(57)【要約】椎間板変性を伴う疾患、特には椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症および変形性脊椎症を治療するため、ヒト由来の蛋白質分解酵素を、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与する薬剤を提供する。ヒト由来の蛋白質分解酵素としては、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７等が使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１または複数のヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有し、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与されることを特徴とする椎間板変性に伴う疾患の治療剤。
【請求項２】
椎間板変性に伴う疾患が、ヘルニア、腰痛症、椎間板症または変形性脊椎症である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
ヒト由来の蛋白質分解酵素が細胞外マトリックス分解酵素である請求項１または２記載の治療剤。
【請求項４】
ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＴ１−ＭＭＰおよびアグリカネース（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）からなる群から選択される１または複数の細胞外マトリックス分解酵素を有効成分として含有する請求項１〜３のいずれかに記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有する椎間板変性に伴う疾患の治療剤に関する。この治療剤は、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与され、例えば椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症の治療に有効であり、ヘルニアの自然退縮を促進する。
【背景技術】  脊椎体と脊椎体の間に存在する円盤状の軟骨体である椎間板は、内側の髄核とこれを取り囲む外側の線維輪から構成され、プロテオグリカン、アグリカン、ＩＩ型コラーゲンなどの軟骨成分からなる。椎間板は、主に加齢と共に生じる椎間板中の水の含量の減少により弾力性が失われ、椎間板の軟骨成分の消失と線維組織の増生が認められ、いわゆる内層の髄核と外層の線維輪の２重構造が破綻する。これらの変化を椎間板変性とよぶ。この椎間板変性は加齢性変化であり、２０才から始まって、７０才までにはほぼ全ての椎間板組織で変性変化を認める。椎間板ヘルニアは変性髄核が脆弱した線維組織を破って脊柱管内に脱出して、神経根や馬尾を圧迫して疼痛や麻痺などを起こすものである。腰痛症は、骨代謝異常、外傷、腫瘍などの原因で起きるものもあるが、椎間板の退行変性に起因する場合が多い。
磁気共鳴画像法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）は、椎間板変性を診断するために広く利用されている。レントゲンと異なり被爆もしないために、頻回の検査の施行が可能である。経時的に撮像を行うことにより、椎間板ヘルニアでは経時的に体積が減少する自然退縮機序が認められることがわかってきた。また、造影剤ガドリニウム−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）を用いることで椎間板ヘルニア組織に造影効果が確認された場合には、ヘルニア内での血管増生が盛んであると判断でき、より自然退縮が起きることが期待できる。これにより、予後診断も可能となる。
手術により摘出されたヘルニア塊を免疫組織学的に検討すると、ヘルニア塊の軟骨基質の中に新生血管の増生と多数のマクロファージを中心とした炎症性細胞の浸潤が認められる（Ｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  ２１（１９９６），１６４７−１６５２）。また、浸潤してきたマクロファージや椎間板内の軟骨細胞がマトリックスメタロプロテアーゼ（Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）に属するＭＭＰ−３とＭＭＰ−７を強発現していることが確認された（Ｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  ２２（１９９７），１０９８−１１０４およびＨａｒｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｓｐｉｎａｌ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  １２（１９９９），２４５−２４９）。ＭＭＰは中性領域で主に作用する酵素で、関節内や椎間板組織では生理的に発現している。ＭＭＰ−３とＭＭＰ−７は軟骨組織の主成分であるプロテオグリカン、アグリカンを基質としている。このため、椎間板ヘルニア内ではＭＭＰ−３とＭＭＰ−７がヘルニア組織の分解及び退縮に重要な作用を有することが推測されている。
