(57)【要約】コールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域を有するベクターであって、前記５’非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とするベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域を有するベクターであって、前記５’非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とするベクター。
【請求項２】
導入された変異が、塩基の挿入若しくは欠失である請求項１記載のベクター。
【請求項３】
配列表の配列番号１中の塩基番号５９３〜５９８に相当する領域に変異が導入されている請求項１または２記載のベクター。
【請求項４】
５’非翻訳領域をコードする領域がさらにオペレーターを有している請求項１〜３いずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
配列表の配列番号２、３、４のいずれかで示される塩基配列の５’非翻訳領域をコードする領域を有している請求項４記載のベクター。
【請求項６】
５’非翻訳領域をコードする領域の上流にプロモーターを有している請求項１〜５いずれか１項に記載のベクター。
【請求項７】
５’非翻訳領域をコードする領域の下流に、用いる宿主のリボソーマルＲＮＡのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を有している請求項１〜６いずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
プラスミドベクターである請求項１〜７いずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
下記工程を包含することを特徴とする目的蛋白質の発現方法：
（１）目的蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ請求項１〜８いずれか１項に記載のベクターで宿主を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、
（３）培養温度を通常の温度より低下させて目的蛋白質を発現させる工程。
【請求項１０】
工程（３）と同時もしくはその後にプロモーターを誘導することを特徴とする請求項９記載の目的蛋白質の発現方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子組換え技法において使用されるベクター、及び該ベクターを用いた蛋白質の発現方法に関する。
【背景技術】  遺伝子組換え技術を用いた有用蛋白質の生産は、今日では広く用いられている技術である。中でも大腸菌を宿主とした発現系は最も一般的に用いられている発現系であり、多くの蛋白質が組換体によって生産されるようになってきた。これら組換体による有用蛋白質の生産には、ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター支配下に目的遺伝子を配置した、いわゆる発現ベクターを構築して用いるのが一般的である。発現ベクターに用いられるプロモーターの例としては、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｇａｌ、ａｒａ等のプロモーター等が使用されている。また、これら大腸菌のＲＮＡポリメラーゼに直接認識されるプロモーター以外のものを利用した発現ベクターとして、大腸菌に感染するバクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターを利用したｐＥＴ−システム（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）（ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第１８９巻、第１１３〜１３０頁（１９８６）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、第５６巻、第１２５〜１３５頁（１９８７）参照）がある。ｐＥＴ−システムの場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを大腸菌内で発現させ、このＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより発現ベクター上のＴ７プロモーター下流に配置された目的遺伝子の転写が行われ、更に宿主の翻訳システムによって目的蛋白質の合成が行われる。
しかしながら、ｐＥＴ−システムも含めた多くの大腸菌発現系で目的蛋白質が高レベルで発現された場合、目的蛋白質が不溶性の複合体、いわゆるインクルージョンボディとなり、活性型の目的蛋白質の量が非常に低くなる場合が多い。いくつかのポリペプチドでは、インクルージョンボディを可溶化後リフォールディング操作を行って活性型ポリペプチドを得た例が報告されているが、一般的にその回収量は低い場合が多く、また、各目的蛋白質ごとに適切なリフォールディング条件を検討する必要がある。そのため、活性型蛋白質を直接大腸菌内で発現させるシステムが求められていた。
インクルージョンボディの形成は、翻訳されたポリペプチド鎖が正しい立体構造にフォールディングする前の中間体の段階で、分子間相互作用により他のポリペプチド鎖と絡み合い、巨大な不溶性の複合体となることによると考えられている。このような場合、組換体大腸菌の培養温度を通常用いられる３７℃よりも低い温度（２０〜３０℃）で行うと活性型蛋白質の発現量が増加することが知られている。これは、リボソームによる翻訳の速度が遅くなることにより、中間体が正しい構造にフォールディングする時間的ゆとりが得られることと、低温条件下で細胞内蛋白質分解酵素の働きが遅くなり、発現された活性型蛋白質の安定性が増すためと推測されている。このように、インクルージョンボディとなる蛋白質の生産には、低温条件下で組換体大腸菌を培養する方法は有効な方法として注目されてきた。
