(57)【要約】本発明はアンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）またはＡｎｇ１をコードするベクターを投与する工程を含む、虚血疾患の治療方法を提供する。また本発明は、Ａｎｇ１を含む虚血疾患治療キットを提供する。Ａｎｇ１を発現するベクターを作製し、ラット心筋梗塞急性期にベクターを心筋内に単独投与してＡｎｇ１を心筋局所で発現させた。その結果、梗塞後死亡率の低下、心筋での血管数の増加、心筋梗塞巣の縮小、および心機能の改善などの顕著な効果が得られることが判明した。Ａｎｇ１の血管形成作用に必要なＶＥＧＦを投与する必要はなかった。さらに、動脈結紮により誘導した重症虚血肢モデル動物にＡｎｇ１発現ウイルスベクターを単独投与したところ、顕著な救肢効果が得られることが判明した。Ａｎｇ１遺伝子治療は、虚血性心疾患および四肢虚血などの虚血疾患に対する安全かつ効果的な治療法として優れている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターを投与する工程を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法。
【請求項３】
アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターが、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターがｎａｋｅｄ  ＤＮＡ（裸のＤＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターが、ＣＡプロモーターあるいはＣＡプロモーターと同等またはそれ以上の転写活性を有するプロモーターによりアンギオポエチン−１の発現を駆動するベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターの投与が心筋への注入である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
虚血疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターを投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の虚血疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法。
【請求項１１】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターの投与が虚血部位への注入である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
アンギオポエチン−１をコードする外来遺伝子を有する、遺伝子改変された間葉系細胞。
【請求項１５】
アンギオポエチン−１をコードするアデノウイルスベクターが導入されている、請求項１４に記載の間葉系細胞。
【請求項１６】
アンギオポエチン−１をコードするマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが導入されている、請求項１４に記載の間葉系細胞。
【請求項１７】
請求項１４に記載の間葉系細胞および薬学的に許容される担体を含む虚血治療組成物。
【請求項１８】
遺伝子改変された間葉系細胞の製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを間葉系細胞に接触させる工程を含む方法。
【請求項１９】
遺伝子がアンギオポエチン−１をコードする、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はアンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１；Ａｎｇ１）またはＡｎｇ１をコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法に関する。また本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを含む虚血疾患治療キットに関する。
【背景技術】  急性の損傷または動脈閉塞による虚血は、ときに四肢脱落、機能障害、または死をもたらす重篤な疾患となる。特に急性心筋梗塞・重症狭心症などの虚血性心疾患は社会環境変化、老齢化社会の到来により急速に増加し、成人病のなかでも多くの比重を占めている。急性心筋梗塞に対する治療はＰＴＣＡ（経皮冠動脈形成術）・ＣＡＢＧ（冠動脈バイパス術）など外科的な血行再建術が主体である。これらの既存の治療法に加え血管再生を促進する遺伝子工学的手法を合わせることにより心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が可能となり得る。
これまで米国を中心に、その強い血管内皮増殖刺激作用から、血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）遺伝子・蛋白質を用いた冠動脈虚血（Ｌｏｓｏｒｄｏ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９８：２８００−２８０４；Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｔ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１００：４６８−４７４；Ｌａｔｈｉ，Ｋ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ．９２：１９−２５；Ｓｙｍｅｓ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．６８：８３０−８３６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ８３６−８３７）および重症虚血肢（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９７：１１１４−１１２３；Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．２８：９６４−９７３；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ９７３−９６５；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１３２：８８０−８８４）に対する血管新生療法臨床試験が進行中である。また現在のところ、ＶＥＧＦ遺伝子治療の虚血性心疾患に対する適応は重症狭心症に限られ、急性心筋梗塞はその対象とはなっていない。心筋梗塞などの急性虚血では梗塞後、短時間で心筋局所・末梢血白血球・単核球、マクロファージでのＶＥＧＦ産生が亢進し、循環ＶＥＧＦが極めて高い状態であることが明らかとなっている（Ｘｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１２１：７３５−７４２；Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７０：Ｈ１８０３−１８１１；Ｌａｄｏｕｘ，Ａ．ａｎｄ  Ｃ．Ｆｒｅｌｉｎ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：１００５−１０１０；Ｓｅｋｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ  ９２，４５３−４５４，１９９７；Ｂａｎａｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２８，１１７６−１１７９，１９９４；Ｂｅｒｓｅ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ，３，２１１−２２０，１９９２；Ｔａｉｃｈｍａｎ  ＮＳ，Ｊ  ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，６２，３９７−４００，１９９７）。このＶＥＧＦ産生亢進の生理的意義については不明な点も多いが、虚血部における血管保護・修復に働き虚血からの敏速な回復に寄与していると推測されている（Ｂａｎａｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２８，１１７６−１１７９，１９９４）。その一方で過剰なＶＥＧＦ投与は脆弱血管および未成熟血管を増加させ（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８６：２５１１−２５１４）、投与部位で血管腫形成を誘発する（Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｅ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．３５：１３２３−１３３０）。さらに心筋梗塞での高ＶＥＧＦ状態が肺水腫などを増悪させ、急性心筋梗塞での死亡率を増加させる可能性があることが最近Ｍａｔｓｕｎｏらに（Ｍａｔｓｕｎｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １００，２４８７，２００２）より報告され��いる。
【発明の開示】
本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法を提供する。また本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを含む虚血疾患治療キットを提供する。
強力な血管誘導作用を有することが知られるＶＥＧＦ１６５を心筋梗塞急性期にアデノウイルスベクターにより心筋局所で発現させたところ、生存ラットの梗塞心で血管誘導作用は確認されたものの、梗塞後４〜５日後の急性期死亡率増加が確認された。この死亡ラットを剖検したところ著明な４〜５ｍｌの胸水貯留が認められた（データ省略）。ＶＥＧＦが毛細血管透過性を亢進させることから、ＶＥＧＦ１６５投与による心筋梗塞後の肺血管透過性を検討したところ著明に増加していた（データ省略）。Ｍａｔｓｕｎｏらはα１−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎノックアウトマウスで心筋梗塞後高ＶＥＧＦ状態が誘導され肺水腫による死亡が増加することを報告している。本発明者らが行なった上記の実験においても、心筋梗塞後の高ＶＥＧＦ状態に加え、ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎしたＶＥＧＦ１６５が肺血管の透過性を亢進し肺水腫を誘発し死亡率を増大させたことが推定される。本発明者らは、より安全で有効な心筋梗塞遺伝子治療法を開発するため、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１；Ａｎｇ１）に着目した。
Ｔｉｅ−２受容体リガンドであるＡｎｇ１はＶＥＧＦと協調的に作用し血管新生・血管成熟・血管安定化に関わる重要な血管新生因子である（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｅｌｌ．８７：１１６１−１１６９；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ．３７６：７０−７４）。Ａｎｇ１とＶＥＧＦとを同時に投与することによって、虚血動物モデルにおいて血管再生が促進されることが報告されている（Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２１：１０４０−１０４７；Ｃｈａｅ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０：２５７３−２５７８）。また本発明者らは閉塞性動脈硬化症モデルにおいてＡｎｇ１遺伝子およびＶＥＧＦ遺伝子を併用した遺伝子治療がＶＥＧＦの血管透過性亢進による浮腫などの副作用を軽減しつつＶＥＧＦの血管新生作用を増強することを報告してきた（Ｉｔｏ．，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５（５），Ｓ１６２，２００２；ＷＯ０２／１００４４１）。今回本発明者らは、虚血心にＡｎｇ１を単独で投与して、その治療効果を検証した。Ａｎｇ１は単独では血管内皮増殖刺激活性はないと言われており、実際に、Ａｎｇ１トランスジェニックマウスでは血管内径の増大が認めらるが血管密度は増加しない（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，Ｊ．Ａｎａｔ．２００：５７５−５８０（２００２））。しかし心筋梗塞などの急性虚血では内因性のＶＥＧＦが極めて高い状態であることから、本発明者らは、Ａｎｇ１の単独投与でも血管新生効果が得られると考えた。すなわち、Ａｎｇ１を心筋梗塞急性期に使用することにより、生体内で産生が亢進するＶＥＧＦと協調的に血管新生を促進し、ＶＥＧＦ産生亢進に伴うｔｏｘｉｃｉｔｙを軽減しつつ血管再生を促すストラテジーが可能となると考えた。Ａｎｇ１は心筋梗塞の増悪にかかわるＶＥＧＦ、ＩＬ−１、およびＴＮＦなど炎症性サイトカインにより誘導される血管透過性亢進・血液凝固亢進状態などを拮抗的に抑制する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．（２００２）Ｊ  Ａｎａｔ．２００：５７５−５８０；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．６：４６０−４６３；Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８６：２５１１−２５１４）。本発明者らは、Ａｎｇ１投与により、心筋梗塞急性期に産生の亢進する炎症性サイトカインによる血管透過性亢進・血液凝固亢進をも予防できると予想した。
そこで本発明者らは、Ａｎｇ１遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを作製し、ラット心筋梗塞モデルを用いてＡｎｇ１発現ベクターを心筋内投与し、その血管新生効果、梗塞巣縮小効果、心機能の改善、および死亡率の低下を検討した。
動脈結紮により誘導した心筋梗塞により、梗塞部およびその周辺領域の血管密度は著明に減少した。さらに遺伝子投与部位より離れた中隔心筋でも心筋梗塞後に血管密度の減少が認められた。この理由は不明であるが心筋梗塞後の心不全状態を反映していると推測される。このモデルラット心臓の梗塞予定領域の周辺部にアデノウイルスベクターを心筋内投与した。手術の５日後に導入遺伝子の発現を調べたところ、梗塞心においても正常心に投与した場合とほぼ同レベル（約８０％）の発現を示し、梗塞周辺領域にベクターを注入することで導入遺伝子の十分な発現量が得られることが実証された。興味深いことにＡｎｇ１遺伝子投与群において梗塞部とその周辺領域の血管密度が増加していたのみならず中隔領域での血管密度も明らかに増加していた。このことはＡｎｇ１が投与局所での血管新生を促しているのみではなく流血中に分泌され遠隔心筋での血管新生を誘導することを示唆している。またＡｎｇ１遺伝子投与群では直径１０μｍ以上の血管の増加が明らかであり、さらにより機能的な血管であることを示す周囲細胞を伴った血管も明らかに増加していた。これはＡｎｇ１により誘導された血管がより機能的であることを支持している。
さらに本発明者らは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが、虚血疾患に対するＡｎｇ１遺伝子治療のために非常に優れた治療効果を奏することを見出した。心筋細胞を用いた遺伝子導入試験では、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは心筋細胞に対してアデノウイルスベクターよりも有意に優れた遺伝子導入能を示すことが証明された。そしてＡｎｇ１遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、心筋梗塞および虚血肢に対して優れた治療効果を示した。これまで心血管系、特に心疾患治療ベクターとしては、心筋細胞を含む非分裂細胞に対する遺伝子導入効率の高さ、高遺伝子発現からアデノウイルスベクターが最も汎用されている。しかし高い免疫原性による炎症の誘発、極めて高い肝親和性による副作用発現の可能性が指摘され、アデノウイルスベクターに代わる安全で効率的な遺伝子導入手法が求められている。これまでアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスウイルスベクターなどが試みられ心臓での長期間の遺伝子発現が示されている。これらのレトロウイルスベクターやＤＮＡウイルスベクターは核内にて宿主細胞染色体と相互作用し、宿主染色体への組み込みが懸念される。これに対してマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれることなく、細胞質において搭載遺伝子を高発現する能力を有することから、染色体損傷のリスクがない。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いたＡｎｇ１遺伝子治療により、より効果的で安全性に優れた虚血疾患の遺伝子治療が可能になるものと考えられる。
Ａｎｇ１が梗塞心において血管密度を増大させることが明らかとなったが、この血管密度の増大がはたして梗塞巣の減少、心機能の改善に寄与しているか否かが臨床応用において最も重要である。心筋梗塞後４週目に梗塞巣を計測したところ、Ａｎｇ１遺伝子投与群において梗塞巣の縮小と梗塞壁厚の増大が認められた。心機能的には特に左室短径短縮率（ＦＳ，ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、収縮期左室面積（ＬＶＡｓ，ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａ  ａｔ  ｓｙｓｔｏｌｅ）、および左室駆出率（ＥＦ，ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の改善を認めた。これまで肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、およびＶＥＧＦがラット左前下行枝結紮による心筋梗塞モデルにおいて血管新生を誘導し、梗塞巣を縮小することが報告されている。しかしながら、血管新生因子単独で重篤な心筋梗塞での心機能を改善した報告はほとんどなく、心機能の改善は胎児心筋、ＥＳ細胞、筋芽細胞など心筋の絶対量を補う細胞療法を併用した場合にのみに効果が認められている（Ｙａｕ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：Ｉ２１８−Ｉ２２２（２００１）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：Ｉ２０７−２１２（２００１）；Ｏｒｌｉｃ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１０３４４−１０３４９（２００１））。本発明においてＡｎｇ１の単独投与が、梗塞心の心機能を改善できることが初めて示された。心筋梗塞急性期におけるＡｎｇ１投与により、梗塞後死亡率の低下、心筋での血管数の増加、心筋梗塞巣の縮小、および心機能の改善などの顕著な効果がもたらされる。Ａｎｇ１遺伝子治療は、急性心筋梗塞に対するあらたな治療法として有効である。
また本発明者らは、Ａｎｇ１を高発現するアデノウイルススベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いて、重症虚血肢モデル動物に対してＡｎｇ１遺伝子の単独投与による遺伝子治療を実施した。心筋においてｎａｋｅｄ  ＤＮＡが極めて効率的な発現を示すのとは対照的に、骨格筋においてはｎａｋｅｄ  ＤＮＡベクターによる導入遺伝子の発現レベルは低く（実施例８）、Ａｎｇ１プラスミドの直接投与では虚血肢において十分は救肢効果は期待できなかった（ＷＯ０２／１００４４１）。しかし骨格筋においてｎａｋｅｄ  ＤＮＡよりも発現効率の高いウイルスベクターを用いることによって、Ａｎｇ１遺伝子の単独投与が、顕著な救肢効果を発揮することが明らかとなった（実施例７、１３、および１４）。特筆すべきことに、Ａｎｇ１遺伝子投与による救肢効果は、ａｒｔｅｔｉｏｇｅｎｅｓｉｓによる血液の組織還流が開始するよりも前においても観察された。従ってＡｎｇ１遺伝子治療は、血管形成の誘導による治療効果だけでなく、抗アポトーシス作用などによる効果により、血管形成が誘導されるよりも早い段階から虚血組織を保護するという予想外の効果を発揮したと考えられる。このように、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターを用いたＡｎｇ１遺伝子の単独投与は、虚血心疾患のみならず、四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などを含む虚血疾患一般においても、プラスミドベクターでは困難であった治療効果を得ることが期待できる。ＶＥＧＦを併用するこれまでの治療では、過剰なＶＥＧＦが血管の透過性亢進をもたらし肺水腫などを増悪させる懸念があるが、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターの単独投与により、このような副作用を回避しつつ効果的な虚血治療を実施することが可能である。
すなわち本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを用いる虚血疾患の治療方法、およびＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを含む虚血疾患治療キットに関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明、特に、同一の独立項（他の項に記載の発明に包含されない発明に関する項）を引用する項（従属項）に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、
〔１〕虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターを投与する工程を含む方法、
〔２〕〔１〕に記載の虚血性心疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法、
〔３〕アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターが、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターである、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、〔３〕に記載の方法、
〔５〕ウイルスベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔３〕に記載の方法、
〔６〕アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターがｎａｋｅｄ  ＤＮＡ（裸のＤＮＡ）である、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔７〕アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターが、ＣＡプロモーターあるいはＣＡプロモーターと同等またはそれ以上の転写活性を有するプロモーターによりアンギオポエチン−１の発現を駆動するベクターである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法、
