(57)【要約】野生型セリンアセチルトランスフェラーゼにおける８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が、配列番号４〜９のアミノ酸配列のいずれか１つで置換され、かつＬ−システインによるフィードバック阻害が脱感作された変異型アセチルトランスフェラーゼを保持するエシェリヒア属細菌を使用して、Ｏ−アセチルセリン、Ｌ−システイン、およびそれらに由来する含硫化合物を製造する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの８９〜９６位に相当するアミノ酸配列が１又は複数の変異を含み、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの８９〜９６位に相当する前記アミノ酸配列が、配列番号４、５、６、７、８及び９から選ばれるのアミノ酸配列のいずれか１つで置換され、かつ、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、請求項１に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
野生型セリンアセチルトランスフェラーゼはエシェリヒア・コリ由来である、請求項１又は２に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
５１位でのＡｓｎからＬｙｓ、９１位でのＡｒｇからＨｉｓ、および２３３位でのＨｉｓからＴｙｒの置換を有する三重変異を除き、８９〜９６位以外の位置の１又は複数の箇所で、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項５に記載のＤＮＡで形質転換され、かつＬ−システイン生産能を有する、エシェリヒア属細菌。
【請求項７】
請求項６に記載の細菌を培地に培養し、同培地からＬ−システインを回収する、Ｌ−システインの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、微生物産業、詳しくはアミノ酸の製造法に関し、より詳しくは、本発明は、システイン生合成に関与する新規なフィードバック耐性酵素の使用に関する。より詳しくは、本発明は、新規なフィードバック耐性変異型セリンアセチルトランスフェラーゼ、その酵素を保持するエシェリヒア・コリ菌株、および同菌株株を用いた発酵によるＬ−システインの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から得られた微生物株、またはＬ−アミノ酸生産能が向上するように改変されたそれらの変異株を利用する発酵法により、工業的に製造されてきた。【０００３】  Ｌ−アミノ酸生産能を向上させる多くの技術（例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換による）が開示されてきた（例えば、米国特許第４，２７８，７６５号を参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、および／または、産生されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害から標的酵素を脱感作させることによる（例えば、特開昭５６−１８５９６（１９８１）、ＷＯ９５／１６０４２、または米国特許第５，６６１，０１２号および第６，０４０，１６０号を参照）。【０００４】  エシェリヒア・コリにおけるＬ−セリンからのＬ−システイン生合成は、ｃｙｓＥ遺伝子によりコードされるセリンアセチルトランスフェラーゼ、ならびにｃｙｓＫおよびｃｙｓＭ遺伝子によりコードされる、−Ａおよび−Ｂで表されるＯ−アセチルセリン（チオール）−リアーゼアイソザイムにより行われる。セリンアセチルトランスフェラーゼ（「ＳＡＴ」とも呼ばれる；ＥＣ２．３．１．３０）は、アセチル−ＣｏＡとＬ−セリンからのＯ−アセチル−Ｌ−セリン形成を触媒し、Ｌ−システインによるフィードバック阻害を介してシステインの生合成において調節的役割を果たす（エシェリヒア・コリおよびサルモネラ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、第二版、編集長：Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９９６）。【０００５】  Ｌ−システインに対してフィードバック感受性がないエシェリヒア・コリのＳＡＴ変異体、次いで野生型ＳＡＴが、Ｄｅｎｋ  Ｄ．およびＢｏｃｋ  Ａ．により単離された（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８７，１３３（Ｐｔ３），５１５−２５）。変異型ｃｙｓＥ遺伝子は、７６７位での１塩基変化しており、それによってメチオニン２５６からイソロイシン置換していた。この変異体はＬ−システインを排出する。【０００６】  ｃｙｓＥ遺伝子によりコードされるエシェリヒア・コリＳＡＴにおける本来のＭｅｔ−２５６を他の１９個のアミノ酸残基で置換すること、又は終止コドンを導入して２５６〜２７３のＣ末端領域を切断することにより、ほとんどの場合、フィードバック耐性（ｆｂｒ）表現型となる。しかし、変異型ＳＡＴタンパク質は野生型ＳＡＴの活性レベルを維持しない（Ｎａｋａｍｏｒｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８，６４，５，１６０７−１６１１、ＷＯ９７／１５６７３）。これらの改変ｃｙｓＥ遺伝子を有するプラスミドを保持する株は、２００ｍｇ／Ｌに至るシステイン（シスチンを含む）を産生した。【０００７】  エシェリヒア・コリからの多数のフィードバック非感受性変異型ＳＡＴが、ＰＣＲランダム変異法により得られた。ＳＡＴのアミノ酸配列にわたって突然変異が同定されたが、全ての変異型ＳＡＴは、顕著に減少した比活性レベルを示した（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，４５２，３２３−３２７）。【０００��】  Ｌ−システインによるフィードバック阻害におけるＳＡＴのＣ末端領域の基本的役割はまた、Ｍｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，６３，１，１６８−１７９）により示された。切詰めたＳＡＴ、すわなち、野生型ＳＡＴをＳｅｒ２５３とＭｅｔ２５４との間で切断し、その結果Ｃ末端から２０個のアミノ酸残基を欠失したものは、フィードバック阻害に対して野生型ＳＡＴよりもさらに感受性が低下していた。【０００９】  抑制されたＬ−システイン分解系、例えば、より低活性のシステインデスルフヒドラーゼ、および、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が減少したＳＡＴ、例えば、野生型ＳＡＴの２５６番目のメチオニン残基が他のアミノ酸残基で置換された変異型ＳＡＴの保持、の両方により特徴付けられるエシェリヒア属細菌株が、Ｌ−システインを産生し得ることもまた報告されている（特開平１１−１５５５７１）。