(57)【要約】本発明の技術的課題は、インビトロで分化した多能性幹細胞から、早期の分化段階にある間葉系幹細胞を得ることである。本発明は、ａ）多能性幹細胞を培養する段階、ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、およびｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、により、間葉系幹細胞を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞であって、ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性であり、Ｍｅｓｐ２を発現しない細胞。
【請求項２】
さらにＬｉｍ１および／またはメソジェニンを発現しない、請求項１に記載の間葉系幹細胞。
【請求項３】
ストロマ細胞様形態である、請求項１または請求項２に記載の間葉系幹細胞。
【請求項４】
多能性幹細胞が哺乳動物由来である、請求項１ないし３のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項５】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１ないし４のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項６】
哺乳動物に移植するための、請求項１ないし５のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項７】
哺乳動物に移植するための細胞を得るために使用する、請求項１ないし６のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項８】
ａ）多能性幹細胞を培養する段階、
ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階、
を含む、請求項１ないし７のいずれかに記載の間葉系幹細胞の調製方法。
【請求項９】
ｄ）ｃ）で選別分離した細胞の一部を取り、Ｍｅｓｐ２、Ｌｉｍ１およびメソジェニンからなる群から選択される少なくとも１つの中胚葉マーカー遺伝子の発現がないことを確認する段階、をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｃ）を培養５日目以降に実施する、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｃ）において、抗ＰＤＧＦＲα抗体および／または抗ＦＬＫ１抗体を使用する、請求項８ないし請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
段階ｃ）において、ＦＡＣＳにより細胞を選別し分離する、請求項８ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
段階ａ）において、多能性幹細胞の分化を促進させる処理を施す、請求項８ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該処理がコラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で多能性幹細胞を培養することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該処理が、培養培地にｔｒａｎｓ−レチノイン酸、インシュリン、デクサメタゾン、ＩＢＭＸおよびトログリタゾンから選択される少なくとも１つの物質を添加することを含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
物質がｔｒａｎｓ−レチノイン酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の間葉系幹細胞を脂肪細胞に分化させる処理を含む、脂肪細胞の調製方法。
【請求項１８】
該処理がコラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で間葉系幹細胞を培養することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培養培地にｔｒａｎｓ−レチノイン酸、インシュリン、デクサメタゾン、ＩＢＭＸおよびトログリタゾンから選択される少なくとも１つの物質を添加することを含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる処理を含む、骨芽細胞の調製方法。
【請求項２１】
該処理がゼラチンでコートした培養プレート上で間葉系幹細胞を培養することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
培養培地にＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸塩、デクサメタゾン、β−グリセロリン酸塩から選択される少なくとも１つの物質を添加することを含む、請求項２０または請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させる処理を含む、軟骨細胞の調製方法。
【請求項２４】
培養培地にデクサメタゾンを添加することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項８ないし請求項１６のいずれかに記載の方法で得られる間葉系幹細胞。
【請求項２６】
請求項１７ないし請求項１９のいずれかに記載の方法で得られる脂肪細胞。
【請求項２７】
請求項２０ないし請求項２２のいずれかに記載の方法で得られる骨芽細胞。
【請求項２８】
請求項２３または請求項２４に記載の方法で得られる軟骨細胞。
【請求項２９】
請求項１ないし請求項７、および請求項２５ないし請求項２８のいずれかに記載の細胞を哺乳動物に移植することを含む、哺乳動物の障害の処置方法。
【請求項３０】
請求項１ないし請求項７、および請求項２５ないし請求項２８のいずれかに記載の細胞を使用する、薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞、およびそのような細胞の調製方法に関する。
