(57)【要約】プライマー伸長反応および核酸増幅反応が二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で実施されることを特徴とする、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法、ならびに該方法に使用されるキットおよび緩衝液。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法であって、
（１）レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを使用し、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応を行う工程、
（２）工程（１）で得られたプライマー伸長物を回収し、当該伸長物に相補的なＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを得る工程、
（３）工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する工程、および
（４）工程（３）で得られたオリゴヌクレオチド付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーと前記二本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーとを使用する核酸増幅反応を実施する工程、
の各工程を包含し、かつ、工程（１）のプライマー伸長反応ならびに工程（４）の核酸増幅反応が二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程（１）のプライマー伸長反応がポリメラーゼ連鎖反応により実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（４）の核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応により実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応に３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物が使用されることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程（１）または（４）が９５℃、６０秒；５８℃、４５秒；７２℃、９０秒の温度サイクルでのポリメラーゼ連鎖反応により実施されることを特徴とする請求項２または３記載の方法。
【請求項６】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウム塩から選択される物質である請求項１記載の方法。
【請求項７】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がトリメチルグリシンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（４）が二段階のポリメラーゼ連鎖反応により実施されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
工程（３）において、工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡを制限酵素消化し、生じた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
工程（１）の染色体ＤＮＡがあらかじめ制限酵素消化されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）において標識されたプライマーを使用し、工程（２）において前記標識を利用してプライマー伸長物を回収することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ビオチン標識されたプライマーを使用する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（４）で得られた増幅産物について、その塩基配列を決定する工程をさらに包含することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程（４）で得られた断片をベクターに組み込んだ組換えＤＮＡを鋳型として塩基配列の決定が実施される請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ塩基配列を決定するためのキットであって、
（ａ）レトロウイルスのＬＴＲ部分にアニーリングできるプライマー、
（ｂ）リンカーカセット、
（ｃ）（ｂ）のリンカーカセットにアニーリングできるプライマー、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｅ）制限酵素、および
（ｆ）二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含むプライマー伸長反応用緩衝液、
を含有することを特徴とするキット。
【請求項１６】
ＤＮＡポリメラーゼが３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物である請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウム塩から選択される物質である請求項１５記載のキット。
【請求項１８】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がトリメチルグリシンである請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
（ａ）のプライマーがプライマー伸長産物の回収のための標識を有していることを特徴とする請求項１５記載のキット。
【請求項２０】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法において使用される、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含むプライマー伸長反応用緩衝液。
【請求項２１】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウム塩から選択される物質である請求項２０記載の緩衝液。
【請求項２２】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がトリメチルグリシンである請求項２１記載の緩衝液。
【請求項２３】
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法において使用されるプライマー伸長反応用緩衝液の製造における、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の使用。
【請求項２４】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウム塩から選択される物質である請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物がトリメチルグリシンである請求項２４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は遺伝子導入された細胞における、染色体上の遺伝子組み込み部位の解析方法に関する。
【背景技術】  遺伝子治療は、細胞のもつ「遺伝情報の誤り」に起因する遺伝病やがんなどの難病について、正しい遺伝子情報の付加によってその細胞の機能を修正したり、細胞が本来持っていなかった新しい「保護遺伝子」を付加したりして病気の治療または予防をしようとする治療法である。
遺伝子治療に使用される細胞への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する方法、リポソームのような遺伝子導入剤を使用する方法等が知られている。
ウイルスベクターは遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適している。一方、レトロウイルスベクターは宿主染色体に目的の遺伝子を安定に組み込む機能を有しているために、長期にわたり安定して遺伝子発現させることが可能であり、遺伝病の遺伝子治療への利用、トランスジェニック動物作製の分野に期待されているベクターである。しかし、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、目的遺伝子が宿主染色体上にランダムに組み込まれることから、組み込まれる部位によっては細胞ががん化するなどの可能性が指摘されている。そのためこのレトロウイルスベクターにより宿主染色体上のどの部位に遺伝子が組み込まれているのかその導入部位を解析すること、また被験細胞集団におけるクローン種（モノクローン、オリゴクローン、ポリクローン）の判定を感度良くモニタリングすることが重要となってくる。
一般的にウイルス、トランスポゾンやトランスジーンなどの染色体ＤＮＡ中への挿入、組み込み部位の解析方法としては、インバースＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ）法（ジャーナル  オブ  ヴィロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、第１９２４〜１９２８頁（１９８９）参照）やＬＭ  ＰＣＲ法（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４６巻、第７８０〜７８６頁（１９８９）参照）があるが、検出感度が悪い（実施するためにより多くの鋳型ＤＮＡを必要とする）、特異性が低いなどの問題点が指摘されていた。
そこでこれらの問題点を克服する方法として、Ｌｉｎｅａｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ（ＬＡＭ  ＰＣＲ法）が開発された（国際公開第００／２４９２９号パンフレット、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１００巻、第２７３７〜２７４３頁（２００２）参照）。この方法では、まずレトロウイルス特有の配列であるＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）配列に相補的で、かつ末端がビオチンラベルされたプライマーを使用し、染色体ＤＮＡを鋳型としたｌｉｎｅａｒ  ＰＣＲを行なう。このｌｉｎｅａｒ  ＰＣＲでは１種類のプライマーのみを使用し、このプライマーのアニールした位置よりも下流の一本鎖ＤＮＡが増幅される。このｌｉｎｅａｒ  ＰＣＲ産物をストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズに吸着させ、効率よくＬＴＲ配列と染色体由来の配列を有する一本鎖の増幅ＤＮＡ断片を回収する。この一本鎖ＤＮＡについて相補鎖を合成して二本鎖とした後、４塩基を認識・切断する制限酵素で切断し、その末端にリンカーカセットと呼ばれる二本鎖ＤＮＡを連結する。こうして得られた連結産物を鋳型として、ＬＴＲとリンカーカセットにそれぞれ相補的なプライマーでＰＣＲを行うことにより、ＬＴＲとそれに隣接する宿主染色体由来のＤＮＡを含むＤＮＡ断片が増幅されることから、レトロウイルスの組み込み部位の解析を行なうことができる。またこのＰＣＲ増幅断片をアガロースゲルなどで回収し、適当なベクターにサブクローニング後、その断片の塩基配列を解読することにより、宿主染色体ＤＮＡのどの部位に組み込まれたか解析することが可能である。
この方法では、従来の方法に比べて検出感度が改善されたばかりでなく、磁性ビーズを用いることで反応ステップごとのサンプルの精製が簡略化され、また鋳型となる染色体ＤＮＡも少量ですむという利点もある。
