(57)【要約】本発明は、クリスタリン阻害物質を有効成分として含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤を提供するものである。クリスタリン阻害物質の具体例としては、ＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＡＣＵＧＧＵＡＵＧＴＴ（配列番号１）のヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるｓｉＲＮＡ等の二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。本発明の医薬組成物は、眼内における血管新生を抑制する効果を有しており、糖尿病網膜症、未熟児網膜症等の眼内血管新生疾患に有用である。
2004096277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤。
【請求項２】
クリスタリンがクリスタリンβである、請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、請求項２記載の予防または治療剤。
【請求項４】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、請求項１〜３の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４記載の予防または治療剤。
【請求項６】
ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、請求項５記載の予防または治療剤。
【請求項７】
クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項８】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項９】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、請求項１〜３の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項１０】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１〜３の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項１１】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、請求項１〜１０の何れかに記載の予防または治療剤。
【請求項１２】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項１１記載の予防または治療剤。
【請求項１３】
眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項１１記載の予防または治療剤。
【請求項１４】
眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項１１記載の予防または治療剤。
【請求項１５】
眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項１１記載の予防または治療剤。
【請求項１６】
クリスタリン阻害物質を有効量投与することからなる、眼内血管新生疾患の予防または治療方法。
【請求項１７】
クリスタリンがクリスタリンβである、請求項１６記載の予防または治療方法。
【請求項１８】
クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、請求項１７記載の予防または治療方法。
【請求項１９】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、請求項１６〜１８の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２０】
二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項１９記載の予防または治療方法。
【請求項２１】
ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、請求項２０記載の予防または治療方法。
【請求項２２】
クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６〜１８の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２３】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１６〜１８の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２４】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、請求項１６〜１８の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２５】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項１６〜１８の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２６】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、請求項１６〜２５の何れかに記載の予防または治療方法。
【請求項２７】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項２６記載の予防または治療方法。
【請求項２８】
眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項２６記載の予防または治療方法。
【請求項２９】
眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項２６記載の予防または治療方法。
【請求項３０】
眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項２６記載の予防または治療方法。
【請求項３１】
眼内血管新生疾患の予防または治療用の医薬組成物を製造するためのクリスタリン阻害物質の使用。
【請求項３２】
クリスタリンがクリスタリンβである、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、請求項３１〜３３の何れかに記載の使用。
【請求項３５】
二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３１〜３３の何れかに記載の使用。
【請求項３８】
クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３１〜３３の何れかに記載の使用。
【請求項３９】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、請求項３１〜３３の何れかに記載の使用。
【請求項４０】
クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、請求項３１〜３３の何れかに記載の使用。
【請求項４１】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、請求項３１〜４０の何れかに記載の使用。
【請求項４２】
眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、請求項４１記載の使用。
【請求項４４】
眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、請求項４１記載の使用。
【請求項４５】
眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、請求項４１記載の使用。
【請求項４６】
配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるｓｉＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、眼内血管新生疾患の予防または治療剤に関するものである。
更に詳しく述べれば、クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤に関するものである。
【背景技術】  血管新生は、一般的に、プロテアーゼによる血管の基底膜の消化・破壊、血管内皮細胞の遊走・増殖及び血管内皮細胞の分化による管腔形成、並びに血管の再構成を伴い進展する。眼内においてこのような血管新生が原因として発症する血管新生疾患としては、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症を始め種々の疾患が知られている。例えば、糖尿病網膜症は、視神経乳頭、網膜、虹彩或いは隅角に血管新生を認める失明原因の最大疾患であり、血管新生がその予後に最も重要な要因となる眼科疾患の一つである。網膜静脈閉塞症は、網膜新生血管膜を認め、硝子体出血を繰り返す重篤な血栓性疾患である。未熟児網膜症は、環境変化に伴うストレス、酸素投与、呼吸窮迫症候群、交換輸血、敗血症等の原因により早産児の網膜に血管新生を認める疾患であり、その大半は自然寛解するが、網膜剥離等の視力障害に至る場合がある。加齢黄斑変性症は、加齢に伴い網膜色素上皮細胞が脆弱化し、主として脈絡膜から網膜下に血管新生が起こり、視機能に障害を来たすことのある疾患である。
その治療方法としては、網膜光凝固術、汎網膜冷凍凝固術、硝子体手術、レーザー毛様体破壊術、毛様体冷凍凝固術、放射線照射が施行されている。また、加齢黄斑変性症はおいては、ビタミンＥなどの抗酸化薬、亜鉛、インターフェロンα２ａやインターフェロンβが投薬され、未熟児網膜症では、イブプロフェンが有効であることが報告されている（例えば、下記文献１参照）。しかしながら、眼内における血管新生の形成機序は未だ解明されておらず、確立された薬物療法も存在しない。
最近、加齢黄斑変性症患者のドルーゼンにおいてクリスタリンが検出されたことが報告されているが、クリスタリンと血管新生の形成との関係については何ら言及されていない（例えば、下記文献２参照）。現在、上述の眼内血管新生疾患に対し、新規な予防又は治療方法の開発が望まれている。
文献１：特開２００２−３２６９２９号公報
文献２：Ｃｒａｂｂ  ＪＷ．、外１１名，「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」，２００２年１１月，第９９巻，第２３号，ｐ．１４６１９−１４６２１
【発明の開示】
本発明の目的は、新規な眼内血管新生疾患の予防又は治療剤を提供することである。
本発明者らは、眼内血管新生疾患の予防または治療に有用な薬剤を見出すべ鋭意検討した結果、クリスタリンが眼内における血管新生の形成に深く関与しており、このクリスタリンの発現を阻害することにより未熟児網膜症を始めとする眼内血管新生疾患における血管新生を抑制できるという驚くべき知見を得、本発明を成すに至った。
即ち、本発明は、
［１］クリスタリン阻害物質を含む、眼内血管新生疾患の予防または治療剤；
［２］クリスタリンがクリスタリンβである、前記［１］記載の予防または治療剤；
［３］クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、前記［２］記載の予防または治療剤；
［４］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、前記［１］〜［３］の何れかに記載の予防または治療剤；
［５］二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、前記［４］記載の予防または治療剤；
［６］ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、前記［５］記載の予防または治療剤；
［７］クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記［１］〜［３］の何れかに記載の予防または治療剤；
［８］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記［１］〜［３］の何れかに記載の予防または治療剤；
［９］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、前記［１］〜［３］の何れかに記載の予防または治療剤；
［１０］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、前記［１］〜［３］の何れかに記載の予防または治療剤；
［１１］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、前記［１］〜［１０］の何れかに記載の予防または治療剤；
［１２］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記［１１］記載の予防または治療剤；
［１３］眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記［１１］記載の予防または治療剤；
［１４］眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、前記［１１］記載の予防または治療剤；
［１５］眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記［１１］記載の予防または治療剤；
［１６］クリスタリン阻害物質を有効量投与することからなる、眼内血管新生疾患の予防または治療方法；
［１７］クリスタリンがクリスタリンβである、前記［１６］記載の予防または治療方法；
［１８］クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、前記［１７］記載の予防または治療方法；
［１９］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、前記［１６］〜［１８］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２０］二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、前記［１９］記載の予防または治療方法；
［２１］ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、前記［２０］記載の予防または治療方法；
［２２］クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記［１６］〜［１８］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２３］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記［１６］〜［１８］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２４］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、前記［１６］〜［１８］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２５］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、前記［１６］〜［１８］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２６］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、前記［１６］〜［２５］の何れかに記載の予防または治療方法；
