(57)【要約】本発明は、下記一般式2004031165.tif 000012［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ結合している炭素原子と一緒になって、ヒドロキシジメチルヘキサン環を形成するか、またはＲ１が水酸基、Ｒ２がイソヘキセニル基を示す。］で表される新規なカルコン類化合物、その誘導体又はその塩に関する。また、本発明は、前記化合物を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞保護、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患の治療剤又は予防剤；神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤；並びに上記疾患の治療又は予防用の食品、飲料又は飼料に関する。
2004031165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）で表される化合物、その誘導体又はその塩。
2004031165.tif 000011
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ結合している炭素原子と一緒になって、ヒドロキシジメチルシクロヘキサン環を形成するか、またはＲ１が水酸基を示し、この場合、Ｒ２はイソヘキセニル基を示す。）
【請求項２】
請求項１記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする当該化合物に感受性を示す疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
該化合物に感受性を示す疾患が治療又は予防に神経細胞保護、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患である請求項２記載の治療剤又は予防剤。
【請求項４】
請求項１記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤。
【請求項５】
請求項１記載の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患の治療用又は予防用の食品、飲料又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は新規なカルコン類化合物、および当該化合物の生理作用を利用した医薬、飲食品等に関する。
【背景技術】  カルコン類化合物とは、以下の式のカルコン骨格を有する化合物の総称であり、これらの化合物として、天然物からの抽出や合成によって得られたさまざまな化合物が知られている。
2004031165.tif 000003
また、これらの化合物の生理活性については、化合物によってそれぞれ多種多様であり、例えば細胞毒性、抗がん活性、化学防御、抗変異原性、抗菌活性、抗ウィルス活性、抗原虫性、殺虫作用等が知られている（例えば、Ｊ．Ｒ．Ｄｉｍｍｏｃｋ  他３名，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（オランダ），１９９９年，Ｖｏｌ．６，ｐ．１１２５〜１１４９参照）。また、本発明者らは、これらのカルコン類化合物に神経成長因子（ＮＧＦ）産生増強作用があることを見出している（例えば、国際公開第０１／５４６８２号パンフレット参照。）。
【発明の開示】
本発明の目的は、新規なカルコン類化合物とその生理作用を利用した医薬、もしくは飲食品等を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、以下の一般式（１）で表される化合物、その誘導体又はその塩に関する。
2004031165.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ結合している炭素原子と一緒になって、ヒドロキシジメチルシクロヘキサン環を形成するか、またはＲ１が水酸基を示し、この場合、Ｒ３はイソヘキセニル基を示す。）
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、当該化合物に感受性を示す疾患の治療剤または予防剤に関する。本発明の第２の発明において、当該化合物に感受性を示す疾患としては、神経細胞保護、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患が例示される。
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤に関する。
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の化合物を有効成分として含有することを特徴とする、神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患の治療用又は予防用の食品、飲料又は飼料に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、化合物ａの質量スペクトルを示す図である。
第２図は、化合物ａの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第３図は、化合物ａの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第４図は、化合物ｂの質量スペクトルを示す図である。
第５図は、化合物ｂの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第６図は、化合物ｂの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
第７図は、化合物ａ、化合物ｂによるＮＯ産生抑制作用を示す図である。
第８図は、化合物ａ、化合物ｂによるＩＬ−６産生抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者らは上記一般式（１）で表される食用植物由来の新規なカルコン類化合物、その誘導体又はその塩（以下、本発明の化合物と称することがある）と、当該化合物の有する神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用およびインターロイキン産生抑制作用を見出し、該化合物を有効成分とする医薬、飲食品、飼料の提供が可能になった。なお、本発明の化合物としては、以下の式（Ａ）で示す（Ｅ）−１−（５，６，７，８，８ａ，１０ａ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８，８，１０ａ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−４−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ、および以下の式（Ｂ）で示す（Ｅ）−１−（３，４，−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−（３−ｉｓｏｈｅｘｅｎｅｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−８−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｅ−１−ｏｎｅが例示される。
