(57)【要約】  本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞には、強力な抗腫瘍効果が認められたＡ５４９細胞、２９３細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞のいずれかが使用される。本発明は、in vitroおよびin vivoの双方において高い抗腫瘍効果が認められたこれらの細胞をキャリアー細胞として用いているので、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果を得ることができる。
2005037322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（１）〜（４）の細胞から選ばれる、癌遺伝子治療薬。
（１）Ａ５４９細胞
（２）２９３細胞
（３）ＳＷ６２６細胞
（４）ＨＴ―３細胞
【請求項２】
上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウイルスは、治療対象の癌の種類等に応じて、１Ａ１．３Ｂプロモーター、ミッドカインプロモーター、β―ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーター、ｃｏｘ−２プロモーター、ＰＳＡプロモーター、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項３】
上記オンコリティックウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス等のレンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はその他のオンコリティックウイルスから選ばれる、請求項１又は２記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項４】
さらに、キャリアー細胞投与に対する生体のＣＴＬ反応を誘導するために投与される免疫処置用ウイルスを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項５】
さらに、アテロコラーゲンを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項６】
さらに、投与前にキャリアー細胞に感染させるＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項７】
さらに、鉄剤および／又はポルフィリン化合物を備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項８】
さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌遺伝子治療薬、および同治療薬を用いた癌遺伝子治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌治療に関し、遺伝子治療が注目されており、これまでにも様々な遺伝子治療法が提案され、臨床試験が行われている。このうち、キャリアー細胞を使用した遺伝子治療については、Freemanらによって臨床試験が行われている。この遺伝子治療は、レトロウイルスによってＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入した卵巣癌細胞ＰＡ−１をキャリアー細胞に使用するものであり、卵巣癌治療、さらに悪性中皮腫治療のための臨床試験が行われている（後述の非特許文献１・２参照）。一方、Culverらは、キャリアー細胞にマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用して脳腫瘍に対する臨床試験を行っている（後述の非特許文献３参照）。しかし、ヒトへの癌治療の適用を考慮すると、キャリアー細胞にはヒト由来細胞を使用することが要請される。【０００３】
卵巣癌細胞ＰＡ−１をキャリアー細胞に使用した遺伝子治療は、Coukosらによっても行われている（後述の非特許文献４参照）。この遺伝子治療は、腫瘍細胞において特異的に増殖するオンコリティックウイルス（oncolytic virus）を構築し、同ウイルスをキャリアー細胞（プロデューサー細胞）に感染させた後、このキャリアー細胞を腫瘍部位に投与するというものである。オンコリティックウイルスには単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）が用いられ、ヌードマウスの卵巣癌腹腔内播種性転移モデルに対して腹腔内投与する動物実験が行われている（後述の特許文献１・２参照）。【０００４】
しかし、上記の卵巣癌細胞ＰＡ−１は、増殖能力が高く操作しやすい細胞ではあるものの、細胞質が小さく壊れやすい。そのため、レトロウイルスによってＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入しても腫瘍部位でのＨＳＶ−ｔｋ遺伝子発現は少なく、Freemanらの臨床試験では、卵巣癌および悪性中皮腫に対する充分な抗腫瘍効果は得られていない。【０００５】
オンコリティックウイルスＨＳＶ−１による癌遺伝子治療においてキャリアー細胞としてＰＡ−１を使用した場合も、オンコリティックウイルスＨＳＶ−１の単独療法に比べて著明な抗腫瘍効果は得られていない。ウイルスによる癌遺伝子治療の問題点は、血中の中和抗体により頻回投与ができない点である。ＰＡ−１を使用した場合、細胞が脆弱でウイルス産生量も少ないため、細胞間相互作用（cell to cell interaction）により標的腫瘍細胞に感染する前に細胞が壊れてしまうこと、さらに、直接的に中和抗体によりウイルスが不活化され、抗腫瘍効果が得られないことなどが考えられる。【０００６】
また、細胞性免疫遺伝子治療の臨床試験において、患者自身の癌細胞あるいは線維芽細胞（fibroblast）をキャリアー細胞に使用することがあるが、この場合安定した細胞系が得られるまで時間がかかり、手技が困難であること、さらに遺伝子導入が個体により差があり一定でないことから安定した効果を得ることが困難であった。【０００７】
【非特許文献１】Human Gene Therapy, 6, 927-939, 1995
【非特許文献２】Human Gene Therapy, 9, 2641-2649, 1998
【非特許文献３】Science, 256, 1550-1552, 1992
【非特許文献４】Clinical Cancer Research, 5, 1523-1537, 1999
【特許文献１】国際公開第９９／４５７８３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／２３００４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような従来の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、オンコリティックウイルスを用いた癌遺伝子治療において、強力な抗腫瘍効果が得られる新たなキャリアー細胞を見出すこと、さらに得られたキャリアー細胞を用いて劇的な抗腫瘍効果が得られる新たな癌遺伝子治療法を確立すること、および、同治療法に用いる新たな癌遺伝子治療薬を提供すること、にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意研究を進めた結果、（１）キャリアー細胞に特定の細胞株を使用することで、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果が得られること、さらに、（２）予めウイルスを投与して免疫処置を施した後、オンコリティックウイルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体のＣＴＬ反応が誘導・惹起され、in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果が得られること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
即ち、本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（１）〜（４）の細胞から選ばれるものである。
（１）Ａ５４９細胞
（２）２９３細胞
（３）ＳＷ６２６細胞
（４）ＨＴ―３（ＨＴ―ＩＩＩ細胞）【００１１】
後述するように、上記４種の細胞の中でもＡ５４９細胞の使用は特に好ましい。【００１２】
オンコリティックウイルスは、好ましくは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス等のレンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はその他のオンコリティックウイルスから選ばれる。このうち、アデノウイルスの使用は、後述のように良好な結果が得られたため、特に好ましい。【００１３】
また好ましくは、本発明のオンコリティックウイルスは、治療対象の癌の種類等に応じて、１Ａ１．３Ｂプロモーター（ＩＡＩ．３Ｂプロモーター）、ミッドカインプロモーター、β―ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーター、ｃｏｘ−２プロモーター、ＰＳＡプロモーター、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する。なお、本発明においてオンコリティックウイルスは、標的腫瘍細胞に感染し、増殖しうるものであればよく、例えばアデノウイルスの場合、その範疇には、野生型アデノウイルスが含まれる。その他オンコリティックウイルスは、ＯＮＹＸ社のＥ１Ｂ遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウイルス、あるいは、ＵＡＢ大学のＥ１Ａ遺伝子の一部欠損型のAd5-△24アデノウイルスなど、腫瘍特異的プロモーターを有しないものであってもよい。【００１４】
本発明の癌遺伝子治療薬を、癌治療用薬剤キットとして構成し、さらに、キャリアー細胞投与に対する生体のＣＴＬ反応を誘導するために投与される免疫処置用ウイルスを備えた構成とすることは好ましい。免疫処置用ウイルスには、オンコリティックウイルスと同種類のものを使用することが好ましい。また、免疫処置用ウイルスには、非増殖型のものおよび／又は紫外線等で不活化したものを使用することが好ましい。紫外線等で不活化することによって、免疫処置用ウイルスの投与からキャリアー細胞投与までの期間を短期間にすることができる。【００１５】
本発明の癌遺伝子治療薬は、癌治療用薬剤キットとして、キャリアー細胞、またはキャリアー細胞とオンコリティックウイルスとの組み合わせ（あるいはこれに免疫処置用ウイルスを加えた３者の組み合わせ）に加えて、さらに下記（１）〜（４）の物質のうち、１又は２以上の物質を備えたものであってもよい。
（１）アテロコラーゲン
（２）投与前にキャリアー細胞に感染させるＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte-macrophage colony stimulating factor：顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）発現ベクター
（３）鉄剤
（４）ポルフィリン化合物（例えば、５−アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid：ＡＬＡ））【００１６】
また、免疫処置用ウイルスの投与と共に、あるいはその前後に、腫瘍免疫のため患者由来の腫瘍細胞またはそれと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可能な放射線照射した腫瘍細胞を投与することが好ましいが、本発明の癌遺伝子治療薬は、腫瘍免疫のためこのような放射線照射した腫瘍細胞を備えたものであってもよい。【００１７】
本発明の癌遺伝子治療薬による好適な癌治療方法は、キャリアー細胞投与に対する生体のＣＴＬ反応を誘導するために免疫処置用ウイルスをヒトに投与し、所定期間経過後、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を少なくとも１回ヒトに投与する、というものである。【００１８】
上記癌治療方法において、好ましくは、免疫処置用ウイルス投与からキャリアー細胞投与までの期間を、およそ２週間以上１３週間以下（より好ましくは、３週間以上４週間以下）とする。また好ましくは、（１）免疫処置用ウイルスの投与量を、当該ウイルスに対する抗体陰性の患者にはおよそ１０５ウイルス粒子以上１０11ウイルス粒子以下とする一方、当該ウイルスに対する抗体陽性の患者にはおよそ１０２ウイルス粒子以上１０７ウイルス粒子以下（場合によっては、１０２ウイルス粒子未満または非投与としてもよい。）とし、（２）キャリアー細胞によるオンコリティックウイルスの１回の投与量を、およそ１０９ウイルス粒子以上１０１４ウイルス粒子以下とし、（３）キャリアー細胞に対するオンコリティックウイルスの感染量を、およそ０．１ウイルス粒子／細胞（viral particle/cell：以下、「vp/cell」という。）以上２０００vp/cell以下（より好ましくは、５vp/cell以上５００vp/cell以下）とする。【００１９】
また上記癌治療方法において、下記（１）〜（５）の方法を採用することは好ましい。
（１）腫瘍内投与によりキャリアー細胞を投与する。
（２）キャリアー細胞と共に、アテロコラーゲンを投与する。
（３）オンコリティックウイルスのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを感染させたキャリアー細胞を投与する。
（４）キャリアー細胞と共に、鉄剤および／又はポルフィリン化合物（例えば、５−アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid：ＡＬＡ））を投与する。
