(57)【要約】アリル炭化水素受容体（ＡＨＲ）遺伝子における多型と吸入ステロイド応答性との関連が明らかにされた。ＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓの解析によって吸入ステロイド応答性の検査が可能である。たとえば、ＡＨＲ遺伝子の９０１０番目の塩基および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方の多型のジェノタイピングにより、吸入ステロイド応答性が予測される。本発明の方法により、プロピオン酸ベクロメタゾンなどの吸入ステロイドに対する被検者の応答性を予測することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、吸入ステロイド応答性の検査方法。
（ａ）被検者が有する、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
（ｂ）（ａ）で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の吸入ステロイド応答性を決定する工程
【請求項２】
多型が１塩基多型である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
アリル炭化水素受容体遺伝子の多型が、アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方の多型である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基の多型が、ＴとＣである、請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
アリル炭化水素受容体遺伝子の９２３１番目の塩基の多型が、ＴとＣである、請求項３に記載の検査方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１に記載の検査方法。
（ａ）被検者から採取された生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）アリル炭化水素受容体遺伝子における塩基部位であって、該受容体遺伝子の９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方のジェノタイプを決定する工程
（ｃ）９０１０番目および９２３１番目のいずれか、または両方の塩基がＣである被検者は吸入ステロイド耐性を有すると判定する工程
【請求項７】
吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、およびプロピオン酸フルチカゾンからなる群から選択されたいずれかのステロイドである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾンである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプライマー。
【請求項１０】
多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である請求項９に記載のプライマー。
【請求項１１】
アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプローブ。
【請求項１２】
多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である請求項１１に記載のプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ステロイド耐性の検査方法に関する。
【背景技術】  通常、小児喘息患者の治療初期はプロピオン酸ベクロメタゾンが処方されることが多い。しかし重症患者では徐々にプロピオン酸ベクロメタゾンに耐性となるため、プロピオン酸フルチカゾンに処方を変更する。プロピオン酸ベクロメタゾンの代謝に、ＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写制御を受けている薬物代謝酵素が関わっているならば、ＡＨＲのＳＮＰｓを持つ重症小児患者群では代謝活性が亢進し、徐々にプロピオン酸ベクロメタゾン耐性になる機構が想定される。したがって、小児喘息患者のＡＨＲにあるＳＮＰｓの有無の診断は、プロピオン酸フルチカゾンのようなＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写調節を受けない代謝酵素により分解される薬剤を選定するための指標となる可能性がある。これらの指標を使うことにより、副作用の予防や、医療費の軽減が期待される。
ダイオキシン類による転写刺激に関与する核内受容体として、アリル炭化水素受容体（Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下ＡＨＲと省略する）が知られている。ＡＨＲは、そのリガンドである２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）との結合によって核内に移行する。核内に移行したＡＨＲは、アリル炭化水素受容体核移行因子（Ａｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ；以下ＡＲＮＴと省略する）とヘテロダイマーを形成する。このヘテロダイマーは、異物応答配列（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；以下ＸＲＥと記載する）を認識する。その結果、プロモーター領域にＸＲＥを含む遺伝子の転写を活性化する。ＸＲＥの塩基配列は公知である（ＴＮＧＣＧＴＧ，Ｎは任意）。
ＸＲＥによる転写制御を受けている代表的な遺伝子には、ＣＹＰ１Ａ１等の薬物代謝酵素遺伝子が挙げられる。また、ＡＨＲ関連遺伝子群の一つであるＡＨＲ抑制因子（ＡＨＲ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ；以下ＡＨＲＲと記載する）は、核内でＡＲＮＴと結合することから、ＡＨＲとは互いに競合的な関係にある。ＡＨＲＲ遺伝子もＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写制御を受けることから、ＡＨＲＲはＡＨＲのネガティブフィードバック制御に働くことが示唆されている（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｈ（ｄｉｏｘｉｎ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｕｒａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  １３，２０−２５（１９９９））。
ＡＨＲにある非同義置換を伴う１塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ；以下ＳＮＰｓと記載する）として、例えば次のような多型が報告されている。
Ｐｒｏ  ５１７  Ｓｅｒ（５１７位のプロリン→セリンへの置換）
Ａｒｇ  ５５４  Ｌｙｓ（５５４位のアルギニン→リジンへの置換）
Ｖａｌ  ５７０  Ｉｌｅ（５７０位のバリン→イソロイシンへの置換）
これらのＳＮＰｓのうち、次の組み合せを有する場合に、ＴＣＤＤによるＣＹＰ１Ａ１の発現が抑制されたことが報告されている（Ｈｕｍａｎ  Ａｒｙｌ  Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＣＹＰ１Ａ１  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｗｏｎｇ  ＪＭＹ  ｅｔ  ａｌ．ＢＢＲＣ  ２８８，９９０−９９６（２００１））。
Ｓｅｒ  ５１７／Ｌｙｓ  ５５４／Ｉｌｅ  ５７０、または
Ｌｙｓ  ５５４／Ｉｌｅ  ５７０
なお本発明者らの解析によると、日本人にはＰｒｏ  ５１７  Ｓｅｒ、あるいはＶａｌ  ５７０  Ｉｌｅの多型は確認できていない。
一般に、ＣＹＰ１Ａ１等の薬物代謝酵素遺伝子の多型と、薬物に対する患者の応答性の関連性を示唆する報告は多い。しかし、その転写制御に関与する因子の多型と薬剤応答性との関連性は未知である。
