(57)【要約】本発明は、ＰＨＡ含有菌体から分離されるＰＨＡを、著しい分子量の低下を引き起こすことなく高純度で精製する方法を提供すること。微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加することによって、前記水性懸濁液のｐＨをコントロールしながら過酸化水素による処理を行うことからなる精製方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、
微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加することによって、前記水性懸濁液のｐＨをコントロールしながら過酸化水素による処理を行うことを特徴とする精製方法。
【請求項２】
水性懸濁液のｐＨを７〜１３の間にコントロールすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の精製方法。
【請求項３】
水性懸濁液中の過酸化水素の濃度が０．０１重量％〜１重量％の範囲であることを特徴とする請求の範囲第１又は２項記載の精製方法。
【請求項４】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートと他のＤ−３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート及び３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の精製方法。
【請求項６】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとの２成分共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエートとＤ−３−ヒドロキシブチレートとＤ−３−ヒドロキシバレレートとの３成分共重合体である請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス属に属する微生物である請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエまたはアエロモナス・ハイドロフィラである請求の範囲第７項記載の精製方法。
【請求項９】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の精製方法。
【請求項１０】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の水性懸濁液が、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによって３−ヒドロキシアルカン酸共重合体以外の菌体構成物質の全てまたは一部を可溶化して３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を分離し、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を水に懸濁させたものである請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、微生物菌体によって産生された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法に関する。
【背景技術】  ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋立などにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能と考えられる。
微生物が生成するＰＨＡは、通常顆粒体を形成してその微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて菌体からＰＨＡを抽出する方法と、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法に分けられる。
有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法では、ＰＨＡが可溶である溶媒として、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン含有炭化水素を用いて抽出する方法がある（特開昭５５−１１８３９４号公報、特開昭５７−６５１９３号公報参照）。しかし、これらハロゲン含有炭化水素は疎水性溶媒であるため、抽出前に、菌体を予め乾燥する等の、溶媒が菌体中のＰＨＡと接触できるようにするための工程が必要となる。また、これらの方法においてはＰＨＡを実用に値する濃度（たとえば５％）以上に溶解すると抽出液は極めて粘稠となり、溶解しなかった菌体残渣とＰＨＡを含む溶媒層との分離が非常に困難である。更に、溶媒層からＰＨＡを高い回収率で再沈殿させるためには溶媒層の４〜５倍容のメタノールやヘキサン等のＰＨＡ不溶性溶媒が必要であるなど、再沈殿工程には大容量の容器が必要とされる。さらには、溶媒の使用量が膨大なため、溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさむことになる。加えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の使用は制限される方向にあり、この方法での工業化は難しいのが現状である。
そこで、ＰＨＡが可溶でありかつ水と混ざり合う溶媒、例えばジオキサン（特開昭６３−１９８９９１号公報参照）またはプロパンジオール（特開平０２−６９１８７号公報参照）またはテトラヒドロフラン（特開平０７−７９７８８号公報参照）の様な親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。これらの方法は乾燥菌体や湿菌体からでもＰＨＡを抽出することが可能な点と、菌体残渣と分離した溶媒層を冷却するだけでＰＨＡの沈殿物が得られる点では好ましいと考えられる。しかし、これらの方法でもＰＨＡの溶解した溶媒層の粘稠性の問題は解決されておらず、加えて抽出効率を上げるためには加熱が必要であり、水存在下で加熱するためにＰＨＡの低分子化が避けられないことや、回収率が劣ることなどの欠点を有している。
一方、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５８年，第１９巻，ｐ．１９８−２０９には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、プロセスとしては簡単ではあるが、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにコストが高くなる。また、ＰＨＡの著しい低分子化が引き起こされることや、得られたＰＨＡ内に無視できない量の塩素が残存することから実用には適さないと考えられる。
