(57)【要約】本発明は、β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカン、または該グルカンと、第２の多糖、あるいは、アクリルアミド及び／又はその誘導体との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル；β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンを溶解する第２の溶媒に溶解し、加熱処理する上記電気泳動用ゲルの製造法を提供するものである。本発明のゲルは、孔径の調整が容易で、広範囲の分子量の核酸又は蛋白質の分離分析ができ、ゲル上又はゲル中に分離展開した核酸又は蛋白質の染色による検出が妨害されることが無い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンから調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
【請求項２】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、該グルカン以外の第２の多糖との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
【請求項３】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
【請求項４】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、該グルカン以外の第２の多糖と、及びポリアクリルアミド形成用組成物との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
【請求項５】
乾燥ゲルである請求項１〜４のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル。
【請求項６】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンを溶解する第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項７】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、アルカリ性水溶液に溶解し、該溶液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項８】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、アルカリ性水溶液に溶解し、該溶液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項９】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去して得られる該１本鎖構造のグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とを第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１０】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１１】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１２】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とを第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１３】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１４】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は請求項６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用することを特徴とする電気泳動法。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は請求項６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用することを特徴とする核酸又は蛋白質の分離精製法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は請求項６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用し、電気泳動後のゲルを酵素処理することを特徴とする核酸又は蛋白質の分離精製法。
【請求項１８】
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンの、電気泳動用ゲルの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な電気泳動用ゲル、その製造方法、およびそれを用いる電気泳動法に関するものであり、さらに詳しくは生化学、医学の分野において、核酸又は蛋白質の電気泳動による分離分析に際して、支持体として使用される新規なゲル、その製造方法、およびそれを用いる電気泳動法に関するものである。
【背景技術】  従来、核酸又は蛋白質を電気泳動により分離分析するための支持体として、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルが用いられている。通常、これらのゲルによる分離分析は分子篩い効果により行われるが、それぞれのゲルの孔径は異なり、分析の対象となる物質の大きさにより使い分けられている。すなわち、比較的高分子量の核酸又は蛋白質の電気泳動にはアガロースゲルが、比較的低分子量の核酸又は蛋白質にはポリアクリルアミドゲルが使われている。
近年、アガロースやポリアクリルアミドを支持体とするゲル電気泳動法が確立され、高い精度の分子篩い効果により高分解能が期待できるようになった。しかし、アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルによる電気泳動法には以下のような問題点がある。
まず、アガロースはゲルの透明性が低く、白濁している。特に、対象物質が低分子の場合、より高濃度のゲルを用いる必要があるが、低分子のＤＮＡの分画に高濃度ゲルを使用すると、電気泳動後、ＤＮＡの鮮明な検出像を得ることが困難となる。また、微量の不純物として、硫酸基やカルボキシル基などの陰性荷電基を含むため、電気浸透が大きくなり、特に等電点電気泳動法においては大きな問題になる。
一方、ポリアクリルアミドの場合は、電気泳動に使用するに足る強度を持つゲルを形成できるポリアクリルアミド濃度が実質４〜３０質量％である。この濃度範囲のゲルは、孔径が小さいので、電気泳動に使用できる強度を持つアガロースゲル内なら移動できる分子量の物質でも、大きな分子量のものはポリアクリルアミドゲル内の移動が阻害される。即ち、ポリアクリルアミドゲルは、アガロースゲルに比べ、分離可能な物質の分子量の範囲が狭い。また、ポリアクリルアミドゲルの調製方法は非常に煩雑である。
また、電気泳動法は、分離した物質をゲルから容易に抽出回収することができれば、特に蛋白質の有用な分離精製法となり得るが、ポリアクリルアミドゲルからの蛋白質の回収率は一般的に低い。比較的回収率の高い電気的溶出法の場合でも、専用の装置が必要であること、操作が煩雑であることなどの問題がある。
また、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  Ｆｒｉｅｓ（スエヒロタケ）が産生するシゾフィラン、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｇｌｕｃａｎｉｃｕｍが産生するスクレログルカン、レンチナン、ラミナラン、パキマンなどの水溶性グルカンは、何本かの分子鎖が絡み合ってヘリックス構造を持つ多量体を形成しており、これらヘリックス構造を持つ多量体を、水素結合を破壊する溶媒に溶解すると１本鎖状に溶解し、この溶解液から該溶媒を除去するとゲルを形成することが知られている（例えば、特許文献１参照）。
例えば、シゾフィランについては、水中では三重らせん（以下３本鎖という）分子として、またジメチルスルホキシド中では３本鎖がほどけたランダムコイル（以下１本鎖という）として溶解することが確かめられている（例えば、非特許文献１参照）。また、シゾフィランの水溶液を１３５℃に加熱しても、３本鎖が１本鎖として融解し、これを再び冷却すると、ゲルを形成することが見出されている（例えば、非特許文献２参照）。
なお、グルカンと類似した構造をもつ多糖であるカードランを電気泳動用ゲルとして利用できることが知られているが（例えば、特許文献２及び３参照）、カードランゲルは透明ではなく、特に蛋白質を分離した後、染色法により蛋白質のスポットを検出する際にその不透明さが問題となる。
特許文献１  特開昭５６−１２７６０３号公報
特許文献２  特許第２６２８２２９号
特許文献３  米国特許第４７７４０９３号
非特許文献１  Ｔ．Ｎｏｒｉｓｕｅ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｐｈｙｓ．Ｅｄ．，１８．５４７（１９８０）
非特許文献２  Ｔ．Ｙａｎａｋｉ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．，５，２７５（１９８５）
【発明の開示】
本発明は、上記問題を解決することを目的とするものであり、生化学、医学の分野における核酸又は蛋白質の分離分析を、電気泳動法により、より簡便に、より効率良く、かつより安全に行うことができる、新規の電気泳動用ゲル、その製造方法、およびそのゲルを用いる電気泳動法を提供することを目的としている。
さらに具体的には、本発明の目的は、孔径の調整が容易で、広範囲の分子量の核酸又は蛋白質の分離分析ができ、ゲル上又はゲル中に分離展開した核酸又は蛋白質の染色による検出が妨害されることが無いような電気泳動用ゲルを提供することである。
本発明の他の目的は、上記電気泳動用ゲルの製造法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、上記電気泳動用ゲルを用いた電気泳動法を提供することである。
本発明の他の目的は、上記電気泳動用ゲルを用いた核酸又は蛋白質の分離精製法を提供することである。
本発明者は上記課題を克服すべく鋭意研究を重ねた結果、β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖にもつ、種々の分子量の水溶性グルカンを含有するゲルを調製し、それを電気泳動の支持体とすることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下に示す電気泳動用ゲル、その製造方法、それを用いる電気泳動法、それを用いる核酸又は蛋白質の電気泳動による分離精製法を提供するものである。
なお、この明細書において、「核酸」とは、ポリヌクレオチド鎖のみからなる核酸の他、ヌクレオチド以外の成分が結合した核酸複合体（例えば、各種糖類と結合した糖核酸、各種脂質と結合したリポ核酸、各種蛋白質と結合した核酸蛋白質など）、これらの同種又は異種のものが２以上会合した会合体も意味するものであり、「蛋白質」とは、ポリペプチド鎖のみからなる単純蛋白質の他、アミノ酸又はペプチド以外の成分が結合した複合蛋白質（例えば、各種糖類が結合した糖蛋白質、各種脂質が結合したリポ蛋白質、各種核酸が結合した核酸蛋白質）、これらの２種以上が会合した会合体も意味するものとする。
