(57)【要約】アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と無疹部、または患者皮疹部と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺伝子ＳＫ４０４を見出した。そしてこの遺伝子が、アトピー性皮膚炎の検査や治療薬のスクリーニングにおいて指標として有用であることを明らかにした。すなわち本発明は、こうして見出された指標遺伝子ＳＫ４０４の発現レベルの比較に基づく、アトピー性皮膚炎の検査方法、および該疾患の治療のための化合物のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（１）〜（３）を含む、アトピー性皮膚炎の検査方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である方法。
（１）被検者の皮疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（２）工程（１）で測定された皮疹部の発現レベルを、対照として同じ被検者の無疹部または健常者皮膚から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（３）工程（２）の比較の結果、対照と比較して発現レベルが高い場合に前記被検者はアトピー性皮膚炎を有すると判定する工程
【請求項２】
遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。
【請求項４】
指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
【請求項５】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
【請求項６】
次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【請求項７】
細胞が株化皮膚細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるキット。
【請求項９】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるキット。
【請求項１０】
指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物であって、指標遺伝子がＳＫ４０４またはその機能的に同等な遺伝子であるモデル動物。
【請求項１１】
非ヒト脊椎動物がマウスである請求項１０に記載のモデル動物。
【請求項１２】
次のｉ）またはｉｉ）に記載の成分をマウスに投与する工程を含む、アレルギー性皮膚炎モデル動物の製造方法。
ｉ）ＳＫ４０４のホモログを構成する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＫ４０４のホモログを構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
【請求項１３】
請求項１２におけるｉ）またはｉｉ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含む、マウスにアレルギー性皮膚炎を誘導するための誘導剤。
【請求項１４】
次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４またはそのホモログであるスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、
【請求項１５】
次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、
【請求項１６】
次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４、またはＳＫ４０４と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【請求項１７】
請求項６、請求項１４、請求項１５、および請求項１６のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アトピー性皮膚炎の治療薬。
【請求項１８】
指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを有効成分として含むアトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である治療薬。
【請求項１９】
指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アトピー性皮膚炎の検査方法に関する。
【背景技術】  アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。これらの病気は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、特定の病気を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難である。
またアレルギー性疾患には、変異や欠陥を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲を伴う検査であると言うことができる。
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎喘息等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
従って、アレルゲンに関わらず、アレルギー患者の病態の把握や治療方針の決定に役立てることができる診断指標が求められていた。さらに、患者に対する侵襲が小さく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができるアレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
【発明の開示】
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、アトピー性皮膚炎の検査を可能とする新しい指標を提供することにある。さらに本発明は、該指標に基づくアトピー性皮膚炎の検査方法、およびアトピー性皮膚炎治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った。すなわち、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部、または健常者の皮膚との間で発現レベルに差が見られる遺伝子を明らかにし、アトピー性皮膚炎反応との関連性を明らかにすることにより、アトピー性皮膚炎治療の新たな標的を見出すことができると考えた。
このような考えに基づき、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部、および健常者の皮膚との間で発現状態の違う遺伝子を探索した。遺伝子の発現状態を比較する生体試料としては、被検者の皮膚組織を選択した。実際に炎症が起きている皮膚組織検体には病態形成に重要なリンパ球などが多く浸潤しており、皮膚局所における遺伝子発現解析を行えばアトピー性皮膚炎の病態の解明につながると考えられる。
本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部、並びに健常者の皮膚で発現している遺伝子について、ジーンチップを用いて発現プロファイルを比較した。２倍以上の発現変動のあった遺伝子を選別し、遺伝子の発現レベルを測定した。そして、ＳＫ４０４の発現が変動していることを確認した。
本発明における指標遺伝子ＳＫ４０４の塩基配列は既知である（ＷＯ２００１６４８３５）。ＳＫ４０４については次のような情報があるが、アレルギー性疾患との関係は示唆されていない。
−大腸癌で発現している大腸癌関連遺伝子である（ＷＯ２０００５５３５１）
−分泌蛋白質である（ＷＯ９８５４２０６）
−２型樹状細胞前駆細胞（Ｔｙｐｅ  ２  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）由来のＤＮＡ（ＥＰ１１７４５０２）
アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部または健常者との間において、指標遺伝子の発現レベルに変動が観察されたという事実は、本発明の指標遺伝子とアトピー性皮膚炎症状との深い結びつきを表している。また、ダニアレルゲン感作マウスの耳介皮膚とダニアレルゲン非感作マウスの耳介皮膚において、上記指標遺伝子のマウスにおけるカウンターパートの発現レベルに差が見られることも、本発明の指標遺伝子とアトピー性皮膚炎症状との結びつきを裏付けている。以上の知見に基づいて、本発明者らは、指標遺伝子の発現レベル、あるいは指標遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を指標とすることにより、アトピー性皮膚炎の診断、および該疾患のための治療薬のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、以下のアトピー性皮膚炎の検査方法、並びにアトピー性皮膚炎治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程（１）〜（３）を含む、アトピー性皮膚炎の検査方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である方法。
（１）被検者の皮疹部から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
（２）工程（１）で測定された皮疹部の発現レベルを、対照として同じ被検者の無疹部または健常者皮膚から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程、および
（３）工程（２）の比較の結果、対照と比較して発現レベルが高い場合に前記被検者はアトピー性皮膚炎を有すると判定する工程
〔２〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
