(57)【要約】本発明者らは、２Ｄ７抗体の抗原を同定することを目的として、２Ｄ７抗原のクローニングを行った。その結果、２Ｄ７抗原はＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子であることが示唆された。本発明者らは、この知見に基づき、２Ｄ７抗体が細胞死誘導活性を有するか否かを検討した。その結果、２Ｄ７抗体をさらに別の抗体でクロスリンクすることで核の断片化が観察され、細胞死が誘導されることが分かった。さらに、２Ｄ７抗体のＤｉａｂｏｄｙは、さらに別の抗体を添加しなくても非常に強力な細胞死誘導活性を有することが判明した。以上の結果は、ＨＬＡを認識する抗体の低分子化抗体が細胞死誘導剤として利用できることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を認識する低分子化抗体。
【請求項２】
ＨＬＡがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉである、請求項１に記載の低分子化抗体。
【請求項３】
ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩがＨＬＡ−Ａである、請求項２に記載の低分子化抗体。
【請求項４】
２Ｄ７抗体の低分子化抗体。
【請求項５】
低分子化抗体がＤｉａｂｏｄｙである請求項１〜４のいずれかに記載の低分子化抗体。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の低分子化抗体。
（ａ）  配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｂ）  配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ａ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
（ｃ）  配列番号：２のＣＤＲおよび配列番号：４のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｄ）  配列番号：２のＣＤＲおよび配列番号：４のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
【請求項７】
ＨＬＡを認識する抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
【請求項８】
ＨＬＡがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩがＨＬＡ−Ａである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２Ｄ７抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
【請求項１１】
低分子化がＤｉａｂｏｄｙ化である、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
活性が細胞死誘導活性又は細胞増殖抑制活性である、請求項７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤。
【請求項１４】
Ｂ細胞またはＴ細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１５】
Ｂ細胞またはＴ細胞が、活性化Ｂ細胞または活性化Ｔ細胞である、請求項１４に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
【請求項１８】
腫瘍が血液腫瘍である請求項１７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれかに記載の低分子化抗体、請求項７〜１２のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾患治療剤。
【請求項２０】
抗体がＤｉａｂｏｄｙである請求項１３〜１５のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
【請求項２１】
抗体がＤｉａｂｏｄｙである請求項１６に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項２２】
抗体がＤｉａｂｏｄｙである請求項１７または１８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２３】
抗体がＤｉａｂｏｄｙである請求項１９に記載の自己免疫疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＨＬＡを認識する抗体の低分子化抗体に関する。
【背景技術】  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗原は、３つのドメイン（α１、α２、α３）からなる４５ＫＤのα鎖と、１２ＫＤのβ２ミクログロブリンのヘテロダイマーによって形成される。ＨＬＡ分子の主な役割は、細胞の中で作られる８〜１０程度のアミノ酸でできた抗原ペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することであり、これによって誘導される免疫応答や免疫寛容に非常に重要な役割を担っている。
また、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡ抗原の抗体によるライゲーションで、細胞増殖抑制や細胞死誘導効果がリンパ球細胞において観察されており、ＨＬＡ分子のシグナル伝達分子としての可能性も示唆されている。
すなわち、例えばヒトＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡのα１ドメインに対する抗体Ｂ９．１２．１、α２ドメインに対する抗体Ｗ６／３２、α３ドメインに対する抗体ＴＰ２５．９９，Ａ１．４は、活性化リンパ球に対して細胞増殖を抑制するとの報告がある（非特許文献１，２）。また、α１ドメインに対する二種類の抗体ＭｏＡｂ９０，ＹＴＨ８６２は、活性化リンパ球に対してアポトーシスを誘導することが報告されている（非特許文献２，３，４）。この２つの抗体によって誘導されるアポトーシスはカスパーゼを介した反応であることが明らかにされており（非特許文献４）、このことからリンパ細胞で発現するＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡ抗原は、アポトーシスの信号伝達にも関与していると推測されている。
さらに、ヒトＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡのα３ドメインに対する抗体５Ｈ７（非特許文献５）、マウスＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡのα２ドメインに対する抗体ＲＥ２（非特許文献６）も、活性化リンパ球などに細胞死を誘導することが報告されている。しかしながら前出のアポトーシス誘導抗体ＭｏＡｂ９０やＹＴＨ８６２とは違い、これらの抗体によって誘導される細胞死は、いずれもカスパーゼを介さないことが示されている。このことから、５Ｈ７やＲＥ２による細胞死は、従来知られているアポトーシスの機構とはまったく異なるタイプの細胞死であると推測されている。
以上のように、抗ＨＬＡ抗体による細胞増殖抑制、細胞死誘導作用に関する報告はこれまで複数なされている。ただし、ここで利用されている抗体の分子形態はいずれもＩｇＧ抗体、もしくはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂであり、またＦ（ａｂ’）２やＦａｂのように抗体を低分子化することで、細胞死誘導活性が上昇したとの知見は今のところない。
一方２Ｄ７抗体は、ヒトミエローマ細胞をＢａｌｂ／ｃマウスに免疫して得たマウスモノクローナル抗体である（非特許文献７）。これまで２Ｄ７抗体が、種々のリンパ系腫瘍細胞の細胞表面に高い特性を持って結合することは確認されていたが、２Ｄ７抗体が認識する抗原については同定されてはいなかった。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
〔非特許文献１〕  Ｆａｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１３４７−１３５８（１９９８）
〔非特許文献２〕  Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：３６２９−３６３９（１９９７）
〔非特許文献３〕  Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０：７２６−７３５（１９９７）
〔非特許文献４〕  Ｇｅｎｅｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５０６０−５０６６（１９９８）
〔非特許文献５〕  Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２１５６−２１６４（１９９７）
〔非特許文献６〕  Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２００７−２０１５（１９９５）
〔非特許文献７〕  Ｇｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８４：１９２２（１９９４）
【発明の開示】
本発明の第一の目的は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡを認識する抗体の低分子化抗体を提供することにある。本発明のさらなる目的は、この低分子化抗体を利用した新たな腫瘍または自己免疫疾患の治療剤を提供することにある。
本発明者らは、２Ｄ７抗体の抗原を同定することを目的として、まず、２Ｄ７抗原発現細胞ＲＰＭＩ８２２６より精製したｍＲＮＡから、ランダムヘキサマーによりｃＤＮＡを合成した。これをレトロウイルスベクターｐＭＸに挿入し、レトロウイルス発現ライブラリーを作製した。該レトロウイルス発現ライブラリーをＢＯＳＣ２３細胞にトランスフェクトすることでレトロウイルスにパッケージングした。その後得られたウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させ、２Ｄ７抗体で染色した後、ＦＡＣＳにより発現解析を行うことで、２Ｄ７抗原のスクリーニングを行った。さらに、２Ｄ７抗原を発現しているＲＰＭＩ８２２６細胞、および、Ｕ２６６細胞によりｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調整し、免疫沈降法により２Ｄ７抗原の同定を行った。これらの検討の結果、２Ｄ７抗原はＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子であることが判明した。
２Ｄ７抗体が認識する分子がＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＡであったことから、本発明者らは、２Ｄ７抗体が細胞死誘導活性を有するか否かを検討した。具体的には、Ｊｕｒｋａｔ細胞に２Ｄ７存在下あるいは非存在下で、さらに抗マウスＩｇＧ抗体を加え培養を行い、４８時間後、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色し、死細胞に特徴的な細胞核の断片化が認められるか観察した。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、２Ｄ７抗体単独ではほとんど細胞死誘導活性が検出されなかったが、さらに抗マウスＩｇＧ抗体でクロスリンクすることで核の断片化が観察され、細胞死が誘導されることが分かった。
このように２Ｄ７抗体による細胞死誘導には抗マウスＩｇＧ抗体によるクロスリンクが必要であるため、腫瘍または自己免疫疾患に対する２Ｄ７抗体の臨床応用は難しい。そこで、本発明者らは、細胞死誘導に対する２Ｄ７抗体の低分子化の効果を検討した。具体的には、ハイブリドーマより２Ｄ７抗体の可変領域をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子改変技術により２Ｄ７抗体のＤｉａｂｏｄｙ化を行い、細胞死誘導活性に対する効果を検討した。その結果、驚くべきことに、Ｄｉａｂｏｄｙ化した２Ｄ７抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体によるクロスリンクを行わなくても、非常に短時間かつ低い用量で強力な細胞死誘導活性を示した。また、該Ｄｉａｂｏｄｙは、正常末梢血由来リンパ球や、付着細胞にはほとんど作用せず、各種ミエローマ細胞やＴ細胞白血病細胞株、活性化リンパ球に対してのみ特異的に細胞死を誘導した。以上の結果は、ＨＬＡを認識する抗体の低分子化抗体が細胞死誘導剤として利用できることを示している。
