(57)【要約】本発明の課題は、成体組織由来の幹細胞を生体内での性質を維持したまま分離、同定および培養する技術を確立すること、成体組織由来の幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を提供することである。該課題を解決するため、本発明は、成体組織由来であって、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性である幹細胞を提供する。また本発明は、該幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体組織由来であって、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性であることを特徴とする幹細胞。
【請求項２】
成体組織が、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織および末梢血からなる群から選ばれる組織である、請求項１記載の幹細胞。
【請求項３】
骨髄を酵素処理により細胞を抽出したのち、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｔｅｒ１１９抗体を用いて分離される請求項１または２記載の幹細胞。
【請求項４】
酵素が、コラゲナーゼである請求項３記載の幹細胞。
【請求項５】
幹細胞が多分化能幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項記載の幹細胞。
【請求項６】
骨髄を酵素処理により細胞を抽出したのち、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｔｅｒ１１９抗体を用いて幹細胞を分離することを特徴とする請求項１または２記載の幹細胞の分離方法。
【請求項７】
酵素が、コラゲナーゼである請求項６記載の方法。
【請求項８】
幹細胞が多分化能幹細胞である請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項記載の幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤。
【請求項１０】
組織破壊を伴う疾患が、神経疾患、呼吸器系疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患および皮膚疾患のいずれかである請求項９記載の予防および／または治療剤。
【請求項１１】
ファイブロネクチンを含み、かつマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびリューケミア阻害因子（ＬＩＦ）の少なくとも１種類の物質を添加した培地で培養することを特徴とする、請求項１〜５記載の幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１２】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、リューケミア阻害因子（ＬＩＦ）およびフィブロネクチンで添加した培地で培養することを特徴とする請求項１〜５記載の幹細胞を増殖させる方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項記載の幹細胞を用いることを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療方法。
【請求項１４】
組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項記載の幹細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織、末梢血等の成体組織に存在する幹細胞に関する。本発明は、また該幹細胞を含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療薬及び該幹細胞の利用法に関する。
【背景技術】  神経変性疾患、脳梗塞、閉塞性血管病、心筋梗塞組織、心不全、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、間質性肺疾患、喘息、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全、膵炎、糖尿病、クローン病、炎症性大腸炎、ＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全、褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍などの組織の破壊、変性、異型新生（線維化など）を伴う疾患を根治する有効な治療法はない。
近年の幹細胞生物学の進展から該疾患の治療を目的として培養幹細胞からヒト組織や細胞を分化誘導する技術が検討されている。幹細胞とは自己複製能と様々な組織に分化できる多分化能とを併せ持つ細胞である。幹細胞は採取部位から胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎生幹細胞、成体幹細胞、臍帯血幹細胞、胎盤幹細胞の大きく５つに分類することができる。本発明での成体とは出産後の個体を示す。すなわち成体組織とは、非胎児性、非胚性の組織を示す。
胞胚期の胚の内部細胞塊と呼ばれる部位から分離されるＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）や胎児の生殖腺から採取されるＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）は、成体のすべての細胞に分化できる全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有することから組織を再構築するための材料として注目されている［今日の移植，１４，５４２−５４８（２００１）］。また、胎児の組織からは神経幹細胞などの組織特異的な幹細胞が分離・培養されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４７２０−１４７２５（２０００）］。しかし、このような胚や胎児由来の幹細胞を取得するには、胚や胎児を破壊することが必要なことから倫理的な問題を包含しており、また脳死臓器移植の場合と同様に患者自身の細胞でないことから免疫拒絶の問題を回避することも簡単ではない。さらに、胚の幹細胞や胎児の幹細胞は個体の発生のために機能する細胞であることから、成体の幹細胞とは性質が異なり、また成体組織に対する親和性も異なっている。実際、ＥＳ細胞を成体の組織に移植すると腫瘍を形成する。以上のことから、胚や胎児由来の細胞を成体に移植する治療法は長期間にわたる安全性を検証することが容易ではないことを示している。
成体組織由来の幹細胞の場合には患者自身の細胞を用いた治療が可能である。
幹細胞は、自己複製能を有することから細胞の大量製造が可能である。したがって、生体外で培養・製造した幹細胞が組織中の幹細胞と同質のものであることを証明することで、移植の際の安全性を担保することが可能である。皮膚や軟骨を再生するための商品がすでに販売されている［蛋白質  核酸  酵素，４５，２３４２−２３４７（２０００）］。
しかし、成体の組織中に存在する組織特異的な幹細胞は分裂能に限りがあることから、十分に細胞量を確保するのが困難という欠点がある。また、組織特異的な幹細胞を用いる限りは、その組織の治療にしか利用できず、汎用性がない。
しかし、最近成体組織中に成体のほとんどすべての細胞に分化する能力を持つ多分化能幹細胞が存在することが明らかになった（ＷＯ０１／１１０１１、ＷＯ０１／２１７６７、ＷＯ０１／４８１４９）。
当該細胞は無限に増殖する自己複製能を有することから大量に細胞を製造することも可能である。また本細胞は胚由来のＥＳ細胞とは異なり、成体組織に移植しても腫瘍を形成することはない。このような多分化能幹細胞は、出生後のヒト皮膚、骨格筋、骨髄から取得できることが示されている。
しかし、該細胞は長期培養を経た後に多分化能を獲得することから、培養により生体内とは異なる性質を獲得した可能性がある。このような培養により人工的に性質を改変した細胞を治療目的で移植すると、長期的には患者にガン化や異型新生などの副作用を引き起こすおそれがある。
【発明の開示】
本発明の目的は、成体組織由来の幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療剤を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）  成体組織由来であって、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性であることを特徴とする幹細胞。
（２）  成体組織が、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織および末梢血からなる群から選ばれる組織である、上記（１）記載の幹細胞。
（３）  骨髄を酵素処理により細胞を抽出したのち、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｔｅｒ１１９抗体を用いて分離される上記（１）または（２）記載の幹細胞。
（４）  酵素が、コラゲナーゼである上記（３）記載の幹細胞。
（５）  幹細胞が多分化能幹細胞である、上記（１）〜（４）のいずれか１項記載の幹細胞。
（６）  骨髄を酵素処理により細胞を抽出したのち、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体および抗Ｔｅｒ１１９抗体を用いて幹細胞を分離することを特徴とする上記（１）または（２）記載の幹細胞の分離方法。
（７）  酵素が、コラゲナーゼである上記（６）記載の方法。
（８）  幹細胞が多分化能幹細胞である上記（６）または（７）記載の方法。
（９）  上記（１）〜（５）のいずれか１項記載の幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤。
（１０）  組織破壊を伴う疾患が、神経疾患、呼吸器系疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患および皮膚疾患のいずれかである上記（９）記載の予防および／または治療剤。
（１１）  ファイブロネクチンを含み、かつマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）およびリューケミア阻害因子（ＬＩＦ）の少なくとも１種類の物質を添加した培地で培養することを特徴とする、上記（１）〜（５）記載の幹細胞を増殖させる方法。
（１２）  マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、リューケミア阻害因子（ＬＩＦ）およびフィブロネクチンで添加した培地で培養することを特徴とする上記（１）〜（５）記載の幹細胞を増殖させる方法。
（１３）  （１）〜（５）のいずれか１項記載の幹細胞を用いることを特徴とする組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療方法。
（１４）  組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤の製造のための、（１）〜（５）のいずれか１項記載の幹細胞の使用。
本発明の幹細胞としては、成体組織由来であって、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性である幹細胞があげられる。好ましくは、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性であって、幹細胞抗原マーカーを発現する幹細胞があげられる。
幹細胞抗原マーカーとしては、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１などがあげられる。
成体組織としては、成体内の組織であれば特に制限はないが、例えば骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪細胞、末梢血などがあげられる。
本発明の幹細胞は骨髄を酵素処理により細胞を分離した後、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗Ｔｅｒ１１９抗体等の各種細胞マーカーに対する抗体を用いることにより調製することができる。酵素としては、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼなどがあげられる。
例えば骨髄をコラゲナーゼ処理により細胞を抽出する方法としては、後述する１の方法があげられる。
本発明において、組織破壊を伴う疾患としては、神経疾患、呼吸器系疾患、循環器系疾患、肝臓疾患、膵臓疾患、消化管系疾患、腎臓疾患、皮膚疾患、肺疾患などがあげられる。
神経疾患としては、脳梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄損傷、うつ病、躁鬱病などがあげられる。
呼吸器系疾患としては、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、気管支炎、喘息、間質性肺炎、肺線維症などがあげられる。
循環器系疾患としては、閉塞性血管病、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患などがあげられる。
肝臓疾患としては、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝不全などがあげられる。
膵臓疾患としては、糖尿病、膵炎などがあげられる。
