(57)【要約】硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および変性剤を組成に含む緩衝剤が提供された。本発明の緩衝剤は、低温条件下においてもプライマーのアニールと相補鎖合成を可能とする。本発明により、たとえぱ１０ｍｅｒのような短いプライマーを利用した、部位特異的な相補鎖合成が可能となる。本発明は、ＧＰ法に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の組成を含む、核酸合成用緩衝剤組成物。
ａ）核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、
ｂ）０．１−５０ｍＭのＭｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩のいずれか、または両方
ｃ）１−２００ｍＭの１価の金属塩
ｄ）０．００５〜０．５Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
【請求項２】
緩衝剤が、７．５−９のｐＨを与える緩衝剤である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｍｇ２＋塩が、ＭｇＣｌ２である請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
１価の金属塩が、ＫＣｌ、およびＮａＣｌのいずれか、または両方である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩が、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａＨＣＯ３からなる群から選択される少なくとも１種類の塩である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
変性剤が、非イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、および洗浄剤からなる群から選択される少なくとも１種類の変性剤である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
非イオン系界面活性剤が、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、およびソルビトールエステルのポリオキシエチレンエーテルからなる群から選択される少なくとも１種類の非イオン系界面活性剤である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
洗浄剤が、ドデシル硫酸塩、ラウロイルサルコシン塩、ラウリル酸塩、およびメルカプト酢酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の化合物である請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
合成すべき核酸が、鋳型となる核酸の複数の領域を鋳型とする相補鎖である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
下記の成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方の存在下で、低温でオリゴヌクレオチドを相補鎖にアニーリングさせる方法。
ｄ）０．０１−０．１Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
【請求項１１】
低温条件が、前記オリゴヌクレオチドの融解温度よりも１０〜３０℃低い温度である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、５−２０塩基の長さを有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、７−１５塩基の長さを有する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが、鋳型となる核酸の複数箇所にアニールするプライマーである請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
下記の成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方を有効成分として含有する、オリゴヌクレオチドのアニーリングの安定剤。
ｄ）０．０１−０．１Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、核酸の合成反応に有用な緩衝液組成物に関する。
【背景技術】  ＤＮＡ合成酵素やＲＮＡ合成酵素を利用した、核酸の相補鎖合成反応は公知である。相補鎖合成反応は、鋳型となる核酸にアニールしたプライマーの３’末端に、鋳型を構成する塩基と相補的な塩基を付加する反応である。反応の結果、鋳型と鋳型に相補的な塩基配列からなる２本鎖核酸が生成される。相補鎖合成反応は、遺伝子の単離や解析のための様々な操作に応用されている。
遺伝子の解析は、相補鎖合成反応の主要な用途の一つである。相補鎖合成反応には、まずプライマーのアニールが必要である。言い換えれば、プライマーがアニールしなければ相補鎖合成反応は進行しない。この原理を利用して、相補鎖合成反応生成物を指標とする核酸の検出方法や同定方法が実用化されている（特公平４−６７９５７号公報）。たとえばＰＣＲ法に基づく遺伝子の検出方法は、感度と特異性に優れた遺伝子の検出方法として知られている。
ＰＣＲ法に基づく遺伝子の検出方法においては、検出対象の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがプライマーとして利用される。以下、検出対象として想定された塩基配列を標的塩基配列と記載する。試料中に標的塩基配列を含む核酸が存在すれば、プライマーのアニールと相補鎖合成反応が進行する。しかし標的塩基配列を含む核酸が存在しなければ、アニールも相補鎖合成反応も起こらない。したがって、ＰＣＲ反応産物が検出されたときには、標的塩基配列の存在を証明することができる。
ＰＣＲ法は、標的塩基配列が明らかな場合には、強力な解析ツールとなる。その反面、たとえば、比較すべき塩基配列が必ずしも明確でない場合には、適切なプライマーをデザインすることができない。更にＰＣＲ法は、ある特定の塩基配列の存在を証明する場合には、優れた感度と特異性を発揮する。このことは、類似の核酸をＰＣＲ法によって識別するためには、両者の識別が可能な塩基配列を標的塩基配列として選択しなければならないことを意味する。そのため、未知の核酸や、きわめて類似性の高い核酸の間の相違を、ＰＣＲ法によって区別するには、それを可能とするプライマーのデザインが大きな課題となっていた。
ＰＣＲ法の課題を解決するために様々な方法が提案されている。本発明者らは、ＰＣＲ法の課題を解決するための方法として、ＧＰ法（Ｇｅｎｏ−Ｐａｔｅｒｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を開発した。ＧＰ法は、類似性の高い核酸の間の相違を明瞭に識別することができる核酸の解析方法である。ＧＰ法においては、被検核酸の複数の領域について、相補鎖が合成される。このとき、各相補鎖はできるだけ１本鎖として合成されるようにプライマーと相補鎖合成反応がデザインされる。その結果、１つの反応系に相補鎖を伴わない核酸が混在する状態が作り出される。
それぞれの核酸は、異なる領域に由来しているため、それぞれ異なる塩基配列を含んでいる。もしも部分的に相補的な塩基配列を含んでいるものがあれば、両者は互いにハイブリダイズする。しかし完全な相補鎖ではないため、ハイブリダイズは部分的な現象に過ぎない。同様に、一つの核酸の中でも、相補的な塩基配列があれば、自身にハイブリダイズする場合もある。こうして、複雑に絡み合った核酸の集合体が構成される。ＧＰ法における集合体を図１に模式的に示した。図１においては、「波形生成用プライマー」で示したプライマーによって、被検核酸の複数の領域を鋳型として相補鎖が合成されている。そしてこの合成産物が集合体を構成する。
ＧＰ法は、こうして構成された核酸の集合体を解析の対象とする。すなわち、この集合体の融解曲線の比較によって、核酸が同定される。ＧＰ法における核酸の集合体は、様々な組み合わせの２本鎖核酸を含むため、融解曲線には複数の融解温度が記録される。相補鎖合成反応の条件が同一であれば、同じ被検核酸から得られる融解曲線のパターンは同一である。融解曲線のパターンは被検核酸にユニークなので、融解曲線の比較により核酸の同定が可能となる。
さて、ＧＰ法においては、被検核酸の複数の領域について、相補鎖合成が行われる。そのためには複数のプライマーが必要である。つまり、合成すべき領域に対してそれぞれ個別のプライマーをデザインすればよい。しかし、もしもより短い塩基配列のプライマーを利用することができれば、複数の領域の間でプライマーを共有できる可能性がある。たとえば７ｍｅｒのプライマーは、確率的には、１６３８４塩基（４７）に１回の割合でアニールすると期待できる。すなわち、たとえば７ｍｅｒの長さを有する１種類のプライマーの利用によって、（被検核酸の全長／１６３８４）種類の合成産物を得ることができる。反応に必要なプライマーの種類が少ないことは、経済的なメリットである。また少ないプライマーで反応を構成すれば、各領域間のプライマーのアニーリングの条件を一定に保つことが容易なので、再現性の向上にも貢献するはずである。
しかし実際には、相補鎖合成反応において、短いプライマーを鋳型にアニールさせるためには様々な問題を伴う。まず、短いプライマーは融解温度（以下Ｔｍと省略する）が低いため、低いアニーリング温度が必要である。Ｔｍ（℃）はＷａｌｌａｃｅの式″２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）″に基づいて導かれる（Ｔｈｅｉｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｓｅａｓｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．ＫＥ  Ｄａｖｉｅｓ，ｐｐ３３−５０．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。