【００１０】  アミノ酸９７〜１００、１６４〜１６９、２３７、２３９〜２４０、２４５〜２５９、および２６７〜２６９の配列領域に変異を有するか、又は、アミノ酸２３７〜２４０、２４５〜２５９、および２６７〜２６９のＣ末端配列領域に欠失を有する組換えセリンアセチルトランスフェラーゼは、野生型酵素に比べてＬ−システインに対する感受性が減少し、これは米国特許第６，２１８，１６８号に開示されている。７２１位でのＡからＧへの置換（結果としてＴｈｒｌ６７からＡｌａｌ６７に変化する）および９８８〜９９０位でのＡＴＧからＴＡＧへの置換（結果としてＭｅｔ２５６の代わりに終止コドンが形成する）の両方を有する、二重変異型ｃｙｓＥＸＩＶ対立遺伝子によりコードされるＳＡＴは、システインに対する良好な耐性を示し（Ｋｉ＞１０００μＭ）、比較的高い活性（０．４５３μＭ／分×ｍｇ）を有していた。ｃｙｓＥＸＩＶ対立遺伝子で形質転換されたＪＭ１５株は、４８時間のフィードーバッチ発酵プロセスの後、２．３ｇ／ＬのＬ−システインを産生した。しかし、Ｌ−システインの最高収率（３．９ｇ／Ｌ）は、Ｃ末端領域で１８個のアミノ酸が切り詰められたｃｙｓＥＤｅｌ＿２５５変異型対立遺伝子を使用して得られた。【００１１】  通常、酵素のｆｂｒ表現型は、タンパク質配列中、１又はそれ以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換した結果として生じ、そしてこれらの置換により酵素の活性低下が導かれる。【００１２】  したがって、上記で記載される方法により得られる変異型酵素の不利な点は、変異型酵素が野生型酵素と比較して活性が減少することである。本技術分野において、ｆｂｒ表現型で変異型酵素の活性を維持することが必要なことは明らかである。
【発明の開示】
【００１３】  本発明の目的は、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの８９〜９６位のアミノ酸配列中に１又は複数の変異を含み、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が脱感作されている、変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することにある。
本発明のさらなる目的は、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼの８９〜９６位に相当する前記アミノ酸配列が、配列番号４、５、６、７、８及び９から選ばれるアミノ酸配列で置換された、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、野生型セリンアセチルトランスフェラーゼはエシェリヒア・コリ由来である、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、５１位でのＡｓｎからＬｙｓ、９１位でのＡｒｇからＨｉｓ、および２３３位でのＨｉｓからＴｙｒの置換を有する三重変異を除き、８９〜９６位以外の位置の１又は複数の箇所で、１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を含む、前記変異型セリンアセチルトランスフェラーゼを提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記の変異型セリンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記ＤＮＡで形質転換され、かつＬ−システイン生産能を有する、エシェリヒア属細菌を提供することである。
本発明のさらなる目的は、前記細菌を培地に培養し、同培地にＬ−システインを蓄積させ、同培地からＬ−システインを回収する、Ｌ−システインの製造法を提供することである。
【００１４】  上記したようなｆｂｒ突然変異のいずれかを有するＳＡＴは「変異型ＳＡＴ」と、変異型ＳＡＴをコードするＤＮＡは「変異型ｃｙｓＥ遺伝子」と、変異を有さないＳＡＴは「野生型ＳＡＴ」とも称することがある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】配列番号１８および１９のプライマーの構築を示す。
【図２】ＳＡＴのオリゴマー構造を示す（写真）。Ａは側面図。Ｂは上面図。
【図３】ＳＡＴサブユニットの三次元構造を示す（写真）。
【図４】変異型ｃｙｓＥ遺伝子プール構築のためのスキームを示す。
【図５】変異型ＳＡＴの触媒特性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  本発明は、エシェリヒア・コリによるシステイン生合成において重要な役割を担う酵素であって、フィードバック耐性を有し、かつ高活性な酵素に関する。本発明はまた、ｃｙｓＥ遺伝子フラグメントの全無作為化を使用して、変異型ｃｙｓＥ遺伝子の巨大セットを合成する方法に関する。
酵素の三次元構造を正確に評価することにより、ｆｂｒ突然変異が存在し得るタンパク質フラグメントにおける複数のアミノ酸残基の同時置換によって、天然型に近い活性レベルを持つ変異型タンパク質を構築することができる。【００１７】  以下、本発明をより詳細に説明する。【００１８】＜１＞変異型ＳＡＴおよび変異型ｃｙｓＥ遺伝子
本発明により得られたＳＡＴの三次元構造のデータに従って、Ｌ−システインとの相互作用に必須であり、かつ、ＳＡＴのＬ−システインに対する感受性に関与するＳＡＴの新規領域が明らかになった（実施例１参照）。【００１９】  本発明の変異型ＳＡＴおよび変異型ｃｙｓＥ遺伝子は、無作為化フラグメントによる突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により得られた。ｃｙｓＥ遺伝子の多数の変異は、ｃｙｓＥ遺伝子の２４−ヌクレオチドフラグメント、すなわちＳＡＴタンパク質における８９位のアルギニンから９６位のアスパラギンまでの領域をコードするフラグメントの無作為化により得られた。２個の隣り合うアミノ酸残基が同時に無作為化されたので、タンパク質の８９〜９６領域の全体は、連続する４回の実験で無作為化された。【００２０】  続いて、発現ベクター中にクローニングされた変異型ｃｙｓＥ遺伝子を保持する組換えクローンの選択およびスクリーニングによって、抑制されていない野生型（ｗｔ）ＳＡＴの生物活性レベル及びそれに至る種々の活性レベルを持つ変異型ＳＡＴのｆｂｒ変異体を選択することができる。野生型ＳＡＴには、エシェリヒア・コリのＳＡＴ（ＥＣ番号２．３．１．３０）が含まれる（配列番号２）。【００２１】  ｆｂｒ表現型を持つ変異型ＳＡＴのアミノ酸配列は、本発明に含まれる。変異型ＳＡＴは、通常の方法によって野生型ｃｙｓＥ遺伝子に変異を導入することにより取得し得る。野生型ｃｙｓＥ遺伝子は、例えば、同遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて調製されたプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９）を参照）により取得することができる。