(57)【要約】配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド、配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド、及びこれらのアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド、並びにこれらのペプチドを含む腫瘍の治療または予防のための医薬を提供する。本発明のペプチドはワクチンとして使用することができる。
2004024766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
【請求項２】
配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、請求項２または３に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
【請求項６】
配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
【請求項７】
Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、請求項６または７に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
【請求項１２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１１に記載のエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、請求項１２に記栽のエキソソーム。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記酸のペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記酸のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１８】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
【請求項１９】
請求項１４または１５に記載の方法によって誘導される、請求項１８に記載の抗原提示細胞。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
【請求項２１】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、請求項２０または２１に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及び該ペプチドを含む腫瘍の治療及び予防のための医薬に関する。
【背景技術】  腫瘍拒絶抗原遺伝子が悪性黒色腫を中心に同定されるに従って、それを応用した癌免疫療法が開発されている。とりわけ、抗腫瘍免疫応答におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の重要性が認識されるに伴い、腫瘍特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を生体内で惹起させる癌ワクチン療法が着目され、種々の臨床応用が行われている。また、１０個前後のアミノ酸残基からなるペプチドが種々の共刺激分子の補助によりＣｌａｓｓＩ経路を介してＴ細胞を活性化し、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導する機序が解明され、さらに個々のＨＬＡ分子に拘束性を示すペプチドの同定も精力的に進んでいる。
しかしながら、腫瘍を制御する事は未だ完全に出来ていないのが現状である。その原因として、腫瘍細胞の不均一性、腫瘍細胞におけるＭＨＣ−Ｃｌａｓｓ  Ｉの発現低下や消失、さらに腫瘍細胞における標的分子の欠落が考えられる。また、現在同定されている腫瘍抗原ペプチドはある種の腫瘍に存在するが、全ての腫瘍を網羅できるものではない。そこで、これらの問題点を解決するため、標的細胞を腫瘍細胞ではなく、腫瘍血管における内皮細胞に着目した。すなわち、内皮細胞はＭＨＣ−Ｃｌａｓｓ  Ｉの発現低下や消失、また不均一性といった問題がほとんどないので、腫瘍血管を標的にするＣＴＬが誘導できれば、腫瘍の種類に関係なく、またＣｌａｓｓ  Ｉの消失や標的分子の欠損といった従来の癌ワクチン療法で問題となっていた原因を凌駕でき、治療効果が大いに期待できると考えられる。癌における新生血管の研究は１９７０年代のＦｏｌｋｍａｎらの先駆的な仮説の提唱に始まり、様々な角度から研究がなされている。なかでも、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）において多くの検討がなされ、腫瘍新生血管におけるその意義が評価されている。特に癌治療においては、ｔａｒｇｅｔ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｄｒｕｇとして新生血管阻害剤の開発が精力的に進められ、すでに臨床治験も行われているが、この考え方を癌ワクチン療法に生かした治療は未だ行われていない。一つの理由としてＶＥＧＦＲが正常細胞に発現しているため免疫寛容状態になっていると考えられた。しかしながら、１９９０年代のＰｌａｔｅ，Ｍｉｌｌａｕｅｒ，Ｒｉｓａｕらの研究により腫瘍組織における内皮細胞においてＶＥＧＦＲが強発現している事が確認され、また、ＣＥＡ，ＨＥＲ／ｎｅｕのように正常細胞でも発現している自已抗原に対する免疫応答が必ずしも免疫寛容状態になっていないことが明らかになった事により、ＶＥＧＦＲが癌ワクチン療法の標的に成り得るのではないかと考えた。
最近、ＶＥＧＦＲに対する能動免疫を行うことにより、腫瘍における血管新生及び転移を抑制できることが報告された（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ２００２年  第１９５巻  第１２号  ｐ．１５７５−１５８４）。しかし、この文献では可溶性のＶＥＧＦＲタンパク質を用いているに過ぎず、有効なペプチドのアミノ酸配列についての検討は何らなされていない。
【発明の開示】
本発明者等は、ＶＥＧＦシグナルにおいて内皮細胞の増殖に関与すると考えられ、腫瘍組織内皮細胞において強発現しているＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ｆｌｋ−１、以下ＫＤＲという）を標的とした癌ワクチン療法の可能性に着目し、ワクチンとして有効に用いることができるペプチドの探索を行い、その特異性について検討を行い、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）を提供する。
（１）  配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド。
（２）  配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（３）  Ｎ末端から２番目のアミノ酸がフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンである、上記（２）に記載のペプチド。
（４）  Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンである、上記（２）または（３）に記載のペプチド。
