(57)【要約】  エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、（Ａ）電極の表面に核酸を担持させる工程；（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程、からなる方法。本方法により、接着性細胞に障害を与えることなく、遺伝子を効率よく細胞に導入できるとともに、望ましい時期に望ましい位置で遺伝子を導入できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面に核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法。
【請求項２】
エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（ａ）カチオン性表面電極基板を提供する工程；
（ｂ）該カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させる工程； 
（ｃ）工程（ｂ）で得られた核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる工程；および
（ｄ）該細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法。
【請求項３】
カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】
カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物またはシラン処理剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】
カチオン性表面電極基板が、透明電極基板の表面にカチオン性高分子を吸着させてなるカチオン性表面電極基板である請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項６】
工程（ｂ）を、カチオン性表面電極基板の表面に直接核酸を１回だけ吸着させるか、あるいは該表面に核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層させることにより行う請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項７】
電極基板が、白金、金およびアルミニウムから選ばれる金属の電極基板である請求の範囲第３項または第４項記載の方法。
【請求項８】
電極基板が、金電極基板である請求の範囲第３項または第４項記載の方法。
【請求項９】
金電極基板が、金蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
透明電極基板が、インジウム−スズ酸化物、酸化インジウム、アルミニウムをドープした酸化亜鉛、アンチモンをドープした酸化スズを蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項１１】
透明電極基板が、インジウム−スズ酸化物を蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項１２】
末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物が、式（１）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、Ｒ１はアニオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基およびホスホン酸基から選ばれる基である請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１４】
式（１）で示されるチオール化合物が、１１−メルカプトウンデカン酸、８−メルカプトオクタン酸および１５−メルカプトヘキサデカン酸から選ばれるメルカプトアルカン酸である請求の範囲第１２項記載の方法。
【請求項１５】
カチオン性高分子が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、アミノアセタール化ポリビニルアルコール、１〜４級アミンを側鎖末端に持つアクリル系またはメタクリル系ポリマー、酸処理ゼラチン、プロタミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、キトサン、ＤＥＡE−セルロース、ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリアミドアミンデンドリマーから選ばれる高分子である請求の範囲第３項、第４項または第５項記載の方法。
【請求項１６】
末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物が、式（２）：
Ｒ２（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （２）
（式中、Ｒ２はカチオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物である請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ２がアミノ基である請求の範囲第１６項記載の方法。
【請求項１８】
核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡまたはそれらの発現ベクターである請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項１９】
核酸がタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部である請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項２０】
工程（Ｂ）を、核酸担持電極の表面で細胞を培養することにより行う請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）を、核酸担持電極基板の表面で細胞を培養することにより行う請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２２】
工程（Ｃ）を、細胞を介して電極基板に対峙して反対電極を設け、両電極間に電気パルスを発生させることにより行う請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）を、細胞を介して電極基板に対峙して反対電極を設け、両電極間に電気パルスを発生させることにより行う請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２４】
カチオン性表面電極基板が、ミクロパターン化表面をもつ基板である請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項２５】
電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板。
【請求項２６】
ガラス基板上に金蒸着した金電極基板の表面に、式（１）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、Ｒ１はアニオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物の単分子膜が形成されており、該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸導入方法に関し、さらに詳しくは、エレクトロポレーション法により核酸を細胞に導入する方法に関する
【背景技術】
【０００２】
細胞への遺伝子導入方法は、遺伝子の機能や遺伝子にコードされているタンパク質の性質を解明したり、組み換えタンパク質を多量に生産する場合に利用されている。また、細胞への遺伝子導入法は、目的の酵素やサイトカインの遺伝子を患者の細胞内に導入し、その遺伝子により体内に目的とする物質を生産させて疾患の治療を行う場合にも利用されている。【０００３】
ヒトゲノムのＤＮＡ塩基配列の解読がほぼ終了し多くの機能未知の遺伝子の存在が予測され、今後、これらの新規ヒト遺伝子の機能解析が研究の大きなターゲットとなるが、数万種類に及ぶ遺伝子の機能解析を行うには、網羅的かつ高速に遺伝子の過剰発現やノックアウトできる手法が必要である。【０００４】
細胞内に遺伝子を導入する技術としては、生物学的手段、すなわちアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス由来のウイルスベクターを利用する導入方法と、リポフェクション法（リポソーム法）、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの物理的手段を用いる導入方法とに大別される。【０００５】
これらのうち、ウイルスベクターを利用する方法は、遺伝子導入効率は高いが、ウイルスベクターの作製が煩雑である、安全性に問題があるなどの難点がある。リポフェクション法は、安全性は高いが、ウイルスを利用する方法に較べて、遺伝子導入効率が低い、細胞毒性が強いなどの難点がある。【０００６】
マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの直接導入法は、細胞の障害が大きく、効率よく遺伝子を導入するための最適化条件の検討が煩雑であり、また技術的操作に関しても特殊な技能や装置が必要であるなどの難点がある。【０００７】
また、従来のエレクトロポレーション法は、遺伝子と細胞とを懸濁させた媒体を平行板などの電極間に配置し、両電極間に電気パルスを印加して細胞の細胞膜に小孔を生じさせ、それが修復される前に細胞外の遺伝子を細胞内に取り込ませる方法がとられていた（非特許文献１、２）。この方法は、遺伝子導入効率は高いものの、細胞の障害が大きい、遺伝子導入する時期や場所を自由に選択し難いなどの難点がある。【０００８】
