(57)【要約】（課題）  本発明の課題は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断するための有用な方法およびキットを提供することにある。  （解決手段）  癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定する方法であって、（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、を含み、ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定される方法を用いる。また、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定するためのキットを用いる。
2005010180.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定する方法であって、
（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、
を含み、
ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定される方法。
【請求項２】
少なくとも２つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも３つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する、請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】
癌が、甲状腺癌、胃癌、肝癌、乳癌、大腸癌からなる群より選ばれる少なくとも１つである、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＨＯＸＤ９の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、甲状腺癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、甲状腺癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、浸潤する可能性のある甲状腺癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも２つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、浸潤する可能性のある甲状腺癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、およびＨＯＸＤ４の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、浸潤する可能性のある甲状腺癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、胃癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、リンパ節転移する可能性のある胃癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＨＯＸＤ１１の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移する可能性のある胃癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管に浸潤する可能性がある肝癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＨＯＸＡ４および／またはＨＯＸＢ１の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、進行した肝癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、乳癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、乳癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高いか、および／または、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、大腸癌が存在すると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移の可能性のある大腸癌であると判定される、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
閾値ＨＯＸ遺伝子発現量が、正常な組織のＨＯＸ遺伝子の発現量である、請求の範囲第１項ないし第６項、第１０項、第１３項、第１４項、第１７項ないし第１９項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
閾値ＨＯＸ遺伝子発現量が、転移能および／または浸潤能を有しない癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量である、請求の範囲第１項ないし第４項、第１項ないし第９項、第１１項、第１２項、第１５項、第２０項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
閾値ＨＯＸ遺伝子発現量が、Ｉ期ないしＩＶ期からなる群より選ばれる少なくとも１つの進行度の癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量である、請求の範囲第１項ないし第４項、第１６項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
以下からなる群より選ばれる少なくとも１組のプライマーペアを用いたＰＣＲによりＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する、請求の範囲第１項ないし第２３項のいずれかに記載の方法：
配列番号１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号１８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号１９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号２８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号２９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号３８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号３９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号４８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号４９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号５８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号５９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号６８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号６９で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７０で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７１で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７２で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７３で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７４で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７５で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７６で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
