(57)【要約】カンゾウから配列番号１で表わされるアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼが単離された。また、配列番号２の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドが取得できた。さらに、ダイズからも２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアミノ酸配列を同定、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチドが取得できた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされる１−３２８のアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項２】
２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンあるいは２，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンに作用してフォルモネチンあるいはビオカニンＡを生成するための脱水反応を促進する請求項１記載の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項３】
請求項１または２に記載の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２で表わされる１−１１７８個の塩基からなる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号２に含まれるヌクレオチド配列に対して５０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ（カンゾウ）からクローニングされた請求項３〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号２のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２の少なくとも１５個の連続した配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしうる、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列または２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのｃＤＮＡのプライマーまたはプローブとして機能しうるポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドでコードされる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするたんぱく質を用い、２−ヒドロキシイソフラバノンを脱水する方法。
【請求項１１】
少なくともフラバノン、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）と請求項３〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするたんぱく質を用いてイソフラボノイドを生産する方法。
【請求項１２】
請求項３〜６のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項１３】
宿主細胞中で、請求項３〜６のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
宿主細胞が酵母である請求項１４に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６２の組換え大腸菌細胞である請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載された宿主細胞を培養することを含む２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの製造方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれかに記載された宿主細胞を用いるイソフラボノイドの生産方法。
【請求項１９】
請求項３〜６のいずれかに記載されたポリヌクレオチドおよび２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）をコードするポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を用いるイソフラボノイドの生産方法。
【請求項２０】
請求項３〜６のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニック植物。
【請求項２１】
マメ科植物である請求項２０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の植物を用いるイソフラボノイドの生成方法。
【請求項２３】
請求項２０または２１に記載の植物を用いるイソフラボノイドの改変方法。
【請求項２４】
配列番号３で表わされる１−３１９のアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項２５】
２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンあるいは２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンに作用してダイゼインあるいはゲニステインを生成するための脱水反応を促進する請求項２４記載の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項２６】
請求項２４または２５に記載の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号４で表わされる１−９６０の塩基からなる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号４に含まれるヌクレオチド配列に対して５０％以上の相同性を有し、且つ２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ダイズからクローニングされた請求項２６〜２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号４のヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号４の少なくとも１５個の連続した配列またはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズしうる、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列または２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのｃＤＮＡのプライマーまたはプローブとして機能しうるポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項２６〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドでコードされる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ。
【請求項３３】
請求項２６〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするたんぱく質を用い、２−ヒドロキシイソフラバノンを脱水する方法。
【請求項３４】
少なくともフラバノン、２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）と請求項２６〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするたんぱく質を用いてイソフラボノイドを生産する方法。
【請求項３５】
請求項２６〜２９のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
【請求項３６】
宿主細胞中で、請求項２６〜２９のいずれかに記載されたポリヌクレオチドを発現しうる発現系を含む組換え体ＤＮＡまたはＲＮＡ。
【請求項３７】
請求項３５に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項３８】
宿主細胞が酵母である請求項３７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項３９】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６１の組換え大腸菌細胞である請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）をコードするポリヌクレドチドが挿入されたベクターおよび請求項２６〜２９のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが挿入されたベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項４１】
宿主細胞が酵母である請求項４０に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項４２】
寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６３の組換え酵母である請求項４１に記載の宿主細胞。
【請求項４３】
請求項３７〜４２のいずれかに記載された宿主細胞を培養することを含む２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの製造方法。
【請求項４４】
請求項３７〜４２のいずれかに記載された宿主細胞を用いるイソフラボノイドの生産方法。
【請求項４５】
請求項２６〜２９のいずれかに記載されたポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニック植物。
【請求項４６】
マメ科植物である請求項４５に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載の植物を用いるイソフラボノイドの生成方法。
【請求項４８】
請求項４５または４６に記載の植物を用いるイソフラボノイドの改変方法。
【請求項４９】
カルボキシルエステラーゼのモチーフを持ち脱水反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５０】
