(57)【要約】本発明は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞および細胞混合物に関する。本発明による樹状細胞は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示するものである。本発明による細胞混合物は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる細胞混合物であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなるものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示する、樹状細胞。
【請求項２】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１に記載の樹状細胞：
2004078957.tif 000014
（上記式中、
Ｒ１はＨまたはＯＨであり、
Ｘは７〜２７のいずれかの整数であり、
Ｒ２は下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される置換基であり（ここで、Ｙは５〜１７のいずれかの整数である）：
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、そして
Ｒ３〜Ｒ９は下記のｉ）またはｉｉ）で定義される置換基である：
ｉ）Ｒ３、Ｒ６、およびＲ８がＨのとき、
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000015
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ５はＯＨ、または下記基（Ｅ）および（Ｆ）：
2004078957.tif 000016
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ７は、ＯＨまたは下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000017
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ９はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、または下記基（Ａ’）〜（Ｄ’）：
2004078957.tif 000018
からなる群から選択される置換基である；
ｉｉ）Ｒ３、Ｒ６およびＲ７がＨのとき、
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000019
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ５はＯＨ、または下記基（Ｅ）および（Ｆ）：
2004078957.tif 000020
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ８はＯＨ、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000021
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ９はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたは下記基（Ａ’）〜（Ｄ’）：
2004078957.tif 000022
からなる群から選択される置換基である）。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物中、Ｒ３、およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す、請求項３に記載の樹状細胞。
【請求項５】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項３に記載の樹状細胞。
【請求項６】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項３に記載の樹状細胞。
【請求項７】
式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオールである、請求項３に記載の樹状細胞。
【請求項８】
抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を製造する方法であって、
樹状細胞をα−グリコシルセラミド誘導体の存在下で培養する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
樹状細胞を前記抗原または前記抗原断片の存在下で培養する工程をさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項８に記載の方法：
2004078957.tif 000023
（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物中、Ｒ３、およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオールである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を製造するための、α−グリコシルセラミド誘導体の使用。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１６に記載の使用：
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（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項１９】
抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる細胞混合物であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなる、細胞混合物。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項１９に記載の細胞混合物。
【請求項２１】
前記抗原断片を提示する樹状細胞と、前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞とを含んでなる、請求項１９に記載の細胞混合物。
【請求項２２】
前記抗原断片を提示する樹状細胞および／または前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞、ならびに前記抗原断片と前記α−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を含んでなる、請求項１９に記載の細胞混合物。
【請求項２３】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項１９に記載の細胞混合物：
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（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項２４】
式（Ｉ）の化合物中、Ｒ３、およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す、請求項２３に記載の細胞混合物。
【請求項２５】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項２３に記載の細胞混合物。
【請求項２６】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項２３に記載の細胞混合物。
【請求項２７】
式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオールである、請求項２３に記載の細胞混合物。
【請求項２８】
抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞の組み合わせ物であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなる、組み合わせ物。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項２８に記載の組み合わせ物。
【請求項３０】
前記抗原断片を提示する樹状細胞と、前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞とを含んでなる、請求項２８に記載の組み合わせ物。
【請求項３１】
前記抗原断片を提示する樹状細胞および／または前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞、ならびに前記抗原断片と前記α−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を含んでなる、請求項２８に記載の組み合わせ物。
【請求項３２】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項２８に記載の組み合わせ物：
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（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項３３】
治療上有効な量の請求項１〜７のいずれか一項に記載の樹状細胞を被験者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法。
【請求項３４】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
