(57)【要約】本発明の目的は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することである。本発明によれば、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項２】
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項３】
配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。
【請求項４】
炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
プライマーがフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５から７のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キット。
【請求項９】
炎症性疾患が心筋梗塞である請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現状態の分析方法。
【請求項１１】
候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】
候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を増大させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
候補物質の存在下でリンホトキシン−α（ＬＴＡ）とｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子産物との結合を測定し、該結合を阻害する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２（ガレクチン−２）遺伝子に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の診断方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】  ライフスタイルの変化及び新しい薬理学的アプローチにも関わらず、心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている（Ｂｒｅｓｌｏｗ，Ｊ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３，６００−６０１，１９９７；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｅ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７，１３６０−１３６９，１９９７）。従って、それらの発症における遺伝的及び環境的因子を同定することが強く望まれている。
共通の遺伝的変異は、糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕著に関連していることが知られている（Ｒｉｓｃｈ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３，１５１６−１５１７，１９９６；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，１５８０−１５８１，１９９７；Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，５３６−５３９，１９９６）。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析では、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マーカー（主としてマイクロサテライト）の座位が連鎖しているかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では特定の遺伝マーカー（主として一塩基多型：ＳＮＰ）のどの型（アレル：対立遺伝子）が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。従って、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対する連鎖解析のよりもずっと強力といえる。一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。ＳＮＰｓは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、ある疾患や薬剤による重篤な副作用に対する危険性を増やすことがある。よって、多くのＳＮＰｓを探索することにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄与できることを期待される。
遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、これまでヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（特開２００２−１３６２９１号公報）などがある。しかしながら、心筋梗塞と関連のある遺伝子変異の解明は未だ十分なものではない。
一方、現在までの所、哺乳類には１０種類のガレクチンが知られている。そのうちのｇａｌｅｃｔｉｎ−２はｇａｌｅｃｔｉｎ−１に対して４３％と高い相同性を示す。ｇａｌｅｃｔｉｎ−２はｇａｌｅｃｔｉｎ−１と同様、１４ｋＤａのサブユニット２つからなる非共有結合性の二量体を形成し、還元剤非存在下では自己凝集し、活性を失う。また、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２はｇａｌｅｃｔｉｎ−１と比較して組織分布は狭い。ｇａｌｅｃｔｉｎ−１の場合、筋肉等の間充組織をはじめ様々な細胞系列に豊富に存在するが、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２は正常成人組織の中では下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められる。ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の詳細な機能につてはまだ解明されていない（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．４５，（１９９７）ｐｐ．８７−９３）。
【発明の開示】
本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、同定したＳＮＰを利用して、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１およびｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物が心筋梗塞感受性遺伝子産物ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ（ＬＴＡ）に結合すること、並びにｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内の新規一塩基多型（ＳＮＰ）が心筋梗塞の発症進展に関連していることを同定することにより本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
好ましくは、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
さらに好ましくは、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
本発明の別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
好ましくは、プライマーはフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現状態の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を増大させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、候補物質の存在下でリンホトキシン−α（ＬＴＡ）とｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子産物との結合を測定し、該結合を阻害する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性の測定方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片を細胞に導入し、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のスクリーニング方法により得られるｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する物質が提供される。
