(57)【要約】本発明の課題は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤を提供することである。そして本発明の殺センチュウ剤は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養濾液を必要に応じてｐＨ７以下にしてから水と分離する第１の有機溶媒で分配抽出し、得られる第１有機溶媒抽出画分をアルカリ性水溶液で分配抽出し、得られるアルカリ性水溶液抽出画分をｐＨ７以下にしてから水と分離する第２有機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。また、本発明の殺センチュウ剤は、ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とするものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養濾液を必要に応じてｐＨ７以下にしてから水と分離する第１の有機溶媒で分配抽出し、得られる第１有機溶媒抽出画分をアルカリ性水溶液で分配抽出し、得られるアルカリ性水溶液抽出画分をｐＨ７以下にしてから水と分離する第２有機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とする殺センチュウ剤。
【請求項２】
センチュウがマツノザイセンチュウであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤。
【請求項３】
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス  メリウス  ＪＡＭ４０２２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  ＪＡＭ４０２２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２６）であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤。
【請求項４】
第１の有機溶媒と第２の有機溶媒がいずれも酢酸エチルであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤。
【請求項５】
ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とする殺センチュウ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤に関する。
【背景技術】  マツノマダラカミキリを媒介昆虫として松に寄生するマツノザイセンチュウ、キュウリやキャベツに寄生するネコブセンチュウ、ジャガイモに寄生するシストセンチュウなどに対する種々の殺センチュウ剤が開発されて市販されている。
例えば、特公平２−３２２５１号公報には、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）などに属する菌またはその代謝産物を用いたセンチュウの駆除方法が提案されており、アスペルギルス属に属する菌としてアスペルギルス  メリウス  ＪＡＭ４０２２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  ＪＡＭ４０２２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２６）などが記載されている。しかしながら、この特許文献では、菌の代謝産物に関しては配糖体の存在が示唆されているに過ぎず、菌の培養液からの殺センチュウ活性を有する成分の抽出・精製については検討がなされていない。
そこで本発明は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤を提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記の点に鑑みてなされた本発明の殺センチュウ剤は、請求の範囲第１項記載の通り、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養濾液を必要に応じてｐＨ７以下にしてから水と分離する第１の有機溶媒で分配抽出し、得られる第１有機溶媒抽出画分をアルカリ性水溶液で分配抽出し、得られるアルカリ性水溶液抽出画分をｐＨ７以下にしてから水と分離する第２有機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求の範囲第２項記載の殺センチュウ剤は、請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤において、センチュウがマツノザイセンチュウであることを特徴とする。
また、請求の範囲第３項記載の殺センチュウ剤は、請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤において、アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス  メリウス  ＪＡＭ４０２２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  ＪＡＭ４０２２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２６）であることを特徴とする。
