(57)【要約】基質特異性が高く、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸よりＤ−アミノ酸を簡便かつ効率的さらに安価に製造することができるＤ−アミノアシラーゼの提供。  デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が産生するＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用し、分子量（電気泳動）約５５，０００ダルトン、等電点（変性系２次元電気泳動）５．３、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン等に作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン等に作用しない、至適温度３７℃（ｐＨ８）、至適ｐＨ８〜８．５（３７℃）、１ｍｍｏｌ／ＬのＭｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋で活性が阻害され、５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで活性が阻害されるＤ−アミノアシラーゼ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の酵素学的性質を有するＤ−アミノアシラーゼ。
（ａ）作用：Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用しＤ−アミノ酸を生成する。
（ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量約５５，０００ダルトンを示す。
（ｃ）等電点：変性系２次元電気泳動における測定で、等電点５．３を示す。
（ｄ）基質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用し、特にＮ−アセチル−Ｄ−バリンに良く作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸に作用しない。基質として、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−チロシンに作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンには作用しない。
（ｅ）温度安定性：ｐＨ８．５で１日加温した場合、４℃から３０℃まで比較的安定である。
（ｆ）至適温度：ｐＨ８で３０分反応させた場合、３７℃において作用が至適である。
（ｇ）ｐＨ安定性：温度３０℃で１日加温した場合、ｐＨ９付近で安定であり、ｐＨ７付近からｐＨ１０付近でも比較的安定である。
（ｈ）至適ｐＨ：温度３７℃で反応させた場合、ｐＨ８からｐＨ８．５付近で最も良く作用する。
（ｉ）金属イオンの影響：１ｍｍｏｌ／ＬのＭｎ２＋、ＣＯ２＋、Ｎｉ２＋、、Ｚｎ２＋で活性が阻害される。
（ｊ）阻害剤の影響：５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで活性が阻害される。
【請求項２】
次の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＤ−アミノアシラーゼ。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
次の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＤ−アミノアシラーゼをコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
次の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡからなるものである請求項３記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を生成するＤ−アミノアシラーゼを産生するデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物。
【請求項６】
デフルビバクター・エスピー（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ａ１３１−３と命名され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６３として寄託された請求項５記載の微生物。
【請求項７】
請求項１又は２記載のＤ−アミノアシラーゼを産生するものである請求項５又は６記載の微生物。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項記載の微生物を培養し、その培養物からＤ−アミノアシラーゼを採取することを特徴とする請求項１又は２記載のＤ−アミノアシラーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２記載のＤ−アミノアシラーゼをＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用させることを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属細菌より産生される新規なＤ−アミノアシラーゼ及び該Ｄ−アミノアシラーゼを用いた医薬品、化成品等に利用されるＤ−アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】  近年、Ｄ−アミノ酸が医薬品等の原料として有効であることが明らかになり、光学的に純度の高いＤ−アミノ酸を安価に製造することが産業上重要な課題となっている。この方法として一般的に、化学合成したラセミ体を分割する方法が用いられ、特に副生成物や多量の廃溶媒を発生させない酵素法が現在注目されている。
従来、Ｄ−アミノ酸の酵素法による製造方法として、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させ、Ｄ−アミノ酸を特異的に得る方法が知られていて工業化されている。
Ｄ−アミノアシラーゼを産生する微生物として、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＡＡＡ６０２９株（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（米国）、１９７８年、第２６巻、ｐ２６９８）、ストレプトミセス・オリバゼウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）Ｓ・６２株（例えば、特開昭５３−５９０９２号公報）、アルカリゲネス・キシロースオキシダンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ）Ａ−６株（例えば、特開平２−２３４６７７号公報）等が挙げられ、これらの微生物由来のＤ−アミノアシラーゼが報告されている。
しかしながら、これらのＤ−アミノアシラーゼはＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の種類により反応特性が大きく異なり、公知のＤ−アミノアシラーゼを用いて広範囲のＤ−アミノ酸を安価に製造することは困難であった。
また、Ｄ−アミノ酸を工業的に製造するために、遺伝子組み換え技術を用いて生産されたＤ−アミノアシラーゼを使用する方法（例えば、特開２００１−１８５号公報及び特開２００１−２７５６８８号公報）が知られているが、本質的に反応性の低いＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に酵素を作用させてＤ−アミノ酸を製造するには多量の酵素が必要であるため、価格や生産量に制限がある。
【発明の開示】
本発明は、従来報告されている酵素では反応性が低いＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に対して高い活性を有するＤ−アミノアシラーゼを産生する新規微生物を自然界より見出し、Ｄ−アミノ酸を安価に製造する為の新規なＤ−アミノアシラーゼの製造法及び該新規なＤ−アミノアシラーゼを用いたＤ−アミノ酸の製造方法を提供する。また、該新規なＤ−アミノアシラーゼを産生する微生物を提供することにある。
本発明者等は、上述の問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来の酵素では反応性が低い基質に対しても良く作用する新規なＤ−アミノアシラーゼを産生する能力を有するデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属細菌を自然界より見い出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次の酵素学的性質を有するＤ−アミノアシラーゼを提供するものである。
