(57)【要約】ＰＡＬＳＡＲ法によりＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにＰＡＬＳＡＲ法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供する。ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるようにした。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
【請求項２】
捕捉用プローブと第１プローブをターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせる第１工程、
ターゲットＤＮＡの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第１プローブを連結させる第２工程、
前記ターゲットＤＮＡを除去させる第３工程、及び
複数のオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第４工程を有し、
前記捕捉用プローブと前記第１プローブの塩基配列が、前記第１工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記ターゲットＤＮＡの変異部位に位置し且つ該末端と前記第１プローブが隣接する状態でターゲットＤＮＡとアニーリングするように構成されており、
前記複数のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが前記第１プローブと相補的な領域を有することを特徴とする変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法。
【請求項３】
前記自己集合反応が、互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させるものであることを特徴とする請求項１又は２記載のシグナル増幅方法。
【請求項４】
前記自己集合反応が、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、
Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、
該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、
該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、自己集合体を形成させる自己集合反応であることを特徴とする請求項１又は２記載のシグナル増幅方法。
【請求項５】
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項４記載のシグナル増幅方法。
【請求項６】
前記プローブの塩基配列を、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、
第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、
第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることを特徴とする請求項４記載のシグナル増幅方法。
【請求項７】
前記ターゲットＤＮＡに一本鎖のＤＮＡ又は二本鎖のＤＮＡを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項８】
前記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列を、あらかじめ前記第１プローブと相補的な配列にすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項９】
前記捕捉用プローブが、支持体に結合していることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１０】
前記支持体が、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型の支持体であることを特徴とする請求項９記載のシグナル増幅方法。
【請求項１１】
前記自己集合体に対して、標識プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１２】
前記標識プローブが、発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープで標識した標識プローブであることを特徴とする請求項１１記載のシグナル増幅方法。
【請求項１３】
前記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により前記自己集合体の存在を検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１４】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、前記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１５】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、前記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１６】
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、前記自己集合体の存在を光化学的な変化により検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項記載のシグナル増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ライゲーション反応及び自己集合体を形成する自己集合反応を用いて、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズ（本発明では、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、マイクロウェル又は球状ビーズをＤＮＡチップと総称する。）の変異遺伝子の検出感度を向上させることができるシグナル増幅方法に関する。
【背景技術】  従来の遺伝子変異検出は、オリゴヌクレオチド同士をターゲットに結合させＤＮＡリガーゼを用いて連結させるＯＬＡ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）法（例えば、米国特許第４，９８８，６１７号明細書及びＤ．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．８９２３−８９２７（１９９０）．参照。）、標識したｄｄＮＴＰを用い一塩基伸長させるＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法（例えば、Ｃｈｅｎ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，ｐｐ．３４７−３５３（１９９７）．参照。）、インベーダー法（例えば、米国特許第５，９８５，５５７号明細書参照）等、様々な方法を利用しているが、上記の方法は、マルチプレックスやコスト、汎用性などに課題を持つ。
