(57)【要約】７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの新規な分画法、特に工業的規模で行え、高精度で効率のよい分画法を目的とする。また、脂質会合蛋白質の混入率が少なく、純度の高い７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの特徴ある性質を有する蛋白画分を得ることにある。大豆蛋白を含む溶液を、ｐＨ３．８〜６．８の酸性下で３０〜７５℃の加温処理の後、イオン強度０．０２以上、ｐＨ４．５以上５．６未満で可溶性画分と不溶性画分に分画することを特徴とする大豆蛋白の製造法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆蛋白を含む溶液を、酸性下で加温処理の後、イオン強度０．０２以上、ｐＨ４．５以上５．６未満で可溶性画分と不溶性画分に分画することを特徴とする大豆蛋白の製造法。
【請求項２】
大豆蛋白を含む溶液が脱脂大豆の加水スラリー、同スラリーから得られる脱脂豆乳、酸沈澱大豆蛋白スラリー、または分離大豆蛋白溶液である請求項１記載の製造法。
【請求項３】
酸性がｐＨ３．８〜６．８である請求項１記載の製造法。
【請求項４】
加温処理が３０〜７５℃である請求項１記載の製造法。
【請求項５】
請求項１記載の分画方法によって得られる可溶性画分から７Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．５以上であり、固形分中のクロロホルム：メタノール＝２：１溶媒で抽出される極性脂質含量が１重量％以下である７Ｓグロブリン蛋白を分取する請求項１記載の製造法。
【請求項６】
固形分中のフィチン酸含量が１．２重量％以下である請求項５記載の方法で得られた７Ｓグロブリン蛋白。
【請求項７】
請求項１記載の分画方法によって得られる不溶性画分から１１Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．７以上であり、固形分中のクロロホルム：メタノール＝２：１溶媒で抽出される極性脂質含量が２重量％以下である１１Ｓグロブリン蛋白を分取する請求項１記載の製造法。
【請求項８】
固形分中のフィチン酸含量が１．２重量％以下である請求項７記載の方法で得られた１１Ｓグロブリン蛋白。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、大豆蛋白を含む溶液から７Ｓグロブリンに富んだ画分と１１Ｓグロブリンに富んだ画分を製造する方法、およびその方法により得られる大豆蛋白に関する。
【背景技術】  大豆の貯蔵蛋白は、ｐＨ４．５付近でし、比較的簡単に蛋白以外の成分と分けることができる。この貯蔵蛋白は、大豆分離蛋白といわれ、食品工業における利用は多くこの形でなされる。蛋白はまた超遠心分析による沈降定数から、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ及び１５Ｓの各グロブリンに分類される。このうち、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンはグロブリン画分の主要な構成蛋白成分（注：７Ｓグロブリン、１１Ｓグロブリンは沈降法による分類名であり、免疫学的命名法にいうβ−コングリシニン、グリシニンに実質的に相当する。）であり、この両者は粘性・凝固性・界面活性等において異なる性質を有する。したがって、大豆蛋白質を７Ｓグロブリンに富んだ区分と１１Ｓグロブリンに富んだ区分に分画することができれば両蛋白の性質を利用することが可能となり、産業における蛋白利用分野の拡大が期待できる。
７Ｓグロブリン、１１Ｓグロブリンは幾つかのサブユニットからなり、７Ｓグロブリンはα、α’、βの３種類のサブユニット、１１Ｓグロブリンは酸性ポリペプチド（Ａ）と塩基性ポリペプチド（Ｂ）を一対とした数種のサブユニットからなっている。従来の最も通常の大豆において、その存在比率は、典型的にはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で得られたパターンのデンシトメトリーによる面積比で７Ｓグロブリン：１１Ｓグロブリンが略１：２である。７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの性質は、分子量も荷電の状態もよく似ている。特に、両グロブリンはサブユニットの組み合わせにより多様性を持つ蛋白で、これらの性質はある程度幅があり、相互にオーバーラップしている。したがって、両者の相互の混入が少ない有効な分離をするのは、容易でない。
