(57)【要約】式：2004083186.tif 000013［式中、Ｒ１は水素原子、リボフラノシル基を表す。Ｒ２は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。］で表される化合物またはその塩を含有する、インターフェロンとの併用投与による慢性Ｃ型肝炎治療剤及び制癌剤を提供する。
2004083186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
2004083186.tif 000012
［式中、Ｒ１は水素原子、窒素原子の保護基あるいは窒素原子の置換基を表し、Ｒ２は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。］で表される化合物またはその塩を有効成分とする、ウイルス性肝炎あるいは癌疾患に対するインターフェロンとの併用療法剤。
【請求項２】
Ｒ１の窒素原子の置換基が、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ−２−フリル基あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基であることを特徴とする、請求項１記載のインターフェロンとの併用療法剤。
【請求項３】
Ｒ１が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
インターフェロンがインターフェロン−αである請求項１〜３いずれか記載の剤。
【請求項５】
インターフェロンがスミフェロン、イントロンＡ、アドバフェロン、ペグイントロンまたはペガシスである請求項１〜４いずれか記載の剤。
【請求項６】
インターフェロンがインターフェロン−βである請求項１〜３いずれか記載の剤。
【請求項７】
前記ウイルス性肝炎がＣ型慢性肝炎である請求項１〜６いずれか記載の剤。
【請求項８】
前記癌が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、表在性膀胱癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌や食道癌である請求項１〜６いずれか記載の剤。
【請求項９】
式（１）で表される化合物（式中、Ｒ１とＲ２の定義は前述の通りである。）またはその塩を有効成分とする、免疫活性化剤。
【請求項１０】
細胞性免疫活性化を特徴とする請求項９記載の剤。
【請求項１１】
インターフェロン−γ産生誘導（産生増強）を特徴とする請求項９または１０記載の剤。
【請求項１２】
Ｒ１の窒素原子の置換基が、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ−２−フリル基あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基であることを特徴とする、請求項９〜１１いずれか記載の剤。
【請求項１３】
Ｒ１が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする請求項９〜１２いずれか記載の剤。
【請求項１４】
Ｒ２が水素原子であることを特徴とする請求項９〜１３いずれか記載の剤。
【請求項１５】
請求項１０〜１４いずれか記載の製剤であって、投与後の血中濃度が１０μＭ以下になるように投与することを特徴とする、経口投与用製剤。
【請求項１６】
投与後の血中濃度が１μＭ〜８μＭになるように経口投与されることを特徴とする、請求項１５記載の経口投与用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ウイルス性肝炎あるいは癌疾患に対するインターフェロンとの併用療法剤に関する。
【背景技術】  肝炎の治療方法の主流として、例えばＣ型慢性肝炎に対しては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の排除及び肝機能改善を主体とした治療が進められている。特にその中で、ＨＣＶの排除及び肝機能改善作用を併せ持つインターフェロンによるＣ型慢性肝炎治療は、ウイルスを排除する唯一の治療法とされるが、ＨＣＶの完全排除効率は２０〜３０％程度と低く、近年ではリバビリンやアマンタジン等によるインターフェロン併用療法が進められている。インターフェロンの作用は、感染細胞に直接働く抗ウイルス作用と宿主免疫の賦活化作用に大別される。
インターフェロンによる抗ウイルス作用は、インターフェロンレセプターを介したシグナル伝達によって生じ、抗ウイルス因子の産生を誘導することによってＨＣＶのＲＮＡの分解や翻訳阻害等を促進する。また、インターフェロンによる免疫の活性化は、細胞性免疫や液性免疫の活性化による生体の抗ウイルス状態の活性化及び維持に関わる。ＨＣＶに対するインターフェロン療法では、ＨＣＶの血清型、ウイルス量、組織学的な進行度等の患者背景により、その治療効果に差が生じる。特にジェノタイプＩ型や高ウイルス血症の症例においてその改善効果は低く、ウイルスの排除率も低いことが知られている。この排除率の低さは、ウイルス側の因子と患者の免疫的な背景因子が関与していると考えられている。
インターフェロンに対して、抵抗性を示す患者に対しては、グリチルリチン製剤やインターフェロン等の免疫調節剤による肝機能改善が試みられているが、グリチルリチン製剤投与終了後は速やかに肝機能が悪化する等、インターフェロン抵抗性Ｃ型慢性肝炎に対する肝細胞発癌抑制は達成されていないのが現状である。
現在、最も有効な療法としてインターフェロンやペグ化インターフェロンとリバビリンとの併用であるが、インターフェロンとリバビリンによる１年間の併用治療でもウイルスの完全排除率は５０％程度であり、依然としてその有効性は完全ではない（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋａｋｉｂｙｏ  Ｇａｋｋａｉ  Ｚａｓｓｈｉ．１９９５；９２：１９２９−１９３６）。また、インターフェロンが奏効しにくいと考えられるＨＣＶのジェノタイプ１型に対して依然として５０％以下の奏効率しか期待できない。また、ジェノタイプ１型に感染した難治性の高ウイルス症例に対する奏功率は４０％程度であり、臨床上の治療効果としては未だ不十分である。また、リバビリンは高い体内蓄積性により溶血性貧血が多発することが報告されている（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００２；３４７：９７５−９８２）。
インターフェロンは、癌に対する療法としても進められているが、その投与はインターフェロン単剤では慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキン悪性リンパ腫、腎細胞癌など、インターフェロンと化学療法剤等との併用では肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、表在性膀胱癌などの限られた癌に限られている（Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．２０００；１７９：３６７−３７１、Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １９９８；３５：５６−６２、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２；２５：３９１−３９７）。その効果はインターフェロンによる細胞増殖抑制作用と細胞性免疫の活性化作用によるものであると考えられているが、治療効果は満足なものとは言えない。
従って、細胞性免疫を活性化し、インターフェロンの抗ウイルス作用を増強し、且つ体内蓄積性等の問題のない安全性の高い薬剤が見いだされれば、Ｃ型慢性肝炎に非常に有用であるだけでなく、癌に対しても有効な薬となる可能性が高い。
【発明の開示】
