(57)【要約】（課題）  肝臓ガン特異的ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドの発現を抑制するＲＮＡ分子を提供する。（解決手段）  配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有するポリペプチド、及びこれらのヌクレオチド断片、該ポリペプチド及びその断片をコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対応する部分配列を有するＲＮＡ分子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し；配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列を有し；かつ配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
相同性が少なくとも９０％である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
相同性が少なくとも９５％である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列の部分配列；又は配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列の部分配列を有し；かつ請求項４のポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド断片。
【請求項６】
請求項１、又は４記載のポリペプチド、又は請求項５のポリペプチド断片からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、請求項４のポリペプチドに対し特異的な抗体製造用組成物。
【請求項７】
請求項６記載の組成物を、哺乳類に投与することを含む、請求項４のポリペプチドに対する抗体の製造方法。
【請求項８】
請求項４記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項９】
該抗体が、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体である、請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８記載の抗体を含む、肝臓ガン、又は肝臓前ガン状態診断用キット。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し；配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列を有し；かつ請求項４のポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
該相同性が少なくとも９０％である、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
該相同性が少なくとも９５％である、請求項１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸配列の部分配列；又は配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列の部分配列を有し；かつ請求項４のポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１１、１４、１５、又は１６のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１、又は４記載のポリペプチド、又は請求項５記載のポリペプチド断片を製造する方法であって、請求項１８の宿主細胞を該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片が産生され得る条件で培養し、次いで該ポリペプチド又は該ポリペプチド断片を回収することを含む、該製造方法。
【請求項２０】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに対応する、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、相補的なポリヌクレオチドに対応する、少なくとも１５ヌクレオチドを含む、ＰＣＲ用プライマー。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドの検出方法であって、請求項２０及び２１のＰＣＲ用プライマーを用い、ＰＣＲを行うことを含む、該検出方法。
【請求項２３】
配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを検出するキットであって、請求項２０及び２１のＰＣＲ用プライマーを含む該キット。
【請求項２４】
配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列の部分配列に対応するヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制する、ヌクレオチド対が１５〜２５のＲＮＡ分子。
【請求項２５】
該ヌクレオチド対が１８〜２４である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項２６】
該ヌクレオチド対が２１〜２３である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項２７】
該特異的タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその変異タンパク質である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項２８】
該変異タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項２９】
該変異タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項３０】
該変異タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列と９５％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項２４記載のＲＮＡ分子。
【請求項３１】
配列番号１０のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ分子。
【請求項３２】
配列番号１０の配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、かつ、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子。
【請求項３３】
その３’−末端に水酸基を有する、請求項２４記載の該ＲＮＡ分子。
【請求項３４】
請求項２４〜３２のいずれか１項記載のＲＮＡ分子を含む、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制する医薬組成物。
【請求項３５】
ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質、又はその変異タンパク質を発現する細胞に、請求項２４〜３２のいずれか１項記載のＲＮＡ分子を導入すること、該ＲＮＡ分子によりＲＮＡ干渉が生じる条件下に前記細胞を維持し、該特異的タンパク質、又はその変異タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解させることを含む、ノックアウト細胞の製造方法。
【請求項３６】
請求項３４記載の方法で製造した、ノックアウト細胞。
【請求項３７】
請求項２４〜３２のいずれか１項記載のＲＮＡ分子を含む、ヒト肝臓ガン特異的タンパク質の機能解析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な肝臓ガン特異的ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドの発現を抑制するＲＮＡ分子に関するものである。さらに詳細に述べると、ヒト原ガン遺伝子Ｐｉｍ−３にコードされている新規な肝臓ガン特異的ポリペプチド、その特異的な抗体、診断キット、該特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド、又は断片を含むベクター、形質転換体、及び該特異的ポリペプチドの発現を特異的に抑制し、肝臓ガンの治療に適用し得るＲＮＡ分子に関するものである。
【背景技術】  肝臓ガンは、東南アジア、アフリカ、南ヨーロッパに多く見られるガンであって、ガンによる死因の第８位を占め、我国でも西日本を中心に発生率が高い。この肝臓ガンは、Ｂ型又はＣ型肝炎ウィルスの持続感染による慢性肝炎、肝硬変が主な原因と考えられている（非特許文献１）。
この肝臓ガンの診断方法として、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）やＰＩＶＫＡ−ＩＩなどの腫瘍マーカを利用した血液検査、レントゲン、超音波検査、ＣＴ、ＭＲＩ、血管造影などの画像診断などが行われている。しかし、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）などの腫瘍マーカは、慢性肝炎や肝硬変があれば肝臓ガンがなくとも比較的高値を示すため、再検査や、画像診断の併用と経過観察が必要であり、さらに、原発性肝臓ガンが発生していても検出されないケースもある。また、画像診断では、ヒトによっては見にくかったり、死角が有ったりするため、複数の検査を組み合わせないと見落としが起きるなどの問題がある。このため、肝臓ガンに関し、さらに精度が高く、効率的な検査方法が必要とされている。
