(57)【要約】本発明は、セクレターゼ活性を抑制する方法を提供する。セクレターゼ活性を抑制するには、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する方法、又はシノビオリンをＨｅｒｐ（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  １）と結合させる方法などが採用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物。
【請求項２】
セクレターゼがβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
セクレターゼ活性を抑制する物質が、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質が、シノビオリンの発現抑制物質である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
シノビオリンの発現抑制物質が、シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
シノビオリンをコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を含むものである請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
ｓｉＲＮＡが、配列番号１に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
一部の配列が、配列番号３〜１６に示す塩基配列から選ばれる少なくとも１つである請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
セクレターゼ活性を抑制する物質がシノビオリンである請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項１０】
脳神経系疾患を治療するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
脳神経系疾患がアルツハイマー病である請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することを特徴とする、セレクターゼ活性を抑制する方法。
【請求項１３】
セクレターゼ阻害剤の感受性の促進が、シノビオリンの発現を抑制することによるものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
シノビオリンをＨｅｒｐと結合させることを特徴とする、セレクターゼ活性を抑制する方法。
【請求項１５】
Ｈｅｒｐのシノビオリンとの結合領域が、Ｈｅｒｐのアミノ酸配列の１６１〜２００番目のアミノ酸残基で示される領域である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
セクレターゼがβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼである請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、セクレターゼ活性を抑制する方法および医薬組成物に関する。具体的には、シノビオリンの発現を抑制してセクレターゼ阻害剤の感受性を促進することによりセクレターゼ活性を抑制する方法、及びシノビオリンをＨｅｒｐと結合させることによりセクレターゼ活性を抑制する方法、並びに、セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】  シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞に存在する膜タンパク質として発見された新規タンパク質である（ＷＯ０２／０５２０７）。遺伝子改変動物を用いた研究により、骨・関節の発生および関節症の発症に同因子が直接関与することが明らかとなったことから、シノビオリンは正常な骨形成又は四肢の発達に貢献する活性を有するタンパク質であると考えられる。
シノビオリンの発現は、骨・関節にとどまらず全身にユビキタスにみられるため、シノビオリンの生体内での機能を解析するためには、シノビオリンと結合する因子の探索が有力な手法となる。特に、シノビオリンの基質タンパク質を検出することは、シノビオリンが関与する細胞内シグナル伝達経路の同定に重要な手係りになると考えられる。
そこで、本発明者は、シノビオリンがどのような細胞内シグナル伝達経路に関わっているかを解明するために、シノビオリンをＢａｉｔとしたＹｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ法によりシノビオリンと結合する因子の探索を行なった。その結果、Ｈｅｒｐ（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  １）と呼ばれるタンパク質がシノビオリンと相互作用をもつ分子として同定された。Ｈｅｒｐとは、１９９６年にＭｉｙａｔａらによって血管内皮細胞のホモシステイン応答性遺伝子の産物として発見されたタンパク質である（Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｎｏｖ  ２２；２７１（４７）：２９６５９−２９６６５）。
その後の研究によって、Ｈｅｒｐは、小胞体ストレスによって発現が誘導され、構造的にはＮ末端側にｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＵＢＬ）をもつ膜タンパク質であることが明らかとなった（Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ａｇａｒｗａｌａ  ＫＬ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ．Ｈｅｒｐ，ａ  Ｎｅｗ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  Ｓｔｒｅｓｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００  Ｏｃｔ  ２０；２７５（４２）：３２８４６−３２８５３）。