(57)【要約】本発明は、ヒト末梢血単核球であるＣＤ１４陽性細胞からランゲルハンス細胞を調製するための方法を提供を目的とする、ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項２】
ヒト末梢血単核球のノッチにノッチリガンドを用いてノッチシグナルを伝達させ、かつ該単核球をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項３】
ノッチリガンドを培養用容器に固相化しておくことを特徴とする、請求項１または２記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項４】
ノッチリガンドが他のペプチドとの融合ペプチドを構成し、培養用容器に該他のペプチドに対する抗体を固相化し、ノッチリガンドが該抗体と前記他のペプチドの結合を介して培養用容器に固相されている、請求項３記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項５】
他のペプチドがｍｙｃである請求項４記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項６】
ノッチリガンドが、Ｄｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−２、Ｄｅｌｔａ−３、Ｄｅｌｔａ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２からなる群から選択される請求項１から５のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項７】
ノッチリガンドがＤｅｌｔａ−１である請求項６記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項８】
ヒト末梢血単核球が単離されたＣＤ１４陽性細胞である、請求項１または２に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項９】
ランゲルハンス細胞表面に、Ｅ−カドヘリン、ランゲリンおよびＣＣＲ６が発現されていることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項１０】
さらに、ランゲルハンス細胞表面に、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が発現されていることを特徴とする請求項９記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の調製方法で調製したランゲルハンス細胞にＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−α及びＬＰＳからなる群から選択される一種以上を添加して、さらに培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項１２】
ランゲルハンス細胞が未成熟なものである、請求項１から１０のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項１３】
ランゲルハンス細胞が成熟なものである、請求項１から１１のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法で調製されたランゲルハンス細胞。
【請求項１５】
Ｅ−カドヘリン、ランゲリンおよびＣＣＲ６が細胞表面に発現されている請求項１４記載のランゲルハンス細胞。
【請求項１６】
さらに、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が細胞表面に発現されている請求項１５記載のランゲルハンス細胞。
【請求項１７】
ヒト末梢血単核球由来である、Ｅ−カドヘリン、ランゲリン、ＣＣＲ６、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が表面に発現されているランゲルハンス細胞。
【請求項１８】
未成熟細胞である、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞。
【請求項１９】
成熟細胞である、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれか１項に記載のランゲルハンス細胞を含む医薬組成物。
【請求項２１】
癌または感染症治療薬である請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ランゲルハンス細胞が成熟細胞である、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
細胞、臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に用いられる、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ランゲルハンス細胞が未成熟細胞である、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ヒトから採取した末梢血単核球を、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、癌または感染症治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項２６】
ヒトから採取した末梢血単核球を、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、癌、感染症、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項２７】
ノッチリガンドが、Ｄｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−２、Ｄｅｌｔａ−３、Ｄｅｌｔａ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２からなる群から選択される請求項２５または２６に記載の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
【請求項２８】
ノッチリガンドがＤｅｌｔａ−１である請求項２７記載の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；ＤＣ）の一亜型である表皮ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ；ＬＣ）の培養に関し、ヒト末梢血単核球であるＣＤ１４陽性細胞からノッチリガンド（Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ）Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βを用いてランゲルハンス細胞を調製する方法に関する。該細胞は、癌、感染症、移植片拒絶、移植片対宿主病、自己免疫疾患あるいはアレルギー性疾患などの治療剤に利用することができる。
【背景技術】  樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ；ＤＣ）は、Ｔ細胞を介する初期免疫応答を惹起する最も強力な抗原提示細胞である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：２７１−２９６，１９９１；Ｃａｕｘ  Ｃら，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １６：２−５，１９９５；Ｈａｒｔ  ＤＮＪ、Ｂｌｏｏｄ  ９０：３２４５−３２８７，１９９７；Ｃｅｌｌａ  ＭＦら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１０−１６，１９９７；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２，１９９８；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７６７−８１１，２０００）。皮膚の表皮に存在するＤＣの一亜型である表皮ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｃｅｌｌｓ；ＬＣ）は、細胞表面にランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＣＲ６を発現し、細胞内にはＢｉｒｂｅｃｋ顆粒を保持するなどの特徴を持つ（Ｓｃｈｕｌｅｒ  Ｇ（ｅｄ．）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  Ｃｅｌｌｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９１；Ｖａｌｌａｄｅａｕ  Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１−８１，２０００；Ｔａｎｇ  Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：８２−８５，１９９３；Ｇｒｅａｖｅｓ  ＤＲら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８６：８３７−８４４，１９９７）。ＬＣは皮膚に侵入した様々な異物に対する適切な免疫反応を引き起こす。具体的には、ＬＣは皮膚に侵襲した病原体や腫瘍細胞などの異物を取り込んだ後、所属リンパ節に移動し、そこでプロセッシングした抗原をｎａｉｖｅ  Ｔ細胞あるいはメモリーＴ細胞に提示し、それらを初期活性化あるいは再活性化し、異物に由来する抗原に対する特異的免疫応答を効果的に誘導する。活性化されたＴ細胞が異物の侵襲した組織に浸潤し、それらの除去を進行させ、過度の組織傷害から組織を防御している。