配列番号７７で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および配列番号７８で表される塩基配列またはその１若しくは２塩基が置換されている塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア。
【請求項２５】
ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定するためのキット。
【請求項２６】
ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、甲状腺癌の存在を判定するためのキット。
【請求項２７】
ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、浸潤する可能性のある甲状腺癌を判定するためのキット。
【請求項２８】
ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、胃癌の存在を判定するためのキット。
【請求項２９】
ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、リンパ節転移する可能性のある胃癌を判定するためのキット。
【請求項３０】
ＨＯＸＤ１１の発現量を測定する手段を備えた、肝転移する可能性のある胃癌を判定するためのキット。
【請求項３１】
ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、肝癌の存在を判定するためのキット。
【請求項３２】
ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管に浸潤する可能性がある肝癌を判定するためのキット。
【請求項３３】
ＨＯＸＡ４および／またはＨＯＸＢ１の発現量を測定する手段を備えた、進行した肝癌を判定するためのキット。
【請求項３４】
ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、乳癌の存在を判定するためのキット。
【請求項３５】
ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、乳癌の存在を判定するためのキット。
【請求項３６】
ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、大腸癌の存在を判定するためのキット。
【請求項３７】
ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、肝転移の可能性のある大腸癌を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ホメオボックス遺伝子の発現量および発現パターンを測定することにより、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定および／または診断する方法、およびキットに関する。
【背景技術】  ホメオボックス遺伝子は、胚発生の形態形成のマスター調節遺伝子であり、転写因子をコードしている。ホメオボックス遺伝子の１ファミリーであるＨＯＸ遺伝子群は、４つの染色体に存在し、各染色体上には９から１１個の遺伝子からなるクラスターを形成している。現在、ＨＯＸファミリーに属する遺伝子は、ヒトでは３９個の遺伝子が同定されている。３９個のＨＯＸ遺伝子は、胚発生の形態形成過程では時間的、空間的に統制のとれた発現パターンを示す。ＨＯＸ遺伝子は、細胞の持つ位置情報（番地）の担い手であり、その発現パターンが発現領域における組織構築や機能の特異化を決定している。ＨＯＸ遺伝子は、胎生期だけでなく成体においても臓器、組織に特徴的な発現パターンを示し、組織構築や機能の維持に一役を担っていると考えられる。
一方、一般に癌が転移性および／または浸潤性のものであるかどうかを判定および／または診断することは容易ではなく、さらにどの部位に転移するのかを事前に判定および／または診断することは、事実上不可能である。また、癌の存在やその進行度を判定および／または診断する方法については、多くの提案がなされているが、まだ改善の余地がある。
ところで、癌とＨＯＸ遺伝子の発現との関連については、いくつかの報告がなされている（例えば、Ｃｉｌｌｏ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １８８：１６１−１６９，２００１；Ｃｉｌｌｏ  Ｃ，Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １４：３８−４９，１９９４−９５；Ｔｉｂｅｒｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８：６０８−６１５，１９９４；Ｃａｌｖｏ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１２７７６−１２７８１，２０００；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｍ  Ｃｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１３２：３３２−３３４，１９９２）。しかし、これらの報告には、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定し、これに基づいて癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定および／または診断することについては記載されていない。また、複数のＨＯＸ遺伝子の発現量を用いることにより、これらの判定および／または診断の精度が向上することについても知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の課題は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断するための有用な方法およびキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】  癌における組織構築の乱れや浸潤、転移といった現象は、細胞の持つ位置情報（番地）の異常が原因と捉えることができる。即ち、間違った番地には住めないから癌細胞は原発巣から出て行き、番地にあった転移巣へ移住するというのが浸潤、転移であると考えることができる。したがって、ＨＯＸ遺伝子によって位置情報が決められているのであれば、癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現パターンを解析すれば、その癌が転移しやすいのか、またどこの臓器に転移するのかわかるはずである。本発明者らは、上記の発想の下に研究を進めた結果、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定し、これをあらかじめ決定した閾値ＨＯＸ遺伝子の発現量と比較することにより、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、および癌の進行度を判定および／または診断できることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、または癌の進行度を判定および／または診断する方法であって、