特公平０４−６１６３８号公報には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせて、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、熱処理によってタンパク質が変性・不溶化するために、次のタンパク質分解酵素処理工程での負荷が増大すること、更には、処理工程が多く複雑であること、酵素は比較的高価であることからコストがかかる等の欠点を有している。
ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する方法として、界面活性剤で処理したのち、菌体から放出された核酸を過酸化水素処理して分解し、ＰＨＡを分離する方法が提案されている（特表平０８−５０２４１５号公報参照）が、界面活性剤を含む廃液は発泡が激しいことに加えて高いＢＯＤ負荷値を持つ。このような観点から界面活性剤の使用は工業的規模において望ましくない。
ＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−１７７８９４号公報、特開平０７−３１４８８号公報参照）。しかし、これらの方法は微生物菌体懸濁液を少なくとも３回、場合によっては加温して１０回も高圧処理しなければ純度の高いＰＨＡを得ることは出来ず、なおかつ得られるＰＨＡの純度は６５〜８９％程度と低いという欠点がある。
また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平０７−３１４８７号公報参照）。しかし、得られるポリマーの純度は７５．１〜８０．５％と低く、収率向上のためにアルカリ添加量を増やすとポリマーの低分子化が起こるなどの欠点があった。さらに、アルカリ添加後に物理的破砕を行う方法もいくつか提案されているが（特開平０７−３１４８９号公報、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，１９９１年，第２巻，第９５−１０５項参照）、アルカリ処理だけでは菌体構成成分は少量しか菌体外に出ておらず、続く高圧破砕処理後でも菌体構成成分がＰＨＡ画分に残存しており効率的でないこと、従って微生物菌体懸濁液を少なくとも５回高圧処理しなければ純度の高いＰＨＡを得ることは出来ず、なおかつ得られるＰＨＡの純度は７７〜８５％程度と低いという欠点がある。加えて、アルカリを添加する方法においては、一般に、微生物菌体から流出する菌体成分、特に核酸が、菌体懸濁液の粘度を上昇させ、その後の処理が困難になるという問題があった。
また、ＰＨＡ含有微生物懸濁液をｐＨ２未満の酸性に調整し５０℃以上でＰＨＡを分離する方法が提案されている（特開平１１−２６６８９１号公報参照）。しかし、この方法はｐＨ２未満のような強酸性で処理を行うために工業的規模では望ましくないこと、純度向上のためには酸処理の後にアルカリ性に調整する必要があり大量の塩が発生すること、また、得られるＰＨＡの分子量が２４７万から１００万程度にまで低下するなどの欠点を有している。
特開平０７−１７７８９４号公報では菌体を高圧破砕処理したあと酸素系漂白剤で処理することによりポリ−３−ヒドロキシブチレート（以後ＰＨＢ）を分離精製する方法を提案している。ＰＨＢのスラリーを各種酸素系漂白剤で処理する方法を提示しているが、漂白処理時のｐＨについては記載されていない。
発明の要約
本発明の目的は、上記現状に鑑み、微生物菌体によって産生された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体から少ない工程で３−ヒドロキシアルカン酸共重合体以外の菌体構成成分を効率よく取り除き、深刻な分子量の低下を引き起こすことなく、高純度で溶融時の黄変や異臭のない３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を高収率で得ることのできる精製方法を提供することにある。
本発明者らは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシアルカン酸単独重合体の場合と比較して、過酸化水素処理に伴う分子量低下が顕著であるという課題を見出し、この課題を解決するため鋭意検討した。その結果、過酸化水素処理を行う際に、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液のｐＨをアルカリでコントロールすることによって深刻な分子量低下を防止することができることを見出した。
すなわち本発明は、微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加することによって、上記水性懸濁液のｐＨをコントロールしながら過酸化水素による処理を行うことからなる精製方法に関する。
以下、本発明を詳述する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の精製方法を実施するための装置の一例の概略図を示す。
【符号の説明】
１  攪拌槽
２  攪拌装置
３  ｐＨ検知制御装置
４  ポンプ
５  管路
６  アルカリ貯留槽
７  ｐＨ計
発明の詳細な開示
本発明における微生物は、細胞内に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の菌株、更には、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群の遺伝子を導入した菌株、特にラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２）（ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地  中央第６）、寄託日１９９７年８月７日、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８、原寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６より移管）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７））等がより好ましい。これら微生物を適切な条件で培養して菌体内に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９号等に挙げられる方法が用いられる。
