(57)【要約】ＰＡＣＡＰペプチドまたはＶＩＰペプチドより誘導したペプチドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、医薬組成物。本発明によれば、溶液状態における互変異性化を抑制し、臨床上長期間にわたって使用できるＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体が提供される。本ペプチド類は、退行性神経変性疾患、勃起不全、気管支喘息などの疾患の症状改善に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
2004048401.tif 000047
（式中、Ａは、ＶａｌまたはＩｌｅ；Ｂは、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｌａ；Ｃは、ＡｓｎまたはＳｅｒ；Ｄは、ＴｈｒまたはＳｅｒ；Ｅは、ＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｆ，Ｈ，ＩはＬｙｓまたはＡｒｇ；Ｇは、ＬｅｕまたはｎＬｅｕ；Ｊは、Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｋは、Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ                    ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ；ＬはＣ末端アミノ酸のα位カルボキシル基修飾を表し、−ＮＨ２あるいは−ＯＨを示す。）
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＧｌｕ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｌａ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項９】
一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される請求項１に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
請求項１〜９のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の含有量が有効成分としての生理活性ペプチド全体の５０重量％以上である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
脳塞栓症および脳血栓症を含む虚血性脳血管障害、中枢あるいは末梢神経に毒性をもたらす疾患、コンフォメーション病、神経変性疾患、脱毛、男性不能症、痴呆症、腎不全、視神経萎縮、虚血性視神経症を含む視神経変性疾患および網膜変性疾患からなる群から構成される１種以上の疾患または症状の治療または予防のための、または血流改善、気管支平滑筋弛緩若しくは胃腸管運動抑制のための、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体の製造過程、保存時、そして生体内において異性化反応が抑制され安定性の高いペプチド誘導体に関する。
【背景技術】  ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド；Ｖｏｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、脳−腸管ペプチドと呼ばれ、血流促進、血圧低下作用をもつ生理活性ペプチドの一種である。このＶＩＰは、ブタ腸管から抽出されており、２８個のアミノ酸残基からなる（例えば非特許文献１参照）。一方、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド；Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、羊の視床下部から下垂体培養細胞のアデニル酸シクラーゼを活性化させるバイオアッセイ系を指標にして単離され構造決定された３８個のアミノ酸残基よりなるペプチドであり、ＰＡＣＡＰ３８と、ＰＡＣＡＰ２７の２種類がある（例えば非特許文献２参照）。このＰＡＣＡＰのＮ末端側から２７個のアミノ酸配列はＶＩＰと極めて類似した構造を有している。また、ＶＩＰとＰＡＣＡＰのアミノ酸配列は、セクレチン、グルカゴン等に類似していることから、グルカゴン−セクレチンスーパーファミリーに属するペプチドとされている。これらＰＡＣＡＰおよびＶＩＰはＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターを介してその生理作用を示すが、このＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターは生体内において広い分布を示し、それ故ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰは多くの生理活性を有することが報告されている。例えば、抗喘息作用（特許文献１）、血圧低下作用（特許文献２）、増毛作用（特許文献３）、インポテンツ改善作用（特許文献４）、膣潤滑誘発作用（特許文献５）、胃腸管蠕動運動抑制作用（特許文献６）、神経変性疾患・低酸素症・記憶能力低下改善作用（特許文献７）、皮膚潰瘍治療作用（特許文献８）、ニューロンネットワーク形成促進（特許文献９）、コンフォメーション病改善薬（非特許文献３）などである。これらの生理作用を考慮すれば医薬応用の可能性は非常に大きいものと考えられるが、ＰＡＣＡＰやＶＩＰ等の生理活性ペプチドは概して不安定であり、特に生体内においては速やかな代謝を受けるためにその作用継続時間は非常に短いものである。そこで本発明者らは先に、酵素耐性を新規機能として保持させたＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体を創製し（特許文献１０）、実際にこれらがトリプシン等生体内ペプチダーゼによる代謝に対して優れていること（非特許文献４参照）、さらには気管支拡張作用を指標としてこれらの誘導体が著しい薬効持続作用を有することを明らかにした（非特許文献５及び６を参照）。従って、この長時間作動型ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体は医薬応用において極めて有用なものと考えられ、特に先述の各種生理・薬理作用を目的とした薬剤の有力な候補として考えられた。しかしながら、生物化学的には安定であることを確認したＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体は、製剤学的な安定性、特に溶液状態における長期安定性において大きな問題が起こりうることが今回初めて明らかとなり、これら著しい減成はＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ類の活性減退、もしくは生成する不純物による予期せぬ副作用等が強く懸念されるところである。ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ類の生理・薬理作用を考慮すれば、これらの薬剤は単回投与に終わることはまずあり得ず、臨床使用において長期にわたって投与し続ける必要性をも���た薬剤となることは推測するに容易である。それ故、この安定性の諸問題から生じる副反応物の生成は殊更に重大な問題と考えられる。