また、野生型マウスの椎間板を蛋白分解性のマクロファージと共培養した場合には、ＭＭＰ−３欠損型マウスの椎間板とマクロファージとの共培養の場合に比べて椎間板重量の減少が大きかった。また、野生型マウスおよびＭＭＰ−３欠損マウスを用いた実験によって、ＭＭＰ−３がマクロファージを椎間板内に走化させる作用のある（ＭＭＰ−３がマクロファージに対する走化性因子として働く）ことも確認されている（Ｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（２）（２０００），１３３−１４１）。
ＭＭＰ−７は炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αを誘導し、そのＴＮＦ−αが椎間板細胞におけるＭＭＰ−３の産生を促進することも報告されている（Ｈａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（２）（２０００），１４３−１５０）。しかし、ヒトの椎間板ヘルニアで発現しているＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７等のヒト由来の蛋白質分解酵素を治療剤として使用する試みは全くなされていない。
椎間板ヘルニアの外科治療は、ヘルニア塊を外科的に摘出して神経の除圧をはかることが広く行われている。しかし、本疾患が青年層や中年層に多く、スポーツ選手にも比較的多く認められることから、手術治療ではなく非侵襲的な治療が求められている。
すでに、米国やヨーロッパでは、植物から抽出したキモパパイン等の酵素を椎間板ヘルニア中に注入する治療が行われているが、免疫反応や神経毒性などが報告されている。また、ヘルニア患部にキモパパインを注入した場合は、蛋白分解により生じたヘルニア腔が時間経過により回復することが報告されているが、これは軟骨マトリックスではなく、線維性の結合組織が造生してくるためであると考えられている。イヌの椎間板内にキモパパインを注入した場合の組織学的観察によれば、髄核中心が線維軟骨組織に置換されていたことが報告されている（Ｋｕｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９３，Ａｐｒ，５５（２）２１１−５）。また、本発明者の実験によれば、イヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注入した例では、軟骨のマトリックスが髄核部と線維輪全体にわたって分解され、残存した軟骨細胞は大幅に減少しており大きく損傷されていた。このようにキモパパインによりヘルニアを溶解した場合は、椎間板の再生能が無くなるか低下すると考えられる。軟骨細胞はマトリックス中に浮遊した状態で機能を保持するため、マトリックスは椎間板再生に不可欠のものである。このような公知の事実および本発明者が確認した事実を勘案した場合、ヘルニア患部に蛋白分解酵素を直接投与し、変性髄核を除去する従来の方法では、軟骨細胞が椎間板再生機能を保持するために必要なマトリックスを保持することが困難であると思われた。
【発明の開示】
驚くべきことにヒト由来の蛋白分解酵素であるＭＭＰ類をヘルニア中に注入した場合には、椎間板ヘルニアを退縮させるが、正常の軟骨細胞には損傷を与えないことが見出された。すなわち、椎間板再生機能を保ったまま椎間板ヘルニアを溶解することができたのである。軟骨細胞が機能を維持するにはマトリックスが不可欠である。したがって、本発明はヒト由来の蛋白分解酵素であるＭＭＰ類をヘルニア中に注入することにより、正常軟骨細胞を温存しながらヘルニアを選択的に退縮させるという画期的な知見に基づくものである。この発明によって、これまでのキモパパインによる正常軟骨の損傷と言う弊害の可能性のない全く新しいヘルニア治療が可能となる。
本発明は、ヒトの椎間板ヘルニアの自然退縮に関与していると考えられるヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分とし、変性した椎間板に直接投与される椎間板変性に伴う疾患の治療剤を治療剤を提供するものである。また、ヒト由来の蛋白質分解酵素を変性した椎間板に直接投与する椎間板変性に伴う疾患の治療方法を提供するものである。本発明の治療剤によって治療される疾患は、椎間板の変性に伴う疾患であり、例えば、椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症が挙げられる。
