(57)【要約】リンパ管特異的抗体のエピトープとなり得るＬＹＶＥ−１の特定のペプチドフラグメント及びそのペプチドフラグメントを認識する抗体を提供すること。  アミノ酸配列：Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  ＳｅｒＬｙｓからなるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のペプチドフラグメントに対する抗体。
【請求項３】
ヒトリンパ管特異的ヒアルロナン受容体−１（ＬＹＶＥ−１）に特異的である、請求の範囲第２項に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体によって認識されるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント。
【請求項５】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を調製するための、請求の範囲第１項又は第４項に記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項６】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管免疫染色用組成物。
【請求項７】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管免疫染色用試薬キット。
【請求項８】
採取したヒト組織におけるリンパ管を、請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて特異的に免疫染色する方法。
【請求項９】
悪性腫瘍の悪性度の鑑別方法であって、次のステップ；
ａ）採取したヒト組織におけるリンパ管を、請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて特異的に免疫染色するステップ、
ｂ）ステップａ）で染色した染色像における悪性腫瘍の浸潤度を測定するステップ、
ｃ）ステップｂ）に基づいて悪性腫瘍の悪性度を鑑別するステップ、
からなる方法。
【請求項１０】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて、ヒトリンパ球を分離及び／又は精製する方法。
【請求項１１】
ヒトリンパ管の新生治療における、請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、炎症時の創傷治癒時に多く出現する細胞外基質のグリコサミノグリカンヒアルロナンに対する受容体であるＬＹＶＥ−１（リンパ管特異的ヒアルロナン受容体−１）の中の特定のペプチドフラグメント、そのペプチドフラグメントに対する抗体およびそれらの用途に関する。特に、本発明のペプチドフラグメント及びそれに対する抗体はリンパ管の組織学的証明やリンパ管への悪性腫瘍の浸潤に対する免疫組織化学検査に関して有用である。
【背景技術】  細胞外基質の一つであるヒアルロン酸は、細胞遊走、創傷治癒、腫瘍転移等に関連した重要な因子であり、生体組織における殆んど全ての細胞に存在する。ヒアルロン酸と細胞表面のヒアルロン酸結合受容体を介した細胞間応答は、細胞間相互作用の重要な手段の一つに挙げられる。また、最近では、ヒアルロン酸については細胞遊走因子としてのみでなく、核内転写因子の一つであるＮＦ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ）−κＢの活性化や脈管形成の促進因子としての能力も報告されている。
細胞膜に局在するいくつかのヒアルロン酸結合受容体については、今日までに、例えば、ＣＤ４４（リンパ球抗原群Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎのうちの一つ）、ＬＹＶＥ−１（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ＨＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、ＬＥＣ（Ｌｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）受容体などが同定されており、これらヒアルロン酸結合受容体の中で、ＬＹＶＥ−１は３２２個のアミノ酸残基からなる受容体として見出された（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４４，７８９−８０１（１９９９）参照）。
ＬＹＶＥ−１のｍＲＮＡは脾臓、リンパ節、胎児肝臓、心臓、肺など全身に広く発現されており、ＬＹＶＥ−１受容体は、それら組織内のリンパ管内皮に局在することが明らかにされている。このことから、ＬＹＶＥ−１は、形態的に毛細血管と区別が困難なリンパ管の同定に利用できると考えられる。
例えば、悪性腫瘍のリンパ行性転移においては、腫瘍が周囲の組織へと浸潤した後、リンパ管壁を破壊性に浸潤してリンパ管に侵入し、リンパ行性に運搬されて、原発巣とは離れた部位に転移する行程を経るが、この浸潤過程において、リンパ管を含む宿主組織の破壊がもたらされる。
従って、病理組織におけるリンパ管の詳細な所見が得られれば、その腫瘍の破壊性浸潤性増殖の有用な病理像となるものと考えられる。
