(57)【要約】【課題】歯周病を検出して、歯周病ならびに全身疾患を診断することができる歯周病マーカーを提供すること。【解決手段】歯周病マーカーは、ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼからなる。システインプロテアーゼは、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインと、リジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインとからなるジンジパインである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼからなる歯周病検出のための歯周病マーカー。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記システインプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病マーカー。
【請求項３】
請求の範囲第１項または第２項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインと、リジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病マーカー。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号１に記載するアミノ酸配列を有すること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有することを特徴とする歯周病マーカー。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号３に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号４に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有することを特徴とする歯周病マーカー。
【請求項６】
ジンジパリス菌が産生するシステインプロテアーゼを歯周病検出のための歯周病マーカーとして使用することを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項７】
請求の範囲第６項に記載する歯周病検出方法において、唾液中の前記システインプロテアーゼを検出することを特徴とする歯周病検出方法
【請求項８】
請求の範囲第６項または第７項に記載する歯周病検出方法において、前記システインプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項９】
請求の範囲第６項ないし第８項のいずれか１項に記載する歯周病検出方法において、前記システインプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項１０】
請求の範囲第６項ないし第９項のいずれか１項に記載する歯周病検出方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインと、リジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項１１】
請求の範囲第６項ないし第１０項のいずれか１項に記載する歯周病検出方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号１に記載するアミノ酸配列を有すること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有することを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項１２】
請求の範囲第６項ないし第１１項のいずれか１項に記載する歯周病検出方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号３に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号４に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有することを特徴とする歯周病検出方法。
【請求項１３】
ジンジパリス菌が産生するシステインプロテアーゼを歯周病検出のための歯周病マーカーとして使用して歯周病を診断することを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１４】
請求の範囲第１３項に記載する歯周病診断方法において、唾液中の前記システインプロテアーゼを歯周病マーカーとして使用することことを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１３項または第１４項に記載する歯周病診断方法において、前記システインプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１２項ないし第１５項のいずれか１項に記載する歯周病診断方法において、前記システインプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１２項ないし第１６項のいずれか１項に記載する歯周病診断方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインと、リジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１２項ないし第１７項のいずれか１項に記載する歯周病診断方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号１に記載するアミノ酸配列を有すること