ヒトのＬＣは、再生不良性貧血に対する同種骨髄移植における観察において、移植を受けた患者さんの皮膚のＬＣが骨髄の提供者（ドナー）と同じ組織適合抗原を表現していたことから、骨髄細胞由来であると考えられていた（Ｖｏｌｃ−Ｐｌａｔｚｅｒ  Ｂら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１０：１１２３−１１２４，１９８４）。これまでのｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験においては、臍帯血あるいは末梢血のＣＤ３４陽性造血前駆細胞をｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＭ−ＣＳＦ）  ＋  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）の存在下に培養すると、培養細胞の一部はＬＣに分化していることが報告されており（Ｃａｕｘ  Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８−２６１，１９９２；Ｃａｕｘ  Ｃら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：６９５−７０６，１９９６；Ｓｔｒｕｎｋ  Ｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：１２９２−１３０２，１９９６）、ＬＣは造血幹細胞由来であることが示されていた。しかしながら、造血幹細胞からＬＣまでの分化経路およびそれらの制御機構については未だ十分に明らかにされていない。また、ヒト末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ４（ＩＬ−４）  ＋  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）、ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βなどの造血因子の組み合わせで培養すると、一部の細胞はＬＣに分化すると報告されているが（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：９６１−９６６，１９９８；Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ  Ｍら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１０１３−１０２０，２００１；Ｇｕｉｒｏｎｎｅｔ  Ｇら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１：８４５−８５３，２００２）、これらの造血因子の存在下におけるＬＣへの分化は十分なものとは言い難い。一方、皮膚の真皮などには、ＬＣとは異なる骨髄系ＤＣである真皮ＤＣ（ｄｅｒｍａｌ  ＤＣ）が存在しており、これらのｄｅｒｍａｌ  ＤＣはヒト末梢血単球からＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４によって分化誘導される（Ｒｏｍａｎｉ  Ｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：８３−９３，１９９４；Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７９：１１０９−１１１８，１９９４）。造血系を含め様々な組織の発生や分化に重要な役割をしていることが明らかにされてきているＮｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄの一つであるＤｅｌｔａ−１が（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７５：４４９−４５９，２００２；Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４：１４３−１５０，２００３）、ヒト末梢血単球あるいは骨髄由来のＣＤ３４陽性細胞からのｄｅｒｍａｌ型ＤＣの分化に関わっていることも報告されている（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１４０２−１４０７，２００１）。このように、造血幹細胞からＤＣへの分化は、多種類のサイトカインや他の因子からなるネットワークにより制御されていると推察される。
【発明の開示】
ヒト末梢血単核球であるＣＤ１４陽性細胞からランゲルハンス細胞を調製するための方法を提供する。
本発明者等は、抗原提示能を有する樹状細胞の一亜型であるランゲルハンスを細胞生物学的研究やＤＣを用いたワクチン細胞療法の開発に利用すべく、該細胞の培養分化方法について鋭意検討を行った。従来より、ランゲルハンス細胞を培養により得る試みは為されていたが、細胞の発現抗原から考え、ランゲルハンス細胞と言える細胞は得られていなかった。
本発明者等は、ノッチリガンド（Ｎｏｔｃｈ  ｌｉｇａｎｄ）Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βを用いた動物細胞培養培地にてヒト末梢血単核球であるＣＤ１４陽性細胞を培養することにより、ランゲルハンス細胞が得られることを見出し、本発明のランゲルハンス細胞の調製方法を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法、
［２］  ヒト末梢血単核球のノッチにノッチリガンドを用いてノッチシグナルを伝達させ、かつ該単核球をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法、
［３］  ノッチリガンドを培養用容器に固相化しておくことを特徴とする、［１］または［２］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［４］  ノッチリガンドが他のペプチドとの融合ペプチドを構成し、培養用容器に該他のペプチドに対する抗体を固相化し、ノッチリガンドが該抗体と前記他のペプチドの結合を介して培養用容器に固相されている、［３］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［５］  他のペプチドがｍｙｃである［４］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［６］  ノッチリガンドが、Ｄｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−２、Ｄｅｌｔａ−３、Ｄｅｌｔａ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２からなる群から選択される［１］から［５］のいずれかのランゲルハンス細胞の調製方法、
［７］  ノッチリガンドがＤｅｌｔａ−１である［６］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［８］  ヒト末梢血単核球が単離されたＣＤ１４陽性細胞である、［１］または［２］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［９］  ランゲルハンス細胞表面に、Ｅ−カドヘリン、ランゲリンおよびＣＣＲ６が発現されていることを特徴とする［１］から［８］のいずれかのランゲルハンス細胞の調製方法、
［１０］  さらに、ランゲルハンス細胞表面に、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が発現されていることを特徴とする［９］のランゲルハンス細胞の調製方法、
［１１］  ［１］から［１０］のいずれかの調製方法で調製したランゲルハンス細胞にＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−α及びＬＰＳからなる群から選択される一種以上を添加して、さらに培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法、
［１２］  ランゲルハンス細胞が未成熟なものである、［１］から［１０］のいずれかのランゲルハンス細胞の調製方法、
［１３］  ランゲルハンス細胞が成熟なものである、［１］から［１１］のいずれかのランゲルハンス細胞の調製方法、
［１４］  ［１］から［１３］のいずれかの方法で調製されたランゲルハンス細胞、
［１５］  Ｅ−カドヘリン、ランゲリンおよびＣＣＲ６が細胞表面に発現されている［１４］のランゲルハンス細胞、
［１６］  さらに、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が細胞表面に発現されている［１５］のランゲルハンス細胞、
［１７］  ヒト末梢血単核球由来である、Ｅ−カドヘリン、ランゲリン、ＣＣＲ６、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が表面に発現されているランゲルハンス細胞、
［１８］  未成熟細胞である、［１５］から［１７］のいずれかのランゲルハンス細胞、
［１９］  成熟細胞である、［１５］から［１７］のいずれかのランゲルハンス細胞、
［２０］  ［１４］から［１９］のいずれかのランゲルハンス細胞を含む医薬組成物、
［２１］  癌または感染症治療薬である［２０］の医薬組成物、
［２２］  ランゲルハンス細胞が成熟細胞である、［２１］の医薬組成物、
［２３］  細胞、臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に用いられる、［２０］の医薬組成物、
［２４］  ランゲルハンス細胞が未成熟細胞である、［２３］の医薬組成物、
［２５］  ヒトから採取した末梢血単核球を、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、癌または感染症治療用ランゲルハンス細胞の調製方法、
［２６］  ヒトから採取した末梢血単核球を、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、癌、感染症、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法、
［２７］  ノッチリガンドが、Ｄｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−２、Ｄｅｌｔａ−３、Ｄｅｌｔａ−４、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２からなる群から選択される［２５］または［２６］に記載の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法、ならびに
［２８］  ノッチリガンドがＤｅｌｔａ−１である［２７］の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−２７７８９２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｄｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でのＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−βによりＣＤ１４陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。
図２は、Ｄｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でのＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５によりＣＤ１４陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。
