(57)【要約】（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させる工程、および（ｂ）前記（ａ）工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、を含む核酸導入法、およびオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を成分として含有する核酸導入用試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む核酸導入法：
（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程。
【請求項２】
前記工程（ｂ）において、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させる、請求項１記載の核酸導入法。
【請求項３】
核酸がオリゴヌクレチドである、請求項１または２記載の核酸導入法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれらの類縁体である、請求項３記載の核酸導入法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸である、請求項３又は４記載の核酸導入法。
【請求項６】
高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を含有する、請求項１〜５いずれか記載の核酸導入法。
【請求項７】
オリゴ糖が二糖類である、請求項６記載の核酸導入法。
【請求項８】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項７記載の核酸導入法。
【請求項９】
多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、請求項６記載の核酸導入法。
【請求項１０】
ジオールがグリコール誘導体である、請求項９記載の核酸導入法。
【請求項１１】
トリオールがグリセリン誘導体である、請求項９記載の核酸導入法。
【請求項１２】
ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項９記載の核酸導入法。
【請求項１３】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項９記載の核酸導入法。
【請求項１４】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項１３記載の核酸導入法。
【請求項１５】
グリコール誘導体がエチレングリコールである、請求項１０記載の核酸導入法。
【請求項１６】
グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項１１記載の核酸導入法。
【請求項１７】
ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項１２記載の核酸導入法。
【請求項１８】
ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、請求項１７記載の核酸導入法。
【請求項１９】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、請求項１８記載の核酸導入法。
【請求項２０】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項１３記載の核酸導入法。
【請求項２１】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項１４記載の核酸導入法。
【請求項２２】
高張液が、（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを含有する、請求項６記載の核酸導入法。
【請求項２３】
オリゴ糖が二糖類である、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項２４】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項２３記載の核酸導入法。
【請求項２５】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項２６】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項２５記載の核酸導入法。
【請求項２７】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項２５記載の核酸導入法。
【請求項２８】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項２６記載の核酸導入法。
【請求項２９】
ジオールがグリコール誘導体である、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項３０】
トリオールがグリセリン誘導体である、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項３１】
ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項３２】
グリコール誘導体がエチレングリコールである、請求項２９記載の核酸導入法。
【請求項３３】
グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項３０記載の核酸導入法。
【請求項３４】
ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項３１記載の核酸導入法。
【請求項３５】
ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、請求項３４記載の核酸導入法。
【請求項３６】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、請求項３５記載の核酸導入法。
【請求項３７】
高張液が、（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを含有する、請求項２２記載の核酸導入法。
【請求項３８】
高張液が、（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを含有する、請求項３７記載の核酸導入法。
【請求項３９】
高張液がオリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質を含有する、請求項６記載の核酸導入法。
【請求項４０】
オリゴ糖が二糖類である、請求項３９記載の核酸導入法。
【請求項４１】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項４０記載の核酸導入法。
【請求項４２】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項３９記載の核酸導入法。
【請求項４３】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項４２記載の核酸導入法。
【請求項４４】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項４２記載の核酸導入法。
【請求項４５】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項４３記載の核酸導入法。
【請求項４６】
高張液がショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する、請求項３９記載の核酸導入法。
【請求項４７】
高張液中に存在するオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内である、請求項１〜４６いずれか記載の核酸導入法。
【請求項４８】
高張液中に存在するオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲内である、請求項４７記載の核酸導入法。
【請求項４９】
低張液の浸透圧が等張以下である、請求項２〜４８いずれか記載の核酸導入法。
【請求項５０】
オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を成分として含有する、核酸導入用試薬。
【請求項５１】
請求項１〜４９いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、請求項５０記載の核酸導入用試薬。
【請求項５２】
オリゴ糖が二糖類である、請求項５０または５１記載の核酸導入用試薬。
【請求項５３】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項５２記載の核酸導入用試薬。
【請求項５４】
多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、請求項５０または５１記載の核酸導入用試薬。
【請求項５５】
ジオールがグリコール誘導体である、請求項５４記載の核酸導入用試薬。
【請求項５６】
トリオールがグリセリン誘導体である、請求項５４記載の核酸導入用試薬。
【請求項５７】
ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項５４記載の核酸導入用試薬。
【請求項５８】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項５４記載の核酸導入用試薬。
【請求項５９】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項５８記載の核酸導入用試薬。
【請求項６０】
グリコール誘導体がエチレングリコールである、請求項５５記載の核酸導入用試薬。
【請求項６１】
グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項５６記載の核酸導入用試薬。
【請求項６２】
ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項５７記載の核酸導入用試薬。
【請求項６３】
ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、請求項６２記載の核酸導入用試薬。
【請求項６４】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、請求項６３記載の核酸導入用試薬。
【請求項６５】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項５８記載の核酸導入用試薬。
【請求項６６】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項５９記載の核酸導入用試薬。
【請求項６７】
（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを成分として含有する、請求項５０または５１記載の核酸導入用試薬。
【請求項６８】
オリゴ糖が二糖類である、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項６９】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項６８記載の核酸導入用試薬。
【請求項７０】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項７１】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項７０記載の核酸導入用試薬。
【請求項７２】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項７０記載の核酸導入用試薬。
【請求項７３】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項７１記載の核酸導入用試薬。
【請求項７４】
ジオールがグリコール誘導体である、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項７５】
トリオールがグリセリン誘導体である、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項７６】
ポリオールがポリグリコール誘導体である、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項７７】
グリコール誘導体がエチレングリコールである、請求項７４記載の核酸導入用試薬。
【請求項７８】
グリセリン誘導体がグリセリンである、請求項７５記載の核酸導入用試薬。
【請求項７９】
ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、請求項７６記載の核酸導入用試薬。
【請求項８０】
ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、請求項７９記載の核酸導入用試薬。
【請求項８１】
ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、請求項８０記載の核酸導入用試薬。
【請求項８２】
（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを成分として含有する、請求項６７記載の核酸導入用試薬。
【請求項８３】
（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを成分として含有する、請求項８２記載の核酸導入用試薬。
【請求項８４】
オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質を成分として含有する、請求項５０または５１記載の核酸導入用試薬。
【請求項８５】
オリゴ糖が二糖類である、請求項８４記載の核酸導入法。
【請求項８６】
二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、請求項８５記載の核酸導入用試薬。
【請求項８７】
糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、請求項８４記載の核酸導入用試薬。
【請求項８８】
オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、請求項８７記載の核酸導入用試薬。
【請求項８９】
単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、請求項８７記載の核酸導入用試薬。
【請求項９０】
二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、請求項８８記載の核酸導入用試薬。
【請求項９１】
ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを成分として含有する、請求項８４記載の核酸導入用試薬。
【請求項９２】
成分が固体または液体の形状にある、請求項５０〜９１いずれか記載の核酸導入用試薬。
【請求項９３】
オリゴ糖又は多価アルコールに属する２種以上の成分を含有する場合に、各成分が各々独立した固体または液体の形状にある、請求項９２記載の核酸導入用試薬。
【請求項９４】
高張液中でのオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内になるようにあらかじめ調製された、請求項５０〜９３いずれか記載の核酸導入用試薬。
【請求項９５】
高張液中でのオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲内になるようにあらかじめ調製された、請求項９４記載の核酸導入用試薬。
【請求項９６】
請求項５０〜９５いずれか記載の試薬を含有する核酸導入用キット。
【請求項９７】
請求項５０〜９６いずれか記載の試薬またはキットの、核酸導入における使用。
【請求項９８】
請求項５０〜９６いずれか記載の試薬またはキットを成分とする核酸導入剤。
【請求項９９】
請求項１〜４９いずれか記載の導入法により核酸が導入された細胞。
【請求項１００】
請求項１〜４９いずれか記載の導入法により核酸が導入された、マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、ハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞。
【請求項１０１】
請求項９９または１００記載の細胞から調製された細胞由来のＲＮＡまたはタンパク質。
【請求項１０２】
請求項９９または１００記載の細胞、若しくは請求項１０１記載のＲＮＡまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な核酸導入法に関する。より詳細には、本発明は、浸透圧の差を利用した新規な核酸導入法に関する。
【背景技術】  アンチセンス核酸、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などのオリゴヌクレオチドの細胞への効率的な導入は、これらの分子を用いた遺伝子機能解析において極めて重要である。従来の遺伝子導入法は、機能性分子の負電荷と細胞膜の負電荷およびそれらとイオン結合するカチオンリポソーム（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，ＦＯＣＵＳ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３（１９９９））やポリエチレンイミン（Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，７２９７（１９９５））などの正電荷をもった運搬担体の複合体を細胞へ導入する方法や、細胞透過性ペプチドとオリゴヌクレオチドを共有結合させた融合分子を導入する方法（Ｔｈｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４８２，２６５（２０００）、Ｎａｇａｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４，１４４９（１９９８））、細胞に一過性に電気的に穴をあけて細胞へ導入する方法（Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ，１，８４１（１９８２））などであった。