（５）免疫処置用ウイルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞を投与する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の癌遺伝子治療薬は、選別の結果、in vitroおよびin vivoの双方において高い抗腫瘍効果が認められたＡ５４９細胞などの細胞株をキャリアー細胞として用いているので、従来のキャリアー細胞に比べて強力な抗腫瘍効果を得ることができる。【００２１】
また、予め投与される免疫処置用ウイルスと、その後に投与されるキャリアー細胞との２種類の薬剤を組み合わせた構成とした場合、予めアデノウイルス等のウイルス投与により免疫処置を施した後、オンコリティックウイルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、同ウイルスが標的腫瘍細胞に感染して直接的な抗腫瘍効果をもたらし、さらに感染標的細胞に対し生体のＣＴＬ反応が誘導され、in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】各種細胞株をキャリアー細胞に用いた場合の卵巣癌細胞ＨＥＹに対する増殖抑制効果をＩＣ５０における細胞数で調べた結果を示すグラフである。
【図２】オンコリティックウイルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウイルス抗体存在下、卵巣癌細胞ＨＥＹに対する増殖抑制効果をＩＣ５０における抗アデノウイルス抗体の抗体価で調べた結果を示すグラフである。
【図３】オンコリティックアデノウイルス感染２９３細胞などについて、ウイルス抗体存在下の卵巣癌細胞ＨＥＹに対する増殖抑制効果をＩＣ５０における抗アデノウイルス抗体の抗体価で調べた結果を示すグラフである。
【図４】２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞の各キャリアー細胞について、ウイルス抗体存在下の卵巣癌細胞ＨＥＹに対する増殖抑制効果を細胞数で調べた結果を示すグラフである。
【図５】ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞ＲＭＧ−１を移植し形成された１０−１５ｍｍの巨大腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。
【図６】ヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞ＰＡ−１を移植し形成された１０−１５ｍｍの巨大腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。
【図７】免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス（(C57BL/6×C3/He)F1マウス）を用いて本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した結果を示すグラフである。
【図８】アデノウイルス投与によるＡ５４９細胞の細胞融合を顕微鏡により観察した図である。
【図９】コントロールであり、アデノウイルスを投与しなかったＡ５４９細胞を顕微鏡により観察した図である。
【図１０】（ａ）は、１〜２１のヒト手術標本におけるミッドカイン（ＭＫ）ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した結果、（ｂ）は、同様の方法により、悪性グリオーマの４つの細胞株におけるミッドカインｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した結果、（ｃ）は、上記各細胞株におけるミッドカインの発現をウエスタンブロット解析によって検討した結果、である。
【図１１】長さが異なる２つのミッドカインプロモーターを用いて上記各細胞株におけるプロモーター活性を比較した結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）は、今回設計した、ミッドカインプロモーターを有するオンコリティックアデノウイルスの構造を模式的に示す図であり、（ｂ）は、３種類のアデノウイルスを上記各細胞株に感染させ、それぞれの細胞株におけるＥ１Ａ蛋白の発現をウエスタンブロット解析によって検討した結果である。
【図１３】（ａ）は、３種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結果であり、（ｂ）は、アデノウイルスのＥ３領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した結果であり、（ｃ）は、直径５ｍｍのヌードマウス皮下移植モデルにおけるアデノウイルスの抗腫瘍効果を検討した結果である。
【図１４】ミッドカインプロモーターを有するオンコリティックウイルスをキャリアー細胞に感染させて本発明の癌遺伝子治療薬を調製し、直径１０−１５ｍｍの巨大腫瘍に対するその抗腫瘍効果をウイルス単独投与の場合と比較した結果を示すグラフである。
【図１５】アデノウイルスAdE3-1A1.3Bの卵巣癌細胞ＰＡ−１に対する増殖抑制効果に対するＦｅの影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１６】アデノウイルスAdE3-1A1.3Bの卵巣癌細胞ＰＡ−１に対する増殖抑制効果に対するＡＬＡの影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１７】アデノウイルスAdE3-1A1.3Bの卵巣癌細胞ＰＡ−１に対する増殖抑制効果に対するＦｅおよびＡＬＡ両存在下の影響を検討した結果を示すグラフである。
【図１８】（ａ）は、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス（(C57BL/6×C3/He)F1マウス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬（免疫処置用ウイルスをＵＶ処理していない場合）のin vivo抗腫瘍効果を検討した結果であり、（ｂ）は、この実験に供された各マウスの生存率を長期間観察した結果を示すグラフである。
【図１９】免疫処置用ウイルス投与からキャリアー細胞投与までの投与間隔について検討を行った結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。
【図２０】ＵＶで不活化処理したアデノウイルスＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用することにより、上記投与間隔を短くすることができるか検討した結果を示すグラフ（サバイバル・カーブ）である。
【図２１】上記ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用した場合の当該ウイルスの投与量について検討した結果を示すグラフ（腫瘍成長カーブ）である。
【図２２】腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。各群のマウスの数はｎ＝５である。図中、コントロールの「SCC7」「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、扁平上皮癌細胞ＳＣＣ７または卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植し、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を投与したマウスの結果である。「OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7, OVHM」は、放射線照射したＯＶＨＭによる腫瘍免疫およびAd-β-galによるアデノウイルスに対するＣＴＬを誘導した後に、ＳＣＣ７あるいはＯＶＨＭの皮下腫瘍を作成し、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を投与したマウスの結果である。
【図２３】非小細胞性肺癌細胞Ａ５４９細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果を示すグラフ（サバイバル・カーブ）である。各群のマウスの数はｎ＝１０である。図中、コントロールの「OVHM」は、腫瘍免疫を行わずに、卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植し、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を投与したマウスの結果である。図中「AdE3-IAI.3B-infected A549→OVHM」は、AdE3-1A1.3Bを感染し放射線照射したＡ５４９細胞を106個、皮下に免疫し、卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植し、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を投与したマウスの結果である。
【図２４】キャリアー細胞と共にアテロコラーゲンを投与した場合に、副作用による死亡率が改善されるかどうか調べた結果を示すグラフである。図中、かっこ内のＮはマウスの数を示す。
【図２５】ＵＶで不活化処理していないアデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1−３回投与し、抗アデノウイルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。キャリアー細胞には、Ａ５４９細胞と２９３細胞とを混合したものを使用した。各群のマウスの数はｎ＝５である。
【図２６】ＵＶで不活化処理していないアデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1−３回投与し、抗アデノウイルス抗体存在下での抗腫瘍効果について検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。キャリアー細胞にはＡ５４９細胞のみ使用した。各群のマウスの数はｎ＝５である。
【図２７】アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを感染させたキャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と共にアテロコラーゲンを投与した場合のin vivo抗腫瘍効果について検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「Ad-β-gal」の前の「×１」「×２」「×３」は、それぞれ、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回、３回投与したことを示す。各群のマウスの数はｎ＝５である。
【図２８】キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合のin vivo抗腫瘍効果について検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「Ad-β-gal」の前の「×１」「×２」「×３」は、それぞれ、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回、３回投与したことを示す。各群のマウスの数はｎ＝５である。
【図２９】キャリアー細胞Ａ５４９に対して行う放射線処理において照射する線量について、ヌードマウスを用いて検討した結果を示すグラフである。
【図３０】(C57BL/6×C3/He)F1マウスにＯＶＨＭを皮下移植した実験で、キャリアー細胞Ａ５４９を異なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果を示すグラフである。
【図３１】キャリアー細胞Ａ５４９に対するオンコリティックウイルスの感染量について検討した結果を示すグラフである。
【図３２】卵巣癌細胞ＯＶＨＭによる腫瘍免疫の効果を検討した結果であり、（ａ）は、各マウスの腫瘍体積を観察した結果、（ｂ）は、各群マウスの生存率を観察した結果である。図中、「A549」は腫瘍免疫なしにAdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を3回投与したマウス、「OVHM-RT→A549」は放射線照射したＯＶＨＭによる腫瘍免疫後、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞Ａ５４９を３回投与したマウス、各群のマウスの数はｎ＝５である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の一形態について説明する。
〔１〕本発明の癌遺伝子治療薬
本発明の癌遺伝子治療薬は、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（１）〜（４）の細胞から選ばれる。
（１）Ａ５４９細胞
（２）２９３細胞
（３）ＳＷ６２６細胞
（４）ＨＴ―３細胞（ＨＴ―ＩＩＩ細胞）【００２４】
