(57)【要約】プロテインチップテクノロジーを利用して血清等生体試料のプロテオーム解析を行い、習慣飲酒に伴って増減するヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ）の分解産物であって分子量５，９００の蛋白質、アポリポプロテインＡＩＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ）の分解産物であって分子量７，８００の蛋白質およびアポリポプロテインＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）であって分子量２８，０００の蛋白質を新たに見出し、これらの蛋白質の検出あるいは定量により問題飲酒者等の肝臓疾患を早期に診断することができる。
2004058966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ）の分解産物であって分子量５，９００の蛋白質（５．９ｋＤａ蛋白質）、アポリポプロテインＡＩＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ）の分解産物であって分子量７，８００の蛋白質（７．８ｋＤａ蛋白質）、アポリポプロテインＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）であって分子量２８，０００の蛋白質およびこれらの蛋白質の変異体であってこれらと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体から選ばれる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項２】
５．９ｋＤａ蛋白質が配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号１のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項１の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項３】
７．８ｋＤａ蛋白質が配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号２のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項１の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項４】
アポリポプロテインＡＩであって分子量２８，０００の蛋白質が配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、その変異体が該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質あるいは配列番号３のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である請求項１の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項５】
飲酒が要因の肝臓疾患診断用の請求項１から４のいずれかの肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項６】
アルコール性肝障害診断用またはアルコール依存症診断用の請求項５の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質。
【請求項７】
肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、請求項１から６のいずれかの肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断する方法。
【請求項８】
肝臓疾患が飲酒が要因の肝臓疾患である請求項７の診断方法。
【請求項９】
肝臓疾患がアルコール性肝障害またはアルコール依存症である請求項８の診断方法。
【請求項１０】
検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定を質量分析法により行なう請求項７から９のいずれかの診断方法。
【請求項１１】
質量分析計で得られるスペクトルのパターン分析により診断する請求項１０の診断方法。
【請求項１２】
質量分析をレーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により行う請求項１０または１１の診断方法。
【請求項１３】
レーザーイオン化飛行時間型質量分析計が表面増強レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）である請求項１２の診断方法。
【請求項１４】
検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定を、該蛋白質に対する抗体を用いた免疫測定法により行う請求項７から９のいずれかの診断方法。
【請求項１５】
免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法または蛍光法である請求項１４の診断方法。
【請求項１６】
免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）である請求項１５の診断方法。
【請求項１７】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号１のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体。
【請求項１８】
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号２のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体。
【請求項１９】
請求項１７または１８の蛋白質またはその変異体、あるいはアポリポプロテインＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）であって分子量２８，０００の蛋白質またはその変異体であってそれと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体の測定方法であって、それらの蛋白質または変異体に対する抗体を用いて免疫測定法により測定する測定方法。
【請求項２０】
免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法または蛍光法である請求項１９の診断方法。
【請求項２１】
免疫測定法が、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）である請求項２０の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、プロテインチップテクノロジーを利用した血清試料のプロテオーム解析の結果、習慣飲酒に伴って増減し従って肝臓疾患診断用マーカー蛋白質として利用できることが見出された複数の血清蛋白質およびそれらの蛋白質の存否の検出あるいは定量により問題飲酒者等の肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患、肝臓疾患の予後等を診断する方法に関するものである。