カルボキシルエステラーゼのモチーフを持ち２−ヒドロキシイソフラバノンの脱水反応を触媒する酵素をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、２−ヒドロキシイソフラバノンの脱水反応を触媒する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ、それをコードする新規ポリヌクレオチド、及びその応用に関する。
【背景技術】  イソフラボンおよびイソフラボンから誘導される化合物（イソフラボノイド）は、マメ科植物特有の成分で、近年、健康補助食品として注目されている。そして、イソフラボンを含むイソフラボノイドは、抗菌物質や共生シグナルとして植物が生物環境に適応するために極めて重要な役割を果たすことが知られている。
イソフラボノイドの最も簡単な骨格はイソフラボンであって、フラボノイド代謝によって生成されるイソフラボノイドグループのきわめて初期の産物である（図１参照）。イソフラボンとそのグリコシド（配糖体）はマメ科植物の器官に蓄積され、ダイズの種子に含まれるダイゼイン（７，４’−ジヒドロキシイソフラボン）やゲニステイン（５，７，４’−トリヒドロキシイソフラボン）の遊離体および配糖体は健康を促進し、疾病を予防するフィトエストロゲン（植物エストロゲン）として知られている。
イソフラボンは、生態生理学的に活性のあるイソフラボノイド、たとえば、プテロカルパンやイソフラバン骨格を有する抗菌性のフィトアレキシンが生合成される場合の中間体である。イソフラボノイドのうち約５０％は４’−メトキシルに由来する官能基を有し、これらは主として４’−メトキシル化されたイソフラボンであるフォルモノネチン（７−ヒドロキシ−４’−メトキシイソフラボン）に由来する。
イソフラボノイド骨格は、シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）、すなわち２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）の作用によって、（２Ｓ）−フラバノンから生合成される。ＩＦＳは１，２−アリル基転位を伴うフラボノイド骨格の２位の炭素のヒドロキシル化を触媒する。生成物である２−ヒドロキシイソフラバノンは脱水されてイソフラボンを形成する（図１参照）。
ＩＦＳのｃＤＮＡは、マメ科植物であるＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ（以下カンゾウと記載する。）（非特許文献１、特許文献１）およびダイズ（非特許文献２、非特許文献３）から同定されている。酵母のミクロソームで過剰発現させた組換えＩＦＳを用いたインビトロ検定では、最初の生成物である２−ヒドロキシイソフラバノンに加えて、多量のイソフラボンが自発的な脱水によって生成した（非特許文献１、非特許文献３）。さらに、昆虫細胞で発現したＩＦＳは、イソフラボンのみを生産することが報告された（非特許文献２）。このように、ＩＦＳ反応の直接生成物からイソフラボン生産を非酵素的に進めることができること、およびＩＦＳの基質である（２Ｓ）−フラバノンはマメ科および非マメ科植物の共通の成分であることから、ＩＦＳを用いてイソフラボノイドを含まない非マメ科植物を形質転換することによって、それらをイソフラボン産生植物に変換することができると推測された（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
このような知見に基づき、イソフラボンを本来含有しない非マメ科植物（シロイヌナズナやタバコ）にダイズＩＦＳ遺伝子を導入して非マメ科植物によるイソフラボン生産が試みられたが、その生産量はダイズ種子の１／１０００程度というわずかな量であった（非特許文献３、非特許文献７、非特許文献８）。よって、ＩＦＳのみでは、イソフラボンの生産は効率的に行われないということが推測される。
一方、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンをダイゼインに変換する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの酵素活性がＰｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ（クズマメ）の細胞で検出され、そのタンパク質が精製された（非特許文献９、非特許文献１０）。また、本発明者らの実験によると、カンゾウの無細胞抽出物では、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンはフォルモノネチンに変換されたが、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンはダイゼインに変換されなかった（非特許文献１１）。これらの結果は、植物細胞での２−ヒドロキシイソフラバノンからイソフラボンへの脱水が酵素（２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ）に依存しており、酵素が置換基の異なる２−ヒドロキシイソフラバノンに対して基質特異性を有していることを示している。
このように、従来の研究によって、ＩＦＳのみでは、イソフラボンの生産は効率的に行えないこと、２−ヒドロキシイソフラバノンからイソフラボンへの脱水には、基質特異的酵素が重要な役割をしていることが解明されてきたが、２−ヒドロキシイソフラバノンからイソフラボンへの脱水に関与する酵素（２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ）の詳細は不明であった。
【特許文献１】国際公開第００／４６３５６号パンフレット
【非特許文献１】Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｏｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ａｙａｂｅ，Ｓ．（１９９９）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｉｎ  ｌｉｃｏｒｉｃｅ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：８２１−８２８．
【非特許文献２】Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｉｊｚｅｎ，Ｍ．，Ｑｕｔｏｂ，Ｄ．ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒｙｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｓｏｙｂｅａｎ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３６７：１４６−１５０．
【非特許文献３】Ｊｕｎｇ，Ｗ．，Ｙｕ，Ｏ．，Ｌａｕ，Ｓ．Ｍ．，Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｐ．，Ｏｄｅｌｌ，Ｊ．，Ｆａｄｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ，Ｂ．（２０００）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｔｈｅ  ｋｅｙ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｉｎ  ｌｅｇｕｍｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２０８−２１２．
【非特許文献４】Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｌ．（１９９９）Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ−ａ  ｇｏｌｄ  ｍｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．４：３９４−４００．
【非特許文献５】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｌｅ，Ｃ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ’ｐｈａｒｍｉｎｇ’  ｗｉｔｈ  ｐｌａｎｔ  Ｐ４５０ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．５：２７１−２７２．
【非特許文献６】Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．（２００１）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０ｓ  ａｓ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｒｏｐ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．４：１６２−１６７．
【非特許文献７】Ｙｕ，Ｏ．，Ｊｕｎｇ，Ｗ．，Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｃｒｏｅｓ，Ｒ．Ａ．，Ｆａｄｅｒ，Ｇ．Ｍ．，ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ，Ｂ．ａｎｄ  Ｏｄｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．（２０００）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ  ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｄａｉｄｚｅｉｎ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｌｅｇｕｍｅ  ｄｉｃｏｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｏｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４：７８１−７９３．
【非特許文献８】Ｌｉｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｌｏｕｎｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．（２００２）Ｂｏｔｔｌｅｎｅｃｋｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４５７８−１４５８３．
【非特許文献９】Ｓａｎｋａｗａ，Ｕ．ａｎｄ  Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａ，Ｔ．（１９９７）Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ．Ｉｎ  Ｄｙｎａｍｉｃ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｏｇｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓａｎｋａｗａ，Ｕ．ｐｐ．２５−４８．Ｋｏｄａｎｓｈａ／Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｔｏｋｙｏ．
