(57)【要約】本発明は、ヒト高分子量ＣＤ１４のアミノ酸配列の１〜６８番目から選択される８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、または該１〜６８番目のうちの特定のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を提供する。該抗体を用いる本発明のヒト低分子量ＣＤ１４測定キットおよび測定方法、好ましくはサンドイッチ法によれば、ヒト低分子量ＣＤ１４を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量でき、敗血症患者の診断に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
【請求項２】
配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
【請求項３】
配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体。
【請求項４】
配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体。
【請求項５】
少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せずに、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するためのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項６】
上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または該抗体の断片を含む請求項５に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項７】
上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、請求項４に記載の抗体または該抗体の断片を含む請求項５に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項８】
サンドイッチ免疫測定法によりヒト低分子量ＣＤ１４を測定する請求項５〜７のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項９】
ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質をさらに含む請求項８に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１０】
上記第二の結合物質が、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片である請求項９に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１１】
上記第二の結合物質が、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合するモノクローナル抗体若しくは該抗体の断片である請求項９に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１２】
上記第二の結合物質が、ヒト高分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である請求項９に記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結合している請求項９〜１２のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または該抗体の断片が標識されている請求項９〜１２のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１５】
さらに第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質及び第二の特異結合物質のパートナーを含む請求項９〜１４のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１６】
上記サンドイッチ免疫測定法がイムノクロマト法を利用した測定法である請求項８〜１５のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１７】
上記サンドイッチ免疫測定法がフロースルー法を利用した測定法である請求項８〜１５のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
【請求項１８】
ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せず、ヒト低分子量ＣＤ１４を検出するために、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体を使用し、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するヒト低分子量ＣＤ１４測定方法。
【請求項１９】
上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体として、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体または該抗体の断片を使用する請求項１８に記載のヒト低分子量ＣＤ１４の測定方法。
【請求項２０】
ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の診断方法。
【請求項２１】
配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチド。
【請求項２２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチド、若しくは配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原とする、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はヒト高分子量ＣＤ１４の特定のアミノ酸配列から選択される８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体に関する。また、ヒト高分子量ＣＤ１４のアミノ酸配列のうちの特定のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体に関する。
また本発明はヒト低分子量ＣＤ１４測定キット及びその測定方法に関する。さらにヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の新規な診断方法に関する。さらに上記抗体の作製に有用なペプチド及び上記抗体の作製方法に関する。
【背景技術】  ＣＤ１４分子は単核球細胞の膜表面上に発現している糖蛋白質を認識する一群の抗体により同定される蛋白質として１９８６年に第３回Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅにて、命名された。１９９０年、ＷｒｉｇｈｔらはこのＣＤ１４分子が、エンドトキシンであるＬＰＳのレセプターであることを明らかにした（「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）、１９９０年、第２４９巻、ｐ．１４３１−１４３３）。このＣＤ１４分子は分子量５３〜５５ｋＤａの糖蛋白質で、ｍＲＮＡは約１．４ｋｂのサイズで３５６個のアミノ酸からなることがｃＤＮＡの解析から明らかにされた（「ヌクレイック  アシッド  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」（英国）、１９８８年、第１６巻、ｐ．４１７３）。
ヒトＣＤ１４分子には、膜結合型ＣＤ１４のほかに可溶型ＣＤ１４があり、血中には分子量の異なる複数の可溶型ＣＤ１４が存在することが報告された（「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（独国）、１９９３年、第２３巻、ｐ．２１４４−２１５１）。また、Ｌａｎｄｍａｎｎらは、敗血症患者血清の可溶型ＣＤ１４のウエスタンブロット分析を行い、約５５ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が敗血症死亡例や発作性夜行性ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者で高値であり、正常人血清中にはこの分子が認められず、正常人には分子量の少し小さい４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が検出されたことを報告した（「ザ  ジャーナル  オブ  インフェクショウス  ディジーズ（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」（米国）、１９９５年、第１７１巻、ｐ．６３９−６４４）。
この分子量の異なるサブタイプについては、糖鎖の違いが関与していること、またＮおよびＯ結合型糖鎖を除去してもなお２種の異なる分子量の可溶型ＣＤ１４が血中に存在することをＳｔｅｌｔｅｒらが報告している（「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（独国）、１９９６年、第２３６巻、ｐ．４５７−４６４）。また、Ｂｕｆｌｅｒらは可溶型ＣＤ１４のＣ末端分析を行い可溶型ＣＤ１４の３２７番のセリン残基にＧＰＩ基が結合すること、約５６ｋＤａの分子量を持つ可溶型ＣＤ１４はＧＰＩアンカリングされない分子種であることを報告した（「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（独国）、１９９５年、第２５巻、ｐ．６０４−６１０）。
ＣＤ１４分子に対する抗体は、Ｂａｚｉｌらの作製したＭＥＭ−１８（「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（独国）、１９８６年、第１６巻、ｐ．１５８３−１５８９）、Ｓｈｕｔｔらの作製したＲｏＭｏ−１（「アレルギー  ウント  イムノロジー（Ａｌｌｅｒｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ）」（独国）、１９８８年、第３４巻、ｐ．１７−２６）、Ｓｔｅｉｎｍａｎらの作製した３Ｃ１０（「ジャーナル  オブ  イクスペリメンタル  メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（米国）、１９８３年、第１５８巻、ｐ．１２６−１４５）をはじめ、多くの抗ＣＤ１４抗体が作製され、ＣＤ１４蛋白質の同定に使用されている。
また、これら抗体を用いた可溶型ＣＤ１４の測定系が、Ｓｈｕｔｔら（西独国特許公開第２８６８７６号）、Ｂａｚｉｌら（「モレキュラー  イムノロジー  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（英国））１９８９年、第２６巻、ｐ．６５７−６６２頁；Ｇｒｕｎｗａｌｄら（「ジャーナル  オブ  イムノロジカル  メソッズ（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」（蘭国）、１９９２年、第１５５巻、ｐ．２２５−２３２）により報告され、ヒト体液中の可溶型ＣＤ１４が測定されるようになった。
さらに、可溶型ＣＤ１４−ＥＬＩＳＡキットがＩＢＬ−Ｈａｎｂｕｒｇ、Ｍｅｄｇｅｎｉｘ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより発売され、敗血症をはじめとして多くの疾患で可溶型ＣＤ１４の測定が行われている（「クリニカル  イムノロジー  アンド  イムノパソロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」（米国）、１９９６年  第８０巻、ｐ．３０７−３１０；「臨床検査」、１９９４年、第３８巻、ｐ．３４１−３４４）。
しかし敗血症以外の疾患でも疾患の進行度に伴って前述の約５５ｋＤａ，４９ｋＤａを含む可溶型ＣＤ１４（報告により、その分子量は異なるため、約５５ｋＤａ、４９ｋａに限定されるわけではない、以下同）濃度が上昇し、可溶型ＣＤ１４は敗血症特異的なマーカーではないことが明らかになった（「インフェクション  アンド  イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」（米国）、１９９９年、第６７巻、ｐ．４１７−４２０；「クリニカル  アンド  イクスペリメンタル  イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（英国）、２０００年、第１２０巻、ｐ．４８３−４８７；「クリニカル  アンド  イクスペリメンタル  イムノロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（英国）、１９９４年、第９６巻、ｐ．１５−１９）。また、可溶型ＣＤ１４は敗血症の重症化のマーカーとして期待されていたが、敗血症性ショックとの相関が見られないこと（「ペディアトリック  アレルギー  アンド  イムノロジー（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（デンマーク）、１９９７年、第８巻、ｐ．１９４−１９９）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）との相関が認められないことから（「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」（英国）、１９９８年  第２８巻、ｐ．６７２−６７８）、敗血症の診断薬としてなり得なかった。
発明者らは、Ｌａｎｄｍａｎｎらが報告した上記約５５ｋＤａと４９ｋＤａの２種等の可溶型ＣＤ１４（高分子量ＣＤ１４（報告により、その分子量は異なるため、約５５ｋＤａ、４９ｋａに限定されるわけではない、以下同））とは別に、約３６ｋＤａの可溶型低分子量ＣＤ１４が血中に存在すること、該低分子量ＣＤ１４は、正常人では少なく、敗血症患者において増加することを見出し、可溶型低分子量ＣＤ１４の測定が臨床上有用であることを確認した。しかし公知の抗ＣＤ１４抗体は高分子量の可溶型ＣＤ１４蛋白質のみを認識する抗体であるか、高分子量および低分子量の両方の可溶型ＣＤ１４蛋白質を認識する抗体であり、低分子量ＣＤ１４のみを認識する抗体は知られていなかった。また低分子量ＣＤ１４蛋白質のアミノ酸配列は、高分子量の可溶型ＣＤ１４蛋白質のアミノ酸配列の一部と全く同じ配列と考えられたため、上記のような抗体を作製すること、該抗体を用いて該低分子量ＣＤ１４を免疫学的に直接測定することは困難であると考えられていた。そのため該可溶型低分子量ＣＤ１４の測定法として、血中可溶型ＣＤ１４総量から、血中高分子量ＣＤ１４量を差し引いて、血中低分子量ＣＤ１４量を間接的に求めることを提案している（国際公開第ＷＯ０１／２２０８５号）。
【発明の開示】
かかる状況下において、ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定することができ、敗血症患者の診断に有用である、ヒト低分子量ＣＤ１４を、高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量する測定方法及びその測定キットが望まれている。さらには、その測定方法に有用な該ヒト低分子量ＣＤ１４に対する抗体が望まれている。
発明者等は鋭意研究の結果、ヒト低分子量ＣＤ１４を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量するために用いることのできる抗体として、ヒト高分子量ＣＤ１４の１〜６８番目までのアミノ酸配列から選択される８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体を発明した。また、ヒト高分子量ＣＤ１４のアミノ酸配列のうちの特定のアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体を発明した。
またヒト低分子量ＣＤ１４を特異的に測定する方法を発明し、ヒト低分子量ＣＤ１４測定キットを発明した。さらに、ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の新規な診断方法を発明した。さらに、上記抗体の作製に有用なペプチド及び上記抗体の作製方法を発明した。
すなわち、本発明は、以下の新規な抗体、及びヒト低分子量ＣＤ１４の測定キットを提供する。
（１）下記（１−１）〜（１−５）に示す抗体。
（１−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
（１−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜２０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
（１−３）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、５３〜６８番目までのアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
（１−４）配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
（１−５）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体。
（２）下記（２−１）〜（２−２）に示す抗体。
（２−１）配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体。
（２−２）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体。
（３）下記（３−１）〜（３−２２）に示すヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１）少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せずに、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するためのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−２）上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、上記（１−１）〜（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体または該抗体の断片を含む（３−１）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−３）上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、上記（１−４）、（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体または該抗体の断片を含む（３−１）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−４）上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、上記（１−５）若しくは（２−２）の抗体または該抗体の断片を含む（３−１）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−５）サンドイッチ免疫測定法によりヒト低分子量ＣＤ１４を測定する、（３−１）〜（３−４）のいずれかのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−６）ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質をさらに含む（３−５）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−７）上記第二の結合物質が、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片である（３−６）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−８）上記第二の結合物質が、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合するモノクローナル抗体である（３−６）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−９）上記第二の結合物質が、ヒト高分子量ＣＤ１４の１〜５２番目のアミノ酸残基のいずれかの領域に結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量ＣＤ１４の１〜５２番目のアミノ酸残基のいずれかの領域に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である（３−６）のキット。
