(57)【要約】ＧＷＴ１蛋白を発現した膜画分を用いた簡単なＧｌｃＮ−ＰＩへのアシル基転移反応の測定により、ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌細胞壁への輸送を阻害する化合物がスクリーニング可能となった。ＧＰＩアンカー蛋白質が細胞壁に輸送される過程を阻害することにより、真菌細胞壁の合成を阻害し、同時に宿主細胞への付着も阻害する新規抗真菌剤が創出できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）過剰発現させたＧＷＴ１遺伝子にコードされる蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
（２）ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを検出する工程、
（３）ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
ＧＷＴ１遺伝子が下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
である請求項１に記載の抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
アシル化されたＧＰＩを検出する工程が薄相クロマトグラフィーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、（４）選択された被検試料が、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否か、または、真菌の増殖を抑制するか否かを検定する工程、を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  真菌の細胞壁合成に関与するＧＰＩ合成酵素阻害活性を有する抗真菌剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】  本発明者らは、真菌が病原性を発揮するためには宿主細胞に付着することが重要であり、付着に関与する付着因子は一旦細胞膜にＧＰＩ（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカリングした後、細胞壁表層に輸送されることに着目した（非特許文献１／Ｈａｍａｄａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５８：５３−５９，１９９８）。そしてＧＰＩでアンカリングされた蛋白質（ＧＰＩアンカー蛋白質）が細胞壁に輸送される過程を阻害することにより、真菌細胞壁の合成を阻害し、同時に宿主細胞への付着も阻害する新規抗真菌剤が創出できると考えて研究に着手した。
【発明の開示】
本発明の課題は、真菌細胞壁へのＧＰＩアンカー蛋白質の輸送を阻害して真菌細胞壁の合成を阻害するとともに、宿主細胞への付着を阻害して、病原性真菌が病原性を発揮できないようにする抗真菌剤を開発することにある。
本発明者らはＷＯ  ０２／０４６２６で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードする蛋白質が、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにおいて配列番号３及び５に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードする蛋白質が、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ  ｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅにおいて配列番号７に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードする蛋白質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいて配列番号９及び１１に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードする蛋白質が、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓにおいて配列番号１２及び１３に記載の塩基配列を有するＤＮＡがコードする蛋白質が、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に関与することを見出しＧＷＴ１遺伝子と命名した。更に、該遺伝子を欠失した真菌が細胞壁を合成できないこと、式（Ｉａ）に示す化合物が該蛋白質と結合して、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送を阻害し、真菌の細胞壁合成を阻害することを見出した。
2004048604.tif 000002
そして、ＧＷＴ１遺伝子産物（以下ＧＷＴ１蛋白）が、ＧＰＩの生合成経路（図１、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ；４（６）：６３２−８；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９９  Ｏｃｔ  ８；１４５５（２−３）：３２７−４０）中のＧｌｃＮ−ＰＩにアシル基を転移しＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを合成する活性を有することを見出し、本活性を阻害する化合物をスクリーニングすることにより真菌細胞壁の合成を阻害する化合物を見出すことができると考えて、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記１から４を提供するものである。
［１］．抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）過剰発現させたＧＷＴ１遺伝子にコードされる蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
（２）ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを検出する工程、
（３）ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
ここでＧＷＴ１とはＷＯ  ０２／０４６２６に開示された真菌の細胞壁合成遺伝子であり、過剰発現させたとは本来持っていた遺伝子ではなく、外部から導入した遺伝子から発現させることを意味する。
