(57)【要約】デング熱ウィルスの感染を効果的に阻害する薬剤として、少なくとも、次式（Ｉ）Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−（Ｉ）（ただし、Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）で表されるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
（ただし、Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）
で表されるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項２】
少なくとも、次式（ＩＩ）
（Ｘ）ｎ−Ｒ                                                        （ＩＩ）
（ただし、Ｘは、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
（Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）
で表されるオリゴ糖鎖を表し；Ｒは水素原子、Ｓ、Ｎ、Ｏ、Ｐ原子を有する置換基、炭化水素基、脂質、タンパク質、および合成高分子からなる群より選択される基質であり、いずれの場合にも置換基を有していてよく；ｎはＲに結合するオリゴ糖鎖の数を表す１以上の数である）
で表される分子を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項３】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖の非還元末端には、Ｈｅｘ３で表されるヘキソースまたはＨｅｘ３ＮＡｃで表されるアミノヘキソースのいずれかがβ１−４結合している請求項１または２のいずれかのデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項４】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖におけるＨｅｘ１はグルコース（Ｇｌｃ）であり、Ｈｅｘ２は、ガラクトース（Ｇａｌ）またはマンノース（Ｍａｎ）である請求項１または２のいずれかのデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項５】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖におけるＨｅｘ１はグルコース（Ｇｌｃ）であり、Ｈｅｘ２は、ガラクトース（Ｇａｌ）またはマンノース（Ｍａｎ）であり、Ｈｅｘ３は、ガラクトース（Ｇａｌ）またはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である請求項３のデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項６】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖は、
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉａ）
で表されるパラグロボシドである請求項３のデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項７】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖は、
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉｂ）
である請求項３のデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項８】
式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖は、
ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−  （Ｉｃ）
である請求項３のデング熱ウィルス感染阻害剤。
【請求項９】
次式（Ｉａ）
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉａ）
で表されるパラグロボシドに対するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
次式（Ｉｂ）
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉｂ）
で表されるオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体。
【請求項１１】
次式（Ｉｃ）
ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−  （Ｉｃ）
で表されるオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体。
【請求項１２】
少なくとも請求項９ないし１１のいずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、デング熱ウィルス感染阻害剤に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、少なくともパラグロボシド糖鎖等のオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子を有効成分として含有するデング熱ウィルス感染阻害剤に関するものである。
【背景技術】  デング熱（ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ）は、デングウィルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）の急性感染症で、その臨床的特徴から、予後良好な古典的デング熱（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｄｅｎｇｕｅ  ｆｅｖｅｒ：ＣＤＦ）、出血傾向を示すデング出血熱（ｄｅｎｇｕｅ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＤＨＦ）、最も重篤でショックを特徴とするデングショック症候群（ｄｅｎｇｕｅ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＤＳＳ）に分類される（平林義弘，「感染症症候群  Ｉ  領域別症候群シリーズＮｏ．２３」，１９９９年，ｐ．１４５−１４９）。
ＣＤＥは、３〜９日の潜伏期間の後、４０℃前後の発熱、頭痛、腰背部痛、顔面紅潮、結膜充血などを突然発症し、全身の激しい関節痛と筋肉痛を伴う疾患である（Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ，１９５２，Ｖｏｌ．２，ｐ．３０−５０）。また、やや遅れて、消化器症状や上気道炎症も出現する。しかし、これらの症状は、自己限定的であり、自然経過で治癒・回復する。一方、ＤＨＦ／ＤＳＳもＣＤＥとほぼ同様に発症するが、２〜６日で出血傾向もしくはショック様症状が著明となり、虚脱感や全身衰弱が激しく、状態が急速に悪化する点で異なる（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１９６６，Ｖｏｌ．６８，ｐ．４４８−４５６；Ｎｉｍｍａｎｎｉｔｙａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｙｇｉｅｎｅ，１９６９，ｐ．９５４−９７１）。
デング熱の病原体であるデングウィルスは、直径約４０〜６０ｎｍでエンベロープを有し、約１１ｋｂのプラス極性の１本鎖ＲＮＡを有し、ウィルス学的には黄熱ウィルスや日本脳炎ウィルスなどとともにフラビウィルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）に属する。また、デングウィルスは、感染中和抗体の交叉性に基づいて１〜４型の４種の血清型に分類されることが知られている（Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９８５，Ｖｏｌ．２４，ｐ．１８３−１９２；Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，Ｖｏｌ．４４，ｐ．６４９−６８８）。
自然界におけるデングウィルスベクターは、シマカ類の蚊であり、中でも熱帯地方に広く生息するネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ）が主要な媒介蚊となっている（Ｂａｎｃｒｏｆｔ，Ｔ．Ｌ．，Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇａｚｅｔｔｅ，１９０６，Ｖｏｌ．２５，ｐ．１７−１８）。都市部では、ウィルス保有蚊の刺咬によってヒトが感染し、逆にウィルス血症を呈している患者を刺咬して蚊がウィルスを獲得するという蚊−ヒト−蚊の生活環が成立しており、人口のまばらな森林地帯では、蚊とサル類によってサイクルが成立していると考えられている（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｔｈｅ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２，１９８８，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２２３−２６０）。
デング熱は、世界各地の熱帯地方に広く分布しており、感染力が極めて強く、流行時には人口の約８０％が感染することが知られている。地球上の患者は２０００万人／年（ＷＨＯ）にもおよび、流行地域も患者数も年毎に拡大の一途をたどっている（Ｒｉｇａｕ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，１９９８，Ｖｏｌ．３５２，ｐ．９７１−９７７）。また、かつては見られなかったＤＨＦ／ＤＳＳが、近年各地で多発しており、出血熱の致死率が４０％以上と高いことからも、この症状は、再興感染症として位置付けられ、その対策は公衆衛生上極めて重要な問題となっている。