（３−１０）上記第二の結合物質が、ヒト高分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である（３−６）のキット。
（３−１１）上記（１−１）〜（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体または該抗体の断片が不溶性担体に結合している（３−６）〜（３−１０）のいずれかのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１２）上記第二の結合物質が不溶性担体に結合している（３−６）〜（３−１０）のいずれかのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１３）上記（１−１）〜（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体または該抗体の断片が標識されている（３−６）〜（３−１０）若しくは（３−１２）のいずれかのヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１４）上記第二の結合物質が標識されている（３−６）〜（３−１１）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１５）さらに第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質及び第二の特異結合物質のパートナーを含む（３−６）〜（３−１４）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１６）第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合物質のパートナーが不溶性担体に結合している（３−１５）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１７）第二の特異結合を形成する第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合物質のパートナーが標識されている（３−１５）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１８）競合法によるサンドイッチ免疫測定法により測定する、標識したヒト低分子量ＣＤ１４若しくは標識したヒト低分子量ＣＤ１４類似物質を含む（３−５）〜（３−１２）、（３−１５）若しくは（３−１６）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−１９）標識が、酵素、色素、金コロイド、着色ラテックス、酵素、化学発光物質、蛍光物質またはアイソトープの少なくとも一つによる標識である（３−５）〜（３−１８）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−２０）該サンドイッチ免疫測定法がイムノクロマト法を利用した測定法である（３−５）〜（３−１９）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−２１）該サンドイッチ免疫測定法がフロースルー法を利用した測定法である（３−５）〜（３−１９）のいずれかに記載のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
（３−２２）凝集法、直接固相法若しくは競合法により測定する、（３−１）のヒト低分子量ＣＤ１４測定キット。
また、以下のヒト低分子量ＣＤ１４の測定方法、敗血症の新規な診断方法、ペプチド及び抗体の作成方法を提供する。
（４）下記（４−１）〜（４−３）に示すヒト低分子量ＣＤ１４測定方法。
（４−１）ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せず、ヒト低分子量ＣＤ１４を検出するために、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体を使用し、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するヒト低分子量ＣＤ１４測定方法。
（４−２）上記ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体として、上記（１−１）〜（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体または該抗体の断片を使用する（４−１）のヒト低分子量ＣＤ１４の測定方法。
（４−３）サンドイッチ免疫測定法によりヒト低分子量ＣＤ１４を測定する、（４−２）のヒト低分子量ＣＤ１４の測定方法。
（５）ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の診断方法。
（６）配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチド。
（７）下記（７−１）〜（７−２）に示す抗体の作製方法。
（７−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチド、若しくは配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原とする、上記（１−１）〜（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体の作製方法。
（７−２）配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原とする上記（１−４）、（１−５）、（２−１）若しくは（２−２）のいずれかの抗体の作製方法。
本発明の抗体は、本発明のヒト低分子量ＣＤ１４測定キットに用いることができ、該キットは、ヒト低分子量ＣＤ１４を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量でき、敗血症患者の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体を用いたイムノクロマト法キットの概要図である。（Ａ）は、標識抗体として金コロイド標識Ｆ１０３１−８−３を用いたイムノクロマト法の概要図である。（Ｂ）は、第二の結合物質として、ビオチン及びストレプトアビジンを用いたイムノクロマト法キットの概要図である。
図２は、Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体を用いたイムノクロマトキットにより、標準物質を測定した結果を示す。
図３は、Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体と低分子量ＣＤ１４蛋白質の結合をＳ６８ペプチドのみが阻止する結果を示した図である。（Ａ）は、正常人血清中で結合していない状態を示し、（Ｂ）は、敗血症患者血清中でのＳ６８ペプチドの結合阻害を示す。
図４は、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いた本発明の低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡキットの標準曲線を示した図である。
図５は、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質を用いて本発明の低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡキットの測定値に正常人血清由来可溶型ＣＤ１４蛋白質が影響しないことを示した図である。
図６は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血中の低分子量ＣＤ１４蛋白質及び高分子量ＣＤ１４蛋白質をそれぞれ低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡキット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）により解析した結果を示した図である。
図７は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより敗血症患者血清中の低分子量ＣＤ１４蛋白質及び高分子量ＣＤ１４蛋白質をそれぞれ低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡキ、ット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）により解析した結果を示した図である。上方の黒矢印は、キャリブレーションに用いたマーカーの位置を示す。左からＢＳＡ、オブアルブミン、キモトリプシノーゲンＡ、リボヌクレアーゼＡである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、より詳細に本発明を説明する。
ヒト血中に存在する主要な可溶型ＣＤ１４には、先行技術の欄に記載したＬａｎｄｍａｎｎらの報告に記載される約５５ｋＤａ及び約４９ｋＤａの可溶型ＣＤ１４（以降、「ヒト」を省略し、高分子量ＣＤ１４と記載することがある）がある。これらの高分子量ＣＤ１４は、Ｆ１０２５−３−１抗体と結合することが確認されている（ＷＯ０１／２２０８５号公報参照）。
一方、Ｆ１０２５−３−１抗体と結合しないＣＤ１４断片が存在すること、すなわち高分子量ＣＤ１４より低分子量のＣＤ１４が存在することも明らかにされており、この低分子量のＣＤ１４が特定の疾患では血中に増加するしていることが示されている（ＷＯ０１／２２０８５号公報参照）。
以下に、本発明において測定対象とするヒト低分子量ＣＤ１４（以降、「ヒト」を省略し、低分子量ＣＤ１４と記載することがある）について説明する。
本発明において測定対象とするヒト低分子量ＣＤ１４は、少なくとも以下の３つの特徴を有する。
１）Ｆ１０２５−３−１抗体と結合しない、
２）配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体に特異的に結合する、及び
３）ゲルろ過クロマトグラフィーでは、分子量２５〜４５ｋＤａの間にピークを示す。
上記１）の特徴から、本発明において測定対象とするヒト低分子量ＣＤ１４は、上記に記載の高分子量ＣＤ１４とは異なる分子であることが理解される。また、特徴１）に記載されるＦ１０２５−３−１抗体は、配列番号５に記載の全長ヒトＣＤ１４の３１６番目から３２８番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として作製された抗体である。従って、Ｆ１０２５−３−１抗体と結合しないことから、ヒト低分子量ＣＤ１４には、配列番号５に記載の全長ヒトＣＤ１４の３１６番目以降の配列が存在しない可能性が考えられる。
上記２）の特徴に記載される配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドは、配列番号５に記載のヒトＣＤ１４の５３番から６８番までの１６アミノ酸残基に該当する。現在ヒト蛋白質において配列番号２の配列を含む他の蛋白質はヒトＣＤ１４以外には知られておらず、該配列はヒトＣＤ１４に特異的に含まれる配列であるといえる。このことから、本発明において測定対象とするペプチドは、ヒトＣＤ１４の一種であることが確認される。
また、本発明における測定対象としてのヒト低分子量ＣＤ１４は、特徴２）の代わりに特徴２’）として、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体と結合することで特徴付けられるものであってもよい。
上記３）の特徴から、本発明における測定対象としてのヒト低分子量ＣＤ１４は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、分子量２５〜４５ｋＤａの間に溶出ピークを示す。一般的に、ゲルろ過クロマトグラフィーでの分子量の解析は、クロマトグラフィーに使用する樹脂や、カラムの大きさ、用いたマーカーの分子量等の実験条件により、測定結果に幅が生じ得る。本発明における測定対象としてのヒト低分子量ＣＤ１４は、ゲルろ過クロマトグラフィーにおいてヒト高分子量ＣＤ１４と区別され、より低分子量側に溶出されるものとして特徴付けられる。
上記の１）〜３）によってその特徴を説明できるヒト低分子量ＣＤ１４が、本発明において測定対象とされる。本発明における測定対象としてのヒト低分子量ＣＤ１４について、更に好ましい特徴を以下に説明する。
４）抗ヒトＣＤ１４ポリクロナール抗体と特異的に結合する。
本発明における測定対象としてのヒト低分子量ＣＤ１４は、全長ヒトＣＤ１４あるいは組換え全長ヒトＣＤ１４を抗原としたポリクロナール抗体と特異的に結合する。抗ヒトＣＤ１４ポリクロナール抗体としては、例えば、後述する実施例３−（２）−［２］に記載されるヒト血中のＣＤ１４蛋白質でマウスを免疫して得られた抗体価の上昇した抗血清及びその中に含まれる特異抗体が挙げられる。
なお、当該ヒト低分子量ＣＤ１４は、特定の抗ＣＤ１４モノクロナール抗体とも結合する特徴を有する。例えば、ヒト低分子量ＣＤ１４は、配列番号５に記載の全長ヒトＣＤ１４の１７番目から２６番目のアミノ酸配列を認識する抗ＣＤ１４モノクロナール抗体、若しくは該抗体と競合する抗ＣＤ１４モノクロナール抗体と結合することが特に特徴づけられる。具体的な例としては、ヒト血清中のＣＤ１４を抗原として作製した後述するＦ１０３１−８−３抗体及び組換体ヒトＣＤ１４を抗原として作製した後述するＦ１１０６−１３−３抗体が挙げられる。
一方、当該ヒト低分子量ＣＤ１４は、以下の様にも特徴付けられる。配列番号５に記載の全長ヒトＣＤ１４の１７番目から２６番目のアミノ酸配列を認識する抗ＣＤ１４モノクロナール抗体、若しくは該抗体と競合する抗ＣＤ１４モノクロナール抗体のいずれか一つの抗体と、上記２）の特徴に記載される配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製した抗体とにより、２箇所同時に結合され得るものとして、例えばこれら２つの抗体を組み合わせたサンドイッチ法で測定され得るものとして、特徴付けられる。
本発明者らは、以上に説明したヒト低分子量ＣＤ１４が、ヒト血中可溶型蛋白質であり、正常人と比較して敗血症患者の血中に多く存在すること、また、当該蛋白質が特定の抗体を用いて直接測定可能であることを見出した。なお、上記ＷＯ０１／２２０８５号公報においては、測定対象の低分子量のＣＤ１４の分子種として分子量３６ｋＤａの蛋白質が例示されている。
なお、本明細書に記載する「可溶型ＣＤ１４」とは、ヒト血漿中に存在している蛋白質のことであり、細胞膜に結合しヒト血漿中には存在しない「膜結合型ＣＤ１４」と対比する意味で用いられる。
本発明で記載する「抗原として作製される抗体」とは、「抗原」とするペプチドをエピトープ若しくはエピトープの一部分とする抗体である。また、「抗原として作製される抗体」の「抗原」とするペプチドに対して結合を示す抗体である。「抗原として作製される抗体」には、「抗原」とするペプチドに免疫原性を有させるためにキャリア若しくはキャリア蛋白を付加させたり、他のアミノ酸残基を付加させたりしたペプチドを免疫原として作製した抗体であっても、上記の性質を示せば「抗原として作製される抗体」に含まれる。
本発明の第一の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。
本発明の第一の態様の抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される。
配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体であれば、アミノ酸残基数は特に限定されない。好ましくは、連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。また好ましくは２５個以下、より好ましくは２０個以下のアミノ酸からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。
また、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１〜６８番目までのいずれの領域でもよく、特に限定されない。好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、５３〜６８番目までのアミノ酸配列から選択される連続した８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。また好ましくは、配列番号２〜４に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。配列番号５には、全長ヒトＣＤ１４のアミノ酸配列を示しているが、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、配列番号５に記載のアミノ酸配列の１〜６８番に該当する。また、配列番号２、３および４に記載のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５に記載のアミノ酸配列の５３〜６８番（１６アミノ酸残基）、１〜１７番（１７アミノ酸残基）、１４〜３２番（１９アミノ酸残基）に該当する。すなわち、配列番号２〜４に記載のアミノ酸残基は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうちに含まれる連続したアミノ酸残基である。
より好ましくは、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体である。
本発明の第一の態様の抗体はその特徴として、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する。この特徴により、本発明の第四の態様のキット、本発明の第五の態様の測定方法に利用できる。
またヒト低分子量ＣＤ１４は、高分子量ＣＤ１４と分子量が異なり、高分子量ＣＤ１４よりもアミノ酸配列が短い。このため、血液中での低分子量ＣＤ１４の構造が、高分子量ＣＤ１４と異なり、抗体に対する反応性が異なると考えられ、本発明の第一の態様の抗体は低分子量ＣＤ１４により強く結合することが考えられる。
本発明の第二の態様は、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体である。
本発明の第二の態様の抗体は、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合すれば、抗体が結合する領域はペプチドのいずれの領域でもよく、特に限定されない。
好ましくは、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体である。
本発明の第二の態様の抗体はその特徴として、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する。その特徴により、本発明の第四の態様のキット、本発明の第五の態様の測定方法に利用できる。
またヒト低分子量ＣＤ１４は、高分子量ＣＤ１４と分子量が異なり、高分子量ＣＤ１４よりもアミノ酸配列が短い。このため、血液中での低分子量ＣＤ１４の構造が、高分子量ＣＤ１４と異なり、抗体に対する反応性が異なると考えられ、本発明の第二の態様の抗体は低分子量ＣＤ１４により強く結合することが考えられる。
本明細書で記載する「配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する」とは、それぞれの配列番号に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として特異的に結合し、通常の抗原抗体反応を示すことをいう。例えば、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する」とは、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として特異的に結合し、通常の抗原抗体反応を示すことをいう。抗原抗体反応を示すことは、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等で確認できる。