正電荷をもった運搬担体との複合体を用いる導入法は接着培養細胞株への導入効率は概ね良好であるが、オリゴヌクレオチド−運搬担体複合体の細胞外から細胞内への取り込みにおいては細胞内在性の取り込み機構を用いるため、取り込み活性の低い細胞への導入は困難であった。また、運搬担体自身に細胞毒性や免疫アジュバント活性があるため、リンパ球などの浮遊細胞や初代培養細胞への導入は困難であった。細胞透過性ペプチドとオリゴヌクレオチドを共有結合させた融合分子を導入する方法では、共有結合形成反応効率の問題や反応の煩雑さに加え、オリゴヌクレオチドだけの作用ではなく、細胞透過性ペプチドと機能性分子の共有結合体としての作用しか観察することができないなどの問題があった。また細胞に一過性に電気的に穴をあけて機能性分子を導入する方法は、電気パルスのため細胞が極度のダメージを受け、多くの細胞が破裂してしまう問題などがあった。このように従来の核酸導入法は各々問題点があるため、細胞種を問わず効率良く核酸を導入することの可能な新たな核酸導入法が望まれている状況にあった。
【発明の開示】
本発明は、新規な核酸導入法を提供することを目的とする。より詳細には、本発明は浸透圧の差を利用した新規な核酸導入法を提供することを目的とする。
発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、運搬担体、細胞透過性ペプチド、電気パルスに依らない核酸の細胞への効率的な導入法を開発することに成功した。すなわち本発明は、細胞外液と細胞内液の浸透圧差を利用し、細胞が外界の溶液を摂取する現象の一つとして知られるｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ（飲作用）を促進し、オリゴヌクレオチド等核酸の細胞への効率的な導入を可能にしたものである。
これまでｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓを利用して細胞内へ低分子化合物や蛋白質を導入した報告はなされていた（Ｃｒａｉｇ  Ｙ  Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９，３３−４１，１９８２）。しかしながら現在では既に陳腐化した技術となっており、核酸の導入に用いられた報告もない。
本発明者らは浸透圧差を利用した核酸を導入する方法につき検討した。すなわち（１）核酸を含有する高張液と細胞とを接触させてｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓにより核酸を細胞内に取り込ませ、（２）その後前記高張液の浸透圧を低下させて細胞内でｐｉｎｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅを破裂・核酸を細胞内に放出させることにより、核酸を導入する方法につき鋭意検討を行った。その結果驚くべきことに、本方法を用いることにより、従来にない高い効率で核酸を導入できることを見出した。しかも、従来技術では導入が極めて困難であった細胞種へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能であることを見出した。また本方法は従来使用していたアジュバント（リポソーム、ポリエチレンイミン等）を使用しない方法であるため、従来法の問題点であった細胞毒性や免疫アジュバント活性も認められない。そのため接着性細胞株だけでなく、細胞毒性への感受性が高い初代培養細胞やリンパ球へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能となった。
本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、下記に掲げるものである：
（１）  以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む核酸導入法：
（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、
（２）  前記工程（ｂ）において、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させる、前記（１）記載の核酸導入法、
（３）  核酸がオリゴヌクレチドである、前記（１）または（２）記載の核酸導入法、
（４）  オリゴヌクレオチドが、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはそれらの類縁体である、前記（３）記載の核酸導入法、
（５）  オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、架橋型核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ・アンチセンス核酸である、前記（３）又は（４）記載の核酸導入法、
（６）  高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を含有する、前記（１）〜（５）いずれか記載の核酸導入法、
（７）  オリゴ糖が二糖類である、前記（６）記載の核酸導入法、
（８）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（７）記載の核酸導入法、
（９）  多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、前記（６）記載の核酸導入法、
（１０）  ジオールがグリコール誘導体である、前記（９）記載の核酸導入法、
（１１）  トリオールがグリセリン誘導体である、前記（９）記載の核酸導入法、
（１２）  ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（９）記載の核酸導入法、
（１３）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（９）記載の核酸導入法、
（１４）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（１３）記載の核酸導入法、
（１５）  グリコール誘導体がエチレングリコールである、前記（１０）記載の核酸導入法、
（１６）  グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（１１）記載の核酸導入法、
（１７）  ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（１２）記載の核酸導入法、
（１８）  ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、前記（１７）記載の核酸導入法、
（１９）  ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、前記（１８）記載の核酸導入法、
（２０）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（１３）記載の核酸導入法、
（２１）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（１４）記載の核酸導入法、
（２２）  高張液が、（ａ）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（ｂ）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを含有する、前記（６）記載の核酸導入法、
（２３）  オリゴ糖が二糖類である、前記（２２）記載の核酸導入法、
（２４）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（２３）記載の核酸導入法、
（２５）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（２２）記載の核酸導入法、
（２６）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（２５）記載の核酸導入法、
（２７）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（２５）記載の核酸導入法、
（２８）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（２６）記載の核酸導入法、
（２９）  ジオールがグリコール誘導体である、前記（２２）記載の核酸導入法、
（３０）  トリオールがグリセリン誘導体である、前記（２２）記載の核酸導入法、
（３１）  ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（２２）記載の核酸導入法、
（３２）  グリコール誘導体がエチレングリコールである、前記（２９）記載の核酸導入法、
（３３）  グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（３０）記載の核酸導入法、
（３４）  ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（３１）記載の核酸導入法、
（３５）  ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、前記（３４）記載の核酸導入法、
（３６）  ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、前記（３５）記載の核酸導入法、
（３７）  高張液が、（ａ）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（ｂ）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを含有する、前記（２２）記載の核酸導入法、
（３８）  高張液が、（ａ）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（ｂ）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを含有する、前記（３７）記載の核酸導入法、
（３９）  高張液がオリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質を含有する、前記（６）記載の核酸導入法、
（４０）  オリゴ糖が二糖類である、前記（３９）記載の核酸導入法、
（４１）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（４０）記載の核酸導入法、
（４２）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（３９）記載の核酸導入法、
（４３）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（４２）記載の核酸導入法、
（４４）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（４２）記載の核酸導入法、
（４５）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（４３）記載の核酸導入法、
（４６）  高張液がショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する、前記（３９）記載の核酸導入法、
（４７）  高張液中に存在するオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内である、前記（１）〜（４６）いずれか記載の核酸導入法、
（４８）  高張液中に存在するオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲内である、前記（４７）記載の核酸導入法、
（４９）  低張液の浸透圧が等張以下である、前記（２）〜（４８）いずれか記載の核酸導入法、
（５０）  オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を成分として含有する、核酸導入用試薬、
（５１）  前記（１）〜（４９）いずれか記載の核酸導入法のために用いられる、前記（５０）記載の核酸導入用試薬、
（５２）  オリゴ糖が二糖類である、前記（５０）または（５１）記載の核酸導入用試薬、
（５３）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（５２）記載の核酸導入用試薬、
（５４）  多価アルコールがジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールである、前記（５０）または（５１）記載の核酸導入用試薬、
（５５）  ジオールがグリコール誘導体である、前記（５４）記載の核酸導入用試薬、
（５６）  トリオールがグリセリン誘導体である、前記（５４）記載の核酸導入用試薬、
（５７）  ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（５４）記載の核酸導入用試薬、
（５８）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（５４）記載の核酸導入用試薬、
（５９）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（５８）記載の核酸導入用試薬、
（６０）  グリコール誘導体がエチレングリコールである、前記（５５）記載の核酸導入用試薬、
（６１）  グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（５６）記載の核酸導入用試薬、
（６２）  ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（５７）記載の核酸導入用試薬、
（６３）  ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、前記（６２）記載の核酸導入用試薬、
（６４）  ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、前記（６３）記載の核酸導入用試薬、
（６５）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（５８）記載の核酸導入用試薬、
（６６）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（５９）記載の核酸導入用試薬、
（６７）  （ａ）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（ｂ）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを成分として含有する、前記（５０）または（５１）記載の核酸導入用試薬、
（６８）  オリゴ糖が二糖類である、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（６９）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（６８）記載の核酸導入用試薬、
（７０）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（７１）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（７０）記載の核酸導入用試薬、
（７２）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（７０）記載の核酸導入用試薬、
（７３）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（７１）記載の核酸導入用試薬、
（７４）  ジオールがグリコール誘導体である、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（７５）  トリオールがグリセリン誘導体である、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（７６）  ポリオールがポリグリコール誘導体である、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（７７）  グリコール誘導体がエチレングリコールである、前記（７４）記載の核酸導入用試薬、
（７８）  グリセリン誘導体がグリセリンである、前記（７５）記載の核酸導入用試薬、
（７９）  ポリグリコール誘導体がポリエチレングリコールである、前記（７６）記載の核酸導入用試薬、
（８０）  ポリエチレングリコールが分子量２０００以下のものである、前記（７９）記載の核酸導入用試薬、
（８１）  ポリエチレングリコールがＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である、前記（８０）記載の核酸導入用試薬、
（８２）  （ａ）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（ｂ）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを成分として含有する、前記（６７）記載の核酸導入用試薬、
（８３）  （ａ）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（ｂ）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを成分として含有する、前記（８２）記載の核酸導入用試薬、
（８４）  オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質を成分として含有する、前記（５０）または（５１）記載の核酸導入用試薬、