消化管系疾患としては、クローン病、潰瘍性大腸炎などがあげられる。
腎臓疾患としては、ＩｇＡ腎症、腎炎、腎不全などがあげられる。
皮膚疾患としては、褥瘡、熱傷、縫合創、裂傷、切開創、咬傷、皮膚炎、肥厚性瘢痕、ケロイド、糖尿病性潰瘍、動脈性潰瘍、静脈性潰瘍などがあげられる。
肺疾患としては、肺気腫、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、特発性間質性肺炎（肺線維症）、びまん性肺線維症、結核、喘息などがあげられる。
以下に本発明の幹細胞を調製する方法を示す。
１．骨髄中の幹細胞の分離法
ヒトの骨髄中より本発明の幹細胞を取得する方法としては、以下の方法があげられる。
ヒト体内から骨片を回収し、骨片表面の筋肉・腱・軟骨などの組織を除去した後、はさみで細かく切断ならびに破砕することで細かい骨片にする。細かい骨片をＰＢＳで３回洗った後、酵素を含む培養液に懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションする。培養液を４０μｍマイクロフィルターに通過させ、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌ（以下ＢＭＥＣと称する）を回収することができる。ＢＭＥＣ中には多能性を有する幹細胞が含有される。
酵素としては、コラゲナーゼ、トリプシンなどがあげられるが、好ましくはコラゲナーゼがあげられる。具体的にはＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＡ（Ｓｉｇｍａ社製）などがあげられる。コラゲナーゼ濃度としては、０．０６〜０．６％、好ましくは０．２％があげられる。
培養液としては、上述の酵素および２．４ｕｎｉｔｓ  Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ社製）などがあげられる。
ＢＭＥＣから本発明の幹細胞を分離する方法としては、抗体とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳソーター）を利用する方法があげられる。
骨髄は造血組織である。そこで、ＢＭＥＣ液に含まれる血球細胞を分離するために、白血球細胞マーカーであるＣＤ４５、赤血球細胞マーカーであるＴｅｒ−１１９を指標として、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ３０−Ｆ１１）、抗Ｔｅｒ−１１９抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｔｅｒ−１１９）を用いて、ＣＤ４５陽性・Ｔｅｒ−１１９陽性画分（以下ＢＭＥＣ  ＣＤ４５＋細胞と称する）を除去する。
残りの細胞画分は、幹細胞マーカーであるＣＤ３４を指標として、抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＲＡＭ３４）を用いてＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性画分（以下ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性画分（以下ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−と称する）に分離する。二つの画分にはいずれもＣＸＣＲ４陽性細胞が存在する。二つの画分から、さらにＣＸＣＲ４陽性細胞を濃縮するには、抗ＣＸＣＲ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性・ＣＸＣＲ４陽性細胞画分（以下ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋／ＣＸＣＲ４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性・ＣＸＣＲ４陽性画分（以下ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−／ＣＸＣＲ４＋と称する）を分離する。
ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−またはＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋中の幹細胞をさらに濃縮するには、幹細胞を染色しない核酸染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて、ｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（以下ＳＰ細胞）を採取するか、血管内皮細胞及び造血幹細胞を初めとする幹細胞マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ１４４およびＦｌｋ−１を指標として、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ＭＥＣ１３．３）
抗ＣＤ１４４抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  １１Ｄ４．１）および抗ＦＬＫ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａｖａｓ１２α１）、造血幹細胞で発現されているマーカーであるＣＤ１１７、Ｔｉｅ−２およびＣＤ９０を指標として、抗ＣＤ１１７抗体（ＢＤ  Ｐａｍｉｎｇｅｎ  ２Ｂ８）、抗体Ｔｉｅ−２抗体および抗ＣＤ９０抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ５２−２．１）、ならびに間葉系幹細胞のマーカーであるＡＬＣＡＭ−１を指標として、抗ＡＬＣＡＭ−１抗体を用いて本発明の幹細胞を分画することができる。
２．皮膚中の幹細胞の分離・培養法
ヒトの皮膚より本発明の幹細胞を取得する方法としては、以下の方法があげられる。
ヒトのひざの裏や臀部より表皮、真皮を含む皮膚組織を採取する。該皮膚組織を０．６％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ社製）／ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ社製）／１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ社製）に皮膚内側を下にして浸し、３７℃３０分間処理する。
皮膚組織を裏返して内側をピンセットで軽くこすった後、はさみを使って皮膚組織を約１ｍｍ２に細断し、１２００ｒｐｍ１０分間室温で遠心分離する。上清を除去し、組織沈殿に対して２５ｍｌ  ０．１％トリプシン／ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃｓを加えスターラーを用いて３７℃２００−３００ｒｐｍ４０分間で攪拌する。組織沈殿が十分消化されたことを確認後、３ｍｌ  ＦＢＳ（ＪＲＨ）を加えガーゼ（ＰＩＰ社製Ｔｙｐｅ  Ｉ）、１００μｍナイロンフィルター（ＦＡＬＣＯＮ）、４０μｍナイロンフィルター（ＦＡＬＣＯＮ）の順で濾過する。１２００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離し上清を除去後、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃｓを加えて沈殿を洗浄し、１２００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離する。上清を除去し、５ｍｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２／Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ）／１％ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃｓ，ａｎｔｉ−ｍｙｃｏｔｉｃｓ／２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）／４０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を加えφ６０ｍｍ浮遊細胞用培養皿（ＦＡＬＣＯＮ）を用いて３７℃  ５％  ＣＯ２で培養を行う。
培養開始後１週毎にＳｐｈｅｒｅ形成細胞を含む浮遊細胞分画を回収し、１２００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離する。細胞沈殿をＴｒａｎｓｆｅｒ  ｐｉｐｅｔｔｅｓ（Ｓａｍｃｏ  ＳＭ２６２−１Ｓ）を用いてバラバラにした後、５０％コンディションメディウムに交換して培養を継続する。ＥＧＦ，ＦＧＦは２〜３日毎に添加する。このようにして、取得されたＳｐｈｅｒｅの中に皮膚由来の本発明の幹細胞が濃縮される。このようにして得られた皮膚中の本発明の幹細胞はＣＸＣＲ４陽性となる。
３．骨格筋中の幹細胞の分離法
ヒトの骨格筋より幹細胞を取得する方法としては、以下の方法があげられる。
ヒトの上腕二頭筋の外側頭や下腿の縫工筋などの筋肉を含む結合組識を切皮して摘出後、縫合する。取得した全筋ははさみあるいはメスを利用してミンチ状にした後、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＡ（ｓｉｇｍａ）を０．０６％、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）にけん濁し、３７Ｃで２時間インキュベーションする。ミンチ状の筋肉より分離してきた細胞を回収後、遠心分離により細胞を回収しＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）にけん濁する。該けん濁液をまず半径４０μｍマイクロフィルターを通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりＳｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌ（以下ＳＭＥＣと称する）を回収することができる。ＳＭＥＣ中には多能性幹細胞が含有される。
幹細胞は、抗体とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳソーター）を利用してＳＭＥＣ液より分離することができる。まずＳＭＥＣ液に含まれる血球細胞を分離するために、白血球細胞マーカーであるＣＤ４５、赤血球細胞マーカーであるＴｅｒ−１１９を指標として、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ３０−Ｆ１１）、抗Ｔｅｒ−１１９抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｔｅｒ−１１９）を用いて、ＣＤ４５陽性・Ｔｅｒ−１１９陽性画分（以下ＳＭＥＣ  ＣＤ４５＋細胞と称する）を除去する。残りの細胞画分は、幹細胞マーカーであるＣＤ３４を指標として、抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＲＡＭ３４）を用いてＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性画分（以下ＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性画分（以下ＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−と称する）に分離する。二つの画分にはいずれもＣＸＣＲ４陽性細胞が存在する。二つの画分から、さらにＣＸＣＲ４陽性細胞を濃縮するには、抗ＣＸＣＲ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性・ＣＸＣＲ４陽性細胞画分（以下ＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋／ＣＸＣＲ４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性・ＣＸＣＲ４陽性画分（以下ＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−／ＣＸＣＲ４＋と称する）を分離する。
ＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４−またはＳＭＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋中の幹細胞をさらに濃縮するには、幹細胞を染色しない核酸染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて、ｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（以下ＳＰ細胞）を採取するか、血管内皮細胞及び造血幹細胞を初めとする幹細胞マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ１４４およびＦｌｋ−１を指標として、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ＭＥＣ１３．３）、抗ＣＤ１４４抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  １１Ｄ４．１）および抗ＦＬＫ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａｖａｓ１２α１）、造血幹細胞で発現されているマーカーであるＣＤ１１７、Ｔｉｅ−２およびＣＤ９０を指標として、抗ＣＤ１１７抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ２Ｂ８）、抗体Ｔｉｅ−２抗体および抗ＣＤ９０抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ５２−２．１）、ならびに間葉系幹細胞のマーカーであるＡＬＣＡＭ−１を指標として、抗ＡＬＣＡＭ−１抗体を用いて細胞を分画することができる。
