(57)【要約】ハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基種に応じて蛍光シグナル強度が変化する新しいヌクレオチド誘導体であって、１本鎖ヌクレオチド配列のメンバーとして存在し、この１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基が、（２）アデニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するチミン／ウラシル誘導体；（２）グアニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するシトシン誘導体；（３）シトシンである場合に蛍光色素が最も強く発光するアデニン誘導体；または（４）シトシンまたはチミン／ウラシルである場合に蛍光色素が最も強く発光するグアニン誘導体。
2004058793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリミジン塩基またはプリン塩基に、リンカーを介して蛍光色素インターカレーターが結合しているヌクレオチド誘導体であって、１本鎖ヌクレオチド配列のメンバーとして存在し、この１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基が、
（１）  アデニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するチミン／ウラシル誘導体；
（２）  グアニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するシトシン誘導体；
（３）  シトシンである場合に蛍光色素が最も強く発光するアデニン誘導体；または
（４）  シトシンまたはチミン／ウラシルである場合に蛍光色素が最も強く発光するグアニン誘導体。
【請求項２】
チミン／ウラシル誘導体が以下の一般式（１）で表される請求項１のヌクレオチド誘導体。
2004058793.tif 000030
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項３】
シトシン誘導体が以下の一般式（２）で表される請求項１のヌクレオチド誘導体。
2004058793.tif 000031
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項４】
アデニン誘導体が以下の一般式（３）で表される請求項１のヌクレオチド誘導体。
2004058793.tif 000032
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項５】
グアニン誘導体が以下の一般式（４）で表される請求項１のヌクレオチド誘導体。
2004058793.tif 000033
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項６】
チミン／ウラシル誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（５）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000034
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項７】
シトシン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（６）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000035
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項８】
アデニン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（７）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000036
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項９】
グアニン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（８）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000037
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。）
【請求項１０】
請求項１のヌクレオチド誘導体（１）〜（４）の１以上をメンバーとして有する１本鎖ヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項１０の１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の１塩基種Ｘを決定する方法であって、１本鎖ヌクレオチド配列中の、
（ｉ）チミン／ウラシル誘導体（１）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはアデニン；
（ｉｉ）シトシン誘導体（２）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはグアニン；
（ｉｉｉ）アデニン誘導体（３）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはシトシン；
（ｉｖ）グアニン誘導体（４）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはシトシンまたはチミン／ウラシル、
と決定する塩基種決定方法。
【請求項１２】
アデニン誘導体（３）とグアニン誘導体（４）を同一位置に有する２本の１本鎖ヌクレオチド配列をそれぞれ同一の相手鎖にハイブリダイズさせ、
（ｖ）アデニン誘導体（３）とグアニン誘導体（４）の両方の蛍光色素が最も強く発光した場合の相手鎖の塩基種Ｘはシトシン；
（ｖｉ）グアニン誘導体（４）の蛍光色素のみが最も強く発光した場合の相手鎖の塩基種Ｘはチミン／ウラシル、
と決定する請求項１１の塩基種決定方法。
【請求項１３】
請求項６の１本鎖ヌクレオチド配列をキャプチャープローブとするＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１４】
標的ヌクレオチド配列の１塩基多型（ＳＮＰ）を検出するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列の少なくともＳＮＰヌクレオチドを含む領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは、標的ヌクレオチド配列のＳＮＰヌクレオチドと対応する位置のヌクレオチドがそれぞれヌクレオチド誘導体（１）〜（４）である請求項１３のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１５】
配列が未知であるｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチド配列を決定するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブは、ヌクレオチド配列が全て異なる少なくとも４ｎ個のセットであり、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までの少なくとも１つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）である請求項１３のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１６】
標的ヌクレオチド配列中に、ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる既知配列領域と相同の領域が存在するか否かを検出するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までの少なくとも一つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）である請求項１３のＤＮＡマイクロアレイ。
【請求項１７】
ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる未知配列領域と既知配列領域とを有する標的ヌクレオチド配列の未知配列領域の配列を決定するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域に対する相補配列と、ヌクレオチド配列が全て異なるプローブ配列領域とを有する少なくとも４ｎ個のセットであり、各プローブ配列領域の第１位から第ｎ位までの少なくとも１つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）である請求項１３のＤＮＡマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、ヌクレオチド配列中の特定塩基種を決定するためのヌクレオチド誘導体と、このヌクレオチド誘導体を含むキャプチャープローブを備えたＤＮＡマイクロアレイに関するものである。
