(57)【要約】本発明の目的は、腸疾患、特に、炎症性腸疾患に対して有効な薬剤を提供する。上記目的は、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腸疾患の予防剤および／または治療剤により達成される。具体的には、本発明は、プレニルケトン系化合物である、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分として含有する、腸疾患の予防剤および／または治療剤を提供する。
2005002558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項２】
前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項１に記載の腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項３】
前記プレニルケトン系化合物が、
2005002558.tif 000012
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである、請求項２に記載の腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項４】
前記腸疾患は、炎症性腸疾患である、請求項１ないし３のうち何れか一項に記載の腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項５】
前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項４に記載の腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項６】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である、請求項１ないし５のうち何れか一項に記載の腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項７】
2005002558.tif 000013
式（Ｉ）で表される、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分とする炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項８】
前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項７に記載の炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤。
【請求項９】
熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を投与する工程を含む、腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１０】
前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項９に記載の腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１１】
前記プレニルケトン系化合物が、
2005002558.tif 000014
2005002558.tif 000015
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである、請求項１０に記載の腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１２】
前記腸疾患は、炎症性腸疾患である、請求項９ないし１１のうち何れか一項に記載の腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１３】
前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項１２に記載の予防方法および／または治療方法。
【請求項１４】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である、請求項９ないし１３のうち何れか一項に記載の腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１５】
2005002558.tif 000016
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分とする炎症性腸疾患の予防方法および／または治療方法。
【請求項１６】
前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項１５に記載の予防方法および／または治療方法。
【請求項１７】
熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腸疾患の予防剤および／または治療剤を製造するための、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用。
【請求項１８】
前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記プレニルケトン系化合物が、
2005002558.tif 000017
2005002558.tif 000018
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記腸疾患は、炎症性腸疾患である、請求項１７ないし１９のうち何れか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である、請求項１７ないし２１のうち何れか一項に記載の使用。
【請求項２３】
2005002558.tif 000019
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分として含有する、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤を製造するための、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用。
【請求項２４】
前記炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、炎症性腸疾患の予防および／または治療剤に係り、より詳細には、潰瘍性大腸炎やクローン病のような炎症性腸疾患の予防および／治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒト炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下、単に「ＩＢＤ」という。）は、大腸および小腸の粘膜に慢性の炎症または潰瘍を引き起こし慢性の経過をたどる炎症性疾患であり、その疾患の病因は知られていない（たとえば、非特許文献１参照）。このＩＢＤは、主として大腸粘膜を侵し、びらんや潰瘍を形成する原因不明のびまん性非特異的炎症である潰瘍性大腸炎や繊維化あるいは潰瘍、さらに非特異性の肉芽腫を伴う炎症性疾患であるクローン病等を含むほか、広義的には腸管型ベーチェット病や虚血性腸炎等も含まれる。現在、日本においては、これらの疾患の患者は増加の一途をたどり、一昨年の厚生労働省難治性腸管障害研究班報告によると潰瘍性大腸炎、クローン病をあわせ１０万人におよび、特に、１０〜２０代の若年者に多く見られており、根治治療がない現在、生涯にわたりこれらの病気と闘い、苦しまなければならない難病の一つである。【０００３】  炎症の作用機序とＩＢＤにおける免疫応答は未だに解明されていないが、腫瘍壊死因子（以下、「ＴＮＦ」という。）αやマクロファージ遊走阻止因子のような、さまざまな炎症メディエータが病変や悪化に関与していることが明らかになった（たとえば、非特許文献２ないし５を参照）。【０００４】  ＩＢＤに対する現代の治療は、５−アミノサリチル酸（５−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ、単に「５−ＡＳＡ」という。）、グルココルチコイド、免疫抑制剤や免疫制御剤を、主に使用する。しかし、この治療に対して耐性を有する患者も存在する。最近、新規な治療剤として、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体が開発された（たとえば、非特許文献６および７参照）。