【背景技術】  アルコールによる臓器障害の診断の第一歩は正確な飲酒歴の把握であるが、アルコール依存は否認の病気といわれ、常習飲酒家が、その飲酒量を正確に申告しないのは古今東西変わりがない。従って、その裏づけとなる客観的なマーカーが必要である。習慣飲酒のマーカーとして最も広く測定されているのはγ−ＧＴＰ（ＧＧＴ）であるが、飲酒家がＧＧＴ高値を示す場合でも、その値は肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後のＧＧＴの変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンリスポンダーが相当数存在する。
一方、飲酒習慣がない場合でも肥満に伴う脂肪肝、ある種の薬剤の常用者など飲酒以外の要因でＧＧＴが上昇する場合も多く、人間ドック等などにおいてＧＧＴ高値、即ち飲酒家といった短絡的指導が行われる場合も少なくない。従って、ＧＧＴに相補的な検査として糖鎖欠損トンランスフェリン（ＣＤＴ）が北欧の研究者達により開発され、欧米の文献ではその有用性が強調されているが、日本人を対象とした成績では飲酒マーカーとしてのＣＤＴはＧＧＴのノンレスポンダーの１０％程度を拾いあげるにとどまっている。
エタノールの第一代謝産物であるアセトアルデヒドは反応性に富み、種々の蛋白との間で各種のアセトアルデヒド付加体を形成する。例えばアセトアルデヒド−ヘモグロビン付加体をＨＰＬＣなどにより検出する試みがなされている。糖尿病におけるＨｂＡ１ｃのように飲酒量を過去にさかのぼって推測しうる興味深いマーカーと期待されるものもあるが、感度に難があり実用化していない。
習慣飲酒は慢性肝障害の２大要因のひとつである。わが国の肝硬変症例において、純粋にアルコールのみに起因する症例の割合は１０〜１５％に過ぎないとされている。しかし、これは主として大学病院などを対象にして得られたデータであり、２００万人を超えると予想されるアルコール依存症の存在を考えると、医療機関を受診する機会がないアルコール性肝障害患者が多数潜在していると予想される。また、習慣飲酒は脳出血、高血圧、痛風などの増悪因子でもあり、問題飲酒者を早期にかつ的確にスクリーニングすることは極めて重要である。しかし、上記のように、現在存在するいわゆる飲酒マーカーにおいて感度・特異度において決定的なものはなく、新たなマーカーを検索することが求められている。
網羅的発現タンパク解析の手法として一般的なのは二次元タンパク電気泳動であるが、低分子量蛋白またはペプチドの検出に難がある。近年、ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーが米国Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発され、新規腫瘍マーカーの検出など臨床応用が始まっている。従ってこれらのプロテオミクス技術などを活用して網羅的に新たなマーカーを検索することが求められている。
【発明の開示】
本発明は、問題飲酒者などの肝臓疾患を早期にしかも的確にスクリーニングしうる新規マーカーを見出し、その測定系を確立し、医療に役立てることを課題としている。
本発明者らは上記の課題に関して鋭意検討した結果、本発明を完成した。即ち、本発明者らはプロテインチップテクノロジーを応用し、断酒目的に入院したアルコール依存症患者において経時的に採取された血清検体を用い、習慣飲酒に伴って増減する新規の血清蛋白を同定することに成功した。そしてこれらの血清蛋白は肝臓疾患診断マーカー蛋白質として利用できることを見出し本発明を完成させた。
従って、本発明は、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ）の分解産物であって分子量５，９００の蛋白質（５．９ｋＤａ蛋白質）、アポリポプロテインＡＩＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ）の分解産物であって分子量７，８００の蛋白質（７．８ｋＤａ蛋白質）、アポリポプロテインＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）であって分子量２８，０００の蛋白質およびこれらの蛋白質の変異体であってこれらと同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体から選ばれる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に関するものである。
更に本発明は、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、上記肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断する方法に関するものである。
更に本発明は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有する新規蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号１のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体に関するものである。
更に本発明は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する新規蛋白質またはその変異体であって該蛋白質と同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくは配列番号２のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体に関するものである。
更に本発明は、上記の蛋白質またはそれらの変異体の測定方法であって、それらの蛋白質または変異体に対する抗体を用いて免疫測定法により測定する測定方法に関するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社のプロテインチップシステムを利用し、ＳＡＸＩＩチップを使用して測定されたアルコール性肝障害患者血清の測定結果である。ピークの高さの減少から入院時、１週間後、３ヶ月後と経時的に２８ｋＤａ蛋白質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）が血清中から徐々に低下していることがわかる。
図２は、図１と同様にＷＣＸＩＩチップを使用して測定したアルコール性肝障害患者血清の測定結果である。入院時から治療に伴い経時的に、（１）５．９ｋＤａ蛋白質、（２）７．８ｋＤａ蛋白質の血中濃度が上昇している様子がわかる。
図３は、図１と同様にＷＣＸＩＩチップを使用して測定した健常人血清の測定結果である。（１）５．９ｋＤａ蛋白質、（２）７．８ｋＤａ蛋白質は一定の高値を示しており、図２と比較することにより、同蛋白質が疾患によって低下したことがわかる。
図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる７．８ｋＤａ蛋白質及び２８ｋＤａ蛋白質の電気泳動結果である。サンプル中に目的蛋白質を含むことがわかる。
図５は、合成された５．９ｋＤａ蛋白質の質量分析値とＨＰＬＣのデータを示す。質量分析値は、理論値に一致していることがわかる。
図６は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社のプロテインチップシステムを利用し、ＷＣＸＩＩプロテインチップアレイを用いて、合成された５．９ｋＤａ蛋白質と飲酒しない患者血清検体のデータを比較したものである。両者とも、５．９ｋＤａにピークを有し、同一した挙動を示した。
