(57)【要約】キトサン、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進物質を以下の質量比率（％）で含むことを特徴とする栽培植物中の硝酸塩含有量低減用組成物。  キトサン………………………………１５−２５  有機酸  ……………………………１５−２５  硝酸塩還元酵素活性物質……………２５−３０  葉緑素合成促進物質…………………２９−３５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサン、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進物質を以下の質量比率（％）で含むことを特徴とする栽培植物中の硝酸塩含有量低減用組成物。
キトサン……………………………………１５−２５
硝酸塩還元酵素活性物質…………………２５−３０
葉緑素合成促進物質………………………２９−３５
有機酸………………………………………１５−２５
【請求項２】
キトサンの質量平均分子量が、２０〜１８０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項３】
キトサンの脱アセチル化度が、７０％以上であることを特徴とする請求項１又は請求項２のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項４】
有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項５】
有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項６】
有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する有機酸全体に対して質量比率で、琥珀酸２、アスコルビン酸０．８〜１．２、ソルビン酸０．８〜１．２の範囲であることを特徴とする請求項５に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項７】
硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸、ナフチル酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項８】
硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項９】
硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する硝酸塩還元酵素活性物質全体に対して質量比率で、硝酸鉄２０、モリブデン酸アンモニウム４〜６、インドール酢酸０．５〜１．５、エチレンジアミンテトラ酢酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする請求項８に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１０】
硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、ナフチル酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１１】
硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、ナフチル酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する硝酸塩還元酵素活性物質全体に対して質量比率で、硝酸鉄２０、モリブデン酸アンモニウム４〜６、ナフチル酢酸０．５〜１．５、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする請求項１０に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１２】
葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１３】
葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１４】
葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する葉緑素合成促進物質全体に対して質量比率で、２−オクソグルタール酸３０、Ｌ−グルタミン酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする請求項１３に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１５】
硝酸塩含有量低減用組成物１００質量部に対してに、更に界面活性剤を１質量部〜３質量部の範囲で含むことを特徴とする請求項１〜請求項１４のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１６】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートであることを特徴とする請求項１５に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を水に溶解したことを特徴とする硝酸塩含有量低減用組成物水溶液。
【請求項１８】
