す図面である（左図は、ＭＰＯ抗体を用いて免疫染色した結果を示し、右図はＨＥ染色した結果を示す。）。
図１７は、野生型マウスの腹腔内にカゼインナトリウムを投与して分離した好中球に全長ＯＰＮ、ＮハーフＯＰＮ、およびＣハーフＯＰＮを添加した培養上清中のＭＰＯ活性を示す図面である。
図１８は、野生型マウスにＣｏｎＡを投与してから６時間後の肝臓内好中球数をＦＡＣＳ解析にて算出した結果を示す図面である。
図１９は、野生型マウスへのＣｏｎＡ投与後のＭＩＰ−２濃度の経時変化を示す図面である。
図２０は、野生型マウスへのＣｏｎＡ投与後の肝臓内におけるα４、α９インテグリンｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示す図面である（黒丸はコントロール抗体投与のグラフ、白丸はＭ５抗体投与後のグラフである。）。
図２１は、マウス肝臓のＮＫＴ細胞およびＴ細胞の培養上清中におけるＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図面である。
図２２は、Ｍ５抗体を投与したＣｏｎＡ肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したＣｏｎＡ肝炎マウスにおける肝臓中のＩＦＮ−γ発現量をＩＦＮ−γ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）を用いて定量した結果を示す図面である。
図２３は、４００μｇのＭ５抗体を、ＣｏｎＡを投与する３時間前とＣｏｎＡの投与と同時に各マウスに投与した場合のＡＬＴ値を比較した図面である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤（以下、「本発明阻害剤」という）は、ＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分（以下、「ＯＰＮ等」という）に対する抗体（ＯＰＮ阻害抗体）を有効成分とし、これを適当な薬学的に許容される担体成分と組み合わされることにより調製される。
本発明において用いられるＯＰＮ阻害抗体は、ＯＰＮ等を認識するものであれば特に制限無く使用することができる。
このようなＯＰＮ阻害抗体としては、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとＯＰＮ等との結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとＯＰＮ等との結合を阻害するものが好ましく、特にＲＧＤ配列を認識するインテグリン、例えばαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５等とＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリン、例えばα９β１、α４β１、α４β７等とＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害するものが好ましい。
ここでＮ末端フラグメントとは、ＯＰＮがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントのうちＮ末端側のフラグメントをいう。上記タンパク質分解酵素としては、例えばトロンビンが挙げられる。また、上記のＳＶＶＹＧＬＲ配列は、ヒトＯＰＮ（アクセッションナンバー：Ｊ０４７６５）の１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列である。
本発明におけるＯＰＮ阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃや、これらのＮ末端フラグメント、あるいは次の（Ａ）で示されるアミノ酸配列またはその相当配列を含んでいるペプチド（以下、これらを「ＯＰＮ関連ペプチド」と総称する）を抗原として用いることにより作製されたものが使用できる。
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なお、上記の相当配列とは、ヒト以外の動物のＯＰＮにおける、ヒトＯＰＮの１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列（ＳＶＶＹＧＬＲ）に相当する配列をいい、例えばブタではヒトと同じくＳＶＶＹＧＬＲ、サルではＳＶＡＹＧＬＲ、マウスやラットではＳＬＡＹＧＬＲ、ウシではＳＶＡＹＧＬＫ、ウサギではＳＶＡＹＲＬＫである。
ヒトについての好ましいＯＰＮ阻害抗体は、例えば、上記（Ａ）の配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、例えばこの両配列を連続して有するＯＰＮ−ａ（アクセッションナンバー：Ｊ０４７６５）の１５３番目バリン残基から１６９番目セリン残基までのペプチド（Ｂ）を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。
