(57)【要約】本発明のヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体は、ヒトＩＬ−１８に対する抗体であり、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドとからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域とを含むものである。（ａ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｂ）（ａ）に記載のポリペプチドの改変体であって、Ｈ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。（ｃ）配列番号１０〜１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。（ｄ）（ｃ）に記載のポリペプチドの改変体であって、Ｌ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。これにより、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体およびその利用方法を提供することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン−１８に対する、ヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む請求の範囲１に記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
（ａ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
【請求項３】
以下（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む請求の範囲１または２に記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項４】
以下（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体のＨ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項５】
以下（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体のＬ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
【請求項６】
請求の範囲２に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または請求の範囲４に記載のＨ鎖可変領域断片と、請求の範囲２に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または請求の範囲５に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体の１本鎖可変領域断片。
【請求項７】
請求の範囲２に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または請求の範囲４に記載のＨ鎖可変領域断片、および／または、請求の範囲２に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または請求の範囲５に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体またはその断片。
【請求項８】
上記抗体の断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、またはｓｃＦｖＦｃである請求の範囲７に記載の抗体の断片。
【請求項９】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
【請求項１０】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片をコードする遺伝子。
【請求項１１】
配列番号１または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求の範囲１０に記載の遺伝子。
【請求項１２】
請求の範囲１０または１１に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求の範囲１０または１１に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１４】
請求の範囲１０または１１に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト由来のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体またはその断片を生産する方法。
【請求項１５】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片、または請求の範囲９に記載の修飾抗体を用いたヒトインターロイキン−１８の検出器具。
【請求項１６】
請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片、または請求の範囲９に記載の修飾抗体を含むヒトインターロイキン−１８検出試薬を用いて、被検試料中のヒトインターロイキン−１８量を測定する免疫疾患の診断キット。
【請求項１７】
請求の範囲１６に記載の検出試薬を用いて測定した被検試料中のヒトインターロイキン−１８量に基づいて免疫疾患を診断する方法。
【請求項１８】
ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストを有効成分とするヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
【請求項１９】
上記ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストが、以下のいずれかの物質である請求の範囲１８に記載のヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
ｉ）請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体
ｉｉ）請求の範囲４〜８のいずれか１項に記載の抗体の断片
ｉｉｉ）請求の範囲９に記載の修飾抗体
ｉｖ）上記ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかに記載の抗体、抗体の断片、または修飾抗体が認識するヒトインターロイキン−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。
【請求項２０】
請求の範囲１０または１１に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
【請求項２１】
請求の範囲１８または１９に記載のヒトインターロイキン−１８活性阻害剤、または請求の範囲２０に記載の遺伝子治療剤を含む免疫疾患治療剤。
【請求項２２】
請求の範囲２１に記載の免疫疾患治療薬を投与することによる免疫疾患の治療方法。
【請求項２３】
抗原とヒトインターロイキン−１８とによる刺激によってヘルパーＴ１細胞から産生するサイトカインを阻害することを特徴とする請求の範囲２１に記載の免疫疾患治療剤。
【請求項２４】
ヒトＩＬ−１８が関与するアレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患に適用するものであることを特徴とする請求の範囲２１または２３に記載の免疫疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体およびその断片、並びにそれらの利用方法に関し、より詳細には、ヒトインターロイキン−１８（以下、ヒトＩＬ−１８とする）に結合し、その生理活性を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体およびその抗体フラグメント、並びにそれらの利用方法に関するものである。この抗体及び抗体フラグメントは、ＩＬ−１８が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】  アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＡＤ））は、主に外的刺激に対する炎症性皮膚病変で、慢性反復性の強い掻痒を伴う疾患である。ＡＤ発症のメカニズムは不明な点が多いが、ＡＤ発症には遺伝的背景があり、ＡＤ患者の血清中には高いレベルのＩｇＥが存在する。また、ＡＤ発症のメカニズムには、活性化Ｔ細胞、好塩基球、肥満細胞が深く関与する。特に、アレルゲンによる肥満細胞あるいは好塩基球上のＦｃε受容体（ＦｃεＲ）に結合したＩｇＥ分子の架橋によって、これらの細胞が活性化される。その結果、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞由来のサイトカインとケミカルメディエーターとの産生が起こり、ＡＤが発症すると考えられている。Ｔｈ２サイトカインとして重要なのは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３等であり、ケミカルメディエーターとして重要なのは、ヒスタミン、セロトニン、ロイコトリエン等である。
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、抗原刺激を受けるとサイトカインを産生するが、その産生パターンから２つの亜集団（Ｔｈ１とＴｈ２細胞）に分類される。１型ヘルパーＴ（Ｔｈ１）細胞が刺激を受けるとＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−βなどのＴｈ１サイトカインを産生し、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞が刺激を受けるとＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインを産生する。前者（Ｔｈ１細胞）はおもに細胞性免疫を誘導し、後者（Ｔｈ２細胞）は液性免疫を誘導し、ときにはアレルギー応答を誘導する。ナイーブＴ細胞は、ＩＬ−１２の存在下で抗原刺激を受けるとＴｈ１細胞に、またＩＬ−４の存在下で抗原刺激を受けるとＴｈ２細胞に分化する。
ＩＬ−１８は、発見当初、Ｔ細胞やＮＫ（ナチュラルキラー）細胞からＩＦＮ−γの産生を誘導する因子として注目されていた（Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８（１９９５）．）。しかし、ＩＬ−１８がこの様な機能を発揮するのはＩＬ−１２が共存した場合である（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９，４２３（２００１））。また、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４の作用を阻止するので、ＩＦＮ−γを誘導するＩＬ−１８は、Ｔｈ２細胞による免疫反応を抑制し、抗アレルギー作用を示すと考えられた。
寄生虫をマウスに感染させると、Ｔｈ２細胞が誘導されＩｇＥ産生がおこる。発明者は、感染直後からＩＬ−１２とＩＬ−１８とを投与すると、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞などから、ＩＦＮ−γの産生が誘導されＩｇＥ産生が抑制されることを明らかにした（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９４，３９４８（１９９７））。
さらに、ＩＬ−１８だけを投与するとＩｇＥ産生が増強されることも明らかにした（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，１３９６２（１９９９））。また、その後の解析から、ＩＬ−１８を正常なマウスに投与するとＩｇＥ産生が誘導されることも明らかとなった（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．１，１３２（２０００））。
生体内に投与されたＩＬ−１８は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）に作用してＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の発現と、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等の産生とを誘導する（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７，９９７（２００３））。また、生体内でＢ細胞は、ＩＬ−１８の刺激を受けたＣＤ４陽性Ｔ細胞が発現するＣＤ４０Ｌと、ＩＬ−４との刺激を受けてＩｇＥを産生する。
ＩＬ−１８は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＩＬ−３によって誘導された好塩基球と肥満細胞とに作用して、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ヒスタミン等の産生を誘導する（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１３４０（２００２））。
従来の定説では、初めに述べた様に、肥満細胞上のＦｃεＲにＦｃ部位を介して結合する複数のＩｇＥ分子に、アレルゲンが結合して、これらのＩｇＥ分子を架橋することによって、肥満細胞が活性化されると考えられていた。今もこの定説は正しいが、発明者らはＩＬ−１８が、アレルゲンおよびＩｇＥの介在無しに、直接的に肥満細胞や好塩基球を活性化してＩＬ−４、ＩＬ−１３、ヒスタミン等の産生を誘導することを明らかにした（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，１３９６２（１９９９））。この様な場合もアレルギー性炎症がおこる。