１．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンから調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
２．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、該グルカン以外の第２の多糖との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
３．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
４．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンと、該グルカン以外の第２の多糖と、及びポリアクリルアミド形成用組成物との混合物から調製されたゲルを含む電気泳動用ゲル。
５．乾燥ゲルである上記１〜４のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル。
６．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンを溶解する第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
７．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、アルカリ性水溶液に溶解し、該溶液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
８．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、アルカリ性水溶液に溶解し、該溶液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
９．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去して得られる該１本鎖構造のグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とを第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１０．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１１．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、グルカン以外の第２の多糖とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１２．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とを第２の溶媒に溶解し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１３．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１４．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理することを特徴とする電気泳動用ゲルの製造法。
１５．上記１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は上記６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用することを特徴とする電気泳動法。
１６．上記１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は上記６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用することを特徴とする核酸又は蛋白質の分離精製法。
１７．上記１〜５のいずれか１項記載の電気泳動用ゲル、又は上記６〜１４のいずれか１項記載の方法により製造された電気泳動用ゲルを支持体として使用し、電気泳動後のゲルを酵素処理することを特徴とする核酸又は蛋白質の分離精製法。
１８．β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有する１本鎖構造のグルカンの、電気泳動用ゲルの製造のための使用。
本発明の電気泳動用ゲルは、グルカンの分子量、濃度などにより容易にゲルの孔径などを幅広い範囲で調節することができ、特に高分子量の１本鎖シゾフィランの低濃度ゲルはポリアクリルアミドゲルに比べてゲルの孔径が大きいため、１０００ｋＤａ以上の高分子量の核酸又は蛋白質を、その高次構造および生理活性を保ったまま分離分析することができる。
また、本発明のゲルは、ゲルの透明性が非常に高いため、ゲル上又はゲル中の核酸又は蛋白質の染色による検出が妨害されず、広範囲の分子量の蛋白質、ＤＮＡなどの分離分析が可能になる。さらに、ゲル上又はゲル中に展開分離した物質の回収が容易なため、分取を目的とする電気泳動用ゲルとしても利用できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例３、比較例（１）及び比較例（２）の各ゲル上での２５〜２５０ｋＤａの蛋白質の電気泳動パターンを示す図である。
図２は、シゾフィランの分子量及び濃度が異なる２種類のゲル上での５０ｋＤａの蛋白質（ＢＰＢ）の電気泳動パターンを示す図である。
図３は、実施例５とその比較例の各ゲル上での７５〜２５０ｋＤａの高分子量蛋白質の電気泳動パターンを示す図である。
図４は、実施例６とその比較例の各ゲル上での６７〜１０００ｋＤａの高分子量蛋白質の電気泳動パターンを示す図である。
図５は、２種類のＤＮＡ分子量マーカー（（１）Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ及び（２）ｐＢＲ３２２／Ｍｓｐ  Ｉ  ｄｉｇｅｓｔ）の電気泳動パターンについて、実施例８のゲル上のものと、３重量％アガロースゲル上のものを比較した図である。
図６は、１本鎖シゾフィランとデンプンから調製した変性系電気泳動用チューブゲル上での、蛋白質分子量マーカーの泳動パターンを示す図である。
図７は、ＤＮＡの電気泳動パターンを、１本鎖シゾフィランと市販寒天の混合物から調製したゲルと、市販寒天のみから調製したゲルとで比較した図である。
図８は、実施例１６とその比較例の各ゲル上での１０〜２５０ｋＤａの蛋白質の分離パターンを示す図である。
図９は、実施例２０とその比較例（１７％ポリアクリルアミドゲル）の各ゲル上での４−３４．５ｋＤａの蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１０は、勾配ゲル形成器の一例を示す図面である。
図１１は、実施例２２とその比較例（４−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル）の各ゲル上での１０−２５０ｋＤａの蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１２は、実施例２３の４５−２００万分子量勾配グルカンゲル及びＰＡ（ポリアクリルアミド）勾配ゲル上での１０−２５０ｋＤａの蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１３は、実施例２４の１０〜２５０ｋＤａ蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１４は、実施例６の電気泳動パターンと実施例２５の２３２〜６６９ｋＤａ蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１５は、実施例２７とその比較例の等電点４．４５〜９．６蛋白質の分離パターンを示す図である。
図１６は、実施例２８の１２．２〜２３２ｋＤａ、ｐＩ４．４５〜９．６の蛋白質の２次元分離（１次元目：シゾフィランゲル、２次元目：ＰＡゲルで共に非変性系）パターンを示す図である。
図１７は、実施例２８の１２．２〜２３２ｋＤａ、ｐＩ４．４５〜９．６の蛋白質の２次元分離（１次元目（非変性系）：シゾフィランゲル、２次元目（変性系）：シゾフィランゲル）パターンを示す図である。
図１８は、実施例３０の２３２〜６６９ｋＤａ蛋白質の分離パターンを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のゲルの原料となるグルカンは水溶性グルカンであり、具体例としては、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ  Ｆｒｉｅｓ（スエヒロタケ）が産生するシゾフィラン、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｇｌｕｃａｎｉｃｕｍが産生するスクレログルカン、レンチナン、ラミナラン、パキマンなどが挙げられ、好ましくはシゾフィラン、スクレログルカンが挙げられる。前述のとおり、これらの多糖は何本かの分子鎖が絡み合ってヘリックス構造を持つ多量体を形成しているが、これらヘリックス構造を持つ多量体を、水素結合を破壊する溶媒に溶解すると１本鎖状に溶解し、この溶解液から該溶媒を除去するとゲルを形成することが知られている。
例えば、シゾフィランについては、水中では３本鎖の分子として、またジメチルスルホキシド中では３本鎖がほどけたランダムコイル（以下１本鎖という）として溶解することが確かめられている。３本鎖の水素結合を破壊し１本鎖状に溶解するための溶媒としては、ジメチルスルホキシド以外に、０．１５Ｍ以上のアルカリ水溶液、トリエチレンジアミンカドミウムヒドロキシドなどが利用できる。
また、シゾフィランの水溶液を１３５℃に加熱しても、３本鎖が１本鎖として融解し、これを再び冷却すると、ゲルを形成することが知られている。
水溶性グルカンのゲルを調製する方法としては、上述の知見からも示唆されるように、（１）加熱ゲル化法、（２）透析ゲル化法、及び（３）中和ゲル化法がある。
（１）加熱ゲル化法は、まず、３本鎖グルカンを１本鎖状に溶解するための第１の溶媒、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム等のアルカリ金属化合物又はアルカリ土類金属化合物の水溶液のようなアルカリ性水溶液（例えば、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）、ジメチルスルホキシド、トリエチレンジアミンカドミウムヒドロキシド、尿素水溶液などの溶媒に、ゲル化させない場合には約１質量％以下となるように溶解した後、透析、イオン交換などの方法によりこれらの溶媒を除去し、こうして得られた１本鎖シゾフィランを第２の溶媒、例えば、水、緩衝液などの適当な溶媒に溶かして６０℃〜１３５℃、好ましくは８０〜１２０℃で数秒〜数時間、好ましくは１０〜６０分間加熱した後、例えば、室温付近まで冷却してゲルを得る方法である。
例えば、グルカンを第１の溶媒に低濃度で溶解後、透析によりこれらの溶媒を除去（この段階ではゲルではない）して得た透析液を凍結乾燥して１本鎖グルカン（固体）を得る。この１本鎖グルカンを水などの溶媒に溶解して加熱してゲルを得る。
なおグルカンを第１の溶媒に高濃度で溶解後、透析によりこれらの溶媒を除去（この段階でゲルとなる）して得たゲルを凍結乾燥して得たグルカンを水などの溶媒に溶解して加熱してもゲルが得られる。
（２）透析ゲル化法は、グルカンを高濃度で、好ましくは１〜１０質量％となるように、第１の溶媒に溶解して調製した１本鎖グルカン溶液から、透析などの方法により該溶媒を除去してゲルを得る方法である。