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また、ＯＰＮ阻害抗体の作製にあたり、ＯＰＮ関連ペプチドの抗原性を高めるためには、当該ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。このＯＰＮ関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）およびサイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。
上記ＯＰＮ関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５４）：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４，１０９０−１０９４）または活性化エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，４２，３０１−３０９）等の公知の方法によって行うことができる。
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＯＰＮ関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。
また、上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ＯＰＮ関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。
上記の方法によるＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。
次に、上のようにして得られた結合物を抗原とする抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。
すなわち、上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。
例えば、まず、ＯＰＮ関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射および筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回、行うことができる。
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、ＯＰＮ阻害抗体を得ることができる。
また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてＯＰＮ阻害抗体を得ることもできる。
更に、上記したＯＰＮ阻害抗体は常法により上記抗体の定常領域を治療対象とするヒトの抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体（欧州特許公開公報  ＥＰ０１２５０２３参照）やヒト化抗体（欧州特許公開公報  ＥＰ０２３９４００またはＥＰ０４５１２６、国際公開公報  ＷＯ０３／０２７１５１参照）としてもよい。
更にまた、このようにして得られたＯＰＮ阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したＦｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２のかたちで用いることもできる。
一方、実験動物としてマウスを用い、ＯＰＮに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのＯＰＮに対応するＯＰＮ阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、ＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。
以上説明した本発明阻害剤は、上記ＯＰＮ阻害抗体を有効成分とするものであるが、これを薬学的に許容される担体と組み合わせ、常法に従って製剤化することにより免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬（以下、「本発明治療薬」という）が得られる。
本発明治療薬における、ＯＰＮ阻害抗体の患者への投与量としては、患者の症状の程度、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、通常一日当り０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．５〜８０ｍｇ／ｋｇ程度であるから、これに適合した量を用いて製剤化することが好ましい。
また、本発明治療薬の剤型の例としては、注射剤、点眼用剤などの非経口剤が挙げられ、これらには本発明の効果を損なわない範囲で、通常医薬組成物の製造に使用される他の任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、例えば、吸着剤、保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、矯味・香剤、硬化剤、界面活性剤、懸濁化剤、甘味剤、滑沢剤、賦形剤、コーティング剤、流動化剤、光沢化剤、等張化剤、結合剤、増量剤等が挙げられる。
