(57)【要約】本発明は、聴覚機能障害の遺伝子治療用として適した聴覚機能障害用医薬を提供する。すなわち、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、又はそのプラスミドを封入したウイルスエンベロープベクターを有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬である。特に難聴の予防、治療を目的とする遺伝子治療用医薬として適している。
2004030702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬。
【請求項２】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドを有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬。
【請求項３】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、又はそのプラスミドを封入したウイルスエンベロープベクターを有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬。
【請求項４】
ウイルスが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスから選ばれる１種である、請求項３記載の聴覚機能障害用医薬。
【請求項５】
聴覚機能障害が難聴である、請求項１〜４のいずれか１項記載の聴覚機能障害用医薬。
【請求項６】
聴覚機能障害の予防薬である、請求項１〜５のいずれか１項記載の聴覚機能障害用医薬。
【請求項７】
聴覚機能障害の治療又は改善薬である、請求項１〜５のいずれか１項記載の聴覚機能障害用医薬。
【請求項８】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子または肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドの聴覚機能障害用医薬を製造する用途。
【請求項９】
肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子または肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドの治療に有効な量を聴覚機能障害を有する患者に投与することによる聴覚機能障害を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子治療等に用いられる、難聴のような聴覚機能障害の予防薬、治療乃至は改善薬として好適な聴覚機能障害用医薬に関する。
【背景技術】  聴覚障害は、人間にとって最も一般的な感覚欠損であり、１０人中１人以上が罹患すると言われている。聴覚障害は、例えばアミノグリコシド系抗生物質やシスプラチン（ＣＤＤＰ）のような耳毒性薬剤、騒音及び加齢を含む様々な要素によって引き起こされる可能性がある。
これらの要素は、聴覚シグナルを収集し、聴覚ニューロンを介して脳に転送する聴覚細胞として機能するコルチ器内の内耳有毛細胞に影響を及ぼす。更に、感覚有毛細胞の喪失に続発して聴覚神経の変性が発生し、聴覚の機能障害が悪化するものと考えられる。
一般に、哺乳類脊椎動物における有毛細胞及び聴覚ニューロンは、新しい有毛細胞及びニューロンを産生する出生後の細胞有糸分裂能力を有していない。哺乳類平衡聴覚上皮では、ｉｎ  ｖｉｖｏ前庭受容体については低レベルの再生が可能である。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの新生児マウス蝸牛において極めて限定された再生が観察されたことを除いて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの聴覚感覚上皮の再生は観察されていない。
重度の難聴を治療する目的で、人工内耳が患者にとって大きな利益を提供し、効果的に関与することは証明されているが、人工内耳の利点を享受できるかどうかは聴覚神経集団の質及び量に左右され、聴覚神経集団の消失は聴覚上の利点を大きく低下させる。
これまでに実施された試験で、刺激に利用できる生存聴覚ニューロンの総数と人工内耳を装着した被験者の聴力との間に明確な関係があることが証明されており、これは、人工内耳が必ずしも満足できる結果を生み出せないことを示している。
このため、人工内耳の有効性を高めるには、聴覚ニューロンを保存又は再生する治療方法を開発することが不可欠である。近年の試験では、例えば神経成長因子（ＮＧＦ：ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Ｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ：ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３：ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ−３）及びＮＴ−４／５のような多数の神経栄養因子が螺旋神経節細胞（ＳＧＣｓ）を含む内耳聴覚ニューロンの生存に影響を及ぼすことが証明されている。