一方、対数増殖期の大腸菌の培養温度を３７℃から１０〜２０℃に低下させると大腸菌の増殖は一時的に止まり、その間にコールドショック蛋白質と呼ばれる一群の蛋白質の発現が誘導される。該蛋白質はその誘導レベルに応じて第Ｉ群（１０倍以上）第ＩＩ群（１０倍未満）に分けられ、第Ｉ群の蛋白質としては、ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、及びＣｓｄＡなどが挙げられる（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）、ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）、第１７８巻、第２９９４〜２９９７頁（１９９６）参照）。中でもＣｓｐＡ（国際公開第９０／０９４４７号パンフレット参照）は、３７℃から１０℃への温度シフトの１．５時間後にその発現量は全菌体蛋白質の１３％までに達することから（プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシーズ  オブ  ザ  ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８７巻、第２８３〜２８７頁（１９９０）参照）、低温における組換え蛋白質の生産にｃｓｐＡ遺伝子のプロモーターを利用することが試みられてきた。
ｃｓｐＡ遺伝子を用いた低温条件下での組換体蛋白質発現系は、上述のように該遺伝子のプロモーターが低温で高効率で転写を開始させること以外に、以下のような有効性が示されている。
（１）ｃｓｐＡ遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡが機能を有するＣｓｐＡ蛋白質をコードしていない場合、より具体的には、ＣｓｐＡ蛋白質のＮ末端配列の一部のみをコードしている場合には、このようなｍＲＮＡはコールドショック蛋白質も含めた他の大腸菌蛋白質の発現を長時間阻害し、その間は該ｍＲＮＡの翻訳が優先的に行われる（ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）、国際公開第９８／２７２２０号パンフレット参照）。この現象はＬＡＣＥ（ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｃｓｐＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）効果と呼ばれている。
（２）ｃｓｐＡ遺伝子の開始コドンから１２塩基下流の位置には、１５塩基からなるダウンストリームボックス（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｂｏｘ）と呼ばれる配列があり、低温条件下での翻訳効率を高いものにしている。
（３）ｃｓｐＡ遺伝子ｍＲＮＡの転写開始点から開始コドンまでにある１５９塩基からなる５’非翻訳領域は、ＣｓｐＡの発現に対して、３７℃では負の、低温条件下では正の影響を与えている。
特に上記（１）の現象は、ｃｓｐＡ遺伝子を利用して目的の蛋白質のみを特異的に発現させる可能性を示唆するものであり、高純度の組換え蛋白質生産、構造解析のための同位体標識された蛋白質の調製への応用が期待されている。
一方、該遺伝子のプロモーターの発現調節が不完全であり、その産物が宿主にとって有害であるような遺伝子の場合、発現ベクターを含有する大腸菌を誘導可能な状態まで培養するのが困難であったり、あるいは発現ベクターの構築すら不可能なこともあることが知られている（例えば、米国特許第５６５４１６９号公報参照）。
このような問題を解決するとともに、遺伝子発現の効率をより向上させ、発現産物の取得を容易にする観点から、ｃｓｐＡ遺伝子の５’非翻訳領域を使用した発現ベクターの改変が試みられている（国際公開第９９／２７１１７号パンフレット参照）。ここには、オペレーターを導入することにより発現制御を厳密にすること、５’非翻訳領域に変異を導入して遺伝子発現量を向上させること等の改変が開示されている。
【発明の開示】
上記のように低温条件下での蛋白質発現系は非常に有効なシステムと考えられており、さらに発現効率等について改善されることが望まれている。
本発明の目的は、ｃｓｐ遺伝子を利用した発現ベクターについて、例えばその遺伝子発現効率を向上させ、より優れた低温条件下での遺伝子発現系を構築することにある。
本発明者らは、かかる目的を達成するためにｃｓｐ遺伝子由来の５’非翻訳領域についてその塩基配列の改変を導入し、その効果の評価を行った。その結果、５’非翻訳領域部分のｍＲＮＡが形成するステム間の距離を調節することにより、その下流にコードされる蛋白質の発現量が上昇することを見出した。そして、この改変５’非翻訳領域をコードするＤＮＡを含有するベクターを構築し、本発明を完成するに至った。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はベクターに関し、コールドショック蛋白質遺伝子ｍＲＮＡ由来の５’非翻訳領域をコードする領域を有するベクターであって、前記５’非翻訳領域が、該領域が形成するステム構造の距離が変化するように変異を導入されたものであることを特徴とする。
第１の発明において、５’非翻訳領域に導入される変異としては塩基の挿入若しくは欠失が例示される。特に好適な態様としては、配列表の配列番号１に示される大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子中の塩基番号５９３〜５９８に相当する領域に変異が導入されているベクターが挙げられる。
第１の発明のベクターは、５’非翻訳領域をコードする領域がさらにオペレーターを有していてもよい。このようなベクターの５’非翻訳領域の特に好適な例として配列表の配列番号２、３、４に示される塩基配列の５’非翻訳領域が挙げられる。
また、第１の発明のベクターは５’非翻訳領域をコードする領域の上流にプロモーターを有していてもよい。さらに、５’非翻訳領域をコードする領域の下流に、用いる宿主のリボソーマルＲＮＡのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を有していてもよい。
第１の発明のベクターは、例えばプラスミドベクターであってもよい。
本発明の第２の発明は目的蛋白質の発現方法に関し、下記工程を包含することを特徴とする。
（１）目的蛋白質をコードする遺伝子を組込んだ第１の発明のベクターで宿主を形質転換する工程、
（２）得られた形質転換体を培養する工程、
（３）培養温度を通常の温度より低下させて目的蛋白質を発現させる工程。
また、第２の発明においては、工程（３）と同時もしくはその後にプロモーターを誘導してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を具体的に説明する。