また、肝臓ガンの治療方法として、手術による肝臓ガンの切除、マイクロウエーブ凝固法（ＭＣＴ）、ラジオ波凝固法（ＲＦＡ）、エタノール注入療法（ＰＥＩＴ）、肝動脈塞栓術、リザーバーを用いた肝動脈内抗癌剤投与のよる化学療法、放射線療法などが行われている。しかし、肝臓ガンの患者は、慢性肝炎や肝硬変などの慢性肝疾患を合併しているため肝機能が悪く治療法が制約されることが多く、手術ができないだけでなく、肝臓にかかる負担が小さい低侵襲の治療方法しか選択できない場合も少なくない。このため、肝機能が悪くとも適用できる負担の小さい治療方法が必要とされている。
近年、分子生物学、遺伝子工学の著しい進歩に伴い、各種のガンにおいて新しい腫瘍マーカ、抗体、また低分子干渉性ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）が報告されており（特許文献１及び２）、肝臓ガンに関しても同様の研究により、優れた診断方法及び治療方法の開発が望まれている。
【特許文献１】      国際公開第９９／０３２６１９号パンフレット
【特許文献２】      国際公開第０１／０７５１６４号パンフレット
【非特許文献１】    Ｇｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ａ．２００２．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．６：３１７−３３４．
【発明の開示】
本発明は、肝臓ガンの新規な診断方法、診断薬、及び治療薬の開発につながる、新規な肝臓ガン特異的ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該ポリペプチドの発現を抑制するＲＮＡ分子を提供することを目的とする。
肝臓ガンの原因と考えられている肝炎ウイルスの感染は、ウイルスの根絶と肝臓障害の両方に影響を与える、ウイルス抗原特異的な細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を発生させる。さらに、ＣＴＬが関与する肝臓細胞の破壊と再生の循環は、肝臓ガンへと導く分裂誘発性と突然変異誘発性の環境を作り出すと考えられている。この仮定は、骨髄を除去したＨＢＶ抗原（ＨＢｓ）トランスジェニックマウス（ＨＢｓＴｇ）が、ＨＢｓで免疫した同系の野生型マウスから骨髄細胞と脾臓細胞の移植を受けて１５ヶ月目に、肝臓ガンに罹患していたことを報告した、Ｎａｋａｍｏｔｏらの報告により示されている（＊１）。しかし、この肝癌発症の基礎をなす分子機構は未だ完全には調べられていない。
これまで、腫瘍の初期発生と悪性化は、様々な遺伝子の発現と構造の変化が蓄積された結果であることを示唆する証拠が相次いで報告されている。ＨＢｓＴｇの肝臓ガンモデルにおいても、症状の長期に渡る潜伏が、これと同じような複合的変化の存在を示唆している。遺伝子発現において、ゲノムの広範囲な変化を明らかにするために、肝臓ガンを含む様々なタイプの腫瘍でトランスクリプトーム解析が行われている。ほとんどの肝臓ガン研究において、遺伝子発現様式は、同一患者由来の肝臓の腫瘍部位と非腫瘍部位とで比較されてきた。しかし、正常組織に比べると、この非腫瘍部位においても複合的変化が予想されるため、このタイプの解析は、腫瘍部位と正常組織ではない非腫瘍部位に共通するのいくつかの遺伝子発現の変化を検出できていない可能性があった。移植後１５ヶ月目において、ＨＢｓＴｇの肝臓内では、肝細胞の形成異常が確認できた非腫瘍部位と、腫瘍部位とが混在して存在していた。そのため、この非腫瘍部位を前癌状態の病変とし、正常組織と蛍光ディファレンシャルディスプレー（ＦＤＤ）を用いて遺伝子発現様式の比較をした。
すなわち、本発明者らは、ＨＢｓＴｇの肝臓ガンモデルにおいて、前癌状態の病変で発現していた、いくつかの遺伝子を同定し、この中で、これまで肝臓における発現とヒトホモログが報告されていない原ガン遺伝子について研究を行った。その結果、Ｐｉｍ−３遺伝子がヒト肝臓ガン特異的タンパク質をコードするという知見を得て、そのポリペプチドのアミノ酸配列、及びＤＮＡのポリヌクレオチド配列を決定し、さらにその性質の研究を行い、本発明を完成したのである。
したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、並びに配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し；配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列を有し；かつ前記ポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有するポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは単離されたものを含む。
さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列；又は配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列の部分配列を有し；かつ前記ポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド断片を提供する。該ポリペプチド断片は単離されたものを含む。
また、本発明は、前記ポリペプチド、又は前記ポリペプチド断片からなる群から選ばれる少なくとも１を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造用組成物を提供する。
また、本発明は、前記組成物を、哺乳類に投与することを含む、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体の製造方法を提供する。
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的な抗体を含む、肝臓ガン、又は肝臓前ガン状態診断用キットを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、さらに配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し；配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６、又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列を有し；かつ前記ポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列；又は配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６、又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列の部分配列を有し；かつ配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。本発明のこれらポリヌクレオチドは単離されたものを含む。
また、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクター、及び該ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
さらに本発明は、配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列の部分配列に対応するヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制する、ヌクレオチド対が１５〜２５のＲＮＡ分子を提供する。
また本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ分子、又は配列番号３の配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、かつ、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子を提供する。
また本発明は、前記ＲＮＡ分子を含む、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制する医薬組成物を提供する。
また本発明は、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質、又はその変異タンパク質を発現する細胞に、前記ＲＮＡ分子を導入すること、該ＲＮＡ分子によりＲＮＡ干渉が生じる条件下に前記細胞を維持し、該特異的タンパク質、又はその変異タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解させることを含む、ノックアウト細胞の製造方法を提供する。
また本発明は、前記ＲＮＡ分子を含む、ヒト肝臓ガン特異的タンパク質の機能解析用キットを提供する。
本発明により、ヒト原ガン遺伝子Ｐｉｍ−３にコードされている新規な肝臓ガン特異的ポリペプチド、その特異的な抗体、該特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該特異的ポリペプチドの発現を特異的に抑制し、肝臓ガンの治療に適用し得るｓｉＲＮＡが提供され、その結果、新規な肝臓ガンの診断方法、診断試薬、及び肝臓ガンの治療方法を開発することが可能になった。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＢｓＴｇマウスにおけるＰｉｍ−３発現レベルを示すグラフである。
図２は、ｈＰｉｍ−３のポリヌクレオチド配列、及び対応するポリペプチド配列を示す。
図３は、ヒト、マウス及びラットのＰｉｍ−３のアミノ酸配列を比較した図である。
図４は、ヒトＰｉｍ−１、Ｐｉｍ−２及びＰｉｍ−３のアミノ酸配列を比較した図である。
図５は、ヒト正常組織におけるｈＰｉｍ−３とＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現を示す図である。
図６は、ヒト肝臓ガン細胞株におけるヒトＰｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現を示す図である。
図７は、ヒト肝ガン組織におけるｈＰｉｍ−３の発現を特異的示す図である。
図８は、ｈＰｉｍ−３のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合における、ヒト肝臓ガン細胞の生存活性の減少を示すグラフである。