（３）中和ゲル化法は、特許文献２に記載されているように、３本鎖グルカンをアルカリ水溶液に溶解後、アルカリ中和物質で中和することにより（透析などによりこれらの溶媒を除去することなく）ゲル化する方法である。アルカリ中和物質としては、特許文献２に記載されているように、各種酸から選ばれる少なくとも１種を用いることができる。また、酸アミド及び／又はエステルからなる群から選ばれる少なくとも１種を用いることもできる。酸としては、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸等の有機酸、硫酸、りん酸等の無機酸が挙げられる。また、酸アミド及びエステルとしては、上記酸と、アンモニア、炭素数１〜４の直鎖又は分岐アルキルアミン、又は炭素数２〜８の直鎖又は分岐ジアルキルアミン等のアミンとの酸アミド、例えば、ホルムアミドが挙げられ、エステルとしては、上記酸とアルコール、好ましくは、炭素数１〜４の直鎖又は分岐アルコールとのエステルが挙げられる。さらに、上記酸を酸成分とする酸無水物や酸ハロゲン化物（ハロゲンとして好ましくは弗素、塩素、臭素）等も、アルカリ中和物質として使用できる。中和物質としての酸、酸アミド、エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物の添加量は、アルカリ性水溶液中のアルカリ１当量に対して０．６当量以上、好ましくは０．６〜１０当量、特に好ましくは１〜４当量である。
いずれの方法で得られたゲルも特性に大きな差はなく、本発明の電気泳動用ゲルとして充分な強度を持っている。しかし、電気泳動用ゲルの形態調整の容易性、及びグルカン濃度調整の容易性という点においては、加熱ゲル化法と、酸アミド及び／又はエステルを用いる中和ゲル化法が好ましい。
なお、１本鎖グルカンは水溶液中では経時的にヘリックス構造を形成し３本鎖グルカンを形成することが知られているが、加熱ゲル化法、透析ゲル化法、中和ゲル化法ともに、ゲル化の過程で１本鎖グルカンがヘリックス構造を形成して３本鎖グルカンになることが考えられる。また、加熱ゲル化法で用いる１本鎖グルカン粉末の調製時に３本鎖グルカンが混在することも考えられるが、その粉末中の１本鎖グルカン濃度が０．２質量％以上であれば、本発明のゲルを形成することができる。
本発明の電気泳動用ゲルの作成方法を次に具体的に説明する。前述の如く、１本鎖グルカンからゲルを形成するには（１）加熱ゲル化法、（２）透析ゲル化法、（３）中和ゲル化法があるが、いずれの場合も適当なゲル形成器を用いる。すなわち、（１）加熱ゲル化法では、加熱可能なゲル形成器を用い、電気泳動用平板ゲル又はチューブゲルを調製することができる。また、（２）透析ゲル化法では、透析膜と補強板を組み合わせた透析ゲル形成器を用い、電気泳動用平板ゲルを調製することができる。（３）中和ゲル化法では、通常のゲル形成器を用いて、電気泳動用平板ゲル、チューブゲル等任意の形状のゲルを調製することができる。加熱ゲル化法及び中和ゲル化法では、濃度勾配、分子量勾配、分子種勾配、ｐＨ勾配等の種々の勾配ゲルを容易に調製することができる。
また、濃度、分子量、分子種、ｐＨ等が異なる数種類の層からなるゲルも調製することができる。
また、シゾフィランゲルでは垂直型電気泳動装置用のサンプル溝の作成が容易ではないことが多い。この場合には、まずシゾフィランゲルでほぼ全体の泳動用ゲルを作成し、これにサンプル溝形成部分を、溝形成が容易な他のゲル、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルを用いて作成しても良い。
平板ゲルの大きさは、例えば、平幅×長さ×厚さ＝７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍが一般的であり、チューブゲルの大きさは、例えば、直径×長さ＝５ｍｍ×８５ｍｍが一般的であるが、これらに限定されるものではなく、必要に応じて任意の大きさのゲルを調製することができる。
このようにして得られるゲルは、非常に透明で、ゲル上又はゲル中に展開した蛋白質や核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のスポットの各種染色法による検出、特に、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）のスポットのエチジウムブロマイドによる染色による検出が阻害されず、鮮明な検出像の写真撮影ができるという、電気泳動用ゲルとして、公知のカードランゲルと比較して非常に優れた有益な特徴を有している。
本発明のゲルは、グルカンの分子量、濃度、種類などにより容易にゲルの強度、孔径などを幅広い範囲で調節することができる。具体的には、本発明に使用するグルカンは、好ましくは分子量１万から５００万の１本鎖グルカンであるが、低分子量のグルカンの場合は高濃度のゲルの調製が、高分子量のグルカンの場合は低濃度のゲルの調製が可能となり、グルカン濃度０．２から５０質量％のゲルを調製することができる。特に分子量が５０万から５００万の１本鎖グルカンは、低濃度でも、電気泳動後の染色、脱色などの操作を行うために充分な強度を持つゲルを調製することが可能である。このような高分子量１本鎖グルカンの低濃度ゲルはポリアクリルアミドゲルに比べてゲルの孔径が大きいため、高分子量の核酸又は蛋白質の分離分析にも適用できる。例えば、ポリアクリルアミドゲルでは電気泳動され難い１０００ｋＤａ以上の高分子量蛋白質でも、その高次構造および生理活性を保ったまま、すなわち変性剤を用いない非変性条件下でも分離することが可能になる。
また、本発明のゲルは、ゲル上に展開した物質の回収率がポリアクリルアミドゲルよりも高く、分取又は回収を目的とする電気泳動用ゲルとしても有用である。従って本発明のゲルを用いた電気泳動法は核酸又は蛋白質などの生体由来物質の有用な分離精製法となり得る。電気泳動後、ゲル上又はゲル中に分離展開した物質を回収する具体的な方法としては、溶出液により溶出する方法、凍結融解により溶出する方法、電気泳動的に溶出する方法、β−１，３−グルカナーゼ活性を有する酵素でゲルを溶解させる酵素法などが適用できる。特に酵素法によれば、加熱、有機溶媒処理等を伴わず、ゲル全体を完全に溶解させるので、目的の核酸又は蛋白質を変性させることなく天然の状態で理論上１００％回収することができる。
本発明のゲルは、１本鎖グルカン単独でゲル化したものでもよいが、アガロース、ローカストビーンガム、タラガム、グァーガム、タマリンドガム、プルラン、デキストラン、デンプン、セルロース等の１種類以上の第２の多糖を併用してゲル化したものでも良い。１本鎖グルカンと第２の多糖を併用したゲルの調製には、上記（１）加熱ゲル化法、（２）透析ゲル化法、及び（３）中和ゲル化法のいずれも使用することができる。こうして得られたゲルはいずれも優れた電気泳動用支持体となる。
１本鎖グルカンと第２の多糖を併用する場合、１本鎖グルカンと第２の多糖の総量に対する１本鎖グルカンの比率は、好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは１〜９０質量％である。１本鎖グルカンの比率が０．１質量％未満では、本発明の目的が充分に達成されなくなる。
低純度アガロースとしては、一般的な市販アガロースを挙げることができる。それらのゲルの多くは、不純物として硫酸基やカルボキシル基などの陰性荷電基を数％含むため電気浸透度が大きく、電気泳動に用いた場合、核酸又は蛋白質の分離能が劣る。しかし、本発明者らは、そのようなアガロースでも、１本鎖グルカンを併用してゲル化したゲルにすると、電気浸透度が緩和されて、電気泳動時の核酸又は蛋白質の分離能が飛躍的に向上することを見出した。
一般に電気泳動用として使用されているアガロースは、海藻から抽出されるアガロースの不純物を徹底的に除去することにより高度に精製したものである。従って、電気泳動用アガロースは、製造に膨大な労力とコストを要し、非常に高価なものとなっている。しかし、上述のように、一般的な市販のアガロースに１本鎖グルカンを併用してゲル化することにより、電気泳動時の核酸又は蛋白質の分離能が高度に精製したアガロースのゲルと同等のゲルが調製可能となるため、高度に精製したアガロースのゲルに匹敵する電気泳動用ゲルを安価かつ容易に提供できる。
β−１，３−グルコシド結合を主鎖とするグルカンは、例えば増粘多糖として食品用途にも多く利用されており、その安全性は非常に高い。
本発明のゲルは、１本鎖グルカン単独でゲル化したものでも、これに第２の多糖を併用したものでもよいが、さらにアクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を併用してゲル化したものでも良い。１本鎖グルカンとアクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を併用したゲルの調製には、上記（１）加熱ゲル化法、（２）透析ゲル化法、及び（３）中和ゲル化法のいずれも使用することができるが、（１）加熱ゲル化法、及び（３）中和ゲル化法が好適である。こうして得られたゲルはいずれも優れた電気泳動用支持体となる。
１本鎖グルカンと、アクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を併用する場合、１本鎖グルカンとアクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体の総量に対する１本鎖グルカンの比率は、好ましくは０．１〜１００質量％、さらに好ましくは１〜９０質量％である。１本鎖グルカンの比率が０．１質量％未満では、本発明の目的が充分に達成されなくなる。
１本鎖グルカンとアクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を併用した本発明のゲルは、例えば、β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンを、該グルカンのヘリックス構造を破壊し得る第１の溶媒に溶解して１本鎖構造のグルカンとした後、第１の溶媒を除去し、該１本鎖構造のグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とを第２の溶媒に溶解し、加熱処理する方法、β−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和する方法、あるいはβ−１，３−グルコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グルコシド結合を側鎖に有するグルカンと、ポリアクリルアミド形成用組成物とをアルカリ性水溶液に溶解し、当該溶解液にアルカリ中和物質を加えて中和し、加熱処理する方法等により製造することができる。
ポリアクリルアミド形成用組成物は、モノマー、架橋剤、重合開始剤、重合促進剤及び溶媒を含み、必要により、変性剤、還元剤を含有させてもよい。モノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ置換アクリルアミド誘導体、例えば、一般式：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ（式中、ｎは１〜５の整数を示し、Ｒは、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基等の酸性基、又はジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、又はモルホリノ基等の塩基性基を示す。）等が挙げられる。架橋剤としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等が、重合促進剤としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）等が、重合開始剤としては、過硫酸アンモニウム等が、溶媒としては、水、ｐＨ３〜１１の緩衝液等が挙げられる。また変性剤としては、ＳＤＳ、尿素、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標））、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）等が、還元剤としては、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等が挙げられる。
アクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドは電気泳動用グレードとして単独で市販されており、最近ではアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを一定の割合で混合したものも市販されている。市販のアクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド混合品は、混合比１９／１〜３７．５／１のものが入手可能である。
Ｎ置換アクリルアミド誘導体としては、アマシャムファルマシア社製「イモビライン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）（登録商標）ＩＩ」等が挙げられる。「イモビライン（登録商標）」には、上記一般式のｎ及び置換基Ｒの違いによりｐＫの異なる製品があり、ｐＫ３．６，４．６，６．２，７．０，８．５，９．３のものが入手可能である。
上記試薬は最初からゲルを作成する場合の溶液（０．２Ｍ）として市販されている。実際には上記ｐＫの異なる「イモビライン（登録商標）」を混合して勾配範囲の最低ｐＨと最大ｐＨのものを用意しておき、これらの混合比をグラジェントしながら市販のアクリルアミド（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの混合品を使用）と混合して共重合させることで、ｐＨ勾配をつけたゲルを作成することができる。
本発明の１本鎖グルカンとアクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を用いてｐＨ勾配ゲルを製造するには、ゲル中のグルカン濃度は好ましくは０．２〜５０質量％、ゲル中のアクリルアミドの濃度範囲は好ましくは０．０１〜１０質量％、さらに好ましくは０．１〜４質量％、及びゲル中のアクリルアミド誘導体の濃度範囲は、好ましくは０．２Ｍ〜０．００２Ｍ、さらに好ましくは０．０１Ｍ〜０．０３Ｍである。
以上のように、本発明に使用するグルカンが、特定の条件下でゲルを形成することは公知であるが、このゲル、あるいは該グルカンに第２の多糖、あるいは、アクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を併用して調製したゲルが電気泳動用ゲルとして優れた特性を有することは従来全く知られておらず、本発明者等が初めて見出したものである。
【実施例】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】１本鎖シゾフィランの調製
Ａ  ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１０．０ｇ（３本鎖としての分子量約４５万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  １０００ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。溶解液を、透析用セルロースチューブ（孔径約５０オングストローム）を用いて、透析液が中性になるまで、脱イオン水に対して透析した。そして、セルロースチューブ内のシゾフィラン水溶液を凍結乾燥して分子量約１５万の１本鎖シゾフィランを９．７９ｇ得た。
Ｂ  ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン５．０ｇ（３本鎖としての分子量約６００万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  １００ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。溶解液を、透析用セルロースチューブを用い、透析液が中性になるまで、脱イオン水に対して透析した。そして、セルロースチューブ内のシゾフィランゲルを凍結乾燥して分子量約２００万の１本鎖シゾフィランを４．８５ｇ得た。
Ｃ  ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１０．０ｇ（３本鎖としての分子量約１５万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  ２０００ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。透析液が中性になるまで、脱イオン水に対して透析した。次に、セルロースチューブ内のシゾフィラン水溶液を別の容器に移し、アセトン２０００ｍｌを攪拌しながら徐々に加えてシゾフィランを凝固させた。そして、凝固物をろ過法によって回収し、減圧下、６０℃で一夜乾燥して、分子量約５万の１本鎖シゾフィランを９．２ｇ得た。
なお、上記で用いた３法は、ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィランから１本鎖シゾフィランを調製する方法であり、いずれの方法によっても分子量に関係なく１本鎖シゾフィランを調製することができる。
【実施例２】ゲルの調製
１−１．加熱ゲル化法による平板ゲルの調製
実施例１のＡ、Ｂ、又はＣで調製した１本鎖シゾフィランを、脱イオン水とともにホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。これを減圧下で脱気した後、加熱ゲル形成器に注入し、１２０℃で２０分加熱してゲル化させ、電気泳動用平板ゲル（７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。
１−２．加熱ゲル化法による変性系チューブゲルの調製
実施例１のＡ、Ｂ、又はＣで調製した１本鎖シゾフィランを脱イオン水１１．１ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）３．７５ｍｌとともにホモジナイズ処理して減圧下で脱気した後、１０％ＳＤＳ水溶液０．１５ｍｌを加えて攪拌して１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。この液をガラス管（直径×長さ＝５ｍｍ×１００ｍｍ）に注入し、１２０℃で２０分間加熱してゲル化させ、変性系電気泳動用チューブゲル（直径×長さ＝５ｍｍ×８５ｍｍ）を作製した。
１−３．加熱ゲル化法による非変性系チューブゲルの調製
実施例１のＡ、Ｂ、又はＣで調製した１本鎖シゾフィランを脱イオン水１５ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）５ｍｌとともにホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。この液を減圧下で脱気した後、ガラス管（直径×長さ＝５ｍｍ×１００ｍｍ）に注入し、１２０℃で２０分間加熱してゲル化させ、非変性系電気泳動用チューブゲル（直径×長さ＝５ｍｍ×８５ｍｍ）を作成した。
１−４．中和ゲル化法による平板ゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１．５ｇ（３本鎖としての分子量約４５万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  ２５ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。これを５５℃に保温しながら５Ｍ酢酸で中和した。中和溶液をすばやくゲル形成器に注入し、冷却ゲル化させて電気泳動用平板ゲルを作製した。
なお、１本鎖シゾフィランから加熱ゲル化法によりゲルを調製するときの１本鎖シゾフィラン濃度、分子量、加熱温度、および加熱時間とゲルの状態との関係について、表１〜表３に示す。１本鎖シゾフィランから加熱ゲル化法によりゲルを調製するとき、１本鎖シゾフィラン濃度が高いほど、分子量が大きいほど、加熱温度が高いほど、さらに加熱時間が長いほど強いゲルが形成される。
ゲル強度の判定
ゲル強度測定容器（３０ｍｌ容のサンプル管）中で、加熱ゲル化法によりゲルを調製し、２０℃でレオメーター（不動工業（株）、モデルＮＲＭ−２０１０Ｊ−ＣＷ）により破断強度を測定し、破断強度が５００ｇ／ｃｍ２以上のゲルを＋＋＋、５００ｇ／ｃｍ２未満５０ｇ／ｃｍ２以上のゲルを＋＋、５０ｇ／ｃｍ２未満のゲルを＋で示す。
グルカンの分子量の測定
試料の一定量を水に溶解し、ウベローデ型粘度計により２５℃で極限粘度を測定した。則末らにより得られた極限粘度と分子量の関係（Ｔ．Ｎｏｒｉｓｕｅ，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｐｙｓ．Ｅｄ．，１８，５４７（１９８０））を用いて各試料の重量平均分子量を求めた。
３本鎖グルカンは水溶液中でコンゴーレッドと可溶性の錯体を形成し、その可視部における極大吸収波長はコンゴーレッドの極大吸収波長よりも長波長側にシフトする。一方、１本鎖グルカンは錯体を形成しない。従って、グルカンとコンゴーレッドの混合液の極大吸収波長を測定することにより、１本鎖又は３本鎖グルカンを識別できる（Ｋ．Ｔａｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１２１−１３５（１９８１））。また１本鎖及び３本鎖グルカンが混合されている場合のそれぞれのグルカンの割合は、示差走査熱量計によるピーク面積比から決定することができる。
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さらに、実施例により作製したゲルと、比較例として作製した（１）濃度１０質量％で作製したポリアクリルアミドゲル（比較例１）、（２）濃度１質量％で作製したアガロースゲル（和光純薬工業（株）、Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ）（比較例２）、及び（３）濃度１質量％で作製したカードランゲル（和光純薬工業（株）、カードラン）（比較例３）の７００ｎｍから２２０ｎｍの各波長における吸光度を表４に示した。これらの測定値は、形成されたゲル中の曇りの量、及び、ＤＮＡや蛋白質を紫外吸収により検出する際の妨害度合いを反映するものである。実施例のゲルの吸光度は、現在、電気泳動用として汎用されているポリアクリルアミドゲルのものと比較して、可視領域でほぼ同程度であり、紫外領域では同程度からやや小さい値であった。また、アガロースゲルおよびカードランゲルに比較すると、明らかに小さい値であった。即ち、本発明の実施例のゲルは、従来の電気泳動用ゲルよりもより広範囲の波長に対して透明性に優れ、電気泳動用ゲルとしてより適していることが確認できた。
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２．透析ゲル化法による平板ゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１．５ｇ（３本鎖としての分子量約４５万）を０．５Ｍ−ＮａＯＨ水溶液２５ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。これを透析ゲル形成器に注入し、脱イオン水に対して透析液が中性になるまで透析してゲル化させ、電気泳動用平板ゲル（１５０ｍｍ×１００ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。
【実施例３】蛋白質の平板ゲル電気泳動
