(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索し、検索結果に基づきＲＮＡｉを生じさせるｓｉＲＮＡの設計、合成等を行う。（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
2004048566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索する、ＲＮＡ干渉の標的塩基配列の検索方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【請求項２】
前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である、請求の範囲第１項に記載の標的塩基配列の検索方法。
【請求項３】
前記規則（ｄ）において、塩基数が１３〜２８である、請求の範囲第１項または第２項に記載の標的塩基配列の検索方法。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基配列を標的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計する、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【請求項５】
前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である、請求の範囲第４項に記載の塩基配列設計方法。
【請求項６】
設計される相同な塩基配列の塩基数が１３〜２８である、請求の範囲第４項または第５項に記載の塩基配列設計方法。
【請求項７】
前記設計される相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が検索された塩基配列と一致するように設計する、請求の範囲第４項から第６項のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
【請求項８】
検索された塩基配列の３’末端の塩基と設計される塩基配列の３’末端の塩基とが同一であり、かつ、検索された塩基配列の５’末端の塩基と設計される塩基配列の５’末端の塩基とが同一である、請求の範囲第４項から第７項のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドの３’末端に、オーバーハング部位を付加する、請求の範囲第４項から第８項のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
【請求項１０】
２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法であって、
一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、
他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、
各鎖の塩基数が１５〜３０であるように設計された２本鎖ポリヌクレオチドを合成する、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【請求項１１】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように合成された、２本鎖ポリヌクレオチド。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【請求項１２】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索する工程と、
一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように設計された２本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程と、
合成された２本鎖ポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に導入して標的遺伝子の発現を抑制する工程と、
を含む、遺伝子発現抑制方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
【請求項１３】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段と、
上記３’末端塩基判定手段、上記５’末端塩基判定手段、および、上記特定塩基含有判定手段にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報から上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択手段と、
を備えたことを特徴とする塩基配列処理装置。
【請求項１４】
上記部分塩基配列作成手段は、
上記塩基配列情報の上記標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成手段、
をさらに備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の塩基配列処理装置。
【請求項１５】
上記部分塩基配列作成手段は、
異なる生物に由来する複数の上記塩基配列情報の間で共通する、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成手段、
をさらに備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載の塩基配列処理装置。
【請求項１６】
上記リッチな上記塩基配列情報は、
上記７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基が少なくとも３塩基以上含まれる上記塩基配列情報であること、
を特徴とする請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
【請求項１７】
上記予め定めた上記塩基数は、１３〜２８であること、
を特徴とする請求の範囲第１３項から第１６項のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
【請求項１８】
上記部分塩基配列作成手段は、
オーバーハング部位を含む上記部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成手段、
をさらに備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
【請求項１９】
上記規定配列情報の少なくとも一方の末端に上記オーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加手段、
を備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項から第１７項のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
【請求項２０】
上記オーバーハング部位の塩基数は、２であること、
を特徴とする請求の範囲第１８項または第１９項に記載の塩基配列処理装置。
【請求項２１】
上記規定配列情報と同一または類似の上記塩基配列情報を他の上記塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索手段と、
上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価手段と、
を備えたことを特徴とする請求の範囲第１３項から第２０項のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
【請求項２２】
上記無関係遺伝子標的評価手段は、
上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報のうち上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報の総数、および、上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、上記同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段と、
上記総和算出手段にて算出された上記総和に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価手段と、
をさらに備えたことを特徴とする請求の範囲第２１項に記載の塩基配列処理装置。
【請求項２３】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成工程と、
上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定工程と、
上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定工程と、
上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定工程と、
上記３’末端塩基判定工程、上記５’末端塩基判定工程、および、上記特定塩基含有判定工程にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報から上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択工程と、
を含む塩基配列処理方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【請求項２４】
上記請求の範囲第２３項に記載されたプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項２５】
ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を処理する塩基配列処理装置と、クライアント装置とをネットワークを介して通信可能に接続された塩基配列処理システムにおいて、
上記クライアント装置は、
上記標的遺伝子の名称または上記塩基配列情報を上記塩基配列処理装置に送信する塩基配列送信手段と、
上記塩基配列処理装置より送信された、上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を取得する規定配列取得手段と、
を備え、
上記塩基配列処理装置は、
上記クライアント装置より送信された上記標的遺伝子の名称に対応する塩基配列情報または上記クライアント装置より送信された上記塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段と、
上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段と、
上記３’末端塩基判定手段、上記５’末端塩基判定手段、および、上記特定塩基含有判定手段にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報から上記規定配列情報を選択する規定配列選択手段と、
上記規定配列選択手段にて選択された上記規定配列情報を上記クライアント装置に送信する規定配列送信手段と、
を備えたことを特徴とする塩基配列処理システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）に関し、詳しくは、ＲＮＡ干渉を利用した試験、製造などの効率を向上させる、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの配列設計方法等に関する。以下本明細書においてＲＮＡ干渉のことを「ＲＮＡｉ」と表記する場合がある。
また、本発明は、塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システムに関し、特にＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、標的遺伝子に対してＲＮＡ干渉を生じさせる塩基配列を効率よく選択することができる塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システムに関する。
【背景技術】  ＲＮＡ干渉は、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、以下「ｄｓＲＮＡ」という）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象で、１９９８年に線虫を用いた実験により初めて提唱された。しかし、哺乳類においては、約３０塩基対以上の長いｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、インターフェロンレスポンスが誘導され、細胞がアポトーシスによって死んでしまうため、ＲＮＡｉ法を用いることが困難であった。
一方、マウス初期胚や哺乳類培養細胞では、ＲＮＡ干渉が起こりえることが示され、ＲＮＡ干渉の誘導機構そのものは、哺乳類細胞にも存在することがわかってきた。現在では、およそ２１〜２３塩基対の短い２本鎖ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）が、哺乳類細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡ干渉を誘導できることが示され、哺乳類においてもＲＮＡｉ法を利用することが可能となってきている。
【発明の開示】
ＲＮＡｉ法は様々な応用が期待される技術である。しかし、ショウジョウバエや線虫では、ある遺伝子の特定領域と相同なｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ほとんどの配列でＲＮＡ干渉効果を示すのに対して、哺乳類では無作為に選択した（２１塩基の）ｓｉＲＮＡの７０〜８０％はＲＮＡ干渉効果を示さない。これは、哺乳類においてＲＮＡｉ法を用いた遺伝子機能解析を行う際に大きな問題点となっている。
また、従来ｓｉＲＮＡを設計するにあたっては、試験者等の経験やセンスに依存する部分が大きく、実際にＲＮＡ干渉効果を示すｓｉＲＮＡを高い確率で設計することが困難であった。さらに、ＲＮＡ合成は、費用、時間等を要することから、ＲＮＡ干渉を行うために無駄なｓｉＲＮＡを合成してしまうことは、ＲＮＡ干渉のさらなる研究や、ＲＮＡ干渉を利用した数々の利用法の普及を妨げる要因となっていた。
以上のような状況の下、ＲＮＡｉ法をより簡便に効率よく行うことができる手段を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、ＲＮＡｉ法を用いる際最も労力、時間、費用を要する部分の１つである、ｓｉＲＮＡの入手を容易に行う手法について検討を進めた。ｓｉＲＮＡの調製は哺乳類において特に問題となっていることから、本発明者らは哺乳類培養細胞系を用いて、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列規則性を同定することを試みたところ、有効なｓｉＲＮＡの配列には所定の規則性があることを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の通りである。
〔１〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索する、ＲＮＡ干渉の標的塩基配列の検索方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
〔２〕  前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である、上記〔１〕に記載の標的塩基配列の検索方法。
〔３〕  前記規則（ｄ）において、塩基数が１３〜２８である、上記〔１〕または〔２〕に記載の標的塩基配列の検索方法。
〔４〕  下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基配列を標的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計する、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
〔５〕  前記規則（ｃ）において、７塩基のうち少なくとも３塩基以上がアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である、上記〔４〕に記載の塩基配列設計方法。
〔６〕  設計される相同な塩基配列の塩基数が１３〜２８である、上記〔４〕または〔５〕に記載の塩基配列設計方法。
〔７〕  前記設計される相同な塩基配列の少なくとも８０％以上の塩基が検索された塩基配列と一致するように設計する、上記〔４〕から〔６〕のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
〔８〕  検索された塩基配列の３’末端の塩基と設計される塩基配列の３’末端の塩基とが同一であり、かつ、検索された塩基配列の５’末端の塩基と設計される塩基配列の５’末端の塩基とが同一である、上記〔４〕から〔７〕のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
〔９〕  ポリヌクレオチドの３’末端に、オーバーハング部位を付加する、上記〔４〕から〔８〕のいずれか一項に記載の塩基配列設計方法。
〔１０〕  ２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法であって、
一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、
他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、
各鎖の塩基数が１５〜３０であるように設計された２本鎖ポリヌクレオチドを合成する、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
〔１１〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように合成された、２本鎖ポリヌクレオチド。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
〔１２〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索する工程と、
一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように設計された２本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程と、
合成された２本鎖ポリヌクレオチドを、発現を抑制しようとする標的遺伝子の発現系に添加して標的遺伝子の発現を抑制する工程と、
を含む、遺伝子発現抑制方法。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