ＡＨＲ遺伝子の多型について、いくつかの研究成果が報告されている。たとえば、フランス人におけるＡＨＲのＳＮＰｓ解析（肺癌患者でのＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）において、次のような多型が見出された。しかし肺癌のケースコントロールスタディで疾患との有意な関連はない。またＣＹＰ１Ａ１の誘導能とも相関しなかった（Ｃａｕｃｈｉ  Ａ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｈＲ）ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａ  Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ＣＹＰ１Ａ１  ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００１  ２２：１８１９−２４）。
アミノ酸置換ＳＮＰｓ：
Ａｒｇ  ５５４  Ｌｙｓ（１７２１Ｇ／Ａ）、および
Ｍｅｔ  ７８６  Ｖａｌ（２４１７Ａ／Ｇ）
５’ＵＴＲ中のＳＮＰｓ：１５７Ｇ／Ａ（頻度０．００５の稀なＳＮＰｓ）
多種の人種におけるＡＨＲのＳＮＰｓ解析も実施されている。その結果、最も高い頻度のＳＮＰｓとして、Ａｒｇ  ５５４  Ｌｙｓ（Ｌｙｓ  ３５％）、およびＰｒｏ  ５１７  Ｓｅｒがアフリカ人で検出された。また、Ｖａｌ  ５７０  Ｉｌｅがアフリカ人とアメリカ人で検出された。更にｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬｙｓ  ５５４／Ｉｌｅ５７０、Ｓｅｒ  ５１７／Ｌｙｓ  ５５４／Ｉｌｅ  ５７０変異を有するＡＨＲのリガンド結合能が調べられている。これらの変異体の、ＡＲＮＴとのダイマー形成能、およびＤＮＡ結合能には野生型との変化は見られなかった。一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでＨｅｐａ１細胞に変異ＡＨＲを発現させてＴＣＤＤで刺激した実験においては、Ｌｙｓ  ５５４／Ｉｌｅ  ５７０を持つ変異ＡＨＲで、ＣＹＰ１Ａ１の誘導が抑制された（Ｗｏｎｇ  ＪＭ  ｅｔ．ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＣＹＰ１Ａ１  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２００１  ２８８：９９０−６）。
ＡＨＲで高頻度に検出されるアミノ酸置換ＳＮＰｓであるＡｒｇ  ５５４  Ｌｙｓについて、人種間での頻度が調査されている。その結果、以下に示すような頻度情報が報告された。
Ｊａｐａｎｅｓｅ：０．４３
Ｉｖｏｒｙ  ｃｏａｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ：０．５７
Ａｆｒｉｃａｎ：０．５３
Ｃａｒｂｂｅａｎ−ａｆｒｉｃａｎ：０．３９
Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ：０．３２
Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｎｄｉａｎ：０．１４
Ｆｒｅｎｃｈ  Ｃａｎａｄｉａｎ：０．１２
Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（ｍｉｘｅｄ  ｅｔｈｎｉｃｉｔｙ）：０．１１
Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｉｎｕｉｔ：０．０９
Ｇｅｒｍａｎ：０．０７
更にＡＨＲに見出されたアミノ酸置換を伴うＳＮＰｓについて、アミノ酸の置換による生物学的な活性に与える影響が調べられている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡｒｇ  ５５４  Ｌｙｓ変異を有するＡＨＲのリガンド結合能、ＡＲＮＴとのダイマー形成能、およびＤＮＡ結合能には変化は見られなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでＨｅｐａ１細胞に変異ＡＨＲを発現させてＴＣＤＤで刺激した実験においては、Ａｒｇ  ５５４、あるいはＡｒｇ  ５５４Ｌｙｓを持つ変異ＡＨＲで、ＣＹＰ１Ａ１の誘導能には変化がなかった（Ｗｏｎｇ  ＪＭ  ｅｔ．ａｌ．Ｅｔｈｎｉｃ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｌｅｌｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｄｏｎ  ５５４  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００１，１１：８５−９４）。
日本人に見出されるＳＮＰｓを解析した報告もある。日本人のＡＨＲの主要なＳＮＰｓは、Ａｒｇ  ５５４  Ｌｙｓの置換を伴うＳＮＰｓであり、Ａｒｇ  ５５４の頻度は０．５７、Ｌｙｓ  ５５４の頻度は０．４３であった。このＳＮＰｓは肺癌の発症には関与していなかった（Ｋａｗａｊｉｒｉ  Ｋ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ａｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５，５：１５１−８）。
【発明の開示】
本発明は、ステロイド応答性と関連する多型を明らかにし、ステロイド応答性の検査を可能とする多型マーカーを提供することである。
ＣＹＰ１Ａ１などの薬剤代謝に関連する遺伝子は、ＡＨＲの転写制御を受けている。本発明者らは、アレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性に対して、ＡＨＲが関与している可能性があると考えた。そこで本発明者らは、ＡＨＲとアレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性との関連性を見出すために、ＡＨＲ遺伝子の多型解析を試みた。ＡＨＲ遺伝子やその周辺遺伝子のＳＮＰｓと喘息との関連性を検討した結果、小児喘息との有意な相関を示すＳＮＰｓを見出した。本発明者らは、これらのＳＮＰｓとステロイド応答性との関連について更に解析を進め、吸入ステロイド応答性のマーカーとして有用な多型を明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の吸入ステロイド応答性の検査方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、吸入ステロイド応答性の検査方法。
（ａ）被検者が有する、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
（ｂ）（ａ）で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の吸入ステロイド応答性を決定する工程
〔２〕多型が１塩基多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕アリル炭化水素受容体遺伝子の多型が、アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方の多型である、〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕アリル炭化水素受容体遺伝子の９０１０番目の塩基の多型が、ＴとＣである、〔３〕に記載の検査方法。
〔５〕アリル炭化水素受容体遺伝子の９２３１番目の塩基の多型が、ＴとＣである、〔３〕に記載の検査方法。
〔６〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者から採取された生体試料からゲノムＤＮＡを採取する工程
（ｂ）アリル炭化水素受容体遺伝子における塩基部位であって、該受容体遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方のジェノタイプを決定する工程
（ｃ）９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方がＣである被検者は吸入ステロイド耐性を有すると判定する工程
〔７〕吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾン、ブデソニド、およびプロピオン酸フルチカゾンからなる群から選択されたいずれかのステロイドである〔６〕に記載の方法。
〔８〕吸入ステロイドがプロピオン酸ベクロメタゾンである〔７〕に記載の方法。
〔９〕アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプライマー。
