(57)【要約】転写抑制因子をコードする腎症関連遺伝子。該遺伝子を導入することによって作成される、尿量、尿中アルブミン量及び尿中ＮＡＧ量の増加、腎盂の拡大、腎細管の拡大及び糸球体の初期の肥大とその後の硬化が観察される腎症発症トランスジェニック非ヒト動物。
2004072282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードすることを特徴とする腎症関連遺伝子。
【請求項２】
インスリン転写抑制因子がＣＲＥＭα、ＩＣＥＲＩ及びＩＣＥＲＩγからなる群から選ばれるいずれか１つである請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
インスリン転写抑制因子がＩＣＥＲＩγである請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号１で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる請求項１の遺伝子。
【請求項５】
配列番号２で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる請求項１の遺伝子。
【請求項６】
腎症が糖尿病性腎症である請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
前記遺伝子がヒト由来である請求項１に記載の遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む腎症発症剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む糖尿病性腎症発症剤。
【請求項１０】
請求項７に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な１５塩基以上のヌクレオチド配列からなるヒト腎症判定乃至診断用プローブ。
【請求項１１】
転写因子ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有する腎症関連蛋白質。
【請求項１２】
ＣＲＥＭα、ＩＣＥＲＩ及びＩＣＥＲＩγからなる群から選ばれるいずれか１つである請求項１０に記載の腎症関連蛋白質。
【請求項１３】
ヒト由来である請求請求項１１に記載の蛋白質。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の蛋白質又はその部分に特異的に結合する抗体。
【請求項１５】
ヒト腎症関連蛋白質と特異的に結合する請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体を含有するヒト腎症診断薬。
【請求項１７】
請求項７に記載のヒト腎症関連遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１５に記載の抗体または請求項１７に記載のアンチセンスＤＮＡを有効成分とする腎症予防乃至治療薬。
【請求項１９】
請求項１０に記載のプローブまたは請求項１２に記載の抗体を用いて、検体における請求項７に記載のヒト腎症関連遺伝子の発現レベルを調べる工程を有する腎症の判定又は診断方法。
【請求項２０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を導入してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
腎症を発症する請求項２０に記載の哺乳動物。
【請求項２２】
前記腎症が糖尿病性腎症である請求項２１に記載の哺乳動物。
【請求項２３】
糖尿病を発症する請求項２０に記載の哺乳動物。
【請求項２４】
前記糖尿病が糖尿病性腎症を併発する請求項２３に記載の哺乳動物。
【請求項２５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を導入する工程を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種に対して被検物質が与える影響を測定する工程を有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防乃至治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項７に記載のヒト腎症関連遺伝子のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を組み込んでなる、哺乳類細胞で安定発現可能な発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
【請求項２９】
哺乳類細胞がヒト細胞である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記マーカー遺伝子の発現量を測定する工程を含むヒト腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防ないし治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３１】
請求項２６または３０に記載のスクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防ないし治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、腎症に関連する遺伝子、該遺伝子を導入してなる腎症発症トランスジェニック非ヒト哺乳動物、腎症治療剤、並びに腎症の診断乃至治療に有効な薬物のスクリーニング方法等に関する。本発明は、腎症のうち、特に糖尿病性腎症に関する。
【背景技術】  腎症は、特効薬がなく、進行すると人工透析療法が必要になるなど、患者に著しい苦痛を与えるものであった。特に、糖尿病性腎症は、糖尿病の患者が増えるにつれて深刻な問題となってきている。
糖尿病の発症機序については、重度のインスリン障害が糖尿病状態を導くことが知られている。近年インスリン障害の機序が明らかにされつつあり（稲田明理他、分子糖尿病学、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．７３−８１、１９９９）、糖尿病の発症機序の解明や治療に関する研究が盛んに行われている。しかしながら、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などの糖尿病性合併症の発症機序については、未だ有効な知見がなく、有効な診断乃至治療方法も開発されていなかった。
一方、糖尿病乃至糖尿病性合併症の診断乃至治療方法の開発のために、糖尿病モデルマウスが開発され（特開平０４−２４８９４１号公報）、検討されてきた。しかし、従来の糖尿病モデルマウスは、あくまで、低インスリン症状、高血糖症状を示すにとどまっており、糖尿病性合併症に関連する症状を発症したモデルで有効なものは未だ開発されていなかった。唯一、２種類の遺伝子改変マウスを掛け合わせて得られるホモ型マウスで、糖尿病性腎症を示すものが報告されていた（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、ｖｏｌ．１０８、Ｎｏ．２、ｐ．２６１、２００１）。しかし、これは、膵ランゲルハンス島のインスリン分泌細胞であるβ細胞に障害性に働く一酸化窒素（ＮＯ）を産生するＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）を遺伝子的に組み込んで糖尿病を発症するマウス（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２７３、ｐｐ．２４９３−２４９６、１９９８）と高血糖状態が持続することで産生されるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔ（ＡＧＥ）を処理するために必要なＡＧＥ受容体を大量に発現させるトランスジェニックマウスをかけあわせてダブルトランスジェニックマウスとしたもので、両者がともに発現したときにはじめてヒト糖尿病に類似した高度蛋白尿と腎糸球体硬化が現れるものである。このモデルの場合、ＮＯＳの膵での過剰発現とＮＯＳの過剰発現といういずれも通常はみられない状態を作り出したもので、実際の糖尿病の状態からはかけ離れているといわざるを得ない。