〔１３〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段と、上記３’末端塩基判定手段、上記５’末端塩基判定手段、および、上記特定塩基含有判定手段にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報から上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択手段とを備えたことを特徴とする塩基配列処理装置。
〔１４〕  上記部分塩基配列作成手段は、上記塩基配列情報の上記標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔１３〕に記載の塩基配列処理装置。
〔１５〕  上記部分塩基配列作成手段は、異なる生物に由来する複数の上記塩基配列情報の間で共通する、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔１３〕または〔１４〕に記載の塩基配列処理装置。
〔１６〕  上記リッチな上記塩基配列情報は、上記７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基が少なくとも３塩基以上含まれる上記塩基配列情報であることを特徴とする〔１３〕から〔１５〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
〔１７〕  上記予め定めた上記塩基数は、１３〜２８であることを特徴とする〔１３〕から〔１６〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
〔１８〕  上記部分塩基配列作成手段は、オーバーハング部位を含む上記部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔１３〕から〔１７〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
〔１９〕  上記規定配列情報の少なくとも一方の末端に上記オーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加手段を備えたことを特徴とする〔１３〕から〔１７〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
〔２０〕  上記オーバーハング部位の塩基数は、２であることを特徴とする〔１８〕または〔１９〕に記載の塩基配列処理装置。
〔２１〕  上記規定配列情報と同一または類似の上記塩基配列情報を他の上記塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索手段と、上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価手段とを備えたことを特徴とする〔１３〕から〔２０〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理装置。
〔２２〕  上記無関係遺伝子標的評価手段は、上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報のうち上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報の総数、および、上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、上記同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段と、上記総和算出手段にて算出された上記総和に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価手段とをさらに備えたことを特徴とする〔２１〕に記載の塩基配列処理装置。
〔２３〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定工程と、上記３’末端塩基判定工程、上記５’末端塩基判定工程、および、上記特定塩基含有判定工程にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報から上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択工程とを含む塩基配列処理方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
〔２４〕  上記〔２３〕に記載されたプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
〔２５〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を処理する塩基配列処理装置と、クライアント装置とをネットワークを介して通信可能に接続された塩基配列処理システムにおいて、上記クライアント装置は、上記標的遺伝子の名称または上記塩基配列情報を上記塩基配列処理装置に送信する塩基配列送信手段と、上記塩基配列処理装置より送信された、上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を取得する規定配列取得手段とを備え、上記塩基配列処理装置は、上記クライアント装置より送信された上記標的遺伝子の名称に対応する塩基配列情報または上記クライアント装置より送信された上記塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段と、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段と、上記３’末端塩基判定手段、上記５’末端塩基判定手段、および、上記特定塩基含有判定手段にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成手段にて作成された上記部分塩基配列情報から上記規定配列情報を選択する規定配列選択手段と、上記規定配列選択手段にて選択された上記規定配列情報を上記クライアント装置に送信する規定配列送信手段とを備えたことを特徴とする塩基配列処理システム。
〔２６〕  ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、上記塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の５’末端の上記塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定工程と、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報の上記３’末端の７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基がリッチな上記塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定工程と、上記３’末端塩基判定工程、上記５’末端塩基判定工程、および、上記特定塩基含有判定工程にて判定された結果に基づいて、上記部分塩基配列作成工程にて作成された上記部分塩基配列情報から上記標的遺伝子に特異的に上記ＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択工程とを含むことを特徴とする塩基配列処理方法。
〔２７〕  上記部分塩基配列作成工程は、上記塩基配列情報の上記標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２６〕に記載の塩基配列処理方法。
〔２８〕  上記部分塩基配列作成工程は、異なる生物に由来する複数の上記塩基配列情報の間で共通する、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２６〕または〔２７〕に記載の塩基配列処理方法。
〔２９〕  上記リッチな上記塩基配列情報は、上記７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基が少なくとも３塩基以上含まれる上記塩基配列情報であることを特徴とする〔２６〕から〔２８〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理方法。
〔３０〕  上記予め定めた上記塩基数は、１３〜２８であることを特徴とする〔２６〕から〔２９〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理方法。
〔３１〕  上記部分塩基配列作成工程は、オーバーハング部位を含む上記部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２６〕から〔３０〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理方法。
〔３２〕  上記規定配列情報の少なくとも一方の末端に上記オーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加工程を含むことを特徴とする〔２６〕から〔３０〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理方法。
〔３３〕  上記オーバーハング部位の塩基数は、２であることを特徴とする〔３１〕または〔３２〕に記載の塩基配列処理方法。
〔３４〕  上記規定配列情報と同一または類似の上記塩基配列情報を他の上記塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索工程と、上記同一類似塩基配列検索工程にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価工程とを含むことを特徴とする〔２６〕から〔３３〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理方法。
〔３５〕  上記無関係遺伝子標的評価工程は、上記同一類似塩基配列検索工程にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報のうち上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報の総数、および、上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、上記同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出工程と、上記総和算出工程にて算出された上記総和に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価工程とをさらに含むことを特徴とする〔３４〕に記載の塩基配列処理方法。
〔３６〕  上記部分塩基配列作成工程は、上記塩基配列情報の上記標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２３〕に記載のプログラム。
〔３７〕  上記部分塩基配列作成工程は、異なる生物に由来する複数の上記塩基配列情報の間で共通する、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２３〕または〔３６〕に記載のプログラム。
〔３８〕  上記リッチな上記塩基配列情報は、上記７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基が少なくとも３塩基以上含まれる上記塩基配列情報であることを特徴とする〔２３〕、〔３６〕、〔３７〕のいずれか一つに記載のプログラム。
〔３９〕  上記予め定めた上記塩基数は、１３〜２８であることを特徴とする〔２３〕、〔３６〕、〔３７〕、〔３８〕のいずれか一つに記載のプログラム。
〔４０〕  上記部分塩基配列作成工程は、オーバーハング部位を含む上記部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成工程をさらに含むことを特徴とする〔２３〕、〔３６〕、〔３７〕、〔３８〕、〔３９〕のいずれか一つに記載のプログラム。
〔４１〕  上記規定配列情報の少なくとも一方の末端に上記オーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加工程を含むことを特徴とする〔２３〕、〔３６〕、〔３７〕、〔３８〕、〔３９〕のいずれか一つに記載のプログラム。
〔４２〕  上記オーバーハング部位の塩基数は、２であることを特徴とする〔４０〕または〔４１〕に記載のプログラム。
〔４３〕  上記規定配列情報と同一または類似の上記塩基配列情報を他の上記塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索工程と、上記同一類似塩基配列検索工程にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価工程とを含むことを特徴とする〔２３〕、〔３６〕、〔３７〕、〔３８〕、〔３９〕、〔４０〕、〔４１〕、〔４２〕のいずれか一つに記載のプログラム。
〔４４〕  上記無関係遺伝子標的評価工程は、上記同一類似塩基配列検索工程にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報のうち上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報の総数、および、上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、上記同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出工程と、上記総和算出工程にて算出された上記総和に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価工程とをさらに含むことを特徴とする〔４３〕に記載のプログラム。
〔４５〕  上記〔２３〕、〔３６〕から〔４４〕のいずれか一つに記載されたプログラムを記録したことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
〔４６〕  上記塩基配列処理装置において、上記部分塩基配列作成手段は、上記塩基配列情報の上記標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔２５〕に記載の塩基配列処理システム。
〔４７〕  上記塩基配列処理装置において、上記部分塩基配列作成手段は、異なる生物に由来する複数の上記塩基配列情報の間で共通する、上記予め定めた上記塩基数の上記部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔２５〕または〔４６〕に記載の塩基配列処理システム。
〔４８〕  上記塩基配列処理装置において、上記リッチな上記塩基配列情報は、上記７塩基からなる上記塩基配列情報が、上記アデニン、上記チミン、および、上記ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の上記塩基が少なくとも３塩基以上含まれる上記塩基配列情報であることを特徴とする〔２５〕、〔４６〕、〔４７〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理システム。
〔４９〕  上記塩基配列処理装置において、上記予め定めた上記塩基数は、１３〜２８であることを特徴とする〔２５〕、〔４６〕、〔４７〕、〔４８〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理システム。
〔５０〕  上記塩基配列処理装置において、上記部分塩基配列作成手段は、オーバーハング部位を含む上記部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成手段をさらに備えたことを特徴とする〔２５〕、〔４６〕、〔４７〕、〔４８〕、〔４９〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理システム。
〔５１〕  上記塩基配列処理装置は、上記規定配列情報の少なくとも一方の末端に上記オーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加手段を備えたことを特徴とする〔２５〕、〔４６〕、〔４７〕、〔４８〕、〔４９〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理システム。
〔５２〕  上記塩基配列処理装置において、上記オーバーハング部位の塩基数は、２であることを特徴とする〔５０〕または〔５１〕に記載の塩基配列処理システム。
〔５３〕  上記塩基配列処理装置は、上記規定配列情報と同一または類似の上記塩基配列情報を他の上記塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索手段と、上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価手段とを備えたことを特徴とする〔２５〕、〔４６〕、〔４７〕、〔４８〕、〔４９〕、〔５０〕、〔５１〕、〔５２〕のいずれか一つに記載の塩基配列処理システム。