（ａ）作用：Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用しＤ−アミノ酸を生成する。
（ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における測定で、分子量約５５，０００ダルトンを示す。
（ｃ）等電点：変性系２次元電気泳動における測定で、等電点５．３を示す。
（ｄ）基質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用し、特にＮ−アセチル−Ｄ−バリンに良く作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸に作用しない。基質として、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−チロシンに作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンには作用しない。
（ｅ）温度安定性：ｐＨ８．５で１日加温した場合、４℃から３０℃まで比較的安定である。
（ｆ）至適温度：ｐＨ８で３０分反応させた場合、３７℃において作用が至適である。
（ｇ）ｐＨ安定性：温度３０℃で１日加温した場合、ｐＨ９付近で安定であり、ｐＨ７付近からｐＨ１０付近でも比較的安定である。
（ｈ）至適ｐＨ：温度３７℃で反応させた場合、ｐＨ８からｐＨ８．５付近で最も良く作用する。
（ｉ）金属イオンの影響：１ｍｍｏｌ／ＬのＭｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋で活性が阻害される。
（ｊ）阻害剤の影響：５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで活性が阻害される。
また、本発明は、次の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＤ−アミノアシラーゼ及び当該Ｄ−アミノアシラーゼをコードする遺伝子を提供するものである。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
また本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に効率的に変換するＤ−アミノアシラーゼを産生するデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を提供するものである。
また、本発明は、該微生物を培養し、その培養物から、前記のＤ−アミノアシラーゼを採取することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの製造方法を提供するものである。
また、本発明は、当該Ｄ−アミノアシラーゼをＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用させることを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法を提供するものである。
本発明により、デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物より得られた新規なＤ−アミノアシラーゼは、基質特異性が高く例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン等よりＤ−アミノ酸を簡便かつ効率的さらに安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本酵素の電気泳動法による分子量測定時の電気泳動像を示す図である。
図２は、本酵素の温度安定性測定時の残存活性を示す図である。
図３は、本酵素の至適温度測定時の相対活性を示す図である。
図４は、本酵素のｐＨ安定性測定時の残存活性を示す図である。
図５は、本酵素の至適ｐＨ測定時の相対活性を示す図である。
図６は、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンの分割率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、新規なＤ−アミノアシラーゼを産生する能力を有する微生物を自然界から見出し、新規なＤ−アミノアシラーゼの諸性質並びにその遺伝子を明らかにし、Ｄ−アミノ酸の製造に有効であることを明らかにする事により確立された。
すなわち、本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼを産生する微生物としては、上記の本発明Ｄ−アミノアシラーゼを産生するものである限り特に限定されないが、本発明で見出した新規なＤ−アミノアシラーゼ産生菌の一例は、第一化学薬品株式会社・岩手工場内の土壌中より単離されたデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物であり、例えば、デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａ１３１−３）等が挙げられる。当該Ａ１３１−３株は次のような菌学的性質を有する。
（形態的所見）
１．細胞形態：桿菌（０．６〜０．７×１．５〜２．０μｍ）
２．グラム染色：陰性
３．胞子形成：なし
４．運動性：あり
５．鞭毛：あり
６．普通寒天培地：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、くすんだ灰色から黄淡色
（生理学的性質）
１．カタラーゼ生産：陽性
２．オキシダーゼ生産：陽性
３．酸／ガス生産（グルコース）：陰性
４．Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：陰性
５．嫌気性生育：しない
６．好気性成育：絶対好気性
（生物学的性状）
ＡＰＩ２０ＮＥ同定システム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｆｒａｎｃｅ）を使い、その測定方法に従い生化学的性状試験を実施した。
１．硝酸塩還元：陰性
２．インドール生産：陰性
３．ブドウ糖  酸性化：陰性
４．アルギニンジヒドラーゼ：陰性
５．ウレアーゼ：陰性
６．エスクリン加水分解：陰性
７．ゼラチン加水分解：陰性
８．β−ガラクトシダーゼ：陰性
９．チトクロームオキシダーゼ：陽性
（資化性試験）
１．ブドウ糖：陽性
２．Ｌ−アラビノース：陰性
３．Ｄ−マンノース：陽性
４．Ｄ−マンニトール：陰性
５．Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性
６．マルトース：陰性
７．グルコン酸カリウム：陽性
８．ｎ−カプリン酸：陰性
９．アジピン酸：陰性
１０．ＤＬ−リンゴ酸：陽性
１１．クエン酸ナトリウム：陰性
１２．酢酸フェニル：陰性
１３．２，４−ジクロロフェノール：陰性
１４．フェノール：陰性
（脂肪酸組成分析）
脂肪酸組成測定には、ガスクロマトグラフィーシステムＨＰ６８９０（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、菌種データ照合はＳｈｅｒｌｏｃｋ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＩＤＩ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用い、データベースはＭＩＳ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＭＩＤＩ，ＤＥ，ＵＳＡ）のＴＳＢＡ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０）を用いた。
１．要脂肪酸：Ｃ１８：１ω７ｃの直鎖・モノ不飽和脂肪酸
２．ヒドロキシ脂肪酸：Ｃ１２：０３ＯＨ
（ユビキノン分析）
高速液体クロマトグラフを用いユビキノン標準試料のリテンションタイムの比較から分子種の同定を行った。
１．主要ユビキノン系：Ｑ−１０
（細胞壁アミノ酸分析）
高性能薄層プレートＨＰＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、細胞壁ペプチドグルカンに含まれる特異的アミノ酸を対照として展開し、特異的アミノ酸の検出を行った。
細胞壁アミノ酸：ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸
（１６Ｓ  ｒＤＮＡ−Ｆｕｌｌ塩基配列解析）
ＢＬＡＳＴを用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対して相同性検索を行った。