さらに、近年、遺伝子の機能を高速に解析するため、発現プラスミドをプリントしたガラス基板上で細胞を培養し、細胞に遺伝子をリポフェクション法により導入するトランスフェクショナルアレイが開発された（非特許文献３）。この方法は、トランスフェクションにリポフェクション法を用いるものであるため、リポフェクション法に起因する前記した難点が依然として存在している。【０００９】
一方、核酸やタンパク質などの生体分子を、その活性を維持した状態で基材表面に固定化する方法として交互吸着法が報告されている（非特許文献４）。この方法は、基板上に電荷の異なる高分子を交互に吸着させ、静電的な相互作用（ポリイオンコンプレックス形成）により、逐次的に高分子薄膜を積層する方法であるが、遺伝子導入法に適用された例は報告されていない。
【非特許文献１】ＥＭＢＯ ジャーナル、１９８２年、第１巻、８４１〜８４５頁
【非特許文献２】バイオエレクトロケミストリー  アンド  バイオエネルゲティクス（Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．）  １９９９年、第４８巻、３〜１６頁
【非特許文献３】ネイチャー、２００１年、第４１１巻、１０７〜１１０頁
【非特許文献４】バイオセンサーズ  アンド  バイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、１９９４年、第９巻、６７７〜６８４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、従来のエレクトロポレーション法の問題を解決した遺伝子導入方法を提供するものであり、より具体的には、細胞に障害を与えることなく、遺伝子を効率よく細胞に導入するとともに、望ましい時間に細胞集団内の望ましい位置で遺伝子導入を実施し得る方法を提供するものである。また、本発明の他の目的は、細胞の顕微鏡観察において良好な観察環境を提供できる電極基板を用いて、上記のような遺伝子導入を実施し得る方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、従来のエレクトロポレーション法による遺伝子導入方法を改良すべく種々研究を重ねた結果、電極の表面に核酸を担持させ、得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させ、ついで接着した細胞に電気パルスを印加すれば、細胞にさほど障害を与えることなく、効率よく遺伝子を細胞に導入し得るとともに、所望の時期にかつ所望の位置でエレクトロポレーションを実施し得ることを見出した。また、本発明者らはさらに研究を重ねた結果、電極として透明半導体電極を用いれば、細胞の顕微鏡観察が良好に実施し得ることを見出した。本発明者らは、上記のような知見に基づいて、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面に核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法、
（２）  エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（ａ）カチオン性表面電極基板を提供する工程；
（ｂ）該カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させる工程； 
（ｃ）工程（ｂ）で得られた核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる工程；および
（ｄ）該細胞に電気パルスを印加する工程；
からなる方法、
（３）  カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板である前記（２）記載の方法、
（４）  カチオン性表面電極基板が、電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物またはシラン処理剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着させてなるカチオン性表面電極基板である前記（２）記載の方法、
（５）  カチオン性表面電極基板が、透明電極基板の表面にカチオン性高分子を吸着させてなるカチオン性表面電極基板である前記（２）記載の方法、
（６）  工程（ｂ）を、カチオン性表面電極基板の表面に直接核酸を１回だけ吸着させるか、あるいは該表面に核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層させることにより行う前記（２）記載の方法、
（７）  電極基板が、白金、金およびアルミニウムから選ばれる金属の電極基板である前記（３）または（４）記載の方法、
（８）  電極基板が、金電極基板である前記（３）または（４）記載の方法、
（９）  金電極基板が、金蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である前記（８）記載の方法、
（１０）  透明電極基板が、インジウム−スズ酸化物、酸化インジウム、アルミニウムをドープした酸化亜鉛、アンチモンをドープした酸化スズを蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である前記（５）記載の方法、
（１１）  透明電極基板が、インジウム−スズ酸化物を蒸着したガラス基板もしくは透明プラスチック基板である前記（５）記載の方法、
（１２）  末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物が、式（１）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、Ｒ１はアニオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物である前記（３）記載の方法、
（１３）  Ｒ１がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基およびホスホン酸基から選ばれる基である前記（１２）記載の方法、
（１４）  式（１）で示されるチオール化合物が、１１−メルカプトウンデカン酸、８−メルカプトオクタン酸および１５−メルカプトヘキサデカン酸から選ばれるメルカプトアルカン酸である前記（１２）記載の方法、
（１５）  カチオン性高分子が、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、アミノアセタール化ポリビニルアルコール、１〜４級アミンを側鎖末端に持つアクリル系またはメタクリル系ポリマー、酸処理ゼラチン、プロタミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、キトサン、ＤＥＡE−セルロース、ＤＥＡＥ−デキストランおよびポリアミドアミンデンドリマーから選ばれる高分子である前記（３）、（４）または（５）記載の方法、
（１６）  末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物が、式（２）：
Ｒ２（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （２）
（式中、Ｒ２はカチオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物である前記（４）記載の方法、
（１７）  Ｒ２がアミノ基である前記（１６）記載の方法、
（１８）  核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡまたはそれらの発現ベクターである前記（１）または（２）記載の方法、
（１９）  核酸がタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部である前記（１）または（２）記載の方法、
（２０）  工程（B）を、核酸担持電極の表面で細胞を培養することにより行う前記（１）記載の方法、
（２１）  工程（ｃ）を、核酸担持電極基板の表面で細胞を培養することにより行う前記（２）記載の方法、
（２２）  工程（Ｃ）を、細胞を介して電極基板に対峙して反対電極を設け、両電極間に電気パルスを発生させることにより行う前記（１）記載の方法、
（２３）  工程（ｄ）を、細胞を介して電極基板に対峙して反対電極を設け、両電極間に電気パルスを発生させることにより行う前記（２）記載の方法、および
（２４）  カチオン性表面電極基板が、ミクロパターン化表面をもつ基板である前記（２）記載の方法、
である。【００１３】
また、本発明は、
（２５）  電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、および
（２６）  ガラス基板上に金蒸着した金電極基板の表面に、式（１）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、Ｒ１はアニオン性官能基を表し、ｎは１〜４０の整数を表す。）
で示されるチオール化合物の単分子膜が形成されており、該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、
である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞に障害を与えることなく、核酸を効率よく細胞に導入することができるとともに、望ましい時期に電極上の望ましい位置で細胞に導入することができる、エレクトロポレーション法による核酸導入方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】接着細胞への遺伝子導入を行うための核酸担持金電極基板ならびに該基板への電気パルス負荷システムの配置図である。