しかしながら現在の反応条件では、生体サンプル由来の数多くの異なる組み込み部位を持つ集団（ポリクローン）から得られた染色体ＤＮＡを解析する場合において、鋳型とするＤＮＡの種類や量によっては特定のクローンに偏った増幅断片が得られてしまう現象が見受けられる。この場合には、増幅結果が使用された試料中の実際の細胞集団におけるクローンの存在状態を反映していない。さらに、試料中での存在割合が低いクローンについてはその存在が検出されない可能性がある。このように従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法ではその感度、再現性、正確性の面で問題を有している。すなわち、実際に遺伝子の導入された細胞集団の状況を反映する情報を得て正確な判断を行うことが困難である。
上記のようにＬＡＭ  ＰＣＲ法は現段階でレトロウイルスベクターによる遺伝子の組み込みの解析に有効なシステムとして考えられているものの、多種多様の部位にレトロウイルスが組み込まれている生体サンプルを用いて、遺伝子を組み込まれた細胞がどの程度集団の中に存在するのか（ポリクローン、オリゴクローン、モノクローンのどの状態で存在するのか）、さらにはどの程度の割合で特定の細胞が集団中に存在しているのか正確に、感度良く、高い再現性をもってモニタリングする面では改善される必要がある。
【発明の開示】
本発明の目的は、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法を用いた組み込み部位の解析法を改良し、例えばレトロウイルスを組み込んだ様々な遺伝子導入部位をもつ細胞集団において、より多くの組み込み断片を特定のクローン由来の増幅断片に偏ることなくＰＣＲ反応によって増幅させ、またその集団に含まれる特定の増幅断片を感度よく検出する系を構築することにある。これにより、被験細胞集団におけるクローン種（モノクローン、オリゴクローン、ポリクローン）の判定、細胞集団中の特定の細胞の存在割合を高感度に、感度良く、高い再現性をもってモニタリングすることが可能である。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、プライマー伸長反応を二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物の存在下で実施し、ＰＣＲ条件を含む反応スキームを改良することにより、感度良く、偏りのない増幅断片による検出が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
本発明の第１の発明は、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法であって、
（１）レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーを使用し、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡを鋳型としたプライマー伸長反応を行う工程、
（２）工程（１）で得られたプライマー伸長物を回収し、当該伸長物に相補的なＤＮＡを合成して二本鎖ＤＮＡを得る工程、
（３）工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する工程、および
（４）工程（３）で得られたオリゴヌクレオチド付加二本鎖ＤＮＡを鋳型とし、レトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーと前記二本鎖オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な配列を有するプライマーとを使用する核酸増幅反応を実施する工程、
の各工程を包含し、かつ、工程（１）のプライマー伸長反応ならびに工程（４）の核酸増幅反応が二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の存在下で実施されることを特徴とする。
第１の発明の方法において、工程（１）のプライマー伸長反応および／または（４）の核酸増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応により実施されることができる。また、このポリメラーゼ連鎖反応には３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物を使用することができる。上記のポリメラーゼ連鎖反応の条件としては、９５℃、６０秒；５８℃、４５秒；７２℃、９０秒の温度サイクルが例示される。
第１の発明の方法に使用される二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物としてはベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウム塩から選択される物質が例示される、例えば、ベタインとしてはトリメチルグリシンを使用することができる。
第１の発明の工程（４）は、二段階のポリメラーゼ連鎖反応により実施されてもよい。
また、第１の発明の工程（３）においては、工程（２）で得られた二本鎖ＤＮＡを制限酵素消化し、生じた二本鎖ＤＮＡの末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加することができる。また、工程（１）の染色体ＤＮＡをあらかじめ制限酵素消化したうえで使用することもできる。
第１の発明の工程（１）において標識されたプライマーを使用することにより、工程（２）において前記標識を利用してプライマー伸長物を回収することができる。前記標識としてはビオチンによる標識が例示される。
第１の発明の方法は、工程（４）で得られた増幅産物の塩基配列を決定する工程をさらに包含することができる。当該方法においては、工程（４）で得られた断片をベクターに組み込んだ組換えＤＮＡを鋳型として塩基配列の決定を実施することができる。
本発明の第２の方法は、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ塩基配列を決定するためのキットであって、
（ａ）レトロウイルスのＬＴＲ部分にアニーリングできるプライマー、
（ｂ）リンカーカセット、
（ｃ）（ｂ）のリンカーカセットにアニーリングできるプライマー、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｅ）制限酵素、および
（ｆ）二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含むプライマー伸長反応用緩衝液、
を含有することを特徴とする。
第２の発明のキットに含有されるＤＮＡポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物であってもよい。また、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物としてはベタイン、ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、テトラメチルアンモニウム塩が例示される。また、ベタインとしてはトリメチルグリシンを使用することができる。
第２の発明のキットに含有されるプライマーは、プライマー伸長産物の回収のための標識を有しているものであってもよい。
本発明の第３の発明は、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法において使用される、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物を含むプライマー伸長反応用緩衝液に関する。
本発明の第４の発明は、レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡにおける、前記ベクターに隣接する染色体由来のＤＮＡ領域を解析する方法において使用されるプライマー伸長反応用緩衝液の製造における、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる化合物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】  １．本発明の遺伝子組み込み部位の解析方法
（１）ＬＴＲに隣接する染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ（プライマー伸長物）の合成
本発明において、染色体ＤＮＡを鋳型とするプライマー伸長反応に使用されるプライマーはレトロウイルスベクターのＬＴＲの塩基配列に相補的な配列を有するものである。前記プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長反応が起こる条件においてＬＴＲ部分にアニーリングできるものであれば特に限定はなく、ＬＴＲの塩基配列に基づいて任意に設計、作製することができる。ＬＴＲ部分とのアニーリングが可能な範囲であれば、プライマーはＬＴＲの配列と相補的でない塩基を含有していてもかまわない。その鎖長にも特に限定はないが、たとえば１２〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基の鎖長のものが使用される。
本発明の方法を適用することができるレトロウイルスベクターには特に限定はない。ＬＴＲの配列が公知のレトロウイルスベクターであればその配列に基づいてプライマーを作成し、本発明の方法を実施することができる。本発明に使用されるプライマーの一例としては、配列表の配列番号２に示される塩基配列のプライマーが挙げられる。
前記のプライマーとしては、プライマー伸長産物の回収を容易にするための標識を有するものが好適である。たとえばビオチンのような特異的なレセプターが知られているリガンド、ハプテン等で標識されたプライマーを使用することができる。
本発明に試料として使用される染色体ＤＮＡには特に限定はないが、通常はレトロウイルスベクターにより遺伝子導入された、もしくはその可能性のある細胞より調製された染色体ＤＮＡである。当該染色体ＤＮＡの調製材料となる細胞はモノクローン、オリゴクローン、ポリクローン由来のいずれのものでもよい。前記の細胞にも特に限定はなく、生体から採取された細胞、生体外で培養された細胞のいずれであってもよい。生体から採取された細胞としては、例えば造血幹細胞のような造血系の細胞が遺伝子導入の対照であった場合には、これらの細胞、もしくはこれらの細胞より分化した細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ等）やそれらの混合物を本発明の方法に使用する染色体ＤＮＡの調製材料とすることができる。
レトロウイルスベクターが組み込まれた染色体ＤＮＡに上記のプライマーをアニーリングさせ、このプライマーからのＤＮＡ伸長反応を行ってＬＴＲならびにそれに隣接する染色体ＤＮＡを含むＤＮＡ鎖を合成する。この工程にはＤＮＡポリメラーゼが使用される。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、鋳型ＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を合成できるものであればよい。たとえば、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ等）、古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等）ならびにこれらの改変体を本発明に使用することができる。
さらに２以上の酵素を混合して使用してもよい。例えば、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ等）と当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、前記の３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失変異体等）とを混合して使用する方法が本発明に特に好適である。このような方法は、例えば米国特許第５４３６１４９号に開示されている。さらに、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物として、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（いずれもタカラバイオ社製）等が市販されている。