本発明の第二の態様の抗体は、該ペプチド若しくは低分子量ＣＤ１４に対する親和性として表した場合の解離乗数（ＫＤ）は、１０−７Ｍ未満が好ましい。より好ましくは、１０−８Ｍ以下、さらに好ましくは１０−９Ｍ以下である抗体である。
本発明の第二の態様の抗体の作製において、抗原とするペプチドは、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドであり、好ましくは、連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個以上のアミノ酸を含むペプチドである。さらに、ペプチドは配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含めば、その他のアミノ酸配列に限定はないが、好ましくはペプチドすべてのアミノ酸配列が配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列由来であることである。
本発明の第二の態様の抗体は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸を含むペプチドを抗原として作製した抗体である。好ましくは連続した１０個以上、より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸を含むペプチドを抗原として作製した抗体である。
本発明の第一の態様の抗体及び本発明の第二の態様の抗体（以下、本発明の抗体と記載することがある）はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体が由来する動物種は特に限定されない。抗体作製の容易さの面では、ウサギ、ヤギ等が好ましい。また分子種は特に限定されない。いずれのクラス、サブクラス及びアイソタイプに分類される免疫グロブリンであってもよい。
免疫原とするペプチドの作製方法は、一般的に使用されるペプチド合成機（ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、パーキン−エルマージャパン）等を用いた方法、遺伝子組換え法（東京大学医科学研究所  制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社）等が挙げられる。
例えば、配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸からなるペプチドは４３３Ａ型ペプチド合成機を用いてＦｍｏｃ法により合成でき、ＴＦＡによる脱保護、樹脂からの切断の後、Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Ｃａｐｃｅｌｌ−ｐａｋ、資生堂）を用いて精製し、目的のペプチドを調製することができる。
抗原が蛋白質である場合は、そのまま免疫原とすることができるが、８〜３０アミノ酸残基以下のペプチドの場合は分子量が小さいため、通常免疫原性を持たないことがある。この場合、キャリアと結合させて若しくはＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＭＡＰ）法を用いてＭＡＰペプチドを調製して、免疫原性を有する分子量を有させ、免疫原とすればよい。
上記ペプチドと結合させるキャリアは、キャリア蛋白、ポリマーが挙げられる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリンまたはオボアルブミン等の異種蛋白を用いればよい。これらキャリア蛋白は、ペプチド若しくはキャリア蛋白のアミノ酸に含まれる側鎖の官能基を利用して、またはマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）基若しくはアルデヒド基を導入して、上記ペプチドと結合させればよい。ポリマーはマンナン若しくはキトサン等の糖類、ポリビニルピロリドン（ＰＶＡ）が挙げられる。これらポリマーは上記ペプチドと、吸着若しくは上記のような化学結合により結合させればよい。
本発明の抗体は公知技術を用いることにより作製できる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。例えばポリクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
上記のとおり調製した免疫原２０〜１０００μｇをフロインド完全アジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＡＬＵＭ等のアジュバントと混合し、各種動物に免疫することができる。各種動物としては馬、羊、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス等が使用可能である。免疫方法としては筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、リンパ節投与等の方法が使用可能であり、初回投与後１〜４週間間隔でフロインド不完全アジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＡＬＵＭ等のアジュバントと混合した免疫原を同様に投与することにより、あるいは免疫原を直接静脈内に投与することにより追加免疫を行うことができる。抗血清は、免疫した動物から通常の採血方法、例えば頚動脈、耳静脈、心臓、足の静脈等より血液を採取し、遠心等により血清を分離することにより調製することができる。得られた抗血清は硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等を添加する塩析法によりγグロブリン分画を沈殿させ、適当な緩衝液に透析後、プロテインＡ、プロテインＧ等のγグロブリンを特異的に精製することができるアフィニティーマトリクスを用いて目的のペプチドに対するＩｇＧ画分の精製ポリクローナル抗体を調製することができる。また、上記抗原と結合する抗体を選択することにより、特異精製することができる。
また、モノクローナル抗体は下記の方法で作製できる。
免疫した哺乳動物の免疫細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマの中から、上記ペプチドと結合する抗体を産生するクローンを選択することにより、本発明の抗体を作製することができる。好ましくは、５３番から６８番までのアミノ酸残基の連続した１０個以上からなるペプチドを免疫原とすることである。より好ましくは連続した１２個以上、特に好ましくは連続した１６個のアミノ酸からなるペプチドを免疫原とすることである。
免疫する哺乳動物は、特に限定されないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットまたはハムスター等が好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはＰ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、ＮＳ−１、ＹＢ２／０及びＹ３−Ａｇ１，２，３等の骨髄種細胞が含まれる。
免疫は公知の方法により行うことができる。例えば、抗原を腹腔内、皮下、静脈内またはフットパッド内に投与して行う。この抗原の投与はアジュバントを併用してもよく、また複数回投与することが好ましい。免疫細胞は抗原の最終投与の数日後、例えば３日後に、摘出した脾細胞またはリンパ節由来の細胞が好ましい。免疫細胞とミエローマ細胞との融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎなどの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３巻３頁）等の公知の方法を用いて行うことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法または電気融合法等が挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、免疫細胞に対し、ミエローマ細胞を１／１０量ないし等量を使用することが好ましい。ＰＥＧ（平均分子量１，０００〜４，０００）を使用して細胞融合を行う方法ではＰＥＧ濃度は特に限定されないが５０％で行うことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加してもよい。融合は３７℃に加温したＰＥＧ溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、１〜５分間反応後、培地を添加することにより終了する。この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。
得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を得ることができる。また、ハイブリドーマをこれと適合性を有する哺乳動物に投与して増殖し、その腹水より得ることができる。抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
また、下記に態様の記載の通り、本発明のヒト低分子量ＣＤ１４測定キットに本発明の抗体が使用できることから、ヒト低分子量ＣＤ１４とは結合し、ヒト高分子量ＣＤ１４とは結合しない抗体が作製できることが考えられる。
ヒト低分子量ＣＤ１４とは結合し、ヒト高分子量ＣＤ１４とは結合しない抗体は、低分子量ＣＤ１４を抗原として抗体を作製し、高分子量ＣＤ１４とは結合しない抗体を選択することにより得ることが考えられる。
低分子量ＣＤ１４の調製方法は、ＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例１６に記載されている。また、本発明の抗体を用いて、ヒト血清、好ましくは敗血症患者血清より、特異精製することにより調製できる。
高分子量ＣＤ１４と結合しない抗体を選択するためには、得られた抗体と高分子量ＣＤ１４の結合を凝集法、サンドイッチ法、固相直接法若しくは固相結合法、または競合法等により測定すればよい。これらの測定法については、後述する。
高分子量ＣＤ１４の調製は、ＷＯ０１／２２０８５号公報の実施例５に記載の高分子量ＣＤ１４に特異的な抗体を用いて行えばよい。
また、ヒトＣＤ１４のアミノ酸配列の一部からなるペプチドを免疫原として上記と同様に作製し、高分子量ＣＤ１４とは結合しない抗体を選択することにより得ることにより作製する方法も考えられる。ヒトＣＤ１４のアミノ酸配列の一部からなるペプチドとは、例えば、配列番号２に記載の１６個のアミノ酸配列中の連続した８個以上のアミノ酸を含む各ペプチドが挙げられる。
本発明の第三の態様は、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せずに、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するヒト低分子量ＣＤ１４測定キットである。
本発明のキットは、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する。また、目的であるヒト低分子量ＣＤ１４を検出し、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出しないため、ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定することができる。該抗体の断片とは、該抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくはＦ（ａｂ’）２である
本発明のヒト低分子量ＣＤ１４測定キットは、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定することができる限り、特に限定されない。好ましくは、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、本発明の抗体若しくは該抗体の断片を含むヒト低分子量ＣＤ１４測定キットである。より好ましくは、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体若しくは該抗体の断片を含むヒト低分子量ＣＤ１４測定キットである。また好ましくは、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体若しくは該抗体の断片を含むヒト低分子量ＣＤ１４測定キットである。特に好ましくは、ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片として、配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体若しくは該抗体の断片、または配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体若しくは該抗体の断片を含むヒト低分子量ＣＤ１４測定キットである。
また、測定する原理も該抗体若しくは該抗体の断片を使用して免疫学的にヒト低分子量ＣＤ１４を測定する方法であれば特に限定されない。
測定する原理の一例として、本発明の第二の態様の抗体の好ましい例である「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」を使用して、サンドイッチ免疫測定法によりヒト低分子量ＣＤ１４を測定するヒト低分子量ＣＤ１４測定キット（以下、サンドイッチ免疫測定系キットと記載することがある）について下記に具体的に記載する。
サンドイッチ免疫測定法は公知の技術を利用することができる。測定法の原理、応用及び改良法については、例えば、「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）に記載されている。
また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む。該配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体の特徴、及び作製法等は本発明の第一の態様に記載した通りである。該抗体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもよく、特に限定されない。
サンドイッチ免疫測定法は、通常測定する蛋白質を認識する部位の異なる２種類以上の抗体を用いて抗体−抗原−抗体複合体を形成させることにより測定する方法である。
まず、第一の抗体が結合した不溶性担体を用意し、固相若しくは反応場所とする。検体を固相の該不溶性担体に添加し、反応させる。一定時間反応させた後、洗浄して固相に結合しなかった物質を除去する。続いて標識した第二の抗体を添加する。一定時間反応させた後、洗浄して複合体を形成しなかった標識抗体を除去し、標識物に基づいて固相に結合した複合体の量を特異的に定性または定量する。サンドイッチ法は上記のように２段階で行う方法（２ステップ法）と抗原及び標識抗体を同時に加える１段階法（１ステップ法）のどちらを使用することもできる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの構成としては、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が結合した不溶性担体、及び標識した低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質（以下、単に、第二の結合物質と記載することがある）を含むこと、
あるいは、第二の結合物質が結合した不溶性担体、及び標識した配列番号２に記の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む。
第二の結合物質の例示としては、低分子量ＣＤ１４に結合する抗体が挙げられる。該低分子量ＣＤ１４に結合する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、特に限定されないが、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法における相性の点では、モノクローナル抗体が好ましい。また、該モノクローナル抗体の断片であってもよい。抗体の断片とは、該モノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくはＦ（ａｂ’）２である。
低分子量ＣＤ１４に結合する抗体（以下、第二の抗体と記載することもある）は、低分子量ＣＤ１４と特異的に結合する抗体でも、高分子量ＣＤ１４とも結合する抗体でもよく、特に限定されない。好ましくは、本発明の抗体と結合する領域が異なる抗体である。本発明の抗体として、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を用いる場合は、低分子量ＣＤ１４の配列番号２に記載の１６アミノ酸に相当する領域以外の領域と結合する抗体である。より好ましくは、上記第二の結合物質がヒト高分子量ＣＤ１４の１〜５２番目のアミノ酸残基のいずれかの領域に結合する抗体または該抗体の断片、あるいはヒト高分子量ＣＤ１４の１〜５２番目のアミノ酸残基のいずれかの領域に結合する抗体と競合する若しくは交差反応性を示す抗体、または該抗体の断片である。特に好ましくは、上記第二の結合物質がヒト低分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体若しくは該抗体の断片、またはヒト低分子量ＣＤ１４の１７〜２６番目のアミノ酸残基のいずれかに結合する抗体と競合する（交差反応性を示す）抗体若しくは該抗体の断片である。
作製法は、例えば高分子量ＣＤ１４、低分子量ＣＤ１４、高分子量ＣＤ１４及び低分子量ＣＤ１４の混合物若しくは組換体ＣＤ１４を抗原として、本発明の第一の態様に記載の方法と同様にポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体を作製すればよい。高分子量ＣＤ１４及び低分子量ＣＤ１４の混合物、及び組換体ＣＤ１４を抗原とした第二の抗体の作製法の例示を後述する実施例３に示した。
また、実際の測定をする前に予備的に、後述する実施例３と同様に、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体と第二の抗体の候補の抗体とサンドイッチ法の系を構成し、測定感度を確認して、第二の抗体を選択することが好ましい。
また、抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２は公知の方法（「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著  ２５−４０頁、学会出版センター、１９９３年）で作製できる。
サンドイッチ免疫測定法において、上記の別法として競合法により測定することもできる。抗体−抗原−抗体複合体を形成させる中で、検体中の抗原と標識した抗原若しくは標識した抗原類似物質を競合させることにより測定する方法である。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−標識ヒト低分子量ＣＤ１４（若しくはその類似物質）−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの競合法の構成としては、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が結合した不溶性担体、第二の結合物質、及び標識したヒト低分子量ＣＤ１４若しくは標識したヒト低分子量ＣＤ１４類似物質を含むこと、
あるいは、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、第二の結合物質が結合した不溶性担体、及び標識したヒト低分子量ＣＤ１４若しくは標識したヒト低分子量ＣＤ１４類似物質を含む。
ヒト低分子量ＣＤ１４類似物質とは、例えば、ヒトＣＤ１４のＮ末端１〜２８５番目のアミノ酸を有する可溶性ポリペプチド（以下、ｓＣＤ１４（１−２８５）と記載）及びヒトＣＤ１４のＮ末端１〜３０７番目のアミノ酸を有しかつ２８６番目のセリンをシステインに置換した組換えポリペプチド（以下、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃと記載）が例示される。しかし、測定系において検体中のヒト低分子量ＣＤ１４と競合可能な物質である限り、特に限定されない。ｓＣＤ１４（１−２８５）及びｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃの調整法は、ＷＯ０１／７２９９３号公報に記載されている。
