(57)【要約】本発明は、小胞体ストレスを誘導する物質を含む、アポトーシス誘導剤及び自己免疫疾患治療剤、並びに、細胞（例えば滑膜細胞）を、前記誘導剤で処理することを特徴とする細胞の増殖抑制方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小胞体ストレスを誘導する物質を含む、アポトーシス誘導剤。
【請求項２】
小胞体ストレスを誘導する物質がツニカマイシン、タプシガルギン及びブレフェルディンＡからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１記載の誘導剤。
【請求項３】
シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項１又は２記載の誘導剤。
【請求項４】
小胞体ストレスを誘導する物質を含む、自己免疫疾患治療剤。
【請求項５】
小胞体ストレスを誘導する物質がツニカマイシン、タプシガルギン及びブレフェルディンＡからなる群から選択される少なくとも１つである請求項４記載の治療剤。
【請求項６】
自己免疫疾患が関節リウマチである請求項４記載の治療剤。
【請求項７】
シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
細胞を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導剤で処理することを特徴とする細胞の増殖抑制方法。
【請求項９】
細胞が滑膜細胞である請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、小胞体ストレスを誘導する物質を含む自己免疫疾患治療剤、特に関節リウマチ治療剤に関する。
【背景技術】  滑膜細胞は、関節リウマチにおいて顕著に増殖し、関節を破壊するための中軸的な役割を果たす細胞である。従って、関節リウマチを治療するために、滑膜細胞をターゲットとして、特にその細胞の自立的増殖の抑制を目標として多くの研究がなされてきた。しかしながら、その自立的増殖にかかわるメカニズムは十分に解明されていない。
本発明者は、リウマチにおける滑膜細胞の増殖をもたらす分子を探索する目的で抗滑膜抗体を用いた免疫スクリーニングを行なった結果、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ＥＲ）に存在するユビキチンリガーゼである「シノビオリン」（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）と呼ばれるタンパク質を単離し、それをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。
興味深いことに、シノビオリン分子を強発現したマウスの約３０％は、滑膜細胞の増殖を伴う関節症を自然発症した。これに対し、シノビオリンの発現をヘテロノックアウトしたｓｙｎｏ＋／−マウスは、関節リウマチのモデルである２型コラーゲン誘導関節炎に対して抵抗性を示した。そして、この抵抗性が滑膜細胞のアポトーシス亢進に起因することを見出した。
これらの結果から、本発明者は小胞体ストレスに関与するＥＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ（ＥＲＡＤ）機能の亢進が滑膜細胞増殖をトリガーし、関節症をきたしうるというモデルを提唱した。
シノビオリンは、ＲＩＮＧフィンガードメインを有するユビキチンリガーゼ（Ｅ３）であり、小胞体における品質管理を担う機能を有する。そのような小胞体の品質管理を担うために、小胞体に生じた不良タンパク質を分解し、ＥＲストレス（後述）を軽減させるＥＲＡＤと呼ばれる機構が知られている。このＥＲＡＤについて詳述すると以下の通りである。タンパク質は、細胞質で合成された後、正しい立体構造を形成して所定の場所に運ばれて初めて機能することができる。適切な高次構造がとれなかった不良又は損傷タンパク質は、細胞のもつ品質管理機能によりチェックを受けて、再生又は分解されて、細胞機能の恒常性を保つ。
小胞体内腔における生合成途中のタンパク質は不安定であるため、種々の物理化学的ストレス（例えば虚血、低酸素、熱ショック、アミノ酸飢餓、遺伝子変異等）に曝される。このようなストレスを小胞体ストレス（ＥＲストレス）と呼び、小胞体内に異常な折りたたみ構造を持つタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の出現頻度を上昇させる。立体構造に異常を来たした不良タンパク質は小胞体を出てゴルジ体に輸送されないため、そのままでは小胞体内に不良タンパク質が蓄積されてしまう。そこで、これらのＥＲストレスに対して、細胞はＵＰＲ及びＥＲＡＤと呼ばれる小胞体特異的なストレス応答機構によって、不良タンパク質を分解し、そのような不良タンパク質が蓄積することによる小胞体のストレスを防ぐのである。
本発明者は、このようなＥＲＡＤ機能に着目し、シノビオリン依存性のＥＲＡＤ機能を抑制することが関節症の治療につながることを実証した。
しかしながら、この疾患モデルはヒトの関節リウマチにも当てはまるとは限らず、Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現阻害がヒトの関節リウマチの治療に有効であるかは明らかでない。