従来から知られている分画法を以下に示す。すなわち、等電点の違いを利用するもの：１１Ｓグロブリンの等電点近傍で７Ｓグロブリンのみを抽出させる方法（特開昭５５−１２４４５７号公報）。カルシウムとの反応性の違いを利用するもの：抽出時に少量のカルシウム塩を添加して７Ｓグロブリンに富む画分を抽出させる方法（特開昭４８−５６８４３号公報）。ｐＨ・イオン強度での溶解性の違いを利用する方法：ｐＨ１．２〜４．０の塩化ナトリウムまたは塩化カリウム存在下で不溶性区分を除去して７Ｓグロブリンを製造する方法（特開昭４９−３１８４３号公報）、等電点したスラリーをｐＨ５．０〜５．６に調整し、かつ塩化ナトリウム濃度を０．０１〜０．２Ｍのモル濃度に調整して、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンを分離する方法（特開昭５８−３６３４５号公報）、蛋白含有溶液のイオン強度を０．２〜０．３に調整し、かつｐＨ値を４．８〜５．２に調整して不溶性画分を除いた後、イオン強度を０．２未満およびｐＨ値を４．６〜５．０に調整して７Ｓグロブリンを分取する方法（特開平５−４３５９７号公報）。冷沈現象と還元剤等を利用するもの：１１Ｓグロブリンが低温下では溶解性が低下する現象（冷沈現象とよぶ）を利用したもので、大豆蛋白原料を亜硫酸化合物、グルタチオン化合物、またはシステイン化合物の存在下、かつｐＨ６．５以上の水系下処理し、ｐＨ５．５〜７．０かつ２２℃以下の範囲に調整して７Ｓグロブリンに富んだ可溶性画分と１１Ｓグロブリンに富んだ不溶性画分に分画する方法（特開昭６１−１８７７５５号公報）。
これら従来から知られている分画方法は、７Ｓグロブリンと１１ＳグロブリンのｐＨ、イオン強度、ある種の塩の存在、温度等による溶解性の違いをたくみに利用した技術であるが、明確な分画を行う為には高い遠心力による分離を必要とするなど、工業的な分画法としては不適当であるという問題点があり、実用面で問題を残していた。例えば、特開昭６１−１８７７５５号公報の方法では、冷沈現象は温度に強く依存するため５℃程度まで冷却する必要があり、工業的な低い遠心力で分離するには大量の亜硫酸化合物などの添加を要するという実用面での問題と、可溶性画分への１１Ｓグロブリンの混入が少なからずあるという分画精度面での問題を残していた。
７Ｓグロブリンに富む蛋白を得るということでは、育種による１１Ｓグロブリン欠損大豆、すなわち７Ｓグロブリンに富んだ種子（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６，１１，１９９６）から蛋白を分離することが検討され、それを応用した報告（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０，１０１，２０００）や特許（ＵＳ  ６，１７１，６４０  Ｂ１）も出されている。
以上のように、可溶性および不溶性画分への相互の混入率が少なく、かつ簡便に効率よく工業規模での製造が行える７Ｓグロブリンに富んだ画分と１１Ｓグロブリンに富んだ画分の分画法の開発研究が行われている。
一方、大豆由来の蛋白には、細胞膜をはじめとするプロテインボディー、オイルボディー等の膜を構成する極性脂質との親和力の高い蛋白質（脂質会合蛋白質）が存在し、工業的に生産する分離大豆蛋白の約３５％をも占めていることが佐本らにより報告されている（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２（５），９３５−９４０（１９９８））。この脂質会合蛋白質は膜蛋白質を主体とする蛋白群の総称で、特にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による推定分子量において主に３４ｋＤａ、２４ｋＤａ、１８ｋＤａを示す蛋白質を含み、クロロホルム：メタノール＝２：１の極性溶媒により抽出される極性脂質を１０〜１２重量％程度含有する。
従来の分画法は７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンのみに注目しており、各画分に混在する脂質会合蛋白質については考慮されていない場合が多かった。その理由として、脂質会合蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分析では７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンほど明確に特定することができず、その存在を過少に評価する場合が多かった。言い換えれば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により測定される純度だけでは、真の純度を過大に評価している場合が多く、真に純度の高い７Ｓグロブリンや１１Ｓグロブリンを得るには、この脂質会合蛋白質の挙動を考慮する必要がある。つまり、これまでの７Ｓグロブリン／１１Ｓグロブリンの２画分への分画では、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの比率によってのみ分画品の純度を議論している場合が多かった。しかし各画分は脂質会合蛋白質を随伴し、実際の蛋白質組成としては脂質会合蛋白質を多く含む精製純度のやや低い粗分画品となっている場合が多かった。
本発明者等は、工業的な７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの分画が可能となる酸性下での加温処理のみの方法（ＷＯ  ０２／２８１９８  Ａ１）を提案したが、さらに鋭意研究した結果、大豆蛋白を含む溶液の酸性下での加温処理と、イオン強度の調整を組み合わせることで、７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分の分離ｐＨを低くすることが可能となり、それにより、可溶性画分と不溶性画分の分離が一層容易になることを見出した。