（８５）  オリゴ糖が二糖類である、前記（８４）記載の核酸導入法、
（８６）  二糖類がショ糖、麦芽糖または乳糖である、前記（８５）記載の核酸導入用試薬、
（８７）  糖アルコールが単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールである、前記（８４）記載の核酸導入用試薬、
（８８）  オリゴ糖アルコールが二糖アルコール類である、前記（８７）記載の核酸導入用試薬、
（８９）  単糖アルコール類がマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールである、前記（８７）記載の核酸導入用試薬、
（９０）  二糖アルコール類がマルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースである、前記（８８）記載の核酸導入用試薬、
（９１）  ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを成分として含有する、前記（８４）記載の核酸導入用試薬、
（９２）  成分が固体または液体の形状にある、前記（５０）〜（９１）いずれか記載の核酸導入用試薬、
（９３）  オリゴ糖又は多価アルコールに属する２種以上の成分を含有する場合に、各成分が各々独立した固体または液体の形状にある、前記（９２）記載の核酸導入用試薬、
（９４）  高張液中でのオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内になるようにあらかじめ調製された、前記（５０）〜（９３）いずれか記載の核酸導入用試薬、
（９５）  高張液中でのオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲内になるようにあらかじめ調製された、前記（９４）記載の核酸導入用試薬、
（９６）  前記（５０）〜（９５）いずれか記載の試薬を含有する核酸導入用キット、
（９７）  前記（５０）〜（９６）いずれか記載の試薬またはキットの、核酸導入における使用、
（９８）  前記（５０）〜（９６）いずれか記載の試薬またはキットを成分とする核酸導入剤、
（９９）  前記（１）〜（４９）いずれか記載の導入法により核酸が導入された細胞、
（１００）  前記（１）〜（４９）いずれか記載の導入法により核酸が導入された、マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、ハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞、
（１０１）  前記（９９）または（１００）記載の細胞から調製された細胞由来のＲＮＡまたはタンパク質、ならびに
（１０２）  前記（９９）または（１００）記載の細胞、若しくは前記（１０１）記載のＲＮＡまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明核酸導入法（上段）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法（中段）およびポリエチレンイミン法（下段）によるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入結果を示す。図中、左側は導入細胞の明視野像を、また右側は蛍光視野像を示す。
図２は、本発明核酸導入法によりＲＡＷ２６４．７細胞にＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡを導入し、定量的ＰＣＲによりｓｉＲＮＡ効果を測定した結果を示す。図中、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡはＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＴＬＲ４  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図３は、本発明核酸導入法によりＲＡＷ２６４．７細胞にＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡを導入し、ＬＰＳまたはＧＬＡ−６０刺激によるＴＮＦα産生の抑制効果を測定した結果を示す。図中、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡはＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、ＴＮＦα産生量を示す。
図４は、本発明核酸導入法によりＲＡＷ２６４．７細胞にＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを導入し、導入効率（上図）および細胞毒性（下図）を測定した結果を示す。横軸は導入効率のマーカーＦＩＴＣの蛍光量（上図）および細胞毒性のマーカー７ＡＡＤの蛍光量（下図）を示し、縦軸はＥｖｅｎｔ数を示す。
図５は、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図６は、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、高張液が含有するショ糖と多価アルコール（ＰＥＧ）の組み合わせが細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図７は、ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、高張液が含有するソルビトールと多価アルコール（ＰＥＧ）の組み合わせが細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を測定した結果を示す。図中、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図８は、ＤＯ１１．１０細胞を用いて、本発明核酸導入法が電荷を持たない核酸にも適用できるかどうかを検討した結果を示す。上図は電荷を持たない核酸アナログであるモルフォリノ・アンチセンス核酸を導入した結果を示し、下図は電荷を持つ核酸アナログであるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを導入した結果を示す。上図中、横軸は導入マーカーＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎの蛍光量を示し、縦軸はＥｖｅｎｔ数を示す。下図中、横軸は導入マーカーＦＩＴＣの蛍光量を示し、縦軸はＥｖｅｎｔ数を示す。
図９は、ＤＯ１１．１０細胞を用いて、本発明核酸導入法によるｓｉＲＮＡの反復導入の効果を調べた結果を示す。図中、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図１０は、本発明核酸導入法によりラット初代培養分化脂肪細胞にｓｉＲＮＡを導入し、導入効率（ノックダウン活性）を測定した結果を示す。図中、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡはＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを導入した結果を示し、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡはネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。また縦軸は、Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡ量でノーマライズ後のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ相対量を示す。
図１１は、本発明核酸導入法によりＲＡＷ２６４．７細胞にｓｉＲＮＡを反復導入し、導入効率（ノックダウン活性）をタンパクレベルで測定した結果を示す。図中、ＣｔｒｌはネガティブコントロールｓｉＲＮＡを示し、ＴＬＲ２はＴＬＲ２に対するｓｉＲＮＡを示す。またＡｎｔｉ−ＴＬＲ２は抗ＴＬＲ２抗体によって検出されたＴＬＲ２蛋白質を示し、Ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨは抗ＧＡＰＤＨ抗体によって検出されたＧＡＰＤＨ蛋白質を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、少なくとも以下の工程（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させる工程、
（ｂ）前記（ａ）の工程の後、高張液の浸透圧を低下させる工程、
を含む核酸導入法を提供する。
工程（ａ）において用いられる核酸は、方法の原理上、その種類に制限は無くどのような核酸であっても導入対象として用いることができる。すなわちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれであっても良く、また一本鎖・二本鎖およびこれらの類縁体のいずれの形態であっても良い。本発明の核酸が一本鎖である場合、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれも用いることができる。さらに本発明の核酸がポリヌクレオチドの場合、プラスミドの形態であっても良い。
本発明の核酸として好ましくはオリゴヌクレオチドを挙げることができる。方法の原理上、導入するオリゴヌクレオチドの種類に制限はなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドまたはこれらの類縁体のいずれも用いることができる。具体的には、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（実施例１等参照）、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾核酸（２’−ＭＯＥ−修飾核酸）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ、実施例２及び３参照）、架橋型核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＬＮＡ；Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４５５，１９９８）、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ：ＰＮＡ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７，１９９１）、またはモルフォリノ・アンチセンス核酸（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１８７，１９９７）などを例示することができる。
本発明の核酸の高張液中での濃度は、細胞への導入が可能な濃度であれば如何なる濃度であっても良いが、通常は０．０１μＭ〜１ｍＭの範囲を、好ましくは１μＭ〜１００μＭの範囲を挙げることができる。
工程（ａ）において用いられる高張液は、等張以上の浸透圧を保ち、かつ核酸を含有する当該高張液と細胞とを接触させることにより細胞内への核酸の取り込みを可能とするような溶液であれば、如何なる溶液であっても、本発明の高張液として使用することができる。好ましくは、オリゴ糖類又は多価アルコール類に属する少なくとも１種（１つ）の物質を含有する高張液が挙げられる。
ここでオリゴ糖とは具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖または乳糖が挙げられる。
また前記で多価アルコールとは具体的にはジオール、トリオール、ポリオール、糖アルコールが挙げられる。より好ましくはトリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。
ここでジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としてはエチレングリコールが例示される。
またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。
またポリオールとしては、ポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールが挙げられる。
当該ポリエチレングリコールは、分子量２０００以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０およびＰＥＧ２０００が例示される。
前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。
単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
本発明の核酸導入法において用いられる高張液は、前記に挙げた種々のオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を少なくとも１種含有していれば良い。具体的には、前記において列挙した物質、例えばショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノース、ロビノビオース、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量２０００以下のＰＥＧ−例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、ラクチトールおよび還元パラチノース等の物質の中から、任意に選択した少なくとも１種の物質を含有していれば良い。より具体的には、前記列挙した物質の中から任意に選択した１種の物質、２種の物質、３種の物質、または４種以上の物質を含有する高張液が例示される。その際、当該高張液、核酸及び細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及び／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるように調製する必要がある。この範囲内であれば如何なるモル濃度であっても良いが、好ましくは０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍ、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の核酸導入法において用いられる高張液は、前記のようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種（１つ）の物質を含有していれば良い。当該物質は１種のみを含有していても良く、２種以上を含有していても良い。２種以上を含有する場合は、（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを含有することが好ましい。
ここで用いられるオリゴ糖は、具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。
また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。
単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。
二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
前記でジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としては、エチレングリコールが挙げられる。
またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。
またポリオールとしては、ポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールが挙げられる。
当該ポリエチレングリコールは、分子量２０００以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０およびＰＥＧ２０００が例示される。
以上のような（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを含有する本発明の高張液の好ましい組み合わせとしては、（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを含有する高張液が例示される。
より好ましくは、（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する１種の物質とを含有する高張液が挙げられ、具体的には、（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを含有する高張液が例示される。
このようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する２種以上の物質を含有する本発明の高張液は、当該高張液中に存在するオリゴ糖および／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるように調製されていれば、成分の各々はどのようなモル濃度であっても良い。好ましくは総モル濃度０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の高張液がオリゴ糖又は多価アルコールに属する２種の物質を含有する場合、前記のように総モル濃度が前記の範囲内であれば各々の成分のモル濃度は如何なる値であっても良いが、例えば（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質のモル濃度が０．５Ｍ〜２Ｍの範囲であり、かつ（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する１種の物質のモル濃度が０．１Ｍである場合などを例示することができる。
本発明の核酸導入法において用いられる高張液が、オリゴ糖又は多価アルコールに属する物質を１種類のみ含有する場合は、オリゴ糖又は糖アルコールの中から選択することが好ましい。