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２３〕を提供するものである。
〔１〕  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を認識する低分子化抗体。
〔２〕  ＨＬＡがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉである、〔１〕に記載の低分子化抗体。
〔３〕  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩがＨＬＡ−Ａである、〔２〕に記載の低分子化抗体。
〔４〕  ２Ｄ７抗体の低分子化抗体。
〔５〕  低分子化抗体がＤｉａｂｏｄｙである〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の低分子化抗体。
〔６〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の低分子化抗体。
（ａ）  配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｂ）  配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ａ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
（ｃ）  配列番号：２のＣＤＲおよび配列番号：４のＣＤＲのアミノ酸配列を有する低分子化抗体。
（ｄ）  配列番号：２のＣＤＲおよび配列番号：４のＣＤＲのアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する低分子化抗体であって、（ｃ）に記載の低分子化抗体と機能的に同等な低分子化抗体。
〔７〕  ＨＬＡを認識する抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
〔８〕  ＨＬＡがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉである、〔７〕に記載の方法。
〔９〕  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩがＨＬＡ−Ａである、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕  ２Ｄ７抗体を低分子化することによって、活性が上昇した抗体を製造する方法。
〔１１〕  低分子化がＤｉａｂｏｄｙ化である、〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕  活性が細胞死誘導活性又は細胞増殖抑制活性である、〔７〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の低分子化抗体、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤。
〔１４〕  Ｂ細胞またはＴ細胞に対する細胞死誘導であることを特徴とする、〔１３〕に記載の細胞死誘導剤。
〔１５〕  Ｂ細胞またはＴ細胞が、活性化Ｂ細胞または活性化Ｔ細胞である、〔１４〕に記載の細胞死誘導剤。
〔１６〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の低分子化抗体、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
〔１７〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の低分子化抗体、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
〔１８〕  腫瘍が血液腫瘍である〔１７〕に記載の抗腫瘍剤。
〔１９〕  〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の低分子化抗体、〔７〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法によって製造される低分子化抗体、または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、自己免疫疾患治療剤。
〔２０〕  抗体がＤｉａｂｏｄｙである〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載の細胞死誘導剤。
〔２１〕  抗体がＤｉａｂｏｄｙである〔１６〕に記載の細胞増殖抑制剤。
〔２２〕  抗体がＤｉａｂｏｄｙである〔１７〕または〔１８〕に記載の抗腫瘍剤。
〔２３〕  抗体がＤｉａｂｏｄｙである〔１９〕に記載の自己免疫疾患治療剤。
本発明は、ＨＬＡを認識する低分子化抗体を提供する。本発明における低分子化抗体は、活性が上昇している点で有用である。ここで、活性とは、抗体が抗原に結合することにより生じる生物学的作用をいう。具体的な例としては、細胞死誘導作用、アポトーシス誘導作用、細胞増殖抑制作用、細胞分化抑制作用、細胞分裂抑制作用、細胞増殖誘導作用、細胞分化誘導作用、細胞分裂誘導作用、細胞周期調節作用などを挙げることができるが、好ましくは細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用である。
細胞死誘導作用、細胞増殖抑制作用などの上記作用の対象となる細胞は特に限定されないが、血球系細胞や浮遊細胞が好ましい。血球系細胞の具体的な例としては、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、単球（好ましくは活性化した末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ））、ミエローマ細胞などを挙げることができるが、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞）、ミエローマ細胞が好ましく、Ｔ細胞またはＢ細胞（特に活性化したＢ細胞または活性化したＴ細胞）が最も好ましい。浮遊細胞は、細胞を培養した際、細胞がガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着することなく、浮遊状で増殖する細胞である。これに対し、接着細胞（付着細胞）とは、細胞を培養した際、ガラスやプラスチックなどの培養器の表面に付着する細胞である。
本発明においては、上記ＨＬＡを認識する低分子化抗体を投与することにより、例えば、血液腫瘍（造血器腫瘍）などの腫瘍（具体的な例として、白血病、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、形質細胞異常症（骨髄腫、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症）、骨髄増殖性疾患（真性赤血球増加症、本態性血小板血症、特発性骨髄繊維症）など）や自己免疫疾患（具体的な例として、リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性水疱症、自己免疫性副腎皮質炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性レセプター病、自己免疫不妊、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、バセドウ病、若年性糖尿病、アジソン病、重症筋無力症、水晶体性ブドウ膜炎、乾癬、ベーチェット病など）のような疾患の治療、予防などをおこなうことが可能である。
本発明において、ＨＬＡとは、ヒト白血球抗原を意味する。ＨＬＡ分子はｃｌａｓｓ  Ｉとｃｌａｓｓ  ＩＩに分類され、ｃｌａｓｓ  ＩとしてはＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊなどが知られており、ｃｌａｓｓ  ＩＩとしてはＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、ＤＰなどが知られている。本発明の抗体が認識する抗原はＨＬＡ分子であれば特に制限されないが、好ましくはｃｌａｓｓ  Ｉに分類される分子であり、より好ましくはＨＬＡ−Ａである。
本発明において低分子化抗体とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはＶＨとＶＬの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）、などを挙げることができるが、好ましくはｓｃＦｖ（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３、Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｖｏｌ．１１３，Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，（１９９４））である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体のＶＨを２つ以上及びＶＬを２つ以上含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカー等を介して間接的に結合した抗体である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、また、共有結合と非共有結合の両方でよい。さらに好ましい低分子化抗体は、ＶＨとＶＬが非共有結合により結合して形成されるＶＨ−ＶＬ対を２つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体中の一方のＶＨ−ＶＬ対と他方のＶＨ−ＶＬ対との間の距離が、全長抗体における距離よりも短くなる抗体が好ましい。
本発明において特に好ましい低分子化抗体はＤｉａｂｏｄｙである。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でよいが、好ましくは非共有結合である。
また、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士をリンカーなどで結合して、一本鎖Ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＤｉａｂｏｄｙ）とすることも可能である。その際、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士を２０アミノ酸程度の長いリンカーを用いて結合すると、同一鎖上に存在するＤｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成する。
Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメントは、ＶＬとＶＨを結合したもの、ＶＬとＶＬを結合したもの、ＶＨとＶＨを結合したもの等を挙げることができるが、好ましくはＶＨとＶＬを結合したものである。Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカーは特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ましい。そのようなリンカーの長さは当業者が適宜決定することができるが、通常２〜１４アミノ酸、好ましくは３〜９アミノ酸、特に好ましくは４〜６アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため、同一鎖上のＶＬとＶＨの間で非共有結合がおこらず、単鎖Ｖ領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。さらに、Ｄｉａｂｏｄｙ作製と同じ原理で、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメントを３つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。