かくして得られる本発明阻害剤により、活性化が阻害される免疫担当細胞としては、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球等が挙げられる。これらの免疫担当細胞の中でもＴ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球の活性化を好適に阻害する。
また、本発明阻害剤は、上記免疫担当細胞の活性化により引き起こされるＦａｓ／ＦａｓＬ細胞障害や好中球媒介細胞障害を好適に阻害する。
更に、本発明治療薬により治療ないし改善される疾患としては、特に限定されないが、例えば、肝障害、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症等が挙げられる。また、本発明治療薬はこれらの疾患の中でも肝細胞の壊死を好適に抑制できるのでウイルス性肝炎や薬物耐性肝炎等の肝障害、特に自己免疫性肝炎等の急性肝障害に有効な治療薬となる。
本発明阻害剤ないし治療薬の作用機序については、不明な部分があるが、ＯＰＮまたはタンパク質分解酵素等により分解されたＯＰＮにより直接的または間接的に引き起こされる免疫担当細胞の活性化を、ＯＰＮ等に対する抗体（ＯＰＮ阻害抗体）が阻害すると考えられる。
以下、肝障害を具体例として作用機序を説明する。
まず、コンカナバリンＡ（以下「ＣｏｎＡ」という）誘導性肝炎においては、以下の実施例で示すように、肝臓内のＮＫＴ細胞がＯＰＮを産生していると考えられる。ここで産生されたＯＰＮは、タンパク質分解酵素等により分解されＯＰＮのフラグメントペプチドとなる。そして、ＯＰＮ等がオートクライン的にＮＫＴ細胞を活性化させると、ＮＫＴ細胞はＩＦＮ−γを産生する。このＩＦＮ−γについては以下のような作用を有することが知られている（Ｈｏｎｇ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００２  Ｎｏｖ；１１０（１０）：１５０３−１３）。産生されたＩＦＮ−γは細胞膜に存在するサイトカインレセプターに結合すると、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル経路（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ−ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）が動く。すなわち、チロシンキナーゼであるＪＡＫキナーゼ（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ）が活性化し、活性化したＪＡＫキナーゼは、レセプター細胞内領域のチロシン残基をリン酸化し、それに続いてサイトカイン誘導性転写活性化因子であるＳＴＡＴ１（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １）を活性化させる。さらにこの活性化ＳＴＡＴ１は、ＮＫＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させる。
また、ＮＫＴ細胞は活性化されるとＩＬ−４を産生することが知られており（Ｋａｎｅｋｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０００，Ｊａｎ  ３；１９１（１）：１０５−１４）、このときＩＬ−４はオートクライン的にＮＫＴ細胞に作用し、その結果ＮＫＴ細胞はＦａｓリガンドを発現する。そしてＮＫＴ細胞は肝細胞に対してＦａｓ／ＦａｓＬ媒介細胞障害を引き起こすこととなる。
一方、上記ＯＰＮ等によるＮＫＴ細胞の活性化によって、ＮＫＴ細胞はＭＩＰ−２（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）を産生する。このＭＩＰ−２は好中球の遊走・集積を促すことが知られており（Ｘｉａｏ  ＹＱ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９７  Ａｕｇ  ２２：１３６１（２）：１３８−４６．）、その結果好中球が産生する活性酸素は肝細胞に対して障害を引き起こすこととなる（好中球媒介細胞障害）。
これに対し、本発明阻害剤ないし治療薬の有効成分であるＯＰＮ阻害抗体は、ＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分に結合することにより、ＯＰＮ等により活性化するマクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球等の免疫担当細胞の活性化を阻害することができる。
また、ＯＰＮ阻害抗体が、上記のように免疫担当細胞を不活性化することに伴い、ＮＫＴ細胞のＩＦＮ−γ産生、ＭＩＰ−２産生、ＩＬ−４産生も阻害することができる。
そして、ＩＦＮ−γの産生が阻害される結果、これにより活性化されるＳＴＡＴ１や、このＳＴＡＴ１により活性化されるＮＫＴ細胞やＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化も阻害することができる。
また、ＩＬ−４の産生が阻害される結果、これにより活性化されるＮＫＴ細胞の活性化を阻害し、それに続くＦａｓリガンドの発現も阻害することができる。
