(57)【要約】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（ＧＰＲ８８；Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８８）の機能抑制作用を有する物質を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤、および式（Ｉ）2004054617.tif 000091（式中、Ａは置換もしくは非置換のアリール等を表し、Ｒ１は水素原子等を表し、Ｒ２は−ＮＲ３Ｒ４等を表し、Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５等を表し、Ｙは水素原子等を表す）で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩等を提供する。
2004054617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（ＧＰＲ８８；Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８８）の機能抑制作用を有する物質を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第１項記載の予防および／または治療剤。
【請求項３】
（ａ）試験化合物をＧＰＲ８８発現細胞に接触させ、細胞応答を測定する工程と、（ｂ）該試験化合物を添加しない場合のＧＰＲ８８発現細胞の細胞応答と比較して、試験化合物を接触させた場合の細胞応答が低下することを確認する工程とを含む中枢疾患の予防および／または治療作用を有する化合物のスクリーニング方法。
【請求項４】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】
ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質が配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである請求の範囲第１項記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項６】
ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質が、ＧＰＲ８８に対する抗体である請求の範囲第１項記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項７】
請求の範囲第３項記載のスクリーニング方法によって確認されたＧＰＲ８８の細胞応答を低下させる化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項８】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第５〜７項のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【請求項９】
配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１０】
配列番号８で表される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドである請求の範囲第１０項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求の範囲第１０または１１項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１３】
請求の範囲第１０または１１項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項１４】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第１３項記載の予防および／または治療剤。
【請求項１５】
式（Ｉ）
2004054617.tif 000088
＜式中、Ａは置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のアラルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたはシクロアルキルアルキルを表し、
Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表すか、
またはＡとＲ１が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたは−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環基または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）を表し、
Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５｛式中、Ｒ５はヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシまたは−ＮＲ６Ｒ７〔式中、Ｒ６およびＲ７は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環アルキル、ヒドロキシまたは−ＳＯ２Ｒ８（式中、Ｒ８は置換もしくは非置換の低級アルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す）を表すか、
またはＲ６とＲ７が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する〕を表す｝、ニトロ、置換もしくは非置換のヒドロキシメチルまたは１，２，３，４−テトラゾール−５−イルを表し、
Ｙは、水素原子、ハロゲンまたは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す＞で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１６】
Ｙが水素原子である請求の範囲第１５項記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１７】
Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である請求の範囲第１５または１６項記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１８】
Ｘが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである請求の範囲第１５〜１７項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項１９】
Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である請求の範囲第１５〜１７項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２０】
Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ｂ（式中、Ｒ５Ｂはヒドロキシまたは低級アルコキシを表す）である請求の範囲第１５〜１７項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２１】
Ｘが置換もしくは非置換のヒドロキシメチルである請求の範囲第１５〜１７項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２２】
Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環基である請求の範囲第１５〜２１項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２３】
Ｒ１が水素原子である請求の範囲第１５〜２２項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２４】
Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであるか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第１７〜２３項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２５】
Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４が水素原子または低級アルキルである請求の範囲第１７〜２３項のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項２６】
式（Ｉ）
2004054617.tif 000089
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２７】
Ｙが水素原子である請求の範囲第２６項記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２８】
Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である請求の範囲第２６または２７項記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項２９】
Ｘが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３０】
Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３１】
Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ｂ（式中、Ｒ５Ｂはヒドロキシまたは低級アルコキシを表す）である請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３２】
Ｘが置換もしくは非置換のヒドロキシメチルである請求の範囲第２６〜２８項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３３】
Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環基である請求の範囲第２６〜３２項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３４】
Ｒ１が水素原子である請求の範囲第２６〜３３項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３５】
Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであるか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第２８〜３４項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３６】
Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４が水素原子または低級アルキルである請求の範囲第２８〜３４項のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項３７】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第２６〜３６項のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
【請求項３８】
式（ＩＡ）
2004054617.tif 000090
｛式中、ＡおよびＲ１はそれぞれ前記と同義であり、ＸＡは１，２，３，４−テトラゾール−５−イル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａ［式中、Ｒ５Ａはヒドロキシまたは−ＮＲ６ＡＲ７Ａ（式中、Ｒ６Ａは水素原子または低級アルキルを表し、Ｒ７Ａは水素原子、ヒドロキシ、ヒドロキシ低級アルキル、カルボキシ低級アルキル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニルまたはトリフルオロメタンスルホニルを表す）を表す］または置換もしくは非置換のヒドロキシメチルを表し、（ｉ）ＸＡが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルであるとき、Ｒ３ＡおよびＲ４Ａは、同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す（ただし、同時に水素原子にはならない）か、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、（ｉｉ）ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａまたは置換もしくは非置換のヒドロキシメチルであるとき、Ｒ３ＡおよびＲ４Ａは、同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す（ただし、同時に水素原子にはならない）か、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換のピペラジニル、４−メチルホモピペラジニル、４−メチルピペリジノ、４−ピペリジノピペリジノ、４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノまたはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する｝で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項３９】
ＸＡが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである請求の範囲第３８項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４０】
ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａ（式中、Ｒ５Ａは前記と同義である）である請求の範囲第３８項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４１】
ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである請求の範囲第３８項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４２】
ＸＡがヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチルまたは１−ヒドロキシ−１−メチルエチルである請求の範囲第３８項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４３】
Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換の複素環基またはシクロアルキルアルキルであるか、またはＡとＲ１が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第３８〜４２項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４４】
Ａが置換もしくは非置換のアリール、アラルキル、複素環基またはシクロアルキルアルキルである請求の範囲第３８〜４２項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４５】
Ａがベンジル、４−フェニル−ｎ−ブチル、３−フェニルプロピル、３−フェニル−１−メチルプロピル、２−フェニルプロピル、２−フェノキシエチル、２−フェノキシ−１−メチルエチル、１，４−ベンゾジオキサン−６−イル、２−ベンジルフェニル、２−フェノキシフェニル、３−フェノキシフェニル、４−フェノキシフェニル、４−ビフェニル、ビフェニル−４−イルメチル、２−インダニルおよびシクロプロピルメチルからなる群から選ばれる基である請求の範囲第３８〜４２項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４６】
Ｒ１が水素原子、低級アルキルまたはアラルキルである請求の範囲第３８〜４５項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４７】
Ｒ１が水素原子である請求の範囲第３８〜４５項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４８】
Ｒ３ＡおよびＲ４Ａが同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第３８〜４７項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４９】
Ｒ３ＡおよびＲ４Ａが同一または異なって、水素原子、低級アルキル、シクロアルキルメチル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは複素環アルキルである請求の範囲第３８〜４７項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５０】
Ｒ３Ａが低級アルキル、シクロアルキルメチルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４Ａが水素原子である請求の範囲第３８〜４７項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５１】
Ｒ３Ａが３−メトキシベンジル、３−クロロベンジル、３−フルオロベンジル、２，６−ジフルオロベンジル、２−メチルベンジル、３−トリフルオロベンジル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチル、１，５−ジメチル−ｎ−ヘキシルおよび２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−２−イルメチルからなる群から選ばれる基であり、Ｒ４Ａが水素原子であるか、Ｒ３ＡがベンジルでありＲ４Ａがｎ−ブチルであるか、Ｒ３Ａがｎ−ヘキシルでありＲ４Ａがメチルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノもしくはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する請求の範囲第３８および４０〜４７項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５２】
Ｒ３Ａが３−メトキシベンジル、３−クロロベンジル、３−フルオロベンジル、２，６−ジフルオロベンジル、２−メチルベンジル、３−トリフルオロベンジル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチルおよび１，５−ジメチル−ｎ−ヘキシルからなる群から選ばれる基であり、Ｒ４Ａが水素原子であるか、Ｒ３ＡがベンジルでありＲ４Ａがｎ−ブチルであるか、Ｒ３Ａがｎ−ヘキシルでありＲ４Ａがメチルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノもしくはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する請求の範囲第３９項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５３】
式（ＩＡ）で表される化合物が、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボヒドロキサム酸、［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］アミノ酢酸、｛［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］メチルアミノ｝酢酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン、Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］−４−メチルベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］メタンスルホンアミド、［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］トリフルオロメタンスルホンアミド、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（ベンジルブチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−２−（オクタヒドロイソキノリン−２−イル）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェニルプロピルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（３−クロロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（３−フルオロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（３−メトキシベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（２，６−ジフルオロベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（２−メチルベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−（３−トリフルオロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（３−フルオロベンジルアミノ）−４−（４−フェニルブチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（４−ビフェニルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（２−ピリジルメチルアミノ）ピリミジンおよび２−［ビス（２−メトキシエチル）アミノ］−４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチルピリミジン、２−（３−フルオロベンジルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジンからなる群から選択される化合物であるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５４】
請求の範囲第３８〜５３項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
【請求項５５】
請求の範囲第３８〜５３項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
【請求項５６】
請求の範囲第３８〜５３項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
【請求項５７】
中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である請求の範囲第５６項記載の予防および／または治療剤。
【請求項５８】
中枢疾患の予防および／または治療剤の製造のための、ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質の使用。
【請求項５９】
ＧＰＲ８８の機能抑制剤の製造のための、配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項６０】
ＧＰＲ８８の機能抑制剤の製造のための、請求の範囲第１５項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項６１】
中枢疾患の予防および／または治療剤の製造のための、請求の範囲第１５項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の使用。
【請求項６２】
ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患の予防および／または治療方法。
【請求項６３】
配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とするＧＰＲ８８の機能抑制方法。
【請求項６４】
請求の範囲第１５項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とするＧＰＲ８８の機能抑制方法。
【請求項６５】
請求の範囲第１５項記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患の予防および／または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（ＧＰＲ８８；Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８８）の機能抑制作用を有する物質を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤に関する。また本発明は、ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有し、中枢疾患の予防および／または治療に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはピリミジン誘導体もしくはその薬理学的に許容される塩に関する。
【背景技術】  パーキンソン病は、黒質のドパミン作動性神経細胞が進行性に変性脱落し、その投射部位である線条体の神経活動が異常になることにより発症する運動障害である。現在、レボドーパ（ｌｅｖｏｄｏｐａ）、ドパミン受容体作動薬等により、症状を改善することができるとされている。しかし、ｌｅｖｏｄｏｐａやドパミン受容体作動薬を、２〜３年以上の長期に渡って服用すると、不随意運動や精神障害等の副作用や、薬効における耐性が現れることが知られていることから、新しい作用機序を有する副作用の少ない治療剤が求められている。
また中枢疾患としては、パーキンソン病の他に、うつ病、不安、精神分裂病等の精神疾患等が挙げられるが、これらの疾患の治療剤に関しても、新しい作用機序を有する副作用の少ない治療剤が求められている。
ＧＰＲ８８はリガンドおよび機能が不明なオーファンＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であり、ヒト、ラットおよびマウスのＧＰＲ８８のｃＤＮＡが単離され、各ｃＤＮＡの塩基配列およびそれらがコードす各ＧＰＲ８８のアミノ酸配列が報告されている（「ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、２０００年、第６９巻、ｐ．３１４−３２１）。ＧＰＲ８８はそのｍＲＮＡが特に線条体、側坐核や小脳のオリーブ核に特異的に発現し、一方で末梢組織での発現は極めて低いことから、なんらかの運動調節作用、および／または情動調節作用を有することが推察されるが、今までのところ実験的にこのことを示した報告はない。
一方、ピリミジン環、ピリジン環またはベンゼン環をその構造中に有する化合物が、炎症治療剤（国際公開第ＷＯ９７／０９３１５号）、Ｓｙｋチロシンキナーゼ阻害剤（国際公開第ＷＯ９９／３１０７３号、国際公開第ＷＯ２０００／７５１１３号）、Ｖ型ホスホジエステラーゼ阻害剤（国際公開第ＷＯ２００１／８３４６０号）、抗ウイルス剤（国際公開第ＷＯ９９／４１２５３号）、抗腫瘍剤（国際公開第ＷＯ２０００／３９１０１号）、プロテインキナーゼＣ阻害剤（国際公開第ＷＯ２０００／７６９８０号）、ＣＤ４０機能阻害剤（特開２００１−８９４５２号公報）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤（国際公開第ＷＯ２００２／２０４９５号、国際公開第ＷＯ９９／６５８９７号）として、それぞれ知られている。
【発明の開示】
本発明の目的は、（Ａ）ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤を提供すること、（Ｂ）中枢疾患の予防および／または治療に有用なＧＰＲ８８アンチセンスヌクレオチドまたはピリミジン誘導体もしくはその薬理学的に許容される塩等を提供することである。
本発明は、以下の（１）〜（６５）に関する。
（１）  Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質８８（ＧＰＲ８８；Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ８８）の機能抑制作用を有する物質を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
（２）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（１）記載の予防および／または治療剤。
（３）  （ａ）試験化合物をＧＰＲ８８発現細胞に接触させ、細胞応答を測定する工程と、（ｂ）該試験化合物を添加しない場合のＧＰＲ８８発現細胞の細胞応答と比較して、試験化合物を接触させた場合の細胞応答が低下することを確認する工程とを含む中枢疾患の予防および／または治療作用を有する化合物のスクリーニング方法。
（４）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（３）記載の方法。
（５）  ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質が配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである（１）記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（６）  ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質が、ＧＰＲ８８に対する抗体である（１）記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（７）  （３）記載のスクリーニング方法によって確認されたＧＰＲ８８の細胞応答を低下させる化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
（８）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（５）〜（７）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
（９）  配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１０）  配列番号８で表される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（１１）  アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドである（１０）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（１２）  （１０）または（１１）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１３）  （１０）または（１１）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
（１４）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（１３）記載の予防および／または治療剤。
（１５）  式（Ｉ）
2004054617.tif 000003
＜式中、Ａは置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換のアラルキルオキシアルキル、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたはシクロアルキルアルキルを表し、
Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表すか、
またはＡとＲ１が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、
Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ、ハロゲン、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルキルチオ、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環基、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたは−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環基または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）を表し、
Ｘは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５｛式中、Ｒ５はヒドロキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアリールオキシまたは−ＮＲ６Ｒ７〔式中、Ｒ６およびＲ７は同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換の複素環アルキル、ヒドロキシまたは−ＳＯ２Ｒ８（式中、Ｒ８は置換もしくは非置換の低級アルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す）を表すか、
またはＲ６とＲ７が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する〕を表す｝、ニトロ、置換もしくは非置換のヒドロキシメチルまたは１，２，３，４−テトラゾール−５−イルを表し、
Ｙは、水素原子、ハロゲンまたは置換もしくは非置換の低級アルキルを表す＞で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１６）  Ｙが水素原子である（１５）記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１７）  Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である（１５）または（１６）記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１８）  Ｘが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである（１５）〜（１７）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（１９）  Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である（１５）〜（１７）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２０）  Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ｂ（式中、Ｒ５Ｂはヒドロキシまたは低級アルコキシを表す）である（１５）〜（１７）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２１）  Ｘが置換もしくは非置換のヒドロキシメチルである（１５）〜（１７）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２２）  Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環基である（１５）〜（２１）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２３）  Ｒ１が水素原子である（１５）〜（２２）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２４）  Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであるか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する（１７）〜（２３）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２５）  Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４が水素原子または低級アルキルである（１７）〜（２３）のいずれかに記載のＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（２６）  式（Ｉ）
2004054617.tif 000004
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、ＸおよびＹはそれぞれ前記と同義である）で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
（２７）  Ｙが水素原子である（２６）記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（２８）  Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である（２６）または（２７）記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（２９）  Ｘが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである（２６）〜（２８）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３０）  Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）である（２６）〜（２８）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３１）  Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ｂ（式中、Ｒ５Ｂはヒドロキシまたは低級アルコキシを表す）である（２６）〜（２８）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３２）  Ｘが置換もしくは非置換のヒドロキシメチルである（２６）〜（２８）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３３）  Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環基である（２６）〜（３２）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３４）  Ｒ１が水素原子である（２６）〜（３３）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３５）  Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであるか、またはＲ３とＲ４が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する（２８）〜（３４）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３６）  Ｒ３が置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４が水素原子または低級アルキルである（２８）〜（３４）のいずれかに記載の中枢疾患の予防および／または治療剤。
（３７）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（２６）〜（３６）のいずれかに記載の予防および／または治療剤。
（３８）  式（ＩＡ）
2004054617.tif 000005