図１は、癌遺伝子治療薬に用いる効果的なキャリアー細胞を見出すために本発明者がキャリアー細胞の選別を行った結果であり、より具体的には、各種候補細胞株にオンコリティックウイルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各々の癌細胞増殖抑制効果を調査した結果を示すグラフである。オンコリティックウイルスには、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂ（ＩＡＩ．３Ｂ）を使用した。このアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂは、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ３遺伝子を有し、かつ、Ｅ１Ａ遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターとして卵巣癌特異的１Ａ１．３Ｂプロモーター（ＩＡＩ．３Ｂプロモーター）を有するアデノウイルスである。このアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを各種候補細胞株に対して５００vp/cellで２日間感染させた後、各細胞を培養２日目の卵巣癌細胞ＨＥＹに添加し、培養５日目に同癌細胞ＨＥＹの増殖抑制効果を調べた。【００２５】
図１のグラフ縦軸は、各種候補細胞株について５０％の増殖抑制効果（ＩＣ５０）が得られる細胞数を示し、細胞数が少ない細胞株ほど増殖抑制効果が高いことになる。同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞（ＨＴ―ＩＩＩ細胞）の順に高い増殖抑制効果を示した。２９３細胞、Ａ５４９細胞およびＳＷ６２６細胞は、従来キャリアー細胞として使用されていたＰＡ−１細胞に比べて、およそ１００倍程度の高い増殖抑制効果を示した。ＨＴ―３細胞についても、ＳＷ６２６細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。【００２６】
また、上記の２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞およびＨＴ―３細胞にオンコリティックアデノウイルスを感染させた癌遺伝子治療薬を調製し、各治療薬について、充分量の抗アデノウイルス中和抗体存在下（Ａｂ（+））における、癌細胞増殖抑制効果を検討した。その結果、図４に示すように、抗体存在下であっても、上記４種の細胞をキャリアー細胞に用いた癌遺伝子治療薬はいずれも強い癌細胞増殖抑制効果を示した。従来、ウイルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、上記４種の細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、抗体存在下にもかかわらずin vitroにおいて強力な増殖抑制効果が得られた。なお、図４に示すように、上記４種類の細胞のうち、Ａ５４９細胞をキャリアー細胞に用いた場合に最も強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗アデノウイルス中和抗体存在下にアデノウイルス感染Ａ５４９細胞を投与すると、標的癌細胞の増殖は抗体存在下にもかかわらずほぼ完全に抑制された。【００２７】
さらに、直径１０−１５ｍｍの巨大なヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いたin vivoの実験においても、上記のＡ５４９細胞、２９３細胞およびＳＷ６２６細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、強力な抗腫瘍効果を示した（図５および図６参照）。なお、これら実験の詳細は後述の実施例において説明する。【００２８】
このように、オンコリティックウイルスをキャリアー細胞に感染させて得られる癌遺伝子治療薬において、キャリアー細胞にＡ５４９細胞、２９３細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞のいずれかを使用することで高い抗腫瘍効果を得ることができる。【００２９】
上記４種の細胞について説明すると、Ａ５４９細胞は、非小細胞性肺癌細胞株であり、その詳細については例えば論文Giard,D.J., Aaronson,S.A., Todaro,G.J., Arnstein,P., Kersey,J.H., Dosik,H., and Parks,W.P. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors, J. Natl. Cancer Inst., 51: 1417-1423, 1973.などに記載されている。２９３細胞は、ヒト胎児腎由来細胞であり、アデノウイルス産生細胞として試験研究に多く用いられている細胞株である。２９３細胞については例えば論文Xie QW , et al. Complementation analysis of mutants of nitric oxide synthase reveals that the active site requires two hemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4891-4896, 1996.などに説明がある。ＳＷ６２６細胞は、大腸癌卵巣転移株であり、その詳細については例えば論文Fogh J , et al. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。ＨＴ―３細胞は、子宮頚部扁平上皮癌細胞であり、その詳細については例えば論文Fogh J , et al. Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived from human tumors. J. Natl. Cancer Inst. 58: 209-214, 1977.などに記載されている。これら４種の細胞株はいずれもＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）等の細胞保存機関から入手可能であり、その他、市販されているものを使用してもよい。【００３０】
Ａ５４９細胞は、（１）高力価のオンコリティックアデノウイルスを産生し、非常にタフな細胞で扱いやすい、（２）抗アデノウイルス抗体存在下において癌細胞の増殖を最も強力に抑制する、（３）アデノウイルス等のウイルスが感染するとＡ５４９細胞は由来がtype IIの肺胞上皮細胞であるため分泌顆粒を放出し、この性質が癌治療において有利に作用すると考えられる、（４）アデノウイルスに感染した後もＡ５４９細胞はＣＴＬによる殺細胞効果を受けにくい、などキャリアー細胞として使用する場合に多くの利点を有している。したがって、上記４種の細胞のうち、Ａ５４９細胞の使用は特に好ましい。【００３１】
また、キャリアー細胞として、複数の種類の細胞を併用してもよい。後述の実施例では、キャリアー細胞にＡ５４９細胞と２９３細胞とを併用することによって、強力な癌治療効果が認められた。このように、複数の種類の細胞を併用した場合は、各細胞の特徴、利点を癌治療に利用することができ、好ましい。例えば、ＳＷ６２６細胞は、接着（adhere）するのに比較的時間を要するため、腹腔内投与すると局所のみにとどまらず周囲全体に拡散し、卵巣癌などの腹腔内治療に好適と考えられる。また、ＳＷ６２６細胞は、ウイルス産生量のピークがＡ５４９細胞や２９３細胞などよりも遅く、作用時間が比較的長いという特徴を有している。【００３２】
本発明の癌遺伝子治療薬において、上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウイルスとしては、従来遺伝子導入に用いられるウイルスベクターを使用することができ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、ＨＩＶウイルス（エイズウイルス）等のレンチウイルスやマウス白血病ウイルス等のレトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などが例示され、さらにその他のオンコリティックウイルスであってもよい。オンコリティックウイルスは、増殖型ウイルスベクターであって標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において特異的に増殖するようウイルス遺伝子を改変し、標的細胞を融解・殺傷するcell lysis作用を有するものであればよく、例えばアデノウイルスの場合、その増殖に必要なＥ１ＡまたはＥ１Ｂ領域を有するものであればよい。【００３３】
本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、治療対象となる癌の種類は、卵巣癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌等）、消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌などが例示される。また、アデノウイルス34,35型など血液細胞にも感染可能なウイルスを使用することで、本発明の癌遺伝子治療薬は血液性悪性腫瘍にも適用可能である。【００３４】
治療対象となる癌の種類に応じて、オンコリティックウイルスに導入する腫瘍特異的プロモーターの種類を選択するとよい。例えば、卵巣癌に対しては１Ａ１．３Ｂプロモーター、脳腫瘍、悪性グリオーマなどに対してはミッドカインプロモーター、精巣癌に対してはβ―ＨＣＧプロモーター、扁平上皮癌に対してはＳＣＣＡ１プロモーターおよびＳＣＣＡ２プロモーター、大腸癌に対してはＣＥＡプロモーター、前立腺癌に対してはＰＳＡプロモーター、肝癌に対してはＡＦＰプロモーター、を使用することができる。勿論、他の公知の腫瘍特異的プロモーター、例えば、種々の悪性腫瘍に対してプロモーター活性を発揮し、広い作用スペクトラムを有するｃｏｘ−２プロモーターや、その他オステオカルシンプロモーター等の各種癌特異性プロモーターを使用してもよい。上記ミッドカインプロモーターについては、脳腫瘍、悪性グリオーマのほか種々の悪性腫瘍に対して使用可能であり、この点においてｃｏｘ−２プロモーターと同様に広い作用スペクトラムを有する。【００３５】
使用する各プロモーター配列の長さ等については、腫瘍特異的プロモーター活性が得られる限りにおいて特に限定されるものではない。上記１Ａ１．３Ｂプロモーターは、国際公開第０３／０２５１９０号パンフレットおよび文献Cancer Research 63, 2506-2512, 2003の記載にしたがって設計・調製し、ウイルスゲノムに挿入することができる。上記のミッドカインプロモーター、β―ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーターについては、それぞれ、国際公開第０２／１０３６８号パンフレット、国際公開第０１／９０３４４号パンフレット、国際公開第００／６００６８号パンフレットの記載にしたがって設計・調製し、ウイルスゲノムに挿入することができる。【００３６】
上記ＳＣＣＡ１プロモーターについては、論文Biochimica et Biophysica Acta 91522 (2001) 1-8, Molecular cloning of human squamous cell carcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter, Katsuyuki Hamada, Hiroto Shinomiya, Yoshihiro Asano, Toshimasa Kihana, Mari Iwamoto, Yasushi Hanakawa, Koji Hashimoto, Susumu Hirose, Satoru Kyo, Masaharu Itoにも詳細な説明がなされている。【００３７】
例えば、オンコリティックアデノウイルスを作製する場合、アデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入するか、あるいは、初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂプロモーターと置換することにより構築することができる。ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、レトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）など、アデノウイルス以外のウイルスを使用する場合も、同様に、ウイルスの増殖に必要な遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入するか、あるいは、当該遺伝子のプロモーターと置換することにより構築することができる。【００３８】
もっとも、オンコリティックウイルスは、標的の腫瘍細胞または腫瘍組織において特異的に増殖する性質を有する限り、必ずしも腫瘍特異的プロモーターを有するものでなくてもよい。例えば、ＯＮＹＸ社のＥ１Ｂ遺伝子欠失型のオンコリティックアデノウイルス、あるいは、ＵＡＢ大学のＥ１Ａ遺伝子の一部欠損型のAd5-△24アデノウイルスなど、腫瘍特異的プロモーターを有しないオンコリティックウイルスを使用することも可能である。また、オンコリティックウイルスとして野生型アデノウイルス、あるいは、その一部遺伝子を欠失させたものを使用することとしてもよい。【００３９】
オンコリティックウイルスをキャリアー細胞に感染させる方法は、常法に従って行えばよく特に限定されるものではないが、例えばキャリアー細胞をデイッシュに播き、これにオンコリティックウイルスをすべての細胞に感染可能な量添加し、９５％Ｏ2、５％ＣＯ2、３７℃、牛胎児血清ＦＣＳ（−）、ＲＰＭＩ培地の条件下で６時間から３６時間程度培養し感染させる方法が簡便である。後述の実施例においては、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞はこの方法で培養し、オンコリティックウイルスを感染させたが、２９３細胞に関してはＦＣＳ（＋）１０％、ＤＭＥＭ培地の条件下で培養し、オンコリティックウイルスを感染させた。なお、牛胎児血清ＦＣＳは、３−６時間感染の場合はＦＣＳ（−）の条件で、それ以上の時間感染させる場合は３−６時間ＦＣＳ（−）の状態におき、後にＦＣＳ１０％を加えるとよい。【００４０】