【非特許文献１０】Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｅｂｉｚｕｋａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｓａｎｋａｗａ，Ｕ．（１９９８）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９：４９７−５０５．
【非特許文献１１】Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ａｏｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ａｙａｂｅ，Ｓ．（２０００）Ｎｅｗ  ｓｃｈｅｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ２，７，４’−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄａｉｄｚｅｉｎ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：２２７６−２２７９．
【非特許文献１２】Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｓａｗａｄａ，Ｙ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，Ｓａｋｕｒａｉ，Ｎ．，Ａｏｋｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ａｙａｂｅ，Ｓ．（２００３）ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ：２，７，４’−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ４’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｇｕｍｅ  ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４：１０３−１１２．
【非特許文献１３】Ａｙａｂｅ，Ｓ．，Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ａｏｋｉ，Ｔ．（２００２）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐ４５０ｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ／ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙｆｒｏｍ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５７：３６０−３６９．
【非特許文献１４】Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ａｏｋｉ，Ｔ．，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ａｙａｂｅ，Ｓ．（１９９９）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ａｎｄ  ｒｅｔｒｏｃｈａｌｃｏｎｅ  ｂｒａｎｃｈｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｅｃｈｉｎａｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：１６１８−１６２０．
【発明の開示】
本発明は、植物体においてイソフラボンを生産する工程に重要な役割を果たす脱水酵素を単離し、そのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列を解明することを課題とする。より詳細には、本発明は、２−ヒドロキシイソフラバノンからイソフラボンへの脱水反応を触媒する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアミノ酸構造を決定し、それをコードする遺伝子を提供することを課題とする。さらにまた、本発明は、そのようにして得られた遺伝子をイソフラボンを含むイソフラボノイドの生産に応用することを課題とする。
上記の課題を解決するために、本発明者らは、まず、カンゾウ（フォルモノネチン生産植物）およびダイズ（ダイゼイン生産植物）抽出物の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼを調査し、種特異的な脱水酵素の存在を確認した。次に、生合成酵素のｃＤＮＡに関する新しい遺伝子クローニング法「機能発現分画スクリーニング」を用いて（非特許文献１２）、カンゾウの２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン２，３−デヒドラターゼ（フォルモノネチン合成酵素）をコードするｃＤＮＡを単離した。さらに、配列情報から、基質特異性の異なる相似酵素、すなわちダイズの２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン２，３−デヒドラターゼ（ダイゼイン合成酵素）のｃＤＮＡを得た。
２−ヒドロキシインフラバノンデヒドラターゼをコードする新規な遺伝子を取得したことで、該遺伝子を非マメ科の植物に導入し、イソフラボノイドの生産量を増大できる可能性を提供できた。
また、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードする遺伝子とＩＦＳをコードする遺伝子を同時形質転換した微生物を用いてイソフラボノイドを生産できることを確認した。
さらに、本発明者らは、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアミノ酸配列には、カルボキシルエステラーゼで知られているモチーフが含まれていることを見出した。相似タンパク質は高等植物に広く分布しており、天然産物の生合成における脱水の一部はこの酵素ファミリーによって介在されていることを示唆している。
すなわち、本発明は、カンゾウに含まれる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ、特に、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン２，３−デヒドラターゼ（フォルモノネチン合成酵素）およびそれをコードするヌクレオチド配列に関するものである。カンゾウに含まれる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼは、配列番号１に表わす１−３２８のアミノ酸配列を含んでいる。カンゾウの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするｃＤＮＡの配列は、配列番号２に示した。さらに、本発明は、該新規な遺伝子を発現する組換え体、該遺伝子を組み込んだ形質転換体にも関する。形質転換体としては、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）が好ましく、該遺伝子を導入したＥ．ｃｏｌｉＫ１２株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５７（寄託日平成１５年３月２０日）として寄託した。そして、平成１６年３月１５日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６２が付されている。
本発明は、さらにまた、該遺伝子あるいは該遺伝子とＩＦＳをコードする遺伝子とを同時に組み込んだ酵母やＥ．ｃｏｌｉなどの微生物あるいは植物により、イソフラボンを含むイソフラボノイドを生産する方法にも関するものである。形質転換に好ましい酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ２１６８株（ニッポンジーン社，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、酵母用ベクターとしては、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。
本発明は、また、ダイズに含まれる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼである、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ（ダイゼイン合成酵素）およびそれをコードするヌクレオチド配列にも関するものである。ダイズに含まれる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼは、カンゾウに含まれる２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼと相似しているが、カンゾウのデヒドラターゼがイソフラバノンの４’−メトキシ体を基質とするのに対して、４’−ヒドロキシ体を基質とするものであって、配列番号３に表わす１−３１９のアミノ酸配列を含んでいる。ダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするｃＤＮＡの配列は、配列番号４に示した。さらに、本発明は、該新規な遺伝子を発現する組換え体、該遺伝子を組み込んだ形質転換体にも関するもので、形質転換体としては、酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）が好ましく、該遺伝子を導入したＥ．ｃｏｌｉＫ１２株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２５６（寄託日平成１５年３月２０日）として寄託した。そして、平成１６年３月１５日にブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６１が付されている。
