(57)【要約】本発明は、トランスポゾンを用いて外来遺伝子を効率よく細胞に導入する技術に関する。より詳細には、本発明は、トランスポゾンを含む配列をメチル化することによって、トランスポゾンの転移活性を飛躍的に向上させ、効率よくトランスジェニック生物を作製する技術に関する。メチル化は、ゲノムに組み込まれた後も保持されており、実際のゲノムへの遺伝子の組み込みにも利用することが可能になった。本発明を用いれば、従来のトランスポゾンを用いたトランスジェニック生物の作製方法よりも、格段に効率よく遺伝子を形質転換することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子。
【請求項２】
さらに、所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
前記トランスポゾンはＤＮＡ型である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
前記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
前記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記所望の遺伝子は、前記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると該トランスポゾンに作動可能に連結され得る、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記宿主は、真核生物を含む、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記宿主は、哺乳動物を含む、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記宿主は、げっ歯類を含む、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
トランスポゾンをコードする核酸配列を有する遺伝子カセットであって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、遺伝子カセット。
【請求項１４】
トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有するベクターであって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、ベクター。
【請求項１５】
前記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記トランスポゾンはＤＮＡ型である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
前記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１８】
前記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１９】
前記所望の遺伝子は、前記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると該トランスポゾンに作動可能に連結され得る、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２０】
外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２１】
前記細胞は、真核生物細胞を含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
前記細胞は、哺乳動物細胞を含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
前記細胞は、げっ歯類細胞を含む、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２４】
前記核酸配列が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用する、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２５】
ゲノム上に挿入される外来核酸分子に対してトランスポザーゼを作用させるための組成物であって、該組成物は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および該外来核酸分子を含み、該トランスポゾンをコードする配列はメチル化されている、組成物。
【請求項２６】
トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む細胞であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、細胞。
【請求項２７】
前記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記トランスポゾンはＤＮＡ型である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２９】
前記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３０】
前記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３１】
前記所望の遺伝子は、前記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると該トランスポゾンに作動可能に連結され得る、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３２】
外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３３】
前記細胞は、真核生物細胞を含む、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３４】
前記細胞は、哺乳動物細胞を含む、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３５】
前記細胞は、げっ歯類細胞を含む、請求項２６に記載の細胞。
【請求項３６】
トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む組織であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、組織。
【請求項３７】
前記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、請求項３６に記載の組織。
【請求項３８】
前記トランスポゾンはＤＮＡ型である、請求項３６に記載の組織。
【請求項３９】
前記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、請求項３６に記載の組織。
【請求項４０】
前記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、請求項３６に記載の組織。
【請求項４１】
前記所望の遺伝子は、前記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると該トランスポゾンに作動可能に連結され得る、請求項３６に記載の組織。
【請求項４２】
外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、請求項３６に記載の組織。
【請求項４３】
前記組織は、真核生物組織を含む、請求項４２に記載の組織。
【請求項４４】
前記組織は、哺乳動物組織を含む、請求項４２に記載の組織。
【請求項４５】
前記組織は、げっ歯類組織を含む、請求項４２に記載の組織。
【請求項４６】
トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む生物であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、生物。
【請求項４７】
前記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、請求項４６に記載の生物。
【請求項４８】
前記トランスポゾンはＤＮＡ型である、請求項４６に記載の生物。
【請求項４９】
前記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、請求項４６に記載の生物。
【請求項５０】
前記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、請求項４６に記載の生物。
【請求項５１】
前記所望の遺伝子は、前記トランスポゾンに作動可能に連結される、請求項４６に記載の生物。
【請求項５２】
前記生物は、真核生物を含む、請求項４６に記載の生物。
【請求項５３】
前記生物は、哺乳動物を含む、請求項４６に記載の生物。
【請求項５４】
前記生物は、げっ歯類を含む、請求項４６に記載の生物。
【請求項５５】
前記所望の遺伝子は、前記生物に由来しない、請求項４６に記載の生物。
【請求項５６】
トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する工程；
Ｂ．該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；
Ｃ．該生殖細胞において該トランスポゾンをコードする核酸配列がメチル化している個体を選択する工程；
Ｄ．形質転換された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記生物は、真核生物を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記生物は、哺乳動物を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子を提供する工程；
Ｂ．該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；ならびに
Ｃ．形質転換された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
を包含する、方法。
【請求項６０】
前記生物は、真核生物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記生物は、哺乳動物を含む、請求項５９に記載の方法。。
【請求項６２】
前記生物は、げっ歯類を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
トランスジェニック生物を作製するためのキットであって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子；
Ｂ．トランスポザーゼ、を包含する、キット。
【請求項６４】
さらに、前記核酸分子およびトランスポザーゼの使用法を記載する説明書を含む、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子の、トランスジェニック生物の作製のための使用。
【請求項６６】
少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント。
【請求項６７】
前記核酸配列は、外来遺伝子の少なくとも一部を含む、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項６８】
前記核酸配列は、少なくとも一つの発現制御領域を含む、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項６９】
前記発現制御領域は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーからなる群より選択される、請求項６８に記載のフラグメント。
【請求項７０】
外来遺伝子の少なくとも一部をさらに含み、前記核酸配列は、該外来遺伝子の少なくとも一部をコードする配列と作動可能に連結される、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項７１】
前記細胞は、動物由来である、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項７２】
前記細胞が脊椎動物から得られたものである、請求項７１に記載の核酸フラグメント。
【請求項７３】
前記脊椎動物は、哺乳動物である、請求項７２に記載の核酸フラグメント。
【請求項７４】
前記哺乳動物は、霊長類またはげっ歯類である、請求項７３に記載の核酸フラグメント。
【請求項７５】
前記細胞のＤＮＡは、細胞ゲノム、エピソームおよびプラスミドからなる群より選択される、請求項６６に記載される核酸フラグメント。
【請求項７６】
前記少なくとも１つの逆方向反復配列は、配列番号２０もしくは２１、またはその一部を含む、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項７７】
前記トランスポザーゼは、ＳＢタンパク質である、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項７８】
前記トランスポザーゼは、配列番号３に対して少なくとも８０％のアミノ酸相同性を有する、請求項７７に記載の核酸フラグメント。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、該直列反復配列は、配列番号２６に記載される塩基配列または該塩基配列に対して少なくとも８０％相同な塩基配列を含む、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、該直列反復配列は、配列番号２２〜２５に記載される核酸配列からなる群より選択される、請求項６６に記載の核酸フラグメント。
【請求項８１】
細胞中のＤＮＡに別のＤＮＡを導入するための核酸導入システムであって、該システムは：
Ａ）少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント；および
Ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする核酸、
を含む、核酸導入システム。
【請求項８２】
前記トランスポザーゼは、ＳＢタンパク質である、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８３】
前記トランスポザーゼは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列またはその改変体を有するか、または前記トランスポザーゼをコードする核酸配列は、配列番号２に記載される核酸配列またはその改変体を有する、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８４】
前記トランスポザーゼをコードする核酸は、細胞ゲノムに組み込まれる、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８５】
プラスミドまたはウイルスベクターをさらに含み、該プラスミドまたはウイルスベクターは、前記核酸フラグメントをその一部として含む、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８６】
前記核酸フラグメントは、外来遺伝子をコードする配列の少なくとも一部を含む、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８７】
前記核酸フラグメントは、前記細胞の中に、粒子ボンバードメント；エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；遺伝子導入試薬の利用；およびウイルスベクターの利用からなる群より選択される方法を用いて導入される、請求項８１に記載の核酸導入システム。
【請求項８８】
トランスジェニック生物を生産するための方法であって、
核酸フラグメントおよびトランスポザーゼを多能性細胞に導入する工程であって、該核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程；
該細胞を生物体へと成長させる工程；
を包含する、方法。
【請求項８９】
前記多能性細胞は、卵母細胞、胚細胞、卵および幹細胞からなる群より選択される、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記生物は、げっ歯類または霊長類である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記生物は、マウスまたはラットである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
核酸を細胞中のＤＮＡに導入するための方法であって、
核酸フラグメントを細胞に導入する工程であって、該核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、該トランスポザーゼの存在下で細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程、
を包含する、方法。
【請求項９３】
さらに、トランスポザーゼを前記細胞中に導入する工程を包含する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記トランスポザーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞は、前記トランスポザーゼをコードする核酸を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記トランスポザーゼをコードする核酸は、細胞ゲノムに組み込まれる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記トランスポザーゼは、細胞中で安定に発現される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記トランスポザーゼは、誘導性プロモーターに制御下にあるように作動可能に連結される、請求項９５記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸配列は、タンパク質をコードする、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
前記核酸配列は、マーカータンパク質をコードする、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０１】
細胞内の核酸配列を移動させるための方法であって：
少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、を含む細胞の中に、トランスポザーゼを導入する工程、
を包含し、該トランスポザーゼは、該細胞のＤＮＡ中の第一の位置から該ＤＮＡの第二の位置に該核酸配列を移動させる、
方法。
【請求項１０２】
前記細胞のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第一の位置は、染色体外ＤＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第二の位置は、染色体外ＤＮＡである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記トランスポザーゼは、前記細胞中に核酸として導入する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
細胞内の遺伝子を同定するための方法であって：
少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、およびトランスポザーゼを、細胞の中に導入する工程；
該細胞中のＤＮＡを、該核酸配列を切断することができる制限エンドヌクレアーゼで消化する工程；
該逆方向反復配列を同定する工程；
該逆方向反復配列に近い核酸の配列を決定する工程；および
該配列と配列情報データーベース内の配列情報と比較する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞に外来核酸分子を導入するためのシステム、キット、組成物に関する。より詳細には、トランスジェニック生物の作製およびそのための組成物、キット、システムなどに関する。
【背景技術】  トランスジェニック生物は、その応用の範囲の広さから、現在非常に注目されている技術である。しかし、効率よくトランスジェニック生物を作製する方法は、それほど開発されておらず、そのようなトランスジェニック生物の効率よい作製方法の開発は注目されている。
最近、トランスポゾンがトランスジェニック生物の作製に応用することが試みられている。トランスポゾン（または、転移可能（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）エレメントとも呼ばれる）は、反復配列が並んだ核酸分子または配列である。トランスポザーゼは、ある核酸分子への別の核酸の挿入を促進する酵素である。通常、トランスポザーゼは、トランスポゾンの中にある。
トランスポゾンは、比較的広範な範囲の生物から見出されており、その現象は普遍的であると考えられている。転移はカット＆ペースト形式により行われるとされている。脊椎動物でもトランスポゾンが発見されており（Ｒａｄｉｃｅ，Ａ．Ｄ．ら、１９９４．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４，６０６−６１２）、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ、ｈＡＴ（ｈｏｂｏ／Ａｃ／Ｔａｍ）などのスーパーファミリーに属するトランスポゾンが種々の生物（例えば、魚類、両生類、哺乳動物を含む）から同定されている（Ｏｏｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８７３；Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７，３１２−３２２；Ｋｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８３，３０；Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５７，３５９−３６６、およびＬａｍ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１０８７０−１０８７５）。トランスポザーゼは、トランスポゾンのもとあった位置からの切除および再組み込みを触媒または促進することが知られている（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，ＲＨＡ．，１９９９、ＴＩＧ  １５：３２６−３３２；Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ＲＨＡ．，１９９６  Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４，１２５−１４３）。トランスポゾンの自律メンバーは、トランス作用性因子である活性トランスポザーゼを発現することができることから、自分自身が転移可能であるという性質も有する。非自律エレメントは、シス作用性因子であり得、この場合逆方向末端反復配列とも呼ばれる。一部の逆方向反復配列は、１または複数の直列反復配列を含む。このような配列は、末端逆方向反復配列（ＩＲｓ）中に埋め込まれており、相補性トランスポザーセの存在下で別のエレメントからの移動の用いられ得る。
このような系を用いて種々の生物において外来遺伝子の導入が試みられている。
植物では、Ａｃ／Ｄｓ、Ｓｐｍスーパーファミリーなどの転移可能エレメントが利用されており、すでに慣用的な技術となっている（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，１９９５  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７，４０６−４１３）。動物でもまた、近年になって試みが行われている。ただし、エレメントには種特異性があり、なかなかうまくいかないことが多いといわれている。非ショウジョウバエ昆虫、ゼブラフィッシュ、哺乳動物などの細胞の遺伝子形質転換のためのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＰエレメントトランスポゾンの利用の試みはうまくいっていない（Ｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３．Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２，３７３−３８４；Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．ｏｌ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，３１７−３２６；およびＲｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００，４１１−４１５）。そこで、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーに属するメンバーが種特異性をほとんど要求しないことから現在注目されており、ヒトなどの哺乳動物にまで応用が試みられている。このうち、Ｍｉｎｏｓ、ＴｃＥなどもその応用が試みられている。
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）は、分子系統分類データーを利用してサケ型Ｔｃ１様トランスポゾン（ＳＢ）の転移を促進する活性として特定された。推定トランスポザーゼ遺伝子の共通配列はまず８種類の魚由来のサケサブファミリー要素の不活性要素から推定し、そしてこのような要素を不活性にする変異を排除することにより操作されている。トランスポザーゼを構築し、その機能性ドメインを同定し、そして生化学的機能を個別におよび全長トランスポザーゼの観点から試験した。トランスポザーゼはサケ要素の逆方向反復配列内の２つの結合部位に結合し、そして基質特異性があり、そのことは近縁な魚類要素サブファミリー間での交差移動を阻止できうる。ＳＢトランスポザーゼは魚類のみでなく、マウスおよびヒト細胞における操作トランスポゾンの染色体組込みを有意に高める。トランスポザーゼにおける特異的なモチーフのための要件および標的トランスポゾン内の特異的な配列は、魚類および哺乳動物細胞等における活性と共に、ＳＢトランスポザーゼを脊椎動物における生殖系形質転換および挿入式変異誘発のための最初の活性ＤＮＡトランスポゾンシステムとして確立する。本発明の一の観点において、本発明は核酸フラグメントであって：少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含んで成り、その逆方向反復配列がＳＢタンパク質に結合でき、そしてその核酸フラグメントが細胞中のＤＮＡは組込まれることのできる核酸フラグメントに関連する。一の態様において、細胞は動物、例えば無脊椎動物または脊椎動物から入手する。好適な無脊椎動物には甲殻類または軟体動物、例えば限定することなく、エビ、ホタテ、ロブスター、ハマグリまたはカキが含まれる。好適な脊椎動物の態様には魚類、鳥類、ならびに哺乳動物、例えばマウス、有蹄類、ヒツジ、ブタおよびヒトから成る群より選ばれるものが挙げられる。細胞のＤＮＡは細胞ゲノムまたは染色体外ＤＮＡ、例えばエピソームまたはプラスミドであってよい。
ＤＮＡを細胞に導入するための方法は知られており、例えば、ＤＮＡ凝縮試薬（例えばリン酸カルシウム、ポリエチレングリコール等）、脂質含有試薬（例えばリポソーム、多重層小胞体など）およびウィルス媒介法などがある。これらの方法は全てそれ自身の制約をもつ。例えば、ＤＮＡ凝縮試薬およびウィルス媒介法には、サイズが限定されるという欠点がある。核酸量もまた制約される。導入核酸の組み込みの促進もまた効率がよいというわけではない。
細胞にＤＮＡを導入するための新しい方法、特に細胞の核酸の中への様々なサイズの核酸フラグメントの効率的な組込み、特に細胞のゲノムへのＤＮＡの組込みを促進する方法のニーズが残っている。
Ｚ．Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ，９１：５０１−５１０（１９９７）は、培養細胞でのトランスポゾンシステムの発現を報告しており、成熟した哺乳動物個体またはその臓器、器官等ではトランスポゾンシステムの効果は確認されていない。動物細胞においては、ショウジョウバエの亜種Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍａｕｒｉｔｉａｎａからｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンが単離され、これを用いてベクターが構築されている。
例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＰ因子トランスポゾンを用いて種々の異種生物染色体ＤＮＡへの組み込みが試みられたが、種特異性の理由から、Ｐ因子ベクターの機能は維持されなかった。ＤｒｏｓｏｐｈｉＩａ以外のイエバエ、ハヤトビバエ、ノミバ工などのハエを用いた実験では、いずれの場合もＰ因子の転移活性が維持されなかった（Ｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２２：３７３−３８４（１９９３））。Ｐ因子およびリポーター遺伝子が組み込まれたトランスジェニックゼブラフィッシュは、遺伝的に安定した発現が得られなかった（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｍｏｌ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：３１７−３２６（１９９４））。最も研究された真核生物トランスポゾンであるＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンを異種生物で用いた場合、それらの種特異性は比較的低く転移が起こり易いことが知られている（Ｚ．Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，９１：５０１−５１０（１９９７））。このＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ・１ｉｋｅトランスポゾンより再構築されるトランスポゾンおよびトランスポザーゼを含むトランスポゾンシステムの例に、ＳＢトラシスポゾンおよびＳＢトランスポザーゼを含む前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍがある。このＳＢトランスポゾンをヒトのＨｅＬａ細胞およびマウスのＬＭＴＫ細胞へ導入した例（Ｚ．Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ，９１：５０１−５１０（２０００））、マウスの胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ：ＥＳ）細胞へ導入した例（Ａ．Ｌｕｏ．ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１０７６０−１０７７３（１９９８））・ヒト培養細胞に導入した線虫（Ｃａｅｎｏｒｌｌａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来Ｔｃ１トランスポゾンに活性がみられた例（Ｇ．Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：３０１３−３０１７（１９９８））が報告されている。しかしながら、例えばマウスの胚性幹細胞へＳＢトランスポゾンを導入した上記例においては、トランスポゾンの転移頻度は外来遺伝子が導入された細胞あたり最大でも１世代の１細胞当たり３．５×１０−５回と極めて低く、所望の細胞を得るためには大量の細胞を扱う必要があった。また、ヒトＨｅｌａ培養細胞に導入した例は、動物個体には適用できない。哺乳動物におけるトランスポゾンの導入については、ＳＢトランスポゾンおよびＳＢトランスポザーゼ遺伝子を体細胞ゲノム中に血液を介して導入して得られる。トランスポゾンが転移したマウス（ＳＲ  Ｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５：３５・４１（２０００））が報告されている。しかしながら、この場合のトランスポゾン転移頻度は、該遺伝子が導入された肝臓細胞中わずか約５−６％であり、この方法では遺伝子導入の効率が悪く、系統的にトランスジェニック動物を得ることもできない。また、これまでの方法では、１動物個体の体内で数多くの遺伝子にランダムに変異を導入することが困難であり、その発現頻度も低いものであった。従って、遺伝子変異誘発のた���の一般的な方法を設計する必要があった。