図３は、Ｄｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でのＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βによりＣＤ１４陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。
図４は、Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導されたＬＣ様細胞中のＣＤ１ａ陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとＣＣＲ６の発現の解析の結果を示す図である。
図５は、Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導された細胞の抗原提示機能関連分子の発現の解析の結果を示す図である。
図６は、ＣＤ１４陽性細胞におけるＤｅｌｔａ−１によるＨＥＳ−１遺伝子の発現亢進を示す図である。
図７は、培養細胞の電子顕微鏡像を示す写真である。
図８は、ＬＣのＦＩＴＣ−デキストランの取り込みの検討の結果を示す図である。
図９は、ＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αにより成熟したＬＣのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３の発現を示す図である。
図１０は、ＣＤ１４陽性細胞から生成された成熟ＬＣのペプチド特異的ＣＤ８陽性細胞の活性化を示す図である。
図１１は、成熟ＬＣと成熟ＤＣによる自己ＣＤ４陽性細胞の刺激の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】１．ランゲルハンス細胞の調製
本発明は、ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法である。
ヒト末梢血単核球は、ヒトから採取した血液から公知の方法で得ることができる。例えば、ヒトから末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ等を用いた比重遠心法で得ることができる。本発明においてはヒト末梢血単核球のうちのＣＤ１４陽性細胞を用いる。該ＣＤ１４陽性細胞は、公知の方法で単離することができ、例えばＭＡＣＳ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いればよい。ランゲルハンス細胞の調製に用いるＣＤ１４陽性細胞の純度は、９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上である。用いる細胞が単球であるかどうかは、例えば非特異的エステラーゼ染色を行うことにより判断することができる。
本発明の方法においては、このようにしてヒト末梢血単核球より得られたＣＤ１４陽性細胞をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βで処理する。処理とはＣＤ１４陽性細胞をこれらの化合物と接触させることをいい、ＣＤ１４陽性細胞の培養時にこれらの化合物を添加して培養を行えばよい。この際、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βのいずれもＣＤ１４陽性細胞の培養用培地に溶解状態で添加させればよいが、ノッチリガンドは後述のように培養に用いる容器の内表面等に固相化させて細胞と接触させるのが望ましい。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）は細胞が有する細胞の分化に関連するシグナル伝達に関与するたんぱく質であり、ノッチリガンドがノッチに結合することでノッチが活性化される。ノッチリガンドにはデルタ（Ｄｅｌｔａ）とジャグド（Ｊａｇｇｅｄ）があり、それぞれＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−２、Ｄｅｌｔａ−３およびＤｅｌｔａ−４ならびにＪａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２と呼ばれるホモローグが存在する（Ｍｕｍｍ  ＪＳら．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２２８，１５１−１６５，２０００）。本発明においてはこれらのいずれのノッチリガンドも用いることができ、また今後発見されるノッチリガンドも含まれる。この中でも特にＤｅｌｔａ−１が好ましい。ノッチリガンドまたはノッチリガンドをコードするＤＮＡは、Ｄｅｌｔａ−１を発現しているヒト由来の細胞、例えばケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）より遺伝子増幅法により単離可能であり、また、既に報告されている配列情報（Ｇｒａｙ  ＧＥら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５４，７８５−７９３，１９９９）を基に合成することもできる。
ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βは天然のものリコンビナントのものいずれを用いてもよい。公知の遺伝子配列情報から容易に作製することもできるし、市販品を用いてもよい。
培養用培地は通常動物細胞の培養に用いられる培地を用いればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ等がある。培地には必要に応じて、ＦＣＳ等の動物血清、糖、アミノ酸、抗生物質等を添加する。無血清培地あるいはヒト由来血清、血漿あるいはその成分をＦＣＳ等の動物血清の代わりに用いた培養液が望ましい。培養用容器も通常細胞培養に用いる容器を用いればよく、培養規模に応じてプレート、ディッシュ、フラスコ等を用いればよい。なお、後述のようにノッチリガンドを培養容器内面に固相化して用いる場合は、培養容器はタンパク質等の固相化に適したポリスチレン製容器やアミノ基等の適当な官能基を結合させた容器を用いるのが好ましい。また、採血用バッグを用いて行ってもよい。
培養形式は、限定されず回分培養、連続培養いずれの形式で行ってもよい。
培養時のヒト末梢血から得られたＣＤ１４陽性細胞の密度は、１×１０４〜１×１０７個／ｍＬ、好ましくは１×１０５〜１×１０６個／ｍＬである。
ヒト末梢血から得られたＣＤ１４陽性細胞を培養する際の、ＧＭ−ＣＳＦ濃度は、１０〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましく、ＴＧＦ−βは１〜１００ｎｇ／ｍＬが好ましい。
ノッチリガンドは、前述のように培養容器の内表面等に固相化して用いるのが好ましい。また、培養容器内表面だけではなく、ポリスチレンビーズ等の粒子上に固相化し、細胞培養時に培養系に該固相化粒子を添加してもよい。
ノッチリガンドの固相化は直接ノッチリガンドを容器内面等に固相化してもよいが、スペーサー等を介して固相化するのが望ましい。スペーサーは限定されないが、アミノ酸数個から十数個からなるペプチドを用いるのが望ましい。スペーサーに用いるペプチドとして、ｍｙｃタンパク質、Ｖ５タンパク質、６×Ｈｉｓ等のポリヒスチジン等を用いることができる。これらのスペーサーとノッチリガンドを結合させるが、結合方法は限定されず、これらのペプチドをコードするＤＮＡとノッチリガンドをコードするＤＡＮをインフレームで融合させ、適当な宿主細胞に導入し、リコンビナント融合タンパク質として発現させればよい。ＤＮＡの融合方法、遺伝子組み換えタンパク質の産生は公知の方法で行うことができ、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ及びＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｃ（１９８８）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ等の当業者に良く知られた文献に記載された方法に従って行えばよい。本発明において、ノッチリガンド単体ではなく他のペプチドが結合している場合であっても、細胞を培養した際にノッチリガンドが細胞にノッチシグナルを伝達する限り、ノッチリガンドで細胞を処理するという。また、１分子のノッチリガンドに結合させるペプチドは１分子に限らない。ペプチド分子の数が多くなると、ノッチリガンドの固相化密度が高くなり、ノッチリガンドの作用が増強される。ペプチドは１個から数十個、好ましくは１個から１５個を連結させたものを用いる。
あらかじめこれらのスペーサー用ペプチドに結合する特異的抗体を培養用容器内表面等に結合させ、スペーサーペプチドと抗体を結合させることにより、間接的にノッチリガンドを培養用容器内表面等に結合させればよい。抗体と培養用容器内表面等とは、物理的吸着によって結合させてもよいし、特定の官能基を利用した化学的結合によってもよく、公知の方法で行うことができる。ノッチリガンドの容器内表面等への結合密度に限定はなく、用いるプレートやバッグ等によって結合性が異なり、適宜決定することができる。ノッチリガンドの固相化密度が大きくなればなるほど、ノッチリガンドの細胞に対する作用が大きくなるので、固相化密度は大きいほうが望ましい。例えば、培養にポリスチレン製のプレートを用い、ノッチリガンドＤｅｌｔａ−１を６分子のｍｙｃタンパク質と融合させて用いる場合、培養用容器に１μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの濃度の抗ｍｙｃ抗体を入れ固相化すればよい。
ヒト末梢血から得たＣＤ１４陽性細胞のノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下での培養は、１日から１０日間程度、例えば６日間行えばよく、その間適宜培地の一部または全部を交換する。この際、培養細胞の表面抗原の発現をＦＡＣＳ等で調べることにより、ランゲルハンス細胞が得られる培養期間を適宜決定することができる。
このようにヒト末梢血から得た末梢血単核球よりＣＤ１４陽性細胞を単離し、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することによりランゲルハンス細胞を調製することができる。ここで、ノッチリガンドにより細胞を処理することにより、ノッチリガンドが細胞が元々有するノッチに結合し、細胞にノッチシグナルを伝達する。すなわち、細胞をノッチリガンドで処理することは、細胞のノッチにノッチリガンドを用いてノッチシグナルを伝達させることを意味する。
