(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１；
ｂ）配列番号２；
ｃ）配列番号１全体又は配列番号２全体に少なくとも９０％同一な配列；
ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、
前記ｃ）の同一なヌクレオチド配列が、配列番号３に示されるアミノ酸配列のポリペプチドの機能的ドメインを少なくとも１つコードすることを特徴とする、前記単離核酸分子。
【請求項２】
該核酸分子がＤＮＡである請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
該核酸分子がＲＮＡである請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
該ヌクレオチド配列が配列番号２を含む請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６】
該核酸分子が配列番号２を含む請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】
該ベクターがプラスミドである請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
該ベクターがウイルス粒子である請求項５に記載のベクター。
【請求項９】
該ベクターが、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスから成る群より選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
該核酸分子が、シミアンウイルス４０、マウス乳腺癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのロングターミナルリピート、モロニーウイルス、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタイン−バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインから成る群より選択されるプロモーターに作動可能に連結している請求項５に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項５に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１２】
該細胞が細菌細胞である請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
該細菌細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求項１２に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
該細胞が酵母である請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
該酵母がサッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
該細胞が昆虫細胞である請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
該昆虫細胞がＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａである請求項１６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
該細胞が哺乳類細胞である請求項１１に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト２９３細胞、及びマウス３Ｔ３線維芽細胞から成る群より選択される請求項１８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのフラグメント、又は配列番号３と少なくとも９０％同一な配列を含むポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）請求項５に記載の組換え発現ベクターを適合性宿主細胞に導入し、
ｂ）該ポリペプチドの発現のための条件下で該宿主細胞を増殖させ、
ｃ）該宿主細胞から該ポリペプチドを回収する
ステップを含む方法。
【請求項２１】
該宿主細胞を溶解し、該宿主細胞の溶解産物から該ポリペプチドを回収する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該宿主細胞を溶解せずに該宿主細胞からの培地を精製することによって該ポリペプチドを回収する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の核酸分子と許容される担体又は希釈剤を含む組成物。
【請求項２４】
請求項５に記載の組換え発現ベクターと許容される担体又は希釈剤を含む組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載の核酸分子によってコードされる単離ポリペプチド。
【請求項２６】
該ポリペプチドが配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
該ポリペプチドが配列番号３に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記配列番号３に少なくも９０％同一な配列が、配列番号３に比べて少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を含む請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
該ポリペプチドが配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントを含む請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２５に記載のポリペプチドと許容される担体又は希釈剤を含む組成物。
【請求項３１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列のポリペプチド上のエピトープに結合する単離抗体であって、ただし、前記抗体は配列番号３の１位〜８２位のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体ではない、単離抗体。
【請求項３２】
該抗体がモノクローナル抗体である請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
請求項３１に記載の抗体と許容される担体又は希釈剤を含む組成物。
【請求項３４】
請求項２５に記載のポリペプチドに結合する抗体（ただし、該抗体は配列番号３の１位〜８２位のアミノ酸配列からなるポリペプチドに結合する抗体ではない）と陰性対照抗体を含むキット。
【請求項３５】
付加的なキット成分をさらに含む請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
該付加的キット成分が指示書を含む請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列のＤＲＦ１のポリペプチド又はＤＲＦ１含有複合体に結合する化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体を化合物に接触させるステップと、
ｂ）該化合物がＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体に結合するかどうかを判定するステップ
とを含み、
前記ＤＲＦ１がＤＢＦ４／ＡＳＫ１のヒトのホモログをコードする核酸分子であり、前記ＤＲＦ１含有複合体がＤＲＦ１−ＣＤＣ７である、前記方法。
【請求項３８】
ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体への該化合物の結合を蛋白質結合アッセイによって判定する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該蛋白質結合アッセイが、ゲルシフト分析、ウエスタンブロット、放射性標識競合アッセイから成る群より選択される請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
配列番号３に示されるアミノ酸配列のＤＲＦ１のポリペプチド又はＤＲＦ１含有複合体をコードする核酸分子に結合する化合物を同定するための方法であって、
ａ）ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体をコードする該核酸分子を化合物に接触させるステップと、
ｂ）該化合物が該核酸分子に結合するかどうかを判定するステップ
とを含み、
前記ＤＲＦ１がＤＢＦ４／ＡＳＫ１のヒトのホモログをコードする核酸分子であり、前記ＤＲＦ１含有複合体がＤＲＦ１−ＣＤＣ７である、前記方法。
【請求項４１】
結合をゲルシフト分析によって判定する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＤＲＦ１ポリペプチド又はＤＲＦ１含有複合体のキナーゼ活性を変化させる化合物を同定するための方法であって、
ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列のＤＲＦ１ポリペプチド又はＤＲＦ１含有複合体を化合物に接触させるステップと、
ｂ）ＤＲＦ１ポリペプチド又はＤＲＦ１含有複合体のキナーゼ活性が変化したかどうかを判定するステップ
とを含み、
前記ＤＲＦ１がＤＢＦ４／ＡＳＫ１のヒトのホモログをコードする核酸分子であり、前記ＤＲＦ１含有複合体がＤＲＦ１−ＣＤＣ７である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１蛋白質の新規ヒト相同体をコードする核酸分子を対象とする。この新規蛋白質はＤＲＦ１（ＤＢＦ４関連因子１（ＤＢＦ４  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  １）より）と命名され、ここではこの用語で称する。本発明はまた、新規ポリペプチド、ならびにＤＲＦ１に結合する及び／又はＤＲＦ１の活性を変化させる化合物、及びＤＲＦ１関連複合体をスクリーニングするためのアッセイを対象とする。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡの複製開始とＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼの役割
真核生物において、ＤＮＡの複製は細胞周期において厳密に調節されており、Ｓ期に１回だけ起こる（Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，１６５９−１６６４（１９９６））。広範囲の変種の真核生物で保存されるいくつかの因子が、ＤＮＡ複製の開始と伸長の工程において決定的な役割を果たすことが知られている。これらは、ＯＲＣ（複製開始点認識蛋白質複合体（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）、ＭＣＭ（ミニ染色体維持（Ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ））、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ４５、ＲＰＡ（一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ））、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。ＯＲＣ、Ｃｄｃ６及びＭＣＭ蛋白質の作用に関わる、複製起点での前複製複合体（プレＲＣ）の構築がＤＮＡ複製の開始のために不可欠であるが（Ｄｉｆｆｌｅｙら、Ｃｅｌｌ  ７８、３０３−３１６（１９９４）；Ｎｅｗｌｏｎ，Ｃｅｌｌ  ９１、７１７−７２０（１９９７）、そのような構築は、それだけではＤＮＡ合成の引き金となるには不十分である。出芽酵母サッカロミセスセレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの遺伝学的証拠は、ＤＮＡ複製の開始にはセリン／トレオニンＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼの作用が不可欠であることを示唆した。現在では、分子試験により、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼがＤＮＡ複製起点の作動において直接の役割を果たすことが明らかになった。この証拠を下記に要約する：
１）温度感受性ｃｄｃ７及びｄｂｆ４突然変異体菌株は、制限温度への移行後Ｇ１  ＤＮＡ内容物によって阻止される（Ｂｏｕｓｓｅｔ（１９９８）、［公表されたＧｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９８８  Ａｐｒ  １；１２（７）：１０７２には誤植があると思われる］Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，４８０−４９０）。
【０００３】
２）ＣＤＣ７活性は起点作動のためにＳ期を通じて必要である；それ故それは単なるＧ１とＳ間の分子スイッチではない、すなわち初期と後期起点の作動のために必要である（Ｂｏｕｓｓｅら、前出、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎら（１９９８）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １２，４９１−５０１）。
【０００４】
３）ＤＢＦ４蛋白質はインビボで起点ＤＮＡ配列に集積する（Ｄｏｗｅｌｌら（１９９４）、［コメント参照］、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５，１２４３−１２４６）。
【０００５】
４）ＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼは、起点で結合する前複製複合体の成分であるＭＣＭ蛋白質を選択的にリン酸化する（Ｓａｔｏら（１９９７）、ＥＭＢＯ  Ｊ  １６、４３４０−４３５１；Ｌｅｉら（１９９７）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１、３３６５−３３７４）。
【０００６】
５）ＭＣＭ５遺伝子における非常に特異的な突然変異がＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼの必要性を回避することが認められたため、このリン酸化は重要であると考えられる（Ｈａｒｄｙら（１９９７）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４、３１５１−３１５５）。
【０００７】
最近、出芽酵母Ｃｄｃ７−Ｄｂｆ４に関連するキナーゼ複合体の存在が、分裂酵母、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）及び哺乳類を含めた他の真核生物において明らかにされた（Ｍａｓａｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４、３０９４−３１０４（１９９５）；Ｓａｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、４３４０−４３５１（１９９７）；Ｋｉｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、２３２４８−２３２５７（１９９８）；Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１４３２０−１４３２５（１９９７）；Ｈｅｓｓら（１９９８）、Ｇｅｎｅ  ２１１、１３３−１４０；Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９））。
【０００８】
ＤＮＡ複製におけるヒトＣＤＣ７／ＤＢＦ４複合体の役割が抗体マイクロインジェクションアプローチを用いて評価された。最初に、特異的抗ＣＤＣ７抗体のマイクロインジェクションはヒト腫瘍細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する（Ｊｉａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、５７０３−５７１３（１９９９））。第二に，２つの独立した抗ＤＢＦ４抗体は、ヒト一次線維芽細胞ＫＤ細胞に注入したときＤＮＡ合成を阻害した（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９））。抗原を抗体と同時注入したときにはＤＮＡ複製が回復した。合わせて考えると、哺乳類ＣＤＣ７関連キナーゼ複合体は、酵母で発見されたように、細胞周期の進行において、おそらくＳ期の開始において極めて重要な役割を果たす。
【０００９】
ヒトＣＤＣ７／ＤＢＦ４遺伝子及び蛋白質
ＣＤＣ７キナーゼ相同体をコードするヒト完全長ｃＤＮＡが３つの異なるグループによってクローン化された：
１）東京大学のＳａｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、４３４０−４３５１（１９９７）。