本発明に関連する先行技術であるＵＳ−Ａ  ６，１３６，７８５には、脊椎動物に成長因子又はその混合物を投与することによって、アミノグリコシドのような耳毒性薬剤により引き起こされる損傷から内耳の感覚毛細胞を保護する方法が開示されている。その他の関連する先行技術としては、ＷＯ−Ａ  ９８／０００１４、ＵＳ−Ｂ  ６，０１７，８８６、ＪＰ−Ａ  ２００２−５０３６８７等が知られている。
【発明の開示】
本発明は、聴覚ニューロンを保存又は再生することで、聴覚機能障害を予防、治療等できる聴覚機能障害用医薬を提供することを課題とする。
本発明者は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）遺伝子が聴覚障害を治癒させることに有効な治療物質であることに注目し、研究を重ね、本発明を完成した。
請求項１の発明は、課題の解決手段として、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬を提供する。
請求項２の発明は、課題の他の解決手段として、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドを有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬を提供する。
請求項３の発明は、課題の他の解決手段として、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、又はそのプラスミドを封入したウイルスエンベロープベクターを有効成分として含有する、聴覚機能障害用医薬を提供する。
請求項４の発明は、課題の他の解決手段として、ウイルスが、センダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスから選ばれる１種である、請求項３記載の聴覚機能障害用医薬を提供する。
本発明の聴覚機能障害用医薬は、聴覚機能障害の予防薬、聴覚機能障害の治療又は症状の改善薬として適しており、特に難聴のための遺伝子治療用医薬として適している。
本発明は肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子または肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドの聴覚機能障害用医薬を製造する用途または肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子または肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子のプラスミドの治療に有効な量を聴覚機能障害を有する患者に投与することによる聴覚機能障害を治療する方法を提供する。
本発明でいう「肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）」は、様々な薬理作用を示す配列表の配列番号１で示される生理活性ペプチドであり、その薬理作用については、例えば、実験医学  Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３（増刊）３３０−３３９（１９９２）に記載されており、ＷＯ−Ａ  ９７／７８２４においても、従来技術として様々な用途が記載されているが、聴覚機能障害に対する薬理作用については、全く知られていない。
発明の詳細な説明
本発明の聴覚機能障害用医薬に有効成分として含有される肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子は、ＨＧＦを発現できる遺伝子をいい、具体的には配列表の配列番号２で示される。  この遺伝子には、発現されるポリペプチドがＨＧＦと実質的に同じ効果を奏する限り、その遺伝子配列の一部が欠失したり、他の塩基により置換されていたり、他の塩基配列が一部挿入されていたり、５’末端及び／又は３’末端に塩基が結合したりしたような遺伝子も包含される。
このようなＨＧＦ遺伝子としては、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９），ＪＰ−Ａ  ５−１１  １３８３、ＷＯ−Ａ  ９０／１０６５１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，９６７（１９８９）等に記載のＨＧＦ遺伝子を用いることができる。
ＨＧＦ遺伝子は、適当なベクター、好ましくはＨＧＦ遺伝子をプラスミドに組み込んだものを用いることができる。
ＨＧＦ遺伝子は、ＲＮＡを取り除いたウイルスの膜（ウイルスエンベロープ）にＨＧＦ遺伝子を封入したもの、又はＨＧＦ遺伝子をプラスミドに組み込んだものを封入したウイルスエンベロープベクターを用いることができる。
ここで用いるウイルスは、野生型ウイルスであっても、組み替え型ウイルスであっても良い。このウイルスとしては、センダイウイルス（ＨＶＪ）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルスから選ばれる１種が好ましい。これらの中でも、ＨＶＪがより好ましく、特に不活性化ＨＶＪが好ましい。この不活性化とは、ゲノムを不活性化したウイルスである。