治療上有効な量の請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の細胞混合物を被験者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを、別々にまたは同時に、治療上有効な量で被験者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項４０】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原断片を提示する樹状細胞と、前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞とを、別々にまたは同時に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗原断片を提示する樹状細胞および／または前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞、ならびに前記抗原断片と前記α−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を、別々にまたは同時に投与することを含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項３９に記載の方法：
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（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項４５】
式（Ｉ）の化合物中、Ｒ３、およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療用医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の樹状細胞の使用。
【請求項５０】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療用医薬の製造のための、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の細胞混合物の使用。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療用医薬の製造のための、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞との組み合わせの使用。
【請求項５６】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
前記組み合わせが、前記抗原断片を提示する樹状細胞と、前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞とからなるものである、請求項５５に記載の使用。
【請求項５９】
前記組み合わせが、前記抗原断片を提示する樹状細胞および／または前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞、ならびに前記抗原断片と前記α−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞からなるものである、請求項５５に記載の使用。
【請求項６０】
α−グリコシルセラミド誘導体が式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物である、請求項５５に記載の使用：
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（上記式中、Ｒ１〜Ｒ９およびＸは請求項３において定義した通りである）。
【請求項６１】
式（Ｉ）の化合物中、Ｒ３、およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項６０に記載の使用。
【請求項６３】
式（Ｉ）の化合物中、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す、請求項６０に記載の使用。
【請求項６４】
式（Ｉ）の化合物が、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオールである、請求項６０に記載の使用。
【請求項６５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の樹状細胞を含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６６】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の細胞混合物を含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項６９】
前記Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記疾患が、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択されるものである、請求項６８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
［発  明  の  背  景］
発明の分野
本発明は、α−グリコシルセラミド誘導体と抗原とを提示する樹状細胞を用いた、各種自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、および各種アレルギー性疾患などの治療剤に関する。
【背景技術】  海綿に由来するアゲラスフィン類の誘導体の一つとして合成されたＫＲＮ７０００（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４：５５９１−５５９２，１９９３；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３４：５５９３−５５９６，１９９３；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５０：２７７１−２７８４，１９９４）は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に発現する不可変型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のリガンドであることが判明している（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：１６２６−１６２９，１９９７；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：１５２１−１５２８，１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１５２９−１５３４，１９９８）。
ＫＲＮ７０００に代表されるα−グリコシルセラミド誘導体は、親水性のガラクトース、グルコースなどの糖類と脂肪酸−スフィンゴシン塩基からなる疎水性セラミドとがα配位にて結合したスフィンゴ糖脂質であり、リガントとしてＮＫＴ細胞を刺激することにより強い抗腫瘍活性を示すことが報告されている（Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．，７：５２９−５３４，１９９５；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：１２０２−１２０７，１９９８）。α−グリコシルセラミド誘導体は、糖脂質抗原として樹状細胞（ＤＣ）をはじめとした抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれた後、蛋白抗原のプロセスを担うことで知られるＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）経路を介さずにプロセシングされた後、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩｂ様の非多形性分子ＣＤ１ｄによってＡＰＣ膜上に提示される。ＮＫＴ細胞は、その膜上にある多様性のないＴＣＲが、ＡＰＣ上のＣＤ１ｄにより提示されたα−グリコシルセラミド誘導体を認識することにより活性化される。この原理に基づいて、α−グリコシルセラミド誘導体を取り込ませたヒト単球由来ＤＣを用いることにより、ヒトＮＫＴ細胞の効率の良い培養が可能とされている（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６０：１０−１９，１９９９）。さらに、インターロイキン−７（ＩＬ−７）やＩＬ−１５は、α−グリコシルセラミド誘導体と相乗的にＮＫＴ細胞をインビトロで増殖させることが報告されている（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６１：３５７−３６５，１９９９）。
ＮＫＴ細胞は、中程度にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ＴＣＲ細胞（ＴＣＲｉｎｔ細胞）であり、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）様の形態を示す点、ＩＬ−２受容体β鎖を常時表出する点、パーフォリン顆粒を有する点などでは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と類縁の細胞であるが、ＴＣＲを有するという点でＮＫ細胞とは決定的に異なる細胞群であることが明らかにされている（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，２９７２，１９９５）。そして、マウスにおいて、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）により活性化されたＴＣＲｉｎｔ細胞の中でもＮＫ１．１を発現しているＮＫ１．１＋ＴＣＲｉｎｔ（ＮＫＴ）細胞が、腫瘍の肝臓や肺への血行性転移抑制の重要なエフェクター細胞であることが証明されている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，４３３３，１９９５；Ａｎｚａｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８８，８２，１９９６）ことから、このＮＫＴ細胞は、癌細胞、寄生虫や原虫、およびリステリアや結核菌などの細胞内感染細菌の排除に重要な役割を果たす細胞であると考えられている（Ｓｅｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，１０６９，１９９６）。さらに、このＮＫＴ細胞は、骨髄移植における急性期拒絶反応（Ｙａｎｋｅｌｅｖｉｃｈ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４２３，１９８９）やヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２の分化制御によるＩｇＥ抗体産生の制御（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９，１２８５，１９９４）などにも深く関与する細胞としても知られている。以上のように、ＮＫＴ細胞は、近年、様々な生体機構に関与する新しい細胞群として非常に注目を集めている細胞群である。