〔８〕アンギオポエチン−１またはアンギオポエチン−１をコードするベクターの投与が心筋への注入である、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法、
〔９〕虚血疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターを投与する工程を含む方法、
〔１０〕〔９〕に記載の虚血疾患の治療方法であって、アンギオポエチン−１をコードするウイルスベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子を投与しない方法、
〔１１〕ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、〔９〕または〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕ウイルスベクターがマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである、〔９〕または〔１０〕に記載の方法、
〔１３〕ベクターの投与が虚血部位への注入である、〔９〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕アンギオポエチン−１をコードする外来遺伝子を有する、遺伝子改変された間葉系細胞、
〔１５〕アンギオポエチン−１をコードするアデノウイルスベクターが導入されている、〔１４〕に記載の間葉系細胞、
〔１６〕アンギオポエチン−１をコードするマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが導入されている、〔１４〕に記載の間葉系細胞、
〔１７〕〔１４〕から〔１６〕のいずれかに記載の間葉系細胞および薬学的に許容される担体を含む虚血治療組成物、
〔１８〕遺伝子改変された間葉系細胞の製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを間葉系細胞に接触させる工程を含む方法、
〔１９〕遺伝子がアンギオポエチン−１をコードする、〔１８〕に記載の方法、を提供する。
本発明は、虚血性心疾患の治療方法であって、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを投与する工程を含む方法に関する。Ａｎｇ１は単独では血管内皮増殖刺激活性はなく、Ａｎｇ１遺伝子単独投与により虚血性心疾患に対する治療効果が得られるか否かについては不明であった。しかし本発明において、心筋梗塞におけるＡｎｇ１の単独投与が顕著な治療効果をもたらすことが実証された。急性心筋梗塞患者においては、梗塞後２〜３日後に血清中ＶＥＧＦが増加すること、心筋梗塞モデルでも心局所でのＶＥＧＦ発現が心筋梗塞１〜３日後より増加し、１週間以上持続することが知られている。また、本発明者らが作製したラット心筋梗塞モデルでも局所および血清ＶＥＧＦの増加が確認できた（データ省略）。従って、Ａｎｇ１単独投与による治療効果は、内因性のＶＥＧＦとの併用効果である可能性がある。過剰なＶＥＧＦは肺血管の透過性を亢進し肺水腫を誘発し死亡率を増大させるが、ＶＥＧＦを投与せずＡｎｇ１のみを単独で投与することにより、内因性のＶＥＧＦと遺伝子導入により発現するＡｎｇ１が協調的に作用し、強力な血管新生作用を発揮し、同時にＶＥＧＦ投与により起こり得る副作用を回避することができる。特に本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを投与する工程を含み、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはその遺伝子を投与しない、虚血性心疾患の治療方法を提供する。Ａｎｇ１単独投与で梗塞部およびその周辺部に明らかな血管密度の増大が認められ、この血管密度の増大効果は同量のＶＥＧＦ１６５遺伝子単独をアデノウイルスベクターにより導入した場合とほぼ同程度であった。本発明に従って、ＶＥＧＦを投与することなくＡｎｇ−１またはその遺伝子を投与することによって、虚血組織をより安全で効果的の保護することが可能となる。本発明の虚血性疾患および虚血性心疾患の治療方法は、虚血組織の保護のための方法として、また、拒絶組織の再生方法として、さらには拒絶組織における血管の再生方法としても有用である。
本発明においてアンギオポエチン−１（Ａｎｇ１）とは、Ｔｉｅ−２受容体に結合し、この受容体を介するシグナル伝達を活性化させ血管新生を促進するリガンドを言う。Ｔｉｅ−２はチロシンキナーゼ受容体であり内皮細胞系列で発現される（Ａｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿０００４５９，ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ．Ｑ０２７６３，ＮＰ＿０００４５０）（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８（３），６６３−６７０（１９９３）；Ｂｏｏｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３（９），１５８３−１５８７（１９９４）；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２３（２），５１２−５１３（１９９４）；Ｇａｌｌｉｏｎｅ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３２（３），１９７−１９９（１９９５）；Ｖｉｋｋｕｌａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７（７），１１８１−１１９０（１９９６）；Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２９），１８５１４−１８５２１（１９９８）；Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３（３），２３３−２４０（１９９８）；Ｃａｌｖｅｒｔ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．８（７），１２７９−１２８９（１９９９））。Ｔｉｅ−２はヒト以外にも、ウシ、マウスを含む哺乳動物で単離されている（Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（２０），９３５５−９３５８（１９９３）；Ｉｗａｍａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５（１），３０１−３０９（１９９３））。野生型ヒトＴｉｅ−２をコードするＤＮＡの塩基配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１および２に例示した。配列番号：２に示したヒトＴｉｅ−２および上記の哺乳動物ホモログに対するリガンドであって、血管新生を促進するものは本発明において好適に用いることができる。また本発明においてＡｎｇ１は、天然の蛋白質のみならず、その改変体または部分ペプチドなどであって、天然のＡｎｇ１と同様にＴｉｅ−２リガンドとして機能するものが含まれる。また、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインに結合する抗Ｔｉｅ−２抗体の断片または非ペプチド性化合物であってＴｉｅ−２リガンドとして機能するものであってもよい。
哺乳動物Ａｎｇ１蛋白質は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシなどを含む様々な哺乳動物から単離されている（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７（７），１１６１−１１６９（１９９６）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（５），１９０４−１９０９（１９９９）；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８７（７），１１７１−１１８０（１９９６）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（５），１９０４−１９０９（１９９９）；Ｋｉｍ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４９（４），８７２−８８１（２００１）；Ｍａｎｄｒｉｏｔａ，Ｓ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐｅｐｐｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３（８），８５２−８５９（１９９８）；Ｇｏｅｄｅ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８（１１），１３８５−１３９４（１９９８））（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃ．Ｎｏ：Ｕ８３５０８，ＵＮＭ＿００９６４０，ＡＦ２３３２２７，ＮＭ＿０５３５４６；ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＩＤ：ＡＡＢ５０５５７，ＮＰ＿０３３７７０，００８５３８，ＡＡＫ１４９９２，ＮＰ＿４４５９９８，０１８９２０）。野生型ヒトＡｎｇ１をコードするＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および４に例示した。配列番号：４に示したヒトＡｎｇ１および上記の哺乳動物ホモログを好適に用いることができる。
また、ヒトまたはその他の哺乳動物Ａｎｇ１のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加したアミノ酸配列を含む蛋白質、ヒトまたはその他の哺乳動物Ａｎｇ１のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ配列を含む蛋白質、ならびにヒトまたはその他の哺乳動物Ａｎｇ１遺伝子のコード領域の一部または全部を含む核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸がコードする蛋白質であって、哺乳動物Ｔｉｅ−２受容体に結合し、この受容体を介するシグナル伝達を活性化させ血管新生を促進する蛋白質は本発明においてＡｎｇ１に含まれる。これらの蛋白質には、Ａｎｇ１の多型およびスプライシングバリアントなどが含まれ得る。
アミノ酸の置換、欠失、および／または付加においては、改変されるアミノ酸数は、通常１５以内、好ましくは１１以内、より好ましくは９以内、より好ましくは７以内、より好ましくは５以内である。特にアミノ酸を保存的に置換した蛋白質は活性が維持されやすい。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。具体的にはｂｌａｓｔｐプログラムを用いることができる。例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブページにおいてＬｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、例えば哺乳動物野生型Ａｎｇ１蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。また、ハイブリダイゼーションにおいては、ヒトなどのＡｎｇ１遺伝子の蛋白質コード配列を含む核酸、またはハイブリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば５×ＳＳＣ、７％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（１×デンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、および０．２％フィコールを含む）を含む溶液中、４８℃、好ましくは５０℃、より好ましくは５２℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは６０℃、さらにこの好ましくは６５℃、最も好ましくは６８℃で２×ＳＳＣ中、好ましくは１×ＳＳＣ中、より好ましくは０．５×ＳＳＣ中、より好ましくは０．１×ＳＳＣ中で、振蘯しながら２時間洗浄する条件である。
Ａｎｇ１をコードするベクターとは、Ａｎｇ１蛋白質をコードする核酸を含むベクターである。蛋白質をコードするとは、核酸が該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンス（ある種のウイルスベクター等においては）に含むことを言う。核酸は一本鎖または二本鎖であってよい。また核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ベクターとしては、例えばプラスミドベクター、その他のｎａｋｅｄ  ＤＮＡ、ウイルスベクターが挙げられる。
Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡとは、ＤＮＡが、ウイルスエンベロープ、リポソーム、またはカチオニック脂質などの核酸を細胞に導入する試薬と結合していないＤＮＡを言う（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１４６５−１４６８）。この場合、ＤＮＡは生理的に許容可能な溶液、例えば滅菌水、生理食塩水、または緩衝液中に溶解して使用することができる。プラスミドなどのｎａｋｅｄ  ＤＮＡの注入は最も安全で簡便な遺伝子送達法であり、これまでに承認されている臨床心血管遺伝子治療プロトコルの多くを占めるが（Ｌｅｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７２：２３０−２３５）、導入遺伝子の発現が比較的低いことと心筋細胞への導入効率が悪いことが、このアプローチの治療的な利益を損なっていた（Ｌｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９０；８２：２２１７−２２２１；Ｋａｓｓ−ｅｉｓｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：１１４９８−１１５０２）。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは入手可能な最も強力な転写制御配列の１つであり、ＣＭＶプロモーターを含むベクターは臨床の遺伝子治療にも広く用いられている（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ，Ｍ．Ｋ，ａｎｄ  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ．Ｇｅｎｅ  １９８６；４５：１０１−１０５）。しかしながら、骨格筋にプラスミドを注入した幾つかの報告により、強力なＣＭＶプロモーターを利用したとしても、導入遺伝子の発現量または発現期間はしばしば不十分であることが指摘されていた。
ところが驚くべきことに、本発明者らが、ｎａｋｅｄプラスミドを心筋に直接注入により投与したところ、骨格筋に比べ心筋では約一桁の高い発現レベルが得られることが判明した。特に転写活性の強いＣＡプロモーターを持つプラスミドベクターを２０μｇ用いた時の心臓における導入遺伝子の発現レベルは、６．０×１０９ｏｐｔｉｃａｌ  ｕｎｉｔｓ（ＯＰＵ）のアデノウイルスベクターによるものに匹敵した。従って、ＣＡプロモーターあるいはこれと同等以上の転写活性を持つプロモーターを持つプラスミドを用いて、本発明の虚血疾患の遺伝子治療を実施することができる。ＣＡプロモーターとは、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターを含むキメラプロモーターである（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ．１０８：１９３−１９９）。ＣＡプロモーターまたはこれを同等以上の転写活性を有するプロモーターを用いれば、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡを用いてより安全に遺伝子治療を実施することができる。
ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙエンハンサーとしては、所望のＣＭＶ株のｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙ遺伝子エンハンサーを用いることができるが、例えば配列番号：５の１〜３６７番目までの塩基配列を例示することができる。また、ニワトリβアクチンプロモーターとしては、ニワトリβアクチンゲノムＤＮＡの転写開始部位を含むＤＮＡ断片であって、プロモーター活性を持つ断片を使用することができる。ニワトリβアクチン遺伝子の第１イントロンには転写を促進する活性があるため、このイントロンの少なくとも一部までを含むゲノムＤＮＡ断片を用いることが好ましい。このようなニワトリβアクチンプロモーターとしては、具体的には、例えば配列番号：５の３６８〜１６１５番目までの塩基配列を例示することができる。イントロンのアクセプター配列は、適宜他の遺伝子の配列を使うことができ、例えばウサギβグロビンのイントロンアクセプター配列を用いてよい。本発明においてＣＡプロモーターとしては、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙエンハンサー配列の下流に、イントロンの一部までを含むニワトリβアクチンプロモーターを連結し、その下流に所望のイントロンアクセプター配列を付加したＤＮＡが好適である。一例を配列番号：５に示した。この配列の最後のＡＴＧを開始コドンとして、Ａｎｇ１蛋白質のコード配列を付加すればよい。但し、ＣＭＶエンハンサーおよびニワトリβアクチン遺伝子は、単離株または単離個体によって配列に多様性があり得る。また、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｅａｒｌｙエンハンサーおよびニワトリβアクチンプロモーターとして配列番号：５に示したのと全く同一の領域を使う必要はなく、当業者であれば様々なバリアントを構築することができる。配列番号：５に示したプロモーターと同等またはそれ以上の転写活性を有するバリアントは全て、本発明において好適に用いることができる。
ベクター中にＳＶ４０ｏｒｉが含まれる場合は、ＳＶ４０ｏｒｉ配列を欠失させることが好ましい。ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎは幾つかのヒト癌に関連しており、ＳＶ４０に関連した癌を持つ患者ではＳＶ４０ｏｒｉを含むベクターの増幅が懸念される（Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ２００２；９４：１０３７−１０４８；Ｍａｌｋｉｎ，Ｄ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３５９：８１２−８１３）。本発明者らの検証によれば、ベクターからＳＶ４０ｏｒｉを欠失させても、導入遺伝子の発現は骨格筋でも心臓でも影響されなかった（実施例８）。この結果は、ＣＡプロモーターの制御下にＡｎｇ１を発現する、ＳＶ４０ｏｒｉを持たないベクターが、心筋遺伝子治療への臨床適用に最も安全かつ有用なベクターの１つであることを示唆する。特にＳＶ４０ｏｒｉを欠失させたｐＣＡ１ベクターは、心筋遺伝子治療に適していると考えられる。
また、ＤＮＡは適宜トランスフェクション試薬と組み合わせて投与することもできる。例えば、リポソームまたは所望のカチオニック脂質と結合させてトランスフェクション効率を上昇させることができる。
本発明の虚血疾患治療に用いられるもう１つの好ましいベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターを用いることによって、心筋のみならず骨格筋など他の組織においても十分な量のＡｎｇ１を発現させることができる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに制限されない。好ましいウイルスベクターの１つはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、心筋細胞に高い効率で遺伝子を導入し、導入遺伝子を高発現させることができる。実施例に示すように、Ａｎｇ１を発現するアデノウイルスベクターは、虚血心および虚血肢に対して有意な治療効果を発揮する。このように、本発明においてはアデノウイルスベクターを好適に用いることができる。本発明において、アデノウイルスベクターは適宜公知のベクターを用いることができ、それらは例えば外来遺伝子発現の向上のため、または抗原性の減弱などのために野生型ウイルスの遺伝子が改変されていてよい。アデノウイルスベクターの作製は、例えば斎藤らにより開発されたＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３２０−１３２４（１９９６））を用いることができる。
ベクターにＡｎｇ１を組み込む場合は、Ａｎｇ１遺伝子の発現効率を高めるため、Ａｎｇ１の開始コドン周辺の配列はＫｏｚａｋのコンセンサス配列［例えばＣＣ（Ｇ／Ａ）ＣＣＡＴＧ］とすることが好ましい（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ９（２０），５２３３（１９８１）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ  ４４，２８３（１９８６）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８１２５（１９８７）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７（１９８７）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０８，２２９（１９８９）；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８，２８２８（１９９０））。
本発明において好適に用いることができるウイルスベクターの他の１つは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターである。実施例に示すように、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、アデノウイルスよりも低い力価でより高い導入遺伝子を発現をもたらすことが示された。本発明において、Ａｎｇ１をコードするマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、最も好適に用いられるベクターの１つである。マイナス鎖ＲＮＡウイルスとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖に対するアンチセンス鎖）のＲＮＡをゲノムとして含むウイルスである。マイナス鎖ＲＮＡはネガティブ鎖ＲＮＡとも呼ばれる。本発明において用いられるマイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルス（非分節型（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわちマイナス鎖］ＲＮＡをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。本発明において用いられるマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、伝播能を有していてもよく、伝播能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