図９は、ｈＰｉｍ−３のｓｉＲＮＡトランスフェクション４日目以降に、その処理群で、細胞が剥がれ始めたことを示す図である。
図１０は、Ｐｉｍ−３のｓｉＲＮＡを導入したヒト肝臓ガン細胞における細胞周期の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の肝臓ガン特異的ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、本発明のポリペプチドは、さらに該ポリペプチドと共通の抗原性を有するホモログ（ポリペプチド）、又はこれらと共通の抗原性を有するペプチド断片を含む。本発明のポリペプチドを検出することにより、肝臓ガンの診断を行うことができ、また、本発明のポリペプチド、そのホモログ、及び該ポリペプチド断片は、肝臓ガン診断用、及び治療用抗体の作製に有用である。本発明の特異的ポリペプチドの発見、及び単離の工程は、後述する実施例で詳細に説明されている。
本明細書における「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列の一次構造、該一次構造のポリペプチド断片、立体構造を伴う生物活性を有するポリペプチド、又はタンパク質を意味する。
本明細書における「ホモログ」という用語は、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はタンパク質と、アミノ酸配列が相同性を有し、かつ共通の生物活性又は抗原性を有するポリペプチドをいう。
本発明における「ｓｉＲＮＡ」という用語は、特定の遺伝子の発現を抑制する短ＲＮＡ断片、又は該ＲＮＡ断片とその相補鎖からなる二本鎖ＲＮＡ分子を意味する。
図３に示すように、本発明の肝臓ガン特異的ポリペプチドである、ヒトＰｉｍ−３タンパク質は、ラット、及びマウスＰｉｍ−３タンパク質と比較し、そのアミノ酸配列（配列番号：１）において、次の特徴的な相違点がある。すなわち、配列番号１のアミノ酸配列は、ラット、及びマウスと比較し、Ｎ−末端から３９、８４、２９６、及び３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３及び３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５及び２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、及び３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌである点で相違するのである。
したがって、本発明のポリペプチドホモログは、配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し；配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６、又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列を有し；かつ配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチドである。なお、該ホモログの相同性は、特に９０％、好ましくは９５％、特に好ましくは９７％である。
また、本発明の特異的ポリペプチドのペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸配列の部分配列；又は配列番号１のアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％の相同性を有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列に対応して、少なくともＮ−末端から３９、８４、２９６、又は３００番目のアミノ酸残基がＡｌａ、８５番目のアミノ酸残基がＴｈｒ、１６３又は３３３番目のアミノ酸残基がＳｅｒ、１９５又は２５７番目のアミノ酸残基がＬｅｕ、２７１番目のアミノ酸残基がＡｒｇ、２９７番目のアミノ酸残基がＡｓｐ、３１３番目のアミノ酸残基がＰｒｏ、又は３１６番目のアミノ酸残基がＶａｌであるアミノ酸配列の部分配列を有し；かつ配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有する、ポリペプチド断片である。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性とは、一線上に並べた場合における、基準となるアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列との同一性（％）をいう。該相同性は、塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行うための標準のプログラムである、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−６９）等の解析ソフトで、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算することができる。
本明細書において、ポリヌクレオチド、該ホモログ及び該ポリペプチドの断片（以下、必要な場合はポリヌクレオチド等と略す。）は、標準的標記法に従い、左端がＮ−末端（アミノ末端）、右端がＣ−末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチド等は、Ｃ−末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）とすることもできる。このエステルの側鎖Ｒの例を挙げると、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基、又はα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのアルキル基などがある。
また、本発明のポリペプチド等は、Ｎ−末端のアミノ酸残基のアミノ基が、ホルミル基、アセチル基などの保護基、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基で保護されたもの、又は糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
また、本発明のペプチド断片は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体産生を誘導するものであれば、特に限定されるものではないが、前記ポリペプチド、及びそのホモログ部分ペプチドであって、これらの２０個〜２００個、好ましいくは２０個〜１００個、さらに好ましくは２０〜７０個のアミノ酸配列を有するものである。
また、本発明のポリペプチド等は、生理学的に許容し得る無機又は有機酸付加塩として用いることができる。該無機酸付加塩の例を挙げると、塩酸、リン酸、臭化水素酸、及び硫酸の塩があり、また有機酸付加塩の例を挙げると、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、及びベンゼンスルホン酸などの塩がある。
本発明の配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的な抗体の製造に用いる組成物は、前記ポリペプチド、そのホモログ、これらのペプチド断片、又はこれらの酸付加塩を含むものである。また、必要に応じて、該組成物はベヒクル、希釈剤、アジュバンドなどの成分を含んでいてもよい。
本発明の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はそのペプチド断片に特異的に反応する抗体であり、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体は、次の方法で製造することができる。まず、前記抗体製造用組成物を非ヒト哺乳動物に投与する。抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行う。該非ヒト哺乳動物の例を挙げると、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリがあり、一般に好ましいのはマウス、又はラットである。
前記抗原で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生が認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓、又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞採取し、同種、又は異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製する。抗血清中の抗体価の測定は、標識化タンパク質と抗血清とを反応させ、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行う。また細胞融合は、ケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６、４９５，１９７５）などの常法で行うことができる。融合促進剤として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどを用いることができる。