多くのプライマー伸長物を得る観点からは、プライマー伸長反応を複数回繰り返すことが望まれる。この場合にはプライマー伸長物の合成をＰＣＲによって実施し、伸長物の鋳型ＤＮＡからの解離、新たなプライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、プライマー伸長反応、の３工程を反復すればよい。
従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法においてこのプライマー伸長物を得る工程はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施されていたが、鋳型となる染色体ＤＮＡの種類や量によっては、ＰＣＲによって得られるプライマー伸長産物はある特定の分子が富化されたものであることが多く、バラエティに富んだプライマー伸長物が得られないことがあった。
本発明者らは二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物、たとえばベタイン（トリメチルグリシン等）、有機溶媒（ホルムアミド、ジメチルスルフォキシド）、テトラメチルアンモニウム塩［テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）、テトラメチルアンモニウムアセテート（ＴＭＡＡ）、テトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド（ＴＭＡＨ）］等を含有する反応液を使用し、またＰＣＲ反応条件を変えて、プライマー伸長反応を行った場合には、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法に比べて多くの分子種から構成されるプライマー伸長物が得られることを明らかにした。また、ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼとしては３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したものが好適である。
ＰＣＲ反応は、公知の文献等の記載に基づいてその条件を設定し、実施すればよい。ＤＮＡポリメラーゼとしては上記のポリメラーゼのうちで高い耐熱性を有するもの、たとえばサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等や、これらを混合したものを使用することができる。反応液組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼに適したものを選択し、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す上記の化合物を添加すればよい。また、これらの化合物は２以上のものを組み合わせて添加してもよい。その濃度は所望の効果を得られる範囲であれば特に限定はない。たとえばベタインの場合には終濃度０．１〜３Ｍ、好ましくは０．１〜１Ｍの範囲で、ジメチルスルフォキシドの場合には終濃度０．５〜１５％、好ましくは１〜１０％の範囲で、また、テトラメチルアンモニウム塩の場合には終濃度０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの範囲で、それぞれ本発明に使用することができる。
また、ＰＣＲ反応における反応サイクルにも特に限定はないが、たとえば９５℃、６０秒；５８℃、４５秒；７２℃、９０秒のサイクルが例示される。さらに、前記条件の温度を±２℃の範囲で変化させた条件および／または時間を±３０％の範囲で変化させた条件であってもよい。サイクル数は増幅効率等を考慮して決定すればよいが、例えば２０〜１５０サイクル、好ましくは４０〜１００サイクルで実施される。
上記のプライマー伸長反応において使用されるプライマーの量としては、１００ｎｇの染色体ＤＮＡあるいは反応液５０μｌあたり０．０２５〜１．０ｐｍｏｌが適当である。
（２）プライマー伸長物の二本鎖への変換
以上に説明した工程において合成されたプライマー伸長物は、たとえばプライマーに付加された標識を利用して反応液から回収される。
プライマーにリガンド標識が付されている場合には当該リガンドに結合するレセプター、また、ハプテン標識の場合には当該ハプテンを認識する抗体を使用することができる。このような標識物質に結合する物質を固定化した固層を利用すればプライマー伸長物を容易に反応液から回収することができる。たとえば、ビオチン標識を付加したプライマーを用いて得られたプライマー伸長物は、伸長反応液にアビジンを固定化したビーズを添加してビーズ上に伸長物を捕獲し、次いでこのビーズを洗浄した後に伸長物をビーズから脱着させることにより鋳型とされた染色体ＤＮＡから分離されたプライマー伸長物を得ることができる。
さらに、前記のプライマー伸長物の回収に先立って未反応のプライマーを除去する操作を行ってもよい。このような操作は、例えば適当なポアサイズのフィルターを用いたろ過や長鎖の核酸のみが選択的に沈殿するような条件での分別沈殿法により実施することができる。
次に、回収されたプライマー伸長物（一本鎖ＤＮＡ）を二本鎖ＤＮＡに変換する。その手段には限定はなく、例えば、プライマー伸長物にランダムプライマーをアニーリングさせた後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてランダムプライマーから前記プライマー伸長物に相補的なＤＮＡを合成し、二本鎖核酸を得ることができる。
（３）リンカーカセットの付加
上記（２）の工程で二本鎖に変換されたプライマー伸長物を制限酵素消化し、生じた末端に二本鎖オリゴヌクレオチドを付加する。
本発明に使用される制限酵素には特に限定はないが、プライマー伸長物に含有されるＬＴＲ部分の塩基配列中に認識切断部位が存在するものは適当ではない。次の二本鎖オリゴヌクレオチドの付加を効率よく行う観点からは、付着末端を生じる制限酵素が本発明にはより好ましい。また、適切な鎖長のＤＮＡ断片を得るためには４塩基認識の制限酵素が好適であり、例えば、Ｔｓｐ５０９Ｉ（Ｓｓｅ９Ｉ）、ＭｂｏＩ（Ｓａｕ３ＡＩ）等を使用することができる。制限酵素消化は使用する制限酵素に応じた条件で実施すればよい。
制限酵素消化された二本鎖のプライマー伸長物の末端には二本鎖のオリゴヌクレオチド（リンカーカセット）が付加される。リンカーカセットは上記の制限酵素消化で生じる末端に対応する末端、好ましくは付着末端と、以降の核酸増幅工程において使用されるプライマーがアニーリングしうる配列とを有している。以上の条件を満たすものであればその配列、鎖長には特に限定はないが、通常、２０〜１００塩基対、好ましくは３０〜６０塩基対のリンカーカセットが本発明に使用される。プライマーがアニーリングしうる配列にも特に限定はなく、プライマーの設計に不適切な配列（ＧＣ含量が偏ったもの、分子内もしくは分子間で水素結合を形成しうるもの）を除く任意の配列が使用できる。
リンカーカセットの付加は公知のＤＮＡ結合方法（ライゲーション反応）によって実施することができ、例えば市販のキット等を使用してもよい。
（４）二本鎖ＤＮＡの増幅
こうして得られた二本鎖ＤＮＡは、一方の末端にＬＴＲ由来の塩基配列を、もう一方の末端にリンカーカセットの塩基配列を有している。このＤＮＡを鋳型とし、ＬＴＲ由来の塩基配列にアニーリングできるプライマー、リンカーカセットの塩基配列にアニーリングできるプライマーとを使用する核酸増幅反応を行うことにより、前記の二本鎖ＤＮＡを増幅することができる。
本発明の方法に使用される核酸増幅方法には特に限定はなく、公知の核酸増幅法、例えばＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法などが使用できる。
ＰＣＲ法を使用する場合には公知の方法に準じ、適切な条件（反応液組成、サイクル条件）を設定して実施すればよい。好ましくは上記（１）に記載された方法に準じて、二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含有する反応液、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとの混合物が使用される。また、サイクル条件も上記（１）記載のものを使用できるが、サイクル数については上記条件よりも少なくすることができる。また、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ法として知られている、２段階のＰＣＲ法を使用してもよい。
以上の（１）〜（４）に示した一連の工程によって、レトロウイルスベクターのＬＴＲ部分の塩基配列と、染色体上の当該ベクターが組み込まれた位置に隣接する（すなわち前記ＬＴＲに隣接する）領域の塩基配列とを含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
また、別法として、工程（１）において鋳型として使用される染色体ＤＮＡをあらかじめ適切な制限酵素、例えば上記（３）の項に記載された制限酵素であらかじめ消化しておき、これを使用してプライマー伸長反応を行うことができる。この場合には、得られた伸長産物を二本鎖ＤＮＡに変換した後、これを制限酵素消化することなくリンカーカセットの付加が実施される。この場合、リンカーカセットとしては平滑末端を有するものが使用される。
本発明の方法で得られた増幅ＤＮＡ断片は、例えばアガロースゲル電気泳動によって分析することにより、試料とされた細胞集団中にどの程度の種類の組み込み部位が存在するかを調べることができる。
さらに、上記の増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法によって決定することができる。
増幅されたＤＮＡ断片は反応液より回収した後、適当なベクター（プラスミドベクター、ファージベクター等）に連結される。この組換えＤＮＡ分子で適当な宿主を形質転換して得られる形質転換体より組換えＤＮＡ分子を調製し、これを鋳型としてシークエンシング反応を行い、上記のＤＮＡ断片の塩基配列を解読することができる。ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡ断片のクローニングには３’末端にＴ塩基が突出したベクター（Ｔ−ベクター）が好適であるが、これに限定されるものではない。
また、増幅されたＤＮＡ断片の分子種が限られており、アガロースゲル電気泳動等によって単離可能である場合には、単離された増幅ＤＮＡ断片を鋳型としたダイレクトシークエンシングを行ってもよい。
こうして得られた塩基配列情報は、出発材料となった染色体ＤＮＡにおいてレトロウイルスベクター由来の配列に隣接する配列を有している。従って、この配列を公知の染色体ＤＮＡ塩基配列と比較することにより、当該染色体上のどの位置にレトロウイルスベクターが組み込まれているかを知ることができる。
ポリクローン由来の染色体ＤＮＡが試料とされた場合であっても、本発明の方法によれば、特定の配列のＤＮＡ断片が富化されていない、多種多様の配列のＤＮＡ断片からなるライブラリーを得ることができる。このライブラリー中のＤＮＡ断片の配列を解析すれば、レトロウイルスベクターの染色体組み込み部位の特定、組み込み頻度の高い配列または領域の推定、特定の遺伝子導入細胞の生体中での分布や割合のモニタリング等を実施することができる。
さらに本発明の方法は従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法に比較してその感度も優れており、遺伝子導入されたものの割合がより少ない染色体ＤＮＡを使用しても、再現性よく良好な結果を得ることができる。
２．本発明の解析方法に使用されるキット
本発明の、遺伝子組み込み部位の解析方法に使用されるキットは、上記１．に記載された各工程に使用される試薬類を含有するものであり、例えば下記のコンポーネントを含有するものが例示される。
（ａ）レトロウイルスのＬＴＲ部分にアニーリングできるプライマー、
（ｂ）リンカーカセット、
（ｃ）（ｂ）のリンカーカセットにアニーリングできるプライマー、
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｅ）制限酵素、および