また、表面を特殊加工したスライドガラスなどの支持体に多数のＤＮＡプローブを高密度に固定し、標識したターゲットもしくはシグナル検出用プローブをハイブリダイゼーションさせシグナルを検出する技術は、従来から用いられてきたサザンブロット法と比較して、感度が十分の一と低く（例えば、村松正明ら、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」秀潤社、８５−８６，２０００．参照。）、反応時間が長いという課題があった。
上記の問題を鑑み、本発明者らは酵素を使用しない新規な等温核酸増幅法を報告した（例えば、特許第３２６７５７６号公報参照。）。この方法は、３箇所の領域から構成される一対のオリゴヌクレオチド（ＨｏｎｅｙＣｏｍｂ  Ｐｒｏｂｅ、以下、ＨＣＰと称する。）を用いる方法であり、第一ＨＣＰと第二ＨＣＰの各々の３箇所の領域は互いに相補的な塩基配列を有し、両者を反応させた場合、領域の１箇所のみとハイブリダイズする様に塩基配列を工夫したものである。この工夫により、一対のＨＣＰを反応させた場合、互いにハイブリダイズし、ＨＣＰの自己集合反応により集合体を形成させることができる（以下、この自己集合反応による集合体の形成法をＰＡＬＳＡＲ法と称する。）。
【発明の開示】
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、上記したＰＡＬＳＡＲ法を用いて、変異遺伝子の検出感度を高くすべく、鋭意研究を重ねた結果、本発明に到達したものである。
本発明は、ＰＡＬＳＡＲ法によりＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにＰＡＬＳＡＲ法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することを目的とする。
上記問題を解決するため、本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第１の態様は、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応と、オリゴヌクレオチドの二本鎖の規則的な高次構造である自己集合体を形成する自己集合反応とを有し、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させるものである。
本発明の変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法の第２の態様は、捕捉用プローブと第１プローブをターゲットＤＮＡにハイブリダイズさせる第１工程、ターゲットＤＮＡの変異部位が該捕捉用プローブと相補的な場合、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応により前記捕捉用プローブと前記第１プローブを連結させる第２工程、前記ターゲットＤＮＡを除去させる第３工程、及び複数のオリゴヌクレオチド・プローブを添加し、該オリゴヌクレオチド・プローブの自己集合反応により自己集合体を形成させ、シグナルを増幅させる第４工程を有し、前記捕捉用プローブと前記第１プローブの塩基配列が、前記第１工程において、前記捕捉用プローブの末端が前記ターゲットＤＮＡの変異部位に位置し且つ該末端と前記第１プローブが隣接する状態でターゲットＤＮＡとアニーリングするように構成されており、前記複数のオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが前記第１プローブと相補的な領域を有することを特徴とする。上記シグナル増幅方法により、ＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させることができる。上記第１工程において、捕捉用プローブと第１プローブのターゲットＤＮＡへの結合は、捕捉用プローブと第１プローブをターゲットＤＮＡに同時に結合させても良く、捕捉用プローブをターゲットＤＮＡに結合させた後、第１プローブとターゲットＤＮＡを結合させても良く、第１プローブをターゲットＤＮＡに結合させた後、捕捉用プローブとターゲットＤＮＡを結合させても良く、結合順序は特に限定されない。
上記自己集合反応に用いるオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を、あらかじめ上記第１プローブと相補的な配列にすることが好適である。
上記自己集合反応として、第１に、互いに相補的な部分がｎ（ｎ≧３）カ所の数から構成される一対のオリゴヌクレオチド・プローブ（本発明では、ＨＣＰと称する。）を用いて、互い違いに交差するようにハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用することができる。一種類の変異遺伝子を検出する場合、上記一対のＨＣＰの一方が上記第１プローブとして用いることができるように構成することが好ましい。
上記自己集合反応として、第２に、Ｎｏ．１及びＮｏ．２の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域、中央領域、及び５’側領域の３つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの中央領域を互いに相補的な塩基配列としてダイマープローブを形成するとともに、３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対のダイマー形成用プローブを複数対含む第１の系と、
Ｎｏ．３及びＮｏ．４の一対のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドを３’側領域及び５’側領域の２つの領域に分け、各オリゴヌクレオチドの３’側領域及び５’側領域を互いに非相補的な塩基配列とした一対の架橋プローブを複数対含む第２の系とを有し、該架橋プローブを該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な塩基配列とし、該プローブをハイブリダイゼーションさせることにより、オリゴヌクレオチドが自己集合し、二本鎖の自己集合体を形成させる自己集合反応を利用できる。上記一対のダイマー形成用プローブ及び上記一対の架橋プローブを、該プローブのいずれか一つ、より好ましくは一対のダイマー形成用プローブの一方が上記第１プローブとして用いることができるように構成することが好適である。
上記プローブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