さらに、ＩＣＥＲがインスリン遺伝子の転写を抑制すること（Ａ．Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ＪＢＣ  １９９９  ｖｏｌ．２７４  ｎｏ．３０  ｐ．２１０９５−２１１０３；Ａ．Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ＢＢＲＣ  １９９８  ｖｏｌ．２５３  ｎｏ．３  ｐ．７１２−７１８）および糖尿病状態でＩＣＥＲが増加していること（Ａ．Ｉｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ  ＢＢＲＣ  １９９８  ｖｏｌ．２５３  ｎｏ．３  ｐ．７１２−７１８）は知られていたが、ＩＣＥＲと腎症との関連は知られていなかった。
このため、糖尿病性腎症をはじめとする腎症の診断乃至治療に有効な薬物の開発や、腎症乃至糖尿病性腎症の病態モデルとして有用な実験系の開発が強く求められていた。
本発明は、糖尿病性腎症を含む腎症の診断乃至治療に有用な方法、並びに、腎症の病態モデルとして有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供することを主な目的とする。
【図面の簡単な説明】  図１は、作成したＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスにおけるＩＣＥＲＩγ発現とその影響を調べた結果を示す。図１ａは作成したコンストラクトを示す。図１ｂはＩＣＥＲＩγｍＲＮＡの検出結果を示す。ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウス（Ｔｇ）において、ＩＣＥＲＩγのｍＲＮＡの発現がみられる。図１ｃはウェスタンブロットにより、ＩＣＥＲＩγの蛋白発現を確認した図面である。Ｔｇマウスにおいて蛋白の多量発現がみられる。図１ｄはインシュリンｍＲＮＡ量を調べた結果を示す。インシュリンはＴｇマウスにてほとんど発現していない。
図２は、ＩＣＥＲＩγ発現の影響を評価するために血糖値と血中パラメータの変動を調べた結果を示す。図２ａ及び２ｂは血糖値の変化を示し、白丸はワイルドタイプ（ＷＴ）、黒丸はトランスジェニックマウス（Ｔｇ）を示す。図２ａは、０日目と７日目の変化を示す。Ｔｇでは生後７日目で血糖の上昇が認められる。図２ｂは、２０週間の血糖の変化を示す。Ｔｇは高血糖を維持していることが分かる。図２ｃは血漿インシュリンの変化を示す。Ｔｇではインシュリンは抑制されている。図２ｄはケトン体（アセトン、アセト酢酸およびβ−ヒドロキシ酪酸）の変化を示す図面である。Ｔｇではケトン体は増加している。図２ｅはグルカゴンの変化を示す図面である。Ｔｇではグルカゴンの産生が増加している。Ｆｉｇ．２ｆ：生後７日の膵島の抗インスリン（緑）、抗ＩＣＥＲＩγ（赤）抗体による染色を示す。Ｔｇでは、ＩＣＥＲＩγの発現、およびインスリン産生細胞数の減少が認められた（バーは１０μｍ）。右端は、１つあるいは２つの細胞を示す。
図３は、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウス（Ｔｇ）とワイルドタイプ（ＷＴ）の体重の変化を調べた図面である。図３ｂは、０日目と７日目の変化を調べた図面であり、図３ａ及び図３ｃは、２０週にわたって変化を調べた図面である。生後７日までの成長に差はないが（図３ｂ）、６週位からＴｇマウスの成長が抑制される（図３ｃ）。
図４ａは尿量の変化を示す。Ｔｇは多尿を呈している。図４ｂは、尿中アルブミンの排泄量の変化を示す。Ｔｇは週齢に従って蛋白尿が増加している。図４ｃは尿細管障害の指標である尿ＮＡＧ量の変化を示す。Ｔｇは尿量、尿アルブミン排泄、尿中ＮＡＧ量のいずれも週齢と共に増加している。尿量、尿アルブミン排泄、尿中ＮＡＧ量のいずれも、ＴｇはＷＴに比べて増加している。
図５は腎臓にＨＥ染色を施し光学顕微鏡にて観察した結果を示す。Ｔｇでは、腎盂及び尿細管の拡張が認められる。
図６は腎臓にＰＡＳ染色を施し光学顕微鏡にて観察した結果を示す。ＴｇはＷＴに比べ４週で糸球体の肥大が認められ、１２週で硬化が認められる。
図７は３７週の糸球体を示す。Ｔｇでは明らかな糸球体硬化がみられる（図７ａ，ｂ，ｃ）。また糸球体肥大を定量的に調べると、４週から１２週で肥大が見られる（図７ｄ）。
図８は腎臓におけるコラーゲンタイプＩＶの蛍光染色の結果を示す。ＴｇではコラーゲンタイプＩＶの増加が認められる。
図９は、腎臓におけるコラーゲンタイプＩＶ、ラミニンの蛍光染色の結果を示す。Ａ、Ｂともに、左がＷＴ、右がＴｇ４０週の腎臓切片を示し、Ｃ、Ｄはそれぞれを判定した点数を示す。Ｔｇでは、コラーゲンタイプＩＶ、ラミニンの増加が認められた。
図１０：Ｔｇ２３系統（ｌｉｎｅ  Ｔｇ２３）の膵島の形態学（ｉｓｌｅｔ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）．
Ａ：生後０日（ｄａｙ０）から３６週齢（３６ｗｋ  ｏｆ  ａｇｅ）までの膵切片の抗インスリン（ｐｉｎｋ）及び抗グルカゴン（ｒｅｄ）抗体を用いた免疫組織化学染色。Ｔｇ：生まれたとき（ｄａｙ０）でさえすでにインスリン産生細胞（β細胞）が少なくなり、膵島（ｉｓｌｅｔ）は有意に増大したグルカゴン産生細胞（ｇｌｕｃａｇｏｎ＋）（ｒｅｄ）で組織が極度に乱れている（ｓｅｖｅｒｅｌｙ  ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）ようである。血糖の正常なｄａｙ０の時点でβ細胞がすでに激減していることから、これらの変化は高血糖の二次的作用によるものではなくＩＣＥＲＩγ増大に直接起因することを示す。
Ｂ：生後７日目（ｄａｙ７）のＴｇのインスリン産生細胞（矢印）の減少。（ｘ１０００）
Ｔｇではインスリンを産生しているβ細胞が減少しており、産生している細胞においても細胞あたりのインスリン量にばらつきが大きい。
Ｃ：生後７日目の膵島をグルカゴン（緑）とβ細胞マーカーのＩＡＰＰ（赤）での二重染色（ｄｕａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）の共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析（ｘ１０００）
Ｔｇではグルカゴン産生細胞が異常に多く見られ（Ａの結果）、また産生量がＷＴの約２倍に増加している。これは、インスリン産生細胞が激減し、膵島の形が保てなくなり配列が乱れ、グルカゴン産生細胞が増加したものと考えられる。
ＩＡＰＰはインスリン産生細胞で産生され、β細胞のマーカーとして用いた。β細胞のマーカーとして一般にはインスリンを用いるが、Ｔｇでは、インスリンが少ないため、β細胞が存在していてもインスリン抗体では染まらないため、インスリン以外のβ細胞のマーカーでβ細胞の存在を確認した。
Ｄ：生後７日目のインスリン産生細胞（矢印）のｓｃａｔｔｅｒｅｄ  ｓｉｎｇｌｅｔ／ｄｏｕｂｌｅｔ。Ｔｇでもβ細胞の新生は正常に起こっていることが確認された。（ｘ４００）
このマウスでは、インスリン遺伝子の転写が阻害されインスリンが激減した事に加え、インスリンを産生するβ細胞自身も少なくなった結果、正常な血糖値を保つことができなくなり高血糖値になったと考えられる
図１１：Ｔｇ２３系統（ｌｉｎｅ  Ｔｇ２３）のｄａｙ７での膵島の発現及び増殖
Ａ：生後７日目の膵島（ｉｓｌｅｔ）をインスリンとＫｉ６７でのｄｕａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇをｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙで分析したもの