野生型ｃｙｓＥ遺伝子には、エシェリヒア・コリのｃｙｓＥ遺伝子が含まれる（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿０００９１３．１；ｇｉ：１６１２７９９４の配列中ヌクレオチド番号３７７９３６８〜３７８０１８９）。他の微生物のＳＡＴをコードする遺伝子も同様にして取得し得る。野生型ｃｙｓＥ遺伝子への変異の導入は、例えば、部位特異的変異法によって行うことができる。【００２２】  本発明の変異型ＳＡＴ中の８９〜９６位のアミノ酸配列は、１又は複数の突然変異を含む。好ましくは、本発明の変異型ＳＡＴ中の８９〜９６位のアミノ酸配列は、配列番号４〜９の配列のいずれか１つである。本発明の変異型ＳＡＴ（Ｖａｌ−９５およびＡｓｐ−９６がＡｒｇ−９５およびＰｒｏ−９６、Ｇｌｙ−９５およびＧｌｙ−９６、又はＬｅｕ−９５およびＰｒｏ−９６で置換されるか、Ａｌａ−９４がＴｈｒ−９４で置換されるか、Ａｒｇ−８９がＰｒｏ−８９で置換されるか、Ａｒｇ−８９およびＴｈｒ−９０がＳｅｒ−８９およびＬｅｕ−９Ｏで置換されている）、およびエシェリヒア・コリの野生型ＳＡＴの対応するアミノ酸配列を表１に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例も表１に示す。【００２３】
【表１】
2005007841.tif 000003
【００２４】  変異型ＳＡＴは、ＳＡＴ活性が損われない限り、８９番目〜９６番目以外の位置の１箇所又は複数箇所で１又は複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加を含んでもよい。用語「ＳＡＴ活性」は、アセチル基をアセチル−ＣｏＡからＬ−セリンに転移させる反応を触媒する活性を意味する。ＳＡＴ活性は、例えば、Ｋｒｅｄｉｃｈ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｇ．Ｍ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６６，２４１，２１，４９５５−４９６５）に記載される方法により測定され得る。５１位でのＡｓｎからＬｙｓ、９１位でのＡｒｇからＨｉｓおよび２３３位でのＨｉｓからＴｙｒへの置換を有する三重変異は、先にＴａｋａｇｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，４５２，３２３−３２７）により記載されており、本発明から除かれる。【００２５】  「複数」のアミノ酸の数はタンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置又はアミノ酸残基の種類によって異なる。これは以下の理由による。すなわち、複数のアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そのようなアミノ酸における差異はタンパク質の三次元構造に大きくは影響しないからである。したがって、本発明の変異型ＳＡＴは、ＳＡＴを構成する全アミノ酸残基に対して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好ましくは７０〜９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつｆｂｒ  ＳＡＴ活性を有するものであり得る。あるいは、ここでいう「複数」のアミノ酸の数は、具体的には２〜２０、好ましくは２〜１０、特に好ましくは２〜１５である。【００２６】  本発明において、「８９〜９６位の配列に相当するアミノ酸配列」は、エシェリヒア・コリ野生型ＳＡＴのアミノ酸配列中の８９〜９６位のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を意味する。アミノ酸残基の位置は変わり得る。例えば、１個のアミノ酸残基がＮ末端部分に挿入される場合、本来的に８９位に位置するアミノ酸残基は９０位になる。本発明においては、そのような場合、９０位のアミノ酸残基は、本来の８９位に相当するアミノ酸残基として表される。
上記のようなＳＡＴの改変は、ＳＡＴ活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。ＳＡＴタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。【００２７】  上記に記載されるように変異型ＳＡＴと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１又は複数のアミノ酸残基が特定部位で欠失、置換、挿入、又は付加されるように、例えば部位特異的変異法を用いてヌクレオチド配列を修飾することにより、得ることができる。上記のようにして改変されるＤＮＡは、通常知られている突然変異処理により得ることができる。そのような突然変異処理には、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を含むＤＮＡを、インビトロで、例えばヒドロキシルアミンで処理すること、および微生物、例えば、変異型ｃｙｓＥ遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌を、ＵＶ照射により、又はそのような処理に通常使用される、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸のような突然変異剤で処理する方法が含まれる。【００２８】  上記のような、ヌクレオチドの置換、欠失、挿入、又は付加には、天然に生じる変異（ミュータントあるいはバリアント）、例えば、ランダム変異、ＳＡＴを保持する細菌の個体差又は種もしくは属での差異が含まれる。【００２９】  変異型ＳＡＴと実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下で、プローブとしての既知のｃｙｓＥ遺伝子配列（配列番号１）又はその一部とハイブリダイズし、かつＳＡＴ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、変異型ＳＡＴを保持する細胞から単離することにより、得ることができる。【００３０】  用語「ストリンジェントな条件」には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ非特異的ハイブリッドが形成されないような条件が含まれる。この条件を数値を用いて表現することは困難であるが、例えば、ストリンジェントな条件には、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば互いに５０％以上の相同性を有するＤＮＡはハイブリダイズし、かつ互い���上記より低い相同性を有するＤＮＡはハイブリダイズしない条件が含まれる。あるいは、ストリンジェントな条件は、サザンンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄の条件、すなわち、６０℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でＤＮＡ同士が互いにハイブリダイズする条件が含まれる。【００３１】  上記のような条件下でハイブリダイズする遺伝子には、遺伝子のコード領域内に生じた終止コドンを有する遺伝子、および活性中心の突然変異により活性を有さないものが含まれる。しかしながら、そのような不都合は、遺伝子を市販の発現ベクターと連結し、発現したタンパク質のＳＡＴ活性を調べることにより、容易に除くことができる。【００３２】＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌。