〔１０〕多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である〔９〕に記載のプライマー。
〔１１〕アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、吸入ステロイド耐性検査用のプローブ。
〔１２〕多型部位が、９０１０番目の塩基、および９２３１番目の塩基のいずれか、または両方である〔１１〕に記載のプローブ。
あるいは本発明は、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域を合成するためのプライマーの、吸入ステロイド耐性の生体外における検査における使用に関する。また本発明は、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位を含む領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの、吸入ステロイド耐性の生体外における検査における使用に関する。
本発明は、次の工程を含む、吸入ステロイド応答性の検査方法を提供する。
（ａ）被検者が有する、アリル炭化水素受容体遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程、および
（ｂ）（ａ）で決定されたジェノタイプに基づいて、被検者の吸入ステロイド応答性を決定する工程
多型とは、遺伝学的には、人口中１％以上の頻度で存在している１遺伝子におけるある塩基の変化と一般的に定義される。しかしながら、本発明の「多型」はこの定義に制限されず、１％未満の塩基の変化であっても本発明の「多型」に含まれる。本発明における多型の種類としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ）から数十塩基が欠失、置換あるいは挿入されている多型等が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明者らにより、アリル炭化水素受容体（ＡＨＲ）遺伝子座には吸入ステロイド応答性と関連する多型が存在することが明らかにされた。当業者は、本発明の知見に基づいて、吸入ステロイド応答性と関連する多型を明らかにすることができる。たとえば、当該遺伝子座には、先に述べたような様々な多型が見出されている。吸入ステロイド応答性に差のある集団の間で、これらの多型の頻度を比較し、有意な差が見られた多型を、吸入ステロイド応答性の指標として選択することができる。あるいは、実施例に示すように、当該遺伝子の塩基配列解析に基づいて、新規な多型を見出すこともできる。
本発明において、吸入ステロイド応答性と関連する多型は望ましくは１塩基多型（ＳＮＰｓ）である。ＳＮＰｓは、ヒトゲノム上に、１０００塩基に１つの割合で存在すると考えられている。したがって、およそ４７ｋｂからなるＡＨＲの遺伝子座には、理論的には４０以上のＳＮＰｓが存在していると考えられる。これらのＳＮＰｓから、連鎖解析によって吸入ステロイド応答性との関連性を有するＳＮＰｓを見出すことができる。
本発明における好ましい多型として、ＡＨＲ遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目における多型を示すことができる。本発明者らは、この部位における塩基が多型（ｔ／ｃ）を有しており、いずれかの部位において塩基Ｃである場合に、プロピオン酸ベクロメタゾン耐性であることを明らかにした。本発明において吸入ステロイド応答性との関連を有する多型として見出されたＡＨＲ遺伝子の９０１０番目、および９２３１番目における多型は、連鎖不平衡の関係にある。したがって、これらの多型はいずれか一方の多型を知ることで、吸入ステロイド応答性を知ることができる。あるいは両方の部位における塩基を確認すれば、より正確に吸入ステロイド応答性を判定することもできる。
本発明において、塩基の部位を示す数字は、ゲノムにおける翻訳開始点を１とする数字である。ＡＨＲ遺伝子は、ヒト７番染色体の７ｐ１５の約４７ｋｂにマッピングされている。この領域の塩基配列はＱＶ４０以上（１００００ｂに１ヶ所以下のエラー頻度）の精度で既に解析され、塩基配列が明らかにされている（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  ＮＴ＿００７８１９）。ＡｈＲ遺伝子は、ＮＴ＿００７８１９の塩基配列上で塩基番号１６６３１７７１から１６６８１２４１に位置している。この塩基配列において、ＡｈＲのｃｄｓは、塩基番号１６６３４７３８からスタートしている。またＡｈＲのｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列も公知である（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  ＮＭ＿００１６２１、Ｌ１９８７２など）。両者の情報を照合することによって、ＡＨＲ遺伝子のエクソンを特定することができる。たとえば、ＡＨＲ遺伝子の第一エクソンから最終エクソンまでを含むゲノムの塩基配列は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）から取得できる。ゲノムの塩基配列上にｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃  Ｌ１９８７２、５２２８ｂｐ）の塩基配列をマッピングした結果を図１に示した。ＡＨＲ遺伝子は７ｐ１５（ＬＯＣＵＳ  ＩＤ  １９６）の約４７ｋｂにマッピングされた。
本発明において吸入ステロイド応答性との関連が見出された多型部位は、配列番号：１および配列番号：２に基づいて示すこともできる。配列番号：１および配列番号：２は、それぞれＡＨＲ遺伝子座における９０１０番目、および９２３１番目の多型部位を含む領域の塩基配列である。配列番号：１の塩基配列において、５′末端を１としてカウントしたときに、９０１０番目の塩基は１５０番目に相当する。同様に、配列番号：２の塩基配列において、９２３１番目の塩基は１５０番目に相当する。つまり配列番号：１および配列番号：２は、本発明においてジェノタイピングすべき多型部位を中心として、その５′側と３′側にそれぞれ１５０塩基づつの連続する塩基配列を示している。
すなわち本発明において明らかにされた吸入ステロイド応答性と関連している多型部位は、ヒトゲノムにおける配列番号：１または配列番号：２に示す塩基配列に相当する領域の、各塩基配列中１５０番目の塩基に相当する。当業者は、ゲノムの塩基配列に対して配列番号：１および配列番号：２の塩基配列をマッピングして、それぞれの１５０番目に相当する塩基のゲノムにおける位置を特定することができる。したがって本発明は、ヒト７番染色体における配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列によって特定される領域の、それぞれ１５０番目の塩基の多型についてジェノタイプを決定する工程を含む。本発明において、ジェノタイプは、好ましくは、被検者から採取された生体試料の解析によって決定することができる。
一般に吸入ステロイドとは、気道から投与されるステロイド製剤を言う。吸入ステロイドは、局所（気道）に直接投与することができ、ステロイドの全身への影響を小さく抑えることができる。そのため、連続的な投与においても副作用が現れにくいとされている。吸入ステロイドには、粉末製剤、エアゾールなどがあり、アプリケーターを利用して気道に直接投与される。吸入ステロイドには、強力な抗炎症作用を有し、循環に達すると急速に代謝されるステロイド剤が好ましい。
このようなステロイド剤として、グルココルチコイド、あるいは副腎皮質ホルモン剤を示すことができる。具体的には、プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、ブデソニド（ＢＵＤ）、およびプロピオン酸フルチカゾン（ＦＰ）などを有効成分として含有する吸入ステロイドが市販されている。本発明においては、これらの吸入ステロイドに対する被検者の応答を予測することができる。本発明において、応答性の予測にもとっとも適する吸入ステロイドは、プロピオン酸ベクロメタゾンである。
本発明において、「吸入ステロイドに対して応答性が低い」とは、被検者において吸入ステロイドの薬理効果が見られない、もしくは抑制された状態をいう。治療開始初期は吸入ステロイドの効果があるが、徐々に耐性を獲得して「吸入ステロイドに対して応答性が低い」状態となる患者も、本発明における「吸入ステロイドに対して応答性が低い」患者に含まれる。本発明において「抑制」とは、完全な抑制に限定されず、対照（通常、健常人）と比較して抑制されていれば、上記「抑制」の意味に解される。