また、ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩとはＧＰＩの生合成経路（図１、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ；４（６）：６３２−８；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９９  Ｏｃｔ  ８；１４５５（２−３）：３２７−４０）中のＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧｌｃＮ−ＰＩ）のＩｎｏｓｉｔｏｌにアシル基が結合したＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌである。
［２］．ＧＷＴ１遺伝子が下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、
である［１］に記載の抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば６５℃  ４ｘＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０．１ｘＳＳＣ中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド中４２℃４ｘＳＳＣである。また、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ）溶液中６５℃２．５時間ハイブリダイゼーション、次いで１）．２ｘＳＳＣ，０．０５％ＳＤＳ溶液：２５℃５分、２）．２ｘＳＳＣ，０．０５％  ＳＤＳ溶液：２５℃１５分、３）．０．１ｘＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳ溶液５０℃２０分の洗浄といった条件も許される。
また、「１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質」は、当業者に公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｓａｍｂｒｕｃｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）などを用いて調製することができる。また、このような変異は自然界において生じることもある。アミノ酸の変異数は、ＧｌｃＮ−ＰＩにアシル基を転移させる活性が保持される限り特に制限はない。典型的には、３０アミノ酸以内であり、好ましくは、１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の変異部位も、上記活性が保持される限り特に制限はない。
上記ハイブリダイゼーションを利用して調製される蛋白質や変異蛋白質は、通常、配列番号：２、４、６、８、１０または１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質とそのアミノ酸配列において高い相同性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、あるいは９５％以上の相同性）を有する。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
［３］．アシル化されたＧＰＩを検出する工程が薄相クロマトグラフィーである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］．さらに、（４）選択された被検試料が、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否か、または、真菌の増殖を抑制するか否かを検定する工程、を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
以下に本発明に記載された、１．ＧＷＴ１蛋白を調製する方法、２．アシル基転移活性の測定方法について開示する。
１．ＧＷＴ１蛋白を調製する方法
ＧＷＴ１蛋白は、真菌、好ましくＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、更に好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの膜画分から調製する。アシル基転移活性の測定は、調製した膜画分をそのまま使用してもよいし、更に精製して用いてもよい。真菌に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列のＤＮＡを導入して、ＧＷＴ１蛋白を過剰発現させることにより、アシル基転移活性の測定を容易に行うことが可能である。以下にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合について具体的に説明する。
（１）ＧＷＴ１遺伝子の導入
ＧＷＴ１遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列を基にプライマーを設計し、真菌のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより得ることができる。
ＧＷＴ１遺伝子をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで働く発現ベクター、例えばＹＥｐ３５２のマルチクローニングサイトに適当なプロモーター・ターミネーター、例えばｐＫＴ１０（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：４３０３−４３１３，１９９０）由来のＧＡＰＤＨプロモーター及びＧＡＰＤＨターミネーターを挿入した発現ベクターに挿入してＧＷＴ１発現プラスミドを作製する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ例えばＧ２−１０株を、適当な培地例えばＹＰＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ−Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地）にて、適当な温度例えば３０℃で振とう培養し、対数増殖後期の時点で集菌する。洗浄後、例えば酢酸リチウム法によりＧＷＴ１発現プラスミドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入する。酢酸リチウム法についてはＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌに記載されている。ＳＤ（ｕｒａ−）培地で３０℃、２日間培養することによりＧＷＴ１過剰発現株および空ベクター導入株を得ることができる。