生後７日目はもっともβ細胞の新生・増殖が盛んなときであるので、増殖マーカーであるＫｉ６７（緑：核）が発現してくるはずであるが、Ｔｇではインスリン産生細胞であるβ細胞（赤）にＫｉ６７の発現を一切認めなかった
Ｂ：生後７日目の膵島をサイクリンＡで染めたもの
生後７日目はもっともβ細胞の新生・増殖が盛んなときであるので、ＤＮＡ合成に重要であるサイクリンＡ（緑）が発現してくるはずであるが、ＴｇではサイクリンＡの発現が減少していた。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた。そして、インスリン転写が阻害されたトランスジェニックマウスを作製し、鋭意検討を行った結果、該トランスジェニックマウスが、ヒト腎症と類似した症状を発症することを見出し、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の事項に係る。
１．転写因子ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードすることを特徴とする腎症関連遺伝子。
２．インスリン転写抑制因子がＣＲＥＭα、ＩＣＥＲＩ及びＩＣＥＲＩγからなる群から選ばれるいずれか１つである項１に記載の遺伝子。
３．インスリン転写抑制因子がＩＣＥＲＩγである項１に記載の遺伝子。
４．配列番号１で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる項１の遺伝子。
５．配列番号２で表される塩基配列、その相補配列又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、腎症を発症させることができる項１の遺伝子。
６．腎症が糖尿病性腎症である項１に記載の遺伝子。
７．前記遺伝子がヒト由来である項１に記載の遺伝子。
８．項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む腎症発症剤。
９．項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を含む糖尿病性腎症発症剤。
１０．項７に記載の遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な１５塩基以上のヌクレオチド配列からなるヒト腎症判定乃至診断用プローブ。
１１．転写因子ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有する腎症関連蛋白質。
１２．ＣＲＥＭα、ＩＣＥＲＩ及びＩＣＥＲＩγからなる群から選ばれるいずれか１つである項１０に記載の腎症関連蛋白質。
１３．ヒト由来である請求項１１に記載の蛋白質。
１４．項１１〜１３のいずれかに記載の蛋白質又はその部分に特異的に結合する抗体。
１５．ヒト腎症関連蛋白質と特異的に結合する項１４に記載の抗体。
１６．項１５に記載の抗体を含有するヒト腎症診断薬。
１７．項７に記載のヒト腎症関連遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ。
１８．項１５に記載の抗体または項１７に記載のアンチセンスＤＮＡを有効成分とする腎症予防乃至治療薬。
１９．項１０に記載のプローブまたは項１２に記載の抗体を用いて、検体における項７に記載のヒト腎症関連遺伝子の発現レベルを調べる工程を有する腎症の判定又は診断方法。
２０．項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を導入してなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
２１．腎症を発症する項２０に記載の哺乳動物。
２２．前記腎症が糖尿病性腎症である項２１に記載の哺乳動物。
２３．糖尿病を発症する項２０に記載の哺乳動物。
２４．前記糖尿病が糖尿病性腎症を併発する項２３に記載の哺乳動物。
２５．項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を導入する工程を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製方法。
２６．項２０〜２５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種に対して被検物質が与える影響を測定する工程を有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防乃至治療薬のスクリーニング方法。
２７．項７に記載のヒト腎症関連遺伝子のプロモーターの制御下にマーカー遺伝子を組み込んでなる、哺乳類細胞で安定発現可能な発現ベクター。
２８．項２７に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
２９．哺乳類細胞がヒト細胞である項２８に記載の方法。
３０．項２８または２９に記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記マーカー遺伝子の発現量を測定する工程を含むヒト腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防ないし治療薬のスクリーニング方法。
３１．項２６または３０に記載のスクリーニング方法によって得られる物質を有効成分として含有する腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の予防ないし治療薬。
以下、本発明について、より詳細に説明する。
腎症関連遺伝子
本願発明に係る遺伝子は、転写調節因子（ｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＥ））に結合してインスリン遺伝子の転写を調節する因子ＣＲＥＭ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）のファミリーに属するインスリン転写抑制因子をコードする。本発明者は、該遺伝子が腎症の発症機序や腎症の病状の進行等に関連していることを明らかにした。
転写因子ＣＲＥＭのファミリーに属するインスリン転写抑制因子としては、例えば、ＩＣＥＲＩ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃＡＭＰ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  Ｉ），ＩＣＥＲＩγ，ＣＲＥＭα等が挙げられる。このうち、ＩＣＥＲＩγが、特に有用である。
本願発明の腎症関連遺伝子には、マウス由来の遺伝子（配列番号１、２など）の他に、ヒト、ラット、サル、イヌ、ウサギ、ハムスター、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来の腎症関連遺伝子が広く包含され、これらの遺伝子或いはその相補鎖又はそれらとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドが包含される。特に、マウス由来の遺伝子は、トランスジェニックマウスの作製に有用であり、ヒト由来の遺伝子は、ヒトの腎症の診断または将来的に腎症になる可能性の評価、ヒトの腎疾患治療薬の探索に有用である。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件とは、通常、「１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７℃」程度であり、好ましくは「０．５ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，４２℃」程度であり、更に好ましくは「０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡは、例えばマウス由来の腎症関連遺伝子の場合、配列番号１又は２に記載の塩基配列により表わされるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。さらに、ハイブリダイゼーションによって得られるＤＮＡ或いは該ＤＮＡによりコードされる腎症関連蛋白質は、腎症を発症させる作用を有する。