【特許文献１】  特開平８−３３３２７６号公報
【特許文献２】  特開昭６３−１７９８９４号公報
【特許文献３】  特開平０１−８３０１２号公報
【特許文献４】  特開平０１−１９０９７号公報
【特許文献５】  特表平０１−５０１９３７号公報
【特許文献６】  特表平０６−５０７４１５号公報
【特許文献７】  特開平０７−６９９１９号公報
【特許文献８】  特開平０８−４０９２６号公報
【特許文献９】  特開２００１−２２６２８４号公報
【特許文献１０】  特開平８−３３３２７６号公報
【非特許文献１】  サイド（Ｓ．Ｉ．Ｓａｉｄ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）１９７０年  １６９巻  ｐ．１２１７
【非特許文献２】  宮田（Ａ．Ｍｉｙａｔａ）ら、「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」（米国）１９８９年  １６４巻  ｐ．５６７
【非特許文献３】  尾上（Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．）ら、「フェブス  レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」（オランダ）２００２年  ５２２巻  ｐ．６５−ｐ．７０
【非特許文献４】  樫本（Ｋａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．）ら、「ペプチド  ケミストリー（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」１９９６年  １９９７巻  ｐ．２４９−ｐ．２５２
【非特許文献５】  吉原（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．）ら、「ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」（米国）１９９８年  １９巻  ｐ．５９３−ｐ．５９７
【非特許文献６】  吉原（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．）ら、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」１９９７年  １２１巻  ｐ．１７３０−ｐ．１７３４
【発明の開示】
従って、本発明は、安定性に富み、臨床上安全に使用できるＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体からなる医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰおよびその誘導体ペプチドの溶液中における不安定に寄与する要因について鋭意研究を重ねた結果、幾つかの配列において異性化反応が起こり、臨床的に医薬組成物の有効成分として使用するには好適でないことを見出した。この異性化反応はアスパラギン酸やグルタミン酸等の酸性アミノ酸やそのアミド体であるアスパラギンおよびグルタミンに特徴的なものであり、これらアミノ酸を含むペプチド・蛋白質は隣接するアミノ酸構成によって、酸性や塩基性条件でスクシンイミドやグルタル酸イミドを副生しやすいことが報告されている（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．，１９７８，１２，６９；泉屋信夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」丸善，７１−７２）。この反応はアミノ酸側鎖をベンジルエステルなどで保護している場合に、側鎖が遊離している場合よりも副反応の起こる傾向が大きい。特にアスパルチルペプチドは不安定で、中性でもイミドを形成することがある。また、ペプチド中においてアスパラギン酸およびアスパラギンの次にグリシン、セリン、スレオニンあるいはヒスチジンが存在すると特に不安定である。ＶＩＰの場合は２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列が特に異性化が起こりやすく、酵素耐性ＶＩＰ誘導体であるペプチド４は、２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列に加えて、２８，２９位のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列においても同様の異性化が起こると考えられる。また、Ｋｉｔａｄａらの報告（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，１９９１，２３９−２４４）によれば、ＶＩＰおよびその関連誘導体の８，９位のＡｓｐ−Ａｓｎ配列も容易にスクシンイミドを形成することが報告されている。さらに、ＰＡＣＡＰの場合においても、その３，４位のＡｓｐ−Ｇｌｙ配列はスクシンイミドを形成する可能性を有しており、溶液中における安定性が非常に問題となるところである。
そこで、本発明者らは、これらの配列に注目してより安定なアミノ酸配列に置換することによって、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドとしての生理活性を有し、かつより安定な化合物群を創製することを試みた。
まず、本発明者らの先の報告（Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，１９９９，２０，２１９−２３１；Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００１，２２，８６７−８７２；Ｏｎｏｕｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｒｅｖ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００２，１２，１−９）によれば、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰが作用を発現するために必須なＰＡＣＡＰ／ＶＩＰレセプターとの結合に関して、この受容体特異認識性に大きく寄与するのはそのＮ末端構造である。この概念に従って、
（ｉ）ＶＩＰの不安定要因配列２４，２５位をＰＡＣＡＰの安定配列２４，２５位に置換した。
加えて、本発明者が先に見出した（Ｎａｇａｎｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１  ２００２，１４７−１５０）、ＶＩＰの２８位Ａｓｎ残基は活性に寄与しないという事実から、
（ｉｉ）ペプチド４（天然型ＶＩＰに対してＡｒｇ残基含量を増すよう改変したペプチド）の２８位を削除し、Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列による異性化の危険性を排除した。