しかし、感染における標的組織、感染初期過程の宿主・ウィルス相互作用に関する分子、遺伝子の情報は極めて少なく、デング熱、デング出血熱に有効な薬は未だ知られていないのが実情である。デング熱ワクチンについても、弱毒性ワクチンを始め、不活性ワクチン、サブユニットワクチン、組み換えワクチン、ＤＮＡワクチンなどの開発が進められてはいるものの、有効性や副反応の問題により実用化には達していない（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１４９４−１５０２）。
一方、ヒトゲノム計画等により、ゲノムの解析によって膨大な遺伝子情報が明らかにされている。そして、遺伝子の機能を解析、解明していくことがこの分野の新たな課題となっている。そして、遺伝子の機能解明のために、遺伝子発現の研究がますます注目されている。
例えば、これまでに、リバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）が毒性ＲＮＡウィルス感染に対して効能を示すことが報告され、デング熱ウィルスに対する有効な薬剤として作用することが期待された（非特許文献１１）。しかし、アカゲザルを用いたデングウィルス感染において、リバビリンは予防効果を示さず、反対に貧血や血小板増加症を誘発したことが報告されている（Ｃａｎｏｎｉｃｏ，Ｐ．Ｇ，，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８５，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐ．７５−８１）。また、これまでに細胞表面にあるヘパリン様グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸がデング熱ウィルスの受容体として、その外皮蛋白質と結合することが明らかにされ、この結合を阻害する物質がデング熱ウィルスの感染の治療薬として有望視されている（Ｍａｒｋｓ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１３，ｐ．２１７８−２１８７）。しかし、この分子のみではデング熱ウィルスの宿主特異性を説明することができないことから、他のレセプター構成分子が存在することが予想されている。
さらに、デング熱は、ウィルス抗体により感染が助長される例が多く報告されており、抗原・抗体複合体、Ｆｃレセプターの関与なども考えられているが、詳細な機構については不明である（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．２６０，ｐ．８４−８８；Ｗａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２１３，ｐ．２５４−２５７）。デング熱ウィルスの受容体研究の多くは、宿主固体、細胞レベルで行われているが、未だ分子、遺伝子レベルでは解明されていない。デング熱ウィルスのヒトにおける標的細胞は、血球系に存在していると予想されているが（例えばＣｈｅｎ，Ｙ．Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｖｏｌ．７３，ｐ．２６５０−２６５７）、受容体分子は未同定である。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの問題点を解決し、デング熱ウィルスの感染を効果的に阻害する薬剤を提供することを課題としている。
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、少なくとも、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
（ただし、Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）
で表されるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
この出願の発明は、第２には、少なくとも、次式（ＩＩ）
（Ｘ）ｎ−Ｒ                                                        （ＩＩ）
（ただし、Ｘは、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
（Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）
で表されるオリゴ糖鎖を表し；Ｒは水素原子、Ｓ、Ｎ、Ｏ、Ｐ原子を有する置換基、炭化水素基、脂質、タンパク質、および合成高分子からなる群より選択される基質であり、いずれの場合にも置換基を有していてよく；ｎはＲに結合するオリゴ糖鎖の数を表す１以上の数である）
で表される分子を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
さらに、第３には、この出願の発明は、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖の非還元末端に、Ｈｅｘ３で表されるヘキソースまたはＨｅｘ３ＮＡｃで表されるアミノヘキソースのいずれかがβ１−４結合している前記いずれかのデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
この出願の発明は、第４には、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖におけるＨｅｘ１がグルコース（Ｇｌｃ）であり、Ｈｅｘ２がガラクトース（Ｇａｌ）またはマンノース（Ｍａｎ）である前記いずれかのデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
また、この出願の発明は、第５には、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖におけるＨｅｘ１がグルコース（Ｇｌｃ）であり、Ｈｅｘ２がガラクトース（Ｇａｌ）またはマンノース（Ｍａｎ）であり、Ｈｅｘ３がガラクトース（Ｇａｌ）またはＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であるデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
さらに、この出願の発明は、第６には、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎮が
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉａ）
で表されるパラグロボシドであるデング熱ウィルス感染阻害剤を、第７には、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖が
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉｂ）
であるデング熱ウィルス感染阻害剤を、そして第８には、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖が
ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−  （Ｉｃ）
であるデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
この出願の発明は、第９には、次式（Ｉａ）
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉａ）
で表されるパラグロボシドに対するモノクローナル抗体を、第１０には、次式（１ｂ）
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−        （Ｉｂ）
で表されるオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体を、そして第１１には、次式（Ｉｃ）
ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−  （Ｉｃ）
で表されるオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体を提供する。
そして、この出願の発明は、第１２には、少なくとも前記いずれかのモノクローナル抗体を有効成分として含有することを特徴とするデング熱ウィルス感染阻害剤を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、この出願の発明の実施例において、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理後のＫ５６２細胞の中性等脂質画分のＴＬＣ分析およびｖｉｒｕｓ結合性の結果を示した写真である。（ａ：Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬噴霧、ｂ：Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬噴霧、ｃ：ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ；１：中性糖脂質画分（未処理）、２：中性糖脂質画分（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（＋））、３：中性糖脂質画分（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（−））、４：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（＋））、５：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（−））；展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）；使用プレート：Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）。
