(57)【要約】臓器の線維化の改善及び／又は予防に有用である新規なヒト及びラットのポリペプチド並びに前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリヌクレオチドは、慢性腎不全モデルラットの腎臓及び膀胱の線維化病態が惹起されているラットの膀胱において正常個体より発現量が顕著に減少する。また、前記ポリペプチドの過剰発現により細胞外マトリックスの産生が抑制される。前記ポリペプチドのプロモーター領域、線維化病態治療薬をスクリーニングする方法、及び該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする線維化病態改善用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、あるいは配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
【請求項４】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求の範囲５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする線維化改善及び／又は予防用医薬組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項８】
請求の範囲７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする線維化改善及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項９】
（１）配列番号２３で表される塩基配列、又は（２）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求の範囲９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求の範囲１０に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１２】
（１）請求の範囲９に記載のポリヌクレオチド又は配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（２）（１）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは（３）前記発現ベクターで形質転換された細胞からなる線維化改善薬スクリーニングツール。
【請求項１３】
（１）請求の範囲９に記載のポリヌクレオチド又は配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（２）（１）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは（３）前記発現ベクターで形質転換された細胞
の線維化改善薬スクリーニングのための使用。
【請求項１４】
（１）（ｉ）請求の範囲９に記載のポリヌクレオチド、あるいは（ｉｉ）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含み、請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞と試験物質とを接触させる工程、
（２）プロモーター活性を検出する工程、及び
（３）プロモーター活性を亢進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする線維化改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求の範囲１４に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、線維化病態改善用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、慢性腎不全及び／又は膀胱における線維化病態の改善に関連する新規なポリペプチド、並びに該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドに関する。また、前記ポリペプチドのプロモーター、及び該プロモーターを利用したスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  臓器の線維化とは、ファイブロネクチンやコラーゲン等の細胞外マトリックスが組織に過剰に沈着した状態を言い、この過剰な細胞外マトリックスの沈着は、組織の非可逆的な変化を引き起こし、臓器不全に至る予後不良な病態である。
臓器の線維化をきたす疾患は数多く知られているが、なかでも腎臓における線維化は慢性腎不全の進行と一致する組織学的変化である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。すなわち、慢性腎不全は糸球体硬化と尿細管および間質の線維化をきたし腎機能廃絶へ至る病態である。臨床的には糸球体濾過値（Ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ＧＦＲ）の測定が代表的な腎機能評価のひとつとして用いられている。クレアチニンクリアランスは最もよく使用されているＧＦＲ検査法であり、血清クレアチニン値から簡便にクレアチニンクリアランスの見当をつけることもできる。しかしながら、クレアチニンは糸球体障害の進行により尿細管から分泌されることからクレアチニンクリアランスは真のＧＦＲに比して高値を示し、実際のＧＦＲの低下を過小評価してしまう事が知られている。また、腎臓には予備能があり腎機能が低下していく初期過程、つまりネフロンが失われても５０％以上は保たれている状態では血液生化学的な異常所見や臨床症状を認めない。血清クレアチニン値も同様であり、これが明らかに異常値を示したときはすでに腎機能の５０％以上が失われていると考えられる（非特許文献３参照）。さらに、原疾患のいかんに関わらずＧＦＲが３０−４０％以下に低下すると腎機能障害は確実に一定の割合で進行し、原疾患の活動性が明らかに消失している場合でもこの腎機能障害は進行してしまう（非特許文献３参照）。従って、より早期に腎機能低下を発見し治療を開始することが望まれている。また、進行した腎機能障害に対しては人工透析の適用となり、最終的には腎移植が必要となる（非特許文献３参照）。人工透析は一生涯続けられることから患者に多大な身体的、経済的負担を強いることとなる。このため、慢性腎不全の病因解析、治癒、進行遅延化に関する研究の必要性は非常に高いとされてきた。この研究に際し、慢性腎不全を模倣した実験動物モデルとして腎臓の５／６を摘出したラットが用いられてきた。このラットの腎臓においてその発現が変動している遺伝子は、慢性腎不全に関与している可能性が高いと考えられる（非特許文献４、非特許文献５参照）。
臓器の線維化を引き起こす因子の一つとしてＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β）がすでに知られている。このＴＧＦ−βによる細胞外マトリックスの過剰産生のシグナルを遮断すれば臓器の線維化を抑制出来るのではないかと考えられ、実際、ＴＧＦ−βの中和抗体が腎間質線維化を抑制することが実験動物で確認された。しかしながら、ＴＧＦ−β欠失動物は生後まもなく多臓器不全により死亡することが明らかとなり、長期間にわたるＴＧＦ−βの抑制を臨床応用しようとする試みには、まだ議論の余地があると考えられている（非特許文献１参照）。
また、この細胞外マトリックスの過剰産生を抑制するような抗線維化作用を主作用とした薬剤はこれまでに上市されておらず、したがって、慢性腎不全のように臓器の線維化が進展した病態の薬物療法による根治は望めないのが現状である。
ＴＧＦ−βは尿細管上皮細胞由来であるＮＲＫ５２Ｅ細胞におけるファイブロネクチン遺伝子の発現を亢進すること（Ｙｏｋｏｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．：２８２，Ｆ９３３−Ｆ９４２，２００２）、タイプＩコラーゲンの発現量を亢進すること（Ｃｒｅｅｌｙ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．：１４０，４５−５５，１９９２）が報告されている。
末期腎不全に至る慢性腎不全の約半数は原発性腎炎に由来するものであることから、腎炎の抑制が結果として慢性腎不全への進行を遅延するものと考えられる。近年、腎炎の進展にＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１；単球走化性因子）が関与していることが明らかにされてきた。すなわち、ＭＣＰ−１欠損マウスを用いて腎炎モデル（馬杉腎炎）を作製すると、この動物の尿細管障害は顕著に改善することが報告され（非特許文献６参照）、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群モデルラットにＭＣＰ−１のアンチセンスオリゴを投与した結果、ＭＣＰ−１遺伝子発現の抑制に伴って間質へのマクロファージ浸潤抑制と腎機能が保持されることが報告された（非特許文献７参照）。このようなことから、ＭＣＰ−１の発現抑制が腎炎治療に有効である可能性が示唆されている。前述のように、腎炎は慢性腎不全の主要原疾患であることから、これの治癒、進行遅延は結果として慢性腎不全への進行を遅延、予防することとなる。従って、細胞外マトリックスの過剰産生を抑制するだけでなく、ＭＣＰ−１遺伝子発現を抑制するなど炎症反応も同時に抑制できればより強力に臓器の線維化を予防、遅延させることができると考えられる。しかしながら、このような抗線維化作用と抗炎症作用をもつ薬剤は現在のところ無い。
臓器の線維化は肺、気管、皮膚、肝、前立腺、膵臓、膀胱などの諸臓器に認められ（非特許文献１参照）、上述の腎臓だけに限定されるものではない。例えば、膀胱における線維化病態の一つとして間質性膀胱炎が挙げられる（非特許文献８、非特許文献９参照）。間質性膀胱炎は頻尿、尿意切迫感および膀胱部の疼痛を主訴とし、明確な病因は明らかではない。軽症例では慢性膀胱炎、神経性頻尿、過活動膀胱、前立腺肥大等と混同されやすく、鑑別診断されたものは重症度が高い。このようなことから間質性膀胱炎に決定的な治療法が確立されるには至っていない（非特許文献９参照）。そのため間質性膀胱炎を適用とする薬剤は現在のところなく、抗うつ剤や抗アレルギー剤などが対症療法的にこの治療に用いられている。間質性膀胱炎の末期では外科的な手段に頼ることとなり、最終的には膀胱摘出と尿路変更もしくは新膀胱形成の適用という甚だ侵襲的なものとなっている（非特許文献９参照）。
【非特許文献１】医学のあゆみ、第２０１巻、第１２号、医歯薬出版株式会社、２００２年
【非特許文献２】「モレキュラー・メディシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第３８巻、第８号、中山書店２００１年
【非特許文献３】最新内科学体系  腎泌尿器疾患  ４  腎不全、中山書店、１９９５年
【非特許文献４】「ザ・アメリカン・ジャーナル・ナブ・パソロジー（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９７５年，第７９巻，ｐ９５−１０６
【非特許文献５】腎と透析、第３１巻、臨時増刊号「腎疾患モデル」、東京医学社、１９９１年
【非特許文献６】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，（米国），１９９９年，第１０３巻，ｐ７３−８０
【非特許文献７】「キドニィ・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）」，（米国），２０００年，第５７巻，ｐ９２７−９３６
【非特許文献８】第Ｖ版エッセンシャル泌尿器科学、医歯薬出版株式会社、１９８９年
【非特許文献９】間質性膀胱炎−疫学から治療まで−、日本間質性膀胱炎研究会編、医学図書出版株式会社、２００２年
【発明の開示】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、慢性腎不全及び膀胱の線維化病態の診断に有用であり、臓器の線維化の改善及び／又は予防に有用である蛋白質ＦＲＥＰ（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする新規な塩基配列のヒト及びラット由来ｃＤＮＡのクローニングに成功した。前記ラット遺伝子は慢性腎不全モデルラットの腎臓において正常個体より発現量が顕著に減少していることを明らかにし、同遺伝子の発現量から慢性腎不全病態の診断に有用な検査方法を可能にした。また、膀胱の線維化病態が惹起されているラットの膀胱において正常個体より発現量が顕著に減少していることを明らかにし、同遺伝子の発現量から膀胱の線維化病態の診断に有用な検査方法を可能にした。更に、ＦＲＥＰの過剰発現により、その過剰産生が線維化病態の原因となる事が知られているファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンといった細胞外マトリックスの産生が抑制されると共に腎炎の進展に関与する因子であるＭＣＰ−１の産生が抑制されることを明らかにした。また、ＦＲＥＰのＮ末端部分蛋白質（ＦＲＥＰ−Ｎ；配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番）を取得し、該蛋白質によりファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの産生が抑制されることを明らかにした。これらの知見より、ＦＲＥＰ又はその一部が臓器の線維化及び炎症の、改善及び／又は予防に有用であることを明らかにした。