ＩＬ−１８は、生物学的に不活性な前駆体（ＩＬ−１８前駆体）として産生され、カスパーゼ１の作用で開裂されて活性型となり、細胞外に分泌される（Ｇｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，２０６（１９９７））。発明者は、皮膚のケラチノサイトで、ＩＬ−１８前駆体が産生されて蓄積されていることから、皮膚のケラチノサイト特異的にカスパーゼ１を過剰発現させたマウス（カスパーゼ１トランスジェニックマウス）を作製した（Ｙａｍａｎａｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５，９９７（２０００））。その結果、このマウスは、生物学的に活性のあるＩＬ−１８を大量に産生した。また、このマウスは、血中に大量のＩｇＥを産生していた（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，．１，１３２（２０００），Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１３４０（２００２））。さらに、このマウスは、アレルゲンのない環境で飼育されているにも関わらず、強いアトピー性皮膚炎を発症した（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１３４０（２００２））。
ところで、ＩＬ−４とＩＬ−１３のシグナルは、Ｓｔａｔ  ６を介して標的細胞の核内に伝達されることで、これらのサイトカインの作用を発揮することが明らかにされている。発明者らは、ｓｔａｔ６を欠損させたマウスが、ＩｇＥを産生しないことを明らかにした（Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，６２７（１９９６））。そして、この様なＳｔａｔ  ６遺伝子を欠損させたマウスと、皮膚のケラチノサイト特異的にカスパーゼ１を過剰発現させたマウス（カスパーゼ１トランスジェニックマウス）とを交配して、ｓｔａｔ６遺伝子欠損カスパーゼ１トランスジェニックマウスを作製した。その結果、このマウスは、全くＩｇＥを作らなかったが、強いアトピー性皮膚炎を発症することが明らかとなった（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１３４０（２００２））。
一方、発明者は、ＩＬ−１８遺伝子を欠損したマウスとカスパーゼ１トランスジェニックマウスとを交配することにより、ＩＬ−１８欠損カスパーゼ１トランスジェニックマウスも作製した。その結果、このマウスは、ＩｇＥ産生を抑制されてはいたが、なおも大量のＩｇＥを血中に認めた。ところが、このマウスは、ＩｇＥを産生しているにもかかわらず、アトピー性皮膚炎の発症が完全に抑制されていた（Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１１３４０（２００２））。
これらの結果から、ＩｇＥの産生を抑制することよりも、ＩＬ−１８の作用を抑制することが、アトピー性皮膚炎の治療に有効と考えられる。
ＩＬ−１８は、発見当初ＩＦＮ−γ誘導因子とよばれていたように、ＩＬ−１２と相乗的に、Ｔｈ１細胞やＮＫ細胞に作用してＩＦＮ−γの産生を強力に誘導する（Ｏｋａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８（１９９５）．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９，４２３（２００１））。さらに、ＩＬ−１８は、これらの細胞上にＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）の発現を増強する（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，３９６１（１９９７））。ＦａｓＬは、三量体になると、細胞のアポトーシスを誘導する。
発明者は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓを投与したマウスの肝臓に存在するＫｕｐｆｆｅｒ細胞が、Ｆａｓを発現しており、ＦａｓＬの刺激を受けると、活性型のＩＬ−１８を産生することを示した（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１，３５９（１９９９））。さらに、ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞およびＴｈ１細胞に作用してＦａｓＬの発現を増強する。このように、ＩＬ−１８とＦａｓＬとの間には、正の相関性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ）があることも明らかになった（Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９，３９６１（１９９７）、Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１，３５９（１９９９）、Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１７４，１９２（２０００））。そのため、生体内でＩＬ−１８が過剰に産生されると、肝臓や腸管で重篤な臓器障害が起こることが明らかとなった。このように、ＩＬ−１８は、いわゆるＴｈ１病の原因にもなる。
このような疾患以外にも、Ｔｈ１細胞に誘導される気管支喘息、その他の様々な疾患において、ＩＬ−１８の病態への関与が指摘されている。
以上のように、ＩＬ−１８の産生あるいは活性の制御は、このようなＩＬ−１８依存性のアトピー性皮膚炎をはじめとする、ＩＬ−１８依存性疾患の治療法として、あるいはＩＬ−１８の過剰産生が原因となり疾患の発症を誘導あるいは増悪するＴｈ１病の治療法として、極めて重要である。
それゆえ、ＩＬ−１８の生理活性を中和する特異的なモノクローナル抗体を開発することができれば、ＩＬ−１８の関与する多くの疾患の有効な治療手段になることが期待される。
ところが、ヒトＩＬ−１８に対するする抗体（抗ヒトＩＬ−１８抗体）としては、マウスやラット由来のモノクローナル抗体がいくつか取得されているに過ぎない（例えば、日本国公開特許公報  特開２０００−２３６８８４号（２０００年９月５日公開）、ＷＯ００／５６７７１の国際出願（２０００年９月２８日公開））。
しかしながら、従来の抗ヒトＩＬ−１８抗体は、主に、ヒト以外の異種動物由来のモノクローナル抗体であるため、ヒトに対して投与した場合、異物として認識・排除される。したがって、従来の抗ヒトＩＬ−１８抗体を、ヒトＩＬ−１８の関与する疾患の治療薬剤として利用することは困難である。特に、慢性の自己免疫性疾患の治療では、長期間の継続投与が行われるので、投与抗体に対する抗体の出現が問題となる。
この問題を解決する方法として、ヒトＩＬ−１８に対するマウスモノクローナル抗体を、遺伝子工学的手法を用いてヒト化することが考えられる。
しかしながら、マウスモノクローナル抗体をヒト化すれば、抗原性は低下するものの、慢性の自己免疫性疾患患者に対する反復投与や長期投与を行った際には、そのヒト化抗ＩＬ−１８抗体の活性を阻害するような抗体（阻止抗体）が作り出される可能性も否定できない。その結果、顕著な治療効果は期待できず、場合によっては重大な副作用が生じる可能性もあるという問題を有している。
それゆえ、反復投与や長期投与を行った場合でも、安全性の高い抗ヒトＩＬ−１８抗体の開発が強く望まれている。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、安全性と治療効果を兼ね備えたヒト抗ヒト抗インターロイキン−１８抗体およびその断片を提供するとともに、それらの利用方法を提案することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意に検討した結果、健常人の末梢血Ｂリンパ球より調製した免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨ，ＶＬ）をコードする遺伝子を発現したファージディスプレイライブラリーから、完全ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）分子（抗体断片）を取得し、そのアミノ酸配列およびそれをコードするｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。さらに、このｓｃＦｖが、ヒトＩＬ−１８の生理活性を阻害することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法・物質として下記Ａ）〜Ｘ）の発明を含むものである。
Ａ）ヒトインターロイキン−１８に対する、ヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
Ｂ）以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドからなるＨ鎖の相補性決定領域と、（ｃ）または（ｄ）のポリペプチドからなるＬ鎖の相補性決定領域とを含む上記Ａ）に記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
（ａ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
（ｃ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド。
Ｃ）以下（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＨ鎖可変領域と、（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＬ鎖可変領域とを含む上記Ａ）またはＢ）に記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
（ｇ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
Ｄ）  以下（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体（ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体）のＨ鎖可変領域断片。
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド。
Ｅ）以下（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体（ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体）のＬ鎖可変領域断片。
（ｇ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド。
Ｆ）上記Ｂ）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または上記Ｄ）に記載のＨ鎖可変領域断片と、上記Ｂ）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または上記Ｅ）に記載のＬ鎖可変領域断片とを連結してなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体の１本鎖可変領域断片。
Ｇ）上記Ｂ）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＨ鎖可変領域断片または上記Ｄ）に記載のＨ鎖可変領域断片、および／または、上記Ｂ）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域断片または上記Ｅ）に記載のＬ鎖可変領域断片に、ヒト由来の定常領域を連結してなる、ヒトインターロイキン−１８に対するヒト由来の抗体（ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体）またはその断片。
Ｈ）上記抗体の断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、またはｓｃＦｖＦｃである上記Ｇ）に記載の抗体の断片。
Ｉ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の抗体またはその断片に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
Ｊ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の抗体またはその断片をコードする遺伝子。
Ｋ）配列番号１または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する上記Ｊ）に記載の遺伝子。
Ｌ）上記Ｊ）またはＫ）に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
Ｍ）上記Ｊ）またはＫ）に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
Ｎ）上記Ｊ）またはＫ）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト由来のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体またはその断片を生産する方法。
Ｏ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の抗体またはその断片、または上記Ｉ）に記載の修飾抗体を用いたヒトインターロイキン−１８検出器具。
Ｐ）上記Ａ）〜Ｈ）のいずれかに記載の抗体またはその断片、または上記Ｉ）に記載の修飾抗体を含むヒトインターロイキン−１８検出試薬を用いて、被検試料中のヒトインターロイキン−１８量を測定する免疫疾患の診断キット。
Ｑ）上記Ｐ）に記載の検出試薬を用いて測定した被検試料中のヒトインターロイキン−１８量に基づいて免疫疾患を診断する方法。
Ｒ）ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストを有効成分とするヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
Ｓ）上記ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストが、以下のいずれかの物質である上記Ｒ）に記載のヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
以下のいずれかの物質を含むヒトインターロイキン−１８活性阻害剤。
ｉ）上記Ａ）〜Ｃ）のいずれかに記載のヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体