ｐＨが４．５〜５．５の範囲であることを特徴とする、請求項１７に記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を、栽培植物の種子に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【請求項２０】
請求項１７又は請求項１８のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液を、栽培植物の種子に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【請求項２１】
請求項１〜請求項１６のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を、栽培植物の葉面に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【請求項２２】
請求項１７又は請求項１８のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液を、栽培植物の葉面に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【請求項２３】
栽培植物が、ホウレン草、レタス、キャベツ、イノンド、パセリ、ラディッシュ、タマネギ、ビート、にんじんおよびじゃがいもからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項１９〜請求項２２のいずれかに記載の栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、農業分野、とりわけ栽培植物の生産分野において、環境に実質的に害を及ぼさない生物活性物質を用いて、野菜、飼料、およびその他農産物中の硝酸塩含有量を低下させることで農産物製品の品質を向上させる技術に関する。
【背景技術】  周知の通り、食品中に含まれる硝酸塩は、人の健康に害を及ぼし、血中ヘモグロビン含有量を低下させるなど、多くの代謝障害を引き起こす可能性を有する。この硝酸態窒素は、生体内で変異原性および発ガン性ニトロソアミンの形成を促す原因となる物質と考えられている。
そのため、栽培植物製品、とりわけ、非加熱で食用に供される野菜類、また、牛乳やその他の畜産製品に硝酸塩が混入するおそれのある畜産飼料用栽培植物では、硝酸塩含有量を低減させる手段や方法が求められている。
他方、硝酸塩は大多数の農業用栽培植物中で最も重要な窒素原でもある。植物の生育を促し、栄養素や信号の作用も果たす。栄養素としての硝酸塩は、アンモニウム塩まで還元され、次いで、アミノ酸の成分となり、その後は蛋白質、葉緑素、ホルモン、その他、植物の窒素含有化合物の成分へと変わる。また、信号としての硝酸塩は、遺伝子の大きなグループの発現を強めることにより、窒素と炭素の新陳代謝を調整する。
硝酸塩は二つの段階を経てアンモニウム塩に還元される。第１段階では、硝酸還元酵素によって反応が促され、硝酸塩が亜硝酸塩まで還元され、第２段階の反応で亜硝酸塩が亜硝酸塩還元酵素によりアンモニウム塩に還元される。アンモニウム塩のアミノ酸への取り込みは、主としてグルタミン酸合成促進酵素とグルタミン酸塩合成促進酵素によって触媒される。
植物中の硝酸態窒素含有量を低下させる組成としては、５−アミノレブリン酸とその塩の水溶液をベースとしたもの（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９６、米国特許第５，４８９，５７２号）が知られている。
この組成の欠点は、高価な（１ｋｇ当たり５万から７万５０００ドル）５−アミノレブリン酸を大量に必要とする（１ｈａ当たり８０ｇから３ｋｇまで）点であり、組成自体の価格を高め、経済的に見合わないことにある。この組成には更にもう１つ欠点がある。５−アミノレブリン酸は除草剤であり、一定条件下では、少量の使用でも、適用した栽培植物の生育を阻害するおそれがある。この特許によれば、５−アミノレブリン酸は、土壌および／または植物の処理を行うために使用することになっている。いずれの場合でも、低濃度（除草剤としての濃度でなく）で使用すれば、成長を促す作用は、目的とする植物ばかりでなく雑草にまでおよぶことになる。
われわれが原型（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）として採用したのは、キトサンをベースとした、植物の病気に対する耐性を強める目的で提案された組成である（Ｎｏｖｏｄｚｉｌｏｖら、２０００、ロシア共和国特許第２１５８５１０号）。
当該公報によれば、この組成は栽培植物製品中の硝酸態窒素含有量に実質的に影響を及ぼさないとされている。
【特許文献１】ロシア共和国特許第２，１５８，５１０号
【特許文献２】米国特許第５，４８９，５７２号
【発明の開示】
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消することが可能な薬剤を提供することにある。
本発明の目的は、更に詳しくは、遺伝子導入植物や高価な化合物を必須とすることなく、栽培植物中に含まれる硝酸塩量を減少させる薬剤を開発することにある。
本発明の他の目的は、当該薬剤による栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法を提供することにある。