Ｖα１４＋ＮＫＴ細胞は、上記のＮＫＴ細胞の一つのサブセットである。Ｖα１４＋ＮＫＴ細胞の多くはＶα１４Ｊα２８１ｍＲＮＡを発現しており、そのタンパク質はＴＣＲα鎖として機能する。近年、このＶα１４＋ＮＫＴ細胞が、自己免疫疾患の発症に深く関わっていることが証明されている。すなわち、ＭＲＬ／ｌ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、生後１７〜２０週齢で異常リンパ球の集積をきたす自己免疫疾患（ヒト全身性エリテマトーデス）のモデルマウスであるが、このマウスにおいては、自己免疫疾患発症に先行して、Ｖα１４＋ＮＫＴ細胞が選択的に減少することが判明している（Ｍｉｅｚａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６，４０３５，１９９６）。同様の現象は、他の自己免疫疾患モデルマウスであるｇｌｄマウスや（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおいても観察され、Ｖα１４＋ＮＫＴ細胞が自己免疫疾患の発症に深く関わっていることが報告されている（Ｍａｋｉｎｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，１４８７，１９９６）。さらに、興味深いことに、ヒトにおいても同様の現象が観察されている。すなわち、マウスＶα１４Ｊα２８１鎖と相同のヒトホモログであるＶα２４ＪαＱα鎖は、健常人では末梢血のＣＤ４−／ＣＤ８−Ｔ細胞中に２０〜５０％存在しているが、強皮症患者では極端に減少していることが観察されている（Ｓｕｍｉｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２，１１６３，１９９５）。このように、原因遺伝子や遺伝的背景の異なる様々な自己免疫疾患において、マウスＶα１４＋ＮＫＴ細胞やヒトＶα２４ＪαＱαＴ細胞が関与していることが知られている。これらのことから、上記のようにＮＫＴ細胞を活性化する作用を有するＩＬ−１２は、ヒト全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：ＳＬＥ）や全身性強皮症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ：ＳＳｃ）のような自己免疫疾患の治療剤として期待された。しかし、ＩＬ−１２をＭＲＬ／ｌ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに投与すると、非投与マウスに比べて、脾およびリンパ節に異常リンパ球（ＣＤ３＋Ｂ２２０＋ＣＤ４  ＣＤ８  ｄｏｕｂｌｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔ細胞）の著明な増加が認められた（筒井建紀ら，日本免疫学会総会・学術集会記録，３４７，１９９６）。
一方、生体内には種々の糖がセラミドとβ結合しているβ−ガラクトシルセラミドやβ−グルコシルセラミドが存在している（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２８０，６２６，１９７２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｋ．−Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３１６，３１７，１９７３）。また、α−ガラクトシルセラミドが顕著な免疫賦活作用および抗腫瘍作用を有すること（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，２１７６，１９９５）、さらには、α−ガラクトシルセラミドやα−グルコシルセラミドのこれらの作用は、β−ガラクトシルセラミドやβ−グルコシルセラミドの作用よりもはるかに強力であること（Ｍｏｔｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１８，１４８７，１９９５）が知られている。さらに、α−グルコシルセラミド構造を有する化合物は、生体内に投与した場合における放射線防護作用（Ｍｏｔｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，５，２４１３，１９９５）、マウスメラノーマＢ１６の肺転移抑制作用（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓ．，７，５２９，１９９５）、およびマウス大腸癌Ｃｏｌｏｎ２６やマウスＴリンパ腫ＥＬ−４の肝転移抑制作用（元木一宏ら、日本癌学会総会記事、５２３，１９９６）を有すること、ならびに血小板数や白血球数を増加させること（Ｍｏｔｏｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９，９５２，１９９６）が知られている。また、α−グリコシルセラミド誘導体の投与が、ＮＯＤマウスのＩ型糖尿病（Ｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１０５２，２００１；Ｓｈａｒｉｆ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，７，１０５７，２００１）やＥＡＥ（Ｓｉｎｇｈ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９４，１８０１，２００１）、あるいはマウス自己免疫疾患モデルにおける治療に有効であることが報告されている。
さらに、α−グリコシルセラミド誘導体はＤＣ上に高度に発現されているＣＤ１ｄに提示されるが、体外でＤＣをα−グリコシルセラミド誘導体で処理した後にこれをマウスに投与することによって強い抗腫瘍効果が発揮されることが報告されている。その際、ＤＣ上に提示されたα−グリコシルセラミド誘導体は、効率よくＮＫＴ細胞画分を活性化し、ＩＦＮ−γやＩＬ−４などのサイトカインの産生を促す。
ＤＣはＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を活性化することが知られている（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７２，６３１，１９９０；Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，１９７，１９９０；Ｐｏｒｇａｄｏｒ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｏａ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８２，２５５，１９９５）。ＤＣは非リンパ組織に未成熟な状態で分布しており、この状態では高い抗原取り込み能を保持している。抗原の取り込み後、ＤＣは所属するリンパ節に移行し、そのＴ細胞領域においてＴ細胞に対して抗原を提示し、Ｔ細胞を活性化する。
炎症性刺激によって、ＤＣは免疫活性化状態になる。この過程はＤＣの「成熟」と呼ばれており、ＤＣの表現型や機能に変化（副刺激分子、接着分子および特定のケモカイン／ケモカイン受容体の発現上昇など）が生ずる。
近年、未成熟なＤＣを用いた場合には免疫反応の誘導は起こらず、免疫抑制が起こることが報告されている（米国特許第５８７１７２８号明細書；Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｊｕｌ；３０（７）：１８１３−２２，２０００）。その場合、ＤＣの前投与によって免疫寛容が誘導されることが示されているが、さらにＳｔｅｉｎｍａｎらにより、未成熟ＤＣの繰り返し投与によって一度成立した免疫についても寛容が誘導されることが示されている（国際公開第０２／０５６８３０号パンフレット）。
また、成熟のための処理を行ったＤＣについても、その成熟度合いが半成熟で、かつ静脈内投与した場合には、抑制性の免疫反応が成立することが知られている（Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２３  Ｎｏ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２）。この文献では、成熟に用いるサイトカインの種類などによりＤＣの半成熟状態が誘導され、これにより抗原特異的な免疫抑制が成立するため、自己免疫疾患において有効な治療法の開発が期待されている。
しかしながら、ＤＣに抗原とα−グリコシルセラミド誘導体を共付与した場合に免疫応答が強力に抑制されるということは、報告されていない。また、抗原を付与したＤＣとα−グリコシルセラミド誘導体を付与したＤＣとを組み合わせて用いた場合に免疫応答が強力に抑制されるということも、報告されていない。
［発  明  の  概  要］
本発明者らは、ミエリン抗原およびα−グリコシルセラミド誘導体を付与した樹状細胞（ＤＣ）の投与により、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症が顕著に抑制されることを見出した。この効果は、ミエリン抗原またはα−グリコシルセラミド誘導体を単独で付与したＤＣの投与では見られず、ミエリン抗原およびα−グリコシルセラミド誘導体の双方をＤＣに付与することによりはじめて得られる抑制効果である。その抑制効果は、α−グリコシルセラミド誘導体を単体で全身投与した場合を上回る。
また、ウシ由来ＩＩ型コラーゲンおよびα−グリコシルセラミド誘導体を付与したＤＣの投与により、関節リウマチのモデルであるＩＩ型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の症状が顕著に抑制されることを見出した。