本発明は、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの新規な分画法を提案するものであり、特に工業的規模で行え、高精度で効率のよい分画法を目的とする。また他の目的は、脂質会合蛋白質の混入率が少なく、純度の高い７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの、特徴ある性質を有する蛋白画分を得ることにある。
【特許文献１】  特開昭５５−１２４４５７号公報
【特許文献２】  特開昭４８−５６８４３号公報
【特許文献３】  特開昭４９−３１８４３号公報
【特許文献４】  特開昭５８−３６３４５号公報
【特許文献５】  特開平５−４３５９７号公報
【特許文献６】  特開昭６１−１８７７５５号公報
【特許文献７】  ＵＳ  ６，１７１，６４０  Ｂ１
【特許文献８】  ＷＯ  ０２／２８１９８  Ａ１
【非特許文献１】  Ｋ  Ｙａｇａｓａｋｉ  ｅｔｃ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４６，１１，１９９６
【非特許文献２】  Ｋ  Ｙａｇａｓａｋｉ  ｅｔｃ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５０，１０１，２０００
【非特許文献３】  Ｍ  Ｓａｍｏｔｏ  ｅｔｃ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２（５），９３５−９４０，１９９８
【発明の開示】
本発明は、
（１）  大豆蛋白を含む溶液を、酸性下で加温処理の後、イオン強度０．０２以上、ｐＨ４．５以上５．６未満で可溶性画分と不溶性画分に分画することを特徴とする大豆蛋白の製造法。
（２）  大豆蛋白を含む溶液が脱脂大豆の加水スラリー、同スラリーから得られる脱脂豆乳、酸沈澱大豆蛋白スラリー、または分離大豆蛋白溶液である（１）記載の製造法。
（３）  酸性がｐＨ３．８〜６．８である（１）記載の製造法。
（４）  加温処理が３０〜７５℃である（１）記載の製造法。
（５）  （１）記載の分画方法によって得られる可溶性画分から７Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．５以上であり、固形分中のクロロホルム：メタノール＝２：１溶媒で抽出される極性脂質含量が１重量％以下である７Ｓグロブリン蛋白を分取する（１）記載の製造法。
（６）  固形分中のフィチン酸含量が１．２重量％以下である（５）記載の方法で得られた７Ｓグロブリン蛋白。
（７）  （１）記載の分画方法によって得られる不溶性画分から１１Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．７以上であり、固形分中のクロロホルム：メタノール＝２：１溶媒で抽出される極性脂質含量が２重量％以下である１１Ｓグロブリン蛋白を分取する（１）記載の製造法。
（８）  固形分中のフィチン酸含量が１．２重量％以下である（７）記載の方法で得られた１１Ｓグロブリン蛋白。
に、関する。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、大豆蛋白を含む溶液の酸性下での加温処理と、イオン強度の調整を組み合わせることで、工業的な７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの分画が可能となる酸性下での加温処理のみの方法（ＷＯ  ０２／２８１９８  Ａ１）と比べて、７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分の分離ｐＨを低くすることが可能となり、それにより、可溶性画分と不溶性画分の分離が一層容易になることを特徴とする分画大豆蛋白の製造法である。上記酸性はｐＨ３．８〜６．８が好ましく、加温する温度は３０〜７５℃が好ましい。イオン強度は０．０２以上が好ましく、可溶性画分と不溶性画分の分離はｐＨ４．５以上５．６未満が好ましい。これにより、７Ｓグロブリンに富み脂質会合蛋白質の少ない可溶性画分を得ることができる。またこれにより、１１Ｓグロブリンおよび脂質会合蛋白質に富んだ不溶性画分が生成するが、この不溶性画分の１１Ｓグロブリンを略中性（概ねｐＨ６．５〜７．５）の水溶液中で弱い煎断力で溶解、あるいは抽出することにより、脂質会合蛋白質を不溶化させたまま１１Ｓグロブリンを選択的に溶解させ分離することが可能で、１１Ｓグロブリンに富み脂質会合蛋白質の少ない画分を得ることができる。
また、本発明は製造工程中、フィターゼによるフィチン酸分解を施すことにより、得られる蛋白当たり１．２％以下の低フィチンの蛋白画分を得ることができる。さらに、可溶性画分と不溶性画分を分離する前のフィターゼ処理により、分離効率を向上させることができる。
上記製造法によって得られた可溶性画分は、７Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．５以上であり、可溶性画分と不溶性画分の分離ｐＨを適当に選択することによって当該比が０．８以上、０．８５以上、或いは０．９以上の高純度７Ｓグロブリン画分を容易に得ることができる。もう一つの画分である不溶性画分は、１１Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．７以上の画分であり、可溶性画分と不溶性画分の分離ｐＨを適当に選択することによって当該比が０．８以上、０．８５以上、或いは０．９以上の高純度１１Ｓグロブリン画分を容易に得ることができる。