従って、これらの活性化を阻害することにより、Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介細胞障害を阻害することができる。
更に、ＯＰＮ阻害抗体はＭＩＰ−２の産生を阻害する結果、好中球の遊走やＭＰＯの産生を阻害することができ、それに続く好中球媒介細胞障害も阻害することができる。
そしてひいてはＦａｓ／Ｆａｓ  Ｌ媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害による肝細胞の壊死を抑制し、肝障害を軽減、治療することができる。
同様、喘息、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、動脈硬化、肺線維症においても、ＯＰＮ阻害抗体で関連する免疫担当細胞の活性化を阻害することにより、これら疾患を治療することができるのである。
【実施例】  以下に、本発明の具体的な態様を実施例として示すが、本願は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例１】      ＯＰＮ阻害抗体の作製：
下に示すような、ヒトＯＰＮの内部配列（Ｖ１５３からＳ１６９）に対応する合成ペプチド（２Ｋ１ペプチド）を用意し、免疫化に使用した。
2004103403.tif 000004
この２Ｋ１ペプチドは、αｖβ３とα９β１インテグリンレセプターを認識するＲＧＤとＳＶＶＹＧＬ配列を有する。
この２Ｋ１ペプチドを、サイログロブリンと結合し、これを用い常法に従ってマウスを免疫化した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３７２１−３７２８）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたＧＳＴ／ＯＰＮａとＣＨＯ細胞から導いたＯＰＮ−ａには反応するが、ＧＳＴには反応しないように見えるハイブリドーマを選ぶことにより行った。
２Ｋ１ペプチドで免疫したマウスから、２Ｋ１と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体２Ｋ１を産生するハイブリドーマをＨｕｍａｎ  Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２Ｋ１と名付けて２００１年６月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７８８３として寄託した。
試験例  １
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物（トロンビン切断型ＯＰＮ）とＯＰＮ阻害抗体の反応性：
上記で得られた２Ｋ１抗体のＯＰＮおよびそのトロンビン消化物に対する結合能をウエスタンブロット法を用いて試験した。２Ｋ１抗体はＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃおよびＯＰＮ−ａのトロンビン消化物であるＮハーフＯＰＮと反応することがわかった。更に、この２Ｋ１抗体は、大腸菌から生産した非グリコシル化フォームの組換えＯＰＮと結合するばかりでなく、ＣＨＯ細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えＯＰＮ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７７：４８７−４９８，２００２）とも反応した。
【実施例２】      肝炎モデルマウスへのＯＰＮ阻害抗体の投与：
肝炎におけるＯＰＮ阻害抗体の働きを明らかにするため、野生型マウスにＣｏｎＡを投与して人工的に作製した肝炎モデルマウスにＯＰＮ阻害抗体を投与し、その作用を確認した。
なお、本実施例はマウスの系で行うため、ヒトＯＰＮに対する２Ｋ１抗体をそのまま用いることができない。そこでヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列に相当するマウスＯＰＮのＳＬＡＹＧＬＲ配列と、ＲＧＤ配列とを有する下記のマウスオステオポンチンの内部配列（Ｃ＋Ｖ１３８からＲ１５３）に対応する合成ペプチド（Ｍ５ペプチド）を用意し、実施例１と同様にしてＭ５抗体を作製し、これを用いた。
2004103403.tif 000005
一晩絶食させたＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に、Ｍ５抗体をＣｏｎＡ投与３時間前に４００μｇ／匹で静脈内投与した。コントロール群にはウサギＩｇＧを同容量投与した。次いで、ＣｏｎＡを３００μｇ／匹で静脈内投与した。Ｍ５抗体投与２、６、１２および２４時間後に血清を採取し当該血清中のＡＬＴ値の測定を行った。その結果を図１に示す。また、Ｍ５抗体あるいはコントロール抗体を投与した後、ＣｏｎＡ投与後２４時間のそれぞれの肝臓を採取し、ＨＥ染色を行った。その結果を図２に示した。ＨＥ染色の結果はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅで定量解析し、肝炎組織の顕微鏡視野中（４０倍）の壊死の細胞数の比率を算出した。その結果を図３に示した。