これまでの研究によって椎間板ヘルニアの退縮に関与していると考えられる物質としては、上記したＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７が挙げられている。また、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）およびアグリカネース（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）も同様の作用を有すると考えられる。ＭＭＰ−３（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．１７）は、ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１またはｔｒａｎｓｉｎとも呼ばれ、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、各種コラーゲンなどを分解する。ＭＭＰ−７（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．３３）は、ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎまたはＰＵＭＰとも呼ばれ、タイプＩＶおよびタイプＸコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、プロテオグリカンなどを分解する。ＭＭＰ−８（Ｅ．Ｃ．３．４．２４．３４）は、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−２またはｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅとも呼ばれ、タイプＩコラーゲンをタイプＩＩやタイプＩＩＩよりも優先的に分解する。ＭＭＰ−１３は、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−３とも呼ばれ、タイプＩＩコラーゲンに対して特異性が高い。ＭＴ１−ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ−１  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）は、ＭＭＰ−１４とも呼ばれ、プロＭＭＰ−２およびプロＭＭＰ−１３を活性化する。アグリカネースは、ＡＤＡＭ−ＴＳ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）ファミリーに属し、軟骨アグリカンを分解する。
これらの蛋白質分解酵素は、近年リコンビナント法によって製造され、供給されるようになった。本発明者は、これらの蛋白質分解酵素を椎間板変性に伴う疾患、特にはヘルニアへの注入療法に使用してその有効性を確認した。さらに、これらのヒト由来の蛋白質分解酵素がキモパパインのもつ軟骨細胞を損傷させる可能性のないことを確認して本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】  図１は、椎間板ヘルニア検体をＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、その混合物、ポジティブコントロールとしてのキモパパイン、およびコントロール（ＤＭＥＭ培地）と培養した場合の重量変化を示す図である。
図２は、椎間板ヘルニア検体をＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、その混合物、ポジティブコントロールとしてのキモパパインと培養して得られた組織標本を、サフラニンＯで染色した結果を示す図である。
図３は、ウサギの椎間板にＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ポジティブコントロールとしてのキモパパイン、およびコントロールとしての生理食塩水（ＮＳ）を注入し、１週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラニンＯで染色した結果を示す図である。
図４は、ヘルニアを自然発症したミニチュアダックスフンドから摘出した、ヘルニアの組織標本（ヘマトキシリンエオジン染色）の顕微鏡写真を示す図である。
図５は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＸ線透視下でＭＭＰ−７を注入する図である。
図６は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−７を注入する前（Ｐｒｅ）と注入後（Ｐｏｓｔ）のＭＲＩ（脂質強調画像Ｔ１）である。
図７は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−７を注入する前（Ｐｒｅ）と注入後（Ｐｏｓｔ）のＭＲＩ（水分強調画像Ｔ２）である。
図８は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−３を注入する前（Ｐｒｅ）と注入後（Ｐｏｓｔ）のＭＲＩ（水分強調画像Ｔ２）である。
図９は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−７およびコントロールとしての生理食塩水を注入し、１週間後に屠殺して作成した椎体標本をカットした状態を示す図である。
図１０は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−７およびコントロールとしての生理食塩水を注入し、１週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラニンＯで染色した結果を、ＭＭＰ−７注入と生理食塩水注入について示す図である。
