(57)【要約】糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣｅｌｌｕｌａｒＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）が増強された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体、具体的にはα−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有する抗体、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体、又はα−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有し、且つバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖が改変された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）。
【請求項２】
糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）が増強された、請求項１に記載のＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項６】
α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有し、且つバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
フコースを含まない糖鎖を有する抗ＨＭ１．２４抗体を含む抗体組成物であって、フコースを含まない糖鎖の相対比率が３０％以上である抗体組成物。
【請求項１０】
請求項６に記載の抗体の製造方法において、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）をコードする核酸が導入された糖鎖へのフコース付加能力を欠失した細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の抗体の製造方法において、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の抗体の製造方法において、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入した糖鎖へのフコース付加能を欠失した細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）が増強された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）及びその製造方法に関する。
【背景技術】  ＨＭ１．２４抗原は、骨髄腫細胞表面に高発現する分子量２９〜３３ｋＤａの膜蛋白質であり（Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６（１９９５），５２７−５３４）、骨髄腫細胞以外にもＢ腫瘍細胞及びＴ腫瘍細胞においても発現が認められている。正常細胞においては、イムノグロブリン産生Ｂ細胞や活性化Ｔ細胞で確認されており、その他の細胞においてはほとんど発現が認められていない（Ｇｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４（１９９４），１９２２−１９３０）。
ＨＭ１．２４抗原の上記の如き組織分布にため、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）は、腫瘍に特異的に集積するため、この抗体をラジオアイソトープで標識することによる腫瘍局在の診断や、ラジオイムノセラピー（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）などのミサイル療法への利用が期待されるほか、抗ＨＭ１．２４抗体は、それ自体、抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）を有する（Ｏｚａｋｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０（１９９７），３１７９−３１８６）ので、多発性骨髄腫などの骨髄腫治療薬などとしての利用が期待される。
このような、抗ＨＭ１．２４抗体の療法的使用に当っては、ヒトに対する免疫原性が低いことが望ましく、このため抗ＨＭ１．２４抗体の再構成ヒト（ヒト化）抗体が開発されている（ＷＯ  ９８／１４５８０）。しかしながら、ＡＤＣＣ活性が一層増強されたＨＭ１．２４抗体、特にＡＤＣＣ活性が増強されたヒト化ＨＭ１．２４抗体の提供が望まれている。
抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、ＷＯ  ９９／５４３４２には、抗体のグリコシル化を修飾することによりＡＤＣＣ活性を改良することが記載されている。また、ＷＯ  ００／６１７３９には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりＡＤＣＣ活性を調節することが記載されている。ＷＯ  ０２／３１１４０には、ＹＢ２／０細胞において抗体を産生せしめることにより、α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。ＷＯ  ０２／７９２５５には、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを有する糖鎖を有する抗体が記載されている。しかしながら、糖鎖の修飾によってＡＤＣＣ活性が増強されたＨＭ１．２４抗体は知られていない。
【特許文献１】ＷＯ  ９８／１４５８０
【特許文献２】ＷＯ  ９９／５４３４２
【特許文献３】ＷＯ  ００／６１７３９
【特許文献４】ＷＯ  ０２／３１１４０
【特許文献５】ＷＯ  ０２／７９２５５
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６（１９９５），５２７−５３４
【非特許文献２】Ｇｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８４（１９９４），１９２２−１９３０
【非特許文献３】Ｏｚａｋｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９０（１９９７），３１７９−３１８６