〔５４〕  上記塩基配列処理装置において、上記無関係遺伝子標的評価手段は、上記同一類似塩基配列検索手段にて検索された上記同一または上記類似の上記塩基配列情報のうち上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報の総数、および、上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子の上記塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値に基づいて、上記同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段と、上記総和算出手段にて算出された上記総和に基づいて、上記規定配列情報が上記標的遺伝子とは無関係の上記遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価手段とをさらに備えたことを特徴とする〔５３〕に記載の塩基配列処理システム。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ヒトとマウスとで共通配列であるｓｉＲＮＡの設計を示す図であり、第２図は、ＲＮＡｉ効果を示すｓｉＲＮＡの規則性を示す図であり、第３図は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１の塩基配列中の規定配列を有する共通部位（太字部分）を示す図であり、第４図は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１に共通の規定配列を列挙した図であり、第５図は、ヒトＦＢＰ１およびマウスＦｂｐ１に共通の規定配列にスコアを付した図であり、第６図は、標的以外の遺伝子をノックアウトしないよう、規定配列のうちの１つをＢＬＡＳＴ検索した結果を示す図であり、第７図は、標的以外の遺伝子をノックアウトしないよう、規定配列のうちの１つをＢＬＡＳＴ検索した結果を示す図であり、第８図は、プログラムの出力結果を示す図であり、第９図は、ＲＮＡ断片の設計（ａ〜ｐ）を示す図であり、第１０図は、ａ〜ｐのｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を示すか試験した結果を示す図であり、「Ｂ」はショウジョウバエ培養細胞における結果を、「Ｃ」はヒト培養細胞における結果を示す図であり、第１１図は、ａ〜ｐのｓｉＲＮＡの配列の特徴を分析した結果を示す図であり、第１２図は、本発明の基本原理を示す原理構成図であり、第１３図は、本発明が適用される本システムの塩基配列処理装置１００の構成の一例を示すブロック図であり、第１４図は、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図であり、第１５図は、部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図であり、第１６図は、判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報の一例を示す図であり、第１７図は、規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図であり、第１８図は、参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図であり、第１９図は、同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図であり、第２０図は、評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報の一例を示す図であり、第２１図は、本発明が適用される本システムの部分塩基配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図であり、第２２図は、本発明が適用される本システムの無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図であり、第２３図は、本実施形態における本システムのメイン処理の一例を示すフローチャートであり、第２４図は、本実施形態における本システムの無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートであり、第２５図は、標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構造を示す図であり、第２６図は、実施例２の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされていない場合のＰＣＲの結果を示す図であり、第２７図は、実施例２の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされている場合のＰＣＲの結果を示す図であり、第２８図は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ３５の配列および構造を示す図であり、第２９図は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ８１２の配列および構造を示す図であり、第３０図は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの配列および構造を示す図であり、第３１図は、ｓｉＶＩＭ８１２およびｓｉＶＩＭ３５のＲＮＡｉ活性をアッセイした結果を示す図である。第３２図は、���ｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ８１２およびｓｉＶＩＭ３５のビメンチンに対するＲＮＡｉ活性を示す図であり、第３３図は、抗体染色の結果を示す図であり、第３４図は、プログラムにより設計されたｓｉＲＮＡのルシフェラーゼ遺伝子に対するＲＮＡｉ活性の測定結果を示す図であり、第３５図は、プログラムにより設計されたｓｉＲＮＡのＳＡＲＳウイルスが有する配列に対するＲＮＡｉ活性の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の実施の形態を、以下の＜１＞から＜７＞順に従って説明する。
＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
＜３＞２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法
＜４＞遺伝子の発現抑制方法
＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム
＜６＞ｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステム
＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等
＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法
本発明の検索方法は、標的とする遺伝子の塩基配列中から、ＲＮＡ干渉の起因となる塩基配列を探し出す方法である。具体的には、本発明の検索方法では、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索する。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。
「標的遺伝子」における「遺伝子」とは、遺伝情報をコードする媒体のこという。「遺伝子」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの複合体など遺伝情報をコードする物質により構成されるが、遺伝情報としては物質そのものではなく塩基配列を電子データ化したものをコンピュータ上などで扱うことが可能である。「標的遺伝子」は、１つのコード領域としてもよいし、複数のコード領域に渡り標的としてもよいし、また、配列が判明したすべてのポリヌクレオチドを標的としてもよい。特定の機能を有する遺伝子について検索したい場合には、その特定遺伝子のみを標的とすることにより、当該特定遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる塩基配列を効率よく検索することができる。すなわち、ＲＮＡ干渉はｍＲＮＡを干渉破壊する現象として知られており、特定のコード領域を選択することにより検索負荷を軽減できる。また、転写領域のひとまとまりを標的遺伝子として検索してもよい。なお、本明細書において塩基配列は特に断らない限りセンス鎖、すなわち、ｍＲＮＡの配列を基準として示す。また、本明細書中では上記（ａ）から（ｄ）の規則を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。
規則（ｃ）は、３’末端近傍の配列にアデニン、チミン、およびウラシルからなる群より選ばれる塩基がリッチに含まれていることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端部から７塩基の範囲内において、アデニン、チミン、およびウラシルから選ばれる塩基がリッチな配列であることを規定している。
規則（ｃ）において、「リッチな配列」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、割合を概略的に示すと、規定配列における３’末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。より具体的には、例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。
規則（ｃ）に該当するか否かを確認する手段は特に制限はなく、７塩基中の好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上がアデニン、チミンまたはウラシルであることを確認できればよい。例えば、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、３’末端側の７塩基の配列中に３つ以上含まれることをリッチであると定義した場合を例として説明すると、３’末端の第１番目の塩基から逐次上記３種の塩基のいずれかであるか照合し、第７番目の塩基に至るまでに３つ現れた場合に、規則（ｃ）に適合すると判断することができる。例えば、第３番目までに３つ現れれば、３つの塩基を調べれば足りる。すなわち、規則（ｃ）について検索する場合、必ずしも３’末端側の７塩基についてすべて照合することは要しない。逆に第７番目までに３つ以上現れなければリッチではなく、規則（ｃ）を満たさないと判断される。
二本鎖ポリヌクレオチドにおいてはアデニンとチミンまたはウラシルとが相補的に水素結合することは周知である。また、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては３つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては２つの水素結合部位からなり、一般的に言ってＧ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。
規則（ｄ）においては、検索する塩基配列の塩基数を規定している。検索する塩基配列の塩基数は、ＲＮＡ干渉を生じさせ得る塩基数である。また、生物の種類などの条件により、塩基数があまりに大きすぎるｓｉＲＮＡでは細胞毒性を生じてしまうことが知られている。塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の塩基数はいずれの種にせよ３０以下であることが好ましい。また、哺乳動物の塩基数にあっては、好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下である。また、下限はＲＮＡ干渉を生じさせる限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１５以上、より好ましくは１８以上、さらに好ましくは２０以上である。ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖としての塩基数は、２１で検索することが特に好ましい。
なお、下記にても説明するが、ｓｉＲＮＡには、規定配列の３’末端にオーバーハング部が設けられる。オーバーハング部は塩基数２であることが好適である。したがって、オーバーハング部を含めず、規定配列のみの塩基数の上限としては、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、下限としては、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上である。規定配列の最も好ましい塩基数は１９である。ＲＮＡｉの標的塩基配列の検索は、オーバーハング部を含める場合および含めない場合のいずれで検索してもよい。
規定配列に従う塩基配列は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率が極めて高い。したがって、本発明の検索方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる配列を極めて高い確率で検索することが可能であり、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することができる。
また、他の好ましい例として、規定配列は７塩基以上グアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）が連続した配列を含まない配列であることなどが挙げられる。７塩基以上グアニンおよび／またはシトシンが連続するというのは、例えば、グアニンまたはシトシンの一方のみが連続する場合と、グアニンおよびシトシンとが混在する配列となっている場合の双方を含み、より具体的には、ＧＧＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣＣＣのほか、ＧおよびＣの混合配列であるＧＣＧＧＣＣＣなども含まれる。
なお、規定配列の検索は、塩基数を定めた上で上記の（ａ）から（ｃ）の規則などに従う部分を検索するようなプログラムを搭載するコンピュータを用いて効率的に検出可能である。より具体的な実施の形態は下記＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム、および、＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等の欄に示す。
＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
本発明の塩基配列設計方法は、上記の検索方法により検索された塩基配列に基づいてＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）の塩基配列を設計するものである。ｓｉＲＮＡは主としてＲＮＡからなるが、一部にＤＮＡが含まれている混成ポリヌクレオチドも含まれる。本発明の塩基配列設計方法では、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基配列を標的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計する。また、他の好ましい設計例としては、規定配列は７塩基以上グアニン（Ｇ）および／またはシトシン（Ｃ）が連続した配列を含まない配列であることなどを考慮してもよい。（ａ）から（ｄ）の規則および検索の手法などについては、上記本発明の検索方法について説明したとおりである。
「相同な配列」とは、同一の配列および当該ＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲で同一配列に対し欠失、置換、挿入などの変異を含む配列のことをいう。標的遺伝子の種類、配列などの条件にもよるが、許容される変異を相同性（ホモロジー）で例示すると、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズム用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したものが好適であり、より具体的にはＢＬＡＳＴ、ｓｓｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。
上記のように、検索された配列は若干の改変が許容されるが、設計される塩基配列の塩基数は、検索された配列と同一とすることが特に好ましい。塩基数を同一とした場合について改変の許容度を例示すると、設計される塩基配列の塩基が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上検索された配列と一致することが好適である。例えば、塩基数１９の塩基配列を設計する場合であれば、好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１８塩基以上が、検索された塩基配列と一致することが好ましい。また、検索された塩基配列と相同な配列を設計する場合、検索された塩基配列の３’末端の塩基と設計される塩基配列の３’末端の塩基とは同一であることが望ましく、また、検索された塩基配列の５’末端の塩基と設計される塩基配列の５’末端の塩基とが同一であることが望ましい。
通常ｓｉＲＮＡ分子には、オーバーハング部が設けられる。オーバーハング部とは、２本鎖のｓｉＲＮＡ分子において、各鎖の３’末端に設けられた、一本鎖の状態で突出した部分である。オーバーハング部は、生物の種類などにもよるが、塩基数は２が特に好適である。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、検索元の標的遺伝子と同一の塩基配列、ＴＴ、あるいはＵＵなどが好適に用いられる場合がある。上記のように検索された塩基配列と相同な配列となるように設計された規定配列の３’末端に、オーバーハング部を設けることにより、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖が設計される。
また、最初から規定配列およびオーバーハング部を含めて検索を行い、設計することもできる。オーバーハング部の好ましい塩基数は２である。したがって、例えば、塩基数１９の規定配列および塩基数２のオーバーハング部からなるｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の設計をする場合には、オーバーハング部を含めたｓｉＲＮＡの塩基数としては塩基数２１の配列を標的遺伝子から検索すればよく、また２本鎖の状態について検索する場合には、塩基数２３の配列を検索してもよい。
本発明の塩基配列設計方法では、上記のように所望の標的遺伝子から所定の配列を検索してくるが、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする対象は、標的遺伝子の由来と必ずしも一致せずともよく、類縁種などに適用可能である。例えば、第１の種から単離された遺伝子を標的遺伝子とし、第１の種の類縁種である第２の種に用いるｓｉＲＮＡを設計することもできる。さらに、例えば複数種の哺乳類から共通配列を検索し、この共通配列から上記規定配列を検索して設計することにより、哺乳類に幅広く適用可能なｓｉＲＮＡの設計が可能である。複数の哺乳類に共通する配列は、他の哺乳類においても保存されている確率が高いと考えられるためである。
標的遺伝子と関係のない遺伝子についてまでＲＮＡ干渉を生じさせないようにするためには、設計した配列と同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていないか検索することが好ましい。設計した配列と同一または類似の配列の検索は、一般的なホモロジー検索を行うことができるソフトウエア等を用いて行えばよい。このような同一／類似配列を除外することにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を設計することができる。
本発明の設計方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。ＲＮＡの合成は、未だ労力、時間、費用を要するが、本発明の設計方法によりそれらを大幅に軽減することが可能である。
＜３＞２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法
本発明の２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高い２本鎖ポリヌクレオチドを作製する方法である。本発明の２本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列が上記本発明の塩基配列設計方法に従って設計され、その配列設計に従うように２本鎖ポリヌクレオチドが合成される。配列の設計における好ましい形態は、上記塩基配列設計方法についての説明と同様である。