ここで用いられるオリゴ糖は、具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。
また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。
単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。
二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
以上のような、オリゴ糖又は糖アルコールに属する物質を１種類のみ含有する本発明の高張液としては、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有する高張液が好ましい。
このようにオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を１種類のみ含有する本発明の高張液は、当該高張液中に存在するオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるように調製されていれば良い。好ましくはモル濃度０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の高張液は、オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を含有しており、かつ当該高張液と核酸及び細胞を接触させることにより細胞内への核酸の取り込みを可能とするような溶液であれば、如何なる溶液であっても、本発明の高張液として使用することができる。具体的には本発明の高張液は、培養液、緩衝液および／または血清を含有することが好ましく、培養液、緩衝液および血清のいずれも含有することがより好ましい。
ここで用いられる培養液は、各々の細胞に合った培養液であればどのような培養液であっても良い。例えばＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＥＡＧＬＥ  ＭＥＤＩＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｆ−１０  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＭＩＮＩＭＵＭ  ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＭＥＤＩＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが例示される。
また緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）、ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社）、ＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが例示される。高張液中の緩衝液の濃度はどのようなモル濃度であっても良い。好ましくはモル濃度０Ｍ〜１Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭ、最も好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲が挙げられる。
また血清としては、ウシ胎児血清、ウシ血清、仔ウシ血清、ウマ血清などが例示される。高張液中の血清の濃度はどのような濃度であっても良い。好ましくは０〜２０％（ｖ／ｖ）の範囲が挙げられ、より好ましくは５〜１０％（ｖ／ｖ）の範囲が挙げられる。
本発明の高張液全体の総モル濃度は、等張〜３Ｍの範囲内であれば良い。
本発明の核酸導入法において用いられる細胞は、方法の原理上、適応細胞種に制限はない。すなわち実施例で示したように、本発明の核酸導入法は、これまで核酸導入が極めて困難であった種々の細胞種への核酸導入を可能とした。従って細胞種を制限することなく、本発明の核酸導入法を適用することができる。
具体的には、通常の核酸導入が容易な細胞は勿論のこと、ハイブリドーマ、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆褐色脂肪細胞、初代培養褐色脂肪細胞、初代培養前駆白色脂肪細胞、初代培養白色脂肪細胞または初代培養神経細胞等に対して本発明の核酸導入法を適用することができる。
さらに本発明の方法は、原理上細胞の由来する種にとらわれることなく、動物細胞だけでなく、プロトプラスト状態を含む植物細胞、昆虫細胞、線虫細胞などに対しても適応可能である。
本発明の核酸導入法は、（ａ）核酸、高張液および細胞を接触させた後に、（ｂ）前記高張液の浸透圧を低下させることを特徴とする。
ここで前記（ｂ）において高張液の浸透圧を低下させるためには、具体的には、等張液またはそれ以下の浸透圧の溶液（低張液）と細胞とを接触させれば良く、低張液と細胞とを接触させることにより浸透圧を低下させることがより好ましい。具体的な組成としては、例えば培地：水（好ましくはＤＥＰＣ処理水）が６：４の比率で混合された低張液、または水（蒸留水、ＤＥＰＣ処理水等）を挙げることができる。
次に本発明の核酸導入法の具体例を示す。
まず導入対象となる細胞を培養する。培養は、各々の細胞に合った培養液を用いて通常の条件（３７℃、５％ＣＯ２）下で培養すれば良い。また細胞数（密度）は、各々の細胞が良好に生育できる程度の細胞数であれば良い。
高張液および低張液は、前述した本発明の高張液および低張液の組成となるように適宜調製すれば良い。
細胞への核酸の導入は以下のようにして行う。まず細胞から培養上清を除き、核酸及び高張液を接触させる。接触のさせ方としては、最終的に高張液中で核酸と細胞とが接触するような方法であればどのようなものであっても良い。具体的には、核酸を含有する高張液を予め調製し、これを前記細胞に添加する方法や、細胞に対してまず核酸（核酸含有溶液）を添加し、その後高張液を添加する方法などが例示される。
その後細胞を適当な時間保温する。保温時間は２分〜２０分程度が好ましく、１０分〜１５分程度がより好ましい。その後核酸を含有する高張液を除去し、低張液を添加する。または高張液を除去することなく水を添加して低張にしても良い。その後適当な時間保温しても良いし、また添加した低張液を除去した後ふたたび低張液を添加して適当な時間保温しても良い。保温時間は２分〜１０分程度が好ましい。前記高張液、低張液を添加した後の保温温度は、液体状態を保つ温度であれば特に制限はないが、好ましくは０℃〜４２℃の範囲が、より好ましくは室温〜３７℃の範囲が挙げられる。
その後低張液を除去し、通常の増殖培地を添加する。以上の操作により、核酸の導入が達成される。なお、この導入操作は反復して行うことが出来る。
本発明の核酸導入法は、従来にない高い効率（５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上）でオリゴヌクレオチドを導入することができる。しかも、従来技術では極めて困難であった細胞種へのオリゴヌクレオチドの効率的な導入が可能である。また本方法は従来使用していたアジュバント（リポソーム、ポリエチレンイミン等）を使用しない方法であるため、従来法の問題点であった細胞毒性や免疫アジュバント活性も認められない。そのため接着性細胞株だけでなく、細胞毒性への感受性が高い初代培養細胞やリンパ球へもオリゴヌクレオチドを効率的に導入することができる。
本発明は、前記本発明の核酸導入法のために用いられる核酸導入用試薬を提供する。
本発明の核酸導入用試薬は、オリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種の物質を成分として含有することを特徴とする。
オリゴ糖及び多価アルコールは、従来公知の通常の手法にて調製することができる。
ここでオリゴ糖とは具体的には二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。
また前記で多価アルコールとはジオール、トリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。より好ましくはトリオール、ポリオールまたは糖アルコールが挙げられる。
ここでジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としてはエチレングリコールが例示される。
またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。
またポリオールとしてはポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコールが挙げられる。
当該ポリエチレングリコールは、分子量２０００以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０およびＰＥＧ２０００が例示される。
前記で糖アルコールとしては単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。単糖アルコール類としてはマンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。
二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
本発明の核酸導入用試薬は、前記に挙げた種々のオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を少なくとも１種含有していれば良い。具体的には、前記において列挙した物質、例えばショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノース、ロビノビオース、エチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量２０００以下のＰＥＧ−例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００等）、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、ラクチトールおよび還元パラチノース等の物質の中から、任意に選択した少なくとも１種の物質を含有していれば良い。より具体的には、前記列挙した物質の中から任意に選択した１種の物質、２種の物質、３種の物質または４種以上の物質を含有していても良い。その際、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及び／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の各成分の濃度はどのようなものであっても良い。なお高張液中のオリゴ糖及び／または多価アルコールの総モル濃度は前記範囲内であれば如何なるモル濃度であっても良いが、好ましくは０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍ、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の核酸導入用試薬は、前記のようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する少なくとも１種（１つ）の物質を含有していれば良い。当該物質は１種のみを含有していても良く、２種以上を含有していても良い。２種以上を含有する場合は、（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種とを含有することが好ましい。
ここで用いられるオリゴ糖は、二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。
また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。
単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。
二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
前記でジオールとしては、グリコール誘導体が挙げられる。グリコール誘導体としては、エチレングリコールが挙げられる。
またトリオールとしては、グリセリン誘導体が挙げられる。グリセリン誘導体としては、グリセリンが挙げられる。
またポリオールとしては、ポリグリコール誘導体が挙げられる。ポリグリコール誘導体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
当該ポリエチレングリコールは、分子量２０００以下のポリエチレングリコールであれば如何なる分子量のものであっても良い。具体的には、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０およびＰＥＧ２０００が例示される。
以上のような（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質とを含有する本発明の核酸導入用試薬の好ましい組み合わせとしては、（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから選択される少なくとも１種と、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００およびグリセリンから選択される少なくとも１種とを成分として含有する核酸導入用試薬が例示される。
より好ましくは、（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質と、（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する１種の物質とを含有する核酸導入用試薬が挙げられ、具体的には（１）ショ糖、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールと、（２）ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００またはグリセリンとを成分として含有する核酸導入用試薬が例示される。
このようにオリゴ糖又は多価アルコールに属する２種以上の物質を含有する本発明の核酸導入用試薬は、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液（すなわち核酸導入時に用いられる本発明の高張液）と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖及び／または多価アルコールの総モル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の各成分の濃度は、どのようなモル濃度であっても良い。好ましくは、高張液中のオリゴ糖及び／または多価アルコールの総モル濃度０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍ、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の核酸導入試薬がオリゴ糖又は多価アルコールに属する２種の物質を含有する場合、前記のように高張液中でのこれら２種の成分の総モル濃度が前記の範囲内であれば、各々の成分のモル濃度は如何なる値であっても良いが、例えば、高張液中における（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質のモル濃度が０．５Ｍ〜２Ｍの範囲であり、かつ（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する１種の物質のモル濃度が０．１Ｍである場合などを例示することができる。
本発明の核酸導入用試薬が、オリゴ糖又は多価アルコールに属する物質を１種類のみ含有する場合は、オリゴ糖又は糖アルコールに属する１種の物質を含有することが好ましい。
ここで用いられるオリゴ糖は、具体的には二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、または十糖類が挙げられ、好ましくは二糖類が挙げられる。また二糖類としてはショ糖、麦芽糖、乳糖、トレハロース、レバンビオース、キトビオース、ビシアノース、サンブビオース、メリビオース、エピセロビオース、ツラノース、ルチノースまたはロビノビオースが挙げられ、好ましくはショ糖、麦芽糖、乳糖が挙げられる。
また前記で糖アルコールとしては、単糖アルコール類またはオリゴ糖アルコールが挙げられる。
単糖アルコール類としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはエリスリトールが挙げられる。
前記でオリゴ糖アルコールとしては、二糖アルコール類が挙げられる。
二糖アルコール類としては、マルチトール、ラクチトールまたは還元パラチノースが挙げられる。
以上のような、オリゴ糖又は糖アルコールに属する物質を１種類のみ含有する本発明の核酸導入用試薬としては、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはマルチトールを含有することが好ましい。
このようにオリゴ糖類または多価アルコール類に属する物質を１種のみ含有する本発明の核酸導入用試薬は、本発明の核酸導入用試薬を用いて調製した高張液（すなわち核酸導入時に用いられる本発明の高張液）と核酸および細胞を接触させた際に細胞内への核酸の取り込みを可能とするために、高張液中に存在するオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度が０．２９Ｍ〜３Ｍの範囲内となるものであれば、本発明の核酸導入用試薬中の当該物質（成分）の濃度は、どのようなモル濃度であっても良い。好ましくは、高張液中のオリゴ糖または多価アルコールのモル濃度０．３５Ｍ〜２．５Ｍの範囲が挙げられ、より好ましくは０．３５Ｍ〜２．１Ｍ、さらに好ましくは０．５Ｍ〜２．１Ｍの範囲が挙げられる。
なお、如何なるモル濃度が適しているかは細胞によって異なっているが、例えば所望の細胞に対して１Ｍ、１．５Ｍおよび２Ｍの３種類の濃度で導入検討を行うことなどにより、その細胞に適したモル濃度を容易に決定することができる。