本発明における３−ヒドロキシアルカン酸共重合体とは、３−ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体の総称である。３−ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、Ｄ−３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または、Ｄ−３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）を含む３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。さらに、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート及び３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマー成分として３ＨＨを含む共重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））、または、３ＨＢとＤ−３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７５７号，特開平０８−２８９７９７号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＨユニットを１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０モル％といった範囲のものが好適である。
本発明における「微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体」とは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物菌体を破砕することによって、微生物から遊離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体のことをいう。微生物菌体の破砕方法としては特に限定されないが、従来公知の物理的破砕や、アルカリ添加による破砕等が挙げられる。
本発明における「微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液」とは、微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を水に懸濁させたものであれば特に限定されない。また、悪影響がない範囲で有機溶剤が共存しても差し支えない。通常、当該懸濁液には、微生物菌体の破砕によって生じた菌体構成物質等が混入している。
上記水性懸濁液は、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによって３−ヒドロキシアルカン酸共重合体以外の菌体構成物質の全てまたは一部を可溶化して３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を分離し、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を水に懸濁させたものであることが好ましい。
本発明における「３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液」の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体濃度は、精製を効率よく行うという観点から、５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、３００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。
本発明においては、過酸化水素による上記水性懸濁液の処理と並行して、上記水性懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加することによって、上記水性懸濁液のｐＨをコントロールする。これによって、過酸化水素によるタンパク質（懸濁液に残存する菌体構成物質）の分解を行うとともに、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量の深刻な低下を防止することができる。
本発明で使用するアルカリとしては、ｐＨを特定の範囲に調整できるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどを含めたアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウムなどのアルカリ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。
本発明において、アルカリの添加によってコントロールするｐＨの範囲は特に限定されないが、共重合体の分子量低下防止という観点から、ｐＨ７以上が好ましく、ｐＨ８以上がより好ましい。また上限はｐＨ１３以下が好ましく、ｐＨ１２以下がより好ましい。特に、ｐＨ８からｐＨ１１の間で調整されることが好ましい。
コントロールするｐＨの上下幅としては設定値のそれぞれ１以内が好ましく、さらに好ましくは上下それぞれ０．５以内である。
本発明においては、アルカリの添加速度は特に限定されず、上記水性懸濁液のｐＨの推移を計測しながら、上記ｐＨを所望の範囲にコントロールできるような速度でアルカリを添加することが好ましい。
一般に、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を過酸化水素で処理すると、精製が進むにつれて、上記水性懸濁液のｐＨが徐々に下がっていく現象が見られる。本発明は、この現象を抑止するために、アルカリを連続的又は断続的に添加して上記水性懸濁液のｐＨを一定範囲内にコントロールするものである。ｐＨ１４を越えるような過剰なアルカリを添加すると、過酸化水素の分解が起こり精製の効率が下がるだけではなく、かえって３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量の低下を招きやすい。また、アルカリの添加量が不足すれば、過酸化水素の活性が下がり十分な精製効果が得られず、また、酸性側に傾くと、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量も大きく低下する傾向がある。適正な量のアルカリを連続的又は断続的に添加してｐＨをコントロールすることによってはじめて、精製効率の向上と分子量低下の抑止という２つの目的を同時に達成することができる。
本発明において、過酸化水素の添加量は特に制限されないが、水性懸濁液中の濃度として１０重量％以下が好ましく、５重量％以下がより好ましく、１重量％以下がさらに好ましい。また適切な精製効果を得るためには、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上がより好ましく、０．１重量％以上がさらに好ましい。
特に本発明の場合、アルカリの添加による水性懸濁液のｐＨのコントロールによって、過酸化水素の添加量を低減しても優れた精製効果を得ることが可能となる。過酸化水素の添加量の低減は、精製工程のコストダウンや、排水処理負担の削減を可能にするため非常に好ましい。すなわち本発明においては、例えば、１重量％以下、さらには０．５重量％未満であっても優れた精製効果を得ることができる。アルカリの添加による水性懸濁液のｐＨのコントロールを行わず過酸化水素の処理のみを行った場合、このような低濃度では十分な精製効果を達成することができない。