２本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉を生じさせる２本鎖ポリヌクレオチドを合成するものであり、このような２本鎖ポリヌクレオチドとしてｓｉＲＮＡが知られている。なお、本発明の製造法により製造される２本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡにより構成されることが好ましいが、一部にＤＮＡを含む混成ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書では一部にＤＮＡを含むものもｓｉＲＮＡの概念に含める。また、本発明者らの研究によれば、ｓｉＲＮＡは構造・機能的にアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められ、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５’末端側の半分、アンチセンス鎖の３’末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。
２本鎖ポリヌクレオチドは、一方の鎖が標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成される。各鎖の塩基数はオーバーハング部を含め１８〜２４であり、より好ましくは２０〜２２、特に好ましくは２１である。また、オーバーハング部の塩基数は２であることが好ましい。全体の塩基数が２１、そのうちオーバーハング部が塩基数２で構成されるｓｉＲＮＡは、哺乳類でも細胞毒性を生じさせずに高確率でＲＮＡ干渉を生じさせるｓｉＲＮＡとして好適である。
ＲＮＡの合成は、例えば、化学合成によって合成してもよいし、また、通常のバイオテクノロジー等の手法に従って行うこともでき、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを２本鎖化するなどの手法により合成することができる。
なお、分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがある。
上記本発明の製造方法により得られるポリヌクレオチドとして好ましい形態を示すと、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から前記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、前記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように合成された、２本鎖ポリヌクレオチドが例示される。当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高いポリヌクレオチドである。
また、ｓｉＲＮＡを発現するような発現ベクターを調製することもできる。規定配列を含む配列を発現するベクターを、発現が行われ得る無細胞系または細胞系の条件下におくことで、発現ベクターを用いて所定のｓｉＲＮＡを供給することができる。
従来、ｓｉＲＮＡの設計は、試験者の経験や勘に依存していたため、試行錯誤を繰り返すことが多かった。しかし、本発明の２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる２本鎖ポリヌクレオチドを高い確率で製造することが可能である。上記本発明の検索方法、配列設計方法またはポリヌクレオチドの作製方法によれば、ＲＮＡ干渉を利用した各種の試験や製造等に要する労力、時間、コストを大幅に削減することが可能である。すなわち、本発明は、遺伝子解析、創薬ターゲットの探索、創薬、遺伝子治療、生物種間の差の研究などのＲＮＡ干渉を利用する様々な試験、研究、開発、製造等を大幅に簡便にし、効率の向上を図ることができる。
＜４＞遺伝子の発現抑制方法
本発明の遺伝子発現抑制方法は、所定の塩基配列を検索する工程と、検索された塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡの塩基配列を設計して合成する工程と、得られたｓｉＲＮＡを標的遺伝子を含む発現系に導入する工程とを含む。
所定の塩基配列を検索する工程は、上記ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に従う。好ましい態様も上記の通りである。また、検索された塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡの塩基配列を設計して合成する工程は、上記、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法に従って行うことができ、好ましい形態も同様である。
得られた２本鎖ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現系に添加して標的遺伝子の発現を抑制する。標的遺伝子の発現系とは、標的遺伝子が発現している体系のことであり、より具体的には、少なくとも標的遺伝子のｍＲＮＡが形成される反応系を備える系である。標的遺伝子の発現系としては、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれも含まれる。標的遺伝子の発現系として、培養細胞、培養組織、生体などのほか、無細胞系で用いることも可能である。発現抑制をしようとする標的遺伝子（抑制標的遺伝子）は必ずしも検索された配列の由来と一致する生物種のものに限らずともよいが、検索対象遺伝子と抑制対象遺伝子の由来が近縁であればあるほど、特異的かつ効果的に特定遺伝子の抑制を行うことができる。
標的遺伝子の発現系に導入するとは、標的遺伝子の発現反応系の中に取り込ませるということである。具体的に例を挙げると、標的遺伝子を有する培養細胞に２本鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、細胞内に取り込ませる、規定配列およびオーバーハング部からなる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、標的遺伝子を有する細胞内に導入するなどの手法が挙げられる。
本発明の遺伝子抑制方法によれば、効率よくＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドを得られるため、効率よく、また簡便に遺伝子を抑制することが可能である。
＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム
以下、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムの実施形態例を説明する。
（５−１）プログラムの概要
本プログラムは、ゲノムのシークエンスが進んでいない種、たとえばウマ、ブタなどに対してＲＮＡ干渉を行う際に、既に公開されているヒトとマウスのホモログの配列情報をもとに、目的の種で使用可能なｓｉＲＮＡの配列を計算するものである。本プログラムでｓｉＲＮＡを設計すれば、標的遺伝子をシークエンスすることなく迅速にＲＮＡ干渉を行うことができる。ｓｉＲＮＡの設計（計算）にあたっては、ＧまたはＣ配分の規則（上記（ａ）〜（ｄ）で示される規則）を考慮してＲＮＡｉ活性を有する確率が高い配列を選ぶとともに、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対してＲＮＡ干渉が起こらないようホモロジーサーチによるチェックを行っている。なお、本明細書において「ＧまたはＣ」を「Ｇ／Ｃ」と、「ＡまたはＴ」を「Ａ／Ｔ」とそれぞれ表記する場合がある。また、「Ａ／Ｔ（Ｕ）」とは、デオキシリボ核酸による配列の場合Ｔ（チミン）であり、リボ核酸による配列の場合Ｕ（ウラシル）であることを示す。
（５−２）ｓｉＲＮＡ設計の方針
ヒトの遺伝子Ｘおよび、そのホモログであるマウスの遺伝子Ｘの配列が既知であるとする。本プログラムはそれらの配列を読み込み、コード領域（ＣＤＳ）部分から２３塩基以上の完全に共通な配列を探し出す。この共通部分からｓｉＲＮＡを設計すれば、そのｓｉＲＮＡはヒトとマウスの遺伝子Ｘをともに標的とすることができる（第１図）。
ヒトとマウスとで完全に共通な部分は、他の哺乳類でも保存されている確率が高いと考えられるので、上記のｓｉＲＮＡはヒトとマウスの遺伝子Ｘのみならず、他の哺乳類の遺伝子Ｘに対しても機能することが期待される。つまり、標的遺伝子の配列が未知の動物種であっても、対応するヒトとマウスのホモログについて配列情報が既知であれば、本プログラムを用いてｓｉＲＮＡを設計することができる。
なお、哺乳類においては、実際に機能するｓｉＲＮＡは配列に規則性があることが判っている（第２図）。本プログラムでは、その規則に適合した配列のみを選ぶようにした。第２図は、ＲＮＡｉ効果を示すｓｉＲＮＡの配列の規則性（ｓｉＲＮＡのＧ／Ｃ配分の規則）を示す図である。第２図において、２１塩基の長さをもつ２本のＲＮＡ鎖が、それぞれ３’側に２塩基のオーバーハングを持つように５’側の１９塩基どうしで塩基対を形成しているようなｓｉＲＮＡで、塩基対を形成している１９塩基のうちコーディング側の配列の、１）３’末端がＡ／Ｕであること、２）５’末端がＧ／Ｃであること、３）３’側の７文字は、Ａ／Ｕの割合が高いこと、が求められる。特に、１）および２）の条件は重要である。
（５−３）プログラムの構造
本プログラムは３つの部分から構成されている。すなわち、（５−３−１）ヒトとマウスとで共通部位の配列（部分配列）を検索する部分、（５−３−２）Ｇ／Ｃ配分の規則に基づいて配列にスコアをつける部分、（５−３−３）無関係の遺伝子を標的にしないようホモロジーサーチによりチェックする部分、である。
（５−３−１）共通配列を検索する部分
複数の塩基配列ファイル（ｆｉｌｅ１，ｆｉｌｅ２，ｆｉｌｅ３，．．．）を読み込み、全ファイルに共通に出現する２３文字の配列をすべて見いだす。
（計算例）
ｆｉｌｅ１としてヒトの遺伝子ＦＢＰ１（ＮＭ＿０００５０７：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １）、ｆｉｌｅ２としてマウスの遺伝子Ｆｂｐ１（ＮＭ＿０１９３９５：Ｍｕｓｍｕｓｕｃｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １）の配列をプログラムに入力した。その結果、両者の配列（第３図）から両者に共通な２３文字の配列（ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列）が１５個見いだされた（第４図）。
（５−３−２）配列にスコアをつける部分
前述のＧ／Ｃ配分の規則に適合した配列のみを選択するために、２３文字の配列に対してスコアを付ける。
（方法）
２３文字の配列に対して、以下のようにスコアを付ける。
スコア１：先頭から２１文字目がＡ／Ｕか。［ｎｏ＝０，ｙｅｓ＝１］
スコア２：先頭から３文字目がＧ／Ｃか。［ｎｏ＝０，ｙｅｓ＝１］
スコア３：先頭から１５文字目から２１文字目までの７文字のうち、Ａ／Ｕの数。［０−７］
総合スコア：スコア１〜３の積。ただし積が３以下の場合は０とする。
（計算例）
第４図に示した１５個の配列に対して計算を行った結果を、第５図に示す。第５図は、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列にスコアを付した図である。なお、第５図に示す配列の後には、スコア１、スコア２、スコア３、総合スコアが順に記載されている。
（５−３−３）無関係の遺伝子を標的にしないようチェックする部分
設計したｓｉＲＮＡが、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対して機能しないよう、公開されているヒト・マウスの全ｍＲＮＡに対してホモロジーサーチを行い、無関係の遺伝子がヒットする度合いを評価する。ホモロジーサーチには各種アルゴリズムが使用可能であるが、ここでは、ＢＬＡＳＴを使用した例を示す。なお、ＢＬＡＳＴを用いる場合は、検索配列が２３塩基と短いことを考慮して、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅを十分に小さくすることが望ましい。
ＢＬＡＳＴの結果、Ｅ  ｖａｌｕｅが１０．０以下のヒットのうち、標的遺伝子以外の全てのヒットについて、Ｅ  ｖａｌｕｅの逆数の総和を求める（以下、この値をホモロジー・スコアと呼ぶ）。すなわち、ホモロジー・スコア（Ｘ）は、下記式により求められる。
2004048566.tif 000003
注意点：Ｅ  ｖａｌｕｅが低いヒットほど、ｑｕｅｒｙの２３文字とホモロジーが高く、ｓｉＲＮＡの標的とされる危険性が高い。また、ヒットの数が多いほど、より多くの無関係な遺伝子を標的にする確率が高い。この２点を考慮して、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と無関係の遺伝子を標的にする危険性を、上の式を用いて評価している。
（計算例）
２３文字の配列に対して、上記のホモロジーサーチを行った結果と、ホモロジー・スコアを示す（第６図、第７図）。なお、第６図には、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列「ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」をＢＬＡＳＴした結果が示されており、最初の２行は、マウスＦｂｐ１とヒトＦＢＰ１がヒットしたものである。ホモロジー・スコアは５．９で、ヒットが少ない例である。この配列のｓｉＲＮＡは、他の遺伝子を標的にする危険性が低い。また、第７図には、ヒトＦＢＰ１とマウスＦｂｐ１に共通な配列「ｇｃｃｔｔｃｔｇａｇａａｇｇａｔｇｃｔｃｔｇｃ」をＢＬＡＳＴした結果が示されている。ヒットが多い例で、ホモロジー・スコアは１７０．８である。他の遺伝子を標的にする危険性が高いため、ｓｉＲＮＡとして適さない。
実際には、上記の（５−３−１）、（５−３−２）、（５−３−３）の部分は一体として構成してもよく、第３図に示したヒトとマウスの配列を入力すると、第８図のような出力が直接得られる。ここで、第８図に示す配列の後には、スコア１、スコア２、スコア３、総合スコア、および、ホモロジー・スコアを１０倍した値が順に記載されている。なお、処理時間短縮のため、総合スコアが０の配列はホモロジー・スコアを計算しないようにしてもよい。この結果から、ｓｉＲＮＡとして「３６  ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」の部分を使えばよいことがわかる。また、（５−３−１）、（５−３−２）、（５−３−３）の部分のうち１つの機能を単独で利用することもできる。
（５−４）実際の計算
ヒト・マウス間のホモログのうち約６４００遺伝子のペアに対して、実際に本プログラムでｓｉＲＮＡの設計をおこなった。その結果、約７割について、ヒトとマウスとに共通な配列で、かつ有効なｓｉＲＮＡの配列規則性の規則を満たし、無関係な遺伝子を標的としないようなｓｉＲＮＡが設計できた。
これらのｓｉＲＮＡはヒトとマウスのみならず、多岐の哺乳類で効果的に標的遺伝子を抑える効果があると期待され、家畜や愛玩動物などへの応用など産業的価値が高いと考えられる。また本プログラムを用い、同種内の複数の遺伝子、たとえばｅＩＦ２Ｃ１とｅＩＦ２Ｃ２を同時に標的とするｓｉＲＮＡを設計することも可能であり、本プログラムが提供するｓｉＲＮＡ設計の手法は、応用範囲が広くきわめて強力なものといえる。さらに、ヒトとマウスの共通な部分の配列を用いてＰＣＲプライマーを設計すれば、多岐の哺乳類で目的の遺伝子を増幅できる、といった利用法もある。
なお、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する装置の実施の形態は、下記＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等の欄に詳細に示す。
＜６＞ｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステム
本発明のｓｉＲＮＡ配列設計ビジネスモデルシステムは、ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを適用するにあたり、ゲノムデータベース、ＥＳＴデータベース、進化系統樹データベースを本プログラムのロジックに添って単独で或いは組み合わせて参照し、遺伝子配列情報のａｖａｉｌａｂｌｅ状態に応じた効果的なｓｉＲＮＡを顧客へ提案するというシステムである。ａｖａｉｌａｂｌｅ状態とは、情報が利用可能な状態であることをいう。
（１）ゲノム情報がａｖａｉｌａｂｌｅだがＯＲＦの特定が困難なものについては、ＥＳＴ情報、等を基にエクソン想定部位に対して効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、スプライシングバリアントを考慮したｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（２）遺伝子配列、遺伝子名が明らかなものは、遺伝子配列または遺伝子名を入力後、効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、ｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（３）ゲノム情報がａｖａｉｌａｂｌｅでないものについては、同種の遺伝子機能を保存している類縁関係（同属、乃至は起源を同じとする）にある生物種の遺伝子配列、或いは進化系統樹的に挟まれた、ゲノム配列がａｖａｉｌａｂｌｅな２種類以上の生物種の遺伝子配列、を用いて効果的なｓｉＲＮＡ候補を抽出し、ｓｉＲＮＡ配列とその評価結果を表示する。
（４）感染症の遺伝子機能解析、創薬ターゲット発掘には、微生物のゲノムデータベース・進化系統樹データベースヘ更に微生物のアポトーシス誘導部位情報、機能発現部位情報を組み合わせて網羅的なｓｉＲＮＡ候補配列を求める手法が有効である。
＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等
以下、上述したｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する装置である、本発明にかかる塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。
［本発明の概要］
以下、本発明の概要について説明し、その後、本発明の構成および処理等について詳細に説明する。第１２図は、本発明の基本原理を示す原理構成図である。
本発明は、概略的に、以下の基本的特徴を有する。すなわち、本発明は、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する（ステップＳ−１）。
