(57)【要約】検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ｉ）非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミン、または、ｉｉ）ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
【請求項２】
水性媒体が、胆汁酸誘導体を含有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項８】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項７記載の試薬。
【請求項９】
さらに、胆汁酸誘導体を含有する請求項６〜８のいずれかに記載の試薬。
【請求項１０】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項９記載の試薬。
【請求項１１】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである請求項６〜１０のいずれかに記載の試薬。
【請求項１２】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項６〜１１のいずれかに記載の試薬。
【請求項１３】
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項１４】
ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項１５】
コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬と、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項１６】
ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項１７】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項１５または１６記載のキット。
【請求項１８】
さらに、胆汁酸誘導体を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項１３〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである請求項１３〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項１３〜２０のいずれかに記載のキット。
【請求項２２】
検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ｉ）非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミン、またはｉｉ）ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
【請求項２３】
検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
【請求項２４】
さらにポリアニオンを含有する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
さらにアルブミンを含有する請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項２８】
ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項２９】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項２８記載の試薬。
【請求項３０】
さらにポリアニオンを含有する請求項２７〜２９のいずれかに記載の試薬。
【請求項３１】
ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項３０記載の試薬。
【請求項３２】
さらにアルブミンを含有する請求項２７〜３１のいずれかに記載の試薬。
【請求項３３】
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項３４】
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンエーテル多環フェニル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項３５】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
さらにポリアニオンを含有する請求項３３〜３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
さらにアルブミンを含有する請求項３３〜３６のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、検体中の高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）中のコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットに関する。
【背景技術】  生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、カイロミクロン（ＣＭ）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。その中で、ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
従来のＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと略記する）の測定法は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。
近年、上記の問題を解決するために、種々の測定法が報告されている。例えば、血清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、および、胆汁酸塩、胆汁酸誘導体またはジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ中のコレステロールをＨＤＬコレステロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリオキシエチレンオキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、ＨＤＬコレステロールと当該酵素とを反応させ、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別定量する方法（特開昭６２−６９９９９号公報）、血清を、特定のｐＨおよび特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりＨＤＬコレステロールを測定する方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）が知られている。特許文献２に記載の測定法では、まず、ＬＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、次いで、ＨＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、ＨＤＬコレステロールの測定が可能となる。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要し、また、必ずしも、ＨＤＬコレステロールに特異的な測定法ではなかった。
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えばデキストラン硫酸等のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法（特開平８−１３１１９７号公報）、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特開平８−２０１３９３号公報）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特開平９−２８５２９８号公報）、血清または血漿を、リポ蛋自分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価陽イオンとの組み合わせ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特開平８−１１６９９６号公報）、生体試料に、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白質と複合体を形成する物質と、リポ蛋白質を溶解しない特定の界面活性剤とを添加した後、酵素的にＨＤＬコレステロールを測定する方法（特開平８−２０１３９３号公報）等が知られている。
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるＨＤＬコレステロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等の問題がある。
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させずにＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えば、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとを、胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン存在下に反応させ、当該酵素反応により消費または生成する化合物を測定することによる生体試料中のＨＤＬコレステロールの測定方法（国際公開第９７／４０３７６号パンフレット）、ＨＤＬ画分に対して反応選択性をもつＨＬＢ値が１６以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼならびにコレステロール酸化酵素とを反応させて、検体中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（国際公開第００／５２４８０号パンフレット）等が知られている。また、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、ＨＤＬコレステロールを酵素的に測定する方法（特開平９−２９９号公報）も知られている。
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロールの測定法においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールの不完全な消去や、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
また、光学的手法により検体中の特定物質の測定を行う場合、Ｍ蛋白血症や骨髄腫等の患者由来の検体では、水不溶性の蛋白に起因する濁りが光学的な影響を与えることが大きな問題となっている。この光学的な影響を回避するために、反応液中の塩類を高濃度とし、水不溶性蛋白に起因する濁りを解消させる方法が一般的に知られている。しかしながら、ＨＤＬコレステロールの測定においては、高濃度の塩類を存在させることにより、ＨＤＬコレステロールに対する特異性の低下や、さらには含有されている酵素の失活を招く場合があることから、高濃度の塩類の存在下でのＨＤＬコレステロールの測定は、極めて困難である場合が多い。
【発明の開示】
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な測定ができるＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを提供することにある。
本発明は、下記［１］〜［３７］に関する。
［１］  検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［２］  水性媒体が、さらに、胆汁酸誘導体を含有する［１］記載の測定方法。
［３］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である［２］記載の測定方法。
［４］  非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］  ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である［１］〜［４］のいずれかに記載の測定方法。
［６］  非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［７］  非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［８］  さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する［７］記載の試薬。