また、Ｈｅｒｐは、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）の原因遺伝子とされているプレセニリン（ＰＳ）と相互作用をもちβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）の膜内切断に関わるタンパク質分解酵素であるγ−セクレターゼ（γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の活性を上昇させるということが報告されている（Ｓａｉ  Ｘ，Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｙ，Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｈ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ｋａｗａｉｃｈｉ  Ｍ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ，Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，Ｓｔｒｏｏｐｅｒ  ＢＤ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｋ，Ｋｏｍａｎｏ  Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１５）：１２９１５−１２９２０）。
アルツハイマー病は、高齢化が進む現代において高い関心が払われている疾患の一つである。その最も重要な特徴は、脳に老人斑、すなわち繊維状のβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）の沈着が観察されることである。そして、βタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がβ−セクレターゼとγ−セクレターゼによって切断されることにより生じるタンパク質であり、アルツハイマー病患者では、この切り出しが増加している。
従って、セクレターゼの酵素活性を阻害する物質は、アルツハイマー病の治療薬として注目され、世界中でスクリーニングが行われている。
しかし、候補物質は幾つか得られているものの、未だにセクレターゼ阻害剤の開発は成功していない。
【発明の開示】
本発明は、脳神経疾患、特にアルツハイマー病を治療するために有用な薬剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、セクレターゼ活性を抑制する物質に着目し、当該物質を用いると、Ａβの蓄積を抑制してアルツハイマー病を治療し得る知見を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物。
（２）セクレターゼがβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼである（１）記載の医薬組成物。
（３）セクレターゼ活性を抑制する物質が、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質である、（１）又は（２）記載の医薬組成物。
（４）セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質が、シノビオリンの発現抑制物質である（３）記載の医薬組成物。
（５）シノビオリンの発現抑制物質が、シノビオリンをコードする遺伝子に対するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡである（４）記載の医薬組成物。
（６）シノビオリンをコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を含むものである（５）記載の医薬組成物。
（７）ｓｉＲＮＡが、配列番号１に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とするものである（５）記載の医薬組成物。
（８）一部の配列が、配列番号３〜１６に示す塩基配列から選ばれる少なくとも１つである（７）記載の医薬組成物。
（９）セクレターゼ活性を抑制する物質がシノビオリンである（１）又は（２）記載の医薬組成物。シノビオリンとしては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
（１０）脳神経系疾患を治療するための（１）〜（９）のいずれか１項に記載の医薬組成物。
（１１）脳神経系疾患がアルツハイマー病である（１０）記載の医薬組成物。
（１２）セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することを特徴とする、セレクターゼ活性を抑制する方法。
（１３）セクレターゼ阻害剤の感受性の促進が、シノビオリンの発現を抑制することによるものである、（１２）記載の方法。
（１４）シノビオリンをＨｅｒｐと結合させることを特徴とする、セレクターゼ活性を抑制する方法。
（１５）Ｈｅｒｐのシノビオリンとの結合領域が、Ｈｅｒｐのアミノ酸配列の１６１〜２００番目のアミノ酸残基で示される領域である、（１４）記載の方法。
（１６）セクレターゼがβ−セクレターゼ又はγ−セクレターゼである（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、シノビオリンの全長構造とｂａｉｔに用いたＳｙｎｏ  ｄＴＭ及びＳｙｎｏ  Ｒｉｎｇの構造を示す模式図である。
図２は、Ｈｅｒｐの全長構造と断片化したＨｅｒｐの構造を示す模式図である。
図３は、Ｆｌａｇ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭとＨｅｒｐ各コンストラクトとのＧＳＴ融合タンパク質との結合実験の結果を示す図である。
図４は、ＨＡ／ＳｙｎｏとＦｌａｇ／Ｈｅｒｐとの免疫沈降実験の結果を示す図である。
図５は、野生型及びシノビオリン欠損マウス胎児繊維芽細胞におけるγ−セクレターゼ阻害剤の効果を示す図である。
図６は、Ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙにおけるシノビオリンとＨｅｒｐとの関係を示す図である。
図７は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるシノビオリンとＨｅｒｐとの結合領域を示す図である。
図８Ａは、ＭＥＦ細胞におけるＨｅｒｐの発現を示す図である。
図８Ｂは、Ｈｅｒｐのユビキチン化を示す図である。
図８Ｃは、Ｈｅｒｐの解析に用いたｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓを示す図である。