また、ＧＷＴ１遺伝子を導入する菌株は、好ましくは自身のＧＷＴ１遺伝子を欠失した欠失株であることが望ましい。ＧＷＴ１遺伝子を欠失したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、以下の方法により得ることができる。
マーカー遺伝子、好ましくはＳ．ｐｏｍｂｅのｈｉｓ５遺伝子を鋳型とし、両端に３０ｂｐ以上好ましくは４０ｂｐ以上の欠失したいＧＷＴ１遺伝子の配列（例えば配列番号１に記載の配列）を含んだＰＣＲ産物が得られるように設計したプライマーを用いＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ産物を精製し、真菌に導入後、マーカー遺伝子に対応した選択、ｈｉｓ５であればｈｉｓ−の培地で培養して、欠失株を得ることができる。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の真菌の発現ベクター及び遺伝子導入法は、Ｓ．ｐｏｍｂｅの発現ベクターｐｃＬ等及びその導入法についてＩｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８０−８３，１９９１に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの発現ベクターｐＲＭ１０等及びその導入法についてＰｌａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ，１２：１６７７−１７０２，１９９６に、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの発現ベクターｐＡＮ７−１等及びその導入法についてＰｕｎｔ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ，ＧＥＮＥ，５６：１１７−１２４，１９８７に、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの発現ベクターｐＰＭ８等及びその導入法についてＭｏｎｄｅｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１８７：４１−４５，２０００に記載されている。
また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの欠失株の作製法は、Ｆｏｎｚｉ  ＷＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４：７１７−７２８，１９９３に記載されている。
（２）膜画分の調製法
ＧＷＴ１遺伝子を導入したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、適当な培地例えばＳＤ（ｕｒａ−）液体培地にて、適当な温度例えば２４℃で振とう培養し、対数増殖中期の時点で集菌する。菌体をＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄した後、適量例えば２ｍｌのＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ＋ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ社製））にて懸濁し、適量例えば１．５ｍｌのガラスビーズを加える。これをボルテックスしては氷上に置く操作を繰り返して（例えば、３０秒間ボルテックスして３０秒間氷上に置く操作を１０回繰り返して）菌体を破砕する。
遠心例えば１，０００ｇで５分間遠心してガラスビーズおよび未破砕の菌体を沈殿させる。上清を別のチューブにとり、遠心例えば１３，０００ｇで２０分間遠心することによりオルガネラを含む膜画分（Ｔｏｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を沈殿させる。必要ならば、更に沈殿を１ｍｌの適当なａｓｓａｙ用のバッファーに懸濁し、遠心例えば１，０００ｇで１分間遠心することにより懸濁されなかった部分を取り除き、上清を遠心例えば１３，０００ｇで２０分間遠心して沈殿を適当なａｓｓａｙ用のバッファーに再懸濁し膜画分とする。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の真菌の膜画分調製は、Ｓ．ｐｏｍｂｅについてはＹｏｋｏ−ｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７：６３０−６３７（１９９８）に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓについてはＳｅｎｔａｎｄｒｅｕ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：２８２−２８９，１９９８に、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓについてはＭｏｕｙｎａ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１４８８２−１４８８９，２０００に、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓについてはＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１：４４４−４５３，１９９９に記載の方法により行うことができる。
別法としてＧＷＴ１蛋白は、真菌以外の細胞、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、大腸菌等で発現させ、調製することができる。
哺乳類細胞では、例えばＣＭＶプロモーターを持つ過剰発現用ベクターにつないだＧＷＴ１を哺乳類細胞に導入し、Ｐｅｔａｊａ−Ｒｅｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：４４１６−２３，２００１に記載の方法により膜画分を調製することができる。
昆虫細胞では、例えばＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のバキュロウイルス発現キットを用いてＧＷＴ１発現昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）を作製し、ここからＯｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：７４２−７５１，２００１に記載の方法により膜画分を調製することができる。