例えば、本発明の検査方法によって、ある被検者について吸入ステロイドに対して耐性であると判定された場合には、該被検者への吸入ステロイドの投与による治療効果は見られない、もしくは低いと予想することができる。あるいは初期には吸入ステロイドの効果が見られたとしても、やがて耐性を獲得するであろうことが予測される。本発明の方法によって得られた被検者についての吸入ステロイドの応答性に関する情報によって、該被検者に対する治療方針等を適宜決定することができる。
本発明の検査方法は、ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型のジェノタイプを決定する工程を含む。ジェノタイプは、例えば、被検者のＡＨＲ遺伝子座の塩基配列を明らかにすることにより決定すること（ジェノタイピング）ができる。ジェノタイピングのためには、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の生体試料から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。生体試料は、被検者から採取された、染色体ＤＮＡを含む任意の試料と定義される。生体試料としては、末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便、および毛髪等を利用することができる。本発明の検査方法は、上記のように直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型を有する部位の塩基配列を決定すれば、被検者のジェノタイプを決定することができる。より具体的には、被検者のゲノムにおける当該多型部位がどの塩基で構成されているのかを決定すれば、ジェノタイピングが可能である。たとえば、本発明者らが見出した吸入ステロイド応答性と関連する多型である、Ｔ  ９０１０  Ｃ並びにＴ  ９２３１  Ｃのジェノタイピングは、当該領域の塩基配列を決定し、いずれの塩基であるかを確認すればよい。ゲノムは１対の染色体によって構成されているので、各多型部位のそれぞれについて、ホモかヘテロであるかを決定する。本発明においては、９０１０または９２３１がｃであるアレルをホモまたはヘテロで有するとき、被検者は吸入ステロイド耐性を有すると判定される。したがって、本発明におけるジェノタイピングは、９０１０または９２３１がｃであることを検出することによって、その目的を達することができる。言い換えれば、必ずしもホモかヘテロかを識別する必要は無い。
予め塩基のバリエーションが明らかにされている多型部位について、ジェノタイプを決定するための様々な方法が公知である。本発明のジェノタイピングのための方法は、限定されない。たとえば、ＰＣＲ法を応用した解析方法として、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、ＡｃｙｃｒｏＰｒｉｍｅｒ法、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法等が実用化されている。またＰＣＲに依存しないジェノタイピングのための方法としてＩｎｖａｄｅｒ法やＲＣＡ法が知られている。更にＤＮＡアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる。以下にこれらの方法について簡単に述べる。ここに述べた方法は、いずれも本発明におけるジェノタイピングに応用できる。
これらの解析方法においては、実際には、たとえば配列番号：１並びに配列番号：２に記載の塩基配列に対してハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドがプライマーやプローブとして用いられる。当業者は、配列番号：１または配列番号：２に示したような塩基配列をもとに、各解析手法に必要なオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。なおＰＣＲのような増幅反応を伴う解析手法において、増幅すべき領域は配列番号：１あるいは配列番号：２に示した塩基配列に限定されない。各領域における多型部位を含む塩基配列を増幅することができれば、たとえば配列番号：１や配列番号：２を越える領域、あるいはこれらの領域から選択された部分配列を増幅することができる。更にゲノムＤＮＡが２本鎖であることから、配列番号：１あるいは配列番号：２に記載の塩基配列のみならず、その相補鎖における塩基配列を対象としてジェノタイピングが可能であることは言うまでも無い。すなわち本発明におけるジェノタイピングとは、センス鎖またはアンチセンス鎖における多型部位の塩基を決定する工程を含む。
たとえば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰにおいては、対象となる多型部位が制限酵素サイトを形成する場合には、１８０〜２００塩基からなる産物を与えるプライマーが用いられることが多い。あるいは多型部位が制限酵素サイトになるようにプライマーの塩基配列を変更する場合には、一般に１５０−１６０塩基からなる増幅産物を与えるようなプライマーがデザインされる。
［ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法］
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法の原理は次のとおりである。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、アレルを含む領域を増幅することができるプライマーセットと、ＴａｑＭａｎプローブを利用した解析方法である。ＴａｑＭａｎプローブは、このプライマーセットによって増幅されるアレルを含む領域にハイブリダイズするように設計されてる。
ＴａｑＭａｎプローブのＴｍに近い条件で標的塩基配列にハイブリダイズさせれば、１塩基の相違によってＴａｑＭａｎプローブのハイブリダイズ効率は著しく低下する。ＴａｑＭａｎプローブの存在下でＰＣＲ法を行うと、プライマーからの伸長反応は、いずれハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブに到達する。このときＤＮＡポリメラーゼの５′−３′エキソヌクレアーゼ活性によって、ＴａｑＭａｎプローブはその５′末端から分解される。ＴａｑＭａｎプローブをレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、ＴａｑＭａｎプローブの分解を、蛍光シグナルの変化として追跡することができる。つまり、ＴａｑＭａｎプローブの分解が起きれば、レポーター色素が遊離してクエンチャーとの距離が離れることによって蛍光シグナルが生成する。１塩基の相違のためにＴａｑＭａｎプローブのハイブリダイズが低下すればＴａｑＭａｎプローブの分解が進まず蛍光シグナルは生成されない。
多型に対応するＴａｑＭａｎプローブをデザインし、更に各プローブの分解によって異なるシグナルが生成されるようにすれば、同時にジェノタイプを判定することもできる。たとえば、レポーター色素として、あるアレルのアレルＡのＴａｑＭａｎプローブに６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を、アレルＢのプローブにＶＩＣを用いる。プローブが分解されない状態では、クエンチャーによってレポーター色素の蛍光シグナル生成は抑制されている。各プローブが対応するアレルにハイブリダイズすれば、ハイブリダイズに応じた蛍光シグナルが観察される。すなわち、ＦＡＭまたはＶＩＣのいずれかのシグナルが他方よりも強い場合には、アレルＡまたはアレルＢのホモであることが明らかになる。他方、アレルをヘテロで有する場合には、両者のシグナルがほぼ同じレベルで検出されることになる。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法の利用によって、ゲル上での分離のような時間のかかる工程無しで、ゲノムを解析対象としてＰＣＲとジェノタイピングを同時に行うことができる。そのため、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、大量の被検者のジェノタイピング方法として有用である。
［Ａｃｙｃｌｏ  Ｐｒｉｍｅ法］
