(57)【要約】本発明は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的として、細胞アポトーシスを安定かつ確実に誘導するための新しい手段を提供することを目的とする。  本発明は、ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質、又はこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分とする含有するアポトーシス誘導剤、ならびに該アポトーシス誘導剤を細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＵＳＥ結合タンパク質（ＦＵＳＥ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と相互作用するタンパク質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
ＦＵＳＥ結合タンパク質と相互作用するタンパク質が、
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドである、請求項１に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
ＦＵＳＥ結合タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
ＦＵＳＥ結合タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
又は、それらの部分断片である、請求項３に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
細胞内に導入可能な形態を有していることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
細胞内に導入可能な形態がベクターである、請求項５に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
癌の治療のために用いる、請求項１〜６のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現により増殖する細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、請求項１〜７のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法。
【請求項９】
細胞が癌細胞である請求項８の方法。
【請求項１０】
細胞が哺乳動物の体内にある細胞である請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物に対して、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項１３】
哺乳動物に対して、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又はそれらの断片の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アポトーシス誘導剤及びアポトーシス誘導方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、その存在が宿主動物にとって有害となるような細胞（例えば癌細胞）にアポトーシスを誘導するための薬剤、ならびにこの薬剤を用いるアポトーシス誘導及び癌の治療方法に関する。
【背景技術】  アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）は、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞死であり、環境悪化による細胞死（壊死：ネクローシス）と明確に区別されている。このアポトーシスは、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝集等を形態学的な特徴としている。アポトーシスを生じた細胞は萎縮し、細胞内容物は外部に放出されずにマクロファージや周囲の細胞に速やかに取り込まれるため、炎症が引き起こされず、周囲の細胞に影響を与えることはない。従って、その存在が宿主生物にとって有害である細胞（例えば癌細胞等）にアポトーシスを誘導することによって疾患を治療する試みが多くなされている。
これまでに、アポトーシスを誘導する手段、因子としては、例えばグルココルチコイド処理、サイトトキシック−Ｔ細胞による細胞障害、ホルモン依存性組織の萎縮、放射線照射、ＮＫ細胞、キラー細胞、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシン（ＬＴ）等のサイトカイン類等が報告されている（Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：５５５−５５６，１９８６；Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．６８：２５１，１９８０；Ｄｕｖａｌｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，７：１１５−１１９，１９８６；Ｓｅｌｌｉｎｓ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３１９９，１９８７；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．５３：６５，１９８８；Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：１８８１−１８８５，１９８６；Ｊｏｈｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９（４）：１７８２−１７８７，１９８２；Ｈｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：６８９−６９２，１９８８；Ｇｉｌｌｉａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：６８９−６９３，１９８７）。また、ある種の抗体（例えば抗ＣＤ３抗体、抗ＡＰＯ−Ｉ抗体等）によってもアポトーシスが誘導されることも知られている（Ｔｒａｕｔｈ，Ｂ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：３０１−３０５，１９８９；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８１−１８４，１９８９；Ｔａｄａｋｕｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：７７９，１９９０）。さらに、タンパク質合成阻害剤であるＣｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅは急性白血病細胞に、ＲＮＡ合成阻害剤であるＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄは小腸陰窩細胞に、そして両者がＨＬ−６０細胞にそれぞれアポトーシスを誘導することも報告されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８５９−１８６７，１９９０）。
アポトーシスに関連する治療法としては、前記抗Ａｐｏ−Ｉ抗体による癌治療の試みの他、芽球の活発な増殖に起因する骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）に対するｅｔｏｐｏｓｉｄｅやａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎの投与が検討されている（Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｔ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６０（５）：３１９−３２３，１９９２）。これらの他にも、アポトーシスの誘導方法やそのための薬剤組成物の発明が知られている（例えば、特開２００１−２７５６８１号公報；特表２００２−５２６１０９号公報；特表平１０−５０８５７５号公報；特開平９−３２８４２５号公報；国際公開第ＷＯ９５／２８１５４号パンフレット等）。