さらに、本発明者らは、特定抗原とα−グリコシルセラミド誘導体とを付与したＤＣの投与により、前記抗原に特異的な細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導が抑制されることを見出した。
すなわち、本発明者らは、抗原と共にα−グリコシルセラミド誘導体を付与したＤＣの投与により、ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫応答を抑制的に制御することが可能であることを見出した。
さらに、本発明者らは、抗原を付与したＤＣとα−グリコシルセラミド誘導体を付与したＤＣとを組み合わせて投与することにより、ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞の免疫応答を抑制的に制御することが可能であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
従って、本発明の目的は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞およびその製造方法、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる細胞混合物、ならびに前記樹状細胞または前記細胞混合物を含む医薬組成物を提供することにある。
そして、本発明による樹状細胞は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示するものである。
さらに、本発明による製造方法は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片とα−グリコシルセラミド誘導体とを提示する樹状細胞を製造する方法であって、樹状細胞をα−グリコシルセラミド誘導体の存在下で培養する工程を含んでなるものである。
さらに、本発明による細胞混合物は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる細胞混合物であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなるものである。
さらに、本発明による医薬組成物は、本発明による樹状細胞または本発明による細胞混合物を含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患を治療するための医薬組成物である。
本発明によれば、Ｔ細胞が関与する免疫応答を病因とする種々の疾患に対して、新たな治療法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＫＲＮ７０００とＭＯＧペプチド抗原を付与したＤＣの投与によるＥＡＥ発症の抑制効果を示す。
図２は、ＫＲＮ７０００とＭＯＧペプチド抗原を付与したＤＣの投与により、ＥＡＥ発症に伴う体重減少が抑制されたことを示す。
図３は、抗原付与したＤＣ投与による抗腫瘍効果とＫＲＮ７０００を付与したＤＣの投与による抗腫瘍効果の抑制効果を示す。
図４は、抗原付与したＤＣ投与による抗原特異的インターフェロンγの産生誘導とＫＲＮ７０００のＤＣへの付与による産生抑制を示す。
図５は、ＫＲＮ７０００と抗原を同時付与したＤＣの投与によるＩＩ型コラーゲン誘導関節炎の抑制効果を示す。
図６は、ＫＲＮ７０００と抗原を同時付与したＤＣの投与により、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎の発症に伴う体重減少が抑制されたことを示す。
図７は、ＥＡＥの誘導後に、ＫＲＮ７０００とＭＯＧペプチド抗原を同時付与したＤＣ、またはＫＲＮ７０００を付与したＤＣとＭＯＧペプチド抗原を付与したＤＣとの細胞混合物を投与した場合における、ＥＡＥの抑制効果を示す。
図８は、ＫＲＮ７０００とＭＯＧペプチド抗原を同時付与したＤＣ、またはＫＲＮ７０００を付与したＤＣとＭＯＧペプチド抗原を付与したＤＣとの細胞混合物の投与により、ＥＡＥ発症に伴う体重減少が抑制されたことを示す。
図９は、ＫＲＮ７０００とＯＶＡ抗原を同時付与したＤＣの投与による、ＯＶＡを抗原とする遅延型過敏症の発症抑制効果を示す。
［発明の具体的説明］
本発明による樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）では、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片と、α−グリコシルセラミド誘導体とが提示される。これにより、本発明によるＤＣは、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制することができる。前記Ｔ細胞は特に限定されるものではないが、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞とされる。
本発明による細胞混合物は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、上述のα−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなる。これにより、本発明による細胞混合物は、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制することができる。前記Ｔ細胞は特に限定されるものではないが、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞とされる。
一つの実施態様によれば、本発明による細胞混合物は、前記抗原断片を提示する樹状細胞（以下「特定抗原提示ＤＣ」という）と、前記α−グリコシルセラミド誘導体を提示する樹状細胞（以下「α−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣ」という）とを含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、本発明による細胞混合物は、特定抗原提示ＤＣおよび／またはα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣ、ならびに本発明によるＤＣを含んでなるものとされる。
また、本発明による細胞混合物に含まれるＤＣは、混合されることなく、組み合わせて用いることによっても、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制することができる。従って、本発明の他の態様によれば、抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答を抑制しうる樹状細胞の組み合わせ物が提供され、該組み合わせ物は、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される前記抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを含んでなる。前記Ｔ細胞は特に限定されるものではないが、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはＣＤ８陽性Ｔ細胞とされる。
一つの実施態様によれば、本発明による組み合わせ物は、特定抗原提示ＤＣと、α−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣとを含んでなるものとされる。他の実施態様によれば、本発明による組み合わせ物は、特定抗原提示ＤＣおよび／またはα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣ、ならびに本発明によるＤＣを含んでなるものとされる。
本発明においてＤＣ上に提示されるα−グリコシルセラミド誘導体は特に限定されるものではないが、好ましくは下記の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物とされる：
2004078957.tif 000003
（上記式中、
Ｒ１はＨまたはＯＨであり、
Ｘは７〜２７のいずれかの整数であり、
Ｒ２は下記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される置換基であり（ここで、Ｙは５〜１７のいずれかの整数である）：
（ａ）−ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｅ）−ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３、そして
Ｒ３〜Ｒ９は下記のｉ）またはｉｉ）で定義される置換基である：
ｉ）Ｒ３、Ｒ６、およびＲ８がＨのとき、
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000004
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ５はＯＨ、または下記基（Ｅ）および（Ｆ）：
2004078957.tif 000005
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ７は、ＯＨまたは下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000006
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ９はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、または下記基（Ａ’）〜（Ｄ’）：
2004078957.tif 000007
からなる群から選択される置換基である；
ｉｉ）Ｒ３、Ｒ６およびＲ７がＨのとき、
Ｒ４はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＣＨ３、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000008
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ５はＯＨ、または下記基（Ｅ）および（Ｆ）：
2004078957.tif 000009
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ８はＯＨ、または下記基（Ａ）〜（Ｄ）：
2004078957.tif 000010
からなる群から選択される置換基であり、