【背景技術】  現代社会では、糖尿病や虚血性心疾患、脳血管障害を始めとする動脈硬化性疾患などの生活習慣病を患う人が急増している。生活習慣病の危険因子の一つに、肥満症、特に内臓脂肪の蓄積がある。脂肪組織は、体内のエネルギーバランスの変化や脂肪細胞自身の形態変化に対応してホルモンやサイトカインを始めとする種々の生理活性物質を分泌する、全身の糖・脂質代謝にとって極めて重要な組織であることが最近明らかにされた。そのため、脂肪細胞の分化に関して積極的に解析がなされてきたが、そのほとんどは脂肪前駆細胞株である３Ｔ３Ｌ１細胞などの培養細胞株を用いる分化の終末段階の解析であり、早期の分化過程に関する解析は進んでいない（Ｆｒａｎｃｉｎｅ  Ｍ．Ｇｒｅｇｏｉｒｅ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２２６；９９７−１００２，２００１、およびＣｈｒｉｓｔｙ  Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３；１３２３−１３３５，１９８９）。
骨芽細胞は、骨細胞へ分化する前の前駆細胞の総称であり、骨原性の未分化間葉系幹細胞から分化した、骨形成能を有する単核細胞である（Ｓｈｉｎｉｃｈ  Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２３；３４９−３５５，２００３）。未分化の間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化の調節機構は不明であるが、骨誘導因子（ＢＭＰ）が関与する可能性がある。
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＥＳ細胞）は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生３．５日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持させつつ、増殖を維持させることが可能である。マウス胚性幹細胞は、発生３．５日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、インビボで再びすべての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分化させることが可能になっている。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。
胚性幹細胞を強制的にインビトロで分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグループの研究で明らかとなった（例えば、Ｓｈｉｎｉｃｈｉ  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５；１７４７−１７５７，１９９８；Ｔｏｒｕ  Ｎａｋａｎｏ，ｅｔ，ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５；１０９８−１１０１，１９９４；Ｔａｋｕｍｉ  Ｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９５；８７０−８７８，２０００参照）。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階にある幹細胞を経て完全な成熟細胞に至ると考えられているが、その分化過程には未だ不明な点が多い。胚性幹細胞から脂肪細胞への分化に関しては、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を形成させた後、効率的に分化させる方法が報告されている（Ｃ．Ｄａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０；１２７９−１２８５，１９９７）。Ｎａｏｋｉ  Ｎａｋａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１６；２０１５−２０２８，２００３には、軟骨細胞への分化が記載されている。
【発明の開示】
本発明は、インビトロで分化した多能性幹細胞から、分化の早期段階にある間葉系幹細胞を得ることを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、胚性幹細胞をインビトロで培養すると、間葉系幹細胞が分化の早期段階で出現し、この細胞集団が２種類の特別な細胞表面マーカー、即ち、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α：ＰＤＧＦＲα）および胎児肝キナーゼ１（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ−１：ＦＬＫ１）を、ある一定の様式で発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は、インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた間葉系幹細胞を提供する。この細胞は、ストロマ細胞様形態であり、ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性あり、Ｍｅｓｐ２を発現しない。この細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞および／または軟骨細胞への分化能を有し得る。
本発明は、以下の段階を含む間葉系幹細胞の調製方法を提供する。
ａ）多能性幹細胞を培養する段階、
ｂ）ストロマ細胞様形態の細胞の出現を確認する段階、および
ｃ）ＰＤＧＦＲα陽性かつＦＬＫ１陰性の細胞を選別し分離する段階。
本方法の段階ａ）では、多能性幹細胞を間葉系幹細胞に分化させる処理を施してもよい。
本発明はさらに、上記の方法で得られる間葉系幹細胞を、脂肪細胞、骨芽細胞、または軟骨細胞に分化させる方法、およびこれらの方法で得られる脂肪細胞、骨芽細胞および軟骨細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】図１  ＲＡによる分化誘導後のＰＤＧＦＲαの発現の経過を示す。
図２Ａ−Ｃ  脂肪細胞への分化誘導後のＰＤＧＦＲαの発現の経過を示す。
図３Ａ−Ｃ  ＰＤＧＦＲα陽性および陰性細胞の、脂肪細胞への分化を示す。
図４  ＲＡ（−）４日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞は、脂肪細胞へ分化しないことを示す。
図５  ＲＡ（−）４日目およびＲＡ（＋）９日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の、マーカー遺伝子発現パターンを示す。
図６  ＲＡ添加の時期による脂肪細胞分化効率を比較したグラフである。
図７  ９日目に選別分離したＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の自己複製能を示す。
