(57)【要約】本発明に係るＰＫＡ活性調節剤は、メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含むものである。また、本発明に係るＰＫＡ活性化剤は、癌疾患の予防又は治療剤、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤抑制剤、並びにＡＰ−２，ＣＲＥＢ，及びＵＳＦ−１の活性化剤を製造する際に有用である。さらに、本発明は、メナテトレノンまたはその塩を対象物に有効量投与することを特徴とするＰＫＡ活性の調節法を提供するものである。
2004056351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性調節剤。
【請求項２】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性化剤。
【請求項３】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞浸潤抑制剤。
【請求項６】
癌疾患の予防又は治療に用いられる、請求項２記載のＰＫＡ活性化剤。
【請求項７】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，及びＵＳＦ−１の活性化剤。
【請求項８】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性の変化に由来する疾患の予防又は治療剤。
【請求項９】
メナテトレノンまたはその塩を対象物に有効量投与する工程を含む、ＰＫＡ活性の調節法。
【請求項１０】
ＰＫＡ活性化剤の製造のための、メナテトレノンまたはその塩の使用。
【請求項１１】
メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を、癌患者に投与するための医薬品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ｃＡＭＰ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ（以下、単に「ＰＫＡ」という。）活性調節剤等に関する。
【背景技術】  肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者は、高率に門脈浸潤（ＰＶＩ：Ｐｏｒｔａｌ  Ｖｅｎｏｕｓ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ）をきたすことが知られており、一旦ＰＶＩが発生すると予後は極めて不良である。ＨＣＣ患者におけるＤｅｓ−γ−Ｃａｒｂｏｘｙ  Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（以下、「ＤＣＰ」と称する。）の高値が、その後のＰＶＩ進展と密接に関連することが知られている（たとえば、非特許文献１参照）。ここで、ＤＣＰとは、正常な凝固活性を持たないプロトロンビンで、ビタミンＫ（以下、「ＶＫ」と称する。）が欠乏した状況で増えることが知られており、ＶＫの欠乏・ＶＫの吸収障害のマーカーとして用いられるタンパク質である。
一方で、ＤＣＰ高値ＨＣＣ患者に対しＶＫを投与すると血清のＤＣＰ値が低下すること（たとえば、非特許文献２参照）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＣＰ産生のＨＣＣ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅに対しＶＫ−ＩＩを投与することで細胞の増殖が抑制されること（たとえば、非特許文献３参照）が報告されている。
肝癌に関する臨床的な研究としては、非環式ｒｅｔｉｎｏｉｄによる肝癌再発抑止（たとえば、非特許文献４参照）、ＡＣＥ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（たとえば、非特許文献５参照）やＣＯＸ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（たとえば、非特許文献６参照）による肝発癌抑制・肝癌細胞増殖抑制やアポトーシス促進作用が知られている。
他方、ビタミンＫ２が、白血病細胞やＭＤＳ細胞（たとえば、非特許文献７参照）、乳癌細胞（たとえば、非特許文献８参照）、線維芽細胞（たとえば、非特許文献９参照）等における癌細胞の増殖を抑制することが報告されている。
しかしながら、より癌細胞増殖抑制作用ないしは癌細胞浸潤抑制作用に優れた、有用な癌疾患治療剤は未だ提供されていなかった。
［非特許文献１］  Ｋｏｉｋｅ  Ｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１；９１：５６１−９
［非特許文献２］  Ｃａｎｃｅｒ  １９９２；６９：３１−８
［非特許文献３］  Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９５；２２：８７６−８２