本発明の核酸導入用試薬中の各成分は、固体の形状であっても、また液体の形状であっても良い。ここで固体の形状とは、ロウ状（ワックス等）の形態、ワセリン状の形態、フレーク状の形態、結晶化された形態、粉状の形態などを指す。また液体の形状とは、高粘性の形態、低粘性の形態、非粘性の形態などを指す。
オリゴ糖又は多価アルコールに属する２種以上の成分（物質）を含有する場合は、各々の成分は、独立した固体または液体の形状であっても、また混合した固体または液体の形状であっても良い。
ここで独立した固体とは、各成分が別個に固体化していることを指す。各々の成分は１つの容器中に封入されていても良く、また別々の容器中に封入されていても良い。また前記で独立した液体とは、各々の成分が液体の状態で別々の容器中に封入されていることを指す。
前記で混合した固体とは、各成分が固体の形状で混合されている形態、または各成分が混合した状態で固形化され、１つの容器中に封入された形態を指す。また前記で混合した液体とは、各成分が液体の状態で混合され１つの容器中に封入されている形態、または１つの成分が液体の状態で他方の成分が固体の状態で混合され１つの容器中に封入されている形態を指す。
具体的には、例えば（１）オリゴ糖又は糖アルコールに属する少なくとも１種の物質が結晶化されており、かつ（２）ジオール、トリオール又はポリオールに属する少なくとも１種の物質がロウ（ワックス）状の形態にある場合が例示される。この場合、両者は１つの容器中に封入することが可能である。より具体的には、（１）結晶化されたショ糖、および（２）ロウ（ワックス）状のポリエチレングリコールが１つの容器中に封入された形態が例示される。
各々の成分が固体の形状にある場合、それぞれの成分にあった方法（加熱、希釈等）により溶解すれば良い。最終的に、培養液、緩衝液及び／または血清等を添加することにより、前記に示したモル濃度を示す本発明の高張液となるように調製すれば良い。
以上のような本発明の核酸導入用試薬は、核酸導入用のキットの一成分とすることができる。当該キットは、前記本発明の核酸導入試薬のみからなるキットであっても、また本発明の核酸導入試薬と他の成分とを含むキットであっても良い。当該キット中の他の成分としては、蛍光標識オリゴヌクレオチド、ポジティブコントロールｓｉＲＮＡなどが挙げられる。
本発明の核酸導入用試薬およびキットは、核酸の導入を可能とするための核酸導入剤として使用することができる。
本発明は、前記本発明の核酸導入法により核酸が導入された細胞を提供する。
前述のように、本発明の核酸導入法により、高い効率で細胞に核酸導入することが可能となった。また、従来核酸の導入が困難であった種々の細胞にも核酸を導入できるようになった。本発明は、このような本発明の核酸導入法により核酸が導入された細胞を提供するものである。
本発明の細胞は、本発明の核酸導入法により核酸導入された如何なる細胞であっても良いが、例えばマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、ハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞が挙げられる。
好ましくは、従来核酸導入が困難であった細胞、すなわちマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、ハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞が挙げられる。
これらの細胞は、前記本発明の核酸導入法により作製することができる。
本発明は、前記本発明の細胞から調製された細胞由来のＲＮＡまたはタンパク質を提供する。これら細胞由来のＲＮＡやタンパク質を調製する方法は既に公知であり、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）などを参考にして容易に行うことができる。
本発明は、前記本発明の細胞、若しくは前記本発明のＲＮＡまたはタンパク質を用いることを特徴とする、導入した核酸に関連する遺伝子またはタンパク質の機能解析方法も提供する。
本発明の核酸導入法は、前記のようにどのような核酸導入をも可能とするものであるが、標的遺伝子の発現・機能を抑制する、すなわちノックダウン細胞を作製する際に、特に好ましく用いることができる。
たとえばノックダウン細胞を用いた機能解析としてはアンチセンス核酸、短い干渉ＲＮＡまたはおとり型核酸を導入し、標的遺伝子またはその遺伝子がコードする蛋白質の生成または機能を抑制し、当該遺伝子の細胞での働きを調べることなどが挙げられる。
本発明の機能解析方法は、従来核酸導入が困難であった細胞、すなわちマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、ハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞または初代培養神経細胞に対して本発明の核酸導入法により核酸導入された細胞や、当該細胞由来のＲＮＡ、タンパク質を用いて行うことが好ましい。
【実施例】  次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】本発明核酸導入法および従来法を用いたマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、浸透圧ショックによる本発明の核酸導入法（以下Ｏｓｍｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法とも称する）と従来法との比較を行った。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、５分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
１−２）Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチドの導入
オリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液の調製はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ９μｌを１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、室温で５分間静置後、等量のオリゴヌクレオチド希釈液（２０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド９μｌと１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩの混合液）と混和し、２０分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液として用いた。その後、上記２４ｗｅｌｌプレートで調製した細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００混合液３１８μｌを静かに加え、６時間３７℃、５％ＣＯ２下で静置後、上清を除去し、増殖培地１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で導入後２４時間培養を行った。
３．導入効率の観察
導入効率の観察は上記実施例１−１）と同様にＣＣＤカメラを用いて実施した。
１−３）ポリエチレンイミンによるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチドの導入
ポリエチレンイミンとしてはｊｅｔＰＥＩ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ社）を用いた。オリゴヌクレオチド／ポリエチレンイミン混合液の調製はＰｏｌｙＰｌｕｓ社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、７．５ｍＭ  ｊｅｔＰＥＩ  ８μｌを１９２μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（ナカライテスク）に懸濁し、等量のオリゴヌクレオチド希釈液（２０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド４０μｌと１６０μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液）と混和し、１５分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド／ポリエチレンイミン混合液として用いた。その後、上記２４ｗｅｌｌプレートで調製した細胞にオリゴヌクレオチド／ポリエチレンイミン混合液４００μｌを静かに加え、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２下で導入後２４時間培養を行った。
３．導入効率の観察
導入効率の観察は上記実施例１−１）と同様にＣＣＤカメラを用いて実施した。
１−４）本発明核酸導入法、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびポリエチレンイミン法によるオリゴヌクレオチド導入結果の比較
前記本発明核酸導入法、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびポリエチレンイミン法によるＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド導入２４時間後の細胞の形態、細胞へのダメージおよび導入効率を比較した。結果を図１に示す。
その結果、本発明核酸導入法では細胞の形態変化、ダメージはみとめられず、また視野中の８０％以上の細胞にオリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。一方、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法、およびポリエチレンイミン法では視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられたが、導入操作時の細胞の剥離による細胞数の減少が認められると同時に明視野中の全ての細胞に形態変化がみとめられ、ほとんどの細胞がバーストし、細胞死がみとめられた。これらの結果から、本発明核酸導入法は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法、およびポリエチレンイミン法とは異なり、細胞に形態変化やダメージを与えることなく、オリゴヌクレオチドを導入できることが分かった。
【実施例２】本発明核酸導入法によるＲＡＷ２６４．７細胞へのＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡの導入と定量的ＰＣＲによるｓｉＲＮＡ効果の測定
１．本発明核酸導入法によるＲＡＷ２６４．７細胞へのＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡの導入
ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ（ｓｅｎｓｅ配列５’−ＡＵＣＣＡＣＡＡＧＵＣＡＡＵＣＵＣＵＣＵＵ−３’；配列番号：２、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ配列５’−ＧＡＧＡＧＡＵＵＧＡＣＵＵＧＵＧＧＡＵＵＵ−３’；配列番号：３の二本鎖ＲＮＡ））はＰｒｏｌｉｇｏ社にて合成した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎ社から購入した。本発明核酸導入法によるＲＡＷ２６４．７細胞へのＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡおよびＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡの導入は上記実施例１−１）と同様に１０μＭのＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡあるいはＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡを含有する高張液を調製し、実施例１−１）と同手法にて実施した。
２．導入細胞からのトータルＲＮＡの回収及び定量的ＰＣＲ
導入２４時間後にＱｉａｇｅｎ社ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ＴＬＲ４  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：１２））およびノーマライゼーションコントロールであるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＡＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＴ−３’（配列番号：１３）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＴＡＴＧＧ−３’（配列番号：１４））を用いて、以下のように定量的ＰＣＲを実施した。
まずｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇを鋳型にＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、キットのプロトコールにしたがってｃＤＮＡ合成を行った。得られたトータルＲＮＡ５０ｎｇ由来のｃＤＮＡを鋳型に検出用特異的Ｐｒｉｍｅｒ  ＳｅｔおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ａｎｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をキットのプロトコールにしたがって混合し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社リアルタイムＰＣＲシステムＡＢＩ７７００にて測定した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ導入群とＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ導入群におけるＧＡＰＤＨの発現量を等しいものとみなし、ＴＬＲ４  ｍＲＮＡの低減の割合を計算した。結果を図２に示す。
その結果、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＴＬＲ４  ｍＲＮＡが８３％消失していることが分かった。
以上の結果から、本発明核酸導入法によって蛍光標識オリゴヌクレオチドだけでなくｓｉＲＮＡも導入することができること、導入したｓｉＲＮＡは高い効率で細胞のｍＲＮＡを消失させることが分かった。
【実施例３】本発明核酸導入法によるＲＡＷ２６４．７細胞へのＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡの導入とノックダウン細胞を用いたバイオアッセイ
ＴＬＲ４はＬＰＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＧＬＡ−６０（ＷＡＫＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ）の受容体であり、ＲＡＷ２６４．７細胞をこれらの化合物で刺激するとＴＮＦαの産生が誘導されることが知られている。そこで、実施例２に記載のようにＲＡＷ２６４．７細胞にＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡを導入し、２４時間後に細胞をスクレーパーで剥がし、増殖培地に懸濁し、１００００細胞を９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに播き、３７℃、５％ＣＯ２にて培養を行った。ｓｉＲＮＡの導入４８時間後に培養上清を除去し、無刺激、１０μｇ／ｍｌ  ＧＬＡ−６０、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳにて８時間刺激を行い、培養上清を回収した。対照として、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡの代わりにＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ（Ｓｅｑｕｉｔｕｒ社）を同条件にて導入し、４８時間後に培養上清を除去し、無刺激、１０μｇ／ｍｌ  ＧＬＡ−６０、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳにて８時間刺激を行い、培養上清を回収した。
ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ導入細胞および対照細胞の培養上清に含まれるＴＮＦαをＭｏｕｓｅ  ＴＮＦ−αＡＮ’ＡＬＹＺＡ  ＥＬＩＳＡキット（コスモバイオ）にて定量した。結果を図３に示す。その結果、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ導入細胞では対照細胞と比較してＬＰＳ刺激によるＴＮＦαの産生が４５％、ＧＬＡ−６０刺激によるＴＮＦαの産生が６６％低減することが分かった。
これらの結果から、本発明核酸導入法によってＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡを導入した細胞では通常の細胞と同様にＬＰＳ、あるいはＧＬＡ−６０の刺激に応じたＴＮＦαの産生誘導がみとめられるが、ＴＬＲ４  ｓｉＲＮＡ導入細胞ではこれらの刺激に応じたＴＮＦαの産生誘導が有意に抑制されることが分かり、本発明核酸導入法によるｓｉＲＮＡの導入によって細胞機能が抑制されたことが示され、具体的には受容体−リガンド対の同定などの遺伝子機能の解析に有効であることが示された。
【実施例４】本発明核酸導入法によるラット初代培養肝細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養肝細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