この抗体は、ＴＮＦ−αの活性を抑制し、クローン病を罹患した患者における腸炎症を急速に改善させる。しかし、感染および悪性腫瘍のような副作用が、度々発症する（たとえば、非特許文献８および９参照）。これらの副作用が、抗ＴＮＦ−αモノクローナル抗体による治療の継続を困難にしている。【０００５】  熱ショックタンパク質（以下、単に「ＨＳＰ」という。）は保護的性質を示し、免疫応答を制御する、ストレス誘導性タンパク質である（たとえば、非特許文献１０参照）。ＨＳＰの主な機能は、異常に折畳みこまれたまたは変異タンパク質に対する細胞内シャペロンとして作用し、ストレス条件下において、細胞に細胞保護機能を付与する。多くのＨＳＰの一つとして、分子量が約７０ｋＤａであることから名づけられたＨＳＰ７０がある。そのサブファミリーには、胃、肝臓および心臓へのストレスに対して強い細胞保護機能を有するものがある（たとえば、非特許文献１１ないし１４参照）。ＨＳＰ７０−トランスジェニックマウスは、心臓損傷モデルに対して抵抗性を示す（たとえば、非特許文献１５および１６参照）。ヒトの腸において、大腸粘膜における非特異的大腸炎と比して、潰瘍性大腸炎では、ＨＳＰ７０の発現が増大する（非特許文献１７参照）。しかし、ＩＢＤの病態におけるＨＳＰの役割は十分に検討されていない。【０００６】  ところで、ゲラニルゲラニルアセトン（以下、単に「ＧＧＡ」という。）は、胃を潰瘍などの障害から保護する非環式ポリイソプレノイドである。この化合物は、胃酸分泌に影響を与えることなく、さまざまなストレスに対して胃粘膜を保護するのに有効であることが知られている（たとえば、非特許文献１８ないし２０参照）。くわえて、ＧＧＡは、胃ムチンの合成や分泌だけでなく（たとえば、非特許文献２１参照）、糖タンパク質や表面活性リン脂質成分（たとえば、非特許文献２２参照）の合成や分泌を増大させることが報告されている。数年前には、ＧＧＡは、胃粘膜細胞においてＨＳＰ７０の発現を誘導することが報告されている（たとえば、非特許文献２３参照）。さらに、ＧＧＡの経口投与により、インビボにて、多くの局所組織にて、ＨＳＰ７０の発現を誘導し、破壊および炎症に対して組織を保護する（たとえば、非特許文献２４ないし２６参照）。【０００７】  また、ＧＧＡが炎症性腸疾患に有効である旨を記載した特許出願がなされている（特許文献１参照）が、単に請求の範囲に記載されているにすぎず、詳細な説明にはゲラニルゲラニルアセトンが炎症性腸疾患に有効であることを示す実験例は全く記載されていないため、炎症性腸疾患に対して有効であるか否かは不明のままである。【０００８】  腸内炎症や免疫応答を誘導するであろう因子を調査するために、多くの実験動物モデルが利用されている。これらのモデルの中で、モデル自体の信頼性および利便性のため、デキストラン硫酸ナトリウム（以下、単に「ＤＳＳ」という。）や２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（以下、「ＴＮＢＳ」という。）誘導腸炎モデルが、幅広く利用されている（たとえば、非特許文献２７ないし２９参照）。【０００９】  一方、同様の胃粘膜保護剤としてエカベトナトリウムが知られ、本願発明の如く炎症性腸疾患の予防・治療剤として知られているが（たとえば、特許文献２参照）、エカベトナトリウムは、ＧＧＡと化学構造が非類似であり、さらに経口投与によると大腸などの下部消化管までの到達が困難であるため、炎症性腸疾患の治療に用いるためには、前述した特許文献１の数々の実験例でも見られるように少なくとも注腸による投与が必要である。かかる注腸の場合、炎症部位周辺に直接薬剤が投与されるため患者に大きな負担を強いるものである他、下行結腸や横行結腸の一部にまでしか到達することができず治療範囲が限定されるという問題がある。
【非特許文献１】Ｐｏｄｏｌｓｋｙ  ＤＫ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２；３４７：４１７−２９．
【非特許文献２】Ｓａｒｔｏｒ  ＲＢ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９７；９２（１２  Ｓｕｐｐｌ．）：５Ｓ−１１Ｓ．
【非特許文献３】Ｐａｐａｄａｋｉｓ  ＫＡ，Ｔａｒｇａｎ  ＳＲ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  ２０００；５１：２８９−９８．
【非特許文献４】ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＹＰ，Ａｂａｄｉａ−Ｍｏｌｉｎａ  ＡＣ，Ｓａｔｏｓｋａｒ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＭＩＦ．２００１；２：１０６１−６６．
【非特許文献５】Ｏｈｋａｗａｒａ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ  Ｊ，Ｔａｋｅｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００２；１２３：２５６−７０．
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｄｕｌｌｅｍｅｎ  ＨＭ，ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ  ＳＪ，Ｈｏｍｍｅｓ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃＡ２）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９５；１０９：１２９−３５．
【非特許文献７】Ｔａｒｇａｎ  ＳＲ，Ｈａｎａｕｅｒ  ＳＢ，ｖａｎ  Ｄｅｖｅｎｔｅｒ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃＡ２  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｒｏｈｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｃＡ２  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９７；３３７：１０２９−３５．
【非特許文献８】Ｂｉｃｋｓｔｏｎ  ＳＪ，Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ  ＧＲ，Ａｒｓｅｎｅａｕ  ＫＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９９；１１７：１４３３−３７．
【非特許文献９】Ｋｅａｎｅ  Ｊ，Ｇｅｒｓｈｏｎ  Ｓ，Ｗｉｓｅ  ＲＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ，ａ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１；３４５：１０９８−１０４．
【非特許文献１０】Ｐｏｃｋｌｅｙ  ＡＧ．Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００３；９；３６２（９３８２）：４６９−７６
【非特許文献１１】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ｒｏｋｕｔａｎ  Ｋ，Ｍａｒｕｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９１；１０１：１６１−１６６
【非特許文献１２】Ｍｅｓｔｒｉｌ  Ｒ，Ｃｈｉ  ＳＨ，Ｓａｙｅｎ  ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｓｈｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：７５９−７６７．
【非特許文献１３】Ｕｒａｙａｍａ  Ｓ，Ｍｕｓｃｈ  ＭＷ，Ｒｅｔｓｋｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ＩＥＣ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０２：１８６０−１８６５．
【非特許文献１４】Ｆｕｊｉｍｏｒｉ  Ｓ，Ｏｔａｋａ  Ｍ，Ｏｔａｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ７２−ｋＤａ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９７；４２：１９８７−１９９４．