ｉｉ）上記Ｄ）〜Ｈ）のいずれかに記載の抗体の断片
ｉｉｉ）上記Ｉ）に記載の修飾抗体
ｉｖ）上記ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかに記載の抗体、抗体の断片、または修飾抗体が認識するヒトインターロイキン−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。
Ｔ）上記Ｊ）またはＫ）に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
Ｕ）上記Ｒ）またはＳ）に記載のヒトインターロイキン−１８活性阻害剤、または上記Ｔ）に記載の遺伝子治療剤を含む免疫疾患治療剤。
Ｖ）上記Ｕ）に記載の免疫疾患治療剤を投与することによる免疫疾患の治療方法。
Ｗ）抗原とヒトインターロイキン−１８とによる刺激によってヘルパーＴ１細胞から産生するサイトカインを阻害することを特徴とする上記Ｕ）に記載の免疫疾患治療剤。
Ｘ）ヒトＩＬ−１８が関与するアレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患に適用するものであることを特徴とする上記Ｕ）またはＷ）に記載の免疫疾患治療剤。
本発明によれば、これまでのようにキメラ抗体またはヒト化抗体ではなく、ヒト由来のヒトＩＬ−１８に対する抗体およびその断片、並びにそれらの利用方法を提供できる。それゆえ、ヒトＩＬ−１８が直接または間接的に関与する疾病の治療において、反復投与や長期投与を行っても、顕著な治療効果と高い安全性とを維持した治療薬を提供できる。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１において分離したクローンｓｃＦｖのヒトＩＬ−１８に対する特異性をＥＬＩＳＡによって評価した結果を示すグラフである。
図２は、実施例１において精製したヒト由来のｓｃＦｖのヒトＩＬ−１８に対する特異性をＥＬＩＳＡによって評価した結果を示すグラフである。
図３は、実施例１におけるｓｃＦｖ（ｈ１８−４０、ｈ１８−１０８）が、ＩＬ−１８によるヒト骨髄単核球ＫＧ−１細胞からのＩＮＦ−γの産生を阻害することを示すグラフである。
図４は、実施例１におけるｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）が、ＩＬ−１８のヒト骨髄単核球ＫＧ−１細胞への結合を阻害することを示すグラフである。
図５は、図４において、ｓｃＦｖ（コントロール）の結果を示すグラフである。
図６は、ｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
図７は、ｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
図８は、実施例２における、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の刺激により、各細胞から産生されたサイトカインの量を示すグラフである。
図９は、実施例２における、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞の刺激により、各細胞の表面のＩＬ−１８Ｒα鎖の発現レベルを示す図である。
図１０は、実施例２における、ＩＬ−１８の用量と、Ｔｈ１細胞からのサイトカインの産生量との関係を示すグラフである。
図１１は、実施例２における、Ｔｈ１細胞への刺激後の培養時間と、Ｔｈ１細胞からのサイトカインの産生量との関係を示すグラフである。
図１２は、実施例２において、ＩＬ−１８刺激を受けたＴｈ１細胞における、細胞質ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１３に陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析した結果を示す図である。
図１３は、実施例２における、抗ＣＤ３抗体刺激を受けたＴｈ１細胞中の、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞の割合と、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞の陽性選別例とを示す図である。
図１４は、実施例２における、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を、抗ＣＤ３とＩＬ−１８とにより刺激した場合の、サイトカインの産生量を示すグラフである。
発明を実施する最良の形態
本発明の具体的態様について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）本発明の抗体およびその断片
本発明者は、ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）に対するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体について検討した結果、ファージディスプレイ法によって得られたヒト由来の１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）が、ヒトＩＬ−１８により誘導されるシグナル伝達およびＩＮＦ−γ産生を阻害することを明らかにした。さらに、この１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）における、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列およびそれらをコードする遺伝子の塩基配列を同定した。
配列番号３には、ＶＨ鎖のアミノ酸配列が示される。配列番号４〜６は、このＶＨ鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列が示される。すなわち、配列番号３に示すＶＨ鎖のアミノ酸配列において、３１番目〜３５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号４）、５０番目〜６６番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号５）、９９番目〜１０８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６）に対応している。
一方、配列番号９は、ＶＬ鎖のアミノ酸配列を示している。配列番号１０〜１２は、このＶＬ鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ１〜３）のアミノ酸配列を示している３３番目のアミノ酸配列がＣＤＲ１（配列番号１０）、４９番目〜５５番目のアミノ酸配列がＣＤＲ２（配列番号１１）、８８番目〜９８番目のアミノ酸配列がＣＤＲ３（配列番号６）に対応している。
本発明の抗体およびその断片は、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖、並びにそれらのＣＤＲとして、配列番号３〜６および９〜１２に示される配列に限定されるものではなく、それらの一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。
すなわち、ＶＨ鎖のＣＤＲとしては、（ａ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｂ）配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド、も含まれる。
一方、ＶＬ鎖のＣＤＲとしては、（ｃ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｄ）配列番号１０〜１２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖の相補性決定領域となるポリペプチド、も含まれる。
また、ＶＨ鎖可変領域は、（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｆ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＨ鎖可変領域となるポリペプチド、も含まれる。
同様に、ＶＨ鎖可変領域は、（ｇ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、のみならず、（ｈ）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトインターロイキン−１８に対するＬ鎖可変領域となるポリペプチド、も含まれる。
ここで、上記「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。したがって、例えば、上記（ｂ）のポリペプチドは、上記（ａ）のポリペプチドの変異ペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然（例えばヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
なお、上記「変異」は、後述のように本発明の抗体またはその断片を、治療薬として利用する場合（ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造またはヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして利用する場合（ヒトに投与しない場合）には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するＣＤＲの高次構造を維持する範囲で、変異を行うことが好ましい。
また、本発明に係る抗体およびその断片は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
なお、ＣＤＲは抗原を認識する領域であるため、ヒトＩＬ−１８は、本発明にかかる抗体またはその断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）に認識される。したがって、少なくとも上記ＣＤＲを有する抗体は、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識できる。すなわち、上記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、少なくとも前記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲを含んでいればよく、それ以外は、ヒト由来のＶＨ鎖およびＬ鎖のアミノ酸配列であればよい。これにより、ヒトＩＬ−１８に対する特異性は保持される。ただし、ＣＤＲは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域の１次構造と高次構造とによって、特異的に構築されている。このため、少なくとも前記ＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＣＤＲを含み、それ以外を、ヒト由来のＶＨ鎖およびＬ鎖からヒト抗ＩＬ−１８抗体を構成する場合、ヒトＩＬ−１８に対する特異性を有する抗体とすることが可能である。例えば、少なくともＣＤＲの高次構造を維持することによって、ヒトＩＬ−１８に対する特異性を有する抗体とすることが可能である。
より具体的には、本発明にかかる抗体およびその断片としては、ヒト由来のものであって、例えば、以下に示すイ）〜ニ）に示すものが挙げられる。
イ）上記（ａ）または（ｂ）に記載のＨ鎖の相補性決定領域を含むＶＨ鎖、
ロ）上記（ｅ）または（ｆ）のポリペプチドからなるＶＨ鎖、
ハ）上記（ｃ）または（ｄ）に記載のＬ鎖の相補性決定領域を含むＶＬ鎖、
ニ）（ｇ）または（ｈ）のポリペプチドからなるＶＬ鎖、
ホ）上記イ）またはロ）のＶＨ鎖および上記ハ）またはニ）のＶＬ鎖とを連結してなる１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、
ヘ）上記イ）またはロ）のＶＨ鎖および／または上記ハ）またはニ）ＶＬ鎖にヒト由来の定常領域を連結してなる断片などであってもよい。
上記ホ）およびヘ）において、上記ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを連結する場合、通常、適当なペプチドリンカーなどによって連結される。このペプチドリンカーとしては、例えば、１０〜２５アミノ酸残基からなる任意の１本鎖ペプチドが用いられる。
また、上記ヘ）に記載の上記ＶＨ鎖および／またはＶＬ鎖にヒト由来の定常領域を連結してなる断片（フラグメント）は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２や、少なくとも一部のＦｃ部を有したｓｃＡｂ、またはｓｃＦｖＦｃ、さらには完全抗体であってもよい。なお、ｓｃＡｂとはｓｃＦｖにＬ鎖またはＨ鎖の定常領域の一部のドメイン（Ｃドメイン）が結合したもの、ｓｃＦｖＦｃとはｓｃＦｖにＨ鎖およびＬ鎖の全定常領域が結合したものである。
さらに、本発明の抗体およびその断片には、安定性や抗体価を向上させるために、修飾剤が結合されていてもよい。すなわち、本発明の抗体およびその断片は、修飾抗体であってもよい。この修飾剤としては、例えば、糖鎖や高分子などが挙げられる。糖鎖修飾を行った場合には、その糖鎖が何らかの生理活性を有する可能性があるが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの単純な高分子修飾を行った場合にはそれ自体生理活性を示さない。さらに、ＰＥＧ化によって肝臓での吸収を抑制したり、血中での安定性を向上したりする可能性がある。つまり、修飾剤としては、ＰＥＧなどの単純高分子が好ましい。
なお、本発明の抗体およびその断片の修飾剤による修飾は、前述の変異ペプチドの作製と同様に、治療薬として利用する場合には、ヒトが免疫反応を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして利用する場合には、特に制限されない。また、本発明の抗体またはその断片を、ヒトに投与する場合、抗原を認識するＣＤＲの高次構造を維持する範囲で、修飾することが好ましい。
また、上記抗体は、抗体と構造的に関連したタンパク質も包含する意味、すなわち免疫グロブリンの意味である。さらに、本発明の抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの何れのクラスでもよい。言い換えると、単量体であってもよいし、２量体、３量体、４量体、５量体といった多量体であってもよい。