ここで、ステップＳ−１において、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成してもよい。また、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報（例えば、ヒトの塩基配列情報およびマウスの塩基配列情報など）の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成してもよい。また、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。また、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。また、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。これにより、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列を効率よく選択することができ、計算負荷を軽減できる。
さらに、ステップＳ−１において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分塩基配列情報を作成してもよい。すなわち、部分塩基配列情報とオーバーハング部位含有情報とを相互に関連付けてもよい。これにより、最初から規定配列およびオーバーハング部位を含めて選択を行い、設計することができるようになる。
なお、上述の予め定めた塩基数の上限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは３２以下、より好ましくは２６以下、さらに好ましくは２４以下である。また、予め定めた塩基数の下限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは２２以上である。そして、最も好ましい予め定めた塩基数は、オーバーハング部位を含まない場合は、１９であり、オーバーハング部位を含む場合は、２３である。これにより、哺乳類においても細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列を効率よく選択することができる。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する（ステップＳ−２）。なお、具体的には、例えば、３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する（ステップＳ−３）。なお、具体的には、例えば、５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果として出力してもよい。
ついで、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定する（ステップＳ−４）。なお、具体的には、例えば、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を判定結果として出力してもよい。ステップＳ−４における判定の規則は、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端近傍の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端から７塩基の範囲内の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定している。
ここで、ステップＳ−４において、「リッチな塩基配列情報」は、上述の＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に記述されている「リッチな配列」であり、具体的には、例えば、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報が１９塩基程度からなる場合、当該部分塩基配列情報の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基が少なくとも好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上含まれる塩基配列情報である。
また、ステップＳ−２からステップＳ−４において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を判定する場合、部分塩基配列情報のオーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として判定する。
ついで、ステップＳ−２、ステップＳ−３、および、ステップＳ−４にて判定された結果に基づいて、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する（ステップＳ−５）。
具体的には、例えば、ステップＳ−２にて３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであると判定され、ステップＳ−３にて５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであると判定され、かつ、ステップＳ−４にて部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であると判定された部分塩基配列情報を規定配列情報として選択する。ここで、具体的には、例えば、ステップＳ−２、ステップＳ−３、および、ステップＳ−４にて出力される数値の積を算出し、当該積の値に基づいて、ステップＳ−１にて作成された部分塩基配列情報から規定配列情報を選択してもよい。
これにより、哺乳類などにおいて、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率が極めて高い、つまりＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列を効率よく、容易に作成することができる。
ここで、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加してもよい。なお、例えば、ターゲット側を検索する場合は、規定配列情報の両末端にオーバーハング部位を付加してもよい。これにより、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することができる。
なお、上述のオーバーハング部位の塩基数は、上述の＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法に記述されている塩基数であり、具体的には、例えば、２が特に好適である。
また、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）などの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、検索された同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
具体的には、例えば、ステップＳ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、算出された総和に基づいて（例えば、算出された総和の大小などに基づいて）、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
これにより、規定配列情報から、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を選出することができる。
以上、本発明により選択された、標的遺伝子と関係のない遺伝子についてまでＲＮＡ干渉を生じさせない規定配列情報に基づいてＲＮＡの合成を行えば、それにかかる労力、時間、費用を従来に比べ大幅に軽減することができる。
［システム構成］
まず、本システムの構成について説明する。第１３図は、本発明が適用される本システムの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
本システムは、概略的に、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を処理する塩基配列処理装置１００と、配列情報や構造情報等に関する外部データベースやホモロジー検索等の外部プログラム等を提供する外部システム２００とを、ネットワーク３００を介して通信可能に接続して構成されている。
第１３図において、ネットワーク３００は、塩基配列処理装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネット等である。
第１３図において、外部システム２００は、ネットワーク３００を介して、塩基配列処理装置１００と相互に接続され、利用者に対して配列情報や構造情報等に関する外部データベースやホモロジー検索やモチーフ検索等の外部プログラムを実行するウェブサイトを提供する機能を有する。
ここで、外部システム２００は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよく、そのハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置およびその付属装置により構成してもよい。また、外部システム２００の各機能は、外部システム２００のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。
第１３図において塩基配列処理装置１００は、概略的に、塩基配列処理装置１００の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の制御部１０２、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（図示せず）に接続される通信制御インターフェース部１０４、入力装置１１２や出力装置１１４に接続される入出力制御インターフェース部１０８、および、各種のデータベースやテーブルなどを格納する記憶部１０６を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。さらに、この塩基配列処理装置１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワーク３００に通信可能に接続されている。
記憶部１０６に格納される各種のデータベースやテーブル（標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａ〜標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈ）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、各種処理に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
これら記憶部１０６の各構成要素のうち、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を格納する標的遺伝子塩基配列格納手段である。第１４図は、標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報の一例を示す図である。
標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａに格納される情報は、第１４図に示すように、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を一意に識別する塩基配列識別情報（例えば、第１４図の「ＮＭ＿０００５０７」）と、塩基配列情報（例えば、第１４図の「ＡＴＧＧＣＴＧＡ・・・ＡＧＴＧＡ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、部分塩基配列ファイル１０６ｂは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を格納する部分塩基配列格納手段である。第１５図は、部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報の一例を示す図である。
部分塩基配列ファイル１０６ｂに格納される情報は、第１５図に示すように、部分塩基配列情報を一意に識別する部分塩基配列識別情報（例えば、第１５図の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、部分塩基配列情報（例えば、第１５図の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」）と、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報（例えば、第１５図の「含有」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、判定結果ファイル１０６ｃは、後述する３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果を格納する判定結果手段である。第１６図は、判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報の一例を示す図である。
判定結果ファイル１０６ｃに格納される情報は、第１６図に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、第１６図の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、３’末端塩基判定部１０２ｂにて判定された結果である３’末端塩基判定結果（例えば、第１６図の「１」）と、５’末端塩基判定部１０２ｃにて判定された結果である５’末端塩基判定結果（例えば、第１６図の「１」）と、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果である特定塩基含有判定結果（例えば、第１６図の「４」）と、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｄにて判定された結果を総合した結果である総合判定結果（例えば、第１６図の「４」）とを相互に関連付けて構成されている。
なお、第１６図において、３’末端塩基判定結果および５’末端塩基判定結果は、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃのそれぞれにて「含む」と判定された場合「１」を設定し、「含まない」と判定された場合「０」を設定した場合の一例である。また、第１６図において、特定塩基含有判定結果は、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を設定した場合の一例である。さらに、第１６図において、総合判定結果は、３’末端塩基判定結果、５’末端塩基判定結果、および、特定塩基含有判定結果の積を設定した場合の一例である。なお、具体的には、例えば、当該積が３以下の場合は、「０」を設定してもよい。
また、規定配列ファイル１０６ｄは、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分塩基配列情報である規定配列情報を格納する規定配列格納手段である。第１７図は、規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報の一例を示す図である。
規定配列ファイル１０６ｄに格納される情報は、第１７図に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、第１７図の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる部分塩基配列情報である規定配列情報（例えば、第１７図の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｔｃａｔｇｇ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、参照配列データベース１０６ｅは、後述する同一類似塩基配列検索部１０２ｇにて規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を検索するために参照する塩基配列情報である参照塩基配列情報を格納するデータベースである。なお、参照配列データベース１０６ｅは、インターネットを経由してアクセスする外部の塩基配列情報データベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。第１８図は、参照配列データベース１０６ｅに格納される情報の一例を示す図である。
参照配列データベース１０６ｅに格納される情報は、第１８図に示すように、参照配列識別情報（例えば、第１８図の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」）と、参照塩基配列情報（例えば、第１８図の「ｃａｃｃｃｔ・・・ｇｃａｔｇｇ」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、同一類似度ファイル１０６ｆは、後述する同一類似塩基配列検索部１０２ｇにて検索された同一または類似の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値である同一類似度を格納する同一類似度格納手段である。第１９図は、同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報の一例を示す図である。
同一類似度ファイル１０６ｆに格納される情報は、第１９図に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、第１９図の「ＮＭ＿０００５０７：３６」）と、参照配列識別情報（例えば、第１９図の「ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１５８２０．１｜」および「ｒｅｆ｜ＮＭ＿００３８３７．１｜」）と、同一類似度（例えば、第１９図の「０．５２」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、評価結果ファイル１０６ｇは、後述する無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価した結果を格納する評価結果格納手段である。第２０図は、評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報の一例を示す図である。
評価結果ファイル１０６ｇに格納される情報は、第２０図に示すように、部分塩基配列識別情報（例えば、第２０図の「ＮＭ＿０００５０７：３６」および「ＮＭ＿０００５０７：４４１」）と、後述する総和算出部１０２ｍにて算出された総和（例えば、第２０図の「５．９」および「１７０．８」）と、評価結果（例えば、第２０図の「非標的」および「標的」）とを相互に関連付けて構成されている。なお、第２０図において、「非標的」は、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にしないことを意味し、また、「標的」は、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にすることを意味する。