（ｆ）二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含むプライマー伸長用緩衝液
なお、上記のコンポーネントのうち、（ｆ）の緩衝液は二本鎖核酸のＴｍ値を低下させる作用を示す化合物を含有している。このような化合物としては前記のものが例示される。また、その組成は（ｄ）のＤＮＡポリメラーゼの使用に適したものであることが好ましい。また、その形態として、緩衝液中にプライマーやＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ添加されているもの、緩衝液とは別にｄＮＴＰやＭｇ塩が添付されているものなども本発明のキットに包含される。
ＰＣＲによってプライマー伸長反応を実施する場合、（ｄ）のＤＮＡポリメラーゼは耐熱性を有するものが選択される。さらに、ＤＮＡポリメラーゼとして３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと当該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとを混合したＤＮＡポリメラーゼ組成物が含有されていてもよい。
また、（ａ）のプライマーは伸長物の回収に適した標識、例えばビオチン等が付加されたものであってもよい。この場合には、当該標識に対応する伸長産物の精製のためのコンポーネント、例えばアビジン固定化ビーズ等がさらに含まれているキットが好適である。
本発明のキットは、上記以外のコンポーネント、例えばプライマー伸長物の二本鎖化のための試薬、制限酵素反応用緩衝液、リンカーカセットのライゲーションのための試薬等を含有することもできる
該キットを用いることで、本発明のレトロウイルス組み込み部位解析を簡便に行なうことができる。
本発明によれば、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法によるレトロウイルス組み込み部位の解析方法の問題点であった数多くの異なる組み込み部位を持つ集団（ポリクローン）から得られた染色体ＤＮＡを解析する場合において、鋳型とするＤＮＡの種類や量によっては特定のクローンに偏った増幅断片が得られてしまう現象は克服され、つまり、本法によりレトロウイルスベクターにより遺伝子を組み込まれている細胞が、どの程度集団の中に存在するのか（ポリクローン、オリゴクローン、モノクローンのどの状態で存在するのか）、さらにはどの程度の割合で特定の細胞が集団中に存在しているのか正確に、感度良く、高い再現性をもってモニタリングすることが可能である。
即ち、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法によるレトロウイルスの組み込み部位の解析方法では、鋳型として用いるゲノムＤＮＡの種類や量によってＰＣＲによる増幅物が特定のクローン由来のものに偏ってしまう傾向がある。このため、組み込まれた部位数に見合うだけの断片数が確認されず、さらに再現性が悪いなどの問題点から正確な判定には障害がある可能性が考えられた。しかしながら本発明の方法によれば、これらの問題点は解消され、それによってより精度の高い判定が可能となった。
【実施例】  以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
【実施例１】レトロウイルスベクターを組み込んだ２９３細胞及びＣＤ３４陽性細胞の解析（ポリクローンの解析）
（１）レトロウイルス上清液の調製
２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）およびＰＧ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）は１０％ウシ胎児血清（ＪＲＨ社製）ならびに５０μｇ／ｍｌのペニシリン（ギブコ社製）及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）中で３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。なお、以降の操作に使用したＤＭＥＭはすべて５０μｇ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだものである。
アンフォトロピックレトロウイルスベクターは以下のようにして調製した。すなわち、プラスミドｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号１）について、プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入し、ｐＤＯＮ−ＧＦＰを構築した。
次に、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いてプラスミドｐＤＯＮ−ＧＦＰを２９３細胞に導入し、キットに添付の説明書に従って培養上清を回収した。培養上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過したものをａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。得られたａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液のＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対する感染力価は４×１０６感染ウイルス粒子／ｍｌであった。
ＧＡＬＶシュードタイプレトロウイルスベクターは以下のようにして調製した。すなわち、先に調製したａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストック２００μｌを使用し、２×１０４個のＰＧ１３細胞にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ法［ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１３０巻、ｐ３３１−３３４（２００１）］で遺伝子導入を２回繰り返し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８および１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で２週間選択培養し、得られた細胞をＧＡＬＶシュードタイプレトロウイルス産生細胞とした。この産生細胞を１０ｃｍシャーレで培養し、セミコンフルエントに生育したところで新しい７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地を交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。この上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過したものをｇａｌｖＧＦＰウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。得られたｇａｌｖＧＦＰウイルス上清液のＨＴ１０８０細胞に対する感染力価は６×１０５感染ウイルス粒子／ｍｌであった。
（２）２９３細胞及びＣＤ３４陽性細胞へのレトロウイルスベクターの導入
実施例１（１）で調製したｇａｌｖＧＦＰウイルス上清液２ｍｌと２９３細胞１×１０７個を混合し、φ１０ｃｍのレトロネクチンコートプレート（タカラバイオ社製）２枚に播種し、ウイルス感染を行なった。３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、細胞をトリプシンではがし、φ１０ｃｍの組織培養用プレート６枚に分注してさらに４８時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。その後、トリプシン処理して回収した細胞を遠心管に移し、ＰＢＳで二回洗浄した後に−８０℃で保存した。この導入細胞群を２９３Ｒ１と命名した。２９３Ｒ１について蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による解析を行ったところ、遺伝子導入効率は５９％であった。
ヒトＣＤ３４陽性造血幹細胞への遺伝子導入は以下のようにして行った。ａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液１ｍｌと２４時間サイトカイン刺激したＣＤ３４陽性細胞（バイオウィターカー社製）を混合し、φ６ｃｍのレトロネクチンコートプレート（タカラバイオ社製）に添加し（感染時の細胞数は全量１．１４×１０６個）、一回目のウイルス感染を行なった。３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、遠心して上清を除き、サイトカイン培地２ｍｌ［３００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ジェンザイム社製）、１００ｎｇ／ｍｌ  トロンボポエチン（ペプロテックハウス社製）、６０ｎｇ／ｍｌ  ヒトインターロイキン−３（ジェンザイム社製）、３００ｎｇ／ｍｌ  ヒトＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド（Ｒ＆Ｄシステム社製）、４％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（バイオウイターカー社製）］とａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液１ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。遠心して上清を除き、さらにサイトカイン培地２ｍｌとａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液１ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培養終了後トリプシン処理して細胞を回収し、−８０℃で保存した。この導入細胞群をＣＤ＋Ｒ１と命名した。ＣＤ＋Ｒ１についてＦＡＣＳによる解析を行ったところ、遺伝子導入効率は２０．３％であった。
（３）染色体ＤＮＡの調製
−８０℃で保存した凍結細胞（２９３Ｒ１及びＣＤ＋Ｒ１、それぞれ約２．０×１０６細胞相当）を５ｍｌの懸濁溶液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に懸濁し、１μｌのＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）、５０μｌの１０％ＳＤＳ溶液、及び２５μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（２０ｍｇ／ｍｌ、タカラバイオ社製）を加えて転倒混和した。その後、５０℃で３時間加熱し、次いで等量のフェノール溶液を加えて１５分間転倒混和した。室温で遠心した後に上清を回収し、これに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液を加えて１５分間転倒混和した。遠心して上清を回収した後、全量の１／２５量になるように５Ｍ  塩化ナトリウムを加えて混合した。さらに全量の２．５倍量になるようにエタノールを添加し、室温で放置後、生じた沈殿物を回収した。沈殿物を７０％エタノールで洗浄して１０分間風乾した後、ここにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、２４時間低温室に放置して溶解させた。以上の操作を行うことによって、２９３Ｒ１及びＣＤ＋Ｒ１より染色体ＤＮＡのサンプルが回収された。
（４）遺伝子導入部位の解析