加えて、ＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター領域を同定し、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の治療に有用な物質をスクリーニングする方法を構築して提供し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］  配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、あるいは配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、
［２］  配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［３］  配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、
［４］  ［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］  ［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［６］  ［５］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［７］  下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分とする線維化改善及び／又は予防用医薬組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＧＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
（ｂ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド。
（ｃ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［８］  ［７］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有効成分とする線維化改善及び／又は予防用医薬組成物。
［９］  （１）配列番号２３で表される塩基配列、又は（２）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
［１０］  ［９］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［１１］  ［１０］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［１２］  （１）［９］に記載のポリヌクレオチド又は配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、［４］に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（２）（１）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは（３）前記発現ベクターで形質転換された細胞からなる線維化改善薬スクリーニングツール、
［１３］  （１）［９］に記載のポリヌクレオチド又は配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／若しくは挿入された塩基配列を含み、［４］に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（２）（１）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、あるいは（３）前記発現ベクターで形質転換された細胞
の線維化改善薬スクリーニングのための使用、
［１４］  （１）（ｉ）［９］に記載のポリヌクレオチド、あるいは（ｉｉ）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含み、［４］に記載のポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞と試験物質とを接触させる工程、
（２）プロモーター活性を検出する工程、及び
（３）プロモーター活性を亢進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする線維化改善薬をスクリーニングする方法、
［１５］  ［１４］に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、線維化病態改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
配列番号２、配列番号２の第１〜１６６番、又は配列番号４に記載の本発明のポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドと同一の配列は知られていない。米国特許出願公開第２００２／０９０６７２号明細書、国際公開第０１／５５３１５号パンフレット、第０１／５４４７４号パンフレット、及び第０１／９０３０４号パンフレットには、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドの部分配列と相同性を有する配列を含む多数の配列が開示され、開示された新規ポリペプチド等は疾患の診断、予防、又はアゴニスト若しくはアンタゴニストのスクリーニングに有用であると記載されている。しかしながら、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドと相同性を有する配列が何に利用できるかの具体的記載はなく、また、多数の配列に対して記載された用途の根拠も記載されていない。加えて、実際にこれらポリペプチドを取得したとの情報はおろか、どのように取得できるかの具体的情報もない。更に、実施例の記載をみると現在形で記載されているにすぎず、これらの用途の裏付けは全くない。
本願優先日後に、配列データベースＧｅｎＰｅｐｔにおいてアクセッション番号ＢＣ０４４２４０、ＡＹ１３４８５７として本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番を含む配列が開示され、ＡＫ０３５５０４、ＢＣ０１０４８５、ＡＫ０３６８４４、ＢＣ０５７６４４として本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列の部分配列と相同性を有する配列が収載されたが、配列が開示されたにすぎず、その具体的用途については記載されていない。また、本願優先日後に公開された国際公開第０３／０２５１３０号パンフレットには、本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列（６３５アミノ酸）の第１〜５３３番が一致する５４６アミノ酸からなるポリペプチド（ヒトＲＥＭＡＰ−６）（すなわち、本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番を含む配列）が収載されている。ヒトＲＥＭＡＰ−６を含む数個のＲＥＭＡＰが関与するとしてパンフレット数ページに渡り多数の疾患が列挙されており、その中には線維症も含まれる。しかしながら、実施例の記載をみると現在形で記載されているにすぎず、これらの用途の根拠に関する記載は全くない。
本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、線維化病態の診断に有用であること、線維化及び炎症の改善及び／又は予防に有用であることを初めて明らかにした。また、ＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター領域を利用した慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の治療に有用な物質をスクリーニングする方法は本発明者らによって初めて提供された方法である。
【図面の簡単な説明】  図１は、培養細胞におけるヒトＦＲＥＰの発現を示す図である。ＭＷＭは分子量マーカーを示している。レーン１はｐｃＤＮＡ３−ｈＦＲＥＰを導入したサンプルを、レーン２はｐｃＤＮＡ３．１を導入したサンプルを、レーン３は何も導入していないＣＯＳ−１細胞サンプルを示している。
図２は、慢性腎不全モデルラット（５／６腎摘ラット）及び正常ラットにおける腎臓でのＦＲＥＰ発現量の比較を示す図である。図の縦軸はｍＲＮＡ相対量を、レーン１は偽手術（２週）、レーン２〜４は５／６腎摘（レーン２；２週、レーン３；４週、レーン４；６週）の結果を示す。
図３は、ヒトＦＲＥＰ安定発現細胞及びＦＲＥＰ非導入細胞におけるファイブロネクチン発現量変動を示す図である。図の縦軸はｍＲＮＡ相対量を、横軸はＴＧＦ−β量を示す。斜線のバーはｐｃＤＮＡ導入細胞を、黒塗りのバーはヒトＦＲＥＰ安定発現細胞を用いた結果を示す。
図４は、ヒトＦＲＥＰ安定発現細胞及びＦＲＥＰ非導入細胞におけるタイプＩコラーゲン発現量変動を示す図である。図の縦軸はｍＲＮＡ相対量を、横軸はＴＧＦ−β量を示す。斜線のバーはｐｃＤＮＡ導入細胞を、黒塗りのバーはヒトＦＲＥＰ安定発現細胞を用いた結果を示す。
図５は、ヒトＦＲＥＰ安定発現細胞及びＦＲＥＰ非導入細胞におけるＢＳＡによるＭＣＰ−１発現量変動を示す図である。図の縦軸はｍＲＮＡ相対量を、横軸はＢＳＡ量を示す。斜線のバーはｐｃＤＮＡ導入細胞を、黒塗りのバーはヒトＦＲＥＰ安定発現細胞を用いた結果を示す。
図６は、実施例８で行われたルシフェラーゼ活性を示す図である。図の縦軸は相対的ルシフェラーゼ活性を、横軸の１はｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ、２はｐＧＬ３−ＦＲ−４０２ｂｐ、３はｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐを用いた結果を示す。
図７は、精製したＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を示す図である。ＭＷＭは分子量マーカーを示している。レーン１は素通り画分を、レーン２及び３は洗浄画分を、レーン４、５、及び６は溶出画分を示している。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明について詳細に説明する。本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能であり、蛋白質操作技術は特に断りのない限り「タンパク実験プロトコール」（秀潤社、１９９７年）等の公知技術に従って実施可能である。
＜本発明のポリペプチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；及び
（２）ｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、かつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、ｉｉ）配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、あるいは、ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番で表されるアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）が含まれる。
本発明のポリペプチドは、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限りヒト及びラット由来のポリペプチドに限定されず、他の脊椎動物（例えばマウス、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、ニワトリなど）由来のものも包含する。また、前述の（１）〜（２）のいずれかに該当する限り、天然のポリペプチドに限定されず人工的に製造した変異体も含まれる。
「タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制する」とは、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現が、対象となるポリペプチドの存在により抑制されることを意味しており、検討対象ポリペプチドが「タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制する」か否かは、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１が発現している細胞に検討対象のポリペプチドを発現させ、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現量を検討することにより確認することができる。例えば実施例６（タイプＩコラーゲン及びファイブロネクチン）、実施例７（ＭＣＰ−１）、又は実施例１０（タイプＩコラーゲン及びファイブロネクチン）の方法により確認することができる。好ましくは実施例６の方法において、ＴＧＦ−β未添加の条件で、検討対象のポリペプチドを発現させることにより１０％以上（好ましくは２０％以上、更に好ましくは３０％以上）のファイブロネクチンの発現量が減少、ＴＧＦ−β添加の条件で１０％以上（好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上）のファイブロネクチンの発現量が減少するポリペプチドが本発明のポリペプチドとして好ましい。あるいは、実施例６の方法において、ＴＧＦ−β未添加又は添加の条件で、検討対象のポリペプチドを発現させることにより１０％以上（好ましくは２０％、より好ましくは４０％、更に好ましくは６０％、特に好ましくは８０％以上）のタイプＩコラーゲンの発現量が減少するポリペプチドが本発明のポリペプチドとして好ましい。タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及びＭＣＰ−１の発現をすべて抑制するポリペプチドが本発明のポリペプチドとして最も好ましい。
本発明のポリペプチドのひとつである配列番号４に記載のポリペプチドは、腎臓組織及び／又は膀胱組織において正常状態と臓器の線維化した病態とで大きく発現量が変動するポリペプチドであり、病態では発現量が減少するポリペプチドである。従って、本発明のポリペプチドの量を測定することにより慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態が診断される。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体の作製に用いることができ、該抗体は慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の診断に有用である。また、本発明のポリペプチドの一つである配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチド又はその第１〜１６６番であるポリペプチドは、その過剰産生が線維化病態の原因となる事が知られているファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンといった細胞外マトリックスの産生を抑制すると共に腎炎の進展に関与する因子であるＭＣＰ−１の産生を抑制したことから、本発明のポリペプチドは線維化改善薬として有用である。
配列番号２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドはヒトＦＲＥＰ蛋白質であり、配列番号４で表されるアミノ酸からなるポリペプチドはラットＦＲＥＰ蛋白質である。
本発明のポリペプチドとして、ヒトＦＲＥＰ蛋白質又はラットＦＲＥＰ蛋白質のＮ末端及び／又はＣ末端に適当なマーカー配列を付加したポリペプチドが含まれる。上記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、あるいは精製等を容易に行うための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のポリペプチドとして最も好ましいのは配列番号２、配列番号２の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、
［１］本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［２］（１）配列番号２３で表される塩基配列、又は（２）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド（以下、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または機能的等価改変体をコードする塩基配列ならいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１、配列番号１の第１〜４９８番、又は配列番号３に記載の塩基配列である。なお、本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする限り、あらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変し作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記本発明のポリペプチドをコードする全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６８）１５０，１７８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うＤＮＡを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりＤＮＡ分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することが出来る。
本発明のポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等］でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト腎臓を挙げることができる。ヒト腎臓からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＧＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドの内、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を挙げることが出来る。ＲＴ−ＰＣＲによって本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する場合に用いられるプライマーは、該ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できるものである限り特に制限は無く、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することが出来る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための特異プライマー及び特異プローブとして利用できる。
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるために用いることもできる。
本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを用い、試験化合物が本発明のプロモーター活性を亢進するか否かを分析することにより、本発明のポリペプチドの発現を亢進する物質をスクリーニングすることができる。本発明者らは、本発明のポリペプチドの１つであるＦＲＥＰを過剰発現すると、尿細管上皮細胞からの線維化病態の原因となる事が知られているファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲン発現並びにＴＧＦ−βによるそれらの発現亢進が抑制されること（実施例６）、ＢＳＡによる尿細管上皮細胞からの腎炎の進展に関与する因子であるＭＣＰ−１発現量亢進が抑制されること（実施例７）、並びにＦＲＥＰ−Ｎ（配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番のアミノ酸からなる蛋白質）の存在によりファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲン発現が抑制されること（実施例１０）を明らかにした。これらのことから前記本発明のポリペプチドの発現を亢進する物質は、線維化病態改善及び／又は予防薬として有用である。従って、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドは線維化病態改善及び／又は予防薬のスクリーニングツールとして使用することができる。
＜本発明の発現ベクター、細胞、及びポリペプチドの製造法＞
本発明には、本発明の形質転換された細胞を培養することを特徴とする本発明のポリペプチドの製造方法も包含される。
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］等に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることに利用できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’側にある本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターには、本発明のポリペプチドを製造するための発現ベクターと、遺伝子治療により体内で本発明のポリペプチドを産生させるための発現ベクターとが含まれる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
遺伝子治療のベクターとしては、例えば、（１）ウイルスベクター、又は（２）非ウイルスベクターがあり、一般的に使用されているベクター（ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセンダイウイルス等）を用いることができる［高久史麿監修，実験医学（増刊号）「遺伝子治療の最前線」，第１２巻，第１５号，１９９４年］。
宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーＲＮＡレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のＦＲＥＰが豊富に存在する腎臓由来細胞、あるいは膀胱由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
また、本発明の発現ベクターには、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを発現させるベクターも含まれる。
本発明のプロモーター発現細胞は、目的に応じ適宜選択した宿主細胞に本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込むことにより製造できる。目的に応じ適宜選択したベクターに本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込むことにより製造するのが好ましく、例えば、プロモーター活性を亢進するか否かを分析する系の構築を目的とする場合には実施例８に示したように、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を組み込んだベクターに本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを組み込んで製造することが好ましい。プロモーター領域と融合するレポーター遺伝子は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドと機能的に融合されていればよい。
例えば、本発明のプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系の構築を目的とする場合には、細胞としては哺乳動物（例えば、ヒト、マウス又はラットなど）由来の細胞を用いることが好ましく、ヒト由来の細胞を用いることがより好ましい。
本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び細胞は実施例８に示す本発明のプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系の構築に用いることができ、該スクリーニングのツールとして有用である。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリポフェクション法を用いてＣＯＳ−１細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記ＣＯＳ−１細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された細胞としては、本発明のポリペプチドを発現している細胞が好ましい。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。より具体的には以下のようにしてタグ蛋白質を利用して精製することができる。