得られた細胞がランゲルハンス細胞であるかどうかは、細胞の表面抗原を調べればよく、本発明の方法で調製されるランゲルハンス細胞においては、細胞表面にＥ−カドヘリン、ランゲリン、およびＣＣＲ６が発現している。さらに、本発明の方法で調製されるランゲルハンス細胞の表面には、ＭＨＣクラスＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０およびＣＤ８６が発現されている。これらの抗原が発現されているかどうかは、これらの抗原に対する抗体であって、発色酵素、蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等により決定することができる。例えば、これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、表面抗原の有無を決定することができ、また該抗体を結合させた磁性ビーズを用いても決定することができる。また、ＦＡＣＳまたはフローサイトメーターを用いても表面抗原があるかどうか決定することができる。ＦＡＣＳ、フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
なお、本発明の方法により成熟したランゲルハンス細胞も未成熟のランゲルハンス細胞も得られる。
ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養する方法によっては、主に未成熟のランゲルハンス細胞が得られ、さらに成熟化させて成熟ランゲルハンス細胞を得ることができる。免疫応答刺激のためには、成熟ランゲルハンス細胞を用いることが好ましい。
未成熟のランゲルハンス細胞を成熟させるための因子として、樹状細胞を成熟させるために通常用いられている因子を用いることができ、例えばＴＮＦ−α、ＬＰＳ、ＩＬ−１β等のＩＬ−１、ＩＬ−６、ＰＧＥ２等のプロスタグランジン、ＩＮＦ−α、β、γ、ＣＤ４０リガンド等またはこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
未成熟のランゲルハンス細胞を成熟させるための因子としての適当な濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲が挙げられる。例えば、ＴＮＦ−α濃度は１〜２００ｎｇ／ｍＬが好ましく、ＣＤ４０リガンド濃度は０．１〜１０μｇ／ｍＬが好ましく、ＬＰＳ濃度は０．１〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましい。
本発明は、またヒト末梢血単核球を上記の方法によりノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することにより得られるランゲルハンス細胞をも包含する。該ランゲルハンス細胞等は、上記のような表面抗原を発現している。
２．ランゲルハンス細胞の利用
本発明は上記の方法により得られたランゲルハンス細胞を含む医薬組成物をも包含する。本発明のランゲルハンス細胞は、細胞療法に用いることができ、本発明のランゲルハンス細胞を含む医薬組成物は細胞療法に用いるための医薬組成物として利用することができる。
該医薬組成物は、癌やＡＩＤＳ等の感染症の治療、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患等の治療に用いることができる。特に成熟したランゲルハンス細胞は、免疫増強作用を有しているため癌やＡＩＤＳ等の感染症の治療に適しており、未成熟のランゲルハンス細胞は、反対に免疫抑制作用を有しているため、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患等の治療に適している。また、本発明のランゲルハンス細胞、特に未成熟のランゲルハンス細胞は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変）、乾癬、突発性血小板減少性紫斑病、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群（例えば、糸球体腎炎）、悪性貧血、橋本病、尋常性白斑、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症のような自己免疫疾患、あるいは接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息のようなアレルギー性疾患等の治療に用いることもできる。
癌や感染症の治療に用いる場合、本発明のランゲルハンス細胞を成熟させた後、そのまま用いるか、あるいは患者の末梢血を共培養することにより得られるＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）を利用することもできる。
本発明のランゲルハンス細胞に対象疾患によって適宜選択された抗原を付与するが、付与は数日間の期間、タンパク質抗原の場合、１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度でｉｎ  ｖｉｔｒｏで付与すればよい。
本発明のランゲルハンス細胞を含む医薬組成物を治療に用いる場合、０．５×１０６〜１０９を、静脈内あるいは皮下、皮内で投与すればよい。また、患者への投与に関しては随時におこなえる。特に臓器・組織移植に伴う移植片拒絶、移植片対宿主病については、発症が予想される処置以前での投与が好ましい。ランゲルハンス細胞の投与時期、投与量は、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の状態等に応じて適宜決定することができる。
さらに、本発明は、ヒトから採取した末梢血単核球を、ノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することを含む、癌、感染症、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患治療用ランゲルハンス細胞の調製方法を含む。この方法により得られた治療用ランゲルハンス細胞により、上記のように各種疾患の治療を行うことができる。細胞は、治療目的によって患者本人の細胞あるいは患者本人以外の細胞を適宜選択して用いる。
従って、本発明はさらに、上記のランゲルハンス細胞を用いて癌またはＡＩＤＳ等の感染症、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患等を治療する方法を提供する。
本発明はさらに、ランゲルハンス細胞により癌またはＡＩＤＳ等の感染症、細胞、臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患等を治療するための医薬品の製造における、上記のヒト抗原提示細胞の使用を提供する。
以下に、本明細書における参考文献を示す。
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さらに、本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  ランゲルハンス細胞の調製
本実施例において、用いた培養液と試薬は以下の通りである。
培養液は２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０（日水製薬、東京）を使用し、牛胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）を１０％で添加した。ＧＭ−ＣＳＦはキリンビール（東京）、ＩＬ−４は小野薬品（大阪）から供与を受けた。ＴＧＦ−βとＩＬ−１５はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入した。ＧＭ−ＣＳＦは１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４は１０ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βは１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５は１０ｎｇ／ｍｌで使用した。
Ｄｅｌｔａ−１の固相化は、以下のようにして行った。
Ｄｅｌｔａ−１はこれまでに報告してきた方法で培養用プレートに固相化した（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１４０２−１４０７，２００１；Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２８４７−２８５４，２０００；Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１０：１１６５−１１７４，２００２）。まず、マウス抗ｍｙｃ抗体Ｆ（ａｂ’）２断片をＰＢＳにて５〜１０μｇ／ｍｌの濃度に調整し、２４ウェル組織培養用プレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に１〜２時間３７℃で添加し固相化した。ＰＢＳで洗浄した後、非特異的結合をブロックするために２〜１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０を培養用プレートへ３０分３７℃で添加し、その後、ヒトＤｅｌｔａ−１の細胞外ドメインと６個のｍｙｃ蛋白からなるＤｅｌｔａ−１コンストラクトを加えて固相化した。Ｄｅｌｔａ−１コンストラクトは、遺伝子導入したＮＳＯ細胞株の上清から精製した。Ｄｅｌｔａ−１コンストラクトのコントロールとして、遺伝子改変してないＮＳＯ細胞株の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を用いた（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１４０２−１４０７，２００１；Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２８４７−２８５４，２０００）。
使用した抗体および入手先は以下の通りである。
使用したモノクローナル抗体：ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１ａ抗体，ＰＥ−抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）；ＰＥ−抗ＣＤ１４抗体，ＰＥ−抗ＣＤ８０抗体，ＰＥ−抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰＥ−抗Ｌａｎｇｅｒｉｎ（ＣＤ２０７）抗体，抗Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＥ−抗ＣＤ８６抗体，（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＦＩＴＣ−抗ＣＣＲ６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＨＴＣ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＩＴＣ−ｒａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１，ＰＥ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉａｍｉ，ＦＬ，ＵＳＡ）。