これまでに、腫瘍がリンパ管壁を破壊性に浸潤してリンパ管に浸潤する様子をとらえた報告がいくつかなされている（高沢  博：「実験的リンパ行性転移形成における移植部リンパ管の電顕的研究」日本癌学会総会記事、３０，２９６（１９７１）、荒木  京二郎：「癌の浸潤初期とリンパ管侵襲の電顕的研究−Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ（ＭＮＮＧ）誘発ラット胃癌における観察−」岡山医誌、９１，６５９−６６９（１９７９）、Ｊａｍｅｓ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ：「Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｏｔｐａｄ  ｏｆ  ｍｉｃｅ．」Ｅｘｐｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５６，２２１−２２８（１９９２）、Ｃａｒｒ  Ｉ．，ｅｔ  ａｌ：「Ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ，ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｒｄ／３  ｔｕｍｏｕｒ．」Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１１８，９１−９９（１９７６）、Ｐａｋｕ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ：「Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ  ｂｙ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃａｌｌｙ．」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６，９５７−９６６（１９８６）参照）。
しかし、これらの報告は電子顕微鏡による細胞レベルの研究であり、組織においてリンパ管に浸潤する腫瘍の様子を組織レベルで観察した報告はない。
一方、病理組織における病理像を染色によって観察するための、組織等の染色方法が種々開発されてきた。例えば、酵素抗体法などの免疫組織化学的な染色方法は、特異性、再現性等に優れており、本発明による方法もこの範疇に属するものである。しかしながら、リンパ管を染色の標的とし、これを選択的に染色する方法はこれまで知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の目的は、リンパ管特異的抗体のエピトープとなり得るＬＹＶＥ−１の特定のペプチドフラグメント及びそのペプチドフラグメントを認識する抗体を提供することである。また、本発明の目的は、ＬＹＶＥ−１における特定のペプチドフラグメントに基づいて得られた抗体を用いてリンパ管を選択的に染色する方法、言い換えれば、その染色結果から悪性腫瘍の破壊性浸潤性増殖についての病理学的所見を得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】  本発明者らは、上記課題を解決するため、ＬＹＶＥ−１のアミノ酸配列の中から種々のペプチドフラグメントを選択し、その選択したペプチドフラグメントに適当な、リンカーとしてのアミノ酸（例えば、システインなど）及び適当なスペーサー（例えば、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）など）を介して免疫源認識補助基（例えば、ＫＬＨ：ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（スカシ貝ヘモシアニン）など）を結合し、これを免疫源としてウサギを免疫した。免疫したウサギの血清から抗体を抽出、精製し、採取したヒト組織を使用して免疫染色を行った。
すると、種々のペプチドフラグメントの中でも、ＬＹＶＥ−１受容体のアミノ酸配列上の領域であって、▲１▼親水性領域であること、▲２▼糖付加されない領域であること、▲３▼βターン構造をとる領域であること及び▲４▼細胞内領域であることの４つの条件を満たすアミノ酸配列のうち、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１１８１０８の下に登録されたアミノ酸配列における第２９７位〜第３０８位に相当する、以下の配列：
2004081035.tif 000002
で表されるペプチドフラグメントを用いて、上記の抗体の調製及び免疫染色を行ったところ、その染色がリンパ管に特異的であることがわかった。さらに、本発明の抗体を用いた免疫染色の結果から、生体組織におけるリンパ管の詳細な所見を得ることができた。また、特に、通常は確認が困難な早期の悪性腫瘍の破壊性浸潤性増殖についての病理学的所見を得ることができたのである。
すなわち、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメントに関するものであり、さらに当該ペプチドフラグメントに対する抗体にも関する。
また、本発明は、以下の配列：
2004081035.tif 000003