４．脂肪組織中の幹細胞の分離法
ヒトの脂肪組織より幹細胞を取得する方法としては、以下の方法があげられる。
ヒトの胸部あるいは腹部の脂肪組織を主に含む結合組識を切皮して摘出後、縫合する。取得した脂肪組織ははさみまたはメスを利用してミンチ状にした後、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＡ（ｓｉｇｍａ）を０．０６％、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）にけん濁し、３７Ｃで２時間インキュベーションする。ミンチ状の脂肪組織より分離してきた細胞を回収後、遠心分離により細胞を回収しＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）にけん濁する。該けん濁液をまず半径４０μｍマイクロフィルターを通過させた後、半径２０μｍのマイクロフィルターを通すことによりＡｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌ（以下ＡＣＥＣと称する）を回収することができる。ＡＣＥＣ中には多能性幹細胞が含有される。
幹細胞は、抗体とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳソーター）を利用してＡＣＥＣ液より分離することができる。まずＡＣＥＣ液に含まれる血球細胞を分離するために、白血球細胞マーカーであるＣＤ４５、赤血球細胞マーカーであるＴｅｒ−１１９を指標として、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ３０−Ｆ１１）、抗Ｔｅｒ−１１９抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｔｅｒ−１１９）を用いて、ＣＤ４５陽性・Ｔｅｒ−１１９陽性画分（以下ＡＣＥＣ  ＣＤ４５＋細胞と称する）を除去する。残りの細胞画分は、幹細胞マーカーであるＣＤ３４を指標として、抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＲＡＭ３４）を用いてＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性画分（以下ＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性画分（以下ＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４−と称する）に分離する。二つの画分にはいずれもＣＸＣＲ４陽性細胞が存在する。二つの画分から、さらにＣＸＣＲ４陽性細胞を濃縮するには、抗ＣＸＣＲ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陽性・ＣＸＣＲ４陽性細胞画分（以下ＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋／ＣＸＣＲ４＋と称する）、ＣＤ４５陰性・Ｔｅｒ−１１９陰性・ＣＤ３４陰性・ＣＸＣＲ４陽性画分（以下ＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４−／ＣＸＣＲ４＋と称する）を分離する。
ＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４−またはＡＣＥＣ  ＣＤ４５−／３４＋中の幹細胞をさらに濃縮するには、幹細胞を染色しない核酸染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて、ｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（以下ＳＰ細胞）を採取するか、血管内皮細胞及び造血幹細胞を初めとする幹細胞マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ１４４およびＦｌｋ−１を指標として、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ＭＥＣ１３．３）、抗ＣＤ１４４抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  １１Ｄ４．１）および抗ＦＬＫ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａｖａｓ１２α１）、造血幹細胞で発現されているマーカーであるＣＤ１１７、Ｔｉｅ−２およびＣＤ９０を指標として、抗ＣＤ１１７抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ２Ｂ８）、抗体Ｔｉｅ−２抗体および抗ＣＤ９０抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ５２−２．１）、ならびに間葉系幹細胞のマーカーであるＡＬＣＡＭ−１を指標として、抗ＡＬＣＡＭ−１抗体を用いて細胞を分画することができる。
５．末梢血中の多能性幹細胞の分離・培養法
ヒト末梢血より幹細胞を取得する方法としては、以下の方法があげられる。
まず静脈中から血液を５０ｍｌから５００ｍｌ程度採取して細胞を回収し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ法により単核細胞を回収する［Ｋａｎｏｆ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｄ．１９９３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｋ，ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．）ｐｐ７．１．１−７．１．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．］。次にヒト末梢血単核細胞１×１０７〜１×１０８程度を１０％牛胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｇ／ｍｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  １００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下末梢血幹細胞培養基本培地と称する）を用いて懸濁し、２度洗浄して回収する。回収した細胞は末梢血幹細胞培養基本培地で再懸濁し、１００ｍｍ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）当たり１×１０７ｃｅｌｌｓになるように播種して３７℃インキュベーターにて８％のＣＯ２条件下で培養し、１０時間後に浮遊細胞を除去して付着細胞のみをピペッティングにて取得する。取得した付着細胞はＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＢＤ）処理（５μｇ／ｍｌ）したｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に３ｎＭ  ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ，ナカライ社製）、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（以下、Ｍ−ＣＳＦと略記するＳｉｇｍａ社製）、または５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  Ｍ−ＣＳＦ及び１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（以下、ＬＩＦと略記するＳｉｇｍａ社製）を含む末梢血幹細胞培養基本培地を用いて５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種し、５〜７日に一度培地を半分交換しながら培養する。培養開始後およそ２〜３週間で、双極性の形態を有する末梢血中の多能性幹細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、以下ＰＢＦＳＣと称す）を増幅して取得することができる。
６．本発明の多能性幹細胞を有効成分とする組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤とその投与方法
上述の方法により得られた本発明の幹細胞を有効成分とする組織破壊を伴う疾患の予防および／または治療剤は、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪、末梢血いずれの組織由来の幹細胞も用いることができる。
上記１〜５の方法で調製した本発明の幹細胞はヘモネテイックス社のヘモライト２など閉鎖系で細胞の濃縮、洗浄、回収処理が可能な機器を用いて生理食塩水で洗浄し、分離・培養に用いた抗体やサイトカインなどを限りなく１００％近くまで除去することが好ましい。このようにして、洗浄濃縮された幹細胞は、通常の点滴法で静脈中に注入するか、患部に直接注入することで組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療に用いることができる。
本発明の幹細胞の投与量としては、疾患または組織破壊の状況によって異なるが、１回あたり１０〜１０６細胞投与するのが好ましい。
また、体内の組織に存在する本発明の幹細胞を、薬剤を用いて組織破壊された部位に動員させることにより、幹細胞を用いて組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療することもできる。
体内の組織、例えば骨髄から薬剤により動員された本発明の幹細胞は、ＣＸＣＲ４のリガンドであるストローマ由来因子−１（ＳＤＦ−１と略記する）が、組織破壊を受けた部位で発現が増大しているため、組織破壊を受けた部位へ特異的に集積させることができる。したがって、本発明の幹細胞は、組織破壊を伴う疾患を選択的に治療することができる。
体内の組織に存在する幹細胞を動員する薬剤としては、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド、レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体、ＣＸＣＲ４阻害剤などがあげられる。これらの薬剤は単剤（合剤）としてでも複数の製剤の組み合わせとしてでも使用または投与することができる。複数の製剤の組み合わせとして使用する際には、同時にまたは時間をおいて別々に使用または投与することができる。
Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド等があげられる。
具体的には、ナルトグラスチム（商品名ノイアップ、協和発酵工業製）、フィルグラスチム（商品名グラン、三共製；商品名Ｇｒａｎｕｌｏｋｉｎｅ、ホフマン・ラ・ロシュ製；商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、アムジェン製）、レノグラスチム（商品名ノイトロジン、中外製薬製；商品名Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ、アベンティス製）、ペグフィルグラスチム（商品名Ｎｅｕｌａｓｔａ、アムジェン製）、サルグラモスチム（商品名Ｌｅｕｋｉｎｅ、シェーリング製）等があげられる。
また、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドとしては、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）によって、配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦとのアミノ酸配列の相同性を検索した際に、好ましくは６０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドがあげられる。配列番号１記載のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が置換し、かつＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドの具体例を表１に示す。
2004101775.tif 000002
またＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドは、化学修飾されていてもよい。
化学修飾の方法としては、例えばＷＯ００／５１６２６に記載の方法等があげられ、例えばポリアルキレングリコールで修飾、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾したＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドが包含される。