（１）被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する工程、
（２）前記ＨＯＸ遺伝子の発現量を対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量と比較する工程、
を含み、
ここで、前記ＨＯＸ遺伝子の発現量が閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行している、と判定および／または診断される方法、に関連する。
さらに、本発明は、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段を備えた、癌の存在、癌の転移の可能性、癌の浸潤の可能性、癌の進行度を判定および／または診断するためのキットに関連する。
【図面の簡単な説明】図１は、ヒトの正常臓器の各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を示す。
図２は、甲状腺癌細胞株８株（ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２，８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１）と正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を示す
図３は、ヒト甲状腺癌細胞の浸潤能を評価した結果を示す。
図４は、ヒト甲状腺細胞の浸潤能とＨＯＸ遺伝子の発現量との関係を示す。
図５は、ヒト胃癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図６は、リンパ節転移または肝転移のあるヒト胃癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図７は、ヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図８は、浸潤によるヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量および各進行度におけるヒト肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図９は、ヒト乳癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１０は、検体別のヒト乳癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１１は、ヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１２は、検体別のヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
図１３は、肝転移のあるヒト大腸癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明において、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する方法または手段としては、その発現を定量することができるものであれば特に制限はないが、ＰＣＲを用いた以下の方法が好ましい。即ち、組織または細胞から全ＲＮＡを抽出し、この全ＲＮＡに対するｃＤＮＡを逆転写反応により得た後、例えば表１に示されるプライマーペアを用いて定量的ＰＣＲにより各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定することができる。この場合、最初のＲＮＡ量に依存したサンプル間のばらつきをなくすために、例えば、β−アクチン遺伝子またはＧ３ＰＤＨ遺伝子等の細胞内で安定して発現する遺伝子を内部標準として用いることができる。そして、これら内部標準遺伝子の発現についても同様の定量を行い、ＨＯＸ遺伝子の発現量をこれら内部標準遺伝子の発現量で割って規格化した値を、ＨＯＸ遺伝子発現量として用いてもよい。また、ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する他の方法または手段としては、例えば、ＤＮＡチップを用いるものや、ＨＯＸ遺伝子産物に対する抗体を用いるものなどを挙げることができる。特に、本発明のキットに用いるＨＯＸ遺伝子の発現量を測定する手段としては、ＤＮＡチップまたは抗体を用いるものが簡便であり、好ましい。
本発明に用いられる閾値ＨＯＸ遺伝子発現量としては、本発明の判定および／または診断ができるものであれば特に制限はないが、例えば、正常な組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量、癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量、転移能および／または浸潤能を有しない癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量、転移能および／または浸潤能を有する癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量、Ｉ期ないしＩＶ期からなる群より選ばれる少なくとも１つの進行度の癌組織におけるＨＯＸ遺伝子の発現量等を挙げることができる。また、例えば、正常な組織と癌組織との間でＨＯＸ遺伝子の発現量が異なる場合、これらをあらかじめ求めておき、これらの間で任意にカットオフ値を設定し、これを閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とすることもできる。同様に、浸潤能のある組織とない組織、転移能のある組織とない組織、進行度の異なる組織間におけるＨＯＸ遺伝子発現量の違いをあらかじめ求めておき、これらの間で閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を設定することもできる。
そして、被験者から採取した組織の少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子発現量が、判定および／または診断の目的に応じてあらかじめ決定した閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合または低い場合に、癌が存在する、癌の転移の可能性がある、癌の浸潤の可能性がある、または、癌が進行していると判定および／または診断されることとなる。さらに、転移や浸潤に関しては、どの部位に転移や浸潤が起こるのかを判定および／または診断することも可能となる。
本発明において比較されるＨＯＸ遺伝子の数としては、少なくとも１つであるが、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上である。比較されるＨＯＸ遺伝子の数が多いほど、判定および／または診断の精度が向上することとなる。