従って、上述のように、これらのＳＢなどを用いても、細胞レベルで遺伝子を導入しようとした場合に、首尾よく行かない場合が多く、形質転換効率を上げることが課題となっている。
本発明は、形質転換効率をさらに上げるトランスポゾン系を開発し、トランスジェニック生物の生産をより効率よく行うことを課題とする。
発明の要旨
上記課題は、上記状況にかんがみ、鋭意研究を重ねた結果、部分的には、導入する核酸配列の少なくとも一部をメチル化することによって、予想外に形質転換効率が上昇したことを見出したことによって解決される。
本発明は、トランスポゾンを用いて外来遺伝子を効率よく細胞に導入する技術に関する。より詳細には、本発明は、トランスポゾンを含む配列をメチル化することによって、トランスポゾンの転移活性を飛躍的に向上させ、効率よくトランスジェニック生物を作製する技術に関する。メチル化は、ゲノムに組み込まれた後も保持されており、実際のゲノムへの遺伝子の組み込みにも利用することが可能になった。本発明を用いれば、従来のトランスポゾンを用いたトランスジェニック生物の作製方法よりも、格段に効率よく遺伝子を形質転換することができる。
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子。
（２）さらに、所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する、項目１に記載の単離された核酸分子。
（３）上記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、項目１に記載の単離された核酸分子。
（４）上記トランスポゾンはＤＮＡ型である、項目１に記載の単離された核酸分子。
（５）上記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、項目１に記載の単離された核酸分子。
（６）上記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、項目１に記載の単離された核酸分子。
（７）上記所望の遺伝子は、上記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると上記トランスポゾンに作動可能に連結され得る、項目２に記載の単離された核酸分子。
（８）外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、項目１に記載の単離された核酸分子。
（９）上記宿主は、真核生物を含む、項目８に記載の単離された核酸分子。
（１０）上記宿主は、哺乳動物を含む、項目８に記載の単離された核酸分子。
（１１）上記宿主は、げっ歯類を含む、項目８に記載の単離された核酸分子。
（１２）上記核酸分子が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用する、項目１に記載の単離された核酸分子。
（１３）トランスポゾンをコードする核酸配列を有する遺伝子カセットであって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、遺伝子カセット。
（１４）トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有するベクターであって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、ベクター。
（１５）上記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、項目１４に記載のベクター。
（１６）上記トランスポゾンはＤＮＡ型である、項目１４に記載のベクター。
（１７）上記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、項目１４に記載のベクター。
（１８）上記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、項目１４に記載のベクター。
（１９）上記所望の遺伝子は、上記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると上記トランスポゾンに作動可能に連結され得る、項目１４に記載のベクター。
（２０）外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、項目１４に記載のベクター。
（２１）上記細胞は、真核生物細胞を含む、項目２０に記載のベクター。
（２２）上記細胞は、哺乳動物細胞を含む、項目２０に記載のベクター。
（２３）上記細胞は、げっ歯類細胞を含む、項目２０に記載のベクター。
（２４）上記核酸配列が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用する、項目１４に記載のベクター。
（２５）ゲノム上に挿入される外来核酸分子に対してトランスポザーゼを作用させるための組成物であって、上記組成物は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および上記外来核酸分子を含み、上記トランスポゾンをコードする配列はメチル化されている、組成物。
（２６）トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む細胞であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、細胞。
（２７）上記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、項目２６に記載の細胞。
（２８）上記トランスポゾンはＤＮＡ型である、項目２６に記載の細胞。
（２９）上記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、項目２６に記載の細胞。
（３０）上記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、項目２６に記載の細胞。
（３１）上記所望の遺伝子は、上記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると上記トランスポゾンに作動可能に連結され得る、項目２６に記載の細胞。
（３２）外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、項目２６に記載の細胞。
（３３）上記細胞は、真核生物細胞を含む、項目２６に記載の細胞。
（３４）上記細胞は、哺乳動物細胞を含む、項目２６に記載の細胞。
（３５）上記細胞は、げっ歯類細胞を含む、項目２６に記載の細胞。
（３６）トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む組織であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、組織。
（３７）上記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、項目３６に記載の組織。
（３８）上記トランスポゾンはＤＮＡ型である、項目３６に記載の組織。
（３９）上記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、項目３６に記載の組織。
（４０）上記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、項目３６に記載の組織。
（４１）上記所望の遺伝子は、上記トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されると上記トランスポゾンに作動可能に連結され得る、項目３６に記載の組織。
（４２）外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される、項目３６に記載の組織。
（４３）上記組織は、真核生物組織を含む、項目４２に記載の組織。
（４４）上記組織は、哺乳動物組織を含む、項目４２に記載の組織。
（４５）上記組織は、げっ歯類組織を含む、項目４２に記載の組織。
（４６）トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む生物であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、生物。
（４７）上記メチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在する、項目４６に記載の生物。
（４８）上記トランスポゾンはＤＮＡ型である、項目４６に記載の生物。
（４９）上記トランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する、項目４６に記載の生物。
（５０）上記トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む、項目４６に記載の生物。
（５１）上記所望の遺伝子は、上記トランスポゾンに作動可能に連結される、項目４６に記載の生物。
（５２）上記生物は、真核生物を含む、項目４６に記載の生物。
（５３）上記生物は、哺乳動物を含む、項目４６に記載の生物。
（５４）上記生物は、げっ歯類を含む、項目４６に記載の生物。
（５５）上記所望の遺伝子は、上記生物に由来しない、項目４６に記載の生物。
（５６）トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する工程；
Ｂ．上記核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；
Ｃ．上記生殖細胞において上記トランスポゾンをコードする核酸配列がメチル化している個体を選択する工程；
Ｄ．形質転換された上記生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
を包含する、方法。
（５７）上記生物は、真核生物を含む、項目５６に記載の方法。
（５８）上記生物は、哺乳動物を含む、項目５６に記載の方法。
（５９）トランスジェニック生物を作製するための方法であって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子を提供する工程；
Ｂ．上記核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；ならびに
Ｃ．形質転換された上記生殖細胞を用いて生物を再生する工程、
を包含する、方法。
（６０）上記生物は、真核生物を含む、項目５９に記載の方法。
（６１）上記生物は、哺乳動物を含む、項目５９に記載の方法。。
（６２）上記生物は、げっ歯類を含む、項目５９に記載の方法。
（６３）トランスジェニック生物を作製するためのキットであって、
Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子；
Ｂ．トランスポザーゼ、を包含する、キット。
（６４）さらに、上記核酸分子およびトランスポザーゼの使用法を記載する説明書を含む、項目６３に記載のキット。
（６５）トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子の、トランスジェニック生物の作製のための使用。
（６６）少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント。
（６７）上記核酸配列は、外来遺伝子の少なくとも一部を含む、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（６８）上記核酸配列は、少なくとも一つの発現制御領域を含む、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（６９）上記発現制御領域は、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーからなる群より選択される、項目６８に記載のフラグメント。
（７０）外来遺伝子の少なくとも一部をさらに含み、上記核酸配列は、上記外来遺伝子の少なくとも一部をコードする配列と作動可能に連結される、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（７１）上記細胞は、動物由来である、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（７２）上記細胞が脊椎動物から得られたものである、項目７１に記載の核酸フラグメント。
（７３）上記脊椎動物は、哺乳動物である、項目７２に記載の核酸フラグメント。
（７４）上記哺乳動物は、霊長類またはげっ歯類である、項目７３に記載の核酸フラグメント。
（７５）上記細胞のＤＮＡは、細胞ゲノム、エピソームおよびプラスミドからなる群より選択される、項目６６に記載される核酸フラグメント。
（７６）上記少なくとも１つの逆方向反復配列は、配列番号２０もしくは２１、またはその一部を含む、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（７７）上記トランスポザーゼは、ＳＢタンパク質である、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（７８）上記トランスポザーゼは、配列番号３に対して少なくとも８０％のアミノ酸相同性を有する、項目７７に記載の核酸フラグメント。
（７９）上記少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、上記直列反復配列は、配列番号２６に記載される塩基配列または上記塩基配列に対して少なくとも８０％相同な塩基配列を含む、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（８０）上記少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、上記直列反復配列は、配列番号２２〜２５に記載される核酸配列からなる群より選択される、項目６６に記載の核酸フラグメント。
（８１）細胞中のＤＮＡに別のＤＮＡを導入するための核酸導入システムであって、上記システムは：
（Ａ）少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント；および
（Ｂ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする核酸、
（を含む、核酸導入システム。
（８２）上記トランスポザーゼは、ＳＢタンパク質である、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８３）上記トランスポザーゼは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列またはその改変体を有するか、または上記トランスポザーゼをコードする核酸配列は、配列番号２に記載される核酸配列またはその改変体を有する、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８４）上記トランスポザーゼをコードする核酸は、細胞ゲノムに組み込まれる、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８５）プラスミドまたはウイルスベクターをさらに含み、上記プラスミドまたはウイルスベクターは、上記核酸フラグメントをその一部として含む、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８６）上記核酸フラグメントは、外来遺伝子をコードする配列の少なくとも一部を含む、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８７）上記核酸フラグメントは、上記細胞の中に、粒子ボンバードメント；エレクトロポレーショシ；マイクロインジェクション；遺伝子導入試薬の利用；およびウイルスベクターの利用からなる群より選択される方法を用いて導入される、項目８１に記載の核酸導入システム。
（８８）トランスジェニック生物を生産するための方法であって、
核酸フラグメントおよびトランスポザーゼを多能性細胞に導入する工程であって、上記核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程；
上記細胞を生物体へと成長させる工程；
を包含する、方法。
（８９）上記多能性細胞は、卵母細胞、胚細胞、卵および幹細胞からなる群より選択される、項目８８に記載の方法。
（９０）上記生物は、げっ歯類または霊長類である、項目８８に記載の方法。
（９１）上記生物は、マウスまたはラットである、項目８９に記載の方法。
（９２）核酸を細胞中のＤＮＡに導入するための方法であって、
核酸フラグメントを細胞に導入する工程であって、上記核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、上記トランスポザーゼの存在下で細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程、
を包含する、方法。
（９３）さらに、トランスポザーゼを上記細胞中に導入する工程を包含する、項目９２に記載の方法。
（９４）上記トランスポザーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有する、項目９２に記載の方法。
（９５）上記細胞は、上記トランスポザーゼをコードする核酸を含む、項目９２に記載の方法。
（９６）上記トランスポザーゼをコードする核酸は、細胞ゲノムに組み込まれる、項目９５に記載の方法。
（９７）上記トランスポザーゼは、細胞中で安定に発現される、項目９５に記載の方法。
（９８）上記トランスポザーゼは、誘導性プロモーターに制御下にあるように作動可能に連結される、項目９５記載の方法。
（９９）上記核酸配列は、タンパク質をコードする、項目９２に記載の方法。
（１００）上記核酸配列は、マーカータンパク質をコードする、項目９２に記載の方法。
（１０１）細胞内の核酸配列を移動させるための方法であって：
少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、を含む細胞の中に、トランスポザーゼを導入する工程、
を包含し、上記トランスポザーゼは、上記細胞のＤＮＡ中の第一の位置から上記ＤＮＡの第二の位置に上記核酸配列を移動させる、
方法。
（１０２）上記細胞のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである、項目１０１に記載の方法。
（１０３）上記第一の位置は、染色体外ＤＮＡである、項目１０１に記載の方法。
（１０４）上記第二の位置は、染色体外ＤＮＡである、項目１０１に記載の方法。
（１０５）上記トランスポザーゼは、上記細胞中に核酸として導入する、項目１０１に記載の方法。
（１０６）細胞内の遺伝子を同定するための方法であって：
少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、およびトランスポザーゼを、細胞の中に導入する工程；
上記細胞中のＤＮＡを、上記核酸配列を切断することができる制限エンドヌクレアーゼで消化する工程；
上記逆方向反復配列を同定する工程；
上記逆方向反復配列に近い核酸の配列を決定する工程；および
上記配列と配列情報データーベース内の配列情報と比較する工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、高頻度の転移が、ＣｐＧメチル化に関連することを示す。
図１Ａは、挿入型相同組換えによる単一コピーのＳｐｔｌｃ２遺伝子座へのＳＢトランスポゾンの導入およびＰＣＲによるトランスポゾン切り出しの検出。白い四角：エキソン、黒三角：ｌｏｘＰ部位、灰色および白の矢印：ネスティッドＰＣＲプライマー、薄い線：プラスミドの骨格配列、ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター、ＩＲ／ＤＲ−ＲおよびＩＲ／ＤＲ−Ｌ：それぞれ、右ＩＲ／ＤＲおよび左ＩＲ／ＤＲ、Ｘｂ：ＸｂａＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ。
図１Ｂは、ＥＳ細胞のＳｐｔｌｃ２遺伝子座でのＳＢトランスポゾンの切り出しを示す。Ｓｐｔｌｃ２遺伝子座に標的化して挿入したＳＢトランスポゾンを有するＥＳ１１５クローン（パネルＡに示す）を、段階希釈した野生型のＳＢトランスポザーゼ（トランスポザーゼ＋）を発現するｐＳＢ１０または、ＤＤＥボックスが欠質した不活性のＳＢトランスポザーゼ（トランスポザーゼ−）を発現するｐＳＢ１０−ＤＤＥ（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）でトランスフェクトし、パネルＡに示すように、ネスティッドＰＣＲでスクリーニングした。ｐＳＢ１０の各希釈因子について４つの独立したトランスフェクションを行い、８つの独立したＰＣＲの１反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡを使用して、各トランスフェクションにおいて８μｇのゲノムＤＮＡをスクリーニングした。ｐＳＢ１０の最大量（２μｇ）を有する代表的なＰＣＲの結果を左のパネルに示す。各トランスフェクションについての陽性ＰＣＲの平均数およびＳＢトランスポザーゼの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を右のパネルに示す。Ａｃｔｂ：βアクチン。
図１Ｃは、雄マウスの生殖細胞およびＥＳ細胞におけるトランスポゾン配列内のメチル化状態のサザンブロット分析。ＥＧＦＰをプローブとして使用した。生殖細胞由来のゲノムＤＮＡは、ＨｐａＩＩで消化されなかった。これは、この部位がメチル化ことを示す。一方、ＥＳ１１５クローン由来のゲノムＤＮＡは、ほとんど完全に消化された。かすかなバンドの存在（アスタリスクで示す）は、ＥＳ細胞において、ＨｐａＩＩ部位の小画分がメチル化ことを示す。黒丸：ＨｐａＩＩ（Ｈ）またはＭｓｐＩ（Ｍ）部位、Ｘ：ＸｈｏＩ部位。ＫＭ、ＫＸＭおよびＫＸＨレーンにおけるＨｐａＩＩ−ＭｓｐＩフラグメント由来の０．５ｋｂのバンドを矢印で示す。
図１Ｄは、一過性トランスポゾン切り出しアッセイの結果を示す。
ａ）  実験方法を示す。トランスポゾンＤＮＡ（ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：ｎｅｏ，Ｈｏｒｉｅ  ｅｔ．ａｌ．ＰＮＡＳ，２００１）を、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼにて、あらかじめメチル化しておく。マウス赤白血病細胞（ＭＥＬ  ｃｅｌｌ）に、トランスポゾンＤＮＡ  とＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  （ＳＢ）転移酵素ともに導入する。細胞から全ＤＮＡを抽出し、プラスミドベクター上のプライマーを用いてＰＣＲ  を行い、切り出し反応が起こった時に増幅される３５８ｂｐのＰＣＲ産物を検出する。
ｂ）  ＰＣＲの結果を示す。メチル化したトランスポゾンを転移酵素と共に導入した細胞において、メチル化していないトランスポゾンよりも、高頻度に切り出し反応が起きていた。
略号  ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター、ＥＧＦＰ：  緑色蛍光タンパク質、ｐＡ：  ポリＡ  付加シグナル、Ｌ：左ＩＲ／ＤＲ、Ｒ：右ＩＲ／ＤＲ、Ｍ：メチル化、Ｎ：  非メチル化、ＮＣ：  ネガティブコントロール（ＭＥＬ  ｃｅｌｌ  ゲノムＤＮＡ）。
図２は、マウスゲノムの同一遺伝子座にメチル化または非メチル化のトランスポゾンを有する細胞の樹立の様子を示す図である。Ａは、例示的実験のフローチャートを示す。Ｂは、サザンブロット分析を示す。Ｃ〜Ｄは、メチル化の維持を確認する実験結果例である。図２ｄは、所定のゲノムの遺伝子座にメチル化ＳＢトランスポゾンまたは非メチル化ＳＢトランスポゾンを有する細胞の生成を示す
図２Ｅは、標的クローンにおけるＥＧＦＰ発現の、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）分析。灰色の領域：野生型の細胞、薄い線：標的クローン。
図３Ａは、マウスゲノムにおける、ＤＮＡメチル化のトランスポゾン切り出し反応への効果を示す一例である。
図３Ｂ〜Ｃは、所定のゲノムの遺伝子座でのメチル化ＳＢトランスポゾンの高頻度の切り出しの詳細を示す。一部は、図３Ａと重複する。
図２に示すクローンからの１μｇまたは１０ｎｇをネスティッドＰＣＲのための鋳型として使用した。各クローンについて、１０のＰＣＲを行った。（Ｂ）方向Ｄ；（Ｃ）方向Ｉ。ＮＣ：ネガティブコントロールとしてのトランスフェクトしていないゲノムＤＮＡ、Ｍ：１００ｂｐラダー。トランスポゾン領域のメチル化状態および親クローンを、右に示す。
図４は、トランスポゾンのゲノムへの挿入に及ぼす効果を示す例である。Ａは、例示的に使用されるプラスミド構成を示す。Ｂにおいて、左はメチル化および右は非メチル化のものを示す。
図４Ｂは、ＳＢ転移に及ぼすＣｐＧメチル化の影響を示す。３つの独立したトランスフェクションに対し、培養皿あたりのＧ４１８耐性コロニーの平均数を右に示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
図４Ｃは、トラップした遺伝子の構造およびトランスポゾン挿入部位。挿入部位を黒矢印で示す。クローンＭ１〜Ｍ４は、メチル化トランスポゾンでのトランスフェクション由来であり、クローンＮ１〜Ｎ６は、非メチル化トランスポゾン由来である。染色体の数、Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子デシグネーター、および遺伝子名もまた示す。２つの挿入部位（Ｍ２ＳおよびＭ２Ｌと示される）が特徴付けされたクローンＭ２を除いて、各クローンにおいて１つの挿入部位を同定した。いくつかのクローン（Ｍ２Ｓ、Ｍ２Ｌ、Ｍ４およびＮ１）における正確なスプライシングは、上流のエキソン（白い矢印）およびトランスポゾンに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって確認した。黒四角：エキソン。５キロベースのスケールバーを右に示す。
図４Ｄは、Ｔｃ転移に及ぼすメチル化の影響。トラップベクターの構造を上部に示す。ＴＩＲ：末端逆方向反復。３つの独立したトランスフェクションについて、ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの平均数を底部に示す。
図５（Ａ〜Ｆ）は、代表的なトランスポゾンの配列のアラインメントである。Ｘ０１００５（１〜１６１０）、Ｚ２９０９８（１５〜１７８７）、Ｚ２９１０２（１５〜１７８７）、Ｕ１１６４１（１８８〜１４５１）、Ｕ１１６５２（１４６〜１４４２）、Ｌ４８６８５（１〜１４５５）のマルチプルアライメント［丸括弧内の数字は、各登録番号の配列における塩基範囲を示す］。
図６は、裸のメチル化ＩＲ／ＤＲに対するＳＢトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインの不変の親和性を示す。
図６Ａは、ＩＲ／ＤＲにおけるＣｐＧ部位およびトランスポザーゼ結合部位の模式図。黒丸：ＣｐＧ部位。
図６Ｂ〜Ｅは、組換えＳＢトランスポザーゼペプチド（Ｎ１２３）での電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ−Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ＝ＥＭＳＡ）を示す。
図６ＢおよびＣは、ＩＲ／ＤＲ−Ｌの３４ｂｐの外側結合部位で得られた結果であり、図６ＤおよびＥは、３００ｂｐのＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントで得られた結果である。
図６Ｂに示すように、非メチル化またはメチル化外側結合部位を増大する濃度のＮ１２３ペプチド（１６００〜１００倍希釈の精製ペプチド）と混合し、核タンパク質複合体を形成した。
図６Ｃに示すように、非メチル化外側結合部位をプローブとして標識化し、非メチル化外側結合部位またはメチル化外側結合部位を、増大する濃度で（１〜５０倍のモル過剰のプローブ）競合物質として使用した。
図６Ｄに示すように、非メチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントまたはメチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントを、核タンパク質複合体の形成のために、増大する濃度のＮ１２３ペプチド（５１００〜１６０倍希釈の精製ペプチド）と混合した。
図６Ｅに示すように、非メチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントをプローブとして標識化し、非メチル化またはメチル化のＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントを、増大する濃度（５００〜８０００倍モル過剰のプローブ）で、競合物質として使用した。Ｕｎｍｅｔ：非メチル化、Ｍｅｔ：メチル化、Ｆ：遊離プローブ、Ｃ：複合体。複合体１（Ｃ１）およびＣ２は、それぞれ、ＩＲ／ＤＲあたりのＮ１２３ペプチドの１および２分子の結合を示す（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）。
図７は、所定の遺伝子座でのメチル化トランスポゾンまたは非メチル化トランスポゾンのＣｈＩＰアッセイを示す。
図７Ａは、ＣｈＩＰアッセイにおいて分析されたＳＢトランスポゾン領域。ＰＣＲ増幅領域を各成分の下の薄い線として示す。黒三角：ｌｏｘ５１１部位。
図７ＢおよびＣは、沈降したＤＮＡのＰＣＲ分析。図３および４に示すように、クローン５Ｍ３および５Ｕ３（Ｂ）ならびにクローン６Ｍ１１および６Ｕ１（Ｃ）を、それぞれ、親クローンＲＬ５およびＲＬ６から誘導した。投入および沈降したＤＮＡの５倍段階希釈を分析した。ＡｃＨ３：抗アセチルＨ３、ＭｅＨ３Ｋ９：抗トリメチル化Ｈ３Ｋ９、ｎｏ  Ａｂ：抗体を含まないコントロール。アミラーゼ２．１およびβ−小グロビンを、異色領域かつ真性染色質領域に対する代表的なコントロールとして使用した。アミラーゼ２．１およびβ−小グロビンのバンドの強度は５Ｍ３の抗アセチルＨ３画分において同じであるが、投入ＤＮＡにおけるアミラーゼ２．１配列のより高い増幅効率は、β−小グロビン配列が、この画分においてアミラーゼ２．１配列と比較して富化されることを示す。抗体を含まないコントロールのレーンに見られるかすかなバンドは、タンパク質に対するゲノムＤＮＡの非特異的な結合由来である。アガロースビーズを調製に使用した。定量は２回行い、代表的な結果を示す。
図中、「ＧＦＰ」はＧＦＰ遺伝子を意味する。本明細書では、ときに、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステムにおけるトランスポゾンはＳＢトランスポゾン、トランスポザーゼはＳＢトランスポザーゼと記載される。一方、図中においては、「ＳＢ」はＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ遺伝子を意味する。
（配列表の説明）
配列番号１：ＳＢ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンＤＮＡの配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｌ４８６８５）。
配列番号２：ＳＢトランスポザーゼの核酸配列。
配列番号３：ＳＢトランスポザーゼのポリペプチド配列。
配列番号４：左外側反復の核酸配列。
配列番号５：左内側配列の核酸配列。
配列番号６：ＴｇＴＰ−１Ｕの核酸配列。
配列番号７：ＴｇＴＰ−２Ｌの核酸配列。
配列番号８：ＴｇＴＰ−２Ｕの核酸配列。
配列番号９：ＴｇＴＰ−３Ｌの核酸配列。
配列番号１０：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来の転移性要素Ｔｃ１の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｘ０１００５）。
配列番号１１：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来の転移性要素Ｔｃ１のアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｘ０１００５）。