上記プローブの塩基配列を、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．３−オリゴヌクレオチドの５’側領域、第１の系のＮｏ．２−オリゴヌクレオチドの３’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの３’側領域、第１の系のＮｏ．１−オリゴヌクレオチドの５’側領域と第２の系のＮｏ．４−オリゴヌクレオチドの５’側領域をそれぞれ相補的な塩基配列とすることができる。
上記ターゲットＤＮＡに一本鎖のＤＮＡ又は二本鎖のＤＮＡを用いることができる。上記シグナル増幅方法において、直接ターゲットＤＮＡとして用いられるのは、一本鎖のＤＮＡであるが、二本鎖を解離することにより、二本鎖のＤＮＡも使用することができる。例えば、ＤＮＡを鋳型にした遺伝子増幅法（例えば、ＰＣＲ法やＬＣＲ法等）を用いて増幅されたＤＮＡを使用することが可能である。また、標的遺伝子がＲＮＡである場合、ＲＮＡを鋳型にした遺伝子増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等）を用いて増幅されたＤＮＡを使用することも可能であり、本発明に含まれるものである。
上記ＤＮＡチップが、ターゲットＤＮＡを捕捉するための捕捉用プローブを結合する支持体を有し、該支持体として、マイクロプレート型、スライドグラス型、微粒子型、又は電気伝導性の基板型等の支持体を用いることが好適である。上記マイクロプレート型と微粒子型の支持体の材質にはプラスチックやポリスチレン等を使用することができる。また、スライドグラス型の支持体では、ガラスやプラスチック等の素材を使用することができる。電気伝導性の基板型の支持体には、金電極やＩＴＯ電極（ｉｎｄｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ電極）などを使用することができる。
上記自己集合体に対して、あらかじめ発色系酵素、発光系酵素、又はラジオアイソトープ等で標識した標識プローブをハイブリダイゼーションさせて自己集合体の存在を検出することが可能である。
上記自己集合体に対して、核酸と結合する性質を持った蛍光物質を加え、その蛍光物質の光化学的な変化により上記自己集合体の存在を検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを蛍光物質で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドをラジオアイソトープで標識し、上記自己集合体の存在をラジオアイソトープにより検出することが可能である。
あらかじめ自己集合体を形成するオリゴヌクレオチドを発色系酵素又は発光系酵素で標識し、上記自己集合体の存在を蛍光物質の光化学的な変化により検出することが可能である。
上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはＬＮＡのいずれかから選ばれる塩基から構成される。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１〜第４の例におけるステップ１００を原理的に示す模式図である。
図２は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１〜第４の例におけるステップ１０２を原理的に示す模式図である。
図３は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１０を原理的に示す模式図である。
図４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１２を原理的に示す模式図である。
図５は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１４を原理的に示す模式図である。
図６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例におけるステップ１１６を原理的に示す模式図である。
図７は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ１２４を原理的に示す模式図である。
図８は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例におけるステップ１２６を原理的に示す模式図である。
図９は、ターゲットＤＮＡの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ２００を原理的に示す模式図である。
図１０は、ターゲットＤＮＡの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ２０２を原理的に示す模式図である。
図１１は、ターゲットＤＮＡの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ２０４を原理的に示す模式図である。
図１２は、ターゲットＤＮＡの変異部位が捕捉用プローブの末端と相補していない場合の参考例におけるステップ２０６を原理的に示す模式図である。
図１３は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例におけるステップ１３６を原理的に示す模式図である。
図１４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例におけるステップ１３８を原理的に示す模式図である。
図１５は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第４の例におけるステップ１４６を原理的に示す模式図である。
図１６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第４の例におけるステップ１４８を原理的に示す模式図である。
図１７は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第５の例におけるステップ１５０を原理的に示す模式図である。
図１８は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第５の例におけるステップ１５２を原理的に示す模式図である。
図１９は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第５の例におけるステップ１５４を原理的に示す模式図である。
図２０は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第５の例におけるステップ１５６を原理的に示す模式図である。
図２１は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６０を原理的に示す模式図である。
図２２は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６２を原理的に示す模式図である。