【発明の開示】
従って、本発明は糖鎖の修飾によってＡＤＣＣ活性が増強された抗ＨＭ１．２４抗体及びその製造方法を提供しようとするものである。
本発明者は上記の課題を解決すべく種々検討した結果、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）（還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位とがα結合している。）を含まない糖鎖を有する抗ＨＭ１．２４抗体、及びバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体が高いＡＤＣＣ活性を有するほか、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖とバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を共に有する抗ＨＭ１．２４抗体が、一層高いＡＤＣＣ活性を有することを見出し本発明を完成した。
従って本発明は、糖鎖が改変された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）、例えば糖鎖の改変により抗体依存性細胞傷害性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）が増強された、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）を提供する。この抗体は、典型的にはモノクローナル抗体またはそれに由来する抗体であり、例えばキメラ抗体、又は更に好ましくはヒト化抗体である。より具体的には、本発明は、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有する抗体、及びバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体、更には、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を含まない糖鎖を有し、且つバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を有する糖鎖を有する抗体を提供する。
本発明はまた、フコースを含まない糖鎖を有する抗ＨＭ１．２４抗体を含む抗体組成物であって、フコースを含まない糖鎖の相対比率が３０％以上である抗体組成物を提供する。かかる相対比率は、より好ましくは３５％以上である。
本発明はまた、上記の糖鎖が修飾された抗体製造方法において、ＨＭ１．２４抗原に対する抗体（抗ＨＭ１．２４抗体）をコードする核酸が導入されたＹＢ２／０細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；並びに、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする核酸を導入したＹＢ２／０細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＹＢ２／０で発現させた精製ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％Ｔ）のパターンを示す。左図：還元条件下、右図：非還元条件下。精製ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体各４μｇをアプライした。
図２は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＨＭ１．２４抗体−ＹＢの各抗体濃度におけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、４種類のＨＭ１．２４抗原発現ＣＨＯ細胞（ＨＭ２６，ＨＭ３１，ＨＭ２１，ＨＭ３６）を標的細胞として、Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ＝２５で測定した結果である。
図３は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＨＭ１．２４抗体−ＹＢ  １ｍｇ／ｍＬにおけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、ＨＭ３１を標的細胞として、Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ＝１，５，２５で測定した結果である。
図４は、ＣＨＯ由来の抗体（ａ）及びＹＢ２／０由来抗体（ｂ）から調製したＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。産生細胞の種類により糖鎖パターンが変化し、特にＹＢ２／０由来抗体では、フコース無しと推定されるピーク群（Ａ−Ｄ）が増加していることを示している。
図５は、第４図と第１表で示した糖Ａ〜Ｈの構造を示す。
図６は、第４図と第１表で示した糖Ｉ〜Ｏの構造を示す。
図７は、ヒトＧｎＴＩＩＩ  ｃＤＮＡのＰＣＲによる全合成に使用したプライマー配列と組合わせを示した。予めプライマーに導入したＢａｍＨＩ配列の前後のＰＣＲ断片を同部位で連結し、ヒトＧｎＴＩＩＩ  ｃＤＮＡ全配列を取得した。
図８は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４及びＧｎＴＩＩＩ発現ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体産生株由来抗体１００ｎｇ／ｍＬにおけるＡＤＣＣ活性の比較。ＧｎＴＩＩＩを発現させることによりＡＤＣＣ活性が増強している抗体産生株が得られた。
図９は、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４とＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞由来ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体の各抗体濃度におけるヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を、ＨＭ３６を標的細胞として、Ｅ／Ｔ  ｒａｔｉｏ＝２５で測定した結果である。