ここに、７Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）や１１Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で得られた泳動パターンをデンシトメーターで測定し、該当画分の面積の比率から得られる。
また、上記脂質会合蛋白質は、ほとんど変性していない酸沈澱蛋白から硫酸ナトリウムを用いて精密に得ると酸沈澱蛋白中に３０〜３５％程度存在（前記Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２（５），９３５−９４０（１９９８））する。また、クロロホルム／メタノール＝２：１（容量比）で抽出される極性脂質が、該酸沈澱蛋白固形物中には３〜４重量％存在し、脂質会合蛋白質中には１０〜１２％存在する事実から、上記極性脂質（以下「クロメタ油分」と略すことがある）は酸沈澱蛋白の中でも脂質会合蛋白質中に偏在し、クロメタ油分の１０重量倍が脂質会合蛋白質であると換算できる。ただしこの換算は、脂質会合蛋白質がヘキサンなどによる脱脂の工程を経ている対象に適用でき、ヘキサン抽出の工程を経ていない対象である場合にはヘキサンで予め脱脂した後に適用できる。
本発明により得られる７Ｓグロブリンに富む可溶性画分は、クロメ油分が１％以下であり、換算すると脂質会合蛋白質は１０％以下となる。また、不溶性画分から抽出した１１Ｓグロブリンに富む画分は、クロメタ油分が２％以下であり、換算すると脂質会合蛋白質は２０％以下の大豆蛋白画分となる。
本発明に用いた分析方法を以下に記載する。
＊粗蛋白質；ケールダール法に基づき窒素含量を求め、係数６．２５を掛けて粗蛋白質に換算した。
＊不溶性画分の分離沈降速度；Ｌ．Ｕ．Ｍ．社製の分離特性分析装置ＬＵＭｉＦｕｇｅ１１４を用い、不溶性画分を含む試料溶液０．５ｍｌをポリスチレン製角型セルに入れ、１００Ｇで遠心分離した時の透過率２０％の界面の移動速度を分離沈降速度とした。
＊ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動；Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））の方法に基づきゲル濃度１０〜２０％のグラディエントゲルで分析した。蛋白アプライ量は固形分換算で６μｇとし、染色はクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０を用いて行った。
＊フィチン酸；Ａｌｉｉ  Ｍｏｈａｍｅｄの方法（Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６３，４７５−４７８．１９８６）に準拠して測定した。
＊クロメタ油分；試料乾物に対してクロロホルム・メタノールの混合液（容量比、２：１）を約５０倍加え、還流抽出される固形分の重量比をクロメタ油分として測定した。
＊純度（ＳＰＥ基準）；上記のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で得られた泳動パターンをデンシトメーターで測定し、その全体に対する該当画分の面積比率を純度（ＳＰＥ基準）とした。ここに７Ｓグロブリン含量はα、α’、βサブユニットの総含量を指し、１１Ｓグロブリン含量は酸性ポリペプチド（Ａ）と塩基性ポリペプチド（Ｂ）の総量を指す。
＊補正純度；上記で得られた純度（ＳＰＥ基準）から、混在する脂質会合蛋白質の量も考慮した補正純度を以下のように算出した。すなわち試料の純度（ＳＰＥ基準）の値をＡ％として、当該試料中には７Ｓグロブリン及び１１Ｓグロブリン以外にクロメタ油分の１０倍重量に相当する脂質会合蛋白質も存在するので、７Ｓグロブリン及び１１Ｓグロブリンに脂質会合蛋白質の量を含めた合計蛋白に対する純度として算出する。
補正純度（％）＝（１００（％）−クロメタ油分（％）＊１０）＊Ａ（％）／１００
＊イオン強度；導電率計（２％／℃  温度換算機能付）を用いて、溶液の導電率を測定し、その導電率に相当するＮａＣｌモル濃度をイオン強度とした。
以下に本発明の好ましい態様を記載する。
本発明に用いる原料大豆は市販の大豆、または育種や遺伝子操作などにより特定の画分が欠損した大豆のいずれも用いることが可能である。大豆蛋白を含む溶液は、脱脂大豆の加水スラリー（以下、脱脂大豆スラリーと呼ぶ。）、同スラリーから得られる脱脂豆乳、酸沈澱大豆蛋白スラリー（以下、カードスラリーと呼ぶ。）、または分離大豆蛋白溶液のいずれでも良いが、特に脱脂大豆の加水スラリーを用いた方が可溶性画分と不溶性画分の分離が容易となるので好ましい。また、７Ｓグロブリンに富んだ画分と１１Ｓグロブリンに富んだ画分に分画するためには、未変性もしくは低変性大豆蛋白溶液が好ましい。