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号２に記載するアミノ酸配列を有することを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１２項ないし第１８項のいずれか１項に記載する歯周病診断方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号３に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、またＬｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号４に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有することを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項２０】
試料採取用具と、歯周病検出のための歯周病マーカーと、合成基質と、バッファと、還元剤と、請求項１ないし５のいずれか１項に記載する歯周病マーカーと、から構成されていることを特徴とする歯周病検出キット。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項に記載する歯周病診断キットにおいて、前記合成基質が、Ｒｇｐに対しては、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＭＣＡ＝４−メチルクマリル−７−アミド）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡまたはＮ−ａ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｂ−ナフチルアミド（ＢＡＰＮＡ）であり、またＫｇｐに対しては、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｚ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡまたはＮ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）であることを特徴とする歯周病検出キット。
【請求項２２】
請求の範囲第２０項または第２１項に記載する歯周病診断キットにおいて、前記還元剤がシステインであることを特徴とする歯周病診断キット。
【請求項２３】
請求の範囲第２０項ないし第２２項のいずれか１項に記載する歯周病診断キットを使用して歯周病を診断することを特徴とする歯周病診断方法。
【請求項２４】
請求の範囲第２３項に記載する歯周病診断方法において、唾液を使用して歯周病を診断することを特徴とする歯周病診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、歯周病マーカーに関するものである。更に詳細には、この発明は、歯周病マーカー、それを用いた歯周病検出方法ならびに診断方法および歯周病検出用キットに関するものである。
【背景技術】  歯周病は、成人における歯牙喪失の主因であり、成人の罹患率が４０％以上にも達する、いわば国民病のひとつである。かつては、歯周病は、加齢とともに起こる生理現象のひとつと考えられ、高齢における歯牙喪失は不可避なことと理解されていた。
歯牙喪失は、口腔機能の低下を招くばかりではなく、各種神経機能に異常をもたらすことや、歯周病が全身疾患（冠状動脈性心疾患、低体重児出産・早産、糖尿病、心内膜炎、細胞性肺炎など）のリスクファクターであることなどが明らかにされ、歯周病の克服がＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）の向上を実現するために必須の課題と考えられるようになってきた。
歯周病は、歯肉縁下プラーク中の細菌によって惹起される感染症であることは周知の事実であり、歯周病の治療や予防の第一の目的は、歯周病原性細菌のコントロールにあると考えられている。そのために、歯周病を早期にかつ確実に診断することが、本疾患に対する的確な治療と予防に向けた新たな方法論を確立するうえで極めて重要である。
これまで歯周病のスクリーニングでは歯周ポケットを測定することが標準とされてきたが、この方法は、費用、労力、再現性などに問題があり、一度に多数の人をスクリーニングすることができないという欠点がある。
そこで、歯周病を早期に診断する方法として、唾液を検査することが提唱されてきた。唾液は、血液とは異なり、ほぼ無侵襲でかつ簡便に試料採取が可能であり、その上、唾液には、歯肉溝滲出液、細菌性プラークなど、歯周組織の状況把握に有用な種々のマーカーが含まれていることから、歯周病診断や治療効果の判断に使用できる材料と考えられてきている。
唾液を歯周病診断の材料として使用する方法として、唾液サンプルにβ−グルコニダーゼに対する基質を添加して、その基質上のβ−グルコニダーゼの反応生成物を測定することによって唾液中のβ−グルコニダーゼ濃度を測定する方法が提案されている（アメリカ特許第６０６３５８８号）。しかしながら、この方法は、歯周病を早期にかつ確実に診断する方法として診断などに実際に使用するためには、精度、再現性等改良すべき点があるといわざるを得ない。
ところで、近年における遺伝子解析技術の急速な進展に伴い、歯周病の主要な原因菌と考えられているグラム陰性嫌気性細菌Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（以下、「ジンジバリス菌」という）の産生産物であるタンパク質や、その細胞表面タンパク質などについても遺伝子研究が精力的に進められてきた。