本明細書において「領域」とは核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）上のある範囲を指す。また、本明細書に記載の「ｍＲＮＡの５’非翻訳領域」とは、ＤＮＡからの転写によって合成されるｍＲＮＡのうち、その５’側に存在し、かつ蛋白質をコードしていない領域をいう。以降の本明細書においては該領域を「５’−ＵＴＲ（５’−Ｕｎｔｒａｎｌａｔｅｄ  Ｒｅｇｉｏｎ）」と記載することがある。なお、特に断らない限り５’−ＵＴＲは大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子のｍＲＮＡ、あるいはこれが改変されたものの５’非翻訳領域をさす。
本明細書において「コールドショック蛋白質遺伝子」とは、生物の生育温度を生理的な温度から低下させた際にその発現が誘導される蛋白質をコードする遺伝子を指す。
本発明に使用される、コールドショック蛋白質ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲをコードする領域とは、当該遺伝子のｍＲＮＡの開始コドンよりも５’側の部分をコードしている領域である。大腸菌のコールドショック蛋白質遺伝子（ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｄＡ等）にはこの領域が特徴的に見出されており［Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．、第１７８巻、第４９１９〜４９２５頁（１９９６）、Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．、第１７８巻、第２９９４〜２９９７頁（１９９６）］、これらの遺伝子から転写されたｍＲＮＡのうちの５’末端より１００塩基以上の部分が蛋白質に翻訳されない。この領域は遺伝子発現の低温応答性に重要であり、任意の蛋白のｍＲＮＡの５’末端にこの５’非翻訳領域を付加することにより、該ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳が低温条件下で起こるようになる。
なお、本発明に使用される「ｍＲＮＡの５’非翻訳領域」は上記の特定の遺伝子由来のものに限定されるものではなく、コールドショック蛋白質遺伝子に由来し、かつ２以上のステム構造を形成しうる５’非翻訳領域を本発明に使用することができる。
本発明のベクターには上記に列記されたコールドショック蛋白質遺伝子由来の５’−ＵＴＲをコードする領域を使用することができるが、特に大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来のものが好適に使用できる。大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ遺伝子データベースに受託番号Ｍ３０１３９として登録、公開されている。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。さらに、本発明にはその塩基配列を一部改変した５’−ＵＴＲを使用することもでき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載されたプラスミドｐＭＭ０４７、ｐＭＭ０４８等に保持されたｃｓｐＡ遺伝子由来５’−ＵＴＲをコードする領域を使用することができる。上記プラスミドｐＭＭ０４８に保持された大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来の５’−ＵＴＲをコードする領域の塩基配列を配列番号５に示す。当該配列は、本願実施例において使用されているプラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の保持している５’−ＵＴＲをコードする領域の塩基配列と同一である。
本発明は、５’−ＵＴＲが形成すると予想される二次構造において、ステム間の距離を調整するような変異を５’−ＵＴＲをコードする領域に導入することを特徴とする。例えば、ステム間に相当する部分に塩基を挿入する、若しくはこの部分の塩基の一部を欠失させることによりステム間の距離を広げる、あるいは狭めることができる。このような変異は、当該変異によって変異を導入していないものに比べてその下流に接続された遺伝子の発現量が上昇する限りにおいて、その導入位置、挿入、あるいは欠失される塩基の数には限定はない。また、当該変異としては、５’−ＵＴＲの有している低温特異的な遺伝子発現を達成する能力を妨げないものが好ましいことは言うまでもない。
大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来の５’−ＵＴＲは、配列表の配列番号１に示される塩基配列において、塩基番号５８４〜５９３、５９８〜６０８の領域でそれぞれステム構造を形成することが予想される。したがって、この間の領域（塩基番号５９３〜５９８）、若しくは変異を導入された５’−ＵＴＲにおける前記領域に相当する領域に塩基の挿入、若しくは欠失を導入することにより、ステム間の距離を調節することができる。なお、本発明は上記のステム間の距離の調節に限定されるものではない。
前記の欠失変異としては、ステム間の領域の１塩基〜全塩基の欠失が本発明に包含される。また、挿入変異としては、１〜１００塩基、好ましくは３〜６０塩基、より好ましくは８〜４０塩基の挿入が例示される。
特に本発明を限定するものではないが、下記実施例に記載されたプラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ２、ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２に含まれる５’−ＵＴＲは本発明の好適な態様として例示される。前記プラスミドベクターに含まれる５’−ＵＴＲの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２、３、４に示す。
上記の、本発明により作製される、ステム間の距離が調節された５’−ＵＴＲをコードする領域を使用し、本発明の発現ベクターを作製することができる。すなわち、出発材料となる、５’−ＵＴＲをコードするＤＮＡについて、そこにコードされるｍＲＮＡが形成する二次構造を推定し、ステム間に相当すると予想された位置に公知の手法により挿入または欠失変異を導入し、こうして得られたＤＮＡを適切なプロモーターとともにベクターに組込み、作製すればよい。
本発明のベクターは、ベクターとしての目的を達成できるものであれば一般的に用いられるベクター、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等のいずれであってもよい。さらに、本発明のベクターは宿主に導入された後にはそのゲノムＤＮＡ上に組込まれてもかまわない。