ＣＲＥＭファミリーである転写抑制因子は、インシュリン転写活性の調節因子であって、該因子が過剰に発現すると、インシュリンの産生が低下し、糖尿病様の症状が発症する。本発明者は、該因子の発現によって、糖尿病様の症状だけでなく、腎症が発症することを明らかにした。該因子の高発現によって腎症が導かれるということは、該因子及び該因子をコードする遺伝子が、腎症の発症や症状の進行等の機序に深く関与していることを示唆するものである。
このような性質を有する本発明の腎症関連遺伝子は、腎症の発症機序や進行の解明、更には、腎症患者の症状の解明などに寄与するものであり、腎症発症用、腎症解析用、腎症検出用、腎症診断用などとして有用に用い得るものである。
特に、本発明の遺伝子を高発現させると、糖尿病性腎症を発症させることから、糖尿病性腎症発症用、糖尿病性腎症解析用、糖尿病性腎症検出用、糖尿病性腎症診断用などとして有用に用い得るものである。
本発明の遺伝子は、宿主となる哺乳動物中で高発現するプロモーターの制御下に、必要に応じてベクター等に組み込み、腎症発症剤乃至糖尿病性腎症発症剤として利用できる。該腎症発症剤乃至糖尿病性腎症発症剤は、例えば、糖尿病性腎症発症モデル動物の作成などに利用することができる。
本発明の腎症関連遺伝子は、該遺伝子を高発現させると腎症（特に糖尿病性腎症）を発症させるが、腎症以外の糖尿病合併症（血管障害、網膜症、神経障害など）を同時に発現させる可能性がある。特に神経障害については、ＳＴＺ（ストレプトゾトシン）誘発糖尿病モデルでもみられることから、本発明のトランスジェニックマウスでも起きている可能性が高いと考えられる。
腎症関連遺伝子とそのＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号を以下に例示する：
ＡＪ３１１６６７，ＡＪ２９２２２２（ｍｏｕｓｅ  ＩＣＥＲＩ）；
Ｓ６７７８６（ｍｏｕｓｅ  ＩＣＥＲＩｒ）；
ＡＢ０３１４２３（ｒａｔ  ＣＲＥＭ１７Ｘ）
Ｓ６６０２４（ｒａｔ  ＩＣＥＲＩＩ）
Ｕ４４８３６（ｈｕｍａｎ  ＩＣＥＲＩ）
Ｓ６８２７１，Ｚ１５１５９，Ｚ１５１５８（ｈｕｍａｎ  ＣＲＥＭ）
Ｕ０４８３５（ｒａｔ  ＣＲＥＭ）
Ｍ６０２８５（ｍｏｕｓｅ  ＣＲＥＭ）
本発明の腎症関連遺伝子は、これらに限定されず、ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子を広く包含し、さらにこのようなインスリン転写抑制因子とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る改変体を包含する。
本発明の腎症関連遺伝子は、全身で発現させることもできるが、膵臓、腎臓などの臓器、好ましくは膵臓、より好ましくは膵臓のランゲルハンス島細胞で選択的に発現させるのが好ましい。例えば、膵臓のランゲルハンス島細胞での選択的な発現は、腎症関連遺伝子をインスリンプロモーターの制御下に発現させればよく、他の部位／臓器での選択的発現は、発現部位／臓器で選択的に発現される遺伝子のプロモーターの制御下に本発明の腎症関連遺伝子をおけばよい。
例えば、膵臓で発現させる場合、インスリンプロモーターの他に、グルカゴン、消化酵素（トリプシン、キモトリプシン、ペプシンなど）などの膵臓で選択的に発現するのプロモーターに連結させても腎症（糖尿病性腎症を含む）及び糖尿病モデルの作製に有用であると考えられる。
本発明の腎症関連遺伝子を高発現させると、コラーゲンＩＶとラミニンが増加し、これらの現象は、糸球体の硬化を示している。糸球体が硬化すると、濾過能力（ＧＦＲ）が落ちて腎機能傷害がおき、腎不全、最終的には尿毒症になる。また、これに付随して血管内圧も上昇し、高血圧になる。従って、本発明の腎症関連遺伝子を高発現させると、これらの各種腎疾患の病態のモデルを作製できる。
プローブ
本発明のプローブは、上記本発明の遺伝子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な１５塩基以上の配列、特に本発明の遺伝子又はその相補鎖と相補的なヌクレオチド配列よりなるものであって、腎症判定乃至診断用等の腎症に関連する事項を調べる目的等に有用に用い得るものである。また、腎症解析用、腎症検出用などとしても用いることができる。本発明のプローブは、特に糖尿病性腎症判定乃至診断用として好適に用いることができる。
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、該プローブはヒトの腎症診断の対象となるヒト腎症関連遺伝子の配列の一部を有するものである。
本発明のプローブは、適当な標識を付与し、疾患マーカーとして利用することもできる。
本発明のプローブ又は疾患マーカーは、検体試料に接触させて、プローブと結合する遺伝子またはその発現産物（ｍＲＮＡ）の有無や量を測定する工程等に用いることによって、腎症乃至糖尿病性腎症の発症の有無や進行度の判断などの腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至判定に有効に用いることができる。
蛋白質
本発明の蛋白質は、転写因子ＣＲＥＭファミリーに属するインスリン転写抑制因子活性を有し、腎症に関連した機能を有する。具体的には、該蛋白質は腎症の発症や進行、症状の進展等に関する機能を有する。本発明の蛋白質は、腎症のうち、特に糖尿病性腎症に関連した機能を有している。
インスリン転写抑制因子としては、例えば、ＣＲＥＭα、ＩＣＥＲＩ及びＩＣＥＲＩγなどが挙げられる。このうち、ＩＣＥＲＩγが特に有用である。
本発明の蛋白質を取得する方法は特に限定されないが、例えば、以下のような方法で得ることができる。
本発明の遺伝子、例えば、配列番号１又は２に記載の配列を有する遺伝子を、適当なプロモーターの下流に連結される形でベクターに挿入し、発現ベクターを構築する。ついで得られた発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作成する。ベクターとしては、例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター、バキュロウィルスベクターなどを用いることができる。宿主としては、例えば、菌類、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞などを用いることができる。
作成した形質転換体を培養し、培養物中に生成蓄積する蛋白質を採取することによって、本発明の腎症関連蛋白質を得る。生産された蛋白質は、公知の精製方法、例えば、無機塩類による塩析、有機溶媒による分画沈殿、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過法、免疫沈降法などの公知の精製技術を用いることによって、分離精製することができる。また公知の方法で適宜製剤化することもできる。
本発明の蛋白質は、腎症の発症や進行の機序との強い関連性を有すると考えられ、腎症の診断や、腎症の発症機序の解析、腎症の悪性度の判定などに有効に利用することができる。
抗体
本発明の抗体は、上記本発明の腎症関連蛋白質またはその一部と特異的に結合する抗体であって、腎症関連蛋白質を検出又は測定しうるものであり、腎症関連蛋白質検出用、腎症診断用、腎症検出用又は腎症判定用、腎症治療用などとして有用に用い得るものである。本発明の抗体は、腎症のうち、特に糖尿病性腎症に対し、好適に用いることができる。
本発明の蛋白質又はその一部と特異的に結合し得るものであれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよい。
