(57)【要約】Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖をコードする遺伝子を同じベクター上に配置し、適当な宿主細胞に形質転換することにより、５量体のＩｇＭが取得できる。Ｊ鎖をコードする遺伝子は、共形質転換により導入されていても良い。また、Ｊ鎖の発現を伴わない場合には、ＩｇＭは６量体として生産される。本発明に基づいて得られた形質転換体のＩｇＭの産生量は高い。更に本発明は、多量体ＩｇＭを分離定量することができる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ｍｇ／Ｌ以上のＩｇＭを産生できる形質転換細胞。
【請求項２】
３５ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ以上のＩｇＭを産生できる形質転換細胞。
【請求項３】
真核細胞である請求項１または請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
原核細胞である請求項１または請求項２に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
哺乳動物細胞である請求項３に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
株化細胞である請求項１〜請求項５のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７】
非リンパ球系細胞株である請求項６に記載の形質転換細胞。
【請求項８】
ＣＨＯ細胞株である請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
同じベクター上に（１）ＩｇＭ  Ｈ鎖をコードする塩基配列および（２）ＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする塩基配列の両方を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子（１）および（２）を含む遺伝子断片。
【請求項１０】
同じベクター上に（１）ＩｇＭ  Ｈ鎖をコードする塩基配列、（２）ＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする塩基配列、および（３）ＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子（１）、（２）、および（３）を含む遺伝子断片。
【請求項１１】
転写調節配列によりＩｇＭの分泌が制御される請求項９または請求項１０に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
【請求項１２】
転写調節配列が、アデノウイルス２型主後期プロモーター、シミアンウイルス４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群から選択される請求項１１に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
【請求項１３】
転写調節配列が、シミアンウイルス４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群から選択される請求項１２に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
【請求項１４】
請求項９〜請求項１３のいずれかに記載のベクターあるいは遺伝子断片で形質転換された形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１〜請求項８のいずれかに記載の形質転換細胞から選択される、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
発現ベクターまたは遺伝子断片が、Ｊ鎖をコードする塩基配列を含んでいる請求項１４または請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ６０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する請求項１４〜請求項１６のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
８０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する請求項１７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ５０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する請求項１４または請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
８０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する請求項１９に記載の形質転換細胞。
【請求項２１】
前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ産生する５量体と６量体の比（５量体／６量体比）が１．５以上であるＩｇＭを産生する請求項１４〜請求項１６のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項２２】
前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ産生する６量体と５量体の比（６量体／５量体比）が１．５以上であるＩｇＭを産生する請求項１４または請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項２３】
ＩｇＭ  Ｈ鎖およびＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターまたは遺伝子断片が、Ｊ鎖をコードする塩基配列を含まず、かつ共形質転換によりＪ鎖をコードする塩基配列が発現可能に導入されている請求項１４または請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項２４】
請求項１〜請求項８、並びに請求項１４〜請求項２３のいずれかに記載の細胞を培養し、ＩｇＭを採取する工程を含むＩｇＭを製造する方法。
【請求項２５】
請求項１〜請求項８、並びに請求項１４〜請求項２３のいずれかに記載の細胞培養物の培養上清からＩｇＭを精製する工程を含む、実質的に純粋なＩｇＭを製造する方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法により得られるＩｇＭ。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法により得られる実質的に純粋なＩｇＭ。
【請求項２８】
ヒト抗体、マウス抗体、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である請求項２６または請求項２７に記載のＩｇＭ。
【請求項２９】
実質的に純粋な５量体あるいは６量体である請求項２６〜請求項２８のいずれかに記載のＩｇＭ。
【請求項３０】
ＣＨＯ細胞が付加する糖鎖を有する実質的に純粋な５量体または６量体ＩｇＭ。
【請求項３１】
抗糖鎖抗体である請求項２６〜請求項３０のいずれかに記載のＩｇＭ。
【請求項３２】
抗ガングリオシド抗体である請求項３１に記載のＩｇＭ。
【請求項３３】
抗ＧＭ２またはＧＭ３抗体である請求項３２に記載のＩｇＭ。
【請求項３４】
配列番号：１に記載の塩基配列、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
配列番号：３に記載の塩基配列、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項３４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
【請求項３７】
請求項３５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
【請求項３８】
請求項３６に記載の蛋白質と請求項３７に記載の蛋白質を構成単位として含むＩｇＭ。
【請求項３９】
更にＩｇＭ  Ｊ鎖を含む請求項３８に記載のＩｇＭ。
【請求項４０】
５量体である請求項３９に記載のＩｇＭ。
【請求項４１】
配列番号：１９に記載の塩基配列、または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号：２１に記載の塩基配列、または配列番号：２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
【請求項４４】
請求項４２に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
【請求項４５】
請求項４３に記載の蛋白質と請求項４４に記載の蛋白質を構成単位として含むＩｇＭ。
【請求項４６】
更にＩｇＭ  Ｊ鎖を含む請求項４５に記載のＩｇＭ。
【請求項４７】
５量体である請求項４６に記載のＩｇＭ。
【請求項４８】
請求項２６〜請求項３３、請求項３８、および請求項４５のいずれかに記載のＩｇＭを含有する医薬組成物。
【請求項４９】
８０％以上の５量体ＩｇＭを含有する医薬組成物。
【請求項５０】
５０％以上の６量体ＩｇＭを含有する医薬組成物。
【請求項５１】
８０％以上の６量体ＩｇＭを含有する請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
５量体／６量体比が１．５以上であるＩｇＭを含有する医薬組成物。
【請求項５３】
６量体／５量体比が１．５以上であるＩｇＭを含有する医薬組成物。
【請求項５４】
次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを担体としてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＩｇＭを分離する工程を含む、ＩｇＭの多量体を分析する方法。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
【請求項５５】
条件ａ）における温度が３７℃以上である請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
条件ｂ）における過硫酸アンモニウムの濃度が０．２５％以上である請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ポリアクリルアミドゲルが、前記ａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも２つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルである請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
ポリアクリルアミドゲルが、前記ａ）−ｃ）の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルである請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
電気泳動用のバッファーがＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ泳動バッファーである請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
ＩｇＭの多量体が、ＩｇＭの５量体および／または６量体である請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ＩｇＭの会合体を分析することを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
ＲＩを使用しないことを特徴とする請求項５４に記載の分析方法。
【請求項６３】
電気泳動後に分離されたＩｇＭの多量体を定量する工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲル。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
【請求項６５】
次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの工程を含む、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法。
ａ）アクリルアミドを高温で重合させる工程、
ｂ）アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
ｃ）重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子操作技術を利用するＩｇＭの製造に関する。
【背景技術】  多くの高等動物の免疫グロブリンには、５種類の異なったクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する。各クラスの免疫グロブリンは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、糖含量等の性状が異なっている。これらのクラスの中で、ＩｇＭは血漿免疫グロブリン全体の約１０％を占めている。ＩｇＭは、複雑な抗原性を持つ細胞膜抗原、感染性微生物、あるいは溶解性抗原に対して産生される初期抗体の主成分である。
ヒトＩｇＭは、生体内では、通常、５量体構造を有している。ＩｇＭの５量体構造を構成する５つのサブユニットは、ＩｇＧに類似した４本鎖構造からなっている。ＩｇＭのＨ鎖であるμ鎖はＩｇＧのＨ鎖であるγ鎖とアミノ酸配列が異なる以外にも次のような相違を有する。
μ鎖は、定常領域のドメインを、γ鎖よりも一つ余分に持っている。
μ鎖は、オリゴ糖鎖の数がγ鎖と比較して４箇所多い。
ＩｇＭは、ＩｇＧには見られないＪ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。Ｊ鎖は、ＩｇＭが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の会合を補助すると考えられている。
近年、モノクローナル抗体技術および組換えＤＮＡ技術の進歩により、純粋な免疫グロブリンを大量に生産することが可能になった。更に遺伝子組み換え技術は、キメラ抗体やヒト化抗体生産を可能にした。キメラ抗体とは、可変領域を異なる種に由来する可変領域に組み換えた構造を有する抗体である。たとえば、ヒト以外の動物種の可変領域とヒト抗体の定常領域を有する「キメラ抗体」（文献１／Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８４）８１：６８５１）が公知である。更に、他の動物種の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ；ＣＤＲ）をヒトイムノグロブリンに移植したヒト化抗体も公知である（文献２／Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２１）。
実際に、抗腫瘍抗体に関して列挙すると、抗ＣＤ２０ヒトキメラ抗体であるリツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ登録商標：ＩＤＥＣ社）や抗ＨＥＲ２／ｎｅｕヒト化抗体であるハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ登録商標：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）が臨床試験を終了し、既に承認・販売されている。ＩｇＧおよびＩｇＭのエフェクター機能として抗体依存性細胞障害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞障害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）が知られている。ＩｇＭのＣＤＣ活性はＩｇＧと比較して高いことから、ＣＤＣ活性を主薬効とする抗腫瘍抗体となる可能性が極めて高いと思われる。しかし上述のとおり、ＩｇＭはＩｇＧと異なり多量体を形成する。そのため、組換え体ＩｇＭを工業的規模で生産することは困難であると考えられていた。
ＩｇＭ組換え体については、非リンパ球細胞を用いた生産系についていくつかの報告がある。Ｃ６グリオーマ細胞、ＣＨＯ細胞、あるいはＨｅＬａ細胞にＩｇＭ  Ｈ鎖、Ｌ鎖の遺伝子を導入し、多量体の形成が確認されたが、ＣＨＯ細胞の産生量は非常に低いことが確認されている（文献３／ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）９；２７５３）（特許文献１／ＷＯ８９／０１９７５）。さらにＣＨＯ細胞において、ＩｇＭ  Ｈ鎖、Ｌ鎖それぞれを発現ベクターに組み込み、共発現させることにより、ＩｇＭ産生株が取得されている（文献４／Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４５；３０１１）（文献５／Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９９７）８；１３７）。これらの報告でもＣＨＯ細胞が産生する組換えＩｇＭは多量体を形成しているが、５量体および６量体の存在比などについては明確にされていない。
ＩｇＭの組み換え体の多量体構造が確認されていない最大の理由は、解析技術が確立されていないことである。すなわち公知のイムノグロブリンの解析方法では、多量体構造を有するＩｇＭを正しく分析することはできなかった。たとえば蛋白質の分離および同定技術として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのようなゲル電気泳動が知られている。しかしＩｇＭは分子量約１００万を有する巨大分子である。そのため一般的な方法では多量体構造（５量体と６量体）を定量的に解析することは困難である。
報告されているＩｇＭの多量体構造の分析法においては、ＲＩ標識したＩｇＭを用いて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっている（文献６／Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２；１２０６）。ＩｇＭを医薬品として開発するためには、製造過程においてＩｇＭの多量体構造を分析することができる技術が必要である。具体的には、製造細胞の選定、細胞培養のモニタリング、精製、原体製造、製剤製造のあらゆる工程においてＩｇＭの多量体構造の分析が必要である。しかしＲＩを用いる方法では、これら全ての工程の評価に対応することは現実的ではない。
〔文献１〕Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９８４）８１：６８５１
〔文献２〕Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２１
〔文献３〕ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）９；２７５３
〔文献４〕Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）１４５；３０１１
〔文献５〕Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９９７）８；１３７
〔文献６〕Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２；１２０６
【特許文献１】ＷＯ８９／０１９７５
【発明の開示】
本発明は、高いＩｇＭ産生能を有する細胞の提供を課題とする。また本発明は、５量体または６量体構造を有するＩｇＭの供給を可能とする技術の提供を課題とする。更に本発明は、ＩｇＭの多量体構造あるいは会合体の解析方法の提供を課題とする。