肝炎組織の顕微鏡視野中の壊死細胞数の比率（壊死率）は、Ｍ５抗体を投与した肝臓が１０％程度であったのに対して、ウサギＩｇＧを投与した肝臓は５０％程度であった（図３）。一方、ＡＬＴ値はＭ５抗体を投与した場合には１５００程度であり、５０００程度であったコントロールよりも低い値となった（図１）。この結果、Ｍ５抗体は肝炎による肝細胞の壊死を抑制することが判明した。
上記の通り、マウスＯＰＮに対するＭ５抗体が肝細胞の壊死を抑制したことから、ヒトＯＰＮに対する２Ｋ１抗体についても、ヒトの肝炎による肝細胞の壊死を抑制しうることが判明した。
【実施例３】      肝炎モデルマウスにおけるＯＰＮの発現：
肝炎マウスモデルは、野生型マウスにＣｏｎＡを１５ｍｇ／ｋｇで尾静脈に投与することにより作製した。この肝炎モデルマウスの肝臓内でのＯＰＮ発現を、ｍＯＰＮ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（（株）免疫生物研究所製）を用いたＥＬＩＳＡ法および抗オステオポンチン抗体（（株）免疫生物研究所製）を用いたウエスタンブロット法を用いて解析した。ＥＬＩＳＡ法の結果を図４に示した。また、ウエスタンブロットの結果を図５に示した。
ＥＬＩＳＡ法の結果より、マウスにＣｏｎＡを投与することで肝臓中のＯＰＮ濃度が時間と共に増加していた。また、ウエスタンブロットの結果より、肝臓中にトロンビン切断型ＯＰＮの上昇が確認された。
【実施例４】      肝炎におけるＯＰＮの機能の解析：
野生型マウスとＯＰＮ欠損マウス（ＯＰＮ−／−）（Ｒｉｔｔｌｉｎｇ  ＳＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１９９９，７：１０３−１１３）にそれぞれＣｏｎＡを２００μｇ／匹で投与した後、実施例２と同様に血清中のＡＬＴ値測定を行った。また、ＣｏｎＡを４００μｇ／匹投与してからの生存率を比較した。ＡＬＴ値測定の結果を図６に示した。また、生存率の結果を図７に示した。
ＡＬＴ値測定の結果より、ＯＰＮ欠損マウスでは、野生型マウスと比べてＡＬＴ値が減少していた。また、ＯＰＮ欠損マウスでは生存率も上昇していた。
【実施例５】      肝臓内におけるＯＰＮとその受容体の産生細胞の解析：
（１）肝浸潤白血球の調製
３００μｇのＣｏｎＡを尾静脈内投与し作製した肝炎モデルマウスの肝臓を（６時間）取りだした後、ホモジナイズし、メッシュを通した。次いでこれを、ＰＢＳにて洗浄後、肝細胞を取り除くため、ヘパリン（１００Ｕ／ｍｌ）を含む３３％のＰｅｒｃｏｌｌに加え、２，０００回転で１５分間処理して細胞ペレットを調製した。得られた細胞ペレットを赤血球溶血用緩衝液（以下、「ＨＬＢ液」という）（（株）免疫生物研究所製）で処理することにより、赤血球を溶血させた。更に、これらをＰＢＳで３回洗浄した後、Ｄ−ＭＥＭ／１０％ＦＣＳに加えて肝浸潤白血球を調製した。
（２）肝浸潤白血球を用いた細胞内ＯＰＮの検出
肝臓内においてＯＰＮが、ＮＫＴ細胞またはＴ細胞のどちらの細胞から産生しているのかを確認するため、細胞内サイトカイン染色および細胞培養上清からのＥＬＩＳＡ法による測定をそれぞれ以下の手順で行った。
まず、上記（１）で調製した肝浸潤白血球は、モネンシン（ｍｏｎｅｎｓｉｎ）存在下で９０分培養し、抗ＮＫ１．１抗体と抗ＴＣＲβ抗体（ともにＰｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ製）で細胞表面分子を染色した。次に、４％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、サポニンバッファー（１％ＦＣＳ、０．１％サポニン、０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ溶液）で膜透過処理を行った。更に、ビオチン化したＯＰＮ阻害抗体（（株）免疫生物研究所製）を加え、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ジャクソン製）を二次抗体として使用し、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ：ＢＤ製）にて解析した。
また、細胞培養上清からのＥＬＩＳＡはｍＯＰＮ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（（株）免疫生物研究所製）を用いて行った。
肝炎モデルマウスの細胞内サイトカイン染色の結果を図８に示した。また、細胞培養上清のＥＬＩＳＡ法による測定結果を図９に示した。
細胞内サイトカイン染色により、ＮＫ１．１＋ＴＣＲ＋であるＮＫＴ細胞集団の細胞内にＯＰＮの発現が確認された。また、細胞培養上清中におけるＯＰＮ量のＥＬＩＳＡ測定により、ＮＫ１．１＋ＴＣＲ＋であるＮＫＴ細胞集団においてＯＰＮ発現は検出されたが、ＮＫ１．１−ＴＣＲ＋であるＴ細胞集団においてＯＰＮ発現は検出されなかった。
従って、肝臓内におけるＯＰＮ産生細胞は主にＮＫＴ細胞であることが示唆された。
（３）肝炎発症に関わるＯＰＮ受容体およびＭＩＰ−２の解析