１．デフルビバクター  ルサチエンシス（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｕｓａｔｉｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ１１０９９）と９９．９％の１６ＳｒＤＮＡ相同性
以上の生化学的および菌学的諸性質から、自然界より新たに発見した微生物はデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属の細菌に分類されたが、同様の性質を持つ微生物としてはデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属のＤｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｕｓａｔｉｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ１１０９９が報告されている（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｌｕｓａｔｉａｅ  ｇｅｎ．ｎｏｖ．，ｓｐ．ｎｏｖ．，ａ  ｎｅｗ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  α−２  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，２２，１９７−２０４．）。しかし、公知のデフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属の細菌がＤ−アミノアシラーゼを産生することの記載はなく、デフルビバクター（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ）属の微生物がＤ−アミノアシラーゼを産生する能力を持つことは、本発明で初めて明らかにされた。なお、本発明で発見した菌株はデフルビバクター・エスピー  Ａ１３１−３（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａ１３１−３）と命名し、平成１４年９月２６日、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５６３として寄託した。
そして、本発明で見出した新規なＤ−アミノアシラーゼを得るためには、デフルビバクター属の細菌、例えばデフルビバクター・エスピー  Ａ１３１−３（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａ１３１−３）株を親株として人工的に変異処理及び突然変異、又は組み換えＤＮＡ操作などの公知の一般的な酵素の生産性及び性質を向上させる方法で得られた遺伝子組み換え体や、その変異株や改良株を用いることも可能である。
本発明の新規なＤ−アミノアシラーゼは、当該微生物を適当な培地に接種し培養することにより得ることができる。
ここで使用される培地は、通常の微生物の培地に用いられ、当該微生物が生育し新規なＤ−アミノアシラーゼが産生されるものであれば、特に限定されないが、該培地中には、資化し得る窒素源、炭素源、無機塩類を適当量含有せしめておくことが好ましい。
窒素源、炭素源、無機塩類は特に制限されない。
例えば窒素源として、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等が挙げられる。炭素源として、グルコース、フルクトース、ショ糖、グリセリン、酢酸等が挙げられる。無機塩類として、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硝酸アンモニウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛等が挙げられる。
また、本発明のＤ−アミノアシラーゼの生成に誘導物質等は特に必要ないが、Ｄ−アミノアシラーゼ高産生化のために、誘導化物質として、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸或いはＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸等のアシル化アミノ酸誘導体を培地中に０．０１〜０．５重量％（以下単に％と記載する）程度添加することが望ましく、特に、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン等が誘導物質として有効である。
培地のｐＨは、菌が生育可能な範囲であればいずれのｐＨ範囲でも良いが、特に７〜９程度が好ましく、培養温度は１５〜４０℃、より好ましくは２５〜３７℃である。培養時間は、２０〜４８時間液体培地を用い振とう培養することが好ましいが、用いる培地によって時間は変動する。また、同様の培地に寒天を加えた固体培地でも菌の培養を行うことが可能である。
このような方法によって得られた微生物菌体中に、Ｄ−アミノアシラーゼが産生される。
培養物からの目的物質であるＤ−アミノアシラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製手段に準じて行うことができる。すなわち、培養物を遠心又はろ過などによって菌体を分離し、機械的磨砕又は超音波破砕等により菌体を破砕し、その破砕液から通常の分離手段、例えば、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等により採取、精製する方法が挙げられる。
このようにして得られた、本発明Ｄ−アミノアシラーゼの酵素学的性質及びアミノ酸配列は次のとおりである。また、本発明Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列も以下に示す。
（１）作用：Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用しＤ−アミノ酸を生成する。
（２）分子量：定法に則り、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第一化学薬品（株）製、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０）を行い、タンパク質分子量マーカー（第一化学薬品（株）製、タンパク質分子量マーカー「第一」・ＩＩＩ）の移動度より分子量を求めた結果、約５５，０００ダルトンを示す。
（３）等電点：２次元電気泳動法に則り、変性系２次元電気泳動（第一化学薬品製、ＩＰＧチューブゲル「第一」４−１０及び、ＰＡＧラージ「第一」２Ｄ−１０／２０）を行い、２Ｄ−タンパク質等電点マーカー（第一化学薬品（株）製、２Ｄ−タンパク質等電点マーカー「第一」）の移動度より等電点を求めた結果、ｐＩ値５．３を示す。
（４）基質特異性：以下のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸及びＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸を基質として、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ或いはＬ−アミノ酸オキシダーゼを組み合わせる方法で本発明のアシラーゼの基質特異性を確認した。以下のＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸には作用しない。Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸としてＮ−アセチル−Ｄ−バリンに最も良く作用し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−チロシンにも作用する。Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシンには作用しない。
尚、Ｌ−アミノ酸の測定は、下記に示す活性測定法で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの代わりにＬ−アミノ酸のオキシダーゼを使用する。
（５）温度安定性：ｐＨ８．５で４℃、２５℃、３０℃、４０℃、５０℃で１日加温し、下記の活性測定法に則り残存する酵素活性を測定した結果、４℃から３０℃まで比較的安定である。
（６）至適温度：ｐＨ８で４℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃で下記の活性測定法に則り酵素活性を測定した結果、３７℃において作用が至適である。
（７）ｐＨ安定性：温度３０℃でｐＨ４から１２で１日間加温後、下記の活性測定法に則り残存する酵素活性を測定した結果、ｐＨ９付近で安定であり、ｐＨ７付近からｐＨ１０付近までは比較的安定である。
（８）至適ｐＨ：温度３７℃でｐＨ６から１２で下記の活性測定法に則り酵素活性を測定した結果、ｐＨ８からｐＨ８．５付近で最も良く作用する。