本発明におけるＤｉａｂｏｄｙとしては、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙまたは配列番号：６に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙであって、配列番号：６に記載の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと機能的に同等なＤｉａｂｏｄｙや、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙまたは配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙであって、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと機能的に同等なＤｉａｂｏｄｙを例示できるが、これらに限定されるものではない。
ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤｉａｂｏｄｙが、配列番号：６に記載の配列を有するＤｉａｂｏｄｙ、または配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙと同等の活性（例えば、ＨＬＡ−Ａへの結合活性、細胞死誘導活性など）を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。
また、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するＤｉａｂｏｄｙまたは、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有するＤｉａｂｏｄｙを、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的としてヒト化、キメラ化してもよい。
配列番号：２に記載されているアミノ酸配列で、１番目〜１３４番目が可変領域に相当し、５０番目〜５４番目がＣＤＲ１、６９番目〜８５番目がＣＤＲ２、１１８番目〜１３４番目がＣＤＲ３に相当する。配列番号：４に記載されているアミノ酸配列で、１番目〜１２８番目が可変領域に相当し、４６番目〜５５番目がＣＤＲ１、７１番目〜７７番目がＣＤＲ２、１１０番目〜１２８番目がＣＤＲ３に相当する。
本発明においてＨＬＡを認識する低分子化抗体は、ＨＬＡに特異的に結合し、生物学的作用を有していれば特に制限されない。本発明の低分子化抗体は、当業者に公知の方法により作製することが可能である。例えば、実施例に記載されているように、ＨＬＡを認識する抗体の配列（特に可変領域の配列や相補鎖決定領域（ＣＤＲ）の配列）を基に、当業者に公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することが可能である。
ＨＬＡを認識する抗体の配列は、既に公知の抗体の配列を用いることが可能であり、又、ＨＬＡを抗原として、当業者に公知の方法により抗ＨＬＡ抗体を作製し、その抗体の配列を取得して用いることも可能である。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。ＨＬＡタンパク質若しくはその断片を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングする。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（ＷＯ９８／４６７７７など）等に準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。その後、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの配列を公知の方法により解読すればよい。
ＨＬＡを認識する抗体は、ＨＬＡと結合する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。又、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体なども使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体等であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
これらキメラ抗体やヒト化抗体などについては、低分子化した後にキメラ化やヒト化等を行ってもよいし、キメラ化やヒト化等を行った後に低分子化を行ってもよい。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
本発明において、ＨＬＡを認識する抗体の好ましい例として２Ｄ７抗体が挙げられる。２Ｄ７抗体は、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有する抗体が例示できるが、これに限定されるものではなく、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異（置換、欠失、挿入、および／または付加）したアミノ酸配列を有する抗体であって、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）および配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有する抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の２Ｄ７抗体に含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が、配列番号：２のＣＤＲ（又は可変領域）及び配列番号：４のＣＤＲ（又は可変領域）の配列を有する抗体と同等の活性（例えば、ＨＬＡ−Ａへの結合活性、細胞死誘導活性、など）を有することを意味する。
変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。また、抗体の定常領域などのアミノ酸配列は当業者に公知である。
また、２Ｄ７抗体を当業者に公知の方法でキメラ化、ヒト化などをすることも可能であり、このようなキメラ抗体、ヒト化等された抗体も本発明の２Ｄ７抗体に含まれる。
本発明の抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
本発明は、本発明の抗体をコードするＤＮＡを包含する。又、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、抗原への結合能及び活性を有する抗体をコードするＤＮＡを包含する。ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）は当業者に公知であり、ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のＤＮＡは、本発明の抗体のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の抗体をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の抗体をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体のＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明の抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＮ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の抗体を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的のＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
本発明において、抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
本発明において、本発明の抗体が浮遊細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、実施例と同様にＪｕｒｋａｔ細胞又はＡＲＨ７７細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定することができる。又、抗体が接着細胞に対して細胞死を誘導するか否かは、実施例と同様にＨｅＬａ細胞に対して細胞死を誘導するか否かにより判定することができる。
また、本発明は、本発明の低分子化抗体または２Ｄ７抗体を有効成分として含有する、細胞死誘導剤または細胞増殖抑制剤を提供する。本発明の低分子化抗体または２Ｄ７抗体の細胞死誘導活性は、活性化されたＴ細胞またはＢ細胞で特に効果が大きいと考えられるので、癌などの腫瘍（特に血液腫瘍）や自己免疫疾患の治療や予防に特に有効であると考えられる。このように本発明は、本発明の低分子化抗体または２Ｄ７抗体を用いた、癌などの腫瘍（特に血液腫瘍）や自己免疫疾患の治療方法や予防方法も提供するものである。低分子化されていない２Ｄ７抗体を有効成分として用いる場合には、抗ＩｇＧ抗体などでクロスリンクすることが好ましい。
上記抗体には各種試薬を結合してコンジュゲート抗体として使用することもできる。このような試薬としては、化学療法剤、放射性物質、トキシンなどを挙げることができる。このようなコンジュゲート抗体は公知の方法により作製することができる（ＵＳ５０５７３１３、ＵＳ５１５６８４０）。
上記薬剤は、直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の薬剤の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１０００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｐＭＸ２ベクターの作製に用いたアダプターを示す図である。太字部分はＢｓｔＸＩ認識配列を示している。
図２Ａおよび図２Ｂは、２Ｄ７抗原の細胞株における発現を示す図である。２Ｄ７抗体で各種細胞を染色し、その発現を調べた。（実線：一次抗体なし、点線：２Ｄ７抗体）
図３は、２Ｄ７抗体による免疫沈降を示す写真である。ＮＩＨ３Ｔ３，ＲＰＭＩ８２２６，Ｕ２６６細胞を可溶化し、２Ｄ７抗体、抗ＢＳＴ−１抗体（コントロール），またはプロテインＧのみで免疫沈降を行い、銀染色で蛋白を検出した。ＲＰＭＩ８２２６，Ｕ２６６で２Ｄ７抗体により特異的に沈降する約１２ＫＤの分子（矢印）が検出された。このバンドを切り出し、ペプチドシークエンスを行った結果、β２ミクログロブリンであることが分かった。
図４は、スクリーニングの流れを示す図である。プール分け、ＤＮＡの調製、ウイルスへのパッケージング、３Ｔ３細胞への感染、ＦＡＣＳによるスクリーニングまでを一つのスパンとして行った（図４Ａ）。四次スクリーニング終了までに約２０クローンにまで絞った。五次スクリーニングでは、コロニー６４個をそれぞれ９６ウェルプレートに植菌し、縦の列、横の列でプールを作りスクリーニングを行った。その結果、１２個の候補クローンが絞れた（図４Ｂ）。
図５は、ＦＡＣＳによるスクリーニングの結果を示す図である。図５Ａは二次スクリーニングの結果を、図５Ｂは三次スクリーニングの結果を、図５Ｃは四次スクリーニングの結果を示している。各プールよりレトロウイルスを調製後ＮＩＨ３Ｔ３に感染させ３日後に２Ｄ７抗体で細胞を染色した。スクリーニングごとにプールのサイズを徐々に小さくすることでクローンを絞っていった。
図６は、ＦＡＣＳによるスクリーニングの結果を示す図である。図６Ａは五次スクリーニングの結果を、図６Ｂは最終スクリーニングの結果を示している。五次スクリーニングの結果、３，４，６，８の列、Ｅ，Ｆ，Ｇの列に陽性クローンが含まれていることが分かった。１２個の候補クローンをスクリーニングした結果、Ｅの列では６Ｅが陽性クローンであることが分かった。この６Ｅの塩基配列を解析した結果ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ  Ａ＊６８０２をコードしていた。
図７は、２Ｄ７抗体添加による細胞への影響を示す図及び写真である。２Ｄ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）添加後、４８時間後に生細胞数を測定した。２Ｄ７抗体を加えても、細胞増殖にほとんど変化が見られなかった（図７Ａ）。Ｋ５６２細胞（図７Ｂ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図７Ｃ）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（図７Ｄ）をそれぞれ抗体添加２４時間後に観察した。２Ｄ７抗体はＪｕｒｋａｔに対して細胞凝集を誘導した。