前記の５’−ＵＴＲは、本発明のベクターにおいてはプロモーターと目的蛋白質をコードする領域との間に挿入される。本発明に使用されるプロモーターとしては、低温で高いプロモーター活性を有することが期待されるコールドショック蛋白質遺伝子由来のプロモーター、例えばｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、ｃｓｄＡといった遺伝子由来のプロモーターが例示されるがこれらに限定されるものではなく、使用する宿主中でＲＮＡへの転写を開始する活性を有するものであればよい。大腸菌が宿主として用いられる場合には、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｇａｌ、ａｒａ等のプロモーターを使用することができる。
また、本発明のベクターに含有される上記の構成要素以外の領域としては、例えば複製起点、選択マーカーとして使用される薬剤耐性遺伝子、オペレーター、ターミネーター等の調節配列を有することができる。
前記オペレーターとしては種々の遺伝子の発現調節領域に存在するオペレーター、例えば、大腸菌ラクトースオペロン由来のｌａｃオペレーターを本発明に使用することができる。ｌａｃオペレーターは適当な誘導物質、例えばラクトースやその構造類似体、特に好適にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の使用によってその機能を解除し、プロモーターを作用させることが可能である。このようなオペレーター配列は、通常、プロモーター下流の転写開始点付近に配置される。
本発明のベクターはさらに、オペレーターの機能に必要な調節遺伝子、例えばｌａｃオペレーターに対してはｌａｃＩｑ遺伝子等を有していてもよい。
また、上記構成要素に加えて、用いる宿主のリボソーマルＲＮＡのアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する塩基配列を５’非翻訳領域の下流に含有させることにより発現効率を上昇させることができる。例えば大腸菌の場合、１６ＳリボソーマルＲＮＡの１４６７−１４８１の位置にアンチダウンストリームボックス配列が存在し（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、第１５巻、第６６５〜６７４頁（１９９６））、この配列と高い相補性を示す塩基配列を含有するコールドショック蛋白質のＮ末端ペプチドをコードする領域を用いることができる。アンチダウンストリームボックス配列と相補性を有する配列は、開始コドンから数えて１〜１５塩基目程度のところから始まるように配置されると効果的である。目的蛋白質をコードする遺伝子は、該蛋白質がこれらのＮ末端ペプチドとの融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれるか、あるいは、目的蛋白質をコードする遺伝子がアンチダウンストリームボックス配列と相補性を有するように、部位特異的変異導入法により塩基置換が導入されることができる。目的蛋白質が融合蛋白質として発現されるようにベクターに組込まれている場合、該ペプチドは目的蛋白質が活性を失わない範囲で任意の長さのものであってよい。このような融合蛋白質発現用ベクターは、例えば適当なプロテアーゼによって該融合蛋白質から目的蛋白質を単離できるよう、その接続部分に工夫が施されたもの、精製あるいは検出に利用可能なペプチドと融合蛋白質として発現されるように工夫が施されたもの等であることができる。発現蛋白の精製に利用可能なポリペプチドとしては、特に限定するものではないが、例えばヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が例示される。
例えば、プラスミドとして構築された本発明のベクターを使用した目的蛋白質の発現は以下のような工程で実施される。本発明のプラスミドベクターに目的の蛋白質をコードする遺伝子をクローニングし、該プラスミドで適当な宿主を形質転換することにより、該蛋白質を発現させるための形質転換体を得ることができる。このような形質転換体は培養温度を低下させることにより、目的蛋白質を特異的に発現する。この際、オペレーターを保持するベクターの場合には、適切な手段で当該オペレータの機能を解除し、プロモーターを誘導してもよい。
本発明のベクターを使用した蛋白質の発現においては、前記のＬＡＣＥ効果のために目的の蛋白質の翻訳が優先的に行われるため、従来の組換え蛋白質の発現に比較して培養物あたりの目的蛋白質の含量が高い。したがって高純度の目的蛋白質を調製することが可能である。さらに、適切な同位体の存在下に目的蛋白質の発現を実施して同位体標識された蛋白質を調製することができる。こうして得られた高純度の標識蛋白質はＮＭＲによる構造解析に適しており、例えば培養物、もしくはその溶解物を直接ＮＭＲ解析に供することも可能である。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については１９８９年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。更に、以下に示すプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＪＭ１０９を宿主とし、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）あるいは前記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ寒天培地を用いた。
参考例  プラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の構築
国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの記載に基づき、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＭＭ０４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５２３）（平成９年（１９９７年）１０月３１日（原寄託日）に日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）に保持されたプラスミドｐＭＭ０４７を出発材料としてｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を構築した。プラスミドｐＣｏｌｄ０８Ｎｃ２は、上流側より順番にｌａｃプロモーター、改変された大腸菌ｃｓｐＡ遺伝子由来５’−ＵＴＲ、マルチクローニングサイトを有するプラスミドである。また、当該プラスミドは、ｌａｃＩ遺伝子、大腸菌１６ＳリボソーマルＲＮＡ中に存在するアンチダウンストリーム配列に完全に相補的なダウンストリームボックス配列、６個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグおよびファクターＸａの認識するアミノ酸配列をコードする塩基配列、をそれぞれ有している。