実施例１−（３）で調製した２９３Ｒ１及びＣＤ３４＋Ｒ１のゲノムＤＮＡそれぞれ１００ｎｇに２５μｌの×２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ９．２、２８ｍＭ  硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  塩化カリウム、５．０ｍＭ  塩化マグネシウム、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）  ＤＭＳＯ、０．５Ｍ  ベタイン（トリメチルグリシン）］、５μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、５’末端にビオチンを付加したプライマーＬＴＲ  Ｉ（ＬＴＲ  ＩはレトロウイルスベクターのＬＴＲに相補的な配列を持つ、配列表の配列番号２にプライマーＬＴＲ  Ｉの塩基配列を示す）０．１ｐｍｏｌ、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ、タカラバイオ社製）及び滅菌水を加えて５０μｌとした。自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間（変性）、５８℃、４５秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃、９０秒間（合成反応）を１サイクルとする５０サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した。
上記の反応終了後、以下のようにして未反応のプライマーの除去を行なった。５０μｌのＰＣＲ反応液に３００μｌのＴＥ溶液を加え、Ｓｕｐｒｅｃ０２（タカラバイオ社製）に添加し、５，０００ｒｐｍ、約７分間遠心した。さらに３５０μｌのＴＥ溶液を添加し、同様にして遠心し、フィルターを洗浄した。次いでフィルターに液量が４０μｌとなるようにＴＥ溶液を添加して、プライマーが除去されたＤＮＡ溶液を回収した。
回収された溶液にストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ（ＭＰＧ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、タカラバイオ社製）４０μｌ（２００μｇ相当）を加え、時折混和させながら室温で１時間放置した。反応液の入ったチューブを磁石スタンド（Ｍａｇｎｅｔｉｇｈｔ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄ、タカラバイオ社製）上で１分間放置した後、上清を廃棄し、ビーズの回収を行なった。このビーズに１００μｌのＢＷ緩衝液（５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０Ｍ  塩化ナトリウム）を添加して穏やかに混和し、磁石スタンド上で静置後、同様に上清を廃棄し、さらに１００μｌの滅菌水で同様の操作を行い、ビーズの回収を行なった（この操作をビーズ洗浄操作とする）。
洗浄したビーズを．１４．１μｌの滅菌水に穏やかに懸濁し、×１０  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液（下記Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｌａｇｍｅｎｔに添付のもの）２μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）２．４μｌ、ランダムプライマー（ランダム６ｍｅｒ、１００ｐｍｏｌ／μｌ、タカラバイオ社製）１μｌ、及びＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）０．５μｌを加えて全量を２０μｌとしたものを調製し、３７℃で時折混和させながら１時間反応させ、相補鎖の合成を行なった。反応後、ビーズ洗浄操作を行い、回収したビーズを１７．５μｌの滅菌水に懸濁し、そこに２μｌの×１０  ＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ１（下記Ｔｓｐ５０９Ｉに添付のもの）、０．５μｌの制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ（１０Ｕ／μｌ、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を加えて、時折混和させながら６５℃で１時間保温した。ビーズ洗浄操作を行い、そのビーズに５０ｐｍｏｌ／μｌリンカーカセットＡ（配列表の配列番号３、４にそれぞれリンカーカセットＡを構成する二つのオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す）２μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１、タカラバイオ社製）１６μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１、タカラバイオ社製）２μｌを添加し、時折混和させながら１６℃で１時間反応させた。
滅菌水でビーズの洗浄を１回行った後、ビーズを回収して５μｌの０．１Ｎ  水酸化ナトリウムに懸濁し、室温で１０分間放置した。磁石スタンド上で約５μｌの上清を回収し、このうち１μｌを用いて以下のＰＣＲ反応を行なった。１μｌの上記溶液に２５μｌの×２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＮＴＰ混合液（各２．５ｍＭ）、ＬＴＲと相補的な配列を持つプライマーＬＴＲ  ＩＩ（配列表の配列番号５、２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びリンカーカセットに相補的な配列を持つプライマーＬＣ  １（配列表の配列番号６、２５ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌずつ、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ及び滅菌水を加えて５０μｌとした。この反応液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーにセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間（変性）、５８℃、４５秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃、９０秒間（合成反応）を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した（一回目）。その後、一回目のＰＣＲ反応液１μｌを鋳型として用いて、ＬＴＲＩＩのアニールする配列より下流のＬＴＲに相補的な配列を持つプライマーＬＴＲＩＩＩ（配列表の配列番号７、２５ｐｍｏｌ／μｌ）、及びＬＣ１より下流のリンカーカセットに相補的な配列を持つプライマーＬＣ２（配列表の配列番号８、２５ｐｍｏｌ／μｌ）で二回目のＰＣＲを行なった。なお二回目のＰＣＲは一回目のＰＣＲ条件に従った。
こうして得られた反応液５０μｌの内、５μｌを３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動し、反応液中の増幅産物の確認を行った。その結果、２９３Ｒ１、ＣＤ＋Ｒ１由来のどちらの染色体ＤＮＡを鋳型にした場合も約５００ｂｐ以下の様々な種類の増幅断片群がブロードなバンドを形成して泳動されていることが確認された。この結果は、染色体上のさまざまな位置にレトロウイルスベクターが組み込まれた細胞の集まるポリクローンから調製された染色体ＤＮＡが鋳型として用いられたことを反映しており、また、上記の方法により特定のクローン由来の断片に偏っていない増幅が可能であることが明らかとなった。
ＣＤ３４＋Ｒ１由来のゲノムＤＮＡを鋳型として増幅された断片群を３．０％低融点アガロースゲルより回収し、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ  ベクター（タカラバイオ社製）に連結した。この連結産物で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧ（共にタカラバイオ社製）を含む固体培養プレートに生育させて得られた白コロニーより、６８種類を挿入断片の連結されたベクターを含むクローン候補株として選抜した。このコロニーについてプライマーＬＴＲ  ＩＩＩ及びＬＣ２、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用したＰＣＲにより、インサートサイズの確認を行なった。反応液はＥｘ  Ｔａｑ添付の説明書に準じて調製し、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間、５８℃、４５秒間、７２℃、９０秒間を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。増幅後の反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動したところ、様々な長さの増幅断片が確認され、本方法によって様々なクローン由来の組み換え部位領域が増幅されていることが判明した。
さらに、新たな白コロニー３８４個を選び、以下の方法でシークエンス用鋳型ＤＮＡを調製した。各コロニーをアンピシリンを含むＬＢ培養液（１００ｍｌ当り１ｇトリプトン、０．５ｇ  酵母エキス、１ｇ  塩化ナトリウム）４０μｌに接種し、３７℃、１８時間培養した。この培養液に６０％グリセロール溶液２０μｌを加え、終濃度２０％のグリセロールストックを調製した。次いで、このグリセロールストック溶液０．５μｌについてＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いたシークエンス用サンプルの調製を行った。なおこの際の調製方法はキットの手順書に従った。この反応溶液をシークエンサーＭｅｇａＢＡＣＥ  ４０００（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて塩基配列の解析を行なったところ、１１５種類のまったく異なった組み込み部位を示すヒト由来の配列が得られた。この結果からも、本法により様々なクローン由来の増幅断片が得られていることが判明した。
【実施例２】ポリクローン由来の染色体ＤＮＡとモノクローン由来の染色体との混合物を試料とした解析（１）
（１）レトロウイルスを導入した２９３細胞クローンの単離
ポリブレンを８μｇ／ｍｌ濃度で含む１ｍｌのＤＭＥＭ培地中の２９３細胞（５×１０４個）に、実施例１（１）で調製したａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストックを１０２倍希釈したもの１００μｌを添加し、感染させた。２時間後、培地交換を行い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。翌日、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍｌで含む培地を入れた９６穴プレートに、上記の細胞を１ウェル当り１細胞となるように撒きなおし、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。その後、Ｇ４１８耐性を示した２種類の細胞（クローン）を単離して、拡大培養し、１クローン当り２×１０６個の細胞を得た。これら２つのクローンをクローン１及びクローン２とし、実施例１（３）と同様にして、それぞれの染色体ＤＮＡを調製した。
（２）モノクローン由来染色体ＤＮＡを鋳型とした場合の増幅
実施例２（１）で調製したクローン１及びクローン２の染色体ＤＮＡをそれぞれ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇを鋳型とし、実施例１（４）と同様の操作を行うことによってクローンゲノム中のレトロウイルスベクターの組み込まれた部位が検出されるか実施した。最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１については１ｎｇの染色体ＤＮＡ、クローン２については１０ｎｇの染色体ＤＮＡまでクローン由来の増幅断片が確認された。これにより特定のクローン由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
（３）クローン由来染色体ＤＮＡに、ポリクローン由来の染色体ＤＮＡを混入させた試料の解析