キャリアー細胞に対するオンコリティックウイルスの感染量および感染時間は、治療対象の腫瘍の大きさ・種類、キャリアー細胞の種類・投与量、使用するオンコリティックウイルスの種類、本遺伝子治療薬の投与方法などに応じて最適な量と時間を選択すればよい。特に限定されないが、一例として、キャリアー細胞にＡ５４９細胞を使用した場合、腹腔内投与では約５−２５０vp/cellでおよそ６−２４時間、腫瘍内投与では約５−５００vp/cellでおよそ１２−２４時間、ＳＷ６２６細胞の場合、腹腔内投与では約２５０−２０００vp/cellでおよそ６−２４時間、腫瘍内投与では約１００−５００vp/cellでおよそ１２−２４時間、２９３細胞の場合、腫瘍内投与では約５−５０vp/cellでおよそ１２−２４時間、腹腔内投与では約０．１−1０vp/cell でおよそ６−２４時間、に設定することができる。このようにキャリアー細胞の種類、投与方法に応じて感染量・感染時間も異なるが、上記の例では腹腔内投与のときは約０．１−２０００vp/cellでおよそ６−２４時間、腫瘍内投与のときは約５−５００vp/cellでおよそ１２−２４時間、の範囲でそれぞれ感染量・感染時間を設定することができる。【００４１】
キャリアー細胞にオンコリティックウイルスを感染させ、本発明の癌遺伝子治療薬を調製する場合、使用時まではオンコリティックウイルスを感染させない状態でキャリアー細胞を保存しておいてもよい。他方、オンコリティックウイルスを感染させ放射線照射したキャリアー細胞を凍結し、これを医療現場で解凍して使用するという製品形態にする場合は、ウイルス感染させたキャリアー細胞を保存しておくことが好ましい。キャリアー細胞の保存は、例えば液体窒素中あるいは−１５０℃程度の温度にて保存することができる。一方、オンコリティックウイルスは、例えば−８０℃程度の温度にて保存することができる。【００４２】
使用時には、前記の方法によりオンコリティックウイルスをキャリアー細胞に感染させ、得られたウイルス感染キャリアー細胞を、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに本発明の癌遺伝子治療薬となし、ヒト（またはマウス、ラット等の実験動物）に投与することができる。後述のように、キャリアー細胞投与時に、アテロコラーゲン、鉄剤、ポルフィリン化合物のうち、１又は２以上を組み合わせてキャリアー細胞と同時に投与することは好ましい。また、ＣＴＬ反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウイルスのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターをも感染させ、いわばウイルスベクターをダブルで感染させたキャリアー細胞を投与することは好ましい。【００４３】
本発明の癌遺伝子治療薬を後述の免疫処置用ウイルスと組み合わせて構成する場合、キャリアー細胞は、免疫処置用ウイルスを投与してから所定期間経過後に投与する。キャリアー細胞に癌細胞を用いる際には、ウイルス感染前または感染後に放射線照射することが好ましい。後述の実施例では、キャリアー細胞にＡ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞を使用した場合、これらの細胞をヌードマウスに投与する前にそれぞれ１２０−４００Ｇｙ、２０−４０Ｇｙ、２０−４０Ｇｙにて放射線照射を行った。Ａ５４９細胞に対する放射線の照射量について検討した結果、１２０Ｇｙ以上であれば細胞の増殖は観察されなかったので（図２９）、照射量は１２０Ｇｙ以上６００Ｇｙ以下（より好ましくは１５０Ｇｙ以上４００Ｇｙ以下）程度に設定することが好ましい。【００４４】
本発明の癌遺伝子治療薬は、非経口剤として投与することが好ましいが、経口剤として使用できる可能性もある。非経口剤としての投与は、in vivo法、ex vivo法のいずれであってもよい。in vivo法の場合、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて用量（換言すれば、ウイルス感染キャリアー細胞の投与量）を調節し、例えば、静注、点滴静注、腫瘍内注射、腹腔注射のような腔内注射などによって投与することができるが、キャリアー細胞は、腫瘍内注射の方法により投与することが好ましい。このような注射剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に生理食塩水、細胞培養液等を用いることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えてもよい。これら製剤中のウイルス感染キャリアー細胞の配合量は特に限定されるものではなく任意に設定できる。【００４５】
勿論、本発明の癌遺伝子治療薬は、数回にわたり患者に投与してもよいし、複数回のクールに分け、一クール当たりの投与回数、投与間隔などを任意に設定してもよい。【００４６】
上記のように、ウイルス感染キャリアー細胞の投与量は、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて決定すればよいが、通常の場合、１回のキャリアー細胞の投与量をおよそ１０7細胞数以上１０１０細胞数以下に、キャリアー細胞によるオンコリティックウイルスの１回の投与量をおよそ１０９ウイルス粒子以上１０１４ウイルス粒子以下に設定することができる。【００４７】
キャリアー細胞の種類は治療対象の癌の種類などに応じて適宜選択してもよい。また、遺伝子組換え技術によってキャリアー細胞を改変し、例えば標的腫瘍細胞と結合しやすくなるようキャリアー細胞の細胞表面に人為的に特定タンパク質等を発現させてもよいし、キャリアー細胞にセンダイウイルスを感染させる等の処置を行ってもよい。【００４８】
オンコリティックウイルスは、細胞間相互作用（cell to cell interatcion）によりキャリアー細胞から標的腫瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を融解・殺傷するcell lysis作用を発揮することができる。ウイルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、キャリアー細胞を用いると細胞間相互作用により標的腫瘍細胞に直接的に感染が成立することによって頻回投与が可能となり、強力な抗腫瘍効果が期待できる。【００４９】
〔２〕本発明の癌遺伝子治療薬を免疫処置用ウイルス等と組み合わせて構成した場合とその好適な使用例
以下に説明するように、本発明の癌遺伝子治療薬を免疫処置用ウイルス等と組み合わせて構成することは好ましい。【００５０】
免疫処置用ウイルスと組み合わせる場合、本発明の癌遺伝子治療薬は、キャリアー細胞投与に対する生体のＣＴＬ反応を誘導するために投与される免疫処置用ウイルスと、オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを生体の腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞とを組み合わせたもの、つまり、予め投与される免疫処置用ウイルスと、その後に投与されるキャリアー細胞との２種類の薬剤を組み合わせたものであり、予めアデノウイルス等のウイルス投与により免疫処置（事前免疫（イムナイゼーション））を施した後、オンコリティックウイルスを感染させたキャリアー細胞を投与することで、生体のＣＴＬ反応が誘導・惹起され、in vivoにおいて劇的な抗腫瘍効果を得ることができる。【００５１】
実際に免疫機能が正常なsyngenicモデルマウスを使った実験において、本発明の癌遺伝子治療薬は劇的な抗腫瘍効果を示した。詳細は後述するが、(C57BL/6×C3/He)F1マウスに卵巣癌細胞ＯＶＨＭを皮下移植し、その後、卵巣癌特異的プロモーターを導入したオンコリティックアデノウイルスを感染させたキャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を局所注射したところ、３ヶ月前に予めアデノウイルス（Ad-β-gal）により免疫処置を施こしたマウスでは、投与開始後３−４日で明らかな抗腫瘍効果を示し、９日後に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した（図７および図１８以下参照）。【００５２】
このように、抗体産生があるにもかかわらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力かつ劇的な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生体のＣＴＬ反応（細胞障害性Ｔ細胞を介した細胞障害活性）が誘導・惹起されたためと考えられる。つまり、従来のウイルスによる癌遺伝子治療は、抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、本発明の癌遺伝子治療薬は、生体の免疫機構を利用してウイルスが感染した標的腫瘍細胞を攻撃させることにより、むしろこれを武器に変えるものといえる。【００５３】
免疫処置用ウイルスとオンコリティックウイルスとは同種類のものを使用することが好ましい。免疫処置用ウイルスには非増殖型のものおよび／又は不活化したものを使用することが好ましく、非増殖型のものを更に紫外線照射等によりＤＮＡを破壊し不活化したものがより好ましい。例えば、免疫処置用ウイルスにアデノウイルスを使用する場合は、Ｅ１領域が欠失したものおよび／又は紫外線照射によりＤＮＡを破壊し不活化したものを使用するとよい。このように、免疫処置用ウイルスには、増殖型ウイルスを紫外線照射等により不活化したものを使用してもよい。【００５４】
後述の実施例では、免疫処置用ウイルスとして、Ｅ１領域が欠失し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にβ-galactosidase（β−ｇａｌ）をコードするＬａｃＺ遺伝子が組み込まれたアデノウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）を使用した。勿論、免疫処置用ウイルスとしてはこれに限定されるものではなく、増殖型アデノウイルスを紫外線（ＵＶ）で不活化したものでもよく、さらに、ＬａｃＺ遺伝子ほか何らの遺伝子も組み込まれておらず、ｐｏｌｙＡ配列のみの非増殖型アデノウイルス（Ａｄ−ｐｏｌｙＡ）を紫外線照射により不活化して使用することは好ましい。【００５５】
本発明の癌遺伝子治療薬において、免疫処置用ウイルスの投与量は、患者のウイルスに対する抗体価、腫瘍の大きさ・種類、症状の程度、患者の年齢、体重などに応じて適宜選択すればよいが、ウイルスに対する抗体が陽性か陰性かに応じて投与量を変更することは好ましい。例えば、免疫処置用ウイルスおよびオンコリティックウイルスにタイプ５のアデノウイルスを使用する場合、当該アデノウイルスに対する抗体陰性（−）の患者には免疫処置用ウイルスの投与量をおよそ１０５ウイルス粒子以上１０11ウイルス粒子以下とする一方、当該アデノウイルスに対する抗体陽性（＋）の患者には免疫処置用ウイルスの投与量をおよそ１０２ウイルス粒子以上１０７ウイルス粒子以下（場合によっては、１０２ウイルス粒子未満または非投与としてもよい。）とする。免疫処置用ウイルスの投与方法は特に限定されるものではないが、皮内注射または皮下注射の方法により投与することが好ましい。【００５６】
なお、実験などでマウス、ラット等の動物に対して本発明の癌遺伝子治療薬を投与する場合は、体重差を考慮してヒトに投与する場合のおよそ１０００分の１量に各薬剤の投与量を設定すればよい。【００５７】
免疫処置用ウイルス投与からキャリアー細胞投与までの期間はおよそ２週間以上３ヶ月以下に設定することができるが、できるだけ短期間であることが望ましい。後述の実施例では、免疫処置用ウイルス（アデノウイルス）を紫外線照射により不活化することで、上記期間を３週間以上４週間以下程度に短縮することができるようになった。【００５８】
ウイルス感染キャリアー細胞の投与量などについては前述したが、キャリアー細胞によるオンコリティックウイルスの１回の投与量をおよそ１０９ウイルス粒子以上１０１４ウイルス粒子以下に、キャリアー細胞に対するオンコリティックウイルスの感染量を、およそ０．１vp/cell以上２０００vp/cell以下（より好ましくは５vp/cell以上５００vp/cell以下、さらに好ましくは１５０vp/cell以上４００vp/cell以下）に設定することができる。【００５９】
免疫処置用ウイルスの投与と共に、またはその前後に、腫瘍免疫のため腫瘍細胞（癌細胞）を投与することは好ましい。即ち、免疫処置用ウイルスによるイムナイゼーション時、またはその前後に、腫瘍細胞によるワクチネーションを行う（予め放射線、エタノール、ホルマリン等処理した腫瘍細胞を投与することにより、治療対象の腫瘍細胞に対する生体の免疫応答を高めるようにする）ことは好ましい。【００６０】
上記ワクチネーション（腫瘍免疫）に使用する腫瘍細胞としては、患者由来の腫瘍細胞が望ましいが、それと類似した抗原を提示すると考えられる一般に入手可能な腫瘍細胞を使用してもよい。後述の実施例では、卵巣癌（ＯＶＨＭ）に対する治療効果を調べる実験で、治療対象の腫瘍細胞とは種類の異なる腫瘍細胞（扁平上皮癌細胞ＳＣＣ７や肺癌細胞Ａ５４９細胞）を腫瘍免疫に使用した場合にも、良好な癌治療効果が認められた。【００６１】
上記ワクチネーション（腫瘍免疫）において、腫瘍細胞の投与量は特に限定されるものではないが、例えば、およそ１０５細胞数以上１０１０細胞数以下に設定することができる。腫瘍細胞への放射線の照射量は、１２０Ｇｙ以上６００Ｇｙ以下（より好ましくは２００Ｇｙ以上５００Ｇｙ以下）程度に設定することが好ましく、腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射の方法により投与することが好ましい。【００６２】