図２は、この出願の発明の実施例において、Ｋ５６２細胞の中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶに対するｖｉｒｕｓ結合性の結果を示した写真である。（ａ：Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬噴霧、ｂ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｃ：ｖｉｒｕｓ（＋）；１：中性糖脂質画分Ｉ、２：中性糖脂質画分ＩＩ、３：中性糖脂質画分ＩＩＩ、４：中性糖脂質画分ＩＶ、５：ＬａｃＣｅｒ、６：ＣＴＨ、７：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、８：ＧＡ１、９：ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ；展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）；使用プレート：Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）
図３は、この出願の発明の実施例において、Ｋ５６２細胞の中性糖脂質画分ＩＩ−２に対するｖｉｒｕｓ結合性の結果を示した写真である。（ａ：Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬噴霧、ｂ：ｖｉｒｕｓ（＋）；１：中性糖脂質画分ＩＩ−２、２：ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、３：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、４：ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ；展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）；使用プレート：Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）
図４は、この出願の発明の実施例において、抗ＰＧモノクローナル抗体（Ｈ１１）によるＫ５６２細胞精製糖脂質画分の免疫化学的検出の結果を示した写真である。（１：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、２：中性糖脂質画分ＩＩ−２；展開溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）；使用プレート：Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）
図５は、この出願の発明の実施例において、パラグロボシドによるデングウィルスのＫ５６２細胞への結合阻害効果の解析結果を示した図である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（＋）、ｂ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｃ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ１００μＭ、ｄ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ２００μＭ、ｅ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ５００μＭ、ｆ：ＧＡ１５００μＭ）
図６は、この出願の発明の実施例において、パラグロボシドによるデングウィルスのＫ５６２細胞への結合阻害効果の解析結果を示した写真である。（ａ：ｖｉｒｕｓ（＋）、ｂ：ｖｉｒｕｓ（−）、ｃ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ１００μＭ、ｄ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ２００μＭ、ｅ：ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ５００μＭ、ｆ：ＧＡ１５００μＭ）
図７は、この出願の発明の実施例において、蚊由来Ｃ６／３６細胞から得られた中性糖脂質画分からデングウィルス結合脂質を単離する際の溶出パターンをＴＬＣで分析した結果を示した写真である。
図８は、この出願の発明の実施例において、蚊由来Ｃ６／３６細胞から得られた糖脂質とデングウィルスとの結合性の解析結果を示した図である。（１：Ｃ６／３６細胞から抽出した中性糖脂質画分、２：１より精製したＦｒａｃｔｉｏｎ１３および１４、３：１より精製したＦｒａｃｔｉｏｎ１５）
図９は、この出願の発明の実施例において、パラグロボシド糖鎖によるデングウィルスのＫ５６２細胞への感染阻害を解析した結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明者らは、デング熱を引き起こすデング熱ウィルスの宿主がヒトと蚊に限定されているという点に注目し、この２種の生物が共通して有する受容体分子を突き止めるべく鋭意研究を進めた。そして、ウィルスが感染・増殖できる培養細胞（Ｋ５６２細胞：ヒト骨髄性白血病細胞株、およびＣ６／３６細胞：Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来）を用いて、受容体が脂質である可能性、タンパク質である可能性、これらの糖鎖付加体である可能性について、生化学的、免疫学的、細胞生物学的手法により検討したところ、デング熱ウィルスのレセプターの検索と同定に成功し、本願発明に至ったものである。
すなわち、この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
で表されるオリゴ糖を必須構成要素として有する糖質分子を有効成分として含有するものである。このような糖質分子は、多糖類に限定されず、糖脂質や糖タンパクであってもよい。
また、このような糖質分子において、Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表し、具体的には、グルコース（Ｇｌｃ）、フルクトース（Ｆｒｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）が例示される。中でも、Ｈｅｘ１としては、Ｇｌｃが好ましく、Ｈｅｘ２としては、ＧａｌまたはＭａｎが好ましい。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、また、有効成分として、上記のオリゴ糖部位が、例えば炭化水素基、合成高分子、脂質、タンパク質等の合成化合物や天然化合物に結合した物質、すなわち、
（Ｘ）ｎ−Ｒ                                                        （ＩＩ）
（ただし、Ｘは、次式（Ｉ）
Ｈｅｘ１ＮＡｃβ１−３Ｈｅｘ２β１−４Ｈｅｘ１β１−                  （Ｉ）
（Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２はヘキソースを表す）
で表されるオリゴ糖鎖を表し；Ｒは水素原子、Ｓ、Ｎ、Ｏ、Ｐ原子を有する置換基、炭化水素基、脂質、タンパク質、および合成高分子からなる群より選択される基質であり、いずれの場合にも置換基を有していてよく；ｎはＲに結合するオリゴ糖の数を表す１以上の整数である）で表される物質を有効成分として含有するものであってもよい。
このとき、Ｈｅｘ１およびＨｅｘ２としては、前記のとおりのヘキソースが例示される。また、Ｒとしては、Ｈ、置換基を有していてもよいＣ１−２０アシル基、置換基を有していてもよいＣ１−２０アルキル基、ラクチル基、アミノ基、ヒドロキシル基、硫酸基、リン酸基等の置換基や、ポリエチレングリコール、ポリグルタミン酸等の高分子鎖、デンドリマー、ポリペプチド、あるいはグリセリン、セラミド等の脂質、アルブミン、フェツイン、トランスフェリン等の血清糖タンパク質、ＤＮＡなどが好ましく例示される。中でも、ヒトに対する毒性が低いグリセリン、セラミド等の脂質、あるいは血清糖タンパク質をＲとして用いることにより、安定で扱いの容易なデング熱ウィルス感染阻害剤の有効成分を得ることができる。なお、ＲはβＧｌｕのＣ１位に結合していればよく、Ｒのどの位置で、どのような形態でβＧｌｕのＣ１炭素と結合していてもよい。
上記式（ＩＩ）の物質は、例えば、Ｋｉｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．やＮｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．の報告にあるような、一つのＲに対して複数（ｎ個）のオリゴ糖鎖が結合した構造を有するものであってもよい（Ｋｉｔｏｖ，Ｐ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，Ｖｏｌ．４０３，ｐ．６６９−６７２；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，ｐ．７６６９−７６７４）。
さらに、本発明者らの研究によれば、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖の非還元末端に、Ｈｅｘ３で表されるヘキソースまたはＨｅｘ３ＮＡｃで表されるアミノヘキソースのいずれかがβ１−４結合しているとき、オリゴ糖鎖がとくに高いデングウィルス結合性を示し、デング熱ウィルス感染阻害剤の効果が高まることが明らかになっている。したがって、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖は