で表される、上記酸配番号１で表されるペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントにも関する。
また、本発明は、ヒトリンパ管特異的ヒアルロナン受容体−１（ＬＹＶＥ−１）に特異的である、上記抗体にも関する。
また、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ上記抗体によって認識されるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント及びそれらをコードするＤＮＡフラグメントにも関する。
さらに、本発明は、上記抗体を調製するための、上記ペプチドフラグメントの使用にも関する。
加えて、本発明は、上記抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管免疫染色用組成物及びヒトリンパ管免疫染色用試薬キットにも関する。
ここで、当該ヒトリンパ管免疫染色用試薬キットは、本発明の抗体の他、３％過酸化水素水等の内因性パーオキシダーゼのブロッキング試薬、ビオチン化標識抗ウサギイムノグロブリン抗体、パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、トリス塩酸緩衝液等の基質緩衝液、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸塩）等の発色試薬及び／又は０．８％過酸化水素水等の基質試薬等を含むことができる。
また、本発明は、採取したヒトリンパ管を、本発明の抗体を用いて特異的に免疫染色する方法にも関する。
さらに、本発明は、本発明の抗体を用いてヒトリンパ管を特異的に免疫染色することによる、悪性腫瘍における浸潤度の測定方法、及び当該浸潤度を測定することによる、悪性腫瘍の悪性度の診断方法にも関する。
さらに加えて、本発明は、本発明の抗体を用いたヒトリンパ球の分離、精製、すなわちリンパ管細胞及びその前駆細胞の分取にも関する。細胞の分取には、例えば、細胞分離機器（セルソーター）、磁気細胞分離法等を利用することができる。また、分取した細胞は、例えば、リンパ管浮腫の軽減を目的としたリンパ管新生治療等に用いることができる。
ペプチドフラグメントの調製
本発明のペプチドフラグメントの調製は、市販の自動ペプチド合成装置を用いて容易に行うことができる。
抗原の調製
ペプチドフラグメントの抗原性を高めるために、ペプチドフラグメントにキャリアタンパク質を結合させる。また、ペプチドフラグメントとキャリアタンパク質との結合には、立体障害等による抗原−抗体反応の阻害を避けるため、リンカー及びスペーサーを用いる。すなわち、抗原として、ペプチドフラグメント−リンカー−スペーサー−キャリアタンパク質の結合物を用いるのが有利である。
抗原の調製において用いることのできるリンカーとしては、例えば、システイン、グルタミン酸、チロシン等の、ペプチドフラグメントとスペーサーとの結合を仲介する能力、すなわち、リンク能力を有するアミノ酸が挙げられ、好ましくはシステインを挙げることができる。
ここで、リンカーは、ペプチドフラグメントのＣ末端又はＮ末端のどちらに結合することもできるが、Ｎ末端に結合することが好ましい。
リンカーをＮ末端に結合するほうが好ましい理由は次のとおりである。すなわち、ペプチドフラグメントはＣ末端から合成されるため、リンカーをＮ末端に結合することにより、不完全長のペプチドフラグメントがキャリアタンパク質と結合されるのを防ぐことができる。また、Ｃ末端にシステインがある場合は、ラセミ化が起こることがあり、その防止措置を講じなければならず、収量も低くなるからである。
また、抗原の調製において用いることのできるスペーサーとしては、例えば、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）、ＳＭＣＣ（スクシニミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸）、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシニミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸）又はＳｕｌｆｏ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシニミドエステル）等の架橋試薬を挙げることができ、ＭＢＳが好ましい。
さらに、抗原の調製において用いることのできるキャリアタンパク質としては、例えば、牛アルブミン、卵白アルブミン、ミオグロビン及びスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）等のタンパク質が挙げられ、好ましくはＫＬＨが有利に用いられる。
ペプチドフラグメントとリンカーとの結合は、自動ペプチド合成装置により容易に行うことが出来る。また、スペーサー及びキャリアタンパク質の結合も従来の方法により容易に行うことができる。
抗体の調製
上記抗原の調製において得られた抗原をアジュバントと共に乳化して動物に免疫する。免疫後、動物を放血させ、抗血清を分離する。この抗血清からアフィニティークロマトグラフィー法により抗体を分取する。