本発明において得に好適に用いられるマイナス鎖ＲＮＡウイルスを具体的に挙げれば、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスのセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）の水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）等が例示できる。
本発明において用いることができるウイルスをさらに例示すれば、例えばＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、Ｎｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−２（ＨＰＩＶ−２）、ｓｉｍｉａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ５（ＳＶ５）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ａ（ＨＰＩＶ−４ａ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−４ｂ（ＨＰＩＶ−４ｂ）、ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ（Ｍｕｍｐｓ）、およびＮｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ（ＮＤＶ）などが含まれる。より好ましくは、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ（ＳｅＶ）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−１（ＨＰＩＶ−１）、ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ−３（ＨＰＩＶ−３）、ｐｈｏｃｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＶ）、ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＣＤＶ）、ｄｏｌｐｈｉｎ  ｍｏｌｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ（ＤＭＶ）、ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ（ＰＤＰＲ）、ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ＭＶ）、ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ（ＲＰＶ）、Ｈｅｎｄｒａ  ｖｉｒｕｓ（Ｈｅｎｄｒａ）、およびＮｉｐａｈ  ｖｉｒｕｓ（Ｎｉｐａｈ）からなる群より選択されるウイルスが挙げられる。
より好ましくは、パラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモルビリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウィルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウィルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウィルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウィルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウィルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウィルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウィルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
組み換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；ＷＯ００／７００５５；ＷＯ００／７００７０；ＷＯ０３／０２５５７０；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１５４００−１５４０４；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のウイルスを再構成させることができる。ウイルスゲノムをコードするＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子等のエンベロープを構成する蛋白質をコードする遺伝子をウイルスゲノムから欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質（例えば水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：５１９−５２８（１９８１）））をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である（Ｈｉｒａｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０４：１２５−１３３；Ｉｎｏｕｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６４１９−６４２９）。
マイナス鎖ＲＮＡウイルスは宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ，（ｅｄｓ）．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６，ｐｐ．１１７７−１２０４）。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。またセンダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：５３３−５４０，１９９７；Ｂｉｔｚｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，．５：５４３−５５３，２００３）。このように、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、ヒトの虚血疾患に対する遺伝子治療のための治療用ベクターとして極めて有用である。
回収したウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターを含む溶液中で該ウイルスの成分が主要な割合を占めることを言う。例えば実質的に純粋なウイルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクターの成分として含まれる蛋白質の割合が１０％（重量／重量）以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウイルスベクターであれば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができるが、これらに制限されない。
本発明において虚血疾患とは、組織への血液供給の減少または途絶による機能異常あるいは組織変性または壊死を言い、具体的には心筋梗塞および狭心症などの虚血性心疾患、並びに四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などが含まれる。すなわち本発明において虚血疾患には、虚血性の疾病のみならず、損傷・傷害による虚血状態も含まれる。Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを投与することにより、血管形成誘導、および抗アポトーシス作用および抗炎症作用などの他の作用により、虚血組織周辺の壊死が抑えられ、機能が改善される。本発明のＡｎｇ１の投与において、好ましくはＶＥＧＦは投与しない。ＶＥＧＦを投与しなくても、Ａｎｇ１の単独投与で有意な治療効果が期待できる。ＶＥＧＦを投与しないとは、具体的には、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの投与の前後、少なくとも１２時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１４日以内に、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦをコードするベクターを投与しないことを言う。なお、微量または痕跡量のＶＥＧＦまたはＶＥＧＦをコードするベクターを投与したとしても、そのＶＥＧＦの作用が有意に検出できない程度であればそれは投与しないと考える。ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）は血管内皮細胞に特異的な増殖因子でありＶＰＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｆａｃｔｏｒ；血管透過性亢進因子）として１９８９年に報告され現在ＶＥＧＦ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅに分類されている（渋谷正史，ＶＥＧＦ受容体とシグナル伝達，最新医学５６：１７２８−１７３４，２００１）。ＶＥＧＦ  Ａはさらに６種類のサブタイプに分けられそのうち可溶性のＶＥＧＦ１２１，１６５が特に強い血管増殖能を持つとされ現在臨床応用されている。本発明においてＶＥＧＦとしては特にＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２１が挙げられ、好ましくはＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２１を含むＶＥＧＦの各種メンバーが含まれる。特に、内因性ＶＥＧＦレベルが亢進する症状を伴う虚血疾患に対して本発明の治療方法は有効性が高い。内因性ＶＥＧＦレベルが亢進するとは、血中または組織局所における内因性ＶＥＧＦレベルが健常者のそれよりも高いことを言う。上記に挙げた心筋梗塞、狭心症、急性四肢虚血、血流不全を伴う損傷、切断、骨折等においては、内因性ＶＥＧＦレベルが上昇する。
本発明において虚血性心疾患とは、心筋への血液供給の減少または途絶による心機能異常あるいは心筋の変性または壊死を言い、具体的には狭心症、心筋梗塞、および一部の心筋症が含まれる。Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを虚血心に投与することにより、血管形成が促進され心機能が改善される。本発明の方法は、特に内因性ＶＥＧＦレベルが亢進する症状を伴う虚血性心疾患に対して高い効果を発揮し、例えば狭心症、心筋梗塞、および虚血性心筋症などが治療の対象として適している（Ｘｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｓｕｒｇ．１２１：７３５−７４２；Ｂａｎａｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２８：１１７６−１１７９；Ｓｅｌｌｋｅ，Ｆ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｈ７１３−７２０）。本発明の方法が最も有効な虚血性心疾患は心筋梗塞である。
狭心症とは、心筋が一過性に虚血、つまり酸素欠乏に陥ったために生ずる胸部不快感を主症状とする臨床的症候群を意味する（小川久雄，狭心症に対する薬物療法，別冊医学のあゆみ；循環器疾患：３５２−３５５，１９９６，矢崎義雄他編，医歯薬出版株式会社）。急性心筋梗塞は冠動脈の血流障害により心筋壊死を伴う虚血性心疾患である（阿武正弘，高野照夫，急性心筋梗塞，循環器疾患最新の治療２００２−２００３ＩＩ冠動脈疾患：３７−４２，２００２，篠山重威、矢崎義雄編、南江堂）。
本発明の虚血疾患の治療においては、ＶＥＧＦのみならず、他の血管新生因子または血管新生因子をコードするベクターも投与しないことが好ましい。血管新生因子とは、血管構成に関与する細胞の発生、遊走、増殖、成熟に直接、あるいは間接的に関わる因子を言う。具体的には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦｓ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、胎盤由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、単球走化性蛋白質−１（ＭＣＰ−１）、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＴＰ）、アンギオポエチン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エフリン（ｅｐｈｒｉｎ／Ｅｐｈ）、マトリクスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰ），ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）などが含まれる（Ｋｕｗａｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．４０：５６５−５７２（２００１）；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３６：５４−７１（２００２））。投与しないとは、投与個体においてこれらの血管新生因子の作用を有意に検出するほどの量またはそれ以上を投与しないという意味である。
虚血組織への投与においては、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを、全身投与または虚血組織に局所投与する。Ａｎｇ１は大量投与によっても顕著な副作用を示さないことから、全身投与による虚血治療が可能である。投与においては、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの直接投与、あるいは担体を用いた投与が挙げられる。担体は、生理的に許容できるもので、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などがあげられる。更に担体はこれらの生理的に許容される材料の混合組成物でも良い。用いるベクターは生理的に許容されるベクターならば特に制限はなく、上に例示したウイルスベクター、あるいは非ウイルスベクターも含めて、所望のベクターが利用できる。またベクターはベクターにより処理された患者自身の細胞の形態で投与してもよい。例えばベクターまたはベクターを導入した細胞の筋肉（心筋または骨格筋）内注射や静脈内注射（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与およびｅｘ  ｖｉｖｏ投与）が考えられる。全身投与（筋注、ないし静注）された細胞は、病変局所へ移行することにより虚血組織の生存を促進し得る。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などへ分化するとともに、骨格筋、心筋、神経系細胞への分化能の保持することが近年示され、再生医療の細胞源として多くの研究がなされている。本発明に従ってＭＳＣにＡｎｇ−１遺伝子を導入し、これを虚血治療に用いることによって、優れた効果を発揮することが期待できる。ＭＳＣは例えばＴｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７（３）：３５４−６５に記載の方法に従って調製することができる。心臓への局所投与のためには、注射によりＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを心筋に注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）すればよい。あるいは、Ａｎｇ１をコードするベクターを導入した細胞を、心筋に移植することもできる（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）。注入手段は通常の医療用注射器または、体外および体内に留置される持続注入器などの工業製品があげられる。
投与量は、例えばウイルスであれば虚血部位周辺の生存筋（骨格筋または心筋など）に１箇所または複数箇所（例えば２から１０箇所）に投与してよい。投与量は、アデノウイルスであれば、例えば１０１０〜１０１３ｐｆｕ／ｂｏｄｙ、より好ましくは１０１１〜１０１３ｐｆｕ／ｂｏｄｙが望ましい。マイナス鎖ＲＮＡウイルスであれば、例えば２×１０５ＣＩＵ〜５×１０１１ＣＩＵが望ましい。Ｎａｋｅｄ  ＤＮＡであれば、虚血部位周辺の生存筋に１箇所または複数箇所（例えば２から１０箇所）に投与してよい。投与部位１箇所あたりの投与量は、例えば１０μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１００μｇ〜１ｍｇが望ましい。Ｅｘ  ｖｉｖｏ投与において、ベクターを導入した細胞を投与する場合は、例えばＭＯＩ  １〜５００の間で体外（例えば試験管またはシャーレ内）で標的細胞にベクターを導入する。本発明においてマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、間葉系細胞に対して極めて高い効率で外来遺伝子を導入することが判明した。従って、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与において間葉系細胞を用いる場合は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いて間葉系細胞に遺伝子導入を行うことが好ましい。Ａｎｇ−１遺伝子導入細胞は、例えば１０５〜１０９細胞、好ましくは１０６〜１０８細胞を虚血組織に移植することができる。蛋白製剤であれば虚血部位周辺の生存筋に１箇所または複数箇所（例えば２から１０箇所）に投与してよい。投与量は、例えば１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇが望ましい。より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが望ましい。また、ベクターまたは蛋白質製剤は、例えば虚血組織に至る動脈内（例えば虚血心であれば心臓の冠動脈内）に複数回（１〜１０回）動脈投与してよい。この場合投与部位１箇所あたりの投与量は、蛋白質製剤であれば例えば１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇが望ましい。より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが望ましい。またベクターまたは蛋白質製剤は、経静脈的に複数回（１〜１０回）または持続投与してよい。この場合総投与量は、蛋白製剤であれば例えば１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇが望ましい。より好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが望ましい。ベクターであれば、上記の筋注と同様の量を投与することができる。投与量については、文献Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３６：５４−７１（２００２）を参照することができる。
但し、ベクターの投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状、投与組成物の形態、投与方法等により異なってよく、当業者であれば適宜調整することが可能である。投与回数は、１回または臨床上容認可能な副作用の範囲で複数回可能であり、投与部位についても一箇所または複数箇所投与してよい。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりヒトと同様の投与量とするか、あるいは例えば目的の動物とヒトとの虚血器官（心臓など）の容積比（例えば平均値）等で上記の投与量を換算した量を投与することができる。本発明の治療の対象動物としては、ヒトおよびその他の所望の哺乳動物が挙げられ、具体的にはヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなどが含まれる。
本発明の治療方法は、単独ないし、他のスタンダードないし先進的な治療法との組み合わせで実施することができる。例えば、本発明の虚血性心疾患の治療方法をＰＴＣＡ（経皮冠動脈形成術）および／またはＣＡＢＧ（冠動脈バイパス術）などの外科的な血行再建術と組み合わせることも好適である。本発明の治療法を合わせて用いることにより、心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が可能となる。また、本発明のＡｎｇ１を用いた治療は、梗塞心筋の再生などの梗塞巣に対するリモデリングの促進などの治療を組み合わせることにより、より高い効果が期待される。Ａｎｇ１による遺伝子治療は梗塞巣厚の増加をもたらすが、細胞療法の併用など心筋絶対量の不足を改善した際に認められるＬＶＡｄ，Ｅｄｄなど拡張期パラメーターの改善については比較的効果が弱い。Ａｎｇ１による収縮期容積、駆出率などの改善は、梗塞周囲筋など残存心筋の血管密度が増加することにより梗塞周囲筋での機能低下を予防し、さらに残存心筋の代償性肥大を促進し、心筋機能を改善しているものと推測される。そこで、例えば、胎児心筋、ＥＳ細胞、筋芽細胞、または間葉系細胞などの移植、または梗塞部位への移動を誘導することにより心筋の絶対量を補う細胞療法を併用することは好ましいと考えられる。これらの細胞にＡｎｇ−１遺伝子をｅｘ  ｖｉｖｏで導入し、虚血組織の治療効果をより高めることも有用である。
また本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを含む虚血性心疾患治療剤を提供する。また本発明は、虚血性心疾患の治療における、虚血心へ投与するためのＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの使用を提供する。さらに本発明は、該Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを虚血心へ投与するための虚血性心疾患の治療薬製造における、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの使用を提供する。特に本発明は、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを含む虚血性心疾患治療剤であって、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずに該Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを虚血心へ投与するための治療剤を提供する。また本発明は、虚血性心疾患の治療におけるＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの使用であって、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずに該Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを虚血心へ投与するための使用を提供する。さらに本発明は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずに該Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを虚血心へ投与するための虚血性心疾患の治療薬製造における、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの使用を提供する。上記の治療剤および使用においては、ＶＥＧＦのみならず、他の血管新生因子またはその血管新生因子をコードするベクターも投与しないものであることがより好ましい。またＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターは、虚血心への局所投与のために製剤化されることが好ましい。例えば、心筋への注入により投与されるものが好ましい。Ａｎｇ１をコードするベクターは、好ましくはＡｎｇ１をコードするウイルスベクターまたはｎａｋｅｄ  ＤＮＡである。ウイルスベクターとしては特に制限はないが、特にアデノウイルスベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが好ましい。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡとしてはプラスミドが挙げられる。プラスミドは環状でも直鎖化されていてもよい。またプラスミドにはＳＶ４０ｏｒｉが含まれないことが好ましい。ベクターにおいてＡｎｇ１転写を駆動するプロモーターは強力な転写活性を持つものが好ましく、例えばＣＡプロモーターを好適に用いることができる。