図８  ３０回継代したＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が脂肪細胞への分化能を有することを示す。
図９  ＰＤＧＦＲα陽性および陰性細胞の、骨芽細胞および軟骨細胞への分化を示す。
図１０  ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞のクローニング過程を図解する。
図１１  クローン細胞株の全細胞がＰＤＧＦＲα陽性であることを示す。
図１２  ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が、脂肪細胞と骨芽細胞の両方に分化することを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書において、「間葉系細胞」とは、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などの、間葉系組織を形成する細胞およびそれらに分化し得る間葉系幹細胞を意味する。胚発生中に生じる間葉系細胞、動物個体中にある間葉系細胞、インビトロまたはインビボで多能性幹細胞から分化して生じる間葉系細胞は、全て「間葉系細胞」の用語に包含される。
本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、１またはそれ以上の間葉系細胞に分化する能力と自己複製能を有する間葉系細胞を意味する。間葉系幹細胞は、中胚葉系細胞と同様に、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、ストロマ細胞、腱細胞などに分化できる多分化能を有する。多分化能と自己複製能力を有する中胚葉系細胞が、発生の進行に伴ってその能力を喪失するのに対して、間葉系幹細胞は、発生段階を経た後、成体内に長く存在することが知られている。そのため、間葉系幹細胞は、細胞移植治療に有用であると期待されている。
本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養および／または分化させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも２つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：胚性幹細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＡＰＳ細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものである。
本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚性幹細胞を使用してもよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。
本発明の間葉系幹細胞は、ストロマ細胞様形態を有する。ストロマ細胞は、星状形や紡錘形の扁平な細胞であり、核が比較的大きく、核小体もはっきりしている。ストロマ細胞の形態は線維芽細胞とよく似ているが、線維芽細胞よりも細胞質が大きく、やや丸みを帯びており、典型的には、図２Ｃ（左図）のような形態である（Ｋｏｄａｍａ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８２；１１２，８９−９５参照）。
ＰＤＧＦＲαは、膜貫通型受容体であり、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する（Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４；２６９１−２７００，１９９７）。そのリガンドは血小板由来増殖因子である。ＰＤＧＦＲαを欠損したマウスは、体節および血管形成分化に異常をきたす。ＦＬＫ１は、ＰＤＧＦＲαと同様に、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型受容体である（Ｓｈａｌａｂｙ，Ｆ．，Ｃｅｌｌ  ８９；９８１−９９０，１９９７）。そのリガンドは血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）である。ＦＬＫ１を欠損したマウスは、血液および血管内皮細胞の分化に異常をきたし、胎生致死である。
本明細書において、ある分子について「陽性である」は、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性である」は、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、後述のＦＡＣＳ等により判定できる。
本発明の間葉系幹細胞は、ＰＰＡＲγ１、ＰＰＡＲγ２、アジポネクチン、ＵＣＰ１などの脂肪細胞マーカーとして知られている遺伝子を発現せず、またＭｅｓｐ２、ＤＬＬ１、Ｌｉｍ１、Ｓｏｘ４、メソジェニンなどの中胚葉マーカー、およびＯｔｘ１およびＯｔｘ２などの神経細胞マーカーも発現しない（実施例６参照）。このことは、本発明の間葉系幹細胞が、中胚葉系幹細胞よりも分化が進んでおり、かつ既知の脂肪前駆細胞である３Ｔ３Ｌ１細胞よりも早期の分化段階にあることを意味している。
本発明者らは、以前に、胚性幹細胞をコラーゲンＩＶ上で培養し分化を誘導した場合、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が誘導後３日目から出現し、４日目で最大になること、およびこれらの細胞は中胚葉系幹細胞を含むことを開示した（特願２００２−３３２２３２）。本発明の間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞および／または軟骨細胞などの間葉系細胞への分化能を有する点で、上記の細胞と異なる（例えば、実施例４参照）。また、上記の細胞は、Ｍｅｓｐ２、ＤＬＬ１、Ｌｉｍ１、Ｓｏｘ４、メソジェニンなどの中胚葉マーカーを発現するが、本発明の間葉系幹細胞は発現しない。他の各種マーカー遺伝子の発現様式においても、本発明の間葉系幹細胞は、上記の細胞と異なる（実施例５参照）。これらの相違に加えて、本発明の細胞は、ストロマ細胞様形態を有することを特徴とする。