抗体の調製においては、免疫動物として、例えば、マウス、ウサギ、ラット、羊等を用いることができるが、好ましい免疫動物としては、ウサギ又は羊を挙げることができる。
また、一般的なモノクローナル抗体調製方法により、本抗体をモノクローナル抗体として調製することもできる。
抗体の免疫特異性の検討
ＬＹＶＥ−１遺伝子を発現させた細胞より通常の方法にてタンパク質試料を得、これをウェスタンブロットティングによりナイロンフィルターに転写してフィルター試料とした。このフィルター試料を複数作製した。フィルター試料の一部は本発明のＬＹＶＥ−１抗体と反応させ、残りのフィルター試料を、本発明のＬＹＶＥ−１抗体と免疫に使用したペプチドを予め反応させておいた試液と反応させた。反応させたフィルターは、酵素結合第２抗体を用いた染色方法等の一般的な染色方法により染色した。
その結果、本発明のＬＹＶＥ−１抗体と反応させたフィルター試料にはＬＹＶＥ−１とＬＹＶＥ−１抗体とが結合したバンドが確認され、本発明のＬＹＶＥ−１抗体と免疫に使用したペプチドを予め反応させておいた試液を反応させたフィルター試料にはそのバンドが確認されないことから、本発明のＬＹＶＥ−１抗体はＬＹＶＥ−１に特異的であることが確認された。
組織染色
ヒト正常組織の固定パラフィン切片又は凍結切片を作製し、本発明のＬＹＶＥ−１抗体を反応させた。そして、酵素抗体法、蛍光抗体法等の一般的な染色法により染色を行った。
その結果、組織切片のリンパ管のみが染まり、その他の部分は染まらなかった。この結果から、本発明のＬＹＶＥ−１抗体は、リンパ管を特異的に認識する抗体であることがわかった。さらに、癌浸潤が見られる標本においてＬＹＶＥ−１抗体に陽性を示す部分がリンパ管であることからも、本発明のＬＹＶＥ−１抗体がリンパ管に特異的であることがわかった。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】  図１は、合成した抗原ペプチドをベンジル化し、０．１％トリフルオロ酢酸を加えて質量分析を行った、その質量分析スペクトルを示す図である。測定条件を以下に示す。
2004081035.tif 000004
図２は、本発明の抗体を用いたヒトの各種正常及び悪性腫瘍の組織の染色図である。図２の各染色図において、矢印（ａｒｒｏｗ）はＬＹＶＥ−１抗体により染色されたリンパ管を指し、矢じり（ａｒｒｏｗｈｅａｄ）はｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｄ  ｆａｃｔｏｒ（ｖＷｆ）により染色された血管を指す。
図２−ａは、全長のＬＹＶＥ−１のｃＤＮＡを組み込み、蛋白発現させたｃｏｓ７細胞をＬＹＶＥ−１抗体により免疫染色した図である。図２−ａにおいて、ＬＹＶＥ−１は主に細胞表面の細胞膜に発現がみられ、細胞質にも軽度の発現を認めた。
図２−ｂ〜ｄは、胃組織の連続切片の染色図である。図２−ｂはＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ染色（ＨＥ染色）によるもの、図２−ｃはＬＹＶＥ−１抗体による染色、そして、図２−ｄはｖＷｆ抗体を用いた免疫染色図である。
図２−ｅ〜ｍは、ヒトの各種正常組織のＬＹＶＥ−１抗体を用いた免疫染色図である。図２−ｅは食道、図２−ｆは結腸、図２−ｇは図２−ｆのＬＹＶＥ−１陽性管腔部の強拡大像、図２−ｈは心臓、図２−ｉは肺、図２−ｊは腎臓、図２−ｋは前立腺、図２−１は卵巣、そして図２−ｍは膵臓組織の染色結果である。
図２−ｎ〜ｑは、ヒトの各種正常組織の中で洞構造を持つ主な臓器の染色図である。図２−ｎでは肝臓の類洞内皮細胞に認められるＬＹＶＥ−１発現を認め、図２−ｏはその強拡大像である。図２−ｐでは脾臓の脾洞の内皮細胞に、また、図２−ｑではリンパ節内のりンパ管の内皮細胞及び網状線維に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図２−ｒ〜ｘは、ヒト悪性腫瘍の病変部組織の染色図である。そのうち、図２−ｒ〜ｔは、食道癌の組織に関するものであり、図２−ｒにおいては食道癌（扁平上皮癌）の腫瘍細胞塊がＬＹＶＥ−１陽性管腔内に認められ、リンパ管侵襲が示されている。また、図２−ｓはその部分の強拡大像である。図２−ｔは図２−ｒの連続切片を用いたｖＷｆ抗体の染色図である。
図２−ｕ及びｖは、肺癌の組織に関するものである。図２−ｕにおいては、肺気管支周囲結合織内のＬＹＶＥ−１陽性管腔内に肺癌（腺癌）の腫瘍細胞塊を示したものである。図２−ｖは図２−ｕの連続切片を用いたｖＷｆ抗体の染色図である。
図２−ｗ及びｘは、ヒトの心臓に発生した血管肉腫の組織染色図で、図２−ｗではＬＹＶＥ−１陽性管腔内に血管肉腫の腫瘍塊を認め、その連続切片を用いてｖＷｆ染色を行った図２−ｘでは、ｖＷｆ一部陽性の腫瘍細胞がｖＷｆ陽性管腔内にも認められる。
図２−ｒ〜ｘにおいて、ＬＹＶＥ−１陽性内皮細胞をもつリンパ管内への腫瘍細胞浸潤を確認することができる。
各図における拡大率はそれぞれ次の通りである。ａ；５５０倍、ｇ及びｓ；３５０倍、ｏ；３００倍、ｊ、ｕ及びｖ；２５０倍、ｗ及びｘ；２２５倍、ｋ及びｐ；１８５倍、ｂ〜ｄ、ｆ、ｌ、ｍ及びｑ；１３０倍、ｈ、ｉ、ｎ、ｒ及びｔ；１１０倍、ｅ；５０倍。