本発明者は鋭意研究の結果、硝酸塩含有量を低減する薬剤としてキトサンを含む組成物を用いることが、上記課題の解決に極めて効果的なことを見出し本発明を完成させた。更に詳しくは、キトサンを含む組成物は、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進剤と組み合わせることによって、栽培植物中の硝酸塩含有量を効率的に低下させることができる。
本発明は、例えば以下の事項を含む。
〔１〕キトサン、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進物質を以下の質量比率（％）で含むことを特徴とする栽培植物中の硝酸塩含有量低減用組成物。
キトサン………………………………………１５−２５
硝酸塩還元酵素活性物質……………………２５−３０
葉緑素合成促進物質…………………………２９−３５
有機酸…………………………………………１５−２５
〔２〕キトサンの質量平均分子量が、２０〜１８０ｋＤａの範囲であることを特徴とする〔１〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔３〕キトサンの脱アセチル化度が、７０％以上であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔４〕有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔５〕有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸の組み合わせであることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔６〕有機酸が、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する有機酸全体に対して質量比率で、琥珀酸２、アスコルビン酸０．８〜１．２、ソルビン酸０．８〜１．２の範囲であることを特徴とする〔５〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔７〕硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸、ナフチル酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔８〕硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸の組み合わせであることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔９〕硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する硝酸塩還元酵素活性物質全体に対して質量比率で、硝酸鉄２０、モリブデン酸アンモニウム４〜６、インドール酢酸０．５〜１．５、エチレンジアミンテトラ酢酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする〔８〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１０〕硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、ナフチル酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸の組み合わせであることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１１〕硝酸塩還元酵素活性物質が、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、ナフチル酢酸およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する硝酸塩還元酵素活性物質全体に対して質量比率で、硝酸鉄２０、モリブデン酸アンモニウム４〜６、ナフチル酢酸０．５〜１．５、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする〔１０〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１２〕葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上であることを特徴とする〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１３〕葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせであることを特徴とする〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１４〕葉緑素合成促進物質が、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせであって、かつその割合が含有する葉緑素合成促進物質全体に対して質量比率で、２−オクソグルタール酸３０、Ｌ−グルタミン酸０．５〜１．５の範囲であることを特徴とする〔１３〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１５〕硝酸塩含有量低減用組成物１００質量部に対してに、更に界面活性剤を１質量部〜３質量部の範囲で含むことを特徴とする〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１６〕界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートであることを特徴とする〔１５〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物。