〔５〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アトピー性皮膚炎検査用試薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるアトピー性皮膚炎検査用試薬。
〔６〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程、
（２）前記遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔７〕細胞が株化皮膚細胞である〔６〕に記載の方法。
〔８〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるキット。
〔９〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるキット。
〔１０〕指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物であって、指標遺伝子がＳＫ４０４またはその機能的に同等な遺伝子であるモデル動物。
〔１１〕非ヒト脊椎動物がマウスである〔１０〕に記載のモデル動物。
〔１２〕次のｉ）またはｉｉ）に記載の成分をマウスに投与する工程を含む、アレルギー性皮膚炎モデル動物の製造方法。
ｉ）ＳＫ４０４のホモログを構成する塩基配列を含むポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＫ４０４のホモログを構成する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質
〔１３〕〔１２〕におけるｉ）またはｉｉ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含む、マウスにアレルギー性皮膚炎を誘導するための誘導剤。
〔１４〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４またはそのホモログであるスクリーニング方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）前記被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、
〔１５〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、
〔１６〕次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４、またはＳＫ４０４と機能的に同等な遺伝子であるスクリーニング方法。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１７〕〔６〕、〔１４〕、〔１５〕、および〔１６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アトピー性皮膚炎の治療薬。
〔１８〕指標遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡを有効成分として含むアトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である治療薬。
〔１９〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療薬であって、指標遺伝子がＳＫ４０４である治療薬。
あるいは本発明は、〔６〕、〔１４〕、〔１５〕および〔１６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療方法に関する。また本発明は、〔６〕、〔１４〕、〔１５〕および〔１６〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物の、アトピー性皮膚炎の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
加えて本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）を投与する工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療方法に関する。あるいは本発明は、次の成分（ｉ）または（ｉｉ）の、アトピー性皮膚炎の治療用医薬組成物の製造における使用に関する。
（ｉ）ＳＫ４０４遺伝子、またはその一部のアンチセンスＤＮＡ、
（ｉｉ）ＳＫ４０４遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本発明において、アトピー性皮膚炎の指標とすることができる遺伝子を、指標遺伝子という。また指標遺伝子がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質を指標蛋白質という。指標遺伝子は特に断らない限り、ＳＫ４０４またはＳＫ４０４と機能的に同等な遺伝子を示す用語として用いられる。本発明における指標遺伝子の塩基配列、およびこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列は公知である。ヒトＳＫ４０４の塩基配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号：１と配列番号：２にそれぞれ示した。またマウスＳＫ４０４の塩基配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、配列番号：３と配列番号：４にそれぞれ示した。
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定し、対照として同じ被検者の無疹部または健常者から採取された生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程を含む。比較の結果、対照と比較して発現レベルが高い場合に被検者がアトピー性皮膚炎と判定される。
発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が股定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。あるいは、同一患者の無疹部との発現レベルの比較においては、予め無疹部における指標遺伝子の発現レベルを測定して、その患者における無疹部の標準値を決定することができる。標準値を設定した後には、皮疹部の発現レベルのみを測定し、予め決定されたその患者の無疹部の標準値との比較に基づいて、本発明の検査方法を実施することもできる。
被検者の指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、被検者はアトピー性皮膚炎であると判定される。被検者の指標遺伝子の発現レベルが許容範囲内であれば、アトピー性皮膚炎である可能性は低いと予想される。
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、該指標遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。従って本発明によるアトピー性皮膚炎の検査方法は、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは該指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
本発明におけるアトピー性皮膚炎の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、例えばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の指標遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、指標遺伝子の塩基配列に基づいてデザインすることができる。指標遺伝子の塩基配列、および該指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は公知である。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列が異なる遺伝子であっても、指標遺伝子と同様の活性を持ち、アトピー性皮膚炎に関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
また、本発明において、指標遺伝子は、ヒトのみならず、他種におけるホモログも含む。従って、ヒト以外の種における指標遺伝子とは、特に断らないときには、その種に固有の指標遺伝子のホモログ、あるいはその個体に導入されている外来性の指標遺伝子を言う。
本発明においてヒト指標遺伝子のホモログとは、ヒト指標遺伝子をプローブとしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、ヒト以外の種に由来する遺伝子を言う。ストリンジェントな条件とは、一般的には以下のような条件を示すことができる。すなわち、４×ＳＳＣ、６５℃でハイブリダイゼーションさせ、０．１×ｓｓｃを用いて６５℃で１時間洗浄する。ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、ホルムアミドやドデシル硫酸ナトリウム濃度）によって変動する。従って、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を実験または経験的に設定することができる。
プライマーあるいはプローブには、指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（Ｂｅｒｇｅｒ  ＳＬ，Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ．（１９８７）Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＳＪ（１９８５）Ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，Ｒｅｂａｇｋｉａｔｉ  ＭＲ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ，Ｚｉｎｎ  Ｋ，Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Ｋｒｉｃｋａ  ＬＪ．（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）
