(57)【要約】ゲノムＤＮＡに複数存在するメチル化領域のうち、他のメチル化領域には影響を与えることなく、特定のメチル化領域のみを脱メチル化できる脱メチル化法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域の脱メチル化するために、（ａ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ、又は（ｂ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ、を前記生細胞中で人為的に生成させる。
2004078971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域の脱メチル化法であって、以下のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を前記生細胞中で人為的に生成させる工程を含む前記脱メチル化法。
（ａ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
【請求項２】
前記ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターを前記生細胞に導入する工程を含む請求項１記載の脱メチル化法。
【請求項３】
請求項１記載のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクター。
【請求項４】
生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域を脱メチル化するための脱メチル化用キットであって、請求項３記載の組換えベクターを含む前記脱メチル化用キット。
【請求項５】
請求項３記載の組換えベクターを導入した生細胞。
【請求項６】
請求項５記載の生細胞を培養して作製された組織又は器官。
【請求項７】
請求項５記載の生細胞から単離された細胞核。
【請求項８】
請求項７記載の細胞核を用いて作製されたクローン動物。
【請求項９】
生細胞を培養して組織又は器官を作製する方法であって、請求項１記載のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を前記生細胞中で人為的に生成させ、前記生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域を脱メチル化する工程を含む前記方法。
【請求項１０】
除核した未受精卵に移植する細胞核として請求項７記載の細胞核を用いるクローン動物の作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生細胞のゲノムＤＮＡに存在する標的メチル化領域の脱メチル化法、該脱メチル化法に使用し得る組換えベクター、該組換えベクターを含む脱メチル化用キット、上記組換えベクターを導入した生細胞、該生細胞から単離した細胞核、上記生細胞を培養して作製された組織又は器官、上記細胞核を用いて作製されたクローン動物、上記生細胞を培養して組織又は器官を作製する方法、及び上記細胞核を用いたクローン動物の作製法に関する。
【背景技術】  哺乳動物の体を構成する様々な細胞が、免疫細胞等の一部の例外を除き、全て同じ遺伝子セットを有していることは、除核した未受精卵へ体細胞核を移植する核移植技術を用いたヒツジ、マウス、ウシ等のクローン動物の誕生により証明された。したがって、個々の細胞の違いは、発現する遺伝子セットと発現しない遺伝子セットの違いによって生じる。
遺伝子の発現には、ゲノムＤＮＡのメチル化が関連していることが知られており、多くの場合、ゲノムＤＮＡのメチル化は遺伝子発現を抑制する。例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化による転写抑制機構として、メチル化シトシンを認識して結合するメチルＣｐＧ結合タンパク質（ＭｅＣＰ２）が、遺伝子の制御領域に結合して転写因子の結合を抑制するサプレッサーとして機能することが報告されている（ナン（Ｎａｎ）Ｘら，「セル（Ｃｅｌｌ）」，１９９９年，第８８巻，ｐ．４７１−４８１）。また、メチル化シトシンは、ＭｅＣＰ２及びＳｉｎ３とともにヒストン脱アセチル化酵素との複合体を形成すること、並びに、ヒストン脱アセチル化酵素がＭｅＣＰ２によりリクルートされ、メチル化ゲノム領域のクロマチン構造が凝縮し、不活性なヘテロクロマチンとして安定化されることが報告されている（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ＰＬら，「ネイチャー  ジェネティックス（ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ）」，１９９８年，第１９巻，ｐ．１８７−１９１）。すなわち、シトシンメチル化とヒストンアセチル化によるクロマチン構造の変化が互いに独立した現象ではなく密接に連係しながらゲノム中の各座位の遺伝子発現を制御しているのである。