レチノイン酸誘導体としては、レチノイン酸受容体に結合する化合物であればいかなるものでもよいが、具体的にはパルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール等のレチノイン酸誘導体、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、β−クリプトキサンチン、エキネノン等のプロビタミンＡ等をあげることができる。また、モトレチナイド（商品名Ｔａｓｍａｄｅｒｍ、ホフマン・ラ・ロシュ製、ＵＳ４１０５６８１参照）、ＷＯ０２／０４４３９に記載の化合物、タザロテン（商品名Ｔａｚｏｒａｃ、Ａｌｌｅｒｇａｎ社、ＥＰ２８４２８８参照）、ＡＧＮ−１９４３１０及びＡＧＮ−１９５１８３（Ａｌｌｅｒｇａｎ製、ＷＯ９７／０９２９７参照）、ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ＴｏｐｉＣａｒｅ（商品名Ａｖｉｔａ、Ｍｙｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、ＵＡＢ−３０（ＣＡＳ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２０５２５２−５９−１、ＵＡＢ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ製）等があげられる。
ＣＸＣＲ４阻害剤としてはＡＭＤ−３１００などがあげられる。
本発明で用いられるＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドと、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤は、これらそれぞれの有効成分を含有するように製剤化したものであれば、単剤（合剤）としてでも複数の製剤の組み合わせとしてでも使用または投与することができる。複数の製剤の組み合わせとして使用する際には、同時にまたは時間をおいて別々に使用または投与することができる。なお、これら製剤は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、またはドライパウダー、エアロゾル等の吸入剤等の形態として用いることができる。
前記の製剤は、それぞれの有効成分の他に製剤学的に許容される希釈剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、水、生理食塩水、植物油可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いて常法により製造することができる。
錠剤の製造にあたっては、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。
注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶化剤、等張化剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。
また、吸入剤はＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該ポリペプチドを微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体としては、例えば乳糖、グリセリン等が挙げられる。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、Ｇ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドでは通常成人１日当たり０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、レチノイン酸もしくはレチノイン酸誘導体、またはＣＸＣＲ４阻害剤では通常成人１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施例を示す。
実施例１  マウス大腿骨・脛骨より骨髄内深部の幹細胞の分離
３〜１２週齢の雌マウス（日本クレア社）を頚椎脱臼により致死させ、７０％エタノールで十分に消毒した後、はさみまたはメスで皮膚を切除し、下肢大腿骨及び脛骨を取得した。実体顕微鏡下で、微細ハサミ及びメスで、骨の表面にある筋肉・腱・軟骨などの組織を除去した。次に骨を０．５％Ｔｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）に浸し、３７℃で１時間インキュベーションした。トリプシン処理した骨から、さらに骨の表面組織を完全に除去し、ＰＢＳで十分に洗浄した。ハサミで両端の骨端部を切除し、注射器（ＰＢＳ入り）の針を骨髄内に刺し、十分量のＰＢＳを溶出することにより骨髄細胞（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌ、以下ＢＭＣと略する）を回収した。
次に、溶出した骨をはさみで細かく切るあるいは砕くことで、骨片にし、ＰＢＳで３回洗った後、０．２％のＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＡ（ｓｉｇｍａ）および２．４単位Ｄｉｓｐａｓｅ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、３７℃で２時間インキュベーションした。懸濁液を４０μｍマイクロフィルターに通過させ、マウスＢＭＥＣを得た。
ＢＭＣ液およびＢＭＥＣ液をＦＢＳ５％入りＤＭＥＭにそれぞれ浮遊させ、遠心操作を行い、再度ＦＢＳ入りＤＭＥＭに懸濁させることで、細胞を洗浄した。この細胞の洗浄を２回行った。
ＢＭＥＣ液より幹細胞を取得するために、抗体とフローサイトメトリー（ＦＡＣＳソーター）を利用して分離を行った。ＢＭＥＣ液に含まれる細胞から、死細胞を染め分けるｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ３０−Ｆ１１）、抗Ｔｅｒ−１１９抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｔｅｒ−１１９）および抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＲＡＭ３４）を用いて細胞の分離、回収を行った。また核酸染色試薬Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＳＩＧＭＡ）を用いて、幹細胞が濃縮するｓｉｄｅ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ（以下ＳＰ細胞）及びマウス造血幹細胞マーカーであるＫＳＬ細胞［ＣＤ１１７陽性、Ｓｃａ−１陽性およびＬｉｎａｇｅ（ＣＤ４，ＣＤ８ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０，Ｔｅｒ−１１９，Ｇｒ−１，ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ）陰性細胞］の解析を行った。
またＢＭＥＣのＣＤ４５陰性およびＴｅｒ−１１９陰性細胞を、抗ＣＤ３４抗体、抗Ｓｃａ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｄ７）、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ＭＥＣ１３．３）、抗ＣＤ１４４抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  １１Ｄ４．１）、抗ＦＬＫ−１抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａｖａｓ１２α１）、抗ＣＤ１１７抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ２Ｂ８）、抗ＡＬＣＡＭ−１抗体、抗Ｔｉｅ−２抗体および抗ＣＤ９０抗体（ＢＤ  Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ  ５２−２．１）、抗ＣＸＣＲ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ２Ｂ１１）の各抗体を用いて解析を行った。
従来法によって得られるＢＭＣは、ＣＤ４５陰性且つＴｅｒ−１１９陰性細胞がわずか（０．０３〜０．５％）であるのに対し、上記に示した方法により得られるＢＭＥＣは約２２．６〜１９７倍（５．９〜１１．３％）であった。またＣＤ４５陰性且つＣＤ３４陽性細胞は、ＢＭＣ中にはほとんどなかったのに対し、ＢＭＥＣ中には０．５〜１．１％存在した。従来法では分離できなかった骨髄由来のＣＤ４５陰性細胞が、本発明の手法で回収することができた。
ＢＭＥＣ中のＣＤ４５陰性且つＴｅｒ−１１９陰性細胞は、ＣＤ３４陽性細胞（１〜１８％）とＣＤ３４陰性細胞（８２〜９９％）の２集団に分離することができた。この２集団について、細胞表面に発現する抗原の解析を行った。以下、ＣＤ４５陰性、Ｔｅｒ−１１９陰性およびＣＤ３４陽性細胞をＣＤ４５−／ＣＤ３４＋と称し、ＣＤ４５陰性、Ｔｅｒ−１１９陰性およびＣＤ３４陰性細胞をＣＤ４５−／ＣＤ３４−と称する。
ＦＡＣＳソーターを使用したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋の細胞表面マーカー解析の結果、Ｓｃａ−１＋（９１．８％），ＣＸＣＲ４＋（３１．５％），Ｆｌｋ−１＋（３３．４％），ＣＤ１１７（１５．２％），Ｔｉｅ−２＋（５７．２％），ＣＤ１４４＋（５１．３％），ＣＤ３１＋（５８．９％），Ｌｉｎｅａｇｅ−（８４．０％），ＣＤ９０．２＋（８３．４％），ＳＰ細胞（１．３〜１．３５％）であった。ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋中のＳＰ細胞の細胞表面マーカー解析を行なった結果、Ｓｃａ−１（１００％），Ｔｉｅ−２＋（６６％），ＣＤ１４４＋（６９．３％），ＣＤ３１＋（９３．３％）であった。
同様にＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４−の細胞表面マーカー解析の結果は、
Ｓｃａ−１＋（１７．６％），ＣＸＣＲ４＋（１６．３％），Ｆｌｋ−１＋（３．６％），ＣＤ１１７（１９．９％），Ｔｉｅ−２＋（１１．３％），ＣＤ１４４（３．０％），ＣＤ３１＋（４．５％），Ｌｉｎｅａｇｅ−（９６．２％），ＣＤ９０．２＋（６．９％）、ＳＰ細胞（０〜０．０７％）であった。ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４−中のＳＰ細胞の細胞表面マーカーを解析した結果、Ｓｃａ−１（０％），Ｔｉｅ−２＋（２４．０％），ＣＤ１４４＋（１９．４％），ＣＤ３１＋（０％）であった。
次に、ＦＡＣＳソーターにより取得したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋及びＣＤ４５−／ＣＤ３４−より、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、細胞よりＲＮＡを分離し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用してｃＤＮＡを合成した。各ＤＮＡと以下に示す塩基配列を有するプライマーを用いることにより、ＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１、Ｔｉｅ−２およびＣＸＣＲ４の各発現を解析した。対照としてはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨと略記する）の発現を解析した。
ＧＡＰＤＨプライマー：配列番号２および３
Ｆｌｋ−１プライマー：配列番号４および５
Ｆｌｔ−１プライマー：配列番号６および７
Ｔｉｅ−２プライマー：配列番号８および９
ＣＸＣＲ４プライマー：配列番号１０および１１、配列番号１２および１３
ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋では、Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１、Ｔｉｅ−２およびＣＸＣＲ４はすべて陽性であったが、ＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞は、Ｆｌｋ−１およびＣＸＣＲ４は陽性であり、Ｆｌｔ−１およびＴｉｅ−２は陰性であった。
実施例２  ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋およびＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞の培養
実施例１により取得したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞の多分化能を解析するために以下の方法で培養実験を行った。
ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞をそれぞれ１００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの条件で、完全なメチルセルロース培地ＭｅｔｈｏｃｕｌｔｏＧＦＨ４４３４Ｖ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）で培養を行った。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２に設定した。培養１０〜１４日目に、ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞のなかに自律拍動する筋肉様細胞が検出された。そこで、実施例１と同様の方法でＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞からＤＮＡを抽出し、心筋型トロポニンＩ（Ｃａｒｄｉａｃ  ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ）および骨格筋型トロポニンＩ（Ｆａｓｔ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ＴｒｏｐｏｎｉｎＩ）の発現をみるために配列番号１４および配列番号１５ならびに配列番号１６および１７の特異的プライマーをそれぞれ用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、心筋型トロポニンＩ陽性、骨格筋型トロポニンＩが陽性であることから、骨格筋細胞、心筋細胞への分化が確認された。また細胞内に油滴を持ちＯｉｌ  Ｒｅｄで染色される脂肪細胞も検出された。