（５）  配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチド。
（６）  配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチド。
（７）  Ｎ末端から２番目のアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである、上記（６）に記載のペプチド。
（８）  Ｃ末端のアミノ酸がバリンまたはロイシンである、上記（６）または（７）に記載のペプチド。
（９）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療及び／または予防のための医薬。
（１０）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを１種以上含む、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症の治療のための医薬。
（１１）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを含む複合体を表面に提示しているエキソソーム。
（１２）  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である、上記（１１）に記載のエキソソーム。
（１３）  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１である、上記（１２）に記載のエキソソーム。
（１４）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬ誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１５）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法。
（１６）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法。
（１７）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞。
（１８）  ＨＬＡ抗原と上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞。
（１９）  上記（１４）または（１５）に記載の方法によって誘導される、上記（１８）に記載の抗原提示細胞。
（２０）  上記（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドを有効成分とする、病態部位における血管新生阻害のためのワクチン。
（２１）  ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である被験者に対して投与するための、上記（２０）に記載のワクチン。
（２２）  悪性腫瘍の増殖及び／または転移を抑制するために使用される、上記（２０）または（２１）に記載のワクチン。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−２６７２８５、２００３−０６２００３、２００３−１６７０４２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、標的細胞に対するＣＴＬクローンによる細胞傷害活性を示す。
図２は、樹立したＣＴＬクローンのＨＬＡ−テトラマー解析の結果を示す。
（ａ）本発明のペプチドによって誘導されたＣＴＬクローン及びフィーダー細胞
（ｂ）フィーダー細胞（対照）
図３は、ｃｏｌｏｎ２６を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
図４は、ｃｏｌｏｎ２６由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
図５は、Ｂ１６を接種したマウスの生存に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。
図６は、Ｂ１６メラノーマ由来の腫瘍の増殖に対する本発明のペプチドを用いたワクチン接種の効果を示す。Ａ２／Ｋｂ  ＴＧＭに対してＢ１６腫瘍細胞を皮下注射でチャレンジする前に、ＫＤＲ７７３でパルスしたＤＣ（●）、ＤＣ単独（△）、またはＨＢＳＳ（□）で１週間の間隔をおいて２回ワクチン接種した。平均の腫瘍増殖を図示した。Ｐ＜０．０１。
図７は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ２９−１６９の殺細胞効果を示す。
図８は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ２９−１６９の殺細胞効果を示す。
図９は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５）の殺細胞効果を示す。
図１０は、ＫＤＲペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲＣ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５）の殺細胞効果を示す。
図１１は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１）の殺細胞効果を示す。
図１２は、ＫＤＲペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲＣ５１−１３２８（ＫＷＣ５１）の殺細胞効果を示す。
図１３は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ）の殺細胞効果を示す。
図１４は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ）の殺細胞効果を示す。
図１５は、ＫＤＲペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＤＲＣ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ）の殺細胞効果を示す。
図１６は、ＣＴＬクローンの殺細胞効果に対する各種抗体の阻害作用を示す。
図１７は、Ａ２／Ｋｂ  ＴＧＭにおいてＢ１６細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをＨＢＳＳ、パルスしていないＤＣ、または本発明のエピトープペプチド（ＫＤＲ１９０、７７２、７７３、７７３−２Ｌ、７７５、または１０８４）でパルスしたＤＣで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
図１８は、本発明のペプチドのトランスジェニックマウスにおけるヒト腫瘍体積の増加に対する抑制効果を示す。