ゲノムＤＮＡのメチル化量は、胚盤胞期に最低となり、その後、体細胞系列の細胞では分化に伴って増加すると考えられる（ジェニッシュ（Ｊａｅｎｉｓｃｈ）Ｒら，「トレンズ  イン  ジェネティックス（ＴＲＥＮＤＳ  ＩＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ），１９９７年，第１３巻，ｐ．３２３−３２９）。そして、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの形成は、細胞・組織特異的な遺伝子発現パターンを限定することを可能にしていると考えられる。したがって、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンに異常が生じると、細胞・組織は正常な機能・形質を保持することが困難となり、結果として様々な疾病を生じるおそれがある。すなわち、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンに異常が生じると、細胞の機能不全、機能停止、異常増殖、異常細胞死等が誘導され、組織の正常な機能に障害を来たし、個体レベルでは発生異常、癌及び生活習慣病を含む様々な疾病が生じるおそれがある。例えば、癌抑制因子のメチル化は癌の発生の原因となることが報告されているし（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ＰＡら，「ネイチャー  ジェネティックス（ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ）」，２００２年，第３巻，ｐ．４１５−４２８）、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常がクローン動物の発生異常や出生後の異常の原因となることが報告されている（シオタ（Ｓｈｉｏｔａ）ｋら，「ディファレンシエイション（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」，２００２年，第６９巻，ｐ．１６２−１６６）。
【発明の開示】
ゲノムＤＮＡのメチル化は、主として、５’−ＣＧ−３’配列（ＣｐＧ配列）を有するシトシンで生じる。哺乳動物のゲノムＤＮＡには、ＣｐＧ配列が密に存在するＣｐＧアイランドが存在しており、ＣｐＧアイランドには、組織依存的にメチル化される領域（Ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：Ｔ−ＤＭＲ）が存在している。そして、Ｔ−ＤＭＲを有するＣｐＧアイランドは、ゲノムＤＮＡに複数存在している。
本来メチル化されていない領域がメチル化されることによってゲノムＤＮＡのメチル化パターンに異常が生じた場合、その特定のメチル化領域を脱メチル化することによってゲノムＤＮＡのメチル化パターンを正常化することができると考えられる。そして、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンを正常化できれば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常によって引き起こされる疾病の予防・治療、再生医療に有用な細胞、組織及び器官の作製、体細胞核移植によるクローン動物作製の効率化等が可能となると考えられる。
メチル化領域の脱メチル化には、例えば、脱メチル化作用を有する化合物を利用でき、そのような化合物として、例えば、５−アザシチジン、５−アザデオキシシチジン等が知られている。しかしながら、これらの化合物は、ゲノムＤＮＡ全域又は不特定領域を広範囲に脱メチル化してしまう。また、ＤＮＡメチル転移酵素の遺伝子を破壊して脱メチル化を図ることも考えられるが、この場合も、脱メチル化領域は広範に渡り、特定のメチル化領域のみを脱メチル化することは不可能である。
そこで、本発明は、ゲノムＤＮＡに複数存在するメチル化領域のうち、他のメチル化領域には影響を与えることなく、特定のメチル化領域のみを脱メチル化できる脱メチル化法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記脱メチル化法に使用できる組換えベクター及び該組換えベクターを含む脱メチル化用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、上記組換えベクターを導入した生細胞、該生細胞から単離した細胞核、上記生細胞を培養して作製された組織又は器官、上記細胞核を用いて作製されたクローン動物、上記生細胞を培養して組織又は器官を作製する方法、及び上記細胞核を用いたクローン動物の作製法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の脱メチル化法、組換えベクター、該組換えベクターを含む脱メチル化用キット、上記組換えベクターを導入した生細胞、該生細胞から単離した細胞核、上記生細胞を培養して作製された組織又は器官、上記細胞核を用いて作製されたクローン動物、上記生細胞を培養して組織又は器官を作製する方法、及び上記細胞核を用いたクローン動物の作製法を提供する。
（１）生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域の脱メチル化法であって、以下のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を前記生細胞中で人為的に生成させる工程を含む前記脱メチル化法。
