(57)【要約】本発明は、単一分子で機能し、分枝鎖アミノ酸を中心とする中性アミノ酸を輸送する新規なアミノ酸トランスポーター及びその遺伝子を提供することを目的とする。  本発明は、配列番号２、４、６又は８で示されるアミノ酸配列からなるか、又は、配列番号２、４、６又は８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる、分枝鎖アミノ酸を中心とする中性アミノ酸及びその類似物質をナトリウム非依存的に輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質を提供する。  本発明はまた、配列番号１、３、５、あるいは７で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又はそれとハイブリダイズし得るＤＮＡからなる遺伝子であって、分枝鎖アミノ酸をナトリウム非依存的に輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）ないし（Ｈ）から選択されるタンパク質であって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
ヒト又はマウス由来である請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
【請求項３】
臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）ないし（ｈ）から選択されるＤＮＡであって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項６】
ヒト又はマウス由来である請求の範囲第５項に記載の遺伝子。
【請求項７】
臓器、組織、もしくは培養細胞由来である請求の範囲第５項に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求の範囲第４項〜第７項のいずれかに記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド。
【請求項９】
発現プラスミドである請求の範囲第８項に記載のプラスミド。
【請求項１０】
請求の範囲第８項又は第９項に記載のプラスミドで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１、３、５又は７で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチド。
【請求項１２】
ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである請求の範囲第１１項に記載のヌクレオチド。
【請求項１３】
ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用するものである請求の範囲第１１項に記載のヌクレオチド。
【請求項１４】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１５】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質を用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質あるいは阻害物質としての作用を検出する方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、正常細胞もしくは腫瘍細胞の増殖を制御する方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質の有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される薬物、毒物、あるいは外来性異物体内動態を変更する方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、該タンパク質を特定の細胞に過剰発現させるか、あるいはすでに細胞に存在する該タンパク質の有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態あるいは生体内代謝を変更する方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１３項に記載のヌクレオチドを用いて、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質の発現を変調させることにより、正常細胞もしくは腫瘍細胞の増殖を制御する方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１３項に記載のヌクレオチドを用いて、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質の発現を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される薬物、毒物、あるいは外来性異物体内動態を変更する方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１３項に記載のヌクレオチドを用いて、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質の発現を変調させることにより、該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態あるいは生体内代謝を変更する方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載のタンパク質に対する特異抗体、あるいは請求の範囲第１１項及び第１２項に記載のヌクレオチドを用いて、腫瘍細胞と正常細胞を区別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質のナトリウム非依存的な輸送に関与するタンパク質、及びそのタンパク質をコードする遺伝子に関する。
【背景技術】  細胞は、栄養としてアミノ酸を常時取り込むことを必要とするが、この機能は細胞膜に存在する膜タンパク質であるアミノ酸トランスポーターによって担われている。特に中性アミノ酸輸送系Ｌは、多くの必須アミノ酸の細胞への供給を担当することから、細胞栄養において最も重要な輸送機構のひとつであると同時に、腸管からの吸収、腎尿細管からの再吸収、血液・組織関門の通過においても重要な役割を果たしている。また、中性アミノ酸輸送系Ｌは、基質選択性が広いことから、中性アミノ酸類似物質もしくは中性アミノ酸類似の構造を有する薬物や毒物を輸送することでも知られていた。
中性アミノ酸輸送系Ｌは、もともとは、アミノ酸類似化合物２−Ａｍｉｎｏｂｉｃｙｃｌｏ−（２，２，１）−ｈｅｐｔａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＣＨ）によって特異的に抑制されるアミノ酸輸送系として、腫瘍細胞株で始めて記載され、その後、培養細胞、膜小胞標本、摘出臓器標本もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ標本を用いて検討されてきた［クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）著、フィジオロジカル・レビュー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９０年、第７０巻、第１号、ｐ．４３−７７］。中性アミノ酸輸送系Ｌは、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターである。その輸送基質選択性や輸送特性は、細胞や組織により差異があることが知られていた。
しかし、従来の方法では、中性アミノ酸及びその類似物質の輸送の詳細や、細胞の生存もしくは増殖に対する中性アミノ酸輸送系Ｌの役割を解析することは困難であり、中性アミノ酸輸送系Ｌの機能を担う中性アミノ酸トランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。
中性アミノ酸トランスポーターとしては、ナトリウム依存的なトランスポーターとして、ＡＳＣＴ１およびＡＳＣＴ２がクローニングされている［金井著、カレント・オピニオン・イン・セルバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９７年、第９巻、第４号、ｐ．５６５−５７２］。しかし、これらは、アラニン、セリン、システイン、スレオニン、グルタミンを主な基質とするものであり、中性アミノ酸輸送系Ｌとは基質選択性が異なっている。また、グリシントランスポーターとプロリントランスポーターがクローニングされているが、中性アミノ酸輸送系Ｌとは異なる［アマラ（Ａｍａｒａ）とクハール（Ｋｕｈａｒ）著、アニュアル・レビュー・オブ・ニューロサイエンス（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９３年、第１６巻、ｐ．７３−９３］。
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を１回しか持たない二型膜糖タンパク質であるｒＢＡＴ及び４Ｆ２ｈｃのｃＤＮＡがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させると中性アミノ酸とともに塩基性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている［パラシン（Ｐａｌａｃｉｎ）著、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４年、第１９６巻、ｐ．１２３−１３７］。