図８は、２Ｄ７抗体のクロスリンクによる細胞死誘導を示す写真である。Ｊｕｒｋａｔ細胞に２Ｄ７抗体，抗マウスＩｇＧを各組み合わせで作用させ、４８時間後に細胞核を染色した。２Ｄ７抗体と抗マウスＩｇＧを同時に作用させることにより、細胞死による核の断片化が観察された。
図９は、２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ（２Ｄ７ＤＢ）の配列である。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙの構造を示した図である。図１０ＣはＣＯＳ７での一過性発現を示した写真である。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＣＯＳ７で一過性に発現させた２Ｄ７ＤＢの細胞傷害活性を示した図である。
図１２は、ＣＯＳ７で一過性に発現させた２Ｄ７ＤＢの細胞傷害活性を示した図である。Ｋ５６２細胞（図１２Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１２Ｂ）を用いて行った。
図１３は、ＣＯＳ７で一過性に発現させた２Ｄ７ＤＢの細胞傷害活性を示した図である。ＲＰＭＩ８２２６細胞（図１３Ａ）、ＩＬ−ＫＭ３細胞（図１３Ｂ）、Ｕ２６６細胞（図１３Ｃ）、ＡＲＨ７７細胞（図１３Ｄ）を用いて行った。
図１４は、精製２Ｄ７ＤＢの増殖抑制効果を示したグラフである。
図１５は、誘導４８時間後における精製２Ｄ７ＤＢによる細胞死誘導を示した図である。ＡＲＨ７７細胞（図１５Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１５Ｂ）、Ｋ５６２細胞（図１５Ｃ）、ＨｅＬａ細胞（図１５Ｄ）を用いて行った。
図１６は、誘導４８時間後における精製２Ｄ７ＤＢによる細胞死誘導を示した図である。Ｕ２６６細胞（図１６Ａ）、ＩＬ−ＫＭ３細胞（図１６Ｂ）を用いて行った。
図１７は、２Ｄ７ＤＢ（２μｇ／ｍｌ）による細胞死誘導のタイムコースを示した図である。１２時間から３８時間における細胞死誘導を調べた。ＡＲＨ７７細胞（図１７Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１７Ｂ）を用いて行った。
図１８は、２Ｄ７ＤＢ（２μｇ／ｍｌ）による細胞死誘導のタイムコースを示した図である。３時間から６時間における細胞死誘導を調べた。ＡＲＨ７７細胞（図１８Ａ）、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１８Ｂ）を用いて行った。
図１９は、２Ｄ７ＤＢによる細胞死に対するＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの効果を示した図である。ＡＲＨ７７細胞を用いて、誘導後１６時間に行った。
図２０は、２Ｄ７ＤＢによる細胞死に対するＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの効果を示した図である。Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いて、誘導後１６時間に行った。
図２１は、２Ｄ７ＤＢによる細胞死がＤＮＡの断片化に伴わないことを示した写真である。細胞死誘導後２４時間後に行った。
図２２は、２Ｄ７ＤＢの細胞死誘導活性に対するサイトカラシンＤの影響を調べた結果を示す図である。ＡＲＨ７７細胞をアクチン重合阻害剤であるサイトカラシンＤであらかじめ処理しておくことにより、２Ｄ７ＤＢによって誘導される細胞死に対して抵抗性を示すようになった。
図２３は、細胞内のアクチンと核の様子を、免疫染色によって調べた結果を示す写真である。ＡＲＨ７７細胞を図中の条件下で反応させた後、抗アクチン抗体でアクチンを（赤）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で細胞核を（青）検出した。２Ｄ７ＤＢ処理した細胞はアクチンが消失していた。
図２４は、２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙがヒト骨髄腫マウスモデルにおいて、血清中のヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）濃度の上昇を抑制することを示した図である。データは平均＋ＳＥＭで表す。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ投与群との間に、対応の無いｔ検定において有意差（＊：ｐ＜０．０５）が存在した。
図２５は、２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙがヒト骨髄腫マウスモデルにおいて、延命効果を有することを示した図である。Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群と２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ投与群との間に、一般化Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定において有意差（＊：ｐ＜０．０５）が存在した。
図２６は、ＰＢＭＣに対する２Ｄ７ＤＢの作用を解析した図である。マイトゲンにはＰＨＡ−Ｍ（図２６Ａ）、ＣｏｎＡ（図２６Ｂ）およびＳＡＣ（図２６Ｃ）を用いた。また、図２６Ｄはマイトゲン非存在下での結果を示し、図２６Ｅは陽性対照（ＡＲＨ７７）での結果を示す。上から順に、２Ｄ７ＤＢ非添加、３時間添加、２４時間添加での結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔１〕  細胞株
ヒトミエローマ細胞株（ＲＰＭＩ８２２６，Ｋ５６２，ＡＲＨ７７）、ヒトＴ細胞白血病細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）、ＦＤＣ−Ｐ１、ＨＣＩ−１６、及び、２Ｄ７ハイブリドーマ細胞株（徳島大学由来）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０倍地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で、ヒトミエローマ細胞株（ＩＬ−ＫＭ３、Ｕ２６６）は同培地にそれぞれ２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６（Ｒ  ＆  Ｄ社製）を添加した培地で、Ｂａ／Ｆ３は同培地に２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（Ｒ  ＆  Ｄ社製）を添加した培地で培養した。またＣＯＳ７，２９３Ｔ，ＨｅＬａ，ＮＩＨ３Ｔ３及びＢＯＳＣ２３は１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ倍地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で、ＣＨＯはα−ＭＥＭ倍地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）＋５％ＦＣＳまたは１０％ＦＣＳで培養した。
〔２〕  ｐＭＸ２ベクターの作製
ＧＦＰ遺伝子をウイルス粒子中にパッケージングするレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＧＦＰのＧＦＰ遺伝子領域をＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで切り出し除いた。この領域に、ＢｓｔＸＩ  ｓｉｔｅを配列上に持つアダプター（図１）（ＡＢＩ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで合成後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアニールさせ使用）を挿入し、ｐＭＸ２とした。
〔３〕  ｃＤＮＡライブラリーの作製
ＲＰＭＩ８２２６細胞より、Ｔｒｉｓｏｌ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて定法によりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。さらに、このＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００μｇから、μＭＡＣＳ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用い添付されたマニュアル書に従ってｍＲＮＡを精製した。３．６μｇのｍＲＮＡを鋳型にしてランダムヘキサマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、ＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を両末端に連結した。このｃＤＮＡを、ＢｓｔＸＩで切断したｐＭＸ２ベクターに挿入し、ＥＬＥＣＴＲＯ  ＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）にエレクトロポレーション法により導入した（２．５ＫＶ，２００Ω、２５μＦ）。その後、１ｍｌのＳＯＣを加え３７℃で一時間インキュベートし、４０％グリセロール／ＬＢ＋Ａｍｐ  １ｍｌを加え、一部をタイターチェックに使用し、残りは−８０℃に保存した。得られたライブラリーを、１ウェルあたり１０００クローンになるように９６穴プレート２枚に２００μｌ／ウェル（７％ＤＭＳＯ／ＬＢ＋Ａｍｐ）で巻き込み、３７℃で一晩培養した。このプレートの４ウェル分（４０００クローン分）をアンピシリン入りＬＢ培地（４ｍｌ）一本に植菌した。これを一つのプールとし、残りのウェルについても同様の操作を行い、最終的にプレート一枚より２４プールを作製した。各プールを３７℃で一晩培養後ＤＮＡを調整し（ＱＩＡＧＥＮ社製）、パッケージング細胞へのトランスフェクションに用いた。植菌に使用したプレートは二次スクリーニングで使用するまで−８０℃に保存した。
〔４〕  抗体の精製
２Ｄ７抗体は、徳島大から送付された腹水０．５ｍｌをＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｈｉ  Ｔｒａｐ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させたのち、ＩｇＧ画分を０．１Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ３．０で溶出し、回収した。これをセントリコン（ＹＭ−１０；ミリポア）で濃縮したのちＰＢＳにバッファー置換を行い、最終的にトータル５．３４ｍｇの抗体を得た。これらを分注して−２０℃に保存した（濃度０．８９μｇ／μｌ）。
〔５〕  ＦＡＣＳ
付着細胞の場合は１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞をはがし、浮遊細胞の場合は遠心回収後ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（２．５％ＦＣＳ，０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳ）に懸濁し、２Ｄ７抗体（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含むｂｕｆｆｅｒ（５％ＦＣＳ／ＰＢＳ）中に氷上で一時間おいた。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）溶液中（１：１５０，５０μｌ  ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）で、氷上で３０分間反応させ、これをＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ＥＬＩＴＥ（ＣＯＵＬＴＥＲ社製）で解析を行った。
〔６〕  レトロウイルス感染
（ｉ）  レトロウイルスパッケージング
レトロウイルスパッケージング細胞であるＢＯＳＣ２３細胞は、トランスフェクション前日に６×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル２ｍｌで６ウェルプレートに撒いておいた。トランスフェクションは以下の手順で行った。各プール由来プラスミドＤＮＡ１μｇに対してＦｕＧＥＮＥ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）３μｌを混ぜ室温で２０分置いた後、前日撒いておいたＢＯＳＣ２３細胞の培地中に加えた。その後３７℃で４８時間培養後培地を回収した。３０００回転で５分遠心し死細胞を除いた培養液をウイルス液として使用した。