肝細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で３分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で５分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。
【実施例５】本発明核酸導入法によるラット初代培養筋芽細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養筋芽細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
筋芽細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で５分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。
【実施例６】本発明核酸導入法によるラット初代培養筋細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養筋芽細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。その後、培養上清を除き、添付の筋分化培地に交換し、５日間培養を行い、分化筋細胞を得た。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
分化筋細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で５分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。
【実施例７】本発明核酸導入法によるラット初代培養脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の分化培地に交換し培養を行い、分化白色脂肪細胞を得た。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
分化脂肪細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。
【実施例８】本発明核酸導入法によるラット初代培養神経細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養神経細胞は住友ベークライト株式会社より購入した。具体的には、添付の２４ウェルプレート（住友ベークライト）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、添付の培地に交換し培養を行い、神経細胞を得た。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
神経細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。また、明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。
【実施例９】本発明核酸導入法および従来法を用いたラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
ラット初代培養前駆脂肪細胞を用い、本発明核酸導入法と従来法との比較を行った。
９−１）本発明核酸導入法によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
前駆白色脂肪細胞の培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
９−２）Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅによるラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。
２．オリゴヌクレオチドの導入
オリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液の調製はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ９μｌを１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、室温で５分間静置後、等量のオリゴヌクレオチド希釈液（２０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド９μｌと１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩの混合液）と混和し、２０分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液として用いた。その後、上記２４ｗｅｌｌプレートで調製した細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド／Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００混合液３１８μｌを静かに加え、６時間３７℃、５％ＣＯ２下で静置後、上清を除去し、生育培地を３ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で導入後２４時間培養を行った。
３．導入効率の観察
導入効率の観察は上記実施例９−１）と同様にＣＣＤカメラを用いて実施した。
９−３）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の生育培地に交換し培養を行った。
２．オリゴヌクレオチドの導入
オリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液の調製はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の推奨マニュアルに従って実施した。具体的には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  ３μｌを１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、室温で５分間静置後、等量のオリゴヌクレオチド希釈液（２０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド３μｌと１５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩの混合液）と混和し、２０分間室温に置いたものをオリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液として用いた。その後、上記２４ｗｅｌｌプレートで調製した細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭＩにて洗浄、培養上清を除去し、オリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００混合液３０６μｌを静かに加え、６時間３７℃、５％ＣＯ２下で静置後、上清を除去し、生育培地を３ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で導入後２４時間培養を行った。
３．導入効率の観察
導入効率の観察は上記実施例９−１）と同様にＣＣＤカメラを用いて実施した。
９−４）本発明核酸導入法、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００法によるラット初代培養前駆脂肪細胞へのオリゴヌクレオチド導入結果の比較
前記本発明核酸導入法、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法によるＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド導入２４時間後の細胞の形態、細胞へのダメージおよび導入効率を比較した。
その結果、本発明核酸導入法では細胞の形態変化、ダメージはみとめられず、視野中の８０％程度の細胞にオリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。一方、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法では視野中のほとんどの細胞にＦＩＴＣオリゴヌクレオチドの導入がみとめられなかった。これらの結果から、本発明核酸導入法は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ法とは異なり、細胞に形態変化やダメージを与えることなく、ラット初代培養前駆脂肪細胞へもオリゴヌクレオチドを導入できることが分かった。
【実施例１０】高張液のショ糖濃度が導入効率に及ぼす効果に関する検討
高張液中のショ糖以外の組成は実施例１−１）と同様に保ったまま、ショ糖の濃度を０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１Ｍと変化させた時の導入効率の変化について調べた。
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、０．５Ｍ、０．７５Ｍまたは１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
０．７５Ｍおよび１Ｍショ糖含有高張液を用いた場合は視野中のほとんどすべての細胞に蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。０．５Ｍショ糖含有高張液を用いた場合は、０．７５Ｍおよび１Ｍショ糖含有高張液を用いた場合に比してやや少なかったものの、細胞への蛍光オリゴヌクレオチドの導入がみとめられた。またいずれのショ糖濃度含有高張液を用いた場合においても明視野中の細胞に形態変化、細胞死はみとめられなかった。以上の結果から、高張液中のショ糖濃度としては０．５Ｍ〜１Ｍがより好ましいことが分かった。
【実施例１１】高張液の糖の種類が導入効率に及ぼす効果に関する検討
高張液中の溶質のモル濃度は実施例１−１）と同様に保ったまま、糖の種類をショ糖、マンニトール、ソルビトール、あるいはキシリトールと変化させた時の導入効率の変化について調べた。
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍの各種糖（ショ糖、マンニトール、ソルビトールあるいはキシリトール）、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
ショ糖、マンニトール、ソルビトールあるいはキシリトールのいずれの糖でも、導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、いずれの糖も用いることができることが分かった。
【実施例１２】高張液のＰＥＧの種類が導入効率に及ぼす効果に関する検討
高張液中の溶質のモル濃度は実施例１−１）と同様に保ったまま、ＰＥＧの種類をＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００と変化させた時の導入効率の変化について調べた。
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）（＝１００ｍＭ）ポリエチレングリコール１０００あるいは等モル濃度のＰＥＧ（ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
ＰＥＧのポリマー化の程度（平均分子量）を問わず、導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、いずれのポリマー化の程度（平均分子量）のＰＥＧも用いることができることが分かった。
【実施例１３】高張液のＰＥＧをグリセリンと置換した場合に導入効率に及ぼす効果に関する検討
高張液中の溶質のモル濃度は実施例１−１）と同様に保ったまま、１０％（ｗ／ｖ）（＝１００ｍＭ）ＰＥＧ１０００を等モル濃度のグリセリンに置換した場合の導入効率の変化について調べた。
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖、１０％（ｗ／ｖ）（＝１００ｍＭ）ポリエチレングリコール１０００あるいは１００ｍＭグリセリン、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
ＰＥＧだけでなくグリセリンを用いた場合も導入効率に相違はみとめられなかった。これらの結果から、高張液の溶質として、ＰＥＧだけでなくグリセリンも用いることができることが分かった。
【実施例１４】実施例１−１）の高張液のＰＥＧとショ糖を等モル濃度のショ糖または糖アルコールと置換した場合に導入効率に及ぼす効果に関する検討
高張液中の溶質のモル濃度は実施例１−１）と同様に保ったまま、１０％（ｗ／ｖ）（＝１００ｍＭ）ＰＥＧ１０００と１Ｍショ糖を等モル濃度のショ糖、ソルビトール、マンニトールまたはキシリトールに置換した場合の導入効率の変化について調べた。
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で一晩培養した。
２．オリゴヌクレオチド含有高張液の調製
オリゴヌクレオチド含有高張液は以下の組成：１０μＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（２０−ｍｅｒ；５’−ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＧＧ−３’；配列番号：１）、１Ｍショ糖と１０％（ｗ／ｖ）（＝１００ｍＭ）ＰＥＧ１０００、または１．１Ｍの各種糖（ショ糖、ソルビトール、マンニトールまたはキシリトール）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各ｗｅｌｌに１００，０００細胞ずつ播き、終夜培養したのちに培養上清を除き、オリゴヌクレオチド含有高張液を４００μｌ添加した。次に、室温で１０分間保温したのち、オリゴヌクレオチド含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、すぐに低張液を除いた。再び低張液３ｍｌを添加し、室温で２分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
６．導入効率の観察
導入効率の観察は蛍光顕微鏡システム：紫外光源アキシオバード１３５用蛍光検鏡装置（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）による励起光をＦＩＴＣバンドパスフィルターを通し、２０ｘ対物レンズ、超高感度ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）搭載微分干渉顕微鏡アキシオバード１３５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。導入２４時間後にＦＩＴＣの蛍光を上記蛍光顕微鏡システムによって２秒間露光して撮影した。細胞の形態は同システムにて可視光源、フィルターなしの条件下で０．０３秒間露光して撮影した。
７．結果
同じモル濃度（１．１Ｍ）であれば、ＰＥＧとショ糖の混合物だけでなく各種糖単体（ショ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）を用いた場合もオリゴヌクレオチドの導入が可能であることが分かった。これらの結果から、高張液の溶質として、ＰＥＧとショ糖の混合物だけでなく各成分単体も用いることができることが分かった。
【実施例１５】本発明核酸導入法を用いたマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
本発明核酸導入法による導入効率、細胞毒性を調べるため、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、ＦＩＴＣ標識核酸の導入効果、導入による細胞毒性の有無をＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙにより調べた。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのＦＩＴＣ標識ヌクレオチドの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：１．４Ｍショ糖、１００ｍＭ（１０％）ＰＥＧ１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液の調製
実施例１と同様にして調製した。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各２．０ｍｌチューブに５００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭ  ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液を１０μｌ、高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．１ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。
１−２）ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド導入効果の測定
Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ−ＸＬ  ＩＩシステムを用いて、フルオレセイン蛍光量を指標にオリゴヌクレオチド導入効果を調べた。
導入２４時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍｌの生育培地に再懸濁した。得られた細胞のフルオレセイン蛍光強度をＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＩＩシステム（ベックマン・コールター）を用いて測定した。ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドの代わりに等量のＤＥＰＣ−処理水を用いたコントロール細胞と本発明導入法によりＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを導入した細胞の結果を図４（上図）に示す。
