(57)【要約】易変性で葉緑素の蓄積が低下するｐｙｌ変異体の原因遺伝子を同定し、この変異にＡｃ／Ｄｓ型に分類される新規トランスポゾンが関与することを見いだした。イネにおいて通常の栽培条件下で初めて転移活性をもつＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンｎＤａｒｔ（配列番号１）を確認した。更に、このＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンを解析することにより、その自律性因子Ｄａｒｔを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）のいずれかのＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子。
（１）配列番号１で表される塩基配列から成るＤＮＡ
（２）（１）の塩基配列と相同性が９８％以上の塩基配列から成り、該ＤＮＡを有するイネを薬剤で処理することにより転移するＤＮＡ
【請求項２】
以下の（３）又は（４）のいずれかのＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子。
（３）配列番号６〜８のいずれかで表される塩基配列から成るＤＮＡ
（４）（３）の塩基配列と相同性が９８％以上の塩基配列から成り、該ＤＮＡを有するイネを薬剤で処理することにより転移するＤＮＡ
【請求項３】
前記薬剤が５−アザシチジンである請求項１又は２に記載のトランスポゾン遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項６】
宿主が植物である請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
宿主がシロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシである請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の形質転換体を薬剤で処理することにより請求項１又は２に記載のトランスポゾン遺伝子を転移させる方法。
【請求項９】
前記薬剤が５−アザシチジンである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の方法により、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、イネのトランスポゾン遺伝子に関し、より詳細には、イネのＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾン遺伝子及びその自律性因子に関する。
従来技術
トランスポゾンは、転移の様式によりＲＮＡ中間体を介して転移するクラスＩ因子と、ＤＮＡ分子のままで切り出され転移するクラスＩＩ因子に大別される。イネではクラスＩ因子であるＴｏｓ１７を用いた大規模な遺伝子タギングシステムが展開されているが、Ｔｏｓ１７の転移にはカルス培養を経由するため高頻度で体細胞変異が同時に出ることが知られている（Ｔｒｅｎｄ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６：１２７−１３４（２００１））。一方、クラスＩＩ因子としては、ＭＩＴＥ型のｍＰｉｎｇが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２１，Ｎｏ．６９１９，ｐｐ．１６７−１７０（Ｊａｎ．２００３））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  しかし、ｍＰｉｎｇの転移には体細胞変異や高頻度の突然変異の誘発が引き起こされる葯培養やγ線照射が必要とされる（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２１，Ｎｏ．６９１９，ｐｐ．１６７−１７０（Ｊａｎ．２００３））。更にこれらトランスポゾンの標的配列の特異性などから、一部の変異しか得られないと考えられており、それ故、新たなタギングシステムが求められている。