また、サンドイッチ免疫測定法において、さらに別法として第二の特異結合を利用して測定することもできる。抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合物質の特異結合パートナー（以下、第二の特異結合パートナーと記載することがある）の複合体を形成させて測定する方法である。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの複合体を形成させること、若しくは、「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの複合体を形成させることにより測定する。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットの第二の特異結合を利用した構成としては、第二の特異結合物質で標識した配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、標識した低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質、及び第二の特異結合パートナーが結合した不溶性担体を含むこと、
あるいは、標識した配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、第二の特異結合物質で標識した低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質、及び第二の特異結合パートナーが結合した不溶性担体を含む。
第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーの組み合わせとしては、抗原とその抗体、リガンドとそのレセプター、糖鎖含有物質とレクチン、ビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジン等が挙げられる。
さらに、サンドイッチ免疫測定法において、抗体に対する抗体、すなわち、抗イムノグロブリン抗体を利用して、抗体−抗原−抗体−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させて測定する方法、また、抗イムノグロブリン抗体及び第二の特異結合を利用して、抗イムノグロブリン抗体−抗体−抗原−抗体−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナー等を形成させて測定する方法が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットにおいては、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させること、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−抗イムノグロブリン抗体の複合体を形成させること、若しくは抗イムノグロブリン抗体−「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーを形成させること、若しくは抗イムノグロブリン抗体−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−第二の特異結合物質−第二の特異結合パートナーを形成させること等により測定する。
いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」を含む複合体を形成させることにより測定する測定法であれば、第二の特異結合を利用して、固相、標識物質等を作製しても、本発明の測定法に含まれる。
すなわち、いずれのサンドイッチ免疫測定法にしても、サンドイッチ免疫測定系のキットとして、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む限り、本発明のキットに含まれる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる不溶性担体は、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、プレート、チューブまたはメンブレン等を用いればよい。ビーズ、プレートまたはチューブは、その材料としてポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、ステンレス、プラスチック等が挙げられる。メンブレンは、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾紙等が挙げられる。形状としては、ビーズ、ラテックス粒子または磁性粒子等は球形として用いることができる。保存時のスペースの確保の点で有利である。プレートまたはチューブはウエル形として用いることができる。市販の自動化測定器、プレートリーダー等に対応可能な点で有利である。また、メンブレンは後述するイムノクロマト法、フロースルー法に用いることができる。
配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体の不溶性担体への結合は熱吸着法、化学結合法等により行うことができる。
また、不溶性担体に上記物質が結合していない非吸着面に対して、測定系に影響しない物質でブロッキング処理することが好ましい。測定系の特異性若しくは感度をあげることができるからである。測定系に影響しない物質とはＢＳＡ、カゼイン等の蛋白質及びＴｗｅｅｎ２０、ＮＰ−４０等の界面活性剤等が例示される。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに用いる標識は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、オキシダーゼ及びウロキナーゼ等の酵素、アクリジニウム若しくはその誘導体、またはエクオリン若しくはその改変体等の化学発光物質、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、色素、金コロイド、着色ラテックス、あるいはアイソトープを用いればよい。
例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合は、発色基質として３，３’，５，５’−テトラベンジジンまたは１，２−フェニレンジアミン等が、アルカリフォスファターゼを用いる場合は、発色基質として４−ニトロフェニルフォスフェート等が、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は、発色基質として２−ニトロフェニル・β−Ｄ−ガラクトシド等が例示される。
配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、第二の結合物質、第二の特異結合物質若しくはそのパートナー、または抗イムノグロブリン抗体への酵素標識は、二段階グルタルアルデヒド法、過ヨーソ酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法等により行うことができる。
酵素以外の標識についても熱吸着法、化学結合法等の公知の技術を利用して行うことができる。
酵素標識は、上記に例示される様な発色基質を用いれば、通常の吸光度測定系を用いて測定でき、また感度も比較的高く好ましい。また、簡易な測定キット、例えば後述するイムノクロマト法、フロースルー法を利用したキットに用いる標識は、色素、金コロイド若しくは着色ラテックスが視覚的にも観察可能であるので好ましい。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法により測定することを特徴とし、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含むものである。サンドイッチ免疫測定法は上記した通り公知の技術を利用することができ、上記の具体的な説明の他、サンドイッチ免疫測定法を特徴としたキットであれば、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれ、特に限定されない。すなわち、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体、及びサンドイッチ免疫測定法に必要な試薬が含まれていれは良く、また測定原理に基づく測定結果を阻害しない限り、含まれるのは限定されない。
例えば、任意の構成要素として、検体若しくは標識抗体等の緩衝液若しくは希釈剤、標識抗体に酵素が使われる場合の酵素に適した発色基質（上記参照）、ブロッキング剤、反応停止剤または洗浄剤等が例示される。また標準物質も例示される。標準物質はヒト低分子量ＣＤ１４、低分子量ＣＤ１４類似物質が挙げられる。
また、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、サンドイッチ免疫測定法を測定原理とするイムノクロマト法またはフロースルー法を利用したキットも含まれる。
イムノクロマト法は、試験ストリップ上を、検体中の溶液と共に被検物質である抗原が、試験ストリップ中に移動可能なように配置された標識抗体と反応しながら、抗体が固相化されている不溶性担体に移動し、不溶性担体上に抗体−抗原−抗体複合体を形成させる方法である。通常試験ストリップに検体を滴下する１ステップにより測定できる。
例えば、特開平１−６３８６５、ＷＯ８８／０８５３４、ＷＯ９０／０９５９２にイムノクロマト法の装置が開示されている。また、展開速度の異なる流路を有するイムノクロマト法の装置が、ＷＯ８９／０３９９３、ＷＯ９９／２７３６４に開示されており、例えば固相抗体と抗原との反応しその複合体形成後、標識抗体が反応可能なように応用できる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットのイムノクロマト法を利用した例を以下に示す。
例えば、装置すなわちキットとしては、試料添加部、試薬部、検出部及び吸収部を、試料添加部に添加される液性検体が上記の順に移動するように設けた試験ストリップである。試薬部に標識した第二の結合物質を含浸させ、検出部に配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が結合した不溶性担体を設置されればよい。
試料添加部に添加された検体は、試薬部で標識した第二の結合物質を吸収する。ヒト低分子量ＣＤ１４と標識した第二の結合物質が反応し、複合体を形成しながら、検出部に進む。検出部で上記の複合体と配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が反応し、不溶性担体上に「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体が形成される。反応に関わらない検体中の物質及び試薬は、吸収部に移動する。検出部に形成された複合体の標識を測定、特に視覚的に測定すればよい。
試験ストリップは、多孔性担体等を用いることが例示される。多孔性担体は、例えばニトロセルロース、セルロース、セルロース誘導体、ナイロン、ナイロン繊維、ガラス線維、多孔性合成ポリマー等が挙げられる。
試料添加部、試薬部は、試験ストリップの一部をそのまま利用してもよく、また試料量若しくは試薬量に応じたセルロース濾紙、グラスファイバー、布、不織布または多孔性合成ポリマー等を用いることが例示される。
検出部は、上記した通り、セルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、多孔性合成ポリマー、グラスファイバー、布、不織布、濾紙等を用いることが例示される。
吸収部は、水吸収性材料を用いることが例示される。水吸収性材料とは、例えばスポンジ等の吸収性ポリマー、セルロース濾紙、濾紙等が挙げられる。
以上はイムノクロマト法の一例であり、反応が進行したことを確認する対照部を追加したり、試験ストリップに支持体をつけたり、外部カバーで覆ったりしてもよく、本発明のキットはこれらに限定されるものではない。
また、上記のサンドイッチ免疫測定法に関する説明に記載した通り、不溶性担体上に「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体を形成させる他、抗イムノグロブリン抗体、第二の特異結合を利用した複合体を形成させて測定するイムノクロマト法のキットも本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
フロースルー法は、不溶性担体であるメンブレン上で、検体中の溶液と共に被検物質である抗原が、抗体−抗原−抗体複合体が形成させる方法である。このとき、メンブレンに固定されなかった物質は、通常は垂直にメンブレンの表から裏を通って除去される。
メンブレン上に検体、試薬及び洗浄剤を滴下する多ステップ法の装置がＷＯ８８／０１６０３に開示されている。
また、メンブレンを多層にし、試薬部を設け、検体のみを滴下すれば測定できる１ステップに改良した方法が、特開平６−２７３４１９に開示されている。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットのフロースルー法を利用した例を以下に示す。
例えば、装置すなわちキットとしては、試料添加部、試薬部、検出部及び吸収部を、試料添加部に添加される液性検体が上記の順に移動するように重ねて設けたキットである。試薬部に標識した第二の結合物質を含浸させ、検出部に配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が結合した不溶性担体を設置されればよい。
試料添加部に添加された検体は、試料添加部を垂直にメンブレンの表から裏を通って（以下、試料の移動は同様）、試薬部で標識した第二の結合物質を吸収する。ヒト低分子量ＣＤ１４と標識した第二の結合物質が反応し、複合体を形成しながら、検出部に移動する。検出部で上記の複合体と配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が反応し、不溶性担体上に「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体が形成される。反応に関わらない検体中の物質及び試薬は、吸収部に移動する。検出部に形成された複合体の標識を測定、特に視覚的に測定すればよい。検出部を、試料添加部及び試薬部と、若しくは吸収部と分離可能な装置にしておけば、簡単に目視できる。また、試料添加部及び試薬部を半透明な部材であれば、試料添加部側から目視でき、特開平６−２７３４１９の様に吸収部を検出部の上方（試料添加部側）に配置すれば、下方側から目視できる。
部材は、イムノクロマト法と同様の部材を用いることができ、各部材をメンブレン様にして、検体中の溶液が移動できるようにしておけばよい。
以上はフロースルー法の一例であり、反応が進行したことを確認する対照部を追加したり、各部材に支持体をつけたり、外部カバーで覆ったりしてもよく、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットはこれらに限定されるものではない。
また、上記のサンドイッチ免疫測定法に関する説明に記載した通り、不溶性担体上に「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４−「ヒト低分子量ＣＤ１４に結合する第二の結合物質」複合体を形成させる他、抗イムノグロブリン抗体、第二の特異結合を利用した複合体を形成させて測定するフロースルー法のキットも本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
さらに、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、標識の信号を電気化学的に測定するＭＥＤＩＡ法（特開平５−２６４５５２）による測定、マイクロチップを使用したイムノアッセイ法（「バイオサイエンスとインダストリー」第６１巻４４９−４５４頁２００３年）による測定にも利用可能である。これらの原理を用いた測定キットも、サンドイッチ免疫測定法により測定することを特徴とし、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む限り、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
本発明のサンドイッチ免疫測定系キットは、配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含むことを特徴としており、低分子量ＣＤ１４を特異的に測定できる。本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに使用する検体は、水性の検体が好ましい。特に血液、血清若しくは血漿等の血液成分、尿、その他の体液、細胞培養上清、またはカラム溶出液等が好ましく、これらに含まれる低分子量ＣＤ１４の測定に有用である。しかし、ヒトの血液成分以外からの検体、例えばヒト尿若しくはその他の体液、ヒト以外の種からの血液成分、尿若しくはその他の体液、細胞培養上清、またはカラム溶出液等の検体では、低分子量ＣＤ１４だけではなく、低分子量ＣＤ１４類似の蛋白質、ポリペプチド等も測定することが可能である。配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を含む限り、上記の低分子量ＣＤ１４類似の蛋白質、ポリペプチド等を測定するためのキットも、本発明のサンドイッチ免疫測定系キットに含まれる。
また、以上の説明において、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」の代わりに「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくは（Ｆａｂ’）２」を用いてもよい。
上記には、サンドイッチ免疫測定系キットの一例として、本発明の第二の態様の抗体の好ましい例である「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」を使用した例を具体的に示したが、本発明の第一の態様の抗体、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」の他の本発明の第二の態様の抗体若しくはこれらの抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくは（Ｆａｂ’）２を用いることもできる。
好ましくは、本発明の第二の態様の抗体を用いたサンドイッチ免疫測定系キットである。より好ましくは、「配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体」を用いたサンドイッチ免疫測定系キットである。
また、測定する原理の例として、サンドイッチ免疫測定法の他にも、凝集法、固相結合法及び溶液反応法が挙げられ、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を、好ましくは、本発明の抗体若しくは該抗体の断片を含むこれらの方法に応じたそれぞれのキットを構成することができる。
凝集法は、抗体を粒子の表面に結合させて、抗原が存在することにより粒子の凝集を生じさせて、該粒子の凝集の程度を指標として抗原を特異的に定性または定量する。
本発明の凝集法免疫測定系キットにおいては、「本発明の抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４を形成させ、凝集させることにより測定する。
本発明の凝集系免疫測定系キットの構成としては、本発明の抗体がその表面に結合した粒子を含む。
粒子としては、ラテックス、赤血球（例えば羊赤血球）、ゼラチン、マイクロビーズまたはカーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。
固相結合法は、固相上で抗体と抗原の複合体を形成することにより測定する方法である。抗原を含む検体を不溶性担体（すなわち固相、以下同）に吸着させる。次に標識抗体を添加し、反応させ、標識物に基づいて固相に結合した複合体の量を特異的に定性または定量する。
また、競合法として、抗原類似物質を不溶性担体に吸着させて、標識抗体と検体中の抗原との反応を競合させることにより、抗原類似物質と結合した標識抗体の量を測定する方法がある。さらに競合法の別法として、抗体を不溶性担体に吸着させて、検体中の抗原との反応を、標識抗原類似物質により競合させ、抗体と結合した標識抗原類似物質の量を測定する方法がある。
本発明の固相結合法免疫測定系キットにおいては、「本発明の抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４複合体、「本発明の抗体」−標識ヒト低分子量ＣＤ１４（若しくはその類似物質）複合体または「標識した本発明の抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４（若しくはその類似物質）複合体を形成させることにより測定する。
本発明の固相結合法免疫測定系キットの構成例としては、本発明の抗体、不溶性担体、及び検体を不溶性担体に吸着させる試薬を含むこと、
本発明の抗体、及び標識したヒト低分子量ＣＤ１４（若しくはその類似物質）が結合した不溶性担体を含むこと