また、請求の範囲第４項記載の殺センチュウ剤は、請求の範囲第１項記載の殺センチュウ剤において、第１の有機溶媒と第２の有機溶媒がいずれも酢酸エチルであることを特徴とする。
また、本発明の殺センチュウ剤は、請求の範囲第５項記載の通り、ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とする。
本発明によれば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例の実験例における殺マツノザイセンチュウ活性を有する成分の抽出工程図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の殺センチュウ剤は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養濾液を必要に応じてｐＨ７以下にしてから水と分離する第１の有機溶媒で分配抽出し、得られる第１有機溶媒抽出画分をアルカリ性水溶液で分配抽出し、得られるアルカリ性水溶液抽出画分をｐＨ７以下にしてから水と分離する第２有機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。また、本発明の殺センチュウ剤は、ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とするものである。ペニシリン酸（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｃ  ａｃｉｄ、３−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｏｘｏ−２，５−ｈｅｘａｄｉｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の生物活性については、抗細菌活性や抗カビ活性や抗ウイルス活性などが知られているが、殺センチュウ活性についてはこれまでに報告された例はない。
本発明において、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌としては、アスペルギルス  メリウス  ＪＡＭ４０２２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  ＪＡＭ４０２２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２６）を好適に用いることができるが、この他、アスペルギルス  パラシティクス  ＪＡＭ４００２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ  ＪＡＭ４００２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２４）、アスペルギルス  タマリ  ＪＡＭ４００７（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉｉ  ＪＡＭ４００７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２３）、アスペルギルス  フミガタス  ＪＡＭ４００８（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  ＪＡＭ４００８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７）、アスペルギルス  ニガー  ＪＡＭ４０５４（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＪＡＭ４０５４，ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３００）、アスペルギルス  ニガー  ＪＡＭ４０５５（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＪＡＭ４０５５，ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３０１）などを用いることもできる。なお、ＪＡＭとは、株式会社応微研の菌株分類記号を意味する（ＪＡＰＡＮＡＰＰＬＩＤＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳの略称）。
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養濾液から有機酸性画分抽出物を得るための具体的な操作は、有機酸を含有する酸性画分抽出物を抽出・精製するための一般的な方法に則って行えばよい。第１の有機溶媒と第２の有機溶媒として用いることができる水と分離する有機溶媒としては酢酸エチルを好適に用いることができる。アルカリ性水溶液としては飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を好適に用いることができる。培養濾液やアルカリ性水溶液抽出画分をｐＨ７以下に調整する際には塩酸を用いて行えばよい。