【発明の開示】
本発明は、自己免疫疾患、特に関節リウマチを治療するために有用な薬剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、小胞体ストレスを誘導する物質に着目し、当該物質を用いると関節リウマチを治療し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）小胞体ストレスを誘導する物質を含む、アポトーシス誘導剤。
小胞体ストレスを誘導する物質としては、例えばツニカマイシン、タプシガルギン及びブレフェルディンＡからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。また、本発明の誘導剤には、シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡをさらに含めることができる。
（２）小胞体ストレスを誘導する物質を含む、自己免疫疾患治療剤。
小胞体ストレスを誘導する物質としては、例えばツニカマイシン、タプシガルギン及びブレフェルディンＡからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。本発明の治療剤は、関節リウマチなどを対象とする。上記治療剤には、シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡをさらに含めてもよい。
（３）細胞を、上記（１）に記載の誘導剤で処理することを特徴とする細胞の増殖抑制方法。細胞としては、例えば滑膜細胞が挙げられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、関節リウマチ及び変形性関節症の滑膜におけるシノビオリンの発現を示す写真である。
図２は、ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンの発現亢進を示すウエスタンブロットの写真である。
図３Ａは、ｓｉＲＮＡで処理した滑膜細胞でＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現を抑制すると、その増殖活性が低下することを示す図である。
図３Ｂは、ツニカマイシンを用いたアポトーシス誘導、及びシノビオリンに対するｓｉＲＮＡを用いたアポトーシス誘導の増強を示す図である。
図４は、リウマチ滑膜細胞が他の細胞に比べ小胞体ストレス誘導性アポトーシスに抵抗性を示すグラフである。
図５は、リウマチ滑膜細胞が変形性関節症滑膜細胞に比べ小胞体ストレスの刺激に対して抵抗性であることを示すグラフである。
図６は、コラーゲン誘導関節炎における小胞体ストレスを示す写真である。
コラーゲン誘導関節炎マウスの膝関節におけるＡＴＦ６の発現。左の図はシノビオリン野生型、右の図は、シノビオリンヘテロ欠損型。
図７は、関節リウマチ滑膜組織における小胞体ストレスを示す写真である。
関節リウマチ滑膜組織におけるＡＴＦ６の発現。左の図は、抗ＡＴＦ６抗体による組織免疫染色。右の図は、ネガティブコントロール。上：倍率ｘ１００倍。下：倍率ｘ２００倍。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
前述の通り、ＥＲストレス存在下でも、ＥＲＡＤ機能により滑膜細胞が増殖する。
しかし、ＥＲＡＤの処理能力にも限界があり、その限界を超えてさらにＥＲストレスを付与するとＥＲＡＤの機能はもはや果たすことができなくなる。本発明はこの点に着目し、ＥＲストレスを誘導させることによって、好ましくはＥＲＡＤの処理能力を超えるように過剰にＥＲストレスを誘導させることによって、ＥＲＡＤ→滑膜細胞増殖→関節症という発症プロセスとは異なるプロセス（関節症の発症とは逆である関節症の抑制）を引き起こすことに成功したものである。
従って、本発明はＥＲストレスを誘導させることにより、ＥＲＡＤの機能を抑えて細胞にアポトーシスを誘導することを特徴とする。例えば、滑膜細胞にアポトーシスを誘導してその増殖を抑制し、ひいては関節症の治療を行なうことを特徴とする。
ここで、アポトーシスとは、細胞自らが引き起こす細胞死を意味し、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集、カスペースの活性化、ミトコンドリア膜電位の消失、等を特徴とする。細胞に上記特徴が生じたときに、アポトーシスが誘導されたもの、すなわちアポトーシスが引き起こされたと判断する。
２．ＥＲストレス誘導物質
ＥＲストレスを誘導するために使用される物質は、一般に、小胞体におけるタンパク質の３次元構造を形成するために必要なシャペロンタンパク質の機能を阻害する物質を選択すればよい。ＥＲストレスが誘導されたか否かは、以下の通り確認することができる。すなわち、小胞体に局在している転写因子（ＡＴＦ６：ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ６）の活性化、小胞体に局在しているリン酸化酵素（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｋｉｎａｓｅ（ＰＥＲＫ））の活性化、小胞体に局在する特異的カスペース（カスペース１２）の活性化である。