〔１７〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を水に溶解したことを特徴とする硝酸塩含有量低減用組成物水溶液。
〔１８〕ｐＨが４．５〜５．５の範囲であることを特徴とする、〔１７〕に記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液。
〔１９〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を、栽培植物の種子に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
〔２０〕〔１７〕又は〔１８〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液を、栽培植物の種子に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
〔２１〕〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物を、栽培植物の葉面に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
〔２２〕〔１７〕又は〔１８〕のいずれかに記載の硝酸塩含有量低減用組成物水溶液を、栽培植物の葉面に散布することにより栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
〔２３〕栽培植物が、ホウレン草、レタス、キャベツ、イノンド、パセリ、ラディッシュ、タマネギ、ビート、にんじんおよびじゃがいもからなる群から選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする〔１９〕〜〔２２〕のいずれかに記載の栽培植物中の硝酸塩含有量を低減する方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、「粘度測定法」により求められた既知の分子量を有するキトサンを用いた硝酸塩低減用組成物のＧＰＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明におけるキトサンには特に制限はない。一般的にキトサンと称されているものであればどのような形態、性状のものでも使用することができる。
キトサンの定義としては具体的には例えば、天然多糖類である下記式（１）で表されるキチン、別名β−ポリ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、のアセトアミド基を加水分解により脱アセチル化し、アミノ基とした生成物で、下記式（２）であらわされるβ−ポリ−Ｄ−グルコサミンを挙げることができる。
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キチン、キトサンの詳細に関しては、必要に応じて、例えば、技報堂出版「−最後のバイオマス−キチン、キトサン」１９９５年６月２０日発行（１版５刷）の記載（特に、第１〜２０頁の記載）を参照することができる。
キチンを脱アセチル化してキトサンを生成させる際、厳密に全てのアセトアミド基が加水分解されてアミノ基になることは必須ではない。本発明のキトサンとして用いるにあたって支障がない限り、一部のアセトアミド基が残っていてもかまわない。もちろん、アセトアミド基が検出されない、実質的に存在しないものでもかまわない。本発明においては、一部のアセトアミド基が残留しているものも含めて“キトサン”と定義する。
キトサン分子中に存在するアミノ基とアセトアミド基の比率は、一般に「脱アセチル化度」と呼ばれ、次の式で定義される。なお測定方法については後述する。
脱アセチル化度＝（アミノ基の数／（アセトアミド基の数＋アミノ基の数））×１００（％）
本発明における組成物は、脱アセチル化度に依存するわけではないが、通常７０％以上の脱アセチル化度を有するキトサンを使用することが好ましい。
脱アセチル化度が低すぎるとキトサンの水への溶解度が低下するため、使用し難くなり、効力も低下する恐れがある。また、脱アセチル化度が高すぎる場合にも、安定した効力を得ることが困難となる傾向がある。
脱アセチル化度として、より好ましくは７５％〜９５％の範囲、最も好ましくは７５％〜９０％の範囲である。
また、キチンを脱アセチル化する過程では、ポリマーの一部に解重合が起こると言われており、生成したキトサンの分子量は低分子量から高分子量までの分布を有している。
本発明において論じるキトサンの分子量とは、質量平均分子量を指すこととし、その測定方法については後述する。
本発明では、当該組成の調整に、上記のように定義した分子量において、２０〜１８０ｋＤａのキトサンの使用を提案している。これは重合度で１２０から１０２０までに相当するものであるが、できれば分子量２０〜１２０ｋＤａを有するキトサンの使用が好ましい。このような分子量のキトサンを含む組成物は、水への溶解が容易で、植物中への浸透も速いとされている点で好ましい。