本発明のポリペプチド（例えば、配列番号２、配列番号２の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるポリペプチド）は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１、配列番号１の第１〜４９８番、又は配列番号３で示されるポリヌクレオチド）を例えばＨｉｓタグが融合されるベクター、より具体的には例えば実施例１に記載のｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）等に組み込むことで培養細胞に発現させ、Ｈｉｓタグを用いて精製した後でタグ部分を除去することにより得ることができる。例えば実施例１においてｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯを用いて作製したヒト又はラットのＦＲＥＰ発現プラスミドは、いずれもＦＲＥＰのＣ−末端にＶ５およびＨｉｓタグが付加されるように設計されている。これにより、それらのＨｉｓタグを利用して、実施例２に示したＦＲＥＰを発現させた培養細胞からＦＲＥＰ蛋白質を精製することができる。具体的には公知の方法（実験医学別冊  タンパク質の分子間相互作用実験法、１９９６年３２頁  中原ら）又は実施例１０に従って、破砕した細胞の抽出液よりＨｉｓタグと融合したＦＲＥＰ蛋白質をＨｉｓＴｒａｐカラム（アマシャムバイオサイエンス社）に結合させて単離精製することができる。より具体的には培養フラスコ（例えば１０ｃｍ径のシャーレ）に培養させた本発明のポリペプチド発現細胞を適当な量の緩衝液（例えば、１ｍｌ）を加えて掻き取り、破砕した後、毎分１５０００回転で５分間の遠心分離によって上清を分離し、ＨｉｓＴｒａｐカラムに結合させる。適当な緩衝液で洗浄した後、高濃度のイミダゾールを含む緩衝液で溶出、分取することで本発明のポリペプチドを精製することができる。上記緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を用いることができる。精製した蛋白質分子中のＨｉｓタグは、例えばＮ末端側にＨｉｓタグを融合させる様設計することによりＴＡＧＺｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社）を用いることで分子中から除去することができる。
あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、例えば、本発明のポリペプチドの物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を１個ずつ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
＜本発明の線維化改善及び／又は予防用医薬組成物＞
本発明者らは、実施例６、７、１０において本発明のポリペプチドの一つであるＦＲＥＰ又はＦＲＥＰ−ＮがタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現を抑制することを示した。これらの知見より、
（ａ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含みかつタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現を抑制するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第１〜１６６番、又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
は、線維化した臓器（特には腎臓又は膀胱）のタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現抑制用医薬組成物の有効成分として有用である。また、上記（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドは、臓器（特には腎臓又は膀胱）の線維化改善及び／又は予防用医薬組成物の有効成分として有用である。
本発明においては、本発明のポリペプチドを、それ単独で、あるいは、所望により薬剤学的に許容することのできる通常の担体と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。本発明には、上記（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現抑制が必要な対象（好ましくは線維化の改善及び／又は予防が必要な対象）に、有効量で投与することを含む、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現を抑制する方法（好ましくは線維化を改善及び／又は予防する方法）も含まれる。
また、上記（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドは、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現抑制用医薬組成物、あるいは、線維化改善及び／又は予防用医薬組成物を製造するために使用することができる。
本発明によるタイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン、及び／又はＭＣＰ−１の発現抑制用医薬組成物、あるいは、線維化改善及び／又は予防用医薬組成物は、有効成分に応じて、それらの製剤化に通常用いられる添加剤を用いて調製することができる。
投与方法は、その有効量が患部に到達するような方法で投与される限り、特に限定されるものではない。例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、非経口投与を挙げることができる。非経口投与としては例えば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与又は筋肉内投与等）、局所投与（例えば、膀胱内投与等）、経粘膜投与（例えば、鼻腔内投与又は口腔内投与等）、又は腸管内投与（例えば、座剤投与等）等が挙げられるが、膀胱の線維化病態の場合には特に膀胱内投与を選択することも出来る。［Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｄｍａｎ．Ｊ．Ｇ，Ｌｉｍｂｉｒｄ  Ｌ．Ｅ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ  Ａ．Ｇ．，Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，２００１］。また前記有効成分が消化酵素の影響を受けるポリペプチドにあっては、静注等の非経口投与とするか、あるいは、消化酵素の影響の少ない消化管の下部（例えば、空腸、回腸、結腸、又は大腸）に前記ポリペプチドが分解されずに送達される製剤技術を用いることが好ましい。このような製剤技術としては、例えば、徐放性製剤（例えば国際公開パンフレットＷＯ９４／０６４１４号）、結腸放出製剤（例えば国際公開パンフレットＷＯ９５／２８９６３号）又は時間放出型若しくはパルス放出型製剤（例えば国際公開パンフレットＷＯ９３／０５７７１号）を挙げることができる。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの薬学的に許容される不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン等と混合することができ、また、前記希釈剤以外の薬学的に許容される添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。経口のための液体組成物は薬学的に許容される不活性な希釈剤（例えば精製水又はエタノール）および、薬学的に許容される添加剤、例えば乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、湿潤剤、芳香剤又は防腐剤を含有することができる。
非経口投与のための注射剤としては、溶解補助剤、保存剤、安定剤、乳化剤、無痛化剤、等張化剤、緩衝剤、賦形剤、着色剤又は増粘剤などの添加剤を配合することができる。前記溶解補助剤としては、例えばシクロデキストリン類等を挙げることができる。前記保存剤としては、例えばパラ安息香酸メチル等を挙げることができる。前記乳化剤としては、例えばレシチン等を挙げることができる。前記無痛化剤としては、例えばベンジルアルコール等を挙げることができる。前記等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム等を挙げることができる。前記賦形剤としては、例えばマルトース等を挙げることができる。前記増粘剤としては、例えばヒアルロン酸等を挙げることができる。前記注射剤は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過、殺菌剤の配合、あるいは放射線照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物として製造し、使用に際して無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に無菌的に溶解して使用することもできる。
投与量は、例えば、症状、投与対象の年齢又は性別等を考慮して適宜決定することができる。例えば経口投与の場合、その投与量は通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
遺伝子治療のための、遺伝子伝達方法としては、例えば、（１）ウイルスベクター、（２）非ウイルスベクター、又は（３）むきだしのＤＮＡを用いることができる。また、遺伝子治療の方法としては、遺伝子導入細胞を患者に移植する方法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）、あるいは、細胞を介さずに直接個体にこれらの遺伝子自体を注入する方法（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）を用いることができる［新津洋司郎ら編集，蛋白質核酸酵素（増刊号）「遺伝子治療」，第４０巻，第１７号，１９９５年］。
投与方法は、その有効量が患部に到達するような方法で投与される限り、特に限定されるものではない。例えば、全身的投与（例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、又は経口投与など）、局所投与（例えば、膀胱内投与など）、経粘膜投与（例えば、鼻腔内投与、気管内投与、又は口腔内投与など）、又は腸管内投与（例えば、座剤投与など）などによる治療方法が含まれるが、膀胱の線維化病態の場合には膀胱内投与が好ましい［Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｄｍａｎ．Ｊ．Ｇ，Ｌｉｍｂｉｒｄ  Ｌ．Ｅ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ  Ａ．Ｇ．，Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，２００１］。
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターと、薬学的に許容することのできる担体又は溶媒（例えば、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、安定剤、保存剤、又は懸濁剤など）とを混合して、タイプＩコラーゲン、ファイブロネクチン及び／若しくはＭＣＰ−１の発現抑制用医薬組成物、あるいは、線維化改善及び／又は予防用医薬組成物とすることができる。また、遺伝子治療の効果をあげるために、例えば、ベクター自身を生分解性のゲルに包埋する技術を用いることができる。具体的には、アテロコラーゲン（ＫＯＫＥＮ  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡの放出を持続させる方法（Ｔ．ＯＣＨＩＹＡら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，７０７−７１０，１９９９）を用いることができる。あるいは、遺伝子の細胞導入効率を向上させる目的で、リン脂質及び／又はコレステロールを配合することができる。
＜本発明のスクリーニングツール及びスクリーニングのための使用＞
本発明には、（１）（ｉ）本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含み、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は（ｉｖ）前記ベクターで形質転換された細胞からなる線維化改善薬スクリーニングツール、
（２）（ｉ）本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含み、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド、（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は（ｉｖ）前記ベクターで形質転換された細胞の線維化改善薬スクリーニングのための使用が含まれる。