【背景技術】  ポストゲノムの時代を迎え、ヌクレオチド配列中の塩基種を正確に、効率よく、さらには低コストで検出するための新しい技術が求められている。例えば、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）はヒトゲノムに約０．１％（約１０００塩基に一塩基）の割合で存在する最も頻度の高い多型であり、その有無が様々な疾病にも関連することが明らかになりつつあり（例えば肺癌に関するｐ５３遺伝子のＳＮＰ：非特許文献１）、診断や遺伝的治療法等を目的としてＳＮＰの有無を正確に判定すること（ＳＮＰタイピング）の重要性が高まりつつある。
ＳＮＰタイピングの方法としては、「ハイブリダイゼーション効率を利用した方法」、「酵素認識効率を利用した方法」、「電気的手法を利用した方法」等が知られているが、特にハイブリダイゼーション効率を利用した方法は、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば特許文献１−４、非特許文献２、３参照）への適用が様々に検討されていおり、例えば非特許文献４にはＤＮＡマイクロアレイ（マイクロアレイ）を用いたＢＲＣＡ１遺伝子ＳＮＰの検出例が報告されている。
しかしながら、従来のＤＮＡマイクロアレイは、ＳＮＰの検出に限ったことではないか、通常は標的ヌクレオチド配列を蛍光等によって標識し、マイクロアレイのキャプチャープローブとハイブリダイズした標的ヌクレオチド配列を蛍光シグナルを指標として検出する。このため、例えば標的ヌクレオチド配列の調製には、標識ｄＮＴＰを用いたＰＣＲ増幅等の手段が用いられているが、これには多大な労力と時間、費用を必要とする。また、ＳＮＰ等の検出では、プローブと標識ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションにおける融解温度を指標とする方法が一般的に採用されているが、この場合には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件を個々の標的ヌクレオチド配列ごとに厳密に設定する必要があり、またそのような条件設定によってもミスハイブリダイゼーション等による測定誤差が避けられないといった不都合も存在した。
一方、天然の核酸塩基に蛍光分子を結合させた蛍光修飾核酸塩基が知られていおり、例えば非特許文献５には、ハイブリダイズした相手鎖の環境によって蛍光シグナル強度を変化させ蛍光プローブの利用が提案されている。
【特許文献１】米国特許第５，４７４，７９６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６０５，６６２号明細書
【特許文献３】国際公開第９５／２５１１１６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９５／３５５０５号パンフレット
【非特許文献１】Ｂｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ４８（５）：４０７−１１，２００１
【非特許文献２】Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：１０６１４−１０６１９，１９９６
【非特許文献３】Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５，１９９７
【非特許文献４】Ｈａｃｉａ  ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１４：４４１−４４７，１９９６
【非特許文献５】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ９７，２００２
【発明の開示】
前記のとおり、ＳＮＰの検出等における塩基種の決定のためには、特にＤＮＡマイクロアレイへの適用を考慮した場合、標的ヌクレオチド配列の蛍光等による標識操作を必要とせず、しかも融解温度測定等の間接的な指標に頼ることのない、新しい方法が求められている。そのような観点から、蛍光修飾核酸塩基を用いたプローブ（例えば非特許文献５）はプローブ側の蛍光シグナルの変化を指標として直接的に塩基種を特定可能である点において有効な方法である。ただし、この非特許文献５の方法の場合には、蛍光修飾核酸塩基と対合する塩基種の周辺の環境（特定の塩基配列等）に応じた蛍光シグナルを指標とするものであり、一塩基の種類に応じて蛍光シグナルが変化するものではない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、ハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基種に応じて蛍光シグナル強度が変化する新しいヌクレオチド誘導体を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、前記のヌクレオチド誘導体を用いた塩基種の決定方法と、この方法を測定原理とするＤＮＡマイクロアレイを提供することを課題としている。
この出願の第１の発明は、ピリミジン塩基またはプリン塩基に、リンカーを介して蛍光色素インターカレーターが結合しているヌクレオチド誘導体であって、１本鎖ヌクレオチド配列のメンバーとして存在し、この１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基が、
（１）アデニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するチミン／ウラシル誘導体；
（２）グアニンである場合に蛍光色素が最も強く発光するシトシン誘導体；
（３）シトシンである場合に蛍光色素が最も強く発光するアデニン誘導体；または
（４）シトシンまたはチミン／ウラシルである場合に蛍光色素が最も強く発光するグアニン誘導体、
である。
この第１発明において、「ヌクレオチド誘導体」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルであるヌクレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の任意位置にアルキレン鎖を介して蛍光色素インターカレーターを結合した化合物である。また、このヌクレオチド誘導体が「１本鎖ヌクレオチド配列のメンバーとして存在する」とは、３ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列中の端部ではない位置に、ヌクレオチド誘導体がその左右のヌクレオチドとホスホジエステル結合した状態を言う。さらに、「蛍光色素が最も強く発光する」とは、例えば蛍光分光光度計で測定した場合、例えばチミン／ウラシル誘導体の場合には、相対する塩基種がグアニン、シトシンおよびチミン／ウラシルである場合に比較して、アデニンである場合に最も強い蛍光シグナル強度が得られることを意味する。
なお、以下の説明において「チミン／ウラシル」は単に「ウラシル（Ｕ）」または「チミン（Ｔ）」と記載することがある。
この第１発明の具体例は、以下の一般式（１）で表されるチミン誘導体：
2004058793.tif 000003
以下の一般式（２）で表されるシトシン誘導体：
2004058793.tif 000004
以下の一般式（３）で表されるアデニン誘導体：
2004058793.tif 000005
および、以下の一般式（４）で表されるグアニン誘導体：
2004058793.tif 000006
である。
また、この出願の第２の発明は、前記各ヌクレオチド誘導体の前駆物質の具体例であって、それぞれ以下のヌクレオシド誘導体である。
チミン／ウラシル誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（５）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000007
シトシン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（６）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000008
アデニン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（７）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000009
グアニン誘導体の前駆物質であって、以下の一般式（８）で表されるヌクレオシド誘導体。
2004058793.tif 000010
なお、以上の一般式（１）〜（８）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。
この出願の第３の発明は、前記第１発明のヌクレオチド誘導体（１）〜（４）の１以上をメンバーとして有する１本鎖ヌクレオチド配列である。
この第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列においては、いずれかのヌクレオチド誘導体が複数個存在してもよく、または２種以上のヌクレオチド誘導体が１個ずつ、あるいはそれぞれ複数個存在してもよい。なお、前記のとおり、この１本鎖ヌクレオチド配列では、ヌクレオチド誘導体は配列の端部には存在しない。
この出願の第４の発明は、前記第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の１塩基種Ｘを決定する方法であって、１本鎖ヌクレオチド配列中の、