実施例１で使用した２９３Ｒ１より調製した染色体ＤＮＡに、実施例２（１）で調製したクローン１及びクローン２の染色体ＤＮＡをそれぞれ重量％（ｗ／ｗ）で０％、０．１％、１％、１０％、５０％、１００％となるように混入させ、全量が１００ｎｇとなるものを調製した。これを鋳型として、実施例１（４）と同様の操作を行うことによって２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡへ混入させたクローンＤＮＡが検出されるか実施した。最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１については１０％、クローン２については５０％まで２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡが混入した場合でもクローン由来の増幅断片が確認された。また２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡを含むサンプルでは、実施例１と同様にブロードなバンドを形成した増幅断片群が確認された。
またこれとは別に、２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡの一定量（１００ｎｇ）にクローン１及びクローン２由来の染色体ＤＮＡをそれぞれ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇになるように加えたものを鋳型として、同様にクローンＤＮＡ由来の増幅断片が検出されるか行った。なおこの際には実施例１（４）と同様の操作を行った。その結果、どの反応サンプルにおいてもブロードなバンドを形成した増幅断片群が確認され、さらにクローン１については１０ｎｇ、クローン２については５０ｎｇまで添加されたクローン由来の増幅断片が検出された。これによりポリクローンサンプルに混在する特定のクローン由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
【実施例３】ポリクローン由来の染色体ＤＮＡとモノクローン由来の染色体との混合物を試料とした解析（２）
（１）２種類のクローン由来染色体ＤＮＡの混合物を鋳型とした場合の増幅
実施例２（１）で調製したクローン１、クローン２の染色体ＤＮＡを０、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇずつ等量混ぜた混合液を鋳型として、実施例１（４）と同様の操作を行うことによって２種類のゲノム中の組み込み部位由来断片が検出されるか検討した。最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１由来の増幅断片については１ｎｇ、クローン２のものについては１０ｎｇずつ混合したものまで検出された。これにより２種類のクローン由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
（２）２種類のクローン由来染色体ＤＮＡの混合物にポリクローン由来のものを混入させたものを鋳型とした場合の増幅
実施例１で使用した２９３Ｒ１より調製した染色体ＤＮＡに、実施例２（１）で調製したクローン１及びクローン２由来の染色体ＤＮＡを等量ずつ混合したものをそれぞれ重量％（ｗ／ｗ）で０、０．１％、１％、１０％、５０％、１００％となるように混入させ、全量を１００ｎｇとしたものを調製した。これを鋳型として、実施例１（４）と同様の操作を行うことによって２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡへ混入させた２種類のクローンＤＮＡが検出されるか実施した。
上記の操作によって得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１由来の増幅バンドについては１０％、クローン２のものについては５０％の混入までクローン由来の増幅断片が確認された。また２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡを含むサンプルでは、実施例１と同様にブロードに泳動されている増幅断片群が確認された。
また、これとは別に２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡの一定量（１００ｎｇ）にクローン１、クローン２由来の染色体ＤＮＡを０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇずつ等量混ぜた混合液を鋳型として、同様にクローン由来の増幅断片が検出されるか行った。なおこの際には実施例１（４）と同様の操作を行った。その結果、電気泳動後のアガロースゲルではどの反応サンプルにおいてもブロードなバンドを形成した増幅断片群が確認され、さらにクローン１については１０ｎｇ、クローン２については５０ｎｇずつの混入までクローン由来の増幅断片が検出された。これによりポリクローンサンプルに混在する２種類のクローン由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
（３）２種類のクローン由来染色体ＤＮＡを比率を変えて混合したものを鋳型とした場合
実施例２（１）で調製したクローン１、クローン２の染色体ＤＮＡを重量比（クローン１：クローン２、ｗ：ｗ）で１：０、４：１、２：１、１：１、１：２、１：４、０：１となるように混合し、全量を１００ｎｇとしたものを調製した。またそれとは別に、この混合したものに実施例１で使用した２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡ  １００ｎｇを混合したものも用意した。これらを鋳型として実施例１（４）と同様の操作を行った場合に、各比率で混合したクローン１、２の由来の増幅断片が検出されるか実施した。
上記の操作で得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、クローン１、クローン２の混合物については混合した際とほぼ同じ比率でクローン由来の増幅断片が確認され、またこれらに２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡを添加されたサンプルでは、ブロードなバンドを形成した増幅断片群中にクローン１、２由来のＤＮＡ断片が確認された。その場合もクローン１、２由来の増幅断片の増減は確認された。これによりポリクローンサンプルに混在する２種のクローンを感度よく、その存在比に応じて検出されることが明らかとなった。
【実施例４】４種のクローン由来染色体ＤＮＡを試料とした解析
（１）レトロウイルスを導入したＨＬ６０細胞クローンの単離
実施例１（１）と同様の操作によりプラスミドｐＤＯＮ−ＧＦＰをパッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６に導入し、得られたウイルス産生細胞よりａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストックを調製した。
ポリブレンを８μｇ／ｍｌ濃度で含む１ｍｌのＤＭＥＭ培地中のＨＬ６０細胞（バイオウィターカー社製、５×１０４個）に、上記のａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストックを１０２倍希釈したもの１００μｌを添加して感染させた。２時間後に培地交換を行い、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、細胞をトリプシンではがし、φ１０ｃｍの組織培養用プレート６枚に分注して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。翌日、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍｌで含む培地を入れた９６穴プレートに上記の細胞を１ウェル当り１細胞となるように撒きなおし、３７℃、５％ＣＯ２中で培養した。その後、同様に２４穴プレートに撒きなおして４日間、さらに６穴プレートに撒きなおして４日間、各細胞（クローン）を培養した。得られた細胞のうちＧ４１８耐性を示した４種類のクローンを単離して拡大培養し、１クローン当り１×１０７個の細胞を得た。これら４つのクローンをクローンａ、クローンｂ、クローンｃ及びクローンｄとし、実施例１（３）と同様の操作でそれぞれのクローンより染色体ＤＮＡを調製した。
（２）４種のクローン由来の染色体ＤＮＡを鋳型とした反応
実施例４（１）で調製したクローンａ〜ｄの染色体ＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、また４種の染色体ＤＮＡを等量混合したものを調製し、これを鋳型とした。なお混合したものは、４種の染色体ＤＮＡをそれぞれ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ及び１００ｎｇずつ混合したものを用意した。これらのそれぞれを鋳型として実施例１（４）と同様の操作を行った場合に、各クローン単独での増幅バンド、あるいは４種の染色体由来のバンドの混合物が検出されるか検討した。
上記の操作により得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果クローンａ、ｂ、ｃ、ｄのいずれにおいても単独での増幅断片が確認された。また４種の染色体ＤＮＡを混合したものでは４種の増幅断片が検出され、その感度についてはほぼ１ｎｇずつ混合したものまで検出可能であった。これにより４種類のクローン（オリゴクローン）由来の増幅断片が感度よく検出されることが明らかとなった。
【実施例５】検出感度の上昇
実施例１（３）で作製した２９３Ｒ１由来の染色体ＤＮＡに、実施例２（１）で調製したクローン２の染色体ＤＮＡを重量％で０、０．１％、１％、１０％、５０％、１００％となるように混入させ、全量を１００ｎｇとしたものを調製した。そこに０．５μｌの×１０  ＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ１、０．５μｌの制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ（１０Ｕ／μｌ）、及び滅菌水を加えて全量を５μｌとし、６５℃で１時間保温した。その反応液に２５μｌの×２  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＮＴＰ混合液（２．５ｍＭ）、１μｌの５’末端にビオチンを付加したプライマーＬＴＲ  Ｉ（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、０．２５μｌのＥｘ  Ｔａｑ及び滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。反応液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーにセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間、５８℃、４５秒間、７２℃、９０秒間を１サイクルとする５０サイクルのＰＣＲを実施した。その後、実施例１（４）と同様にして未反応のプライマーを除去し、４０μｌの液量のＤＮＡ溶液を得た。
この溶液にストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズ（ＭＰＧ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）４０μｌを加え、時折混和させながら室温で１時間放置した。反応液の入ったチューブを磁石スタンド上で１分間放置した後、上清を廃棄してビーズの回収を行ない、ビーズ洗浄操作を行った。このビーズを１４．１μｌの滅菌水に穏やかに懸濁し、×１０  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液  ２μｌ、ｄＮＴＰ混合液（２．５ｍＭ）２．４μｌ、ランダムプライマー（６ｍｅｒ、１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ０．５μｌを加えて全量を２０μｌとしたものを３７℃で１時間反応させた。