【課題を解決するための手段】  本発明者らは、易変性で葉緑素の蓄積が低下するｐｙｌ（ｐａｌｅ−ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ）変異の原因遺伝子を同定し、この変異にＡｃ／Ｄｓ型に分類される新規トランスポゾンが関与することを見いだした。この結果は、イネにおいて通常の栽培条件下で初めて転移活性をもつＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンｎＤａｒｔ（ｎｏｎａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｄｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｃｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を確認したものである。更に、このＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンを解析することにより、その自律性因子Ｄａｒｔを見出した。
即ち、発明は、以下の（１）又は（２）のいずれかのＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子（ｎＤａｒｔ）である。
（１）配列番号１で表される塩基配列から成るＤＮＡ
（２）（１）の塩基配列と相同性が９８％以上の塩基配列から成り、該ＤＮＡを有するイネを薬剤で処理することにより転移するＤＮＡ
更に、本発明は、以下の（３）又は（４）のいずれかのＤＮＡから成るイネのトランスポゾン遺伝子（Ｄａｒｔ）である。
（３）配列番号６〜８のいずれかで表される塩基配列から成るＤＮＡ
（４）（３）の塩基配列と相同性が９８％以上の塩基配列から成り、該ＤＮＡを有するイネを薬剤で処理することにより転移するＤＮＡ
トランスポゾンは細胞分裂が活発になる条件下の生育により、転移頻度が上昇することが知られている。そのため通常の生育条件で転移するｎＤａｒｔ及びＤａｒｔの転移頻度をさらに上昇させるためには、植物をストレス環境下で生育させることが有効である。このストレス環境とは、ＤＮＡの脱メチル化を引き起こす薬剤５−アザシチジン処理、紫外線・γ線などの各種放射線の照射、又は植物細胞を脱分化させたカルス培養等の人工培養系の利用などである。上記処理によりｎＤａｒｔ及びＤａｒｔの転移頻度を上昇させ、突然変異体の出現率を上げることによって効率的に望む変異体を得ることが可能である。
本発明は、また、上記に記載のいずれかのトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミドである。ここで用いることのできるプラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。ここで用いることのできるプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、熱ショックプロモーター、化学物質誘導性プロモーター等が挙げられる。またプロモータ及び上記遺伝子の結合方法に特に制限は無く、通常の遺伝子工学的手法に従って適宜行うことができる。
また、本発明は、上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体である。この宿主は植物であることが好ましく、宿主としては、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシが好ましい。このような植物を形質転換するには、通常の遺伝子工学的手法を用いて、この遺伝子を上記プラスミドに挿入し、この植物を形質転換することができる。
更に、本発明は、上記のいずれかの方法により、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種である。この植物としてシロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ又はトウモロコシが好ましい。
【図面の簡単な説明】  第１図は、易変性ｐｙｌ−ｖ変異体を示す。
第２図は、表現型が安定となったｐｙｌ−ｓｔｂ（左図）と野生型の“台中６５号”（右図）を示す。改変ｗｈｉｔｅ培地に播種後７日目の個体を示す。
第３図は、ｐｌｙ遺伝子マップベースクローニングを示す。
第４図は、実施例１のＰＣＲ産物の電気泳動を示す。
第５図は、ｐｌｙ変異体のＯｓＣｌｐＰ遺伝子を示す。黒い四角はエキソンを示し、ａｔｇは開始コドンを示す。
第６図は、ｐｌｙ−ｓｔｂ変異体のＯｓＣｌｐＰ遺伝子の転写開始点周辺領域を示す。小文字はタンパク質へ翻訳される領域を示し、下線のａｔｇは開始コドンを示す。最上の矢印は野生型の転写開始点を示し、その他の矢印はｐｌｙ−ｓｔｂ変異体の転写開始点を示す。肩の数字はクローニングした数を示す。
第７図は、復帰突然変異体のＯｓＣｌｐＰ遺伝子構造（Ａ）と残されたフットプリント（Ｂ）を示す。下線のａｔｇは開始コドンを示す。
第８図は、ＢＬＡＳＴ法で検索した自立性因子を示す。