モノクローナル抗体は、例えば、次のように製造される。本発明の蛋白質又はその部分ペプチドを抗原として免疫された非ヒト哺乳動物、例えばマウスから、抗体価の認められる個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を探取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製する。該ハイブリドーマを培養して、抗体を産生し、適宜分離精製を行うことによって、モノクローナル抗体を得ることができる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）やその変法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ，３９，２８５，１９８０、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８，４３７，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ，２８５，４４６，１９８０）に従い、実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルス等が用いられる。また、本発明のモノクローナル抗体を適宜公知の方法を用いてヒト化抗体として用いてもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、次のように作成できる。蛋白質抗原自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、モノクローナル抗体の製造方法と同様に非ヒト哺乳動物に免疫を行う。該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより、得ることができる。
本発明の抗体を用いることにより、腎症関連蛋白質の検出または測定を行うことができる。また、本発明の抗体を利用して、腎症（糖尿病性腎症を含む）の検出、判定又は診断等を行うことができる。例えば、検体から調製した試料に、本発明の抗体を接触させ、腎症関連蛋白質の発現量や存在する部位を検出乃至測定することによって、腎症の発症や重症度、予後の判定や診断などを行うことができる。特に、腎症のうち、糖尿病性腎症に対し、有用に利用できる。
また、本発明の抗体は、適宜製剤化して、腎症診断薬や検出乃至判定薬、または腎症の予防乃至治療薬等として用いることもできる。腎症診断薬は、例えば、腎症関連蛋白質に関する検出乃至測定を行う医薬などとして利用できる。また、腎症の予防乃至治療薬は、例えば、腎症関連蛋白質の発現又は機能を抑える医薬などとして利用できる。本発明の抗体を含有する医薬は、特に、糖尿病性腎症の診断薬、または、糖尿病性腎症の予防乃至治療薬として、有用に利用できる。
予防または治療剤
本発明の腎症関連遺伝子は、腎症、特に糖尿病の合併症としての腎症を発症させることができる。従って、該遺伝子の発現ないし機能を抑制する物質は、腎症の予防ないし治療剤だけでなく、糖尿病性腎症の予防ないし治療剤、さらには糖尿病の予防ないし治療剤としても有用である。
腎症関連遺伝子の発現ないし機能抑制剤、該遺伝子のアンチセンスＤＮＡ、腎症関連蛋白質に対する抗体などは、腎症、糖尿病性腎症、糖尿病の予防ないし治療剤として有用であり得る。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明におけるトランスジェニック非ヒト哺乳動物とは、上記本発明の遺伝子を導入し、遺伝子組換えにより作成した、ヒト以外の哺乳動物のことをいう。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ウサギ、ラットなどが挙げられる。
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成する方法としては、例えば、位相差顕微鏡下で前核期卵子の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法、レトロウィルスベクターまたはアデノウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵子に感染させる方法、または、精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法などが挙げられる。
本発明の１つの好ましい実施形態において、腎症関連遺伝子（例えばＩＣＥＲ、ＩＣＥＲＩγ）のトランスジェニックマウス（Ｔｇマウス）は、該遺伝子を膵臓のβ細胞に特異的に過剰発現させる。その結果、高血糖に起因して糖尿病になり、それが原因で腎症、即ち、純粋な糖尿病性腎症を引き起こすことができる。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症に特徴的な以下の症状を示す。
１）尿量、尿中アルブミン量、及び尿中ＮＡＧ量が大量になる；
２）腎盂の肥大を示す；
３）腎細管の拡大を示す；
４）糸球体の初期の肥大と繊維化、その後の硬化が観察される。
更に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、重度の糖尿病に特徴的な、以下の症状も示す。
５）多飲；
６）多尿；
７）低体重；
８）高血糖；
９）低インスリン。
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルでの最も重要な症状は、１）の尿中アルブミン量の増大と２）〜４）の症状（腎盂の肥大、腎細管の拡大、糸球体の初期の肥大と繊維化、その後の硬化）である。これまでの糖尿病モデルでは尿量の増加は認められたものの、蛋白尿は認められていなかった。唯一ダブルトランスジェニックマウスで認められていますが、実際の糖尿病の状態とはかけ離れていると考えられ、特に糖尿病の合併症としての糖尿病性腎症の症状（蛋白尿や糸球体硬化）を示すモデルは本発明により初めて提供された。
従って、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症モデル動物だけでなく糖尿病モデル動物として有用に利用し得るものである。
特に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトの糖尿病性腎症によく類似した症状を発症していることから、糖尿病性腎症モデル動物として、有用である。例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて、腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、候補物質の適切な投与量や投与時期、副作用などを調べることもできる。
スクリーニング
本発明を適用すれば、腎症乃至糖尿病性腎症診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを効率よく行うことができる。
例えば、上記本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被検物質を投与し、該哺乳動物の腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種に対して被検物質が与える影響を測定することによって、腎症、糖尿病性腎症及び糖尿病からなる群から選択される少なくとも１種の診断乃至治療薬の候補物質のスクリーニングを行うことができる。
また、ヒト転写抑制因子、例えばヒトＩＣＥＲＩγのプロモーター、及び、該プロモーターにより発現され得るよう連結されたレポーター遺伝子を含むベクターにより形質転換されたヒト形質転換細胞株の培養系に、被検物質を添加し、レポーター遺伝子の発現を指標として、腎症乃至糖尿病性腎症、糖尿病の治療に有効な物質のスクリーニングを行うこともできる。