本発明の細菌は、上記のような変異型ｃｙｓＥ遺伝子が導入された、エシェリヒア属に属する細菌である。用語「エシェリヒア属細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。エシェリヒア属に属する細菌の例として、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。【００３３】  「Ｌ−システイン生産能を有する細菌」は、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中にＬ−システインを蓄積する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−システイン生産能は、育種により付与又は増強されてもよい。本明細書中で使用される用語「Ｌ−システイン生産能を有する細菌」はまた、野生株又は親株よりも大量に培地中にＬ−システインを生成および蓄積し得る細菌を意味する。野生型エシェリヒア・コリ菌株の例には、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６，ＡＴＣＣ７００９２６、ＶＫＰＭ  Ｂ−６１９５）、Ｋ−１２株などが例示され得る。ＭＧ１６５５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、住所  １０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。【００３４】  変異型ｃｙｓＥ遺伝子は、例えば、エシェリヒア属細菌を、エシェリヒア属細菌で機能するベクターおよび変異型ｃｙｓＥ遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換することにより、導入され得る。変異型ｃｙｓＥ遺伝子は、染色体上でｃｙｓＥ遺伝子を変異型ｃｙｓＥ遺伝子で置換することによっても、導入することができる。【００３５】  変異型ｃｙｓＥ遺伝子の導入に使用するベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＵＣ１９のようなプラスミドベクター、ｌ１０５９、ｌＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９のようなファージベクター、およびＭｕ、Ｔｎ１０、Ｔｎ５のようなトランスポゾンなどが含まれる。【００３６】  エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、例えば、Ｄ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，３２６（１９７９））又はＤＮＡの透過性を増加させるためにレシピエント細菌細胞を塩化カルシウムで処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９，（１９７０））などにより行われ得る。【００３７】  上記のように、変異型ｃｙｓＥ遺伝子をエシェリヒア属に属するＬ−システイン生産菌に導入することにより、Ｌ−システインの生産量を増加することができる。また、Ｌ−システイン生産能は、変異型ｃｙｓＥ遺伝子が既に導入されている細菌に付与してもよい。【００３８】  Ｌ−システイン生産能を有するエシェリヒア属細菌には、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるｃｙｓＥ対立遺伝子で形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）、細胞にとって毒性の物質を排出するのに好適なタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェリヒア・コリＷ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）、システインデスルフヒドラーゼ活性が低下した��シェリヒア・コリ菌株（特開平１１−１５５５７１Ａ２）、及び、ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンに対するポジティブな転写調節因子の活性が上昇したエシェリヒア・コリＷ３１１０株（ＷＯ０１２７３０７Ａ１）などが含まれる。【００３９】＜３＞本発明の方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養してＬ−システインを生成させ、培地に蓄積したＬ−システインを培地から回収する、Ｌ−システインの製造法を含む。
本発明において、培養、培地からのＬ−システインの回収および精製等は、従来の微生物を用いたアミノ酸の発酵生産法によって行ってもよい。【００４０】  本発明においては、培養、培地からのＬ−システインの回収および精製は、微生物を用いてアミノ酸を製造する従来の発酵法と同様にして行うことができる。
本発明に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、及び必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。
炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。
窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用され得る。硫黄源としては、硫酸塩およびチオ硫酸塩が使用され得る。
ミネラル類としては、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、第一鉄塩、マンガン塩などが使用され得る。【００４１】  必要に応じて、さらなる栄養が培地に添加され得る。例えば、微生物が生育にメチオニンを必要とする場合（メチオニン栄養要求性）、培養のため十分量のメチオニンが培地に添加され得る。【００４２】  培養は、好ましくは、振盪培養、通気を伴う撹拌培養のような好気的条件下、２０℃〜４２℃、好ましくは３７℃〜４０℃の温度で行われる。培養のｐＨは、通常５〜９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１日〜５日間の培養で、培地に目的のＬ−アミノ酸が蓄積する。【００４３】  培養後、細胞のような固体は、遠心分離または膜濾過により培養液から除去することができ、次いで目的のＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮、および結晶法により回収および精製され得る。