【００１０】
２）Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＵＳＡのＪｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１４３２０−１４３２５（１９９７）。
【００１１】
３）Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＵＳＡのＨｅｓｓら（１９８８）、Ｇｅｎｅ  ２１１、１３３−１４０。
【００１２】
ヒトＤＢＦ４サブユニットをコードするｃＤＮＡは、１９９９年７月にＫｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９）によって初めて公表され、より最近ではＪｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１４３２０−１４３２５（１９９９）によって発表されている。
【００１３】
サイクリン依存性キナーゼと同様に、ＣＤＣ７／ＤＢＦ４キナーゼは触媒サブユニットＣＤＣ７と調節サブユニットＤＢＦ４から成り、後者はＡＳＫ１（Ｓ期キナーゼの活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｓ  ｐｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ）とも称される（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９））。キナーゼの活性は２つのサブユニット間の物理的相互作用に依存し、ＣＤＣ７蛋白質単独ではキナーゼ活性を示さない（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９）；Ｊｉａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、５７０３−５７１３（１９９９））。
【００１４】
キナーゼ活性は細胞周期中に変動する。ＣＤＣ７レベルは一定であるので、この変動はアクチベーター蛋白質の使用可能な量を反映すると考えられる（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９）；Ｊｉａｎｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１８、５７０３−５７１３（１９９９））。酵素の活性を調節することができる他の機構は現在まで認められていないが、完全に排除することはできない。
【００１５】
ＣＤＣ７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＤＣ７蛋白質と強い相同性を共有する５７４アミノ酸のポリペプチドである（Ｓａｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、４３４０−４３５１（１９９７）；Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４、１４３２０−１４３２５（１９９７）；Ｈｅｓｓら（１９９８）、Ｇｅｎｅ  ２１１、１３３−１４０）。ＤＢＦ４蛋白質は酵母相対物と非常に限られた配列相同性を持つ。この相同性は、ＡＳＫモチーフ−Ｎ（Ｎ末端）とＡＳＫモチーフ−Ｃ（Ｃ末端）と呼ばれる２つのボックス内に限定される。モチーフ−ＣはＣＤＣ７との相互作用ドメイン内にあるが、これらのボックスの役割は明らかではない（Ｋｕｍａｇａｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９、５０８３−５０９５（１９９９））。現時点では、これら２つのボックスはＤＢＦ４関連蛋白質の固有の特徴であると思われる。ＤＮＡ複製過程におけるＣＤＣ７／ＤＢＦ４蛋白質の重要性の故に、関連する機能又は構造を備え、ＣＤＣ７キナーゼ自体の活性を調節しうる遺伝子及び蛋白質を同定することは重要である。
【００１６】
本発明は、ヒトＤＢＦ４／ＡＳＫ１と機能的相同性を示す、ここでＤＲＦ１と称する新規ポリペプチドの予想外の発見、例えばＣＤＣ７キナーゼ活性を調節する際に鍵となる成分としてのその役割に関する。ＤＲＦ１は、それ故、ＤＲＦ１及び／又はＣＤＣ７キナーゼ活性を変化させる及び／又は制御することができる新規物質についての探索において有用である。本発明のこれらやその他の態様を下記に述べる。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は、一部には、配列番号１、又はそのフラグメント；配列番号２、又はそのフラグメント；配列番号１又は配列番号２の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列；配列番号１又は配列番号２に相同なヌクレオチド配列、又はそのフラグメント；配列番号３を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、あるいは配列番号３に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はそのフラグメントを含む単離核酸分子を対象とする。
【００１８】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを対象とする。
【００１９】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を対象とする。
【００２０】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを適合性宿主細胞に導入し、ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を増殖させて、宿主細胞からポリペプチドを回収することにより、配列番号３、あるいはその相同体又はフラグメントを含むポリペプチドを作製する方法を対象とする。
【００２１】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかと許容される担体又は希釈剤を含む組成物を対象とする。
【００２２】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかによってコードされる単離ポリペプチドを対象とする。
【００２３】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドと許容される担体又は希釈剤を含む組成物を対象とする。
【００２４】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離抗体を対象とする。
【００２５】
本発明はまた、上述した核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに結合する抗体と陰性対照抗体を含むキットを対象とする。
【００２６】
本発明はまた、免疫応答を誘導するのに十分な量のポリペプチドを哺乳類に投与することにより、哺乳類において上述した核酸分子のいずれかによってコードされるポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を対象とする。
【００２７】
本発明はまた、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体を化合物に接触させ、化合物がＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体に結合するかどうかを判定することにより、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体に結合する化合物を同定する方法を対象とする。
【００２８】
本発明はまた、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体をコードする核酸分子を化合物に接触させ、化合物が核酸分子に結合するかどうかを判定することにより、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体をコードする核酸分子に結合する化合物を同定する方法を対象とする。
【００２９】
本発明はまた、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体を化合物に接触させ、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体の活性が変化するかどうかを判定することにより、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体の活性を変化させる化合物を同定する方法を対象とする。
【００３０】
本発明はまた、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体を化合物に接触させ、化合物がＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体の活性を変化させる、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体に結合する、あるいはＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体をコードする核酸分子に結合するかどうかを判定することによって同定される、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１含有複合体の活性を変化させる化合物を対象とする。
【００３１】
本発明のこれらやその他の態様を下記でより詳細に説明する。
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、中でも特に、ＤＲＦ１又はその一部をコードする単離精製ポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、これらのベクターで形質転換した宿主細胞、ＤＲＦ１を作製する工程、上記のポリヌクレオチド及びベクターを使用する方法、単離精製したＤＲＦ１、及びＤＲＦ１活性を変化させる化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００３３】
この明細書全体を通じて様々な定義が為されている。大部分の語は、当業者がそれらの語に帰属させる意味を有する。本明細書中下記又は他の箇所で特に定義される語は、全体として本発明に関連して与えられ、また当業者によって典型的に理解されるような意味を持つ。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「活性」の語は、直接又は間接の結合を示唆する又は明らかにする；応答に影響を及ぼす、すなわち、例えば本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに直接結合するための化合物の親和性、あるいは例えば何らかの刺激又は事象後の上流又は下流蛋白質の量又は他の同様の機能の測定を含めて、何らかの暴露又は刺激に対する応答に測定可能な影響を与える、様々な測定可能な指標を指す。
【００３５】
本明細書で使用するとき、小文字の略語ｄｒｆ１は遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸配列を指し、大文字バージョンのＤＲＦ１は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド又はアミノ酸配列を指す。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「抗体」の語は、完全な無傷の抗体、及びそのＦａｂフラグメントとＦ（ａｂ）２フラグメントを指すことが意図されている。完全な無傷抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体のようなモノクローナル抗体を含む。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「結合」の語は、２つの蛋白質又は化合物あるいはその関連蛋白質又は化合物又はそれらの組合せの間での物理的又は化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用、等々を含む。物理的相互作用である結合は、直接又は間接のいずれであってもよく、間接結合とは、もう１つの蛋白質又は化合物の作用を通してであるか又はもう１つの蛋白質又は化合物の作用によるものである。直接結合は、もう１つの蛋白質又は化合物の作用を通して又はもう１つの蛋白質又は化合物の作用によって起こるのではなく、他の実質的な化学的中間体を伴わない相互作用を指す。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「化合物」の語は、低分子量分子、ペプチド、蛋白質、糖、ヌクレオチド、又は核酸を含むがこれらに限定されない、何らかの同定可能な化学物質又は分子を意味し、そのような化合物は天然又は合成のいずれでもよい。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「相補的」の語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン−クリック型塩基対合を指す。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「接触させる」の語は、直接又は間接的に、化合物を本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドに物理的に近接させることを意味する。ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、緩衝液、塩、溶液等々のいずれかの中に存在しうる。接触させることは、例えば、ＤＲＦ１又はそのフラグメントをコードする核酸分子又はポリペプチドを含む、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、又は遺伝子チップのようなマイクロアレイ、等に化合物を入れることを含む。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「相同ヌクレオチド配列」又は「相同アミノ酸配列」の語句、あるいはそのバリエーションは、ヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルで、配列番号１又は配列番号２の全体、あるいはコードされるポリペプチドの機能的ドメインをコードする配列番号１又は配列番号２の少なくとも一部分、あるいは配列番号３に対する少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性によって特徴付けられる配列を指す。相同ヌクレオチド配列は、ＤＲＦ１蛋白質のアイソフォームをコードする配列を含む。そのようなアイソフォームは、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同じ生物の異なる組織において発現されうる。あるいは、アイソフォームは異なる遺伝子によってコードされることもある。相同ヌクレオチド配列は、哺乳類を含むがそれに限定されない、ヒト以外の種のＤＲＦ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同ヌクレオチド配列はまた、ここで述べる、天然に起こる対立遺伝子変異及びヌクレオチド配列の突然変異を含むが、それらに限定されない。相同ヌクレオチド配列は、しかしながら、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同アミノ酸配列は、配列番号３における保存的アミノ酸置換、ならびにＣＤＣ７キナーゼ活性化作用を持つポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含む。相同アミノ酸配列は、しかしながら、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１のアミノ酸配列を含まない。パーセント相同性は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（その全体が参照してここに組み込まれる、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１、２、４８２−４８９）を使用する、デフォールト設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって決定することができる。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「単離」核酸分子の語は、その天然環境から移転された核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。単離核酸分子の例は、ベクター内に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞内に維持された組換えＤＮＡ分子、部分的又は実質的に精製された核酸分子、及び合成ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「変化させる」又は「修飾する」の語は、特定の活性又は蛋白質の量、質、又は作用の上昇又は低下を意味する。