Ｒ９はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨまたは下記基（Ａ’）〜（Ｄ’）：
2004078957.tif 000011
からなる群から選択される置換基である）。
前記式（Ｉ）の化合物中、セラミド部分のＸは、好ましくは１１〜２５の整数である。また、Ｒ２におけるＹは、好ましくは９〜１７の整数、より好ましくは１１〜１５である。
式（Ｉ）のセラミド部分におけるＸおよびＲ２の好ましい組み合わせは、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す化合物、およびＸが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５である）を表す化合物である。
式（Ｉ）の糖部分におけるＲ３〜Ｒ９の好ましい組み合わせは、Ｒ３およびＲ６がＨを表し、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかの置換基を表し、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）もしくは（Ｆ）の置換基を表し、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｈ、または基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す化合物である。
更に好ましい組み合わせとしては、Ｒ３およびＲ６がＨであり、Ｒ４およびＲ５がＯＨであり、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨのいずれかを表し（但し、Ｒ７およびＲ８の両方が同一の基を表すことはない）、かつＲ９がＣＨ２ＯＨまたは基（Ａ’）〜（Ｄ’）のいずれかの置換基を表す化合物、およびＲ３、Ｒ６およびＲ８がＨであり、Ｒ４、Ｒ５およびＲ７がＯＨであり、かつＲ９がＣＨ２ＯＨである化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の好ましい例としては、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５の整数である）であり、Ｒ３およびＲ６がＨであり、Ｒ４がＯＨまたは基（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選択される基であり、Ｒ５がＯＨまたは基（Ｅ）および（Ｆ）からなる群から選択される基であり、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨであり（但し、両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨまたは基（Ａ’）〜（Ｄ’）からなる群から選択される基である化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の他の好ましい例としては、Ｘが９〜１３の整数であり、Ｒ２が置換基（ａ）（式中、Ｙは１１〜１５の整数である）であり、Ｒ３およびＲ６がＨであり、Ｒ４およびＲ５がＯＨであり、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨであり（但し、両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＨ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＯＨである化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の他の好ましい例としては、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５の整数である）であり、Ｒ３およびＲ６がＨであり、Ｒ４およびＲ５がＯＨであり、Ｒ７およびＲ８がそれぞれＨまたはＯＨであり（但し、両方が同一の基を表すことはない）、Ｒ９がＣＨ２ＯＨまたは基（Ａ’）〜（Ｄ’）からなる群から選択される基である化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の他の好ましい例としては、Ｘが２１〜２５の整数であり、Ｒ２が置換基（ｂ）（式中、Ｙは１１〜１５の整数である）であり、Ｒ３、Ｒ６、およびＲ８がＨであり、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ７がＯＨであり、Ｒ９がＣＨ２ＯＨである化合物が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物のさらに好ましい例としては、以下の化合物が挙げられる：
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール（ＫＲＮ７０００）、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール（ＡＧＬ−５１７）、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール（ＡＧＬ−５６３）、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（６’−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール（ＡＧＬ−５７１）、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（β−Ｌ−アラビノピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール（ＡＧＬ−５７７）、
Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−ヘキサコサノイル−１，３，４−オクタデカントリオール（ＡＧＬ−５８６）、
Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−ヘキサコサノイル−１，３，４−オクタデカントリオール（ＡＧＬ−５８４）、
Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→２）−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイル］−１，３，４−オクタデカントリオール（Ｓ１１４０Ｂ−９）、
Ｏ−β−Ｄ−ガラクトフラノシル−（１→３）−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイル］−１，３，４−オクタデカントリオール（７１９−７）、および
Ｏ−（Ｎ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシ−α−Ｄ−カラクトピラノシル−（１→３）−Ｏ−［α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）］−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→１）−（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−Ｎ−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイル］−１，３，４−オクタデカントリオール（ＳＴＬ−８）。
式（Ｉ）の化合物として特に好ましい化合物は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール（ＫＲＮ７０００）である。
式（Ｉ）の化合物は、薬学上許容される非毒性の塩であることができる。式（Ｉ）の化合物の塩としては、酸付加塩、例えば、無機酸（例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、オレイン酸、パルミチン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルタミン酸、パントテン酸、ラウリルスルホン酸、メタンスルホン酸およびフタル酸）との塩が挙げられる。また、式（Ｉ）の化合物は溶媒和物（例えば、水和物）であることができる。
式（Ｉ）の化合物は、α−グリコシルセラミドを合成するための合目的的な任意の方法により製造することができる。例えば、Ｄ−リキソースを出発物質としてセラミド部分を合成し、次いで、このセラミドに糖を導入することによって、式（Ｉ）の化合物を調製することができる。このようなα−グリコシルセラミドの一般的な合成方法については、例えば、ＷＯ９３／５０５５号、ＷＯ９４／２１６８号、ＷＯ９４／９０２０号、およびＷＯ９４／２４１４２号を参照することができる。また、式（Ｉ）の化合物は、天然物（生物等）からカラムクロマトグラフィー等によって単離および精製することもできる。
本発明においてＤＣ上に提示される抗原断片は、目的とする抗原特異的なＴ細胞依存性免疫応答において、Ｔ細胞に対して提示されるものである。従って、前記抗原断片は、目的とする免疫応答に応じて当業者により適宜決定されうる。例えば、自己免疫疾患における免疫応答を抑制する場合には、前記抗原断片は、その疾患と関連する組織または臓器に存在する抗原の断片とすることができる。移植片拒絶または移植片対宿主病における免疫応答を抑制する場合には、前記抗原断片は、必要に応じてドナーまたはレシピエント由来の抗原の断片とすることができる。アレルギー性疾患における免疫応答を抑制する場合には、前記抗原断片は、その疾患の原因となる外来性抗原または外来性物質によって修飾され、新規に抗原性を獲得した物質の断片とすることができる。
本発明に用いられるＤＣは特に限定されるものではないが、目的とする動物に由来するものとすることが好ましい。目的とする動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。ヒトＤＣの種類としては、好ましくは、ヒト単球由来ＤＣ（Ｂｗａｔｒｉｃｅ  Ｔｈｕｒｎｅｒ，Ｇｅｒｏｌｄ  Ｓｃｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９  １９０（１１）：１６６９−１６７８；Ａｘｅｌ  Ｈｅｉｓｅｒ，Ｅｌｉ  Ｇｉｌｂｏａ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００２，１０９（３）：４０９−４１７）、ヒト末梢血ＤＣ（Ｓｍａｌｌ  ＥＪ．，Ｌ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００，１８（２３）：３８９４−３９０３）、またはヒトＣＤ３４陽性細胞由来ＤＣ（Ｃａｕｘ  Ｃ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９７，９０（４）：１４５８−１４７０）とされる。