また本発明は、（ａ）Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードする、ベクター、および（ｂ）Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの投与において、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含む虚血性心疾患治療キットに関する。本キットは、心筋梗塞または狭心症を含む虚血性心疾患の少なくとも１つに対する治療キットである。好ましくは、本発明のキットは、狭心症および／または急性心筋梗塞に対する治療キットである。このキットには、上記で説明したＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターが含まれる。Ａｎｇ１をコードするベクターは、好ましくはＡｎｇ１をコードするｎａｋｅｄ  ＤＮＡまたはウイルスベクターであり、ウイルスベクターとしては特に制限はないが、特にアデノウイルスベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが好ましい。キット中に含まれるＡｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターは、Ａｎｇ１以外に、薬学的に許容できる所望の担体および／または添加物等を含む組成物であってよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤などを含んでよい。局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと組み合わせることも好ましい。好ましい態様においては、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターは注射に適当な剤型に調製される。このためには、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターは薬学的に許容される水溶液中に溶解されているか、または溶解できるように例えば凍結乾燥製剤であることが好ましい。本発明のキットには、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターを溶解または希釈するために用いることができる、薬学的に許容できる所望の担体をさらに含んでもよい。このような担体としては、例えば蒸留水、生理食塩水などが挙げられる。
また本発明は、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターを含む虚血疾患治療剤を提供する。また本発明は、虚血疾患の治療における、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターの使用を提供する。さらに本発明は、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターを含む虚血疾患の治療薬製造における、該Ａｎｇ１ウイルスベクターの使用を提供する。特に本発明は、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターを含む虚血疾患治療剤であって、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずに該Ａｎｇ１ウイルスベクターを虚血個体へ投与するための治療剤を提供する。また本発明は、虚血疾患の治療におけるＡｎｇ１をコードするウイルスベクターの使用であって、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずに該Ａｎｇ１ウイルスベクターを虚血個体へ投与するための使用を提供する。さらに本発明は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与せずにＡｎｇ１をコードするウイルスベクターを虚血個体へ投与するための虚血疾患の治療薬製造における、該Ａｎｇ１ウイルスベクターの使用を提供する。上記の治療剤および使用においては、ＶＥＧＦのみならず、他の血管新生因子またはその血管新生因子をコードするベクターも投与しないものであることがより好ましい。またＡｎｇ１をコードするウイルスベクターは、虚血組織への局所投与のために製剤化されることが好ましい。ウイルスベクターとしては、好ましくはアデノウイルスベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが用いられる。
また本発明は、（ａ）Ａｎｇ１をコードするウイルスベクター、および（ｂ）Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターの投与において、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含む虚血疾患治療キットに関する。本キットは、心筋梗塞および狭心症などの虚血性心疾患、並びに四肢虚血、血流不全を伴う損傷、および切断などの外傷および骨折などを含む虚血疾患の少なくとも１つに対する治療キットである。このキットには、上記で説明したＡｎｇ１をコードするウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターとしては特に制限はないが、特にアデノウイルスベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが好ましい。キット中に含まれるＡｎｇ１をコードするウイルスベクターは、ベクター以外に、薬学的に許容できる所望の担体および／または添加物等を含む組成物であってよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、または保存剤などを含んでよい。局所投与のために、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などと組み合わせることも好ましい。好ましい態様においては、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターは注射に適当な剤型に調製される。このためには、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターは薬学的に許容される水溶液中に溶解されているか、または溶解できるように例えば凍結乾燥製剤であることが好ましい。本発明のキットには、Ａｎｇ１をコードするウイルスベクターを溶解または希釈するために用いることができる、薬学的に許容できる所望の担体をさらに含んでもよい。このような担体としては、例えば蒸留水、生理食塩水などが挙げられる。
本発明のキットには、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの投与において、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与しないことの指示の記載または該記載へのリンクを含む記録媒体が含まれている。ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与しないことの指示とは、例えばＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターの投与を禁忌または避けるように指示または推奨する内容の記載である。具体的には、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの投与の前後、少なくとも１２時間以内に、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦをコードするベクターを投与しないことを指示する内容が記載されている。好ましくは、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１ベクターの投与の前後の２４時間以内、より好ましくは１４日以内に、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦベクターを投与しないことが指示されている。ＶＥＧＦとしては特にＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２１が挙げられ、好ましくはＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２１を含むＶＥＧＦの各種メンバーが含まれる。本キットには、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの治療的有効量を罹患個体に投与することの記載または該記載へのリンクを含むことが好ましい。記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク（ＦＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられる。リンクとは、Ａｎｇ１またはＡｎｇ１をコードするベクターの投与において、ＶＥＧＦ１２１を投与しないことの指示に関する記載が、キット中に直接には記載されていないが、キットに含まれる印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙またはＵＲＬなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙またはＵＲＬに該記載がある場合などが含まれる。
以下に、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いた間葉系細胞への遺伝子導入について記載する。本発明による間葉系細胞とは、好ましくは骨髄細胞（骨髄細胞の単核球分画成分）、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞、間葉系幹細胞、またはこれらの細胞に由来する細胞などを指す。また、本発明の間葉系細胞には、たとえば、間葉系に関連する細胞、中胚葉幹細胞などが含まれる。尚、本発明において「間葉系細胞」として記述された細胞が、将来的に間葉系細胞以外の細胞として分類される場合であっても、本発明においては当該細胞を好適に利用することができる。
骨髄中には、幹細胞として、造血幹細胞と、「間葉系幹細胞（ＭＳＣ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」とがある。ここで「幹細胞」とは、一般に、生体を構成する細胞の生理的な増殖・分化などの過程において、自己増殖能と、特定の機能を持つ細胞に分化する能力とを併せ有する未分化細胞のことである。造血幹細胞は、赤血球、白血球、あるいは血小板に分化する幹細胞である。間葉系幹細胞は、神経に分化する場合、心血管系に分化する場合、内臓に分化する場合、または、骨、軟骨、脂肪、あるいは筋肉に分化する場合があることが知られている。
本発明では、主として間葉系幹細胞を利用するが、造血幹細胞や、体内の他の幹細胞（前駆細胞）を利用できる可能性があることにも言及しておく。間葉系幹細胞は、骨髄から採取された骨髄細胞から分離して得られる。なお、間葉系幹細胞を分離していない骨髄細胞も、有効性は若干劣るものの、間葉系幹細胞と同じように治療に用いることができる。
また、間葉系幹細胞のような細胞が、末梢血中から調製できる可能性も考えられる。従って、末梢血中の細胞を培養することにより、間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞を調製し、本発明に利用することも可能である。
本発明において、中胚葉性幹細胞とは、発生学的に中胚葉と分類される組織を構成している細胞を指し、血液細胞も含まれる。また、中胚葉幹細胞とは、自己と同じ能力を持った細胞をコピー（分裂、増殖）することができ、中胚葉の組織を構成している全ての細胞へ分化し得る能力を持った細胞を指す。中胚葉幹細胞は、たとえば、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）の特徴を有する細胞であるが、これらマーカーに特に制限されない。また、いわゆる、間葉系に関連する幹細胞も、本発明の中胚葉幹細胞に含まれる。
上記の間葉系に関連する細胞とは、間葉系幹細胞、間葉系細胞、間葉系細胞の前駆細胞、間葉系細胞から由来する細胞のことを意味する。
間葉系幹細胞とは、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、さらには、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞のことである。また、末梢血中の細胞を培養して得ることができる間葉系幹細胞と同等の機能を有する細胞も本発明の間葉系幹細胞に含まれる。
本発明において好ましい間葉系細胞としては、骨髄細胞、骨髄幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を好適に示すことができる。その他、本発明の細胞の好ましい例として、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞などをあげることができる。
本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、胎児肝細胞の好ましい態様としては、骨髄、臍帯血、末梢血、または、胎児肝より分離して得た細胞の１分画であって、心血管系細胞あるいは心筋細胞などへ分化し得る細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
他の一つの態様において、該細胞分画は、ＳＨ２（＋）、ＳＨ３（＋）、ＳＨ４（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ１４（−）、ＣＤ３４（−）、ＣＤ４５（−）の特徴を有する中胚葉肝細胞を含む細胞分画である。
本発明において、上記以外の細胞分画の例としては、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤｗ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する間質細胞を含む細胞分画、あるいはＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画を挙げることができる。
本発明における骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞（細胞分画）は、一般的には、脊椎動物に由来する。好ましくは哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ヒトなど）由来であるが、特に制限されない。
本発明において、Ａｎｇ１遺伝子を導入した間葉系細胞は、遺伝子改変されていない間葉系細胞に比べ高い虚血治療効果を発揮することが示された。従って、間葉系細胞にＡｎｇ１遺伝子を外来的に導入することによって、虚血治療に有用な細胞を調製することができる。この細胞を虚血組織に投与することによって、虚血組織における血管形成および再生を促進することができる。間葉系細胞へのＡｎｇ１遺伝子導入は、上述のプラスミドベクター、その他のｎａｋｅｄ  ＤＮＡ、およびウイルスベクターを用いて実施することが可能である。ベクターのプロモーターは、投与した組織でＡｎｇ１を高発現できるように効率の高いものを用いることが好ましい。好ましくは上記のＣＡプロモーターが用いられる。より好ましい態様では、ウイルスベクターを用いてＡｎｇ１遺伝子を間葉系細胞に導入する。特に好ましいウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクターおよびマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが挙げられる。最も好ましくは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターが用いられる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いることで、Ａｎｇ１遺伝子を間葉系細胞において極めて高いレベルで発現させることが可能である。
ウイルスベクターを用いて間葉系細胞に遺伝子を導入するには、導入したい遺伝子を持つウイルスベクターを間葉系細胞に接触させる。ベクターと間葉系細胞との接触は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的水溶液中で実施すればよい。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入する場合は、ＭＯＩ（多重感染度；細胞１つあたりの感染ウイルス数）は１〜５００の間にすることが好ましく、より好ましくは１〜３００、さらに好ましくは１〜２００、さらに好ましくは１〜１００、さらに好ましくは１〜７０である。例えば、間葉系細胞を含む細胞分画とウイルスベクターとを混合することによって感染を実施することができる。マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いる場合は、ベクターと間葉系細胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば１分以上、好ましくは３分以上、５分以上、１０分以上、または２０分以上接触させればよく、例えば１〜６０分程度、より特定すれば５分〜３０分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば２４時間、数日間またはそれ以上接触させてもよい。接触は体内でも体外でも実施し得る。例えば、体内から取り出した間葉系細胞を体外でウイルスベクターと接触させ、ベクターを導入後に体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入において、ベクターとの接触時間が短くて済むマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターによる遺伝子導入方法は好適に用いられる。本方法により血管新生遺伝子を導入した間葉系細胞は、心虚血および四肢虚血等の遺伝子治療において有用である。
間葉系細胞の調製は例えばＴｓｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７（３）：３５４−６５に記載の方法に従って調製することができる。またヒト間葉系細胞の培養などに関しては、Ｋｏｂｕｎｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｍａｄａ  Ｈ，Ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎ  ｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ  ａｒｅａ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．３１（８）：７１５−２２，２００３の記載を参照することができる。調製した細胞は、すぐに治療に用いてもよく、また、１０から４０ＰＤ（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｏｕｂｌｉｎｇ）程度まで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養増殖させて用いることもできる。
より具体的に記載すると、間葉系細胞を含む細胞分画は、例えば、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇ／ｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。また、脊椎動物から採取した臍帯血細胞を上記と同様に調製し、細胞分画として利用することもできる。