あるいは、標識した本発明の抗体が結合した不溶性担体、及び標識したヒト低分子量ＣＤ１４（若しくはその類似物質）が結合した不溶性担体を含む。
不溶性担体、ヒト低分子量ＣＤ１４類似物質、標識及び吸着させる試薬については、サンドイッチ免疫測定系キットの説明に記載した通りである。
溶液反応法は、抗原と標識抗体を液相中で反応させ、その後抗体を用いた凝集沈降法若しくは物理化学的な手法によって、抗原、抗体と抗原抗体複合体とを分離し、低分子量ＣＤ１４を特異的に定性または定量する方法もある。
本発明の溶液反応法免疫測定系キットの構成例としては、キットにおいては、「標識した本発明の抗体」−ヒト低分子量ＣＤ１４」複合体を液相中で形成させ、未結合の標識抗体を分離することにより測定する。
本発明の溶液反応法免疫測定系キットの構成例としては、標識した本発明の抗体を含む。
また、以上の説明において、「本発明の抗体」の代わりに「本発明の抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくは（Ｆａｂ’）２」を用いてもよい。
以上、本発明の測定キットの例を測定する原理に基づいて記載したが、本発明のキットはこれらの原理に限定されない。少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体若しくは該抗体の断片を含み、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定することができる限り、本発明の測定キットに含まれる。免疫測定法の原理については、公知の技術を利用することができる。上記した「超高感度酵素免疫測定法」石川栄治著、学会出版センター（１９９３年）、「免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用」免疫測定法開発研究会、経営教育出版、酵素免疫測定法（第３版）石川栄治等編、医学書院（１９８７年）も参考にできる。
本発明のキットで特異的に測定できる低分子量ＣＤ１４は、敗血症患者において増加する。このため、低分子量ＣＤ１４を測定することは敗血症の診断の指標となり、本発明のキットは、敗血症の診断に有用である。
本発明の第四の態様は、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せず、ヒト低分子量ＣＤ１４を検出するために、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体を使用し、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するヒト低分子量ＣＤ１４測定方法である。
本発明の測定方法は、ヒト低分子量ＣＤ１４測定方法であって、ヒト高分子量ＣＤ１４を検出せず、ヒト低分子量ＣＤ１４を検出するために、少なくとも一つのヒト低分子量ＣＤ１４に結合する抗体を使用し、検体に含まれるヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定するヒト低分子量ＣＤ１４を測定する方法である。好ましくは、本発明の抗体を使用する低分子量ＣＤ１４の測定方法である。より好ましくは、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体を使用する低分子量ＣＤ１４の測定方法である。また好ましくは、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を使用する低分子量ＣＤ１４の測定方法である。特に好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、または配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体を使用する低分子量ＣＤ１４の測定方法である。また、以上の説明において、「抗体」の代わりに「該抗体の断片であるＦａｂ、Ｆａｂ’、若しくは（Ｆａｂ’）２」を用いてもよい。
また、好ましくは、サンドイッチ免疫測定法によりヒト低分子量ＣＤ１４を測定する低分子量ＣＤ１４の測定方法である。
本発明の抗体を固相抗体、若しくは標識抗体等として使用することができる。また、第二の特異結合、抗イムノグロブリン抗体を利用した測定方法も含まれる。この場合、本発明の第一の態様の抗体は遊離の抗体、第二の特異結合物質若しくは第二の特異結合パートナーに結合した抗体等としても使用することができる。
本発明の測定方法は、サンドイッチ免疫測定法の非競合法、または競合法が可能であり、またイムノクロマト法、またはフロースルー法での測定も含まれる。
また、本発明の測定方法の原理は、サンドイッチ免疫測定法に限定されず、その他の例としては凝集法、固相結合法及び溶液反応法等が挙げられる。
詳細は本発明の第三の態様に記載した通りである。
本発明の第五の態様は、ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の診断方法である。
本発明の敗血症の診断方法は、低分子量ＣＤ１４を直接測定する。
低分子量ＣＤ１４を直接測定する方法は、本発明の第四の態様に記載したとおりである。また本発明の第三の態様に記載したキットを用いて診断することができる。
後述する実施例３、１０及び１１に記載の通り、本発明のキットを用いて正常人及び各種患者の血中の低分子量ＣＤ１４を測定したところ、敗血症患者の血中で特異的に低分子量ＣＤ１４量が高いことが確認された。このことから、上記のキットを用いて測定した結果を、敗血症の診断の指標とすることができる。例えば、患者の血中の低分子量ＣＤ１４の量を求め、これを正常人の測定結果の平均値をとる等により標準化した正常人の値または正常人の値の範囲と比較することにより行う。例えば、正常人の平均値＋２ＳＤまたは３ＳＤをカットオフ値として、それよりも低分子量ＣＤ１４値が高い場合は陽性の指標とする等である。また、予め正常人および敗血症患者の低分子量ＣＤ１４濃度の値またはその範囲を標準化した値と、各個体の低分子ＣＤ１４の測定値とを比較することにより診断の指標とすることもできる。例えば、正常人の低分子量ＣＤ１４値を０〜０．１μｇ／ｍＬとし、敗血症患者の値を０．２μｇ／ｍＬ以上として測定値と比較し、陰性、擬陽性または陽性の指標とする等である。
本発明の第六の態様は、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなるペプチドである。本発明のペプチドは、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸残基からなる。本発明のペプチドは、本発明の抗体を作製する抗原として有用である。
本発明の第七の態様は、配列番号１に記載のアミノ酸配列から選択される連続した８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原とする、本発明の抗体の作製方法である。抗原として用いるペプチドの好ましい例は、本発明の第六の態様のペプチド及び配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上のアミノ酸からなるペプチドである。「配列番号２に記載のアミノ酸残基の連続した８個以上１６個以下のアミノ酸からなるペプチド」とは、下記１）〜９）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであり、配列番号２中の下記配列に連続する上流側および／または下流側配列であり、合計１０個以上、１２個以上、さらには１６個であるのが好ましい。
2004044005.tif 000002
本発明の方法の詳細は本発明の抗体の態様の項に記載したとおりである。
本発明のペプチドは本発明の抗体の態様の項に記載した方法により作製することができる。
【実施例】  以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくものである。
なお、以下の実施例に使用した正常人血清及び敗血症患者血清はＰｒｏＭｅｄＤｘ社製及びＳｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製を購入して、使用した。
（実施例１）合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製
１−（１）抗原とするペプチドの調製＜１＞
配列番号２に記載の配列（配列番号５に記載の５３番目から６８番目の配列に該当）を有するペプチド（以下、Ｓ６８ペプチドと記載）を、Ｎ末端でＳＨ基を介してキャリア蛋白質と結合させるため、Ｎ末端にシステインを挿入して合成した。すなわち、ペプチド合成機ＡＢＩ４３３Ａ（アプライド）を用いて、アミノ酸配列に従ってアミノ酸カラムを並べ、Ｎ末端にシステイン用のアミノ酸カラムを設置し自動合成を行った。合成したペプチドは定法により樹脂より切り出し、エーテルで沈殿させ回収後、再度蒸留水で溶解し凍結乾燥した。得られた粗精製ペプチドは溶解後、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて５〜７０％のアセトニトリル濃度の直線グラジエントで溶出し、目的のペプチドを含む分画を回収した。回収した分画は凍結乾燥し、精製ペプチドとして２〜３ｍｇを得た。
１−（２）合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の調製＜１＞
１−（１）で調製した２種類のペプチドをそれぞれ蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、生理食塩水で平衡化したＮＡＰ−１０カラム（アマシャム  バイオサイエンス）で脱塩し、Ｓ６８ペプチドキャリア抗原（以下、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨと記載）を１ｍｇ得た。以下の実施例に記載の蛋白質濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを使用した。
１−（３）抗原とするペプチドの調製＜２＞
表１に示す２種類のペプチド配列を、ペプチド合成機（ＰＳＳＨ−８、島津製作所）を用いて１−（１）と同様に合成し、精製し、各ペプチドそれぞれを約５ｍｇ得た。なお、表中の「番号」は以下の説明に記載するペプチドの名称を、「位置」は配列番号５に記載のアミノ酸配列中に存在する位置を示す。
2004044005.tif 000003
１−（４）合成ペプチドを用いたペプチドキャリア抗原の調製＜２＞
１−（３）で調製したそれぞれのペプチドをそれぞれ０．１Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶解し、１−（２）と同様に、それぞれのペプチドにＫＬＨが結合したそれぞれのペプチドキャリア抗原を３ｍｇ得た。
１−（５）合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製＜１＞
１−（２）で調製したＳ６８ペプチド−ＫＬＨに対するポリクローナル抗体を作製するため、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨを用いてウサギに免疫を行った。すなわち、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、ニュージーランド白色ウサギ（北山ラベス）メス２．１−２．２ｋｇの背部皮下に投与した。その２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ各１００μｇを５００μＬの生理食塩水に希釈し、５００μＬのフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後、背部皮下に投与した。さらにその２週間後、Ｓ６８ペプチド−ＫＬＨ１００μｇを１ｍＬの生理食塩水に希釈し耳静脈内に投与した。
投与終了１週間後、耳静脈より採血し、定法にしたがい抗血清を分離し、抗体を精製した。まず抗血清に最終飽和濃度３３％となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で１時間攪拌後、析出した沈殿を遠心分離した。次に沈殿を７６ｍＭリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）と記載）で溶解し、一夜透析した。透析液を濾過後、プロテインＡカラム（プロセップＡ、ミリポア）にアプライし、結合したＩｇＧ画分を０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により溶出し、精製抗体を得た。ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より蛋白濃度を算出した（吸光係数：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）。以降、得られた抗体をＳ６８ペプチドポリクローナル抗体と記載する。
１−（６）合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体の作製＜２＞
１−（４）で調製したそれぞれのペプチドキャリア抗原を用いて１−（３）と同様に免疫及び抗血清の精製を行い、それぞれのペプチドポリクローナル抗体（Ｐ００１およびＰ００２のポリクローナル抗体）を作製した。なお、免疫は２ヶ月間にペプチドキャリア抗原（０．５ｍｇ／ウサギ）を５回投与し、全採血後それぞれの抗血清（抗血清Ｐ００１およびＰ００２）を得た。
１−（７）特異精製ポリクローナル抗体の調製
Ｓ６８ペプチドポリクローナル抗体よりＳ６８ペプチドに対する抗体のみを精製するため、以下の方法により特異精製を行った。まず、システインを挿入したＳ６８ペプチド（以下、Ｃ−Ｓ６８ペプチドと記載）をＳＨ基を介して担体に結合させるため、マニュアルに従ってＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ）１ｍＬあたりＣ−Ｓ６８ペプチド２００μｇを混合し反応した。反応終了後残った活性基をブロッキングし、Ｓ６８ペプチド結合アフィニティーカラムを調製した。次に、１−（３）に記載の精製ＩｇＧ画分７．９２ｍｇをアプライし、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（ダルベッコ、以下、Ｄ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と記載）でカラムを洗浄し、次に０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で結合した抗Ｓ６８ペプチド抗体を溶出した。溶出後ｐＨを中性に戻しＰＢＳで透析後、蛋白質濃度を２８０ｎｍの吸光度より算出した（吸光係数：０．５３３ｍｇ／ｍＬ）ところ、０．５２ｍｇの抗Ｓ６８ペプチド抗体（以下、Ｓ６８抗体と記載）が得られた。
（実施例２）合成ペプチドを抗原としたモノクローナル抗体の作製
実施例１−（２）で調製したＳ６８ペプチド−ＫＬＨ２０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬずつ投与した。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。細胞融合は安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と５：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。融合した細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ハイブリドーマを選別後、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをスクリーニングした。
スクリーニングはｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを直接プレートに固相化するＥＬＩＳＡ法を用いた。すなわち、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈したｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを各ウエルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。次にプレートをイオン交換水で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、室温で１時間静置してブロッキングを行った。得られたハイブリドーマからサンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で測定し、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃと結合する抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択した。
次に、選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３頁、１９９１年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、同様にｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃに対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、６種類のハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、プロテインＧカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。精製したＦ１１４６−１７−２抗体のサブタイプをラットタイピングキット（ＺＹＭＥＤ）を用いて決定したところサブタイプはラットＩｇＧ２ｂ・κであった。
なお、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃは、ＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例９に記載の方法を用いて調製した。
（実施例３）ヒト低分子量ＣＤ１４の測定系の検討
実施例１及び実施例２に記載の抗体を用いて、サンドイッチＥＩＡ法によるヒト低分子量ＣＤ１４の測定系を検討した。
３−（１）組換えヒトＣＤ１４の調製
まず、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の第二の抗体とするｓＣＤ１４（１−２８５）に対するモノクローナル抗体を作製するため、その免疫原であるｓＣＤ１４（１−２８５）を大腸菌で調製した。ｓＣＤ１４（１−２８５）を大腸菌で発現させるために、以下の方法で発現プラスミドｐＴｒｐ１６５９を構築した。
まず、オリゴマー８，ｌｉｎｋＳ（５’−ａｇｃ  ｔｔａ  ｇｇａ  ａｔｔ  ｔ−３’）（配列番号１５）及びオリゴマー８，ｌｉｎｋＡ（５’−ｃｔａ  ｇａａ  ａｔｔ  ｃｃｔ  ａ−３’）（配列番号１６）を合成した。
これらのオリゴマーを等量混合し、９９℃で１分間加温した後に、室温まで徐々に冷却してアニーリングを行った。さらにＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅで５末端をリン酸化してリンカーを作製した。
次にセンスプライマー（５’−ａｃａ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｔｇａ  ｃｃａ  ｃｇｃ  ｃａｇ  ａａｃ  ｃｔ−３’）（配列番号１７）及びアンチセンスプライマー（５’−ｔｔｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｔｔａ  ｃｔａ  ｇａｇ  ａｔｃ  ｇａｇ  ｃａｃ  ｔｃｔ−３’）（配列番号１８）を合成し、ＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例８に記載のプラスミドｐＭ１６５９を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行った。
反応液を９０℃で２分間加温した後に、９８℃  １０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分のサイクルを３０回繰り返して行った。