2004037272.tif 000002
であることが好ましい。このとき、Ｈｅｘ３としては、グルコース（Ｇｌｃ）、フルクトース（Ｆｒｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）等が例示される。また、Ｈｅｘ３ＮＡｃとしては、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルマンノサミシ（ＭａｎＮＡｃ）等が例示される。中でも、Ｈｅｘ３としては、Ｇａｌが、また、Ｈｅｘ３ＮＡｃとしては、ＧａｌＮＡｃが好ましい。
以上のとおりのデング熱ウィルス感染阻害剤において、式（Ｉ）で表されるオリゴ糖鎖としてとくに好ましいものを挙げるならば、
2004037272.tif 000003
で表されるパラグロボシド、
2004037272.tif 000004
および
2004037272.tif 000005
で表されるオリゴ糖鎖が例示される。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、発明者らにより明らかにされた、デングウィルスが前記の式で表される特定のオリゴ糖鎖を特異的に認識・結合するという性質を利用するものである。したがって、これらのオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体を公知の生物学的手法により製造すれば、このようなモノクローナル抗体もまた、デング熱ウィルス感染阻害剤の有効成分として作用する。
また、以上のとおりのデング熱ウィルス感染阻害剤において、有効成分として用いられるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子やオリゴ糖部位を有する物質、あるいはオリゴ糖に対するモノクローナル抗体以外の成分の組成や、医薬品としての形態はとくに限定されない。オリゴ糖へのデングウィルスの結合を阻害しない限り、各種の成分を含有していてもよく、その投与形態もとくに限定されない。具体的には、錠剤、粒・散剤、シロップ剤等の形態での経口投与、注射剤等の形態での非経口投与、座薬等の形態での直腸投与など患者の症状や状態に応じた投与方法を選択することができる。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤を経口投与する場合には、錠剤、トローチ、カプセル、霊薬、粉末、顆粒、懸濁液、乳液、およびシロップ等の形態とすることができる。また、被覆粒子、多層錠剤あるいは微小顆粒等として、緩慢放出または遅延放出される形態としてもよい。これらの形態においては、デング熱ウィルス感染阻害剤は、オリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子やオリゴ糖鎖部位を有する物質、あるいはオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体とともに、薬学認容性の結合剤、甘味料、崩壊剤、希釈剤、人工香味料、被覆剤、保存剤、潤滑剤および／または効果遅延剤等を含有していてもよい。
非経口投与では、有効成分であるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子やオリゴ糖鎖部位を有する物質、あるいはオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体は、毒性を有さず、非経口的に認容される希釈剤や溶媒、具体的には、無菌の水溶液、または油性溶液、あるいは懸濁液中で調製してもよい。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤では、有効成分であるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子、オリゴ糖鎖部位を有する物質、およびオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体は、座薬等の形態で直腸投与されるものであってもよい。好適な座薬は、活性物質を常温では固体で直腸では融解する非刺激性の賦形剤と混合することによって調製してもよい。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、さらに、あまり一般的ではないものの、吸入スプレーや軟膏等の経皮投与用形態を有するものであってもよい。例えば、吸入スプレーは、溶液、懸濁液または乳状液とし、二酸化炭素や一酸化二窒素等の低毒性の吸入可能な噴霧剤を含んでもよい。一方、経皮投与用としては、クリーム、軟膏、ジェル、ゼリー、チンキ、懸濁液または乳状液の形態が好ましく挙げられる。これらは、薬学認容性の結合剤、希釈剤、崩壊剤、保存剤、潤滑剤、分散剤、懸濁剤および／または乳化剤を含有してもよい。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、一般的に知られる各種の方法によって製造されてもよい。例えば、有効成分であるオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子あるいはオリゴ糖鎖部位を有する分子、さらには、オリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体を１種以上の好適なキャリア、補助剤、希釈剤または賦形剤と共にすりつぶす、粉砕する、ブレンドする、分散する、溶解する、懸濁する、混合する、混和する、組合せる、乳化する、またはホモジネートすることによって調製される。またこれらのステップを１以上組合せて製造されるものであってもよい。
この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤において、有効成分の含有量はとくに限定されない。例えば、有効成分としてのオリゴ糖鎖を必須構成要素として有する糖質分子やオリゴ糖鎖部位を有する分子、あるいはオリゴ糖鎖に対するモノクローナル抗体の濃度が５００〜１０００ｍｇ／人／日となるように配合することができる。もちろん、患者への投与量は、患者の年齢、性別、体重などを考慮して主治医の診断により患者の症状、状態に応じて決定されるべきものである。好ましくは、患者の体重に応じて１０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することが望ましい。
以上のとおりのこの出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、デング熱症状の発症を抑制する目的で、デング熱ウィルスに感染した恐れのある患者に対して、感染初期の段階で投与できる。また、この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤を、デング熱症状を示す患者に投与すれば、デング熱の治療も可能となる。さらに、この出願の発明のデング熱ウィルス感染阻害剤は、デング熱流行地域の住民や流行地域への渡航者に対して投与することにより、デング熱ウィルスへの感染予防剤としても効果的に作用する。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明する。もちろん、この出願の発明は、以下の実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【実施例】＜実施例１＞  Ｋ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）からのＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ結合性脂質の単離・精製
（１）中性糖脂質の単離・精製
Ｋ５６２細胞（Ｔ−２２５フラスコ２６本分）に冷ＰＢＳ（−）０．５ｍｌを加え懸濁し、４℃で遠心した。得られたペレットに５ｍｌの精製水を加えてよく懸濁し、次にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を１００ｍｌ加え、攪拌しながら１時間、総脂質の抽出を行った。抽出液をろ過し、残渣に対して同じ処理を再度行い、得られたろ液をあわせてナス型フラスコに移し、溶媒を除去した。乾固した総脂質画分にＭｅＯＨ３０ｍｌを加え、超音波処理を５分間行った後、１０Ｎ  ＮａＯＨ３００μｌを加え３７℃で一晩インキュベートした。
反応終了後、１Ｎ  ＡｃＯＨ３ｍｌを加え、よく懸濁し、超音波処理を５分間行い、再び溶媒を除去した。乾固した総脂質画分に精製水５ｍｌを加えてよく懸濁し、超音波処理を５分間行った。同じ処理を再度行い、あわせた懸濁液を４℃で一晩透析した。凍結乾燥を行い、これを総脂質画分とした。
得られた総脂質画分をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）５ｍｌに溶かし、よく懸濁した後、超音波処理を５分間行った。同じ処理を再度行い、あわせた懸濁液を予め同じ溶媒で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（酢酸型、ゲル容積１００ｍｌ）カラムにアプライした。ゲル容積の１０倍量のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）を流し、この画分を集めて中性糖脂質画分とし、溶媒を除去した。
中性糖脂質画分に２ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を加え、よく懸濁した。
（ａ）中性糖脂質画分のＴＬＣ分析