【非特許文献１５】Ｍａｒｂｅｒ  ＭＳ，Ｍｅｓｔｒｉｌ  Ｒ，Ｃｈｉ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ７０−ｋＤ  ｈｅａｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９５；９５：１４４６−５６．
【非特許文献１６】Ｈｕｔｔｅｒ  ＪＪ，Ｍｅｓｔｒｉｌ  Ｒ，Ｔａｍ  ＥＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７２  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９６；９４：１４０８−１１．
【非特許文献１７】Ｌｕｄｗｉｇ  Ｄ，Ｓｔａｈｌ  Ｍ，Ｉｂｒａｈｉｍ  ＥＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９９；４４：１４４０−４７．
【非特許文献１８】Ｔｅｒａｎｏ  Ａ，Ｓｈｉｇａ  Ｊ，Ｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ．Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９８６；３５：１８２−８８．
【非特許文献１９】Ｐａｐｐａｓ  ＴＮ，Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ  ＳＪ，Ｇｏｔｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｃ  ｕｌｃｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  １９８７；１２２：４４７−５０．
【非特許文献２０】Ｂｉｌｓｋｉ  Ｊ，Ｓａｒｏｓｉｅｋ  Ｊ，Ｍｕｒｔｙ  ＶＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｕｓ  ｂｙ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ．ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ  １９８７；３６：４０５９−６５．
【非特許文献２１】Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｔ，Ｂｅｓｓｈｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ  ｏｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｓｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９８２；７７：１１３−１８
【非特許文献２２】Ｉｔｏ  Ｍ，Ｔａｎａｋａ  Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｐｒｅｎｏｎｅ，ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｕｌｃｅｒ  ａｇｅｎｔ，ｏｎ  ｈｉｇｈ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｕｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｌｃｅｒ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊｐｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９８６；４１：１１７−２５．
【非特許文献２３】Ｈｉｒａｋａｗａ  Ｔ，Ｒｏｋｕｔａｎ  Ｋ，Ｎｉｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９６；１１１：３４５−５７．
【非特許文献２４】Ｏｏｉｅ  Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，Ｓａｉｋａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｏｒａｌ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  Ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７２  ａｎｄ  ｒｅｎｄｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００１；１０４：１８３７−４３．
【非特許文献２５】Ｙａｍａｇａｍｉ  Ｋ，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｒａｎｙｌ−ｇｅｒａｎｙｌ−ａｃｅｔｏｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｂｅｆｏｒｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒｓ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  ２０００；１３５：４６５−７５．
【非特許文献２６】Ｕｎｏｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｉｗａｓａｋａ  Ｈ，Ｅｔｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ：ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭｘＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＫＲ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２００３；４７：２９１４−２１．
【非特許文献２７】Ｅｌｓｏｎ  ＣＯ，Ｓａｒｔｏｒ  ＲＢ，Ｔｅｎｎｙｓｏｎ  ＧＳ，ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１９９５；１０９：１３４４−６７．
【非特許文献２８】Ｏｋａｙａｓｕ  Ｉ，Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｓ，Ｙａｍａｄａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９９０；９８：６９４−７０２．
【非特許文献２９】Ｍｏｒｒｉｓ  ＧＰ，Ｂｅｃｋ  ＰＬ，Ｈｅｒｒｉｄｇｅ  ＭＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｐｔｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｃｏｌｏｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８９；９６：７９５−８０３．
【特許文献１】ＷＯ０２／０９８３９８号広報
【特許文献２】特開２００２−１０４９６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  本発明は、患者に大きな負担を強いることなく、腸管全体における炎症性腸疾患の予防および／または治療において、安全かつ有効な新規な薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは鋭意検討した結果、特定の非環式ポリイソプレノイド化合物が、腸管にてＨＳＰを誘導し、炎症性腸疾患の予防および／または治療に有効であるという知見を得て、本発明を完成するに至った。【００１２】  すなわち、本発明の第一の態様によれば、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腸疾患の予防および／または治療剤を提供する。【００１３】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療剤の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である。【００１４】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療剤の好ましい態様において、前記プレニルケトン系化合物が、【００１５】