本発明の方法で好ましくは、前記ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。さらに好ましくは、前記リポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片とｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子の存在が予想される試料とを接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、検出はゲルシフトアッセイにより行われる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−１及び−２とのインビトロでの結合を確認した実験の結果を示す。
図２は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の３２７９Ｃ＞ＴのＳＮＰが転写活性に与える影響を調べた結果を示す。
図３は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２と微小管との相互作用を調べた結果を示す。ａはＴＡＰのタグのｇａｌｅｃｔｉｎ−２と相互作用タンパク質の単離を示す。ｂは、内因性α−チューブリンとＦｌａｇのタグのついたｇａｌｅｃｔｉｎ−２又はＬＴＡとの共免疫沈降の実験結果を示す。ｃは、Ｕ９３７細胞における内因性α−チューブリンと内因性ｇａｌｅｃｔｉｎ−２又はＬＴＡとの共局在の実験結果を示す。
図４は、冠状動脈粥腫切除切片におけるｇａｌｅｃｔｉｎ−２とＬＴＡの発現及び共局在を調べた結果を示す。ａは抗ヒトＬＴＡで染色、ｂは抗ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−２で染色、ｃはモノクローナル抗ＳＭＣα−アクチンで染色、ｄはモノクローナル抗ＣＤ６８で染色した。ｅは、抗ＬＴＡ抗体及び抗ｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗体で二重染色した。ｆは、抗ヒトＬＴＡで染色した。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１およびｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物が心筋梗塞等の炎症性疾患感受性遺伝子産物として知られているｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ（ＬＴＡ）（Ｏｚａｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２，６５０−６５４，２００２）産物と結合することを同定した。さらに、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内の新規一塩基多型（ＳＮＰ）を同定し、それぞれ約２０００人の心筋梗塞患者群とコントロール群についてＰＣＲ−ＤＮＡシークエンス法によりタイピングし、相関解析（カイ二乗検定など）を行った結果、この新規ＳＮＰの頻度が統計学的に有意に心筋梗塞患者で少ないことを見出した。さらにルシフェラーゼアッセイ法を用いた実験により、この新規ＳＮＰが実際に生物学的機能を有し、このｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物量の変化が心筋梗塞に限らず様々な炎症性疾患を引き起こすことを明らかにした。
上記の通り、本発明では、ＬＴＡタンパク質に結合する新たな分子としてｇａｌｅｃｔｉｎ−１およびｇａｌｅｃｔｉｎ−２タンパク質を同定した。さらにｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内の新規ＳＮＰが生物学的な機能を有し、心筋梗塞等の疾患に関連することを同定した。従って、本発明により同定されたｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子の新規ＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可能になる。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
［１］  炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。
本発明において「ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、（ｉ）当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び（ｉｉ）前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子に存在する遺伝子多型の好ましい具体例としては、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を挙げることができる。
本明細書において、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基は、配列番号２に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のゲノム配列の３４４９番目の塩基に相当する。
例えば、後記表１に示すように、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＣである場合（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２  イントロン１  ３２７９Ｃ）は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。
これに対し、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＴである場合（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２イントロン１  ３２７９Ｔ）は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。
本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析（ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）及び／又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。
（検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
（増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、配列番号１（又は配列番号３）に示される配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅するように行う。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。
（遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号１（又は配列番号３）に示す配列における前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する。
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等の公知の方法により行うことができる。
遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ＨＥＴ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ  ｍｅｔｈｏｄ）法、ＰＥＸ（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等を用いることができる。