［非特許文献４］  Ｍｕｔｏ  Ｙ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９９６；３３４：１５６１−７
［非特許文献５］  Ｙｏｓｈｉｊｉ  Ｈ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；７：１０７３−８
［非特許文献６］  Ｋｅｒｎ  ＭＡ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００２；３６：８８５−９４
［非特許文献７］  Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｋ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００１；１５：１１１１−７
［非特許文献８］  Ｋａｒ  Ｓ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２０００；１８５：３８６−９３
［非特許文献９］  Ｌｉ  Ｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９８；１７５：３５９−６９
【発明の開示】
そこで、本発明は、癌疾患治療に有用な、ＰＫＡ活性調節剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記事情に鑑み、ＰＫＡ活性調節剤を鋭意研究した結果、ビタミンＫ２（メナテトレノンまたはその塩）がＰＫＡを調節すること、ビタミンＫ２がＰＫＡを活性化すること、ビタミンＫ２がＰＫＡを活性化することにより、転写因子ＣＲＥ／ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１，ＡＰ−２の系が活性化されること、ビタミンＫ２がＰＫＡ活性化することにより肝癌細胞の増殖抑制作用及び浸潤抑制作用がもたらされること、を見出した。すなわち、肝癌細胞の増殖抑制作用及び浸潤抑制作用の機序としてＰＫＡ活性化が介在するという知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性調節剤と、
［２］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性化剤と、
［３］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌疾患の予防又は治療剤と、
［４］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞増殖抑制剤と、
［５］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、癌細胞浸潤抑制剤と、
［６］癌疾患の予防又は治療に用いられる、上記［２］記載のＰＫＡ活性化剤と、
［７］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を含む、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，及びＵＳＦ−１の活性化剤と、
［８］メナテトレノンまたはその塩を有効成分として含む、ＰＫＡ活性の変化に由来する疾患の予防又は治療剤と、
［９］メナテトレノンまたはその塩を対象物に有効量投与することを特徴とする、ＰＫＡ活性の調節法と、
［１０］ＰＫＡ活性化剤の製造のための、メナテトレノンまたはその塩の使用と、
［１１］メナテトレノンまたはその塩を有効成分とするＰＫＡ活性化剤を、癌患者に投与するための医薬品キット、を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、肝癌細胞の増殖抑制に対するビタミンＫ２添加の効果を示したグラフである。
図２は、細胞周期に対するビタミンＫ２添加の効果を示したチャートである。
図３は、細胞の浸潤能に対するビタミンＫ２の効果を示したゲル写真である。
図４は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現変化を示した（ａ）グラフ，（ｂ）解析チャート写真である。
図５は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現量変化を示したＲＴ−ＰＣＲによる解析チャート写真である。
図６は、ビタミンＫ２添加による遺伝子発現の経時的変化を示した図である。
図７は、遺伝子ネットワークを示す図である。
図８は、ビタミンＫ２添加による蛋白質発現変化を示した（ａ）解析写真、（ｂ）グラフである。
図９は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路の活性化を示した解析写真である。
図１０は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路（ＡＰ−２）の活性化を示した解析写真である。
図１１は、ビタミンＫ２添加によるシグナル伝達経路（ＣＲＥＢ）の活性化を示した解析写真である。
図１２は、ビタミンＫ２添加によるＰＫＡの活性化を示した解析写真である。