たとえば実施例に用いたプライマーＢＡＵＰ６５；５’−ＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：６／１１ｍｅｒ）のＴｍは、３８℃である（２（２［ａ］＋１［ｔ］）＋４（０［ｃ］＋８［ｇ］）＝３８）。ＰＣＲ法などにおけるプライマーのアニーリング温度は、一般的にはプライマーのＴｍより５℃程度低い温度に設定される。すなわちＴｍが３８℃であれば、３３℃がアニーリング温度となる。ＰＣＲなどの一般的な相補鎖合成反応は、通常６０℃以上の温度がアニーリングに利用される。たとえば５０℃以下といった低温条件下での相補鎖合成反応には、さまざまな障害が伴うことが知られている。
まずアニーリング温度の低下は、非特異的なアニーリングの増加の原因となる。つまりアニーリング温度の低下に伴って、相補的な塩基配列のみならず、相補性の低い塩基配列に対してもアニーリングしてしまう現象が増えてくる。一方で、低温条件下では、プライマーの構造変化によってアニーリングが起こりにくくなることが知られている。たとえば、温度の低下によるプライマー間の非特異的な凝集、あるいはプライマーの物理的な自由度（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）の低下などが、相補鎖合成を妨げると考えられている。いずれにせよ、１０塩基前後という短いプライマーを用いて相補鎖を合成することは、現状では困難である。そのため、通常、相補鎖合成のためのプライマーは、少なくとも２０塩基前後の長さが必要とされている。
一方、複数の領域の相補鎖合成のために、ランダムプライマーが利用されている。ランダムプライマーは、１０ｍｅｒ前後の長さを有するオリゴヌクレオチドの集合体である。ランダムプライマーを構成するオリゴヌクレオチドは、任意の塩基配列からなっている。ランダムプライマーは、一般には、多型解析やプローブの合成などに利用されている。ランダムプライマーを使った相補鎖合成反応には、通常、特異性が要求されない。そのため低いストリンジェンシー条件の下で、相補鎖合成が行われる。言い換えれば、非特異的なアニーリングを積極的に誘導するときに、ランダムプライマーが利用されている。
ＧＰ法では、複数の領域が、特異的に再現性を維持して合成されることが望ましい。相補鎖が特異的に合成されなければ、融解曲線の再現性の維持が難しくなる可能性がある。したがって、ランダムプライマーの反応条件をＧＰ法に応用することはできない。ＧＰ法のためには、低温条件下での特異的な相補鎖合成反応を可能とする技術が必要である。
【発明の開示】
本発明は、低温条件における相補鎖合成反応に有用な緩衝剤組成物の提供を課題とする。
ＰＣＲ法などの相補鎖合成反応のために利用されている一般的な緩衝液の組成の例を以下に示す（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  ｅｄ．Ｖｏｌ．３  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １．９，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。
１０ｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ
５００ｍＭ  ＫＣｌ
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３  ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ）
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
ストリンジェンシーは、温度条件に加えて、塩濃度にも支配されている。更にもしも溶液中に変性剤などのハイブリダイズに影響する成分が共存するときには、これらの成分によってもストリンジェンシーは変動する。したがって、温度を一定に維持しつつ、これらの成分の使用量を調節することによって、ある程度、ストリンジェンシーを調節することは可能である。
たとえば、塩濃度の低下はストリンジェンシーを強める方向に作用する。つまり塩濃度が高い条件は、低い条件に比べてアニーリングが容易になる。この現象を利用して、ＰＣＲ法などでは、しばしばＭｇ２＋イオンの濃度を上げてストリンジェンシーを弱めることが試みられる。反応が十分に進まないときには、更にジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール、あるいはグリセリンなどが反応増強のために添加される。しかし、これらの手法を組み合わせても、たとえば室温でのアニーリングは不可能である。
本発明者らは、低温条件下で特異性を維持しつつ、十分な相補鎖合成を可能とする緩衝剤を見出すために、様々な添加剤の組み合わせについて見当を重ねた。その結果、一般的な相補鎖合成反応用の緩衝液を構成する２価あるいは１価の金属塩に加えて、特定の塩類を添加することで、前記課題を解決できることを見出した。更に、変性剤を添加することによって、十分な相補鎖合成反応効率を達成できることを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の緩衝剤組成物ならびにその使用に関する。
〔１〕下記の組成を含む、核酸合成用緩衝剤組成物。
ａ）核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、
ｂ）０．１−５０ｍＭのＭｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩のいずれか、または両方
ｃ）１−２００ｍＭの１価の金属塩
ｄ）０．００５〜０．５Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
〔２〕緩衝剤が、７．５−９のｐＨを与える緩衝剤である〔１〕に記載の組成物。
〔３〕Ｍｇ２＋塩が、ＭｇＣｌ２である〔１〕に記載の組成物。
〔４〕１価の金属塩が、ＫＣｌ、およびＮａＣｌのいずれか、または両方である〔１〕に記載の組成物。
〔５〕硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩が、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａＨＣＯ３からなる群から選択されるいずれかの塩である〔１〕に記載の組成物。
〔６〕変性剤が、非イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、および洗浄剤からなる群から選択される〔１〕に記載の組成物。
〔７〕非イオン系界面活性剤が、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、およびソルビトールエステルのポリオキシエチレンエーテルからなる群から選択されるいずれかの非イオン系界面活性剤である〔６〕に記載の組成物。
〔８〕洗浄剤が、ドデシル硫酸塩、ラウロイルサルコシン塩、ラウリル酸塩、およびメルカプト酢酸塩からなる群から選択されるいずれかの化合物である〔６〕に記載の組成物。
〔９〕合成すべき核酸が、鋳型となる核酸の複数の領域を鋳型とする相補鎖である〔１〕に記載の組成物。
〔１０〕下記の成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方の存在下で、低温でオリゴヌクレオチドを相補鎖にアニーリングさせる方法。
ｄ）０．０１−０．１Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
〔１１〕低温条件が、前記オリゴヌクレオチドの融解温度よりも１０〜３０℃低い温度である〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕オリゴヌクレオチドが、５−２０塩基の長さを有する〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕オリゴヌクレオチドが、７−１５塩基の長さを有する〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕オリゴヌクレオチドが、鋳型となる核酸の複数箇所にアニールするプライマーである〔１０〕に記載の方法。
〔１５〕下記の成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方を有効成分として含有する、オリゴヌクレオチドのアニーリングの安定剤。
ｄ）０．０１−０．１Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
本発明は以下の組成を含む緩衝剤組成物に関する。
ａ）核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、
ｂ）０．１−５０ｍＭのＭｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩のいずれか、または両方
ｃ）１−２００ｍＭの１価の金属塩
ｄ）０．００５〜０．５Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
本発明において、オリゴヌクレオチドとは、複数のヌクレオチドが連結した分子を言う。一方核酸は、多数のヌクレオチドのポリマーを意味する。核酸には、ＤＮＡとＲＮＡが含まれる。オリゴヌクレオチドも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいは両者のハイブリッド分子であることができる。オリゴヌクレオチドが相補的な塩基配列を有する核酸にハイブリダイズして相補鎖合成の基点を与えるとき、当該オリゴヌクレオチドを特にプライマーという。そしてプライマーが鋳型にハイブリダイズすることを、特にアニールと表現する。