本発明に用いられるＤＣにおいては、前記抗原断片およびα−グリコシルセラミド誘導体は、それぞれＭＨＣ分子およびＣＤ１ｄ分子に提示されていることが好ましい。
本発明によるＤＣは、体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）において製造されるものである。そして、本発明によれば、本発明によるＤＣを製造する方法が提供され、該方法は、樹状細胞をα−グリコシルセラミド誘導体の存在下で培養する工程を含んでなる。また、他の態様によれば、本発明によるＤＣを製造するための、α−グリコシルセラミド誘導体の使用が提供される。α−グリコシルセラミド誘導体の使用量は当業者により適宜決定されうるものであり、特に限定されないが、好ましくは１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度とされる。培養期間もまた当業者により適宜決定されうるものであり、特に限定されないが、好ましくは培養最終日を含む１〜１０日間とされる。
移植片拒絶反応や移植片対宿主病における免疫応答を抑制する場合には、既に必要な抗原を提示しているドナーまたはレシピエント由来の樹状細胞を用いて、それぞれレシピエントまたはドナーへ投与するための本発明によるＤＣを製造することができる。また、他の疾患における免疫応答を抑制する場合にも、既に必要な抗原を提示している患者由来の樹状細胞を用いて、その患者へ投与するための本発明によるＤＣを製造することができる。これらの場合には、本発明による製造方法において、α−グリコシルセラミド誘導体存在下での培養工程のみを実施すればよい。
本発明による製造方法はまた、必要に応じて、樹状細胞を上記抗原または上記抗原断片の存在下で培養する工程をさらに含んでなることもできる。必要な抗原を提示していない樹状細胞を用いて本発明によるＤＣを製造する場合には、この工程が必要となる。抗原または抗原断片の使用量は当業者により適宜決定されうるものであり、特に限定されないが、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１０μｇ〜２ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度とされる。培養期間もまた当業者により適宜決定されうるものであり、特に限定されないが、好ましくは培養最終日を含む１〜１０日間とされる。また、抗原または抗原断片に代えて、これをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡまたはこれらの改変体を用いることにより、樹状細胞に抗原断片を提示させてもよく、これは当業者に公知の方法によって行なうことができる。
上記２つの各工程における他の培養条件は、通常の細胞培養に用いられる条件であればよい。すなわち、培地への細胞または細胞画分の添加量、培養温度、ＣＯ２濃度、培養期間などの条件は、当業者が適宜設定することができる。培養温度は、好ましくは約３７℃とされる。また、必要に応じて、ＣＯ２濃度を調節してもよく、好ましくは約５％とすることができる。さらに、必要に応じて、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ（例えば１０ｎｇ／ｍＬ）、またはＦＣＳ（例えば１％）などを培地に添加してもよい。上記２つの工程の両方を行なう場合には、いずれの工程を先に行なってもよく、または同時に行なってもよい。
本発明に用いられる特定抗原提示ＤＣおよびα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣもまた、上述の方法と同様の方法により製造することができる。すなわち、特定抗原提示ＤＣは、例えば、樹状細胞を抗原または抗原断片の存在下で培養する上述の工程により製造することができる。また、α−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣは、例えば、樹状細胞をα−グリコシルセラミド誘導体の存在下で培養する上述の工程により製造することができる。
本発明によるＤＣは、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患を治療する目的で、細胞医療において利用することができる。従って、本発明によれば、治療上有効な量の本発明によるＤＣを被験者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法が提供される。被験者は、好ましくは哺乳動物とされ、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。前記Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞とされる。
さらに、本発明による細胞混合物および組み合わせ物もまた、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患を治療する目的で、細胞医療において利用することができる。従って、本発明によれば、治療上有効な量の本発明による細胞混合物を被験者に投与することを含んでなる、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法が提供される。さらに、本発明によれば、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療方法であって、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞とを、別々にまたは同時に、治療上有効な量で被験者に投与することを含んでなる方法が提供される。被験者は、好ましくは哺乳動物とされ、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物とされる。前記Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＣＤ８陽性Ｔ細胞とされる。一つの実施態様によれば、前記治療方法は、特定抗原提示ＤＣと、α−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣとを、別々にまたは同時に投与することを含んでなる。他の実施態様によれば、前記治療方法は、特定抗原提示ＤＣおよび／またはα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣ、ならびに本発明によるＤＣを、別々にまたは同時に投与することを含んでなる。本発明の好ましい実施態様によれば、これらのＤＣは同時に投与される。
Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患は、好ましくは、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主病、およびアレルギー性疾患からなる群より選択される疾患とされる。自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変）、乾癬、突発性血小板減少性紫斑病、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群（例えば、糸球体腎炎）、悪性貧血、橋本病、尋常性白斑、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症などが挙げられる。アレルギー性疾患としては、例えば、接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息などが挙げられる。遅延型過敏反応（ＤＴＨ反応）は、典型的なＴｈ１応答であり、臓器特異的自己免疫疾患における慢性炎症のベースとなる反応と考えられている。Ｔｈ１免疫応答が関与する臓器特異的自己免疫疾患としては、主として多発性硬化症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎、自己免疫性心筋炎、クローン病が挙げられ、アレルギーとしては、接触過敏症などが挙げられる。
本発明によるＤＣは、細胞医療の分野において一般に用いられる投与経路および治療上有効量で投与することができる。よって、投与経路は特に限定されるものではないが、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与とされる。治療上有効量もまた特に限定されるものではなく、被験者の状態、例えば、患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して適宜決定されるが、ＤＣ画分換算で、好ましくは５×１０５〜１０９個、より好ましくは０．５〜６０×１０６個、さらに好ましくは２〜２０×１０６個とされる。投与の時期もまた特に限定されるものではなく、免疫応答の生じる前または後、上記疾患が発症する前または後など、どの時期でもよいが、好ましくは寛解期とされる。特に臓器または組織の移植に伴う移植片拒絶および移植片対宿主病の治療については、発症が予想される処置以前での投与が好ましい。
本発明による細胞混合物または本発明による組み合わせ物に含まれるＤＣの投与経路および投与の時期は、本発明によるＤＣについて上述したとおりである。また、治療上有効量も特に限定されるものではなく、被験者の状態、例えば、患者の年齢、体重、性別、疾患の相違、症状の程度などを考慮して適宜決定されるが、投与されるＤＣ上に提示されている抗原断片およびα−グリコシルセラミド誘導体の合計量が、本発明によるＤＣについて上述した量と同等となるように設定することが好ましい。例えば、特定抗原提示ＤＣとα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣとの組み合わせを投与する場合には、それぞれのＤＣの投与量は、ＤＣ画分換算で、好ましくは５×１０５〜１０９個、より好ましくは０．５〜６０×１０６個、さらに好ましくは２〜２０×１０６個とされる。また、本発明によるＤＣを併せて投与する場合には、特定抗原提示ＤＣとα−グリコシルセラミド誘導体提示ＤＣの投与量は、上記のそれぞれの投与量から本発明によるＤＣの投与量を差し引いた量とすることが好ましい。