（ａ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）前記標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、前記標的メチル化領域の近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
（２）前記ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターを前記生細胞に導入する工程を含む前記（１）記載の脱メチル化法。
（３）前記（１）記載のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクター。
（４）生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域を脱メチル化するための脱メチル化用キットであって、前記（３）記載の組換えベクターを含む前記脱メチル化用キット。
（５）前記（３）記載の組換えベクターを導入した生細胞。
（６）前記（５）記載の生細胞を培養して作製された組織又は器官。
（７）前記（５）記載の生細胞から単離された細胞核。
（８）前記（７）記載の細胞核を用いて作製されたクローン動物。
（９）生細胞を培養して組織又は器官を作製する方法であって、前記（１）記載のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を前記生細胞中で人為的に生成させ、前記生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域を脱メチル化する工程を含む前記方法。
（１０）除核した未受精卵に移植する細胞核として前記（７）記載の細胞核を用いるクローン動物の作製法。
【図面の簡単な説明】  図１は、ラット由来スフィンゴシンキナーゼ遺伝子におけるＣｐＧアイランド、Ｔ−ＤＭＲ及び翻訳開始点の存在位置、並びにＲＮＡ−Ａ及びＲＮＡ−Ｂの対応位置を示す図である。
図２は、ＲＮＡ−Ａ又はＲＮＡ−ＢをＮＲＫ細胞中で人為的に生成させる前又は後における、代表的なＣｐＧサイト（−３２２９、−３２０５、−３１３９、−３０８６、−３０２３）のメチル化状態（％）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明において、「生細胞」とは、生物体から分離された状態で存在する生細胞を意味する。したがって、現に生物体を構成している生細胞は、本発明における「生細胞」には含まれない。
本発明において、生細胞が由来する生物種は特に限定されるものではなく、動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、動物であることが好ましく、哺乳動物であることがさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
本発明において、生細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、又はこれらの培養細胞等が挙げられる。体細胞の具体例としては、脳、脊髄等の神経系組織；網膜細胞、嗅細胞等の感覚器；食道、胃、小腸、大腸等の消化器；肺、気管支等の呼吸器；精巣、卵巣、子宮、胎盤等の生殖器；腎臓、膀胱等の泌尿器；骨髄細胞、血球細胞等の造血器；骨格筋、平滑筋、心筋等の筋組織；骨芽細胞、破骨細胞等の骨組織；皮膚、毛根細胞等の皮膚組織等の各種組織・器官から分離された生細胞又はその培養細胞等が挙げられ、生殖細胞の具体例としては、卵、精子又はその培養細胞等が挙げられ、幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、栄養膜幹細胞（ＴＳ細胞）、骨髄幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。
本発明において、脱メチル化の標的となるメチル化領域は、生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する特定のメチル化領域である。哺乳動物のゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖には、細胞・組織特異的にメチル化された領域（Ｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ：Ｔ−ＤＭＲ）が複数存在しており、細胞・組織特異的なメチル化パターンを形成しているが、例えば、これら複数のＴ−ＤＭＲのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する特定のＴ−ＤＭＲが、本発明における標的メチル化領域となる。この際、いずれのＴ−ＤＭＲを脱メチル化の標的とするかは、脱メチル化の目的等に応じて適宜選択される。標的メチル化領域の塩基長は特に限定されるものではないが、通常１〜１００００塩基長、好ましくは１００〜２０００塩基長である。