2004031165.tif 000005
本発明において有効成分として使用される、本発明の化合物は、天然物由来でもよく、合成品、半合成品でもよい。天然物としては食用植物由来が好ましく、食用植物としてはセリ科植物のアシタバが例示される。また、本発明の化合物に種々の異性体が存在する場合、いずれも任意に本発明において使用することができる。本発明の化合物は、単独で、若しくは２種以上を混合して使用することができる。
本明細書において上記一般式（１）で表される化合物の誘導体とは、該化合物を元化合物として合成される化合物であって、一般式（１）で表される化合物と同等の作用、すなわち、神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用またはインターロイキン産生抑制作用を有する化合物である。かかる誘導体としては、例えば上記一般式（１）で表される化合物のエステル体、エーテル体、配糖体など、体内で容易に加水分解し、所望の効果を発揮し得る化合物（プロドラッグ）を挙げることができる。かかるプロドラッグの調製は公知の方法に従えばよい。なお、かかる誘導体は、それらの塩であってもよい。
また、本発明の化合物において、塩としては薬理学的に許容される塩が好ましい。本発明で使用される塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、有機塩基との塩などが例示される。かかる塩としては薬理学的に許容される塩が好ましい。なお、本発明において使用される薬理学的に許容される塩とは生物に対して実質的に無毒である塩を意味する。当該塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムまたはプロトン化されたベンザチン（Ｎ，Ｎ′−ジ−ベンジルエチレンジアミン）、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグラミン（Ｎ−メチルグルカミン）、ベネタミン（Ｎ−ベンジルフェネチルアミン）、ピペラジンもしくはトロメタミン（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）との塩が挙げられる。
天然物由来の本発明の化合物の製造は、公知の製造方法を組み合わせて行うことができる。例えば、上記一般式（１）で表される化合物含有物、例えばアシタバ等の植物から当該化合物を精製することができる。精製手段としては化学的方法、物理的方法等の公知の精製手段を用いればよく、ゲルろ過法、分子量分画膜による分画法、溶媒抽出法、イオン交換樹脂等を用いた各種クロマトグラフィー法等の従来公知の精製方法を組合せて本発明の化合物を精製すればよい。例えば、本発明の化合物の製造は、下記実施例１及び２を参考にして行うことができる。
また、例えば、天然物由来のカルコン類化合物を原料として有機合成することにより半合成品が得られ、全てを有機合成することにより合成品が得られる。有機合成の方法は、例えば、Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ  Ｌａｔｔａｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ．２００２，Ｎｏ．６，ｐ９４２−９４６；Ｌ．Ｃｌａｉｓｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｒ．１８８１，Ｎｏ．１４，ｐ２４６０等を参照すればよい。
本発明により、本発明の化合物を有効成分として含有する、当該化合物に感受性を示す疾患の治療剤又は予防剤が提供される。ここで当該化合物に感受性を示す疾患とは、当該化合物により治療効果若しくは予防効果が得られ得る疾患をいい、該疾患としては、例えば神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患が挙げられる。
神経細胞死に伴う脳機能障害は、脳卒中、老年痴呆、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳虚血など多くの中枢変性疾患の主たる原因として捉えられている。これらの疾患において観察される神経細胞死の機序としてグルタミン酸−Ｃａ２＋−ＮＯ説が提唱されており、神経細胞死のメディエーターとしてＮＯの役割が注目されている。
本発明の化合物は実施例４に記載のとおり、ＮＯドナーからの神経細胞保護作用（ＮＯ毒性抑制作用）を有することから、神経細胞保護を要する疾患に対して有用な化合物である。前記神経細胞保護を要する疾患としては、例えば脳卒中、老年痴呆、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、脳虚血等の疾患が例示される。
固形がんの増大に血管新生は必須であるが、血管内皮増殖因子／血管透過性亢進因子（ＶＥＧＦ）はこの過程に重要な役割を演じている。さまざまながん細胞においてＶＥＧＦはＮＯによって誘導される。すなわち、がん細胞のＮＯ産生を抑制することによって、ＶＥＧＦ産生が抑制され、その結果、がん組織周辺での血管新生が阻害され、がんを脱落させることができる。
また、ＮＯはｐＨ中性の生理的条件下でアミンと反応してニトロソアミンを生成する。このニトロソアミンはＤＮＡに損傷を与えることにより発がん性を示すことが知られている。また、疫学的にがんとの関連が高い肝吸虫感染患者や肝硬変患者においてＮＯ産生は亢進している。したがって、ＮＯ産生を抑制することによりハイリスクグループの発がんを予防することができる。
ＮＯはまた、炎症性病変に特徴的に認められる浮腫、すなわち血管透過性亢進作用を誘発し〔Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第８５巻、第３３１〜３３４ページ（１９９４）〕、また炎症性メディエーターであるプロスタグランジン類の生合成を亢進させる〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、第９０巻、第７２４０〜７２４４頁（１９９３）〕。一方、ＮＯはスーパーオキシドラジカルと速やかに反応してペルオキシ亜硝酸イオンを生じ、ペルオキシ亜硝酸イオンが炎症性の細胞、組織障害を引き起こすとも考えられている。