これまでのＩｇＭ研究は、多くがミエローマ、ハイブリドーマ、Ｂリンパ腫細胞株などのリンパ球細胞を使用して行われてきた。Ｂ細胞分化の各過程の細胞株にＪ鎖遺伝子を導入することにより、Ｊ鎖を発現していない細胞が分泌するＩｇＭは６量体を形成し、Ｊ鎖を発現している細胞が分泌するＩｇＭは５量体を形成することが確認された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，（１９９５）９２：２８８４）。また、Ｂリンパ腫細胞株およびＨｙｂｒｉｄｏｍａが分泌するＩｇＭの５量体、６量体成分を分画し、６量体成分が５量体成分と比較してＣＤＣ活性が高いことが示された（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９９０）２０：１９７１）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０；５９７９）。このようにＣＤＣ活性とＩｇＭのコンホメーションとの関係は重要であると考えられている。しかし、リンパ球細胞が分泌したＩｇＭの５量体、あるいは６量体成分を大量に取得することは困難である。
取得が困難な蛋白質を大量に入手するための手法として、しばしば遺伝子組み換え技術が利用される。しかしＩｇＭについては、組み換え体においてその多量体構造の構築を可能とする技術が見出されていなかった。そこで本発明者らは、ＩｇＭを多量に供給することができる細胞、並びに多量体構造を有するＩｇＭの産生を可能とする技術を確立することを目的として研究を重ねた。
その結果、本発明者らは、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＪ鎖をコードする遺伝子を適当なベクター上に配置し、それを宿主細胞に形質転換することにより、５量体のＩｇＭが取得できることを見出した。また本発明者は、形質転換細胞がＪ鎖の発現を伴わない場合には、ＩｇＭが主として６量体を形成することを明らかにした。更に、これらの発現細胞のＩｇＭ産生量が極めて高いことを確認して本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のＩｇＭ産生細胞、ＩｇＭ産生方法、並びにこれらの細胞あるいは方法によって得ることができるＩｇＭ多量体に関する。更に本発明は、ＩｇＭ多量体構造あるいはＩｇＭ会合体の解析方法を提供する。
〔１〕１００ｍｇ／Ｌ以上のＩｇＭを産生できる形質転換細胞。
〔２〕３５ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ以上のＩｇＭを産生できる形質転換細胞。
〔３〕真核細胞である〔１〕または〔２〕に記載の形質転換細胞。
〔４〕原核細胞である〔１〕または〔２〕に記載の形質転換細胞。
〔５〕哺乳動物細胞である〔３〕に記載の形質転換細胞。
〔６〕株化細胞である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔７〕非リンパ球系細胞株である〔６〕に記載の形質転換細胞。
〔８〕ＣＨＯ細胞株である〔７〕に記載の形質転換細胞。
〔９〕同じベクター上に（１）ＩｇＭ  Ｈ鎖をコードする塩基配列および（２）ＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする塩基配列の両方を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子（１）および（２）を含む遺伝子断片。
〔１０〕同じベクター上に（１）ＩｇＭ  Ｈ鎖をコードする塩基配列、（２）ＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする塩基配列、および（３）ＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有する発現ベクター、あるいは前記遺伝子（１）、（２）、および（３）を含む遺伝子断片。
〔１１〕転写調節配列によりＩｇＭの分泌が制御される〔９〕または〔１０〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔１２〕転写調節配列が、アデノウイルス２型主後期プロモーター、シミアンウイルス４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群から選択される〔１１〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔１３〕転写調節配列が、シミアンウイルス４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター、およびＣＡＧプロモーターからなる群から選択される〔１２〕に記載の発現ベクターあるいは遺伝子断片。
〔１４〕〔９〕〜〔１３〕のいずれかに記載のベクターあるいは遺伝子断片で形質転換された形質転換細胞。
〔１５〕〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の形質転換細胞から選択される、〔１４〕に記載の形質転換細胞。
〔１６〕発現ベクターまたは遺伝子断片が、Ｊ鎖をコードする塩基配列を含んでいる〔１４〕または〔１５〕に記載の形質転換細胞。
〔１７〕前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ６０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔１８〕８０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する〔１７〕に記載の形質転換細胞。
〔１９〕前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ５０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する〔１４〕または〔１５〕に記載の形質転換細胞。
〔２０〕８０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する〔１９〕に記載の形質転換細胞。
〔２１〕前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ産生する５量体と６量体の比（５量体／６量体比）が１．５以上であるＩｇＭを産生する〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の形質転換細胞。
〔２２〕前記ベクターまたは遺伝子断片がＩｇＭ  Ｊ鎖をコードする塩基配列を有さず、かつ産生する６量体と５量体の比（６量体／５量体比）が１．５以上であるＩｇＭを産生する〔１４〕または〔１５〕に記載の形質転換細胞。
〔２３〕ＩｇＭ  Ｈ鎖およびＩｇＭ  Ｌ鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターまたは遺伝子断片が、Ｊ鎖をコードする塩基配列を含まず、かつ共形質転換によりＪ鎖をコードする塩基配列が発現可能に導入されている〔１４〕または〔１５〕に記載の形質転換細胞。
〔２４〕〔１〕〜〔８〕、並びに〔１４〕〜〔２３〕のいずれかに記載の細胞を培養し、ＩｇＭを採取する工程を含むＩｇＭを製造する方法。
〔２５〕〔１〕〜〔８〕、並びに〔１４〕〜〔２３〕のいずれかに記載の細胞培養物の培養上清からＩｇＭを精製する工程を含む、実質的に純粋なＩｇＭを製造する方法。
〔２６〕〔２４〕に記載の方法により得られるＩｇＭ。
〔２７〕〔２５〕に記載の方法により得られる実質的に純粋なＩｇＭ。
〔２８〕ヒト抗体、マウス抗体、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体である〔２６〕または〔２７〕に記載のＩｇＭ。
〔２９〕実質的に純粋な５量体あるいは６量体である〔２６〕〜〔２８〕のいずれかに記載のＩｇＭ。
〔３０〕ＣＨＯ細胞が付加する糖鎖を有する実質的に純粋な５量体または６量体ＩｇＭ。
〔３１〕抗糖鎖抗体である〔２６〕〜〔３０〕のいずれかに記載のＩｇＭ。
〔３２〕抗ガングリオシド抗体である〔３１〕に記載のＩｇＭ。
〔３３〕抗ＧＭ２またはＧＭ３抗体である〔３２〕に記載のＩｇＭ。
〔３４〕配列番号：１に記載の塩基配列、または配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔３５〕配列番号：３に記載の塩基配列、または配列番号：４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔３６〕〔３４〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔３７〕〔３５〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔３８〕〔３６〕に記載の蛋白質と〔３７〕に記載の蛋白質を構成単位として含むＩｇＭ。
〔３９〕更にＩｇＭ  Ｊ鎖を含む〔３８〕に記載のＩｇＭ。
〔４０〕５量体である〔３９〕に記載のＩｇＭ。
〔４１〕配列番号：１９に記載の塩基配列、または配列番号：２０に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔４２〕配列番号：２１に記載の塩基配列、または配列番号：２２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
〔４３〕〔４１〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔４４〕〔４２〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む単離された蛋白質。
〔４５〕〔４３〕に記載の蛋白質と〔４４〕に記載の蛋白質を構成単位として含むＩｇＭ。
〔４６〕更にＩｇＭ  Ｊ鎖を含む〔４５〕に記載のＩｇＭ。
〔４７〕５量体である〔４６〕に記載のＩｇＭ。
〔４８〕〔２６〕〜〔３３〕、〔３８〕、および〔４５〕のいずれかに記載のＩｇＭを含有する医薬組成物。
〔４９〕８０％以上の５量体ＩｇＭを含有する医薬組成物。
〔５０〕５０％以上の６量体ＩｇＭを含有する医薬組成物。
〔５１〕８０％以上の６量体ＩｇＭを含有する〔５０〕に記載の医薬組成物。
〔５２〕５量体／６量体比が１．５以上であるＩｇＭを含有する医薬組成物。
〔５３〕６量体／５量体比が１．５以上であるＩｇＭを含有する医薬組成物。
〔５４〕次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを担体としてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＩｇＭを分離する工程を含む、ＩｇＭの多量体を分析する方法。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔５５〕条件ａ）における温度が３７℃以上である〔５４〕に記載の方法。
〔５６〕条件ｂ）における過硫酸アンモニウムの濃度が０．２５％以上である〔５４〕に記載の方法。
〔５７〕ポリアクリルアミドゲルが、前記ａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも２つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔５４〕に記載の方法。
〔５８〕ポリアクリルアミドゲルが、前記ａ）−ｃ）の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルである〔５４〕に記載の方法。
〔５９〕電気泳動用のバッファーがＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ泳動バッファーである〔５４〕に記載の方法。
〔６０〕ＩｇＭの多量体が、ＩｇＭの５量体および／または６量体である〔５４〕に記載の方法。
〔６１〕ＩｇＭの会合体を分析することを特徴とする〔５４〕に記載の方法。
〔６２〕ＲＩを使用しないことを特徴とする〔５４〕に記載の分析方法。
〔６３〕電気泳動後に分離されたＩｇＭの多量体を定量する工程を含む、〔５４〕に記載の方法。
〔６４〕次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲル。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウム、及び、グリセロールを含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル、
〔６５〕次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの工程を含む、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法。
ａ）アクリルアミドを高温で重合させる工程、
ｂ）アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
ｃ）重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、
本発明は、１００ｍｇ／Ｌ以上のＩｇＭを産生する形質転換細胞を提供する。本発明における形質転換細胞とは、外来性のＩｇＭ遺伝子を発現可能に保持した細胞を言う。１００ｍｇ／Ｌ以上のＩｇＭの産生とは、ＩｇＭ産生細胞がその培養物１Ｌ中に、１００ｍｇ以上のＩｇＭを蓄積しうることを言う。培養物中のＩｇＭの産生量は、ＥＬＩＳＡなどによって測定することができる。本発明において、ＩｇＭの蓄積量は、通常１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは１２０ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは１５０ｍｇ〜３００ｍｇ／Ｌである。多量体であるために高度な産生量を実現しにくいと考えられていたＩｇＭにおいて、本発明の形質転換細胞の産生量はきわめて高い水準にあると言って良い。
細胞融合法によって樹立されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、高い産生量を期待できるＩｇＧにおいても一般に数ｍｇ〜数１０ｍｇ／Ｌとされている。つまり本発明の形質転換細胞は、ハイブリドーマの標準的なモノクローナル抗体の産生量をはるかに上回る量のＩｇＭを産生する。
本発明において、ＩｇＭとはＨ鎖の定常領域としてμ鎖の定常領域を有し、かつ５量体または６量体の構造を持つイムノグロブリンを言う。一方、本発明におけるＩｇＭを構成する可変領域の由来は限定されない。したがって、μ鎖由来の可変領域に加えて、ＩｇＧ由来の可変領域やその部分構造を含むことができる。可変領域の部分構造としては、フレームワークやＣＤＲを示すことができる。なお本発明におけるＩｇＭは、形質転換細胞に導入された外来性のＩｇＭ遺伝子の発現産物を言う。
更に、本発明のＩｇＭを構成する定常領域が由来する動物種も限定されない。つまり本発明のＩｇＭは、ＩｇＭタイプのイムノグロブリンを有するあらゆる動物種に由来するＩｇＭ定常領域を含む。ＩｇＭを体内への投与に用いる場合には、少なくともその定常領域は、投与対象となる種と同じ種に由来することが望ましい。したがって、ヒトへの投与を目的とする場合には、少なくとも定常領域がヒト由来であることが望ましい。ヒト由来の定常領域と、他の動物種、あるいはヒト由来であるが他の個体に由来する可変領域とで構成されるＩｇＭは、キメラ抗体と呼ばれる。
定常領域に加えて、可変領域のフレームワークもヒト由来としたＩｇＭは、ヒトへの投与用のＩｇＭとして更に好ましいＩｇＭである。可変領域のフレームワークの構造を維持し、ＣＤＲのみを他の動物種の抗体と組み換えられた抗体は、ヒト化抗体と呼ばれている。
また本発明は３５ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ以上のＩｇＭを産生する形質転換細胞を提供する。本発明の望ましい形質転換細胞において、１細胞、１日あたりのＩｇＭ産生量は、通常３５ｐｇ以上、好ましくは４０ｐｇ以上である。細胞あたりのＩｇＭの産生量は、培養物中に蓄積されたＩｇＭの量と、培養物を構成する形質転換細胞の数に基づいて明らかにすることができる。形質転換細胞がクローニングされた細胞である場合には、こうして決定された１細胞あたりのＩｇＭ産生量は、当該細胞集団を構成する全ての細胞が等しく有している特性であるとみなすことができる。
ＩｇＭは、通常、細胞内での発現とコンフォーメーションの獲得を経て、培養上清中へ分泌される。しかし、細胞の破砕等により、機能的なコンフォーメーションを有するＩｇＭを回収できるのであれば、ＩｇＭが細胞内に蓄積されたままであっても良い。また、回収されたＩｇＭ分子に何らかの処理により機能的なコンフォーメーションを与えることが可能ならば、必ずしも培養物中でＩｇＭとしての活性を示していなくてもよい。
本発明が提供する高度なＩｇＭ産生能を有する形質転換細胞は、μ鎖を構成するＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を同一のベクター上に発現可能に配置したベクターまたは遺伝子断片を、適当な宿主細胞に形質転換することによって得ることができる。本発明の形質転換細胞を得ることができる宿主細胞とそれを形質転換するための方法について以下に述べる。
本発明の形質転換細胞を得ることができる宿主細胞と、それを形質転換するための方法について以下に述べる。まず、目的とするＨ鎖とＬ鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターへ組み込む。発現ベクターに組み込む遺伝子として、更にＪ鎖をコードする遺伝子を組み合せることもできる。これらの遺伝子は、発現制御領域の制御下に発現するよう発現ベクターに組み込まれる。
ＩｇＭのＨ鎖、Ｌ鎖あるいはＪ鎖をコードする遺伝子（ＩｇＭ遺伝子）を取得する方法は公知である。以下、「ＩｇＭ遺伝子」は、ＩｇＭを構成するＨ鎖、Ｌ鎖、あるいはＪ鎖の遺伝子のいずれかを示す用語として用いる。
まずヒトＪ鎖をコードする遺伝子はクローニングされ、その構造が明らかにされている（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ１２７５９、Ｍａｘ  ＆  Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８５）１６１：８３２−８４９）明らかにされた塩基配列情報に基づいて、ＩｇＭ産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として、Ｊ鎖をコードする遺伝子を取得することができる。
たとえば実施例に記載したＪ鎖増幅用プライマーＪ−ｆ１およびＪ−ｒ１を利用して、Ｊ鎖をコードするＤＮＡを増幅することができる。実施例において単離されたＪ鎖をコードするｃＤＮＡの塩基配列は配列番号：５に、またこの塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号：６に示した。
次にＨ鎖またはＬ鎖の遺伝子について述べる。一般にイムノグロブリンの遺伝子の取得においては、その可変領域をを含む領域をコードする塩基配列が重要である。イムノグロブリンの定常領域の構造は保存されている。そのため、いったんクローニングされれば、可変領域を組み換えることによって、目的とする抗原結合活性を有するイムノグロブリンを再構成できると考えられている。したがって、通常は、可変領域やＣＤＲの遺伝子を取得し、先にクローニングされた定常領域やフレームワークに移植することによって、イムノグロブリン全体をコードする塩基配列が構築される。ＩｇＭを構成するμ鎖のＨ鎖あるいはＬ鎖の定常領域の構造は既に明らかにされている。
μ鎖定常領域：Ｄｏｒａｉ  ＆  Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７：６４１２
κ鎖定常領域：Ｈｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８０）２２：１９７−２０７
γ鎖定常領域：Ｈｉｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９４：５３６−５４０
更に本発明におけるＩｇＭは、定常領域を改変したＩｇＭが含まれる。たとえば、ＩｇＭを構成するμ鎖のＨ鎖あるいはＬ鎖の定常領域を改変して、そのＣＤＣ活性を高められる可能性がある。あるいはＩｇＧのＦｃ領域を接合することによって、ＡＤＣＣ活性を有するＩｇＭ分子を創出することもできる。