ＰＣＲ法を利用したジェノタイピング方法として、Ａｃｙｃｌｏ  Ｐｒｉｍｅ法も実用化されている。Ａｃｙｃｌｏ  Ｐｒｉｍｅ法では、ゲノム増幅用のプライマー１組と、ＳＮＰｓ検出用の１つのプライマーを用いる。まず、ゲノムのＳＮＰｓを含む領域をＰＣＲで増幅する。この工程は、通常のゲノムＰＣＲと同じである。次に、得られたＰＣＲ産物に対して、ゲノム検出用のプライマーをアニールさせ、伸長反応を行う。ゲノム検出用のプライマーは、検出対象となっているＳＮＰｓに隣接する領域にアニールするようにデザインされている。
このとき、伸長反応のためのヌクレオチド基質として、蛍光偏光色素でラベルし、かつ３′−ＯＨをブロックしたヌクレオチド誘導体（ターミネータ）を用いる。その結果、ＳＮＰｓに相当する位置の塩基に相補的な塩基が１塩基だけ取りこまれて伸長反応が停止する。ヌクレオチド誘導体のプライマーへの取りこみは、分子量の増大による蛍光偏光（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＦＰ）の増加によって検出することができる。蛍光偏光色素に波長の異なる２種類のラベルを用いれば、特定のＳＮＰｓが２種額の塩基のうちのいずれであるのかを特定することができる。蛍光偏光のレベルは定量することができるので、１度の解析でアレルがホモかヘテロかを判定することもできる。
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法］
ＰＣＲ産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳで解析することによってジェノタイプを解析することもできる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳは、分子量をきわめて正確に知ることができるため、蛋白質のアミノ酸配列や、ＤＮＡの塩基配列のわずかな相違を明瞭に識別することができる解析手法として様々な分野で利用されている。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによるジェノタイピングのためには、まず解析対象であるアレルを含む領域をＰＣＲで増幅する。次いで増幅産物を単離してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによってその分子量を測定する。アレルの塩基配列は予めわかっているので、分子量に基づいて増幅産物の塩基配列は一義的に決定される。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを利用したジェノタイピングには、ＰＣＲ産物の分離工程などが必要となる。しかし標識プライマーや標識プローブを使わないで、正確なジェノタイピングが期待できる。また複数の場所の多型の同時検出にも応用することができる。
［ＩＩｓ型制限酵素を利用したＳＮＰｓ特異的な標識方法］
ＰＣＲ法を利用した更に高速でジェノタイピングが可能な方法も報告されている。たとえば、ＩＩｓ型制限酵素を利用してＳＮＰｓのジェノタイピングが行われている。この方法においては、ＰＣＲにあたり、ＩＩｓ型制限酵素の認識配列を有するプライマーが用いられる。遺伝子組み換えに利用される一般的な制限酵素（ＩＩ型）は、特定の塩基配列を認識して、その塩基配列中の特定部位を切断する。これに対してＩＩｓ型の制限酵素は、特定の塩基配列を認識して、認識塩基配列から離れた部位を切断する。酵素によって、認識配列と切断個所の間の塩基数は決まっている。したがって、この塩基数の分だけ離れた位置にＩＩｓ型制限酵素の認識配列を含むプライマーがアニールするようにすれば、ＩＩｓ型制限酵素によってちょうどＳＮＰｓの部位で増幅産物を切断することができる。
ＩＩｓ型制限酵素で切断された増幅産物の末端には、ＳＮＰｓの塩基を含む付着末端（ｃｏｎｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）が形成される。ここで、増幅産物の付着末端に対応する塩基配列からなるアダプターをライゲーションする。アダプターは、ＳＮＰｓに対応する塩基を含む異なる塩基配列からなり、それぞれ異なる蛍光色素で標識しておくことができる。最終的に、増幅産物はＳＮＰｓ部位の塩基に対応する蛍光色素で標識される。
前記ＩＩｓ型制限酵素認識配列を含むプライマーに、捕捉プライマー（ｃａｐｔｕｒｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を組み合せてＰＣＲ法を行えば、増幅産物は蛍光標識されるとともに、捕捉プライマーを利用して固相化することができる。たとえばビオチン標識プライマーを捕捉プライマーとして用いれば、増幅産物はアビジン結合ビーズに捕捉することができる。こうして捕捉された増幅産物の蛍光色素を追跡することにより、ジェノタイプを決定することができる。
［Ｉｎｖａｄｅｒ法］
ＰＣＲ法に依存しないジェノタイピングのための方法も実用化されている。たとえばＩｎｖａｄｅｒ法では、アレルプローブ、インベーダープローブ、およびＦＲＥＴプローブの３種類のオリゴヌクレオチドと、ｃｌｅａｖａｓｅと呼ばれる特殊なヌクレアーゼのみで、ジェノタイピングを実現している。これらのプローブのうち標識が必要なのはＦＲＥＴプローブのみである。
アレルプローブは、検出すべきアレルに隣接する領域にハイブリダイズするようにデザインされる。アレルプローブの５′側には、ハイブリダイズに無関係な塩基配列からなるフラップが連結されている。アレルプローブは多型部位の３′側にハイブリダイズし、多型部位の上でフラップに連結する構造を有する。
一方インベーダープローブは、多型部位の５′側にハイブリダイズする塩基配列からなっている。インベーダープローブの塩基配列は、ハイブリダイズによって３′末端が多型部位に相当するようにデザインされている。インベーダープローブにおける多型部位に相当する位置の塩基は任意で良い。つまり、多型部位を挟んでインベーダープローブとアレルプローブとが隣接してハイブリダイズするように両者の塩基配列はデザインされている。
多型部位がアレルプローブの塩基配列に相補的な塩基であった場合には、インベーダープローブとアレルプローブの両者がアレルにハイブリダイズすると、アレルプローブの多型部位に相当する塩基にインベーダープローブが侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ）した構造が形成される。ｃｌｅａｖａｓｅは、このようにして形成された侵入構造を形成したオリゴヌクレオチドのうち、侵入された側の鎖を切断する。切断は侵入構造の上で起きるので、結果としてアレルプローブのフラップが切り離されることになる。一方、もしも多型部位の塩基がアレルプローブの塩基に相補的でなかった場合には、多型部位におけるインベーダープローブとアレルプローブの競合は無く、侵入構造は形成されない。したがってｃｌｅａｖａｓｅによるフラップの切断が起こらない。
ＦＲＥＴプローブは、こうして切り離されたフラップを検出するためのプローブである。ＦＲＥＴプローブは５′末端側に自己相補配列を有し、３′末端側に１本鎖部分が配置されたヘアピンループを構成している。ＦＲＥＴプローブの３′末端側に配置された１本鎖部分は、フラップに相補的な塩基配列からなっていて、ここにフラップがハイブリダイズすることができる。フラップがＦＲＥＴプローブにハイブリダイズすると、ＦＲＥＴプローブの自己相補配列の５′末端部分にフラップの３′末端が侵入した構造が形成されるように両者の塩基配列がデザインされている。ｃｌｅａｖａｓｅは侵入構造を認識して切断する。ＦＲＥＴプローブのｃｌｅａｖａｓｅによって切断される部分を挟んで、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲと同様のレポーター色素とクエンチャーで標識しておけば、ＦＲＥＴプローブの切断を蛍光シグナルの変化として検知することができる。
なお、理論的には、フラップは切断されない状態でもＦＲＥＴプローブにハイブリダイズするはずである。しかし実際には、切断されたフラップとアレルプローブの状態で存在しているフラップとでは、ＦＲＥＴに対する結合効率に大きな差が有る。そのため、ＦＲＥＴプローブを利用して、切断されたフラップを特異的に検出することは可能である。
Ｉｎｖａｄｅｒ法に基づいてジェノタイプを決定するためには、アレルＡとアレルＢのそれぞれに相補的な塩基配列を含む、２種類のアレルプローブを用意すれば良い。このとき両者のフラップの塩基配列は異なる塩基配列とする。フラップを検出するためのＦＲＥＴプローブも２種類を用意し、それぞれのレポーター色素を識別可能なものとしておけば、ＴａｃＭａｎ  ＰＣＲ法と同様の考えかたによって、ジェノタイプを解析することができる。