2005002558.tif 000003
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである。【００１６】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療剤の好ましい態様において、前記腸疾患は、炎症性腸疾患である。【００１７】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療剤の好ましい態様において、前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管型ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される疾患である。【００１８】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療剤の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である。【００１９】  また、本発明は、【００２０】
2005002558.tif 000004
式（Ｉ）で表される、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分とする炎症性腸疾患の予防剤および／または治療剤を提供する。【００２１】  本発明に係る予防剤および／または治療剤における炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される。【００２２】  また、本発明の第二の態様によれば、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を投与する工程を含む、腸疾患の予防および／または治療方法を提供する。【００２３】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療方法の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である。【００２４】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療方法の好ましい態様において、前記プレニルケトン系化合物が、【００２５】
2005002558.tif 000005
式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである。【００２６】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療方法の好ましい態様において、前記腸疾患は、炎症性腸疾患である。【００２７】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療方法の好ましい態様において、前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管型ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される疾患である。【００２８】  本発明に係る腸疾患の予防および／または治療方法の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である。【００２９】  また、本発明は、【００３０】
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式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分とする炎症性腸疾患の予防方法および／または治療方法を提供する。【００３１】  本発明に係る予防方法および／または治療方法における炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される。【００３２】  さらに、本発明の第三の態様によれば、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分として含有する、腸疾患の予防および／または治療剤を製造するための、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用を提供する。【００３３】  本発明による前記使用の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質誘導剤が、プレニルケトン系化合物である。【００３４】  本発明による前記使用の好ましい態様において、前記プレニルケトン系化合物が、【００３５】
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式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンである。【００３６】  本発明による前記使用の好ましい態様において、前記腸疾患は、炎症性腸疾患である。【００３７】  本発明による前記使用の好ましい態様において、前記炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管型ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される疾患である。【００３８】  本発明による前記使用の好ましい態様において、前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質７０である。【００３９】  また、本発明は、【００４０】
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式（Ｉ）で表される６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンを有効成分として含有する、炎症性腸疾患の予防剤または治療剤を製造するための、熱ショックタンパク質誘導剤もしくはその塩またはそれらの水和物の使用を提供する。【００４１】  本発明に係る使用における炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管ベーチェット病および虚血性腸炎からなる群から選択される。
【発明の効果】
【００４２】  本発明によれば、本発明に係る化合物である６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オンは、腸にて熱ショックタンパク質７０を誘導し、腸疾患、より具体的には炎症性腸疾患の予防および／または治療に対して有効である。また、本発明に係る化合物は注腸によることなく経口的に投与が可能であるため、患者に過度の負担を与えることなく、腸疾患を予防および／または治療することはできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】  以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。【００４４】  本発明は、腸疾患、特に炎症性腸疾患の治療に対して有効である、毒性のない予防剤および／または治療剤を提供するものである。以下、本発明を詳細に説明する。【００４５】  本発明において有効成分である化合物は、式（Ｉ）で表されるプレニルケトン系化合物である。【００４６】