本発明において、可変領域をコードする遺伝子の由来は限定されない。たとえば、ＩｇＭ産生細胞からＰＣＲ法によって可変領域遺伝子を増幅することができる。可変領域遺伝子をＰＣＲ法によって増幅することができるプライマーは公知である（Ｉｖａｎｏｖｚｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９１：２４３３−２４４２）。またファージ抗体ライブラリーから可変領域遺伝子を単離することもできる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２：５８１−５９７）。更に、ＩｇＧのようなＩｇＭ以外のイムノグロブリンの可変領域遺伝子をＩｇＭの定常領域に接合することもできる。
可変領域遺伝子を取得するためのＩｇＭ産生細胞、あるいはＩｇＭ以外のクラスのイムノグロブリン産生細胞としては、任意のイムノグロブリン産生細胞を利用することができる。たとえば、ヒトの末梢血から採取されたＢ細胞から、ヒトＩｇＭあるいはヒトＩｇＧなどの可変領域遺伝子を取得することができる。具体的には、ヒトＩｇＭあるいはヒトＩｇＧを産生するＢ細胞とミエローマ細胞との融合細胞の作製またはヒトＩｇＭあるいはヒトＩｇＧを産生するＢ細胞をＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで形質転換させることにより不死化させ、目的とする抗原に対するＩｇＭを産生する細胞をスクリーニングしてから可変領域遺伝子を取得するのが望ましい。また、目的とする抗原で免疫した免疫動物のＢ細胞あるいは免疫担当細胞から、ＩｇＭあるいはＩｇＧなどの可変領域遺伝子を取得することもできる。
更にＩｇＭ産生細胞のｍＲＮＡから、ＩｇＭをコードする塩基配列の全長を取得することもできる。まず予め構造の明らかにされている定常領域をコードする部分をＰＣＲ法によって増幅する。次に５’方向の未知塩基配列を決定するための手法によって、可変領域をコードする部分を取得する。既知塩基配列情報に基づいて、未知塩基配列部分を増幅するための手法が公知である。たとえば５’ＲＡＣＥによって、５’側の未知塩基配列を取得することができる。
あるいは既にクローニングされたＩｇＭ遺伝子が入手できる場合には、その遺伝子をそのまま、あるいは必要に応じて増幅して、以下のベクターあるいは遺伝子断片の構築に利用することもできる。
たとえば、ガングリオシドＧＭ３に対するＩｇＭ抗体であるＬ６１２遺伝子の塩基配列が明らかにされている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３；５３：５２４４−５２５０）。またガングリオシドＧＭ２に対するＩｇＭ抗体であるＬ５５遺伝子の塩基配列が公知である（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；４８：７３−７５）。
本発明に用いるＩｇＭ遺伝子を改変してＩｇＭ抗体変異体とすることができる。本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。どのように改変されたアミノ酸バリアントであれ、元となった抗体と同じ結合特異性を有すれば、本発明における「抗体変異体」に含まれる。このような変異体は、抗体のＨ鎖若しくはＬ鎖の可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性または類似性を有するアミノ酸配列と１００％よりも少ない配列相同性、または類似性を有する。
たとえば、ＩｇＭ  Ｈ鎖にＣｙｓ残基を導入された変異体において、５／６量体の構造変換が確認されている（Ｄａｖｉｓ，ｅｔ．ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９）８，２５１９−２５２６）。あるいは、ＩｇＭ  Ｈ鎖の４領域（Ｃμ１，Ｃμ２，Ｃμ３，Ｃμ４）に欠失、変異を加えて、Ｊ鎖の取り込みや５／６量体構造の変化が確認されている。これらの知見に基づいて、目的とする５量体あるいは６量体を構成しうるＩｇＭの変異体をコードする遺伝子を得ることができる。
また、本発明のＩｇＭ抗体は糖鎖が改変されたＩｇＭ抗体であってもよい。
一方、本発明における発現制御領域としては、たとえば、エンハンサーやプロモーターが利用される。この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、ＩｇＭを発現させることができる。
あるいは、これらの遺伝子を含む遺伝子断片によって宿主細胞を形質転換し、本発明の形質転換細胞を得ることができる。たとえば、発現制御領域と構造遺伝子とからなる発現カセットを含む遺伝子断片は、宿主細胞のゲノムに相同組み換えによって導入することができる。遺伝子断片を保持した宿主細胞は、当該構造遺伝子を発現することができる。
本発明の形質転換細胞を得るには、適当な宿主細胞と発現ベクターまたは遺伝子断片の組み合わせを使用することができる。宿主細胞には、原核細胞や真核細胞が利用される。原核細胞としては、大腸菌や枯草菌などを利用することができる。一方真核細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母細胞等の細胞において、様々な外来性遺伝子の発現システムが実用化されている。
本発明の形質転換細胞を得るための望ましい宿主細胞として、哺乳動物細胞や昆虫細胞を示すことができる。既に述べたように、μ鎖はいくつかの糖鎖結合部位を有している。これらの糖鎖結合部位糖鎖を付加することによって、より天然のＩｇＭに近い構造のＩｇＭを得ることができる。天然の構造を模倣したμ鎖からなるＩｇＭには、ＩｇＭとしての高い活性が期待できる。ＩｇＭの活性とは、たとえばＣＤＣ活性や多量体あるいは会合体の形成能を示すことができる。また、ＩｇＭの構造が天然の分子に近いことは、ＩｇＭの治療効果、および安全性の向上にも貢献する。天然の構造を有するＩｇＭには、レシーピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の免疫学的な排除機構が作用しにくいことが予測されるためである。
糖鎖を備えた状態でＩｇＭを発現させるためには、真核細胞の利用が有利である。中でも哺乳動物細胞は、好ましい宿主細胞として示すことができる。より具体的には、非リンパ球系の哺乳動物細胞は、培養が容易であり、Ｊ鎖を発現していない細胞（Ｃａｔｔａｎｅｏ  ＆  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：２７５３−２７５８、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１８：１００１−１００８）が多いため宿主細胞として好ましい。非リンパ球系細胞株として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を示すことができる。これらの動物細胞においては、天然のＩｇＭに近い糖鎖の付加を期待することができる。特にＣＨＯ細胞は、高いＩｇＭの発現レベルと、天然に近い糖鎖の付加が期待できるため、宿主細胞として好ましい。
本発明の形質転換細胞は、これらの宿主細胞にＩｇＭのＨ鎖とＬ鎖、あるいは更にＪ鎖をコードする塩基配列（ＩｇＭ遺伝子）を導入し発現させることによって得ることができる。これらの宿主細胞に外来性の遺伝子を導入し発現させるための発現ベクターが公知である。
本発明において、宿主細胞として真核細胞を用いる場合には、たとえば次のような宿主ベクター系を利用することができる。
たとえば哺乳動物由来の発現ベクターとして、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、およびｐＣＤＭ８が公知である。動物ウィルス由来の発現ベクターによって哺乳動物細胞を形質転換することもできる。ウイルス由来の発現ベクターとして、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、あるいはｐＡｄｅｘＬｃｗを示すことができる。その他、レトロウィルス由来の発現ベクターであるｐＺＩＰｎｅｏも、動物細胞の形質転換に有用である。
更にｐＢａｃＰＡＫ８が、昆虫細胞用の発現ベクターとして市販されている（「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」、ギブコＢＲＬ社製）。また植物細胞用の発現ベクターとして、例えばｐＭＨ１やｐＭＨ２を示すことができる。更に酵母用の発現ベクターとして、例えば「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１を示すことができる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、ＩｇＭ遺伝子が発現制御領域の制御下に発現できるように配置する。発現制御領域はエンハンサーやプロモーターを含む。たとえば哺乳動物細胞において有効なプロモーターとして、次のプロモーターを示すことができる。
アデノウイルス２型主後期プロモーター、
シミアンウイルス４０初期プロモーター、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、
ウシ成長ホルモンプロモーター、
βアクチン遺伝子プロモーター、および
ＣＡＧプロモーター
ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、
マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）−ＬＴＲプロモーター、
これらのプロモーターの中で、好ましいプロモーターを以下に示す。これらのプロモーターは、哺乳動物細胞において高い発現誘導作用が期待できる。
シミアンウイルス４０初期プロモーター、
サイトメガロウイルスプロモーター、
ポリペプチド鎖伸長因子１αプロモーター、
ＣＡＧプロモーター
更に選択マーカーを含む発現ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする。選択マーカーとしては、ネオマイシンやＧ４１８に対する薬剤耐性遺伝子が一般に用いられる。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、あるいはｐＯＰ１３などが挙げられる。
形質転換細胞において、導入された遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数を増幅するための技術が公知である。たとえば、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクターを導入すれば、メトトレキセート（ＭＴＸ）により遺伝子の発現を増幅することができる。ＤＨＦＲ遺伝子には、としてはｐＣＨＯＩ等を示すことができる。
その他に、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクターで形質転換すれば、遺伝子の一過性の発現を得ることができる。ＳＶ４０の複製起点を持つベクターとしては、ｐｃＤ等が公知である。複製開始点としては、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。
発現ベクターは、形質転換細胞における遺伝子コピー数増幅のために、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むこともできる。
真核細胞に加えて原核細胞の発現システムを本発明に利用することもできる。例えば、大腸菌の発現ベクターとしては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また枯草菌由来の発現ベクターとして、ｐＰＬ６０８やｐＫＴＨ５０が挙げられる。宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーターを利用する必要がある。このようなプロモーターとして、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを示すことができる。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴなどが挙げられる。ｐＥＴの場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
本発明は、上記ベクターまたは遺伝子断片が導入された形質転換細胞を提供する。上記ベクターを導入する宿主細胞は限定されない。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることができる。本発明の形質転換細胞は、例えば、ＩｇＭの製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞株あるいはヒト細胞株としては、たとえば以下のような哺乳動物細胞株が知られている。
ＣＨＯ（ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃｅｌｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、
ＣＯＳ（ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ，Ｍｉｙａｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７９，２６９）、
３Ｔ３（ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、
ＰＣ１２（ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ，Ｎｅｕｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８２）１，８４１）、
ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、
ＨｅＬａ（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ，Ｃａｔｔａｎｅｏ，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６，２７５３）、
Ｃ６（ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌ，Ｃａｔｔａｎｅｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８３）１３５，２８５）、
Ｖｅｒｏ、および
アフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）などの両生類細胞
この他、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、あるいはＴｎ５等の昆虫細胞が知られている。
ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）、あるいはＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）等を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。これらの細胞株は、寄託機関から入手することができる。以下に代表的な細胞株と、ＡＴＣＣのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒを記載した。
ＣＨＯ      ＣＣＬ−６１，ＣＲＬ−９０９６        ＢＨＫ    ＣＲＬ−１６３２
ＣＯＳ      ＣＲＬ−１６５０，ＣＲＬ−１６５１    ＨｅＬａ  ＣＣＬ−２
３Ｔ３      ＣＲＬ−１６５８                      Ｖｅｒｏ  ＣＣＬ−８１
発現ベクターは、任意の方法によって宿主細胞に導入することができる。ベクターの導入方法として、たとえば次のような方法を示すことができる。
リン酸カルシウム法、
ＤＥＡＥデキストラン法、
カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、
エレクトロポーレーション法、
リポフェクション
植物細胞としては、例えば、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）由来の細胞がポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。また、近年、ウキクサ（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）やトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）でのポリペプチド生産が報告されている。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの宿主細胞を上記発現ベクターまたは遺伝子断片により形質転換すれば、ＩｇＭ産生能を有する形質転換細胞を得ることができる。これらの形質転換細胞から、高いＩｇＭ産生能を有する細胞を選択することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
例えば形質転換細胞をクローニングし、各クローンのＩｇＭ産生能を評価する。ＩｇＭ産生能は、適当な培地中で形質転換細胞を培養し、その培養上清中に含まれるＩｇＭを測定することによって知ることができる。目的とする反応性を有する高力価のＩｇＭを産生する細胞を選択するために、目的とする抗原を用いたイムノアッセイを利用することができる。たとえば、抗原を結合させたマイクロプレートを利用するＥＬＩＳＡ法は抗原特異的なＩｇＭの産生を確認する方法として好ましい。更に、ＩｇＭの細胞障害作用を評価するために、補体受容体の解析やＩｇＭが有するＣＤＣ作用を評価することもできる。ＩｇＭの測定方法や、細胞当たりのＩｇＭの産生量を決定するための具体的な手法は、たとえば実施例（１．６）に示したとおりである。
更に本発明は、５量体または６量体のＩｇＭを産生する形質転換細胞を提供する本発明者らにより、宿主細胞を形質転換する発現ベクターまたは遺伝子断片に含まれるＩｇＭ遺伝子がＪ鎖をコードする塩基配列を有する場合には、ＩｇＭが５量体として発現されることが明らかにされた。またＪ鎖をコードする塩基配列を含まない場合には、ＩｇＭは６量体として発現されることが明らかにされた。このように、本発明の知見に基づいて、ＩｇＭの多量体構造を制御することが可能となった。
本発明において、Ｊ鎖をコードする塩基配列は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする塩基配列を保持したベクターと同じベクター上に配置することができる。あるいは、Ｊ鎖をコードする塩基配列を保持したベクターを、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードする塩基配列を保持したベクターとともに共形質転換（コトランスフェクション；ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することによって細胞に導入することもできる。更に、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＪ鎖をコードする塩基配列を、それぞれ別のベクターに配置して、同一の細胞にコトランスフェクションすることもできる。
単一のベクターに３つの遺伝子を配置して宿主細胞を形質転換することによって、ベクター間の形質転換効率の違い、あるいは発現レベルの差を防ぐことができる。すなわち、Ｈ鎖、Ｌ鎖、およびＪ鎖の３つの遺伝子を配置された発現ベクターは、本発明の形質転換細胞を得るためのベクターとして好ましい。
すなわち本発明は、前記ベクターまたは遺伝子断片が、ＩｇＭのＨ鎖、ＩｇＭのＬ鎖、およびＩｇＭのＪ鎖をコードする塩基配列を有し、かつ６０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する形質転換細胞に関する。本発明において、好ましい形質転換細胞は、８０％以上の含量を持つ５量体ＩｇＭを産生する。産生されたＩｇＭ分子に占める５量体ＩｇＭの割合は、たとえば後に述べる方法（実施例４）によって知ることができる。本発明において、全ＩｇＭ中の５量体と６量体の比（５量体／６量体比）は、たとえば１．５以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上である。