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから、実施例２の１−１と同様にして、グルカン濃度６質量％の平板ゲル（７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。このゲルを、ゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８−１０％ＳＤＳ  １１１：３７．５：１．５ｖ／ｖ）と平衡化するため、該ゲルバッファーに一夜浸漬した。次に、この平衡化したゲルを泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイに移し、蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンスタンダード、分子量範囲：１０−２５０ｋＤａ）を、マーカー色素ＢＰＢ（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）がゲルの端から約５１ｍｍの位置に移動するまで定電流２０ｍＡで電気泳動した。
比較例として、（１）１０％ポリアクリルアミドゲル、及び（２）１．５％アガロースゲルでも、同様の電気泳動を行った。泳動後の蛋白質の検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法によった。図１に実施例と比較例の泳動パターンを示す。実施例のゲルは、比較例の（１）１０％ポリアクリルアミドゲルとほとんど同程度の分離能を示したが、特に７５ｋＤａから２５０ｋＤａの高分子量蛋白質において鮮明な分離パターンが得られ、その良好な分子篩い効果が示された。これに対して、比較例の（２）１．５％アガロースゲルではほとんど分離されなかった。
【実施例４】蛋白質の平板ゲル電気泳動
実施例１で調製した分子量約１５万又は２００万の１本鎖シゾフィランから、実施例２の１−１と同様にして、グルカン濃度１０質量％又は２質量％の平板ゲル（７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。以下、実施例３と同様に電気泳動を行った。図２に泳動パターンを示す。また、５０ｋＤａの蛋白質のＢＰＢに対する相対移動度とグルカン濃度の関係を表５に示す。グルカン濃度が高くなるにつれて蛋白質の相対移動度が低くなり、グルカン濃度によりゲル孔径が調節できることが観察された。
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【実施例５】蛋白質の変性系ディスク電気泳動
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから、実施例２の１−２と同様にして、グルカン濃度６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを作製した。更に、そのゲル上に、厚さ５ｍｍとなるように、脱イオン水６．１ｍｌ、３０％アクリルアミド１．３ｍｌ、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）２．５ｍｌ、並びに１０％ＳＤＳ  ０．１ｍｌを溶解後脱気した溶液にＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）１０μｌ及び１０％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）５０μｌを混合した溶液を注入してゲル化させ、濃縮ゲルを作成した。そして、このように上部に厚さ５ｍｍの濃縮ゲルが形成されたチューブゲルを、ディスク型電気泳動装置に取り付け、該装置の上部泳動槽及び下部泳動槽に泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を入れ、蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンスタンダード、分子量範囲：１０−２５０ｋＤａ）を、マーカー色素のＢＰＢがゲルの下端から約５ｍｍの位置に移動するまで、チューブゲル１本当たり５ｍＡの定電流で電気泳動した。
比較例として、脱イオン水５．７３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．６７ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ０．１ｍｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、及び１０％ＡＰＳ  ５０μｌから調製した５質量％ポリアクリルアミドチューブゲルにより、蛋白質分子量マーカーを、実施例と同様に電気泳動した。泳動後の蛋白質の検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法にて行った。得られたそれぞれの泳動パターンを図３に示す。実施例の６質量％シゾフィランゲルによる分子量７５ｋＤａから２５０ｋＤａの蛋白質の分離は、比較例の５質量％ポリアクリルアミドゲルによるものと同程度であった。
【実施例６】蛋白質の非変性系ディスク電気泳動
実施例１で調製した分子量約２００万の１本鎖シゾフィランから、実施例２の１−３と同様に、グルカン濃度として２．５質量％の非変性系電気泳動用チューブゲルを作製した。このチューブゲルをディスク型電気泳動装置に取り付け、該装置の上部泳動槽及び下部泳動槽に泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３）を入れ、ＩｇＭ（ケミコンインターナショナルＩＮＣ．、ＨＵＭＡＮ  ＩｇＭ）、α２−マクログロブリン（和光純薬工業（株））、及び分子量マーカー（アマシャムファルマシアバイオテク、ＨＭＷマーカーキット（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用））を、マーカー色素のＢＰＢがゲルの下端から約５ｍｍの位置に移動するまで、チューブゲル１本当たり２ｍＡの定電流で電気泳動した。
比較例として、脱イオン水５．７３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．６７ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、及び１０％ＡＰＳ  ５０μｌから調製した５％ポリアクリルアミドチューブゲルについても、実施例と同様の電気泳動を行った。蛋白質の検出には、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法を用いた。その結果得られたそれぞれの泳動パターンを図４に示す。分子量９００〜１，０００ｋＤａのＩｇＭは、比較例の５質量％ポリアクリルアミドゲルではほとんど泳動せず原点付近に留まっていたのに対し、実施例のシゾフィランゲルでは泳動しており、ＢＰＢに対する相対移動度は０．０７であった。また、分子量７２０ｋＤａのα２−マクログロブリンのＢＰＢに対する相対移動度は、５質量％アクリルアミドゲルでは０．１４、シゾフィランゲルでは０．５８で、後者の方が大きかった。電気泳動に使用するに足る強度を持つゲルを形成できるポリアクリルアミドのゲル濃度は最低４〜５質量％である。従って、ここの比較例よりも、蛋白が移動し易い電気泳動用ポリアクリルアミドゲルを作製することは困難である。即ち、実施例のシゾフィランゲルは５質量％アクリルアミドゲルよりも蛋白の電気泳動による移動が大きかったことから、このゲルは、広範囲の分子量の蛋白質分析に利用でき、特に、ポリアクリルアミドゲルでは分離することが困難なより大きな蛋白質の分離に適していることが示唆された。
【実施例７】蛋白質の平板ゲル電気泳動
実施例１のＢと同様の方法で調製した分子量約２００万の１本鎖スクレログルカンから、実施例２の２と同様にして、グルカン濃度３質量％の平板ゲル（１５０ｍｍ×１００ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。以下、実施例３と同様の条件で電気泳動を行った。その結果、シゾフィランから調製したゲルを用いた場合と同様、鮮明な分離パターンを確認することができた。
【実施例８】ＤＮＡの平板ゲル電気泳動
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約２５０万）から実施例２の２と同様にして、５質量％のグルカンの平板ゲル（１５０ｍｍ×１００ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。そのゲルを、１×ＴＡＥ泳動バッファー（０．０４Ｍトリス、０．０４Ｍ氷酢酸、０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ）に一夜浸漬し、平衡化した。そして、この平衡化したゲルを用いて、２種類のＤＮＡ分子量マーカー（ニッポンジーン、Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ及びｐＢＲ３２２／Ｍｓｐ  Ｉ  ｄｉｇｅｓｔ）を、マーカー色素のＢＰＢがゲル長の約２／３移動するまで、５０Ｖ定電圧で電気泳動した。
比較例として、３質量％のアガロース（ニッポンジーン、Ａｇａｒｏｓｅ  ２１）ゲルについても、同様の電気泳動を行った。泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネーターでＤＮＡの泳動パターンを観察した結果を図５に示す。実施例のゲルによる方が比較例のゲルによるよりもバンド間の幅が広く、実施例のゲルの方が分解能に優れることが確認できた。
【実施例９】超音波法による蛋白質の回収
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから実施例２の１−２と同様に、グルカン濃度として６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを作製した。次に、実施例５と同様に、ヒト血清アルブミン（和光純薬工業（株））を電気泳動した。電気泳動後のゲルを、固定液（酢酸：メタノール：水＝５：２０：７５）に一夜浸漬した後、１０ｍｌ容量のねじ口瓶に入れてスパーテルで破砕した。破砕したゲルに水５ｍｌを加え、６０分間超音波処理し、４℃で一晩インキュベーションした後、ろ過（フィルター孔径０．８０μｍ）し、得られたろ液を蛋白質回収溶液とした。蛋白質回収溶液中の蛋白質濃度をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＢＩＯ  ＲＡＤ）を用いて測定し、蛋白質回収率（＝（蛋白質回収量／電気泳動に供した蛋白質量）×１００）を求めた。なお、電気泳動後のゲルを固定液に浸漬せずに処理した場合についても、同様にして蛋白質回収率を求めた。
比較例として、脱イオン水５．７３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．６７ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ  ０．１ｍｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、１０％ＡＰＳ  ５０μｌから調製した５質量％ポリアクリルアミドチューブゲルについても、実施例と同様にヒト血清アルブミンを電気泳動し、蛋白質の回収率を測定した。結果を表６に示した。固定化処理した場合、固定化処理しない場合のいずれにおいても、実施例の回収率の方が比較例の回収率よりも高かった。
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【実施例１０】溶解法による蛋白質の回収