第９図は、インド型イネ（カサラス）と台中６５号（Ｔ−６５）ｐｙｌ−ｖ変異体との交雑種（Ｂ３Ｆ１）の変異部分の電気泳動を示す。（１）はｎＤａｒｔ１−０（第３染色体）、（２）はｎＤａｒｔ１−４（３−１）（第３染色体）、（３）はｎＤａｒｔ１−１２（第１染色体）、（４）はｎＤａｒｔ２００−２（第１２染色体）の変異を示す。Ｌｉｎｅ１はカサラス、Ｌｉｎｅ２はＴ−６５ｐｙｌ−ｖ、Ｌｉｎｅ３−２１は交雑種（Ｂ３Ｆ１）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  ｎＤａｒｔと相同性の高いトランスポゾンの検索をＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）で行った。検索を行ったデータベースサイトは、米国立バイオテクノロジー情報センター及び国立遺伝学研究所ＤＮＡデータバンクであり、ｎＤａｒｔ（配列番号１）をＱｕｅｒｙとした。また、遺伝子予測プログラムは、ＲｉｃｅＧＡＡＳシステムを使用した（Ｙｕ．Ｊ，Ｈｕ．Ｓ，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：７９−９２）。ＢＬＡＳＴによる解析結果を表１に示す。３１個のイネ塩基配列が相同性を示し、７つはｎＤａｒｔと９８％以上の相同性を持っていた。
本発明においてｎＤａｒｔの配列（配列番号１）が解明されたため、栽培品種改良に効率的な変異原として、交配により活性のあるＤＮＡトランスポゾンを任意の系統に外来遺伝子を一切いれることなく持たせることができる。
ｎＤａｒｔを転移させることによって、遺伝子が破壊された変異体を得ることができ、変異体の自殖後代よりｎＤａｒｔが再転移しフットプリントによって変異が完全に安定化した変異体や野生型と同じ表現型に戻った復帰突然変異体を分離できる。ｎＤａｒｔ配列中にプライマーを設計し、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法等により転移したｎＤａｒｔの再挿入により破壊された遺伝子を特定することができる。また、このような変異体とその遺伝子との相関を解明することにより、その遺伝子の機能を知ることができる。この場合上記の方法により、転移したｎＤａｒｔにより破壊された遺伝子を特定することができる。
また従来の形質転換法によって他の植物に導入して転移させることにより、遺伝子が破壊された変異体を得ることができる。このような変異体とその遺伝子との相関を解明することにより、その遺伝子の機能を知ることができる。この場合、上記の方法により、転移したトランスポゾンにより破壊された遺伝子を特定することができる。
本発明のｎＤａｒｔ及びＤａｒｔ遺伝子の利用法として、これを変異原として利用し、イネや所望の植物等において、トランスポゾンでタグギングされた系統を作出することができる。特にイネにおいてタギング系統を作出する場合は、交配によって容易に任意のイネ系統にｎＤａｒｔ及び活性なＤａｒｔ遺伝子を持たせることができる。このような系統は外来遺伝子を導入していないため、遺伝子組換え植物を育成する場合に必要な物理的封じ込め設備を全く必要とせずに、従来の栽培方法を用いて屋外の圃場でタギング系統を大規模に展開することができる。このようにして得られた突然変異体は、遺伝学的解析方法や逆遺伝学的解析方法により解析することができる。この遺伝学的方法とは、変異体の表現型からその原因遺伝子を単離する方法であり、本トランスポゾンと変異体の表現型が連鎖していることを指標として、このタグ（トランスポゾン）を利用して、容易に原因遺伝子の同定と単離を行える。
また、逆遺伝学解析方法とは、遺伝子からその遺伝子の機能が失われた変異体を単離する方法である。多数の変異体よりＤＮＡを抽出し、プールを作る。そのプールを対象にＰＣＲで選抜を行うことにより、目的の遺伝子にトランスポゾンが挿入した変異体を釣り上げることができる。
以下、実施例により本発明を例証するが、これらは本発明を制限することを意図したものではない。
試験例１
易変性のｐｙｌ−ｖ突然変異体は、日本型Ｈ−１２６とインド型Ｃ−５０５２の交雑Ｆ２で生じた１個体の斑入り葉緑素の蓄積が低下した変異体として、本発明者の一人である前川によって１９８６年に分離された（第１図）。ｐｙｌ−ｖ系統は、淡黄色の葉の中に野生型のイネと同じ濃緑色のセクターが細胞系列に沿った状態で出現することと、遺伝学的解析から易変性の原因はＤＮＡ型トランスポゾンの挿入と脱離によると予想された。
試験例２
次に、試験例１で得たｐｙｌ−ｖ変異体と日本型の“しおかり”又は“台中６５号”との交配の繰り返しにより準同質系統を作出し、ｐｙｌ表現型が一見安定となったｐｙｌ−ｓｔｂ（ｐａｌｅ−ｙｅｌｌｏｗ  ｌｅａｆ−ｓｔａｂｌｅ）を分離した。