キトサンの分子量は、より好ましくは２０〜１００ｋＤａの範囲、最も好ましくは２０〜７０ｋＤａの範囲である。
本発明において使用可能なキトサンの由来は、特に制限されない。すなわち、天然由来のキチンを化学的もしくは生化学的手法を用いて脱アセチル化して得たもののみならず、菌類の細胞壁より抽出されたものをも使用することができる。
また、大日精化工業株式会社（商品名：ダイキトサン）や焼津水産化学工業株式会社等より市販されているものを購入して使用することもできる。
硝酸塩含有量低減用組成物におけるキトサンの割合としては、質量比率で１５％〜２５％の範囲である。このキトサンの割合は、好ましくは１５％〜２０％の範囲であり、より好ましくは１８％〜２０％の範囲である。なお本明細書において、キトサンを始めとする各成分の割合（質量比率）のベースは、該成分自体をも包含する硝酸塩含有量低減用組成物の全質量である。すなわち、キトサンの質量をＡグラム、キトサン以外の成分の質量合計をＢグラムとした場合に、硝酸塩含有量低減用組成物の全質量は（Ａ＋Ｂ）グラム、キトサンの質量比率は、｛Ａ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００（％）で表される。
本発明の硝酸塩含有量低減用組成物は、キトサンに加えて、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進物質を含むことが特徴である。以下にそれぞれの成分について説明する。
（硝酸塩還元酵素活性物質）
農業ないし植物栽培用途に使用可能である限り、本発明において使用可能な硝酸塩還元酵素活性物質は特に制限されない。ここに、「硝酸塩還元酵素活性物質」とは、植物中の硝酸塩還元酵素の活性を高める作用を有する物質を言う。結果として硝酸塩還元酵素の活性を高める作用を発現できる限り、その作用メカニズムは特に制限されない（このような硝酸塩還元酵素活性物質の詳細に関しては、必要に応じて、論文「野菜類の硝酸還元酵素の生化学」中川弘毅著、日本食品科学工学会誌、第４５巻、第１号、１９９８年１月発行、または技報堂出版「安全・持続型農業を目指して〜キトサンの農業利用の理論と実際」２０００年１１月６日発行（１版１刷）の記載（特に、第３９頁の記載）を参照することが出来る）。
栽培植物中の硝酸塩含有量を効果的に低下させる効果の点からは、この硝酸塩還元酵素活性物質は、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸、ナフチル酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、およびＮ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上が好適に使用可能である。
本組成物を水に溶解して栽培植物へ施用する際の植物に及ぼす活性の点からは、複数の硝酸塩還元酵素活性物質の組み合わせが好ましい。特に、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸（又はナフチル酢酸）、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（又は、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸）の組み合わせが好ましい。
硝酸塩含有量低減用組成物における硝酸塩還元酵素活性物質の割合としては、質量比率で２５％〜３０％の範囲である。好ましくは２７％〜３０％の範囲であり、より好ましくは２７％〜２８％の範囲である。
硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸（又はナフチル酢酸）、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（又は、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸）の組み合わせを用いる際に、おのおのの比率に特に制限はない。硝酸塩還元酵素の活性化をより効果的に高める点から、硝酸鉄、モリブデン酸アンモニウム、インドール酢酸（又はナフチル酢酸）、およびエチレンジアミンテトラ酢酸（又は、Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸）の質量比率が２０：４〜６：０．５〜１．５：０．５〜１．５の範囲が好ましく、更に好ましくは２０：５：１：１である。
ここで言う、硝酸塩還元酵素活性物質には、同時に植物中の亜硝酸塩還元酵素を活性化する働きもある。
（葉緑素合成促進物質）
農業ないし植物栽培用途に使用可能である限り、本発明において使用可能な葉緑素合成促進物質は特に制限されない。結果として葉緑素合成を促進する作用を発現できる限り、その作用メカニズムは特に制限されない（このような葉緑素合成促進物質の詳細に関しては、必要に応じて、技報堂出版「安全・持続型農業を目指して〜キトサンの農業利用の理論と実際」２０００年１１月６日発行（１版１刷）の記載（特に、第３９頁の記載）を参照することが出来る）。
栽培植物中の硝酸塩含有量を効果的に低下させる効果の点からは、この葉緑素合成促進物質は、２−オクソグルタール酸、およびＬ−グルタミン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上が好適に使用可能である。