図１３は、ＰＫＡｉｎｈｉｂｉｔｏｒによるビタミンＫ２の細胞増殖抑制作用の阻害を示すグラフである。
図１４は、ビタミンＫ２添加によるＲｈｏの活性化の抑制を示す解析写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明において用いるメナテトレノンは、好ましくはメナキノン−１〜１４であり、より好ましくはメナキノン４〜８であり、さらに好ましくはメナキノン−４である。
本発明において、癌疾患としては、肝癌等が挙げられる。慢性肝炎、肝硬変からは高率に肝癌が発癌し、いったん発癌するとさらに高率に再発する。例えば、Ｃ型肝炎やＢ型肝炎から肝硬変となり、腫瘍切除後、再発するケースがある。本発明に係るＰＫＡ調節剤によれば、このような肝癌治療後の予後を極めて有効に改善（再発の予防又は治療）することができる。また、予後不良な肝癌の再発形態の一つであるＰＶＩの発生を極めて有効に抑制することができる。
また、本発明において、ＰＫＡ活性の変化に由来する疾患としては、白血病、膵癌、卵巣癌などが挙げられる。
ＰＫＡ（ｃＡＭＰ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）は、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）などの種々の刺激によって細胞内濃度が高まったｃＡＭＰが、ＰＫＡのｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔに結合することでＰＫＡのｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔが遊離しはじめて活性を出す分子として知られている（Ｗａｌｓｈ  ＤＡ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９９４；８：１２２７−３６）。活性化されたＰＫＡは下流のシグナル分子を活性化してさまざまな作用を細胞にもたらすが、細胞増殖の観点からＰＫＡを見ると、活性化されたＰＫＡは細胞の増殖に促進的に関わるという報告もあるのに対し、活性化ＰＫＡは癌細胞の増殖を抑えるという報告もある（ｖａｎ  Ｏｉｒｓｃｈｏｔ  ＢＡ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：３３８５４−６０他）。
細胞内では様々な転写因子が働いて多くの遺伝子発現に寄与しているが、ＰＫＡは活性化されるとｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ）に結合する転写因子であるＣＲＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）をリン酸化することで転写を活性化し、下流の遺伝子発現を調節していることが知られている。ＰＫＡが制御している転写因子にはＵＳＦ−１（Ｘｉａｏ  Ｑ，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００２；２８３：Ｈ２１３−９）、ＡＰ−２（Ｇａｒｃｉａ  ＭＡ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９９；４４４：２７−３１）など他にも多くのものが報告されており、その下流のシグナル伝達系の制御は極めて複雑なものと考えられる。
メナテトレノンは、ビタミンＫ２とも称され、イソプレニル基の数ｎによってメナキノン−ｎ（ＭＫ−ｎ）とも呼ばれる。２−メチル−１，４−ナフトキノン環の３位にイソプレニル基を持つ物質をビタミンＫ２（ＶｉｔａｍｉｎＫ２）と総称する。ビタミンＫ２にはイソプレニル基の数の違いによる同族体がある。メナテトレノンの構造式を以下に示す。
2004056351.tif 000003
式中、ｎは、好ましくは１〜１４であり、より好ましくは４〜８である。特にｎが４である、２−メチル−３−テトラプレニル−１，４−ナフトキノン（２−ｍｅｔｈｌ−３−ｔｅｔｒａｐｒｅｎｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ；ＭＫ−４）が好ましい。
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質で、におい及び味はなく、光により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。メナテトレノン（ビタミンＫ２）の薬理作用は、血液凝固因子（プロトロンビン、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ）のタンパク合成過程で、グルタミン酸残基が生理活性を有するγ−カルボキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシル化反応に関与するものであり、正常プロントロビン等の肝合成を促進し、生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用を発現するものである。