肝炎モデルマウスの肝臓内のＮＫＴ細胞およびＴ細胞から、α４インテグリン、α９インテグリンおよびＭＩＰ−２が発現されているかどうかを、ＮＫＴ細胞およびＴ細胞からそれぞれ抽出したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲで確認した。その結果を図１０に示した。Ｇ３ＰＤＨはコントロールとして使用した。以下にＲＴ−ＰＣＲに利用したプライマーとその配列を示した（配列番号４〜１１）。
Ｇ３ＰＤＨ：
2004103403.tif 000006
α４インテグリン：
2004103403.tif 000007
α９インテグリン：
2004103403.tif 000008
（センス）
2004103403.tif 000009
（アンチセンス）
ＭＩＰ−２：
2004103403.tif 000010
図１０より、α９インテグリンおよびＭＩＰ−２はＮＫＴ細胞に発現しているが、Ｔ細胞には発現していなかった。一方、α４インテグリンはＮＫＴ細胞およびＴ細胞の両方に発現していた。
【実施例６】      ＯＰＮのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験：
（１）細胞遊走試験
肝浸潤白血球のＯＰＮのトロンビン消化物に対する細胞遊走試験を行った。まず、実施例５で調製した肝炎モデルマウスの肝浸潤白血球の１０μｇ／ｍｌに、それぞれ全長ＯＰＮ（ｒＯＰＮ：非切断型ＯＰＮ）を１０μｇ／ｍｌ、トロンビン（Ｔｈｒ）を１Ｕ／ｍｌ、ＯＰＮのトロンビン消化物（Ｔｈｒ−ＯＰＮ）を１０μｇ／ｍｌを添加し、３７℃で２時間培養した後、細胞遊走効果をケモタキシスチャンバー（ポアサイズ５μｍの２４穴Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ製））を用いて行った。また、野生型マウスから得られた肝浸潤白血球についても同様の細胞遊走試験を行った。それらの結果を図１１に示した。
細胞遊走試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞は、ＯＰＮのトロンビン消化物に対する遊走効果が認められたが、全長ＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）に対する遊走効果はほとんど認められなかった。一方、野生型マウスから採取した細胞は、いずれのＯＰＮにも反応性を示さなかった。次に、どの受容体が細胞遊走に関わっているかを、抗体を用いた阻害試験によって同定した。
（２）細胞遊走阻害試験
肝炎モデルマウスから得られた細胞の、ＯＰＮのトロンビン消化物（Ｔｈｒ−ＯＰＮ）１０μｇ／ｍｌに対する細胞遊走効果を、実施例２で得られたＭ５抗体、Ｍ１抗体（Ｏ−１７）（（株）免疫生物研究所製）、抗インテグリンβ１（ＨＭβ１）抗体、抗β３（ＨＭβ３）抗体、抗αｖ（ＲＭＶ−７）抗体および抗α４（Ｒ１−２）抗体（何れもＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）の１００μｇ／ｍｌで阻害した。その結果を図１２に示した。
阻害試験の結果、肝炎モデルマウスから得られた細胞のＯＰＮのトロンビン消化物（Ｔｈｒ−ＯＰＮ）に対する細胞遊走はＭ５抗体により阻害された。また、抗インテグリンβ１抗体と抗α４インテグリン抗体も細胞遊走を阻害した。
【実施例７】      ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化阻害試験：
実施例２で得られたＭ５抗体を用いてＣＤ４＋Ｔ細胞活性化阻害試験を行った。肝浸潤活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、ＰＥ標識ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４：ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）抗体とＦＩＴＣ標識ＣＤ６９抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）を用い、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ：ＢＤ製）にて解析した（以下、「ＦＡＣＳ解析」という）。また、比較としてコントロール抗体（正常ウサギＩｇＧ）を用いて同様に試験を行った。それらの結果を図１３に示した。また、それらの解析結果から活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞数を算出したものを図１４に示した。
肝浸潤活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を解析した結果、Ｍ５抗体投与により肝臓中の活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合の減少および細胞数の減少が認められた。
【実施例８】      ＣｏｎＡ投与後の肝臓内浸潤細胞の解析：
（１）好中球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ数の算出