得られた中性糖脂質画分（５μｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＥ）（１μｌ）、ＬａｃＣｅｒ（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（１μｌ）、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｍｏｎｏｈｅｘｉｏｓｉｄｅ（ＣＭＨ：Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（２μｌ）、Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｅ（ＣＴＨ：Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（２μｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＣ）（２μｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ（ＰＳ）（２μｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＩ，ウシ肝臓由来，ＳＩＧＭＡ社）（２μｌ）をＨＰＴＬＣ上にスポットし、一度アセトンで展開し、風乾した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（６０／３５／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、１枚はＯｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、１枚はＤｉｔｔｍｅｒ試薬を噴霧し発色を行った。
（ｂ）中性糖脂質画分の再アルカリ加水分解
中性糖脂質画分の溶媒を除去し、ＭｅＯＨ５ｍｌを加えてよく懸濁した後、超音波処理を５分間行った。１０Ｎ  ＮａＯＨ５０μｌを加え、３７℃、３時間インキュベートした。反応終了後、０．１Ｎ  ＡｃＯＨ５ｍｌを加えて、よく懸濁し、超音波処理を５分間行い、再び溶媒を除去した。これに精製水５ｍｌを加え、よく懸濁し、超音波処理を５分間行った。同じ処理を再度行い、合わせた懸濁液を４℃で一晩透析し、凍結乾燥した。
（ｃ）ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理
中性糖脂質画分にはリン脂質が含まれていると考えられるため、ＰＣが完全に加水分解される条件でｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理を行った。
まず、中性糖脂質画分（５０μｌ）とｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとしてＰＣ（５μｌ）をそれぞれ２本の試験管に取り、窒素気流下で蒸発固化し、ｅｔｈｅｒ／ｅｔｈａｎｏｌ（９８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）を１００μｌずつ加えた。１分間の超音波処理を行い、各試料の１本の試験管にはＣａＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）（ｐＨ７．２）で溶解したｐｈｏｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ由来，ＳＩＧＭＡ社）（０．１ｍｇ／１００μｌ）溶液を、残りの１本には、ＣａＣｌ２含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．２）のみを１００μｌずつ加え、よく懸濁した後、２５℃の水浴にて３時間反応させた。
反応終了後、溶媒を窒素気流下で除去し、生成物を逆相カラムで脱塩した。脱塩画分を窒素気流下で蒸発固化し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を、中性糖脂質画分には３０μｌ、ＰＣには１５μｌ加え、よく懸濁した後、ＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）上にスポットした。ＴＬＣプレートを一度アセトンで展開し、風乾した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、１枚はＯｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、１枚はＤｉｔｔｍｅｒ試薬を噴霧し発色を行った。
また、ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。
図１に結果を示した。Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理によるｖｉｒｕｓ結合性の変化は認められなかった。Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理後においても、まだＰＣ以外のリン脂質のバンドがいくつか観察されたことから、イアトロビーズカラムを用いて中性糖脂質画分をさらに４つの画分に精製した。
中性糖脂質画分全量をｐｈｏｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ処理し、反応液全量を４℃で一晩透析することで脱塩を行った。乾燥標品に対し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）を１ｍｌ加え、懸濁し、超音波処理を５分間行った後、これをイアトロビーズカラムにかけ、▲１▼ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）、▲２▼ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５／２５／４，ｂｙ  ｖｏｌ．）、▲３▼ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６０／３５／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）、▲４▼ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）の４種の溶媒で連続して溶出し、中性糖脂質画分をさらに４つの画分に分けた。（各々、中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶとした。）
これらを窒素気流下で蒸発固化し、それぞれに１ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を加え、うち５μｌずつをＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）にスポットした。プレートをアセトンでもう一度展開し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬を噴霧し発色した。
（ｄ）中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶの化学分析およびｖｉｒｕｓ結合性の検討
前記（ｃ）で得られた中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶ（１０μｌずつ）、対照標品として、ＬａｃＣｅｒ（１μｌ）、ＣＴＨ（２μｌ）、ｐａｒａｇｌｏｂｏｓｉｄｅ（ＰＧ：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（２μｌ）、ＧＡ１（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（２μｌ）、ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ（ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１’Ｃｅｒ）（２μｌ）をＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）にスポットし、アセトンで一度展開した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、発色した。中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶについて、前記の方法によりＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。
結果を図２に示した。
図２より、中性糖脂質画分Ｉ〜ＩＶのうち、中性糖脂質画分ＩＩはｖｉｒｕｓと強い結合性を示し、ＣＴＨ、ＰＧ及びｇｌｏｂｏｓｉｄｅと呼ばれる中性糖脂質と非常に近い分子構造を有していることが示唆された。
（ｅ）ＴＬＣプレートからの目的糖脂質のかきとり・抽出
そこで、ｖｉｒｕｓとの結合性を示す部分をＴＬＣプレートからかきとり、抽出を行い、目的物質を含む中性糖脂質画分を得た。
ＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）を前処理としてＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開、風乾しておいた。中性糖脂質画分ＩＩを窒素気流下で蒸発固化し、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を０．１ｍｌ加え、その全量を１μｌ／ｍｍ  ｌａｎｅとなるようにプレート上にスポットし、アセトンで一度展開後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開した。
ＴＬＣの両端を切り取り、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、発色させた後、目的糖脂質のバンドを確認した。
残ったプレート上のバンドに対応する部分をはさみで切り取り、切り取ったＴＬＣプレートからシリカゲルをかきとり、これにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）を２５ｍｌ加え、１時間攪拌し、抽出を行った。抽出液を綿栓ろ過し、ろ液から溶媒を除去した。これにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）１ｍｌを加え、超音波処理を行い、パスツールピペットに詰めたイアトロビーズカラム（ゲル容量１ｍｌ）にアプライした。