本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングの為に用いる物（具体的には、スクリーニングの為に用いるプロモーター型ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はプロモーター型ポリヌクレオチドを発現している細胞）をいう。「線維化改善薬スクリーニングツール」とは、線維化改善薬（例えば腎不全又は膀胱の線維化病態の改善薬）をスクリーニングするために、本発明のスクリーニング方法において、試験化合物を接触させる対象となる細胞又はプロモーター型ポリヌクレオチドである。本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター又は細胞の線維化改善薬スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
＜本発明のスクリーニング方法＞
本発明のポリペプチドの１つであるＦＲＥＰを過剰発現すると、尿細管上皮細胞からのファイブロネクチンおよびタイプＩコラーゲンの発現及びＴＧＦ−βによる発現亢進が抑制されること（実施例６）、ＢＳＡによる尿細管上皮細胞からのＭＣＰ−１発現亢進が抑制されること（実施例７）、本発明のポリペプチドの１つであるＦＲＥＰ−Ｎの存在によりファイブロネクチンおよびタイプＩコラーゲン発現が抑制されることを明らかにした。ファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンといった細胞外マトリックスの過剰産生は線維化病態の原因となること、並びに、ＭＣＰ−１は腎炎の進展に関与する因子であることが知られている。これらのことから前記本発明のポリペプチドの発現を亢進する物質は、線維化病態改善及び／又は予防薬として有用であることがわかった。従って、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチドの有するプロモーター活性を指標として線維化病態改善及び／又は予防薬をスクリーニングできることがわかった。
即ち、本発明のスクリーニング方法には、本発明のスクリーニングツールであるポリヌクレオチド（すなわち、本発明のプロモーター型ポリヌクレオチド、あるいは配列番号２３で表される塩基配列の第１１２４〜１５２５番において、１〜１０個の塩基が欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含み、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのプロモーター活性を有するポリヌクレオチド）を利用して、該プロモーター活性の変化を指標とすることからなる線維化病態改善作用を有する物質のスクリーニング方法が含まれる。
本発明のスクリーニング方法には、より具体的には以下の方法が含まれる。
本発明のスクリーニングツールであるポリヌクレオチドを発現している細胞と試験物質とを接触させる工程、
プロモーター活性を検出する工程、及び
プロモーター活性を亢進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする線維化改善薬をスクリーニングする方法。
本発明のスクリーニング方法の実施態様の一つとしてレポーター遺伝子アッセイ系が挙げられる。レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を検出する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。したがって、本発明のスクリーニングツールであるポリヌクレオチドを用いたレポーター遺伝子アッセイにより、本発明のポリペプチドの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。本発明のスクリーニングツールであるポリヌクレオチド（例えば配列番号２３で表される塩基配列からなる配列）と融合された「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、クラゲ由来の緑色蛍光蛋白質遺伝子（ＧＦＰ）等があげられる。レポーター遺伝子は、本発明のスクリーニングツールであるポリヌクレオチドと機能的に融合されていればよい。本発明のプロモーターと融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより試験物質依存的な転写誘導活性の変化を分析することができる。上記工程を実施することにより、線維化改善薬のスクリーニングを実施できる。具体的には、実施例８に記載の方法により、前記スクリーニングを実施できる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，４（１）：４１，１９９９）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
＜慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の検査方法＞
本発明のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするプローブを用いることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現量を調べることができ、その発現量（好ましくは腎臓又は膀胱における発現量）の減少を指標として慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の検出並びに診断をすることができる。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的な結合が起こらない条件を意味し、具体的には、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する０．１×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）溶液を使用し、温度が６５℃である条件を意味する。本発明のポリヌクレオチド（またはその相補配列）及び本発明のポリヌクレオチドの一部を有する少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡは、上記プローブとして有用である。
より具体的には、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の検出方法では、上述のプローブと試験試料とを接触させ、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ又はそれ由来のｃＤＮＡ）と前記プローブとの結合体を、公知の分析方法（例えば、ノザンブロッティング）で分析することにより、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態であるか否かを検出することができる。前記結合体の量、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量が、正常人に比べて減少している場合には、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態であると判定（すなわち診断）することができる。以上のように、本発明のポリヌクレオチドは、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の検出並びに診断に有用である。
慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の検出方法としては、上述の様に本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法の他に、発現レベルを本発明のポリペプチドの検出によって測定する方法が可能である。このような検査方法としては、例えば、試験試料を本発明のポリペプチドに結合する抗体、好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を利用したウエスタンブロッティング、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することが出来る。本発明のポリペプチドは、試験試料中に含まれる本発明のポリペプチドの量を定量する際の標準量として利用することができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに結合する抗体を作製するために有用である。本発明のポリペプチドの量が正常人に比べて減少している場合には、慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態であると判定することができる。
＜線維化病態改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び製剤化する工程を含むことを特徴とする、線維化病態改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
経口投与、経口投与のための固体組成物及び液体組成物、非経口投与、非経口のための注射剤並びに投与量に関しては、本明細書の＜本発明の線維化改善及び／又は予防用医薬組成物＞と同様に実施できる。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、「タンパク実験プロトコール」秀潤社、１９９７年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
＜実施例１＞ヒト腎臓由来遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
（１）ヒト腎臓由来遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニングおよび発現ベクターの作製
配列番号５および配列番号６で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いてヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）中からＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９５℃（５分）の後、９５℃（３０秒）・５５℃（３０秒）・７２℃（２分）のサイクルを３７回繰り返した。配列番号６に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１５５１−１５５７，１９９１）及び６×Ｈｉｓタグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１４０−１４９）が付加されるように設計した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離して約２０００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した後、反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰと名付けた）中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、シーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示す塩基配列を含むクローンであることを確認した。これにより配列番号１に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をＦＲＥＰ遺伝子と名付けた。
（２）ラットＦＲＥＰ遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニング
配列番号７および配列番号８で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いてラット腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）中からＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９５℃（５分）の後、９５℃（３０秒）・５５℃（３０秒）・７２℃（２分）のサイクルを３７回繰り返した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離して約２０００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した後、反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号３に示す塩基配列を含むクローンであることを確認した。これにより配列番号３に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子の塩基配列はヒトＦＲＥＰ遺伝子と最も高い相同性を示し、ヒトＦＲＥＰ遺伝子の塩基配列と比較して約８０％の相同性を示した事から、この遺伝子がヒトＦＲＥＰ遺伝子のラットオルソログであることが明らかとなった。ラットＦＲＥＰとヒトＦＲＥＰの推定アミノ酸レベルにおける相同性は約８０％であり、高い相同性を示すことからラットＦＲＥＰはヒトＦＲＥＰと同等の機能を持つ蛋白質であることが推察された。なお、前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３，２３７−２４４，１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ  ｔｕｐｌｅ  １