反応終了後、ビーズ洗浄操作を行い、そのビーズに５０ｐｍｏｌ／μｌリンカーカセットＢ（配列表の配列番号９、１０にリンカーカセットＢを構成する二つのオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す）２μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１）１６μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１）２μｌを添加し、時折混和させながら１６℃で１時間反応させた。滅菌水でビーズの洗浄を１回行った後、ビーズを回収して５μｌの０．１Ｎ  水酸化ナトリウムに懸濁し、室温で１０分間放置した。磁石スタンド上で約５μｌの上清を回収し、このうち１μｌを用いて実施例１（４）と同様にしてＰＣＲ反応を行なった。二回目のＰＣＲ反応液５０μｌの内、５μｌを３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動し、増幅断片を確認した。
なお比較対照として、同じ鋳型を用いて、実施例１（４）と同一の操作で実施した方法も同時に行なった。その結果、実施例１（４）での方法では５０％までクローン２由来の増幅バンドが確認されたが、この方法では１０％までのバンドが確認され、混入したクローン由来の増幅産物の検出感度を上昇させることが可能であった。
【実施例６】従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法との比較（１）
（１）ｐＤＯＮ−ＧＦＰを導入したＨＬ６０細胞集団の作製
実施例４（１）で調製したプラスミドｐＤＯＮ−ＧＦＰをパッケージング細胞ＧＰ＋Ｅ−８６に導入し、構築されたａｍｐｈｏＧＦＰウイルス産生細胞からウイルス粒子を回収した。
ポリブレンを８μｇ／ｍｌ濃度で含む１ｍｌのＤＭＥＭ培地中のＨＬ６０細胞（５×１０４個）に、実施例４（１）で調製したａｍｐｈｏＧＦＰウイルス上清液ストックを１０２倍希釈したもの１００μｌを添加して感染させた。２時間後に培地交換を行い、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した後、細胞をトリプシンではがし、φ１０ｃｍの組織培養用プレート６枚に分注して３７℃、５％ＣＯ２存在下で４８時間培養した。
その後、細胞をトリプシン処理して遠心管に回収し、細胞をＰＢＳで二回洗浄した後に−８０℃で保存した。この導入細胞群をＨＬ６０Ｒ１と命名した。ＨＬ６０Ｒ１についてＦＡＣＳによる解析を行ったところ、遺伝子導入効率は約２０％であった。このＨＬ６０Ｒ１（約２．０×１０６個の細胞）より、実施例１（３）と同様にして染色体ＤＮＡを調製した。
（２）遺伝子組み込み領域ＤＮＡの増幅
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１００巻、２７３７頁〜２７４３頁（２００２）に記載の方法に従って、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法を以下のように実施した。実施例６−（１）で調製したＨＬ６０Ｒ１のゲノムＤＮＡ  １ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇに１０μｌの×１０  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（キアゲン社製）、８μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）混合液、０．２５ｐｍｏｌの５’末端にビオチンを付加したプライマーＬＴＲ  Ｉを添加し、０．５μｌのＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ、キアゲン社製）及び滅菌水を加えて１００μｌとした。この反応液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間、６０℃、４５秒間、７２℃、６０秒間を１サイクルとする１００サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した（なお５０サイクル実施後に新たにＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを同量追加し、さらに５０サイクル行ない１００サイクルとした）。
この反応液にストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ（ＭＰＧ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）１００μｌ（２００μｇ相当）を加え、時折混和させながら室温で１時間放置した。反応液の入ったチューブを磁石スタンド上で１分間放置した後、上清を廃棄し、ビーズの回収を行なった。そこに１００μｌのＢＷ緩衝液（５ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．０Ｍ  塩化ナトリウム）を添加して、ビーズを穏やかに混和し、磁石スタンド上で静置後、同様に上清を廃棄し、さらに１００μｌの滅菌水で同様の操作を行い、ビーズの回収を行なった（この操作をビーズ洗浄操作とする）。
このビーズを１４．１μｌの滅菌水に穏やかに懸濁し、×１０  Ｋｌｅｎｏｗ緩衝液  ２μｌ、ｄＮＴＰ混合液（２．５ｍＭ）２．４μｌ、ランダムプライマー（ランダム６ｍｅｒ、１００ｐｍｏｌ／μｌ、タカラバイオ社製）１μｌ、及びＫｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ社製）０．５μｌを加えて全量を２０μｌとしたものを３７℃で時折混和させながら１時間反応させ、相補鎖の合成を行なった。
反応後、ビーズ洗浄操作を行い、回収したビーズを１７．５μｌの滅菌水に懸濁し、そこに２μｌの×１０  ＮＥ  ｂｕｆｆｅｒ１、０．５μｌの制限酵素Ｔｓｐ５０９Ｉ（１０Ｕ／μｌ）を加えて、時折混和させながら６５℃で１時間保温した。次いでビーズ洗浄操作を行い、そのビーズに２μｌのリンカーカセットＡ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１）１６μｌ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ（Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１）２μｌを添加し、時折混和させながら１６℃で１時間反応させた。
反応終了後、ビーズの洗浄を滅菌水で１回行ってビーズを回収し、５μｌの０．１Ｎ  水酸化ナトリウムに懸濁して室温で１０分間放置した。磁石スタンド上で約５μｌの上清を回収し、このうち１μｌを用いて以下のＰＣＲ反応を行なった。１μｌの上記溶液に１０μｌの×１０  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）混合液、プライマーＬＴＲ  ＩＩ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）及びプライマーＬＣ  １（２５ｐｍｏｌ／μｌ）をそれぞれ１μｌずつ、０．５μｌのＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（キアゲン社製）及び滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーにセットし、９５℃、５分間の変性の後、９５℃、６０秒間、６０℃、４５秒間、７２℃、６０秒間を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを実施し、その後７２℃で１０分間保温した（一回目）。その後一回目のＰＣＲ反応液  ０．２μｌ分を鋳型として用いて、ＬＴＲ  ＩＩＩ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）、及びプライマーＬＣ２（２５ｐｍｏｌ／μｌ）で二回目のＰＣＲを行なった。なお二回目のＰＣＲは一回目と同じＰＣＲ条件で行った。
なお、同じくＨＬ６０Ｒ１の染色体ＤＮＡ  １ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを試料として、実施例１（４）に記載の方法（本発明の方法）でも同様にレトロウイルスベクター組み込み部位に隣接するＤＮＡ断片の増幅を行なった。
上記の反応液のうち５μｌを３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで電気泳動し、増幅産物の確認を行った。この結果、実施例１（４）記載の方法では、１００ｎｇ、１０ｎｇの染色体ＤＮＡを使用した場合に約５００ｂｐ以下の部分にブロードなバンドを形成した増幅断片群が確認されたのに対し、ブラッド記載の方法（従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法）では、１０ｎｇの染色体ＤＮＡでは既に特定のクローン由来の増幅バンドに偏ってしまっていた。このことから、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法で行なった場合に較べ、本発明の実施例１（４）に記載の方法では鋳型量が少なくても、言い換えれば遺伝子の導入された染色体の割合が少なくても、特定のクローン由来の増幅に偏らず、種々の遺伝子導入細胞由来のＤＮＡ断片を増幅することが可能であることが明らかとなった。
また、再度同様の操作を行なったところ、実施例１（４）記載の方法では先の実験と同様に１００ｎｇ、１０ｎｇの染色体ＤＮＡを使用した場合に約５００ｂｐ以下の部分にブロードなバンドを形成した増幅断片群が確認されたのに対し、ブラッド記載の方法（従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法）では、１０ｎｇに加えて１００ｎｇの染色体ＤＮＡを使用した場合でも特定のクローン由来の増幅バンドに偏ってしまっていた。このことから、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法に較べ、本発明の方法は再現性良くレトロウイルス実施することも可能であることが明らかとなった。
【実施例７】従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法との比較（２）
実施例２（１）で調製したクローン１由来の染色体ＤＮＡ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇを鋳型とした場合（Ａ）、実施例１で使用した２９３Ｒ１より調製した染色体ＤＮＡ（ポリクローナルＤＮＡ）１００ｎｇにクローン１由来のＤＮＡを０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ混入し、鋳型とした場合（Ｂ）、クローン１由来の染色体ＤＮＡ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇに実施例１で使用した２９３Ｒ１より調製した染色体ＤＮＡをトータル鋳型量が１００ｎｇとなるように混入し、鋳型とした場合（Ｃ）、及びクローン１由来の染色体ＤＮＡ０、０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇに遺伝子導入を行なっていない２９３細胞より調製した染色体ＤＮＡをトータル鋳型量が１００ｎｇとなるように混入し、鋳型とした場合（Ｄ）の４種類の場合について、実施例６（２）に記載の操作に従って、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法によるレトロウイルス組み込み部位部分のＤＮＡ断片の増幅を行った。また、同じ鋳型について実施例１（４）に記載された本発明の方法によるＤＮＡの増幅も実施し、両方法の比較を行った。
最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行ない、増幅断片が確認された反応液に使用されたクローン１由来のＤＮＡ量を表１に示した。
