(57)【要約】Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチド、例えばＧｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤、調味料および該ペプチド、こく味増強剤または調味料を添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤。
【請求項２】
該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、請求項１記載のこく味増強剤。
【請求項３】
該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、請求項１または２記載のこく味増強剤。
【請求項４】
該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、請求項１〜３いずれか１項に記載のこく味増強剤。
【請求項５】
該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１〜４いずれか１項に記載のこく味増強剤。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のこく味増強剤を添加してなる飲食品。
【請求項７】
Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする調味料。
【請求項８】
該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、請求項７記載の調味料。
【請求項９】
該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、請求項７または８記載の調味料。
【請求項１０】
該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、請求項７〜９いずれか１項に記載の調味料。
【請求項１１】
該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項７〜１０いずれか１項に記載の調味料。
【請求項１２】
請求項７〜１１いずれか１項に記載の調味料を添加してなる飲食品。
【請求項１３】
Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを飲食品に添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法。
【請求項１４】
該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、請求項１３〜１５いずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１３〜１６いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、こく味増強剤、調味料および飲食品のこく味増強方法に関する。
【背景技術】  基本味とは、味覚の質を表すもっとも基本的な要素で、生理学的には甘味、塩味、酸味、苦味、うま味の５種類の味をいう（丸善食品総合辞典、丸善、ｐ．２８０、（１９９８））。
また、基本味以外の味として、こく味がある。こく味とは、持続性のあるうま味をいい、好ましくはこれに濃厚感が付与された味をいう。
うま味調味料や、酵母エキス、蛋白加水分解物、魚介エキス、畜肉エキス等の天然調味料は、うま味等の基本味を付与することはできるが、こく味を十分に付与することは難しい。
こく味を付与する方法としては、ピラジン化合物類（特開平１１−３１３６３５号公報）、グルタチオン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，１９７７−１９８０（１９９７））、スルホン基含有化含物、リン酸塩およびベタイン（開平８−２８９７６１号公報）、ゼラチンおよびトロポミオシンの酵素分解物（特開平８−２２８７１５号公報）、Ｏ／Ｗ型の乳化組成物（特開平１０−１７９０２６号公報）、分子量１０００〜５０００のペプチドとカルボニル化合物とのアミノ−カルボニル反応物（特開２００２−３３５９０４号公報）等を添加する方法等が知られている。
ペプチドは呈味成分として知られ、甘味、苦味、塩味、うま味を有するペプチドが報告されている。例えば、うま味を有するペプチドとしては、魚肉蛋白質を酵素で分解して得られた分子量１０００以下の酸性ペプチドで、Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ＆  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，４９−５３（１９７５））が知られている。
また、ペプチドは基本味の強さを変化させて味覚を変化させる作用があることが知られており、甘味を抑制する作用、苦味を抑制する作用、酸味を抑制する作用およびうま味を増強する作用を有するペプチドが知られている。例えば、うま味を増強する作用を有するペプチドとして、鶏肉蛋白質をプロテアーゼ、ブロメラインで処理した加水分解物中に、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ＆  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０，１５１５−１５２２（２００２））が報告されている。