ＶＩＰの１７位Ｍｅｔは生体内あるいはその製造工程中において速やかな代謝を受けてメチオニンスルホキシドとなり、活性に大きな影響を与えるので、
（ｉｉｉ）１７位ＭｅｔはＬｅｕまたはＮｌｅに置換する。
また、ＶＩＰにおける８位のＡｓｐを、異性化の危険性がＡｓｐよりも少ないＧｌｕ、またはＡｌａに置換した化合物も作製した。ＶＩＰの８位をＡｌａに置換した場合、そのレセプター結合活性が向上することが報告されており（Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２００２，３７−５０）、誘導体の安定化と高活性の両者が期待できる。
尚、ＶＩＰの活性最小単位は２３残基であることが本発明者らによって報告されており（Ｎａｇａｎｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，２００２，１４７−１５０）、上記アミノ酸置換を施したＶＩＰ誘導体に関してＮ末端より少なくとも２３残基以上保持していればＶＩＰの生理活性が期待できる。
また、ＰＡＣＡＰの３，４位によるスクシニルペプチド形成を阻害するために
（ｉｖ）４位のＧｌｙ残基をＶＩＰの同位置アミノ酸に相当するＡｌａ残基に置換することにより、安定化を図ることができる。この置換はＰＡＣＡＰ２７（ペプチド２）のみならず、ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド３）、ペプチド５（ＰＡＣＡＰ３０）、そしてペプチド６（ＰＡＣＡＰ３８に対してＡｒｇ残基含量を増すよう改変したペプチド）のようなＰＡＣＡＰ関連ペプチドの安定化に対しても有効である。
ＡＰＣＡＰの最小活性単位はＶＩＰと同様Ｎ末端より２３残基であることが公知の事実となっており（Ｋｉｔａｄａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，１９９１，２３９−２４４）、上記ＰＡＣＡＰ誘導体群についてもＮ末端より２３残基以上あればＰＡＣＡＰの生理・薬理効果が期待できる。
上記観点から本発明者らは多数のペプチドを合成し、天然型ＶＩＰ及びＰＡＣＡＰと同様、またはそれ以上の高い生理活性を有すると共に、高い安定性を有するペプチドを見出すに到った。
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）の発明を提供する。
（１）下記式（Ｉ）：
2004048401.tif 000002
（式中、Ａは、ＶａｌまたはＩｌｅ；Ｂは、Ａｓｐ，ＧｌｕまたはＡｌａ；Ｃは、ＡｓｎまたはＳｅｒ；Ｄは、ＴｈｒまたはＳｅｒ；Ｅは、ＬｅｕまたはＴｙｒ；Ｆ，Ｈ，ＩはＬｙｓまたはＡｒｇ；Ｇは、ＬｅｕまたはｎＬｅｕ；Ｊは、Ｉｌｅ，Ｖａｌ；Ｋは、Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ                      ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ；ＬはＣ末端アミノ酸のα位カルボキシル基修飾を表し、−ＮＨ２あるいは−ＯＨを示す。）
で示されるペプチドのうち、Ｎ末端より少なくとも２３残基からなるペプチド、または薬学的に許容されるその塩。
（２）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド１０（配列番号１１）に相当する。
（３）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド１２（配列番号１３）に相当する。
（４）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＧｌｕ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２１（配列番号２２）に相当する。
（５）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｌａ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＩｌｅ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２３（配列番号２４）に相当する。
（６）一般式（Ｉ）において、ＡがＶａｌ、ＢがＡｓｐ、ＣがＡｓｎ、ＤがＴｈｒ、ＥがＬｅｕ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２５（配列番号２６）に相当する。
（７）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２６（配列番号２７）に相当する。
（８）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、ＪがＶａｌ、ＫがＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、Ｌが−ＮＨ２である上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド２９（配列番号３０）に相当する。
（９）一般式（Ｉ）において、ＡがＩｌｅ、ＢがＡｓｐ、ＣがＳｅｒ、ＤがＳｅｒ、ＥがＴｙｒ、Ｆ，Ｈ，ＩがＡｒｇ、ＧがＬｅｕ、Ｌが−ＮＨ２であり、Ｎ末端より２３残基のアミノ酸から構成される上記（１）に記載のペプチド、または薬学的に許容されるその塩。該ペプチドは、具体的には、後記のペプチド３１（配列番号３２）に相当する。
上記ペプチド１０，１２，２１，２３，２５，２６，２９，３１は、いずれも上記の（ｉ）〜（ｉｖ）の改変を行ったペプチドであり、ペプチド２１及び２３は更に８位のアミノ酸がＧｌｕ、またはＡｌａとなっている。
（１０）上記（１）〜（９）のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。
（１１）上記（１）〜（９）のペプチドまたは薬学的に許容されるその塩の含有量が有効成分としての生理活性ペプチド全体の５０重量％以上である、上記（１０）に記載の医薬組成物。
ここで、「有効成分」とは、医薬組成物において被験者の疾患、症状または状態を治療、予防、変化または緩和させることを目的として被験者に対する作用を有するものとして含有させるものである。また、「生理活性ペプチド」とは、上記被験者に対して生理活性を有するペプチドのことであり、本明細書では特にＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチド、その塩、及び誘導体を包含する。また、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドとは、ヒト及び動物の天然型ＰＡＣＡＰまたはＶＩＰ、及びこれらと類似のアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＰＡＣＡＰまたはＶＩＰと同様の生理活性を有するペプチドのことをいい、グルカゴン−セクレチンファミリーに属するペプチドが包含される。
（１２）脳塞栓症および脳血栓症を含む虚血性脳血管障害、中枢あるいは末梢神経に毒性をもたらす疾患、脳血管虚血、血栓症、コンフォメーション病、神経変性疾患、脱毛、男性不能症、痴呆症、腎不全、視神経萎縮、虚血性視神経症を含む視神経変性疾患および網膜変性疾患からなる群から構成される１種以上の疾患または症状の治療または予防のための、または血流改善、気管支平滑筋弛緩若しくは胃腸管運動抑制のための、上記（１０）または（１１）に記載の医薬組成物。