図７は、種々の飲酒量の健常人や患者で、血清検体を、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社のプロテインチップシステムを利用し、ＷＣＸＩＩプロテインチップアレイを用いて５．９ｋＤａのピークの大小を測定したものである。飲酒量依存的に、ピークが小さくなることが判明した。
図８は、検体として種々の濃度の５．９ｋＤａ蛋白質を含むものを用い、ＥＩＡ法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）により吸光度を測定したものである。横軸は５．９ｋＤａ蛋白質の濃度を示し、縦軸は測定された吸光度を示す。５．９ｋＤａ蛋白質の濃度依存的に、吸光度の上昇がみられる。すなわち、検体中の５．９ｋＤａ蛋白質の濃度をＥＩＡ法により測定できることを示している。
発明を実施するための形態
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明により肝臓疾患診断用マーカー蛋白質として利用できることが見出された蛋白質は、ヒトフィブリノーゲンα−Ｅ鎖（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ）の分解産物であって分子量５，９００の蛋白質（以下５．９ｋＤａ蛋白質という）、アポリポプロテインＡＩＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ）の分解産物であって分子量７，８００の蛋白質（以下７．８ｋＤａ蛋白質という）およびアポリポプロテインＡＩ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）であって分子量２８，０００の蛋白質（以下２８ｋＤａ蛋白質という）である。これらの５．９ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質および２８ｋＤａ蛋白質は、それぞれ配列表の配列番号１、２および３に示すアミノ酸配列を持つ蛋白質である。
次にそれぞれの蛋白質を説明する。５．９ｋＤａ蛋白質はヒトＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎの分解産物であり、５４個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、その理論分子量は５９０４．２である。７．８ｋＤａ蛋白質はヒトのＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ分解産物であり、６８個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、その理論分子量は７７５３．８である。また２８ｋＤａ蛋白質はＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩであり、２４３個のアミノ酸よりなる蛋白質であって、理論分子量２８０７８．８である。これら蛋白質の中、５．９ｋＤａ蛋白質および７．８ｋＤａ蛋白質については、その血中の存在、肝障害等における臨床的意義が明らかになったのは本発明が初めてであって、新規蛋白質並びに新規マーカー物質である。また２８ｋＤａ蛋白質であるＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩは既知の蛋白質であり、脂質代謝における臨床的意義が確立して臨床的に測定されてきたものである。
本発明により肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能が見出された５．９ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質および２８ｋＤａ蛋白質は、配列表に示したアミノ酸配列を有するもののみに限定されるものではなく、同様に肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有するそれらの蛋白質の変異体であってもよい。即ち、特に血液、組織中では多種類のエンド及びエキソプロテアーゼによって分解を受ける可能性が大きく、アミノ酸の全長や配列の長さに変化があることは十分考慮されるべきである。また組換え蛋白質作製においては発現効率を下げないために抗原性を極力変化させないようなアミノ酸変異を持たせることは定法である。よって本発明の５．９ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質および２８ｋＤａ蛋白質のそれぞれのアミノ酸配列と９０％以上の相同性（ここで相同性とはアミノ酸の同一性を意味する）を有する蛋白質であるそれらの変異体であってもよい。それらのアミノ酸配列の長さが１５％以内で変化していても問題はなく、肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する場合は本発明に包含される。そして好ましくは９５％以上の相同性を持つ蛋白質、より好ましくは９８％以上の相同性を持つ蛋白質がよい。アミノ酸配列の相同性は既に公知のソフトウエア、例えばＷｉｌｂｅｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，７２６−７３０，１９８３）に記載の検索方法を原理とするソフトウエアを利用して検索できる。またＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社）などは市販される汎用ソフトであって簡単に利用できる。
本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である５．９ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質および２８ｋＤａ蛋白質の変異体としては、配列番号１、２および３のそれぞれのアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって同様の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質としての機能を有する変異体でもよい。このような変異体としては、例えば１０％未満のアミノ酸残基が修飾を受けた蛋白質、好ましくは５％未満、更に好ましくは２％未満のアミノ酸残基が修飾を受けた蛋白質などが挙げられる。アミノ酸残基の修飾は、当業者に周知の遺伝子技術によりアミノ酸変異として導入することができる。また翻訳後修飾、リン酸化、アセチル化、糖鎖付加などの周知の修飾を受けた変異体も本発明の範囲に含まれる。
以上に説明した本発明により見出された肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に基づいて肝臓疾患の診断が可能になる。即ち、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の、上記肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定して、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断することができる。
本発明で用いることのできる検体としては、肝臓疾患が疑われる患者から採取した血清、血漿、血液、尿などが挙げられる。
本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否の検出あるいはその量の測定は、現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。