図３−Ａは、心臓筋層内の結合組織内、心外膜脂肪織内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｂは、肺胸膜下、血管周囲などに認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｃは、腎ボウマン嚢周囲、尿細管周囲の問質に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｄは、膵臓の血管周囲を主とする間質に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｅは、扁桃の上皮下のリンパ小節内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｆは、胸腺の小葉間結合組織内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｇは、胃の粘膜固有層から漿膜まで全層に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。特に粘膜筋板沿い、筋層に多く見られる。
図３−Ｈは、小腸の粘膜固有層の粘膜上皮近傍から漿膜の間質に至る組織の染色図である。
図３−Ｉは、舌の上皮下の結合織内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｊは、食道の上皮下の結合織内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｋは、結腸の粘膜下層から漿膜までの間質に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｌは、膀胱の粘膜下層から漿膜までの間質に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｍは、前立腺の腺腔間の血管近傍、被膜に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｎは、精巣の曲精細管周囲の間質に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｏは、卵巣の皮質間質内に認められるＬＹＶＥ−１陽性管腔を示したものである。
図３−Ｐは、胎盤絨毛の間質に認められるＬＹＶＥ−１陽性発現細胞を示したものである。
図３−Ｑは、肝類洞血管の内皮細胞に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図３−Ｒは、脾洞の内皮細胞に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図３−Ｓは、輸出入リンパ管内皮細胞および細網細胞に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図３−Ｔは、副腎の洞様血管内皮細胞に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図３−Ｕは、食道癌におけるリンパ管侵襲の染色像である。食道の粘膜下層のＬＹＶＥ−１陽性管腔内に腫瘍塊が認められる。
図３−Ｖは、胃癌におけるリンパ管侵襲の染色像である。組織のＬＹＶＥ−１陽性管腔内に腫瘍塊が認められる。
図３−Ｗは、ＥＭＲ切除を行った胃癌組織におけるリンパ管侵襲を示した図である。粘膜固有層のＬＹＶＥ−１陽１生管腔内に腫瘍塊が認められる。
図３−Ｘは、図３−Ｗの拡大図です。
図３−Ｙは、心臓の血管肉腫におけるリンパ管侵襲を示した図である。ＬＹＶＥ−１陽性管腔内に腫瘍塊が認められる。
図３−Ｚは、リンパ管腫の不規則に増生する管腔の内皮細胞に部分的に認められるＬＹＶＥ−１発現を示したものである。
図４は、抗体の特異性を確認したウェスタンブロット図である。
レーン１及び３はＬＹＶＥ−１遺伝子を組み込んだＣｏｓ−７細胞より得られた試料と反応させた図であり、レーン２及び４はＬＹＶＥ−１遺伝子を組み込んでいないＣｏｓ−７細胞より得られた試料と反応させた図である。更に、レーン３及び４は、予め過剰量の本発明のペプチドフラグメントを反応させておいたＬＹＶＥ−１抗体を用いて反応させたものである。
レーン１で発色が認められレーン３で発色が認められないことから、本発明の抗体はＬＹＶＥ−１タンパク質に特異的であることがわかる。
【実施例】実施例１（抗原の調整）
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗原ペプチドフラグメントは、Ｇｅｎｏｓｙｓ社製ＡＢｃｕｓ７自動ペプチド合成装置を用いて固相法により合成した。その際、Ｎ末端にリンカーとなるシステインを付加し、リンカーを付加した抗原ペプチドフラグメント３０ｍｇを得た。合成後、抗原ペプチドフラグメントを高速液体クロマトグラフィーにて精製した。
得られた抗原ペプチドフラグメントの確認は次のようにして行った。すなわち、抗原ペプチドフラグメントをベンジル化し、０．１％トリフルオロ酢酸を加えた後、ＡＢＩ社製ＶｏｙａｇｅｒＳｙｓｔｅｍ１１６２質量分析器にて測定した。測定にあたっては、標準コントロールサンプルを測定し、その理論分子量の差異を補正した後に、合成したペプチドフラグメントを測定し、理論値と一致することを確認した（図１）。