図９は、ＭＥＦにおけるγ−セクレターゼ活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者は、シノビオリンがアルツハイマー病の発症機序に関与する可能性に着目し、シノビオリンの発現をノックアウトした細胞において、セクレターゼ阻害剤の感受性が高まることを明らかにした。このことは、シノビオリンの発現を阻害させた状態において、セクレターゼ阻害剤の感受性が促進されることを意味しており、シノビオリンの欠失を介してセクレターゼ阻害剤の感受性が促進されることを示すものである。そして、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質を用いることが、アルツハイマー病の治療につながることを実証した。
また、本発明は、シノビオリンをＨｅｒｐ蛋白質と結合させると、Ｈｅｒｐ蛋白質がユビキチン化されて分解され、その結果、セクレターゼ活性が低下することを見出した。
１．概要
前述の通り、アルツハイマー病においては、セクレターゼ（例えばγ−セクレターゼ活性）によってＡＰＰが切り出され、Ａβが蓄積して老人斑が形成される。そこで本発明者は、セクレターゼがアルツハイマー病の発症機序に関与する点に着目し、セクレターゼ活性を抑制することによってＡβの蓄積並びに老人斑の形成を抑制するというプロセスの構築を考えた。
従って、本発明はセクレターゼ活性を抑制することにより、Ａβの蓄積を抑えることを特徴とする。そして、Ａβ蓄積を抑えることで、老人斑の形成を抑制し、アルツハイマー病の治療を行うことが可能となる。
シノビオリンは全身に発現が認められるタンパク質であり、生体において必須な機能を司ることが示されている。このため、シノビオリンの生体内での機能を解明することが求められていた。一般に、タンパク質の機能を明らかにするには、シノビオリンと結合する因子の探索が有力な手法のひとつに挙げられ、特に、シノビオリンの基質タンパク質を検出することは、シノビオリンが関与する細胞内シグナル伝達経路の同定に重要な手係りになると考えられる。
そこで、シノビオリンがどのような細胞内シグナル伝達経路に関わっているかを解明するために、本発明者は、前述の通り、酵母内での結合実験及びＧＳＴ  Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙにより、シノビオリンとＨｅｒｐが相互作用をもつことを示した。次に細胞内での相互作用を確認するために、シノビオリンとＨｅｒｐをＨＥＫ２９３細胞に共発現させ免疫沈降によって観察したところ、酵母内・ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果と同様にシノビオリンとＨｅｒｐの相互作用がみられた。このことは、シノビオリンがＨｅｒｐと相互作用することを裏付けるものである。そして、タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンにＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒモチーフの存在が示された。このモチーフはタンパク質の分解に関わるＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼに存在することが知られている。またＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒモチーフは、Ｅ２ユビキチン結合酵素の結合部位と考えられている。
従って、シノビオリンは、アルツハイマー病の発症機序、特に、セクレターゼ活性に関与すると考えられた。
ここで、本発明においてセクレターゼの活性を抑制するための機構として、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する場合と、シノビオリンをＨｅｒｐタンパク質（以下、単に「Ｈｅｒｐ」ともいう）に結合する場合が考えられる。
前者は、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することによりセクレターゼの活性を抑制し、Ａβの蓄積を抑えるというものであり、後者は、シノビオリンをＨｅｒｐに結合させてＨｅｒｐのユビキチン化を起こし、Ｈｅｒｐを分解させることによりＡβの蓄積を抑えるというものである。
以下、それぞれの態様について説明する。
２．セクレターゼ阻害剤の感受性の促進
本発明者は、セクレターゼ阻害剤の感受性に着目し、当該阻害剤の感受性を高めることによってＡβの蓄積並びに老人斑の形成を抑制するというプロセスの構築を考えた。そして、シノビオリンがアルツハイマー病の発症機序に関与する可能性に着目し、シノビオリンの発現をノックアウトした細胞において、セクレターゼ阻害薬の感受性が高まることを明らかにした。このことは、シノビオリンの発現を阻害させた状態では、セクレターゼ阻害剤の感受性が促進されることを意味しており、シノビオリンの欠失を介してセクレターゼ阻害剤の感受性が促進されることを示すものである。そして、セクレターゼ阻害薬の感受性を促進する物質を用いることが、アルツハイマー病の治療につながることを実証した。
ここで、「セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する」とは、セクレターゼ阻害剤が有効に機能するようにその薬物効果を高めることを意味する。
（１）シノビオリン発現阻害及び活性阻害
セクレターゼ阻害剤の感受性を高めるためには、シノビオリンの発現を阻害する方法が採用される。
シノビオリンの発現阻害には、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。シノビオリン遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ）シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０２４６９０（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
（ｂ）選択した領域から、ＡＡで始まる配列を選択し、その配列の長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。その配列のＧＣ含量は、例えば４０〜６０％となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号１に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列を含むＤＮＡをｓｉＲＮＡの標的配列として使用することができる。特に、（ｉ）（配列番号３）、（ｉｉ）（配列番号４）、（ｖｉ）（配列番号８）、（ｖｉｉ）（配列番号９）、（ｖｉｉｉ）（配列番号１０）を標的とすることが好ましい。