（ｉ）チミン誘導体（１）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはアデニン；
（ｉｉ）シトシン誘導体（２）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはグアニン；
（ｉｉｉ）アデニン誘導体（３）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはシトシン；
（ｉｖ）グアニン誘導体（４）の蛍光色素が最も強く発光した場合の塩基種Ｘはシトシンまたはチミン、
と決定する塩基種決定方法である。
この第４発明の方法は、また、アデニン誘導体（３）とグアニン誘導体（４）のそれぞれを同一位置に有する２本の１本鎖ヌクレオチド配列をそれぞれ同一の相手鎖にハイブリダイズさせ、
（ｖ）アデニン誘導体（３）とグアニン誘導体（４）の両方の蛍光色素が最も強く発光した場合の相手鎖の塩基種Ｘはシトシン；
（ｖｉ）グアニン誘導体（４）の蛍光色素のみが最も強く発光した場合の相手鎖の塩基種Ｘはチミン、
と決定することを好ましい態様としている。
第４発明の前記態様において、「２本の１本鎖ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド誘導体（３）（４）以外は全く同一の塩基配列からなる２本の１本鎖ヌクレオチド配列を言う。
この出願の第５の発明は、前記第２発明の１本鎖ヌクレオチド配列をキャプチャープローブとするＤＮＡマイクロアレイである。
前記第５発明のＤＮＡマイクロアレイは、標的ヌクレオチド配列の１塩基多型（ＳＮＰ）を検出するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列の少なくともＳＮＰヌクレオチドを含む領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは、標的ヌクレオチド配列のＳＮＰヌクレオチドと対応する位置のヌクレオチドがそれぞれヌクレオチド誘導体（１）〜（４）であることを一つの態様としている。
前記第５発明のＤＮＡマイクロアレイは、また、配列が未知であるｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチド配列を決定するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブは、ヌクレオチド配列が全て異なる少なくとも４ｎ個のセットであり、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までの少なくとも１つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）であることを別の態様としている。
前記第５発明のＤＮＡマイクロアレイは、さらに、標的ヌクレオチド配列中に、ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる既知配列領域と相同の領域が存在するか否かを検出するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までの少なくとも一つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）であることをさらに別の態様としている。
前記第５発明のＤＮＡマイクロアレイは、またさらに、ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる未知配列領域と既知配列領域とを有する標的ヌクレオチド配列の未知配列領域の配列を決定するＤＮＡマイクロアレイであって、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域に対する相補配列と、ヌクレオチド配列が全て異なるプローブ配列領域とを有する少なくとも４ｎ個のセットであり、各プローブ配列領域の第１位から第ｎ位までの少なくとも１つがヌクレオチド誘導体（１）〜（４）であることをさらにまた別の態様としている。
この出願の各発明における具体的構成、用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【発明の効果】
前記の第１発明によれば、ハイブリダイズした相手鎖の相対する塩基種に応じて蛍光シグナル強度が変化する新しいヌクレオチド誘導体が提供される。標的ヌクレオチド配列の標識操作を必要とせず、しかも融解温度測定等の間接的な指標に頼ることなく、キャプチャープローブの発する蛍光強度を直接測定することによって標的ヌクレオチド配列の所定の塩基種を判定することが可能となる。またこの発明のヌクレオチド誘導体は、塩基種の周辺の環境（特定の塩基配列等）に応じた蛍光シグナルを指標とするものではなく、対合する塩基の種類にのみ応じて蛍光シグナルが変化するため、標的配列がどのような配列あっても適応することができる。
前記の第２発明によれば、前記第１発明のヌクレオチド誘導体の前駆体であるヌクレオシド誘導体が提供される。このヌクレオシド誘導体を用いることによって前記第１発明のヌクレオチド誘導体を容易に作成することができる。
前記第３発明によれば、前記第１発明のヌクレオチド誘導体を有する１本鎖ヌクレオチド配列が提供され、このヌクレオチド配列をプローブとすることによって、標的ヌクレオチド配列中の未知塩基の塩基種を決定すること等が可能となる。
前記の第４発明によれば、前記第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列をプローブとして使用することによって、標的ヌクレオチド配列中の未知塩基の塩基種を決定する方法が提供される。この方法はプローブの蛍光強度を指標として簡便かつ確実に未知塩基種を決定することを可能とする。
前記の第５発明によれば、前記第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列をキャプチャープローブとするＤＮＡマイクロアレイが提供される。これによって、標的ヌクレオチド配列の１塩基多型（ＳＮＰ）、配列未知のヌクレオチド配列の配列決定、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域と相同の領域の存在等を、キャプチャープローブの蛍光強度を指標として簡便かつ確実に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、第３位に未知の塩基種Ｘを含む標的ヌクレオチド配列に対して、それぞれ第３位にヌクレオチド誘導体を有するプローブ配列をハイブリダイズさせて塩基種Ｘを決定した例を示す。Ｔ誘導体を有するプローブ配列が最も強い蛍光シグナルを発するため、標的ヌクレオチド配列の未知塩基種Ｘはアデニンであると決定することができる。
図２は、第３位に未知の塩基種Ｘを含む標的ヌクレオチド配列に対して、それぞれ第３位にＡ誘導体およびＧ誘導体を有するプローブ配列をハイブリダイズさせて塩基種Ｘを決定した例を示す。上段ではＡ誘導体およびＧ誘導体を有するプローブ配列が最も強い蛍光シグナルを発するため、標的ヌクレオチド配列の未知塩基種Ｘはシトシンであると決定することができる。下段ではＧ誘導体を有するプローブ配列が最も強い蛍光シグナルを発するため、標的ヌクレオチド配列の未知塩基種Ｘはチミンであると決定することができる。
図３は、第４位にＧ／Ａ多型を含む標的２本鎖ヌクレオチド配列に対して、それぞれ第４位にヌクレオチド誘導体を有するプローブ配列をハイブリダイズさせてＧ／Ａ多型を決定した例を示す。上段に示したＧ／Ｇホモ接合の場合には当該位置にＣ誘導体を含むプローブが強い蛍光シグナルを発し、中段に示したＧ／Ａヘテロ接合の場合にはＣ誘導体を含むプローブとＴ誘導体を含むプローブが強いシグナルを発する。また下段に示したＡ／Ａホモ接合体の場合には、Ｔ誘導体を含むキャプチャープローブから強いシグナルが得られる。
図４は、配列未知の６ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＮＮＮＮＮＮ）の塩基配列を決定した例を示す。第１位のＸに対して当該位置にＴ誘導体を含むキャプチャープローブから強いシグナルが得られたことからこのオリゴヌクレオチドの第１位Ｘはチミン（Ｔ）と相補結合するアデニン（Ａ）であると決定される。同様にして第２〜６位までを調べることによって、この６ｍｅｒオリゴヌクレオチドはＡＧＧＣＧＡからなる配列であると決定される。
図５は、標的ヌクレオチド配列が目的の既知配列領域に対して一部が不一致である場合にその不一致塩基を決定した例を示す。第３位にＴ誘導体を有するプローブと第６位にＣ誘導体を有するプローブがそれぞれ強いシグナルを発することから、標的ヌクレオチド配列の第３位がＡに置換し、第６位がＧに置換していることが判明する。
図６は、この発明のヌクレオチド誘導体の一例（ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５））の合成工程である。Ｐｙは１−ｐｙｒｅｎｙｌ、ＤＭＴｒは４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌである。
図７は、この発明のヌクレオチド誘導体の一例（ＰｙＡ（７））の合成工程である。Ｐｙは１−ｐｙｒｅｎｙｌ、ＤＭＴｒは４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌである。