中胚葉マーカー遺伝子の発現の有無を調べることにより、本発明の細胞と特願２００２−３３２２３２の細胞を区別することができる。中胚葉マーカー遺伝子であるＭｅｓｐ２の発現の有無を調べるだけでよいが、好ましくは、さらにＬｉｍ１および／またはメソジェニンの発現の有無も調べる。Ｍｅｓｐ２、Ｌｉｍ１およびメソジェニンは、各々、Ｓａｇａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：１８２７−３９，１９９７；Ｔｓａｎｇ  Ｔ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２３：７７−９０，２０００およびＹｏｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：３２０４−３２１４，２０００に記載されている。
本発明の間葉系幹細胞は、哺乳動物に移植するために、あるいは、哺乳動物に移植するための細胞を得るために使用できる。移植はヒトを含むいかなる哺乳動物に対しても行うことができる。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法において、本発明による多能性幹細胞の培養の具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）、Ｈｏｇａｎ，Ｇ．ら編：マウス胚の操作：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９９４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９８７）などの記載を参酌して適宜に決定することができる。
代表的な継代操作と培養条件を胚性幹細胞を例に説明すると、以下のとおりである。即ち、ディッシュをゼラチンでコートし、そのディッシュに１０，０００個／ｃｍ２の濃度で胚性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養する。翌日１度培地を交換し、２日目でコンフレントになったら、リン酸緩衝塩水で１〜２回リンスし、その後十分量の０．２５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを、細胞層を覆うように添加して約５分間放置する。トリプシン液を除去し、適量の胚性幹細胞培養用培地を添加し、ピペッティングによりディッシュから分離させる。この細胞懸濁液から、通常遠心分離により細胞を沈殿させる。上清を除去後、沈殿した細胞を胚性幹細胞培養用培地に再懸濁し、再び１０，０００個／ｃｍ２の濃度で、ゼラチンコートしたディッシュに播種し、培養する。
多能性幹細胞を未分化状態で維持するには、多能性幹細胞維持用培地を使用する。例えば、胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、ＬＩＦ、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、組成の一例を挙げると、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦである。
多能性幹細胞を分化させるためには、上記の多能性幹細胞維持用培地からＬＩＦを除いた、多能性幹細胞分化用培地で多能性幹細胞を培養する。組成の一例を挙げると、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンである。多能性幹細胞分化用培地で多能性幹細胞を培養すると、多能性幹細胞は未分化状態から脱して様々な細胞への分化を開始する。本明細書において培養日数に言及する場合は、多能性幹細胞分化用培地で培養した日数を意味する。
多能性幹細胞維持用培地および分化用培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、培地の各成分に代えて、同等の機能を有する代替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、ストロマ細胞の出現を確認する段階を含む。本発明では、「ストロマ細胞の出現」は、ストロマ細胞様形態の細胞が細胞全体の１％以上、好ましくは５％以上、最も好ましくは１０％以上を占めることを意味する。未分化状態を維持しない通常の培養条件では、培養５日目あたりでストロマ細胞様形態の細胞が出現し始める。細胞の形態は、一般的な光学顕微鏡、位相差顕微鏡、位相差倒立顕微鏡などにより観察できる。
また、本発明の間葉系幹細胞の調製方法は、選別分離した細胞の一部を取り、Ｍｅｓｐ２、Ｌｉｍ１およびメソジェニンからなる群から選択される少なくとも１つの中胚葉マーカー遺伝子を発現がないことを確認する段階、をさらに含んでもよい。中胚葉マーカー遺伝子の発現の有無は、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザン・ブロット法、ＤＮＡチップを使用する方法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＺＡ）および抗体染色法など、当分野で一般的ないかなる方法で確認してもよい。通常、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認するのが好ましい。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法において細胞の選別・分離のために使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、後述のＦＡＣＳで使用する場合、モノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、実施例に記載の方法を参照して当業者が作成することができるが、市販のものを使用してもよい。抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体（品番５５８７７４）および抗ＦＬＫ１モノクローナル抗体（品番５５５３０８）はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから販売されており、容易に入手できる。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法において、各細胞表面マーカーを指標に細胞を選別し、分離する際には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用できる。ＦＡＣＳは、通常、フローサイトメーター、レーザー発生装置、光学系、データ処理装置および細胞分取装置を備えている。ＦＡＣＳの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。ＦＡＣＳにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射し、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。ＦＡＣＳの装置はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ等から市販されており、製造者の指示に従って当業者が操作することが可能である。