また、標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈは、標的遺伝子に関するアノテーション情報を格納する標的遺伝子アノテーション格納手段である。なお、標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈは、インターネットを経由してアクセスする、遺伝子に関するアノテーション情報を格納する外部のアノテーションデータベースであってもよく、また、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自のアノテーション情報等を付加したりして作成したインハウスデータベースであってもよい。
標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈに格納される情報は、標的遺伝子を識別する標的遺伝子識別情報（例えば標的遺伝子の遺伝子名、アクセッション（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号など（例えば、第３図の最上部に記載の「ＮＭ＿０００５０７」、「ＦＢＰ１」））と標的遺伝子に関する簡略的な情報（例えば第３図の最上部に記載の「Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１，６−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  １」）とを相互に関連付けて構成されている。
また、第１３図において、通信制御インターフェース部１０４は、塩基配列処理装置１００とネットワーク３００（またはルータ等の通信装置）との間における通信制御を行う。すなわち、通信制御インターフェース部１０４は、他の端末と通信回線を介してデータを通信する機能を有する。
また、第１３図において、入出力制御インターフェース部１０８は、入力装置１１２や出力装置１１４の制御を行う。ここで、出力装置１１４としては、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカを用いることができる（なお、以下においては出力装置１１４をモニタとして記載する場合がある）。また、入力装置１１２としては、キーボード、マウス、および、マイク等を用いることができる。また、モニタも、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現する。
また、第１３図において、制御部１０２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部１０２は、機能概念的に、部分塩基配列作成部１０２ａ、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、特定塩基含有判定部１０２ｄ、規定配列選択部１０２ｅ、オーバーハング部位付加部１０２ｆ、同一類似塩基配列検索部１０２ｇ、および、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈを備えて構成されている。
このうち、部分塩基配列作成部１０２ａは、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成する部分塩基配列作成手段である。ここで、部分塩基配列作成部１０２ａは、第２１図に示すように、領域指定塩基配列作成部１０２ｉ、共通塩基配列作成部１０２ｊ、および、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋをさらに含んで構成される。
第２１図は、本発明が適用される本システムの部分塩基配列作成部１０２ａの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
第２１図において、領域指定塩基配列作成部１０２ｉは、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成する領域指定塩基配列作成手段である。
また、共通塩基配列作成部１０２ｊは、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成する共通塩基配列作成手段である。
また、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋは、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成するオーバーハング部位含有塩基配列作成手段である。
再び第１３図に戻り、３’末端塩基判定部１０２ｂは、部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定する３’末端塩基判定手段である。
また、５’末端塩基判定部１０２ｃは、部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定する５’末端塩基判定手段である。
また、特定塩基含有判定部１０２ｄは、部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定する特定塩基含有判定手段である。
また、規定配列選択部１０２ｅは、３’末端塩基判定部１０２ｂ、５’末端塩基判定部１０２ｃ、および、特定塩基含有判定部１０２ｃにて判定された結果に基づいて、部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択する規定配列選択手段である。
また、オーバーハング部位付加部１０２ｆは、規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加するオーバーハング部位付加手段である。
また、同一類似塩基配列検索部１０２ｇは、規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を他の塩基配列情報から検索する同一類似塩基配列検索手段である。
また、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する無関係遺伝子標的評価手段である。ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、第２２図に示すように、総和算出部１０２ｍ、および、総和基準評価部１０２ｎをさらに含んで構成される。
第２２図は、本発明が適用される本システムの無関係遺伝子標的評価部１０２ｈの構成の一例を示すブロック図であり、該構成のうち本発明に関係する部分のみを概念的に示している。
第２２図において、総和算出部１０２ｍは、同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（同一類似度）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出する総和算出手段である。
また、総和基準評価部１０２ｎは、総和算出部１０２ｍにて算出された総和に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価する総和基準標的評価手段である。
なお、これら各部によって行なわれる処理の詳細については、後述する。
［システムの処理］
次に、このように構成された本実施の形態における本システムの処理の一例について、以下に第２３図、および、第２４図を参照して詳細に説明する。
［メイン処理］
まず、メイン処理の詳細について第２３図等を参照して説明する。第２３図は、本実施形態における本システムのメイン処理の一例を示すフローチャートである。
まず、塩基配列処理装置１００は、部分塩基配列作成部１０２ａにて行われる部分塩基配列作成処理により、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列情報を取得して標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａの所定の記憶領域に格納し、塩基配列情報の予め定めた塩基数の配列部位である部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−１）。
ここで、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、領域指定塩基配列作成部１０２ｉの処理により、塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
また、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、共通塩基配列作成部１０２ｊの処理により、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報（例えば、ヒトの塩基配列情報およびマウスの塩基配列情報など）の間で共通する、予め定めた塩基数の部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。なお、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の間で共通する、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。
また、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、領域指定塩基配列作成部１０２ｉ、および、共通塩基配列作成部１０２ｊの処理により、異なる生物に由来する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報を部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。なお、同じ生物種における類似する複数の塩基配列情報の標的遺伝子のコード領域、または、転写領域に対応する部位から、予め定めた塩基数の共通な部分塩基配列情報を作成してもよい。
さらに、ステップＳＡ−１において、部分塩基配列作成部１０２ａは、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋの処理により、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を作成してもよい。具体的には、例えば、部分塩基配列作成部１０２ａは、オーバーハング部位含有塩基配列作成部１０２ｋの処理により、オーバーハング部位が含まれていることを表すオーバーハング部位含有情報が付加された部分塩基配列情報を作成し、作成された部分塩基配列情報とオーバーハング部位含有情報と相互に関連付けて部分塩基配列ファイル１０６ｂの所定の記憶領域に格納してもよい。
なお、上述の予め定めた塩基数の上限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは３２以下、より好ましくは２６以下、さらに好ましくは２４以下である。また、予め定めた塩基数の下限は、オーバーハング部位を含まない場合は、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上であり、オーバーハング部位を含む場合は、好ましくは１７以上、より好ましくは２０以上、さらに好ましくは２２以上である。そして、最も好ましい予め定めた塩基数は、オーバーハング部位を含まない場合は、１９であり、オーバーハング部位を含む場合は、２３である。
ついで、塩基配列処理装置１００は、３’末端塩基判定部１０２ｂの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−２）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、３’末端塩基判定部１０２ｂの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
ついで、塩基配列処理装置１００は、５’末端塩基判定部１０２ｃの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−３）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、５’末端塩基判定部１０２ｃの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであるときには「１」を、そうでないときには「０」を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。
ついで、塩基配列処理装置１００は、特定塩基含有判定部１０２ｄの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であるか否かを判定し、判定した結果を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−４）。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、特定塩基含有判定部１０２ｄの処理により、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報に含まれる、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基の数を判定結果ファイル１０６ｃの所定の記憶領域に格納してもよい。ステップＳＡ−４における判定の規則は、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報の３’末端近傍の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３’末端から７塩基の範囲内の塩基配列情報がアデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であることを規定している。
ここで、ステップＳＡ−４において、「リッチな塩基配列情報」は、上述の＜１＞ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に記述されている「リッチな配列」であり、具体的には、例えば、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報が１９塩基程度からなる場合、当該部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基が少なくとも好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上含まれる塩基配列情報である。
また、ステップＳＡ−２からステップＳＡ−４において、オーバーハング部位を含む部分塩基配列情報を判定する場合、部分塩基配列情報のオーバーハング部位を除いた配列部位を判定対象として判定する。
ついで、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３、および、ステップＳＡ−４にて判定された結果に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報から標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択し、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＡ−５）。
具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２にて３’末端の塩基がアデニン、チミン、または、ウラシルであると判定され、ステップＳＡ−３にて５’末端の塩基がグアニン、または、シトシンであると判定され、かつ、ステップＳＡ−４にて部分塩基配列情報の３’末端の７塩基からなる塩基配列情報が、アデニン、チミン、および、ウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチな塩基配列情報であると判定された部分塩基配列情報を規定配列情報として選択し、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納する。ここで、具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、規定配列選択部１０２ｅの処理により、ステップＳＡ−２、ステップＳＡ−３、および、ステップＳＡ−４にて出力される数値の積を算出し、当該積の値に基づいて、ステップＳＡ−１にて作成された部分塩基配列情報から規定配列情報を選択してもよい。
ここで、塩基配列処理装置１００は、オーバーハング部位付加部１０２ｆの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報の少なくとも一方の末端にオーバーハング部位を付加して、規定配列ファイル１０６ｄの所定の記憶領域に格納してもよい。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、オーバーハング部位付加部１０２ｆの処理により、規定配列ファイル１０６ｄの規定配列情報の項に記憶されている規定配列情報を、少なくとも一方の末端にオーバーハング部位が付加された規定配列情報に書き換えてもよい。なお、例えば、ターゲット側を検索する場合は、規定配列情報の両末端にオーバーハング部位を付加してもよい。
なお、上述のオーバーハング部位の塩基数は、上述の＜２＞ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法に記述されている塩基数であり、具体的には、例えば、２が特に好適である。
また、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和算出部１０２ｍの処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和基準評価部１０２ｎの処理により、算出された総和に基づいて、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価してもよい。
ここで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈにて行われる無関係遺伝子標的評価処理の詳細について第２４図を参照して説明する。
第２４図は、本実施形態における本システムの無関係遺伝子標的評価処理の一例を示すフローチャートである。
まず、塩基配列処理装置１００は、同一類似塩基配列検索部１０２ｇの処理により、ステップＳＡ−５にて選択された規定配列情報と同一または類似の塩基配列情報を、他の塩基配列情報（例えばＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑなどの公的データベースで公開されている塩基配列情報）から、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ｓｓｅａｒｃｈなどの既存のホモロジー検索手法を用いて検索し、規定配列情報の識別情報（第１９図における「部分塩基配列識別情報」）と、検索された同一または類似の塩基配列情報の識別情報（第１９図における「参照配列識別情報」）と、検索された同一または類似の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）（第１９図における「同一類似度」）とを相互に関連付けて、同一類似度ファイル１０６ｆの所定の記憶領域に格納する。