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンは、塩を形成していてもよく、かかる塩における好ましい例としては、ハロゲン化水素酸塩（例：フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等）、無機酸塩（例：硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）有機カルボン酸塩（例：酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等）、有機スルホン酸塩（例：メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩等）、アミノ酸塩（例：アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等）、四級アミン塩、アルカリ金属塩（例：ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例：マグネシウム塩、カルシウム塩等）等があげられる。
本発明に係る医薬の有効成分であるメナテトレノンまたはその塩は、無水物であってもよいし、水和物を形成していてもよい。また、メナテトレノンまたはその塩には結晶多形が存在することもあるが同様に限定されず、いずれかの結晶形が単一であってもよいし、結晶形混合物であってもよい。さらに、本発明に用いるメナテトレノンまたはその塩が生体内で分解されて生じる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。
本発明において用いるメナテトレノンは、公知の方法で製造することができ、代表的な例として、特開昭４９−５５６５０号公報に開示される方法によれば容易に製造することができる他、合成メーカーから容易に入手することもできるし、公知の方法に準じて塩にすることもできる。また、メナテトレノンはカプセル剤、注射剤等の製剤としても入手できる。
本発明に係る医薬は、メナテトレノンをそのまま用いてもよいし、または、公知の薬学的に許容できる担体等（例：賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、等）、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して慣用される方法により製剤化してもよい。また、必要に応じて、血流促進剤、殺菌剤、消炎剤、細胞賦活剤、ビタミン類、アミノ酸、保湿剤、角質溶解剤、等の成分を配合してもよい。製剤化の剤形としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、坐剤、注射剤、凍結乾燥剤、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等があげられる。
また、本発明においては、メナテトレノンの投与形態は特に限定されないが、経口的に投与することが好ましい。メナテトレノンのカプセル剤は商品名ケイツーカプセル（エーザイ株式会社製）として、またシロップ剤は商品名ケイツーシロップ（エーザイ株式会社製）として入手することができる。
本発明に係るメナテトレノン含有医薬は、哺乳類（例：ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル等）の肝疾患治療・予防に有用で、特に、ヒトの肝疾患の治療・予防に有用である。メナテトレノンの好ましい投与量としては通常は１０〜１００ｍｇ／日であり、更に好ましくは３０〜６０ｍｇ／日である。
【実施例】  以下に本発明の実施例を挙げるが、これらは例示的なものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は、以下に示す実施例のみならず本特許請求の範囲に様々な変更を加えて実施することが可能であり、かかる変更も本特許請求の範囲に包含される。
〔ビタミンＫ２による肝癌細胞増殖抑制〕
代表的な肝癌細胞株であるＨｅｐＧ２を用いた系に、ＭＫ−４（ビタミンＫ２）を２×１０−５，６×１０−５，８×１０−５，１０×１０−５Ｍの各濃度になるように添加し、経時的に細胞増殖の程度をＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ＭＴＴアッセイ）で測定した。
図１は、肝癌細胞の増殖抑制に対するビタミンＫ２添加の効果を示したグラフである。図１に示すように、ビタミンＫ２添加後１日目，２日目では細胞増殖の程度にそれほど変化は認められなかったが、３日目，５日目になると、ビタミンＫ２濃度に依存して生細胞の数が抑制された。また、図１に示す結果から、ビタミンＫ２のＨｅｐＧ２細胞増殖５０％抑制濃度は、約５×１０−５Ｍであると考えられる。
次に、この肝癌細胞増殖抑制作用が、細胞周期のどのステージで効果を発揮しているのかを調べるため、ＭＫ−４を５×１０−５Ｍの濃度になるように添加した後５日間経過したＨｅｐＧ２細胞を、核染色して、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ；蛍光標示式細胞分取器）で細胞周期を測定した。図２にチャートを示すように、Ｇ１期及びＧ２／Ｍ期の細胞分画が増え、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）の細胞分画が相対的に減少していることが分かった。これより、主に細胞周期の停止が細胞増殖抑制につながっていることが分かった。