実施例１  ｐＣｏｌｄ０８ｓ２ベクターの構築及び蛋白質発現量の検討
（１）プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ２の構築
下記の操作に従い、参考例１記載のプラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の５’−ＵＴＲをコードする領域に２０塩基の挿入変異を導入した。
プラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２を鋳型として、合成プライマーＳｐ２０Ｆ及びプライマーＣＳＰｔｅｒＲ（プライマーＳｐ２０Ｆ及びＣＳＰｔｅｒＲの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号６、７に示す）を用いてＰＣＲを行なった。５０ｎｇのｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２、５μｌのＥｘ  Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、５ｐｍｏｌのプライマーＳｐ２０、５ｐｍｏｌのプライマーＣＳＰｔｅｒＲ、０．５μｌのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。この反応液について９４℃、１分間（変性）、５５℃、１分間（プライマーのアニーリング）、７２℃、１分間（合成反応）を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応液全量を３％（ｗ／ｖ）低融点アガロース電気泳動を行なった後、約３００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルより精製し、これを５μｌの滅菌水に懸濁して増幅断片ＳＣとした。
合成プライマーＳｐ２０Ｒ及びプライマーＮｈｅＦ２（プライマーＳｐ２０Ｒ及びＮｈｅＦ２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号８、９に示す）を用いてｐＣｏｌｄ０８を鋳型としたＰＣＲを同様の条件で行なった。このＰＣＲ反応液全量を３％（ｗ／ｖ）低融点アガロース電気泳動を行なった後、約１５０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルより精製し、これを５μｌの滅菌水に懸濁して、増幅断片ＳＮとした。
このようにして得られた増幅断片ＳＣとＳＮのそれぞれ１μｌに５μｌのＥｘ  Ｔａｑ緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ混合液を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。その後９４℃、１０分間加熱し、６０分間かけて３７℃まで冷却し、さらに３７℃で１５分間保温した。ここに０．５μｌのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加えて、７２℃で３分間加熱した。
こうして得られた反応液にそれぞれ５ｐｍｏｌのプライマーＮｈｅＦ２、プライマーＣＳＰｔｅｒＲ、５μｌのＥｘ  Ｔａｑ緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ混合液を加え、滅菌水を加えて全量を１００μｌとした。この反応液について９４℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、２分間を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応液全量を３％（ｗ／ｖ）低融点アガロースで電気泳動した後、約４００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルより精製し、これを５μｌの滅菌水に懸濁し、増幅断片Ｓｐ２０−１とした。
Ｓｐ２０−１を制限酵素ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ（ともにタカラバイオ社製）で２重消化し、生成したＤＮＡ断片を１％低融点アガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。この精製ＤＮＡ断片とＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＣｏｌｄ０８を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンスを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＣｏｌｄ０８ｓ２と命名した。このｐＣｏｌｄ０８ｓ２は、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の５’−ＵＴＲ（配列表の配列番号５、ｌａｃオペレーター中の転写開始点を＋１とした）の＋１２０〜＋１２１の間に５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡ−３’の塩基配列（配列番号１１）が挿入されている（なお、この位置は配列表の配列番号１に示したｃｓｐＡ遺伝子の塩基配列の塩基番号５９７〜５９８間に相当する）。ｐＣｏｌｄ０８ｓ２に含有されている５’−ＵＴＲの塩基配列を配列番号２に示す。
（２）蛋白質発現用プラスミドの構築
（２）−１  プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ＧＦＰの構築