図２３は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６３を原理的に示す模式図である。
図２４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６４を原理的に示す模式図である。
図２５は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６５を原理的に示す模式図である。
図２６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例におけるステップ１６６を原理的に示す模式図である。
図２７は、実施例１の結果を示す写真である。
図２８は、実施例２の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、これらの実施の形態は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能であることはいうまでもない。
図１〜図６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第１の例を原理的に示す模式図である。第１の例は、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）の変異部位（１１ａ）が捕捉用プローブ（１２ａ）の末端（１３ａ）と相補している場合を示す。さらに、第１の例は、互いに相補的な３領域から構成され、自ら自己集合して集合体を形成することができる一対のオリゴヌクレオチド・プローブ［即ち、一対のＨＣＰ；ＨＣＰ−１（５’−Ｘ−Ｙ−Ｚ−３’）（１６ａ）及びＨＣＰ−２（５’−Ｘ’−Ｙ’−Ｚ’−３’）（１８ａ）］を用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅方法であり、該一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）は、図３に示した如く、あらかじめ蛍光物質（２２）で標識されており、ＨＣＰ−１（１６ａ）はターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、捕捉用プローブ（１２ａ）と隣接してターゲットＤＮＡ（１０ａ）にハイブリダイズするように構成されている。
図１に示した如く、支持体（１４）上にターゲットＤＮＡ（１０ａ）に相補的な領域を有し且つ該ターゲットＤＮＡ（１０ａ）の遺伝子変異部位（１１ａ）が末端（１３ａ）に位置する捕捉用プローブ（１２ａ）を結合させ、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を加える（ステップ１００）。次に図２に示した如く、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を捕捉した後（ステップ１０２）、図３に示した如く、そのターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質（２２）で標識された片方のＨＣＰ−１（１６ａ）を捕捉用プローブ（１２ａ）と隣り合った形で結合させる（ステップ１１０）。
ターゲットＤＮＡ（１０ａ）の変異部位（１１ａ）と捕捉用プローブ（１２ａ）の末端（１３ａ）とが相補されているため、図４に示した如く、ライゲーション反応により、捕捉用プローブ（１２ａ）とＨＣＰ−１（１６ａ）が連結される（ステップ１１２）。ライゲーション反応後、図５に示すように、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を除去する（ステップ１１４）。図５は、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を解離させ、ＨＣＰ−１（１６ａ）を連結させた捕捉用プローブ（１２ａ）が支持体（１４）に結合している状態を示す。
図６に示したごとく、一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）を加えて、自己集合反応により自己集合体（２０ａ）を形成させ、シグナルを増幅することができる（ステップ１１６）。
図７及び図８は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第２の例を原理的に示す模式図である。第２の例は、一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）を用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅方法であり、且つターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、蛍光物質（２２）で標識されていない一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）を用いる例を示す。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、そのターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる片方のＨＣＰ−１（１６ａ）を捕捉用プローブ（１２ａ）と隣り合った形で結合させる。
ライゲーション反応により、捕捉用プローブ（１２ａ）とＨＣＰ−１（１６ａ）を連結させた後、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を除去する（ステップ１２０）。一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）を加えて、自己集合反応により自己集合体（２０ｂ）を形成させた後（ステップ１２２）、図７に示したごとく、形成された自己集合体（２０ｂ）に対してインターカレーター（２４）を挿入し（ステップ１２４）、図８に示した如く、シグナルを増幅することができる（ステップ１２６）。なお、ステップ１２２とステップ１２４を同時に行うことも可能である。
図９〜図１２は、ターゲットＤＮＡ（１０ｂ）の変異部位（１１ｂ）が捕捉用プローブ（１２ａ）の末端（１３ａ）と相補していない場合の参考例を原理的に示す模式図である。図９に示した如く、ターゲットＤＮＡ（１０ｂ）を捕捉した後（ステップ２００）、図１０に示した如く、そのターゲットＤＮＡ（１０ｂ）と相補的な領域を持ち、自ら自己集合して集合体を形成することができる蛍光物質（２２）で標識された片方のＨＣＰ−１（１６ａ）を捕捉用プローブ（１２ａ）と隣り合った形で結合させる（ステップ２０２）。次に図１１に示した如く、ターゲットＤＮＡ（１０ｂ）の変異部位（１１ｂ）と捕捉用プローブ（１２ａ）の末端（１３ａ）とが相補されないため、ライゲーション反応が行われず（ステップ２０４）、図１２のようにターゲットＤＮＡ（１０ｂ）を解離させると（ステップ２０６）、捕捉用プローブ（１２ａ）のみ支持体（１４）に結合した状態となり、その後、一対のＨＣＰ（１６ａ，１８ａ）を加えることにより形成される自己集合体（２０ａ）は、捕捉用プローブ（１２ａ）に結合せず、洗浄等により除去されるため、シグナル増幅は行われない。