後述する実施例に示すように、上記ｓｃＦｖについて詳細な解析を進めた結果、後の実施例において詳述するように、その作用・性質について以下の知見が得られた。
〔１〕ヒトＩＬ−１８と特異的に結合する。
〔２〕ヒトＩＬ−１８により誘導されるシグナル伝達およびＩＮＦ−γの産生を阻害する。
このように、上記ｓｃＦｖは、ヒト由来のアミノ酸配列を有しているため、抗体の活性を阻止する阻止抗体が形成される可能性は極めて低い。さらに、ヒトＩＬ−１８と強く結合することにより、その生理活性を阻害する作用があるので、ヒトＩＬ−１８によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができる。よって、上記ｓｃＦｖおよびそれを含む抗体またはその断片は、ヒトＩＬ−１８が直接または間接的に関与する疾患、例えば、この免疫応答によって惹起されるアレルギー、炎症、および慢性免疫異常疾患の治療のために利用することができる。このような治療薬が開発されれば、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患の新しい治療方法の確立が期待される。
（２）本発明にかかる遺伝子
本発明にかかる遺伝子は、上記（１）で説明した抗体またはその断片をコードする遺伝子であり、配列番号１または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域として有する遺伝子、およびその塩基配列の一部を改変した改変遺伝子などが含まれる。
上記の遺伝子は、本発明の抗体またはその断片をコードしているので、適当な宿主（例えば細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはその断片を発現させることができる。
さらに、上記「遺伝子」は、上記（１）の抗体またはその断片をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、配列番号１または７に記載の配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。また、後述するように、本発明の遺伝子は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患用の遺伝子治療剤（遺伝子治療薬）として利用できる。
（３）本発明の抗体およびその断片の取得方法・生産方法
上記（１）に記載の抗体およびその断片は、例えば、後述する実施例に示すように、いわゆるファージディスプレイ法を利用することにより、取得することができる。また、上記（１）に記載の抗体およびその断片は、上記（２）に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、生産することができる。なお、抗体およびその断片の取得方法および生産方法は、これに限定されるものではない。
より具体的には、健常人の末梢血Ｂリンパ球からｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に、更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ  ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖ  ＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組込み、ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリを作製する。このライブラリをプラスチックチューブに固相化したヒトＩＬ−１８と反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖディスプレイファージを除去した後に、ヒトＩＬ−１８と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ  ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養して目的のｓｃＦｖ蛋白のみを得るというものである。
なお、配列番号１および７は、ファージディスプレイ抗体法によって、取得したヒトＩＬ−１８に対する１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードするｃＤＮＡの塩基配列である。
ｓｃＦｖ  ＤＮＡの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることが出来る。例えば、プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，ＳＰ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１６９：４３７９−４３８３）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
前記のように発現されたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本願発明で発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＥ  ｔａｇ配列が付加されているので、抗Ｅ  ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。
このようにして得られたｓｃＦｖ蛋白（ポリペプチド）は、後述する実施例に示すようにヒトＩＬ−１８に対する結合活性を有することが明らかになった。本発明のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体の抗原結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ等の方法がある。例えばＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＩＬ−１８を固相化した９６穴プレートに目的の抗ＩＬ−１８抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸菌の培養上清や精製抗体を加える。次にアルカリホスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質パラニトロフェニルホスフェートを加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することが出来る。
さらにまた、本願発明により得られたｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＩＬ−１８により誘導されるヒト骨髄単核球ＫＧ−１細胞からのＩＦＮ−Ｙ産生を容量依存的に抑制することも明らかとなった。
従って、このｓｃＦｖ蛋白は、ヒトＩＬ−１８の生物活性を抑制する事から、ＩＬ−１８の作用により惹起される疾患の予防または治療に有効であると期待される。
（４）本発明の組換え発現ベクター等
本発明の組換え発現ベクターは、前記（２）の遺伝子、すなわち、上記（１）の抗体またはその断片をコードする遺伝子を含むものであり、例えば、配列番号１又は７に示される何れかの塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
このように、組換え発現ベクターは、本発明の遺伝子を含むものである。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
本発明の遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明に係る抗体またはその断片を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る抗体またはその断片をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、上記（２）遺伝子が全長ＤＮＡの場合のホスト細胞としては、ヒト又はマウス由来の細胞をはじめとして、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等などの動物細胞が挙げられ、ＤＮＡフラグメントの場合のホスト細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
本発明の形質転換体は、前記（２）の遺伝子、すなわち、上記（１）の抗体またはその断片をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体を含む意味である。対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。特に、マウスやラット等の齧歯目動物は、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、なかでも近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが実験動物・病態モデル動物として好ましく、ノックアウトマウス等は、上記抗体やその断片の更なる機能解析、ヒトＩＬ−１８が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
なお、上記（１）の抗体またはその断片は、本発明の組換え発現ベクターを用いて作製した、本発明の形質転換体によっても生産することが可能である。
（５）本発明の抗体およびその断片の利用方法
（５−１）ヒトＩＬ−１８検出器具・免疫疾患の診断キット・診断方法
上記（１）の抗体、その抗体断片、または修飾抗体は、ヒトＩＬ−１８に対して、特異的に強く結合するため、ヒトＩＬ−１８の検出・測定などに利用できる可能性がある。すなわち、上記ヒトインターロイキン−１８検出器具によれば、例えば、血液や尿などの試料中に含まれるヒトＩＬ−１８を高精度に検出できる。それゆえ、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患の判定や治療効果の評価を行うための診断用、治療用として利用できる。
なお、本発明のヒトＩＬ−１８検出器具は、本発明の抗体における少なくともＣＤＲのアミノ酸配列を用いればよい。ヒトＩＬ−１８検出器具は、種々の条件下でのＩＬ−１８の検出・測定などに利用できる。本発明のヒトＩＬ−１８検出器具としては、例えば、ヒトＩＬ−１８と特異的に結合する本発明の抗体またはその断片を基盤（担体）上に固定化した抗体チップや抗体カラム等が挙げられる。
また、本発明の抗体またはその断片は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるヒトＩＬ−１８の精製にも極めて有用である。この精製方法は、本発明の抗体またはその断片をヒトＩＬ−１８とそれ以外の物質の混合物に接触させて抗体またはその断片にヒトＩＬ−１８を吸着させる工程と、吸着したヒトＩＬ−１８を抗体またはその断片から脱着させ、採取する工程を含むものである。この精製方法によれば、ＩＬ−１８を短時間かつ高精度に精製できる。
本発明の抗体またはその断片、およびそれらの修飾抗体は、ヒトＩＬ−１８を検出するための試薬（ヒトＩＬ−１８検出試薬）としても広範な用途を有する。すなわち、これらの抗体またはその断片によるラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中のヒトＩＬ−１８を迅速且つ正確に定性又は定量分析することができる。この標識イムノアッセイでは、上記抗体またはその断片は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。また、これらの抗体およびその断片は、ヒトＩＬ−１８に特異的に反応し、免疫反応を呈するので、その免疫反応を標識物質を指標に測定すれば、被検試料中のごく微量のヒトＩＬ−１８を精度良く検出することができる。標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できるうえに、分析に要する時間と労力が少なくてすみ、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。
本発明の免疫疾患の診断キット、および免疫疾患を診断する方法は、このようなヒトＩＬ−１８の検出方法に従い、被検試料（血液や体液、組織など）中のヒトＩＬ−１８量を測定し、その測定結果に応じて免疫疾患の診断を行うものである。なお、上記「免疫疾患」は、ヒトＩＬ−１８が関与する疾患であり、例えば、アトピー性皮膚炎、気道炎症、気道過敏性（ＡＨＲ）、喘息などが例示される。
このように、本発明のヒトＩＬ−１８の検出器具による検出方法は、ヒトＩＬ−１８を製造する際の工程管理や製品の品質管理に有用である。また、本発明の免疫疾患の診断キットおよび診断方法は、組織や体液におけるヒトＩＬ−１８のレベルを指標とする種々の感受性疾患の診断や、各種免疫疾患の治療評価を行うために極めて有用である。
なお、一般に診断用に用いる抗体は、マウス、ウサギ、ヤギなどのヒト以外の動物を免疫して作成される。しかし、動物の免疫系では、自己の体を構成する分子に結合する抗体を産生するリンパ球は、排除または不活性化される。つまり、動物を免疫して作成した抗ヒトＩＬ−１８抗体のうち、ヒトＩＬ−１８と動物のＩＬ−１８とで酷似した部分を抗原決定領域とした抗体は含まれない。
これに対し、本発明の抗体は、ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体を提示させたファージライブラリーからスクリーニングされた抗体である。このファージには、動物のように抗体を排除または不活性化する機構は存在しない。それゆえ、本発明の抗体には動物の免疫では作製できない、ヒト、サル、その他各種の動物のＩＬ−１８に共通した抗原決定領域に結合特異性を示す抗ＩＬ−１８抗体が含まれる。このような抗体を本発明の検出器具や診断キットに用いれば、ヒトのみならずサルをはじめとする各種動物疾患モデルにおけるＩＬ−１８関連疾患を診断することができる。
（５−２）ヒトＩＬ−１８活性阻害剤など
上記（１）の抗体は、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識するヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体である。さらに、この抗体は、ヒトＩＬ−１８に特異的に結合するとともに、ヒトＩＬ−１８の受容体への結合を阻害してこの受容体を介したシグナル伝達も阻害し、さらには、ヒトＩＬ−１８によって誘導されるＩＦＮ−γの産生も阻害する。