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ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループを構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるシノビオリン遺伝子（配列番号１）の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
（２）セクレターゼ阻害活性
セクレターゼ阻害剤の感受性を評価する方法として、アルツハイマー病患者の脳での感受性測定実験は倫理上極めて困難であり、他の評価系を用いる必要がある。そこで、本発明者は、細胞にセクレターゼ阻害剤を処置し、当該細胞の増殖活性をセクレターゼ阻害の指標とした評価系を用いる。ここで、セクレターゼの種類は特に限定されるものではなく、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼが挙げられる。従って、セクレターゼ阻害剤は、β−セクレターゼ阻害剤及びγ−セクレターゼ阻害剤のいずれでもよい。セクレターゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、例えばＬ−６８５，４５８（（株）ペプチド研究所）、（３，５−Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ）−Ａｌａ−Ｐｈｇ−ＯＢｕｔ［ＤＡＰＴ］（（株）ペプチド研究所）、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｔａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（（株）ペプチド研究所）、Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ（Ｗａｋｏ社）などが挙げられる。
細胞の増殖活性が抑制されたときに、セクレターゼ活性が阻害されたと判断する。つまり、細胞の増殖活性がより抑制されるほど、セクレターゼ阻害剤の作用、感受性が強いことになる。細胞は、野生型のシノビオリン遺伝子をもつマウス、及び、シノビオリン遺伝子をノックアウトさせたシノビオリン欠損マウスの胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いて、シノビオリンの発現の有無によるセクレターゼ阻害剤の感受性の変化を比較する。
上記シノビオリン欠損細胞を用いて阻害剤の効果を調べた結果、シノビオリンを欠損した細胞の方が、シノビオリンを持っている野生型の細胞に比べ細胞増殖の低下がみられた。すなわち、シノビオリンを欠失すると、セクレターゼ阻害剤の感受性が促進したことを意味する。
（３）医薬組成物
本発明において作製されたｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡは、シノビオリンの発現を抑制する物質であり、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質を含む医薬組成物（特にアルツハイマー病などの脳神経系疾患の遺伝子治療剤）として使用することができる。
本発明の医薬組成物を脳神経系疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、脳（大脳、間脳、中脳、小脳）、延髄、脊髄などの中枢神経系を対象として適用される。
上記脳神経系疾患は、単独であっても、併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
３．シノビオリンとＨｅｒｐとの結合
上記したように、Ｈｅｒｐは、小胞体ストレスによって発現が誘導され、構造的にはＮ末端側にＵＢＬをもつ小胞体膜貫通タンパク質であり、細胞内在性のＨｅｒｐはポリユビキチン化されていることが分かっている。本発明者は、このＨｅｒｐに着目し、当該Ｈｅｒｐを分解することによって、γ−セクレターゼ活性を抑制してＡβの膜内切断を抑えることにより、Ａβの蓄積並びに老人斑の形成を抑制するというプロセスの構築を考えた。
一方、上記のように、シノビオリンをＢａｉｔとしたＹｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ法によりシノビオリンと結合する因子の探索を行なったところ、シノビオリンとＨｅｒｐが相互作用をもつことが示され、この相互作用は細胞内でも観察された。そこで、発明者らはシノビオリンをＨｅｒｐに結合させることにより、セクレターゼ活性を抑制する方法を検討した。
（１）シノビオリンとＨｅｒｐの最小結合部位の決定
シノビオリンとＨｅｒｐとの最小結合部位は、Ｈｅｒｐの各種切断断片を用いて、その断片とシノビオリンとの結合試験を行うことにより決定することができる。Ｈｅｒｐを用いてシノビオリンとの結合実験を行うと、Ｈｅｒｐのシノビオリンとの最小結合部位は、ヒトＨｅｒｐ遺伝子（配列番号１７）によりコードされるアミノ酸配列（配列番号１８）のうち第１６１〜２００番目の４０アミノ酸残基にあたる領域である（下記配列）。
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ここで、本発明において使用されるシノビオリンは、上記配列番号１によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）を有するものであってもよく、また、当該アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってＨｅｒｐをユビキチン化により分解させる活性を有するものでもよい。本発明においては、上記欠失、置換等の変異の導入は、公知の部位特異的突然変異誘発法により行うことができる（例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等（Ｔａｋａｒａ社製）を使用することができる。
培養細胞におけるシノビオリンとの結合に必須なＨｅｒｐタンパク質領域を同定するには、以下の通り行うことができる。
ヒトＨｅｒｐに関して、上記４０アミノ酸残基の領域を欠失させたＨｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）遺伝子を作製し、この遺伝子を適当なベクターに挿入してＨＥＫ２９３Ｔ等の細胞に導入し、シノビオリンと強発現させると、欠失部位がシノビオリンとＨｅｒｐとの結合に必須の部位であるか否かが分かる。免疫沈降試験を行うためにこのＨｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）のＮ端にＨＡ  ｔａｇをつけて標識し、同様に、シノビオリンの標識には、ＦＬＡＧ  ｔａｇをつけてもよい。
