(57)【要約】本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ＰｅｐＴに結合する抗体がペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有することが見出された。これらの抗体は、細胞増殖抑制剤として、例えば癌の治療や予防への利用が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体。
【請求項２】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１又はＰｅｐＴ２である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
【請求項７】
膵臓癌である、請求項６に記載の抗癌剤。
【請求項８】
ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、ペプチドトランスポーターを発現する細胞に接触させることを含む、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する方法。
【請求項９】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、ペプチドトランスポーターを発現する細胞に接触させ、該ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害することを含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項１２】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞が癌細胞である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
癌細胞が膵臓癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体、及び該抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】  哺乳動物は、生体外から栄養源を取り込む必要性があり、細胞には多くの輸送タンパク質が存在することが知られている。ペプチドの輸送を行っているのはペプチドトランスポーター（ペプチド輸送タンパク質）であり、現在までに多数のペプチドトランスポーターが見出されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、特許文献１、特許文献２、特許文献３など）。ペプチドトランスポーターはペプチドの細胞内への流入を行うタンパク質と細胞外への流出を行うタンパク質に分けられる。又、輸送の際に利用するエネルギー源の違いによっても分類することができ、細胞内外のプロトンの濃度差を利用して輸送を行うプロトン駆動型ペプチドトランスポーターは、ＰＴＲファミリーに属する（非特許文献３）。一方、生体内のＡＴＰを使用して輸送を行うペプチドトランスポーターはＡＢＣファミリーに属する（非特許文献４）。
ペプチドトランスポーターはジペプチド、トリペプチドなどの小分子ペプチドだけでなく、β−ラクタム抗生物質、ＡＣＥ阻害剤などの薬剤の輸送にも関与していることが報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２は小分子ペプチドを細胞内に取り込むことによりタンパク質の吸収やペプチド性窒素源の維持に寄与しているプロトン駆動型ペプチドトランスポーターであり、ＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２はそれぞれアミノ酸７０８個、７２９個からなる１２回膜貫通型タンパク質である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献１１）。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２もβ−ラクタム抗生物質やベスタチンなどの薬物を輸送することが報告されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４）。
ＰｅｐＴ１は主に小腸で発現し、腎臓、膵臓での発現も確認されている。ＰｅｐＴ２は腎臓、脳、肺、脾臓での発現が確認されている。ＰｅｐＴ１、ＰｅｐＴ２は小腸や腎尿細管上皮細胞の刷子縁膜に局在していることが報告されている（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１１）。
また、ヒト膵管癌株でＰｅｐＴ１が細胞膜に過剰発現していること（非特許文献１８）、およびＰｅｐＴ２のｍＲＮＡがヒト膵管癌株で発現していること（非特許文献１９）が報告されている。しかしながら、ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２の癌細胞増殖への関与は不明であり、ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２の機能を阻害することにより癌細胞の増殖に影響を与えるか否かの議論は行われていなかった。
【特許文献１】特開平６−２６１７６１
【特許文献２】特開平１１−１７２
【特許文献３】ＵＳ５８４９５２５
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１２）；６４５６−６４６３，（１９９５）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２３５；４６１−４６６，（１９９５）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１６，ｐ８２５，（１９９５）