［２７］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記［２６］記載の予防または治療方法；
［２８］眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記［２６］記載の予防または治療方法；
［２９］眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、前記［２６］記載の予防または治療方法；
［３０］眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記［２６］記載の予防または治療方法；
［３１］眼内血管新生疾患の予防または治療用の医薬組成物を製造するためのクリスタリン阻害物質の使用；
［３２］クリスタリンがクリスタリンβである、前記［３１］記載の使用；
［３３］クリスタリンがクリスタリンβ−Ｂ２である、前記［３２］記載の使用；
［３４］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡである、前記［３１］〜［３３］の何れかに記載の使用；
［３５］二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、前記［３４］記載の使用；
［３６］ｓｉＲＮＡが配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるＲＮＡである、前記［３５］記載の使用；
［３７］クリスタリン阻害物質がクリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記［３１］〜［３３］の何れかに記載の使用；
［３８］クリスタリン阻害物質がクリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドである、前記［３１］〜［３３］の何れかに記載の使用；
［３９］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターである、前記［３１］〜［３３］の何れかに記載の使用；
［４０］クリスタリン阻害物質が、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、及びクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターから選択される組換えベクターにより形質転換された宿主細胞である、前記［３１］〜［３３］の何れかに記載の使用；
［４１］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシスおよびＥａｌｅｓ病から選択される疾患である、前記［３１］〜［４０］の何れかに記載の使用；
［４２］眼内血管新生疾患が糖尿病網膜症である、前記［４１］記載の使用；
［４３］眼内血管新生疾患が未熟児網膜症である、前記［４１］記載の使用；
［４４］眼内血管新生疾患が網膜静脈閉塞症である、前記［４１］記載の使用；
［４５］眼内血管新生疾患が加齢黄斑変性症又は血管新生黄斑症である、前記［４１］記載の使用；
［４６］配列番号１〜７の何れかに示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるｓｉＲＮＡ；等に関するものである。
詳細に述べれば、第一に、本発明者らは、高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、血管新生が認められた網膜組織中にクリスタリンβ−Ｂ２、クリスタリンβ−Ａ３、クリスタリンβ−Ａ１、クリスタリンγ−Ｃなどの種々のクリスタリンのｍＲＮＡが高発現していることをＤＮＡマイクロアレーにて確認した。また、血管新生が認められた網膜組織においてクリスタリンβタンパク質産生が亢進していることをウエスタンブロット法にて確認し、網膜内の新生血管が生じる部位にのみクリスタリンβが存在していることを免疫染色にて確認した。更には、ヒト糖尿病網膜症患者において、網膜新生血管部位にクリスタリンβが局在していることを免疫染色にて確認した。それ故、以上の結果から、血管新生形成やその進展においてクリスタリン、特にはクリスタリンβが深く関与していることが認められる。
更に、本発明者らは、眼内におけるクリスタリン産生を阻害すべく、特異的なクリスタリンβ阻害物質であるｓｉＲＮＡを作製し、高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルに眼内投与した。その結果、網膜組織切片の硝子体側に認められる新生血管核数が顕著に減少していることを観察した。それ故、クリスタリン阻害物質は、眼内に起きる血管新生を阻害でき、血管新生が関与して発症する眼内血管新生疾患の予防又は治療に有用であることが認められた。
即ち、下記配列番号１〜７で示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成されるｓｉＲＮＡを始めとするクリスタリン阻害物質を有効成分として含有させることにより、眼内血管新生疾患の予防または治療に有用な薬剤を提供することができる。
本発明において、眼内血管新生疾患とは、血管新生が関与して発症する眼内疾患をいい、例えば、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、虹彩ルベオーシス、Ｅａｌｅｓ病等を挙げることができる。
本発明において、クリスタリン阻害物質とは、クリスタリン阻害作用を有する物質をいい、クリスタリン阻害作用とは、それ自体クリスタリンの産生或いは作用の阻害に限定されるものではなく、生体内または培養系におけるクリスタリンの産生或いは作用の阻害を含む。クリスタリン阻害物質としては、クリスタリンβに対するものが好ましく、クリスタリンβ−Ｂ２に対するものが更に好ましい。具体的には、（ｉ）クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）クリスタリン阻害作用を有する化合物及びそのセンスオリゴヌクレオチド、並びに（ｉｖ）クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、（ｖ）クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、（ｖｉ）クリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、（ｖｉｉ）クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターによって形質転換された宿主細胞等を例示することができる。二本鎖ＲＮＡおける二本鎖構造は、単一の自己相補性ＲＮＡ鎖又は２つの別個の相補性ＲＮＡ鎖により形成することができる。本発明において二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、クリスタリン遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間ハイブリダイゼーション後に洗浄）するＲＮＡ及びその相補的ＲＮＡより構成される二本鎖ＲＮＡが含まれる。ストリンジェントな条件下とは、通常、クリスタリン遺伝子又はその一部とＲＮＡの間において少なくとも９０％の配列同一性を確立するために当該技術分野における当業者により用いられる条件を指す。ハイブリダイゼーション及びそれに続く洗浄の条件としては、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｃｈａｐ．２．１０，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を参照することができる。上記の配列同一性は、当業者に公知の配列比較又はアラインメント・アルゴリズム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７））により計算することができる。