｛式中、ＡおよびＲ１はそれぞれ前記と同義であり、ＸＡは１，２，３，４−テトラゾール−５−イル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａ［式中、Ｒ５Ａはヒドロキシまたは−ＮＲ６ＡＲ７Ａ（式中、Ｒ６Ａは水素原子または低級アルキルを表し、Ｒ７Ａは水素原子、ヒドロキシ、ヒドロキシ低級アルキル、カルボキシ低級アルキル、ｐ−トルエンスルホニル、メタンスルホニルまたはトリフルオロメタンスルホニルを表す）を表す］または置換もしくは非置換のヒドロキシメチルを表し、（ｉ）ＸＡが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルであるとき、Ｒ３ＡおよびＲ４Ａは、同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す（ただし、同時に水素原子にはならない）か、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成し、（ｉｉ）ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａまたは置換もしくは非置換のヒドロキシメチルであるとき、Ｒ３ＡおよびＲ４Ａは、同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換の複素環アルキルまたは置換もしくは非置換のアラルキルを表す（ただし、同時に水素原子にはならない）か、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換のピペラジニル、４−メチルホモピペラジニル、４−メチルピペリジノ、４−ピペリジノピペリジノ、４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノまたはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する｝で表されるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（３９）  ＸＡが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルである（３８）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４０）  ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５Ａ（式中、Ｒ５Ａは前記と同義である）である（３８）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４１）  ＸＡが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである（３８）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４２）  ＸＡがヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチルまたは１−ヒドロキシ−１−メチルエチルである（３８）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４３）  Ａが置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のアラルキル、置換もしくは非置換のアリールオキシアルキル、置換もしくは非置換の複素環基またはシクロアルキルアルキルであるか、またはＡとＲ１が隣接する窒素原子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する（３８）〜（４２）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４４）  Ａが置換もしくは非置換のアリール、アラルキル、複素環基またはシクロアルキルアルキルである（３８）〜（４２）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４５）  Ａがベンジル、４−フェニル−ｎ−ブチル、３−フェニルプロピル、３−フェニル−１−メチルプロピル、２−フェニルプロピル、２−フェノキシエチル、２−フェノキシ−１−メチルエチル、１，４−ベンゾジオキサン−６−イル、２−ベンジルフェニル、２−フェノキシフェニル、３−フェノキシフェニル、４−フェノキシフェニル、４−ビフェニル、ビフェニル−４−イルメチル、２−インダニルおよびシクロプロピルメチルからなる群から選ばれる基である（３８）〜（４２）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４６）  Ｒ１が水素原子、低級アルキルまたはアラルキルである請求の範囲第３８〜４５項のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４７）  Ｒ１が水素原子である（３８）〜（４５）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４８）  Ｒ３ＡおよびＲ４Ａが同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、シクロアルキルアルキル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは置換もしくは非置換の複素環アルキルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒となって置換もしくは非置換の複素環基を形成する（３８）〜（４７）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（４９）  Ｒ３ＡおよびＲ４Ａが同一または異なって、水素原子、低級アルキル、シクロアルキルメチル、置換もしくは非置換のアラルキルまたは複素環アルキルである（３８）〜（４７）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（５０）  Ｒ３Ａが低級アルキル、シクロアルキルメチルまたは置換もしくは非置換のアラルキルであり、Ｒ４Ａが水素原子である（３８）〜（４７）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（５１）  Ｒ３Ａが３−メトキシベンジル、３−クロロベンジル、３−フルオロベンジル、２，６−ジフルオロベンジル、２−メチルベンジル、３−トリフルオロベンジル、２−ピリジルメチル、３−ピリジルメチル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチル、１，５−ジメチル−ｎ−ヘキシルおよび２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−２−イルメチルからなる群から選ばれる基であり、Ｒ４Ａが水素原子であるか、Ｒ３ＡがベンジルでありＲ４Ａがｎ−ブチルであるか、Ｒ３Ａがｎ−ヘキシルでありＲ４Ａがメチルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノもしくはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する（３８）および（４０）〜（４７）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（５２）  Ｒ３Ａが３−メトキシベンジル、３−クロロベンジル、３−フルオロベンジル、２，６−ジフルオロベンジル、２−メチルベンジル、３−トリフルオロベンジル、シクロヘキシルメチル、シクロヘプチルおよび１，５−ジメチル−ｎ−ヘキシルからなる群から選ばれる基であり、Ｒ４Ａが水素原子であるか、Ｒ３ＡがベンジルでありＲ４Ａがｎ−ブチルであるか、Ｒ３Ａがｎ−ヘキシルでありＲ４Ａがメチルであるか、またはＲ３ＡとＲ４Ａが隣接する窒素原子と一緒になって４−ベンジルピペリジノ、４，４−エチレンジオキシピペリジノもしくはデカヒドロイソキノリン−１−イルを形成する（３９）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（５３）  式（ＩＡ）で表される化合物が、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボヒドロキサム酸、［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］アミノ酢酸、｛［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］メチルアミノ｝酢酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン、Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］−４−メチルベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］メタンスルホンアミド、［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］トリフルオロメタンスルホンアミド、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（ベンジルブチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−２−（オクタヒドロイソキノリン−２−イル）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン、２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェニルプロピルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、５−ヒドロキシメチル−４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（３−クロロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（３−フルオロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（３−メトキシベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（２，６−ジフルオロベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（２−メチルベンジルアミノ���−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−（３−トリフルオロベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（３−フルオロベンジルアミノ）−４−（４−フェニルブチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（４−ビフェニルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸、４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン、４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（２−ピリジルメチルアミノ）ピリミジンおよび２−［ビス（２−メトキシエチル）アミノ］−４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチルピリミジン、２−（３−フルオロベンジルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジンからなる群から選択される化合物であるピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩。
（５４）  （３８）〜（５３）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬。
（５５）  （３８）〜（５３）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤。
（５６）  （３８）〜（５３）のいずれかに記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤。
（５７）  中枢疾患がパーキンソン病、うつ病および時差ぼけからなる群から選ばれる疾患である（５６）記載の予防および／または治療剤。
（５８）  中枢疾患の予防および／または治療剤の製造のための、ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質の使用。
（５９）  ＧＰＲ８８の機能抑制剤の製造のための、配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
（６０）  ＧＰＲ８８の機能抑制剤の製造のための、（１５）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の使用。
（６１）  中枢疾患の予防および／または治療剤の製造のための、（１５）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の使用。
（６２）  ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患の予防および／または治療方法。
（６３）  配列番号１、３または５で表される塩基配列の連続する１０塩基以上の配列に相補的または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とするＧＰＲ８８の機能抑制方法。
（６４）  （１５）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とするＧＰＲ８８の機能抑制方法。
（６５）  （１５）記載のピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩の有効量を投与することを特徴とする中枢疾患の予防および／または治療方法。
本発明において、ＧＰＲ８８としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ８８ポリペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するマウスＧＰＲ８８ポリペプチドおよび配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するラットのＧＰＲ８８ポリペプチドが挙げられる。また、ヒトＧＰＲ８８  ｃＤＮＡのコード領域の配列である配列番号１で表される塩基配列の４３８〜１５９２番目の配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする、上記のポリペプチドと実質的に同一な機能を有するポリペプチドも含まれる。本発明で用いるＧＰＲ８８としては、特に配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＲ８８ポリペプチドが好ましい。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１で表される塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−２００１）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
＜ＧＰＲ８８発現細胞を用いた、ＧＰＲ８８の構成活性阻害物質、中枢疾患の予防および／または治療のための作用を有する化合物のスクリーニング法＞
参考例５〜７に示す通り、ＧＰＲ８８は、細胞に過剰に発現させた際に、リガンドが存在しなくても活性化し、シグナル情報伝達を起こす構成活性型ＧＰＣＲであるため、ＧＰＲ８８を発現する細胞は、リガンドが存在しなくともＧＰＲ８８の活性化に伴う細胞応答を示す。ＧＰＲ８８を発現する細胞に任意の試験物質を添加して、該細胞と試験物質とを接触させた場合の該細胞の細胞応答と、試験物質を添加しない場合の該細胞の細胞応答をそれぞれ測定して比較し、試験物質を添加しなかった場合と比較して、試験物質を添加した場合の細胞応答が低下する試験物質を、ＧＰＲ８８の構成活性阻害物質として選択することができる。また、他の構成活性型ＧＰＣＲを発現させた細胞を以下に示すＧＰＲ８８発現細胞と同様にして作製し、上記の方法と同様にして、該細胞と上記の方法で選択された物質とを接触させた場合の細胞応答の低下を測定して、ＧＰＲ８８発現細胞での細胞応答の低下と比較することにより、選択された物質がＧＰＲ８８特異的に構成活性を阻害するかどうかを調べることができる。ＧＰＲ８８の構成活性阻害物質は、ＧＰＲ８８の機能を抑制する作用を有しており、ＧＰＲ８８の機能抑制剤となる。ＧＰＲ８８の構成活性阻害物質には、ＧＰＲ８８と結合してその構成活性を阻害するインバースアゴニスト、ＧＰＲ８８とＧ蛋白質とのカップリングを阻害する物質等のＧＰＲ８８が関与するシグナル伝達を阻害する物質が含まれる。後述するように、ＧＰＲ８８の機能抑制剤は、中枢疾患の予防および／または治療に有効であるので、上記の方法により中枢疾患治療薬または予防作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。
ＧＰＲ８８を発現する細胞は、ＧＰＲ８８を天然に発現する組織から、あるいはＧＰＲ８８をコードするＤＮＡを含む発現ベクター（ＧＰＲ８８発現ベクター）を宿主細胞に導入することによって得ることができる。ＧＰＲ８８の構成活性を測定するためには、ＧＰＲ８８を大量に発現している細胞が適しているため、ＧＰＲ８８発現ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞が好ましい。
ＧＰＲ８８をコードするＤＮＡは、以下のようにして取得できる。ＧＰＲ８８  ｃＤＮＡの塩基配列、例えば配列番号１で表されるヒトＧＰＲ８８  ｃＤＮＡの塩基配列を元にして、該受容体をコードする領域を含む該ｃＤＮＡの領域を適当に選択する。選択した領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、選択した領域の塩基配列の３’端２０〜４０塩基と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成する。例えば、配列番号２６および２７で表される塩基配列をそれぞれ有するＤＮＡが例示される。組織や細胞から染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡの場合はＧＰＲ８８が発現している組織や細胞を用いる。調製した染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより該受容体をコードするＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からの染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載の方法に従って行うことができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、導入する宿主細胞で機能するプロモーターを含有しているものを用いることができる。発現ベクター中のプロモーターの下流にＧＰＲ８８をコードするＤＮＡを挿入することにより、ＧＰＲ８８発現ベクターを構築することができる。
宿主細胞にＧＰＲ８８発現ベクターを導入する方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等を用いることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモニター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
宿主細胞としては、例えば、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等を挙げることができる。またＧＰＣＲの発現に適した変異株を用いることもできる〔Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４８７（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，６１８８（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４７００（１９９６）〕。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＣＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３等を例示することができる。特に誘導発現用のベクター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を発現する宿主細胞に導入した場合に、１７β−エストラジオールの添加により発現誘導が可能となるｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄ等が好ましい。また、複製開始点として、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有するｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＧａｌ９−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ等のベクターは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞等のエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するＢ細胞株を宿主細胞としたときに、染色体外にプラスミド状態で安定に存在するため、高い発現を示す形質転換株を容易に得ることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、例えば、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株、カエルの卵母細胞およびカエルのメラニン細胞等を挙げることができる。
具体的には、マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等を挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等を挙げることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ＧＰＲ８８を発現する形質転換体を得ることができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等を挙げることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ  Ｎ４等を挙げることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を挙げることができる。また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもできる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてＧＰＲ８８を発現する形質転換体を得ることができる。
このとき用いられるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等を挙げることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率を挙げることもできる。
このとき用いられる宿主細胞としては、例えば、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等を挙げることができる。
このとき用いられる組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等を挙げることができる。
細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰＫ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞増殖活性、あるいはレポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発現量があげられ、これらを調べることにより細胞の応答を測定することができる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８５７（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，９８（１９９５）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２７４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７，５７（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４００（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４７１（１９９７）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，１３３４（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１，４７１（１９９８）、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５，１３８７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５２，１１５（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ，３５８，３２５（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ，３９３，２７２（１９９８）、Ｃｅｌｌ，９２，５７３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２７４９７（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２０，３７０（１９９９）、ＷＯ９８／４６９９５〕。
レポーター系を用いて細胞の応答をモニターする場合は、例えば、ＧＰＲ８８を発現させた細胞に、ＧＰＲ８８の活性化により発現が誘導されるような適当な転写因子の結合配列と基本プロモーターからなる人工プロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを導入することにより、ＧＰＲ８８の活性化をレポーター遺伝子の発現で測定することができる。転写因子の結合配列としては、Ｇｓと共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｇｑと共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＴＲＥ（ＴＰＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｇｉと共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）等が利用できる。また、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉおよびＧαｑのＣ末端５アミノ酸にそれぞれ置換したキメラＧαｓをＧＰＲ８８の発現細胞に発現させることにより、ＧＰＲ８８が共役するＧ蛋白質の種類が不明でＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑのいずれであっても、ＧＰＲ８８の活性化に伴いＣＲＥを含む人工プロモーターからのレポーター遺伝子の発現が誘導される。
レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用可能であるが、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子等が利用できる。
本発明で予防および／または治療される中枢疾患としては、例えば脳内におけるＧＰＲ８８の発現部位との関連が知られている疾患が挙げられ、具体的にはパーキンソン病、うつ病、不安、精神分裂病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、脊髄小脳変性症、脳卒中、不随意運動、注意欠陥障害、錐体外路症状、薬物中毒、アルコール中毒、時差ぼけ等が挙げられる。
本発明において、ＧＰＲ８８の機能抑制剤は、その性質のひとつとしてＧＰＲ８８の機能抑制作用を有している物質を有効成分として含有していればよく、その物質の構造は特に限定されない。ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質としては例えば、ＧＰＲ８８拮抗作用を有する化合物（例えば、インバースアゴニスト、アンタゴニスト）、抗体（例えば、中和抗体等）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等の、ＧＰＲ８８の発現を低下させる物質、ＧＰＲ８８とＧ蛋白質とのカップリングを阻害するもの等シグナル伝達を阻害する物質等が挙げられる。
本発明で用いられるＧＰＲ８８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号１、３または５の塩基配列の連続する１０塩基以上、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基の配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有し、ＧＰＲ８８遺伝子の発現を特異的に抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。特にヒトＧＰＲ８８ｃＤＮＡの配列である配列番号１の塩基配列の連続する１０塩基以上、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基の配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ＧＰＲ８８遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するためには、翻訳開始点（配列番号１に示す塩基配列の４３８番目の塩基に相当する）を含む領域あるいは翻訳開始点近傍の領域と相補的な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。実質的に相補的な塩基配列とは、配列番号１、３または５の塩基配列の連続する１０〜４０塩基の配列と９０％以上の相同性を有し、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするような塩基配列をいう。ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基は例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置、ＷＯ９３／２００９５、ＷＯ０２／１０１８５に記載の方法等を用いて製造することができる。
本発明で用いられるＧＰＲ８８に対する抗体は、以下のようにして作製することができる。
ＧＰＲ８８ポリペプチドまたは部分ペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。該抗原を投与する動物としては、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を挙げることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。抗原としてペプチドを用いる場合は、ペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニンや牛チログロブリン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを用いることができる。ＧＰＲ８８ポリペプチドは、上記のＧＰＲ８８を発現する細胞から、通常の蛋白質の精製法により得ることができる。また、ＧＰＲ８８を発現する細胞あるいは、その膜画分を抗原とすることもできる。ＧＰＲ８８の部分ペプチドは、ペプチド合成機によって合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法：医学書院刊（１９７６年）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した上記動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法が挙げられる。
さらに、ＧＰＲ８８に対するモノクローナル抗体を以下のようにして作製することができる。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した上記動物に抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリスリン酸−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ  １６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地に０．１ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとりＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）等に記載されている酵素免疫測定法により、免疫に用いた抗原に特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法を挙げることができる。免疫の際、抗原に用いたＧＰＲ８８ポリペプチドまたはＧＰＲ８８の部分ペプチドをプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清を第一抗体として反応させる。さらに第二抗体としてペルオキシダーゼ等の酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体（免疫の際、抗原を投与した動物のイムノグロブリンに対する抗体、例えばマウスを免疫した場合は抗マウスイムノグロブリン抗体を用いる）を反応させた後に、酵素により発色する試薬を添加して反応を行ない、その培養上清が特異的に反応したものをＧＰＲ８８に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
選択したハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをＧＰＲ８８に対する抗体の産生ハイブリドーマ株として選択する。
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、取得したＧＰＲ８８に対する抗体の産生ハイブリドーマ株５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナル抗体の作製で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
以上のようにして得られた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を試験物質として、上記のＧＰＲ８８の構成活性阻害物質のスクリーニング法を行い、該抗体から、ＧＰＲ８８の構成活性を抑制する抗体を選択することができる。
後述の試験例２および３に記載されているように、ＧＰＲ８８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与によりドパミン受容体拮抗薬により誘発される運動不全状態の改善、レセルピン投与により誘発される中枢機能不全状態の改善が認められたことから、ＧＰＲ８８の機能を抑制する化合物もしくはその塩またはＧＰＲ８８の機能を抑制するＧＰＲ８８に対する抗体も同様の作用を示すと考えられる。したがって、ＧＰＲ８８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧＰＲ８８の機能を抑制する化合物もしくはその塩またはＧＰＲ８８の機能を抑制するＧＰＲ８８に対する抗体を含有する医薬は、ドパミン神経系の異常に基づく疾患、およびカテコールアミン神経系の異常に基づく疾患、例えば、パーキンソン病、不随意運動、錘体外路症、ハンチントン舞踏病、脊髄小脳変性症、脳卒中等の運動障害を伴う疾患の予防および／または治療剤として使用することができる。またうつ病、精神分裂病、不安、アルツハイマー病、注意欠陥障害、薬物中毒、アルコール中毒等の精神症状を改善する作用も期待できる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬は、ＧＰＲ８８  ｍＲＮＡの一部、好ましくは翻訳開始点を含む領域あるいはその近傍の領域に相補的な配列を有し、ＧＰＲ８８遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、低毒性であり、生体内におけるＧＰＲ８８の機能を抑制することができるので、例えば、パーキンソン病、不随意運動、錘体外路症、ハンチントン舞踏病、脊髄小脳変性症、脳卒中等の運動障害を伴う疾患の予防および／または治療剤として使用することができる。またうつ病、精神分裂病、不安、アルツハイマー病、注意欠陥障害、薬物中毒、アルコール中毒等の精神症状の予防および／または治療剤として使用することができる。上記アンチセンスヌクレオチドを上記の予防および／または治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、該アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ウシ、ネコ等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やカテーテルによっても投与できる。また、脳室内、あるいは側座核、小脳のオリーブ核または線条体内注入によっても投与できる。
ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する化合物としては、例えば式（Ｉ）および（ＩＡ）で表される化合物が挙げられる。以下、式（Ｉ）および（ＩＡ）で表される化合物をそれぞれ化合物（Ｉ）および（ＩＡ）という。他の式番号の化合物についても同様である。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＡ）の各基の定義において、以下の例示が挙げられる。
（ｉ）低級アルキル、低級アルコキシおよび低級アルキルチオの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数１〜１０のアルキルが挙げられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、１，５−ジメチルヘキシル、イソオクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。
（ｉｉ）シクロアルキルおよびシクロアルキルアルキルのシクロアルキル部分としては、例えば炭素数３〜８のシクロアルキルが挙げられ、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。
（ｉｉｉ）低級アルケニルとしては、例えば直鎖、分岐または環状の炭素数２〜８のアルケニルが挙げられ、具体的にはビニル、アリル、１−プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキセニル、２，６−オクタジエニル等が挙げられる。
（ｉｖ）低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜８のアルキニルが挙げられ、具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル等が挙げられる。
（ｖ）ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の各原子を表す。
（ｖｉ）アリール、アリールオキシおよびアリールオキシアルキルのアリール部分としては、例えば炭素数６〜１４の単環式、二環式または三環式のアリールが挙げられ、具体的にはフェニル、ナフチル、インデニル、アントラニル等が挙げられる。
（ｖｉｉ）アラルキル、複素環アルキル、シクロアルキルアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、カルボキシ低級アルキルおよびアリールオキシアルキルのアルキレン部分ならびにアラルキルオキシアルキルの２つのアルキレン部分は、前記低級アルキル（ｉ）の定義で挙げた基から水素を一つ除いたものと同義である。アラルキルオキシアルキルの２つのアルキレン部分は、同一でも異なっていてもよい。
（ｖｉｉｉ）アラルキルおよびアラルキルオキシアルキルのアリール部分としては、前記アリール（ｖｉ）の定義で挙げた基に加え、例えば前記アリール（ｖｉ）の定義で挙げた基がシクロアルキルと縮合した多環性縮合環基が挙げられ、具体的にはインダニル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾシクロヘプチル等が挙げられる。
（ｉｘ）複素環基および複素環アルキルの複素環基部分としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む５員または６員の単環性複素環基、３〜８員の環が縮合した二環または三環式であって窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれる少なくとも１個の原子を含む縮環性複素環基等が挙げられ、具体的にはピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ベンゾイミダゾリル、２−オキソベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾジオキソリル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチルリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チエニル、フリル、ピロリジニル、２，５−ジオキソピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、ホモピペリジル、ホモピペリジノ、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、オクタヒドロキノリル、インドリニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシニル等が挙げられる。
（ｘ）隣接する窒素原子と一緒になって形成される複素環基としては、例えば少なくとも１個の窒素原子を含む５員または６員の単環性複素環基（該単環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、３〜８員の環が縮合した二環または三環式で少なくとも１個の窒素原子を含む縮環性複素環基（該縮環性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）等が挙げられ、具体的にはピリジル、テトラヒドロピリジル、インドリニル、イソインドリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジノ、ホモピペリジノ、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ペルヒドロアゼピニル、ペルヒドロアゾシニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、オクタヒドロキノリル、デカヒドロイソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、インドリル、イソインドリル、プリニル、ジヒドロインドリル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル等が挙げられる。
（ｘｉ）ハロゲン化低級アルキルは、ハロゲン（該ハロゲンは、前記ハロゲン（ｖ）と同義である）で置換された低級アルキル（該低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義である）を意味し、置換基であるハロゲンは同一または異なって例えば置換数１〜３である。