本発明は、さらにまた、該遺伝子あるいは該遺伝子とＩＦＳをコードする遺伝子とを同時に組み込んだ酵母やＥ．ｃｏｌｉなどの微生物あるいは植物により、イソフラボンを含むイソフラボノイドを生産する方法にも関するものである。形質転換に好ましい酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ２１６８株（ニッポンジーン社，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、酵母用ベクターとしては、ｐＹＥＳ２（インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などが挙げられる。該遺伝子とＩＦＳをコードする遺伝子とを同時に組み込んだ酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＪ２１６８株はブダペスト条約に基づき日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６６３（寄託日平成１６年３月１５日）として寄託した。
【図面の簡単な説明】  図１は、フラバノンからイソフラボノイドの生成経路を示す説明図である。
図２は、カンゾウ細胞の２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするｃＤＮＡクローニングの説明図である。
図３Ａは、カンゾウおよびダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアミノ酸配列を示す。
図３Ｂは、カンゾウなどマメ科植物の遺伝子の分子系統樹を示す。（Ｇ．ｅｃｈｉｎａｔａ  Ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ＝カンゾウＨＩＤＭ，Ｓｏｙｂｅａｎ  ＴＣ９８４６０＝ダイズＨＩＤＨ）
図４は、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ生成物のＨＰＬＣプロフィルを示す。
図５は、遺伝子発現レベルを示すＲＴ−ＰＣＲ分析パターンを示す。
図６は、ＩＦＳとＨＩＤＨ共発現酵母（上段），ＩＦＳ発現酵母（中段），コントロール酵母（下段）をナリンゲニンを含む培地でインキュベートし、得られた抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
［発明の実施するための最良の形態］
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明において、カンゾウの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼたんぱく質をＨＩＤＭ、それをコードする遺伝子をＨＩＤＭ、ダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼたんぱく質をＨＩＤＨ、それをコードする遺伝子をＨＩＤＨと記することがある。
本発明は、配列番号１あるいは３で表わされるアミノ酸配列を実質的に有する２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼに関するが、本発明で、「アミノ酸配列を実質的に有する」とは、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ活性を有する限り、当該アミノ酸配列に欠失、置換、付加、挿入等の変異があるものを含むことを意味する。欠失、置換、付加、挿入されるアミノ酸の数は、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、特に１〜５個であり得る。特に、アミノ酸残基を同様の特性のアミノ酸残基で置換したものであり、典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間、ＳｅｒおよびＴｈｒ間、ＡｓｐおよびＧｌｕ間、ＡｓｎおよびＧｌｎ間、ＬｙｓおよびＡｒｇ間、ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換である。
さらに、本発明は、配列番号２あるいは４で表わされるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を実質的に有するポリヌクレオチドに関するが、本発明で、「ヌクレオチド配列を実質的に有する」とは、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードする配列からなるポリヌクレオチドのほか、該配列と縮重による配列の相違、５’末端あるいは３’末端又はその両末端に適当な配列が付加されたポリヌクレオチドを含む意味である。
【実施例】  以下に、実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
＜材料と方法＞
本発明において用いた材料と手法は次のとおりである。
（１）化学物質
ダイゼイン、ゲニステイン、ビオカニンＡは、エクストラシンテース社（Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈ▲ｅ▼ｓｅ）から、（ＲＳ）−ナリンゲニンおよびｐ−ニトロフェニル酪酸はシグマ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から得た。フォルモノネチンは本発明者らの研究室のストックから入手した。
２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン（非特許文献１３）および２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン（非特許文献１２）は次のように調製した。すなわち、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンは、ＣＹＰ９３Ｃ２（ＩＦＳ）を発現する酵母ミクロソーム、リクイリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）、ＮＡＤＰＨをインキュベートして、酢酸エチルで抽出、シリカゲルＴＬＣで分離し、さらに逆相ＨＰＬＣで精製して調製した。２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン、組み換え２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＨＩ４’ＯＭＴ）の反応混合物を酢酸エチルで抽出し、シリカゲルＴＬＣで分離、さらにＨＰＬＣで精製して調製した。
２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンは、ＣＹＰ９３Ｃ２を発現する酵母のミクロソーム（非特許文献１）と（ＲＳ）−ナリンゲニンおよびＮＡＤＰＨとのインキュベーションによって調製した。生成物（Ｒｆ０．３０）は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）［Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  Ｆ２５４（メルク社，Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ．）；溶媒はトルエン：酢酸エチル：メタノール：石油エーテル＝６：４：１：３］によって精製した。
（２）植物材料
カンゾウの培養細胞（Ａｋ−１系）は文献（非特許文献１）に従って、カンゾウの葉及び葉柄から作製した。α−ナフタレン酢酸（１μｇ／ｍｌ）及びＮ６−ベンジルアデニン（１μｇ／ｍｌ）を含有する１／２濃度のＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地（０．３％（ｗ／ｖ）ジェランガムで固化）中、１２時間光照射（６，０００ルクス）／１２時間暗所サイクルで培養し、エリシター処理した細胞よりｃＤＮＡライブラリーを構築した。懸濁培養物は２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（０．１μｇ／ｍｌ）とカイネチン（０．１μｇ／ｍｌ）添加Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地中、暗所で維持した。エリシター処理は０．２％（ｗ／ｖ培養液）の酵母抽出物（インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して行った（非特許文献１４）。
ダイズの種子（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  Ｌ．中生枝豆：トーホク社，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｌｔｄ．）は、水に２４時間浸漬し、コニカルビーカー内の濾紙の上に撒いた。ダイズの実生は、明１２時間／暗１２時間という条件で室温で１週間成長させた。
（３）無細胞抽出物の調製
操作はすべて４℃で行った。エリシター処理（２４時間）後のカンゾウ細胞（１０ｇ）あるいは１週齢のダイズの実生（１０ｇ）は、１０％スクロースおよび１４ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌおよび海砂（２．５ｇ）を用いて乳鉢でホモジェナイズした。ホモジェネートはガーゼで濾過し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を２．５ｇのＤｏｗｅｘ  １−Ｘ２（１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液で平衝化、ｐＨ７．５）と混合し、２０分間放置した。濾過によって得られた溶液は、硫酸アンモニウムを用いて分画し、３０％〜８０％飽和画分をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで脱塩し、１０％スクロースおよび１４ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解しアッセイに用いた（約６００μｇタンパク質／ｍｌ）。
（４）２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのアッセイ
２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンまたは２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノン（各５ｎｍｏｌ）を含む２−メトキシエタノールに酵素調製液を加え（総容量：１００μｌ）、３０℃で１０分間インキュベートした。
２，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンデヒドラターゼ（ビオカニンＡ合成酵素）のアッセイは以下のように行った。２−メトキシエタノールに溶解した２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノン（１０ｎｍｏｌ）を、カンゾウＨＩ４’ＯＭＴ（１μｇ）、１μｍｏｌ  Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）とともに３０℃で１５分間インキュベートした。