［９］  さらに、胆汁酸誘導体を含有する［６］〜［８］のいずれかに記載の試薬。
［１０］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である［９］記載の試薬。
［１１］  非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである［６］〜［１０］のいずれかに記載の試薬。
［１２］  ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である［６］〜［１１］のいずれかに記載の試薬。
［１３］  第一試薬および第二試薬からなるキットであって、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［１４］  ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［１５］  第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［１６］  ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［１７］  さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する［１５］または［１６］に記載のキット。
［１８］  さらに、胆汁酸誘導体を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する［１３］〜［１７］のいずれかに記載のキット。
［１９］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性胆汁酸誘導体である［１８］記載のキット。
［２０］  非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンである［１３］〜［１９］のいずれかに記載のキット。
［２１］  ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である［１３］〜［２０］のいずれかに記載のキット。
［２２］  検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ｉ）非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミン、または、ｉｉ）ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［２３］  検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
［２４］  さらにポリアニオンを含有する［２３］記載の方法。
［２５］  ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である［２３］または［２４］記載の方法。
［２６］  さらにアルブミンを含有する［２３］〜［２５］のいずれかに記載の方法。
［２７］  ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［２８］  ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［２９］  さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する［２８］記載の試薬。
［３０］  さらにポリアニオンを含有する［２７］〜［２９］のいずれかに記載の試薬。
［３１］  ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である［３０］に記載の試薬。
［３２］  さらにアルブミンを含有する［２７］〜［３１］のいずれかに記載の試薬。
［３３］  第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有するとことを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［３４］  第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［３５］  さらに、第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、還元型補酵素測定用試薬を含有する［３４］記載のキット。
［３６］  さらに、第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、ポリアニオンを含有する［３３］〜［３５］のいずれかに記載のキット。
［３７］  さらに、第一試薬と第二試薬のいずれかまたは両方に、アルブミンを含有する［３３］〜［３７］のいずれかに記載のキット。
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿および血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、例えばコレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ３１１；東洋紡製社製）、リポプロテインリパーゼ“Ａｍａｎｏ”６（ＬＰＬ６；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ［ＣＯＥ３１３（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製］等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳおよびサンブライトＭＥＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズおよびサンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００およびＭ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水酢酸（ＤＴＰＡ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）等が挙げられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾方法は特に制限はなく、例えば、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌することにより行うことができる。本発明に使用する化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素としては、この反応液そのもの、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも使用することもできる。
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Ａｍａｎｏ”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ−ＰＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Ａｍａｎｏ”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰ等が挙げられる。
本発明において用いられるアルブミンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
本発明において用いられるポリアニオンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸またはその塩、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩、カラギーナン等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が４万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを２種以上用いてもよい。
本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるポリアニオンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
本発明において用いられる非イオン性界面活性剤としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする非イオン性界面活性剤であれば特に制限はなく、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアリールエーテル誘導体、エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレン等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンが好ましい。
ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンとしては、例えば一般式（Ｉ）
2004035816.tif 000002
［式中、Ｒは直鎖または分岐状のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｘは水素原子または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨを表し、ｍおよびｎは同一または異なって、１〜１００の整数を表し、ｍ＋ｎは２〜２００の整数である］で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）という］が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルアミン、化合物（Ｉ）およびポリオキシエチレンアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０の、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）等が挙げらる。
ポリオキシエチレンアルケニルアミン、化合物（Ｉ）およびポリオキシエチレンアルケニルエーテルにおけるアルケニルとしては、直鎖または分枝上の炭素数６〜３０の、例えばヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの具体例（製品）としては、例えばナイミーンＬ２０１（オキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＬ２０７（ポリオキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＳ２０４、ナイミーンＳ２１０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本油脂社製）、ニューコールＯＤ４２０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ３１０４（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３１１０（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３６０５［ポリオキシエチレンアルキル（大豆）アミン；竹本油脂社製］、パイオニンＤ３６１５Ｔ［ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；竹本油脂社製］、ＢＬＡＵＮＯＮ  Ｏ２０９（ポリオキシエチレンオレイルアミノエーテル；青木油脂社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシエチレンアルケニルエーテルの具体例（製品）としては、例えばエマルミンＬ９０Ｓ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル；三洋化成社製）、ニューコール１３１０（ポリオキシエチレントリデシルエーテル；日本乳化剤社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ−ＥＮ１５２０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル；青木油脂社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアリールエーテル誘導体としては、例えばポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチレン化メチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアリールエーテル誘導体の具体例（製品）としては、例えばニューコール２６０４、ニューコール７１０（いずれもポリオキシエチレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）、ニューコール２６０８Ｆ（ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ６３１０、パイオニンＤ６３２０（いずれもポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル縮合物；竹本油脂社製）、ニッコールＲ１０２０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物；日光ケミカルズ社製）などが挙げられる。
エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレンとしては、例えばエチレンジアミンポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、エチレンジアミンテトラポリオキシエチレン、エチレンジアミンテトラポリオキシプロピレン等が挙げられる。
エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレンの具体例（製品）としては、例えばアデカプルロニックＴＲ７０４、アデカプルロニックＴＲ７０１、アデカプルロニックＴＲ９１３Ｒ（いずれもエチレンジアミンポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物；旭電化社製）、ユニルーブ３２ＴＹ−６５ＢＩ（エチレンジアミンテトラポリオキシアルキレン；日本油脂社製）等が挙げられる。
ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアリールエーテル誘導体およびエチレンジアミンテトラポリオキシアルキレンにおけるオキシアルキレン鎖（オキシエチレン鎖またはオキシプロピレン鎖）の重合数は、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜６０である。
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルとしては、例えばポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル硫酸エステル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル硫酸エステル等が挙げられる。
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルの具体例（製品）としては、例えばニューコール７０７ＳＦ、７０７ＳＮ、７１４ＳＦ、７２３ＳＦ、７４０ＳＦ（いずれも日本乳化剤社製）等が挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルにおけるオキシエチレン鎖の重合数としては、１〜１００が好ましく、５〜４０がより好ましい。
本発明においては、非イオン性界面活性剤を２種類以上用いてもよい。本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法における非イオン性界面活性剤の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１０％であることが好ましく、０．００１〜１％がより好ましい。
本発明における胆汁酸誘導体としては、例えば陰イオン性胆汁酸誘導体、両性胆汁酸誘導体、非イオン性胆汁酸誘導体等が挙げられるが、陰イオン性胆汁酸誘導体が好ましい。
陰イオン性胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。
両性胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（ＩＩ）
2004035816.tif 000003
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物［以下、化合物（ＩＩ）という］等が挙げられる。以下、Ｒ２が水素原子である化合物（ＩＩ）をＣＨＡＰＳと、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉ）をＣＨＡＰＳＯとよぶ。
非イオン性胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（ＩＩＩ）
2004035816.tif 000004
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル、または、置換もしくは非置換のアルカノイルを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ）という］等が挙げられる。アルキル、アルカノイルにおけるアルキルとしては、直鎖または分岐状の炭素数１〜１０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。置換アルキルおよび置換アルカノイルにおける置換基としては、例えば水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。化合物（ＩＩＩ）のうち、Ｒ３およびＲ４が共に、
ＣＯＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ
（以下、置換基Ａという）である化合物が好ましい。以下、Ｘ、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、水素原子、置換基Ａおよび置換基Ａである化合物をｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、水酸基、置換基Ａおよび置換基Ａである化合物をＢＩＧＣＨＡＰとよぶ。
胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定方法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。
緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
以下に、本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを具体的に説明する。
（ＨＤＬコレステロールの測定方法）
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法が挙げられる。
測定方法１
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有し、必要に応じ安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
（２）必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存在下に、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法２
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミンおよび胆汁酸誘導体を含有し、必要に応じ安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
（２）必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存在下に、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法３
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体を含有し、必要に応じポリアニオン、アルブミン、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有する水性媒体中で反応させ、
（２）必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存在下に、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法４
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルおよび陰イオン性胆汁酸誘導体を含有し、必要に応じポリアニオン、アルブミン、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有するする水性媒体中で反応させ、
（２）必要に応じて過酸化水素測定用試薬または還元型補酵素測定試薬の存在下に、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
本測定法においては、（１）および（２）の反応は、同一または異なる条件下、同時または順次に、それぞれ、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素測定用試薬により測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。
ロイコ型色原体としては、例えば１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００〜５００ｎｍが好ましく、３３０〜４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム  モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
（ＨＤＬコレステロール測定用試薬）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬が挙げられる。
試薬１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬３
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬４
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬５
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬６
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬７
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬８
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬９
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル、陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬１０
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬１１
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬１２
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル、陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬１３
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬１４
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、陰イオン性胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬１５
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル、陰イオン性胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬においては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法において挙げられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
（ＨＤＬコレステロール測定用キット）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれであってもよいが、２試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好ましい。ポリアニオンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬に含有されることが好ましい。非イオン性界面活性剤およびアルブミンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。また、胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
本発明のキットは例えば下記の態様のものが挙げられる。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬、必要に応じて胆汁酸誘導体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび過酸化水素測定試薬、必要に応じて胆汁酸誘導体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素、必要に応じて還元型補酵素測定用試薬、胆汁酸誘導体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