（ｘｉｉ）置換低級アルキル、置換低級アルコキシおよび置換低級アルキルチオにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数１〜３の、低級アルカノイル、低級アルコキシ、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アラルキルオキシ、置換アラルキルオキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、低級アルキルチオ、モノまたはジ低級アルキルアミノ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、低級アルコキシカルボニルアミノ、低級アルカノイルアミノ、（低級アルカノイル）（低級アルキル）アミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニル、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルオキシ等が挙げられる。
ここで示した置換アリールオキシおよび置換アラルキルオキシにおける置換基（ｘｉｉｉ）としては、同一または異なって、例えば置換数１〜３の、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アリール、複素環基、オキソ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等が挙げられ、低級アルキル、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分、アリール、複素環基は、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、アリール（ｖｉ）、複素環基（ｉｘ）と同義であり、ハロゲンは前記ハロゲン（ｖ）と同義である。
また、ここで示したアリールオキシおよびアラルキルオキシのアリール部分、ハロゲンならびに低級アルカノイル、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルキルチオ、モノまたはジ低級アルキルアミノ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、低級アルコキシカルボニルアミノ、低級アルカノイルアミノ、（低級アルカノイル）（低級アルキル）アミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルオキシの低級アルキル部分は、それぞれ前記アリール（ｖｉ）、ハロゲン（ｖ）および低級アルキル（ｉ）と同義であり、アラルキルオキシのアルキレン部分は、前記アラルキルのアルキレン部分（ｖｉｉ）と同義である。
また、ここで示したジ低級アルキルアミノ、（低級アルカノイル）（低級アルキル）アミノ、ジ低級アルキルアミノカルボニルおよびジ低級アルキルアミノカルボニルオキシにおける２つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい。
（ｘｉｖ）置換アリール、置換アラルキル、置換シクロアルキル、置換シクロアルキルアルキル、置換低級アルケニル、置換低級アルキニル、置換アリールオキシ、置換複素環基、置換複素環アルキル、置換アリールオキシアルキル、置換アラルキルオキシアルキル、置換ピペラジニルおよび隣接する窒素原子と一緒になって形成される置換複素環基における置換基としては、前記置換低級アルキルにおける置換基（ｘｉｉ）の定義で挙げた基に加え、例えば低級アルキル、置換低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、アリールカルボニル、置換アリールカルボニル、複素環基、置換複素環基、複素環アルキル、置換複素環アルキル、エチレンジオキシ等が挙げられる。
ここで示した置換低級アルキル、置換シクロアルキル、置換アリール、置換アラルキル、置換アリールカルボニル、置換複素環基および置換複素環アルキルにおける置換基は、前記置換アリールオキシおよび置換アラルキルオキシにおける置換基（ｘｉｉｉ）と同義である。
また、ここで示した低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、アリールおよびアリールカルボニルのアリール部分、複素環基および複素環アルキルの複素環基部分、アラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分ならびにアラルキルのアリール部分は、それぞれ前記低級アルキル（ｉ）、シクロアルキル（ｉｉ）、低級アルケニル（ｉｉｉ）、低級アルキニル（ｉｖ）、アリール（ｖｉ）、複素環基（ｉｘ）、アラルキルのアルキレン部分（ｖｉｉ）およびアラルキルのアリール部分（ｖｉｉｉ）と同義である。
（ｘｖ）置換ヒドロキシメチルの置換基としては、同一または異なって、例えば置換数１または２の低級アルキル等が挙げられる。
ここで示した低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義である。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＡ）の薬理学的に許容される塩としては、毒性のない、水溶性のものが好ましく、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、モルホリン付加塩、ピペリジン付加塩等の有機アミン付加塩、グリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
次に化合物（Ｉ）の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化するか、または方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される方法、例えば官能基の保護、脱保護等［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第三版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）、ワッツ（Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）］の手段に付すことにより容易に製造を実施することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
化合物（Ｉ）のうちＹが水素原子であり、Ｘが１，２，３，４−テトラゾール−５−イルであり、Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉ−ｉ）は、例えば以下に示す製造法１によって得ることができる。
製造法１：
2004054617.tif 000006
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義であり、ｍは１または２を表す）
［工程１］
２−エトキシメチレン−２−シアノ酢酸エチル〔化合物（Ａ）〕を、溶媒中、アルカリ存在下、０．５当量〜大過剰量、好ましくは０．５当量〜２当量の硫酸メチルイソチオ尿素〔化合物（Ｂ）〕と反応させることにより、化合物（Ｃ）を得ることができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、２−プロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもエタノールが好ましい。
アルカリとしては、例えば水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウムまたは水酸化カルシウム等のアルカリ水溶液、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの水溶液、テトラヒドロフラン溶液もしくは２−メチル−２−プロパノール溶液、ナトリウムメトキシドの水溶液もしくはメタノール溶液等を用いることができ、中でも水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。
反応は、０℃〜５０℃の間の温度、好ましくは０℃〜１５℃の間の温度で行われ、通常１時間〜４８時間で終了する。
［工程２］
工程１で得られる化合物（Ｃ）を、反応に不活性な溶媒中または無溶媒で、１当量〜大過剰量の塩基の存在下または非存在下、１当量〜大過剰量の塩素化剤と反応させることにより化合物（Ｄ）を得ることができる。
塩素化剤としては、例えばオキシ塩化リン等が用いられる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えば１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができる。塩基としては、例えばトリエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン等が挙げられる。
反応は、０℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは５０℃〜溶媒の沸点の間の温度で行われ、通常１時間〜４８時間で終了する。
なお、本工程で得られる化合物（Ｄ）は上記の方法以外に、ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．）、８（３）巻、４４５頁（１９７１年）、ＷＯ９９／６１４４４等に記載の方法でまたはそれらに準じた方法によっても得ることができる。
［工程３］
工程２で得られる化合物（Ｄ）を、無溶媒または反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜３当量の化合物（Ｅ）と反応させることにより、化合物（Ｆ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフラン、クロロホルムまたはそれらの混合溶媒が好ましい。
反応は、０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１０分間〜４８時間で終了する。
また、この反応は必要に応じて、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜１０当量の塩基を添加して行ってもよい。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、キノリン等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の無機塩基、アンバーリストＡ−２１（ロームアンドハース社製）、ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッド社製）等の塩基性アニオン交換レジン、ポリビニルピリジン、モルホリノメチルポリスチレン等の固相に担持された塩基等を用いることができ、並列合成法（コンビナトリアル・ケミストリー）で反応を行う場合には、中でもモルホリノメチルポリスチレンが好ましい。
化合物（Ｅ）は、市販品としてまたはコンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）等に記載の方法に準じて得ることができる。
［工程４］
工程３で得られる化合物（Ｆ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜５当量の酸化剤で処理することにより、化合物（Ｇ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、水等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもジクロロメタンが好ましい。
酸化剤としては、例えばメタクロ濾過安息香酸、過酸化ベンゾイル、過酢酸、過酸化水素水、過ヨウ素酸ナトリウム等を用いることができ、中でもメタクロ濾過安息香酸が好ましい。
反応は０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１０分間〜２４時間で終了する。
なお、化合物（Ｇ）において、ｍが１である化合物とｍが２である化合物は、それぞれ例えば酸化剤の当量数、反応の温度等の条件等を調節することにより得られ、それらが混在することもある。混在する場合、その比率は特に限定されず、いずれの場合もそのまま次工程に使用することができる。
［工程５］
工程４で得られる化合物（Ｇ）を、無溶媒または反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量の、好ましくは１当量〜５当量の化合物（Ｈ）と反応させることにより、化合物（Ｊ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフランが好ましい。
反応は０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは２０℃〜６０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜７２時間で終了する。
化合物（Ｈ）は、市販品としてまたはコンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）等に記載の方法に準じて得ることができる。
［工程６］
工程５で得られる化合物（Ｊ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜１０当量のアジ化ナトリウムまたはアジ化アンモニウムと反応させることにより、化合物（Ｉ−ｉ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばクロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが好ましい。また、反応を加速する目的で、反応系中へ塩化アンモニウム、塩化エチルアンモニウム等を１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜１０当量添加することもできる。
反応は０℃〜１８０℃の間の温度、好ましくは５０℃〜１２０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜７２時間で終了する。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘが−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ５であり、Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉ−ｉｉ）は、例えば以下に示す製造法２によって得ることができる。
製造法２：
2004054617.tif 000007
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙおよびｍはそれぞれ前記と同義である。）
［工程７］
化合物（Ｋ）を、無溶媒または反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜３当量の化合物（Ｅ）と反応させることにより、化合物（Ｌ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフラン、クロロホルム、１，２−ジメトキシエタンまたはそれらの混合溶媒が好ましい。
反応は、０℃〜１５０℃の間の温度、好ましくは５０℃〜１２０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜９６時間で終了する。
また、この反応は必要に応じて、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜１０当量の塩基を添加して行ってもよい。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、キノリン等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の無機塩基、アンバーリストＡ−２１（ロームアンドハース社製）、ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッド社製）等の塩基性アニオン交換レジン、ポリビニルピリジン、モルホリノメチルポリスチレン等の固相に担持された塩基等を用いることができ、中でもトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンまたはＤＢＵが好ましい。
化合物（Ｅ）は、市販品としてまたはコンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）等に記載の方法に準じて得ることができる。
化合物（Ｋ）は、市販品としてまたは例えばＷＯ００／７６９８０、ＷＯ００／２７８２６、ＷＯ０１／８３４６０、ＷＯ９７／０９３１５、特開２００１−８９４５２号公報、ＷＯ９９／３１０７３等に記載の方法に準じて得ることができる。
［工程８］
工程７で得られる化合物（Ｌ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜５当量の酸化剤で処理することにより、化合物（Ｍ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、水等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもジクロロメタンが好ましい。
酸化剤としては、例えばメタクロ濾過安息香酸、過酸化ベンゾイル、過酢酸、過酸化水素水、過ヨウ素酸ナトリウム等を用いることができ、中でもメタクロ濾過安息香酸が好ましい。
反応は０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１０分間〜２４時間で終了する。
なお、化合物（Ｍ）において、ｍが１である化合物とｍが２である化合物は、それぞれ例えば酸化剤の当量数、反応の温度等の条件等を調節することにより得られ、それらが混在することもある。混在する場合、その比率は特に限定されず、いずれの場合もそのまま次工程に使用することができる。
［工程９］
工程８で得られる化合物（Ｍ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜５当量の化合物（Ｈ）と反応させることにより、化合物（Ｉ−ｉｉ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフランまたは１，２−ジメトキシエタンが好ましい。
反応は２０℃〜１５０℃の間の温度、好ましくは５０℃〜１２０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜７日間で終了する。
化合物（Ｈ）は、市販品としてまたはコンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）等に記載の方法に準じて得ることができる。
また、化合物（Ｉ−ｉｉ）のうち、Ｒ５がヒドロキシである化合物（Ｉ−ｉｉｂ）は、化合物（Ｉ−ｉｉ）のうち、Ｒ５がＲ５ａ（式中、Ｒ５ａはＲ５の定義のうち置換もしくは非置換の低級アルコキシを表す）である化合物（Ｉ−ｉｉａ）から、以下に示す工程１０によっても得ることができる。
［工程１０］
2004054617.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ａ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
工程９で得られる化合物（Ｉ−ｉｉａ）を、溶媒中、１当量〜１０当量、好ましくは１当量〜５当量の塩基で処理することにより、化合物（Ｉ−ｉｉｂ）を得ることができる。
溶媒は、特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のプロトン性溶媒と水との混合溶媒、またはテトラヒドロフラン、ジオキサン等の非プロトン性溶媒と水との混合溶媒があげられ、これらを混合して用いることもでき、中でもエタノールと水の混合溶媒が好ましい。
塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸リチウム等の無機塩基、アンバーリストＡ−２１（ロームアンドハース社製）、ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッド社製）等の塩基性アニオン交換レジン等を用いることができる。
反応は０℃〜１５０℃の間の温度、好ましくは２０℃〜１００℃の間の温度で行われ、通常１時間〜４８時間で終了する。
また、化合物（Ｉ−ｉｉ）のうち、Ｒ５が−ＮＲ６Ｒ７である化合物（Ｉ−ｉｉｃ）は、例えば以下に示す製造法３によっても得ることができる。
製造法３：
2004054617.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ａ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７およびＹはそれぞれ前記と同義である）
［工程１１］
製造法２の工程１０で得られる化合物（Ｉ−ｉｉｂ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜１０当量の縮合剤の存在下、１当量〜５当量、好ましくは１当量〜３当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと反応させることにより、化合物（Ｎ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、水等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもクロロホルム、テトラヒドロフランまたはそれらの混合溶媒が好ましい。
縮合剤としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはその塩酸塩、ポリスチレンに担持されたＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ポリスチレンに担持されたＮ−ベンジル−Ｎ’−シクロヘキシルカルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩、ジフェニルホスホリルアジド等を用いることができ、中でもＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドまたはその塩酸塩またはポリスチレンに担持されたＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが好ましい。
反応は０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは０℃〜６０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜１２０時間で終了する。
［工程１２］
工程１１で得られる化合物（Ｎ）を無溶媒または反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜５当量のＨＮＲ６Ｒ７（式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ前記と同義である）と反応させることにより、化合物（Ｉ−ｉｉｃ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、水等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフランと水の混合溶媒が好ましい。
反応は０℃〜１００℃の間の温度、好ましくは２０℃〜６０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜９６時間で終了する。
また、この反応は必要に応じて、１当量〜１０当量、好ましくは１当量〜５当量の塩基を添加して行ってもよい。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＤＢＵ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、キノリン等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の無機塩基、アンバーリストＡ−２１（ロームアンドハース社製）、ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッド社製）等の塩基性アニオン交換レジン、ポリビニルピリジン、モルホリノメチルポリスチレン等の固相に担持された塩基等を用いることができ、中でも炭酸カリウムまたはＤＢＵが好ましい。
［工程１３］
また、製造法３で得られる化合物（Ｉ−ｉｉｃ）のうち、Ｒ７にカルボキシ低級アルキル（該カルボキシ低級アルキルは前記と同義である）を有する化合物（Ｉ−ｉｉｃａ）は、製造法２の工程１０と同様にして、化合物（Ｉ−ｉｉｃ）のうち、Ｒ７に低級アルコキシカルボニル低級アルキル（該低級アルコキシカルボニル低級アルキルは前記と同義である）を有する化合物（Ｉ−ｉｉｃｂ）を、加水分解処理することによっても得ることができる。
また、化合物（Ｉ−ｉｉｃｂ）のうち、低級アルコキシカルボニル低級アルキルの低級アルコキシ部分がｔｅｒｔ−ブトキシである化合物（Ｉ−ｉｉｃｃ）を、溶媒中、１当量〜大過剰量の酸で処理することにより化合物（Ｉ−ｉｉｃａ）を得ることもできる。
溶媒としては、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、水等を単独でまたは混合して用いることができ、中でもジクロロメタンが好ましい。
酸としては、例えばトリフルオロ酢酸等のカルボン酸、塩酸等の鉱酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等のスルホン酸等を用いることができ、中でもトリフルオロ酢酸が好ましい。
反応は０℃〜１５０℃の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜４８時間で終了する。
化合物（Ｉ）のうち、Ｘがヒドロキシメチルであり、Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉ−ｉｉｉａ）は、例えば以下に示す製造法４によって得ることができる。
製造法４：
2004054617.tif 000010
（式中、Ａ、ｍ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
［工程１４］
製造法２の工程７で得られる化合物（Ｌ）のうち、Ｒ５がＲ５ａ（式中、Ｒ５ａは前記と同義である）である化合物（Ｌａ）を、反応に不活性な溶媒中、２当量〜１０当量、好ましくは２当量〜６当量の還元剤で処理することにより、化合物（Ｏ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジオキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等を単独でまたはそれらを混合して用いることができる。
還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム等を用いることができ、中でも水素化リチウムアルミニウムが好ましい。
反応は−７８℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１分間〜１０時間で終了する。
［工程１５］
製造法１の工程４に示した方法と同様にして、工程１４で得られた化合物（Ｏ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜５当量の酸化剤で処理することにより、化合物（Ｐ）を得ることができる。
溶媒、酸化剤、反応温度、反応時間等の各種条件は工程４に記載の条件と同様である。
［工程１６］
工程１５で得られる化合物（Ｐ）を、無溶媒または反応に不活性な溶媒中、１当量〜大過剰量、好ましくは１当量〜１０当量の塩基の存在下または非存在下、１当量〜５当量の化合物（Ｈ）と反応させることにより、化合物（Ｉ−ｉｉｉａ）を得ることができる。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもジオキサンまたは１，２−ジメトキシエタンが好ましい。
塩基としては、例えばトリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、モルホリノメチルポリスチレン等の固相に担持された塩基等を用いることができ、中でもＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが好ましい。
反応は２０℃〜１５０℃の間の温度、好ましくは８０℃〜１２０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜９６時間で終了する。
化合物（Ｉ）のうちＸが置換ヒドロキシメチルであり、Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）である化合物（Ｉ−ｉｉｉｂａ）は、例えば以下に示す製造法５によって得ることができる。
製造法５：
2004054617.tif 000011
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４およびＹはそれぞれ前記と同義であり、Ｒ８は低級アルキルを表し、該低級アルキルは前記低級アルキル（ｉ）と同義である）
［工程１７］
製造法４の工程１４で得られる化合物（Ｏ）を溶媒中、酸化剤で処理することにより、化合物（Ｑ）を得ることができる。
酸化剤としては、アルコールの酸化反応に用いられる各種試薬を任意に用いることができ、例えば二酸化マンガン、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）、二クロム酸ピリジニウム（ＰＤＣ）、酸化クロム（ＩＶ）−ピリジシ錯体、重クロム酸カリウム、重クロム酸ナトリウム、硝酸セリウム（ＩＶ）アンモニウム等が挙げられるが、中でも二酸化マンガンが好ましい。
溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、酢酸エチル、アセトニトリル、ピリジン、水等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもクロロホルムが好ましい。
反応は、−７８℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは０℃〜５０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜９６時間で終了する。
［工程１８］
工程１７で得られる化合物（Ｑ）を、反応に不活性な溶媒中、１当量〜５当量、好ましくは２当量〜３当量の対応するアルキル化剤と反応させることにより、化合物（Ｒ）を得ることができる。
対応するアルキル化剤としては、例えばＲ８ＭｇＢｒ（式中、Ｒ８は前記と同義である）、Ｒ８Ｌｉ（式中、Ｒ８は前記と同義である）等が用いられる。より具体的には、Ｒ８がメチルの場合、例えば臭化メチルマグネシウム、メチルリチウム等を用いることができ、中でも臭化メチルマグネシウムが好ましい。
反応に不活性な溶媒は、反応に不活性であればいずれでもよく、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、ジイソプロピルエーテル等を単独でまたはそれらを混合して用いることができ、中でもテトラヒドロフランが好ましい。
反応は−７８℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは−４０℃〜２０℃の間の温度で行われ、通常１時間〜９６時間で終了する。
［工程１９］
工程１８で得られる化合物（Ｒ）から、製造法４の工程１５および工程１６と同様にして、化合物（Ｉ−ｉｉｉｂ）のうち、ＸＡがモノ置換ヒドロキシメチルである化合物（Ｉ−ｉｉｉｂａ）を得ることができる。
［工程２０］
また、化合物（Ｉ−ｉｉｉｂ）のうち、ＸＡがジ置換ヒドロキシメチルである化合物（Ｉ−ｉｉｉｂｂ）は、工程１８で得られる化合物から、工程１７、工程１８次いで工程１９と同様にして処理することにより得ることができる。
製造法６：
製造法４に記載した方法に加え、下記の製造法に従っても化合物（Ｉ−ｉｉｉａ）を得ることができる。
2004054617.tif 000012
（式中、Ａ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５ａおよびＹはそれぞれ前記と同義である）
［工程２１］
製造法２の工程９で得られる化合物（Ｉ−ｉｉａ）を、溶媒中、１当量〜１０当量、好ましくは１．５当量〜３当量の還元剤で処理することにより、化合物（Ｉ−ｉｉｉａ）を得ることができる。
溶媒は反応に不活性なものであればいずれでもよく、特に限定されないが、例えばペンタン、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、ジオキサン等を単独でまたはそれらを混合して用いることができる。
還元剤としては、例えば水素化リチウムアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ビス（メトキシエトキシ）アルミニウム等を用いることができ、中でも水素化ビス（メトキシエトキシ）アルミニウムが好ましい。
反応は−７８℃〜溶媒の沸点の間の温度、好ましくは０℃〜３０℃の間の温度で行われ、通常１０分間〜２４時間で終了する。
製造法７：
化合物（Ｉ）は上記で示した製造法の他に、例えばＷＯ９２／０１６７５、ＷＯ９７／０９３１５、ＷＯ９９／６５８９７、特開２００１−８９４５２等に記載の方法でまたはそれらに準じて得ることができる。また、例えばＷＯ９２／０１６７５、ＷＯ９７／０９３１５、ＷＯ９９／６５８９７、特開２００１−８９４５２、イー・キリングスバーグ（Ｅ．Ｋｌｉｎｇｓｂｅｒｇ）編、ザ・ケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ｖｏｌ．１４、ピリジン・アンド・イッツ・デリバティブス（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、パート１、ニューヨーク、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９６０年）、同パート２（１９６１年）、同パート３（１９６２年）、同パート４（１９６４年）、ジー・アール・ニュウコム（Ｇ．Ｒ．Ｎｅｗｋｏｍｅ）編、ザ・ケミストリー・オブ・ヘテロサイクリック・コンパウンズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ｖｏｌ．１４、ピリジン・アンド・イッツ・デリバティブス（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、パート５（１９８４年）等に記載の方法でまたはそれらに準じて得られる化合物を中間体として、例えばシンレット（Ｓｙｎｌｅｔｔ）、２０００年、ｐ．６２５−６２６、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９５２年、ｐ．８００−８０３、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ）、１９８７年、第４３巻、ｐ．２５５７−２５６４、ジャーナル・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８７年、第２４巻、ｐ．８５−８９、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９５年、第６０巻、ｐ．１８７５−１８７７等に記載の方法でまたはそれらに準じて官能基変換を行うことにより、目的とする化合物を得ることができる。
化合物（Ｉ）、原料化合物および中間体における各官能基の変換および置換基に含まれる官能基の変換は、公知の方法［例えば、コンプリヘンシブ・オーガニック・トランスフォーメーションズ第二版（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレーティッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（１９９９年）に記載の方法］等によって行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望の官能基を有する化合物（Ｉ）を得ることができる。
上記製造法における中間体および目的化合物の単離・精製は、通常の有機合成で用いられる方法、例えば濾過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、結晶化、各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行うことができる。さらに一般的な並列合成法で常用される精製法、例えば、スカベンジャーレジン、イオン交換レジン等を用いた精製法によって行うことができる。また、中間体においては、特に精製することなく次の反応に供することもできる。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＡ）には、位置異性体、幾何異性体、光学異性体または互変異性体のような異性体が存在し得るものもあるが、これらを含め可能な全ての異性体および該異性体のいかなる比率における混合物も本発明の治療剤に用いられるか、本発明に包含される。
化合物（Ｉ）または化合物（ＩＡ）の塩を取得したい場合には、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＡ）の塩が得られるときはそのまま精製すればよく、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＡ）が遊離の形で得られるときは化合物（Ｉ）または化合物（ＩＡ）を適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えて単離・精製すればよい。
また、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＡ）またはそれらの薬理学的に許容される塩は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の治療剤に用いられるか、本発明に包含される。
以下、本発明によって得られる化合物（Ｉ）の具体例を第１表〜第６表に示す。
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次に、代表的な化合物（Ｉ）の薬理作用について試験例により具体的に説明する。
試験例１：ＧＰＲ８８の機能抑制作用（ＧＰＲ８８特異的な構成活性阻害作用）
参考例５で構築したＧＰＲ８８アッセイ細胞１を白色プレートに１ウェル当たり１０５個ずつ播種し、ＧＰＲ８８を誘導発現するため、反応液中１０ｎｍｏｌ／Ｌになるように１７β−エストラジオール（１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ、以下Ｅ２と略する；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を培地で希釈したものと試験化合物とを加え、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６時間反応させた。その後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）溶液を加え反応を停止し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社製）で１秒間の発光量を測定した。
試験化合物の活性（拮抗作用）は、下の式に示す通りＥ２添加時と非添加時の１秒あたりのカウント数をもとに算出した阻害率で表した。
阻害率（％）＝［１−｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝］ｘ１００
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは各々以下の意味を表す。
Ａ：Ｅ２および試験化合物添加時の１秒あたりのカウント数
Ｂ：Ｅ２および試験化合物ともに非添加時の１秒あたりのカウント数
Ｃ：Ｅ２のみ添加時の１秒あたりのカウント数
ＩＣ５０値は、阻害率からＬｏｇｉｔ−Ｌｏｇ変換法の線形近似解析法によって算出した。その結果を第７表に示す。
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また、細胞を試験化合物の最終濃度が３μｍｏｌ／Ｌになる条件で処理したときの阻害率（％）を第８表に示す。
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以上の結果より、化合物（Ｉ）はＧＰＲ８８の機能抑制作用（ＧＰＲ８８拮抗作用）を有することが示された。
また、ＷＯ０３／０８７３６６に記載の方法に従って、他の構成活性型ＧＰＣＲ（例えば、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６またはＧＰＲ１２）を誘導発現するアッセイ細胞を用いて同様のアッセイを行った際には、化合物（Ｉ）は阻害活性を示さなかった。このことから、化合物（Ｉ）はＧＰＲ８８の構成活性を特異的に阻害することが示された。
なお、参考例６および７でそれぞれ構築したＧＰＲ８８アッセイ細胞２および３も、ＧＰＲ８８アッセイ細胞１と同様に、ＧＰＲ８８特異的な構成活性阻害物質（ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質）の探索に用いることができる。
試験例２：ＧＰＲ８８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内投与による運動機能改善（ドパミン受容体拮抗薬によるモデル動物での評価）
配列番号７に示す塩基配列を有するＧＰＲ８８遺伝子に対するホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｔｒｇ−ＡＳ１：ジェンセット社に合成を依頼した）（１０μｇ／２０μＬ）を、生理食塩液（大塚製薬社製）に溶解し、この溶液を、後述のドパミン受容体拮抗薬ＳＣＨ２３３９０投与の３日前から、２段針を用いて、１２時間ごとに６回、マウスの脳室内へ繰り返し投与した。別のマウスに同様の手法でクマジー液を脳室内投与し、脳を摘出し投与液が脳内に拡散していることを確認した。Ｓｔｒｇ−ＡＳ１（１０μｇ／２０μＬ）の最終脳室内投与の３時間後に、ドパミン受容体拮抗薬ＳＣＨ２３３９０（０．５ｍｇ／ｋｇ；シグマ社製を生理食塩水で０．０５ｍｇ／ｍＬに希釈）を皮下注射して、運動不全状態を作製した。ＳＣＨ２３３９０の皮下投与の３０分後に、１匹ずつ高さ４．５ｃｍ、幅１．０ｃｍの垂直に立てたアクリル製の台にマウスの両後肢を掛け、１分間を上限に動物が動き出すまでの時間（不動時間）を測定した。この不動時間を指標として運動機能不全の程度を表わした。なお、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１を投与せずＳＣＨ２３３９０のみを皮下投与した群を、陰性対照群とした。