得られた約９００ｂｐの増幅物を、ＸｂａＩとＢａｍＨＩとでｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎして、ＤＮＡ断片を回収した。特開平０６−０２５２８９号公報の実施例１０に記載のベクターｐＭ７１０を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａＨＩとでｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎした後に、アガロースゲル電気泳動を行い、回収した。前述したリン酸化済みリンカー、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片／ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ消化断片、そしてベクター／ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＢａｍＨＩ断片の３種をｌｉｇａｔｉｏｎした後に（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）、大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ））にｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行い、目的のプラスミドを含むクローンを得た。プラスミドＤＮＡは定法により調製した。
次にｓＣＤ１４（１−２８５）を生産するためのＪＥ７９２４形質転換株をエレクトロポレーション法により調製した。
まず、大腸菌ＪＥ７９２４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３  ４７９９頁（１９９１））をグリセロールストックより回復し、ＬＢ培地にて３７℃  一晩培養した。さらに５０ｍＬのＬＢ培地に植菌し直し、６００ｎｍの吸光度が０．５〜０．６になるまで培養を続けた後に、培養フラスコごと３０分間氷冷した。次に大腸菌を集菌し、氷冷した滅菌蒸留水にて２回、氷冷した１０％グリセロール溶液で１回洗浄した後に、氷冷した１０％のグリセロール溶液１００μＬに懸濁した。５０μＬずつ２本のチューブに分注して、液体窒素で急速凍結し、コンピテントセル（ＪＥ７９２４）を調製し、使用時まで−８０℃で保存した。
次に、ＪＥ７９２４コンピテントセル５０μＬに、ｐＴｒｐ１６５９約３０ｎｇをエレクトロポレーション法で導入した。機器はＢＩＯ−ＲＡＤ社のＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用した。また、その時の設定は、Ｖｏｌｔａｇｅ２．５ｋＶ、Ｒｅｓｉｓｔｏｒ  ２００Ω、Ｃａｐａｓｉｔｏｒ  ２５μＦで行った。その後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢアガープレートで一晩培養することで、ｐＴｒｐ１６５９が導入された形質転換株を得た。このクローンをＬＢ培地にて３７℃で一晩培養した後に、新しい培地に再度植菌し直し、さらに５時間培養した。６００ｎｍの吸光度が２〜３であることを確認し、３β−ＩＮＤＯＬＥＡＣＲＹＬＩＣ  ＡＣＩＤ（Ｓｉｇｍａ社）を終濃度１００μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で４時間培養を行い、ｓＣＤ１４（１−２８５）を誘導発現させた。次に、大腸菌を回収し、Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いてＩｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙを調製した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用バッファーにて溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＣＤ１４抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｌｏｔｔｉｎｇでｓＣＤ１４（１−２８５）の発現を確認した。
免疫原用ｓＣＤ１４（１−２８５）は同様にＪＥ７９２４形質転換株を１ＬのＬＢ培地で培養し調製した。まず培養液を遠心分離し、大腸菌を集菌後、菌体をＤ−ＰＢＳで洗浄し、集めた菌体に５０ｍＬのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、以下Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒと記載）を加えて懸濁し、室温で３０分間放置した。菌体溶解後、１０分間ソニケーション（ＵＳ−３、井内盛栄堂）処理し、１００００×ｇ、４℃にて２０分間遠心分離し、上清を除去した。再度同様にソニケーション処理し、得られた沈殿を５０ｍＬのＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒに懸濁した。懸濁液に１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（生化学工業）を加えて緩やかに攪拌後、室温で１０分間放置し、続けて２００ｍＬの１０分の１量の高濃度Ｂｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒを加えて攪拌後、同様に遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿に、２００ｍＬの１／１０濃度のＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒを加えて懸濁し、同様に遠心分離し、この操作を数回繰り返した。最終的に得られた沈殿に１００ｍＬのＤ−ＰＢＳを加え、Ｉｎｃｕｌｕｓｉｏｎ  Ｂｏｄｙを得た。
ｓＣＤ１４（１−２８５）の調製は、まずＩｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｂｏｄｙを１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、凍結融解を３回行い、遠心し沈殿を回収した。再度１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００を含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、氷冷後２５０μＡで１０秒間隔で１２分間超音波処理を行い、遠心後沈殿を回収した。沈殿を１％のＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．２Ｍ  ＮａＯＨを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ニッポンジーン）に溶解し、３７℃で１０分間処理、遠心、再溶解を３回行った後、沈殿を回収した。得られた沈殿を６Ｍのグアニジン塩酸を含む水溶液に溶解し、精製ｓＣＤ１４（１−２８５）を調製した。濃度はＢＳＡを標準品としてブラッドフォードのタンパクアッセイ法により算出した。
３−（２）抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の作製
［１］Ｆ１１０６−１３−３抗体の作製
上記に記載の大腸菌由来ｓＣＤ１４（１−２８５）を投与抗原として、モノクローナル抗体を作製した。まず、ｄｄｙマウス６週齢メスの腹腔に精製ｓＣＤ１４（１−２８５）２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合して２００μＬ投与した。２週間後、精製ｓＣＤ１４（１−２８５）２０μｇをフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、腹腔内に２００μＬ投与した。細胞融合３日前にマウスの腹腔に抗原５０μｇを投与した。３日後、無菌的に脾臓を摘出し、脾臓よりリンパ球を分離し、安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがってミエローマ細胞（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１）と１０：１で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選別後、ｓＣＤ１４（１−２８５）と結合する抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングをＥＬＩＳＡ法で行った。
まず、ｓＣＤ１４（１−２８５）をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で０．４μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加し、ブロッキングを行った。サンプリングした培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した溶液を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ．ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度をプレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で測定し、ｓＣＤ１４（１−２８５）と結合する抗体を産生するハイブリドーマを含むウエルを選択した。次に選択したウエルより安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって限界希釈法によりクローニングした。１０日後、同様にｓＣＤ１４（１−２８５）に対する反応性を指標としてスクリーニングを行い、ハイブリドーマを選択したところ１２種類の抗ｓＣＤ１４（１−２８５）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマが得られた。
選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養し抗体を産生させ、プロテインＡ（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）を用いて抗体を精製した。
特に反応性の高い抗体であるＦ１１０６−１３−３抗体のサブタイプをＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定したところサブタイプはＩｇＧ２ｂ・κであった。
［２］Ｆ１０３１−８−３抗体の作製
Ｆ１０３１−８−３抗体はＷＯ０１／２２０８５号公報の実施例７に記載の方法を用いて作製した。簡単に記載すれば、ヒト血中のＣＤ１４蛋白質２０μｇを生食に溶解し、フロインド完全アジュバンド（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、初回及び２週間後に２回目をマウスに腹腔内投与をした１週間後、血清中の抗体価の上昇を、ＷＯ０１／２２０８５号公報の実施例５と同様に組換えヒトＣＤ１４蛋白質との反応性をＥＬＩＳＡ法により確認した。マウスの腹腔に抗原１００μｇを投与し最終投与を行い、３日後、脾臓を摘出した。脾臓よりリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ．１）と１０：１で混合しポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的に抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを上記記載のＥＬＩＳＡ法により行った。固相化した可溶型ＣＤ１４蛋白質と反応したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、１０日後同様にスクリーニングを行い、抗ＣＤ１４蛋白質モノクロナール抗体を得た。代表的な抗体として、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて決定したサブタイプがＩｇＧ２ｂ・κであるＦ１０３１−８−３抗体を得た。
３−（３）ヒト低分子量ＣＤ１４の測定系の検討
ヒト低分子量ＣＤ１４を特異的に検出可能な系を作製するため、実施例１、２、３−（２）に記載の抗体を用いてサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
［１］ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
ペルオキシダーゼ標識抗体は中根らの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２巻、ｐ．１０８４、１９７４年）に従い４ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後、１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応させ１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。精製したＦ１０３１−８−３抗体及びＦ１１０６−１３−３抗体それぞれを１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、４ｍｇに対して０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を７０μＬ添加して活性化した４ｍｇのペルオキシダーゼを抗体と等量に混合し２５℃で２時間反応した。次に４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２時間４℃で反応した。反応液をＰＢＳに透析し、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体（以下、Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰと記載する場合がある）及びペルオキシダーゼ標識Ｆ１１０６−１３−３抗体（以下、Ｆ１１０６−１３−３−ＨＲＰと記載する場合がある）を得た。液量を測定し使用した抗体量より抗体濃度を算出した。
［２］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈１〉
固相抗体として実施例１で作製したＳ６８抗体を使用し、標識抗体として実施例３−（２）［１］及び［２］で作製した抗体を使用する２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。すなわちＳ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％の正常人血清（３Ｃ１０を用いて可溶型ＣＤ１４を除去した血清、以下、ＣＤ１４吸収血清と記載）、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として、ヒト正常人血清及びヒト敗血症患者血清を２０倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０３１−８−３−ＨＲＰまたはＦ１１０６−１３−３−ＨＲＰを各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、表２に示すようにＳ６８ペプチド由来抗体を組み合わせた系では正常人では上昇せず、敗血症患者特異的に上昇する、血中可溶型蛋白質、すなわち本発明で定義している低分子量ＣＤ１４が測定できた。
［３］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈２〉
１）固相抗体として実施例２で作製したＦ１１４６−１７−２抗体を使用し、標識抗体として実施例３−（２）［２］で作製した抗体を使用する２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。Ｆ１１４６−１７−２抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で１２０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。５６℃で３０分反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬）を含むＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を希釈液としてヒト正常人血清及びヒト敗血症患者血清を１０倍に希釈した希釈検体を調製した。希釈検体をウエル当たり５０μＬ添加し、２５℃で２時間反応した。
反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で０．５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。２５℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、表２に示すようにＳ６８ペプチド特異的モノクローナル抗体はＳ６８抗体同様、正常人血清ではほとんどなく、敗血症患者血清では高値を示す低分子量ＣＤ１４が測定できた。すなわち、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体はポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも、サンドイッチ測定系ができることを確認できた。
２）固相抗体として実施例１−（６）で作製した合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体を使用した２ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。Ｓ６８抗体の代わりにＰ００１ポリクローナル抗体、Ｐ００２ポリクローナル抗体またはＰ０１２ポリクローナル抗体を使用した他は、３−［２］と同様に、ヒト正常人血清中の及びヒト敗血症患者を検体として測定した。その結果、表２に示すように合成ペプチドを抗原としたポリクローナル抗体はＳ６８抗体同様、正常人血清ではほとんどなく、敗血症患者血清では高値を示す低分子量ＣＤ１４が測定できた。本結果より、ヒト高分子量ＣＤ１４の１〜２８５番目までのアミノ酸配列から選択される８〜１６アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体を用いた系でもサンドイッチ測定系ができることを確認できた。
表２の＋＋は４５０ｎｍの吸光度が希釈液単独の吸光度の４倍以上を示し、＋は２倍以上、−は希釈液と同等の吸光度を示す。
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［４］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈３〉
固相抗体としてＦ１０３１−８−３抗体を使用し、標識抗体としてＳ６８抗体を使用する３ステップサンドイッチＥＩＡ系を作製した。本ＥＩＡ系は以下のようにＳ６８抗体をビオチン化して行った。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置換し０．９３ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したＳ６８抗体０．５ｍＬにＤＭＳＯで溶解し３００μｇ／ｍＬに調製したＤ−Ｂｉｏｔｉｎｏｙｌ−ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  Ｅｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を５０μＬ添加し、室温で２時間攪拌しながら反応した。反応終了後、脱塩カラム（ＮＡＰ−５、アマシャムバイオサイエンス）によりＰＢＳ（ｐＨ７．４）に置換した。調製したビオチン化Ｓ６８抗体（Ｂｉｏ−Ｓ６８抗体と記載する場合がある）の濃度は２８０ｎｍの吸光度より吸光係数１．４を用いて算出した。
サンドイッチＥＩＡ系はイムノプレート（ＮＵＮＣ）にＦ１０３１−８−３抗体を固相化し、ブロッキングした。ブロッキング液を廃棄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに溶解したｓＣＤ１４（１−３０７）ｓ２８６ｃ（以下、標準品と記載することがある）５００ｎｇ／ｍＬと標準品を添加していない溶液をネガティブコントロールとして各ウエルに添加した。３７℃で１時間反応後プレートを洗浄し、続けて２％ラット血清、１％マウス血清、１％ウサギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し１μｇ／ｍＬに調製したビオチン化Ｓ６８抗体を５０μＬ添加し３７℃で１時間反応した。反応終了後洗浄し、１万倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰと記載する場合がある、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を添加した。１時間反応後洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）で発色後、停止液で反応を停止し４５０ｎｍの吸光度をプレート吸光度計Ｅ−Ｍａｘ（モレキュラーデバイス）で測定した。