［２］  炎症性疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。
［３］  ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現状態の分析方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を検出することによって、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現状態を分析することができる。
例えば、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＣである場合（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２  イントロン１  ３２７９Ｃ）は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現量が低いと判断できる。これに対し、配列番号１に示すｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＴである場合（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２  イントロン１  ３２７９Ｔ）である場合は、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現量が高いと判断できる。
［４］  炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明によれば、候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択することによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、候補物質の存在下で細胞内のｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析し、その発現量を増大又は減少させる物質を選択することができ、特に好ましくはその発現量を増大させる物質を選択することができる。さらに本発明によれば、候補物質の存在下でリンホトキシン−α（ＬＴＡ）とｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子産物又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子産物との結合を測定し、該結合を阻害する物質を選択することによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子又はｇａｌｅｃｔｉｎ−１遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を変化させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
［５］  ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性の測定方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を含むｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、前記ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
［６］  ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記した一塩基多型を含むｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片を細胞に導入し、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってｇａｌｅｃｔｉｎ−２転写活性を阻害又は促進する物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、前記ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２  イントロン１  ３２７９Ｔ）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はｇａｌｅｃｔｉｎ−２転写活性阻害物質として選択することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上記のスクリーニング法により得られるｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する物質もまた本発明の範囲内である。このようなｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写活性を阻害又は促進する物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。
［７］  ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記した一塩基多型を含む遺伝子断片とｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子をスクリーニングすることもできる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片とｇａｌｅｃｔｉｎ−２の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ，ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるＤＮＡの移動度が低下するので、３２Ｐで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでＤＮＡの位置を見ると、因子の結合したＤＮＡはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】（Ａ）方法・材料
（１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ
ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｃｈＴＭ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。ライブラリー作製のための培養ヒト冠状動脈血管平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）は、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社より購入した。１×１０７個の細胞より  ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ２．０ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｍＲＮＡを調製し、５μｇのＨＣＡＳＭＣ  ｍＲＮＡを用い、添付プロトコールに従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、添付プロトコールに従ってＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングを施行した。
（２）リコンビナントｇａｌｅｃｔｉｎ−１、−２、−３及びＬＴＡの作製、免疫沈降によるＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎの結合確認
