(57)【要約】本発明は、目的の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織に分化し得る条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする軟骨の作製方法、及び目的の関節の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織に分化し得る条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする人工関節の作製方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織への分化誘導条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする軟骨の作製方法。
【請求項２】
目的の関節の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織への分化誘導条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする人工関節の作製方法。
【請求項３】
関節面が、細胞、細胞が産生するマトリックス又はこれらの組合せにより形成されるものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
担体が微細孔を有するものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
細胞が間葉系幹細胞又は軟骨細胞である請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
培養が、生体外かつ成長因子又は増殖因子の存在下により行われるものである請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、人工関節の作製方法に関する。具体的には、任意の曲面に適切な厚みを持つ細胞層をロードし、軟骨層を関節面全体に及んで修復するための基礎技術に関する。
【背景技術】  軟骨は、軟骨細胞と軟骨基質から構成される結合組織であり、関節骨は、十分に厚みのある軟骨により覆われている組織である。そして、関節は、スムーズな動きができるように軟骨によって支えられている。しかし、軟骨が一旦損傷や破壊を受けると、自然治癒することは極めて稀である。そのため従来、変形性関節症や、関節リウマチなどにより、関節としての機能が高度に低下した症例に対しては、金属やセラミックス、ポリエチレンからなる人工関節置換術が選択されてきた。この方法は、損傷した関節軟骨を切除し、金属やセラミックスやポリエチレンなどの人工物で関節面を覆うようにかぶせる手術法であり、世界中で広く普及し、現在でも主要な治療法である。また、長年にわたり素材の改良又はデザインの改良などで、１０年以上の長期にわたって有用性が確認されている。
しかし、金属やセラミックス、ポリエチレンは、生体にとって異物であり、また自己修復能力が望めない素材である。さらに素材に起因する様々な問題、例えば、摩擦、腐食疲労、人工関節と骨界面のゆるみ、沈み込み、感染などが生じる。実際に、人工関節が摩耗及び損傷し、再手術を余儀なくされている症例は数多くある。
従って、人工物を素材として利用する現在の人工関節を用いた治療法を代替する、あらたな治療法の開発が望まれていた。
近年、ＥＳ細胞や、自己由来の細胞をベースとした組織や器官の再生の研究が活発となっている。関節軟骨においても、部分欠損に関して様々な組織工学を利用した技術が開発されてきた。例えば、欠損部に自己由来の細胞を移植することにより、周囲の健常部からの再生因子の分泌を誘導し、欠損の治癒を期待する方法が開発された（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｅｐ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｎｅｅ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９９４  Ｏｃｔ  ６；３３１（１４）：８８９−９５）。しかし、この技術は欠損部を埋めるという方法に過ぎないため、広範囲の関節破壊に対する治療法として応用することは困難である。
一方、Ｖａｃａｎｔｉらによって、欠損した耳介や指の再生方法に関する研究が発表された（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈａｐｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｅａｒ．Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．１９９７  Ａｕｇ；１００（２）：２９７−３０２）。この方法は、予め耳や指の形に成型したポリマーなどの担体の上に患者の細胞を付着させ、これをヌードマウスの皮下に移植して、マウスから供給される栄養を用いてコラーゲンなどの細胞外マトリックスの産生を促し、移植組織の形状を得るという方法である。ヌードマウスは免疫系が欠損したマウスであり、患者由来の細胞をマウス体内で増殖させた後、患者に再移植しても、拒絶反応がないという特徴を有するため利用価値が高い。