合成した抗原ペプチドフラグメントの抗原性を高めるために、抗原ペプチドフラグメントにリンカー及びスペーサーを介してヘモシアニン（ＫＬＨ）を結合させた。まず、スペーサーとＫＬＨの結合は次のようにして行った。ＫＬＨ１６ｍｇを１０ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）１ｍｌに溶解し、これにＭＢＳ２．８ｍｇのジメチルホルムアミド１ｍｌ溶液を加える。室温中で３０分撹拌後、溶液を１６，０００ｒｐｍで遠心し、その上清をセファデックスＧ２５によるカラムクロマトグラフィーにて精製し、ＫＬＨ−ＭＢＳ結合物質を得た（含有量は１．８ｍｇ／ｍｌ）。次に、１ｍｇの上記抗原ペプチドフラグメントとＫＬＨ−ＭＢＳ結合物質（ＫＬＨ１ｍｇ相当）および１／２体積の０．２Ｍ燐酸ナトリウムバッファーを混合し、窒素ガス存在下で室温にて３時間反応することにより、抗原を得た。
実施例２（ＬＹＶＥ−１抗体の調製）
抗原（抗原ペプチド１００μｇ相当）を、フロイントの完全アジュバントと共にウサギ背部皮下に免疫した。
以後、２週間に一度の割合で、抗原ペプチド１００μｇに相当する量の抗原をフロイント不完全アジュバントと共に同様に免疫し、合計５回免疫した。第２回目の免疫以降、抗原及びセルロースアセテート膜を使用したドットブロット法にて抗体価上昇の確認を行った。抗体価の上昇を確認した後、全採血を行い、抗血清を分離した。
次に、抗体の精製を以下のようにして行った。まず、Ａｆｆｉｇｅ１０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に抗原ペプチドを結合させて、精製用アフィニティーカラムを作製した。そして、非動化血清１０ｍｌを同量のＰＢＳ（燐酸緩衝食塩水）で希釈し、０．４５μｍのフィルターに通した後、アフィニティーカラムに添加した。カラムを約５０ｍｌのＰＢＳにて洗浄した後、５ｍｌの５０ｍＭクエン酸バッファーで抗体を溶出した。溶出した抗体に２Ｍトリスバッファー（ｐＨ９．５）を少量加え、溶出抗体溶液のｐＨを７．４に補正した。２８０ｎＭの波長の吸光度を測定することにより、抗体濃度を計測した。
実施例３（ＬＹＶＥ−１抗体の特異性の検討）
ＬＹＶＥ−１のタンパク質翻訳域の全長遺伝子を、真核細胞発現プラスミドベクターに組み込み、リポソーム試薬を使用して、このプラスミドベクターをＣｏｓ−７細胞に導入し、一過性にＬＹＶＥ−１タンパク質を発現させた。導入２４時間後にＣｏｓ−７細胞をＰＢＳで洗い、Ｌｙｓｉｓバッファー（２０ｍＭトリス塩酸バッファー、１４０ｍＭ  食塩水、０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１μｇ／ｍＬ  蛋白分解阻害剤（ペプスタチン、リューペプチン及びアプロチニン）の混合液）により溶解した。この混合液を１５，０００ｒｐｍにて遠心した後、その上清をＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にて分画した後、ナイロンフィルターに転写し、フィルター試料とした。このフィルター試料の一部をＬＹＶＥ−１抗体と反応させた。
一方、抗体を抗原ペプチドと４℃にて一晩反応させ、抗体吸収試液とし、同様にフィルター試料の一部を抗体吸収試液と反応させた。その後、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ山羊血清と反応させた後、化学発光検出試薬（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇキット）を反応させた。検出は、フルオロイメージアナライザーＬＡＳ−１０００（富士フィルム）を用いて行った。その結果、ＬＹＶＥ−１抗体と反応させたフィルター試料にはＬＹＶＥ−１とＬＹＶＥ−１抗体とが反応した特異的なバンドが確認されたが、抗体吸収試液と反応させたフィルター試料ではそのバンドは確認されなかった。このことより、本抗体がＬＹＶＥ−１特異的な抗体であることが証明された。
実施例４（ＬＹＶＥ−１抗体を用いた組織染色）
下記表１に示すヒトの各種正常及び病理学的組織のパラフィン固定切片を使用し、ＬＹＶＥ−１の局在について検索した。
2004081035.tif 000005
各切片を脱パラフィン後にガラススライド上に置き、ガラススライド上の組織とＬＹＶＥ−１抗体を室温にて３０分反応させた。これをＰＢＳで洗浄した後、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ山羊血清と室温にて３０分反応させた。
反応物をＰＢＳで洗浄し、さらにストレプトアビジンペルオキシダーゼ結合試薬と室温にて３０分反応させた。ＰＢＳ洗浄後３，３−ジアミノベンジジン塩酸を基質として発色を行った。各組織の染色像を図２に示す。
また、同一組織におけるリンパ管内皮細胞の染色と血管内皮細胞の染色を比較するため、ｖｏｎ  Ｗｉｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）による血管内皮細胞の染色も同様にして行った。
その結果、ヒトの各種正常及び病理学的組織において、ＬＹＶＥ−１抗体によりリンパ管内皮細胞は染色されたが、血管内皮細胞は染色されなかった。また、ｖＷＦにより血管内皮細胞は染色されたが、リンパ管内皮細胞は染色されなかった。各組織の染色像を図３に示す。
上記実験の結果から、ＬＹＶＥ−１抗体はリンパ管内皮細胞を特異的に認識する抗体であること、及びＬＹＶＥ−１抗体はリンパ管内の癌細胞浸潤部の特定に有用であることが証明された。