図８は、この発明のヌクレオチド誘導体の一例（ＰｙＧ（８））の合成工程である。
図９は蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＣ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸（Ｇ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
図１０は別の蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＣ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸（Ｇ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
図１１は蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＵ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸（Ａ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
図１２は、図１１に示した結果の蛍光写真像である。
図１３は蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＵ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸（Ａ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
図１４は蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＡ（７）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＡ（７）と対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸（Ｃ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
図１５は蛍光スペクトルであり、ヌクレオチド誘導体ＰｙＧ（８）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＧ（８）と対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸（Ｃ）である場合と、デオキシチミジル酸（Ｔ）である場合には強い発光シグナルを発することを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  第１発明は、ピリミジン塩基またはプリン塩基に、リンカーを介して蛍光色素インターカレーターが結合しているヌクレオチド誘導体であって、１本鎖ヌクレオチド配列のメンバーとして存在し、この１本鎖ヌクレオチド配列がハイブリダイズした相手鎖の相対する特定の塩基種を認識して、他の塩基種と比較して相対的に強い蛍光シグナルを発することを特徴としている。具体的には、
（１）アデニン（Ａ）を認識するチミン（Ｔ）誘導体；
（２）グアニン（Ｇ）を認識するシトシン（Ｃ）誘導体；
（３）シトシン（Ｃ）を認識するアデニン（Ａ）誘導体；および
（４）シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）を認識するグアニン（Ｇ）誘導体、
である。
「蛍光色素インターカレーター」は、２本鎖ヌクレオチド配列の隣接したヌクレオチド対間に挿入することのできる物質であって、かつ蛍光を発する物質である。このような物質しては、蛍光シグナルを発し、かつインターカレーションを生じさせるピレン（１−ｐｙｒｅｎｙｌ）等を使用することができる。あるいはまた、公知のインターカレーターに、同じく公知の蛍光物質を結合させたものを使用することもできる。インターカレーターとしては、例えば、アクリジンオレンジ、プロフラビン、臭化エチジウム、アクチノマイシンＤ等の芳香族色素分子を使用することができる。また蛍光物質としては、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン誘導体（例えばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネートアイソマーＲ）等を使用することができる。またインターカレーターと蛍光物質との結合は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。
ピリミジン塩基またはプリン塩基にインターカレーターを連結するための「リンカー」は、例えば炭素鎖やポリマー等を使用することができる。さらに、リンカーを介してインターカレーターを連結するピリミジン塩基またはプリン塩基の位置は、それぞれの非置換炭素位置から任意に選択して使用することができる。すなわち、ピリミジン塩基の場合には第４位または第５位であり、プリン塩基の場合には第７位または第８位である。
このようなヌクレオチド誘導体は、より具体的には、それぞれ前記の一般式（１）〜（４）でそれぞれ示すことができる。すなわち、式（１）はピリミジン塩基第５位置換のＴ誘導体、式（２）はピリミジン塩基第５位置換のＣ誘導体、式（３）はプリン塩基第７位置換のＡ誘導体、式（４）はプリン塩基第８位置換のＧ誘導体である。以下の記載において、蛍光色素インターカレーターとしてピレン（Ｐｙ）を使用した場合、これらのヌクレオチド誘導体はそれぞれ、ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７）、ＰｙＧ（８）と記載することがある。
これらのヌクレオチド誘導体は、ピリミジン塩基またはプリン塩基、リンカー、および適宜な蛍光色素インターカレーターを使用し、例えば後記実施例に記載した方法によって合成することができる。また前記の一般式（１）〜（４）に示したヌクレオチド誘導体の場合には、前記の一般式（５）〜（８）でそれぞれ表されるヌクレオシド誘導体を前駆体とすることによって、容易に作成することができる。
なお、一般式（１）〜（８）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、同一または別異に、水素原子または置換基を示し、Ｒ１０は水素原子または水酸基であり、Ｘはイミノ（ＮＨ）、オキシ（Ｏ）、チオ（Ｓ）、メチレン（ＣＨ２）およびアルキルアミノ基から選択される連結基であり、アルキレン鎖長を表す整数ｎは、Ｘがメチレンまたはアルキルアミノ基の場合には０〜５であり、Ｘがイミノ、オキシまたはチオの場合には１〜５である。このうち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９の置換基は、ハロゲン原子、含酸素基、含窒素基、含硫黄基、およびこれらの原子や置換基を有してもよい炭素水素基もしくは複素環基などである。さらに詳しくは、置換基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、エステル基、アミノ基、置換アミノ基、ニトロ基、アミド基、シアノ基、カルバメート基、ウレイド基、チオール基、チオエーテル基、チオエステル基などである。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が同時に水素原子であることなく、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９の隣接するもの同士が結合して置換基を有してもよいフェニル基を形成してもよい。
第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列は、前記のヌクレオチド誘導体を１個または複数個有する３〜２００個、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチドの配列（オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド断片）である。このような  １本鎖ヌクレオチド配列は、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。また、ＤＮＡ合成装置を用いて自動的に合成することもできる。
以上の１本鎖ヌクレオチド配列を利用することによって、この出願の第４発明の塩基種決定方法を実施することができる。
この第４発明の方法は、未知塩基種Ｘを含む標的ヌクレオチド配列と、塩基種Ｘの同一の位置にヌクレオチド誘導体を有する第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列（以下「プローブ配列」と記載することがある）とをハイブリダイズさせ、ヌクレオチド誘導体（１）〜（４）のそれぞれの蛍光色素が最も強く蛍光シグナルを発した場合、塩基種Ｘを以下のとおりに決定する。
（ｉ）Ｔ誘導体の蛍光色素が最も強く発光した場合はアデニン；
（ｉｉ）Ｃ誘導体の蛍光色素が最も強く発光した場合はグアニン；
（ｉｉｉ）Ａ誘導体の蛍光色素が最も強く発光した場合はシトシン；
（ｉｖ）Ｇ誘導体の蛍光色素が最も強く発光した場合はシトシンまたはチミン。