本発明の目的は、インターフェロンと併用することにより肝炎ウイルス消失率及び癌細胞排除率、特にＣ型肝炎ウイルス消失率および慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、肝細胞癌や胃癌等の癌細胞排除率を向上させ、且つ体内蓄積性がなく安全性の高い化合物を提供することにある。
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、式（１）で表される化合物がインターフェロンと併用することによって、抗ウイルス作用を増強することを見いだした。更に、当該抗ウイルス作用増強作用の至適濃度域が化合物のインターフェロン−γ産生を誘導（産生増強）する濃度域と一致することを新たに見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は式（１）
2004083186.tif 000003
［式中、Ｒ１は水素原子、窒素原子の保護基あるいは窒素原子の置換基を表し、Ｒ２は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。］で表される化合物またはその塩を有効成分として含有する、ウイルス性肝炎及び癌疾患に対して有効で安全なインターフェロンとの併用剤に関する。
本発明の要旨は、下記（１）−（４９）の点にある。
（１）  式（１）
2004083186.tif 000004
で表される化合物（式中、Ｒ１およびＲ２は前述と同じ意味を表す。）またはその塩を有効成分とする、ウイルス性肝炎あるいは癌疾患に対するインターフェロンとの併用療法剤、
（２）Ｒ１の窒素原子の置換基が、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ−２−フリル基あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基であることを特徴とする、（１）記載のインターフェロンとの併用療法剤、
（３）Ｒ１が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする（１）または（２）記載の剤、
（４）Ｒ２が水素原子であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の剤、
（５）インターフェロンがインターフェロン−αである（１）〜（４）いずれか記載の剤、
（６）インターフェロンがインターフェロン−αｎ１である（１）〜（４）いずれか記載の剤、
（７）インターフェロンがスミフェロン、イントロンＡ、アドバフェロン、ペグイントロンまたはペガシスである（１）〜（４）いずれか記載の剤、
（８）インターフェロンがインターフェロン−βである（１）〜（４）いずれか記載の剤、
（９）前記剤が、１回の投与量が１０ｍｇ〜３００ｍｇであって、１日に１〜３回投与されることを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１０）前記剤が、１回の投与量が２０ｍｇ〜１００ｍｇであって、１日に１〜３回投与されることを特徴とする（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１１）前記剤が濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１２）前記剤が濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１３）前記剤が血中濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１４）前記剤が血中濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（１）〜（８）いずれか記載の剤、
（１５）前記ウイルス性肝炎がＣ型慢性肝炎である（１）〜（１４）いずれか記載の剤、
（１６）前記癌が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、表在性膀胱癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌や食道癌である（１）〜（１４）いずれか記載の剤、
（１７）式（１）で表される化合物（式中のＲ１とＲ２の定義は前述の通りである。）またはその塩を有効成分とする、インターフェロンと併用することを特徴とする抗肝炎ウイルス剤、
（１８）前記肝炎ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、上記（１７）記載の剤、
（１９）Ｒ１の窒素原子の置換基が、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ−２−フリル基あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基であることを特徴とする、（１７）または（１８）記載の剤、
（２０）Ｒ１が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする（１７）〜（１９）いずれか記載の剤、
（２１）Ｒ２が水素原子であることを特徴とする上記（１７）〜（２０）いずれか記載の剤、
（２２）インターフェロンがインターフェロン−αである（１７）〜（２１）いずれか記載の剤、
（２３）インターフェロンがインターフェロン−αｎ１である（１７）〜（２１）いずれか記載の剤、
（２４）インターフェロンがスミフェロン、イントロンＡ、アドバフェロン、ペグイントロンまたはペガシスである（１７）〜（２１）いずれか記載の剤、
（２５）インターフェロンがインターフェロン−βである（１７）〜（２１）いずれか記載の剤、
（２６）前記剤が、１回の投与量が１０ｍｇ〜３００ｍｇであって、１日に１〜３回投与されることを特徴とする（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（２７）前記剤が、１回の投与量が２０ｍｇ〜１００ｍｇであって、１日に１〜３回投与されることを特徴とする（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（２８）前記剤が濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（２９）前記剤が濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（３０）前記剤が血中濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（３１）前記剤が血中濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（１７）〜（２５）いずれか記載の剤、
（３２）ウイルス性肝炎患者にインターフェロンを投与すると共に、上記（１７）〜（３１）いずれかの抗肝炎ウイルス剤を併用することからなるウイルス性肝炎の治療方法、
（３３）ウイルス性肝炎がＣ型肝炎である、上記（３２）記載の治療方法、
（３４）上記（１７）〜（３１）いずれかの化合物を経口投与すると共に、インターフェロンを皮下投与することによる上記（３２）または（３３）に記載の治療方法。
（３５）式（１）で表される化合物（式中、Ｒ１とＲ２の定義は前述の通りである。）またはその塩を有効成分とする、免疫活性化剤、
（３６）細胞性免疫活性化を特徴とする（３５）記載の剤、
（３７）インターフェロン−γ産生誘導（産生増強）を特徴とする（３５）または（３６）記載の剤、
（３８）Ｒ１の窒素原子の置換基が、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−５−ヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−テトラヒドロ−２−フリル基、３−ヒドロキシメチル−４、５−ジヒドロキシ−５−メチル−テトラヒドロ−２−フリル基あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基であることを特徴とする、（３５）〜（３７）いずれか記載の剤、
