(57)【要約】ＡＤＡＭとの相互作用活性を有するタンパク質からなる、細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質，及び当該タンパク質のいずれかとＡＤＡＭの間の相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法，並びに細胞増殖抑制剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）からなることを特徴とする、細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質。
（Ａ）下記のいずれかの配列番号で表されるタンパク質
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
（Ｂ）（Ａ）のいずれかのタンパク質の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭと相互作用するＳＨ３ドメインを含むタンパク質
【請求項２】
ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、請求項１記載の細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のいずれかのタンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、請求項３記載の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項１記載のいずれかのタンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用を阻害する物質を有効成分として含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、請求項５に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
請求項１記載のいずれかのタンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉能力を有する物質，又はこれらのタンパク質に対する抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
ＲＮＡ干渉能力を有する物質の干渉標的が、配列番号５で表される配列である、請求項７記載の細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法に関するものであり、癌の原因となる細胞増殖を効果的に抑制できる物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】  ヘパリン結合性上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）は、細胞の増殖と分化を促進する上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーに属する（非特許文献６，７）。ＥＧＦファミリーに属する他の因子と同様に、ＨＢ−ＥＧＦは、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合してそのリン酸化を促すことにより生理的役割を果たしている（非特許文献７）。ＥＧＦファミリーに属する他の因子と同様に、ＨＢ−ＥＧＦは、膜結合型（ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦ）として合成され、その後、生物活性を有する分泌型になる。ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングと呼ばれるこの過程は、繋がれた非分泌性のジャクスタクリン型を、オートクリン／パラクリン活性を有する分泌型の増殖因子に転換する、重要な翻訳後修飾である（非特許文献５）。ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングは、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）によって誘導される（非特許文献５）。
また、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのシグナル伝達経路も、このタンパク分解プロセシングに関与している（非特許文献３）。加えて、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のアゴニストは、ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングを誘導し、その結果、ＧＰＣＲ誘導性の細胞増殖シグナル伝達における重要な要素である、ＥＧＦＲのトランスアクチベーションを引き起こす（非特許文献１４）。ＧＰＣＲによるＥＧＦＲのトランスアクチベーションには、メタロプロテアーゼの活性化による、ＥＧＦＲのリガンドのシェディング、特にｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦの中央でのシェディングが必須である。フェニレフリン、エンドセリン−１、アンギオテンシンＩＩなどのＧＰＣＲアゴニストによるＥＧＦＲのトランスアクチベーションにおけるｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングを触媒し、心肥大をもたらす特異的な酵素として、本発明者等は、膜型メタロプロテアーゼＡＤＡＭ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）ファミリーに属するＡＤＡＭ１２を同定した（非特許文献１）。さらに、ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングは、ＥＧＦＲのトランスアクチベーションの鍵となる現象である。Ｌｅｍｊａｂｂａｒ及びＢａｓｂａｕｍは、ＨＭ３において、血小板活性化因子受容体を刺激すると、ＡＤＡＭ１０によるｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦの切断を経て、ＥＧＦＲがトランスアクチベートされることを述べた（非特許文献１２）。Ｙａｎらは、ＣＯＳ−７細胞において、ボンベシン受容体を刺激すると、ＡＤＡＭ１０依存性のｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦの切断を経て、ＥＧＦＲがトランスアクチベートされることを証明した（非特許文献２１）。Ｉｚｕｍｉらは、ＡＤＡＭ９が、ＰＫＣδが活性化された時の、Ｖｅｒｏ−Ｈ細胞におけるＴＰＡ誘導性のｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングに関与していることを示した（非特許文献９）。一方、Ｗｅｓｋａｍｐらは、ＡＤＡＭ９欠損マウス由来の胚繊維芽細胞においては、ＴＰＡ刺激性のｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングが影響を受けないことを見出した（非特許文献２０）。Ｋｕｒｉｓａｋｉらは、ＡＤＡＭ１２欠損マウス由来の胚繊維芽細胞において、ＴＰＡ依存性のｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングが完全に無くなることを発見した（非特許文献１１）。
これらの報告は、ＥＧＦＲリガンド、特にｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングが、ＧＰＣＲシグナル伝達の重要なネットワークであるＥＧＦＲトランスアクチベーションの分子機構の鍵となることを示唆している。しかしながら、ＧＰＣＲのシグナル伝達がＡＤＡＭ酵素の活性化につながる経路については、まだ明らかになっていない。ＡＤＡＭ１２は、膜１回貫通型タンパク質であり、その細胞外部分には、メタロプロテアーゼドメインがあり、細胞質ドメインには、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメイン（ＳＨ３ｄｏｍａｉｎ）と相互作用する、７つの、プロリンに富むモチーフがある。
従って、ＡＤＡＭ１２は、ＳＨ３ドメインを有するシグナル伝達分子と相互作用し得る。ＡＤＡＭ１２の活性化の調節機序を明らかにすれば、ＧＰＣＲによるＥＧＦＲトランスアクチベーションのシグナル伝達経路を明確にすることができる。
尚、ＡＤＡＭファミリーには、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するものとして、このほか、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７等がある。
［非特許文献］
【非特許文献１】Ａｓａｋｕｒａ，Ｍ．，Ｍ．Ｋｉｔａｋａｚｅ，Ｓ．Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｌｉａｏ，Ｆ．Ｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｔ．Ｙｏｓｈｉｎａｋａ，Ｈ．Ｏｈｍｏｔｏ，Ｋ．Ｎｏｄｅ，Ｋ，Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｈ．Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｈ．Ａｓａｎｕｍａ，Ｓ．Ｓａｎａｄａ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｈ．Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．Ｂｅｐｐｕ，Ｍ．Ｔａｄａ，Ｍ．Ｈｏｒｉ，ａｎｄ  Ｓ．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ．２００２．Ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１２  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ＨＢ−ＥＧＦ：ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：３５−４０．