本発明において、標的メチル化領域を脱メチル化する際に、生細胞中で人為的に生成させるＲＮＡは、以下のＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）である。なお、生細胞中で人為的に生成させるＲＮＡは、以下のＲＮＡ（ａ）及び（ｂ）の両者であってもよい。
（ａ）標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
（ｂ）標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の近傍領域を含む領域の塩基配列に相当する塩基配列からなるＲＮＡ
ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）の塩基長は特に限定されるものではなく、標的メチル化領域の塩基長等に応じて適宜調節し得るが、通常１００〜５０００塩基長、好ましくは１００〜２０００塩基長である。
ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）において、「標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖」とは、生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖を意味し、「標的メチル化領域が存在しないＤＮＡ鎖」とは、もう一方のＤＮＡ鎖を意味する。また、「相当する塩基配列」とは、ＤＮＡとＲＮＡとが、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）である点を除き、同一の塩基配列からなることを意味する。
ＲＮＡ（ａ）において、「標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域」には、標的メチル化領域の一部又は全体からなる領域、標的メチル化領域の５’末端側又は３’末端側の領域（標的メチル化領域のうち５’末端側又は３’末端側に位置する領域）とその隣接領域とからなる領域、標的メチル化領域の全体とその５’末端側及び／又は３’末端側の隣接領域とからなる領域等が含まれる。また、「標的メチル化領域の一部」には、標的メチル化領域のいずれの部分も含まれ、その塩基長は特に限定されるものではなく、標的メチル化領域の塩基長等に応じて適宜調節し得るが、通常１〜１０００塩基長、好ましくは１〜２００塩基長である。
ＲＮＡ（ｂ）において、「標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の近傍領域を含む領域」には、標的メチル化領域の近傍領域からなる領域、標的メチル化領域の近傍領域とその５’末端側及び／又は３’末端側の隣接領域とからなる領域等が含まれる。また、「標的メチル化領域の近傍領域」とは、標的メチル化領域の５’末端側又は３’末端側に位置し、標的メチル化領域との距離が通常０〜１０００塩基長、好ましくは０〜１００塩基長である領域を意味する。ここで、「標的メチル化領域と近傍領域との距離」とは、標的メチル化領域の３’末端から近傍領域の５’末端までの距離、又は標的メチル化領域の５’末端から近傍領域の３’末端までの距離を意味し、標的メチル化領域との距離が０である領域は、標的メチル化領域の隣接領域を意味する。
ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を生細胞中で人為的に生成させたときに、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）が標的メチル化領域の脱メチル化を進行させる作用機序の詳細は不明であるが、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）は生細胞中の核酸（例えば、標的メチル化領域が存在しないＤＮＡ鎖、ｍＲＮＡ等）にハイブリダイズすると考えられ、当該核酸に対して、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）がハイブリダイズし得る領域と同一の領域にハイブリダイズし得るＲＮＡは、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）と同様に標的メチル化領域の脱メチル化を進行させ得ると考えられる。
ＲＮＡ（ａ）がハイブリダイズし得る領域と同一の領域にハイブリダイズし得るＲＮＡとしては、ＲＮＡ（ａ）の塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなるＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ（ａ）の塩基配列において置換される塩基の個数は、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個である。
ＲＮＡ（ｂ）がハイブリダイズし得る領域と同一の領域にハイブリダイズし得るＲＮＡとしては、ＲＮＡ（ｂ）の塩基配列において１又は複数個の塩基が置換された塩基配列からなるＲＮＡが挙げられる。ＲＮＡ（ｂ）の塩基配列において置換される塩基の個数は、通常１〜１０個、好ましくは１〜５個である。