また、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病などの関節炎患者の病変部の関節液には同患者の正常な関節や健常人の関節の関節液に比べて高濃度のＮＯが含まれている。
本発明の化合物は実施例５に記載のとおり、ＮＯ産生抑制作用を有することから、上記のがん性疾患および炎症性疾患に対して有用な化合物である。本発明の化合物が有効なＮＯ産生抑制を要する疾患としては、例えばがん性疾患、炎症性疾患、慢性関節性リウマチ、変形性関節リウマチ、痛風性関節炎、ベーチェット病等の疾患が挙げられる。
アルドースレダクターゼ（Ａｌｄｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：以下、ＡＲと称することがある。）は生体内においてグルコース代謝経路の一つであるポリオール経路に関与する酵素である。該経路はＡＲが関与するグルコースからソルビトール系の還元経路、およびソルビトールデヒドロゲナーゼ（以下、ＳＤＨと称することがある。）が関与するソルビトールからＤ−フルクトースへの脱水素反応経路からなる。細胞内に流入するグルコース量が増大すると、解糖系で処理できないグルコースがポリオール経路を亢進させる。ところが、ＳＤＨ活性はＡＲ活性より低いことから、グルコースの流入が続くと中間代謝物のソルビトールが大量に産生されることになる。このようなソルビトールの蓄積に起因するさまざまな疾患、すなわち糖尿病合併症として起こる疾患としては、例えば白内障、末梢神経疾患、腎疾患、白血球の食菌作用の低下に起因する感染症、糖尿病性昏睡、大血管壁におけるアテローム変性による動脈硬化等の疾患が知られている。
本発明の化合物は実施例３に記載のとおり、ＡＲ阻害作用を有することから、上記の糖尿病合併症に対して有用な化合物である。本発明の化合物が有効なＡＲ阻害作用を要する疾患としては、例えば糖尿病合併症として引き起こされる疾患、例えば白内障、末梢神経疾患、腎疾患、白血球の食菌作用の低下に起因する感染症、糖尿病性昏睡、大血管壁におけるアテローム変性による動脈硬化等の疾患が例示される。また、本発明の化合物は、他の糖尿病治療剤と併用することもできる。
インターロイキンはリンパ球、単球などが生産するタンパク質性生理活性物質の総称であり、インターロイキン−１〜２５の存在が知られている。インターロイキン−６（以下、ＩＬ−６と称することがある。）はＢ細胞の最終分化を誘導する因子であり、また免疫応答だけでなく、造血系、神経系の細胞分化や急性反応に関与しており、さらに種々の免疫異常や炎症性疾患、リンパ系腫瘍の発症とも密接に関係している。また、ＩＬ−６は、Ｂ細胞に対し抗体産生を誘導し、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡの各クラスの免疫グロブリンを産生するが、ＩＬ−４とは異なりクラススイッチには関与しない。また、ＩＬ−６は、Ｂ細胞やプラズマサイトの増殖因子としても働いている。一方、Ｔ細胞系にも関与しており、Ｔ細胞を増殖させたり、分化させたりする。ＩＬ−６は、造血系にも関与しており、ＩＬ−３と協調して、Ｇ０期を短縮させることにより造血幹細胞を増殖させる。また、巨核球の成熟を促し血小板の増加を誘導する。ＩＬ−６は、細菌やウイルス感染、悪性腫瘍など生体が即座に反応する急性期反応にも関与している。ＩＬ−６は、神経系にも関与しており、グリオブラストーマやアストロサイトーマなどの神経系細胞から分泌され、神経系の分化誘導にも働く。
慢性関節リウマチや全身性エリトマトーデスでは、Ｂ細胞の活性化がみられ、患者の関節液中に高濃度のＩＬ−６が存在することが知られている。また、全身性リンパ節腫脹を特徴とするＣａｓｔｌｅｍａｎ症候群では、血中ＩＬ−６濃度が非常に高いことが知られている。また、自己免疫疾患様症状をしめす心房粘液腫の患者では、腫瘍細胞から大量のＩＬ−６が産生されていることが知られている。また、多発性骨髄腫患者由来のミエローマ細胞の増殖が抗ＩＬ−６抗体で抑制されることより、ＩＬ−６は、ミエローマ細胞の自己増殖因子である可能性が高いことが知られている。さらに、原発性糸球体腎炎患者の尿中にもＩＬ−６が含まれており、ＩＬ−６は腎メサンギウム細胞の増殖因子として働いていることが知られている。
本発明の化合物は実施例６に記載のとおり、ＩＬ−６産生抑制作用を有することから、ＩＬ−６産生抑制を要する疾患に対して有用な化合物である。本発明の化合物が有効な、ＩＬ−６産生抑制を要する疾患としては、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｂ細胞異常症、Ｃａｓｔｌｅｍａｎ症候群、自己免疫疾患、心房内粘液腫、多発性骨髄腫、原発性糸球体腎炎、メサンギウム細胞増殖性糸球体腎炎、形質細胞腫、骨髄腫、後天性免疫不全症（ＡＩＤＳ）等の疾患が例示される。
上記した本発明の治療剤又は予防剤は、本発明の化合物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せて製剤化することにより製造できる。一般的には、これらの化合物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることができる。
医薬用担体は、治療剤または予防剤の投与形態および剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、たとえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。
以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における有効成分の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該有効成分を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。
本発明の治療剤または予防剤における前記有効成分の含有量は、特に限定はないが、通常、０．００１〜８０重量％、好適には０．０１〜５０重量％、特に好適には０．１〜２０重量％が例示される。
本発明の治療剤又は予防剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され、一定ではないが、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、ヒト（例えば成人）１日当り１０μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