その結果、本発明導入法を用いることにより、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞にオリゴヌクレオチドを効率よく導入できることが分かった。
１−３）．細胞毒性の測定
Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ−ＸＬ  ＩＩシステムを用いて、死細胞を染色する試薬７−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）蛍光量を指標に導入処理時の細胞毒性を調べた。
導入処理２４時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍｌの生育培地に再懸濁した。１０μｌの７ＡＡＤ溶液（ベックマン・コールター）を添加し、１０分間室温にて保温後、得られた細胞の７ＡＡＤ蛍光強度をＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＩＩシステム（ベックマン・コールター）を用いて測定した。高張液、低張液の代わりに成育培地を用いて同様の処理を行ったコントロール細胞と本発明導入法により導入処理を行った細胞の結果を図４（下図）に示す。
その結果、本発明導入処理は細胞毒性を示さないことが分かった。
以上の結果から、本発明導入法は効率良く核酸を導入できるとともに、細胞毒性が認められないことが確認された。
【実施例１６】本発明核酸導入法を用いたマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの導入
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を検討した。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：１．４Ｍオリゴ糖または多価アルコール、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。オリゴ糖としてショ糖（二糖類、シグマ）、多価アルコールとしてソルビトール（単糖アルコール類、シグマ）、マンニトール（単糖アルコール類、シグマ）、キシリトール（単糖アルコール類、シグマ）、マルチトール（二糖アルコール類、シグマ）、グリセリン（トリオール、ナカライテスク）を用いた。
３．ｓｉＲＮＡ溶液の調製
ｓｉＲＮＡはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたｓｉＲＮＡは以下の配列：１ｍＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’；配列番号：４、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＵＵ−３’；配列番号：５、プロリゴジャパン）、１ｍＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＵＡＵＧＡＣＡＡＣＵＣ−３’；配列番号：６、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＵＵＵＣＵＣＧＵＧＧＵＵ−３’；配列番号：７）。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各２．０ｍｌチューブに１００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を１０μｌ、各高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．１ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。
１−２）ｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果の測定
ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡによる内在性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を調べた。
導入２４時間後にＱｉａｇｅｎ社ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号：１５）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１６））およびノーマライゼーションコントロールであるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：１８））を用いて、実施例２と同様にして定量的ＰＣＲを実施した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群とＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群におけるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎの発現量を等しいものとみなし、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの低減の割合を計算した。結果を図５に示す。
その結果、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが、ショ糖含有高張液群で８０．２％、ソルビトール含有高張液群で６８．５％、マンニトール含有高張液群で７５．６％、キシリトール含有高張液群で７４．７％、マルチトール含有高張液群で６９．８％、およびグリセリン含有高張液群で３８．２％消失していることが分かった。
以上の結果から、高張液の溶質としてオリゴ糖、多価アルコールいずれを用いた場合でも、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと同様にｓｉＲＮＡも効率良く導入できること、および導入されたｓｉＲＮＡがノックダウン活性を示すことが分かった。また、オリゴ糖とＰＥＧ類の組合せだけでなく、各種オリゴ糖や多価アルコールをそれぞれ単独に溶質として用いた場合においてもｓｉＲＮＡを効率良く導入可能できたことから、導入効果は細胞と高張液の接触に依存することが確認された。
【実施例１７】本発明核酸導入法を用いたマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの導入
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、高張液が含有するオリゴ糖と多価アルコールの組合せが細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を検討した。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：１．４Ｍオリゴ糖、１００ｍＭ多価アルコール、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。オリゴ糖としてショ糖またはソルビトール、多価アルコールとしてポリエチレングリコール２００（ＰＥＧ２００）、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００を用いた。ショ糖、ソルビトールはシグマ、ＰＥＧ類はナカライテスクより購入した。
３．ｓｉＲＮＡ溶液の調製
ｓｉＲＮＡはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたｓｉＲＮＡは以下の配列：１ｍＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’；配列番号：４、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＵＵ−３’；配列番号：５、プロリゴジャパン）、１ｍＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＵＡＵＧＡＣＡＡＣＵＣ−３’；配列番号：６、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＵＵＵＣＵＣＧＵＧＧＵＵ−３’；配列番号：７）。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各２．０ｍｌチューブに１００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を１０μｌ、各高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．１ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。
１−２）ｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果の測定
ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡによる内在性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖と多価アルコールの組合せが細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を調べた。
導入２４時間後にＱｉａｇｅｎ社ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号：１５）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１６））およびノーマライゼーションコントロールであるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：１８））を用いて、実施例２と同様にして定量的ＰＣＲを実施した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群とＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群におけるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎの発現量を等しいものとみなし、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの低減の割合を計算した。ショ糖と各種ＰＥＧ類の組合せの結果を図６に、またソルビトールと各種ＰＥＧ類の組合せの結果を図７に示す。
その結果、ショ糖と各種ＰＥＧ類の組合せではＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが、ショ糖とＰＥＧ２００含有高張液群で６９．２％、ショ糖とＰＥＧ３００含有高張液群で７７．９％、ショ糖とＰＥＧ４００含有高張液群で６９．１％、ショ糖とＰＥＧ６００含有高張液群で７２．９％、ショ糖とＰＥＧ１０００含有高張液群で６８．７％、およびショ糖とＰＥＧ１５００含有高張液群で７３．３％消失していることが分かった。また、ソルビトールと各種ＰＥＧ類の組合せではＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが、ソルビトールとＰＥＧ２００含有高張液群で６５．０％、ソルビトールとＰＥＧ３００含有高張液群で６２．９％、ソルビトールとＰＥＧ４００含有高張液群で４９．６％、ソルビトールとＰＥＧ６００含有高張液群で４１．８％、ソルビトールとＰＥＧ１０００含有高張液群で７０．５％、ソルビトールとＰＥＧ１５００含有高張液群で５７．７％、ソルビトールとＰＥＧ１５４０含有高張液群で３７．８％、およびソルビトールとＰＥＧ２０００含有高張液群で４５．４％消失していることが分かった。
以上の結果から、高張液が含有する溶質としてオリゴ糖と多価アルコールの組合せを用いた場合でも、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと同様にｓｉＲＮＡも効率良く導入できること、および導入されたｓｉＲＮＡがノックダウン活性を示すことが分かった。また、オリゴ糖とＰＥＧ類の組合せだけでなく、糖アルコールとＰＥＧ類の組合せを溶質として用いた場合においてもｓｉＲＮＡを効率良く導入可能でき、導入されたｓｉＲＮＡがノックダウン活性を示したことから、高張液の溶質としてオリゴ糖と多価アルコールの様々な組合せを用いることができることが確認された。
【実施例１８】本発明核酸導入法を用いたマウスＴ細胞様細胞株ＤＯ１１．１０細胞へのモルフォリノ・アンチセンス核酸の導入
本発明核酸導入法に核酸の電荷が必要であるのか否かを調べるため、マウスＴ細胞様細胞株ＤＯ１１．１０細胞を用いて、電荷を持たない核酸アナログであるモルフォリノ・アンチセンス核酸の導入効果を調べた。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞へのモルフォリノ・アンチセンス核酸の導入
１．細胞の調製
ＤＯ１１．１０細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：２．０Ｍショ糖、１００ｍＭ  ＰＥＧ１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．モルフォリノ・アンチセンス核酸溶液の調製
フルオレセイン標識モルフォリノ・アンチセンス核酸はフナコシから凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたフルオレセイン標識モルフォリノ・アンチセンス核酸は以下の配列：１ｍＭモルフォリノ・アンチセンス（２５−ｍｅｒ；５’−ＣＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＴＡ−３’；配列番号：８）。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＤＯ１１．１０細胞を各２．０ｍｌチューブに５００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭモルフォリノ・アンチセンス核酸溶液を１０μｌ、高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．１ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。
１−２）モルフォリノ・アンチセンス核酸導入効果の測定
Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ−ＸＬ  ＩＩシステムを用いて、フルオレセイン蛍光量を指標にモルフォリノ・アンチセンス核酸導入効果を調べた。
導入２４時間後に細胞を回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍｌの生育培地に再懸濁した。得られた細胞のフルオレセイン蛍光強度をＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ＩＩシステム（ベックマン・コールター）を用いて測定した。モルフォリノ・アンチセンス核酸の代わりに等量のＤＥＰＣ−処理水を用いたコントロール細胞と本発明導入法によりモルフォリノ・アンチセンス核酸を導入した細胞の結果を図８（上図）に示す。同様の条件でモルフォリノ・アンチセンス核酸の代わりに、電荷をもつ核酸アナログＦＩＴＣ標識ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを導入したときの結果を図８（下図）に示す。
その結果、本発明導入法を用いることにより、電荷を持つ核酸だけでなく、電荷を持たない核酸アナログであるモルフォリノ・アンチセンス核酸も細胞に効率よく導入できることが分かった。
以上の結果から、本発明導入法の効果は核酸電荷に依存しないことが分かった。
【実施例１９】本発明核酸導入法を用いたマウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞へのｓｉＲＮＡの反復導入
マウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞を用いて、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡの反復導入の効果を調べた。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞へのｓｉＲＮＡの導入
１．細胞の調製
ＤＯ１１．１０細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：２．０Ｍショ糖、１００ｍＭ  ＰＥＧ１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．ｓｉＲＮＡ溶液の調製
ｓｉＲＮＡはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたｓｉＲＮＡは以下の配列：１ｍＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’；配列番号：４、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＵＵ−３’；配列番号：５、プロリゴジャパン）、１ｍＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＵＡＵＧＡＣＡＡＣＵＣ−３’；配列番号：６、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＵＵＵＣＵＣＧＵＧＧＵＵ−３’；配列番号：７）。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＤＯ１１．１０細胞を各２．０ｍｌチューブに５００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭモルフォリノ・アンチセンス核酸溶液を１０μｌ、高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１５分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．５ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。反復導入においては導入２４時間毎に細胞を回収し、同条件にて再導入を実施した。