図１１は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にＭＭＰ−７を注入し、１週間後に屠殺して作成した椎体標本をサフラニンＯで染色した結果を示す図である。
図１２は、ヘルニアを自然発症しているビーグル犬の椎間板にコントロールとしての生理食塩水を注入し、１週間後に屠殺して作成した椎体の組織標本をサフラニンＯで染色した結果を示す図である。
図１３は、ＭＭＰ−７によるプロテオグリカンの分解を試験したウエスタンブロット法の結果を示す図である。
図１４は、イヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注射して、注射後１週間に屠殺して作成した病理標本をサフラニンＯで染色した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、１または複数のヒト由来の蛋白質分解酵素を有効成分として含有し、椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与される椎間板変性に伴う疾患の治療剤である。特には椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症の治療剤である。有効成分とする蛋白質分解酵素は細胞外マトリックス分解酵素であり、例えば、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１３、ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）およびアグリカネース（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）である。
本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤は、例えばヘルニア患部に直接投与される。また、本発明の治療剤の投与方法としては、ヘルニア近傍の椎間板内に投与する場合も含まれる。例えば椎間板穿刺でレントゲン透視下に経皮的に穿刺針を進め、椎間板内に穿刺する。そこから、脱出椎間板ヘルニア方向に内筒を進めて脱出したヘルニアに選択的に穿刺して、本発明の薬剤を注入する。または硬膜外腔注射により投与することができる。本発明の治療剤をこのように投与することによってヘルニアの自然退縮を促進させることができる。
本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤の使用に際しては、神経症状で神経根症や馬尾症、脊髄症などの神経症状を有し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により神経圧迫の状態および椎間板変性、例えばヘルニアの部位並びに程度を確認するという診断が必要である。また、椎間板造影検査により、治療を行う部位のヘルニア塊を造影して椎間板ヘルニアの部位並びに程度を正確に判断することが重要である。
従って、本発明の一態様は、椎間板変性例えばヘルニアの疑いがある患者に対してＭＲＩと椎間板造影検査を実施し、患者に椎間板変性例えばヘルニアが認められた場合には、その病態に応じて本発明のヒト由来の蛋白質分解酵素をヘルニア患部に直接投与して、ヘルニア組織の自然退縮を促進する椎間板ヘルニアの治療方法である。
本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤の投与量は、椎間板変性例えばヘルニアの程度、患者の状態、蛋白質分解酵素の種類等により異なる。本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤は、患部に直接投与され、その投与量は通常１回当たり約１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲である。投与回数は、１回から数回が望ましいが、退縮の度合いを見てさらに多くすることができる。
【実施例】  本発明を下記の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１  ヒト椎間板ヘルニア手術検体を用いた器官培養実験
手術時に摘出した腰椎椎間板ヘルニア検体（４℃にて保存）を、細かく切断し、湿重量を測定し、１検体を６０〜８０μｇとなるように配分して、９６ウエル（ｗｅｌｌ）プレート内に入れた。ついで以下の試料溶液を加え、３７℃においてＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。
（１）コントロール／ＤＭＥＭ培地  ２００μｌ
（２）ヒトリコンビナントＭＭＰ−３（４５ｋＤａ）  ２０μｇ／２００μｌ
（３）ヒトリコンビナントＭＭＰ−７（１９ｋＤａ）  ２０μｇ／２００μｌ
（４）ヒトリコンビナントＭＭＰ−３  １０μｇ＋  ヒトリコンビナントＭＭＰ−７  １０μｇ／２００μｌ
（５）ヒトリコンビナントＭＭＰ−３  ２０μｇ＋  ヒトリコンビナントＭＭＰ−７  ２０μｇ／２００μｌ