具体例を示せば、まず、脊椎動物より採取した骨髄液（５−１０μｌ）を溶液（Ｌ−１５を２ｍｌ＋Ｆｉｃｏｌを３ｍｌ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）し、単核細胞分画（約１ｍｌ）を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（ＤＭＥＭ  ２ｍｌ）に混合して、再度、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収する。本発明の細胞分画の採取源としては、大腿骨以外にも、胸骨や、骨盤を形成している腸骨から採取することもできる。これらの骨以外でも大きい骨であれば採取可能である。また、骨髄バンクに保存してある骨髄液や臍帯血から採取することも可能である。臍帯血細胞を利用する場合には、骨髄バンクに保存してある臍帯血から採取することも可能である。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞より単離・精製して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画である。中胚葉幹細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＳＨ２等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、心血管系細胞へ分化しうる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）を含む細胞分画は、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、９００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、細胞の由来する動物の種類（例えば、ヒト、ラット、マウス）により変動しうる。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるが、これらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液（２５ｍｌ）または臍帯血を同量のＰＢＳ溶液に混合し、遠心（９００ｇで１０分間）し、沈降細胞をＰＢＳに混合して回収（細胞密度は４×１０７細胞／ｍｌ程度）することにより、血液成分を除去する。その後、そのうち５ｍｌをＰｅｒｃｏｌ液（１．０７３ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（９００ｇで３０分間）し、単核細胞分画を抽出する。細胞の洗浄のために、抽出した単核細胞分画を培養溶液（ＤＭＥＭ，１０％  ＦＢＳ，１％  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転で１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去し、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ２  ｉｎ  ａｉｒ）。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞より分離して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分化しうる間質細胞を含む細胞分画である。間質細胞は、例えば、Ｌｉｎ（−）、Ｓｃａ−１（＋）、ＣＤ１０（＋）、ＣＤ１１Ｄ（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ４５（＋）、ＣＤ７１（＋）、ＣＤ９０（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤＷ１２３（＋）、ＣＤ１２７（＋）、ＣＤ１６４（＋）、フィブロネクチン（＋）、ＡＬＰＨ（＋）、コラーゲナーゼ−１（＋）の特徴を有する細胞である。間質細胞を含む細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記Ｌｉｎ等の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、脊椎動物から採取した骨髄細胞、臍帯血細胞を、８００ｇで比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる一定の比重の細胞分画を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。回収する細胞分画の比重は、好ましくは１．０７ｇ／ｍｌから１．０８ｇ／ｍｌの範囲（例えば、１．０７７ｇ／ｍｌ）である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した骨髄液または臍帯血を同量の溶液（ＰＢＳ＋２％ＢＳＡ＋０．６％クエン酸ナトリウム＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン）溶液に混合し、そのうちの５ｍｌをＦｉｃｏｌ＋Ｐａｑｕｅ液（１．０７７ｇ／ｍｌ）と混合し、遠心（８００ｇで２０分間）し、単核細胞分画を抽出する。この単核細胞分画を細胞の洗浄のために培養溶液（Ａｌｆａ  ＭＥＭ，１２．５％  ＦＢＳ，１２．５％ウマ血清，０．２％  ｉ−イノシトール，２０ｍＭ葉酸，０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１μＭヒドロコルチゾン，１％  ａｎｔｉ−ｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に混合し、遠心（２０００回転、１５分間）する。次いで、遠心後の上澄みを除去した後、沈降した細胞を回収し、培養する（３７℃、５％ＣＯ２  ｉｎ  ａｉｒ）。
本発明の細胞分画の他の態様は、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、または胎児肝細胞より分離して得た単核細胞分画であって、心血管系細胞へ分化しうるＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を含む細胞分画である。この細胞分画は、例えば、骨髄細胞、臍帯血細胞、あるいは末梢血細胞から遠心分離して得た上記の細胞分画の中から、上記ＡＣ１３３（＋）の細胞表面マーカーを有する細胞を選択することにより得ることができる。
また、その他の態様として、脊椎動物から採取した胎児肝細胞を、２０００回転で比重に応じた分離に十分な時間、溶液中にて密度勾配遠心を行ない、遠心後、比重１．０７ｇ／ｍｌから１．１ｇ／ｍｌの範囲に含まれる細胞分画を回収し、この細胞分画から、ＡＣ１３３（＋）の特徴を有する細胞を回収することにより調製することができる。ここで「比重に応じた分離に十分な時間」とは、密度勾配遠心のための溶液内で、細胞がその比重に応じた位置を占めるのに十分な時間を意味する。通常、１０〜３０分間程度である。密度勾配遠心のための溶液としては、Ｆｉｃｏｌ液やＰｅｒｃｏｌ液を用いることができるがこれらに制限されない。
具体例を示せば、まず、脊椎動物から採取した肝臓組織をＬ−１５溶液内で洗浄し、酵素処理（Ｌ−１５＋０．０１％ＤＮａｓｅＩ，０．２５％トリプシン，０．１％コラーゲナーゼを含む溶液中で、３７℃で３０分間）し、ピペッティングにより単一細胞にする。この単一細胞となった胎児肝細胞から、大腿骨から単核細胞分画を調製する場合と同様に、遠心分離を行なう。これにより得られた細胞を洗浄し、洗浄後の細胞からＡＣ１３３抗体を利用してＡＣ１３３（＋）細胞を回収する。これにより胎児肝細胞から心血管系細胞へ分化しうる細胞を調製することができる。抗体を利用したＡＣ１３３（＋）細胞の回収は、マグネットビーズを利用して、または、セルソーター（ＦＡＣＳなど）を利用して行なうことができる。
また、上記細胞分画に含まれる心血管系細胞に分化し得る細胞として、例えば、上記細胞分画に含まれる中胚葉幹細胞（間葉系幹細胞）、および間質細胞、ＡＣ１３３陽性細胞が含まれるが、心血管系細胞に分化し得る限り、これらに制限されない。
また本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを口腔扁平上皮細胞に接触させる工程を含む、遺伝子改変された口腔扁平上皮細胞の製造方法に関する。また本発明は、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターをマクロファージに接触させる工程を含む、遺伝子改変されたマクロファージの製造方法に関する。さらに本発明は、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む、遺伝子改変された樹状細胞の製造方法に関する。一般に導入遺伝子の高発現が期待されるアデノウイルスベクターと比べても、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、口腔扁平上皮細胞、マクロファージ、および樹状細胞に対して、はるかに高い効率で遺伝子を導入できることが判明した。従って、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターは、口腔扁平上皮細胞（口腔扁平上皮癌細胞を含む）、マクロファージ、および樹状細胞への遺伝子導入に極めて有用である。すなわち本発明は、（ｉ）遺伝子改変された口腔扁平上皮細胞の製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを口腔扁平上皮細胞に接触させる工程を含む方法、（ｉｉ）遺伝子改変されたマクロファージの製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む方法、および（ｉｉｉ）遺伝子改変されたマクロファージの製造方法であって、遺伝子を搭載するマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを樹状細胞に接触させる工程を含む方法に関する。さらに本発明は、これらの方法により製造された遺伝子改変細胞にも関する。これらの細胞の遺伝子改変は、口腔扁平上皮癌の遺伝子治療、癌および免疫疾患の遺伝子治療における免疫系の制御などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、正常または梗塞ラット心へのアデノウイルス遺伝子導入によるＬａｃＺ発現を示す図である。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つアデノウイルスベクター（１×１０９〜１×１０１０ｏｐｕ）を、正常または梗塞後のラット心前壁（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｗａｌｌ）に注入した。遺伝子投与の５日後にラットを屠殺し、摘出した心臓を組織溶解液中でホモジェナイズした。心ホモジェネートのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。白いバーは偽手術（正常）心、灰色のバーは梗塞心を示す。
図２は、ラットの偽手術心または梗塞心のＬａｃＺ陽性域の分布を示す写真である。（Ａ）Ｘ−ｇａｌ染色した心臓の全体図。上段パネル，ＡｘＣＡＺ３（１ｘ１０１０ｏｐｕ）を心筋内注入した正常（偽手術）心。中段パネル，生理食塩水を注入した梗塞心。下段パネル，ＡｘＣＡＺ３（１ｘ１０１０ｏｐｕ）を心筋内注入した梗塞心。左パネル，右室側より観察、中央のパネル，腹側（正面）より観察、右パネル，左室側より観察。実線の矢印（黄色）は左冠状動脈（ＬＡＤ）の結紮部位を示し、破線の矢印（白）は注入部位を示す。矢尻（赤）で囲んだ領域は梗塞域心筋を表す。（Ｂ）Ｘ−ｇａｌ染色した心筋梗塞心の横断面。梗塞心を結紮部位と心尖部との中間および下１／４部位で水平に切断した。薄い灰色の領域，梗塞域、濃い灰色の領域，Ｘ−ｇａｌ陽性心筋。ＬＶ，左心室、ＲＶ，右心室。
図３は、偽手術心および梗塞心のアデノウイルスによるＡｎｇ１の発現を示す写真である。遺伝子導入の５日後の正常心および梗塞心において、ヒトＡｎｇ１特異的ｍＲＮＡの発現をＰＣＲにより調べた。（Ａ）ヒトＡｎｇ１特異的発現。レーン１：長さのマーカーとしての１００塩基対ＤＮＡラダー、レーン２：陽性対照（ＡｘＣＡｈＡｎｇ１を感染させたＨｅＬａ細胞）、レーン３：正常心、レーン４：ＡｘＣＡＺ３を注入した心臓、レーン５：ＡｘＣＡｈＡｎｇ１を注入した正常心、レーン６：ＡｘＣＡｈＡｎｇ１を注入した梗塞心。（Ｂ）内部対照としての対応する細胞・組織のラットＧＡＰＤＨの発現。長さのマーカーの最も明るいバンドは５００塩基対の長さである。
図４は、梗塞心の様々な領域の毛細血管密度を示す図および写真である。ＣＤ３４陽性の毛細管密度を各領域で測定した（Ａ，梗塞壁、Ｂ，中隔壁、Ｃ，梗塞域と隣接する境界領域）。抗ＣＤ３４モノクローナル抗体で染色された毛細管数をブラインドで計数し、毛細管密度を数／ｍｍ２で表した。＊：ｐ＜０．０１を示す。
図５は、偽手術心および梗塞心の組織学的所見を示す写真である。心筋梗塞の４週間後、心臓を摘出しＭａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（Ａ〜Ｄ）、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体による免疫染色（Ｅ〜Ｈ）、および抗α−ＳＭＡモノクローナル抗体による免疫染色（Ｉ〜Ｌ）を行なった。偽手術心（Ａ，Ｅ，Ｉ）、生理食塩水の対照（Ｂ，Ｆ，Ｊ）、アデノウイルスの対照（Ｃ，Ｇ，Ｋ）、Ａｎｇ１処置心（Ｄ，Ｈ，Ｌ）。バーは５０μｍを表す。
図６は、エコーカルヂオグラフィーによる収縮末期（ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｅ）および拡張末期（ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｅ）の長軸図を示す写真である。心筋梗塞の４週間後、エコーカルヂオグラフィーにより心機能を評価した。２次元エコーカルヂオグラフによる長軸断面が示されている。上パネル，収縮末期の図；下パネル，拡張期の図。矢尻の間の領域は梗塞した前壁を示す。破線で囲んだ領域は左室腔を示す。
図７は、マウス急性下肢虚血モデルにおけるＡｎｇ１発現アデノウイルスベクターの単独投与による壊死抑制効果を示す写真である。
図８は、ラット骨格筋（Ａ）および心臓（Ｂ）におけるｎａｋｅｄ  ＤＮＡの注入によるＬａｃＺ発現を示す図である。図示した量のプラスミド（２０μｇ）を下肢大腿筋または心臓心尖に注入した（ｎ＝４）。プラスミド注入の４日後にＧａｌａｃｔｏ−ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓ  ｋｉｔを用いてβ−ｇａｌ活性を測定し、筋または心当たりのｎｇ活性ＬａｃＺとして表した。バーは標準誤差を表す。
図９は、ラット心へのｎａｋｅｄ  ＤＮＡ注入とアデノウイルスベクター注入におけるＬａｃＺ発現の比較を示す図である。２０μｇのｐＣＡＺ２または様々な量のＡｘＣＡＺ３を心筋に注入した。バーは標準誤差を表す（ｎ＝４）。
図１０は、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターおよびセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターの心筋細胞への遺伝子導入効果を示す図である。ＬａｃＺをコードするアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＺ３）およびＳｅＶベクター（ＳｅＶＡｎｇ１）を、ｍｏｉおよび感染時間を変えてラット心筋細胞に導入し、β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅの発現を測定した。
図１１は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与における心筋へのアデノウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターの遺伝子導入を示す図である。ＬａｃＺ発現ＡｄＶまたはＳｅＶを心筋内投与して３日後のレポーター遺伝子発現を示す。
図１２は、ＡｄベクターおよびＳｅＶベクター静脈または心筋内投与による遺伝子発現の臓器分布を示す図である。１×１０８ＣＩＵのＳｅＶＬａｃＺまたは１ｘ１０１０ｏｐｕのＡｘＣＡＺ３を正常ラット陰茎静脈より投与し、７２時間後に摘出した臓器におけるＬａｃＺ発現を測定した。また、ＳｅＶベクターの心筋内投与後の各臓器のＬａｃＺ発現を測定した。
図１３は、ＳｅＶベクターを用いたラット梗塞心へのＡｎｇ１遺伝子導入による心筋梗塞治療効果を示す図である。５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１をＬＡＤ還流域周囲の左室前壁に２カ所に分け注射し、４週間後に測定した梗塞サイズおよび梗塞厚を示す。
図１４は、ラット梗塞心へのＳｅＶベクターを用いたＡｎｇ１遺伝子導入による心筋梗塞治療効果を示す図である。５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１をＬＡＤ還流域周囲の左室前壁に２カ所に分け注射し、４週間後に測定した心筋内血管密度を示す。
図１５は、ラット下肢虚血モデルに対するＳｅＶを用いたＡｎｇ１遺伝子導入による治療効果を示す図である。大腿動脈結紮ラットの大腿直筋２ヶ所に５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１を投与し、虚血後２週間にわたりレーザードップラー血流イメージ解析により血流測定を行った。正常側の下肢血流に対する虚血側の下肢血流の比（組織血流比：虚血側血流／正常側血流）を示す。
図１６は、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターおよびセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターの間葉系細胞（ＭＳＣ）の遺伝子導入を示す図である。ＬａｃＺをコードするアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＺ３）およびＳｅＶベクター（ＳｅＶＡｎｇ１）を、ｍｏｉを変えてラットＭＳＣに導入し、β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅの発現を測定した。
図１７は、アデノウイルス（Ａｄ）ベクターおよびセンダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターによりＬａｃＺ遺伝子を導入したＭＳＣのＸ−ｇａｌ染色を示す写真である。
図１８は、Ａｎｇ１導入ＭＳＣを用いた虚血肢治療の治療効果を示す図である。
図１９は、培養細胞株へのＳｅＶベクターによる遺伝子導入を、アデノウイルスベクターと比較した結果を示す図および写真である。
図２０は、アデノウイルス抵抗性ヒト口腔扁平上皮癌細胞株に対するＳｅＶベクターの遺伝子導入を示す図である。
図２１は、ヒトマクロファージおよびヒト樹状細胞に対するＳｅＶベクターの遺伝子導入を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１発現アデノウイルスベクター
ヒトＶＥＧＦ遺伝子はヒトグリオーマ細胞株Ｕ２５１由来のｃＤＮＡからＰＣＲ法にてクローニングし得られたＶＥＧＦ遺伝子の塩基配列はＢｉｇ−ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）によりシークエンスを確認した。同様にヒトＡｎｇ１遺伝子はヒト骨髄細胞ｃＤＮＡよりＰＣＲ法によりクローニングし、塩基配列を確認した。得られたＡｎｇ１遺伝子の塩基配列をジーンバンクＵ８３５０８と比較したところ９３３番目の塩基がＡからＧへ置換されていたことを除き同一であった。本塩基置換によるＡｎｇ１蛋白質のアミノ酸配列はジーンバンクＵ８３５０８と同一であった。これらのクローニングされたＶＥＧＦ／Ａｎｇ１  ｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ．１０８：１９３−１９９）由来のｐＣＡｃｃベクター（ＷＯ０２／１００４４１；Ｉｔｏ．，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：Ｓ１６２）のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ制限酵素サイト間に挿入し、ＶＥＧＦ／Ａｎｇ１発現ベクターであるｐＣＡｈＶＥＧＦおよびｐＣＡｈＡｎｇ１を作製した。ＶＥＧＦ／Ａｎｇ１発現アデノウイルスは斎藤らにより開発されたＣＯＳ−ＴＰＣ法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３２０−１３２４（１９９６））を用い作製した。ｐＣＡｈＶＥＧＦおよびｐＣＡｈＡｎｇ１をＣｌａＩ制限酵素により切断し得られるＶＥＧＦ／Ａｎｇ１  ｃＤＮＡ、ＣＡプロモーターを含む遺伝子発現ユニットをアデノウイルス５型遺伝子の一部を含むコスミドｐＡｘｃｗ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：６１３−６２６）のＣｌａＩ制限酵素部位に挿入しｐＡｘＣＡｈＶＥＧＦ／Ａｎｇ１を作製した。ｐＡｘＣＡｈＶＥＧＦ／Ａｎｇ１と５型アデノウイルス全長を含むＤＮＡ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＴＰＣ）のＥｃｏＴ２２Ｉ制限酵素切断産物をリン酸カルシウム共沈法により２９３細胞に遺伝子導入し、改変アデノウイルスを含むプラークを回収した（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５２：４５６−４６７）。個々のプラークのアデノウイルスを制限酵素切断パターンで確認しさらにＰＣＲを用い野生ウイルスの混入がないことを確認し、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１発現アデノウイルスベクターであるＡｘＣＡｈＶＥＧＦ、ＡｘＣＡｈＡｎｇ１を得た。ラット心筋梗塞モデルにはＣｓＣｌ不連続密度勾配を用いた超遠心法により精製した後、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ添加ＰＢＳにて透析をした精製アデノウイルスを用いた（Ｋａｎｅｇａｅ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１）。精製アデノウイルスベクターの濃度（ｏｐｕ／ｍｌ，ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）は０．１％ＳＤＳ存在下でのＡ２６０により測定し以下の式を用い決定した（Ｎｙｂｅｒｇ−Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３：８０８−８１１）。
ｏｐｕ＝Ａ２６０ｘ（１．１  ｘ  １０１２）
ウイルス力価（ｐｆｕ：ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）は２９３細胞を用いた限界希釈法により決定した（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９３：１３２０−１３２４）。コントロールアデノウイルスとしてＥ．ｃｏｌｉ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ遺伝子を発現するＡｘＣＡＺ３（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：６１３−６２６）を用いた。このベクターは、挿入したｃＤＮＡ以外はＡｘＣＡｈＡｎｇ１と同一である。今回用いたウイルスベクターのＡｘＣＡｈＡｎｇ１、ＡｘＣＡｈＶＥＧＦおよびＡｘＣＡＺ３のｏｐｕ／ｐｆｕ比はそれぞれ１３．３，２８．０，８０．０であった。
［実施例２］  アデノウイルスベクターによる梗塞心での遺伝子発現
これまで梗塞心では、正常心と比べ外来遺伝子発現が極めて低いことが報告（Ｌｅｏｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２８：２０５７−２０６７）されていたことから、治療実験を行う前にラット心筋梗塞モデルにおいてアデノウイルスで遺伝子導入した際に十分な遺伝子発現がされるか否かを検討した。
ラット心筋梗塞モデルの作製
ラット心筋梗塞モデルはＰｆｅｆｆｅｒらの方法（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．４４：５０３−５１２，１９７９）にしたがい作製した。Ｌｅｗｉｓラット（８週齢、雄、体重約３００ｇ）をジエチルエーテル吸入およびケタミン７０ｍｇ／ｋｇ，キシラジン６〜７ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与にて麻酔後，挿管した。その後、分時換気量２００〜２５０ｍｌ、１回換気量３ｍｌ、呼吸回数６０〜８０回／ｍｉｎ、Ｏ２１１／ｍｉｎ、ハロセン０．５〜２．０％の条件で吸入麻酔を行い、左側胸部より開胸した。左前下行枝（ＬＡＤ）を確認し６−０の非吸収糸（ナイロン糸）を用い，左前下行枝を左心耳の高さで結紮した。結紮後、呼気終末陽圧式人工呼吸（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｎｄ−ｅｘｐｉｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で肺を拡張させた。肺を傷つけないように肋間を閉じた後，筋層，皮膚と連続縫合にて閉創した。対照の偽手術では、冠動脈を結紮しない以外は同様に手術を行なった。アデノウイルスベクターの心筋内投与は、左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右二ヶ所に３０Ｇ針を用い５×１０９ｏｐｕ／５０μｌ（総量１×１０１０ｏｐｕの場合）ずつアデノウイルスベクターを心筋内投与した。
心筋内ＬａｃＺ遺伝子発現の検討