図１９は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＷＣ６５−１９０の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２０は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＷＣ７２−７７２の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２１は、ＫＤＲペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＷＣ７２−７７２の殺細胞効果を示す。■：ＨｅＰＧ２−ＶＥＧＦＲ２、□：ＨｅＰＧ２−ＥＧＦＰ
図２２は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ７−１３１８の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２３は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＷＣ４６の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２４は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ１８−１８９の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２５は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ６５−８２６の殺細胞効果を示す。■：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
図２６は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４腸性細胞に対するＣＴＬクローンＣ７−１３１８の殺細胞効果を示す。■：ＨＴ２９−ＶＥＧＦＲ２、□：ＨＴ２９−ＥＧＦＰ
図２７は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＫＷＣ４６の殺細胞効果を示す。■：ＨＴ２９−ＶＥＧＦＲ２、□：ＨＴ２９−ＥＧＦＰ  図２８は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ１８−１８９の殺細胞効果を示す。■：ＨＴ２９−ＶＥＧＦＲ２、□：ＨＴ２９−ＥＧＦＰ
図２９は、本発明のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対するＣＴＬクローンＣ６５−８２６の殺細胞効果を示す。■：ＨＴ２９−ＶＥＧＦＲ２、□：ＨＴ２９−ＥＧＦＰ
図３０は、ＢＡＬＢ／ｃにおいてｃｏｌｏｎ２６細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害活性を示す。マウスをＨＢＳＳ、パルスしていないＤＣ、または本発明のエピトープペプチド（ＫＤＲ１８９または８２６）でパルスしたＤＣで２回ワクチン接種した。矢印は特徴的なジグザグに進む新たに形成された血管を示す。
図３１は、ＢＡＬＢ／ｃにおいてｃｏｌｏｎ２６細胞によって誘導される血管新生応答に対する本発明のペプチドの阻害を示す。柱は平均を、縦棒は標準誤差を示す。
図３２は、本発明のペプチドで刺激した患者由来のＣＴＬによるＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対する殺細胞効果を示す。◆：ペプチド存在下、□：ペプチド不存在下
（Ａ）配列番号８（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）で刺激して得られた結腸癌患者由来のＣＴＬの殺細胞効果
（Ｂ）配列番号５（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１８９）で刺激して得られた結腸癌患者由来のＣＴＬの殺細胞効果
（Ｃ）配列番号３（アミノ酸開始位置ＫＤＲ２２０）で刺激して得られた結腸癌患者由来のＣＴＬの殺細胞効果
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者等はまず、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原提示細胞上に提示される場合に、種々のタンパク質が９量体のペプチド（ノナペプチド）に分解されてから提示されることを考慮し、ＫＤＲタンパク質の９量体または１０最体の部分ペプチドについて、ヒト主要組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）であるＨＬＡ抗原との結合親和性を検討した。尚、表１の右側のペプチドにおいて、小文字は５番目のアミノ酸を示す。
ヒトＫＤＲタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えば米国特許第５，８６１，３０１号に記載されており、当業者であれば容易に入手することができる。９量体及び１０量体ペプチドは、得られたＫＤＲタンパク質の全アミノ酸配列に基づいて、任意の位置からのペプチドを合成して得ることができる。ペプチドの合成は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。通常用いられる合成方法は、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成、丸善（株）、１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店、１９９１等の文献や、国際公開ＷＯ９９／６７２８８号等の公報に記載されている。ＨＬＡ抗原との結合は、細胞表面にＨＬＡ抗原を有する細胞、例えば樹状細胞を単離して、細胞へのペプチドの結合を通常行われる手法を用いて測定することができる。
あるいはまた、最近インターネット上で利用可能となっているソフトウェア、例えばＰａｒｋｅｒ  Ｋ．Ｃ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，１９９４に記載されているもの等を用いて、種々のペプチドとＨＬＡ抗原との結合親和性をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで計算することもできる。尚、ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばＰａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，１９９４；Ｎｕｋａｙａ，Ｉ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８０，１９９９等に記載のように測定することができる。