また、骨髄腫細胞の例を挙げると、ＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／Ｏ，及びＡＰ−１などの非ヒト哺乳動物の骨髄腫細胞があり、特にＰ３Ｕ１が好ましい。融合に用いる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０程度であり、ＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００を１０〜８０％度の濃度で添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、種々の方法で行うことができる。例えば、抗原を直接、又は担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）と、ハイブリドーマ培養上清を接触させ、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を含む溶液を接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体などを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を接触させ、次いで放射性物質や酵素などで標識したタンパク質の溶液と接触させ、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがある。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別は常法で行うことができる。例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地に、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））、又はハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は２０〜４０℃、培養時間は、通常５日〜３週間で、培養は、通常５％炭酸ガス存在下で行う。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
また、得られたモノクローナル抗体の分離精製は、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、及び電気泳動法などの免疫グロブリンの分離精製法、イオン交換体（ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相、又はプロテインＡ活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などの常法で行うことができる。
また、本発明のポリクローナル抗体は、免疫抗原である前記ポリペプチド等、又は該そのペプチド断片とキャリアータンパク質との複合体で、非ヒト哺乳動物を免疫し、その後、血清などの抗体含有成分を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
該免疫抗原とキャリアータンパク質との混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よく産生されるように決定する。例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で用いることができる。また、ハプテンとキャリアーのカップリングには、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等を用いることができる。
該複合体抗原は、単独で、又は担体、希釈剤、さらに抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントとともに投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回行う。該ポリクローナル抗体は、免疫された哺乳動物の血液、腹水、卵黄などから採取する。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。また、ポリクローナル抗体の分離精製は、前記モノクローナル抗体の分離精製と同様に行うことができる。
本発明の肝臓ガン、又は肝臓前ガン状態診断用キットは、このようにして得られたポリクローナル、又はモノクローナル抗体を含む。また、該診断用キットは、必要に応じて、免疫反応用ウェル、染色剤、検出用の酵素標識抗体、洗浄液、抗体希釈液、検体希釈液、酵素基質、酵素基質液希釈液、その他の試薬を含むものである。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、該ポリペプチドと共通の抗原性を有するホモログ（ポリペプチド）、又はこれらと共通の抗原性を有するペプチド断片をコードする、ポリヌクレオチドである。特に、配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、及びＲＮＡのいずれであってもよい。該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記肝臓ガン細胞又は組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれの形態であってもよい。また該ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、又はファージミドなどである。また、前記肝臓ガン細胞又は組織から調製した全ＲＮＡ、又はｍＲＮＡ画分を用いて直接、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅したものでもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドに抗原性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
該ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）などに記載された常法で行うことができる。また、該ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件をいう。
また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部、又は全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。該ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などで行うことができる。得られたＤＮＡは、目的に応じて、そのまま、又は制限酵素で消化したり、リンカーを付加して使用することができる。該ＤＮＡはその５’−末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを付加し、また３’−末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧを付加してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
なお、ここで用いるプライマーには、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドに対応する、又はそれに相補的なポリヌクレオチドに対応する、それに少なくとも１５ヌクレオチドを含むＰＣＲ用プライマーがある。
また、これらのプライマーを用いて、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを検出するキットを作製することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当なベクター中のプロモーターの下流に連結することで製造することができる。
ここで用いるベクターには、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどがある。
本発明で用いるプロモーターは、使用する宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがある。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどがあり、該宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、該宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどがあり、さらに該宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどである。
本発明の発現ベクターには、さらに所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジンなどを含むものを用いることができる。該選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがある。また、必要に応じて、宿主に適したシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ−端末側に付加する。該宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、該宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、該宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが、該宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などを利用できる。このように構築した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
本発明で用いる宿主には、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、及び動物細胞などがある。
該バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１６８巻、１１１（１９７９）などに記載の方法がある。酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９４巻、１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７５巻、１９２９（１９７８）などの方法がある。昆虫細胞又は昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６、４７−５５（１９８８）などに記載の方法がある。また、動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール、２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２巻、４５６（１９７３）に記載の方法がある。このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を作製することができる。
該宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含くまれている。ここで炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液など、また無機栄養分としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどある。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、４３１−４３３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。
また、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、７７巻、４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８１巻、５３３０（１９８４）〕がある。該培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する場合、グレイスインセクト培地（Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を加えた倍地などを用いる。該培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
また、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１２２巻、５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、８巻、３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、１９９巻、５１９（１９６７）〕、１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、７３巻、１（１９５０）〕などを用いる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。このようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜又は細胞外に本発明のポリペプチドを産生させることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、常法に従う。例えば、本発明のポリペプチドを培養菌体、細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体又は細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などである。該緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体又は細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、又は抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行う。これらの公知の分離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などがある。
該ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法よって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前又は精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどがある。このようにして生成した本発明のポリペプチドは、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、本発明はヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子を提供する。該ＲＮＡ分子は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、その対応する配列で切断することにより発現を抑制するものと考えられている。例えば、ファイアらの論文（Ｆｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１，（１９９８））に記載されているＲＮＡ干渉と同じ現象を起こすと考えられる。
該ＲＮＡ分子は、配列番号２の第４３６〜第１４１３のヌクレオチド配列の部分配列に対応するヌクレオチド配列、又は該ヌクレオチド配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制する、ＲＮＡ分子である。また、該ＲＮＡ分子のヌクレオチド対の数は、１５〜２５、好ましくは１８〜２４、特に好ましくは２１〜２３である。
前記該特異的タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその変異ポリペプチドである。該変異ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と８０％の相同性、好ましくは９０％の相同性、特に好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
また、本発明の該ＲＮＡ分子は、配列番号３のヌクレオチド配列からなるＲＮＡ分子、又は配列番号３の配列において、少なくとも１塩基が付加、欠失、又は置換された変異クレオチド配列からなり、かつ、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子であってもよい。該ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）は、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４頁、２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列をもとに設計することができる。
なお、本発明のＲＮＡ分子をＩｎ  ｖｉｖｏ又はＩｎ  ｖｉｔｒｏで使用する場合、該ＲＮＡ分子とその相補的ＲＮＡからなる２本鎖ＲＮＡ分子とする。この場合、該二本鎖ＲＮＡ分子が細胞内で分解しないよう、又は一本鎖に解離しないよう処理するのが好ましい。例えば、該ＲＮＡ分子の３’−末端に水酸基付加する、二本鎖の両末端をチオホスホリル基によって化学結合させる、又各鎖の間に紫外線、ビス（２−クロロメチル）アミン、４−チオウラシル、ソラレンなどの二官能基により化学結合を誘導するなどの方法で処理することである。
本発明のＲＮＡ分子は、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質の発現を抑制するものであるから、肝臓ガンの治療、及び前ガン状態細胞のガンへの移行を阻止する医薬組成物として使用することができる。
該ＲＮＡ、又はその塩は、経口的に、又は非経口的に投与することができ、さらに該非経口的投与は、組織への局所的な投与を含む。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、汎用されている担体などの製剤用成分、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、緩衝剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、コーティング剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、湿潤剤、吸着剤、滑沢剤及び賦形剤などを用いることができる。また、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの添加剤を用いてもよい。
製薬用成分の具体的な例を挙げると、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸などの賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖などの崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤などである。さらに必要に応じて、上記の各剤形について公知のドラッグデリバリーシステムの技術を採用し徐放化、局所適用化（トローチ、バッカル剤、舌下錠等）、薬物放出制御、腸溶性化、胃溶性化などを施すことができる。
また、非経口投与する場合、点滴、静脈注射、皮下注射、筋肉注射などの注射による投与、油脂製坐剤、水溶性坐剤、座剤による直腸投与などの形態とすることができる。該調剤は、製薬分野における通常の担体を用い、常法により容易に行うことができる。
本発明のｓｉＲＮＡは、安全で低毒性なので、例えば、ヒト、その他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該ｓｉＲＮＡ、又はその塩の投与量は、肝臓ガンの状況、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。例えば、経口投与する場合、一般的に、体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜４０００ｍｇ、好ましくは約２０〜２０００ｍｇ、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該ｓｉＲＮＡの１回投与量は投与対象、肝臓ガンの状況などによっても異なるが、例えば、注射剤の形で体重６０ｋｇの成人患者においては、一日につき約１０〜２０００ｍｇ程度、好ましくは約２０〜１０００ｍｇ程度、より好ましくは約５０〜５００ｍｇ程度を静脈から投与するのが好ましい。