図１０は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１１は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１２は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１３は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１４は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
図１５は、生来型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明において、糖鎖が改変された抗体（糖鎖改変抗体）とは、基準となる宿主細胞により産生される抗体（好ましくは、かかる宿主細胞により産生される抗体のうち、最も高い割合で産生される抗体）の糖鎖構造と比較した場合に、これとは異なる糖鎖構造を有する抗体をいい、これには、基準となる宿主細胞によっては通常（又は主としては）産生されない糖鎖構造を有する抗体なども含まれる。また、本発明の糖鎖改変抗体を、必ずしも均一ではない種々の構造の糖鎖を有する抗体分子の集合体（本願においては、抗体組成物とも称する）として考える場合には、基準となる宿主細胞により産生される抗体組成物と比較して、これとは糖鎖改変抗体の割合が異なる抗体組成物であることを意味し、このような本発明の抗体組成物には、基準となる宿主細胞によっては通常（又は主としては）産生されない糖鎖構造を有する抗体を含む抗体組成物なども含まれる。
基準となる宿主細胞は特に限定されず、例えば、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ  Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ  ＤＧ４４等を挙げることができるが、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を基準となる宿主細胞として用いることが好ましい。
糖鎖改変抗体の例としては、フコース（好ましくは、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）が欠損した糖鎖を有するフコース欠損抗体、糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が付加した抗体などを挙げることができる。
本発明の糖鎖改変抗体を抗体組成物として捉える場合には、全て同一の構造の糖鎖を有する均一な抗体を含有する組成物である必要はなく、従って、本発明においては、抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体の割合が、上述のような基準となる宿主細胞により産生される抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体と比較して異なっていればよい。本発明は、このような糖鎖改変抗体組成物を含む。本発明の糖鎖改変抗体組成物であるか否かは、対象となる抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体の割合が、上述のような基準となる抗体組成物に含まれる糖鎖改変抗体の割合と異なるか否かで判断することができる。かかる割合の比較は、例えば、後述の実施例８に記載のような分析方法により認識される各糖鎖の相対比率を比較することにより行うことができる。
本発明の糖鎖の修飾によりＡＤＣＣ活性が増強された抗ＨＭ１．２４抗体を得るには、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を付加する能力を有しないか又はその能力が低い宿主細胞中で抗ＨＭ１．２４抗体を発現させるか、あるいは糖鎖にバイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗ＨＭ１．２４抗体を発現させる必要がある。そして、そのためには、目的とする抗ＨＭ１．２４抗体をコードする遺伝子がクローニングされなければならない。そして、クローニングされた遺伝子によりコードされた抗ＨＭ１．２４抗体としては、モノクローナル抗体、可変領域がマウスなどのヒト以外の動物に由来し、不変領域がヒトの抗体に由来するキメラ抗体、可変領域中の相補性決定領域のみがマウスなどのヒト以外の動物の抗体に由来し、それ以外の抗体部分はヒト抗体に由来するヒト化抗体などが上げられる。
ＷＯ  ９８／１４５８０の記載から明らかな通り、モノクローナル抗ＨＭ１．２４抗体を産生するハイブリドーマは既に樹立されており、このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成７年４月２７日に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２３３として寄託されている。また、このハイブリドーマから、軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするＤＮＡ及び重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）をコードするＤＮＡがクローニングされ、そしてこれらのＤＮＡを含むプラスミドを収容した大腸菌が、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｌ−ｇκ）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４６）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ｐＵＣ１９−１．２４Ｈ−ｇγ１）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５６４４）として、平成８年８月２９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。さらに、上にクローニングしたＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ及びＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡから、キメラ抗ＨＭ１．２４抗体及びヒト化抗ＨＭ１．２４抗体が作成された。ヒト化抗体については、ＷＯ  ９８／１４５８０の第３７頁〜第４０頁の表１〜表４に示されるように、ヒト化抗体のＬ鎖についてはバージョンａ及びｂが作製され、Ｈ鎖については、バージョンａ〜ｓが作製され、これらを込み合わせたヒト化抗体の抗原結合活性の測定の結果、Ｌ鎖バージョンａとＨ鎖バージョンｒ又はｓとの組合わせから成るヒト化抗体が強力な抗原結合活性を有することが確認された。