【非特許文献４】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ８，ｐ６７，（１９９２）
【非特許文献５】Ｇａｎａｐａｔｈｙ，Ｌｅｉｂａｃｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．３，６９５−７０１，（１９９１）
【非特許文献６】Ｎａｋａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．３３，３３４５−３３５２，（１９８４）
【非特許文献７】Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｉｄｏｎ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，６，１０４３−１０４７，（１９８９）
【非特許文献８】Ｏｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６１，１４１３０−１４１３４，（１９８６）
【非特許文献９】Ｍｕｒａｎｕｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，６，３０８−３１２，（１９８９）
【非特許文献１０】Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ａｍｉｄｏｎ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．，１３，１４１−１４６，（１９９０）
【非特許文献１１】Ｔｅｒａｄａ，Ｉｎｕｉ，Ｔａｎｐａｋｕｓｉｔｓｕ  Ｋａｋｕｓａｎ  Ｋｏｕｓｏ．，Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ５，（２００１）
【非特許文献１２】Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１６３１−１６３７，（１９９５）
【非特許文献１３】Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｓ．Ａｃｔａ，１２８０，１７３−１７７，（１９９６）
【非特許文献１４】Ｔｅｒａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８１，１４１５−１４２１（１９９７）
【非特許文献１５】Ｏｇｉｈａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０，８４８−８５２，（１９９６）
【非特許文献１６】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８６，１０３７−１０４２（１９９８）
【非特許文献１７】Ｈｏｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６，Ｆ６５８−Ｆ６６５（１９９９）
【非特許文献１８】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８，５１９−５２５，（１９９８）
【非特許文献１９】Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（２０００）
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体、及び該抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤、特に膵臓癌などの癌細胞増殖抑制剤を提供することにある。
本発明者らは、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する物質が細胞増殖を抑制することを見出した。さらに、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する抗体を見出した。これらの知見は、抗体を用いてペプチドトランスポーターの活性を阻害させ、細胞増殖を抑制しうることを示すものである。癌細胞などの増殖抑制剤の開発において、ペプチドトランスポーターの活性の抑制は重要な指標となると考えられる。
本発明は、より詳しくは、
（１）ペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体
（２）ペブチドトランスポーターがＰｅｐＴ１又はＰｅｐＴ２である、（１）に記載の抗体
（３）ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、（２）に記載の抗体
（４）モノクローナル抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗体
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤
（７）膵臓癌である、（６）に記載の抗癌剤
（８）ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、ペプチドトランスポーターを発現する細胞に接触させることを含む、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害する方法
（９）ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２である、（８）に記載の方法
（１０）ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、（９）に記載の方法
（１１）ペプチドトランスポーターに結合する抗体を、ペプチドトランスポーターを発現する細胞に接触させ、該ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害することを含む、細胞の増殖を抑制する方法