質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により行う方法が挙げられる。レーザーイオン化飛行時間型質量分析計としては、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）などを例示できる。
例えば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法を用いる場合、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用することができる。この機械はＳＥＬＤＩ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーである。その詳細はＷＯ  ０１／２５７９１  Ａ２号公報、特開２００１−２８１２２号公報等に詳しい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。
これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質を吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的の蛋白質に対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
その他の質量分析法としては、例えばＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）による質量分析法が挙げられる。ＥＳＩ法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。
免疫測定法としては、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られている蛋白質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
上記免疫測定法に使用できる抗体としては既に汎用されている方法により作製されるポリクローナルやモノクローナル抗体が挙げられる。これらの抗体はヒト血液由来精製蛋白質、具体的には、２８ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質、５．９ｋＤａ蛋白質を免疫原（抗原）として使用することにより得ることができる。抗体を作成するためのこれらの蛋白質は、ヒト血液から精製して入手してもよいが、公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。これに限らず培養細胞などの産生蛋白質も抗原として用いることができる。更には、遺伝子工学的に作製された完全長の組換え蛋白質、それらの変異体、それらの一部分を用いることも常套手段であり、利用され得るものである。
モノクローナル抗体は、上記したさまざまな抗原、例えば、２８ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質、５．９ｋＤａ蛋白質、即ち、マーカー蛋白質などを免疫原として動物を免疫し、その脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることにより得られるハイブリドーマによって産生される。
ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述のようにして得た抗原、例えば、マーカー蛋白質をフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は通常１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等を試験管内で融合する。融合法としては既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
融合した細胞からマーカー蛋白質を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地及びＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にマーカー蛋白質に対する抗体が含まれている場合には、マーカー蛋白質をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等、２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、マーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでマーカー蛋白質それぞれに対する特異的抗体のスクリーニングができることになる。つまりマーカー蛋白質プレートのいずれかで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡ法で陰性のクローンを選択する。
例えば、本発明者が樹立したハイブリドーマＣＮ−１およびＣＮ−２はヒト５．９ｋＤａ蛋白質を特異的に認識するクローンであり、好ましい例として挙げることができる。ハイブリドーマＣＮ−１およびＣＮ−２は、〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）にそれぞれ、平成１５年１２月１２日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６４として、また平成１５年１２月１２日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６５として寄託されている。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。ハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記方法によって精製された本発明によるモノクローナル抗体によって検体中の２８ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質または５．９ｋＤａ蛋白質を精密測定することができる。ＥＩＡ法で検体中の２８ｋＤａ蛋白質、７．８ｋＤａ蛋白質または５．９ｋＤａ蛋白質を測定する方法としては、方法それ自体は公知であり、抗体としてマーカー蛋白質に対する１種または複数のモノクローナル抗体を用いることにより行うことができる。以下にその例を記述する。初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用してマーカー蛋白質に対するモノクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は通常１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体に検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し対応する二次標識抗体（例えば、抗２８ｋＤａ蛋白質２次標識抗体、抗７．８ｋＤａ蛋白質２次標識抗体、抗５．９ｋＤａ蛋白質２次標識抗体）を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、ＤＡＢ発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
上記した免役測定法以外にも、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などによりマーカー蛋白質を測定することができる。これらの方法も既に当業者に周知であり、それらの周知の方法をそのまま採用することができる。