なおセンダイウィルスとして具体的には、例えばＶＲ−１０５，ＶＲ−９０７等をＰ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡ在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），ｔｅｌｅｐｈｏｎｅ  １−７０３−３６５−２７００から購入することができる。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１５２３７６，ＶＲ−１０５＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１３７５４７８，ＶＲ−９０７＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ウイルスエンベロープベクターとしては、ＷＯ−Ａ  ０１／５７２０４に開示されたＨＶＪエンベロープベクターを用いることができる。
本発明の聴覚機能障害用医薬の剤型は、投与方法との関連において決定されるが、本発明においては注射薬とすることが好ましい。
本発明の聴覚機能障害用医薬を注射薬とするときは、ＨＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子のプラスミド、又は肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、又はそのプラスミドを封入したウイルスエンベロープベクターと、薬学的に受容可能なキャリア（滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、緩衝液等）とを混合することで製造できる。
キャリアには、等張性及び化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含有させることができる。このような物質は、使用された投薬量及び濃度において、患者に対して非毒性であるものである。
このような物質としては、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、その他の有機酸又はこれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニン又はトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン）；単糖、二糖及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、蔗糖、デキストリン、セルロース又はその誘導体）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）；ポリエチレングリコール等を挙げることができる。
本発明の聴覚機能障害用医薬を注射薬とするときは、密封アンプル又はバイアルにより、乾燥体および溶解液として別々に、あるいは水溶液として保存する。
本発明の聴覚機能障害用医薬を人に投与するときの投与部位は、例えば注射薬の場合、内耳内に蝸牛経由で直接投与する方法、内耳内に半規管経由で直接投与する方法、脳脊髄液内に投与し、内耳へ伝達させる方法、中耳内に投与し、内耳へ浸潤させる方法、人工内耳挿入手術の際に挿入電極に付着させる、又は除放させる装置を組み込み、内耳内へ直接投与する方法等を適用できる。
本発明の聴覚機能障害用医薬は、医療実施基準に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防又は処置されるべき状態）、投与方法、投与部位、投与計画及び当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、投与される。従って、本発明の聴覚機能障害用医薬の有効量又は適切な投与量は、このような考慮事項によって決定する。
本発明の聴覚機能障害用医薬の人への投与量は、ウイルスエンベロープベクターを投与する場合、患者の体重１ｋｇ当たり、通常０．００１μｇ〜１ｇ、好ましくは０．０１μｇ〜５００ｍｇ、より好ましくは０．１μｇ〜１００ｍｇのウイルスエンベロープベクターを投与する。
投与されるウイルスエンベロープベクター中のＨＧＦ遺伝子の量は、患者の体重１ｋｇ当たり、通常０．０１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍｇである。
本発明の聴覚機能障害用医薬は、聴覚機能障害の遺伝子治療用医薬として用いることができ、聴覚機能障害用の予防薬、治療又は症状改善薬として適しており、聴覚機能障害の内、特に難聴用の予防薬、治療又は症状改善薬として適している。
我々は本研究において、ヒトＨＧＦを含むＨＶＪ−Ｅのクモ膜下脳脊髄液中への注入が、アポトーシス抑制により有毛細胞および螺旋神経節細胞の喪失を予防することを示した。
すなわち、ＨＧＦ遺伝子をカナマイシン処置直前に投与することにより聴覚障害を予防することができ、またカナマイシンによる聴覚障害惹起後でも聴覚機能が回復した。
これらの結果は、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いるＨＧＦ遺伝子治療の、極めて高い有用性を示している。
内耳への遺伝子移入に関しては、基本的に４つの外科的手法が行われている。