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」の語は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用されるのに十分な数の塩基を持つ一連の連結されたヌクレオチド残基を指す。この短い配列はゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づき（又はゲノム又はｃＤＮＡ配列から設計され）、特定細胞又は組織において同一、類似又は相補的ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅する、その存在を確認する、又は存在を明らかにするために使用される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド、多くとも約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５から３０ヌクレオチドを持つＤＮＡ配列の部分を含む。それらは化学的に合成され、プローブとして使用しうる。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「プローブ」の語は、用途に依存して変更しうる長さ、好ましくは少なくとも約１０から多くとも約６，０００ヌクレオチドの長さの核酸配列を指す。それらは同一、類似又は相補的核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは通常天然又は組換えソースから得られ、高度に特異的であって、オリゴマーよりもはるかに緩やかにハイブリダイズする。それらは一本鎖又は二本鎖で、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション膜ベース、又はＥＬＩＳＡ様テクノロジーにおいて特異性を持つように慎重に設計されうる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェント条件」の語は、その条件下でプローブ、プライマー、又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は配列依存的であり、種々の状況によって異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度とｐＨでの特定配列についての融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、（規定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が結合される。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的にはｐＨ７．０から８．３で約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン（又は他の塩）であって、温度が、短いプローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチド（例えば１０から５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤を加えて達成することもできる。
【００４７】
アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向へ、左から右に示している。アミノ及びカルボキシ基は配列中に示していない。ヌクレオチド配列は、５’から３’方向へ、左から右に一本鎖だけで示している。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されているように、又は（アミノ酸については）３文字コードによって示している。
【００４８】
本発明の１つの態様は、ＤＲＦ１をコードする新規ヌクレオチド配列を含む核酸分子を対象とする。核酸分子は好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであるが、ＲＮＡとＤＮＡの両方の単量体又はペプチド核酸単量体を含みうる。核酸分子は一本鎖又は二本鎖でありうる。核酸分子の単量体は、従来のホスホジエステル結合、又は例えばホスホロチオエート結合等のような修飾結合を通して連結されうる。さらに、単量体の糖部分は、例えばヌクレアーゼ耐性を付与するのを助ける及び／又は細胞取込みを助ける２’置換の付加によって修飾されうる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、核酸分子は配列番号１を含み、配列番号１は３００６塩基の長さであって、ＤＲＦ１をコードする約１８４５ヌクレオチド（配列番号１内の約１３９位から約１９８３位まで）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ヒトｄｂｆ４／ａｓｋ１  ｃＤＮＡと配列番号１のｄｒｆ１  ｃＤＮＡの比較は４２．８％の全体的配列相同性（同一残基）を示した。
【００５０】
代替的に、核酸分子は配列番号１のフラグメントを含む。好ましくは、フラグメントは、約１０から約１００ヌクレオチド、約１０１から約２００ヌクレオチド、約２０１から約３００ヌクレオチド、約３０１から約４００ヌクレオチド、約４０１から約５００ヌクレオチド、約５０１から約６００ヌクレオチド、約６０１から約７００ヌクレオチド、約７０１から約８００ヌクレオチド、約８０１から約９００ヌクレオチド、約９０１から約１０００ヌクレオチド、約１００１から約１１００ヌクレオチド、約１１０１から約１２００ヌクレオチド、約１２０１から約１３００ヌクレオチド、約１３０１から約１４００ヌクレオチド、約１４０１から約１５００ヌクレオチド、約１５０１から約１６００ヌクレオチド、約１６０１から約１７００ヌクレオチド、約１７０１から約１８００ヌクレオチド、約１８０１から約１９００ヌクレオチド、約１９０１から約２０００ヌクレオチド、約２００１から約２１００ヌクレオチド、約２１０１から約２２００ヌクレオチド、約２２０１から約２３００ヌクレオチド、約２３０１から約２４００ヌクレオチド、約２４０１から約２５００ヌクレオチド、約２５０１から約２６００ヌクレオチド、約２６０１から約２７００ヌクレオチド、約２７０１から約２８００ヌクレオチド、約２８０１から約２９００ヌクレオチド、約２９０１から約３０００ヌクレオチド、約３００１から約３００６ヌクレオチド、及びそれらの何らかの組合せを含む。フラグメントは配列番号１のいずれの部分内にも位置しうる。
【００５１】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、核酸分子は配列番号２を含み、配列番号２は１８４５塩基の長さであって、上述したＯＲＦ（配列番号１内の約１３９位から約１９８３位まで）を含む。代替的に、核酸分子は配列番号２のフラグメントを含む。好ましくは、フラグメントは、約１０から約１００ヌクレオチド、約１０１から約２００ヌクレオチド、約２０１から約３００ヌクレオチド、約３０１から約４００ヌクレオチド、約４０１から約５００ヌクレオチド、約５０１から約６００ヌクレオチド、約６０１から約７００ヌクレオチド、約７０１から約８００ヌクレオチド、約８０１から約９００ヌクレオチド、約９０１から約１０００ヌクレオチド、約１００１から約１１００ヌクレオチド、約１１０１から約１２００ヌクレオチド、約１２０１から約１３００ヌクレオチド、約１３０１から約１４００ヌクレオチド、約１４０１から約１５００ヌクレオチド、約１５０１から約１６００ヌクレオチド、約１６０１から約１７００ヌクレオチド、約１７０１から約１８００ヌクレオチド、約１８０１から約１８４５ヌクレオチド、及びそれらの何らかの組合せを含む。フラグメントは配列番号２のいずれの部分内にも位置しうる。
【００５２】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、核酸分子は配列番号１又は配列番号２の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子は、配列番号１又は配列番号２に列挙されている配列全体に相補的なヌクレオチド配列を含む。代替的には、配列番号１又は配列番号２の一部に相補的な（すなわち上述したフラグメントのいずれかに相補的な）ヌクレオチド配列を含む。配列番号１又は配列番号２の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列は、例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で配列番号１又は配列番号２の少なくとも一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む。好ましいオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチドから多くとも約５０ヌクレオチド、好ましくは約１５から３０ヌクレオチドを含む。それらは化学合成され、プローブ、プライマー、及びアンチセンス物質として使用できる。
【００５３】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、核酸分子は配列番号１又は配列番号２に相同なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２の全体に少なくとも約６０％相同、より好ましくは少なくとも約７０％相同、より好ましくは少なくとも約８０％相同、より好ましくは少なくとも約９０％相同、最も好ましくは少なくとも約９５％相同である。代替的には、ヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号２によってコードされるポリペプチドの機能的ドメインをコードする配列番号１又は配列番号２の部分に少なくとも約６０％相同、より好ましくは少なくとも約７０％相同、より好ましくは少なくとも約８０％相同、より好ましくは少なくとも約９０％相同、最も好ましくは少なくとも約９５％相同である。さらに、配列番号１又は配列番号２に相同なヌクレオチド配列はまた、上述した長さの配列番号１又は配列番号２に相同なヌクレオチド配列のフラグメントを含む。相同ヌクレオチド配列は、しかしながら、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１をコードするヌクレオチド配列を含まない。
【００５４】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号３を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。核酸分子は、好ましくは配列番号２を含むか、又は遺伝暗号の縮重を反映するコドン置換を有する配列番号２を含む。当該技術において既知であるように、遺伝暗号の縮重のために、配列番号２によってコードされるのと同じポリペプチドをコードすることができる数多くの他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子が存在する。本発明は、それ故、発現されたときに配列番号３のポリペプチドをコードする、これらの他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子を想定する。単に特定アミノ酸についてのコドンの変化によって特徴付けられる、ここで特定して開示するもの以外のＤＮＡ及びＲＮＡ分子は本発明の範囲内である。
【００５５】
当該技術において周知であるように、遺伝暗号の縮重のために、上述したｄｒｆ１遺伝子によってコードされるのと同じポリペプチドをコードすることができる数多くの他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子が存在する。本発明は、それ故、発現されたときに配列番号３のポリペプチドをコードする、それらの他のＤＮＡ及びＲＮＡ分子を想定する。ｄｒｆ１遺伝子によってコードされるアミノ酸残基配列が同定されているので、各々の特定アミノ酸残基についてのすべてのトリプレットコドンの知識をもってすれば、そのようなすべてのコードＲＮＡ及びＤＮＡ配列を述べることが可能である。単に特定アミノ酸についてのコドンの変化によって特徴付けられる、ここで特定して開示するもの以外のＤＮＡ及びＲＮＡ分子は本発明の範囲内である。
【００５６】
アミノ酸とそれらの代表的略語、符号及びコドンの表を下記の表１に示す。
【００５７】
【表１】
0005142115.tif 000002
【００５８】
当該技術において既知であるように、コドンはｍＲＮＡ分子においてヌクレオチドのトリプレット配列を構成し、それ自体は、塩基チミジン（Ｔ）（これはＤＮＡ分子中に存在する）に代わる塩基ウラシル（Ｕ）によって特徴付けられる。ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基についてのコドンの単純な変化は、コードされるポリペプチドの配列又は構造を変化させない。
【００５９】
代替的に、核酸分子は、配列番号３をコードするポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、フラグメントは、約５から約２０アミノ酸、約２１から約４０アミノ酸、約４１から約６０アミノ酸、約６１から約８０アミノ酸、約８１から約１００アミノ酸、約１０１から約１２０アミノ酸、約１２１から約１４０アミノ酸、約１４１から約１６０アミノ酸、約１６１から約１８０アミノ酸、約１８１から約２００アミノ酸、約２０１から約２２０アミノ酸、約２２１から約２４０アミノ酸、約２４１から約２６０アミノ酸、約２６１から約２８０アミノ酸、約２８１から約３００アミノ酸、約３０１から約３２０アミノ酸、約３２１から約３４０アミノ酸、約３４１から約３６０アミノ酸、約３６１から約３８０アミノ酸、約３８１から約４００アミノ酸、約４０１から約４２０アミノ酸、約４２１から約４４０アミノ酸、約４４１から約４６０アミノ酸、約４６１から約４８０アミノ酸、約４８１から約５００アミノ酸、約５０１から約５２０アミノ酸、約５２１から約５４０アミノ酸、約５４１から約５６０アミノ酸、約５６１から約５８０アミノ酸、約５８１から約６００アミノ酸、約６０１から約６１０アミノ酸、及びそれらの何らかの組合せを含む。フラグメントは配列番号３のいずれの部分内にも位置しうる。
【００６０】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号３に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。代替的には、核酸分子は、配列番号３に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、フラグメントは、約５から約２０アミノ酸、約２１から約４０アミノ酸、約４１から約６０アミノ酸、約６１から約８０アミノ酸、約８１から約１００アミノ酸、約１０１から約１２０アミノ酸、約１２１から約１４０アミノ酸、約１４１から約１６０アミノ酸、約１６１から約１８０アミノ酸、約１８１から約２００アミノ酸、約２０１から約２２０アミノ酸、約２２１から約２４０アミノ酸、約２４１から約２６０アミノ酸、約２６１から約２８０アミノ酸、約２８１から約３００アミノ酸、約３０１から約３２０アミノ酸、約３２１から約３４０アミノ酸、約３４１から約３６０アミノ酸、約３６１から約３８０アミノ酸、約３８１から約４００アミノ酸、約４０１から約４２０アミノ酸、約４２１から約４４０アミノ酸、約４４１から約４６０アミノ酸、約４６１から約４８０アミノ酸、約４８１から約５００アミノ酸、約５０１から約５２０アミノ酸、約５２１から約５４０アミノ酸、約５４１から約５６０アミノ酸、約５６１から約５８０アミノ酸、約５８１から約６００アミノ酸、約６０１から約６１０アミノ酸、及びそれらの何らかの組合せを含む。フラグメントは配列番号３のいずれの部分内にも位置しうる。
【００６１】
本発明において開示されるヌクレオチド配列情報の知識により、当業者は、当業者に既知であり、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）によって開示される様々な手段を通して、種々のソース（すなわち種々の組織又は種々の生物）からＤＲＦ１をコードするヌクレオチド配列を同定し、入手することができる。
【００６２】
例えば、ＤＥＦ１をコードするＤＮＡは、ここで提供するｄｒｆ１遺伝子配列情報から作製されるオリゴヌクレオチドプローブでｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡをスクリーニングすることによって入手しうる。プローブは、当業者に既知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによって述べられているような従来のハイブリダイゼーションアッセイで使用される手順に従って、蛍光群、放射性元素又は化学発光群のような検出可能な群で標識することができる。
【００６３】