しかし、マウスの大きさには限界があり、そのため、この方法で作製可能な組織の大きさはマウスの大きさに依存する。また、この方法には宗教上の、あるいは動物愛護の観点から問題が生じる。さらに、動物に対する拒否感、狂牛病に代表される感染症のリスクなどを常に考慮しなければならない。マウスより大型の動物、例えばブタの免疫能を欠損させ、再生医療に応用する試みもあるが、この場合においても、他種動物の体内を経た組織をヒトに移植する行為に対する嫌悪感や未知の感染症のリスクなどの問題点に何らの解決を見出していない。
また、ゲルで鋳型を作り、鋳型の周囲に細胞懸濁液を付着した上で、ポリマーなどに細胞を付着させる方法が開示されている（特開２００３−１４４１３９号公報）。この方法は、細胞懸濁液の付着を目的とするものであるため、実際には膜状のものが作製されるに過ぎず、関節軟骨のように厚みをもった組織を作製することは困難である。
このため、関節軟骨相当部分に厚みをもたせるため、あらかじめ分解性ポリマーで作製した、綿状の足場に軟骨細胞を付着させて厚みを持たせる方法が発表されている。しかし、この方法によれば関節軟骨部分にポリマーが残存するため、分解される過程において有毒な物質に変わり、細胞に悪影響を与える可能性が危惧される（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｃｅｌｌ−ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９８  Ａｐｒ  １０；２４０（１）：５８−６５．）。
他方、コラーゲンゲル内に細胞を埋没させて軟骨再生を行なう試みがなされているが、コラーゲンは牛など他の動物由来である点、移植母床との親和性に関して問題があると考えられる（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｌｉｋｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｄｅ  ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｎｅｅ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ｂｒ．２００２  Ｍａｙ；８４（４）：５７１−８．））。
【発明の開示】
上記のように、これまでの金属やセラミックス、ポリエチレンによる人工関節を代替し、広範囲の関節破壊に有効であり、さらに他種動物を用いることへの嫌悪感や未知の感染症のリスクを払拭できる、新たな人工関節の開発が望まれていた。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、任意の担体の表面に細胞塊を付着させて所定の条件で培養することにより、目的とする軟骨が形成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、目的の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織への分化誘導条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする軟骨の作製方法である。さらに、本発明は、目的の関節の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、軟骨組織への分化誘導条件下で前記細胞塊を培養することを特徴とする人工関節の作製方法である。
関節面としては、細胞、細胞が産生するマトリックス又はこれらの組合せにより形成されるものが挙げられる。
本発明の方法において、担体としてはトリリン酸カルシウム製のものを例示することができ、その表面が微細孔を有するものであることが好ましい。また、細胞としては間葉系幹細胞又は軟骨細胞が挙げられる。上記培養は、例えば生体外かつ成長因子又は増殖因子の存在下により行われる。
【図面の簡単な説明】  図１は、細胞だけからなる球状の関節面を示す図である。
図２は、ウサギ大腿骨遠位部の３次元データをもとに設計した担体の図である。
図３は、担体に細胞塊を付着させたことを示す図である。
図４は、担体に細胞塊を再度付着させたことを示す図である。
図５は、ウサギ大腿骨遠位関節面の全体像を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、細胞層が必要十分な厚みをもち、任意の曲面に付与することが可能である自己細胞由来の軟骨及び人工関節を作製する方法を提供するものであり、予め目的の形状に加工した担体の表面に細胞塊を付着させ、これを軟骨組織に分化し得る条件下で培養することを特徴とする。これにより、細胞塊は担体の形状にそって細胞塊同士が融合し関節面が再生され、人工関節として機能する。さらに、成長因子の添加や力学的負荷により、細胞外マトリックスの産生が増進され、強度の面においても理想的な関節軟骨を生体外で作製させることを特徴とするものである。