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ３
Ｗｉｎｄｏｗ  ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ  ５
＜実施例２＞ＦＲＥＰ蛋白質を発現する形質転換細胞の作製
（１）ＦＲＥＰ発現細胞の作製
ｉ）ＣＯＳ−１細胞におけるヒトＦＲＥＰ蛋白質一過性発現
上述の実施例１（１）で作成した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰをＣＯＳ−１細胞に導入した。ＣＯＳ−１細胞は培養皿（直径１０ｃｍ、旭テクノグラス社）に１０ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えてコンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリポフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００；インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション試薬添付のプロトコールに従い、ｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）あるいはｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ（３μｇ）を一過性にトランスフェクトした。２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後に０．２５ｍｌの細胞溶解液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を添加して細胞を溶解した。何も導入していないＣＯＳ−１細胞についても同様に細胞溶解液を調製した。
ｉｉ）ＮＲＫ５２Ｅ細胞におけるヒトＦＲＥＰ蛋白質安定発現
発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰをラット尿細管上皮細胞由来の細胞株であるＮＲＫ５２Ｅ細胞に導入した。ＮＲＫ５２Ｅ細胞は培養皿（直径１０ｃｍ、旭テクノグラス社）に１０ｍｌの１％牛胎児血清（ＪＲＨ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えてコンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリポフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００；インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション試薬添付のプロトコールに従い、ｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）あるいはｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ（３μｇ）をトランスフェクトした。２４時間培養した後、培地を新しいものに交換し、さらにその後、培地に最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ナカライテスク社）を添加して継代培養し、発現プラスミドが染色体に組み込まれて薬剤耐性を獲得したと思われる細胞を選択した。
（２）ＦＲＥＰ蛋白質の検出
上述＜実施例２＞（１）ｉ）の空ベクター発現細胞、ヒトＦＲＥＰ発現細胞、又は何も導入していないＣＯＳ−１細胞の溶解液２０μｌに２０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウリル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ  β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノルブルー）を添加し、１００℃で５分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ、日本ミリポア社）膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ＰＶＤＦ膜上のＦＲＥＰ蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＦＲＥＰのＣ末端に融合させたＶ５エピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体には抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６８０アミノ酸からなるＦＲＥＰ−Ｖ５−ＨＩＳ６融合蛋白質を示す約８０ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰの存在に依存して検出されることを確認した（図１）。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のＦＲＥＰ遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとることが明らかになった。
上述＜実施例２＞（１）ｉｉ）の空ベクター導入及びＦＲＥＰ発現ＮＲＫ５２Ｅ細胞をＰＢＳで洗浄した後に０．２５ｍｌの上述の細胞溶解液を添加して細胞を溶解し、上述のＣＯＳ−１細胞の場合と同様にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティングを行った。その結果、４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む６８０アミノ酸からなるＦＲＥＰ−Ｖ５−ＨＩＳ６融合蛋白質を示す約８０ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰの存在に依存して検出されることを確認した。これにより、単離した形質転換ＮＲＫ５２Ｅ細胞においてｈＦＲＥＰ遺伝子が確かに発現していることが明らかになった。
＜実施例３＞ヒトＦＲＥＰ遺伝子の組織別発現分布解析
ＲＴ−ＰＣＲ法により本発明のヒトＦＲＥＰ遺伝子の発現分布を解析した。ヒトの各臓器由来のｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡ（５ｍｇ）（クロンテック社）をＤＮａｓｅ（プロメガ社）を用い３７℃で３０分反応させた。このＤＮａｓｅ処理したｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡ全量を、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いてキット添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは９００μｌの滅菌水に溶解した。配列番号９及び配列番号１０に示す一対のプライマーを用いて、配列番号１に示すヒトＦＲＥＰ遺伝子の部分ｃＤＮＡ断片を、上述の各種組織由来ｃＤＮＡからＰＣＲ反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるＦＲＥＰの発現の有無を調べた。上述のように合成したｃＤＮＡを溶解したのもののうち各１μｌをＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９５℃（５分）の後、９５℃（３０秒）・５５℃（３０秒）・７２℃（３０秒）のＰＣＲサイクルを４０回繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、腎臓、膀胱、前立腺由来の各ｃＤＮＡから所望するヒトＦＲＥＰの部分断片を含むと思われる約２００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。このことから、配列番号１で示されるヒトＦＲＥＰ遺伝子の発現は線維化を引き起こしうる臓器において発現していることが判明した。
＜実施例４＞正常及び慢性腎不全モデルラットにおけるＦＲＥＰ発現量の測定
上述の知見により本発明のヒトＦＲＥＰ蛋白質は、腎臓などの臓器線維症が認められる臓器で発現していることが判明し、本発明のポリペプチドが慢性腎不全に関わることが予想された。そこで慢性腎不全モデルラットである、５／６腎摘ラット（Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．：１００，５１３−５２８，１９８０）の腎臓におけるラットＦＲＥＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定し、比較した。
遺伝子発現量は、ラットＦＲＥＰ遺伝子の発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出し定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
慢性腎不全モデルラットとして８週齢の雄のＷｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー社）５匹を用い、５／６腎摘手術後、２週、４週、６週間経過したもの、及び正常コントロールとして８週齢の雄のＷｉｓｔａｒラット（日本エスエルシー社）５匹を用い偽手術後２週間経過したものを用意した。５／６腎摘手術及び偽手術はＳｈｅａらの方法（Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．：１００，５１３−５２８，１９８０）に従った。ＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて説明書に従い、前記各ラットの腎臓から全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡは滅菌水に溶解し−８０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、１μｇのＲＮＡを用い、逆転写反応用酵素（ＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作成
ＦＲＥＰ−Ｆ，ＦＲＥＰ−Ｒ，Ｇ３ＰＤＨ−Ｆ，Ｇ３ＰＤＨ−Ｒと命名した以下の４つのオリゴヌクレオチド（配列番号１１−１４）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。ＦＲＥＰ遺伝子に対しては配列番号１１と配列番号１２の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては配列番号１３と配列番号１４の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は１０μｌの系で説明書に従って行った。各系において１本鎖ｃＤＮＡは４μｌ、２ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬を５μｌ、各プライマーは３ｐｍｏｌ使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのラットゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を適当に希釈したものを４μｌ用いた。ＰＣＲは、９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、５９℃で６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるラットＦＲＥＰ遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＦＲＥＰ補正発現量］＝［ＦＲＥＰ遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
上述の結果、図２に示す通り、本発明のＦＲＥＰのラットオルソログ遺伝子の発現は慢性腎不全モデルラットの腎臓において減少していることが判明した。従って本発明のＦＲＥＰは腎臓における機能低下により慢性腎不全を惹起すると考えられる。
上述したように、ＧＦＲ測定を代表とする従来の腎機能評価方法では初期の腎機能障害を検出することは困難であった。また、より早期に腎機能低下を発見し治療を開始することが望まれていた。本実施例において、ＦＲＥＰ遺伝子発現量の減少は５／６腎摘手術２週間後から観察されており、ＦＲＥＰ遺伝子発現量は標準的な臨床指示物質が出現する前の慢性腎不全の初期指標となることが明らかとなった。
＜実施例５＞正常及び膀胱で線維化が惹起されているラットにおけるＦＲＥＰ発現量の測定
尿道狭窄ラット（Ｍａｌｍｇｒｅｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．：１４２，１１３４−１１３８，１９８９）の膀胱におけるＦＲＥＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定し、正常ラットのそれと比較した。このラットの膀胱では線維化が惹起されていることが知られている（Ｃｈａｑｏｕｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．：２８３，Ｅ７６５−Ｅ７７４，２００２）。