オワンクラゲ由来のＧＦＰ蛋白質をコードする遺伝子を下記の操作にしたがってｐＣｏｌｄ０８ｓ２に組み込んだ。プラスミドｐＱＢＩ６３（タカラバイオ社製）を鋳型として、合成プライマーＧＦＰ−Ｆ及びプライマーＧＦＰ−Ｒ（プライマーＧＦＰ−Ｆ及びＧＦＰ−Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１１、１２に示す）を用いてＰＣＲを行なった。５０ｎｇのｐＱＢＩ６３、５μｌのＥｘ  Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、それぞれ５ｐｍｏｌのプライマーＧＦＰ−Ｆ、プライマーＧＦＰ−Ｒ、０．５μｌのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。この反応液について９４℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、１分間を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応液後の反応液全量を３％（ｗ／ｖ）低融点アガロース電気泳動を行なった後、約７００ｂｐのＧＦＰ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をゲルより精製し、これを５μｌの滅菌水に懸濁した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１％低融点アガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。精製したＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化したｐＣｏｌｄ０８ｓ２を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンスを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ＧＦＰと命名した。また、同様にして５’ＵＴＲへの挿入配列のないｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２にＧＦＰ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を組み込みｐＣｏｌｄ０８−ＧＦＰとした。
（２）−２  プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ２−Ｈ２９６の構築
フィブロネクチン由来のヘパリン結合ポリペプチドであるＨ２９６フラグメント蛋白質をコードする遺伝子を、下記の操作によりｐＣｏｌｄ０８ｓ２に組み込んだ。
米国特許第５１９８４２３号に記載のプラスミドｐＣＨ１０２を鋳型として、合成プライマーＨ２９６−Ｆ及びプライマーＨ２９６−Ｒ（プライマーＨ２９６−Ｆ及びＨ２９６−Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１３、１４に示す）を用いてＰＣＲを行なった。５０ｎｇのｐＣＨ１０２、５μｌのＥｘ  Ｔａｑ緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合液、それぞれ５ｐｍｏｌのプライマーＨ２９６−Ｆ、プライマーＨ２９６−Ｒ、０．５μｌのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑを加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。この反応液について９４℃、１分間、５５℃、１分間、７２℃、１分間を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲを実施した。このＰＣＲ反応液全量を３％（ｗ／ｖ）低融点アガロース電気泳動を行なった後、約１ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片をゲルより精製し、これを５μｌの滅菌水に懸濁した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、生成したＤＮＡ断片を１％低融点アガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。精製したＨ２９６遺伝子を含むＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＣｏｌｄ０８ｓ２を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンスを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＣｏｌｄ０８ｓ２−Ｈ２９６と命名した。また、同様にして５’−ＵＴＲへの挿入配列のないｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２にＨ２９６遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を組み込みｐＣｏｌｄ０８−Ｈ２９６とした。
（２）−３  プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ｌａｃの構築
β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を含むプラスミドｐＫＭ００５（１９８３年、ニューヨークアカデミックプレス発行、井上正順編集、エクスペリメンタル  マニピュレーション  オブ  ジーン  エクスプレッション、第１５〜３２頁）をＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ（タカラバイオ社製）で消化後、１％（ｗ／ｖ）低融点アガロース電気泳動を行ない、ｌａｃＺ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲルより精製してこれを５μｌの滅菌水に懸濁した。この精製ＤＮＡ断片とＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したｐＣｏｌｄ０８ｓ２を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液１０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンスを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これをｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ｌａｃと命名した。また、同様にして５’−ＵＴＲへの挿入配列のないｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２にｌａｃＺ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を組み込みｐＣｏｌｄ０８−ｌａｃとした。