【非特許文献２】Ｆｅｎｇ，Ｓ．，Ｊ．Ｋ．Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙｕ，Ｊ．Ａ．Ｓｉｍｏｎ，ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ．１９９４．Ｔｗｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ＳＨ３−ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６６：１２４２−１２４７．
【非特許文献３】Ｇｅｃｈｔｍａｎ，Ｚ．，Ｊ．Ｌ．Ａｌｏｎｓｏｎ，Ｇ．Ｒａａｂ，Ｄ．Ｅ．Ｉｎｇｂｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ．１９９９．Ｔｈｅ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｅｆ／ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ａｎｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７４：２８８２８−２８８３５．
【非特許文献４】Ｇｉｌｐｉｎ，Ｂ．Ｊ，Ｆ．Ｌｏｅｃｈｅｌ，Ｍ．，−Ｇ．Ｍａｔｔｅｉ，Ｅ．Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｒ．Ａｌｂｒｅｃｈｔｓｅｎ，ａｎｄ  Ｕ．Ｍ．Ｗｅｗｅｒ．１９９８．Ａ  ｎｏｖｅｌ，ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＡＭ１２（Ｍｅｌｔｒｉｎ  α）ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１５７−１６６．
【非特許文献５】Ｇｏｉｓｈｉ，Ｋ．，Ｓ．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｎ．Ｎａｋａｎｏ，Ｔ．Ｕｍａｔａ，Ｍ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．Ｍｅｋａｄａ，ａｎｄ  Ｎ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ．１９９５．Ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｊｕｘｔａｃｒｉｎｅ  ｔｏ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．６：９６７−９８０．
【非特許文献６】Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．，Ｊ．Ａ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｊ．Ｃ．Ｆｉｄｄｅｓ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ．１９９１．Ａ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ＥＧＦ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５１：９３６−９３９．
【非特許文献７】Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．，Ｋ．Ｌａｕ，Ｇ．Ｅ．Ｂｅｓｎｅｒ，Ｊ．Ａ．Ａｂｒａｈａｍ，ａｎｄ  Ｍ．Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ．１９９２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｒｍｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６２０５−６２１２．
【非特許文献８】Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．，Ｋ．Ｋ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｍａｃｉｅｗｉｃｚ，ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｂｌｏｂｅｓ．１９９９．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＭＤＣ９  ａｎｄ  ＭＤＣ１５  ｗｉｔｈ  ｔｗｏ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅｎｄｏｐｈｉｌｉｎ  Ｉ  ａｎｄ  ＳＨ３ＰＸ１  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１６９３−３１６９９．
【非特許文献９】Ｉｚｕｍｉ，Ｙ．，Ｍ．Ｈｉｒａｔａ，Ｈ．Ｈａｓｕｗａ，Ｒ．Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｕｍａｔａ，Ｋ．Ｍｉｙａｄｏ，Ｙ．Ｔａｍａｉ，Ｔ．Ｋｕｒｉｓａｋｉ，Ａ．Ｓｅｈａｒａ−Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｓ．Ｏｈｎｏ，ａｎｄ  Ｅ．Ｍｅｋａｄａ．１９９８．Ａ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ，ＭＤＣ９／Ｍｅｌｔｒｉｎ−Ｙ／ＡＤＡＭ９  ａｎｄ  ＰＫＣδ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＴＰＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：７２６０−７２７２．
【非特許文献１０】Ｋａｎｇ，Ｑ．，Ｙ．Ｃａｏ，ａｎｄ  Ａ．Ｚｏｌｋｉｅｗｓｋａ．２００１．Ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ  ｏｆ  ＡＤＡＭ１２  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ８５α  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  Ｃ２Ｃ１２  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４４６６−２４４７２．
【非特許文献１１】Ｋｕｒｉｓａｋｉ，Ｔ．，Ａ．Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．Ｓｕｄｏ，Ｊ．Ｓａｋａｇａｍｉ，Ｓ．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．Ｎａｇａｂｕｋｕｒｏ，Ａ．Ｔｓｕｊｉ，Ｙ．Ｎａｂｅｓｈｉｍａ，Ｍ．Ａｓａｎｏ，Ｙ．Ｉｗａｋｕｒａ，Ａ．Ｓｅｈａｒａ−Ｆｕｊｉｓａｗａ．２００３．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｅｌｔｒｉｎ  α（ＡＤＡＭ１２）−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｌｔｒｉｎ  α  ｉｎ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：５５−６１．
【非特許文献１２】Ｌｅｍｊａｂｂａｒ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｃ．Ｂａｓｂａｕｍ．２００２．Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＡＤＡＭ１０  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：４１−４６．
【非特許文献１３】Ｐｏｇｈｏｓｙａｎ，Ｚ．，Ｓ．Ｍ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｍ．Ｄ．Ｈｏｕｓｌａｙ，Ａ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｇ．Ｍｕｒｐｈｙ，ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｅｄｗａｒｄｓ．２００２．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＡＤＡＭ１５  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｒｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４９９９−５００７．
【非特許文献１４】Ｐｒｅｎｚｅｌ，Ｎ．，Ｅ．Ｚｗｉｃｋ，Ｈ．Ｄａｕｂ，Ｍ．Ｌｅｓｅｒｅｒ，Ｒ．Ａｂｒａｈａｍ，Ｃ．Ｗａｌｌａｓｃｈ，ａｎｄ  Ａ．Ｕｌｌｒｉｃｈ．１９９９．ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ．Ｎａｔｕｒｅ．４０２：８８４−８８８．
【非特許文献１５】Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｒ．，Ｊ．，Ｍ．Ｃ．Ｂｏｔｆｉｅｌｄ，Ｘ．Ｍ．Ｚｈｏｕ，Ｐ．Ａ．Ｈｅｎｒｙ，Ｊ．Ｓ．Ｂｒｕｇｇｅ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｚｏｌｌｅｒ．１９９５．Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  ｄｏｍａｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１０９０９−１０９１３．