（１２）ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２である、（１１）に記載の方法
（１３）ペプチドトランスポーターがＰｅｐＴ１である、（１２）に記載の方法
（１４）細胞が癌細胞である、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の方法
（１５）癌細胞が膵臓癌細胞である、（１４）に記載の方法
を、提供するものである。
本発明は、ペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体を提供する。本発明のペプチドトランスポーターは特に限定されないが、好ましいのはプロトン駆動によりペプチドを細胞内に取り込むペプチドトランスポーターであり、さらに好ましいのはＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２であり、特に好ましいのはＰｅｐＴ１である。
ＰｅｐＴ１およびＰｅｐＴ２の塩基配列、アミノ酸配列は既に知られている（ヒトＰｅｐＴ１：ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００７０６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１２）；６４５６−６４６３，（１９９５）、ヒトＰｅｐＴ２：ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００２９２２、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２３５；４６１−４６６，（１９９５））。
本発明のペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有する抗体は、ペプチドトランスポーターを介した輸送（例えば、ペプチドトランスポーターによる細胞内へのペプチドの取り込み）を阻害することが可能な抗体であれば特に限定されない。ペプチドトランスポーターを介した輸送を阻害するとは、ペプチドの輸送を完全に遮断する必要はなく、輸送されるペプチドの量を減少させることができればよい。
本発明の抗体は、ペプチドトランスポーターと結合し、ペプチドトランスポーターの輸送活性を阻害することができれば特に限定されず、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。免疫される動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。抗原の調製は公知の方法、例えばバキュロウイルスを用いた方法（ＷＯ９８／４６７７７など）等に準じて行うことができる。免疫原として、バキュロウイルス膜上に発現したペプチドトランスポーターを用いる場合には、免疫動物としてｇｐ６４トランスジェニックマウスを用いることができる（国際特許出願公開番号ＷＯ０３／１０４４５３）。
ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３：３−４６）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
なお、当業者であれば公知技術に基づきＣＤＲを決定することができ、例えば、Ｋａｂａｔらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）を用いて、相同性を調べることにより決定することができる。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を挿入した適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、抗体はＰｅｐＴに結合し、ＰｅｐＴの機能を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンなどで処理し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、Ｄｉａｂｏｄｙを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，���８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野において、すでに確立されている。
本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はペプチドトランスポーター分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がペプチドトランスポーターを認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
又、本発明においては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
特定の分子がペプチドトランスポーターに結合するか否かは、公知の方法により測定することができる。公知の方法としては、例えば、免疫沈降法、ウエストウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、蛍光免疫法、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法、などが挙げられる。
抗体がペプチドトランスポーターの輸送機能を阻害するか否かの検出は公知の方法、例えば、放射性物質（１４Ｃなど）、蛍光物質などでペプチドなどの基質を標識し、該基質がペプチドトランスポーター発現細胞に取り込まれた量を測定すること等により判断することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ０３／０８３１１６、続医薬品の開発４−薬物の生体膜輸送と組織標的化Ｉ，ＩＩ（編集、寺田弘、辻彰）など）。