配列番号１２：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｙｄｅｉ由来のＭｉｎｏｓ−２の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｚ２９０９８）。
配列番号１３：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｙｄｅｉ由来のＭｉｎｏｓ−２のアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｚ２９０９８）。
配列番号１４：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｙｄｅｉ由来のＭｉｎｏｓ−３の核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｚ２９１０２）。
配列番号１５：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｙｄｅｉ由来のＭｉｎｏｓ−３のアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｚ２９１０２）。
配列番号１６：Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｉｒｒｉｔａｎｓ由来のＨｉ２  ｍａｒｉｎｅｒの核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｕ１１６４１）。
配列番号１７：Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ  ｉｒｒｉｔａｎｓ由来のＨｉ２  ｍａｒｉｎｅｒのアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｕ１１６４１）。
配列番号１８：Ｃｈｒｙｓｏｐｅｒｌａ  ｐｌｏｒａｂｕｎｄａ由来のｍａｒｉｎｅｒの核酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｕ１１６５２）。
配列番号１９：Ｃｈｒｙｓｏｐｅｒｌａ  ｐｌｏｒａｂｕｎｄａ由来のｍａｒｉｎｅｒのアミノ酸配列（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｕ１１６５２）。
配列番号２０：ＩＲ／ＤＲ−Ｒの配列を示す：ａａｔｔｃｃａｔｃａｃａａａｇｃｔｃｔｇａｃｃｔｃａａｔｃｃｔａｔａｇａａａｇｇａｇｇａａｔｇａｇｃｃａａａａｔｔｃａｃｃｃａａｃｔｔａｔｔｇｔｇｇｇａａｇｃｔｔｇｔｇｇａａｇｇｃｔａｃｔｃｇａａａｔｇｔｔｔｇａｃｃｃａａｇｔｔａａａｃａａｔｔｔａａａｇｇｃａａｔｇｃｔａｃｃａａａｔａｃｔａａｔｔｇａｇｔｇｔａｔｇｔｔａａｃｔｔｃｔｇａｃｃｃａｃｔｇｇｇａａｔｇｔｇａｔｇａａａｇａａａｔａａａａｇｃｔｇａａａｔｇａａｔｃａｔｔｃｔｃｔｃｔａｃｔａｔｔａｔｔｃｔｇａｔａｔｔｔｃａｃａｔｔｃｔｔａａａａｔａａａｇｔｇｇｔｇａｔｃｃｔａａｃｔｇａｃｃｔｔａａｇａｃａｇｇｇａａｔｃｔｔｔａｃｔｃｇｇａｔｔａａａｔｇｔｃａｇｇａａｔｔｇｔｇａａａａａｇｔｇａｇｔｔｔａａａｔｇｔａｔｔｔｇｇｃｔａａｇｇｔｇｔａｔｇｔａａａｃｔｔｃｃｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｔａ。
配列番号２１：ＩＲ／ＤＲ−Ｌの配列：ｃｃｔｔｇａａａｔａｃａｔｃｃａｃａｇｇｔａｃａｃｃｔｃｃａａｔｔｇａｃｔｃａａａｔｇａｔｇｔｃａａｔｔａｇｔｃｔａｔｃａｇａａｇｃｔｔｃｔａａａｇｃｃａｔｇａｃａｔｃａｔｔｔｔｃｔｇｇａａｔｔｔｔｃｃａａｇｃｔｇｔｔｔａａａｇｇｃａｃａｇｔｃａａｃｔｔａｇｔｇｔａｔｇｔａａａｃｔｔｃｔｇａｃｃｃａｃｔｇｇａａｔｔｇｔｇａｔａｃａｇｔｇａａｔｔａｔａａｇｔｇａａａｔａａｔｃｔｇｔｃｔｇｔａａａｃａａｔｔｇｔｔｇｇａａａａａｔｇａｃｔｔｇｔｇｔｃａｔｇｃａｃａａａｇｔａｇａｔｇｔｃｃｔａａｃｔｇａｃｔｔｇｃｃａａａａｃｔａｔｔｇｔｔｔｇｔｔａａｃａａｇａａａｔｔｔｇｔｇｇａｇｔａｇｔｔｇａａａａａｃｇａｇｔｔｔｔａａｔｇａｃｔｃｃａａｃｔｔａａｇｔｇｔａｔｇｔａａａｃｔｔｃｃｇａｃｔｔｃａａｃｔｇｔａ。
配列番号２２：逆方向反復配列の反復部分の例：ｇｔｔｃａａｇｔｃｇ  ｇａａｇｔｔｔａｃａ  ｔａｃａｃｔｔａｇ  。
配列番号２３：逆方向反復配列の反復部分の例：ｃａｇｔｇｇｇｔｃａ  ｇａａｇｔｔｔａｃａ  ｔａｃａｃｔａａｇｇ。
配列番号２４：逆方向反復配列の反復部分の例：ｃａｇｔｇｇｇｔｃａ  ｇａａｇｔｔａａｃａ  ｔａｃａｃｔｃａａｔ  ｔ。
配列番号２５：逆方向反復配列の反復部分の例：ａｇｔｔｇａａｔｃｇ  ｇａａｇｔｔｔａｃａ  ｔａｃａｃｃｔｔａｇ  。
配列番号２６：逆方向反復配列の反復部分の共通部分例：ｃａｋｔｇｒｇｔｃｒ  ｇａａｇｔｔｔａｃａ  ｔａｃａｃｔｔａａｇ。
配列番号２７：左外側反復の例
配列番号２８：左内側反復の例
配列番号２９：ｐＣＭＶ−ＳＢからのＰＣＲ増幅に使用する順向き配列
配列番号３０：ｐＣＭＶ−ＳＢからのＰＣＲ増幅に使用する逆向き配列
配列番号３１：プライマーＥＧＦＰ−１Ｕ
配列番号３２：プライマーＥＧＦＰ−１Ｌ
配列番号３３：プライマーＨＹＧ−１Ｕ
配列番号３４：プライマーＴＫ−１Ｌ
配列番号３５：プライマーＭ１３Ｆ
配列番号３６：プライマーＲＭＣＥ−ＤＬ１
配列番号３７：プライマーＲＲＭＣＥ−ＩＬ−１
配列番号３８：プライマーＴｇＴＰ−２Ｌ
配列番号３９：プライマーｎｅｏ−Ｕ１
配列番号４０：プライマーｎｅｏ−Ｌ１
配列番号４１：切り出し産物に対する蛍光標識化プローブ
配列番号４２：切り出し産物に対する蛍光標識化プローブ
配列番号４３：ｎｅｏフラグメントに対する蛍光標識プローブ
配列番号４４：ｎｅｏフラグメントに対する蛍光標識プローブ
配列番号４５：切り出し産物に対するＰＣＲプライマー
配列番号４６：切り出し産物に対するＰＣＲプライマー
配列番号４７：ｎｅｏフラグメントに対するＰＣＲプライマー
配列番号４８：ｎｅｏフラグメントに対するＰＣＲプライマー
配列番号４９：プライマーＬＣＢ２ＸＬ２
配列番号５０：プライマーＰＧＫ２
配列番号５１：プライマーＬＣＢ２ＸＬ１
配列番号５２：プライマーＰＧＫ４
配列番号５３：ＳＢトランスポザーゼ遺伝子の増幅のための順向きプライマー
配列番号５４：ＳＢトランスポザーゼ遺伝子の増幅のための逆向きプライマー
配列番号５５：β−アクチントランスポザーゼ遺伝子の増幅のための順向きプライマー
配列番号５６：β−アクチントランスポザーゼ遺伝子の増幅のための逆向きプライマー
配列番号５７：プライマーβ−ｇｅｏ
配列番号５８：Ｍ２Ｓに特異的なプライマー
配列番号５９：Ｍ２Ｌに特異的なプライマー
配列番号６０：Ｍ４に特異的なプライマー
配列番号６１：Ｎ１に特異的なプライマー
配列番号６２：Ｕｎｍｅｔ−Ｕ
配列番号６３：Ｕｎｍｅｔ−Ｌ
配列番号６４：Ｍｅｔ−Ｕ
配列番号６５：Ｍｅｔ−Ｌ
配列番号６６：アミラーゼ２．１遺伝子のための順向きプライマー
配列番号６７：アミラーゼ２．１遺伝子のための逆向きプライマー
配列番号６８：β−小グロビン遺伝子のための順向きプライマー
配列番号６９：β−小グロビン遺伝子のための逆向きプライマー
配列番号７０：ＩＲ／ＤＲ−Ｌのための順向きプライマー配列
配列番号７１：ＩＲ／ＤＲ−Ｌのための逆向きプライマー配列
配列番号７２：ＩＲ／ＤＲ−Ｒのための順向きプライマー配列
配列番号７３：ＥＧＦＰ−１Ｕプライマー
配列番号７４：ＥＧＦＰ−１Ｌプライマー
配列番号７５：ＳＢ−２Ｕプライマー
配列番号７６：ＳＢ−１Ｌプライマー
発明の実施の形態
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義および説明）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「トランスポゾン」とは、染色体上のある部位から別の部位に移動（転移）し得る核酸分子または核酸配列をいう。代表的には、トランスポゾンは、ＤＮＡセグメント（ＤＮＡ型トランスポゾン）である。ＤＮＡ型トランスポゾンは、トランスポザーゼにより活性化されて転移する。トランスポゾンとしては、例えば、ＳＢトランスポゾン（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ４８６８５）（配列番号１）、配列番号１０〜１９に示す配列に含まれるものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンを認識してその配列を転移させる触媒活性を有する酵素をいう。トランスポザーゼとしては、例えば、ＳＢトランスポザーゼ（配列番号２、３）、配列番号１０〜１９に示す配列に含まれるものなどに示されるものが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において、トランスジェニック生物に用いられるトランスポゾン配列およびトランスポザーゼ遺伝子は、内因性のものでも外来性のものでも制限なく使用することができるが、好ましくは外来性のトランスポゾン配列およびトランスポゼース遺伝子を用いることができる。
トランスポゾンは、通常両末端に反復配列（以下、本明細書では「トランスポゾン配列」という）を有し、これがトランスポザーゼの認識部位である。そのような反復配列の例としては、たとえば、配列番号２２〜２６の配列を挙げることができるがそれらに限定されない。該トランスポゾン配列は、トランスポザーゼの作用により転移可能であれば、不完全な繰り返し部分を含み得るトランスポゾンが挿入されるＤＮＡ中の、トランスポゾンに特有な長さの挿入認識サイトは標的配列と呼ばれる。例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾンシステム（Ｚ．Ｉｖｉｃｓ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ９１：５０１−５１０（１９９７））の場合、標的配列はＴＡであり、トランスポゾン挿入後の配列はＴＡ−トランスポゾン−ＴＡである。従って、本明細書では、トランスポゾン配列とは、トランスポザーゼにより認識され、目的となる生物において転移可能な天然または人工トランスポゾンの任意の配列を包含する。
トランスポゾンの標的配列としては、例えばＴＡ、ＡＴＡＴ，ＴＡＴＡＴＡ、ＴＡＣＡなどが知られている。標的配列に関わらずトランスポゾンによる遺伝子導入の効率を上げるという課題は、本発明においてトランスポゾンをメチル化することによって達成された。
トランスポゾンには、主に自らの転移を触媒できる活性な酵素トランスポザーゼを内部にコードしている自己完結型と、トランスポザーゼ活性を欠損した非自己完結型とがある。トランスポゾン配列またはトランスポザーゼ遺伝子を各々有する生物を交配させて、トランスポゾン配列およびトランスポザーゼ遺伝子を有する生物を得る場合、あるいは、転移が固定されたトランスポゾン配列を有する（トランスポザーゼ遺伝子を含まない）生物を得る場合、非自己完結型のトランスポゾンを用いる。トランスポゾンおよびトランスポザーゼを両方含む生物またはシグニチャー部位（を含みトランスポゾンおよびトランスポザーゼ遺伝子を含まない生物を得る場合、自己完結型、非自己完結型の両方のトランスポゾンが利用できる。自己完結型トランスポゾンは、後述するＣｒｅｌｏｘＰシステムを用いて、即ちｌｏｘＰ配列をトランスポザーゼ遺伝子の両側に有する生物とＣｒｅを有する非生物を交配することによりトランスポザーゼを切り出すことで、非自己完結型に変換することができる。さらに、トランスポゾンには宿主依存型のものと宿主非依存型のものがあり、これらをいずれも用い得る。一般的には宿主非依存型のものを用い得る。
本発明においては、トランスポゾンおよびトランスポザーゼ遺伝子を含むトランスポゾンシステムよりトランスポゾンのみおよび／またはトランスポザーゼのみを切り出して用いるか、またはトランスポザーゼを不活性化させて、トランスポゾンを非自己完結型として用い得る。本発明の実施に有用なトランスポゾンシステムは、生物細胞で転移可能な任意の配列を包含するものであり、好ましくは、ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリーのメンバーを用い得る。例として、Ｔｃ１、ＳＢ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｘｒ、Ｔｃ３等のトランスポゾンファミリー、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ｍｏｓ１、Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ等のｍａｒｉｎｅｒトランスポゾンファミリー・Ｐｏｇｏ・Ｔｉｇｇｅｒ、“４等のＰｏｇｏトランスポゾンファミリーが挙げられる（ＲＨ  Ｐｌａｓｔｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：Ｎｏ．８：３２６−３３２（１９９９））。最も好ましくは、ＳＢ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）．トランスポゾンを用い得る。非自己完結型トランスポゾンは、自己完結型トランスポゾンのトランスポゼース遺伝子を除去または不活性化することにより得ることができる。
本明細書において「ＤＮＡ型」トランスポゾンとは、ＤＮＡの転移を行うトランスポゾンをいうをいう。通常のトランスポゾンは、ＤＮＡ型である。代表的な実施形態では、本発明は、ＤＮＡ型トランスポゾンを利用して実施される。
本明細書において、「Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン」とは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒに類似したトランスポゾンをいう。Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属するトランスポゾンとしては、例えば、Ｍｉｎｏｓ、ＳＢ、Ｔｃ１、ｍａｒｉｎｅｒなどが挙げられるがそれに限定されない。このスーパーファミリーは、脊椎動物ゲノムが起源であるといわれている（Ｒａｄｉｃｅら、１９９４；Ｓｍｉｔ  ａｎｄ  Ｒｉｇｇｓ，１９９６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１４４３−１４４８）。
本明細書において、「ＳＢ」または「Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ」とは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾンであって、哺乳動物またはその細胞においてトランスポゾン活性を有するものをいう（Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１：５０１−５１０、１９９７）をいう。本明細書ではまた、このＳＢは、ＳＢポリペプチド、ＳＢトランスポゾンなどという。
トランスポゾン配列に挟まれる部分には、様々なＤＮＡ配列（例えば、マーカー遺伝子、遺伝子発現調節配列、所望の遺伝子など）を挿入することができ、トランスポゾン配列の他に必要に応じて種々の構成要素を組み合わせたトランスポゾン構築物を構築することができる。本発明において、トランスポゾン構築物またはトランスポザーゼ遺伝子を導入する対象となる細胞は、生物（好ましくは非ヒト生物）の個体に分化し得るポテンシャルをもつ細胞であればよく、そのような細胞としては例えば幹細胞または受精卵がある。
本発明のトランスジェニック生物には、トランスポゾン構築物およびトランスポザーゼの一方または両方を含むｆｏｕｎｄｅｒ（第１世代だけでなく、このｆｏｕｎｄｅｒを基に確立されるトランスジェニック生物の系統も当然に本発明に包含される。さらに、本発明のトランスジェニック生物系統由来の臓器（器官）、組織、卵、精子、および受精卵、トランスジェニック生物の系統から確立される株化細胞、トランスジェニック生物の系統から作出される生物クローン個体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明のトランスポゾン構築物は、トランスポゾン配列の他に種々の構成要素を組み合わせて構築され、幹細胞または受精卵等に導入することができる。
以下に本発明者らが行ったトランスポゾンシステムの開発を説明する。
遺伝子破壊効率の高いトランスポゾンベクターの開発：本明細書において使用されるトランスポゾンシステムは、通常、ゲノム上を移動するＤＮＡ配列であるトランスポゾン配列と、転移を触媒する要素であるトランスポゼースの２つの要素からなる。転移先に遺伝子が存在すると、その遺伝子機能を破壊する可能性があるが、遺伝子の大部分はイントロンであることから、たとえ遺伝子内へ挿入しても、スプライシングの際に容易にトランスポゾン配列が排除されてしまう可能性がある。これを防ぐために内部にスプライスアクセプターを有するような構造を構築することができる。内在性遺伝子の転写産物がトランスポゾン内で止まり、その結果、内在性遺伝子の機能が率に破壊されると期待される。この仮説を検証するために、遺伝子内部にトランスポゾンが挿入した３系統のマウスについてホモ接合体のマウスを得、テールのＲＮＡを用いて、挿入部位上流および下流のエキソンに対応するプライマーによってＲＴ−ＰＣＲを行って、正常遺伝子産物に対応するバンドの消失を確認することができる。さらに、期待したスプライシングができたことをｌａｃＺ遺伝子などの発現により確認することができる。このようにして、作製したベクターの遺伝子破壊効率が極めて高いことを証明することができる。さらに、転移の分布を２００以上の転移位を決定して調べたところ、約８割の転移は転移前と同一の染色体上に、残りの２割が他の染色体へ起きることも確認することができる。よって、ゲノム全体に対して網羅的に変異を導入するには、種々の染色体上にトランスポゾンを有したマウスを作製することが望ましい。この考えのもとに、現在までに、ゲノム上の異なる部位にトランスポゾンを有するマウスを多数系統確立することができ、実際に本発明者らは２０系統以上している。本手法においては、転移前のトランスポゾン挿入部位自体が表現型に影響しないことが重要なので、この条件を満たす系統を同定中である。一方、転移が同一染色体に起きる場合、転移前の３Ｍｂ以内の距離に集中するようである。このことは、トランスポゾンが、特定の遺伝子座に種々の異なる変異を導入できる可能性を示唆する。実際、ある系統のマウスにおいては、Ｎｅｕｒｅｘｉｎ３遺伝子内へのトランスポゾンの挿入を４匹のマウスにおいて同定した。Ｎｅｕｒｅｘｉｎ３遺伝子からは、異なるプロモーターによってα型およびβ型の２種類のタンパク質が産生されるが、上記４匹中２匹はα型のみに、残りの２匹はα型およびβ型両方に変異を導入する位置に挿入を認めることも本発明者らは見出した。このような部位特異的な遺伝子変異導入は、トランスポゾン特有の性質と考えられ、今後の応用が期待できる。
本発明において、トランスポゾンをインビトロでメチル化し、トランスポゼース発現ベクターとともにＥＳ細胞へ導入したところ、ゲノムへの転移効率が著しく上昇した。さらに、ゲノム上での転移効率を検定するために、ゲノムの特定の部位へ、メチル化またはメチル化状態のトランスポゾンを挿入した。トランスポゾンのメチル化およびメチル化状態が、ゲノムへの挿入後も維持されていることを確認したのち、細胞内でトランスポゼースを発現させたところ、メチル化導入時の方が、転移反応が百倍以上高かった。トランスポゾン領域がヘテロクロマチン化されていることも明らかとなり、トランスポゾン領域のゲノムの状態を修飾することで転移頻度が高められる可能性が示された。
本明細書において「メチル化」とは、核酸分子にメチル基を付加することをいう。同様の効果があれば、メチル基は類似の基（例えば、低級アルキル基）などであってもよい。メチル化は、生体内ではメチル化酵素（メチラーゼ）によって触媒される。ここでは、メチル基は、メチル基転移反応によって基質から提供される。
１つの例示として、メチル基は５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸の酵素的還元により５−メチルテトラヒドロ葉酸として生成し、ホモシステインに一種のコバミド酵素の作用で転移しメチオニンが作られる。メチオニンはＡＴＰの作用によりＳ−アデノシルメチオニンになり，これがメチル供与体として種々のメチル化合物の生成に用いられる。コリンの酸化された形であるベタインなどもメチル供与体として働くことがある。各化合物に特異的なメチル基転移酵素が数十種明らかにされており、必要に応じて、適切なものを当業者は選択することができ、本発明において使用することができる。あるいは、メチル化は、酵素を用いるほかに、化学反応によって付加されてもよい。
本明細書においてメチル化の確認は、当該分野において公知の任意の技術を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、メチル化による物理的挙動の変動の確認、重亜硫酸改変配列決定（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｇｉｔａｎ  ＲＳ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．Ｊａｎ；１２：１５８−６４．２００２；Ｌｉｌｉｓｃｈｋｉｓ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ．２０００；９：１６５−７１．）が挙げられるがそれらに限定されない。
ＳＢのようなトランスポゾンを用いたシステムは、代表的に、各々の逆方向反復は少くとも１の同方向反復を含む。本発明のこの態様の遺伝子転移システムは、それゆえ、２つの構成物：トランスポザーゼおよびクローン化された非自律性（即ち非自己挿入性）サケ科型因子またはトランスポゾン基質ＤＮＡの逆方向反復を有するトランスポゾンを含む。一緒にした場合、これら２つの構成物は活性なトランスポゾン活性を供する。
本明細書において、「逆方向反復配列」（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、トランスポゾンにおいて作動する配列であって、構造上の特徴としては，両末端の１５〜４０塩基対が逆方向に繰返しのある配列があること（例えば、配列番号２２〜２６）が多い。本発明において使用される代表的な配列は、配列番号２０および２１に示される。この逆方向反復配列は、挿入配列であり、転移因子のひとつである。各逆方向反復配列は好ましくは少なくとも１つの直列反復配列を含む（それ故、ＩＲ／ＤＲと称される）。トランスポゾン要素は直鎖状フラグメントとして利用できる直鎖状核酸フラグメント（便宜上、５’末端から３’末端に至る）、または例えばプラスミドの中で環状のものであってよい。好適な態様において、各逆方向反復配列の中には２つの直列反復配列がある。
本明細書において好ましい逆方向反復配列としては、例えば、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、ＳＢトランスポゾンの逆方向反復配列が挙げられるがそれらに限定されない。これらの中で、ＳＢに結合するものは、ＳＢトランスポゾンの逆方向反復配列が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において好ましい直列反復配列としては、例えば、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポゾン、ＳＢトランスポゾンの直列反復配列が挙げられるがそれらに限定されない。これらの中で、ＳＢに結合するものは、ＳＢトランスポゾンの直列反復配列が挙げられるがそれらに限定されない。
同方向反復は、代表的に、約２５〜約３５塩基対の長さ、好ましくは約２９〜３１塩基対の長さである。しかしながら、これにかかわらず、逆方向反復は、唯一の同方向反復を含み得る。この場合、それは実際には反復でないが、以下により詳しく記載するように、共通の同方向配列に対して少くとも約８０％の同一性を有するヌクレオチド配列である。トランスポゾン因子は、直鎖フラグメントまたは環状フラグメントとして、例えばプラスミドにおいて用いることができる（慣用的に、５′末端から３′末端に広がる）直鎖核酸フラグメントである。
トランスポゾンの好ましい実施形態において、各々の逆方向反復配列に２つの同方向反復がある。（この実施形態において４つになる）同方向反復は、類似したヌクレオチド配列を有し得る。この実施形態の核酸フラグメントの５′側での逆方向反復は、代表的に、同方向反復（即ち左外側の反復）、介在領域、および第２の同方向反復（即ち左内側反復）を含む。この実施形態の核酸フラグメントの３′側での逆方向反復は、同方向反復（即ち右内部反復）、介在領域、および第２の同方向反応（即ち右外側反復）を含む。
それらは核酸フラグメント上で互いに対して逆に向いているので、核酸フラグメントの５′逆方向反復内の同方向反復は、核酸フラグメントの３′逆方向反復内の同方向反復と比べて逆方向にある。逆方向反復内の介在領域は、一般に、少くとも約１５０塩基対の長さ、好ましくは少なくとも約１６０塩基対の長さである。その介在領域は、好ましくは約２００塩基対以下の長さ、より好ましくは約１８０塩基対以下の長さである。１つの逆方向反復の介在領域のヌクレオチド配列は別の逆方向反復中の介在領域のヌクレオチド配列と同様であってもそうでなくてもよい。
本明細書において使用され得るほとんどのトランスポゾンは完全な逆方向反復を有するが、ＳＢタンパク質に結合する逆方向反復は、共通同方向反復と少くとも約８０％の同一性、好ましくは共通同方向反復と約９０％の同一性を有する。好ましい共通同方向反復は、ＳＢトランスポゾンの配列のような配列が挙げられるがそれらに限定されない。
ＳＢタンパク質のコア結合部位と仮定される部位は、配列番号３のＮ末端から１２３アミノ酸に存在する。ヌクレオチド同一性は、同方向反復と配列番号１などに記載される配列との間の相同性を行うことにより決定される。
ＳＢタンパク質に結合する同方向反復配列の例としては、ＳＢトランスポゾンの配列が挙げられるがそれらに限定されない。また、左外側反復の例としては、ｇｔｔｇａａｇｔｃｇｇａａｇｔｔｔａｃａｃｔｔａｇｇ（配列番号２７）が挙げられるがそれらに限定されない。左内側反復としては、ｃｃａｇｔｇｇｇｔｃａｇｇａａｇｔｔｔａｃａｔａｃａｃｔａａｇ（配列番号２８）が挙げられるがそれらに限定されない。右内側反復としては、左内側反復と類似する配列（例えば、９０％以上の同一性）が挙げられるがそれらに限定されない。右外側反復としては、左外側反復配列と類似する配列（例えば９０％以上の同一性）が挙げられるがそれらに限定されない。
逆方向反復は、ポリ（Ａ）シグナルＡＡＴＡＡＡを含んでいてもよい。このポリ（Ａ）シグナルは、核酸フラグメント中に存在するコーディング配列により利用され得、ポリ（Ａ）テールをｍＲＮＡに付加する。ポリ（Ａ）テールのｍＲＮＡへの付加は、典型的には、ポリ（Ａ）テールのない同じｍＲＮＡと比べてｍＲＮＡの安定性を増加させる。好ましくは、逆方向反復は、各々の逆方向反復配列中に２つの同方向反復を含む核酸フラグメントの３′側に存在する。
逆方向反復は、細胞内のＤＮＡに挿入された核酸配列に隣接するようになる。核酸配列は、遺伝子のオープンリーディングフレームの全部または一部（即ちタンパク質をコードする遺伝子の部分）、単独でまたはオープンリーディングフレームの全部もしくは一部を伴う１または複数の発現調節配列（即ち核酸中の調節配列）を含み得る。好ましい発現調節配列には、これらに限らないが、プロモーター、エンハンサー、ボーダー調節因子、遺伝子座調節領域またはサイレンサーを含む。好ましい実施形態において核酸配列は、オープンリーディングフレームの少くとも一部に作用可能に連結されたプロモーターを含む。
トランスポゾンはトランスポザーゼの存在下でＤＮＡ上の第一の位置から第二の位置へと移動できる（これを可動性ともいう）。任意の可動カット−アンド−ペースト型トランスポゾンには２つの基本的な成分であり、それは活性トランスポザーゼの起源と、トランスポザーゼにより認識され、かつ、移動するＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列の移動は認識されたＤＮＡ配列の間の介在核酸も移動することを可能にする。
本明細書において「外来遺伝子」とは、本発明の遺伝子転移によって導入されることが意図される遺伝子またはそれをコードする核酸分子をいう。そのような外来遺伝子は、導入が意図される宿主とは異なる起源のものであっても、その宿主由来であってもよい。また、導入が意図される限り、その外来遺伝子をコードする核酸配列は、どのようなタンパク質をコードするものであってもよい。そのような核酸配列によりコードされるタンパク質はマーカータンパク質、例えばグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、成長ホルモン（例えば遺伝子導入動物の成長を促進するもの）β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、この外来遺伝子は、タンパク質をコードしないものであってもよい。
トランスジェニック生物の一の実施形態において、タンパク質は細胞からの単離のための生成物である。バイオリアクターとしてのトランスジェニック生物公知である。タンパク質は、例えば、乳、尿、血液、体液、果実または卵の中で大量に生産され得る。乳、尿、血液、体液、果実または卵の中での発現を促進するプロモーターが知られている。そのようなものとしては、カゼインプロモーター、マウス尿性タンパク質プロモーター、β−グロビンプロモーターおよびオボアルブミンプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。組換タンパク質が細胞内でタンパク質を製造するためのその他の方法を利用して製造されており、本発明は、そのような組み換えタンパク質を製造する工場を生産するツールまたは技術として使用することができる。これらまたはその他のタンパク質をコードする核酸を本発明の核酸フラグメントの中に組込み、そして細胞に導入することができる。細胞のＤＮＡの核酸フラグメントの効率的な組込みは本発明の組成物が存在するときに起きる。細胞が遺伝子導入動物の組織または器官の一部であるとき、大量の組換タンパク質が得られ得る。
（細胞・生物学）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、本発明の核酸分子を導入することができる限り、どのような由来であっても使用することができ、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、形質転換またはトランスフェクションが容易な細胞が使用される。本発明において使用される細胞は、核酸分子を導入することが容易な細胞であることが好ましい。
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。また、そのような細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物などであり得る。
本発明において、臓器が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において「臓器」または「器官」とは、互換可能に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。植物の場合は、「器官」は、カルス、根、茎、幹、葉、花、種子、胚芽、胚、果実、胚乳などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、構成細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。本発明では、組織を用いてセンサまたはチップを構成することもできる。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性）（「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得るがそれらに限定されない。従って、本発明では、幹細胞の使用を直接使用することができる。
本明細書において「体細胞」とは、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないをいう。従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはポリペプチドを指す。単離された核酸は、好ましくは、その核酸が由来する生物において天然に該核酸に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。したがって、樹立された幹細胞は、多分化能を維持する。本発明では、安定した結果を提供することができることから、このような樹立された細胞を用いることが好ましい。