【非特許文献１６】Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｙ．，Ｎ．Ａｏｋｉ，Ｋ．Ｉｔｏ，ａｎｄ  Ｍ．Ｉｔｏ．２００３．Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈ３ｄ１９，ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆｉｖｅ  Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３  ｄｏｍａｉｎｓ，ｉｎ  ａｎａｇｅｎ  ｍｏｕｓｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．３１：４３−５１．
【非特許文献１７】Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．，Ｎ．Ｋａｄｏｔａ，Ｔ．Ｈａｒａ，Ｙ．Ｎａｋａｇａｍｉ，Ｔ．Ｉｚｕｍｉ，Ｔ．Ｔａｋｅｎａｗａ，Ｈ．Ｓａｂｅ，ａｎｄ  Ｔ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｌｔｒｉｎ  α  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｒｃ  ａｎｄ  Ｇｒｂ２  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｖ−Ｓｒｃ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９：５８４２−５８５０．
【非特許文献１８】Ｔａｎａｂｅ，Ｙ．，Ｍ．Ｓｅｉｋｉ，Ｊ．Ｆｕｊｉｓａｗａ，Ｐ．Ｈｏｙ，Ｋ．Ｙｏｋｏｔａ，Ｋ．Ａｒａｉ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，ａｎｄ  Ｎ．Ａｒａｉ．１９８８．ＳＲα  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒ−Ｕ５  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２．
【非特許文献１９】Ｔｏｋｕｍａｒｕ，Ｓ．，Ｓ．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｔ．Ｅｎｄｏ，Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａ，Ｊ．Ｍｉｙａｇａｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｏｒｉ，Ｙ．Ｈａｎａｋａｗａ，Ｈ．Ｏｈｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙｏｓｈｉｎｏ，Ｙ．Ｓｈｉｒａｋａｔａ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，ａｎｄ  Ｎ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ．２０００．Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５１：２０９−２１９．
【非特許文献２０】Ｗｅｓｋａｍｐ，Ｇ．，Ｈ．Ｃａｉ，Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｄｉｅ，Ｓ．Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｋ．Ｍａｎｏｖａ，Ｔ．Ｌｕｄｗｉｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｐ．Ｂｌｏｂｅｌ．２００２．Ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ＭＤＣ９（ＡＤＡＭ９）ｈａｖｅ  ｎｏ  ｅｖｉｄｅｎｔ  ｍａｊｏｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｒ  ａｄｕｌｔ  ｌｉｆｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２２：１５３７−１５４４．
【非特許文献２１】Ｙａｎ，Ｙ．，Ｋ．Ｓｈｉｒａｋａｂｅ，ａｎｄ  Ｚ．Ｗｅｒｂ．２００２．Ｔｈｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｋｕｚｂａｎｉａｎ（ＡＤＡＭ１０）ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：２２１−２２６．
ここで、本発明者は、ＡＤＡＭ１２結合タンパク質を同定するために酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施し、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質（第１図，配列番号１〜４）を見出した（ＡＤＡＭの結合相手であることから、以下、これらを総称してＥｖｅ−１と記載することがある。）。本発明者は、アンギオテンシンＩＩ及びＴＰＡによって誘導される、ＡＤＡＭ１２の活性化及びｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングに、Ｅｖｅ−１が関与することを確かめて本発明を完成した。
【発明の開示】
つまり本発明者は、Ｅｖｅ−１が、ＡＤＡＭ１２を始めとするＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭと相互作用し、それらの有する細胞膜結合型増殖因子のエクトドメインシェディング活性を促進することを見出し、本発明を完成したものであって、その目的とするところは、細胞膜結合型増殖因子のシェディング阻害活性ひいては細胞増殖抑制活性を有する、新たな物質をスクリーニングするための指標タンパク質を提供すること，これらのタンパク質を用いたスクリーニング方法を確立すること、そして具体的な細胞増殖抑制剤を提供することにある。
以下、本発明を詳細に説明する。
上述の目的は、以下の発明によって達成される。
第一の発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）からなることを特徴とする、細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質である。
（Ａ）下記のいずれかの配列番号で表されるタンパク質
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
（Ｂ）（Ａ）のいずれかのタンパク質の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつ、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭと相互作用するＳＨ３ドメインを含むタンパク質（以下、（Ａ）の類縁タンパク質ということがある。）
第二の発明は、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、前記細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質である。
第三の発明は、（Ａ）又は（Ｂ）いずれかのタンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする、細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法である。
第四の発明は、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、前記細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法である。
第五の発明は、（Ａ）又は（Ｂ）いずれかのタンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用を阻害する物質を有効成分として含むことを特徴とする、細胞増殖抑制剤である。
第六の発明は、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭが、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１２，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７の少なくともいずれかである、上記第五の発明の細胞増殖抑制剤である。
第七の発明は、（Ａ）又は（Ｂ）いずれかのタンパク質のｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉能力を有する物質，又はこれらのタンパク質に対する抗体を有効成分として含む該細胞増殖抑制剤である。
第八の発明は、ＲＮＡ干渉能力を有する物質の干渉標的が、配列番号５で表される配列である、上記細胞増殖抑制剤である。
尚、本発明において、「細胞増殖抑制」とは、例えば、細胞膜結合型増殖因子のシェディング抑制等を意味するものである。細胞膜結合型増殖因子としては、ＨＢ−ＥＧＦ，ＴＧＦ−α，アンフィレグリン（ＡＲ），エピレグリン（ＥＰＲ）等が挙げられる。
＜細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質＞
本発明の細胞増殖抑制剤スクリーニング用タンパク質とは、下記のいずれかの配列番号で表されるタンパク質、またはその１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭと相互作用するＳＨ３ドメインを含むタンパク質である。
配列番号１
配列番号２