従って、本発明においては、上に引用したＷＯ  ９８／１４５８０に記載されている種々のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することができる。しかしながら、上記の抗体のみならず、ＨＭ１．２４に対する他のモノクローナル抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することもできる。その場合、これらの調製方法としては、例えばＷＯ  ９８／１４５８０に記載されている方法を用いることができる。
抗ＨＭ１．２４抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のアスパラギンの側鎖のＮ原子に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリン又はスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合するＯ−グリコシル結合糖鎖とがあり、本発明においてフコースの存否が問題となるのはＮ−グリコシル結合糖鎖である。このＮ−グリコシル結合糖鎖は、図５及び図６に示すごとく、１個のマンノース（Ｍａｎ）と２個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合で結合した基本構造（コア）「−Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮｃ−」を有し、この構造の右のＧｌＮＡｃを還元末端と称し、左側のＭａｎを非還元末端と称する。フコース（Ｆｕｃ）が結合している場合、これは主として、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位とがα結合している。
本発明の一つの態様によれば、抗ＨＭ１．２４抗体は上記のフコースを含まない糖鎖を有する。抗体分子が複数のＮ−グリコシル糖鎖を有する場合、少なくとも１個の糖鎖は上記のフコースを有しない。このような、フコースを含まない糖鎖を有する抗体は、当該抗体を、糖鎖へのフコース付加能を欠失した細胞、すなわち、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い宿主中で発現させれば良い。
本発明においては、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い任意の宿主を用いることができるが、具体例として、ラットミエローマＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞と略される）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２として保存されている）が挙げられる。本発明で用いることができるその他の細胞としては、例えば、ＦＴＶＩＩＩノックアウトＣＨＯ細胞（ＷＯ  ０２／３１１４０）、Ｌｅｃ１３細胞（ＷＯ０３／０３５８３５）、フコーストランスポーター欠損細胞（特願２００３−１７４００６、特願２００３−２８２０８１、特願２００３−１７４０１０、特願２００３−２８２１０２）を挙げることができる。
本発明のもう一つの態様によれば、本発明の抗ＨＭ１．２４抗体は、バイセクティング（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖を有する。Ｎ−グリコシル結合糖鎖は前記の如き基本構造（コアー）を有し、その非還元末端には、図５に示すごとく、マンノースを含む２個の鎖がα１，６結合及びα１，３結合により結合している。他方、図６に示す糖鎖においては、基本構造（コアー）の非還元末端に、前記２個の糖鎖のほかに、１個のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がβ１，４結合により結合している。このＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が、「バイセクテングＮ−アセチルグルコサミン」である。
バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖は、Ｏ−グリコシル結合糖鎖又はＮ−グリコシル結合糖鎖であり、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）により、Ｎ−アセチルグルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列は記載されている（ＮＣＢＩデーターベース（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｄ１３７８９））。また、このＤＮＡは、上記の配列情報に基づいてＰＣＲ法など、常法に従って、クローニングすることができる。
ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを用いて、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖を形成するには、このＤＮＡを含んでなる発現ベクターにより、抗ＨＭ１．２４抗体を産生する宿主細胞を形質転換すればよい。すなわち、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターと抗ＨＭ１．２４抗体をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターとにより、宿主細胞を形質転換し、これを培養すればよい。
本発明の第三の態様によれば、本発明の抗ＨＭ１．２４抗体は、α−１，６コアーフコース（α−１，６ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｅ）を有しない糖鎖とバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを有する糖鎖の両方を有する。このタイプの抗体を製造するには、ＧｎＴＩＩＩをコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターと抗ＨＭ１．２４抗体をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターとにより、α−１，６コアーフコースを有する糖鎖を形成する活性を有しないか又はこの活性が弱い宿主細胞、例えばＹＢ２／０細胞、を形質転換し、これを培養すればよい。