本発明の緩衝剤組成物において、前記組成ａ）−ｃ）は、公知の相補鎖合成反応用の反応液を構成する成分と同様の成分を利用することができる。たとえばａ）核酸合成酵素による相補鎖合成反応に好適なｐＨを与える緩衝剤には、中性〜弱アルカリのｐＨを与える緩衝剤を利用することができる。より具体的には、現在市販されている多くのＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨは、７．５−９、好ましくは８−８．５である。したがって、このｐＨを与える緩衝剤は本発明に有用である。本発明に有用な緩衝剤として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーなどを例示することができる。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを用いる場合には、たとえば１−５０ｍＭ、通常５−２０ｍＭ、好ましくは８−１５ｍＭの濃度とすることができる。緩衝剤組成物を構成する組成の濃度は、特に断りが無ければ、最終濃度を表す。
次に、組成ｂ）０．１−５０ｍＭのＭｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩についても、公知の相補鎖合成反応用の反応液を構成する成分と同様の成分を利用することができる。これらの金属イオンは、ＤＮＡポリメラーゼの相補鎖合成活性の維持において、重要である。本発明の組成物におけるＭｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩は、そのいずれか、または両方を組み合わせて利用することができる。Ｍｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩として、具体的には、ＭｇＣｌ２、あるいはＭｎＣｌ２を用いることができる。これらの塩は、通常０．１−５０ｍＭ、たとえば０．５−２０ｍＭ、好ましくは０．８−１０ｍＭを添加することができる。Ｍｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩として複数種の塩を組み合わせるときには、Ｍｇ２＋塩、およびＭｎ２＋塩の合計濃度がこれらの濃度範囲となるように調節する。
またｃ）１−２００ｍＭの１価の金属塩は、一般にオリゴヌクレオチドのハイブリダイズの調節のために添加されている。１価の金属塩には、たとえばＫＣｌ、およびＮａＣｌなどが利用されている。本発明の組成物における１価の金属塩は、単独でも複数種を組み合わせても良い。これらの塩は、通常１−２００ｍＭ、たとえば５−１００ｍＭ、好ましくは１０−８０ｍＭを添加することができる。１価の金属塩として複数の塩を組み合わせるときには、金属イオンの合計濃度がこれらの濃度範囲となるように調節する。
ｂ）の２価の金属イオンと、ｃ）に示した１価の金属イオンは、いずれもその濃度の上昇とともに、ストリンジェンシーは低下する。したがって、これらの金属イオンの濃度は、目的とするアニーリングと相補鎖合成が可能な濃度に適宜調整することができる。濃度の調整に当たっては、オリゴヌクレオチドのＴｍに加えて、後に述べるｄ）およびｅ）の使用量などの条件も考慮される。
本発明の組成物において、次の組成ｄ）およびｅ）は、本発明の課題である低温条件下でのプライマーのアニーリングのために必要な成分である。
ｄ）０．００５〜０．５Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩、および
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
本発明において、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩としては、たとえばＮａ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、およびＮａＨＣＯ３からなる群から選択されるいずれかの塩を用いることができる。これらの塩は、単独で、あるいは異なる塩を組み合わせて本発明の緩衝剤組成物に利用することができる。これらの塩の濃度は、通常０．００５〜０．５Ｍ、たとえば０．０１〜０．１Ｍ、より具体的には０．０３〜０．０５Ｍとすることができる。硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩として複数種の塩を組み合わせるときには、塩類の合計濃度がこれらの濃度範囲となるように調節する。
一方、本発明における変性剤とは、核酸の高次構造を解消する作用を有する化合物である。核酸は、たとえば、１本鎖のポリヌクレオチドであっても、高次構造を有する場合がある。特に温度が低い状態では、単純な鎖状構造ではなく、さまざまな高次構造を有していると考えられている。変性剤は、核酸の高次構造の解消によって、オリゴヌクレオチドのアニーリングを助ける作用を有していると考えられる。
本発明における変性剤として、非イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、および洗浄剤を示すことができる。非イオン系界面活性剤は、エーテル型、エーテルエステル型、エステル型、および含窒素型に分類される。これらの非イオン型界面活性剤の中では、エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤が好ましい。より具体的には、グリセリンエステルのポリオキシエチレンエーテル、ソルビタンエステルのポリオキシエチレンエーテル、およびソルビトールエステルのポリオキシエチレンエーテルをエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤として示すことができる。エーテルエステル型の非イオン系界面活性剤には、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ヒマシ油、ポリキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アルカノールアミド硫酸塩などが含まれる。本発明において、特に好ましいエーテルエステル型の非イオン系界面活性剤は、ポリキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。以下に本発明の組成物に利用することができる市販の非イオン系界面活性剤を例示する。
ポリオキシエチレンアルキルエーテル：
ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）
Ｂｒｊ３５（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２３）Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル：
ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（８）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）
ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（８）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）
ＮＰ−４０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（９）Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ）
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル：
ＴＷＥＥＮ  ２０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）
ＴＷＥＥＮ  ８０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）
ＴＷＥＥＮ  ４０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ）
ＴＷＥＥＮ  ６０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）
ＴＷＥＥＮ  ８５（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ）
一方本発明に利用可能な陰イオン系界面活性剤としては、スルホン酸塩、カルボン酸塩、硫酸エステル塩、あるいはリン酸エステル塩などの界面活性剤を示すことができる。更に以下に示す洗浄剤も本発明の組成物に利用することができる。これらの洗浄剤は、ナトリウム塩以外の塩を利用することもできる。
ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）
ラウロイルサルコシンナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌ  Ｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）
ラウリル酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｌａｕｒａｔｅ）
メルカプト酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔａｔｅ）
変性剤の反応液における濃度は、アニールさせるべきプライマーを構成する塩基配列や、相補鎖合成反応の温度に応じて、適宜調節することができる。一般的には０．０１％Ｗ／Ｖ〜１０％Ｗ／Ｖ、例えば０．５％Ｗ／Ｖ〜５％Ｗ／Ｖ、より具体的には１％Ｗ／Ｖ〜３％Ｗ／Ｖとなるように添加することができる。