その結果、ジンジバリス菌由来の酵素が、コラーゲンを主体とする歯周組織に対し直接的な分解能を有すると共に、好中球などの炎症性細胞に対して障害活性を有することが見出された（日本国特許公開第平７−１３５９７３号公報）。この酵素は、既知のジンジバリス菌由来の５０ｋＤａシステインプロテアーゼ（Ｃｈｅｎ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１８８９６−１８９０１，１９９２）と至適ｐＨやインヒビターに対する感受性などの酵素学的性質は類似しているが、基質特異性や熱安定性などの性質においては相違していると報告されている。
また、アメリカ特許第６５１１６６６号明細書には、アルギニン特異性ならびにリジン特異性チオールエンドペプチダーゼのアミノ酸配列の僅かな断片部分からなる９個のタンパク質断片を有するタンパク質複合体を、ジンジバリス菌に対する免疫応答を誘導するために使用することが記載されている。
他方、本発明者らは、ジンジパインが、他のプロテアーゼとはアミノ酸配列においてほとんど類似性を示さない独自のファミリー（Ｃ２５）を構成する酵素群であって、触媒活性として強力なトリプシン様活性を有していること、またそのペプチド結合切断特異性から、アルギニン残基のＣ末端側に特異的なＡｒｇ−ジンジパイン（以下、「Ｒｇｐ」という）とリジン残基のＣ末端側に特異的なＬｙｓ−ジンジパイン（以下、「Ｋｇｐ」という）に分けることができることを報告している（山本健二他：プロテオリシス−蛋白質分解の分子機構とバイオロジー（鈴木紘一・木南英紀・田中啓二編）、蛋白質核酸酵素増刊、ｐｐ．２４２５−２４３１、共立出版（１９９７）；Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｔｕｒｋ．Ｖ．ｅｄ．），ｐｐ．１７５−１８４，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ（１９９９）；山本健二：細胞工学、１９，２９５−３０１（２０００）；Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，１５３−１５９（２０００））。更に、本発明者らは、これらの酵素がいずれも、大部分が膜結合型酵素として存在し、一部が分泌型として菌体外へ分泌され、それらの生理ならびに病理作用を発現していることを確認している。
しかしながら、かかるジンジパインならびにその１部が歯周病マーカーとして作用することができるという記載は一切ない。
さらに、歯周病を早期にかつ確実に診断する方法が今まで確立されていないのが現況である。
そこで、本発明者らは、歯周病の早期かつ確実な診断手段を見出すべく、歯周病の主要な原因菌と考えられているジンジバリス菌について研究を進めてきた結果、ジンジバリス菌が産生する２種類のシステインプロテアーゼ（以下、「ジンジパイン」（ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）ともいう）が、歯周病を早期にかつ確実に、その上簡便に検出することができるマーカーとして利用できることを見出して、この発明を完成した。
したがって、この発明は、ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼ（ジンジパイン）を歯周病の検出のために使用することからなる歯周病マーカーを提供することを目的としている。
この発明の別の目的は、上記ジンジパインを歯周病検出のマーカーとして使用することからなる歯周病検出方法を提供することである。
この発明はさらに、ジンジパインを歯周病検出マーカーとして唾液を使用して歯周病を診断する歯周病診断方法を提供することを目的としている。
この発明はさらに、ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を簡便に診断することができる歯周病診断キットを提供することを目的としている。
【発明の開示】
上記目的を達成するために、この発明は、ジンジバリス菌が産生するジンジパインからなる歯周病検出用マーカーを提供する。また、この発明は、上記ジンジパインを歯周病検出用マーカーとして使用することからなるジンジパインの使用方法と、上記ジンジパインを歯周病マーカーとして使用して歯周病を検出する歯周病検出方法を提供する。
この発明の好ましい態様として、上記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパイン（Ｒｇｐ）と、リジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）とから構成されている。
この発明はまた、上記ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を診断することからなる歯周病診断方法を提供する。
この発明はさらに、上記ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を簡便に診断することができる歯周病診断キットを提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、抗体を用いたウェスタンブロット法によるＫｇｐとＲｇｐとの測定結果を示す図である。
図２は、抗Ｋｇｐ・Ｒｇｐ抗体を用いたウェスタンブロット法による歯周病患者の唾液中のＫｇｐとＲｇｐとの測定結果を示す図である。
図３は、抗Ｋｇｐ・Ｒｇｐ抗体を用いたウェスタンブロット法によるＩ型糖尿病患者の唾液中のＫｇｐとＲｇｐとの測定結果を示す図である。
図４は。抗Ｋｇｐ・Ｒｇｐ抗体を用いたウェスタンブロット法によるＩ型糖尿病患者の唾液中のＫｇｐとＲｇｐとの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  この発明は、ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼ（ジンジパイン）を歯周病検出用マーカーとして使用することを特徴としている。