１．細胞
培養の対象となる細胞は、幹細胞（ＥＳ細胞、臍帯血由来細胞、未分化間葉系幹細胞等）などの未分化細胞又はその分化型細胞である。特に、未分化間葉系幹細胞が好ましい。
骨芽細胞、軟骨細胞は未分化間葉系幹細胞から容易に分化誘導することが可能なため、これらの分化誘導した細胞（関節軟骨細胞、骨細胞等）も使用することができる。また、成体間葉系幹細胞を使用することもできる。
さらに、幹細胞は、複数の種類の細胞、例えば骨細胞と軟骨細胞とを組み合わせて任意の部位に混合して培養することができる。例えば、上層が軟骨細胞から作った細胞塊だけからなる層、下層が骨細胞由来の細胞塊のように２層に組み合わせることができる。また、大腿骨の場合は、関節部分は軟骨系細胞塊を接着させ、骨の部分は骨系の細胞塊を接着させることができる。このような混合培養は、関節面を含む骨全体の再生に応用することが可能である。
上記細胞は、例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシなどの実験動物又は患者の骨髄から、Ｄｅｘｔｅｒ法、磁気ビーズ法、セルソーティング法などの公知の手法により採取することができる。
ところで、細胞には、浮遊系細胞と足場依存性細胞とに大きく分類され、前者には血液系や免疫系の細胞が属し、後者には皮膚や骨などの細胞が属する。皮膚や骨などの細胞は、培養液中で浮いている状態では死んでしまうため、ガラスなどのシャーレに付着することで増殖する。このため、テフロン（登録商標）中に細胞を一カ所に集めるようにすると、細胞は足場を求めて、お互いに接着し合い、細胞凝集塊、すなわちスフェロイドが形成される。さらに、スフェロイド同士が接着・融合すると大きな形状のものができる。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ第三版に記載されいているように、酵素処理などでばらばらにした細胞は、自然に凝集することが知られており、この現象はウニなどの下等動物から哺乳類の細胞でもみられることが知られている。この自然凝集は、カドヘリンを含むＣｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＡＭ）という細胞外接着因子によって引き起こされており、生物の発生初期における四肢の形成の際におこる間葉系幹細胞凝集とほぼ同様の現象が、成熟個体でも再現されていると考えられる（Ｇｅｒｉｓｃｈ，Ｇ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４：２４３−２７０．１９８０．；Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１４３：１２７−１４２．１９８３．；Ｍｏｓｃｏｎａ，Ａ．Ａ．；Ｈａｕｓｍａｎ，Ｒ．Ｅ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｊ．Ｗ．Ｌａｓｈ，Ｍ．Ｍ．Ｂｕｒｇｅｒ，ｅｄｓ．），Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．１７３−１８５．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９７７．；Ｒｏｔｈ，Ｓ．；Ｗｅｓｔｏｎ，Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５８：９７４−９８０．１９６７．）。
さらに近年、間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化の際には、カドヘリンを介した細胞同士の接着がスイッチとなり、コラーゲンなどの発現が開始されることを示唆する報告がなされた（Ｙｏｏｎ  ＹＭ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２；８７（３）：３４２−５９）。
そこで本発明においては、一旦スフェロイドにしてから所定の形状に形成することが好ましい。本発明においては、上記間葉系幹細胞などを単層培養した後、撥水性又は細胞非接着性の丸底マルチウェル又はＵ字型ウェルに移してインキュベートする。その結果、細胞は自然に凝集して細胞塊（細胞凝集塊）を生ずる。細胞塊を生ずるまでのインキュベート時間は、６〜４８時間、好ましくは２４〜４８時間である。細胞塊の作成方法は、上記の方法のほか、旋回している溶液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れ、遠心分離器で沈殿させる方法、アルギネートビーズ法などが採用され、特に限定されるものではない。均一の細胞塊を大量に処理できる点で、撥水性や細胞非接着性のマルチウェルに細胞懸濁液を入れる方法が、効率がよい点で好ましい。