また本発明は、遺伝子断片またはベクターがＩｇＭのＨ鎖およびＬ鎖をコードする塩基配列を有し、かつＪ鎖をコードする塩基配列を有さず、５０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する形質転換細胞に関する。本発明において、好ましい形質転換細胞は、８０％以上の含量を持つ６量体ＩｇＭを産生する。産生されたＩｇＭ分子に占める６量体ＩｇＭの割合は、たとえば後に述べる方法（実施例４）によって知ることができる。本発明において、全ＩｇＭ中の６量体と５量体の比（６量体／５量体比）は、たとえば１．５以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上である。６量体のＩｇＭは５量体に比べてＣＤＣ活性が高いことが既に報告されている。したがって、６量体ＩｇＭを優先的に製造することができる本発明の方法は、抗体医薬の製造技術として有用である。
生体内に存在するＩｇＭの主成分は、Ｊ鎖を介して構成された５量体である。５量体含有量が高い組換えＩｇＭを生産することは、天然分子に近いＩｇＭが得られることを意味し、有用である。また、Ｊ鎖を含むことにより、５量体以外の分子（１量体〜４量体および６量体）がほとんど形成されないこと（Ｗｉｅｒｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：５９７９−５９８９、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１２：１９−２７）から、より純粋な組み換えＩｇＭの生産が可能となる。
上記形質転換細胞を培養し、その培養物からＩｇＭを取得することができる。形質転換細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養する方法が公知である。例えば動物細胞は、適当な動物細胞培養用の培地で培養される。ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、あるいはＩＭＤＭ等の培地が、動物細胞培養用の培地として公知である。これらの培地には、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８が好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、あるいは攪拌を加える。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法として、培地中に細胞を分散させて培養する方法や、半透膜を介して細胞と培地を接触させる方法が公知である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの培養方法としては、マウスの腹腔内に細胞を接種する方法が知られている。
ＩｇＭ発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ細胞等の動物細胞は、培養上清中にＩｇＭを分泌する。したがって、培養上清を回収することによって、目的とするＩｇＭを得ることができる。培養上清は、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、あるいは各種のアフィニティクロマトグラフィーなどの精製技術を利用して、精製ＩｇＭとすることができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。本発明は、培養上清から精製された実質的に純粋なＩｇＭの製造方法を提供する。本発明において、実質的に純粋なＩｇＭとは、そのＩｇＭ分子が由来する生物種の蛋白質を含まないＩｇＭと定義することができる。たとえば、ヒト由来のＩｇＭ遺伝子によって形質転換された細胞から回収されたＩｇＭ分子が、ヒト由来のＩｇＭ以外の蛋白質を含まないとき、このＩｇＭは実質的に純粋なＩｇＭと言うことができる。あるいは、マウス−ヒトキメラＩｇＭであれば、マウスとヒトのいずれの蛋白質も含まないＩｇＭは、実質的に純粋なＩｇＭである。本発明における実質的に純粋なＩｇＭは、宿主細胞由来の蛋白、および宿主細胞の培養に使用した培養液の蛋白成分を実質的に含まないことが望ましい。実質的に含まないとは、これらの蛋白質成分が総蛋白質に対して２０％以下、たとえば１０％以下、好ましくは５％以下、あるいは２％以下、更に好ましくは１％以下であることを言う。
これらの製造方法によって得ることができるＩｇＭ抗体、あるいは実質的に純粋なＩｇＭ抗体は本発明に含まれる。本発明における好ましいＩｇＭ抗体は、５０％以上の６量体、６０％以上の５量体、好ましくは８０％以上の５量体または６量体のＩｇＭ分子からなる。本発明において、少なくとも５０％以上の６量体または６０％以上の５量体で構成されるＩｇＭ抗体は、実質的に純粋な５量体あるいは６量体である。本発明において、より望ましい実質的に純粋な５量体あるいは６量体は、たとえば８０％以上の含量を有する。このような実質的に純粋なＩｇＭは、医薬用組成物として有用である。
本発明におけるＩｇＭ抗体が由来する種は限定されない。本発明によって、たとえば、ヒト抗体、あるいはマウス抗体を得ることができる。また本発明のＩｇＭ抗体は、先に述べたように、定常領域と可変領域の遺伝子の由来が異なるキメラ抗体とすることもできる。キメラ抗体として、ヒト（定常）−ヒト（可変）キメラ抗体、あるいはヒト（定常）−異種動物（可変）キメラ抗体を示すことができる。ヒト−ヒトキメラ抗体をコードする遺伝子は、予めクローニングされたヒト定常領域遺伝子に、任意の可変領域遺伝子を接合して得ることができる。更に本発明は、ヒト化抗体を含む。ヒト化抗体は、ヒト可変領域遺伝子のフレームワークに、異種動物由来のＣＤＲを組み込んだ遺伝子を発現させることによって得ることができる。
本発明のＩｇＭ抗体が認識する抗原は限定されない。ＩｇＭ抗体は、ＣＤＣ活性を備えた細胞障害性の強い抗体である。さらに、細胞死誘導活性を持つＩｇＭ抗体も報告されている（Ｙｏｎｅｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８９）１６９：１７４７−１７５６）。したがって、ＩｇＭ抗体は、癌の治療のような細胞障害を治療戦略とする医療技術に有用である。たとえば、様々な糖鎖抗原が腫瘍細胞の細胞表面マーカーとして利用できることが知られている。そのため糖鎖を認識するＩｇＭ抗体は、細胞を標的とする抗体医薬として有用である。たとえば、ある種のガングリオシドは腫瘍細胞に対する抗体医薬の標的分子として有用なことが知られている。具体的には、ガングリオシドＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、あるいはＧＭ３に対する抗体の、いくつかの腫瘍細胞に対する障害作用が確認されている。ガングリオシドＧＭ２あるいはガングリオシドＧＭ３に対するＩｇＭ抗体は、本発明における好ましいＩｇＭとして示すことができる。これらのＩｇＭ抗体を本発明の方法によって製造することもできる。
ガングリオシドＧＭ２あるいはＧＭ３を認識するいくつかの抗体が報告されている。本発明における抗ガングリオシドＧＭ２  ＩｇＭ抗体、あるいは抗ガングリオシドＧＭ３  ＩｇＭ抗体の由来は限定されない。既知のＩｇＭ抗体の遺伝子を利用することもできるし、新たな抗ＩｇＭ抗体遺伝子を取得して、本発明に応用することもできる。たとえば、以下の配列番号に記載のアミノ酸配列は、本発明における好ましい抗ガングリオシドＧＭ２抗体、および抗ガングリオシドＧＭ３抗体の可変領域として示すことができる。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を（）内に記載した。
抗ガングリオシドＧＭ２抗体（Ｌ５５）：
Ｈ鎖：配列番号：２０（配列番号：１９）
Ｌ鎖：配列番号：２２（配列番号：２１）
抗ガングリオシドＧＭ３抗体（Ｌ６１２）：
Ｈ鎖：配列番号：２（配列番号：１）
Ｌ鎖：配列番号：４（配列番号：３）
更に本発明は、上記のＩｇＭ抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。特に本発明は、５量体あるいは６量体のいずれかを他方に比べて多く含むＩｇＭを提供した。その結果、本発明によって、ＩｇＭの５量体あるいは６量体に富む医薬組成物が提供された。すなわち本発明は、５量体／６量体比が、たとえば１．５以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上である医薬組成物を提供する。あるいは本発明は、６量体／５量体比が、たとえば１．５以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上である医薬組成物を提供する。
たとえば、本発明の抗ガングリオシドＧＭ２  ＩｇＭ抗体または抗ガングリオシドＧＭ３  ＩｇＭ抗体を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、癌の治療（または癌の予防）を行うことができる。さらに抗ガングリオシドＧＭ２  ＩｇＭ抗体を有効成分として含有する薬剤を投与することにより、エイズの治療（またはエイズの予防）を行うこともできる。本発明は、このような治療方法（または予防方法）もまた提供する。
抗ガングリオシドＧＭ２  ＩｇＭ抗体または抗ガングリオシドＧＭ３  ＩｇＭ抗体を有効成分として含有する薬剤は、任意の方法によって投与することができる。したがって、経口、非経口投与のいずれでも可能である。好ましい投与方法は、非経口投与である。非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。さらに癌の疾患局所に直接投与することもできる。
抗ガングリオシドＧＭ２  ＩｇＭ抗体または抗ガングリオシドＧＭ３  ＩｇＭ抗体を有効成分として含有する薬剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与することもできる。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように調節することができる。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが利用される。補助剤には、具体的には、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等を利用することができる。医薬組成物には、適当な溶解補助剤を加えることもできる。例えばアルコールや非イオン性界面活性剤は、溶解助剤として好ましい。アルコールとしては、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を示すことができる。また非イオン性界面活性剤としては、例えばポリソルベート８０ＴＭ、あるいはＨＣＯ−５０を用いることができる。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
細胞膜に付着、あるいは細胞内に取り込まれたＩｇＭ抗体は、補体の存在下で、またはＩｇＭ単独で細胞障害作用を有する。本発明のＩｇＭ抗体を利用した抗体医薬製剤において、抗体には各種の治療用成分を結合してその治療効果を更に高めることもできる。治療用成分としては、ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、放射核種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ解毒素などのトキシン類を挙げることができる。治療用成分との結合体を生産する方法および治療に使用する方法については、米国特許５０５７３１３号、米国特許５１５６８４０号に記載されている。あるいは、本発明によって得られたＩｇＭ抗体を、化学療法剤あるいは同種抗原、他種抗原を認識する抗体製剤と併用することによって、治療効果を高めることもできる。
更に本発明は、次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってＩｇＭを分離する工程を含む、ＩｇＭの多量体を分析する方法を提供する。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウムを含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
ＩｇＭは分子量１００万程度と非常に高分子量であるため、一般的な方法では多量体構造（５量体と６量体）を定量的に解析することは困難である。報告されているＩｇＭの多量体構造の分析法においては、ＲＩ標識したＩｇＭを用いて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なっている（文献６／Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２；１２０６）。この方法には、ＲＩが必要である。一方、ＩｇＭを医薬品として開発するためには、製造過程においてＩｇＭの多量体構造を分析することができる技術が必要である。具体的には、製造細胞の選定、細胞培養のモニタリング、精製、原体製造、製剤製造のあらゆる工程においてＩｇＭの多量体構造の分析が必要である。これらの工程におけるＩｇＭの解析には、ＲＩを必要としない解析方法が求められる。本発明者らは、上記のような条件を利用することによって、ＩｇＭの多量体構造を解析しうることを見出し、本発明を完成した。以下に各条件について具体的に述べる。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル：
通常、イムノグロブリンなどの蛋白質の電気泳動に利用されるポリアクリルアミドゲルの重合温度は、室温である。これに対して、たとえば３７℃以上、好ましくは４０℃〜６０℃で重合させたポリアクリルアミドゲルは、本発明のＩｇＭの解析方法に有用である。このような高温条件を与えることにより、アクリルアミドを迅速に重合させることができる。
ｂ）高濃度の過硫酸アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ＰｅｒＳｕｌｆａｔｅ；ＡＰＳ）を含有するポリアクリルアミドゲル：
一般にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは、０．０５％程度のＡＰＳを含んでいる。これに対して、たとえば０．２５％以上、好ましくは０．１％〜０．５％のＡＰＳを含むポリアクリルアミドゲルは、本発明のＩｇＭの解析方法に有用である。
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル：
電気泳動分析用のポリアクリルアミドゲルは、気泡を生じないように均一に調製することが重要である。そのため、ポリアクリルアミドゲルの重合開始剤を添加後、気泡が混入しないように注意しながら重合溶液を十分に攪拌する。これに対して本発明では、ＨＹＢＲＩＤ  ＭＩＸＥＲ（ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて、より完全に重合溶液を均一に攪拌し、かつ、気泡の混入を防ぐために脱泡を行い、均一なゲルを作製した。
本発明のＩｇＭ解析方法は、上記条件ａ）−ｃ）のうち、少なくともいずれか一つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いることによって実施することができる。ＩｇＭを、その多量体構造を維持したまま高い精度で解析するためには、好ましくは上記条件ａ）−ｃ）のうちの少なくとも２つ以上、より好ましくはａ）−ｃ）の全ての条件を満たすポリアクリルアミドゲルを用いることができる。
本発明によるＩｇＭの解析において、電気泳動用の緩衝液は任意の緩衝液を利用することができる。たとえばＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ泳動バッファーは、本発明のＩｇＭの解析方法において好ましい緩衝液である。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ  ＳＤＳ泳動バッファーの具体的な組成は、後に述べる実施例に記載されたとおりである。
本発明のＩｇＭの解析方法は、５量体および／または６量体のＩｇＭを解析対象とすることができる。本発明におけるＩｇＭの解析とは、ＩｇＭ分子が５量体構造を有しているのか、あるいは６量体構造を有しているのかを明らかにすることを言う。５量体とは、２分子のＨ鎖と２分子のＬ鎖からなるＩｇＭの構成単位を５つ有するＩｇＭを言う。同様に６量体は、構成単位が６であるＩｇＭを指す。
ＩｇＭ分子の５量体構造、あるいは６量体構造とは、公知の方法（文献６／Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２；１２０６）によって確認することができる５量体構造、あるいは６量体構造を言う。更に本発明のＩｇＭの解析方法によれば、５量体または６量体として存在するＩｇＭの量比を明らかにすることもできる。例えば、電気泳動後のゲル中のＩｇＭを直接あるいは膜に転写して可視色素あるいは蛍光色素等で染色できる。更に、染色強度あるいは蛍光強度を測定して目的のＩｇＭ構造体を定量することができる。本発明に基くＩｇＭの５量体あるいは６量体の定量方法は、具体的には実施例３および実施例４に記載したような方法に基いて実施することができる。その他、超遠心分離を利用した公知の方法によって、ＩｇＭの５量体および６量体の量比を推定することもできる。
本発明のＩｇＭの多量体の分析方法は、ＩｇＭの会合体の分析に利用することができる。本発明において、複数のＩｇＭ分子が共有結合によって結合した分子を会合体と言う。会合体の形成によってＩｇＭの抗体としての活性は変化する。たとえば、分子が巨大化しているため、ＩｇＭの会合体は沈殿を生じやすい。したがって医薬品としてＩｇＭを開発するためには、ＩｇＭの会合体の定量的評価が必要である。本発明のＩｇＭの多量体の分析方法は、ＩｇＭの５量体と６量体の量比のみならず、ＩｇＭの会合体の量比の定量的な評価も可能である。
より具体的には、上記条件でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施し、５量体（または６量体）に相当する分子量を有する位置に蛋白質が泳動され、かつ抗ＩｇＭ抗体がその蛋白に結合されれば、ＩｇＭが５量体（または６量体）として存在していることを明らかにすることができる。蛋白質が精製されたＩｇＭであれば、蛋白質染色によって泳動位置を知ることができる。あるいは未精製のＩｇＭであっても、抗μ鎖抗体を使ったイムノブロット解析によってＩｇＭのバンドを同定することができる。同定されたＩｇＭのバンドの強度を定量的に、あるいは半定量的に評価すれば、ＩｇＭの量を決定することができる。電気泳動像から蛋白質の量を決定する方法は公知である。
本発明のＩｇＭの分析方法を利用すれば、ＩｇＭの多量体構造を明瞭に識別することができる。したがって、電気泳動後のＩｇＭは、放射性同位元素（ＲＩ）を使用しないで検出することができる。本発明において、ＲＩを使用しない分析方法（ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）とは、電気泳動後のＩｇＭを放射性同位元素以外の手段によって検出する工程を含む分析方法を言う。放射性同位元素以外の手段としては、たとえば蛋白質の染色、あるいはＩｇＭに結合する親和性物質による検出を示すことができる。親和性物質としては、抗ＩｇＭ抗体、プロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＧ、ＩｇＭ  Ｆｃレセプターなどを用いることができる。本発明の分析方法において、これらの親和性物質は予め標識しておくことができる。親和性物質の標識には、酵素、あるいは色素を用いることができる。酵素としては、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、βガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、あるいはアルカリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ）などが用いられる。色素には、蛍光色素、発光色素、あるいは発色色素などが含まれる。これらの標識は、いずれも非放射性物質である。