これらのスクリーニング方法によって得られた物質を有効成分として、適宜製剤化、又は適当な薬学的許容担体と組み合わせて調製することにより、腎症乃至糖尿病性腎症の治療剤乃至診断薬を作成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。
【実施例１】（１）材料及び手順
ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスの作製
ＩＣＥＲＩγｃＤＮＡを、トランスジェニックプラスミドｐｌｎｓ−１のヒトインスリンプロモーター下流に挿入した。トランスジーンカセット（ｐｌｎｓ−ＩＣＥＲＩγプラスミド）は制限酵素によって切り出し、精製し、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣ５７ＢＬ／６マウス（純Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の受精卵に導入した。トランスジェニックマウス（Ｔｇ）は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｔａｉｌ  ＤＮＡのＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）解析により確認した；
ｈｕｍａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，５’−ＡＴＧＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＣＣＡＧ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１
ｒａｂｂｉｔ  β  ｇｌｏｂｉｎ，５’−ＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ１）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２
５’−ＧＣＴＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ２）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３
ＩＣＥＲＩγ，５’−ＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＡＣＡＧＣＣＡＴ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ１）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４  ａｎｄ
５’−ＣＴＧＣＴＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＡＡＧＧ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ２）；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５。
トランスジーンのコピー数は、サザンブロット法にて検討した。すべての実験においてトランスジェニックマウスでない同腹子（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ；ＷＴ）を使用した。すべてのマウスは京都大学動物施設指針に従って扱った。
血糖値、血中パラメーター、血圧、ＨｂＡ１ｃの測定
血糖値は尻尾より得た全血でｅｎｚｙｍｅ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ法により測定した。血は麻酔下で膵島を単離する前にすばやく心臓より探取した。
インスリン、ケトン、グルカゴンは、以下のＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて測定した。
インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）：ＭＯＲＩＮＡＧＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、
ケトン体（ｋｅｔｏｎｅ）：Ｓａｎｗａ  Ｋａｇａｋｕ、
グルカゴン（ｇｌｕｃａｇｏｎｓ）：Ｙａｎａｉｈａｒａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．
血圧は、Ｔａｉｌ  ｃｕｆｆ  ｍｅｔｈｏｄを用いて測定した。
ＨｂＡ１ｃはＤＣＡ  ２０００  ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。
膵島の単離、インスリン分泌、コンテント
膵島はコラゲナーゼ法によって単離した。インスリン分泌能、インスリンコンテント及びＤＮＡコンテントは、１２週齢のＴｇ（ｎ＝５）およびＷＴ（ｎ＝５）から単離されたフレッシュな膵島を用いてバッチインキュベーション法（ｂａｔｃｈ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）、ＲＩＡ，フルオロメトリックアッセイ（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）によって測定した。
ＲＮＡ単離、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは１０週齢のＴｇ（ｎ＝１０）とＷＴ（ｎ＝１０）からフレッシュに単離された膵島からＴＲＩＺＯＬ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて抽出した。Ｔｏｔａｌ  ｉｓｌｅｔ  ＲＮＡの存在は電気泳動によって確認した。１本鎖ｃＤＮＡはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを用いてｔｏｔａｌ  ｉｓｌｅｔ  ＲＮＡから合成した。トランスジーンから発現されるＩＣＥＲＩγｍＲＮＡの発現はマウスｉｓｌｅｔ  ｃＤＮＡと以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ法にて検討した。
ｒａｂｂｉｔ  β  ｇｌｏｂｉｎ；５’−ＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）ａｎｄ  ＩＣＥＲＩγ；５’−ＣＴＧＣＴＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＡＡＧＧ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）、
コントロールβ−ａｃｔｉｎ；５’−ＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６），
５’−ＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７）。
これらのプライマーはゲノムＤＮＡとｍＲＮＡを区別するためにまたＲＮＡ準備段階でＤＮＡがコンタミしていないかどうか確認することができるように遺伝子のイントロンをまたぐようにデザインされている。イントロンを含むＴｇゲノムＤＮＡとトランスジーンをもたないＷＴ  ｉｓｌｅｔ  ｃＤＮＡをコントロールとして使用した。ＰＣＲ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓは４０ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  ９４℃ｆｏｒ１５ｓ、５５℃ｆｏｒ１５ｓ、７２℃ｆｏｒ３０ｓ、７２℃ｆｏｒ  ５ｍｉｎであった。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
ウェスタンブロッティング