輸送系Ｌに相当するトランスポーターとして、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１［金井その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９９年、第２７３巻、第３７号、ｐ．２３６２９−２３６３２］及びＬＡＴ２［瀬川その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９９年、第２７４巻、第２８号、ｐ．１９７４５−１９７５１］がクローニングされている。両者は４Ｆ２ｈｃとヘテロ二量体を形成することにより機能するトランスポーターであり、両者ともにＮａ＋非依存的な輸送を示す。ＬＡＴ１はロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、ヒスチジンなど大型の中性アミノ酸を輸送する交換輸送活性を示し、ＬＡＴ２は、大型の中性アミノ酸に加えグリシン、アラニン、セリン、システイン、スレオニンなどの小型の中性アミノ酸も輸送とする広い基質選択性を有する。しかし、この２種の輸送系Ｌトランスポーターのみでは、全身の輸送系Ｌは説明できず、他の未同定の輸送系Ｌアイソフォームが存在すると想定されていた。
既知の輸送系ＬトランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２は、ＳＬＣ７ファミリーに属するヘテロ二量体型タンパク質であり、１回膜貫通型タンパク質である４Ｆ２ｈｃと連結することにより機能性のトランスポーターを形成する。すでに公開されたマウスゲノム及びヒトゲノムデータベースにおいて、ＳＬＣ７ファミリーの機能未同定のメンバーを探索したが、そのなかにはさらなる輸送系Ｌに相当する新規トランスポーターは見い出されなかった。従って、未同定の新たな輸送系Ｌトランスポーターは、ＳＬＣ７ファミリー以外のタンパク質である可能性が想定されていた。
さらに、中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１の類似蛋白質として、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送する輸送系ｙ＋Ｌの機能を有するｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２がクローニングされた［トレンツ（Ｔｏｒｒｅｎｔｓ）その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９８年、第２７３巻、第４９号、ｐ．３２４３７−３２４４５］。また、ｙ＋ＬＡＴ１、ｙ＋ＬＡＴ２共に補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することによってのみ機能することが示された。ｙ＋ＬＡＴ１とｙ＋ＬＡＴ２は、中性アミノ酸としてはグルタミン、ロイシン、イソロイシンを主に輸送し、中性アミノ酸に対する基質選択性は狭い。
さらに、芳香族アミノ酸を輸送する中性アミノ酸トランスポーターとして、輸送系Ｔに相当するアミノ酸トランスポーターＴＡＴ１［キムその他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第２７６巻、第２０号、ｐ．１７２２１−１７２２８］がクローニングされている。ＴＡＴ１は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸をＮａ＋非依存的に輸送するが、ロイシン、イソロイシン、バリン等の分枝アミノ酸は受け入れず、輸送系Ｌ特異的な抑制薬ＢＣＨによって抑制されず、アミノ酸輸送系Ｌとは異なっている。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては次のものがある。
１．クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）著、フィジオロジカル・レビュー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ）、１９９０年、第７０巻、第１号、ｐ．４３−７７
２．金井著、カレント・オピニオン・イン・セルバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９７年、第９巻、第４号、ｐ．５６５−５７２
３．アマラ（Ａｍａｒａ）とクハール（Ｋｕｈａｒ）著、アニュアル・レビュー・オブ・ニューロサイエンス（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９３年、第１６巻、ｐ．７３−９３
４．パラシン（Ｐａｌａｃｉｎ）著、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・バイオロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４年、第１９６巻、ｐ．１２３−１３７
５．金井その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９９年、第２７３巻、第３７号、ｐ．２３６２９−２３６３２
６．瀬川その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９９年、第２７４巻、第２８号、ｐ．１９７４５−１９７５１
７．トレンツ（Ｔｏｒｒｅｎｔｓ）その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９８年、第２７３巻、第４９号、ｐ．３２４３７−３２４４５
８．キムその他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００１年、第２７６巻、第２０号、ｐ．１７２２１−１７２２８
９．コール（Ｃｏｌｅ）その他著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９８年、第５１巻、第２号、ｐ．２８２−２８７
【発明の開示】
本発明の目的は、単一分子でナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸を輸送し、輸送系Ｌの機能を示すトランスポーター及びそのトランスポーターをコードする遺伝子を提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ヒトＦＬＣ４細胞由来ｍＲＮＡ及びそのサイズ画分を注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験の結果を示す。
第２図は、ヒトＬＡＴ３とマウスＬＡＴ３のアミノ酸配列の比較を示す。予想される膜貫通部位を付線で示した。また、予想される糖鎖付加部位を＃、プロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化部位を＊、チロシンリン酸化部位を＆で示した。
第３図は、ヒトの各臓器組織におけるＬＡＴ３遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した図面に代わる写真である。
第４図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験の結果を示す。
第５図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示す。
第６図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において基質ロイシンの濃度の影響を調べた結果を示す図。挿図は、そのＥａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅプロット。
第７図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系へのグリシン及び各種Ｌ−アミノ酸添加の影響を調べた結果を示す。
第８図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種Ｄ−アミノ酸添加の影響を調べた結果を示す。
第９図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種アミノ酸輸送系選択的抑制薬添加の影響を調べた結果を示す。
第１０図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種アミノ酸誘導体添加の影響を調べた結果を示す図面である。
Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ，Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＨ，Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｏｌ；Ｒ１−ＣＨ２ＮＨ２，ｉｓｏｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ；Ｒ１−ＣＨ２ＣＯＯＨ，４−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３，１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＮＨ２，Ｌ−ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＣＨ３，Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ−ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨＣＯＣＨ３）ＣＯＯＨ，Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ；Ｒ１−ＣＨ（ＮＨＣＨ３）ＣＯＯＨ，Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ；Ｒ２−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ，Ｌ−ｖａｌｉｎｅ；Ｒ２−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＨ，Ｌ−ｖａｌｉｎｏｌ；Ｒ２−ＣＨ２ＮＨ２，ｉｓｏｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ；Ｒ２−ＣＨ２ＣＯＯＨ，ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  ａｃｉｄ；Ｒ３−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ，Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；Ｒ３−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＨ，Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｏｌ；Ｒ３−ＣＨ２ＮＨ２，２−ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ；Ｒ３−ＣＨ２ＣＯＯＨ，３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ；Ｒ４−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ，Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ；Ｒ４−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＨ，Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｏｌ；Ｒ４−ＣＨ２ＮＨ２，ｔｙｒａｍｉｎｅ；Ｒ４−ＣＨ２ＣＯＯＨ，３−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ．