また、本発明によれば、上記の疾患の治療用医薬の製造のための、本発明によるＤＣの使用が提供される。
さらに、本発明によれば、上記の疾患の治療用医薬の製造のための、本発明による細胞混合物の使用が提供される。
さらに、本発明によれば、上記の疾患の治療用医薬の製造のための、本発明による組み合わせ物の使用、すなわち、Ｔ細胞に依存する免疫応答に起因する疾患の治療用医薬の製造のための、前記免疫応答において前記Ｔ細胞に対して提示される抗原の抗原断片を少なくとも提示する樹状細胞と、α−グリコシルセラミド誘導体を少なくとも提示する樹状細胞との組み合わせの使用が提供される。
さらに、本発明によれば、本発明によるＤＣを含んでなる、上記疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、本発明による細胞混合物を含んでなる、上記疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
これらの医薬組成物は、上述の投与経路および投与量に応じて、または細胞医療における周知技術に従い、当業者によって適宜製造されうる。
【実施例】  以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１：免疫調節性ＤＣの自己免疫疾患モデルに対する作用
１−１：骨髄細胞からのＤＣの誘導および分離
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨を摘出し、ハンクス液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を２５Ｇの注射針をつけたシリンジから注入することにより骨髄細胞を洗出した。これを、塩化アンモニウム緩衝液（ＳＩＧＭＡ）を用いて溶血し、赤血球を除去した。次いで、これをヒトγグロブリン（ＳＩＧＭＡ）でコートしたプレートに播種し、通常の培養条件下にてインキュベートすることによりＦｃレセプター発現細胞を除去し、ＤＣの前駆細胞を濃縮した。これを、ＧＭ−ＣＳＦ（ＫＩＲＩＮ）（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（１０％）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＳＩＧＭＡ）（１０ｍＭ）および２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）（５０μＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁し、２４ウェルプレート上、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下で培養した。培養開始２日後および４日後に、以下の培地交換および細胞濃縮操作を行った。培地交換は、パスツールピペットを用いて、細胞をウェル中で穏やかに懸濁し、細胞中の集合塊（ｃｌｕｓｔｅｒ）が沈んだ瞬間に上清の４分の３を除去し、サイトカインを含む新鮮な上記培地を添加することにより行なった。培養開始６日後、上清の除去までは同様に行い、残りの細胞をすべて回収し、これをＤＣ画分とした。このＤＣ画分に磁気ビーズ標識抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を加えた後、磁気細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）によりＤＣを分離した。
１−２：改変ＤＣの調製
上記１−１において分離されたＤＣを、ミエリン・オリゴデンドロサイト糖蛋白の第３５〜５５残基に相当するペプチド（ＭＯＧ；アミノ酸配列：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）（１０μＭ）およびＫＲＮ７０００（１００ｎｇ／ｍＬ）の一方または両方を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含む）中、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下でさらに２日間の培養（付与）を行うことにより、改変ＤＣを得た。なお、ＭＯＧは、後に実験的自己免疫性脳脊髄炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）を惹起するための免疫の際に用いる抗原である。
１−３：得られたＤＣの性状解析
上記１−１および１−２により得られた細胞について、以下の抗体を用いた染色およびフローサイトメーターを用いた解析により、それがＤＣであることを確認した。具体的には、マウスＤＣに特異的なマーカーであるＣＤ１１ｃを以下の方法により染色し、解析を行った。抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、またはそのアイソタイプコントロールとなるハムスターＩｇＧ（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を洗浄緩衝液（２％ＦＣＳ／０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中に懸濁した細胞に５μｇ／ｍＬで添加し、４℃で３０分間反応させ、洗浄し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて解析した。前記細胞のいずれについても、ＣＤ１１ｃ陽性細胞が９７％以上であり、ほとんどがＤＣであることが確認された。その割合は、ＭＯＧまたはＫＲＮ７０００の添加によっても変化が認められなかった。また、抗ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａ）抗体および抗ＣＤ８６抗体を用いた蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による解析により、前記細胞のほとんどがＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａ）陽性およびＣＤ８６陽性であることを確認した。
１−４：ＥＡＥに対する作用
上記１−１および１−２により得られたＤＣは、ＥＡＥを誘導するための抗原免疫の前（７、５および３日前の３回；図１Ａ）、またはその１日後（図１Ｂ）に投与した。実験群として、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）投与群、無処理ＤＣ投与群、ＫＲＮ７０００付与ＤＣ投与群、ＭＯＧ付与ＤＣ投与群、ＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣ投与群を設け、各種ＤＣ投与群については上記２種類の時期に投与を行う群をそれぞれ設定した。ＰＢＳ投与群のマウスには、抗原免疫の前後におけるＤＣ投与の何れの日にもＰＢＳを投与した。
ＥＡＥは、９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾根部皮内に抗原（ＭＯＧ）エマルジョンを２００μＬ投与し、その翌日に、４００ｎｇの百日咳毒素（Ｐｅｒｔａｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ：生化学工業）を腹腔内投与することにより誘導した。各群には９から１０匹のマウスを使用した。抗原エマルジョンは、マウス１匹当たり２００μｇのＭＯＧおよび６００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）が投与されるように調製した生理食塩液と、等量のフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）とを混合して調製した。
抗原免疫日を０日目として、その後の体重変化およびＥＡＥ症状の観察を３週間実施した。ＥＡＥ症状は、０＝無症状、１＝尾の随意運動性の低下、２＝正向反射の不全、３＝中等度後肢麻痺、４＝完全後肢麻痺、５＝四肢麻痺、および６＝死亡、の６段階で評価し、スコア化した。
その結果を、図１および図２ならびに表１に示す。表１は、ＥＡＥの症状状況に関する各種パラメータ（平均累積ＥＡＥスコア（ＡＵＣ）、平均発症日、平均最高スコアおよび発症率）の数値を示す。
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ＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣ投与群において、何れの時期に投与を行った場合においてもＥＡＥの発症や症状の抑制が認められ、その効果はＥＡＥ誘導前３回のＤＣ投与を行なった群においてより顕著であった（図１および表１）。また、ＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣ投与群のＥＡＥ抑制効果は、ＥＡＥに随伴する体重減少の抑制を伴い（図２）、ＰＢＳ投与群と比較して、平均累積ＥＡＥスコア（ＡＵＣ：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）のみでなく、平均最高スコア、発症頻度（ＥＡＥ誘導前３回投与群のみ）の項目において有意な差を示した（表１）。なお、ＥＡＥ誘導前３回投与を行ったＭＯＧ付与ＤＣ投与群においても、平均累積ＥＡＥスコアの有意な抑制がみられたが、その程度はＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣ投与群にはおよばなかった（表１）。
例２：免疫調節性ＤＣの細胞傷害性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導抑制作用
２−１：ＯＶＡペプチドを抗原として処理したＤＣの調製
上記１−１により得られたＤＣを、さらにＧＭ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。この２日間の培養の間に、ＫＲＮ７０００を添加する群と非添加群を設定した。成熟したＤＣは、培地を１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、合成したＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＥＬ）（Ｑｕｉａｇｅｎ社製）を添加し、同条件で４時間培養した。４時間後に回収した成熟ＤＣはＰＢＳを用いて洗浄し、その濃度を５×１０５個／ｍＬに調整した。