アデノウイルスベクター投与によるラット心筋でのＥ．ｃｏｌｉ  β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子発現をＸ−ｇａｌ染色（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：５７５７−５７６０）により確認した。ＡｘＣＡＺ３  １×１０１０ＯＰＵ／１００μｌを心筋内投与５日後、深麻酔下に２％  ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｉｄｅを全身に還流し臓器を固定した。摘出した固定後の心臓をＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ，１ｍｇ／ｍｌ  Ｘｇａｌ）に３０℃で１６時間浸し染色した。また心臓でのβ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子発現をＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ｐｕｌｓ  ｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）とβ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ標準標本（Ｒｏｃｈｅ）を用い、β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ酵素活性を定量的にて検討した（Ｓｈａｐｅｒ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４０），２５１６５−２５１７１，１９９４）。ＡｘＣＡＺ３  １  ｘ  １０９〜１  ｘ  １０１０ｏｐｕを心筋内投与５日後にラットを屠殺、摘出心をＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．８，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．２ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，５μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）存在下でｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅした。１２，５００ｘｇ，１０ｍｉｎ遠心後、上清中の内因性β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ活性を失活するため４８℃、１時間インキュベートした（Ｙｏｕｎｇ  ＤＣ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ．２１５，２４−３０，１９９３）。
上清中の酵素活性はＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ｐｕｌｓを用い室温で１時間反応後、化学発光をＭｉｎｉ−Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ，Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い測定した。得られた結果（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）は組み換えβ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ標準標本（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた標準曲線により、β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ活性（ｐｇ／ｍｌ）に変換した。
アデノウイルスベクターの心筋内投与は以下のごとく施行した。左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右二ヶ所に３０Ｇ針を用い５×１０９ｏｐｕ／５０μｌ（総量１×１０１０ｏｐｕの場合）ずつアデノウイルスベクターを心筋内投与した。正常心および梗塞心の２ヶ所に分け心筋内投与し、５日後にその発現を測定した。図１に示すごとく５ｘ１０９ｏｐｕ以上のアデノウイルスベクター投与により正常心、梗塞心で明らかな遺伝子発現を認め、梗塞心でも正常心とほぼ同等の発現であった。導入遺伝子の発現は用量依存的であり、アデノウイルスの用量の増加に従って発現も増加した。また梗塞心での遺伝子発現の分布は図２（Ａ）に示すように遺伝子導入部である前側壁を中心に広範囲に認められたが、横断面でのＸ−ｇａｌ染色像（図２（Ｂ））で明らかなように梗塞部心筋および中隔部、右室心筋での遺伝子発現は認めなかった。
［実施例３］  ＶＥＧＦおよびＡｎｇ１遺伝子導入による心筋梗塞後生存率
アデノウイルス１ｘ１０１０ｏｐｕにより梗塞心筋で明らかな遺伝子発現を認めたことから血管新生因子遺伝子によるラット心筋梗塞モデルの治療を行った。また慢性心筋虚血に対しすでに効果が示されているＶＥＧＦ遺伝子による心筋梗塞治療効果を同時に検討した。心筋梗塞後未治療群、コントロールアデノウイルス投与群、ＡｘＣＡｈＶＥＧＦ投与群、ＡｘＣＡｈＡｎｇ１投与群の心筋梗塞４週後のラット生存率を算出した。モデル作製２４時間以内の死亡ラットは本算出より除外した。
また、ベクターを投与した心臓におけるＡｎｇ１の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた（図３）。アデノウイルスベクターによる遺伝子導入（１×１０１０ｏｐｕ／心）の５日後に心臓を摘出し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｋ．Ｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により左心室心筋から抽出した。心筋全ＲＮＡ中のＤＮＡのコンタミネーションを避けるため、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて説明書に従ってＤＮａｓｅＩ消化を行った。第一鎖ｃＤＮＡ合成はランダムプライマーミクスチャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＳｅｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡのランダムプライマー法により行なった。アデノウイルスベクターから転写されたヒトＡｎｇ１特異的ｍＲＮＡは、ヒトＡｎｇ１特異的フォワードプライマーと、Ａｎｇ１発現単位のターミネーター部位にあるウサギβグロブリンに対するリバースプライマーを用いて検出した。また内部対照としてラットｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）をＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ヒトＡｎｇ１フォワードプライマー、ウサギβグロブリンリバースプライマー、およびＧＡＰＤＨプライマーを以下に示した。
ヒトＡｎｇ１プライマー
2004074494.tif 000002
ウサギβグロブプライマー
2004074494.tif 000003
ウサギＧＡＰＤＨプライマー
2004074494.tif 000004
３０サイクルのＰＣＲを行い、ヒトＡｎｇ１  ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出した。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルで分離した。ヒトＡｎｇ１  ｍＲＮＡの陽性対照として、１００ｏｐｕ／ｃｅｌｌでＡｘＣＡｈＡｎｇ１を感染させたＨｅＬａ細胞から抽出した全ＲＮＡを用いた。
ラットＧＡＰＤＨ遺伝子由来の産物（内部対照）は全ての心筋ＲＮＡ試料で４０７ｂｐの位置に等しく検出された（図３）。ヒトＡｎｇ１に特異的な４５３ｂｐのＰＣＲバンドを、ＡｘＣＡｈＡｎｇ１投与したラット心サンプル、ＡｘＣＡｈＡｎｇ１を用い遺伝子導入したＨｅＬａ細胞サンプルに認めた。また正常心、ＡｘＣＡＺ３投与心ではヒトＡｎｇ１に特異的なバンドは認められなかった。
心筋梗塞モデルにおけるモデル作製２４時間以内の死亡を抜いた死亡率は約２５％であり、コントロールアデノウイルスＡｘＣＡＺ３を投与した群では死亡率２０％とアデノウイルス投与による死亡率への影響は軽微であった。まず慢性心筋虚血に対し既に効果が示されているＶＥＧＦ遺伝子による心筋梗塞治療効果を検討したところ、ＶＥＧＦ遺伝子投与群では心筋梗塞４週後死亡率が約４０％とむしろ増加することが明らかとなった。一方、１ｘ１０１０ｏｐｕのＡｘＣＡｈＡｎｇ１を投与群では８％と死亡率の低下が認められた（表１）。
このことから急性心筋梗塞ではＶＥＧＦよりＡｎｇ１がより有効であることが明らかとなった。
2004074494.tif 000005
［実施例４］  Ａｎｇ１遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子による心筋梗塞後血管誘導
ＶＥＧＦ遺伝子は強力な新生血管誘導作用があることが知られている。またＡｎｇ１はＶＥＧＦとの協同作用にて新生血管誘導を増強することが知られている。そこでＡｎｇ１遺伝子導入効果を直接証明するために、遺伝子投与した梗塞心での血管密度を測定した。心筋梗塞作製４週後の心筋内血管密度を、ＣＤ３４モノクロナール抗体を用いた血管内皮細胞の免疫組織染色により評価した。心臓をホルマリンで固定後パラフィン包埋し、１０μｍの切片を作製した。１次抗体としてＡｎｔｉ−ＣＤ３４モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）（ＮＵ−４Ａ１，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）使用し、ビオチン化ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２次抗体とアビジン化  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＤＡＢ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ＩＨＣ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ，Ｔｕｓｏｎ，ＡＺ）を用い染色した。サブタイプが同一のマウスＩｇＧを用いて一次抗体の特異性を確認した。心室中隔、梗塞部周辺領域、心筋梗塞巣内残存心筋での切片内の血管数を２００倍拡大し顕微鏡下でブラインドにて測定した。心臓当たり４０の切片のそれぞれに対して、ランダムに選んだ５つの視野について計数した。染色された血管を、梗塞領域、境界領域、および中隔壁について計数した。結果は血管数／ｍｍ２の平均値として表記した。また、成熟血管を確認するため、抗α−ＳＭＡ  ＭｏＡｂ（ｃｌｏｎｅ  １Ａ４，Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、抗ＣＤ３４  ＭｏＡｂと同様に染色を行なった。α−ＳＭＡ陽性の血管は、上記の毛細管密度の計数と同様に行なった。
梗塞心では正常心に比べ梗塞部、梗塞周囲部心筋で血管密度の低下が認められた（図４）。ＶＥＧＦあるいはＡｎｇ１をアデノウイルスにより投与したところ、その梗塞部、梗塞周囲心筋で有意な血管密度の増加が認められ、特に遺伝子投与部近傍である梗塞周囲部では正常心筋よりさらに増加していた（梗塞周囲心筋の血管密度は、Ａｎｇ１処理群では６４４±９６／ｍｍ２、生理食塩水処理群では３５０±７９／ｍｍ２（ｐ＜０．０１  ｖｓ  Ａｎｇ１処理群）、ＡｘＣＡＺ３処理群では３３２±１２７／ｍｍ２（ｐ＜０．０１  ｖｓ  Ａｎｇ１処理群）、偽手術群では４０２±１２１／ｍｍ２）。Ａｎｇ１処理群では、血管腫は肉眼でも顕微鏡でも観察されなかった。興味深いことに、生食投与群およびＡｘＣＡＺ３投与群では、遺伝子投与部位から離れた心室中隔部でも心筋梗塞後４週目で血管数の減少を認め（それぞれ３４１±６０／ｍｍ２および３６７±１１３／ｍｍ２）、Ａｎｇ１遺伝子（４６１±１００／ｍｍ２）またはＶＥＧＦ遺伝子の投与によりこの中隔部での血管数の減少は抑制された（偽手術群では４８３±４６／ｍｍ２）。図５にａｎｔｉ−ＣＤ３４  ＭｏＡｂによる血管内皮の免疫染色像を示すがＡｎｇ１遺伝子投与群では１０μｍ以下のｍｉｃｒｏ  ｖｅｓｓｅｌの増加とともに１０μｍ以上のｖｅｓｓｅｌの増加も観察された（Ａｎｇ１処置した梗塞心の左心室領域では、全ての試料で多数のα−ＳＭＡ陽性血管が観察された；中隔領域で３８．９±７．３５／ｍｍ２、梗塞境界域で３８．９±４．８１／ｍｍ２、梗塞域で１１２±２６．１／ｍｍ２）。Ａｎｇ１処理群を除くいずれの群でも、１０μｍを超えるα−ＳＭＡ陽性の血管密度は有意に変化しなかった（１９−２２／ｍｍ２）。またＡｎｇ１単独の遺伝子投与でもＶＥＧＦ遺伝子投与と同程度の血管密度の増加が観察された（図４）。
［実施例５］  Ａｎｇ１遺伝子による心筋梗塞巣の縮小
心筋梗塞モデルでのＡｎｇ１遺伝子による梗塞巣への影響を確認した。以下のように、心筋梗塞域の測定を行なった。心筋梗塞４週後の梗塞域のサイズをＥｄｅｌｂｅｒｇら（Ｅｄｅｌｂｅｒｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５，６０８−６１３，２００１）の方法およびＲｏｂｅｒｔｓらの方法（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＣＳ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５１，８７２−８７６，１９８３）に従い測定した。モデル作製後、４週後にラットを屠殺し梗塞心を摘出、冷生理食塩水に浸して心室から余分な血液を除去した後、４％ｆｏｒｍａｌｄｅｈｉｄｅで４８時間固定、ｐａｒｒａｆｉｎ包埋し、１０μｍの切片を作製した。左前下行枝結紮部と心尖部の中間部位にて短軸方向に切片を作製、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ−Ｅｏｓｉｎ染色、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色にて梗塞部を染色した。切片をデジタルカメラにて取り込みＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて以下のパラメーターをブラインドにて測定した。
総左心室（ＬＶ）域（Ｔｏｔａｌ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（ＬＶ）ａｒｅａ）（ｍｍ２），梗塞域（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｒｅａ）（ｍｍ２），中隔壁厚（ｓｅｐｔａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（ｍｍ），梗塞壁厚（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（ｍｍ），ＬＶの心外膜側周および心内膜側周（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ＬＶ）（ｍｍ），心外膜側および心外膜側の梗塞長（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）（ｍｍ）。
これらの結果から以下の式を用い評価を行った。
％梗塞サイズ（％  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ）＝梗塞域／総ＬＶ域  ｘ  １００
％前／中隔壁厚（％  Ａｎｔ／ｓｅｐｔａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）＝前壁（梗塞）厚／中隔壁厚  ｘ  １００
生存ＬＶ域（ｖａｉａｂｌｅ  ＬＶ  ａｒｅａ）＝（総ＬＶ心筋域）−（梗塞心筋域）；
％心内膜側梗塞長（％  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｒａｃｔ  ｌｅｎｇｔｈ）＝梗塞の心内膜側長／ＬＶの心内膜側周  ｘ  １００；
％心外膜側梗塞長（％  ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｒａｃｔ  ｌｅｎｇｔｈ）＝梗塞の心外膜側長／ＬＶの心外膜側周  ｘ  １００；
図５に示すように梗塞心筋では梗塞巣さらには左室残存心筋全体にわたる心筋壁のひ薄化、左室内腔の拡大傾向を認め心不全兆候が明らかである。表２に示すようにＡｎｇ１遺伝子投与群でコントロールと比べ有意な梗塞域の縮小（％梗塞サイズ（％ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ））、さらに残存心筋量の有意な増加（％生存ＬＶ域（％  ｖｉａｂｌｅ  ＬＶ  ａｒｅａ））を認め、Ａｎｇ１の心筋梗塞巣の縮小効果とともに残存心筋に対する効果も明らかであった。また梗塞壁厚を反映する％梗塞厚（％ｉｎｆａｒｃｔ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）でも有意な増加をＡｎｇ１投与群で認めた。
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（表の説明）値は平均±ＳＤで示した。ＬＶは左心室を示す。心筋梗塞の４週間後にラットを屠殺した。全てのパラメーターは、心臓の冠動脈結紮部位と心尖部の中間部横断面で測定した。統計解析はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎの検定によＡＮＯＶＡを用いて行なった。
［実施例６］  Ａｎｇ１遺伝子による心筋梗塞後心機能の改善
Ａｎｇ１による梗塞心での血管新生作用、心筋梗塞巣縮小効果が明らかとなったが、はたしてこれらの効果が心機能の改善に結びついているか否かを検討した。心機能の計測は心エコーを用いＭ−ｍｏｄｅ法、Ｂ−ｍｏｄｅ長軸断を用いたＡｒｅａ−ｌｅｎｇｔｈ法により評価した。
具体的には、ＬＡＤ結紮の４週間後にエコーカルヂオグラム（ＬＯＧＩＱ５００，ＧＥ  Ｙｏｋｏｋａｗａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて心機能測定を行った。測定中は、塩酸ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）を筋注により麻酔を行なった。１０−ＭＨｚプローブを用いｌｏｎｇ  ａｘｉｓ  ｖｉｅｗによりＭモードの計測部位を決定した。Ｍモード法により左室拡張終末期径Ｅｄｄ（ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ），左室収縮終末期径Ｅｓｄ（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）を計測し左室短径短縮率（ＦＳ，ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）を算出した。
ＦＳ（％）＝（Ｅｄｄ−Ｅｄｓ）／Ｅｄｄ  ｘ  １００
またＢモードにて心の左室長軸断を描出し、拡張期左室面積（ＬＶＡｄ，ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａ  ａｔ  ｄｉａｓｔｏｌｅ）、収縮期左室面積（ＬＶＡｓ，ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａ  ａｔ  ｓｙｓｔｏｌｅ）、拡張期左室長軸径（ＬＶＬｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｏｎｇ−ａｘｉｓ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｔ  ｄｉａｓｔｏｌｅ）、収縮期左室長軸径（ＬＶＬｓ，ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｏｎｇ−ａｘｉｓ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｔ  ｓｙｓｔｏｌｅ）を測定し以下の式により左室駆出率（ＥＦ，ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を算出した（Ａｒｅａ−ｌｅｎｇｔｈ法）（Ｓｊａａｓｔａｄ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８９：１４４５−１４５４）。
ＥＦ（％）＝［（０．８５ｘＬＶＡｄ２／ＬＶＬｄ）−（０．８５ｘＬＶＡｓ２／ＬＶＬｓ）］／（０．８５ｘＬＶＡｄ２／ＬＶＬｄ）  ｘ  １００
ラット心筋梗塞モデルでの心エコー長軸断層像を図６に示すが、梗塞心では梗塞部である左室前壁のひ薄化とエコー輝度の増加、左室内腔の拡大を明瞭に認め、組織像と同様に心不全所見を呈していた。
心エコーにて測定した各種のパラメーターを表３に示す。心筋梗塞後、生食コントロール群、アデノウイルスコントロール（ＡｘＣＡＺ３）群いずれもＥｄｄ，Ｅｓｄ，ＬＶＡｄ，ＬＶＡｓの著明な増加を認め、ＦＳ，ＥＦも正常心の４０−５０％と低下しており心筋梗塞後４週目には心エコーパラメーターでも心不全状態を呈していることが確認できた。一方、Ａｎｇ１遺伝子投与群ではＥｄｄ，Ｅｓｄ，ＬＶＡｄの有意な改善は認められなかったもののＦＳ，ＬＶＡｓはコントロールにくらべ増加し、ＥＦも５５％と改善していた。
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（表の説明）梗塞の４週間後、１×１０１０ｏｐｕのＡｘＣＡＺ３またはＡｘＣＡｈＡｎｇ１で処理した心臓の心機能を心エコーカルヂオグラフィーによるＭモードおよびＡｒｅａ−ｌｅｎｇｔｈ法を用いて測定した。値は平均±ＳＤで示した。Ｅｄｄは左室拡張終末期径（ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）、Ｅｓｄは左室収縮終末期径（ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｄｉａｍｅｔｅｒ）、ＦＳは左室短径短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、ＬＶＡｄは拡張期左室面積（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａ  ａｔ  ｄｉａｓｔｏｌｅ）、ＬＶＡｓは収縮期左室面積（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａ  ａｔ  ｓｙｓｔｏｌｅ）、ＦＡＣは左室内腔面積変化率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ａｒｅａ  ｃｈａｎｇｅ）、ＥＦは左室駆出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を表す。統計解析はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎの検定によるＡＮＯＶＡを用いて行なった。
［実施例７］  マウス急性下肢虚血モデルに対するＡｎｇ１遺伝子単独投与による壊死抑制効果
下肢急性虚血は、心筋虚血と同様に組織ＶＥＧＦ産生が亢進する。そこでマウス急性下肢虚血モデルを作製し、Ａｎｇ１発現アデノウイルスベクターの単独投与により虚血治療を試みた。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｍａｌｅ，２０−２５ｇ）を用いてＣｏｕｆｆｉｎｈａｌらの方法（Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５２（６）：１６６７−７９）に準じ下肢虚血モデルを作製した。全身麻酔下はケタラール（５０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）を筋注した。両下肢の悌毛後、左鼠径部を切開、左大腿動脈とその全分枝を露出した。大腿動脈起始部７−０ナイロン縫合糸を用いて結紮、さらに膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前で同様に結紮した。また他の全分枝を結紮後、左大腿動脈を切除・除去した。切開創を縫合閉鎖し手術を終了した。