この発明において歯周病検出用マーカーとして使用するジンジパインは、他のプロテアーゼとはアミノ酸配列においてほとんど類似性を示さない独自のファミリー（Ｃ２５）を構成する酵素群であって、触媒活性として強力なトリプシン様活性を有している。ジンジパインは、そのペプチド結合切断特異性から、アルギニン残基のＣ末端側に特異的なＡｒｇ−ジンジパイン（以下、「Ｒｇｐ」という）とリジン残基のＣ末端側に特異的なＬｙｓ−ジンジパイン（以下、「Ｋｇｐ」という）に分けることができる（山本健二他：プロテオリシスー蛋白質分解の分子機構とバイオロジー（鈴木紘一・木南英紀・田中啓二編）、蛋白質核酸酵素増刊、ｐｐ．２４２５−２４３１、共立出版（１９９７）；Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：ｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｎｅｗ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｔｕｒｋ．Ｖ．ｅｄ．），ｐｐ．１７５−１８４，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ（１９９９）；山本健二：細胞工学、１９，２９５−３０１（２０００）；Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，１５３−１５９（２０００））。両酵素とも、大部分が膜結合型酵素として存在し、一部が分泌型として菌体外へ分泌され、それらの生理ならびに病理作用を発現している。
以下に、ジンジパインの構造特性について説明する。
Ｒｇｐをコードする遺伝子はジンジバリス菌染色体上に２つ（以下、「ｒｇｐＡ」（配列表配列番号１）（Ｐａｖｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１００７−１０１０（１９９５））と、「ｒｇｐＢ」（配列表配列番号２）（Ｎａｋａｙａｍａ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４１，１８５−１９６（１９９７））という）存在する。ｒｇｐＡ遺伝子は、プロテアーゼドメインのほかに、Ｎ末端側にシグナルペプチドとプロペプチド、Ｃ末端側に付着因子ドメインをもっている。付着因子ドメインはさらに赤血球凝集素活性やヘモグロビン結合活性をもつ、いくつかのサブドメインからなっている（図１ａ）。シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸に富む２４個のアミノ酸からなっており、生合成後の遺伝子産物の内膜への挿入に重要であると考えられる。また、それに続く２０３個のアミノ酸からなるプロペプチドは、酸性アミノ酸より塩基性アミノ酸に富み、輸送過程の酵素分子の高次構造の保持に寄与していると考えられる。付着因子ドメインは、極性アミノ酸が非対称性の分布を示し、全体としては酸性を示している。この付着因子ドメインは、外膜蛋白質の膜貫通領域に特徴的な両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｉｃ）のβストランド構造を有しており、これによって外膜に移送・挿入されるものと考えられる（非特許文献７）。また、付着因子ドメインの機能的重要性を示すものとして、このドメインに赤血球凝集素やヘモグロビン結合を担う重要なサブドメインが存在している（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３１６，９１７−９２５（１９９５）；Ｐａｖｌｏｆｆ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１００７−１０１０（１９９５））。これらサブドメインは付着因子ドメインが外膜への輸送過程でプロセシングを受け、いったん解離した後、プロテアーゼドメインに再会合する形で複合体を形成し、プロテアーゼ活性と共役した形でそれぞれの機能を発揮するものと考えられている。
ｒｇｐＡ遺伝子産物の一部は細胞外へ、残りの大部分は外膜に局在する。細胞外へ分泌される酵素は主としてプロテアーゼドメインのみからなっているが、例外的にＨＧ６６株では付着因子ドメインをもつ高分子型酵素が主成分として存在する（Ｐｉｋｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，４０６−４１１（１９９４））。膜結合型酵素には、プレプロペプチドが除去された後、プロテアーゼドメインと付着因子ドメインのサブドメインが非共有的に結合した高分子複合体として存在するものと、プロテアーゼドメインのみからなるものが存在する。さらに、Ｒｇｐは糖鎖の修飾（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７，３８１６−３８２３（１９９９））やリポ多糖の付加（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３，８５５−８６５（１９９７））を受けることが指摘されており、これらの糖の種類や修飾の程度によってもさまざまなアイソザイムが存在すると考えられている。第二遺伝子のｒｇｐＢ遺伝子はｒｇｐＡ遺伝子の付着因子ドメインの大部分を欠失していることを除けば、本質的にはｒｇｐＡ遺伝子と同一である（プレプロペプチドおよびプロテアーゼドメインの同一性はアミノ酸配列でそれぞれ７６％および９３％）（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．：Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１，１８５−１９６（１９９７））。このように、Ｒｇｐをコードする遺伝子が同一染色体に２つ存在することは、本酵素が本菌にとってきわめて重要な因子であることを示すとともに、本菌が外界や宿主との関係で常に多様化（進化）していることを示唆している。