【実施例】
【００４４】  本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して具体的に説明する。【００４５】〔実施例１〕ＳＡＴの三次元構造
ＳＡＴの三次元構造を、以下のようにして決定した。【００４６】＜１＞セレノメチオニルＳＡＴの製造および精製
エシェリヒア・コリで組換えＳＡＴを製造するために、ベクターｐＱＥ＊（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＳＡＴをコードするｃｙｓＥ遺伝子の発現プラスミドを構築した。前記ベクターは、エシェリヒア・コリ発現ベクターｐＱＥ３０を改変することにより作製された。【００４７】  鋳型としてｐＱＥ３０を用い、オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１７および１８）を用いてＰＣＲを行った。これらのプライマーは、ベクターｐＱＥ３０のヌクレオチド配列（ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ）に基づいて構築した。プライマー配列番号１８は、Ｓｐｈｌ認識部位および図１に示すミスマッチを含む。１５０ｂｐの単一の増幅バンドを制限酵素ＸｈｏｌおよびＳｐｈｌで消化して８０ｂｐのフラグメントを回収した。このフラグメントは、予め同じ制限酵素で消化したｐＱＥ３０の大フラグメントに連結した。得られるプラスミドｐＱＥ＊は、６個の連続Ｈｉｓアミノ酸残基をコードする配列の代わりに開始コドンの位置にＳｐｈｌ切断部位と、ＢａｍＨＩ部位を含む。【００４８】  ｃｙｓＥ遺伝子のＤＮＡフラグメントを、エシェリヒア・コリＤＨ５αのゲノムＤＮＡ、およびｃｙｓＥ遺伝子のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセション番号Ｍ１５７４５）に基づいて構築したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９および２０）を用いたＰＣＲにより調製した。プライマー配列番号１９は、ＳｐｈＩ認識部位および図１に示すミスマッチを含む。プライマー配列番号２０は、５’−末端にＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む。８４０ｂｐの単一の増幅バンドを制限酵素ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで予め同じ制限酵素で消化したｐＱＥ＊の大フラグメントに連結して、プラスミドｐＱＥ−ＳＡＴを構築した。結果として、組換えＳＡＴ中の２位でＴＣＧトリプレットによりコードされる本来のセリン残基は、ＣＣＧトリプレットによりコードされるプロリンで置換された。【００４９】  ＳＡＴ発現プラスミドｐＱＥ−ＳＡＴを保持するエシェリヒア・コリＢ８３４／ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を、アンピシリン（５μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地［２０ｇ／Ｌのバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌのバクトイーストエキストラクト、２０ｇ／ＬのＮａＣｌ］で、３７℃で一晩培養した。続いて、この種培養を、セレノメチオニン（４０μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を加えたＭ９培地［１５．１ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、４ｇ／Ｌのグルコース、２ｍｌの１ＭのＭｇＳＯ４、１ｍｌの１ＭのＣａＣｌ２、１ｍｌのＦｅＣｌ３（３．５ｍｇ／ｍｌ）、２．４ｍｌのチアミン（１ｍｇ／ｍｌ）］に移した。３７℃で培養を続けた。５６０ｎｍでの光学密度が０．６に到達したところで、セレノメチオニルＳＡＴ発現の誘導のために、１ｍＭのイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを加えた。培養した細胞を、遠心分離で集めた。【００５０】  細胞ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩）、２ｍＭの（±）−ジチオトレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）の溶液に懸濁させ、超音波処理して破砕した。上清を６０℃で１０分間インキュベートした後、氷上で１０分間冷却した。沈殿物を遠心分離で除去した。可溶性セレノメチオニルＳＡＴ溶液を硫酸アンモニウム沈殿で精製し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭの（±）−ジチオトレイトール、および５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２の溶液で透析した。次いで、これを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭの（±）−ジチオトレイトール、および５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２で平衡化した陰イオン交換カラム（ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ  ６ｍｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、東京、日本）に供した。１カラム体積の同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、６ｍｌ／分の流速で、１０カラム体積以上の０〜１Ｍの塩化ナトリウム直線勾配を用いて、セレノメチオニルＳＡＴを溶出させた。溶出した画分を集めた。この溶液を、硫酸アンモニウムを加えた後、０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭの（±）−ジチオトレイトール、および５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２で平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  Ｂｕｔｙｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、東京、日本）に供した。１カラム体積の同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、５ｍｌ／分の流速で、１０カラム体積以上の０．７５〜０Ｍの硫酸アンモニウム直線勾配を用いて、セレノメチオニルＳＡＴを溶出させた。緩衝液交換のため、プールした画分を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭの（±）−ジチオトレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２の溶液を用いて透析した。【００５１】＜２＞結晶化