本実施例において用いた細胞の細胞分離は、以下のようにして行った。
同意を得た後、健常日本人より末梢血をヘパリン加採取した。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｍａ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いての比重遠沈法にて分離した。ＣＤ１４陽性細胞はＰＢＭＣｓよりＭＡＣＳ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて分離した（Ｍｉｔａｎｉ  Ｈら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０９：２８８−２９５，２０００；Ａｒａｋｉ  Ｈら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１４：６８１−６８９，２００１）。この方法で得られたＣＤ１４陽性細胞の純度は９５％以上である。非特異的エステラーゼ染色（武藤化学、東京）を施行すると、ＣＤ１４陽性細胞は非特異的エステラーゼ陽性であった。
得られたＣＤ１４陽性細胞を以下の方法により培養した。
ＣＤ１４陽性細胞は５×１０５個／ｍｌの濃度で、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０を用いて２４ウェル組織培養用プレートに培養した。培養液は３〜４日毎に交換した。このような条件で６日間培養後、位相差顕微鏡を用いて形態学的観察を行い、生細胞数はｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法で算定した。
細胞の評価のための細胞形質の解析は、以下の方法により行った。
細胞表面形質の検討は蛍光標識あるいは非蛍光標識モノクローナル抗体での単一あるいは二重染色で行い、分析はＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて施行した。データ解析にはＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフト（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使用した。染色方法は、細胞を２％ＡＢ型血清にて非特異的結合をブロックした後、各種抗体を４℃で３０分間添加して行った。Ｐｒｏｐｉｕｍｉｏｄｉｄｅ陽性細胞を死細胞として除去した。なお、Ｅ−カドヘリンとランゲリンの二重染色は、まず、抗Ｅ−カドヘリン抗体と反応させ、洗浄後ＦＩＴＣ−ラット抗マウスＩｇＧ１抗体を添加し、十分量のマウスＩｇＧ１でブロックした後、ＰＥ−抗ランゲリン抗体で染色した。
（１）  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−β存在化におけるＣＤ１４陽性細胞に対するＤｅｌｔａ−１の作用
Ｄｅｌｔａ−１のヒト末梢血単球からＬＣへの分化に及ぼす作用を検討するために、ＰＢＭＣｓより分離したＣＤ１４陽性細胞をあらかじめＤｅｌｔａ−１が固相化された。培養用プレートに、単球からＬＣへの分化を支持すると報告されているＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−β（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：９６１−９６６，１９９８）、ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５（Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ  Ｍら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１０１３−１０２０，２００１）、あるいはＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−β（Ｇｕｉｒｏｎｎｅｔ  Ｇら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１：８４５−８５３，２００２）の存在下に６日間培養し、細胞形態および表現形質を検討した。Ｄｅｌｔａ−１のコントロールとしては、方法に示した馴化培地を用いた。ＣＤ１４陽性細胞を２４ウェルプレートに５×１０５個／ｍｌの濃度でＤｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−βを添加して培養した。培養６日後に、細胞を回収し、図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色した。
図１に、Ｄｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でのＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−βによりＣＤ１４陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す。
ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−βで誘導された細胞は、形態学的にはＤＣ様で、ＣＤ１ａ陽性ＣＤ１４陰性でＥ−カドヘリンを発現していたが、ランゲリンを発現していなかった。また、Ｄｅｌｔａ−１を添加しても形態学的には変化はみられなかったが、Ｅ−カドヘリンの発現は若干増強された（図１）。図１中、白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。結果は数回の実験の内の代表的な１つからのものである。
（２）  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５存在化におけるＣＤ１４陽性細胞に対するＤｅｌｔａ−１の作用
次に、Ｄｅｌｔａ−１のＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５存在下におけるＣＤ１４陽性細胞に対する作用を検討した。ＣＤ１４陽性細胞を２４ウェルプレートに５×１０５個／ｍｌの濃度でＤｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５を添加して培養した。培養６日後に、細胞を回収し、図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色した。図２に結果を示す。白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。結果は数回の実験の内の代表的な１つからのものである。ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５で誘導された細胞は、形態学的はマクロファージ様であり、表面形質ではＣＤ１ａ弱陽性ＣＤ１４弱陽性で、Ｅ−カドヘリンとランゲリンはともに陰性であった。Ｄｅｌｔａ−１の添加により、ＣＤ１ａの発現は誘導されランゲリンの発現も軽度に誘導されたが、Ｅ−カドヘリンの発現は誘導されなかった。
（３）  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−β存在化におけるＣＤ１４陽性細胞に対するＤｅｌｔａ−１の作用
ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−β存在化におけるＣＤ１４陽性細胞に対するＤｅｌｔａ−１の作用についても検討した。ＣＤ１４陽性細胞を２４ウェルプレートに５×１０５個／ｍｌの濃度でＤｅｌｔａ−１存在下あるいは非存在下でＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βを添加して培養した。培養６日後に、細胞を回収し、図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色した。図３に結果を示す。白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。結果は数回の実験の内の代表的な１つからのものである。ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導された細胞はマクロファージ様の形態を示し、ＣＤ１ａ陰性ＣＤ１４陽性であり、Ｅ−カドヘリンとランゲリンはともに陰性であった。興味深いことに、Ｄｅｌｔａ−１の添加によりＣＤ１４が発現されたまま、ＣＤ１ａの発現が強く誘導され、Ｅ−カドヘリンとランゲリンともに陽性となった。
（４）  Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導されたＬＣ様細胞のＣＤ１ａ陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとＣＣＲ６の発現
Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導された細胞がＬＣであることを検討するために、ＣＤ１ａ陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽性細胞におけるＥ−カドヘリンとＣＣＲ６の発現を検討した。ＣＤ１４陽性細胞を２４ウェルプレートに５×１０５個／ｍｌの濃度でＤｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βを添加して培養した。培養６日後に、細胞を回収し、抗ＣＤ１ａ抗体と抗ランゲリン抗体あるいは抗Ｅ−カドヘリン抗体、抗ランゲリン抗体と抗Ｅ−カドヘリン抗体あるいは抗ＣＣＲ６抗体で染色し、解析結果をドットプロットで示した。図４に結果を示す。結果は数回の実験の内の代表的な１つからのものである。ＣＤ１ａ陽性細胞の８１％の細胞がランゲリン陽性で、６０％の細胞がＥ−カドヘリン陽性であった。また、ランゲリン陽性細胞の７８％の細胞がＥ−カドヘリン陽性で、５８％の細胞がＣＣＲ６陽性であった。５×１０５個のＣＤ１４陽性細胞から２．１±０．７ｘ１０５（ｎ＝５）の細胞が回収された。
（５）  Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導されたＬＣ様細胞の抗原提示機能関連分子の発現
Ｄｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βで誘導されたＬＣ様細胞の抗原提示機能関連分子の発現をランゲリン陽性細胞分画で検討した。ＣＤ１４陽性細胞を２４ウェルプレートに５×１０５個／ｍｌの濃度でＤｅｌｔａ−１  ＋  ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βを添加して培養した。培養６日後に、細胞を回収し、抗ランゲリン抗体と図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色し、ランゲリン陽性細胞におけるそれぞれの抗原分子の発現を解析した。結果を図５に示す。白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。結果は数回の実験の内の代表的な１つからのものである。ランゲリン陽性分画の細胞は主要組織適合抗原（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）のクラスＩ、クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲや共刺激分子（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であるＣＤ８０、ＣＤ８６を発現していた。