ハイブリダイゼーション技術を利用したアトピー性皮膚炎の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の指標遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いることができる。
また本発明のアトピー性皮膚炎の検査方法は、指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。このような検査方法としては、例えば、指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
この検出に用いる指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば指標遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、該蛋白質が備える生物学的な活性を言う。
本発明の検査方法においては、被検者の皮膚組織を試料とする。皮膚組織試料の採取は、被検者に多少の痛みを伴う。一方で、皮膚組織は容易に採取できるため、診断材料としては有用である。
皮膚組織を採取する方法は公知である。皮膚組織は、例えば次のようにして採取することができる。すなわち、まず、局所麻酔薬により採取部位を麻酔する。生検個所の周囲の皮膚を引っ張ってたるみの無い状態とした後、パンチを皮膚の中に埋め込み、回転させて標本分の組織をパンチの中に入れる。パンチを引き出し、切り取られたパンチ内の皮膚を回収する。パンチは、中空の皮膚組織採取用の器具である。たとえば直径３ｍの皮膚組織の採取が可能な器具が一般に利用されている。
本発明において、皮膚組織とは、解剖学的には表皮および真皮を含む。皮膚組織には、皮膚固有の細胞のみならず、リンパ球、ランゲルハンス細胞、あるいはマスト細胞などの、皮膚組織において見出される皮膚以外の細胞が含まれる場合がある。これらの皮膚細胞とともに採取される細胞も皮膚組織試料に含まれる。
本発明において、皮疹部における指標遺伝子の発現レベルを決定するために、皮疹部の皮膚組織試料が用いられる。皮疹部とは、急性病変を形成している皮膚を言う。たとえば日本皮膚科学会誌１０４：１２１０（１９９４）に報告されている診断基準にしたがって、急性病変部を判定することができる。具体的には、たとえば次のような臨床所見が急性病変部の指標とされている。
急性病変：紅斑、湿潤性紅斑、丘疹、漿液性丘疹、鱗屑、痂皮
また患者の無疹部における指標遺伝子の発現レベルを決定するために、無疹部の皮膚組織試料が用いられる。患者における無疹部とは、上記病変を伴わない部位の皮膚である。更に、健常者の皮膚における指標遺伝子の発現レベルを決定するには、健常者の皮膚組織が用いられる。本発明における健常者とは、アレルギー性疾患を有していないことが明らかなヒトを言う。皮膚組織の採取は、患者の皮膚組織の採取と同様の手法によって採取することができる。指標遺伝子の発現レベルの比較においては、できるだけ同じ部位の皮膚を比較するのが望ましい。しかし同一患者の皮疹部／無疹部の比較においては、同じ部位に無疹部の皮膚を見出すのが困難であるケースも予想される。このようなケースでは、異なる部位の皮膚を比較に用いることもできる。
皮膚組織試料の採取は容易であるため、ベッドサイドにおける簡便な検査が可能である。例えば、実施例に示す方法によって調製することができる。調製された皮膚組織を破壊してライセートとすれば、指標蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。
上記の生体試料からライセートを調製すれば、指標蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、指標遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートまたはｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。また指標蛋白質が血中に分泌されていれば、被検者の血液や血清などの体液試料に含まれる目的とする蛋白質の量を測定することによって、それをコードする遺伝子の発現レベルの比較が可能である。上記試料は、必要に応じて緩衝液等で希釈して本発明の方法に使用することができる。
ｍＲＮＡを測定する場合には、本発明における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、上記生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ等を挙げることができる。
更に本発明は、本発明の検査方法のための試薬を提供する。すなわち本発明は、指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アトピー性皮膚炎の検査用試薬に関する。あるいは本発明は、指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アトピー性皮膚炎の検査用試薬に関する。本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは本発明の試薬を構成するオリゴヌクレオチドや抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。また本発明の試薬は、前記オリゴヌクレオチドまたは前記抗体の他に、検査や保存に必要な付加的な要素と組み合せて検査用キットとすることもできる。キットを構成することができる付加的な要素を、以下に示す。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
試薬や生体試料を希釈するための緩衝液
陽性対照
陰性対照
標識を測定するための基質
反応容器
アッセイプロトコルを記載した指示書
本発明における指標遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部と同一の患者における無疹部との比較において、各皮膚組織において発現量の変動が確認された。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、アトピー性皮膚炎の検査を行うことができる。
本発明におけるアトピー性皮膚炎の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アトピー性皮膚炎が疑われる症状を示しながら、一般的な検査ではアトピー性皮膚炎と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアトピー性皮膚炎の患者であるか否かを容易に判定することができる。より具体的には、アトピー性皮膚炎が疑われる症状を示す患者において、指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアトピー性皮膚炎である可能性が高いことを示している。
あるいは、アトピー性皮膚炎が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。つまり、アトピー性皮膚炎に対する治療効果の判定に有用である。たとえばアトピー性皮膚炎と診断された患者において、指標遺伝子の発現の上昇は、アトピー性皮膚炎がさらに進行している可能性が高いことを示している。
更に、発現レベルの違いに基づいてアトピー性皮膚炎の重症度を判定することもできる。すなわち、指標遺伝子の発現の上昇の程度は、アトピー性皮膚炎の重症度に相関する。
また本発明は、指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の、皮膚における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト動物からなるアトピー性皮膚炎モデル動物に関する。
本発明によって、指標遺伝子の発現強度が、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部において上昇することが明らかとなった。したがって、皮膚において、指標遺伝子または指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アトピー性皮膚炎のモデル動物として利用することができる。
本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。たとえばマウスＳＫ４０４は、マウスにおける機能的に同等な遺伝子である。マウスＳＫ４０４の塩基配列はｏｎｚｉｎという名称で登録されているが、機能的な情報は伴っていない。マウスＳＫ４０４遺伝子は、本発明に基づくスクリーニングをマウスを用いて実施するときに望ましい指標遺伝子である。マウスＳＫ４０４は、感作マウス耳介皮膚と非感作マウス耳介皮膚における遺伝子の発現レベルを比較したときに、２倍以上の差が見られた遺伝子である。
したがって、マウス指標遺伝子の発現レベルの調節や、投与によって、アトピー性皮膚炎モデル動物を作り出すことができる。すなわち本発明は、マウス指標遺伝子の発現レベルの調節による、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、マウス指標遺伝子によってコードされるタンパク質そのものの投与による、アトピー性皮膚炎モデル動物の製造方法に関する。
本発明のマウス指標遺伝子は、発現レベルの上昇によってアトピー性皮膚炎を誘導することができる。あるいはこの遺伝子や、その遺伝子がコードするタンパク質の投与によって、アトピー性皮膚炎モデル動物を作り出すことができる。これらのカウンターパートはいずれもマウスの遺伝子であることから、遺伝子やタンパク質を投与する場合には、マウスに投与するのが望ましい。