以上に説明した方法により、肝臓疾患が疑われる患者から得た検体中の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の存否を検出しあるいはその量を測定することにより、肝臓疾患発症可能性、肝臓疾患あるいは肝臓疾患の予後を診断することができる。本発明の診断方法は、上記した質量分析により行う場合には、質量分析計によって得られるスペクトルのパターン分析によって診断することもできる。本発明の診断方法は、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変などを診断することもでき、また通常の肝臓疾患を診断することもできる。更には、肝臓疾患の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害、アルコール依存症などの診断に適している。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】ＳＡＸＩＩプロテインチップアレイを用いる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の同定
インフォームド・コンセントを行なった患者血清を使用し、ＳＡＸＩＩプロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて血清中の新規肝傷害マーカーを検索した。ＳＡＸＩＩチップとはＳｔｒｏｎｇ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｉｐのことであり、検体中の負電荷物質を結合させるという特徴を持っている。検体としてアルコール性肝障害患者入院直後及び禁酒後１週間、３ヶ月そして正常者の血清を用いた。
（１）方法
以下にプロテインチップアレイ実験操作法を簡単に述べる。血清サンプルは８Ｍ尿素（ＳＩＧＭＡ）／１％ＣＨＡＰＳ（ＳＩＧＭＡ）溶液で１０倍に希釈した。１０分間氷上処理を行なった後、５０ｍＭトリス（ＳＩＧＭＡ）緩衝液（ｐＨ９．０）にて更に１０倍希釈し、４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離操作を行なってその上清を希釈サンプルとして用いた。ＳＡＸＩＩチップはＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒに取り付けて実験した。Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒとは金属チップ上に立体的ウェルを簡易作製する穴付プラスチック製アダプターであり、この方法によって希釈サンプルを大量にアプライできる。
初めに１５０μＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）をウェル状になったチップに加え、振とう機上で５分間洗浄を行なった。これを２回行なった後に先の希釈サンプル１００μＬを添加し、室温で２０分間振とうしてチップと反応させた。続いて希釈サンプルを除き、１５０μＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて振とう機上で５分間洗浄を行なった。この操作を３回繰り返した。その後４００μＬの蒸留水で２回洗浄し、チップをＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒから取り外した。チップが乾いた後、ＰＡＰｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）で蛋白質の接着しているスポットを囲み、０．５μＬの飽和シナピン酸（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）／５０％アセトニトリル（Ｗａｋｏ）／０．５％ＴＦＡ（Ｗａｋｏ）溶液を２回添加した。作製したプロテインチップアレイは、プロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。
（２）結果
図１に、代表的なアルコール肝障害入院時患者血清の測定データを示す。このデータフォーマットでは、ＳＡＸＩＩプロテインチップから脱着されたサンプルのタンパク質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。よって図１から明らかなように、アルコール性肝障害患者の入院時のデータでは、分子量２８ｋＤａの蛋白質のピークが観察されたが、入院後はほとんど観察されないことが判明した。従って、この２８ｋＤａ蛋白質を指標として、肝臓疾患を診断できることが判った。
【実施例２】ＷＣＸＩＩプロテインチップアレイを用いる肝臓疾患診断用マーカー蛋白質の同定
次に実施例１と全く同一検体を使用し、ＷＣＸＩＩプロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて血清中の新規肝傷害マーカーを検索した。ＷＣＸＩＩチップとはＷｅａｋ  Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｉｐのことであり、検体中の正電荷物質を結合させるという特徴を持っている。
（１）方法
以下にプロテインチップアレイ実験操作法を簡単に述べるが殆ど実施例１と同様である。血清サンプルを８Ｍ尿素（ＳＩＧＭＡ）／１％ＣＨＡＰＳ（ＳＩＧＭＡ）溶液で１０倍に希釈した。１０分間氷上処理を行なった後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）緩衝液（ｐＨ６．５）にて更に１０倍希釈し、４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離操作を行なってその上清を希釈サンプルとして用いた。ＷＣＸＩＩチップはＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒに取り付けて実験し、初めに１５０μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）をウェル状になったチップに加え、振とう機上で５分間洗浄を行なった。これを２回行なった後に先の希釈サンプル１００μＬを添加し、室温で２０分間振とう反応させた。続いて希釈サンプルを除き、１５０μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて振とう機上で５分間洗浄を行なった。この操作を３回繰り返した。その後４００μＬの蒸留水で２回洗浄し、チップをＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒから取り外した。チップが乾いた後、ＰＡＰｅｎ（Ｚｙｍｅｄ）で蛋白質の接着しているスポットを囲み、０．５μＬの飽和シナピン酸（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）／５０％アセトニトリル（Ｗａｋｏ）／０．５％ＴＦＡ（Ｗａｋｏ）溶液を２回添加した。プロテインチップアレイは、プロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。
（２）結果
図２に代表的なアルコール性肝障害入院時患者血清の測定データ、図３に正常者の測定データを示す。図３から明らかなように、図３の正常者のデータでは、分子量５，９００Ｄａ（５．９ｋＤａ蛋白質）及び分子量７，８００（７．８ｋＤａ蛋白質）のピークが大きいにもかかわらず、図２のアルコール性肝障害患者の入院直後のデータでは、ピークがほとんど認められないことが判明した。この５．９ｋＤａ蛋白質と７．８ｋＤａ蛋白質のピークは治療に従ってピークが高くなり治療効果をよく示している。これらの蛋白質は肝臓疾患診断用マーカー蛋白質となりうることが判った。