また、ヒト肝臓ガンの特異的タンパク質、又はその変異タンパク質を発現する細胞に、前記ＲＮＡ分子を導入すること、該ＲＮＡ分子によりＲＮＡ干渉が生じる条件下に前記細胞を維持し、該特異的タンパク質、又はその変異タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解させることにより、Ｐｉｍ−３遺伝子のノックアウト細胞を製造することができる。このノックアウト細胞を使うことにより、Ｐｉｍ−３遺伝子がコードするポリペプチドの機能を調べることができる。したがって、前記ＲＮＡ分子を利用することにより、Ｐｉｍ−３遺伝子ヒト肝臓ガン特異的タンパク質の機能解析用キットを作製することができる。
【産業上の利用可能性】  本発明により提供されたヒト原ガン遺伝子Ｐｉｍ−３にコードされている新規な肝臓ガン特異的ポリペプチド、その特異的抗体、該特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び該特異的ポリペプチドの発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡは、新規な肝臓ガンの診断方法、診断試薬、及び肝臓ガンの治療方法などの用途を有する。
【実施例１】  肝臓ガンモデルマウスの作製
チサリ博士（Ｄｒ．Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｓａｒｉ：Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から、１０７−５Ｄ系統のＨＢｓＡｇトランスジェニックマウス（公式名称；Ｔｇ［Ａｌｂ−１，ＨＢＶ］Ｂｒｉ６６；ｉｎｂｒｅｄ  Ｂ１０Ｄ２，Ｈ−２ｄ）の提供を受けた。１０７−５Ｄ系統には、アルブミンプロモーターの転写制御下に置かれたＨＢＶエンベローブ全体をコードした領域（ｓｕｂｔｙｐｅ  ａｙｗ）が存在し、ＨＢＶのそれぞれスモール、ミドル、ラージエンベローブ蛋白質を肝細胞内で発現する（＊２）。
このマウスは、Ｔ細胞レベルでのＨＢｓ導入遺伝子に対し免疫寛容であるため（＊３）、ＨＢｓＡｇ特異的細胞障害性Ｔ細胞の養子移入を受けなければ、一生涯肝臓疾患の症状を見せることはない（＊２、＊４）。
慢性肝炎が関与する肝臓疾患モデルを下記の方法で作製した。すなわち、オスのＨＢｓＡｇトランスジェニックマウスの胸腺を摘出し、放射線（９００ｃＧｙ）を照射した後、同系統の遺伝子操作をしていないＢ１０Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスから骨髄細胞を移植しトランスジェニックマウスの造血システムを再構築した。そして骨髄移植後１週間目に、該マウスに、脾臓細胞の移植３週間前に、ＨＢｓＡｇを発現している組換えワクシニアウイルス（ＨＢｓ−ｖａｃ）を、腹膜内に感染させた同系統の遺伝子操作を行っていないＢ１０Ｄ２（Ｈ−２ｄ）マウスの脾臓細胞１０８個を移植した。リンパ球の移植から１２から１５ヶ月後、複合的な肝臓ガンの病巣が該マウスに発生していた（＊１）。
非腫瘍部位と腫瘍部位とを実体顕微鏡下で区別し、別々に切り離した。そして、得られた非腫瘍部位を光学顕微鏡下で観察し、非ガン細胞で異常な形態をした肝細胞の存在を確かめた。そして、この非ガン細胞を含む非腫瘍部位を次の実験において前癌状態の病変として用いた。また、肝臓組織はコントロールとしてリン酸緩衝液で処理、または免疫していないマウス脾細胞を移植したトランスジェニックマウスからも得た。
【実施例２】  肝臓ガン特異的タンパク質遺伝子のスクリーニング
実施例１のモデルマウス、及び正常マウス肝臓組織から抽出した全ＲＮＡを、イトウらにより記述されている方法に従い、蛍光ディファレンシャルディスプレー（ＦＤＤ）にかけた（＊５）。
すなわち、全ＲＮＡをＲＮＡ−ビー（ＲＮＡ−Ｂｅｅ：Ｂｉｏｔｅｃｘ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて単離後、ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼ（宝酒造株式会社）で処理した。精製されたＲＮＡ２．５μｇ、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び蛍光ラベルしたアンカープライマーＧＴ１５Ａ、ＧＴ１５Ｃ、ＧＴ１５Ｇを用いて逆転写反応を行った。
５０ｎｇのＲＮＡに相当するｃＤＮＡを合成し、該ｃＤＮＡを、アンカープライマー０．５μＭと、任意のプライマー（１０ｍｅｒ  ｋｉｔ  Ａ、Ｏｐｅｒｏｎ社）０．５μＭ、それぞれのｄＮＴＰ  ５０μＭ、Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（株式会社ニッポンジーン）１ユニット、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社）１ユニットのとともに用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ生産物は、６％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルで分離し、Ｖｉｓｔｒａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）で分析した。
そして、目的のバンドをゲルから抽出し、ｐＳＴＢｌｕｅ−１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いてクローニングした。そして、挿入したｃＤＮＡの塩基配列を、ＣＥＱ２０００ＤＮＡ分析システム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて決定し、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋのデータベースと照らし合わせるため、ＢＬＡＳＴプログラムで分析した。
このようにして、本発明者らは、前癌状態の病変と正常肝臓との遺伝子発現様式を、６０個の独立したプライマーの組み合わせを用いて、ＦＤＤで比較することができた。２回の独立した実験で、３８個と５６個のバンドの発現がそれぞれ再現性をもって上昇、または減少した。得られたバンドの塩基配列は、前癌状態の病変において発現が上昇、または減少したバンドで、それぞれ２４個と１９個の独立した遺伝子を確認することができた。これまでの研究報告では、これらのほとんどの遺伝子が肝臓において発現していることが示されている。
しかし、前癌状態の病変において発現が上昇したＰｉｍ−３遺伝子に関して、正常肝細胞や肝臓ガン細胞における発現は報告されていなかったので、本発明者らは該Ｐｉｍ−３、すなわちＰｉｍ−１とＰｉｍ−２を含むセリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ原ガン遺伝子ファミリーに属するＰｉｍ−３に焦点を当てて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。
【実施例３】  Ｐｉｍ−３の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
実施例２の方法で抽出した全ＲＮＡを用い、キタムラらの論文に記載された方法により半定量的ＰＣＲ分析を実施した（＊６）。Ｐｉｍ−３遺伝子、及びグリセロアルデヒド３リン酸脱水酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子増幅用プライマーセットを用いて増幅を行ない、対応するｃＤＮＡを得た。
これらのプライマーの配列を次に示す。
Ｐｉｍ−３  センス；
2005014809.tif 000002
Ｐｉｍ−３  アンチセンス；
2005014809.tif 000003
ＧＡＰＤＨ  センス；
2005014809.tif 000004
ＧＡＰＤＨ  アンチセンス；
2005014809.tif 000005
逆転写酵素（ＲＥｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ：東洋紡績株式会社）・ヘキサヌクレオチド・ランダム・プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｅｔｃｈ社）を含む２０μｌの反応液中で、精製全ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ０．５μｌとＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社）及び配列番号３と４ないし５と６の組み合わせのプライマーを用いて、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて、以下の温度条件で遺伝子増幅を行なった：（９４℃・２分）×（９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・１分）×３０回、（７２℃・５分）×１回。
得られたＰＣＲ生産物を、１．５％アガロースゲルにより分離し、臭化エチジウム染色で可視化した。バンドの強度をＮＩＨイメージ分析ソフトウェアＶｅｒ１．６１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて測定し、ＧＡＰＤＨとの比率を計算した。
図１は、Ｐｉｍ−３発現レベルを示すグラフである。図１において、Ｎは、免疫した脾臓細胞を導入する前、９は免疫した脾細胞を導入後９ヶ月目（慢性肝炎の病変）、１５は免疫した脾細胞を導入後１５ヶ月目（前癌状態の病変）、及びＣは免疫していない脾細胞を導入後１５ヶ月目のＨＢｓＴｇマウス肝臓組織から全ＲＮＡを抽出し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行うことにより測定したデータを示す。Ｐｉｍ−３とＧＡＰＤＨのＰＣＲ生産物の比率を決定し、何も処理していないマウスの比率を１．０と仮定して比強度を計算した。そして、平均とＳＤを計算し、図に示した。統計学的有意性はＡＮＯＶＡ検定を用いて評価し、ｐ＜０．０５は統計学的に有意とした。