さらに、ペプチドは、こく味を付与する作用を有することが知られている（特開平５−８４０５０号公報）。このようなペプチドとしてグルタチオン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６１，１９７７−１９８０（１９９７））があげられるが、グルタチオンは加熱により二量体を形成しやすく、こく味付与の機能が低下しやすい等の問題がある。
ペプチドは飲食品の味に様々な影響を与えるため、飲食品のこく味を効果的に増強することのできるペプチドの開発が望まれている。
【発明の開示】
本発明の目的は、こく味増強剤、調味料およびこく味増強方法を提供することにある。
本発明は以下（１）〜（１７）に関する。
（１）  Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする飲食品のこく味増強剤。
（２）  該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、上記（１）のこく味増強剤。
（３）  該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸が、Ｌ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、上記（１）または（２）のこく味増強剤。
（４）  該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、上記（１）〜（３）いずれか１つのこく味増強剤。
（５）  該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記（１）〜（４）いずれか１つのこく味増強剤。
（６）  上記（１）〜（５）いずれか１つのこく味増強剤を添加してなる飲食品。
（７）  Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを有効成分として含有することを特徴とする調味料。
（８）  該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、上記（７）の調味料。
（９）  該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、上記（７）または（８）の調味料。
（１０）  該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、上記（７）〜（９）いずれか１つの調味料。
（１１）  該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記（７）〜（１０）いずれか１つの調味料。
（１２）  上記（７）〜（１１）いずれか１つの調味料を添加してなる飲食品。
（１３）  Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下のペプチドを飲食品に添加することを特徴とする飲食品のこく味増強方法。
（１４）  該ペプチドが、３、６または９残基のアミノ酸からなるペプチドである、上記（１３）の方法。
（１５）  該ペプチドのＮ末端から３番目のアミノ酸がＬ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニンである、上記（１３）または（１４）の方法。
（１６）  該ペプチドを構成するアミノ酸のうちの３分の１以上がグリシンである、上記（１３）〜（１５）いずれか１つの方法。
（１７）  該ペプチドが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３ＨｙｐもしくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、上記（１３）〜（１６）いずれか１つの方法。
本発明に用いられるペプチド（以下、本発明のペプチドという）は、Ｎ末端から１および２番目のアミノ酸が、それぞれグリシン（Ｇｌｙ）およびＬ−プロリン（Ｌ−Ｐｒｏ）であり、かつ分子量が１０００以下のペプチドであればいずれのペプチドも用いられる。
ペプチドを構成するアミノ酸の数は、特に限定されないが、３、６または９残基であることが好ましい。
ペプチドを構成するアミノ酸は特に限定されないが、ペプチドを構成するアミノ酸のうち、３分の１以上がグリシンであることが好ましい。
本発明のペプチドとしては、例えば、Ｎ末端から３番目のアミノ酸が、Ｌ−ヒドロキシプロリンまたはＬ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ）であり、かつ分子量が１０００以下のペプチドがあげられる。
本発明のペプチドにおいて、Ｌ−ヒドロキシプロリンは、３−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（３Ｈｙｐ）、４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（４Ｈｙｐ）および５−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（５Ｈｙｐ）のいずれであってもよい。