また本発明は、次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルからなる、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルに関する。あるいは本発明は、次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの条件を満たすポリアクリルアミドゲルの、ＩｇＭの多量体を分析する方法における使用に関する。
ａ）高温で重合させたポリアクリルアミドゲル、
ｂ）高濃度のＡＰＳ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ＰｅｒＳｕｌｆａｔｅ）を含有するポリアクリルアミドゲル、および
ｃ）重合させる前に攪拌、脱泡により均一化したポリアクリルアミドゲル。
これらのポリアクリルアミドゲルは、いずれも本発明のＩｇＭ解析方法に有用である。上記の条件ａ）−ｃ）の少なくとも一つを満たすポリアクリルアミドゲルが、ＩｇＭの解析に有用であることは本発明によって始めて明らかにされた。本発明における好ましいポリアクリルアミドゲルは、上記条件のａ）−ｃ）の２つ以上、より好ましくはａ）−ｃ）の全ての条件を満たす。更に本発明は、次のａ）−ｃ）からなる群から選択された少なくとも１つの工程を含む、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法に関する。
ａ）アクリルアミドを高温で重合させる工程、
ｂ）アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、および
ｃ）重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程。
本発明における好ましいポリアクリルアミドゲルの製造方法は、上記工程のａ）−ｃ）の２つ以上、より好ましくはａ）−ｃ）の全ての工程を含む。すなわち本発明は、次の工程ａ）−ｃ）を含む、ＩｇＭの多量体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離するための電気泳動用ゲルの製造方法を提供する。
１）アクリルアミドに高濃度の過硫酸アンモニウムを添加する工程、
２）重合させる前にアクリルアミドを攪拌、および脱泡により均一化する工程、および
３）アクリルアミドを高温で重合させる工程。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、組換え型Ｌ６１２の培養上清のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。左（Ｊ鎖＋）はＪ鎖発現形質転換細胞の、右（Ｊ鎖−）はＪ鎖遺伝子を導入していない形質転換細胞の培養上清の解析結果を示す。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。
ｍａｒｋｅｒ：分子量マーカー
ｂｕｌｋ：Ｌ６１２精製品
左の写真（Ｊ鎖＋）のＣＪ１５、ＣＪ２５、ＣＪ３８、ＣＪ４５、およびＣＪ６７は、それぞれ実施例１．５で得たＬ６１２安定発現細胞株の培養上清の結果を示す。
右の写真（Ｊ鎖−）のＣＡ０２、ＣＡ１５、ＣＡ１９、ＣＡ２０、およびＣＡ２４は、それぞれ実施例１．５で得たＬ６１２安定発現細胞株の培養上清の結果を示す。
図２は、組換え型Ｌ５５の培養上清のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。左（Ｊ鎖＋）はＪ鎖遺伝子を導入していない形質転換細胞の、右（Ｊ鎖−）はＪ鎖発現形質転換細胞の培養上清の解析結果を示す。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。
Ｓｔ：Ｌ５５精製品
左の写真（Ｊ鎖＋）の０５、２３、３２、４９、および６１は、それぞれ実施例２．３で得たＬ５５安定発現細胞株ＬＪ０５、ＬＪ２３、ＬＪ３２、ＬＪ４９、およびＬＪ６１の培養上清の結果を示す。
右の写真（Ｊ鎖−）の２４、２６、３９、６６、および７４は、それぞれ実施例２．４で得たＬ５５安定発現細胞株ＬＡ２４、ＬＡ２６、ＬＡ３９、ＬＡ６６、およびＬＡ７４の培養上清の結果を示す。
図３は、組換え型Ｌ６１２の培養上清中の各多量体を検出した結果を示す写真である。各レーンはそれぞれ次の試料の結果に対応している。
Ｌ６１２：Ｌ６１２精製品の結果を示す。
ＣＡ１９：実施例１．５で得たＬ６１２安定発現細胞株ＣＡ１９の培養上清の結果を示す。
ＣＪ４５：実施例１．５で得たＬ６１２安定発現細胞株ＣＪ４５の培養上清の結果を示す。
図４は、ｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４導入株における多量体形成を解析した結果を示す写真である。
図５は、組換え型Ｌ６１２の細胞障害活性を測定した結果を示す図である。上図は、補体原として全血を加えた場合を示し、下図はヒト由来血漿１００％を加えた場合を示す。縦軸は標的細胞から特異的に放出された５１Ｃの割合（％）を示す。横軸は抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕ガングリオシドＧＭ３に対する組換え型ヒト抗体Ｌ６１２の作製
１．１  抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の構築
ガングリオシドＧＭ３に結合するヒト抗体（以下、Ｌ６１２と表記する）のＨ鎖をコードする遺伝子は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで形質転換されたヒトＢ細胞（以下、Ｌ６１２発現Ｂ細胞と表記する）より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ６１２のＨ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｈｏｏｎらにより報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３；５３：５２４４−５２５０）。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１×１０７細胞のＬ６１２発現Ｂ細胞より抽出した。ＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域の塩基配列に基づいて２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＨ−ｆ３、ＬＭＨ−ｒ３）を設計した。ＬＭＨ−ｆ３（配列番号：７）はセンス方向で、ＬＭＨ−ｒ３（配列番号：８）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｒ３を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ、
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３またはＬＭＨ−ｒ３
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＳａｃＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片を混合し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）へクローニングし、完全長Ｌ６１２Ｈ鎖遺伝子を得た。
動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＨ−ｆｘｈｏ（配列番号：１１）は前方プライマーでＬ６１２Ｈ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＸｈｏＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）１９６，９４７）を持つように、またＬＭＨ−ｒｓａｌ（配列番号：１２）は後方プライマーでＬ６１２Ｈ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＳａｌＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
１０ｎｇの完全長Ｌ６１２Ｈ鎖遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間、
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＵＣＡＧの制限酵素ＸｈｏＩ部位に連結し、クローニングした。本ベクターｐＵＣＡＧは、ｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られる２．６ｋｂｐの断片をｐＵＣ１９ベクター（東洋紡社製）の制限酵素ＢａｍＨＩ部位に連結し、クローニングしたベクターである。完成したプラスミドをｐＵＣＡＧ／Ｌ６１２Ｈと命名した。本プラスミドに含まれるＬ６１２Ｈ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：１及び配列番号：２に示す。
１．２  抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の構築
Ｌ６１２のＬ鎖をコードする遺伝子はＬ６１２発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ６１２のＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｈｏｏｎらにより報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３；５３：５２４４−５２５０）。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、実施例１．１と同様にしてＬ６１２発現Ｂ細胞より抽出した。ＩｇＭ  Ｌ鎖定常領域の塩基配列に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＬ−ｆ１、ＬＭＬ−ｒ１）を設計した。ＬＭＬ−ｆ１（配列番号：９）はセンス方向で、ＬＭＬ−ｒ１（配列番号：１０）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｒ１を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１またはＬＭＬ−ｒ１
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間、
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復、
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．７ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．９ｋｂｐの断片を混合し、合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＬ−ｆｅｃｏ（配列番号：１３）は前方プライマーでＬ６１２Ｌ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＬＭＬ−ｒｎｏｔ（配列番号：１４）は後方プライマーでＬ６１２Ｌ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＮｏｔＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）
５’末端側遺伝子断片、
３’末端側遺伝子断片、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターｐＣＸＮＤ３の構築の流れについて、以下に述べる。ＤＨＦＲ−ΔＥ−ｒｖＨ−ＰＭ１−ｆ（ＷＯ９２／１９７５９参照）の抗体Ｈ鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  ａｄａｐｔｏｒ（宝酒造社製）をクローニングした。このベクターをｐＣＨＯＩと命名した。
ｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位をｐＣＸＮ（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ  １９９１；１０８：１９３−２００）の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしたベクターをｐＣＸＮＤ３と命名した。また、Ｌ鎖遺伝子断片をｐＣＸＮＤ３にクローニングし、完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２Ｌと命名した。本プラスミドに含まれるＬ６１２Ｌ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：３および配列番号：４に示す。
１．３  抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体の発現ベクターの構築
Ｌ６１２発現ベクターを作製するために、ｐＵＣＡＧ／Ｌ６１２Ｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約４．０ｋｂｐの断片をｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２Ｌの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、およびＬ６１２遺伝子を発現する。
１．４  抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体Ｊ鎖遺伝子および発現ベクターの構築
Ｌ６１２のＪ鎖をコードする遺伝子はＬ６１２発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、上記と同様にしてＬ６１２発現Ｂ細胞より抽出した。ＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒト抗体Ｊ鎖遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ番号：Ｍ１２７５９）に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（Ｊ−ｆ１、Ｊ−ｒ１）を設計し、合成した。Ｊ−ｆ１（配列番号：１５）はセンス方向でヒト抗体Ｊ鎖遺伝子Ｅｘｏｎ３にハイブリダイズし、Ｊ−ｒ１（配列番号：１６）はアンチセンス方向でヒト抗体Ｊ鎖遺伝子Ｅｘｏｎ４にハイブリダイズする。
１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＪ−ｒ１を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆ１を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆ１またはＪ−ｒ１
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。
塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約０．５ｋｂｐの断片、および３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．０ｋｂｐの断片を混合し合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆｅｃｏ、Ｊ−ｒｘｂａを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。
Ｊ−ｆｅｃｏ（配列番号：１７）は前方プライマーでＬ６１２Ｊ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＪ−ｒｘｂａ（配列番号：１８）は後方プライマーでＬ６１２Ｊ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＸｂａＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）
５’末端側遺伝子断片、
３’末端側遺伝子断片、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＪ−ｆｅｃｏ、Ｊ−ｒｘｂａ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、６０℃／３０秒間、６８℃／２分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で５分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏの制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ切断部位に連結し、クローニングした。
本ベクターｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏは、上述のｐＣＨＯＩのＤＨＦＲ遺伝子発現部位を除去し、Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子発現部位をクローニングしたベクターである。完成したプラスミドをｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ  ｃｈａｉｎと命名した。本プラスミドに含まれるＬ６１２Ｊ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：５および配列番号：６に示す。
１．５  動物細胞を用いた抗ガングリオシドＧＭ３ヒト抗体の発現
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
Ｊ鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。Ｌ６１２発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭ（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について実施例１．６に示す濃度定量法で測定した。Ｌ６１２高発現細胞株を順次拡大培養し、Ｌ６１２安定発現細胞株ＣＡ０２、ＣＡ１５、ＣＡ１９、ＣＡ２０、およびＣＡ２４を得た。
また、Ｊ鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。Ｌ６１２発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭ（２５μｇ）およびＪ鎖発現ベクターｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ  ｃｈａｉｎ（２０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。
同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および０．６ｍｇ／ｍＬ濃度のＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について実施例１．６に示す濃度定量法で測定した。Ｌ６１２高発現細胞株を順次拡大培養し、Ｌ６１２安定発現細胞株（ＣＪ１５、ＣＪ２５、ＣＪ３８、ＣＪ４５、ＣＪ６７）を得た。
１．６  培養上清中のＩｇＭ濃度の測定
培養上清中のＩｇＭ濃度の測定は以下のように行った。Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）を１μｇ／ｍｌになるようにＣｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．０２％ＮａＮ３）で希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレートに１００μｌ／ウェルで加え、４℃で２４時間以上反応させ、コーティングを行った。