上述したｄｒｆ１ヌクレオチド配列のいずれかを含む核酸分子は、代替的に、ここで提供するヌクレオチド配列から生成されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法の使用によって回収することができる。Ｍｕｌｌｉｓらへの米国特許第４，６８３，１９５号及びＭｕｌｌｉｓらへの米国特許第４，６８３，２０２号参照。ＰＣＲ反応は、その配列がそれまで精製されておらず、特定試料中に単一コピーしか存在しないときでも、特定核酸配列の濃度を選択的に高めるための方法を提供する。かかる方法は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを増幅するために使用できる。方法の骨子は、２つのオリゴヌクレオチドプローブを、所望する核酸分子の鋳型依存性のポリメラーゼを介した複製のためのプライマーとして使用することを含む。
【００６４】
極めて多様な代替的クローニング及びインビトロ増幅法が当業者に既知である。これらの手法の例は、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｅｒｇｅｒら、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）に認められる。
【００６５】
本発明の核酸分子及びそれらから誘導されるフラグメントは、ある種の疾患に関連する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）についてのスクリーニングのため、ならびに遺伝子マッピングのために有用である。
【００６６】
ＤＲＦ１をコードする本発明のヌクレオチド配列から誘導される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１又は配列番号２のフラグメント、あるいはそれらに相補的な配列は、様々な組織において遺伝子発現を探索するための診断ツールとして有用である。例えば、この酵素の天然発現又はそれに関連する病的状態を検討するための従来のオートラジオグラフィー手法により、検出可能な群を担うオリゴヌクレオチドプローブを用いて組織をインサイチューで探査することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列、等を含むがこれらに限定されない、配列番号１又は配列番号２の調節領域あるいはそれらに対応するｍＲＮＡを対象とする。
【００６７】
自動塩基配列決定法を使用してｄｒｆ１のヌクレオチド配列を入手又は確認した。本発明のｄｒｆ１ヌクレオチド配列は二本のＤＮＡ鎖について得られ、１００％正確であると考えられる。しかし、当該技術において知られているように、自動シークエンシング法によって得られるヌクレオチドは誤りを含むことがある。自動シークエンシング法によって決定されるヌクレオチド配列は、典型的には所与の核酸分子の実際のヌクレオチド配列に少なくとも約９０％、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術において既知の手動塩基配列決定法を用いてより正確に決定しうる。１個又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失をもたらす配列の誤りは、翻訳の際にフレームシフトを生じさせることがあり、その結果予想アミノ酸配列が、突然変異の点から始まる、核酸分子の実際のヌクレオチド配列から予想されるものとは異なることになる。
【００６８】
本発明のもう１つの態様は、上述した核酸分子のいずれかを含むベクター又は組換え発現ベクターを対象とする。ベクターは、ここではＤＲＦ１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するため及び／又はＤＲＦ１をコードするＤＮＡを発現するために使用される。好ましいベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子又はウイルス、及び組込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち相同的組換えによって宿主ゲノムに組込み可能なフラグメント）を含むが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子は、アデノウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスを含むが、これらに限定されない。好ましい発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むが、これらに限定されない。他の発現ベクターは、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び一連のＧａｔｅｗａｙ発現プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
好ましい発現ベクターは、ＤＲＦ１をコードするＤＮＡ配列が、適当な宿主においてＤＲＦ１の発現を実現することができる適当な制御配列に作動可能に連結されている、複製可能なＤＮＡ構築物である。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連するとき作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合にはコード配列に作動可能に連結されている。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要とせず、通常は複製起点によって与えられる、宿主において複製する能力、及び形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子だけを必要とする。発現ベクターにおける制御配列の必要性は、選択する宿主と選択する形質転換法に依存して異なる。一般に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を制御する配列を含む。
【００７０】
好ましいベクターは、好ましくは宿主生物によって認識されるプロモーターを含む。本発明のプロモーター配列は、原核生物、真核生物又はウイルスのいずれでもよい。適当な原核生物配列の例は、バクテリオファージλのＰＲ及びＰＬプロモーター（その全体が参照してここに組み込まれる、Ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９７３）；その全体が参照してここに組み込まれる、Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８０））、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショック、及びｌａｃＺプロモーター、及びＳＶ４０初期プロモーター（その全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｅｎｏｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８１、２９０、３０４−３１０）を含む。さらなるプロモーターは、マウス乳腺癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのロングターミナルリピート、マロネイウイルス、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタイン−バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、及びヒトメタロチオネインを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
さらなる調節配列も好ましいベクター内に含まれうる。適当な調節配列の好ましい例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子及びバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガーノに代表される。シャイン−ダルガーノ配列は、そのすぐ後にＤＲＦ１をコードするＤＮＡが続き、成熟ＤＲＦ１蛋白質の発現をもたらすと考えられる。
【００７２】
さらに、適当な発現ベクターは、形質転換した宿主細胞のスクリーニングを可能にする適切なマーカーを含みうる。選択した宿主の形質転換は当該技術の専門家に既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている様々な手法のいずれかを用いて実施される。
【００７３】
複製の起点はまた、外来性起点を含むベクターの構築によって提供されるか、又は宿主細胞の染色体複製機構によって提供されうる。ベクターを宿主細胞染色体に組み込む場合には、後者が十分であると考えられる。代替的には、ウイルスの複製起点を含むベクターを使用するのではなく、当業者は、選択マーカーとＤＲＦ１  ＤＮＡを用いる同時形質転換の方法によって哺乳類細胞を形質転換することができる。適当なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はチミジンキナーゼ（米国特許第４，３９９，２１６号参照）である。
【００７４】
ＤＲＦ１をコードするヌクレオチド配列は、ライゲーションのための平滑末端又は付着末端、適切な末端を提供する制限酵素消化、適宜に付着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び適切なリガーゼによるライゲーションを含めて、従来の手法に従ってベクターＤＮＡと組み換えることができる。そのような操作のための手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に開示されており、当該技術において既知である。哺乳類発現ベクターの構築のための方法は、例えば、各々その全体が参照してここに組み込まれる、Ｏｋａｙａｍａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３、３，２８０、Ｃｏｓｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６、２３、９３５、Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８４、３１２、７６８、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６号、及びＷＯ９１／１８９８２号に開示されている。
【００７５】
本発明のもう１つの態様は、上述した核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを有する形質転換宿主細胞を対象とする。発現ベクターが適切な宿主細胞に導入されたときにヌクレオチド配列の発現が起こる。本発明のポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、及び真核生物を含むが、これらに限定されない。原核生物発現ベクターを用いる場合には、適切な宿主細胞は、クローン化した配列を発現することができる原核細胞であろう。適当な原核細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
真核生物発現ベクターを用いる場合には、適切な宿主細胞は、クローン化した配列を発現することができる真核細胞であろう。好ましくは、真核細胞は高等真核生物の細胞である。適当な真核細胞は、ヒト以外の哺乳類の組織培養細胞及びヒト組織培養細胞を含むが、これらに限定されない。好ましい宿主細胞は、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞、及びマウス３Ｔ３線維芽細胞を含むが、これらに限定されない。細胞培養でのそのような細胞の増殖は常用手順となっている（その全体が参照してここに組み込まれる、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編集、（１９７３）参照）。
【００７７】
さらに、酵母宿主が宿主細胞として使用できる。好ましい酵母細胞は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、及びクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属を含むが、これらに限定されない。好ましい酵母宿主はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである。好ましい酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択マーカー遺伝子を含みうる。酵母と大腸菌における複製のためのシャトルベクターもここに包含される。
【００７８】
代替的に、昆虫細胞が宿主細胞として使用できる。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドはバキュロウイルス発現系を用いて発現される（各々その全体が参照してここに組み込まれる、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８、６，４７、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら（編集）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、及び米国特許第４，８７９，２３６号参照）。さらに、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が昆虫細胞での生産のために使用できる。
【００７９】
本発明のもう１つの態様は、上述した核酸分子又は組換え発現ベクターのいずれかと許容される担体又は希釈剤を含む、製薬組成物を含めた組成物を対象とする。好ましくは、担体又は希釈剤は製薬上許容される。適当な担体は、その全体が参照してここに組み込まれる、この分野の標準参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａ．Ｏｓｏｌの最新版に述べられている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例は、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。リポソーム及び不揮発性油のような非水性賦形剤も使用しうる。製剤は一般的に使用される手法によって滅菌される。
【００８０】
本発明のもう１つの態様は、上述した核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドを対象とする。本発明の好ましい実施形態では、単離ポリペプチドは配列番号３に示すアミノ酸配列を含む。ヒトＤＢＦ４／ＡＳＫ１と配列番号３のＤＲＦ１の比較は２２．１％の全体的配列相同性（同一残基）を示した。
【００８１】
代替的には、ポリペプチドは、配列番号３をコードするポリペプチドのフラグメントである。好ましくは、フラグメントは、約５から約２０アミノ酸、約２１から約４０アミノ酸、約４１から約６０アミノ酸、約６１から約８０アミノ酸、約８１から約１００アミノ酸、約１０１から約１２０アミノ酸、約１２１から約１４０アミノ酸、約１４１から約１６０アミノ酸、約１６１から約１８０アミノ酸、約１８１から約２００アミノ酸、約２０１から約２２０アミノ酸、約２２１から約２４０アミノ酸、約２４１から約２６０アミノ酸、約２６１から約２８０アミノ酸、約２８１から約３００アミノ酸、約３０１から約３２０アミノ酸、約３２１から約３４０アミノ酸、約３４１から約３６０アミノ酸、約３６１から約３８０アミノ酸、約３８１から約４００アミノ酸、約４０１から約４２０アミノ酸、約４２１から約４４０アミノ酸、約４４１から約４６０アミノ酸、約４６１から約４８０アミノ酸、約４８１から約５００アミノ酸、約５０１から約５２０アミノ酸、約５２１から約５４０アミノ酸、約５４１から約５６０アミノ酸、約５６１から約５８０アミノ酸、約５８１から約６００アミノ酸、約６０１から約６１０アミノ酸、及びそれらの何らかの組合せを含む。フラグメントは配列番号３のいずれの部分内にも位置しうる。
【００８２】
本発明のもう１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３に相同なアミノ酸配列又は上述したようなそのフラグメントを含む。本発明が、ここで述べるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに相同であり、且つ基本的に同じ生物学的特性を持つ蛋白質、すなわち変異体を包含することは明白である。この定義は、ここで述べるｄｒｆ１遺伝子のアイソフォーム及び天然の対立遺伝子変異体を包含することを意図している。これらの変異体形態は、例えば選択的スプライシング又は同じソース生物の異なる組織における異なる発現から生じうる。変異体形態は、例えばアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって特徴付けることができる。これに関して、配列番号３に少なくとも約７０％の配列相同性、少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは約９０％の配列相同性、より好ましくは約９５％の配列相同性、最も好ましくは約９８％の配列相同性を持つアミノ酸配列を含む変異体形態は本発明に包含されることが想定されている。好ましい相同ポリペプチドは、配列番号３に比べて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸の「挿入」、「置換」又は「欠失」は、アミノ酸配列への変化又はアミノ酸配列内の変化である。個々のアミノ酸配列において認められる変異は、合成によってペプチドを生成するか、又は組換えＤＮＡ手法を用いてｄｒｆ１配列においてヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を体系的に創造することによって実験的に決定しうる。