活性化の測定は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法や蛍光免疫染色法をすることにより行なう。その結果、転写因子、リン酸化酵素やカスペースの活性化を起こすものをＥＲストレス誘導物質として選択することができる。
本発明においては、ＥＲストレス誘導物質として、ツニカマイシン、タプシガルギン、ブレフェルディンＡ、２−メルカプトエタノールなどを使用することができ、例えばツニカマイシン、タプシガルギン、ブレフェルディンＡが好ましい。ツニカマイシンは，ニューカッスルウイルスに対する抗ウイルス作用をマーカーとして発見された抗生物質であり、β−ガラクトサミンとα−ガラクトサミンの組み合わせに炭素鎖１３から１７の脂肪酸が結合した物質の総称である。その機能は、動物細胞のＮ−グリコシド型糖鎖合成を選択的に阻害するというものである。上記ＥＲストレス誘導物質は、合成することにより得ることができ、あるいはシグマ社などから購入することも可能である。
タプシガルギンは、ＥＲ膜のカルシウムポンプ阻害作用を介して、ＥＲ内のシャペロン分子の機能を抑制することにより、ＥＲにおけるタンパク質阻害、さらには、ＥＲストレス誘導物質として利用できる。
ブレフェルディンＡは、細胞内タンパク質輸送、即ち、ゴルジ体輸送を抑制する薬剤として知られており、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で、分泌タンパク質の輸送を抑制しＥＲストレスを誘導できる。
これらのＥＲストレス誘導物質を用いてアポトーシスを引き起こすための用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合は１μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌである。あるいは、細胞あたり１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌである。ＥＲストレス誘導物質をヒトに投与する場合は、後述の治療剤と同様の用法及び用量を採用することができる。
３．ＲＮＡｉの利用
さらに、本発明においては、上記ＥＲストレス誘導物質のほかに、シノビオリンをコードする遺伝子（「Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ遺伝子」ともいう）の発現を抑制するためにＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を利用することができる。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制される現象である。
Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ遺伝子の発現を抑制するには、ＲＮＡｉを起こさせるために、例えばＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを作用させればよい。
ｓｉＲＮＡの設計基準は、以下の通りである。
（ａ）シノビオリンをコードする遺伝子の開始コドンの１００ヌクレオチド下流の領域を選択する。
（ｂ）選択した領域から、ＡＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９塩基の配列を探し、その配列のＧＣ含量が３０〜７０％、好ましくは４５〜５５％となるものを選択する。
具体的には、以下の塩基配列を有するものをｓｉＲＮＡとして使用することができる。
2005018675.tif 000002
ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
４．用法、用量
本発明のＥＲストレス誘導物質を有効成分として含有する治療剤は、自己免疫疾患を対象とすることができる。なお、自己免疫疾患とは、自分自身の組織に対する免疫反応によって引き起こされる疾患をいい、関節リウマチ、橋本病（慢性甲状腺炎）、悪性貧血、アジソン病、糖尿病、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病などがある。本発明の治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能である。非経口投与の場合は、経肺剤型（例えばネフライザーなどを用いたもの）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜１０μｇである。但し、上記治療剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の治療剤は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容される担体や添加物を含むものであってもよい。このような担体及び添加物として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