配列番号３
配列番号４
これらのタンパク質は、そのアミノ酸配列内に、ＡＤＡＭ中のＳＨ３ドメイン結合モチーフ，つまりプロリンリッチドメインと相互作用可能な、ＳＨ３ドメインを有するヒトタンパク質である（第１図）。
第１図（Ａ）に表された７６７個のアミノ酸からなる配列が、Ｅｖｅ−１ａである（第１図（Ｂ）の一番上の模式図）。そしてＥｖｅ−１ａの４１４番目と４１５番目のアミノ酸の間に、第１図（Ａ）に記載した様に２３個のアミノ酸が挿入された７９０個のアミノ酸からなる配列が、Ｅｖｅ−１ｂである（第１図（Ｂ）の二番目の模式図）。このＥｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂは、同一のＥｖｅ−１遺伝子から選択的スプライシングにより生じるアイソフォームである。また、第１図（Ａ）に記載した様に、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂの３７１番目に相当するＭｅｔから始まって翻訳される３９７個あるいは４２０個のアミノ酸からなる短型が、それぞれＥｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄである（第１図（Ｂ）の三番目、又は四番目の模式図）。
＜細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法＞
本発明の細胞増殖抑制剤のスクリーニング方法は、被験物質による、上記のスクリーニング用タンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用阻害活性を測定することによって実施することができる。
この相互作用阻害には、上記２つの物質間の結合やシグナル授受の阻害の他、これらの物質が、相互作用することの間接的な阻害，例えば、スクリーニング用タンパク質が、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭとの相互作用のために細胞膜近傍へ移動することの阻害や、スクリーニング用タンパク質が相互作用に先立って翻訳後修飾を受けるものである場合には、その翻訳後修飾を阻害することも含まれる。
スクリーニング用タンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭとの相互作用阻害活性が強い被験物質は、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭに起因する細胞膜結合型増殖因子のシェディングの阻害効果に優れており、これは、細胞増殖抑制効果が高いことを意味する。
細胞膜結合型増殖因子であるｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングは、下記▲１▼▲２▼の２つのルートによって、細胞増殖を促進することが明らかとなっているからである（東山繁樹等，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３年，第１６３巻，第４８９〜５０２頁）。
▲１▼ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングによって生じるＨＢ−ＥＧＦの細胞外ドメイン（可溶化ＨＢ−ＥＧＦ）がＥＧＦレセプターに作用し、細胞増殖を促進するルート。
▲２▼ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングによって生じるＨＢ−ＥＧＦの細胞質ドメインが、ＰＬＺＦ等のＤＮＡ核内転写調節因子を核外に輸送し、このため、ＰＬＺＦ等が果たしていた細胞周期の促進阻害というブレーキの役割が解除され、細胞増殖が促進されるルート。これは、本発明者等によって見出された第二のルートである。
本発明のスクリーニング方法によって得られる物質は、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭによる細胞膜結合型増殖因子のシェディングを阻害するので、細胞増殖の２つのルートを、ともに効果的に抑制し得るものである。
スクリーニング用タンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの間の相互作用阻害活性を測定するには、蛋白質相互間の作用を確認する一般的な方法、例えば酵母ツーハイブリッド法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴を利用した方法等を用いることができる。また、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの有する細胞膜結合型増殖因子シェディングの抑制効果を検出することによって、スクリーニング用タンパク質と当該ＡＤＡＭの間の相互作用が阻害されていることを間接的に確認することもできる。
このＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭの有するｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦシェディングの抑制効果は、シェディングによって生じる可溶化ＨＢ−ＥＧＦの生成を確認することにより検出可能である。
可溶化ＨＢ−ＥＧＦの生成を確認する方法としては、以下の方法を挙げることができる。
（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）のトランスフェクタントを使用する方法）
ＰＣＴ公開公報（ＷＯ０１／７０２６９）に記載された手法に従って、ＡＰ活性を測定することにより可溶化ＨＢ−ＥＧＦの生成を確認できる。
（ヘパリン−ビーズを用いる沈降方法）
培養上清１ｍｌにＮａＣｌを０．３５モル濃度になるように添加する。これにヘパリン−セファロース（ヘパリン−ビーズ）を２０μｌ添加し、室温で３０分インキュベーションする。次に、ヘパリン−ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁し、ＨＢ−ＥＧＦ抗体＃Ｈ６（ｓｏｌｕｂｌｅ  ＨＢ−ＥＧＦに対する抗体）を反応させ、ＡＰ−結合２次抗体を反応させて、ＡＰ活性を測定する。
（ジフテリア毒素とＨＢ−ＥＧＦ抗体＃Ｈ６を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法）
９６イムノプレートにジフテリア毒素（シグマ社製）３μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、１００μｌ／ウエルで固相化する。細胞培養上清１００μｌを加え室温で２時間反応したのち、ビオチン標識１次抗体、ＡＰ標識ストレプトアビジンで反応させ、ＡＰ活性を検出する。各反応後のプレート洗浄はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で行う。
尚、本発明で言うスクリーニングには、複数候補の中から、本発明の阻害剤を選択するための、いわゆる一次スクリーニングの他、被験物質の抗腫瘍性（細胞増殖抑制能）を確認するための、二次スクリーニング（確認試験）も、含まれる。
＜細胞増殖抑制剤＞
本発明の細胞増殖抑制剤としては、Ｅｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ，Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄのいずれかのタンパク質とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭとの間の相互作用，特に、ＡＤＡＭのＳＨ３ドメイン結合モチーフ、つまりプロリンリッチドメインと、Ｅｖｅ−１タンパク質のＳＨ３ドメインとの間の相互作用を阻害する物質が挙げられる。
上記細胞増殖抑制剤は、前記スクリーニング方法を用いることにより得ることができる。
また、本発明の細胞増殖抑制剤には、直接、Ｅｖｅ−１側に作用するものと、ＡＤＡＭ側に作用するものも含まれる。具体的には、前者としては、例えば下記の（１）〜（４）等が挙げられ、後者としては、（５）等が挙げられる。
（１）Ｅｖｅ−１のｍＲＮＡ中の下記配列番号５で表される領域を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりノックダウンすることのできる、ＲＮＡｉ用の二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ），マイクロＲＮＡ、またはそれらの発現ベクター等である。下記の配列は、ＮＣＢＩデータベースに収載されている他の配列のいずれとも類似性を有しないものであるため、細胞におけるＲＮＡｉ実験によって、Ｅｖｅ−１だけを選択的にノックダウンすることができる，つまり、他の遺伝子を阻害することなく、細胞増殖を抑制できる点で非常に有用である。これらのＲＮＡおよび発現ベクターは、リポフェクタミン（商標）の様な、オリゴヌクレオチド導入用カチオン性脂質により、細胞内に導入することができる。
2004113532.tif 000002
（２）Ｅｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ，Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄのいずれかのタンパク質に対する抗体
（３）Ｅｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ，Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄのいずれかのタンパク質の、ｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ
（４）プロリンリッチドメインタンパク質（例えば、（Ｒ／Ｋ）ＸＸＰＸＸＰ又はＰＸＸＰＸ（Ｒ／Ｋ）等で表される。）
（５）ＳＨ３ドメインタンパク質
【図面の簡単な説明】第１図
Ｅｖｅ−１の、導き出されたアミノ酸配列及びドメイン構造。