【実施例３】２８ｋＤａ蛋白質の同定
（１）ＳＡＸＩＩプロテインチップ実験によって見出された２８ｋＤａ蛋白質についてＦＰＬＣ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）により、ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムを用いて５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ９．０）、流速２ｍｌ／ｍｉｎ条件下で血清サンプルを用いた精製を行なうと目的とする２８ｋＤａ蛋白質をほぼ単一に精製できた。このフラクションを電気泳動法により次のように確認した。フラクションはＳＤＳを含む２×サンプルバッファー（０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．０１％ＢＰＢ，１０％β−メルカプトエタノール）と１：１の割合で混合し、９０℃で２分間処理した後使用した。電気泳動は１５−２５％Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＮＴ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて１０ｍＡで行った。
（２）図４のレーン４および５に示すように、Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｔａｂｌｅｔ  Ｒ−３５０（Ｐｈａｓｔ  Ｇ１  Ｂｌｕｅ  Ｒ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）によるクマシーブリリアントブルー染色によって２８ｋＤａの位置にバンドが確認された。
（３）次にこのゲルのバンドを切り出してＩｎ−Ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法によりペプチドを分離した。簡単にはＧｅｌ片を２回洗浄した後、３５℃で一晩トリプシン処理した。次にこのトリプシン処理サンプルを逆相ＨＰＬＣ法により精製した。精製条件はＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡ（ＴＯＳＯＨ）カラムを用いた０．１％ＴＦＡと０．０９％ＴＦＡ  ９０％アセトニトリルによるグラジエント溶出である。
この結果得られた２８ｋＤａ蛋白質フラグメントの内部アミノ酸配列を決定した。２８ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号３に示した。２８ｋＤａ蛋白質フラグメントのアミノ酸配列分析を行なうとその内部配列からヒトＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩであることがわかった。
（４）そこでチップ実験に用いた同一血清検体を後の実施例６に述べる既知の自動分析機による免疫測定法を用いて測定し、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ値を調べると表１のような結果が得られた。この免疫測定法結果より治療効果の認められた患者検体では治療後明らかにＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ値が低下していた。一方、プロテインチップ実験結果の２８ｋＤａ蛋白質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩ）ピークも治療によって低くなり、治療効果を反映していた。このように免疫測定法による結果とプロテインチップ実験結果が非常によく相関し、ピークの大きさは病態解析に利用できることを示していることがわかった。
【実施例４】７．８ｋＤａ蛋白質の同定
（１）ＷＣＸＩＩプロテインチップ実験によって見出された７．８ｋＤａ蛋白質についても２８ｋＤａ蛋白質と同様にＦＰＬＣ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）にてＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを用い、５０ｍＭ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅバッファー、流速２ｍｌ／ｍｉｎ条件下で血清サンプルの精製を行なうと目的とする７．８ｋＤａ蛋白質を精製できた。プロテインチップ実験によって７．８ｋＤａ蛋白質の確認出来たフラクションを電気泳動法により確認した。検体血清はＳＤＳを含む２×サンプルバッファーと１：１の割合で混合し、９０℃で２分間処理した後使用した。電気泳動は１５−２５％Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌを用いて１０ｍＡで行った。
（２）図４のレーン２および３に示すように、クマシーブリリアントブルー染色によって７．８ｋＤａの位置にバンドが確認された。この７．８ｋＤａの蛋白質をほぼ単一に含むフラクションを濃縮し、先の２８ｋＤａ蛋白質の実施例３と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なってゲルから目的とする７．８ｋＤａバンドを切り出してＩｎ−Ｇｅｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ法によりペプチドを分離した。この方法は実施例３と同様であるが簡単にはＧｅｌ片を２回洗浄した後、３５℃で一晩トリプシン処理する。次にこのトリプシン処理サンプルを逆相ＨＰＬＣ法により精製した。精製条件はＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡ（ＴＯＳＯＨ）カラムを用いた０．１％ＴＦＡと０．０９％ＴＦＡ  ９０％アセトニトリルによるグラジエント溶出である。
（３）７．８ｋＤａ蛋白質フラグメントのアミノ酸配列分析を行なうとその内部配列からヒトＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩであることがわかった。しかし完全長ヒトＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩの理論分子量は１１４３２．４であり、７．８ｋＤａ蛋白質はつまりヒトＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＡＩＩ分解産物であることがわかった。７．８ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【実施例５】５．９ｋＤａ蛋白質の同定
（１）ＷＣＸＩＩプロテインチップ実験によって見出された５．９ｋＤａ蛋白質についてＦＰＬＣ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）にてＨｉＴｒａｐ  ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムを用い、５０ｍＭ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅバッファー、流速２ｍｌ／ｍｉｎ条件下で血清サンプルの精製を行なうと目的とする５．９ｋＤａ蛋白質を精製できた。再びプロテインチップ法により５．９ｋＤａ蛋白質を多く含むフラクションをチェックした後、濃縮してＨＰＬＣ（ＴＯＳＯＨ）によって更に精製を行なった。精製条件はＳｅｐｈａｓｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）、アセトニトリルグラジエント、１ｍＬ／ｍｉｎである。