ポリアニオンを含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、コレステロールエステル加水分解酵素、非イオン性界面活性剤、アルブミンおよび酸化型補酵素、必要に応じて還元型補酵素測定用試薬、胆汁酸誘導体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定試薬、必要に応じてポリアニオン、アルブミン、安定化剤、防腐剤および影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
第一試薬および第二試薬からなるキットであって、コレステロールエステル加水分解酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンもしくはポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルもしくは陰イオン性胆汁酸誘導体および酸化型補酵素、必要に応じて、還元型補酵素測定用試薬、ポリアニオン、アルブミン、安定化剤、防腐剤および影響物質消去剤の各々を任意に第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
より具体的には、例えば以下の態様のキットが挙げられるが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット３
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット４
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット５
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット６
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット７
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット８
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット９
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１０
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１１
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１２
第一試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、胆汁酸誘導体および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１３
第一試薬
ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１４
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
キット１５
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１６
第一試薬
ポリアニオン、アルブミンおよび非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１７
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
キット１８
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、非イオン性界面活性剤および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１９
第一試薬
ポリアニオン、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２０
第一試薬
ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２１
第一試薬
ポリアニオン、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、非イオン性界面活性剤、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２２
第一試薬
ポリアニオンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２３
第一試薬
ポリアニオン、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、アルブミン、非イオン性界面活性剤および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２４
第一試薬
ポリアニオンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、アルブミン、非イオン性界面活性剤、胆汁酸誘導体および過酸化水素用測定試薬を含有する試薬。
キット２５
第一試薬
陰イオン性胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２６
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、アニオン性胆汁酸誘導体、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２７
第一試薬
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステルおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２８
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法において挙げられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、非イオン性界面活性剤、ポリアニオン、アルブミン、胆汁酸誘導体、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて前述の、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＨＤＬコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜８００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．０２〜４００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける非イオン性界面活性剤の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜１０％となる含量が好ましく、０．００１〜５％となる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリアニオンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜１０％となる含量が好ましく、０．０１〜５％となる含量がより好ましい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜１０％となる含量が好ましく、０．０１〜５％となる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜１０％となる含量が好ましく、０．０１〜５％となる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および酵素を使用した。
ＨＥＰＥＳ（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（ファルマシア社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量８万）（ＩＣＮ社製）、ι−カラギナン（純正化学社製）、ヘパリンリチウム（和光純薬社製）、リンタングステン酸ナトリウム（関東化学社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；オリエンタル社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＬＰＬ３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）、ＣＯＯ３２１（コレステロールオキシダーゼ；東洋紡績社製）、ＬＰＬ６（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ナイミーンＬ２０７（ポリオキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＳ２０４（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＳ２１０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本油脂社製）、ニューコールＯＤ４２０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ３１０４（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３１１０（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３６０５［ポリオキシエチレンアルキル（大豆）アミン；竹本油脂社製］、ニューコール２６０８Ｆ（ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤社製）、ニッコールＲ１０２０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルホルムアルデヒド縮合物；日光ケミカルズ社製）、アデカプルロニックＴＲ７０４（エチレンジアミンポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物；旭電化社製）、エマルミンＬ９０Ｓ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル；三洋化成社製）、コール酸ナトリウム（ＡＣＲＯＳ社製）、タウロコール酸ナトリウム（東京化成社製）、グリココール酸ナトリウム（東京化成社製）、ニューコール７４０−ＳＦ、ニューコール７０７−ＳＦ（いずれもポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩；日本乳化剤社製）。
【発明を実施するための最良の形態】参考例１  化学修飾ＬＰＬ３１１（化学的に修飾されたＬＰＬ３１１）の調製
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５，０．１５ｍｏｌ／Ｌ）に、ＬＰＬ３１１を３３ｇ／Ｌとなるように加え５℃に冷却した後、サンブライトＶＦＭ−４１０１（日本油脂社製）を３３０ｇ／Ｌとなるよう加え、さらに３時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾ＬＰＬ３１１として使用した。
実施例１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ６．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ６．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｆ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットを用いて、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＨＤＬコレステロール濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）および血清（ＨＤＬコレステロール濃度：６０．０ｍｇ／ｄＬ）を、キットとして実施例１のキットを用いて、日立７１７０型自動分析装置により、ＨＤＬコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１およびＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（３μＬ）と第一試薬（０．２４ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０８ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体と実施例１のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