【図２】電気パルス（電場強度７５Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数1回）を印加してから４８時間後のＨＥＫ２９３細胞の位相差顕微鏡写真（Ａ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ）である。  スケールバー  ２００μｍ
【図３】遺伝子導入効率に対する電場強度の効果を示す棒グラフである。
【図４】細胞生存率と電場強度の関係の示す線図である。
【図５】遺伝子導入効率に対するポリエチレンイミン、ポリアリルアミンの分子量の効果を示す線図である。
【図６】各種カチオン表面におけるＤＮＡの担持量を示す線図である。
【図７】各種カチオン表面におけるパルス後のDNA遊離量を示す線図である。
【図８】遺伝子導入効率とＤＮＡ遊離量の関係を示す相関図である。
【図９】電気パルスを印加するまでの細胞培養期間を変化させたときの、電気パルス印加４８時間後の蛍光顕微鏡像（Ａ，Ｂ，Ｃ）である。
【図１０】電気パルスを印加するまでの細胞培養期間を変化させたときの、遺伝子導入効率を示す線図である。
【図１１】初代神経培養細胞に遺伝子（ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄ混合物）を導入したときの、電気パルス負荷から４８時間後の位相差顕微鏡像（左）および蛍光顕微鏡像（中、右）である。上段および下段の写真は、同一の条件下で遺伝子導入を行ったときの異なる視野における観察像である。
【図１２】異なる遺伝子（ｐＥＧＦＰまたはｐＤｓＲｅｄ）を、場所を限定してＨＥＫ２９３細胞に導入したときの、電気パルス負荷から４８時間後の明視野顕微鏡像（左）および蛍光顕微鏡像（右）である。
【図１３】積層数の異なる表面のＡＴＲ−赤外吸収スペクトルを示す線図である。
【図１４】積層数とリン酸基に由来する２つのピーク面積との関係を示す線図である。
【図１５】積層数と表面の水接触角の関係を示す線図である。
【図１６】電気パルス（電場強度２５０Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を印加してから４８時間後のＨＥＫ２９３細胞の位相差顕微鏡写真（Ａ）および蛍光顕微鏡写真（Ｂ）である。
【図１７】遺伝子導入効率と細胞生存率に対する電場強度の効果を示す線図である。
【図１８】遺伝子導入効率と細胞生存率に対する積層数の効果を示す線図である。
【図１９】積層数の異なる表面におけるＤＮＡの担持量を示す線図である。
【図２０】遺伝子導入効率とＤＮＡ遊離量の関係を示す相関図である。
【図２１】初代神経培養細胞に遺伝子（ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄ混合物）を導入したときの、電気パルス負荷から４８時間後の位相差顕微鏡像（左）および蛍光顕微鏡像（中、右）である。上段および下段の写真は、同一の条件下で遺伝子導入を行ったときの異なる視野における観察像である。
【図２２】異なる遺伝子（ｐＥＧＦＰ、ｐＤｓＲｅｄもしくは両者の混合物）を、場所を限定してＨＥＫ２９３細胞に導入したときの、電気パルス負荷から４８時間後の蛍光顕微鏡像である。
【符号の説明】
【００１６】
図１における記号の意味は次の通りである。
Ａ  エレクトロポレーター
Ｂ  エレクトロポレーションバッファー
Ｃ  細胞
Ｄ  核酸−カチオン性高分子複合層
Ｅ  金薄膜電極（陰極）
Ｆ  金電極（陽極）
Ｇ  シリコーンスペーサ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の一側面は、エレクトロポレーション法により細胞に核酸を導入する方法であって、
（Ａ）電極の表面に核酸を担持させる工程；
（Ｂ）得られた核酸担持電極の表面に細胞を接着させる工程；および
（Ｃ）接着した細胞に電気パルスを印加する工程
からなる方法である。【００１８】
以下、前記各工程について順次説明する。
工程（Ａ）：
電極に核酸を担持させるには、たとえば、
（Ａ１）カチオン性表面電極基板を提供し、ついで該カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着させる方法、
（Ａ２）カチオン性表面電極基板を提供し、ついで該カチオン性表面電極基板の表面に核酸とカチオン性高分子とを交互に吸着させて、カチオン性高分子−核酸−カチオン性高分子−核酸のように多層を形成させる方法、
などを採用することができる。【００１９】
（カチオン性表面電極基板の提供）
前記カチオン性表面電極基板は、電極基板の表面がプラスに荷電したものであればよく、その様なものとしては、たとえば
（ａ１）電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜が形成されており、かつ、該単分子膜の表面にカチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面電極基板、
（ａ２）電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有する、チオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物またはシラン処理剤の単分子膜が形成されており、かつ該単分子膜の表面にアニオン性高分子が吸着され、さらにその表面にカチオン性高分子が吸着させてなるカチオン性表面金属基板、
（ａ３）電極基板の表面に、カチオン性高分子が吸着されてなるカチオン性表面金属基板、
などがあげられる。【００２０】
前記（ａ１）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、１）電極基板の表面に、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物の単分子膜を形成させ、ついで２）該単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸着させることにより製造できる。【００２１】
また、前記（ａ２）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、１）電極基板の表面に、末端にカチオン性官能基を有する、チオール化合物、ジスルフィド化合物もしくはスルフィド化合物またはシラン処理剤の単分子膜を形成させ、２）該単分子膜の表面にアニオン性高分子を吸着させ、ついで３）該アニオン性高分子の表面にカチオン性高分子を吸着させることにより製造できる。
さらに、前記（ａ３）のカチオン性表面電極基板は、たとえば、電極基板の表面にカチオン性高分子を吸着させることにより製造できる。【００２２】
電極基板における「基板」は、電極を支持するプレート、チップ(マイクロチップを含む)、アレイなどであり、それらを構成する基材は、電極を支持し得る絶縁性のものであればとくに制限がなく、たとえば、ガラス、マイカ、石英、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などの無機絶縁材料、あるいはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機絶縁材料を用いることができる。【００２３】
これらのうち、とくに前記（ａ１）および（ａ２）のカチオン性表面電極基板における「基板」の基材は、ガラス、マイカ、石英、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などの無機絶縁材料または透明プラスチックが好ましい。また、前記（ａ３）のカチオン性表面電極基板における「基板」の基材は、ガラスまたは透明プラスチックが好ましく、ガラスが特に好ましい。上記透明プラスチックは、自家蛍光のない透明な高分子材料であれば特に限定されず、公知のものであってよい。このような透明プラスチックとしては、例えば、上記した有機絶縁材料などが挙げられるが、中でも好ましくはポリエチレンテレフタレートである。【００２４】
一方、電極基板における「電極」は、エレクトロポレーション法における電極になりうるものであればとくに制限がなく、白金、金、アルミニウムなどの金属からなる電極が好適にあげられる。また、細胞の顕微鏡観察を容易にするために透明電極も好適にあげられる。このような透明電極としては、インジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ：Ｉｎ２Ｏ３−ＳｎＯ３）、酸化インジウム（Ｉｎ２Ｏ３）、アルミニウムをドープした酸化亜鉛（ＺｎＯ）、アンチモンをドープした酸化スズ（ＳｎＯ３）などが好適にあげられ、特にインジウム−スズ酸化物が好ましい。【００２５】
上記「基板」と「電極」とからなる電極基板の好ましい例は、ガラス基板、プラスチック基板もしくはマイカ基板の片面に、白金、金、アルミニウムなどの金属の電極あるいは透明電極を設けたものがあげられ、前者のより好ましい例としては、ガラス基板、マイカ基板または透明プラスチック基板の片面に金の電極を設けたものがあげられ、後者のより好ましい例として、ガラス基板、透明プラスチック基板などの透明基板の片面にインジウム−スズ酸化物の透明電極を設けたものが挙げられる。【００２６】
基板の片面に電極を設けるには、公知の方法に従って行えばよく、たとえば上記金属を無機絶縁基板上に加熱または／および加圧などして合体させるなどの公知の手段を用いる方法があげられる。また、前記方法以外に、真空蒸着法、スパッタリング法、イオン注入法、メッキ法などもあげられる。【００２７】
電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物としては、たとえば、下記一般式（１）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （１）
（式中、記号は前記と同一意味を有する）