ついで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和算出部１０２ｍの処理により、検索された同一または類似の塩基配列情報のうち標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報の総数、および、標的遺伝子とは無関係の遺伝子の塩基配列情報に付された同一類似の度合いを示す値（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびｓｓｅａｒｃｈの場合は、「Ｅ  ｖａｌｕｅ」）に基づいて、同一類似の度合いを示す値の逆数の総和を算出し、規定配列情報の識別情報（第２０図における「部分塩基配列識別情報」）と算出された総和（第２０図における「総和」）とを相互に関連付けて、評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−１）。
ついで、無関係遺伝子標的評価部１０２ｈは、総和基準評価部１０２ｎの処理により、ステップＳＢ−１にて算出された総和に基づいて（例えば、ステップＳＢ−１にて算出された総和の大小などに基づいて）、規定配列情報が標的遺伝子とは無関係の遺伝子を標的にするか否かを評価し、評価結果（第２０図における「非標的」および「標的」）を評価結果ファイル１０６ｇの所定の記憶領域に格納する（ステップＳＢ−２）。
これにて、メイン処理が終了する。
［他の実施の形態］
さて、これまで本発明の実施の形態について説明したが、本発明は、上述した実施の形態以外にも、請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。
例えば、塩基配列処理装置１００がスタンドアローンの形態で処理を行う場合を一例に説明したが、塩基配列処理装置１００とは別筐体で構成されるクライアント端末からの要求に応じて処理を行い、その処理結果を当該クライアント端末に返却するように構成してもよい。具体的には、例えば、クライアント端末はＲＮＡ干渉の標的遺伝子の名称（例えば遺伝子名、アクセッション番号など）または標的遺伝子に係る塩基配列情報を塩基配列処理装置１００に送信し、塩基配列処理装置１００は当該名称に対応する塩基配列情報またはクライアント端末より送信された塩基配列情報に対して制御部１０２で行われる上述した各処理を行い、標的遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選択してクライアント端末に送信してもよい。この場合、例えば、クエリーの遺伝子に対して公共データベースから配列情報を取得してｓｉＲＮＡを選択してもよく、また、例えば、予め全遺伝子のｓｉＲＮＡを計算して記憶しておき、クライアント端末からの要求（遺伝子の名称またはアクセッション番号など）に対して即座にｓｉＲＮＡを選択し、選択したｓｉＲＮＡをクライアント端末に返してもよい。
また、塩基配列処理装置１００は、標的遺伝子とは無関係の遺伝子に対する規定配列情報の特異性を確認してもよい。これにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる規定配列情報を選出することができる。
また、クライアント端末と塩基配列処理装置１００とで構成される本システムには、例えば、Ｗｅｂページの利用者から、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉効果（例えば、「効く」、「効かない」など）の結果をＷｅｂ上でフィードバックしてもらい、利用者からフィードバックされた実験例を塩基配列処理装置１００に蓄積し、上述したＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡの配列規則性を改善するためのインターフェース機能を導入してもよい。
また、塩基配列処理装置１００は、規定配列情報からｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列情報および当該センス鎖と相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）なアンチセンス鎖の塩基配列情報を計算してもよい。具体的には、例えば、塩基配列処理装置１００は、上述した各処理の結果、規定配列の両端に各２塩基のオーバーハング部を付加した２３塩基の配列情報として「ｃａｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｃｔｔｃｇｔｃａｔｇｇ」を選択した場合、センス鎖の塩基配列情報「５’−ＣＣＣＵＧＡＣＣＣＧＣＵＵＣＧＵＣＡＵＧＧ−３’」およびアンチセンス鎖の塩基配列情報「５’−ＡＵＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＧＵＣＡＧＧＧＵＧ−３’」を計算する。これにより、ポリヌクレオチドを発注する時にセンス鎖、アンチセンス鎖を手作業でまとめる必要がなくなり、利便性が高まる。
また、実施形態において説明した各処理のうち、自動的に行なわれるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行なわれるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。
この他、上記文書中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各種の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
また、塩基配列処理装置１００に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。
例えば、塩基配列処理装置１００の各部または各装置が備える処理機能、特に制御部１０２にて行なわれる各処理機能については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現することができ、あるいは、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現することも可能である。なお、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて塩基配列処理装置１００に機械的に読み取られる。
すなわち、ＲＯＭまたはＨＤなどの記憶部１０６などには、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）と協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭ等にロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部１０２を構成する。また、このコンピュータプログラムは、塩基配列処理装置１００に対して任意のネットワーク３００を介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記録されてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。
また、本発明にかかるプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、フラッシュディスク等の任意の「可搬用の物理媒体」や、各種コンピュータシステムに内蔵されるＲＯＭ、ＲＡＭ、ＨＤ等の任意の「固定用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。
また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
記憶部１０６に格納される各種のデータベース等（標的遺伝子塩基配列ファイル１０６ａ〜標的遺伝子アノテーションデータベース１０６ｈ）は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやファイルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。
また、塩基配列処理装置１００は、既知のパーソナルコンピュータ、ワークステーション等の情報処理端末等の情報処理装置にプリンタやモニタやイメージスキャナ等の周辺装置を接続し、該情報処理装置に本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を実装することにより実現してもよい。
さらに、塩基配列処理装置１００等の分散・統合の具体的形態は明細書および図面に示すものに限られず、その全部または一部を、各種の負荷等に応じた任意の単位で、機能的または物理的に分散・統合して構成することができる（例えば、グリッド・コンピューティングなど）。例えば、各データベースを独立したデータベース装置として独立に構成してもよく、また、処理の一部をＣＧＩ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を用いて実現してもよい。
また、ネットワーク３００は、塩基配列処理装置１００と外部システム２００とを相互に接続する機能を有し、例えば、インターネットや、イントラネットや、ＬＡＮ（有線／無線の双方を含む）や、ＶＡＮや、パソコン通信網や、公衆電話網（アナログ／デジタルの双方を含む）や、専用回線網（アナログ／デジタルの双方を含む）や、ＣＡＴＶ網や、ＩＭＴ２０００方式、ＧＳＭ方式またはＰＤＣ／ＰＤＣ−Ｐ方式等の携帯回線交換網／携帯パケット交換網や、無線呼出網や、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ等の局所無線網や、ＰＨＳ網や、ＣＳ、ＢＳまたはＩＳＤＢ等の衛星通信網等のうちいずれかを含んでもよい。すなわち、本システムは、有線・無線を問わず任意のネットワークを介して、各種データを送受信することができる。
【実施例】  以下、実施例を示し、本発明についてより具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】＜１＞ＲＮＡｉ効果を測定するための遺伝子、発現ベクター
ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ効果を測定するための標的遺伝子としてはホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ，Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ）のｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：Ｕ４７２９６）を用い、これを含む発現ベクターとしてはｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子断片はこのベクター中でＳＶ４０のプロモーターとポリＡシグナルで挟まれた形になっている。また内部コントロール遺伝子はウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｌｕｃ遺伝子を用い、これを含む発現ベクターとしてｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。
＜２＞２１塩基２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の合成
２１塩基センス鎖と２１塩基アンチセンス鎖ＲＮＡ（第９図にしめされている位置のもの；ａ〜ｐ）は、日立計測器サービス株式会社を通じてジェンセット株式会社に合成を委託した。
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ遺伝子の発現を阻害するために用いた２本鎖ＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖とを会合させることで作製した。会合は、センス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ＮａＣｌ反応液中で９０℃、３分間加熱し、３７℃で１時間インキュベートし、その後室温になるまで放置することで行った。２本鎖ポリヌクレオチドの形成は、ＴＢＥ緩衝液中での２％アガロースゲルでの電気泳動で検定するが、上記条件では殆どすべての１本鎖ポリヌクレオチドが２本鎖ポリヌクレオチドに会合していた。
＜３＞哺乳類細胞培養法
哺乳類培養細胞としては、ヒトのＨｅＬａ細胞とＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスターのＣＨＯ−ＫＩ細胞（ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）を用いた。培地はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｓｅｉ社製）及び抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）５０μｇ／ｍｌを添加したものを用いた。３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
＜４＞哺乳類培養細胞への標的遺伝子、内部コントロール遺伝子、ｓｉＲＮＡの培養細胞へのトランスフェクション
哺乳類細胞は０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４穴プレートにまき、１日後にＣａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法（細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２））で１．０μｇ  ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、０．５または１．０μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡ、及び０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭの各ｓｉＲＮＡを導入した。
＜５＞ショウジョウバエ細胞培養法
ショウジョウバエ培養細胞としてはＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２７，３５３−３６５（１９７２））を用いた。培地はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に非慟化１０％牛胎児血清（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｓｅｉ社製）及び抗生物質としてｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）１０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｍｅｉｊｉ社製）５０μｇ／ｍｌを添加したものを用いた。２５℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
＜６＞ショウジョウバエ培養細胞への標的遺伝子、内部コントロール遺伝子、ｓｉＲＮＡの培養細胞へのトランスフェクション
このＳ２細胞は１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４穴プレートにまき、１日後にＣａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法（細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２））で１．０μｇ  ｐＧＬ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、０．１μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡ、及び０．０１、０．１、１、１０、１００ｎＭの各ｓｉＲＮＡを導入した。
＜７＞ＲＮＡｉ効果の測定
ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞は、トランスフェクション後２０時間後に回収し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、２種類のルシフェラーゼ（Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ  ｌｕｃ及びＲ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ｌｕｃ）タンパクの発現量（ルシフェラーゼ活性）を測定した。発光量の測定はＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて行った。
＜８＞結果
ルシフェラーゼ活性を測定した結果を第１０図に示す。また、ルシフェラーゼ活性と各塩基配列との対応を検討した結果を第１１図に示す。
第１０図中、Ｂで示されるグラフはショウジョウバエでの結果であり、Ｃで示されるグラフはヒトでの結果を示す。第１０図に示されるように、ショウジョウバエでは塩基数を２１のＲＮＡを作製することにより、殆どの配列においてルシフェラーゼ活性を抑制できた。他方、ヒトの場合については、単に塩基数を２１としただけではルシフェラーゼ活性を抑制できる配列が得られにくいことが明らかとなった。
そこで、ａ〜ｐのＲＮＡの塩基配列の規則性を分析した。配列の分析は、第１１図に示すように２本鎖ＲＮＡの５箇所について塩基配列を分析した。第１１図の表中最上段のａのｓｉＲＮＡについてみると、ルシフェラーゼ相対活性（ＲＬＡ）は０．０３、アンチセンス鎖について３’末端側から順に見ると、オーバーハング部（ＯＨ）の塩基配列がＵＣ、続く７塩基（図１１中３’−Ｔ）中のＧ／Ｃ含有量（グアニンまたはシトシンの含有量）は５７％、さらに続く５塩基（第１１図中Ｍ）のＧ／Ｃ含有量は２０であり、さらに続く７塩基（第１１図中５’−Ｔ）のＧ／Ｃ含有量は１４％であり、５’末端はＵであり、合計のＧ／Ｃ含有量は３２％である。表中、ＲＬＡの値が低いほど、ＲＬＡの活性が低く、すなわちルシフェラーゼの発現が抑制されたことを示す。
この結果から、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列は、３’末端がアデニンまたはウラシルであり５’末端がグアニンまたはシトシンである確率が極めて高いことが明らかになった。また、３’末端側の７塩基ついてはアデニンまたはウラシルが豊富な状態であることが明らかとなった。
【実施例２】１．標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構築
下記のようにして標的発現ベクターを構築した。標的発現分子は、ＲＮＡｉの標的となる配列（以下「標的配列」という場合がある）を有するＲＮＡを発現させる分子である。