実施例１の方法により調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから実施例２の１−２と同様にして、グルカン濃度として６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを２本作製した。それぞれのチューブゲルについて、実施例５と同様にして、ヒト血清アルブミン（和光純薬工業（株））の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを各々１０ｍｌ容量のねじ口瓶に入れてスパーテルで破砕した。破砕したゲルに、１％ＳＤＳを含む０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液５ｍｌ、又は１％ＳＤＳを含む９Ｍ尿素溶液５ｍｌを加えた。ゲルが溶媒に解けるまで８０℃で加熱し、得られた溶解液を蛋白質回収溶解液とした。以下、実施例９と同様に蛋白質回収溶解液中の蛋白質量を測定し、蛋白質の回収率を求めた。
比較例として、脱イオン水５．７３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．６７ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ  ０．１ｍｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、１０％ＡＰＳ  ５０μｌから調製した５質量％ポリアクリルアミドチューブゲルにより、実施例と同様にヒト血清アルブミンを電気泳動し、その回収率を測定した。結果を表７に示した。実施例での蛋白質回収率は、ＮａＯＨ溶液又は尿素溶液のいずれの溶解液を使用した場合でも、比較例での回収率より高かった。
2004077042.tif 000008
【実施例１１】凍結融解法による蛋白質の回収
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから実施例２の１−２と同様に、グルカン濃度として６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを作製した。次に、実施例５と同様の方法により、ヒト血清アルブミン（和光純薬工業（株））を電気泳動した。電気泳動後のゲルを１０ｍｌ容量のねじ口瓶に入れてスパーテルで破砕した。破砕したゲルに水１ｍｌを加え、−２０℃で、一晩凍結した後、３０℃で融解した。融解液をろ過（フィルター孔径０．８０μｍ）し、ろ液を蛋白質回収液とした。以下、実施例９と同様の方法により蛋白質回収液中の蛋白質量を測定し回収率を求めた。
比較例として、脱イオン水５．７３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．６７ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、１０％ＳＤＳ  ０．１ｍｌ、ＴＥＭＥＤ  １０μｌ、及び１０％ＡＰＳ  ５０μｌから調製した５質量％ポリアクリルアミドチューブゲルを用いて、実施例と同様にヒト血清アルブミンを電気泳動し、蛋白質の回収率を測定した。結果を表８に示した。実施例の回収率は、比較例に比べて非常に高い回収率であった。
2004077042.tif 000009
【実施例１２】１本鎖シゾフィランと中性多糖の混合ゲルを用いた蛋白質の変性系ディスク電気泳動
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィラン０．９ｇと、デキストラン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、平均分子量１１，０００）０．０７５ｇ、デンプン（和光純薬工業（株））０．０７５ｇ、又はローカストビーンガム（台糖（株））０．０７５ｇを、脱イオン水１１．１ｍｌ、１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）３．７５ｍｌとともにホモジナイズ処理して、減圧下で脱気した後、１０％ＳＤＳ水溶液０．１５ｍｌを加えて攪拌し、１本鎖シゾフィランと中性多糖の混合懸濁液を得た。以下、実施例２の１−２と同様に、これら混合液から変性系電気泳動用チューブゲル（直径×長さ＝５ｍｍ×８５ｍｍ）を作製し、実施例５と同様に蛋白質分子量マーカーを電気泳動した。何れの中性多糖を用いたゲルについても、実施例５に示したシゾフィラン単独ゲルに比較して、蛋白質の移動度は異なるが、蛋白質の分離能は同等であることが確認できた。デンプンを用いたゲルでの泳動パターンを図６に示す。
【実施例１３】低純度アガロースの分解能の改善
１×ＴＡＥ泳動バッファーに、分子量約１５万の１本鎖シゾフィラン０．６質量％と、低純度アガロース（台糖（株））１質量％を入れて加熱溶解した後、この溶解液をサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイ（７０ｍｍ×８５ｍｍ）に移し、冷却して、ゲルを調製した。該ゲルを用いて、ＤＮＡ分子量マーカー（（株）ニッポンジーン、Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ）を、マーカー色素のＢＰＢがゲル長の約２／３移動するまで、５０Ｖ定電圧で泳動させた。
比較例として、１質量％の低純度アガロースゲルについても、同様の電気泳動を行った。実施例及び比較例の電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドで染色し、トランスイルミネーターでＤＮＡの泳動パターンを観察した。図７に実施例と比較例の泳動パターンを示す。実施例のゲルの方が明らかに分離能が優れていることが確認できた。
【実施例１４】中和ゲルを支持体とする蛋白質の平板ゲル電気泳動
３本鎖としての分子量が約４５万のシゾフィランから、実施例２の１−４と同様にして、グルカン濃度６質量％の平板ゲル（７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。このゲルを、脱イオン水に対して２日間透析した後、ゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８−１０％ＳＤＳ  １１１：３７．５：１．５ｖ／ｖ）と平衡化するため、該ゲルバッファーに２日間浸漬した。次に、この平衡化したゲルを泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイに移し、蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンスタンダード、分子量範囲：１０−２５０ｋＤａ）を、マーカー色素のＢＰＢがゲルの端から約５ｍｍの位置に移動するまで定電流４０ｍＡで電気泳動した。
蛋白質の検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法により行った。中和ゲル化法のゲルを支持体とした電気泳動によって、２５０〜３７ｋＤａの蛋白質が分離できた。
【実施例１５】ホルムアミドを用いた平板ゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン０．８ｇ（３本鎖としての分子量約４５万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  １０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液を、減圧下で脱気した後、ホルムアミド０．１８２ｍｌを加えてよく攪拌した。続いて、ゲル形成器に注入し、二晩放置してゲル化させ、電気泳動用平板ゲル（６０ｍｍ×５２ｍｍ×４ｍｍ）を作製した。
【実施例１６】蛋白質の平板ゲル電気泳動
実施例１５と同様にして、グルカン濃度８質量％の平板ゲル（６０ｍｍ×５２ｍｍ×４ｍｍ）を作製した。このゲルを、ゲル容量に対して４０倍量のイオン交換水に浸漬（１時間×２回）した後、１０倍量のゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８−１０％ＳＤＳ  １１１：３７．５：１．５ｖ／ｖ）に一晩浸漬して該ゲルバッファーと平衡化した。次に、この平衡化したゲルを泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイに移し、蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンプラススタンダード、分子量範囲：１０〜２５０ｋＤａ）を該ゲルの試料溝に載せ、マーカー色素のＢＰＢがゲルの先端から約５ｍｍの位置に移動するまで、定電圧１００Ｖで電気泳動を行った。
比較例として、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、同様の電気泳動を行った。泳動後の蛋白質の検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法によった。図８に実施例１６とその比較例の泳動パターンを示す。実施例１６のゲルは、比較例の１２％ポリアクリルアミドゲルとほとんど同程度の分離能を示した。
【実施例１７】酵素法による蛋白質の回収１
ビオチン標識β−１，３−グルカナーゼの調製
Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業（株））５０ｍｇをゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００，２５φ×４００）に付し、精製β−１，３−グルカナーゼを約１０ｍｇ得た。この精製β−１，３−グルカナーゼをビオチンラベル化キット（同仁化学（株））により、ビオチン標識した。
蛋白質の回収
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから実施例２の１−２と同様にしてグルカン濃度６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを作成した。次に、このチューブゲルを用いて実施例５と同様に、ヒト血清アルブミン（和光純薬工業（株））を電気泳動した。電気泳動後のゲルを１０ｍｌ容量のねじ口瓶に入れてスパーテルで破砕した。破砕したゲルを上記ビオチン標識β−１，３−グルカナーゼの１％水溶液１ｍｌに加え、約３７℃で一夜放置した。その酵素反応溶液を分子量１万カット透析膜を用いてリン酸緩衝溶液中で透析した後、その内液を固定化アビジンカラム（ＰＩＥＲＣＥ）に付し、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）溶出緩衝液で溶出した。その溶出液を蛋白質回収液とした。以下、実施例９と同様に蛋白質回収溶液中の蛋白質を測定し、蛋白質の回収率を求めたところ、回収率は９０％であった。
【実施例１８】酵素法による蛋白質の回収２
固定化酵素の調製
アミノセルロファイン（生化学工業（株））約５ｍｌを純水で洗浄後、２．５％グルタルアルデヒド溶液５ｍｌに懸濁し、減圧下約１時間撹拌した。これを純水及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、上記精製β−１，３−グルカナーゼ溶液（０．１ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを加え、室温、一昼夜放置した。これを５０ｍＭリン酸緩衝液でよく洗浄して固定化酵素とした。
蛋白質の回収
実施例１で調製した分子量約１５万の１本鎖シゾフィランから実施例２の１−２と同様にしてグルカン濃度６質量％の変性系電気泳動用チューブゲルを作成した。次に、このチューブゲルを用いて実施例５と同様に、ヒト血清アルブミン（和光純薬工業（株））を電気泳動した。電気泳動後のゲルを１０ｍｌ容量のねじ口瓶に入れてスパーテルで破砕した。破砕したゲルに水１ｍｌを加え、さらに上記固定化酵素２０ｍｇを加えて約３７℃で一夜放置した。その酵素反応溶液をろ過し、分子量１万カット透析膜を用いてリン酸緩衝溶液中で透析してその内液を蛋白質回収液とした。以下、実施例９と同様に蛋白質回収溶液中の蛋白質を測定し、蛋白質の回収率を求めたところ、回収率は８７％であった。