本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
本明細書において「生物体」は、生命体として存在し得る１個の個体として存在し得る生物の一形態をいう。従って、植物の場合は、例えば、種子なども含まれ得る。
（生化学・分子生物学）
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、トランスポザーゼ遺伝子というときは、通常、トランスポザーゼの構造遺伝子およびトランスポザーゼのプロモーターの両方を包含するが、本発明の目的を達成することができる限り、トランスポザーゼの構造遺伝子のみをさしてもよい。本明細書において通常、遺伝子とは、調節領域、コード領域、エキソン、イントロンを含む。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。したがって、通常、本明細書において、遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含し、またその長さに何ら制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、ならびにそのセンス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、およびそれらのフラグメントのいずれもが含まれる。
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、特に言及しない限り、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡにおいてデフォルトパラメータを用いて算出される。あるいは、同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）を包含する。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。タンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとるが、同様の機能を有する限り、ポリペプチドの改変体であってもよい。特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、そのフラグメント、同族体、誘導体、改変体を含む。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。タンパク質などの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号  １文字記号  意味
Ａｌａ      Ａ          アラニン
Ｃｙｓ      Ｃ          システイン
Ａｓｐ      Ｄ          アスパラギン酸
Ｇｌｕ      Ｅ          グルタミン酸
Ｐｈｅ      Ｆ          フェニルアラニン
Ｇｌｙ      Ｇ          グリシン
Ｈｉｓ      Ｈ          ヒスチジン
Ｉｌｅ      Ｉ          イソロイシン
Ｌｙｓ      Ｋ          リジン
Ｌｅｕ      Ｌ          ロイシン
Ｍｅｔ      Ｍ          メチオニン
Ａｓｎ      Ｎ          アスパラギン
Ｐｒｏ      Ｐ          プロリン
Ｇｌｎ      Ｑ          グルタミン
Ａｒｇ      Ｒ          アルギニン
Ｓｅｒ      Ｓ          セリン
Ｔｈｒ      Ｔ          トレオニン
Ｖａｌ      Ｖ          バリン
Ｔｒｐ      Ｗ          トリプトファン
Ｔｙｒ      Ｙ          チロシン
Ａｓｘ                  アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ                  グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ                  不明または他のアミノ酸。
塩基
記号  意味
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において「ヌクレオチド」は、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含み、天然のものでも非天然のものでもよい。ここで、ヌクレオシドは、塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物をいう。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含む。
１つの実施形態において、改変体は、天然に存在する対立遺伝子変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および／または挿入がなされた変異体；コードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味し得る。
１つの実施形態において、これらアミノ酸配列の改変（変異等）は、天然において、例えば変異、翻訳後の修飾等により生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なうこともできる。
１つの実施形態において、上記ポリペプチドは、対立遺伝子変異体、ホモログ、天然の変異体で少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを含む。
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、あるトランスポゾン配列であれば、そのトランスポゾン配列の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、核酸分子、ポリペプチドなど）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなどに対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなど）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット、イヌ、ネコ）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。このような対応する遺伝子は、ゲノムデータベースを利用すれば、当業者は容易に得ることができる。そのようなゲノム配列の入手方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載される。本発明では、このような検索によって得られた配列も利用可能である。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能（例えば、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなどの機能）を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本発明では、マウストランスポゾン、マウストランスポザーゼなどとして機能する、すなわち、転移活性を有する限り、どのようなフラグメントであっても使用可能であることが理解される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。
本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。従って、本明細書では生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子（糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質など）などが包含されるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイトカインであり得る。
本明細書において「化学合成物」とは、通常の化学技術を用いて合成され得るすべての物質をいう。従って、化学合成物は、化学物質の範囲内にある。実質的には化学物質は、ほぼすべて合成することができる。そのような合成技術は、当該分野において周知であり、当業者は、適宜そのような技術を組み合わせて化学合成物を製造することができる。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転移活性）を発揮する活性が包含される。ある因子がアンチセンス分子である場合、その生物学的活性は、対象となる核酸分子への結合、それによる発現抑制などを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドまたはレセプターである場合、そのリガンドまたはレセプターがそれぞれ対応するレセプターまたはリガンドへの結合が生物学的活性に包含される。その生物学的活性が転写調節活性である場合は、転写レベルまたはその変動を調節する活性をいう。例えば、ある因子がトランスポゾンであるとき、その生物学的活性は転移活性である。転移活性を測定する例は、例えば、実施例に記載されるような技術が挙げられ、そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって決定することができる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、このような検索によって同定されたトランスポゾン、トランスポザーゼ、トランスポゾン配列などもまた、使用され得る。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ，１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
トランスポゾン、トランスポザーゼまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１、２、１０、１２、１４、１６、１８などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいトランスポザーゼまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１、２、１０、１２、１４、１６、１８などに示される核酸配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。このようなプローブを用いて本発明において使用され得るトランスポゾンを得ることができる。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
遺伝子工学分野において通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。このようなプライマーを用いて本発明に用いるトランスポゾンを作製することができる。
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基を意味する。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（１９８４）（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎらＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２３：７０９（１９８６）（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは、市販のキット（例えば、ＰｅｐＳｅｔＴＭ（クラボウ））を用いて当業者が容易に決定することができる。本発明では、あるシグナル伝達において役割を果たすタンパク質のエピトープを提示することによって、シグナル伝達を測定する系を利用してもよい。
本明細書においてある核酸分子またはポリペプチドに「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、このような特異的に結合する因子（例えば、カルシウムに特異的に結合する因子、特定の遺伝子産物に対する抗体など）は、シグナル伝達を測定する際に利用され得る。
（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの改変）
本発明では、トランスポゾン、トランスポザーゼなどの機能的ポリペプチドを使用する場合、同様の機能（転移活性など）が達成することができる限り、その改変体（本明細書において機能的改変体ともいう）を使用してもよい。
ここで、あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
また、本発明において用いられるタンパク質の改変を考慮する場合、親水性指数も考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
例えば、下記のＲＮＡコドン（それ故、対応のＤＮＡコドンではＴがＵに置き代わる）が各特定のアミノ酸をコードするのに交換可能に利用できることが当業界において周知である：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）ＵＵＵまたはＵＵＣロイシン（ＬｅｕまたはＬ）ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＵ，ＣＵＣ，ＣＵＡまたはＣＵＧイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）ＡＵＵ，ＡＵＣまたはＡＵＡメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）ＡＵＧバリン（ＶａｌまたはＶ）ＧＵＵ，ＧＵＣ，ＧＵＡ，ＧＵＧセリン（ＳｅｒまたはＳ）ＵＣＵ，ＵＣＣ，ＵＣＡ，ＵＣＧ，ＡＧＵ，ＡＧＣプロリン（ＰｒｏまたはＰ）ＣＣＵ，ＣＣＣ，ＣＣＡ，ＣＣＧスレオニン（ＴｈｒまたはＴ）ＡＣＵ，ＡＣＣ，ＡＣＡ，ＡＣＧアラニン（ＡｌａまたはＡ）ＧＣＵ，ＧＣＧ，ＧＣＡ，ＧＣＣチロシン（ＴｙｒまたはＹ）ＵＡＵまたはＵＡＣヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）ＣＡＵまたはＣＡＣグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）ＣＡＡまたはＣＡＧアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）ＡＡＵまたはＡＡＣリジン（ＬｙｓまたはＫ）ＡＡＡまたはＡＡＧアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）ＧＡＵまたはＧＡＣグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）ＧＡＡまたはＧＡＧシステイン（ＣｙｓまたはＣ）ＵＧＵまたはＵＧＣアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）ＣＧＵ，ＣＧＣ，ＣＧＡ，ＣＧＧ，ＡＧＡ，ＡＧＣグリシン（ＧｌｙまたはＧ）ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ終止コドン  ＵＡＡ，ＵＡＧまたはＵＧＡ  さらに、特定のＤＮＡ配列を修飾して特定の細胞タイプは好適なコドンを採用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのための好適なコドン用法は、動物およびヒトにとっての好適なコドン用法と同じように公知である。このような変更は当業者に周知であり、本発明の一部を構成する。
このようにして作製した改変体もまた、本発明の範囲内にあり、任意のそのような改変体が本発明において利用され得る。
（抗原・抗体）
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメント、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５））またはその改変（例えば、ＢｕｃｋらＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：３７７（１９８２））を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することにより、スクリーニングされ得る。抗原に特異的なイムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、このハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させることができる。
本明細書において「抗原」（ａｎｔｉｇｅｎ）とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。したがって、トランスポザーゼまたはその下流の産物は、抗原または免疫原として使用され、抗原抗体反応を利用して本発明のセンサを実現することができる。
（遺伝子操作）
本明細書において、「遺伝子カセット」とは、遺伝子をコードするＤＮＡと、これに作動可能に（すなわち、そのＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された植物遺伝子プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、必要に応じてプロモーターと、これに作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異種遺伝子とを含む核酸配列をいう。このカセットは、必要に応じて他の調節エレメントと組み合わせて使用することもまた、本発明の範囲に含まれる。好ましい発現カセットは、特定の制限酵素で切断され、容易に回収され得る遺伝子カセットである。
本明細書において遺伝子操作について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」とは、通常遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列をいう。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。代表的には、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在するがそれに限定されない。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「サイレンサー」とは、遺伝子発現を抑制し静止する機能を有する配列をいう。本発明では、サイレンサーとしてはその機能を有する限り、どのようなものを用いてもよく、サイレンサーを用いなくてもよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、核酸（通常遺伝子をコードするが、それに限定されない）の導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々なソースから市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明においては、本発明の核酸分子を細胞に導入する際にこのような遺伝子導入試薬が使用され得る。
遺伝子導入効率は、単位面積（例えば、１ｍｍ２など）あたりの導入外来物質（導入遺伝子）（例えば、レポーター遺伝子の産物、蛍光タンパク質ＧＦＰなど）の導入（発現）細胞数、または総信号（蛍光タンパク質の場合は、蛍光）量を測定することによって算定することができる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部（組織など）をいう。形質転換体としては、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫などの細胞などの生命体の全部または一部（組織など）が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。あるいは、本発明では、天然物から分離した細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。あるいは、本発明では、初代培養細胞も使用することができる。
本明細書において遺伝子操作などにおいて使用され得る植物細胞としては、カルスまたはその一部および懸濁培養細胞、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科などの植物の細胞が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」または「発現量」の「増加」とは、細胞内に遺伝子発現に関連する因子（例えば、発現されるべき遺伝子またはそれを調節する因子）を導入したときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まったくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。
本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位（特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。本発明によって生物に導入される遺伝子は、特異的に発現するように改変されていてもよい。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、コラーゲンがそのリガンドと相互作用する場合、その生物学的活性は、結合体の形成または他の生物学的変化を包含する。別の好ましい実施形態では、そのような生物学的活性は、遺伝子転移活性などであり得る。遺伝子転移活性は、その目的とする遺伝子をコードする配列の移動を任意の方法によって確認することによって判定され得る。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（本明細書において引用）などを参照）。
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、粒子、細胞、核酸など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、粒子など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。このような説明書は、どのような媒体であってもよく、例えば、そのような媒体としては、紙媒体、伝送媒体、記録媒体などが挙げられるがそれらに限定されない。伝送媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、エクストラネット、ＬＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。記録媒体としては、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、フレキシブルディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＭＤ、ミニディスク、ＭＯ、メモリースティックなどが挙げられるがそれらに限定されない。
（トランスジェニック生物）
トランスジェニックマウスを作製するための一般的な技術は、国際公開ＷＯ０１／１３１５０（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）に記載されている。米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）は、哺乳動物接合体へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって得られた、外因性ＤＮＡを有する哺乳動物を教示している。さらに転移性遺伝因子（トランスポゾン）を内因性ＤＮＡに挿入あるいはさらに転移させることで、該ＤＮＡの構造変化を起こしてこれを不活性化させ、動植物等の変異体を効率的に作出する方法が研究されてきている。トランスポゾンを利用した、染色体への特定遺伝子の導入・付加等が可能となってきている。
このほかにもまた、トランスジェニック生物を作り出すための様々な方法は、例えば、Ｍ．Ｍａｒｋｋｕｌａら、Ｒｅｖ．Ｒｅｐｒｏｄ．，１，９７−１０６（１９９６）；Ｒ．Ｔ．ＷａｌｌらＪ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，８０，２２１３−２２２４（１９９７）；Ｊ．Ｃ．Ｄａｌｔｏｎ、ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４１１，４１９−４２８（１９９７）；およびＨ．Ｌｕｂｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．，１０，１３１−１４３（１９９６）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの文献の各々は、本明細書において参考として援用される。
そのような中、最近１０年間ほどで、遺伝子機能の解析を目的として、胚性幹（ＥＳ）細胞の相同組換えを介したトランスジェニック（ノックアウト、ノックインを含む）動物の解析が重要な手段となってきている。
高等生物では、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いる陽性選択およびＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリア毒素遺伝子を用いる陰性選択により組換え体の効率的な選別が行われている。ＰＣＲまたはサザンブロット法により相同組換え体の選択が行われる。すなわち、標的遺伝子の一部を陽性選択用のネオマイシン耐性遺伝子等で置換し、その末端に陰性選択用のＨＳＶＴＫ遺伝子等を連結したターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８およびガンシクロビルの存在下で選択して、生じたコロニーを単離し、さらにＰＣＲまたはサザンブロットにより相同組換え体を選択する。
このように、内在する標的遺伝子を置換または破壊して、機能が喪失したかまたは変更された変異を有するトランスジェニック（標的遺伝子組換え）マウスを作製する方法は、標的とした遺伝子だけに変異が導入されるので、その遺伝子機能の解析に有用である。本発明を使用すれば、さらにメチル化により転移効率が上がることから、遺伝子の解析効率が飛躍的に上昇する。
所望の相同組換え体を選択した後、得られた組換えＥＳ細胞を胚盤注入法または集合キメラ法により正常な胚と混合してＥＳ細胞と宿主胚とのキメラマウスを作製する。胚盤注入法では、ＥＳ細胞を胚盤胞にガラスピペットで注入する。集合キメラ法では、ＥＳ細胞の塊と透明帯を除去した８細胞期の胚とを接着させる。ＥＳ細胞を導入した胚盤胞を偽妊娠させた代理母の子宮に移植してキメラマウスを得る。ＥＳ細胞は、全能性を有するので、生体内では、生殖細胞を含め、あらゆる種類の細胞に分化することができる。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を有するキメラマウスと正常マウスを交配させるとＥＳ細胞の染色体をヘテロに有するマウスが得られ、このマウス同士を交配するとＥＳ細胞の改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスが得られる。得られたキメラマウスから改変染色体をホモに有するトランスジェニックマウスを得るには、雄性キメラマウスと雌性野生型マウスとを交配して、Ｆ１世代のヘテロ接合体マウスを産出させ、生まれた雄性および雌性のヘテロ接合体マウスを交配して、Ｆ２世代のホモ接合体マウスを選択する。Ｆ１およびＦ２の各世代において所望の遺伝子変異が導入されているか否かは、組換えＥＳ細胞のアッセイと同様に、サザンブロッティング、ＰＣＲ、塩基配列の解読など当該分野において慣用される方法を用いて分析され得る。
しかし、現在行われているトランスジェニック動物の作製技術では、多様な遺伝子機能を選択的に解析することが困難であるという欠点を有する。また容易にトランスジェニック生物を作製できないという欠点も存在する。
また、現行のトランスジェニック動物の作製は、目的の遺伝子を同定した後に、上述のようにその目的の遺伝子を一から置換または破壊および置換することが必要であり、非常に労力および時間がかかる上、熟練した研究者でも必ずうまくいくとは限らない。従って、未だに労働集約的な作業を要する仕事である。
そのため、多様な遺伝子機能を選択的に解析することができないという問題を克服する次世代技術として、Ｃｒｅレコンビナーゼの細胞種特異的発現とＣｒｅ−ｌｏｘＰの部位特異的組み換えを併用する技術が注目されている。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを用いるトランスジェニックマウスは、標的遺伝子の発現を阻害しない位置にネオマイシン耐性遺伝子を導入し、後に削除するエキソンをはさむようにしてｌｏｘＰ配列を挿入したターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、その後相同組換え体を単離する。この単離したクローンからキメラマウスを得、遺伝子改変マウスが作製される。次に、大腸菌のＰ１ファージ由来の部位特異的組換え酵素Ｃｒｅを組織特異的に発現するトランスジェニックマウスとこのマウスを交配させると、Ｃｒｅを発現する組織中でのみ遺伝子が破壊される（ここでは、Ｃｒｅは、ｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ）を特異的に認識して、２つのｌｏｘＰ配列にはさまれた配列で組換えを起こさせ、これが破壊される）。臓器特異的なプロモータに連結したＣｒｅ遺伝子を有するトランスジェニックマウスと交配させるか、またはＣｒｅ遺伝子を有するウイルスベクターを使用して、成体でＣｒｅを発現させることができる。さらに、本発明を使用すれば、さらにメチル化により転移効率が上がることから、遺伝子の解析効率が飛躍的に上昇する。
特定の遺伝子を解析する方法としてジーントラップ（遺伝子トラップ）法が注目されている。ジーントラップ法では、プロモータを有しないレポーター遺伝子が細胞に導入され、その遺伝子が偶発的にゲノム上に挿入されると、レポーター遺伝子が発現することを利用して、新規な遺伝子を単離（トラップ）される。ジーントラップ法は、マウス初期胚操作法，胚性幹細胞培養法，相同組換えによる遺伝子ターゲティング法に基づく、効率的な挿入変異と未知遺伝子同定のための方法である（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  ＷＬ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：７５６−７６８（２００１））。ジーントラップ法では、遺伝子の導入ならびに挿入変異体の選択およびその表現型解析が比較的に容易である。
ジーントラップ法では、例えば、スプライシング／アクセプター配列とポリＡ付加シグナルとの間にｌａｃＺとｎｅｏとの融合遺伝子であるβ−ｇｅｏを連結したジーントラップベクターをＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択すると、ＥＳ細胞で発現している遺伝子を偶然にトラップしたクローンだけが選択される。
このようにして得られたクローンからキメラ胚を作製すると、トラップした遺伝子の発現パターンにより、さまざまなＸ−ｇａｌの染色パターンを示す。このようにして、ジーントラップ法では、未知の遺伝子が単離され、その遺伝子発現パターンが解析され、またその遺伝子が破壊される。本発明を使用すれば、さらにメチル化により転移効率が上がることから、遺伝子の解析効率が飛躍的に上昇する。
本発明を用いれば、トランスポザーゼ遺伝子を有するトランスジェニック生物と、非自己完結型トランスポゾン含有トランスジェニック生物とを交配して、「トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾン含有トランスジェニック生物」を得ることができる。ここでは、非自己完結型トランスポゾンとは、それ自身では転移が不可能なものをいう。自己完結型トランスポゾンとは、それ自身で転移が可能なものをいう。この方法によると、同様の親を交配させることにより、同一遺伝子をもつ仔哺乳動物を新たに得ることができる。この方法によれば、トランスポゾン構築物のみが導入されたことによる哺乳動物における表現型に与える影響をあらかじめ知ることができる。同様に、トランスポザーゼ構築物のみが導入されたことによる哺乳動物における表現型に与える影響をあらかじめ知ることができる。あるいは、トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾンを初めから導入した、交配によらない「トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾン含有トランスジェニック生物」を得ることもできる。この方法によれば親同士を交配する必要がないため、手間や時間、コスト面で効率がよい。従って、本発明では、このようなトランスジェニック生物の作製方法を適用することができる。