この場合の「最も強く発光する」とは、例えば、ＰｙＵ（５）の場合には他のヌクレオチドと比較して約３倍以上、ＰｙＣ（５）の場合には１．５倍以上、ＰｙＡ（７）の場合には２．５倍以上、ＰｙＧ（８）の場合には２倍以上の発光シグナルが観察された場合に、それぞれが対合した塩基種を前記のとおりに決定することができる。
具体的には、例えば、図１に示した例では、第３位に未知の塩基種Ｘを含む標的ヌクレオチド配列に対して、それぞれ第３位にＡ誘導体、Ｔ誘導体、Ｇ誘導体、Ｃ誘導体を有するプローブ配列を用意し、それぞれのプローブ配列を標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせれば、Ｔ誘導体を有するプローブ配列が最も強い蛍光シグナルを発するため、標的ヌクレオチド配列の未知塩基種Ｘはアデニンであると決定することができる。
ただし、前記第４発明の方法では、Ａ誘導体とＧ誘導体は共にシトシンを認識し、Ｇ誘導体はシトシンとチミンをそれぞれ認識してしまう。このため、第４発明の方法は、例えば図２に示したように、Ａ誘導体とＧ誘導体のそれぞれを同一位置に有する２本の１本鎖ヌクレオチド配列をそれぞれ同一の相手鎖にハイブリダイズさせ、それぞれの蛍光シグナル強度の組み合わせによって以下のとおりに塩基種Ｘを決定する。
（ｖ）Ａ誘導体とＧ誘導体の両方の蛍光色素が最も強く発光した場合はシトシン。
（ｖｉ）Ｇ誘導体の蛍光色素のみが最も強く発光した場合はチミン。
以上の方法によって、標的ヌクレオチド配列中のＳＮＰの検出、未知配列の配列決定、既知配列領域と相同の領域の存否、あるいは既知配列領域内の未知配列の配列決定等が可能となる。これらは、前記のプローブ配列を用いた一般的なハイブリダイゼーションアッセイとして実施することもできるが、特に前記のプローブ配列をキャプチャープローブとするＤＮＡマイクロアレイにおいて実施することができる。
第５発明のＤＮＡマイクロアレイは、前記第３発明の１本鎖ヌクレオチド配列をキャプチャープローブとすることを除き、通常のＤＮＡマイクロアレイと同様にして作製することができる。ＤＮＡマイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接キャプチャープローブを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したキャプチャープローブを固相担体表面に固定する方法とが知られているが、この発明のＤＮＡマイクロアレイは後者の方法で作製することが好ましい。予め調製したキャプチャープローブを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したキャプチャープローブを合成し、表面処理した固相担体表面にキャプチャープローブを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。キャプチャープローブは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこにキャプチャープローブを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９１３，１９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化キャプチャープローブを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１１９−１１２３，１９９７）。この発明のＤＮＡマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。
また、このＤＮＡマイクロアレイと標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションも通常のＤＮＡマイクロアレイと同様に行うことができる。すなわち、標的ヌクレオチド配列をＤＮＡマイクロアレイに接触させ、ＤＮＡマイクロアレイのキャプチャープローブにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
ただし、この発明のＤＮＡマイクロアレイの場合には、標的ヌクレオチド配列をハイブリダイズしたキャプチャープローブが蛍光シグナルを発するため、通常のＤＮＡマイクロアレイのように標的ヌクレオチド配列に標識ラベル等を付加する必要はない。
この第５発明のＤＮＡマイクロアレイの一つの態様は、標的ヌクレオチド配列の１塩基多型（ＳＮＰ）を検出するためのＤＮＡマイクロアレイである。すなわち、このＤＮＡマイクロアレイのキャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列の少なくともＳＮＰヌクレオチドを含む領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは、標的ヌクレオチド配列のＳＮＰヌクレオチドと対応する位置のヌクレオチドがそれぞれに異なるヌクレオチド誘導体である。従って、キャプチャープローブ中のヌクレオチド誘導体が発する蛍光シグナル強度を指標として、標的オリゴヌクレオチド配列のＳＮＰを検出することができる。例えば図３に示したようなＧ／Ａ多型の場合には、Ｇ／Ｇホモ接合の場合には当該位置にＣ誘導体を含むキャプチャープローブが強い蛍光シグナルを発し、Ｇ／Ａヘテロ接合の場合にはＣ誘導体を含むキャプチャープローブとＴ誘導体を含むキャプチャープローブが強いシグナルを発する。またＡ／Ａホモ接合体の場合には、Ｔ誘導体を含むキャプチャープローブから強いシグナルが得られる。
この発明のＤＮＡマイクロアレイにおける別の態様は、配列が未知であるｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチド配列を決定するためのＤＮＡマイクロアレイである。すなわち、このＤＮＡマイクロアレイにおいて、キャプチャープローブは、ヌクレオチド配列が全て異なる少なくとも４ｎ個のセットであり、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までが順次に異なるヌクレオチド誘導体であることを特徴としている。例えば、図４に例示したような配列未知の６ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＮＮＮＮＮＮ）の場合、第１位のＸに対して当該位置にＴ誘導体を含むキャプチャープローブから強いシグナルが得られた場合、このオリゴヌクレオチドの第１位Ｘは、チミン（Ｔ）と相補結合するアデニン（Ａ）である。同様にして第２〜６位までを調べることによって、この６ｍｅｒオリゴヌクレオチドＮＮＮＮＮＮはＡＧＧＣＧＡからなる配列であると決定することができる。また図２に示したようなＡ誘導体とＧ誘導体との蛍光の比較によって、チミン（Ｔ）を含む未知配列を決定することもできる。なお、通常のシークエンサーでは短鎖（３〜１００）のオリゴヌクレオチドの配列決定は不可能であるが、この発明のＤＮＡマイクロアレイを用いることによって、短鎖オリゴヌクレオチドの配列を簡便かつ正確に決定することが可能となる。
この発明のＤＮＡマイクロアレイのさらに別の態様は、標的ヌクレオチド配列中に、ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる既知配列領域（ドメインやモチーフ）と相同の領域が存在するか否かを検出するためのＤＮＡマイクロアレイである。すなわち、このＤＮＡマイクロアレイにおけるキャプチャープローブのセットは、既知配列領域と相補的であるが、個々のキャプチャープローブは第１位から第ｎ位までが順次に異なるヌクレオチド誘導体であることを特徴としている。従って、例えば、標的ヌクレオチド配列が目的の既知配列領域と全く相同の配列を有している場合、既知配列のそれぞれに対応する位置に所定のヌクレオチド誘導体を含む全てのキャプチャープローブから強いシグナルが得られる。一方、図５に例示したように、第３位がＡに置換し、第６位がＧに置換している配列の場合には、第３位にＴ誘導体を含むキャプチャープローブと、第６位にＣ誘導体を有するキャプチャープローブがそれぞれ強いシグナルを発する。これによって、既知配列領域と完全に一致する配列の存在だけでなく、一部が不一致である相同配列の存在をも簡便かつ容易に検出することが可能である。
さらに、この発明のＤＮＡマイクロアレイの別の態様は、ｎ（ｎ＝３〜１００）個のヌクレオチドからなる未知配列領域と既知配列領域とを有する標的ヌクレオチド配列の未知配列領域の配列を決定することを目的とするＤＮＡマイクロアレイである。すなわちこのＤＮＡマイクロアレイにおいて、キャプチャープローブのセットは、標的ヌクレオチド配列中の既知配列領域に対する相補配列と、ヌクレオチド配列が全て異なるプローブ配列領域とを有する少なくとも４ｎ個のセットであり、各プローブ配列領域の第１位から第ｎ位までの少なくとも１つがヌクレオチド誘導体である。この場合、標的ヌクレオチド配列とキャプチャープローブとは、その既知配列領域の相補性によってハイブリダイズし、前記と同様の未知配列決定用のキャプチャープローブからの蛍光シグナルによって、その配列が決定される。
【実施例】  以下、この発明のヌクレオチド誘導体について実施例を示すが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】          ヌクレオチド誘導体（ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７））の合成