（９）金属イオンの影響：酵素液に金属イオンとして、塩化カルシウム・２水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物、塩化ナトリウム、塩化コバルト（ＩＩ）・６水和物、塩化カリウム、塩化ニッケル・６水和物、塩化マグネシウム・６水和物、硫酸銅（ＩＩ）・５水和物、塩化マンガン（ＩＩ）・４水和物、塩化亜鉛、モリブデン酸ナトリウムを、１ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加して、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンと反応させ、生成されたＤ−バリン量をＨＰＬＣで測定した結果、１ｍｍｏｌ／ＬのＭｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、、Ｚｎ２＋で活性が阻害される。
（１０）阻害剤の影響：酵素液に阻害剤として、エチレンジアミン四酢酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−エチルマレイミド、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システイン、ヨードアセトアミド、ジチオスレイトールを、５ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加して、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンと反応させ、生成したＤ−バリン量をＨＰＬＣで測定した結果、５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システインで活性が阻害される。
本発明Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列及びＤ−アミノアシラーゼタンパク質アミノ酸配列は、以下の公知の方法により決定した。
精製された酵素のＮ末及び内部アミノ酸配列から考えられるＤＮＡをすべて包含したミックスプライマーより、デフルビバクター・エスピー  Ａ１３１−３（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａ１３１−３）より抽出精製したＤＮＡを用い、ＰＣＲ法の反応結果から、得られた増幅産物をクローニングした結果、本発明Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列は配列番号１に記載の塩基配列と決定した。また、その塩基配列から、本発明Ｄ−アミノアシラーゼタンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有することが判明した。
本発明のＤ−アミノアシラーゼには、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質だけでなく、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなり、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質が含まれる。ここで、上記の１もしくは数個のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入されたアミノ酸配列には、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる。
本発明のＤ−アミノアシラーゼ遺伝子としては、前記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であれば制限されないが、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤ−アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが好ましい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を挙げることができる。また、上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが含まれる。
アミノ酸オキシダーゼを用いたアシラーゼ活性の測定方法：１０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ８に４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ０．６１ｍｇ（ナカライテスク（株）製、Ｃｏｄｅ：０１９０７−５２）、Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ，ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ３．２２ｍｇ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｃｏｄｅ：ＯＣ１３）、ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ３０ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ｐ−６７８２）、Ｄ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ  １ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−９１２８）又はＬ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ  １ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−５１４７）、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬５００μＬと１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン１００μＬ、測定酵素サンプル１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）３００μＬを含む１ｍＬの反応液を３７℃で３０分間加温後、分光光度計を用い５５５ｎｍの吸光度値を測定し、Ｄ−バリンを用いて作成した検量線から酵素活性を求めた。
尚、１Ｕは１分間に１μｍｏｌのＤ−バリンの生成を触媒する酵素量とした。
ＨＰＬＣを用いたアシラーゼの測定方法：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＧＬ  サイエンス（株）製）カラムを用い、０．０１５％１−ペンタンスルホン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝８０：２０緩衝液を用い、流速０．５ｍＬ／分、検出２３０ｎｍ、カラム温度３０℃で分析した。酵素活性は検出されたアセチル体と遊離体の面積比から、無添加を１００として分割率を求め、相対活性値で表す。
得られた新規なＤ−アミノアシラーゼは、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に特異的に作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸には作用しないので、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を製造するために利用できるが、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を分割分離するためにも使用される。すなわち、Ｄ，Ｌ−アミノ酸をアセチル化してＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸とし、次にＤ−アミノアシラーゼを加えてＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸を加水分解しＤ−アミノ酸を生成する事により、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸を分離することが可能である。なお、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸のみを用いれば、Ｄ−アミノ酸だけが得られる。
Ｄ−アミノアシラーゼをＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸に作用させる場合、Ｄ−アミノアシラーゼ添加量は、通常１〜１０００Ｕ／ｍＬ基質溶液の範囲で、好ましくは５０〜５００Ｕ／ｍＬ基質溶液である。また、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−アセチル−Ｄ−アミノ酸量は１〜４０重量％（以下％と記載する）、さらには５〜２５％水溶液とすることが好ましい。