この「トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾン含有トランスジェニック生物」において、トランスポゾンは転移可能な状態で含まれるため染色体上の任意の部位に転移可能であり、この転移により染色体上の任意部位の遺伝子機能を破壊、低下ないし活性化することが可能である。
さらに、「トランスポザーゼ遺伝子およびトランスポゾン配列含有トランスジェニック生物」と「トランスポザーゼを含まない生物」を交配して、「トランスポゾンを有するがトランスポザーゼ遺伝子を有しない生物」を得ることができる。トランスポザーゼがｌｏｘＰで挟まれている場合、Ｃｒｅを含む生物と交配してもよい。
好ましい実施形態では、ほぼ全細胞に（ｉ）少なぐとも、１つのトランスポザーゼ遺伝子および少なぐとも１つの非自己完結型トランスポゾシあるいは自己完結型トランスポゾン、ならびに（ｉｉ）少なくとも１つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック生物」は、「ＧＦＰを任意成分として内部に含むトランスポゾン配列（ＴＰ）とトランスポザーゼ遺伝子（ＳＢ）を両方有するトランスジェニック生物（以下、「ＴＰ−ＳＢ生物」ということがある）」に対応し、「ＧＦＰを任意成分として内部に含むトランスポゾン配列（ＴＰ）を有するがトランスポザーゼ遺伝子（ＳＢ）を有しない生物（以下、「ＴＰ生物」ということがある）」と、「トランスポザーゼ遺伝子（ＳＢ）を有するがトランスポゾン配列を有しない生物（以下、「ＳＢ哺乳動物」ということがある）」を交配して得られるものである。
１つの実施形態において、本発明のこのトランスジェニック生物はトランスポゾンあるいはシグニチャー部位を有する動物幹細胞または受精卵から誘導されているので、本質的に全ての細胞においてトランスポザーゼ遺伝子を有するはずであるが、トランスポゾンが切り出される際にシグニチャー部位を残さずかつ転移しないこともあり得ることから、「ほぼ全細胞」と表現することができる。本明細書では、「ほぼ全細胞」はこのような特別な細胞を除く全細胞を意味する。上記生物は、その各細胞においてトランスポゾンがランダムに転移しており、そのため、トランスポゾンにより導入された遺伝子変異に関して個体全体として統一的な変異が見いだされないものである。
別の実施形態において、本発明のトランスジェニック哺乳動物のうち「ＴＰ−ＳＢ哺乳動物」と「トランスポザーゼを含まない生物」を交配して得られるものは、「ＴＰ−ＳＢ哺乳動物」のシグニチャー配列に基づく遺伝子変異が受精卵の段階で既に存在し、哺乳動物個体のほぼ全細胞で共通のシグニチャー部位を含むものである。
本発明においては、所望のトランスジェニック生物をプレスクリーニングし得る。プレスクリーニングの方法としては、例えばジーントラップ法を用いることができる（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ，３９２：６０８・６１１（１９９８）；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：４６３−４６５（１９８９）；Ｓｋａｌｌｎｅｓ，ＷＣ．ｅ七ａｌ・；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：９０３・９１８（１９９２）；Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．ｅｔａＬ；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５１３−１５２３（１９９１））。このように、プレスクリーニングを行うことにより遺伝子機能の解明に有望な．トランスジェニック生物を予め選抜Ｌ仁その後２世代以上の交配あるいはその他適宜の手段により、１対の染色体の両遺伝子が変異したトランスジェニック生物を得ることができる。
遺伝子破壊してその表現型を解析する手法は、遺伝子機能を解明するための有効な手段である。哺乳動物個体、特にマウスで網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を解析するためには、克服しなければいけない大きな問題点が二つある。一番目は、網羅的に遺伝子破壊を起こし表現型を目安に遺伝子機能を探る手法、いわゆるフォワードジェネティックスが整備されていないことである。二番目は、遺伝子が一対（両対立遺伝子）あるために片側の遺伝子を破壊しただけでは表現型が現れないことである。両対立遺伝子変異を導入するためには、現在のところ片側の遺伝子が破壊された個体同士の交配に依存している。つまり、両対立遺伝子変異導入個体を得るための交配に長時間をかける必要性がある。
一番目の問題点は、本発明において改良されたトランスポゾンシステムでよりよく克服できる。二番目の問題点は、迅速な両対立遺伝子変異導入法により克服できる二番目の問題点を克服するための具体的手段として、両対立遺伝子変異を有する細５胞が高頻度に現れるＢｌｏｏｍ遺伝子ノックアウトマウスを用いることができる（Ｇ．Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２６：４２４・４２９（２０００））。但し、完全なＢｌｏｏｍ遺伝子ノックアウトマウスは致死性であり（Ｎ．Ｃｈｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．：，１２：３３８２−３３９３（１９９８））、二番目の問題点を克服できない可能性がある。そこで、本発明者らは、Ｂｌｏｏｍ遺伝子の発現を自由に調節できうる様なマウスをｔｅｔＯＦＦのシステム（ＣＴ，Ｂｏｎｄｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：１９４２−１９４６（２０００））を用いて作製中である。Ｂｌｏｏｍ遺伝子はＤＮＡへリカーゼをコードし、その活性が欠損すると、姉妹染色分体交換（ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ＝ＳＣＥ）が起こり、同時に別のｃｈｒｏｍａｔｉｄとの交換も起こる。従って、Ｂｌｏｏｍ遺伝子を欠損させると、４倍体の状態で組換えが起こり、一対の遺伝子が両方とも変異した細胞を、個体の一部で生じさせ得る。
例としてＢｌｏｏｍ遺伝子のＯＮ／ＯＦＦをテトラサイクリン依存的に行うようにしておくと（Ａ．Ｋｉｓｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ。．ＵＳＡ，９３：１０９３３−１０９３８（１９９６））Ｔ−テトラサイクリンを与えるまたは与えない時期を調節することで、時期特異的により多くの組換えを誘発し、一対の変異遺伝子を有する細胞に導くことができる。従って、交配を繰り返すことなく、一対の遺伝子の変異した生物を得ることができる。時期特異的に変異を導入するには、例えば、ペレットを持続的に生物母体に経口投与することで、一対の遺伝子の変異した胎児を得ることができる。
Ｂｌｏｏｍ遺伝子を調節可能に発現させるための一例としてのテトラサイクリンレギュレータブルユニット（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｕｎｉｔ）のような手段の導入は、トランスポゾンシステムと組み合わぜて行う。例えば、トランスポゾンコンストラクト、トランスポザーゼ、自己完結型トランスポゾンなどが導入される受精卵等に予めＢｌｏｏｍ遺伝子を調節可能に発現する手段を導入しておいて交配を行う。得られたトランスポゾン転移部位が導入されたマウスに、Ｂｌｏｏｍ遺伝子の発現を抑制する手段（例えばテトラサイクリンの投与）を実施することで、トランスポゾンシステムにより得られた遺伝子の変異を両対立遺伝子に導入し、表現型の確認を迅速に行うことができる。本発明において選択マーカー遺伝子を用いない場合は、該トランスジェニック生物の細胞からＤＮＡを抽出し、サザンプロット法により転移の有無を調べることで、スクリーニングを行ない得る。本発明によれば、動物体内で、効率のよいトランスポゾン配列の転移を達成することができる。トランスポゾンを用いた変異の導入法によれば、他の方法に比べ、多種多様な表現型をもつ生物を効率よくかつランダムに得ることが可能となる。本発明のトランスジェニック生物は、遺伝子機能研究において、多様な遺伝子変異を導入することにより、複雑な生命現象を解明するためのツールとしてきわめて有用である。
また、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５：１０７６９・１０７７３，１９９８に記載されるように、細胞におけるトランスポゾンの発現頻度は細胞あたり最大で３．５×１０−５回／１世代あたりの１細胞と極めて低い。これに対して、本発明による個体でのトランスポゾン発現率は、例えば実施例においては全マウス中４２％、ＧＦＰ遺伝子陽性マウス中最大８０％であり、著しく高いという特徴をもつ。このようにトランスポゾン発現システムが動物またはその組織、器官などの細胞集合体となることでトランスポゾンの転移効率が飛躍的に高めることが容易になったのは、本発明において初めて見出された知見である。
本発明の１実施態様によれば遺伝子機能を鮮明する手段として、ランダムにトランスポゾン構築物を導入したトランスジェニック生物群の中から、マーカーあるいは他の手段によりランダムに導入された変異を有する個体を見出すことが可能である。遺伝子機能を網羅的に解析するには、トランスポゾンがゲノムのより多くの部位へ転移する必要がある。本発明によれば、「ほぼ全細胞に（ｉ）少なくとも１つのトランスポザーゼ遺伝子および少なくとも１つの非自己完結型トランスポゾンあるいは自己完結型トランスポゾンならびに（ｉｉ）少なくとも１つのシグニチャー部位を有するトランスジェニック生物」を得ることができる。例えばマウスを対象とした以下の実施例などで示され得るにように、細胞１０個当たり１個以上の割合でシグニチャー部位を導入することができ、その結果種々雑多な細胞をモザイク状にもつそのような「種マウス」が得られ、該マウスは１個体当たり約１万以上の転移部位を有するとの結果を得ている。従って、異なる種マウスから変異マウスを作製することにより、約３万以上あるとされる遺伝子のほぼ全てについて網羅的に変異導入することも可能である。このように、変異を有する生物個体を解祈する際、本発明では遺伝子変異の発現頻度が極めて高いので、複数の変異をもつ生物が１個体得られれば、多くの変異の機能変化を一度で分析することができ、遺伝子機能の解明を極めて効率的に行うことができる。また、変異導入の対象としてマウスを例にとると、従来のＥＳ細胞への変異導入法であれば、１つの細胞からわずか１匹のトランスジェニックマウスしか得られなかった。本発明を使用すれば、さらにメチル化により転移効率が上がることから、遺伝子の解析効率が飛躍的に上昇する。
一方、本発明のトランスジェニック生物作製方法によれば、得られた「ほぼ全細胞に少なくとも１つの非自己完結型トランスポゾンおよび少なくとも１つのシグニチャー部位からなる群がら選ばれる少なくとも１種を有するトランスジェニック生物（例えばマウス）」を種マウスとすると、１匹の個体から１万種類のトランスジェニック個体を産ませることができる。即ち、１匹のマウスから膨大な種類の転移をもつ子が産まれるとの利点があり」、生命現象を解明するために種々雑多な変異個体を得ることができる。
本発明によれば、得られたトランスジェニック生物を交配することで、転移が固定された遺伝子解明上有用な生物を得ることが司能である。ここで「転移が固定された」とは、活性なトランスポザーゼを有さないためトランスポゾンの転移によるシグニチャー部位数が増加しないことを意味する。具体的には、少なくとも１つのシグニチャー部位を有しトランスポゾンが存在するがトランスポザーゼが存在しないまたは不活性である場合、少なくとも１つのシグニチャー部位を有するがトランスポゾンが存在しない場合のいずれかを指す。このようなトランスジェニック哺乳動物個体が得られれば、１個体を調べることで、対応する１種の遺伝子機能をシンプルに解析することができる。また、特定の変異を有する個体について、その成長過程に伴い該変異の影響を調べることができる。また、こうした生物の中で何らかの機能を欠損したものについて、例えばスプライスアクセプターを含むトランスポゾン配列を用い、トランスポザーゼをその受精卵に加えるかあるいはトランスポザーゼを有する生物と交配することで該トランスポゾン配列を除去し、その結果機能が回復するかどうかを見ることにより、特定の機能に関与する原因遺伝子を確認することができる。本発明では、トランスポゾンにより変異を導入しているため、突然変異誘発物質などを用いて変異を導入するのと比較して、どこに変異が導入されたのかをシグニチャー配列あるいはトランスポゾン構築物由来の配列を利用してＰＣＲ等の適当な方法により、容易に検出することができる。また、本発明の実施態様においては、培養細胞でなく個体の生物で遺伝子変異を導入することにより、個体レベルでの遺伝子機能の解析が可能である。また、生物個体を生存させたままの状態では操作が困難な組織に対しても、外部から手を加えることなしに、個体体内で遺伝子変異を導入し得る。さらに、同じ組織内であっても転移部位が異なり、従って遺伝的に異なる一群の細胞が存在するので、血液系、免疫系などの任意の組織・臓器・器官で、増殖、分化等における細胞系譜を系統的に調べることができる．
本発明によれば、本発明の新規な生物、特にマウスは、遺伝子機能解明のための便利なモデルシステムを提供する。本発明のこの実施態様は、生きた動物モデルにおいて遺伝性疾患の研究のための疾患モデルシステムを提供し得る。該システムにおいて、動物モデルに導入される疾患遺伝子としては、ヒト疾患原因遺伝子、または生物におけるその相同遺伝子がｃＤＮＡの遺伝子全長、ｃＤＮＡの遺伝子断片、ゲノムＤＮＡの遺伝子全長、あるいはゲノムＤＮＡの遺伝子断片であるものが挙げられる。疾患原因遺伝子は、生物に導入して、得られたトランスジェニック生物をヒト疾患モデル動物として研究に供し得るものであればいずれでも良く、特に限定されないが、ヒト疾患原因遺伝子であるのが好適である。本発明によれば、種々のエンハンサーを含むトランスポゾンが癌原遺伝子の近傍に転移した場合、これらを包含する細胞においては結果的に癌が発現するため、これにより癌原遺伝子をスクリーニングできる。特に、トランスポゾン配列およびトランスポザーゼ遺伝子を両方含むトランスジェニック生物を用いた場合、癌原遺伝子の発現はクローナルであるため、癌は組織だけでなく全体に転移し得る。また同時に、各動物細胞内で転移による遺伝子機能の低下、破壊ないし活性化がランダムに進行しているので、複数の癌が同一個体内で発生することも予測され、癌に関与する遺伝子機能の解明を効率よく進めることができる。さらに、同一個体内で複数の癌を認めた場合、各々の癌細胞においてトランスポゾンベクターの挿入部位が同じかどうかを調べることによって、癌細胞が同一の細胞に由来しているかどうかを調べることができ、癌の転移のメカニズム研究に寄与し得る。
本発明では、本発明のトランスジェニック生物を臓器提供用ドナーとして使用することができる。例えば、ヒトへの異種間臓器移植のドナーとして考えられる臓器として、具体的には神経細胞、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、角膜、皮膚などが挙げられる。この場合、導入される遺伝子は、例えば異種間での臓器移植に拒絶反応を低減する機能を有する遺伝子あるいは生着率の上昇を期待し得る機能を有する遺伝子が好ましい。
トランスジェニック生物の作製についてはまた、米国特許第５，４６４，７６４号公報；米国特許第５，４８７，９９２号公報；米国特許第５，６２７，０５９号公報；特開２００１−５４３３７号公報；Ｇｏｓｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｅｅ  ２４４，４６３−４６５；Ｗｕｒｓｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３９，８８９−８９９；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ、Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，６０８−６１１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９；村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊  新訂  遺伝子工学ハンドブック  改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）中特に２３９から２５６頁；相沢慎一（１９９５）実験医学別冊「ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「ノックアウト」とは、遺伝子について言及されるとき、その遺伝子を破壊（欠損）または機能不全にさせることをいう。従って、ノックアウトの概念は、トランスジェニックの中に含まれる。
本明細書において、「ノックアウト生物」とは、ある遺伝子がノックアウトされた生物（例えば、マウス）をいう。従って、ノックアウト生物の概念は、トランスジェニック生物の中に含まれる。
本明細書においてトランスジェニックの対象とされる「生物」は、トランスポゾンが作用し、そのような系が機能し得る任意の生物が含まれる。このような生物には、動物、植物、細菌などが含まれるがそれらに限定されない。
本明細書において、「動物」は、核酸配列（好ましくは遺伝子をコードする外来配列）の導入を目的とすることができるものであればどのような動物であってもよい。従って、動物には、脊椎動物および無脊椎動物が包含される。動物としては、哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、ネコ、ラット、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、イルカ、クジラ、ヤギ、ウマなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラなど）、両生類（例えば、カエルなど）、爬虫類、昆虫（例えば、ショウジョウバエなど）などが挙げられる。好ましくは、動物は、哺乳動物であり得、より好ましくは、ノックアウトを作製することが容易な動物（例えば、マウス）であり得る。別の好ましい形態では、動物は、ヒトのモデル動物として適切であることが判明している動物（例えば、サル）であり得る。ある実施形態では、動物は、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物であり得るが、それに限定されない。例えば、ブタ、サル・ウシ・ウマ・ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、またはハムスター等であり、より好ましくは、マウスまたはラットである。ここで本発明の生物には、特に言及しない限り、哺乳動物個体だけでなく個体の一部および個体の有する臓器、器官も包含される。これらはヒト疾患モデルとして、また臓器移植用ドナーとして有用である。
本明細書において用いられる「植物」とは、植物界に属する生物の総称であり、クロロフィル、かたい細胞壁、豊富な永続性の胚的組織の存在，および運動する能力がない生物により特徴付けられる。代表的には、植物は、細胞壁の形成・クロロフィルによる同化作用をもつ顕花植物をいう。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物としては、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ソルガムなどのイネ科に属する単子葉植物が挙げられる。より好ましくは、植物は、イネであり得る。イネとしては、ジャポニカ種、インディカ種のものが挙げられるがそれらに限定されない。より好ましくは、イネは、ジャポニカ種のものであり得る。本明細書において、イネの品種としては、例えば日本晴、ニホンマサリ、コシヒカリ、あきたこまち、どんとこい、ヒノヒカリなどが挙げられるがそれらに限定されない。インディカ種の品種としては、Ｔｅｔｅｐ、Ｂａｓｍａｔｉ、ＩＲ８、湖南早などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましい植物は作物に限られず、花、樹木、芝生、雑草なども含まれる。特に他で示さない限り、植物は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくは単子葉植物であり、より好ましくは、イネ科植物である。さらに好ましくは、イネであり得る。
上述の生物において、遺伝子の導入技術はマイクロインジェクション、核酸フラグメントと陽イオン脂質小胞体またはＤＮＡ凝縮試薬との組合せ；ならびに核酸フラグメントをウィルスベクターに導入し、そしてこのウィルスベクターを細胞と接触させること、ならびに粒子ボンバードメントおよびエレクトロポレーションから成る群より選ばれる方法を含む。
本明細書において使用され得るウィルスベクターはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスまたはアデノ関連ウィルスベクターからなる群より選ばれるものが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。したがって、「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において使用される場合「ジーントラップ（法）」とは、目的の細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出できること利用した遺伝子の同定方法をいう。このようなジーントラップは、「ジーントラップベクター」を、真核生物の宿主染色体中に導入して、宿主遺伝子を破壊することにより達成される。レポーター遺伝子が挿入された遺伝子は、レポーターとの複合タンパク質を発現するため、そのタンパク質をモニターすることによって遺伝子を同定することが可能である。したがって、相同組換えと同様に本来の遺伝子座にレポーター遺伝子が組み込まれるため、転写調節が完全なレポーター系を作ることができる。この手法を用いることによって、遺伝子破壊によって変異体を単離する手法では、得られなかった遺伝子の同定を行うことができる。したがって、本発明では、このようなジーントラップ法もまた利用することができる。
本明細書において「ジーントラップベクター」とは、真核生物遺伝子のｍＲＮＡが成熟ｍＲＮＡとなる過程においてスプライシングを受ける現象を利用して、遺伝子中へ挿入されたベクターを選択するためのベクターである。ジーントラップベクターとしては、（１）プロモーターを有さないレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスアクセプター部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、または（２）プロモーターを有するレポーター遺伝子のコード領域、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡ配列を含むベクター、ならびに（３）これら（１）および（２）の両方のＤＮＡ配列を含むベクターが挙げられるがこれらに限定されない。
上述のようなスプライスアクセプター配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、ポリＡ付加シグナルを含んでもよい。スプライスドナー配列を含むジーントラップベクターは、必要に応じて、エンハンサー領域、および／またはｍＲＮＡ不安定化領域を含んでもよい。ポリＡ付加シグナルとしては、「ＡＡＴＡＡＡ」が挙げられるが、これに限定されない。
本発明において使用するプロモーターとしては、ＭＣ１プロモーター、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるエンハンサーとしては、ポリオーマウイルスエンハンサー（ＰＹＦ４４１）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるスプライスドナー配列としては、マウスｈｐｒｔ遺伝子エキソン８スプライスドナーが挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において使用されるスプライスアクセプター配列としては、ヒトｂｃｌ−２遺伝子エキソン３スプライスアクセプターが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において使用される「レポーター」分子または「レポーター」遺伝子とは、細胞内において遺伝子発現の指標として使用することのできる分子（例えば、ポリペプチド）または遺伝子をいう。そのような分子としては、公知のレポータータンパク質を用いることができ、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはエクオリンなどが挙げられる。ここで、遺伝子の導入方法自体は、当該分野において公知の技術をもちいて所望の材料を用いて行うことができる。そのような場合、例えば、目的とする胚性幹細胞に、例えば、プロモーターを欠いたレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン蛍光遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、Ｃｒｅレコンビナーゼ遺伝子など）を導入し、染色体上で活性化されているプロモーターの下流に挿入された場合にのみレポーター活性が検出する。使用されるベクターはこのレポーター遺伝子のほか、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、レスキューマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子＋コリシンＥ１複製開始起点）などを含んでいてもよい。ここで、選択マーカー遺伝子は、ベクターが入った宿主を選択するために使用される。レスキューマーカー遺伝子は、ベクターをレスキューするために使用される  （Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）を参照のこと）。上述のような技術を用いることによって、胚性幹細胞が生成される。この改変胚性幹細胞は、遺伝子がトラップされている。ここで、トラップされているとは、ゲノムへのトラップベクターの挿入により内在性遺伝子が破壊され、同時にそのベクターによって破壊された遺伝子がマーキングされた状態をいう。
特定の配列を有するオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．ｅｄ．”Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）に記載される方法で行うことができる。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、蛍光、放射能などで標識することができる。そのような標識方法は当該分野において周知であり、本明細書において引用される文献に記載されている。
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の方法または生物を使用することができる。本発明では、種々のトランスジェニック生物が作製されることから、任意の核酸分子およびその機能調節因子をスクリーニングすることができる。
本発明では、任意の核酸分子を本発明の核酸分子、方法またはシステムを利用することによってスクリーニングすることができる。本発明はまた、そのようなスクリーニングによって同定された化学物質またはその組み合わせを包含することが企図される。
本発明のトランスポゾンシステムは種々の分野に応用できる。例えば、１）本発明の方法を利用して生物の染色体への遺伝子材料を効率的に挿入することができる；２）挿入変異因子としてのトランスポゾンの利用により、生命体の成長、維持、調節および発育に関わる遺伝子の同定、単離および特性を決定することができる（例えば、Ｋａｉｓｅｒら、１９９５「Ｅｕｋｅｒｙｏｔｉｃｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ，ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ａｓ  ｔｏｏｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｍｏｂｉｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．６９−１００）；３）生命体の成長、維持、調節および発育を調節する転写調節配列の同定、単離およびをの同定することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６，Ｍｏｌ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５，１０５−１１３）。一例において、本発明の方法およびシステムは無菌遺伝子導入マウスを作るために利用できる。活性化遺伝子を有する同腹群を交配させ、生物的封じ込めまたは養殖魚の成長率を最大にするために無菌子孫を作ることができる。
（遺伝子治療）
本発明の用途としては、核酸フラグメントを修飾して細胞に遺伝子治療を施す遺伝子を組込むことが挙げられる。遺伝子は組織特異的プロモーターのコントロール下、または汎存プロモーター、またはその遺伝子を必要とする細胞における遺伝子の発現のための１もしくは複数のその他の発現コントロール領域のコントロール下に置く。遺伝子治療に使用される遺伝子としては、例えば、嚢胞性線維症のためのＣＦＴＲ遺伝子、肺疾患のためのα−１−アンチトリプシン、免疫系疾患のためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、血液細胞疾患のための１×因子およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）、ならびに癌治療のための腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
遺伝子治療に使用することが可能な遺伝子配列は公知のデーターベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ等において検索し、入手できる。
さらに、本発明は、ライブラリーで作業するまたはそれをスクリーニングするための工程の一部として、配列の機能を評価するため、またはタンパク質発現をスクリーニングするため、または特定の細胞タイプに対する特定のタンパク質または特定の発現コントロール領域に対する効果を評価するために利用することができる。１つの実施形態において、組換え配列のライブラリー、例えばコンビナトリアルライブラリーまたは遺伝子シャフリングの生成物を本発明の核酸フラグメントの中に組込んで、一定の逆方向反復配列の間に配置された様々な核酸配列を有する核酸フラグメントのライブラリーを作る。次いでこのライブラリーを前述の通りＳＢタンパク質などのトランスポザーゼと一緒に細胞の中に導入する。
本発明の利点は、それが逆方向反復配列の間に配置される介在核酸配列のサイズを著しく制約しないというトランスポゾントランスジェニック生物作製システムの利点をフルに活用することができ、メチル化により効率が飛躍的にアップすることである。このＳＢタンパク質は１．３キロベース（ｋｂ）〜約５．０ｋｂのトランスポゾンを組込むのに利用されており、ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼは約１３ｋｂまでのトランスポゾンを移動させた。ＳＢタンパク質を用いて細胞のＤＮＡの中に組込むことのできる核酸配列のサイズにわかっている制限はない。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
１つの局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子を提供する。このような核酸分子は、予想外に、宿主内でのトランスポゾン活性を保持し、活性化することができるという優れた効果を持つ。このような効果により、本発明は、どのような生物であってもトランスジェニック生物を作ることが可能になったという優れた有用性を有する。