（３９）Ｒ１が水素原子あるいはリボフラノシル基であることを特徴とする（３５）〜（３８）いずれか記載の剤、
（４０）Ｒ２が水素原子であることを特徴とする上記（３５）〜（３９）いずれか記載の剤、
（４１）前記剤が濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（３５）〜（４０）いずれか記載の剤、
（４２）前記剤が濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（３５）〜（４０）いずれか記載の剤、
（４３）前記剤が血中濃度１０μＭ以下で活性を示すという特徴を有するものである、（３５）〜（４０）いずれか記載の剤、
（４４）前記剤が血中濃度１μＭ〜８μＭで活性を示すという特徴を有するものである、（３５）〜（４０）いずれか記載の剤、
（４５）（３５）〜（４０）いずれか記載の製剤であって、投与後の血中濃度が１０μＭ以下になるように投与することを特徴とする、経口投与用製剤、
（４６）投与後の血中濃度が１μＭ〜８μＭになるように経口投与されることを特徴とする、（３５）〜（４０）いずれか記載の経口投与用製剤、
（４７）ウイルス性肝炎患者に、上記（３５）〜（４６）いずれか記載の剤を投与することからなるウイルス性肝炎の治療方法、
（４８）ウイルス性肝炎がＣ型肝炎である、上記（４７）の治療方法、
（４９）癌疾患患者に、上記（３５）〜（４６）いずれか記載の剤を投与することからなる癌疾患の治療方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、ミゾリビンがインターフェロン−γを誘導することを示す図である。脾細胞は無感作マウスから調製し、培養上清にはスーパー抗原であるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ）を４００ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。培養液にミゾリビンを添加することによって刺激を加え、４８時間培養後、培養上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡ法により測定した。
図２は、ミゾリビン投与時の体内動態を示す。
（Ａ）は、１回５０ｍｇ、１日３回投与時の体内動態であり、（Ｂ）は、１回１００ｍｇ、１日３回投与時の体内動態をしめす。
図３は、ＨＬＢＩ投与によるＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡの測定結果である。
図４は、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ（ＲＢＶ）と天然型インターフェロン−αの併用によるレプリコンＲＮＡの抑制効果を示す。
図５は、Ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ（ＭＩＺ）と天然型インターフェロン−αの併用によるレプリコンＲＮＡの抑制効果を示す。
図６は、ＳＭ−１０８と天然型インターフェロン−αの併用によるレプリコンＲＮＡの抑制効果を示す。
図７は、天然型インターフェロン−αの併用によるレプリコンＲＮＡの抑制効果を示す。リアルタイムＰＣＲ法によって２回測定されたコピー数の平均値とレプリコンＲＮＡの減少量（％）を示している。リバビリン及びミゾリビンは２回、ＳＭ−１０８は１回の実験の結果を示している。
図８は、ＨＬＢＩとリバビリン併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各レーンのサンプルは、１；＃５０−１細胞、２〜７；ＨＬＢＩ  ３ＩＵ／ｍｌ＋リバビリン（２；０μＭ、３；１μＭ、４；３μＭ、５；５μＭ、６；１０μＭ、７；２０μＭ）である。
（Ａ）１％アガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。（Ｂ）ＨＣＶ  ＲＮＡを検出するプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はレプリコンＲＮＡである）。（Ｃ）Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出プローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡである）。
図９は、ＨＬＢＩとミゾリビン併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各レーンのサンプルは、１；＃５０−１細胞、２〜７；ＨＬＢＩ  ３ＩＵ／ｍｌ＋ミゾリビン（２；０μＭ、３；１μＭ、４；３μＭ、５；５μＭ、６；１０μＭ、７；２０μＭ）である。
（Ａ）１％アガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。（Ｂ）ＨＣＶ  ＲＮＡを検出するプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はレプリコンＲＮＡである）。（Ｃ）Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出プローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡである）。
図１０は、ＨＬＢＩとＳＭ−１０８併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各レーンのサンプルは、Ｎ．Ｃ．；Ｈｕｈ−７細胞、１；＃５０−１細胞、２〜７；ＨＬＢＩ  ３ＩＵ／ｍｌ＋ＳＭ−１０８（２；０μＭ、３；１μＭ、４；３μＭ、５；５μＭ、６；１０μＭ、７；２０μＭ）である。
（Ａ）１％アガロースゲル電気泳動による泳動パターンを示した図である。（Ｂ）ＨＣＶ  ＲＮＡを検出するプローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はレプリコンＲＮＡである）。（Ｃ）Ｇ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡを検出プローブを用いたノーザンハイブリダイゼーションの結果である（矢印はＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡである）。
図１１は、ノーザンハイブリダイゼーション解析によるＨＬＢＩとリバビリン併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各リバビリン添加量におけるＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量に対するレプリコンＲＮＡの比を示す。
図１２は、ノーザンハイブリダイゼーション解析によるＨＬＢＩとミゾリビン併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各ミゾリビン添加量におけるＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量に対するレプリコンＲＮＡの比を示す図である。
図１３は、ノーザンハイブリダイゼーション解析によるＨＬＢＩとＳＭ−１０８併用によるレプリコンＲＮＡの消失効果を示す。各ＳＭ−１０８添加量におけるＧ３ＰＤＨ遺伝子発現量に対するレプリコンＲＮＡの比を示す図である。
図１４は、スミフェロン、ミゾリビンおよびＳＭ−１０８の単独あるいは併用した場合の抗ＢＶＤＶ活性を示す（縦軸は細胞増殖の度合いを示し、値が大きいほど薬剤処理により細胞が抗ウイルス効果を示して増殖していることを示す）。
（Ａ）は、スミフェロン３０ＩＵ／ｍｌ、ミゾリビンおよびＳＭ−１０８は０．１２μＭ、（Ｂ）はスミフェロン１０ＩＵ／ｍｌ、ミゾリビンおよびＳＭ−１０８は０．０８μＭ、で単独あるいは併用した場合の結果を示している。