２−２：ＯＶＡペプチドを抗原として処理したＤＣによる癌治療効果に対するＫＲＮ７０００の影響
上記２−１により得られたＤＣは、マウス１匹当たり１Ｘ１０５個／２００μＬとなるようＰＢＳに懸濁し、マウスに静脈内注射した。さらに７日後に、Ｅ．Ｇ７（ＯＶＡ遺伝子でトランスフェクトしたＥＬ−４細胞）またはコントロールとしてのＥＬ−４細胞をマウスの右腹部に皮下注射し、その後の腫瘍の容積を経時的に測定した。腫瘍の容積は、腫瘍の縦×横×高さ／２として算出した。
その結果、ＯＶＡペプチドのみを付与したＤＣを投与したマウスの群では、腫瘍の増殖が著しく阻害されたのに対し、ＫＲＮ７０００およびＯＶＡペプチドを付与したＤＣを投与した群については、未処理の群と同等の腫瘍増殖がみられ、著しい腫瘍増殖抑制効果の阻害が観察された（図３）。
２−３：ＯＶＡペプチドを抗原として用いたペプチド特異的ＩＦＮγ産生誘導に対する影響
上記２−１により得られたＤＣを投与したマウスから経時的（３、５、７および９日後）に脾臓リンパ球を採取した。脾臓は、ＲＰＭＩ１６４０培地中で膨潤させた後、スライドガラスで押しつぶし、得られた細胞はＮＨ４Ｃｌを含む緩衝液で溶血して脾臓リンパ球とした。これをクリック培地（Ｃｌｉｃｋｓ’  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｒｖｉｎｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）中に懸濁し、ＯＶＡペプチドを添加し、または添加しない条件下で３日間培養した後、上清中のＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡ法により測定した。
その結果、ＯＶＡペプチドのみを付与したＤＣを投与したマウスでは、投与５日後をピークとしたＯＶＡペプチド特異的なＩＦＮγ産生が観察されたが、ＫＲＮ７０００およびＯＶＡペプチドを同時付与したＤＣを投与したマウスでは、ＯＶＡペプチド特異的なＩＦＮγ産生が抑制されていた（図４）。
例３：マウスのＩＩ型コラーゲン誘導関節炎に対する作用
マウスＤＣの誘導および分離は、例１−１の通りに行った。
分離されたＤＣを、予め９５℃〜１００℃で１０分間ボイルしておいたウシ由来ＩＩ型コラーゲン（Ｋ−４１，コラーゲン技術研修会）（１ｍｇ／ｍＬ）およびＫＲＮ７０００（１００ｎｇ／ｍＬ）の一方または両方を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含む）中、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下でさらに２日間の培養（付与）を行うことにより、改変ＤＣを得た。なお、ウシ由来ＩＩ型コラーゲンは、後にＩＩ型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を惹起するための免疫の際に用いる抗原である。
実験には、一群あたり１０匹の雄性ＤＢＡ／１ＪＮＣｒｊマウス（１１週齢）（日本チャールスリバー社）を用いた。まず、５ｍＬのウシ由来ＩＩ型コラーゲン０．３％含有溶液（Ｋ−４１，コラーゲン技術研修会）、１５ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ）、２．５ｍＬの生理食塩液（大塚製薬工業）および７．５ｍＬの不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ）の混合溶液からエマルジョンを調製し、これを抗原エマルジョンとした。次に、０．１ｍＬの前記抗原エマルジョンを、マウスの尾根部皮内に、３週間の間隔で２回投与することにより、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を誘導した。マウスに対するＤＣ（１×１０６細胞／マウス）の尾静脈内への投与は、初回抗原投与の１日後に行った。
２回目の抗原投与の日を０日目として、その後のマウスの体重変化および関節炎症状の観察を実施した。関節炎症状は、０＝正常（変化なし）、１＝１指または足が腫脹（あるいは明らかな発赤）、２＝２指以上が腫脹（あるいは明らかな発赤）もしくは軽度の足全体の明らかな腫脹、３＝足全体の明らかな腫脹（中等度）、４＝足全体が高度に腫脹し、かつ関節の可動性に障害が見られる、の４段階で評価し、４肢についての合計値をＣＩＡスコアとした（最高スコアは１６）。
その結果を、図５および図６に示す。ＫＲＮ７０００およびＫ−４１同時付与ＤＣ投与群において、関節炎の症状（平均累積ＣＩＡスコア（ＡＵＣ））の有意な抑制が認められた（図５）。また、ＫＲＮ７０００およびＫ−４１同時付与ＤＣ投与の関節炎抑制効果には、関節炎に随伴する体重減少の抑制が伴っていた（図６）。
例４：ＫＲＮ７０００を付与したＤＣとＭＯＧペプチドを付与したＤＣとの混合投与による実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の発症抑制効果。
例１−２の通りに調製したＤＣを、ＥＡＥ誘導のための抗原免疫の２日後に投与した。実験群として、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）投与群、ＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣを投与する２用量群（５×１０５細胞／マウスおよび１×１０６細胞／マウス）、ならびにＫＲＮ７０００付与ＤＣ（５×１０５細胞／マウス）とＭＯＧ付与ＤＣ（５×１０５細胞／マウス）との混合投与群を設け、いずれも静脈内投与を行った。
ＥＡＥは、９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾根部皮内に抗原（ＭＯＧ）エマルジョンを２００μＬ投与し、その翌日に、４００ｎｇの百日咳毒素（Ｐｅｒｔａｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ：生化学工業）を腹腔内投与することにより誘導した。各群には９から１０匹のマウスを使用した。抗原エマルジョンは、マウス１匹当たり２００μｇのＭＯＧおよび６００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）が投与されるように調製した生理食塩液と、等量のフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）とを混合して調製した。
抗原免疫日を０日目として、その後の体重変化およびＥＡＥ症状の観察を３週間実施した。ＥＡＥ症状は、０＝無症状、１＝尾の随意運動性の低下、２＝正向反射の不全、３＝中等度後肢麻痺、４＝完全後肢麻痺、５＝四肢麻痺、および６＝死亡、の６段階で評価し、スコア化した。
その結果を、図７および図８ならびに表２に示す。表２は、ＥＡＥの症状状況に関する各種パラメータ（平均累積ＥＡＥスコア（ＡＵＣ）、平均発症日、平均最高スコアおよび発症率）の数値を示す。
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ＫＲＮ７０００およびＭＯＧ同時付与ＤＣ投与群において、投与細胞数に依存的な有意なＥＡＥ発症の抑制が認められ、さらに、ＫＲＮ７０００付与ＤＣとＭＯＧ付与ＤＣとの混合投与群においても有意なＥＡＥの発症および症状の抑制効果が認められた（図７）。これらのＥＡＥ抑制効果は、ＰＢＳ投与群と比較して、平均累積ＥＡＥスコア（ＡＵＣ：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）のみでなく、平均発症日、平均最高スコアおよび発症率の項目において有意なＥＡＥ発症抑制効果を示した（表２）。また、このＥＡＥ抑制効果は、ＥＡＥに随伴する体重減少の抑制を伴っていた（図８）。
例５：ＯＶＡを抗原として用いた遅延性過敏反応（ＤＴＨ反応）に対する、ＫＲＮ７０００とＯＶＡとを同時付与したＤＣの投与による発症抑制効果
上記１−１において分離されたＤＣを、ＯＶＡ（２ｍｇ／ｍＬ）およびＫＲＮ７０００（１００ｎｇ／ｍＬ）の一方または両方を含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含む）中、３７℃、５．０％ＣＯ２の条件下でさらに２日間の培養（付与）を行うことにより、改変ＤＣを得た。なお、ＯＶＡは、後に遅延性過敏反応（ＤＴＨ反応）を惹起するための免疫の際に用いる抗原である。
次いで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＫＲＮ７０００付与ＤＣまたはＫＲＮ７０００およびＯＶＡ抗原同時付与ＤＣ（１．５×１０６個／マウス）を、ＯＶＡ免疫の７日前、５日前、および３日前に３回静脈内投与した。対照群にはＰＢＳ（ＰＢＳ群）あるいは何も付与していないＤＣ（無処理ＤＣ群）を同様に投与した。本実験では、以上の対照群のほかに、ＯＶＡ非感作群を設けた。また、陽性対照群としてプレドニゾロン投与群（酢酸プレドニゾロン（塩野義製薬）の０．２ｍｇ／マウスを、免疫後９日目、１０日目、および１１日目に腹腔内投与）を設けた。ＯＶＡ非感作群には５匹、その他の群には１０匹のマウスを供した。
ＯＶＡを抗原とするＤＴＨ反応は、１００μｇのニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ社）に加えて作製したエマルジョンを、第０日目に、マウスの背部皮内に免疫することによって感作し、第１０日目に、ＰＢＳで溶解した１０μｇ／２０μＬのＯＶＡ溶液を耳介に投与することによって惹起した。その翌日に、エーテル麻酔下において、ＯＶＡを投与した部分を中心とした直径５ｍｍのマウス耳介を皮膚生検用パンチにて打ち抜いて採取し、電子天秤にてその重量を測定し、得られた測定値をＤＴＨの程度を表す指標とした。
以上の実験を実施した結果、ＫＲＮ７０００およびＯＶＡ抗原同時付与ＤＣ投与群において耳介腫脹の有意な抑制効果が認められ、その効果は、陽性対照であるプレドニゾロンによる抑制効果と同等以上であった（図９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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