このＰｉｍ−３に焦点を当てた半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果は、前記ＦＤＤ解析の結果と矛盾せず、図１から明らかなように、Ｐｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現がコントロールと比べて前癌状態の組織で有意に強くなっていることを示している。
【実施例４】  ヒトＰｉｍ−３遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
実施例２及び３で、マウス肝癌モデルの前癌状態で特異的に発現する遺伝子と判断されたＰｉｍ−３（ｈＰｉｍ−３）のヒト相同遺伝子のヌクレオチド配列を決定するため、ヒト肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２からｃＤＮＡライブラリーを作製し、スクリーニングを行ってＰｉｍ−３  ｃＤＮＡのクローニングとヌクレオチド配列の決定を行った。
まず、細胞株ＨｅｐＧ２を、熱で不活化したウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇａ．）１０％を加えたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ社）を用いて、炭酸ガス５％を含む空気で満たされた加湿環境において、３７℃で培養した。
続いて、細胞株ＨｅｐＧ２から全ＲＮＡを単離し、ポリＡ  Ｔａｉｌを含むｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ＴＭ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  Ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ：宝酒造株式会社）で分離した。得られたｃＤＮＡを、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とオリゴ−ｄＴプライマーで合成し、使用説明書に従い、大腸菌ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にｃＤＮＡライブラリーを構築した。１段階目のスクリーニングは、配列番号７のオリゴマーをプローブとして使用し、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＰＰＥＲ  ｃＤＮＡポジティブセレクションシステム（ＧＥＮＥ  ＴＲＡＰＰＥＲ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を利用して行った。
2005014809.tif 000006
得られたコロニーに対し、前記プライマーセットを用いて２段階目のコロニーＰＣＲスクリーニングを行った。
該２段階スクリーニングにより３個の陽性クローンが得られ、これらの３個の独立したｃＤＮＡクローンは、２，３９２ｂｐのヌクレオチド配列からなる、同じインサートを含んでいた。５’非翻訳領域はＧＣ含有率が８２．３％であり、そして３’非翻訳領域はＡＴＴＴＡモチーフが５コピーとＴＡＴＴモチーフが８コピー含まれていた（図２）。この配列は、ＥＳＴデータベース上で示されたｈＰｉｍ−３  ｃＤＮＡ配列の特定部分配列と同一であった。そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は３２６残基のアミノ酸配列（配列番号：１を含む分子量３５，８７５のポリペプチド（タンパク質）をコードしていた（図３）。なお、図２おいてＡＴリッチモチーフ（ＴＡＴＴ又はＡＴＴＴＡ）はハイライトで示した。
さらに、該ＯＲＦから得られアミノ酸配列（配列番号：１）は、マウスやラットのＰｉｍ−３ポリヌクレオチドと高度な同一性（９５．０％）を有していた（図３）。これらの結果をもとに、本発明者らは該クローンをヒトＰｉｍ−３  ｃＤＮＡと判断した。
該ｃＤＮＡにコードされているヒトＰｉｍ−３ポリペプチドは、ウズラＰｉｍ（７３．９％）やツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）Ｐｉｍ−３（Ｐｉｍ−１：６８．７％）とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。さらに、該ヒトＰｉｍ−３はヒトＰｉｍ−１（５７．１％）及びヒトＰｉｍ−２（４４．０％）とアミノ酸レベルで高い相同性を示した（図４）。なお、図３におけるヒト、ラット、及びマウスＰｉｍ−３の比較、並びに、図４のヒトＰｉｍ−１〜３のアミノ酸配列の比較は、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃバージョン３．０ソフトウェア（ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．０ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。これらの配列においてｈＰｉｍ−３と同じアミノ酸残基はハイライトで示した。
【実施例５】  ヒト正常組織におけるヒトＰｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現
ヒト正常組織におけるｈＰｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現を調べるため、実施例３のｈＰｉｍ−３陽性ｃＤＮＡクローン（２，３９２ｂｐ）に対応する２．４ｋ  ｂｐのｍＲＮＡの発現をノーザンブロット解析により調べた。対象にした組織は、１：脳、２：心臓、３：骨格筋、４：結腸、５：胸腺、６：脾臓、７：腎臓、８：肝臓、９：小腸、１０：胎盤、１１：肺、及び１２：末梢血の白血球（数字は図５におけるレーン参照番号）であり、ｍＲＮＡの量を評価するために、同じ組織をおけるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現を解析し、それぞれのｈＰｉｍ−３のレーンに並行して示した。
該ノーザンブロット解析におけるｍＲＮＡの分析は、ヒト１２−レーンＭＴＮＴＭブロット（Ｈｕｍａｎ  １２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮＴＭ  Ｂｌｏｔ：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いておこなった。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）でラベルしたプローブをそれぞれ適切な温度（Ｐｉｍ−３；７０℃，ＧＡＰＤＨ；６８℃）でハイブリダイズさせた。その後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×ＳＳＣバッファーを用い６８℃で１５分間洗浄し、次いで０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣバッファーを用い６８℃で１５分間洗浄行った。そして、ハイブリダイズしたプローブを使用説明書に従い、ＤＩＧ検出キット（ＤＩＧ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）で検出した。
その結果、図５示すようにＰｉｍ−３は心臓と骨格筋で強く、脳、脾臓、腎臓、胎盤、肺、及び末梢血の白血球で中程度に発現していたのに対し、結腸や胸腺、肝臓、及び小腸では発現は検出されなかった。
【実施例６】  ヒト肝臓ガン細胞株におけるヒトＰｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現
ヒト肝臓ガン細胞におけるｈＰｉｍ−３  ｍＲＮＡの発現を調べるため、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。すなわち、ヒト肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２（１）、Ｈｅｐ３Ｂ（２）、ＨＬＥ（３）、ＨＬＦ（４）、ＨｕＨ７（５）、及びＳＫ−Ｈｅｐ（６）から、実施例２の方法で全ＲＮＡを抽出し、Ｐｉｍ−３遺伝子、及びグリセロアルデヒド３リン酸脱水酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子増幅用プライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、図６に示されているように、解析した肝臓ガン細胞すべてにｈＰｉｍ−３が検出された。なお、上記（１）〜（６）は図６における参照番号である。
【実施例７】  Ｐｉｍ−３ポリペプチドに対する抗体の作製
抗Ｐｉｍ−３抗体を、アサヒテクノグラス株式会社に受託し、調製した。まず、Ｐｉｍ−３のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸残基１３位から３２位に対応するペプチド断片を、カサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させた化合物（ＫＬＨ：ＣＧＰＧＧＶＤＨＬＰＶＫＩＬＱＰＡＫＡＤ：配列番号：８）を作製し、これを２羽のニワトリに投与して免疫した。免疫前と免疫後に卵黄を取得し、ＩｇＹ蛋白質を使用説明書に従いＥＧＧストラクトＩｇＹ精製システム（ＥＧＧｓｔｒａｃｔ  ＩｇＹ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社））を用いて精製し、２８０ｎｍで吸光度を測定することにより定量した。
【実施例８】  ヒト肝臓ガン組織におけるｈＰｉｍ−３の発現
ヒト肝臓ガン組織におけるｈＰｉｍ−３の発現を調べるため、ヒト肝臓ガン組織と正常肝臓において抗体を用いて免疫組織化学的解析を行った。