本発明の緩衝剤組成物には、核酸の相補鎖合成に利用される付加的な成分を含むことができる。付加的な成分の例を以下に示す。
相補鎖合成のための基質
酵素の保護剤
核酸の相補鎖合成には、ｄＸＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）が基質として必要である。あるいは合成の目的に応じて、ヌクレオチド誘導体や標識されたヌクレオチドを利用することもできる。酵素の保護剤は、相補鎖合成を触媒する酵素の保護を目的として添加される化合物である。具体的には、ウシ血清アルブミンなどの不活性蛋白質、あるいはＤＭＳＯなどの界面活性剤が、酵素の保護作用を有する。
また本発明の緩衝剤組成物には、相補鎖合成の成果物の解析に必要な物質を加えておくことができる。たとえば遺伝子の解析方法の一つであるＧＰ法では、インターカレーターは反応産物の解析における重要な指示薬である。２本鎖の核酸に結合してシグナルを生成する化合物を、インターカレーターという。インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド（臭化エチジウム）、あるいは入手可能な商品としてサイバーグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）が知られている。
更に、本発明の緩衝剤組成物には、相補鎖合成のためのプライマーをあらかじめ添加しておくこともできる。本発明の緩衝剤組成物は、核酸の相補鎖合成に有用である。相補鎖合成のためのプライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に合わせて適宜デザインされる。予め鋳型とする核酸の塩基配列が明らかな場合には、本発明の緩衝剤組成物中に、相補鎖合成のためのプライマーを含有させた状態で流通させることができる。あるいは、ユーザーの指定する塩基配列のプライマーを合成し、本発明の緩衝剤組成物中に組み入れることもできる。
更に本発明の緩衝剤組成物には、相補鎖合成を触媒する核酸合成酵素をも添加することができる。基質、プライマー、および核酸合成酵素を含む緩衝剤組成物には、鋳型となる核酸を加えるだけで、相補鎖合成を開始することができる。あるいは、基質と核酸合成酵素を含む緩衝剤組成物においては、プライマーと鋳型となる核酸を加えることによって、目的とする相補鎖合成反応を開始することができる。これらの付加的な成分は、いずれも最終的な反応に必要な濃度を添加しておくことができる。
本発明の緩衝剤組成物は、任意の剤型で供給することができる。具体的には、液状、粉末、あるいは錠剤とすることができる。液状製剤には、最終濃度に調整されたものと、濃縮されたものが含まれる。たとえば１０倍濃度で各組成を含む液状の濃縮組成物は、使用時に１０倍に希釈して利用される。あるいは、本発明の緩衝剤組成物に含まれる固体成分を混合して、粉末あるいは錠剤の形で供給することができる。ユーザーは、指定された容量の溶媒で粉末あるいは錠剤を溶解することによって、最終濃度に調整された緩衝剤組成物を得ることができる。緩衝剤としてＴｒｉｓ−ＨＣｌを用いる場合には、溶解のための溶媒としてＴｒｉｓ−ＨＣｌを指定することができる。
本発明の緩衝剤組成物は、プライマーのアニーリングをともなう相補鎖合成反応のための反応液として利用することができる。本発明の緩衝剤組成物は、特に、構成塩基数の少ないオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合に有用である。通常、プライマーのアニーリングは、Ｔｍよりも５℃程度低い温度で行われる。しかし構成塩基数の少ないオリゴヌクレオチドはＴｍが低い。低温では非特異的なアニーリングや、オリゴヌクレオチドの高次構造などが原因となって、相補鎖合成が進行しなくなる。あるいは相補鎖合成が可能な条件を与えたとしても、非特異的な合成産物が目立つため、目的とする合成産物を特異的に合成することが難しい。本発明の緩衝剤組成物を用いれば、これらの障害を解消することができる。
構成塩基数の少ないオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる相補鎖合成反応を必要とする核酸の解析方法として、ＧＰ法を示すことができる。図１に示すように、ＧＰ法は、被検核酸の複数の領域を鋳型として合成された相補鎖の集合体を解析対象とする。複数の領域を合成するための方法の一つに、構成塩基数の少ないプライマーを、複数の場所にアニールさせる方法がある。プライマーを構成する塩基の数が少なければ、プライマーに相補的な塩基配列が被検核酸中に存在する可能性が高まる。その結果、単一のプライマーが複数の領域においてプライマーとして作用することができる。
ＧＰ法の実施に当たっては、たとえば以下のような考え方に基づいて、相補鎖合成すべき複数の領域が選択される。
複数の領域は、比較すべき核酸の間で塩基配列の相違があることが期待できる領域を含むことが望ましい。比較の対象とする核酸が多種類である場合、各核酸の合成対象領域の塩基配列は、少なくともいずれかの領域で他の核酸との相違が含まれるようにデザインするのが好ましい。塩基配列の相違は、複数の領域の全てにおいて含まれなくても良い。たとえば、３つの核酸Ｘ、Ｙ、およびＺについてａ−ｃの３つの領域について合成するとする。各領域の塩基配列に相違が含まれることを’で示す。以下の例では、核酸Ｙが他の核酸と異なる塩基配列からなるｂ’を、また核酸Ｚがｃ’を有している。これらの領域を合成することにより、３者の識別が可能となる。
核酸Ｘ：［ａ］−［ｂ  ］−［ｃ  ］
核酸Ｙ：［ａ］−［ｂ’］−［ｃ  ］
核酸Ｚ：［ａ］−［ｂ  ］−［ｃ’］
ＧＰ法に基づく核酸の同定方法において、前記複数の領域は、被検核酸からできるだけ多様な塩基配列情報を特異的に取り出すことが望まれる。つまり、被検核酸の間で、できるだけ塩基配列の相違している部分が多く合成される方が好ましい。したがって、たとえば前記核酸Ｘ−Ｚの例においては、ａ−ｃのできるだけ多くの領域において、相互に塩基配列が異なっている方が、好ましい。
たとえば微生物やウイルスのようなゲノムサイズが限られている生物種では、ゲノムの塩基配列情報が既に明らかにされているものも少なくない。これらの生物種については、予め、比較の対象となる生物種の間で、他の種との間で、塩基配列が相違する領域を選択することができる。また、ゲノムの塩基配列情報が不十分な場合であっても、既に明らかにされているゲノムや、遺伝子の情報に基づいて、塩基配列の相違する領域を選択することは可能である。
なお複数の領域は、再現性を有する方法で合成されることが好ましい。本発明において、相補鎖合成の再現性とは、同じ領域が相補鎖合成の鋳型として利用されることを言う。相補鎖合成反応の原理によっては、合成産物の長さの均一性を保障できない場合があるかもしれない。本発明においては、鋳型として同じ領域が利用されていれば、合成産物の長さの変動は許容できる。本発明における再現性を有する相補鎖合成反応とは、あるプライマーが特異的に相補鎖合成を開始することであると言うこともできる。したがって本発明の相補鎖合成反応は、ランダムプライマーによる相補鎖合成反応とは区別される。
複数の核酸について複数の領域を合成する以上、各核酸が同じ条件で合成されるべきであることは言うまでも無い。したがってプライマーとＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖合成反応によって複数領域を合成する場合には、プライマーのハイブリダイゼーションの特異性は維持されることが望まれる。
核酸の合成方法は、鋳型依存性の合成方法であれば、特に限定されない。被検核酸が２本鎖からなる場合には、前記複数の領域は、センス鎖、あるいはアンチセンス鎖を鋳型として合成することができる。複数の領域の全てが、センス鎖あるいはアンチセンス鎖を鋳型として合成されても良いし、両者を鋳型として合成することもできる。
続いて、ＧＰ法のための伸長産物を得る方法について説明する。伸長産物を得るための代表的な方法として、ＤＮＡポリメラーゼを利用した相補鎖合成反応を利用することができる。ＧＰ法においては、被検核酸の複数の領域を合成するために、被検核酸の複数の領域にアニールすることができるプライマーを利用する。ＧＰ法において、被検核酸の複数の領域にアニールすることができるプライマーから、相補鎖合成反応によって合成された伸長生成物を伸長産物という。伸長産物は、被検核酸の複数の領域を鋳型として合成された、ポリヌクレオチドの集合体である。したがって伸長産物を構成する各ポリヌクレオチド鎖の塩基配列は相互に異なる。ただし、相補鎖合成反応が繰り返されたときには、同じ塩基配列を含むポリヌクレオチド鎖が複数分子生成される。
また、異なる領域に同じ塩基配列を有する被検核酸を鋳型として場合には、同じ塩基配列を含む伸長産物が生成される可能性もある。しかし本発明においては、解離曲線の多用な波形パターンを得ることが望ましいため、伸長産物の塩基配列はできるだけ相違を含むようにデザインすることが望ましい。
被検核酸の複数の領域にアニールし、複数の領域の相補鎖合成を可能とするプライマーを、ＧＰ法では波形生成用プライマーという。ＧＰ法の波形生成用プライマーは、被検核酸の複数の領域の相補鎖合成に利用されるとともに、相補鎖合成の結果として、異なる塩基配列からなる伸長産物の混合物を与える。ＧＰ法における異なる伸長産物の混合物とは、好ましくは解離曲線を解析したときに複数のＴｍを与えるポリヌクレオチドの混合物を言う。
ＧＰ法における波形生成用プライマーは、次のように定義することもできる。すなわちＧＰ法の波形生成用プライマーは、被検核酸上の複数箇所に出現する特定の塩基配列領域に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであって、同一の条件下で被検核酸上の複数の領域において、鋳型依存性のＤＮＡポリメーラーゼによる相補鎖合成を開始することができる。波形生成用プライマーの塩基配列の少なくとも一部は、前記特定の領域に対して相補的な塩基配列からなる。前記特定の領域に対して相補的な塩基配列は、オリゴヌクレオチドの任意の領域に配置することができる。すなわち、たとえばオリゴヌクレオチドの３’末端を含む領域、末端を含まない中間の領域、そして５’末端を含む領域に配置することができる。