本発明における細胞の選別方法について、抗体を使用する方法を詳述したが、各細胞表面マーカーのｍＲＮＡの存在を指標にして選別することも可能である。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法の段階ａ）では、多能性幹細胞の分化を促進させる処理を施してもよい。様々な間葉系細胞への分化処理を施すと、分化の途中で目的の間葉系幹細胞が出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよい。例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、コラーゲンＩＶコートディッシュ上で胚性幹細胞を培養し、培養２日目から４日目まで、ｔｒａｎｓ−レチノイン酸を培養培地に添加し、インキュベートする。効率は低いが、コラーゲンＩＶコートディッシュまたはゼラチンコートディッシュ上で多能性幹細胞を培養するだけでも、目的の細胞が出現する。
本発明の方法では、多能性幹細胞の分化を促進させる処理として、多能性幹細胞を脂肪細胞に分化させる処理を採用してもよい。本発明では、多能性幹細胞を完全に脂肪細胞に分化させる必要はなく、目的の間葉系幹細胞は分化処理の途中で出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、典型的には、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ４；１１９−１２９，２００３に記載されたＪｕｎ  Ｎａｋａｅらの方法に従って分化させる。例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、コラーゲンＩＶコートディッシュ上で多能性幹細胞を培養し、培養２日目から４日目までｔｒａｎｓ−レチノイン酸、場合により５日目からインシュリン、７日目ないし１１日目からインシュリン、デクサメタゾン、ＩＢＭＸおよびトログリタゾンを培養培地に添加し、インキュベートする。また、Ｃ．Ｄａｎｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０；１２７９−１２８５に記載のように、胚様体を形成させた後に分化させてもよい。
あるいは、本発明の方法では、多能性幹細胞を間葉系幹細胞の分化を促進させる処理として、多能性幹細胞を骨芽細胞に分化させる処理を採用してもよい。本発明では、多能性幹細胞を完全に骨芽細胞に分化させる必要はなく、目的の間葉系幹細胞は分化処理の途中で出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、ゼラチンコートディッシュ上で多能性幹細胞を培養し、培養２日目から、ＢＭＰ−４、アスコルビン酸−２−リン酸、デクサメタゾンおよびβ−グリセロリン酸塩を培養培地に添加し、インキュベートする。あるいは、胚様体を形成させて長期間培養し、骨芽細胞が出現してくるのを待ってもよい（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６５：２５１−２６８，２００３）。
あるいは、本発明の方法では、多能性幹細胞の分化を促進させる処理として、多能性幹細胞を軟骨細胞に分化させる処理を採用してもよい。本発明では、多能性幹細胞を完全に軟骨細胞に分化させる必要はなく、目的の間葉系幹細胞は分化処理の途中で出現する。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地を使用して、培養２日目から、デクサメタゾンを培養培地に添加し、インキュベートする。
本発明の間葉系幹細胞の調製方法では、培養培地にｔｒａｎｓ−レチノイン酸を添加することにより、本発明者らが以前に開示した中胚葉系幹細胞を含むＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞（特願２００２−３３２２３２）の出現を抑えることができる（実施例１参照）。
本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、脂肪細胞に分化させる処理を含む、脂肪細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、実施例に記載のように、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地に、５μｇ／ｍｌのインシュリン、１μＭのデクサメタゾン、５００μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチンおよび１μＭのトログリタゾンを添加した培地中、コラーゲンＩＶコートディッシュ上で間葉系幹細胞を培養することを含む。脂肪細胞は、オイル・レッドを使用する細胞染色により確認できる。
本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、骨芽細胞に分化させる処理を含む、骨芽細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、実施例に記載のように、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地に、１０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４、５０μＭのアスコルビン酸−２−リン酸、０．１μＭのデクサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩を添加した培地中、ゼラチンコートディッシュ上で間葉系幹細胞を培養することを含む。骨芽細胞は、アリザリン・レッドを使用する細胞染色により確認できる。
本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞を、軟骨細胞に分化させる処理を含む、軟骨細胞の調製方法を提供する。該処理は、例えば、胚性幹細胞の場合、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む胚性幹細胞分化用培地に０．１μＭのデクサメタゾンを添加した培地中で、間葉系幹細胞を培養することを含む。軟骨細胞は、アルシアン・ブルーを使用する細胞染色により確認できる。