本発明において、過酸化水素による処理は、室温以上の温度から水性懸濁液の沸点までの範囲で行うのが好ましい。短期間でより精製の効果を高めるために、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上で処理を行う。また、通常１０分から１０時間、好ましくは３０分から５時間、さらに好ましくは１時間から３時間処理を行う。
過酸化水素処理を行った後、遠心分離を行って得られた沈殿物を水や有機溶媒、好ましくは親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどの溶媒で洗浄し、乾燥させることによって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を単離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
（重合体の純度の測定方法）
重合体の水性懸濁液を遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上清を除去し、メタノール（ただし実施例４と比較例３の場合のみエタノールを使用）で２回洗浄した後、加熱・減圧下で乾燥して重合体の粉体を得た。重合体の粉体１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、メタノール０．８５ｍｌと濃硫酸０．１５ｍｌを加えて１００℃で１４０分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモニア飽和水溶液０．５ｍｌを加えて激しく攪拌して静置し、下層部をキャピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、重合体の純度を求めた。
（重合体の分子量の測定方法）
重合体の分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物１０ｍｇを、クロロホルム１ｍｌに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液をＳｈｏｄｅｘ  Ｋ８０５Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した。
（重合体の溶融時のＹＩ値の測定方法）
重合体の水性懸濁液を遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上清を除去し、メタノール（ただし実施例４と比較例３の場合のみエタノールを使用）で２回洗浄した後、加熱・減圧下で乾燥して各サンプルを得た。ＰＨＢＨサンプルは１７０℃、ＰＨＢサンプルは１９０℃に熱したアルミブロックで１０分間溶融させてペレットとし、日本電色工業（株）製分光式色彩計ＳＥ−２０００で測定を行い、黄色度指数（ＹＩ値）を求めた。
（重合体中の残留窒素量の測定方法）
重合体の水性懸濁液を遠心分離（２４００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）して上清を除去し、メタノールで２回洗浄した後、加熱・減圧下で乾燥して各サンプルを得た。各サンプルに関しダイヤインスツルメンツ社製の微量窒素分析装置ＴＮ−１０を用いて測定した窒素濃度に６．３８をかけてタンパク質換算を行った値で表示した。
（微生物から分離したＰＨＢＨを含む水性懸濁液の調製）
ＰＨＢＨの懸濁液は、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子を導入したラルストニア・ユウトロファ（旧名アルカリゲネス・ユウトロファス  ＡＣ３２（上述の寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８））をＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７）に記載の方法で培養し、ＰＨＢＨを約６７ｗｔ％含有した菌体を得た。遠心（５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）によって培養液から分離したペースト状の菌体に水を加えて７５ｇ乾燥菌体／Ｌの水性懸濁液とし、アルカリとして水酸化ナトリウム水溶液を添加してｐＨ１１．７に保ちながら攪拌と物理的破砕とを行うことでＰＨＢＨ以外の菌体構成物質を可溶化し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）を行って沈殿物を得た。沈殿物はさらに水洗を行い、平均分子量約７０万、３ＨＨモル分率５％、純度９１％のＰＨＢＨを分離した。得られたＰＨＢＨを７５ｇ／Ｌの水性懸濁液として、以下の実施例１〜２及び比較例１〜２で使用した。
図１は本発明の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法を実施するための装置の一例の概略図である。もちろん本発明はこの装置例に限定されるものではない。
【実施例１】  ＰＨＢＨの水性懸濁液５０ｍｌを、ｐＨ電極を装着した１００ｍｌ攪拌槽に入れて７０℃に保温した。ｐＨ電極は丸菱バイオエンジン社製ラボコントローラーＭＤＬ−６Ｃ型に接続し、ｐＨが設定値以下になるとペリスタポンプが作動して水酸化ナトリウム水溶液が設定値に達するまで該懸濁液内に入るように設定した。ラボコントローラーのｐＨを１０に設定し、該懸濁液に３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加して１時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洸浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。
同様にラボコントローラーのｐＨを７および８に設定して上記処理を行った。これらの結果を表１に示す。
2004029266.tif 000002
この結果から、過酸化水素処理時にアルカリを添加してｐＨをコントロールすると、共重合体の純度が向上し残留窒素量が減少するとともに、共重合体の分子量は変化せず、さらには共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かった。
【実施例２】  実施例１と同様な方法で、ラボコントローラーのｐＨを１０に設定して、５０℃で３時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。
この結果を表２に示す。
2004029266.tif 000003