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本発明に好適に用いられる化合物の化合物名は、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ナノデカテトラエン−２−オン（別名：ゲラニルゲラニルアセトン、一般名：テプレノン、以下、単に「ＧＧＡ」ともいう。）である。本発明に用いるＧＧＡは、その構造中に４カ所に二重結合を有しており、計８種類の幾何異性体が存在するが、本発明においては特に限定されず、いずれか１つの異性体でもよく、また２種以上の混合物であってもよい。これらの中でも好ましい化合物としては、（５Ｅ，９Ｅ，３Ｅ）−６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン及び（５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅ）−６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オンを挙げることができる。【００４７】  本発明に用いるＧＧＡは、公知の化合物であり、試薬、工業原料として入手することが可能である。ＧＧＡの合成法としては、たとえば、特開昭５３−１４５９２２号公報に開示されている方法に従って合成することができる。【００４８】  本発明に用いる有効成分であるＧＧＡには結晶多形が存在することもあるが限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよい。さらに、本発明に用いるＧＧＡが生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。【００４９】  本発明に係る予防剤および／または治療剤は、ＧＧＡをそのまま用いてもよいし、または、公知の薬学的に許容できる担体等、たとえば、賦形剤（具体的には、乳糖、白糖、でんぷん、マンニトールなど）、結合剤（具体的には、α化澱粉、アラビアゴム、カルボキシセルロース、ポリビニルピロリドンなど）、滑沢剤（具体的には、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤等、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合してもよい。【００５０】  本発明に係る予防剤および／または治療剤の製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、凍結乾燥剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等が挙げられる。【００５１】  また、本発明においては、ＧＧＡの投与形態は、特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。ＧＧＡは、商品名「セルベックス」（エーザイ株式会社製）として入手することができる。【００５２】  本発明に係るＧＧＡ含有予防剤および／または治療剤は、哺乳類（例：ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル等）の腸疾患の予防および／または治療に有用で、特に、ヒトの腸疾患の治療および／または予防に有用である。
本発明に係るＧＧＡ含有予防剤および／または治療剤の投与量は、症状、年齢、体重などの条件により適宜選択されるが、成人一日あたり、２０〜２０００ｍｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは１００〜５００ｍｇである。【００５３】  本発明に係るＧＧＡ化合物が有効な疾患は腸疾患であり、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸管型ベーチェット病、単純性潰瘍、放射線腸炎および虚血性腸炎などが挙げられ、特に、クローン病や潰瘍性大腸炎に対して有効である。【００５４】  本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。本発明の記載に基づき、種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に包含される。
【実施例】
【００５５】実験例１
（実験動物）
マウスは、８−１０週齢、体重２２〜２５ｇのＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）ＢＡＬＢ／ｃ雄性マウス（チャールズリバージャパン（株）製）を使用した。全てのマウスは、標準的実験飼料を与え、自由に摂食飲水させた。本発明は、ヘルシンキ宣言を遵守し、北海道大学医学部の動物実験倫理規定委員会の承認を得て行われた。【００５６】（統計的解析）
特に断りがない限り、後述する全てのデータは平均値±標準誤差として示す。Ｆ検定と、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定（ＳｔａｔＶｉｅｗ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｒａｙ，ＮＣ）を用い、結果を統計的に解析した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなした。【００５７】（ＧＧＡの調製と経口投与）
ＧＧＡ（商品名「セルベックス」、エーザイ株式会社製）は、５％アラビアゴム溶液と、０．０００８％のトコフェロールで混合したものを使用した。１ｍｌシリンジに付いた金属チューブを介して、３００ｍｇ／ｋｇ／回の投与量で、５ｍｌ／ｋｇ／回の体積のＧＧＡをマウスに経口投与した。コントロール群のマウスは、同量のトコフェロール含有アラビアゴム（以下コントロール試薬）を投与した。各群のマウスは、ＤＳＳ投与２時間前とＤＳＳの最初の投与後一日おきに７日間、ＧＧＡまたはコントロール試薬を投与した（全体で４回）。投与量依存の実験は、ＤＳＳ大腸炎の臨床的評価において、ＧＧＡの異なる投与量（５０，１００，３００，５００ｍｇ／ｋｇ）で評価した。ウエスタンブロット法によるＨＳＰ７０の誘導に対するＧＧＡの効果を検討するため、マウスは、ＧＧＡ  ３００ｍｇ／ｋｇの単回の経口投与で処理した。ＧＧＡまたはコントロール試薬投与の前後における各マウスから大腸組織のサンプルを集めた。【００５８】（デキストラン硫酸ナトリウム：ＤＳＳ大腸炎の誘導と評価）
マウスに３．０％ＤＳＳ（分子量：４０，０００；ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ製，米国カリフォルニア州）の水溶液を７日間自由飲水させることにより、腸炎を誘導させた。投与開始日から毎日、マウスの体重を観察し、直腸出血および下痢を、観察した。各マウスの体重を計測した。実験の各段階において、組織学的評価、サイトカイン、ＨＳＰおよびミエロペルオキシターゼ（以下、「ＭＰＯ」という。）活性の測定のため、さまざまな時間間隔で大腸組織を採取した。大腸は使用する直前まで−８０℃で保存した。さらに、大腸炎の重症度は、ＤＳＳ投与開始７日後に、大腸の長さ及び組織学的検査により評価した。【００５９】  図１は、本発明の実施例において、マウスへのコントロール試薬投与群とＧＧＡ処理群における、ＤＳＳ大腸炎誘導時の下痢および直腸出血の頻度を示す図である。図１から明らかなように、３００ｍｇ／ｋｇ／回および５００ｍｇ／ｋｇ／回のＧＧＡ処理群は、コントロール試薬投与群に比べ、下痢および直腸出血の頻度は有意に減少していた。また、コントロール試薬投与群では、ＤＳＳ投与前の体重を１００％とすると、ＤＳＳ投与７日後では、マウスの体重は８６．３±２．４％へ減少したが、ＧＧＡ処理群では、処理群と比して体重の変化は有意に低減している（３００ｍｇ／ｋｇ／回の群では、９３．８±４．１％であり、５００ｍｇ／ｋｇ／回の群では、９４．７±５．０％である。）。ＧＧＡの投与量依存効果の臨床的評価では、ＧＧＡの３００ｍｇ／ｋｇ／回の投与量が、疾患を抑制するには十分であることが判明した。【００６０】  大腸の短小化と組織的変化とは十分な相関関係があることが知られており、大腸の長さは、通例、炎症の程度の形態学的パラメータとして利用される。大腸の長さを評価するため、各群におけるマウスを所定の時間にて殺した。図２は、ＤＳＳ投与７日後における、大腸の長さを示す図である。図２は、ＧＧＡ処理群における大腸の長さ（６．８±０．３ｃｍ）は、コントロール試薬処理群の大腸の長さ（５．１±０．１ｃｍ）よりも有意に長いことを示している。【００６１】（ＤＳＳ大腸炎の組織学的解析）