一方、Ｋｇｐは単一の遺伝子（ｋｇｐ）によってコードされており、その遺伝子産物はＲｇｐＡの遺伝子産物と同様にシグナルペプチド、プロペプチド、プロテアーゼドメイン、および付着因子ドメインからなっている（図１ａ）（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２０，３９８−４０６（１９９６）；Ｂａｒｃｏｃｙ−Ｇａｎａｇｈｅｒ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，２７３４−２７４１（１９９６）；Ｐａｖｌｏｆｆ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５９３−１６００）。菌株の違いからＫｇｐをコードする遺伝子もＲｇｐと同様に数種類報告されているが、それらはきわめてよく似たアミノ酸配列を示すことから、異なる株での同一遺伝子と考えられ、現在ではＫｇｐという名で統一して扱われている。ＫｇｐとＲｇｐのプレプロペプチドおよびプロテアーゼドメインには相同性はほとんど認められないが、付着因子ドメイン間には高い相同性が認められる（図２）。このことは、これらの遺伝子間にｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔが起こっている可能性を強く示唆する。ＫｇｐもＲｇｐと同様に一部は細胞外へ、残りの大部分は外膜に輸送され、細胞外のものはプロテアーゼドメインのみからなり、膜結合型のものは主としてプロテアーゼドメインと付着因子ドメインに由来するサブドメインの複合体として存在している（図１ｂ）（山本健二他蛋白質核酸酵素、Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１７８１−１４２７（２００１））。
ＲｇｐおよびＫｇｐの触媒ドメインには、アミノ酸配列上ほぼ同位置に活性発現に必須のＨｉｓ２１１／Ｃｙｓ２４４  ２連子（ｄｉａｄ）が存在する。ｒｇｐＢのＸ線結晶構造解析の結果は、本酵素が触媒ドメインと免疫グロブリンスーパーファミリードメインをもつ単一のポリペプチドであることを示しており、触媒ドメインはさらにαヘリックスに挟まれた４個と６個のβシート構造をもつ２つのサブドメインからなっていることを明らかにしている（非特許文献１８）。この２つのサブドメインはカスパーゼー１のサブドメインｐ２０とｐ１０によく似たトポロジーをもっている。すなわち、両者は同じ位置に活性アミノ酸残基のＣｙｓとＨｉｓをもち、類似の基質認識サブサイトとＳ１ポケットを有している。これらの結果は、ジンジパインファミリー（ｆａｍｉｌｙ  Ｃ２５）がカスパーゼファミリー（ｆａｍｉｌｙ  Ｃ１１）と共通の祖先から進化したということを支持している。Ｘ線結晶構造解析の結果は、本発明者らが２次構造解析から得た結果（図３）ともよく符合する。（Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．：ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，５４５３−５４６２（１９９９）
この発明に係る歯周病検出方法は、生物学的試料中のジンジパイン活性を測定することによって歯周病を検出することからなっている。
この発明に使用することができる生物学的試料としては、例えば、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）、唾液、血清などが挙げられる。これらの試料のうち、歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）の試料としては、ろ紙などを歯肉溝に挿入してその滲出液を採取し、ＰＢＳなどの溶媒中に浸漬・溶出させて調製したものを使用するのがよい。唾液、血清などの試料としては、遠心分離をして不溶性沈殿物を除去して調製したものを使用するのがよい。
この発明に係る歯周病検出方法においては、このようにして調製した生物学的試料について、例えば、ＥＩＡ法、酵素学的測定法、ウェスタンブロット法などの酵素活性測定法によって、そのジンジパイン活性を測定するのがよい。この発明に使用することができる測定方法それ自体は、いずれもこの発明が属する技術分野で慣用されている方法である。
この発明において、ＥＩＡ法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料を特異抗体と反応させて得られた抗原抗体複合物を除去した後の残存活性を、抗体無添加の試料中の活性から差し引いた活性をＲｇｐ活性あるいはＫｇｐ活性として測定する。
この発明において、酵素学的測定法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料を特異合成基質と反応させて、得られた遊離蛍光基質成分を蛍光光度計で測定することによってＲｇｐ活性あるいはＫｇｐ活性を測定することからなっている。
この発明に使用することができる酵素学的測定法に使用する特異合成基質としては、ジンジパイン活性測定に適用することができる合成基質であればいずれも使用することができる。例えば、Ｒｇｐに対する特異合成基質としては、例えば、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＭＣＡ＝４−メチルクマリル−７−アミド）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｎ−ａ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｂ−ナフチルアミド（ＢＡＰＮＡ）などが挙げられる。また、Ｋｇｐに対する特異合成基質としては、たとえば、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｚ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｎ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）などが挙げられる。