遺伝子発現量は、本発明ラットＦＲＥＰの発現量を測定し、同時に測定したＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出・定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
１０週齢の雌のＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット（日本チャールス・リバー社）４匹の尿道を絹糸で直径約１ｍｍに狭窄し６週間飼育して膀胱線維化が惹起されているラットを作製した。正常コントロールとして１０週齢の雌のＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット（日本チャールス・リバー社）４匹を用い偽手術後６週間経過したものを作製した。膀胱線維化が惹起されているラットの作製方法及び偽手術の方法はＭａｌｍｇｒｅｎ  Ａ．らの方法に従った。前記膀胱線維化が惹起されているラット及び正常ラットの膀胱を摘出し、膀胱の全ＲＮＡをＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ）を用いて説明書に従い調製した後、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社）上で説明書に従いＤＮａｓｅ処理を行った。調製した全ＲＮＡは滅菌水に溶解し−８０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、１μｇのＲＮＡを用い、逆転写反応用酵素（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；インビトロジェン社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は１０μｌの系で説明書に従って、上述実施例４と同様に行い、各試料におけるラットＦＲＥＰ遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＦＲＥＰ補正発現量］＝［ＦＲＥＰ遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
その結果、本発明のラットＦＲＥＰ遺伝子の発現量は膀胱線維化が惹起されているラットの膀胱において正常動物に比して約４８％減少していることが判明した。従って本発明のポリペプチドの発現量の低下は膀胱における機能低下により膀胱線維化を惹起することがわかった。
間質性膀胱炎は膀胱鏡による所見や膀胱部の痛みにより鑑別診断されるが、客観的にその診断を支持するような臨床指示物質についてはこれまで明らかではなかった。本発明者らは、正常動物に比して膀胱線維化が惹起されているラットの膀胱においてＦＲＥＰ遺伝子発現量が減少することを見出し、ＦＲＥＰ遺伝子が膀胱の線維化病態診断に有用であることを明らかにした。
＜実施例６＞ファイブロネクチンおよびタイプＩコラーゲン発現に対するＦＲＥＰの効果
ＴＧＦ−βはＮＲＫ５２Ｅ細胞におけるファイブロネクチン遺伝子の発現を亢進することが報告されている（Ｙｏｋｏｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．：２８２，Ｆ９３３−Ｆ９４２，２００２）。また、ＮＲＫ５２Ｅ細胞においてはＴＧＦ−β処置によりタイプＩコラーゲンの発現量が亢進することが報告されている（Ｃｒｅｅｌｙ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．：１４０，４５−５５，１９９２）。そこで、前述のＦＲＥＰ安定発現細胞の培養液中にＴＧＦ−βを未添加又は添加した時におけるファイブロネクチン遺伝子発現量の変化を測定し、ファイブロネクチン発現又はＴＧＦ−β添加により惹起されるファイブロネクチン発現亢進に対するＦＲＥＰの効果を観察した。また、細胞外マトリックス構成成分の１つであるタイプＩコラーゲン遺伝子の発現量変化についても測定しＦＲＥＰの効果を観察した。遺伝子発現量（ｍＲＮＡ発現量）は、ラットファイブロネクチンおよびタイプＩコラーゲンの発現量を測定し、同時に測定したＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
コラーゲンコートディッシュ（６ウェルディシュ、旭テクノグラス社）に＜実施例２＞（１）ｉｉ）のＦＲＥＰ発現ＮＲＫ５２Ｅ細胞又はＮＲＫ５２Ｅ細胞を１Ｘ１０５細胞／ウェルで播種し一晩培養した後、ＴＧＦ−β（シグマ社）を未添加又は添加した。２４時間後に細胞を回収し、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ−ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社）を用いて説明書に従い全ＲＮＡを調製した。この時、同説明書に従いＤＮａｓｅ処理を同時に行った。調製した全ＲＮＡは滅菌水に溶解し−８０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、０．５μｇのＲＮＡを用い、逆転写反応用酵素（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；インビトロジェン社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
ＦＮ−Ｆ，ＦＮ−Ｒ  Ｃｏｌ−Ｆ，Ｃｏｌ−Ｒと命名した以下の４つのオリゴヌクレオチド（配列番号１５−１８）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。ファイブロネクチン遺伝子に対しては配列番号１５と配列番号１６の組合せ、タイプＩコラーゲン遺伝子に対しては配列番号１７と配列番号１８の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては＜実施例４＞（３）で作製した配列番号１３と配列番号１４の組み合せで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は１０μｌの系で説明書に従って行い、各試料におけるラットファイブロネクチン遺伝子の発現量およびラットタイプＩコラーゲン遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ファイブロネクチン補正発現量］＝［ファイブロネクチン遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
［タイプＩコラーゲン補正発現量］＝［タイプＩコラーゲン遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
その結果、本発明のＦＲＥＰを安定的に過剰発現する細胞では、コントロール細胞に比してＴＧＦ−β未添加及び添加時のファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの発現量が減少することがわかった。本発明のＦＲＥＰを安定的に過剰発現する細胞ではコントロール細胞に比してファイブロネクチンの発現量は最大で約６４％減少（ＴＧＦ−β  ３ｎｇ／ｍＬ添加時）していることが判明した（図３）。またタイプＩコラーゲンの発現量は最大で約９４％減少（ＴＧＦ−β  １ｎｇ／ｍＬ添加時）していることが判明した（図４）。従って本発明のＦＲＥＰは、尿細管上皮細胞のファイブロネクチンおよびタイプＩコラーゲンの発現及びＴＧＦ−βによる発現亢進を抑制し、その結果尿細管における過剰な細胞外マトリックス産生を減少させることにより、尿細管間質の線維化を改善及び／又は予防し、さらにこれから派生する腎臓の機能不全病態の進行を遅延、予防することがわかった。
＜実施例７＞ＢＳＡ添加により惹起されるＭＣＰ−１発現亢進に対するＦＲＥＰの効果
初代培養ラット近位尿細管上皮細胞の培養液中に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加するとＭＣＰ−１の発現が上昇することがすでに報告されている（Ｗａｎｇ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ：８，１５３７−１５４５，１９９７）。そこで、前述ＦＲＥＰ安定発現細胞の培養液中にＢＳＡを添加したときのＭＣＰ−１発現量の変化を測定し、ＢＳＡ添加により惹起されるＭＣＰ−１発現亢進に対するＦＲＥＰの効果を観察した。遺伝子発現量はラットＭＣＰ−１の発現量を測定し、同時に測定したＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
＜実施例６＞（１）と同様に行った。ただし、ＴＧＦ−βの代わりにＰＢＳに溶解したＢＳＡ（シグマ社）を添加した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
＜実施例６＞（２）と同様に行った。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
ＭＣＰ−Ｆ，ＭＣＰ−Ｒと命名したオリゴヌクレオチドを（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。ＭＣＰ−１遺伝子に対しては配列番号１９と配列番号２０の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては＜実施例４＞（３）で作製した配列番号１３と配列番号１４の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は１０μｌの系で説明書に従って、上述実施例６と同様に行い、各試料におけるラットＭＣＰ−１遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＭＣＰ−１補正発現量］＝［ＭＣＰ−１遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
その結果、本発明のＦＲＥＰを安定的に過剰発現する細胞ではコントロール細胞に比してＭＣＰ−１の発現量は最大で約８６％減少していることが判明した（図５）。従って本発明のＦＲＥＰは蛋白尿による尿細管上皮細胞のＭＣＰ−１発現亢進を抑制し、その結果尿細管近傍における過剰な炎症反応を抑制することにより、腎炎さらにこれから派生する腎臓の機能不全病態の進行を予防、遅延するものと考えられる。
本発明者らは、ＦＲＥＰ過剰発現によりＭＣＰ−１発現量が抑制されることを見いだし、ＦＲＥＰ遺伝子が腎臓の炎症性疾患の改善に有用であることを明らかにした。
＜実施例８＞ヒトＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター活性の検出
（１）ヒトＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター領域の単離とレポーターベクターの作製
配列番号２１および配列番号２２のプライマーを用いてヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型として、ＰＣＲ法（ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（５分）の後、９６℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（９０秒）のサイクルを３５回繰り返した後７２℃で７分加温）により、配列番号２３で示される、ヒトＦＲＥＰ遺伝子上流配列を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素（ＢｇＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ；宝酒造社）で処理し、同様に制限酵素処理したルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター；プロメガ社）に連結してレポーターベクター（ｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐ）を構築した。さらに、このｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐを制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ；宝酒造社）で処理して得られたＤＮＡ断片（配列番号２３の第１１２４〜１５２５番）を、制限酵素処理（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ；宝酒造社）したｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクターに連結し、レポーターベクター（ｐＧＬ３−ＦＲ−４０２ｂｐ）を構築した。
（２）ヒトＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター活性の検出