該アトピー性皮膚炎モデル動物は、アトピー性皮膚炎における生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、該アトピー性皮膚炎モデル動物を使用することにより、指標遺伝子のさらなる機能を解明すること、および該遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアトピー性皮膚炎モデル動物は、アトピー性皮膚炎のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。たとえば本発明によるアトピー性皮膚炎モデル動物が皮膚炎を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
本発明において、発現レベルの上昇とは、指標遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、あるいは被験動物が本来備えている指標遺伝子の転写と蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。
遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すようなＤＮＡチップにおけるシグナル強度の差により確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
代表的なトランスジェニック動物は、指標遺伝子を導入し強制発現させた動物等を示すことができる。その他、たとえば指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変した動物などを示すことができる。アミノ酸配列の変異として、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、本発明の指標遺伝子の発現そのものを調節することもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．ＬａｖｉｔｒａｎｏｅｔらＣｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性の指標遺伝子の発現レベルを調整することができる。
本発明のアトピー性皮膚炎のモデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
さらに本発明は、アトピー性皮膚炎治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子はＳＫ４０４である。ＳＫ４０４遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の無疹部に比較して同一の患者の皮疹部において有意に発現レベルが上昇している。またＳＫ４０４遺伝子は、健常者と比較してアトピー性皮膚炎患者の皮疹部において有意に発現レベルが上昇している。
したがって、前記指標遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アトピー性皮膚炎の治療薬を得ることができる。
本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、およおび蛋白質の活性発現のいずれかのステップに対して抑制的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患治療候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行うこともｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）前記被検動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子としては、ＳＫ４０４遺伝子と機能的に同等な遺伝子を利用することができる。本発明において機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。機能的に同等な遺伝子の代表的なものとしては、被験動物が本来備えている、その動物種における指標遺伝子のカウンターパートを挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、例えばアトピー性皮膚炎モデル動物を利用することができる。アトピー性皮膚炎モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原（５μｇ／耳）を２−３日間隔で計８回投与すると、２週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによって本発明によるスクリーニングを実施することができる。
このようにして被験動物に薬剤候補化合物を接触させ、被験動物由来の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を評価することができる。被験動物の由来の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの評価の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、皮膚組織試料を採取し、指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を接触させない対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。皮膚組織試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の抑制
・指標遺伝子の転写活性の抑制
・指標遺伝子の転写産物の安定化阻害もしくは分解の促進等
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、例えば以下のような工程に従って実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の指標遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅ  ｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法においては、指標遺伝子を発現する細胞として、皮膚細胞に加えて、ランゲルハンス細胞、マスト細胞、Ｔ細胞、好酸球、Ｂ細胞、好中球、あるいは好塩基球等の皮膚組織に見出される細胞を用いることができる。
ヒト表皮角化細胞（ケラチノサイト）の初代培養細胞ＮＨＥＫ（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）に対してＴＧＦ−βあるいはｓｏｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅにより刺激を加えることにより分化を誘導することができるという報告がある（例えばＧｅｎｇ  Ｗａｎｇら、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １９８，２７−３０（１９９２））。分化に伴いｃｏｒｎｉｆｉｅｄ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ（ＣＥ）という細胞内構造物が形成される。ＣＥの形成あるいはＣＥ構成分子（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ，ｌｏｒｉｃｒｉｎなど）の遺伝子発現を指標として分化を確認することができる。こうして分化した細胞は、本発明におけるスクリーニングに有用である。
皮膚組織に見出される細胞として、皮膚細胞、Ｔ細胞、好酸球、マスト細胞、好塩基球、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、好中球を利用することもできる。株化皮膚細胞は、均質な細胞を大量に入手できること、培養が容易なことなどの点で、本発明のスクリーニング方法に好適である。以下に本発明に利用できる皮膚細胞株の例を示す。
−株化皮膚細胞：ＨａＣａＴ，Ａ４３１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５５）
−株化Ｔ細胞：Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２），Ｍｏｌｔ−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８２），Ｈ９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１７６）
−株化好酸球：ＡＭＬ１４．３Ｄ１０
−株化マスト細胞：ＨＭＣ−１
−株化好塩基球：ＫＵ−８１２
−株化Ｂ細胞：ＤＮＤ３９，Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）
−（株化）ランゲルハンス細胞：ＭＵＴＺ−３
−（株化）好中球：ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）
株化にカッコをつけたものは、使用に先だって上記株化細胞から分化させる。ランゲルハンス細胞（Ａｌｌａｎ  Ｊ．ＭａｓｔｅｒｓｏｎらＢｌｏｏｄ  ２００２  Ｊｕｌ  １５；１００（２）：７０１−３）、あるいは好中球（Ｓａｎｔｏｓ−Ｂｅｎｅｉｔ  ＡＭらＪ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｍａｙ；６７（５）：７１２−２４）の分化は公知である。
スクリーニングの方法は、まず前記株化皮膚細胞に候補化合物を接触させる。その後、該株化皮膚細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定し、候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、該遺伝子がコードする蛋白質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルを比較するためには、蛋白質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡや蛋白質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４遺伝子、またはＳＫ４０４遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。
またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
あるいは本発明における指標遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示したｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、ＢＡＣライブラリー、ＹＡＣライブラリー等のヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該ｃＤＮＡの配列を含むゲノムＤＮＡクローンを得る。得られたゲノムＤＮＡの配列を基に、本発明で開示したｃＤＮＡの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、候補化合物を接触させない対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択することにより本発明のスクリーニングを行うことができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アトピー性皮膚炎の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＳＫ４０４遺伝子、またはＳＫ４０４遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と侯補化合物を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質が有する活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、指標遺伝子の働きを抑制する。その結果、皮膚において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アトピー性皮膚炎を制御することができる。
これらスクリーニングに用いる被験候補物質としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。
さらに、指標遺伝子によってコードされる蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体も、アトピー性皮膚炎の治療薬として有用である。指標遺伝子は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部において発現が上昇する遺伝子である。したがってこれらの遺伝子の発現、あるいはこれら遺伝子によってコードされる蛋白質の機能を抑制することによって、アトピー性皮膚炎の治療効果を期待することができる。
本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、スクリーニング方法によって選択された化合物を有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＴＡＲＣ遺伝子の患者皮膚組識における発現解析（ＧＡＰＤＨ補正）の結果を表わすグラフである。縦軸は遺伝子の発現強度（ｃｏｐｙ／５ｎｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）、横軸は試料の種類を示す。
図２は、ＣＣＲ４遺伝子の患者皮膚組識における発現解析（ＧＡＰＤＨ補正）の結果を表わすグラフである。縦軸と横軸は図１と同じ。
図３は、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子の患者皮膚組識における発現解析（ＧＡＰＤＨ補正）の結果を表わすグラフである。縦軸と横軸は図１と同じ。
図４は、ＣＸＣＲ３遺伝子の患者皮膚組識における発現解析（ＧＡＰＤＨ補正）の結果を表わすグラフである。縦軸と横軸は図１と同じ。
図５は、ＳＫ４０４のアトピー性皮膚炎患者および健常者皮膚組識における発現解析の結果を表わすグラフである。縦軸と横軸は図１と同じ。
図６は、ヒトＳＫ４０４（上）とマウスＳＫ４０４Ｍ（下）のアミノ酸配列を比較した図である。｜はアミノ酸の一致、．は類似のアミノ酸への置換、そして：はより類似度の高いアミノ酸への置換、を意味する。アミノ酸配列中のドット（．）はギャップを示す。
図７は、ＳＫ４０４ＭのＮｃＮｇａマウスモデルの耳介皮膚における発現解析（ＧＡＰＤＨ補正）の結果を表わすグラフである。縦軸は遺伝子の発現強度（ｃｏｐｙ／５ｎｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）、横軸はＮｃＮｇａモデルマウスの条件を示す。
図８は、ＳＫ４０４遺伝子のヒト組織における発現を表わすグラフである。
図９は、ＳＫ４０４遺伝子の血球細胞における発現を表わすグラフである。健常人（５名）由来の血球細胞を用いた。
図１０はＳＫ４０４のＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ解析を表す写真である。
図１１はアトピー性皮膚炎と乾癬患者皮膚組織におけるＳＫ４０４遺伝子の発現解析を表すグラフである。
図１２はＳＫ４０４蛋白質の発現を表す図および写真である。
【発明を実施するための最良の形態】〔実施例１〕アトピー性皮膚炎患者の皮膚組織におけるＴＡＲＣ、ＣＣＲ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＸＣＲ３遺伝子の発現解析
アトピー性皮膚炎患者の皮疹部ではケモカインＴＡＲＣの高発現や、そのケモカインレセプターＣＣＲ４を発現するＴｈ２細胞の皮膚組織浸潤が報告されており、このようなリンパ球の浸潤が病態形成の一因であることが明らかになっている。
このような報告に基づき、リンパ球の遊走に重要な役割を果たしているケモカイン（ＴＡＲＣ，ＲＡＮＴＥＳ）およびリンパ球上に発現しているケモカインレセプター（ＣＣＲ４，ＣＸＣＲ３）についてアトピー性皮膚炎患者皮膚組織における発現を定量し、患者の炎症皮膚組織におけるリンパ球の浸潤を評価した。
（１）皮膚検体の入手
アトピー性皮膚炎患者１４例、健常者４例から同意を得て、患者からは無疹部と急性病変部を、健常者からは正常皮膚を、各部位からそれぞれ３個の皮膚検体（直径３ｍｍ）を採取した。急性病変部位は日本皮膚科学会の診断基準に基づき判定した。皮膚を採取したアトピー性皮膚炎患者の臨床情報を表１に示す。
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（２）ヒト皮膚からの遺伝子発現解析用のＲＮＡ調製
採取した３個の皮膚ｂｉｏｐｓｙ（直径３ｍｍ）をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に浸漬し、ウルトラタックスＴ８ホモジナイザー（ＩＫＡ社）を使用してホモジナイズした。ホモジナイズ以降はＩｓｏｇｅｎのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして回収した。回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、そのマニュアルに従って更に精製した。
（３）定量的ＰＣＲ用のｃＤＮＡ合成
前述の方法で抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＤｎａｓｅ（ニッポンジーン）処理し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。同時に、コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。定量的ＰＣＲの反応液組成は表２に示した。
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（４）ＴＡＲＣ，ＣＣＲ４，ＲＡＮＴＥＳおよびＣＸＣＲ３遺伝子の皮膚組織における発現解析
ＴＡＲＣ，ＣＣＲ４，ＲＡＮＴＥＳおよびＣＸＣＲ３遺伝子の皮膚組織における発現量を定量的に評価するために、ＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ  ７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、各遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。使用した全てのＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識した。
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。各遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。測定した遺伝子の塩基配列に対応するＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号を、遺伝子名に続けて表示した。
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ＧＡＰＤＨにより補正した各遺伝子の発現量（ｃｏｐｙ／５ｎｇ  ＲＮＡ）を図１〜図４に示す。症例４、１３、１６の３例では無疹部と比較して皮疹部においてＴＡＲＣ、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＲ４およびＣＸＣＲ３の発現量が著しく増加していた。皮疹部の無疹部に対する変動倍率を表３に示した。
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これらの３例では、皮疹部におけるケモカインの発現が高く、すなわちリンパ球が皮膚に遊走しやすい環境にあり、かつリンパ球自身のマーカーであるケモカインレセプターの発現が高い、すなわち既に皮膚に遊走してきているリンパ球数が多いことが推定される。
〔実施例２〕ジーンチップによるディファレンシャル発現解析