（Ａ）Ｅｖｅ−１のアミノ酸配列。Ｅｖｅ−１ａのオープンリーディングフレームから７６７アミノ酸が導き出された。Ｅｖｅ−１ｂにおいては、２３アミノ酸の挿入が見られる。予見されるＳＨ３ドメインは四角で囲み、ＳＨ３ドメインに結合する、７つのプロリンに富むモチーフには、下線を引いている。
（Ｂ）Ｅｖｅ−１のアイソフォームの模式図。
第２図
（Ａ）Ｅｖｅ−１の組織分布。
方法の項で述べたようにして調べた、多様なヒト組織のノーザンブロット。各レーンの上には、ｍＲＮＡの組織源が記されている。
（Ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１），二種のヒト結腸癌細胞（ＳＷ４８０，ＷｉＤｒ），及びヒト繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０）由来のｃＤＮＡは、Ｅｖｅ−１特異的なプライマー対を用いて、ＰＣＲで増幅した。
（Ｃ）ウェスタンブロット分析。
４つの細胞系からの溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＥｖｅ−１抗体を用いたウェスタンブロット分析に供した。レーンには、１００μｇのタンパク質を装填した。ＨＴ１０８０細胞に発現したリコンビナントＥｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ，Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄの混合物を、陽性コントロールとした。
アスタリスクは、Ｅｖｅ−１の他の分解アイソフォームと考えられる。
第３図
ＡＤＡＭ１２とＥｖｅ−１の共局在。
ＥＹＦＰ融合ＡＤＡＭ１２及び各ＥＣＦＰ融合Ｅｖｅ−１アイソフォームを発現しているＨＴ１０８０細胞を、ＥＹＦＰ（左の図）及びＥＣＦＰ（中央の図）で蛍光画像化した。右の図は画像を併せたものである。ＥＹＦＰ融合ＡＤＡＭ１２の、各ＥＣＦＰ融合Ｅｖｅ−１アイソフォームとの原形質膜における共局在は、一列に並んだ２つの矢尻で示している。ＥＣＦＰ融合Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂは、ＥＹＦＰ融合ＡＤＡＭ１２と、細胞質でも共局在している（矢尻）。挿入図は、四角で囲んだ領域を拡大したものである。
第４図
ＨＴ１０８０細胞における、Ｅｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄの、ＡＤＡＭ１２との結合。
ＨＴ１０８０細胞に一時的に発現させたＦＬＡＧ標識タンパク質が、抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降し（下の図）、共免疫沈降したＡＤＡＭ１２が、抗ＡＤＡＭ１２抗体を用いた免疫ブロッティングにより検出された（上の図）。
アスタリスクは、ＩｇＧのバンドを示している。
第５図
ｓｉＲＮＡによるＥｖｅ−１のノックダウン。
（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。
ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＡＰ細胞（スクランブルｓｉＲＮＡ又はＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞）から調製されたｃＤＮＡを、Ｅｖｅ−１に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲによって増幅した。
（Ｂ）免疫ブロット分析。
ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＡＰ細胞（ｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ−Ｅｖｅ−１ａと、スクランブルｓｉＲＮＡ又はＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞）の溶解液を、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫ブロットした。
（Ｃ）Ｅｖｅ−１がｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングに及ぼす作用。
Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＡＰ又はＨＴ１０８０／ＨＢ−ＡＰ／ＡＴ１細胞の、培養上清におけるＡＰ活性を、１００ｎＭアンギオテンシンＩＩ又は１００ｎＭ  ＴＰＡとともに各々３７℃で３０分間インキュベートした後に、測定した。値は、平均値±標準偏差（ｎ＝４）を表す。
第６図
Ｅｖｅ−１が、他の細胞膜結合型増殖因子のエクトドメインシェディングに及ぼす影響。
ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＴ１０８０／ＴＧＦ−α−ＡＰ，ＨＴ１０８０／ＡＲ−ＡＰ，ＨＴ１０８０／ＥＰＲ−ＡＰの培養上清におけるＡＰ活性を、１００ｎＭのＴＰＡで、３７℃，３０分間インキュベートした後、測定した。細胞表面のｐｒｏ−ＴＧＦ−α，ｐｒｏ−ＡＲ，ｐｒｏ−ＥＰＲの発現は、細胞表面のビオチン化，及び抗ＴＧＦ−α抗体，抗ＡＲ抗体，抗ＥＰＲ抗体を用いた免疫沈降によって測定した。値は、平均値±標準偏差（ｎ＝４）を表す。
アスタリスクは、ｐ＜０．０００１スクランブルｓｉＲＮＡやＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡの、アンギオテンシンＩＩ又はＴＰＡとの関係の差である。
第７図
ＨＴ１０８０細胞中でのＥｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄとＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７との結合。
ＨＴ１０８０細胞で一時的に発現させたｍｙｃ−標識タンパク質を、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降させた。
共免疫沈降したＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１７は、抗ＡＤＡＭ１０抗体，抗ＡＤＡＭ１７抗体で検出し、ＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１５は、抗ＦＬＡＧ抗体で検出した。
アスタリスクは、非特異的バンドである。
第８図
抗Ｅｖｅ−１抗体による内因性Ｅｖｅ−１の検出。
ＨＴ１０８０細胞に一時的に発現させたＦＬＡＧ標識ＡＤＡＭ１２を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させた。共免疫沈降したＥｖｅ−１ｃは、抗Ｅｖｅ−１抗体による免疫ブロッティングで検出した。ＨＴ１０８０細胞で発現したリコンビナントＥｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ，Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄ混合物を、陽性コントロールとした。
【発明を実施するための最良の形態】  実施例によって、本発明をより詳細に説明する。代表的な例として、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭとしてはＡＤＡＭ１２，細胞膜結合型増殖因子としてはＨＢ−ＥＧＦを用いて説明するが、本発明はこれらに関するものに限られるものではない。
以下、実施例に先立って、実施例において用いた試験方法を記載する。
〈試験方法〉
［発現ベクター及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）］
ｐＢＴＭ１１６ベクター（クロンテック）のＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩマルチクローニングサイトにＡＤＡＭ１２の細胞質ドメインのｃＤＮＡを挿入することにより、ＡＤＡＭ１２の細胞質ドメインが融合したＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードする、酵母の発現プラスミドを構築した。ＡＤＡＭ１２の全長ｃＤＮＡは、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１ベクター（クロンテック）のＳａｃＩ及びＳａｌＩ部位でクローン化した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってヒト心臓のｃＤＮＡライブラリーから単離したＥｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂの全長ｃＤＮＡを、ＳＲαプロモーターを有する改変型ｐＭＥ１８Ｓベクター（ｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ）のＳａｌＩ及びＮｏｔＩマルチクローニングサイトに導入した。これらのｃＤＮＡも、ｐＥＣＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック）のＸｈｏＩ及びＳｍａＩ部位でクローン化した。Ｅｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄのｃＤＮＡを、それぞれ、鋳型として挿入されたＥｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂを含有するベクターを用いて増幅し、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬＡＧベクターのＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ部位でクローン化した。ｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ及びｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬＡＧベクターは、Ｋ．Ｔｏｕｈａｒａ博士（東京大学、東京、日本）から供給を受けた。Ｅｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄも、ｐＥＣＦＰ−Ｃ１ベクターのＢｇｌＩＩ及びＳｍａＩ部位でクローン化した。