本発明において、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を生細胞中で人為的に生成させる方法は特に限定されるものではない。例えば、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターを生細胞に導入することにより、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を生細胞中で人為的に生成させることができる。
ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターの構成は特に限定されるものではないが、一般的には、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡとその上流に位置するプロモーターとを含む発現カセットを有する。発現カセットは、プロモーター以外の転写調節領域、例えば、ターミネーター、エンハンサー等を含むことができる。発現カセットの具体的な構造としては、例えば、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡの上流にプロモーターを有し、下流にターミネーターを有する構造が挙げられる。組換えベクターが有する発現カセットの数は特に限定されるものではなく、組換えベクターは１個の発現カセットを有していてもよいし、同一の又は異なる複数の発現カセットを有していてもよい。
ＲＮＡ（ａ）をコードするＤＮＡとしては、標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の一部又は全体を含む領域と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。また、ＲＮＡ（ｂ）をコードするＤＮＡとしては、標的メチル化領域が存在するＤＮＡ鎖のうち、標的メチル化領域の近傍領域を含む領域と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。これらのＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ、化学合成等の公知の方法により得ることができる。
組換えベクターを構築する際に使用するベクターの種類は、対象となる生細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
組換えベクターの発現カセットに含まれるプロモーターの種類は、対象となる生細胞中で機能し得る限り特に限定されるものではない。対象となる生細胞が動物細胞である場合、プロモーターとしては、例えば、Ｒαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター、ＣＡＧプロモーター等を使用することができる。
対象となる生細胞への組換えベクターの導入方法は、対象となる生細胞へＤＮＡを導入し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等を使用することができる。
ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターは、生細胞のゲノムＤＮＡのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか一方のＤＮＡ鎖に存在する標的メチル化領域を脱メチル化するための脱メチル化用キットの構成要素として利用することができる。脱メチル化用キットは、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を発現し得る組換えベクターの他、生細胞に組換えベクターを導入するために必要な試薬や器具、組換えベクターを導入した生細胞を培養するために必要な試薬や器具等の任意の要素を含むことができる。
生細胞に組換えベクターを導入して、ＲＮＡ（ａ）又は（ｂ）を生細胞中で人為的に生成させることによって、標的メチル化領域を脱メチル化することができる。ここで、「標的メチル化領域の脱メチル化」とは、標的メチル化領域に存在するメチル化シトシンの脱メチル化を意味し、「標的メチル化領域の脱メチル化」には、標的メチル化領域の完全な脱メチル化及び低メチル化のいずれもが含まれる。また、脱メチル化の対象となるメチル化シトシンとしては、例えば、ＣｐＧ配列に含まれるメチル化シトシン、ＣｐＡｐＧ配列に含まれるメチル化シトシン、ＣｐＴｐＧ配列に含まれるメチル化シトシン、ＣｐＮｐＧ配列（ＮはＡ，Ｔ，Ｃ又はＧ）に含まれるメチル化シトシン等が挙げられる。