【実施例１９】高濃度グルカンゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約４５万）３．５ｇに対して０．５Ｍ  ＮａＯＨを加えて２５ｇにした（１４質量％）。気泡が無くなるまでよく攪拌したのち、ホルムアミド０．４５５ｍｌ（ＮａＯＨに対して１当量）を加えて均一になるまで攪拌してからゲル形成器に流し込んだ。室温で二晩放置してゲル化させた後、イオン交換水，ゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８−１０％ＳＤＳ  １１１：３７．５：１．５ｖ／ｖ）に浸漬して置換させて電気泳動用支持体とした。
【実施例２０】低分子ポリペプチドの電気泳動
実施例１９と同様にして、グルカン濃度１４質量％の平板ゲル（７ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。このゲルを、ゲル容量に対して４０倍量のイオン交換水に浸漬（１時間×２回）した後、１０倍量のゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８−１０％ＳＤＳ  １１１：３７．５：１．５ｖ／ｖ）に一晩浸漬して該ゲルバッファーと平衡化した。次に、この平衡化したゲルを、泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭトリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイに移し、カレイドスコープポリペプチドスタンダード（ＢＩＯ  ＲＡＤ、分子量範囲：４−３４．５ｋＤａ）を該ゲルの試料溝に載せ、マーカー色素のＢＰＢがゲルの先端から約５ｍｍの位置に移動するまで、定電圧１００Ｖで電気泳動を行った。
比較例として、１７％ポリアクリルアミドゲルを用いて、同様の電気泳動を行った。
図９に実施例２０とその比較例の泳動パターンを示す。実施例２０のゲルは、比較例の１７％ポリアクリルアミドゲルとほとんど同程度の分離能を示した。
【実施例２１】濃度勾配ゲルによる泳動
実施例１５と同様にしてグルカン濃度６％，１４％のアルカリ溶液を調製し、それぞれにホルムアミドを水酸化ナトリウムに対して当量を加えてよく攪拌した。各濃度のグルカン溶液を勾配ゲル作成器（図１０）に充填した。グルカン濃度が高い方を図１０のＡ層に入れ、低い方をＢ層に入れた。Ａ層の上部をストッパーで止めた後、Ａ層を攪拌しながらペリスタポンプでグルカン溶液をゲル形成器に静かに流し入れ、６−１４％濃度勾配平板ゲルを作成した。
【実施例２２】蛋白質の濃度勾配平板ゲル電気泳動
実施例２１と同様にして、グルカン濃度６〜１４％の平板ゲル（７０ｍｍ×８５ｍｍ×３ｍｍ）を作製した。実施例１５と同様にこのゲルを用いて蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンプラスプロテインスタンダード、分子量範囲：１０−２５０ｋＤａ）を泳動した。
泳動後の蛋白質の検出は、クマシーブリリアントブルーＲ２５０染色法によった。
比較例として、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルによる泳動パターン（ＢＩＯ  ＲＡＤ社  プレシジョンプラスプロテインスタンダード添付のマニュアルより抜粋）を記載した。
図１１に実施例２２とその比較例の泳動パターンを示す。実施例２２のグルカン濃度６〜１４％のゲルは、比較例の４〜２０％ポリアクリルアミドゲルとほとんど同程度の分離能を示した。
【実施例２３】分子量勾配グルカンゲルの作製
３本鎖としての分子量が４５万のシゾフィラン２．１ｇに対して０．５Ｍ  ＮａＯＨを加えて１５ｇにしたもの（１４％ｗ／ｗ）と、３本鎖としての分子量が２００万のシゾフィラン１．２ｇに対して０．５Ｍ  ＮａＯＨを加えて２０ｇにしたもの（６％ｗ／ｗ）を、気泡が無くなるまでよく攪拌したのち、それぞれにホルムアミド０．２７３ｍｌと０．３６４ｍｌ（ＮａＯＨに対して当量）を加えて均一になるまで攪拌した。
１４％グルカン（４５万シゾフィラン）溶液を図１０に示す勾配ゲル形成器のＡ層に入れ、６％グルカン（２００万シゾフィラン）溶液をＢ層に入れた。Ａ層の上部をストッパーで止めた後、Ａ層を攪拌しながらペリスタポンプでグルカン溶液をゲル形成器に静かに流し入れた。室温で二晩放置してゲル化させた後、イオン交換水，ゲルバッファー（イオン交換水１１１ｍｌ、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８  ３７．５ｍｌ、１０％  ＳＤＳ  １．５ｍｌ）に浸漬して置換させて電気泳動用支持体とした。
電気泳動はＬａｅｍｍｌｉ法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））に基づいて、サンプルを１０μｌアプライしたのち１００Ｖ定電圧で行った。
図１２に４５−２００万分子量勾配グルカンゲルの泳動パターンを示した。ＰＡ（ポリアクリルアミド）勾配ゲルと比べると、７５−２５０ｋＤａの分離は悪いが１５−２５０ｋＤａの蛋白質が分離できた。
【実施例２４】ホルムアミド−加熱ゲル化法を用いた平板ゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１．０ｇ（３本鎖としての分子量約４５万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  １０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液を、減圧下で脱気した後、ホルムアミド０．１８２ｍｌを加えてよく攪拌した。続いて、ゲル作製器に注入し、二晩放置してゲル化させた。その後、ゲル作製器のまま８０℃、３０分間加熱処理を行い、電気泳動用平板ゲル（６０ｍｍ×５２ｍｍ×４ｍｍ）を作製した。次にこのゲルを用いて実施例１６と同様に、蛋白質分子量マーカー（ＢＩＯ  ＲＡＤ、プレシジョンスタンダード、分子量範囲：１０−２５０ｋＤ）を電気泳動した。結果を図１３に示す。
【実施例２５】シゾフィラン／ポリアクリルアミド（ＰＡ）混合ゲルの調製
１．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、脱イオン水、１本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約６００万）（実施例１）を表９の通りに混ぜて、スターラーで一晩攪拌してシゾフィランを溶解させた。３０％アクリルアミド溶液（アクリルアミド／Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝３７．５／１）、１０％過硫酸アンモニウム５０μｌ、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）１０μｌを加えて攪拌した。１０分間脱気した後、この溶液をガラス管（直径×長さ＝５ｍｍ×１００ｍｍ）に注入し、１２０℃２０分間加熱してゲル化させ、シゾフィラン／ポリアクリルアミド（ＰＡ）混合の非変性系電気泳動用チューブゲル（直径×長さ＝５ｍｍ×８５ｍｍ）を作製した。
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作製したシゾフィラン／ＰＡ混合非変性系電気泳動用チューブゲルを用いて、実施例６と同様にして分子量マーカー（アマシャムファルマシアバイオテク、ＨＭＷマーカーキット（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用））を電気泳動した。その結果得られた泳動パターンを、実施例６の泳動パターンとともに図１４に示す。分子量６６９ｋＤａ及び４４０ｋＤａは、実施例６ではバンドがテーリングしているのに対して、実施例２５のシゾフィラン／ＰＡ混合ゲルでは分離能が改善されていることがわかる。
【実施例２６】等電点電気泳動用乾燥シゾフィランゲルの調製
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン１．６ｇ（３本鎖としての分子量約６００万）を０．５Ｎ−ＮａＯＨ  ４０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液にホルムアミド０．９６ｍｌを加えてよく攪拌した後、減圧下で脱気した。続いてこの溶液を、ガラスプレート（プレーン）とガラスプレート（ノッチ、厚さ１ｍｍのスペーサー付き）のプレーン側に、親水性フィルム（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｅｌ  Ｂｏｎｄ  Ｆｉｌｍ）を貼り付けたゲル形成器（２００ｍｍ×２００ｍｍ×１ｍｍ）に注入して二晩ゲル化させた。８０℃で１５分間加熱した後、ゲル作成器からフィルムに接着した平板ゲルを取り出した。このゲルを、フィルム上で一昼夜室温乾燥、脱イオン水で膨潤する操作を３回行い、ゲル中の中和不純物を除いた後、膨潤状態で１２０℃、１５分間オートクレーブ処理をした。最後に１０％グリセリン水溶液中に１時間浸漬してから、一晩乾燥させたゲルに疎水性フィルム（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｅｌ  Ｂｏｎｄ  Ｆｉｌｍ）をゲルに接着して、親水性フィルム、シゾフィランゲル、疎水性フィルムの三層構造である等電点電気泳動用乾燥シゾフィランゲルを作製した。
【実施例２７】乾燥シゾフィランゲルを用いた等電点電気泳動
実施例２６と同様にして、グルカン濃度４質量％の等電点電気泳動用乾燥シゾフィランゲル（７０×５０×１ｍｍ）を作製した。このゲルを５ｍｌの膨潤液（バイオライト３／１０（ＢＩＯ  ＲＡＤ）２５０μｌ、バイオライト５／７（ＢＩＯ  ＲＡＤ）６２．５μｌ、０．１％（ｗ／ｖ）オレンジＧ（和光純薬工業（株））１２５μｌをイオン交換水で５ｍｌにメスアップしたもの）で一晩膨潤させた。膨潤終了後、等電点電気泳動にはクールホレスターＩＰＧ−ＩＥＦ  Ｔｙｐｅ−Ｐ（アナテック（株））を用いた。サンプル（ＢＩＯ  ＲＡＤ、ＩＥＦ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）５μｌを試料用ろ紙にしみ込ませて平板ゲル上の陽極側にアプライした。電極用ろ紙を蒸留水に浸し、ゲルの両端に置いて密着させ、電極ろ紙に電極をのせて２００Ｖ−２０分、５００Ｖ−３０分、８００Ｖ−１０分の３電圧プログラムで泳動を行った。結果を、比較例（ポリアクリルアミドゲルによる泳動パターン（ＢＩＯ  ＲＡＤ、ＩＥＦ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ添付マニュアルより抜粋））とともに図１５に示す。
【実施例２８】乾燥シゾフィランゲルを用いた２次元電気泳動
実施例２６と同様にして、グルカン濃度４質量％の等電点電気泳動用乾燥シゾフィランゲルを作製し、ゲルの幅を３ｍｍにカット（７０×３×１ｍｍ）した。実施例２７と同様にして１次元目として等電点電気泳動を行い、泳動終了後、ゲルを表１０に示す平衡化緩衝液またはＳＤＳ処理液に２０分間浸漬して平衡化またはＳＤＳ処理した。次にこのゲルを非変性系電気泳動または変性系電気泳動に供した。２次元目の変性系電気泳動は実施例１６と同様にして、非変性系電気泳動は実施例１６から変性剤を除いて行った。非変性系電気泳動の分離パターンを図１６に、変性系電気泳動の分離パターンを図１７に示す。
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【実施例２９】シゾフィランゲルからの蛋白質の回収
分子量約２００万の３本鎖シゾフィランから実施例１５と同様に、グルカン濃度として５質量％の平板ゲル（６０ｍｍ×５２ｍｍ×４ｍｍ）を作製した。このゲルを、ゲル容量にして４０倍量のイオン交換水に浸漬（１時間×２回）した後、１０倍量のゲルバッファー（イオン交換水−１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８  １１２．５：３７．５ｖ／ｖ）に一晩浸漬して該ゲルバッファーと平衡化した。