大腸菌では、例えばｐＧＥＸ（Ｐｆｉｚｅｒ社製）の大腸菌発現用ベクターにＧＷＴ１をつなぎ、ＢＬ２１などの大腸菌に導入しＧＷＴ１蛋白を調製することができる。
２．アシル基転移活性の測定方法
ＧＰＩにアシル基を転移する反応の検出は、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｏｒｌｅａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：８５９９−８６０３；またはＦｒａｎｚｏｔ  ａｎｄ  Ｄｏｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９９）３４０：２５−３２に報告されている方法により可能である。以下に具体的な方法の例を挙げるが、以下の実験条件は使用するＧＷＴ１遺伝子産物に合わせて最適化することが好ましい。
適当な金属イオン（Ｍｇ、Ｍｎ）、ＡＴＰ、Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、及び好ましくはＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃが他の反応に使われるのを阻害する阻害剤、例えばキチンの合成阻害剤としてｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ  Ｚ、アスパラギン結合型糖鎖の合成阻害剤としてｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎを含むバッファーに、１で調製したＧＷＴ１遺伝子産物、好ましくはＧＷＴ１遺伝子産物を含む膜画分を加え、更に被検化合物を加えて適当な温度で適当な時間（例えば２４℃で１５分間）保温する。
その後、適当に標識した、好ましくは放射性同位元素で標識したＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩの前駆体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、Ａｃｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ、好ましくはＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃを加えて、更に適当な時間（例えば２４℃で１時間）保温する。クロロホルム：メタノール（１：２）を添加し攪拌して反応を止め脂質を抽出する。抽出した反応産物を適当な溶媒、好ましくはブタノールに溶解し、ＨＰＬＣ・薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等の方法、好ましくはＴＬＣにより、反応で生成したＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを分離する。ＴＬＣで展開する場合、展開溶媒は例えばＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ（６５：２５：４）、ＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（１０：１０：３）、ＣＨＣｌ３／ｐｙｒｉｄｉｎｅ／ＨＣＯＯＨ（３５：３０：７）等適宜選択することができるが、好ましくはＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（１０：１０：３）により展開する。分離したＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩを、標識に対応した方法、放射性同位元素で標識したのであれば、分離したＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩの放射活性により定量する。
被検化合物が存在する場合に、生成するＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩが減少すれば、被検化合物にＧＷＴ１蛋白によるアシル基転移を抑制する活性があると判断される。
このようなアシル基転移を抑制する活性が検出された被検試料は、さらに、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否か、または、真菌の増殖を抑制するか否かを検定することが好ましい。この検定の結果、被検試料が、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害、ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害、または、真菌の増殖を阻害した場合には、該試料は抗真菌剤の有力な候補となる。
被検試料が、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、あるいはＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否かは、（１）．レポータ酵素を用いる方法、（２）．真菌細胞壁の表層糖蛋白質と反応する抗体を用いる方法、（３）．動物細胞に対する付着能により検定する方法、（４）．真菌を光学顕微鏡あるいは電子顕微鏡で観察する方法により検定できる。
（１）〜（４）の方法はＷＯ  ０２／０４６２６の発明の開示に示されており、実施例に具体的に開示されている。（１）〜（４）の方法により、好ましくは（１）〜（４）の方法を組み合わせて用いることにより、被検試料がＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害する、あるいはＧＰＩアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害すると判断され、しかも本件発明に記載のＤＮＡがコードする蛋白質を、真菌に過剰発現させることにより、その阻害の程度が減弱する、あるいは阻害が見られなくなる場合に、被検試料は、ＧＰＩアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程に影響を与えたと判断される。
また被検試料が真菌の増殖を抑制するか否かは、通常の抗真菌活性を測定する方法により検定できる（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ．１９９２．Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｙｅａｓｔｓ．Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍ２７−Ｐ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，Ｐａ．）。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＧＰＩの生合成経路を示した図である。