この発明において、ウェスタンブロット法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて測定することによって行なうことができる。使用できる１次抗体としては、例えば、抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体を使用することができ、２次抗体としては、例えば、ＨＲＰ標識抗ウサギ抗体を使用することができる。
また、１次抗体としては、上記の他に、Ｋｇｐ単独に反応する抗体、Ｒｇｐ単独に反応する抗体なども使用することができる。
この発明において１次抗体として使用することができるＫｇｐ単独に反応する抗体としては、例えば、Ｋｇｐ酵素活性型分子のＮ末端から１６アミノ酸に相当する合成ペプチドを抗原として、ウサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。
Ｒｇｐ単独に反応する抗体としては、例えば、Ｒｇｐ酵素前駆体分子に相当するＤＮＡを大腸菌に高発現させ精製したものを抗原として、ウサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。
なお、抗原とする組換え型Ｒｇｐは、アミノ酸にして翻訳開始のＭｅｔ（１）〜Ａｒｇ（７１９）をＮ末端とＣ末端の両方にＨｉｓタグが付くように、ベクターｐＥＴ２８ａに組み込んだものを、大腸菌ＢＬ２１に形質転換して、ＩＰＴＧで発現誘導するのがよい。
ＫｇｐとＲｇｐとの両者を認識する抗体としては、例えば、ジンジバリス菌の培養上清から精製したＫｇｐとＲｇｐとを混合してウサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。
この発明に係る歯周病検出用キットは、試料採取用具と、合成基質含有反応液と、ポジテイブコントロールとしての上記歯周病マーカーと、から構成されているのがよい。合成基質含有反応液は、合成基質の他に、例えば、バッファ、還元剤などを含んでいるのがよい。
前記合成基質としては、Ｒｇｐに対しては、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル；ＭＣＡ＝４−メチルクマリル−７−アミド）、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル）、Ｎ−ａ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｂ−ナフチルアミド（ＢＡＰＮＡ）などが挙げられ、またＫｇｐに対しては、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、Ｚ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡまたはＮ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）などが挙げられる。
なお、Ｚの他に、ペプチドのアミノ基末端の保護修飾のために使用されているものであればいずれも使用することができる。
また、前記還元剤としては、例えば、システイン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールなどが挙げられる。
この発明に係る歯周病検出用キットは例えば次のようにして使用することができる。ペリオペーパーなどの試料採取用具によって、被験者の唾液や歯肉溝浸出液を採取し、この試料の所定量を合成基質含有反応液に添加して反応させた後、蛍光光度計で遊離のＡＭＣを測定することによって、試料中の両酵素活性を測定することができる。
【実施例】  次ぎに、この発明を実施例によって更に詳細に説明する。なお、下記実施例は、この発明を限定する意図で記載するものでは一切なく、この発明をより具体的にかつ例示的に説明するために記載するものである。
製造例１：試料の調製
歯肉溝浸出液（ＧＣＦ）は、ペリオペーパーを３０秒間歯肉溝に２回挿入して採取し、同ペーパーを２００μＬのＰＢＳに浸漬することによって溶出したものを試料として調製した。
唾液または血清は、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して不溶性沈殿物を除去したものを試料として調製した。
実施例１：ＥＩＡによる測定法
製造例１において調製した試料１−５０μＬに対して、１−３０ｎｍｏｌの特異抗体を添加し、ＰＢＳにて１００μＬに調整し、３７℃で１０分間反応した後、４℃で一夜静置した。この反応液を、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して抗原抗体複合物を除去し、上清に残った残存活性を測定した。この残存活性を、抗体を添加しない試料中の活性から差し引いた活性をＲｇｐ活性またはＫｇｐ活性とした。
以上の結果、歯周炎の程度の高い患者ほど試料中の両酵素活性、特に高いＲｇｐ活性が検出された。
実施例２：酵素学的測定法
製造例１において調製した歯肉溝浸出液または唾液１０−３０μＬと特異合成基質（最終濃度１０μＭ）を含む反応液（２０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．５、５ｍＭシステイン）１ｍＬも４０℃で１０分間反応させた後、１ｍＬの１０ｍＭヨード酢酸を含む０．１Ｍ酢酸バッファ、ｐＨ５．０）を添加して反応を停止させ、蛍光光度計で遊離のＡＭＣを測定した（励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）。