したがって、この抗体は、言い換えれば、ヒトＩＬ−１８アンタゴニストである。そして、このヒトＩＬ−１８アンタゴニストは、ヒトインターロイキン−１８活性阻害剤として利用することができる。
上記「ヒトＩＬ−１８アンタゴニスト」としては、特に限定されるものではないが、例えば、以下のｉ）〜ｉｖ）の物質が挙げられる。
ｉ）上記（１）に記載の本発明の抗体。
ｉｉ）上記（１）に記載の本発明の抗体の断片。
ｉｉｉ）上記（１）に記載の本発明の抗体またはその断片の修飾抗体。
ｉｖ）ｉ）〜ｉｉｉ）に記載の抗体、抗体の断片、または修飾抗体が認識するヒトＩＬ−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。
ここで、上記「ヒトインターロイキン−１８活性阻害剤」は、ヒトインターロイキン−１８の活性を抑制するのはもちろん、ヒトインターロイキン−１８の受容体への結合も拮抗的に阻害するもの、さらには、ヒトＩＬ−１８とＩＬ−１８受容体との複合体に結合して、シグナル伝達を阻害するものであってもよい。
また、上記（２）に記載の本発明の遺伝子は、ヒトＩＬ−１８が関与する免疫疾患における遺伝子治療剤として利用することができる。この遺伝子治療剤を摂取すれば、体内で本発明の抗体またはその断片が形成されるので、上記ヒトＩＬ−１８活性抑制剤と同様の効果が得られる。なお、ヒト抗ＩＬ−１８抗体が、生体内で形成され続けると、ヒトＩＬ−１８の作用を過剰に抑制してしまうが、ヒトの場合、ＩＬ−１８が欠失したとしても、ＩＬ−１がＩＬ−１８と同様の作用を示すため、特に問題は生じない。
本発明の抗体は、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識するヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８である。すなわち、この抗体のアミノ酸配列は、従来のキメラ抗体やヒト化抗体とは異なり、すべてヒト由来である。
したがって、本発明の抗体の作用を阻止する抗体（阻止抗体）が形成される虞はない。それゆえ、たとえ、この抗体を反復投与または長期投与したとしても、高い安全性を保持したまま、効果も持続することが可能である。
それゆえ、本発明のヒトＩＬ−１８活性阻害剤および遺伝子治療剤は、ヒトＩＬ−１８が関与する免疫疾患の治療法として有用な免疫疾患治療剤（免疫治療薬）として利用可能である。
なお、本発明の免疫疾患治療剤は、体内でその効果を発揮すればよいので、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（またはこれを含むヒトＩＬ−１８活性阻害剤）を投与してもよいし、プロドラッグ化して体内で代謝されて当該ポリペプチドが発現されてもよい。すなわち、本発明の免疫疾患治療剤は、上記ｉ）〜ｉｖ）のヒトＩＬ−１８アンタゴニスト（ヒトＩＬ−１８活性阻害剤）または上記遺伝子治療剤がプロドラッグ化されていてもよい。すなわち、体内で、活性代謝物となるように、免疫治療薬剤を修飾してもよい。
また、本発明の免疫疾患治療薬剤には、１種類以上の賦形剤、１種類以上の結合剤、１種類以上の崩壊剤、１種類以上の滑沢剤、１種類以上の緩衝剤などのように、医薬品として許容される添加物が含まれていてもよい。
以上のように、本発明の抗体（ヒトモノクローナル抗体）及び、当該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗ヒトＩＬ−１８抗体の可変領域を有し、ヒトＩＬ−１８と強く反応して、ＩＬ−１８とＩＬ−１８受容体間の結合に阻害作用を示す。さらに、ＩＬ−１８によって惹起される種々の免疫応答を阻害することができ、当該免疫応答により惹起されるアレルギー、炎症及び免疫異常性疾患の予防または治療薬、例えば、抗炎症剤あるいは自己免疫疾患の治療及び予防のための薬剤として使用することができる。
また、本願発明のヒトＩＬ−１８に対するヒト由来ｓｃＦｖは、ＩＬ−１８と特異的に結合し、ＩＬ−１８により誘導されるシグナル伝達及びＩＦＮ−Ｙ産生を阻害するものであることが示された。従って、当該ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖのＶＨ鎖及びＶＬ鎖をヒト定常領域またはその一部と結合させたヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体またはその抗体フラグメントは、ＩＬ−１８の関与する疾患、例えば慢性炎症性疾患や自己免疫疾患等の治療への適用が期待される。また、ＩＬ−１８とは結合するが抑制作用を示さなかった抗体を含めてこれらの抗体で、ＩＬ−１８の血中濃度を測定し、病態の症状の変動をモニターすることもできる。
なお、前述のように本発明の抗体は、ＩＬ−１８に対するシグナル伝達及びＩＮＦ−γ産生を阻害するので、そのような特性を有する抗体とヒトＩＬ−１８との結合特異性を示すＩＬ−１８上の抗原決定領域を明らかにすれば、低分子化合物の免疫疾患治療薬の開発への応用が可能となる。この抗原決定領域を、エピトープという。このエピトープは、アミノ酸の１次配列そのものである場合や、もしくは、ペプチド鎖の折り畳まれ方で構築た立体構造である場合がある。いずれの場合でも、例えば、本発明者等が提案した「モノクローナル抗体を用いた分子鋳型デザイン法」によって、エピトープの類似化合物（ミミック分子）をデザインすることができる（Ｔ．Ｆｕｋｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：２６７−２７０，１９９８．）。ここで、「低分子化合物」とは、例えば、ペプチドや抗体などの比較的分子量の大きい化合物（分子量１万以上）のものではなく、一般に低分子医薬として用いられている、分子量１万未満、好ましくは、分子量３０００未満の化合物を示している。なお、低分子化合物の分子量は、小さいほど好ましい。
なお、上記低分子化合物として、ペプチドやさらに低分子量の化合物を創製する場合、このミミック分子の分子構造に着目して分子設計を行う、いわゆるｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏプロセスによって、設計することができる。このように、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏによる分子設計を行うことにより、安価かつ迅速に、治療薬となりうる低分子化合物を、リード化合物として選抜できる。
具体的には、例えば、後述の実施例では、ヒト抗ヒトＩＬ−１８ｓｃＦｖ抗体のＣＤＲは、配列番号４〜６，１０〜１２に示されている。一般に、抗体において、ＣＤＲは、抗原を認識する領域（部位）である。すなわち、ＣＤＲは、抗体の活性中心となる。つまり、実施例１に示したｓｃＦｖは、ＣＤＲによって、ヒトＩＬ−１８を特異的に認識する。従って、このＣＤＲの高次構造と略一致（好ましくは完全に一致）するように、低分子化合物を設計すれば、その低分子化合物は、低分子医薬品として利用できる。言い換えれば、低分子化合物は、ＣＤＲのコンフォメーションに近づくように設計する。なお、ｉｎ  ｓｉｌｌｉｃｏプロセスの方法は、特に限定されるものではないが、例えば、ＳＢＤＤ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ），ＣＡＤＤ（Ｃｏｎｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）などにより、ＣＤＲが有する官能基や、ＣＤＲの高次構造に基づいて、コンピューター上で設計できる。
このようにして設計した低分子化合物は、抗体のようなタンパク質（ペプチド）に比べて、安定性が高い。このため、この低分子化合物は、取り扱いやすい医薬品として利用できる。
（５−３）免疫疾患治療薬剤の適用例−１
前述のように、本発明のヒトＩＬ−１８活性阻害剤および遺伝子治療剤は、ヒトＩＬ−１８が関与する免疫疾患の治療法として有用な免疫疾患治療薬剤となる。ここで、免疫疾患治療薬剤の適用例について説明する。
Ｔｈ１細胞優位な免疫応答は、一般に、自己免疫疾患の病態に検討される。しかし、Ｔｈ１細胞優位な免疫応答は、Ｔｈ２細胞が関与する疾患（喘息・アトピーなど）に対して、防御的である。しかしながら、最近の研究で、Ｔｈ１細胞が、Ｔｈ２細胞が関与する気道過敏を増大させることに関与することが明らかとなった。さらに、Ｔｈ１細胞が、好中球の増加と活性化によって、気道過敏性（ＡＨＲ）を誘導することが示された。
実際、喘息患者の気道は、好中球数の増加だけでなく、ＩＦＮ−γ，ＴＮＦα，およびＩＬ−８レベルの増加も見られる場合がある。それにもかかわらず、どのようにＴｈ１細胞がＴｈ２細胞の影響を妨げ、病態を示すのか、そのメカニズムは、未だ解明されていない。従って、気道炎症および気道過敏性が誘導された場合の、Ｔｈ１細胞の病態への関与を解明することは重要である。
ＩＬ−１８は、本来は、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ−１２存在下、Ｔｈ１細胞から産生するＩＦＮ−γを増加させる因子として、発見された。このため、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との混合物を注入すると、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＦＮ−γ産生細胞を誘導して、Ｔｈ２細胞が誘導するＩｇＥ応答を阻害する。しかしながら、本発明者等の最近の研究によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導した抗原特異的Ｔｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞を、ナイーブホストマウス（非感作性ホストマウス）に受動移入後、ホストマウスを約１ヶ月間、無処置で放置しておくと、移入した各細胞が、メモリー表現型のＴｈ１細胞あるいはＴｈ２細胞となること、および、これらの細胞を、経鼻的に投与した抗原、または、抗原とＩＩＬ−１８とにより刺激された場合に、ホスト動物が、気道炎症を発症することが明らかとなった（Ｔ．Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．，２００４，１９９，５３５−５４５．）。従来の報告は、ＩＬ−１３の中和は、Ｔｈ２細胞が移入されたマウスの、好酸球の増加とＡＨＲとを阻害するというものであった。これに対し、同様の処理をしたＴｈ１細胞が移入されたマウスでは、たとえ、この処理が、著しく気道の好酸球の増加を減少させるものであっても、ＡＨＲが阻害されない。
これらの結果は、Ｔｈ１細胞が、Ｔｈ２細胞とは全く異なる様式で、ＡＨＲを誘導することを示唆している。Ｔｈ１細胞は、抗原とＩＬ−１８とによる刺激に対して、ユニークな応答を示し、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ），Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−９，ＩＬ−１３），ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α（マクロファージ由来炎症性タンパク質−１α），およびＧＭ−ＣＳＦを産生する。Ｔｈ２サイトカインとＧＭ−ＣＳＦは、主に、気管支喘息を誘導する因子として、広く認められている。いくつかの研究から、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とは互いに阻害しあうものではなく、むしろ共同することで、気管支喘息の発症を誘導するとともに、その症状を増幅することが示唆されている。実際、ＩＦＮ−γとＩＬ−１３との同時投与は、最も重篤な気管支喘息を誘導する。本発明者等が見出したＴｈ１細胞の新規機能は、抗原とＩＬ−１８とで刺激を受けると、Ｔｈ１サイトカイン，Ｔｈ２サイトカイン，ＧＭ−ＳＣＦおよびケモカインを産生することにより、様々な炎症性病態を誘導することである。
従って、ヒトＴｈ１細胞も、同条件下で、病態を示す可能性がある。
後述の実施例２では、ヒトＴｈ１細胞が、抗原とＩＬ−１８存在下で、Ｔｈ１サイトカイン，Ｔｈ２サイトカイン，ＧＭ−ＳＣＦおよびケモカインを産生することが確認された。この実施例では、新たに誘導されたＩＬ−１８Ｒαを強く発現するＴｈ１細胞が、抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１８とによる刺激によって、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−１３，ＧＭ−ＣＳＦ，およびＩＬ−８の産生を著しく増加させることが示された。この結果は、Ｔｈ１細胞が、Ｔｈ１サイトカイン，Ｔｈ２サイトカインだけでなく、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−８の産生により、組織の損傷を誘導する可能性を示している。
このように、ＩＬ−１８は、抗原と共同してＴｈ１細胞を刺激することにより、重篤な気道炎症およびＡＨＲを発症する。従って、例えば、前述したヒトＩＬ−１８アンタゴニスト（前述のｉ）〜ｉｖ））は、その治療薬となる。
（５−４）免疫疾患治療薬剤の適用例−２
次に、免疫疾患治療薬剤の別の適用例について説明する。
これまで、アトピー性皮膚炎は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体依存性の獲得型アトピーとして考えられていた。このため、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を標的とする、ＩｇＥ抗体阻害剤や、抗アレルギー剤などが、アトピー性皮膚炎の治療薬として用いられてきた。しかし、これらの治療薬では治癒できない、または、再燃を繰り返すアレルギー患者が、年々増加している。
従来のように、獲得型アトピー性皮膚炎（ＩｇＥ抗体依存性アトピー性皮膚炎）を照準とした治療法では無効な、自然型アトピーの発症および重症度には、ＩＬ−１８が重要な役割を果たしている。
しかし、そのような症例に対する有効な治療法は、未だ確立されていない。
Ｔｈ２細胞の機能に対し拮抗作用を示すＴｈ１細胞を、ＣｐＧＤＮＡ投与するなどの方法で誘導できるが、同時に誘導されるＩＬ−１８はＴｈ１細胞に作用して、ＴＨ１型の気管支喘息を誘導することが問題となる。