結果の解析は、強発現後にｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＷＣＥ）を抽出して、タンパク質の発現を確認した上、抗ＨＡ抗体あるいは抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行えばよい。得られた免疫沈降産物をウェスタンブロット法で試験すると、Ｈｅｒｐはシノビオリンと結合するが、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）はシノビオリンと結合しないため、Ｈｅｒｐタンパク質上の１６１番目から２００番目アミノ酸領域（配列番号１９）はシノビオリンとの結合に必須であることがわかる。
（２）Ｈｅｒｐのユビキチン化による分解の確認
Ｈｅｒｐは、シノビオリンと結合することによりユビキチン化されて分解する。従って、Ｈｅｒｐがシノビオリンの基質であるか否かは、Ｈｅｒｐのポリユビキチン化により確認することができる。すなわち、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＦＬＡＧ  ｔａｇをつけ、さらにアミノ酸残基の一部を変異させたＨｅｒｐ変異体を作製して、ＨＡ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎおよびシノビオリンを発現させる。その後、細胞抽出物（ＷＣＥ）を抽出し、ウェスタンブロット法で各タンパク質の発現を確認した後、抗−ＨＡ抗体による免疫沈降を行うことにより、Ｈｅｒｐが細胞内でポリユビキチン（ｐｏｌｙ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ；Ｕｂ）化されているか否かを確認する。
Ｈｅｒｐ野生型においては、ユビキチンだけ強発現させた場合、またはユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合に、ポリユビキチン化のバンドが観察される。また、ユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合は、ユビキチンだけ強発現させた場合よりもＨｅｒｐとＨｅｒｐ変異体のＵｂ化バンドは弱いことから、Ｕｂ化されたＨｅｒｐの分解が亢進していることが分かる。一方、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）ではユビキチンだけ強発現させた場合、およびユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合のいずれにおいても、ポリユビキチン化のバンドは検出されない。また、Ｈｅｒｐからユビキチン領域（ＵＢＬ）を欠失させたＨｅｒｐ（−ＵＢＬ）の場合は、ユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合の方がユビキチンだけ強発現させた場合よりＨｅｒｐ（−ＵＢＬ）のＵｂ化バンドが強い。これらのことから、ＨｅｒｐのＵＢＬ領域はシノビオリンとの結合やシノビオリンによるＵｂ化に必須ではないが、分解に必須であることがわかる。
（３）ＭＥＦにおけるγ−セクレターゼ活性の比較
アルツハイマー病におけるシノビオリンの関与は、シノビオリンをノックアウトした細胞（例えばＭＥＦ（ｓｙｎｏ（−／−））を用いて、野生型細胞（例えばＭＥＦ（ｓｙｎｏ（＋／＋））におけるγ−セクレターゼ活性と比較することにより、検討することができる。すなわち、ＭＥＦ細胞を溶解バッファーで処理して細胞溶解液とした後、反応バッファーと蛍光標識された基質を加えて酵素反応を行い、所定の励起波長、測定波長で蛍光を測定すると、ＭＥＦにおいてγ−セクレターゼ活性の増加の有無を確認することができる。
本発明においては、シノビオリンをＨｅｒｐに結合させると、Ｈｅｒｐが分解されてγ−セクレターゼ活性を抑制することができる。なお、Ｈｅｒｐは、ＦＡＤの原因遺伝子とされているプレセニリン（ＰＳ）と相互作用をもち、複合体を形成することにより、γ−セクレターゼの活性を上昇させることも分かっている。従って、シノビオリンとＨｅｒｐの結合体及びシノビオリンとＨｅｒｐ−ＰＳ複合体との結合体を用いると、アルツハイマー病の治療につながることが実証されている。
（４）医薬組成物
本発明において、シノビオリンをＨｅｒｐ又はＨｅｒｐ−ＰＳ複合体に結合させると、ユビキチン化によりＨｅｒｐの分解を引き起こし、ひいてはアルツハイマー病の原因となるＡβタンパク質の蓄積を抑制することから、シノビオリンは、セクレターゼ活性の抑制に関与する物質であり、アルツハイマー病などの脳神経系疾患を治療するための医薬組成物として使用することができる。
本発明の医薬組成物を脳神経系疾患の治療剤として使用する場合は、脳（大脳、間脳、中脳、小脳）、延髄、脊髄などの中枢神経系を対象として適用される。本発明の医薬組成物は、そのまま患部に適用することもできるし、あらゆる公知の方法、例えば、静脈、筋肉、腹腔内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与、カテーテルなどを用いた血管内投与等により対象となる細胞や臓器に導入することもできる。
また、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる。）などと混合することができる。
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、筋肉、腹腔等への局部注射、静脈への注射等が例示される。
投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日の維持量として成人１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇであり、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。シノビオリンは、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
本発明の医薬組成物（シノビオリン）を生体内で遺伝子発現させて使用する場合（遺伝子治療の場合）は、前記遺伝子治療剤について述べたのと同様に、シノビオリン遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、シノビオリン遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