（３）発現量の評価
（３）−１  ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ＧＦＰ、ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−Ｈ２９６を用いた発現量評価
実施例１−（２）−１及び（２）−２で作製したｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ＧＦＰ、ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−Ｈ２９６及び比較対照としてｐＣｏｌｄ０８−ＧＦＰ、ｐＣｏｌｄ０８−Ｈ２９６を用いて、大腸菌ＢＬ２１（ノバジェン社製）及びＣＬ８３［ジャーナル  オブ  バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）、第１８０巻、第９０〜９５頁（１９９８）］を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２．５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液をそれぞれ３ｍｌの同じ培地に１％（ｖ／ｖ）ずつ植菌して３７℃で振とう培養し、濁度がＯＤ６００ｎｍ＝０．２に達した時点で、培養温度を１５℃に下げて１５分間保温した。その後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、そのまま培養温度を１５℃に保ち２４時間振とう培養した。濁度（ＯＤ６００ｎｍ）を測定した後、２ｍｌ分の菌体を遠心分離により集め、１００μｌの菌体懸濁溶液（５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に懸濁した。前記の濁度から算出して約３．７５×１０６個の菌数分に相当する懸濁液をそれぞれ１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供し、ゲルをＣＢＢ（クマジーブリリアントブルー）により染色した後、脱色を行なった（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、生物化学実験のてびき２（化学同人社）に従った）。このゲルについてＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析を行い、ＧＦＰ、Ｈ２９６それぞれの発現量を定量した。この結果より得られた、ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ＧＦＰ、ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−Ｈ２９６を保持する組み換え体による各蛋白質発現量を、それぞれ５’ＵＴＲへの挿入のないｐＣｏｌｄ０８−ＧＦＰ、ｐＣｏｌｄ０８−Ｈ２９６のものに対する倍率として表１に示した。
2004053126.tif 000002
表１に示したように、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析の結果、５’ＵＴＲに２０塩基の挿入を持つｐＣｏｌｄ０８ｓ２をベクターを用いて作製されたクローン体は、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２のものを上回る発現量を有していた。
（３）−２  ｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ｌａｃを用いた発現量評価
実施例１−（２）−３で作製したｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ｌａｃ及び比較対照としてｐＣｏｌｄ０８−ｌａｃを用いて、大腸菌ＢＬ２１及びＣＬ８３を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２．５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液をそれぞれ３ｍｌの同じ培地に１％（ｖ／ｖ）ずつ植菌して３７℃で振とう培養し、濁度がＯＤ６００ｎｍ＝０．２に達した時点で一部サンプリングした後、培養温度を１５℃に下げて１５分間保温した。その後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えて発現を誘導し、そのまま培養温度を１５℃に保ちさらに培養した。これら誘導直前の３７℃培養液及び誘導後３時間後、２４時間後にサンプリングされた培養液を試料として１９７２年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）著、エクスペリメンツ  イン  モレキュラー  ジェネティクス、第３５２〜３５５頁に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行ない、その結果を表２に示した。
2004053126.tif 000003
表２に示したように、誘導２４時間後において、５’ＵＴＲに２０塩基の挿入を持つｐＣｏｌｄ０８ｓ２−ｌａｃを保持する形質転換体は、ｐＣｏｌｄ０８−ｌａｃを保持するものの１．４倍（宿主：ＢＬ２１）、２．３倍（宿主：ＣＬ８３）のβ−ガラクトシダーゼ活性を有していた。
実施例２  ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２ベクターの構築及び蛋白質発現量の検討
（１）プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ１２ベクターの構築
プライマーＳｐ２０Ｆ及びプライマーＣＳＰｔｅｒＲにかえて、プライマーＳｐ１２Ｆ、プライマーＳｐ１２Ｒ（プライマーＳｐ１２Ｆ及びＳｐ１２Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１５、１６に示す）をそれぞれ使用した他は、上記の実施例１−（１）の操作に従い、参考例１記載のプラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の５’−ＵＴＲをコードする領域に１２塩基の挿入変異が導入されたプラスミド、ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２を構築した。