獲得型アトピー性皮膚炎（ＩｇＥ抗体依存性アトピー性皮膚炎）の治療法として、抗原特異的減感作療法が知られているが、その分子機構は、未だ解明されておらず、治療の有効性も低い。なお、減感作療法とは、ＩｇＥ抗体が関与する即時型アレルギー反応（Ｉ型アレルギー反応）の原因抗原であるアレルゲン，特に吸入性アレルゲンを生体内に投与し（一般には注射）、アレルゲンに対する過敏反応を軽減させようとする治療法である。
ＩｇＥ抗体のＦｃ部に特異的で、ＦｃＲ１部への結合を阻害するヒト型マウス抗体が、Ｇｅｎｅｎｔｉｃ社で開発され、アレルギー治療薬として有効であることが報告されている（Ｍｉｌｇｒｏｍ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９９：３４１，１９６６−７３．）。
また、、Ｔｈ２サイトカイン阻害剤は、抗ＩＬ−４抗体，抗ＩＬ−５抗体，抗ＩＬ−１３抗体、および、これらの受容体に対する抗体は、アレルギー治療薬としての抗体医薬（医薬品）になり得ると考えられるが、未だ、有効な抗体医薬は開発されていない。
ＦＫ５０６に代表される低分子免疫抑制剤の低量使用は、抗アレルギー作用を発揮するが、副作用として、腎障害などが報告されている。
ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ  Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介する刺激を加え、ＩＬ−１２の産生を誘導する手段として、ＣｐＧＤＮＡが注目されている。このＣｐＧＤＮＡは、非メチル化ＣｐＧモチーフを有するＤＮＡである。ＣｐＧＤＮＡは、特にＴｈ１反応（マクロファージを活性化する反応）を強く惹起し、臨床面での応用が期待されている分子である。しかし、ＣｐＧＤＮＡは、前述のように、同時に誘導されるＩＬ−１８はＴｈ１細胞に作用して、ＴＨ１型の気管支喘息を誘導することが問題となる。
このように、アトピー性疾患は、これまで、アレルゲン特異的ＩｇＥ依存性の獲得型のアトピー疾患として論じられ、それを照準としたＩｇＥ阻害剤や抗アレルギー剤などが、治療薬として用いられている。しかし、これらの治療薬では、治癒しない、あるいは、再燃を繰り返す患者が年々増加している。
すなわち、従来の獲得型アトピーを照準とした治療法では、無効な自然型アトピーが存在しており、その発症には、ＩＬ−１８が重要な役割を果たしている。
従来の免疫学の考え方では、Ｔｈ１細胞誘導は、Ｔｈ２細胞機能を抑制することによって、抗アレルギー作用を発揮するものと考えられてきた。しかし、本発明者等は、ＩＬ−１８が、Ｔｈ１細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で刺激することにより、ＩＮＦ−γ，ＩＬ−８，９，１３などを産生し、難知性の気管支喘息を誘導することを見出した。これは、アレルギー性炎症発症が、Ｔｈ１とＴｈ２とのバランスが原因であるという、従来の定説を覆すものである。つまり、従来のバランス是正を目指す治療法を明確に否定するものである。
ＩＬ−４，５，９，１３は、重要なＴｈ２サイトカインである。一方、ロイコトリエン、ヒスタミン、セロとインなどは、重要なケミカルメディエーターである。これらを個々に抑制（阻害）する技術はあっても、その上流から阻止するものではない。すなわち、各サイトカインに直接作用して、それらの機能を抑制（阻害）する技術はあっても、各サイトカインの産生を上流で、阻害する技術はない。ＩＬ−１８は、上記各サイトカインの上流にあることから、ＩＬ−１８の活性を阻害することによって、アレルギー性疾患（アレルギー性炎症）に有効であると考えられる。
アレルギー性疾患の発症メカニズムには、活性化Ｔ細胞，好塩基球，および肥満細胞が深く関与する。特に、アレルゲンによる肥満細胞または好塩基球上のＦｃεＲに結合したＩｇＥ分子の架橋によって、これらの細胞が活性化される。その結果、Ｔｈ２サイトカインとケミカルメディエーターとが産生され、アレルギー性炎症（アレルギー性疾患）が誘導されると考えられている。しかし、アレルゲンやＩｇＥ関与がなく、感染を契機にアレルギー性炎症が誘導される場合がある。抗アレルギー剤，免疫抑制剤など、非特異的な治療法は存在するものの、ＩＬ−１８を特異的に抑制する技術は開発されていない。
そして、これまで作製されている抗ＩＬ−１８抗体は、マウス抗体をヒト化したものであるため、臨床応用できる抗体医薬にはなりえない。
本発明の抗体は、自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性疾患）を誘導するＩＬ−１８に対する、ヒト由来のヒト抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（完全ヒト型抗体）である。これまで、ヒトＩＬ−１８に対する完全ヒト抗体は、開発されておらず、本発明の抗体が、国際的に唯一のものである。この抗体は、臨床適用しても、マウス抗体のように、抗原性を示さない。従って、この抗体は、副作用のない優れた抗体医薬として利用できる。これにより、アレルギー性疾患，自然型アトピー，および喘息などの新規な治療法を確立できる。例えば、この抗体は、従来型の獲得免疫系の異常に基づく獲得型アトピー（ＩｇＥ依存性）を照準とした治療法では無効な、自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性）を標的とした新規な治療法と確立できる。
後述する実施例に示すように、この抗体は、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系で、ＩＬ−１８の活性を抑制した。特に、この抗体は、抗原とＩＬ−１８とによる刺激によって生じるＴｈ１細胞からのＴｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインとの産生抑制機能を有している。この機能は、ＩＬ−１２の作用を損なわない点で重要である。
従って、上記免疫疾患治療薬は、現在の難病の１つであるアレルギー性炎症の治療標的として、重要な役割を果たす。さらに、上記免疫疾患治療薬は、従来のアレルギー性炎症治療薬と全く異なる新しいタイプの治療薬を創製するために有用である。
以上のように、ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞を刺激して、気管支喘息を誘導する。
また、ＩＬ−１８は、樹状細胞、マクロファージなどの免疫系の細胞だけでなく、皮膚ケラチノサイト、腸管上皮細胞、気道上皮細胞など、種々の非免疫系の細胞からも産生する。
また、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２の存在下で、様々な免疫系または非免疫系の細胞から、ＩＦＮ−γの産生を誘導する。一方、ＩＬ−１８は、ＩＬ−１２の非存在下で、ＮＫＴ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞から、ＩＬ−４，ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカイン（ヘルパーＴ２細胞から産生するサイトカイン）の産生を誘導して、抗原非特異的にＩｇＥ産生を誘導する。
また、ＩＬ−１８は、抗原刺激を受けたＴｈ１細胞を刺激して、Ｔｈ１サイトカインに属するＩＦＮ−γの産生を増強するばかりか、Ｔｈ２サイトカインに属するＩＬ−９，ＩＬ−１３、さらに代表的なケモカインであるＩＬ−８の産生を誘導する。
また、ＩＬ−１８は、ＯＶＡ特異的Ｔｈ１型メモリーＴ細胞を移入したマウスに、経鼻的にＯＶＡと共に投与する（ＩＬ−１８とＯＶＡとを投与）ことにより、肺胞と間質内への好中球・リンパ球・マクロファージ・好酸球の強い湿潤像と、気道過敏性とを特徴とするＴｈ１型の気管支喘息を誘導できる。
また、ＩＬ−１８は、抗原／ＩｇＥ非依存的に、直接、肥満細胞や高塩基球を刺激する。その結果、様々なサイトカインや化学伝達物質の産生を誘導し、自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性炎症）を誘導する。
Ｔｈ２細胞依存性の喘息は、抗ＩＬ−５抗体、あるいは、抗ＩＬ−１３抗体によって、抑制できる。しかし、抗原とＩＬ−１８とにより刺激されたＴｈ１細胞が誘導する喘息に対しては、これらの抗体による治療は無効である。本発明の抗体は、上記の抗体では無効な喘息の治療に有効である。すなわち、本発明の抗体は、ＩＬ−１８によって誘導される喘息（感染が原因で発症する喘息）に対して有効である。
本発明は、ＩＬ−１８が関与する喘息病態の発見を含み、かつ、従来型の獲得免疫系の異常に基づく獲得型アトピー（ＩｇＥ依存性）を標準とした治療法では無効な自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性）を標的とする新規な治療法を確立する上で重要となる。
また、本発明の抗体は、自然免疫系と獲得免疫系とを結合する上で重要な役割を果たすヒトＩＬ−１８に対するヒトＩＬ−１８モノクローナルヒト抗体（抗ヒトＩＬ−１８抗体）である。
この抗体は、従来型の獲得免疫系の異常に基づく獲得型アトピー（ＩｇＥ依存性）を照準とした治療法では無効な自然型アトピー（ＩＬ−１８依存性）を標的とした新しい治療法を提供するものである。
さらに、この抗体は、アトピー性皮膚炎疾患だけでなく、喘息や鼻炎，その他のアレルギー性疾患に対する新規な治療法を提供するものである。特に、ＩＬ−１８は、Ｔｈ１細胞を刺激して、難治性の気管支喘息を発症する。このため、気道上皮に感染して、気道上皮細胞からＩＬ−１８の産生を誘導する作用を示す病原体は、気管支喘息を発症する原因となる。従って、この抗体は、感染によって発症した喘息に対して有効な治療薬となる。
本発明にかかる抗体およびその断片は、ヒトＩＬ−１８の受容体への結合を阻害するヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体およびその断片である。従って、ヒトＩＬ−１８が原因となる様々な炎症性疾患の治療薬（治療方法）または予防薬（予防方法）として利用可能である。
また、本発明は、例えば、後述の実施例に示した、ｓｃＦｖ抗体のうち、ＣＤＲの高次構造に基づき、低分子化合物を設計することにより、ＩＬ−１８依存の低分子医薬品（化学合成薬剤）の開発に重要な手段を提供する。
本発明で得られたヒト抗ＩＬ−１８抗体は、感染を契機に増悪するアトピー性皮膚炎、難知性の気管支喘息の治療に対して有効である。
本発明のヒト抗ＩＬ−１８抗体は、アレルゲン／ＩｇＥを原因としないＩＬ−１８依存性炎症（例えば、自然型アトピー）に対して新規な治療法を確立できる。
前述のように、本発明のヒト抗ＩＬ−１８抗体は、ＩＬ−１８の受容体への結合を阻害する。従って、この抗体は、上記のような、ＩＬ−１８が原因となって発症する、様々な炎症性疾患の治療と予防に有効となる。
本発明では、ヒト１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を提示するファージディスプレイライブラリから、ＩＬ−１８に特異的に結合するｓｃＦｖの単離に成功した。この１本鎖抗体も、ＩＬ−１８の受容体への結合を、特異的に阻害することが可能である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【実施例１】  （１−１）健常者からのファージライブラリーの構築
ファージライブラリーの構築は、Ｊ．Ｄ．Ｍａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７，１９９１）により報告されている方法を参考に、健常者２０名の末梢血由来リンパ球を出発材料として行った。構築したＶＨ（Ｙ）−ＶＫ、ＶＨ（Ｙ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−ＶＫ、、ＶＨ（μ）−Ｖλの各サブライブラリーは、それぞれ１．１×１０８、２．１×１０８、８．４×１０７、５．３×１０７クローンの多様性を有すると評価された。
（１−２）パンニング
ヒトＩＬ−１８を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３１ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディッシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。次いで、０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで６回洗浄した。これに、健常人由来の抗体ファージライブラリー（１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）提示ファージ液）を０．９ｍＬ（１×１０１２ｔｕ／ｍＬ）加え、反応させた。
次に、この反応液を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ＩＬ−１８と結合するｓｃＦｖ提示ファージを溶出した。溶出したファージに、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ＨＣｌ，（ｐＨ９．１）を加えてｐＨを調製した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１を３０００×ｇ，１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイパー（Ｃｏｓｔａｒ）を使って懸濁、回収した。
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ（Ｙ）−ＶＫ、ＶＨ（Ｙ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−ＶＫ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて、前述のＩＬ−１８固定化プレートを用いてパンニングを計２回行った。２回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認及びＩＬ−１８  ＥＬＩＳＡによる特異性の確認（スクリーニング）と塩基配列の解析とを行った。
（１−３）ＩＬ−１８  ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
分離したクローンをスクリーニングするためのＥＬＩＳＡは、ヒトＩＬ−１８をＥＬＩＳＡプレートに固定化して行った。具体的には、２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１８、２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を、４０μＬ／ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチン及び５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液４００μＬ／ｗｅｌｌをＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