第１１図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種アニオン性化合物添加の影響を調べた結果を示す。
第１２図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞による放射能標識Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の取り込みを調べた結果を示す。
第１３図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験においてｐＨの影響を調べた結果を示す。
第１４図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞よる１４Ｃ−ロイシンの放出の時間経過を調べた結果を示す図。□：対照としてヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡの代わりに水を注入した卵母細胞における１４Ｃ−ロイシンの放出、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液へのロイシン未添加の場合。：対照としてヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡの代わりに水を注入した卵母細胞における１４Ｃ−ロイシンの放出、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液へロイシンを添加した場合。○：ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞における１４Ｃ−ロイシンの放出、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液へのロイシン未添加の場合。●：ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞における１４Ｃ−ロイシンの放出、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液へロイシンを添加した場合。縦軸は、放出された放射活性を卵母細胞に注入した放射活性に対する％で示す。
第１５図は、ヒトＬＡＴ３遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）処理の影響を調べた結果を示す図。
第１６図は、ヒト前立腺癌（Ａ及びＢ）及びヒト腎癌（Ｃ及びＤ）における抗ＬＡＴ３抗体によるＬＡＴ３の免疫組織化学的解析の結果を示した写真。Ａ及びＣ：抗ＬＡＴ３抗体による染色像。Ｂ及びＤ：抗原ペプチドによる吸収実験。
第１７図は、ヒト  ＬＡＴ３とヒト  ＬＡＴ４のアミノ酸配列の比較を示す図。
第１８図は、ヒトＬＡＴ４とマウスＬＡＴ４のアミノ酸配列の比較を示す図。予想される膜貫通部位を付線で示した。また、予想される糖鎖付加部位を＃、ｃＡＭＰ依存性のリン酸化部位を＋、プロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化部位を＊で示した。
第１９図は、マウスＬＡＴ４遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において添加する塩の影響を調べた結果を示す図。
第２０図は、マウスＬＡＴ４遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系へのグリシン及び各種Ｌ−アミノ酸添加の影響を調べた結果を示す図。
第２１図は、マウスＬＡＴ４遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種Ｄ−アミノ酸添加の影響を調べた結果を示す図。
第２２図は、マウスＬＡＴ４遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において、系への各種アミノ酸輸送系選択的抑制薬添加の影響を調べた結果を示す図。
第２３図は、マウスＬＡＴ４遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞による放射能標識Ｌ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の取り込みを調べた結果を示す図。
第２４図は、ヒトの各臓器組織におけるＬＡＴ４遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した図面に代わる写真である。
第２５図は、マウスの各臓器組織におけるＬＡＴ４遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した図面に代わる写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者らは、ヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを材料とし、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた発現クローニングを行い、単一分子で分枝鎖中性アミノ酸を輸送する能力を発揮する輸送系Ｌの性質を示す新規トランスポーターの遺伝子をクローニングした。さらに、それと類似の配列を有する別の遺伝子をＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースを用いて同定した。これらの遺伝子の産物をアフリカツメガエルの卵母細胞に発現させて、その機能特性を明らかにし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）ないし（Ｈ）から選択されるタンパク質であって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質を提供する。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｈ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
また、本発明は、以下の（ａ）ないし（ｈ）から選択されるＤＮＡであって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子を提供する。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｈ）配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、ヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ３）のアミノ酸配列（５５９アミノ酸）を表す。そして、該トランスポーターをコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号１に示される。
配列番号４で示されるアミノ酸配列は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ３）のアミノ酸配列（５６４アミノ酸）を表す。そして、該トランスポーターをコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号３に示される。
配列番号６で示されるアミノ酸配列は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ４）のアミノ酸配列（５７３アミノ酸）を表す。そして、該トランスポーターをコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号５に示される。
配列番号８で示されるアミノ酸配列は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ４）のアミノ酸配列（５６８アミノ酸）を表す。そして、該トランスポーターをコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号７に示される。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質、すなわちアミノ酸トランスポーターＬＡＴ３（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ３）及びＬＡＴ４（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４）は、ロイシン、イソロイシン、バリン等の分枝鎖アミノ酸及びフェニルアラニンを中心とする中性アミノ酸を選択的に輸送する（取り込む）能力を有する。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターＬＡＴ３を介する中性アミノ酸の輸送は、分枝鎖アミノ酸アルコール及びフェニルアラニノールによって強く抑制される。また、ＬＡＴ３を介する中性アミノ酸の輸送は、Ｎ−エチルマレイミドによって抑制される。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターＬＡＴ３は、ヒト体内においては膵臓、肝臓、骨格筋、心臓、骨髄、及び胎児肝臓において強く発現し、腎臓、胎盤、肺、小腸、卵巣、精巣、前立腺、及び脾臓に弱く発現している。