血液細胞および血管内皮細胞への支持能が高いマウスストローマ細胞ＯＰ−９を培養したのち、６０００細胞／ｍｌ、ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭの条件でＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞のそれぞれについてＯＰ−９との共培養を行った。インキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２に設定した。
培養１０日目の細胞の様子を顕微鏡下で確認した。ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞より、筋肉様細胞（２４コロニー）および多数の脂肪様細胞が検出された。また、抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫染色によりＣＤ３１陽性の血管内皮様細胞（１０３コロニー）が確認された。
ＦＢＳを１０％含むＤＭＥＭ培地で、細胞密度５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の条件で培養を行い、細胞がサブコンフレントになった後、継代培養を行った。
抗α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ抗体（ＤＡＫＯ  １Ａ４）を用いた免疫染色を行った結果、継代数３以上のＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋由来培養細胞から平滑筋細胞が検出された。
無血清培地として、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、またはＮｅｕｒｏＣｕｌｔｏ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）にｈｕｍａｎ  ＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）２０ｎｇ／ｍｌ，ｍｕｒｉｎ  ＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）２０ｎｇ／ｍｌを添加した培地を用いて、各２００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞を培養した。
約３週間培養したＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞をＦＡＣＳ解析した結果、ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋が１０〜１３％検出された。このことは、ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞を培養することによりＣＤ４５−／ＣＤ３４＋を誘導し、増殖させたことを示している。
同様のＢ２７サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に、ＦＧＦおよびＥＧＦ、または５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  β−ＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ）、ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３（ＳＩＧＭＡ）およびｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＩＧＭＡ）を加えた神経幹細胞用培地または神経細胞分化誘導用培地を用いて、ラミニンコートディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞をそれぞれ７〜１４日間培養した結果、いずれの細胞も突起を持つ神経様細胞を増殖し、分化誘導することができた。
肝細胞分化誘導培地である、ＦＢＳを１０％含むＨＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に５０ｎｇ／ｍｌヒトＨＧＦ（ＳＩＧＭＡ）および２０ｎｇ／ｍｌマウスＥＧＦの培地で、ラミニンコートディッシュ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞をそれぞれ培養した。その結果、ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞の両群で、接着型細胞を増殖し、肝細胞に特徴的な２核を有する細胞を検出した。
実施例３  マウス皮膚からの多能性幹細胞の分離・培養
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス  １２週齢（日本ＳＬＣ社）の体毛を除去し、腹側および背側から皮膚組織を採取した。ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄した後、皮下組織を物理的に除去し、残った皮膚組織（表皮組織および真皮組織）を０．６％トリプシン溶液に浸し３７℃で３０分間反応させた。０．６％トリプシン溶液は２．５％トリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）に希釈して作製した。
はさみを使って皮膚組織を約１ｍｍ２に細断した後、１２００ｒｐｍ室温で１０分間（ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ  ０５Ｐ−０２１）（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）遠心分離により皮膚組織片を回収し、０．１％トリプシン溶液に懸濁して攪拌機（ＭＡＧＮＥＴＩＣ  ＳＴＩＲＲＥＲ  ＨＳ−３Ｅ）（ＩＵＣＨＩ社製）を用いて２００−３００ｒｐｍ  ３７℃  ４０分間攪拌した。０．１％トリプシン溶液は２．５％トリプシン溶液を１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に希釈して用いた。
皮膚組織片が十分消化されたことを確認し、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）（ＪＲＨ社製）を１／１０量加えた後、ガーゼ（Ｔｙｐｅ  ＩＰＩＰ社製）、１００μｍナイロンフィルター（ＦＡＬＣＯＮ社製）、４０μｍナイロンフィルター（ＦＡＬＣＯＮ社製）の順で濾過した。１２００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離して上清を除去後、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を用いて沈殿を洗浄し、１２００ｒｐｍ室温で１０分間遠心分離した。上清を除去し、５ｍｌのＢ−２７（ＧＩＢＣＯ社製）、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、４０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に懸濁し、直径６０ｍｍ浮遊細胞用培養皿（ＦＡＬＣＯＮ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養を行った。
培養開始後１週間毎にＳｐｈｅｒｅ形成細胞を含む浮遊細胞分画を回収し、０．１〜４×１０６細胞／培養皿の密度を保って継代培養を繰り返したところ、Ｓｐｈｅｒｅを形成して活発に増殖する細胞（以下Ａ１６３細胞と記載する）を取得した。また、Ａ１６３細胞から限界希釈法を用いて単一細胞由来のクローン細胞株計８株（以下Ｙ１６４、Ｙ１６５、Ｙ１６６、Ｙ１６８、Ｙ１７０、Ｙ１７１、Ｙ１７２、Ｙ１７３と称する）を樹立した。
限界希釈法は以下に記載する方法で行った。対数増殖期にあるＡ１６３細胞を培養上清に希釈し、９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に０．５細胞／ウェルで捲き、３７℃  ５％ＣＯ２存在下で培養した。２−３日毎にＥＧＦ、ＦＧＦを添加し、１週間毎に１／２量の培地を交換した。細胞数が１０００細胞／ウェル以上に達したところで２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に拡大培養し、２×１０４細胞／ｍｌ以上の細胞密度を維持しながら拡大培養を行うことで、Ａ１６３細胞の単一細胞由来のクローン細胞株を取得した。
トリプシン溶液処理により単一細胞にしたＡ１６３細胞をポリ−Ｌ−オルニチン（ＳＩＧＭＡ社製）／ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）コート上で培養し、１％ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で分化誘導したところ、９０％以上の効率でＯｉｌ  Ｒｅｄ染色陽性脂肪細胞への分化が認められた。また、１０％ＦＢＳ、１％  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で分化誘導したところ、長径５０〜１００μｍ、繊維状形態を示し核膜構造が明瞭で抗フィブロネクチン抗体（ＦＮ−３Ｅ２）（ＳＩＧＭＡ社製）陽性な繊維芽細胞への分化が９０％以上の効率で認められた。その中には抗α−平滑筋アクチン抗体（１Ａ４）（ＳＩＧＭＡ社製）陽性の平滑筋細胞が低頻度（〈５％）ながら含まれることが確認された。Ａ１６３細胞より樹立したクローン細胞株計８株（Ｙ１６４、Ｙ１６５、Ｙ１６６、Ｙ１６８、Ｙ１７０、Ｙ１７１、Ｙ１７２、Ｙ１７３）について同様の解析を行ったところ、全てのクローンでＥＧＦおよびＦＧＦ依存的なＳｐｈｅｒｅ形成能と増殖が認められ、Ｙ１７１、Ｙ１７３を除いて脂肪細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞への分化が認められた。Ｙ１７１、Ｙ１７３は脂肪細胞と繊維芽細胞への分化能を示した。
以上の結果より、Ａ１６３細胞がＥＧＦ、ＦＧＦ依存的な自己複製能と多分化能をもった成体多能性幹細胞であることが明らかとなった。
抗体による染色は以下の方法で行った。細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで室温で１５分間固定し、ＰＢＳを用いて３回洗浄した後、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライ社製）を含むＰＢＳに室温１５分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳを用いて１／２０に希釈した正常ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）を室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳを用いて１／４００に希釈した抗フィブロネクチン抗体もしくは抗α−平滑筋アクチン抗体溶液（抗α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ｋｉｔ）（ＳＩＧＭＡ社製）を室温で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ＬＳＡＢ２  ｋｉｔ（ＤＡＫＯ社製）を用いて陽性細胞を検出した。