宿主細胞の形質転換方法、培養方法、及び培養物からの抗体の単離・精製方法は、常法に従って行うことができる。
また、本発明の糖鎖改変抗体はＡＤＣＣ活性が増強されていることが好ましい。本発明において、ＡＤＣＣ活性が増強されているか否かは、糖鎖が改変されていない抗体又は糖鎖が改変されていない抗体組成物のＡＤＣＣ活性と比較して、これよりも高いＡＤＣＣ活性を示す場合にはＡＤＣＣ活性が増強されていると判断される。
ＡＤＣＣ活性は当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、エフェクター細胞、標的細胞及び抗ＨＭ１．２４抗体を混合し、ＡＤＣＣの程度を調べることにより測定することができる。より具体的には、例えば、エフェクター細胞としてマウス脾細胞やヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を利用し、標的細胞としてはＨＭ１．２４抗原を発現するＣＨＯ細胞等を用いる。標的細胞をあらかじめ５１Ｃｒにより標識し、これに抗ＨＭ１．２４抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりＡＤＣＣ活性を測定することができる。
【実施例】  次に、実施例により、本願発明を更に具体的に説明する。
［実施例１］．  ラットミエローマＹＢ２／０でのヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体の発現
１０μｇのヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体発現ベクター（ＡＨｉ／Ｎ５ＫＧ１Ｖ−ｌａｒｋ，Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｍａｒｋｅｒ．Ｉｎ：Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．＆  Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．（ｅｄｓ）ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ  ６０４：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２７，１９９５，ＷＯ  ９８／４５８０）を２×１０６／０．６ｍＬ  ＰＢＳ（−）のＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＴ−１６６２）へ、エレクトロポレーション法で１．５ｋＶ，２５μＦの条件で導入した。培養は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で行った。
１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）に４００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを加えて選択した後、５０ｎＭ  ＭＴＸ，１００ｎＭ  ＭＴＸ，２００ｎＭ  ＭＴＸと順次ＭＴＸ濃度をあげ、遺伝子増幅を行った。また、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に２００ｎＭ  ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０中、０．５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで蒔きこみ、限界希釈法にて細胞のクローニングを行った。
ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体遺伝子を導入したＹＢ２／０細胞の培養上清は実施例２で示すＥＬＩＳＡにより定量した。
［実施例２］．  ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体の定量（ＥＬＩＳＡ法）
９６−ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社製）にコート緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸水素ナトリウム，ｐＨ９．６）で１００ｎｇ／ｍｌ程度に希釈した可溶型ＨＭ１．２４抗原を１００μＬずつ添加し、４℃で１晩以上反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μＬ／ウエルで加え室温で約２時間放置し、作製したプレートは４℃で保存した。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを転倒除去した後、各ｗｅｌｌをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。
適宜希釈したヒト化抗ＨＭ１．２４抗体標準液又はサンプル溶液と１００ｎｇ／ｍＬに希釈したビオチン標識ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体を１：１で混ぜた後、１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。室温で、約１時間反応させた後、各ウエルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。アビジン標識ＨＲＰを各ウエルに添加し、室温で１５分以上反応させ、ＴＭＢ  ｌｉｑｉｄ（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μＬ／ウエルで加え、２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ／ウエル加えることにより反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ヒト化抗ＨＭ１．２４抗体標準液の濃度−吸光度の検量線から、サンプル溶液のヒト化ＨＭ１．２４抗体濃度を算出した。