また、本発明の化合物を有効成分として含有する神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤を提供することもできる。本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤としては、前記有効成分そのものであってもよく、また、前記有効成分を含む組成物であってもよい。本発明の態様においては、有効成分としての塩は薬理学的に許容される塩が好適である。本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤は、たとえば、前記有効成分を当該有効成分と同じ用途に使用可能な他の成分などと配合し、上記治療剤または予防剤の製造方法に準じて通常使用される試薬の形態に製造すればよい。本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤における前記有効成分の含有量は、これらの投与方法、使用目的などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではないが、通常、０．００１〜１００重量％、好適には０．０１〜８０重量％、特に好適には０．１〜８０重量％が例示される。また、使用量も本発明の所望の効果の発現が得られ得るようであれば特に限定されるものではない。特に、生体に投与して使用する場合には、好ましくは前記治療剤または予防剤における有効成分の投与量範囲内で有効成分を投与できるような量で使用すればよい。本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤は、神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を必要とする疾患において有用である。また、本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤はこれらの疾患に対する薬物のスクリーニングにも有用である。さらに本発明の神経細胞保護剤、ＮＯ産生抑制剤、アルドースレダクターゼ阻害剤又はインターロイキン産生抑制剤は、これらの疾患の物理的変化に関する機能研究にも有用である。
本発明の飲食品又は飼料は、前記有効成分を含有してなる。すなわち、本発明の化合物を含有、添加および／または希釈してなる食品、飲料又は飼料であり、その神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用により、神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患の症状改善、予防に極めて有用である。
なお、本明細書において、前記「含有」とは食品、飲料または飼料中に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、前記「添加」とは食品、飲料または飼料の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、前記「希釈」とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料または飼料の原料を添加するという態様をいうものである。
本発明の食品、飲料又は飼料の製造方法は、特に限定はないが、一般に用いられている食品、飲料又は飼料の製造方法を採用でき、製造された食品、飲料又は飼料に、本発明の化合物が有効成分として高含有されていればよく、通常の飲食品、飼料より高含有されておれば良い。なお、本明細書において、高含有とは、原料、例えばアシタバの単位重量あたりの本発明の化合物重量よりも本発明の食品、飲料又は飼料の単位重量あたりの本発明の化合物重量の方が多いことを意味する。
本発明の食品又は飲料は、特に限定するものではないが、例えば、穀物加工品、油脂加工品、大豆加工品、食肉加工品、水産製品、乳製品、野菜・果実加工品、菓子類、アルコール類、嗜好飲料、調味料、缶詰・瓶詰・袋詰食品、半乾燥または濃縮食品、乾燥食品、冷凍食品、固形食品、液体食品、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。
本発明の食品または飲料には前記有効成分が単独もしくは複数含有、添加および／または希釈されており、その神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を発現するための必要量が含まれていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状の経口的に摂取可能な形状物も包含する。
本発明の食品又は飲料中の前記有効成分の含有量は特に限定されず、その官能と活性発現の観点から適宜選択できるが、例えば食品１００重量％中、好ましくは０．００００１重量％以上、より好ましくは０．０００１〜１０重量％、更に好適には０．０００６〜６重量％であり、例えば、飲料１００重量％中、好ましくは０．００００１重量％以上、より好ましくは０．０００１〜１０重量％、更に好適には０．０００６〜６重量％である。また本発明の食品又は飲料は、好ましくは、それらに含有される有効成分が、ヒト（例えば成人）１日当たり１０μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重となるように摂取すればよい。
また、本発明は、前記有効成分を含有してなる、神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を有する生物用の飼料を提供するものであり、さらに、別の一態様として、前記有効成分を生物に投与することを特徴とする生物の飼育方法をも提供する。また、本発明の別の一態様として、前記有効成分を含有することを特徴とする生物飼育用剤が提供される。ここで、「含有」とは、前記の含有、添加および／または希釈を意味する。
これらの発明において、生物とはたとえば養殖動物、ペット動物などであり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類または貝類が例示される。飼料としては体調の維持および／または改善用飼料が例示される。生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。
これらの発明によれば、それらを適用する前記例示するような生物において、本発明に使用される前記有効成分の神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用に基づき、本発明の前記治療剤または予防剤によるのと同様の効果の発現が期待できる。すなわち、本発明の飼料、生物用飼育用剤は、それらが適用される生物における神経細胞保護、ＮＯ産生抑制、アルドースレダクターゼ阻害又はインターロイキン産生抑制を要する疾患の治療または予防効果を有する。