上記スフェロイドを形成することにより、細胞は細胞周期における静止期に移行し、タンパク質の産生が増加すると考えられる。なお、細胞を静止期に誘導してから分化させることを「細胞が増殖サイクルから外れて、細胞分化へ移行する」という。
２．細胞塊の培養
次に、あらかじめ任意の形状に成形しておいた担体に上記の通り作製した細胞塊を付着させ、培養する。細胞塊の個数は特に限定されるものではなく、任意に設定することができる。さらに、必要であれば、付着後にさらに細胞塊を追加して付着させても、既存の細胞塊とも融合する。
本発明において、細胞塊を付着させる担体は、ヒトやウサギの関節構造に応じて任意に形状を設計することができる。さらに、耳介、鼻など、立体的な形状を得る目的の場合は、あらかじめ３次元データをもとにした鋳型を設計して担体を作製することが可能である。
「担体」とは、細胞塊が接着できる素材であって人工関節の全体又は一部を構成し、細胞塊の支持体として機能するものを意味する。この担体は、生体適合性の素材があり、生体内で吸収、自己組織に置換されるものが好ましい。また、担体の表面は微細孔を有していることが好ましい。このような担体として、例えばトリリン酸カルシウム製の担体が挙げられ、高分子の乳酸ポリマーなどの生体分解性のポリマーも適用可能である。
なお、担体のうち細胞塊を付着させる必要がない領域は、撥水性や細胞非接着性の素材でマスキングすることも可能である。
担体上に付着させた細胞塊同士は、生体が本来具備している創傷治癒とほぼ同等の機序に基づき、それぞれが融合し、結果的に目的の大きさ及び細胞構造を有する構造体を形成する。
本発明では立体構造を有する担体への細胞塊の付着を目的とするため、縦方向（高さ又は厚み）を長くする必要がある。その結果、細胞は液面から深いところに存在することとなり、ガス交換の効率が低下することになる。
そこで本発明では、培養液を、細胞塊の一部が気相に若干ふれる程度（気相にふれても乾燥しない程度）の量に調節することとした。そして、担体の微細孔から培養液が出入りして、細胞塊に届くようにした。「微細孔」とは、細胞塊は通過せず、培養液が通過できる程度の大きさの孔を意味する（直径１０〜５００μｍ）。微細孔は、担体自体の成形過程で生じる場合もあるが、担体を細い針で突き刺して形成することも可能である。
培養液は自由に担体の微細孔を通過できるため、培養液を常に細胞に供給することができ、細胞塊は分化・成熟・細胞塊同士の融合、成熟を満足に行うことができる。なお、この場合の成熟とは、細胞が産生する各種コラーゲンやプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスの増加を指しており、本来、生体内の細胞は豊富な細胞外マトリックスに囲まれていることが多い。
培養液の量は、細胞が増殖・分化することができる限り特に限定されるものではないが、１個の細胞塊あたり、全量で少なくとも０．５ｍｌの培養液が必要である。
培養に用いられる培養液としては、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地、血清無添加ＤＭＥＭハイグルコース培養液などが挙げられる。
培養は、細胞塊が軟骨に分化し誘導し得る条件下で行なわれる。細胞塊から軟骨への分化誘導は、成長因子又は細胞増殖因子の存在下で培養すればよい。成長因子又は細胞増殖因子としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ：Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）などを用いることができる。
上記因子は、増殖させる大きさ、細胞外マトリックスの産生量に応じて、単独で、又は適宜組み合わせて種類や量を調整して添加する。例えば、間葉系幹細胞から軟骨細胞に分化するにはＴＧＦ−βを添加するが、さらに、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＩＧＦなどを追加することにより、よりコラーゲンの豊富な軟骨様組織を得ることができる。
ここで、細胞に何らかの刺激が加わると、一般にｍＲＮＡ量が増加し、その後タンパク質の産生が増加することが知られている。この点に着目し、本発明において、培養条件（培養時間、その他の条件）を変え、細胞の成熟度を調整した。「成熟度」とは、細胞塊を骨や関節等の欠損部に移植するために適した度合いを意味する。その移植時期を、（１）ｍＲＮＡが増加した時点で移植するか、（２）タンパク質（この場合、コラーゲンなどの細胞外マトリックス）が増加途中の時点で移植するか、あるいは（３）タンパク質が十分量産生された（＝成熟）時点で移植するかを検討することが可能である。
人工関節型の場合、タンパク質が十分産生された時期に移植を行うのが望ましく、培養期間は１ヶ月以上が好ましい。このため、長期にわたって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで変性しない担体を用いることが重要である。