図１５は、スミフェロン、アドバフェロンあるいはイントロンＡを、ミゾリビンあるいはＳＭ−１０８と併用した場合の抗ＢＶＤＶ活性を示す。
（Ａ）は、スミフェロンあるいはアドバフェロン１ＩＵ／ｍｌ、ミゾリビン１．８８μＭを、（Ｂ）は、スミフェロンあるいはアドバフェロン１０ＩＵ／ｍｌ、ミゾリビン１．８８μＭを、単独あるいは併用した場合の結果を示している。（Ｃ）はインターフェロン−αとしてスミフェロン、イントロンＡあるいはアドバフェロンのそれぞれ１０ＩＵ／ｍｌ、およびＳＭ−１０８の７．５μＭを単独あるいは併用した場合の結果を示している。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の第１の態様は、一般式（１）で表される化合物またはそれらの塩に関するインターフェロンとの併用療法剤である。
2004083186.tif 000005
［式中、Ｒ１は水素原子、窒素原子の保護基あるいは窒素原子の置換基を表し、Ｒ２は水素原子あるいは水酸基の保護基を表す。］
本発明化合物のＲ１で示される置換基として、例えば水素原子、リボフラノシル基、２−ヒドロキシエトキシメチル基、２−ヒドロキシメチル−１、３−オキサチオラン−５−イル基、４−ヒドロキシメチル−２−シクロプロペニル基、［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ］メチル基、テトラヒドロ−２−フリル基、ｎ−ヘキシルカルバモイル基、３−ヒドロキシメチル−テトラヒドロ−２−フリル基、あるいは３−ヒドロキシメチル−４−アジド−テトラヒドロ−２−フリル基が挙げられ、なかでも水素原子、リボフラノシル基が好ましいものとして挙げることができる。
本発明化合物のＲ１で示される保護基として、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等の置換または無置換のアルコキシカルボニル基、例えばｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基等の置換または無置換のアリルオキシカルボニル基等が挙げられる。また、生体内で脱保護される保護基も使用可能であり、状況に応じて使用することができる。
本発明化合物のＲ２で示される置換基として、水素原子あるいは水酸基の保護基が挙げられる。ここで、水酸基の保護基とは、例えば日本化学会実験化学講座（丸善）に記載のものが挙げられ、化学的あるいは生物学的に切断されて水酸基に戻ることができる保護基を言う。例えば、アセチル基、ベンゾイル基等のアシル基を挙げることができる。
さらに、抗ウイルス活性を持つカルボキシル基を持つ化合物と縮合して、エステル結合を形成して保護することもできる。例えば、カルボキシル基を持つ化合物がＪＴＫ−００３やＢＩＬＮ−２０６１のようなＨＣＶ  ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤であってもよい。
上記塩としては、薬学的に許容される塩が挙げられ、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ‘−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
本発明において上記一般式（１）のＲで示される置換基がリボフラノシル基である化合物はミゾリビンとして、水素原子である化合物はＳＭ−１０８として公知である。
ミゾリビンは腎拒絶反応や慢性関節リウマチ等に対する薬剤として上市されているが、溶血性貧血等の重篤な副作用は、臨床上殆ど現れていない。ミゾリビンは、特定の癌細胞細胞に対して、増殖抑制作用を有すること（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９７５；３５：１６４３−１６４８）、抗ウイルス作用を有すること（Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇ  ２０００；９：２２１−２３５、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｃｈｅｍｉ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９４；５：３６６−３７１、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９９３；１６８：６４１−６４）が示されている。免疫に関する作用として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、免疫の刺激応答は維持されるが（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．１９９２；２４：２８４５−２８４６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８７：９４０−９４８）、Ｔ細胞やＢ細胞の増殖を抑制することが知られており（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８７：９４０−９４８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１５５：５１７５−５１８３、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１２０：４４８−４５３）、低濃度での免疫を活性化する作用については知られていない。また、ミゾリビン添加により、ＩＭＰＤＨ−２型遺伝子の発現誘導が生じることが報告されている（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００１；１４２：１９３−２０４）。ミゾリビンの血中半減期は、２時間程度と報告され、蓄積性の無い薬剤である（リウマチ科  １９９１；５：２８７−３００）。
ＳＭ−１０８は、ミゾリビンの活性体のプロドラッグであり、アデニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼによって、ミゾリビンに変換される化合物である（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８２；４２：１０９８−１１０２）。慢性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、真性多血症等の造血器腫瘍や肺癌に対する単剤投与で臨床効果が認められ、制癌剤としては極めて安全性が高い薬剤であることが報告されている（癌と化学療法１９８９；１６：１２３−１３０、癌と化学療法１９８９；１６：１１３−１２１）。
ミゾリビン及びＳＭ−１０８においては、ＨＣＶに対する抗ウイルス作用やウイルス感染細胞の排除能があるかについて、Ｃ型慢性肝炎に投与されたことがなく、その有効性については不明である。また、インターフェロンとの併用で検討がなされたこともない。
本発明におけるウイルス性肝炎とは、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）やＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等のウイルス感染による肝炎、すなわちＣ型肝炎、Ｂ型肝炎などをいう。ウイルス性肝炎は、急性肝炎、劇症肝炎または慢性肝炎であってもよく、慢性肝炎は肝硬変を伴っていてもよい。ウイルス性肝炎は、好ましくは、Ｃ型慢性肝炎やＢ型慢性活動性肝炎を挙げることができるが、より好ましくはＣ型慢性肝炎である。
Ｃ型肝炎ウイルスには、例えば、ジェノタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ等の遺伝子型が存在するが、これらＨＣＶの遺伝子型に限定されない。