まず、パラフィンで包埋したヒト肝臓ガン領域組織をキシレン中で脱パラフィンを行ない、エタノール濃度（１００〜７０％）の緩やかな勾配で処理し再水和した。該試料を０．３％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含むＰＢＳ（−）中で処理した後、３％の正常なウサギの血清（ＤＡＫＯ）を含む２％のＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液に加え、アビジン−ビオチンブロッキングキット（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｋｉｔ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｉｓｅ社）で処理した。続いて、該試料を載せたスライドを１０μｇ／ｍｌの抗Ｐｉｍ−３  ＩｇＹ、又は免疫前に得たＩｇＹにより一晩４℃で処理し、引き続き２．５μｇ／ｍｌのビオチン結合ラビット−抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、室温で３０分間処理した。得られた免疫複合体を、ベクタステインエリートＡＢＣキット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とベクタステインＤＡＢ基質キット（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ：Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、使用説明書に従い可視化した。その後、前記スライドを、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｉｘｙｌｉｎ：ＤＡＫＯ社）で共染色し、顕微鏡下で観察した。また、コントロールとして、正常な肝臓組織を用い同様の処理を行って比較試料を作製した。
その結果、図７に示すように肝臓ガン組織において、免疫前ＩｇＹではｈＰｉｍ−３ポリペプチドは検出されなかったが（図なし）、抗Ｐｉｍ−３抗体では、再生している胆管上皮と同じように（図なし）、多くの肝臓ガン細胞で免疫反応活性が検出された。一方、正常細胞ではｈＰｉｍ−３ポリペプチドは検出されなかった（図なし）。これらの結果から、正常肝臓胞ではＰｉｍ−３が発現しておらず、一方、肝臓ガン細胞では特異的に発現していることが示されている。
なお、図７のＢは、Ａの四角内領域の１つを拡大したものであり、Ｂは特異的に染色された肝臓ガン細胞を示している。拡大倍率はＡが４０倍、Ｂが４００倍である。
【実施例９】  ｓｉＲＮＡの作製
まず、肝臓ガン特異的にｈＰｉｍ−３が発現するという知見に基づき、次の手順でｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を作製した。その合成は、サイレンサーＴＭ  ｓｉＲＮＡ合成キット（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ＴＭ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ：Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、使用説明書に従い行った。まず、ｓｉＲＮＡ標的ファインダ（ｓｉＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ：Ａｍｂｉｏｎ社）及びｓｉＲＮＡ設計ツール（ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ：Ａｍｂｉｏｎ社）を使用し、ｍＲＮＡにおける標的が、Ｐｉｍ−３をコードしているｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にあるＡＡ（Ｎ１９）ＵＵ配列となるよう、ｓｉＲＮＡ二本鎖分子を設計した。すなわち選択したｓｉＲＮＡの標的配列は、配列番号９のヌクレオチド配列を持つＲＮＡ部分である。該ＲＮＡ部分に関し、他のヒトゲノム配列とともにＢＬＡＳＴ検索にかけて標的の特異性を確認した。標的となるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と、作製したｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は次のとおりである。
標的となるｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ対応）：
2005014809.tif 000007
ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列：
2005014809.tif 000008
次いで、陰性コントロールとして、Ｂ−ブリッジインターナショナル社で設計されたランダムＲＮＡ断片（配列番号：１１）を採用した。
ランダムＲＮＡ断片のヌクレオチド配列：
2005014809.tif 000009
【実施例１０】  ｈＰｉｍ−３  ｓｉＲＮＡの効果試験
実施例９のｓｉＲＮＡ、及びランダムＲＮＡ断片を用いてｓｉＲＮＡの効果を試験した。
まず、ＨｕＨ７細胞（７×１０５個）を直径６ｃｍ細胞培養ディッシュに播き、２日間培養したのち、前記ｓｉＲＮＡ二本鎖分子、及びランダムＲＮＡ断片をそれぞれ１２５ｐｍｏｌと、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１２．５μｌ、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２．５ｍｌを混ぜ、室温２０分間静置した。該混合液は、事前に無血清ＤＭＥＭで洗浄した飽和前の細胞に直接加えた。次の日、ＦＢＳを２０％含むＤＭＥＭを２．５ｍｌ加え、ＦＢＳの最終濃度が１０％になるように調整した。所定の時間静置した後、次の解析のために細胞を回収した。
このようにトランスフェクションしてから２日後、細胞をトリプシンで処理し９６−ウェルプレートにそれぞれ５×１０３個の細胞を播いた。細胞の生存活性はＷＳＴ−１試薬（ＭＴＴのアナログ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）を使用して、毎日測定し、０日目の値を基準として比率を計算することにより細胞増殖解析を行った。
該解析の結果、図８のグラフで示すように、ランダムＲＮＡ断片をトランスフェクションさせたコントロールと比較し、Ｐｉｍ−３のｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合、明らかに細胞の生存活性は減少していた。また、トランスフェクション後４日目以降では、図９に示すように、ランダムＲＮＡ断片処理群は細胞が剥がれていないのに対し、Ｐｉｍ−３のｓｉＲＮＡの処理群では細胞が剥がれ始めた。したがって、Ｐｉｍ−３のｓｉＲＮＡ処理によりヒト肝臓ガン細胞ＨｕＨ７の生存活性が低下することが示されている。
【実施例１１】  ｈＰｉｍ−３  ｓｉＲＮＡを導入した肝臓ガン細胞の細胞周期の解析
実施例１０と同じ方法でｈＰｉｍ−３  ｓｉＲＮＡを導入した肝臓ガン細胞ＨｕＨ７を用い、フローサイトメトリーによる細胞周期解析を行った。すなわち、該細胞をトランスフェクション後４日目に回収し、氷中でエタノールを用いて細胞を固定した。そして、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）５０μｇ／ｍｌと、ＲＮアーゼＡｌμｇ／ｍｌを加え、室温で３０分間処理し、ＥＤＴＡを最終濃度１０μＭとなるように加えて反応を止めた。細胞をフィルター処理した後、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を用いて分析し、次いで、それぞれの細胞周期の分布を細胞探索分析ソフトウェア（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて検討した。その結果、図１０に示すように、Ｐｉｍ−３のｓｉＲＮＡを導入した肝臓ガン細胞では、ランダムｍＲＮＡ断片を導入した細胞や、コントロールの細胞と比較し、Ｇ１期やＧ２／Ｍ期の細胞が減少し、サブ−Ｇ１期の細胞が高い比率で含まれていた。実施例１０で示されたガン細胞ＨｕＨ７の生存活性の低下、及び細胞周期の変化は、ｈＰｉｍ−３  ｓｉＲＮＡにより、ｈＰｉｍ−３の発現が抑制され細胞ＨｕＨ７の細胞死が誘導されたこと示している。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
（配列番号：１）
本発明の肝臓ガン特異的ポリペプチドに含まれる、アミノ酸配列の示す。
（配列番号：２）
本発明の肝臓ガン特異的ポリペプチド、及びその調整領域等をコードする塩基配列を示す。
（配列番号：３）
実施例３で用いたＰｉｍ−３センスプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：４）
実施例３で用いたＰｉｍ−３アンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：５）
実施例３で用いたＧＡＰＤＨセンスプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：６）
実施例３で用いたＧＡＰＤＨアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
（配列番号：７）
実施例４でｈＰｉｍ−３の一次スクリーニングに用いたプローブの塩基配列を示す。
（配列番号：８）
実施例７で用いられたｈＰｉｍ−３ポリペプチドに対する抗体製造に用いたエピトープのアミノ酸配列を示す。
（配列番号：９）
実施例９における標的となるｍＲＮＡのヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ対応）を示す。
（配列番号：１０）
実施例９で作製した本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
（配列番号：１１）
実施例９で用いたランダムＲＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す。
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【配列表】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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