本組成物を水に溶解して栽培植物へ施用する際の植物に及ぼす活性の点からは、複数の葉緑素合成促進物質の組み合わせが好ましい。特に、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせが好ましい。
硝酸塩含有量低減用組成物における葉緑素合成促進物質の割合としては、質量比率で２９％〜３５％の範囲である。好ましくは３１％〜３４％の範囲であり、より好ましくは３１％〜３２％の範囲である。
２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の組み合わせを用いる際に、おのおのの比率に特に制限はない。葉緑素合成促進をより効果的にする点から、２−オクソグルタール酸およびＬ−グルタミン酸の質量比率が３０：０．５〜１．５の範囲が好ましく、更に好ましくは３０：１である。
（有機酸）
農業ないし植物栽培用途に使用可能である限り、本発明において使用可能な有機酸は特に制限されない。栽培植物中の硝酸塩含有量を効果的に低減する効果の点からは、この有機酸は、琥珀酸、アスコルビン酸およびソルビン酸からなる群から選ばれる少なくとも一種以上が好適に使用可能である。
本組成物を水に溶解して栽培植物へ施用する際の植物に及ぼす活性の点からは、複数の有機酸の組み合わせが好ましい。特に、琥珀酸、アスコルビン酸、およびソルビン酸の組み合わせが好ましい。
硝酸塩含有量低減用組成物における有機酸の割合としては、質量比率で１５％〜２５％の範囲である。好ましくは１８％〜２５％の範囲であり、より好ましくは２０％〜２５％の範囲である。
琥珀酸、アスコルビン酸、およびソルビン酸の組み合わせを用いる際に、おのおのの比率に特に制限はない。水に溶解して水溶液とした際に最適となるｐＨ範囲の点から、琥珀酸、アスコルビン酸、およびソルビン酸の質量比率が２：０．８〜１．２：０．８〜１．２の範囲が好ましく、更に好ましくは２：１：１である。
（界面活性剤）
本発明の組成物は、必要に応じて、植物の葉の表面上における本組成の保持率を高めるために、界面活性剤を含んでもよい。農業ないし植物栽培用途に使用可能である限り、本発明において使用可能な葉緑素合成促進物質は、特に制限されない。農業ないし植物栽培用途に使用可能な界面活性剤の詳細に関しては、必要に応じて、ＪＡ全農肥料農薬部農薬技術普及課編集「クミアイ農薬総覧２００１（改正）」平成１３年１月３１日発行の記載（特に、展着剤、第１５９２〜１６０１頁の記載）を参照することができる。
栽培植物の葉面上における本組成の保持能力の点からは、この界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノステアレートが好ましい。花王株式会社（商品名：レオドールスーパーＴＷ−Ｓ１２０）より市販されているものを購入して使用することもできる。
硝酸塩含有量低減用組成物における界面活性剤の割合としては、質量比率で１％〜３％の範囲である。好ましくは１．５％〜２．５％の範囲であり、より好ましくは１％〜２％の範囲である。
（水溶液としての使用）
本発明は、上記組成を水溶液として使用する方法をも提供する。栽培植物中の硝酸塩の含有量を低下させる目的で、例えば、硝酸塩含有量低減用組成物をｐＨ５〜９の水に溶解し、水溶液のｐＨを４．５から５．５とする。ついでこの水溶液を農産物の種子へ散布するか、またはこの水溶液中に種子を浸漬する方法および成長期の植物の葉面にこの水溶液を散布する方法である。
（既存の技術レベルとの比較）
既存の技術レベルを分析した結果によると、キトサンおよび有機酸類についてこれまでに知られていたのは、植物の成長調節作用および病気に対する耐性を強める作用のみに限られていた。モリブデン酸塩陰イオンと硝酸塩陰イオンには、硝酸還元酵素の活性を高める作用のあることがすでにわかっていたが、これを、硝酸塩含有量を低減する手段として野菜やその他の栽培植物に実用化する道はまだ開かれていなかった。
本組成が有する、植物による無機窒素の同化効率を高め、その結果、栽培植物中の硝酸塩含有量を低下させる作用は、われわれが発見したもので、従来報告されてきた成長促進作用から導き出されるものではない。
（適用）
本発明で提案される組成は、どのような種類の植物にも適用できる。硝酸塩の含有レベルが高い植物（植物の商品化される部分に含まれる総窒素中の硝酸態窒素が０．５％以上）では、本発明の組成物の効果がとりわけ顕著に現われる。これに類する植物には、例えば、一連の野菜（ホウレンソウ、各種のレタス類、キャベツ、イノンド、パセリ、ラディッシュ、タマネギ）、各種根菜類（ビート、ニンジン、ジャガイモ）などがある。
（組成物の作用）
本発明の組成物が有する作用は、実質的に毒性がなく、環境に害を及ぼさない生物活性物質であるキトサンの中でも以前未解明であった部分に基礎をおくものである。本組成中に含まれるその他の成分と併せて、硝酸塩還元酵素、亜硝酸塩還元酵素を活性化させ、植物中の葉緑素を増加させ、更に浸透活性を高める物質にするという利点を有し、これにより、無機窒素の同化を高め、農産物中の硝酸塩含有量を低下させることが可能となる。
キトサンはごく限定された有機酸、およびわれわれが出願した化合物中の一部のみを含む、特異的な組み合わせによってのみ上記の作用を発現できる。その理由は、硝酸塩の含有量を低下させる本組成の作用が以下に述べる３つの作用によることに起因すると推定される。