次に、このＥＬＩＳＡプレートに、ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。続いて、この固定化されたｓｃＦｖファージに、ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として反応させた。この反応液を洗浄液で５回洗った後、発色基質液（１ｇ／ｍＬ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ）、１０％ジエタノールアミン（Ｗａｋｏ）を含むＰＢＳ溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮＪ−２００１（Ｉｎｔｅｒ  Ｍｅｄ）で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ＩＬ−１８に特異的であることが確認できた。その結果を図１に示す。
（１−４）クローンの配列分析
次に、単離したクローンのｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子のＤＮＡ塩基配列をＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。ＥＬＩＳＡ及び配列分析の結果、単離したクローンは２種に分類された（ｈ１８−４０、ｈ１８−１０８）。
なお、配列番号１および７にはクローン番号ｈ１８−１０８のＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子の塩基配列がそれぞれ示される。また、配列番号３および８にはこのＶＨ鎖及びＶＬ鎖のアミノ酸配列が示される。
（１−５）ヒト抗ＩＬ−１８  ｓｃＦｖの発現と精製
前記（１−２、３）で単離したヒトＩＬ−１８に反応するｓｃＦｖクローン（ｈ１８−４０・ｈ１８−１０８）からプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌ＨＢ１２５１を形質転換した。２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで８，９００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍフィルター濾過後、ペリプラズム画分からｓｃＦｖを精製するための出発材料とした。
このようにして調製した精製のための出発材料を、抗Ｅ  ｔａｇ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラムＤｅｔｏｘｉ−ｇｅｌ（ＰＩＥＲＣＥ社）で添付のプロトコルに従いエンドトキシンを除去した。分子量カット１０，０００のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮後、０．４５μｍフィルター濾過して精製標品とした。
（１−６）精製ｓｃＦｖのＩＬ−１８に対する結合性
次に、精製ｓｃＦｖ（ｈ１８−４０・ｈ１８−１０８）のＩＬ−１８に対する結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した。ＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに調製したヒトＩＬ−１８を固相化した９６穴プレート（ＮＵＮＣ．ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に、精製ｓｃＦｖを１００μＬ加えて３７℃で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴと省略することもある）で５回洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗Ｅ  ｔａｇ抗体と更に３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで５回洗浄後、発色基質液を加えて呈色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定して結合性を評価した。その結果を図２に示す。同図に示すように、２種の抗体（ｈ１８−４０・ｈ１８−１０８）は全てＩＬ−１８と特異的に結合した。
（１−７）ＩＬ−１８に刺激されたヒト骨髄単核球ＫＧ−１細胞からのＩＦＮ−Ｙ産生に対する作用
ＩＬ−１８（２０ｎｇ／１００μＬ）とｓｃＦｖとを反応させた後に、ＫＧ−１  ｃｅｌｌ（３×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）培養液に加え、２４時間後の培養上清中におけるＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）により測定した。ｓｃＦｖ（ｈ１８−４０・ｈ１８−１０８）に関してＩＬ−１８阻害活性をＫＧ−１  ｃｅｌｌのＩＦＮ−γ産生で調べた結果、コントロールおよびｓｃＦｖ（ｈ１８−４０）では阻害活性は見られなかったが、ｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）は濃度依存的にＫＧ−１  ｃｅｌｌのＩＦＮ−γ産生を抑制した。図３に、その結果を示す。
（１−８）ＩＬ−１８のヒト骨髄単核球ＫＧ−１細胞への結合阻害作用
ビオチン標識ＩＬ−１８（４００ｎｇ／５０μＬ）とｓｃＦｖ（コントロールまたはｈ１８−１０８）とを反応させた後にＫＧ−１  ｃｅｌｌ（１×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）培養液に加え、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を反応させフローサイトメトリー解析（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を行った。
図４および５に示すように、ｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）がＩＬ−１８のＫＧ−１  ｃｅｌｌへの結合を阻害するかをフローサイトメトリー解析で調べた結果、コントロールｓｃＦｖはＩＬ−１８の結合に変化は見られなかったが（図４）、ｈ１８−１０８はＩＬ−１８のＫＧ−１  ｃｅｌｌへの結合を濃度依存的に阻害した（図５）。
（１−９）ｓｃＦｖ（ｈ１８−１０８）の特性
ヒトＩＬ−１８に対する特異性を示したｓｃＦｖｈ１８−１０８について、ウェスタンブロッティングを行った結果、図６に示すように、分子量は約３０ｋＤａであった。また、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果、図７に示すように、分離パターンから、９割がモノマーのｓｃＦｖを形成し、残りの１割がダイマーを形成していることが確認された。
【実施例２】  実施例２では、ＩＬ−１８によって刺激したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞から産生するサイトカインについて検討した。
（２−１）試薬
組み換えヒトＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ−１２，およびＩＦＮ−γは、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。組み換えＩＬ−１８は、ＭＢＬ社（名古屋日本）から入手した。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）−抗ヒトＣＤ４ｍＡｂ（モノクローナル抗体）またはＣｙＣｈｒｏｍｅ（シトクロム）−抗ヒトＣＤ４ｍＡｂ，ＦＩＴＣ−抗ヒトＣＤ４５ＲＡｍＡｂ，ＦＩＴＣ−抗ヒトＩＦＮ−γｍＡｂ，ＰＥ−抗ヒトＩＬ−１３ｍＡｂ，および抗ヒトＩＬ−１２ｍＡｂは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ＰＥ−抗ヒトＩＬ−１８ＲαｍＡｂ（クローン７０６２５），抗ヒトＣＤ３εｍＡｂ、および抗ヒトＩＬ−４ｍＡｂは、Ｒ＆Ｄから入手した。
（２−２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｈ１細胞またはＴｈ２細胞の作製
健常なドナー末梢血から、ナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（ＣＤ４およびＣＤ４５陽性Ｔ細胞）を単離した（Ｋ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１５１．）。ＰＨＡ（１μｇ／ｍＬ），ＩＬ−１２（５０μｇ／ｍＬ），および中和抗ＩＬ−４ｍＡｂ（５００ｎｇ／ｍＬ）、または、ＰＨＡ（１μｇ／ｍＬ），ＩＬ−４（２００μｇ／ｍＬ），および中和抗ＩＬ−１２ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）とともに、２４ウェルプレートで、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞（１×１０６／ｍＬ）を培養することにより、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞を作製した。このようにして刺激したＴ細胞を、３日目に洗浄し、培地にＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬを加え、さらに４日間培養した。
（２−３）ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞の単離
ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を単離するため、分極化したＴｈ１細胞を、固定化抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）とともに、２４ウェルプレート中で培養した。次に、その培養物に、生存するＴｈ１細胞がＩＦＮ−γの発現を豊富にする処理を行った。３時間後、付着細胞のみを、回収し、抗ＣＤ４５／抗ＩＦＮ−γ二重特異性抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共に、５分間氷上でインキュベートした。処理した細胞を５０ｍＬの底部が円錐状の試験管に移し、その試験管を３７℃の水浴に配し、２０ｍｌの温めた培養液中で５×１０４細胞／ｍｌの濃度で細胞を培養した。３０分後、冷却した０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液溶液（ＰＢＳ）で、細胞を洗浄した。細胞表面で捕捉されたＩＦＮ−γを、ＰＥ−抗ヒトＩＦＮ−γを用いて検出した。また、自動ＭＡＣＳを用いる抗ＰＥマイクロビーズにより、表面にＩＦＮ−γを発現したＴｈ１細胞を、確実に単離した。
（２−４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
新たに分極化したＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞、および、新たに分極化したＴｈ１細胞から選別したＩＦＮ−γ＋細胞を、種々の濃度のＩＬ−１８存在下、固定化抗ＣＤ３（５μｇ／ｍＬ）を含んだ１×１０５／０．２ｍＬ／ウェルで再培養した。培養開始から６時間から７２時間経過後、上澄を回収し、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−８，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，およびＧＭ−ＣＳＦの含有量を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｇ）により測定した。
（２−５）フローサイトメトリー
分極化したＴｈ１細胞（１×１０６／ｍＬ）を、２４ウェルプレートで、固定化ＣＤ３のみ、および、固定化ＣＤ３とＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍＬ）とにより、７２時間再刺激した。最後の３時間は、サイトカインの分泌を阻害するため、２μＭのモネンシンを添加した。細胞質内のＩＦＮ−γ＋、および／またはＩＬ−１３＋細胞の染色による分析は、文献（Ｋ．Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＥＸＰ．Ｍｅｄ．，２００４，１９９，５３５−５４５．）に従って行った。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞上のＩＬ−１８Ｒαの発現量を測定するため、ヒトＩｇＧによるＦｃＲのブロッキング後、各細胞を、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４、およびＰＥ抗ヒトＩＬ−１８Ｒα鎖ｍＡｂまたはコントロールＰＥ−マウスＩｇＧ１ｍＡｂにより、３０分間、４℃で、１％ＦＣＳを含むＰＢＳ中でインキュベーションした。このようにして得られたサンプルを、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって分析した。
（２−６）実験結果
（２−２）〜（２−５）に従い、健常なドナー末梢血から単離したナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞を誘導する条件下、連続して７日間刺激した。
その結果を、図８に示す。なお、図８では、固定化抗ＣＤ３のみにより刺激した結果（α−ＣＤ３）と、固定化抗ＣＤ３とＩＬ−１８とにより刺激した結果（α−ＣＤ３＋ＩＬ−１８）を示している。
図８に示すように、固定化抗ＣＤ３を用いた試験では、Ｔｈ２細胞は、かなりの量のＩＬ−４，ＩＬ−５，およびＩＬ−１３を産生したが、ＩＦＮ−γを産生しなかった。また、Ｔｈ１細胞は、主に、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＧＭ−ＣＳＦを産生した。
また、図８に示すように、固定化抗ＣＤ３に加えてＩＬ−１８により刺激しても、Ｔｈ２細胞からのＴｈ２サイトカインの産生は、増加しなかった。これに対し、その処理によって、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＩＬ−１３，およびＧＭ−ＣＳＦの産生は、著しく増加した。