Ａｎｇ１発現アデノウイルスＡｘＣＡｈＡｎｇ１（ｏｐｕ／ｐｆｕ比は１３．３）は上記と同様に作製した。ＡｘＣＡｈＡｎｇ１（１×１０１０ｏｐｕ／匹）を、下肢虚血を作製直後に左大腿部・内転筋及び左腓腹筋に２．５×１０９ｏｐｕ／２５μｌを各２カ所ずつ、計４カ所に２９Ｇ針付き１．０ｍｌ注射器により筋肉内投与した。対照群には虚血作製マウス５匹を使用した。モデル作製３日後、９または１０日後に壊死部の確認、肢指脱落、下肢脱落、潰瘍形成を肉眼により確認し、虚血の評価を行った。
対照群ではモデル作製３日後に壊死部の確認（３／５）（すなわち５例中３例）、肢指脱落（２／５）、下肢脱落（０／５）、潰瘍形成（１／５）を認め、さらに９日後には壊死部の確認（３／５）、肢指脱落（３／５）、下肢脱落（０／５）、潰瘍形成（１／５）と虚血の進行を認めた。一方、Ａｎｇ１群ではモデル作製３日後に壊死部の確認（０／５）、肢指脱落（０／５）、下肢脱落（０／５）、潰瘍形成（２／５）を認め、さらに９日後には壊死部の確認（３／５）、肢指脱落（１／５）、下肢脱落（０／５）、潰瘍形成（２／５）と虚血の進行が抑制されていた。結果を図７に示した。
Ａｎｇ１発現アデノウイルスの単独投与により、肢指脱落、下肢脱落の明らかな抑制効果を認めた。虚血３日目の患肢の状況を検討したところＡｎｇ１投与肢では対照に比べ明らかに虚血による変化は軽減されていた。血管新生には萌出、分岐など多くのステップがある。特に組織還流を促す機能的な血管の形成には動脈新生（ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が関与し、主に虚血１０日以後と血管新生の後期に観察される。したがって今回観察されたＡｎｇ１の早期の効果は血管新生によるものとは考え難く、血管新生以外の機序が推定される。Ａｎｇ１はＴｉｅ−２を介しＰＩ３キナーゼを活性化し、抗アポトーシス作用有するＡｋｔを活性化することが知られている。またＴｉｅ−２を介し血管内皮アポトーシス抑制効果を有するＮＯ産生を亢進させる。これらのＡｎｇ１の作用により血管内皮細胞のアポトーシスを抑制し、虚血の進展を抑制した可能性がある。
急性虚血によりもたらされるＶＥＧＦの産生亢進は組織浮腫を増悪させ、組織還流の更なる低下をもたらすと推定される。実際、本モデルでＶＥＧＦを高発現させると、下肢の壊死脱落を促進することが報告されている。本実施例においては、Ａｎｇ１を虚血急性期に投与することにより還流低下につながる浮腫の進展を抑制したと推測される。Ａｎｇ１投与群では９日目でも肢指脱落を伴う高度の壊死は１例に観察されるのみであった。
以上、急性下肢虚血モデルにＡｎｇ１を投与することにより壊死の進展を抑制し、壊死後の肢脱落より救肢できることが確認された。
［実施例８］  Ｎａｋｅｄプラスミドによる骨格筋および心筋へのＡｎｇ１遺伝子導入
Ｎａｋｅｄプラスミドを直接組織に注入することは、最も安全で簡便な遺伝子送達方法であり、これまで承認された臨床の心血管遺伝子治療プロトコルの多くにおいて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをベースにしたプラスミドが採用されている。Ｎａｋｅｄプラスミド注入に主要な限界の１つは導入遺伝子の発現レベルが低いことである。ＣＡプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーを持つニワトリβアクチンプロモーター）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける最も強力な転写制御モジュールの１つである。しかしながら、ＣＡプロモーターにより駆動される遺伝子発現は細胞および器官の種類に依存する。実際、ＣＡプロモーターベースのベクターを用いてｎａｋｅｄプラスミドの注入することによって、心組織で適切なレベルの導入遺伝子の発現が得られるかは不明である。そこで、ＣＡプロモーターをベースにしたｎａｋｅｄプラスミドを作製し、心筋への直接注入による導入遺伝子に発現レベルを検討した。
ｐＩＮＤ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）からＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を切り出し、ｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＡプロモーターを持つｐＣＡＧＧＳベクター（Ｎｉｗａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−１９９）、およびｐＣＡＧＧＳからｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ複製ｏｒｉｇｉｎ（ＳＶ４０ｏｒｉ）を欠失したｐＣＡ１に組み込み、それぞれｐｃＤＮＡ３ＬａｃＺ、ｐＣＡＺ２、およびｐＣＡ１ＬａｃＺとした。なお、ｐＣＡＺ２はＹｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２５０３−２５１５，１９９８に記載されているプラスミドｐＣＡＺ２を用いた。また、ｐＣＡ１は、ｐＣＡＧＧＳをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断してＳＶ４０ｏｒｉを含む断片（５２２ｂｐ）を除いて作製した。その後、切断したプラスミドの５’端のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼでｆｉｌｌ  ｉｎし、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲーションして発現ベクターｐＣＡ１とした。全てのプラスミドはＥｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。
０．１ｍｌの０．９％生理食塩水中の２０μｇのｎａｋｅｄプラスミドを、２７ゲージの注射針を持つ１ｍｌシリンジを用いて、Ｌｅｗｉｓラット（雄，８週齢，２５０〜３００ｇ重，Ｓａｎｋｙｏ  Ｌａｂｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））の骨格筋または心臓に注入した。０．１ｍｌの０．９％生理食塩水中のＡｘＣＡＺ３アデノウイルス粒子（１０１０，５×１０９，および１０９ＯＰＵ）も同様に心臓に注入した。骨格筋への注入では、後肢の大腿筋への注入を容易にするため２ｃｍ切開した（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０；２４７：１４６５−１４６８）。心臓への注入では、左胸を開胸しｎａｋｅｄプラスミドまたはアデノウイルス粒子を心尖部に注入した（Ｌｉｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９０；８２：２２１７−２２２１）。注入後、切開部を絹縫合糸で縫合した。
骨格筋および心臓におけるβ−ｇａｌ活性を以前のように解析した（Ｓｈａｐｅｒ，Ｎ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｉｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４；２６９：２５１６５−２５１７１）。具体的には、４ｍｌの組織溶解液（１００ｍＭ  リン酸カリウム，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，２ｍＭ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅ  ｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，および０．５ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ｐＨ７．８）中で１分間組織（０．８〜１．０ｇ）をホモジェナイズした。ホモジェナイズした組織は、続いて１２，０００ｘｇで１０分遠心した。上清を回収し、４８℃で１時間加熱して内在性のβガラクトシダーゼ活性を不活化した。上清中のβ−ｇａｌ活性はＧａｌａｃｔｏ−ＬｉｇｈｔＴＭ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により、製造元のプロトコルに従って測定した。ケミルミネッセンスはＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６  ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて検出した。Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ（ＲＬＵｓ）として得られたデータは、組み換えβガラクトシダーゼ標準（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＬａｃＺのｎｇ活性に変換した。ＬａｃＺの組織化学的検出では、１０μｍの心組織凍結切片をまずＸ−ｇａｌ溶液で３７℃で２４時間染色（Ｎａｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４４：１３４２−１３４４）し、その後エオシンで対比染色した。値は平均±Ｓ．Ｅ．で表した。統計学的解析は、Ｓｃｈｅｆｆｅの検定で行った。０．０５未満のｐ値を有意とする。
ここで用いたｎａｋｅｄプラスミド量（２０μｇ）は、虚血肢（Ｌｏｓｏｒｄｏ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９８；９８：２８００−２８０４）および心疾患（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９８；９７：１１１４−１１２３）の臨床遺伝子治療の試行において用いられた用量（ｇ／ｋｇ）と相同である。前者は、計４ｍｇのｎａｋｅｄ  ＤＮＡが用いられ、後者では２００〜２，０００μｇのｎａｋｅｄ  ＤＮＡが用いられた。ここでは、ＣＡプロモーターおよびＣＭＶプロモーターベースのベクターからのレポーター遺伝子の発現を、ラット骨格筋および心臓において調べた。２つの組織は、臨床心血管遺伝子治療におけるｎａｋｅｄプラスミドの注入部位として共によく知られている。後肢の大腿筋（ｎ＝４）および心臓（ｎ＝４）にプラスミドを注入してから５日後に、ＣＭＶプロモーター（ｐｃＤＮＡ３ＬａｃＺ，ｐＣＭＶβ）およびＣＡプロモーター（ｐＣＡＺ２，ｐＣＡ１ＬａｃＺ）ベースのベクターに媒介されるＬａｃＺの発現は、骨格筋においてそれぞれ１．６±０．４、１０．２±２．０、３７．２±６．９、および２７．２±６．８ｎｇであった（図８Ａ）。骨格筋において、ＣＡプロモーターベースのベクターはＣＭＶプロモーターベースのベクターよりもレポーター遺伝子の発現レベルが高かった。同様に、心臓では、ＣＡプロモーターベースのベクターの導入遺伝子発現（ｐＣＡＺ２，５１０．８±６９．８ｎｇ；ｐＣＡ１ＬａｃＺ，５０９．９±６６．７ｎｇ）は、ＣＭＶプロモーターベースのベクターの場合（ｐｃＤＮＡ３ＬａｃＺ，４６．２±１３．２ｎｇ；ｐＣＭＶβ，１０８．８±３７．８ｎｇ）と比較して優れていた。心臓における導入遺伝子の発現レベルは、全てのプラスミドにおいて骨格筋で観察されたものよりも約一桁高いことが判明した（図８Ｂ）。安全性を向上させるためＳＶ４０ｏｒｉ配列を取り除いたｐＣＡ１ＬａｃＺベクターに関しても、導入遺伝子の発現を検討した。図８に示したように、骨格筋または心臓のどちらにおいても、ｐＣＡ１ＬａｃＺとｐＣＡＺ２との間でＬａｃＺの発現について有意な違いは見られなかった。
心臓における、ＣＡプロモーターベースのプラスミドベクターとアデノウイルスベクターとの間のＬａｃＺ発現の比較を行なった。様々な量のアデノウイルスベクターＡｘＣＡＺ３（１０１０、５×１０９、１０９ＯＰＵ）を心臓の心尖部に注入した（ｎ＝４）。５日後に、ＡｘＣＡＺ３を注入した心臓におけるＬａｃＺの発現レベルを、２０μｇのｐＣＡＺ２を注入した心組織と比較した。その結果、２０μｇのｐＣＡＺ２に媒介される心臓における導入遺伝子発現の平均レベルは、６．０×１０９ＯＰＵのＡｘＣＡＺ３によるものとほぼ同等であることが判明した（図９）。
ｐｃＤＮＡ３ＬａｃＺ（２０μｇ）、ｐＣＡＺ２（２０μｇ）、または５×１０９ＯＰＵのＡｘＣＡＺ３を注入し、その後Ｘ−ｇａｌで染色した。ＬａｃＺ陽性筋細胞が調べた全てのグループの試料において検出された。ｐｃＤＮＡ３ＬａｃＺを注入した心試料では、針を注入した部位周辺にほとんどＬａｃＺ陽性細胞は見られなかった。これに対して、ｐＣＡＺ２の場合は、散発的ではあるが発現の強いＬａｃＺ陽性心筋細胞が注入領域周辺に観察された。５×１０９ＯＰＵのＡｘＣＡＺ３を注入した心組織は、ｐＣＡＺ２を注入したもので見られたのと類似した導入遺伝子発現のレベルおよびパターンを示した。以上のように、プラスミドの直接投与は心筋においては極めて効率的に導入遺伝子を発現することができ、特にＣＡプロモーターを用いることにより、アデノウイルスベクターとほぼ同等の高いレベルの発現が得られることが実証された。
［実施例９］  ヒトＡｎｇ１発現マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターによる心筋細胞への遺伝子導入効果
ヒトＡｎｇ１  ｃＤＮＡを挿入した伝播型センダイウイルスベクター（ＳｅＶＡｎｇ１）は、公知の方法に基づいて製造した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９；Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：４５７−４６６）。対照ベクターとして、外来遺伝子発現のないＳｅＶ（ＳｅＶＮｕｌｌ）およびＥ．ｃｏｌｉ  β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子（ＬａｃＺ）発現ＳｅＶ（ＳｅＶＬａｃＺ）を用いた。また比較として、ＬａｃＺをコードするアデノウイルスベクターＡｘＣＡＺ３を用いた。ＳｅＶベクターは、１０−ｄａｙ−ｏｌｄの有胚鶏卵の尿膜腔に注入して増殖させ回収した。ニワトリ赤血球を用いたヘマグルチネーションアッセイによりタイターを決定し、使用するまで−８０℃で保存した。ＬａｃＺをコードするアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＺ３）はヒト胚腎由来２９３細胞で増殖させ、ＣｓＣ１不連続密度勾配を用いた超遠心法により精製した後、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ添加ＰＢＳで透析後、使用するまで−７０℃で保存した。使用前に、ウイルスストック中のアデノウイルスの濃度、タイター、および複製能を持つアデノウイルスのコンタミネーションを評価した。アデノウイルスのタイターは、２９３細胞を用いたＬＤ５０（ｐｆｕ，ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）およびＡ２６０測定（ｏｐｕ，ｏｐｔｉｃａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｕｎｉｔｓ）により決定した。
ラット新生児心筋細胞でのアデノウイルスベクターおよびセンダイウイルスベクターによるＬａｃＺ遺伝子発現を以下のように検討した。ラット新生児心筋細胞分離を、以下のように行った。Ｌｅｗｉｓラット新生児を深麻酔下に心を摘出し酸素飽和Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ液（１４３ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．３３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，５．５ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に浸し心室筋を分離した。得られた心室筋をｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（５ｍｇ／ｍｌ，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）含Ｃａ２＋−ｆｒｅｅ  Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ液にて３７℃１時間インキュベーションし心筋細胞を単離した。単離したラット新生児心筋細胞はＫＢ液（５０ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ，４０ｍＭ  ＫＣｌ  ４０，２０ｍＭ  ｔａｕｒｉｎｅ，２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，０．５ｍＭ  ＥＧＴＡ，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）内で５分間ピペッティングし細胞懸濁液を作製し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中、５×１０４／ｗｅｌｌの濃度で２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種した。
ラット新生児心筋細胞への遺伝子導入は以下のごとく行った。上記のようにラット新生児心筋細胞を５×１０４／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種、翌日ウイルスベクター感染を行った。ＳｅＶＬａｃＺまたはＡｘＣＡＺ３を２％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）添加Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて希釈した各種ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍｏｉ，ＳｅＶベクターについてはＣＩＵ／ｃｅｌｌｓ、Ａｄベクターについてはｐｆｕ／ｃｅｌｌｓ）のウイルス液にてラット新生児心筋細胞に３７℃１時間感染した。その後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用い洗浄後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭにて２４時間培養し、ＬａｃＺ発現を検討した。ＬａｃＺ活性はｂｅｔａ−ｇａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒｏｓｃｈｅ）とｂｅｔａ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ標準標本（Ｒｏｓｃｈｅ）を用い、ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ酵素活性を定量的にて検討した。
結果を図１０に示した。ＳｅＶＬａｃＺおよびＡｘＣＡＺ３は両者とも、高ｍｏｉ（＞３０ｍｏｉ）ではラット心筋細胞において導入遺伝子の高発現をもたらすことが示された。ＳｅＶは１０ｍｏｉ以下の低ｍｏｉによる感染でも高いレポーター遺伝子の発現を示し、ウイルス濃度依存性にその発現は増加し３０ｍｏｉ以上でほぼプラトーに達した。一方Ａｄベクターのラット新生児心筋細胞での遺伝子導入はウイルス濃度依存性であり、１００ｍｏｉのウイルス濃度でも最大発現量に達していなかった。Ａｄベクター１０ｍｏｉとＳｅＶベクター１ｍｏｉのラット新生児心筋細胞ＬａｃＺ発現はほぼ同等であり、特に低ｍｏｉ（１０ｍｏｉ以下）ではＳｅＶベクターの遺伝子導入効率はＡｄＶと比較し高かった。次にウイルス液曝露時間のラット新生児心筋細胞への遺伝子導入に与える影響を検討した。アデノウイルスベクターでは、心筋細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入において導入遺伝子を最大に発現させるには長時間（１２０分以上）が必要であった。それに対し、ＳｅＶベクターでは、ウイルス液を同条件で短時間（３０分以内）暴露させるだけでも導入遺伝子の最大発現を得るのに十分であった。
［実施例１０］  ＳｅＶベクター心筋内投与による遺伝子発現
ラット新生児心筋細胞でのＳｅＶベクターによる効率的な遺伝子発現が確認されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏ心筋内投与による心臓での遺伝子発現は未だ報告がなく不明である。そこで正常ラット心に各種濃度のＬａｃＺ発現ＡｄベクターまたはＳｅＶベクターを心筋内投与し、３日後に屠殺し心臓でのレポーター遺伝子発現を検討した。ラット心におけるｉｎ  ｖｉｖｏにおけるベクターからの遺伝子発現の評価は以下にように行った。Ｌｅｗｉｓラットをジエチルエーテル吸入および塩酸ケタミン５０ｍｇ／ｋｇ，キシラジン２．５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与にて麻酔後、挿管した。その後、左側胸部より開胸し、３０Ｇ針をつけたシリンジで様々なタイターのＳｅＶＬａｃＺまたはＡｘＣＡＺ３を心尖部中に心筋内投与した。遺伝子導入の７２時間後にラットを屠殺しＬａｃＺ発現を評価した。
結果を図１１に示した。図から分かるように、心臓でのレポーター遺伝子発現はウイルスベクターの容量依存性に増加した。また３．３×１０９ｏｐｕのＡｄベクターと１×１０８ＣＩＵのＳｅＶベクターはほぼ同等のレポーター遺伝子発現を示した。
［実施例１１］  ＳｅＶベクター静脈・心筋内投与による遺伝子発現臓器分布
心筋内投与後、オーバーフローなどにより流血中にウイルスが混入した際の他臓器での発現は副作用を誘発する可能性もあり臨床的には極めて重要な問題である。しかしＳｅＶベクター静脈投与後の遺伝子発現臓器分布の報告はない。そこで静脈投与後および心筋投与後の遺伝子発現臓器分布を検討した。
１×１０８ＣＩＵのＳｅＶＬａｃＺを正常ラット陰茎静脈より投与し、７２時間後に屠殺し心、右肺、肝、右腎、脾を摘出しＬａｃＺ発現を測定した。また同様に１×１０８ＣＩＵのＳｅＶＬａｃＺまたは１ｘ１０９〜１ｘ１０１０ｏｐｕのＡｘＣＡＺ３を正常ラット心筋内投与し７２時間後に屠殺し、心、右肺、肝、右腎、脾を摘出しＬａｃＺ発現を測定した。
ＬａｃＺ発現の測定には、摘出臓器をＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．８，０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，０．２ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，５μｇ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）存在下でホモジェナイズした。１２，５００ｘｇ，１０ｍｉｎ遠心後、上清中の内因性β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ活性を失活するため４８℃、１時間インキュベートした（Ｙｏｕｎｇ  ＤＣ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ．２１５，２４−３０，１９９３）。上清中の酵素活性はβ−ｇａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ用い室温で１時間反応後、化学発光をＭｉｎｉ−Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６（Ｂｅｔｈｏｌｄ）を用い測定した（Ｓｈａｐｅｒ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉ．２６９（４０），２５１６５−２５１７１，１９９４）。得られた結果（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）はβ−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ標準標本を用いた標準曲線により、β−ｇａｌａｃｏｓｉｄａｓｅ活性（ｐｇ／ｍｌ）に変換した。