（ｉｉ）  ウイルス感染
前日１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル２ｍｌで６ウェルプレートに撒いたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ポリブレン（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ；ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍｌを添加したウイルス液１ｍｌ中で２４時間培養した。その後フレッシュな培地１．５ｍｌを加えさらに４８時間培養を行い、その後遺伝子発現をＦＡＣＳにより解析した。
〔７〕  免疫沈降
細胞をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，５μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）で溶解したのち、遠心して不溶化蛋白を除きｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅとした。これに、２Ｄ７抗体１μｇを加え４℃で４時間インキュベートし、引き続きｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（ＢｉｏＭａｇ社製）を加えさらに１時間インキュベートした。その後免疫複合体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで３回ｗａｓｈしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。このゲルを添付のマニュアルに従って銀染色（第一化学）した。一方ペプチドシークエンスするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＰｒｏＢｌｏｔｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に転写し、クマシーブルー染色液（０．１％ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０  ｉｎ  ４０％ＭｅｔＯＨ／１％ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）で一分間染色した。５０％ＭｅｔＯＨで数回洗浄した後目的のバンドを切り出し、１ｍｌ  ＤＤＷで５回洗浄した後真空乾燥し、ペプチドシークエンサーにかけた。
〔８〕  ２Ｄ７抗体を用いた細胞増殖アッセイ
各細胞を９６ウェルプレートに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌでＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ），ＰＨＡ（１０μｌ／ｍｌ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）存在下または非存在下で撒いた。そこに２Ｄ７抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加または非添加後４８時間培養した。培養後、細胞の形態変化を顕微鏡下で観察した。生細胞数測定は、ＷＳＴ−８（生細胞数測定試薬ＳＦ；ナカライテスク）を添加し、３７℃で２時間培養後、ＯＤ４５０を測定することで相対的な生細胞数を測定した。
〔９〕  クロスリンクによる細胞死誘導
Ｊｕｒｋａｔ細胞を８×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで２４ウェルプレートに撒き、２Ｄ７抗体存在下（５μｇ／ｍｌ）または非存在下で、さらに抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１０μｇ／ｍｌ添加した。４８時間後に細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄後メタノールを７０％濃度になるように加え、−２０℃で１５分置いた。細胞をＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで数回洗浄後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を１０μｇ／ｍｌ濃度で添加し室温で３０分インキュベートした。再度ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、スライドグラスの上に細胞を滴下し蛍光顕微鏡で核の様子を観察した。
〔１０〕  ２Ｄ７可変領域のクローニング
２Ｄ７ハイブリドーマ（徳島大学より供与）よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌを用いて定法により精製した。このＲＮＡ  ３μｇを鋳型にして、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、添付のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にしてｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの可変領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅を行った。
2004033499.tif 000002
増幅された各可変領域をコードするｃＤＮＡはｐＣＲ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし塩基配列（配列番号：１および３）を決定した。
〔１１〕  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターの作製
各可変領域ｃＤＮＡをサブクローニングしたプラスミドを鋳型にしてＨｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、及び、Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの可変領域（ＶＨ，ＶＬ）をそれぞれ以下のプライマーにより増幅した。
2004033499.tif 000003
2004033499.tif 000004
これにより増幅したＶＨ、ＶＬの各ｃＤＮＡを一つのチューブに混合しさらにＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物を鋳型にして、今度は２Ｄ７ＤＢ−Ｈ１、２Ｄ７ＤＢ−Ｌ２をプライマーにして再度ＰＣＲ反応を行い、ＶＨとＶＬが５ｍｅｒのリンカーをはさんで連結したｃＤＮＡ（配列番号：５）を合成した。このｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ切断し、動物細胞発現ベクターｐＣＸＮＤ３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ間に挿入した。塩基配列を確認し２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターｐＣＸＮＤ３−２Ｄ７ＤＢの構築を終了した。
〔１２〕  ＣＯＳ７細胞での一過性発現
ｐＣＸＮＤ３−２Ｄ７ＤＢ、あるいはコントロールとして空のベクター２μｇに対してトランスフェクション試薬（ＬＴ−１，ＭＩＲＵＳ社製）６μｌを添付のマニュアルに従って混合し、無血清培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に培地交換したＣＯＳ７細胞（前日に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルで６ウェルプレートに撒いたもの）に添加した。５時間後に血清２００μｌを添加し２日から３日間培養した。その後培地を回収し、遠心により死細胞を除去した培養上清を細胞傷害活性の検出実験に用いた。
一方培養上清中の２Ｄ７ＤＢの発現はウエスタンブロットにより確認した。すなわち、培養上清の一部に等量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、また細胞はｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて溶解したのち、遠心して不溶化蛋白を除きｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調整しこれに等量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えた。各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＦＬＡＧ抗体で２Ｄ７  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎの発現を検出した。
〔１３〕  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ産生発現細胞株の樹立
ＰｖｕＩで切断し直鎖化したｐＣＸＮＤ３−２Ｄ７ＤＢ  ２０μｇをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１株）に以下のようにエレクトロポレーション法により導入した。
ＣＨＯ細胞をｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ＰＢＳで２回洗浄した後１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＰＢＳに懸濁した。これに２０μｇの上記プラスミドを混合し、電気パルス（１．５ＫＶ，２５μＦＤ）を与えた。適当な割合で細胞を希釈し１０ｃｍ  ｄｉｓｈに撒きこみ、終濃度５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）存在下で培養を行った。生育したコロニーを〜３０クローンほどピックアップし、それら培養上清中のＤｉａｂｏｄｙの発現量をウエスタンブロットにより調べた。最も発現の高かったクローンを５ｎＭ  ＭＴＸを含む核酸フリーのＭＥＭα培地に拡大後、これを高産生細胞株としてストックした。
〔１４〕  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙの大量精製
Ｔ−１２５フラスコでサブコンフルエントの２Ｄ７ＤＢ高産生ＣＨＯ細胞株をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡではがした後ローラーボトル（ＭＥＭα  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＋５％ＦＣＳ  ２５０ｍｌ）に移した。４日後に培養液を除去しＰＢＳで２回洗浄した。その後、無血清化するためにＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）２５０ｍｌに置換し３日間培養を行った後培養上清を回収した。遠心によって死細胞を除去した後フィルターを通してこれを精製に用いた。
Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖの精製は以下のとおり行った。まず、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２カラムに回収した培養上清をＡｐｐｌｙし吸着させた。これをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）でｗａｓｈした後、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｈ３．５，０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）でＳｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖを溶出した。回収したサンプルは直ちに終濃度２５ｍＭになるようにＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で中和した。これをひき続きＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ（２６／６０）カラムによるゲルろ過精製に用いた。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中でＳｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖのｄｉｍｅｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎを回収した。回収したサンプルの一部をＳＤＳ電気泳動および銀染色を行い、目的の蛋白が精製されていることを確認した後これを濃縮し、２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ精製標品とした。