図１３及び図１４は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第３の例を原理的に示す模式図である。第３の例はターゲットＤＮＡ（１０ａ）の変異部位（１１ａ）が捕捉用プローブ（１２ａ）の末端（１３ａ）と相補している場合を示す。さらに、第３の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ［ダイマー形成用プローブ−１，２（５’−Ｘ−ａ−ｂ−３’，５’−ｄ−ａ’−ｅ−３’）（２６，２８）］及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ［架橋プローブ−１，２（５’−ｄ’−ｂ’−３’，５’−Ｘ’−ｅ’−３’）（３０，３２）］を用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅方法であり、あらかじめ蛍光物質（２２）で標識された一対のダイマー形成用プローブ（２６，２８）により形成されたダイマーを用いた場合の例を示す。なお、該ダイマー形成用プローブ−１（２６）は、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、且つ捕捉用プローブ（１２ａ）と隣接してターゲットＤＮＡ（１０ａ）にハイブリダイズするように構成されている。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、そのターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を持ち、蛍光物質（２２）で標識された一対のダイマー形成用プローブ−１，２（２６，２８）より形成されたダイマーを捕捉用プローブ（１２ａ）と隣り合った形で結合させる（ステップ１３０）。次に、ライゲーション反応により、捕捉用プローブ（１２ａ）とダイマー形成用プローブ−１（２６）を連結し（ステップ１３２）、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を解離させた後（ステップ１３４）、図１３に示した如く、ダイマー形成用プローブ−１，２（２６，２８）より形成されたダイマー及び架橋プローブ−１，２（３０，３２）を添加し、上記プローブ（２６，２８，３０及び３２）をハイブリダイゼーションさせ（ステップ１３６）、図１４に示した如く、ダイマー形成用プローブ（２６，２８）と架橋プローブ（３０，３２）の自己集合反応により自己集合体（２０ｃ）を形成させ、シグナル増幅させることができる（ステップ１３８）。
図１５及び図１６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第４の例を原理的に示す模式図である。第４の例は、自らダイマーを形成する一対のダイマー形成用プローブ［ダイマー形成用プローブ−１，２（２６，２８）］及び該ダイマー形成用プローブより形成されるダイマーを架橋することが可能な一対の架橋プローブ（３０，３２）を用いたＰＡＬＳＡＲ法を利用したシグナル増幅方法であり、一対のダイマー形成用プローブにより形成されたダイマーを用いて、ダイマー形成用プローブ（２６，２８）及び架橋プローブ（３０，３２）を標識しない場合の例である。
上記した第１の例と同様にして、ステップ１００及びステップ１０２を行った後、そのターゲットＤＮＡ（１０ａ）と相補的な領域を有する一対のダイマー形成用プローブ−１，２（２６，２８）より形成されたダイマーを捕捉用プローブ（１２ａ）と隣り合った形で結合させる（ステップ１４０）。
ライゲーション反応により、捕捉用ブローブ（１２ａ）とダイマー形成用プローブ−１（２６）を連結させた後、ターゲットＤＮＡ（１０ａ）を除去する（ステップ１４２）。一対のダイマー形成用プローブ（２６，２８）より形成されたダイマー及び一対の架橋プローブ（３０，３２）を加えて、自己集合反応により自己集合体（２０ｄ）を形成させた後（ステップ１４４）、図１５に示したごとく、形成された自己集合体（２０ｄ）に対してインターカレーター（２４）を挿入し（ステップ１４６）、図１６に示した如く、シグナルを増幅することができる（ステップ１４８）。なお、ステップ１４４とステップ１４６を同時に行うことも可能である。
上記した例では、自己集合体を形成するオリゴヌクレオチド・プローブの一つを第１プローブと同一とした場合の例を示したが、必ずしも同一である必要はなく、第１プローブとオリゴヌクレオチド・プローブの少なくとも一つが結合できるように構成されているプローブを用いることができる。
上記した例では、予め支持体に結合させておいた捕捉用プローブを用いたが、捕捉用プローブと支持体とを結合させる段階は、ターゲットＤＮＡを除去する段階までであればいつでもよく、特に限定されない。例えば、捕捉用プローブとターゲットＤＮＡを結合させた後、捕捉用プローブ、ターゲットＤＮＡ、第１プローブが全て結合した後、及びライゲーション反応後等が挙げられる。
図１７〜図２０は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第５の例を原理的に示す模式図である。第５の例は、同時に複数の変異遺伝子を検出する方法であり、各ターゲットＤＮＡ（１０ｅ，１０ｆ，１０ｇ）の相補的配列を先端に持ち、２箇所のＨＣＰ領域を含む第１プローブ（３４ｅ，３４ｆ，３４ｇ）と、一対のＨＣＰ（１６ｅ，１８ｅ）を用いる例を示す。第１プローブは標的とする遺伝子の数だけ必要であり、この例では３種類の遺伝子（１０ｅ，１０ｆ及び１０ｇ）の例を示しているため、先端領域の異なる３種類の第１プローブ（３４ｅ，３４ｆ及び３４ｇ）を用いる。第１プローブの先端領域を除く２領域は共通のＨＣＰの配列を有しているため、第１プローブの種類に関わらずＨＣＰは一対のみでシグナルを増幅することができる。
図１７に示したごとく支持体（１４）上にターゲットＤＮＡ−１（１０ｅ）に相補的な領域を有し且つ該ターゲットＤＮＡの遺伝子変異部位（１１ｅ）が末端（１３ｅ）に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる４種の捕捉用プローブ（１２ｅ）、ターゲットＤＮＡ−２（１０ｆ）に相補的な領域を有し且つ該ターゲットＤＮＡの遺伝子変異部位（１１ｆ）が末端（１３ｆ）に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる４種の捕捉用プローブ（１２ｆ）、並びにターゲットＤＮＡ−３（１０ｇ）に相補的な領域を有し且つ該ターゲットＤＮＡの遣伝子変異部位（１１ｇ）が末端（１３ｇ）に位置し、該末端の塩基がそれぞれ異なる４種の捕捉用プローブ（１２ｇ）を別々に結合させる（ステップ１５０）。なお、図１７〜図２０において、末端のみ異なる捕捉用プローブ及び該末端はそれぞれ同一符号で示した。次に図１８に示した如く、ターゲットＤＮＡ（１０ｅ，１０ｆ及び１０ｇ）及び第１プローブ（３４ｅ，３４ｆ及び３４ｇ）を捕捉用プローブ（１２ｅ，１２ｆ及び１２ｇ）に応じて結合させる（ステップ１５２）。変異部位が相補されていない場合でも末端部分を除き同様に結合するが、この図には末端部分が相補されている場合のみを示した。次に図１９に示した如く、ライゲーション反応後ターゲットＤＮＡ（１０ｅ，１０ｆ及び１０ｇ）及び未反応プローブを除去する（ステップ１５４）。