ｓｉＲＮＡ二重鎖は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．が化学合成し、精製した。Ｅｖｅ−１のノックダウンのために、Ｅｖｅ−１の標的配列として、配列番号５：５’−ＡＡＣＣＵＵＣＵＧＵＡＧＣＵＣＣＣＡＡＡＣ−３’を選択した。この配列は、ＮＣＢＩデータベースに収載されている他の配列のいずれとも、実質上類似性を有さなかった。配列番号６：５’−ＧＣＧＣＧＣＵＵＵＧＵＡＧＧＡＵＵＣＧ−３’に直接対応するスクランブルｓｉＲＮＡを陰性対照とした。ＮＣＢＩデータベースには、この配列を有する哺乳動物のｍＲＮＡは存在しなかった。
［酵母ツーハイブリッドスクリーニング］
ｐＢＴＭ１１６−ＡＤＡＭ１２を含有する酵母Ｌ４０株（Ｃｙｔｏ）を、トリプトファンを含まない完全合成培地上で選別した。ｐＡＣＴ２におけるヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを形質転換細胞に逐次導入し、酵母細胞を、３．５ｍＭの３−アミノトリアゾールの存在下で、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジンを含まない完全合成培地上に播種した。３０℃で３〜７日間、ドロップアウトプレート上で増殖させた形質転換細胞を、β−ガラクトシダーゼ活性の分析に供した。ライブラリーのプラスミドＤＮＡを、大腸菌ＨＢ１０１細胞への形質転換によって回収し、配列を決定した。
［ノーザンブロット分析］
ヒトのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ、＃７７８０−１、クロンテック）をブロットした正帯電ナイロン膜を、全長ｃＤＮＡを包含する３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識Ｅｖｅ−１プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせた膜をＢＡＳ１０００プレート（Ｂａｓ−ＩＩＩ型）に接触させて置き、ＢＡＳ１０００バイオイメージアナライザー（富士写真フィルム、日本）で解析した。データの再現性を確保するため、独立した実験を２回行い、ヒトのβ−アクチンを対照プローブとした。
［ウエスタンブロット分析］
ヒトの癌細胞（乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１），二種の結腸癌細胞（ＳＷ４８０，ＷｉＤｒ），及び繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０）を用い、常法に従って行った。ＧＡＰＤＨを対照プローブとした。
［細胞培養］
ＨＴ１０８０細胞、及び、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦを発現する安定なトランスフェクタント（ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ細胞）、又は、ＡＰ標識ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦとＩ型アンギオテンシンＩＩ（ＡＴ１）受容体の両者を発現する安定なトランスフェクタント（ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ／ＡＴ１細胞）を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸及び１０％ウシ胎仔血清を補充したイーグルの最小必須培地で、５％二酸化炭素下、３７℃で培養した。
また、同様にして、ＡＰ標識ＴＧＦ−α，ＡＰ標識ＡＲ，ＡＰ標識ＥＰＲ等の他の細胞膜結合型増殖因子についても、安定なトランスフェクタント（ＨＴ１０８０／ＴＧＦ−α−ＡＰ，ＨＴ１０８０／ＡＲ−ＡＰ，ＨＴ１０８０／ＥＰＲ−ＡＰ）を作成し、培養した。
［免疫沈降及び免疫ブロット分析］
１０ｃｍディッシュで８０〜９０％のコンフルエンスに達したＨＴ１０８０細胞を、製品指示書に従い、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いて、２０μｇのｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｃ又はｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｄでトランスフェクトし、その後、３０時間インキュベートした。トランスフェクトした細胞をリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、及びコンプリート・プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ  モレキュラー  バイオメディカル）を含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（溶解緩衝液）に溶解した。その溶解液を遠心分離し、上澄みを抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２）（シグマ−アルドリッチ）とともに１時間インキュベートした。その混合物にプロテインＧセファロース（アマシャム  バイオサイエンス）を加えて３０分間インキュベートした。
免疫沈降物を遠心分離によって集め、溶解緩衝液で３回洗浄した後に、ＳＤＳサンプル緩衝液の中で煮沸し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離してポリビニリデンジフルオライド膜に移した。シグマアルドリッチから購入した抗ＦＬＡＧ抗体又は瀬原淳子博士（京都大学、京都、日本）から得た抗ＡＤＡＭ１２ポリクローナル抗体を一次抗体として用いて、免疫ブロッティングを実施した。
二次抗体は、ＡＰで標識した抗マウス又は抗ウサギ抗体（プロメガ）とし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸及びニトロブルーテトラゾリウムを基質として用いて発色させた。
［蛍光顕微鏡法］
ＨＴ１０８０細胞（８０〜９０％コンフルエント）を、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を用いて、２．０μｇのｐＥＹＦＰ−Ｎ１−ＡＤＡＭ１２、及び、２．０μｇのｐＥＣＦＰ−Ｅｖｅ−１ａ、ｐＥＣＦＰ−Ｅｖｅ−１ｂ、ｐＥＣＦＰ−Ｅｖｅ−１ｃ又はｐＥＣＦＰ−Ｅｖｅ−１ｄでコトランスフェクトし（３５ｍｍディッシュ）、その後、２４時間インキュベートした。強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）融合ＡＤＡＭ１２、及び、強化シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）融合Ｅｖｅ−１の細胞内局在性を、オリンパスＩＸ−７０倒立蛍光顕微鏡下で調べた。
［ｓｉＲＮＡによるＥｖｅ−１のノックダウン］
ＨＴ１０８０細胞（８０〜９０％コンフルエント）を、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のために４．０μｇのｓｉＲＮＡで（３５ｍｍディッシュ）、ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰのシェディング分析のために０．８μｇのｓｉＲＮＡで（２４ウェルプレートのウェル毎に）、又は、免疫ブロッティングのために０．２μｇのｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ−Ｅｖｅ−１ａ及び０．６μｇのｓｉＲＮＡで（２４ウェルプレートのウェル毎に）、リポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクトし、その後、４０時間インキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲのために細胞から総ＲＮＡをトライゾール（インビトロジェン）を用いて抽出し、ファーストストランドｃＤＮＡをスーパースクリプトＩＩ（イシビトロジェン）を用いて合成した。ＰＣＲは、Ｅｖｅ−１に特異的な１組のプライマー対（配列番号７：５’−ＡＴＧＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＣＡＧ−３’及び配列番号８：５’−ＣＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣＴＧ−３’）を用いて行った。免疫ブロット分析においては、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）（サンタ  クルズ  バイオテクノロジー）を一次抗体とした。
［ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰのシェディング分析］
トランスフェクションは、上述したように行った。その後、細胞を１００ｎＭのアンギオテンシンＩＩ又はＴＰＡとともに３７℃で３０分間インキュベートした。培養上清を１００μｌずつ９６ウェルプレートに等分し、ＡＰ活性を上述の様にして測定した（１９）。
［抗体の作成］
抗ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０）は、サンタ  クルズ  バイオテクノロジーから購入した。
抗ＦＬＡＧ抗体は、シグマアルドリッチから購入した。
ＡＤＡＭ１０やＡＤＡＭ１７に対するラビットポリクローナル抗体は、ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から各々購入した。