一般に、ＲＮＡ産生は誘導培養開始２週間でピークになり、その後コラーゲン産生の上昇が見られ、５〜６週で安定する。
さらに、各種成長因子又は増殖因子を添加することにより、細胞外マトリックスの量を調整することが可能である。また、静水圧やせん断弾力などの機械的刺激、超音波や衝撃波などを加えることにより、細胞外マトリックスを増やすことができる。従って、上記成長因子や静水圧や超音波などの機械的刺激を加えることで、ＲＮＡ産生をピークにする時期を早めることができる。
成長因子又は細胞増殖因子としては、前記と同様、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦなどを用いることができる。
このように、培養条件や培養期間を調節することにより、成熟度を任意に調節することができる。
本発明の方法によれば、従来のヌードマウスの皮下に一時的に移植して再生組織を熟成させる方法とは異なり、動物を必要としない。そのため、マウスの体の大きさに制限されることなく、任意の大きさの形状が得られる。
患者本人の未分化間葉系幹細胞を用いることにより、骨、軟骨等の自己由来細胞を用いた組織を再生することが可能である。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例は、ヒト股関節、大腿骨頭を模した実施例である。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞を単層培養した。最終的に間葉系幹細胞を１５ｃｍディッシュ一枚あたり１．０ｘ１０６得た。この細胞をトリプシン処理して細胞懸濁液にし、住友ベークライト社製スフェロイドプレートにそれぞれ１．０ｘ１０５個の細胞が入るように播種した。その後３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養を行い、翌日には直径が平均０．５ｍｍの細胞塊が１プレートあたり９６個得られた。この細胞塊を、半球状に加工したトリリン酸カルシウムの上に付着させた。その後、ＴＧＦ−βを０．０１μｇ／ｍｌ量添加し、４８時間培養することにより、細胞塊を軟骨に分化させた。この曲面に付着した細胞塊同士は、２４から４８時間程度で融合し、細胞だけからなる球状の関節面が得られた（図１）。図１において、ＢはＡの拡大図である。
【実施例２】  本実施例は、ウサギ大腿骨遠位関節面の作製例である。
ウサギ関節軟骨切片にコラゲナーゼ処理を行い、得られた軟骨細胞の単層培養を行った。最終的に軟骨細胞を１５ｃｍディッシュ一枚あたり１．０ｘ１０６個得た。この細胞をトリプシン処理して細胞懸濁液にし、住友ベークライト社製スフェロイドプレートにそれぞれ１．０ｘ１０５個の細胞が入るように播種した。その後３７℃、５％二酸化炭素の条件下で培養を行い、翌日には直径が平均０．５ｍｍの細胞塊が１プレートあたり９６個得られた。
一方、ウサギ大腿骨遠位関節面の形状を模して予め３次元データを作成し（図２）、この形状のトリリン酸カルシウム製担体を作製した。
上記細胞塊をトリリン酸カルシウムの上に付着させた。このトリリン酸カルシウムの大腿骨遠位関節面には微細孔が付与されている。その後、ＴＧＦ−βを０．０１μｇ／ｍｌ量添加し、４８時間培養することにより、細胞塊を軟骨に分化させた。この曲面に付着した細胞塊同士は、２４から４８時間程度で融合し、細胞だけからなる関節面が得られた（図３）。図３において、やや褐色の部分が細胞塊を付着させた箇所である。さらに翌週（７日後）に、このようにして得られた関節面（図３）の上に３２０個の細胞塊を再度付着させた。その結果、新たに付着させた細胞塊は、既に付着している細胞塊と融合してスムーズな曲面を形成した（図４Ａ）。
さらに上記関節面を３２０個の細胞塊を付着させた結果、最終的に図４Ｂに示すように目的の関節を作製することができた。図４Ｂにおいて、茶色の部分が細胞塊を付着させた領域である。周囲の白色部分が、余分な部分に細胞塊が付着しないようマスクとして用いたパラフィン樹脂である。
図５に、ウサギ大腿骨遠位関節面の全体像を示す。
図５Ａはコンピュータに入力した３次元データをもとに作成した、トリリン酸カルシウムからなるウサギ大腿骨遠位関節面型の担体（細胞付着前）である。
図５Ｂ、図５Ｃは細胞塊付着翌日の概観である。軟骨相当部分にのみ細胞層が形成されているのがわかる。図５Ｄは細胞付着部（図５Ｂ、Ｃ）の拡大図である。若干細胞塊の境界が判明できる程度に融合している。
【産業上の利用可能性】  本発明により、軟骨及び人工関節の作製方法が提供される。本発明により提供される技術は、細胞凝集塊を多量に作成し、それぞれを融合する事で、ポリマーなどの担体を利用する必要がなく、自己由来の細胞単独で関節軟骨層を作製することが可能である。更には、関節を成熟させるための動物への移植を必要としないため、他種動物を経由することなく、任意の形状の軟骨層を作製することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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