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明の高安定性ペプチド誘導体は、具体的には一般式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドであり、それに含まれるペプチドの代表例を表１に示した。ここに示したペプチド１０〜３２は、後記配列表の配列番号１１〜３３に対応するペプチドである。ただし、ペプチド１０，２２，２４，３１，３２はＮ末端より２３残基に相当するペプチドであり、ペプチド１３，２８，３２はＮ末端アミノ基にアセチル基が、そしてペプチド１４のＮ末端アミノ基にはステアリル基が結合している。ペプチド３３（配列番号３４）は４番目のアミノ酸がグリシンである以外はペプチド３１（配列番号３２）と同じアミノ酸配列を有する２３残基のペプチドである。
2004048401.tif 000003
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上記ペプチドは、使用の際にはそのＮ末端に極性物質または非極性物質（脂肪酸、アシル基等）を結合させて分子の極性を変化させたり、ポリエチレングリコール、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸等）の高分子を結合させて酵素耐性を増強したり、リポソーム基質に結合させてリポソームに封入したり、あるいは脂質膜表面に固定することもできる。アシル基の導入は、その活性の向上のみならず、自己凝集を抑制することが当業者間で知られている。
本発明のペプチドは、蒸留水や緩衝液等の水性溶液中における安定性が非常に高いことが確認された。例えば本発明のペプチドは、ｐＨ６．０及び７．０に調製した溶液中で４０℃で１週間保存した場合、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上の残存率で存在し得る。また、ｐＨ６．０及び７．０に調製した溶液中で５５℃で３日間保存した場合は、８５％以上、好ましくは９０％以上の残存率で存在し得る。本発明において、特に好ましいペプチドは、ペプチド１０，１２，２１，２３，２５，２６，２９，及び３１である。
本発明の神経突起誘発剤に使用するペプチドは、特に限定するものではないが、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）［Ｓｃｈｒｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｈｋｅ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．Ａ．］、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。
本発明においてペプチド合成は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法によって、または数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方法により行われる。
例えばステップワイズ法による固相合成は、具体的には、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ．Ｒ．Ｂ．）の方法［Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９−２１５９（１９６３）］に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するものであればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げられる。
また、α−アミノ基の保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）を使用する場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂など、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から脱離できるものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を使用する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂から脱離できるものがよい。樹脂１ｇ当りペプチド濃度は０．５ｍｍｏｌｅ以下とすることが好ましい。
上記の方法においては、アミノ酸のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化が必要である。
アミノ基の保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。
また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するもの、例えばＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＳｅｒは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のような通常の保護基を結合させることにより行われ、反応終了後、該保護基は脱離される。
Ｈｉｓのイミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられる。
Ｓｅｒ及びＴｈｒの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によって保護することができるが、この保護は必須ではない。エステル化に適する基としては、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばベンジル（Ｂｚｌ）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
Ａｒｇのグアニジノ基の保護基としては、例えばｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）基などが挙げられる。
Ａｓｐのカルボキシル基の保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ）などによるエステル化により行われる。
その他のアミノ酸の保護基として、Ｔｒｐのインドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カルボベンゾキシル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。
Ｍｅｔのチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は必須ではない。