図２は、野生株（ＷＴ）、ＧＷＴ１遺伝子を破壊したΔｇｗｔ１株（Δ）、Δｇｗｔ１株にＧＷＴ１遺伝子を導入した株（Δ／Ｇ）から調製した膜画分について、ＧＰＩアシル化反応を測定した結果を示す写真である。
図３は、ＧＷＴ１遺伝子を開示しているＷＯ０２／０４６２６の表１に記載の、実施例Ｂ２の化合物（１−（４−ブチルベンジル）イソキノリン、）及び、実施例Ｂ６０の化合物（Ｎ−（３−（４−（１−イソキノリルメチル）フェニル）−２−プロピニル）アセトアミド）のアシル化ＧＩＰ検出系におけるＧＰＩアシル化反応の阻害活性を測定した結果を示す写真である。
図４は、ＧＷＴ１遺伝子を開示しているＷＯ０２／０４６２６の表１に記載の、実施例Ｂ７３の化合物（Ｎ−（３−（４−（１−イソキノリルメチル）フェニル）プロピル）−Ｎ−メチルアセトアミド、）及び、実施例Ｂ８５の化合物（５−ブチル−２−（１−イソキノリルメチル）フェノール）のアシル化ＧＩＰ検出系におけるＧＰＩアシル化反応の阻害活性を測定した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。
［実施例１］ＧＷＴ１蛋白を発現した膜画分の調製
（１）．ＧＷＴ１発現プラスミドの作製
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで働く発現ベクターを作製するため、ＹＥｐ３５２のマルチクローニングサイトにｐＫＴ１０（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：４３０３−４３１３，１９９０）由来のＧＡＰＤＨプロモーターおよびＧＡＰＤＨターミネーターを挿入し、更にマルチクローニングサイトをｐＵＣ１８マルチクローニングサイトに置き換えてＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩを作製した。またＧＷＴ１遺伝子の挿入を容易にするため、マルチクローニングサイトに存在するＳａｌＩサイトをＣｌａＩサイトに変換したＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩＣｌａＩΔＳａｌを作製した。
配列番号１に記載の塩基配列を含むＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＷＴ１遺伝子を配列番号１５に記載のプライマーおよび配列番号１６に記載のプライマーを用いて増幅し、ＹＥｐ３５２ＧＡＰＩＩＣｌａＩΔＳａｌベクターのマルチクローニングサイトに挿入してＧＷＴ１過剰発現プラスミドを作製した。
（２）．ＧＷＴ１遺伝子を欠失したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Δｇｗｔ１株の作製
Ｓ．ｐｏｍｂｅのｈｉｓ５遺伝子（Ｌｏｎｇｔｉｎｅ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ，Ｙｅａｓｔ，１４：９５３−９６１，１９９８）を鋳型とし、配列番号１７及び配列番号１８をプライマーとして、両端にＧＷＴ１配列を含むｈｉｓ５カセットをＰＣＲで増幅した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを培養・集菌し、上述のＰＣＲ産物で形質転換した。ＳＤ（Ｈｉｓ−）培地で３０℃、５〜７日間培養することによりＧＷＴ１遺伝子を欠失したΔｇｗｔ１株を得た。
（３）ＧＷＴ１発現細胞の作製
Δｇｗｔ１株を、ＹＰＤ培地（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ−Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ−Ｄｅｘｔｒｏｓｅ培地）にて、３０℃で振とう培養し、対数増殖後期の時点で集菌した。洗浄後、酢酸リチウム法（ＹＥＡＳＴ  ＭＡＫＥＲＴＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製））によりＧＷＴ１発現プラスミドをΔｇｗｔ１株に導入した。ＳＤ（ｕｒａ−）培地で３０℃、２日間培養することによりＧＷＴ１遺伝子を過剰発現させたΔｇｗｔ１株を得た。
（４）膜画分の調製
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ野生株、ＧＷＴ１遺伝子を欠失したΔｇｗｔ１株、あるいはΔｇｗｔ１株にＧＷＴ１過剰発現プラスミドを導入した株を、１００ｍｌのＹＰＤ培地にて２４℃で振とう培養し、対数増殖中期（ＯＤ６００＝１〜３）の時点で集菌した。菌体をＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で洗浄した後、２ｍｌのＴＭ  ｂｕｆｆｅｒ＋ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ（Ｒｏｃｈｅ社製）１ｔａｂｌｅｔ／２５ｍｌ）にて懸濁し、１．５ｍｌのガラスビーズを加えた。これを３０秒間ボルテックスして３０秒間氷上に置く操作を１０回繰り返すことにより菌体を破砕した。菌体破砕液を新しいチューブに移し、４℃で１０００ｇ、５分間遠心してガラスビーズおよび未破砕の菌体を沈殿させた。上清を別のチューブにとり、４℃で１３，０００ｇ，２０分間遠心することによりオルガネラを含む膜画分（Ｔｏｔａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を沈殿させ、膜画分とした。
（５）アシル化されたＧＰＩの検出
ＧＰＩ生合成反応は、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＩ）が脱アセチル化されることによりＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧｌｃＮ−ＰＩ）を生じ、これにアシル基が付加することによりＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ−ａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＧｌｃＮ−（ａｅｙｌ）ＰＩ）へと進むことが知られている（図１）。そこで、Ｇｗｔ１タンパク質がこのアシル基転移反応に関わっているかを以下の方法によって調べた。