大腸組織を長手方向に開き、１０％の中性ホルマリン緩衝液で固定化し、パラフィンにて浸漬した。ガラススライド上にて前記組織部分のパラフィンを除いた後、サンプルをヘマトキシリンエオシン（以下、「ＨＥ」という。）で染色した。組織損傷の組織学的評価として、炎症性病変の領域を顕微鏡で観察し、Ｃｏｏｐｅｒらの手法（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  ＩＪ，ＭｃＭＩｌｌａｎ  ＤＲ．Ｓｔｒｅｓｓ（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１９９８  ２７；８３：１１７−３２．）に若干の修正を加えて、二人の病理学専門家により定量化した。大腸損傷を６段階に分類した。すなわち、０：正常の粘膜、１：炎症細胞の浸潤、２：半分以下の腺窩の短小化、３：半分以上の腺窩の短小化、４：腺窩の消失、５：上皮細胞の欠落（潰瘍形成および侵食）である。くわえて、炎症病変の範囲も評価した。大腸全体における病変の範囲を、６段階に分類した。すなわち、０：０％、１：１〜２０％、２：２１〜４０％、３：４１〜６１％、４：６１〜８０％、５：８１〜１００％である。【００６２】  図３は、本発明におけるＤＳＳ大腸炎の組織学的解析の結果を示す。ＤＳＳ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腸における組織学は、ＨＥ染色を用いて、組織損傷に対するＧＧＡの効果を評価するために検討した。大腸における浸潤細胞の数は、ＤＳＳ処理前が最小であったが（図３Ａ参照）、浸潤細胞の数は、ＤＳＳ処理７日後には、腺窩の消失と上皮細胞の破壊とともに増大した（図３Ｂ参照）。ＧＧＡ処理群では、組織損傷は有意に改善され、浸潤炎症細胞の数は、コントロール試薬処理群と比して減少した（図３ＣおよびＤ参照）。ＧＧＡ処理マウスにおいて、組織損傷および病変範囲双方に対する病理組織学的スコアの結果は、未処理およびコントロール試薬処理マウスと比して、有意に減少した（図４参照）。なお、図４は、本発明による３％ＤＳＳ投与７日後のマウスの大腸の組織学的スコアの結果を示す。【００６３】（ウエスタンブロット解析）
組織をＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｌｕｃｅｒｎｅ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で粉砕した。等量のホモジネートを、２−メルカプトエタノール（１％）、ＳＤＳ（２％）、グリセリン（２０％）およびブロモフェノールブルー（０．０４％）を含有する２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ（ｐＨ６．８）に溶解させ、サンプルを５分間、１００℃に加熱した。次いで、そのサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いた電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜へ電気泳動的に転写した。その膜をＰＢＳ中の１％の無脂肪乾燥乳によりブロックし、抗ＨＳＰ２５、４０、７０、９０抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ  Ｃａｎａｄａ）とβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）を用いてプローブし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という。）と結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた。残存した複合体を製造者プロトコールに基づく検出システムのために処理した。細胞ホモジネートのタンパク質濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キットを用いて定量化した。【００６４】（免疫組織化学）
ＨＳＰ７０に対する免疫組織化学的解析は、製造者プロトコールに基づいて、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキットを用いて行った。パラフィン浸漬大腸組織を、４μ厚に小片に切除した。この小片を、３％Ｈ２Ｏ２に、４℃１０分間前処理し、次いで、室温で３０分間、１０％の正常ヤギ血清にて処理し、その後、４℃にて、抗ＨＳＰ７０抗体（１：２００に希釈、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）で一晩インキュベーションした。ＨＳＰ７０陽性染色は、ジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）にて可視化させた。【００６５】  図５は、３％ＤＳＳ処理した大腸炎モデルマウスの大腸における、ＨＳＰ２５、４０、７０、９０のウエスタンブロット解析の結果である。ＨＳＰの発現を、ＨＳＰ２５、４０、７０、９０に対する抗体を用いて、ウエスタンブロット解析により検討した。ＨＳＰ７０は、ＧＧＡ添加（３００ｍｇ／ｋｇ）前は弱く検出されたが、ＧＧＡ処理１２時間後では、その発現レベルは増大した。一方、ＨＳＰ２５、４０、および９０の発現は、ＧＧＡ処理でも変化しなかった（図５参照）。【００６６】  図６は、本発明による、ＤＳＳ誘導大腸炎の大腸におけるＨＳＰ７０の免疫組織化学的解析の結果を示す。ＤＳＳ誘導大腸炎を患ったマウスの大腸におけるＨＳＰ７０の発現箇所を確認するために、ＨＳＰ７０の免疫組織学を大腸組織におけるＨＳＰ７０の特異性抗体を利用して行った。ＨＳＰ７０の免疫反応性は、上皮細胞および正常マウスの腺窩において、弱い陽性であった（図６Ｂ参照）。ＤＳＳ誘導およびコントロール試薬処理マウスにおいては、大腸にてＨＳＰ７０陽性の染色細胞はほとんど存在しなかった。興味深いことに、ＧＧＡ処理マウスの大腸組織における染色は、コントロール試薬処理マウスにおけるそれよりも非常に強かった（図６Ｄ参照）。これらの知見は、ＧＧＡが大腸において内因性ＨＳＰを誘導するという仮説を支持するものである。【００６７】（大腸におけるミエロペルオキシターゼ活性の測定）
組織ＭＰＯ活性は、Ｋｒａｗｉｓｚらの手法（Ｋｒａｗｉｓｚ  ＪＥ，Ｓｈａｒｏｎ  Ｐ，Ｓｔｅｎｓｏｎ  ＷＦ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １９８４；８７：１３４４−５０．）を若干修正した方法により求めた。すなわち、組織試料（約３００ｍｇ）を、各試料ごとに氷上で、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ型ホモジナイザーを用いて３０秒、３回を、緩衝液（ｐＨ６．０、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液中の、０．５％のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）中でホモジナイズさせた。そのサンプルを、４℃で２０分間、２０，０００ｘｇにて遠心分離させ、その上澄み液を収集した。そのサンプル（１００μｌ）を、０．１６７ｍｇ／ｍｌのｏ−ジアニシジン塩酸塩と０．０００５％の過酸化水素を含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）の２．９ｍｌへ添加し、２５℃にて分光器を用いて測定した。上澄み液のタンパク質濃度は、補正のため、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定し、その値は、ヒト白血球（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）から精製したＭＰＯを用いて標準化した。【００６８】  炎症の別のパラメータとしては、大腸組織におけるミエロペルオキシターゼ（ＭＰＯ）活性のレベルがある。ＭＰＯは、多形核白血球により主に産生される酵素であって、組織の顆粒球と関連する酵素である。図７は、本発明による、マウスでの３％ＤＳＳ誘導大腸炎処理７日後、大腸のＭＰＯ活性の結果を示す図である。ＤＳＳ投与のビヒクル処理マウスにおいて、ＭＰＯ活性のレベルは顕著に増大した（図７参照）。対照的に、ビヒクル処理群におけるＭＰＯ活性のレベル（２．８±０．３ｕｎｉｔｓ／ｇ）と比して、ＧＧＡ処理マウスでは、ＭＰＯ活性のレベルは有意に減少した（１．４±０．４ｕｎｉｔｓ／ｇ、Ｐ＜０．０３）。これらの結果は、ＧＧＡが顆粒球浸潤を阻害することを例証した。【００６９】（サイトカインのための酵素免疫測定法）