大豆蛋白を含む溶液の酸性下の加温処理は、ｐＨ３．８〜６．８、好ましくはｐＨ４．０〜６．６、より好ましくはｐＨ４．２〜６．２の酸性下で３０〜７５℃、好ましくは３５〜６５℃、さらに好ましくは４０〜６０℃での加温処理が良い。イオン強度は０．０２以上で可溶性画分と不溶性画分の分離が容易になり、より高くすることで可溶性画分と不溶性画分の分離が一層容易になる。但し、イオン強度０．２以上の場合、分離後の可溶性画分から７Ｓグロブリンを等電点沈澱させる為にはイオン強度を０．２未満にする必要があり、操作が煩雑となるので、好ましくは０．０２以上０．２未満が良い。可溶性画分と不溶性画分の分離は、ｐＨ４．５以上５．６未満で行うことによりが７Ｓグロブリンに富んだ可溶性画分と１１Ｓグロブリンに富んだ不溶性画分が得られる。また、製造工程中、特に可溶性画分と不溶性画分を分画するまでのいずれかの工程で、大豆蛋白と共存するフィチン酸をフィターゼで分解することにより、７Ｓグロブリンに富んだ画分と１１Ｓグロブリンに富んだ画分の分離が一層容易になる。フィターゼ処理は酸性下での加温処理と同時に行うと簡便である。フィターゼは、起源により多少異なるものの、通常ｐＨ３．５〜９．０，温度２０〜７０℃、５分間〜３時間、蛋白重量（ｇ）あたり０．１〜１００ｕｎｉｔ程度作用させるのが適している。なお１ｕｎｉｔのフィターゼ活性はｐＨ５．５、３７℃の下で反応初期の１分間に基質のフィチン酸から１μモルのリン酸を遊離する酵素量を表わす。
上記加温処理のための加温保持時間の長短は、加温処理のｐＨや温度に比べて分離の難易にあまり大きく影響せずあまり重要ではない。加温処理時のｐＨが３．８〜６．８の範囲外、または温度が３０℃〜７５℃の範囲外であると、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの分離が難しくなる。
加温処理後は、微生物管理上冷却する方が好ましいが、そのままの温度で分画に移ってもよい。分画の手段は、公知の分離手段（ろ別、遠心分離等）を用いることができ、特に連続式遠心分離機（例えばデカンター）等を用いても容易に、かつ効率的に分離することができる。むろんバッチ式等の非連続式遠心分離機の使用を妨げるものではない。
本発明による可溶性画分である７Ｓグロブリンに富んだ画分と不溶性画分である１１Ｓグロブリンに富んだ画分の分画精度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で得られたパターンで評価できる（純度はＳＰＥ基準）。
しかし、ＳＰＥ基準の純度では、脂質会合蛋白質がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動での染色性が低いために過少に評価されるので、前記補正純度（％）＝（１００（％）−クロメタ油分（％）＊１０）＊Ａ（％）／１００の式を用いた補正純度の値の方が、より真の純度に近い値と考えられる。
分離後の可溶性画分は、そのまま、あるいは濃縮して、あるいは中和して、あるいは殺菌して、あるいは乾燥して、７Ｓグロブリンに富んだ画分として用いることができる。濃縮する手段としては、イオン強度を０．２未満に調整し、かつｐＨ値を４．０〜５．０に調整して生じる不溶性画分を分離回収する方法が例示され、その後加水、中和、加熱殺菌処理し、乾燥する形態が最も通常である。加熱殺菌処理は公知のＨＴＳＴ、ＵＨＴ処理等で行うことができる。目的に応じて、溶液の状態でプロテアーゼ等を用いた酵素処理をすることももちろん可能である。
分離後の不溶性画分からは、略中性（概ねｐＨ６．５〜７．５）の水溶液を用いて１１Ｓグロブリンを溶解、あるいは抽出し、不溶性の脂質会合蛋白質（不溶性画分がおから成分を含む場合はおから成分も含む）と分離することができる。この際、１１Ｓグロブリンの溶解、あるいは抽出は可能な限り弱い煎断力で行った方が脂質会合蛋白質画分の可溶化を防ぎ、１１Ｓグロブリンを選択的に溶解、あるいは抽出することができるので好ましい。また、溶解、あるいは抽出した１１Ｓグロブリンと脂質会合蛋白質との分離には約４，０００Ｇ以上の、好ましくは約５，０００Ｇ以上の高Ｇ遠心分離機に掛けるのが好適であり、これにより１１Ｓグロブリン／（１１Ｓグロブリン＋７Ｓグロブリン）の比が０．７以上を維持したまま、クロメタ油分が固形物中２％以下の蛋白を得ることができる。
略中性の水溶液を用いて溶解、あるいは抽出したクロメタ油分が２％以下の１１Ｓグロブリンに富む画分は、このまま、あるいは濃縮して、あるいは中和して、あるいは殺菌して、あるいは乾燥して、１１Ｓグロブリンに富んだ画分として用いることができる。濃縮する手段としては、可溶性画分をｐＨ４．５以上５．６未満に調整して生じる不溶性画分を分離回収する方法が例示され、その後加水、中和、加熱殺菌処理し、乾燥する形態が最も通常である。加熱殺菌処理は公知のＨＴＳＴ、ＵＨＴ処理等で行うことができる。目的に応じて、溶液の状態でプロテアーゼ等を用いた酵素処理をすることももちろん可能である。
以下、この発明の実施例を示すが、本発明がこれらによってその技術範囲が限定されるものではない。