で示されるチオール化合物があげられる。化合物（１）の好ましい例としては、アニオン性官能基であるＲ１がカルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基であり、ｎが１〜４０、好ましくは７〜１８のものがあげられる。【００２８】
また、チオール化合物（１）の代わりに、下記一般式（１Ａ）または（１Ｂ）：
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１  （１Ａ）
Ｒ１（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１      （１Ｂ）
（上記式中、Ｒ１およびｎは前記と同一意味を有し、ｍは１〜４０の整数を表す）
で示されるジスルフィド化合物またはスルフィド化合物を用いることもできる。該ジスルフィド化合物またはスルフィド化合物は対称型であっても、非対称型であってもよいが、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。【００２９】
好ましい化合物（１）またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物の具体例としては、たとえば、１１−メルカプトウンデカン酸、８−メルカプトオクタン酸、１５−メルカプトヘキサデカン酸、１０−カルボキシデシルジスルフィドなどがあげられる。【００３０】
また、電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物としては、たとえば、下記一般式（２）：
Ｒ２（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ  （２）
（式中、Ｒ２はカチオン性官能基を表し、ｎは前記と同一意味を有する）
で示されるチオール化合物があげられる。Ｒ２で示されるカチオン性官能基としては、たとえばアミノ基があげられ、ｎとしては、１〜４０、好ましくは７〜１８の整数があげられる。【００３１】
また、チオール化合物（２）の代わりに、下記一般式（２Ａ）または（２Ｂ）：
Ｒ２（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ２  （２Ａ）
Ｒ２（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ２      （２Ｂ）
（上記式中、Ｒ２およびｎは前記と同一意味を有し、ｍは１〜４０の整数を表す）
で示されるジスルフィド化合物またはスルフィド化合物を用いることもできる。該ジスルフィド化合物またはスルフィド化合物は対称型であっても、非対称型であってもよいが、対称型のもののほうが、均一な単分子膜が形成される意味で好ましい。
好ましい化合物（２）またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物の具体例としては、たとえば、１１−アミノ−１−ウンデカンチオールなどが好適にあげられる。【００３２】
電極基板の表面に単分子膜を形成させるのに用いる、末端にカチオン性官能基を有するシラン処理剤としては、たとえば、下記一般式（３）
Ｒ２（ＣＨ２）ｐ−Ｓｉ（ＯＲ）３      （３）
(式中、Ｒ２は前記と同一意味を有し、ｐは1〜４０の整数、ＯＲはアルコキシ基を表す)
で示されるシラン化合物があげられる。Ｒ２で示されるカチオン性官能基としては、たとえばアミノ基があげられ、ｐとしては、１〜４０、好ましくは７〜１８の整数があげられ、ＯＲとしては、炭素数が１〜６、好ましくは１〜３の低級アルコキシ基があげられる。【００３３】
電極基板の表面に単分子膜を形成させるには、常法にしたがって行えばよく、たとえば、電極基板をチオール化合物（式１または２）またはそのジスルフィド化合物（式１Ａまたは２Ａ）もしくはスルフィド化合物（式１Ｂまたは２Ｂ）あるいはシラン処理剤（３）の溶液に浸漬することにより実施することができる。これにより、電極基板上に高密度、高配向性な単分子膜が形成される。【００３４】
チオール化合物として、末端にアニオン性官能基を有するチオール化合物（１）またはそのジスルフィドもしくはスルフィド化合物（１Ａもしくは１Ｂ）を用いた場合には、これら化合物の単分子膜の表面に、カチオン性高分子を吸着させることにより、前記（ａ１）のカチオン性表面電極基板が得られる。【００３５】
ここで使用される「カチオン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜と電気的結合（たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するカチオン性の高分子であればよく、たとえば、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリビニルピリジン、アミノアセタール化ポリビニルアルコール、１〜４級アミンを側鎖末端にもつアクリル系あるいはメタクリル系ポリマー（たとえば、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートなど）、酸処理ゼラチン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、プロタミン、キトサン、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアミドアミンデンドリマー（カチオニックデンドリマー）などがあげられる。これらのうち、とりわけポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンが好ましい。【００３６】
前記カチオン性高分子の平均分子量は、５００〜５，０００，０００、好ましくは６００〜１００，０００である。たとえば、ポリエチレンイミンの場合は、その平均分子量は２００〜２５，０００が好ましく、とりわけ５００〜１０，０００が好ましい。またポリアリルアミンの場合は、その平均分子量は５００〜１５０，０００、とりわけ１，０００〜７０，０００が好ましい。【００３７】
単分子膜の表面にカチオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にカチオン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面に、カチオン性高分子を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した溶液を添加し、室温で静置することにより好適に実施できる。カチオン性高分子溶液の濃度は、特に限定されないが、０．１％〜１０％であるのが好ましい。かくして、単分子膜とカチオン性高分子とがイオン結合により吸着されて、前記（ａ１）のカチオン性表面電極基板が提供される。【００３８】
一方、チオール化合物として、末端にカチオン性官能基を有するチオール化合物（２）、そのジスルフィドもしくはスルフィド化合物（２Ａもしくは２Ｂ）を用いた場合、あるいは、シラン処理剤として末端にカチオン性官能基を有するシラン処理剤（３）を用いた場合には、これら化合物の単分子膜の表面に、まずアニオン性高分子を吸着させる。【００３９】
ここで使用される「アニオン性高分子」は、電極基板の表面に形成された単分子膜と電気的結合（たとえばイオン結合）によって該単分子膜の表面に結合するアニオン性の高分子であればよく、たとえば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）のような合成高分子、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルカリ処理ゼラチンのような天然高分子があげられる。【００４０】
単分子膜の表面にアニオン性高分子を吸着させるには、該単分子膜の表面にアニオン性高分子の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば、該単分子膜の表面に、アニオン性高分子を適当な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した溶液を添加し、室温で静置することにより好適に実施できる。【００４１】
ついで、吸着したアニオン性高分子の表面に、カチオン性高分子を吸着させることにより、前記（ａ２）のカチオン性表面電極基板が得られる。ここで用いるカチオン性高分子は前記と同一のものを使用でき、吸着処理も前記と同様に実施できる。【００４２】
さらに、たとえば電極としてインジウム−スズ酸化物、酸化インジウムなどの前記透明電極を用いる場合には、電極基板の表面をカチオン性高分子で処理することにより、カチオン性高分子が電極表面に吸着した前記（ａ３）のカチオン性表面電極基板が得られる。ここで用いるカチオン性高分子も前記と同一のものが使用でき、該カチオン性高分子による処理は、電極基板の表面にカチオン性高分子の溶液を添加し、室温で静置することにより好適に実施できる。【００４３】
（カチオン性表面電極基板への核酸の担持）
前記で提供されたカチオン性表面電極基板の表面に核酸を担持させることにより、核酸担持電極基板が得られる。
本発明で使用される「核酸」は、ポリヌクレオチドであっても、オリゴヌクレオチドであってもよく、またＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡの場合、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡあるいは合成ＤＮＡであってもよい。「核酸」には、ＤＮＡ誘導体またはＲＮＡ誘導体が含まれ、該誘導体とはホスホロチオエート結合を有する核酸、または酵素による分解を避けるためにインターヌクレオチドのリン酸部分、糖部分、塩基部分に化学修飾を施した核酸を意味する。【００４４】