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上記の結果より、様々な状況下（反応液中に遺伝子導入されたポリクローナルＤＮＡまたは遺伝子導入されていない染色体ＤＮＡが共存する場合）で優勢に存在するクローンを検出する場合において、本発明の方法が、従来の方法に較べて５倍から１０倍の優れた感度を有することが明らかとなった。
【実施例８】５種のクローン由来染色体ＤＮＡを試料とした従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法との比較
実施例４（１）で作製した遺伝子導入細胞群から、本発明の方法によりレトロウイルス組み込み部位部分のＤＮＡ断片を増幅した際に長さの異なる増幅断片の得られる５種類のクローンを選抜した。この５種類のクローン由来の染色体ＤＮＡ混合物を鋳型として、以下の実施を行なった。
５種のクローン由来の染色体ＤＮＡをそれぞれ１ｎｇ、２５ｎｇ、及び１００ｎｇずつ等量混合したもの及びこれらに実施例６−（１）で調製したＨＬ６０Ｒ１の染色体ＤＮＡ（ポリクローナルＤＮＡ）を１００ｎｇ混入したものについて、実施例６（２）記載の方法（従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法）及び実施例１（４）記載の方法（本発明の方法）との比較を行った。
上記の操作により得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。５種類のクローン由来の染色体ＤＮＡ混合物のみを鋳型として用いた場合、従来法と本発明の方法ともに１００ｎｇ、２５ｎｇの鋳型量で５種類全てのクローン由来の増幅断片が確認された。鋳型量を１ｎｇとした場合、本発明の方法では４種のクローン由来の増幅断片が確認されたが、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法ではまったくＤＮＡの増幅は見られなかった。
鋳型にポリクローナルＤＮＡが共存する場合、本発明の方法では２５ｎｇにおいても５種類のクローン由来の増幅断片が確認されるが、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法では２５ｎｇにおいては１種類のクローン由来の増幅断片のみが確認され、残り４種類の増幅断片は確認されなかった。
このことから、ポリクローンに共存する複数の優勢に存在するクローンを検出する場合、本発明の方法では従来法に較べ、より感度良く検出が行えること、つまりはクローンの存在状態をより反映した増幅が可能であることが判明した。
【実施例９】骨髄再構築マウスの末梢血クローン由来染色体ＤＮＡを試料とした従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法との比較
（１）レトロウイルスの作製
エコトロピックレトロウイルスベクターは以下のようにして調製した。Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｅｃｏ（タカラバイオ社製）に添付の説明書に従って、同キットのｐＧＰとｐＥ−ｅｃｏおよび実施例１（１）で作製したプラスミドｐＤＯＮ−ＧＦＰを導入した２９３細胞を培養し、培養上清を回収した。培養上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過したものをｅｃｏＧＦＰウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。得られたｅｃｏＧＦＰウイルス上清液のＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対する感染力価は１．６×１０６感染ウイルス粒子／ｍｌであった。
（２）マウス骨髄細胞の調製
７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（メス、日本エスエルシー社製）腹腔内に１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、シグマ社製）を投与し、その７日後に大腿骨及び脛骨を摘出して骨髄を採取した。得られた骨髄細胞液をＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｍ（第一化学薬品社製）に重層して遠心分離し、単核細胞画分を調製してこれをマウス骨髄細胞とした。
５０ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２リガンド、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、５μＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＦＭ培地（ギブコ社製）中に１．４５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で上記のマウス骨髄細胞を添加し、５％  ＣＯ２中、３７℃で４８時間インキュベートすることにより予備刺激を行った。予備刺激した細胞は容器に付着したものを含め、ピペットを用いて吸引、採集した。
（３）形質転換骨髄細胞の作製
レトロネクチン（タカラバイオ社製）をコーティングしたプレート（タカラバイオ社製）に実施例９（１）で調製されたｅｃｏＧＦＰウイルス上清液を添加し、３２℃でインキュベートした。４時間後に上清を吸引除去し、上記のマウス骨髄細胞（細胞数、培地）を加え、５％  ＣＯ２中、３７℃で２２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ピペッティングにより細胞を回収し、生理食塩水で１回洗浄したあと生理食塩水（大塚製薬社製）に懸濁し、遺伝子導入骨髄細胞とした。
（４）形質転換細胞のマウスへの移植
致死量のＸ線（９００Ｒａｄ）で処理した８週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅマウス（メス）の尾静脈から遺伝子導入骨髄細胞（０．２ｍｌ／匹、５×１０４細胞分）を投与した。細胞移植後２１週目の上記マウス２匹より末梢血を採取し、ＱＩＡ  ａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、染色体ＤＮＡを調製し、これらをそれぞれサンプルＩ、サンプルＩＩとした。なお染色体ＤＮＡ調製操作はキット添付プロトコルに従った。
（５）遺伝子導入部位の解析
上記のサンプルＩ、サンプルＩＩそれぞれ１００ｎｇを鋳型として、実施例６（２）記載の方法（従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法）及び実施例１（４）記載の方法（本発明の方法）の比較を行った。なおこの操作は両サンプルについて２人の実施者が独立して行なうこととした。
上記の操作により得られた最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行った。その結果、従来のＬＡＭ  ＰＣＲ法の場合、２人のうち１人ではサンプルＩの増幅断片として１種のメジャープロダクトが確認されたが、もう１人の実施者では前記のメジャープロダクトが確認されなかった。またサンプルＩＩについては２人の実施者共に明瞭な増幅断片は確認されなかった。一方、本発明の方法の場合には、どちらのサンプルでもメジャープロダクトである増幅断片が明瞭に確認された他、マイナープロダクトも検出された。また、実施者による増幅断片パターンの違いも見られなかった。
このことから、動物由来のサンプルにおいても、本発明により、より感度良く、つまりクローンの存在状態に応じた増幅が可能であることが示唆された。また、本発明の方法では実施者の違いにより再現性が失われることはなかった。
（６）マイナープロダクトである増幅断片の解析
実施例９（５）において、本発明の方法で増幅されたマイナープロダクトである増幅断片がレトロウイルスにより遺伝子導入された細胞由来のものであることを以下の操作で確認した。実施例１と同様に、サンプルＩを用いて本発明の方法で増幅された３００ｂｐ前後のマイナーバンドをゲルより回収し、ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに連結した。この組換えプラスミドで形質転換した大腸菌より１０クローンを選抜し、それぞれに保持されているプラスミドの挿入断片の塩基配列を解析した。その結果、全てがマウス染色体ＤＮＡ上の配列であることが確認された。
このことからマウスで再構築された血液細胞について、本発明の方法によって増幅されたマイナープロダクトは、遺伝子導入された細胞のクローンに由来する増幅断片であることが実証された。またこのマイナープロダクトは従来の方法では見られていないことから、本発明の方法が従来の方法に較べ、遺伝子導入された細胞のクローンを高感度に検出できることが判明した。
【実施例１０】ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を含有する反応液での増幅
反応緩衝液への化合物の添加の効果について検討した。
実施例１において調製された２９３Ｒ１の遺伝子導入効率は５９％であることから、遺伝子導入されたＤＮＡが２０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇとなるように、２９３Ｒ１より調製した染色体ＤＮＡ３４ｎｇ、１７ｎｇ、８．５ｎｇに遺伝子導入を行なっていない２９３細胞より調製した染色体ＤＮＡをトータル鋳型量が１００ｎｇとなるように混入し、実施例１（４）に記載された方法によるＤＮＡの増幅を実施した。この際、実施例１（４）記載の反応液のほか、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）とベタインにかえて、終濃度６％のＤＭＳＯ、終濃度６％のＤＭＳＯ及び終濃度１０ｍＭのＴＭＡＣ、または終濃度１０ｍＭのＴＭＡＣを含有する反応液を作製し反応に使用した。
最終反応液の一部を３．０％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物の確認を行なった。この結果、６％のＤＭＳＯを含む反応液では、実施例１（４）記載の緩衝液とほぼ同じように約５００ｂｐ以下のブロードな増幅断片群が確認された。１０ｍＭのＴＭＡＣを含む反応液ではＤＭＳＯの有無に関わらず実施例１（４）記載の反応液に比較して増幅効率の上昇が認められ、また遺伝子導入ＤＮＡ量が少ない場合においてもブロードな増幅断片群が確認された。今回の緩衝液の中ではＤＭＳＯを含有しない、１０ｍＭのＴＭＡＣのみを含有する反応液で最も良好な結果が得られた。
さらに、上記の１０ｍＭのＴＭＡＣのみを含有する反応液を使用する増幅方法について、プライマーＬＴＲ  ＩＩ、ＬＣ  １を使用するＰＣＲ工程、プライマーＬＴＲ  ＩＩＩ、ＬＣ２を使用するＰＣＲ工程の反応液についてＴＭＡＣを同濃度のテトラメチルアンモニウムアセテートに変更して増幅を実施した。この場合にはＴＭＡＣを使用した場合とほぼ同様の増幅が認められた。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、多種多様の組み込み部位をもつ生体サンプルを用いて、遺伝子を組み込まれた細胞が、どの程度集団の中に存在するのか（ポリクローン、オリゴクローン、モノクローンのどの状態で存在するのか）、さらにはどの程度の割合で特定の細胞が集団中に存在しているのか正確に、感度良く、高い再現性をもってモニタリングすることができる。従来の方法ではその限界により効果が限定されていたレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入細胞群（モノクローン、オリゴクローン、ポリクローン）における組み込み部位の解析に応用することで、遺伝子治療の現場などでより精度の高いモニタリングを期待できる等、優れた有用性を示す。
【配列表フリーテキスト】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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