Ｉｎｖａｄｅｒ法の利点は、標識の必要なオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴプローブのみであることである。ＦＲＥＴプローブは検出対象の塩基配列とは無関係に、同一のオリゴヌクレオチドを利用することができる。したがって、大量生産が可能である。一方アレルプローブとインベーダープローブは標識する必要が無いので、結局ジェノタイピングのための試薬を安価に製造することができる。
［ＲＣＡ法］
ＰＣＲ法に依存しないジェノタイピングのための方法として、ＲＣＡ法を挙げることができる。鎖置換作用を有するＤＮＡポリメラーゼが、環状の１本鎖ＤＮＡを鋳型として、長い相補鎖を合成する反応に基づくＤＮＡの増幅方法が、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法である（Ｌｉｚａｒｄｒｉ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２２５，１９９８）。ＲＣＡ法においては、環状ＤＮＡにアニールして相補鎖合成を開始するプライマーと、このプライマーによって生成する長い相補鎖にアニールする第２のプライマーを利用して、増幅反応を構成している。
ＲＣＡ法には、鎖置換作用を有するＤＮＡポリメラーゼが利用されている。そのため、相補鎖合成によって２本鎖となった部分は、より５′側にアニールした別のプライマーから開始した相補鎖合成反応によって置換される。たとえば環状ＤＮＡを鋳型とする相補鎖合成反応は、１周分では終了しない。先に合成した相補鎖を置換しながら相補鎖合成は継続し、長い１本鎖ＤＮＡが生成される。一方、環状ＤＮＡを鋳型として生成した長い１本鎖ＤＮＡには、第２のプライマーがアニールして相補鎖合成が開始する。ＲＣＡ法において生成される１本鎖ＤＮＡは、環状のＤＮＡを鋳型としていることから、その塩基配列は同じ塩基配列の繰り返しである。したがって、長い１本鎖の連続的な生成は、第２のプライマーの連続的なアニールをもたらす。その結果、変性工程を経ることなく、プライマーがアニールすることができる１本鎖部分が連続的に生成される。こうして、ＤＮＡの増幅が達成される。
ＲＣＡ法に必要な環状１本鎖ＤＮＡがＳＮＰｓの塩基に応じて生成されれば、ＲＣＡ法を利用してＳＮＰｓをタイピングすることができる。そのために、直鎖状で１本鎖のパドロックプローブが利用される。パドロックプローブは、５′末端と３′末端に検出すべきＳＮＰｓの両側に相補的な塩基配列を有している。これらの塩基配列は、バックボーンと呼ばれる特殊な塩基配列からなる部分で連結されている。ＳＮＰｓ部分がパドロックプローブの末端に相補的な塩基配列であれば、アレルにハイブリダイズしたパドロックプローブの末端をＤＮＡリガーゼによってライゲーションすることができる。その結果、直鎖状のパドロックプローブが環状化され、ＲＣＡ法の反応がトリガーされる。ＤＮＡリガーゼの反応は、ライゲーションすべき末端部分が完全に相補的でない場合には反応効率が著しく低下する。したがって、ライゲーションの有無をＲＣＡ法で確認することによって、ＳＮＰｓのジェノタイピングが可能である。
ＲＣＡ法は、ＤＮＡを増幅することはできるが、そのままではシグナルを生成しない。また増幅の有無のみを指標とするのでは、アレル毎に反応を行わなければジェノタイプを決定することができない。これらの点をジェノタイピング用に改良した方法が公知である。たとえばモレキュラービーコンを利用して、ＲＣＡ法に基づいて１チューブでジェノタイピングを行うことができる。モレキュラービーコンは、ＴａｑＭａｎ法と同様に、蛍光色素とクエンチャーを利用したシグナル生成用プローブである。モレキュラービーコンの５′末端と３′末端は相補的な塩基配列で構成されており、単独ではヘアピン構造を形成する。両端付近を蛍光色素とクエンチャーで標識しておけば、ヘアピン構造を形成している状態では蛍光シグナルが検出できない。モレキュラービーコンの一部を、ＲＣＡ法の増幅産物に相補的な塩基配列としておけば、モレキュラービーコンはＲＣＡ法の増幅産物にハイブリダイズする。ハイブリダイズによってヘアピン構造が解消されるため、蛍光シグナルが生成される。
モレキュラービーコンの利点は、パドロックプローブのバックボーン部分の塩基配列を利用することによって、検出対象とは無関係にモレキュラービーコンの塩基配列を共通にできる点である。アレル毎にバックボーンの塩基配列を変え、蛍光波長が異なる２種類のモレキュラービーコンを組み合せれば、１チューブでジェノタイピングが可能である。蛍光標識プローブの合成コストは高いので、測定対象に関わらず共通のプローブを利用できることは、経済的なメリットである。
これらの方法はいずれも多量のサンプルを高速にジェノタイピングするために開発された方法である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを除けば、いずれの方法にも何らかの形で標識プローブなどを用意する必要がある。これに対して、標識プローブなどに頼らないジェノタイピングも古くから行われている。このような方法の一つとして、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
ＲＦＬＰは、制限酵素の認識部位の変異、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内における塩基の挿入または欠失が、制限酵素処理後に生じる断片の大きさの変化として検出できることを利用している。検出対象となる多型を含む塩基配列を認識する制限酵素が存在すれば、ＲＦＬＰの原理によって多型部位の塩基を知ることができる。
標識プローブを必要としない方法として、ＤＮＡの二次構造の変化を指標として塩基の違いを検出する方法も公知である。ＰＣＲ−ＳＳＣＰでは、１本鎖ＤＮＡの二次構造がその塩基配列の相違を反映することを利用している（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２．）。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに解離させ、非変性ゲル上で分離する工程により実施される。ゲル上の移動度は、１本鎖ＤＮＡの二次構造によって変動するので、もしも多型部位における塩基の相違があれば、移動度の違いとして検出することができる。
その他、標識プローブを必要としない方法として、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。
具体的には、まずＰＣＲ法等によってＳＮＰｓ部位を含む領域を増幅する。増幅産物に、塩基配列がわかっているプローブＤＮＡをハイブリダイズさせて２本鎖とする。これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。プローブＤＮＡとのハイブリダイズによってミスマッチを生じたＤＮＡ断片では、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなる。こうして生じた移動度の差を検出することによりミスマッチの有無を検出することができる。
更にＤＮＡアレイを使ってジェノタイプを決定することもできる（細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」，秀潤社，２０００．４／２０発行，ｐｐ９７−１０３「オリゴＤＮＡチップによるＳＮＰの解析」，梶江慎一）。ＤＮＡアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）をハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズが検出される。多くのプローブに対する反応を同時に観察することができることから、たとえば、多数のＳＮＰｓを同時に解析するには、ＤＮＡアレイは有用である。
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することもできる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
オリゴヌクレオチドは、検出すべきＳＮＰｓを含む領域に相補的な塩基配列で構成される。基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。更に、一般にＤＮＡアレイ法においては、クロスハイブリダイゼーション（非特異的ハイブリダイゼーション）による誤差を避けるために、ミスマッチ（ＭＭ）プローブが用いられる。ミスマッチプローブは、標的塩基配列と完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとのペアを構成している。ミスマッチプローブに対して、完全に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドはパーフェクトマッチ（ＰＭ）プローブと呼ばれる。データ解析の過程で、ミスマッチプローブで観察されたシグナルを消去することによって、クロスハイブリダイゼーションの影響を小さくすることができる。