［実施例３］．  ＹＢ２／０で発現させたヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体の精製
ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体の発現が確認された細胞は、１７００ｃｍ２のローラーボトル（ＣＯＲＮＩＮＧ社）で拡大培養を行った。すなわち１×１０９個のヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体発現ＹＢ２／０細胞を４００ｍＬの２００ｎＭ  ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地で（２．５ｒｐｍ）でコンフルエントになるまで培養した。その後、培養上清の回収用にＦＣＳをＰＢＳ（−）で平衡化したｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）を予め素通りさせることでウシ由来ＩｇＧを除き（ＦＣＳ（−））、このＦＣＳ（−）を用いた２００ｎＭ  ＭＴＸ、４００μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含む１０％ＦＣＳ（−）／ＲＰＭＩ１６４０培地で３〜４日間培養した。
培養上清は０．２２μｍフィルター処理した後、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＦＦ（ＰＢＳ／ＰＢＳ−クエン酸：リニアグラジエント溶出）およびＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ（２０ｍＭ酢酸、０−０．５ｍＭ  ＮａＣｌ：リニアグラジエント溶出）で精製した。精製したヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体はＨＭ１．２４抗体−ＹＢと名付けた（図１）。
［実施例４］．  ＨＭ１．２４抗原（ＢＳＴ−２）を発現するＣＨＯ細胞の作製
ＨＭ１．２４抗原蛋白質を発現するＣＨＯ細胞を次のようにして作製した（Ｏｈｔｏｍｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２５８（１９９９），５８３−５９１）。即ち、ＤＨＦＲを欠損したＣＨＯ細胞株に、ＨＭ１．２４抗原をコードする発現ベクターｐ３．１９（上記文献）を導入し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択し、さらに限界希釈法によりＨＭ２６、ＨＭ３１、ＨＭ２１及びＨＭ３６の４つの細胞株を得た。細胞表面上のＨＭ１．２４抗原の発現数は特願２００１−１１５８８９に記された方法にてフローサイトメトリーで測定したところ、それぞれ細胞あたり３．８×１０３、２．２×１０４、２．２×１０４及び１．８×１０５個であった。
［実施例５］．  ヒト末梢血由来ＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣ活性の測定
（１）ヒトＰＢＭＣ溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、ＰＢＳ（−）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭＰＬＵＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）に重層した。これを遠心（５００×ｇ、３０分間、２０℃）した後、単核球画分である中間層を分取した。３回洗浄後、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ヒトＰＢＭＣ溶液とした。
（２）標的細胞溶液の調製
実施例４に示したＨＭ１．２４抗原（ＢＳＴ−２）を発現するＣＨＯ細胞は、細胞剥離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてディッシュから剥離し、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ  ２００μＬに浮遊し、５．５５ＭＢｑのＣｈｒｏｍｉｕｍ−５１を加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃１時間培養した。この細胞を３回洗浄した後、１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地中個々の細胞濃度に調製し、標的細胞溶液とした。
（３）クロム遊離試験（ＡＤＣＣ活性）
標的細胞溶液を９６ウェルＵ底プレートに５０μＬずつ分注し、各濃度に調製した抗体溶液５０μＬを添加し、氷上で１時間反応させた後に、ヒトＰＢＭＣ溶液１００μＬを加え、５％炭酸ガスインキュベータ中３７℃４時間培養し、培養後培養上清１００μＬ中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率（％）＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
Ａは各ウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｂは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＮＰ−４０水溶液（Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ−４０，ナカライテスク社製）を２０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１３０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値、Ｃは標的細胞浮遊液を５０μＬ、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地を１５０μＬ添加したウェルにおける放射活性（ｃｐｍ）の平均値を示す。
［実施例６］．  βガラクトシダーゼ安定発現ＣＨＯ細胞株を用いたＡＤＣＣ活性測定法
エフェクター細胞として健常人の末梢血より比重遠心法で分離した単核球を用いた。すなわち、健常人の末梢血に等量のＰＢＳを加え、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に積層し、５００ｇで３０分間遠心した。単核球相を分取し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄後、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭで細胞数が５ｘ１０６／ｍＬになるように調製した。