本発明はさらに、本発明の間葉系幹細胞、脂肪細胞、骨芽細胞および／または軟骨細胞を哺乳動物に移植することを含む、哺乳動物の障害の処置方法を提供する。例えば、変形性膝関節症などの軟骨が壊されるような病気の治療のために、本発明の間葉系幹細胞から大量の軟骨細胞を分化させ、関節内へこの軟骨細胞を移植することができる。また、例えば、心筋梗塞の治療において、本発明の間葉系幹細胞を静脈注射し、心筋再生を促すことができる。本発明の処置方法は、ヒトを含むいかなる哺乳動物に対しても行うことができる。
本発明はまた、本発明の間葉系幹細胞、脂肪細胞、骨芽細胞および／または軟骨細胞を使用する、薬剤のスクリーニング方法を提供する。例えば、骨粗鬆症の治療用薬剤の開発のために、候補物質を添加した培地中で本発明の間葉系幹細胞を培養し、これらの細胞を骨芽細胞に分化させる物質をスクリーニングする。
以下、実施例により本発明の詳細を説明するが、これは本発明の１つの実施態様にすぎず、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。
【実施例】胚性幹細胞から分化した間葉系幹細胞の調製
参考例１．胚性幹細胞の維持
ａ．材料
胚性幹細胞の維持には、表１の試薬および器具を使用した。
2004106502.tif 000002
胚性幹細胞維持用培地の組成は、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、であった。胚性幹細胞は、マウス１２９ｓｖ系統由来のＣＣＥ胚性幹細胞を使用した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２３，４４５−４４８，１９８６）。
ｂ．方法
６ｃｍディッシュをゼラチンでコートした。このディッシュに２ｘ１０５のＣＣＥ胚性幹細胞を播種した。翌日、１度培地を交換した。２日目でコンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離させ、再び２ｘ１０５の濃度で、ゼラチンコートされたディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。
参考例２．胚性幹細胞の分化
ａ．材料
胚性幹細胞の分化には、表２の試薬および器具を使用した。
2004106502.tif 000003
胚性幹細胞分化用培地の組成は、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、であった。
ｂ．方法
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶコート１０ｃｍディッシュに３ｘ１０３のＣＣＥ胚性幹細胞を播種した。５日目および７日目に、胚性幹細胞分化用培地を用いて培地を交換した。
脂肪細胞への誘導は、２−ＭＥを含まない胚性幹細胞分化用培地に表３の試薬を添加することにより行った。培養は、コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で行った。
2004106502.tif 000004
骨芽細胞への誘導は、２−ＭＥを含まない胚性幹細胞分化用培地に表４の試薬を添加することにより行った。培養は、ゼラチンでコートした培養プレート上で行った。
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軟骨細胞への誘導は、２−ＭＥを含まない胚性幹細胞分化用培地に、０．１μＭのデクサメタゾンを添加することにより行った。
参考例３．抗体の作製
当業者に周知の方法で各分子の細胞外部分を認識するモノクローナル抗体を作成した。具体的には、以下のように行った。マウスＰＤＧＦＲαの細胞外部分のｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅させ、このＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のＤＮＡ配列と結合させて融合ｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡをＣＯＳ１細胞に導入し、培養上清中の融合タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを用いて回収した。回収したタンパク質でラットを免疫した。免疫終了後、脾臓を回収し、脾臓細胞を骨髄腫細胞株Ｘ６３．Ａｇ８と融合させてハイブリドーマ細胞を作成した。目的の抗体を得るために、ハイブリドーマ細胞の培養上清中に含有される抗体の中から、融合蛋白およびＰＤＧＦＲαを発現しているＢａｌｂ／ｃ−３Ｔ３細胞に反応する抗体を選別し、そのハイブリドーマ細胞のクローンを同定した。この方法により、ＰＤＧＦＲαを特異的に認識するモノクロナール抗体を得た。ほぼ同様の方法で抗マウスＦＬＫ１モノクローナル抗体を作成した。
参考例４．抗体染色とＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅによる細胞の選別
ａ．試薬の作成
表５の試薬を使用した。
2004106502.tif 000006
脱イオン水９００ｍｌに対して１００ｍｌの１０ｘハンクス緩衝液と１０ｇのＢＳＡ（最終濃度１％）を加えてよく撹拌した。ＢＳＡが溶解したら、０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した。
ｂ．方法
抗ＰＤＧＦＲα抗体をビチオンで、抗ＦＬＫ１抗体をフィコエリスリンで（両方ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅより購入した）でそれぞれ標識し、以下の染色に使用した。分化９日目の細胞を細胞分離緩衝液で分離した後、マウス血清を１０μｌ／細胞１０６個で加え、氷上で２０分間インキュベートした。次に、１００ｎｇないし５００ｎｇの各抗体を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。２０分後、１％ＢＳＡハンクス緩衝液で細胞を１回洗浄した。ストレプトアビジン−アロピコシアニン（Ａｌｌｏｐｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＡＰＣ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む５００μｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に細胞を再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートした。最後に１％ＢＳＡハンクス緩衝液で２回洗浄し、細胞１０６個につき１ｍｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。
ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦａｃｓＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅの場合、ノズルの振動の頻度は２６０００程度、レベルは３Ｖ、ｄｒｏｐ  ｄｅｌａｙは約１２−１４で行った。
実施例１．ＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の出現時期
１０−７ＭのＲＡを含む胚性幹細胞分化用培地で、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、ＰＤＧＦＲαの発現の経過をＦＡＣＳで調べた。ＰＤＧＦＲα陽性細胞は培養４日目には殆ど確認されず、５日目から出現し、９日目に最大になった（図１）。
実施例２．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の分離
ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。即ち、胚性幹細胞分化用培地に培養２日目から４日目までＲＡ、１１日目からインシュリン、デクサメタゾン、ＩＢＭＸおよびトログリタゾンを添加した培地でＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、脂肪細胞への分化を誘導した。ＰＤＧＦＲαおよびＦＬＫ１の発現をＦＡＣＳにより経時的に調べた。分化誘導後８日目・９日目あたりから、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が出現した（図２Ｂ）。ＦＡＣＳにより培養９日目にＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞を分離し、この細胞の形態を位相差顕微鏡で観察した。図２Ｃ（右）のように、この細胞の形態は、骨髄由来の間葉系細胞であるストロマ細胞に極めて類似していた。さらにこの細胞の培養を続け、脂肪染色を施したところ、脂肪細胞の出現が確認された（Ｏｉｌ  Ｒｅｄによる脂肪染色像：左）。
実施例３．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の脂肪細胞への分化能
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を選別分離後７日間培養し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄによる脂肪染色を施した。その結果、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の分画の細胞は、高い効率で脂肪細胞に分化することが判明した（図３Ａ）。これらの細胞は、脂肪細胞特異的物質であるトリグリセリドを大量に有していた（図３Ｂ）。また、ＲＴ−ＰＣＲ法により、選別分離後３日間および７日間培養した細胞の脂肪特異的マーカーの発現を調べ、選別分離後７日間培養した細胞が脂肪特異的マーカーであるアジポネクチンとＰＰＲγを発現していることを確認した（図３Ｃ）。これらの細胞は、培地にデキサメタゾンおよびインシュリンを添加して培養すると、より効率よく脂肪細胞に分化した。同様に、ＰＤＧＦＲα陰性ＦＬＫ１陰性細胞を選別分離し、７日間培養し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄによる脂肪染色、トリグリセリド測定およびＲＴ−ＰＣＲを行った。図３Ａ−Ｃから明らかなように、ＰＤＧＦＲα陰性細胞からは脂肪細胞は出現しなかった。
実施例４．培養４日目のＰＤＧＦＲα陽性細胞は脂肪細胞への分化能を有さない
ＲＡを含まない胚性幹細胞分化用培地でＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、培養４日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陽性細胞、およびＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞を選別分離した。これらの細胞を、脂肪細胞への分化誘導条件下でさらに１４日間（培養２３日目まで）培養した後、脂肪染色した。その結果、両細胞とも脂肪細胞への分化能は極めて低いことが判明した（図４）。
実施例５．培養４日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞と培養９日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞との遺伝子発現の相違
ＲＡを含まない胚性幹細胞分化用培地でＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、培養４日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞を選別分離した。また、１０−７ＭのＲＡを含む胚性幹細胞分化用培地でＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞およびＰＤＧＦＲα陰性ＦＬＫ１陰性細胞を選別分離した。これらの細胞について、中胚葉細胞マーカーとして知られている遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた（図５）。ＲＡ（−）４日目の細胞はＬｉｍ１などの中胚葉細胞マーカーを発現しているのに対し、ＲＡ（＋）９日目の細胞では中胚葉細胞マーカーの発現が見られなかった（図５）。このことは、培養９日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞は、培養４日目のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞とは異なる細胞であることを示す。
実施例６．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞は脂肪細胞マーカーを発現しない
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。図５のように、脂肪細胞マーカーを発現しておらず、さらに神経細胞マーカーも発現していなかった。細胞形態（実施例２参照）とこの遺伝子発現のパターンより、この細胞は、脂肪細胞以前の分化段階にあることが明らかになった。
実施例７．培養２、３日目のＲＡ添加は、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞を効率よく分化させる