反応温度は１０〜５０℃、さらには１５〜４５℃であるのが好ましく、反応はｐＨ６．５〜１０．５、さらには７．５〜１０であるのが好ましい。また、反応時間は０．２〜１０日間、さらには１〜５日間であるのが好ましい。
反応液からのＤ−アミノ酸の分離回収は、例えば、濃縮、等電点、沈殿、イオン交換樹脂処理、膜分離等の公知の方法で行なわれる。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例１  デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３株の単離
第一化学薬品株式会社岩手工場内の土壌を採取し、次法により菌体を採取した。
培地として、硝酸アンモニウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．２％、リン酸水素二ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０５％、誘導物質Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン０．２％を含むｐＨ８．５の培地に少量の土壌を添加し３０℃で試験管を用いて振盪培養した。次に同様の培地で寒天２％を含む同一培地組成の平板培地上に培養液をプレートアウト（接種）し、３０℃で培養後生育した微生物を分離した。
分離した微生物を再度上記と同一組成の培地を用いて試験管で振盪培養し、以下の２つの方法で従来とは異なるＤ−アミノアシラーゼを産生する能力を有する微生物を選抜した。
（１）Ｄ−アミノアシラーゼ活性測定法：５ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ８に４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ  ０．６１ｍｇ（ナカライテスク（株）製、Ｃｏｄｅ：０１９０７−５２）、Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ，ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ３．２２ｍｇ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｃｏｄｅ：ＯＣ１３）、ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ３０ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ｐ−６７８２）、Ｄ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ１ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−９１２８）、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬１００μＬと、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン１００μＬと上記培養液を遠心分離し再懸濁を行った菌体液１００μＬをマイクロプレートのセル中で混和し３７℃で１時間反応後、マイクロプレートリーダーを用いて５５５ｎｍの吸光度を測定した。発色が確認された菌株についてＤ−アミノアシラーゼ活性を持つ菌株として選んだ。
（２）ＨＰＬＣ分析による産生菌の選抜：次に上記の発色法でＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンに対して強い活性を示すことが確認された菌株について、下記のＨＰＬＣによる分析を行った。
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＩ  ＯＡ−５０００（５μｍ、４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ）、移動相：２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸銅：アセトニトリル＝９０：１０、温度：４０℃、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、検出：２３０ｎｍの条件で、培養後遠心分離した菌体と１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンの反応液３０μＬを用いて、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸の分解とＤ−アミノ酸あるいはＬ−アミノ酸の生成を、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリン，Ｎ−アセチル−Ｌ−バリンとＤ−バリン，Ｌ−バリンが溶出される時間のピーク面積より分析した。その結果、発色法で選抜した菌株はいずれもＮ−アセチル−Ｄ−バリンが速やかに減少し、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンの減少量に相当するＤ−バリンの増加が認められた。
次に、各種のＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸との反応を比較して、Ｄ−アミノ酸に特異性が高く、さらに既存のＤ−アミノアシラーゼとは異なりＤ−バリンに対する反応性が優れている酵素を産生する微生物を新規なＤ−アミノアシラーゼ産生菌として選抜した。
このような方法を経て得られた菌株は、前記の菌学的性質を有するものであった。この菌株をデフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３株と命名した。
実施例２  Ｄ−アミノアシラーゼの製造
デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３株を、実施例１で使用した培地に粉末酵母エキスＤ−３  ０．１％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９０−００５３１）、ポリペプロン０．１％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９４−００１１５）、塩化ナトリウム０．０５％を添加したｐＨ８の培地２０Ｌで、ジャーファーメンターを用い３０℃、１５０ｒ／ｍｉｎ、２７時間通気攪拌培養した。培養終了時の濁度（ＡＢＳ６６０ｎｍ）は１．５２で、ｐＨ７．７５であった。
培養後、冷却遠心分離機（日立工機（株）製）を用い、４０００ｒ／ｍｉｎで６０分間遠心分離を行い集菌した。集菌した菌体を、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液で洗浄した後、再度遠心分離機により菌体を集めて１１２ｇの菌体を得た。得られた菌体は、−８０℃で凍結保存した。
凍結保存菌体を融解し、菌体量の３倍の２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液３４０ｍＬで懸濁後、低温室内（４℃）で攪拌しながら投入式超音波破砕機を用い、１２０分間超音波破砕を行った。破砕後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間遠心分離後、上清液３６５ｍＬを得た。これを粗酵素液とした。
なお、本菌株は培養時にＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンを添加しなくともＤ−アミノアシラーゼを産生したが、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンを添加することにより、その酵素産生量を２倍以上に増加することが可能であった。
実施例３  Ｄ−アミノアシラーゼの精製
粗酵素液を透析チューブに詰め、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液中に投入し、低温室内（４℃）で攪拌を行いながら、数回緩衝液を交換し一昼夜透析を行った。透析終了後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間遠心分離後上清液３４２ｍＬを得た。