「核酸」には、疾患症状の治療あるいは改善効果のある生理活性を有するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ、または疾患症状の予防、治療あるいは改善効果のある免疫反応を誘導するタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡ、あるいはこれらＤＮＡの一部を含む。
「核酸」にはまた、アンチセンス核酸も包含する。「アンチセンス核酸」は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり、細胞内に導入されることにより、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖の分子を形成する。細胞は二本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸は該ｍＲＮＡの翻訳を干渉する。「核酸」には、さらにｓｉＲＮＡ（ＲＮＡ干渉を起こす短い二本鎖RNA）を包含する。さらに、「核酸」には、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡなどの発現ベクターを包含する。【００４５】
核酸がタンパク質をコードしているプラスミドＤＮＡである場合、細胞内に導入されたとき、コードする遺伝情報を細胞内で発現するように構成された形態が好ましく、プロモータ等、目的遺伝子の発現に必要な要素を含有する。また、目的遺伝子が細胞内に導入されたかどうかを確認する必要がある場合、目的遺伝子のほかにさらにレポーター遺伝子を含んだＤＮＡでもよい。【００４６】
「核酸」のサイズは特に制限されないが、一般に、１０ｂｐ〜２００ｋｂｐ、好ましくは、１５ｂｐ〜１００ｋｂｐである。【００４７】
カチオン性表面電極基板の表面に核酸を吸着、担持させるには、カチオン性表面電極基板の表面に、核酸の溶液を接触させることにより実施でき、たとえば該カチオン性表面電極基板の表面に、核酸を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した溶液を添加し、室温に放置することにより好適に実施できる。吸着しない核酸は、カチオン性表面電極基板の表面を適当な緩衝液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄することにより除去できる。かくして、核酸担持電極基板が得られる。【００４８】
なお、カチオン性表面電極基板の表面に、核酸およびカチオン性高分子を、核酸、カチオン性高分子、核酸の順序で交互吸着法により積層することによっても核酸担持電極基板が得られる。ここで交互に実施される核酸の吸着およびカチオン性高分子の吸着は、前記と同様にして実施することができる。【００４９】
工程（Ｂ）：
本工程は、上記で得られた核酸担持電極基板の表面に、細胞を接着させる工程である。
本発明で使用される「細胞」は、接着性のものであれば、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の（たとえば、細菌、酵母）または多細胞生物（たとえば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など）でもよい。たとえば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞でも用いられ、より詳細には、哺乳動物（たとえば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、肉食類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、とくにヒト由来の細胞が用いられる。ヒト由来細胞の具体例としては、たとえば、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨｅＬａ）などのヒト由来株化細胞；ヒト胎児腎臓由来細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒト大動脈平滑筋細胞、ヒト肝細胞、ヒト繊維芽細胞、ヒト角膜上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞などのヒト由来初代培養細胞；間葉系幹細胞、胚性幹細胞、神経幹細胞などのヒト由来幹細胞などがあげられる。【００５０】
核酸担持電極基板の表面に細胞を接着させる方法は、特に制限されず、たとえば、細胞の懸濁液を前記基板の上に添加するか、あるいは細胞を適当な培地に懸濁させ、得られた細胞懸濁液を前記基板上に滴下し、該細胞に適した条件下で培養することにより行うことができる。しかし、核酸を導入する細胞集団内の場所の限定および導入の効率の観点からは、核酸担持電極基板上で細胞を培養して行うのが好ましく、培養することにより細胞は増殖し、該基板の表面に接着する。接着しない細胞は、電気パルスを印加する前に除いておくのが望ましい。非接着細胞の除去は、たとえば、培地を適当な緩衝液と交換することにより行うことができる。【００５１】
工程（Ｃ）：
細胞への電気パルスの印加は、表面に細胞が接着した核酸担持電極基板の電極を一方の電極（第１電極という）とし、細胞を介して第１電極と対峙して反対電極（第２電極という）を設け、第１電極と第２電極の間で、適当なエレクトロポレーターを用いて電気パルスを発生させることにより行うことができる。この際、電気パルスは交流または直流のいずれで発生させてもよいが、一般に直流で発生させるのが好ましい。【００５２】
電気パルスを直流で発生させる場合には、核酸を担持した第１電極を陰極（−）としたときには、第２電極は陽極（＋）とする。あるいはその逆も可能である。好ましくは、第１電極を陰極（−）とし、第２電極を陽極（＋）とする。第２電極の材質は、電導性のものであればとくに限定されないが、たとえば金、白金、銅、アルミニウム、ステンレス、タングステン、チタン、コバルト−クロム合金、コバルト−クロム−モリブデン合金（バイタリウム）などの金属、あるいは透明電極材料であるＩＴＯ（インジウム−スズ酸化物）、酸化インジウムなどがあげられる。【００５３】
電気パルスの条件は、電極材料の種類、細胞の種類、導入される核酸の種類、基板上のカチオン性高分子の種類などにより、電場強度、電気パルスの長さ、パルス印加の回数などを適宜選択すればよい。通常、電場強度は１０〜５００Ｖ／ｃｍ、好ましくは２５〜３００Ｖ／ｃｍであり、電気パルスの長さは１〜９９ｍｓｅｃ、好ましくは１〜５０ｍｓｅｃであり、パルス印加の回数は１〜９９回、好ましくは１〜５回であるが、これらに限定されるものではない。【００５４】
電気パルスを印加する時期は、特に限定されず、適宜選択できる。すなわち、細胞を核酸担持電極基板の上に播種後、培養し、該基板上に細胞を接着させてから、必ずしもすぐに電気パルスを印加する必要はなく、接着後望ましい時期、たとえば、細胞の播種から約４〜５日以内であれば、自由に選択して電気パルスを印加することができる。この電気パルスの印加により、細胞中に核酸が効率よく導入される。【００５５】
上記本発明方法を実施するに当たって使用される核酸担持電極基板および電気パルス負荷システムの配置図の一例を示せば、図１の通りである。この図を用いて本発明方法を説明すると、たとえばガラス基板の表面に金薄膜電極（Ｅ）が設けられており、その上に核酸が担持された核酸−カチオン性高分子複合層（Ｄ）が設けられており、さらにその表面に細胞（Ｃ）が接着している。そして、この細胞はたとえばシリコーンスペーサ（Ｇ）で区画化されており、ウェル中にはエレクトロポレーションバッファー（Ｂ）が充填されている。シリコーンスペーサ（Ｇ）の上には金薄膜電極（Ｅ）と平行に反対電極となる金電極（Ｆ）が設けられている。金薄膜電極（Ｅ）と金電極（Ｆ）は電気パルス発信装置であるエレクトロポレーター（Ａ）に接続されている。本例では、金薄膜電極（Ｅ）と金電極（Ｆ）との間隔は２ｍｍに設定されており、ウェル面積は１３×１３ｍｍ２に設定されている。電気パルスの負荷は、金薄膜電極（Ｅ）を陰極（−）とし、金電極（Ｆ）を陽極（＋）とし、エレクトロポレーター（Ａ）により電気パルスを発生させることにより、細胞（Ｃ）中に核酸（ＤＮＡ）が導入される。【００５６】
本発明の別の側面として、上記核酸導入法を、ミクロパターン化した表面を有する基板を用いて実施することができる。ミクロパターン化はそれ自体公知の方法によって行うことができ、たとえば、核酸を担持させる前のカチオン性表面電極基板の表面を、適当な手段で区画化しておき、複数の異なった核酸をそれぞれ別個の区画に担持させることによりミクロパターン化された核酸担持電極基板とすることができる。また、電極基板の表面を有機シラン化合物（たとえば、オクタデシルトリエトキシシラン）やアルカンチオールで処理してそれらの自己組織化単分子膜を形成させたのち、フォトマスクを電極基板表面に固定し、紫外線照射し、ついで紫外線照射によって分解された自己組織化単分子膜を除去することによるミクロパターン化された電極基板が得られるので、かかる基板を用いれば核酸をアレイ状に配置することができる。したがって、上記のようなミクロパターン化された核酸担持金属基板あるいは電極基板を用いて本発明を実施すれば、核酸を導入する場所を限定することが可能である。【００５７】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００５８】
ＤＮＡを静電的に担持するためのカチオン性表面電極基板を作製した。まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、末端にカルボキシル基をもつチオール化合物（１１−メルカプトウンデカン酸、シグマ社製）の単分子膜を形成させた。この単分子膜上に、平均分子量８００のポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩ８００と表示、アルドリッチ社製）を１％濃度で含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を添加し、３０分間、室温で静置した。得られた基板の表面を十分に水洗し、窒素ガスで乾燥させ、カチオン性表面金電極基板を得た。【００５９】