標的メチル化領域が脱メチル化されたか否かは、例えば、ＲＬＧＳ法（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｌａｎｄｍａｒｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ法）、ＭＳ−ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、ＣｐＧアイランドマイクロアレイ法等を用いてメチル化パターンを作製することにより確認することができる。例えば、ＲＬＧＳ法においては、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、メチル化感受性制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＳａｌＩ等）で切断してＤＮＡ断片を作製し、標識物質（例えば３２Ｐ）で末端を標識した後、一次元電気泳動でＤＮＡ断片を分離する。さらに電気泳動後のＤＮＡ断片をメチル化感受性制限酵素とは異なる他の制限酵素で消化し、二次元電気泳動にかけ、オートラジオグラフィー等によりスポットを解析する。そして、細胞特有のスポットのパターンから、標的メチル化領域が脱メチル化されたか否かを確認する。この方法によれば、ゲノムＤＮＡの数千箇所に渡る領域のメチル化状況及び脱メチル化状況を一度に解析することができる。
本発明によれば、生細胞のゲノムＤＮＡに存在する複数のメチル化領域のうち、他のメチル化領域には影響を与えることなく、特定のメチル化領域のみを脱メチル化することができるので、生細胞のゲノムＤＮＡにおけるメチル化パターンを所望のメチル化パターンに変化させることができる。ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常は、遺伝子発現やゲノム安定性に影響し、発生停止、発生異常、癌及び生活習慣病を含む様々な疾病等を生じさせる危険性があるが、メチル化パターンを正常なメチル化パターンに変化させることにより、それらを予防・治療することができる。
標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞は、例えば、再生医療のための移植用細胞として有用であり、移植の際に高い安全性、移植効率等を期待することができる。また、標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞から作製（再生）した組織又は器官も、再生医療のための移植用組織又は器官として有用である。組織又は器官の作製（再生）にあたっては、生細胞として幹細胞を用いることが好ましい。生細胞からの組織又は器官の作製（再生）は、生細胞の培養によって行うことができる。ここで、「培養」は、体外培養一般を意味し、組織構築から解放した細胞の水準で行う細胞培養、組織の水準で行う組織培養、器官の構築を保持したままで行う器官培養等が含まれる。培養に使用する培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ  Ｆ１２培地、Ｈａｍ  Ｆ１２Ｋ培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用することができ、培養条件は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃である。
標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞の細胞核は、クローン動物（非ヒトクローン動物）を作製する際に、除核した未受精卵に移植する細胞核として有用である。細胞核を提供する生細胞としては、通常、初期胚割球、初期胚由来培養細胞、胚性幹細胞、体細胞等が用いられる。他の細胞核を移植した卵を培養し、移植可能胚へ発生したものを仮親の子宮内に移植することにより、クローン動物を作製することができる。
【実施例】  ラット由来スフィンゴシンキナーゼ遺伝子（Ｉｍａｍｕｒａ．Ｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７６：１１７−１２５（２００１））の５’上流には、組織特異的にメチル化された領域（Ｔ−ＤＭＲ）が存在する（図１参照）。このＴ−ＤＭＲは、ラット胎生期・成熟個体の脳では低メチル化状態であるが、成熟個体の他の組織（例えば、心臓）では高メチル化状態にある（Ｉｍａｍｕｒａ．Ｔら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７６：１１７−１２５（２００１））。同様に、ラットの線維芽細胞様細胞株であるＮＲＫ細胞でも高メチル化状態にある。
ＮＲＫ細胞（ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ）を培養下、Ｔ−ＤＭＲの塩基配列を含むＲＮＡ−Ａ、又はＴ−ＤＭＲの近傍領域の塩基配列を含むＲＮＡ−Ｂを当該細胞中で人為的に生成させた。ＮＲＫ細胞は、ＤＭＥＭ培地に終濃度１０％の牛胎児血清を添加した培地を用い、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
ＲＮＡ−Ａの塩基配列を配列番号１に示し、ＲＮＡ−Ｂの塩基配列を配列番号２に示す。ＲＮＡ−Ａは、Ｔ−ＤＭＲの一部に相当し、対応するゲノムＤＮＡの領域は−３２３５〜−３０２３である（図１参照）。また、ＲＮＡ−Ｂは、Ｔ−ＤＭＲの３’末端側の領域と当該領域の３’末端に隣接する領域とからなる領域に相当し、対応するゲノムＤＮＡの領域は−３０２２〜−２０９６である（図１参照）。なお、各塩基の位置は、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の開始コドンのＡを＋１としたときの位置である。