また、本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターＬＡＴ４は、ヒト体内においては胎盤、腎臓、骨格筋、脳、心臓、脾臓、肺、白血球、小賜において強く発現し、肝臓及び胸腺に弱く発現している。
本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター及びそれをコードする遺伝子を利用する発明に関するものである。
すなわち、本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列において連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターに対する抗体を提供する。
本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターを用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質あるいは阻害物質としての作用を検出する方法を提供する。
さらに本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター、その特異抗体、その機能促進物質もしくは機能抑制物質、又は該トランスポーターをコードする遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを用いて、該タンパク質の有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、正常細胞もしくは腫瘍細胞の増殖を制御し、該タンパク質によって輸送される薬物、毒物、もしくは外来性異物体内動態を変更し、又は該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態もしくは生体内代謝を変更する方法を提供する。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質としては、後記配列表の配列番号２，４，６又は８で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ３）である。
配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ３）である。
配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ４）である。
配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ４）である。
本発明のタンパク質としては、この他に、例えば配列番号２、４、６又は８で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、アミノ酸輸送活性が失われない程度であればよく、配列番号２に関しては通常１〜約１１１個、好ましくは１〜約５６個、配列番号４に関しては通常１〜約１１３個、好ましくは１〜約５７個、配列番号６に関しては通常１〜約１１５個、好ましくは１〜約５７個、配列番号８に関しては通常１〜約１１４個、好ましくは１〜約５７個である。このようなタンパク質は、配列番号１及び配列番号２で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、ヒト前立腺癌に高発現する機能未同定の配列として報告されたＰＯＶ１［コール（Ｃｏｌｅ）その他著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９８年、第５１巻、第２号、ｐ．２８２−２８７］と同一であった。配列番号４、６及び８に示されるアミノ酸配列は、報告されておらず新規のものであると考えられる。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードする遺伝子としては、後記配列表の配列番号１，３，５又は７で示された塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
配列番号１で示される塩基配列は、ヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ３）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約２．５ｋｂｐ）を表す。
配列番号２で示される塩基配列は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ３）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約２．５ｋｂｐ）を表す。
配列番号３で示される塩基配列は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（ヒトＬＡＴ４）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約３．３ｋｂｐ）を表す。
配列番号４で示される塩基配列は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター（マウスＬＡＴ４）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約３．２ｋｂｐ）を表す。
本発明の遺伝子としては、この他に、配列番号１、３、５又は７で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が中性アミノ酸を輸送する能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号１、３、５又は７で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
本発明の分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を選択的に輸送する単一分子で機能を発揮するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターの遺伝子は、適当な哺乳動物の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、発現クローニング法（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）などにより好適に実施できる。
例えば、ヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これをサイズ分画し、各画分についてアフリカツメガエル卵母細胞に導入する。
ｍＲＮＡを導入した卵母細胞について、例えば、ロイシンなどを基質として、細胞内への基質の輸送（取り込み）を測定し、高い取り込み活性を示したｍＲＮＡ画分を選択することにより、ＬＡＴ３のｍＲＮＡを濃縮できる。この濃縮されたｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを作製する。ライブラリーのｃＤＮＡから、約５００クローンをーグループとして、ｃＲＮＡ（キャップ化されたもの）を調整し、各々のグループについて、卵母細胞に導入し、基質の取り込み活性を指標として、陽性グループを選択する。陽性グループが見い出せたら、それをさらにサブグループに分け、同様の操作を繰り返すことにより、ＬＡＴ３遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
また、ＬＡＴ４のｃＤＮＡの単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、ヒト胎児脳あるいはマウス腎を遺伝子源として用い、そのｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を用いて、ｃＤＮＡライブライーを作製する。ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースの検索によって得られるＬＡＴ３類似配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ１６２９１７）に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってＬＡＴ４遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４のアミノ酸配列を決定することができる。
得られたｃＤＮＡが、分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送する単一分子で機能を発揮するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、すなわちｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送する単一分子で機能するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＬＡＴ３遺伝子あるいはＬＡＴ４遺伝子のｃＤＮＡから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（キャップ化されたもの）を卵母細胞内に導入して発現させ、分枝鎖中性アミノ酸を細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、適当な分枝鎖中性アミノ酸を基質とする通常の取り込み試験（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１頁、１９９２年）により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