その結果、ＳＣＨ２３３９０のみを皮下投与した陰性対照群における不動時間の平均は５８秒間であった。一方、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１を脳室内投与した群における不動時間は３４．４秒間と減少し、運動機能を改善する作用が認められた。
つまり、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１の繰り返し投与により、ドパミン受容体拮抗薬により誘発される運動不全状態は改善されたことから、ＧＰＲ８８遺伝子がドパミン神経系の運動調節に関係していることが明らかとなり、ＧＰＲ８８遺伝子を標的とした薬物は、脳内ドパミン神経系の異常に基づく疾患（例えばパーキンソン病、不随意運動、錐体外路症、うつ病、精神分裂病等）の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
なお、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１はマウスＧＰＲ８８ｍＲＮＡの翻訳開始点を含む、配列番号５に示す塩基配列の４０１〜４１８番目の配列と相補的な配列からなるホスホロチオエート・オリゴＤＮＡである。また、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１の塩基配列は、マウスＧＰＲ８８ｍＲＮＡだけでなく、ヒトＧＰＲ８８ｍＲＮＡの翻訳開始点を含む、配列番号４に示す塩基配列の４２５〜４４２番目の配列とも相補的な配列であるため、ヒトに投与した場合もＧＰＲ８８遺伝子の発現を抑制し、下記および試験例２で示されるマウスに対する作用と同様の作用を示すと考えられる。
試験例３：ＧＰＲ８８遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの脳室内投与による、中枢機能改善（レセルピン処置動物での評価）
後述のレセルピン投与の３日前から、２段針を用いて、生理食塩液に溶解したＳｔｒｇ−ＡＳ１（１０μｇ／２０μＬ）を、１２時間ごとに６回マウスの脳室内へ繰り返し投与した。別のマウスに同様の手法でクマジー液を脳室内投与し、脳を摘出し投与液が脳内に拡散していることを確認した。Ｓｔｒｇ−ＡＳ１（１０μｇ／２０μＬ）の最終脳室内投与の２０時間前に、レセルピン（２．５ｍｇ／ｋｇ：アポプロン注；第一製薬を蒸留水で０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈）を皮下注射して、中枢機能不全状態を作製した。レセルピン投与の２４時間後に、試験例２と同様の方法により測定を１匹ずつ行なって、１分間を上限にマウスが動き出すまでの時間（不動時間）を測定した。この不動時間を指標として中枢機能不全の程度を表わした。なお、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１を投与せずレセルピンのみを皮下投与した群を、陰性対照群とした。
その結果、レセルピンのみを皮下投与した陰性対照群における不動時間の平均は６０秒間であった。一方、Ｓｔｒｇ−ＡＳ１を脳室内投与した群における不動時間は３９．６秒間と減少し、中枢機能を改善する作用が認められた。
つまり、ＧＰＲ８８遺伝子に対するホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドであるＳｔｒｇ−ＡＳ１の繰り返し投与により、レセルピン投与により誘発される中枢機能不全状態は改善された。すなわち、ＧＰＲ８８遺伝子を標的とした薬物は、脳内カテコールアミン神経系の異常に基づく（カテコールアミン枯渇に基づく）疾患（例えばパーキンソン病、不随意運動、錐体外路症、うつ病、精神分裂病等）の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
試験例４：ドパミン受容体拮抗薬ＳＣＨ２３３９０誘発カタレプシーに対する作用
５週齢の雄性ｄｄＹマウス（体重２２〜２５ｇ、日本エスエルシー）を１群１０匹用いて実験を行った。ＳＣＨ２３３９０（シグマ社製）を生理食塩液（大塚製薬社製）に溶解し、マウスに０．５ｍｇ／ｋｇで皮下注射した。試験化合物（化合物３７）は蒸留水（大塚製薬社製）で懸濁して用いた。ＳＣＨ２３３９０を皮下注射する３０分前に、化合物３７を含む懸濁液または蒸留水のみ（対照）をそれぞれ経口投与した（マウス体重１０ｇあたり０．１ｍＬ）。化合物３７投与の１時間後に１匹ずつ高さ４．５ｃｍ、幅１．０ｃｍの垂直に立てたアクリル製の台にマウスの両前肢のみ、両後肢のみを順次懸け、カタレプシーを測定した。第９表にカタレプシースコアの判定基準を示す。
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作用の強度は、１群１０匹のカタレプシースコアの平均値として表した（満点５点）。その結果を図１に示す。
図１より、化合物３７の投与によりドパミン受容体拮抗薬の投与により誘発されるカタレプシー症状の改善（運動機能の改善）が認められ、化合物（Ｉ）がドパミン神経系の異常に基づく疾患（例えばパーキンソン病、不随意運動、錐体外路症、うつ病、精神分裂病等）の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
試験例５：レセルピン誘発カタレプシーに対する作用
レセルピンのような抗精神病薬の投与で誘発されるカタレプシーは、パーキンソン病やうつ病の症候モデルとされている［ジャーナル・オブ・ニューラル・トランスミッション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）、８巻、３９−７１頁（１９９４年）］。
５週齢の雄性ｄｄＹマウス（体重２２〜２５ｇ、日本エスエルシー）を１群１０匹用いて実験を行った。予備飼育期間中は、室温２２±３℃、湿度５０±２０％の動物室内で飼育し、餌、水は自由に摂取させた。レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ：アポプロン注：第一製薬社製を蒸留水で希釈）を皮下投与して１８時間後よりカタレプシー惹起作用を観察し、カタレプシースコアが５（試験例４第４表判定基準）を示すマウスを選別して実験に供した。試験化合物（化合物３７）は、注射用蒸留水（大塚製薬社製）で懸濁液として用い、化合物３７を含む懸濁液または注射用蒸留水のみ（対照）をそれぞれ経口投与（マウス体重１０ｇあたり０．１ｍＬ）し、化合物３７の投与１時間後に１匹ずつ高さ４．５ｃｍ、幅１．０ｃｍの台にマウス両前肢のみ、両後肢のみを順次懸け、カタレプシーを測定した。
作用の強度は、１群１０匹のカタレプシースコアの平均値として表した（満点５点）。その結果を図２に示す。
図２より、化合物３７の投与によりレセルピン投与により誘発されるカタレプシーの改善（中枢機能の改善）が認められ、化合物（Ｉ）は、脳内カテコールアミン神経系の異常に基づく（カテコールアミン枯渇に基づく）疾患（例えばパーキンソン病、不随意運動、錐体外路症、うつ病、精神分裂病等）の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
試験例６：自発運動量の増大作用
５週齢の雄性ｄｄＹマウス（体重２２〜２５ｇ、日本エスエルシー）を１群１０匹用いて実験を行った。化合物２６３を投与する一時間前に、マウスを幅４０ｃｍ、奥行き４０ｃｍ、高さ４０ｃｍのアクリル製の箱に静置し環境に馴化させた。化合物２６３は０．５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；大塚製薬社製）を含む蒸留水で懸濁して用いた。化合物２６３（２．５ｍｇ／ｍＬ）を含む懸濁液または溶媒のみをそれぞれ腹腔内投与した（マウス体重１０ｇあたり０．１ｍＬ）。自発運動量測定装置（ＳＣＡＮＥＴ  ＭＶ−１０ＭＴ、東洋産業株式会社医薬機器事業部）を用いて、身づくろい行動、歩行行動および後ろ足立ち行動の３項目について、投与直後から４時間測定した。明期の運動は午前１０時から、暗期の運動は午後７時から測定した。
その結果、明期においては、溶媒を投与した陰性対照群および化合物２６３を投与した群における身づくろい行動はそれぞれ１１０１３カウントおよび１７８３０カウント、歩行行動はそれぞれ６７４５カウントおよび１３６１３カウント、後ろ足立ち行動はそれぞれ１９カウントおよび５２カウント、と化合物２６３投与群でいずれも増大していた。
化合物２６３投与によって自発運動量が増大したことから、ＧＰＲ８８の機能抑制剤は運動機能障害を伴う疾患、例えばパーキンソン病、不随意運動、錐体外路症候群、ハンチントン舞踏病、脳血管疾患、脊髄小脳変性症等の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
一方、暗期においては、溶媒を投与した陰性対照群および化合物２６３を投与した群における身づくろい行動はそれぞれ２０１５６４カウントおよび１０８４１１カウント、歩行行動はそれぞれ９８２５４カウントおよび８６６７７カウント、後ろ足立ち行動はそれぞれ１４３９カウントおよび５４１カウント、と化合物２６３投与群でいずれも減少していた。
以上のように、夜行性動物であるマウスにおいて、化合物２６３の投与によって明期の運動量が増大し暗期の運動量が減少した。このことは、体内時計が外界の明暗環境の周期に合わせる光同調を、ＧＰＲ８８が修飾していることを示唆している。したがってＧＰＲ８８の機能制御剤はリズム障害、例えば時差ぼけや季節性感情障害等の治療および／または予防に有効であることが示唆された。
化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩は、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分としてＧＰＲ８８に対する抗体もしくは化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与または静脈内等の非経口投与をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、注射剤等が例示される。
錠剤の調製にあたっては、例えば乳糖、マンニット等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を常法に従って用いればよい。
注射剤の調製にあたっては、水、生理食塩水、植物油、可溶化剤、保存剤、抗酸化剤等を常法に従って用いればよい。
化合物（Ｉ）またはその薬理学的に許容される塩の有効量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常、例えば、成人一日当り０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを３〜４回に分けて投与するのが好ましい。しかしながら、これら投与量および投与回数は前述の種々の条件等により変動する
【図面の簡単な説明】  第１図は、ドパミン受容体拮抗薬ＳＣＨ２３３９０誘発カタレプシーに対する化合物３７の１ナトリウム塩の作用の強度をカタレプシースコアとして示したものである。縦軸はカタレプシースコア（満点５点）を表し、横軸は化合物３７の１ナトリウム塩の投与量（ｍｇ／ｋｇ）を表す。棒グラフは左が対照群の場合を示し、他は化合物３７の１ナトリウム塩の投与群の場合を示す。＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｅｅｌ  ｔｅｓｔ）の有意差を示し、＊＊はｐ＜０．０１（Ｓｔｅｅｌ  ｔｅｓｔ）の有意差を示す。
第２図は、レセルピン誘発カタレプシーに対する化合物３７の１ナトリウム塩の作用の強度をカタレプシースコアとして示したものである。縦軸はカタレプシースコア（満点５点）を表し、横軸は化合物３７の１ナトリウム塩の投与量（ｍｇ／ｋｇ）を表す。棒グラフは左が対照群の場合を示し、右は化合物３７の１ナトリウム塩の投与群の場合を示す。＊はｐ＜０．０５（Ｓｔｅｅｌ  ｔｅｓｔ）の有意差を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、本発明を実施例および参考例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例により限定されることはない。
下記実施例および参考例中の各化合物の物理化学的データは、以下の機器類によって測定した。
１Ｈ  ＮＭＲ：ＪＥＯＬ  ＥＸ−２７０型（２７０ＭＨｚ）またはＪＥＯＬ  ＧＸ−２７０型（２７０ＭＨｚ）
ＩＲ：ＨＯＲＩＢＡ  ＦＴ−２００
ＭＳ：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ（ＡＰＣＩ法）またはＭｉｃｒｏＭａｓｓ  ＺＱ２０００（ＥＳＩ法）
参考例１  Ｇａｌ４−ＥＲを発現する宿主細胞ＫＪＭＧＥＲ８および誘導発現用ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
（１）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２の造成
ｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬株式会社製）をＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）の遺伝子〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を含有するＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ（東京大学の加藤茂明先生より分与）をＡａｔＩＩとＮｄｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐＳＶ２ｂｓｒ由来のＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片およびＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ由来のＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を結合することにより、Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を造成した。
（２）ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドの造成
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＫｐｎＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＫｐｎＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。該プラスミドをＢｇｌＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）をＸｈｏＩとＮｓｉＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ｏｒｉＰ配列を含む２．２ｋｂのＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のＸｈｏＩ切断部位とＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３由来のＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰを造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。
ｐＳＥ０ｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、アンピシリン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、プラスミドｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１を造成した。ｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．１１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。
上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１を造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を取得した。
配列番号８、９、１０および１１で表される塩基配列を有する４種のＤＮＡを合成した。該合成ＤＮＡは混合してアニールすることによりポリアデニル化シグナルをもつ２本鎖ＤＮＡを形成する。該合成ＤＮＡをそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化後、混合してアニールさせることにより、二本鎖ＤＮＡとした。
該二本鎖ＤＮＡとｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１由来のＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡを造成した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＦＲ−ｌｕｃ（ストラタジーン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、０．１４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）断片およびｐＦＲ−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を結合し、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１を作製した。ｐＡＧａｌＳｄ１は、Ｇａｌ４ｐ応答配列（ＵＡＳＧ）を５回繰り返した配列を有するプロモーターを含有している。ｐＡＧａｌＳｄ１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。
ｐＳＥ０ｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理することにより、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を取得した。
上記のｐＳＥ０ｌｕｃ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳｃａＩ（平滑末端）断片およびｐＡＧａｌＳｄ１由来のＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃを造成した。
上記のｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃ内に存在する二つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子から離れた位置に存在する１つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのみをＫｌｅｎｏｗ処理により消失させることにより、ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃを造成した。
上記のｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃをＡｓｐ７１８で切断後、ＳｔｕＩで部分消化しｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃ由来の９．５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ処理し、自己結合させることによりプラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを造成した。
（３）誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
上記（２）で造成したプラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ｏｒｉＰを含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
ｐＡＭｏ−ｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｃＲ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片およびｐＡＭｏ−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｄのＳｔｕｆｆｅｒ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄを造成した。
ｐＡＭｏ−ｎｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。
上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｎｄのＳｔｕｆｆｅｒ配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを造成した。
（４）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の染色体ＤＮＡに組み込んだ細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
（１）で造成したｐＧＥＲｂｓｒＲ２を、１μｇ／μＬになるようにＴＥ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸〕に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、該プラスミドをＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞は、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である。
該形質転換体を、８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地〔ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に、１／４０量の７．５％  ＮａＨＣＯ３、３％  ２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社製）、０．５％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、５，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、５，０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）、３μｇ／ｍＬインシュリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１２５ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬガラクトースを添加した培地〕に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（Ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ  Ｓ）（ＫＫ−４００：科研製薬株式会社製）を２．０μｇ／ｍＬになるように添加し、９６穴プレートに分注（５００〜２０００細胞／穴）して培養を行い、ｐＧＥＲｂｓｒＲ２が染色体ＤＮＡに組み込まれた安定形質転換株（シングルクローン）を多数取得した。各形質転換株は、２．０μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、誘導倍率が高く、かつ非誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
各形質転換株にホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃをエレクトロポレーション法により導入し、２日間培養した。
培養後、Ｅ２（Ｅ８８７５：シグマ−アルドリッチ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、更に２４時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性の測定を行った。活性の測定は、ルミノメーターＬＢ９５３（ベルトールド社製）を用い、細胞溶解用緩衝液〔１％トリトンＸ−１００、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール〕１００μＬを、上記培養液に自動注入後、基質溶液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン〕３００μＬを自動注入し、１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性とした。比較のために、Ｅ２無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
Ｅ２添加条件下のルシフェラーゼ活性とＥ２無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出し、該誘導倍率が高く、且つＥ２無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
（５）ＫＪＭＧＥＲ８を宿主としたホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の誘導発現
（４）で選択したＫＪＭＧＥＲ８細胞に（２）で造成したホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃまたは（３）で造成したコントロールプラスミド（ｐＡＧａｌ９−ｎｄ）を、エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、安定形質転換株（ＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃおよびＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｎｄ）を取得した。
該安定形質転換株を、８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；インビトロジェン社製）（０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（０．２μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（インビトロジェン社製）（０．５ｍｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
該形質転換株にＥ２（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、上記と同様にしてルシフェラーゼ活性の測定を行った。比較のために、Ｅ２無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
Ｅ２添加条件下のルシフェラーゼ活性とＥ２無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出した。その結果、ＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃにおける遺伝子発現の誘導倍率は、約１万倍であった。Ｅ２無添加条件下でのＫＪＭＧＥＲ８／ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のルシフェラーゼ活性は非常に低かった（約６０ＲＬＵ／１０秒）。この結果は、Ｅ２無添加条件下ではほとんどルシフェラーゼ遺伝子が発現していないことを示している。
上記のように、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを誘導発現プラスミド、ＫＪＭＧＥＲ８を宿主として用いた系においては、非誘導時のルシフェラーゼ活性が非常に低く、誘導時のルシフェラーゼ活性が非常に高かった。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃの構造は、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ９−ｄに誘導発現させるレポーター遺伝子として、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を挿入した構造である。したがって、ＫＪＭＧＥＲ８を宿主、ｐＡＧａｌ９−ｎｄまたはｐＡＧａｌ−ｄを誘導発現ベクターとして用いる系は、非誘導時の遺伝子発現量が非常に低く、かつ遺伝子発現の誘導倍率が高い、極めて優れた誘導発現系であることが判明した。
参考例２  Ｇａｌ４−ＥＲを発現し、レポータープラスミドを導入した宿主細胞ＧＢＣ７およびＧＢＣＲ２の作製
（１）ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃおよびｐＡＣＲＥｐｌｕｃの造成
ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を発現することのできるレポータープラスミドであるｐＡＣＲＥｌｕｃおよびｐＡＣＲＥｐｌｕｃを以下の方法で造成した。ｐＡＣＲＥｌｕｃおよびｐＡＣＲＥｐｌｕｃは、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有している。
ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕をＣｌａＩで部分消化し、一カ所切断されたＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＭｌｕＩで部分消化し、９．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）〕をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片、およびｐＡＧＥ２４８由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏｈを造成した。
造成したｐＡＭｏｈをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｒｉＰ、ＵＡＳＧを含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および上記のｐＡＭｏｈ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌ９ｈを造成した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（ストラタジーン社製）をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５由来、宝酒造株式会社製）を用いて脱リン酸化処理し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。配列番号１２および１３で表される塩基配列を有す合成オリゴヌクレオチドをアニールさせることにより、ＣＲＥ配列を２つ含む二本鎖ＤＮＡを調製した。該二本鎖ＤＮＡとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋由来の上記ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を２つ含むプラスミドｐＢＳ−ＣＲＥＩを造成した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩは、該二本鎖ＤＮＡが、ＳａｌＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、上記切断部位をそれぞれ１つ有している。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を４つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＩを造成した。
上記のｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を８つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＶを造成した。
上記のｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断しファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断しＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を１６含むｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩを造成した。
上記のｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、１６個のＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＧａｌＳｄ１をＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９ｈをＸｂａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＭｌｕＩで切断することによりＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＧａｌ９ｈ由来のＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｈを作製した。
参考例２の（２）で造成したｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｈをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＲＥ配列を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＣＲＥｈ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃを作製した。
上記のｐＡＣＲＥｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＸｈｏＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片、およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片をそれぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来の上記２種のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片を結合することにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃ中のＣＲＥ配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトが消失したプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＨを作製した。
ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断し、ｌｕｃ＋遺伝子（改変型のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を取得した。上記で作製したｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを作製した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の造成
上記（１）で作製したレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを、１μｇ／μＬになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、該プラスミドを、エレクトロポレーション法によりＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）（３００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０−ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
ＣＲＥを介した遺伝子発現が起こるかどうかを確認するために、該形質転換株を、２ａ型のアデノシン受容体（Ａ２ａ）のアゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ：シグマ−アルドリッチ社製）、アデニレートシクラーゼの活性剤であるフォルスコリン（シグマ−アルドリッチ社製）、またはカルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７〔リサーチ・バイオケミカル・インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製〕を用いて、下記条件で刺激した。
即ち、上記安定形質転換株を４８穴プレート１穴あたり１×１０５細胞ずつ分注し、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）、フォルスコリン（終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ）、またはＡ２３１８７（終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加後、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で５時間培養し、刺激した。
刺激後、参考例１の（４）に記載の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性測定をおこなった。
その結果、ＮＥＣＡ刺激で約７倍、フォルスコリン刺激で約１０倍のホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇がみられた。一方、Ａ２３１８７刺激ではホタル・ルシフェラーゼ活性はほとんど変化しなかった。
以上の結果から、ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞においては、ＣＲＥからの転写を促す刺激により、ルシフェラーゼ遺伝子が発現することが明らかになった。
即ち、ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞を用いることにより、ＣＲＥからの転写を促す活性を有する物質を探索することが可能である。
ｐＡＣＲＥｐｌｕｃを導入したＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞をＮＥＣＡで刺激し、６、２４、４８、７２、および９６時間後にホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した結果、６時間で活性が最大となり、２４時間でほぼ半減した。従って、該細胞を任意の物質で刺激する場合は、刺激後６時間目に活性を測定することが好ましいと考えられた。
（３）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
（１）で作製したｐＡＣＲＥｐｌｕｃ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＨｐａＩ、ＳｐｅＩ、またはＢａｌＩで切断したｐＡＣＲＥｐｌｕｃを１μｇ／μＬになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法により、参考例１の（４）で造成したＫＪＭＧＥＲ８に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に７日間培養した。生細胞数を確認後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびＫＪＭＧＥＲ８を１×１０５細胞／ｍＬを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６穴プレートに分注（平均３０細胞／穴）して培養を行い、実際に１穴当たり１コロニーを形成した穴を選択し、４２０個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（４）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（３）で取得した各クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６時間培養した。
培養後、参考例１の（４）に記載の方法を用いて各穴のホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。測定器としてはＭｉｃｒｏ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）を使用した。活性の高かった１７クローンを選択した。
該１７クローンを用い、上記（２）と同様の方法でＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない場合と比較し、ルシフェラーゼ活性が６０倍以上上昇した８クローンを選択した。該８クローンをそれぞれＧＢＣ１、ＧＢＣ２、ＧＢＣ３、ＧＢＣ４、ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７およびＧＢＣ８と命名した。
該８クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２〔構成活性型のＧ蛋白質共役型受容体であるＧＰＲ１２を誘導発現するためのプラスミド：下記参考例４の（３）参照〕を、上記エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株にＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、参考例１の（４）と同様の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、Ｅ２無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