ｐｙｌ−ｓｔｂは交配により再び易変性を示す系統を分離することと薬剤処理により易変性を示す系統となることから、自律性因子の分離・不活化によって一過的に安定となっている系統である。
土壌上で発芽したｐｙｌ−ｓｔｂ変異体実生は、第４葉に至らずに枯死する。
本試験例では、ｐｙｌ−ｓｔｂ種子を寒天培地上で無菌的に第４葉まで培養し、そののち土に移植することによって高い確率でｐｙｌ−ｓｔｂを結実に至らせた。改変Ｗｈｉｔｅ培地（Ｋｕｓｕｍｉ  Ｋ．，Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２：１２４１−５０）を用い、白色蛍光灯・連続光２６μｍｏｌ  ｍ−２  ｓｅｃ−１、２８℃の条件下でｐｙｌ−ｓｔｂの種子を無菌的に播種し発芽させると第４葉以上に生育する。第４葉期まで生育させたｐｙｌ−ｓｔｂは、土に移し替えることによって、高い確率でｐｙｌ−ｓｔｂを結実させることができる。その様子を第２図に示す。
【実施例１】  本実施例では、このｐｙｌ−ｖの斑入を引き起こすＤＮＡ型トランスポゾン遺伝子とｐｙｌ変異の原因遺伝子を同定することを目的としてマップベースクローニングを行った。
マップベースクローニングの解析には、試験例１で得たｐｙｌ−ｖ変異体を“しおかり”で戻し交雑して育成した準同質遺伝子型系統とインド型イネの“カサラス”を交雑して養成したＦ２集団を用いた。このＦ２の幼苗におけるｐｙｌ−ｖ変異体２１個体からＤＮＡを抽出して、１２染色体を網羅する５４個のランドマークＳＳＲマーカー（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１００：６９７−７１２（２０００））を用いて、ｐｙｌの簡易マッピングを行った。その結果、ｐｙｌ遺伝子は第３染色体の短腕のＲＭ２８２とＲＭ２５１の間２２ｃＭ内にあることが判明した。
そこで、この２個のマーカー間に存在する日本晴のＥＳＴクローン（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４，５２５−３５（２００２））を選抜した。これらのＥＳＴクローンの塩基配列を基に、これらのＥＳＴクローンを含むインド型９３−１１の一群の連結したゲノムＤＮＡ配列であるコンティグ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：７９−９２（２００２））を選抜した。同時に、アメリカのＣＳＨＬグループが発表した日本晴のＢＡＣクローンも選抜し、両者の塩基配列の比較から塩基配列に８ｂｐ以上の差のある部位を挟むようにして、ＰＣＲ産物で判別できるようなマーカーを１８個作成した。これらのマーカーを用いて、Ｆ２１１８００個体の幼苗からｐｙｌの遺伝形質を示す個体のみを選抜して、３１１２個体について組み換え体を選抜した。その結果、約８０．４ｋｂ内にｐｙｌの候補遺伝子を絞り込むことができた。これらの関係を第３図に示す。
この領域には９個のＯＲＦが推定され、これらのすべてのＯＲＦについてゲノミックを増幅できるようにプライマーを設計し、“台中６５号”、ｐｙｌ−ｓｔｂ及び“カサラス”についてその増幅産物を調べた。
ＰＣＲの反応は５０μｌの系で行ない、２．５ＵのＬＡ  Ｔａｑ、１×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭ  ｄＡＴＰ、４００μＭ  ｄＧＴＰ、４００μＭ  ｄＣＴＰ、４００μＭ  ｄＴＴＰ（Ｔａｋａｒａ社）、０．２μＭのプライマーセットに、１００ｎｇの“台中６５号”、ｐｙｌ−ｓｔｂ及び“カサラス”のゲノミックＤＮＡを加え滅菌ＭｉｌｌｉＱ水（ミリポア社）で液量を調整した。反応産物は、０．８％ＬＯＩＩＩアガロースゲル（Ｔａｋａｒａ社）にて分画した。
その結果、プライマーＣｌｐ−３Ｆ（配列番号２）とＣｌｐ−４Ｒ（配列番号３）を用いてＰＣＲを行なった場合に、ｐｙｌ−ｓｔｂと他の系統との間に約６００ｂｐの違いが存在していることが判明した。その電気泳動図を第４図に示す。
このＣｌｐ−３ＦとＣｌｐ−４Ｒで増幅される遺伝子は、シロイヌナズナのＣｌｐＰ５遺伝子（Ｔｒｅｎｄ．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６：１２７−１３４（２００１））と８０％の相同性のある遺伝子（ＯｓＣｌｐＰ，配列番号９）であり、葉緑体に輸送されるタンパク質分解酵素であると考えられる。
【実施例２】  本実施例では、実施例１で増幅されたＰＣＲ産物の差を確認するために、増幅産物の塩基配列を決定した。