ここで、本発明において使用されるシノビオリン遺伝子は、上記配列番号１に示す塩基配列を有するものに限定されるものではなく、当該塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｈｅｒｐとの結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜５００ｍＭ、好ましくは１５０〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件を意味する。
また、シノビオリン遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。上記遺伝子を保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。
シノビオリン遺伝子の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
シノビオリン遺伝子を目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例は、Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍによるＨｅｒｐのスクリーニングの実施例である。
Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍは、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い、酵母形質転換法（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２，１９９１）で行った。
シノビオリンｃＤＮＡの７０６ｂｐ（２３６番目のアミノ酸）から１８５１ｂｐ（６１７番目のアミノ酸）又は８０５ｂｐ（２６９番目のアミノ酸）から１２６０ｂｐ（４２０番目のアミノ酸）の末端をＥｃｏＲ  Ｉ／Ｘｈｏ  ＩとしｐＧＢＴ９  ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏＲ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉサイトに挿入した（以下、シノビオリンの７０６ｂｐ（２３６番目のアミノ酸）から１８５１ｂｐ（６１７番目のアミノ酸）をＳｙｎｏ  ｄＴＭ、８０５ｂｐ（２６９番目のアミノ酸）から１２６０ｂｐ（４２０番目のアミノ酸）をＳｙｎｏ  Ｒｉｎｇという。図１参照。）。なお、図１において「ｂｐ」は塩基配列の位置番号を示している。
Ｈｅｒｐのスクリーニングに用いるライブラリーはヒト軟骨由来のｃＤＮＡをｐＡＣＴ２  ｖｅｃｔｏｒに挿入したものを用いた（ｐＡＣＴ２−Ｙ）。４２℃、１５分のヒートショックの後、酵母株Ｙ１９０にｐＧＢＴ９−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ又はｐＧＢＴ９−Ｓｙｎｏ  Ｒｉｎｇ（２．０μｇ）、ｐＡＣＴ２−Ｙ（２０μｇ）を導入した。
各ベクターを導入したＹ１９０をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）緩衝液（ＴＥ）で洗浄後、ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ＨｉｓプレートにＴＥで希釈したＹ１９０の溶液を広げ、３０℃で１０日培養した。現れてきたコロニーに対し、０．５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを基質とするβガラクトシダーゼフィルターアッセイを行い、陽性クローンを検出した。
陽性クローンをＳＤ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地にて３０℃で１０日震盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１６９−１８２，１９９１）にてプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡを大腸菌株ＨＢ１０１に形質転換し、Ｍ９プレート（−Ｌｅｕ）に広げ、３７℃で２日培養した。現れてきたコロニーを２０μｇ／ｍｌ  ＬＢ培地で３７℃、１６時間震盪培養しアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドＤＮＡを抽出した。
抽出したプラスミドＤＮＡに挿入されているヒト軟骨由来のｃＤＮＡ断片の解析にはＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。シークエンスの解析結果をＢＬＡＳＴにより検索した結果、ホモシステイン誘導性の小胞体タンパク質ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｓｉｂｌｅ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｍｂｅｒ  １（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＢＣ０３２６７３以下、Ｈｅｒｐと略す）を得た。
【実施例２】  本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてシノビオリンとＨｅｒｐを結合させた実施例である。
ＴＮＴ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びシノビオリンの７０６ｂｐから１８５４ｂｐを挿入したｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭを作製した。これを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎを行い、（ｉ）Ｆｌａｇ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ融合タンパク質、（ｉｉ）ＨｅｒｐのＧＳＴ融合タンパク質、（ｉｉｉ）断片化したＨｅｒｐのＧＳＴ融合タンパク質を作製した（図２）。図２において、「ａ．ａ．」はアミノ酸配列の位置番号を示し、ＵＢＱはユビキチンドメインを示している。
これらの融合タンパク質及び（ｉｖ）対照としてのＧＳＴタンパク質を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ，５％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．２ｍＭ  ＮａＶＯ４，５ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む結合バッファーに加え、４℃で１６時間反応させた。その反応物についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、イメージアナライザー（ＢＡＳ２０００，Ｆｕｊｉｘ）で放射活性を検出した。