さらに、治療対象の癌におけるウイルス産生量を高めるために、鉄剤の投与および／又はポルフィリン化合物の投与を行ってもよい。ポルフィリン化合物としては、５−アミノレブリン酸（5-aminolevulinic acid：ＡＬＡ）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）、フォトフィリン（photofrin）等が例示される。鉄剤としては、経口剤として硫酸第一鉄（FeSO4）、クエン酸第一鉄、静注用鉄剤としてコンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄が例示される。投与方法は特に限定されるものではないが、本発明の癌遺伝子治療薬とともに、注射剤あるいは経口剤として投与することが好ましい。【００６３】
実際に、鉄剤（Ｆｅ）および／又は５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を投与することにより、オンコリティックアデノウイルスAdE3-1A1.3Bの癌細胞増殖抑制効果を著しく亢進することができた（図１５−１７および図２８参照）。【００６４】
キャリアー細胞と共に、アテロコラーゲン（コラーゲンのテロペプチド結合のみをペプシン処理などで切断し、分子量を小さくすることで水溶性としたもの）を投与することも好ましい。後述の実施例に示すように、アテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与した場合は、副作用による死亡率が激減した（図２４）。これは、アテロコラーゲンによりオンコリティックアデノウイルスの拡散が抑制されると共に抗アデノウイルス抗体に対するブロックが生じたためと考えられる。【００６５】
したがって、アテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することにより副作用を抑え、オンコリティックウイルスの高投与が可能になる。アテロコラーゲンは、市販品（例えば、株式会社高研の製品）を使用してもよいし、あるいは、コラーゲンをペプシン処理するなどして製造したものを使用してもよい。アテロコラーゲンは、キャリアー細胞と共に注射液に混ぜて投与することが好ましく、薬液中濃度０．０１―３．０％（ｗ／ｖ）程度で十分効果を発揮すると考えられる。（後述の実施例では、薬液中０．１―０．２％という低濃度でも十分効果が認められた。）【００６６】
また前述したように、免疫反応を高めるため、キャリアー細胞に、オンコリティックウイルスのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターをも感染させ、いわばウイルスベクターをダブルで感染させたキャリアー細胞を投与することは好ましい。（あるいは、両ベクターをそれぞれ個別に感染させたキャリアー細胞を同時に投与する方法としてもよい。）【００６７】
ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターには、オンコリティックウイルスと同種類のウイルスベクターを使用することが好ましい。例えば、オンコリティックウイルスにアデノウイルスを使用する場合、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターには、Ｅ１領域が欠失し、ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte-macrophage colony stimulating factor：顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が組み込まれたアデノウイルスを使用することができる。【００６８】
また、このようにウイルスベクターをキャリアー細胞に感染させる場合は、オンコリティックウイルスおよびＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターの両者を合わせた感染量を、およそ５ウイルス粒子／細胞以上２０００ウイルス粒子／細胞以下とする。【００６９】
実際にＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを使用することで、非常に優れた癌治療効果が認められた（図２７）。【００７０】
その他、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを使用する代わりに、ＧＭ−ＣＳＦ蛋白をキャリアー細胞と共に注射液に混ぜる、あるいは経静脈的に全身投与する方法も考えられる。【００７１】
本発明の癌遺伝子治療薬の使用方法は、勿論、上述した方法に限定されるものではなく、様々な使用例が考えられる。例えば、オンコリティックウイルスの感染力を高めるために、本発明の癌遺伝子治療薬を他の抗がん剤あるいは放射線照射などと併用してもよい。【００７２】
本発明の癌遺伝子治療薬の好適な使用例について、（１）免疫処置用ウイルスに対する抗体が陰性の患者の場合と、（２）同抗体が陽性の患者の場合とに分けて説明する。【００７３】
上記（１）の場合、免疫処置用ウイルスには、例えば、前述の非増殖型アデノウイルスを紫外線照射により不活化して使用する。投与量はおよそ１０５ｖｐから１０１１ｖｐ程度とする。免疫処置用ウイルスの投与と共に、腫瘍免疫のため２００Ｇｙ程度で放射線処理した患者由来の腫瘍細胞（癌細胞）をおよそ１０５個から１０１０個投与する。免疫処置用ウイルスおよび腫瘍細胞の投与方法は、皮内注射または皮下注射とする。【００７４】
免疫処置用ウイルスおよび腫瘍細胞の投与からおよそ３−４週後に、キャリアー細胞を腫瘍内注射にて投与する。キャリアー細胞の投与量は、例えば１回につき、１×１０７個―１×１０１０個程度とする。キャリアー細胞にはＡ５４９細胞を使用し、１５０Ｇｙから４００Ｇｙ程度で放射線処理した後、投与する。オンコリティックウイルスおよびＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターにはアデノウイルスを使用し、キャリアー細胞にはそれぞれ、２５０vp/cell程度、５−２０vp/cell程度感染させる。注射液には液中濃度およそ０．１−０．２％となるようアテロコラーゲンを混ぜて投与する。また同時に、鉄（Ｆｅ）を４０−１００ｍｇ程度静注する。あるいは、同時に、ＡＬＡを２−２０００ｍｇ腫瘍内に投与する。
以上を１回として、キャリアー細胞等を１−６回投与する。複数回投与する場合は、連日あるいは２，３日おきに投与する。【００７５】
患者が抗体陽性の上記（２）の場合、免疫処置用ウイルスの投与量をおよそ１０５ｖｐ以下とする以外は、上記（１）と同様に、本発明の癌遺伝子治療薬を投与すればよい。【００７６】
本発明の癌遺伝子治療薬の具体例としては、（１）特定のキャリアー細胞、（２）さらに、キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウイルスを組み合わせたもの、（３）上記（１）又は（２）の組み合わせに、さらに、免疫処置用ウイルスを組み合わせたもの、（４）上記（１）〜（３）の組み合わせに、さらに、アテロコラーゲンを組み合わせたもの、（５）上記（１）〜（４）の組み合わせに、さらに、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを組み合わせたもの、（６）上記（１）〜（５）の組み合わせに、さらに、ウイルス産生量を高めるための鉄剤および／又はポルフィリン化合物を組み合わせたもの、（７）上記（１）〜（６）の組み合わせに、さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を組み合わせたもの、（８）上記（１）〜（７）の組み合わせに、保存、感染・培養、医薬製剤の調製などに必要な化合物（試薬、緩衝液、酵素等）、または容器（反応用、感染・培養用、保存用等）などを組み合わせたもの、を挙げることができる。
【実施例】
【００７７】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。【００７８】
〔実施例１：キャリアー細胞の選別と、抗体存在下における抗腫瘍効果〕
既存の癌細胞株のうち、キャリアー細胞として強力な癌細胞増殖抑制効果を発揮する細胞株を選別するため、以下の実験を行った。【００７９】
キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウイルスには、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂ（ＩＡＩ．３Ｂ）を使用した。このアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂは、Ｅ１Ａ遺伝子およびＥ３遺伝子を有し、かつ、Ｅ１Ａ遺伝子の上流に腫瘍特異的プロモーターとして卵巣癌特異的１Ａ１．３Ｂプロモーター（ＩＡＩ．３Ｂプロモーター）を有するアデノウイルスである。このアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを種々のキャリアー細胞に対し５００vp/cellで２日間感染させた後、同キャリアー細胞を培養２日目の卵巣癌細胞株ＨＥＹに加え、培養５日目に同細胞株ＨＥＹのin vitro増殖抑制効果を調査した。【００８０】
上記実験結果を図１に示す。同図グラフの縦軸は、各細胞株について５０％の増殖抑制効果（ＩＣ５０）が得られる細胞数を示し、細胞数が少ない細胞株ほど増殖抑制効果が高いことになる。同図に示すように、今回調査した癌細胞株では、２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３（ＨＴ―ＩＩＩ細胞）細胞の順に高い抗腫瘍効果を示した。２９３細胞、Ａ５４９細胞およびＳＷ６２６細胞は、従来キャリアー細胞として使用されていたＰＡ−１細胞に比べて、およそ１００倍程度の高い増殖抑制効果を示した。ＨＴ―３細胞についても、ＳＷ６２６細胞と同程度の高い増殖抑制効果を示した。【００８１】
次に、オンコリティックウイルス単独の場合とキャリアー細胞を用いた場合とで、ウイルス抗体存在下、増殖抑制効果がどのように変化するかを調べた。キャリアー細胞には２９３細胞を用い、この２９３細胞に上記アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２日間感染させ、得られたアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂ感染２９３細胞およびその細胞上清（AdE3-1A13B 293 cell+SUPT）を、抗アデノウイルス抗体存在下、１２ウェルプレートに投与した。各ウェルには前日に５万個程度の卵巣癌細胞株ＨＥＹがまき込まれている。抗アデノウイルス抗体には、６００倍の抗体価を有するものを様々な抗体価に希釈して用いた。同様に、オンコリティックウイルス単独の場合として、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを、抗アデノウイルス抗体存在下、１ウェル１０００vp/cellで１２ウェルプレートに投与した。そして、それぞれの場合において培養５日目に癌細胞（ＨＥＹ細胞）の増殖抑制効果を調べた。【００８２】
上記実験結果を図２に示す。同図グラフの縦軸は、５０％の増殖抑制効果（ＩＣ５０）が得られるときの抗アデノウイルス抗体の希釈度を示す。つまり、２９３細胞を用いた場合は、５倍程度の希釈（１２０倍の抗体価）でも５０％の増殖抑制効果が得られ、アデノウイルス単独の場合は、６００倍程度の希釈（１倍の抗体価）によって５０％の増殖抑制効果が得られた。このように、キャリアー細胞を用いた場合は、抗体価の高い条件下においても増殖抑制効果を発揮することが示された。【００８３】
同様に、抗アデノウイルス抗体存在下、ＨＥＹ細胞に対する増殖抑制効果を、(1)アデノウイルス感染２９３細胞の上清と細胞成分（AdE3-1A13B 293 cell+SUPT）、(2)アデノウイルスを含む細胞上清（AdE3-1A13B, SUPT）、(3) アデノウイルスを含む細胞上清を０．２μｍのフィルターで処理したもの（AdE3-1A13B, SUPT, filter）、(4)アデノウイルス単独（AdE3-1A13B）、のそれぞれの場合について調べた。その結果を図３に示す。同図グラフの縦軸は、５０％の増殖抑制効果（ＩＣ５０）が得られるときの抗アデノウイルス抗体の希釈度を示す。同図に示すように、キャリアー細胞（２９３細胞）を用いた場合に、他の場合と比べてより強力な抗腫瘍効果が得られた。【００８４】
さらに上記と同様の実験で、２９３細胞、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２６細胞、ＨＴ―３細胞の各キャリアー細胞について、６００倍の抗体価を有する抗アデノウイルス抗体存在下（Ａｂ（+））、または非存在下（Ａｂ（−））における、癌細胞株ＨＥＹ細胞に対する増殖抑制効果を検討した。その結果を図４に示す。同図グラフの縦軸は、培養５日目の癌細胞数を示す。同図に示すように、上記４種類の細胞のうち、Ａ５４９細胞をキャリアー細胞に用いた場合に最も強力な増殖抑制効果を示した。即ち、充分量の抗アデノウイルス中和抗体存在下にアデノウイルス感染Ａ５４９細胞を投与すると、標的癌細胞の増殖は抗体存在下にもかかわらずほぼ完全に抑制された。他の３種類の細胞についても、抗体存在下、充分な増殖抑制効果が得られた。【００８５】
ウイルスによる癌遺伝子治療は、ウイルスに対する中和抗体産生により頻回投与ができないことが難点とされていたが、キャリアー細胞を用いることで、細胞間相互作用により標的癌細胞に直接的に感染が成立することによって、頻回投与が可能となる。さらに、キャリアー細胞として上記４種類の細胞を用いることで、強力な抗腫瘍効果を得ることができる。【００８６】
〔実施例２：ヌードマウス皮下腫瘍モデルにおけるin vivo抗腫瘍効果〕