結果を図１２に示した。静脈投与後のＡｄベクター導入外来遺伝子は良く知られているように大部分は肝臓で発現していた。一方ＳｅＶベクターでは肺・心・脾での遺伝子発現を認めたもののＡｄＶと異なり肝でのレポーター遺伝子発現は殆んど認めなかった。図に示した結果は全臓器（肺は右肺、腎は右腎）抽出液による結果であり臓器重量を考慮すると肺＞脾＞心の順に高い遺伝子発現が認められた。心筋内投与後の遺伝子発現の臓器分布でも静脈投与とほぼ同様の遺伝子発現の臓器分布パターンを認め、ベクターオーバーフローによる他臓器遺伝子発現の標的臓器が肺および脾であることが明らかとなった。
［実施例１２］  ＳｅＶを用いたＡｎｇ１遺伝子導入による心筋梗塞治療
ＳｅＶベクターによるヒトａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ａｎｇ１）遺伝子を用いた心筋梗塞治療を以下のように実施した。上記のアデノウイルスベクターを用いたＡｎｇ１遺伝子治療では１×１０１０ｏｐｕ（７．５×１０８ｐｆｕ相当）のアデノウイルスベクターを用いたが、ＳｅＶベクターによる心筋細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および心臓（ｉｎ  ｖｉｖｏ）へのＬａｃＺ遺伝子導入においてＡｄベクターに比べ比較的高い遺伝子導入効率がえられたので、５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１心筋内投与によるラット心筋梗塞治療を試みた。Ｌｅｗｉｓラット左冠状動脈前下行枝結紮直後に５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１をＬＡＤ還流域周囲の左室前壁に２カ所に分け注射し、４週間後に心筋梗塞域・毛細血管数を組織学的に検討した。
ラット心筋梗塞モデルはＰｆｅｆｆｅｒら（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）．Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．４４：５０３−５１２）の方法に従い作製した。Ｌｅｗｉｓラット（８週齢、雄、体重約３００ｇ）をジエチルエーテル吸入およびケタミン７０ｍｇ／ｋｇ，キシラジン６〜７ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与にて麻酔後，挿管した。その後、分時換気量２００〜２５０ｍｌ、１回換気量３ｍｌ、呼吸回数６０〜８０回／ｍｉｎ、Ｏ２１１／ｍｉｎ、ハロセン０．５〜２．０％の条件で吸入麻酔を行い、左側胸部より開胸した。左冠状動脈前下行枝（ＬＡＤ）を確認し６−０の非吸収糸（ナイロン糸）を用い，左前下行枝を左心耳の高さで結紮した（ＬＡＤ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）。肺を傷つけないように肋間を閉じた後，筋層，皮膚と連続縫合にて閉創した。
ＳｅＶベクターの心筋内投与は以下のごとく施行した。左前下行枝の結紮後、左前下行枝還流域と推定される領域周辺部左右２ヶ所に３０Ｇ針を用い５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＡｎｇ１を心筋内投与した。Ｎｕｌｌ群としては、ＳｅＶＡｎｇ１の代わりに５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＮｕｌｌを注入した。陰性対照群は０．９％生理食塩水を注入した。
心筋梗塞４週後の梗塞域のサイズをＥｄｅｌｂｅｒｇら（Ｅｄｅｌｂｅｒｇ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５，６０８−６１３，２００１）の方法およびにＲｏｂｅｒｔｓらの方法（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＣＳ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．５１，８７２−８７６，１９８３）に従い測定した。モデル作製後、４週後にラットを屠殺し梗塞心を摘出ｆｏｒｍａｌｄｅｈｉｄｅ固定、ｐａｒｒａｆｉｎ包埋した。左前下行枝結紮部と心尖部の中間部位にて短軸方向に切片を作製、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎｅ−ｅｏｓｉｎ染色、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色にて梗塞部を染色した。切片をＤｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａにて取り込みＮＩＨ  ｉｍａｇｅにて以下のパラメーターをブラインドにて測定した。
総左心室（ＬＶ）域（Ｔｏｔａｌ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ（ＬＶ）ａｒｅａ）（ｍｍ２），梗塞域（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｒｅａ）（ｍｍ２），中隔壁厚（ｓｅｐｔａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（ｍｍ），梗塞壁厚（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）（ｍｍ），ＬＶの心外膜側周および心内膜側周（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ＬＶ）（ｍｍ），心外膜側および心外膜側の梗塞長（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ）（ｍｍ）。
これらの結果から以下の式を用い評価を行った。
％梗塞サイズ（％  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ）＝梗塞域（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｒｅａ）／総ＬＶ域（ｔｏｔａｌ  ＬＶ  ａｒｅａ）ｘ  １００
％梗塞厚（％  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）＝前壁（梗塞）厚（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｗａｌｌ（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）／中隔壁厚（ｓｅｐｔａｌ  ｗａｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）ｘ  １００
Ｖｉａｂｌｅ  ＬＶ  ａｒｅａ，（ｔｏｔａｌ  ＬＶ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｒｅａ）−（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｒｅａ）
また、心筋梗塞作製４週後の心筋内血管密度の評価を、ＣＤ３４モノクロナール抗体を用いた血管内皮細胞の免疫組織染色により行った。１次抗体としてＡｎｔｉ−ＣＤ３４ＭｏＡｂ（ＮＵ−４Ａ１，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）使用し、ビオチン化ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２次抗体とアビジン化ＨＲＰ（ＤＡＢ  ｐａｒａｆｆｉｎ  ＩＨＣ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ，Ｔｕｓｏｎ，ＡＺ）を用い染色した。心室中隔、梗塞部周辺領域、心筋梗塞巣内残存心筋での切片内の血管数を２００倍拡大し顕微鏡下でブラインドにて測定した。結果は血管数／ｍｍ２で表記した。
ＳｅＶＡｎｇ１による心筋梗塞治療後の梗塞サイズおよび梗塞厚を図１３に示すが、コントロールベクターであるＳｅＶＮｕｌｌの心筋投与では明らかな心筋梗塞サイズおよび梗塞厚に改善を認めなかったのに対し、ＳｅＶＡｎｇ１投与群ではＡｎｇ１発現アデノウイルスによる心筋梗塞治療と同様に有意な梗塞巣縮小および梗塞厚増加を認めた。また血管数評価でもＳｅＶＡｎｇ１治療群において梗塞周囲心筋および梗塞巣での有意な毛細血管増加が観察された（図１４）。このように比較的少量のウイルス力価のＳｅＶＡｎｇ１でもラット心筋梗塞モデルに対しＡｄベクターと同様の治療効果が認められた。
［実施例１３］  ラット下肢虚血モデルに対するＳｅＶＡｎｇ１の治療効果
Ｌｅｗｉｓラット（８週齢、雄、体重約３００ｇ）をジエチルエーテル吸入およびケタミン４０ｍｇ／ｋｇ，キシラジン４ｍｇ／ｋｇを上肢への筋肉内投与にて麻酔した。両側下肢の悌毛後、腹部および左鼠径部を切開し右腸骨動脈と右大腿動脈その全分枝を露出した。右腸骨動脈と分枝を結紮後さらに左大腿動脈起始部、膝窩動脈と伏在動脈の分岐部直前で同様に結紮した。また左大腿動脈の他の全分枝を確認・結紮後、左大腿動脈を切除・除去した。手術時にＳｅＶベクター５×１０７ＣＩＵを大腿直筋２ヶ所に３０Ｇ針を用い５×１０７ＣＩＵを投与した。出血の無いことを確認後、切開創を縫合閉鎖し手術を終了とした。Ｎｕｌｌ群としては、ＳｅＶＡｎｇ１の代わりに５×１０７ＣＩＵのＳｅＶＮｕｌｌを注入した。陰性対照群は０．９％生理食塩水を注入した。
レーザードップラー血流イメージ解析は次のようにして実施した。Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｏｒ  ＬＤＩ，Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｅｖｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して下肢血流測定を連続的に虚血後２週間（虚血後１、３、７、１４８日）にわたり実施した。血流測定はエーテルによる吸入麻酔後、ケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）による麻酔にて鎮静し、３７℃の環境下で１０分間保温した後に測定した。連続血流測定は同一ラットの同一領域において実施され、得られた血流イメージより両肢の足部および腓腹部の平均血流量を解析後、測定条件による影響を少なくするため正常側（右下肢）の血流に対する虚血側（左下肢）の血流の比（組織血流比：虚血側血流／正常側血流）を算出した。
ラット下肢虚血モデル作製３日後の患肢血流は生食群で健肢の４５％、コントロールＳｅＶベクター群（ＳｅＶＮｕｌｌ）で４８％と重度の血流障害が認められた。一方、ＳｅＶＡｎｇ１群の３日後の患肢血流は６３％と有意に高かった。この生食群、ＳｅＶＮｕｌｌ群とも虚血モデル作製７，１４日後には患肢血流の自然回復を認めたがＳｅＶＡｎｇ１投与によりこの血流回復は促進され、１４日後には健常肢の８７％まで改善した（図１５）。
［実施例１４］  Ａｎｇ１遺伝子導入間葉系細胞を用いた虚血肢治療
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は骨、脂肪など間葉組織のみならず心筋組織、筋組織などへの分化が示されている。また種々の血管新生因子を分泌し血管新生を誘導する可能性が示されている。本実施例では、ＭＳＣ移植による組織血流改善効果を遺伝子治療と比較した。また虚血治療用の遺伝子修飾ＭＳＣを作製した。
ラット心間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を既報（Ｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｔ．Ｗａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７（３）：３５４−６５）に準じＬｅｗｉｓラット大腿骨より分離した。両端を裁断した大腿骨を注射器により１０％ＦＢＳ添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）をフラッシュし骨髄を回収した。骨髄浮遊液を１８，２０，２２Ｇ注射針に順に通すことにより骨髄細胞浮遊液を作製した。得られた骨髄細胞を５×１０７有核細胞／１０ｃｍ培養皿の濃度で播種し培地（１０％ＦＢＳ、１００ｍｉｃｒｏ  ｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，０．２５ｍｉｃｒｏ  ｇ／ｍｌ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎｅ，２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ添加ＤＭＥＭ）にて４日間培養した。３〜４日ごとに培地を交換し、浮遊細胞を除去し、付着細胞を系代培養しラットＭＳＣとして用いた。
ラット下肢虚血モデルを実施例１３と同様に作製し５×１０６のラットＭＳＣを虚血作製直後に大腿直筋内に投与した。遺伝子治療群としてａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１（Ａｎｇ１）遺伝子を発現するセンダイウイルスベクターを用いた。Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒを用い、経時的に組織血流（患側／健側）を測定した。虚血３日後、対照（ｍｅｄｉｕｍ）群の血流比は４８．２％と重度の虚血が確認され、７日目には６０％に回復し、その後プラトーとなった。ＭＳＣ投与群の３，７日目の血流は対照群と差を認めず、１４日目に８９％と有意な血流改善を認めた。一方、遺伝子治療群では３日目より６３％と早期血流改善を認め１４日目には８７％に達した。
遺伝子・細胞治療両者の利点を合わせた遺伝子修飾ＭＳＣを作製した。ＭＳＣは物理・化学的遺伝子導入やレトロウイルス・アデノウイルスなどのウイルスベクターに比較的抵抗性であることが知られている。そこで多くの初代培養細胞に高い遺伝子導入効率を示すセンダイウイルスベクターによるラット間葉系幹細胞への遺伝子導入を試み、その効率をアデノウイルスベクターと比較検討した。
ラットＭＳＣへの遺伝子導入は以下のごとく行った。ラットＭＳＣを２．５×１０４／ｗｅｌｌの細胞密度で２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種、翌日ウイルスベクター（ＳｅＶＬａｃＺまたはＡｘＣＡＺ３）感染を行った。ＳｅＶＬａｃＺまたはＡｘＣＡＺ３を２％  Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）添加Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて希釈した各種ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍｏｉ，ＳｅＶベクターについてはＣＩＵ／ｃｅｌｌｓ、Ａｄベクターについてはｐｆｕ／ｃｅｌｌｓ）のウイルス液にてラット新生児心筋細胞に３７℃１時間感染した。その後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）を用い洗浄後、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭにて２４時間培養しＬａｃＺ発現を検討した。ＬａｃＺ活性はβ−ｇａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｒｏｓｃｈｅ）を用い測定した。
結果を図１６に示す。ＳｅＶは３ｍｏｉ以下の低ｍｏｉによる感染でも高いレポーター遺伝子発現を示し、ウイルス濃度依存性にその発現は増加し３０ｍｏｉ以上でほぼプラトーに達した。一方ＡｄベクターのラットＭＳＣでの遺伝子導入はウイルス濃度依存性ではあるが、今回比較したいずれのウイルス濃度でも遺伝子発現は悪く３０ｍｏｉ以下ではＳｅＶベクターによる遺伝子発現の１／１００以下であった。１００ｍｏｉでのＳｅＶベクター、ＡｄベクターによるＬａｃＺ遺伝子導入ＭＳＣのＸ−ｇａｌ染色の結果、Ａｄベクターでは陽性細胞は比較的少なかったのに対し、ＳｅＶベクターではほぼ１００％の細胞がＬａｃＺ陽性であった（図１７）。
Ａｎｇ１遺伝子を導入したＭＳＣを用いてラット重症虚血肢モデルの虚血治療を行った。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）はＬｅｗｉｓラット（８ｗｏ，Ｍ）より既報（Ｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｔ．Ｗａｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ７（３）：３５４−６５）に従い分離、培養した。得られたＭＳＣはｍｏｉ  ２の条件で３７℃、一時間のＳｅＶ／Ａｎｇ１感染により遺伝子導入ＭＳＣを作製した。遺伝子導入から２４時間後、５×１０６の遺伝子導入ＭＳＣをラット下肢虚血モデルに投与した（モデル作製は実施例１３と同様）。遺伝子改変ＭＳＣの注入は虚血直後に行った。その後、レーザードップラー血流イメージ解析により肢の血流を調べた。データは％血流（虚血側血流／正常側血流  ｘ  １００）で表した。Ａｎｇ１遺伝子導入ＭＳＣｓの移植により虚血肢の血流は治療３日後より対照に比べ有意な血流改善を示した（図１８）。７日後には、その改善度はＳｅＶ／Ａｎｇ１の直接投与に比べても良好な血流改善が得られた（図１８）。
［実施例１５］  マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターを用いた遺伝子導入
以下の哺乳動物細胞を用いて、マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターの遺伝子導入効率を、アデノウイルスベクターと比較した。
（１）培養細胞株
ＬａｃＺ遺伝子を発現するＳｅＶベクター（ＳｅＶ−ＬａｃＺ）またはアデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＺ３）を、様々な濃度でＨｅＬａ細胞に１時間感染させた。ベクター感染から２４時間後に、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイキットまたはＸ−ｇａｌ染色により、ＬａｃＺ活性を測定した。ＳｅＶベクターは、ＭＯＩ  １０以下（特にＭＯＩ  ０．３〜３）の低ＭＯＩ条件において、導入遺伝子の発現量がアデノウイルスベクターに比べ極めて高いことが判明した（図１９Ａ）。遺伝子導入細胞をＸ−ｇａｌ染色により確認したところ、ＳｅＶベクターを用いた場合、遺伝子導入された細胞の割合は、アデノウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高く、個々細胞における導入遺伝子の発現量も、アデノウイルスベクターによる場合よりも有意に高いことが判明した（図１９Ｂ）。
（２）ヒト口腔扁平上皮癌
アデノウイルスベクター（ＡｘＣＡＺ３）による遺伝子導入に対して抵抗性を示すヒト口腔扁平上皮癌細胞株ＨＳＣ３（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ：ＪＣＲＢ０６２３，Ｒｉｋｉｍａｒｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２６：８４９−８５６，１９９０）およびＯＳＣ１９（ＪＣＲＢ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ：ＪＣＲＢ０１９８，Ｙｏｋｏｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｓ．，２３：４３−５７，１９８８；Ｙｏｋｏｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓ．，２４：５７−７７，１９８９；Ｋａｗａｈａｒａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８４：４０９−４１８，１９９３；Ｋａｗａｈａｒａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，８４：４０９−４１８，１９９３；Ｋａｗａｓｈｉｒｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂ  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．，３１Ｂ：２１６−２２１，１９９５）に対する遺伝子導入効果を検討した。ＳｅＶ−ＬａｃＺまたはＡｘＣＡＺ３を様々なＭＯＩで１時間感染後、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイキットによりＬａｃＺ活性を定量した。ＯＳＣ１９およびＨＳＣ３とも、調べた全てのＭＯＩにおいて、ＳｅＶ−ＬａｃＺによる遺伝子導入はＡｘＣＡＺ３より良好であった（図２０）。特に野生型アデノウイルスおよびインテグリン標的としたアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ＲＧＤ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｆｉｂｅｒ）（Ｄｅｈａｒｉ  Ｈ，Ｉｔｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：７５−８５，２００３）に対しても抵抗性を示し遺伝子導入が極めて困難であったＨＳＣ３に対しても良好な遺伝子導入が確認された。このようにＳｅＶベクターは、口腔扁平上皮癌細胞への遺伝子導入に非常に適している。
（３）ヒトマクロファージおよび樹状細胞
ヒトマクロファージおよび樹状細胞へのＳｅＶベクターによる遺伝子導入を、アデノウイルスベクターを比較した。ＬａｃＺを発現するＳｅＶベクターおよびアデノウイルスベクターをＭＯＩ  １で１時間感染させ、ベクターの感染から２４時間後にβ−ガラクトシダーゼレポーターアッセイキットを用いてＬａｃＺ活性を測定した。ＳｅＶベクターは、アデノウイルスベクターの１０００倍以上の発現量を示した（図２１）。従ってＳｅＶベクターは、マクロファージおよび樹状細胞への遺伝子導入に非常に適している。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、虚血疾患に対する新たな遺伝子治療剤および治療方法が提供された。本発明の方法は、副作用の少ない、安全で効果的な虚血治療法として優れている。現在、急性心筋梗塞に対する治療はＰＴＣＡ（経皮冠動脈形成術）・ＣＡＢＧ（冠動脈バイパス術）など外科的な血行再建術が主体であるが、本発明の方法を用いることにより遺伝子工学的な血管再生促進が可能となる。これにより、心機能の積極的な改善、病床期間の短期化が期待される。また、四肢虚血等の治療においても、本発明の方法は優れた治療効果を発揮する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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