実施例１のＰＣＲ産物をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて塩基配列を決定し各種のソフトウェアを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、６０７ｂｐの配列（配列番号１）がＯｓＣｌｐＰ遺伝子のエキソン１に挿入されていることが判明した。その様子を第５図に示す。
この領域にはＤＮＡトランスポゾンの挿入時におきる８ｂｐの標的配列の重複（ＴＳＤ：Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｉｔｅ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を引き起こしており、６０７ｂｐの両末端には１９ｂｐの逆向きの繰り返し配列（ＴＩＲ：Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｒｅｐｅａｔ）が存在していた。
この挿入配列は、ＴＳＤが８ｂｐであることとＴＩＲのこれまで報告されているＤＮＡトランスポゾンとの類似からＡｃ／Ｄｓ型に分類された。既知のＡｃ／Ｄｓ型トランスポゾンとこの挿入配列（ｎＤａｒｔ）の比較を表２に示す。この挿入配列は、自律性因子を持たないＤｓに似た新規のトランスポゾン遺伝子である。
【実施例３】  本実施例は、ｐｙｌ変異体においてｎＤａｒｔ（配列番号１）が挿入されたＯｓＣｌｐＰタンパク質をコードしていると予想される遺伝子の転写開始点と遺伝子の全長を決定するために、ｍＲＮＡのＣＡＰ構造を認識する５’ＲＡＣＥ法と３’ＲＡＣＥ法を行った。
ＲＮＡはグアニジンチオシアン塩酸を用いてｐｙｌ−ｓｔｂから抽出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｇからＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡ鋳型としてＧｅｎｅＲａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＯｓＣｌｐＰ遺伝子の塩基配列から作成したプライマーＰＧ８−８１３Ｒ（配列番号４）とＣｌｐ−３Ｒ（配列番号５）で２度のＰＣＲにより転写開始点を決定した。その結果を第６図に示す。
ｐｙｌ−ｓｔｂではタンパク質に翻訳される最初のアミノ酸となるメチオニンをコードする位置よりも下流に殆どの転写開始点があることが分かり、ｐｙｌ変異の原因がＯｓＣｌｐＰ遺伝子にあると考えられた。
【実施例４】  本実施例では、ｐｙｌ−ｖ変異体から現れた独立した１５系統由来の４９個体の復帰突然変異体においてｎＤａｒｔの脱離を調べるために、ＯｓＣｌｐＰ遺伝子の第１エキソンから第７エキソンを含んだ領域を増幅するプライマーＣｌｐ−３Ｆ（配列番号３）とＣｌｐ−４Ｒ（配列番号４）を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応は５０μｌの系で行ない、２．５ＵのＬＡ  Ｔａｑ、１×ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭ  ｄＡＴＰ、４００μＭ  ｄＧＴＰ、４００μＭ  ｄＣＴＰ、４００μＭ  ｄＴＴＰ（Ｔａｋａｒａ社）、０．２μＭのプライマーセットに、１００ｎｇの復帰突然変異体Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを加え滅菌ＭｉｌｌｉＱ水（ミリポア社）で液量を調整した。反応産物は、０．８％ＬＯＩＩＩアガロースゲル（Ｔａｋａｒａ社）にて分画し、配列番号１のトランスポゾン遺伝子のサイズが欠損した時と同じサイズのＰＣＲ生産物が増幅されていることを確認した。
【実施例５】  本実施例では、実施例４で増幅されたＰＣＲ産物が、ＯｓＣｌｐＰの第一イントロン領域からトランスポゾン遺伝子（配列番号１）が転移した結果であることを確認するために、増幅産物の塩基配列を決定した。
実施例４のＰＣＲ産物をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて塩基配列を決定し各種のソフトウェアを用いて塩基配列の解析を行った。その結果を第７図に示す。
復帰突然変異体では、２種類のフットプリントによる塩基配列の変化以外はＯｓＣｌｐＰ遺伝子エキソン１領域に変化は認められなかった。また、フットプリントによる変化もＯｓＣｌｐＰのｍＲＮＡからタンパク質への翻訳には影響を与えず野生型と同じＣＬＰタンパク質が復帰突然変異体では生産されていると考えられた。
【実施例６】  本実施例では、試験例２で得たｐｙｌ−ｓｔｂ種子をアザシチジン処理によって、ｐｙｌ−ｖ変異体とすることが出来ることを調べた。