トリプシン−ＥＤＴＡで剥がし、１０％ＦＣＳを含むα−ＭＥＭで懸濁した２ｘ１０５細胞／ｍＬのβガラクトシダーゼ安定発現ＣＨＯ＃３０細胞株５０μＬと、様々な濃度の抗ＨＭ１．２４抗体５０μＬを９６ウエルＵ底プレートに加え、４℃で１５分間反応させた。ついでエフェクター細胞１００μＬを加え、３７℃で４時間培養した。培養後、２０μＬの培養上清を採取し、βガラクトシダーゼ活性を測定した。最大遊離酵素量はＧａｌａｃｔｏｎｅ−ｓｔａｒアッセイキットの細胞溶解緩衝液により遊離される酵素量とした。
細胞傷害活性は、
細胞傷害活性（％）  ＝（Ａ−Ｃ）×１００／（Ｂ−Ｃ）
（％β−ガラクトシダーゼ）
として計算した。ここでＡは抗体存在下において遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）、Ｂは細胞溶解緩衝液により遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）、Ｃは抗体を含まず培養液のみで遊離されたβガラクトシダーゼ活性（ＲＬＵ／ｓｅｃ）を示す。
［実施例７］．  ＹＢ２／０由来ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＹＢ２／０で発現させたＨＭ１．２４抗体（ＨＭ１．２４抗体−ＹＢ）のＡＤＣＣ活性を実施例５の方法にて測定した結果を図２〜図３に示した。図２に示したように、いずれの標的細胞においても、ＨＭ１．２４抗体−ＹＢは、ＤＧ４４（ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｇａｍｍａ  Ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｌｏｃｕｓ：Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）  ａｎｄ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：５５５，１９８６）で産生したＨＭ１．２４抗体（ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４）よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。
具体的には、より低濃度でＡＤＣＣ活性の誘導が認められ、最大のＡＤＣＣ活性にも向上が見られた。特にＨＭ１．２４抗原の発現数が少ない標的細胞ＨＭ２６，ＨＭ３１を用いた場合、ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４では非常に低いＡＤＣＣ活性しか示さなかったのに対してＨＭ１．２４抗体−ＹＢでは高いＡＤＣＣ活性が出現した。また、図３に示したように、標的細胞数に対するＰＢＭＣ数の割合（Ｅ／Ｔ比）が２５の時のみならず、Ｅ／Ｔ比が５の場合もＨＭ１．２４抗体−ＹＢはＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。
［実施例８］．  糖鎖の解析
１．２−アミノピリジン標識糖鎖（ＰＡ化糖鎖）の調製
本発明のＹＢ２／０由来抗体、及び対照試料としてＣＨＯ由来の抗体に、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ）を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させた（Ｗｅｉｔｚｈａｎｄｌｅｒ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８３：１２（１９９４），１６７０−１６７５）。セルロースカートリッジ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いた固相抽出（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３２（２００１），３８１−３８８）により脱塩した後濃縮乾固し、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った（Ｋｏｎｄｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５４：８（１９９０），２１６９−２１７０）。得られたＰＡ化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製ＰＡ化糖鎖とした。
２．精製ＰＡ化糖鎖の逆相ＨＰＬＣによる分析
上記実施例８の１項の方法で、本発明のＹＢ２／０由来抗体、及び対照試料としてＣＨＯ由来の抗体についてＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ＯＤＳカラム（ＴＡＫＡＲＡ製Ｐａｌｐａｋ  Ｔｙｐｅ  Ｒ）による逆相ＨＰＬＣ分析を行い、クロマトグラムを比較した。ＣＨＯ由来抗体の糖鎖に比較して、ＹＢ２／０由来抗体の糖鎖は、２０分から３５分までに溶出するフコース無しと推定される糖鎖（Ａ−Ｄ）のピーク増加が確認された（図４）。
３．精製ＰＡ化糖鎖の二次元マッピングによる分析
上記実施例．８の１項の方法で、本発明のＹＢ２／０由来抗体についてＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ＯＤＳカラムによる逆相ＨＰＬＣ分析及びアミンカラム（ＴＡＫＡＲＡ製Ｐａｌｐａｋ  Ｔｙｐｅ  Ｎ）による順相ＨＰＬＣ分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施した。具体的には、アミンカラムによる順相ＨＰＬＣで、精製ＰＡ化糖鎖のメインピークを粗分画し、各分画を逆相ＨＰＬＣにて分析した。
各糖鎖の同定は、ＰＡ化糖鎖標準品（ＴＡＫＡＲＡ製、ホーネン製、生化学工業製；図５のＫ，Ｏ，Ｐを除く）とのＨＰＬＣにおける溶出位置の比較及びＴＯＦ−ＭＳによる分子量確認にて行った。同定された各糖鎖の相対比を第１表に示す（Ｊ，Ｋの区別及びＮ，Ｏの区別は本実施例においては行っていない）。また、表１に示す糖鎖の構造を図５及び図６に示す。この結果本発明のＹＢ２／０由来抗体は、フコースの無い糖鎖が３０％以上存在し、且つバイセクティングＧｌｃＮＡｃを持つ糖鎖が存在することが確認された。