表３に示すように本系においてもサンドイッチＥＩＡ系ができた。すなわち、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体を、固相抗体として用いても、遊離の抗体若しくは標識抗体として用いても、サンドイッチ測定系ができることを確認できた。表３の＋＋は標準品０−５００ｎｇ／ｍＬでの吸光度の差が０．５Ａｂｓ以上、＋は０．１以上、−は０．１未満を示している。
［５］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈４〉
固相抗体及び標識抗体は［２］同様な系で、検体と標識抗体を同時に添加する１ステップＥＩＡ系を作製した。すなわち、Ｓ６８抗体を固相化したプレートに標準品０及び５００ｎｇ／ｍＬを２５μＬ添加し、続けて２％ラット血清、１％マウス血清、１％ウサギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し１μｇ／ｍＬに調製したＦ１０３１−８−３−ＨＲＰを２５μＬ添加し、３７℃で１時間反応した。反応終了後プレートを洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）で発色後、停止液で反応を停止し４５０ｎｍの吸光度をプレート吸光度計Ｅ−Ｍａｘ（モレキュラーデバイス）で測定した。表３に示すように本系においてもサンドイッチＥＩＡ系が作製できた。すなわち、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体を使用するサンドイッチ測定系では、反応順序に関係なく、測定できることが確認できた。
［６］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈５〉
固相抗体及び標識抗体は［２］と同様な系で、検体と標識抗体を反応後、固相抗体と反応させる２ステップＥＩＡ系を作製した。すなわち、０及び５００ｎｇ／ｍＬの標準品２５μＬと２％ラット血清、１％マウス血清、１％ウサギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬに調製したＦ１０３１−８−３−ＨＲＰ  ２５μＬを混合し、３７℃で１時間反応した。反応終了後、反応液をＳ６８抗体固相化プレートに添加し３７℃で１時間反応した。プレートを洗浄後ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）で発色し、停止液で反応を停止後４５０ｎｍの吸光度をプレート吸光度計Ｅ−Ｍａｘ（モレキュラーデバイス）で測定した。表３に示すように本系においてもサンドイッチＥＩＡ系が作製できた。すなわち、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体を使用するサンドイッチ測定系では、反応順序に関係なく、測定できることがさらに確認できた。
［７］サンドイッチＥＩＡ系の作製〈６〉
ビオチン−ストレプトアビジンの特異結合を利用したサンドイッチＥＩＡ系を作製した。
１）ストレプトアビジンを固相側に使用した測定系
イムノプレート（ＮＵＮＣ）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈したストレプトアビジン（ＰＩＥＲＣＥ）を５０μＬ分注し４℃で一夜処理し固相化した。ブロッキング後、液を廃棄し０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに溶解した標準品０及び５００ｎｇ／ｍＬと２％ラット血清、１％マウス血清、１％ウサギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し２μｇ／ｍＬにしたビオチン化Ｓ６８抗体を各々２５μＬ添加した。３７℃で１時間反応後プレートを洗浄し、続けて１μｇ／ｍＬにと希釈したＦ１０３１−８−３−ＨＲＰを５０μＬ添加し３７℃で１時間反応した。反応終了後洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）で発色後、停止液で反応を停止し４５０ｎｍの吸光度をプレート吸光度計Ｅ−Ｍａｘ（モレキュラーデバイス）で測定した。本系は標準品、ビオチン化Ｓ６８抗体、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体の同時添加においても同様に試験した。表３に示すように両系ともにサンドイッチＥＩＡ系が作製できた。
２）ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使用した測定系
本系は［４］に示す方法で作製した。さらに、Ｓ６８抗体固相プレートに標準品と［４］にしたがって調製したビオチン化Ｆ１０３１−８−３抗体（Ｂｉｏ−Ｆ１０３１−８−３と記載する場合がある）を同時に添加後、３７℃で１時間反応し、洗浄後１万倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を添加する２ステップ法も検討した。１時間反応後洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＢｉｏＦｉｘ）で発色させ、停止液で反応を停止し４５０ｎｍの吸光度をプレート吸光度計Ｅ−Ｍａｘ（モレキュラーデバイス）で測定した。表３に示すように本系においてもサンドイッチＥＩＡ系が作製できた。すなわち、測定対象物、ヒト血清では低分子量ＣＤ１４を、Ｓ６８ペプチドと結合する抗体と低分子量ＣＤ１４に結合する抗体によるサンドイッチで結合させれば、ビオチンとストレプトアビジンの結合等の第二の特異結合を利用して、固相、標識物質を作製しても測定できることが確認できた。なお、Ｓｔｒはストレプトアビジンを示し、Ｂｉｏはビオチン化を示す。
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（実施例４）イムノクロマト測定系の作製
４−（１）金コロイド標識抗体を用いたイムノクロマト法＜１＞
検査室、ベッドサイドなどで簡便に使用できる測定系をイムノクロマト法により作製した。概要を図１（Ａ）に示した。まず、金コロイド（粒子径４０ｎｍ、Ｂ．Ｂ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１ｍＬにＦ１１０６−１３−３抗体９μｇを混合し、金コロイド標識Ｆ１１０６−１３−３抗体を調製した。次に、コンジュゲートパッドを作製した。すなわち、金コロイド標識Ｆ１１０６−１３−３抗体を５２０ｎｍの吸光度が約１．５となるようにコンジュゲート塗布ｂｕｆｆｅｒに希釈し、１０×１５０ｎｍの３３−Ｇｌａｓｓストリップに１ｍＬ塗布して一夜減圧乾燥した。このとき１テスト分の試薬に含まれる、金コロイド標識Ｆ１１０６−１３−３抗体量は約５０ｕｎｉｔｓ（１ｕｎｉｔはＯＤ５２０＝１．０の、金コロイド標識Ｆ１１０６−１３−３抗体１μＬ）となる。抗体固相化メンブレンは以下のように作製した。Ｓ６８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＢｉｏＤｏｔ社製インクジェット塗布機を用いて０．７５μＬ／ｃｍとなるようニトロセルロースメンブレン（ＦＦ８５／１００、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にライン状に塗布した。このときコントロールライン（抗マウスポリクローナル抗体、ＤＡＫＯ）も同時に塗布した。乾燥後メンブレンを、０．５％カゼインを含むブロッキング液に３０分間浸漬し、余分な液を取り除いた後再度乾燥させた。次に作製した各材料を用いてイムノクロマト法試薬を組み立てた。すなわち、コンジュゲートパッド、固相化メンブレン、上部吸収パッド（＃９００濾紙、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、サンプル滴下パッド（３３−Ｇｌａｓｓグラスファイバーフイルター、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）をＰＢ０２０プラスチックバッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ）に貼り付け、ＢｉｏＤｏｔ社製ストリップカッターで５ｍｍ幅にカットした。カットしたストリップはハウジングケース（ニップンテクノクラスター）に組み込んでイムノクロマト法試薬とした。
作製した試薬を用いて以下のようにアッセイを行った。標準品を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００〜１ｎｇ／ｍＬの範囲で１０ｎ希釈したものをサンプルとし、サンプル１００μＬを試薬へ滴下し、室温で２０分放置後ラインの有無を判定した。判定基準は以下のとおりとした。
（＋＋）：濃いラインが出現し明らかに陽性と判定できるレベル
（＋）：発色は薄いもののラインとして判定できるレベル
（±）：発色らしきものが認められるがラインとして認識し難いレベル
（−）：発色が認められないもの
その結果、図２及び表４に示すようにサンプル１０ｎｇ／ｍＬ以上の濃度において「＋」以上の感度が得られ、イムノクロマト測定系により簡便に迅速に測定できることが確認された。
４−（２）金コロイド標識抗体を用いたイムノクロマト法＜２＞
４−（１）で作製したイムノクトマト測定系の固相抗体と金コロイド標識抗体を逆にして測定した。Ｓ６８抗体の金コロイド標識及びイムノクロマト系の作製は４−（１）と同様である。その結果、表４に示すようにサンプル１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度において「＋」以上の感度が得られた。
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４−（３）ストレプトアビジン−ビオチン系を使用したイムノクロマト法の作製
また、ストレプトアビジン−ビオチン系を用いたイムノクロマト法を作製した。概要を図１（Ｂ）に示した。まず、実施例３−２［４］にしたがってＦ１０３１−８−３抗体をビオチン化した。次に金コロイド（粒子径４０ｎｍ、Ｂ．Ｂ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）１ｍＬにストレプトアビジン１０μｇを混合し、金コロイド標識ストレプトアビジンを調製した。金コロイド標識ストレプトアビジンを５２０ｎｍの吸光度が約１．５となるようにコンジュゲート塗布ｂｕｆｆｅｒに希釈し、１０×１５０ｎｍの３３−Ｇｌａｓｓストリップに１ｍＬ塗布して一夜減圧乾燥した。このとき１テスト分の試薬に含まれる、金コロイド標識ストレプトアビジン量は約５０ｕｎｉｔｓ（１ｕｎｉｔはＯＤ５２０＝１．０の、金コロイド標識ストレプトアビジン１μＬ）となる。抗体固相化メンブレンは以下のように作製した。Ｓ６８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＢｉｏＤｏｔ社製インクジェット塗布機を用いて０．７５μＬ／ｃｍとなるようニトロセルロースメンブレン（ＦＦ８５／１００、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）にライン状に塗布した。このときコントロールライン（抗マウスポリクローナル抗体、ＤＡＫＯ）も同時に塗布した。乾燥後メンブレンを、０．５％カゼインを含むブロッキング液に３０分間浸漬し、余分な液を取り除いた後再度乾燥させた。次に作製した各材料を用いてイムノクロマト法試薬を組み立てた。
すなわち、コンジュゲートパッド、固相化メンブレン、上部吸収パッド（＃９００濾紙、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、サンプル滴下パッド（３３−Ｇｌａｓｓグラスファイバーフイルター、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）をＰＢ０２０プラスチックバッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ）に貼り付け、ＢｉｏＤｏｔ社製ストリップカッターで５ｍｍ幅にカットした。カットしたストリップはハウジングケース（ニップンテクノクラスター）に組み込んでイムノクロマト法試薬とした。作製した試薬を用いて以下のようにアッセイを行った。標準品を１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００〜１ｎｇ／ｍＬの範囲で１０ｎ希釈したものをサンプルとし、サンプル１００μＬを０．１μｇのビオチン化Ｆ１０３１−８−３を含む試薬１００μＬへ滴下し、混合後ハウジングケースのサンプル滴下パッドに１００μＬを滴下し、室温で２０分放置後ラインの有無を判定した。その結果、本系を用いても（１）と同様に１００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度において「＋」以上の感度が得られた。
（実施例５）フロースルー測定系の作製
フロースルー測定系は特開平６−２７３４１９の基づき作製する。すなわち、１ｇの分散染料（ＲＥＤ  ＶＩＯＬＥＴ、ＫＡＹＡＲＯＮ社）を１０ｍＬの蒸留水に懸濁し、蒸留水で洗浄後５ｍＬの蒸留水に再懸濁する。分散染料０．２ｍＬに生理食塩水で希釈した０．５ｍｇ／ｍＬのＦ１０３１−８−３抗体を０．２ｍＬ添加し４５℃で３０分間インキュベートする。氷冷後遠心分離し、得られた沈殿に０．５％ＢＳＡ、１０％ラクトースを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁し分散染料標識Ｆ１０３１−８−３抗体を調製する。次に分散染料標識Ｆ１０３１−８−３抗体を直径１４ｍｍの大きさに切断したろ紙（Ｎｏ．６３、アドバンテック東洋）に０．１ｍＬずつ分注して含浸させ、凍結乾燥を行い、可溶性試薬を被着させた多孔体を作製する。
メンブレンへの固相は以下のように行う。まず、孔径５ミクロンのニトロセルロースメンブレン（アドバンテック東洋）に生理食塩水で希釈した２ｍｇ／ｍＬのＳ６８抗体を塗布し、３７℃で乾燥させる。次に１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でブロッキングを行い、抗体固相メンブレンを作製する。作製した材料をハウジングケースに以下の順序で組み立てる。可溶性試薬を被着させた多孔体、抗体固相メンブレン、ポリプロピレンをラミネートしたろ紙（Ｎｏ．２８、アドバンテック東洋）、０．５ｍｍ厚のポリカーボネートの透明板を順位組み合わせて測定試薬を作製する。アッセイはサンプル０．５ｍＬを測定試薬に添加することにより開始し、サンプルが完全に吸収されて後、裏側から肉眼で呈色を観察することにより判定を行う。
（実施例６）Ｓ６８抗体の特異性
実施例１で作製したＳ６８抗体の特異性を確認するため、実施例３−（３）と同様な測定で、ペプチドにより阻止されるか検討した。すなわち、敗血症患者血清及び正常人血清の５０倍希釈溶液２５μＬにＳ６８ペプチド（アミノ酸配列５３〜６８番）、実施例１と同様に調製した合成ペプチド（アミノ酸配列５３〜５８番、アミノ酸配列５７〜６２番、アミノ酸配列５９〜６４番）またはネガティブコントロール用ペプチド（Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｃｙｓ）を０、０．１、１、１０μｇ／ｍＬに希釈したもの２５μＬをそれぞれ添加、Ｓ６８抗体と混合し競合反応させた後、Ｓ６８抗体に阻止されずに結合した敗血症患者血清及び正常人血清中の低分子量ＣＤ１４量を測定した。その結果、図３に示すように、低値を示した正常人血清、高値を示した敗血症患者血清ともにＳ６８ペプチドではＳ６８抗体と血中低分子量蛋白質の結合は阻止されたが、他の部分ペプチド（各々６アミノ酸）及びネガティブコントロール用ペプチドでは阻止されなかった。以上の結果より、Ｓ６８抗体により血清中に検出されている蛋白質はＳ６８抗体が特異的に認識しているものであることが確認された。また、Ｓ６８ペプチドの部分ペプチドである３種類の合成ペプチド（アミノ酸数６個）では阻止されないことより、抗体の認識する配列は最低でも７アミノ酸以上の長さを必要とすることが確認された。
（実施例７）作製した抗体の反応速度定数
実施例１で作製したＳ６８抗体と実施例２で作製したＦ１１４６−１７−２抗体の特異性と反応速度定数をＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア）を用いて解析した。まず、固定化するＳ６８ペプチド−ＢＳＡを実施例１記載の方法と同様にマレイミド化ＢＳＡ（Ｉｍｊｅｃｔ  Ｍａｌｅｉｍｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＢＳＡ、ＰＩＥＲＣＥ）を用いて調製した。次に、Ｓ６８ペプチド−ＢＳＡをアミンカップリングキット（ビアコア）を用いてセンサーチップＣＭ５（ビアコア）に固定化した。測定はランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（ビアコア）を使用し、Ｆ１１４６−１７−２抗体の希釈列（５０、１００、１５０、２００、３００ｎＭ）をフローセルにインジェクトすることで行った。データ解析はＳ６８ペプチド−ＢＳＡのフローセル測定データからリファレンスセルデータを差し引き、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔ  ｗｅａｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．０（ビアコア）を用いて実施した。解離定数（ＫＤ）を算出した結果、Ｆ１１４６−１７−２抗体は４．８×１０−９Ｍと高い親和性を示した。なお、同様に測定した特異精製ウサギＳ６８ペプチドポリクローナル抗体のＫＤは２．２×１０−１０Ｍであった。
（実施例８）抗ＣＤ１４モノクローナル抗体の特異性
８−（１）Ｆ１１０６−１３−３抗体の解析
Ｆ１１０６−１３−３抗体の結合領域（エピトープ）を明らかにするため、ＣＤ１４のアミノ酸配列をＮ末端側から１０アミノ酸ずつ合成したペプチドライブラリーメンブレン（Ｃｕｓｔｏｍ  ＳＰＯＴｓ、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いて解析した。すなわち、メンブレンをマニュアルに従ってブロッキングした後、Ｆ１１０６−１３−３抗体を反応させ、洗浄後、βガラクトシダーゼ結合抗マウス抗体を反応させた。メンブレンを洗浄後、Ｘ−ｇａｌを用いて抗体が結合するペプチド配列を検出した。なお、ペプチドライブラリーメンブレンのペプチドの配列は、１番目から１５４番目までのアミノ酸配列をＣ末端の２アミノ酸を重ねる形で１０アミノ酸ずつ合成した１９ペプチドを解析に使用した。ペプチドは実施例１−（１）と同様に調製した。
その結果、Ｆ１１０６−１３−３抗体は高分子量ＣＤ１４のＮ末端より１７〜２６番のアミノ酸配列（ＣＮＦＳＥＰＱＰＤＷ）に相当する領域に結合することが明らかになった。
８−（２）Ｆ１０３１−８−３抗体の解析＜１＞
Ｆ１０３１−８−３抗体の特異性を確認するため、実施例３−（１）記載の大腸菌由来ｓＣＤ１４（１−２８５）及びＷＯ０１／７２９９３号公報の実施例８及び実施例９に記載の方法を用いてＣＯＳ細胞により調製したｓＣＤ１４（１−３５６）、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃを用いて結合活性を測定した。
まず、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  ｅｘｔｒａ（アマシャム  バイオサイエンス）にｓＣＤ１４（１−３５６）、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ、ｓＣＤ１４（１−２８５）またはＢＳＡを各２５０ｎｇ／スポットでメンブレン上に固定化し、乾燥後０．０５ｇ／ｍＬのスキムミルク（明治乳業）を含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）でブロッキングした。室温で１時間静置後、０．５％ＢＳＡを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で３μｇ／ｍＬに希釈したＦ１０３１−８−３抗体を加え、室温で１時間反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で洗浄した。