ｐｙｌ−ｓｔｂの種子を０．１５、０．３、０．４５ｍＭのアザシチジン水溶液に２４時間、３０℃で浸漬し、水洗した後発芽させｐｙｌ−ｖの出現を確認した。その結果を表３に示す。アザシチジンの濃度を高くすることによって、ｎＤａｒｔの転移の頻度を増加させることができることがわかる。
【実施例７】  本実施例は、ｎＤａｒｔの転移を制御している自律性因子トランスポゼースの検索をＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）で行った。
トランスポゼースを持っている配列は両端にｎＤａｒｔと同じ配列を持ち、その内部にトランスポース遺伝子を持っていると予想されるので、ｎＤａｒｔ（配列番号１）の両端と同じ配列を有しているものを検索した結果、３つの配列が見出された（配列番号６〜８）。これらを第８図に示す。
配列番号６は、これらのうち末端配列の相同性が最も高かった。。配列番号６の両端各々１８３ｂｐは、配列番号１の両端と９８％以上の相同性をもっており、その内部のＯＲＦは、トランスポゼースを持っていることが遺伝子予測プログラムから示された。配列番号６は、キンギョソウで報告されたＴａｍ３トランスポゼースと相同性の高い自律性因子遺伝子であると考えられる。
配列番号６から予想される最もＴａｍ３と相同性が高い自律性遺伝子を検索した。Ｔａｍ３のトランスポゼースはイントロンを含まない構造であることが報告されており、上記３１個の塩基配列からイントロンを含まないトランスポゼースを検索し、配列番号７を同定した。遺伝子予測プログラムによる解析から、配列番号７はイントロンを含まない構造を持っており、３末端にはＤＮＡ結合領域であるＢＥＤ  Ｚｉｎｃ  ｆｉｇｅｒ領域が存在していた。配列番号７は、ｎＤａｒｔの転移を支配している自律性因子であると思われる。
配列番号７から予想されるトランスポゼースを指標にして、異なったスプライシングバターンを示す配列を検索し、配列番号８を同定した。第８図に示すように配列番号８は、相同性領域の１と３はもっているが相同性領域２はもっておらず、配列番号７とは異なった発現パターンと機能が予想される。
【実施例８】  本実施例では、インド型イネ（カサラス）に試験例２で得た台中６５号（Ｔ−６５）ｐｙｌ−ｖ変異体を交雑させ、カサラスにｎＤａｒｔ及び自律性因子（Ｄａｒｔ）を導入した。戻し交雑の回数は３回で理論的には９３．８％がカサラスの遺伝子型に変換していると考えられる。
ｐｙｌ変異体はＯｓＣｌｐＰ遺伝子に挿入していたｎＤａｒｔ１−Ｏｒｉｇｉｎ（ｎＤａｒｔ１−０という。）が変異の原因となっていた。ＢＬＡＳＴ解析により日本型イネ（日本晴）には、ｎＤａｒｔ１−０と９８％以上類似しているｎＤａｒｔが少なくとも１４個存在していることが分かった。ｎＤａｒｔ１−０への類似性の高さから番号を割り振り、ｎＤａｒｔ１−１からｎＤａｒｔ１−１２と命名した。そのうち２組のｎＤａｒｔ（ｎＤａｒｔ１−３及びｎＤａｒｔ１−４）は全く同じ配列を持ちながらイネゲノム上の異なる位置に座乗していたことから、括弧内に染色体番号を示し区別した。
インド型イネ（カサラス）と台中６５号（Ｔ−６５）ｐｙｌ−ｖ変異体との交雑種（Ｂ３Ｆ１）の変異部分をＰＣＲで増幅した。プライマーとして、ｎＤａｒｔ１−０（第３染色体）には配列番号１０（Ｆ）及び１１（Ｒ）、ｎＤａｒｔ１−４（３−１）（第３染色体）には配列番号１２（Ｆ）及び１３（Ｒ）、ｎＤａｒｔ１−１２（第１染色体）には配列番号１４（Ｆ）及び１５（Ｒ）、ｎＤａｒｔ２００−２（第１２染色体）には配列番号１６（Ｆ）及び１７（Ｒ）に示すものを用いた。
第９図に、交雑種（Ｂ３Ｆ１、第９図Ｌｉｎｅ  ３−２１）の変異部分の電気泳動を示す。１９個体中、９個体にｎＤａｒｔ（配列番号１）が導入されていることがわかる（第９図（１））。同時に、カサラス型のバンドも出現していることから、戻し交雑した個体でもｎＤａｒｔの切り出しが行われている。このｎＤａｒｔは第３染色体に座乗するものであるが、他の染色体におけるカサラスの導入程度を調べてみると、第１、３及び１２染色体のマーカーは１９個体全てがカサラス型になっている（第９図（２）〜（４））。以上から、ｎＤａｒｔ及び自律性因子（Ｄａｒｔ）はインド型イネの中でもその活性を維持できることが結論できる。
さらに、インド型イネ（９３−１１）をアザシチジン処理をし、ｎＤａｒｔの脱雌を確認した。通常成育条件下ではｎＤａｒｔの脱離は観察されないが、アザシチジン処理をおこなった９３−１１ではｎＤａｒｔの脱離が確認された。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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