本発明における癌疾患とは、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、皮膚Ｔリンパ腫を代表とする造血器系腫瘍や肝細胞癌、胃癌、表在性膀胱癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌、メラノーマ、ＡＩＤＳに伴うカポジ肉腫を代表とする固形癌を挙げることができるが、好ましくは慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、表在性膀胱癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌や食道癌である。
本発明におけるインターフェロン（ＩＦＮ）とは、天然型ＩＦＮまたは遺伝子組換型ＩＦＮであり、天然型ＩＦＮはリンパ芽球由来、白血球由来等の何れでもよく、ＩＦＮの型としてはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βやＩＦＮ−ω等が挙げられる。ＩＦＮは、当該天然型ＩＦＮと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失および／または付加された改変体、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法等によりスクリーニングされた改変体、糖鎖が置換、欠失および／または付加された改変体であってもよく、また同様に、ＰＥＧ化ＩＦＮやアルブミン付加ＩＦＮ等の持続性インターフェロン剤や組織吸収性や組織移行性を高めたＩＦＮのＤＤＳ製剤であってもよい。好ましくは、天然型もしくは遺伝子組換型ＩＦＮ−α、天然型もしくは遺伝子組換型ＩＦＮ−β、コンセンサスＩＦＮ、ＰＥＧ化ＩＦＮを挙げることができる。前記ＩＦＮは、公知の市販のＩＦＮを使用することができる。
インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）とは、例えば、天然型ＩＦＮ−α、組換えＩＦＮ−α２ａおよび組換えＩＦＮ−α２ｂ等を挙げることができ、ＩＦＮ−αであればいかなるサブタイプでもよい。具体的には、例えば、天然型ＩＦＮ−αのＩＦＮ−αｎ１であるスミフェロン（住友製薬）、オーアイエフ（大塚製薬）およびＩＦＮ−αモチダ（持田製薬）、組換えＩＦＮ−α２ａであるキャンフェロンＡ（武田薬品）やロフェロンＡ（中外製薬）および組換えＩＦＮ−α２ｂであるイントロンＡ（シェリング・プラウ）等を挙げることができるが、これらに何ら限定されるものではない。
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）とは、例えば、天然型ＩＦＮ−βや組換えＩＦＮ−β等を挙げることができるが、ＩＦＮ−βであればいかなるタイプでもよい。具体的には、例えば、天然型ＩＦＮ−βであるＩＦＮβモチダ（持田製薬）やフエロン（東レ）、組換えＩＦＮ−β１ｂであるベタフェロン（日本シェーリング）等を挙げることができるが、これらに何ら限定されるものではない。
コンセンサスインターフェロン（コンセンサスＩＦＮ）とは、コンセンサスシークエンス理論に基づいて新たに開発されたＩＦＮであり、例えばインターフェロンアルファコン−１を挙げることができるが、これに限定されるものではない。インターフェロンアルファコン−１としては、アドバフェロン（山之内製薬）が挙げられる。
持続性インターフェロン剤とは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、マイクロ粒子やナノ粒子、アテロコラーゲン、シリコンその他の徐放性担体を用いて持続性を向上させたインターフェロン製剤のことであり、ＰＥＧ化ＩＦＮとは、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）をＩＦＮ蛋白分子に結合させたものである。持続性インターフェロン剤とは、例えばＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ａやＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂを挙げることができるが、ＩＦＮの種類はこれらに限定されるものではない。具体的には、例えば、ＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ａであるペガシス（ロシュ）やＰＥＧ化ＩＦＮ−α２ｂであるペグイントロン（シェリング・プラウ）等を挙げることができる。
組織吸収性を高めたインターフェロンのＤＤＳ製剤とは、例えば、マイクロ粒子、ナノ粒子やその他の微粒子担体を用いて、経肺や経鼻等の投与による、肺、気管支、鼻粘膜等での吸収効率を向上させたインターフェロン製剤を挙げることができるが、組織吸収性を高めたインターフェロンＤＤＳ製剤であればよく、これらに何ら限定されるものではない。
組織移行性を高めたインターフェロンのＤＤＳ製剤とは、例えば、糖鎖をアシアロ化するなどの修飾により肝臓への親和性を高めたインターフェロン製剤等が挙げられるが、組織移行性を高めたインターフェロンのＤＤＳ製剤であればよく、これらに何ら限定されるものではない。
本発明におけるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、好ましくはスミフェロン、イントロンＡ、アドバフェロン、ペグイントロンおよびペガシス、特に好ましくはスミフェロン、イントロンＡおよびアドバフェロン、更に好ましくはスミフェロンが挙げられる。
本発明における投与とは、経口投与、非経口投与（直腸投与、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などを含む）等が挙げられるが、これに限定されない。投与は、より好ましくは経口投与が挙げられる。投与は、投与形態、患者の年齢、体重、症状、副作用の出現等により投与量、投与回数を適宜調整して投与することができる。
１回の投与量は、副作用を惹起する量以下であれば特に制限はないが、例えば１０ｍｇ〜５００ｍｇであり、好ましくは１０ｍｇ〜３００ｍｇ、更に好ましくは２０ｍｇ〜１００ｍｇであるが、これに限定されない。
投与回数は、例えば、１日に１〜３回が挙げられるが、これに限定されず、隔日や数日に１回投与でも良い。投与初期時には連日複数回投与、その後継続して連日複数回または１回投与ないしは数日に１回投与するのでもよい。
本発明における濃度とは、剤投与後の剤の血中濃度をいう。血中濃度とは、剤投与後の体内における剤の血液中の濃度であり、副作用を惹起する濃度以下で、且つ有効な濃度であれば特に制限はされない。血中濃度は、例えば１０μＭ以下であり、好ましくは１μＭ〜８μＭが挙げられる。
本発明における活性とは、抗ウイルス作用や免疫を活性化する作用であり、インターフェロンと併用することによって抗ウイルス作用を増強する作用およびウイルス感染細胞の排除能を増強する作用のことを言う。
本発明の第２の態様は、一般式（１）で表わされる化合物またはそれらの塩を有効成分とする免疫活性化剤である。
本発明における免疫活性化剤とは、免疫を活性化する作用を有する剤のことであり、細胞性免疫活性化剤とは、細胞性免疫を活性化する作用を有する剤のことである。細胞性免疫とは、免疫細胞自身が異物を攻撃排除する免疫機構であり、細胞内寄生菌、真菌、原虫などに対する殺作用といった細胞内寄生性の微生物の防御を担うほか、ウイルス感染細胞の破壊・除去や腫瘍細胞の破壊などに関わっており、自然免疫と獲得免疫がある。
本発明の第３の態様は、一般式（１）で表わされる化合物またはそれらの塩を有効成分とするインターフェロン−γ産生誘導（産生増強）剤である。