次に、これらの３例（症例４、１３、１６）の皮膚組織（無疹部と皮疹部）について、アフィメトリックス社ジーンチップによるディファレンシャル発現解析を行い、リンパ球浸潤が多いあるいはリンパ球が遊走しやすい環境にあるアトピー性皮膚炎皮膚組織において発現が誘導あるいは抑制される遺伝子の探索を行った。この解析によりリンパ球の皮膚組織への遊走、浸潤を促す遺伝子、病変部皮膚浸潤リンパ球で発現変動している遺伝子、すなわちアトピー性皮膚炎の病態形成に重要な遺伝子を選択することができる。
（１）ジーンチップ用のｃＲＮＡ合成
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２−５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）２４（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌの方法に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し、１本鎖ｃＤＮＡを作製した。
Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列に（ｄＴ）２４を付加した塩基配列からなる。
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次に、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに従い、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ，ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩおよびＲＮａｓｅ  Ｈを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓに供し、エタノール沈殿により精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１０μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをＤＮＡチップに入れ、４５℃で１６時間ハイブリダイゼーションした。ＤＮＡチップとしてはＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａｖ２，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を用いた。
ＤＮＡチップを洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌヤギＩｇＧとビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンＩｇＧ抗体の混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＤＮＡチップ解析ソフトにて解析した。
（２）ＤＮＡチップ解析
ＤＮＡチップ解析ソフトであるＳｕｉｔｅを用いて発現蛍光強度を測定し、データ解析を行った。まず全てのチップについてＡｂｓｏｌｕｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓを行い、用いたサンプル各々の遺伝子発現量を測定した。
１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔに対応するチップデータの解析は、プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ，Ｌｏｇ  Ａｖｇ，Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅ  ＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ），Ａ（ａｂｓｅｎｔ），およびＭ（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定を行った。用語定義は以下に示した。
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合
Ｌｏｇ  Ａｖｇ；パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｖｇ  Ｄｉｆｆ）も計算した。
サンプル間の遺伝子発現を比較する場合には、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｕｉｔｅ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅに従いＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓを行った。チップ間の補正は、各チップの全プローブセットの蛍光強度の平均値が一定になるように補正を行った。
（３）アトピー性皮膚炎患者の無疹部と急性病変部間で発現変動する遺伝子の解析
上記で選んだ３例の各患者の無疹部における遺伝子発現と急性病変部における遺伝子発現をＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓによって比較解析し、急性病変部で無疹部と比べて２倍以上発現が増加している遺伝子、１／２以下に発現が減少している遺伝子を選択した。患者ごとに選んできた遺伝子について、今度は３例の患者全てで共通変動している遺伝子群を選択した。共通変動遺伝子群の中から、アトピー性皮膚炎患者の急性病変部で発現が増加しているＳＫ４０４を選択した。ＳＫ４０４遺伝子について、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓにより算出されたｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅを表４に示した。
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ＳＫ４０４の全長塩基配列を配列番号：１に、全長アミノ酸配列を配列番号：２に示した。
（４）ＳＫ４０４遺伝子の定量的ＰＣＲ発現解析による皮膚組織での評価
更に、先に記載した方法に従ってＡＢＩ７７００を用いた定量的ＰＣＲを行い、チップ解析を行った３症例を含めたアトピー性皮膚炎患者１２例と健常者４例の皮膚組織についてＳＫ４０４の遺伝子発現を評価した。定量的ＰＣＲに用いたフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、Ｔａｑｍａｎプローブ（ＴＰ）の配列を以下に示した。サンプル間の発現量の補正はＧＡＰＤＨの発現量に基づいて行った。
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解析の結果を図５および表５に示した。ＳＫ４０４は解析した１１例の患者皮膚のうち９例において急性病変部で高発現というプロファイルを示した。
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（５）統計解析
ＡＢＩ７７００を用いた定量的ＰＣＲにより得られたＳＫ４０４  ｍＲＮＡのコピー数をもとに、ウィルコクソン符号付順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋｓ  ｔｅｓｔ）を行った。ｐ値は０．０２６２と算出され、ＳＫ４０４のアトピー性皮膚炎患者急性病変部での高発現（無疹部比較）が統計学的に有意であることが示された。
〔実施例３〕マウス皮膚炎モデルにおけるＳＫ４０４遺伝子の発現解析
ヒトアトピー性皮膚炎の無疹部と皮疹部間で発現変動している遺伝子とマウス皮膚炎モデルの非感作皮膚と感作皮膚間で発現変動している遺伝子を比較解析し、共通変動している遺伝子群を選ぶことができれば、共通変動している遺伝子についてノックアウトマウスあるいはトランスジェニックマウスを作製することにより、その遺伝子の皮膚炎病態における重要性を評価することができる。また、共通変動遺伝子が液性因子あるいは膜蛋白質であった場合には中和抗体、液性因子そのもの、あるいは可溶性レセプターなどを投与することにより、遺伝子改変マウスを利用した場合に比べて短期間で、その遺伝子のヒト皮膚炎病態における重要性を評価できる。ＳＫ４０４についてマウスホモログを同定し、マウス皮膚炎モデルでの遺伝子発現解析を行った。
（１）ＳＫ４０４マウスホモログ（ＳＫ４０４Ｍ）の同定
ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースに対して相同性検索を行い、ＳＫ４０４のマウスホモログ、ＳＫ４０４Ｍを同定した。ＳＫ４０４Ｍの全長塩基配列を配列番号：３に、全長アミノ酸配列を配列番号：４に示した。ＳＫ４０４とＳＫ４０４Ｍのアミノ酸レベルでの配列比較の結果を図６に示した。
（２）ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚炎モデルの作製
ＳＰＦ  ＮＣ／Ｎｇａマウス（♂・６週齢）の耳介部と背部皮膚にダニ抗原（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａ  ｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ  ５μｇ／部位）を３日間隔で計９回皮内投与した。耳浮腫の測定と背部皮膚の症状観察は週１回の割合で行った。血中のｔｏｔａｌ  ＩｇＥ濃度については、ダニ抗原投与前、投与開始１４日後、２８日後に採血を行い、マウスＩｇＥ測定キット（ヤマサ醤油）にて測定した。コントロールとして非感作群を取り、各群２０匹（１０匹：ダニ抗原投与開始１４日後解剖、１０匹：ダニ抗原投与開始２８日後解剖）で試験を行った。
ダニ抗原投与１４日後解剖および２８日解剖のいずれの試験においても非感作群では耳浮腫は認められなかったが、感作群ではダニ抗原投与１週間後より明らかな耳の肥厚を示し、２週間後以降高値を維持した（表６）。
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また、血中のｔｏｔａｌ  ＩｇＥ濃度は、感作群においてダニ抗原投与２週間後より濃度の上昇が認められた（表７）。