Ｅｖｅ−１に対するラビットポリクローナル抗体は、リコンビナント  Ｅｖｅ−１ｃに対するものを作成した。
〈試験結果〉
［酵母ツーハイブリッドスクリーニングによる、ＡＤＡＭ１２と相互作用する細胞質内タンパク質の同定］
ＡＤＡＭ１２の細胞質ドメインと相互作用するタンパク質を同定するために、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーの３．０ｘ１０６クローンを、ＡＤＡＭ１２の細胞質ドメインをベイトとして用いる酵母ツーハイブリッドシステムによってスクリーニングした。単離されたクローンの一つであるＡ１２−＃２には、２９７アミノ酸をコードする２．８ｋｂの挿入部分が含まれていた。Ａ１２−＃２のｃＤＮＡ配列についてのＢＬＡＳＴ検索により、７６７アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する仮想タンパク質のカルボキシ末端領域に一致することが判明した。本発明者は、その全長タンパク質を、ＡＤＡＭの結合相手であることから、Ｅｖｅ−１と呼ぶこととした。ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって同時にクローン化された２つの全長ｃＤＮＡは、それぞれ、予見された２３アミノ酸の挿入部分がない７６７アミノ酸、及び２３アミノ酸の挿入部分がある７９０アミノ酸のタンパク質をコードしていた。
これらのタンパク質を、本発明者は、それぞれ、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂと呼ぶこととした。ドメインの構造解析により、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂは、それぞれ、４つ及び５つの一列のＳＨ３ドメインをカルボキシ末端領域に有することが明らかとなった。また、アミノ末端領域において、７つの、プロリンに富む、ＳＨ３ドメイン結合モチーフ〔（Ｒ／Ｋ）ＸＸＰＸＸＰ又はＰＸＸＰＸ（Ｒ／Ｋ）（非特許文献２、１５）〕も見出された（第１図Ａ及びＢ）。Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂのＭｅｔ３７１から始まって翻訳される短型は、新規アダプタータンパク質として最近同定されたマウスのＳｈ３ｄ１９（非特許文献１６）に相当するヒトタンパク質である。これらを、本発明者は、Ｅｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄと名付けた（第１図Ａ及びＢ）。Ｅｖｅ−１遺伝子のゲノム解析により、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂは、染色体４ｑ３１に位置する単一の遺伝子から選択的スプライシングによって生じたアイソフォームであることが明らかとなった。
［Ｅｖｅ−１の組織分布］
ノーザンブロット分析により、各種ヒト組織における、Ｅｖｅ−１のｍＲＮＡの発現を調べた。Ｅｖｅ−１プローブとのハイブリダイゼーションにより、ほとんどの組織で５．８ｋｂの一本鎖ｍＲＮＡが検出された。骨格筋、心臓、腎臓及び胎盤では比較的多量の発現が見られ、脳、胸腺、脾臓及び白血球では非常に低い発現が見られた（第２図（Ａ））。
［癌細胞におけるＥｖｅ−１の分布］
ヒトの癌細胞（乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１），二種の結腸癌細胞（ＳＷ４８０，ＷｉＤｒ），及び繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０）由来のｃＤＮＡを、Ｅｖｅ−１特有のプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。その結果、乳癌細胞以外の３つの癌細胞でＥｖｅ−１遺伝子の発現が確認できた（第２図（Ｂ））。
尚、ウエスタンブロット分析により、各癌細胞中で検出されたＥｖｅ−１は、Ｅｖｅ−１ｃが支配的であることが確認された（第２図（Ｃ））。
これらの結果は、本発明の細胞増殖抑制剤が、実際に癌細胞中で有効に効果を発揮し得ること，及び、既に癌化した細胞においては、本発明の細胞増殖抑制剤の中でも、Ｅｖｅ−１ｃとＡＤＡＭとの間の相互作用を阻害する物質が、より効果的であることを示している。
［ＡＤＡＭ１２とＥｖｅ−１の共局在］
ＡＤＡＭ１２とＥｖｅ−１を細胞内に局在させるために、ＥＹＦＰ融合ＡＤＡＭ１２と、ＥＣＦＰ融合Ｅｖｅ−１アイソフォームの各々を、ＨＴ１０８０細胞に一時的に共発現させた。蛍光顕微鏡法により、ＡＤＡＭ１２−ＥＹＦＰは、すべてのＥＣＦＰ−Ｅｖｅ−１アイソフォームと、細胞内小胞（矢尻；第３図）及び細胞の縁（二重矢尻；第３図）に共局在することが明らかとなった。
［マウスのＳｈ３ｄ１９に相当するヒトタンパク質である、Ｅｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄの、哺乳動物細胞におけるＡＤＡＭ１２との結合］
哺乳動物細胞においてＥｖｅ−１がＡＤＡＭ１２と結合し得ることを確認するために、ＦＬＡＧエピトープで標識したＥｖｅ−１ａ、Ｅｖｅ−１ｂ、Ｅｖｅ−１ｃ又はＥｖｅ−１ｄを、ＨＴ１０８０細胞で一時的に発現させた。第４図は、ＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｃ及びＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｄが抗ＦＬＡＧ抗体により細胞溶解液から免疫沈降し（下の図）、共免疫沈降した内因性のＡＤＡＭ１２が抗ＡＤＡＭ１２抗体を用いて検出された（上の図）ことを示している。
しかしながら、ＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ａ及びＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｂについてはいずれも内因性のＡＤＡＭ１２の共免疫沈降は見られなかった。これは、アミノ末端領域に存在するプロリンに富むドメインによる制御が原因かもしれない。又は、ＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ａ及びＦＬＡＧ−Ｅｖｅ−１ｂの発現が減少したのかもしれない。
上述でＡＤＡＭ１２と結合したＥｖｅ−１ｃ及びＥｖｅ−１ｄは、ヒトのタンパク質であるが、このうちＥｖｅ−１ｄは、最近見つかったマウスのアダプタータンパク質Ｓｈ３ｄ１９（非特許文献１６）に相当するタンパク質である。
マウスでは、ノーザンブロッティングによってＥｖｅ−１の５．８ｋｂの一本鎖ｍＲＮＡが検出されたことから、Ｅｖｅ−１の短型を翻訳するために異なる開始コドンが使われていることが示唆された。一方、Ｓｈ３ｄ１９の転写が起こっても、その翻訳領域の上流に終止コドンがあるため、全長Ｅｖｅ−１に相当するマウスタンパク質は生成しないことが、ＮＣＢＩデータベースの解析によって明らかとなった。データベースから得られたこの情報により、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂは、ヒトに特有な機能を有していると考えられる。Ｅｖｅ−１は、マウスＳｈ３ｄ１９の組織発現とは異なり（非特許文献１６）、骨格筋及び心臓で多量に発現している。まだＥｖｅ−１ａとＥｖｅ−１ｂとの間の差異については明らかになっていないが、Ｅｖｅ−１の発現プロファイルは、ＡＤＡＭ１２の発現プロファイルと類似している。
［Ｅｖｅ−１アイソフォームとＡＤＡＭ１２との関係］
上述の、Ｅｖｅ−１アイソフォームとＡＤＡＭ１２の共局在，あるいは結合確認に関する２つの試験結果から、下記のことが示された。
蛍光顕微鏡による解析の結果、ＥＣＦＰが融合したＥｖｅ−１短型及び全長Ｅｖｅ−１の細胞内局在性には、差異があることが明らかとなった。Ｅｖｅ−１の短型は、細胞質中に拡散するとともに、内因性ＡＤＡＭ１２も存在する原形質膜に部分的に存在した。それに対して、全長Ｅｖｅ−１は、原形質膜に局在した。細胞質に存在するスポットが、原形質膜に適切に輸送されなかった融合タンパク質の集合体の形成を示していることから、全長Ｅｖｅ−１のプロリンに富むアミノ末端領域は、Ｅｖｅ−１が細胞質内に拡散することを妨げてＥｖｅ−１を原形質膜に向かわせるために必要なのかもしれない。
また、全長Ｅｖｅ−１のプロリンに富むアミノ末端領域は分子内のレギュレーターであり、ＡＤＡＭ１２に結合するためには翻訳後の切断を要する可能性がある。ＥＣＦＰ融合全長Ｅｖｅ−１の蛍光強度は、ＥＣＦＰ融合Ｅｖｅ−１短型の蛍光強度よりもかなり弱かった。さらに、全長Ｅｖｅ−１の一時的発現のレベルも、そのｃＤＮＡが強力な哺乳類ＳＲαプロモーターによって駆動されたにもかかわらず、非常に低かった。従って、内因性のＡＤＡＭ１２が、Ｅｖｅ−１の短型と共免疫沈降したのに、ＨＴ１０８０細胞に一時的に発現した全長Ｅｖｅ−１とは、原形質膜におけるＥＹＦＰ融合ＡＤＡＭ１２とＥＣＦＰ融合全長Ｅｖｅ−１の共局在にもかかわらず共免疫沈降しなかったのは、このことが原因であると説明できるかもしれない。
つまり、この結果は、以下のことを示唆している。
まず第一に、本発明の細胞増殖抑制剤のスクリーニング用タンパク質としては、Ｅｖｅ−１の中でも、Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄ及びその類縁タンパク質等の短型が、直接的かつ確実な抑制作用物質を選択できる点で有利であることを示している。
第二に、Ｅｖｅ−１ａ，Ｅｖｅ−１ｂ及びその類縁タンパク質等の全長型が本発明の細胞増殖抑制剤のスクリーニング用タンパク質である場合には、スクリーニングの具体的な方法としては、当該スクリーニング用タンパク質がＡＤＡＭ１２との相互作用のために例えば細胞膜近傍へ移動するのを阻害する物質や、スクリーニング用タンパク質が、短型へと翻訳後修飾されるのを阻害する物質を選択する方法が好ましいことを示している。