上記添加物は、本発明の治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたＥＲストレス誘導物質を溶剤（例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等）に溶解し、これにＴｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
ｓｉＲＮＡを混合する場合の用量は、０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１μｇ／ｍｌである。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例においては、関節リウマチでは滑膜組織におけるＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現が亢進されるかを確認するために、関節リウマチ患者１０人、変形性関節症患者５人の滑膜組織を対象として、Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎに対するモノクローナル抗体による免疫染色の手法を用いて検討した。
その手法は以下の通りである。
パラホルムアルデヒド固定した組織をパラフィン包埋し、４マイクロメートルの厚さに薄切し、プレパラートに固着させた。固着した切片からキシレンを用いてパラフィンを取り除き、３％の過酸化水素水を混じたメタノールに室温で浸透し、内在性ペルオキシダーゼの失活化を行った。リン酸緩衝液によって洗浄した後、ベクスタチン社のＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ（ペルオキシダーゼ）キットに含まれるブッロキング試薬によって非特異的反応を阻害し、リン酸緩衝液によって１μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎモノクローナル抗体を切片と室温で１時間反応させた。その後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ（登録商標）ＡＢＣ（ペルオキシダーゼ）キットに含まれるペルオキシダーゼ複合体と室温で説明書どおりに反応させ、シグマ社のＤＡＢ基質を用いて室温１０分間の発色を行った。対比染色としてメチルグリーンで核染色を行い、染色を完成させた。
ウエスタンブロッティングは、培養滑膜細胞３０万個を６０ｍｍ培養ディッシュに播種し、２４時間後に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％、１μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦを含むタンパク質抽出バッファーによってタンパク質を抽出した。これにＳＤＳサンプルバッファーを加え、１００℃５分間の変性後に、１０％アクリルアミドゲルによって分離した。分離したタンパク質を、ニトロセルロースメンブレンに２５０ｍＡの電流によって２時間トランスファーした。メンブレンは、５％のスキムミルクを混じたＴＢＳＴによって室温１時間ブロッキングを行った。０．５％のスキムミルクを混じたＴＢＳＴを用いて０．１μｇ／ｍｌに希釈した抗Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎを用いて、このメンブレンについて抗原抗体反応を室温で１時間行った。ＴＢＳＴによって洗浄した後、二次抗体である抗マウスＨＲＰ抗体と反応させ、化学蛍光発色によって検出した。
その結果、関節リウマチ滑膜では変形性関節症の滑膜に比べて滑膜細胞におけるＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現が極めて亢進していること（図１）、すなわちＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎ依存性のＥＲＡＤ亢進の存在が証明された。図１において、関節リウマチ滑膜組織（ＲＡ：上段）では、変形性関節症滑膜組織（ＯＡ：下段）に比べてＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの強発現が認められる。ＲＡ滑膜細胞におけるＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現亢進は、培養細胞を用いたウエスタンブロッティングでも確認された（図２）。
【実施例２】  実施例１において、関節リウマチ滑膜では滑膜細胞におけるＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現が極めて亢進していることを示した。しかし、関節リウマチにおいて亢進しているＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎ依存性のＥＲＡＤ機能を抑制することで、ヒト関節リウマチの滑膜細胞の増殖を抑制することができるか否かについては明らかではない。