濃縮した酢酸エチル抽出物を組換えカンゾウＨＩＤＭ（１μｇ）と３０℃で１０分間インキュベートした。混合物の酢酸エチル抽出物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ダイゼインおよびフォルモノネチン分析のＨＰＬＣは、Ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧカラム（４．６×１５０ｍｍ；資生堂社，Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて４０℃（流量０．８ｍｌ／ｍｉｎ）で行った（非特許文献１２）。溶出溶媒はメタノールと３％酢酸水を用いた。４０分の間に３５％〜５５％になるように直線グラジエントで溶出させた。５−ヒドロキシイソフラボンは、Ｃａｐｃｅｌｌ  ｐａｋ  Ｃ１８  ＭＧカラム（４．６×１５０ｍｍ；資生堂社，Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いて５０％メタノール水溶液（ゲニステインの場合）または５５％メタノール水溶液（ビオカニンＡの場合）によって４０℃（流量０．８ｍｌ／分）で分析した。
精製した組換えタンパク質（約１０ｎｇタンパク質）とカンゾウおよびダイズ（約１０μｇタンパク質）の無細胞抽出物を用いて比活性を測定した。イソフラボン濃度は、ダイゼイン、フォルモノネチン、ゲニステインの標準試料のＨＰＬＣピーク面積から算出した。
（５）カンゾウ細胞の２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするｃＤＮＡ（ＨＩＤＭ）のクローニング
タンパク質の発現および大腸菌の粗抽出物の調製は既報のように行った（非特許文献１２）。
酵母抽出物でエリシター処理（６時間および１２時間）したカンゾウ細胞から構築したｃＤＮＡ発現ライブラリー（非特許文献１２）をスクリーニングに使用した。
カンゾウλＺａｐｌｌ  ｃＤＮＡライブラリーをＥｘａｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  Ｆ’ＩＱ（インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎによりファージミドに変換した。
ファージミドはＤＨ５α  Ｆ’ＩＱに導入され、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）／アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で増殖した。母プレートからＬＢ／アンピシリン培養液中に約３０，０００の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体をそれぞれ含む５つの独立したｃＤＮＡ分画プールを調製した。５ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＬＢ液体培地で培養し、細胞を回収後、粗酵素液を調製した。
２−メトキシエタノール２μｌに溶解した２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン（０．４ｎｍｏｌ）に組換えカンゾウＨＩ４’ＯＭＴ（５０ｎｇ）を加え（非特許文献１２）、０．４ｎｍｏｌ  Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−１４Ｃ］メチオニン（［１４Ｃ］ＳＡＭ、２．２６ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、アマシャム  バイオサイエンス社  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の存在下で３０℃で３分間プレインキュベートした（総容量：５０μｌ）。次に、大腸菌プールの粗抽出物（１００μｌ）を混合物に加え、３０℃でさらに１０分間インキュベートした。酢酸エチルを加えて反応を停止させた後、混合物の酢酸エチル抽出物をシリカゲルＴＬＣ［ＬＫ６ＤＦ（ワットマン社，Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．）；溶媒はクロロホルム：アセトン：２５％アンモニア水＝７０：２９：１；２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン（Ｒｆ０．１５）、フォルモノネチン（Ｒｆ０．３０）］で展開し、画像分析装置（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００、アマシャム  バイオサイエンス社，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって分析した。［１４Ｃ］フォルモノネチンを生成した陽性プールを次のスクリーニングのために選択し、小さいサイズ（約３，０００クローン／プール）の１０プールに分画した。陽性プールの分画と検定は４回繰り返し、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンデヒドラターゼ活性を示すクローン（ＨＩＤＭ）を単離した。（図２参照）
プラスミドを回収し、オートシーケンサー（ＬＩＣ−４０００，アロカ社，Ａｌｏｋａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を用いてヌクレオチド配列を決定した。
（６）ＨＩＤＭと相同のダイズｃＤＮＡ（ＨＩＤＨ）のクローニング
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社，Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）を用いてダイズの実生から単離し、ｃＤＮＡをＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて合成した。ＮｄｅＩまたはＢａｍＨＩ部位（下線で示す）を含む２つのＰＣＲ特異プライマーは、開始コドンおよび終止コドン配列を指定するダイズＥＳＴのＴＣ９８４６０のコード領域から設計した（ＴＣ９８−Ｆｏｗ、ＧＴＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡ（配列番号５）；ＴＣ９８−Ｒｅｖ、ＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡ（配列番号６））。プライマーおよび鋳型としてダイズｃＤＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって得られたｃＤＮＡ（ＨＩＤＨ）は、ｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−ベクター（ノバゲン社，Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）に組み込み、ヌクレオチド配列を決定した。
（７）大腸菌におけるカンゾウＨＩＤＭおよびダイズＨＩＤＨの異種発現
ＮｄｅＩまたはＢａｍＨＩ部位（下線で示す）を含む２つのプライマーは、カンゾウＨＩＤＭのコード領域から設計した（ＧｅＤｃｈｙ−Ｆ、ＧＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣ（配列番号７）；ＧｅＤｅｈｙ−Ｒ、ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧ（配列番号８））。カンゾウＨＩＤＭから得られたＰＣＲ生成物のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、ｐＥＴ２８ａ（ノバゲン社  Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）の対応する部位にクローニングした。さらに、クローニングしたダイズｃＤＮＡ（ＨＩＤＨ）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、ｐＥＴ２８ａの対応する部位にもサブクローニングした。遺伝子組換え２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの発現および精製は、次の方法で行った（非特許文献１２）。各ベクターと一緒に形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は３０℃で２０ｍｌの５０μｇ／ｍｌカナマイシンあるいはアンピシリン添加のＬＢ／アンシピリン培地中でＯＤ６００＝０．４まで培養された。ＩＰＴＧが最終濃度１．０ｍＭになるように添加され、６時間３０℃でインキュベートされた。カンゾウＨＩＤＭおよびダイズＨＩＤＨは、ＨｉｓＴｒａｐ  Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＨＩＤＭおよびＨＩＤＨ発現Ｅ．ｃｏｌｉの粗抽出物から精製された。
（８）２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）と２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母の調製
マメ科カンゾウのＩＦＳ（ＣＹＰ９３Ｃ２）を酵母で発現させるためのベクター（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２）は非特許文献１と特許文献１に記載したものを用いた（ＣＹＰ９３Ｃ２遺伝子のコード領域を、酵母発現ベクター（ｐＹＥＳ２，インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のガラクトース誘導性プロモータＧＡＬ１の下流のＫｐｎＩとＥｃｏＲＩサイトに組み込んだもの）。
ダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ（ＨＩＤＨ）を酵母で発現させるためのベクター（ｐＥＳＣ−ＨＩＤＨ）は以下のようにして作成した。ＡｐａＩ、ＸｈｏＩ部位（下線で示す）を付加した２種のプライマー［ＨＩＤＨ−Ｆ１（５’−ＧＧＧＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号９）），ＨＩＤＨ−Ｒ１（５’−ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＣ−３’（配列番号１０））］を、ダイズ２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ（ＨＩＤＨ）のコード領域から設計した。  プライマーとＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡，Ｔｏｙｏｂｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、さらに鋳型としてダイズＨＩＤＨ  ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ（９８℃で１５秒，６０℃で１５秒，７４℃で３０秒を１５サイクル）を行った。増幅産物をＡｐａＩ、ＸｈｏＩで処理し、酵母発現ベクター（ρＥＳＣ−Ｌｅｕ，ストラタジーン社，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のガラクトース誘導性プロモータＧＡＬ１の下流のＡｐａＩとＸｈｏＩサイトに組み込んだベクター（ｐＥＳＣ−ＨＩＤＨ）を作製した。