〔１５〕  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙによる細胞死誘導実験
各種血球系細胞株の場合は、２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように２４ウェルプレートに細胞を撒いた。これに、精製した２Ｄ７ＤＢを、あるいは２Ｄ７ＤＢを一過性に発現させたＣＯＳ７の培養上清を加え細胞死誘導を行った。２Ｄ７ＤＢを一過性に発現させたＣＯＳ７培養上清を用いた場合はその培養上清の濃度が５０％になるように加えた。各ウェルとも培地の量は０．８〜１ｍｌ／ウェルで行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞に刺激を加える場合は、２Ｄ７ＤＢの添加時にＣｏｎ  Ａ（ＷＡＫＯ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌになるように同時に添加した。
付着細胞（ＨｅＬａ）の場合は、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように６ウェルプレートに細胞を撒き一晩培養することで細胞を付着させた。その後培養液中に精製した２Ｄ７ＤＢを添加した。
２Ｄ７ＤＢを添加し数時間から数日経った後、浮遊細胞はそのまま細胞を回収し、付着細胞は１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで細胞をはがして回収した後、ｉｃｅ−ｃｏｌｄ  ＰＢＳで細胞をｗａｓｈし、添付のマニュアルに従ってアポトーシスマーカーであるＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、及び、死細胞マーカーであるＰＩで細胞をラベルした（ＴＡＣＳ  ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，ＴＲＥＶＩＧＥＮ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ社製）。その後、ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙを用いて染色された細胞の割合を測定した（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ，ＣＯＵＬＴＥＲ）。
〔１６〕  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄによる細胞死誘導
各種血球系細胞を２〜５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように２４ウェルプレートに撒いた。アポトーシスの初期過程を阻害する目的でカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ，プロメガ）を終濃度５０μＭで添加し２．５時間インキュベートした後、細胞死誘導を行った。Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄによる細胞死誘導ではＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（ｓｉｇｍａ社製）を１μｇ／ｍｌ（Ｊｕｒｋａｔ）、あるいは５μｇ／ｍｌ（ＡＲＨ７７）添加し、２Ｄ７ＤＢによる細胞死誘導では精製２Ｄ７ＤＢを２μｇ／ｍｌになるように添加した。細胞死誘導から１６時間後に細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、ＰＩで細胞を染色した。
〔１７〕  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙを用いた細胞増殖アッセイ
各細胞を９６ウェルプレートに１〜２×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞濃度で撒いた。そこに２Ｄ７ＤＢを適当な濃度になるように添加し３日培養後細胞数の測定を行った。生細胞数の測定は、ＷＳＴ−８を用いて行った。すなわち本試薬を１０μｌ／ウェルで細胞に添加し３７℃で１．５時間培養後、分光光度計でＯＤ４５０を測定することで相対的な生細胞数を測定した。増殖抑制率は、（１−（ＯＤ４５０  ｏｆ  ２Ｄ７ＤＢ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ／ＯＤ４５０  ｏｆ  ２Ｄ７ＤＢ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ））×１００により算出した。
〔１８〕  ＤＮＡの断片化の検出
ＡＲＨ７７、Ｊｕｒｋａｔ細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞濃度になるように６ウェルプレートに撒き、それぞれのウェルに精製２Ｄ７ＤＢは終濃度２μｇ／ｍｌで、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄは終濃度１μｇ／ｍｌ（ＡＲＨ７７）、あるいは５μｇ／ｍｌ（Ｊｕｒｋａｔ）になるように添加することで細胞死誘導を行った。また何も添加しない１ウェルをコントロールとした。２４時間培養後細胞を回収しＰＢＳで細胞を一回洗浄し、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で溶解した。引き続き遠心することで不溶性蛋白を除いた後、これをＲＮａｓｅ  Ａ，Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理した。その後この一部をアガロースゲルで電気泳動を行い、クロマチンＤＮＡの断片化を検出した。
〔１９〕  サイトカラシンＤによる細胞死誘導阻害
ＡＲＨ７７細胞を、５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル細胞濃度になるように２４ウェルプレートに播き、サイトカラシンＤ（ｓｉｇｍａ社製）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるように加えた。またエタノールのみを加えたウェルをコントロールとした。１時間培養後、精製した２Ｄ７ＤＢを各濃度（０，２００，５００，１０００ｎｇ／ｍｌ）で加え、さらに４時間培養を行った。その後細胞を回収し、ＰＩで染色することで死細胞の割合を検出した。
〔２０〕  ２Ｄ７ＤＢ処理した細胞の抗アクチン抗体を用いた免疫染色
サイトカラシンＤ処理／未処理のＡＲＨ７７細胞に、２Ｄ７ＤＢを１μｇ／ｍｌ濃度で加え、３７℃で１５分培養した後、細胞をサイトスピンによりスライドグラス上に付着させた。−２０℃のメタノールに１５分浸して細胞を固定した後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で４℃１時間ブロッキング処理を行った。その後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１００倍希釈したＣＹ３標識抗アクチン抗体（ｓｉｇｍａ社製）を室温で１時間反応させた後、引き続いてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で細胞核を染色した。ＰＢＳで数回洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（オリンパス）で細胞を観察した。
［実施例１］  各種細胞株における２Ｄ７抗原の発現解析
ｃＤＮＡ発現ライブラリー作製のためのｓｏｕｒｃｅにすべき細胞株、および、宿主にすべき細胞株を決定するため、各種動物細胞における２Ｄ７抗原の発現をＦＡＣＳにより解析した（図２Ａおよび図２Ｂ）。その結果、ヒト由来血球系細胞ではリンパ性腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６，Ｕ２６６，及び、Ｊｕｒｋａｔで２Ｄ７抗原の非常に強い発現が観察されたが、Ｋ５６２では発現が弱いことが分かった。マウス由来血球細胞であるＢａ／Ｆ３，ＦＤＣ−Ｐ１，ＨＣＩ−１６では種の違いによるためか発現が非常に弱かった。付着細胞では、ＣＯＳ７，２９３Ｔ，ＨｅＬａにおいても発現が認められた。マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ほとんど発現が見られなかった。
以上の発現パターンから、発現クローニングに使うｃＤＮＡライブラリーのＳＯＵＲＣＥはＲＰＭＩ８２２６細胞が、また発現ライブラリーを導入してスクリーニングに使用する宿主細胞はＮＩＨ３Ｔ３細胞が適切であると判断した。
［実施例２］  ２Ｄ７抗原のクローニング
〔１〕  蛋白質からのクローニング
２Ｄ７抗原を発現しているＲＰＭＩ８２２６細胞、Ｕ２６６細胞、および、２Ｄ７抗原を発現していないＮＩＨ３Ｔ３細胞よりｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製し、２Ｄ７抗体で免疫沈降を行った。その結果、ＲＰＭＩ８２２６，Ｕ２６６細胞で特異的にｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅされる分子（〜１２ｋＤ）が確認された（図３）。この分子は２Ｄ７抗体によるｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでは検出されないが、少なくとも２Ｄ７抗体では再現良くｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅされるので、２Ｄ７抗原そのもの、あるいは、２Ｄ７抗原との共沈分子であることが強く予想された。
そこで、このバンドをクマシー染色した後切り出し、ペプチドシークエンスを行った。その結果、この１２ｋＤの分子の正体はβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であることが分かった。β２ＭはＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉと非共有結合で会合するクラスＩＭＨＣ蛋白複合体の一つであることから、β２Ｍは２Ｄ７抗体によりＨＬＡ複合体として共沈してきたものと考えられる。ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉは、抗原提示に必要なα１、α２ドメイン、及び、β２Ｍと結合するα３ドメインから成る。２Ｄ７抗体がβ２Ｍ分子を共沈できることから、２Ｄ７抗体はＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉのα１−α２ドメインをエピトープとして認識していると予想される。
〔２〕  遺伝子の発現クローニング
２Ｄ７抗原発現細胞ＲＰＭＩ８２２６より精製したｍＲＮＡからランダムヘキサマーによりｃＤＮＡを合成した。これをレトロウイルスベクターｐＭＸ２に挿入し、レトロウイルス発現ライブラリーを作製した。ライブラリーのタイターを調べた結果、トータルで６Ｘ１０６クローンを含んでいることが分かった。また、このライブラリーより２４個のクローンをランダムにピックアップしコロニーＰＣＲによりインサートサイズを調べた結果、ｃＤＮＡ  ａｖｅｒａｇｅ  ｌｅｎｇｔｈはおよそ１．５ｋｂであることが分かった。従って、作製した発現ライブラリーは発現クローニングに十分使用可能であると判断した。
図４Ａおよび図４Ｂに、以下のスクリーニングの流れを示す。一次スクリーニングでは４０００個のｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔなクローンを１プールとして２４プール（９６０００クローン相当）を作製し、各プラスミドをＢＯＳＣ２３細胞にトランスフェクトすることでレトロウイルスにパッケージングした。その後得られた各プール由来ウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させた。感染３日後に細胞をはがし、２Ｄ７抗体で染色した後ＦＡＣＳにより発現解析を行った。その結果、空ベクター由来のウイルス（コントロール）を感染させたＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較して２Ｄ７陽性細胞が認められたプールが２４プール中３プールで認められた（プール４、１３、２１）。