一方、ｃ−ｍｙｃ遺伝子にコードされるｃ−Ｍｙｃタンパク質は、細胞の増殖や分化、細胞周期といった細胞の生命活動に極めて重要であるばかりか、細胞の腫瘍化（形質転換）にも深く関与している。多くの癌組織でｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現増大が認められ、ｃ−ｍｙｃ遺伝子導入により細胞の腫瘍化が認められる。さらにこのｃ−Ｍｙｃタンパク質はアポトーシスとも関係しており、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の細胞内の発現量が増加しても減少してもアポトーシスが誘導される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：５７５−６００，１９９８）。例えばヒト白血病細胞におけるグルココルイチコイドを用いた実験ではアポトーシス誘導にｃ−ｍｙｃ遺伝子の抑制が必須である（Ｔｈｕｌａｓｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８３０６−１８３１２，１９９３；Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３：１９５−２０２，２０００；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：５５４４−５５５０，１９９１；Ｈｅｌｍｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４：４５２−６０，１９９５）。Ｂ細胞を用いた系ではアポトーシスを誘導する化学物質はいずれもｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現抑制と深くかかわっている（ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．８１：５５４６−５５５０，１９８４；Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｇ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１９９４−１９９７，１９９７；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：２２１−２２８，１９９４；Ｗｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５０１５−５０２５，１９９６）。また、ｃ−ｍｙｃのアンチセンスオリゴヌクレオチドをいくつかの種類の細胞に導入するとアポトーシスが誘導される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：５７５−６００，１９９８）。一方、ＩＬ−３依存性の骨髄細胞において、ＩＬ−３を枯渇させると同時にｃ−ｍｙｃ遺伝子を強制発現させるとアポトーシスが誘導される（Ａｓｋｅｗ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：１９１５−１９２２，１９９１）。また血清を取り除いた培地でＲａｔ１線維芽細胞にｃ−ｍｙｃ遺伝子を強制発現させるとアポトーシスが誘導される（Ｅｖａｎ，Ｇ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６９：１１９−１２８，１９９２）。
このｃ−Ｍｙｃタンパク質はｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写により産生され、ｃ−ｍｙｃ遺伝子は多くの転写因子によって厳密に制御されているが、それがどのように転写制御されているのかについては不明の点が多い。例えば、７０−８０％の大腸癌で異常の見られるＡＰＣ（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）遺伝子は、癌発生の最も初期に異常が起こるといわれている。ＡＰＣタンパク質は、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達経路により安定化されるβカテニンに結合してその働きを抑制している。βカテニンは転写因子Ｔｃｆ／Ｌｅｆと結合してｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写を活性化する。従ってＡＰＣ遺伝子に異常が起こるとβカテニンの活性を抑制できずにｃ−ｍｙｃ遺伝子が持続的に活性化され、細胞の増殖がひきおこされると考えられている。
ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現はＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達経路以外にも多くの転写因子の影響を受けている。例えばヒト前骨髄性白血病細胞であるＨＬ６０はＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；Ｍｅ２ＳＯ）、ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ、ビタミンＤ誘導体等種々の化学物質により分化誘導され、その際には細胞内ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現が減弱することが知られている。これらの事実は、種々の分化誘導物質が様々な転写因子を活性化しｃ−ｍｙｃ遺伝子に影響を与えるが、最終的には一つの経路に集約されてｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写を抑制していることが示唆される。
このような考えからｃ−ｍｙｃ遺伝子の上流のどの部位がその転写に影響を与えるかが解析された結果、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写開始部位の１．５ｋｂも上流の百数十塩基の部位がｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写に極めて重要であることが示され、ＦＵＳＥ（Ｆａｒ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）と命名された（Ａｖｉｇａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８５３８−１８５４５，１９９０）。次にＦＵＳＥに結合する蛋白質がｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙによって解析され、７０ｋＤａの分子量を有するＦＢＰ（ＦＵＳＥ結合タンパク質；ＦＵＳＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）が同定された。またこのＦＢＰタンパク質はそれ自体が強力な転写活性を有し、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を制御している可能性が示されている（Ｂａｚａｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：８２４１−８２４８，１９９５；Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８：４６５−４８０，１９９４；Ｍｉｃｈｅｌｏｔｔｉ，Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：２６５６−２６６９，１９９６）。そしてさらに、このＦＢＰタンパク質に結合（相互作用）するタンパク質としてＦＩＲ（ＦＢＰ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）が同定され（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：３３１−３４１，２０００）、このＦＩＲは基本転写因子ＴＦＩＩＨの機能を抑制することによりｃ−ｍｙｃ遺伝子を転写抑制することが示されている（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０４：３５３−３６３，２００１）。ただし、このＦＩＲがアポトーシスを誘導することは一切知られていない。
このように、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は細胞の癌化とアポトーシスに深く関与しており、その発現を制御することによって癌細胞を死滅させることが期待されている。しかしながら、前記のとおりｃ−Ｍｙｃタンパク質はその発現量が増大しても減少してもアポトーシスを生じさせるため、その発現制御によるアポトーシス誘導は容易ではない。また、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現抑制によるアポトーシス誘導の手段としてグルココルチコイドやｃ−ｍｙｃ遺伝子のアンチセンス鎖を用いる方法が提案されているが（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６０：５７５−６００，１９９８；Ｔｈｕｌａｓｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１８３０６−１８３１２，１９９３；Ｚｈｏｕ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３：１９５−２０２，２０００；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１：５５４４−５５５０，１９９１；Ｈｅｌｍｂｅｒｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１４：４５２−６０，１９９５）、副作用の点や安定した効果の点で臨床的使用には好ましいものではない。
従って、本発明の課題は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的として、細胞アポトーシスを安定かつ確実に誘導するための新しい手段を提供することにある。
本発明のさらなる課題は、前記アポトーシス誘導の手段を用いて動物個体内の細胞、特にその存在が宿主動物にとって有害となるような細胞にアポトーシスを誘導する方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の上流にある転写因子ＦＵＳＥ（Ｆａｒ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合するＦＵＳＥ結合タンパク質（ＦＵＳＥ結合タンパク質；以下、「ＦＢＰタンパク質」という）と相互作用するＦＩＲ（ＦＢＰ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）タンパク質が、ｃ−Ｍｙｃタンパクの発現を抑制するとともに、アポトーシスを誘導できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