この、透析終了液の１／３量について以下の精製を行った。透析の終了した１１４ｍＬを、予め０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液で平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍカラム（東ソー（株）製）（４．４ｃｍφ×３７．５ｃｍ）に供して酵素を吸着させた。次に０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液１５００ｍＬでカラムを洗浄し、続いて０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液５７００ｍＬと０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液５７００ｍＬを用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出した。カラム流下後は２５ｍＬずつ分取して、各フラクションのタンパク量（２８０ｎｍの吸光度）とＤ−アミノアシラーゼ活性（下記の酵素活性測定法を参照）を測定し、活性画分を回収した。
各フラクションのＤ−アミノアシラーゼ酵素活性は、１０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ８に４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ０．６１ｍｇ（ナカライテスク（株）製、Ｃｏｄｅ：０１９０７−５２）、Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ，ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ３．２２ｍｇ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｃｏｄｅ：ＯＣ１３）、ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ３０ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ｐ−６７８２）、Ｄ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ１ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−９１２８）、を溶解して発色試薬とした。この発色試薬５００μＬと１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン１００μＬ、測定酵素サンプル１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）３００μＬを含む１ｍＬの反応液を３７℃で３０分間加温後、分光光度計を用い５５５ｎｍの吸光度値を測定した。
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍクロマトグラフィーで、Ｄ−アミノアシラーゼ活性が認められたフラクション画分（９６８ｍＬ）をビバフロー５０（ザルトリウス（株）製）分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて濃縮し、さらに、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析した。
この透析した酵素液１６０ｍＬを予め５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＢＩＯ−ＧＥＬ  ＨＴ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）ハイドロキシアパタイトカラム（２．２ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着させた。
次に、５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）３５０ｍＬでカラムを洗浄し、続いて５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）７５０ｍＬと２００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）７５０ｍＬを用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出した。カラム流下後は２５ｍＬずつ分取して、各フラクションのタンパク量とＤ−アミノアシラーゼ活性を測定し、活性画分を回収した。
ＢＩＯ−ＧＥＬ  ＨＴ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）によるハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで得られた活性画分２８０ｍＬを、ビバフロー５０（ザルトリウス（株）製）分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて、２０ｍＬに濃縮した。
この濃縮液を、予め０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液で平衡化をしたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐ．ｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）（２．２ｃｍφ×６６ｃｍ）に供し、同緩衝液を１．５ｍＬ／分の流速で流した。カラム流下後は１０ｍＬずつ分取して、各フラクションのタンパク量とＤ−アミノアシラーゼ活性を測定した。
Ｄ−アミノアシラーゼ活性が確認された画分の少量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供し、不純蛋白質が混在しないことを確認した。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品（株）製）を用い、第一化学薬品（株）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動操作法に則って行った。ＳＤＳ−サンプル処理液（第一化学薬品（株）製）５０μＬと精製フラクション５０μＬを同量混合し、５分間煮沸処理を行った。
ＰＡＧミニ「第一」１０／２０ゲルに、煮沸処理を行ったサンプルを２０μＬ供し、４０ｍＡの定電流で電気泳動を行い、ページブルー８３染色液（第一化学薬品（株）製）で染色後、目的のＤ−アミノアシラーゼと推定される蛋白質のバンドを確認した。
比活性（蛋白質量に対する酵素活性の比率）及び電気泳動で純度が高いことを確認した。この活性画分を集め、ビバフロー５０（ザルトリウス（株）製）分画分子量１００００の限外ろ過膜、さらにビバポア１０／２０（ザルトリウス（株）製）分画分子量７５００の限外ろ過膜を用いて濃縮操作を行い、精製酵素として２８ｍＬ得た。
本精製法による酵素精製収率は表１のとおりであった。
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実施例４  精製酵素の酵素学的性質
実施例３で得られたデフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３株由来のＤ−アミノアシラーゼ（以下、本酵素と記載することもある）の酵素学的性質を、以下の方法で測定した。
１．分子量の測定は、前述のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（第一化学薬品（株）製、ＰＡＧミニ「第一」１０／２０）で測定を行った。タンパク質分子量マーカー（第一化学薬品（株）製、タンパク質分子量マーカー「第一」・ＩＩＩ）フォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）、リゾチーム（１４，４００ダルトン）の移動度より求めた分子量は約５５，０００ダルトンであった（図１）。
２．ゲルろ過による分子量の測定は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇＨＲ１０／３０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）（１ｃｍφ×３０ｃｍ）により、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８）緩衝液で流速１ｍＬ／ｍｉｎ、検出２８０ｎｍで分析を行った。分子量マーカーにはＬＭＷ  ＧＥＬ  ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ  ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ社製）Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（６７，０００ダルトン）、Ｏｖａｌｕｂｕｍｉｎ（４３，０００ダルトン）、ＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎＡ（２５，０００ダルトン）、ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＡ（１３，７００ダルトン）を用い、分子量と溶出時間との関係を求めた。本酵素を同じ条件で分析し算出した分子量は約５６，０００ダルトンであった。