本発明の細胞増殖抑制剤の標的となる細胞としては特に限定はされないが、好ましいのは膵臓癌、肝臓癌、肺癌、食道癌、乳癌、大腸癌などの癌細胞であり、特に好ましいのは膵臓癌細胞である。本発明の細胞増殖抑制剤は、細胞増殖に起因する疾患、特に膵臓癌などの癌の治療、予防を目的として使用される。
本発明の抗体はペプチドトランスポーターの輸送阻害剤として利用しうるが、参考例において示したように細胞増殖抑制作用を有するため細胞増殖抑制剤としても利用しうる。細胞増殖抑制剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。また、発明の治療薬は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体や添加物を供に含むものであってもよい。
【図面の簡単な説明】図１は、抗ヒトＰｅｐＴ１モノクローナル抗体の、ＰｅｐＴ１発現ウイルスにおけるＰｅｐＴ１活性の阻害を検出した結果を示すグラフである。ウイルス膜上のＰｅｐＴ１活性は、ウイルスの［１４Ｃ］グリシルザルコシンの取り込み量として測定した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３−４）で表示している。
図２は、ＢａＦ３細胞におけるＡＴ−２６４のＰｅｐＴ１阻害能を示すグラフである。
図３は、ＡＴ−２６４のヒト膵臓癌株ＡｓＰＣ−１に対する細胞増殖抑制効果を示すグラフである。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３−４）で表示した。
図４は、ＢａＦ３／ＰｅｐＴ２におけるＡＴ−２６４のＰｅｐＴ２阻害能を示すグラフである。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３−４）で表示した。
図５は、ＡＴ−２６４のヒト膵臓癌株ＢｘＰＣ−３に対する細胞増殖抑制効果を示すグラフである。データは平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝６）で表示した。
図６は、構築したｇｐ６４遺伝子の塩基配列を表す図である。
図７は、図６の続きを示す図である。
図８は、構築したｐＣＡＧ−ｇｐ６４ベクターの構造を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ｇｐ６４ＴｇＭによる抗ｐｅｐＴ１抗体作製
ＰＢＳに懸濁した１ｍｇのタンパク量に相当するＰｅｐＴ１−ＢＶと２００ｎｇの百日咳毒素をｇｐ６４トランスジェニックマウス（国際特許出願公開番号ＷＯ０３／１０４４５３）に皮下注射する事により初回免疫を行った。以後の免疫は同様に調製した５００μｇタンパク量相当のＰｅｐＴ１−ＢＶ（ただし百日咳毒素は含まない）を皮下注射することにより行った。最終免疫は２５０μｇタンパク量相当のＰｅｐＴ１−ＢＶを尾静注する事により行った。このマウスから脾臓細胞を調製し、通常のポリエチレングリコールを使用する方法によってマウスＰ３Ｕ１細胞との細胞融合を行った。スクリーニングはＢａＦ／３−ＰｅｐＴ１細胞を用いたＦＡＣＳで行った。更にＢａＦ／３−ＰｅｐＴ２細胞を用いたＦＡＣＳによりＰｅｐＴ１特異的に結合するモノクローナル抗体（クローン１１３、クローン１１９、クローン２５３）を樹立した。
［実施例２］ＰｅｐＴ１輸送活性阻害能の測定
［１４Ｃ］グリシルザルコシンを終濃度５０μＭになるようにＨＢＳＳ（ｐＨ６．０）で希釈し、基質溶液とした。また、ヒトＰｅｐＴ１の細胞外領域を認識するマウス型モノクローナル抗体（クローン１１９、クローン２５３、クローン１１３）を終濃度２００μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、抗体溶液とした。Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇを付加したＰｅｐＴ１発現出芽バキュロウイルス溶液２０μＬ（５０μｇ蛋白）と抗体溶液２０μＬを混合し、３７℃で１時間プレインキュベートした。予め、３７℃で加温していた基質溶液１６０μＬをウイルス溶液に添加し、反応を開始させた。１分後、氷冷していたＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）（以下、「反応停止液」と略す）を１ｍＬ添加し、反応を停止させた。直ちにウイルスを含む反応液を混合セルロース膜フィルターを用いて吸引濾過し、５ｍＬの反応停止液で２回洗浄した。膜フィルターを液体シンチレーションバイアルに移し、クリアゾルＩを５ｍＬ添加してフィルターを溶解させた。溶解後、液体シンチレーションカウンターでフィルター上の放射能を計測した。基質溶液を添加する前に反応停止液を添加して同様の操作を行い、フィルターへの非特異的吸着を計測し、各実験の数値から差し引いた。
抗ヒトＰｅｐＴ１モノクローナル抗体によるＰｅｐＴ１活性阻害を図１に示した。抗体非存在下でのＰｅｐＴ１活性を対照として１００で表した。３種類の抗ヒトＰｅｐＴ１モノクローナル抗体の中で、対照に比べてクローン１１９で約２０％、クローン２５３で約１０％のＰｅｐＴ１活性を阻害した。このＰｅｐＴ１活性阻害は統計的（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）に有意であった。以上より、抗ＰｅｐＴ１抗体はＰｅｐＴ１の輸送活性阻害能を有し得ることが判明した。
なお、クローン１１９の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：１に示した。
［参考例１］ＡＴ−２６４のＰｅｐＴ１活性阻害作用
ＡＴ−２６４は下記構造式で示される構造を有している。本化合物がペプチドトランスポーター（ＰｅｐＴ）の阻害剤であることを以下の実験により確認した。
2004087762.tif 000002