上記（１）から（５）の検討の結果より以下の事柄が判明した。
ＤＣは皮膚においては表皮と真皮に存在しており、それぞれＬＣとｄｅｒｍａｌ  ＤＣと呼ばれている（Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：２７１−２９６，１９９１；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７６７−８１１，２０００）。古くからＤＣは単球／マクロファージ系の細胞であると理解されていたが、マウスの骨髄細胞の培養系においてＧＭ−ＣＳＦ存在下に形成される穎粒球およびマクロファージからなるコロニーの内にＤＣの存在が示されたことで、ＤＣが単球／マクロファージ系に属する細胞であることが確認された（Ｉｎａｂａ  Ｋら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７６：１６９３−１７０２，１９９２）。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養系において、ヒトの臍帯血あるいは末梢血などのＣＤ３４陽性細胞からのＬＣの誘導や末梢血ＣＤ１４陽性細胞からのｄｅｒｍａｌ  ＤＣの誘導が可能となったことにより、ヒトの骨髄系ＤＣに関する細胞生物学は飛躍的に進歩し、それらに対する理解も深められた（Ｃａｕｘ  Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８−２６１，１９９２；Ｃａｕｘ  Ｃら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：６９５−７０６，１９９６；Ｓｔｒｕｎｋ  Ｄら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：１２９２−１３０２，１９９６；Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：９６１−９６６，１９９８；Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ  Ｍら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１０１３−１０２０，２００１；Ｇｕｉｒｏｎｎｅｔ  Ｇら，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１：８４５−８５３，２００２）。培養系の経時的な観察から、ＬＣは造血前駆細胞からＣＤ１ａ陽性ＣＤ１４陰性細胞を経て、分化した細胞と認識され、ＣＤ１４陽性の単球／マクロファージとは系列を異にする細胞群と考えられてきた（Ｃａｕｘ  Ｃら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：６９５−７０６，１９９６）。しかしながら、いくつかのサイトカインの組み合わせにより、末梢血ＣＤ１４陽性単球からＬＣ様細胞が誘導できるとの報告がなされ、もう１つのＬＣへの分化経路の可能性が提示された（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：９６１−９６６，１９９８；Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ  Ｍら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１０１３−１０２０，２００１；Ｇｕｉｒｏｎｎｅｔ  ＧらＤｅｚｕｔｔｅｒ−Ｄａｍｂｕｙａｎｔ  Ｃら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１：８４５−８５３，２００２）。
ＬＣはケラチノサイトとともに表皮に存在していること、さらにケラチノサイトはＣＤ１４陽性単球やｄｅｒｍａｌ  ＤＣの分化に影響を与えているＤｅｌｔａ−１を発現していることから（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋら、Ｂｌｏｏｄ  ９８：１４０２−１４０７，２００１；Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２８４７−２８５４，２０００；Ｌｏｗｅｌｌ  Ｓら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １０：４９１−５００，２０００）、我々はこれまで報告されているＣＤ１４陽性単球からＬＣを誘導する培養系におけるＤｅｌｔａ−１の作用について検討してみた。ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４＋ＴＧＦ−βあるいはＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−４  ＋  ＴＧＦ−Ｂ  ＋  Ｄｅｌｔａ−１の存在下にＣＤ１４陽性単球を培養すると、得られた細胞にはＥ−カドヘリンは発現されていたもののランゲリンの発現は全く見られなかった。Ｃ−ｔｙｐｅのレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）であるしランゲリンはＢｉｒｂｅｃｋ穎粒と密接に関連した分子であり、ＬＣに特異性が高いことから（Ｖａｌｌａｄｅａｕ  Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１−８１，２０００）、この分子が発現されていない細胞はＬＣの特性を十分に保持しているとは言い難い。ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＩＬ−１５で得られた細胞はＥ−カドヘリンとランゲリンが陰性であり、それにＤｅｌｔａ−１を加えた培養で得られた細胞はランゲリンを軽度に発現していたが、Ｅ−カドヘリンは陰性であり、いずれの細胞もＬＣの特性を持ちあわせていないと考えられた。ＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βを添加した培養で得られた細胞もランゲリンだけでなくＥ−カドヘリンも陰性であり、同様のことが言えよう。現時点で、これまでの報告（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：９６１−９６６，１９９８；Ｍｏｈａｍａｄｚａｄｅｈ  Ｍら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９４：１０１３−１０２０，２００１；Ｇｕｉｒｏｎｎｅｔ  Ｇら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１：８４５−８５３，２００２）と我々の実験結果の違いは説明できず、今後の検討が必要であると考えている。しかしながら、驚いたことにＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−βにＤｅｌｔａ−１を加えた培養では、５０％以上の細胞にＥ−カドヘリンとランゲリンの発現が見られ、ランゲリン陽性細胞のかなりの部分がＥ−カドヘリンも発現していた。さらには、ランゲリン陽性細胞の約半分の細胞には、未熟なＬＣに発現しそれら真皮への遊走に関連すると言われているケモカインｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３α（ＭＩＰ−３α）の受容体であるＣＣＲ６（Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒ  ＡＳら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９０：１７５５−１７６８，１９９９）も発現されていた。これらのことから、ＣＤ１４陽性単球からＧＭ−ＣＳＦ  ＋  ＴＧＦ−β  ＋  Ｄｅｌｔａ−１で誘導された細胞はＬＣであることが示唆された。また、これらの細胞がヒトＭＨＣのクラスＩ、クラスＩＩ分子あるＨＬＡ−ＡＢＣ，ＨＬＡ−ＤＲや共刺激分子であるＣＤ８０，ＣＤ８６を発現していたことは、これらの細胞には抗原提示能があることが示唆される。
ケラチノサイトはＤｅｌｔａ−１を発現しているだけでなく（Ｌｏｗｅｌｌ  Ｓら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １０：４９１−５００，２０００）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βも分泌している（Ｌｕｇｅｒ  ＴＡら、Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ  １３：５−１０，１９９６）。すなわち、我々がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ１４陽性単球からＬＣを誘導した培養系はｉｎ  ｖｉｖｏでの皮膚環境に近いものと思われ、生体内でも末梢血のＣＤ１４陽性単球が真皮を通して表皮に入り、ケラチノサイトが分泌あるいは発現するＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、Ｄｅｌｔａ−１に触れ、ＬＣに分化すると推測できる。真皮に存在する、付着性、表現型、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒに対する反応性などが単球／マクロファージ系細胞とは異なったＣＤ１４陽性のＬＣ前駆細胞についての報告があるが（Ｌａｒｒｅｇｉｎａ  ＡＴら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：１１５１−１１５８，２００１）、我々がＣＤ１４陽性細胞から誘導したＬＣ様細胞もＣＤ１４陽性であり、これらの２つの細胞群の関連性が注目される。
実施例２  調製したランゲルハンス細胞の特性分析
実施例２において用いた試薬および抗体は以下の通りであった。