３．タンパク質等電点は、２次元電気泳動法に則り、変性系２次元電気泳動（第一化学薬品（株）製、ＩＰＧチューブゲル「第一」４−１０及びＰＡＧラージ「第一」２Ｄ−１０／２０）を用いて測定した。２Ｄ−タンパク質等電点マーカー（第一化学薬品（株）製、２Ｄ−タンパク質等電点マーカー「第一」）ｐＩ値５．１、５．２、５．３、５．４、５．７、６．０、６．２、６．４、６．５、６．７、６．８、７．０、７．１の移動度を基準として求めた本酵素のｐＩ値は５．３であった。
４．基質特異性は、前述したＤ−及びＬ−アミノ酸オキシダーゼ発色試薬を用いた活性測定法に則り検討した。すなわち、初めに２００μｍｏｌ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌの各Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸を基質として用いて反応し、得られた５５５ｎｍの吸光度値と基質濃度の関係から酵素活性の検量線を作成した。
次に同様の発色試薬を用い基質として、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−グルタミン酸を用いて、以下の方法で各アセチルアミノ酸に対する反応を調べた。
すなわち、１０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液ｐＨ８に４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ０．６１ｍｇ（ナカライテスク（株）製、Ｃｏｄｅ：０１９０７−５２）、Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｍｅｔｈｌａｎｉｌｉｎｅ，ｓｏｄｉｕｍ，ｓａｌｔ，ｄｉｈｙｄｒａｔｅ３．２２ｍｇ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｃｏｄｅ：ＯＣ１３）、ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ  ３０ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ｐ−６７８２）、Ｄ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ１ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−９１２８）又はＬ−ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ  ＯＸＩＤＡＳＥ１ｕｎｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃｏｄｅ：Ａ−５１４７）、を溶解して発色試薬とし、この発色試薬５００μＬと１００ｍｍｏｌ／Ｌの各アセチルアミノ酸基質溶液１００μＬ、一定濃度の本酵素液１００μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）３００μＬを含む１ｍＬの反応液を３７℃で３０分間加温後、分光光度計を用い５５５ｎｍの吸光度値を測定し、各Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸を用いて作成した検量線から酵素活性量を求めた。
尚、１Ｕは１分間に１μｍｏｌ／Ｌの各Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の生成を触媒する酵素量とし、上記で求めたＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の濃度との関係式から算出した。
基質特異性は、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンを１００にした場合と、Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンを１００にした場合の相対活性で表２に示した。
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Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸またはＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸を用いて反応を確認した結果、Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸のみに作用し、Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸にはまったく作用しなかった。Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸の中ではＮ−アセチル−Ｄ−バリンに最も良く作用し、Ｎ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｄ−チロシンにも作用した。しかし、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルタミン酸には作用しなかった。Ｎ−アセチル−Ｌ−アミノ酸として、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロシン及びＮ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸のＮ−アセチル−Ｌ−アミノ酸には作用しなかった。
５．温度安定性は、本酵素液をｐＨ８．５で４℃、２５℃、３０℃、４０℃、５０℃で１日加温し、前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いるＤ−アミノアシラーゼ活性測定法に則り加温処理後の残存活性を測定して確認した。本酵素の温度安定性を図２に示す。本酵素は、４℃から３０℃まで残存活性が８０％以上であり、安定であった。
６．至適温度は、本酵素液をｐＨ８で４℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃で前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いるＤ−アミノアシラーゼ活性測定法に則り活性測定を行って確認した。本酵素の至適温度を図３に示す。本酵素は、３７℃において作用が至適であった。
７．ｐＨ安定性は、本酵素をｐＨ４から１２で温度３０℃１日加温後、前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いるＤ−アミノアシラーゼ活性測定法に則りｐＨ処理後の残存活性を測定して確認した。本酵素のｐＨ安定性を図４に示す。結果本酵素は、ｐＨ９付近で最も安定であり、ｐＨ７付近からｐＨ１０付近でも残存活性が５０％以上であり比較的安定であった。なお、ｐＨ６あるいはｐＨ１１でも残存活性は０％にはならなかった。
８．至適ｐＨは、本酵素を温度３７℃でｐＨ６から１２で前述のＤ−アミノ酸オキシダーゼを用いるＤ−アミノアシラーゼ活性測定法に則り酵素活性を測定して確認した。本酵素の至適ｐＨを図５に示す。本酵素は、ｐＨ８からｐＨ８．５付近で最も良く作用した。
９．金属イオンの影響は、０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンと本酵素液（５００Ｕ）を含む反応液に、終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌになるように、塩化カルシウム・２水和物、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水和物、塩化ナトリウム、塩化コバルト（ＩＩ）・６水和物、塩化カリウム、塩化ニッケル・６水和物、塩化マグネシウム・６水和物、硫酸銅（ＩＩ）・５水和物、塩化マンガン（ＩＩ）・４水和物、塩化亜鉛、モリブデン酸ナトリウムを添加して、４０℃で１日加温し、生成されたＤ−バリン量を以下に記述するＨＰＬＣ法により測定し、検出されたＮ−アセチル−Ｄ−バリンとＤ−バリンの面積比から各金属を添加した場合の分割率を求め、金属イオン無添加における分割率を１００として相対値を求めた。
その結果、表３に示すように本酵素は１ｍｍｏｌ／ＬのＭｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋で相対活性が５０％未満となり活性が阻害された。