次に、ヌードマウス皮下腫瘍モデルを用いて、本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した。実験では、生後５週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞ＲＭＧ−１を移植し、４週間後、直径約１０−１５ｍｍになった巨大腫瘍に対し、本発明の癌遺伝子治療薬を６回腫瘍内注射し、腫瘍体積の変化を観察した。その結果を図５のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」はＰＢＳ緩衝液を６回腫瘍内注射した結果、黒丸印の「AdE3-1A1.3B」は上記アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂをマウス１匹に１×１０10ウイルス粒子投与した結果、黒三角印はアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２５０vp/cell感染させたＳＷ６２６細胞をマウス１匹に１×１０７個投与した結果、黒菱形印はアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２５vp/cell感染させた２９３細胞をマウス１匹に１×１０７個投与した結果、白四角印はアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞をマウス１匹に１×１０７個投与した結果、である。同図に示すように、２９３細胞およびＡ５４９細胞をキャリアー細胞に用いた場合は、投与後５０日経過すると、直径約１０−１５ｍｍの巨大腫瘍が完全に消退した。ＳＷ６２６細胞は、９８%の増殖抑制効果を示した。【００８７】
上記と同様の実験を、生後５週のヌードマウスの皮下にヒト卵巣癌細胞ＰＡ−１を移植して行った。その結果を図６に示す。同図に示すように、２９３細胞およびＡ５４９細胞をキャリアー細胞に用いると、直径約１０−１５ｍｍの巨大腫瘍が完全に消退した。ＳＷ６２６細胞は、５匹中４匹のマウスにおいて腫瘍が完全に消失した。【００８８】
〔実施例３：免疫力のある皮下腫瘍モデルマウスにおけるin vivo抗腫瘍効果〕
次に、免疫機能が正常な(C57BL/6×C3/He)F1マウスを用いて本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した。本実験では、(1) syngenicモデルマウスに対し同種の卵巣癌細胞ＯＶＨＭを皮下移植し、その１０日後以降形成された５−１０ｍｍの皮下腫瘍に対し、上記アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２５０vp/cell感染させた放射線処理（放射線治療）後のＡ５４９細胞を６回腫瘍内投与した場合、(2) 生後７週のsyngenicモデルマウスを免疫処置用ウイルスであるアデノウイルス投与により予め免疫し、その３ヶ月後、上記(1)の場合と同様に、卵巣癌細胞ＯＶＨＭを皮下移植し、その１０日後以降、上記アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２５０vp/cell感染させた放射線処理後のＡ５４９細胞を６回腫瘍内投与した場合、(3) コントロールとしてＰＢＳ緩衝液を６回腫瘍内投与した場合、のそれぞれの場合について抗腫瘍効果を検討した。【００８９】
上記実験結果を図７のグラフに示す。グラフ中、黒四角印の「control」は上記(3)のコントロールの場合の結果であり、黒丸印の「Ad(-)→A549」は上記(1)の免疫処置用アデノウイルスを投与しなかった場合の結果であり、黒三角印の「Ad(+)→A549」は上記(2)の免疫処置用アデノウイルスを投与した場合の結果である。なお、免疫処置用アデノウイルスには、Ｅ１遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より具体的には、ＣＭＶプロモーターの下流にＬａｃＺ遺伝子が挿入されたアデノウイルスを使用した。同図に示すように、予めアデノウイルスによる免疫をしていない上記(1)の場合では、コントロールに比べて２０％の抗腫瘍効果を示したのに対し、予めアデノウイルスによる免疫処置を施した上記(2)の場合では、投与開始後３−４日で明らかな抗腫瘍効果を示し、９日後に腫瘍は完全に消失し、リンパ節転移も消失した。このように、抗体産生があるにも関わらずむしろ免疫力のあるマウスでより強力かつ劇的な抗腫瘍効果が得られたのは、免疫処置用アデノウイルスの投与によって生体のＣＴＬ反応が誘導・惹起されたためと考えられる。【００９０】
オンコリティックアデノウイルスは、細胞間相互作用によりキャリアー細胞から標的腫瘍細胞へと感染し、腫瘍細胞内で特異的に増殖し、腫瘍細胞を融解・殺傷するcell lysis作用を発揮すると考えられるが、本発明の癌遺伝子治療薬においては、予め免疫処置用アデノウイルスを投与することによって、オンコリティックアデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞を排除する生体の強いＣＴＬ反応が誘導され、アデノウイルス感染腫瘍細胞の完全な自然排除が誘導されると考えられる。【００９１】
標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染方法の１つとして、アデノウイルスによる細胞融合が考えられる。図８は、Ａ５４９細胞をまき込んだウェルに、紫外線照射により不活化したアデノウイルスを１細胞当たり１００００ウイルス粒子投与し、一晩培養後、顕微鏡により観察した結果を示すものである。同図矢印に示すように、アデノウイルスの投与によって細胞融合が起こり、多核細胞が散見された。アデノウイルスを投与しなかったＡ５４９細胞では、このような変化は観察されなかった（図９参照）。【００９２】
細胞融合以外に考えられる感染方法としては、キャリアー細胞の標的細胞への細胞接着さらに局所的なアデノウイルスのバーストあるいはアデノウイルスを含むキャリアー細胞fragmentによる標的腫瘍細胞へのアデノウイルスの感染が成立すると考えられる。何れの方法にせよ、アデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞においては、腫瘍特異的プロモーターを有するアデノウイルスが増加し強力な免疫原となって（あるいはアデノウイルスに感染した標的腫瘍細胞が有する癌特異的ペプチドを二次的に抗原認識することによって）、ＣＴＬ反応により腫瘍細胞が排除されると考えられる。【００９３】
〔実施例４：ミッドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果〕
次に、ミッドカインプロモーターを使用した場合の抗腫瘍効果を検討した。図１０（ａ）は、１〜２１のヒト手術標本におけるミッドカイン（ＭＫ）ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した結果である。同図に示すように、神経膠芽腫（glioblastoma）、 未分化星細胞腫（anaplastic astrocytoma）といった悪性グリオーマ（malignant glioma）および瀰漫性星細胞腫（diffuse astrocytoma）においてミッドカインｍＲＮＡの過剰発現が認められた。このように、ミッドカインは脳腫瘍など多くの癌において過剰発現が認められる。【００９４】
図１０（ｂ）は、上記と同様の方法により、悪性グリオーマの４つの細胞株におけるミッドカインｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した結果である。同図に示すように、４つの細胞株のうち、Ｕ８７ＭＧでは発現はなく、Ｕ２５１ＭＧ、ＬＮ３１９、 Ｕ３７３ＭＧではミッドカインｍＲＮＡの過剰発現が認められた。【００９５】
図１０（ｃ）は、上記各細胞株におけるミッドカイン蛋白の発現をウエスタンブロット解析によって検討した結果であり、ｍＲＮＡと同様にＵ８７ＭＧでは発現はなく、Ｕ２５１ＭＧ、ＬＮ３１９、Ｕ３７３ＭＧではミッドカイン蛋白の過剰発現が認められた。【００９６】
次に、ミッドカインのプロモーターアッセイを行った。実験では、長さが異なる２つのミッドカインプロモーター（６００塩基と２３００塩基）の活性を比較した。それぞれのプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が挿入されたプラスミド（pGL3-MK600およびpGL3-MK2300）を上記各細胞株に導入し、それぞれのルシフェラーゼ活性を調べることによりプロモーター活性を評価した。その結果、図１１に示すように、悪性グリオーマの細胞株では、長さ６００塩基のほうが長さ２３００塩基より高いプロモーター活性を示した。【００９７】
図１２（ａ）は、今回設計した、ミッドカインプロモーターを有するオンコリティック（細胞融解型）アデノウイルスの構造を模式的に示す図である。長さ６００塩基または２３００塩基のミッドカインプロモーターは、５５２ｂｐの位置に導入された。【００９８】
図１２（ｂ）は、３種類のアデノウイルスを上記各細胞株に感染させ、それぞれの細胞株におけるＥ１Ａ蛋白の発現をウエスタンブロット解析によって検討した結果である。同図に示すように、長さ６００塩基のミッドカインプロモーターを有するアデノウイルス（ＡｄＭＫ６００）を感染させた場合、ミッドカインを発現するＵ２５１ＭＧ、ＬＮ３１９、Ｕ３７３ＭＧでのみアデノウイルスのＥ１Ａ蛋白の発現が観察された。これに対して、野生型のアデノウイルス（ＡｄＷｉｌｄ）では正常脳細胞を含めすべての細胞にＥ１Ａ蛋白の発現が観察され、コントロールウイルスであるＡｄＬａｃＺではいずれの細胞においてもＥ１Ａ蛋白の発現が観察されなかった。【００９９】
図１３（ａ）は、３種類のアデノウイルスによる癌細胞増殖抑制効果を比較検討した結果である。野生型のアデノウイルス（ＡｄＷｉｌｄ）ではすべての細胞において強い増殖抑制効果を示したが、ミッドカインプロモーターを有するアデノウイルス（ＡｄＭＫ６００およびＡｄＭＫ２３００）では、ミッドカインを発現するＵ２５１ＭＧ、ＬＮ３１９、Ｕ３７３ＭＧにおいてのみ増殖抑制効果を示し、これらの値は、ミッドカインｍＲＮＡの発現量、プロモーター活性とよく相関した。また、長さ２３００塩基のミッドカインプロモーターを有するアデノウイルスＡｄＭＫ２３００よりＡｄＭＫ６００のほうが強い増殖抑制効果を示した。【０１００】
図１３（ｂ）は、アデノウイルスのＥ３領域の増殖抑制効果に与える影響を検討した結果であり、同図に示すように、Ｅ３領域のあるＡｄＭＫ６００ではＥ３領域のないアデノウイルス（ＡｄＭＫ６００―ΔＥ３）より１０倍程度の強い増殖抑制効果を示した。【０１０１】
図１３（ｃ）は、腫瘍の直径５−１０ｍｍ程度の大きさのヌードマウス皮下移植モデルにおけるアデノウイルスの抗腫瘍効果を検討した結果である。図中、黒菱形印は野生型のアデノウイルスＡｄＷｉｌｄを投与した結果、黒四角印はミッドカインプロモーターを有するアデノウイルスＡｄＭＫ６００を投与した結果、黒三角印はＬａｃＺ遺伝子が挿入されたアデノウイルスAd-β-galを投与した結果、黒丸印はＰＢＳ緩衝液のみ投与した結果である。同図に示すように、ミッドカインを発現しないＵ８７ＭＧでは野生型のアデノウイルスのみ抗腫瘍効果を示し、ミッドカインを発現するＵ３７３ＭＧではＡｄＭＫ６００とＡｄＷｉｌｄは完全に腫瘍の消失をもたらし、ＰＢＳ緩衝液のみ注射したコントロールとＡｄＬａｃＺを注射したものとの間には大きな差異は認められなかった。【０１０２】
さらに、上記ミッドカインプロモーターを有するアデノウイルス（Ａｄ-ＭＫ６００）をキャリアー細胞に感染させ本発明の癌遺伝子治療薬を調製し、その抗腫瘍効果をＡｄ-ＭＫ６００単独投与の場合と比較した。実験では、２９３細胞およびＡ５４９細胞をキャリアー細胞に使用した。ヌードマウス５週令に上記Ｕ３７３ＭＧ細胞を移植し、３週間後に１０−１５ｍｍの巨大腫瘍が得られた後、本発明の癌遺伝子治療薬またはＡｄ-ＭＫ６００のみを投与し、その４週間後に腫瘍体積の大きさを比較した。その結果を図１４に示す。図中、「Ad-MK600」はＡｄ-ＭＫ６００を単独投与した結果、「293」「A549」はそれぞれ２９３細胞、Ａ５４９細胞をキャリアー細胞に用いた本発明の癌遺伝子治療薬を投与した結果である。同図に示すように、本発明の癌遺伝子治療薬を投与したときは完全に腫瘍が消失した。一方、Ａｄ-ＭＫ６００を単独投与したときはコントロール（control）と殆ど差は認められなかった。【０１０３】
これまでの実験結果から、キャリアー細胞にＡ５４９細胞、２９３細胞などを使用し、オンコリティックウイルスに１Ａ１．３Ｂプロモーター又はミッドカインプロモーターを有するアデノウイルスを使用することによって、実際に卵巣癌、悪性グリオーマに対する良好な治療効果が認められた。ミッドカインプロモーターは、悪性グリオーマのほか種々の悪性腫瘍に対して使用可能であり、悪性グリオーマ以外の癌治療にも有効と考えられる。【０１０４】
〔実施例５：アデノウイルスAdE3-1A1.3Bの増殖抑制効果に対するＦｅおよびＡＬＡの影響〕
卵巣癌細胞ＨＥＹを１２well dishに10000/well播いた後、翌日にFeSO4を50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/mlの各濃度において入れ、全てのwellに細胞障害型アデノウイルスAdE3-1A1.3Bを入れ、５日後にアデノウイルスの増殖抑制効果をＩＣ５０で評価した。その結果を図１５に示す。図中縦軸は、各場合におけるＩＣ５０のウイルス投与量（vp/cell）を相対的に示すものである。同図に示すように、FeSO4 50μg/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ約２０倍、FeSO4 5μg/mlおよびアデノウイルス併用では、アデノウイルス単独に比べ約８倍の増殖抑制効果を示した。【０１０５】