ｉ）蝸牛切開術による、蝸牛中への直接注射
ｉｉ）膜を通した注射あるいは、ベクターを含むジェル（ｇｅｌ）小片を無傷の膜上に置き浸透させることによる、正円窓膜を通じての投与
ｉｉｉ）切開術による、後半規管を通しての内耳内投与
ｉｖ）内リンパ嚢中への投与
これまでアデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のいくつかのウイルスベクターは、上記４つの手法のいずれかを用い、内耳内に直接投与されてきた。
しかしながらそれぞれの手法は、侵襲性および有効性の観点から、それぞれ利点および欠点を有している。
我々は本研究において、蝸牛への直接注射による内耳への侵襲を避けるため、ＨＶＪ−Ｅベクターをクモ膜下脳脊髄液中に注射した。
この方法により、脳脊髄液中における導入遺伝子の発現を酵素活性および免疫染色により確認し、また脳あるいは耳組織内において有意な損傷を認めなかった。この事実は、ＨＶＪ−Ｅベクターそのものが、クモ膜下脳脊髄液への投与後、内耳内螺旋神経節細胞に到達したことを示唆しており、クモ膜下脳脊髄液から内耳への、いくつかの可能性ある経路が示された。
ベクターを膜内に注入した際、離れた器官において、いかなるルシフェラーゼ活性も観察されなかったので、クモ膜下脳脊髄液から内耳に到達する最もあり得る経路は、蝸牛管経由だと考えられる。
仮にベクターが血流経由で全身に広まったのであれば、静注後ルシフェラーゼ活性はまず脾臓において認められるので、脾臓や肺のような離れた器官においても導入遺伝子の発現が検出されるはずである。
従来ＮＧＦ，ＢＤＮＦ，ＧＤＮＦ  ａｎｄ  ＮＴ−３等の向神経因子が、聴覚の治療に用いられてきた。
しかしながら、これまでＨＧＦはこの目的には用いられてこなかった。
肝臓への効果に加え、海馬、大脳皮質、知覚ニューロン、運動ニューロン等においてＨＧＦは向神経活性を示すことが明らかになっているが、今回我々は、ヒトＨＧＦが、クモ膜下脳脊髄液および螺旋神経節細胞の相方に認められ、それがラットの内因性ＨＧＦを誘導したことを示した。
聴覚系へのＨＧＦ遺伝子治療は、ニューロトロフィンを利用する従来の遺伝子治療法に勝るいくつかの利点を有すると思われる。
また人工内耳とＨＧＦ遺伝子治療の併用、すなわち人工内耳手術中にＨＧＦ遺伝子を投与することも効果的であろう。
聴覚障害は有毛細胞および螺旋神経節細胞の喪失を伴い、これらの喪失予防はアポトーシスによる細胞死に対するＨＧＦの保護作用によりなされる。
ＨＧＦの発現は、カナマイシン処置による聴覚障害惹起後の機能回復にも効果的であった。
このように、知覚神経性の聴覚障害治療にあたり、ＨＧＦ遺伝子治療は可能性の高い方法の一つである。
本研究は、ＨＧＦ遺伝子とＨＶＪ−Ｅベクター送達システムの組み合わせにより、聴覚障害治療のための新たな知見と手法を与えるものである。
本発明の聴覚機能障害用医薬は、特に難聴の予防、治療等を目的とした遺伝子治療用の医薬として好適である。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例の聴覚機能試験における聴覚機能の経日変化を示すグラフである。
図２は、実施例の聴覚機能試験における聴覚機能の経日変化を示すグラフである。
図３ａは無傷の螺旋神経節細胞の顕微鏡写真、図３ｂはカナマイシン処置群の顕微鏡写真、図３ｃはカナマイシン＋ＨＧＦ処置群の顕微鏡写真である。
図４は、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群とカナマイシン＋ベクター処置群における、螺旋神経節細胞密度を示すグラフである。
図５は、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群とカナマイシン処置群における、螺旋神経節細胞密度を示すグラフである。
【実施例】  以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
プラスミドＤＮＡの調製
ｐＣＭＶ−ｌａｃＺ（９．２ｋｂ）は、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、マディソン、ワイオミング州、アメリカ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ）（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）内へ、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位で挿入することによって構築した。
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ−ＧＬ３（ｐｃＬｕｃ−ＧＬ３：７．４ｋｂ）は、ｐＧＬ３ベーシックベクター（プロメガ）からのルシフェラーゼ遺伝子をｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）内にクローニングすることによって構築した。
ｐＶＡＸ１−ｈＨＧＦ（５．２ｋｂ）は、ヒトＨＧＦ  ｃＤＮＡをｐＶＡＸ１（３．０ｋｂ）（インビトロゲン）内にＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位で挿入することによって構築した。