図２０に示した如く、一対のＨＣＰ（１６ｅ，１８ｅ）を加え、自己集合体（２０ｅ）を形成させシグナルを増幅することができる（ステップ１５６）。なお、第５の例では、遺伝子変異部位について４塩基全てを分析する場合を示したが、捕捉用プローブ末端の塩基は必要に応じて適宜選択すればよく、特に限定されないものである。
図２１〜図２６は、本発明のシグナル増幅方法の工程順の第６の例を原理的に示す模式図である。第６の系は、ライゲーション反応を２箇所で行い、第１プローブ（３４ｈ）にＨＣＰ−１（１６ｈ）と捕捉用プローブ（１２ｈ）を連結させるという特徴を持つ。ＨＣＰ−１（１６ｈ）、第１プローブ（３４ｈ）、捕捉用プローブ（１２ｈ）は、お互いに隣接するように設計されている。同時に複数の変異遺伝子を検出する場合、第５の例と同様、第１プローブの先端領域を各ターゲットＤＮＡに相補的にする以外は、第２プローブ、ＨＣＰ一対とも遺伝子の種類に関わらず共通のオリゴヌクレオチド・プローブを用いることができる。
図２１は、第１プローブ（３４ｈ）、第２プローブ（３６）、ターゲットＤＮＡ（１０ｈ）及び支持体（１４）上に固定された捕捉用プローブ（１２ｈ）を示す（ステップ１６０）。第１プローブ（３４ｈ）はターゲットＤＮＡ（１０ｈ）に相補的な配列を有し且つＨＣＰ−１（１６ｈ）の配列を１箇所有し、第２プローブ（３６）はＨＣＰ−２（１８ｈ）と同じ配列を２箇所有する。図２２に示したごとく、第１プローブ（３４ｈ）は第２プローブ（３６）とターゲットＤＮＡ（１０ｈ）の両者とハイブリダイズする（ステップ１６２）。図２３に示した如く、ＨＣＰ−１（１６ｈ）を加えハイブリダイゼーションを行い、ＨＣＰ−１（１６ｈ）と第２プローブ（３６）がハイブリダイズすることによりＨＣＰ−１（１６ｈ）と第１プローブ（３４ｈ）が隣接する。この結果、第１プローブ（３４ｈ）の両末端がそれぞれ捕捉用プローブ（１２ｈ）とＨＣＰ−１（１６ｈ）に隣接した状態となる（ステップ１６３）。なお、ステップ１６２とステップ１６３は、同時に行うことも可能である。図２４、図２５に示した如く、捕捉用プローブ（１２ｈ）の末端部分（１３ｈ）がターゲットＤＮＡ（１０ｈ）の変異部位（１１ｈ）と相補している場合ライゲーション反応後（ステップ１６４）、ターゲットＤＮＡ（１０ｈ）、第２プローブ（３６）及び未反応プローブを除去することにより、捕捉用プローブ（１２ｈ）、第１プローブ（３４ｈ）、ＨＣＰ−１（１６ｈ）が１本に連結された状態となる（ステップ１６５）。図２６に示す如く一対のＨＣＰ（１６ｈ，１８ｈ）を加えることにより、自己集合体（２０ｈ）が形成され（ステップ１６６）、シグナルを増幅することができる。
本発明のシグナル増幅方法において、一対のオリゴヌクレオチド・プローブにあらかじめ検出のための標識物質として、１２５Ｉや３２Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光物質やＣｙ３・Ｃｙ５等の蛍光物質、４−メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、ターゲットＤＮＡを検出することも可能である。
核酸と結合する性質を有する色素を添加することにより、ターゲットＤＮＡを検出することも可能である。図８及び図１６に示した如く、インターカレーターのような核酸と結合する性質を有する蛍光物質を用いてターゲットＤＮＡを検出することが好適である。蛍光物質としては、核酸と結合する性質を有する蛍光物質であれば、特に限定されないが、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ  ｓｔａｉｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ  ｓｔａｉｎ、Ｖｉｓｔａ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｔａｉｎ、Ｇｅｌｓｔａｒ  ｓｔａｉｎ、Ｒａｄｌａｎｔ  Ｒｅｄ  ｓｔａｉｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、０１１Ｇｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｂｉｓ−Ｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−１  Ｉｏｄｉｄｅ、ＹＯ−ＰＲＯ−３  Ｉｏｄｉｄｅ（以上、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）、臭化エチジウム、Ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ  Ａ、ＴＯＴＯ、Ｐｓｏｒａｌｅｎ、アクリジニウムオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、ＡＯＡＯ（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）等が使用できる。
上記したオリゴヌクレオチド・プローブを構成する核酸は、通常ＤＮＡ又はＲＮＡで構成されるが、核酸類似体でも構わない。核酸類似体として、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、国際公開第９２／２０７０２号パンフレット参照。）やＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ、例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８．５４，３６０７−３６３０．、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９８．１２０，１３２５２−１３２５３．、及びＷａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．２０００．９７，５６３３−５６３８．参照。）が挙げられる。また、一対のオリゴヌクレオチド・プローブは、通常、同じ種類の核酸で構成されるが、例えばＤＮＡプローブとＲＮＡプローブが一対になっても差し支えない。即ち、プローブの核酸の種類はＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸類似体（例えばＰＮＡやＬＮＡ等）から選択することができる。又、一つのプローブ内での核酸組成は一種類、例えばＤＮＡのみから構成される必要がなく、必要に応じて、例えば、ＤＮＡとＲＮＡから構成されるオリゴヌクレオチド・プローブ（キメラプローブ）を使用することも可能であり、本発明に含まれる。