本発明で対象となる癌としては、細胞の増殖異常に起因する疾患であれが特に制限はないが、例えば、甲状腺癌、胃癌、肝癌、乳癌、大腸癌、脳腫瘍、腎臓癌、膵臓癌、胆嚢・胆道癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、骨肉腫等を挙げることができる。また、原発巣不明の癌（転移巣しか見いだせない癌）についても、ＨＯＸ遺伝子の発現を調べることにより、その起源を明らかにすることができるようになる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は例示のためのものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】１．ＨＯＸ遺伝子の発現量の測定方法
（プライマーペアの設計）
ＨＯＸ遺伝子の塩基配列をＰｒｉｍｅｒ  ＥｘｐｒｅｓｓＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）に入力し、各ＨＯＸ遺伝子間でホモロジーの高い領域を排除してプライマーを設計した。得られたプライマーペアにより増幅される領域をＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｒｃｈ（ＳＷｓｒｃｈＰｒｏｇｒａｍｓ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ＳＷｓｒｃｈ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で解析し、他の遺伝子を増幅する可能性のないことを確認した。
さらに設計したプライマーペアを用いて得られるＰＣＲ産物が目的のＨＯＸ遺伝子であることを次のようにして確認した。まず、被験者から採取した組織から、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。そして、３μｇの全ＲＮＡを、４Ｕ／μＬのモロニーウサギ白血病ウイルス転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７．５ｍＭのジチオスレイトール、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５μＭのｄＮＴＰ、２μＭのランダムプライマーを含んだ全量５０μＬの反応液中で３７℃で２時間反応させて逆転写を行い、ｃＤＮＡを得た。そして、１μＬのｃＤＮＡを用いて、１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０５）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭのプライマー、０．１Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）を含む２５μＬの反応液中でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、９５℃、１０分の初期変性を行った後、９４℃で４０秒、６０℃で４０秒、７２℃で１分のサイクルを３５サイクル行った。ＰＣＲ産物は、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＨＯＸプラスミドベクターを得た。内部標準としてのβ−アクチン遺伝子およびグリセロール−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子についても同様にクローニングを行い、ｐＣＲ２．１−β−アクチンプラスミドベクターおよびｐＣＲ２．１−Ｇ３ＰＤＨプラスミドベクターを得た。これらのプラスミドベクターを鋳型にして、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭ  ＥＴ  ターミネーターサイクルシークエンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｏｋｙｏ）を用いてシークエンス反応を行い、シークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）で塩基配列を決定した。その結果、表１に示すプライマーペアは、各ＨＯＸ遺伝子を特異的に増幅できることを確認した。
（検量線の作成）
上記で得たｐＣＲ２．１−ＨＯＸプラスミドベクターの５×１０４〜５個を鋳型として、表１に示したプライマーペアとＱｕａｎｔｉＴｅｘｔＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ）を加えた全量２０μＬの反応液を、初期変成（９５℃、１５分）の後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分、を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲによる増幅を行った。これらの初期の既知量の対数値に対して、目的遺伝子のＰＣＲ反応生成物量が一定量（レポーター（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ）の蛍光強度で０．３）に到達するのに必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ）をプロットし、検量線を作成した。各ＨＯＸ遺伝子の発現は、５×１０４〜１０コピーの範囲で定量可能であった。また、内部標準としてのｐＣＲ２．１−β−アクチンプラスミドベクターおよびｐＣＲ２．１−Ｇ３ＰＤＨプラスミドベクターについても、５×１０６〜１０３個を鋳型として、同様に検量線を作成した。
（ＨＯＸ遺伝子発現量の定量）
被験者から採取した組織または細胞から、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。１μｇの全ＲＮＡを用いて、ＴａｑＭａｎＲＴ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ）、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５００μＭのｄＮＴＰ、２．５μＭのランダムヘキサマー、０．４Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１．２５Ｕ／μＬのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅＴＭ逆転写酵素を含む１００μＬの反応液中で、２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分間反応させ、ｃＤＮＡを得た。そして、２μＬのｃＤＮＡを鋳型にして、表１に示したプライマーペアとＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｏｋｙｏ）を加えた全量２０μＬの反応液を、初期変成（９５℃、１５分）の後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、４０サイクルの増幅を行った。
そして、レポーターの蛍光強度が０．３となるのに必要なサイクル数から、検量線を用いて内挿法により初期量を求めた。そして、最初のＲＮＡ量に依存したサンプル間のばらつきをなくすために、内部標準として用いたβ−アクチン遺伝子またはＧ３ＰＤＨ遺伝子の初期量で各ＨＯＸ遺伝子の初期量を規格化した量（（ＨＯＸ遺伝子の初期量／β−アクチンまたはＧ３ＰＤＨの初期量）×１００）を、ＨＯＸ遺伝子の発現量とした。