本発明に使用される前記有効成分は通常、対象生物に１日当たり１０μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、好ましくは５０μｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１００μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重投与される。投与は、たとえば、当該有効成分を、対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加混合することで行うことができる。また、前記有効成分の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜設定すれば良いが、０．００１〜１５重量％の割合が好適である。
本発明の飼料の製造法に特に限定はなく、また配合も一般の飼料に準ずるものであればよく、製造された飼料中に神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を有する本発明の前記有効成分が含まれていればよい。
生物飼育用剤は、前記飼料の場合に準じて、製造、使用等すればよい。
本発明が適用できる生物としては限定はないが、養殖動物としては、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、ニワトリ、アヒル、七面烏、駝鳥などの家禽、ペット動物としてはイヌ、ネコなどが挙げられ、広く適用できる。
神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を有する本発明に使用される前記有効成分を含んでなる飼料を摂取させること、または神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を有する本発明に使用される前記有効成分の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、ペット動物などの体調を良好に維持し、または、改善させたりすることができる。なお、ここに例示する態様は、本発明により提供される生物の飼育方法の一態様をなす。
本発明において医薬、飲食品、飼料中の本発明の化合物含有量はその投与、摂取等により、生体内で所望の効果が得られ得る濃度であればよく、通常の飲食品等中の本発明の化合物の含有量以上に高含有されているのが望ましい。
本発明で使用する本発明の化合物またはその塩はマウスの経口投与において毒性は認められない。
【実施例】  以下、本発明を実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１  （Ｅ）−１−（５，６，７，８，８ａ，１０ａ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８，８，１０ａ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−４−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅの調製
（１）アシタバ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｋｅｉｓｋｅｉ  Ｋｏｉｄｚ．）根部の乾燥粉末５．８ｋｇに２４リットルの酢酸エチルを加え、室温で撹拌下、３時間抽出を行い、吸引ろ過後、酢酸エチル抽出液と残査に分けた。酢酸エチル抽出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮後、クロロホルムに溶解し、全量をシリカゲルＢＷ−３００ＳＰ（富士シリシア化学社製：７５０ｍｌ）に吸着させた。次いで、ヘキサン：クロロホルム＝２：５（７５０ｍｌ）、クロロホルム（１０００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝１０：１（１１００ｍｌ）を順に用いて吸着物を段階的に溶出した。
（２）実施例１−（１）で得られたクロロホルム：メタノール＝１０：１溶出画分を濃縮乾固後、クロロホルム３０ｍｌに溶解し、うち半容をシリカゲル（ＢＷ−３００ＳＰ、３００ｍｌ）に吸着させた。次いで、クロロホルム（１８００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：７（３００ｍｌ）、酢酸エチル（３００ｍｌ）を順に用いて吸着物を段階的に溶出した。
（３）実施例１−（２）で得られた酢酸エチル溶出画分を濃縮乾固後、クロロホルム：メタノール＝５０：１（２０ｍｌ）に溶解し、シリカゲル（ＢＷ−３００ＳＰ、３００ｍｌ）に吸着させた。続いて、クロロホルム：メタノール＝５００：１０（１２００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：１３（５００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：１９（５００ｍｌ）、クロロホルム：メタノール＝５００：２２（８００ｍｌ）、酢酸エチル（５００ｍｌ）を順に用いて段階的に溶出し、１フラクションに１８ｍｌずつ分取した。
（４）実施例１−（３）で得られたシリカクロマトフラクションの番号１１５から１５５を集めて減圧濃縮し、７ｍｌのジメチルスルホキシドに溶解した。うち半容を逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。樹脂はコスモシール１４０
Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク社製：樹脂量５０ｍｌ）を用いた。続いて、蒸留水（４０ｍｌ）、２０％エタノール水溶液（５０ｍｌ）、３０％エタノール水溶液（５０ｍｌ）、５０％エタノール水溶液（１回目溶出５０ｍｌ、その後２回目溶出５０ｍｌ）、エタノール（５０ｍｌ）を順に用いて溶出を行った。
（５）実施例１−（４）の５０％エタノール水溶液溶出画分のうち１回目溶出部分５０ｍｌを減圧濃縮した後、３ｍｌの５０％エタノール水溶液に溶解し、逆相クロマトグラフィーを用いて分画した。以下にその条件について述べる。カラムはＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍ×３０ｃｍ：東ソー社製）を用いた。溶媒として蒸留水とアセトニトリルを容量比１対１で混合したものを用い、溶出速度は５ｍｌ／ｍｉｎ、検出は２１５ｎｍで行なった。溶出液の紫外線吸収を指標に逆相クロマトフラクション１〜５を採取した。