次に、この平衡化したゲルを泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ８．３）を入れたサブマリン型小型電気泳動装置のゲルトレイに移し、サンプルバッファー（精製水−０．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．８−グリセロール−０．５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）で３倍に希釈したペルオキシダーゼ（和光純薬工業（株）、西洋わさび由来）をマーカー色素のＢＰＢがゲルの下端から約ｍｍの位置に移動するまで、２００Ｖの定電圧で電気泳動した。続いて、あらかじめ同条件で泳動して確認しておいたペルオキシダーゼのバンド位置を切り出してエッペンドルフチューブに入れ、β−１，３−グルカナーゼ溶液（β−１，３−グルカナーゼ１０ｍｇ、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ６．８  ０．９９ｍｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル（ＳＩＧＭＡ）１０μｌ）１ｍｌを加えてゲルをスパーテルでよく破砕した。３７℃、２．５時間インキュベーションしてゲルを溶解させて、ろ過（フィルター孔径０．８０μｍ）して得られた溶液をペルオキシダーゼ回収溶液とした。ペルオキシダーゼの回収率は約５０％であった。
ペルオキシダーゼの回収率はペルオキシダーゼ活性の測定値から以下の式により求めた。
ペルオキシダーゼ回収率（％）＝（ペルオキシダーゼ回収溶液の活性）／電気泳動に供したペルオキシダーゼ溶液の活性）×１００
【実施例３０】垂直型電気泳動装置用平板ゲル電気泳動
実施例１のＢで調製した分子量２００万の１本鎖シゾフィラン０．２５ｇに、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８を２．５ｍｌ、脱イオン水を７．２５ｍｌ加えてホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。これを減圧下で脱気した後、垂直型電気泳動装置用加熱ゲル形成器に注入し、１２０℃で１５分加熱してゲル化させ、垂直型電気泳動用のグルカン濃度２．５％の平板ゲル（８５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を作製した。このゲルを垂直型電気泳動装置にセットして、泳動バッファー（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．３）を加えて、蛋白質マーカー（アマシャムファルマシアバイオテク、ＨＭＷマーカーキット（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用））を、ＢＰＢがゲルの端から約５ｍｍの位置に移動するまで定電流２０ｍＡで電気泳動した。泳動パターンを図１８に示す。
【実施例３１】加熱ゲル化法によるポリアクリルアミドゲルとシゾフィランゲルの二層ゲル作製方法
脱イオン水５．８ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．７ｍｌ、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、ＴＥＭＥＤ１０μｌ、及び１０％ＡＰＳ５０μｌを混合し、加熱ゲル作製器の中央まで注入し、ゲル化させて５質量％ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に、実施例１のＢで調製した分子量約２００万の１本鎖シゾフィラン０．２５ｇに、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８を２．５ｍｌ、脱イオン水を７．２５ｍｌ加えてホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。これを減圧下で脱気した後、加熱ゲル形成器のポリアクリルアミドゲル上部に注入し、１２０℃で１５分加熱してゲル化させた。このようにして、ポリアクリルアミドゲルとシゾフィランゲルからなる二層の電気泳動用平板ゲル（８５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を作製した。
【実施例３２】加熱ゲル化法によるシゾフィランゲルとアガロースゲルの二層ゲル作製方法
実施例１のＢで調製した分子量約２００万の１本鎖シゾフィラン０．２５ｇに、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８を２．５ｍｌ、脱イオン水を７．２５ｍｌ加えてホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。これを減圧下で脱気した後、加熱ゲル形成器の中央まで注入し、１２０℃で１５分加熱してゲル化させた。次にアガロース（和光純薬工業（株）、Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ）０．１ｇ、脱イオン水７．５ｍｌ、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌの懸濁液を加熱してアガロースを溶解させ、加熱ゲル作製器のシゾフィランゲル上部に注入し、冷却してゲル化させた。このようにして、シゾフィランゲルとアガロースゲルからなる二層の電気泳動用平板ゲル（８５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を作製した。
【実施例３３】加熱ゲル化法によるポリアクリルアミドゲル、シゾフィランゲル、及びアガロースゲルの三層ゲル作製方法
脱イオン水５．８ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．７ｍｌ、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ、ＴＥＭＥＤ１０μｌ、及び１０％ＡＰＳ５０μｌを混合し、加熱ゲル作製器の１／３まで注入し、ゲル化させて５質量％ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に、実施例１のＢで調製した分子量約２００万の１本鎖シゾフィラン０．２５ｇに、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．８を２．５ｍｌ、脱イオン水を７．２５ｍｌ加えてホモジナイズ処理し、１本鎖シゾフィラン懸濁液を得た。これを減圧下で脱気した後、加熱ゲル形成器のポリアクリルアミドゲル上部に２／３となるように注入し、１２０℃で１５分加熱してゲル化させた。最後に、アガロース（和光純薬工業（株）、Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ）０．１ｇ、脱イオン水７．５ｍｌ、１．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）２．５ｍｌの懸濁液を加熱してアガロースを溶解させ、加熱ゲル作製器のシゾフィランゲル上部に注入し、冷却してゲル化させた。このようにして、ポリアクリルアミドゲル、シゾフィランゲル、及びアガロースゲルからなる三層の電気泳動用平板ゲル（８５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）を作製した。
【実施例３４】中和ゲル化法によるポリアクリルアミドゲルとシゾフィランゲルの二層ゲル作製方法
脱イオン水８．３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．７ｍｌ、ＴＥＭＥＤ１０μｌ、及び１０％ＡＰＳ  ５０μｌを混合し、ゲル作製器の中央まで注入し、ゲル化させて５質量％ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に、ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約４５万）１．０ｇを０．５Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液を、減圧下で脱気した後、ホルムアミド０．１８２ｍｌを加えてよく攪拌した。続いて、ゲル作製器のポリアクリルアミドゲル上部に注入し、二晩放置してゲル化させた。このようにして、ポリアクリルアミドゲルとシゾフィランゲルからなる二層の電気泳動用平板ゲル（７５ｍｍ×８５ｍｍ×２ｍｍ）を作製した。
【実施例３５】中和ゲル化法によるシゾフィランゲルとアガロースゲルの二層ゲル作製方法
ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約４５万）１．０ｇを０．５Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液を、減圧下で脱気した後、ホルムアミド０．１８２ｍｌを加えてよく攪拌した。続いて、ゲル作製器の中央まで注入し、二晩放置してゲル化させた。次に、アガロース（和光純薬工業（株）、Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ）０．１ｇ、脱イオン水１０ｍｌの懸濁液を加熱してアガロースを溶解させ、加熱ゲル作製器のシゾフィランゲル上部に注入し、冷却してゲル化させた。このようにしてシゾフィランゲルとアガロースゲルからなる二層の電気泳動用平板ゲル（７５ｍｍ×８５ｍｍ×２ｍｍ）を作製した。
【実施例３６】中和ゲル化法によるポリアクリルアミドゲル、シゾフィランゲル、及びアガロースゲルの三層ゲル作製方法
脱イオン水８．３ｍｌ、３０％アクリルアミド溶液１．７ｍｌ、ＴＥＭＥＤ１０μｌ、及び１０％ＡＰＳ  ５０μｌを混合し、ゲル作製器の１／３まで注入し、ゲル化させて５質量％ポリアクリルアミドゲルを作製した。次に、ヘリックス構造を持つ３本鎖シゾフィラン（３本鎖としての分子量約４５万）１．０ｇを０．５Ｎ  ＮａＯＨ  １０ｍｌに室温で攪拌しながら溶解した。この溶液を、減圧下で脱気した後、ホルムアミド０．１８２ｍｌを加えてよく攪拌した。続いて、ゲル作製器のポリアクリルアミドゲル上部に２／３となるように注入し、二晩放置してゲル化させた。最後に、アガロース（和光純薬工業（株）、Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＥ）０．１ｇ、脱イオン水１０ｍｌの懸濁液を加熱してアガロースを溶解させ、ゲル作製器のシゾフィランゲル上部に注入し、冷却してゲル化させた。このようにしてポリアクリルアミドゲル、シゾフィランゲル、及びアガロースゲルからなる三層の電気泳動用平板ゲル（７５ｍｍ×８５ｍｍ×２ｍｍ）を作製した。
【産業上の利用可能性】  本発明の新規な電気泳動用ゲルは、従来のアガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの電気泳動用ゲルではできなかった、より広範囲の分子量の核酸又は蛋白質の分離分析、及び高い回収率が求められる分離精製に利用可能であり、生化学、医学の分野において重要な分離分析法であるゲル電気泳動法を改善するものである。
本発明によれば、所望のゲル強度及び孔径に調節した電気泳動用ゲルを容易に製造することができる。また本発明のゲルを使用すると、核酸、蛋白質の分離、精製、回収を効率良く行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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