さらに、ＥＧＦ、ＦＧＦ添加培地により培養した未分化なＡ１６３細胞および１０％ＦＢＳ培地により繊維芽細胞に分化誘導したＡ１６３細胞の表面抗原を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて解析した。表面抗原解析は以下の方法で行った。トリプシン溶液処理により単一細胞にした後、５×１０５細胞を１００μｌの０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳに懸濁し、１次抗体２〜１０μｌを添加して氷上で４５分間反応させた。２ｍｌの０．５％  ＢＳＡを含むＰＢＳを加えて洗浄し、１０００ｒｐｍ室温５分間遠心分離後、１ｍｌのＰＢＳに懸濁し、ナイロンメッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社製３５２２３５＋ｔｕｂｅ）で濾過した後測定を行った。２次抗体反応が必要なものについては上清を除去後１次抗体反応と同様の方法で反応、洗浄を行った。測定はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）によって行い、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて解析した。１次抗体として抗ＣＤ１０  ｒａｂｂｉｔ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ビオチン標識抗ＣＤ４５抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ９０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＰＥ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ビオチン標識抗Ｔｅｒ−１１９抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＰＥ標識抗Ｓｃａ−１抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＰＥ標識抗Ｆｌｋ−１抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＦＩＴＣ標識ｃｏｎｔｒｏｌｒａｔ  ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ＰＥ標識ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、ビオチン標識ｒａｔ  ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）、Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＦｒａｃｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ）を用いた。２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）およびＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
未分化なＡ１６３細胞はＣＤ１０陰性、ＣＤ３４陽性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陽性／陰性、ＣＤ１１７弱陽性、Ｔｅｒ−１１９陰性、Ｓｃａ−１強陽性、Ｆｌｋ−１弱陽性を示し、幹細胞抗原であるＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１の発現が確認された。一方、繊維芽細胞に分化誘導したＡ１６３細胞ではＣＤ１０陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ１１７陰性、Ｔｅｒ−１１９陰性、Ｓｃａ−１陽性、Ｆｌｋ−１陰性を示し、ＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔの発現消失、Ｓｃａ−１の発現低下が認められた。未分化Ａ１６３細胞における幹細胞抗原の発現および分化誘導による幹細胞抗原の消失からもＡ１６３細胞は成体皮膚組織由来の多能性幹細胞株であることが明らかとなった。
実施例４  マウス皮膚由来多能性幹細胞でのＣＸＣＲ４受容体の発現
Ａ１６３細胞のＣＸＣＲ４遺伝子の発現はＲｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲにて次のように検討した。
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２により増殖中のＡ１６３細胞及びウシ胎児血清処理にて３日間分化誘導したＡ１６３細胞よりそれぞれＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて取得し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ）処理して混在するｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを除去したものを用いた。上記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２．５μｇに５００ｎｇのｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、４２℃にてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲのテンプレートとした。ＰＣＲはＥｘ−Ｔａｇ  ｆｏｒ  Ｒ−ＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ）及びＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を含む反応液で増幅し（９５℃１５秒間、６０℃３０秒間、７０℃３０秒間  ４０サイクル）、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）にて増幅量を検出した。一反応当たりのテンプレート量はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ２ｎｇに相当する。
この解析の結果、皮膚由来幹細胞株Ａ１６３細胞では未分化状態を維持している状態（ＥＧＦ、ＦＧＦ２存在下での培養）ではＣＸＣＲ４遺伝子が発現しており、ＦＢＳ刺激による分化誘導により少なくとも１／１０に減少することを見出した。
実施例５  ヒト末梢血中の多能性幹細胞（ＰＢＦＳＣ）の分離・培養
凍結保存されたヒト末梢血単核細胞（５×１０７ｃｅｌｌｓ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）は３７℃で融解し、１０％牛胎児血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１００μｇ／ｍｌ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  １００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて懸濁し、２度洗浄して回収した。回収した細胞は上記培地で再懸濁し、１００ｍｍ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）当たり１×１０７ｃｅｌｌｓになるように播種して３７℃インキュベーターにて８％  ＣＯ２条件下で培養し、１０時間後に浮遊細胞を除去して付着細胞のみをピペッティングにて取得した。取得した付着細胞はＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ＢＤ）処理（５μｇ／ｍｌ）または未処理のｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に、３ｎＭ  ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ、ナカライ社製）、５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（Ｍ−ＣＳＦ，Ｓｉｇｍａ）、または５０ｎｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ  Ｍ−ＣＳＦおよび１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ，Ｓｉｇｍａ）を含む上記培地を用いて５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種し、５〜７日に一度培地を半分交換しながら培養した。培養開始後およそ３週間で、Ｍ−ＣＳＦ処理した細胞からは双極性の形態を有する多能性幹細胞が出現した。
また出現頻度はＬＩＦの添加により上昇し、さらにＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎコートしたｄｉｓｈ上で培養することにより出現頻度が上昇した。
実施例６  末梢血由来多能性幹細胞（ＰＢＦＳＣ）数に対するＧ−ＣＳＦの効果
実施例５に従い、凍結ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｒｋｅｒ社製，Ｃａｔ．＃ＣＣ−２７０２，ｌｏｔ  ＃２Ｆ１３８８）及びＧ−ＣＳＦ動員ヒト末梢血単核細胞（ＭＰＢ，ＢｉｏＷｈｉｔｔａｒｋｅｒ社製，Ｃａｔ．＃２Ｇ−１２５Ｃ，ｌｏｔ  ＃２Ｆ０５０１）を培養し、多能性幹細胞（ＰＢＦＳＣ）数に対するＧ−ＣＳＦの効果を検討した。
末梢血単核細胞由来の付着性細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種してｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎコート下でＭ−ＣＳＦ及びＬＩＦ存在下で培養した。およそ４週間後、各末梢血単核細胞からＰＢＦＳＣ細胞が出現したことを目視による形態観察で確認した。単位面積当りのＰＢＦＳＣの数を計測した結果、ＰＢＦＳＣの出現数は通常の末梢血単核細胞では１．１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でＧ−ＣＳＦ動員末梢血由来の単核細胞では２．３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２（Ｐ＝０．００２）で、ＰＢＦＳＣの数はＧ−ＣＳＦ動員末梢血で有意に増加していた。
実施例７  末梢血由来多能性幹細胞（ＰＢＦＳＣ）におけるＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子の発現
ＰＢＦＳＣを含む細胞集団に幹細胞が濃縮されているかどうかを検討するため、Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて幹細胞マーカーであるＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子の発現を解析した（Ｔｓａｉ，ＲＹＬ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎ．＆  Ｄｅｖ．１６，２９９１−３００３，２００２）。
（１）  鋳型ｃＤＮＡの作製
ＰＢＦＳＣを含む細胞集団よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃａｔ．＃７４９０４）を用いて取得し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  Ｃａｔ．＃Ｍ６１０１）処理して混在するｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを除去した。上記ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ２．５ｇに５００ｎｇのｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｃａｔ．＃１８４１８−０１２）および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  Ｃａｔ．＃１８０６４−０１４）を加え、４２℃にてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲのテンプレートとした（２０μｌ）。ｃＤＮＡ作製の際、逆転写酵素を添加しないサンプルを作製した［ＲＴａｓｅ（−）］。
（２）  プライマーの設定
ヒトＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子、ヒトｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ遺伝子に対するプライマーはそれぞれＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．＃ＡＫ０２７５１４、ＡＢ０６２２７３及びＮＭ＿００１１０１を元に設定し、合成した（Ｇｅｎｓｅｔ社製）。ヒトＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子のフォワードプライマーを配列番号１８、リバースプライマーを配列番号１９、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のフォワードプライマーを配列番号２０、リバースプライマーを配列番号２１、ヒトｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ遺伝子のフォワードプライマーを配列番号２２、リバースプライマーを配列番号２３に、それぞれ示した。
（３）  ＲＴ−ＰＣＲによる発現の確認
ＰＣＲ反応はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）を用いて行った。ＰＣＲ反応は、上記ｃＤＮＡ０．１μｌ（一反応当たりのテンプレート量はｔｏｔａｌ  ＲＮＡ２０ｎｇに相当）、各成分３００μＭのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、３００ｎＭのＦｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅプライマー、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｒ−ＰＣＲ  ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ  Ｃａｔ．＃ＲＲ００７Ａ）１単位、１×Ｒ−ＰＣＲバッファー、２．５ｍＭ  Ｍｇ２＋溶液、５％Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ｎａｃａｌａｉ社製Ｃａｔ．＃１３４−４５）及び０．２×ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製Ｃａｔ．＃Ｓ−７５６７）を含む反応溶液２０μＬを用い、９４℃で５分間加熱後、９５℃１５秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、更に７２℃で１０分間加熱することにより行った。反応終了後、得られたＰＣＲ反応液より１０μＬを分取し、２％アガロースゲル〔ＡＧＡＲＯＳＥ（ｎａｃａｌａｉ社）をＴＡＥバッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ  Ｅｔｈｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ  Ｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｉｃ  ａｃｉｄに溶かして作製）〕にて電気泳動した。ゲルをＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ｎａｌａｃａｉ  Ｃａｔ．＃１４６３１−９４）０．５μｇ／ｍｌを含むＴＡＥ溶液にて３０分間染色し、ＵＶサンプル撮影装置（ＴＯＹＯＢＯ  ＦＡＳ−ＩＩＩ）で予想されるＤＮＡ断片（ＮＳ遺伝子：０．５８ｋｂ、ＧＡＰＤＨ遺伝子：０．４３ｋｂ，ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ：０．４８ｋｂ）の増幅を確認した。