一方、カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択し得る。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば無水または含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）などを単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（ＤＣＣ）、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Ｂｏｐ試薬）などの存在下に行うこともできる。
合成されたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、セファデックスＧ−２５などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記のようにして精製したペプチドは、各種の酸を用いて、所望により薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩等にすることができる。
上記ペプチドまたはその塩は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、注射剤、錠剤、散剤、顆粒剤、坐剤、腸溶剤、点鼻剤、吸入経肺剤、口腔吸収剤、カプセル剤、点眼剤，軟膏，経皮吸収剤，徐放製剤，およびその他のドラッグデリバリーシステムなどの医薬組成物として調製する。
本発明のペプチドまたはその塩は、従来公知のＰＡＣＡＰ／ＶＩＰと同様の生理作用を有するものであり、同様にして使用することができる。また、上記ペプチドおよびその塩は、神経突起誘発作用を有するので神経突起誘発剤として有用であり、当該製剤は、各種疾病、具体的には、アルツハイマー型痴呆症、パーキンソン病、神経細胞死、神経芽腫、健忘症などの、神経細胞の変性を伴う疾患の予防・治療、ならびに神経系に障害を与える薬物に対する防御に有効である。さらに、該ペプチドの気管支拡張作用により抗喘息作用として、また内視鏡検査時に用いる胃蠕動運動抑制剤としても有用である。また、本発明のペプチドまたはその塩を含有する医薬組成物は、例えば、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰと同様、脳塞栓症や脳血栓症を含む虚血性脳血管障害、これに伴う／またはその他の原因による脳あるいは末梢の神経脱落、コンフォメーション病、神経変性疾患、脱毛、男性不能症、痴呆症、腎不全、視神経萎縮、虚血性視神経症を含む視神経変性疾患および網膜変性疾患からなる群から構成される１種以上の疾患または症状の治療または予防のために使用することができ、また、血流改善、気管支平滑筋弛緩若しくは胃腸管運動抑制のために使用することもできるが、用途は特に限定されるものではない。尚、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰペプチドがコンフォメーション病を発症し得る特定のタンパク質に対して神経保護作用を有することは、本発明者らが先に見出している（特願２００１−３８６６９９号）。
本発明の医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に、さらには点鼻剤、吸入剤、徐放製剤、点眼剤、軟膏，経皮吸収剤，徐放製剤，口腔吸収剤等ドラッグデリバリーシステムを必要に応じて用いて、安全に投与することができる。実際には、患者の疾患の種類、期待する効果、および患者の全身状態等に応じて、適切な投与方法、投与する剤形、投与頻度等は、担当医師等の専門家により決定され得る。ここで使用する投与デバイスとして、点鼻剤では、ジェットライザー、パブライザーやネーザルインサフレーター、吸入剤では、スピンヘラー、イーヘラー、ＦｌｏｗＣａｐｓ、ジェットヘラー、デスクヘラー、ローターヘラー、ターブヘラー、イージーヘラー、アキュヘラー、クリックヘラー、インスパイヤーイース、インハレーションエイト等があげられるが、これらに限定される物ではない。当該医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、ペプチド量として１人１日当たり約１ｐｇ〜１ｍｇ／ｋｇ程度を適用することが例示される。その際、有効成分として、本発明のペプチドまたはその塩を、組成物中の生理活性ペプチドの５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、更に好ましくは９５重量％以上含有させる。このことは、生理活性ペプチドのうち、一般式（Ｉ）に含まれないペプチドを、組成物中に５０重量％未満、好ましくは２０重量％未満、特に好ましくは５重量％未満しか含有しないことを意味する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３４４５２３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ペプチド４（Ｉ）及びペプチド４をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し（濃度：３００μｇ／ｍＬ）、５５℃の恒温槽に２４時間静置したサンプル（ＩＩ）のクロマトグラムチャートを示す。
図２は、高次構造解析計算方法に基づいて算出されたペプチド１，７及び８の高次構造におけるヘリックス構造の比率を示す。
図３は、ペプチド１（天然型ＶＩＰ）に対するペプチド７及び８のマウス胃平滑筋の相対収縮抑制率を示す。
図４は、ペプチド１２，２１，２３の気管支弛緩作用を示す。（Ａ）はペプチド１２、（Ｂ）はペプチド２１、（Ｃ）はペプチド２３についての結果である。
図５は、コントロール（ペプチド無添加検体）、ペプチド１（天然型ＶＩＰ）、ペプチド４，１２，２１，及び２３の神経突起誘発作用を示す。
図６は、異常プリオン（ＰｒＰ１０６−１２６）に対するペプチド４，１２，２１，２３の神経保護作用を示す。
＃＃：ペプチド非存在下の検体と比して有意（Ｐ＜０．０１）
＊＊：ペプチド１と比して有意（Ｐ＜０．０１）
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を参考例、実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕  ペプチドの合成
配列番号１３に示すアミノ酸配列を有するペプチド１２をペプチド固相合成の常法に従い製造した。