（２）ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質が、
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質；又は、それらの部分ペプチドである、（１）に記載のアポトーシス誘導剤。
（３）ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
（４）ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；
配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
又は、それらの部分断片である、（３）に記載のアポトーシス誘導剤。
（５）細胞内に導入可能な形態を有していることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
（６）細胞内に導入可能な形態がベクターである、（５）に記載のアポトーシス誘導剤。
（７）癌の治療のために用いる、（１）〜（６）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
（８）ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現により増殖する細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、（１）〜（７）のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするアポトーシス誘導方法。
（９）細胞が癌細胞である、（８）に記載の方法。
（１０）細胞が哺乳動物の体内にある細胞である、（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）哺乳動物がヒトである、（１０）に記載の方法。
（１２）哺乳動物に対して、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質；又はそれらの部分ペプチドの有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
（１３）哺乳動物に対して、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又はそれらの断片の有効量を投与することを特徴とする、癌の治療方法。
（１４）哺乳動物がヒトである（１２）又は（１３）に記載の方法。
なお、本発明において、「ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質」とは、ＦＢＰタンパク質と結合して、ＦＢＰタンパク質の機能（すなわちｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写活性）に対して抑制的に働くタンパク質を意味する。
また「ポリヌクレオチドが細胞内に導入可能な形態」とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、そのポリヌクレオチドがコードするタンパク質又はペプチドが発現可能である形態を意味する。
また「タンパク質」及び「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；又はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。また本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、本発明の治療方法等に使用可能な薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学及び分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＦＩＲタンパク質がｃ−ｍｙｃ転写抑制能を有するか否かを調べたＣＡＴアッセイの結果である。
図２は、完全長ＦＩＲ遺伝子（ＨＡ−ＦＩＲ）又はその欠失変異体（ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）を導入したＨｅＬａ細胞について、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を免疫組織化学染色により可視化した蛍光顕微鏡写真である。
図３は、完全長ＦＩＲ遺伝子（ＨＡ−ＦＩＲ）又はその欠失変異体（ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）を導入したＨｅＬａ細胞について、フローサイトメトリー解析（２色ＦＡＣＳｃａｎ解析）によってｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を定量した結果を示す
図４は、完全長ＦＩＲ遺伝子（ＨＡ−ＦＩＲ）又はその欠失変異体（ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）を導入したＨｅＬａ細胞について、アポトーシス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。
図５は、完全長ＦＩＲ遺伝子（ＨＡ−ＦＩＲ）又はその欠失変異体（ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）を導入したＨｅＬａ細胞について、フローサイトメトリー解析（２色ＦＡＣＳｃａｎ解析）によってアポトーシス細胞を定量した結果を示す
図６は、ＦＩＲ遺伝子のみ、ＦＩＲ遺伝子とｃ−ｍｙｃ遺伝子の両方を導入したＨｅＬａ細胞について、ＦＩＲタンパク質及びｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を免疫組織化学染色により可視化した蛍光顕微鏡写真である。
図７は、ＦＩＲ遺伝子のみ、ＦＩＲ遺伝子とｃ−ｍｙｃ遺伝子の両方を導入したＨｅＬａ細胞について、アポトーシス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。
図８Ａは、大腸の腫瘍組織（Ｔ）及び非腫瘍組織（Ｎ）のＦＩＲタンパク質レベルをイムノブロッティングにより分析した結果を示す。
図８Ｂは、大腸の腫瘍組織（Ｔ）及び非腫瘍組織（Ｎ）の全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す。
図８Ｃは、リアルタイム定量的ＰＣＲによって検出した大腸の腫瘍組織（Ｔ）及び非腫瘍組織（Ｎ）のＦＩＲ  ｍＲＮＡ発現レベルのヒストグラムを示す。
図８Ｄは、ＦＩＲとｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの大腸の腫瘍組織（Ｔ）／非腫瘍組織（Ｎ）発現比の相関を示す。
図９は完全長ＦＩＲ遺伝子（ＦＩＲ野生型）、及び大腸癌組織由来のＦＩＲ変異体（１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体、２８Ｔ−ＦＩＲ変異体）を導入したＨｅＬａ細胞について、ｃ−Ｍｙｃタンパク質の発現を免疫組織化学染色により可視化した蛍光顕微鏡写真である。
図１０は完全長ＦＩＲ遺伝子（ＦＩＲ野生型）、及び大腸癌組織由来のＦＩＲ変異体（１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体、２８Ｔ−ＦＩＲ変異体）を導入したＨｅＬａ細胞について、アポトーシス誘導を調べた蛍光顕微鏡写真である。
図１１は、子宮頚癌（ＨｅＬａ）、食道癌（Ｔ．Ｔｎ）細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定したグラフを示す。
図１２は、ＦＩＲアデノウイルスベクター感染後の大腸癌（ＳＷ４８０，ＤＬＤ１）、子宮頚癌（ＨｅＬａ）、食道癌（Ｔ．Ｔｎ）細胞株における核内及び細胞質内のＦＩＲタンパク質発現をイムノブロッティングにより分析した結果を示す。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年４月２１日に出願された日本国特許出願２００３−１１６２９９号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
１．アポトーシス誘導剤
本発明のアポトーシス誘導剤は、有効成分として、ＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質、又はＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態で含有することを特徴とする。