ＨＰＬＣ測定法は、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−２（ＧＬサイエンス（株）製）カラムを用い、０．０１５％１−ペンタンスルホン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝８０：２０緩衝液を用い、流速０．５ｍＬ／分、検出２３０ｎｍ、カラム温度３０℃でＨＰＬＣ分析した。
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１０．阻害剤の影響は、０．５ｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチル−Ｄ−バリンと本酵素液（５００Ｕ）を含む反応液に、終濃度５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにエチレンジアミン四酢酸、２−メルカプトエタノール、Ｎ−エチルマレイミド、ｏ−フェナントリン、Ｌ−システイン、ヨードアセトアミド、ジチオスレイトールを添加して４０℃で１日加温し、生成されたＤ−バリン量を前述したＨＰＬＣ法により測定し、検出されたＮ−アセチル−Ｄ−バリンとＤ−バリンの面積比から各阻害剤を添加した場合の分割率を求め、阻害剤無添加における分割率を１００として相対値を求めた。
その結果、表４に示すように本酵素は５．０ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールで相対活性が５０％未満、ｏ−フェナントリンで相対活性が６０％未満、Ｌ−システインで相対活性が８０％未満となり、活性が阻害された。
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実施例５  新規Ｄ−アミノアシラーゼのクローニング
本菌株のデフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３（Ｄｅｆｌｕｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ａ１３１−３）より精製を行い、単離されたＤ−アミノアシラーゼを元に、公知の方法により、そのＮ末及び内部アミノ酸配列を分析し、Ｎ末；ＫＳＦＤＬＶＩＲＮＧＲＶＶＤＰ、内部；ＡＱＡＱＧＬＸＩＴＸＥＡ、ＴＡＬＩＰＡＱＩＶＥＲの配列を得た。このアミノ酸から考えられるＤＮＡ配列をすべて包含したＮ末及び内部配列ミックスプライマーＡＴＨＭＧＩＡＡＹＧＧＩＭＧＩＧＴＩＧＴ（配列番号３）、及びＣＫＹＴＣＩＡＣＤＡＴＹＴＧＩＧＣＩＧＧＤＡＴ（配列番号４）の２種類の調製を行った。なお、Ｉは、イノシンを表している。
次に、デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３培養菌体より、公知の方法を用いゲノムＤＮＡの抽出を行った。
精製酵素から得られたミックスプライマーと、培養菌体より得られたゲノムＤＮＡを用いＨｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ製）でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲには、供給業者から提供される緩衛液中に以下のものを含む反応液（１０μｌ）を使用した：ｄＮＴＰ２００μＭ、各プライマー５０ｐｍｏｌ、デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３のゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、およびＤＮＡポリメラーゼ１ユニット。反応は、９５℃での変性１５分間の後１）９５℃での変性段階３０秒間；２）４０℃でのアニーリング段階３０秒間；３）７２℃での合成段階９０秒間を、３０サイクル行った。アガロース電気泳動で確認したところ約１．３ｋｂのＤＮＡ増幅があった。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ｔｏｐｏ（インビトロジェン社製）を用いてクローニングを行い、部分塩基配列（部分遺伝子）の決定を行った。
得られた部分遺伝子を元に、プライマーＡＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴ（配列番号５）、及びＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡ（配列番号６）の２種類を設計合成しＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いてＨｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ製）でＰＣＲ反応を行った。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法に用いる鋳型は、デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３から抽出した５μｇのゲノムを制限酵素ＳａｌＩ（ＮＥＢ）を用い３７℃にて一晩消化・精製したものを、Ｔ４  Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）で環状化したものを用いた。反応は、９５℃での変性１５分間の後１）９４℃での変性段階３０秒間；２）６０℃でのアニーリング段階３０秒間；３）７２℃での合成段階４分間を、３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ｔｏｐｏを用いてクローニングを行い、全塩基配列（全遺伝子）の決定を行った。
この塩基配列の結果から、Ｎ末の外側及びＣ末のプライマーＡＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣ（配列番号７）、及びＴＣＡＴＣＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＣＣＧＧＡＴＧ（配列番号８）の作製を行い、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ（ＱＩＡＧＥＮ製）及びＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＵＢＯ製）のポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応を行った。Ｈｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑの反応は、９５℃での変性１５分間の後１）９４℃での変性段階３０秒間；２）５８℃でのアニーリング段階３０秒間；３）７２℃での合成段階２分間を、３０サイクル行い、ＫＯＤ  ｐｌｕｓの反応は、９５℃での変性２分間の後１）９４℃での変性段階３０秒間；２）５８℃でのアニーリング段階３０秒間；３）６８℃での合成段階２分間を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ｔｏｐｏを用いてクローニングを行い、クローンの塩基配列を比較し、本発明Ｄ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号１）並びに本発明Ｄ−アミノアシラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）を確定した。
実施例６  Ｄ−バリンの製造
１５％Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン水溶液を基質として用い、デフルビバクター  エスピー  Ａ１３１−３株由来のＤ−アミノアシラーゼが基質水溶液１ｍＬ当たり２００Ｕの酵素量を添加し、４０℃で３日間反応を行い、生成されたＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリンからＤ−バリンの分割生成率を、実施例１（２）記載のＨＰＬＣ測定法で測定した。結果を図６に示す。
本酵素を基質水溶液に２００Ｕ／ｍＬ含有する系で、反応１日目でＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン中のＮ−アセチル−Ｄ−バリンの９０％以上がＤ−バリンに変換されており、その分割率は９０％以上であった。
また、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリンは全く分解されず、本酵素がＤ−アミノ酸の製造に関して実用性を有することが確認された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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