ＲＮＡ−Ａ又はＲＮＡ−Ｂを発現する組換えベクターは、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＡｐａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位に、ＰＣＲにより増幅したＲＮＡ−Ａ又はＲＮＡ−Ｂの各塩基配列をコードする二本鎖ＤＮＡを挿入することにより構築した。ＰＣＲに使用したプライマーは、ＲＮＡ−Ａに関しては、５’−ｇｇｇｃｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇａｃａｇａｇｇａｇｃｃａｔｔｇｔｇ−３’及び５’−ａａｇｃｔｔｃｇｇｇｇｃｔｇｇａａｃｔｔｃｔｃａｃａｃｔｃｔｇｃｇｇｇｃ−３’であり、ＲＮＡ−Ｂに関しては、５’−ｇｇｇｃｃｃａｇａｃｔｃａａａｇａａａａｇｃｇａｇａｃｃｃｔｇｔｔｃｃａ−３’及び５’−ａａｇｃｔｔａｃｃｃａｃｃｔｃｔｃｔｃｃｔｔｇｃａｔｃｇｃｔｔｃｔｔａａ−３’である。
組換えベクターの細胞への導入は、リポフェクション法により行った。
Ｔ−ＤＭＲのメチル化パターンをＲＬＧＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｌａｎｄｍａｒｋ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）により解析した。ＲＬＧＳは、メチル化感受性の制限酵素と二次元電気泳動とを組み合わせることによって、ＣｐＧアイランド内でのメチル化状況をゲノムワイドに解析する方法であって、具体的には以下のように実施した。
ＮｏｔＩをメチル化感受性の制限酵素として用いてゲノムＤＮＡを切断し、切断された箇所に放射性同位元素（３２Ｐ）でラベルしたシトシン及びグアニンを取り込ませた。これにより、メチル化されていない箇所は標識され、メチル化されている箇所は切断されずに未標識の状態となる。これをさらにＰｖｕＩＩで切断して平均鎖長を減じた後、ディスクゲルを用いて一次元目の電気泳動を行った。電気泳動後、ゲル内でさらにＰｓｔＩによる切断を行い、スラブゲルを用いて二次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを乾燥させてＸ線フィルムに感光させた。これにより、メチル化されていなかった部位のある遺伝子断片はスポットとして感光され、視覚化される。遺伝子断片のある部位がメチル化を受けていた場合、その部分のスポットは消失するのでメチル化を検出することができる。
ＲＮＡ−Ａ又はＢをＮＲＫ細胞で人為的に生成させる前及び後のＴ−ＤＭＲのメチル化状態（％）を図２に示す。図２は、Ｔ−ＤＭＲの代表的なＣｐＧサイト（−３２２９〜−３０２３）におけるシトシンのメチル化状態を示し、各ＣｐＧサイトにおけるシトシンの位置は、−３２２９、−３２０５、−３１３９、−３０８６及び−３０２３である。各シトシンのメチル化状態は、１０個のＮＲＫ細胞のうち、所定位置のシトシンがメチル化されていたＮＲＫ細胞の割合（％）で示す。図２中、カラムＣ（白抜きの棒グラフ）は、ＲＮＡ−Ａ又はＢをＮＲＫ細胞中で人為的に生成させる前のＴ−ＤＭＲのメチル化状態を示し、カラムＡ（斜線付きの棒グラフ）は、ＲＮＡ−ＡをＮＲＫ細胞中で人為的に生成させた後のＴ−ＤＭＲのメチル化状態を示し、カラムＢ（黒抜きの棒グラフ）は、ＲＮＡ−ＢをＮＲＫ細胞中で人為的に生成させた後のＴ−ＤＭＲのメチル化状態を示す。
図２に示すように、ＲＮＡ−Ａ又はＲＮＡ−Ｂを細胞中で人為的に生成させることにより、各ＣｐＧサイトにおけるシトシンのメチル化が低減（低メチル化）した。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、生細胞のゲノムＤＮＡに存在する複数のメチル化領域のうち、他のメチル化領域には影響を与えることなく、特定のメチル化領域のみを脱メチル化することができる脱メチル化法が提供される。本発明の脱メチル化法は、生細胞のゲノムＤＮＡにおけるメチル化パターンを所望のメチル化パターンに変化させることができる。ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常を正常なメチル化パターンに変化させることにより、メチル化パターンの異常によって生じ得る発生停止、発生異常、癌及び生活習慣病を含む様々な疾病等を予防・治療することができる。また、標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞は、例えば、再生医療のための移植用細胞として有用であり、移植の際に高い安全性、移植効率等を期待することができる。さらに、標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞から作製（再生）した組織又は器官も、再生医療のための移植用組織又は器官として有用である。さらに、標的メチル化領域を脱メチル化してメチル化パターンを所望のメチル化パターンとした生細胞の細胞核は、クローン動物（非ヒトクローン動物）を作製する際に、除核した未受精卵に移植する細胞核として有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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