【００８３】
天然に生じるアミノ酸配列の変更は、多くの既知の手法のいずれかによって実施できる。例えば、各々その全体が参照してここに組み込まれる、Ｗａｌｄｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９８６、４２、１３３、Ｂａｕｅｒら、Ｇｅｎｅ，１９８５、３７，７３、Ｃｒａｉｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８５年１月、ｐ．１２−１９、Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）、ならびに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号に述べられている、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発のような当業者に既知の手順によって特定の位置でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに突然変異を導入することができる。
【００８４】
好ましくは、本発明のＤＲＦ１変異体は、天然に生じるＤＲＦ１ポリペプチドの生物活性を実質的に示す。「天然に生じるＤＲＦ１ポリペプチドの生物活性を実質的に示す」とは、本発明の範囲内のＤＲＦ１変異体が保存的に置換された配列を含みうること、すなわちＤＲＦ１ポリペプチドの１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、ＤＲＦ１ポリペプチドの二次及び／又は三次構造を変化させない異なる残基で置換されていることを意味する。そのような置換は、１個の脂肪族残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ）をもう１つの脂肪族残基で置換すること、あるいは塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、又は芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間の置換のような、同様の物理化学的特性を持つ残基によるアミノ酸の置換を含みうる。表現型上サイレントのアミノ酸交換を行うことについてのさらなる情報は、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０、２４７、１３０６−１３１０に認められる。ＤＲＦ１の生物活性を実質的に保持すると考えられる他のＤＲＦ１変異体は、アミノ酸置換が蛋白質の機能的領域の外側部分で生じたものである。
【００８５】
そのような宿主細胞において発現されるポリペプチドはまた、異種蛋白質からの領域を含む融合蛋白質でありうる。そのような領域は、例えばポリペプチドの分泌、改善された安定性、又は精製の容易さを可能にするために含めることができる。例えば、適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。ポリペプチドがシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳されるように、シグナルペプチドについてのＤＮＡ配列（分泌リーダー）をポリヌクレオチド配列にフレーム内融合しうる。意図する宿主細胞において機能性であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。好ましくは、シグナル配列は、細胞からポリペプチドが分泌される際にポリペプチドから開裂される。従って、ＤＲＦ１のＮ末端が担体ペプチドに融合している好ましい融合蛋白質を生成することができる。
【００８６】
１つの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの精製を容易にするために使用される異種領域を含む融合蛋白質を含む。そのような機能のために使用される入手可能なペプチドの多くは、結合パートナーへの融合蛋白質の選択結合を可能にする。好ましい結合パートナーはプロテインＡの１又はそれ以上のＩｇＧ結合ドメインを含み、例えばＩｇＧ結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィーによって容易に均質に精製される。代替的には、多くのベクターが、標的蛋白質のＮ末端又はＣ末端で発現されうるヒスチジン残基の伸長を担うという利点を持つ。そこで、対象蛋白質を金属キレート化クロマトグラフィーによって回収することができる。エンテロキナーゼ、第Ｘ因子、あるいはプロコラゲナーゼ又はトロンビンのような蛋白質分解酵素についての認識部位をコードするヌクレオチド配列は、融合蛋白質の開裂によって成熟ＤＲＦ１蛋白質が得られるようにＤＲＦ１についての配列の直前に存在しうる。融合パートナーのさらなる例は、酵母第Ｉ因子、ｓｆ９昆虫細胞におけるミツバチメラチンリーダー、６−Ｈｉｓタグ、チオレドキシンタグ、赤血球凝集素タグ、ＧＳＴタグ、及びＯｍｐＡシグナル配列タグを含むが、これらに限定されない。当業者には理解されるように、ペプチドを認識し、それに結合する結合パートナーは、金属イオン（例えば金属アフィニティーカラム）、抗体、又はそのフラグメント、及びＦＬＡＧタグのようなペプチドに結合する何らかの蛋白質又はペプチドを含めて、いかなる分子又は化合物であってもよい。
【００８７】
本発明のポリペプチドは、それに対する抗体を惹起するための抗原として使用でき、またＤＲＦ１の活性を変化させる化合物をスクリーニングするために使用できる。ＤＲＦ１はまた、組成物において使用することができる。従って、本発明は、薬剤として使用するための本発明に従ったＤＲＦ１又は抗体、ならびに癌のような制御できない細胞増殖によって引き起こされる疾患を対象とする薬剤の製造における該分子の使用に関する。本発明に従って薬剤として使用される分子は、ここで述べるポリペプチド又は抗体、ならびにここで述べるスクリーニング法において同定される何らかの新規物質でありうる。
【００８８】
もう１つの態様では、本発明は、関連する天然パターンのグリコシル化、アシル化、シアリル化、又は他の翻訳後修飾を伴う又は伴わないＤＲＦ１ポリペプチドを提供する。酵母、昆虫又は哺乳類発現系において発現されるＤＲＦ１（下記で述べる）は、分子量とグリコシル化パターンにおいて天然のＤＲＦ１ポリペプチドと同様であるか、又は有意に異なっていてもよい。言うまでもなく、細菌発現系におけるＤＲＦ１の発現は非グリコシル化ＤＲＦ１を生じる。
【００８９】
本発明のもう１つの態様は、上述したポリペプチドのいずれかと許容される担体又は希釈剤を含む、製薬組成物を含めた組成物を対象とする。好ましくは、担体又は希釈剤は製薬上許容される。上述したようなポリペプチドを含む組成物は、例えば抗体形成を誘導するため、そして例えばワクチンの調製における使用のために免疫応答を誘導するのに使用できる。
【００９０】
本発明のもう１つの態様は、上述した組換え発現ベクターのいずれかを適合性宿主細胞に導入し、ポリペプチドの発現のための条件下で宿主細胞を増殖させて、宿主細胞からポリペプチドを回収することを含む、配列番号３を含むポリペプチド、あるいはその相同体又はフラグメントを生成する方法を対象とする。真核生物系は、例えばグリコシル化、カルボキシ末端のアミド化、ある種のアミノ酸残基の酸化又は誘導体化、立体配座制御、等々をもたらす多様なプロセシング機構を提供することから、好ましい。
【００９１】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離形態で提供され、好ましくは実質的に精製されており、最も好ましくは均一に精製されている。好ましくは宿主細胞を溶解し、宿主細胞の溶解産物からポリペプチドを回収する。代替的には、好ましくは宿主細胞を溶解せずに、宿主細胞から細胞培地を精製することによってポリペプチドを回収する。ポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めて、既知の方法によって組換え細胞培養から回収し、精製することができる。
組換え手法によってこれらの蛋白質を生産することに加えて、自動アミノ酸シンセイサイザーもＤＲＦ１ポリペプチド、あるいはそのフラグメント又は相同蛋白質を生成するために使用しうる。
【００９２】
本発明のもう１つの態様は、ここで述べるポリペプチドのいずれかのエピトープに結合する１又はそれ以上の抗体を対象とする。好ましくは、抗体は配列番号３内のエピトープに結合する。本発明に従った抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり、天然に生じる（完全長）形態と組換え形態の両方の、個体、対立遺伝子、系統又は種変異体、あるいはそれらのフラグメントを含みうる。さらに、抗体は、天然の立体配置又は非天然立体配置の本発明の蛋白質に対して惹起される。抗イディオタイプ抗体も作製することができる。本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ、及び抗体そのものも、ポリペプチドの単離と精製において有用である。それに加えて、抗体はＤＲＦ１活性の特異的阻害因子であると考えられる。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、既知の手法と容易に入手可能な出発物質を用いて天然ソースから蛋白質を精製するために使用できる。そのような抗体はまた、組換えＤＮＡ法によって蛋白質を生産するときに存在する物質から蛋白質を精製するためにも使用できる。
【００９３】
抗体を作製する多くの方法が当業者に既知である。モノクローナル抗体を調製するための手法については、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｓｔｉｉｔｅｓら（編集）、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、及びその中で引用される参考文献参照。ファージ又は同様のベクターにおける組換え抗体のライブラリー選択に関わる手法は、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９、２４６、１２７５−１２８１に述べられている。抗体の作製、及び完全な無傷の抗体、Ｆａｂフラグメント及びＦ（ａｂ）２フラグメントの蛋白質構造、ならびにそのような分子をコードする遺伝子配列の構築は既知であり、また例えば、参照してここに組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．とＤ．Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記述されている。簡単に述べると、例えば、本発明のポリペプチドをマウスに注入する。マウスの脾臓を切除し、脾細胞を単離して不朽化マウス細胞と融合する。ハイブリッド細胞又はハイブリドーマを培養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、ポリペプチドに特異的に結合することが認められれば、それらを産生するハイブリドーマを培養して抗体の継続的供給をもたらす。
【００９４】
本発明はまた、医薬キットを含めたキットを対象とする。キットは、上述した核酸分子のいずれか、上述したポリペプチドのいずれか、又は上述したような本発明のポリペプチドに結合する何らかの抗体、ならびに陰性対照を含みうる。キットは好ましくは、例えば指示書、保持体、数量化のために役立つ試薬、等のような付加成分を含む。
【００９５】
本発明のもう１つの態様は、免疫応答を誘導するのに十分な量の本発明のポリペプチドを哺乳類に投与することにより、哺乳類において本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法を対象とする。その量は動物の種、動物の大きさ、等に依存するが、当業者によって決定されうる。
【００９６】
本発明の下記の実施形態は、本発明のポリペプチド及び核酸の使用の他のいくつかの方法に関する。これに関して、「ＤＲＦ１」の語は、ＤＲＦ１ポリペプチド（又は小文字で書かれている場合にはそれをコードする核酸）それ自体か、又はＤＲＦ１がもう１つ別の分子（ポリペプチド又は核酸）と物理的に結合して生物学的に活性な複合体を形成しているＤＲＦ１含有複合体のいずれかを指すと解釈されねばならない。また、複合体の生物活性は複合体そのものの各々の成分の活性とは異なる場合がある点にも留意すべきである；しかし、ここで下記に開示する使用法はこれが起こった場合も影響を受けず、ＤＲＦ１単独ならびにＤＲＦ１含有複合体の両方について言及される。そのような複合体の、限定ではないが代表的な例は、本特許明細書の実施例の章に示されているように生理的ＣＤＣ７キナーゼ基質へのキナーゼ活性を備える、ＤＲＦ１−ＣＤＣ７複合体によって構成される。
【００９７】
それ故、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１をコードする核酸分子を化合物に接触させ、化合物がＤＲＦ１又はＤＲＦ１をコードする核酸分子に結合するかどうかを判定することを含む、ＤＲＦ１又はＤＲＦ１をコードする核酸分子のいずれかに結合する化合物を同定する方法が本発明のもう１つの態様である。結合は、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹに述べられている、ゲルシフト分析、ウエスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージベースの発現クローニング、クロマトグラフィーによる同時分別（ｃｏ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、共沈、架橋、相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析、サウスウエスタン分析、ＥＬＩＳＡ、等を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の結合アッセイによって判定できる。スクリーニングする化合物は（ＤＲＦ１又はＤＲＦ１をコードする核酸分子に結合すると考えられる化合物を含みうる）、細胞外、細胞内、生物学的又は化学的由来のものを含むが、これらに限定されない。そのような試験で用いるＤＲＦ１ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中に遊離しているか、保持体に結合しているか、細胞表面上に存在するか又は細胞内に位置していてもよい。当業者は、例えば、ＤＲＦ１と試験する化合物間での複合体の形成を測定することができる。代替的には、当業者は、試験する化合物によって引き起こされるＤＲＦ１とその基質間での複合体形成の低下を調べることができる。
【００９８】
本発明のもう１つの態様は、ＤＲＦ１を化合物に接触させ、化合物がＤＲＦ１の活性を変化させるかどうかを判定することを含む、ＤＲＦ１の活性を変化させる（すなわち上昇させるか又は低下させる）化合物を同定する方法を対象とする。被験化合物の存在下での活性を被験化合物なしでの活性と比較する。被験化合物を含む試料の活性が被験化合物を含まない試料における活性よりも高い場合には、化合物は活性を上昇させる。同様に、被験化合物を含む試料の活性が被験化合物を含まない試料における活性よりも低い場合には、化合物は活性を阻害する。
【００９９】
本発明は、様々な薬剤スクリーニング手法のいずれかにおいてＤＲＦ１を使用することによって化合物をスクリーニングするために特に有用である。スクリーニングする化合物は（ＤＲＦ１活性を変化させると考えられる化合物を含みうる）、細胞外、細胞内、生物学的又は化学的由来のものを含むが、これらに限定されない。そのような試験で用いるＤＲＦ１ポリペプチドはいかなる形態であってもよいが、好ましくは、溶液中に遊離しているか、保持体に結合しているか、細胞表面上に存在するか又は細胞内に位置しうる。当業者は、例えば、ＤＲＦ１と試験する化合物間での複合体の形成を測定することができる。代替的には、当業者は、試験する化合物によって引き起こされるＤＲＦ１とその基質間での複合体形成の低下を調べることができる。
【０１００】
本発明のＤＲＦ１ポリペプチドの活性は、例えば、被験化合物の存在下と不在下での、キナーゼ活性の検定、細胞増殖測定及びＤＮＡ複製活性によって決定することができる。これらの測定は、例えば：ＪｉａｎｇとＨｕｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９７）、９４、１４３２０−１４３２５；ＨｕｎｔｅｒとＳｅｆｔｏｎ［編集者］、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９１）、２００、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍｅｌｖｉｎ  Ｉ．及びＤｕｎｐｈｙ，ＷＧ．［編集者］、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９７）、２８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｐａｇａｎｏ，Ｍ．［編集者］、Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、（１９９５）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹの中で述べられているように実施できる。