プラスミド類は、キアゲン・プラスミド単離キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。
ＨＶＪ−エンベロープベクターの調製
センダイウイルス（ＨＶＪ；Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）エンベロープベクター（ＨＶＪ−Ｅ）は、ＷＯ−Ａ  ０１／５７２０４の実施例８に準じて、プラスミドＤＮＡを不活化ＨＶＪ粒子内に組み込むことによって調製した。但し、ＨＶＪは遠心分離により精製し、紫外線照射により不活性化した。
ＨＶＪ−Ｅ懸濁液（本発明の聴覚機能障害用医薬）の調製
１０，０００赤血球凝集単位であるＵＶ不活化ＨＶＪ（Ｚ菌株）を、２００μｇのプラスミドＤＮＡ及び０．３％トライトンＸと混合し、平衡生理食塩液（ＢＳＳ：１３７ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を用いて洗浄し、クモ膜下注入のためにＢＢＳを用いて１００μＬに調製した。本実施例では、ｐＣＭＶ−ｌａｃＺ、ｐｃＬｕｃ−ＧＬ３、ｐＶＡＸ１−ｈＨＧＦ、ｐｃＤＮＡ３又はｐＶＡＸ１プラスミドＤＮＡを含有するＨＶＪ−Ｅを使用した。
実験動物及び処置群
正常なプライエル反射を示すＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄性ラット（６週齢；体重２００〜２１０ｇ）を日本Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社から入手した。すべての処置は、大阪大学実験動物委員会ガイドラインに従って実施した。
動物は、保護群、救済群、保護／救済群、ベクター対照群及び非処置群の５つの群に分けた。全群の動物は、アミノグリコシド中毒によって両耳の聴覚を喪失させ、硫酸カナマイシン（明治製菓、東京）を連続１４日間に渡り、皮下注射（４００ｍｇ／ｋｇ／日）によって投与した。
保護群及び保護／救済群には、カナマイシン処置の初日にｈＨＧＦ遺伝子（ｐＶＡＸ１−ｈＨＧＦ）を含有するＨＶＪ−Ｅ懸濁液をクモ膜下注入した。
ベクター対照群には、上記と同一方法でクモ膜下注入により、対照ベクター（ｐＶＡＸ１）を含有するＨＶＪ−Ｅ懸濁液を投与した。
救済群及び保護／救済群には、カナマイシン処置の最終日（第１４日）にｐＶＡＸ１−ｈＨＧＦを含有するＨＶＪ−Ｅを注入した。
更に、組織化学的解析及びルシフェラーゼ定量のため、ｐＣＭＶ−ｌａｃＺ又はｐｃＬｕｃ−ＧＬ３を含有するＨＶＪ−Ｅを動物に投与した。
このような処置後、トランスフェクション７日後にβ−ガラクトシダーゼの発現を観察し、トランスフェクションの１日後にルシフェラーゼ活性を測定した。
クモ膜下腔へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入
本試験では、ＣＮＳ及び内耳内へのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入法として、ＨＶＪ−Ｅの注入を使用する小脳延髄槽内への遺伝子導入法を実施した。
クモ膜下腔内へ注入するために、ケタミン（三共、日本）及びキシラジン（バイエル）を用いて動物に麻酔をかけた後、各動物の頭部を腹臥位で固定し、後頭脳正中線切開部を通して環椎後頭膜を露出させた。
ステンレス製カニューレ（２７ゲージ；ベクトン・ディッキンソン）を小脳延髄槽（クモ膜下腔）内へ挿入し、カニューレの位置を確認して、脳内圧上昇を回避するために脳脊髄液（１００μＬ）を取り出した後、マーカー遺伝子、ｈＨＧＦ遺伝子又は対照ベクターを含有するＨＶＪ−Ｅ（１００μＬ）を５０μ／ｍｉｎの速度で注入した。
その後３０分間は、動物の頭部を下に向けておいた。投与後に体重減少、活動低下又は行動変化を示したラットはいなかった。
ルシフェラーゼ活性についての定量
ルシフェラーゼ遺伝子がトランスフェクトされたラットを、トランスフェクション２４時間後に麻酔下で屠殺した。器官（脳、肺、脾臓、肝臓及び蝸牛）を採取し、個別に５０ｍＬファルコンチューブ内に入れた。
ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ・アッセイキット（プロメガ）を用いて測定した（４４  ｏｆ  ＨＶＪ−Ｅ）。組織抽出物のタンパク質濃度を測定することによってルシフェラーゼレベルを標準化した（４４  ｏｆ  ＨＶＪ−Ｅ）。ルシフェラーゼ単位は、組織タンパク質１ｇ当たりの相対発光量（ＲＬＵ）として表した。
脳脊髄液中のヒトＨＧＦについての酵素免疫測定法
本試験には、ｈＨＧＦ遺伝子を含有するＨＶＪ−Ｅの注射の５日及び１４日後にラットから採取した脳脊髄液（ＣＳＦ）（１００μＬ）を使用した。
ＣＳＦ中のヒトＨＧＦ及びラットＨＧＦの濃度は、抗ヒト及び抗ラットＨＧＦ抗体を使用するエンザイムイムノアッセイによってアッセイキットの製造業者（免疫研究所、東京）の取扱説明書に従って測定した。
ヒトＨＧＦに対する抗体は、ヒトＨＧＦとのみ反応し、ラットＨＧＦとは反応しなかった。ラットＨＧＦに対する抗体は、ヒト及びラットＨＧＦの両方と反応した。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