（３）ヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度の測定
（２）で算出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。
実施例６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例３のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例４のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例５のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例６のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
次に、実施例５〜８および比較例７〜１２の測定において用いたヒト血清４０検体を用いて、クリニカルケミストリー第４５巻、１０号（１９９９年）に記載されたＤＣＭ法（Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）により当該検体中のＨＤＬコレステロールを測定し、各実施例および比較例での値と比較した。
実施例５〜８および比較例７〜１２それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表１に示す。
2004035816.tif 000005
実施例５と、比較例７〜１２との比較から、コレステロール測定用酵素以外に、ＢＳＡ、デキストラン硫酸ナトリウムおよびポリオキシエチレンアルキルアミンをすべて含有するキットを用いた測定においてのみ、ＤＣＭ法による測定と良い相関係数が得られることが判明した。実施例５と実施例６との比較から、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定と良好な相関係数が得られることが判明した。また、実施例５と実施例７の比較、実施例６と実施例８との比較から、コレステロール測定用酵素、ＢＳＡ、デキストラン硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルアミンの他に、胆汁酸誘導体の１つであるコール酸ナトリウムを加えたキットを用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定と良い相関が認められた。
実施例９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量８万）    ０．５ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｉ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ι−カラギナン                              ０．５ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｊ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ヘパリンリチウム                            ０．５ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｋ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム                ０．５ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例９のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例１４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１０のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例１５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１１のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例１６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例１３〜１６それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表２に示す。
2004035816.tif 000006
実施例５と実施例１３〜１６との比較より、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）以外のポリアニオンを用いた場合においてもＤＣＭ法の測定に対し良好な相関係数が得られることが判明した。
実施例１７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｌ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ニューコールＯＤ４２０                      ０．０５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｍ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３６０５                        ０．０１ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｎ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
エマルミンＬ９０Ｓ                          ０．０５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｏ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ニューコール２６０８Ｆ                      ０．２ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｐ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ニッコールＲ１０２０                        ０．２ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｑ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
アデカプルロニックＴＲ７０４                １．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                    ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｑ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
アデカプルロニックＴＲ７０４                １．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例２４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１７のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１８のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１９のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２０のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２１のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２３のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。実施例２４〜３０それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表３に示す。
2004035816.tif 000007
実施例５と同様、ナイミーンＬ２０７（ポリオキシエチレンドデシルアミン）以外の非イオン性界面活性剤を用いた場合においてもＤＣＭ法の測定に対し良好な相関係数が得られることが判明した。また、実施例２９と実施例３０との比較から、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定と良好な相関係数が得られることが判明した
実施例３１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｒ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                    ２．７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１０４                        ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｒ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                    ２．７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｆ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２０４                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｒ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                    ２．７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２１０                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｓ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２１０                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｔ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
グリココール酸ナトリウム                    ２．４ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２１０                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ６．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｆ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ６．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．０７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ６．０ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｒ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                    ２．７ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｓ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
コール酸ナトリウム                          ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｔ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