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞とのＩＬ−１８に対する応答の違いの根本となるメカニズムは、主に、Ｔｈ１細胞上へのＩＬ−１８Ｒα鎖の発現の選択性によって説明できる。図９は、上記の刺激による、各細胞の表面のＩＬ−１８Ｒα鎖の発現レベルを示す図である。図９に示すように、ヒトＴｈ１細胞は、高レベルのＩＬ−１８Ｒα鎖を発現するのに対し、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−１８Ｒα鎖の発現量は、わずかである。したがって、ＩＬ−１８Ｒを発現するＴｈ１細胞は、抗ＣＤ３とＩＬ−１８とに応答して、Ｔｈ１サイトカイン，Ｔｈ２サイトカイン，およびＧＭ−ＣＳＦを産生する性質を示す。
同時に、固定化抗ＣＤ３により刺激を受けたＴｈ１細胞の、ＩＬ−１８投与量による応答性（ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＩＬ−１３の産生）について検討した。そこで、Ｔｈ１細胞を、種々の濃度のＩＬ−１８（〜５００ｎｇ／ｍＬ）により、固定化抗ＣＤ３存在下、３日間、刺激した。図１０は、ＩＬ−１８の用量と、Ｔｈ１細胞からのサイトカインの産生量との関係を示すグラフである。図１０に示すように、Ｔｈ１細胞は、ＩＬ−１８存在下、用量依存的に、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＩＬ−１３の産生が増加した。なお、抗ＣＤ３刺激を受けたＴｈ２細胞を、ＩＬ−１８によりさらに刺激しても、サイトカイン産生の応答は、増加しなかった。したがって、図１０に示すように、ヒトＴｈ１細胞のみが、抗原とＩＬ−１８との刺激に応答し、Ｔｈ１サイトカイン、Ｔｈ２サイトカインばかりでなく、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−８を産生するという、特有の作用を示した。
このように、ＩＬ−１８は、分極化したヒトＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ産生を誘導した。
次に、抗ＣＤ３とＩＬ−１８による刺激後のサイトカインの産生の速度論を検討した。図１１は、Ｔｈ１細胞の刺激後の培養時間と、Ｔｈ１細胞からのサイトカインの産生量との関係を示すグラフである。図１１に示すように、Ｔｈ１細胞は、刺激後、比較的早期に、ＩＦＮ−γを産生し始めた。抗ＣＤ３による刺激の２４時間後でさえ、大量のＩＦＮ−γが検出された。これに対し、その時点では、ＩＬ−８もＩＬ−１３も検出されなかったが、刺激から７２時間後、ＩＬ−８およびＩＬ−１３が検出された。通常は４８時間の測定を行うため、当初、Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γのみを産生するとみなしていた。しかし、図１１に示すように、７２時間後に、ＩＬ−８およびＩＬ−１３を検出することができた。抗ＣＤ３に刺激されたＴｈ１細胞を、さらにＩＬ−１８によって刺激することにより、上記のサイトカインを、より早く、より多く産生することが、最も重要である。このように、ＩＬ−１８刺激は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，ＩＬ−１３の産生を促進し、増加させた。
前述のように、ＩＬ−１８刺激は、用量依存的に、抗ＣＤ３の刺激を受けたＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γ，ＩＬ−１３の産生を誘導する（図１０）。しかし、Ｔｈ０細胞が、抗原とＩＬ−１８とに対する応答に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３を産生する可能性を排除する必要がある。そこで、この可能性を排除するために、ＩＬ−１８刺激を受けたＴｈ１細胞における、細胞質ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−１３に陽性のＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析によって検討した。その結果を、図１２に示す。
図１２に示すように、固定化抗ＣＤ３とＩＬ−１８とにより刺激されたヒトＴｈ１細胞の５．６５％が、細胞質ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１３に陽性であった。ところが、抗ＣＤ３のみによって処理したＴｈ１細胞のわずか１．２１％が、細胞質ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１３に陽性であった。細胞内ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１３染色の特異性は、アイソタイプが適合するコントロール抗体では染色されないことから示されている。さらに、このような染色は、過剰の組み換えヒトＩＦＮ−γ、または、ＩＬ−１３による前処理によって完全に阻害される（データは示さず）。このように、Ｔｈ１細胞が、抗ＣＤ３とＩＬ−１８とにより刺激された時に、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３を産生した。
次に、ＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞からのＩＬ−１３産生の誘導について検討した。ＩＦＮ−γを産生するＴｈ１細胞も、抗ＣＤ３とＩＬ−１８とによる刺激を受けると、ＩＬ−１３を産生する可能性を検討することは重要である。そこで、ＩＦＮ−γを発現するヒトＴｈ１細胞から分泌されたＩＦＮ−γを、そのＴｈ１細胞の表面に固定化した抗ＩＦＮ−γ抗体によって得ることにより精製した。
図１３は、抗ＣＤ３抗体刺激を受けたＴｈ１細胞中の、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞の割合と、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞の陽性選別例とを示す図である。図１３に示すように、抗ＣＤ３抗体で刺激を受けたＴｈ１細胞の２３．１％が、細胞表面でＩＦＮ−γを発現した。次に、ＩＦＮ−γを細胞表面に発現するＴｈ１細胞（ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞）を、自動ＭＡＣＳを用いて、陽性選別した。９９％の純度でＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞を、精製できた。得られたＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞を、抗ＣＤ３とＩＬ−１８と共に培養し、刺激した。図１４は、この刺激による、ＩＦＮ−γ＋Ｔｈ１細胞からのサイトカインの産生量を示すグラフである。図１４に示すように、その刺激によって、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，およびＩＬ−１３の産生は、かなり増加するが、ＩＬ−４の産生は増加しなかった。従って、高度に精製されたＩＦＮ−γを発現する生きたヒトＴｈ１細胞は、その細胞表面にＩＬ−１８Ｒα鎖を強く発現しており、抗ＣＤ３とＩＬ−１８とによる刺激を受けると、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，およびＩＬ−１３を産生すると結論づけることができる。この結果は、ヒトＴｈ１細胞が、そのＴＣＲ（Ｔ細胞抗原レセプター）に抗原が結合し、さらに、ＩＬ−１８が作用すると、刺激を受けたＴｈ１細胞が、ＩＦＮ−γ，ＩＬ−８，およびＩＬ−１３の産生を増強することを示している。なお、図８，１０，１１，１３および１４では、独立した４回の実験の代表値であり、各実験では、同様の結果が得られた。
以上のように、Ｔｈ１細胞が、抗原とＩＬ−１８とによって刺激されると、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γなど），Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−９，ＩＬ−１３），ケモカイン（ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α，およびＧＭ−ＣＳＦを産生する。気管支上皮に対するＩＦＮ−γとＩＬ−１３との刺激が、最も重篤な気管支喘息を誘導する。従って、実施例１のｓｃＦｖを投与して、ＩＬ−１８の活性を阻害することにより、重篤な気管支喘息の治療が可能となる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明のヒトＩＬ−１８に対する抗体およびその断片は、ヒト由来のものである。それゆえ、ヒトＩＬ−１８が直接または間接的に関与する疾病の治療において、反復投与や長期投与を行っても、顕著な治療効果と高い安全性とを維持した治療薬を提供できるという効果を奏する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月28日(2004.12.28)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】ヒト免疫グロブリンＶＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５および６に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、
ヒト免疫グロブリンＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１０、１１および１２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするヒト抗体。
【請求項２】配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とするヒト抗体。
【請求項３】配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが連結されていることを特徴とするヒト抗体。
【請求項４】請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の抗体であって、
配列番号３〜７および９〜１１のいずれかに示されるアミノ酸配列において、
１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加され、かつ、ヒトインターロイキン−１８に結合することを特徴とするヒト抗体。
【請求項５】ヒトインターロイキン−１８に対する、ヒト抗ヒトインターロイキン−１８抗体であって、
ヒトインターロイキン１８に対する結合活性と、ヒトインターロイキン１８の生理活性を阻害する阻害活性とを有することを特徴とするヒト抗体。
【請求項６】請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体に、修飾剤が結合されてなる修飾抗体。
【請求項７】請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体をコードする遺伝子。
【請求項８】配列番号１または７に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有する請求の範囲７に記載の遺伝子。
【請求項９】請求の範囲７または８に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター
【請求項１０】請求の範囲７または８に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１１】請求の範囲７または８に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒトインターロイキン１８に対するヒト抗体を生産する方法。
【請求項１２】請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載の抗体、または請求の範囲６に記載の修飾抗体を用いたヒトインターロイキン−１８の検出器具。
【請求項１３】請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体、または請求の範囲６に記載の修飾抗体を含むヒトインターロイキン−１８検出試薬を用いて、被検試料中のヒトインターロイキン−１８量を測定する免疫疾患の診断キット。
【請求項１４】請求の範囲１３に記載の検出試薬を用いて測定した被検試料中のヒトインターロイキン−１８量に基づいて免疫疾患を診断する方法。
【請求項１５】ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストを有効成分とするヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
【請求項１６】上記ヒトインターロイキン−１８アンタゴニストが、以下のいずれかの物質である請求の範囲１５に記載のヒトインターロイキン１８活性阻害剤。
ｉ）請求の範囲１〜５のいずれか１項に記載のヒト抗体
ｉｉ）請求の範囲６に記載の修飾抗体
ｉｉｉ）上記ｉ）またはｉｉ）のいずれかに記載の抗体または修飾抗体が認識するヒトインターロイキン−１８上の抗原決定領域に基づいて分子設計された低分子化合物。
【請求項１７】請求の範囲７または８に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
【請求項１８】請求の範囲１５または１６に記載のヒトインターロイキン−１８活性阻害剤、または請求の範囲１７に記載の遺伝子治療剤を含む免疫疾患治療剤。
【請求項１９】請求の範囲１８に記載の免疫疾患治療薬を投与することによる免疫疾患の治療方法。
【請求項２０】抗原とヒトインターロイキン−１８とによる刺激によってヘルパーＴ１細胞から産生するサイトカインを阻害することを特徴とする請求の範囲１８に記載の免疫疾患治療剤。
【請求項２１】ヒトＩＬ−１８が関与するアレルギー、炎症、慢性免疫異常疾患に適用するものであることを特徴とする請求の範囲１８または２０に記載の免疫疾患治療剤。




【国際調査報告】
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