解析の結果、末梢血由来単核細胞に比べ、ＰＢＦＳＣを含む細胞集団ではＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子の発現が増加していることを見出し、ＰＢＦＳＣを含む細胞集団には幹細胞が濃縮されていた。
以上のことから、Ｇ−ＣＳＦにより動員された末梢血単核細胞には幹細胞マーカーであるＮｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ遺伝子を発現する多能性幹細胞ＰＢＦＳＣが多数動員されていることが示唆された。
実施例８  マウス大腿骨・脛骨より骨髄内深部の幹細胞の検出
免疫組織染色法によって、大腿骨および脛骨の組織の幹細胞を検出し、ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋が組織の骨近傍領域に存在するか観察した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）５週齢より大腿骨及び脛骨を採取し、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に４℃で２時間浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ４μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
こうして作成した凍結切片に対し、以下のようにして抗ＣＤ３４抗体による免疫染色をおこなった。
凍結切片の乗せたスライドグラスをアセトン（和光純薬社製）に４℃で１０分間浸し、ＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った。スライドを０．４５％過酸化水素（和光純薬社製）を含むメタノール（和光純薬社製）に室温で３０分間浸し、ＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った。ブロッキング液［１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）、ＰＢＳ］に室温で３０分間浸し、次に一次抗体［Ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｒａｔ  Ａｎｔｉ−ＣＤ３４  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ，ＲＡＭ３４］（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで０．２５μｇ／ｍｌに希釈した溶液と４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＰＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を２００倍希釈したＰＢＳ溶液に室温で３０分間浸し、ＰＢＳで３回洗った。次にＢｉｏｔｉｎｙｌ  ｔｙａｍｉｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＡ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を室温で７分間反応させ、ＰＢＳで５回洗った後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＰＲを２５０倍希釈したＰＢＳ溶液に室温で４５分間浸し、ＰＢＳで３回洗った。発色溶液［０．００７５％過酸化水素、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（和光純薬社製）、ＰＢＳ］で浸し発色させ、ＰＢＳで３回洗った後、顕微鏡ＥＣＬＩＰＳＥＴＥ３００（Ｎｉｋｏｎ社製）で観察した。
その結果、ＣＤ３４陽性細胞として、既知である血管内皮細胞と骨髄中に均一に散らばった一部の血液細胞に加え、新規な細胞として、骨近傍の骨芽細胞に接した細胞、骨組織に直接接着した細胞、皮質骨内に埋もれた細胞が観察された。この骨組織中及び近傍のＣＤ３４＋細胞がＰＢＳ溶出後の骨から抽出されるＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞である。
実施例９  ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋及びＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞の移植
Ｘ線を照射されたマウスは、腸管上皮や骨髄等での細胞新生が起こらなくなることが知られている（ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｃａｎｃｅｒ、２００３年、３巻、ｐ．１１７−１２９）。ここでは特に、全身障害モデルとしてＸ線照射マウスを作成し、ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋及びＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞が組織の修復に寄与しているかどうか確認した。
全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウス（Ｃ５７ＢＬ／６×１２９系統）の５週齢の個体より、実施例１に示した方法に従いＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋及びＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞を、フローサイトメーターを使用して完全純度で分離し、回収した。またＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）８週齢より大腿骨及び脛骨を採取し、骨髄細胞を回収した。
こうして採取したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞（あるいはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞）を、以下のようにして尾静脈より注入して移植を行った。まず、移植をうけるＣ５７ＢＬ／６マウス（日本クレア社）は８週齢のものを用意し、移植の前日に、Ｘ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて９．５Ｇｙの線量のＸ線を照射した。採取したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋を１匹あたり６，０００ｃｅｌｌｓ、またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞１２，０００ｃｅｌｌｓをそれぞれ尾静脈より移植した。Ｘ線照射によって破壊された血液系を再生させるためにＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞２×１０５ｃｅｌｌｓを同時に尾静脈より移植した。ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋（またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞）はＧＦＰ蛋白質を発現していることから、移植マウスの組織において蛍光を発する細胞が、移植したＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋（またはＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞）由来であることで検出できる。
その後５ヶ月経過して生存しているかどうか確認し、移植マウスを作製した。
次に該移植マウスを解剖し、末梢血と、下肢の脛骨より骨髄細胞を回収した後、灌流固定をおこない、肝臓・心臓・肺・脾臓・胃・脳・骨格筋・皮膚・腎臓・膵臓・小腸・大腸を摘出した。具体的には、まず移植マウスにネンブタール（大日本製薬社製）を腹腔内注射して麻酔し、下肢の動脈を紐で縛った後、下肢の脛骨を採取した。骨端をハサミで切り落とし、２５Ｇのテルモ製静注針でＰＢＳを押し出し、骨髄細胞を回収した。マウスを開腹開胸して心臓を露出させ末梢血を回収し、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入し、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍＬ流し、全身を灌流させた。ＰＢＳを全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍＬ流し、固定をおこなった。その後、固定したマウスから肝臓・心臓・肺・脾臓・胃・脳・骨格筋・皮膚・腎服・膵臓・小腸・大腸を摘出した。肺以外の組織は、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンで凍結した。肺は摘出後、ＯＣＴを注入・包埋した後、凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタット（Ｆｒｉｇｏｃｕｔ２８００、Ｌｅｉｃａ社製）を用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成した。
こうして作成した凍結切片に対し、以下のようにして抗ＧＦＰ抗体による免疫染色をおこなった。
凍結切片の乗せたスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回繰り返し、スライドグラスを洗った。ブロッキング液［５％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧ，１Ｅ４］（ＭＢＬ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで５００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、Ｚｅｉｓｓ製蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｐｈｏｔ２で観察した。その結果、ＢＭＥＣ  Ｄ４５−／ＣＤ３４＋移稙マウスについて、肝臓・肺・脾臓・脳・胃・皮膚（毛包細胞）・膵臓・小腸・大腸の組織にＧＦＰ陽性細胞が観察された。ＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４−移植マウスについては、脾臓・腎臓・小腸の組織にＧＦＰ陽性細胞が観察された。
以上のことから、移植に用いたＢＭＥＣ  ＣＤ４５−／ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ４５−／ＣＤ３４−細胞から、Ｘ線照射によって破壊された様々な組織の細胞に新生さらには生着したことが確認された。末梢血および骨髄細胞においてはＧＦＰ陽性細胞は観察されず、肝臓・肺・脾臓・脳・胃・皮膚・膵臓・小腸・大腸・腎臓で観察された細胞は血液系細胞ではないことを確認した。
実施例１０  ｄｂ／ｄｂマウスにおける骨髄細胞の組織機能細胞分化
ｄｂ／ｄｂマウスは、ｄｂ遺伝子の単一劣性変異マウスであり、肥満・過食・高インスリン血症など顕著な糖尿病症状を自然発症する２型糖尿病モデルマウスとして知られている（ジョスリン糖尿病学、１９９５年、ｐ．３１７−３４９）。ｄｂ／ｄｂマウスは生後４〜５週齢頃より肥満が始まり、体重の増加に伴い血糖値が上昇することから、肥満・高血糖により全身の臓器に対して炎症などの組織傷害が誘導されていると推測される。そこでｄｂ／ｄｂマウスにおいて、骨髄細胞からの組織機能細胞への分化が正常マウスよりも高頻度に観察されるか検討を行った。
ｄｂ／ｄｂマウスとしては、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（日本クレア社）の６週齢の雌の個体を用い、移植の前日にＸ線照射装置（日立メディコ社製）を用いて９．５Ｇｙの線量のＸ線を照射した。翌日、このマウスに対し、Ｃ５７ＢＬ／６系統で全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウスの８週齢の個体の骨髄から単離した細胞３×１０６個を尾静脈より移植し、骨髄細胞キメラマウスを作成した。