本発明におけるインターフェロン−γ産生誘導（産生増強）剤とは、血液中または／および生体組織内におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の濃度を上昇させる剤のことである。ＩＦＮ−γは、免疫細胞が認識する表面抗原提示に関与するＨＬＡクラスＩ抗原、ＨＬＡクラスＩＩ抗原、β２−ミクログロブリン、ＴＡＰ、ＬＭＰ等の分子の発現誘導による抗原特異的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化、免疫グロブリンＦｃレセプターの発現誘導によるエフェクター細胞による抗原特異的な獲得免疫を活性化、ＮＫ細胞の活性化、およびマクロファージの活性化等の作用を有する。そのため本剤は、例えば、細胞内寄生菌、真菌、原虫などの細胞内寄生性の微生物に対する殺作用、およびウイルス感染細胞や腫瘍細胞の破壊・除去作用等を示す剤として有効である。
本発明における式（１）で表される化合物またはその塩は、体内半減期が短く体内蓄積性もなく、インターフェロンとの組み合わせにより、ＨＣＶに対するインターフェロンの抗ウイルス作用を増強するため、動物とりわけ哺乳動物に対するウイルス性肝炎または癌疾患の治療剤として有用である。更に、本発明における式（１）で表される化合物またはその塩は、免疫応答を増強する作用を有するため、免疫活性化剤として有用である。
一般式（１）で表される化合物またはその塩は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）、慣用の添加剤などと混合した医薬組成物あるいは製剤（例えば、粉末、顆粒、錠剤、ピル剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、エマルジョン剤、エンキシル剤）として調製し、用いることができる。
【実施例】  次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【実施例１】ミゾリビンの免疫調節作用の解析
マウス（日本チャールス・リバー社）から脾細胞を調製し、培養液にミゾリビン（Ｓｉｇｍａ社）を添加することによって刺激を加え、４８時間培養後、培養上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡ法により測定した。コントロールとしてリバビリン（Ｓｉｇｍａ社）刺激を同様に行った。実験の手法・手順は、Ｔａｍ等の方法に準じて行った（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ．Ｃｈｅｍｏ．２０００；４４：１２７６−１２８３）。
（１）マウス脾細胞の調製
脾細胞は無感作マウスから調製した。マウス脾臓を摘出し、５ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地の入った６０ｍｍシャーレに移し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り壊した後、セルストレイナー（ＦＡＬＣＯＮ  ７０μｍ  Ｎｙｌｏｎ）を通して５０ｍｌ遠沈管に回収した。１，２００ｒｐｍ、５分間遠心し、細胞を回収した。脾細胞のペレットには溶血用ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）を加え、室温、５分間静置した後、２０ｍｌの培地を加え、セルストレイナーを通して５０ｍｌ遠沈管に回収した。
（２）スーパー抗原による刺激
培養上清にはスーパー抗原であるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ；Ｔｏｘｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を４００ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。ＳＥＢ１ｍｇにＰＢＳを２．５ｍｌ添加後、０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌し、４００ｎｇ／ｍｌの濃縮液を調製した。この溶液０．１ｍｌに１００ｍｌ  ＲＰＭＩ１６４０培地（１％  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１０％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，１０％  ＦＣＳ）を添加して、脾臓由来細胞ペレットを１０ｍｌ培地で２回、１，２００ｒｐｍ、５分、４℃の遠心洗浄後、ＳＥＢを含むＲＰＭＩ１６４０培地５ｍｌに懸濁後、細胞数を測定し、２×１０６個／ｍｌになるようにＳＥＢを含むＲＰＭＩ培地に懸濁して、２４ｗｅｌｌプレートに１ｍｌずつ添加した。
（３）ミゾリビンによる免疫応答の検討
各ウェルに１ｍＭミゾリビン溶液を培地に直接添加して３７℃で４８時間培養後、培養上清中のＩＦＮ−γを測定した。なお、ミゾリビン刺激濃度は０，１，２，５，１０，１５，２０μＭで行った。ミゾリビン（分子量２５９．２）は１０．３６８ｍｇをＰＢＳ  ４００μｌに溶解後、リバビリン（分子量２４４．２）は１２．２１ｍｇをＰＢＳ  ５００μｌに溶解後、０．２μｍフィルターで濾過滅菌後、１００ｍＭ溶液とし、ＰＢＳにより１０倍または１００倍に希釈して、実験に供された。
（４）ＩＦＮ−γの測定
ＩＦＮ−γは培養上清を１０μｌ用い、Ｇｅｎｚｔｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社のＡＮ’ＡＬＹＺＡ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  ｋｉｔにより測定した。吸光度の測定は、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ、モデル３５５０ＵＶ）を用いて４５０ｎｍの吸光度をエンドポイント法で測定した。ＳｏｆｔＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４−Ｐａｒａｍｅｔｅｒの回帰を行い、濃度を算出した。測定結果を図１に示した。
図１の結果により、インターフェロン−γの誘導作用は、１μＭから８μＭのミゾリビン濃度が適することが判明した。この濃度は、およそ０．２５μｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌに相当し、体内動態に関する文献（リウマチ科１９９１；５：２８７−３００）に従えば、１回投与量は５０ｍｇから１００ｍｇで良い。文献に記載されたミゾリビンの体内動態を図２に示した。図２に示される通り、ミゾリビンの消失速度は速く（Ｔ１／２＝２．２時間）、薬剤蓄積性は認められない。反復投与を行っても、薬剤に対する反応性は維持される。また、薬剤の蓄積性がないため、投与回数は、１日１回から３回でよい。
インターフェロン−α／βは、抗ウイルス作用の他に、Ｔｈ１細胞に対する分化促進、抗原特異的細胞傷害活性を持つＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖誘導、ＮＫ細胞の分化促進、表面抗原提示分子の発現の促進等、様々な免疫調節活性を有している。ミゾリビンやＳＭ−１０８による細胞性免疫活性化作用は、インターフェロン−α／βとの併用でＣ型慢性肝炎治療に有効であるばかりでなく、本用量をもって癌細胞の排除にも有効であることが示された。
【実施例２】天然型インターフェロン−αによるＨＣＶレプリコン細胞に対する作用
高用量のインターフェロン−α／βの存在化では、併用薬剤添加による抗ウイルス作用の増強を検討することは困難である。そこで、ＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡ量をおよそ１０％にまで減少させる至適濃度を検討した。
（１）ＨＣＶレプリコン細胞の構築及び培養
ＨＣＶレプリコンの構築、培養細胞（Ｈｕｈ−７）への導入、株化細胞（＃５０−１）の樹立、細胞培養に関しては、文献に従った（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００２；２９３：９９３−９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５：１４３７−１４４９）。