次に一次スクリーニングで陽性だったプール４、プール１３を１０００個のｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔなクローンからなるプール４個に分割し二次スクリーニングを行った。その結果、各プールから一つずつ、明らかな陽性プールが認められた（図５Ａ、プール４−４、プール１３−１）。さらにプール１３−１を１６０個のｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔなクローンからなるプール、２１個に分割し、三次スクリーニングを行い、二つの陽性プール（図５Ｂ、１３−１−１１、１３−１−２１）を同定した。続いてプール１３−１−１１を２０個のクローンからなるプール８個に分け四次スクリーニングを行い、陽性プール（図５Ｃ、１３−１−１１−５）を得た。
このプールをＬＢプレートに広げ６４個のコロニーを一つずつ拾いそれぞれを９６ウェルプレートに１ウェルずつ植菌した。縦の列８クローン分を１プールとして８プール（１〜８）を、また横の列８クローン分を１プールとして８プール（Ａ〜Ｈ）を作製し、五次スクリーニングを行った。その結果、プール３，４，６，８及びプールＥ，Ｆ，Ｇがｐｏｓｉｔｉｖｅであったためこの結果から１２個のｐｏｓｉｔｉｖｅ候補クローンを絞ることができた（図６Ａ）。この１２個についてＦＡＣＳを行い、最終的に４つのｐｏｓｉｔｉｖｅクローン（３Ｆ，４Ｇ，６Ｅ，８Ｇ）が２Ｄ７抗体に認識される単一クローンとして同定された（図６Ｂ）。
このクローンのインサート部分のシークエンスを読んだ結果、４つともＨｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＨＬＡ−Ａ−６８０２の全長ｃＤＮＡ配列であることが分かった。
ＨＬＡ−Ａは数十種類ものハプロタイプに分類されている。今回のクローニングの結果、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩのＡ＊６８０２というハプロタイプが２Ｄ７抗原として同定されたが、２Ｄ７抗体はかなり広範な細胞種を認識することから、遺伝子ソースとして使ったＲＰＭＩ８２２６細胞でのＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩのハプロタイプがたまたまＡ＊６８０２だったというだけであって、２Ｄ７抗体は全てのハプロタイプを含むＨＬＡ  ｅｌａｓｓ  Ｉ分子を認識する抗体であると考えられた。
［実施例３］  増殖抑制効果についての検討
２Ｄ７抗体が細胞殺傷作用を有しているかを、数種類のｌｅｕｋｅｍｉａ細胞株（Ｋ５６２，Ｊｕｒｋａｔ，ＲＰＭＩ８２２６）を使って調べてみた。なお、これら三株での２Ｄ７抗原の発現量は、Ｋ５６２（弱陽性），Ｊｕｒａｋａｔ，ＲＰＭＩ８２２６（強陽性）であった。
Ｋ５６２，Ｊｕｒｋａｔ細胞をＰＨＡとＰＭＡ存在下、非存在下で撒き、そこに２Ｄ７抗体を１０μｇ／ｍｌで加えた。２４時間後に細胞を観察した結果、２Ｄ７弱陽性であるＫ５６２細胞では２Ｄ７抗体の有無でその形態に目立った差は認められなかったが、２Ｄ７を強く発現しているＪｕｒｋａｔ細胞では２Ｄ７抗体の添加により著名な細胞凝集が観察された（図７Ｂおよび図７Ｃ）。しかしながら、２Ｄ７抗体添加による増殖抑制は観察されなかった（図７Ａ）。またＰＨＡ，ＰＭＡ刺激により活性化させたＪｕｒｋａｔ細胞においても２Ｄ７による増殖抑制は同様に見られなかった。
さらに、２Ｄ７強陽性細胞であるＲＰＭＩ８２２６細胞においては予想に反して２Ｄ７抗体を添加しても、細胞の形態、増殖に目立った影響を与えなかった（図７Ｄ）。
次に、２Ｄ７抗体にさらに抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を加え、抗体をクロスリンクさせることで細胞殺傷効果が見られるか調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞に２Ｄ７抗体存在下、非存在下で、さらに抗マウスＩｇＧを加え培養を行い、４８時間後、細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色し死細胞に特長的な細胞核の断片化が認められるか観察した（図８）。その結果、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、２Ｄ７をさらに抗体でクロスリンクすることで核の断片化が観察され、細胞死が誘導されていることが分かった。
［実施例４］  ２Ｄ７抗体可変領域をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび予想されるＤｉａｂｏｄｙの構造
マウスＩｇＧ２ｂのｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ，ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの定常領域に対するプライマーを作製し、５’ＲＡＣＥ法により２Ｄ７可変領域をコードするＤＮＡのクローニングを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列は配列番号：１および３に示したとおりである。
続いてこの配列をもとにｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎの構築を行った。図９および図１０Ａに示すように２Ｄ７  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎは、ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎのリーダーシークエンス、ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎの可変領域、そして５ｍｅｒのリンカー（ＧＧＧＧＳ）をはさんでｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎの可変領域、その後ろにｆｌａｇ−ｔａｇをコードするｃＤＮＡ（配列番号：５）から構成される。２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙはこのｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎがｄｉｍｅｒｉｚｅすることで図１０Ｂに示すような構造を形成すると考えられる。
［実施例５］  ２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙの細胞傷害活性解析
（ｉ）  ＣＯＳ７で一過性に発現させた２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙの傷害活性
２Ｄ７  Ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、３日後に培養上清を回収した。培養上清、及びｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅをＳＤＳ−ＰＡＧＥし抗Ｆｌａｇ−ｔａｇ抗体でｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔを行った結果、培養上清中に２Ｄ７  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎが分泌されていることが確認された（図１０Ｃ）。
この培養上清をＪｕｒｋａｔ細胞に５０％の割合で添加し数日後に細胞をＰＩ、及び、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色することで死細胞の割合を測定した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、抗ＢＳＴ−１抗体、２Ｄ７抗体（各５μｇ／ｍｌ）を添加しただけではアポトーシスマーカーに大きな変動は認められなかった。また、ベクターのみをトランスフェクトしたＣＯＳ７の培養上清でも特に変化は認められなかった。一方、２Ｄ７ＤＢを発現させたＣＯＳ７の培養上清を加えたＪｕｒｋａｔ細胞では、明らかな細胞死誘導が認められた（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
次に、この２Ｄ７ＤＢがＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ａ特異的に作用していることを調べる目的で、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ａを発現していないことが知られているＫ５６２細胞を用いて同様の実験を行った。その結果、２Ｄ７ＤＢはＪｕｒｋａｔ細胞に対しては細胞死誘導活性を認めたものの、Ｋ５６２細胞に対しては全く影響を及ぼさなかった（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。このことから２Ｄ７ＤＢの細胞死誘導活性はそのエピトープであるＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  Ａを標的にした作用であることが強く支持された。また、Ｊｕｒｋａｔ細胞の２Ｄ７ＤＢに対する感受性はｃｏｎ  Ａで刺激した細胞の方が若干ではあるが高いような傾向が各データから認められた。
次に他のミエローマ細胞株に対する２Ｄ７ＤＢの作用を解析した。ＲＰＭＩ８２２６，ＩＬ−ＫＭ３，Ｕ２６６，ＡＲＨ７７をベクターのみをトランスフェクトした培養上清（コントロール）、あるいは２Ｄ７ＤＢ発現ＣＯＳ７培養上清とインキュベートし、二日後にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ，ＰＩで二重染色しＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで解析した。その結果いずれの細胞も２Ｄ７ＤＢとのインキュベートにより顕著に細胞死が誘導されることが明らかになった（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。
（ｉｉ）  精製した２Ｄ７ＤＢの細胞傷害活性
精製した２Ｄ７ＤＢの各種細胞株（ＲＰＭＩ８２２６，ＡＲＨ７７，Ｕ２６６，Ｊｕｒｋａｔ）に対する増殖抑制効果について解析した。２Ｄ７ＤＢを０，０．５，１．０，２．０μｇ／ｍｌで添加し３日後に細胞数を測定した。その結果、これらの細胞に対して濃度依存的に細胞増殖を抑制することが分かった（図１４）。
次に、精製２Ｄ７ＤＢを添加し４８時間後に細胞死マーカーであるＰＩ，Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染めて解析を行った。その結果、ＣＯＳ７で一過性に発現させた２Ｄ７ＤＢを用いた時の結果と同様にＪｕｒｋａｔ、ＡＲＨ７７に対して濃度依存的に細胞死を誘導し、Ｋ５６２にはまったく影響を与えないことが明らかになった（図１５Ａ〜図１５Ｃ）。またＵ２６６，ＩＬ−ＫＭ３に対しても２Ｄ７ＤＢ添加４８時間後に著しい細胞死誘導活性が認められた（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
一方、付着細胞であるＨｅＬａ細胞に対しては、この細胞は２Ｄ７抗体で非常によく染色されるにも関わらず、同条件で２Ｄ７ＤＢは全く影響を及ぼさなかった（図１５Ｄ）。このことから、２Ｄ７ＤＢは血球系細胞など浮遊細胞にのみ特異的に作用する可能性が示唆された。
続いて、２Ｄ７ＤＢによる細胞死誘導活性がどれくらいの時間で誘導されるか解析した。ＡＲＨ７７，Ｊｕｒｋａｔ細胞に２Ｄ７ＤＢを２μｇ／ｍｌで添加し、１２、２４、３８時間後に細胞を回収し、細胞死マーカーで染色した。その結果、いずれの細胞も１２時間後で既に細胞死が誘導されていることが判った（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。そこで、さらに早い時間（３時間、６時間）における細胞死誘導を調べた。驚いたことに２Ｄ７ＤＢは添加してから少なくとも３時間以内に細胞死を誘導することが実験から明らかになった（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。これらの結果から２Ｄ７ＤＢは非常に強力な細胞死誘導活性を有することが強く支持された。このように２Ｄ７ＤＢは強力に細胞死を誘導するので、短い血中半減期でも十分な薬効が期待できる。さらに、ｗｈｏｌｅ抗体が仮に強力な細胞死誘導活性を有した場合には、血中半減期の長さから安全性の問題が懸念されるが、Ｄｉａｂｏｄｙ化することにより、そのような問題もクリアされることが考えられる。