上記ＦＢＰタンパク質、好ましくはヒトＦＢＰタンパク質と相互作用するタンパク質としては、ヒトＦＩＲタンパク質（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５：３３１−３４１，２０００；Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０４：３５３−３６３，２００１；ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿１４２８１）、ヒトＳＩＡＨＢＰ１（ｓｉａｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＧｅｎＢａｎｋ／ＢＣ００８８７５）、ヒトＳＩＡＨＢＰ１の転写バリアント１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０７８４８０）、ヒトＳＩＡＨＢＰ１の転写バリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＭ＿０１４２８１）等が挙げられるが、これらの中でも配列番号２に示すアミノ酸配列を有するヒトＦＩＲタンパク質が特に好ましい。
本発明で用いるヒトＦＩＲタンパク質には、配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質も含まれる。
ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
ここで、「アポトーシス誘導活性」とは、細胞を収縮させ、核を断片化させる活性をいい、この活性は、例えば、遺伝子をＨｅＬａ細胞等に導入し、過剰発現させ、その細胞の形態変化の観察、ＦＡＣＳ分析により確認することができる。
また、「アポトーシス誘導活性を有する」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が保持する該活性と実質的に同等であることをいう。
上記のタンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。かかる部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である。
上記のタンパク質又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
上記タンパク質は、公知のアミノ酸配列（例えばＦＩＲタンパク質の場合は配列番号２のアミノ酸配列）に基づいて化学合成する方法や、発現ベクターからのインビトロ転写や、発現ベクターによる形質転換細胞の発現産物として単離精製する方法等によって取得することができる。例えば、タンパク質をインビトロ翻訳で発現させる場合には、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、タンパク質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。また、タンパク質を、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を組換えて発現ベクターを作成する。この発現ベクターで宿主細胞を形質転換すれば、タンパク質を発現する形質転換体細胞を得ることができ、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のタンパク質を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、タンパク質を真核細胞で発現させる場合には、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製する。このベクターを真核細胞内に導入すれば、目的のタンパク質を発現する形質転換真核細胞を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたタンパク質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
また、部分ペプチドは、公知のペプチド合成法又は上記タンパク質を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
また、本発明のアポトーシス誘導剤に使用するポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示す塩基配列を有する、ヒトＦＩＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド好ましい。
本発明で用いるヒトＦＩＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドまた、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましく６５℃での条件をいう。
前記の各タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、このｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡ等を利用することができるが、ｃＤＮＡが特に好ましい。このｃＤＮＡは、前記の公知配列を利用し、公知の方法によって取得することができる。例えば、公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２，１６１−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ  ２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）を用いてｃＤＮＡライブラリーを合成し、前記の公知配列（例えばＦＩＲタンパク質をコードする配列番号１）の塩基配列に基づいて作製したプローブＤＮＡを用いて、目的のｃＤＮＡを単離することができる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法及びＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。また、公知配列に基づいて作製したプライマーセットを用い、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても必要量の各ｃＤＮＡを得ることができる。プライマーセットは、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることによって作製することができる。
上記のタンパク質又はポリヌクオチドを細胞内に導入可能な形態とするためには、例えば以下の手段がある。
タンパク質は、例えば、その構造や機能を変更することなく、かつ薬理学的に許容される担体溶液にタンパク質分子を混合して製剤化することにより細胞内に導入可能な形態とすることができる。
このような薬剤は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞に対してはマイクロインジェクション法により細胞内に導入することができる。あるいは、脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を採用することもできる。
また別の態様としては、タンパク質（ポリペプチド）のＮ端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドとすることによって、タンパク質を細胞内に導入可能な形態することもできる。この細胞膜通過ペプチドを備えることによって、タンパク質は細胞膜を通過して細胞内に取り込まれる。細胞膜通過ペプチドとしては、ＨＩＶ−１・ＴＡＴのＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）又はショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのＰＴＤ等を使用することができる。例えばＨＩＶ−１・ＴＡＴの場合にはそのアミノ酸配列及びそのｃＤＮＡの塩基配列が公知であり（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２，１９９９；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｕ３９３６２Ｍ９６１５５）、そのＰＴＤに相当する領域（ＨＩＶ・ＴＡＴの４７〜５７番アミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片を前記ｃＤＮＡと連結して融合ＤＮＡ断片を作成し、この融合ＤＮＡ断片を大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側にＰＴＤペプチドを連結し融合ポリペプチドを作成することができる。また、アンテナペディアのＰＴＤも公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＥ００１５７３）、同様にしてＰＴＤを連結した融合ポリペプチドを作成することができる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等）を介して、ポリペプチドとＰＴＤペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結した融合ポリペプチドを作成することもできる。
一方、ポリヌクレオチドは、例えば、発現ベクターに組み込むことによって細胞内に導入可能な形態とすることができる。発現ベクターは、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する公知の真核細胞用発現ベクターを使用することができ、この発現ベクターのクローニングサイトに、前記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することによってポリペプチド発現ベクターを構築することができる。