エレクトロポレーション装置（Ｃｅｌｌｊｅｃｔ  Ｄｕｏ，サーモエレクトロン社，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＿ＢＪ２１６８株（ａ；ｐｒｃ１−４０７，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｌｅｕ２，ｔｒｐ１，ｕｒａ３−５２）（ニッポンジーン社，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を形質転換した。エレクトロポレーションはサーモエレクトロン社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が推奨する方法に従って行った。形質転換体は，ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（６．７ｇ／ｌ，インビトロゲン社，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、グルコース（２０ｇ／ｌ），トリプトファン（２０ｍｇ／ｌ），寒天（２０ｇ／ｌ）を含む培地で選択した。以下の３種の組換え酵母を作成した：（１）コントロール酵母（ｐＹＥＳ２とｐＥＳＣ−ＬｅｕをＢＪ２１６８株に導入）、（２）ＩＦＳ発現酵母（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２とｐＥＳＣ−ＬｅｕをＢＪ２１６８株に導入）、（３）ＩＦＳと２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ共発現酵母（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２とｐＥＳＣ−ＨＩＤＨをＢＪ２１６８株に導入）
（９）カルボキシルエステラーゼ活性の測定
組換えカンゾウＨＩＤＭおよびダイズＨＩＤＨタンパク質の特異的カルボキシルエステラーゼ活性は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび７５０ｎｍｏｌ  ｐ−ニトロフェニル酪酸を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）１．５ｍｌ中における吸光度４００ｎｍで３０℃で測定したｐ−ニトロフェノールの生成速度から算出した（Ｈｅｙｍａｎｎ  １９８１）。市販のブタ肝臓カルボキシルエステラーゼ（シグマ社，Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を陽性対照として用いた。熱変性（１００℃、１０分間）させたカンゾウＨＩＤＭ、ダイズＨＩＤＨ、ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼタンパク質を陰性対照として分析した。
（１０）ＲＴ−ＰＣＲ分析
懸濁培養したカンゾウ細胞は、酵母抽出物で処理し、３、６、１２、２４、４８時間後に収集した（非特許文献１）。ｍＲＮＡはＳｔｒａｉｇｈｔ  Ａ’ｓ  ｍＲＮＡ単離システム（ノバゲン社，Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｌｔｄ．）を用いて抽出し、ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲには、カンゾウＨＩＤＭ、ＩＦＳ（非特許文献１２）、ＨＩ４’ＯＭＴ（非特許文献１２）から設計した特異プライマーを使用した。反応は９４℃で１分間の変性によって開始し、３工程のインキュベーション（９４℃、１分間；５５℃、１分間；７２℃、１分間）を３０サイクル繰り返した。生成物は、１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルの電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色した。
上記の材料および方法によって得られた本発明の結果を示す。
（１）カンゾウ細胞およびダイズの実生における２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ活性
カンゾウ細胞はエリシター処理後にメディカルピン（４’−メトキシイソフラボノイド、図１参照）を蓄積するが、４’−ヒドロキシイソフラボノイドは蓄積しない（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ダイズはイソフラボンの、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン配糖体を産生することが知られており、それらはいずれも４’−ヒドルキシル化体である（Ｄｅｗｉｃｋ  １９８６，Ｄｅｗｉｃｋ  １９９３，Ａｕｓｓｅｎａｃ  １９９８）。したがって、カンゾウ細胞およびダイズの実生の抽出物には、それぞれ適切に置換された２−ヒドロキシイソフラバノンからフォルモノネチンおよびダイゼインを生成する活性が存在すると推測される。ＨＰＬＣを用いて活性を調べた結果を表１に示す。
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表１から分かるとおり、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンをカンゾウの無細胞抽出物とインキュベートした場合では、フォルモノネチンが生成した。カンゾウ抽出物による２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンからのダイゼインの生成も少量認められたが、その活性はフォルモノネチンの生成より約１６０倍低かった。
ダイズ実生の無細胞抽出物では、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン（フォルモノネチンを産生）および２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン（ダイゼインを産生）からほぼ１：２のフォルモノネチンとダイゼインの生成が検出された。さらに、ダイズ抽出物は、ダイゼインの生成の約１／１０のレベルで、２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンからのゲニステインの生成を触媒した。
一方、２−ヒドロキシイソフラバノンの自発的な脱水は、中性緩衝液（ｐＨ７．５）における５０μＭの基質濃度による実験条件では無視し得るものであった。これらの結果は、植物細胞でイソフラボンを形成する２−ヒドロキシイソフラバノンの脱水は酵素触媒反応であることを強く示唆している。さらに、カンゾウおよびダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの基質特異性は異なることが推定される。
（２）機能発現分画スクリーニングによるカンゾウの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼｃＤＮＡの取得
２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンからフォルモノネチンへの変換の特異的かつ高感度の検出は、酵母の遺伝子組換えＩＦＳによって調製した精製２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン（非特許文献１）、［１４Ｃ］ＳＡＭおよびアフィニティ精製したＮ末端に６個のヒスチジンを含む組換えカンゾウＨＩ４’ＯＭＴ（非特許文献１２）を組み合わせて用い、検定前に［１４Ｃ］−２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンを産生することによって可能になった。酵母抽出物で処理したカンゾウ細胞のｃＤＮＡ発現ライブラリー（非特許文献１２）を用いてデヒドラターゼのｃＤＮＡのスクリーニングを行った。最初のスクリーニングは、５つのｃＤＮＡプール（形質変換体３０，０００／プール）で実施した。大腸菌プールの抽出物は、［１４Ｃ］−２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンを産生させた上記の混合物と反応させ、反応混合物の酢酸エチル抽出物をＴＬＣオートラジオグラフィーによって分析した。２つのプールが［１４Ｃ］フォルモノネチンを産生することが判明し、任意に選択した陽性プールの一方を小さいサイズ（約３，０００クローン／プール）の１０プールに分画した。タンパク質の発現および分析を再び行い、１０プールのうちの１つの陽性プールを同定した。陽性プールの分画および分析を繰り返した。１０プールのうちの１つの陽性プールを、３回目（約３００クローン／プール）、４回目（３０クローン／プール）および５回目（３クローン／プール）のスクリーニングで繰り返し同定した。最後に、２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンデヒドラターゼ活性を示す単一の大腸菌クローンを単離した（図２参照）。
酵素をコードするｃＤＮＡを回収し、シーケンサーを用いて配列決定を行った。ＨＩＤＭ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｍｅｔｈｏｘｙ  ｔｙｐｅ）のｃＤＮＡは１，１７８ｂｐのヌクレオチドを有し、３２８のアミノ酸をコードしていた（図３Ａ）。タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）検索では、カンゾウのＨＩＤＭの推定アミノ酸配列はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）の推定タンパク質と４０％の同一性（受入れ番号Ａｔ１ｇ４７４８０、ＡＴ３ｇ４８６９０、Ａｔ３ｇ４８６９０）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）ｈｓｒ２０３Ｊと３４％の同一性（受入れ番号Ｘ７７１３６）（Ｐｏｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９４）、エンドウマメＥ８６と３１％の同一性（受入れ番号ＡＢＯ２６２９６）（Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（好熱性硫黄細菌）のカルボキシルエステラーゼと３２％の同一性（受入れ番号１ＪＪＩＡ）（Ｍａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）を示すことが明らかになった。また、カンゾウＨＩＤＭはカルボキシルエステラーゼで記録された保存配列のモチーフを有していた（Ｎ末端から約４０〜１８０アミノ酸）。