Ｅ２を添加した際のルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった３クローン（ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７）を選択した。ＧＢＣ５、ＧＢＣ６およびＧＢＣ７における該上昇率は、それぞれ５６、１９３、および３６４倍であった。
該３クローンに、上記と同様の方法で２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２（下記参考例４の（１）参照）を導入して安定形質転換株を取得し、Ｅ２刺激により導入遺伝子（Ｖ２遺伝子）を誘導発現させた後に、バソプレッシン刺激した際のルシフェラーゼ活性を調べた。同時に、Ｅ２刺激しない場合の活性、およびバソプレッシン刺激しない場合の活性を調べた。
以上の結果、Ｅ２で刺激した時にのみバソプレッシンに反応して高いルシフェラーゼ活性（５９９倍）を示したＧＢＣ７を優良株として選択した。
（５）ウミシイタケ・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃの造成
ｐＲＬ−ＳＶ４０  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＸｂａＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片を取得した。上記（１）で構築したｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＲＬ−ＳＶ４０  ｖｅｃｔｏｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃを造成した。
（６）レポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
上記（３）で記載した方法に準じて、ｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８に導入し、９６個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（７）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、上記（４）に記載した方法に準じ、上記（６）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。
上記（６）で取得した各クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中、３７℃で６時間培養した。その後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）を用いた。活性の高かった９クローンを選択した。該９クローンをそれぞれＧＢＣＲ１、ＧＢＣＲ２、ＧＢＣＲ３、ＧＢＣＲ４、ＧＢＣＲ５、ＧＢＣＲ６、ＧＢＣＲ７、ＧＢＣＲ８およびＧＢＣＲ９と命名した。
該９クローンについて、ＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない時と比較し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が１８倍以上上昇した２クローンを選択した。該２クローンをそれぞれＧＢＣＲ１およびＧＢＣＲ２と命名した。
該２クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２を導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株をＥ２で２４時間刺激後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、Ｅ２無添加条件下でのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性も測定した。Ｅ２を添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった１クローン（ＧＢＣＲ２）を優良株として選択した。該上昇率は３６４倍であった。
参考例３  キメラＧαｓおよびＧａｌ４−ＥＲを発現し、レポータープラスミドを導入した宿主細胞ＧＢＣＣ１３およびＧＢＣＲＣ６の造成
（１）Ｎｏｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて全ＲＮＡを取得した。鋳型として該全ＲＮＡを５μｇ用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で５０倍希釈し、ＰＣＲの鋳型として使用した。
上記一本鎖ｃＤＮＡ（１０μＬ）に、Ｇαｓ４遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｎｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ混合液を４μＬ、ジメチルスルフォキシドを２．５μＬ、５単位／μＬＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．２５μＬ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を５μＬ添加し、滅菌水を加えて全量を５０μＬに調製した。Ｇαｓ４遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１４および１５に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これらプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。サーマルサイクラーＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。
プラスミドｐＡＭｏｈをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。
ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＭｏｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｇαｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４を造成した。
（２）プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑの造成
ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｑのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧαｓ（以下、Ｇαｓ−ｑと呼ぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを以下のように造成した。
上記（１）で構築したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩとＡｓｐ７１８で切断することによりｏｒｉＰを含むＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。また、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩで切断後、ＳｐｈＩで部分消化することにより、Ｃ末端を欠失したＧαｓ４をコードするＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を取得した。
配列番号１６および１７で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。
該二本鎖ＤＮＡ、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを造成した。
（３）プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉの造成
ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧαｓ（以下、Ｇαｓ−ｉと呼ぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを以下のように造成した。
配列番号１８および１９で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｉのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、上記（２）で取得したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを造成した。
（４）プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉおよびｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉの造成
Ｇαｓ−ｑおよびＧαｓ−ｉの発現プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ、ならびにＧαｓ−ｑおよびＧαｓ−ｉの発現プラスミドでありホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドでもあるｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを以下のようにして構築した。
参考例２の（１）で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃをＣｌａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＣｐｏＩで切断することにより、ｏｒｉＰおよびＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分を含むＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片を取得した。上記（３）で造成したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｉをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０（１９９４）〕をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＢｓｓＨＩＩで切断し、モロニー・マウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター〔以下、Ｍｏプロモーターと略す〕配列の一部を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを造成した。
上記（２）で造成したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｑをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ならびに上記で取得したｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片およびｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを造成した。
上記で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを、ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＭｏプロモーターを含むＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ＣｐｏＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＧαｓ−ｉをコードするＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、それぞれ取得した。さらに上記で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを、ＮｈｅＩおよびＣｐｏＩで切断しＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片を、ＮｈｅＩおよびＮａｅＩで切断しＧαｓ−ｑをコードするＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片を、それぞれ取得した。
これらｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ由来のＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片およびＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、ならびにｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑ由来のＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片およびＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片の４断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
造成したｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉプラスミドをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＳａｌＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片をセルフライゲーションすることにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉからＣＲＥレポーターユニットを除去したプラスミドｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
上記のｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＣｐｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＡｓｅＩで切断することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含まないＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ（クロンテック社製；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｕ０７６４８）をＢａｍＨＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、更にＡｓｅＩで切断することにより、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片を取得した。このｐＰＵＲ由来のＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片、および上記のｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ由来のＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を結合し、ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のハイグロマイシン耐性遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子で置き換えたｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
（５）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣ７の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
上記（４）で造成したｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＳｐｅＩで切断したｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを１μｇ／μＬになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法により上記参考例２の（４）で造成した細胞株ＧＢＣ７に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換株を、８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ；シグマ社製）（２．０μｇ／ｍＬ）を添加し、更に７日間培養した。
培養後、該形質転換株の生細胞数を確認し、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびＫＪＭＧＥＲ８（１×１０６細胞／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、該形質転換株が１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６穴プレートに分注（３０細胞／穴）して培養を行い、９３個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（６）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（５）で取得した９３クローンを９６穴プレートにまき（１〜２×１０４細胞／穴）、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００（インビトロジェン社製）を用いて、１型アンジオテンシンＩＩ受容体誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１（下記参考例４の（２）参照）を各クローンに導入し、形質転換株を取得した。遺伝子導入の具体的方法はリポフェクトアミン２０００の説明書に従って行い、１穴当たりプラスミドを０．３μｇ、リポフェクトアミン２０００を０．８μＬ使用した。
該形質転換株を１日培養した後に、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で７日間培養した。各穴へＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、更に１日間培養した。各穴へアンジオテンシンＩＩ（ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、６時間培養後、参考例２の（４）の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩで刺激しない場合の活性を調べた。以上の結果、アンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性を示した１０クローンを選択した。
該１０クローンに、再度ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をエレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株にＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、アンジオテンシンＩＩ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、更に６時間培養後、参考例２の（４）に記載した方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、Ｅ２で刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩで刺激しない場合の活性を測定した。Ｅ２で刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性（８５倍）を示したＧＢＣＣ１３を優良株として選択した。
（７）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣＲ２の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
上記（５）で記載した方法に準じて、（４）で造成したｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを上記参考例２の（６）で造成した細胞株ＧＢＣＲ２に導入することにより、９４個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（８）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）の選択
上記（７）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、上記（６）に記載した方法に準じた。ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性は、参考例２の（７）に記載した方法に準じて測定した。
上記（７）で取得した各クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞をＥ２で処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩで刺激しない場合の活性を測定した。アンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示した１３クローンを選択した。
該１３クローンに再度ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をエレクトロポレーション法により導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞をＥ２で処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、Ｅ２で刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩで刺激しない場合の活性を測定した。Ｅ２で刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性（１３２倍）を示したＧＢＣＲＣ６を優良株として選択した。
参考例４  各種ＧＰＣＲ誘導発現プラスミドおよびＧＰＲ８８誘導発現プラスミドの造成
（１）２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２の造成
鋳型として、ヒト腎臓由来のｍＲＮＡ（１μｇ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、Ｖ２遺伝子特異的プライマーとして配列番号２０および２１に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＶ２遺伝子を取得した。Ｖ２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。
得られたＶ２遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。
プラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。
上記Ｖ２遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｖ２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２を造成した。
（２）１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１の造成
プラスミドｐＡＲ１．８〔Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２３０（１９９１）〕をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ウシＡＴ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。
参考例１の（２）で造成したｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。
ｐＡＲ１．８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合し、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を造成した。
（３）ＧＰＲ１２の誘導発現プラスミドの造成
鋳型として、ヒト脳梁由来のｍＲＮＡ（１μｇ；クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、構成活性型ＧＰＣＲであるＧＰＲ１２遺伝子〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８，３４７（１９９５）、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｕ１８５４８〕特異的プライマーとして配列番号２２または２３に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＧＰＲ１２遺伝子を取得した。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、使用する酵素に付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ〔ＭＪリサーチ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製〕を用い、９５℃で５分間の処理後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を３０サイクル行った。
ＧＰＲ１２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断後、ＧＰＲ１２遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該切断断片を、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄの対応する制限酵素サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）間へ組み込むことにより、誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２を構築した。
プラスミドに組み込んだＤＮＡ断片の配列を決定し、ＧＰＲ１２をコードしていることを確認した。すなわち、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ中の配列に特異的なプライマー（配列番号２４および２５に示した配列を有する合成ＤＮＡ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；アプライド・バイオシステムズ社製）を使用した。
（４）ＧＰＲ８８の誘導発現プラスミドの造成
鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ（１００ｎｇ；クロンテック社製）を、ヒトＧＰＲ８８遺伝子（配列番号１）特異的プライマーとして配列番号２６および２７に記載した配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＧＰＲ８８遺伝子を取得した。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、使用する酵素に付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪリサーチ社製）を用い、９８℃で２分間の処理後、９８℃で１５秒間、６２℃で３０秒間、６８℃で１分間からなる反応を３０サイクル行った。ＧＰＣＲ８８遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＸｈｏＩサイトが導入されている。増幅断片をＸｈｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理した後にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＧＰＣＲ８８遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを、ＮｏｔＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理した後にＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。ＰＣＲにより得られたＧＰＲ８８遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片とｐＡＧａｌ９−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片とを結合することにより、ＧＰＲ８８誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ８８を構築した。
上記（３）に記載の方法に準じてプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄに組み込んだＤＮＡ断片の配列を決定し、ＧＰＣＲ８８をコードしていることを確認した。
参考例５  ＫＪＭＧＥＲ８を宿主としたＧＰＲ８８のアッセイ細胞の構築と利用
参考例４の（４）で構築したＧＰＲ８８誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ８８（２μｇ）、および参考例３の（４）で構築したＧαｓ−ｑおよびＧαｓ−ｉ発現プラスミド兼レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ（２μｇ）を、エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞の参考例１の（４）で選択した細胞株ＫＪＭＧＥＲ８に共導入した。該形質転換株を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株（ＧＰＲ８８アッセイ細胞１と呼ぶ）を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
同様にして、参考例１の（３）で造成したコントロールプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄ（２μｇ）ならびに参考例３の（４）で造成したＧαｓ−ｉおよびＧαｓ−ｑ発現プラスミド兼レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ（２μｇ）をＫＪＭＧＥＲ８に共導入し、安定形質転換株（以下、コントロール細胞１と呼ぶ）を取得した。
ＧＰＲ８８アッセイ細胞１およびコントロール細胞１をそれぞれ９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した。各穴へＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してさらに１日間培養後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を添加し、トップカウント（パッカード社製）を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。また、Ｅ２を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。
Ｅ２を添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とした。コントロール細胞１における誘導倍率は約１であった。一方、ＧＰＲ８８アッセイ細胞１の誘導倍率は約４〜６倍であった。ＧＰＲ８８は、誘導発現するだけでシグナルを流すことから、構成活性型ＧＰＣＲであることがわかった。
参考例６  ＧＢＣＣ１３を宿主としたＧＰＲ８８のアッセイ細胞の構築と利用
参考例４の（４）で構築したＧＰＲ８８誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ８８（４μｇ）を、エレクトロポレーション法により１．６×１０６細胞の参考例３の（６）で選択した細胞株ＧＢＣＣ１３に導入した。該形質転換株を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株（ＧＰＲ８８アッセイ細胞２と呼ぶ）を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
同様にして、参考例１の（３）で造成したコントロールプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄ（４μｇ）をＧＢＣＣ１３に導入し、安定形質転換株（コントロール細胞２と呼ぶ）を取得した。
ＧＰＲ８８アッセイ細胞２またはコントロール細胞２を９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養した。各穴へＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してさらに１日間培養後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、トップカウント（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。また、Ｅ２を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。
Ｅ２を添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とした。コントロール細胞２における誘導倍率は約１であった。一方、ＧＰＲ８８アッセイ細胞２の誘導倍率は約４−１８倍であった。ＧＰＲ８８は、誘導発現するだけでシグナルを流すことから、構成活性型ＧＰＣＲであることがわかった。
参考例７  ＧＢＣＲＣ６を宿主としたＧＰＲ８８のアッセイ細胞の構築
参考例３で構築したＧＢＣＲＣ６に、任意のＧＰＣＲの誘導発現プラスミドを導入することにより任意のＧＰＣＲのアッセイ細胞を構築することができる。
参考例４の（４）で造成したＧＰＲ８８誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ８８（４μｇ）を、エレクトロポレーション法により１．６×１０６細胞のＧＢＣＲＣ６に導入した。該形質転換株を８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、更に１４日間培養して安定形質転換株（ＧＰＲ８８アッセイ細胞３と呼ぶ）を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
同様にして、参考例１の（３）で造成したコントロールプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄ（４μｇ）をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株（コントロール細胞３と呼ぶ）を取得した。
ＧＰＲ８８アッセイ細胞３またはコントロール細胞３を９６穴プレートに分注し（約１×１０４個／穴）、３７℃で１日間培養する。各穴へＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してさらに１日間培養後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）またはＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社製）を用いた。また、Ｅ２を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。Ｅ２を添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とした。
コントロール細胞３における誘導倍率は約１であった。一方、ＧＰＲ８８アッセイ細胞３の誘導倍率は約１５〜４０倍であった。ＧＰＲ８８は、誘導発現するだけでシグナルを流すことから、構成活性型ＧＰＣＲであることがわかった。
参考例８：４−クロロ−５−シアノ−２−メチルチオピリミジンの合成
工程１：５−シアノ−３，４−ジヒドロ−２−メチルチオピリミジン−４−オン・ナトリウム塩の合成
硫酸メチルイソチオ尿素（９０．５ｇ，０．３２５ｍｍｏｌ）を水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｏｌ／Ｌ，３２５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その水溶液に２−エトキシメチレン−２−シアノ酢酸エチル（１００ｇ，０．５９１ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（３５０ｍＬ）を、内温が１５℃を超えないように注意しながら少しずつ滴下した。全てのエタノール溶液を加えた後、水酸化ナトリウム水溶液（２ｍｏｌ／Ｌ，３００ｍＬ）を少しずつ加え、さらにエタノール（１５０ｍＬ）を加え、室温にて一晩攪拌した。反応混合物中に析出した結晶を濾取し、エタノール（５００ｍＬ）で洗浄した。得られた白色結晶を減圧乾燥することで、５−シアノ−３，４−ジヒドロ−２−メチルチオピリミジン−４−オン・ナトリウム塩（１１３．３ｇ，収率１００％）を得た。
工程２：４−クロロ−５−シアノ−２−メチルチオピリミジンの合成
上記で得た５−シアノ−３，４−ジヒドロ−２−メチルチオピリミジン−４−オン（３０．０ｇ，０．１５９ｍｍｏｌ）にオキシ塩化リン（１５０ｍＬ）を加え、７時間加熱還流を行った。反応混合物を放冷した後、オキシ塩化リンを減圧留去した。得られた残渣を氷（約１０００ｍＬ）にあけ、析出した淡黄色固体を濾取し、水で洗浄した。その固体を減圧乾燥することで、４−クロロ−５−シアノ−２−メチルチオピリミジン（１１．９ｇ，収率４０％）を得た。
参考例９：２−ベンジル−Ｎ−メチルアニリンの合成
工程１：２−ベンジルトリフルオロアセトアニリドの合成
２−ベンジルアニリン（５．００ｇ，２７．３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、その溶液に−２０℃にてトリエチルアミン（７．６ｍＬ，５５ｍｍｏｌ）および無水トリフルオロ酢酸（４．１７ｍＬ，３０．０ｍｍｏｌ）を加え、３０分間攪拌した。室温にて１時間攪拌した後、反応液をジクロロメタンで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色結晶として２−ベンジルトリフルオロアセトアニリド（７．５１ｇ，２６．９ｍｍｏｌ，収率９９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：４．００（ｓ，２Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２３−７．４０（ｍ，６Ｈ），７．７９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）
工程２：２−ベンジル−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアニリドの合成
工程１で得られた２−ベンジルトリフルオロアセトアニリド（７．５１ｇ，２６．９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液に炭酸カリウム（７．５４ｇ，５４．６ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（３．４０ｍＬ，５４．６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、２−ベンジル−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアニリド（７．４９ｇ，２５．６ｍｍｏｌ，収率９５％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．１３（ｓ，３Ｈ），３．９４（ｓ，２Ｈ），７．１１−７．３５（ｍ，９Ｈ）
工程３：２−ベンジル−Ｎ−メチルアニリンの合成
工程２で得られた２−ベンジル−Ｎ−メチルトリフルオロアセトアニリド（７．４９ｇ，２５．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍＬ）に溶解し、その溶液に炭酸カリウム（７．５４ｇ，５４．６ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、５時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、２−ベンジル−Ｎ−メチルアニリン（４．７０ｇ，２３．８ｍｍｏｌ，収率９２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．７４（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．８５（ｓ，２Ｈ），６．６３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１３−７．２９（ｍ，６Ｈ）
参考例１０：ベンゾトリアゾール−１−イル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラートの合成
工程１：エチル  ４−（ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラートの合成