なお、４０サイクルの反応終了後、９５℃で１５秒、６０℃で１５秒、９５℃で１５秒の反応を行い、解離曲線を描き、得られたＰＣＲ産物が単一のＴｍ値を持つことを確認した。これにより、表１に示したプライマーペアを用いて定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った場合、プライマーダイマーなどの非特異的なＰＣＲ産物が生じないことを確認した。
２．ヒト正常臓器におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定例
上記の方法を用いて、ヒトの正常臓器の各ＨＯＸ遺伝子の発現量を測定した結果を表２および図１に示す。図１では、最も発現量の高いものを白色、発現のないものを黒色で表している。発現しているＨＯＸ遺伝子の種類は、頭部側に位置する臓器ほど少なく、尾部側の臓器ほど多いことがわかる。また、ＨＯＸパラログの番号の大きい遺伝子（例えば、ＨＯＸ１２、ＨＯＸ１３等の、ＨＯＸクラスターのなかでも、より５’側のゲノムに位置しているもの）ほど、尾部側の臓器で発現が高いことがわかる。
３．甲状腺癌細胞株におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
甲状腺癌細胞株８株（ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２，８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１）と正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図２に示す。なお、ＩＡＡ，ＭＳＡ，Ｋ−１１９，ＲＯＡ，ＫＯＡ−２は、大阪大学大学院医学研究科病態制御外科より、８３０５Ｃ，８５０５Ｃ，ＴＣＯ−１は、Ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（Ｓｅｎｎａｎ，Ｊａｐａｎ）より得た。また、正常甲状腺は、ＲＮＡをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｋ  Ｊａｐａｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より得た。図２より、パラログ９から１３のＨＯＸ遺伝子の発現に特に差があることがわかった。例えば、ＨＯＸＤ９は正常甲状腺では発現しているが、癌細胞では全く発現が見られなかった。また、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２は正常甲状腺では発現していないが、癌細胞では発現しているものがみられた。したがって、正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＤ９の発現量が、正常甲状腺のＨＯＸＤ９の発現量より低い場合に、甲状腺癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、図２より、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、０．００１〜０．０１を設定することができる。また、正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する正常甲状腺におけるＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、甲状腺癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、図２より、それぞれの閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ１０について０．００１、ＨＯＸＡ１１について０．００１、ＨＯＸＡ１３について０．００１、ＨＯＸＢ９について０．０１、ＨＯＸＢ１３について０．０１、ＨＯＸＣ１０について０．００１、ＨＯＸＣ１１について０．００１、ＨＯＸＣ１３について０．０００１、ＨＯＸＤ１１について０．０００１、ＨＯＸＤ１２について０．００１を設定することができる。
次に、８株の甲状腺癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける浸潤能を内皮下基底膜のモデルであるマトリゲルＴＭに対する浸潤アッセイにより評価した。浸潤アッセイは、８μｍの小孔の開いたフィルターで上下に仕切られたチャンバー（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。フィルターの上面には、あらかじめマトリゲルのバリアが形成されている。５００μｌの培養液に懸濁した２万個の癌細胞を上室に入れ、下室には７５０μｌのウシフィブロネクチンを含んだ培養液を注入した。２４時間ＣＯ２インキュベーターで培養後、細胞をホルマリンで固定し、ギムザ染色を施し、フィルター上面の細胞を綿棒で拭い去った。顕微鏡下でフィルター下面の細胞を観察し、２００倍の視野あたりの細胞数により浸潤能を評価した。結果を図３に示す。ＩＡＡおよびＲＯＡ細胞は、他の６株に比べ浸潤能が低いことがわかった。次に、高浸潤株と低浸潤株とを区別できるＨＯＸ遺伝子を前方選択による特徴選択アルゴリズムにより解析し、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３およびＨＯＸＤ４を選定した。いずれの発現も低浸潤株で低い傾向にある。そして、この３つの遺伝子のうちの２つ以上、好ましくは３つすべてを組み合わせることにより、浸潤能をより高い精度で判定および／または診断できるようになった（図４）。即ち、ＩＡＡまたはＲＯＡ細胞におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量とし、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つの、好ましくは２つの、最も好ましくは３つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、浸潤する可能性のある甲状腺癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、ＩＡＡ細胞におけるＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４の閾値を、それぞれ０．００２、０．００００７、０．０００２と、ＲＯＡ細胞におけるＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＤ４の閾値を、それぞれ０．００８、０．０００２、０．００００４と、設定することができる。
４．胃癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
胃癌の手術検体（癌部２１例、非癌部６例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図５に示す。図５より、胃癌組織では、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１の発現量が、非癌部組織に比べて有意に高かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。したがって、非癌部組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、胃癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値をＨＯＸＢ５について０．２、ＨＯＸＢ６について０．３、ＨＯＸＢ７について０．３、ＨＯＸＢ９について０．１、ＨＯＸＣ６について０．０７、ＨＯＸＣ８について０．０４、ＨＯＸＣ９について０．０５、ＨＯＸＣ１０について０．０７、ＨＯＸＣ１１について０．０７と設定することができる。