本発明のペプチドの例としては、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ、配列番号１に示されるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ等のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる（ただし、Ｘａａは任意のアミノ酸を表すものとする）。具体的には、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−３Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列を有するペプチドがあげられるが、これに限定されるものではない。
本発明のペプチドは、ペプチド合成機等を用いてペプチド合成しても得ることができるが、コラーゲンまたはゼラチンを、タンパク質加水分解酵素で加水分解して得られる加水分解物を、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、超遠心分離法等の、ペプチドを分子量により分画できる方法、好ましくは限外ろ過法またはゲルろ過クロマトグラフィー法を用いて、分子量１０００以下の画分を分取して得ることができる。
タンパク質加水分解酵素としては、タンパク質を加水分解することのできる酵素であればいずれの酵素を用いてもよい。例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼがあげられるが、エンドペプチダーゼを用いることが好ましい。エンドペプチダーゼとしては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン等のセリンプロテアーゼ、パパイン、ブロメライン、フィシン等のチオールプロテアーゼ、サーモリシン、コラゲナーゼ等のメタルプロテアーゼ等があげられる。
これらのタンパク質加水分解酵素は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
タンパク質加水分解酵素としては、上記のいずれのものであってもよいが、コラーゲンまたはゼラチンを構成するアミノ酸配列中に存在するＸａａ−Ｇｌｙ（Ｘａａは任意のアミノ酸を、表す）のＸａａ−Ｇｌｙ間のペプチド結合、好ましくは、Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）のＸａａ−Ｇｌｙ間のペプチド結合を切断できるものが好ましく用いられる。このようなタンパク質加水分解酵素としては、例えばコラゲナーゼがあげられる。
コラゲナーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｉｏｐｈａｇｕｓ等の微生物由来のコラゲナーゼ、脊椎動物由来のコラゲナーゼ等があげられるが、微生物由来のコラゲナーゼが好ましく用いられ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼがより好ましく用いられる。
ゼラチンとしては、コラーゲンを酸処理して得られるゼラチン（タイプＡ）と、アルカリ処理して得られるゼラチン（タイプＢ）の二種類があるが、いずれのタイプのものを用いてもよい。
コラーゲンまたはゼラチンは、ウシ、ブタ等の動物の骨、皮、腱、軟骨、骨格筋等から常法により調製して得たものを用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。
コラーゲンまたはゼラチンを、水性媒体中で、コラゲナーゼ、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼで加水分解した場合、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ、配列番号１に示されるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ等のアミノ酸配列からなるペプチド（Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）を、該水性媒体中に生成蓄積させることができる。
タンパク質加水分解酵素は、市販の精製品を用いてもよいし、該タンパク質加水分解酵素活性を有する微生物、動物、植物等の細胞から通常の酵素精製法に準じて粗精製した酵素または精製した酵素を用いてもよい。
また、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細胞の培養液、該細胞の培養液を濾過もしくは遠心分離等で固液分離して得られる細胞、または該細胞の処理物をタンパク質加水分解酵素として用いてもよい。該細胞の処理物としては、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細胞の培養液を濃縮機もしくは乾燥機等で濃縮もしくは乾燥処理して得られる該細胞の培養液の濃縮物もしくは乾燥物、該細胞を乾燥機等で乾燥処理して得られる該細胞の乾燥物、該細胞を界面活性剤および／または有機溶剤等で処理して得られる該細胞の界面活性剤および／または有機溶剤処理物、該細胞をリゾチーム等の酵素で処理して得られる該細胞の細胞溶解酵素処理物、該細胞の固定化物等があげられる。