市販のエチル  ４−クロロ−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラート（１５．０ｇ，６４．５ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン（１５０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２７．６ｍＬ，１６１ｍｍｏｌ）および２−ベンジルアニリン（１３．０ｇ，７０．９ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下１８時間攪拌した。反応液を減圧留去し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水、５％クエン酸水溶液および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（１９．６ｇ，５１．６ｍｍｏｌ，収率８０％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），４．０２（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１０−７．２７（ｍ，８Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．７０（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３８０（Ｍ＋Ｈ）＋
工程２：エチル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラートの合成
工程１で得られたエチル  ４−（ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラート（５．００ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下ｍ−クロ濾過安息香酸（含量６５％，２．７０ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加え、室温で３０分間攪拌した。さらに氷冷下ｍ−クロ濾過安息香酸（含量６５％，１．１３ｇ，７．５３ｍｍｏｌ）を５分間かけて加え、室温で２０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を１，２−ジメトキシエタン（５０ｍＬ）に溶解し、シクロヘキシルメチルアミン（２．５７ｍＬ，１９．８ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下２．５時間攪拌した。反応液を減圧留去し、得られた残渣をエタノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（４．８７ｇ，１１．０ｍｍｏｌ，収率８３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９８（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４０−１．７３（ｍ，６Ｈ），３．０６（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．９８（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０６−７．２４（ｍ，８Ｈ），７．４０（ｂｒ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：４４５（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：２４６８，２４５８，１６６６，１６２９，１６０８，１５７７，１５４６，１５２１，１５０２，１４９４，１４６３，１４４６，１４３０，１３９４，１３９０，１３６９ｃｍ−１
工程３：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸の合成
工程２で得られたエチル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（１．００ｇ，２．２５ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（７．００ｍＬ，７．００ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で４時間攪拌した。次いでエタノール（７ｍＬ）および４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．００ｍＬ，４．００ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、３０分間攪拌した。さらに４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１．００ｍＬ，４．００ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２時間攪拌した。反応液を半分の体積まで減圧濃縮し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液で反応液のｐＨを４．５に調整した。析出した結晶を濾取することにより白色結晶として標記化合物（０．９９ｇ，２．２ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０．７８−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．０３−１．２９（ｍ，３Ｈ），１．４７−１．８１（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），６．８９−７．１０（ｍ，１Ｈ），７．１２−７．３５（ｍ，８Ｈ），７．５０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），１１．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９１８，２８４１，１６６４，１６５５，１６４９，１６３７，１６３２，１６１０，１５８９，１５７８，１５７０，１５５２，１５４１，１５３５，１５１０，１４５４，１４１７，１３８１，１３６２ｃｍ−１
工程４：ベンゾトリアゾール−１−イル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラートの合成
工程３で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（５．００ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４．６０ｇ，２４．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．３０ｇ，２４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌した。さらにＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．３０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．６０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、５％クエン酸水溶液および飽和重曹水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去することにより淡黄色結晶として標記化合物（５．６７ｇ，１０．６ｍｍｏｌ，収率８９％）を得た。この化合物は更なる精製を行うことなく次工程に用いた。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７６−１．０８（ｍ，２Ｈ），１．０９−１．３３（ｍ，３Ｈ），１．４３−１．８２（ｍ，６Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１．５Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，０．５Ｈ），３．９２（ｓ，０．５Ｈ），３．９３（ｓ，１．５Ｈ），５．４７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．２５Ｈ），５．８９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．７５Ｈ），６．９９−７．３０（ｍ，９Ｈ），７．４２−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，０．２５Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，０．７５Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．９５（ｓ，０．７５Ｈ），９．０３（ｂｒ  ｓ，０．２５Ｈ），９．０８（ｓ，０．２５Ｈ），９．１９（ｂｒ  ｓ，０．７５Ｈ）
実施例１：化合物１〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）ピリミジン〕の合成
工程１：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−メチルチオピリミジンの合成
参考例８で得られた４−クロロ−５−シアノ−２−メチルチオピリミジン（８００ｍｇ，４．３１ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（８ｍＬ）に溶解し、その溶液に２−ベンジルアニリン（８６９ｍｇ，４．７４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．９０ｍＬ，６．４６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間攪拌した。反応液を水で希釈し、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、淡黄色結晶として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−メチルチオピリミジン（１．１５ｇ，３．４６ｍｍｏｌ，収率８０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．３４（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１２−７．３２（ｍ，８Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ）
工程２：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジンの合成
工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−メチルチオピリミジン（１．１５ｇ，３．４６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（６５％、１．３８ｇ，５．２ｍｍｏｌ）を５分間かけて加え、室温にて５時間攪拌した。反応液を飽和重曹水で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解し、その溶液にシクロヘキシルメチルアミン（０．５４ｍＬ，４．１５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を水で希釈し、析出した結晶を濾取することにより、淡黄色結晶の４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン（１．２１ｇ，３．０４ｍｍｏｌ，収率８８％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７６−１．０２（ｍ，２Ｈ），１．０５−１．３４（ｍ，３Ｈ），１．３６−１．９１（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，０．６３Ｈ），３．２４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，０．３７Ｈ），３．９８（ｓ，０．７４Ｈ），４．０１（ｓ，１．２６Ｈ），５．２４（ｂｒ  ｓ，０．３７Ｈ），５．５９（ｂｒ  ｓ，０．６３Ｈ），６．５６（ｂｒ  ｓ，０．３７Ｈ），６．７０（ｂｒ  ｓ，０．６３Ｈ），７．０６−７．４２（ｍ，８Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，０．３７Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，０．６３Ｈ），８．１２（ｓ，０．６３Ｈ），８．２３（ｓ，０．３７Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３９６（Ｍ−Ｈ）−
工程３：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）ピリミジンの合成
工程２で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−シアノ−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン（１．００ｇ，２．５２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、その溶液に塩化アンモニウム（４０４ｍｇ，７．５５ｍｍｏｌ）およびアジ化ナトリウム（４９１ｍｇ，７．５５ｍｍｏｌ）を加え、１００℃にて５時間攪拌した。反応液を飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、析出した結晶を濾取した。得られた粗結晶を酢酸エチルとヘキサンの混合溶媒から再結晶することにより、淡黄色結晶として化合物１（６９３ｍｇ，１．５７ｍｍｏｌ，収率６２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．４０−１．７３（ｍ，６Ｈ），３．０５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），７．０８−７．３０（ｍ，９Ｈ），７．６０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．６１（ｓ，１Ｈ），１０．３６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３９（Ｍ−Ｈ）−
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９２２，２８９１，１６５５，１６４７，１６３７，１５９３，１５７０，１５６０，１５４１，１５２７，１５０８，１４８３，１４５４ｃｍ−１
また、対応する塩酸塩は以下の方法に従って調製した。
上記の化合物１（１．５６ｇ，３．５４ｍｍｏｌ）をエタノール（３０ｍＬ）に懸濁し、その懸濁液に塩化水素酢酸エチル溶液（４ｍｏｌ／Ｌ，９．００ｍＬ，３６．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。析出した結晶を濾取し、エタノールから再結晶することにより、化合物１の１塩酸塩（１．５９ｇ，３．３３ｍｍｏｌ，収率９４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．６５−１．００（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．３０（ｍ，３Ｈ），１．３１−１．８１（ｍ，６Ｈ），２．９５（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．８Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．２Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），６．９９−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２２−７．４２（ｍ，３Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．８Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．２Ｈ），８．６２（ｂｒ  ｓ，０．８Ｈ），８．８２（ｓ，１Ｈ），８．８８（ｂｒ  ｓ，０．２Ｈ），１０．６２（ｓ，０．２Ｈ），１０．６８（ｓ，０．８Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４４１（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：１６８４，１６７０，１６６２，１６５３，１６４９，１６３５，１６３０，１５９３，１５７２，１５６０，１５４１，１５２４，１４９７，１４７３，１４５８，１４１２，１３６７ｃｍ−１
実施例２：化合物２〜化合物３６の合成
工程１：化合物Ｆの合成
2004054617.tif 000051
（式中、Ｒ１およびＡはそれぞれ前記と同義である）
参考例８で得られた４−クロロ−５−シアノ−２−メチルチオピリミジン（０．２５ｍｏｌ／Ｌクロロホルム溶液，０．２０ｍＬ，０．０５０ｍｍｏｌ）とＲ１ＡｒＮＨ（式中、Ｒ１およびＡｒはそれぞれ前記と同義である）で表される化合物Ｅ（１．０ｍｏｌ／Ｌクロロホルム溶液，０．０６０ｍＬ，０．０６０ｍｍｏｌ）の混合液に、モルホリノメチルポリスチレン（３５ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて１日間攪拌した。反応混合物にベンゾイルクロリドポリマーバウンド（２３ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）およびクロロホルム（０．５０ｍＬ）を加え、室温にてさらに１日間攪拌した。反応混合物中の樹脂を濾別し、樹脂をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝３／１，１．２ｍＬ）で洗浄した。得られた溶液を全て合わせ、溶媒を留去して化合物Ｆを得た。
工程２：化合物Ｇの合成
2004054617.tif 000052
（式中、Ｒ１、Ａおよびｍはそれぞれ前記と同義である）
工程１で得られた化合物Ｆをジクロロメタン（０．２０ｍＬ）に溶解し、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（０．５０ｍｏｌ／Ｌジクロロメタン溶液，０．１２５ｍＬ，０．０６３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて０．５〜１時間攪拌した。反応混合物に飽和重曹水（０．２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和重曹水（０．２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムと珪藻土の混合物（硫酸マグネシウム／珪藻土＝１／１，１４０ｍｇ）を加えて攪拌した。硫酸マグネシウムと珪藻土の混合物を濾別し、硫酸マグネシウムと珪藻土の混合物をジクロロメタン（０．８０ｍＬ）で洗浄した。得られた溶液を全て合わせ、溶媒を留去して化合物Ｇを得た。
工程３：化合物Ｊの合成
2004054617.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ａ、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）
工程２で得られた化合物Ｇをテトラヒドロフラン（０．２０ｍＬ）に溶解し、その溶液にＲ３Ｒ４ＮＨ（式中、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ前記と同義である）で表される化合物Ｈ（１．０ｍｏｌ／Ｌクロロホルム溶液，０．０６０ｍＬ，０．０６０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１日間攪拌した。反応混合物にクロロホルム（０．４０ｍＬ）、ベンゾイルクロリドポリマーバウンド（２３ｍｇ，０．０５８ｍｍｏｌ）、ポリ４−ビニルピリジン（２３ｍｇ）を加え、室温にて１日間攪拌した。反応混合物中の樹脂を濾別し、樹脂をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝３／１，１．４ｍＬ）で洗浄した。得られた溶液を全て合わせ、溶媒を留去して化合物Ｊを得た。
工程４：化合物２〜化合物３６の合成
工程３で得られた化合物ＪをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．１０ｍＬ）に溶解し、その溶液にアジ化アンモニウムのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，０．０８０ｍＬ，０．０８０ｍｍｏｌ）を加え、１００℃にて１日間撹拌した。反応液から溶媒を留去し、残渣をクロロホルムと１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコールの混合溶媒（クロロホルム／１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロピルアルコール＝３／１，０．４０ｍＬ）に溶解し、５％クエン酸水溶液で洗浄した。有機層を濃縮した後、残渣をエタノール（０．３００ｍＬ）に溶解し、その溶液にイオン交換樹脂ＡＧ１−Ｘ８（バイオラッド社製）を加え、室温にて２時間撹拌した。反応混合物中の樹脂を濾取し、樹脂をメタノール（０．６０ｍＬ）で洗浄した後、樹脂にクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１／１，０．４０ｍＬ）次いで塩化水素の酢酸エチル溶液（４ｍｏｌ／Ｌ，０．０５０ｍＬ）を加え、目的物を溶出した。さらに樹脂をクロロホルムとメタノールの混合溶媒（クロロホルム／メタノール＝１／１，１．２ｍＬ）で洗浄し、得られた溶出液と洗浄液を合わせて濃縮し、目的とする化合物２〜化合物３６をそれぞれ通算収率約３０％で得た。
得られた化合物２〜化合物３６はそれぞれ質量分析により同定した。各化合物の分析結果は第１表に機器データとして記載する。
実施例３：化合物３７〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸〕の合成
工程１：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチルの合成
市販の４−クロロ−２−メチルチオピリミジン−５−イルカルボン酸エチル（１５．０ｇ，６４．５ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン（１５０ｍＬ）に溶解し、その溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２７．６ｍＬ，１６１ｍｍｏｌ）および２−ベンジルアニリン（１３．０ｇ，７０．９ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、１８時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を酢酸エチルで希釈した後、水を加えて分液した。有機層を５％クエン酸水溶液および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノールから再結晶することにより、白色結晶として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチル（１９．６ｇ，５１．６ｍｍｏｌ，収率８０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），４．０２（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．１０−７．２７（ｍ，８Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．７０（ｓ，１Ｈ），１０．００（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３８０（Ｍ＋Ｈ）＋
工程２：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸エチルの合成
工程１で得られた化合物（５．０ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（２．７０ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加え、室温にて３０分間攪拌した。さらに氷冷下、反応液にメタクロ濾過安息香酸（１．１３ｇ，７．５３ｍｍｏｌ）を５分間かけて加え、室温にて２０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を１，２−ジメトキシエタン（５０ｍＬ）に溶解し、その溶液にシクロヘキシルメチルアミン（２．５７ｍＬ，１９．８ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２．５時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をエタノールから再結晶することにより、白色結晶として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸エチル（４．８７ｇ，１１．０ｍｍｏｌ，収率８３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９８（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．２９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４０−１．７３（ｍ，６Ｈ），３．０６（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．９８（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０６−７．２４（ｍ，８Ｈ），７．４０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），９．８５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４４５（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：２４６８，２４５８，１６６６，１６２９，１６０８，１５７７，１５４６，１５２１，１５０２，１４９４，１４６３，１４４６，１４３０，１３９４，１３９０，１３６９ｃｍ−１
工程３：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸の合成
工程２で得られた化合物（１．００ｇ，２．２５ｍｍｏｌ）をエタノール（７ｍＬ）に溶解し、その溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，７．０ｍＬ，６．５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃にて４時間攪拌した。反応液にエタノール（７ｍＬ）および水酸化ナトリウム水溶液（４．０ｍｏｌ／Ｌ，１．０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、３０分間攪拌した。
さらに反応液に水酸化ナトリウム水溶液（４．０ｍｏｌ／Ｌ，１．０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２時間攪拌した。反応液を半分の体積まで減圧濃縮し、塩酸（１．０ｍｏｌ／Ｌ）で反応液のｐＨ値を４．５に調整した。析出した結晶を濾取し、白色結晶として化合物３７（０．９９０ｇ，２．２５ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０．７８−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．０３−１．２９（ｍ，３Ｈ），１．４７−１．８１（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），６．８９−７．１０（ｍ，１Ｈ），７．１２−７．３５（ｍ，８Ｈ），７．５０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．４８（ｓ，１Ｈ），１１．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋
また、対応するナトリウム塩は以下の方法に従って調製した。
上記で得られた化合物３７（１．７ｇ，４．０８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解し、その溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，４．１ｍＬ，４．１ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した後、反応液を減圧濃縮した。得られた残渣を水で再結晶化することにより、白色結晶として化合物３７の１ナトリウム塩（１．６９ｇ，３．８５ｍｍｏｌ，収率９４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，）δ（ｐｐｍ）：０．７６−１．００（ｍ，２Ｈ），１．０２−１．３２（ｍ，３Ｈ），１．４４−１．９０（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），６．７９−７．４９（ｍ，９Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），８．５７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１３．０８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：３０４５，２９９１，２９６６，２９５４，２９３３，２９１４，２８４６，１６６４，１６３１，１６１０，１５９２，１５７７，１５５２，１５３９，１５３５，１５１０ｃｍ−１
実施例４：化合物３８〔４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸〕の合成
工程１：４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチルの合成
市販の４−クロロ−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチル（３．９０ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン（３０ｍＬ）に溶解し、その溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７．８ｍＬ，４６ｍｍｏｌ）および参考例２で得られた２−ベンジル−Ｎ−メチルアニリン（３．０ｇ，１５ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮した。得られた残渣に酢酸エチルおよび水を加えて分液した後、有機層を５％クエン酸水溶液および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノールから再結晶することにより、白色結晶として４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチル（５．０６ｇ，１２．９ｍｍｏｌ，収率７７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．０４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｓ，２Ｈ），７．０７−７．２９（ｍ，９Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ）
工程２：４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸エチルの合成
工程１で得られた４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチル（３．００ｇ，７．６２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（１．５７ｇ，９．１５ｍｍｏｌ）を５分間かけて加え、室温にて３０分間攪拌した。さらに氷冷下、反応液にメタクロ濾過安息香酸（０．６５ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を１，２−ジメトキシエタン（３０ｍＬ）に溶解し、その溶液にシクロヘキシルメチルアミン（１．４８ｍＬ，１１．４ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、１．５時間攪拌した。反応液を放冷した後、生じた結晶を濾取した。得られた粗結晶をエタノールから再結晶することにより、白色結晶として４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸エチル（２．８７ｇ，６．２７ｍｍｏｌ，収率８２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．８５−０．９３（ｍ，２Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．０９−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．５１−１．６５（ｍ，６Ｈ），３．０５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８２（ｓ，２Ｈ），６．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．０３−７．２８（ｍ，９Ｈ），８．１２（ｓ，１Ｈ）
工程３：４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸の合成
工程２で得られた４−［（２−ベンジルフェニル）（メチル）アミノ］−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸エチル（０．５ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）に溶解し、その溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，１０ｍＬ，１０ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２４時間攪拌した。反応液を半分の体積まで減圧濃縮し、塩酸（１．０ｍｏｌ／Ｌ）で反応液のｐＨ値を４．５に調整した。析出した結晶を濾取し、白色結晶として化合物３８（４７４ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．８３−０．９１（ｍ，２Ｈ），１．１２−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．４８−１．６３（ｍ，６Ｈ），３．０４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．１８（ｓ，３Ｈ），３．８７（ｓ，２Ｈ），７．００−７．４１（ｍ，１０Ｈ），８．２２（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９３０，２８４０，２３８０，２３５０，１６５５，１５１０，１４９０，１３８５，１３７５ｃｍ−１
実施例５：化合物３９〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボヒドロキサム酸〕の合成
工程１：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イルの合成
実施例３で得られる化合物３７（５．００ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（４．６０ｇ，２４．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．３０ｇ，２４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて５時間攪拌した。さらに反応液にＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．３０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．６０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を５％クエン酸水溶液および飽和重曹水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去することにより、淡黄色結晶として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（５．６７ｇ，１０．６ｍｍｏｌ，収率８９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７６−１．０８（ｍ，２Ｈ），１．０９−１．３３（ｍ，３Ｈ），１．４３−１．８２（ｍ，６Ｈ），３．１４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１．５Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，０．５Ｈ），３．９２（ｓ，０．５Ｈ），３．９３（ｓ，１．５Ｈ），５．４７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．２５Ｈ），５．８９（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，０．７５Ｈ），６．９９−７．３０（ｍ，９Ｈ），７．４２−７．６０（ｍ，２Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，０．２５Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，０．７５Ｈ），８．１０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．９５（ｓ，０．７５Ｈ），９．０３（ｂｒ  ｓ，０．２５Ｈ），９．０８（ｓ，０．２５Ｈ），９．１９（ｂｒ  ｓ，０．７５Ｈ）
工程２：〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボヒドロキサム酸〕の合成
工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（１．４０ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、その溶液にヒドロキシルアミン塩酸塩（５４６ｍｇ，７．８８ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．２７ｇ，９．１８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水にて洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた油状物質を酢酸エチルから再結晶することにより、淡黄色結晶として化合物３９（４９０ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ，収率４３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７６−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．２６（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．７４（ｍ，６Ｈ），３．０６（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），６．９９−７．２６（ｍ，９Ｈ），８．１１（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ），８．６５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．７７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３２（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例６：化合物４０〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキサミド〕の合成
実施例５の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（２００ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にアンモニア水（２８％，５ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノールから再結晶することにより、白色結晶として化合物４０（７７ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，収率５０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，７０℃）δ（ｐｐｍ）：０．８６−０．９４（ｍ，２Ｈ），１．１２−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．４９−１．６８（ｍ，６Ｈ），３．１２（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），６．９８−７．２４（ｍ，９Ｈ），７．２８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｓ，１Ｈ），１１．３２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１６（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例７：化合物４１〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）カルボキサミド〕の合成