次に、上記で得られたカチオン性表面金電極基板の表面に、エタノールで殺菌したシリコーンスペーサ（内面積：１．３×１．３ｃｍ２、高さ：２ｍｍ）を圧着し、固定した。次に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌ、クロンテック社製）の０．０５ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を、シリコーンスペーサ内のカチオン性表面金電極基板の表面上に添加し、室温、２時間放置して、表面にＤＮＡを静電的に吸着、担持させた。吸着しなかったＤＮＡを除去するため、リン酸緩衝生理食塩水で表面を十分に洗浄し、ＤＮＡ担持金電極基板を得た。【００６０】
ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３：（財）ヒューマンサイエンス財団より分譲）を血清含有培地（培地組成：最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）に懸濁させ、その懸濁液をＤＮＡ担持金電極基板の表面上に滴下した。これを３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下で培養することで、細胞を表面に接着、成長させた。２４時間後、培地を４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）と交換して非接着細胞を除去し、リン酸緩衝生理食塩水を満たした後、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板を第２電極としてシリコーンスペーサに固定した。それらの配置を図１に示す。【００６１】
次に、ＤＮＡ担持金電極基板を陰極（−）、他方を陽極（＋）として高電圧パルス発生装置（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｑｕａｒｅｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０、ＢＴＸ社製）に接続し、電場強度７５Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、印加回数１回の条件で電気パルスを印加し、エレクトロポレーションを行った。パルス印加後、室温で５分間インキュベーションした後、ウェル内のリン酸緩衝生理食塩水をあらかじめ３７℃に保温してあった血清含有培地で交換し、３７℃および５％ＣＯ２の雰囲気下で細胞培養を行った。【００６２】
エレクトロポレーションから４８時間後に導入遺伝子の一過的発現の解析を行った。方法は、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に起因する緑色蛍光を発する細胞をカウントし、遺伝子導入効率を全細胞数当たりのＥＧＦＰ陽性細胞数として算出した。【００６３】
図２にエレクトロポレーションから４８時間後のＨＥＫ２９３細胞の位相差顕微鏡像（Ａ）と蛍光顕微鏡像（Ｂ）を示す。この図からわかるように、基板表面上の細胞は障害を受けることなくＥＧＦＰを発現しており、そのＥＧＦＰ陽性細胞率、すなわち遺伝子導入効率は８０％であった。このことは、本発明の手法が効率的に遺伝子導入できる方法であることを明確に示す。
【実施例２】
【００６４】
実施例１と同様に、ＤＮＡ担持金電極基板上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印加してエレクトロポレーションを行った。その際、電気パルスの電圧を変化させ、遺伝子導入効率に対する電場強度の効果について検討した。なお、印加電圧以外のパルス印加条件は、実施例１と同じ（パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）とし、遺伝子導入効率は、電気パルス印加から４８時間後のＥＧＦＰ陽性細胞率として評価した。結果は図３の通りである。また同時に、細胞生存率に対する電場強度の効果を検討した。細胞生存率は、電気パルス印加から３時間後、細胞をトリプシン処理で回収し、トリパンブルー色素排除法により評価した。すなわち、トリパンブルーによって染色されなかった細胞の数（生細胞数）を求め、次式に従って生存率を算出した。結果は図４の通りである。
【数１】
2005035755.tif 000002
【００６５】
図３に示すように、電圧を加えない場合では全く遺伝子導入が起こらなかった。一方、電圧を印加することにより遺伝子導入が確認された。明視野顕微鏡像から求めた電極上の全接着細胞数、ならびに、蛍光顕微鏡像から求めた蛍光タンパク質発現細胞数を用いて、次式により遺伝子導入効率を算出した。
【数２】
2005035755.tif 000003
【００６６】
電場強度７５Ｖ／ｃｍで遺伝子導入効率は最も高く、２００Ｖ／ｃｍ以上になると導入効率の著しい低下がみられた。また、図４に示すように、トリパンブルー色素排除法によるパルス印加後の細胞生存率は、電場強度１００Ｖ／ｃｍ以下において高い細胞生存率を維持していたが、１５０Ｖ／ｃｍ以上になると電気パルス印加のショックによる細胞の剥離や細胞死がみられ、細胞への障害が顕著に認められた。電圧を加えなければ遺伝子導入が起こらない結果より、電気パルスにより電極表面からのＤＮＡの剥離、さらにそれに引き続く電気パルスによる細胞膜の不安定化、もしくは穿孔形成を経てＤＮＡを取り込んでいることを示す。
【実施例３】
【００６７】
実施例１と同様の方法でＤＮＡ担持金電極基板の上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印加（電場強度７５Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）してエレクトロポレーションを行った。その際、固定化するカチオン性高分子の分子量を変化させ、遺伝子導入効率に対するカチオン性高分子の分子量の効果について検討した。カチオン性高分子は、分子量８００、２５０００および７５００００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ８００、ＰＥＩ２５０００、ＰＥＩ７５００００と表示、いずれもアルドリッチ社製）、ならびに分子量１５０００および７００００のポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＡ１５０００，ＰＡＡ７００００と表示、いずれもアルドリッチ社）を使用した。【００６８】
図５に遺伝子導入効率とポリエチレンイミン、ポリアリルアミンの分子量の関係を示す。この図からわかるように、ポリエチレンイミンの分子量が増加すると、遺伝子導入効率は低下した。図６に各表面に担持されたＤＮＡの量を示す。さらに、電気パルス（電場強度７５Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数1回）を印加後、上清中に含まれるＤＮＡ量をピコグリーンで測定することにより、表面から遊離したＤＮＡ量を評価した。その結果は図７に示すとおりである。これらの図から明らかなように、高分子量になるにつれて、ＤＮＡの担持量は増加したが、電気パルス印加後の表面からのＤＮＡ遊離量は極めて少なかった。反対に、低分子量のポリエチレンイミン表面（ＰＥＩ８００）においては、ＤＮＡ担持量は少ないものの、電気パルスの印加によって、担持されたＤＮＡの約３０％が遊離した。【００６９】
各カチオン表面における遺伝子導入効率とパルス後に遊離したＤＮＡ量の関係を図８に示す。この図から明らかなように、遺伝子導入効率とＤＮＡ遊離量の間には正の相関が認められた。この結果は、本発明において遺伝子導入効率は表面からのＤＮＡの遊離量に強く依存していることを示唆する。
【実施例４】
【００７０】
実施例1と同様の方法でＤＮＡ担持金電極基板上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印加しエレクトロポレーションを行った。その際、細胞播種時から電気パルスを印加するまでの時期を変化させ、遺伝子導入効率に対する細胞培養期間の効果について試験した。【００７１】
図９に、細胞播種から２４、４８、７２時間の所定時間後に電気パルスを印加し、パルス印加のときから４８時間後の細胞の位相差顕微鏡像を示す。この図から細胞播種から２４、４８、７２時間後のいずれの場合も、遺伝子が効率よく導入され発現していることがわかる。また、図１０に、電気パルス印加時間と遺伝子導入効率（％）との関係を示す。この結果から、細胞播種から１２、２４、４８、７２時間後のいずれの場合も高い遺伝子導入効率が保たれており、望ましい時間に接着細胞へ遺伝子を導入することが可能であることがわかる。
【実施例５】
【００７２】
（初代細胞での実証）
ラット胎児脳から海馬を採取し、神経細胞を得た。この初代神経細胞に対し、実施例１と同様の方法でＥＧＦＰまたは赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）をコードするプラスミドの導入を行った。
すなわち、実施例１と同様にして、カチオン性表面金電極基板（カチオン性高分子：ＰＥＩ８００）表面に、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄ、クロンテック社製）を担持させ、その表面上で前記初代神経細胞を３日間培養し、電気パルス（１２５Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を負荷した。電気パルス負荷から４８時間後に導入遺伝子の一過性解析を実施例１と同様に行った。【００７３】
（結果）