胚性幹細胞分化用培地でＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図６に示す様々な時期にＲＡを添加し、培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞を選別分離した。この細胞を脂肪細胞分化誘導条件で９日間培養し、細胞の中性脂肪量を測定した。胚性幹細胞の分化を誘導し始めて、２日目、３日目、４日目にＲＡを添加すると、最も効率よくＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が出現した（図６）。他の時期にＲＡを添加してもこの細胞への分化誘導は起こったが、効率が２日目ないし４日目に添加した場合に比較して悪かった。
実施例８．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の自己複製能
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を、２−ＭＥを含まない胚性幹細胞分化用培地中で３０回継代し、細胞数を計測した。図７に示すように、継代を３０回行っても増殖力は低下せず、逆に、上昇した。継代数２０回および３０回の細胞を脂肪細胞分化用培地で培養した。この細胞をＯｉｌ  Ｒｅｄにより脂肪染色したところ、図８から明らかなように、多数の細胞が脂肪細胞に分化した。従って、この細胞は、分化能を維持したままで自己複製する能力をもっていることが示唆された。
実施例９．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の骨芽細胞への分化能
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を参考例２に記載の骨芽細胞分化誘導条件で１６日間培養し（即ち、２５日間培養）、細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。これらの細胞は、骨芽細胞特異的分子を発現していた（図９左上）。また、この培養２５日目の細胞、およびさらに培養を続けた４２日目の細胞を骨芽細胞特異的染色剤であるアリザリン・レッドで染色した（図９左下）。大部分の細胞が染色され、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が骨芽細胞に分化したことが裏付けられた。
実施例１０．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の軟骨細胞への分化能
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を参考例２に記載の軟骨細胞分化誘導条件で２１日間培養し（即ち、３０日間培養）、細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。これらの細胞は、軟骨細胞特異的分子を発現していた（図９右上）。また、この培養３０日目の細胞を軟骨細胞特異的染色剤であるアルシアン・ブルーで染色した（図９右下）。大部分の細胞が染色され、ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞が軟骨細胞に分化したことが裏付けられた。
実施例１１．ＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞の多分化能
実施例２と同様に、ＣＣＥ胚性幹細胞を培養し、図２Ａのように脂肪細胞への分化処理を施した。培養９日目にＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いてＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性の細胞を選別分離した。これらの細胞を２０回継代培養した。次に０．３細胞／ウェルとなるように平底の９６−ウェルプレートに播種し、胚性幹細胞分化用培地で培養した。細胞が増殖してコンフレントになったら、随時、培養スケールを上げた。最終的に１０ｃｍのディッシュで培養可能な量にまでに増殖させ、クローン細胞株を保存した。クローン細胞株を２８クローン樹立した（図１０）。これらの各クローン細胞株は、すべてＰＤＧＦＲα陽性であった（図１１）。なお、選別分離後の細胞を直接クローニングしようと数回試みたが、機械での選別分離作業の際に細胞へのダメージが大きいためか、成功しなかった。
これらのクローン細胞株のうち、１０クローンを脂肪細胞および骨芽細胞への分化条件下で培養した。それぞれ脂肪細胞染色および骨芽細胞染色を行った（図１２）。５０％のクローン細胞株は、脂肪細胞のみに分化した。３０％のクローン細胞株は、脂肪細胞と骨芽細胞の両方に分化した。１０％のクローン細胞株は、骨芽細胞のみに分化した。
以上のように、本発明のストロマ細胞様形態のＰＤＧＦＲα陽性ＦＬＫ１陰性細胞は、多分化能と自己複製能力の両方を兼ね備えていることから、この細胞が間葉系幹細胞であることが明らかとなった。
産業上の利用の可能性
本発明の間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞などの間葉系細胞への分化能を有する。本発明の間葉系幹細胞およびそれから分化した細胞は、これらを標的とする薬物の開発に使用できる。例えば、脂肪細胞は、糖尿病や高脂血症の処置用薬物の開発に有用である。また、これらの細胞は、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞としても利用でき、脂肪組織を用いる乳房形成などの、形成外科治療や細胞移植治療への応用も可能である。現在、脂肪細胞に効率よく分化する細胞株として３Ｔ３Ｌ１細胞株が知られているが、本発明の間葉系幹細胞は、既に脂肪マーカー遺伝子を発現している３Ｔ３Ｌ１細胞よりも早期の分化段階にあること、そしてガン化した細胞株ではないこと、などの利点を有する。また、骨芽細胞は、例えば、骨粗鬆症の処置および／または子防用の薬剤のスクリーニングに使用し得る。骨芽細胞や軟骨細胞を実験動物に移植することにより、再生医療の基盤的研究を行うこともできる。
【図１】
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【図２】
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2004106502.tif 000009
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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