さらに、Ｒｉｎｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後に、２００μＬ／ウェルのＤｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、室温で１時間以上反応させ、ブロッキングした。Ｒｉｎｓｅ  ＢｕｆｆｅｒおよびＤｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒの組成はそれぞれ次のとおりである。
Ｒｉｎｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ：
ＰＢＳ（−）、
０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、
０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、
０．０２％  ＮａＮ３、
１％  ＢＳＡ
その後、Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒで適当に希釈した培養上清を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。Ｒｉｎｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後に、Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＩＯＳＯＲＣＥ社製）をＤｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒで４０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。最後にＲｉｎｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後にアルカリフォスファターゼ基質（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、吸光光度計Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍの吸光度を測定した。ＩｇＭ濃度はＬ６１２精製品（Ｈｏｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９３；５３：５２４４−５２５０）との比較で算出した。
各種Ｌ６１２安定発現細胞株を７５ｃｍ２培養フラスコ内で初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養し、培養上清中のＩｇＭ濃度を上記の方法で測定した。結果を表１に示す。ＩｇＭ産生量は培養３日目で約２０ｍｇ／Ｌ、培養７日目で約５０ｍｇ／Ｌであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は５〜１９ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。ＩｇＭはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難であるとされていたが、今回の結果より、ＣＨＯ細胞において高い産生量の組換え型ＩｇＭ発現細胞が作製できることが明らかになった。
2005005636.tif 000002
〔実施例２〕ガングリオシドＧＭ２に対する組換え型ヒト抗体Ｌ５５の作製
２．１  抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の構築
ガングリオシドＧＭ２に結合するヒト抗体（以下、Ｌ５５と表記する）のＨ鎖をコードする遺伝子は、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで形質転換されたヒトＢ細胞（以下、Ｌ５５発現Ｂ細胞と表記する）より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ５５のＨ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｎｉｓｈｉｎａｋａらにより報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；４８：７３−７５）。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて１×１０７細胞のＬ５５発現Ｂ細胞より抽出したＩｇＭ  Ｈ鎖定常領域の塩基配列に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＨ−ｆ３、ＬＭＨ−ｒ３）を設計した。ＬＭＨ−ｆ３（配列番号：７）はセンス方向で、ＬＭＨ−ｒ３（配列番号：８）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｒ３を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応させた。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆ３またはＬＭＨ−ｒ３
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。塩基配列決定の後、５’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＳａｃＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片、３’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）及びＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．１ｋｂｐの断片を混合し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター（東洋紡社製）へクローニングし、完全長Ｌ５５Ｈ鎖遺伝子を得た。
動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＨ−ｆｘｈｏ（配列番号：１１）は前方プライマーでＬ５５Ｈ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＸｈｏＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＬＭＨ−ｒｓａｌ（配列番号：１２）は後方プライマーでＬ５５Ｈ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＳａｌＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
１０ｎｇの完全長Ｌ５５Ｈ鎖遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋ベクター、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＨ−ｆｘｈｏ、ＬＭＨ−ｒｓａｌ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、５５℃／３０秒間、６８℃／３分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＸｈｏＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＵＣＡＧの制限酵素ＸｈｏＩ部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＵＣＡＧ／Ｌ５５Ｈと命名した。本プラスミドに含まれるＬ５５Ｈ鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号：１９および配列番号：２０に示す。
２．２  抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体Ｌ鎖遺伝子の構築
Ｌ５５のＬ鎖をコードする遺伝子はＬ５５発現Ｂ細胞より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。Ｌ５５のＬ鎖可変領域遺伝子の塩基配列については、Ｎｉｓｈｉｎａｋａらにより報告されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８；４８：７３−７５）。
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、実施例２．１と同様にしてＬ５５発現Ｂ細胞より抽出した。ＩｇＭ  Ｌ鎖定常領域の塩基配列に基づいて、２本のオリゴヌクレオチド（ＬＭＬ−ｆ１、ＬＭＬ−ｒ１）を設計した。ＬＭＬ−ｆ１（配列番号：９）はセンス方向で、ＬＭＬ−ｒ１（配列番号：１０）はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。１μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使用して、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い５’末端側と３’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。５’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｒ１を用い、３’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１を用いた。逆転写反応は４２℃で１時間３０分間反応した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆ１またはＬＭＬ−ｒ１
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。
塩基配列決定の後、５’末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする前方プライマーＬ５５−ｆ（配列番号：２３）、３’末端側非翻訳領域配列にハイブリダイズする後方プライマーＬ５５−ｒ（配列番号：２４）を設計し、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
５μＬの１０×Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１μＬのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ
（以上の成分はいずれもＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
２．５μＬの逆転写反応産物、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬ５５−ｆおよびＬ５５−ｒ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて３０秒間
９４℃／５秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、７０℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを５回反復
９４℃／５秒間、６８℃／１０秒間、７２℃／３分間のサイクルを２５回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、アガロースゲルから精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。
塩基配列の決定後、合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。ＬＭＬ−ｆｅｃｏ（配列番号：１３）は前方プライマーでＬ５５Ｌ鎖遺伝子の５’末端にハイブリダイズし、かつＥｃｏＲＩ制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またＬＭＬ−ｒｎｏｔ（配列番号：１４）は後方プライマーでＬ５５Ｌ鎖遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、ＮｏｔＩ制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
ＰＣＲ反応溶液（５０μＬ）の組成を次に示す。
５μＬの１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、
１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、
１ユニットのＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−
（以上の成分はいずれも東洋紡社製）、
１０ｎｇのＬ５５Ｌ鎖遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター、
１０ｐｍｏｌｅの合成オリゴヌクレオチドＬＭＬ−ｆｅｃｏ、ＬＭＬ−ｒｎｏｔ
また反応温度条件は次のとおりである。
９４℃の初期温度にて２分間
９４℃／１５秒間、５５℃／３０秒間、６８℃／３分間のサイクルを３０回反復
最後に反応産物を７２℃で７分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、ｐＣＸＮＤ３の制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５Ｌと命名した。本プラスミドに含まれるＬ５５Ｌ鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号：２１および配列番号：２２に示す。
２．３  抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体の発現ベクターの構築
Ｌ５５発現ベクターを作製するために、ｐＵＣＡＧ／Ｌ５５Ｈを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約４．０ｋｂｐの断片をｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５Ｌの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５ＩｇＭと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｌ５５遺伝子を発現する。
２．４  動物細胞を用いた抗ガングリオシドＧＭ２ヒト抗体の発現
ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
Ｊ鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。Ｌ５５発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５ＩｇＭ（２５μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して２週間培養した。
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について実施例１．６に示す濃度定量法で測定した。Ｌ５５高発現細胞株を順次拡大培養し、Ｌ５５安定発現細胞株ＬＡ２４、ＬＡ２６、ＬＡ３９、ＬＡ６６、およびＬＡ７４を得た。
また、Ｊ鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。Ｌ５５発現ベクターｐＣＸＮＤ３／Ｌ５５ＩｇＭ（２５μｇ）および実施例１．４で作製したＪ鎖発現ベクターｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ  ｃｈａｉｎ（２０μｇ）とＰＢＳに懸濁したＣＨＯ細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）の０．７５ｍｌを混合したものを氷上で１０分間冷却し、キュベットに移した後に１．５ｋＶ、２５μＦＤの容量にてパルスを与えた。
室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４０ｍＬに懸濁した。
同様の培地で５０倍希釈溶液を作製し、９６ウェル培養用プレートに１００μｌ／ウェルで分注した。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２４時間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および０．６ｍｇ／ｍＬ濃度のＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加して２週間培養した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｚｅｏｃｉｎ耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のＩｇＭ量について実施例１．６に示す濃度定量法で測定した。Ｌ５５高発現細胞株を順次拡大培養し、Ｌ５５安定発現細胞株ＬＪ０５、ＬＪ２３、ＬＪ３２、ＬＪ４９、およびＬＪ６１を得た。
各種Ｌ５５安定発現細胞株を７５ｃｍ２培養フラスコ内で初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養し、培養上清中のＩｇＭ濃度を実施例１．６で示した方法で測定した。結果を表２に示す。ＩｇＭ産生量は培養３日目で７〜７０ｍｇ／Ｌ、培養７日目で５０〜１５０ｍｇ／Ｌであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は５〜４０ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙであった。
実施例１．６で示した組換え型Ｌ６１２産生細胞株と同等またはそれ以上の産生量が得られた。この結果より、ＣＨＯ細胞において高い産生量の組換え型ＩｇＭ発現細胞株が安定的に作製できることが明らかになった。
2005005636.tif 000003
【実施例３】３．１  組換え型Ｌ６１２（実施例１）および組換え型Ｌ５５（実施例２）の多量体形成の解析
組換え型Ｌ６１２（実施例１）および組換え型Ｌ５５の多量体の解析は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行なった。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の電気泳動ゲルは、以下のとおり作成した。ＨＹＢＲＩＤ  ＭＩＸＥＲ（ＴＯＭＹ）専用の容器に３０％アクリルアミド（Ｃ％＝３．３３％）を１．８０ｍＬ、１．５０Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８を３．７５ｍＬ、ミリＱ水を３．３９ｍＬ、ｇｌｙｃｅｒｏｌを２．２５ｍＬ加え混合し、溶液を５０℃に保温した。さらに２．０％  ａｇａｒｏｓｅを３．７５ｍｌ加え、再び５０℃に保温した。
その後室温に１分静置し、ＴＥＭＥＤを１２μＬ、２５％  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ＡＰＳ）５０μＬを加え、ＨＹＢＲＩＤ  ＭＩＸＥＲ（ＴＯＭＹ）で１５秒攪拌、１５秒脱泡した。ディスポシリンジで溶液を回収し、溶液をゲルプレートに流し込み、３７℃で１時間アクリルアミドの重合反応を行なった。その後室温でａｇａｒｏｓｅを固め、完成した電気泳動ゲルは４℃で保存した。
電気泳動バッファーは、ＮｕＰＡＧＥ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ２０×ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をミリＱ水で２０倍に希釈して作製した。２×サンプルバッファーは、１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、４．０％  ＳＤＳ、３０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．００４％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅを用いた。