（６）キモパパイン１、５、１０、５０、１００、５００ｐｋｔ（ｐｉｃｏＫａｔａｌ）／２００μｌ
ヒトリコンビナントＭＭＰ−３（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）およびヒトリコンビナントＭＭＰ−７（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）は４℃でＤＭＥＭ培地に溶解した。キモパパインはポジティブコントロールであり、キモパパイン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を１ｍＭのＥＤＴＡ，０．０６７ｍＭのメルカプトエタノール、５．５ｍＭのシステイン塩酸塩を含む液に溶かし、２５℃、ｐＨ６．２で３０分インキュベートし活性化してＤＭＥＭ培地に添加した。
得られた培養物の湿重量を測定し、統計学的計算をした。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７を使用する場合および両者を併用する場合は、コントロールに比して湿重量が有意に減少する。
ついで、検体を４％パラホルムアルデヒドに入れ、組織標本を作成し、これをサフラニンＯ染色した結果を図２に示す。その結果、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７またはキモパパインを加えて器官培養したものは、コントロールと比較して優位に染色性の低下（ヘルニアの退縮）を示した。
実施例２  ウサギ椎間板への注入実験
日本白色ウサギ（３〜４ｋｇ）を以下の手順で処理し、薬剤の椎間板内注入による効果を検定した。
１．ケタミン塩酸塩０．５〜１．０ｍｌ／ｋｇを皮下注射することにより、前投薬処理をした。
２．体を固定し、耳の静脈に２３Ｇトンボ針でラインを取りテープで固定（ライン確保）した。ペントバルビタールナトリウムを生理食塩水で半分の濃度に薄め（０．５ｍｇ／ｍｌ）、０．５〜１．０ｍｌ／ｋｇをワンショットで注射し静脈麻酔した。その後は適宜１ｍｌずつを注射する。バリカンで体毛を刈り、半側臥位に固定した（後側方アプローチ）。
３．ドレーピング、電気メス（エアトーム）セットを用い、皮を切り、皮下を展開して、椎体、肋骨から筋肉を剥離し椎間板を露出した。
４．椎間板に直接的に次の薬剤を注入した。
（１）ヒトリコンビナントＭＭＰ−３  １０μｇ／１００μｌおよび４０μｇ／１００μｌ（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３で濃縮したもの）
（２）ヒトリコンビナントＭＭＰ−７  １０μｇ／１００μｌおよび４０μｇ／１００μｌ（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３で濃縮したもの）
（３）キモパパイン  １ｋｐｔおよび５ｋｐｔ
（１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０６７ｍＭのメルカプトエタノール、５．５ｍＭのシステイン塩酸塩を含む液に溶かして２５℃、ｐＨ６．２で３０分インキュベートして活性化して使用した）
（４）コントロール：生理食塩水（ＮＳ：ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）
薬剤は１００μｌを椎間板内に注入した。濃度の異なる薬剤を２個所の椎間板に、生理食塩水のみを１個所の椎間板に投与し、マーキング用ワイヤーを椎体に埋め込んだ。
５．ナイロン針で各層を閉じ、ウサギをケージ内でフリーにした。
６．注射１週後、ケタミン塩酸塩３ｍｌを注射し、ライン確保した後、耳静脈に２３Ｇトンボ針を固定し、ペントバルビタールナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）３ｍｌを投与（全量で５〜７ｍｌ）した。
７．椎体を一まとめにして（ｅｎ  ｂｌｏｃ）摘出し、４％ホルマリン溶液で固定して、組織標本を作成した。
８．組織標本を脱パラフィンし、１％酢酸水溶液に溶かした０．０３％ファーストグリーンで５分間染色した。ついで、１％酢酸水溶液で洗浄後、０．２５％サフラニンＯで７分間染色した。
その結果を図３に示す。コントロールと比較してＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびキモパパイン注入群は有意に染色性が低下した。また、ＭＭＰ−３注入群は椎間板狭小化が認められた。
実施例３  イヌ椎間板ヘルニアへの注入実験
イヌ特にビーグル犬などは高率に椎間板ヘルニアに罹患し、重症の場合は両下肢麻痺等の症状を呈する。イヌのヘルニアの組織像は、ヒトのヘルニアの組織像と非常に類似している。ヘルニアに罹患し下肢麻痺を起こしたミニチュアダックスフンド７才、６．３５ｋｇの第１〜第２腰椎椎間板ヘルニアを外科的に摘出した組織を標本とし、ヘマトキシリンエオジン染色し、顕微鏡写真に撮影した結果を図４として示す。この組織標本は、イヌのヘルニアがヒトのヘルニアモデルとして非常に適切であることを示している。