セレノメチオニルＳＡＴの結晶化を行った。約５日間のうちにＸ線回折に十分な大きさ（０．２×０．２×０．２ｍｍ）に成長した立方晶系結晶が得られた。【００５２】＜３＞データ収集および処理
高エネルギー物理学研究所（筑波、日本）の放射光実験施設でビームライン６Ｂに設置された、Ｑｕａｎｔａｍ４ＲＣＣＤ検出器（ＡＤＳＣ）を使用して、セレノメチオニルＳＡＴ結晶の多波長異常分散（ＭＡＤ）データを収集した。Ｘ線回折データの収集前に、Ｘ線蛍光スペクトルを記録して、ＭＡＤデータ収集に最適な波長を選択するのに使用した。Ｘ線蛍光スペクトル測定およびデータ収集の間、セレノメチオニルＳＡＴ結晶を、３５ｖ／ｖ％の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２）、および１ｍＭのＬ−システインを含む低温溶媒（ｃｒｙｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ）に対する平衡化後、９５Ｋでフラッシュ冷却した。データを、０．９７９１Å（蛍光スペクトルの変曲点、ｆ’最小）、０．９７８９Å（ｆ’最大）、０．９５００Å（遠隔高エネルギー波長）、および１．０５００Å（遠隔低エネルギー波長）で収集した。４つのデータセット全てを、２２０ｍｍの結晶対検出器距離で、かつ１画像あたり１．０°の振幅を用いて、同一結晶から収集した。ＤＰＳ／ＭＯＳＦＬＭプログラム（Ｒｏｓｓｍａｎ，Ｍ．Ｇ．，ａｎｄ  ｖａｎ  Ｂｅｅｋ，Ｃ．Ｇ．（１９９９）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ５５，１６３１−１６４０）を使用して、回折データを処理した。セレノメチオニルＳＡＴの結晶は、２．７Åまでの分解能で回折した。これは空間群Ｒ３に属し、単位胞ベクトル（ｕｎｉｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）ａ＝１０１．２Å、ｃ＝２２３．２Åを持つ。結晶は、３５．３％の溶媒含有量で、非対称単位あたり４個のセレノメチオニルＳＡＴ分子（分子Ａ，Ｂ，Ｃ、およびＤ）を含む。【００５３】＜４＞ＭＡＤ位相付け（ＭＡＤ  ｐｈａｓｉｎｇ）および位相改善
ＭＡＤデータを、ＣＣＰ４（Ｂｅｉｌｅｙ，Ｓ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ５０，７６０−７６３）プログラムＳＣＡＬＥＩＴとともにスケーリングした。ＳＯＬＶＥプログラム（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｅｎｄｚｅｎ，Ｊ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｄ５２，７４３−７４８）を使用して、非対称単位中で予想される３６個のうち１９個のＳｅ部位を決定した。ＣＣＰ４中のＭＬＰＨＡＲＥプログラムで初期ＭＡＤ位相を計算した。最終的な性能指数値（ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔ  ｖａｌｕｅ）は０．５４１となった（４０．０−２．７Å分解能）。【００５４】  ＣＣＰ４中のＤＭプログラムを使用してＭＡＤ位相を改善した。はじめに、４０．０−２．７Å分解能データを使用して、３０％の溶媒含量条件で溶媒領域平滑化（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）手順を繰り返した。電子密度マップは、比較的明瞭なタンパク質−溶媒境界を示したものの、その質は劣っており、解釈するのが困難であった。電子密度マップの解釈およびモデル構築を、Ｏｃｔａｎｅ  ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｃ．）上でＱＵＡＮＴＡプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を使用して行った。【００５５】  次の工程で、分子平均化手順により位相をさらに改善した。Ｓｅ原子の位置を重ね合わせることにより、最初に非結晶学的対称（ＮＣＳ）パラメーターを決定した。分子ＡとＢおよび分子ＣとＤは、それぞれ、非結晶学的２倍軸で相関していた。分子ＡとＣおよび分子ＢとＤは、それぞれ、ｃ−軸にそって１／２平行移動の関係にあった。４０．０−２．７Å分解能で行われた分子平均化手順の間にＮＣＳパラメーターを細密化した。分子平均化手順は成功裡に終了し、組み合わせた位相の平均の熱伝導率と熱膨張係数の比（０．６４４）および相関係数（０．６１７、０．８６８）の値の改善を得た。マップが改善されて、多くの二次構造が示された。セレノメチオニルＳＡＴの三次元構造がこのマップ上に構築された。【００５６】＜５＞ＳＡＴの三次元構造
図２は、ＳＡＴのオリゴマー構造を示す。図１に示されるとおり、ＳＡＴは３２点対称の六量体構造を形成する。３つの非結晶学的２倍軸で相関する二量体が結晶学的３倍軸で相関している。【００５７】  図３は、ＳＡＴサブユニットの三次元構造を示す。ＳＡＴサブユニットは、２つのドメインで形成される。Ｎ末端ドメインは、多くのα−ヘリックスを含む。ＳＡＴ六量体中のＮ末端ドメインヘリックスは、互いに密接に相互作用して、六量体の安定化に重要な役割を果たしている。Ｃ末端ドメインの構造は、左巻き平行βヘリックスドメイン（ＬβＨ）である。ＬβＨ構造は、巨大なコイル状角柱にフォールディングしており、あたかも角柱の表面まわりに左巻き螺旋で巻き付けられているようである。ＬβＨ構造の面は、３つの平らで平行なβシートで形成されている。ＳＡＴ六量体の構造中、隣り合うＬβＨ構造ドメインの間に巨大な割れ目（ｃｌｅｆｔ）があり、これは結晶学的３倍軸で相関している。フィードバック阻害の脱感作の原因である多数の残基（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２，３２３−３２７）は、この割れ目に広く分布している。したがって、この割れ目は、フィードバック阻害の重要な領域であり得る。残基８９〜９６を含む領域もこの割れ目に存在するので、この領域を変異誘発に選択した。【００５８】〔実施例２〕無作為化された、残基８９〜９６を含む領域を有する変異型ＳＡＴの取得
＜１＞無作為化フラグメントによる変異誘発