ヌクレオチド誘導体（ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７））を、図６および７に従って、以下のとおり合成した。なお、化合物の番号は図６および７の番号に対応する。
スキームｉ（化合物２の合成）
プロパルギルアミン（１、和光純薬）と  １−ピレンカルボン酸（２、アルドリッチ）（１：１）を縮合剤ＰｙＢＯＰ（１当量、ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で室温で２．５時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物２（９１％）を得た。
スキームｉｉ（化合物４：ＰｙＵ（５）のヌクレオシド誘導体の合成）
３（５−ヨード−２’−デオキシウリジン（シグマ）を４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（東京化成）とピリジン中で攪拌することで得られる）と２（１：１）を（テトラキストリフェニルホスフィン）パラジウム（０．１５当量、和光純薬）、ヨウ化銅（０．３当量、和光純薬）、トリエチルアミン（１当量、和光純薬）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で室温で１０時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物４（８２％）を得た。
スキームｉｉｉ（化合物５の合成）
４を３％トリクロロ酢酸−ジクロロメタン溶液（グレンリサーチ社）中で室温で５分攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物５（２７％）を得た。
スキームｉｖ（化合物６：ＰｙＵ（５）の合成）
４と２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（アルドリッチ社）（１：１）をテトラゾール（１当量、同仁化学）存在下、アセトニトリル中で室温で２時間攪拌し、そのままＤＮＡ合成機に用いた。
スキームｖ（化合物８の合成）
５−ヨード−２−デオキシシチジン（７、生化学工業）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（１当量、東京化成）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で５５度で２時間攪拌し、濃縮した。粗生成物８は、次の反応へ供した。
スキームｖｉ（化合物９の合成）
化合物８と４，４’ジメトキシトリチルクロリド（東京化成）（１：１）をピリジン中室温で１時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物９（５０％  ｉｎ  ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
スキームｖｉｉ（化合物１０：ＰｙＣ（５）のヌクレオシド誘導体の合成）
化合物９と２（１：１）を（テトラキストリフェニルホスフィン）パラジウム（０．１５当量、和光純薬）、ヨウ化銅（０．３当量、和光純薬）、トリエチルアミン（１当量、和光純薬）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で室温で１２時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物１０（４７％）を得た。
スキームｖｉｉｉ（化合物１１：ＰｙＣ（５）の合成）
化合物４と２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（アルドリッチ社）（１：１）をテトラゾール（１当量、同仁化学）存在下、アセトニトリル中で室温で２時間攪拌し、そのままＤＮＡ合成機に用いた。
スキームｉｘ（化合物１３の合成）
化合物１２（Ｒａｍｚａｅｖａ  ａｎｄ  Ｓｅｅｌａ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７８，１０８３−１０９０（１９９５））と化合物２（１：２）を（テトラキストリフェニルホスフィン）パラジウム（０．１当量、和光純薬）、ヨウ化銅（０．１当量、和光純薬）、トリエチルアミン（２当量、和光純薬）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で室温で６時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物１３（８８％）を得た。
スキームｘ（化合物１４の合成）
化合物１３をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタール（１当量、東京化成）存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で５０度で３時間攪拌し、濃縮した。粗生成物は、次の反応へ供した。
スキームｘｉ（化合物１５：ＰｙＡ（７）のヌクレオシド誘導体の合成）
化合物１４と４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（東京化成）（１：１）をＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン触媒量存在下ピリジン中室温で１時間攪拌し、抽出、カラムクロマトグラフィーで精製後、生成物１５（７３％  ｉｎ  ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
スキームｘｉｉ（化合物１６：ＰｙＡ（７）の合成）
化合物４と２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（アルドリッチ社）（１：１）をテトラゾール（１当量、同仁化学）存在下、アセトニトリル中で室温で２時間攪拌し、そのままＤＮＡ合成機に用いた。
【実施例２】                  ヌクレオチド誘導体（ＰｙＧ（８））の合成
ヌクレオチド誘導体（ＰｙＧ（８））を、図８に従って、以下のとおり合成した。なお、化合物の番号は図８の番号に対応する。
スキーム１（化合物２の合成）
出発材料として１−ブロモピレンを用い、トリメチルシリルアセチレンと薗頭カップリングすることにより化合物１を得た。次いで、メタノール中でナトリウムメトキシドにより保護基であるトリメチルシリル基を除去し、化合物２（ピレンユニット）を得た（収率７０％）。
スキーム２（化合物６：ＰｙＧ（８）のヌクレオシド誘導体の合成）
２’−デオキシグアノシンにＮ−ブロモスクシンイミドを加え、水中で反応させることにより化合物３を得た（収率６０％）。次いで、化合物３の糖の３’位と５’位の水酸基をｔｅｒｔ−ブリルジメチルシリルクロライドとイミダゾールでｔｅｒｔ−ブリルジメチルシリル基により保護した後、化合物２と薗頭カップリングを行い化合物５を得た（収率６１％）。ＴＢＡＦにより化合物５の水酸基保護基であるｔｅｒｔ−ブリルジメチルシリル基を除去したモノマーとしての化合物６を得た（収率６０％）。
スキーム３（化合物１０：ＰｙＧ（８）の合成）
化合物３をＤＭＦ中、ＤＭＦジエチルアセタールと反応させ、化合物７を得た。４，４’−ジメトキシトリチルクロライドにより化合物７の５’位の水酸基に４，４’−ジメトキシトリチル基を導入して化合物８を得た（収率２２％）。薗頭カップリングによりこの化合物８の８位に化合物２を導入し、化合物９を得た（収率５８％）。最後に、アセトニトリルとジクロロメタン中でＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルシアノエチルホスホロジアミダイトとテトラゾールを酸性活性化剤として反応させ、アミダイトユニットである化合物１０を合資した。これを０．１Ｍアセトニトリル溶液としてＤＮＡ合成機に供した。
【実施例３】                  オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成
実施例１で作成したヌクレオチド誘導体（ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７））、および実施例２で作成したヌクレオチド誘導体（ＰｙＧ（８））を用いて、ヌクレオチド誘導体含有のオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、アプライドバイオシステムズ社の３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で通常のホスホロアミダイト法に従って合成された。固相担体からの切り出し及び脱保護は、２５％アンモニア中何度何時間インキュベーションすることによって業われ、その後高速液体クロマトグラフィーによって精製された。
【実施例４】        ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（１）の蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＣＰｙＣＣＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３２９ｎｍ、発光波長４００ｎｍであり、４００ｎｍにおける蛍光強度は、７．０であった。