移植して４週間経過後、マウスを解剖して灌流固定をおこない、各臓器を摘出した。このとき、大腿骨より骨髄細胞を単離しＧＦＰ陽性細胞の生着率をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて解析したところ全骨髄細胞中９０％以上がＧＦＰ陽性の移植骨髄細胞に置き換わっていた。具体的には、まずネンブタール（大日本製薬社製）を腹腔内注射して麻酔し、開腹開胸して心臓を露出させ、２５Ｇのテルモ製翼付静注針を左心室に挿入した後、右心耳を切りＰＢＳを２０ｍＬ流し、全身を灌流させた。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下ＰＢＳと記載）を全量流した後、同様の操作により固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］を２０ｍＬ流し、固定をおこなった。
その後、固定したマウスから各臓器を摘出し、４℃で２時間固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］中に浸した後、ＰＢＳでリンスし、高ショ糖溶液［２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ、ＰＢＳ］中に浸して４℃で一晩置き、翌日、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＭＩＬＥＳ社製）で包埋し、ドライアイスで冷却したイソペンタンを用いて凍結した。
このようにして凍らせた組織を、クライオスタットを用いて薄さ１０μｍに切り、ＡＰＳコート付スライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に貼り付け、よく乾かして凍結切片を作成し、以下の種々の抗体による免疫染色を行った。
肝臓を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ］（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで２００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつアルブミン陽性であり、形態的にも肝実質細胞と同様の細胞が観察された。
膵臓を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ］（Ｓｉｇｍａ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで１０００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつインスリン陽性な膵β細胞が観察された。
心臓を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ  α−ａｃｔｉｎｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ］（Ｓｉｇｍａ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで４００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつアクチニン陽性であり、形態的にも心筋繊維と同様の繊維が確認された。
小腸を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、酵素液［１０μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＰＢＳ］に室温で２０分間浸した。ＰＢＳで２回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］に１０分間浸し、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ］（ＤＡＫＯ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで５０倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつサイトケラチン陽性であり、形態的にも上皮細胞と同様の細胞が観察された。
肺を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、酵素液［０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＰＢＳ］に室温で２分間浸した。直ちに停止液［２％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＰＢＳ］に浸し、ＰＢＳで２回洗った後、固定液［４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）、ＰＢＳ］に４分間浸した後、ブロッキング液［３％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ］に室温で３０分間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−ｋｅｒａｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ］（ＤＡＫＯ社製）を、１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで１００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつケラチン陽性であり、形態的にも肺上皮細胞と同様の細胞が観察された。
脳を摘出して作成した凍結切片の乗ったスライドグラスをＰＢＳで５分間浸すことを３回行って洗浄した後、ブロッキング液［１０％ブタ血清（ＤＡＫＯ社製）、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ、ＰＢＳ］に室温で１時間浸し、次に一次抗体［Ａｎｔｉ−Ｎｅｕ  Ｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ］（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を、１．５％ブタ血清および０．０１％Ｔｒｉｔｏｎを含むＰＢＳで１０００倍希釈した溶液と室温で１時間反応させた。ＰＢＳで４回洗った後、二次抗体［ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４−ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ］（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を１．５％ブタ血清を含むＰＢＳで８００倍希釈した溶液と、室温で１時間反応させた。更にＰＢＳで４回洗った後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を切片に滴下し、カバーガラスをかけて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ＧＦＰ陽性でかつＮｅｕ  Ｎ陽性な神経細胞が確認された。また、形態的な観察から小脳組織中のプルキンエ細胞において、プルキンエ細胞特有の樹状形態を有するＧＦＰ陽性細胞が確認された。
以上のように、Ｘ線照射されたＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスにＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞を移植する実験において、骨髄細胞が肝実質細胞、膵β細胞、心筋細胞、消化管上皮細胞、肺上皮細胞、ニューロン、プルキンエ細胞に新生したことを確認した。
Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（日本クレア社）、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍ（日本クレア社）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クルア社）の６週齢の雌の個体を用い、移植の前日にＸ線照射装置（日立メディコ社製）を用いてそれぞれ９．５Ｇｙ、１２Ｇｙ、９．５Ｇｙの線量のＸ線を照射した。Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍはｄｂ遺伝子のヘテロ変異マウスで、肥満・過食・高インスリン血症などの糖尿病症状を示さないため、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂのコントロールとして用いられる。翌日、このマウスに対し、Ｃ５７ＢＬ／６系統で全身の細胞にＧＦＰ遺伝子が組み込まれＧＦＰ蛋白質が発現しているマウスの８週齢の個体の骨髄から単離した細胞３×１０６個を尾静脈より移植し、骨髄細胞キメラマウスを作成した。
移植して４週間経過後、マウスを解剖して灌流固定をおこない、各臓器を摘出し包埋して凍結切片を作成した。このとき、大腿骨より骨髄細胞を単離しＧＦＰ陽性細胞の生着率をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて解析したところＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂにおいて全骨髄細胞中９０％以上、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍにおいて全骨髄細胞中９０％以上、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにおいて全骨髄細胞中６０〜８０％がＧＦＰ陽性の移植骨髄細胞に置換されていた。こうして作成した心臓、肝臓、膵臓の凍結切片（２０〜４０切片）に対し、それぞれ（１）に示したのと同様の方法で免疫染色を行い、骨髄細胞由来の心筋細胞、肝実質細胞、膵β細胞を判定した。表２に、解析した組織切片の面積に対して検出されたＧＦＰ陽性の心筋細胞、肝実質細胞、膵β細胞の数を解析組織面積あたりの検出頻度［ＧＦＰ陽性・組織機能細胞数／組織面積（ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）］として数値化した結果を示した。
2004101775.tif 000003
表２で示すように、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスではＧＦＰ陽性の心筋細胞、肝実質細胞、膵β細胞がＣ５７ＢＬ／６マウスよりも高頻度に検出されることが定量的に明らかとなった。この原因としては、心筋細胞、膵β細胞への分化についてはＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍでも同程度認められることから、遺伝子バックグラウンドの影響、つまり移植細胞とレシピエントの不一致による同種移植によるものと考えられた。一方、肝実質細胞への分化はＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍで平均値±標準偏差：０．０３２±０．０１５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、Ｃ５７ＢＬ／６で平均値±標準偏差：０．０５５±０．０２５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２とほぼ同程度であるのに対し、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂでは平均値±標準偏差：１．９±０．４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２と有意に増加している（Ｐ〈０．０１）ことから、肥満・糖尿病・高インスリン血症などによって引き起こされる肝臓の機能亢進および傷害が原因と考えられた。
以上のことから、Ｘ線照射されたＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスにＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄細胞を移稙する実験で、移植免疫系の不一致および肥満・糖尿病・高インスリン血症などによって引き起こされる組織機能の亢進や傷害によって骨髄細胞からの組織機能細胞への分化・生着が増加するという現象が見られた。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ＣＤ４５陰性およびＣＸＣＲ４陽性である幹細胞が提供される。また本発明により、該幹細胞を有効成分として含有する組織破壊を伴う疾患の予防及び／または治療薬が提供される。
【配列表フリーテキスト】  配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2004101775.tif 000004
2004101775.tif 000005
2004101775.tif 000006
2004101775.tif 000007
2004101775.tif 000008
2004101775.tif 000009
2004101775.tif 000010
2004101775.tif 000011
2004101775.tif 000012
2004101775.tif 000013
2004101775.tif 000014
2004101775.tif 000015
【国際調査報告】
2004101775.tif 000016
2004101775.tif 000017
2004101775.tif 000018
2004101775.tif 000019
2004101775.tif 000020
2004101775.tif 000021