次に、卵巣癌細胞株ＨＥＹを１２well dishに10000/well播いた後、翌日に5-aminolevulinic acid（ＡＬＡ）を50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/mlの各濃度において入れ、全てのwellに細胞障害型アデノウイルスAdE3-1A1.3Bを入れ、５日後にアデノウイルスの増殖抑制効果をＩＣ５０で評価した。その結果を図１６に示す。図中縦軸は、各場合におけるＩＣ５０のウイルス投与量（vp/cell）を相対的に示すものである。同図に示すように、ＡＬＡ 50μg/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ約１００倍の増殖抑制効果を示した。【０１０６】
さらに、卵巣癌細胞株ＨＥＹを１２well dishに10000/well播いた後、翌日にFeSO4を50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/mlの各濃度において入れ、各wellに細胞障害型アデノウイルスAdE3-1A1.3Bおよび5-aminolevulinic acid（ＡＬＡ）50μg/ml、又はコントロールとしてアデノウイルス単独を入れ、５日後にアデノウイルスの増殖抑制効果をＩＣ５０で評価した。その結果を図１７に示す。図中縦軸は、各場合におけるＩＣ５０のウイルス投与量（vp/cell）を相対的に示すものである。同図に示すように、FeSO4 50μg/ml、ＡＬＡ 50μg/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約１０００倍の増殖抑制効果を示し、FeSO4 5μg/ml、ＡＬＡ 50μg/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約７００倍の増殖抑制効果を示し、FeSO4 0.5μg/ml、ＡＬＡ 50μg/mlおよびアデノウイルスを併用した場合では、アデノウイルス単独に比べ、約２００倍の増殖抑制効果を示した。【０１０７】
以上のように、ＡＬＡおよびＦｅは、オンコリティックアデノウイルスAdE3-1A1.3Bの増殖抑制効果を著しく亢進することが明らかとなった。この理由は、β-gal assayによりアデノウイルスの感染能力を高めること、PFU assayによりアデノウイルスの産生量の増加によることが明らかとなっており、ＡＬＡおよびＦｅは、アデノウイルスの感染力を高め、産生量を増加させること、つまりアデノウイルスの癌細胞内への感染力増加と細胞内における産生量増加とともに抗腫瘍効果を著しく高めることが明らかとなった。【０１０８】
ＡＬＡは、ポルフィリン代謝物で従来より癌細胞に取り込まれ、その代謝物であるprotoporphyrin IXが蓄積されやすいことが知られており、これが光増感作用を有することよりエキシマダイレーザーと併用され、表在性癌のＰＤＴ治療（photodynamic therapy）に用いられてきた。【０１０９】
上記protoporphyrin IXは、Ｆｅと結合することによりhemeとなり、細胞内でcytcrome等のheme蛋白を形成する。このheme蛋白は、細胞内ミトコンドリアで呼吸器系に関与しており、ＡＴＰ産生に働き蛋白合成に関与する。このように、heme蛋白は、アデノウイルス感染時のアデノウイルス産生のための蛋白合成に関与するため、これらポルフィリン代謝が亢進することは、アデノウイルス産生増加につながる可能性が高いと考えられる。【０１１０】
したがって、本発明の癌遺伝子治療薬、癌遺伝子治療方法において、これらＦｅおよび／又はＡＬＡ等のポルフィリン化合物を併用することにより、さらに治療効果を高めることが期待できる。即ち、Ｆｅおよび／又はＡＬＡ等のポルフィリン化合物を併用することにより、直接的な抗腫瘍効果の増加、さらには抗体存在下の感染抑制状態において、標的細胞のアデノウイルス産生増加によるCTL responseの亢進により、syngenic mouse modelにおいて抗腫瘍効果が高まり、ヒトにおいても同様な良好な抗腫瘍効果を呈するものと考えられる。【０１１１】
また、オンコリティックウイルスを用いた癌遺伝子治療において、キャリアー細胞を使用しない場合であっても、Ｆｅおよび／又はＡＬＡ等のポルフィリン化合物を併用することにより、治療効果を高めることが期待できる。【０１１２】
〔実施例６：本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化の検討〕
本発明の癌遺伝子治療薬による癌治療法の最適化を図るため、以下一連の実験を行った。【０１１３】
まず、図７に示す実験と同様に、免疫機能が正常な皮下腫瘍モデルマウス（(C57BL/6×C3/He)F1マウス）を用いて、本発明の癌遺伝子治療薬のin vivo抗腫瘍効果を検討した。本実験では、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスを免疫処置用ウイルスの投与により事前免疫し、その１２週後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、上記アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを２５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞（Ａｄ−Ａ５４９）を腫瘍内投与した。免疫処置用ウイルスには、Ｅ１遺伝子を有しない非増殖型のアデノウイルスを使用し、より具体的には、ＣＭＶプロモーターの下流にＬａｃＺ遺伝子が挿入されたアデノウイルスであって、紫外線等による不活化処理を行っていないアデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを使用し、このＡｄ−β−ｇａｌをマウス１匹あたり１×１０１０vp皮内投与した。また、キャリアー細胞であるＡ５４９細胞は、２００Ｇｙにて放射線処理後、マウス１匹につき１回あたり５×１０６個、合計６回腫瘍内投与した。【０１１４】
上記実験結果を図１８（ａ）（ｂ）に示す。各グラフ中、「Ad-β-gal→Ad-A549」は上記実験結果であり、「Ad-A549」はキャリアー細胞のみ投与した結果、「Ad-β-gal」は免疫処置用ウイルスは投与せず、治療としてAd-β-galのみ投与した結果、「control」はＰＢＳ緩衝液を投与した結果である。各群のマウスの数はｎ＝５である。（ａ）のグラフは、各マウスの腫瘍体積を比較的短期間観察した結果であり、（ｂ）のグラフは、各群マウスの生存率を長期間観察した結果である。これらの図に示すように、「Ad-β-gal→Ad-A549」では強力なin vivo抗腫瘍効果が認められた。【０１１５】
次に、免疫処置用アデノウイルス投与からキャリアー細胞投与までの投与間隔について検討を行った。本実験は、この投与間隔を様々なものに変更した点、および、キャリアー細胞であるＡ５４９細胞にアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させた点以外は、図１８に示す実験と同様に行った。【０１１６】
上記実験結果を図１９（ａ）（ｂ）に示す。各グラフ中、「２−４ｗ」「５−９ｗ」「１０−１５ｗ」「１６−２２ｗ」は、それぞれ、上記投与間隔を２−４週、５−９週、１０−１５週、１６−２２週の間に設定した実験結果であり、各群のマウスの数はｎ＝５である。これらの図に示すように、上記投与間隔を１０−１５週に設定したとき最も良好な抗腫瘍効果が得られた。本実験のように、不活化処理していないアデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用した場合には、当該ウイルス投与後およそ１０−１５週においてＴ細胞によるＣＴＬ反応が中和抗体による感染抑制に比べ優位になると考えられる。【０１１７】
臨床応用を考慮すると、上記投与間隔は短期間であることが望ましい。そこで、不活化処理したアデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用することで上記投与間隔を短くすることができないか検討した。その結果図２０に示すように、紫外線（ＵＶ）照射し、不活化処理したアデノウイルスＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用した場合は、上記投与間隔を４週または３週に設定したときに良好な抗腫瘍効果が得られること、すなわち、免疫処置用ウイルスを不活化処理することで、上記投与間隔を３−４週程度に短縮できることがわかった。【０１１８】
上記実験は、不活化処理したアデノウイルスＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用した点、上記ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌをマウス１匹あたり１×１０７vp皮内投与した点、上記投与間隔を３週、４週、５週または６週に設定した点、および、キャリアー細胞であるＡ５４９細胞にアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させた点以外は、図１８に示す実験と同様に行った。各群のマウスの数はｎ＝１０である。【０１１９】
図２１は、上記ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを免疫処置用ウイルスに使用した場合の当該ウイルスの投与量について検討した結果である。この実験では、上記ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌの投与量を１×１０６vpから１×１０１１vpの範囲で変更した。また、上記投与間隔は６週に設定し、それ以外は図２０に示す実験と同様に行った。その結果、ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌの投与量１×１０７vpのときに最も良好な抗腫瘍効果が得られた。（この結果から、図２０に示す実験では、ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌの投与量を１×１０７vpに設定した。）【０１２０】
図２２（ａ）（ｂ）は、腫瘍免疫（tumor vaccination）の効果を検討した結果である。上記ＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌをマウス１匹につき１×１０７vp皮内投与し、その１０日後に腫瘍免疫のため放射線照射した卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植した。同時に、扁平上皮癌細胞ＳＣＣ７または卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍を形成したマウスにAdE3-1A1.3B感染A549細胞を５×１０6個腫瘍内に６回投与したマウス（図中、「OVHM-RT＋Ad-β-gal→SCC7」「OVHM-RT＋Ad-β-gal→OVHM」）では、コントロール（図中、腫瘍免疫無しにＳＣＣ７腫瘍に対してキャリアー細胞治療した「SCC7」、腫瘍免疫無しにＯＶＨＭ腫瘍に対してキャリアー細胞治療した「OVHM」）に比べて腫瘍の成長・増殖は著しく抑制され、特に放射線照射したＯＶＨＭによって腫瘍免疫しＯＶＨＭ腫瘍形成したマウスにキャリアー細胞による治療を行うと、全てのマウスにおいて腫瘍は消失し、再発は認められなかった。【０１２１】
図２３は、非小細胞性肺癌細胞Ａ５４９細胞による腫瘍免疫の効果を検討した結果である。この実験では、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを１００vp/cell感染させた放射線処理後のＡ５４９細胞をマウス１匹につき１×１０6個皮下移植し、その４０日後に卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植した。このマウス（図中、「AdE3-1A1.3B-infected A549→OVHM」）においても、コントロール（図中、腫瘍免疫無しにＯＶＨＭ腫瘍形成しキャリアー細胞による治療を行った「OVHM」）に比べて腫瘍の成長・増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した。【０１２２】
以上の結果から、種類の異なる癌細胞で腫瘍免疫を行っても抗腫瘍効果があることがわかった。【０１２３】
次に、キャリアー細胞と共にアテロコラーゲンを投与した場合の効果について検討した。この実験では、生後５−１０週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを所定量感染させたＡ５４９細胞を５×１０6個投与したが、このときアテロコラーゲンを混注して最終濃度を０．１％とし、アデノウイルス投与に伴う副作用による死亡率が改善されるかどうかを調べた。その結果を図２４に示す。図中、右側のバーは、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cellまたは２５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞と共にアテロコラーゲンを投与した結果、左側および中央のバーは、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂをそれぞれ５vp/cell、５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を投与した結果（アテロコラーゲンは混注せず）である。同図に示すように、アテロコラーゲンを同時投与した場合は、副作用による死亡率が激減し、投与量も増加することが可能となった。これは、アテロコラーゲンによりアデノウイルスの拡散が抑制されると共に抗アデノウイルス中和抗体に対するブロックが生じたためと考えられる。【０１２４】
以上の結果から、アテロコラーゲンをキャリアー細胞と同時投与することによって副作用を抑え、アデノウイルスの高容量の投与が可能になることがわかった。