エーテルを用いてラットに深い麻酔をかけ、断頭し、側頭骨を低温リボヌクレアーゼ無含有生理食塩液中に入れた。耳嚢を除去し、解剖顕微鏡下で全蝸牛を単離した。ラットからの組織を溶解緩衝液中にプールし、ホモジナイザーを使用してホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ第１鎖合成システム（インビトロゲン）を用いてＲＮＡを逆転写させた。
ヒトＨＧＦ及びＧＡＰＤＨに対する特異的プライマー：ＨＧＦ、上流プライマー５’−ＴＴＣＡＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＡＣＧＣ−３’、下流プライマー５’−ＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧＡＧＴＡＴＡＧＣＡＣＣＡＴＧ−３’；ＧＡＰＤＨ、上流プライマー５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡ−３’、下流プライマー５’−ＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡ−３’（以上それぞれ配列表の配列番号３、４，５および６）を使用して、第１鎖ｃＤＮＡを増幅させた。
ＰＣＲ条件は、各セットのプライマーに対して最適化した。ＰＣＲ反応混合液は、５μＬのｃＤＮＡ、５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、４μＬの２．５ｍＭのｄＮＴＰ、２．５μＬの２０ｐＭ上流及び下流プライマー、及び１．５ＵのＴａｑポリメラーゼを含有しており、４５μＬとなるまで蒸留水を添加した。
加熱サイクル条件：ＨＧＦ、９４℃で４５秒間、７０℃で２分間及び７２℃で２分間；ＧＡＰＤＨ、９４℃で４５秒間、５８℃で１分間及び７２℃で２分間。
聴覚機能の評価
聴覚機能の生理的状態を評価するために、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）聴力検査を実施した。
ＡＢＲｓは、ベースライン値を測定するためにカナマイシン投与初日の前日に測定し、更にカナマイシン処置開始から７、１４、２１、２８及び５６日後に再度記録した。
聴覚機能の各試験前に、動物にはケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）−キシランジン（１０ｍｇ／ｋｇ）溶液の筋肉内注射により麻酔をかけた。針電極を同側右耳翼（参照電極）、対側耳翼（接地電極）及び頭頂（能動電極）の皮下に配置した。全記録は防音室にて、日本光電製Ｎｅｕｒｏｐａｃｋ  ＩＶ（ＭＥＭ−４１０４）システムを用いて実施した。
単一波長１００μｓｅｃのクリック音（１０／ｓｅｃ）によって電位を誘発し、これらのモノラル刺激をラウドスピーカーによって右耳へ送達した。反応をデジタルフィルタリングし（バンドパス：５０〜３，０００Ｈｚ）、増幅させ、５００回の反応を平均化した。
聴覚閾値及びＰ１波の待ち時間は、各前試験値との比較によって評価し、計算した。刺激強度は、閾値を測定するために２ｄＢずつ段階的に上昇させて変化させた。閾値は、反応再現性を確認するために連続２回の試験で反応を記録できる最低強度レベルであると定義されている。結果を図１、図２に示す。
図１は、０日から５６日間の閾値（ｄＢ）であり、図２はＩ波潜時（ｍＳ）を示す。なお、図中のＨＧＦは保護群、保護／救済群、救済群を示し、図中のＶｅｃはベクター対照群を示し、図中のＫＭは非処置群を示す。
図１、図２から明らかなとおり、保護群、保護／救済群、救済群は、５６日経過後においても聴覚の変化（閾値及びＩ波潜時の変化）は僅かであったが、ベクター対照群と非処置群では、聴覚の変化（閾値及びＩ波潜時の変化）が顕著であった。
図３に、蝸牛（うずまき管）の螺旋神経節細胞（ＳＧＣ）の光学顕微鏡写真を示す。図３ａは無傷の蝸牛のもの、図３ｂはカナマイシン処置群（非処置群）のもの、図３ｃはカナマイシン＋ＨＧＦ処置群（保護群、保護／救済群、救済群）のものである。
図３ａ〜ｃから明らかなとおり、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群の螺旋神経節細胞は、カナマイシン処置群の比べると、無傷のものに近かった。
図４に、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群（保護群、保護／救済群、救済群）とカナマイシン＋ベクター処置群（ベクター対照群）における、螺旋神経節細胞密度（１０，０００ｍｍ２当たりの細胞数）を示す。
図５に、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群（保護群、保護／救済群、救済群）とカナマイシン処置群（非処置群）における、螺旋神経節細胞密度（１０，０００ｍｍ２当たりの細胞数）を示す。
図４、図５から明らかなとおり、カナマイシン＋ＨＧＦ処置群は、他の処置群に比べて、螺旋神経節細胞密度が高かった。
以上の結果は、ＨＶＪ−Ｅ懸濁液の投与により、聴覚ニューロンが保存又は再生された結果であると推定される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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