ＤＮＡアレイ法によるジェノタイピングのための試料は、被検者から採取された生物学的試料をもとに当業者に周知の方法で調製することができる。生物学的試料は特に限定されない。例えば被検者の末梢血白血球、皮膚、口腔粘膜等の組織または細胞、涙、唾液、尿、糞便または毛髪から抽出した染色体ＤＮＡから、ＤＮＡ試料を調製することができる。判定すべきＳＮＰｓを含む領域を増幅するためのプライマーを用いて、染色体ＤＮＡの特定の領域が増幅される。このとき、マルチプレックスＰＣＲ法によって複数の領域を同時に増幅することができる。マルチプレックスＰＣＲ法とは、複数組のプライマーセットを、同じ反応液中で用いるＰＣＲ法である。複数のＳＮＰｓを解析するときには、マルチプレックスＰＣＲ法が有用である。
一般にＤＮＡアレイ法においては、ＰＣＲ法によってＤＮＡ試料を増幅するとともに、増幅産物が標識される。増幅産物の標識には、標識を付したプライマーが利用される。たとえば、まずＳＮＰｓを含む領域に特異的なプライマーセットによるＰＣＲ法でゲノムＤＮＡを増幅する。次に、ビオチンラベルしたプライマーを使ったラベリングＰＣＲ法によって、ビオチンラベルされたＤＮＡを合成する。こうして合成されたビオチンラベルＤＮＡを、チップ上のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さや反応温度等の条件に応じて、適宜調整することができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーションの条件をデザインすることができる。ハイブリダイズしたＤＮＡを検出するために、蛍光色素で標識したアビジンが添加される。アレイをスキャナで解析し、蛍光を指標としてハイブリダイズの有無を確認する。
上記の方法以外にも、特定部位の塩基を検出するために、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、検出すべきＳＮＰｓが存在する領域にハイブリダイズする塩基配列で構成される。ＡＳＯを試料ＤＮＡにハイブリダイズさせるとき、多型によってＳＮＰｓ部位にミスマッチが生じるとハイブリッド形成の効率が低下する。ミスマッチは、サザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等によって検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法によって、ミスマッチを検出することもできる。
本発明はまた、本発明の検査方法のためのプローブまたはプライマーを提供する。本発明によって、ＡＨＲ遺伝子における吸入ステロイド応答性と関連する多型部位の存在が明らかにされた。したがって、当該多型部位の塩基を明らかにするためのプローブ、あるいはプライマーは、本発明の検査方法に有用である。ある多型部位における塩基を明らかにするための手法には、上記のような様々な方法を応用することができる。これらの手法においては、一般的に、当該多型部位を含む領域を増幅するためのプライマー、あるいは当該多型部位にハイブリダイズするプローブが用いられる。
本発明において、多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーとは、多型部位を含むＤＮＡを鋳型として、多型部位に向かって相補鎖合成を開始することができるプライマーを言う。本発明のプライマーは、多型部位を含むＤＮＡにおける、多型部位の３′側に複製開始点を与えるためのプライマーと表現することもできる。プライマーがハイブリダイズする領域と多型部位との間隔は、任意である。両者の間隔は、多型部位の塩基の解析手法に応じて、好適な塩基数を選択することができる。
たとえば、ＤＮＡチップによる解析のためのプライマーであれば、多型部位を含む領域として、２０〜５００、通常５０〜３００塩基の長さの増幅産物が得られるようにプライマーをデザインすることができる。つまり多型部位を中心（１５０番目）に示した配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列は、ＤＮＡチップによる塩基の解析において、ＰＣＲによって増幅すべき塩基配列の例として示すことができる。たとえば、配列番号：１または配列番号：２に記載の塩基配列において、多型部位を含む連続する塩基配列を増幅することができるプライマーは、本発明におけるジェノタイピングに有用である。当業者は、アリル炭化水素受容体遺伝子の塩基配列をもとに、解析手法に応じたプライマーをデザインすることができる。本発明のプライマーを構成する塩基配列は、ゲノムの塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列のみならず、適宜改変することができる。
本発明のプライマーには、ゲノムの塩基配列に相補的な塩基配列に加え、任意の塩基配列を付加することができる。たとえば、ＩＩｓ型の制限酵素を利用した多型の解析方法のためのプライマーにおいては、ＩＩｓ型制限酵素の認識配列を付加したプライマーが利用される。このような、塩基配列を修飾したプライマーは、本発明のプライマーに含まれる。更に、本発明のプライマーは、修飾することができる。たとえば、蛍光物質や、ビオチンまたはジゴキシンのような結合親和性物質で標識したプライマーが各種のジェノタイピング方法において利用される。これらの修飾を有するプライマーも本発明に含まれる。
一方本発明において、多型部位を含む領域にハイブリダイズするプローブとは、多型部位を含む領域の塩基配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプローブを言う。より具体的には、プローブの塩基配列中に多型部位を含むプローブは本発明のプローブとして好ましい。あるいは、多型部位における塩基の解析方法によっては、プローブの末端が多型部位に隣接する塩基に対応するように、デザインされる場合もある。したがって、プローブ自身の塩基配列には多型部位が含まれないが、多型部位に隣接する領域に相補的な塩基配列を含むプローブも、本発明における望ましいプローブとして示すことができる。
言いかえれば、ゲノムＤＮＡのＡＨＲ遺伝子座を構成する塩基配列から選択された塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有し、吸入ステロイド応答性と関連する多型部位、または多型部位に隣接する部位にハイブリダイズすることができるプローブは、本発明のプローブとして好ましい。本発明のプローブには、プライマーと同様に、塩基配列の改変、塩基配列の付加、あるいは修飾が許される。たとえばＩｎｖａｄｅｒ法に用いるプローブは、フラップを構成するゲノムとは無関係な塩基配列が付加される。このようなプローブも、多型部位を含む領域にハイブリダイズする限り、本発明のプローブに含まれる。本発明のプローブを構成する塩基配列は、ゲノムにおけるＡＨＲ遺伝子座の塩基配列をもとに、解析方法に応じてデザインすることができる。
本発明のプライマー、またはプローブは、それを構成する塩基配列をもとに、任意の方法によって合成することができる。本発明のプライマーまたはプローブの、ゲノムＤＮＡに相補的な塩基配列の長さは、通常１５〜１００、一般に１５〜５０、通常１５〜３０である。与えられた塩基配列に基づいて、当該塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する手法は公知である。更に、オリゴヌクレオチドの合成において、蛍光色素やビオチンなどで修飾されたヌクレオチド誘導体を利用して、オリゴヌクレオチドに任意の修飾を導入することもできる。あるいは、合成されたオリゴヌクレオチドに、蛍光色素などを結合する方法も公知である。
本発明はまた、吸入ステロイド応答性を検査するための試薬を提供する。本発明の試薬は、前記本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む。本発明の試薬には、ジェノタイピング方法に応じて、各種の酵素、酵素基質、および緩衝液などを組み合せることができる。酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、あるいはＩＩｓ制限酵素などの、上記のジェノタイピングのための方法として例示した各種の解析方法に必要な酵素を示すことができる。緩衝液は、これらの解析に用いる酵素の活性の維持に好適な緩衝液が、適宜選択される。更に、酵素基質としては、たとえば相補鎖合成用の基質等が用いられる。