次に、不活化処理していない前記アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1、２、３回投与し、ブースター効果によりそれぞれ血中抗アデノウイルス抗体が増加したマウスにおける抗腫瘍効果について検討した。この実験では、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回または３回投与し（各回３週おきに、１回あたり１×１０１０vp投与）、その後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、Ａ５４９細胞単独、または、Ａ５４９細胞と２９３細胞とを混合したものを使用した。【０１２５】
Ａ５４９細胞と２９３細胞とを混合したものは、マウス１匹につき、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を３．７５×１０６個、および、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを１０vp/cell感染させた２９３細胞を３．７５×１０６個腫瘍内投与し、これを１回として合計６回腫瘍内投与した。その結果を図２５（ａ）（ｂ）に示す。また、Ａ５４９細胞単独の場合は、マウス１匹につき、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を７．５×１０６個腫瘍内投与し、これを１回として合計６回腫瘍内投与した。その結果を図２６（ａ）（ｂ）に示す。図２５および図２６において、「×１」「×２」「×３」は、それぞれ、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回、３回投与した結果である。これらの図に示すように、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌ数回投与により抗アデノウイルス抗体プラスのマウスにおいても、キャリアー細胞による抗腫瘍効果が認められた。また今回の実験では、Ａ５４９細胞単独に比べて、Ａ５４９細胞と２９３細胞とを混合したものをキャリアー細胞に使用したほうが成績は良好であった。【０１２６】
図２７（ａ）（ｂ）は、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを感染させたキャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を投与し、かつ、このキャリアー細胞と共にアテロコラーゲンを投与した場合のin vivo抗腫瘍効果について検討した結果である。この実験では、図２６に示す実験と同様に、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回または３回投与し（各回３週おきに、１回あたり１×１０１０vp投与）、その後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投与した。ただし、キャリアー細胞（Ａ５４９細胞）には、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させると共に、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクター（アデノウイルスのＥ１遺伝子を欠失した部位にＣＭＶプロモーターの下流にＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を挿入したベクター）を１０vp/cell感染させた。こうして調製した放射線処理後のＡ５４９細胞を１回につき７．５×１０６個、アテロコラーゲン（濃度０．１％）と共に腫瘍内投与し、合計３回（×３）腫瘍内投与した。【０１２７】
図２７（ａ）（ｂ）において、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B＋GMCSF」は上記実験結果であり、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B」はアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂのみ５０vp/cell感染させたキャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を１回につき７．５×１０６個、合計６回（×６）腫瘍内投与した結果である。同図に示すように、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B＋GMCSF」では、３回投与にもかかわらず「AdE3-1A1.3B」６回投与に比べ、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回、３回投与した場合のいずれも非常に強いin vivo抗腫瘍効果が認められた。【０１２８】
以上の結果から、キャリアー細胞にオンコリティックアデノウイルスのみならず、ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターをも感染させることは、癌治療に非常に有効であることがわかった。【０１２９】
図２８（ａ）（ｂ）は、キャリアー細胞投与時に、鉄剤を腹腔内投与した場合の効果について検討した結果である。この実験では、図２７に示す実験と同様に、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回または３回投与し（各回３週おきに、１回あたり１×１０１０vp投与）、その後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、放射線処理後のキャリアー細胞を腫瘍内投与した。ただし、キャリアー細胞投与時に、鉄剤として鉄デキストラン（Ｆｅ−Ｄｅｘｔｒａｎ）０．０１ｍｇを腹腔内投与した。キャリアー細胞には、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を使用し、１回につき７．５×１０６個、合計３回（×３）腫瘍内投与した（各回、鉄剤も投与した）。【０１３０】
図２８（ａ）（ｂ）において、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B＋Fe」は上記実験結果であり、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B」はアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたキャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を１回につき７．５×１０６個、合計６回（×６）腫瘍内投与した結果である。同図に示すように、「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B＋Fe」では、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを1回、２回、３回投与した場合のいずれもキャリアー細胞による治療は３回にもかかわらず、AdE3-1A1.3B感染キャリアー細胞による６回の治療に比べ非常に強いin vivo抗腫瘍効果が認められた。【０１３１】
以上の結果から、キャリアー細胞投与時に、あわせて鉄剤を投与することは、癌治療に非常に有効であることがわかった。【０１３２】
次に、キャリアー細胞投与前にキャリアー細胞に対して行う放射線処理において照射する線量について検討した。実験には、生後５週のヌードマウスを使用し、Ａ５４９細胞を異なる線量で放射線処理後、マウス１匹あたり１×１０７個皮下移植し、腫瘍の形成・成長を観察した。その結果を図２９に示す。同図に示すように、照射する線量を１２０Ｇｙ以上とすることで、腫瘍の形成・成長は抑制された。【０１３３】
(C57BL/6×C3/He)F1マウスを使用した実験で、キャリアー細胞（Ａ５４９細胞）を異なる線量で放射線処理した場合の抗腫瘍効果について検討した結果を図３０に示す。この実験では、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＵＶ−Ａｄ−β−ｇａｌを１×１０１０vp投与し、その５週後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、線量５０Ｇｙ、１００Ｇｙ、２００Ｇｙまたは４００Ｇｙで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を使用し、１回につき７．５×１０６個、合計６回腫瘍内投与した。その結果、放射線処理において照射する線量は、２００Ｇｙよりも４００Ｇｙのほうが良好な結果が得られた。【０１３４】
図３１は、キャリアー細胞に対するオンコリティックウイルスの感染量について検討した結果を示す。この実験では、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを１×１０１０vp投与し、その４週後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、線量２５０Ｇｙで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞（Ａ５４９細胞）に対するアデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂの感染量を、１００vp/cell、２５０vp/cellまたは５００vp/cellのいずれかとし、１回につきキャリアー細胞を７．５×１０６個、合計６回腫瘍内投与した。さらに、キャリアー細胞投与時に、あわせてアテロコラーゲン（濃度０．１％）を腫瘍内投与した。その結果、上記感染量は２５０vp/cellのときに最も良好な結果が得られ、１５０−４００vp/cell程度に設定すれば良好であることがわかった。【０１３５】
図３２（ａ）（ｂ）は、図３１に示す実験と同様の実験において、腫瘍免疫の効果を検討した結果である。この実験では、生後５週の(C57BL/6×C3/He)F1マウスに、アデノウイルスＡｄ−β−ｇａｌを１×１０１０vp投与し、その４週後に腫瘍免疫のため線量８０Ｇｙで放射線処理した卵巣癌細胞ＯＶＨＭ−ＲＴをマウス１匹あたり１×１０6個皮下移植した。さらにこの後、卵巣癌細胞ＯＶＨＭを１×１０6個皮下移植し、５−１０ｍｍの腫瘍形成後、線量２５０Ｇｙで放射線処理したキャリアー細胞を腫瘍内投与した。キャリアー細胞には、アデノウイルスＡｄＥ３−１Ａ１．３Ｂを５０vp/cell感染させたＡ５４９細胞を使用し、１回につき７．５×１０６個、合計３回腫瘍内投与した。また、キャリアー細胞投与時に、あわせてアテロコラーゲン（濃度０．１％）を腫瘍内投与した。その結果、腫瘍免疫を行ったマウス（図中、「OVHM-RT→A549」）では、腫瘍免疫を行わなかったマウス（図中、「A549」）に比べて腫瘍の成長・増殖は著しく抑制され、生存率は大きく改善した。【０１３６】
以上の結果から、本発明の癌遺伝子治療薬の使用に際し、腫瘍免疫を併用することで良好な抗腫瘍効果が得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
以上のように、本発明の癌遺伝子治療薬は、ほぼ全ての悪性腫瘍に適用することができ、卵巣癌、扁平上皮癌（子宮頚部癌、皮膚癌、頭頚部癌、食道癌、肺癌等）、消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌、胃癌等）、神経芽細胞腫、脳腫瘍、乳癌、精巣癌、前立腺癌など各種癌に対する強力な抗腫瘍効果が期待できる。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月11日(2005.8.11)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞は以下の（１）〜（３）の細胞から選ばれる、癌遺伝子治療薬。
（１）Ａ５４９細胞
（２）ＳＷ６２６細胞
（３）ＨＴ−３細胞
【請求項２】上記キャリアー細胞に感染させるオンコリティックウイルスは、治療対象の癌の種類等に応じて、１Ａ１．３Ｂプロモーター、ミッドカインプロモーター、Ｂ−ＨＣＧプロモーター、ＳＣＣＡ１プロモーター、ｃｏｘ−２プロモーター、ＰＳＡプロモーター、又はその他の腫瘍特異的プロモーターを有する、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項３】上記オンコリティックウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶウイルス等のレンチウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はその他のオンコリティックウイルスから選ばれる、請求項１又は２記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項４】さらに、キャリアー細胞投与に対する生体のＣＴＬ反応を誘導するために投与される免疫処置用ウイルスを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項５】さらに、アテロコラーゲンを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項６】さらに、投与前にキャリアー細胞に感染させるＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項７】さらに、鉄剤および／又はポルフィリン化合物を備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項８】さらに、腫瘍免疫のため投与される腫瘍細胞を備えた、請求項１記載の癌遺伝子治療薬。
【請求項９】オンコリティックウイルスを感染させ、同ウイルスを腫瘍細胞に作用させるためのキャリアー細胞を含み、当該キャリアー細胞にはＡ５４９細胞と２９３細胞とが併用される、癌遺伝子治療薬。




【国際調査報告】
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