本発明における標的遺伝子測定用試料は、該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料が適用できる。標的遺伝子は試料より適宜調製または単離したものでもよく、特に限定されない。たとえば、血液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、組識液、細胞培養物等の生体由来試料、ウイルス、細菌、カビ等の含有または感染した可能性のある試料等が挙げられる。また、試料中の標的遺伝子を公知の方法で増幅した核酸も使用可能である。
なお、図において、先端鋭角部は３’末端を示し、起端黒丸印は５’末端を示すものである。
【実施例】  以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
【実施例１】１．目的
ＰＡＬＳＡＲ法を用いて変異末端部位の塩基の違いによる変異遺伝子の検出を試みた。
２．材料
以下に実施例１で用いたオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を示す。
（１）キャプチャープローブ（捕捉用プローブ）
2004074480.tif 000003
（２）ターゲット遺伝子−１（Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ遺伝子の塩基配列をもとに合成。変異部位（８４５番目アミノ酸）を下線で示した。）
ターゲット遺伝子−１−Ｔ：
2004074480.tif 000004
ターゲット遺伝子−１−Ａ：
2004074480.tif 000005
ターゲット遺伝子−１−Ｃ：
2004074480.tif 000006
ターゲット遺伝子−１−Ｇ：
2004074480.tif 000007
（３）第１プローブ
2004074480.tif 000008
（４）ＨＣＰ
ＨＣＰ−１−１：
2004074480.tif 000009
ＨＣＰ−１−２：
2004074480.tif 000010
ハイブリダイゼーション溶液として、［終濃度６×ＳＳＣ、０．１ｍｇ／ｍＬサケの精子ＤＮＡ、５×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ］を調製した。
キャプチャープローブを固定する基盤としてアミノ修飾オリゴＤＮＡ固定マイクロアレイ用コートスライドグラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ  ＧＬＡＳＳ社製）を用い、スポッターとして、ＤＮＡマイクロアレイヤー３２ピン型（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ社製）を用いた。
３．方法
３−１．スライドグラスの作製
ａ）キャプチャープローブのスポッティング
各キャプチャープローブ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）とスポッティング溶液（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ  ＧＬＡＳＳ社製）を等量混ぜ、４種のプローブ溶液を調製した。得られたプローブ溶液をスライドグラス上にＮ＝４となるようスポットした。異なるプローブ溶液をスポットする際は、滅菌水、及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。スポット後のスライドグラスは、湿潤箱に入れ遮光し、一晩静置した。
ｂ）キャプチャープローブの固定
ブロッキング溶液（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ  ＧＬＡＳＳ社製）１つ、滅菌水２つ、冷メタノール１つをそれぞれ染色バットに用意し、ブロッキング溶液にて２０分、各滅菌水にて３分、冷メタノールにて３分、順次、スポッティング後のスライドグラスを浸し、固定後風乾させ、スライドグラスを作成した。
３−２．検出
ａ）ハイブリダイゼーション反応
４組のハイブリダイゼーション溶液に各ターゲット遺伝子をそれぞれ３０ｐｍｏｌ（３０μＬ）となるよう添加し、第１プローブ３０ｐｍｏｌ（３０μＬ）を加えた。９５℃、２分にて熱解離させた各溶液２５μＬを、前記キャプチャープローブを固定したスライドグラス上のチャンバー内にて４２℃、２時間反応させ、キャプチャープローブ、ターゲット遺伝子、第１プローブをハイブリダイズさせた。反応後のスライドは、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で２回、１×ＳＳＣ溶液にて１回、０．２×ＳＳＣ溶液にて１回洗浄し風乾させた。
ｂ）ライゲーション反応及びアルカリ変性
リガーゼは耐熱性リガーゼ（Ｔｔｈ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ）を用いた。このリガーゼ添付の緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ）を用いて、液量３０μＬにリガーゼ（３０Ｕ）を添加し、この溶液の２５μＬをチャンバー内にて反応させた。反応条件は、６５℃１５分とした。
ライゲーション反応後、スライドグラスを０．２×ＳＳＣ溶液にて軽く洗浄し、０．２５Ｍ  ＮａＯＨ溶液にて１０分間アルカリ処理を行い、未反応プローブ及び余剰プローブを除去した。また、ＮａＯＨ溶液の中和には０．２５Ｍ  ＨＣｌ溶液を用いた。変性後のスライドは、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で２回、１×ＳＳＣ溶液にて１回、０．２×ＳＳＣ溶液にて１回、洗浄し風乾させた。
ｃ）自己集合体形成反応
ハイブリダイゼーション溶液に、５’末端をそれぞれＣｙ３標識した一対のＨＣＰ（ＨＣＰ−１−１及びＨＣＰ−１−２）を終濃度１ｐｍｏｌ／μＬとなるよう加えた。９５℃、２分にて熱解離させたこの溶液２５μＬを、アルカリ変性後の洗浄風乾させたスライドグラス上のチャンバー内にて６８℃、２時間反応させ、自己集合体を形成させた。反応後のスライドは、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で２回、１×ＳＳＣ溶液にて１回、０．２×ＳＳＣ溶液にて１回、洗浄し風乾させスライドグラス上のＣｙ３の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２７に示す。
図２７に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。
【実施例２】１．目的
１２種類の遺伝子におけるマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出の検討を行った。
２．材料
以下に実施例２で用いたオリゴヌクレオチド・プローブの塩基配列を示す。
（１）キャプチャープローブ
2004074480.tif 000011
2004074480.tif 000012
（２）第１プローブ