実施例１および実施例２で得られた組換え型Ｌ６１２（実施例１、Ｊ鎖＋、およびＪ鎖−）および組換え型Ｌ５５（実施例２、Ｊ鎖＋、およびＪ鎖−）の培養上清を上記の電気泳動ゲル、電気泳動バッファー、２×サンプルバッファーを用いて定電圧６０Ｖで１３時間、電気泳動を行なった。その後、抗μ鎖抗体を一次抗体に用いたＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇは以下のとおりに行なった。
電気泳動後のゲルをセミドライ方式のブロッティング装置を用いて、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、Ｔｗｅｅｎ８０を０．０５％含む５％スキムミルクを用いて２時間、ブロッキングを行なった。Ｔｗｅｅｎ８０を０．０５％含むＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−ｓａｌｉｎｅ溶液で洗浄後、一次抗体として３０００倍希釈したＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ（ＤＡＫＯ）を用いて１時間反応させた。再び洗浄後、二次抗体として１０００倍希釈したＡＰ−Ｇｏａｔ  Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｇｒａｄｅ（ＺＹＭＥＤ）を用いて１時間反応させた。再び洗浄後、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｌｏｔ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて発色させた。
その結果、組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖＋）は、主にＬ６１２発現Ｂ細胞から得られたＬ６１２の５量体に相当するバンドが得られた（図１）。組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖−）は、主にＬ６１２発現Ｂ細胞から得られたＬ６１２の６量体に相当するバンドが得られた。電気泳動の各バンドについては５量体、あるいは６量体であることを電子顕微鏡で確認済みである。組換え型Ｌ５５においても同様の結果が得られた。（図２）
この結果より、ＩｇＭ産生細胞の培養上清中の、５量体、あるいは６量体の確認ができることが明らかになった。また、Ｊ鎖＋で発現させた組換え型ＩｇＭは主に５量体を形成しており、Ｊ鎖−で発現させた組換え型ＩｇＭは主に６量体を形成していることが明らかになった。Ｊ鎖の有無をコントロールすることで、組換え型ＩｇＭの５量体、および６量体を作り分けできることが明らかになった。
【実施例４】４．１  Ｌ６１２発現細胞株における多量体形成比率の分析
実施例３と同様に非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。電気泳動後のゲルを回収し、１０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ，７％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでゲルを３０分以上洗浄した後、Ｒｕｂｙ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて３時間以上染色した。染色後、１０％  ｍｅｔｈａｎｏｌ，７％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでゲルを６０分以上脱色した。脱色後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて４８０ｎｍで励起し、６１８ｎｍで各多量体のバンドを検出した（図３）。これより、各レーンのｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｍを作製し、ピーク面積を求めることで各バンド強度を定量した。得られた会合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、６量体（ｈｅｘａｍｅｒ）、５量体（ｐｅｎｔａｍｅｒ）、および４量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）の比率を表３に示した。本発明の方法により、ＩｇＭの多量体構造、あるいは会合体を定量的に評価できることが確認された。
2005005636.tif 000004
〔実施例５〕組換え型ヒト抗体Ｌ６１２高産生株の作製
５．１  発現プラスミドｐＬ６１２ＣＡ４の構築
ベクターＩＮＰＥＰ４（Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．ＵＳ２００１００１９７１５）のＣＭＶプロモーターおよびポリＡシグナルを除くために制限酵素ＰｖｕＩＩ部分消化を行い、約５．５ｋｂの断片を回収し環状化した。このベクターをＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子を発現する。
ＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶにマルチクローニングサイトを導入するために、制限酵素ＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩ，ＢａｍＨＩ，ＳａｌＩなどのサイトを含むアダプター配列（配列番号：２５および２６をアニーリングして調製した）をＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶのＡｓｃＩ，ＦｓｅＩサイトにクローニングした。このベクターをＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶ（ＭＣＳ）と命名した。配列番号：２５および２６の配列を以下に示す。
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抗体Ｌ鎖発現ユニットをサブクローニングするために、ｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭの約３．０ｋｂのＳａｌＩ，ＰｓｔＩ部分消化断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ  ＩＩ  ＳＫ＋のＳａｌＩ，ＰｓｔＩサイトにクローニングした。このベクターをＬ６１２ＣＡ−Ｌ／ｐＢｌｕｅと命名した。
抗体Ｌ鎖発現ユニットを発現ベクターに導入するために、ＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶ（ＭＣＳ）のＸｈｏＩ，ＢｇｌＩＩサイトにＬ６１２ＣＡ−Ｌ／ｐＢｌｕｅの約３．０ｋｂのＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このベクターをＬ６１２ＣＡ−Ｌ４／ｄＣＭＶと命名した。
抗体Ｈ鎖発現ユニットをサブクローニングするために、ｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭの約４．１ｋｂのＳａｌＩ，ＰｓｔＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ  ＩＩ  ＳＫ＋のＳａｌＩ，ＰｓｔＩサイトにクローニングした。このベクターをＬ６１２ＣＡ−Ｈ／ｐＢｌｕｅと命名した。
抗体Ｈ鎖発現ユニットを発現ベクターに導入するために、Ｌ６１２ＣＡ−Ｌ４／ｄＣＭＶのＳａｌＩ，ＢａｍＨＩサイトにＬ６１２ＣＡ−Ｈ／ｐＢｌｕｅの約４．１ｋｂのＳａｌＩ，ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このベクターをｐＬ６１２ＣＡ４と命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｌ６１２遺伝子（Ｈ鎖、Ｌ鎖）を発現する。
５．２  エレクトロポレーション、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜
ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドｐＬ６１２ＣＡ４を制限酵素ＰｖｕＩで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しＴＥに溶解した。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した細胞と精製したＰｖｕＩ消化ｐＬ６１２ＣＡ４を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍＬに加え、同培地で適度に希釈した後９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌ播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内で培養を行った。ＣＯ２インキュベーター内で１日間培養後、適当量のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ならびにＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定後、適当量Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ならびにＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて２４ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、３〜７日おきに拡大培養を行い、Ｌ６１２高産生株を選抜した。
５．３  ＭＴＸ選抜
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜で取得したＬ６１２高産生株を適当量のＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、９６ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定後、２４ウェル培養用プレートまたは４８ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、３〜７日おきに拡大培養を行い、Ｌ６１２高産生株を選抜した。ＭＴＸ濃度を段階的に上げながらこの操作を繰り返すことで、遺伝子増幅を誘引させて表４に示すＬ６１２高産生株を選抜した。
2005005636.tif 000006
５．４  培養上清中のＩｇＭ濃度の測定法（１）
ＨＰＬＣシステム：Ｗａｔｅｒ社製ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２４８７  Ｄｕａｌ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、２６９０  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ３２  ｖｅｒ．３．２１
使用カラム：ＧＰＣカラムＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）
標準品：凍結されたＬ６１２  ＩｇＭ精製品を融解後いったん遠心し、その上清を小分注して凍結保存したものをＧＰＣ用標準品として使用した。
移動相：Ｄ−ＰＢＳに、Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅを０．０２％、アジ化ナトリウムを０．０５％となるように添加して調製した。
ＨＰＬＣ条件：移動相流量０．５ｍＬ／ｍｉｎ、測定波長２８０ｎｍ、試料注入量１００μＬ操作は以下のようにして行った。３７℃で数分保温して融解したＧＰＣ用標準品の波長２８０ｎｍにおける吸光度を分光光度計により測定し、その値から波長２８０ｎｍにおける吸光度が０．１２となるような希釈率を算出した。
求めた希釈率にてＧＰＣ標準品を希釈したものを分析して得られたピーク面積と適度に希釈して標準品と同容量注入した未知試料のピーク面積と希釈倍率から未知試料の２８０ｎｍにおける吸光度を算出した。得られた吸光度の値とＬ６１２の吸光数
2005005636.tif 000007
Ｌ６１２濃度（μｇ／ｍＬ）＝吸光度（Ａｂｓ２８０）÷１．４×１０００
５．５  哺乳動物由来成分不含培地でのクローニング
ＭＴＸ選抜で得られたＬ６１２高産生株を適当量のＭＴＸを含有する哺乳動物由来成分不含培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、限界希釈法によって１ｃｅｌｌ／２００μＬになるよう希釈を行った。これを９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。これにＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有する哺乳動物由来成分不含培地で培養したＤＧ４４株を適当量のＭＴＸを含有する哺乳動物由来成分不含培地に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁後、１００μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内に静置し、７日後に適当量のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、適当量のＭＴＸを含有する哺乳動物由来成分不含培地を１００μＬ添加後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内に静置した。約２週間後、得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定後、適当量のＭＴＸを含有する哺乳動物由来成分不含培地を用いて２４ウェル培養用プレートに拡大培養した。その後、３〜７日おきに拡大培養を行い、最終的に５．４のゲルろ過クロマトグラフィ法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定し、表５に示すＬ６１２高産生クローンを樹立した。
2005005636.tif 000008
５．６  培養上清中のＩｇＭ濃度の測定法（２）
ＨＰＬＣシステム：ＨＩＴＡＣＨＩ  ＬａＣｈｒｏｍ  ＨＰＬＣ装置（ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−７１２０  ｐｕｍｐ（Ａ，Ｂ）、Ｌ−７２００  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ、Ｌ−７４２０  ＵＶ−ＶＩＳ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｌ−７６１０  ｄｅｇａｓｓｅｒ）
データ解析ソフトウェア：Ｄ−７０００型  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎａｇｅｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ）
分析用カラム：ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬ７．８ｍｍＩＤｘ３００ｍｍ（Ｃａｔ  Ｎｏ．０８５４２、Ｃｏｌｕｍｎ  Ｎｏ．Ｇ０１５１）
標準品：ＭＡＢＯＮ０１Ｒ３０６（５．４の標準品と同等の品質を有するもの）を使用した。
移動相：５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒ，５００ｍＭ  ＫＣｌ，ｐＨ７．４，０．０５％  ＮａＮ３（ｐＨ７．４）
ＨＰＬＣ条件：０．５ｍＬ／ｍｉｎ（２０ｍｉｎ）→１．０ｍＬ／ｍｉｎ、測定波長２８０ｎｍ、試料注入量１００μＬ
検量線：１６００、８００、１００μｇ／ｍＬの３点で作成した。
５．７  哺乳動物由来成分不含培地でのＬ６１２高産生株の回分培養と流加培養
作製したＬ６１２高産生株を、初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにて回分培養法もしくは流加培養法で培養を行い、培養上清中のＩｇＭ濃度をゲルろ過クロマトグラフィ法（５．４，５．６の方法参照）にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として回分培養法では酵母抽出物を、流加培養法では魚肉抽出物を使用した。増殖因子としては、回分培養法でインスリンを、流加培養法ではインスリンとインスリン様増殖因子−Ｉを用いた。回分培養法においてのＬ６１２産生量は、培養６日目で２６９．９ｍｇ／Ｌであった（５．４の方法による）。一方流加培養法においてのＬ６１２産生量は、培養６日目で３４７．４ｍｇ／Ｌ、培養１４日目で１６６９．１ｍｇ／Ｌであった（５．６の方法による）。ＩｇＭはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難とされていたが、加水分解物の使用と流加培養法を組み合わせて用いることにより、ＣＨＯ細胞において高い産生量の組換え型ＩｇＭの調製が可能であることが明らかとなった。
〔実施例６〕単一の発現ベクターによる５量体Ｌ６１２産生株の作製
６．１  発現プラスミドｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４の構築
ＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶ（ＭＣＳ）のＸｈｏＩ，ＢｇｌＩＩサイトに、Ｌ６１２ＣＡ−Ｈ／ｐＢｌｕｅから約４．１ｋｂのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩの抗体Ｈ鎖発現ユニットをクローニングしてＬ６１２ＣＡ−Ｈ３／ｄＣＭＶを作製した。Ｌ６１２ＣＡ−Ｈ３／ｄＣＭＶのＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに、Ｌ６１２ＣＡ−Ｌ／ｐＢｌｕｅから約３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩの抗体Ｌ鎖発現ユニットをクローニングしてｐＬ６１２ＣＡ３を作製した。
抗体Ｊ鎖発現ユニットを構築するため、ｐＣＯＳＩＩ−Ｚｅｏ／Ｊ  ｃｈａｉｎを鋳型とする配列番号２７：ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＣおよび配列番号２８：ＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＣＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧをプライマーとしたＰＣＲ反応により抗体Ｊ鎖遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にクローニングした。ＳＶ４０のポリＡシグナルはｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８１；１：８５４−８６４）を鋳型とする配列番号２９：ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡおよび配列番号３０：ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧをプライマーとしたＰＣＲ反応により増幅し、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングした。