（６）実施例１−（５）で得た逆相クロマトフラクション２（保持時間２４．１分の検出のピークを含むフラクション）の質量スペクトル（ＭＳ）を質量分析計（ＤＸ３０２：日本電子社製）によりＦＡＢ−ＭＳの手法で測定した。マトリックスにはｍ−ニトロベンジルアルコールを用いた。その結果、ｍ／ｚ  ４０７（Ｍ−Ｈ）−のピークを検出した。第１図に質量スペクトルを示す。第１図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。次いで、逆相クロマトフラクション２を核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル装置（ＡＶＡＮＣＥ６００型：ブルカ・バイオスピン社製）を用い、各種ＮＭＲスペクトルを測定し構造解析した。以下にＮＭＲの帰属の信号を示す。なお、ピークの帰属の番号は以下の式（Ｃ）のとおりである。
2004031165.tif 000006
１Ｈ−ＮＭＲ：δ０．８１（３Ｈ，ｓ，７”−ＣＨ３），１．０３（３Ｈ，ｓ，７”−ＣＨ３），１．２５（３Ｈ，ｓ，３”−ＣＨ３），１．５４（１Ｈ，ｍ，５”−Ｈ），１．６１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１３．２Ｈｚ，２”−Ｈ），１．７１（１Ｈ，ｍ，５”−Ｈ），１．７５（１Ｈ，ｍ，４”−Ｈ），１．８７（１Ｈ，ｍ，４”−Ｈ），２．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１３．２，１６．８Ｈｚ，１”−Ｈ），２．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１６．８Ｈｚ，１”−Ｈ），３．２７（１Ｈ，ｍ，６”−Ｈ），４．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，６”−ＯＨ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，５’−Ｈ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３−Ｈおよび５−Ｈ），７．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，６’−Ｈ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，β−Ｈ），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，α−Ｈ），７．５１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２−Ｈおよび６−Ｈ），９．９７（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，４−ＯＨ），１０．２２（１Ｈ，ｂｒ−ｓ，４’−ＯＨ）
但し、１Ｈ−ＮＭＲにおいてサンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシド中の残留プロトンの化学シフト値を２．５１ｐｐｍとして表した。第２図に１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第２図において横軸は化学シフト値、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１５．３（７”−ＣＨ３），１８．８（１”−Ｃ），２０．７（３”−ＣＨ３），２８．１（７”−ＣＨ３），２８．９（５”−Ｃ），３８．３（４”−Ｃ），３８．９（７”−Ｃ），４６．４（２”−Ｃ），７６．８（６”−Ｃ），７７．９（３”−Ｃ），１０７．７（５’−Ｃ），１１０．４（３’−Ｃ），１１６．８（３−Ｃおよび５−Ｃ），１２０．８（１’−Ｃ），１２５．２（α−Ｃ），１２７．１（１−Ｃ），１３０．２（６’−Ｃ），１３０．８（２−Ｃおよび６−Ｃ），１４１．２（β−Ｃ），１５４．９（２’−Ｃ），１６０．３（４−Ｃ），１６０．６（４’−Ｃ），１８９．８（Ｃ＝０）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲにおいてサンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシドの化学シフト値を４０．２ｐｐｍとして表した。第３図に１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第３図において横軸は化学シフト値、縦軸はシグナルの強度を示す。
以上、逆相クロマトフラクション２について行った質量スペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、逆相クロマトフラクション２が（Ｅ）−１−（５，６，７，８，８ａ，１０ａ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−１，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−８，８，１０ａ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−９Ｈ−ｘａｎｔｈｅｎ−４−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅ（分子量４０８、以下化合物ａ）であることを確定した。
実施例２  （Ｅ）−１−（３，４，−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−（３−ｉｓｏｈｅｘｅｎｅｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−８−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｏｎｅの調製
（１）実施例１−（５）で得た逆相クロマトフラクション４（保持時間３６．２分の検出のピークを含むフラクション）の質量スペクトルを実施例１−（６）と同様の方法で測定した。マトリックスにはｍ−ニトロベンジルアルコールを用いた。質量分析によりｍ／ｚ  ４０７（Ｍ−Ｈ）−のピークを検出した。第４図に逆相クロマトフラクション４の質量スペクトルを示す。第４図において、横軸はｍ／ｚ値、縦軸は相対強度を示す。次いで、逆相クロマトフラクション４のＮＭＲスペクトルを実施例１−（６）と同様の方法で測定した。ＮＭＲの帰属の信号を以下に示す。なお、ピークの帰属の番号は以下の式（Ｄ）のとおりである。
2004031165.tif 000007