ＨＬＡ抗原としては、例えば日本人において多く発現しているといわれるＡ−２４型またはＡ−０２型等を用いることが有効な結果を得るために好ましく、更に好ましくはＡ−２４０２、Ａ−０２０１等のサブタイプである。しかしながら、臨床においては、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を予め調べることにより、これとの結合親和性、あるいは抗原提示による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）誘導能の高いペプチドを適宜選択することができる。更に、結合親和性及びＣＴＬ誘導能の高いペプチドを得るために、天然に存在するＫＤＲ部分ペプチドのアミノ酸配列に基づいて１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加を行うこともできる。ここで、「数個」とは、５個以下、好ましくは３個以下を意味する。更に、天然において提示されるペプチド以外にも、既にＨＬＡ抗原に結合して提示されるペプチドの配列の規則性が知られているので（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，３９１３，１９９４；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４１：１７８，１９９５；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７，１９９４）、得られたペプチドに対してこれらの規則性に基づいた改変を行っても良い。例えば、ＨＬＡ−２４結合親和性の高いものはペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンに置換したペプチドも好適に使用することができる。一方、ＨＬＡ−０２０１結合親和性の高いものは、ペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をロイシンまたはメチオニンに置換したり、Ｃ末端のアミノ酸をバリンまたはロイシンに置換したペプチドも好適に使用することができる。更に、ペプチドのＮ末端及び／またはＣ末端に１〜２個のアミノ酸が付加していても良い。
しかしながら、ペプチドの配列が他の機能を有する内在性または外来性のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一となる場合には、自己免疫疾患等の副作用が生じたり、あるいは特定の物質に対するアレルギー症状を引き起こしたりする可能性があるため、利用可能なデータベースを用いてホモロジー検索を行い、他のタンパク質のアミノ酸配列と一致することを避けるのが好ましい。更に、ホモロジー検索において、アミノ酸が１個または２個異なるペプチドも存在しないことが明らかであれば、ＨＬＡ抗原との結合親和性及び／またはＣＴＬ誘導能を高めるための上記アミノ酸配列の改変もこのような問題を生じるおそれがない。
上記のようにしてＨＬＡ抗原との結合親和性の高いペプチドは、癌ワクチンとして有効である可能性が高いことが予想されるが、高い結合親和性を有することを指標として選択した候補ペプチドについて、実際にＣＴＬ誘導能を有するか否かを検討することが必要である。ＣＴＬ誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を有する抗原提示細胞（例えばＢ−リンパ球、マクロファージ、樹状細胞）、具体的にはヒト末梢血単核球由来の樹状細胞を誘導し、ペプチドで刺激した後にＣＤ８陽性細胞と混合し、標的細胞に対する細胞傷害活性を測定する。反応系として、ヒトＨＬＡ抗原を発現するように作製されたトランスジェニック動物（例えば、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ａｕｇ．；６１（８）：７６４−７９  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｂｏｏｋｓ，Ｌｉｎｋｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ＨＬＡ  Ａ＊０２０１／ＤＲ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ（Ｈ）ｒｅｓｐｏｎｓｅ．，ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ．，Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ．，Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ．，Ａｕｇｅ  Ｃ．，Ｌｏｗ  Ｌ．，Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ．，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ．に記載のもの）を用いることもできる。細胞傷害活性は、例えば標的細胞を５１Ｃｒ等で放射標識し、標的細胞から遊離した放射活性から計算することができる。あるいはまた、ペプチドを拘束した抗原提示細胞の存在下でＣＴＬが産生・放出したＩＦＮ−γ及び抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体によって培地上に可視化される阻止円を測定することによって観察することもできる。
上記のようにしてペプチドのＣＴＬ誘導能を検討した結果、ＨＬＡ抗原との結合親和性が高いものが必ずしも誘導能が高いわけではないことが明らかとなった。そして、ＶＹＳＳＥＥＡＥＬ（配列番号２）、ＧＹＲＩＹＤＶＶＬ（配列番号３）、ＳＹＭＩＳＹＡＧＭ（配列番号５）、ＲＦＶＰＤＧＮＲＩ（配列番号８）、ＫＷＥＦＰＲＤＲＬ（配列番号１１）、またはＤＦＬＴＬＥＨＬＩ（配列番号１２）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチド、及びＡＭＦＦＷＬＬＬＶ（配列番号２９）、ＶＩＡＭＦＦＷＬＬ（配列番号３０）、ＡＶＩＡＭＦＦＷＬ（配列番号３３）、ＫＬＩＥＩＧＶＱＴ（配列番号３４）、ＹＭＩＳＹＡＧＭＶ（配列番号４０）またはＩＱＳＤＶＷＳＦＧＶ（配列番号４６）に示すアミノ酸配列からなるペプチドから選ばれるノナペプチドまたはデカペプチドが特に高いＣＴＬ誘導能を有することが明らかとなった。
本発明は更に、配列番号２、３、５、８、１１または１２に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２、３、５、８、１１または１２に示す９個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。
本発明はまた、配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示すアミノ酸配列において１個、２個または数個のアミノ酸が置換または付加されており、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導能を有するペプチドも提供する。配列番号２９、３０、３３、３４、４０、または４６に示す９個または１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列に基づいて、１個、２個または数個のアミノ酸の置換または付加は、他のタンパク質のアミノ酸配列との一致がない限りにおいて、ＣＴＬ誘導能を有し得る。特に、アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシンまたはメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリンまたはロイシンへの置換、アミノ酸の付加として、Ｎ末端及び／またはＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加は好適な例である。こうした改変ペプチドの例として、限定するものではないが、例えば配列番号３０のペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチド（配列番号５４）が挙げられる。これらの改変ペプチドによる刺激によって得られるＣＴＬクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができる。