−  遺伝子および無機窒素を同化させる重要な酵素、すなわち、硝酸塩還元酵素、亜硝酸塩還元酵素、グルタミン酸塩合成促進酵素、グルタミン酸合成促進酵素の活性化による作用であり、それを可能にしているのが、キトサン、２−オクソグルタール酸、琥珀酸、インドール酢酸、硝酸塩、モリブデンなど、キトサンのマトリクスに吸着して、植物の葉に持続的に付着し、補助因子、基質の前駆物質および前述の酵素活性物質として、これら物質が個別に使用されるよりはるかに長い持続的作用を発現するという仕組みである。硝酸塩還元酵素の活性が向上するに伴って亜硝酸塩還元酵素の活性も上昇し、これによって、特に光が不足しているとか、その他のストレスが存在する条件下では、植物の組織中に亜硝酸塩が蓄積されるのを防ぐ作用が増強される。
−葉緑素の合成をその前駆物質である、２−オクソグルタール酸、Ｌ−グルタミン酸によって強めることにより、植物の葉に含まれる葉緑素を増加させ、その結果生ずる光合成と糖形成を強化する作用。この際、糖は植物中の窒素同化を導く。
−キトサンおよび本組成のその他成分が有する浸透活性による作用で、その結果、窒素の還元型である最終産物への硝酸塩の還元が防止され、炭水化物および窒素の代謝が同調する。
上記の論拠により、これまで知られていなかった「成分・性状」の機能面の依存関係が確認された。これにより、本発明の方法も、上記した課題の解決に効果的であることが理解されよう。
本発明の組成物は水溶性で、膜形成能および付着能に優れ、植物性物質に対し高い粘着性を有する。該組成物は、例えばｐＨは４．５〜５．５の中性に近い水溶液で、活性、安定性を有する。本発明の組成物は、使用範囲の濃度では植物毒性を有しない。
本発明において使用可能なキトサン、２−オクソグルタール酸、Ｌ−グルタミン酸、琥珀酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、インドール酢酸は、本出願では作用物質として使用されており、自然界に存在する既知の化合物として、化学的合成によって、また微生物学的手法、あるいは酵素合成、自然界の資源を用いた抽出法などのいずれによっても取得が可能な物質である。
キトサンをベースとした本組成を非同化硝酸塩の含有量低減を目的として用いる場合、その使用量および使用頻度は、環境条件によって異なる場合がある。通常、本組成による種子の処理と生育段階にある植物への水溶液散布を行う方法を採用することができる。生育途中の植物に対する水溶液散布は、例えば週１回を収穫までの３週間行えばよい。光の不足、またはその他のストレスが存在する条件下では、適宜、散布回数を増やすことができる。
野菜に対する種子段階の処理は、例えば、乾燥状態の本組成を使用した０．５％水溶液に浸して行うことができる。この場合の溶液使用量は、例えば種子１ｋｇ当たり１リットル程度であることが好ましい。散布用には、例えば、乾燥粉末を用いた０．５％水溶液を、１ｈａ当たり２００〜３００リットル使用することができる。
本発明が産業上利用可能であることを示すため、また、本発明の内容に対する理解をより深めるため、ここに具体的使用例を示すが、これにより出願中の発明の特質を全て網羅したわけではない。
【実施例】 使用例１
ハウス栽培のレタスについて、その葉に含まれる硝酸塩還元酵素活性を向上させる組成の作用を示す。
組成（その１）の成分（ｗｔ％）：分子量５０ｋＤａのキトサン−２０、硝酸塩還元酵素活性物質−２７、葉緑素合成促進物質−３１、有機酸−２０、界面活性剤−２。
組成（その２）の成分（ｗｔ％）：分子量１７０ｋＤａのキトサン−１５、硝酸塩還元酵素活性物質−２５、葉緑素合成促進物質−３４、有機酸−２５、界面活性剤−１。
使用例１に関するデータを表１に示す。このデータに示すように、対照より高い硝酸塩還元酵素活性は、レタスに散布後７日間持続した。
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使用例２
レタスの葉緑素含有量を向上させる本組成の作用を示す。組成の種別構成は使用例１に示した通り。例２のデータ（表２）に示すように、出願中の組成は、レタスへの処理実施後３日間にわたって、葉緑素の含有量を増加させることが裏付けられた。
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使用例３〜５
各種レタス（品種名「アザルト」、「ローラ・ロッサ」、「オデッサの縮れ葉」）とホウレンソウ（品種名「マタドール」）の葉中硝酸塩含有量を低下させる本組成の作用を示す。組成（その１）の成分は使用例１、２と同じで、組成（その３）の成分（ｗｔ％）は：分子量１００ｋＤａのキトサン−１８、硝酸塩還元酵素活性物質−３０、葉緑素合成促進物質−３１、有機酸−１８、界面活性剤−３である。
使用例３〜５（表３〜５）に関するデータに示すように、本発明で提案した組成が商品レベルにまで成長したレタスおよびホウレンソウの葉中に含まれる硝酸塩含有量を著しく低下させることが裏付けられた。
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上記したように、本発明の組成物は、キトサンに少量の生物活性物質を加えることにより、野菜や根菜中の硝酸塩含有量を低下させることができる。また、本組成を用いると、窒素肥料の使用効率が向上し、結果として、動物相にとって毒性度の高い硝酸塩による環境汚染（とりわけ水域の汚染）を低減させ、かつ、環境に実質的に害を及ぼさない、硝酸塩含有量の少ない農産物を収穫することが可能となる。
（脱アセチル化度の測定方法）