次に、２Ｄ７ＤＢによる細胞死がカスパーゼの活性化を伴って引き起こされる、いわゆるアポトーシスによるものかどうかについて解析を行った。図１９、図２０で示すようにＡＲＨ７７，Ｊｕｒｋａｔ細胞をアポトーシス誘導剤であるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄで処理し１６時間後にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ，ＰＩで細胞を染色すると顕著にアポトーシスが誘導された。この条件下であらかじめ細胞をカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫで２．５時間前処理するとＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄによるアポトーシスは抑制された。ところが、２Ｄ７ＤＢによって誘導される細胞死はＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫによる前処理を行ってもまったく阻害されなかった。これらの結果から、２Ｄ７ＤＢはカスパーゼを介した通常のアポトーシスの機構とは異なる別の機構によって細胞死を誘導していることが明らかになった。
さらにこのことを確認するため、アポトーシスに伴う最も特徴的生化学的変化として知られているクロマチンＤＮＡの断片化に関しても解析を行った。
ＡＲＨ７７，Ｊｕｒｋａｔ細胞を２Ｄ７ＤＢ（２μｇ／ｍｌ）、あるいはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄで処理し２４時間後にＤＮＡを回収し、電気泳動を行った（図２１）。その結果、アポトーシス誘導剤であるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ処理した細胞はいずれもアポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化が誘導されていたが、その一方で、２Ｄ７ＤＢ処理した細胞では完全に細胞死を誘導しうる濃度の２Ｄ７ＤＢを添加しているにも関わらずＤＮＡの断片化は全く認められなかった。この結果からも、２Ｄ７ＤＢによる細胞死は、アポトーシスの特徴を伴わない未知の細胞死であることが強く支持された。
以上の結果より２Ｄ７ＤＢによる細胞死はこれまで知られている細胞死誘導機構とは異なる経路を介して引き起こされていることが分かった。そこで、２Ｄ７ＤＢによる細胞死誘導のメカニズムを明らかにするため、さらに解析を行った。これまでの実験から、細胞に２Ｄ７ＤＢを反応させると細胞膜が破壊されている様子が顕微鏡下でしばしば観察されていた。このことから、２Ｄ７ＤＢがアクチン骨格系に何らかの影響を及ぼしていると推測した。その可能性に関して検討するため、アクチン重合阻害剤（サイトカラシンＤ）を細胞に作用させ、２Ｄ７ＤＢの細胞死誘導活性に対する影響について解析を行った。
ＡＲＨ７７細胞にサイトカラシンＤ（２０ｕｇ／ｍｌ）を、またはエタノールのみ（コントロール）を添加し、１時間後に２Ｄ７ＤＢを各濃度で加えた。２Ｄ７ＤＢ添加から４時間インキュベート後に細胞を回収し、ＰＩ染色を行い死細胞の割合を測定した（図２２）。その結果、サイトカラシンＤであらかじめ細胞を処理することにより、２Ｄ７ＤＢに対する感受性が消失することが分かった。この結果から、２Ｄ７ＤＢはその標的分子であるＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＡに結合することで、アクチンなど細胞骨格系に何らかの作用を及ぼし細胞死を誘導することが示唆された。
そこで、２Ｄ７ＤＢを作用させた細胞をアクチン抗体で染色し、２Ｄ７ＤＢの添加による細胞骨格系の動態変化について視覚的な解析を行った。ＡＲＨ７７細胞に２Ｄ７ＤＢを作用させ１５分後にメタノールで固定し細胞内のアクチン（赤）の様子を免疫染色により調べた（図２３）。その結果、２Ｄ７ＤＢ非処理の像に比べて、２Ｄ７ＤＢにより細胞内アクチン骨格系が著しく破綻している様子が観察された。
以上の結果から、２Ｄ７ＤＢによる細胞死は、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩＡに結合した２Ｄ７ＤＢが細胞内アクチン骨格系を破壊することで引き起こされている可能性が強く示唆された。これは、これまで報告されていない、全く新しいタイプの細胞死誘導機構である。
［実施例６］  ２Ｄ７  ｄｉａｂｏｄｙのヒト骨髄腫モデル動物での薬効試験
（１）ヒト骨髄腫マウスモデルの作製
ヒト骨髄腫マウスモデルは以下のように作製した。ＡＲＨ７７細胞（ＡＴＣＣ）を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）で２．５×１０７個／ｍＬになるように調製し、あらかじめ前日抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製）０．２ｍｇを腹腔内投与したＳＣＩＤマウス（オス、６週齢、日本クレア）に上記ＡＲＨ７７細胞懸濁液２００μＬ（５×１０６個／マウス）を尾静脈より注入した。
（２）投与抗体の調製
２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙを投与当日、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を用いて、０．８ｍｇ／ｍＬになるように調製し、投与試料とした。
（３）抗体投与
（１）で作製したヒト骨髄腫マウスモデルに対し、ＡＲＨ７７細胞移植後１日目より、１日２回、３日間、上記（２）で調製した投与試料を１０ｍＬ／ｋｇにて、尾静脈より投与した。陰性対照（ｖｅｈｉｃｌｅ）として、濾過滅菌したＰＢＳ（−）を同様に１日２回、３日間、１０ｍＬ／ｋｇにて、尾静脈より投与した。抗体投与群は１群７匹、ｖｅｈｉｃｌｅ投与群は１群８匹で行った。
（４）マウス血清ヒトＩｇＧ定量法
マウス血清中における、ヒト骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧの定量は、以下のＥＬＩＳＡで行った。０．１％重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍＬに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）１００μＬを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化した。ブロッキングの後、段階希釈したマウス血清あるいは標品としてヒトＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製）１００μＬを添加し、室温にて１時間インキュベーションした。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製）１００μＬを加え、室温にて１時間インキュベーションした。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて４０５ｎｍの吸光度を測定し、標品のヒトＩｇＧの吸光度より得られた検量線から、マウス血清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。
（５）抗腫瘍効果の評価
２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙのヒト骨髄腫マウスモデルに対する抗腫瘍効果については、当該骨髄腫細胞が産生するヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）のマウス血清中の量の変化、及び生存期間で評価した。マウス血清中のヒトＩｇＧ量の変化については、ＡＲＨ７７細胞移植後２４日目に血清を採取し、上記（４）で述べたＥＬＩＳＡを用いてヒトＩｇＧ量を測定した。その結果、Ｖｅｈｉｃｌｅ投与群では、血清ヒトＩｇＧ（Ｍタンパク質）量が約７４μｇ／ｍＬまで上昇しているのに対し、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ投与群では対照群に比べ有意に低く（Ｐ＜０．００５，対応のないｔ検定）、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙがＡＲＨ７７細胞の増殖を非常に強く抑制していることが示された（図２４）。一方、生存期間についても図２５に示すとおり、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙ投与群ではｖｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して有意な生存期間の延長が認められた。
以上より、２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙがヒト骨髄腫マウスモデルに対して、抗腫瘍効果を有することが示された。本発明の２Ｄ７ｄｉａｂｏｄｙの抗腫瘍効果は、当該抗体が有する細胞死誘起作用に基づくと考えられる。
［実施例７］  ＰＢＭＣに対する２Ｄ７ＤＢの作用解析
ヒト末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）に対する２Ｄ７ＤＢの作用を解析した。健康成人ボランティアの末梢血より比重遠心分離にてＰＢＭＣを精製した。このＰＢＭＣをマイトゲン存在下または非存在下で２４穴プレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ウェルずつ播いた。マイトゲンにはフィトヘマグルチニンＭ（ＰＨＡ−Ｍ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、終濃度１０μｇ／ｍＬ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、Ｗａｋｏ、終濃度１０μｇ／ｍＬ）、ＳＡＣ（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、終濃度０．０１％）を用いた。５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃にて３日間培養し、培養終了の２４時間前または３時間前に２Ｄ７ＤＢを終濃度２μｇ／ｍＬになるように添加した。培養終了後にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ、ＰＩで二重染色し（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて解析した。なお陽性対照としてマイトゲン非存在下にて、ＡＲＨ７７を２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ウェルずつ２４時間培養し、ＰＢＭＣと同様にして２Ｄ７ＤＢと反応させた。
ＰＢＭＣの場合、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ・ＰＩ共陽性である死細胞の割合はマイトゲン非存在下では、２９％、２３％、２５％（順に２Ｄ７ＤＢ非添加、３時間添加、２４時間添加、以下同）、ＰＨＡ−Ｍ存在下では、２０％、４５％、４２％、ＣｏｎＡ存在下では、２２％、３０％、３４％、ＳＡＣ存在下では、３１％、３８％、４０％であった（図２６Ａ〜図２６Ｄ）。ＡＲＨ７７の場合、１６％、５６％、５８％であった（図２６Ｅ）。以上から２Ｄ７ＤＢは無刺激のＰＢＭＣにはほとんど影響を与えず、マイトゲンにて活性化したＰＢＭＣに短時間で細胞死を誘導することが明らかとなった。
【産業上の利用の可能性】
本発明によって、高比活性の低分子化抗体を提供できるものと期待される。該低分子化抗体を使用することで、短い半減期でも十分な薬効が期待でき、さらに、薬効と毒性の乖離が可能になるものと期待できる。また、臨床投与量の低減化および生産コストの低減化など、コスト全体の低減化が図れるので抗体医薬品の開発上問題になる経済面問題の改善もまた期待される。
【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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