そこで、ＥＲストレスを誘導することによるアポトーシスを、ＥＲ誘導剤であるツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）を用いて検討した。その際、Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ遺伝子に対するｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を処理した滑膜細胞を用いた検討も行なった。
すなわち、ｓｉＲＮＡを処理することによって、関節リウマチ滑膜で発現が亢進しているＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎを人為的に抑制し、滑膜細胞の不活性化およびアポトーシス誘導が可能であることを確認する事を試みた。
実験は以下のように行なった。すなわち、リウマチ滑膜細胞をＦａｌｃｏｎ社の９６穴平底プレートに１６０個ずつ播種し、２４時間後ＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎおよびＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを処理し、さらに９６時間後に増殖活性を検討した。この場合、ＧＦＰは陰性コントロールとして使用している。細胞の増殖の程度は同仁化学研究所のＷＳＴ−８  ａｓｓａｙを用いて測定した。リウマチ滑膜細胞におけるＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎの発現をｓｉＲＮＡによって抑制することで、その増殖活性はＧＦＰを１００とした場合の約６割に低下していることが判明した（図３Ａ）。
次に、Ｎｕｎｃ社の８  ｗｅｌｌ  Ｌａｂ−ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒに２５００個の滑膜細胞を播種し、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて２４時間培養後、６７ｎＭのｓｉＲＮＡをＭｉｒｕ社のトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯを用いて滑膜細胞に導入した。さらに、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４８時間培養後に、ツニカマイシン５０μｇ／ｍｌを添加し、同様に４８時間培養した。その後細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８によってＤＮＡ染色を行い、核の凝集を確認した。
その結果、滑膜細胞において、ツニカマイシンによるアポトーシス誘導が起こり、さらにｓｉＲＮＡを併用することにより、アポトーシスの誘導が増強された（図３Ｂ）。
以上の結果は、本発明者がマウスモデルを用いて証明した関節症発症のモデル、すなわちＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎ依存性のＥＲＡＤ亢進は滑膜細胞のアポトーシス回避による増殖を介して関節症をトリガーし、反対にＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎ阻害によってアポトーシスを引き起こすことで滑膜増殖が抑制できることが、ヒト滑膜細胞においても当てはまることを示している。
ヒトの関節リウマチ滑膜が小胞体ストレスに抵抗性であり、かつ、そのシグナルを活性化することにより滑膜細胞の増殖抑制、さらにアポトーシスの誘導が可能である。
【実施例３】  本実施例では、滑膜細胞、特にリウマチ滑膜細胞が小胞体ストレス誘導性アポトーシスに抵抗性があるか否かについて、リウマチ滑膜細胞の小胞体ストレス誘導性アポトーシスを、ＥＲストレス誘導剤を用いて検討した。
実験は以下のように行った。すなわち、リウマチ滑膜細胞、変形性関節症滑膜細胞と、ＨｅＬａ細胞，ＨＥＫ２９３細胞をＦａｌｃｏｎ社の９６穴平底プレートに３０００個ずつ播種し、２４時間後小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（１０ｏｒ１００μｇ／ｍｌ），タプシガルギン（１ｏｒ１０μＭ），ブレフェルディンＡ（１０ｏｒ１００μｇ／ｍｌ）で４８時間処理することにより、小胞体ストレス誘導性アポトーシスを誘導した。各々の細胞のアポトーシス誘導の程度はＣｈｅｍｉｃｏｎ社のｓｓＤＮＡ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて測定した。滑膜細胞、特にリウマチ滑膜細胞は小胞体誘導性アポトーシスに対して抵抗性があることが示された（図４）。
【実施例４】  本実施例では、リウマチ滑膜細胞が小胞体ストレスの刺激に対して抵抗性を有するか否かについて、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンを用いて検討した。