（２）再びプロテインチップ法によりフラクションをチェックした後、凍結乾燥により濃縮してアミノ酸配列決定を行なった。精製５．９ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列を決定するとヒトＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ分解産物であることがわかった。完全長ヒトＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎは分子量が７２４８８．３であることから、５．９ｋＤａ蛋白質はヒトＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  α−Ｅ  Ｃｈａｉｎ分解産物であることがわかったのである。５．９ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
更に５．９ｋＤａ蛋白質のアミノ酸配列が正確なものであるか確認するためにその配列の蛋白質を全化学合成した。化学合成された５４アミノ酸を有する蛋白質の分子量は５９０４．１であり理論値と一致した（図５）。またこの合成蛋白質を用いて実際の検体と比較検討を行った。実験は実施例２と全く同様のＷＣＸＩＩプロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて行い、サンプルとして１００ｎｇ／ｍＬの濃度の合成蛋白質を反応させて、実際の血清と比較した。結果を図６に示す。結果として合成蛋白質のピークは血清検体の５．９ｋＤａ蛋白質と一致した挙動を示し、これらの結果より、血清中の５．９ｋＤａ蛋白質は、アミノ酸配列が、配列番号１に示したものであることが確認された。
【実施例６】本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質と従来の肝炎
マーカーとに基くアルコール性肝障害患者の診断比較
（１）方法
これまでに使用したのと同じアルコール性肝障害入院患者１６人の入院直後、入院治療１週間経過後、入院治療後３カ月経過後の血清を用いて、従来の肝炎マーカーの測定値を求めた。自動分析機による測定はＡＳＴ、ＧＧＴ、ＴＧ、Ａｐｏ  ＡＩ及びＡｐｏ  ＡＩＩについてはＨｉｔａｃｈｉ  ７１５０型分析機（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用して行い、試薬はそれぞれＮ−アッセイＬ  ＧＯＴ（ＡＳＴ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ）、Ｎ−アッセイＬ  γ−ＧＴＰ−Ｈ（ＧＧＴ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ）、Ｎ−アッセイＴＧ  Ｌ（ＴＧ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ）、Ｎ−アッセイＴＩＡ  Ａｐｏ  ＡＩＩ−Ｈ（Ａｐｏ  ＡＩ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ）、Ｎ−アッセイＴＩＡ  Ａｐｏ  ＡＩＩ（Ａｐｏ  ＡＩＩ（Ｎｉｔｔｏｂｏ）、を使用した。ＦＤＰ及びＦＤＰ−ＥはＬＰＩＡ−Ｓ５００（ダイアヤトロン）を用いて所定のパラメーターにて測定し、試薬はエルピアＦＤＰラテックス、エルピアＦＤＰ−Ｅラテックス（帝国臓器）であった。尚、プロテインチップの測定結果をピークより数値化して比較するが単位はＡＵ（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ）である。
（２）結果
表１はアルコール性肝障害によって入院した患者の一般的な血清中の臨床検査生化学系測定マーカー（ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＴＧ）値、免疫系測定マーカー（Ａｐｏ  ＡＩ、Ａｐｏ  ＡＩＩ、ＦＤＰ、ＦＤＰ−Ｅ）値、そしてプロテインチップ法による本発明の肝臓疾患マーカー蛋白質の測定結果を示す。表１の右から２番目までの欄に（ＦＤＰ−Ｅ  ５，９００ＤａおよびＡｐｏ  ＡＩＩ  ７，８００Ｄａ）、実施例２と同様のプロテインチップを用いた方法で本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である５．９ｋＤａ蛋白質と７．８ｋＤａ蛋白質を測定した時の測定値が示されている。表１の右から６番目の欄（Ａｐｏ  ＡＩ）に、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である２８ｋＤａ蛋白質を従来法で測定した時の測定値が示されている。
表２には健常人の血清検体における、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質である５．９ｋＤａ蛋白質（ＦＤＰ−Ｅ  ５，９００Ｄａ）と７．８ｋＤａ蛋白質（Ａｐｏ  ＡＩＩ  ７，８００Ｄａ）をプロテインチップ法により測定した時の測定値が示されている。
表３は、プロテインチップ法により測定したアルコール性肝障害入院患者の５．９ｋＤａ蛋白質および７．８ｋＤａ蛋白質測定平均値を示す。
2004058966.tif 000003
2004058966.tif 000004
2004058966.tif 000005
表１から３に示されるように、汎用されてきたＡＳＴ、ＧＧＴ値の低下、正常値範囲への回復は肝治療効果を反映していた。しかしＧＧＴノンレスポンダーと思われる検体Ｎｏ．５にみられるように、これまで汎用されてきたＧＧＴ値が治療効果の指標になりえないケースでも、５．９ｋＤａ蛋白質および７．８ｋＤａ蛋白質は血中値が上昇し、治療効果をよく示していた。ＧＧＴは肝障害の重症度や積算飲酒量とは必ずしも相関せず、またアルコール飲用後のＧＧＴの変化には個体差があり、大量飲酒後にも増加しないいわゆるノンレスポンダーが相当数存在するので新規蛋白質はこれらＧＧＴノンレスポンダーの治療判定に有効であると考えられた。
【実施例７】飲酒量と本発明マーカー蛋白質との相関
以上の実施例により、本発明によって見つかった新規肝臓疾患診断用マーカーの特異性について有用性が確認された。更に飲酒量との相関を解明するために、以下の実験を行った。
方法
健常人及び飲酒量の確実なアルコール摂取患者の検体だけを集めて実験を行った。実験では飲酒なしの健常人、飲酒量日本酒１合相当、飲酒量日本酒３合相当の３つの実験区にわけてプロテインチップ法を用いた測定を行い、それぞれの新規マーカーについて比較をした。また、プロテインチップを用いた測定方法は実施例１によるＳＡＸＩＩプロテインチップアレイ、実施例２におけるＷＣＸＩＩプロテインチップアレイで述べたものと全く同様である。
結果
結果を図７に示す。結果として全ての新規肝臓疾患診断用マーカー蛋白質で飲酒量依存的にピークが増減することがわかった。ここでは特に５．９ｋＤａ蛋白質の結果について示す。飲酒量５．９ｋＤａ蛋白質は飲酒量依存的に減少し、３合を飲酒していた実験区ではほぼ検出できないレベルに低下していた。つまり５．９ｋＤａ蛋白質は飲酒量依存的に変化し、アルコール飲酒量を推定するのに十分利用できるマーカーであることが判明した。また、アルコール依存症のマーカーとなり得ることが判明した。
【実施例８】モノクローナル抗体の作製
実施例５で得られた完全合成５．９ｋＤａ蛋白質を抗原として用いて、抗５．９ｋＤａ蛋白質モノクローナル抗体を作成するため以下の実験を行った。
（１）免疫