【０１０１】
例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒ．ＥｉｓｅｎｔｈａｌとＭ．Ｊ．Ｄａｎｓｏｎ編集、１９９２、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられている、光度測定、放射分析、ＨＰＬＣ、電気化学、等を含むがこれらに限定されない他のアッセイも、酵素活性を調べるために使用できる。
【０１０２】
本発明の好ましい実施形態では、ＤＲＦ１活性を変化させる化合物をスクリーニングする方法は、化合物をＤＲＦ１に接触させ、化合物とＤＲＦ１間の複合体の存在に関して検定することを含む。そのようなアッセイでは、典型的にはＤＲＦ１を標識する。適当なインキュベーション後、結合形態で存在するものから遊離ＤＲＦ１を分離し、遊離標識又は複合体化していない標識の量が、特定化合物がＤＲＦ１に結合する能力の測定値である。
【０１０３】
本発明のもう１つの実施形態では、ＤＲＦ１に対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高流量スクリーニングを用いる。簡単に述べると、多数の異なる低分子量ペプチド被験化合物を固体基質上で合成する。ペプチド被験化合物をＤＲＦ１と接触させ、洗浄する。その後当該技術において既知の方法によって結合ＤＲＦ１を検出する。
【０１０４】
本発明の精製ポリペプチドはまた、上述した薬剤スクリーニング手法における使用のためにプレートに直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体を使用して蛋白質を捕獲し、それを保持体上に固定化することができる。
【０１０５】
本発明の他の実施形態は、本発明のポリペプチドに結合することができる中和抗体がポリペプチドへの結合に関して被験化合物と特異的に競合する、競合的スクリーニングアッセイを使用することを含む。このように、抗体は、ＤＲＦ１と１又はそれ以上の抗原決定基を共有する何らかのペプチドの存在を検出するために使用できる。放射性標識競合結合試験は、その開示全体が参照してここに組み込まれる、Ａ．Ｈ．Ｌｉｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，１９９７、第４１巻、Ｎｏ．１０、ｐ．２１２７−２１３１に述べられている。
【０１０６】
本発明の他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、相互作用性の調節蛋白質の同定、特性指摘及び精製のための研究ツールとして使用される。当該技術において既知の様々な方法によって適切な標識を本発明のポリペプチドに組み込み、ポリペプチドを使用して相互作用性分子を捕獲する。例えば、分子を標識ポリペプチドと共にインキュベートし、洗浄して非結合ポリペプチドを除去し、ポリペプチド複合体を定量する。種々の濃度のポリペプチドを使用して得られたデータを用いて、ポリペプチドの数、親和性、及び蛋白質複合体との結合に関する数値を算定する。
【０１０７】
標識ポリペプチドはまた、阻害因子を含むがこれに限定されない、ポリペプチドが相互作用する分子の精製のための試薬としても有用である。アフィニティー精製の１つの実施形態では、ポリペプチドをクロマトグラフィーカラムに共有結合する。細胞とその膜を抽出し、様々な細胞サブコンポーネントをカラムに通過させる。分子はポリペプチドへの親和性によってカラムに結合する。ポリペプチド−複合体をカラムから回収し、解離して、回収した分子を蛋白質配列決定に供する。次にこのアミノ酸配列を使用して、捕獲した分子を同定する又は適切なｃＤＮＡライブラリーから対応する遺伝子をクローニングするための縮重オリゴヌクレオチドを設計することができる。
【０１０８】
代替的に、本発明のＤＲＦ１と類似した特性を示すが、より小さく、ヒト又は動物の体内でＤＲＦ１よりも長い半減期を示す化合物を同定することができる。有機化合物を設計するとき、本発明に従った分子を「先導（ｌｅａｄ）」化合物として使用する。既知の製薬上活性な化合物の模倣物質の設計は、そのような「先導」化合物に基づく薬剤開発における既知のアプローチである。模倣物質の設計、合成及び試験は一般に、標的特性に関して数多くの分子を無作為にスクリーニングすることを回避するために使用される。さらに、本発明のＤＮＡによってコードされる演繹アミノ酸配列の分析から生じる構造データは、より特異的な、それ故より高い薬理学的効力を備えた新しい薬剤を設計するために有用である。
【０１０９】
本発明の蛋白質配列と入手可能なすべてのデータベースに存在する配列との比較は、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１のＮ末端モチーフ及びＣ末端モチーフに関して有意の相同性を示した。従って、他のＤＢＦ４／ＡＳＫ１のＮ末端モチーフ及びＣ末端モチーフドメイン蛋白質の入手可能な情報に基づいて本発明の蛋白質の推定三次構造を開発するためにコンピュータモデリングが使用できる。それ故、ＤＲＦ１の予想される構造に基づいて新しい酵素阻害因子を設計することができる。
【０１１０】
特定実施形態では、本発明に従ったスクリーニング方法によって同定される新規分子は低分子量の有機分子であり、その場合、その組成物又は製薬組成物は錠剤のような経口摂取用に調製することができる。ここで述べるスクリーニング法によって同定される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体及び化合物を含む組成物、又は製薬組成物は、経口、静脈内、経皮、皮下、鼻、筋肉内又は腹腔内を含むがこれらに限定されないいかなる投与経路用にも調製することができる。担体又は他の成分の性質は、個々の投与経路及び投与する本発明の個々の実施形態に依存する。これに関して有用な手法及びプロトコールの例は、中でも特に、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ（編集）、１９８０に認められる。
【０１１１】
これらの低分子量化合物の用量は、治療する疾患の状態又は条件、及びヒト又は動物の体重や状態のような他の臨床要素、及び化合物の投与経路に依存する。ヒト又は動物を治療するためには、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から５００ｍｇ／ｋｇ体重の化合物が投与できる。治療は典型的にはより低い用量で投与され、所望する治療結果が認められるまで継続される。
【０１１２】
本明細書で述べるスクリーニング方法によって同定される核酸分子、ポリペプチド、抗体、化合物を含めて、本発明の化合物及び方法は様々な医薬適用を有しており、例えば癌細胞及び腫瘍成長のような制御不能の細胞増殖を治療する又は予防するために使用しうる。遺伝子治療手順の総説については、例えば、その全体が参照してここに組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２、２５６、８０８−８１３参照。
【０１１３】
本発明を明らかにすることを意図する下記の実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の範囲を限定することを意図しておらず、また本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本発明がここで特定して述べられている以外のやり方でも実施しうることは明らかであろう。ここでの教示に照らして本発明の数多くの修正及び変法が可能であり、それ故、本発明の範囲内に包含される。
【０１１４】
下記に示す実施例１、２、３、４、５、６及び７は実際のものであるが、実施例８、９及び１０は予言的である。下記の実施例において、「ＤＲＦ１（含有）複合体」はＤＲＦ１とＣＤＣ７の複合体を表わす。
【０１１５】
添付の図面において：
図１は、種々の組織におけるｄｒｆ１  ｍＲＮＡの発現を分析するための一連のノーザンブロットである。詳細については実施例３参照。
【０１１６】
図２は、ＤＲＦ１がＣＤＣ７と相互作用することを明らかにするウエスタンブロット分析を示す。詳細については実施例４参照。
【０１１７】
図３は、ＤＲＦ１が哺乳類細胞においてＣＤＣ７キナーゼを活性化することを明らかにしている：ＤＲＦ１の存在下で、ＣＤＣ７はその生理的基質ＭＣＭ２をリン酸化することができる。詳細については実施例５参照。
【０１１８】
図４は、免疫蛍光顕微鏡検査によって証明されるように、哺乳類細胞におけるＤＲＦ１の細胞内局在を示す。Ａ、抗ＨＡ免疫染色；Ｂ、ＤＡＰＩ染色；Ｃ、ＡとＢの二重焼付け（併合）。詳細については実施例６参照。
【０１１９】
図５ＡからＣは、細胞周期中のＤＲＦ１発現のレベルを調べるために実施したフローサイトメトリー分析を示す。詳細については実施例７参照。
【０１２０】
図６は、ノーザンブロットによるｄｒｆ１  ｍＲＮＡ発現の分析である。Ｔはチミジンブロック、Ｎはノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）ブロックを表わし、レーンの上部の数字は遮断の解放後の時間（時）を示す。
【０１２１】
実施例
実施例１：ヒトＤＢＦ４／ＡＳＫ１の相同体の同定
ｄｂｆ４／ａｓｋ１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（アクセス番号ＡＦ１６０２４９及びＮＭ００６７１６）、又はそれから演繹されるアミノ酸配列を、ＬＧｔｅｍｐｌａｔｅｓＦＥＢ２０００データベースのＩｎｃｙｔｅ特許データベースに対する問い合わせ配列として使用した。これまでに同定され、注釈された配列を含むこのデータベースを、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（その全体が参照してここに組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７、２５，３３８９）を用いて類似性の領域に関して検索した。
【０１２２】
簡単に述べると、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを表わすＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列の類似性を決定するのに適している（その全体が参照してここに組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０、２１５，４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手しうる。このアルゴリズムは、最初に、データベース中の同じ長さのワードと整列したとき何らかの正の閾値のスコアＴに適合する又はそれを満たす問い合わせ配列内の長さＷの短いワードを同定することによって高いスコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近接ワードのヒットがそれらを含むＨＳＰを検出するための検索を開始する種子（ｓｅｅｄ）として働く。ワードヒットを累積整列スコアが増加しうる限り各々の配列に沿って両方向に伸長する。１）累積整列スコアがその最大達成値からＸ量だけ低下する；２）１又はそれ以上の負のスコア残基の整列の蓄積のために累積スコアがゼロ又はそれ以下になる；又は３）いずれかの配列の末端に達するとき、各方向のワードヒットについての伸長を停止する。Ｂｌａｓｔアルゴリズムパラメータ、Ｗ、Ｔ及びＸは整列の感受性と速度を決定する。Ｂｌａｓｔプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（その全体が参照してここに組み込まれる、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、１０９１５−１０９１９参照）、５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、＝４、及び二本鎖の比較をデフォールトとして使用する。
【０１２３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズム（その全体が参照してここに組み込まれる、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、５８７３−５７８７）及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は最小総和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、被験核酸をｄｒｆ１核酸と比較した最小総和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸はｄｒｆ１遺伝子又はｃＤＮＡに類似しているとみなされる。
【０１２４】
ＬＧｔｅｍｐｌａｔｅｓＦＥＢ２０００データベースでの相同性検索をＢＬＡＳＴプログラムバージョン２．０．１０で実施した。ＡＳＫ１／ＤＢＦ４ポリペプチド配列を問い合わせ配列として使用して特許Ｉｎｃｙｔｅデータベースを検索した。非常に低いスコア（１０−８未満のＥ値）を持つ２つのＩｎｃｙｔｅ鋳型を同定した。２つの鋳型（番号１５０２１０．１及び１４３４５８．１と同定した）は、Ｉｎｃｙｔｅによって「Ｉｎｃｙｔｅユニーク」と分類され、これは全く注釈がなされないことを意味した。Ｉｎｃｙｔｅ「鋳型」とは、オーバーラップ配列タグに基づいてコンピュータ構築された配列を表わし、「鋳型」は必ずしも物理的クローンとして存在するわけではない。
【０１２５】
非常に低スコアであるにもかかわらず、鋳型１４３４５８．１は、蛋白質レベルで、ヒトＤＢＦ４／ＡＳＫ１のＣ末端ドメイン内で４０．５％の類似性と３３．３％の同一性を示した。このドメインは様々な種のすべてのＤＢＦ４／ＡＳＫ１蛋白質間で非常に良好に保存されており、ＣＤＣ７への結合の役割を担うことを明らかにした。
【０１２６】
他方の鋳型、１５０２１０．１の翻訳物は、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１のＮ末端部分内で配列類似性を示した。この領域も同様にＤＢＦ４／ＡＳＫ１ファミリー内で保存されており、ＢＲＣＴドメインとして知られている。ＢＲＣＴドメインは乳癌感受性遺伝子１産物（ＢＲＣＡ）、ならびに転写調節、ＤＮＡ修復、組換え及び細胞周期制御に関わるいくつかの蛋白質において認められる。ＣＤＣ７−ＤＢＦ４はこのドメインを利用してその下流標的を特定するのであろうと提議されている。ＢＬＡＳＴ検索における非常に低いスコアにもかかわらず、１５０２１０．１鋳型も、蛋白質レベルで、ＤＢＦ４／ＡＳＫ１のＮ末端部分と非常に高い配列類似性を示す（５２．６％の類似性、３７．２％の同一性）。
【０１２７】
Ｎ末端とＣ末端ドメインはＤＢＦ４／ＡＳＫ１蛋白質において常に一緒に認められるので、我々は、それらが同じ遺伝子の一部であり、新しい遺伝子は新しいヒトＤＢＦ４／ＡＳＫ１相同体を構成しうるという仮説を立てた。
【０１２８】
２つの同定された鋳型が同じ遺伝子に属することを確認するため、ゲノム配列のデータベースに対するＴＢＬＡＳＴＮ検索を実施した。我々は、両方の鋳型を含む公開構築されたゲノムクローンを同定した。２つのＩｎｃｙｔｅ鋳型はどちらも染色体１７番のクローン２９６Ｋ１上に位置する。二本のＤＮＡ鎖上で完全、部分及び複数遺伝子を同定することができる遺伝子検出アルゴリズム、ＧＥＮＳＣＡＮを用いて、クローンのエクソン−イントロン境界予測を実施した。このプログラムは遺伝子構造／組成特性の確率モデルに基づいており、蛋白質配列相同性情報を使用しない（Ｂｕｒｇｅ，Ｃ．＆  Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，１９９７、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８，７８−９４）。
【０１２９】
予想されるエクソンをｃＤＮＡライブラリーに関するＰＣＲ分析によって構築し、それによって２つの領域が同じ遺伝子の部分であることを明らかにした（実施例２参照）。
【０１３０】
Ｉｎｃｙｔｅ  ＬＩＦＥＳＥＱ  ＧＯＬＤデータベース（２０００年２月発売）から２つの部分的ｃＤＮＡ分子、Ｉｎｃｙｔｅクローン４７７０４２（配列番号４）及びＩｎｃｙｔｅクローン３０５１５２８（配列番号５）を完全に配列決定した。
【０１３１】
クローン３０５１５２８は１５０２１０．１鋳型の５’配列の大部分である。クローン４７７０４２の５’末端は部分的にクローン３０５１５２８とオーバーラップする。クローン４７７０４２は約６００アミノ酸のオープンリーディングフレームを含むが、開始メチオニンコドンを欠く。クローン３０５１５２８は５’非翻訳配列、ＡＴＧ開始及びクローン４７７０４２で認められるＯＲＦの開始配列を含む。しかし、クローン３０５１５２８は、小さな挿入とＯＲＦを破壊する２つの大きなギャップを含み、それ故このクローンは有効なオープンリーディングフレームを含まない。
【０１３２】
２つのクローンのいずれもが完全長ｃＤＮＡ配列を含まず、またどちらも完全なオープンリーディングフレームを含まない。
【０１３３】
実施例２：ｄｒｆ１  ｃＤＮＡのクローニング