ＭＢＨＡ樹脂ＨＣｌ塩（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−１％  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ共重合体，１００〜２００ｍｅｓｈ）をマニュアル合成用反応槽（ガラス製，φ６．０ｘ２９．５ｃｍ）に加え、樹脂容量の２〜３倍量のメタノールで攪拌洗浄し、次いでジクロロメタン（樹脂容量の２〜３倍量）で攪拌洗浄して樹脂を膨潤させた。１０％トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和反応を行い、Ｃ末端アミノ酸に相当するＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨを樹脂の約２倍当量用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ハイドロキシベンゾトリアゾールを加えて縮合反応を行った。約２時間の反応（攪拌下）後、メタノールおよびジクロロメタンにて洗浄し、カイザー試験にてα−アミノ基の消失を確認後、５０％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンにて３０分間処理して脱保護を行った。次いで、１０％トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和し、メタノールおよびジクロロメタンにて再洗浄後、再びカイザー試験を実施して脱保護反応の確認を行った。確認後はＣ末より２番目のＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨのカップリングを行うため、同様の工程を繰り返した。その後、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｇｌｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｎ（Ｘａｎ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ，Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−ＯＨの順に順次カップリング／脱保護を行い、ペプチド１２に相当する保護ペプチド；Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｔｙｒ（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＢＨＡを得た。ここで得られた保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂にエタンジチオールおよびアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに１０％酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行いペプチド１２を得た。
上記方法と同様にして、下記のペプチド１〜３３を化学合成した。
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〔実施例２〕  （ペプチド４の安定性）
天然型ＶＩＰに対してＡｒｇ残基含量を増すように改変したペプチドであるペプチド４を約１ｍｇ秤量し、ｐＨ４．０，５．０，６．０，７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。４０℃に設定した恒温槽（ＬＨ２０−１１Ｍ，ナガノ科学機械製作所）に２４時間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２８％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４の残存量を検討した。表２に示すようにｐＨが中性付近では顕著な減成を認めた。
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〔実施例３〕  （ペプチド４変異体のアミノ酸分析およびＬＣ−ＭＳ解析）
ペプチド４をｐＨ７．０のリン酸緩衝液に溶解し（濃度：３００μｇ／ｍＬ）、５５℃の恒温槽に２４時間静置し、図１（ＩＩ）に示すようなクロマトグラムチャートを得た。図１（Ｉ）はペプチド４（対照）のチャートである。これら変異体Ａ−Ｂについて、ＨＰＬＣにて分取し、アミノ酸分析を行った。その結果、表３に示すように、各変異体のアミノ酸分析結果はペプチド４の理論値とほぼ同じであった。
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この結果から、変異体のアミノ酸配列はペプチド４と酷似しており、異なる可能性があるのは酸性アミノ酸ＡｓｘとＧｌｘのみであることが示唆された。
さらに、これら変異体の分子量をＬＣ−ＭＳによって測定したところ、表４に示すような結果になった。
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表４の結果から、全ての変異体はペプチド４との比較において分子量が１増えていることが明らかとなった。アミノ酸分析の結果と併せて考慮すれば、ＡｓｎがＡｓｐへと、あるいはＧｌｎがＧｌｕへと変化していることが示唆された。ペプチド４のアミノ酸配列から判断するとＡｓｎ含有領域においてスクシンイミドを形成し、それに伴ってアミノ基が脱離し、分子量が１増加しているものと推定した。従って、ペプチド４では、２４，２５位のＡｓｎ−Ｓｅｒ配列、あるいは２８，２９位Ａｓｎ−Ｇｌｙ配列においてα−ωペプチド転移反応が起こっていることを確認した。
〔実施例４〕  （ペプチド７とペプチド８の構造）
ＶＩＰ（ペプチド１、配列番号２）、ＶＩＰのＮ末端２５残基に相当するペプチド７、（配列番号８）そしてその１７位メチオニンが酸化されたペプチド８（配列番号９）について、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７２０（日本分光）により円二色性スペクトルを検討した。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらによって提唱された高次構造解析計算方法に従うと、ペプチド１は約５０％ヘリックス構造を有することが明らかとなった（図２）。ペプチド７もその高次構造を高い比率で保持していることが示唆されるが、一方、メチオニンが酸化されたペプチド８のヘリックス構造は約半分にまで減少し、著しく構造が変化していることが示唆された。
〔実施例５〕  （ペプチド７とペプチド８の薬理活性）
雄のＩＣＲマウス（９週齢）を１週間予備飼育した後、１０〜１８週齢にわたって使用した。頸椎脱臼処理後、直ちに開腹し胃を全摘出、生理食塩水にて胃内部を十分に洗浄し、標本とした。出来上がった標本を内容量２０ｍＬのマグヌス槽（容量２０ｍＬ，温度３７℃，荷重２．０ｇ，９５％ＣＯ２＋５％ＣＯ２通気下：理研開発）内に懸垂した。生理的溶液としてＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を使用した。反応はアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電機）上に描記した。実験は標本をマグヌス装置にセットして、ベースラインが安定した後、カルバコール溶液（添加濃度６ｘ１０−３Ｍ）を１００μＬ添加した。１０分後に精製ペプチドの試料溶液を添加し、標本の弛緩作用を観察した。カルバコール収縮に対するペプチド１（天然型ＶＩＰ）の作用を１００％として、ペプチド７またはペプチド８を添加したときの平滑筋の最大収縮抑制率を求めた。図３に、ペプチド１，７，そして８の最終濃度１０−６Ｍにおけるマウス胃平滑筋の最大収縮抑制率を相対的に示す。ペプチド８は、ペプチド７と比べて著しい活性の減退を示し、メチオニン残基酸化による影響を強く示唆した。なおかつ実施例４を考慮すれば、この活性減退は、これら化合物のヘリックス含量と高い相関を示していることが分かった。すなわち、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ類のメチオニン酸化によって分子レベルでの高次構造上の変化が誘起され、活性に大きく影響していることが示された。