得られたＬＡＴ３遺伝子あるいはＬＡＴ４遺伝子のｃＤＮＡから調整した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法［Ｈｅｄｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１０６４巻、３６０項、１９９１年］により、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４  タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４の特性、例えば、ＬＡＴ３がアミノ酸の促通拡散型の輸送を行っているという特性や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４の基質選択性、ｐＨ依存性などを調べることができる。
得られたＬＡＴ３遺伝子あるいはＬＡＴ４遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号１、３、５又は７に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４）は、例えば、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチド生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞及び哺乳類細胞を用いることが好ましい。
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１ａプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、又はマウスＳ２細胞などの細胞株などが挙げられる。
単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、３、５又は７で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第８１巻、第５６６２項（１９８４年）］等によって実施できる。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞は、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在する細胞膜や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在すると予想される部位での透過効率についての、インビトロでの試験に使用できる。また、単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞は、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在する細胞膜や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在すると予想される部位を効率良く透過する化合物の開発に使用できる。さらに、単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞は、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在する細胞膜や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在すると予想される部位での薬物間相互作用のインビトロでの試験に使用できる。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４を抑制することにより、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４を発現する細胞膜や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在すると予想される部位の特定の化合物の透過を制限することができる。また、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞は、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４により輸送される化合物の、細胞膜通過や、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４が存在すると予想される部位の透過を制限する薬物（ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４の特異的なインヒビター等）の開発に使用できる。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞は、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４を抑制することによる、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４を高レベルに発現する細胞の増殖抑制効果のインビトロ試験に使用できる。ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４の抑制の目的には、その抑制薬を使用するが、もしくはアンチセンスオリゴＤＮＡあるいは特異抗体を使用することができる。
また、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存トランスポーターＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４、その遺伝子およびその発現細胞を用いて、腫瘍細胞などのＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４を高レベルに発現する細胞の増殖を抑制する目的で使用する、ＬＡＴ３あるいはＬＡＴ４の機能抑制薬や機能抑制作用を持つモノクロナル抗体を開発することができる。
なお、特願２００３−０６２３７９明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【実施例】  次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓより１９８９に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
実施例１：  単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３のヒトｃＤＮＡのクローニング
（１）ヒト肝細胞癌由来細胞株ＦＬＣ４からの発現クローニング
金井らの方法（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１頁、１９９２年）に準じて、発現クローニング法により、以下のようにして行った。
ゲル電気泳動によりヒト肝細胞癌細胞株ＦＬＣ４由来ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ４００μｇを分画した。
分画により得られた各画分を、アフリカツメガエル卵母細胞に注入し、３日間培養した。
ＲＮＡ注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法（Ｋａｎａｉ  ａｎｄ  Ｈｅｄｉｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、４６７−４７１頁、１９９２年）に準じて、以下のように行った。基質として１４Ｃ−Ｌ−ロイシン（１００μＭ）を含むＮａ＋非含有取り込み用溶液［１００ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４］中にて３０分卵母細胞を培養して、細胞内に取り込まれた放射能のカウントで基質の取り込み率を測定した。なお、この系において、ヒト肝細胞腫由来細胞株ＦＬＣ４のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を注入した卵母細胞は、対照として水を注入した卵母細胞に比し、ロイシンの取り込み亢進が見られた（第１図）。
サイズ分画により得られた各ＲＮＡ画分のうち、ＲＮＡを注入した卵母細胞が、最も高いロイシンの取り込み率を示した画分を選択した（第１図）。この画分のポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（２．２〜２．７ｋｂ）について、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用キット（商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ギブコ社製）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。これらＤＮＡはプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（ギブコ社製）の制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ認識部位に組み込み、得られた組み換えプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ株のコンピテントセル（商品名：Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍａｘ  ＤＨ１０Ｂ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ、ギブコ社製）に導入した。得られた形質転換体をニトロセルロース膜上で培養し、１プレート当たり約５００個のコロニーが得られた。これらコロニーから、プラスミドＤＮＡを調製し、これらを制限酵素ＮｏｔＩで切断した。得られたＤＮＡを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、キャップ化されたｃＲＮＡを合成した。
得られたｃＲＮＡ（約５０ｎｇ）を卵母細胞へ注入した。これら卵母細胞について、前記と同様にして、ロイシン取り込み実験を行うことにより陽性クローンのスクリーニングを行った。スクリーニングに際しては、複数のクローンから抽出したＤＮＡをプールしたグループについて調べ、あるグループでロイシン取り込みが確認された場合、さらにそれを複数のグループに分割し、さらにスクリーニングを行った。