ｐＣＸＮＤ３のＣＡＧプロモーターとして約１．７ｋｂのＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片、クローニングしたＪ鎖遺伝子の約０．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片、クローニングしたＳＶ４０ポリＡシグナルの約０．３ｋｂのＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯのＳｐｅＩ−ＸｈｏＩサイトの間で組み合わせた。このベクターをｐＣＲＣＡＧｐｒｏＪｐＡと命名した。
ｐＣＲＣＡＧｐｒｏＪｐＡのＸｈｏＩサイトを、平滑化してＢａｍＨＩ  ｌｉｎｋｅｒ（ｐＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＧ（配列番号：３１）、タカラバイオ社製）を付加することによってＢａｍＨＩサイトに変換し、約２．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片として抗体Ｊ鎖発現ユニットをｐＬ６１２ＣＡ３のＢａｍＨＩサイトにクローニングした。得られたプラスミドをｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４と命名した。
本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｌ６１２遺伝子（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｊ鎖）を発現する。
６．２  エレクトロポレーション、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜
ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４を制限酵素ＰｖｕＩで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しＴＥに溶解した。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した細胞と精製したＰｖｕＩ消化ｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍＬに加え、同培地で適度に希釈した後９６ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内で１日間培養し、適当量のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ならびにＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定することにより高産生株を選抜し、３〜７日おきに順次拡大培養を行うことによりＬ６１２産生株ＣＡ４−１１９ならびにＣＡ４−１３９を得た。
６．３  多量体形成の解析
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜で得られた細胞株をＳ１００  ｓｐｉｎｎｅｒ  ｆｌａｓｋにて初発細胞密度２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで３日間培養した培養上清を用い、実施例３に示す方法に従い非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗μ鎖抗体を一次抗体に用いたＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。その結果ｐＬ６１２ｐｅｎｔａＣＡ４導入株では、主としてＬ６１２発現Ｂ細胞から得られたＬ６１２の５量体に相当するバンドが得られ、６量体に相当するバンドは検出されなかった（図４）。Ｊ鎖発現単位をＨ鎖ならびにＬ鎖発現単位とともに単一の発現ベクター上に載せ、Ｈ鎖ならびにＬ鎖発現に対するＪ鎖の発現レベルを適切に制御することによって、５量体Ｌ６１２を主として生成させることが可能であることが明らかとなった。
〔実施例７〕組換え型Ｌ６１２のＣＤＣ活性
５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウムにて放射性標識した標的細胞であるＭ１メラノーマ細胞１×１０４個／５０μＬ／ｗｅｌｌにＨＡＶＢにて適宜希釈した抗体溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖−；ＣＡ１９）あるいは組換え型Ｌ６１２（Ｊ鎖＋；ＣＪ４５）がそれぞれ抗体の最終濃度０．１６，０．８，４，２０，１００μｇ／ｍＬとなるようにして氷上にて６０分間静置した。続いて、各ウェルに補体源としてヒト由来血漿１００％ないし全血を１００μＬずつ添加し、５％炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で９０分間静置した。遠心（１０００ｒｐｍ，５分間，４℃）後、各ウェルより上清を１００μＬずつ回収し、γカウンター（ＣＯＢＲＡ  ＩＩ  ＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ，ＭＯＤＥＬ  Ｄ５００５，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にて遊離された放射活性を測定した（図５）。ＣＤＣ活性即ち細胞傷害活性（％）は（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００により計算した。Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）、Ｂは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％  ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ登録商標Ｐ−４０，Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２５２−２３，ナカライテスク株式会社）を２０μＬ、ＨＡＶＢを１３０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞浮遊液を５０μＬ、ＨＡＶＢを１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。試験はｔｒｉｐｌｉｃａｔｅにて行い、特異的クロム遊離率について平均値及び標準誤差を算出した。いずれの条件でも、組換え型Ｌ６１２（ＣＡ１９）は、Ｌ６１２よりも強いＣＤＣ活性を誘導し、５０％  Ｌｙｓｉｓを誘導する濃度の比は、５．８ないし５．９倍であった。また、血球の共存によって、ＣＤＣ活性の顕著な減弱は見られなかった。
〔実施例８〕  ６量体ＩｇＭを優先的に産生する細胞株の作製（１）
８．１  発現プラスミドｐＬ６１２ＣＡ３の構築
ＩＮＰＥＰ４−ｄＣＭＶ（ＭＣＳ）のＸｈｏＩ，ＢｇｌＩＩサイトに、Ｌ６１２ＣＡ−Ｈ／ｐＢｌｕｅから約４．１ｋｂのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩの抗体Ｈ鎖発現ユニットをクローニングしてＬ６１２ＣＡ−Ｈ３／ｄＣＭＶを作製した。Ｌ６１２ＣＡ−Ｈ３／ｄＣＭＶのＢａｍＨＩ，ＳａｌＩサイトに、Ｌ６１２ＣＡ−Ｌ／ｐＢｌｕｅから約３．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩの抗体Ｌ鎖発現ユニットをクローニングしてｐＬ６１２ＣＡ３を作製した。
８．２  エレクトロポレーション、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜
ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドｐＬ６１２ＣＡ３を制限酵素ＰｖｕＩで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しＴＥに溶解した。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した細胞と精製したＰｖｕＩ消化ｐＬ６１２ＣＡ３を混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍＬに加え、同培地で適度に希釈した後９６ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内で１日間培養し、適当量のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ならびにＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を等量加え、コロニーが形成されるまでさらに培養した。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定することにより高産生株を選抜し、３〜７日おきに順次拡大培養を行うことによりＬ６１２産生株ＣＡ３−１０１６を得た。
８．３  ＭＴＸ選抜
Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜で取得したＬ６１２産生株ＣＡ３−１０１６を適当量のＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、９６ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）内でコロニーが形成されるまで培養を行った。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定することにより高産生株を選抜し、３〜７日おきに順次拡大培養を行うことによりＬ６１２産生株ＣＡ３−１０１６−５０−１１を得た。
８．４  哺乳動物由来成分不含培地でのＬ６１２高産生株の回分培養
作製したＬ６１２産生株ＣＡ３−１０１６−５０−１１を、初発細胞密度２〜３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにて回分培養法で培養を行い、培養上清中のＩｇＭ濃度を実施例５の５．４に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。哺乳動物由来成分不含培地を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。回分培養法でのＬ６１２産生量は、培養３日目で５６．０ｍｇ／Ｌであった。
８．５  精製方法
回分培養から得られた培養上清を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してＬ６１２を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＬ６１２を溶出した。この溶出画分を１０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してＬ６１２を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、３５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）でＬ６１２を溶出した。これら２種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたＬ６１２画分を、移動相として３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．０）を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。ゲルろ過で得られた目的画分を０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過を行い精製Ｌ６１２画分とした。
〔実施例９〕  ６量体ＩｇＭを優先的に産生する細胞株の作製（２）
９．１  エレクトロポレーション、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ選抜
ＣＨＯ細胞ＤＧ４４株への遺伝子導入はエレクトロポレーション法により行った。発現プラスミドｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭを制限酵素ＰｖｕＩで一晩消化し、フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿により精製しＴＥに溶解した。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含有するＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した細胞と精製したＰｖｕＩ消化ｐＣＸＮＤ３／Ｌ６１２ＩｇＭを混ぜ、キュベットに入れた後に、遺伝子導入装置でパルスを与えて遺伝子を導入した。
遺伝子導入後、キュベットの細胞をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＨＴ不含）８０ｍＬに加え、同培地で適度に希釈した後９６ウェル培養用プレートに播種した。プレーティング終了後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、８％  ＣＯ２濃度）にプレートを入れコロニーが形成されるまで培養した。得られた単一コロニーについて実施例１の１．６に記載の方法に従って培養上清中のＩｇＭ濃度を測定することにより高産生株を選抜し、３〜７日おきに順次拡大培養を行うことによりＬ６１２産生株ＤＧ４４（ＨＴ−）−３０を得た。
９．２  哺乳動物由来成分不含培地でのＬ６１２高産生株の連続回分培養
作製したＬ６１２産生株ＤＧ４４（ＨＴ−）−３０を、初発細胞密度２〜３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬにて連続回分培養法で培養を行い、培養上清中のＩｇＭ濃度を実施例５の５．４に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定した。ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＨＴ不含）を用い、加水分解物として酵母抽出物を使用した。増殖因子としてはインスリンを用いた。３日毎の４回の連続した回分培養においてのＬ６１２産生量は、各々２８．７ｍｇ／Ｌ，３２．０ｍｇ／Ｌ，２５．７ｍｇ／Ｌ，２２．２ｍｇ／Ｌであった。
９．３  精製方法
４回の回分培養から得られた培養上清を、それぞれ１５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した陰イオン交換樹脂充填カラムに負荷してＬ６１２を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）でＬ６１２を溶出した。この溶出画分を１０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で平衡化したハイドロキシアパタイト充填カラムに負荷してＬ６１２を吸着せしめ、次いで同平衡化緩衝液で洗浄した後、３５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）でＬ６１２を溶出した。これら２種のカラムクロマトグラフィーでの不純物分離精製を行った後、得られたＬ６１２画分を、移動相として３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有２０ｍＭ酢酸（ｐＨ６．０）を使用したゲルろ過にて会合体の分離除去を行った。４回の各精製でのＬ６１２回収率はそれぞれ実施例５の５．４に記載のゲルろ過クロマトグラフィー法にて測定し、８３．７％、４５．６％、６３．６％、７５．６％であった。４回分のゲルろ過での目的画分を混合し、０．２μｍのメンブレンフィルターでろ過を行い精製Ｌ６１２画分とした。
実施例１０  ６量体ＩｇＭを優先的に産生する細胞株における多量体形成比率の分析
実施例８および実施例９で得られたそれぞれの精製Ｌ６１２画分について、実施例４に記載の方法と同様の方法でＩｇＭの多量体形成比率を分析した。但し、電気泳動時のゲルの組成、および電気泳動バッファーを以下のとおり変更して実施した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の電気泳動ゲルは、ＨＹＢＲＩＤ  ＭＩＸＥＲ（ＴＯＭＹ）専用の容器に３０％  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ：Ｎ，Ｎ’−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ＝２９：１）を１．８５ｍＬ、１．５０Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ７．０を３．７５ｍＬ、ミリＱ水を３．３４ｍＬ、ｇｌｙｃｅｒｏｌを２．２５ｍＬ混合し、溶液を５０℃で保温した。さらに２．０％  ａｇａｒｏｓｅを３．７５ｍＬ加え、再び５０℃で保温した。
その後室温に１分放置し、ＴＥＭＥＤを１２μＬ、２５％  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ（ＡＰＳ）５０μＬを加え、ＨＹＢＲＩＤ  ＭＩＸＥＲ（ＴＯＭＹ）で１５秒攪拌、１５秒脱泡した。ディスポシリンジで溶液を回収し、溶液をゲルプレートに流し込み、３７℃で１時間アクリルアミドの重合反応を行った。その後室温でａｇａｒｏｓｅを固め、完成した電気泳動ゲルは４℃で保存した。
電気泳動バッファーは、Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅを６．０６ｇ、Ｔｒｉｃｉｎｅを８．９６ｇ、およびＳＤＳを１ｇをミリＱ水で１０００ｍＬにメスアップすることにより調製した。
会合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、６量体（ｈｅｘａｍｅｒ）、５量体（ｐｅｎｔａｍｅｒ）、および４量体（ｔｅｔｒａｍｅｒ）の比率を表６に示した。
2005005636.tif 000009
産業上の利用の可能性
本発明は、ＩｇＭの生産能力の高い細胞を提供する。本発明に基づいて構築された、ＩｇＭ産生細胞は、たとえば細胞融合法によって樹立されたＩｇＭ産生細胞と比較して、高いＩｇＭ産生能力を有する。ＩｇＭはＩｇＧと異なり、５量体あるいは６量体といった多量体構造を有する。そのため、細胞あたりの産生量を高めることは、一般にＩｇＧよりも難しい。つまり、ＩｇＭの産生能力を高められた本発明によるＩｇＭ産生細胞、あるいはこの細胞を利用したＩｇＭの産生方法は、きわめて困難な課題を解決した成果であると言うことができる。
また本発明は、５量体のＩｇＭ、および６量体のＩｇＭの産生方法を提供する。ＩｇＭ分子には、５量体および６量体の構造が存在することはすでに知られていた。しかし、いずれかの構造を有するＩｇＭを優先的に製造するための方法は知られていなかった。本発明は、形質転換に利用するＩｇＭ遺伝子におけるＪ鎖の有無によって、５量体あるいは６量体のいずれかの構造を有するＩｇＭを優先的に産生させることに成功した。
このようにして産生した６量体のＩｇＭは、産生した５量体のＩｇＭと比較して細胞障害作用が強いことが確認された。本発明は、６量体構造の組換えヒトＩｇＭを産生し、ヒト補体を用いて組換えヒトＩｇＭの強い細胞障害作用を示した初めての知見である。このようなことから、本発明の方法は６量体構造のＩｇＭを優先的に製造し、ＩｇＭの細胞障害作用を利用した抗体医薬を得る方法として理想的である。
更に本発明は、５量体および６量体のＩｇＭを解析することができる方法を提供した。公知の方法では、ＩｇＭの多量体構造を識別することが難しかった。本発明の解析方法によれば、ＩｇＭの多量体構造を正しく識別することができる。本発明のＩｇＭの解析方法の利用によって、ある製造方法によって得られたＩｇＭに占める５量体あるいは６量体の割合を正しく知ることができる。いずれの構造を有するＩｇＭがどの程度含まれているのかを明らかにすることは、ＩｇＭの製造技術の評価において重要である。しかも本発明の解析方法は、ＲＩを必要としない。ＲＩが不要な解析方法は、医薬品のあらゆる製造工程の評価に有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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