椎間板ヘルニアを自然発症したビーグル犬の椎間板ヘルニアに薬剤を注入してその効果を次のように検討した。ヒトリコンビナントＭＭＰ−７の試験には７才、体重１２．７５ｋｇのビーグル犬を、ヒトリコンビナントＭＭＰ−３の試験には７才、体重１４．４ｋｇのビーグル犬を用いた。薬剤の注入前に椎間板のＭＲＩを撮影して、正常な椎間板高位、変性している高位、ヘルニアを認める高位を確認した。
ＭＭＰ−７の投与：ビーグル犬の第１２胸椎（Ｔ１２）と第１３胸椎（Ｔ１３）の間の椎間板に２０μｇ／２００μｌ、第１３胸椎（Ｔ１３）と第１腰椎（Ｌ１）の間の椎間板および第１腰椎（Ｌ１）と第２腰椎（Ｌ２）の間の椎間板に１０μｇ／１００μｌ注入した。コントロールとして、第２腰椎（Ｌ２）と第３腰椎（Ｌ３）の間の椎間板に生理食塩水を２００μｌ注入した。
ＭＭＰ−３の投与：ビーグル犬の第１１胸椎（Ｔ１１）と第１２胸椎（Ｔ１２）の間の椎間板に１０μｇ／１００μｌ、第１２胸椎（Ｔ１２）と第１３胸椎（Ｔ１３）の間の椎間板に２０μｇ／２００μｌ、第１３胸椎（Ｔ１３）と第１腰椎（Ｌ１）の間の椎間板に１０μｇ／１００μｌ注入した。第１０胸椎（Ｔ１０）と第１１胸椎（Ｔ１１）の間の椎間板にコントロールとして生理食塩水を２００μｌ注入した。
薬剤の椎間板内への注入はレントゲン透視下に脊椎針（Ｓｐｉｎａｌ  Ｎｅｅｄｌｅ）を用いて行った（図５）。シリンジはツベルクリン用（全量１ｍｌ）を用いた。注入後１週間後に再度ＭＲＩを測定した。注入前と注入後の椎間板のＭＲＩを図６〜８に示した。
図６はＭＭＰ−７を用いた場合の結果を示すＭＲＩのＴ１強調画像であり、図７はＭＭＰ−７を用いた場合の結果を示すＭＲＩのＴ２強調画像である。Ｔ１強調画像はヘルニア実質を見るのに有効であり、Ｔ２強調画像は軟骨組織である椎間板の分解をみるのに有効である。注入前のＴ１２とＴ１３の間に観察されたヘルニアは、注入後の画像において明瞭な退縮をしている。図８は、ＭＭＰ−３を用いた場合の結果を示す水分強調画像（Ｔ２）であり、薬剤投与によるヘルニアの退縮が観察される。
ついで、ＭＭＰ−７を投与したビーグル犬を屠殺し、注入した椎間板を含む脊椎ユニットを一まとめにして摘出し、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定して脱灰操作を行ってから、組織標本を作成した（図９）。詳しくは、４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、１０ｍＭ  ＰＢＳで洗浄、エタノールおよびクロロホルムにて脱脂を行う。次いで、脱灰液（Ｐｌａｎｋ  Ｒｙｃｈｌｏ  ｍｅｔｈｏｄ：Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて脱灰操作を行った。脱灰が十分なことを確認し、パラフィン包埋を行い、組織標本を作成した。
その組織標本を脱パラフィン後、１％酢酸水溶液に溶かした０．０３％ファーストグリーンで５分間染色した。ついで、１％酢酸水溶液で洗浄後、０．２５％サフラニンＯで７分間染色した。
その切片の写真（マクロ図）を図１０に示した。ＭＭＰ−７注入後とあるのは、ＭＭＰ−７を２００μｌ注入した部位（第１２胸椎と第１３胸椎間）の切片であり、生食注入後とあるのは、生理食塩水を注入した第２腰椎と第３腰椎の間の切片である。その切片をさらに詳細に示したものが、図１１および図１２である。図１１はＭＭＰ−７を注入したものであり、その左上隅には図１０の下段と同じマクロ図が示されている。中段はマクロ図を２倍に拡大したものであり、下段は２倍拡大図の一部をさらに１０倍に拡大したものである。図１２は、生理食塩水を注入したものであり、その左上隅がマクロ図、中段が２倍拡大図、下段がその１０倍拡大図である。図１０、図１１および図１２を比較すると、ＭＭＰ−７を注入した場合には、生理食塩水の場合と比較して、染色性が著しく低下している。これはＭＭＰ−７の注入によって髄核内の構造が破綻したことを示している。これに対し、生理食塩水の場合の髄核構造の乱れは、注入個所のみであり、染色性は維持されている。このことから、軟骨基質の破壊は認められない。
さらに、ＭＭＰ−７を注入した図１１では、ＭＭＰ−７が注入された髄核は分解されたマトリックスとなっているが、その他の髄核部や線維輪には正常の軟骨細胞が温存されている。したがって、正常な軟骨細胞が軟骨マトリックスを産生して椎間板を再生する機能を保持していると結論される。
実施例４  イヌ椎間板ヘルニアを用いた分子生物学的検討
実施例３と同様に、椎間板ヘルニアを自然発症している、ビーグル犬（７才、体重１４．０ｋｇ）の第２頚椎（Ｃ２）と第３頚椎（Ｃ３）の間の椎間板にＭＭＰ−７を２０μｇ／２００μｌ、第３頚椎（Ｃ３）と第４頚椎（Ｃ４）の間の椎間板に生理食塩水２００μｌを注入した。注入１週間後に椎間板からタンパク抽出を行い、ヒト成人軟骨のプロテオグリカン抗体を用いて、椎間板内軟骨の分解についてウエスタンブロッティングによる分子生物学的検討を行った。ヒト成人軟骨のプロテオグリカン抗体はイヌの交差が確認されており、コアタンパクとケラタン硫酸側鎖を認識することが確認されている。