上記溶液に、ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＣ（５）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
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をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は４．１であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は２．６であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は１８．３であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は１．４であった。
このように、ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＣ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸である場合には強い発光が観測されたのに比べて、デオキシアデニル酸である場合には蛍光が７８％消光し、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が８６％消光し、デオキシシチジル酸である場合には蛍光が９２％消光した。蛍光スペクトルを図９に示す。
【実施例５】        ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（２）の蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＴＰｙＣＴＡＡＧＣＧ−３’：配列番号６）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３２７ｎｍ、発光波長４０５ｎｍであり、４０５ｎｍにおける蛍光強度は、９．２であった。
上記溶液に、ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＣ（５）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
2004058793.tif 000012
をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４０５ｎｍにおける蛍光強度は１０．９であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は８．８であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は１８．２であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４００ｎｍにおける蛍光強度は１１．９であった。
このように、ＰｙＣ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＣ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸である場合には強い発光が観測されたのに比べて、デオキシアデニル酸である場合には蛍光が４０％消光し、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が５２％消光し、デオキシシチジル酸である場合には蛍光が３５％消光した。蛍光スペクトルを図１０に示す。
なお、この実施例５と前記実施例４の結果を比較すれば、ヌクレオチド誘導体ＰｙＣ（５）がその対合する塩基種の前後の塩基種に関わりなく特定の塩基種（Ｇ）に対して強い蛍光シグナルを発することが確認された。
【実施例６】        ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（１）の蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＣＰｙＵＣＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１１）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３４４ｎｍ、発光波長３９８ｎｍであり、３９８ｎｍにおける蛍光強度は、７．４であった。
上記溶液に、ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＵ（５）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
2004058793.tif 000013
をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は２９．８であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は４．５であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は３．７であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は３．３であった。
このように、ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＵ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシアデニル酸である場合には、強い発光が観測されたのに比べて、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が８５％消光し、デオキシグアニル酸である場合には蛍光が８８％消光し、デオキシシチジル酸である場合には蛍光が８９％消光した。蛍光スペクトルを図１１に示す。また、蛍光写真像を図１２に示す。
【実施例７】        ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（２）の蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＴＰｙＵＴＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１２）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３２７ｎｍ、発光波長３９８ｎｍであり、３９８ｎｍにおける蛍光強度は、６．３であった。
上記溶液に、ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＵ（５）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
2004058793.tif 000014
をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は２６．０であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は２．７であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は４．８であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、３９８ｎｍにおける蛍光強度は１０．６であった。
このように、ＰｙＵ（５）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＵ（５）と対合するヌクレオチドがデオキシアデニル酸である場合には、強い発光が観測されたのに比べて、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が９０％消光し、デオキシグアニル酸である場合には蛍光が８２％消光し、デオキシシチジル酸である場合には蛍光が５９％消光した。蛍光スペクトルを図１３に示す。
なお、この実施例７と前記実施例６の結果を比較すれば、ヌクレオチド誘導体ＰｙＵ（５）がその対合する塩基種の前後の塩基種に関わりなく特定の塩基種（Ａ）に対して強い蛍光シグナルを発することが確認された。
【実施例８】          ＰｙＡ（７）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＡ（７）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＣＰｙＡＣＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１３）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３５３ｎｍ、発光波長３９５ｎｍであり、３９５ｎｍにおける蛍光強度は、４．３であった。
上記溶液に、ＰｙＡ（７）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＡ（７）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
2004058793.tif 000015
をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、３９５ｎｍにおける蛍光強度は２．５であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、３９５ｎｍにおける蛍光強度は１．８であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、３９５ｎｍにおける蛍光強度は７．４であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、３９５ｎｍにおける蛍光強度は１８．２であった。
このように、ＰｙＡ（７）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＡ（７）と対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸である場合には、強い発光が観測されたのに比べて、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が９０％消光し、デオキシアデニル酸である場合には蛍光が８６％消光し、デオキシグアニル酸である場合には蛍光が５９％消光した。蛍光スペクトルを図１４に示す。
【実施例９】          ＰｙＧ（８）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの蛍光分析
実施例３により得られたＰｙＧ（８）含有オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’−ＣＧＣＡＡＴＰｙＧＴＡＡＧＣＧ−３’：配列番号１４）を２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長４２０ｎｍ、発光波長４３０ｎｍおよび４６０ｎｍであり、４３０ｎｍにおける蛍光強度は１６．０、４６０ｎｍにおける蛍光強度は１５．３であった。
上記溶液に、ＰｙＧ（８）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｙＧ（８）以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド：
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をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４３０ｎｍにおける蛍光強度は６５．０であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４３０ｎｍにおける蛍光強度は１４４．０であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４３０ｎｍにおける蛍光強度は６５．０であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４３０ｎｍにおける蛍光強度は１３６．０であった。
このように、ＰｙＧ（８）含有オリゴデオキシリボヌクレオチドは、相補鎖上のＰｙＧ（８）と対合するヌクレオチドがデオキシチミジル酸およびデオキシシチジル酸である場合には、強い発光が観測されたのに比べて、デオキシグアニル酸およびデオキシアデニル酸である場合には蛍光がそれぞれ５５％消光した。相対的な蛍光スペクトルを図１５に示す。
【実施例１０】  配列番号１５のオリゴデオキシリボヌクレオチド（サンプルＤＮＡ断片）の第８−１１位の未知配列を、ＤＮＡマイクロアレイを用いて決定した。ＤＮＡマイクロアレイのキャプチャープローブとしては配列番号１６−３１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ断片）を使用した（表１参照）。なお、サンプルＤＮＡ断片は配列番号１５のヌクレオチド配列を含む全長５０ｂ、プローブＤＮＡ断片１−１６はそれぞれ配列番号１６−３１のヌクレオチド配列を含む全長６８−７０ｂである。
１．プローブＤＮＡ断片の調製
配列番号１６−３１のヌクレオチド配列をそれぞれに含むプローブＤＮＡ断片１−１６をアプライドバイオシステム社の３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用い、通常のホスホロアミダイド法に従って合成した。固相担体からの切り出しおよび脱保護は２５％アンモニア中でインキュベーションすることによって行い、その後、高速液体クロマトグラフィーによって精製した。
なお、配列番号１６−３１のそれぞれの第８位（Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ａ）は、各々ヌクレオチド誘導体（ＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７）、ＰｙＧ（８））である。同様に、配列番号２０−２３の第９位、配列番号２４−２７の第１０位、配列番号２８−３１の第１１位のＴ、Ｇ、Ｃ、Ａは、それぞれＰｙＵ（５）、ＰｙＣ（５）、ＰｙＡ（７）、ＰｙＧ（８）である（表１参照）。
２．固定用基板の調製
１０％ＮａＯＨ−６０％エタノール水溶液に２時間浸漬し、純水で１０回洗浄した７６×２６×１ｍｍサイズのガラス製スライド（松波硝子工業社製）を１０％ポリ−Ｌ−リジン水溶液に１時間浸漬した。純水で１０回の洗浄後、８００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、水分を除去して室温で乾燥して、固定用基板を調製した。
３．ＤＮＡマイクロアレイの調製
上記１で調製したプローブＤＮＡ断片の各々を、最終濃度が５０ｐｍｏｌ／μｌとなるように調整し、上記２で調製した基板に２００ｐｌをそれぞれスポット（１０ｎｍｏｌ）した。その後、８０℃で１時間乾燥処理し、各スポットに水を添加し、基板上にＤＮＡ断片を固定した。この基板を１％ＢＳＡブロッキング溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌ、１０％ＳＤＳ  １．２５ｍｌ）で４５分間（４２℃）振盪した。その後、９５℃純水で１分間、９５％エタノールで１分間それぞれ浸漬させ、遠心（８００ｒｐｍ、１分間）し、目的とするＤＮＡマイクロアレイを調製した。
４．サンプルＤＮＡ断片の調製
配列番号１５のヌクレオチド配列を含む全長５０ｂのオリゴデオキシリボヌクレオチドからなるサンプルＤＮＡ断片（１５ｆｍｏｌ／１０．５μｌ）を含むサンプルチューブに、２０×ＳＳＣ（３．７５μｌ）および１０％ＳＤＳ（０．７５μｌ）を添加した。９５℃ヒートブロックで２分間加熱した後、室温で５分間放置し、遠心してサンプル液を調製した（最終濃度：１ｎＭ）。
５．ハイブリダイゼーション
上記３で調製したＤＮＡマイクロアレイ上に上記２で調製したサンプル液を１２μｌずつ１点にスポットし、カバーガラスで覆ってハイブリダイゼーション反応を行った（６５℃、１６時間）。反応終了後、２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液に５分間、２０分間浸漬し、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ溶液に２０分間浸漬、５５℃でさらに２０分間ずつ２回浸漬させた。同溶液でリンスした後、さらに０．０５×ＳＳＣ溶液でリンスした。９００ｒｐｍで１分間遠心し、放置して乾燥させた。
６．測定
蛍光顕微鏡ＢＸ−５０（オリンパス社製）を使用して、各ＤＮＡスポットの蛍光強度を計測し、画像ファイルを取込んだ後、シグナルの数値化を行った。結果を表１に示す。
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表１に示した蛍光強度の結果から、サンプルＤＮＡ断片における配列番号１５の第８−１１位の未知ヌクレオチドは以下のとおりであることが確認された。
（１）プローブＤＮＡ断片１−４の第８位に位置する各ヌクレオチド誘導体の蛍光強度が、プローブＤＮＡ断片２のＰｙＧ（８）で高く、プローブＤＮＡ断片４のＰｙＡ（７）では明らかに低いことから、サンプルＤＮＡ断片の第８位はチミン（Ｔ）と決定された。
（２）プローブＤＮＡ断片５−８の第９位に位置する各ヌクレオチド誘導体の蛍光強度が、プローブＤＮＡ断片５のＰｙＵ（５）で最も高いことから、サンプルＤＮＡ断片の第９位はアデニン（Ａ）と決定された。
（３）プローブＤＮＡ断片９−１２の第１０位に位置する各ヌクレオチド誘導体の蛍光強度が、プローブＤＮＡ断片１０のＰｙＧ（８）およびプローブＤＮＡ断片１２のＰｙＡ（７）で最も高いことから、サンプルＤＮＡ断片の第１０位はシトシン（Ｃ）と決定された。
（４）プローブＤＮＡ断片１３−１６の第１１位に位置する各ヌクレオチド誘導体の蛍光強度が、プローブＤＮＡ断片１５のＰｙＣ（５）で最も高いことから、サンプルＤＮＡ断片の第１１位はグアニン（Ｇ）と決定された。
またこの結果から、この発明のヌクレオチド誘導体が、対合する塩基種の前後の塩基種に関係なく、特定の塩基種に対して強い蛍光シグナルを発することが確認された。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明は、ＤＮＡプローブやＤＮＡマイクロアレイを用いたＳＮＰ判定や配列決定等における試料調製や測定手順を大幅に簡便化することを可能とする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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