図１１に電気パルス負荷から４８時間後の位相差顕微鏡像（左、ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）および蛍光顕微鏡像（中、右、ＥＧＦＰ，ＤｓＲｅｄ）を示す。左図の顕微鏡像から見る限り、エレクトロポレーションによる細胞障害は見られない。また中図および右図の蛍光顕微鏡像から、ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄの両遺伝子が細胞に導入され、それらの遺伝子がコードしている蛍光タンパクＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの発現した様子が確認できる。また、この図から、本遺伝子導入方法により複数の遺伝子を効率よく細胞に導入できることがわかる。【００７４】
遺伝子導入効率は２０％であり、前記ＨＥＫ２９３細胞と同様に遺伝子導入を確認することができた。比較のため、従来の方法であるリポフェクション法（下記比較例１参照）およびエレクトロポレーション法（下記比較例２参照）により前記初代神経細胞に遺伝子（ｐＥＧＦＰ／ｐＤｓＲｅｄ）を導入したところ、遺伝子導入効率は１０〜２０％と本発明による手法と有意な差は認められなかった。しかしながら、従来の方法では、細胞への障害が大きく、多くの死細胞が認められた。そのときの死細胞率は２０〜３０％であった。一方、本発明による遺伝子導入法では細胞障害は全くみられなかった。【００７５】
（比較例１）
採取した海馬神経細胞を７０〜８０％のコンフルエンスになるように、ポリＬ−リジンコートされた２４ウェルプレートに播種し、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（インビトロジェン社製）を用いて遺伝子導入を行った。遺伝子ＤＮＡは１μｇ、リポフェクタミン２０００は２μｌを使用した。リポフェクション２０００とＤＮＡは５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（無血清培地）にそれぞれ希釈した。両溶液を混合し、２０分室温放置した後、細胞に添加しリポフェクションを行った。リポフェクションから４８時間後にＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認した。上述のように、遺伝子導入効率は１０〜２０％であった。【００７６】
（比較例２）
採取した海馬神経細胞をＰＢＳで洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。その懸濁液２００μｌにプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）１５μｇを加え混合した。この溶液をエレクトロポレーションキュベットに注入し、１０分間、氷上に静置した。その後、電場強度６２５Ｖ／ｃｍ（電極間距離：４ｍｍ）、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回の条件でエレクトロポレーションを行った。処理後、１０分間、室温に放置した後、ＰＬＬコート６０ｍｍ細胞培養皿に播種した。エレクトロポレーションから４８時間後にＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で確認した。上述のように、遺伝子導入効率は１０〜２０％であった。
【実施例６】
【００７７】
実施例１と同様にして調製したカチオン性表面金電極基板の表面に、異なる遺伝子（ｐＥＧＦＰまたはｐＤｓＲｅｄ）を、それぞれ電極上の直径５ｍｍの部位に限定して、用手法により担持させた。以下実施例１と同様にして、ＤＮＡ担持金電極基板の表面にＨＥＫ２９３細胞を接着、成長させ、播種２４時間後に非接着細胞を除去した後、電気パルス（７５Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を負荷した。【００７８】
図１２に電気パルス負荷から４８時間後の位相差顕微鏡（左）および蛍光顕微鏡像（右）を示す。左図は、基板全体（約１．５×１．５ｃｍ２）を観察するために低倍率観察を行った。細胞が基板表面に均一に接着していることがわかる。また右図は、ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄの遺伝子を固定した領域についての蛍光を各々観察し、重ね合わせ処理したものであり、各遺伝子の固定化領域において、その遺伝子産物に由来する蛍光が観察できる。これらのことから、本発明方法は、場所を限定した遺伝子導入が可能であることがわかる。
【実施例７】
【００７９】
片面にインジウム−スズ酸化物（以下、ＩＴＯと表示する）を蒸着したガラス基板をプラズマ処理装置（大熊エンジニアリング製、形式：ＰＡ３００ＡＴ）を用いて、酸素プラズマ処理（出力３０Ｗ、圧力５Ｐａ）を室温で５分間行うことでＩＴＯ表面を清浄化した。【００８０】
次に、平均分子量８００のポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩ８００と表示、アルドリッチ社製）を１％濃度で含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）をＩＴＯ表面に添加し、３０分間、室温で静置した。得られた基板の表面を十分に水洗し、窒素ガスで乾燥させ、カチオン性表面ＩＴＯ電極基板を得た。次に、上記で得られたカチオン性表面ＩＴＯ電極基板の表面に、エタノールで殺菌したシリコーンスペーサ（内面積：１．３×１．３ｃｍ2、高さ：１ｍｍ）を圧着し、固定した。次に、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｃｌ、クロンテック社製）の０．０５ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を、シリコーンスペーサ内のカチオン性表面ＩＴＯ電極基板の表面上に添加し、室温、３０分間放置して、表面にＤＮＡを静電的に吸着、担持させた。吸着しなかったＤＮＡを除去するため、リン酸緩衝生理食塩水で表面を十分に洗浄した。以後、同様にしてＰＥＩ８００とＤＮＡとを交互に吸着させることで積層を繰り返した後、リン酸緩衝生理食塩水で表面を十分に洗浄し、ＤＮＡ担持透明電極基板を得た。【００８１】
以下、未処理のＩＴＯ電極基板を積層数０とし、ＰＥＩとＤＮＡの吸着回数を積層数として示した。すなわち、ＰＥＩ８００−ＤＮＡ−ＰＥＩ８００の表面では、積層数は３と示した。ＰＥＩ８００とＤＮＡを交互に吸着積層させたＩＴＯ電極基板表面の元素組成をＸ線光電子分光分析法（ＸＰＳ）で測定した。その結果を表１に示す。
【表１】
2005035755.tif 000004
【００８２】
上記表１から分かるように、ＰＥＩ８００の吸着によってＮが検出され、ＤＮＡの吸着によりＰが検出された。また、積層数が増加するとともに、基材のＩＴＯに由来するＩｎとＳｎの存在比が減少した。これらの結果は、ＩＴＯ電極基板表面上にＰＥＩ８００とＤＮＡが存在すること、積層によってその膜厚が増加していることを示す。【００８３】
図１３にはＰＥＩ８００とＤＮＡを交互に吸着積層させたＩＴＯ電極基板表面のＡＴＲ−ＩＲスペクトルを示す。１０６５、１２３０ｃｍ−１の２つの吸収はＤＮＡの骨格を構成するリン酸基に由来するものである。図１３からわかるように、積層数が増加すると、それらの吸収は増加した。図１４は、これら２つのピーク面積を積層数に対してプロットしたものである。積層数の増加によって、ピーク面積は直線的に増加した。この結果は、積層数の増加によって、ＩＴＯ基板表面へのＤＮＡの担持量が増加していることを示す。【００８４】
次に、ＰＥＩ８００とＤＮＡを交互に吸着させたときのＩＴＯ電極基板表面の水接触角測定を行い、表面の濡れ性の変化を調査した。図１５にその結果を示す。最表面がＰＥＩ８００のときの水接触角は約４５度であり、最表面がＤＮＡのときは約３２度であった。図１５からわかるように、最表面の種類に応じて、接触角が変化した。この結果は、ＰＥＩ８００とＤＮＡの交互積層膜がＩＴＯ電極基板表面に形成されていることを示す。ＰＥＩ８００を１層吸着させた表面では、その接触角がその後のＰＥＩ８００表面と比べて低いことから、ＰＥＩ８００がＩＴＯ表面を完全に覆っておらず、基材のＩＴＯ表面が部分的に露出していると考えられる。
【実施例８】
【００８５】
実施例７に従って作製したＤＮＡ担持ＩＴＯ電極基板上で細胞へのエレクトロポレーションを行った。まず、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３：（財）ヒューマンサイエンス財団より分譲）を血清含有培地（培地組成：最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１０％ウシ胎児血清、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）に懸濁させ、その懸濁液をＤＮＡ担持透明電極基板（積層数５、基材：ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））の表面上に滴下した。これを３７℃および５％ＣＯ2の雰囲気下で培養することで、細胞を表面に接着、成長させた。２４時間後、培地を４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）と交換して非接着細胞を除去し、リン酸緩衝生理食塩水を満たした後、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板を第２電極としてシリコーンスペーサに固定した。それらの配置を図１（但し、本実施例では、記号ＥはＩＴＯ電極である）に示す。【００８６】