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これらの結果に加え、病理学的検査の結果、感作群の耳介皮膚では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球ならびにリンパ球）、浮腫、結合組織の増生およびマスト細胞の脱顆粒等が軽度から中等度の変化で観察され、皮膚炎病態を形成していることが確認できた。
（３）マウス皮膚からの遺伝子発現解析用のＲＮＡ調製
非感作マウスおよび感作マウス（感作後１４日と２８日）より耳介皮膚および背部皮膚を回収し、Ｉｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に浸漬し、ホモジナイザー（ＮＳ−３１０Ｅ；（株）日音医理科器械製作所）を使用して氷冷下にホモジナイズした。ホモジナイズ以降はＩｓｏｇｅｎのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして回収した。回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、そのマニュアルに従って更に精製を行った。
（４）定量的ＰＣＲ用のｃＤＮＡ合成
１群１０匹の各個体の耳介から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをまとめ、そのｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＤｎａｓｅ（ニッポンジーン）処理し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。同時に、コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。定量的ＰＣＲの反応液組成は表２に示した。
（５）ＳＫ４０４Ｍ遺伝子のマウス皮膚炎モデル皮膚組織における発現解析
ＳＫ４０４Ｍ遺伝子のマウス皮膚炎モデル耳介皮膚組織における発現量を定量的に評価するために、ＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ  ７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ＳＫ４０４Ｍ遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。使用したＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識した。
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
ＳＫ４０４ＭおよびマウスＧＡＰＤＨ遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。指標遺伝子の塩基配列に対応するＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号を、遺伝子名に続けて表示した。
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解析の結果を図７に示した。ＳＫ４０４Ｍは感作１４日後および２８日後の耳介皮膚において非感作耳介皮膚と比べて高い発現を示した。１４日目では非感作マウスの７．５倍の、２８日目では非感作マウスの１７．３倍の発現量が認められた。
ＳＫ４０４はアトピー性皮膚炎の急性期に発現が上昇してくることから、アトピー性皮膚炎の発症に重要な役割を果たしている可能性が考えられる。また、ＴＡＲＣやＣＣＲ４といったケモカイン、ケモカインレセプターと似た患者発現プロファイルを示すことから、皮膚組織へのリンパ球浸潤に関与し、病態形成の一因になっている可能性も考えられる。ＳＫ４０４はその染色体上の位置（４ｑ２１）やアミノ酸の一次構造からＣＸＣケモカインである可能性があり、リンパ球へ直接作用することも充分考えられる。マウス皮膚炎モデル病態においてもヒトのアトピー性皮膚炎と同様の発現変動が認められたことから、皮膚炎病態における重要性が裏付けられた。またこのようなマウスモデルにおいて様々な方法で遺伝子産物を阻害、あるいは強制発現させることによりＳＫ４０４の重要性は容易に評価できる。
〔実施例４〕ＳＫ４０４遺伝子のヒト組織での発現分布
ＳＫ４０４遺伝子のヒト組織における発現をＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法にて解析した。１μｇの各種組織由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して定法によりｃＤＮＡを合成し、そのうちの１／１０量（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ換算で１００ｎｇ相当）のｃＤＮＡを用いてＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ：Ｒｏｃｈｅ社）を行った。定量には２本鎖ＤＮＡ特異的に結合する蛍光色素であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用した。発現解析には脂肪組織、脳、副腎、骨髄、大腸、心臓、腎臓、胎児腎、肝臓、胎児肝、肺、リンパ節、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、子宮、Ｈｅｌａ細胞、腎皮質上皮細胞、冠状動脈血管内皮細胞、冠状動脈血管平滑筋細胞、白血球、ＰＨＡ活性化白血球、正常ヒト近位尿細管上皮細胞由来のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用した。
発現解析に使用したＳＫ４０４遺伝子のフォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）の塩基配列は、以下に示すとおりである。
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解析の結果を図８に示した。発現解析の結果は、組織間の比較が可能なようにＧＡＰＤＨの発現量に基づいて補正を行った。ＳＫ４０４遺伝子は大腸、骨髄、脾臓、リンパ節、肺、気管、脂肪組織、白血球で高発現していた。
〔実施例５〕ＳＫ４０４遺伝子の健常人由来血球細胞における発現
アレルギー疾患の病態形成に重要な役割を果たしているＴ細胞、Ｂ細胞などの血球細胞におけるＳＫ４０４遺伝子の発現を解析した。
（１）末梢血液からの細胞の分画
健常人由来の末梢血液（約５−１０ｍｌ）から比重勾配法と磁気ビーズを用いた磁気細胞分離システム（ＭＡＣＳ・Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）を用いて細胞の分画を行った。まず末梢血液から遠心分離により血漿を除いた後、残りの血液を比重勾配液Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）に重層して遠心分離を行い、層分離した中間層をリンパ球分画、下層を顆粒球分画として分取した。リンパ球分画はＣＤ３磁気ビーズと反応後、ナイロンスチールカラムを用いたＭＡＣＳにかけ、ＣＤ３陽性細胞をＴ細胞として回収した。ＣＤ３陰性細胞はさらにＣＤ１４磁気ビーズと反応させ、ＭＡＣＳによるＣＤ１４陽性細胞を単球、ＣＤ１４陰性細胞をＢ細胞とした。顆粒球分画はＣＤ１６磁気ビーズと反応させ、ＣＤ１６陽性細胞を好中球、ＣＤ１６陰性細胞を好酸球として分取した。
（２）分画した細胞からのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの合成
分画した細胞はＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、そのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして回収した。
調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理を行った後、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとし、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。
（３）ＳＫ４０４遺伝子の血球細胞における遺伝子発現解析
ＳＫ４０４遺伝子の分画した各細胞における発現量を定量的に評価するために、前述した方法に従いＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量的ＰＣＲを行った。解析に使用したＳＫ４０４のプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブは実施例２に記載した。
解析の結果を図９に示した。ＳＫ４０４は解析した５種の細胞全てに発現しており、発現量の高い順にＢ細胞、Ｔ細胞、単球、好酸球、好中球であった。
〔実施例６〕ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚炎モデルの耳介皮膚を用いたＳＫ４０４遺伝子のＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）解析
ＳＫ４０４遺伝子はヒトのアトピー性皮膚炎の病変部位で高発現していることが明らかになり、マウス皮膚炎モデルにおいてもマウスホモログ（ＳＫ４０４Ｍ）が同様に病変部位で高発現していることが明らかになった。我々は病変部におけるＳＫ４０４発現細胞を同定する目的で、ＮＣ／Ｎｇａマウス皮膚炎モデルの耳介皮膚を用いたＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ解析を行った。
感作４週目のマウス耳介皮膚を１０％中性緩衝ホルマリンによる固定後、パラフィン包埋を行い、パラフィンブロックの作製を行った。プローブは配列番号：３５に記載の配列を使用し、ＳＰ６およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてジコキシゲニン標識によるセンスプローブおよびアンチセンスプローブを作製した。シグナルの検出は、スライドグラスに貼り付けたパラフィン切片にプローブを反応させ、更にアルカリフォスファターゼ標識した抗ジコキシゲニン抗体を反応させた後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを発色基質として反応させ、発色させた。