この発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞（培養細胞）に対しては、例えば電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法によって細胞内に導入することができる。
また、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞（すなわち動物個体内の細胞）に対しては、細胞への取り込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で、例えば、ウイルス性又は非ウイルス性の遺伝子導入用ベクターなどの手段により細胞内に導入することができる。このような形態にした薬剤は、遺伝子治療用として生体内に導入することができる（例えば、特開２００３−２４０９２号公報、特開２００３−５０１４４５号公報等）。ここで、ウイルス性ベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性ベクターとしては、リポソーム、人工脂質ベシクル、中空ナノ粒子、デンドリマーなどの高分子化合物等が挙げられる。この場合、市販の導入用試薬（リポフェクチン、リポフェクトアミン、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ、ＤＯＴＡＰ（ＢｉｏＴｅｘ社製）、Ｔｆｘ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が利用できる。
アポトーシスは正常な発生・分化に不可欠な生理的細胞死であり、正常な生体組織の細胞回転などにおいて個々の細胞に起こっている。そのため、アポトーシスが過剰に減少すると多くの機能障害の原因になることが判明している。従って、本発明のアポトーシス誘導剤は、アポトーシスの減少に起因する疾患の治療及び／又は予防剤として使用できる。アポトーシスの減少に起因する疾患としては、代表的には、悪性腫瘍（胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、食道癌、前立腺癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮癌、脳腫瘍、骨肉種、骨髄腫瘍など）であるが、白血病、自己免疫疾患（例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリマトーデス、慢性関節リウマチなど）、ウイルス感染疾患（ＨＩＶ感染など）、肝炎、などが挙げられ、これらに限定はされない。
本発明のアポトーシス誘導剤は、各種製剤形態に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本剤を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本剤を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
本発明のアポトーシス誘導剤の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数、症状、剤型等により異なるが、タンパク質又はポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ又は５〜６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。またタンパク質をコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療等の方法によって導入する場合は、前記の範囲量のタンパク質を発現しうるポリヌクレオチドを投与すればよい。
２．アポトーシス誘導方法
本発明のアポトーシス誘導方法は、ｃ−ｍｙｃ遺伝子発現により増殖する細胞に前記アポトーシス誘導剤を細胞に接触させることを特徴とする。
なお、ｃ−ｍｙｃ遺伝子は殆ど全ての動物細胞においてその増殖に関与することから、本発明の方法は実際には全ての動物細胞のアポトーシスを誘導するために適用することができるが、特に、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の過剰発現によって癌化した細胞を対象とすることが好ましい。
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞（培養細胞）を対象とすることもでき、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞（動物体内の細胞）を対象とすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞を対象とする場合は、前記のとおり、タンパク質発現ベクターを電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法で細胞内に導入する方法、またタンパク質それ自体の溶液をマイクロインジェクションする方法や脂質を介して細胞に導入する方法、あるいはＰＴＤペプチド融合タンパク質を培養細胞に接触させる方法等によって実施することができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞を対象とする場合は、前記のとおり、ポリヌクレオチドを遺伝子治療に準じた方法により体内細胞に導入する方法や、タンパク質それ自体の溶液を体内細胞にマイクロインジェクションする方法や脂質を介して細胞に導入する方法、あるいはＰＴＤペプチド融合タンパク質溶液を体内に投与する方法等によって実施することができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞は、全ての動物個体内の細胞を対象とすることができるが、特に、有用動物（家畜、愛玩動物等）の癌治療等を目的とするアポトーシス誘導が好ましい。また、ヒトの癌治療を目的とするアポトーシス誘導がさらに好ましい。
３．癌の治療方法
本発明の癌の治療方法は、癌を有する哺乳動物に対して前記アポトーシス誘導剤を癌の治療上有効な量で投与することを特徴とする。
ここで、哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられる。「癌の治療上有効な量」とは、増殖中の癌細胞に対する本剤の投与によって、癌細胞の増殖の停止、腫瘤サイズの縮小又は消失をもたらす量をいう。具体的な投与量は、投与経路、患者の年齢及び体重、癌の種類及び悪性度、転移又は再発の有無などにより適宜増減すべきである。
投与形態としては、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、局所、腫瘤内、経口、経皮、直腸内、膣内、鼻腔内、舌下投与等が挙げられる。具体的には、例えば、外科手術により容易に接近可能な各種臓器内の固形腫瘍に対しては腫瘍内に又はその近傍に定位固定針などを用いて局所注入することによって投与すればよく、白血病などの非固形腫瘍、脳腫瘍などの外科的手術により接近しにくい部位の癌、転移性癌については、静脈内注射によって投与することができる。その他、癌の種類や部位によって、上記の投与方法を適宜選択して使用することができる。
遺伝子治療の形態としては、標的細胞を体外に取り出して遺伝子導入を行う体外法（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）、体内に遺伝子を導入する体内法（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）があるが、本発明のアポトーシス誘導剤はいずれの治療形態にも適用される。体外法では患者由来の細胞を一旦体外で培養し、上記ポリヌクレオチドの導入処理をした後に患者に投与すればよいし、体内法では上記のポリヌクレオチド導入ベクターを直接患者体内（臓器組織、皮膚、筋肉など）へ投与すればよい。
また、かかる癌治療は、外科的手術、化学療法、及び放射線治療を含む、周知の癌治療手段と併用してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
（実施例１）発現プラスミドの作製と癌組織標本試料の採取
（１）発現プラスミドの作製
完全長ＦＩＲｃＤＮＡ（配列番号２）及びＦＩＲの転写活性部位であるＮ末側７７個のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸配列の１位から７７位までのアミノ酸配列）が欠失したＦＩＲ変異体をｐＣＧＮＭ２ベクタープラスミド（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０４；３５３−３６３，２００１）にクローニングし、それぞれの発現プラスミド（ＨＡ−ＦＩＲとＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）を作製した。
また、ヒトｃ−Ｍｙｃ発現ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３．１−ｃ−ｍｙｃ、ＧｅｎｅＳｔｏｒｍＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ｒｅａｄｙ  Ｃｌｏｎｅｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．，ＡＬ）を購入した。
（２）ヒト大腸癌組織標本の採取
術前に文書による同意を得た原発性大腸癌の患者１５例から外科的に組織を切除した。切除試料は、腫瘍上皮組織及び腫瘍から５−１０ｃｍ離れた非腫瘍上皮組織から手術による切除後、１時間以内に採取した。二人の病理医が全ての組織試料が腺癌であることを顕微鏡観察によって確認した。全ての切除試料は直ちに液体窒素中に置き、−８０℃にて分析まで保存した。