次に、ＤＮＡ担持透明電極基板を陰極（−）、他方を陽極（＋）として高電圧パルス発生装置（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｑｕａｒｅｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０、ＢＴＸ社製）に接続し、電場強度２５０Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、印加回数１回の条件で電気パルスを印加し、エレクトロポレーションを行った。パルス印加後、室温で５分間インキュベーションした後、ウェル内のリン酸緩衝生理食塩水をあらかじめ３７℃に保温してあった血清含有培地で交換し、３７℃および５％ＣＯ2の雰囲気下で細胞培養を行った。【００８７】
エレクトロポレーションから４８時間後に導入遺伝子の一過的発現の解析を行った。方法は、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に起因する緑色蛍光を発する細胞をカウントし、遺伝子導入効率を全細胞数当たりのＥＧＦＰ陽性細胞数として算出した。【００８８】
図１６にエレクトロポレーションから４８時間後のＨＥＫ２９３細胞の位相差顕微鏡像（Ａ）と蛍光顕微鏡像（Ｂ）を示す。この図からわかるように、基板表面上の約７０％の細胞がＥＧＦＰを発現していた。このことは、本発明の手法が効率的に遺伝子導入できる方法であることを明確に示す。また、細胞の明視野、蛍光観察において、非常に鮮明で明るい像が得られた（基材としてガラスを用いた場合）。このことは、透明電極を用いることで細胞の観察が非常に良好に実施できることを示す。
【実施例９】
【００８９】
実施例８と同様に、ＤＮＡ担持透明電極基板（積層数５、基材：ＰＥＴ）上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印加してエレクトロポレーションを行った。その際、電気パルスの電圧を変化させ、遺伝子導入効率に対する電場強度の効果について検討した。なお、印加電圧以外のパルス印加条件は、実施例８と同じ（パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）とし、遺伝子導入効率は、電気パルス印加から４８時間後のＥＧＦＰ陽性細胞率として評価した。また同時に、細胞生存率に対する電場強度の効果を検討した。細胞生存率は、電気パルス印加から４８時間後、細胞をトリプシン処理で回収し、トリパンブルー色素排除法により評価した。すなわち、トリパンブルーによって染色されなかった細胞の数（生細胞数）を求め、電気パルスを印加していないコントロールの生細胞数に対する割合を算出した。以下に細胞生存率の計算式を示す。
【数３】
2005035755.tif 000005
【００９０】
結果は図１７の通りである。図１７に示すように、電圧を加えない場合では全く遺伝子導入が起こらなかった。一方、電圧を印加することにより遺伝子導入が確認された。トリパンブルー色素排除法により求めた電極上の全生細胞数、ならびに、蛍光顕微鏡像から求めた蛍光タンパク質発現細胞数を用いて、次式により遺伝子導入効率を算出した。
【数４】
2005035755.tif 000006
【００９１】
電場強度を増加することで、遺伝子導入効率は直線的に上昇した。３００Ｖ／ｃｍ以上になると導入効率はプラトーに達し、約８０％の遺伝子導入効率が得られた。一方、トリパンブルー色素排除法によるパルス印加後の細胞生存率は、電場強度２５０Ｖ／ｃｍ以下において良好な細胞生存率を維持していたが、３００Ｖ／ｃｍ以上になると電気パルス印加のショックによる細胞の剥離や細胞死が顕著に認められた。電圧を加えなければ遺伝子導入が起こらない結果より、電気パルスによる電極表面からのＤＮＡの剥離、さらに電気パルスによる細胞膜の不安定化による穿孔の形成が同時に起こり、その穿孔を通じて剥離したＤＮＡを取り込んでいることを示す。
【実施例１０】
【００９２】
実施例８と同様の方法でＤＮＡ担持ＩＴＯ電極基板（積層数５、基材：ＰＥＴ）の上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、接着させた後、電気パルスを印加（電場強度２５０Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）してエレクトロポレーションを行った。その際、ＰＥＩ８００とＤＮＡの積層数を変化させ、遺伝子導入効率に対する積層数の効果について検討した。【００９３】
図１８に遺伝子導入効率と積層数の関係を示す。この図からわかるように、積層数が増加すると、細胞生存率を維持しながら遺伝子導入効率は増加した。図１９には、各積層数の表面に担持されたＤＮＡの量を示す。積層数が多くになるにつれて、ＤＮＡの担持量は増加した。【００９４】
次に、電気パルス（電場強度２００−３００Ｖ／ｃｍ、パルス幅１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を印加後、上清中に含まれるＤＮＡ量を蛍光染料であるピコグリーン（モレキュラープローブ社製）で測定することにより、表面から遊離したＤＮＡ量を評価した。図２０に、各条件における遺伝子導入効率とパルス後に遊離したＤＮＡ量の関係を示す。積層数の増加により、パルス印加後のＤＮＡ遊離量は増加した。電気パルスの印加により、担持されたＤＮＡの約１０−３０％が遊離した。この図から明らかなように、遺伝子導入効率とＤＮＡ遊離量の間には正の相関が認められた。この結果は、本発明において遺伝子導入効率は表面からのＤＮＡの遊離量に依存していることを示唆する。
【実施例１１】
【００９５】
（初代細胞での実証）
ラット胎児脳から海馬を採取し、神経細胞を得た。この初代神経細胞に対し、実施例８と同様の方法でＥＧＦＰと赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）をそれぞれコードする２種類のプラスミドの導入を行った。
すなわち、実施例８と同様にして、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄ、クロンテック社製）を担持させた透明電極基板（積層数５、電極：ＩＴＯ、基材：ガラス）表面上で、前記初代神経細胞を３日間培養し、電気パルス（２００Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を負荷した。電気パルス負荷から４８時間後に導入遺伝子の一過性解析を実施例８と同様に行った。【００９６】
（結果）
図２１に電気パルス負荷から４８時間後の位相差顕微鏡像（左、phase contrast）および蛍光顕微鏡像（中、右、ＥＧＦＰ，ＤｓＲｅｄ）を示す。左図の顕微鏡像から見る限り、エレクトロポレーションによる細胞障害は見られない。また中図および右図の蛍光顕微鏡像から、ｐＥＧＦＰおよびｐＤｓＲｅｄの両遺伝子が細胞に導入され、それらの遺伝子がコードしている蛍光タンパクＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの発現した様子が確認できる。また、この図から、本遺伝子導入方法により複数の遺伝子を効率よく同一細胞に導入できることがわかる。さらにこの結果は、細胞播種から３日間の培養期間後にエレクトロポレーションを実施した場合でも、効率よく遺伝子導入できることを示している。このことより、本手法は遺伝子導入のタイミングを任意に設定することが可能であることがわかった。
【実施例１２】
【００９７】
（ＩＴＯ電極基板表面への核酸のアレイ化とエレクトロポレーション）
ＩＴＯ電極基板（基材：ガラス）の表面を酸素プラズマ処理により清浄化した。次に、ＩＴＯ電極基板をオクタデシルトリエトキシシラン（ＬＳ−６９７０、信越化学）の１％トルエン溶液に浸漬し、室温で２時間静置した。その後、電極基板をトルエンとエタノールで十分に洗浄した後、８０℃で１２時間静置した。次に、石英ガラスにクロムパターンを蒸着したフォトマスクを電極基板表面上に重ねて固定し、室温で1時間紫外線を照射した。マスクを取り外した後、基板をエタノールで洗浄し、紫外線照射によって分解された有機シラン層を除去した。この操作によって、疎水性の有機シラン単分子層の領域と親水性のＩＴＯ表面の露出した領域からなるパターン化表面が作製できる。【００９８】
作製したパターン化ＩＴＯ電極基板（ＩＴＯが露出した丸スポット：直径１ｍｍ、１０×１０点）のＩＴＯスポット表面に、ＰＥＩ８００とプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ、ｐＤｓＲｅｄ、もしくは両者の混合物）とを、それぞれ電極上の部位を限定して、用手法により交互に吸着担持させた（積層数５）。以下実施例８と同様にして、ＤＮＡ担持透明電極基板の表面にＨＥＫ２９３細胞を接着、成長させ、播種２４時間後に非接着細胞を除去した後、電気パルス（２００Ｖ／ｃｍ、１０ｍｓｅｃ、パルス回数１回）を負荷した。【００９９】
図２２に電気パルス負荷から４８時間後の蛍光顕微鏡像を示す。基板全体（約１．７×１．７ｃｍ2）を観察するために低倍率観察を行った。この図は、発現したＥＧＦＰおよびＤｓＲｅｄの蛍光を各々観察し、重ね合わせ処理したものであり、各遺伝子の固定化領域において、その遺伝子産物に由来する蛍光が観察できる。また、両遺伝子を混合したスポット上の細胞は両方のタンパク質を共発現した。これらのことから、本発明方法は、場所を限定した遺伝子導入が可能であることがわかる。  
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明にかかる核酸導入法は、細胞障害を与えず、効率よく遺伝子導入が可能であり、さらに遺伝子導入の時期、場所を限定できる。このため、本発明にかかる核酸導入法は、細胞レベルでの遺伝子や遺伝子産物の機能解析が効率よく実施でき、細胞生物学、ポストゲノム、プロテオーム研究を大きく促し、医療への多大な貢献をなすものである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１６】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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