はじめに、２つのプラスミド、ｐＭＷ−ＰｏｍｐＣおよびｐＭＷ−ＰｎｌｐＤを得た。【００５９】  ｏｍｐＣ遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＭＷ１１８のＰａｅＩ−ＳａｌＩ部位中にクローニングすることにより、プラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣを得た。プライマーＰ４（配列番号２１）およびＰ６（配列番号２２）ならびにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによりｏｍｐＣプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを得た。ｏｍｐＣプロモーター領域は、プライマー４がハイブリダイズするための標的として使用した。ｏｍｐＣプロモーターは任意の配列に置換えることができる。但し、その配列にハイブリダイズするようにプライマーＰ４を設計する。【００６０】  ｎｌｐＤ遺伝子のプロモーター領域を含む０．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＭＷ１１８のＰａｅＩ−ＳａｌＩ部位中にクローニングすることにより、プラスミドｐＭＷ−ＰｎｌｐＤを得た。プライマーＰ５（配列番号２３）およびＰ７（配列番号２４）ならびにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによりｎｌｐＤプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを得た。ｎｌｐＤプロモーター領域は、前記プライマーにハイブリダイズしない。ｎｌｐＤプロモーターは、プライマーＰ４がハイブリダイズしない限り、任意の配列に置換えることができる。【００６１】  次いで、プライマーＰ１（配列番号２５）およびＰ２（配列番号２６）ならびにエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲによりｗｔ（野生型）ｃｙｓＥ遺伝子全長を得た。得られたＤＮＡフラグメント（０．８３ｋｂ）をプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣおよびｐＭＷ−ＰｎｌｐＤのＳａｌＩ−Ｘｂａｌ部位中にクローニングして、それぞれプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥおよびｐＭＷ−ＰｎｌｐＤ−ｃｙｓＥを得た。【００６２】  ＰＣＲ増幅に使用したＰｙｒｏｂｅｓｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼは、宝酒造株式会社（日本）から入手した。供給者の推奨する条件下で使用した。【００６３】  ２８５位〜２９１位が無作為化された変異型ｃｙｓＥ遺伝子のプールを構築するために、まず最初に、ＳＡＴの１番目〜１０２番目のアミノ酸残基の配列をコードするｃｙｓＥ遺伝子のフラグメントをＰＣＲで増幅した。鋳型としてプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥ、および無作為化された６個のヌクレオチドを含むプライマーＰ３（配列番号２７）、およびｏｍｐＣ遺伝子のプロモーター領域の配列と相同なプライマーＰ４（配列番号２１）を使用して、ＰＣＲを行った（図１参照）。プライマーＰ３の、固定された１９−ヌクレオチド３’末端配列はｃｙｓＥ遺伝子下流Ａｓｐ−９６コドンの配列と相同であり、固定された２０−ヌクレオチド５’−末端はｃｙｓＥ遺伝子上流Ｖａｌ−９５の配列と相同である。同じくプライマーＰ３は、配列番号２７において「ｎ」の文字で表される６個の無作為ヌクレオチドを含む。鋳型として２０ｎｇのプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥを、２種のプライマーそれぞれ（１０ｐｍｏｌ）を含むＰＣＲ溶液（５０μｌ）に加えた。２５回のＰＣＲサイクル（９６℃で０．４分、６０℃で０．４分、７２℃で１分）を、モデル２４００ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて行った。２５サイクルのＰＣＲの間に、０．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。【００６４】  第二工程では、先の工程で得られた０．３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で精製し、プライマーイクステンション法のための「プライマー」として使用し、１０サイクルの増幅（９６℃で１分、４０℃で１分、７２℃で０．５分）により、ｃｙｓＥ遺伝子の全配列を得た。鋳型としてプラスミドｐＭＷ−ＰｎｌｐＤ−ｃｙｓＥを使用して、ＰＣＲの第三工程で野生型ｃｙｓＥ遺伝子が増幅されるのを防いだ。【００６５】  第三工程では、１０μｌ分取した反応混合物を、５０ｐｍｏｌのｏｍｐＣ遺伝子のプロモーター領域の配列と相同なプライマーＰ４（配列番号２１）（図４参照）およびプライマーＰ２（配列番号２６）を含む新鮮な反応混合物（４０μｌ）に加え、さらに１５サイクル（９４℃で０．５分、５７℃で０．５分、７２℃で２分）を行った。【００６６】  変異型ｃｙｓＥ遺伝子のプールをコードする０．８３ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動で精製し、ＳａｌＩおよびＸｂａＩで消化し、次いで同じ制限酵素で消化されたｐＭＷ−ＰｏｍｐＣベクターに連結した。【００６７】  得られた約１００ｎｇのプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥ（ｒａｎｄｏｍ）を、エシェリヒア・コリレシピエント細胞の形質転換に使用した。【００６８】＜２＞新規変異型ｃｙｓＥ遺伝子の単離
さらなる実験のために、エシェリヒア・コリＬＥ３９２ｃｙｓＥ：：ＫｍＲ株をレシピエント株として使用した。この株は、エシェリヒア・コリＬＥ３９２株（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８９）のｃｙｓＥ遺伝子を破壊することにより得られた。カナマイシン耐性遺伝子の導入によるｃｙｓＥ遺伝子の破壊は、Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｈ．Ｎａｇａｉｓｈｉ，ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｃｌａｒｋ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７２，６９：１３６６−１３７０）により記載の方法により、ＪＣ７６２３株を使用して行った。【００６９】  エシェリヒア・コリレシピエントＬＥ３９２ｃｙｓＥ：：ＫｍＲ株を、プールプラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥ（ｒａｎｄｏｍ）で形質転換した。活性なＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥ遺伝子を、０．５％のグルコースおよび５０ｍｇ／ｌのメチオニンを補充したＭ９寒天平板上で、エシェリヒア・コリＬＥ３９２ｃｙｓＥ：：ＫｍＲ株の染色体ｃｙｓＥ変異の相補性により選択した。【００７０】  得られた全てのクローンを、システイン栄養要求株に栄養を供給する能力について検査し、約１５の変異体を選択した。これらのクローンからプラスミドを精製し、ｃｙｓＥ遺伝子の構造部分のＤＮＡ配列を、ダイデオキシ・チェイン・ターミネーション法で決定した。ＳＡＴ活性を決定するため、システイン栄養要求株であるＬＥ３９２ｃｙｓＥ：：ＫｍＲ株を、これらのプラスミドで再形質転換した。【００７１】  ７６７位に１つの塩基変化を有するとともに、メチオニン２５６がイソロイシンになった変異型ｃｙｓＥ遺伝子（ｃｙｓＥ２５６）（Ｄｅｎｋ  Ｄ．ａｎｄ  Ｂｏｃｋ  Ａ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８７，１３３（Ｐｔ３），５１５−２５）を、標準的な部位特異的変異法により得た。【００７２】〔実施例３〕ＳＡＴの触媒性におけるアミノ酸置換の効果