得られたクローン、すなわち、ヒト分枝鎖中性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３のｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
これにより、ヒトＬＡＴ３遺伝子の塩基配列が得られた。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるＬＡＴ３のアミノ酸配列を決定した。
この配列を、後記配列表の配列番号２に示した。
ヒトＬＡＴ３は、ヒト前立腺癌に高発現する機能未同定の配列として報告されたＰＯＶ１［コール（Ｃｏｌｅ）その他著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９８年、第５１巻、第２号、ｐ．２８２−２８７］と同一のアミノ酸配列を示した。
ＴｏｐＰｒｅｄ２アルゴリズム［Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５，４８７−４９４（１９９２）］により、ＬＡＴ３のアミノ酸配列を解析した結果、第２図に示したように、１２個の膜貫通領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）が予想された。また、第１膜貫通部位と第２膜貫通部位の間の細胞外ループには糖付加部位、第６膜貫通部位と第７膜貫通部位の間の長い細胞内ループには、２つのプロテインキナーゼＣ依存性リン酸化部位及び１つのチロシンリン酸化部位、第８膜貫通部位と第９膜貫通部位の間の細胞内ループには、１つのプロテインキナーゼＣ依存性リン酸化部位と考えられる部位があった（第２図）。
（２）ヒトの種々の組織における  ＬＡＴ３遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ヒトＬＡＴ３遺伝子の第１７９０−１９３６番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含んだＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ（Ｈｕｍａｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に対して、ノーザンブハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。このフィルター膜を４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＬＡＴ３ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果（第３図）、膵臓、肝臓、骨格筋、心臓、骨髄、及び胎児肝臓において強く発現し、腎臓、胎盤、肺、小腸、卵巣、精巣、前立腺、及び脾臓に弱く発現していることが示された。
実施例２：  単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３のマウスｃＤＮＡの同定
ヒトＬＡＴ３の翻訳領域の塩基配列を用いたＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースの検索によって得られた、ヒトＬＡＴ３と類似のマウス唾液腺由来の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＧ８６５２６８）に相当するｃＤＮＡクローンをＩＭＡＧＥ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）より購入し（ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  Ｉ．Ｄ．：４９１０１４９）、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
この配列を、後記配列表の配列番号４に示した。
マウスＬＡＴ３とヒトＬＡＴ３のアミノ酸配列の比較を第２図に示した。マウスＬＡＴ３とヒトＬＡＴ３のアミノ酸配列は、８２％の相同性を有していた。
実施例３：  単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３の特徴づけ
（１）ヒトＬＡＴ３のツメガエル卵母細胞への機能発現
ヒトＬＡＴ３のｃＤＮＡを含む発現プラスミドベクターｐＳＰＯＲＴ１を制限酵素ＮｏｔＩで切断し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した。
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡ  ２５ｎｇを卵母細胞に注入することによって発現させ、３日間培養した。
ロイシンの取り込み実験は、前記実施例１（１）記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡ、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、１４Ｃ−Ｌ−ロイシン（１００μＭ）を含むＮａ＋非含有取り込み用溶液（実施例１（１）参照）中にて１０分培養して、細胞内への放射能の取り込みを測定した。
その結果（第４図）、対照として水を注入した卵母細胞に比べて、ＬＡＴ３を発現させた卵母細胞においてロイシンのおおきな取り込みが得られた。すでに報告されている輸送系ＬトランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２は、その機能発現には１回膜貫通型補助因子４Ｆ２ｈｃと共存することが要求されるが、ＬＡＴ３は、４Ｆ２ｈｃを必要とせず、単独で機能を発揮した。
（２）ヒトＬＡＴ３の輸送活性の塩依存性
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。ロイシンの取り込み実験は、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。
取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液に代え、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液にかえて、Ｃｌ−非含有取り込み用溶液（標準取り込み用溶液のＣｌ−をグルコネートに代えたもの）を用いた。
その結果（第５図）、細胞外のナトリウムをコリンに代えても、細胞外の塩素イオンをグルコネートに変えても、ロイシン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＬＡＴ３はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
（３）ヒトＬＡＴ３の動力学試験
分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ３の動力学試験を行った。基質ロイシンの濃度の違いによるロイシン取り込み率の変化を調べることにより、ＬＡＴ３の動力学試験を行った。
ロイシンの取り込み実験は、ロイシン濃度１、３、１０、３０、６０、１００、２００、４００、１０００、２０００、３０００μＭにおいて、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。その結果（第６図）、ロイシンの取り込みは濃度依存的な飽和性の取り込みを示し、トランスポーターを介する輸送であることが確認された。加えて、ＬＡＴ３を介するロイシンの輸送は、高親和性成分と低親和性成分からなることが明らかになった（第６図挿図）。
（４）ヒトＬＡＴ３の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。但し、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液を用い、１０ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、１４Ｃ−ロイシン（１００μＭ）の取り込みを測定した。
その結果（第７図）、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニンで、強いｃｉｓ−阻害効果が観察された。酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）及びプロリンは、ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みに影響しなかった。
Ｄ−アミノ酸のうち、Ｄ−ロイシンにより、ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みの比較的強い抑制効果が得られた（第８図）。
輸送系特異的な抑制薬であるＢＣＨ（２−ａｍｉｎｏｂｉｃｙｃｌｏ−（２，２，１）−ｈｅｐｔａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＡＩＢ（α−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ＭｅＡＩＢ（α−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）の効果を調べたが、ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みは、輸送系Ｌ特異的抑制薬ＢＣＨより強く抑制され、ＬＡＴ３が輸送系Ｌトランスポーターであることが示された（第９図）。
ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みは、ロイシノールで強く抑制された（第１０図）。また、バリノール、フェニルアラニノールも比較的強い１４Ｃ−ロイシンの取り込み抑制効果を示した（第１０図）。イソペンチラミン、１，３−ジメチル−ｎ−ブチラミン、ロイシン−メチルエステル、Ｎ−アセチルロイシン、イソブチラミン、フェニルエチラミンも有意な抑制効果を示した（第１０図）。
ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みに対する、各種アニオン性化合物の影響を検討した。その結果（第１１図）、オクラトキシンＡ、インドメタシンにより強い抑制効果が観察された。また、プロベネシド及びサリチル酸も弱いながら有意な抑制効果を示した。
（５）ヒトＬＡＴ３の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、ＬＡＴ３による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、１４Ｃ−ロイシンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
その結果（第１２図）、Ｌ−ロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−イソロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−バリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−フェニルアラニン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合に、卵母細胞への大きな取り込みが認められた。また、Ｌ−メチオニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−チロシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−プロリン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合に、卵母細胞への小さいながら有意な取り込みが認められた。Ｄ−ロイシン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合にも、卵母細胞への有意な取り込みが認められた。オクラトキシンＡは、ＬＡＴ３を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みを強力に抑制したが、オクラトキシンＡ（１４Ｃ化合物）はＬＡＴ３により輸送されなかった。
（６）ヒトＬＡＴ３の輸送活性のｐＨ依存性
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験においてｐＨの影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。
その結果、ロイシン取り込みには、ｐＨ７．０〜８．５で安定した値を示し、生理学的ｐＨが、本トランスポーターの至適ｐＨと考えられた（第１３図）。
（７）ヒトＬＡＴ３を介するアミノ酸の放出試験
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞において、前負荷した１４Ｃ−ロイシンのＬＡＴ３を介する放出を調べた。
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞に１００ｎｌの４００μＭ１４Ｃ−ロイシン（２ｎＣｉ）を注入し、氷冷のロイシンを含まないＮａ＋非含有取り込み用溶液で洗浄した後、室温（１８℃〜２２℃）のロイシン（１ｍＭ）添加あるいは未添加のＮａ＋非含有取り込み用溶液に移し、細胞外に放出される１４Ｃ−ロイシンの量を測定した。また、対照としてヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡの代わりに水を注入した卵母細胞にも同様に１００ｎｌの４００μＭ１４Ｃ−ロイシン（２ｎＣｉ）を注入し、同様にして細胞外に放出される１４Ｃ−ロイシンの量を測定した。
その結果、ヒトＬＡＴ３においては細胞外にロイシンを添加しない場合においても、１４Ｃ−ロイシンの有意な放出が観察され、その放出は細胞外にロイシンを添加することによって僅かに上昇したものの、大きな変化はなかった（第１４図）。これに対して、対照としてヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡの代わりに水を注入した卵母細胞においては、細胞外へのロイシン添加の有無にかかわらず、１４Ｃ−ロイシンの有意な放出は観察されなかった（第１４図）。従って、ＬＡＴ３は僅かな交換輸送モードを含む可能性を残しつつ、大方は促通拡散型輸送を媒介するトランスポーターであると結論された。
（８）Ｎ−エチルマレイミドの影響
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞において、１４Ｃ−ロイシンの取り込みに対するＮ−エチルマレイミドの影響を検討した。
ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞、ヒトＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡと４Ｆ２ｈｃ遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、１４Ｃ−Ｌ−ロイシン（１００μＭ）を含むＮａ＋非含有取り込み用溶液（実施例３（２）参照）中にて１０分培養して、実施例３（１）記載方法に準じて細胞内への放射能の取り込みを測定した。その際、５ｍＭのＮ−エチルマレイミドの１５分間前の処理、及び取り込み用溶液への５ｍＭのＮ−エチルマレイミド含有の有無の、１４Ｃ−Ｌ−ロイシン取り込み量への影響を検討した。
その結果、Ｎ−エチルマレイミド前処置により、ＬＡＴ３による１４Ｃ−Ｌ−ロイシンの取り込みは、ほぼ完全に抑制された（第１５図）。このＮ−エチルマレイミドの効果は、取り込み用溶液中でのＮ−エチルマレイミドの存在の有無によらなかった。これに対して、ＬＡＴ１による１４Ｃ−Ｌ−ロイシン取り込みは、Ｎ−エチルマレイミドにより影響を受けなかった（第１５図）。
（９）ヒト前立腺癌及びヒト腎癌におけるＬＡＴ３の発現。
常法に従い、ヒト前立腺癌及びヒト腎癌の外科手術摘出標本のパラフィン切片をアフィニティー精製抗ＬＡＴ３抗血清（２μｇ／ｍｌ）で処理後、ジアミノベンチジンで発色した。また、染色の特異性を検討する目的で、２００μｇ／ｍｌの抗原ペプチドの存在下でアフィニティー精製抗ＬＡＴ３抗血清（２μｇ／ｍｌ）で処理する実験も行った。
その結果、ヒト前立腺癌（第１６図Ａ）及びヒト腎癌（第１６図Ｃ）では、腫瘍細胞に一致してＬＡＴ３の染色が見られた。この染色は、抗原ペプチドの存在下で抗ＬＡＴ３抗体を作用させた場合には検出されず、染色の特異性が示された（第１６図Ｂ及びＤ）。
（１０）マウスＬＡＴ３の機能の確認
実施例２により得られたマウスＬＡＴ３のｃＤＮＡを、ＮｏｔＩで切断して、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを調製した。マウスＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを卵母細胞に発現させ１４Ｃ−ロイシンの取り込みを測定した。
マウスＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡ２５ｎｇを卵母細胞に注入することによって発現させ３日間培養した。マウスＬＡＴ３遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を実施例３（１）に準じて行った。
その結果、ロイシンの取り込みは、ヒトＬＡＴ３と同様、マウスＬＡＴ３を発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞に比べて大きなロイシンの取り込みが観察された。さらに、マウスＬＡＴ３もヒトＬＡＴ３と同様な基質選択性を示すことが示された。
実施例４：  単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ４のヒト及びマウスｃＤＮＡの同定
（１）ＬＡＴ４  ｃＤＮＡの同定
ヒトＬＡＴ３の翻訳領域の塩基配列を用いたＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースの検索によって得られた、ヒトＬＡＴ３と類似のヒト胎児脳由来の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ１６２９１７）に相当するｃＤＮＡクローン（ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  Ｉ．Ｄ．：２７８３５２５）、及びヒトＬＡＴ３と類似のマウス腎由来の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＷ１０６５５０）に相当するｃＤＮＡクローン（ＩＭＡＧＥ  ｃｌｏｎｅ  Ｉ．Ｄ．：２２３５９７０）をＩＭＡＧＥ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）より購入し、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
このヒト配列を後記配列表の配列番号３に、マウス配列を後記配列表の配列番号４に示した。
ヒトＬＡＴ３とヒトＬＡＴ４のアミノ酸配列の比較を第１７図に示した。ヒトＬＡＴ３とヒトＬＡＴ４のアミノ酸配列は、５８％の相同性を有していた。
ヒトＬＡＴ３とマウスＬＡＴ４のアミノ酸配列の比較を第１８図に示した。ヒトＬＡＴ３とマウスＬＡＴ４のアミノ酸配列は、９０％の相同性を有していた。
（２）ヒト及びマウスの種々の組織におけるＬＡＴ４遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）
ヒトＬＡＴ４遺伝子の第３０７−１０１２番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含んだＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｓ（Ｈｕｍａｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に対して、ノーザンブハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。このフィルター膜を４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＬＡＴ４  ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果（第２４図）、胎盤、腎臓、及び骨格筋において強く発現し、白血球、脳、心臓、脾臓、小腸、肺、及び大腸に弱く発現し、胸腺、及び肝臓にさらに弱く発現していることが示された。