また、胃癌組織の中でも、リンパ節転移のある症例（１４例）は、これのない症例（７例）に比べ、ＨＯＸＢ６（ｐ＜０．０１）、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８およびＨＯＸＢ９（ｐ＜０．０５）の発現量が有意に高かった（図６参照）。したがって、リンパ節転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＤ１１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、リンパ節転移する可能性のある胃癌であると判定および／または診断されることとなる。
さらに、ＨＯＸＢ６において、（ＨＯＸ遺伝子の初期量／Ｂ−アクチンの初期量）×１００で表されるＨＯＸ遺伝子の発現量が０．２４３と０．３０１の間にカットオフ値を設定すると、各群の１例を除きリンパ節転移の有無を判定および／または診断できた。また、ＨＯＸＢ５は０．３７２以上、ＨＯＸＢ７は０．３３３以上、ＨＯＸＢ８は０．０５以上の場合、各々１例を除きリンパ節転移があると判定および／または診断できた。なお、特異値を示した症例（ｓｔ９５およびｓｔ１１０）は、複数のＨＯＸ遺伝子において同様に特異値を示すため、リンパ節に微小転移（組織学的検索では検出不可能なほど小さな転移巣の形成）を起こしている可能性も考えられる。したがって、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９の閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を、それぞれ０．３７２、０．２４３、０．３３３、０．０５、０．０８４、として、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、リンパ節転移する可能性のある胃癌であると判定および／または診断されることとなる。
また、胃癌組織の中でも、肝転移のある症例（５例）は、これのない症例（１６例）に比べ、ＨＯＸＤ１１の発現量が有意に高かった（ｐ＜０．０５）。したがって、肝転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＤ１１の発現量が、対応する閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移する可能性のある冑癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、肝転移に関するＨＯＸＤ１１の閾値を０．０３６に設定することができる。
５．肝癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
肝癌組織（２５例）と非癌部組織（１９例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図７に示す。なお、非癌部組織は、病理組織学的に硬変肝、線維肝、慢性肝炎および正常と診断された組織である。図７より、非癌部組織で発現のあったＨＯＸ遺伝子は、パラログ２からパラログ５に属するものであり、その発現レベルは、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４を除いて極めて低く、β−アクチン遺伝子発現との相対比で０．１％以下であった。一方、癌組織は、ほとんどすべてのＨＯＸ遺伝子を発現していたが、例外的にＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＤ１１を発現している癌組織はほとんどみられなかった。そして、癌組織と非癌組織のＨＯＸ遺伝子の発現量を比較すると、３９個のうち２８個のＨＯＸ遺伝子の発現量が癌組織において有意に高いことが明らかとなった（Ｍａｎｎ  ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。具体的には、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０の発現量が有意に高く、特にＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ９において、その差が大きかった。したがって、非癌部組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ３について０．１４５、ＨＯＸＡ５について０．３１０、ＨＯＸＡ６について０．２７５、ＨＯＸＡ７について０．０１７、ＨＯＸＡ９について０．１６６、ＨＯＸＡ１０について０．０６４、ＨＯＸＡ１１について０．０２１、ＨＯＸＡ１３について０．２６６、ＨＯＸＢ１について０．０２９、ＨＯＸＢ６について０．０５３、ＨＯＸＢ７について０．０６６、ＨＯＸＢ８について０．０９０、ＨＯＸＢ９について０．０３６、ＨＯＸＢ１３について０．０１９、ＨＯＸＣ５について０．２９０、ＨＯＸＣ６について０．０２３、ＨＯＸＣ８について０．０３１、ＨＯＸＣ９について０．１４７、ＨＯＸＣ１０について０．０２１、ＨＯＸＣ１１について０．０３６、ＨＯＸＣ１２について０．０２１、ＨＯＸＣ１３について０．０５０、ＨＯＸＤ１について０．０２１、ＨＯＸＤ３について０．０２８、ＨＯＸＤ４について１．４８６、ＨＯＸＤ８について０．０４４、ＨＯＸＤ９について０．０８９、ＨＯＸＤ１０について０．００７をそれぞれ設定することができる。
次に、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管への癌細胞浸潤のみられた組織では、これがみられなかった組織と比べ、ＨＯＸＡ５（ｐ＜０．０１）、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１（ｐ＜０．０５）の発現量の低下が認められた（図８（１）参照）。したがって、癌細胞浸潤のみられた組織のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ４、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、門脈、肝動脈、肝静脈、または胆管に浸潤する可能性がある肝癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ２について０．０６１、ＨＯＸＡ４について０．０４５、ＨＯＸＡ５について０．０６５、ＨＯＸＡ６について０．０２７、ＨＯＸＡ７について０．０２５、ＨＯＸＡ９について０．１４２、ＨＯＸＡ１０について０．０６７、ＨＯＸＢ１について０．０２５、ＨＯＸＢ５について０．０６７、ＨＯＸＢ７について０．０５３、ＨＯＸＢ８について０．０１７、ＨＯＸＢ１３について０．０１５、ＨＯＸＣ４について０．０６８、ＨＯＸＣ５について０．０３８、ＨＯＸＣ８について０．０１７、ＨＯＸＣ９について０．１５８、ＨＯＸＣ１０について０．０２４、ＨＯＸＣ１１について０．０３２、ＨＯＸＤ１について０．０４３を設定することができる。