次に１０％ウサギ血清を含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）で５００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を添加し、３７℃で３０分間反応した後、同様に洗浄しＥＣＬキット（アマシャム  バイオサイエンス）で結合活性を確認した。その結果、表５に示すようにＦ１０３１−８−３抗体は大腸菌由来ｓＣＤ１４（１−２８５）、ｓＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ、ｓＣＤ１４（１−３５６）に結合したが、ＢＳＡとは結合せず、全てのタイプのＣＤ１４蛋白質を特異的に認識していることが明らかになった。表５の＋はＥＣＬによりフイルム上にスポットが検出された場合を示し、−はスポットが検出されない場合を示す。
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８−（３）Ｆ１０３１−８−３抗体の解析＜２＞
Ｆ１０３１−８−３抗体の結合領域（エピトープ）を明らかにする，ため、８−（１）と同様にｓｐｏｔｓ解析を行ったが、ｓｐｏｔｓ法ではＦ１０３１−８−３抗体の認識領域を特定することができなかった。両抗体の認識領域の類似性を解析する目的で、固相にＳ６８抗体を標識抗体としてＦ１０３１−８−３−ＨＲＰを用いた実施例３−（３）［２］のサンドイッチＥＩＡ系で、Ｆ１１０６−１−３抗体による阻止試験を行った。
まず、実施例３−（３）［２］と同様にＳ６８抗体固相プレートに標準品１００ｎｇ／ｍＬを添加し反応させた。プレートを洗浄後、Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰを添加する前に、６μｇ／ｍＬのＦ１１０６−１３−３抗体、マウスＩｇＧ抗体または抗体を含まないバッファーを２５μＬ添加し、その後Ｆ１０３１−８−３−ＨＲＰ抗体を２５μＬ添加し、実施例３−（３）［２］と同様に測定した。
表６に示すようにマウスＩｇＧ抗体添加の系では、阻止されないのに対して、Ｆ１１０６−１３−３抗体によりＦ１０３１−８−３と標準品との結合が阻止された。このことにより、Ｆ１０３１−８−３抗体が認識する領域の少なくとも一部に、Ｆ１１０６−１３−３抗体が結合していることが考察された。なお表６の「阻害率」はバッファーのみの吸光度を１００％としたときのそれぞれの減少した吸光度より算出した。
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（実施例８）ヒト低分子量ＣＤ１４測定キット
８−（１）サンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例
実施例３−（３）で敗血症患者の測定では高値を示し、正常人の測定で低値を示した固相抗体、標識抗体の組み合わせを用いた可溶型蛋白質キットの構成例を示す。
〈１〉固相抗体：Ｓ６８抗体を固相化したプレート
〈２〉標識抗体：ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体
〈３〉基質溶液（テトラメチルベンジジン溶液）
その他の付属品
プレート系構成例
〈４〉プレート洗浄液（０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液）
〈５〉試料希釈液（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）
〈６〉反応停止液（０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液）
〈７〉標準品（ＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ）
上記の測定キットを用いて測定する場合の測定機器＜参考例＞
〈８〉プレート分光光度計（例えばＥ−Ｍａｘ（モレキュラデバイス社））
８−（２）〜（１１）サンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例
８−（１）に加えて、さらにサンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例を表７に示す。〈１〉はプレートに固相する結合物質を示す。〈２〉は標識した結合物質を示す。構成要素の〈３〉〜〈７〉、及び参考例の測定機器〈８〉は８−（１）と同じ。〈９〉は第二の特異結合物質が結合した抗体を示す。
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８−（１２）サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの標準曲線
（１）の測定キットにより、実施例３−（３）［２］と同様な方法で測定した。すなわち、Ｓ６８抗体をＤ−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加した。４℃で一晩反応後、イオン交換水で５回洗浄し、０．１％ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，Ｉｎｃ）と０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＤ−ＰＢＳを各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングした。次に１％ＣＤ１４吸収血清、０．１％ＢＳＡを含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を希釈液として０、３、２５、６０、１００、１５０ｎｇ／ｍＬのＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ蛋白質標準品希釈系列を調製した。標準品希釈系列をウエル当たり５０μＬ添加し、３７℃で２時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄し、５％ラット血清、１％マウス血清、ペルオキシダーゼ標識Ｆ１０３１−８−３抗体を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む７６ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で０．６μｇ／ｍＬに希釈した希釈標識抗体を各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で２時間反応後、同様に５回洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ、ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。図４に作製した標準曲線を示した。測定感度０．６ｎｇ／ｍＬ（ブランク＋３ＳＤ）の高感度で簡便な測定系が実現された。
８−（１３）サンドイッチＥＩＡ系の特異性
ヒト血清中に存在する高分子量ＣＤ１４が、作製した測定系に及ぼす影響を検討するため、０〜４μｇ／ｍＬの濃度の正常人血清由来可溶型ＣＤ１４をＣＤ１４（１−３０７）Ｓ２８６Ｃ標準品に添加して、（１２）と同様に測定を行った。その結果、図５に示すように正常人血清由来可溶型ＣＤ１４は４μｇ／ｍＬでも測定値に影響を及ぼさなかった。この結果より、本サンドイッチＥＩＡ系において高分子量ＣＤ１４との交差反応性は０．３％以下であることがわかった。すなわち、本系はヒト血清高分子量ＣＤ１４を検出せず、敗血症患者の血清で高値を示す可溶型蛋白質特異的であることが確認された。
８−（１４）サンドイッチＥＩＡ系の測定キットの評価
（１）のキットによる測定結果の再現性を評価した。（１２）と同様に３種類の検体を用いた同時再現性の変動係数（ＣＶ）は５．８、３．６、３．５％、測定間再現性は６．２、５．２、５．１％と良好な結果であった。また、添加回収試験の回収率は８８〜１０９％と良好であり、抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸、ＥＤＴＡ）の影響も認められなかった。以上の結果より、本キットはヒト低分子量ＣＤ１４を測定するのに十分な性能を有していることが示された。
８−（１５）イムノクロマト系の測定キット構成例
〈１〉標識抗体：金コロイドを標識したＦ１０３１−８−３抗体
〈２〉コンジュゲートパッド：〈１〉を塗布したグラスファイバーフィルター（３３−Ｇｌａｓｓストリップ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ製）
〈３〉抗体固相メンブレン：Ｓ６８抗体の固相化ライン及びその下流にコントロールライン（抗マウスポリクローナル抗体の固相化ライン）を有し、０．５％カゼインでブロッキングしたニトロセルロースメンブレン（ＦＦ８５／１００、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ製）
〈４〉サンプル滴下パッド：３３−Ｇｌａｓｓグラスファイバーフイルター、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ製）
〈５〉吸収パッド（＃９００濾紙、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ製）
〈６〉シート：ＰＢ０２０プラスチックバッキングシート（ＢｉｏＤｏｔ製）；〈４〉に滴下した液体が〈２〉、〈３〉、〈５〉の順に流れるように〈２〉〜〈５〉を、〈６〉の上に組み立ててある
〈７〉ハウジングケース（ニップンテクノクラスタ社のＯＥＭ用のケース）
なお、〈１〉〜〈５〉の概要は図１（Ａ）に示される。
８−（１６）〜（１９）イムノクロマト系の測定キット構成例
８−（１５）に加えて、さらに、ビオチンとストレプトアビジンの結合の第二の特異結合を利用したサンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例、及び配列番号２に記載の１６アミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体の断片を利用したサンドイッチＥＩＡ系の測定キット構成例を表８に示す。〈１〉は標識した結合物質を示す。構成要素の〈２〉〜〈７〉は同じであるが、〈３〉に塗布する物質として、〈３〉−（ｉ）は固相化メンブレンに固相する結合物質を示し、〈３〉−（ｉｉ）はコントロールラインに固相する結合物質を示す。〈８〉は、〈１〉と同様に〈２〉に塗布若しくは〈４〉に塗布する、または検体に添加若しくは検体と同時に添加する試薬である第二の特異結合物質が結合した抗体を示す。
なお、（１６）＜１＞〜＜５＞の概要は図１（Ｂ）に示され、（１７）〜（２０）も同様に理解される。
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なお、（２０）＜１＞の金コロイド標識したＳ６８抗体のＦ（ａｂ’）２の調製は、以下のようにして行う。Ｓ６８抗体からのＦ（ａｂ’）２の調製はＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｐｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）を使用して以下のように行う。すなわち、Ｓ６８抗体を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、５ｍｇ／ｍＬに調製する。ＰＩＥＲＣＥのプロトコールにしたがって懸濁した０．２５ｍＬのＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｐｓｉｎを調製し、上記抗体１ｍＬと混合する。次に３７℃の恒温槽で４時間攪拌し、１．５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し反応を停止する。反応液を遠心分離（１０００×ｇ）し、ゲルと上清を分離する。次に分離した上清を１ｍＬのｐｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加し、切断されたＦｃ及び未切断のＩｇＧを結合させる。同様に遠心分離し上清を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ６．４）に対して透析する。Ｆ（ａｂ’）２の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光係数（０．５３３ｍｇ／ｍＬ／ｃｍ−１）より濃度を算出する。得られたＦ（ａｂ’）２を実施例４と同様に金コロイドで標識し、金コロイド標識したＳ６８抗体のＦ（ａｂ’）２を得る。
８−（２１）フロースルー系構成例
〈１〉染料標識抗体：ＲＥＤ  ＶＩＯＬＥＴ染料標識Ｓ６８抗体
〈２〉コンジュゲートパッド：上記〈１〉を含浸させた濾紙（Ｎｏ．６３、アドバンテック東洋製）
〈３〉抗体固相メンブレン：Ｓ６８抗体固相化したニトロセルロースメンブレン（アドバンテック東洋製）
〈４〉吸収パッド：ポリプロピレンをラミネートしたろ紙（Ｎｏ．２８、アドバテック東洋）
〈５〉ハウジングケース：特開平６−２７３４１９に記載のケース（持田製薬製）；〈２〉に滴下した液体が〈２〉、〈３〉、〈４〉の順に流れるように〈２〉〜〈４〉を、〈５〉の中に組み立ててある
（実施例９）ヒト低分子量ＣＤ１４の検出
（１）ゲルろ過クロマトグラフィー＜１＞
実施例８−（１）に記載の測定キットが検出する敗血症患者血清中の物質を解析するため、敗血症患者血清をゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＰＣ３．２／３０（アマシャム  バイオサイエンス）によりＳＭＡＲＴＳＹＳＴＥＭ（アマシャム  バイオサイエンス）でＤ−ＰＢＳを展開溶媒として用いて分画し、各分画を実施例８−（１）に記載の測定キット及び市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いて測定した。分子量の算出はＬＭＷキャリブレーションキットおよびＨＭＷキャリブレーションキット（アマシャムバイオサイエンス）のうちアルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、ＢＳＡ（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシン（２５ｋＤａ）を用いてカラムをキャリブレートして行った。
その結果、図６に示すように市販ＣＤ１４−ＥＩＡキットでは分子量約５７ｋＤａの可溶型ＣＤ１４が検出され、従来より報告のある４９〜５５ｋＤａの高分子量可溶型ＣＤ１４蛋白質であると判断された。一方、実施例８−（１）に記載のキットでは分子量３５〜４５ｋＤａ付近に敗血症患者で検出されたヒト低分子量ＣＤ１４に由来するピークが検出され、また５７ｋＤａ付近にはピークが検出されなかったことから、実施例８−（１）に記載のキットは血中に存在する可溶型蛋白質のみを特異的に検出していることが確認された。
（２）ゲルろ過クロマトグラフィー＜２＞
（２）−＜１＞と同様に敗血症患者の血清５０μｌをゲル濾過クロマトグラフィーカラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００ＧＬ（アマシャム  バイオサイエンス）により展開溶媒として２００ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）を用いて分画し、各キットを用いて測定した。分子量の算出はＬＭＷキャリブレーションキットおよびＨＭＷキャリブレーションキット（アマシャム  バイオサイエンス）のうちＢＳＡ（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲン（２５ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）を用いてカラムをキャリブレートして行った。
その結果を図７に示す。実施例８−（１）に記載のキットでは分子量２５〜３５ｋＤａ付近に、ヒト低分子量ＣＤ１４に由来するピークが検出された。
（３）Ｆ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー
（２）−＜２＞で得られたヒト低分子量ＣＤ１４に由来するピークの画分（例えば、フラクション１２）をＦ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーに供するとヒト低分子量ＣＤ１４に由来するピークは、アフィニティーカラム非吸着画分に溶出される。なお、Ｆ１０２５−３−１抗体アフィニティーカラムの調整並びに実施は、ＷＯ０１／２２０８５号公報に実施例１０として記載されている方法に準じて行うことができる。
これらの結果により、ヒト低分子量ＣＤ１４は、ヒトＣＤ１４のみに検出される配列を有する配列番号２に記載の特定のペプチドに特異的な抗体に結合し、またヒトＣＤ１４のＮ末端より１７〜２６番のアミノ酸配列を認識する抗ＣＤ１４抗体に結合する血中可溶型蛋白質である。また、ゲル濾過で分子量は２５〜４５ｋＤａであり、高分子量ＣＤ１４（従来のｎａｔｉｖｅ  ＣＤ１４）よりも低分子量であると判断される。また、高分子量ＣＤ１４に特異的に結合するＦ１０２５−３−１抗体に、低分子量ＣＤ１４は結合しない。
（実施例１０）各種疾患患者血中低分子量ＣＤ１４の測定
敗血症患者血清は分離菌が同定された１０例を使用した（表９）。また、正常人５２例（男性３１例、女性２１例）、及び各種疾患患者（２０疾患、６０例）を実施例８−（１）に記載の測定キットを用いて測定した。
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血清中の低分子量ＣＤ１４の濃度は正常人で０．００８〜０．１００μｇ／ｍＬに分布し、平均値は０．０４μｇ／ｍＬであった。敗血症患者では０．１９０〜７．２６０μｇ／ｍＬに分布し、平均値は２．０μｇ／ｍＬであった。低分子量ＣＤ１４濃度は敗血症患者では正常人及び各種疾患患者に比べ高値であり、各種疾患患者中には正常人と比較して高値を示す疾患は見出せなかった。
（実施例１１）市販の血中可溶型ＣＤ１４ＥＬＩＳＡキットとの比較
１１−（１）各種疾患患者血中可溶型ＣＤ１４の測定
実施例１０の検体を市販ＣＤ１４−ＥＩＡキット（ＩＢＬ−Ｈａｍｂｕｒｇ）を用いて測定した。血清中の可溶型ＣＤ１４（低分子量ＣＤ１４と高分子量ＣＤ１４の合計と推定）の濃度は正常人で５．６〜１１．２μｇ／ｍＬに分布し、敗血症患者では高値例が認められた。しかしながら、各種疾患患者血清中においても可溶型ＣＤ１４が高値を示す例が多数認められ、敗血症患者との間に差は認められなかった。
１１−（２）Ｓ６８抗体を用いたキットとの比較
実施例１１で測定した低分子量ＣＤ１４の測定値と比較検討を行った。表１０に示すように市販ＣＤ１４−ＥＩＡキットでは正常、各種疾患、敗血症間に最大１．７倍程度の差しか認められないのに対して実施例９−（１）の測定キットでは正常人と各種疾患の間に差は認められないが、正常人と敗血症の間には５０倍の差が認められ、実施例９−（１）の測定キットの測定値が敗血症で特異的に上昇することが明らかになった。
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測定した正常人の平均値＋３Ｓ．Ｄ．をカットオフ値（低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡ：０．１３４μｇ／ｍＬ、市販ＣＤ１４−ＥＩＡ：１１．１４μｇ／ｍＬ）として陽性例（敗血症）と陰性例（正常＋各種疾患）に分けて解析した結果を表１１に示す。その結果に基づき、両キットの一致率（（ＥＩＡ陽性一致数＋ＥＩＡ陰性一致数）／総数×１００）、感度（ＥＩＡ陽性一致数／陽性例×１００）、特異度（ＥＩＡ陰性一致数／陰整例×１００）を算出したところ、表１２に示すように、低分子量ＣＤ１４−ＥＩＡでは一致率９４．３％、感度１００．０％、特異度９３．８％とカットオフ値を設定することにより敗血症の鑑別診断に有用であることが明らかになった。一方、市販のＣＤ１４−ＥＩＡでは感度、特異度ともに敗血症を診断できるほどの特異性は認められなかった。
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【産業上の利用可能性】  本発明によれば、ヒト高分子量ＣＤ１４の１〜６８番目までのアミノ酸配列から選択される８〜３０アミノ酸残基からなるペプチドを抗原として作製される抗体、及び配列番号２〜４に記載のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体が提供される。
このような抗体をヒト低分子量ＣＤ１４測定キットに用いることができ、該キットは、ヒト低分子量ＣＤ１４を高感度、簡便かつ特異的に定性又は定量でき、敗血症患者の診断に有用である。本発明では、上記抗体を含むヒト低分子量ＣＤ１４測定キット及び測定方法を提供する。さらに、ヒト低分子量ＣＤ１４を直接測定する敗血症の新規な診断方法を提供する。さらに、上記抗体の作製に有用なペプチド及び上記抗体の作製方法を提供する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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