大腸組織中のＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−α特異性ＥＬＩＳＡキット（ＧＴ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）により測定した。５０ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた抗マウスＴＮＦ−α  ＩｇＧモノクローナル抗体を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、室温で３０分間放置した。そのプレートを蒸留水で３回洗浄した後、全てのウェルに、ブロックするための０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳを充填し、室温で２０分間放置した。ブロック溶液の除去後、血漿または組織サンプルを、個々のウェルに２回添加し、室温で１時間インキュベートした。ヘパリン添加シリンジを用いて、心臓穿刺により血漿を得た。大腸組織サンプルの調製のため、プロテアーゼ阻害剤（製造者プロトコールによる１μｌ〜２０ｍｇの組織）の混合物を含有するＰＢＳ中の組織を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｌｕｃｅｒｎｅ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモジナイズし、１０分間、１２，０００ｘｇで遠心分離し、上澄液をアッセイした。マウス組換えＴＮＦ−αタンパク質を、標準曲線を得るために利用した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液）を含有するＰＢＳで、３回プレートを洗浄した後、ビオチン結合抗ＴＮＦ−α抗体の５０μｌを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄緩衝液で３回再度洗浄した。次いで、アビジン結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、そのマイクロタイタープレートを室温で１５分間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄後、基質溶液（５０μｌ）を各ウェルに添加した。その基質溶液（１０μｌ）は、８μｇのｏ−フェニレンジアミンと、クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中の３０％のＨ２Ｏ２の４μｌとを含有した。室温で２０分間インキュベーションさせた後、２５μｌの４Ｎ硫酸で反応を終結させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ  ３５５０，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
同様に、組織中のマウスＩＦＮ−γも、ＩＦＮ−γ特異的ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。【００７０】  ＧＧＡ処理による大腸におけるサイトカイン産生阻害という観点から作用部位を説明するため、大腸組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図８は、３％ＤＳＳ処理７日後の、大腸におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生の結果を示す。大腸組織では、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの含有量は、ＤＳＳ投与７日後には増大した（それぞれ、７．９±１．０と、９．７±１．２ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。一方、ＧＧＡ処理マウスにおけるこれらのサイトカインの産生は、ビヒクル処理マウスにおけるそれよりも有意に減少した（それぞれ、４．２±０．８と、４．１±０．８ｐｇ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。これらの結果は、ＧＧＡが、大腸における炎症性促進（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの産生を抑制することを示唆している。【００７１】（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸：ＴＮＢＳ大腸炎の誘導と評価）
ＴＮＢＳ大腸炎は、前述したＢＡＬＢ／ｃマウスにて誘導させた。すなわち、一晩絶食後、ベントバルビタール（７０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射により、マウスを麻酔させた。ＴＮＢＳ大腸炎における生存率を評価するため、５０％のエタノール中の１００μｌのＴＮＢＳ（２５０ｍｇ／ｋｇ）を、ポリエチレンカニューレ（ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ  ＰＥ−２０；Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｎｓｏｎ社製；カリフォルニア州サンノゼ）を有する１ｍｌシリンジにより、腸管内腔（肛門縁から約３ｃｍ）へ注いだ。初日との比較により体重の変化を測定するため、マウスは、５０％のエタノール中における投与量１００ｍｇ／ｋｇ  ＴＮＢＳで処理した。【００７２】  異なる大腸炎モデルにおけるＧＧＡの効果を評価するため、ＴＮＢＳ誘導大腸炎における生存率および体重損失に対する、ＧＧＡの効果を検討した。本モデルでは、２７０ｍｇ／ｋｇのＴＮＢＳ投与量が重症な炎症応答を誘導するので、多くのマウスがＴＮＢＳ投与７日後には死亡した。【００７３】  図９は、本発明による、ＴＮＢＳ誘導の重症な大腸炎における生存率に対するＧＧＡの効果の結果を示す。コントロール試薬処理とＴＮＢＳ処理マウスでは、生存率は２３．３±８．８％まで減少した（図９参照）。対照的に、ＧＧＡの経口投与により、ＴＮＢＳ誘導大腸炎における生存率は、５６．７±３．３％まで有意に上昇した。【００７４】  図１０は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎における体重損失のＧＧＡによる予防効果の結果を示す。生存率と同様に、体重損失も、コントロール試薬処理マウスよりも（２２．１±３．３％）、ＧＧＡ処理マウスでは最小であった（−５．６±１．２％）（図１０参照）。【００７５】実験例２
（ＤＳＳモデルによる大腸炎の発症）
デキストラン硫酸ナトリウム（以下「ＤＳＳ」という）３．０％水溶液を生後８週齢のマウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、チャールスリバー、静岡）（ｎ＝１０）に７日間自由飲水させ腸炎を発症させた。マウスはＤＳＳ水溶液を投与後５〜６日目より下痢、血便、体重減少をきたす。ＧＧＡ（エーザイ株式会社製）１００ｍｇ／ｋｇを、ＤＳＳ投与前とＤＳＳ投与３日後にゾンデを用い生理食塩水に混合した状態で投与した。【００７６】（ＧＧＡ投与による大腸炎モデルの炎症抑制効果）
ＤＳＳ投与開始７日後にマウスの腸管を採取し、肉眼的、組織学的所見を評価した。非投与群と投与群の病理組織図をそれぞれ図１１および図１２に示す。その結果、図１１の対照群投与では組織破壊が進んでいるが、一方でＧＧＡ投与群では組織破壊がほとんど認められなかった。さらに発明者により作成した６段階のスコアを炎症による組織破壊の程度、炎症の範囲のそれぞれについてスコアリングを行った。スコア基準は以下のとおりである。【００７７】炎症による組織破壊度
０：炎症なし
１：炎症細胞の浸潤軽度あり
２：腺窩の短小化が軽度
３：腺窩の短小化が高度
４：腺窩が消失
５：上皮細胞の欠落【００７８】炎症の範囲
０：なし
１：１〜２０％
２：２１〜４０％
３：４１〜６０％
４：６１〜８０％
５：８１〜１００％【００７９】スコアをＧＧＡ投与群と非投与群にて比較し、その結果を表１に示す。表１からも明らかなように、ＧＧＡの投与により、組織破壊の程度が抑えられ、また炎症の範囲が小さくなった。さらに、下痢の発症率、血便の発症率、体重減少率、腸管の長さについても同様に比較した。その結果を表２に示す。表２から明らかなように、ＧＧＡ投与によりＤＳＳ腸炎由来の下痢や血便の発症が抑えられ、体重減少や腸管収縮についても抑制効果があった。
以上のことから、ＧＧＡが炎症性腸疾患のモデルであるＤＳＳ腸炎に対し、極めて有効であることが分かった。【００８０】
2005002558.tif 000010
【００８１】