【実施例１】  大豆を圧扁し、ｎ−ヘキサンを抽出溶媒として油を抽出分離除去して得られた低変性脱脂大豆（窒素可溶指数：ＮＳＩ９１）１重量部に、１０重量部の抽出水（イオン交換水）を加え、ホモミキサーを用いて２２℃で撹拌、２０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．２に維持しながら４０分間抽出した。次いで、抽出液をろ布でろ過し、さらに５，０００Ｇで１０分間遠心分離して不溶物を除いた脱脂豆乳を得た。得られた脱脂豆乳のｐＨを３５％塩酸を用いてｐＨ４．５に調整し、３，０００Ｇで１０分間遠心分離して酸沈澱蛋白を得た後、たん白が乾燥重量で５％となるように酸沈澱蛋白にイオン交換水を加えてポリトロン（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡＡＧ社製）で均質化（以下、カードスラリーと呼ぶ。）した。カードスラリーのイオン強度を塩化ナトリウムを用いて０．１４に調整し、２２℃で３０分間撹拌、次いで、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてカードスラリーのｐＨを５．３に調整し、２２℃で２０分間撹拌した。その後、カードスラリーを５０℃まで昇温し、５０℃で１０分間撹拌した後、直ちに２２℃まで冷却した。この時、昇温初めから２２℃まで冷却するのに要した時間は２５分間であった。２２℃でさらに１５分間撹拌した後、ＬＵＭｉＦｕｇｅ１１４を用いて不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、５，０００Ｇで５分間遠心分離して得られた可溶性画分と不溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による泳動パターンをデンシトメーターで測定した該当画分の面積比）を求めた。
表１に不溶性画分の分離沈降速度、表２に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を示す。
＜比較例１＞
実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を、塩化ナトリウムを用いて０．１４に調整し、２２℃で３０分間撹拌、次いで、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてカードスラリーのｐＨを５．３に調整し、２２℃で６０分間撹拌した。その後、実施例１と同様の方法で不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、５，０００Ｇで１０分間遠心分離して得られた可溶性画分と不溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表１に不溶性画分の分離沈降速度、表２に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を示す。
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実施例１および比較例１の結果より、カードスラリーを酸性下で加温処理することにより、高純度の７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と高純度の１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分の分離が一層容易になることが明らかである。
【実施例２】  実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を、塩化ナトリウムを用いて０．１４に調整し、ｐＨ調整をせずに（約ｐＨ４．５）２２℃で３０分間撹拌した後、５０℃まで昇温、その後直ちに２２℃まで冷却した。この時、昇温初めから２２℃まで冷却するのに要した時間は１５分間であった。冷却後、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてカードスラリーのｐＨを５．５に調整して１５分間撹拌し、実施例１と同様の方法で不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表３に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比、表４に不溶性画分の分離沈降速度を示す。
＜比較例２＞
実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を調整せずに（イオン強度０．０１３）、実施例２と同様の加温処理（ｐＨ未調整、２２℃で３０分間撹拌した後、５０℃まで昇温、その後直ちに２２℃まで冷却）を行った。次いで、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてカードスラリーのｐＨを５．９に調整し（イオン強度が低い場合は、可溶性画分と不溶性画分の分離ｐＨを高くしなければ７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比が同程度の画分を得ることが出来ない）、１５分間撹拌した後に、実施例１と同様の方法で不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表３に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比、表４に不溶性画分の分離沈降速度を示す。
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実施例２および比較例２の結果より、イオン強度を高くし、かつ分離ｐＨを低くすることで、７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分の分離が一層容易になることが明らかである。