ビーグル犬を屠殺したのち、できるだけ早く脊椎ユニットを摘出し氷中にて保存する。次に目的とする部位の椎間板組織を、他の組織が混入しないように注意してメスなどを用いて分離する。採取した組織を１０ｃｍディシュに入れ、ＲＩＰＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｕｎｏ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）緩衝液４ｍｌにプロティナーゼ阻害剤の錠剤（Ｒｏｃｈｅ：ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔｓ）１個を溶かした溶液を加えてディシュ内で破砕する。ＲＩＰＡ緩衝液の組成は１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。４℃にて、一晩撹拌した後、ディシュ内の溶液を採取して、４℃、３０００ｒｐｍ、５分遠心する。その上清を、抽出タンパクとして実験に用いた。
ビーグル犬の椎間板からのタンパクの他、膝関節周囲の骨腫瘍の摘出手術の際に得られたヒトの正常膝軟骨から抽出したタンパクをポジティブコントロールとして用いた。
各タンパクの抽出液をプロテインアッセーにて濃度を調整した上で、Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃、３分間ボイルし、１２％ゲル（第一化学、ＰＡＧミニゲル）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（８０Ｖ、１８０分）。続いて、ニトロセルロース膜に転写した（０．１Ａ、４５分）。これにＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）社製のヒト成人軟骨プロテオグリカン抗体を反応させ、ついでＥＣＬ  ｋｉｔ（Ａｍｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）によって発色させた。その結果を図１３に示した。図中Ｍは分子量マーカーであり、ＰＣはヒトの正常な膝軟骨から抽出したタンパクを用いたポジティブコントロールであり、Ｃ２／３はＭＭＰ−７を注入した椎間板から抽出したタンパクであり、Ｃ３／４は生理食塩水を注入した椎間板から抽出したタンパクであり、Ｃ５／６は無処理の椎間板（第５頚椎と第６頚椎の間）から抽出したタンパクである。
４０ｋＤａから１００ｋＤａまでのバンドはＧ１ドメインを含むコアタンパクとケラタン硫酸側鎖を示している。バンドが単一でないのは、臨床検体であるために、生理的酵素などによるプロテオグリカンの分解度によっていくつかの分解産物が存在することを表している。ヒトの正常な膝軟骨から抽出したタンパクを用いたポジティブコントロール（ＰＣ）の場合は、様々なＭＭＰやアグリカネースなどのプロテオグリカン分解酵素が存在するため、プロテオグリカンの分解産物が検出された。生理食塩水注入の場合（Ｃ３／４）および無処理の場合（Ｃ５／６）でも、プロテオグリカンの分解物が検出された。これらと比較して、ＭＭＰ−７注入の場合はプロテオグリカンの分解産物の量は明らかに減少している。これは、ＭＭＰ−７が椎間板ヘルニア内のプロテオグリカンを分解した結果である。
手術で除去されたヘルニア検体を用いた器官培養実験（実施例１）により、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７がヘルニアを分解することが明らかとなった。また、ウサギ椎間板への注入実験（実施例２）、ビーグル犬の自然発症ヘルニアへの注入実験（実施例３）およびイヌ椎間板ヘルニアを用いた分子生物学的検討（実施例４）により、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７の椎間板内注入により椎間板および椎間板ヘルニアのマトリックス分解が起きることが明らかとなった。これらの事実から、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７が椎間板ヘルニア治療に有効であることが確認された。
参考例
イヌの椎間板ヘルニアにキモパパインを注射して注射後１週間で屠殺し、実施例３と同様に病理標本を作製し染色した。これを図１４に示す。この場合には、軟骨のマトリックスが髄核部と線維輪全体にわたって分解され、残存した軟骨細胞も非常に少ない。したがって、キモパパインをヘルニア患部に注入した場合には、正常な軟骨細胞が損傷を受けるため、椎間板再生能は本発明のＭＭＰ−７の注入と比較して、明らかに椎間板再生能が低いと結論される。
【産業上の利用可能性】  ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−７のような、ヒト由来の蛋白質分解酵素を椎間板変性に伴う疾患の患部に直接投与する本発明の椎間板変性に伴う疾患の治療剤によって、その疾患を速やかに治療することができる。その疾患は、例えば椎間板ヘルニア、腰痛症、椎間板症、変形性脊椎症である。ヒト由来の蛋白質分解酵素は、これまで臨床応用されたキモパパインのような植物由来の酵素と比べて、アナフィラキシーなどの重篤な免疫反応の発症がなく、しかも正常な軟骨細胞を損傷しない点で極めて優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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