好ましい実施形態において、本発明の核酸分子は、所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する。ここで含まれる所望の遺伝子は、どのような遺伝子であってもよく、その遺伝子は、核酸分子が使用される用途によって適宜選択することができる。
好ましい実施形態において、本発明において使用される核酸分子におけるメチル化は、少なくとも、ＣＧ配列におけるＣにおいて存在することが有利であり得るがそれに限定されない。理論に束縛されないが、特にＣＧ配列にメチル基が存在することによって、染色体がヘテロクロマチン化するという現象が生じることが考えられ、トランスポゾンの転移効率に多大な効果を与えるからである。
本発明において使用されるトランスポゾンは、どのような形態であってもよいが、好ましくは、ＤＮＡ型が用いられる。ＤＮＡ型であれば、メチル化の効果が発揮されやすいからである。好ましくは、本発明において使用されるトランスポゾンはＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型に属する。理論に束縛されないが、この型に属するトランスポゾンは、染色体内に組み込まれたときに染色体がヘテロクロマチン化するという現象が生じることが考えられ、トランスポゾンの転移効率に多大な効果を与えるからである。
もっとも好ましい実施形態では、本発明によって用いられるトランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙを含む。このトランスポゾンは、本明細書において他の場所において詳述したように、種の壁を簡単に越えて利用することが可能であるからである。
好ましくは、本発明の核酸分子では、所望の遺伝子は、トランスポゾンに作動可能に連結されるか、または細胞内に導入されるとトランスポゾンに作動可能に連結され得るように構成される。トランスポゾンが作動するように連結するには、例えば、逆方向反復配列を適宜配置したりすることが挙げられるがそれらに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される。外来遺伝子を宿主内に導入することは、たとえ、本発明の核酸分子がインビトロで効果が見られたとしても予想すらできない効果である。ましてや、メチル化の効果がまったくわかっていない状況では、予想の鍵すらないことに鑑みると、本発明のメチル化による外来遺伝子の宿主ない導入の効率化は格別の効果であるといえる。
本明細書において、本発明が対象とする生物（宿主）は、トランスポゾンが作動する限りどのような生物であってもよく、真核生物を含むがそれに限定されない。好ましくは、本発明が対象とする宿主は、哺乳動物（例えば、マウス、ラットなどのげっ歯類；霊長類など）を含むがそれに限定されない。トランスポゾンが作動するかどうかは、ここの動物を実験することによって確認することができる。
本発明の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子では、その核酸分子が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用することが有利である。このように構成されることによって、遺伝子の転移がスムーズに行われることができる。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列を有する遺伝子カセットであって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、遺伝子カセットを提供する。ここで、含まれる核酸分子は、上述のような特徴を有し得る。本明細書において「遺伝子カセット」には、他の要素が付着していてもよい。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有するベクターであって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、ベクターを提供する。ここで、トランスポゾンをコードする配列およびメチル化については、本明細書の他の場所において記載されている。ベクターは通常環状をしているがそれに限定されない。ベクターには、遺伝子の転写、翻訳、発現を調節する要素が付着されていてもよい。そのような要素は、好ましくは作動可能に連結され得る。
好ましくは、このベクターは、外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される。本発明のベクターは、従来不可能であったかまたは困難であった生物種でさえ、トランスジェニック生物を作製することが可能になったという効果が達成される。特に、ＳＢではトランスジェニック生物が作製できないとされていた哺乳動物において、ベクターを用いた形態でトランスジェニック生物を作製することができるようになったということは、簡便に外来遺伝子を挿入することができる系が利用可能になったことを意味する。したがって、このような系の有用性は、多大である。
本発明のベクターは、核酸配列が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用するように構成することができる。
本明細書において、「シグニチャー部位」とは、トランスポゾン配列が切り出されて転移した結果として現れる部位を指す。例えば、本発明でＳＢトランスポゾンを用いた場合、シグニチャー部位は、標的配列であるＴＡの重複の間にトランスポゾン末端配列の３塩基が挿入された「ＴＡｃａｇＴＡ」あるいは「ＴＡｃｔｇＴＡ」という配列を含む。但し、トランスポゾンが移動してもシグニチャー部位が上記特定の完全な配列を有しない場合もあり、本発明においては、こうした不完全な配列を含む部位もシグニチャー部位と見なすことができる。
別の実施形態において、本発明では、本発明の核酸配列が挿入されるゲノム上の位置においてトランスポザーゼが作用するようにベクターが構築される。このような構築は、本発明においてトランスポゾンをコードする配列部分が少なくともメチル化されていることによって達成され得る。
別の実施形態において、本発明は、ゲノム上に挿入される外来核酸分子に対してトランスポザーゼを作用させるための組成物を提供する。この組成物は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および該外来核酸分子を含み、該トランスポゾンをコードする配列はメチル化されていることを特徴とする。ここで、外来核酸分子はメチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む細胞を提供する。ここで、この核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されていることが特徴である。このような細胞を用いることによって、トランスジェニック生物を容易に作製することができることが本発明によって判明した。従って、本発明は格別の有用性を有する。本発明の細胞に含まれ得る核酸分子は、上述のトランスポゾンをコードする配列を含むものであれば、どのようなものであってもよい。ただし、そのような配列は、保持される細胞において機能的であることが好ましい。好ましくは、そのような細胞は、外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される。このような宿主は、その細胞と同じ種類であることが好ましいが必ずしも必要というわけではない。
本発明の細胞は、どのような種類の細胞であってもよいが、好ましくは、真核生物細胞を含み、より好ましくは、哺乳動物細胞を含み、さらに好ましくは、げっ歯類細胞を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の細胞は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の細胞に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む組織を提供する。ここで、この核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されていることが特徴である。このような組織を用いることによって、トランスジェニック生物を容易に作製することができることが本発明によって判明した。従って、本発明は格別の有用性を有する。本発明の組織に含まれ得る核酸分子は、上述のトランスポゾンをコードする配列を含むものであれば、どのようなものであってもよい。ただし、そのような配列は、保持される組織において機能的であることが好ましい。好ましくは、そのような組織は、外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される。このような宿主は、その組織と同じ種類であることが好ましいが必ずしも必要というわけではない。
本発明の組織は、どのような種類の組織であってもよいが、好ましくは、真核生物組織を含み、より好ましくは、哺乳動物組織を含み、さらに好ましくは、げっ歯類組織を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の組織は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の組織に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列、および所望の遺伝子をコードする核酸配列を有する核酸分子を含む生物を提供する。この生物では、上記核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されていることが特徴である。本発明の生物に含まれ得る核酸分子は、上述のトランスポゾンをコードする配列を含むものであれば、どのようなものであってもよい。ただし、そのような配列は、保持される生物において機能的であることが好ましい。好ましくは、そのような生物は、外来遺伝子を宿主内に導入するために使用される。このような宿主は、その生物と同じ種類であることが好ましいが必ずしも必要というわけではない。このような生物は、トランスジェニック生物を作製するために有用である。
本発明の生物は、どのような種類の生物であってもよいが、好ましくは、真核生物生物を含み、より好ましくは、哺乳動物生物を含み、さらに好ましくは、げっ歯類生物を含むがそれらに限定されない。より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物のものが有用である。むしろ、本発明の生物は、導入する核酸分子の性質、目的、核酸分子が導入されるべき宿主との関係で決定されるべきである。本発明の生物に含まれる核酸分子は、本発明のベクターであってもよい。
好ましい実施形態において、本発明の生物は、所望の遺伝子がその生物に由来しないものであることが好ましい。そのような場合、所望の遺伝子は、外来遺伝子という。外来遺伝子として導入されるものは、どのようなものでもよく、目的の遺伝子によって変動し得る。
別の局面において、本発明は、トランスジェニック生物を作製するための方法に関する。この方法は、Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する工程；Ｂ．該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；Ｃ．該生殖細胞において該トランスポゾンをコードする核酸配列がメチル化している個体を選択する工程；Ｄ．形質転換された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、を包含する。
トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供することは、当該分野において公知であり、あるいは、周知である技術を用いて達成され得る。該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換することもまた、当該分野における周知技術（例えば、本明細書において記載されるような遺伝子組み換え技術）を用いて行うことができる。生殖細胞においてトランスポゾンをコードする核酸配列がメチル化している個体を選択することもまた、当該分野において周知の方法を用いて行うことができる。具体的には、この生殖細胞から核酸分子（例えば、ＤＮＡ）をメチル化が破壊されないように取り出し、その核酸分子を脱メチル化し、質量が変化するかどうか、およびそのメチル化されている部分の配列を必要に応じて決定することによって行うことができる。形質転換された生殖細胞を用いて生物を再生するもまた、植物に応じて適宜適切な方法を当業者は選択することができる。
好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック生物が対象とする生物は、真核生物である。本発明におけるトランスポゾンのメチル化の効果がより発揮されやすいからである。
別の好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック生物が対象とする生物は、哺乳動物を含む。本発明におけるトランスポゾンのメチル化の効果がより発揮されやすいからである。ここで、より好ましくは、この哺乳動物は、げっ歯類動物であり、より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物である。
別の局面において、本発明は、トランスジェニック生物を作製するための方法を提供する。この方法は、Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子を提供する工程；Ｂ．該核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換する工程；ならびにＣ．形質転換された該生殖細胞を用いて生物を再生する工程、を包含する。
トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子を提供する工程は、本明細書において上述されたように、十分に説明されており、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。
本発明の方法において、核酸分子で、所望の生物の生殖細胞を形質転換することもまた、当該分野において周知の技術を用いて実施することができる。
本発明の方法において、形質転換された該生殖細胞を用いて生物を再生することもまた、生物に応じて適宜適切な方法を選択することによって、当業者は容易に実施することができる。
別の好ましい実施形態において、本発明のトランスジェニック生物が対象とする生物は、哺乳動物を含む。本発明におけるトランスポゾンのメチル化の効果がより発揮されやすいからである。ここで、より好ましくは、この哺乳動物は、げっ歯類動物であり、より好ましくは、マウス、ラットなどのモデル動物である。本発明は、このように、モデル動物を、容易に、ほぼ自動的に確率の高い方法で、トランスジェニック体とすることができるようになった。従って、本発明は、従来技術にはない格別な効果を有する。
別の局面において、本発明はまた、トランスジェニック生物を作製するためのキットを提供する。ここで、このキットでは、Ａ．トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子；Ｂ．トランスポザーゼが包含される。
本発明のキットに含まれる核酸分子は、本明細書において上述したように、トランスポゾンをコードする部分がメチル化されており、そのような核酸分子は、天然由来またはメチル化酵素によって人工的に作製することができる。また、トランスポザーゼは、キットに含まれるトランスポゾンに対して作動することができるものが使用され得る。
１つの実施形態において、本発明のキットには、核酸分子およびトランスポザーゼの使用法を記載する説明書が備えられる。この説明書は、紙媒体であってもよいが、伝送媒体（例えば、ネットワーク上の情報）であってもよい。この説明書には、核酸分子の扱い、形質転換法、培養法、再生法、トランスポゾンのインキュベーション法など、トランスジェニック生物に関する種々のプロトコルが記載されている。記載は、単言語であってもよいが、二言語以上の言語が併記されていてもよい。
別の局面において、本発明は、トランスポゾンをコードする核酸配列を有する、単離された核酸分子であって、該核酸配列は、少なくとも１つのヌクレオチドがメチル化されている、単離された核酸分子の、トランスジェニック生物の作製のための使用に関する。このようなメチル化された核酸分子の、トランスジェニック生物への使用は従来知られておらず、自明ではない概念である。このような核酸分子に関する説明は、本明細書において上述したとおりであり、種々の改変が可能である。
別の局面において、本発明は、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントを提供する。このフラグメントは、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化されている。ここで、逆方向反復配列としては、任意の物を使用することができるが、例えば、配列番号２２−２６に記載されるような物を例示することができる。ここで核酸配列としては、例えば、外来遺伝子の少なくとも一部または全部を含んでいてもよい。好ましくは、核酸配列は、少なくとも一つの発現制御領域を含む。そのような発現制御領域としては、例えば、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
１つの実施形態において、本発明の核酸フラグメントは、外来遺伝子の少なくとも一部をさらに含み、ここで、核酸フラグメントに含まれる核酸配列は、該外来遺伝子の少なくとも一部をコードする配列と作動可能に連結される。
１つの実施形態において、この細胞は、どのような生物のものであってもよいが、好ましくは動物由来である。好ましい実施形態では、本発明において使用される細胞は脊椎動物（例えば、霊長類またはげっ歯類（例えば、ラット、マウスなど）のような哺乳動物）、である。
ここで使用される細胞のＤＮＡは、細胞ゲノム、エピソームおよびプラスミドなどの任意の細胞に存在するＤＮＡであり得る。
本発明において使用される少なくとも１つの逆方向反復配列は、配列番号２０もしくは２１に記載される配列、またはその一部を含む。
１つの実施形態において、本発明において使用されるトランスポザーゼは、ＳＢタンパク質である。本発明において使用されるトランスポザーゼはまた、、配列番号３に対して少なくとも８０％の、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸相同性を有する。あるいは、本発明において使用されるトランスポザーゼをコードする核酸分子は、配列番号２に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列または配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。あるいは、本発明において使用されるトランスポザーゼは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して１または数個のアミノ酸の、置換、付加、または欠失を有していてもよい。
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸フラグメントにおいて含まれる少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、該直列反復配列は、配列番号２６に記載される塩基配列または該塩基配列に対して少なくとも８０％相同な塩基配列を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明において含まれる少なくとも１つの逆方向反復配列が少なくとも１つの直列反復配列を含み、好ましくはこの直列反復配列は、配列番号２２〜２５に記載される核酸配列からなる群より選択される。
別の局面において、本発明は、細胞中のＤＮＡに別のＤＮＡを導入するための核酸導入システムを提供する。このシステムは：Ａ）少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント；およびＢ）トランスポザーゼまたはトランスポザーゼをコードする核酸、を含む。
好ましい実施形態では、本発明のシステムにおいて使用されるトランスポザーゼは、ＳＢ核酸分子またはＳＢタンパク質であるがこれに限定されず、本発明の核酸フラグメントにおいて使用される任意のトランスポザーゼを利用することができることが理解される。あるいは、本発明において使用されるトランスポザーゼは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列またはその改変体を有するか、または前記トランスポザーゼをコードする核酸配列は、配列番号２に記載される核酸配列またはその改変体であり得る。
ここで、本発明において使用されるトランスポザーゼをコードする核酸は、好ましくは、細胞ゲノムに組み込まれる。
１つの実施形態では、本発明のシステムは、プラスミドまたはウイルスベクターをさらに含み、該プラスミドまたはウイルスベクターは、前記核酸フラグメントをその一部として含む。
本発明のシステムにおいて含まれる核酸フラグメントは、外来遺伝子をコードする配列の少なくとも一部を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明のシステムにおいて含まれる核酸フラグメントは、使用される細胞の中に、粒子ボンバードメント；エレクトロポレーション；マイクロインジェクション；遺伝子導入試薬の利用；およびウイルスベクターの利用からなる群より選択される方法を用いて導入される。粒子ボンバードメント、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子導入試薬、ウイルスベクターなどは、当該分野において公知の任意の技法を用いることができることが理解される。
別の局面において、本発明は、トランスジェニック生物を生産するための方法を提供する。この方法は、核酸フラグメントおよびトランスポザーゼを多能性細胞に導入する工程であって、該核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程；および該細胞を生物体へと成長させる工程；を包含する。ここで、核酸フラグメントおよびトランスポザーゼの細胞への導入は、当該分野において周知の任意の核酸またはペプチドの導入法を用いることできることが理解される。細胞を生物体へと成長させる方法もまた、分化因子などを適宜使用しながら実施することができることが理解される。あるいは、多能性細胞として、卵母細胞、胚細胞、卵および幹細胞からなる群より選択される細胞を用いることによって、通常の条件で成長させて生物体を生産することができることが理解される。
ここで好ましくは、使用される生物は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）または霊長類である。
別の局面において、本発明は、核酸を細胞中のＤＮＡに導入するための方法を提供する。この方法は、核酸フラグメントを細胞に導入する工程であって、該核酸フラグメントは、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、該トランスポザーゼの存在下で細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメントである、工程を包含する。
１つの実施形態において、本発明は、さらに、トランスポザーゼを前記細胞中に導入する工程を包含していてもよい。ここで、使用されるトランスポザーゼは、配列番号３と少なくとも８０％の相同性を有していてもよく、他の改変体であってもよい。そのような改変体の例は、本明細書において他に例示されている。
１つの実施形態において、本発明において使用される細胞は、トランスポザーゼをコードする核酸を含む。このような核酸を含むことによって、外来のトランスポザーゼを導入する必要を回避できる。好ましくは、この核酸は、細胞ゲノムに組み込まれる。恒常的に発現することができるからである。従って、このようなトランスポザーゼは、細胞中では、安定に発現されることが好ましくあり得る。あるいは、トランスポザーゼは、誘導性プロモーターに制御下にあるように作動可能に連結され、一過的に発現されてもよい。このような安定な発現または一過的な発現は、目的とする実験に応じて適宜使用し分けることができることが理解される。
本発明の方法では、挿入される配列は、タンパク質をコードすることが好ましい。そのようなタンパク質としては、例えば、マーカータンパク質、蛍光タンパク質、生理活性タンパク質などを挙げることができるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、細胞内の核酸配列を移動させるための方法を提供する。この方法は、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、該逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、該核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、を含む細胞の中に、トランスポザーゼを導入する工程、を包含する。ここで、このトランスポザーゼは、該細胞のＤＮＡ中の第一の位置から該ＤＮＡの第二の位置に該核酸配列を移動させる。このような細胞内の遺伝子の移動は、トランスポゾンシステムが得意とする機能であり、メチル化によって、トランスポゾンシステムの移動効率が飛躍的に上昇する。
本発明の核酸配列の移動方法において、細胞のＤＮＡはゲノムＤＮＡであることが好ましく、第一の位置または第二の位置は、染色体外ＤＮＡであってもよいがそれに限定されない。染色体外ＤＮＡが関与することによって、遺伝子のオンオフをより単純に行うことができるようになる。ここで、トランスポザーゼは、前記細胞中に核酸として導入することが好ましい。
別の局面において、本発明は、細胞内の遺伝子を同定するための方法を提供する。ここで、この方法は、少なくとも２つの逆方向反復配列の間に位置する核酸配列を含む核酸フラグメントであって、上記逆方向反復配列は、トランスポザーゼに結合する能力を有し、上記核酸フラグメントは、細胞内のＤＮＡに組込まれることができる、少なくとも一つのヌクレオチドがメチル化された核酸フラグメント、およびトランスポザーゼを、細胞の中に導入する工程；上記細胞中のＤＮＡを、上記核酸配列を切断することができる制限エンドヌクレアーゼで消化する工程；上記逆方向反復配列を同定する工程；上記逆方向反復配列に近い核酸の配列を決定する工程；および上記配列と配列情報データーベース内の配列情報と比較する工程、を包含する。ここで、核酸フラグメントおよびトランスポザーゼの細胞への導入は、当該分野において周知の任意の技法を用いることができることが理解される。また、エンドヌクレアーゼは、当該分野において公知の任意の酵素を用いて、例えば、供給業者のマニュアルを用いて切断・消化を行うことができることが理解される。逆方向反復配列の同定は、例えば、特異的な塩基長あるいは切断パターンの同定、配列決定などによって行うことが理解される。配列が決定されると、当該分野において公知の方法により、既存のデータベースまたは自分で作成したデータベースなどと比較することができる。このようにして比較することによって、遺伝子の機能を同定することができる。そのような同定は、例えば、種々の生物学的アッセイを行うか、表現型を観察するなどの技法を用いることができることが理解される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】  以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物の取り扱いは、大阪大学医学部において規定される規準を遵守して行った。本発明で用いる発現ベクターの作製方法を具体例を挙げて説明する。なお、このような例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易である。
以下、本発明の内容を実施例を用いてより具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
（材料および方法）
（プラスミドの構築およびメチル化）
セリンパルミトイルトランスフェラーゼ長鎖塩基性サブユニット（Ｓｐｔｌｃ２）遺伝子座にＳＢトランスポゾンを導入するためのターゲティングベクターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｐＢＳ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ部位にエキソン５を含むＳｐｔｌｃ２遺伝子の５ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩフラグメントの最初のクローニングによって作製し、ｐＢＳ−Ｓｐｔｌｃ２を得た。次いで、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＰｉｇＡ（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ａ．Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｍ．Ｉｋａｗａ，Ｍ．Ｏｋａｂｅ，Ｇ．Ｋｏｎｄｏｈ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，およびＪ．Ｔａｋｅｄａ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９１９１〜９１９６）のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントおよび１５０ｂｐの合成スプライシングドナー部位（Ｍ．Ｉｋａｗａからのギフト）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＢＳのＳａｌＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングし、その後、ＢａｍＨＩ部位を欠失させ、ｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＳＤを作製した。ｐＣＸ−ＥＧＦＰ−ＳＤの平滑末端化したＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＢＳ−ＩＲ／ＤＲ（Ｒ，Ｌ）の平滑末端化したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ−ＳＤを作製した。ＰＧＫ−ｎｅｏカセットを含むｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：Ｎｅｏ（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ａ．Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｍ．Ｉｋａｗａ，Ｍ．Ｏｋａｂｅ，Ｇ．Ｋｏｎｄｏｈ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，およびＪ．Ｔａｋｅｄａ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９１９１〜９１９６）のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントをｐＢＳにクローニングし、この後、ＢａｍＨＩ部位を欠失させ、ｐＢＳ−Ｎｅｏを作製した。ｐＢＳ−ＮｅｏのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントおよびｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ−ＳＤのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩフラグメントをｐＢＳ−Ｓｐｔｌｃ２のＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、ターゲティングベクターを得た。
リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）のためのベクターを以下のように構築した。ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：ＮｅｏのＰＧＫ−ｎｅｏカセットの下流にあるｌｏｘＰ部位を取り除くために、ＢａｍＨＩ−ＡｆｌＩＩＩフラグメントおよびＮｏｔＩ−ＡｆｌＩＩＩフラグメントを連結し、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：Ｎｅｏ−３’ｌｏｘを得た。平滑末端化および全ての切断末端のＮｏｔＩリンカーライゲーションの後、のＣｌａＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ＳＢトランスポゾン、および両側の約２００ｂｐのフランキング配列を含むｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：Ｎｅｏ−３’ｌｏｘのＰｖｕＩフラグメントと置換し、ｐＬ１ＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ１Ｌを得た。