本発明におけるクリスタリン阻害物質としては、特には、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の機能を部分的又は完全��喪失させクリスタリンの発現を阻害する、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを意味する、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）が挙げられる。このようなｓｉＲＮＡとしては、実施例１記載の下記配列番号１〜７の何れかに示されるＲＮＡ鎖及びその相補鎖より構成される二本鎖ＲＮＡが好ましい。尚、本発明において、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターとは、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列を複製し、標的組織または宿主細胞内で当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができる組換えベクターを意味する。クリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターとは、クリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドを標的組織または宿主細胞内で発現することができる組換えベクターを意味する。また、クリスタリン阻害作用を有する化合物としては、クリスタリン抗体を含むタンパク質の他、クリスタリン阻害作用を有する低分子化合物等が含まれる。
本発明で使用されるｓｉＲＮＡは、例えば、酵素的に或いは部分的又は全有機合成的に一般的に行われているＲＮＡ合成技術を用いて作製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｄｎａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）；Ｏｌｉｇｏ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｎｉｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．，（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．，（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）他）。
本発明のクリスタリン阻害物質の使用方法としては、上述のクリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ発現組換えベクター、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクター、クリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチド発現組換えベクターや、それらの組換えベクターによって形質転換された宿主細胞を生体内の標的組織に適当な方法により導入し、所望の二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、各種化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを発現させることによる遺伝子的な予防または治療剤としての使用や、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする医薬組成物を経口または非経口的に投与させることによる薬物的な予防または治療剤としての使用を挙げることができる。非経口的な投与方法としては、例えば、眼内への局所投与や静脈内投与を挙げることができる。
本発明において使用できるベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター）、リポソームベクター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等を挙げることができる。
組換えベクターにおいては、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド等をコードする塩基配列の他に、これを実際に標的組織または宿主細胞に導入して所望の二本鎖ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等を発現させるために、その発現を制御する塩基配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列）や微生物、昆虫細胞または動物培養細胞等を選択するための遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。
本発明において使用できる宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、並びにＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ミンク肺上皮細胞（例えば、Ｍｖ１Ｌｕ細胞）、リンパ球、線維芽細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）、血液系細胞、腎細胞（例えば、２９３細胞）および腫瘍細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞）等の動物細胞を挙げることができる。
組換えベクターの標的組織または宿主細胞への導入方法としては、ＨＶＪリポソーム法（金田，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２，ｐ．７８（１９９４）；森下等，実験医学，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１５，ｐ．１５８（１９９４））、クリスタリン阻害物質を注射等により直接投与する方法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃による方法（Ｔ．Ｍ．Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，ｐｐ．２８６−２９１（１９９２））、リポフェクション法によって投与する方法（Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４４，ｐ．１２８５（１９９０））、ベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等）を使う方法等を挙げることができる。
クリスタリン阻害物質を有効成分とする医薬組成物を実際に眼内血管新生疾患の予防または治療において用いる場合、用法に応じ種々の製剤形態のものが使用される。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤、注射剤、直腸投与剤、座剤等を挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
クリスタリン阻害物質を含有するこれらの各種医薬組成物は、上記クリスタリン阻害物質を有効成分として、通常用いられている賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤等の医薬品添加物と適宜混合または希釈若しくは溶解し、常法に従い調剤することにより製造することができる。
クリスタリン阻害物質の眼内血管新生疾患に対する薬物的な予防または治療における投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度や疾患の種類等を考慮して適宜決定することができる。また、クリスタリン阻害物質の眼内血管新生疾患に対する遺伝的な予防または治療における投与量も同様にして適宜決定することができる。