リパーゼおよびエステラーゼとともにオキシアニオンホールを形成する保存配列（Ｈｉｓ  ８５−Ｇｌｙ  ８６−Ｇｌｙ  ８７：図３Ａにおいて枠で囲んだ配列）は、カルボキシルエステラーゼのモチーフに存在していた（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｌａｕｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｈｏｓｏｋａｗａ  ２００２）。カンゾウＨＩＤＭタンパク質では、一般的なリパーゼおよびエステラーゼの触媒トライアードに保存されたＳｅｒ残基（Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  １９９６，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｍａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｈｏｓｏｋａｗａ  ２００２）がＴｈｒ残基に置換されているものの、仮想の触媒トライアード（Ｔｈｒ  １７３、Ａｓｐ  ２７２およびＨｉｓ  ３０４）がカルボキシルエステラーゼモチーフの外側に認められた。図３Ａにおいて、仮想の触媒トライアード（Ｔｈｒ  １７３、Ａｓｐ  ２７２およびＨｉｓ  ３０４）には＊を付した。
（３）マメ科植物ライブラリーにおけるカンゾウデヒドラターゼの相同ｃＤＮＡの検索
ダイズ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｔｇｉ／ｇｍｇｉ／）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（タルウマゴヤシ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｔｇｉ／ｍｔｇｉ／）、Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（ミヤコグサ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｎ／ｐｌａｎｔ／ｌｏｔｕｓ／ＥＳＴ／）（Ａｓａｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．２０００）のエクスプレスドシーケンスタグ（ＥＳＴ）データベースの検索から、これらの植物にカンゾウＨＩＤＭと相同（アミノ酸同一性＞５０％）のｃＤＮＡが存在することが明らかになった。しかし、これらの配列はすべて仮想タンパク質としてのみ注釈が付けられていた。分子系統樹では、ダイズＢＭ１７７１９４、Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ＴＣ３３３２、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＴＣ４３５４０タンパク質が、カンゾウのデヒドラターゼと同じ分枝を形成（アミノ酸レベルでの同一性＞８０％）することが示された（図３Ｂ）。ダイズＴＣ９８４６０タンパク質は４種類のタンパク質と＞６０％の同一性を有し、Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ  ＢＧ４５６４９６と密接な分枝を形成した（図３Ｂ）。
（４）カンゾウとダイズの遺伝子組換え２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの特性決定
ダイズのＥＳＴ配列ＴＣ９８４６０は、予測された開始コドンおよび終止コドンを有している。ｃＤＮＡのコード領域をダイズ実生からＲＴ−ＰＣＲでクローニングし、ＨＩＤＨ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｆｌａｖａｎｏｎｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｈｙｄｒｏｘｙ  ｔｙｐｅ）と命名した。
カンゾウＨＩＤＭおよびダイズＨＩＤＨは大腸菌で発現させ、Ｎ末端に６つのヒスチジン残基を持つ組換えタンパク質を精製し、２−ヒドロキシイソフラバノンに対する活性を測定した。図４Ａに示すように、カンゾウＨＩＤＭと２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンとのインキュベーションによってフォルモノネチンが生成された。生成物（フォルモノネチン）の同定は標準サンプルとのＲｔ値の比較および電子衝撃質量分析法（ｍ／ｚ  ２６８の分子イオンピーク、ｍ／ｚ  １３２のｒｅｔｒｏ−Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒフラグメントピーク）によって確認した。さらに、カンゾウＨＩＤＭによって２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンから少量のダイゼインが産生された。カンゾウＨＩＤＭの２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンに対する比活性は２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンに対するものより７４倍高く、組換えタンパク質の生化学的特性がカンゾウ無細胞抽出物のものと一致することを示している（表１）。
組換えダイズＨＩＤＨを、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンと２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンを用いてアッセイするとＨＰＬＣ上で、ダイゼインとフォルモノネチンのピークが現われることを確認した（図４Ａ）。イソフラボンの化学構造は電子衝撃質量分析法によって再確認した。さらに、ダイズＨＩＤＨは、２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンからのゲニステインの生成を触媒した（図４Ａ）。表１に示すように、ＨＩＤＨの比活性は２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンに対して最も高かったが、別の４’−ヒドロキシル化された基質に対しては比較的低く（約１／１０）、４’−メトキシ基を持つ基質に対してはきわめて低かった。
さらに、カンゾウＨＩ４’ＯＭＴと２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンおよびＳＡＭとのインキュベーションによって得られた２，５，７−トリヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンと予想される化合物をカンゾウＨＩＤＭとインキュベートした場合には、ＨＰＬＣでビオカニンＡが検出された（図４Ｂ）。
（５）遺伝子組換えカンゾウおよびダイズの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼのカルボキシルエステラーゼ活性
ｐ−ニトロフェニル酪酸は、カルボキシルエステラーゼアッセイで一般に用いられる基質である。遺伝子組換えカンゾウおよびダイズのデヒドラターゼはｐ−ニトロフェニル酪酸に弱い活性を示した（表１）。これに対して、ブタ肝臓カルボキシルエステラーゼは２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンを脱水しなかった（表１）。
（６）カンゾウ細胞のフォルモノネチン経路における遺伝子発現
ＲＴ−ＰＣＲ分析から、カンゾウ細胞のＨＩＤＭ、ＨＩ４’ＯＭＴおよびＩＦＳの転写レベルは酵母抽出物による処理から６〜１２時間後に増加することが明らかになった（図５）。
（７）２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）と２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母でのイソフラボン生産
前記２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼ（ＩＦＳ）と２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼを共発現させた組換え酵母の調製の項で説明した３種の組換え酵母、すなわち、（１）コントロール酵母（ｐＹＥＳ２とｐＥＳＣ−Ｌｅｕを酵母ＢＪ２１６８株に導入）、（２）ＩＦＳ発現酵母（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２とｐＥＳＣ−Ｌｅｕを酵母ＢＪ２１６８株に導入）、（３）ＩＦＳと２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ共発現酵母（ｐＹＥＳ−ＣＹＰ９３Ｃ２とｐＥＳＣ−ＨＩＤＨを酵母ＢＪ２１６８株に導入）を用いてイソフラボン生産能を比較した。
３種の酵母をそれぞれ１．５ｍｌのＳＤ最小液体培地［ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（６．７ｇ／ｌ）、グルコース（２０ｇ／ｌ）、トリプトファン（２０ｍｇ／ｌ）］で一晩振とう培養（２８℃）した。遠心により菌体を回収後、１μｇヘミンを含む３ｍｌのＹＰＧ液体培地［イーストエキストラクト（１０ｇ／ｌ）、ペプトン（２０ｇ／ｌ）、ガラクトース（２０ｇ／ｌ）］に菌体を懸濁し、一晩培養してタンパク質発現を誘導させた。遠心により菌体を回収後、５０μｇナリンゲニン（５μｌ  ｔｗｅｅｎ  ８０と５μｌエタノールに溶解）を含む０．５ｍｌ  ＹＰＧ液体培地に菌体を懸濁し、一晩培養した。培養液にガラスビーズを加えて細胞を破砕し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を乾固後、メタノールに溶解し、ＨＰＬＣ［カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＭＧ  ｃｏｌｕｍｎ（４．６  ｘ  １５０ｍｍ；資生堂社，Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；４０℃；０．８ｍｌ／ｍｉｎ；溶媒３０％メタノール（０分）〜５０％メタノール（３０分）になるように直線グラジエント］で分析した。ゲニステイン標品のピーク面積を基に、各サンプルのゲニステイン量を求めた。
その結果、ＩＦＳと２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼを共発現させた組換え酵母（３）と、ＩＦＳを単独で発現させた組換え酵母（２）では、ＨＰＬＣ上でゲニステインと２，５，７，４’−テトラヒドロキシイソフラバノンの生成が確認された。コントロール酵母（１）では両化合物の生成は見られなかった。ＩＦＳと２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼを共発現させた酵母（３）ではゲニステインを３．２±０．２μｇ（３回の実験）生産した。ＩＦＳを単独で発現させた組換え酵母でのゲニステイン生成量は０．８±０．１μｇ（３回の実験）であり、ＩＦＳと２−ヒドロキシイソフラバノンシンターゼを共発現させるとイソフラボン生産量が増加することがわかった（図６参照）。