ＣＤ４０リガンドはＢｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から購入した。ＴＮＦ−αは大日本製薬（吹田）から、ＩＬ−２は武田薬品工業（大阪）より供与された。ＣＤ４０リガンドは、１μｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αは２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２は２０ＩＵ／ｍｌで使用した。使用したモノクローナル抗体は、ＰＥ−抗ＣＤ４０抗体、ＰＥ−抗ＣＤ８３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＰＥ−抗ＣＤ５４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）であった。
末梢血からの、細胞分離は、以下の方法で行った。同意を得た後、健常日本人より末梢血をヘパリン加採取した。ＰＢＭＣｓはＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いての比重遠沈法にて分離した。ＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞はＰＢＭＣｓよりＭＡＣＳ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）にて分離した。この方法で得られたＣＤ８陽性細胞とＣＤ４陽性細胞の純度は９９％以上である。
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は以前報告されている方法に準じて施行した（Ｏｈｉｓｈｉ  Ｋ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１０：１１６５−１１７４，２００２）。分離されたばかりのＣＤ１４陽性細胞をＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βの存在下で２４時間培養し、これらの細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。用いたｐｒｉｍｅｒｓは以下のものである。ＨＥＳ−１  ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ，５’ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ３’（配列番号１）；ＨＥＳ−１  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ，５’ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣ  ３’（配列番号２）；ＨＥＳ−１  ｐｒｏｂｅ，５’（ＦＡＭ）−ＣＧＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＴＧ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号３）；ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ，ＧＡＰＤＨ，ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ，５’ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ３’（配列番号４）；ＧＡＰＤＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ，５’ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＴＣ  ３’（配列番号５）；ＧＡＰＤＨ  ｐｒｏｂｅ，５’（ＦＡＭ）−ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＧ  ＡＣ−（ＴＡＭＲＡ）３’（配列番号６）。増幅はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７，７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。
ＣＤ１４陽性細胞をＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βの存在下で６日間培養した後、２．５％グルタールアルデヒドで固定し、エタノールで脱水させた後、エポンに包埋した。切片をクエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色後、細胞をＪＥＭ−１２００ＥＸ電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、東京）で観察した。
誘導されたＬＣの貪食能は以下の方法で測定した。Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βの存在下で４日間、さらにＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αを加えて２日間培養して得られた２ｘ１０５個のＬＣを１０％ＦＣＳ  ＲＰＭＩ  １６４０に浮遊し、１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン（分子量４０，０００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と氷上あるいは３７℃で１時間反応させた。ＦＩＴＣ−デキストランの取り込み反応は冷却した１％ＦＣＳ  ＰＢＳで中断させ、その後、細胞を１％ＦＣＳ  ＰＢＳで４回洗浄した。ＦＩＴＣ−デキストランの取り込みはＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで測定した。
ＥＬＩＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｐｏｔ）法は以前報告されている方法を少し変更して施行した（Ｉｋｕｔａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９９：３７１７−３７２４，２００２）。成熟ＬＣはＣＤ１４陽性細胞をＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βの存在下に６日間培養し、後半の２日間はＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αを添加して調製した。９６ウェルのｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）に１０μｇ／ｍｌの抗インターフェロン−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ；Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を入れて、４℃にて一晩放置した。このプレートをＰＢＳで洗浄後、非特異反応をブロックするために、１０％ＡＢ型血清にて２時間３７℃で処理した。ＨＬＡ−ＡＯ２０１陽性の健常人から得られた  ２ｘ１０５個のＣＤ８陽性細胞に改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ  配列番号７）をパルスし、放射線照射（４６Ｇｙ）をされた４ｘ１０４個の成熟ＬＣとともに２４ウェルプレートに、１０％ＡＢ血清添加ＲＰＭＩ  １６４０で培養した。培養４日目と７日目にはＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）を添加した。これらのＣＤ８陽性細胞を培養１０日目に回収し、効果細胞として用いた。改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）をパルスしたあるいは何もパルスしていないＴ２細胞を標的細胞とした。１ｘ１０４個の効果細胞と５ｘ１０４個のｔａｒｇｅｔ細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレートに共培養した。１８時間後に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗インターフェロン−γ抗体（７−Ｂ６−１；Ｍａｂｔｅｃｈ）と２．５時間３７℃で反応させ、洗浄後、さらに１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（Ｍａｂｔｅｃｈ）と１．５時間反応させた。洗浄後、プレートをアルカリフォスファターゼ結合基質キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で染色し、顕微鏡下でスポット数を算定した。
成熟ＬＣによるＣＤ４陽性細胞の刺激は、以下の方法で行った。２ｘ１０５個の成熟ＬＣと２ｘ１０５個の自己ＣＤ４陽性細胞を抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１，０．５ｍｇ／ｍｌ；ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下に２４ウェルプレートに培養し、培養４日目にＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）を添加し、培養７日目にＣＤ４陽性細胞数を算定した。成熟ＬＣの代わりに、ＣＤ１４陽性単球からＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４とＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−αで誘導された成熟ＤＣを用いて、同様のことを施行した。
実施例２の検討により、以下の結果が得られた。
Ｄｅｌｔａ−１によるＨＥＳ−１遺伝子の発現
ＨＥＳ−１遺伝子はノッチシグナルの標的遺伝子として知られている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ  ＥＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３８２−３８６，１９９８、Ｓｔｒｕｈｌ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９３：６４９−６６０，１９９８）。そこで、Ｄｅｌｔａ−１がＬＣにノッチシグナルを伝達しているかどうかを確認するために、Ｄｅｌｔａ−１のＨＥＳ−１遺伝子発現に対する影響について検討した（図６）。培養系にＤｅｌｔａ−１が存在したときは、存在しないときに比べて、ＨＥＳ−１の発現は約８倍に増加していた。Ｄｅｌｔａ−１はＣＤ１４陽性細胞に作用していることが確認された。
図６は、ＣＤ１４陽性細胞におけるＤｅｌｔａ−１によるＨＥＳ−１遺伝子の発現亢進を示す。Ｄｅｌｔａ−１の存在下と非存在下のＨＥＳ−１遺伝子の発現を検討した。結果は、ＨＥＳ−１遺伝子発現のＧＡＰＤＨ遺伝子発現に対する比で表し、新鮮ＣＤ１４陽性細胞のＨＥＳ−１遺伝子の発現レベルを１．０として発現レベルを示した。２回の実験のうちの代表例を示す。
電子顕微鏡検査