水性媒体は、タンパク質加水分解酵素が、コラーゲンまたはゼラチンを加水分解できるものであればいずれでもよく、例えば、水、各種緩衝液があげられ、タンパク質加水分解反応を阻害しなければ、他の成分、例えば、アミノ酸、金属イオン、有機酸等を含んでいてもよい。また、該タンパク質加水分解酵素活性を有する細胞の培養液、該培養液から細胞を除去して得られる上清も、水性媒体として用いることができる。
タンパク質加水分解酵素の使用量は、コラーゲンまたはゼラチンの種類等によって異なるため特に限定されないが、コラーゲンまたはゼラチン１００重量部に対して０．０５〜８重量部であることが好ましく、０．１〜６重量部であることがより好ましく、０．５〜４重量部であることがさらに好ましい。
コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解処理のｐＨや反応温度等は、使用する酵素の至適条件またはそれに近い条件を適宜用いればよい。
ｐＨの調整は、飲食品への使用に許容される酸またはアルカリを使用することができ、酸としては無機酸、有機酸があげられ、無機酸としては、塩酸、リン酸等が、有機酸としては、酢酸、乳酸、クエン酸等があげられる。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水等があげられる。
コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解処理時間は、使用するタンパク質加水分解酵素の使用量、温度、ｐＨ等の諸条件により異なるが、１〜１００時間であることが好ましく、１〜７２時間であることがより好ましい。
タンパク質加水分解酵素による加水分解処理終了後、該加水分解処理液をそのまま次の処理に供することもできるが、加熱処理、酸処理等によって酵素を失活させた後に次の処理に供することもできる。
該加水分解処理液を、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、超遠心分離法等の分子量により分画することのできる公知の方法により分画し、分子量１０００以下のペプチドを含有する画分を分取することができる。
分子量が１０００以下のペプチドを含有する画分を、該画分中に含まれる各ペプチドの電荷、極性、分子量、特異性等の差を利用した通常のタンパク質精製法に従って分画、分取することにより、分子量が１０００以下のペプチドを含有する画分中に含まれる本発明のペプチドを精製することもできる。
電荷の差により精製する方法としては、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、等電点電気泳動法等の方法があげられる。
極性の差により精製する方法としては、吸着クロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等の方法があげられる。
分子量の差により精製する方法としては、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、超遠心分離法等の方法があげられる。
特異性の差により精製する方法としては、アフィニティークロマトグラフィー法等の方法があげられる。
上記のいずれの方法も用いることができるが、分子量または極性の差を利用する方法が好ましく用いられ、極性の差を利用する方法がより好ましく用いられ、逆相クロマトグラフィーがさらに好ましく用いられる。
本発明のペプチドのＮ末端から１および２番目のアミノ酸がそれぞれグリシンおよびＬ−プロリンであるか否かは、以下の方法により決定することができる。
ペプチド合成機等を用いてＮ末端から１および２番目のアミノ酸がそれぞれグリシンおよびＬ−プロリンであり、かつ分子量が１０００以下となるように合成したペプチド、またはこのような配列および分子量を有する市販のペプチドを標準物質として、本発明のペプチドを精製した方法と同じ操作に供し、各ペプチドが該標準物質と同じ画分に分画されるか否かを調べて同定することで決定することができる。
また、同定された本発明のペプチドの量は、該精製されたペプチドが存在する画分に相当する画分中の標準物質の量と比較することにより定量することができる。
コラーゲンまたはゼラチンのタンパク質加水分解酵素による加水分解処理液、該加水分解処理液より分取して得られる本発明のペプチドを含有する溶液は、本発明のペプチドを含有する溶液として、そのまま飲食品に添加しても、本発明のこく味増強剤、または本発明の調味料に用いてもよいし、該溶液の処理物を、飲食品に添加しても、本発明のこく味増強剤または本発明の調味料に用いてもよい。該溶液の処理物としては、該溶液を活性炭等による脱色処理、減圧濃縮等による濃縮処理等をして得られる脱色液、濃縮液等の液体、該液体を減圧乾燥、噴霧乾燥等、乾燥処理して得られる固形物、粉末等としたものがあげられる。
本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発町のペプチド、これらを用いて得られる本発明のこく味増強剤または本発明の調味料を飲食品に添加することにより、飲食品のうま味に持続性を付与させ、飲食品のこく味を増強することができる。
本発明においてこく味とは、持続性のあるうま味をいい、好ましくはこれに濃厚感が付与された味をいう。