本発明によれば、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、クリスタリン阻害作用を有する化合物またはそのセンスオリゴヌクレオチドをコードする塩基配列またはこれを含むベクター、またはそのベクターにより形質転換させた宿主細胞を用いて標的組織に接触又は導入することにより、眼内血管新生疾患の発症または進展を抑制することができる。また、クリスタリン阻害作用を有する二本鎖ＲＮＡ、クリスタリンに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはクリスタリン阻害作用を有する化合物又はそのセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を経口または非経口的に投与することにより、眼内血管新生疾患の発症または進展を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、高濃度負荷マウスの摘出網膜新生血管におけるクリスタリンβタンパク質の発現量を示すウエスタンブロット像である。縦軸は、タンパク質の重量（ｋＤａ）を示し、横軸は誕生から網膜摘出迄の経過日数（日）を示し、ＲＯＰ  Ｐ１３とは生後１３日を、ＲＯＰ  Ｐ１４とは生後１４日を、ＲＯＰ  Ｐ１５とは生後１５日を、ＲＯＰ  Ｐ１６とは生後１６日を、ＲＯＰ  Ｐ１７とは生後１７日を、ＲＯＰ  Ｐ１８とは生後１８日をそれぞれ意味する。
第２図は、マウス網膜内の新生血管におけるクリスタリンβの発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。
第３図は、マウス網膜内の新生血管におけるクリスタリンβの発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。
第４図は、ヒト糖尿病網膜症患者におけるクリスタリンβの発現部位を示す共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真である。
【実施例】  本発明の内容を以下の試験例および実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はその内容に限定されるものではない。
（試験例１）
高酸素負荷マウス網膜血管新生モデルの作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを生後７日から５日間、母親と共に７５％酸素下にて飼育した後、通常酸素濃度に戻した（以下、高酸素負荷群という）。対照群のマウスは生後より通常酸素濃度下にて飼育した。麻酔下にてＦＩＴＣ（蛍光性イソチオシアネート）−デキストラン５０ｍｇ／ｍＬを左心室に注入した後、眼球を摘出した。フラットマウント標本を作製して蛍光眼底造影を行う網膜血管新生の評価を行った。また、摘出眼球を４％パラホルムアルデヒドに固定し、乳頭を通る垂直面で半切したパラフィン包埋切片を作製してヘマトキシリン−エオジン染色を行い光学顕微鏡下で網膜血管新生の評価を併せて行った。その結果、高酸素負荷群では、生後１２日後には新生血管は認められなかったが、生後１５日及び１７日に新生血管を顕著に認めた。
（試験例２）
網膜新生血管におけるｍＲＮＡの発現量の確認
試験例１記載のマウスを用いて、生後１５日に高酸素負荷群および対照群より眼球を摘出し、摘出網膜よりＲＮＡを抽出した。ジーンチップＭＧＵ７４Ａｖ２（アフィメトリックス社製）を用いてハイブリダイゼーションを行い、両群間におけるＲＮＡ発現量の増減を比較検討した。その結果は、以下の表１に示す通りであり、網膜上の新生血管においては、クリスタリンβ−Ｂ２、クリスタリンβ−Ａ３／Ａ１やクリスタリンγ−ＣのｍＲＮＡが顕著に高発現していることが確認された。
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（試験例３）
網膜新生血管におけるクリスタリンβタンパク質の発現量の確認
試験例１記載の高酸素負荷群のマウスを用いて、生後１３〜１８日に眼球を摘出し、摘出網膜よりタンパク質を抽出し、ウエスタンブロット法にてクリスタリンβの発現量を確認した。その結果は、第１図に示す通りであり、網膜上の新生血管においては、生後１４及び１５日にクリスタリンβタンパク質が高発現していた。
（試験例４）
網膜新生血管におけるクリスタリンβの発現部位の確認
試験例１にて作製したパラフィン包埋切片を用いて、クリスタリンβ特異的ペプチド抗体（ＳｔｒｅｓＧｅｎＳＰＡ−２３０）及び血管内皮細胞特異的蛍光抗体（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ）にてクリスタリンβの発現部位を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で確認した。その結果は、第２図及び第３図に示す通りであり、クリスタリンβの発現が血管内皮細胞に局在的に認められた。特に、硝子体側に突出している新生血管部位（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｕｆｔ）に多く発現していた。
（試験例５）
ヒト糖尿病網膜症患者におけるクリスタリンβの発現部位の確認
ヒト糖尿病網膜症患者から摘出した網膜新生血管のパラフィン包埋切片を用いて、クリスタリンβ特異的ペプチド抗体（ＳｔｒｅｓＧｅｎＳＰＡ−２３０）及び血管内皮細胞特異的蛍光抗体（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ）にてクリスタリンβの発現部位を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で確認した。その結果は、第４図に示す通りであり、クリスタリンβの発現が新生血管部位に局在的に認められた。
【実施例１】クリスタリンβに対するｓｉＲＮＡの作製
酵素的に或いは部分的又は全有機合成的に一般的に行われているＲＮＡ合成技術を用いて、下記配列番号１で示されるＲＮＡ及びその相補的ＲＮＡを作製した後、アニーリングによりそのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１）を作製した。
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また、同様にして、下記配列番号２〜７で示されたＲＮＡから相当するｓｉＲＮＡを作製することができる（ｓｉＲＮＡＮｏ．２〜７）。
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【実施例２】網膜血管新生抑制効果の確認試験
試験例１記載の高酸素負荷群のマウスを用いて、生後１２、１４及び１６日に実施例１記載のｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１（５μｇ）を生理食塩水に溶解して静注した（ｓｉＲＮＡ投与群）。尚、対照群には、生理食塩水のみ静注した。生後１７日に網膜を摘出した後、摘出眼球を４％パラホルムアルデヒドに固定し、乳頭を通る垂直面で半切したパラフィン包埋切片を作製してヘマトキシリン−エオジン染色を行い光学顕微鏡下で網膜新生血管核数を測定し、血管新生の抑制効果を評価した。その結果は、表２に示す通りである。ｓｉＲＮＡの投与により顕著な血管新生の抑制効果が確認された。
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【産業上の利用可能性】  本発明は、クリスタリン阻害物質を有効成分として使用した眼内血管新生疾患の予防または治療に関するものである。本発明により、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、網膜静脈閉塞症、加齢黄斑変性症等の各種眼内血管新生疾患の予防または治療剤を提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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