その結果、Ｈｅｒｐ−ＭとＨｅｒｐ−ＣのＧＳＴ融合タンパク質と［３５Ｓ］ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭの結合が観察された。
コントロールであるＧＳＴとｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭとの結合は認められなかった（図３）。この結果から、シノビオリンとＨｅｒｐは、タンパク質の相互作用により結合することが推測された。
【実施例３】  本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてシノビオリンとＨｅｒｐを結合させた実施例である。
ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈに２  Ｘ  １０６ｃｅｌｌｓ蒔き、２４時間培養後、シノビオリンの１ｂｐから１８５４ｂｐを挿入したｐｃＤＮＡ３−ＨＡ／Ｓｙｎｏ、及びＨｅｒｐの１ｂｐから１１７６ｂｐを挿入したｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ／Ｈｅｒｐを、各３μｇずつ遺伝子導入した。遺伝子導入して２４時間後細胞を回収し、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに溶解後、抗ＨＡ及び抗Ｆｌａｇ抗体で４℃下終夜免疫沈降を行った。遠心操作により結合タンパク質と遊離タンパク質を分け、ウェスタンブロット法により検出した。検出には抗ＨＡ及び抗Ｆｌａｇ抗体を用いた。
その結果、シノビオリン及びＨｅｒｐを共発現した細胞では、抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降後、抗Ｆｌａｇ抗体で検出するとＦｌａｇ−Ｈｅｒｐのバンドを確認することができた。また、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降した後、抗ＨＡ抗体で検出するとＨＡ−シノビオリンのバンドを確認することができた。この結果より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下と同様にシノビオリンとＨｅｒｐは、タンパク質の相互作用により結合することが推測された（図４）。なお、図４において、ＩＰは免疫沈降に用いた抗体の種類を示し、ＷＢはウェスタンブロットに用いた抗体の種類を示す。＊印はＩｇＧ  ＨＣ（ＩｇＧ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、重鎖）を示している。
【実施例４】  本実施例は、シノビオリン欠失細胞での細胞増殖活性におけるγ−セクレターゼ阻害剤の影響を確認した実施例である。
シノビオリン遺伝子導入マウス（野生型マウス）及びシノビオリン遺伝子欠損マウスから得られた胎児繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）を、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１  Ｘ  １０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるようにまき、終夜培養した。培養後の細胞にγ−セクレターゼ阻害剤（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ、Ｗａｋｏ）を処理し、２４時間培養した後にＡｌａｍｅｒ  Ｂｌｕｅを加え、２時間後に吸光度を測定した。
結果を図５に示す。なお、図５において、黒いカラムは野生型マウス由来の細胞、白いカラムはシノビオリン欠損マウス由来の細胞を示している。シノビオリン欠損マウス由来の細胞では、γ−セクレターゼ阻害剤の作用が野生型マウス由来の細胞よりも顕著である。なお、Ｔｕｎｉ．はツニカマイシンを表している。
図５より、シノビオリン欠損マウス胎児繊維芽細胞（Ｓｙｎｏ−／−）においてγ−セクレターゼ活性を阻害したものはシノビオリンマウス胎児繊維芽細胞（Ｓｙｎｏ＋／＋）と比較して細胞の増殖活性の抑制がみられた。このことは、シノビオリンの有無で細胞のγ−セクレターゼ阻害剤への感受性が変化するということ、すなわち、シノビオリンを欠失するとγ−セクレターゼ阻害剤の感受性が促進されるということを意味する。そのため、シノビオリンの抑制剤はアルツハイマー病の病理過程の第１段階とされているＡβの蓄積を調節することにより、アルツハイマー病の治療薬として利用することが出来る。
【実施例５】  本実施例は、シノビオリンに対するＨｅｒｐの最小結合部位を決定したものである。
すなわち、シノビオリンをＢａｉｔとしたＹｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇにより、ヒト軟骨ｃＤＮＡライブラリーより得られたシノビオリンの基質候補分子Ｈｅｒｐに関して、シノビオリンとの最小結合部位を決定した。すなわち、ｐｃＤＮＡ３  Ｆｌａｇ又はＨＡベクターに組み込まれたＨｅｒｐを鋳型としたＰＣＲによって、断片化したインサートの作成を行った。ＧＳＴ  Ｐｕｌｌ  Ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙを目的として、シノビオリン及びＨｅｒｐを断片化し、ｐＧＥＸ及びｐｃＤＮＡ３ベクターに挿入した。
その結果、Ｈｅｒｐのアミノ酸配列番号１６１−２００とｓｙｎｏ  ｄＴＭが結合することが予想された（図６）。
【実施例６】  本実施例は、培養細胞におけるシノビオリンとの結合に必須なＨｅｒｐタンパク質領域を同定したものである。
実施例５の結果より、シノビオリンとＨｅｒｐの結合に必要なＨｅｒｐ側のアミノ酸は１６１−２００の４０アミノ酸と考えることができる（図６）。そこで、Ｈｅｒｐの１６１−２００の４０アミノ酸を除いたＨｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）を作製し、細胞内でのシノビオリンとの結合実験を行なった。
Ｈｅｒｐはシノビオリンと結合することが明らかにされ、Ｈｅｒｐタンパク質上シノビオリンと結合する領域（アミノ酸配列の１６１〜２００の間）の同定も進んでいた。本実施例では、この領域を欠失した場合に、Ｈｅｒｐとシノビオリンとの結合にどのような影響が及ぶのかについて、以下のように実験を行った。