このｐＣｏｌｄ０８ｓ１２は、ｐＣｏｌｄ０８Ｎｃ２の５’−ＵＴＲ（配列表の配列番号５）の＋１２０〜＋１２１の間に５’−ＡＴＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡ−３’（配列番号１７）の塩基配列が挿入されている。ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２に含有されている５’−ＵＴＲの塩基配列を配列番号３に示す。
（２）プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ３２ベクターの構築
プライマーＳｐ２０Ｆ及びプライマーＳＰ２０Ｒにかえて、プライマーＳｐ３２Ｆ、プライマーＳｐ３２Ｒ（プライマーＳｐ３２Ｆ及びＳｐ３２Ｒの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１８、１９に示す）をそれぞれ使用した他は、上記の実施例１−（１）の操作に従い、参考例１記載のプラスミドｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２の５’−ＵＴＲをコードする領域に３２塩基の挿入変異が導入されたプラスミド、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２を構築した。
このｐＣｏｌｄ０８ｓ３２は、ｐＣｏｌｄ０８Ｎｃ２の５’−ＵＴＲ（配列表の配列番号５）の＋１２０〜＋１２１の間に５’−ＡＴＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡ−３’（配列番号２０）の塩基配列が挿入されている。ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２に含有されている５’−ＵＴＲの塩基配列を配列番号５に示す。
（３）プラスミドベクターｐＣｏｌｄ０８ｓ１２−Ｈ２９６、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２−Ｈ２９６の構築
実施例１−（２）−１に記載の操作により、Ｈ２９６遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を調製してＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで２重消化し、１％低融点アガロース電気泳動で分離後、抽出精製した。この精製ＤＮＡ断片とＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＣｏｌｄ０８ｓ１２またはｐＣｏｌｄ０８ｓ３２を混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。このライゲーション反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で生育させた。得られたコロニーからプラスミドを調製し、ＤＮＡシークエンスを行ない、正しくＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを選択し、これらをそれぞれｐＣｏｌｄ０８ｓ１２−Ｈ２９６、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２−Ｈ２９６と命名した。
（４）ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２−Ｈ２９６、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２−Ｈ２９６を用いた発現量の評価
（３）で作製したｐＣｏｌｄ０８ｓ１２−Ｈ２９６、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２−Ｈ２９６及び比較対照としてｐＣｏｌｄ０８−Ｈ２９６を用いて、大腸菌ＢＬ２１及びＣＬ８３を形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２．５ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液をそれぞれ３ｍｌの同じ培地に１％（ｖ／ｖ）ずつ植菌して３７℃で振とう培養し、濁度がＯＤ６００ｎｍ＝０．２に達した時点で、培養温度を１５℃に下げて１５分間保温した。その後、終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、そのまま培養温度を１５℃に保ち２４時間振とう培養した。こうして得られた培養液について、実施例１−（３）−１に記載の操作により各組換え体におけるＨ２９６の発現量を定量した。この結果より得られた、ｐＣｏｌｄ０８ｓ１２−Ｈ２９６、ｐＣｏｌｄ０８ｓ３２−Ｈ２９６を保持する組み換え体による各蛋白質発現量を、５’ＵＴＲへの挿入のないｐＣｏｌｄ０８−Ｈ２９６のものに対する倍率として表３に示した。
2004053126.tif 000004
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル解析の結果、５’−ＵＴＲ中に１２、３２塩基を挿入したベクターでは、挿入していないものに比べ発現量が上昇することが判明した。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、低温条件において高い発現効率を示す発現ベクターが提供される。該ベクターを用いることにより、目的の蛋白質を特異的に発現させ、高純度の蛋白質標品を調製することができる。また該ベクターを利用して低温条件下で蛋白質発現を行うことにより、活性を保持した蛋白質を効率よく得ることが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
2004053126.tif 000005
【配列表】
2004053126.tif 000006
2004053126.tif 000007
2004053126.tif 000008
2004053126.tif 000009
2004053126.tif 000010
2004053126.tif 000011
2004053126.tif 000012
2004053126.tif 000013
2004053126.tif 000014
2004053126.tif 000015
【国際調査報告】
2004053126.tif 000016
2004053126.tif 000017
2004053126.tif 000018
2004053126.tif 000019