ｇａｌｅｃｔｉｎ−１、−２、−３は、全長をｐＥＴ  ２８  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）で組み換え体を作製し、添付プロトコールに従って大腸菌で発現、精製した。また、ＬＴＡはｐＥＴ２９  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により作製した。抗ＬＴＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社）はＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付プロトコールに従って架橋した（抗ＬＴＡ抗体セファロース）。ＬＴＡ−ｇａｌｅｃｔｉｎの結合実験は、１０ｍｌｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］中に５μｇのｇａｌｅｃｔｉｎ−１あるいはｇａｌｅｃｔｉｎ−２あるいはｇａｌｅｃｔｉｎ−３を加え、さらに１時間攪拌した。１６００回転で１０分間遠心し、上清を捨て、沈殿をｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ−４０］で３回洗浄し、５０μｌの５×ＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，４％ＳＤＳ，２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０％ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，０．０４％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，ｐＨ６．８）で溶解しサンプルとした。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に移し、抗Ｔ７抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、ＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）によりシグナルを検出した。ＣＯＳ７細胞（Ｒｉｋｅｎ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）を用いた強制発現系によるＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−２の相互作用（結合）の確認では、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５ａ  ｖｅｃｔｏｒ（コスモバイオ社）にＬＴＡを、ｐＣＭＶ−Ｍｙｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にｇａｌｅｃｔｉｎ−２を組み換え体として導入し、ＣＯＳ７細胞にＦｕＧｅｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（ロッシュ社）を用いてトランスフェクションした。３６時間後の細胞を回収、細胞タンパク抽出バッファ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０］によりタンパクを抽出した後、非特異的吸着を抑制するために、この抽出液に５０μｌのｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を加え１時間攪拌し、１６００回転で１０分間遠心し、上清を免疫沈降のサンプルとした。サンプルに５μｇの抗ＬＴＡ抗体を加え１７℃で１時間攪拌後、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ５０μｌを加え１７℃で１時間攪拌し、１６００回転で１０分間遠心し、沈殿をｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ−４０］で３回洗浄してサンプルとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜に移し、抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社）、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ社）によりシグナルを検出した。
（３）ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内ＳＮＰｓと心筋梗塞との相関解析
心筋梗塞患者とコントロール群、そのＤＮＡの採取方法、ＤＮＡのシークエンス法、ＤＮＡタイピング法、相関解析の統計学的手法は既報に従っている（Ｏｚａｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２，６５０−６５４，２００２）。ｇａｌｅｃｔｉｎ−１およびｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子領域のＳＮＰｓは、それぞれ１６人の心筋梗塞およびコントロールからのＤＮＡを用いたＰＣＲダイレクトシークエンス法により同定・発見した。
（４）ルシフェラーゼアッセイ法
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子の３１８８から３４０４までのｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９ＣあるいはＴのＳＮＰを含む領域をゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅しｇａｌｅｃｔｉｎ−２ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒベクターのルシフェラーゼの下流にクローニングした。これらのプラスミド２μｇ及び１００ｍｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（ｐｒｏｍｅｇａ社；トランスフェクション効率を合わせるための内部標準ベクター）をＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９００４）およびＨｅｐＧ２細胞にＦｕＧｅｎｅ  ｒｅａｇｅｎｔを用いてトランスフェクションした。２４時間後細胞を集め、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（５）タンデムアフィニティー精製
タンデムアフィニティー精製は、Ｒｉｇａｕｔ，Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７，１０３０−１０３２（１９９９）に記載の方法に準じて行った。Ｈｉｓ  ｔａｇ、ＴＥＶ切断部位、及びＳ  ｔａｇをＴＡＰｔａｇ配列としてコードする融合カセットをｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター（シグマ社）中に構築した。このＴＡＰベクターは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で哺乳動物細胞中に、カルボキシ末端にＴＡＰタグを有しアミノ末端にＭｙｃタグのついた標的タンパク質を発現する。ＴＡＰベクターをＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９００４）に一過性にトランスフェクションした。標的タンパク質のバンドをＡＰＲＯ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅのＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ｍａｓｓスペクトル測定装置により分析した。
（６）共免疫沈降実験
内因性α−チューブリンとＦｌａｇのタグのついたｇａｌｅｃｔｉｎ−２又はＬＴＡを用いて共免疫沈降実験を以下の通り行った。Ｆｌａｇ又はＳのタグのついたＬＴＡ、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２、そしてｌａｃＺ（陰性対照）をＨｅＬａ細胞にＦｕｇｅｎｅを用いてトランスフェクションした。免疫沈降は、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％Ｎｏｎｉｄｅｎｔ  Ｐ−４０）中で行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、免疫沈降を抗−Ｆｌａｇ  ｔａｇ  Ｍ２アガロース（シグマ社）を用いて行った。ＨＲＰ結合Ｓ−プロテイン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、抗−Ｆｌａｇ  Ｍ２ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）又はヒトαチューブリンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、及びＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、免疫複合体を可視化した。
（７）共焦点顕微鏡分析