１Ｈ−ＮＭＲ：δ１．２０（３Ｈ，ｓ，３”−ＣＨ３），１．３６（３Ｈ，ｓ，７”−ＣＨ３），１．５７（３Ｈ，ｓ，７”−ＣＨ３），１．６８（２Ｈ，ｍ，４”−Ｈ），２．１０（２Ｈ，ｍ，５”−Ｈ），２．４１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．０，１６．８Ｈｚ，１”−Ｈ），２．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，１６．８Ｈｚ，１”−Ｈ），３．７６（１Ｈ，ｍ，２”−Ｈ），５．０１（１Ｈ，ｍ，６”−Ｈ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２”−ＯＨ），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，５’−Ｈ），６．８０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３−Ｈおよび５−Ｈ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，６’−Ｈ），７．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，β−Ｈ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，α−Ｈ），７．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２−Ｈおよび６−Ｈ），９．９６（１Ｈ，ｓ，４−ＯＨ），１０．１９（１Ｈ，ｓ，４’−ＯＨ）
但し、１Ｈ−ＮＭＲにおいてサンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシド中の残留プロトンの化学シフト値を２．５１ｐｐｍとして表した。第５図に逆相クロマトフラクション４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。第５図において横軸は化学シフト値、縦軸はシグナルの強度を示す。
１３Ｃ−ＮＭＲ：δ１８．１（３”−ＣＨ３），１８．２（７”−ＣＨ３），２２．１（５”−Ｃ），２６．３（７”−ＣＨ３），２７．２（１”−Ｃ），３８．７（４”−Ｃ），６６．７（２”−Ｃ），８０．２（３”−Ｃ），１０７．８（５’−Ｃ），１０９．１（３’−Ｃ），１１６．７（３−Ｃおよび５−Ｃ），１２１．０（１’−Ｃ），１２５．１（６”−Ｃ），１２５．１（α−Ｃ），１２７．０（１−Ｃ），１３０．３（６’−Ｃ），１３０．８（２−Ｃおよび６−Ｃ），１３１．６（７”−Ｃ），１４１．５（β−Ｃ），１５４．６（２’−Ｃ），１６０．４（４−Ｃ），１６０．４（４’−Ｃ），１８９．９（Ｃ＝０）
但し、１３Ｃ−ＮＭＲにおいてサンプルは重ジメチルスルホキシドに溶解し、重ジメチルスルホキシドの化学シフト値を４０．２ｐｐｍとして表した。第６図に逆相クロマトフラクション４の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。第６図において横軸は化学シフト値、縦軸はシグナルの強度を示す。
以上、逆相クロマトフラクション４について行った質量スペクトル、ＮＭＲスペクトル解析の結果、逆相クロマトフラクション４が（Ｅ）−１−（３，４，−ｄｉｈｙｄｒｏ−３，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−２−（３−ｉｓｏｈｅｘｅｎｅｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−８−ｙｌ）−３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｐｒｏｐｅｎｅ−１−ｏｎｅ（分子量４０８、以下化合物ｂ）であることを確定した。
実施例３  化合物ａ、化合物ｂのアルドースレダクターゼ（ＡＲ）阻害活性
（１）化合物ａおよびｂのアルドースレダクターゼ阻害活性を以下の方法により測定した。試料としての化合物ａあるいはｂ（５０％ジメチルスルホキシド水溶液に溶解したもの）１０μｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１００μｌ、１ｍＭ  ＮＡＤＰＨ（リン酸緩衝液）２０μｌ、人筋肉細胞由来アルドースレダクターゼ溶液（０．１Ｕ／ｍｌ、和光純薬工業社製、リン酸緩衝液）１０μｌに１００ｍＭメチルグリオキサール２０μｌを加え、３０秒経過の後より１８０秒間、ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。陰性対照として試料の代わりに５０％ジメチルスルホキシド水溶液を使用した。また、各試料のブランクとしてメチルグリオキサール溶液の代わりに蒸留水を使用して吸光度を測定した。測定値は２回の実験値の平均値で示した。アルドースレダクターゼ阻害率（％）は以下の計算式により算出した。
阻害率（％）＝［１−〔（△Ａｓ−△Ａｓｂ）／（△Ａｃ−△Ａｃｂ）〕］×１００
ここで、△Ａｓ及び△Ａｃはそれぞれ試料溶液、陰性対照溶液の１分間あたりの吸光度変化を示し、△Ａｓｂ及び△Ａｃｂはそれぞれ試料溶液、陰性対照溶液のブランクの１分間あたりの吸光度変化を示す。
化合物ａおよびｂの添加量は最終濃度を表１に示す通りとした。その結果、化合物ａおよびｂには濃度依存的なアルドースレダクターゼ阻害活性があることが明らかになった。表１にその結果を示す。
2004031165.tif 000008
実施例４  化合物ｂの一酸化窒素（ＮＯ）毒性からの神経細胞保護活性
（１）化合物ｂのＮＯ毒性抑制活性を以下の方法により測定した。ラット副腎髄質褐色細胞由来ＰＣ１２細胞（ＣＲＬ−１７２１）を１０％ウシ胎児血清（バイオウィタカ社製）含有ＤＭＥＭ培地（バイオウィタカ社製）で１×１０５細胞／ｍｌに懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。２４時間培養後、培地を除き、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ（タカラバイオ社製）、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地に置き換えて３日間培養し、ＰＣ１２細胞を神経細胞様に分化させた。培養後、培地を取り除き、１０μＭの化合物ｂ、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地に置き換えて２時間培養の後、ニトロプルシドナトリウム（ナカライテスク社製、以下ＳＮＰ）を５０μＭとなるよう添加し、４８時間培養した。培養終了後に培地を除き、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（ナカライテスク社製、ＰＢＳ溶液）５０μｌを加え、４時間培養を行った。各ウェルにジメチルスルホキシド１５０μｌを添加、混合し、可溶化したホルマザンを波長５９０ｎｍ（対照波長６３０ｎｍ）で測定した。測定はすべて２連で行った。対照群（化合物ｂならびにＳＮＰを含まない）のＭＴＴ測定値を１００とし、各試験群でのＭＴＴ測定値から細胞生存度（％）を算出した。その結果、化合物ｂにＳＮＰにより誘発された細胞毒性に対する抑制活性のあることが明らかになった。表２にその結果を示す。