〔ビタミンＫ２による肝癌細胞浸潤能の抑制〕
次に、ビタミンＫ２が細胞の浸潤能に与える影響を、ＨｅｐＧ２細胞とマトリゲルチャンバーを用いたｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙで検討した。すなわち、小さな孔のあいたゲルの上層に細胞をまき、下層に走化性因子を含んだ培養液を入れ、細胞が上層から下層に浸潤する数を数えることで、浸潤能を判定した。その際に、上層の培養液中にＭＫ−４（ビタミンＫ２）をＯＭ，４×１０−５Ｍ，８×１０−５Ｍの濃度になるように添加し、まだ細胞増殖に影響のない２４時間経過後に下層に出てきた細胞を染色し、その数を数えることで浸潤能に与える影響を検討した。図３に各濃度におけるゲル写真を示すように、ビタミンＫ２は濃度依存的に癌細胞の浸潤を抑制した。
以上の結果より、ビタミンＫ２は肝癌細胞の増殖に関わるだけでなく細胞の浸潤能を抑制する作用も有することが分かった。
〔ビタミンＫ２による細胞の遺伝子発現への影響〕
ビタミンＫ２添加による細胞の遺伝子発現への影響をｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ｃＤＮＡマイクロアレイ）を用いて検討した。
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４（ビタミンＫ２）を５×１０−５Ｍの濃度になるように添加した後、ＨｅｐＧ２細胞を４日後に回収しＲＮＡを抽出し、次いでこれをラベルした。次に、これを、肝臓や胃組織から抽出したｃＤＮＡを約４３００種類搭載したｉｎ−ｈｏｕｓｅのｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙを用いて遺伝子発現プロファイルを解析した（図４（ｂ））。
図４（ａ）は、横軸にビタミンＫ２非添加細胞（コントロール）を、縦軸にＭＫ−４添加細胞をＳｃａｔｔｅｒｐｌｏｔした遺伝子発現プロファイルである。図４（ａ）において、縦軸及び横軸はいずれもシグナル強度（ｌｏｇｓｃａｌｅ）を示し、赤い点（図４（ａ）中におけるＲ部分）は２倍以上あるいは０．５倍以下の発現変化を示した遺伝子を示す。図４（ａ）に示すように、２倍以上あるいは０．５倍以下の遺伝子発現量変化を示した遺伝子は約１０％弱に認められた。特に、細胞接着因子（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｄｅｓｍｏｐｌａｋｉｎ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  １，Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＤ４４），Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｘ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｂｅｔａ  ２，Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  Ｍ，Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）、アポトーシス関連遺伝子（ＧＡＤＤ３４）、細胞周期関連遺伝子（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ）などの遺伝子発現量に変化が認められた。このようなＭＫ−４添加による遺伝子発現変化が、細胞増殖抑制や浸潤転移抑制につながるものと考えられる。
また、ＨｅｐＧ２細胞の一部（Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ，ＧＡＤＤ３４，Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣｙｃｌｉｎＧ，ＣＤ４４，ＣｙｃｌｉｎＥ）について、ＲＴ−ＰＣＲにより発現量変化を確認した（図５）。
さらに、図６に示すように、ＭＫ−４を添加後１日目，２日目，３日目と経時的に遺伝子変化を解析した。図６は縦方向に今回検討した約４３００遺伝子をならべて、非添加細胞に比べてｄｏｗｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ダウンレギュレーション）している遺伝子を緑（図６中におけるＧ部分）、ｕｐ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（アップレギュレーション）している遺伝子を赤（図６中におけるＲ部分）で描画したものである。図６に示すように、時間が経過するにつれて遺伝子の発現が変化することが明らかとなった。