ＩＳＨ染色により特異的なシグナルが検出できたスライドは水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を行い、ＳＫ４０４Ｍ遺伝子発現細胞の同定を行った。
結果を図１０に示したが、マウス皮膚炎病変部においては、ＳＫ４０４Ｍは好中球およびＴ細胞に発現していた。陽性細胞の多くは好中球であったが、シグナル強度（細胞内の発現量）としてはＴ細胞の方が高かった。
〔実施例７〕ＳＫ４０４遺伝子の乾癬患者皮膚組織における発現解析
ＳＫ４０４はアトピー性皮膚炎患者の急性病変部において無疹部に比べて発現上昇が認められた遺伝子として同定されたが、別の皮膚炎症性疾患である乾癬の患者皮膚組織における遺伝子発現解析を行うことにより、アトピー性皮膚炎特異的な発現変動を示すのか、あるいは両疾患で共通した発現変動を示すのかが明らかになる。アトピー性皮膚炎特異的な発現変動を示した場合には、アトピー性皮膚炎病態を特徴づける遺伝子の一つとして診断および創薬ターゲットとしての価値が高まると考えられる。
（１）皮膚検体の入手
乾癬患者６例から同意を得て、無疹部と病変部を各部位からそれぞれ３個の皮膚検体（直径３ｍｍ）を採取した。
（２）ヒト皮膚からの遺伝子発現解析用のＲＮＡ調製
採取した３個の皮膚ｂｉｏｐｓｙ（直径３ｍｍ）をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に浸漬し、ウルトラタックスＴ８ホモジナイザー（ＩＫＡ社）を使用してホモジナイズした。ホモジナイズ以降はＩｓｏｇｅｎのマニュアルに従い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿を回収した。沈殿は７５％エタノールでリンス、遠心を行い、沈殿をｔｏｔａｌ  ＲＮＡとして回収した。回収したｔｏｔａｌ  ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、そのマニュアルに従って更に精製を行った。
（３）定量的ＰＣＲ用のｃＤＮＡ合成
前述の方法で抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。同時に、コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。定量的ＰＣＲの反応液組成は表２に示した。
（４）ＳＫ４０４遺伝子の乾癬患者皮膚組織における発現解析
ＳＫ４０４遺伝子の乾癬患者皮膚組織における発現量を定量的に評価するために、先に記載した方法に従ってＡＢＩ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）による定量的ＰＣＲを行った。結果を図１１に示したが、ＳＫ４０４遺伝子はアトピー性皮膚炎患者の皮疹部でのみ無疹部と比べて発現亢進を示し、乾癬の病態においては無疹部と皮疹部間で発現変動は認められなかった。この結果から、ＳＫ４０４遺伝子は単に皮膚の炎症により発現が変動しているのではなく、アトピー性皮膚炎病態の特徴を反映した発現変動を示していると考えられた。
〔実施例８〕ＳＫ４０４蛋白質の発現
ＳＫ４０４遺伝子産物が細胞外に分泌される液性因子なのか、あるいは細胞内蛋白質なのかを確かめるために、ＨＥＫ２９３細胞を使用して蛋白質の発現を行った。
（１）ＳＫ４０４遺伝子発現ベクターの作製
ＳＫ４０４遺伝子全長３４８ｂｐから終止コドンを除いて５’側にＥｃｏＲＩサイト、３’側にＢａｍＨＩサイトを付加したＳＫ４０４遺伝子断片をＰＣＲにより合成し、Ｃ末側にＦＬＡＧタグを付加した形で発現可能なｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４ベクター（ｓｉｇｍａ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイト間に連結した。終止コドンを含まないＳＫ４０４遺伝子断片の合成に用いたプライマーの配列を以下に示した。
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（２）ＨＥＫ２９３細胞発現系を用いたＳＫ４０４遺伝子産物の発現
直径１０ｃｍのｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅあたり２Ｘ１０６個のＨＥＫ２９３細胞を遺伝子導入の前日に播種した。翌日、１枚のｐｌａｔｅに対して１０μｇのＳＫ４０４遺伝子発現ベクターをＴｒａｎｓＩＴ  ＬＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ社）を使用し、そのマニュアルに従って導入した。遺伝子導入開始８時間後に培地を交換し、４８時間後まで５％ＣＯ２インキュベーター、３７℃で培養した。４８時間後に培養上清を回収した後、ｐｌａｔｅをＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを加えて細胞を破砕し、細胞破砕液を回収した。
回収した培養上清２００ｍｌを５００μｌのＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（ｓｉｇｍａ）に通塔し、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３）で溶出を行った。溶出時の分画は５００μｌごとに行った。
細胞破砕液は１０μｌ、培養上清精製後の各フラクションは２００μｌ分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルはナイロン膜上にのせ、トランスファー緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，０．１９２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に浸したろ紙で挟み、トランスファー装置上でブロッティングを行った（１４０ｍＡ／ｇｅｌ，１ｈｒ）。ブロッティングした膜はＢｌｏｃｋｉｎｇ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％ＢＳＡ）中で３０分間振とうし、未反応の活性基をブロックした。次に、膜をＢｌｏｃｋｉｎｇ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％ＢＳＡ）で１０μｇ／ｍｌに希釈したＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｓｉｇｍａ）溶液に浸し、室温で２時間反応させた。Ｗａｓｈ溶液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，３０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４）にて膜を３回洗浄した後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，２％ＢＳＡ）で希釈したペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスイムノグロブリン溶液に浸し、室温で１時間反応させた。反応後、膜をＷａｓｈ溶液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，３０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４）にて３回洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、抗体が結合したバンドをＸ線フィルムに感光させて、検出した。
結果を図１２に示す。ＨＥＫ２９３細胞発現系ではＳＫ４０４は細胞外には分泌されず、細胞内に存在していることが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、アレルギー性皮膚炎の指標遺伝子ＳＫ４０４を提供する。ＳＫ４０４は、皮疹部における発現レベルがアトピー性皮膚炎患者の無疹部に比べて高い指標遺伝子として同定された遺伝子である。またＳＫ４０４は、アトピー性皮膚炎患者の皮疹部における発現レベルが健常者の発現レベルに比べて高い指標遺伝子でもあった。
更に本発明は、マウスＳＫ４０４の指標遺伝子としての用途を提供した。マウスＳＫ４０４遺伝子は、ダニアレルゲン感作マウスの耳介皮膚における発現レベルがダニアレルゲン非感作マウスの耳介皮膚に比べて高い指標遺伝子である。
遺伝子の発現レベルを指標とすることにより、アトピー性皮膚炎の検査方法、アレルギー性疾患モデル動物の作成、および該疾患の治療のための化合物をスクリーニングすることが可能となった。
本発明の指標遺伝子は、その発現の変化が病態と結びついている。したがって指標遺伝子の発現や、指標遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を調節することによってアレルギー性皮膚炎の治療が可能となる。例えば患部や患者の皮膚において発現が上昇する遺伝子の場合には、発現やその活性を阻害することが、アトピー性皮膚炎の治療戦略のターゲットとなる。また本発明の指標遺伝子には、アトピー性皮膚炎の治療におけるモニタリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が期待できる。
本発明によって提供された指標遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。従って、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアトピー性皮膚炎の検査方法は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。従って本発明によるアトピー性皮膚炎の検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味で本発明の指標遺伝子の診断的価値は高い。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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