被検核酸の複数の領域にアニールすることができるプライマーのデザイン方法として、たとえば次のような方法を示すことができる。以下のような考え方に基づいてプライマーをデザインすれば、単純に複数の領域の相補鎖合成に必要なプライマーを混合するよりも、プライマーを容易に合成することができる。
複数の領域にアニールする１種類のプライマー：
単一のプライマーであっても、適当な塩基配列を選択すれば、被検核酸の複数の部位にアニールすることができる。通常、配列特異的なアニーリングのためには、２０−５０塩基のオリゴヌクレオチドがプライマーとして用いられる。このような長さのオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下では、複数の部位にアニールする可能性はきわめて低い。
ところが、より少ない塩基数のオリゴヌクレオチドを用いれば、複数の位置にアニールする可能性が高まる。たとえば３〜８塩基からなるオリゴヌクレオチドがアニールしうる領域は、計算上は、１／６４（４３）〜１／６５５３６（４８）の確率で存在することになる。つまり、短いプライマーは、単一で用いても複数領域の相補鎖合成を可能とする。
このような複数領域にアニール可能な１種類のプライマーの設計は、対象とするゲノムの塩基配列情報より、対象ゲノム中に出現頻度の高い３から１０数塩基よりなる短い塩基配列を検索し、出現頻度の高い順に上位候補とすることにより可能となる。出現頻度をカウントするゲノム領域は、すべての塩基配列情報を対象としてもよいし、特定の関心領域に対象を絞ってもよい。
複数の領域にアニールする２種類以上のプライマー：
鋳型となる核酸の塩基配列が明らかであれば、複数の領域を合成するために各々の箇所にアニールする複数のプライマーをデザインすることは容易である。しかしＧＰ法においては、より多くの領域について相補鎖合成が必要な場合もある。合成すべき領域の増加に伴って、必要なプライマーの数も増えてしまう。一方で、反応系に添加することができるオリゴヌクレオチドの量には上限がある。また多様なオリゴヌクレオチドを合成するのは経済的にも不利である。そこで本発明者らは、多くの領域の相補鎖合成をできるだけ少ない種類のプライマーで合成できる方法について、検討した。その結果、以下に示すようなプライマーのデザインが有効であることを見出した。
まず、できるだけプライマー間の塩基配列が共通となるように、合成すべき領域を選択する。たとえば以下の例においては、プライマーをアニールさせるための２つの領域が選択されている。これらの塩基配列は、２種類の抗酸菌Ａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）およびＢ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）のゲノムから選択された。いずれも、ゲノム上の異なる位置にありながら、互いに塩基配列の類似性が高い（一致している塩基を大文字で示した）。
2004104196.tif 000002
この例では、３、５、および１０塩基目の塩基が相違し、それ以外の塩基は一致している。これらの相違している塩基を多義コード（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｃｏｄｅ）で表現すれば、ａｇＢｔＹｇｔａａＷ（配列番号：５）となる。本発明において、多義コードとは、ある位置に複数種の塩基を割り当てるための記号である。本発明において、多義コードで表現されたオリゴヌクレオチドは、当該多義コードの位置において、多義コードによって表される全ての塩基の組み合わせを含む混合物であることを意味している。ここで用いた多義コードはそれぞれ次の塩基に対応している。
Ｂ＝ｃ．ｇ．ｔ  Ｙ＝ｃ，ｔ  Ｗ＝ａ，ｔ
すなわち、共通性の高い塩基配列（ａｇＢｔＹｇｔａａＷ）の選択によって、この例では１菌種当たり２箇所の相補鎖合成を可能とできた。本発明において、多義コードで表現された塩基配列を有するプライマーを多義プライマーという。
通常、４つの領域の相補鎖合成のためには、各領域にアニールする４種類のプライマーが必要である。ところがここに示した例においては、１種類の多義プライマーによって４つの領域の相補鎖合成が可能となった。多義プライマーは、異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの集合体である。しかし操作上は、単一のオリゴヌクレオチドと同様の操作によって合成され、相補鎖合成においても単一のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
更にこのような考え方に基づいて、ゲノム内の複数の特定の関心領域に対し、共通の１種類からなる多義プライマーの設計を行うことも可能である。上記の抗酸菌Ａ，Ｂにおける事例を例に採れば、Ａ，Ｂの種間差をもっとも顕著に示す塩基配列を選択することにより、菌種同定という目的を達成した。一方、この設計方法は更にまったく別の関心領域、例えば薬剤耐性に関わる情報を、同時に取得するための手段を提供する。すなわち、複数の関心領域に対し各々出現頻度の高い塩基配列候補を選択し、次にそれら上位候補間の塩基配列の中から更に共通性の高い塩基配列を選択することにより、複数のまったく独立した情報を同時に得ることが可能な、１種類の多義プライマーの設計を可能とする。
さて、一般に、鋳型となる核酸の塩基配列の一部が不明なときに、しばしば縮重プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ）が利用される。縮重プライマーの塩基配列も本発明における多義プライマーと同じように表記される。しかし多義プライマーは異なる塩基配列を有する複数領域の合成を目的としている。他方、ＰＣＲクローニングなどに用いられる縮重プライマーは、通常、１種類の鋳型に対して１種類の核酸の合成を目的としている。クローニング（すなわち遺伝子の単離）を目的とする場合には、多様な合成産物を生成するプライマーは望ましくない。このように多義プライマーと縮重プライマーとでは、そのデザインの目的がまったく異なっている。他方、縮重プライマーをＧＰ法における波形生成プライマーとして利用することは可能である。
以上の例では、被検核酸の塩基配列から、できるだけプライマーの種類を少なくすることが可能な領域を選び出した。言い換えれば、被検核酸に依存したデザイン方法である。したがって、被検核酸および比較対象となる核酸の塩基配列によっては、適用が難しい場合もあるかもしれない。これに対して、以下に述べる方法は、被検核酸および比較対象となる核酸の塩基配列の影響を受けず、比較的容易に複数のプライマーをデザインしうる方法である。
前記の多義プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に合わせて多義コードを配置した。これに対して、プライマーの５’側に多義コードを配置して、被検核酸の複数の領域にアニールすることができる波形生成用プライマー集合体を得ることもできる。すなわちＧＰ法においては、下記の特異プライマーおよび多義プライマーを含む波形生成用プライマー集合体を利用することができる。
特異プライマー：鋳型核酸の標的領域に相補的な塩基配列を含む
多義プライマー：次の特異領域および多義領域を含む少なくとも１種類の多義プライマー
特異領域：オリゴヌクレオチドの３’末端を含み、前記標的領域に対して相補的な塩基配列で構成される
多義領域：特異領域の５’側に配置され、前記標的領域に対して相補的な塩基配列を構成する塩基が当該塩基以外の塩基で置換された塩基配列を含む
ＧＰ法における特異プライマーは、鋳型核酸の標的領域に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその誘導体からなる。誘導体とは、付加的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは修飾されたオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは、蛍光物質、放射活性物質、あるいは結合性リガンドなどで修飾することができる。
ＧＰ法における標的領域は、鋳型核酸に相補鎖合成のためのプライマーがアニールするべき領域を言う。つまり標的領域は、鋳型核酸の合成すべき領域の３’側に位置する領域である。鋳型核酸の合成すべき領域は、先に述べたように、ＧＰ法による核酸の同定方法において、被検核酸に固有の波形パターンを生じることが期待できる領域として選択された領域であることが望ましい。このような領域は、比較対象である核酸との、塩基配列の相違を含む領域を中心として、選択することができる。一方で、できるだけ少ない種類のプライマーで複数の領域を合成するためには、たとえば異なる位置に見出される相同性の高い塩基配列を標的領域として選択することができる。しかしながら、ＧＰ法に基づく波形生成用プライマー集合体の利用によって、標的領域との相同性が低い領域に対してアニールすることが可能なプライマーを提供することもできる。その結果、単一の標的領域を選択した場合であっても、鋳型核酸の複数の領域の相補鎖合成が可能な波形生成用プライマー集合体を得ることができる。
一方、以下に述べる多義プライマーにおいて、３’側の多義コードを含まない領域を特異領域、５’側の多義コードを配置した領域を多義領域という。特異領域は、特異プライマーの３’末端を含む領域を構成する塩基配列と同一の塩基配列で構成される。すなわち、多義プライマーと特異プライマーの３’末端を含む塩基配列は共通である。特異領域を構成する塩基の数は制限されない。特異領域の長さは、多義領域の条件に応じて適宜設定することができる。たとえば、多義プライマー全体の長さの２０〜９０％の範囲で、特異領域の長さを選択することができる。