細胞は細長い多数の細胞突起を有し、細胞質内にはＢｉｒｂｅｃｋ顆粒も含んでいた（図７）。
図７は、培養細胞の電子顕微鏡像を示し、左のパネルの元の倍率は８，０００倍でバーは２μｍであり、右のパネルの元の倍率は３０，０００倍でバーは０．５μｍである。
ＬＣの貪食能
ＣＤ１４陽性細胞からＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで調製されたＬＣの貪食能をＦＩＴＣ−デキストランの取り込みで検討した（図８）。ＬＣはＦＩＴＣ−デキストランを取り込んだ。生成されたＬＣには貪食能があることが明らかになった。
図８に、ＬＣのＦＩＴＣ−デキストランの取り込みの検討の結果を示す。Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで生成されたＣＤ１４陽性細胞由来のＬＣをＦＩＴＣ−デキストランと３７℃あるいは氷上で１時間反応させた。３回洗浄後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで解析した。同様の結果が３回の実験で得られた。
Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで生成されたＬＣの成熟
Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで生成されたＬＣがＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αに反応して、成熟するかどうかを検討した（図９）。ＣＤ１４陽性細胞をＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β存在下で６日間培養したが、後半の２日間にはＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αを添加した。得られた培養細胞のＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４の発現は著しく亢進し、ＣＤ８３の発現も認められるようになった。Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで生成されたＬＣは成熟できることが示された。
図９に、ＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αにより成熟したＬＣのＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３の発現を示す。ＣＤ１４陽性細胞をＤｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−βで培養し、培養４日目にＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αを追加添加し、６日目に細胞を回収した。ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８３の発現をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒで解析した。太い線が図に示した分子の発現を示しており、細い線がｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌを示している。同様の結果が５回の実験で得られている。
ＣＤ１４陽性細胞由来成熟ＬＣによるＣＤ８陽性細胞の刺激
ＣＤ１４陽性細胞から生成された成熟ＬＣの機能を検討するために、ＨＬＡ−ＡＯ２０１陽性の健常人より成熟ＬＣを調整し、それらにＨＬＡ−ＡＯ２０１に特異的に結合する改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）をパルスした。ペプチドをパルスした成熟ＬＣと共培養した自己ＣＤ８陽性Ｔ細胞を効果細胞として、同じ改変ペプチドをパルスしたＴ２細胞を標的細胞して反応させ、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ８陽性Ｔ細胞数をＥＬＩＳＰＯＴ法にて測定した。ペプチドをパルスした成熟ＬＣはＩＦＮ−γを産生する自己ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導した（図１０）。
図１０に示すように、ＣＤ１４陽性細胞から生成された成熟ＬＣはペプチド特異的ＣＤ８陽性細胞を活性化する。ＨＬＡ−ＡＯ２０１陽性の健常人由来のＣＤ１４陽性細胞より、Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−αを用いて成熟ＬＣを調製した。２ｘ１０５個の自己ＣＤ８陽性Ｔ細胞を４ｘ１０４個の改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）をパルスした成熟ＬＣで１０日間刺激した。その後、ＣＤ８陽性細胞を回収し、１ｘ１０４個のＣＤ８陽性細胞と改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）をパルスした５ｘ１０４個のＴ２細胞をＥＬＩＳＰＯＴ  ｐｌａｔｅに共培養した。１８時間後、インターフェロン−γを産生する自己ＣＤ８陽性Ｔ細胞数を算定した。それぞれのｂａｒは２つの測定値の平均を示している。２回の実験例を示す。
ＣＤ１４陽性細胞由来成熟ＬＣによるＣＤ４陽性細胞の刺激
ＣＤ１４陽性細胞から生成された成熟ＬＣの自己ＣＤ４陽性細胞の刺激能を検討した。成熟ＬＣあるいは成熟ＤＣとＣＤ４陽性細胞を抗ＣＤ３抗体存在下で培養し、刺激を受けたＣＤ４陽性細胞をＩＬ−２で増幅した。培養７日目にＣＤ４陽性細胞数を算定した。成熟ＬＣで刺激されたＣＤ４陽性細胞数の方が、成熟ＤＣで刺激されたＣＤ４陽性細胞数より有意に高かった（図１１）。
図１１は、成熟ＬＣと成熟ＤＣによる自己ＣＤ４陽性細胞の刺激の結果を示す。健常人由来のＣＤ１４陽性細胞より、Ｄｅｌｔａ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−αを用いて成熟ＬＣを、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−αを用いて成熟ＤＣを生成した。２ｘ１０５個の自己ＣＤ４陽性Ｔ細胞を２ｘ１０５個の成熟ＬＣあるいは成熟ＤＣで刺激した。培養４日目にＩＬ−２を添加した。培養７日目に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数を算定した。それぞれのｂａｒは４つの測定値の平均を示している。２回の実験のうちの代表例を示す。
実施例２の結果が示すように、Ｄｅｌｔａ−１がヒト末梢血ＣＤ１４陽性単球に作用していることをノッチシグナルの標的遺伝子であるＨＥＳ−１遺伝子の発現増強で確認した。生成されたＬＣを電子顕微鏡で観察すると、ＬＣに特異的なＢｉｒｂｅｃｋ顆粒が見られた。また、これらのＬＣには貪食能が認められた。ＬＣをＣＤ４０リガンドとＴＮＦ−αに反応させると、主要組織適合抗原（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）のクラスＩ、クラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲやｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分子であるＣＤ８０、ＣＤ８６および接着分子であるＣＤ４０、ＣＤ５４の発現が著しく亢進され、ＣＤ８３の発現が認められるようになり、生成されたＬＣは成熟能を有していることが示された。癌精巣（Ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ）抗原の１つであるＭｅｌａｎ−Ａ分子由来でＨＬＡ−ＡＯ２０１に対する結合モチーフを持つ改変Ｍｅｌａｎ−Ａ２６−３５ペプチド（Ａ２７Ｌ）（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）を用いて、成熟させたＬＣのＭｅｌａｎ−Ａ分子に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導能をｅｎｚｙｍｅｄ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ｓｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）法にて検討したところ、成熟ＬＣはＭｅｌａｎ−Ａ分子に対するＣＤ８陽性ＣＴＬを誘導した。また、ＬＣの自己ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する刺激能は、ヒト末梢血ＣＤ１４陽性単球からＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）とＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ−αで誘導された成熟樹状細胞（ＤＣ）と比べ高かった。
本研究は、ヒトのＬＣの新たな分化経路を確認した点で生物学的に重要であり、さらにはこれまで困難だったｅｘ  ｖｉｖｏおけるヒト末梢血ＣＤ１４陽性単球からのＬＣの効率的な誘導方法を確立した点でその意義は大きい。従来のＤＣを用いたワクチン細胞療法では、ヒト末梢血ＣＤ１４陽性単球からＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αなどによって誘導されるいわゆるｄｅｒｍａｌ型ＤＣが用いられてきているが、本研究で得られた知見を基盤にしたＬＣを用いた新たな免疫細胞療法の開発は、将来のワクチン細胞療法に飛躍的な発展をもたらす可能性がある。
【産業上の利用可能性】  ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＧＦ−βの存在下で培養することにより、従来達成できていなかった、ランゲルハンス細胞を調製することができる。該ランゲルハンス細胞は未成熟細胞または成熟細胞の状態で得ることができ、ワクチン細胞療法として、癌、感染症、細胞、臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に用いることができる。
本発明の方法で得られたランゲルハンス細胞をランゲルハンス細胞の細胞生物学的研究に用いることができる。また、本発明の方法で調製したランゲルハンス細胞をワクチン細胞療法に用いることができ、すなわち、癌、感染症、細胞、臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、移植片対宿主病の治療、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に利用することができる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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