以上の結果から、次のことが明らかになった。
本発明では、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼをコードするｃＤＮＡ、カンゾウＨＩＤＭ、ダイズＨＩＤＨをクローニングした。ＨＩＤＭおよびＨＩＤＨは４’−メトキシルおよび４’−ヒドロキシル置換基を有する２−ヒドロキシイソフラバノンに対して異なった基質特異性を示す。これらの酵素は、命名法に各酵素の最も好ましい基質を用いて、カンゾウの２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノン−２，３−デヒドラターゼ（フォルモノネチン合成酵素）およびダイズの２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノン−２，３−デヒドラターゼ（ダイゼイン合成酵素）と呼ぶことができる。重要なことは、基質特異性は各植物種に含まれるイソフラボンの構造（さらには生合成経路の下流のイソフラボノイド）を反映していることである。したがって、植物細胞の２−ヒドロキシイソフラバノンからのイソフラボンの生成は酵素に依存している可能性が非常に高い。
遺伝子組換えカンゾウＨＩＤＭタンパク質による２−ヒドロキシイソフラバノン脱水酵素反応の比活性は、カンゾウの粗抽出物よりも約４００〜９００倍高く、遺伝子組換えタンパク質および粗抽出物はいずれも２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンよりも２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンに対して極めて高い選択性を示した（表１参照）。これは、粗抽出物の主要な活性がＨＩＤＭタンパク質にあることを強く示唆している。さらに、誘導したカンゾウ細胞のＨＩＤＭ  ｍＲＮＡがＩＦＳとＨＩ４’ＯＭＴのｍＲＮＡと同等に蓄積することは、ＨＩＤＭがフォルモノネチンの生合成に関与していることを示唆している。
一方、ダイズ抽出物は２，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシイソフラバノンおよび２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンに対する脱水活性を約１：２の割合で触媒した。これに対して、遺伝子組換えダイズＨＩＤＨタンパク質の活性は２−ヒドロキシイソフラバノンの４’−ヒドロキシル化体にきわめて特異的であった（表１参照）。これらのことから、ダイズの４’−ヒドロキシル化イソフラボンの生成はＨＩＤＨに起因している可能性が高い。
本発明で、さらに興味深い所見は、２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼは加水分解酵素ファミリーのカルボキシルエステラーゼに分類される配列を有するタンパク質であるということである。実際に、ダイズＨＩＤＨはｐ−ニトロフェニル酪酸に対して弱いカルボキシルエステラーゼ活性を有していた（ブタ肝臓酵素の約１／５０）（表１参照）。本発明は、このファミリーのタンパク質が脱水を触媒することを最初に実証したものである。
Ｐ．Ｉｏｂａｔａ（クズマメ）で報告された２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼの特性はダイズＨＩＤＨの特性と一致する（Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。Ｐ．Ｉｏｂａｔａのタンパク質の分子量（３８ｋＤａ）はダイズＨＩＤＨの計算値（３５，１１５）と近い。さらに、２，７，４’−トリヒドロキシイソフラバノンに対するＰ．Ｉｏｂａｔａのデヒドラターゼの比活性（５６．８ｍｋａｔａｌ／ｋｇタンパク質）は、遺伝子組換えダイズＨＩＤＨの活性（４３．６ｍｋａｔａｌ／ｍｇ）とほぼ同様である。非常に興味深いことに、Ｐ．Ｉｏｂａｔａのタンパク質のＨｉｓ残基は活性に重要であることが報告されており（Ｈａｋａｍａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、Ｈｉｓはカルボキシルエステラーゼの触媒トライアードのアミノ酸の１つである（Ｓａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｈｏｓｏｋａｗａ  １９９５，Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。したがって、Ｐ．Ｉｏｂａｔａの２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼはカルボキシルエステラーゼファミリーのタンパク質でもあると考えられる。
いくつかのデヒドラターゼ遺伝子／タンパク質は、数種類の植物から特性が決定されている。これらにはデヒドロキナ酸デヒドラターゼ（Ｄｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、δ−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（Ｋａｃｚｏｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼ（Ｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）、アレンオキシド合成酵素（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）が含まれる。しかし、これらのデヒドラターゼとＨＩＤＭ／ＨＩＤＨとの間ではヌクレオチドおよびアミノ酸配列の有意な相同性は認められていない。
ＨＩＤＭ／ＨＩＤＨとある程度相同のカルボキシルエステラーゼモチーフを有するタンパク質は植物界に広く分布している。さらに、植物性天然産物の生合成では酵素の特性が決定されていない多くの脱水反応があり、たとえばプテロカルパン骨格を生じる２’−ヒドロキシイソフラバン−４−オールの脱水環化がある（Ｂｌｅｓｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｚ  １９８８，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４ａ，Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９４ｂ）。ヒヨコマメおよびダイズのそれぞれのイソフラボノイドの生合成では各植物のミクロソームの実験から、メチレンジオキシ環の生成およびフェノール環のプレニル置換基の環化はＰ４５０によるものである（Ｃｌｅｍｅｎｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｚ  １９９６，Ｗｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ  １９８８）。しかし、Ｐ４５０とともにデヒドラターゼがこれらの反応に関与している可能性もあり、その酵素タンパク質はカルボキシルエステラーゼファミリーに分類されるかもしれない。また、触媒機能が未同定のこの種のタンパク質をコードするいくつかの植物遺伝子が病原体に反応して誘導されることが報告されている（Ｐｏｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｗａｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｔｒｏｎｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｂｅｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。これらは、防御に関わる化合物の生合成に関与するデヒドラターゼであることも考えられる。
２−ヒドロキシイソフラバノンデヒドラターゼ遺伝子の同定は、マメ科および非マメ科植物の代謝エンジニアリングにきわめて重要である。これまでのところ、非マメ科植物でイソフラボノイドを生成するために、ダイズＩＦＳを過剰発現する形質転換型Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍが構築されているが（非特許文献３、非特許文献７、非特許文献３）、形質転換体のイソフラボノイドの生産性は満足できるものではない。典型的な場合では、シロイヌナズナの生重量１ｇあたり約２ｎｇ〜４ｎｇのゲニステインが生産されるのに対して（非特許文献７、非特許文献８）、ダイズ種子の乾重量１ｇあたり約４ｍｇ〜１０ｍｇ相当のイソフラボン（Ａｕｓｓｅｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）およびルーピン実生の生重量１ｇあたり約３ｍｇのイソフラボンが生産される（Ｋａｔａｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。フラバノンから２−ヒドロキシイソフラバノンへの代謝フローと３−ヒドロキシフラバノンに至る別のフローとの競合は、形質転換型シロイヌナズナにおけるイソフラボン生産のボトルネックになると思われ、実際にＩＦＳで形質変換したシロイヌナズナのフラバノン３−ヒドロキシル化酵素変異体におけるイソフラボン生産は６〜３１倍に増加している（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
ＩＦＳを単独で発現させた組換え酵母と比べて、ＩＦＳとＨＩＤＨを同時に発現させた組換え酵母ではイソフラボン生産量が増加したことから、非マメ科植物でＩＦＳとＨＩＤＨを同時に発現させることにより、イソフラボン生産量が増大する可能性も期待できる。
さらに、ＨＩＤＨおよびＨＩＤＭを導入遺伝子に用いた遺伝子工学によって、マメ科植物のイソフラボノイド経路を修正することも実現可能である。
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【産業上の利用の可能性】
以上、本発明では、植物体においてイソフラボンを生産する工程に重要な役割を果たす脱水酵素を単離し、そのアミノ酸配列およびそれをコードする新規なポリヌクレオチドを提供することができた。さらにまた、本発明は、そのようにして得られた遺伝子をイソフラボンを含むイソフラボノイドの産生に応用することを可能とした。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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