多義領域を構成する多義コードは、たとえば４塩基多義（Ｎ）の連続とすることもできるし、被検核酸の塩基配列に合わせて、抗酸菌の例で述べたように適宜必要な多義コードを配置することもできる。更に、以下に述べるように、プライマーの３’側から５’側にかけて多義領域のバリエーションを段階的に増やすこともできる。
このようにしてデザインされた多義プライマーは、被検核酸の多くの領域に対して、高い再現性でアニールし、複数領域の相補鎖合成産物を与える。多義領域のバリエーションを段階的に変化させることにより、相補鎖合成において、反応特異性を左右する３’側の多義性を小さくする一方で、比較的特異性に対して影響を与えにくい５’側においてプライマーの塩基配列に多様性を与えることができる。このような構造的な特長により、多様な塩基配列に対して安定にアニールすることができるプライマーの集合体とすることができる。
一方、プライマー集合体を構成する個々のオリゴヌクレオチドは、３’側の多様性が低くなるようにデザインされている。その結果、各オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して相補的な塩基配列に選択的にアニールし相補鎖合成を開始する。つまり、幅広い塩基配列について、それぞれ特異的に、かつ安定に相補鎖合成を開始することができるのである。
多義領域における多義性を段階的に変化させた多義プライマーとして、次の構造を示すことができる。すなわち、多義領域の塩基配列が次の３つの領域からなり、それぞれの領域を構成する置換塩基配列の全ての組み合わせを含む多義プライマーの集合体はＧＰ法の波形形成用プライマー集合体として有用である。
（１）Ｎ領域：多義領域の５’末端を構成し、その塩基配列を構成する各塩基は前記標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の３種類のすべての塩基で置換された塩基である
（２）３多義領域：Ｎ領域の３’側に配置され、その塩基配列を構成する各塩基は前記標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の２種類の塩基のすべてで置換された塩基である
（３）２多義領域：３多義領域の３’側に配置され、その塩基配列を構成する各塩基は前記標的領域の塩基配列に相補的な塩基に代えて、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンから選択される当該塩基以外の任意の１種類の塩基で置換された塩基である
図３に示す多義プライマー（ＮＮＶＨＤＢＳＳ）において、多義領域は、５’末端側から３’側にかけて段階的に多義性が高まるようにデザインされている。すなわち、５’末端側には、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、およびＴ（チミン）の何れかを示すＡｍｂｉｇｕｉｔｙ  ＣｏｄｅであるＮで構成されるＮ領域が存在する。Ｎ領域は、標的領域に対して相補的な塩基をそれ以外の３種類のいずれかの塩基に置換した領域と言うこともできる。
Ｎ領域に続いて、標的領域に対して相補的な塩基をそれ以外の２種類の塩基で置換した３多義領域（３  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ；３ＡＲ）が配置されている。更に３ＡＲの３’側に、標的領域に対して相補的な塩基をそれ以外の１種類の塩基で置換した２多義領域（２  ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ；２ＡＲ）が配置されている。図３の例では、５’末端側の２つのＮがＮ領域を構成し、続くＶ，Ｈ，Ｄ，Ｂの４塩基分が３ＡＲを構成する。そして、３’側の２つのＳが２ＡＲを構成する。このような多義領域の構造により、３’側から５’末端にかけて多義性を高めることができる。言い換えれば、このような構造によって、５’側から３’末端にかけて特異性を高めることができる。ＧＰ法に用いる多義コードと実際の塩基の対応は表１にまとめた。
ＧＰ法の多義プライマーにおいて、Ｎ領域の長さは２〜４塩基が好ましい。Ｎ領域の塩基数が５塩基以上になると、ダイマー、ループ等のプライマー相互干渉が出現しやすくなる可能性が高まる。また、３ＡＲの配列は、ＤＨＶＢ、ＨＤＶＢ、ＶＨＤＢ、ＨＶＤＢの順に安定性が高い。このように、３’側におけるＧ又はＣの割合を高めた方が安定性が高くなる。
次に２ＡＲの配列も、標的領域の塩基配列を考慮して設計する必要がある。なお、Ｎ領域、３ＡＲ、２ＡＲの長さの比は、１：２：１が好ましいがこれに限定されない。
プライマー集合体を構成する多義プライマーの多義領域の長さは、プライマーを構成する塩基数の１０％〜８０％であることが好ましい。またプライマー集合体を構成する多義プライマーの特異領域および多義領域の長さの合計は、１０〜３０塩基であることが好ましい。
多義プライマーを含むＧＰ法の波形生成用プライマー集合体は、前記標的領域として、少なくとも１つの領域を設定し、当該領域の塩基配列に基づいてデザインすることができる。標的領域を複数選択することもできる。この場合、特異プライマーの種類が増え、それに応じて多義プライマーの種類も増えることになる。標的領域として複数の領域を選択した場合、波形生成用プライマー集合体は、同時にまたは個別に相補鎖合成に用いることができる。波形生成用プライマー集合体を用いることによって、波形の多様性を高めることができる。すなわち、ＧＰ法の核酸の識別能力を高めることができる。
たとえば図６に示した４種類の波形生成用プライマー集合体ｓＰＧＢＵＰ６５、ｓＰＧＢＵＰＵＰＲ、ｓＰＧＢＵＰＦＸ、およびｓＰＧＢＵＰＲＸは、それぞれ異なる標的領域についてデザインされている。仮に各波形生成用プライマー集合体によって各々１５種の異なる波形パターンが得られるとすると、理論上は、５０，６２５種類（１５×１５×１５×１５）の波形パターンが得られることを意味する。このことは、１５種類の波形パターンを生成することができる４とおりの波形生成用プライマー集合体の利用によって、ＧＰ法に基づく核酸の同定方法が、５万種類以上の核酸の識別できることを示している。
複数の領域に対してデザインされた複数種類の波形生成用プライマー集合体は、集合体同士の混合物として、あるいは集合体毎に独立して相補鎖合成に利用することができる。独立して相補鎖合成に用いることによって、波形パターンとプライマー集合体の関係を、明確に知ることができる。すなわち、ある領域Ａに基づいてデザインされた波形生成用プライマー集合体Ａと別の領域Ｂに基づいてデザインされた波形生成用プライマー集合体Ｂとは、混合しないで個別に相補鎖合成に用いるのが好ましい。
上記のような、複数の領域において相補鎖合成を開始することができるいずれかのプライマーを、相補鎖合成が可能な条件下で鋳型核酸とインキュベートすることにより、相補鎖合成が開始される。相補鎖合成が可能な条件とは、次の条件が満たされることを言う。
鋳型核酸に前記プライマーがアニールすることができる、
鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼの触媒活性が維持される、および
相補鎖合成のための基質が供給される。
ここで、前記プライマーの構成塩基数が少ないために、低いＴｍを採用せざるを得ない場合、本発明の緩衝剤組成物の利用が有効である。本発明の緩衝剤組成物において、特に低温でのアニーリングを可能とするために必要な成分は、以下の成分ｄ）およびｅ）である。したがって本発明に基づいて、下記の成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方の存在下で、低温でオリゴヌクレオチドを相補鎖にハイブリダイズさせる方法が提供される。
ｄ）０．０１−０．１Ｍの、硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、および炭酸塩からなる群から選択される少なくとも１種類の塩
ｅ）０．０１−１０％ｗ／ｖの変性剤
本発明の方法において、低温とは、たとえばハイブリダイズさせるべきオリゴヌクレオチドのＴｍよりも１０℃以上低い温度を言う。より具体的には、本発明の方法における低温には、アニールさせるべきオリゴヌクレオチドのＴｍと比較して、たとえば１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、あるいは２０〜２５℃低い温度が含まれる。オリゴヌクレオチドのＴｍは、先に述べたＷａｌｌａｃｅの方法にしたがって計算することができる。
このような低い温度を必要とするオリゴヌクレオチドは、通常５−２０塩基、たとえば７−１５塩基の長さを有する。したがって、このような長さを有するオリゴヌクレオチドは、本発明の方法を応用するオリゴヌクレオチドとして好ましい。本発明におけるＴｍやオリゴヌクレオチドの長さは、鋳型にハイブリダイズする部分を構成する塩基配列の長さに基づいて算出するべきである。プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドには、しばしばアニールとは無関係な付加的な塩基配列が付加される。たとえば、プロモーター、あるいは制限酵素の認識配列などは、通常、プライマーのアニールとは無関係な塩基配列である。このようなアニールとは無関係な塩基配列については、Ｔｍやアニールする塩基の数には含まれない。
本発明の方法に用いる成分ｄ）およびｅ）は、先に述べたような条件に基づいて利用することができる。また本発明の方法は、ＧＰ法をはじめとする、短いプライマーを利用した相補鎖合成反応において有用である。更に本発明は、上記成分ｄ）およびｅ）のいずれか、または両方を有効成分として含有するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの安定剤を提供する。本発明の安定剤は、特に、構成塩基の少ないオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの安定化に有用である。