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［実施例９］．  ヒトＧｎＴＩＩＩ発現ベクターの作製
ヒトＧｎＴＩＩＩ遺伝子配列はＮＣＢＩデーターベース（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｄ１３７８９）より入手した。配列はＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣで解析し、繰返し配列が多いことから、ＰＣＲによる増幅を容易にする目的で、サイレント変異を複数箇所導入したプライマーをデザインし、ＰＣＲによる合成にて取得した。ＰＣＲにはＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、塩基番号８０１から８７０までの二本鎖を最初の鋳型とし、下に示すプライマーを用いて順次、ＰＣＲを行った。下記のプライマー配列において、大文字はサイレント変異を導入した塩基を示す。また、数字は翻訳開始部位からの何塩基目かを示す。図７は、ＧｎＴＩＩＩ遺伝子に対する各プライマーの位置を示す。
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必要に応じて増幅断片をアガロースゲル電気泳動して、目的断片をゲルから切り出して精製したものを次のＰＣＲの鋳型とした。最終的にＰＣＲのみで全長を増幅することが困難であったため、予めプライマー内にサイレント変異として挿入しておいたＢａｍＨＩ部位を用いて、その前後の断片を増幅後に連結することにより、全長ヒトＧｎＴＩＩＩ遺伝子を取得した。図１１〜図１５に、生来型ヒトＧｎＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２８）（ＧｎＴＩＩＩ  ｏｒｉ．ｎｕｃ）と変異型ヒトＧｎＴＩＩＩをコードする塩基配列（配列番号：２９）（ＧｎＴＩＩＩ  ｍｕｔ．ｎｕｃ）と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。
ヒトＧｎＴＩＩＩは、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｈｙｇｒｏ−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に組込み、配列を確認した。
［実施例１０］．  ＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４発現ＣＨＯ細胞でのＧｎＴＩＩＩの発現
上記実施例．９で得られた１０μｇのＧｎＴＩＩＩ／ｐｃＤＮＡ３．１（Ｈｙｇｒｏ−）をＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４発現ＣＨＯ株にエレクトロポレーション法で１．５ｋＶ，２５μＦの条件で導入した。培養は５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で行った。９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に、１０％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて、１０細胞／１００μＬ／ｗｅｌｌで蒔きこみ、２日間培養した。４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含む１０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ培地に代え、１〜２週間、細胞の選択を行った。ハイグロマイシン耐性コロニーが出現し、増殖の認められた細胞の培養上清を回収し、ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体抗体量を実施例．２のＥＬＩＳＡ法により測定した。
［実施例１１］．  ＧｎＴＩＩＩ発現ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体産生ＣＨＯ細胞のＡＤＣＣ活性によるスクリーニング
ＧｎＴＩＩＩを強制的に発現させたヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体産生細胞（クローンＮｏ．１〜３１）に由来する化抗ヒトＨＭ１．２４抗体及びＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４の培養液を抗体濃度４００ｎｇ／ｍｌに培地を用いて希釈し、実施例６に示した方法を用いてＡＤＣＣ活性を測定し比較した（図８）。
最終的にＡＤＣＣ活性とヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体発現量および増殖速度を考慮してスクリーニングを行い、クローンＮｏ．６（５７Ｂ２）を得た。
［実施例１２］．  ＧｎＴＩＩＩ発現ＣＨＯ細胞由来ヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性の測定
ＧｎＴＩＩＩを強制的に発現させたヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体産生細胞に由来するヒト化抗ヒトＨＭ１．２４抗体のＡＤＣＣ活性を実施例（Ｂ）の方法にて測定した結果を図９に示した。クローンＮｏ．３，Ｎｏ．６（５７Ｂ２）とＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４を比較した結果、いずれのクローンもＨＭ１．２４抗体−ＤＧ４４よりも高いＡＤＣＣ活性を示した。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、高いＡＤＣＣ活性を有する抗ＨＭ１．２４抗体を製造することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2005014651.tif 000027
【図１３】
2005014651.tif 000028
【図１４】
2005014651.tif 000029
【図１５】
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【国際調査報告】
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