うま味としては、うま味物質が単独、または複数で呈する味があげられる。うま味物質としては、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、オキシグルタミン酸、イボテン酸、トリコロミン酸、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム等をあげることができ、特にグルタミン酸ナトリウムによるうま味をあげることができる。
本発明の飲食品のこく味増強方法としては、本発明のペプチドを使用する以外は特に限定はなく、通常用いられる飲食品の調味方法を用いることができる。
本発明の飲食品のこく味増強方法としては、例えば本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、もしくは該溶液から精製して得られる本発明のペプチドをそのまま、または本発明のこく味増強剤または本発明の調味料を、飲食品を製造する際に該飲食品の原材料の一部として添加する方法、製品となっている飲食品を加熱調理、電子レンジ調理、真空調理等の調理する際または摂食の際に添加する方法等があげられる。
本発明の飲食品のこく味増強方法の対象となる飲食品はいずれの飲食品であってもよい。例えば、味噌、醤油、たれ、だし、ドレッシング、マヨネーズ、トマトケチャップ等の調味料、吸い物、コンソメスープ、卵スープ、わかめスープ、フカヒレスープ、ポタージュ、味噌汁等のスープ類、麺類（そば、うどん、ラーメン、パスタ等）のつゆ、ソース類、おかゆ、雑炊、お茶漬け等の米調理食品、ハム、ソーセージ、チーズ等の畜産加工品、かまぼこ、干物、塩から、珍味等の水産加工品、漬け物等の野菜加工品、ポテトチップス、せんべい、クッキー等の菓子スナック類、煮物、揚げ物、焼き物、カレー、シチュー等の調理食品等があげられるが、カレー、シチュー、ハンバーグ、豚骨ラーメン等の、肉類を原材料として得られる飲食品が好適にあげられる。
本発明のこく味増強剤は、本発明のペプチドを含有し、必要に応じて、無機酸、有機酸、アミノ酸、核酸、糖類、調味料、香辛料、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよい。
無機酸としては、食塩、塩化カリウム、塩化アンモニウム等があげられる。
有機酸としては、アスコルビン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、脂肪酸等のカルボン酸およびそれらの塩等があげられる。該塩としては、ナトリウムおよびカリウム塩があげられる。
アミノ酸としては、グルタミン酸ナトリウム、グリシン等があげられる。
核酸としては、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム等があげられる。
糖類としては、ショ糖、ブドウ糖、乳糖等があげられる。
調味料としては、醤油、味噌、エキス等の天然調味料、香辛料としては各種の香辛料があげられる。
賦形剤としては、澱粉加水分解物であるデキストリン、各種澱粉等があげられる。
これらの使用量は、使用目的に応じて適宜設定することができるが、例えば、本発明のペプチド１００重量部に対して、０．１〜５００重量部使用できる。
本発明の調味料は、本発明のペプチドおよびうま味物質を含有し、必要に応じて、上記の無機酸、有機酸、アミノ酸類、核酸、糖類、調味料、香辛料、賦形剤等の飲食品に使用可能な各種添加物を含有していてもよい。
本発明の調味料は、こく味調味料として好適に用いられる。
本発明のこく味増強剤または本発明の調味料は、本発明のペプチド、および必要に応じてうま味物質を配合する以外は、通常の調味料の製造方法を用いて製造することもできる。
本発明の調味料において、うま味物質、例えばグルタミン酸ナトリウムのうま味またはこく味を増強させるためには、グルタミン酸ナトリウム１００重量部に対して、本発明のペプチドを０．０１〜５０重量部となるように配合させることが好ましい。
本発明のこく味増強剤または本発明の調味料は、液状、粉状、顆粒状等のいずれの形状を有するものであってもよい。
本発明のこく味増強剤または調味料中の本発明のペプチドの含有量は特に限定されないが、本発明のこく味増強剤または調味料１００重量部中、０．０１重量部〜１００重量部、好ましくは０．０５〜１００重量部含有されていることが好ましい。
なお、本発明のこく味増強剤または調味料中の本発明のペプチドの含有量は、上記で述べた、分子量１０００以下のペプチド溶液中の本発明のペプチドの定量方法と同様の方法を用いて定量することができる。
本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発明のペプチド、これらを用いて得られる本発明のこく味増強剤または調味料は、飲食品を製造または調理する際に添加するか、製造または調理された飲食品に添加すればよい。
飲食品に使用する本発明のペプチドを含有する溶液、該溶液の処理物、該溶液から精製して得られる本発明のペプチド、これらを用いて得られる本発明のこく味増強剤または本発明の調味料の量は、飲食品１０００重量部に対して、本発明のペプチドとして、好ましくは１×１０−４〜２重量部、さらに好ましくは１×１０−３〜１重量部となるように添加することが好ましい。