変異型ＳＡＴの触媒性を、Ｋｒｅｄｉｃｈ，Ｎ．Ｍ．ａｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｇ．Ｍ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９６６，２４１，２１，４９５５−９６５）により記載される方法を若干変更して、決定した。使用したアセチルコエンザイムＡおよび他の試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）製を用いた。【００７３】  変異型ＳＡＴの活性を決定するため、組換えプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＬＥ３９２ｃｙｓＥ：：ＫｍＲの細胞を、５ｍｌのＭ９培地中で、後期指数増殖期まで増殖させ、０．１４ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、５０ｍＭのリン酸カリウムおよび１００ｍＭのＫＣｌの緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに再懸濁させた。細胞を超音波処理し、ペレットを１３０００ｒｐｍでの遠心分離により分離した。得られた上清中のＳＡＴを含むタンパク質フラクションを、５倍体積の飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４で沈殿させ、ペレットを５０ｍＭのリン酸カリウムおよび１００ｍＭのＫＣｌの緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌに溶解させた。得られた溶液を、０．１ｍｌの反応混合物（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭのＬ−セリン、０．１ｍＭのアセチルコエンザイムＡ）に加え、３７℃で１０分間インキュベートした。０．３ｍｌのエタノールを加えて反応を停止させ、続いて１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清に、０．９５ｍｌの０．２４ｍＭ  ＤＴＮＢ（５，５−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸）溶液を加え、この混合液を１５分間インキュベートした。４１２ｎｍでの吸収を測定してＳＡＴ活性をアッセイした。得られたデータを表２および図５に示す。
【表２】
2005007841.tif 000004
【００７４】  表２および図５に示されるデータからわかるように、得られたｃｙｓＥ遺伝子変異体、特にｃｙｓＥ５、ｃｙｓＥ１２、ｃｙｓＥ１５、およびｃｙｓＥ１は、Ｌ−システインによるフィードバック阻害に対する感受性を示さない変異型ＳＡＴをコードしていた。これらのような、Ｌ−システインによるフィードバック阻害に対して完全に耐性な変異型ＳＡＴは、Ｌ−システイン生産菌を使用するＬ−システインの製造に有用である。【００７５】〔実施例４〕Ｌ−システイン製造における変異型ｃｙｓＥ遺伝子の発現向上の効果
Ｌ−システイン製造における変異型ｃｙｓＥ遺伝子の発現向上の効果の評価のため、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６，ＡＴＣＣ７００９２６）を親株として使用した。【００７６】  プラスミドｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥＸ（米国特許第６，２１８，１６８号に記載される、スレオニン１６７がアラニンで置換された変異型ＳＡＴをコードする変異型ｃｙｓＥＸ遺伝子を含む）およびｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥ５を、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５中株に導入した。得られたＭＧ１６５５／ｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥＸ株およびＭＧ１６５５／ｐＭＷ−ＰｏｍｐＣ−ｃｙｓＥ５株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した２ｍｌの栄養ブロス中、３４℃で振盪しながら一晩培養した。得られた０．２ｍｌの培養物を、２０×２００ｍｍの試験管中、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含む２ｍｌの発酵培地に接種し、２５０ｒｐｍでロータリーシェーカーを用いて、３４℃で４２時間培養した。発酵培地の組成は以下のとおりであった。１５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ＬのＫＨ２Ｐ０４、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、２０．０ｇ／ＬのＣａＣＯ３、０．１ｍｇ／Ｌのチアミン、１％のＬＢ、４％のグルコース、３００ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン、および０．５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３。【００７７】  培養後、培地に蓄積したＬ−システインの量を、Ｇａｉｔｏｎｄｅ，Ｍ．Ｋ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１０４：２，６２７−３３（１９６７））に記載の方法で決定した。得られたデータを表３に示す。
【表３】
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【００７８】  表３からわかるように、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株で過剰発現された、得られた変異型ｃｙｓＥ５遺伝子は、同株によるシステイン生産能を改善した。
【産業上の利用可能性】
【００７９】  本発明により、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が解除されたセリンアセチルトランスフェラーゼが提供される。また、本発明により、エシェリヒア属細菌のＬ−システイン生産能を向上させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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