実験は、以下のように行った。すなわち、リウマチ滑膜細胞（ＲＡ：５症例）および対象として変形性関節症滑膜細胞（ＯＡ：５症例）を小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシンで２４時間処理し、ヒトのリウマチ滑膜細胞は小胞体ストレスに対して抵抗性があるのかを検討した。ツニカマイシンは１０，３０，１００μｇ／ｍｌの濃度を用いて、小胞体ストレス誘導性のアポトーシスを誘導した。アポトーシスはＣｅｍｉｃｏｎ社のｓｓＤＮＡ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて定量した。
結果として、リウマチ滑膜細胞は変形性関節症滑膜細胞と比較して小胞体ストレス誘導性のアポトーシスに対して抵抗性であることが分かった。（１０μｇ／ｍｌ：ＲＡ０．７３±０．３０，ＯＡ２．１８±１．１９，３０μｇ／ｍｌ：ＲＡ０．８４±０．３５，ＯＡ２．７６±１．８４，１００μｇ／ｍｌ：ＲＡ０．８１±０．２８，ＯＡ３．６５±２．５３）（図５）。
【実施例５】  本実施例では、コラーゲン誘導関節炎において小胞体ストレスが存在するか否かについて、コラーゲン誘導関節炎を起こしたシノビオリン野生型および欠損型のマウスの膝関節を用いて、検討した。
すなわち、コラーゲン誘導関節炎を起こしたシノビオリン野生型および欠損型のマウスの膝関節における免疫組織染色により、ＡＴＦ６の発現の有無を確認した。
実験は以下のように行った。すなわち、コラーゲン誘導関節炎を起したシノビオリン野生型およびヘテロ欠損型のマウスの膝関節を採取した。４％パラホルムアルデヒド溶液で４時間固定後、パラフィン包埋したものを４マイクロメーターの厚さに薄切し、プレパラート上に固定した。そして脱パラフィン作業を行った後、小胞体ストレス存在下で細胞核に集積するＡＴＦ６（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ６）の発現を検討した。抗ＡＴＦ６ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）および正常ヤギＩｇＧ（Ｄａｋｏ社）をおのおの０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度で反応させ、Ｖｅｃｔｏｒ社のｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｋｉｔおよびジアミノベンジジン発色系を用いた免疫組織染色を行った。
図６に矢印で示したように、コラーゲン誘導関節炎によって、ＡＴＦ６の細胞核への集積、すなわち小胞体ストレスが出現することが明らかとなった。またこの現象はシノビオリン欠損型マウスで顕著であることから、シノビオリンは関節炎によって惹起される小胞体ストレスを阻害する機能を有することが明らかとなった（図６）。
【実施例６】  実施例５において、シノビオリンは関節炎によって惹起される小胞体ストレスを阻害する機能を有することを示した。また、ＥＲＡＤの亢進が滑膜細胞の増殖に関与することが、マウスを用いた研究により明らかとなった。しかし、ヒトの関節リウマチ滑膜組織においても、ＥＲＡＤの亢進が滑膜細胞の増殖にとって有効なメカニズムとして働きうるのかは明らかではない。
そこで、ヒトの関節リウマチ滑膜組織においても、ＥＲＡＤの亢進が滑膜細胞の増殖にとって有効なメカニズムとして働きうるのかを検討する目的で、ヒトの関節リウマチ滑膜組織における小胞体ストレスの存在を確認した。小胞体ストレスの存在が証明できれば、これを回避する機能としてのＥＲＡＤの亢進は、関節リウマチの滑膜細胞の増殖に関して重要な意味を有するからである。
実験は以下のように行った。すなわち、ヒト滑膜組織は関節リウマチ患者の膝関節置換術時に切除されたものを、文書による承諾を得られた後に採取した。４％パラホルムアルデヒド溶液で４時間固定後、パラフィン包埋したものを４マイクロメーターの厚さに薄切し、プレパラート上に固定した。脱パラフィン作業を行った後、小胞体ストレス存在下で細胞核に集積するＡＴＦ６（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ６）の発現を検討した。抗ＡＴＦ６ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）および正常ヤギＩｇＧ（Ｄａｋｏ社）をおのおの０．００ｌｍｇ／ｍｌの濃度で反応させ、Ｖｅｃｔｏｒ社のｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ｋｉｔおよびジアミノベンジジン発色系を用いた免疫組織染色を行った。その結果、図７の矢印に示されるように、関節リウマチ滑膜組織において、ＡＴＦ６の細胞核への集積がみられた。これにより、小胞体ストレスの存在が明らかとなった（図７）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、自己免疫疾患治療剤が提供される。本発明の治療剤は、例えば関節リウマチの治療薬として有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１：合成ＲＮＡ
配列番号２：合成ＲＮＡ
【配列表】
2005018675.tif 000003
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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