殺センチュウ活性を指標にして、得られた有機酸性画分抽出物を、天然有機化合物の単離・精製のために通常採用されるカラムクロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー法などによってさらに分画してもよい。本発明の殺センチュウ剤は、このようにしてさらに分画された複数成分からなる有機酸性画分抽出物や個々に単離・精製されたペニシリン酸などの有機化合物を有効成分とするものも包含する。なお、本発明の殺センチュウ剤の有効成分としてペニシリン酸を用いる場合、ペニシリン酸は有機酸性画分抽出物から単離・精製されるものに限られず、化学合成などにより得られるものであってもよい。
本発明の殺センチュウ剤は、有効成分を任意の量で含有し、公知の担体や添加剤を用いて粉剤や液剤などの各種の剤型に製剤化されて実用に供される。担体としては、液体担体と固体担体のいずれもがその使用目的に応じて用いることができる。液体担体としては水、アルコール類、ケトン類、エーテル類などが挙げられる。固体担体としては鉱物性粉末、アルミナ、硫黄粉末、活性炭などが挙げられる。添加剤としては、乳化剤、懸濁剤、安定剤、展着剤、浸透剤、分散剤などが挙げられる。その使用量は、その剤型、被害状況、適用方法、適用場所などに応じて適宜決定することができる。
本発明の殺センチュウ剤は、マツノザイセンチュウに対して効果を発揮する他、ネコブセンチュウ、シストセンチュウ、キタネグサレセンチュウなどに対してもその効果が期待される。なお、本発明の殺センチュウ剤は、殺センチュウ活性を有するその他の有効成分を含有していてもよい。
【実施例】  以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定して解釈されるものではない。なお、この実施例は、本発明の殺センチュウ剤を殺マツノザイセンチュウ剤として用いることを想定して行ったものである。
実験例：
アスペルギルス  メリウス  ＪＡＭ４０２２（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  ＪＡＭ４０２２，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２６）をシャーレ内の固体培地としてのＰＤＡ培地（日水製薬社製ＰＤＡ培地３９重量部、蒸留水１０００重量部）に接種し、十分な量の分生子が発生するまで２５℃にて２週間培養した。その後、この固体培地上に滅菌蒸留水を注ぎ、培地表面に生成された培養物が液中に懸濁するように攪拌して懸濁液を得た。続いて、液体麦芽培地〔モルトエキス（オリエンタル酵母工業社製）３０重量部、ペプトン（極東製薬社製）３重量部、グルコース２０重量部、蒸留水１０００重量部〕にこの懸濁液を加え、２４℃にて２８日間暗所にて培養した。
得られた培養液から殺マツノザイセンチュウ活性を有する成分を以下のようにして抽出・精製した。なお、以下の説明中、液体の混合比は体積比を表す。
得られた培養液を濾紙（Ｎｏ．５）を用いて濾過し、培養濾液と残渣（菌体）とに分離した。
得られた培養濾液に２Ｎ塩酸を加えてｐＨ２〜３に調整し、この培養濾液と酢酸エチルを１：３の比率で分液漏斗を用いて振とう抽出した後、静置して上層の酢酸エチル抽出画分と下層の塩酸水溶液画分を得た。下層の塩酸水溶液画分に対して新たに酢酸エチルを上記と同様の比率で加え、同様の操作を２回繰り返し、それぞれ酢酸エチル抽出画分を得た。得られた抽出３回分の酢酸エチル抽出画分を混合して第１酢酸エチル抽出画分を得た。
この第１酢酸エチル抽出画分、塩酸水溶液画分のブタノール抽出画分、残渣（菌体）のアセトン抽出画分について殺マツノザイセンチュウ活性を調べたところ、第１酢酸エチル抽出画分に強い活性が認められたので、この第１酢酸エチル抽出画分についてさらに抽出・精製を進めた。
第１酢酸エチル抽出画分のさらなる抽出・精製を進めるにあたり、培養液を大量に準備した。すなわち、上記の液体麦芽培地３０Ｌを５００ｍＬずつ１２０個のフラスコに分注し、上記と同様にして得た懸濁液をフラスコ各々に０．１ｍＬずつ加えて培養し、得られた培養液を上記と同様に処理して、第１酢酸エチル抽出画分を得た。
第１酢酸エチル抽出画分と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を１：１の比率で分液漏斗を用いて振とう抽出した後、静置して上層の酢酸エチル画分と下層の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液抽出画分を得た。
飽和炭酸水素ナトリウム水溶液抽出画分に２Ｎ塩酸を加えてｐＨ２〜３に調整し、この酸性水溶液画分と酢酸エチルを１：３の比率で分液漏斗を用いて振とう抽出した後、静置して上層の酢酸エチル抽出画分と下層の塩酸水溶液画分を得た。下層の塩酸水溶液画分に対して新たに酢酸エチルを上記と同様の比率で加え、同様の操作を２回繰り返して、それぞれ酢酸エチル抽出画分を得た。得られた抽出３回分の酢酸エチル抽出画分を混合することで第２酢酸エチル抽出画分を得、硫酸ナトリウムを用いて脱水した後、濃縮乾固して有機酸性画分抽出物として赤色の固形物５．５１ｇを得た。この有機酸性画分抽出物の殺マツノザイセンチュウ活性は、濃度５００ｐｐｍにおいて７．０％、濃度１０００ｐｐｍにおいて５０．０％であった。なお、上述の第１酢酸エチル抽出画分と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いた振とう抽出により分画された酢酸エチル画分について殺マツノザイセンチュウ活性を調べたところ、弱いながらも活性が認められた。