本発明により、ＬＹＶＥ−１のペプチドフラグメント及びそのペプチドに対する抗体が提供される。本発明の抗体を利用して、生体組織中のリンパ管のみを選択的に染色することができる。特に、本発明の抗体は、生体組織における腫瘍によるリンパ管の破壊性浸潤性増殖についての病理学的所見を得るための使用において有用であり、ひいては、本発明の抗体を利用して腫瘍の悪性度を診断するための指標を得ることができ、癌患者の治療及び予後に役立つものとなる。
さらに、本発明の抗体は、ヒトリンパ球の分離、精製を利用したリンパ管の新生治療に用いることができる。すなわち、本発明の抗体を用いて、例えば細胞分離機器（セルソーター）、磁気細胞分離法等によりリンパ管細胞及びその前駆体細胞を分取し、これを、例えば、リンパ管浮腫の軽減を目的としたリンパ管新生治療等に用いることができる。（Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ：Ｗｈａｔ  ｄｏ  ｗｅ  ｋｎｏｗ？，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ６０，Ｉｓｓｕｅ  ２，１７１−１８０，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００３；Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｍｙｔｈ  ｏｒ  Ｒｅａｌｉｔｙ？，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．７，４６２−４６８，Ｍａｒｃｈ  ２００１；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｍｓ−Ｌｉｋｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ４  Ｇｅｎｅ  Ｂｅｃｏｍｅｓ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｔｏ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ  ９２，３５６６−３５７０，Ａｐｒｉｌ  １９９５）
【配列表】
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2004081035.tif 000007
【図１】
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【図２】
2004081035.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月16日(2006.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のペプチドフラグメントに対する抗体。
【請求項３】
ヒトリンパ管特異的ヒアルロナン受容体−１（ＬＹＶＥ−１）に特異的である、請求の範囲第２項に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、そのＣ末端若しくはＮ末端以外に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体によって認識されるペプチドフラグメント又はそのＣ末端若しくはＮ末端にリンカーとして一つのアミノ酸が付加されたペプチドフラグメント。
【請求項５】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を調製するための、請求の範囲第１項又は第４項に記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項６】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管免疫染色用組成物。
【請求項７】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管免疫染色用試薬キット。
【請求項８】
採取したヒト組織におけるリンパ管を、請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて特異的に免疫染色する方法。
【請求項９】
悪性腫瘍の悪性度の検査方法であって、次のステップ；
ａ）採取したヒト組織におけるリンパ管を、請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて特異的に免疫染色するステップ、
ｂ）ステップａ）で染色した染色像における悪性腫瘍の浸潤度を測定するステップ、
ｃ）ステップｃ）に基づいて悪性腫瘍の悪性度を検査するステップ、
からなる方法。
【請求項１０】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を用いて、ヒトリンパ球を分離及び／又は精製する方法。
【請求項１１】
請求の範囲第２項又は第３項に記載の抗体を含むことを特徴とする、ヒトリンパ管新生治療用組成物。
【国際調査報告】
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