マウスＬＡＴ４遺伝子の第１２２−５２５番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、マウスの種々の組織から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。３μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたマウスＬＡＴ４ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果（第２５図）、腎臓、胎盤、脳、小腸において強く発現していることが示された。
実施例５：  単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ４の特徴づけ
（１）マウスＬＡＴ４のツメガエル卵母細胞への機能発現
マウスＬＡＴ４のｃＤＮＡを含む発現プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した。
マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡ  ２５ｎｇを卵母細胞に注入することによって発現させ、３日間培養した。
ロイシンの取り込み実験は、前記実施例３（１）記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡ、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、１４Ｃ−Ｌ−ロイシン（１００μＭ）を含むＮａ＋非含有取り込み用溶液（実施例３（１）参照）中にて１０分培養して、細胞内への放射能の取り込みを測定した。
その結果、対照として水を注入した卵母細胞に比べて、ＬＡＴ４を発現させた卵母組胞においてロイシンのおおきな取り込みが得られた。ＬＡＴ３と同様に、またすでに報告されている輸送系ＬトランスポーターＬＡＴ１及びＬＡＴ２と異なり、ＬＡＴ４は、４Ｆ２ｈｃを必要とせず、単独で機能を発揮した。
（２）マウスＬＡＴ４の輸送活性の塩依存性
マウスＬＡＴ４ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。ロイシンの取り込み実験は、マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。
取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液に代え、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液にかえて、Ｃｌ−非含有取り込み用溶液（標準取り込み用溶液のＣｌ−をグルコネートに代えたものを用いた。
その結果（第１９図）、細胞外のナトリウムをコリンに代えても、細胞外の塩素イオンをグルコネートに変えても、ロイシン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＬＡＴ４はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
（３）マウスＬＡＴ４の動力学試験
分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターＬＡＴ４の動力学試験を行った。基質ロイシンの濃度の違いによるロイシン取り込み率の変化を調べることにより、ＬＡＴ３の動力学試験を行った。
ロイシンの取り込み実験は、ロイシン濃度０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０ｍＭにおいて、マウスＬＡＴ４  ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。その結果、ロイシンの取り込みは濃度依存的な飽和性の取り込みを示し、トランスポーターを介する輸送であることが確認された。加えて、ＬＡＴ４を介するロイシンの輸送は、ＬＡＴ３を介するロイシンの輸送と同様、高親和性成分と低親和性成分からなることが明らかになった。
（４）マウスＬＡＴ４の基質選択性（アミノ酸及びその類似物質添加による阻害実験）
マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。但し、Ｎａ＋非含有取り込み用溶液を用い、１０ｍＭの各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下で、１４Ｃ−ロイシン（１００μＭ）の取り込みを測定した。
その結果（第２０図）、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニンで、強いｃｉｓ−阻害効果が観察された。酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）及びプロリンは、ＬＡＴ４を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みに影響しなかった。
Ｄ−アミノ酸のうち、Ｄ−ロイシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−メチオニンにより、ＬＡＴ４を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みの比較的強い抑制効果が得られた（第２１図）。
輸送系特異的な抑制薬であるＢＣＨ（２−ａｍｉｎｏｂｉｃｙｃｌｏ−（２，２，１）−ｈｅｐｔａｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＡＩＢ（ａ−ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ＭｅＡＩＢ（ａ−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）の効果を調べたが、ＬＡＴ４を介する１４Ｃ−ロイシンの取り込みは、輸送系Ｌ特異的抑制薬ＢＣＨより強く抑制され、ＬＡＴ４が輸送系Ｌトランスポーターであることが示された（第２２図）。
（５）マウスＬＡＴ４の基質選択性（各種アミノ酸及びその類似物質を基質とする取り込み試験）
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、ＬＡＴ４による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、マウスＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記実施例３（１）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、１４Ｃ−ロイシンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
その結果（第２３図）、Ｌ−ロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−イソロイシン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−バリン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−フェニルアラニン（１４Ｃ化合物）、Ｌ−メチオニン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合に、卵母細胞への大きな取り込みが認められた。Ｄ−ロイシン（１４Ｃ化合物）を基質とした場合にも、卵母細胞への有意な取り込みが認められた。
（６）ヒトＬＡＴ４の機能の確認
実施例４により得られたヒトＬＡＴ４のｃＤＮＡを、ＸｈｏＩで切断して、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼを用いてｃＲＮＡを調製した。ヒトＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを卵母細胞に発現させ１４Ｃ−ロイシンの取り込みを測定した。
ヒトＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡ  ２５ｎｇを卵母細胞に注入することによって発現させ３日間培養した。ヒトＬＡＴ４遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を実施例３（１）に準じて行った。
その結果、ロイシンの取り込みは、マウスＬＡＴ４と同様、ヒトＬＡＴ４を発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞に比べて大きなロイシンの取り込みが観察された。さらに、ヒトＬＡＴ４もマウスＬＡＴ４と同様な基質選択性を示すことが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸トランスポーターは、当該トランスポーターの発現箇所での分枝鎖中性アミノ酸及び薬物や外来性異物も含めたアミノ酸類似化合物の輸送のインビトロでの検討や、それを基にしたそれら化合物の体内動態のインビトロでの予測を可能とする。さらに、当該トランスポーターの発現箇所を効率良く透過する薬物の開発に有用と考えられる。また、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸トランスポーターは、当該トランスポーターの有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、アミノ酸代謝を変調させる方法、正常細胞及び腫瘍細胞の細胞増殖を制御する方法の開発に利用できる。また当該トランスポーターは、腫瘍抗原として、腫瘍細胞と正常細胞を区別する手段として利用できる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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