（２）天然型インターフェロン−αによるＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡの残存量の検討
細胞培養は１２穴プレートの各ウェルに２〜３ｘ１０４細胞となるように＃５０−１細胞を用意した。３０、１００、３００、１０００、３０００、１００００ＩＵ／ｍｌの天然型インターフェロン−α（スミフェロン；ＨＬＢＩ：住友製薬）溶液を作り、１ウェル（１ｍｌ）あたり１０μｌずつ加えて、０．３、１、３、１０、３０、１００ＩＵ／ｍｌとした。
１週間培養後、細胞を回収し、セパゾールＲＮＡ  １  Ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク社）を用い、説明書通りの方法でＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡの定量は、分光光度計で測定し、濃度を５０ｎｇ／μｌになるように調製した。
（３）リアルタイムＰＣＲによるＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡの測定
機器はＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のもの（７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用した。リアルタイムＰＣＲの反応条件は文献（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００２；２９３：９９３−９９９）に従い、上記ＲＮＡ  ２μｌずつをテンプレートにした。用いたプライマー配列のうち、レプリコンＲＮＡの１３０〜１４６番目の塩基をｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとし、レプリコンＲＮＡの２９０−２７２番目の塩基をｒｅｖｅｒｓ  ｐｒｉｍｅｒとして用いた。
また、ＴａｑＭａｎでの検出用に標識されたプローブとして、レプリコンＲＮＡの１４８−１６８番目の塩基からなるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）をＴａｑＭａｎ  Ｋｉｔ（ロシュ社）で標識した。用いたプライマー及びプローブは、Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒは配列番号１、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒは配列番号２、Ｐｒｏｂｅは配列番号３に示す塩基配列である。
リアルタイムＰＣＲによる測定はサンプル毎に２回行い、その平均値を求めた。平均の測定値と測定結果を図３に示した。ＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡの残存量が１０％程度となる、即ち、３ＩＵ／ｍｌのＨＬＢＩ濃度が併用薬剤の評価に適切と考えられた。
（４）インターフェロン−α存在下での併用薬剤の抗ウイルス作用
リバビリン、ミゾリビン、ＳＭ−１０８の各々をＰＢＳに溶かし、０．５、１、２、５、１０ｍＭ溶液を作製し、２ｘ１０４細胞／ｗｅｌｌとした２４穴プレートの各ウェルに１０μｌずつ薬剤を添加し、最終的に０，５，１０，２０μＭとした。また、ＨＬＢＩの添加量は０、３ＩＵ／ｍｌとなるように添加した。実施例２と同様に培養１週間後、リアルタイムＰＣＲ法により残存ＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡ量を測定した。リバビリン及びミゾリビンのＨＬＢＩ併用における実験は各々２回、ＳＭ−１０８のＨＬＢＩ併用における実験は１回行い、各併用実験の測定結果を１例ずつ、図４、図５、及び図６に示した。
本結果によれば、３ＩＵ／ｍｌ  ＨＬＢＩ存在下で５μＭ前後の比較的低用量の薬剤添加において、何れの薬剤でも一過的なＨＣＶレプリコン由来ＲＮＡの減少が観察された。ＲＮＡ消失率は、リバビリン併用で１８〜３５％、ミゾリビン併用で５３〜６１％、ＳＭ−１０８併用で５９％と、インターフェロンとミゾリビンあるいはＳＭ−１０８との併用はリバビリンとの併用より上回っていた。従って、薬剤の血中濃度が５μＭの場合、ミゾリビンあるいはＳＭ−１０８併用投与におけるＨＣＶに対する作用は、リバビリン併用投与に劣らず、また、リバビリンのＣ型慢性肝炎の血中濃度が１０μＭを超えていることから、慢性Ｃ型肝炎におけるインターフェロンの併用薬剤として、ミゾリビン及びＳＭ−１０８はリバビリンより有用であると判断された。
（５）ノーザンブロット解析によるインターフェロン−α存在化での併用薬剤の抗ウイルス作用の検討
細胞培養は６穴プレートの各ウェルに１ｘ１０５細胞となるように＃５０−１細胞を用意した。３ＩＵ／ｍｌのＨＬＢＩとリバビリン、ミゾリビン、ＳＭ−１０８の各々を添加し、最終的に０，１，３，５，１０，２０μＭとした。１週間培養後、細胞を回収し、セパゾールＲＮＡ  １  Ｓｕｐｅｒを用い、ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡは分光光度計で定量され、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いた１％アガロースゲル電気泳動に供した。常法に従って、メンブレンフィルターにＲＮＡをトランスファーし、ＨＣＶレプリコンを含むプラスミドから得られたＤＮＡ断片及びＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子のＤＮＡ断片を用いてプローブを作製し、ハイブリダイゼーションを行った。
プローブ作製の具体的な方法として、ＨＣＶゲノムが組み込まれ、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで切断されたプラスミドｐＮＮＲｚ２  ＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２００２；２９３：９９３−９９９）を鋳型として、プライマーＸＮ７−４Ｒ（配列番号４）と３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて、１本鎖ＤＮＡプローブ（ＮＳ５Ｂ上流の約３００ｂｐ）を作製すればよい。用いたプローブを配列番号５に示す。
また、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子を検出するプローブは、プライマーＧＡＰＤＨ  Ｓ（配列番号６）とプライマーＧＡＰＤＨ  Ｒ（配列番号７）を用いて増幅された約２５０ｂｐのＰＣＲ断片を、ランダムプライマー法を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識すれば良い。上記何れかのプローブを含むＵＬＴＲＡｈｙｂ溶液（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、４２℃で一晩加温し、ハイブリダイゼーションを行い、フィルターを洗浄後、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ−５０００（富士フィルム社）で解析を行った。
ＨＬＢＩ存在下でリバビリン、ミゾリビン、ＳＭ−１０８を添加した場合の、アガロースゲルによる電気泳動のパターン、ＨＣＶ及びＧ３ＰＤＨをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った結果を、各々図８、図９、図１０に示した。また、検出されたバンドの強度をデンシトメーターで測定し、恒常的に発現するＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現を基準にして、レプリコンＲＮＡの残存量を数値化した結果を、リバビリンは表１と図１１、ミゾリビンは表２と図１２、ＳＭ−１０８は表３と図１３に示した。表２、表３、図１２及び図１３に示されるように、低用量のミゾリビンとＳＭ−１０８は共に、３ＩＵ／ｍｌのインターフェロン−α存在下で、レプリコンＲＮＡを相乗的に減少させることが確認できた。