Ｈｅｒｐ遺伝子上、１６１番目から２００番目までのアミノ酸をコードする部分を、ＰＣＲ法により欠失させ、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）遺伝子を作製した（図７上）。そして、この遺伝子のＮ端にＨＡ  ｔａｇを付け、ｐｃＤＮＡ３  ｖｅｃｔｏｒに挿入した。続いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＨＡ  ｔａｇ付きＨｅｒｐ、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）、空ｖｅｃｔｏｒをそれぞれＦＬＡＧ  ｔａｇ付きシノビオリンと強発現させた。２４時間後にｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＷＣＥ）を抽出し、各タンパク質の発現を確認した上、抗ＨＡ抗体或は抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降を行った。
１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した免疫沈降産物でウェスタンブロット法を行った結果、Ｈｅｒｐはシノビオリンと結合するが、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）はシノビオリンと結合しないことが分かった（図７下）。従って、Ｈｅｒｐタンパク質上の１６１番目から２００番目アミノ酸領域はシノビオリンとの結合に必須であることが明らかになった。
【実施例７】  本実施例は、Ｈｅｒｐはシノビオリンの基質であることを検討したものである。
実験手法は以下の通りである。
Ｈｅｒｐはｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ，ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ実験により、細胞内においてシノビオリンと結合することが明らかになっている。ＨｅｒｐはＮ端にＵＢＬを持つ小胞体膜貫通蛋白質であり、細胞に発現させたＨｅｒｐはポリユビキチン化されていることが報告されている（Ｋｏｋａｍｅ  Ｋ，Ｋａｔｏ  Ｈ，Ｍｉｙａｔａ  Ｔ．Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｎｏｖ  ２２；２７１（４７）：２９６５９−２９６６５）。また、シノビオリン（−／−）ＭＥＦ細胞中のＨｅｒｐ蛋白質は、シノビオリン（＋／＋）ＭＥＦ細胞中に比べ、蓄積されていることも観察された（図８Ａ）。このため、Ｈｅｒｐはシノビオリンの基質である可能性が十分考えられた。
なお、上記実験において、抗Ｈｅｒｐ（Ｎ）抗体の認識部位として、Ｈｅｒｐのアミノ酸配列の第３７〜５０番目の領域であるＬＫＡＨＬＳＲＶＹＰＥＲＰＲ（配列番号２０）からなるアミノ酸配列を用いている。
しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのユビキチン反応系においては、ＨｅｒｐのＧＳＴ融合タンパク質であるＧＳＴ−Ｈｅｒｐに関しては、シノビオリン非存在下でもユビキチン化されるバンドが観察された。
そこで、本実施例では、Ｈｅｒｐがシノビオリンの基質となり、自己ユビキチン化されるのかについて検討した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＦＬＡＧ  ｔａｇ付き各種Ｈｅｒｐ変異ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ（図８Ｃ）を用いて、それぞれＨＡ−Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ／ｐｃＤＮＡ３またはシノビオリン／ｐｃＤＮＡ３と強発現させた。
強発現から２４時間後、細胞からｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＷＣＥ）を抽出し、ウェスタンブロット法で各蛋白質の発現を確認した。そして、抗ＨＡ抗体による免疫沈降を行い、抗ＦＬＡＧ抗体によるＨｅｒｐ蛋白質のポリユビキチン化の有無を検討した。
Ｈｅｒｐ野生型においては、ユビキチンだけ強発現させた場合、またはユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合、ポリユビキチン化のバンドが観察された。また、ユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合は、ユビキチンだけ強発現させた場合よりもＨｅｒｐのＵｂ化バンドは弱くなったことから、Ｕｂ化されたＨｅｒｐの分解が亢進していると思われた。これに対し、Ｈｅｒｐ（−ｂｉｎｄ）ではユビキチンだけ強発現させた場合、またはユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合のいずれも、ポリユビキチン化のバンドが検出されなかった。また、Ｈｅｒｐ（−ＵＢＬ）の場合、ユビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合の方がユビキチンだけ強発現させた場合よりＨｅｒｐ（−ＵＢＬ）のＵｂ化バンドが強かった（図８Ｂ）。従って、ＨｅｒｐのＵＢＬ領域はシノビオリンとの結合やシノビオリンによるＵｂ化に必須ではないが、分解に必須であると考えられた。
【実施例８】  本実施例は、アルツハイマー病でのシノビオリンの関与を検討するため、ＭＥＦ（ｓｙｎｏ（＋／＋）及び（−／−））におけるγ−セクレターゼ活性の比較を行なったものである。
ＭＥＦ（ｓｙｎｏ（＋／＋）及び（−／−））を溶解バッファーで処理して細胞溶解液とした後、反応バッファーと、蛍光標識された基質である合成ＡＰＰを加えて、３７℃、２時間で酵素反応を行なった。測定は、励起波長３６０ｎｍ、測定波長４６５ｎｍで蛍光を測定することにより行なった。
その結果、ｓｙｎｏ（＋／＋）に比べて、ｓｙｎｏ（−／−）のＭＥＦにおいて、γ−セクレターゼ活性の増加が見られた（図９）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、セクレターゼ活性を抑制する方法が提供される。また、本発明により、セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病などの脳神経系疾患治療薬として有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【国際調査報告】
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