マウス骨髄由来細胞株ＢａＦ３にヒトＰｅｐＴ１を強制発現させた細胞（以下、ＢａＦ３／ＰｅｐＴ１と略す）を用いて、ＡＴ−２６４のＰｅｐＴ１阻害能力を検討した。その結果、放射性基質［１４Ｃ］グリシルザルコシンの細胞への取り込みは濃度依存的に阻害された（図２）。以上より、ＡＴ−２６４はＰｅｐＴ１の機能を阻害することが明らかとなった。
［参考例２］ＡＴ−２６４のヒト膵臓癌株ＡｓＰＣ−１に対する細胞増殖抑制作用
ＡＴ−２６４をＲＰＭＩ１６４０−１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（以下、培地と略す）、０．５％エタノール、０．５％ＤＭＳＯで溶解し、２．５ｍＭ  ＡＴ−２６４溶液を調製した。また、この溶液を培地で希釈して０．６２５ならびに０．０６２５ｍＭ  ＡＴ−２６４溶液を調製した。
ヒト膵臓癌株ＡｓＰＣ−１を５０％ＦＢＳを含む培地で５×１０４細胞／ｍＬに調製した。この懸濁液を４０μＬ／ｗｅｌｌ（２×１０３細胞）でＣｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉコート済みの９６ｗｅｌｌプレートに蒔き、１６０μＬのＡＴ−２６４溶液を添加した。ＣＯ２インキュベーターで６日間培養し（培養２日後に１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加）、培養６日後に、生細胞数をＭＴＳ  ａｓｓａｙで定量化した。
図３に細胞増殖試験結果を示した。２ｍＭ  ＡＴ−２６４存在下で約３０％、０．５ｍＭでも若干ではあるが細胞増殖抑制が認められた。顕微鏡下での観察において、ＡｓＰＣ−１の形態変化はＡＴ−２６４存在下でも見られなかった。また、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ＡｓＰＣ−１ではＰｅｐＴ１の発現がＰｅｐＴ２に比べて優勢であった。以上より、ＡＴ−２６４による細胞増殖抑制は、非特異的細胞毒性ではなくＰｅｐＴ１の機能阻害によると考えられた。
［参考例３］ＡＴ−２６４のＰｅｐＴ２活性阻害作用
マウス骨髄由来細胞株ＢａＦ３にヒトＰｅｐＴ２を強制発現させた細胞（以下、ＢａＦ３／ＰｅｐＴ２と略す）を用いて、ＡＴ−２６４のＰｅｐＴ２阻害能力を検討した。その結果、放射性基質［３Ｈ］グリシルザルコシンの細胞内への取り込みは濃度依存的に阻害された（図４）。以上より、ＡＴ−２６４はＰｅｐＴ１のみならず、ＰｅｐＴ２の機能を阻害することが明らかとなった。
［参考例４］ＡＴ−２６４のヒト膵臓癌株ＢｘＰＣ−３に対する細胞増殖抑制作用
ＡＴ−２６４をＲＰＭＩ１６４０−１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン，０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（以下、培地と略す）、０．５％エタノール、０．５％ＤＭＳＯで溶解し、２．５ｍＭ  ＡＴ−２６４溶液を調製した。また、この溶液を培地で希釈して０．６２５ならびに０．０６２５ｍＭ  ＡＴ−２６４溶液を調製した。
ＢｘＰＣ−３を５０％ＦＢＳを含む培地で５×１０４細胞／ｍＬに調製した。この懸濁液を４０μＬ／ｗｅｌｌ（２×１０３細胞）でＣｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅＩコート済みの９６ｗｅｌｌプレートに蒔き、１６０μＬのＡＴ−２６４溶液を添加した。ＣＯ２インキュベーターで６日間培養し、培養６日後に生細胞数をＭＴＳ  ａｓｓａｙで定量化した。
図５に細胞増殖試験結果を示した。２ｍＭ  ＡＴ−２６４存在下で約７５％、０．５ｍＭでも約２０％の細胞増殖抑制が認められた。顕微鏡下での観察において、ＢｘＰＣ−３の形態変化はＡＴ−２６４存在下でも見られなかった。また、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ＢｘＰＣ−３ではＰｅｐＴ２の発現がＰｅｐＴ１に比べて優勢であった。以上より、ＡＴ−２６４による細胞増殖抑制は、細胞毒性ではなくＰｅｐＴ２の機能阻害によると考えられた。従って、ＰｅｐＴ１またはＰｅｐＴ２の輸送活性を阻害する物資は細胞増殖抑制剤となることが判明した。
［参考例５］ｇｐ６４トランスジェニックマウスの作製
ｇｐ６４トランスジェニックマウスは国際特許出願公開番号ＷＯ０３／１０４４５３に記載の方法に従って作製した。即ち、
１）ｇｐ６４トランスジェニックベクターの構築
ｇｐ６４の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ  Ｎｏ．９６２７７４２）を鋳型としＥｃｏＲＩ認識配列とＫＯＺＡＫ配列を５’末端に有する５’ｐｒｉｍｅｒ  ６４Ｆ１とＥｃｏＲＩ認識配列を５’末端に有する３’ｐｒｉｍｅｒ  ６４Ｒ１（図６、図７）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応溶液の組成は、ｘ１０  ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ，ＥｘＴａｑ付属ｄＮＴＰ  ４μＬ，１０μｍｏｌｅ／Ｌ  ６４Ｆ１  １μＬ，１０μｍｏｌｅ／Ｌ  ６４Ｒ１  １μＬ，５００ｐｇ／μＬ  ｐＢａｃ−Ｎ−ｂｌｕｅ  １μＬ，５ｕｎｉｔ／μＬ  ＥｘＴａｑ  ０．５μＬ，ｄｉｗ  ３７．５μＬとした。反応シーケンスは次のとおりである。
９４℃  ５ｍｉｎ→
（９４℃  １５ｓｅｃ，５７℃  ３０ｓｅｃ，７２℃  ３０ｓｅｃ）ｘ  ２５  ｃｙｃｌｅｓ→
７２℃  ７ｍｉｎ→
４℃  ｆｏｒｅｖｅｒ