以上までの実施例および比較例の結果より、大豆蛋白を含む溶液の酸性下の加温処理とイオン強度の調整の組み合わせにより、７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分の分離が、酸性下の加温処理のみ、あるいはイオン強度の調整のみの場合よりも一層容易になることが明らかである。
【実施例３】  実施例１と同様に脱脂した低変性脱脂大豆１重量部に、１０重量部の２２℃の抽出水（イオン交換水）を加え（以下、脱脂大豆スラリーと呼ぶ）、塩化ナトリウムを用いてイオン強度が０．１７となるように調整し、ｐＨ未調整で２２℃、３０分間プロペラ撹拌した。次いで、３５％塩酸を用いてｐＨ５．３に調整し、５０℃まで昇温して１０分間プロペラ撹拌した後、直ちに２２℃まで冷却した。この時、５０℃まで昇温するのに１０分間、２２℃まで冷却するのに５分間それぞれ要した。冷却後、３５％塩酸を用いてｐＨ４．８に調整し、２２℃でさらに１０分間撹拌した後、実施例１と同様に不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、５，０００Ｇで５分間遠心分離して得られた可溶性画分については実施例１と同様に７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。一方、不溶性画分は加水（脱脂大豆の７倍重量）し、ホモミキサーを用いて２２℃で撹拌、２０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを７．２に維持しながら３０分間抽出した後、５，０００Ｇで５分間遠心分離して得られた可溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表５に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比、表６に不溶性画分の分離沈降速度を示す。
＜比較例３＞
実施例３と同様に調製した脱脂大豆スラリーを、塩化ナトリウムを用いてイオン強度が０．１７となるように調整し、２２℃で３０分間撹拌、次いで、３５％塩酸を用いて脱脂大豆スラリーのｐＨを５．３に調整し、２２℃で２５分間撹拌した。その後、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ４．８に調整し、２２℃で１０分間撹拌した後、実施例１と同様の方法で不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表５に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比、表６に不溶性画分の分離沈降速度を示す。
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実施例３および比較例３の結果より、脱脂大豆スラリーを用いる場合も、酸性下の加温処理とイオン強度の調整により可溶性画分と不溶性画分の分離が容易になることが明らかである。
【実施例４】  実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を、塩化ナトリウムを用いて０．１７に調整し、実施例３と同様の加温処理（ｐＨ未調整で２２℃、３０分間プロペラ撹拌。次いで、ｐＨ５．３に調整し、５０℃まで昇温して１０分間プロペラ撹拌した後、直ちに２２℃まで冷却）を行った後、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨ５．４に調整し（イオン強度の同じ脱脂大豆スラリーとカードスラリーの場合、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比が同程度の画分を得る為にはカードスラリーの分離ｐＨを脱脂大豆スラリーの分離ｐＨより高く設定する必要がある）、２２℃でさらに１０分間撹拌を行った。その後、実施例１と同様に不溶性画分の分離沈降速度を測定するとともに、可溶性画分と不溶性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比を求めた。
表７に可溶性画分と不溶性画分の７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンの存在比、表８に不溶性画分の分離沈降速度を示す。
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実施例３および実施例４の結果より、大豆蛋白を含む溶液には脱脂大豆スラリーを用いた方が、不溶性画分の分離沈降が速く、分離が容易になることが明らかである。
【実施例５】  実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を、塩化ナトリウムを用いて０．１４に調整し、ｐＨ調整をせずに（約ｐＨ４．５）２２℃で３０分間撹拌した後、５０℃まで昇温した。この時、昇温に要した時間は１０分間であった。５０℃に達した後、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを５．３に調整し、さらに２０分間加温処理した後、２２℃まで冷却した。この時、冷却に要した時間は５分間であった。冷却後、５，０００Ｇで１０分間遠心分離して可溶性画分と不溶性画分を得た。