（実施例２）ＦＩＲによる外来性ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制試験
外来性のｃ−ｍｙｃプロモーターに対してＦＩＲが転写抑制能を有するか否かを調べるため、ｃ−ｍｙｃプロモーターをｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）遺伝子の上流に持つレポータープラスミドを、実施例１で作製したＨＡ−ＦＩＲ又はＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７とＨｅＬａ細胞にコトランスフェクトし、ＣＡＴの発現を調べた。
（１）方法（ＣＡＴアッセイ）
ＨｅＬａ細胞を１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で培養し、電気穿孔法（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりＨＡ−ＦＩＲ又はＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７を、ｃ−ｍｙｃプロモーターをｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）遺伝子の上流に持つレポータープラスミドとともに導入した。遺伝子導入から４８時間後、文献（Ｔｏｍｏｎａｇａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：４８７５−４８８１，１９９５）の記載に従い、ＣＡＴの発現を調べた。
（２）結果
図１にＣＡＴアッセイの結果を示す。ＦＩＲは顕著にＣＡＴの発現を抑制した。しかし、アミノ末端を削除した変異ＦＩＲは正常のＦＩＲに比べＣＡＴの発現抑制が減弱していた（図１）。
（実施例３）ＦＩＲによる内在性ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写抑制試験
細胞内にもともと存在するｃ−ｍｙｃ遺伝子のプロモーター（内在性のｃ−ｍｙｃプロモーター）がＦＩＲによって転写抑制されるか否かを免疫組織化学染色、及びフローサイトメトリー解析により調べた。
（１）方法
（１−１）免疫組織化学染色
ＨｅＬａ細胞をカバーグラス上で一晩培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、プラスミド（ＨＡ−ＦＩＲ及びＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７）をトランスフェクトした。プラスミド導入から２４時間後、既報（Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ，１９：１０３４−１０４４，２０００）の記載に従い、細胞を処理した。
カバーグラス上の細胞を４％−パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳで洗浄し、室温で１次抗体と１時間反応させた。マウス抗−ＨＡモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）、ウサギ抗−ｃ−Ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＹ）、マウス抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）をブロッキングバッファーで５００倍、１，０００倍、５００倍にそれぞれ希釈したものを１次抗体として使用した。
その後ＰＢＳで再度洗浄し、二次抗体［ローダミン標識−抗マウスＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ）、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識−抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ前記ブロッキングバッファーで１，０００倍及び５００倍に希釈してもの］を反応させた。細胞核のＤＮＡをｄｉａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ，１μｇ／ｍｌ）で染色し、免疫蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＱＦＩＳＨ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
（１−２）フローサイトメトリー解析
ＦＩＲによるｃ−Ｍｙｃ発現抑制を定量するために細胞を２色ＦＡＣＳｃａｎ解析（Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ，１９：１０３４−１０４４，２０００）に供した。すなわち、トランスフェクション２２時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄後、−２０℃のエタノールで少なくとも２時間固定し、細胞を冷ＰＢＳで二回洗浄後、マウス抗−ＨＡ抗体及びウサギ抗−ｃ−Ｍｙｃ抗体を１次抗体として反応させた。ＰＢＳで洗浄後、二次抗体［ＦＩＴＣ−結合−抗−ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）及びＲ−ＰＥ−結合−抗−マウスＩｇＧ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をそれぞれ２００倍に希釈したもの］を反応させた。
各サンプルにつき１０，０００個の細胞を、ｃ−Ｍｙｃ−ＦＩＴＣをＦＬ１強度、ＨＡ−ＰＥをＦＬ２強度として検出するフローサイトメトリーで解析した。トランスフェクトされた細胞（ＰＥ−陽性細胞）をＸ軸にとり、ＦＩＴＣ−陽性細胞（ｃ−Ｍｙｃ発現細胞）をＹ軸にとって表示した。
（２）結果
ＨＡ−ＦＩＲ及びＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、内在性ｃ−Ｍｙｃの発現を免疫組織化学染色によって可視化した結果を図２に示す。
ＨＡ−ＦＩＲ発現細胞ではｃ−Ｍｙｃ発現レベルが大きく抑制されたのに対し（図２、上段のパネル、▲印）、ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７発現細胞ではその抑制活性が弱まっていた（図２、下段のパネル、矢印）。
ＨＡ−ＦＩＲ及びＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、内在性ｃ−Ｍｙｃの発現をフローサイトメトリー解析（２色ＦＡＣＳｃａｎ解析）より定量した結果を図３に示す。ＨＡ−ＦＩＲはｃ−Ｍｙｃ発現を抑制するが（図３、上段、左側のパネル）、ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７ではそのような作用はなく（図３、上段、中央のパネル）、ＨＡベクターのみでは抑制しなかった（図３、上段、右側のパネル）。
また、ＨＡ−ＦＩＲ陽性集団内では、ｃ−Ｍｙｃレベルが顕著にゲート領域で二峰性となり（図３、上段、左側のパネル）、ｃ−ＭｙｃレベルがＨＡ−ＦＩＲトランスフェクト細胞において急激に減少した。ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７又はＨＡ−ｔａｇトランスフェクト細胞においては、ｃ−Ｍｙｃ発現レベルがトランスフェクト細胞及び非トランスフェクト細胞間で一様に区別できなかった（図３、上段の中央及び右側のパネル）。
下段のパネルは上段のパネルにおいて印をつけたゲート領域におけるｃ−Ｍｙｃ発現のヒストグラムを示す。ゲート領域におけるｃ−Ｍｙｃの平均値（Ｇｅｏ−ｍｅａｎ）は、ＨＡ−ＦＩＲに対しては１９．４（８．０）、ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７に対しては２２．６（９．６）、ＨＡ空ベクターに対しては３５．５（３０．０）であった。
以上より、ＦＩＲは内在性ｃ−Ｍｙｃ発現を抑制し、ＦＩＲアミノ末端ドメインはその抑制に必須であることが確認された。
（実施例４）ＦＩＲによる細胞死（アポトーシス）誘導
ＦＩＲは内在性のｃ−ｍｙｃ発現を抑制するので、ＦＩＲ高発現によってアポトーシスを誘導できるかどうかを、全長ＦＩＲ、及びＮ端側の７６アミノ酸配列を欠失した変異ＦＩＲを用いて調べた。
（１）方法（ＴＵＮＥＬ法）
１５０ｆｍｏｌのＨＡ−ＦＩＲ又はＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７、空ベクタープラスミドを６−ウェルプレート内のＨｅＬａ細胞にトランスフェクトし、６０時間後にアポトーシス誘導を調べた。アポトーシス細胞は製造業者の指示に従い、ＴＵＮＥＬ法（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ．Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）により検出した。すなわち、カバーグラス上で培養したＨｅＬａ細胞を４％−パラホルムアルデヒドにて１０分間氷上で固定した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を０．５％トリトン−Ｘ−１００のＰＢＳ溶液で５分間透析した。ＰＢＳで二度洗浄後、ＦＩＴＣ標識−ｄＵＴＰ（ＭＥＢＳＴＡＩＮ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔ：Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＪＡＰＡＮ）を含むターミナルデオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるｉｎ  ｓｉｔｕ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇを用いてＤＮＡのヌクレオソーム内断片化を検出することでアポトーシス細胞を可視化した。