〔実施例６〕  （ペプチド１２の安定性）
ペプチド１２を適当量秤量し、蒸留水（大塚蒸留水）に溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、０．１Ｎ  ＮａＯＨにてｐＨ６．０，７．０に調製した。さらに１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、４０℃に設定した恒温槽にて２４時間静置した。指示時間後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド１２の残存量を検討した。その結果、ｐＨ６．０，７．０の両検体において特に顕著な未同定ピークの生成を認めなかった。従って、本ペプチドは安定性があることが示唆された。
〔実施例７〕  （ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ６．０，７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。５５℃に設定した恒温槽（ＦＣ−６１０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）に３日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を検討した。表５に示すように、ペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、著しく安定性が増していることが見られ、特にｐＨ７．０ではその傾向が顕著であった。
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〔実施例８〕  （ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ７．０に調製した蒸留水（大塚蒸留水）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。５５℃に設定した恒温槽（ＦＣ−６１０，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）にそれぞれ０，１０，２０，３０日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を検討した。表６に示すように、ペプチド４は１０日間の保存で完全に消失しているにも関わらず、ペプチド１２，２１，２３は３０日後でも残存し、著しく安定性が増していることが見られた。
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［実施例９］  （ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ６．０，７．０に調製したリン酸緩衝液（０．００１％リン酸二水素ナトリウム水溶液）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４０℃、７５％ＲＨに設定した恒温恒湿器（ＬＨ−２０−１１，ナガノ化学（株））に１週間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を測定した。表７に示すようにペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、安定性が顕著に増していることが見られた。
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［実施例１０］  （ペプチド４，１２，２１，２３の安定性）
ペプチド４，１２，２１，２３を適量秤量し、ｐＨ７．０に調製したリン酸緩衝液（０．００１％リン酸二水素ナトリウム水溶液）に溶解して終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。４０℃、７５％ＲＨに設定した恒温恒湿器（ＬＨ−２０−１１，ナガノ化学（株））にそれぞれ０，１０，２０，３０日間静置した後、逆相ＨＰＬＣ（検出波長：２２０ｎｍ，移動相：２９．５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸，カラム：ＯＤＳ−１２０Ｔ（トーソー），カラム温度：２５℃）にて分析を行い、ペプチド４，１２，２１，２３の残存率を測定した。表８に示すようにペプチド１２，２１，２３はペプチド４に比べ、安定性が顕著に増し、３０日経過後ではペプチド４は消失したが、ペプチド１２，２１，２３は残存していた。
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〔実施例１１］  （胃蠕動運動抑制作用）
ペプチド９，１０，３３の胃蠕動運動抑制作用を実施例５と同様にして検討した。
マウスは雄のＩＣＲマウス９週齢を使用した。頸椎脱臼処理後、直ちに開腹し胃を全摘出、生理食塩水にて胃内部を十分に洗浄し、標本とした。出来上がった標本を内容量２０ｍＬのマグヌス槽（容量２０ｍＬ、温度３７℃、荷重２．０ｇ、９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２通気下：理研開発）内に懸垂した。生理的溶液としてＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を使用した。反応はアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電機）上に描記した。実験は標本をマグヌス装置にセットして、ベースラインが安定した後、カルバコール溶液（３×１０−６Ｍ）を添加し，収縮安定後に各被験ペプチド（１０−６Ｍ）を添加し、標本の弛緩作用を観察した。カルバコール添加前の収縮度合いを０％、カルバコール添加安定化後の収縮の度合いを１００％として、各試料溶液を添加したときの胃の収縮抑制率を算出した。表９に薬剤投与１５分後の各物質の収縮抑制率を示す（対照薬：ペプチド９を１００としたときの各物質（ペプチド１０，３３）の収縮抑制率を示す）。
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〔実施例１２〕  （気管支平滑筋弛緩作用）
ペプチド１２，２１，２３について、以下の方法に従い、気管支平滑筋拡張時の一時的な収縮作用の有無を試験した。