合成基質としては、Ｒｇｐに対しては、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡおよびＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡを、またＫｇｐに対しては、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡおよびＺ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡを使用した。
以上の結果から、歯周炎の程度の高い患者ほど試料中の両酵素活性、特に高いＲｇｐ活性が検出された。
実施例３：ウェスタンブロット法（１次抗体として抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体を使用）
製造例１において調製した歯肉溝浸出液または唾液１０μＬに０．１ｍＭロイペプチン、ＴＰＣＫを添加して（自己分解するため）、メルカプトエタノールを含む可溶化バッファを用いて１００℃で５分間処理した後、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。電気泳動後のアクリルアミドゲルをニトロセルロース膜と重ねて転写バッファ（４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％ＳＤＳ、２０％メタノール）に浸し、セミドライトランスファ装置を用いて１時間通電（約１５Ｖ）してタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。１次抗体として抗Ｒｐｇ・Ｋｇｐ抗体（１／４００００倍希釈）を用い、２次抗体としてＨＲＰ標識抗ウサギ抗体（１／５０００倍希釈）を反応させ、ＥＣＬにて検出を行った。
なお、本実施例で１次抗体として使用した抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体は、ジンジハリス菌の培養上清から精製したＫｇｐとＲｇｐとを混合してウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。
実施例４：ウェスタンブロット法（１次抗体として抗Ｋｇｐ抗体を使用）
製造例１において調製した歯肉溝浸出液または唾液を、１次抗体として、抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体の代わりにＫｇｐ単独に反応する抗体（抗Ｋｇｐ抗体）０．６９ｍｇ／ｍＬを使用する以外は実施例３と同様にして処理し、その酵素活性を測定した。
なお、本実施例で使用した抗Ｋｇｐ抗体は、Ｋｇｐ酵素活性型分子のＮ末端から１６アミノ酸に相当する合成ペプチドを抗原として、ウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。
実施例５：ウェスタンブロット法（１次抗体として抗Ｒｇｐ抗体を使用）
製造例１において調製した歯肉溝浸出液または唾液を、１次抗体として、抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体の代わりにＲｇｐ単独に反応する抗体（抗Ｒｇｐ抗体）を使用する以外は実施例３と同様にして処理し、その酵素活性を測定した。
なお、本実施例で使用した抗Ｒｇｐ抗体は、Ｒｇｐ酵素前駆体分子に相当するＤＮＡを大腸菌に高発現させ精製したものを抗原として、ウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体（抗血清）である。なお、抗原とする組換え型Ｒｇｐは、アミノ酸にして翻訳開始のＭｅｔ（１）〜Ａｒｇ（７１９）をＮ末端とＣ末端の両方にＨｉｓタグが付くように、ベクターｐＥＴ２８ａに組み込んだものを、大腸菌ＢＬ２１に形質転換して、ＩＰＴＧで発現誘導した。発現したＲｇｐは、大腸菌の封入体画分に回収されたので、６Ｍグアニジン塩酸で可溶化し、ニッケルカラムに結合させ、カラム上で変性剤を徐々に除去することによってリフォールデイングさせた後、イミダゾールにて溶出させて精製した。
参考例１
抗Ｋｇｐ抗体、抗Ｒｇｐ抗体および抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体をそれぞれ使用したウェスタンブロット法の結果を図１に示す。
なお、図中、Ｐｇ＝ジンジバリス菌の細胞抽出液；Ｅｃ＝大腸菌の細胞抽出液；ＰｇＷＴ＝ジンジバリス菌野生株；ＰｇＲｇｐ（−）＝ジンジバリス菌Ｒｇｐ欠損株；ＰｇＫｇｐ（−）＝ジンジバリス菌Ｋｇｐ欠損株をそれぞれ示す。
試験例１
歯周病患者から採取した唾液中のＫｇｐ量ならびにＲｇｐ量を、抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体を用いたウェスタンブロット法にて測定した。その結果を図２に示す。図中、ＭおよびＳはそれぞれ歯周炎の程度、つまり軽度および重度を示す。
試験例２
唾液中のＫｇｐ量ならびにＲｇｐ量の測定値と、歯周病ならびに全身疾患との関連性について検討した。
健常人、歯周病患者（全身疾患の所見無し）、全身疾患・歯周病患者からそれぞれ採取した唾液を、上記実施例に従って合成基質分解活性測定法と、ウェスタンブロット法とによってそのＫｇｐ量ならびにＲｇｐ量を測定した。その結果を表１に示す。
その結果、歯周炎の程度の高い患者ほど、試料中に両酵素が高活性でかつ高蛋白質量で検出されることが判明した。全身疾患を持つ症例では特に酵素量が高いことが示唆されている。一般的には、ＲｇｐとＫｇｐの相対量を比べてみたときに、狭心症を持つ患者ではＫｇｐが、その他の全身疾患を持つ患者ではＲｇｐが相対的に高い傾向が示唆された。
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試験例３
いずれも歯周病の所見がないＩ型糖尿病患者（Ｄ）から採取した唾液中のＫｇｐ量ならびにＲｇｐ量を、抗Ｒｇｐ・Ｋｇｐ抗体を用いたウェスタンブロット法にて測定した。その結果を図３および図４に示す。なお、図中、症例のＰは歯周病患者を、Ｃは健常人を示している。