以下に本発明の実施例を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】（ａ）豚ゼラチン（ＳＩＧＭＡ社製）５０ｇを蒸留水１０００ｍｌに分散させ、３７℃に加温してゼラチンを溶解させ、３７℃で保持した。該ゼラチン溶液にコラゲナーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．３、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来、ナカライテスク社製）を２５０ｍｇ加えて溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨを７．４に調整し、３７℃で２時間反応を行った。反応終了後、反応液を１００℃で１０分間加熱し、コラゲナーゼを失活させた。反応液を５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、得られた上清をろ過し、得られたろ液をゼラチンのコラゲナーゼ分解液とした。得られたゼラチンのコラゲナーゼ分解液１０００ｍｌを凍結乾燥して凍結乾燥粉末約５０ｇを得た。
一方、豚ゼラチン（ＳＩＧＭＡ社製）５０ｇを蒸留水１０００ｍｌに分散させ、３７℃に加温してゼラチンを溶解させ、３７℃で保持した。該ゼラチン溶液にペプシンＡ（ＥＣ  ３．４．２３．１、和光純薬社製）を２５０ｍｇ加えて溶解し、塩酸を用いてｐＨを２．０に調整し、３７℃で２時間反応を行った。反応終了後、反応液を１００℃で１０分間加熱し、ペプシンを失活させた。反応液を５０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離し、得られた上清をろ過し、得られたろ液をゼラチンのペプシン分解液とした。得られたゼラチンのペプシン分解液１０００ｍｌを凍結乾燥して凍結乾燥粉末約５０ｇを得た。
コラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末１０ｇを２００ｍｌの水に溶解して得られた溶液２００ｍｌを、限外ろ過膜（ミリポア社製）を用いて限外ろ過し、分子量１０００以下のペプチドを含有する画分（以下、Ａ画分と略す）約２００ｍｌ、および分子量１０００以上のペプチドを含有する画分（以下、Ｂ画分と略す）を得た。同様にゼラチンのペプシン分解液の凍結乾燥粉末１０ｇを２００ｍｌの水に溶解して得られた溶液２００ｍｌを限外ろ過し、分子量１０００以下のペプチドを含有する画分（以下、Ｃ画分と略す）約２００ｍｌ、および分子量１０００以上のペプチドを含有する画分（以下、Ｄ画分と略す）を得た。
Ａ〜Ｄ画分を凍結乾燥し、それぞれ６．９ｇ、２．８ｇ、１．９ｇ、７．８ｇの凍結乾燥粉末を得た。以下の実験には、この凍結乾燥粉末を用いた。
Ａ画分およびＢ画分中の全窒素含量を、自動窒素分析計（サーモフィニガン社製）を用いてデュマ法により測定し、全窒素含量に６．２５をかけてＡ画分中のタンパク質量を算出した。一方、Ａ画分中の遊離アミノ酸量をアミノ酸アナライザー（日本電子データム社製）を用いて定量した。
Ａ画分中のタンパク質量から遊離アミノ酸量を差し引き、Ａ画分の凍結乾燥粉末中の分子量１０００以下のペプチドの量を計算した結果、６．９ｇであった。
同様に、Ｃ画分の凍結乾燥粉末中の分子量１０００以下のペプチド量を計算した結果、１．９ｇであった。
Ａ〜Ｄ画分の凍結乾燥粉末をそれぞれ適量の水に溶解し、それぞれ１０μｌの溶液を液体クロマトグラフィー／質量分析装置に供した。
液体クロマトグラフィーのカラムは、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ８−３（ＧＬサイエンス社製）を用いた。移動相は、０．０２％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液、および０．０２％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を用い、流速０．２ｍｌ／分で１００分間の濃度勾配溶出によりペプチドを分離した。検出、定量はＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ（サーモエレクトロン社製）を用いて行った。イオン化条件を以下に示す。
キャピラリー温度：２５０℃
シースガス（Ｓｈｅａｔｈ  Ｇａｓ）：窒素  流量：４０ａｒｂ
オグジラリーガス（ＡＵＸ．Ｇａｓ）：ヘリウム  流量：１０ａｒｂ
スプレー電圧：４．５ｋｖ
定量は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐのアミノ酸配列からなるペプチド（Ｂａｃｈｅｍ社製）およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａのアミノ酸配列からなるペプチド（Ｂａｃｈｅｍ社製）を標準物質として用い、ポジティブ・モードの選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）（分子量２４４．３および２８６．３）により実施した。