ｐＲＯＳＡβ−ｇｅｏ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．，およびＰ．Ｓｏｒｉａｎｏ．１９９１；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５１３〜１５２３）の平滑末端化したＸｈｏＩフラグメントを、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＧＦＰ（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ａ．Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｍ．Ｉｋａｗａ，Ｍ．Ｏｋａｂｅ，Ｇ．Ｋｏｎｄｏｈ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，およびＪ．Ｔａｋｅｄａ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９１９１〜９１９６）の平滑末端化したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位およびｐＲＰ７９０（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｈ．Ｇ．ｖａｎＬｕｅｎｅｎ，およびＲ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ．１９９９．；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：２６８〜２７４．）のＢｓｐＥＩ−ＮｃｏＩ部位にそれぞれクローニングすることによって、ｐＴｒａｎｓＳＡβ−ｇｅｏおよびｐＴｃ３／ＳＡβ−ｇｅｏを構築した。
ＳＢトランスポザーゼの６−Ｈｉｓ−タグ化１２３アミノ酸Ｎ末端フラグメント（Ｎ１２３）の発現のために、Ｎ末端フラグメントを、まず以下のプライマー：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号２９）および５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧ−３’（配列番号３０）を用いてｐＣＭＶ−ＳＢ（ｐＳＢ１０）（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）からＰＣＲ増幅し、そして、ＮｃｏＩ、ＢｓｒＧＩおよびＣｈｏＩで消化した。次いで、ＮｃｏＩ−ＢｓｒＧＩフラグメントおよびＢｓｒＧＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＮｃｏＩ消化ｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびＸｈｏＩ消化ｐＥＴ２１ｄにクローニングし、ｐＥＴ−Ｎ１２３を得た。
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のためのＩＲ／ＤＲ−ＬのＤＮＡプローブについて、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：ＮｅｏのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントをｐＢＳのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＢＳ−ＩＲ／ＤＲ−Ｌを得た。
プラスミドＤＮＡのメチル化を、製造業者のプロトコルに従ってＳｓｓＩＣｐＧメチラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行い、その後、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。完全なメチル化を、メチル化感受性酵素での消化に対する耐性によって確認した。
（細胞培養および遺伝子ターゲティング）
マウスのＥＳ細胞を、２０％の仔ウシ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１ｍｌあたり１，０００Ｕの白血病抑制因子を含有するダルベッコの改変イーグル培地中で、マイトマイシンＣで処理したマウスの胚性線維芽細胞の上で培養した。マウス赤白血病（ＭＥＬ）細胞クローンであるＲＬ５およびＲＬ６８を１０％の仔ウシ血清を含有するダルベッコの改変イーグル培地中で培養した。
Ｓｐｔｌｃ２遺伝子座へのＳＢトランスポゾンの標的化挿入を、挿入型の相同組換えによって行った。簡単には、２５μｇのターゲティングベクターを相同性領域に位置するＢａｍＨＩで直線化し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してエレクトロポレーション（２４０Ｖ、５００μＦ）によって、１．０×１０７個のＥＳ細胞に導入した。細胞を１ｍｌあたり、１５０μｇのＧ４１８で７日間選択し、その後、耐性クローンをピックアップし、拡大させ、そして、サザンブロット法で分析した。
ＲＭＣＥを以前に記載されたように実施した（Ｓｃｈｕｂｅｌｅｒ，Ｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｌｏｒｉｎｃｚ，Ｄ．Ｍ．Ｃｉｍｂｏｒａ，Ａ．Ｔｅｌｌｉｎｇ，Ｙ．Ｑ．Ｆｅｎｇ，Ｅ．Ｅ．Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ，およびＭ．Ｇｒｏｕｄｉｎｅ．２０００；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０：９１０３〜９１１２）。簡単には、２５μｇのメチル化または非メチル化プラスミドを、２０μｇのＣｒｅ発現ベクターｐＢＳ１８５および２００μｇのサケ精子ＤＮＡを一緒に用いて、ＭＥＬ細胞クローンＲＬ５およびＲＬ６に、エレクトロポレーション（２５０Ｖ、１，０７０μＦ）によって導入した。細胞を１０日間、エレクトロポレーション後の最初の４日は、１０μＭのガンシクロビルで選択した。独立したクローンを単離するために限界希釈を行い、単離した独立クローンを拡大させ、そして、増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の検出のために、プライマーＥＧＦＰ−１Ｕ（５’−ＣＡＣＣＣＴＣ  ＧＴＧＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号３１））およびプライマーＥＧＦＰ−１Ｌ（５’−ＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣ  ＴＧＣＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号３２））を、ならびに、ＨＹＴＫの検出のために、プライマーＨＹＧ−１Ｕ（５’−ＣＧＧＧＣＧＴＡＴＡＴＧＣＴＣＣＣＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＣ−３’（配列番号３３））およびプライマーＴＫ−１Ｌ（５’−ＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＡＧ−３’（配列番号３４））を用いるＰＣＲによってプレスクリーニングした。交換したカセットの方向を、方向ＤについてプライマーＭ１３Ｆ（５’−ＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号３５））およびプライマーＲＭＣＥ−ＤＬ１（５’−ＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣ−３（配列番号３６）’）を、ならびに方向ＩについてプライマーＭ１３ＦおよびプライマーＲＲＭＣＥ−ＩＬ−１（５’−ＡＡＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧＣＴＡＡＧＧＴＧ−３’（配列番号３７））を用いて決定した。カセット交換およびメチル化状態をさらに、サザンブロット分析によって確認した。
（雄生殖細胞の単離）
ドナートランスポゾン（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ａ．Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｍ．Ｉｋａｗａ，Ｍ．Ｏｋａｂｅ，Ｇ．Ｋｏｎｄｏｈ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，およびＪ．Ｔａｋｅｄａ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９１９１〜９１９６）を有するマウスの精巣を被膜剥離し、剃刀を用いて約１ｍｍ２のフラグメントに切り刻んだ。生殖細胞を、ピペッティングを繰り返して放出させた。精細管を取り除くための簡単な遠心分離の後、上清を回収し、１，５００×ｇでさらに遠心分離して沈殿させた。次いで、ＤＮＡを細胞ペレットから抽出し、サザンブロット法で分析した。
（サザンプロット分析）
ゲノムＤＮＡは、制限酵素で消化され、０．７％アガロースゲルで分画し、ＨｙＢｏｎｄ・Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ＥＧＦＰを含むｐＣＸ・
ＥＧＥＰ（Ｏｋａｂｅ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０７，３１３−９（１９９７））の０．７ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片をトランスポゾン特異的バンドを検出するためのプローブとして使用した。ハイブリダイゼーション及び洗浄を標準的な方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前出）（１９８９））により行った。トランスジェニックマウスのトランスポゾンコピ一致を評価するために、テイルＤＮＡのバンドをＢｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いてトランスポゾンの単一コピーを含むＥＳ細胞クローンに由来するゲノムＤＮＡのものと比較した。
（ＰＣＲ分析）
トランスポゾンの切り出しは、以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより検出した：ＴｇＴＰ−２Ｌ，５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧ−３’（配列番号７）およびＴｇＴＰ−１Ｕ，５’−ＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号６）。各プライマーは、それぞれｐＴｒａｎｓＣＸ−ＧＦＰ：ＮｅｏのＩＲ／ＤＲ（Ｒ）およびＩＲ／ＤＲ（Ｌ）の外側に位置する。ＰＣＲは、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、以下の条件下に行った：
９５℃１５分、５０サイクル（９４℃１分、５９℃１分、７２℃１分）、次いで最終工程で７２℃１０分の１サイクル
トランスジェニックマウスの遺伝子型は、以下のプライマー対を用いて決定した：
ＧＦＰ遺伝子に関して（ＥＧＦＰ−１Ｕ，５’−ＣＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＡ３’（配列番号７３）およびＥＧＦＰ−１Ｌ，５’−ＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧ−３’（配列番号７４））および；ＳＢトランスジーンに関して（ＳＢ−２Ｕ，５’−ＴＣＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＡＣＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号７５）およびＳＢ−１Ｌ，５’−ＡＴＣＣＡＧＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７６））。
ＰＣＲ条件は、アニーリング温度を５５℃とし、サイクル数を３０とした以外は、上記２５’と同じであった。得られたＰＣＲ産物は、ＧＦＰ遺伝子に関し３１３ｂｐおよびＳＢトランスジーンに関し４６６ｂｐであった。トランスポゾンの新規組込部位でのブランキング配列は、既述のようにＰＣＲ増幅した（Ｉｖｉｃｚ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１，５０１−１０（１９９７））。ＰＣＲ産物はダイターミネーターおよびＡＢＩ３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定機（Ａｐｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて直接配列決定した。
（ＧＦＰ発現の測定）
出生直後のマウスの尾の先端を切除し、直ちにＧＦＰ・ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ（オリンパス、東京、日本）およびオリンパス蛍光倒立顕微鏡を用いて×４０の倍率で蛍光強度を観察する。尾全体にＧＦＰ発現を有するマウスをポジティブと判定した。
［実施例１：一過性トランスポゾン切り出しアッセイ］
まず、本実施例において、トランスポゾンをコードする配列のメチル化が一過的に切り出し能を上げるかどうかを確かめた。
（一過性トランスポゾン切り出しアッセイ方法）
トランスポゾンＤＮＡ（ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ；ｎｅｏ、Ｈｏｒｉｅｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．；９８：９１９１−６）を、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１６０μＭ  ＳＡＭ、０．２Ｕ／μｌ  ＳｓｓＩ）を用いてあらかじめメチル化しておいた。メチル化自体の確認はメチル化感受性Ｎｏｔ１で消化されないことを確認することによって行った。
次に、マウス赤白血病細胞（ＭＥＬ細胞、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：７７９−７８５，１９９９）に、トランスポゾンＤＮＡとＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）転移酵素（ＰＣＭＶ−ＳＢ、Ｐ．Ｈａｃｋｅｔｔ博士より入手）とともに導入した。細胞から（ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＤＮＡを抽出し、プラスミドベクター上にプライマーを用いてＰＣＲ（ＴｇＴＰ−１Ｕ、ＴｇＴＰ−２Ｌ（前出の配列））を行い、切り出し反応が起こった場合に増幅される３５８ｂｐのＰＣＲ産物を検出した。検出は、アガロースによる電気泳動の後、エチジウムブロマイドによる染色によって行った。対象としてサイズマーカーも電気泳動した。切り出しシステムの構成例を図１Ｄ（ａ）に示す。
（一過性にトランスフェクトしたトランスポゾンの切り出しアッセイ）
一過性にトランスフェクトしたトランスポゾンの切り出しアッセイのために、１．０×１０６個のＭＥＬ細胞をＴｒａｎｓＦａｓｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、１．０μｇのｐＳＢ１０またはｐＢＳと一緒に１．０μｇのメチル化または非メチル化ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：Ｎｅｏでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＤＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）でゲノムＤＮＡを抽出した。４００ｎｇおよび８０ｎｇのＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡを使用して、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑシステム（ＱＩＡＧＥＮ）で、切り出し産物およびｎｅｏフラグメントをそれぞれ増幅した。ｎｅｏフラグメントは、ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＥＧＦＰ：Ｎｅｏベクター中に存在し、そして、トランスフェクション効率についての内部標準として使用した。プライマーＴｇＴＰ−１Ｕ（５’−ＧＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＴＧＣＴＴＴＡＣＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号６））およびプライマーＴｇＴＰ−２Ｌ（５’−ＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴ  ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧ−３’（配列番号３８））を使用して切り出し産物を検出し、そして、プライマーｎｅｏ−Ｕ１（５’−ＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡ−３’（配列番号３９））およびプライマーｎｅｏ−Ｌ１（５’−ＴＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−３’（配列番号４０））を使用してｎｅｏフラグメントを増幅した。切り出し産物の増幅は、以下の条件下で行った：９５℃で１５分間、これに続く、３５サイクル、９４℃で１分間、６３℃で１分間および７２℃で１分間の３５サイクル、その後に、７２℃で７分間の最終伸長。アニーリング温度が６０℃であり、サイクル数が１９であることを除いて、ｎｅｏフラグメントの増幅にも同じ条件を使用した。
切り出し産物およびｎｅｏフラグメントはまた、製造業者の説明に従って、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒハイブリダイゼーションプローブキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、４０ｎｇの鋳型ＤＮＡから、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でのリアルタイムＰＣＲで定量した。切り出し産物に対する蛍光標識化プローブは、５’−ＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣ−ＦＩＴＣ−３’（配列番号４１）および５’−ＬＣＲｅｄ６４０−ＧＴＡＧＧＧＧＡＴＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号４２）であり、そして、ｎｅｏフラグメントに対する蛍光標識プローブは、５’−ＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧ−ＦＩＴＣ−３’（配列番号４３）および５’−ＬＣＲｅｄ６４０−ＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧ−３’（配列番号４４）であった。切り出し産物に対するＰＣＲプライマーは、５’−ＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣＧＧＡＴ−３’（配列番号４５）および５’−ＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡ−３’（配列番号４６）であり、そして、ｎｅｏフラグメントに対するＰＣＲプライマーは、５’−ＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣ−３’（配列番号４７）および５’−ＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号４８）であった。４アトグラム〜２．０ｐｇ、そして０．２ｐｇ〜２．０ｎｇの、標的配列を有するコントロールプラスミドを、それぞれ、切り出し産物およびｎｅｏフラグメントに対する標準として使用した。増幅条件は、９５℃で１０分間、それに続く９５℃で１０行間、５５℃で１０秒間および７２℃で１０秒間の４５サイクルであった。切り出し産物およびｎｅｏフラグメントを標準曲線に基づいて定量し、正規化のために、切り出し産物の量をｎｅｏフラグメントの量で割った。
（結果）
高頻度の転移は、ＣｐＧメチル化に関連する結果を図１Ａ〜Ｃに示す。
（Ａ）挿入型相同組換えによる単一コピーのＳｐｔｌｃ２遺伝子座へのＳＢトランスポゾンの導入およびＰＣＲによるトランスポゾン切り出しの検出。白い四角：エキソン、黒三角：ｌｏｘＰ部位、灰色および白の矢印：ネスティッドＰＣＲプライマー、薄い線：プラスミドの骨格配列、ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター、ＩＲ／ＤＲ−ＲおよびＩＲ／ＤＲ−Ｌ：それぞれ、右ＩＲ／ＤＲおよび左ＩＲ／ＤＲ、Ｘｂ：ＸｂａＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ。
（Ｂ）ＥＳ細胞のＳｐｔｌｃ２遺伝子座でのＳＢトランスポゾンの切り出し。Ｓｐｔｌｃ２遺伝子座に標的化して挿入したＳＢトランスポゾンを有するＥＳ１１５クローン（パネルＡに示す）を、段階希釈した野生型のＳＢトランスポザーゼ（トランスポザーゼ＋）を発現するｐＳＢ１０または、ＤＤＥボックスが欠質した不活性のＳＢトランスポザーゼ（トランスポザーゼ−）を発現するｐＳＢ１０−ＤＤＥ（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）でトランスフェクトし、パネルＡに示すように、ネスティッドＰＣＲでスクリーニングした。ｐＳＢ１０の各希釈因子について４つの独立したトランスフェクションを行い、８つの独立したＰＣＲの１反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡを使用して、各トランスフェクションにおいて８μｇのゲノムＤＮＡをスクリーニングした。ｐＳＢ１０の最大量（２μｇ）を有する代表的なＰＣＲの結果を左のパネルに示す。各トランスフェクションについての陽性ＰＣＲの平均数およびＳＢトランスポザーゼの発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を右のパネルに示す。Ａｃｔｂ：βアクチン。
（Ｃ）雄マウスの生殖細胞およびＥＳ細胞におけるトランスポゾン配列内のメチル化状態のサザンブロット分析。ＥＧＦＰをプローブとして使用した。生殖細胞由来のゲノムＤＮＡは、ＨｐａＩＩで消化されなかった。これは、この部位がメチル化ことを示す。一方、ＥＳ１１５クローン由来のゲノムＤＮＡは、ほとんど完全に消化された。かすかなバンドの存在（アスタリスクで示す）は、ＥＳ細胞において、ＨｐａＩＩ部位の小画分がメチル化ことを示す。黒丸：ＨｐａＩＩ（Ｈ）またはＭｓｐＩ（Ｍ）部位、Ｘ：ＸｈｏＩ部位。ＫＭ、ＫＸＭおよびＫＸＨレーンにおけるＨｐａＩＩ−ＭｓｐＩフラグメント由来の０．５ｋｂのバンドを矢印で示す。
本実施例の結果を図１Ｄ（ｂ）に示す。写真からも明らかなように、メチル化したトランスポゾンを転移酵素とともに導入した細胞において、メチル化していないトランスポゾンよりも顕著に高頻度に切り出し反応が起きていたことが明らかになった。図中、ＣＡＧは、ＣＡＧプロモーターを示し、ＥＧＦＰは緑色蛍光タンパク質を示し、ｐＡはポリＡ付加シグナルを示す。Ｌは左ＩＲ／ＤＲを示し、Ｒは右ＩＲ／ＤＲを示す。Ｍは、メチル化を示し、Ｎは非メチル化を示す。ＮＣはネガティブコントロール（ＭＥＬ細胞ゲノムＤＮＡ）を示す。
従って、メチル化することによって、トランスポゾンにおいて顕著な効果が奏されることが明らかになった。
［実施例２：マウスゲノムの同一遺伝子座にメチル化または非メチル化トランスポゾンを有する細胞の樹立］
次に、細胞レベルでメチル化の転移活性に対する効果があるかどうかを実証した。
（方法）
２つの逆向きのｌｏｘＰ配列の間にトランスポゾンを配置したプラスミドベクター（ＰＢＳ１８５）を構築し、ＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼによりトランスポゾンをコードする配列をメチル化した。次に、このプラスミドＤＮＡとＣｒｅ組み換え酵素発現ベクターを、逆向きのｌｏｘＰ配列の間にハイグロマイシン耐性遺伝子とヘルペスウイルスチミジンキナーゼの融合遺伝子（ＨＹＴＫ）を、外来遺伝子（トランスジーン）として有するＭＥＬ細胞（株：ＲＬ５、ＲＬ６、Ｅ．Ｅ．Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：７７９−７８５，１９９９）に導入した。Ｃｒｅ組み換え酵素によりプラスミドとゲノム上のｌｏｘＰとの間で組み換えが起こり、トランスポゾンをゲノムの特定部位に有する細胞を樹立した。これによって、ゲノム上の同一部位において、メチル化が及ぼす切り出し反応の効率化を図ることができた。樹立した細胞にＳＢ転移酵素を導入し、切り出し反応を実施例１に記載のように行ってＰＣＲにより検出した。この実験フローチャートを図２Ａに示す。図２Ａでは、黒の矢はｌｏｘＰ部位を示し、白およびグレイの矢はＰＣＲプライマーを示す。ＣＭＶはＣＭＶプロモーターを示す。
（安定に挿入されたトランスポゾンの切り出しアッセイ）
安定に挿入されたトランスポゾンの切り出しアッセイのために、２．０×１０５個の標的ＥＳ細胞クローンまたは１．０×１０６個のＭＥＬ細胞クローンを、２．０、０．６７、０．２２、０．０７４、０．０２５および０．００８２μｇのｐＳＢ１０でトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙキットで抽出した。１μｇのゲノムＤＮＡを、標的ＥＳ細胞クローンに対して、プライマーＬＣＢ２ＸＬ２（５’−ＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＧＴＧ−３’（配列番号４９））およびプライマーＰＧＫ２（５’−ＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴ−３’（配列番号５０））を、ＭＥＬ細胞クローンに対してプライマーＴｇＴＰ−１ＵおよびＴｇＴＰ−２Ｌを用いるＰＣＲにより分析した。１μｌの第１ＰＣＲ産物を鋳型として使用するネスティッドＰＣＲを、標的ＥＳ細胞クローンに対して、プライマーＬＣＢ２ＸＬ１（５’−ＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＧＴ−３’（配列番号５１））およびプライマーＰＧＫ４（５’−ＧＣＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号５２））を、ＭＥＬ細胞クローンに対してプライマーＴｇＴＰ−２Ｕ（５’−ＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号８））およびプライマーＴｇＴＰ−３Ｌ（５’−ＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ−３’（配列番号９））を用いて行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で１５分間、それに続く、９４℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクル、その後、７２℃で７分間の最終伸長であった。ＳＢトランスポザーゼの発現レベルを定量するために、製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡを抽出し、ＲＱ１  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した。１μｇのＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、２０μｌの最終量中でランダムヘキサマープライマーを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写反応を行い、そして、２μｌの反応産物をＰＣＲで分析した。ＰＣＲプライマーは、ＳＢトランスポザーゼ遺伝子の増幅について、５’−ＡＡＴＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５３）および５’−ＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号５４）であり、そして、内部標準として使用したβ−アクチン遺伝子の増幅について、５’−ＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号５５）および５’−ＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣ−３’（配列番号５６）であった。サイクル数が、ＳＢトランスポザーゼ遺伝子について３０、そして、β−アクチン遺伝子について１８である以外は、ＰＣＲ条件は、切り出し産物の増幅に使用したものと同じであった。
（結果）
組み換えが正しく行われたことを示す結果をサザンブロットとして図２Ｂに示す。この図には、右側に各株の制限酵素地図を示す。クローン５Ｍ１、５Ｍ２、５Ｍ３は、ＲＬ５由来のメチル化トランスポゾンを導入した細胞株であり、クローン５Ｎ１、５Ｎ２、５Ｎ３は、ＲＬ５由来の非メチル化トランスポゾンを導入した細胞株を示す。また、６Ｍ１は、ＲＬ６由来のメチル化トランスポゾンを導入した細胞株を示す。６Ｎ１は、ＲＬ６由来の非メチル化トランスポゾンを導入した細胞株を示す。予想されたサイズのバンドが検出された。従って、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを介した組換えが正しく起こったことが示された。ここでは、プローブとしてＥＧＦＰを用いた。。
また、導入したメチル化および非メチル化が維持されていることも確認した。その結果を図２Ｃ〜Ｄに示す。実験は、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたサザンブロット分析を行った。
左に方向Ａおよび右に方向Ｂの制限酵素地図およびサザンブロット分析の結果を示す。いずれの場合も、バンドパターンより導入したメチル化は維持されており、非メチル化の場合は新たなメチル化が導入されていないことが確認された。
図２Ｅには、所定のゲノムの遺伝子座にメチル化ＳＢトランスポゾンまたは非メチル化ＳＢトランスポゾンを有する細胞の生成を示す。標的クローンにおけるＥＧＦＰ発現の、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）分析。灰色の領域：野生型の細胞、薄い線：標的クローン。図２Ｅに示すように、メチル化による、トランスポゾンの効率の上昇がタンパク質の発現レベルでも示された。
メチル化トランスポゾンでトランスフェクトしたＲＬ５由来クローンおよびＲＬ６由来クローンの両方において、ＨｐａＩまたはＳａｌＩ部位のどちらも切断されなかった。これは、メチル化状態が維持されていることを示す。対照的に、ＨｐａＩＩおよびＳａｌＩ部位の両方が、非メチル化トランスポゾンでトランスフェクトした全てのクローンにおいて、完全に切断され、これは、非メチル化状態が維持されていることを示す。これらの結果と一致して、トランスポゾンベクター内のＥＧＦＰレポーターの発現は、メチル化トランスポゾンを含む細胞において抑制されたが、非メチル化トランスポゾンを含む細胞においては抑制されなかった（図２Ｅ）。トランスポゾン領域のメチル化状態および非メチル化状態の両方が、ＲＭＣＥ反応の後、少なくとも１０週間維持された。
このように、メチル化による、トランスポゾンの効率の上昇がタンパク質の発現レベルでも示され、安定に導入されることが明らかになった。
［実施例３：マウスゲノムの同一部位においてＤＮＡメチル化がトランスポゾン切り出し反応に対して及ぼす影響］