実施例５の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（２５０ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．５ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、その溶液に２−アミノエタノール（７１μＬ，１．４６ｍｍｏｌ）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）（２１７μＬ，１．４６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノールから再結晶することにより、白色結晶として化合物４１（８６ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ，収率３２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．６９−０．９０（ｍ，２Ｈ），０．９６−１．２６（ｍ，３Ｈ），１．３１−１．８０（ｍ，６Ｈ），３．００（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．５４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．８１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），６．９４−７．２８（ｍ，９Ｈ），７．７７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．１６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１１．４８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４６０（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：３１２５，２８９０，１７３４，１７１６，１６９５，１６６８，１６６２，１６５５，１６０１，１５８１，１５５８，１５５１，１５２７，１４９７，１４７３，１４５４，１４３１，１４１７ｃｍ−１
実施例８：化合物４２〔２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニルアミノ］酢酸〕の合成
工程１：２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニルアミノ］酢酸＝ｔｅｒｔ−ブチルの合成
実施例５の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（２５０ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、その溶液にグリシンｔｅｒｔ−ブチル塩酸塩（１９６ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（３５０μＬ，２．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて６時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物質として２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニルアミノ］酢酸＝ｔｅｒｔ−ブチル（２４６ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ，収率９９％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．０２−１．２８（ｍ，３Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．４３−１．７７（ｍ，６Ｈ），３．０５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），６．９７−７．４３（ｍ，９Ｈ），８．０９（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），１０．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
工程２：２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニルアミノ］酢酸の合成
工程１で得られた２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニルアミノ］酢酸＝ｔｅｒｔ−ブチル（２４６ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、その溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，１．８４ｍＬ，１．８４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１５分間攪拌した。塩酸（１．０ｍｏｌ／Ｌ）で反応液のｐＨ値を４．５に調整し、水（５ｍＬ）を加え、析出した結晶を濾取した。得られた粗結晶を２−プロパノールから再結晶することにより、白色結晶として化合物４２（１７６ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９９（ｍ，２Ｈ），１．００−１．３２（ｍ，３Ｈ），１．４０−１．５５（ｍ，１Ｈ），１．５６−１．９０（ｍ，５Ｈ），３．０５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），４．０５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），７．０２−７．２３（ｍ，９Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１１．５３（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４７４（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３８０，３２４０，３０６５，２９３０，２８６８，１７０１，１６９７，１６７０，１６６２，１６５２，１６０２，１５８５，１５６０，１５４３，１５２４，１４９８，１４７３，１４５２，１４３７，１４１７，１４１２ｃｍ−１
実施例９：化合物４３〔２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニル−Ｎ−メチルアミノ］酢酸〕の合成
工程１：２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニル−Ｎ−メチルアミノ］酢酸エチルの合成
実施例５の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（１．０ｇ，１．８７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１０ｍＬ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、その溶液にＮ−メチルアミノ酢酸エチル塩酸塩（４３０ｍｇ，２．８１ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８４０μＬ，５．６２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液を加えて分液した後、有機層を飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物質として２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニル−Ｎ−メチルアミノ］酢酸エチル（９９０ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．７６−０．９８（ｍ，２Ｈ），１．０１−１．２７（ｍ，３Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．４２−１．７７（ｍ，６Ｈ），３．０４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ），３．９３（ｓ，２Ｈ），４．１３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１６（ｓ，２Ｈ），６．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．０１−７．２４（ｍ，８Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．９０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
工程２：２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニル−Ｎ−メチルアミノ］酢酸の合成
工程１で得られた２−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−イルカルボニル−Ｎ−メチルアミノ］酢酸エチル（９９０ｍｇ，１．８７ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶解し、その溶液に水酸化ナトリウム水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ，４．０ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を半分の体積まで濃縮し、水（２０ｍＬ）で希釈した。塩酸水溶液（１．０ｍｏｌ／Ｌ）で反応液のｐＨ値を４．５に調整し、析出した結晶を濾取した。得られた粗結晶をエタノールから再結晶することにより、白色結晶として化合物４３（３０５ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ，収率３４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．７７−１．００（ｍ，２Ｈ），１．０４−１．３２（ｍ，３Ｈ），１．４４−１．７４（ｍ，６Ｈ），３．０７（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．０８（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｓ，２Ｈ），６．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．０４−７．２５（ｍ，８Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ），８．９３（ｂｒ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４８８（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：２７８０，１６５３，１６４７，１６３７，１６１８，１６１０，１６０１，１５８３，１５６０，１５４５，１５３５，１５２９，１５０８，１４９５，１４５０，１４２３，１４００ｃｍ−１
実施例１０：化合物４４〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチルピリミジン〕の合成
実施例５の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸＝ベンゾトリアゾール−１−イル（２．００ｇ，３．７５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気中、氷冷下、その溶液に水素化リチウムアルミニウム（０．２８ｇ，７．５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。氷冷下、反応液に水（０．３０ｍＬ）、水酸化ナトリウム水溶液（４．０ｍｏｌ／Ｌ，０．３０ｍＬ）および水（１．０ｍＬ）を順次加え、室温にて１５分間攪拌した。析出した固体を珪藻土を通して濾過し、クロロホルムで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせ、水で希釈したのち、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、淡黄色結晶として化合物４４（１．６９ｇ，０．７６ｍｍｏｌ，収率２０％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．７４−１．０１（ｍ，２Ｈ），１．０２−１．３１（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．８１（ｍ，６Ｈ），３．１５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），４．２７（ｓ，２Ｈ），７．０５−７．２６（ｍ，９Ｈ），７．４１（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４０３（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：３５００，２９００，２８５８，１９１５，１８９４，１８８８，１８７５，１８６７，１７１３，１７０９，１７０５，１６９３，１６８７，１６７８，１６７２，１６５７，１６５１，１６２２，１６１２ｃｍ−１
実施例１１：化合物４５〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）ピリミジン〕の合成
工程１：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−メチルチオピリミジンの合成
実施例３の工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジン−５−カルボン酸エチル（５．０ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気中、氷冷下、その溶液に水素化リチウムアルミニウム（０．６ｇ，１５．８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３．５時間攪拌した。さらに、アルゴン雰囲気中、氷冷下、反応液に水素化リチウムアルミニウム（０．１５ｇ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１．５時間攪拌した。氷冷下、反応液に水（０．８ｍＬ）、水酸化ナトリウム水溶液（４ｍｏｌ／Ｌ，０．８ｍＬ）および水（２．４ｍＬ）を順次加え、室温にて１５分間攪拌した。析出した固体を珪藻土を通して濾過し、クロロホルムで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせ、水で希釈した後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物質として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−メチルチオピリミジン（３．７０ｇ，１１．０ｍｍｏｌ，収率８３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして２．４０（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），４．３４（ｓ，２Ｈ），７．１０−７．３２（ｍ，８Ｈ），７．６６（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）
工程２：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ホルミル−２−メチルチオピリミジンの合成
工程１で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−メチルチオピリミジン（３．７０ｍｇ，１１．０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１００ｍＬ）に溶解し、その溶液に二酸化マンガン（８．０ｇ，１１０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌した。反応液を珪藻土を通して濾過し、濾別した固体をクロロホルムで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせて減圧濃縮し、得られた残渣をエタノールから再結晶することにより、淡黄色結晶として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ホルミル−２−メチルチオピリミジン（１．９４ｇ，５．７８ｍｍｏｌ，収率５３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，）δ（ｐｐｍ）：２．４１（ｓ，３Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），７．０８−７．２８（ｍ，８Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），９．７２（ｓ，１Ｈ），１０．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
工程３：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）−２−メチルチオピリミジンの合成
アルゴン雰囲気下、工程２で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−ホルミル−２−メチルチオピリミジン（５００ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶解し、その溶液に２０℃にて臭化メチルマグネシウム（０．９３ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液，４．０ｍＬ，３．７ｍｍｏｌ）を加え、−２０℃にて１．５時間攪拌した。反応液に−２０℃にて飽和塩化アンモニウム水溶液を徐々に加えた。反応液を酢酸エチルで抽出し、有機層を水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物質として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）−２−メチルチオピリミジン（５６０ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして１．３３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），４．０２（ｓ，２Ｈ），４．６０（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０７−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ）
工程４：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）ピリミジンの合成
工程３で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）−２−メチルチオピリミジン（７３．４ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（５０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、その溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０８０ｍＬ，０．４８ｍｍｏｌ）およびシクロヘキシルメチルアミン（０．０６０ｍＬ，０．４８ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、４日間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、淡黄色油状物質として化合物４５（８６．１ｍｇ，０．２０７ｍｍｏｌ，収率８６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして０．６８−１．０３（ｍ，２Ｈ），１．０４−１．３７（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．８８（ｍ，６Ｈ），２．２５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），３．１８（ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．５８（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｓ，２Ｈ），６．９７−７．２８（ｍ，９Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），９．９３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３９９（Ｍ−ＯＨ）＋
実施例１２：化合物４６〔４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリミジン〕の合成
工程１：５−アセチル−４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジンの合成
実施例１１の工程３で得られた４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシエチル）−２−メチルチオピリミジン（５２４ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶解し、その溶液に二酸化マンガン（１．３ｇ，１５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１２時間攪拌した。さらにその溶液にクロロホルム（１０ｍＬ）および二酸化マンガン（１．３ｇ，１５ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、２時間攪拌した。反応液を珪藻土を通して濾過し、濾別した固体をクロロホルムで洗浄した。濾液および洗浄液を合わせて減圧濃縮することにより淡黄色結晶として５−アセチル−４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジン（３８１ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ，収率７３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，）δ（ｐｐｍ）：２．３７（ｓ，３Ｈ），２．５４（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），７．０８−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），１０．９４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
工程２：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−２−メチルチオピリミジンの合成
アルゴン雰囲気下、工程１で得られた５−アセチル−４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−メチルチオピリミジン（２７２ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解し、その溶液に−２０℃にて臭化メチルマグネシウム（０．９３ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液，２．５ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を加え、−２０℃にて１時間、０℃にて１時間攪拌した。さらに、反応液に０℃にて臭化メチルマグネシウム（０．９３ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液，２．５ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２．５時間攪拌した。反応液に０℃にて飽和塩化アンモニウム水溶液を徐々に加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、淡黄色油状物質として４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−２−メチルチオピリミジン（２６４ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ，収率９３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：主なピークとして１．４６（ｓ，６Ｈ），２．３７（ｓ，３Ｈ），４．０１（ｓ，２Ｈ），７．０１−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．７８（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），８．８４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
工程３：４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリミジンの合成
工程２で得られる４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）−２−メチルチオピリミジン（２８４ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、その溶液にメタクロ濾過安息香酸（２００ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間攪拌した。さらに氷冷下、反応液にメタクロ濾過安息香酸（１３３ｍｇ，０．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をジオキサン（３ｍＬ）に溶解し、その溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３０ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）およびシクロヘキシルメチルアミン（０．２２ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下、４日間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水を加えて分液した後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、油状物質を得た。得られた油状物質をジエチルエーテルから再結晶することにより、淡黄色結晶として化合物４６（８０．５ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ，収率２４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７６−１．０２（ｍ，２Ｈ），１．１０−１．３５（ｍ，３Ｈ），１．４３−１．８０（ｍ，６Ｈ），２．４７（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．０３（ｓ，１Ｈ），４．０７（ｓ，２Ｈ），５．５５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１１−７．２５（ｍ，９Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１５（Ｍ−ＣＨ３）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：３２６０，２８００，２６００，１９９４，１９６９，１９５１，１９４４，１９３２，１９２５，１６２４，１５７８，１５４５，１５２４，１４９８，１４７３，１４６６，１４５４，１４３９，１４２３ｃｍ−１
実施例１３：化合物４７〔Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］−４−トルエンスルホンアミド〕の合成
参考例１０で得られたベンゾトリアゾール−１−イル−４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（０．２０ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、４−トルエンスルホンアミド（０．１０ｇ，０．５６ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８０μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。さらに４−トルエンスルホンアミド（６０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（５０μＬ，０．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた粗結晶を２−プロパノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（９７ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ，収率４６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７０−０．９０（ｍ，２Ｈ），０．９５−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．３０−１．７５（ｍ，６Ｈ），２．３４（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｓ，２Ｈ），７．０５−７．２２（ｍ，１１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），８．０８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），１２．４５（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ５６８（Ｍ−Ｈ）−
ＩＲ（ＫＢｒ）：２８７５，２８５０，１６５６，１６４８，１６４１，１６０１，１５８３，１５５８，１５４１，１５１６，１５１２，１５０８，１４８８，１４５２，１４０２，１３７１ｃｍ−１
実施例１４：化合物４８〔Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］メタンスルホンアミド〕の合成
参考例１０で得られたベンゾトリアゾール−１−イル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（０．２０ｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、メタンスルホンアミド（５０ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８０μＬ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。さらにメタンスルホンアミド（３０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（５０μＬ，０．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。得られた粗結晶を２−プロパノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（３９ｍｇ，０．０８０ｍｍｏｌ，収率２２％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．７４−０．９５（ｍ，２Ｈ），０．９９−１．３０（ｍ，３Ｈ），１．４０−１．８０（ｍ，６Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），４．１３（ｓ，２Ｈ），７．１３（ｍ，９Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），１２．３３（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４９２（Ｍ−Ｈ）−
ＩＲ（ＫＢｒ）：２９２０，２８５０，１６５５，１６３７，１６０８，１５８７，１５７８，１５６０，１５４５，１５４１，１５３５，１５２２，１４５４，１４０２，１３２３，１２７７ｃｍ−１
実施例１５：化合物４９〔Ｎ−［４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボニル］トリフルオロメタンスルホンアミド〕の合成
参考例１０で得られたベンゾトリアゾール−１−イル  ４−（２−ベンジルフェニルアミノ）−２−（シクロヘキシルメチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（０．３０ｇ，０．７０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、氷冷下、トリフルオロメタンスルホンアミド（２５９ｍｇ，１．７４ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（２６０μＬ，１．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、５％クエン酸水溶液、飽和重曹水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を２−プロパノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（０．２５ｇ，０．４６ｍｍｏｌ，収率６５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：０．６４−０．９３（ｍ，２Ｈ），０．９９−１．２３（ｍ，３Ｈ），１．２９−１．７８（ｍ，６Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，２Ｈ），７．０５−７．３４（ｍ，９Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｂｒ，１Ｈ），８．２６（ｓ，１Ｈ），１１．８８（ｓ，１Ｈ）
ＡＰＣＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ５４８（Ｍ＋Ｈ）＋
ＩＲ（ＫＢｒ）：１７５７，１７４９，１７３２，１７１６，１６５３，１６４１，１５８３，１５５６，１５１０，１４９３，１３３１，１３１５，１１９４ｃｍ−１
実施例１６：化合物５０〜２３４の合成
工程１
市販のエチル  ４−クロロ−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラートの１．７５ｇ／３０ｍＬテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液３００μＬ（１７．５ｍｇ，７５．２μｍｏｌ）に、各種アミン試薬（１００μｍｏｌ）およびモリホリノメチルポリスチレン（４２．０ｍｇ，１４７μｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。ＴＨＦ（０．３ｍＬ）とベンゾイルクロリドポリマーバウンド（４５．０ｍｇ，９０μｍｏｌ）を加えてさらに一晩攪拌した後、不溶物を濾過、洗浄し、得られた濾液と洗浄液を合わせて濃縮し、残渣を得た。
工程２
工程１で得られた残渣をジクロロメタン（０．３ｍＬ）に溶解し、ｍ−クロ濾過安息香酸（含量６５％，２６．５ｍｇ，１００μｍｏｌ）を加えて１時間攪拌した。反応液をジクロロメタン（０．１ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣をＴＨＦ（０．２ｍＬ）に溶解し、各種アミン（１００μｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。クロロホルム（０．４ｍＬ）、モリホリノメチルポリスチレン（４２．０ｍｇ，１４７μｍｏｌ）およびベンゾイルクロリドポリマーバウンド（９０．０ｍｇ，１８０μｍｏｌ）を加えてさらに一晩攪拌した後、不溶物を濾過、洗浄し、得られた濾液と洗浄液を合わせて濃縮し、残渣を得た。
工程３
工程２で得られた残渣をエタノール（０．３ｍＬ）およびＴＨＦ（０．０５ｍＬ）の混合溶媒に溶解し、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ水溶液（１４５μＬ）を加えて６５℃で一晩攪拌した。メタノール（０．４ｍＬ）および１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ水溶液（１４５μＬ）を加えて攪拌した後、溶媒を留去し、得られた残渣にクロロホルム（０．３ｍＬ）、メタノール（０．１ｍＬ）およびヘキサフルオロイソプロピルアルコール（０．２ｍＬ）を加えてよく攪拌した。不溶物を濾別し、得られた濾液を濃縮することにより目的化合物５０〜２３４を得た。
以下に、実施例１６で得られた代表的化合物の収率、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータおよびマススペクトルデータを示す。
２−（３−クロロベンジルアミノ）−４−（２−フェニルプロピルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物６４）
収率：５６％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．１８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．９９（ｍ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１４−７．３５（ｍ，９Ｈ），７．７２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．１９（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３９７（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（２−フェニルプロピルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物７１）
収率：５６％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），２．９８（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，０．４Ｈ），４．６６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１．６Ｈ），６．９５−７．７９（ｍ，９Ｈ），８．００（ｂｒ  ｓ，０．２Ｈ），８．１７（ｂｒ  ｓ，０．８Ｈ），８．３８（ｓ，０．２Ｈ），８．５９（ｓ，０．８Ｈ），１０．９０（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１０６）
収率：４６％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．９２−１．０９（ｍ，２Ｈ），１．１３−１．２７（ｍ，３Ｈ），１．４３（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．５８−１．８０（ｍ，６Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝６．０，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄｄ，Ｊ＝４．６，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｍ，３Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），９．７７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３８５（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１１２）
収率：６５％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．２９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝５．３，９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝４．４，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｍ，１Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．８８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ），１０．１６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．４７（ｂｒ  ｔ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４４７（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１１７）
収率：７４％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．８９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３１（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．８２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．０４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），６．８３−６．９３（ｍ，３Ｈ），７．１９−７．２９（ｍ，７Ｈ），８．１６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４２１（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（オクタヒドロイソキノリン−２−イル）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１２１）