完全合成５．９ｋＤａ蛋白質を１ｍｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、５０μｇ（５０μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）５０μｌと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ６週齢雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量の完全合成５．９ｋＤａ蛋白質（５０μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫として完全合成５．９ｋＤａ蛋白質５０μｇ／ｍｌをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
（２）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後に合成５．９ｋＤａ蛋白質により感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（ＭＥＲＫ）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。その融合比率は脾臓細胞数１０×１０７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、５：１であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）α−ＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ）ＨＡＴ（コスモバイオ）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。
（３）スクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために上記実施例にて精製した合成５．９ｋＤａ蛋白質をリン酸緩衝液中に溶解し、１μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。
（４）抗体の確認
ＥＬＩＳＡによって合成５．９ｋＤａ蛋白質との反応性を確認し、クローンＣＮ−１およびＣＮ−２の２種類が合成５．９ｋＤａ蛋白質を認識したものとして選択した。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて検定した結果を表４に示す。
2004058966.tif 000006
（５）モノクローナル抗体の作製及び精製
得られたハイブリドーマＣＮ−１およびＣＮ−２細胞１×１０７細胞個をプリスタン（アルドリッチ）０．５ｍｌ投与後２週間のＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレアー）、１０週齢、雌性に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行ったＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、ＣＮ−１、ＣＮ−２はＳ−３００を用いて精製した。その結果ＣＮ−１、ＣＮ−２は非還元では分子量約９００，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約７０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製された抗体はＣＮ−１、ＣＮ−２ともにマウス１匹あたりそれぞれ約１０ｍｇ以上であって工業的利用を行うには十分量であった。
【実施例９】ＥＩＡ法による５．９ｋＤａ蛋白質の測定
５．９ｋＤａ蛋白質の２種のモノクローナル抗体ＣＮ−２、ＣＮ−１を、それぞれ、一次抗体、標識された二次抗体として使用し、ＥＬＩＳＡ法（ＥＩＡ法）により検体中の５．９ｋＤａ蛋白質を測定できるかどうか検討した。
（１）方法
ＥＬＩＳＡ用プレートを作製するため、一次抗体ＣＮ−２をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄した後に各種濃度の合成５．９ｋＤａ蛋白質を標準品として１００μｌを添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液で３回洗浄し、二次抗体であるＨＲＰ標識ＣＮ−１抗体を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
（３）結果
上記のようにして測定した各種濃度の合成５．９ｋＤａ蛋白質における発色値から、合成５．９ｋＤａ蛋白質測定標準曲線を作成すると図８のような結果であった。図８より、合成５．９ｋＤａ蛋白質の濃度依存的に、吸光度の上昇がみられた。つまり、５．９ｋＤａ蛋白質を認識するモノクローナル抗体ＣＮ−１とＣＮ−２は認識部位を異にするため、これら抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ法に使用することにより、５．９ｋＤａ蛋白質を測定できることが判明した。
【産業上の利用可能性】  以上に具体的に示したように、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質は、ＧＧＴ等の従来の肝炎マーカーが反応性の低いノンレスポンダー、または肥満にともなう脂肪肝、ある種の薬剤常用者など飲酒以外の要因でＧＧＴが高値を示す場合でも、正確に飲酒からくる肝臓疾患患者の治療判定効果を調べ状態把握を行なう指標となり得る。つまりＧＧＴは飲酒以外にウイルス性の慢性肝障害・肥満・ある種の薬剤の連用など他の要因で上昇するために特異性が低いのに対して、この点、本発明の肝臓疾患診断用マーカー蛋白質はウイルス性肝硬変でも変動しないので特異性に期待がもてるという長所がある。また測定対象が生化学的酵素機能に依存しないペプチドであることから検体の取り扱いがよく、測定再現性が良いという特徴があることも判明した。本発明の診断方法は、例えば、習慣飲酒者や問題飲酒者が肝臓疾患を発症する可能性を診断することもでき、飲酒が要因の肝臓疾患、例えば、肝炎、肝硬変などの肝臓疾患を診断することもできる。更には、そのような肝臓疾患の治療経過などを診断することもできる。本発明の診断方法は、特にアルコール性肝障害、アルコール依存症などの診断に適している。本発明の診断方法においては、マーカー蛋白質を汎用的ＥＩＡ法、イムノクロマト、さらには紙験紙などにより測定して実施することができる。これらの汎用されている方法により簡便に診断可能であることは、現在の肝疾患人口から考えても今後の予防医学的見地から意義が大きいものと考えられる。
【配列表】
2004058966.tif 000007
2004058966.tif 000008
2004058966.tif 000009
【図１】
2004058966.tif 000010
【図２】
2004058966.tif 000011
【図３】
2004058966.tif 000012
【図４】
2004058966.tif 000013
【図５】
2004058966.tif 000014
【図６】
2004058966.tif 000015
【図７】
2004058966.tif 000016
【図８】
2004058966.tif 000017
【国際調査報告】
2004058966.tif 000018
2004058966.tif 000019
2004058966.tif 000020
2004058966.tif 000021
2004058966.tif 000022
2004058966.tif 000023
2004058966.tif 000024