１−２）ｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果の測定
ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡによる内在性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を調べた。
単回導入、反復導入したそれぞれの細胞から、導入２４時間、４８時間、および７２時間後にＱｉａｇｅｎ社ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号：１５）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１６））およびノーマライゼーションコントロールであるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴ−３２（配列番号：１７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：１８））を用いて、実施例２と同様にして定量的ＰＣＲを実施した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群とＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群におけるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎの発現量を等しいものとみなし、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの低減の割合を計算した。結果を図９に示す。
その結果、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ単回導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが２４時間後で７２．３％、４８時間後で４８．４％、７２時間後で２８．４％消失していることが分かった。一方、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ反復導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが２４時間後で７１．４％、４８時間後で７０．４％、７２時間後で６８．０％消失していることが分かった。
以上の結果から、本発明導入法によって、マウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞においてもＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと同様にｓｉＲＮＡも効率良く導入できること、および導入されたｓｉＲＮＡがノックダウン活性を示すことが分かった。また、単回導入では時間の経過にしたがいノックダウン効果の減弱がみとめられるが、反復導入を行うことによって任意の期間ｓｉＲＮＡのノックダウン効果を持続できることが分かった。
【実施例２０】本発明核酸導入法によるラット初代培養分化脂肪細胞へのｓｉＲＮＡの導入
１．細胞の調製
ラット初代培養前駆白色脂肪細胞は株式会社ホクドーより購入した。具体的には、２４ウェルプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）に１０００００細胞／ウェルの密度で細胞を播いた状態で入荷し、入荷後直ちに添付の分化培地に交換し培養を行い、分化白色脂肪細胞を得た。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：１．０Ｍショ糖、１００ｍＭ  ＰＥＧ１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．ｓｉＲＮＡ溶液の調製
ｓｉＲＮＡはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたｓｉＲＮＡは以下の配列：１ｍＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’；配列番号：４、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＵＵ−３’；配列番号：５、プロリゴジャパン）、１ｍＭ  ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＵＡＵＧＡＣＡＡＣＵＣ−３’；配列番号：６、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＵＵＧＵＣＡＵＡＵＵＵＣＵＣＧＵＧＧＵＵ−３’；配列番号：７）。
３．低張液の調製
低張液は、ＲＰＭＩ１６４０培地：ＤＥＰＣ処理水（６：４）混合液になるように調製した。
４．生育培地
ホクドーの培養キットに添付の培地を用いた。
５．２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでの導入
分化脂肪細胞の培養上清を除き、ｓｉＲＮＡ含有高張液を２００μｌ添加した。室温で１０分間保温したのち、ｓｉＲＮＡ含有高張液を除き、低張液３ｍｌを添加し、室温で１０分間保温したのち低張液を除去し、増殖培地３ｍｌを添加した。
１−２）ｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果の測定
ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡによる内在性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのノックダウン効率を指標に、高張液が含有するオリゴ糖や多価アルコールの種類が細胞へのｓｉＲＮＡ導入に及ぼす効果を調べた。
単回導入したそれぞれの細胞から、導入２４時間、４８時間、および７２時間後にＱｉａｇｅｎ社ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを用いて細胞からトータルＲＮＡを回収し、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（配列番号：１５）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＴＡＡＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：１６））およびノーマライゼーションコントロールであるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＴＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧ−３’（配列番号：１８））を用いて、実施例２と同様にして定量的ＰＣＲを実施した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群とＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群におけるＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎの発現量を等しいものとみなし、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの低減の割合を計算した。結果を図１０に示す。
その結果、ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが２４時間後で７１．７％、４８時間後で５６．６％、７２時間後で２４．３％消失していることが分かった。
以上の結果から、本発明導入法によって、初代培養分化脂肪細胞においてもＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドと同様にｓｉＲＮＡも効率良く導入できること、および導入されたｓｉＲＮＡがノックダウン活性を示すことが分かった。
【実施例２１】本発明核酸導入法を用いたマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの反復導入
マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞を用いて、ＴＬＲ２  ｓｉＲＮＡの反復導入の効果を蛋白質レベルで調べた。
１−１）本発明核酸導入法によるマウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞へのｓｉＲＮＡの導入
１．細胞の調製
ＲＡＷ２６４．７細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ−７５フラスコ（ＩＷＡＫＩ）にて３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。
２．高張液の調製
高張液は以下の組成：１．４Ｍショ糖、１００ｍＭ  ＰＥＧ１０００、ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）になるように調製した。
３．ｓｉＲＮＡ溶液の調製
ｓｉＲＮＡはプロリゴジャパンから二本鎖アニーリング後の凍結乾燥品として購入した。これをＤＥＰＣ−処理水（ナカライテスク）にて１ｍＭの濃度となるように溶解した。用いたｓｉＲＮＡは以下の配列：１ｍＭ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＣＡＡＧＣＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＡＵ−３’；配列番号：４、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＡＡＣＵＵＣＡＧＧＧＵＣＡＧＣＵＵＧＵＵ−３’；配列番号：５、プロリゴジャパン）、１ｍＭ  ＴＬＲ２  ｓｉＲＮＡ（センス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＧＵＣＵＡＡＡＧＵＣＧＡＵＣＣＧＣＧＡＣＡ−３’；配列番号：９、アンチセンス鎖２１−ｍｅｒ；５’−ＵＣＧＣＧＧＡＵＣＧＡＣＵＵＵＡＧＡＣＵＵ−３’；配列番号：１０）。
４．低張液
低張液として大塚蒸留水（大塚製薬）を用いた。
５．生育培地
ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にウシ胎児血清、硫酸カナマイシンをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）、６０ｍｇ／Ｌ加えて調製した。
６．懸濁状態での導入
ＲＡＷ２６４．７細胞を各２．０ｍｌチューブに５００，０００細胞ずつ回収し、卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、１ｍＭ  ｓｉＲＮＡ溶液を１０μｌ、高張液を１９０μｌ添加した。次に、３７℃で１０分間保温したのち、大塚蒸留水（大塚製薬）１．１ｍｌを添加した。１０分間保温したのち卓上高速遠心機（トミー精工）２，０００回転／分にて５分間遠心し、培養上清を除き、生育培地２ｍｌに再懸濁し、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ）に播いた。初回導入２４時間後に細胞を回収し、同条件にて再導入を実施した。
１−２）蛋白質レベルの測定
ＴＬＲ２  ｓｉＲＮＡの導入による内在性ＴＬＲ２蛋白質のノックダウン効果を調べた。
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ、ＴＬＲ２  ｓｉＲＮＡを導入したそれぞれの細胞から、初回導入から４８時間後に１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ水溶液を用いてｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを調製した。蛋白質の定量はＢＣＡキット（ピアス）を用いて実施。各サンプル４０μｇを１／４容量の５ｘサンプルバッファーと混合し、４％／２０％グラジエントゲルＰＡＧミニ「第一」４／２０（第一化学）にて電気泳同を行った。泳同後、ＢｉｏＲａｄ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｎｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に蛋白質をｂｌｏｔｔｉｎｇした後、フィルターをＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬）に浸し、４℃にて終夜保温することによりブロッキングを行った。
ＴＬＲ２の検出においてはＡｎｔｉ−ＴＬＲ２抗体（ＩＭＧ−５２６、ＩＭＧＥＮＥＸ）１／２５０希釈液（ＢｌｏｃｋＡｃｅで希釈）にてフィルターを４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ保温後、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）にてフィルターを洗浄した。次に、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ−ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）１／１０００希釈液にてフィルターを室温で２時間保温後、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）にてフィルターを洗浄し、その後、フィルターをＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）にて染色した。ＧＡＰＤＨの検出においてはＡｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ（Ｖ−１８、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）１／１００希釈液にてフィルターを４℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ保温後、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）にてフィルターを洗浄した。次に、ｄｏｎｋｙ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ−ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ）１／１０００希釈液にてフィルターを室温で２時間保温後、ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）にてフィルターを洗浄し、その後、フィルターをＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）にて染色した。
結果を図１１に示す。
その結果、ＴＬＲ２  ｓｉＲＮＡ導入群ではＮｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉＲＮＡ導入群と比較してＴＬＲ２蛋白質が減少していることが分かった。
以上の結果から、本発明導入法によって導入されたｓｉＲＮＡのノックダウン効果が蛋白質レベルでもみとめられることが分かった。
以上の実施例１〜２１の結果より以下のことが明らかとなった。
１）本発明の核酸導入法は、従来法になく核酸導入効率が高いことが分かった。
２）本発明の核酸導入法は、従来法と異なり、細胞に形態変化やダメージを与えることなく核酸を導入出来ることが分かった。また導入された核酸は細胞内で有効に機能することが分かった。
３）本発明の核酸導入法は、従来核酸導入が困難であると言われていた細胞（マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞、マウスハイブリドーマＤＯ１１．１０細胞、初代培養肝細胞、初代培養筋芽細胞、初代培養筋細胞、初代培養前駆脂肪細胞、初代培養脂肪細胞、初代培養神経細胞等）へも効率的な導入が可能であり、適応細胞種の制限無く使用できることが分かった。
４）本発明の核酸導入法は、核酸の電荷の有無によらず使用できることが分かった。
５）本発明の核酸導入法において用いられる高張液の成分としては、オリゴ糖、多価アルコールが挙げられ、具体的にはポリエチレングリコール、グリセリン、ショ糖、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール、キシリトール等）等、種類を問わず使用できることが分かった。
６）本発明の核酸導入法において用いられる高張液中の溶質全体のモル濃度は０．５〜２．１Ｍ程度が好ましいことが分かった。
７）本発明の核酸導入法は、反復導入に使用できることが分かった。
【産業上の利用可能性】  本発明の新規な核酸導入法は、従来になく高い効率で核酸を導入することができる。しかも本発明の核酸導入法は、細胞に形態変化やダメージを与えることなく核酸を導入することができるため、導入された核酸は細胞内で有効に機能することができる。また本発明の導入法は、従来核酸導入が困難であると言われていた細胞へも効率良く核酸を導入することができる。従って本発明の核酸導入法は、従来解析不能であったあらゆる細胞を対象とした遺伝子機能解析（例えば受容体−リガンド対の同定などの遺伝子機能解析）に極めて有効に用いることができる。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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