増幅されたバンドをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにサブクローニング後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをトランスフォームした。Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いてｃｏｌｏｎｙ  ＰＣＲを行い、インサートが確認されたクローンを用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒとＢｉｇＤｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｋｉｔとＴ７プライマーあるいはＳＰ６プライマーにより塩基配列を解析し目的の遺伝子を含むクローンを確認した。このクローンから塩基配列に変異が入っていないことを確認したｇｐ６４を含む断片をＥｃｏＲＩにより切り出し、同じくＥｃｏＲＩカットしたｐＣＡＧＧＳ１に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをトランスフォームした。設計通りのクローンを２５０ｍＬのＬＢ培地を用い３７℃で一晩培養し、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ＭＡＸＩ  ｋｉｔを用いて精製し５８１．６μｇのプラスミドを得た。
２）遺伝子の導入
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、次のようにして調製した。まずｇｐ６４遺伝子を挿入したｐＣＡＧＧＳベクター（ｐＣＡＧ−ｇｐ６４；図８）を、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで処理した後、ｇｐ６４遺伝子を含む断片（約３．８ｋｂ）を切り出した。この断片（約３．８ｋｂ）を、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により回収し、３ｎｇ／μｌになるようにＰＢＳ−で希釈してインジェクション用ＤＮＡフラグメントとした。
ＤＮＡフラグメントを注入するマウス前核期卵は、次のようにして回収した。すなわち、まずＢａｌｂ／ｃ系雌マウス（日本クレア）に５ｉ．ｕのＰＭＳＧを腹腔内投与、さらに４８時間後５ｉ．ｕのｈＣＧを腹腔内投与することによって、過排卵処理した。この雌マウスを同系統の雄マウスと交配させた。交配の翌朝、プラグを確認したマウスの卵管を潅流してマウス前核期卵を回収した。
インジェクション用ＤＮＡフラグメントは、マイクロマニピュレーターを用いて前核期卵へ注入した（ジーンターゲティングの最新技術（羊土社）、１９０−２０７  ２０００）。ＤＮＡフラグメントを３７３個のＢＡＬＢ／ｃ胚へ注入し、翌日、２細胞期に発生していた胚２１６個を、偽妊娠１日目の受容雌の卵管に片側当たり１０個前後（１匹あたり２０個前後）を移植した。
［参考例６］ＰｅｐＴ１発現出芽バキュロウイルス（ＰｅｐＴ１−ＢＶ）の調製
免疫原として用いる、ＰｅｐＴ１発現出芽バキュロウイルスを次のようにして調製した。ＰｅｐＴ１は、膜蛋白質であるトランスポーターである。ＰｅｐＴ１の構造は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ  ＸＭ＿００７０６３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１２）：６４５６−６４６３（１９９５））。
ヒト腎臓ライブラリーからＰＣＲを用いて完全長のＰｅｐＴ１遺伝子を単離した。完全長のヒトＰｅｐＴ１遺伝子をｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することでトランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ−ＰｅｐＴ１を作製した後、Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡと共にトランスファーベクターをＳｆ９細胞に導入することでヒトＰｅｐＴ１発現用組換えウイルスを調製した。即ち、４μｇのｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ−ＰｅｐＴ１をＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡに加え、さらに１ｍＬのＧｒａｃｅ’ｓ培地（ＧＩＢＣＯ）２０μＬのＣｅｌｌ  ＦＥＣＴＩＮ試薬を加え、混和し、室温で１５分間静置した後、Ｇｒａｃｅ’ｓ培地で１回洗浄した２×１０６個のＳｆ９細胞に滴下した。室温で４時間静置した後、さらに２ｍＬの完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地）を加え、２７℃で培養した。相同組換えにより作製されたヒトＰｅｐＴ１発現用組換えウイルスはキット添付の指示書に従い二度の純化を行った後、組換えウイルスのウイルスストックを得た。
ヒトＰｅｐＴ１を発現する出芽型ウイルスの調製は以下のようにして行った。すなわち、上記により調製した組換えウイルスをＭＯＩ＝５となるように５００ｍＬのＳｆ９細胞（２×１０６／ｍＬ）に感染させた。２７℃で３日間培養した後、培養液を８００×ｇで１５分間遠心分離し、細胞ならびに細胞破砕物を除去した。遠心分離により回収した上清は４５，０００×ｇで３０分間遠心した後、沈殿物をＰＢＳに懸濁し、さらに８００×ｇで１５分遠心することで細胞成分を除去した。上清は再度４５，０００×ｇで３０分間遠心した後、沈澱物をＰＢＳに再懸濁したものを出芽型ウイルス画分とした。
【産業上の利用の可能性】
本発明者らによって、ＰｅｐＴに結合する抗体がペプチドトランスポーターの輸送活性阻害能を有することが見出された。これらの抗体は、細胞増殖抑制剤として、例えば癌の治療や予防への利用が可能である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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