［Ｅｖｅ−１が、アンギオテンシンＩＩ又はＴＰＡによって誘導されるｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングに及ぼす作用］
ｓｉＲＮＡが媒介するｍＲＮＡの破壊を利用して、Ｅｖｅ−１がｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングに及ぼす作用を調べた。まず始めに、Ｅｖｅ−１ノックダウンにおけるＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡの効果を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲ及び免疫ブロット分析によって、ｍＲＮＡ及びタンパク質の量をそれぞれ調べた。Ｅｖｅ−１のｃＤＮＡは、陰性対照であるスクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ細胞から単離した総ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたが、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた場合には増幅されなかった（第５図Ａ）。さらに、ｍｙｃ−Ｅｖｅ−１ａタンパク質は、ｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ−Ｅｖｅ−１ａ及びスクランブルｓｉＲＮＡでコトランスフェクトされたＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ細胞の溶解液においては検出されたが、ｐＭＥ１８Ｓ−ｍｙｃ−Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでコトランスフェクトされた場合には検出されなかった（第５図Ｂ）。これらの実験により、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡがＥｖｅ−１のｍＲＮＡを破壊したことが確認された。
次に、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡがＨＢ−ＥＧＦのエクトドメインシェディングに及ぼす作用を調べた。ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ／ＡＴ１細胞をスクランブルｓｉＲＮＡ又はＥｖｅ−１−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、１００ｎＭアンギオテンシンＩＩとともに３０分間インキュベートした後に、各トランスフェクタントの培養上清におけるＡＰ活性を測定した。同様に、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰ細胞を用いて、ＴＰＡによって誘導されたＨＢ−ＥＧＦ−ＡＰのシェディングを調べた。
Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡによるＥｖｅ−１のノックダウンにより、アンギオテンシンＩＩ又はＴＰＡに誘導されるＡＰ標識ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングが、それぞれ、対照と比較して５３％又は６５％減少した（第５図Ｃ）。つまり、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡが、細胞増殖抑制剤として有用であることが確認された。
［Ｅｖｅ−１が、他の細胞膜結合型増殖因子のエクトドメインシェディングに及ぼす作用］
また、ＨＢ−ＥＧＦ以外の、ＴＧＦ−α，ＡＲ，ＥＰＲ等の細胞膜結合型増殖因子についても、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡによって、同様にシェディングが抑制されることが確認された（第６図）。
第６図に示されたように、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡによるＥｖｅ−１のノックダウンにより、ＴＰＡに誘導されるＡＰ標識ｐｒｏ−ＴＧＦ−α，ＡＰ標識ｐｒｏ−ＡＲ，ＡＰ標識ｐｒｏ−ＥＰＲのシェディングが、それぞれ、対照と比較して５０％，４０％，あるいは５０％減少した。つまり、Ｅｖｅ−１−ｓｉＲＮＡが、ＨＢ−ＥＧＦ以外の細胞膜結合型増殖因子に由来する細胞増殖の抑制剤としても有用であることが確認された。
［他のＡＤＡＭとＥｖｅ−１との結合］
本発明者は、ＧＰＣＲアゴニスト又はＴＰＡによって誘導され、ＡＤＡＭが仲介する、ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦシェディングの調節機序を理解するのに役立つ手がかりを探索するため、ひとまずｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディング酵素として最近同定されたＡＤＡＭ１２に焦点をあてた、ＡＤＡＭ１２の細胞質ドメインをベイトとして用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって、ＳＨ３ドメインを有するタンパク質を選択し（Ｅｖｅ−１）上述の各試験を行った。
しかし本発明者は、このタンパク質が多数のＳＨ３ドメインを有することを見出したので、Ｅｖｅ−１が、ＡＤＡＭ１２の細胞質内末端に存在するプロリンに富むＳＨ３ドメイン結合モチーフと、相互作用するのではないかと推測した。
一方、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７など、ＡＤＡＭファミリーに属するタンパク質のいくつかは、ＡＤＡＭ１２と同様に、細胞質内末端にこのようなＳＨ３ドメイン結合モチーフを有している。実際に、これらのＡＤＡＭタンパク質のいくつかは、その細胞質ドメインを介して、ＳＨ３ドメインを有する他のシグナル伝達分子と相互作用することが報告されている（非特許文献８、１０、１７）。従って、ＳＨ３ドメインを有するいくつかのタンパク質が、ＡＤＡＭの細胞質ドメインにおいて複合体を形成し、そのメタロプロテアーゼ活性を調節しているものと思われる。
そこで本発明者は、ＡＤＡＭ１２と同様の方法で、これらのＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１０，ＡＤＡＭ１５，ＡＤＡＭ１７とＥｖｅ−１が結合するかどうかを調べた。
ｍｙｃ標識したＥｖｅ−１の各アイソフォームを、ＨＴ１０８０細胞に発現させ、抗ｍｙｃ抗体で免疫沈降させた。そして、抗ＡＤＡＭ１０抗体，抗ＡＤＡＭ１７抗体でＡＤＡＭ１０，１７を，あるいは抗ＦＬＡＧ抗体でＡＤＡＭ９，ＡＤＡＭ１５を各々共免疫沈降させた。
その結果、第７図で示したように、Ｅｖｅ−１ｃ，Ｅｖｅ−１ｄが、これらのＡＤＡＭと結合することが確認された。
この結果は、本発明の細胞増殖抑制剤による細胞増殖抑制効果は、ＡＤＡＭ１２に限らず、ＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭファミリーの、総合的な制御によるものであることを示唆するものである。
［Ｅｖｅ−１の各アイソフォームの生物学的意義］
Ｅｖｅ−１遺伝子は、少なくとも２つの選択的スプライシングアイソフォーム、Ｅｖｅ−１ａ及びＥｖｅ−１ｂをコードする。Ｅｖｅ−１ａは、４つの一列に並んだＳＨ３ドメインの上流に１つの不完全なＳＨ３ドメインを有する。一方、Ｅｖｅ−１ｂにおいては、Ｅｖｅ−１ａの不完全ＳＨ３ドメインに隣接する位置に２３アミノ酸が付加されて、その結果、もう一つの完全なＳＨ３ドメインが形成されている。すなわち、Ｅｖｅ−１ｂは完全な５つのＳＨ３ドメインを有しており、このことは、これらの２つのアイソフォームが、機能的に異なって、ＡＤＡＭの調節に関与していることを示唆している。本発明者のＰＣＲ分析により、ＨＴ１０８０細胞にはＥｖｅ−１ｂよりもＥｖｅ−１ａの方が多量に存在することが示唆された。しかしながら、これらのアイソフォームの生物学的意義を知るためには、さらに、様々な組織における両アイソフォームの発現プロファイルを正確に解析することが必要である。
［抗Ｅｖｅ−１抗体による内因性Ｅｖｅ−１の検出］
尚、本発明者は、Ｅｖｅ−１ｃの組換えタンパク質を用いて抗Ｅｖｅ−１抗体を開発した。そして、免疫ブロッティングによって、ＨＴ１０８０細胞に発現している内因性Ｅｖｅ−１の検出及び分子量推定を試みた。当初の実験では、おそらく抗体の親和性又はＥｖｅ−１の発現レベルが低すぎたために、内因性Ｅｖｅ−１タンパク質を検出することはできなかった。しかし、Ｅｖｅ−１を十分発現させた条件下、更度試みた結果、この抗Ｅｖｅ−１抗体を用いた免疫ブロッティングによって、ＦＬＡＧ−ＡＤＡＭ１２が、Ｅｖｅ−１ｃと共免疫沈降しているのが検出された（第８図）。このことは、抗Ｅｖｅ−１抗体が、Ｅｖｅ−１を介したＡＤＡＭ１２によるｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦのシェディングの抑制剤として有望であることを裏付けている。
【産業上の利用可能性】  本発明のＥｖｅ−１又はその類縁タンパク質からなるスクリーニング用タンパク質、及びスクリーニング方法を用いることによって、ｐｒｏ−ＨＢ−ＥＧＦ，ｐｒｏ−ＴＧＦ−α，ｐｒｏ−ＡＲ，ｐｒｏ−ＥＰＲ等の細胞膜結合型増殖因子のシェディングを抑制できる、すなわち細胞増殖を抑制することのできる物質を、効率良く取得することができる。またこのようにして得られた細胞増殖抑制剤は、癌等の治療剤としても有効である。特に、本発明の細胞増殖抑制剤が二重鎖ｓｉＲＮＡ，ＲＮＡｉ発現ベクター、アンチセンスＲＮＡの場合には、Ｅｖｅ−１のｍＲＮＡの段階でノックダウンを行うため、より確実に、Ｅｖｅ−１とＳＨ３ドメイン結合モチーフを有するＡＤＡＭとの相互作用を阻害することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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