この結果から、アルカリを添加してｐＨをコントロールしながら過酸化水素処理を行うと、共重合体の純度が向上するとともに、共重合体の分子量は変化せず、さらには共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かった。
【実施例３】  上記と同様な処理を行って得られた分子量１４８万、３ＨＨモル分率７％、純度９９％のＰＨＢＨ１１０ｇを水１０００ｍｌに懸濁させた懸濁液を作成し、ｐＨ電極とシルバーソンミキサーを装着した２０００ｍｌ攪拌槽に入れて７０℃に保温した。ｐＨ電極は丸菱バイオエンジン社製ラボコントローラーＭＤＬ−６Ｃ型に接続し、ｐＨが設定値以下になるとペリスタポンプが作動して水酸化ナトリウム水溶液が設定ｐＨ１０に達するまで該懸濁液内に入るように設定した。シルバーソンミキサーの回転数を５０００回転に設定し、該懸濁液に３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加して５０分間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって３回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。結果を表３に示す。
2004029266.tif 000004
この結果から、アルカリを添加してｐＨをコントロールしながら過酸化水素処理を行うと、共重合体の分子量は変化せず、共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かった。
（比較例１）
実施例１で用いたものと同じＰＨＢＨの水性懸濁液（ｐＨ７．１９）（処理１）５０ｍｌと、これに水酸化ナトリウムを添加してｐＨ９．１６とした懸濁液（処理２）５０ｍｌを、それぞれ、１００ｍｌ攪拌槽にいれて７０℃に保温した。該懸濁液に３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加し、ｐＨの調整を行わずに３時間攪拌した。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。この結果を表４に示す。
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この結果から、ｐＨの調整をせずに過酸化水素の処理を行うと、共重合体の分子量は処理前の分子量の９０％未満にまで低下することが分かった。
（比較例２）
実施例１で用いたＰＨＢＨの懸濁液５０ｍｌのｐＨを希塩酸を用いてｐＨ５に調整し、実施例１と同様にｐＨ電極を装着した１００ｍｌの攪拌槽に入れて７０℃に保温した。ラボコントローラーのｐＨを５に設定して、３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加し、１時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。結果を表５に示す。
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以上の結果から、酸によってｐＨをコントロールしながら共重合体の過酸化水素処理を行うと、共重合体の純度は向上し、溶融時の黄変は抑えられたものの、共重合体の分子量が大幅に低下することが判明した。
【実施例４】  上記と同様な処理を行って得られた分子量８０万、３ＨＨモル分率５％、純度＞９９％のＰＨＢＨの懸濁液５０ｍｌに対して、実施例１と同様の処理を行った。ただしラボコントローラーはｐＨ８に設定した。この結果を表６に示す。
（比較例３）
過酸化水素を添加しないこと以外は、実施例４と同様の処理を行った。この結果を表６に示す。
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表６の結果から、アルカリを添加してｐＨをコントロールしながら過酸化水素処理を行うことで、共重合体の分子量の低下を防止し、共重合体の溶融時の黄変を抑えられるが、過酸化処理を行わずにアルカリ添加によるｐＨコントロールのみを行った場合は、分子量は低下し、溶融時の黄変もほとんど抑制できないことがわかった。
（参考例１）
ポリ−３−ヒドロキシブチレート［アルドリッチ社製、純度９５％、分子量６５万］の１０％水性懸濁液に３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加した。この水性懸濁液のｐＨを調整せずに、７０℃で３時間加熱攪拌した。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。この粉体の結果を表７に示す。
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単独重合体に対してｐＨの調整をせずに過酸化水素処理を行っても、分子量の低下はみられず、溶融時の黄変も抑えられることが分かった。
（参考例２）
ＰＨＢ［純度９５％、分子量６５万］の１０％水性懸濁液のｐＨを希塩酸でｐＨ５にし、７０℃で保温した。該懸濁液に３０％過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して５重量％（懸濁液重量に対して０．３７５重量％）となるように添加して、３時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって２回水洗し、さらにメタノールで２回洗浄を行ったあと乾燥して粉体のＰＨＢを得た。この粉体の分子量は６５万であり、過酸化水素処理前の分子量を保持していた。ＰＨＢは酸を添加して過酸化水素処理を行っても分子量を保持していることがわかった。
参考例１及び２の結果から、単独重合体の場合には過酸化水素処理の際にアルカリでｐＨをコントロールしなくとも分子量が低下しないことがわかった。すなわち、過酸化水素処理の際に分子量が低下するのは共重合体に特異な現象であり、本発明の精製方法によればこの共重合体の分子量低下を防止することができる。
【産業上の利用可能性】  本発明の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法によれば、きわめて簡便な方法によって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の過酸化水素処理時の深刻な分子量の低下を防止し、かつ、高純度で溶融時の黄変や異臭のない３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を高収率で得ることができる。
この方法により得られる極めて高純度な３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は幅広い用途に用いることができ、工業的に非常に有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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