Ｔｇの膵島においてＩＣＥＲ蛋白の発現を検討するためにウェスタンブロッティングを行った。１０週齢のＴｇ（ｎ＝３）とＷＴ（ｎ＝３）から単離した膵島を細胞溶解液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％ＳＤＳ，２２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％Ｔｒａｓｉｌｏｌ）の中でつぶし、遠心法によって不溶解物を除いた後、上清（３０μｇ）を４−２０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに泳動し、トランスバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９０ｍＭグリシン，２０％メタノール）中でポリビニリデンジフルオリドメンブレン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）にトランスファーした。メンブレンは５％スキムミルク含有リン酸緩衝液（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）でブロッキングし、抗ＣＲＥＭ抗体（ｄｉｌｕｔｅｄ  ｔｏ  １：２５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で２時間３７℃でインキュベートした。続けて２次抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ（ｈｏｕｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で３０分３７℃でインキュベートした。これらのそれぞれのステップでは５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／リン酸緩衝液で１０分３回ずつ洗った。検出は、ＥＣＬプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って行った。
ノーザンブロッティング
Ｔｏｔａｌ  ｉｓｌｅｔ  ＲＮＡ（２０μｇ）を１ｘＭＯＰＳ（５ｘＭＯＰＳ：０．１Ｍ  ＭＯＰＳ，４０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ），６．７％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）及び５０％ホルムアミド（ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）の液中で５５℃１５分ｄｅｎａｔｕｒｅした後に、１．２％ホルムアルデヒドアガロースゲル（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）で電気泳動し、メンブレンにブロッティングした。６５℃で１時間プレハイブリした後、ラットインシュリンｃＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリ、ハイブリダイゼーションともに６５℃で５ｘ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｓｏｄｉｕｍｕｃｉｔｒａｔｅ（ＳＳＣ），０．１％ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ液中で行った。メンブレンは６５℃で０．１ｘ  ＳＳＣ  ａｎｄ  ０．１％  ｓｏｄｉｕｍｓ  ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ液で２回３０分洗った。プローブのラベリングとデテクションはＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。
尿量、尿中アルブミン量、尿中ＮＡＧ量
上記のように作成した４週齢から３６週齢のマウスを個々のｍｅｔａｂｏｌｉｃケージに飼い、２４時間畜尿を行った。畜尿中はマウスが自由に餌と水を得ることができるようにした。尿中アルブミン量と尿中ＮＡＧ量の測定はそれぞれＡｌｕｂｕｗｅｌｌ  ｋｉｔ（Ｅｘｏｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．），ＮＡＧ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）を使用した。
組織学的検討
（Ｉ）腎臓（半分）をメチルカルノイ液で固定後、パラフィン包理を行い、ミクロトームにて２μＭに薄切した。その標本に、ＰＡＳ、ＰＡＭ染色後を施し、光学顕微鏡にて観察した。残りの腎臓片は蛍光染色に供した。
糸球体面積はＰＡＳ染色検体を用いて解析した。硬化指数はＰＡＭ染色検体をスコア化して（スコア０−３：０＝染色なし、１＝３分の１以上、２＝３分の１から３分の２、３＝３分の２以上）測定した。
蛍光染色においては、組織をただちにＯＣＴコンパウンドに包理し、アセトン−ドライアイスにて凍結した。このブロックをクライオスタットにて３．５μＭに薄切した。１次抗体はウサギポリクローナル抗マウス（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）コラーゲンタイプ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）およびウサギポリクローナル抗マウス（ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）コラーゲンタイプＩＶ（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）を使用した。２次抗体はＦＩＴＣ標識ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を使用した。
（ＩＩ）取り出した腎臓と膵臓の一部はカルノイ固定あるいは１０％フォルマリン固定した後パラフィン包埋した。残りは冷アセトン固定の後、ＯＣＴ包埋にて凍結切片（４μｍ）にした。一部の腎臓切片（３μｍ）はＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色に用いた。それぞれの週齢において６〜８個の腎臓を用いて盲検法により形態学的検討を行った。免疫染色は以下の１次抗体を用いて行った；
抗ＩＣＥＲＩγ抗体（１：５００；Ｄｒ．Ｊ．Ｆ．Ｈａｂｅｎｅｒより提供された，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＭＡ）；抗インスリン抗体（１：５００；ＤＡＫＯ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）；抗コラーゲンＩ抗体（１：５０；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；抗コラーゲンＩＶ抗体（１：２５０；Ｐｒｏｇｅｎ）；及び、抗ラミニン抗体（１：１００；Ｓｉｇｍａ）。
１次抗体はＦＩＴＣ標識２次抗体あるいはテキサスレッド標識２次杭体（１：２００）で蛍光検出した。またビオチン標識の２次抗体で検出後、ＤＡＢで染色を行った。染色切片は共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ４１０）で撮影した。糸球体におけるコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニンの発現は盲検法により半定量的に検討した。判定には以下の点数を用いた；０＝正常、１＝変化が糸球体内の２５％以下、２＝変化が２５−５０％、３＝変化が５０−７５％、４＝変化が７５％以上。
（２）データ解析
上記のデータは平均±標準誤差（ＳＥ）で表示した。統計学的比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。Ｐ値は０．０５未満を有意差があるものと考えた。
（３）評価
トランスジェニックマウスにおけるＩＣＥＲＩγ発現