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【００８２】  以上の結果から、ＧＧＡの経口投与により、ＤＳＳにより誘導された下痢および直腸出血、並びに体重損失のような臨床的疾患活動を抑制することが例証された。そして、ＧＧＡの経口投与により、大腸において、ＨＳＰ７０の発現が誘導され、ＭＰＯ活性のレベルと炎症促進性サイトカインの産生を抑制する。さらに、ＤＳＳ腸炎モデルとは異なる、ＴＮＢＳ誘導大腸炎においてもＧＧＡの効果が確認された。急性ＴＮＢＳ誘導大腸炎は、マウスにおいて、ＤＳＳ誘導腸炎よりも重症であることは知られている。ＴＮＢＳの高投与量にて処理したマウスにおける生存率は、ＧＧＡの経口投与により改善し、体重損失もＧＧＡにより有意に阻害された。これらの結果から、ＧＧＡはＨＳＰ７０のアップレギュレーションを介した抗炎症性作用を有し、ヒトＩＢＤの治療に有用であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】  本発明によれば、ＧＧＡを投与することにより大腸にて熱ショックタンパク質を誘導し、腸疾患、特に、炎症性腸疾患の予防および／または治療に有効であり、ＧＧＡを有効成分として含有する、腸疾患の予防および／または治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】［図１］図１は、本発明における、ＤＳＳ投与７日後の臨床的知見に対するＧＧＡ経口投与の効果の結果を示す図である。下痢と直腸出血のデータは、Ｆ検定にて解析した。体重損失の変化に対するデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔｔ検定にて解析した。全ての値は、ＤＳＳおよびコントロール試薬処理のマウスと比較した。なお、＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、＊＊＊はＰ＜０．００１をそれぞれ示し、ａは投与初日を１００％としたときの比率を示す。
［図２］図２は、飲料水中の３％のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の投与７日後における大腸の短小化の阻害に対する、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）の効果の結果を示す。左の棒は正常なコントロールマウスの結果を示し、中央の棒はコントロール試薬投与マウスの結果を示し、右の棒は３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウスの結果を示す。コントロール試薬投与マウス（ｎ＝１０）とＧＧＡ処理マウス（ｎ＝１０）との差異は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。同様な結果は、３回の独立した実験でも確認された。
［図３］図３が、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＳＳ誘導組織損傷に対するＧＧＡの効果の組織学的検討の結果を示す図である。大腸組織を長手方向に開き、１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに浸漬させた。ガラススライド上の薄い組織小片からパラフィンを除した後、サンプルをＨＥで染色した。（Ａ）飲料水のみを与えたマウス大腸の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）７日間３％ＤＳＳ溶液で処理したマウスの大腸の顕微鏡写真を示す。重症な炎症性細胞浸潤と上皮細胞破壊が観測された。（Ｃ）３％ＤＳＳ溶液が投与されたマウスにて一日おきにコントロール試薬を投与したマウスの大腸の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）と同様な組織学的外観を呈した。（Ｄ）３％ＤＳＳ溶液が投与されたマウスにて、一日おきに（計４回）、３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウスの大腸の顕微鏡写真を示す。ＧＧＡは、粘膜と粘膜下組織における炎症性細胞浸潤を抑制し、大腸粘膜における上皮細胞の破壊に対して保護を示した。なお、本図中の倍率は１００倍である。
［図４］図４は、３％ＤＳＳ投与７日後のマウスの大腸の組織学的スコアの結果を示す。組織損傷の組織学的評価では、炎症性病変の度合は顕微鏡で評価し、本明細書の実施例に記載された手法にて定量化した。細かい点を有する棒は、コントロール試薬投与マウス（ｎ＝１０）の結果を示し、黒棒はＧＧＡ処理したマウス（ｎ＝１０）の結果を示す。組織損傷および病変の度合の双方とも、コントロール試薬投与マウス（ｎ＝１０）の結果と比較して、ＧＧＡ処理したマウス（ｎ＝１０）においては、有意に抑制された。
［図５］図５は、３％ＤＳＳ誘導大腸炎の大腸における、ＨＳＰ２５、４０、７０、９０のウエスタンブロット解析の結果を示す。大腸ホモジネート全体は、ＧＧＡ投与前と投与１２時間後のマウスから調製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに転写し、ＨＳＰまたはβ−アクチン特異抗体を用いて、ＨＳＰ２５、４０、７０、９０の発現を免疫ブロットした。ＨＳＰ７０の発現は、コントロール試薬投与マウスと比して、ＧＧＡ処理マウスにて顕著に増大した。同様の結果は、３回の独立した実験でも確認された。
［図６］図６は、ＤＳＳ誘導大腸炎の大腸におけるＨＳＰ７０の免疫組織化学的解析の結果を示す。抗ＨＳＰ７０抗体またはヤギＩｇＧで処理したマウスの大腸の写真を示す（５０倍）。（Ａ）ヤギＩｇＧで処理した正常マウスからの大腸粘膜の小片の写真を示す。（Ｂ）抗ＨＳＰ７０抗体で処理した正常マウスからの大腸の小片の写真を示す。（Ｃ）抗ＨＳＰ７０抗体で処理したビヒクル処理マウスの大腸の小片の写真を示す。（Ｄ）ＤＳＳおよびＧＧＡで処理したマウスからの大腸の小片の写真を示す。表面上皮膚細胞と浸潤単核細胞におけるＨＳＰ７０発現は、未処理およびコントロール試薬投与マウスと比して増大した。顕微鏡写真は、実験から得られた代表的な小片を示す。同様な外観は、すべての試料にて観測された。
［図７］図７は、マウスにおける３％ＤＳＳ誘導大腸炎処理７日後での、大腸のミエロペルオキシターゼ（ＭＰＯ）活性の結果を示す図である。左の棒は正常なコントロールマウスの結果を示し、中央の棒はビヒクル処理マウスの結果を示し、黒棒は３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウスの結果を示す。ＧＧＡの経口投与により、ＤＳＳ投与により上昇したＭＰＯ活性が抑制された。コントロール試薬投与マウス（ｎ＝１０）とＧＧＡ処理マウス（ｎ＝１０）との差異は、統計的に有意であった。
［図８］図８は、３％ＤＳＳ処理７日後の、大腸におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生の結果を示す。サイトカイン含有量は、本明細書の実施例に記載したＥＬＩＳＡにより解析した。左の棒は正常なコントロールマウスの結果を示し、中央の棒はビヒクル処理マウスの結果を示し、黒棒は３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウスの結果を示す。ＧＧＡ処理マウス（ｎ＝１０）の大腸におけるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの産生は、コントロール試薬投与マウス（ｎ＝１０）と比して有意に減少した。
［図９］図９は、ＴＮＢＳ誘導の重症な大腸炎における生存率に対するＧＧＡの効果の結果を示す。ＴＮＢＳ（２７０ｍｇ／ｋｇ）で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率に対するＧＧＡの効果は、７日後に評価した。左の棒は正常なコントロールマウスの結果を示し、中央の棒はＴＮＢＳおよびビヒクル処理マウスの結果を示し、黒棒はＴＮＢＳおよび３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウスの結果を示す。３回の独立した実験から得られた結果は、平均±ＳＥとして示す。
［図１０］図１０は、ＴＮＢＳ誘導大腸炎における体重損失のＧＧＡによる予防の結果を示す。ＧＧＡは、７日後のＴＮＢＳ誘導による体重損失に対する保護効果を示した。白い棒は未処理マウス（ｎ＝１０）の結果を示し、斜線の入った棒はＴＮＢＳおよびビヒクル処理マウス（ｎ＝６）の結果を示し、黒棒はＴＮＢＳおよび３００ｍｇ／ｋｇのＧＧＡで処理したマウス（ｎ＝６）の結果を示す。結果は、平均±ＳＥとして示す。
［図１１］図１１はＤＳＳ腸炎モデルマウスの対照群の病理組織図である。
［図１２］図１２はＤＳＳ腸炎モデルマウスのＧＧＡ投与群の病理組織図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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