ポリクローナル抗ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗血清を、大腸菌で合成した組み換えタンパク質を用いてウサギで作成した。この抗血清は、ウエスタンブロット分析によれば、構造が類似しているｇａｌｅｃｔｉｎ−１及びｇａｌｅｃｔｉｎ−３との交差反応性を示さなかった。ポリクローナル抗ｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗血清、及びヤギ抗ヒトＬＴＡ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）又はマウス抗ヒトαチューブリンモノクローナルＩｇＭ抗体を、Ａｌｅｘａ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と一緒に使用した。Ｕ９３７細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９０２１）を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（２０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激し、固定した。その後、３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中で対応する一次抗体、そして対応するＡｌｅｘａ二次抗体と一緒にインキュベートした。
（８）免疫組織化学分析
組織試料は、１６名の心筋梗塞患者から方向性冠状動脈粥腫切除術により取得した。免疫組織化学分析は、ヤギ抗ヒトＬＴＡ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びウサギポリクローナル抗ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗体を用いて既報（Ｍｉｎａｍｉ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１，１７９６−１８００（２００１）；及びＳｈｉ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１５，７−１２（２０００））の通り行った。隣接する切片の染色は、ＳＭＣ−２アクチン及びＣＤ６８に対するヒト細胞型特異的モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）を用いて行った。二重標識した免疫組織化学分析としては、切片を先ず抗ＬＴＡ抗体とインキュベートし、それからビオチン化ブタ抗ヤギＩｇＧ、そしてアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートし、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）で可視化した。続いて切片をウサギポリクローナル抗ヒトｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗体とインキュベートし、そしてアルカリホスファターゼ結合ブタ抗ウサギＩｇＧとインキュベートし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質系で可視化した。
（Ｂ）結果
（１）心筋梗塞感受性遺伝子産物ＬＴＡに結合するタンパク質の同定（スクリーニング）
ＬＴＡに結合する新規タンパクをスクリーニングするためにＥ．ｃｏｌｉ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ−ｓｙｓｔｅｍを利用し血管平滑筋細胞由来ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄ−ｌｉｂｒａｒｙより、ＬＴＡの結合候補タンパク質としてｇａｌｅｃｔｉｎ−１を同定した。
（２）ＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−１，２のインビトロでの結合の確認
リコンビナントｇａｌｅｃｔｉｎ−１（Ｔ７ｔａｇをＮ末端側に結合）及びＬＴＡをそれぞれ個別に大腸菌で発現、精製後、抗ＬＴＡ抗体架橋セファロースとこれらを反応し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗Ｔ７抗体を用いたウエスタンブロット法によりｇａｌｅｃｔｉｎ−１を検出した（図１ａ）。
図１ａにおいて、レーン１では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した（陰性コントロール）。レーン２では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１とＬＴＡとをインキュベートし、複合体を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した。レーン３では、１００ｎｇの組換えｇａｌｅｃｔｉｎ−１を陽性コントロールとして用いた。星印は、抗ＬＴＡ抗体セファロース中のイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖に由来する非特異的バンドを示す。
また、ｇａｌｅｃｔｉｎ−１と高いホモロジーを有するｇａｌｅｃｔｉｎ−２および−３についても大腸菌よりリコンビナントプロテインを作製して、同様の手法によりＬＴＡとの結合を確認したところ、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２もＬＴＡと結合することが明らかとなった（図１ｂ）。
図１ｂでは、ＬＴＡと共沈降したＧａｌｅｃｔｉｎを、抗Ｔ７ｔａｇモノクローナル抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧを用いたウエスタンブロット分析により検出した。レーン１では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−３とＬＴＡとをインキュベートし、抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降を行った。レーン２では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２とＬＴＡとをインキュベートし、複合体を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した。レーン３では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した（陰性コントロール）。レーン４及び５では、１００ｎｇのｇａｌｅｃｔｉｎ−３（レーン４）又はｇａｌｅｃｔｉｎ−２（レーン５）を陽性コントロールとして用いた。星印は、抗ＬＴＡ抗体セファロース中のイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖に由来する非特異的バンドを示す。
さらに、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２については、ＬＴＡ  Ｔｈｒ２６及びＬＴＡ  Ａｓｎ２６（Ｏｚａｋｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３２，６５０−６５４，２００２）とのＣＯＳ７細胞（サル腎臓細胞株）への共強制発現系を用いた実験系により、その結合を培養細胞レベルでも確認した（図１ｃ）。
図１Ｃは、抗ＬＴＡ抗体を用いたＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−２との共免疫沈降の結果を示す。ＣＯＳ７細胞にＭｙｃタグ付きｇａｌｅｃｔｉｎ−２プラスミド又はＦＬＡＧタグ付きＬＴＡプラスミド（Ｔｈｒ２６またはＡｓｎ２６）をトランスフェクションし、ライセートを調製し、プロテインＡセファロースと抗ＬＴＡ抗体とを使用して免疫沈降に供した。ＬＴＡと共沈したＧａｌｅｃｔｉｎ−２を、Ｍｙｃ（Ｇａｌｅｃｔｉｎ−２）又はＦＬＡＧ（ＬＴＡ）−抗モノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を使用したウエスタンブロット分析により検出した。レーン１及び２では、ＬＴＡ２６  Ｔｈｒ（レーン１）又はＬＴＡ  ２６  Ａｓｎ（レーン２）をトランスフェクションして沈降させた（ＬＴＡの陽性コントロール）。レーン３では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２をトランスフェクションして沈降させた（ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の陽性コントロール）。レーン４及びレーン５では、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２とＬＴＡ  ２６  Ｔｈｒ（レーン４）又はＬＴＡ  ２６  Ａｓｎ（レーン５）をコトランスフェクションし、共沈降させた。