Ｈａｒｔｌｅｙ系雄性モルモット（４４０ｇ）、７週齢（日本ＳＬＣ）を麻酔下、大腿動脈より放血致死させた後、開胸し気管を摘出した。気管に付着している脂肪組織等を可及的に除去し、軟骨に沿って軟骨４〜５本を含む幅に切断した後、食道と反対側の軟骨部分を縦に切断し、切片とした。気道上部、中央付近及び下部のそれぞれ１切片を標本として用いた。標本はマグヌス槽（容量２０ｍＬ，温度３７℃，荷重０．５ｇ，９５％Ｏ２＋５％ＣＯ２通気下）内に懸引した。生理的溶液にはＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（ＳＩＧＭＡ）溶液を用いた。反応はｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＴＢ−６１１Ｔ：日本光電）を用いてアンプＲＭＰ−６００４（日本光電）を介してレコーダーＲ−６４Ｍ（理化電気）上に描写した。カルバコール３ｘ１０−７Ｍによる収縮が安定後、ペプチド１２を累積的（１０−９Ｍ〜３×１０−６Ｍ）に投与し、一方ペプチド２１及びペプチド２３は単回投与（３ｘ１０−６Ｍ）した。測定後イソプロテレノール１０−６Ｍを投与し、その値を１００％弛緩として各被験物質の弛緩率を求めた。その結果ペプチド１２，２１，２３は全て図４に示すとおり、ペプチド添加に依存した明瞭な気管支弛緩作用を持つことが明らかとなった。
〔実施例１３〕  （神経突起誘発作用）
ペプチド１，４，１２，２１，２３について以下の方法に従って、神経突起誘発作用を試験した。ＰＣ−１２細胞は５％馬血清および５％新生仔ウシ血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの環境で３７℃に保って培養した。トリプシンにて細胞を培養フラスコからはがした後、細胞を血球計算器にてカウントし、１．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう調製した。２４ｗｅｌｌのコラーゲンタイプＩＶバイオコートディッシュに、上記細胞含有液体培地を１ｍｌずつ加え、２４時間５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの環境で３７℃に保って培養した。２４時間後培地を交換し、その際に各ペプチド（１００ｎＭ）を添加した。これを３日間継続培養し、写真撮影を行った。その写真を図５に示す。各写真のスケールバーは全て１００μｍを示す。写真に示すようにペプチド４，１２，２１，２３は、コントロール（ペプチド無添加検体）およびペプチド１（天然型ＶＩＰ）と比較して著しい神経突起誘発を認めた。
〔実施例１４〕  （神経保護作用）
正常プリオンは既に構造変換により異常体のプリオンに変換されることが確認されているので（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，（２０００）ｖｏｌ．７５，２５３６−２５４５）、脳・神経系研究におけるモデル系として用いられているラットの副腎髄質褐色細胞腫由来細胞、ＰＣ１２細胞を使用してフォールディング異常タンパク質のプリオン（１０６−１２６）による細胞死を検討した。５％ウマ血清及び５％新生仔ウシ血清含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）にて、ＰＣ１２細胞を５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの環境下で３７℃に保って培養した。トリプシンにてＰＣ１２細胞を培養フラスコからはがした後、９６ｗｅｌｌ培養プレートにて前記細胞を培養した（１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。このＰＣ１２培養細胞にプリオン（１０６−１２６）（アメリカンペプタイドカンパニー社製）を５０μＭと１０−７Ｍの神経ペプチド（ペプチド１，４，１２，２１，２３）を添加し、ＷＳＴ−８法によって生存細胞数を算出し、異常プリオン（ＰｒＰ１０６−１２６）に対する神経保護作用の程度を数値化した。その結果を図６に示す。ペプチド１（天然型ＶＩＰ）はペプチド非存在下の検体と比して有意（＃＃，Ｐ＜０．０１）に生存細胞数が多く、有意な神経保護作用を示した。一方、ペプチド４，１２，２１，２３は、ペプチド１と比して有意（＊＊，Ｐ＜０．０１）に神経保護作用が強いことを確認した。
〔実施例１５〕  （吸入経肺および点鼻用製剤の作製）
吸入経肺および点鼻用製剤の作製は、原則として、特開２００３−３４６５２に記載の粉末製剤作製方法に従って行った。
粉砕条件
使用機器：            Ａ−Ｏ−Ｊｅｔ  Ｍｉｌｌ（セイシン企業）
原料供給方法：        オートフィーダー
供給エアー圧力：      ６．０ｋｇ／ｃｍ２Ｇ
粉砕エアー圧力：      ６．５ｋｇ／ｃｍ２Ｇ
集塵方法：            アウトレットバグ
上記方法にて、ペプチド４，１２，２１，２３の乳糖希釈物あるいはエリスリトール希釈物を作製し、エリスリトール担体（平均粒径７０μｍ）または乳糖担体（平均粒径５０μｍ）を微粉砕物／担体＝０．４／ｌにて非帯電袋を用いて混合した。
〔実施例１６〕  （点眼剤の作製）
神経ペプチド                    １０ｍｇ
ホウ酸                          ７００ｍｇ
ホウ砂                          適量
塩化ナトリウム                  ５００ｍｇ
ヒドロキシメチルセルロース      ０．５ｇ
エデト酸ナトリウム              ０．００５ｍｇ
ｐＨ７．０
滅菌精製水        全量          １００ｍＬ
滅菌精製水８０ｍＬを約８０℃まで加温し、ヒドロキシメチルセルロースを加えて攪拌し、液温を室温まで戻す。この液に神経ペプチド、塩化ナトリウム、ホウ酸、エデト酸ナトリウムおよび塩化ベンザルコニウムを加えて溶解する。ホウ砂を適量加えてｐＨを７．０に調整する。滅菌精製水を加えて１００ｍＬまでメスアップする。
神経ペプチドとして、ペプチド４，１２，２１，２３を用いた。
〔実施例１７〕  （注射剤の製造）
神経ペプチド                  １０ｍｇ
塩化ナトリウム                ９００ｍｇ
１Ｎ水酸化ナトリウム          適量
注射用蒸留水      全量        １００ｍＬ
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。神経ペプチドとして、ペプチド４，１２，２１，２３を用いた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、長期保存が可能で、副生成物による予期せぬ副作用を回避することが可能なＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体を提供することが出来る。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成ペプチド
配列番号２：合成ペプチド
配列番号３：合成ペプチド
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配列番号５：合成ペプチド
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配列番号２７：合成ペプチド
配列番号２８：合成ペプチド
配列番号２９：合成ペプチド
配列番号３０：合成ペプチド
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３２：合成ベプチド
配列番号３３：合成ペプチド
配列番号３４：合成ペプチド
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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