更に本発明の試薬には、多型部位における塩基が明らかな対照を添付することができる。対照は、予めジェノタイプが明らかなゲノム、あるいはゲノムの断片を用いることができる。ゲノムは、細胞から抽出されたものでもよいし、細胞あるいは細胞の分画を用いることもできる。細胞を対照として用いれば、対照の結果によってゲノムＤＮＡの抽出操作が正しく行われたことを証明することができる。あるいは、多型部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを対照として用いることもできる。具体的には、ＡＨＲ遺伝子座を含み多型部位における塩基が明らかにされたゲノム由来のＤＮＡを含むＹＡＣベクターやＢＡＣベクターは、対照として有用である。あるいは多型部位に相当する数百ｂのみを切り出して挿入したベクターを対照として用いることもできる。
【図面の簡単な説明】  図１は、発明を実施するための最良の形態において見出されたＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓをゲノム上にマッピングした結果を示す図である。図中の位置を示す数値は、転写開始点を＋１としてカウントした塩基数である。連鎖不平衡が見出されたＳＮＰｓには、＃および＄を付けた。図右下のスケールが約１ｋｂに相当する。
【発明を実施するための最良の形態】  ＣＹＰ１Ａ１などの薬剤代謝に関連する遺伝子は、ＡＨＲの転写制御を受けている。本発明者らは、アレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性に対して、ＡＨＲが関与している可能性があると考えた。そこで本発明者らは、ＡＨＲとアレルギー性疾患の治療に用いられる薬剤応答性との関連性を見出すために、ＡＨＲ遺伝子の多型解析を試みた。
試料として、成人喘息患者、小児喘息患者それぞれ１２名の末梢血由来ゲノムＤＮＡを使用した。ＡＨＲ遺伝子のＳＮＰｓスクリーニングに使用したプライマー及びＰＣＲ法の反応条件を以下に示す。各プライマーの塩基配列の後に、そのアニーリング温度と、ＤＭＳＯの添加の有無を有り／＋、または無し／−で示した。
ＡＨＲ用プライマー
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ＰＣＲ法の反応条件は次のとおりである。
ＰＣＲ反応液組成（単位μｌ）
Ｖ−ｂｕｆｆｅｒ  ＊                        １．１
ＤＭＳＯ                                    １ｏｒ０
７８ｍＭ  ＭｇＣｌ２                        ０．５５
２５ｍＭ  ｄＮＴＰ                          ０．５５
ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．１４
ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）    ０．１４
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）                  ０．１１
ＤＷ                            ｕｐ  ｔｏ  １０μｌ
Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ              １（５ｎｇ／μｌ）
Ｖ−ｂｕｆｆｅｒ：１６．６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８），１０ｍＭ  β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．０７ｍＭ  ＥＤＴＡ
ＰＣＲ法の反応温度は、次のとおりである。まず９５℃／２分の変性後、（９４℃／３０秒＝各アニーリング温度／３０秒＝７２℃／３分）を１サイクルとして３７サイクル繰り返した。３７サイクル終了後に７２℃で７分間インキュベートした。
ＰＣＲ反応産物を精製後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いてシーケンス反応を実施した。シーケンス反応の条件は、次のとおりである。
シーケンス反応溶液（単位μｌ）
精製ＰＣＲ産物                            １
ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ試薬    １．５
Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）      ０．０５
ＤＷ                                      ３．４５
トータル                                  ６
シーケンス反応に用いたプライマーは、増幅に用いたプライマーと同じものを使用した。ただし、ＡＨＲ  ｇ  Ｆ３Ｒ３、ＡＨＲ  ｇ  Ｆ１３Ｒ１３は増幅プライマー以外に下記のシーケンス用プライマーを使用した。
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ＰＣＲ法の反応温度は、次のとおりである。まず９５℃で１分変性後、（９６℃／３０秒＝５０℃／３０秒＝６０℃／３分）を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。イソプロパノール沈殿後、ＡＢＩ３７００を使用して塩基配列を解析した。
塩基配列の解析の結果、図１および表１に示すようなＳＮＰｓの存在が確認された。図および表中において、＃および＄をつけたＳＮＰｓは、連鎖不平衡の関係にあった。
これらのＳＮＰｓのそれぞれについて、関連解析（ケースコントロールスタディ）を行った。解析の結果を表５にまとめた。表５中、人数を記載していないものは、小児２８８人、成人２８８人、およびコントロール１９２人の結果である。各ＳＮＰｓには、表２に示すような表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）との関連性が見出された。
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表２に示す関連性の中から統計学的により正しい関連性を見出すために、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を行った。その結果、Ｔ９０１０Ｃ、およびＴ９２３１Ｃの２つのＳＮＰｓが、プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）の投与量と遺伝統計学的な関連性を有することが確認された。すなわち９０１０および９２３１における塩基がＣである患者に、ベクラメタゾンの１日当たりの投与量が多い患者が有意に多かった。９０１０Ｃおよび９２３１Ｃの解析対象集団におけるアレル頻度は、いずれも３５％であった。補正後のχ２値、およびｐ値を表３〜表５に示す。
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【産業上の利用の可能性】
本発明者らによって、ＡＨＲ遺伝子における多型と吸入ステロイド応答性の関連が見出された。その結果、本発明により、被検者における吸入ステロイド応答性の検査が可能となった。より具体的には、たとえば喘息に対して処方される代表的な吸入ステロイドであるプロピオン酸ベクロメタゾンに対する応答性を、本発明によって予測することができる。プロピオン酸ベクロメタゾンは、初期の段階で選択されることの多い吸入ステロイドである。
従来はプロピオン酸ベクロメタゾンの治療効果を予測できないため、投与後の経過を見た後に、第２の選択肢が検討されていた。本発明によって、喘息患者が予めプロピオン酸ベクロメタゾンに耐性であることを予測できれば、早期により有効な薬剤を選択できる可能性が高まる。したがって、本発明は喘息患者のＱＯＬの向上に貢献する。また、本発明によって予め効果の低い薬剤を予測できるため、無駄な投薬を避けることができる。つまり本発明には、医療経済上のメリットも期待できる。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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