ＡＢ１３７７蛍光ベースシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＰＥ／ＡＢＤ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｒｅａｄｙ  Ｄｙｅ−Ｄｅｏｘｙ  ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒキットとＴａｑ  ＦＳポリメラーゼを使用してｃＤＮＡを直接配列決定した。各々のＡＢＩサイクルシークエンシング反応は約０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含んだ。サイクルシークエンシングは、９８℃で１分間の初期変性、次いで９８℃で３０秒間を５０サイクル、５０℃で３０秒間のアニーリング、そして６０℃で４分間の伸長を用いて実施した。温度サイクルと時間はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９６００熱循環器によって管理した。Ｃｅｎｔｒｉｆｌｅｘゲルろ過（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して伸長産物を精製した。各反応産物をピペットでカラムに充填し、それを揺動バケット遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ型ＲＴ６０００Ｂテーブルトップ遠心分離）において室温で４分間、１５００×ｇで遠心分離した。カラム精製した試料を真空下で約４０分間乾かし、次に５μｌのＤＮＡ負荷溶液（８３％脱イオンホルムアミド、８．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び１．６ｍｇ／ｍｌ  Ｂｌｅｕ  Ｄｅｘｔｒａｎ）に溶解した。その後試料を３分間９０℃に加熱し、ＡＢＩ３７７シークエンサーによる配列分析のためにゲル試料ウエルに充填した。ＧｅｎｅＷｏｒｋｓプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ）にファイルを取り込んで配列分析を実施した。一般に、５００ｂｐの配列読み取りが得られた。両方のＤＮＡ鎖から配列情報を得ること、及び配列決定上のすべての不明瞭性が排除されるまで様々な位置でプライマーを使用して難しい領域を再配列決定することにより、潜在的な配列決定の誤りを最小限に抑えた。生じた完全長ｃＤＮＡの配列を配列番号１に示す。
【０１３４】
完全長ｄｒｆ１  ｃＤＮＡを構築するため、１３８ヌクレオチドの非翻訳領域及び１３９位の開始コドンを含む大部分の５’配列のＰＣＲフラグメントを、大部分の５’配列を除くすべてのｄｒｆ１  ｃＤＮＡ配列を含むＩｎｃｙｔｅクローン４７７０４２に挿入した。詳細には、ｄｒｆ１  ｃＤＮＡフラグメントをｃＤＮＡライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅した。５０μｌのＰＣＲ反応混合物は、ポリメラーゼ混合物（０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液及び０．７５μｌ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、１μｇの３２０６４９１プラスミド、及び５０ｐｍｏｌの正プライマー、５’−ＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号６）及び５０ｐｍｏｌの逆プライマー、５’−ＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号７）及び５μｌのヒト精巣組織又はＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ＰＣＲ  ｒｅａｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を含んだ。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＥ９７００熱循環器において次のプログラムを使用して増幅を行った：９５℃で１５秒間、５９℃で３０秒間及び７２℃で２４０秒間；３２サイクル反復。生じた６３４ｂｐ長の増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製して、ＴＯＰＯ−ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）によってあらかじめベクターに挿入した。形質転換後のコロニーを採取し、再増殖させ、プラスミドをＱｉａｇｅｎミディプレップカラムによって精製した。プラスミド挿入部分を両方の鎖に関して完全に配列決定した。確認されたＰＣＲクローンを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切断し、大部分の５’ｄｒｆ１配列に対応する１８０ｂｐのバンドをゲル電気泳動によって単離して、Ｑｉａｑｕｉｃｋで精製した。精製したバンドを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって線状化しておいたＩｎｃｙｔｅクローン４７７０４２に挿入した。生じた形質転換体を単離し、再増殖させて、プラスミドを精製した。プラスミドを、１５０ｂｐ挿入部分についてＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって制限分析して試験した。その後陽性クローンを両方の鎖に関して完全に配列決定した（配列番号１）。
【０１３５】
実施例３：ノーザンブロット分析
ｄｒｆ１  ｍＲＮＡの発現を調べるためノーザンブロットを実施した。センス方向のオリゴヌクレオチド、５’−ＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号６）とアンチセンス方向のオリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧＣＴＣ−−３’（配列番号７）を、配列番号１のｄｒｆ１  ｃＤＮＡ配列の一部を増幅するためのプライマーとして使用した。増幅した１位から６３４位までのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用した。
【０１３６】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの多数のヒト組織ノーザンブロット（ヒト＃７７６０−１、ヒトＩＩ＃７７５９−１、ヒト癌細胞系統＃７７５７−１）をプローブとハイブリダイズした。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中６８℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを実施した。
【０１３７】
プローブをＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によってα−３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｇ５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製して、約２×１０６ｃｐｍ／ｍｌの最終濃度で同じハイブリダイゼーション溶液に加えた。
【０１３８】
６８℃で１時間ハイブリダイゼーションを実施した。フィルターを２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ中、室温で数回洗い、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で２回洗った。フィルターを−８０℃で増感紙を用いてＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰに暴露した。
【０１３９】
検査した組織の中で、３．１ｋｂのｄｒｆ１転写産物が精巣において、次いで卵巣において高いレベルで検出された（図１参照）。骨格筋では６ｋｂと１．５ｋｂの２つのさらなるバンドを検出し、６ｋｂのバンドは他の組織においても存在した。ｄｒｆ１  ｍＲＮＡは検査したすべての癌細胞系統（Ａ５４９肺癌を除く）において高レベルで発現され、増殖におけるこの遺伝子の役割を示唆している。
【０１４０】
実施例４：ＤＲＦ１は哺乳類細胞においてＣＤＣ７キナーゼと相互作用する
哺乳類細胞でのＤＲＦ１の発現のために、ｄｒｆ１コード配列（配列番号１のヌクレオチド１３８から１９８６）をベクターｐＣＤＮＡ１−ＨＡ（もとのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＣＤＮＡ１から改変した）においてクローン化した。このベクターは、抗ＨＡ抗体による組換え蛋白質の検出のためのＮ末端ＨＡエピトープを担う。ｄｒｆ１コード領域の増幅のための正プライマーは：５’−ＣＡＧＡＧＡＴＣＴＡＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＧＡＣ−３’（配列番号８）であり、これは、Ｂｇ１ＩＩクローニング部位を導入するための９ヌクレオチドの５’伸長と、開始コドンを含まないｄｒｆ１コード配列に適合する２１ヌクレオチド（配列番号２のヌクレオチド４から２５）を含む。ＡＴＧ開始コドンはＮ末端のＨＡエピトープによって提供される。逆プライマーは：５’−ＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号９）であり、これは、クローニングのためのＢｇ１ＩＩ制限部位を導入するための９ヌクレオチドの５’伸長と、終結コドンを含むｄｒｆ１配列の逆相補物（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に対応する２１ヌクレオチド（配列番号２の塩基１８２８から１８４９）を含む。ＰＣＲ反応において使用したアニーリング温度は６２℃であった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ベクターのＢｇ１ＩＩ部位にクローニングした。ベクター内での挿入物の方向が正しいことを確認するため、適切な制限酵素による消化を行った。新しい構築物をｐＣＤＮＡＨＡｄｒｆ１と称した。
【０１４１】
ＤＲＦ１が哺乳類細胞においてＣＤＣ７キナーゼに結合する能力を調べるため、Ｑｉａｇｅｎマキシプレップカラムを用いて精製したｐＣＤＮＡＨＡｄｒｆ１プラスミドを、ｐＣｄｃ７ＦＬＡＧ標識した又はキナーゼ陰性形態のＣＤＣ７（ｐＣｄｃ７ＦＬＡＧ  Ｋ９０Ｒ）あるいは制御ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に、２９３細胞において一過性にトランスフェクションした。このために、ヒトｃｄｃ７  ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーター及び組換え蛋白質の抗体検出のためのＦＬＡＧエピトープを含む哺乳類発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２にクローニングした。キナーゼ不活性形態のＣＤＣ７を生成するため、突然変異誘発キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて触媒ドメインに存在する９０位のリシンをアルギニンに突然変異させた。
【０１４２】
これらのトランスフェクションはリポフェクタミンと試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて実施した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採集し、ペレット化して、ＰＢＳで洗い、プロテアーゼ阻害因子（Ｒｏｃｈｅカタログ＃１８３６１７０）とホスファターゼ阻害因子（ＮａＦ  ５０ｍＭ、オルトバナジン酸ナトリウム１００μＭ）のカクテルを含むＮＰ４０細胞溶解緩衝液（１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解した。細胞溶解産物を遠心分離によって清澄化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイキット（カタログ＃５００−０００６）を用いて蛋白質濃度を測定した。別のセットのトランスフェクションからの蛋白質２ｍｇをＮＰ４０細胞溶解緩衝液１ｍｌ中で抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅカタログ＃１  ８６７  ４２３）（レーン１−４）又は抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ｆ−３１６５）（レーン５−８）によって免疫沈降させた。免疫複合体を溶解緩衝液で３回洗い、変性１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に充填して、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。免疫沈降物中のＤＲＦ１−ＨＡ及びＣＤＣ７の存在を、それぞれ抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅカタログ＃１  ８６７  ４２３）又は抗ＣＤＣ７ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットによって検出し、強調化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって視覚化した。
【０１４３】
図２に示すように、抗ＨＡ抗体は内因性及び過剰発現ＣＤＣ７と共にＤＲＦ１を共沈させることができたが（レーン１−３）、ＤＲＦ１が発現されなかったときには同じ抗体はＣＤＣ７を沈降させなかった（レーン４）。相反的に、抗ＦＬＡＧ抗体はＤＲＦ１を効率的に共沈させた（レーン６及び７）。これらの結果はＤＲＦ１がＣＤＣ７と相互作用することを明らかにしている。野生型（ＷＴ）と突然変異体ＣＤＣ７の両方が同じ効率でＤＲＦ１を共沈させることができ（レーン１と２、及びレーン６と７の比較）、これら２つの蛋白質間の相互作用が触媒部位の突然変異によって影響を受けないことを示した。さらに、野生型ＣＤＣ７又は内因性ＣＤＣ７の存在下ではＤＲＦ１はバンドのスミアとして移動したが、Ｋ９０Ｒ  ＣＤＣ７の存在下では移動せず、この蛋白質がＣＤＣ７によってリン酸化されることを示唆した（図６、レーン２及び３）。
【０１４４】
実施例５：ＤＲＦ１はＣＤＣ７キナーゼ活性を誘導する
ＤＲＦ１が哺乳類細胞においてＣＤＣ７キナーゼを活性化することができるかどうかを調べるため、上述したように生成した免疫沈降複合体を、ヒトＭＣＭ２蛋白質の組換え産生フラグメントをリン酸化する能力に関して試験した。ＭＣＭ２アミノ酸１−２８５を細菌においてＧＳＴ−融合蛋白質として発現し、グルタチオン−セファロースクロマトグラフィーによって精製した。精製後、特異的ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって蛋白質分解開裂し、次いでグルタチオン−ビーズに吸収することにより、ＧＳＴ部分を除去した。
【０１４５】
ＭＣＭ２（１−２８５）は、ＣＤＣ７の生理的基質であると思われることから選択した。免疫沈降後、ビーズをキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）でさらに２回洗い、０．５μｇのＭＣＭ２、１００μＭ    ＡＴＰ及び１０μＣｉ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを含む同じ緩衝液２５μｌ中でインキュベートした。３０℃で１５分間反応を実施し、２×試料緩衝液２５μｌを加えて９５℃で５分間インキュベートして反応を停止した。反応産物をランニング緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）中、変性１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。その後、ゲルを１０％酢酸と４０％メタノール中に固定し、乾燥して、オートラジオグラフィーのために暴露した。
【０１４６】
結果を図３に示す。ＨＡ−ＤＲＦ１及び野生型ＣＤＣ７の存在下で、抗ＨＡ抗体と抗ＦＬＡＧ抗体によって得られた免疫沈降物（それぞれレーン２と７）においてＭＣＭ２（１−２８５）の効率的なリン酸化（レーン４、パネルＢに示されているバックグラウンドの上部）が認められた。このキナーゼ活性は、突然変異体Ｋ９０Ｒ（レーン１及び６）の過剰発現によって排除できることから、確実にＣＤＣ７によるものであり、ＣＤＣ７単独では全く活性を持たないので（レーン８）、これはＤＲＦ１によって導入されたものである。
【０１４７】
この結果は、ＤＲＦ１がＤＢＦ４（レーン５）と同等にＣＤＣ７のキナーゼ活性を誘導することができるＣＤＣ７の調節サブユニットであることを明らかにした。さらにＤＲＦ１は、ＤＢＦ４と同様に、野生型ＣＤＣ７と共に発現されたときにはリン蛋白質として検出されたが、キナーゼ陰性型の場合にはリン蛋白質として検出されなかった（図３、パネルＡ）。この結果は、ＤＲＦ１がＣＤＣ７の活性化因子であり、基質であることを示した。
【０１４８】
実施例６：ＤＲＦ１は哺乳類細胞の核に局在する