なお、ここで示した脈管侵襲を伴った肝癌組織におけるＨＯＸ遺伝子のうち、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ６、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ１３、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＣ９、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＤ１の１５のＨＯＸ遺伝子の発現量は、非癌部組織の発現量と同程度であるため、これら１５のＨＯＸ遺伝子の発現量は、肝癌と診断されたものについての脈管侵襲の可能性の判定および／または診断に利用することができる。そして、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９およびＨＯＸＤ１０遺伝子の発現量を、正常か肝癌かを判定および／または診断することに用いるなど、目的に応じた使い分けをすることにより、より有用な指標とすることができる。
さらに、癌の進行度をＩ、ＩＩ期とＩＩＩ、ＩＶ期に分けて比較すると、ＩＩＩ、ＩＶ期の組織のＨＯＸＢ１およびＨＯＸＡ４遺伝子の発現が、Ｉ、ＩＩ期のものより低かった（ｐ＜０．０５）（図８（２）、（３）参照）。したがって、Ｉ期またはＩＩ期におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ４および／またはＨＯＸＢ１の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、ＩＩＩ期またはＩＶ期に進行した肝癌であると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値をＨＯＸＡ４について０．０４５、ＨＯＸＢ１について０．０５９と設定することができる。
６．乳癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
乳癌の手術検体（癌部２６例、非癌部６例）のＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図９に示す。図９に示すように、乳癌組織におけるＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０の発現量が、非癌部組織に比べて有意に低かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。なお、これら１０のＨＯＸ遺伝子の発現量を検体別に棒グラフで図１０に示す。これより、３、４例の検体を除き、非癌部組織の発現量より、癌分組織の発現量の方が低いことが明らかである。特に、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３では、３、４例の検体を除き、非癌部組織の発現量の最低値より、癌分組織の発現量の方が低いことが明らかである。したがって、非癌部組織におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＯＸＤ１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、乳癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値として、ＨＯＸＡ１について０．０５８、ＨＯＸＡ２について０．２５７、ＨＯＸＡ３について０．０９０、ＨＯＸＡ５について０．２７８、ＨＯＸＡ９について０．１３０、ＨＯＸＤ３について０．１７９、ＨＯＸＤ４について０．１７０、ＨＯＸＤ８について０．４４６、ＨＯＸＤ９について０．１７０、ＨＯＸＤ１０について０．０３３を設定することができる。
７．大腸癌におけるＨＯＸ遺伝子発現量の測定
大腸癌の手術検体（癌部３０例、非癌部２０例）のＨＯＸ遺伝子発現量を図１１に示す。図１１より、大腸癌組織では、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９の発現量が、非癌部組織に比べて有意に高かった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。一方、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４の発現量は、非癌部組織に比べて有意に低かった（ｐ＜０．０１）。なお、図１２に、これら８つのＨＯＸ遺伝子発現量を検体別に点グラフで示す。したがって、非癌部組織におけるＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高いか、および／または、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ３、ＨＯＸＤ４からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より低い場合に、大腸癌が存在すると判定および／または診断されることとなる。例えば、閾値としては、ＨＯＸＡ９について１．２３２、ＨＯＸＢ２について０．６６０、ＨＯＸＢ３について０．７０３、ＨＯＸＢ８について０．６７８、ＨＯＸＢ９について０．６３２、ＨＯＸＤ１について０．０７５、ＨＯＸＤ３について０．０２８、ＨＯＸＤ４について０．１０３を設定することができる。
また、癌組織の中で、肝転移のある症例（１０例）とない症例（２０例）についてＨＯＸ遺伝子発現量を測定した結果を図１３に示す。肝転移症例では、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３の発現量が、肝転移のない症例に比べ有意に高いことが明らかとなった（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、ｐ＜０．０１）。したがって、肝転移のない症例のＨＯＸ遺伝子発現量を閾値ＨＯＸ遺伝子発現量として、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つのＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移の可能性のある大腸癌であると判定および／または診断されることとなる。
さらに、図１１より、（ＨＯＸ遺伝子の初期量／β−アクチンの初期量）×１００で表されるＨＯＸ遺伝子の発現量について、ＨＯＸＡ４は０．０６２と０．０８３の間、ＨＯＸＢ１は０．００６と０．００７の間、ＨＯＸＣ１２は０．００８と０．０１１の間、ＨＯＸＣ１３は０．０１７と０．０１８の間、にそれぞれカットオフ値を設定すると、３つ以上のＨＯＸ遺伝子においてその発現量がカットオフ値を上回っている症例は、肝転移を起こしている可能性が高い（７０％）と判定および／または診断できた。したがって、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３の閾値ＨＯＸ遺伝子発現量を、それぞれ０．０６２、０．００６、０．００８、０．０１７とし、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３からなる群より選ばれる少なくとも１つの、好ましくは２つの、より好ましくは３つの、最も好ましくは４つすべての、ＨＯＸ遺伝子の発現量が、閾値ＨＯＸ遺伝子発現量より高い場合に、肝転移の可能性のある大腸癌であると判定および／または診断されることとなる。
なお、肝転移のない２０例のうちの２例において、これらのＨＯＸ遺伝子のうちの３つの発現量がカットオフ値以上であったが、これらについては、今後肝転移を起こす可能性があると考えられる。
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【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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