実施例２で樹立した細胞株にＳＢ転移酵素（ＰＣＭＶ−ＳＢ、Ｐ．Ｈａｃｋｅｔｔ、Ｕ．ｏｆ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａより入手）を導入し、４８時間後にゲノムＤＮＡを回収した。ゲノムの回収は、ゲノム抽出キット（ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。ネスティッドＰＣＲによってトランスポゾンの切り出しを検出した。各細胞株に対して１０回のＰＣＲ反応を行った。１ｓｔ  ＰＣＲにおいて１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型に用いて反応を行った。用いたプライマーを示す：
１−１）ＴｇＴＰ−１Ｕ（配列番号６）
１−２）ＴｇＴＰ−２Ｌ（配列番号７）
２−１）ＴｇＴＰ−２Ｕ（ＴＣＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧ；配列番号８）（２ｎｄ  ＰＣＲ；ネスティッドＰＣＲ）
２−２）ＴｇＴＰ−３Ｌ（ＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ；配列番号９）（２ｎｄ  ＰＣＲ；ネスティッドＰＣＲ）
この結果得られた試料の１μｌをネスティッドＰＣＲの鋳型として用いて次の実験を行った。ネガティブコントロール（ＮＣ）として、各細胞株のゲノムＤＮＡを用いた。メチル化を導入したトランスポゾンにおいて、切り出し反応の頻度が顕著に上昇（少なくとも１０倍以上）していることが明らかになった。
図３Ａは、マウスゲノムにおける、ＤＮＡメチル化のトランスポゾン切り出し反応への効果を示す一例である。
図３Ｂ〜Ｃは、所定のゲノムの遺伝子座でのメチル化ＳＢトランスポゾンの高頻度の切り出しの詳細を示す。一部は、図３Ａと重複する。  図２に示すクローンからの１μｇまたは１０ｎｇをネスティッドＰＣＲのための鋳型として使用した。各クローンについて、１０のＰＣＲを行った。（Ｂ）方向Ｄ；（Ｃ）方向Ｉ。ＮＣ：ネガティブコントロールとしてのトランスフェクトしていないゲノムＤＮＡ、Ｍ：１００ｂｐラダー。トランスポゾン領域のメチル化状態および親クローンを、右に示す。
トランスポゾン切り出しに及ぼすＣｐＧメチル化の影響を決定するために、本発明者らは、ＳＢトランスポザーゼ発現ベクターでクローンをトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に切り出しを検出するためにＰＣＲを行った（図４ＡおよびＢ）。非メチル化トランスポゾンを含むクローンにおいて、１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型として使用した場合、切り出しは、１０中１のＰＣＲで検出された（クローン５Ｕ１および５Ｕ２）か、または検出されなかった（クローン５Ｕ３および６Ｕ１）。この頻度は、Ｓｐｔｌｃ２遺伝子座に非メチル化トランスポゾンを有するＥＳ細胞について観察されるものと同じであった（図１Ｂ）。一方、メチル化トランスポゾンを含むクローンにおいて、切り出しは、全１０反応において検出された（クローン５Ｍ１、５Ｍ２、５Ｍ３および６Ｍ１）。最初のＰＣＲのためのゲノムＤＮＡが希釈された場合、メチル化トランスポゾンを含むクローン由来のゲノムＤＮＡの１０ｎｇは、依然として陽性シグナルを得た（図３Ｂ、クローン５Ｍおよび６Ｍ１）。ＳＢトランスポザーゼ発現ベクターの量が、三段減少を使用して連続して約１０％まで減少された場合、メチル化トランスポゾンは、一貫して高い切り出し頻度を示した（データは示さず）。これは、ＳＢトランスポザーゼの発現レベルが切り出し頻度の変化の原因であることを示唆する。この結果は、トランスポゾンの切り出し効率が、メチル化トランスポゾンにおいて少なくとも１００倍より高いことを示す。この結果はまた、一過性にトランスフェクトしたメチル化トランスポゾンにおける、切り出し効率の約１００倍の増加に一致する（図１Ｂ）。
このような結果から、トランスポゾンをコードする部分のメチル化によって、トランスポゾンの切り出し反応が促進されることが実証された。
［実施例４：トランスポゾンのゲノムへの挿入に及ぼすメチル化の効果］
この実施例では、本発明者らは、トランスポゾンのプラスミドＤＮＡからゲノムへの挿入を検出を行った。プロモータートラップ型トランスポゾンを構築した。この構築方法を以下に簡便に示す。ＸｈｏＩ断片（ｐＲＯＳＡβｇｅｏ由来）をＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｐＴｒａｎｓＣＸ−ＧＦＰ）と置換する。
マウスゲノムの遺伝子内部にトラップ型トランスポゾンを挿入し、アミノ酸の読み枠が一致すればβ−ｇｅｏ（ｐＲＯＳＡβｇｅｏ（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５：１５１３−１５２３，１９９１）が発現し、細胞が抗生物質Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して耐性となる仕組みを利用した。ここで使用したプラスミドの構造を図４Ａに示す。図４Ａにおける略号は、ＳＡ：スプライス・アクセプター、β−ｇｅｏ：β−ｇａｌとネオマイシン耐性遺伝子との融合遺伝子
プロモータートラップ型トランスポゾンをＳｓｓＩ  ＣｐＧメチラーゼでメチル化し、ＳＢ転移酵素とともにマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）（ＲＩＥＳ細胞、Ａ，Ｎａｇｙ）に導入した。導入後、Ｇ４１８によって７日間選択を行った。メタノール固定の後、ギムザ（Ｎａｋａｒａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、熊本、日本）染色した。
（プロモータートラップトランスポゾンのＳＢトランスポザーゼ媒介挿入およびＴｃ３媒介挿入）
プロモータートラップトランスポゾンのＳＢトランスポザーゼ媒介挿入について、２．０×１０５個のＥＳ細胞を、ＴｒａｎｓＦａｓｔを使用して、０．４μｇのｐＢＳ１０と一緒に、１．６μｇのメチル化または非メチル化ｐＴｒａｎｓＳＡβ−ｇｅｏでトランスフェクトし、２４ウェルプレートの１ウェルに配置した。次いで、トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクトした細胞を１０ｃｍ培養皿に移し、１ｍｌあたり１５０μｇのＧ４１８で７日間選択した。この後、コロニーをギムザ染色し、計数した。いくつかのＧ４１８耐性クローンを拡大させ、そのＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。挿入部位の隣接する配列を、以前位記載されたように（Ｈｏｒｉｅ，Ｋ．，Ａ．Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｍ．Ｉｋａｗａ，Ｍ．Ｏｋａｂｅ，Ｇ．Ｋｏｎｄｏｈ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，およびＪ．Ｔａｋｅｄａ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９１９１〜９１９６）、ライゲーション媒介ＰＣＲによって決定し、Ｅｎｓｅｍｂｌマウスゲノムデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ  １６．３０．１）を使用して分析した。プロモータートラップ事象を、トランスポゾン特異的プライマーβ−ｇｅｏ（５’−ＴＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＴＡＴＣＧ−３’（配列番号５７））ならびに各遺伝子に特異的なプライマー（５’−ＴＧＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣ−３’（Ｍ２Ｓ）（配列番号５８）、５’−ＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＧＣＡＣＣＧＴＴＣＡＣ−３’（Ｍ２Ｌ）（配列番号５９）、５’−ＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＣＡＧ−３’（Ｍ４）（配列番号６０）および５’−ＧＡＴＡＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＡＧＴＴＴＧＴＡＧＣＡＧＴＣ−３’（Ｎ１）（配列番号６１））逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって評価した。ＰＣＲ産物を直接配列決定した。プロモータートラップトランスポゾンのＴｃ３媒介挿入について、２．０×１０５個のＥＳ細胞を、ＴｒａｎｓＦａｓｔを使用して、１．０μｇのｐＲＰ２３０２（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｅ．Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，およびＲ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６７５９〜６７６４）、Ｔｃ３トランスポザーゼの発現ベクターと一緒に、１．０μｇのメチル化または非メチル化ｐＴｃ３／ＳＡβ−ｇｅｏでトランスフェクトし、２４ウェルプレートの１ウェルに配置した。トランスフェクトした細胞を継代し、上述の条件下でＧ４１８で選択した。
その結果を図４Ｂに示す。シャーレ上の青色斑点の数から明らかなように、非メチル化トランスポゾンに比べて、メチル化トランスポゾンによって顕著にＧ４１８耐性コロニーが上昇していることが判明した。
図４Ｂは、ＳＢ転移に及ぼすＣｐＧメチル化の影響を示す。３つの独立したトランスフェクションに対し、培養皿あたりのＧ４１８耐性コロニーの平均数を右に示す。エラーバーは、標準偏差を示す。示されるように、ＣｐＧメチル化は、遺伝子のの導入が顕著に上昇している。
図４Ｃは、トラップした遺伝子の構造およびトランスポゾン挿入部位を示すイ。挿入部位を黒矢印で示す。クローンＭ１〜Ｍ４は、メチル化トランスポゾンでのトランスフェクション由来であり、クローンＮ１〜Ｎ６は、非メチル化トランスポゾン由来である。染色体の数、Ｅｎｓｅｍｂ１遺伝子デシグネーター、および遺伝子名もまた示す。２つの挿入部位（Ｍ２ＳおよびＭ２Ｌと示される）が特徴付けされたクローンＭ２を除いて、各クローンにおいて１つの挿入部位を同定した。いくつかのクローン（Ｍ２Ｓ、Ｍ２Ｌ、Ｍ４およびＮ１）における正確なスプライシングは、上流のエキソン（白い矢印）およびトランスポゾンに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって確認した。黒四角：エキソン。５キロベースのスケールバーを右に示す。
図４Ｄは、Ｔｃ転移に及ぼすメチル化の影響を示す。トラップベクターの構造を上部に示す。ＴＩＲ：末端逆方向反復。３つの独立したトランスフェクションについて、ディッシュあたりのＧ４１８耐性コロニーの平均数を底部に示す。
上記図４に示されるように、完全転移に及ぼすメチル化の影響が調べられた。上述のように、ゲノムの遺伝子座からのトランスポゾンの切り出し（転移反応の第１段階）は、ＣｐＧのメチル化によって増強されることが示された。切り出されたトランスポゾンフラグメントは、ゲノムに再挿入され、転移反応を完了させる必要がある。本発明者らは、それゆえ、ゲノムに挿入されたトランスポゾンの数の点で、メチル化トランスポゾンと非メチル化トランスポゾンを比較した。ＣｐＧのメチル化は、プロモーター活性を阻害するので、トランスポゾン内の選択マーカーの発現カセットを利用して、ゲノム内への転移を検出し得る。その代わりに、本発明者らは、遺伝子トラップ型のトランスポゾンベクター（ｐＴｒａｎｓＳＡβ−ｇｅｏ）を構築し、遺伝子トラップ図式（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｇ．，およびＰ．Ｓｏｒｉａｎｏ．１９９１；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１５１３〜１５２３）を使用した。このベクターは、β−ｇｅｏの上流にスプライスアクセプター部位を含んだ（図４Ａ）。このトランスポゾンが活性遺伝子の中に挿入される場合、内因性遺伝子からなるキメラ融合転写物が生じることが考えられる。β−ｇｅｏがトラップされた遺伝子とインフレームである場合、細胞は、β−ｇｅｏの発現に起因してＧ４１８に耐性となる（図４Ａ）。メチル化または非メチル化トランスポゾンベクターを、ＳＢトランスポゾンベクターとともにＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８で選択した。メチル化トランスポゾンは１，６００コロニーを産生し、一方で、非メチル化トランスポゾンは１４０コロニーを得た（図４Ｂ）。この結果は、切り出しおよび挿入の両方を含む全転移の効率が、メチル化トランスポゾンにおいて１１倍増強されることを示す。トランスポゾン挿入部位は、ライゲーション媒介ＰＣＲによって決定され、遺伝子トラップ事象はランダムに選択されたクローンにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって評価され（図４Ｃ）、そして、得られた結果は、ベクターのメチル化が、遺伝子トラップ選択に影響しないことを示唆した。
異なるトランスポゾンシステムにおけるメチル化の影響を調べるために、本発明者らは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＴｃ３トランスポゾンを使用して、別の遺伝子トラップ型ベクター（ｐＴｃ３／ＳＡβ−ｇｅｏ）を構築し（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｈ．Ｇ．ｖａｎ  Ｌｕｅｎｅｎ，およびＲ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ．１９９９．；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：２６８〜２７４．；およびＦｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｅ．Ｗｉｅｎｈｏｌｄｓ，およびＲ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ．２００１；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６７５９〜６７６４）、そして、メチル化を有するかまたは有さないこのベクターを、Ｔｃ３トランスポザーゼ発現ベクターとともにＥＳ細胞に導入した。ＣｐＧのメチル化は、遺伝子トラップ事象を２倍増加させた（図４Ｄ）。この結果は、ＣｐＧのメチル化による転移の増強が他のトランスポゾンシステムにおいても見られるが、増強の程度は可変であることを示唆する。
従って、トランスポゾンのゲノムへの挿入に対してメチル化が効率を顕著に上昇していることが実証された。
［実施例５：タンパク質の発現］
（タンパク質の発現およびＥＭＳＡ）
ＩＲ／ＤＲ認識ドメインを含むＮ１２３ペプチドを、発現させ、以前に記載されたように（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）精製した。ＩＲ／ＤＲ−Ｌの外側結合部位に対応するオリゴヌクレオチドプローブについてのオリゴヌクレオチド配列は、非メチル化プローブについて、５’−ＴＡＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＧ−３’（Ｕｎｍｅｔ−Ｕ）（配列番号６２）および５’−ＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＴＡ−３’（Ｕｎｍｅｔ−Ｌ）（配列番号６３）であり、そして、メチル化プローブについて、５’−ＴＡＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＯＧＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＡＣＡＣＴＴＡＡＧ−３’（Ｍｅｔ−Ｕ）（配列番号６４）および５’−ＣＴＴＡＡＧＴＧＴＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＣＯＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＴＡ−３’（Ｍｅｔ−Ｌ）（配列番号６５）であった（ここで、”Ｏ”は、５−メチルシトシンを表す）。このオリゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでまず標識化され、次いで、アニーリングされる。ＩＲ／ＤＲ−ＬのＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化することによって調製し、その後、ＳｓｓＩメチラーゼを用いてメチル化されるかまたはメチル化されず、次いでこのフラグメントを、アルカリホスファターゼで処理した。この消化したフラグメントを、フェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿し、そして、最終的にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識化した。１．０μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、０．２ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブまたは１００ｐｇのＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメント、および１．０μｌのＮ１２３の存在下で、以前に記載された（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）緩衝液中に核タンパク質複合体を形成させた。２５℃で３０分間のインキュベーションの後、サンプルを、５％の天然ポリアクリルアミドゲルにロードし、１５０Ｖの定電圧で、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ中、オリゴヌクレオチドプローブについて１．５時間、ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントについて２．５時間電気泳動した。ゲルが乾燥した後、核タンパク質複合体をオートラジオグラフィーにて可視化した。
（ＣｈＩＰアッセイ）
製造業者のプロトコルに従って、ＣｈＩＰアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いてクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った。この研究において使用された抗体は、抗アセチル  Ｈ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）および抗−トリメチル化Ｈ３Ｋ９（Ａｂｃａｍ）であった。沈降したＤＮＡを、複数の遺伝子座において、アミラーゼ２．１遺伝子について、プライマー５’−ＣＣＴＴＧＴＡＣＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号６６）および５’−ＣＧＣＣＡＣＴＣＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＡＧ−３’（配列番号６７）、β−小グロビン遺伝子について、５’−ＴＧＣＧＡＧＧＡＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＴＡＣ−３’（配列番号６８）および５’−ＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＧＴＡＡＧＡ−３’（配列番号６９）；ＥＧＦＰ遺伝子について、ＥＧＦＰ−１ＵおよびＥＧＦＰ−１Ｌ、ＩＲ／ＤＲ−Ｌについて、５’−ＧＣＡＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＣ−３’（配列番号７０）および５’−ＣＴＴＣＴＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号７１）、ならびにＩＲ／ＤＲ−Ｒについて、５’−ＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＣＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号７２）および５’−ＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ−３’（配列番号９）を用いるＰＣＲによって分析した。ＰＣＲ条件は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑを用いて、９５℃で１５分間、これに続いて、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で１分間の３５サイクル、その後の、７２℃で７分間の最終伸長からなる。半定量的な分析を可能にするため、１反応あたり１、０．２、０．０４および０．００８μｌで投入ＤＮＡを使用し、１反応あたり１および０．２μｌで沈降したＤＮＡを使用した。ただし、抗トリメチル化Ｈ３Ｋ９の画分中のＥＧＦＰ、ＩＲ／ＤＲ−ＬおよびＩＲ／ＤＲ−Ｒについては、１反応あたり５および１μｌの量を使用した。
図６は、裸のメチル化ＩＲ／ＤＲに対するＳＢトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインの不変の親和性を示す。
図６Ａは、ＩＲ／ＤＲにおけるＣｐＧ部位およびトランスポザーゼ結合部位の模式図。黒丸：ＣｐＧ部位。
図６Ｂ〜Ｅは、組換えＳＢトランスポザーゼペプチド（Ｎ１２３）での電気泳動移動度シフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ−Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ＝ＥＭＳＡ）を示す。
図６ＢおよびＣは、ＩＲ／ＤＲ−Ｌの３４ｂｐの外側結合部位で得られた結果であり、図６ＤおよびＥは、３００ｂｐのＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントで得られた結果である。
図６Ｂに示すように、非メチル化またはメチル化外側結合部位を増大する濃度のＮ１２３ペプチド（１６００〜１００倍希釈の精製ペプチド）と混合し、核タンパク質複合体を形成した。
図６Ｃに示すように、非メチル化外側結合部位をプローブとして標識化し、非メチル化外側結合部位またはメチル化外側結合部位を、増大する濃度で（１〜５０倍のモル過剰のプローブ）競合物質として使用した。
図６Ｄに示すように、非メチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントまたはメチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントを、核タンパク質複合体の形成のために、増大する濃度のＮ１２３ペプチド（５１００〜１６０倍希釈の精製ペプチド）と混合した。
図６Ｅに示すように、非メチル化ＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントをプローブとして標識化し、非メチル化またはメチル化未表しいのＩＲ／ＤＲ−Ｌフラグメントを、増大する濃度（５００〜８０００倍モル過剰のプローブ）で、競合物質として使用した。Ｕｎｍｅｔ：非メチル化、Ｍｅｔ：メチル化、Ｆ：遊離プローブ、Ｃ：複合体。複合体１（Ｃ１）およびＣ２は、それぞれ、ＩＲ／ＤＲあたりのＮ１２３ペプチドの１および２分子の結合を示す（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）。
図７は、所定の遺伝子座でのメチル化トランスポゾンまたは非メチル化トランスポゾンのＣｈＩＰアッセイを示す。
図７Ａは、ＣｈＩＰアッセイにおいて分析されたＳＢトランスポゾン領域。ＰＣＲ増幅領域を各成分の下の薄い線として示す。黒三角：ｌｏｘ５１１部位。
図７ＢおよびＣは、沈降したＤＮＡのＰＣＲ分析。図３および４に示すように、クローン５Ｍ３および５Ｕ３（Ｂ）ならびにクローン６Ｍ１１および６Ｕ１（Ｃ）を、それぞれ、親クローンＲＬ５およびＲＬ６から誘導した。投入および沈降したＤＮＡの５倍段階希釈を分析した。ＡｃＨ３：抗アセチルＨ３、ＭｅＨ３Ｋ９：抗トリメチル化Ｈ３Ｋ９、ｎｏ  Ａｂ：抗体を含まないコントロール。アミラーゼ２．１およびβ−小グロビンを、異色領域かつ真性染色質領域に対する代表的なコントロールとして使用した。アミラーゼ２．１およびβ−小グロビンのバンドの強度は５Ｍ３の抗アセチルＨ３画分において同じであるが、投入ＤＮＡにおけるアミラーゼ２．１配列のより高い増幅効率は、β−小グロビン配列が、この画分においてアミラーゼ２．１配列と比較して富化されることを示す。抗体を含まないコントロールのレーンに見られるかすかなバンドは、タンパク質に対するゲノムＤＮＡの非特異的な結合由来である。アガロースビーズを調製に使用した。定量は２回行い、代表的な結果を示す。
図６および７に示されるように、裸のメチル化ＩＲ／ＤＲに対するＳＢトランスポザーゼＤＮＡ結合ドメインの不変の親和性が本発明によって示された。
ＣｐＧのメチル化による増強された転移の機構を解明するために、本発明者らは、ＥＭＳＡによるメチル化ＩＲ／ＤＲと非メチル化ＩＲ／ＤＲに対する組換えＳＢトランスポザーゼペプチドの親和性を比較した。右と左のＩＲ／ＤＲの両方は、ＳＢトランスポザーゼに対する２つの結合部位を有する（図６Ａ）。外側の結合部位のみがＣｐＧ配列を含む（図６Ａ）ので、左概則の結合部位は、プローブおよび競合物質として使用した。ＩＲ／ＤＲ認識ドメインを含むことが以前に報告された（Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．，Ｐ．Ｂ．Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．Ｐｌａｓｔｅｒｋ，およびＺ．Ｉｚｓｖａｋ．１９９７；Ｃｅｌｌ  ９１：５０１〜５１０）ＳＢトランスポザーゼの最初の１２３アミノ酸（Ｎ１２３）が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中に発現し、Ｃ末端のヒスチジンタグを介して精製し、そして、核タンパク質複合体を作製するのに使用した。非メチル化またはメチル化結合配列っがプローブとして使用された場合、シフトしたバンドの強度は、匹敵した（図６Ｂ）。非メチル化部位またはメチル化部位が、標識化した非メチル化プローブに対する競合物質として使用された場合、差異は観察されなかった（図６Ｃ）。プローブおよび競合物質として左側のＩＲ／ＤＲフラグメントの全領域を使用して同じ実験を行い、メチル化の作用は観察されなかった（図６ＤおよびＥ）。これらの結果は、ＩＲ／ＤＲのＣｐＧメチル化が、裸のＩＲ／ＤＲに対するＮ１２３ペプチドの直接結合を変化しないことを示し、トランスポゾン領域でネイティブのクロマチン構造が転移の増強を理解するとみなされることが必要であり得ることを示唆する。
図７に示されるように、メチル化トランスポゾンおよび非メチル化トランスポゾンでのクロマチン構造が確認された。
ＤＮＡ組換え反応は、ＤＮＡ基質の高次構造上の変化によって影響され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質  ＨＵは、トランスポザーゼ結合部位と結合することによって  バクテリオファージＭｕにおける組換え効率を刺激する２３。ＳＢ転移に関して高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）タンパク質の同様の作用が、最近報告された４２。本発明者らは、それゆえ、ＣｈＩＰアッセイを使用して、ＭＥＬ細胞クローンにおけるメチル化トランスポゾンおよび非メチル化トランスポゾンでのクロマチン構造を調べた。ヒストンテイルの改変がより高い階級のクロマチン構造の機構および遺伝子発現の調節において重大な役割を果たすことが示された。最近の研究は、アセチル化ヒストンＨ３が真性染色質に配置され、ここで、ＤＮＡが大まかにパッケージングされ、そして、リジン９残基（Ｈ３Ｋ９）でメチル化ヒストンＨ３がヘテロクロマチン上に配置され、ここで、ＤＮＡが濃縮されることを示した（Ｇｒｅｗａｌ，Ｓ．Ｉ．，およびＳ．Ｃ．Ｅｌｇｉｎ．２００２；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：１７８〜１８７）。本発明者らは、それゆえ、ＣｈＩＰアッセイにアセチルＨ３またはトリメチル化Ｈ３Ｋ９を認識する抗体を使用し、２つの異なる遺伝子座のメチル化トランスポゾン領域と非メチル化トランスポゾン領域のクロマチン構造を、ＲＬ５由来クローンおよびＲＬ６由来クローンを用いて比較した（図７）。ＣｈＩＰアッセイに対しての内部標準として、膵臓アミラーゼ２．１遺伝子を異色マーカーとして使用し、β−小グロビン遺伝子を真性染色質マーカーとして使用した（Ｄｈａｒ，Ｖ．，Ａ．Ｉ．Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ，およびＣ．Ｌ．Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ．１９８９．；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３５２４〜３５３２；およびＳｃｈｕｂｅｌｅｒ，Ｄ．，Ｃ．Ｆｒａｎｃａｓｔｅｌ，Ｄ．Ｍ．Ｃｉｍｂｏｒａ，Ａ．Ｒｅｉｋ，Ｄ．Ｉ．Ｍａｒｔｉｎ，およびＭ．Ｇｒｏｕｄｉｎｅ．２０００；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：９４０〜９５０）。図７に示すように、アセチルＨ３について富化したものに比例して、トリメチル化Ｈ３Ｋ９について富化した画分におけるアミラーゼ２．１遺伝子の量は、β−小グロビン遺伝子の量よりも有意に高く、アミラーゼ２．１遺伝子とβ−小グロビン遺伝子が、それぞれヘテロクロマチンと真性染色質に位置するという予想に一致する。アセチルＨ３の画分におけるトランスポゾン配列（ＩＲ／ＤＲ−Ｒ、ＥＧＦＰおよびＩＲ／ＤＲ−Ｌ）の富化は、非メチル化トランスポゾンを含むクローン（５Ｕ３および６Ｕ１）において観察された。対照的に、トリメチル化Ｈ３Ｋ９の画分における富化は、メチル化トランスポゾンを含むクローン（５Ｍ３および６Ｍ１）において観察された。この富化は、ＧＦＰレポーターの発現パターンと密接に関係した（図３Ｄ）。これらの結果は、メチル化トランスポゾン領域および非メチル化トランスポゾン領域がそれぞれ、ヘテロクロマチンおよび真性染色質を形成したことを示す。
このように、タンパク質発現レベルでも、トランスポゾンの転移効率が上昇していたことが明らかになった。また、そのメカニズムが明らかになった。
［実施例６：トランスジェニックマウスの作製］
実施例４に示されるような系を用いて、トランスジェニックマウスを作製した。手短に述べると、実施例４で得たＥＳ細胞を胚盤胞に打ち込み、それを偽妊娠マウスの子宮に戻してマウスを誕生させた。このマウスでも、トランスポゾンのゲノムへの挿入に対してメチル化が効率を顕著に上昇させることが実証された。
［実施例７：天然における例］
次に、メチル化がトランスジェニック生物の生産に有用であることを実証した。  手短に述べると、メチル化されているトランスポゾンＤＮＡとトランスポザーゼＲＮＡを同時に受精卵に打ち込むことによってマウスを作製した。このマウスでも、トランスポゾンのゲノムへの挿入に対してメチル化が効率を顕著に上昇させることが実証された。
［実施例８：別のトランスポゾンでの例］
次に、実施例１において使用したＳＢ系の代わりにＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒの一つとして、Ｔｃ１（アクセッション番号Ｘ０１００５）を用いて、実施例１〜３と同様の実験を行った。このマウスでも、トランスポゾンのゲノムへの挿入に対してメチル化が効率を顕著に上昇させることが実証された。
［実施例９：別のトランスポゾンでの例］
次に、実施例１において使用したＳＢ系の代わりにｍｉｎｏｓ−２（アクセッション番号Ｚ２９０９８）を用いて実施例１〜３と同様の実験を行った。このマウスでも、トランスポゾンのゲノムへの挿入に対してメチル化が効率を顕著に上昇させることが実証された。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】  本発明を用いれば、トランスジェニック生物（特に、哺乳動物のような脊椎動物）を効率よく作製することができるようになった。このような生物は、モデル動物、スクリーニング、薬理試験などで非常に有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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