ＨｅＬａ細胞を１ｕｎｉｔ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）で処理し、この細胞を陽性コントロールとした。ＤＮＡはＤＡＰＩ  ＩＩＩ  Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ（Ｖｙｓｉｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）で染色し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＱＦＩＳＨ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で観察した。
２色ＦＡＣＳｃａｎ解析を行うに際し、細胞をトリプシン処理後、−２０℃エタノールで少なくとも２時間固定した。ＰＢＳで二度洗浄後、細胞をＦＩＴＣ標識−ｄＵＴＰを含む５０μｌのＴｄＴ  ｂｕｆｆｅｒ中でインキュベートした。その後、２５０μｇのＤＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＲＮａｓｅ  Ａを含む０．５ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液（ＰＢＳで５μｇ／ｍｌに新たに希釈）に細胞を再懸濁した。
各サンプルにつき１０，０００個の細胞を、ＦＩＴＣをＦＬ１強度、ＰＩをＦＬ２強度として分析した。ＰＩ−陽性細胞をＸ−軸にとり、ＦＩＴＣ−陽性細胞（アポトーシス陽性細胞）をＹ−軸にとって表示した。
（２）結果
ＨＡ−ＦＩＲはＤＮＡ断片化を伴ったアポトーシスを誘導した（図４、上段、左側のパネル、矢印）。一方、ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７又はコントロールベクター（ＨＡ空ベクター）でトランスフェクトした細胞においてはほとんどアポトーシスは起こらなかった（図４、上段、中央及び右側のパネル）。
図５は、２色解析によってアポトーシス細胞を定量した結果を示す。各パネルにおける上部−ゲート領域に見られるアポトーシス細胞を図に示した。１０，０００個あたりのアポトーシス細胞のパーセンテージは、ＨＡ−ＦＩＲでは１６．５％、ＨＡ−ＦＩＲΔＮ７７では６．６％、ＨＡ空ベクターでは２．０％、そしてＤＮａｓｅＩ処理細胞（陽性コントロール）では７５．６％であった。
（実施例５）ＦＩＲとｃ−Ｍｙｃ共発現による細胞死（アポトーシス）誘導
（１）方法（ＴＵＮＥＬ法）
６００ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＦＩＲを６−ウェルプレートに撒いたセミコンフルエントなＨｅｌａ細胞に、６０ｎｇのｃ−Ｍｙｃ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１−ｃ−ｍｙｃ）とともに、又は単独でトランスフェクトし、上記と同様にＴＵＮＥＬ法にて分析を行った。
（２）結果
ｃ−Ｍｙｃ発現は、ｃ−ｍｙｃプラスミドをＦＩＲプラスミドとコトランスフェクトした場合に顕著に上昇したのに対し（図６、中段、右側のパネル）、ＦＩＲ単独をトランスフェクトした場合は顕著に抑制された（図６、中段、左側のパネル）。核蛍光標識像（ＤＡＰＩ染色）では、ｃ−ｍｙｃ共発現細胞（図６、下段、右側のパネル）に比べて、ＦＩＲ単独発現細胞では核が膨張し、分解していることが確認された（図６、下段、左側のパネル）。
また、アポトーシス細胞の数は、ＦＩＲ単独によるアポトーシス細胞は２１．１％であるのに対し、ｃ−ｍｙｃ発現プラスミドとコトランスフェクトした場合は４．２％と大幅に減少した（図７）。
また、ｃ−ｍｙｃプラスミドをＦＩＲプラスミドと種々の割合でコトランスフェクトした場合のアポトーシス細胞の数を調べた結果を表１に示す。これらの結果はＦＩＲによるアポトーシス誘導がｃ−Ｍｙｃ抑制のために起こることを示している。
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（実施例６）腫瘍及び正常組織におけるＦＩＲタンパク質、ＦＩＲ  ｍＲＮＡの解析
（１）方法
（１−１）タンパク質抽出及びイムノブロッティング
全タンパク質溶解物は、上記のペアサンプルより以下のようにして調製した。凍結組織試料をＰｏｌｙｔｒｏｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて溶解バッファー［７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％３−［３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−］１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）、０．１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２％ＩＰＧバッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ］に溶解し、４℃にて１時間遠心分離した（１００，０００×ｇ）。上清のタンパク質量をプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって測定した。タンパク質は８％アクリルアミドゲルで電気泳動し、ｔａｎｋ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｐｐｒａｔｕｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）内のフッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。膜を５％スキムミルクＰＢＳ溶液で１時間ブロックした。それぞれブロッキングバッファーで１０００倍、５００倍に希釈したウサギ抗−ＦＩＲポリクローナル抗体（抗体産生の可能性を高めるため２つの合成ペプチド：ＧＤＫＷＫＰＰＱＧＴＤＳＩＫＭＥ（３０−４５）とＥＶＹＤＱＥＲＦＤＮＳＤＬＳＡ（５２８−５４２）を同時に免疫することによって調製したもの）及びヤギ抗−β−アクチンポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）をブロッキングバッファーにてそれぞれ１０００倍、５００倍に希釈したものを１次抗体として用いた。３０００倍に希釈したヤギ抗−ウサギＩｇＧホースラディッシュパーオキシダーゼ結合体（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及び５００倍に希釈したウサギ抗−ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を二次抗体として用いた。膜上の抗原をＥＣＬＴＭ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって検出した。ｌｏａｄｉｎｇコントロールとしてβ−アクチン抗体を用いるイムノブロッティングを行った。各バンドの強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅによって測定した。
（１−２）ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイム定量的ＰＣＲ
全ＲＮＡ及びゲノムＤＮＡを腫瘍及び非腫瘍上皮組織からＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ及びＤＮ  ｅａｓｙＴＭ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡを全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ用１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて合成した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＦＩＲ  ｃＤＮＡをプライマー（フォワード：５’−ＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号３）、リバース：５’−ＧＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧ−３’）（配列番号４）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。対照として、ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを増幅した。
Ｌｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＦＩＲ  ｃＤＮＡのリアルタイム定量的ＰＣＲを、ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ［ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ；ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、バッファー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｒｏｃｈｅ）、３．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭ各センス及びアンチセンスプライマー、及び１μｌのｃＤＮＡ鋳型をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ内に含む］からなる２０μｌ反応混合物中で実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  ソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ３．３（Ｒｏｃｈｅ）を定量的ＲＴ−ＰＣＲの分析のために用いた。プライマーとＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ条件の最適の最適化はＮｉｈｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．で行った。
リアルタイム定量的ＰＣＲによるＦＩＲｃＤＮＡ増幅のためのプライマーは以下のとおりである（ＰＣＲ産物サイズは２７５ｂｐ）。
2004093900.tif 000003
これらのプライマーによるＰＣＲ産物を、Ｌｉｇｈｔ  ＣｙｃｌｅｒＴＭの定量カーブを決定するためにＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて精製した。
ＦＩＲゲノムＤＮＡもまた以下のプライマーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲによって定量した。
2004093900.tif 000004
ヒトｃ−ｍｙｃ  ｃＤＮＡ及びヒトβ−アクチンｃＤＮＡに対するプライマーは以下のとおりである。
（ｃ−ｍｙｃ用）
2004093900.tif 000005
（β−アクチン用）
2004093900.tif 000006
（２）結果
図８Ａにイムノブロッティング結果を示す。各バンドの強度をＮＩＨ  Ｉｍａｇｅにて測定し、ＦＩＲタンパク質レベルの（Ｔ）及び（Ｎ）間のβ−アクチンに対する相対平均値を測定した（図の下部）。Ｄｕｋｅｓ  ｓｔａｇｅを図８の上部に付記した。ＦＩＲレベルは意外にもほとんどの大腸癌組織において対応する非腫瘍上皮と比べて増加していた（図８Ａ）。
（Ｔ）及び（Ｎ）のペアサンプルから調製した全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図８Ｂに示す。（Ｔ）におけるＦＩＲ  ｍＲＮＡは、（Ｎ）のＦＩＲ  ｍＲＮＡより一例（ケース番号５）を除いて高かった。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルもまた内部コントロールとして示した。
リアルタイム定量的ＰＣＲによって検出された（Ｔ）及び（Ｎ）のＦＩＲ  ｍＲＮＡ発現レベルのヒストグラムを図８Ｃに示す。（Ｔ）におけるＦＩＲ  ｍＲＮＡは（Ｎ）のＦＩＲ  ｍＲＮＡより有意に高かった（ｔ−ｔｅｓｔではｐ＜０．００５６；Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｔｅｓｔではｐ＜０．０００８）。
また、各大腸癌組織におけるＦＩＲとｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの（Ｔ）／（Ｎ）発現比は有意に相関していた（図８Ｄ）。ＦＩＲ発現レベルの平均はｃ−ｍｙｃ発現レベルの平均と顕著に関連しており、Ｙ＝０．７２＋０．２２Ｘ（Ｙ：ＦＩＲ発現比（Ｔ／Ｎ）、Ｘ：ｃ−ｍｙｃ発現比（Ｔ／Ｎ））で表された。相関係数は０．７０で、ｐ値は０．０００１９。
これらの結果より、大腸癌におけるｃ−Ｍｙｃの脱制御はＦＩＲのダウンレギュレーションによるのではなく、ＦＩＲ機能の損傷による可能性が高いといえる。逆にいえば、ＦＩＲはｃ−Ｍｙｃ増加と相関する大腸癌においてアップレギュレートされていると考えられる。
（実施例７）ＦＩＲのアミノ末端変異の検出及び解析
（１）方法
ＦＩＲのアミノ末端領域を以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
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ＦＩＲアミノ末端領域（ＮＴＤ）のＰＣＲ産物を１％アガロースゲルに載せ、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）へのクローニング前にＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、ＤＮＡ配列決定した。直接的なＤＮＡ配列は少なくとも４つの異なるプライマーで（フォワード方向から２つ、リバース方向から２つ）確認した。変異が検出された場合、ＤＮＡ配列決定をフォワード及びリバース方向の両方から少なくとも計８回行った。さらに、ｐＧＥＭＴＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターにクローン化したＦＩＲのＮＴＤに変異がある場合、ＲＴ−ＰＣＲ産物を直接に配列決定してその正確性を確認した。
（２）結果
大腸癌組織から単離された全長ＦＩＲｃＤＮＡを配列決定したところ、驚くべきことに、ＦＩＲのアミノ末端（１位〜１５６位のアミノ酸）において少なくとも一つの変異を含んでいる例が数例確認された。
完全長ＦＩＲｃＤＮＡ（ＨＡ−ＦＩＲ）、及び上記変異体のうちの２例、２８Ｔ−ＦＩＲ変異体（コドン５５においてＧ欠損（ＧＧＧからＧＧ＿）を有し、コドン５９で停止する変異体）と１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体（４つの点変異を有し、そのうち、コドン９０の変異はアミノ酸置換変異（Ｈｉｓ（ＣＧＣ）からＡｒｇ（ＣＡＣ））を有する変異体）ｃＤＮＡクローンをｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにそれぞれクローニングし、Ｈｅｌａ細胞へ導入してｃ−Ｍｙｃ抑制活性とアポトーシス誘導について調べた結果をそれぞれ図９及び図１０に示す。
ＦＩＲ−野生型、１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体、２８Ｔ−ＦＩＲ変異体の発現を赤色で染色した（図９、上段のパネル）。ＦＩＲ−野生型、１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体は、全細胞において発現しているのに対し、２８Ｔ−ＦＩＲ変異体は核内だけに局在化していた。ｃ−Ｍｙｃを緑色で染色し（図９、中段のパネル）、ＤＮＡをＤＡＰＩ  ＩＩＩで対比染色した（図９、下段のパネル）。１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体及び２８Ｔ−ＦＩＲ変異体は両方ともＦＩＲ−野生型に比べてｃ−Ｍｙｃ抑制活性が減少していた。
また、１１８Ｔ−ＦＩＲ変異体及び２８Ｔ−ＦＩＲ変異体は両方ともアポトーシス誘導が損なわれていた（図１０）。
以上より、ヒト大腸癌組織においてＦＩＲはそのアミノ末端領域において変異が生じており、この変異がＦＩＲの有するｃ−Ｍｙｃの抑制とアポトーシス誘導の機能を損なう原因となっていることが示唆される。
（実施例８）ＦＩＲアデノウイルスベクターによる感染試験
ＦＩＲアデノウイルスベクター（１．０１×１０１０ｉｆｕ／ｍｌ）を作成し、子宮頚癌（ＨｅＬａ）、食道癌（Ｔ．Ｔｎ）の各細胞株に感染させ、細胞増殖抑制をＭＴＴアッセイによって定量化した。コントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させ、ＦＩＲアデノウイルスベクターと比較した。細胞数を５０％に減少させるＦＩＲアデノウイルスベクターのＭＯＩを測定したところ、ＨｅＬａ細胞では１９１．４（５３２．８）、Ｔ．Ｔｎ細胞では６１５．１（１４１０．６）であった（括弧内はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のＭＯＩ）。図１１にＨｅＬａ細胞及びＴ．Ｔｎ細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定したグラフを示す。ｃ−Ｍｙｃを高発現するこれらの癌細胞においてＦＩＲアデノウイルスベクターの抗腫瘍効果が確認された。
また、ＦＩＲアデノウイルスベクター感染後の大腸癌（ＳＷ４８０，ＤＬＤ１）、子宮頚癌（ＨｅＬａ）、食道癌（Ｔ．Ｔｎ）の各癌細胞株における核内及び細胞質内のＦＩＲタンパク質発現をイムノブロッティングにより分析した結果を図１２に示す。大腸癌（ＳＷ４８０，ＤＬＤ１）細胞、食道癌（Ｔ．Ｔｎ）細胞において、ＦＩＲアデノウイルスベクターの感染効率に相違が認められた。Ｔ．Ｔｎ細胞ではＦＩＲアデノウイルスベクターの感染効率が低い（タンパク質発現量が低い）にも関わらず、殺細胞効果は高かった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子を標的として、細胞アポトーシスを安定かつ確実に有効するための新しい手段が提供される。これによって癌治療に新たな途が拓かれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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