ｐＣＩ−ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４７１２０、プロメガ社製）のＣＭＶエンハンサー／プロモーター下流に標的ｍＲＮＡ配列を構築した（第２５図）。すなわち、コザック配列（Ｋｏｚａｋ）、ＡＴＧ配列、標的となる２３塩基対配列クローニングサイト（ｔａｒｇｅｔ）及び組み換えのための制限酵素（ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）認識配列を有する下記の２本鎖オリゴマーを合成した。２本鎖オリゴマーは配列表の配列番号１に示す配列とその相補的な配列とからなる。合成した２本鎖オリゴマーをｐＣＩ−ｎｅｏのＮｈｅＩ、ＸｂａＩサイトに挿入し、標的発現ベクターｐＴＲＥＣを構築した（第２５図）。なお、イントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏに当初から組み込まれているβ−グロビン由来のイントロン部位を用いた。
2004048566.tif 000004
第２５図に示すｐＴＲＥＣは、プロモーターおよびエンハンサー（ｐｒｏ／ｅｎｈ）、とＰＣＲプライマーに対応する領域ＰＡＲ（Ｆ）１およびＰＡＲ（Ｒ）１を備ええる。ＰＡＲ（Ｆ）１にはイントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）が挟み込まれており、発現ベクターそのものがＰＣＲの鋳型とならないように設計されている。ｐＴＲＥＣは、ＲＮＡの転写後、真核生物の培養細胞などのスプライシングが行われる環境下において、イントロン部位が除去され、ＰＡＲ（Ｆ）１が連結される。ｐＴＲＥＣから形成されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより増幅できる。イントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏに当初から組み込まれているβ−グロビン由来のイントロン部位を用いた。
ｐＴＲＥＣには、コントロールとしてネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）が組み込まれており、ネオマイシン耐性遺伝子内の配列の一部に対応するＰＣＲプライマーを作製し、ネオマイシン耐性遺伝子の一部についてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ネオマシン耐性遺伝子を内部標準コントロール（インターナルコントロール）として用いることができる。ＰＡＲ（Ｆ）２およびＰＡＲ（Ｒ）２は、ネオマイシン耐性遺伝子中のＰＣＲプライマー対応領域を示す。なお、第２５図の例には示していないが、ＰＡＲ（Ｆ）２またはＰＡＲ（Ｒ）２の少なくとも一方にもイントロンを挟み込んでおくこともできる。
２．標的ｍＲＮＡ検出用プライマーの効果
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣベクターをトランスフェクトした。
（２）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行った。コントロールとして、逆転写酵素を加えないものを用意した。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、５６μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、標的ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および、内部コントロールとしてｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２、３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４、５）をそれぞれ使用した。
2004048566.tif 000005
第２６図および第２７図に、ＰＣＲの結果を示す。第２６図および第２７図は、縦軸にそれぞれのＰＣＲ産物を、横軸にＰＣＲのサイクル回数をとり、グラフに表したものである。ネオマイシン耐性遺伝子の場合、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成したもの（＋ＲＴ）と、逆転写酵素を加えないコントロール（−ＲＴ）で、得られたＰＣＲ産物量の増幅の差は小さかった（第２６図）。これは、ｃＤＮＡのみならず、細胞内に残っているベクターもＰＣＲの鋳型となって増幅されたことを示す。他方、標的配列ｍＲＮＡでは、逆転写酵素を添加した場合（＋ＲＴ）と添加しない場合（−ＲＴ）とによる差が大きかった（第２７図）。この結果は、プライマー対Ｔのうちの一方がイントロンをはさむ形でデザインされているため、イントロンが除去されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡが効率的に増幅される一方、イントロンを有する残存ベクターが鋳型となりにくくなっていることを示している。
３．ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの発現抑制
（１）ターゲット発現ベクターへの評価配列のクローニング
ヒトビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子（ＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００３３８０）コード領域の８１２−８３４、３５−５７に相当する配列を評価の対象とした。これらの配列およびＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩの認識配列を有する下記配列表配列番号６および７の合成オリゴヌクレオチド（評価配列フラグメント）を作製した。
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得られた評価配列フラグメントの両端にあるＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトを利用し、ｐＴＲＥＣのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイト間に、新たな標的配列としてクローニングし、ｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５、ｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２を構築した。
（２）ｓｉＲＮＡの作製
評価配列ＶＩＭ３５（配列表配列番号８、第２８図）、評価配列ＶＩＭ８１２（配列番号９、第２９図）、及びコントロール配列（ｓｉＣｏｎｔｏｒｏｌ、配列番号１０、第３０図）にそれぞれ相当するｓｉＲＮＡフラグメントを合成し、アニーリングした。下記ｓｉＲＮＡの各配列においては、３’末端にオーバーハング部を設けてある。
2004048566.tif 000007
コントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。
2004048566.tif 000008
（３）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２と、それぞれのＶＩＭ由来配列に相当する１００ｎＭのｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ３５、ｓｉＶＩＭ８１２）を同時にトランスフェクトした。コントロール細胞には、０．５μｇのｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２と１００ｎＭのルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）を同時にトランスフェクトした。
（４）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、評価しようとするＶＩＭ由来の配列を含むｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および内部コントロールとして、ｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。
定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２および３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４および５）をそれぞれ使用した。得られたそれぞれのｍＲＮＡの値の比（Ｔ／Ｃ）を縦軸（標的ｍＲＮＡ相対量（％））としてグラフに表した（第３１図）。
コントロール細胞の場合、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡに効果を及ぼさないため、Ｔ／Ｃ比はほぼ１になった。ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡでは、Ｔ／Ｃ比が著しく下がった。これは、ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡが、相当する配列を有するｍＲＮＡを切断したためであり、ＶＩＭ８１２  ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を有することが示された。一方、ＶＩＭ３５  ｓｉＲＮＡの場合、Ｔ／Ｃ比はコントロールとほぼ同じ値であったことから、ＶＩＭ３５の配列にはＲＮＡｉ効果がほとんどないことが示された。
【実施例３】１．ｓｉＲＮＡによる内在性ビメンチンの発現抑制
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０６ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、マニュアルにしたがって、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ３５またはｓｉＶＩＭ８１２）またはコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）１００ｎＭ、トランスフェクション効率のコントロールとして０．５μｇのｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を同時にトランスフェクトした。ｐＥＧＦＰはＥＧＦＰが組み込まれている。
（２）内在性ビメンチンｍＲＮＡの測定
トランスフェクションの３日後、細胞を回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行なった。得られたｃＤＮＡ産物を鋳型として、ビメンチンに対するプライマーＶＩＭ−Ｆ３−８４、ＶＩＭ−Ｒ３−２７４（配列番号１１、１２）を用いてＰＣＲを行った。
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また、コントロールとして、β−アクチンに対するプライマーＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１、ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４（配列番号１３、１４）を用いてＰＣＲを行い、各サンプル間のβ−アクチンの定量値を合わせたうえで、ビメンチンの発現量を評価した。
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結果を第３２図に示す。第３２図では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（すなわち、標的とは無関係な配列）を入れた場合を１００％として比較し、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡを入れた場合に、ＶＩＭのｍＲＮＡがどの程度減少したかを表している。ｓｉＶＩＭ−８１２は効果的にＶＩＭ  ｍＲＮＡを抑制できたのに対して、ｓｉＶＩＭ−３５を用いた場合はほとんどＲＮＡｉ効果を示さなかった。
（３）細胞の抗体染色
トランスフェクションの３日後、細胞を３．７％のホルムアルデヒドにより固定し、定法によりブロッキングを行った。その後、ウサギ抗ビメンチン抗体（α−ＶＩＭ）または内部コントロールとしてウサギ抗Ｙｅｓ抗体（α−Ｙｅｓ）を加え、室温で反応させた。その後、細胞表面をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、二次抗体として蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、室温で反応させた。細胞表面をＰＢＳで洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行った。
蛍光顕微鏡観察の結果を第３３図に示す。第３３図中、９つの各枠内において白く現れている部分が蛍光部分である。ＥＧＦＰおよびＹｅｓについては、何れの細胞でも同程度の発現が確認された。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ３５を導入した細胞では、ビメンチンの抗体染色による蛍光が観察され、内在性ビメンチンの存在が確認された。一方、ｓｉＶＩＭ８１２を導入した細胞では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ３５を導入した細胞に比べて蛍光が著しく弱かった。この結果は、ｓｉＶＩＭ８１２により内在性のビメンチンｍＲＮＡが干渉を受けた結果、ビメンチンの蛋白質の発現量が減少したことを示すものであり、ｓｉＶＩＭ８１２は内在性ビメンチンｍＲＮＡにもＲＮＡｉ効果を有することが明らかになった。
本発明のアッセイ系で得られた結果［実施例２］は、実際に内在性遺伝子に対してそれぞれのｓｉＲＮＡを用いた結果［実施例３］とよく一致していたため、このアッセイ系は任意のｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を評価する方法として有効であることが示された。
【実施例４】  上記所定の規則（ａ）〜（ｄ）に基づき塩基配列を設計した。塩基配列の設計は、上記ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置によって行った。塩基配列は、ＲＮＡｉ活性を有すると予測される配列１５種（配列番号１５〜２９）と、ＲＮＡｉ活性を有しないと予測される配列５種（配列番号３０〜３４）を用意した。
設計された配列に基づき標的配列および評価対象のｓｉＲＮＡを調製する以外ば、上記実施例１と同様にして、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＲＮＡｉ活性の評価を行った。結果を第３４図に示す。ルシフェラーゼ相対活性値が低いものが効いている状態、すなわちＲＮＡｉ活性を備えたｓｉＲＮＡである。上記プログラムによりＲＮＡｉ活性を有すると予測されたｓｉＲＮＡは、全てルシフェラーゼの発現を効果的に抑制した。
［ＲＮＡｉ活性を示した配列；規定配列部分、オーバーハング部を含まない］
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［ＲＮＡｉ活性を示さなかった配列；規定配列部分、オーバーハング部を含まない］
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【実施例５】  ＳＡＲＳウィルスに対するｓｉＲＮＡを設計し、それらのＲＮＡｉ活性を調べた。標的配列および評価対象の配列をそれぞれ変更する以外は、ＲＮＡｉ活性は上記実施例２と同様のアッセイを行うことにより評価した。
ｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳウィルスのゲノムから、３ＣＬ−ＰＲＯ、ＲｄＲｐ、Ｓｐｉｋｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｍａｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍ、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｓ２ｍ  ｍｏｔｉｆの各所について、上記ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを用い所定の規則性に合致するものを設計した。
第３５図アッセイの結果、規則性に合致するように設計した１１個のｓｉＲＮＡは、それぞれ対応するｓｉＲＮＡの配列をターゲットとして組み込んだＲＮＡを効果的に抑制した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（ＳＡＲＳとは関係のない配列）を入れた場合を１００％として、ＳＡＲＳの各ｓｉＲＮＡを入れた場合の相対標的ｍＲＮＡ量を示す。各ｓｉＲＮＡを入れた場合、標的のＲＮＡが１０％程度あるいはそれ以下まで減少しており、ＲＮＡｉ活性があることが確認された。
［設計したｓｉＲＮＡの配列（規定配列部分、オーバーハング部を含まない）］
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【実施例６】  上記「＜５＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラム」および「＜７＞ｓｉＲＮＡ配列設計プログラムを実行する塩基配列処理装置等」に従って、下記ｓｉＲＮＡを設計した。設計されたｓｉＲＮＡの配列を配列表の配列番号４７〜配列番号８９２に示す。
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【発明の効果】
本発明よれば、実際にＲＮＡｉ効果を示すｓｉＲＮＡを高い確率で得ることができる。したがって、新規なｓｉＲＮＡを調製する場合に、試験者の経験等に基づき実際にｓｉＲＮＡを合成してＲＮＡｉ効果を有するか否か確認するため試行錯誤を繰り返す労力を大幅に軽減できる。すなわち、本発明は、新規な配列を有するｓｉＲＮＡの検索あるいは作製に極めて好適である。さらに、本発明により、所望のｓｉＲＮＡを短時間で多種得ることができる。試行錯誤的にｓｉＲＮＡを実際に作製する必要性が低減されるため、ＲＮＡ干渉を利用する試験、製造などの方法に要するコストを大幅に削減することができる。また、本発明は、ＲＮＡｉ効果を利用したあらゆる試験、製造などの方法を大幅に簡略化させると共に、方法としての確実性は大幅に向上させることができる。本発明は、哺乳類などの高等動物を対象とするＲＮＡ干渉を行う際に特に有効性を発揮するものである。
【産業上の利用可能性】  以上のように、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）に関し、詳しくは、ＲＮＡ干渉を利用した試験、製造などの効率を向上させる、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの配列設計方法等に関する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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