図７に、上記の遺伝子発現の経時的な変化に基づいて遺伝子ネットワークを描出した図を示す。図７に示すこれらの遣伝子は発現変化を共にしているものであり、遺伝子発現の制御が近似しているものと考えられる。
次に、ＭＫ−４が遺伝子発現に変化を及ぼすことを蛋白レベルで確認した。ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０−５Ｍになるように添加し、細胞を４日後に回収し蛋白を抽出、二次元電気泳動後、銀染色を行った。図８にその結果を示すように、ＭＫ−４の添加細胞と非添加細胞との間では、蛋白レベルでも遺伝子発現に違いが見られることが確認された。
以上の結果から、ＭＫ−４が細胞の遺伝子発現に影響を及ぼすことが明らかとなった。すなわち、ＭＫ−４による癌細胞増殖抑制作用や浸潤抑制作用の機序として、これらの遺伝子発現の変化が関係していることが分かった。
〔ビタミンＫ２により活性化されるシグナル伝達経路〕
ビタミンＫ２が、どのような経路を介して遺伝子発現を制御しているのかを調べるために、５４種（ＡＰ１  ＡＰ２  ＡＲＥ  Ｂｒｍ３  Ｃ／ＥＢＰ  ＣＢＦ  ＣＤＰ  ｃ−Ｍｙｂ  ＡＰ１  ＣＲＥＢ  Ｅ２Ｆｌ  ＥＧＲ  ＥＲＥ  Ｅｔｓ  ＰＥＡ３  ＦＡＳＴ１  ＩＳＲＥ  ＡＰ２  ＧＡＴＡ  ＧＲＥ  ＨＮＦ４  ＩＲＦ１  ＭＥＦ１  ＭＥＦ２  Ｍｙｃ−Ｍａｘ  ＮＦ１  ＣＲＥＢ  ＮＦＡＴ  ＮＦＥ１  ＮＦＥ２  ＮＦｋＢ  Ｏｃｔ１  ｐ５３  Ｐａｘ５  Ｐｂｘ１  ＥＧＲ  Ｐｉｔ１  ＰＰＡＲ  ＰＲＥ  ＲＡＲ  ＲＸＲ  ＳＩＥ  ＳＢＥ  Ｓｍａｄ３／４  Ｓｐ１  ＳＲＥ  Ｓｔａｔ１  Ｓｔａｔ３  Ｓｔａｔ４  Ｓｔａｔ５  Ｓｔａｔ６  ＴＦＩＩＤ  ＴＲＤＲ４  ＵＳＦ１  ＶＤＲ  ＨＳＥ  ＭＲＥ）の転写因子の活性化の有無について検討した。
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０−５Ｍとなるように添加し、最初の変化を同定するために、２時間，１２時間という比較的短時間で細胞を回収し、その核抽出物を抽出した。核抽出物と上記の転写因子の結合配列ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ｍｉｘとを混合した後、転写因子が結合したｐｒｏｂｅのみを回収し、それらｐｒｏｂｅと相補的な配列を搭載したアレイとハイブリダイズさせ転写因子が結合したＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ（すなわち活性化された転写因子経路）の量を判定し、その転写因子経路の活性化の程度とした。その結果を図９に示すように、ビタミンＫ２の添加により、上記５４種の経路のうち、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，ＵＳＦ１の系が活性化されていることが明らかとなった。
さらに、ＭＫ−４添加前（０時間）と添加後２，６，１２，２４，４８時間経過後の核抽出物と、ＡＰ−２  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｐｒｏｂｅを用いたゲルシフトアッセイを行った。その結果を図１０に示すように、添加後にはＭＫ−４添加前に比べてＤＮＡとの蛋白結合が増えていることが分かった。
また、ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１についても同様にゲルシフトアッセイを行ったところ、ＭＫ−４添加前に比べて添加後２，６時間経過後でＤＮＡと蛋白の結合が増えていることが分かった（データは図示せず）。
ＣＲＥＢについて、ｐＥＧＦＰ−ＣＲＥＢ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＨｅｐＧ２にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、蛍光観察した結果を図１１に示す。図１１に示すように、ＭＫ−４添加によって、この蛍光のシグナル（光量）が添加前に比べて経時的に増したことから、ＣＲＥＢが活性化したことが分かった。
以上の結果より、ビタミンＫ２の添加により、ＡＰ−２，ＣＲＥＢ，ＵＳＦ−１の各転写因子が活性化されることが明らかとなった。
〔ビタミンＫ２によるＰＫＡの活性化〕
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０−５Ｍとなるように添加した後、これを蛍光標識した。この細胞の溶解液に、ＰＫＡの基質ペプチドを混合し、これを電気泳動させた。この結果を図１２に示す。ＰＫＡの基質ペプチドはもともとプラス（＋）に荷電しており、蛍光標識したＰＫＡの基質ペプチドと細胞の溶解液を混合することにより、細胞内のＰＫＡが活性化されている場合には基質ペプチドをリン酸化する結果、基質をマイナス（−）に荷電させることにより、＋極へ移動する。すなわち、リン酸化を受けた場合（すなわち、ＰＫＡが活性化されている場合）は＋極へ、リン酸化を受けない場合（すなわち、ＰＫＡが活性化されていない場合）は−極側へ移動することになる。