（３）ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内一塩基多型と心筋梗塞との相関
ｇａｌｅｃｔｉｎ−１および−２がＬＴＡと結合することが明らかとなり、これらの遺伝子産物の機能変化がＬＴＡの機能変化に結びつき、心筋梗塞の感受性に関連している可能性が示唆されることから、これら遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を新たに同定、発見し、そのＳＮＰｓを用いて、患者、コントロールそれぞれ約２３００例についてｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙを施行した。その結果、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子内ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９番目Ｃ＞Ｔ新規ＳＮＰのｍｉｎｏｒ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ（ＴＴａｌｌｅｌｅ）が心筋梗塞患者で有意に少ない（χ２＝２５．３，Ｐ＝０．００００００５；ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ＝１．６）ことを見出した（表１）（塩基番号は変異命名による：Ｄｕｎｎｅｎ  Ｊ．Ｔ他、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １５，７−１２，２０００）。このことから、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰが心筋梗塞にプロテクティブに働く因子と考えられ、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２の機能変化が心筋梗塞に関連している可能性が示唆された。
2005017200.tif 000002
今回新たに同定したｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｉｎｔｒｏｎ  １の  ３２７９番目Ｃ＞Ｔの新規ＳＮＰの周辺の塩基配列（配列番号３：但し、配列番号３においてＹはＣ又はＴを示す）を以下に示す。
2005017200.tif 000003
［Ｃ／Ｔ］は、ｉｎｔｒｏｎ  １の  ３２７９番目Ｃ＞ＴのＳＮＰを示す。
下線を付したＣＴＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴとＴＣＴＴＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧはＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒを示し、下線を付したＣＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡＣＴＧＴＴはシークエンスプライマーを示す。
（４）ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰのｇａｌｅｃｔｌｎ−２遺伝子転写活性に与える影響
ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰのｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子転写活性に与える影響を測定するために、レポーター遺伝子アッセイ（ルシフェラーゼアッセイ）を施行した。ｇａｌｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｉｎｔｒｏｎ  １  ３１８８から３４０４までのヌクレオチドよりなるＤＮＡフラグメントを、ｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒベクターのＳＶ４０エンハンサーの下流に、５’から３’の方向にクローニングし、レポーターベクターを作製した。これらのレポーターベクターをＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、２４時間後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２（左図はＨｅＬａ細胞、右図はＨｅｐＧ２細胞での結果を示す）
に示す。
（５）ｇａｌｅｃｔｉｎ−２と微小管との相互作用
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２によるＬＴＡ分泌の制御機構を調べるために、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）システムを用いて、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２と相互作用する細胞内分子を探索した。その結果、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２−ＴＡＰタグを発現させた場合のみに検出できる２つの特異的なバンドを同定した（図３ａ）。ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ  ｍａｓｓスペクトル分析により、これらの２つのバンドは、微小管の重要成分であα−及びβ−チューブリンに対応することが示された。Ｆｌａｇのタグをつけたｇａｌｅｃｔｉｎ−２を発現するプラスミドでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞を用いて、内因性のチューブリン及びｇａｌｅｃｔｉｎ−２が一緒に免疫沈降することを確認した（図３ｂ）。チューブリンはＬＴＡとも一緒に免疫沈降した（図３ｂ）。二重免疫染色したＵ９３７細胞の共焦点顕微鏡分析像から、ｇａｌｅｃｔｉｎ−２及びα−チューブリンは、細胞質に発達した網状フィラメントネットワークとして一緒に局在化していた（図３ｃ）。この結果はｇａｌｅｃｔｉｎ−２が細胞内輸送に関与している可能性を示している。
（６）冠状動脈粥腫切除術による試料におけるｇａｌｅｃｔｉｎ−２とＬＴＡの発現と共局在
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２とＬＴＡが、心筋梗塞の損傷（即ち、冠状動脈のアテローム硬化性損傷）で発現しているかどうか、そして発現している場合にはその発現部位を調べるために、抗ＬＴＡ又は抗ｇａｌｅｃｔｉｎ−２抗体を用いて、冠状動脈粥腫切除試料について免疫組織化学染色分析を行った。図４ａ及びｂに示す通り、ＬＴＡ及びｇａｌｅｃｔｉｎ−２についての免疫反応性が、アテローム斑の内膜細胞に検出され、そのうちの一部は紡錘体状、又は限定的に空胞化した丸い細胞質であった。隣接する切片を抗平滑筋細胞（ＳＭＣ）α−アクチン又は抗ＣＤ６８で免疫染色した結果、これらの細胞の大部分は平滑筋細胞であるか、平滑筋細胞由来の泡沫細胞であり、マクロファージも一部に見られた（図４ｃ及びｄ）。二重標識免疫組織化学分析により、ＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−２の共発現が大部分の多形性の平滑筋細胞で見られた（図４ｅ）。対照的に、細胞質が僅かな繊維斑の萎縮性平滑筋細胞や、正常な内側の平滑筋細胞では、何れのタンパク質の発現も検出されなかった（図４ｆ）。これらの結果は、ＬＴＡとｇａｌｅｃｔｉｎ−２が、ヒトのアテローム硬化性斑の内膜の平滑筋細胞及びマクロファージでは共発現しているが、静止期又は正常な内側の平滑筋細胞では存在しないことを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明により、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）が新たに同定された。本発明で同定されたＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することが可能になる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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