財団法人日本健康・栄養食品協会「健康食品規格基準の公示」（平成７年６月１日発行）の方法に準じた下記方法を用いる。ポリビニール硫酸カリウム（ＰＶＳＫ）を使用したコロイド滴定によって遊離アミノ基を測定し、キトサンの脱アセチル化度を求める。２００ｍｌメスフラスコ中に乾燥減量試験法にしたがって乾燥後、キトサン試料１．０ｇを精密採取し、０．５％酢酸水溶液を加えて溶解し、正確に２００ｍｌとする。キトサン試料溶液１．０ｇを正確に滴定容器に採取し、水５０ｍｌとトルイジンブルー（指示薬）試料溶液０．２ｍｌを加えて充分混合後、ポリビニール硫酸カリウム溶液で滴定する。終点は青色が赤紫色に変わる点とする。滴定量をＶｍｌとする。
同様にキトサン試料を加えない溶液を滴定する。滴定量をＢｍｌとする。ポリビニール硫酸カリウム溶液は、約１／４００Ｎで精密に求めておく。その濃度を［ＰＶＳＫ］とする。
キトサン中の遊離アミノ基質量（Ｘ）（グルコサミン残基の質量に相当）と結合アミノ基質量（Ｙ）（Ｎ−アセチルグルコサミン残基の質量に相当）は、
Ｘ＝キトサン中の遊離アミノ基質量＝［ＰＶＳＫ］×１６１／１０００×（Ｖ−Ｂ）
Ｙ＝キトサン中の結合アミノ基質量＝０．５×１／１００−Ｘとなり、脱アセチル化度は下記式：
脱アセチル化度（％）＝（Ｘ／１６１）／（Ｘ／１６１＋Ｙ／２０３）×１００
に従って計算される。尚、１６１はグルコサミン残基の当量分子量であり、２０３はＮ−アセチルグルコサミン残基の当量分子量である。
（キトサン分子量の測定方法：オストワルド粘度測定法）
オストワルド粘度計を用い、比粘度を測定し、以下の表６の換算表を用いて求める。粘度の測定溶液は、キトサン試料５０ｍｇに４％酢酸水溶液５０ｍｌおよび０．６Ｍの食塩水５０ｍｌを加え、溶解して調製する。シバタ製オストワルド粘度計の内径０．５ｍｍの毛細管を使用し、刻線ａから刻線ｂの通過時間を測定し、この時間をｔとする。
キトサンを溶解しない溶液を調製し、同様に刻線ａから刻線ｂの通過時間を測定し、この時間をｔｏとする。
ｔ，ｔｏともに３回測定し、平均値を使用する。
比粘度は、下記式で計算される：
比粘度＝ｔ／ｔｏ−１
表６
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比粘度が上記の数字の間である場合は、比例関係にあるとして求める。
（キトサン分子量の測定方法：ＧＰＣ測定法）
キトサンの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によって求めることも可能である。
ＧＰＣ測定法に用いる分析機器としては、示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１）、ポンプ（Ｓｈｏｄｅｘ  ＤＳ−４）、データ処理装置ＧＰＣソフトウェア（ウォーターズ  Ｍａｘｉｍａ  ８２０Ｊ）、そして分離カラム（Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＨｐａｋ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ）を２本直列に接続して、温度６０℃に設定したカラムオーブン（Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＶＥＮ  ＡＯ−５０）内にセットする。
溶離液として０．１Ｍ酢酸緩衝液（０．１Ｍ酢酸７５０ｍｌに０．１Ｍ酢酸ナトリウム１００ｍｌを加え、更に０．１Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨを４に調製した溶液を、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過した溶液）を用い、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで通液する。
試料は０．１質量％となるように、ＧＰＣ測定の４８時間前までに事前に溶離液に溶解する。溶解の際、溶液を激しく震蕩したり、超音波を用いてはならない。このようにして調整した試料溶液２００μｌを注入する。
標準試料としては、前記「粘度測定法」により求められた既知の分子量を有するキトサンを用いる。
溶離液  ：０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）
カラム  ：Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＢ−８０６Ｍ  ＨＱ×２本  ６０℃
流量    ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器  ：示差屈折率検出器（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１）
注入量  ：２００μｌ（０．１％／溶離液）
以上の条件により測定されたＧＰＣクロマトグラムを図１に示す。
【産業上の利用可能性】  上述したように本発明によれば、キトサン、有機酸、硝酸塩還元酵素活性物質および葉緑素合成促進物質を所定の質量比率で含む栽培植物中の硝酸塩含有量低減用組成物が提供される。本発明によれば、遺伝子導入植物や高価な化合物を必須とすることなく、栽培植物中に含まれる硝酸塩量を減少させることができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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