調製した膜画分（３００μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭ  ＡＴＰ，１ｍＭ  Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ，２１μｇ／ｍｌ  ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ，１０μＭ  ｎｉｋｋｏｍｙｃｉｎ  Ｚ，０．５ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌに対して希釈し全量を１４０μｌに合わせ、反応液とした。これを２４℃で１５分保温した後、１５μＣｉのＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＮＡｃをチューブに添加した。２４℃にて１時間保温した後、１ｍｌのクロロホルム：メタノール（１：２）を添加し攪拌することにより反応を止めて、脂質を抽出した。乾燥させた脂質をブタノール抽出により脱塩し、薄層クロマトグラフィー（ＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ／１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ（１０：１０：３））により、アシル化されたＧＰＩ（ＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩ）、アシル化されていないＧＰＩ（ＧｌｃＮ−ＰＩ）、アシル化も脱アセチル化もされていないＧＰＩ（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＩ）を分離し、オートラジオグラフィーにより各スポットを検出した。
その結果、図２に示すように、野生株ではアシル化されたＧＰＩのスポットが検出されたのに対し、ＧＷＴ１遺伝子を破壊した株（Δｇｗｔ１）ではアシル化ＧＰＩのスポットは全く検出されなかった。また、Δｇｗｔ１株にＧＷＴ１遺伝子を導入した株では、アシル化ＧＰＩのスポットが検出され、アシル化能が回復していた。以上のことより、Ｇｗｔ１タンパク質がＧＰＩへのアシル基転移反応を触媒する酵素であることが示された。
以上の結果より、本ＧＰＩ合成酵素活性測定系にＧＷＴ１遺伝子産物の活性を阻害活性を有する化合物が含まれていれば、アシル化したＧｌｃＮ−（ａｃｙｌ）ＰＩのスポットの強度が減弱あるいは消失すると考えられ、ＧｌｃＮ−（ａｅｙｌ）ＰＩのスポットの強度を指標としてＧＷＴ１遺伝子産物の酵素活性を阻害する化合物、更には真菌の細胞壁合成を阻害する化合物をスクリーニングすることが可能であると考えられた。
（６）アシル化反応を阻害する化合物のスクリーニング
ＧＷＴ１遺伝子を開示しているＷＯ０２／０４６２６において、ＧＷＴ１遺伝子産物の活性を反映したレポータ系での化合物の抑制活性を示した表１に記載の、実施例Ｂ２、実施例Ｂ６０、実施例Ｂ７３、実施例Ｂ８５に記載の化合物について、これらの化合物を（５）に記載のアシル化ＧＩＰ検出系に添加して、ＧＰＩアシル化反応を阻害する活性を測定した。これら化合物の構造は以下に記載する通りである。
実施例Ｂ２に記載の化合物：１−（４−ブチルベンジル）イソキノリン
2004048604.tif 000003
実施例Ｂ６０に記載の化合物：Ｎ−（３−（４−（１−イソキノリルメチル）フェニル）−２−プロピニル）アセトアミド
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実施例Ｂ７３に記載の化合物：Ｎ−（３−（４−（１−イソキノリルメチル）フェニル）プロピル）−Ｎ−メチルアセトアミド
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実施例Ｂ８５に記載の化合物：５−ブチル−２−（１−イソキノリルメチル）フェノール
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結果を図３及び図４に示した。ＷＯ０２／０４６２６表１の中で、１μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で阻害活性を表している実施例Ｂ２及び実施例Ｂ８５に記載の化合物では、用量依存的なアシル化ＧＰＩのスポット強度の減少が見られるのに対し、ＩＣ５０が５０μｇ／ｍｌの実施例Ｂ７３の化合物では、スポット強度の減少が見られなかった。
この結果から、本ＧＰＩアシル化反応の測定系を用いることにより、ＧＷＴ１遺伝子産物の酵素活性阻害する化合物をスクリーニングすることが可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用の可能性】
ＧＰＩアンカー蛋白質の真菌細胞壁への輸送を阻害する化合物が、簡単なアシル基転移活性測定によりスクリーニング可能となった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004048604.tif 000082
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月7日(2005.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、
（１）過剰発現させたGWT1遺伝子にコードされる蛋白質と、被検試料とを接触させる工程、
（２）GlcN-(acyl)PIを検出する工程、
（３）GlcN-(acyl)PIを減少させる被検試料を選択する工程、を含む方法。
【請求項２】
GWT1遺伝子が下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列を含むDNA
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１２または１３に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA
（ｄ）配列番号：２、４、６、８、１０または１４記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNA、
である請求項１に記載の抗真菌作用を有する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
アシル化されたGPIを検出する工程が薄層クロマトグラフィーである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、（４）選択された被検試料が、GPIアンカー蛋白質の細胞壁への輸送過程を阻害するか否か、GPIアンカー蛋白質の真菌表層への発現を阻害するか否か、または、真菌の増殖を抑制するか否かを検定する工程、を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2004048604.tif 000083
2004048604.tif 000084