実施例８の（１）で構築したｐＧＬ３−ＦＲ−４０２ｂｐ、ｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐ、又は陰性対照としてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（１００ｎｇ／ウェル）をそれぞれβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼコントロールベクター；ロッシュダイアグノスティック社）（１０ｎｇ／ウェル）と共に２９３細胞に一過性にコトランスフェクトした。コトランスフェクトは実施例２の（１）と同様の方法で行った。２４時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した。１ウェルあたり８０μｌの細胞溶解液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。この細胞溶解液２０μｌにルシフェラーゼ基質溶液１００μｌ（和光純薬工業社）を添加し、化学発光測定装置（ＭＬ３０００型；ダイナテックラボラトリーズ社）を用いて発光量を測定した。また、別途、前記細胞溶解液のβ−ガラクトシダーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性検出キット（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ＰｌｕｓＴＭ  ｓｙｓｔｅｍ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて測定・数値化した。これを導入遺伝子のトランスフェクション効率として上述のルシフェラーゼ活性を各ウェル毎に補正した。
上記実験の結果、ｐＧＬ３−ＦＲ−４０２ｂｐを用いた時は陰性対照であるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約１７倍、ｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐを用いた時はｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃの約９倍のＦＲＥＰ遺伝子のプロモーター活性が検出された（図６）。これらの結果から、配列番号２３及び配列番号２３の第１１２４〜１５２５番で表されるポリヌクレオチドを用いることにより、ＦＲＥＰプロモーターアッセイ系が構築でき、このアッセイ系によりＦＲＥＰ発現量を亢進する物質をスクリーニングできることがわかった。
またｐＧＬ３−ＦＲ−４０２ｂｐを用いた場合に比してｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐを用いた場合に得られた活性が約半分であったことから、−１５２５ｂｐから−４０２ｂｐまでの領域が転写抑制性調節に関与していることが明らかとなった。この抑制性調節を解除する作用をもつ化合物は、結果としてＦＲＥＰ遺伝子の転写を亢進する作用があると期待され、ｐＧＬ３−ＦＲ−１５２５ｂｐを用いたスクリーニング方法によりこのような物質をスクリーニングすることが可能となった。
＜実施例９＞ヒトＦＲＥＰ−Ｎを発現する形質転換細胞の作製
膜結合型あるいは分泌型の蛋白質ではそのＮ末端配列にシグナルペプチドと呼ばれる、典型的には１６〜３０残基の長さで４〜１２の疎水性残基を含む配列を持つことが知られている（ローン生化学、医学書院、１９９１）。ＦＲＥＰ蛋白質のＮ末端配列にもこのようなシグナルペプチド配列が認められることから、ＦＥＲＰ蛋白質はＮ末端部分が細胞外に露出している膜結合型あるいは分泌型の蛋白質であると想定された。
（１）ヒトＦＲＥＰ−Ｎを発現する発現ベクターの作製
配列番号２４および配列番号２５で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーを用いて上述実施例１で構築したｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰを鋳型としてＰＣＲ法によりＦＲＥＰ−ＮｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（７分）の後、９４℃（３０秒）・５５℃（３０秒）・７２℃（３０秒）のサイクルを２５回繰り返した。配列番号２５に示すプライマーはクローニング後３’側にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１５５１−１５５７，１９９１）及び６×Ｈｉｓタグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１４０−１４９）がＦＲＥＰ遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように設計した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離して約５００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した後、反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ−Ｎと名付けた）中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、シーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１に示す塩基配列の第１番目から第４９８番目を含むクローンであることを確認した。
（２）ＣＯＳ−７細胞におけるヒトＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質の一過性発現と精製
上述の実施例９（１）で作成した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ−ＮをＣＯＳ−７細胞に導入した。ＣＯＳ−７細胞は培養皿（直径１０ｃｍ、旭テクノグラス社）に１０ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えてコンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリポフェクション試薬（リポフェクトアミン２０００；インビトロジェン社）を用いて、リポフェクション試薬添付のプロトコールに従いｐｃＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ−Ｎ（３μｇ）を一過性にトランスフェクトした。２４時間培養した後培地を除去し、新たに５ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）に交換してさらに２４時間培養した。その後この培養液から、市販のニッケルアフィニティカラム（ＨｉｓＴｒａｐ、アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を回収した。適当な条件でカラムを洗浄した後、高濃度のイミダゾールを含む緩衝液で溶出、分取した。各画分を上述＜実施例２＞（２）と同様な方法で処置してｈＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を分離、検出した。その結果、ＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質は約２６ｋＤａの蛋白質として溶出画分において検出された（図７）。このことから、ＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質は細胞外に分泌され比較的安定な形で存在しており、単一蛋白質として精製できることが明らとなった。
＜実施例１０＞ヒトＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質の抗線維化作用
（１）ヒトＦＲＥＰＮ末端部分蛋白質を含む培養液の調製
上述実施例９と同様な方法でｐｃ−ＤＮＡ−ｈＦＲＥＰ−ＮをＣＯＳ−７細胞に導入し、一晩培養した後、培地を最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）に交換してさらに２４時間培養した。この培養液はＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を含む培養液である。遺伝子未導入のＣＯＳ−７細胞の培養液を陰性対象とした。
（２）線維芽細胞における細胞外マトリックス遺伝子発現量の測定
６ウェルディッシュ（旭テクノグラス社）にラット腎線維芽細胞であるＮＲＫ４９Ｆ細胞を２×１０５細胞／ウェルで播種し一晩培養した後、培地を上述のＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を含む培養液又は遺伝子未導入のＣＯＳ−７細胞の培養液に交換した。２４時間後に細胞を回収し、上述実施例６と同様な方法で、全ＲＮＡを調製、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、遺伝子発現量を測定した。
その結果、本発明のＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質を含む培養液で処置したＮＲＫ４９Ｆ細胞では、ファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの発現量が、遺伝子未導入のＣＯＳ−７細胞の培養液で処置したＮＲＫ４９Ｆ細胞よりそれぞれ約５７％および約５０％減少している事が判明した。従って、本発明のＦＲＥＰ−Ｎ蛋白質は線維芽細胞におけるファイブロネクチン及びタイプＩコラーゲンの発現を抑制し、間質における細胞外マトリックス産生を減少させることにより、尿細管間質の線維化、さらにこれから派生する腎臓の機能不全病態の進行を遅延、予防することがわかった。
【産業上の利用可能性】  本発明のポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは慢性腎不全及び／又は膀胱の線維化病態の診断に有用である。また、本発明のポリペプチド、及び本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、線維化改善及び／又は予防用医薬組成物として有用である。本発明のポリペプチドの発現を制御するプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは線維化改善薬のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより選択される物質は線維化改善薬の候補物質として有用である。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号２２、２４及び２５の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
2004078784.tif 000002
2004078784.tif 000003
2004078784.tif 000004
2004078784.tif 000005
2004078784.tif 000006
2004078784.tif 000007
2004078784.tif 000008
2004078784.tif 000009
2004078784.tif 000010
2004078784.tif 000011
2004078784.tif 000012
2004078784.tif 000013
2004078784.tif 000014
2004078784.tif 000015
2004078784.tif 000016
2004078784.tif 000017
2004078784.tif 000018
2004078784.tif 000019
2004078784.tif 000020
2004078784.tif 000021
2004078784.tif 000022
2004078784.tif 000023
2004078784.tif 000024
2004078784.tif 000025
2004078784.tif 000026
2004078784.tif 000027
【図１】
2004078784.tif 000028
【図２】
2004078784.tif 000029
【図３】
2004078784.tif 000030
【図４】
2004078784.tif 000031
【図５】
2004078784.tif 000032
【図６】
2004078784.tif 000033
【図７】
2004078784.tif 000034
【国際調査報告】
2004078784.tif 000035
2004078784.tif 000036
2004078784.tif 000037
2004078784.tif 000038
2004078784.tif 000039
2004078784.tif 000040
2004078784.tif 000041
2004078784.tif 000042
2004078784.tif 000043
2004078784.tif 000044