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）を１５ｍｌカラムに流し、この画分を集めた。（中性糖脂質画分ＩＩ−１）
次に、溶出溶媒をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）に変え、２０ｍｌカラムに流した。（中性糖脂質画分ＩＩ−２）
それぞれの画分から溶媒を除去した後、０．５ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を加えた。５μｌずつＴＬＣプレートにスポットし、アセトンで一度展開した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱発色した。このとき対照標品として、ＰＧ、ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ、ＣＴＨも２μｌずつＴＬＣ上にスポットした。
（２）中性糖脂質画分に対するｖｉｒｕｓ結合性の解析
前記（１）の方法により得られた中性糖脂質画分ＩＩ−２（１０μｌ）、ＰＩ（１０μｌ）、ＰＧ（２μｌ）、ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ（１μｌ）をＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）にスポットし、アセトンで一度展開した後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、発色させた。ＴＬＣ／ｖｉｒｕｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを前記の方法により行った。
結果を図３に示した。
図３より、中性糖脂質画分ＩＩ−２には、ＴＬＣ上でＰＧと非常に近い位置に展開される糖脂質が含まれていること、さらにはこの糖脂質がＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓと強い結合性を示すことが確認された。また、対照標品であるＰＧに対しても、同様のｖｉｒｕｓ結合性が観察された。
（３）中性糖脂質画分に含まれる結合性脂質の構造解析
以上より、Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓと結合性を示す糖鎖分子がＰＧと非常に近い糖鎖構造をしていることが示唆された。そこで、抗ＰＧモノクローナル抗体を用いて免疫化学分析を行った。
（ａ）免疫化学的分析
中性糖脂質画分ＩＩ−２（１０μｌ）およびＰＧ（２μｌ）をＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ）にスポットし、アセトン、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（５０／４０／１０，ｂｙ  ｖｏｌ．）で連続的に展開した。ＴＬＣプレートを１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液中にて４℃で一晩ブロッキングした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０００倍希釈した抗ＰＧモノクローナル抗体（クローンＨ１１）（５ｍｌ）と１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（１０ｍｌ）で３分間洗浄し、これを５回繰り返した。洗浄終了後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０００倍希釈したＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｓｉｄａｓｅ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（５ｍｌ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）と１時間反応させた。プレートをＰＢＳ（−）で３分間洗浄し、これを５回繰り返し行った。最後に発色基質溶液〔０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０（５ｍｌ），０．１１Ｍ  ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ（１００μｌ），０．０６Ｍ  ＤＥＰＤＡ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ（１００μｌ），３０％Ｈ２Ｏ２（１０μｌ）〕と反応させ、スポットを検出した。
結果を図４に示した。
図４より、中性糖脂質画分ＩＩ−２には、ＰＧと同一の糖脂質が含まれていることが判明した。
以上より、Ｋ５６２細胞中のデングウィルス結合性脂質は、次式
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒａｍｉｄｅ
（ただしＧａｌ：Ｇａｌａｃｔｏｓｅ、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、Ｇｌｃ：ｇｌｕｃｏｓｅ）で表されるパラグロボシド（ＰＧ）糖鎖構造を有する中性糖脂質であることが確認された。
＜実施例２＞  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いたＰＧによるＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓのＫ５６２細胞表面への結合阻害効果の解析
Ｋ５６２細胞をコンフルエントまで培養した後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌになるようにマイクロチューブに分取した。これを４℃、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心後、得られた細胞のペレットを０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄した。Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ液（２０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）とＰＧ（０，１００，２００，５００μＭ）あるいは対照糖脂質であるＧＡ１（５００μＭ）を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で４℃、１時間プレインキュベーションした後、それぞれＫ５６２細胞に１００μｌずつ加え、４℃で１時間、細胞へ結合させた。なお、ｖｉｒｕｓ（−）として、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳのみを同量加えた。反応終了後、冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、一次抗体としてヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗血清（ロット＃１）を２００倍希釈して１００μｌずつ加え、よく懸濁した後４℃で３０分間反応させた。冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、二次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）を５０倍希釈して、１００μｌずつ加え、遮光した後、４℃で３０分間反応させた。反応終了後、冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、得られたペレットに対して０．５ｍｌの冷ＰＢＳ（−）を加え、よく懸濁し、フローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で測定した。
ＰＧによるデングウィルスのＫ５６２細胞への結合阻害を調べ、ＰＧ濃度依存性を図５に示した。
図５より、ＰＧの濃度に依存してデングウィルスのＫ５６２細胞への結合が阻害されることが明らかになった。対照糖脂質であるＧＡ１は中性の４糖である点、さらに分子内の非還元末端にガラクトース残基を有する点から、ＰＧと非常に類似した物性であった。しかし、ＧＡ１は５００μＭの濃度においてもデングウィルスのＫ５６２細胞への結合を阻害できなかった。
以上より、ＰＧは、デングウィルスと特異的に結合し、この特異的結合によりウィルスの宿主細胞表面への吸着が阻害されていることが明らかになった。
＜実施例３＞  パラグロボシドによるＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓのＫ５６２細胞表面への結合阻害活性の検討
（１）Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ濃度
Ｋ５６２細胞をコンフルエントまで培養した後、４×１０５ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌになるようにマイクロチューブに分取した。これを４℃、３，５００ｒｐｍで３分間遠心後、得られた細胞のペレットを０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ１ｍｌで１回洗浄した。さらに、４℃、３，５００ｒｐｍで３分遠心した後、Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ原液を、それぞれ０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈して５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，２０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとした後、各々をＫ５６２細胞に１００μｌずつ加え、４℃で１時間反応させた。