本発明の方法、あるいは安定化剤は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイズを必要とする任意の方法に利用することができる。たとえば、先に述べたような短いプライマーのアニーリングは、本発明の方法を応用することができる代表的な例である。その他、ＰＣＲ法などの公知の核酸合成反応において、短いプライマーを利用するときに、本発明の方法、あるいは安定化剤を利用することができる。あるいは、各種のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、短いオリゴヌクレオチドをプローブとして利用するときにも、本発明の方法、あるいは安定化剤を応用することができる。
本発明の方法、あるいは安定剤を構成するｄ）塩類、あるいはｅ）変性剤は、単独で用いても良いし、複数の化合物を混合して利用することもできる。各化合物はいずれも異なる機序でプライマーのアニールの安定化、あるいは特異性の向上をもたらしていると考えられる。したがって、界面活性剤、洗浄剤、および塩類の各成分を添加することによって、スタビライザーの作用は増強される。
あるいは本発明は、上記成分ｄ）塩類およびｅ）変性剤の、低温条件下における短いプライマーを利用した相補鎖合成反応における使用に関する。本発明における低温条件とは、ハイブリダイズさせるべきオリゴヌクレオチドのＴｍよりも１０℃以上低い条件を言う。より具体的には、本発明の方法における低温には、アニールさせるべきオリゴヌクレオチドのＴｍと比較して、たとえば１０〜３０℃、好ましくは１５〜２５℃、あるいは２０〜２５℃低い温度が含まれる。また本発明における短いオリゴヌクレオチドは、通常５−２０塩基、たとえば７−１５塩基の長さを有する。
以下実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
（参考例１）
多義プライマーのデザイン
特異領域と多義領域とを有する多義プライマーを用い、ＧＰ法における好適なプライマーのアニーリング条件を検討した。図２に多義プライマーの概念図を示した。図２の多義プライマーは、５’末端側に多義領域を有することにより、特定塩基配列のみならず、これに類似するような相似性のある配列にもアニールすることができる。なお、実際にこのような構造の波形生成用プライマー集合体を用いる際には、目的に応じて、以下の（ａ）〜（ｅ）に示す条件を調整することが望ましい。
（ａ）プライマー長
（ｂ）特異領域の配列
（ｃ）多義領域の配列
（ｄ）プライマー量
（ｅ）アニーリング温度
そこで、以下では、この波形生成用プライマー集合体を構成する多義プライマーの構造及び反応条件の一例として、上述した（ａ）〜（ｅ）の項目を順に検討した。
（ａ）プライマー長の調整
先ず、プライマー全長が合成効率に与える影響を検討するため、特異領域と多義領域とが１：１であるプライマーについて、９８℃／２秒、４０℃／２０秒、７２℃／２０秒のプロトコルを５０サイクル実施して相補鎖合成反応を行った。相補鎖合成によって得られた伸長産物について、解離曲線の波形を解析し、多義プライマーの構造が結果に与える影響を比較した。多義プライマーは、特異性と安定性の２つの指標に基づいて評価した。
ここで「特異性が高い」とは、標的領域として選択した部分以外の領域に対してアニールしにくいことを言う。本発明においては、多義プライマーの特異性が高いことは、伸長産物の多様性が低くなる原因となる。その結果、波形の多様性は失われる。つまり、特異性をある程度低下させた多義プライマーが、本発明における望ましい多義プライマーであると言うことができる。
一方、安定性とは、多義プライマーを構成する各プライマーのアニールの再現性を言う。多義プライマーが異なる塩基配列のオリゴヌクレオチドからなる集合体であることは既に述べた。しかし集合体を構成している個々のオリゴヌクレオチドは、それぞれの塩基配列に相補的な塩基配列に対してアニールするはずである。ところが、たとえば多義領域の長さが長すぎる場合には、結果的に目的とする塩基配列に対応するオリゴヌクレオチドの量が少なくなる。つまり、十分な相補鎖合成が起きなくなる可能性が高まる。
この検討の結果、プライマー全長が１６〜２４ｍｅｒの場合に、好ましいプライマーの特異性あるいは安定性が見られた。この条件で、伸長産物の波形の多様性が最大となった。
一方、プライマー全長が２４〜３０ｍｅｒでは、プライマーの特異性あるいは安定性が高くなる反面、得られる解離曲線の波形の多様性が低下した。特異性が高まることにより、標的領域として選択した領域以外の領域の相補鎖合成反応が十分に進まなかったと考えられた。プライマー全長が１０〜１６ｍｅｒでは、波形の多様性は高まる。しかし一方で、特異性と安定性は低下した。プライマー全長が９ｍｅｒ以下では、合成反応が起こらなかった。これらの結果から、本発明の多義プライマーのプライマー長としては、１０〜３０ｍｅｒの範囲を使用することができ、中でも好ましい長さは１６〜２４ｍｅｒであると結論した。
次に、プライマー全長に占める特異領域と多義領域の割合を検討した。この結果、プライマー全長に占める多義領域の割合が０．３３〜０．５５の場合に、安定性と伸長産物の多様性が最大となった。塩基数に直すと、全長２４ｍｅｒの多義プライマーでは、８〜１３ｍｅｒの場合に望ましい結果が得られることになる。
一方プライマー全長に占める多義領域の割合が０．５５〜０．８８の場合には、波形の多様性は高まるが安定性が低下した。このときの条件を塩基数で示せば、多義領域が１４〜２５ｍｅｒ、特異領域が４〜７ｍｅｒとなる。また、プライマー全長に占める多義領域の割合が０．１２〜０．３３の場合には、波形の多様性が失われた。このときの条件を塩基数で示せば、多義領域が４〜７ｍｅｒ、特異領域が１４〜２５ｍｅｒとなる。
更に、プライマー全長に占める多義領域の割合が０．８９以上では、いわゆるランダムプライマーとなり、正常な合成が起こらなかった。このときの条件を塩基数で示せば、例えば多義領域が２５ｍｅｒ以上、かつ特異領域が３ｍｅｒ以下となる。また、プライマー全長に占める多義領域の割合が０．１１以下では、通常のＰＣＲプライマーと同じような合成反応が見られた。つまり、ほぼ１種類のみの相補鎖合成産物が見られた。このときの条件を塩基数で示せば、例えば多義領域が３ｍｅｒ以下、かつ特異領域が２５ｍｅｒ以上となる。
なお、以下ではプライマー全長に占める多義領域の割合を０．３３〜０．５５とするものとして説明する。
（ｂ）特異領域の配列
特異領域は、被検核酸から選択された標的領域に相補的な塩基配列からなっている。特異領域の長さは、多義プライマーの全長が１６〜２４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが好ましい。また、３’末端を含む５塩基中におけるＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）が占める割合であるＧＣ％は、５０％以上であることが望ましい。さらに、３’末端の安定性は、−５．５〜−９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上が必要である。なお、３’末端側の３塩基以外において５０％以内のミスマッチがある場合にもアニール可能である。この際、ミスマッチ部分の安定性が−１２．０Ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であれば、合成効率の低下は無視し得る。
（ｃ）多義領域の配列
多義領域は、被検核酸から選択された標的領域以外の領域に対してもアニール可能なプライマーを増やすために配置される領域である。多義領域は、前記標的領域に対して相補的な塩基を、それ以外の塩基に置換した塩基配列からなっている。置換する塩基の種類は１〜３種類の任意の塩基である。本発明において、塩基の置換を表現するために、表１に示す多義コード（Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅ）を用いる。多義プライマーの構造は、例えば図３に示すような塩基配列によって示すことができる。図３に示した塩基配列を有する多義プライマーは、多義領域における多義性が５’〜３’側にかけて段階的に低下する構造を有している。多義領域の長さは、プライマー全長が１６〜２４ｍｅｒであるときに８〜１３ｍｅｒであることが好ましい。
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（ｄ）プライマー量
上述した多義領域を含む多義プライマーの集合体は、実際には異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの集合体である。したがって、１つの２Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅが含まれることは、実際には異なる塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチドが含まれることを意味している。そのため、鋳型核酸とアニールする有効率は１／２となる。
例えば、２Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅ：Ｓ（ＣまたはＧを示す）が含まれたＳＡＴＴという塩基配列は、実際にはＣＡＴＴおよびＧＡＴＴの２種類の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。この場合、それぞれの有効プライマー量は１／２となる。同様に、１つの３Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅまたは４Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅによって有効プライマー量はそれぞれ１／３または１／４となる。つまり、３Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅ：Ｂ（Ｃ、ＧまたはＴを示す）が含まれたＢＡＴＴという配列では、ＣＡＴＴ、ＧＡＴＴ又はＴＡＴＴの３種類の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。