上記方法で作成したＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスを用いて、ＩＣＥＲＩγ過剰発現による影響を評価した。用いたコンストラクトを図１ａに示す。評価には、Ｔｇ７、Ｔｇ１２及びＴｇ２３の３系のトランスジェニックマウスを使用した。ＩＣＥＲ  ｍＲＮＡの存在は、ｒａｂｂｉｔ  β  ｇｌｏｂｉｎ及びＩＣＥＲＩγ特異的オリゴヌクレオチドに特異的な配列を増幅してＲｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）で確認した。トランスジーンから転写されたＩＣＥＲＩγｍＲＮＡに対応する、イントロンがスプライスされたＰＧＲ産物が、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスで検出された（図１ｂ参照）。イントロンを含むＴｇゲノムＤＮＡと、フラグメントを含まないワイルドタイプマウス（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｍｉｃｅ（ＷＴ））ｉｓｌｅｔ  ｃＤＮＡをコントロールとして使用した。またＩＣＥＲＩγ蛋白発現を抗ＣＲＥＭ抗体で確認した。ＣＲＥＭ抗体がＩＣＥＲを認識することは既に報告されている。ウェスタンブロットを行った結果、トランスジェニックマウスにＩＣＥＲＩγが過剰発現していることがわかった（図１ｃ参照）。更に、１０週齢のＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスとＷＴコントロールから抽出したｔｏｔａｌ  ｉｓｌｅｔ  ＲＮＡを使用して、インシュリンｍＲＮＡの発現レベルを解析した。ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスのインシュリンｍＲＮＡの発現量はコントロールと比べて明らかに低かった（図１ｄ参照）。
インシュリンｍＲＮＡのダウンレギュレーションとＩＣＥＲＩγ高発現が対応していることは、ＩＣＥＲＩγがインシュリンの転写活性の抑制に関与していることを示唆するものである。
さらに、インスリン産生細胞（β細胞）は、ｄａｙ０では既に少なくなっており、β細胞の減少はＩＣＥＲＩγが直接の原因である（図１０Ａ〜Ｄ）。
Ｔｇでは、β細胞に過剰発現したＩＣＥＲＩγがｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅの中のＤＮＡ合成期に重要な働きをするサイクリンＡの発現を抑制し、β細胞の増殖が抑制されることによりβ細胞数が減少したものと考えられる（図１１）。
ＩＣＥＲＩγ高発現の影響
ＩＣＥＲＩγ高発現の影響を評価するために、血中パラメーターを測定した。ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスは重度の糖尿病を発症した。ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスの血糖レベルは、０日目は標準であったが、７日目では著しく増加しており、更に、２週齢でも増加しており、その後も高いレベルを示した（図２ａ及びｂ参照）。血漿インシュリン濃度は著しく低く、６週目ではコントロールの５分の１にすぎなかった（図２ｃ参照）。血中ケトンレベルは、６週目及び１２週目で著しく高く、更に死亡前まで増加した（図２ｄ参照）。血漿グルカゴンレベルも著しく高かった（図２ｅ参照）。トランスジェニックマウス（Ｔｇ）では、ＩＣＥＲＩγの発現、およびインスリン産生細胞数の減少が認められた（Ｆｉｇ．２ｆ）。
０日目と７日目の体重はコントロールと同様であったが（図３ｂ参照）、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスの体重は増加せず、８週齢後にわずかな増加を示した（図３ａ及び３ｃ参照）。
次いで、３系のトランスジェニックの雄と雌について、血漿パラメーターと体重を比較した。結果を表１に示す。
2004072282.tif 000003
トランスジーン陽性の３系のＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウス（Ｔｇ７，Ｔｇ１２およびＴｇ２３）を確立した。結果は、各群少なくとも１０動物の平均±ＳＥで表す。１２週齢の雄と雌のどちらにおいても、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスのみが低インシュリンと高血糖を示した。Ｔｇ７及びＴｇ１２は、Ｔｇ２３とは異なるコピー数のトランスジーンを含有しているが、体重、血糖レベル、インシュリンレベルにおいて意味のある差異は見られなかった。これらの結果は、ＩＣＥＲＩγの特異的な高発現と重度の糖尿病の症状との間に強い関連があることを示すものである。
腎臓への影響
更に、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウス（Ｔｇ）における腎臓への影響を評価した。尿量の変化を調べたところ、Ｔｇでは多尿を呈していた（図４ａ）。また、尿中アルブミンの排泄量を調べたところ、Ｔｇでは、週齢に従って蛋白尿が増加していた（図４ｂ）。また、尿細管障害のマーカーである尿ＮＡＧを解析したところ、Ｔｇでは週齢と共に増加していた（図４ｃ）。このように、Ｔｇの尿量、尿中アルブミン量、尿中ＮＡＧ量を測定した結果、いずれも、ＷＴ（コントロール）に比べて極めて大量であった。
更に、２８週齢のＷＴとＴｇについて、比較して解析を行った。比較した結果を表２に示す。
2004072282.tif 000004
表２中、＊はＰ＜０．０５で有意であることを示す。
Ｔｇのグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）量は、ワイルドタイプ（ＷＴ）に比べて著しく増加していた。血圧は、Ｔｇの方がＷＴに比べて低くなっていた。また、ＴｇはＷＴに比べて低体重となっているにも関わらず、腎臓の体重に対する比重（Ｋｉｄｎｅｙ／ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ（％））は、ＴｇがＷＴよりもかなり大きくなっていた。
更に、ＩＣＥＲＩγトランスジェニックマウスの腎臓に関し、組織学的な検討を行った。その結果、腎の腫大や腎盂や尿細管の拡張が見られた（図５）。Ｔｇマウスでは、糸球体は４週齢で肥大し（図６）、１２週齢で硬化が認められた。３７週齢では、Ｔｇでは明らかな糸球体硬化がみられた（図７ａ，ｂ，ｃ）。糸球体肥大を定量的に調べると、４週から１２週で肥大が見られた（図７ｄ）。また繊維化を示すコラーゲンタイプＩＶ、ラミニンの増加がみられた（図８、９）。
これらはヒトの糖尿病性腎症とよく似た症状であり、本発明が、腎症になりにくいｓｔｒａｉｎ（Ｃ５７ＢＬ／６）の初の糖尿病性腎症モデルマウスとして有用であることを示すものである。
本発明の遺伝子又は蛋白質を利用することによって、腎症、特に糖尿病性腎症の診断乃至治療を有効に行うことができる。例えば、本発明の遺伝子に基づくプローブや本発明の蛋白質に結合する抗体を用いることによって、腎症乃至糖尿病性腎症の発症の診断乃至判定や発症機序の解明等を行うことができる。
また、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、腎症、特に糖尿病性腎症とよく似た症状を発症していることから、腎症、特に糖尿病性腎症の適正な評価モデルとして有効に利用し得る。
更に、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物等を用いれば、腎症乃至糖尿病性腎症の判定乃至診断や、若しくは腎症乃至糖尿病性腎症の予防乃至治療薬の有効成分のスクリーニング等を効率よく行うこともできる。
本発明は、腎症乃至糖尿病性腎症の診断乃至治療において、極めて優れた手段を提供するものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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