間接免疫蛍光法を用いて哺乳類細胞におけるＤＲＦ１の細胞内局在を検討した。ＨｅＬａ細胞をカバーガラス上で中等度の密度に増殖させ、上述したようにｐＣＤＮＡ−ｄｒｆ１ＨＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗い、室温でＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドにより２０分間固定した。０．５％Ｔｒｉｔｏｎ中で透過性を上げたあと、細胞を洗い、ＰＢＳ１％血清中で１：２５に希釈した抗ＨＡラット抗体（ＲＯＣＨＥ）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗ったあと、ＰＢＳ１％血清中で１：５０に希釈した抗ラットテキサスレッド複合二次抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に試料を１時間インキュベートした。最後にＰＢＳ中で３回洗ったあと、カバーガラスをＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と共にインキュベートして核を染色し、Ｍｏｗｉｏｌで封入した。
【０１４９】
免疫蛍光顕微鏡検査により、ＤＲＦ１蛋白質は核において明るい点として検出された（図４）。ＤＲＦ１染色とＤＡＰＩ染色を重ね合わせることにより（併合）核内画分における局在が確認された。
【０１５０】
実施例７：ｄｒｆ１  ｍＲＮＡは細胞周期調節される
細胞周期中のＤＲＦ１発現のレベルを調べるため、同調培養からのＨｅＬａ細胞抽出物をノーザンブロットによって分析した。
【０１５１】
ＨｅＬａ細胞を、２ｍＭチミジンで１９時間処理してＧ１／Ｓ期で遮断し、ノコダゾール（５０ｎｇ／ｍｌ）で１６時間処理してＧ２／Ｍ期で遮断した。細胞を遮断から解放することによって得られた同調培養を、フローサイトメトリーによりＤＮＡ含量に関して（図５ＡからＣ）及びノーザンブロットによりｄｒｆ１  ｍＲＮＡ発現に関して（図６）、平行して分析した。フローサイトメトリー分析については、細胞を最初に７０％エタノールに固定し、次にヨウ化プロピジウム（４０ｎｇ／ｍｌ）プラスリボヌクレアーゼＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）により３７℃で３０分間染色した。その後ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で試料を分析してＧ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期におけるＤＮＡ含量を測定した。
【０１５２】
ＱｉａｇｅｎからのＲｎｅａｓｙミニ抽出キット（カタログ＃７４１０４）を用いてノーザンブロットのためのＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ３０μｇをゲル電気泳動し、ニトロセルロース膜に写し取って、上述したようなｄｒｆ１  ｃＤＮＡプローブでブロットした。
【０１５３】
細胞周期中ｄｒｆ１  ｍＲＮＡの発現は調節され、チミジンブロック後、Ｇ１／Ｓ期には低く、細胞の大部分がＧ２  ＤＮＡ含量を持つと思われるまで時間と共に上昇する。細胞がノコダゾール処理によってＧ２／Ｍ期でブロックされたときにも高いレベルのｄｒｆ１が認められた。
【０１５４】
実施例８：ＤＲＦ１蛋白質の精製
１．ＣＯＳ細胞におけるＤＲＦ１の発現
ＣＯＳ７細胞におけるＤＲＦ１の発現のために、配列番号１のヌクレオチド１−１９８６として示される配列を持つポリヌクレオチド分子を、適切なＤＲＦ１コード配列を担うベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）プラスミドにクローニングする。プラスミドは、配列番号１のヌクレオチド１−１９８３、抗ｖ５抗体による組換え蛋白質の検出のためのＶ５エピトープ、ニッケルキレートクロマトグラフィーによる精製のためのＣ末端ポリヒスチジン、及び安定なトランスフェクタントの選択のためのゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子を含む。このｄｒｆ１  ｃＤＮＡの増幅のための正プライマーは：５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＣ−３’（配列番号１０）であり、これは、ＥｃｏＲＩクローニング部位を導入するための８ヌクレオチドの５’伸長とｄｒｆ１配列に適合する２０ヌクレオチド（配列番号１のヌクレオチド１−２０）を含む。逆プライマーは：５’−ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１１）であり、これは、クローニングのためのＮｏｔＩ制限部位を導入するための１０ヌクレオチドの５’伸長と、配列番号１の塩基１９６６−１９８６からのｄｒｆ１配列の逆相補物に対応する２０ヌクレオチドを含む。ＰＣＲ条件はアニーリング温度として５８℃である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ベクターのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位にクローニングする。
【０１５５】
ＣＯＳ細胞培養から発現されるＤＲＦ１は、全細胞溶解産物を調製し、例えばクロマトグラフィーによって蛋白質を精製することにより、精製することができる。ＹＭ−１０膜に取り付けたＡｍｉｃｏｎ濃縮器で精製ＤＲＦ１を０．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃で保存する。
【０１５６】
２．昆虫細胞におけるＤＲＦ１の発現
バキュロウイルス系におけるＤＲＦ１の発現のために、配列番号１のヌクレオチド１３９−１５８として示される配列を持つポリヌクレオチド分子をＰＣＲによって増幅した。正プライマーは：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＧＡＡＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１２）である。このプライマーの最初の８個のヌクレオチドはＢａｍＨＩクローニング部位を付加する５’伸長であり、続く２０個のヌクレオチドは配列番号１に示される配列のヌクレオチド残基１３９から１５８に対応する。逆プライマーは：５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号１３）である。このプライマーの最初の８個のヌクレオチドはＢａｍＨＩクローニング部位を導入する５’伸長であり、続く２０個のヌクレオチドは配列番号１に示される配列のヌクレオチド残基１９６６から１９８６の逆相補物に対応する。
【０１５７】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩで消化して、３’にｄｒｆ１コード領域の挿入のためのＢａｍＨＩ部位を含むＧＳＴフラグメントの挿入によって改変しておいたベクターｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の対応する部位にクローニングして、融合ＧＳＴ−ＤＲＦ１蛋白質を作製する。ｐＶＬ１３９３発現ベクターはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターを含む。リン酸化のための蛋白質キナーゼ部位と組換え蛋白質の切り出しのためのトロンビン部位が先行し、マルチクローニングサイトも存在する。言うまでもなく、ｐＡｃＨＴＬ−Ａの代わりに、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１及びｐＡｃＩＭ１のような多くの他のバキュロウイルスベクターが使用できる。ベクター構築物が、必要に応じて、フレーム内ＡＵＧ及びシグナルペプチドのような転写、翻訳及び輸送のための適切に位置するシグナルを含むことを条件として、ＤＲＦ１ポリペプチドの発現のための他の適当なベクターが使用できる。そのようなベクターは、中でも特に、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９に述べられている。
【０１５８】
Ｓｕｍｍｅｒｓら（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７））に述べられているもののような標準的なバキュロウイルス発現法を用いてウイルスを増殖させ、単離する。
【０１５９】
好ましい実施形態では、「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ」トランスフェクションキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、製造者によって確立された方法を用いて、ｄｒｆ１遺伝子を含むｐＶＬ１３９３−ＧＳＴをバキュロウイルスに導入する。生成されたウイルスを増幅のために２回再感染させる。
【０１６０】
ＧＳＴ−ＤＲＦ１ポリペプチドの発現のために、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞をウイルスに感染させる。感染の４８−７２時間後に細胞を採集し、音波破砕と遠心分離によって溶解産物を調製する。ＧＳＴ−ＤＲＦ１蛋白質を、例えばグルタチオン−アフィニティー精製によって単離することができる。
【０１６１】
ＤＲＦ１を、例えばＣＤＣ７のような機能的パートナーと同時発現するために、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を、ＧＳＴ−ＤＲＦ１を発現するウイルスと、例えばＣＤＣ７をＨＩＳ標識融合蛋白質として発現するウイルスとに同時感染させる。その後、例えば金属アフィニティー精製によって、複合体を含むＤＲＦ１を溶解産物から単離し、抗ＧＳＴ抗体によるウエスタンブロットにおいて確認することができる。
【０１６２】
実施例９：相互作用トラップ／ツーハイブリッドシステム
他のＤＲＦ１相互作用性蛋白質について検定するために、相互作用トラップ／ツーハイブリッドライブラリースクリーニング法が使用できる。このアッセイは、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９、３４０、２４５において初めて記述された。プロトコールは、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９２、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹの中で公開されている。キットはＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ３）から入手可能である。
【０１６３】
ＤＲＦ１の全部又は一部をコードするヌクレオチドと酵母転写因子ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）の融合を、標準的なサブクローニング手法を用いて適切なプラスミド（すなわちｐＧＢＫＴ７）において構築する。同様に、ＧＡＬ４活性ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーを、潜在的ＤＲＦ１結合蛋白質のｃＤＮＡから第二のプラスミド（すなわちｐＧＡＤＴ７）において構築する（ｃＤＮＡライブラリーの形成に関するプロトコールについては、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＤＲＦ１融合構築物を配列決定によって確認し、どちらもツーハイブリッド分析の成功を妨げる、自律的レポーター遺伝子活性化と細胞毒性に関して試験する。宿主細胞における発現と転写活性の欠如を確実にするためＡＤ／ライブラリー融合構築物に関して同様の制御を実施する。酵母細胞を標準的手順に従って（その全体が参照してここに組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２、Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）ＤＲＦ１とライブラリー融合プラスミドの両方で形質転換する（約１０５形質転換体／ｍｇ  ＤＮＡ）。ＤＮＡ−ＢＤ／ＤＲＦ１とＡＤ／ライブラリー蛋白質のインビボ結合は特定酵母プラスミドレポーター遺伝子（すなわちｌａｃＺ、ＨＩＳ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２）の転写をもたらす。酵母細胞を栄養欠乏培地で平板培養して、レポーター遺伝子の発現に関してスクリーニングする。Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）補足培地で増殖させた後コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性に関して２回検定する（β−ガラクトシダーゼ活性に関するフィルターアッセイは、その全体が参照してここに組み込まれる、Ｂｒｅｅｄｅｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，１９８５、５０、６４３に述べられている）。陽性ＡＤ−ライブラリープラスミドを形質転換体から回収し、もとの酵母株ならびに無関係なＤＮＡ−ＢＤ融合蛋白質を含む他の株に再導入して、特異的ＤＲＦ１／ライブラリー蛋白質相互作用を確認する。挿入物ＤＮＡを配列決定して、ＧＡＬ４  ＡＤに融合したオープンリーディングフレームの存在を確認し、ＤＲＦ１結合蛋白質の同一性を決定する。
【０１６４】
実施例１０：ＤＲＦ１活性を変化させる化合物を同定するためのアッセイ
スクリーニングのために、キナーゼ基質、例えばＭＣＭ２を、ＥＺ−リンクビオチンキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）を使用して製造者の指示に従ってビオチニル化する。昆虫細胞において発現される精製組換えＤＲＦ１含有複合体（実施例５参照）を、阻害性化合物の存在下又は不在下で、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ））、１０μＭビオチニル化基質、２５μＭ    ＡＴＰ及び０．５μＣｉ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを含む８０μｌの反応物中でキナーゼ活性に関して評価する。反応は３０℃で３０分間実施する。過剰のＥＤＴＡ（最終濃度２５ｍＭ）を加えて反応を停止する。反応物５０μｌをストレプトアビジン被覆プレート（Ｆｌａｓｐｌａｔｅ，ＮＥＮ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ）のウエルに入れ、３０分間インキュベートして、その後ＰＢＳ中で３回洗う。次にβカウンター（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）でプレートを計数して活性を決定する。
【０１６５】
上述した本発明の好ましい実施形態の一部を下記に概説しており、次の実施形態を含むが、それらに限定されない。当業者が認識するように、本発明の精神から逸脱することなく本発明の好ましい実施形態に数多くの変更及び修正を加えることができる。そのようなすべての変法が本発明の範囲内に含まれることが意図されている。ここで引用した各々の公表文献の開示全体が参照してここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  種々の組織におけるｄｒｆ１  ｍＲＮＡの発現を分析するための一連のノーザンブロットである。詳細については実施例３参照。
【図２】  ＤＲＦ１がＣＤＣ７と相互作用することを明らかにするウエスタンブロット分析を示す。詳細については実施例４参照。
【図３】  ＤＲＦ１が哺乳類細胞においてＣＤＣ７キナーゼを活性化することを明らかにしている：ＤＲＦ１の存在下で、ＣＤＣ７はその生理的基質ＭＣＭ２をリン酸化することができる。詳細については実施例５参照。
【図４】  免疫蛍光顕微鏡検査によって証明されるように、哺乳類細胞におけるＤＲＦ１の細胞内局在を示す。Ａ、抗ＨＡ免疫染色；Ｂ、ＤＡＰＩ染色；Ｃ、ＡとＢの二重焼付け（併合）。詳細については実施例６参照。
【図５Ａ】  細胞周期中のＤＲＦ１発現のレベルを調べるために実施したフローサイトメトリー分析を示す。詳細については実施例７参照。
【図５Ｂ】  細胞周期中のＤＲＦ１発現のレベルを調べるために実施したフローサイトメトリー分析を示す。詳細については実施例７参照。
【図５Ｃ】  細胞周期中のＤＲＦ１発現のレベルを調べるために実施したフローサイトメトリー分析を示す。詳細については実施例７参照。
【図６】  ノーザンブロットによるｄｒｆ１  ｍＲＮＡ発現の分析である。Ｔはチミジンブロック、Ｎはノコダゾール（Ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）ブロックを表わし、レーンの上部の数字は遮断の解放後の時間（時）を示す。
【配列表】
0005142115.tif 000003
0005142115.tif 000004
0005142115.tif 000005
0005142115.tif 000006
0005142115.tif 000007
0005142115.tif 000008
0005142115.tif 000009
0005142115.tif 000010
【図１】
0005142115.tif 000011
【図２】
0005142115.tif 000012
【図３】
0005142115.tif 000013
【図４】
0005142115.tif 000014
【図５Ａ】
0005142115.tif 000015
【図５Ｂ】
0005142115.tif 000016
【図５Ｃ】
0005142115.tif 000017
【図６】
0005142115.tif 000018