野生型マウスとＯＰＮ欠損マウスにそれぞれＣｏｎＡを投与してから６時間後の肝臓内浸潤細胞中の好中球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ数を、ＦＡＣＳ解析にて算出した。Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４＋、Ｆ４／８０＋画分をそれぞれ好中球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ画分とした。Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ４＋、Ｆ４／８０＋の染色は以下のようにして行った。ＣｏｎＡ投与後、６時間の肝臓から浸潤白血球を精製し、ビオチン化ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）抗体、Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）抗体（共にＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）、ビオチン化Ｆ４／８０抗体（Ｃａｌｔａｇ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）で反応させ、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ製）で検出した。ＦＡＣＳ解析の結果から算出された各マウスにおけるそれぞれの好中球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ数を図１５に示した。
ＦＡＣＳ解析の結果、野生型マウスにおいて好中球が他の細胞と比較して非常に多いことが確認された。また、ＯＰＮ欠損マウスでは好中球の欠損が確認された。
（２）ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）抗体による肝炎組織における好中球の発現の解析
肝炎モデルマウスから得られた肝組織をパラフィン包埋した後、５μｍに薄切し、内因性ペルオキシダーゼ処理を行った。次いでこの薄片に１次抗体として抗ＭＰＯ抗体（ＤＡＫＯ製）を４℃一晩反応させた。次に、二次抗体としてＥＮＶＩＳＩＯＮ（ＤＡＫＯ製）を反応させ、免疫染色を行った。
この免疫染色の結果を図１６に示した。
その結果、壊死した肝細胞内に好中球の集積がみられ、肝炎発症と好中球遊走の関与が確認された。
【実施例９】      肝炎モデルマウスにおけるＯＰＮのトロンビン消化物の機能の解析：
（１）好中球のＭＰＯ活性に種々のＯＰＮが与える影響
１２％カゼインナトリウム溶液をマウス腹腔内投与し６時間後に腹腔内から採取した好中球を種々のＧＳＴ融合ＯＰＮ蛋白質２０μｇ／ｍｌで刺激した。
全長マウスＯＰＮ（Ｌ１７−Ｎ２９４）はトロンビンによってＲ１５４とＳ１５５で切断され、Ｎ末端側のＮハーフＯＰＮ（Ｌ１７−Ｒ１５４）とＣ末端側のＣハーフＯＰＮ（Ｓ１５５−Ｎ２９４）となるので、これらをＧＳＴ融合タンパク質となるように次に示す方法にて作製した。なお、ＮハーフＯＰＮとＣハーフＯＰＮは、マウス腎臓ｃＤＮＡから次のプライマー（配列番号１２〜１５）を用いてＰＣＲによりクローニングした。
全長マウスＯＰＮ：
2004103403.tif 000011
（センス）
2004103403.tif 000012
（アンチセンス）
ＮハーフＯＰＮ：
全長ＯＰＮフォワードプライマー
（センス）
2004103403.tif 000013
（アンチセンス）
ＣハーフＯＰＮ
2004103403.tif 000014
（センス）
全長マウスＯＰＮリバースプライマー
（アンチセンス）
上記のプライマーを用いて得られるＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで制限酵素消化後、ｐＧＥＸ６Ｐ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に導入し、ＡＢＩ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて配列を確認した。次に、この配列を大腸菌ＪＭ１０９に導入して大腸菌を形質転換後、ＧＳＴ融合ＯＰＮ蛋白質を常法により精製した。
２０μｇ／ｍｌの上記ＧＳＴ融合ＯＰＮ蛋白質で好中球を３６時間刺激した培養上清からＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）活性を測定した。ＭＰＯ活性は、５０μｌの培養上清と１００μｌの３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ製）とを混和し、３７℃で３０分加温し、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより定量化した。その結果を図１７に示した。図中の全ての値はコントロールＧＳＴで測定されたＭＰＯ活性で差し引いた値である。
本結果から、ＮハーフＯＰＮがＭＰＯ活性を上昇させることが確認された。
（２）好中球の肝臓内への浸潤のＦＡＣＳ解析