したがって、実際にプライマー量を計算する際には、この有効プライマー量を考慮する必要がある。具体的には、最低プライマー量に有効プライマー量の逆数を乗算し、これを多義領域の塩基数とミスマッチ率である４とで除算する。図３の例では、２つの４Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅ、４つの３Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅ、そして２つの２Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅを有するため、有効プライマー量は、１／５１８４（＝（１／４）２×（１／３）４×（１／２）２）となる。また、多義領域の塩基数は８である。これにより、最低プライマー量を１（ｐｍｏｌ／５０μＬ）としたとき、実際に加えるべきプライマー量は、１×５１８４÷８÷４＝１６２（ｐｍｏｌ／５０μＬ）程度となる。なお、このプライマー量の算出方法は一例であり、この方法に限定されるものではない。
（ｅ）アニーリング温度
アニーリング温度を検討するために、先ずプライマーのＴｍ値を算出した。Ｔｍ値とは、互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の５０％が塩基対結合した状態となる温度をいう。具体的には、特異領域のＴｍ値を２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算し、多義領域の平均２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）法で計算した。そして、これらを総合してプライマー全長のＴｍ値を計算した。
通常のＰＣＲ法におけるアニーリング温度は、Ｔｍ値マイナス５℃程度である。本発明におけるアニーリング温度は、波形パターンを多様化するために、Ｔｍ値マイナス２０℃程度とすることが好ましい。低い温度を与えることで、短いプライマーもアニールしやすくなる。実験的には、４０℃以下で解離曲線の波形多様性の向上が顕著となった。一方、１５℃以下ではランダムプライミングのみとなり、殆ど合成反応を示さない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明における相補鎖合成方法を模式的に説明する図である。図１（Ａ）は、本発明によって被検核酸の複数の領域が合成される様子を示す。図１（Ｂ）は、複数の伸長産物が種々の相互干渉構造を形成する様子を示す。
図２は、本発明に用いる多義プライマーの構造を示す図である。
図３は、多義プライマーの多義領域の配列の一例を示す図である。
図４は、相補鎖合成におけるスタビライザーの添加が波形パターンに与える影響を示す。図４（Ａ）がスタビライザー無し、図４（Ｂ）がスタビライザーを添加した場合の波形パターンである。図中、縦軸は蛍光強度微分値を、横軸は温度（℃）を示す。
図５は、相補鎖合成におけるスタビライザーの添加が相補鎖合成に与える影響を示す写真である。図５（Ａ）がスタビライザー無し、図５（Ｂ）がスタビライザーを添加した場合の、合成産物の電気泳動の結果を示す。（Ａ）および（Ｂ）の左端のレーンが２００ｂｐラダー、右側の２つのレーンがサンプル（デュプリケート）の泳動結果である。
図６は、４種類の波形生成用プライマー集合体ｓＰＧＢＵＰ６５、ｓＰＧＢＵＰＵＰＲ、ｓＰＧＢＵＰＦＸ、およびｓＰＧＢＵＰＲＸのデザインのために設定した「標的領域」の、被検核酸上における位置関係を模式的に示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】２５℃の低温アニーリングにおける「スタビライザー」の効果
表２に示すアニーリングの安定剤（以下「スタビライザー」を記載する）の効果について、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
（１）方法
細菌ＤＮＡの特定塩基配列を複数箇所で認識するプライマー、ＢＡＵＰ６５（配列番号：６）を作成し、ＧＰ法に基づいて核酸を同定した。相補鎖合成工程において、スタビライザーを加えた場合と加えない場合の波形パターンを比較して、スタビライザーの効果を確認した。
細菌ＤＮＡは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡを用いた。ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（日本ジーン株式会社製）を用い、大腸菌約１０６個からマニュアルに従ってＤＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡは最終的に０．５μｇ／μＬ（Ｈ２Ｏ）の濃度に調整した。「スタビライザー」の処方を表２に、相補鎖合成反応液の組成を表３および表４に示す。
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「スタビライザー無し」および「スタビライザー有り」の組成を有する反応液について、各々１サンプル５０μＬを加え相補鎖合成反応を行った。反応は、デュプリケートで実施し計４サンプルの波形を観察した。ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて９８℃／２秒、２５℃／４０秒、７２℃／１０秒のプロトコールを５０サイクル実施して相補鎖を合成した。反応後、温度範囲７５〜９５℃、温度ステップ０．１℃の条件で各温度で８秒間観察することにより、合成産物の解離曲線の波形を描画した。
次に、核酸増幅反応終了後のサンプル１０μＬに２μＬのローディングバッファーを添加し、１．２％アガロースゲルを使って、４５分間、５０Ｖで電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して合成産物を確認した。なお、分子サイズマーカとして、２００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒを使用した。
（２）結果
「スタビライザー」の効果を、図４（Ａ）「スタビライザー無し」、図４（Ｂ）「スタビライザー有り」の波形の差異として示す。ここで図４（Ａ）では、核酸の合成が不十分なため波形が不明瞭である。一方図４（Ｂ）では十分な核酸が合成されているため、大腸菌のＤＮＡに特徴的な波形が正常に描画されている。「スタビライザー」の効果は、電気泳動分析の結果によっても裏付けられた。すなわち、図５（Ａ）「スタビライザー無し」では合成産物のバンドが見られない。一方図５（Ｂ）「スタビライザー有り」では合成産物のバンドを確認することができた。
以上の結果から、「スタビライザー」の添加によって、２５℃という低温条件下での相補鎖合成と波形の解析が可能となることが裏付けられた。スタビライザーは、たとえば次のような機序によって２５℃におけるプライマーの特異的なアニーリングと相補鎖合成を成立させていると考えられた。
プライマーおよびＤＮＡの直線化維持、あるいは高次構造形成抑制、
プライマー−鋳型ＤＮＡ間の水素結合安定化。
したがって、低温条件下での相補鎖合成によって本発明を実施する場合には、「スタビライザー」の添加が有効であるといえる。
産業上の利用の可能性
本発明により、低温条件下でのプライマーの特異的なアニーリングを可能とする緩衝剤が提供された。本発明の緩衝剤を利用すれば、たとえば１０塩基前後の短い塩基配列で構成されるプライマーを利用しても、塩基配列特異的な相補鎖合成反応を期待できる。短いプライマーの利用により、被検核酸の複数の領域を少種類のプライマーで合成することが可能となる。本発明の緩衝剤は、ＧＰ法のような、複数の領域の相補鎖合成を必要とする核酸解析方法に有用である。
本発明の緩衝剤は、短いプライマーを利用した相補鎖合成反応に利用することができる。短いプライマーのアニーリングには低い温度が要求される。本発明の緩衝剤により、低温条件下でのアニーリングと相補鎖合成反応を効率的に行うことが可能となった。
短いプライマーは、少数のプライマーで複数の領域を特異的に合成するときに有利である。各領域にそれぞれ特異的なプライマーを混合して用いれば、複数領域を一つの反応系で合成することは可能である。しかし複数のプライマーを合成することはコストアップの原因である。また、構成塩基数の多い複数のプライマーは互いに異なるＴｍを有する可能性がある。このような場合は、複数のプライマー間でストリンジェンシーを一致させることができなくなる。結果として、プライマー間で相補鎖合成反応の効率に差を生む恐れがある。ＧＰ法のように、複数種の相補鎖合成産物の集合体を解析の対象とする解析方法においては、このような合成効率の差は小さいほうが望ましい。
ＧＰ法以外の核酸解析方法においても、短いプライマーによってもたらされる効果が期待できる。たとえばＰＣＲ法において、必ずしも十分な長さのプライマーをデザインできない場合がある。すなわち、合成対象の塩基配列情報が不十分な場合には、十分な長さのプライマーをデザインすることができない。あるいは、相補鎖合成反応以外の目的で組み込まれる塩基配列のために、プライマーにおける相補鎖合成反応のための塩基数が制限される場合も考えられる。たとえば、プロモーターや制限酵素認識配列などを組み込んだプライマーがしばしば利用される。このような場合には、相補鎖合成反応のためのプライマーとして、少ない塩基が必要になる。本発明の緩衝剤を利用すれば、このようなプライマーであっても、ＰＣＲ法を効率的に実施することができる。
本発明の緩衝剤を利用して、短いプライマーで複数領域の相補鎖を合成すれば、プライマー間のストリンジェンシーを容易に一致させることができる。またプライマーが短いときには、複数の領域の間で、同じ塩基配列からなるプライマーを共有できる可能性も期待できる。このように、短いプライマーによる特異的な相補鎖合成を可能にした本発明の意義は大きい。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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