第１プローブ−１ｂ：
2004074480.tif 000013
第１プローブ−２：
2004074480.tif 000014
第１プローブ−３：
2004074480.tif 000015
第１プローブ−４：
2004074480.tif 000016
第１プローブ−５：
2004074480.tif 000017
第１プローブ−６：
2004074480.tif 000018
第１プローブ−７：
2004074480.tif 000019
第１プローブ−８：
2004074480.tif 000020
第１プローブ−９：
2004074480.tif 000021
第１プローブ−１０：
2004074480.tif 000022
第１プローブ−１１：
2004074480.tif 000023
第１プローブ−１２：
2004074480.tif 000024
（３）ターゲット遺伝子
ターゲット遺伝子−３（３’側領域ＣＰ−３−Ｔと相補的）：
2004074480.tif 000025
ターゲット遺伝子−６（３’側領域ＣＰ−６−Ａと相補的）：
2004074480.tif 000026
ターゲット遺伝子−７（３’側領域ＣＰ−７−Ｇと相補的）：
2004074480.tif 000027
ターゲット遺伝子−９（３’側領域ＣＰ−９−Ｇと相補的）：
2004074480.tif 000028
ターゲット遺伝子−１０（３’側領域ＣＰ−１０−Ｃと相補的）：
2004074480.tif 000029
ターゲット遺伝子−１２（３’側領域ＣＰ−１２−Ｔと相補的）：
2004074480.tif 000030
（４）ＨＣＰ
ＨＣＰ−２−１：
2004074480.tif 000031
ＨＣＰ−２−２：
2004074480.tif 000032
なお、上記キャプチャープローブ、第１プローブの３’側領域及びターゲット遺伝子は、それぞれ下記の遺伝子の塩基配列をもとに合成したものである。
Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ遺伝子：ＣＰ−１及び第１プローブ−１（変異部位８４５番塩基），ＣＰ−１０、第１プローブ−１０及びターゲット遺伝子−１０（変異部位１８７番塩基）、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ遺伝子：ＣＰ−２及び第１プローブ−２（変異部位１１２番目アミノ酸），ＣＰ−３、第１プローブ−３及びターゲット遺伝子−３（変異部位１５８番目アミノ酸）、ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ１００遺伝子：ＣＰ−４及び第１プローブ−４、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ遺伝子：ＣＰ−５及び第１プローブ−５、Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃｈａｉｎ  Ａｃｙｌ−ＣｏｅｎｚｙｍｅＡ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ遺伝子：ＣＰ−６、第１プローブ−６及びターゲット遺伝子−６、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ遺伝子：ＣＰ−７、第１プローブ−７及びターゲット遺伝子−７、ｐ５３遺伝子：ＣＰ−８及び第１プローブ−８（変異部位４７番目アミノ酸），ＣＰ−９、第１プローブ−９及びターゲット遺伝子−９（変異部位７２番目アミノ酸）、ＫＲＡＳ遺伝子：ＣＰ−１１及び第１プローブ−１１（変異部位１２番目アミノ酸）、ＣＰ−１２及び第１プローブ−１２（変異部位６１番目アミノ酸）。
ハイブリダイゼーション溶液、スライドグラス及びスポッターは実施例１と同様のものを用いた。
３．方法
３−１．スライドグラスの作製
各キャプチャープローブ（ＣＰ１００ｐｍｏｌ／μＬ）とスポッティング溶液（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ  ＧＬＡＳＳ社製）を等量混ぜ、２４種のプローブ溶液を調製した。このプローブ溶液をスライドグラス上にＮ＝１となるよう１２遺伝子分、計２４ヶ所スポットした。なお、異なるプローブ液をスポットする際は、滅菌水、及び冷エタノールにてピンを洗浄風乾した。スポット後のスライドグラスは、湿潤箱に入れ遮光し、一晩静置した。
その後、実施例１と同様にキャプチャープローブの固定を行い、スライドグラスを作製した。
３−２．検出
ハイブリダイゼーション溶液に、６種類のターゲット遺伝子をそれぞれ３０ｐｍｏｌ（３０μＬ）ずつ添加し、さらに１２種類の第１プローブすべてをそれぞれ３０ｐｍｏｌ（３０μＬ）ずつ加えた。９５℃、２分にて熱解離させたこれらの溶液２５μＬを、前記キャプチャープローブ２４本を固定したスライドグラス上のチャンバー内にて４２℃、２時間反応させ、キャプチャープローブ、ターゲット遺伝子、第１プローブをハイブリダイズさせた。反応後のスライドは、２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で２回、１×ＳＳＣ溶液にて１回、０．２×ＳＳＣ溶液にて１回洗浄し風乾させた。
その後、ＨＣＰとしてＨＣＰ−２−１及びＨＣＰ−２−２を用いた以外は実施例１と同様にして実施例１と同様にして、ライゲーション反応、アルカリ処理及び自己集合体形成反応を行い、スライドグラス上の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２８に示す。
図２８に示した如く、ターゲット遺伝子の変異部位が捕捉用プローブと相補的な場合のみシグナルが増幅された。
【産業上の利用可能性】  以上述べた如く、本発明によれば、ＰＡＬＳＡＲ法によりＤＮＡチップにおける変異遺伝子の検出感度を向上させ、効率よくシグナルの増幅を確立させ、さらにＰＡＬＳＡＲ法に用いるオリゴヌクレオチド・プローブのデザインを工夫することにより簡便な検出を確立させることができるようにした変異遺伝子検出のためのシグナル増幅方法を提供することができる。
【配列表】
2004074480.tif 000033
2004074480.tif 000034
2004074480.tif 000035
2004074480.tif 000036
2004074480.tif 000037
2004074480.tif 000038
2004074480.tif 000039
2004074480.tif 000040
2004074480.tif 000041
2004074480.tif 000042
2004074480.tif 000043
2004074480.tif 000044
2004074480.tif 000045
2004074480.tif 000046
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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