Ｍ５抗体投与の有無でのＣｏｎＡ投与６時間後の肝臓内浸潤好中球を測定した。ＣｏｎＡ投与肝臓から白血球を採取し、Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋細胞をＦＡＣＳ解析した。また、比較としてコントロール抗体（正常ウサギＩｇＧ）を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図１８に示した。
ＦＡＣＳ解析の結果、Ｍ５抗体投与により、好中球の肝臓内への浸潤が抑制されることが確認された。
（３）肝臓中ＭＩＰ−２値の測定
野生型マウスにＣｏｎＡを投与した後、６、１２、２４時間後の肝臓中におけるＭＩＰ−２値をＭＩＰ−２  ＥＩＡ  ｋｉｔ（（株）免疫生物研究所製）を用いて測定した。また、比較としてコントロール抗体（正常ウサギＩｇＧ）を用いて同様に測定を行った。それらの結果を図１９に示した。
肝臓中ＭＩＰ−２値の測定の結果、Ｍ５抗体投与によりＭＩＰ−２の発現が減少していることが確認された。
（４）肝臓内におけるＯＰＮ受容体α４、α９インテグリンの発現の解析
α４インテグリンとα９インテグリンの発現を実施例５と同様のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲで測定した。測定した値はＧ３ＰＤＨにて補正することにより定量化した。また、比較としてコントロール抗体（正常ウサギＩｇＧ）を用いて同様に解析を行った。それらの結果を図２０に示した。
肝臓内におけるＯＰＮ受容体α４、α９インテグリンの発現解析の結果、α４、α９インテグリンｍＲＮＡは、Ｍ５抗体投与により減少していることが確認された。これは肝臓内にα４、α９インテグリンを発現する細胞の浸潤が抑制されていることを示唆する結果であった。
【実施例１０】      肝臓中のサイトカイン濃度の測定：
（１）肝臓中ＩＦＮ−γ発現細胞の解析
ＣｏｎＡ投与マウスから分離したＮＫＴ細胞とＴ細胞の培養上清中のＩＦＮ−γをＩＦＮ−γ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）を用いて測定した。その結果を図２１に示した。
肝臓中ＩＦＮ−γ発現細胞の解析の結果、ＩＦＮ−γは、主にＮＫＴ細胞から産生していることが確認された。
（２）肝臓中ＩＦＮ−γ量の測定
Ｍ５抗体を投与したＣｏｎＡ肝炎マウスと、コントロール抗体を投与したＣｏｎＡ肝炎マウスにおける肝臓中のＩＦＮ−γ発現量をＩＦＮ−γ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）を用いて定量した。それらの結果を図２２に示した。
肝臓中ＩＦＮ−γ量の測定の結果、Ｍ５抗体の投与により、コントロールの抗体を投与した場合よりも、ＩＦＮ−γ量が有意に減少していることが確認された。
以上のことからＮＫＴ細胞が産生するＯＰＮがオートクラインでＮＫＴ細胞に働いてＮＫＴ細胞を活性化させていることが考えられた。ＯＰＮを抗体にて阻害することでＩＦＮ−γ産生が低下したことから、ＯＰＮがＮＫＴ細胞活性化に重要な役割をしていることが示唆された。
【実施例１１】      ＯＰＮ阻害抗体の投与時期の検討：
ＯＰＮ阻害抗体の投与時期を検討するために、Ｍ５抗体の４００μｇをＣｏｎＡを投与する３時間前とＣｏｎＡの投与と同時に各マウスに投与し、ＡＬＴ値を測定した。その結果を図２３に示した。
ＡＬＴ値の測定の結果、ＣｏｎＡの投与３時間前にＭ５抗体を投与した場合には特に優れた肝炎抑制効果が認められた。一方、ＣｏｎＡの投与と同時にＭ５抗体を投与した場合であっても、肝炎抑制効果が認められた。
上記の通り、ＣｏｎＡを投与して発生するマウスの肝炎においてＮＫＴ細胞が主要なＯＰＮ産生細胞であることが判明した。そしてＯＰＮ阻害抗体を投与することにより、ＩＦＮ−γおよびＭＩＰ−２の産生が阻害され、その結果、ＮＫＴ細胞の活性化を阻害できることが判明した。また、ＮＫＴ細胞の活性化を阻害できることから、ＩＬ−４の産生も阻害することができると考えられる。更に、前記活性化に関連するＣＤ４＋Ｔ細胞および好中球の活性化の阻害や、また更にこれらの活性化に関連するＦａｓ／ＦａｓＬ媒介細胞障害および好中球媒介細胞障害も阻害できることが判明した。
従って、上記の活性化を阻害することにより、これら免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療できることが判明した。
このようにマウスのＯＰＮ阻害抗体（Ｍ５抗体）がＮＫＴ細胞活性化、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化、好中球活性等の阻害効果を示し、免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患を治療できることから、ヒトＯＰＮ阻害抗体（２Ｋ１抗体）についても、同様に疾患を治療しうることが示唆された。
【産業上の利用可能性】  本発明の免疫担当細胞活性化阻害剤は、免疫担当細胞の活性化を阻害するものである。
従って、上記阻害剤を有効成分とすることで免疫担当細胞の活性化を原因とする疾患の治療薬として有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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