有機酸性画分抽出物を、Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００（和光純薬社製：内径３．５ｃｍ、長さ４０ｃｍ）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。溶媒はヘキサン−酢酸エチルを用い、これらの混合比を１００：０〜０：１００の間で１０ずつ変え、各混合比溶媒１Ｌずつを流し、溶出液を１Ｌずつ分取して濃縮乾固した。各溶出画分の濃縮乾固物うち、高い殺マツノザイセンチュウ活性を示し、また量が多かったものの活性を表１に示す。表１から明らかなように、３０％酢酸エチル溶出画分、４０％酢酸エチル溶出画分は濃度１０００ｐｐｍにおいても高い殺マツノザイセンチュウ活性を示した。よって、最も殺マツノザイセンチュウ活性が高く、かつ、濃縮乾固物量も多かった３０％酢酸エチル溶出画分を、以下のように２回目のカラムクロマトグラフィーに供した。
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上記の３０％酢酸エチル溶出画分を、Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−２００（和光純薬社製：内径２．０ｃｍ、長さ３５ｃｍ）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。溶媒はヘキサン−酢酸エチルを用い、これらの混合比を１００：０〜０：１００の間で５ずつ変え、各混合比溶媒１Ｌずつを流し、溶出液を５００ｍＬずつ分取して濃縮乾固した。各溶出画分の濃縮乾固物のうち、高い殺マツノザイセンチュウ活性を示し、また濃縮乾固物量が多かったものの性状と活性を表２に示す。表２から明らかなように、フラクション８、フラクション１１、フラクション１２が濃度１０００ｐｐｍにおいても高い殺マツノザイセンチュウ活性を示した。よって、これら３つのフラクションを、以下のように薄層クロマトグラフィーに供した。
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上記のフラクション８、フラクション１１、フラクション１２を、シリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌ  ６０  ＧＦ２５４、メルク社製）を用いた薄層クロマトグラフィーに供した。展開溶媒はフラクション１１にはヘキサン−アセトン（７：３）、フラクション８およびフラクション１２にはヘキサン−アセトン（６：４）を用いた。分画された各々のスポットを掻き取って抽出・分離し、それぞれ殺マツノザイセンチュウ活性と含有物質量を調べた。結果を表３に示す。表３から明らかなように、フラクション８においては、展開開始位置より１番目の画分（Ｒｆ値＝０．０１）および２番目の画分（Ｒｆ値＝０．１５）に高い殺マツノザイセンチュウ活性が認められた。フラクション１１においては、展開開始位置より２番目の画分（Ｒｆ値＝０．１４）が高い殺マツノザイセンチュウ活性を示すと共に、含有物質量が多かった。この２番目の画分はペニシリン酸であることを標準品と比較した薄層クロマトグラフィー、赤外線吸収スペクトル分析、核磁気共鳴スペクトル分析により同定した。フラクション１２においては、展開開始位置より１番目の画分（Ｒｆ値＝０．０１）、２番目の画分（Ｒｆ値＝０．０８）、３番目の画分（Ｒｆ値＝０．１９）、４番目画分（Ｒｆ値＝０．３４）で殺マツノザイセンチュウ活性が認められた。
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上記の殺マツノザイセンチュウ活性は次のようにして評価した。即ち、サンプル（濃縮乾固物）１０ｍｇに１００μＬ〜５００μＬのアセトンまたはメタノールを適宜加えて溶解または懸濁し、さらに精製水を用いて希釈して１００００ｐｐｍとして試験溶液の原液とした。この原液を試験濃度の２倍濃度に調製し、９６穴マイクロプレートの各ウェルに１００μＬずつ入れ、さらにマツノザイセンチュウの蒸留水懸濁液（４００〜１０００頭／ｍＬ）１００μＬを加え、２５℃、暗所にて１週間放置した後、各ウェル内のマツノザイセンチュウの生存数と死亡数とを顕微鏡観察により数え、その死亡率（％）［（死亡数）／（生存数＋死亡数）×１００］で表した（表１〜表３の死亡率は１濃度につき３連で試験した平均値で記載）。なお、マツノザイセンチュウが仮死状態である場合を想定して、上記のようにしてウェル内にてマツノザイセンチュウの死亡率を測定した後、各ウェル内の液をそれぞれチューブに移し、遠心分離して上清を取り除き、さらに蒸留水で２、３回洗浄した沈渣をセンチュウ計数板上に移した。顕微鏡観察によりマツノザイセンチュウの生存数と死亡数とを数え、上記と同様に死亡率を算出した。その結果としてマイクロプレートを用いて求められた死亡率とセンチュウ計数板を用いて求められた死亡率とはほとんど一致することを確認した。
実験例における抽出工程図を図１に示す。
製剤例：
ペニシリン酸１体積％水溶液を調製し、殺センチュウ剤（液剤）とした。
【産業上の利用可能性】  本発明は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【国際調査報告】
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