分析の結果、Ａ画分の凍結乾燥粉末中にはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐが５．９％（Ｗ／Ｗ）、およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａがそれぞれ１．８％（Ｗ／Ｗ）含有されていた。なお、Ｂ〜Ｄ画分からはＧｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐ、およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａは検出されなかった。
（ｂ）ホワイトルウ（ハチ食品社製）４４．６％（Ｗ／Ｗ）、食塩３．５％（Ｗ／Ｗ）、グラニュー糖５．１％（Ｗ／Ｗ）、粉末油脂（植田製油社製）１１．０％（Ｗ／Ｗ）、粉末バター（三協食品社製）７．１％（Ｗ／Ｗ）、チーズパウダー（六甲バター社製）７．１％（Ｗ／Ｗ）、脱脂粉乳８．１％（よつば乳業社製）（Ｗ／Ｗ）、ワキシーコーンスターチ（日澱化学社製）５．１％（Ｗ／Ｗ）、グルタミン酸ナトリウム（協和発酵工業社製）２．５％（Ｗ／Ｗ）、５’−リボヌクレオチド（協和発酵工業社製）０．１％（Ｗ／Ｗ）、チキンブイヨン（協和発酵工業社製）３．５％（Ｗ／Ｗ）、ホワイトペッパー（カネカサンスパイス社製）０．１％（Ｗ／Ｗ）、ローレル末（カネカサンスパイス社製）０．２％（Ｗ／Ｗ）、野菜エキスパウダー（協和発酵社製）２．０％（Ｗ／Ｗ）を含有するクリームスープの素４０ｇに熱水を加えて全量１０００ｍｌとし、クリームスープを調製した。
このクリームスープ１００ｍｌに、上記（ａ）で得られたゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末２００ｍｇ、またはゼラチンのペプシン分解液の凍結乾燥粉末２００ｍｇを添加し、得られたクリームスープをそれぞれスープ１およびスープ２とした。スープ１およびスープ２の風味について、１５人の熟練したパネルにより官能試験を行った。
試験は、スープ１およびスープ２を５０〜６０℃に加熱して口に含み、スープ１とスープ２の「うま味の持続性」、「濃厚感」およびこれらの総合として得られる「こく味」をそれぞれ比較し、強いと感じた方を選択する２点評価法で行った。
結果を第１表に示す。数字は、人数を示す。
2004107880.tif 000002
第１表から明らかなとおり、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末を添加したクリームスープ（スープ１）は、ゼラチンのペプシン分解液の凍結乾燥粉末を添加したクリームスープ（スープ２）に比べて、明らかに「うま味の持続性」および「濃厚感」が強く、これらの総合として感じられる「こく味」も強かった。
（ｃ）上記（ｂ）において、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液の凍結乾燥粉末またはゼラチンのペプシン加水分解液の凍結乾燥粉末のかわりに、第２表に示す添加物を、第２表に示す量添加する以外は同様にして、官能試験を行った。
なお、第２表中、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列からなるペプチドはいずれもＢａｃｈｅｍ社製のものを用いた。
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クリームスープの「うま味の持続性」、「濃厚感」およびこれらの総合である「こく味」について、無添加のクリームスープをコントロールとして、１５人の熟練したパネルにより官能検査を行った。コントロールの「うま味の持続性」、「濃厚感」および「こく味」をそれぞれ３点とし、コントロールよりやや弱い場合を２点、２点の場合よりも弱い場合を１点とした。コントロールより強い場合は、やや強い場合を４点、４点の場合より強い場合を５点、５点の場合よりも強い場合を６点、６点の場合よりも強い場合を７点として評価した。
「うま味の持続性」、「濃厚感」および「こく味」について、１５人の評点の平均を求めた。
結果を第３表に示す。
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第３表から明らかなとおり、ゼラチンのコラゲナーゼ分解液より得られた分子量１０００以下のペプチドを含有する画分（Ａ画分、試験区２）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−４Ｈｙｐで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（試験区４）、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列からなるペプチド（試験区５）をクリームスープに添加することにより、無添加のクリームスープに比べて、クリームスープの「うま味の持続性」および「濃厚感」が有意に増強された。特に「濃厚感」は顕著に増強された。また、これらの総合として感じられるクリームスープの「こく味」が有意に増強された。
【産業上の利用可能性】  本発明により、こく味増強剤、調味料および飲食品のこく味増強方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：Ｘａａはいずれかのアミノ酸をあらわす。
【配列表】
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【国際調査報告】
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