図１２に示すように、ＭＫ−４を添加してから２時間経過した時点において、＋極へ移動したことから、ＭＫ−４によりＰＫＡが活性化されたことが分かった。
〔肝癌細胞増殖におけるＰＫＡ活性の役割〕
ＨｅｐＧ２細胞にＭＫ−４を５×１０−５Ｍとなるように添加した後にＰＫＡのｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｈ８９）４０μＭを添加したグループ、Ｈ８９だけを加えたグループ、ＭＫ−４のみを加えたグループ、何も添加しないもの（コントロール）について、添加後４日目にＭＴＴ  ａｓｓａｙを試行し、ＭＫ−４添加による細胞の増殖を検討した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、ＭＫ−４及びＨ８９を添加したグループは、コントロールほどには細胞増殖はしなかったものの、ＭＫ−４単独添加グループよりも細胞の数は明らかに増えた。これより、ＭＫ−４添加による細胞増殖抑制作用を、Ｈ８９が一部ではあるもののキャンセル（解除）することが分かった。
この結果から、ビタミンＫ２添加による肝癌細胞増殖抑制作用は、少なくとも一部はＰＫＡの活性化を介しているものと考えられる。
〔ビタミンＫ２によるＲｈｏの活性抑制作用〕
Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤと細胞溶解液を混ぜた後、Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤをｐｕｌｌ  ｄｏｗｎして結合したＲｈｏ蛋白の量をプロットすることで、Ｒｈｏ蛋白の活性化にビタミンＫ２が何らかの関与を持つか検討した。
Ｒｈｏ蛋白は活性化されるとＧＴＰが結合したＧＴＰ−Ｒｈｏとなるが、この活性化Ｒｈｏとは、Ｒｈｏｔｅｋｉｎという蛋白のＲｈｏ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ（ＲＢＤ）が高い  ａｆｆｉｎｉｔｙで結合することが知られている（Ｒｅｎ  ＸＤ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９９９；１８：５７８−８５）。Ｒｈｏは、癌の浸潤転移に重要な役割をしていると考えられている低分子量Ｇ蛋白である（Ｃｌａｒｋ  ＥＡ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；４０６：５３２−５）。
ＨｅｐＧ２細胞を用いてコントロールと、ＭＫ−４を５×１０−５Ｍおよび１０×１０−５Ｍで添加したもの、５×１０−５Ｍ添加の上にＨ８９を４０μＭ加えたもので、６時間経過後に細胞を回収しＲｈｏの活性化を検討した結果を図１４に示す。
図１４に示すように、ＭＫ−４濃度に依存してＲｈｏの活性化は抑制され、この効果はＨ８９でキャンセルされた。Ｒｈｏの活性化をＰＫＡが制御するという報告がなされており（Ｆａｕｃｈｅｕｘ  Ｎ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００２；２３：２２９５−３０１；Ｍａｎｇａｎｅｌｌｏ  ＪＭ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２）、今回の結果から、ビタミンＫ２はＲｈｏの活性化を抑制しその作用はＰＫＡを介していることが分かった。
以上の結果から、ビタミンＫ２は、ビタミンＫ依存性γグルタミルカルボキシラーゼの補酵素として機能するよりも数倍高い濃度域においてＰＫＡを活性化し、これにより肝癌細胞の増殖抑制作用、及び浸潤能抑制作用を有し、様々な遺伝子発現を制御することが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明に係るＰＫＡ活性調節剤は、癌疾患治療の予防又は治療に有用である。本発明に係るＰＫＡ活性化剤によれば、癌細胞増殖抑制及び／又は癌細胞浸潤抑制に有用である。
【図１】
2004056351.tif 000004
【図２】
2004056351.tif 000005
【図３】
2004056351.tif 000006
【図４】
2004056351.tif 000007
【図５】
2004056351.tif 000008
【図６】
2004056351.tif 000009
【図７】
2004056351.tif 000010
【図８】
2004056351.tif 000011
【図９】
2004056351.tif 000012
【図１０】
2004056351.tif 000013
【図１１】
2004056351.tif 000014
【図１２】
2004056351.tif 000015
【図１３】
2004056351.tif 000016
【図１４】
2004056351.tif 000017
【国際調査報告】
2004056351.tif 000018
2004056351.tif 000019
2004056351.tif 000020
2004056351.tif 000021
2004056351.tif 000022
2004056351.tif 000023
2004056351.tif 000024