グリココール酸ナトリウム                    ２．４ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｕ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１０４                        ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｕ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｆ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２０４                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例１８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｕ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｇ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＳ２１０                          ０．０５ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例３９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３１のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３３のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３４のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３５のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３６のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３７のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３８のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１３のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１４のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１５のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１６のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１７のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１８のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３９〜４６および比較例１９〜２４それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表４に示す。
2004035816.tif 000008
実施例３９〜４３と比較例１９〜２４との比較から、アニオン性胆汁酸誘導体もしくはポリオキシエチレンアルキルアミンのみを含有したキットの測定よりも、両化合物を含有したキットの測定の方がＤＣＭ法による相関係数が良好であることが判明した。また、実施例４４と実施例４５〜４６との比較から、コレステロール測定用酵素、アニオン性胆汁酸誘導体、ポリオキシエチレンアルキルアミンの他に、デキストラン硫酸またはアルブミンを加えたキットを用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定と良い相関が認められた。
実施例４７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｖ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ニューコール７４０ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例４８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｗ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｉ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ナイミーンＬ２０７                          ０．１ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例４９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｗ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例５０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｘ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例５１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｙ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例５２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｚ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）  １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                      ２．０ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例２５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｖ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ニューコール７４０ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例２６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｗ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
ニューコール７０７ＳＦ                      ０．５ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例２７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｕ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                    ０．３ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｈ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                    １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                      ０．３ｇ／Ｌ
パイオニンＤ３１１０                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                            ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１                        ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例５３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例４７のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例４８のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例４９のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５０のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５１のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５２のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例２５のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例２９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例２６のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例３０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例２７のキットを用いる以外は実施例５の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清４０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例５３〜５８および比較例２８〜３０それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表５に示す。
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実施例５３〜５５と比較例２８〜３０との比較から、ポリオキシエチレン多環フェニル硫酸エステルもしくはポリオキシエチレンアルキルアミンのみを含有したキットの測定よりも、両化合物を含有したキットの測定の方がＤＣＭ法による相関係数が良好であることが判明した。また、実施例５５と実施例５６〜５８との比較から、コレステロール測定用酵素、ポリオキシエチレン多環フェニル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミンの他に、デキストラン硫酸及び／またはアルブミンを加えたキットを用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定と良い相関が認められた。
実施例５９  Ｍ蛋白血症患者由来の血清中のＨＤＬコレステロールの測定
検体としてＭ蛋白血症患者より得られた血清を用い、測定用キットとして実施例１のキットを用いて実施例５の測定法と同様にして日立７１７０型自動分析装置によりＨＤＬコレステロールの測定を行った。試料に第一試薬を添加し５分間反応させた後の吸光度、即ち第二試薬添加前の反応液の吸光度（Ｅ１）の値を表６に、ＨＤＬコレステロールの測定値を表７に示す。また、比較として、当該Ｍ蛋白血症患者由来の血清をＤＣＭ法により測定した際の測定値も表７に示す。
比較例３１  Ｍ蛋白血症患者由来の血清中のＨＤＬコレステロールの測定
検体としてＭ蛋白血症患者より得られた血清を用い、測定用キットとして比較例５のキットを用いて実施例５の測定法と同様にして日立７１７０型自動分析装置によりＨＤＬコレステロールの測定を行った。試料に第一試薬を添加し５分間反応させた後の吸光度、即ち第二試薬添加前の反応液の吸光度（Ｅ１）の値を表６に、ＨＤＬコレステロールの測定値を表７に示す。
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表６に示すように比較例５の測定キットを用いた場合には、第二試薬が添加される前においても水不溶性の蛋白に起因する濁りが解消されていないが、デキストラン硫酸ナトリウムを含有する実施例１の測定キットを用いた場合には、第二試薬が添加される前には水不溶性の蛋白に起因する濁りが解消されていることが判明した。
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表７に示した通り、実施例１のキットを用いた測定（実施例５９）での測定値は、ＤＣＭ法での測定値とほぼ一致したが、比較例５のキットを用いた測定（比較例３１）での測定値は、実施例５９の方法やＤＣＭ法での測定値とは大きく異なっており、正確な測定を反映するものではなかった。このように、本発明のキットを用いることにより、Ｍ蛋白血症患者検体中のＨＤＬコレステロールをも正確に測定できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、簡便、かつ、正確な測定ができるＨＤＬコレステロールの定方法、測定用試薬および測定用キットが提供される。
【国際調査報告】
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