実施例６：歯周病検出用キット
下記の構成からなる歯周病検出用キットを作成した。
試料採取用具として、ペリオペーパー（商標）、
ポジテイブコントロールとしての歯周病マーカー（Ｒｇｐ／Ｋｇｐ）、
合成基質として、Ｒｇｐに対しては、Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、またＫｇｐに対しては、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ、
バッファとして、ＰＢＳ、
還元剤としてもシステイン、
をキットとして調製した。
試験例４
歯肉溝内にペリオペーパーを３０秒間２回挿入して、歯肉溝浸出液を採取し、バッファとしてのＰＢＳ中に浸漬して試料を溶出させた。このように溶出した試料を、特異合成基質（最終濃度１０μＭ）を含む反応液（２０ｍＭリン酸バッファ、ｐＨ７．５、５ｍＭシステイン）１ｍＬに添加して、実施例２と同様にして酵素学的測定法にて蛍光光度計で遊離のＡＭＣを測定した（励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）。
この結果、実施例２で得られた同様の測定値が得られた。
【産業上の利用可能性】  この発明は、ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼ（ジンジパイン）を歯周病検出用マーカーとして使用することによって、歯周病を確実にかつ簡便に検出することが可能になるという大きな利点がある。
また、この発明は、ジンジパインを歯周病検出用マーカーとして使用して歯周病を確実にかつ簡便に検出することによって、同時に狭心症、糖尿病などの全身疾患の診断も可能にすることができるという利点もある。
更に、歯周炎の程度の高い患者ほど、試料中に両酵素が高活性でかつ高蛋白質量で検出されることが判明した。その上、全身疾患を持つ症例では特に酵素量が高く、一般的には、ＲｇｐとＫｇｐの相対量を比べてみたとき、狭心症を持つ患者ではＫｇｐが、その他の全身疾患を持つ患者ではＲｇｐが相対的に高い傾向が示唆された。
したがって、この発明に係る歯周病検出方法や診断方法は、両酵素量の相対比較により歯周炎の程度をも診断することが可能であるという極めて有用な手段を提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月30日(2005.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンジパリス菌が産生するジンジパインを唾液中に検出することからなるジンジパインの検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載のジンジパインの検出方法において、唾液を採取し、該唾液中にジンジパリス菌が産生するジンジパインを検出することからなるジンジパインの検出方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のジンジパインの検出方法において、唾液をペリオペーパーに採取することからなるジンジパインの検出方法。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のジンジパインの検出方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインまたはリジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインであることからなるジンジパインの検出方法。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のジンジパインの検出方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号３に記載するプロテアーゼドメインを有していることからなるジンジパインの検出方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のジンジパインの検出方法において、前記Ｌｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号４に記載するプロテアーゼドメインを有していることからなるジンジパインの検出方法。
【請求項７】
ジンジパリス菌が産生するジンジパインを唾液中に検出することからなる歯周病検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の歯周病検出方法において、唾液を採取し、該唾液中にジンジパリス菌が産生するジンジパインを検出することからなる歯周病検出方法。
【請求項９】
請求項７または請求項８に記載の歯周病検出方法において、唾液をペリオペーパーに採取することからなる歯周病検出方法。
【請求項１０】
請求項６ないし請求項９のいずれか１項に記載の歯周病検出方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＡｒｇ−ジンジパインまたはリジン残基のＣ末端側にペプチド結合切断特異性を有するＬｙｓ−ジンジパインであることからなる歯周病検出方法。
【請求項１１】
請求項７ないし請求項１０のいずれか１項に記載の歯周病検出方法において、前記Ａｒｇ−ジンジパインが配列表の配列番号３に記載するプロテアーゼドメインを有していることからなる歯周病検出方法。
【請求項１２】
請求項７ないし請求項１１のいずれか１項に記載の歯周病検出方法において、前記Ｌｙｓ−ジンジパインが配列表の配列番号４に記載するプロテアーゼドメインを有していることからなる歯周病検出方法。
【国際調査報告】
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