なお、ｖｉｒｕｓ（−）として、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳのみを同量加えたものを用いた。
反応終了後、冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、一次抗体としてヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗血清（ロット＃１）を２００倍希釈して１００μｌずつ加え、よく懸濁した後４℃で３０分間反応させた。冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、二次抗体としてＦＩＴＣ標準ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）を５０倍希釈して、１００μｌずつ加え、遮光した後４℃で３０分間反応させた。
反応終了後、冷ＰＢＳ（−）１ｍｌで細胞を３回洗浄し、得られたペレットに対して０．５ｍｌの冷ＰＢＳ（−）を加え、よく懸濁し、フローサイトメター（Ｅｐｉｃｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で測定した。
以後、ｖｉｒｕｓの濃度は、２０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとした。
ＰＧによるデングウィルスのＫ５６２細胞への結合阻害を調べ、ＰＧ濃度依存性を図６に示した。
（２）一次抗体希釈濃度の検討
（１）より、Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ濃度を１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌに設定し、ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。ここでは冷ＰＢＳ（−）で希釈し、一次抗体の濃度を２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍とした。なお、ｖｉｒｕｓ（−）には２００倍希釈した一次抗体を用いた。実験方法は（１）に準じた。
以後、一次抗体は、２００倍希釈とした。
（３）パラグロボシドによるｖｉｒｕｓ結合性に与える影響
Ｋ５６２細胞（１×１０５  ｃｅｌｌ）を２４ｗｅｌｌ培養用プレートに播種し、ＲＰＭＩ培地で全量１ｍｌにした。パラグロボシドの最終濃度が０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭになるように希釈して加え、３７℃で１時間反応させた。これを低速遠心し、得られたペレットに０．１％ＢＳＡ含有冷ＰＢＳを１ｍｌ加えた。マイクロチューブに移し替え、（１）の方法によりｖｉｒｕｓ結合性を評価した。
図６より、デングウィルスとパラグロボシドを予めインキュベートしておくと、パラグロボシドの濃度に依存してデングウィルスのＫ５６２細胞への結合阻害が起きることが明確に観察された。
また、４糖構造の糖鎖を有する構造類似中性糖脂質であるＧＡ１（アシアロＧＭ１）（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ）を陰性対照として同様の実験を行ったところ、デングウィルスの細胞表面の結合には全く影響しなかった。
したがって、デングウィルス結合阻害性がパラグロボシド糖鎖構造に特異的な特性であることが確認された。
以上より、Ｋ５６２細胞表面に存在するパラグロボシドは、デング熱ウィルスのレセプターそのもの、あるいはその一部として機能していることが示された。
＜実施例４＞  蚊由来培養細胞株からのＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ結合性脂質の単離・精製および同定
（１）Ｃ６／３６細胞の培養
Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓの標的細胞として、このウィルスに対して感受性を示し、さらに高いウィルス産生能を有するＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来Ｃ６／３６細胞株を用いた。Ｃ６／３６細胞は、１０％非働化ウシ胎児血清、および１％非必須アミノ酸含有ＭＥＭ培地中、２８℃で培養した。
細胞株の継代は１／１０の前培養液に対して、新鮮ＭＥＭ培地を加え、全量２０ｍｌとし、Ｔ−７５フラスコ中に播種した。
（２）総脂質の抽出
１５Ｌ培養液からＣ６／３６細胞をハーベストした。得られた細胞のペレットにＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１０／１０／１，ｂｙ  ｖｏｌ．）を１Ｌ加え、よく懸濁した後、２４時間抽出を行った。
これをろ過し、残渣に対して同じ処理を再度行い、得られた上清を合わせてナス型フラスコに移し、溶媒除去した。さらにＭｅＯＨを１００ｍｌ加え、よく懸濁した後、超音波処理を１０分間行い、１０Ｎ  ＮａＯＨ１ｍｌを加えて３７℃で１５時間インキュベートした。
反応後、１０Ｎ  ＡｃＯＨ１ｍｌを加え、よく懸濁し、超音波処理を５分間行い、再び溶媒を除去した。これに蒸留水２０ｍｌを加え、よく懸濁し、超音波処理を３０分間行った。同様の処理を再度行い、合わせた懸濁液を４℃で４６時間透析し、凍結乾燥し、これを総脂質画分とした。
（３）イオン交換カラムクロマトグラフィー
得られた総脂質画分にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）１００ｍｌを加え、よく懸濁した後、超音波処理を１０分間行った。これを予め同じ溶媒で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（酢酸型、ゲル容積４００ｍｌ）カラムにアプライした。ゲル容積の４７．５倍量のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０／６０／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）を流し、この画分を集めて中性糖脂質画分とした。
（４）中性糖脂質画分の精製
中性糖脂質画分を３ｍｌのＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（８／２，ｂｙ  ｖｏｌ．）に溶解した。この画分１ｍｌを同じ溶媒で予め平衡かしたＳｅｎｓｈｕ  Ｐａｋ  ＡＱＵＡＳＩＬ−ＳＳ−３２５１カラム（８φ×２５０ｍｍ）を装着したＨＰＬＣシステム（ＰＵ−２０８０Ｐｌｕｓ、日本分光）にインジョクションした。同溶媒（１００％）から同溶媒：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（６０／３５／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）（３０／７０，ｂｙ  ｖｏｌ．）への直線濃度勾配にて総溶媒量１００ｍｌを流し、カラム溶出液を２ｍｌずつ分取した。各各文をＨＰＴＬＣに２μｌずつスポットし、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２（６０／３５／８，ｂｙ  ｖｏｌ．）でプレートを展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧した１１０℃に加熱し発色を行い、糖脂質の溶出を確認した。
（５）中性脂質画分とＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓとの反応性
３枚のＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ，Ｍａｒｃｈｅｒｙ  Ｎａｇｅｌ）上に、中性糖脂質画分を１μｌずつスポットし、風乾した後、ｎＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ（７５／２５／５，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、風乾させ、１枚はＯｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し発色させた。残り２枚には、ＰＢＳを加え、ゆっくり浸透させた後、吸引し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（１％卵白アルブミン、１％ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ含有ＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。
反応後、ｖｉｒｕｓ（＋）にはＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを用いて１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌに調製したＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ（Ｄ２Ｔｈ７株）懸濁液を３ｍｌ加え、ｖｉｒｕｓ（−）にはＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａのみを同量加えて４℃に一晩静置した。プレートをＰＢＳ（−）で３分間、３回洗浄した。
次にＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａで１０００倍に希釈したヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗血清を２．５ｍｌ加えて室温で１時間反応させた。プレートをＰＢＳ（−）で３分間、３回洗浄した。最後に２．５ｍｌの発色基質溶液（０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０（２．５ｍｌ），０．１１Ｍ  ４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｈｔｈｏｌ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ（５０μｌ），０．０６Ｍ  ＤＥＰＤＡ  ｉｎ  ＣＨ３ＣＮ（５０μｌ），３０％Ｈ２Ｏ２（５μｌ））と反応させ、結合したウィルス粒子を検出した。なお、Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ（Ｄ２Ｔｈ７株）およびヒト抗ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ抗血清は、長崎大学熱帯医学研究所、五十嵐章教授、森田公一教授よりご恵与いただいた。
（６）精製糖脂質のＴＬＣ分析
単離された中性糖脂質１．５〜２μｌずつをＨＰＴＬＣ上にスポットした。ｎＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ（７５／２５／５，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、Ｏｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し、発色を行った。
また、各画分を０．５〜１μｌずつ３枚のＴＬＣプレート（Ｐｏｌｙｇｒａｍ  Ｓｉｌ  Ｇ，）にスポットし、一度アセトンで展開して風乾した後、ｎＰｒＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＮＨ４ＯＨ（７５／２５／５，ｂｙ  ｖｏｌ．）で展開し、風乾させた。１枚はＯｒｃｉｎｏｌ試薬を噴霧して１１０℃に加熱し発色した。残り２枚は、（５）の方法でｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙを行った。
次に、デングウィルス高感受性細胞株である蚊由来Ｃ６／３６細胞より、デングウィルス結合脂質の探索を行った。
デングウィルス結合脂質は、Ｋ５６２細胞の場合と同様に陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画で中性糖脂質画分に溶出された。
この画分から結合性脂質を単離するためにシリカカラムを装着したＨＰＬＣを行った。その溶出パターンをＴＬＣで分析した結果を図７に示した。図中矢印で示した２種類の糖脂質が結合性を有していた。今回行ったＨＰＬＣの条件でこれら２種類の糖脂質が完全に単離された。
そこで、精製糖脂質とデングウィルスとの結合性を解析した結果を図８に示した。Ｆｒａｃｔｉｏｎ１３、１４および１５に含まれていた精製糖脂質が非常に強力にウィルスと結合することが示された。昆虫由来の標準糖脂質との構造比較から、Ｆｒａｃｔｉｏｎ１３、１４に含まれている糖脂質の構造がＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒ（ただし、Ｍａｎ：ｍａｎｎｏｓｅ；Ｃｅｒ：ｃｅｒａｍｉｄｅ）であり、一方、Ｆｒａｃｔｉｏｎ１５に含まれている糖脂質の構造は、全く新規であり、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎβ１−４Ｇｌｃβ１−１Ｃｅｒと推定された。
Ｋ５６２細胞から結合性脂質として単離されたパラグロボシドと、以上の実施例より単離された糖脂質の構造をまとめると、
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となった。
したがって、これらの構造から、デングウィルスと結合するために必要な最小糖鎖構造は、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｍａｎ（またはＧａｌ）β１−４Ｇｌｃβ１−であり、さらに、非還元末端にＧａｌがβ１−４結合することによりその結合性が高められるものと示唆された。
＜実施例５＞  パラグロボシド糖鎖によるＤｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓのＫ５６２細胞への感染阻害活性の検討
以上の実施例において使用されたパラグロボシド糖鎖は、いずれもセラミドに結合した物質であった。
そこで、パラグロボシド糖鎖によるデングウィルスの結合阻害性が、パラグロボシドに対する結合基質に依存せず、セラミド以外の結合基質でも同様の効果が得られることを確認するために、末端に基質を有さないパラグロボシド糖鎖のみについて、そのウィルス結合阻害性を試験した。
（１）パラグロボシド糖鎖分子および他のオリゴ糖の調製
以下のオリゴ糖を用いた。
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いずれも、滅菌ＰＢＳ（−）で１ｍＭのストック溶液として調製した。これを適宜希釈して感染阻害実験に使用した。
（２）デングウィルス溶液の調製
最終ウィルス量が３×１０５  ＦＦＵ（ｆｏｃｕｓ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）／ｓａｍｐｌｅとなるように０．２％ＢＳＡ含有血清非添加ＲＰＭＩ培地（ＳＦ−ＲＰＭＩ）で希釈し、よく攪拌した後、氷上においた。
（３）オリゴ糖によるデングウィルスの前処理
前記（２）で調製したデングウィルス溶液６３０μｌ（１サンプルあたりのウィルス容量）に対して等量の希釈したオリゴ糖含有溶液を加え、よく攪拌した後、２８℃で３０分間インキュベートした。これを前処理済みウィルス溶液とした。
また、陰性対照としてＰＢＳ（−）をウィルス溶液と混合したものを用いた。
（４）ウィルス感染実験
Ｋ５６２細胞をＳＦ−ＲＰＭＩで１回洗浄した後、０．１％ＢＳＡ−ＳＦ−ＲＰＭＩで１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。この細胞懸濁液を１００μｌずつチューブに入れた。これに前処理済みウィルス溶液を加え、軽く攪拌した後、３７℃で２時間細胞への感染を行った。この間、２０分毎にチューブを軽く攪拌した。３，４００ｒｐｍで３分間遠心した後、ウィルス溶液を除去し、細胞を０．１％ＢＳＡ−ＳＦ−ＲＰＭＩで３回洗浄した。細胞のペレットに２％血清含有ＲＰＭＩ培地（２％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ）を２ｍｌ加え、懸濁し、３５ｍｍ  ｄｉｓｈに移して３７℃で培養した。
一定時間培養後に細胞を回収し、ウィルス抗原の検出を行った。
（５）ウィルス抗原の検出（ウィルス感染価の測定）
回収した細胞を新しいチューブに移し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。細胞のペレットに４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ／ＰＢＳ（固定液）を２００〜６００μｌ加え、４℃で１０分間固定操作を行った。
ＰＢＳ（−）を加えて全量１ｍｌとした後、２０００ｒｐｍで５分間遠心した。同様の操作をもう１度行った後、細胞をＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁して４℃で保存した（固定化）。
固定化細胞にｐｅｒｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＣ  ＰｅｒｍＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を７００μｌ加え、ボルテックスした後、室温に４分間置いた。２５００ｒｐｍで３分間遠心した後、ｐｅｒｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎをチューブに４０μｌ残して上清を除去した。さらに２５００ｒｐｍで３分間遠心した後、完全にｐｅｒｍ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを除去した。細胞のペレットにＡｌｅｘａ標識マウス抗フラビウィルスモノクローナル抗体（クローン６Ｂ６Ｃ−１）を加え、よく懸濁した後、氷上にて遮光して３０分間インキュベートした。２５００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を除去し、ＰＢＳ（−）１ｍｌに細胞を懸濁し、氷上に５分間置いた（洗浄）。
同様の操作をさらに２回行い、最後に細胞のペレットに５００〜１０００ｍｌのＰＢＳ（−）を加え、よく懸濁した後、フローサイトメーターで抗原陽性細胞の検出を行った。
結果を図９に示した。結合阻害と同様に、パラグロボシド糖鎖はその濃度に依存してデングウィルスのＫ５６２細胞への感染を阻害した。したがって、パラグロボシド糖鎖や昆虫由来の類似糖鎖は、強力なデングウィルス感染阻害剤として効果的であることが示された。さらに、パラグロボシド糖鎖によるデングウィルスの結合阻害性が結合基質に依存しないことも確認された。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明により、デング熱ウィルスへの感染を効果的に防止できるデング熱ウィルス感染阻害剤が提供される。
デング熱は第４類感染症に指定されているにも関わらず、これまでその効果的な治療法が確立されておらず、原因微生物であるデングウィルスの宿主への感染機構についても不明な点が多かった。
この出願の発明により、初めてデング熱ウィルス感染阻害剤が実現したが、これは同時に、デング熱ウィルスへの感染による細胞応答の分子機構の解明や、より効果の高い抗デング熱剤の開発など、さらなる展開への足がかりとしての有用性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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