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天然型インターフェロン−αであるスミフェロン（ＨＬＢＩ；住友製薬）を３〜６ＭＩＵ投与した場合、投与６〜７時間後に血中Ｃｍａｘがおよそ５０〜８０ＩＵ／ｍｌとなり、投与２日後に数ＩＵ／ｍｌにまで低下する。本発明では、３ＩＵ／ｍｌのＨＬＢＩ存在下で有用性が見出せたが、高用量インターフェロン−α投与でも併用薬剤の相乗効果が付与されると考えられた。
ミゾリビンの場合、おおよそ１０μＭ（約２．５μｇ／ｍｌ）以下の血中濃度を達成できれば、インターフェロンの抗ウイルス作用を増強すると思われた。図２に従えば、１回投与量は５０ｍｇから１００ｍｇでよく、その投与量は、免疫活性化が期待される血中濃度（１〜８μＭ）と一致した。ＳＭ−１０８の場合も、血中濃度は１０μＭ以下で、スミフェロンの抗ウイルス作用を増強すると考えられた。また、ミゾリビンの免疫活性化と抗ウイルス作用の増強がほぼ同じ濃度で達成されていることから、ミゾリビン−１−リン酸のプロドラッグであるＳＭ−１０８の免疫活性化が期待される血中濃度も、１０μＭ以下と判断された。
また、癌治療においても、本用量をもって癌細胞の排除に有効と考えられた。
今回の検討で示されたミゾリビンの投与量は、臨床的に重篤な副作用が出現しないことが確認されている用量であり、リバビリン投与で問題となっている溶血性貧血は生じないと考えられた。
また、ＳＭ−１０８の場合、１日あたり４００ｍｇ／ｍ２（約５２０ｍｇ）投与でヘモグロビン値が若干下がる程度である。ＳＭ−１０８の血中濃度が１０μＭ以下となる投与量は、およそ２０ｍｇ／ｍ２〜６０ｍｇ／ｍ２になると考えられ（癌の臨床：１９８５；３１：７５７−７６６）、この値は、１回投与量として、およそ２６ｍｇから７８ｍｇに相当するため、溶血性貧血は発生しないと判断された。
投与量は、患者の年齢、性別、体重、排泄速度等の要因の影響を受けることも考慮しなければならない。ＳＭ−１０８の場合、高投与量では血中の濃度持続時間が長くなる傾向にあることが示されているが（癌の臨床：１９８５；３１：７５７−７６６）、高投与量であっても、１日後には血中から排除されることが予想される。そのため高用量のＳＭ−１０８投与は、インターフェロンとの併用で相乗効果が生み出される濃度範囲を長時間にわたって維持することができると考えられる。
従って、インターフェロンと併用するＳＭ−１０８は高用量でも有効であり、ＳＭ−１０８を高用量投与する場合は、１日１回投与あるいは隔日投与等でも可能であると考えられる。ミゾリビンについても同様であると考えられる。そのため、投与量は、副作用を惹起する濃度以下の有効濃度であればよく、１００ｍｇ以上であってもよい。
【実施例３】ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する増殖抑制効果
インターフェロンと併用薬のウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉａｒｒｈｅａ  Ｖｉｒｕｓ）に対する増殖抑制効果を検討した。
９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにウシ腎細胞（ＭＤＢＫ：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ細胞，大日本製薬より購入）を８ｘ１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃，５％  ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培地（１０％  ＦＢＳ（抗ＢＶＤＶ抗体陰性）含有Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地）を除き、新しい培地０．１ｍｌ／ｗｅｌｌで細胞を洗浄後、同培地で希釈したＢＶＤＶウイルス（ＢＶＤＶ  ＫＳ−ＷＳ株、住友製薬にて調製）液０．１ｍｌ／ｗｅｌｌを接種し、３７℃，５％  ＣＯ２存在下で２時間培養した。培地で希釈したスミフェロン（住友製薬，Ｌｏｔ．Ｆ−０１８）、ミゾリビン（ＳＩＧＭＡ社製，Ｌｏｔ．０４７Ｈ４０８７）およびＳＭ−１０８（住友製薬，Ｌｏｔ．０３０２１９）、あるいはスミフェロンに代えてイントロンＡ（シェリング・プラウ、Ｌｏｔ．Ｂ３０７Ｅ）、アドバフェロン（山之内製薬、Ｌｏｔ．Ｌ００８Ｙ０１）、ペガシス（ロシュ、Ｌｏｔ．Ｋ００１３Ｙ１）、を０．０５ｍｌ／ｗｅｌｌずつで添加し、３７℃，５％  ＣＯ２存在下で４日間培養した。
培地を除去して同培地０．１ｍｌ／ｗｅｌｌで細胞を洗浄し、新しい培地を添加後、アラマーブルー（和光純薬，Ｌｏｔ．１４１９３７ＳＡ）を添加した。３７℃，５％  ＣＯ２存在下で４時間培養した後、蛍光光度計（フルオロスキャンアセント  Ｔｙｐｅ３７４：Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて蛍光強度（λｅｘ＝５４４ｎｍ，λｅｍ＝５９０ｎｍ）を測定した。
ＢＶＤＶウイルスが細胞内で増殖すると感染細胞の増殖の程度は低くなる。そのため、抗ＢＶＤＶ活性の指標として、薬剤とＢＶＤＶウイルスを添加した被験細胞の細胞増殖の程度を、ＢＶＤＶウイルスを添加していないコントロール細胞の増殖を対照として求めた。
実験結果を図１４および図１５に示した。図１４に示すように、ミゾリビンまたはＳＭ−１０８が薬剤単独では低い抗ＢＶＤＶ活性しか示さない濃度において、スミフェロンと併用すると、スミフェロン単独の活性に比べて２倍以上の抗ＢＶＤＶ活性の増強が認められ、スミフェロンはミゾリビンあるいはＳＭ−１０８との組み合わせで強い併用効果を示すことが判明した。また図１５に示すように、この併用効果はスミフェロンだけではなく、他の組換え型インターフェロン−αであるイントロンＡあるいはアドバフェロンにおいても認められた。
これらの結果から、このようなミゾリビンあるいはＳＭ−１０８とインターフェロンとの併用効果は、スミフェロンに限らず、現在Ｃ型肝炎治療に用いられている他のインターフェロンでも認められることが確認できた。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、ウイルス性肝炎または癌疾患に対するインターフェロンとの併用剤が提供される。本剤は体内蓄積性がなく、細胞性免疫をより活性化し、インターフェロンと併用することにより相乗効果を示すという特徴を有する。そのため特に、インターフェロン等が有効とされるＣ型肝炎、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形性症候群、真性多血症、非ホジキン悪性リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、表在性膀胱癌、膵臓癌、腎細胞癌、前立腺癌、食道癌にとって、非常に有効な併用療剤となり得る。
【配列表フリーテキスト】配列番号：１に記載の塩基配列はＦｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒである。
配列番号：２に記載の塩基配列はＲｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒである。
配列番号：３に記載の塩基配列はＰｒｏｂｅである。
配列番号：４に記載の塩基配列はプライマーＸＮ７−４Ｒである。
配列番号：５に記載の塩基配列はＰｒｏｂｅである。
配列番号：６に記載の塩基配列はプライマーＧＡＰＤＨ  Ｓである。
配列番号：７に記載の塩基配列はプライマーＧＡＰＤＨ  Ｒである。
【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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