2004031165.tif 000009
（２）化合物ｂのＮＯ毒性抑制活性を以下の方法により測定した。ラット副腎髄質褐色細胞由来ＰＣ１２細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに懸濁し、９６穴プレートに０．１ｍｌずつまき、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。２４時間培養後、培地を除き、１０μＭの化合物ｂ、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地に置き換えて２時間培養の後、ＳＮＰを５０μＭとなるよう添加し、６６時間培養した。培養終了後に実施例４−（１）と同様の方法で、ＭＴＴ測定を行い、細胞生存度（％）を算出した。測定はすべて３連で行った。その結果、化合物ｂにＳＮＰにより誘発された細胞毒性に対する抑制活性のあることが明らかになった。表３にその結果を示す。
2004031165.tif 000010
実施例５  化合物ａ、化合物ｂのＮＯ産生抑制活性
１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有，ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカ社製，１２−６０４Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７１）を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、４８穴マイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。２４時間後に、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有，フェノールレッド不含、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテックオリエンタル社製、２５０３０−１４９）含有ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカ社製，１２−９１７Ｆ）に交換し、各ウェルにそれぞれ終濃度が１．５、３、６、１２μＭとなるように化合物ａ（ジメチルスルホキシド溶液）を、あるいは終濃度が３、６、１２、２４μＭとなるように化合物ｂ（ジメチルスルホキシド溶液）を添加した。さらに１時間培養した後、各ウェルに５μｌの１００μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ，シグマ社製、Ｌ−２０１０）水溶液を添加して１５時間培養した後、ＮＯが培地中で酸化されることによって生じるＮＯ２−濃度の測定を行った。なお、陽性対照として化合物ａおよびｂを加えない区分を、陰性対照としてＬＰＳを加えない区分を設定した。上記培養後、１００μｌの培養上清に１００μｌの４％グリース試薬（シグマ社製、Ｇ４４１０）を加え、室温で１５分間放置した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。既知の濃度のＮａＮＯ２で作製した検量線から培地中のＮＯ２−濃度を計算した。測定はすべて２連で行った。この結果、化合物ａ、化合物ｂ添加区分のいずれにおいても、ＬＰＳによるＮＯ産生誘導を濃度依存的に抑制した。その結果を第７図に示す。すなわち第７図は培地中のＮＯ２−濃度を示す図である。第７図において、横軸は各試料を、縦軸はＮＯ２−濃度（μＭ）を示す。
実施例６  化合物ａ、化合物ｂのＩＬ−６産生抑制活性
１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有，ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカ社製，１２−６０４Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ７１）を４×１０５個／ｍｌになるように懸濁し、４８穴マイクロタイタープレートのウェルに５００μｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。２４時間後に、ＵｌｔｒａＣＨＯ培地（バイオウィタカ社製，１２−７２４Ｑ）に交換し、各ウェルにそれぞれ終濃度が１．５、３、６、１２μＭとなるように化合物ａ（ジメチルスルホキシド溶液）を、あるいは終濃度が３、６、１２、２４μＭとなるように化合物ｂ（ジメチルスルホキシド溶液）を添加した。さらに４時間培養した後、各ウェルに５μｌの１００μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ，シグマ社製、Ｌ−２０１０）水溶液を添加して１５時間培養した後、培養上清を回収した。培養上清中のインターロイキン６（ＩＬ−６）の含有はエンザイムイムノサンドイッチアッセイ（ｇｅｎｚｙｍｅ  ＴＥＣＨＮＥ社製、４９２２）で測定した。なお、陽性対照として化合物ａおよびｂを加えない区分を、陰性対照としてＬＰＳを加えない区分を設定した。また測定は全て２連で行った。この結果、化合物ａ、化合物ｂ添加区分のいずれにおいても、ＬＰＳによるＩＬ−６産生誘導を濃度依存的に抑制した。その結果を第８図に示す。すなわち第８図は培養上清中のＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。第８図において、横軸は各試料を、縦軸はＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【産業上の利用可能性】  本発明により、新規なカルコン類化合物が提供される。当該化合物はその神経細胞保護作用、ＮＯ産生抑制作用、アルドースレダクターゼ阻害作用又はインターロイキン産生抑制作用を有しており、当該生理活性を利用した医薬、食品、飲料または飼料の有効成分として有用である。
【図１】
2004031165.tif 000013
【図２】
2004031165.tif 000014
【図３】
2004031165.tif 000015
【図４】
2004031165.tif 000016
【図５】
2004031165.tif 000017
【図６】
2004031165.tif 000018
【図７】
2004031165.tif 000019
【図８】
2004031165.tif 000020
【国際調査報告】
2004031165.tif 000021
2004031165.tif 000022
2004031165.tif 000023
2004031165.tif 000024