得られた可溶性画分は、３５％塩酸を用いてｐＨ４．５に調整し、３，０００Ｇで１０分間遠心分離して沈澱画分を得た。次いで、沈澱画分に加水し、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いて中和した後、フリーズドライして７Ｓグロブリンに富んだ画分を得た。
一方、５，０００Ｇで１０分間遠心分離して得られた不溶性画分は、５倍重量のイオン交換水を加え、２２℃でプロペラ撹拌し、２０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．８に維持しながら３０分間抽出した。次いで、５，０００Ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清画分のｐＨを３５％塩酸を用いてｐＨ４．５に調整し、３，０００Ｇで１０分間遠心分離して沈澱画分を得た。次いで、沈澱画分に加水し、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いて中和した後、フリーズドライして１１Ｓグロブリンに富んだ画分を得た。
得られた各画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による７Ｓ：１１Ｓの存在比、７Ｓグロブリンに富んだ画分の７Ｓグロブリン純度（ＳＰＥ基準）と１１Ｓグロブリンに富んだ画分の１１Ｓグロブリン純度（ＳＰＥ基準）、クロメタ油分、７Ｓグロブリン補正純度、１１Ｓグロブリン補正純度、および両画分のフィチン酸含量を表９に示す。また、表１０に実施例１と同様に測定した不溶性画分の分離沈降速度を示す。
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【００３８】
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以上の結果より、本発明方法によりクロメタ油分の少ない、即ち脂質会合蛋白質含量の少ない、高純度の７Ｓグロブリンおよび１１Ｓグロブリン画分を容易に得られることが明らかである。
また、加温処理後ホールドせずに直ちに冷却した実施例１と、加温処理後２０分間ホールドした実施例５の結果から、加温処理後にホールドすることにより分離沈降速度が向上することが分かる。
【実施例６】  実施例１と同様に調製した５％カードスラリーのイオン強度を、塩化ナトリウムを用いて０．１４に調整し、ｐＨ調整をせずに（約ｐＨ４．５）２２℃で３０分間撹拌した後、５０℃まで昇温した。この時、昇温に要した時間は１０分間であった。５０℃に達した後、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを５．３に調整し、対脱脂大豆０．２重量％のフィターゼ（新日本化学製「スミチームＰＨＹ」）を添加してさらに２０分間プロペラ撹拌した。その後、２２℃まで冷却した。この時、冷却に要した時間は５分間であった。冷却後、５，０００Ｇで１０分間遠心分離して可溶性画分と不溶性画分を得た。得られた可溶性画分は、３５％塩酸を用いてｐＨ４．５に調整し、３，０００Ｇで１０分間遠心分離して沈澱画分を得た。次いで、沈澱画分に加水し、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いて中和した後、フリーズドライして７Ｓグロブリンに富んだ画分を得た。
一方、５，０００Ｇで１０分間遠心分離して得られた不溶性画分は、５倍重量のイオン交換水を加え、２２℃でプロペラ撹拌し、２０％水酸化ナトリウム溶液でｐＨ６．８に維持しながら３０分間抽出した。次いで、５，０００Ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清画分のｐＨを３５％塩酸を用いてｐＨ４．５に調整し、３，０００Ｇで１０分間遠心分離して沈澱画分を得た。次いで、沈澱画分に加水し、２０％水酸化ナトリウム溶液を用いて中和した後、フリーズドライして１１Ｓグロブリンに富んだ画分を得た。
得られた各画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による７Ｓ：１１Ｓの存在比、７Ｓグロブリンに富んだ画分の７Ｓグロブリン純度（ＳＰＥ基準）と１１Ｓグロブリンに富んだ画分の１１Ｓグロブリン純度（ＳＰＥ基準）、クロメタ油分、７Ｓグロブリン補正純度、１１Ｓグロブリン補正純度、およびフィチン酸含量を表１１に示す。また、表１２に実施例１と同様に測定した不溶性画分の分離沈降速度を示す。
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実施例５および実施例６の結果より、フィターゼによるフィチン酸の分解を併用することで可溶性画分と不溶性画分の分離がより一層容易になり、かつ低フィチン酸の７Ｓグロブリンに富んだ画分と１１Ｓグロブリンに富んだ画分を得られることが明らかである。
【産業上の利用可能性】  以上説明したとおり、本願発明は大豆蛋白を含む溶液のイオン強度の調整と、酸性下での加温処理を組み合わせることにより、７Ｓグロブリンを含む可溶性画分と１１Ｓグロブリンを含む不溶性画分を工業的に簡便に分画することができる。
【国際調査報告】
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