収率：３９％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．２７−１．９４（ｍ，１２Ｈ），３．２８−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．８７（ｑ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２６−４．４２（ｍ，２Ｈ），６．９０−６．９５（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），８．１４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３９７（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（２−フェノキシエチルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１２３）
収率：６０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：３．７５（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），６．９２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．４７−７．６３（ｍ，４Ｈ），７．７８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．３９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３３（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−［（ピリジン−２−イルメチル）アミノ］ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１３８）
収率：５０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：４．６６（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−７．１０（ｍ，６Ｈ），７．２０−７．３５（ｍ，４Ｈ），７．７１（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５４（ｔ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），１０．８８（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１４（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１３９）
収率：７０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．９２−１．０９（ｍ，２Ｈ），１．１３−１．２７（ｍ，３Ｈ），１．６２−１．７７（ｍ，６Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），６．９５−７．１８（ｍ，６Ｈ），７．２９−７．３６（ｍ，２Ｈ），７．５３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５１（ｓ，１Ｈ），８．７３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．８７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１９（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（２−メチルベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１４２）
収率：７０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：２．３２（ｓ，３Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−７．３４（ｍ，１３Ｈ），７．９２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），１０．８４（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４２７（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（ベンジルブチルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１４３）
収率：２０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．９２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３５（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６５（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６５（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．９４（ｓ，２Ｈ），６．９６−７．０４（ｍ，６Ｈ）７．２０−７．３２（ｍ，８Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ），１０．４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４６９（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１４８）
収率：６３％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：４．６４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９３−７．０９（ｍ，７Ｈ），７．２９（ｄｄ，Ｊ＝７．５，８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５１−７．６７（ｍ，４Ｈ），８．１３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５６（ｓ，１Ｈ），１０．８３（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４８１（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１７７）
収率：７２％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＤＯ−ｄ６，８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．５６（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｔｔ，Ｊ＝３．８，１１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．００（ｄｔ，Ｊ＝２．３，１４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．０９（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１４−７．３０（ｍ，５Ｈ），７．４８−７．６６（ｍ，５Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４５７（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例１７：化合物２３５〜３９３の合成
工程１
市販のエチル  ４−クロロ−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラートの１．５４ｇ／２２ｍＬ  ＴＨＦ溶液２００μＬ（１４．０ｍｇ，６０．２μｍｏｌ）に、各種アミン試薬（９０μｍｏｌ）およびモリホリノメチルポリスチレン（４２．０ｍｇ，１４７μｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。ＴＨＦ（０．３ｍＬ）とベンゾイルクロリドポリマーバウンド（４５．０ｍｇ，９０μｍｏｌ）を加え、さらに一晩攪拌した後、不溶物を濾過、洗浄し、得られた濾液と洗浄液を合わせて濃縮し、残渣を得た。
工程２
工程１で得られた残渣をジクロロメタン（０．２ｍＬ）に溶解し、ｍ−クロ濾過安息香酸（含量６５％，２３．９ｍｇ，９０．０μｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。反応液をジクロロメタン（０．１ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去した。得られた残渣をＴＨＦ（０．２ｍＬ）に溶解し、各種アミン（９０μｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。クロロホルム（０．４ｍＬ）、モルホリノメチルポリスチレン（４２．０ｍｇ，１４７μｍｏｌ）およびベンゾイルクロリドポリマーバウンド（９０．０ｍｇ，１８０μｍｏｌ）を加えてさらに一晩攪拌した後、不溶物を濾過、洗浄し、得られた濾液と洗浄液を合わせて濃縮し、残渣を得た。
工程３
工程２で得られた残渣をトルエン（０．５ｍＬ）に溶解し、６５重量％水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウム  トルエン溶液（６２．４μＬ，２０８μｍｏｌ）を加え、０℃で４時間攪拌した。３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（３００μＬ）を２回に分けて加えた後、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を留去することにより目的化合物２３５〜３９３を得た。
以下に、実施例１７で得られた代表的化合物の収率、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータおよびマススペクトルデータを示す。
２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン（化合物２５６）
収率：３８％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．８９−１．１０（ｍ，２Ｈ），１．１５−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．３９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），１．４７−１．７８（ｍ，６Ｈ），３．２１（ｄｔ，Ｊ＝２．６，６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９６（ｄｄ，Ｊ＝５．６，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１０（ｄｄ，Ｊ＝３．８，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），４．４６−４．６３（ｍ，１Ｈ），４．８６（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），５．６８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，３Ｈ），７．２３−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３７１（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（ベンジルブチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン（化合物２６４）
収率：５５％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．８９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．３１（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．９８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），４．４５（ｓ，２Ｈ），４．８４（ｓ，２Ｈ），５．８６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１８−７．３０（ｍ，７Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４０７（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−２−（オクタヒドロイソキノリン−２−イル）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン（化合物２６７）
収率：４４％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２５−１．９１（ｍ，１２Ｈ），３．２７（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．２６（ｍ，２Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），５．８５（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．９７（ｍ，３Ｈ），７．２３−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３８３（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（４−フェニルブチルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物２７８）
収率：６０％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．５７−１．６８（ｍ，４Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３８（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，２Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），５．３６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．６５（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），７．１２−７．２９（ｍ，５Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３１（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（３−フルオロベンジルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（インダン−２−イルアミノ）ピリミジン（化合物２８７）
収率：６９％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．２０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，Ｊ＝６．３，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２７（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．３８（ｓ，２Ｈ），４．５７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７９（ｍ，１Ｈ），５．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｔ，Ｊ＝２．１，８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．１３−７．２９（ｍ，５Ｈ），７．５１（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６５（Ｍ＋Ｈ）＋
４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物２９９）
収率：５９％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：４．２３（ｓ，４Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），４．６１（ｄ，，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），５．４６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｓ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３３（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン（化合物３２０）
収率：２７％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９１−１．０３（ｍ，２Ｈ），１．１３−１．３１（ｍ，３Ｈ），１．６５−１．８３（ｍ，６Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４０（ｓ，１Ｈ），５．０６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．９６−７．２２（ｍ，６Ｈ），７．２７−７．３２（ｍ，３Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ），８．６２（ｄ，Ｊ＝６．２，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４０５（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−２−（２−メチルベンジルアミノ）−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン（化合物３２１）
収率：３３％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．３６（ｓ，３Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．９３−７．０８（ｍ，６Ｈ），７．１２−７．３２（ｍ，７Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１３（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物３８６）
収率：４８％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：３．７８（ｑ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），４．６２（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），５．３２（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），６．０５（ｂｒ  ｔ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２４−７．２９（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｓ，２Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１９（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物３８７）
収率：２７％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：４．４１（ｓ，２Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），５．５０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．９２−７．０７（ｍ，６Ｈ），７．２３−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．３９−７．６６（ｍ，５Ｈ），８．３１（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４６７（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）−２−［（ピリジン−２−イルメチル）アミノ］ピリミジン（化合物３８８）
収率：２５％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）：４．２６（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５６（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），５．３２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９３−７．４７（ｍ，１２Ｈ），７．７１（ｄｔ，Ｊ＝１．８，７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｓ，１Ｈ），８．５２（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），８．７１（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４００（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（ベンジルブチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシフェニルアミノ）ピリミジン（化合物３８９）
収率：３１％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．３５（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６０−１．６９（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｓ，２Ｈ），４．８７（ｓ，２Ｈ），６．９３−７．０７（ｍ，６Ｈ），７．１８−７．３２（ｍ，８Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），８．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４５５（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（１−メチル−２−フェノキシエチルアミノ）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物３９０）
収率：４６％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３２（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝５．１，９．１Ｈｚ，１Ｈ），３．９５（ｄｄ，Ｊ＝３．８，９．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４２（ｓ，２Ｈ），４．４６−４．５３（ｍ，１Ｈ），４．６０（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），５．３０（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．７７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝１．１，７．７Ｈｚ，２Ｈ），６．９３（ｔｔ，Ｊ＝１．１，７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．２１−７．２８（ｍ，２Ｈ），７．３８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４３３（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェニルプロピルアミノ）−２−（３−トリラルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物３９１）
収率：４８％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．９８（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．４２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ｍ，１Ｈ），４．３０（ｓ，２Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），５．２８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．５５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１１−７．３０（ｍ，５Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４１７（Ｍ＋Ｈ）＋
２−（３−クロロベンジルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェニルプロピルアミノ）ピリミジン（化合物３９２）
収率：４１％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２６（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），２．９８（ｓｅｘｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．４３（ｍ，１Ｈ），３．６５（ｍ，１Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），５．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．５４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１２−７．３５（ｍ，９Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３８３（Ｍ＋Ｈ）＋
５−ヒドロキシメチル−４−（４−フェニルピペリジン−１−イル）−２−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）ピリミジン（化合物３９３）
収率：６４％（４工程）
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．７３（ｍ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｔｔ，Ｊ＝４．０，１２．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９６（ｄｔ，Ｊ＝２．６，１３．２Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），４．５１（ｓ，２Ｈ），４．６４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），５．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．１８−７．３３（ｍ，５Ｈ），７．４１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ４４３（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例１８：２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１１６）の合成
工程１：エチル  ２−メチルチオ−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラートの合成
市販のエチル  ４−クロロ−２−メチルチオ−５−ピリミジンカルボキシラート（１１．３ｇ，４８．６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．９ｍＬ，９７．０ｍｍｏｌ）および２−フェノキシエチルアミン（９．５４ｍＬ，７２．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌した。反応液を減圧留去し、酢酸エチルで希釈した。有機層を水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（１６．１ｇ，４８．３ｍｍｏｌ，定量的収率）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３５（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）２．５２（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３３（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．２６（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），８．５４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ）
工程２：エチル  ２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラートの合成
工程１で得られたエチル  ２−メチルチオ−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（１０．０ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解し、氷冷下ｍ−クロ濾過安息香酸（含量６５％，１２．０ｇ，４５．２ｍｍｏｌ）を１０分間かけて加え、室温で１時間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に溶解し、シクロヘキシルメチルアミン（５．８９ｍＬ，４５．２ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下１０時間攪拌した。反応液を減圧留去し、得られた粗結晶をエタノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（９．７４ｇ，２４．４ｍｍｏｌ，収率８１％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，８０℃）δ（ｐｐｍ）：０．９３−１．０６（ｍ，２Ｈ），１．１１−１．２７（ｍ，３Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ），１．５１−１．７８（ｍ，６Ｈ），３．２８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８７（ｑ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．１５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），４．２９（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），５．２２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．８９−６．９５（ｍ，３Ｈ），７．２１−７．２８（ｍ，２Ｈ），８．３４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．５５（ｓ，１Ｈ）
工程３：２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボン酸（化合物１１６）の合成
工程２で得られたエチル  ２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（１．００ｇ，２．５１ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に溶解し、３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０．０ｍＬ，３０．０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で５時間攪拌した。反応液を半分の体積まで減圧濃縮し、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液で反応液のｐＨを４．５に調整した。析出した結晶を濾取することにより白色結晶として標記化合物（８８０ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ，収率９５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９０−１．０１（ｍ，２Ｈ），１．０８−１．２５（ｍ，３Ｈ），１．５９−１．８０（ｍ，６Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１８（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９１−６．９８（ｍ，３Ｈ），７．２５−７．３１（ｍ，２Ｈ），８．３６（ｓ，１Ｈ），９．８９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１０．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３７１（Ｍ＋Ｈ）＋
実施例１９：２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−５−ヒドロキシメチル−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン（化合物２６３）の合成
実施例１８の工程２で得られたエチル  ２−（シクロヘキシルメチルアミノ）−４−（２−フェノキシエチルアミノ）ピリミジン−５−カルボキシラート（１．００ｇ，２．５１ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ｍＬ）に溶解し、フラスコ内をアルゴンガスで置換後、０℃で６５重量％水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アルミニウム  トルエン溶液（３．００ｍＬ，９．９９ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。３ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで希釈した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をエタノールから再結晶することにより白色結晶として標記化合物（５００ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ，収率５６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９３−１．００（ｍ，２Ｈ），１．１６−１．２４（ｍ，３Ｈ），１．５１−１．７９（ｍ，６Ｈ），３．２０（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｓ，２Ｈ），４．８７（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），６．０１（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．９７（ｍ，３Ｈ），７．２４−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３５７（Ｍ＋Ｈ）＋
製剤例１：錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。
処方  化合物１                          ２０ｍｇ
乳糖                        １４３．４ｍｇ
馬鈴薯デンプン                    ３０ｍｇ
ヒドロキシプロピルセルロース        ６ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム        ０．６ｍｇ
２００ｍｇ
製剤例２：注射剤
常法により、次の組成からなる注射剤を調製する。
処方  化合物３７                          ２ｍｇ
精製ダイズ油                    ２００ｍｇ
精製卵黄レシチン                  ２４ｍｇ
注射用グリセリン                  ５０ｍｇ
注射用蒸留水                  １．７２ｍＬ
２．００ｍＬ
【産業上の利用可能性】  本発明により、１）ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有する物質、ＧＰＲ８８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩等を有効成分として含有する中枢疾患の予防および／または治療剤、２）ＧＰＲ８８のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩等を有効成分として含有するＧＰＲ８８の機能抑制剤、３）中枢疾患の予防および／または治療作用を有する化合物のスクリーニング方法、４）ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有するピリミジン誘導体またはその薬理学的に許容される塩、５）ＧＰＲ８８の機能抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド等が提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号７−Ｓｔｒｇ−ＡＳ１、ＧＰＲ８８遺伝子に対するフォスフォロチオエート・アンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号８−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号９−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１０−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１１−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ溝築用合成ＤＮＡ
配列番号１２−２つのＣＲＥ配列を含む二本鎖ＤＮＡ溝築用合成ＤＮＡ
配列番号１３−２つのＣＲＥ配列を含む二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１４−Ｇαｓ４遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号１５−Ｇαｓ４遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号１６−ＧαｑのＣ末５アミノ酸残基をコードする二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１７−ＧαｑのＣ末５アミノ酸残基をコードする二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１８−ＧαｉのＣ末５アミノ酸残基をコードする二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号１９−ＧαｉのＣ末５アミノ酸残基をコードする二本鎖ＤＮＡ構築用合成ＤＮＡ
配列番号２０−Ｖ２遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号２１−Ｖ２遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号２２−ＧＰＲ１２遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号２３−ＧＰＲ１２遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号２４−ｐＡＧａｌ９−ｎｄ特異的塩基配列決定用プライマー
配列番号２５−ｐＡＧａｌ９−ｎｄ特異的塩基配列決定用プライマー
配列番号２６−ＧＰＲ８８遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
配列番号２７−ＧＰＲ８８遺伝子特異的ＰＣＲプライマー
【配列表】
2004054617.tif 000054
2004054617.tif 000055
2004054617.tif 000056
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【図１】
2004054617.tif 000092
【図２】
2004054617.tif 000093
【国際調査報告】
2004054617.tif 000094
2004054617.tif 000095
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