上記の本発明のペプチドは、１種または２種以上の組み合わせとして、生体内でＣＴＬを誘導し得る癌ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドの投与により、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に該ペプチドが高密度に提示され、提示されたペプチドとＨＬＡ抗原との複合体に対して特異的に反応するＣＴＬが誘導され、標的細胞となるべき腫瘍細胞内の血管内皮細胞に対する攻撃力が高まる。あるいは、被験者から樹状細胞を取り出して本発明のペプチドで刺激することにより、細胞表面に本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が得られ、これを再度被験者に投与することで被験者においてＣＴＬを誘導し、標的細胞に対する攻撃力を高めることができる。
すなわち、本発明は、本発明のペプチドを１種以上含む、腫瘍の治療または腫瘍の増殖・転移等の予防のための医薬を提供するものである。更に、病態部位における血管新生は、腫瘍の他、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬癖、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：２７−３１（１９９５）；Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，Ｒ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：６０−６５（１９９６））。従って、本発明のペプチドは、腫瘍、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症のような疾患、並びに固形癌の転移の治療に用いることができる。
本発明のペプチドは、悪性腫瘍組織において形成され、正常な血管とは形態学的に異なる蛇行性血管の形成を阻害することが確かめられたが、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した結果、正常な生理的血管新生に対しては悪影響を有さないことも確認した。更に、本発明のペプチドを認識するＣＴＬクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示すことも明らかとなった。すなわち、増殖性内皮細胞が観察される疾患、特に癌において非常に特異的に作用することができる。
尚、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本発明のペプチドによる樹状細胞の刺激は、細胞に対して高濃度のペプチドを存在させることによって、該細胞に予め拘束されているペプチドとの交換が生じ、容易に行われる。このため、本発明において使用されるペプチドは、ＨＬＡ抗原との結合親和性がある程度以上高いことが必要とされる。
本発明の医薬は、本発明のペプチドを単独で直接投与しても良いが、通常用いられる製剤学的方法によって製剤化した医薬組成物として投与しても良い。その場合、本発明のペプチドの他に、通常医薬に用いられる担体、賦形剤等を適宜含むことができ、特に限定されるものではない。本発明の医薬の用途としては、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍等の種々の腫瘍の治療及び予防に用いることができる。本発明のペプチドは、腫瘍細胞そのものではなく、腫瘍組織内に新たに形成される新生血管の内皮細胞を標的とするものであり、従って、治療対象の腫瘍は広範囲にわたり、特に用途を限定するものではない。
本発明のペプチドを有効成分とする腫瘍の治療及び／または予防のための医薬は、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントと共に投与したり、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与したり、また粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能である。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。投与方法としては、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射などが利用でき、全身投与、あるいは目的となる腫瘍の近傍に局所投与しても良い。本発明のペプチドの投与量は、治療すべき疾患、患者の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができるが、通常０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。当業者であれば、適当な投与量を適宜選択することが可能である。
あるいはまた、本発明は、本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を表面に提示している、エキソソームと呼ばれる細胞内小胞を提供する。エキソソームの調製は、例えば特表平１１−５１０５０７号、及び特表２０００−５１２１６１号に詳細に記載されている方法を用いて行うことができるが、好ましくは治療及び／または予防の対象となる被験者から得た抗原提示細胞を用いて調製する。本発明のエキソソームは、上記本発明のペプチドと同様に癌ワクチンとして接種することができる。
ＨＬＡ抗原としては、治療及び／または予防を必要とする被験者のＨＬＡ抗原と同じ型のものであることが必要である。例えば、日本人の場合にはＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２、特にＨＬＡ−Ａ２４０２またはＨＬＡ−０２０１とすると好適であることが多い。
本発明はまた、本発明のペプチドを用いた抗原提示細胞の誘導方法も提供する。樹状細胞を末梢血単球から誘導した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、抗原提示細胞を誘導することができる。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内で本発明のペプチドを拘束した抗原提示細胞が誘導される。あるいは、抗原提示細胞に本発明のペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで拘束させた後に被験者にワクチンとして投与することもできる。
本発明はまた、上記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞に導入することを含む、細胞傷害性Ｔ細胞誘導能の高い抗原提示細胞を誘導する方法を提供する。導入する遺伝子はＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。導入の方法は当分野において通常行われるリポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法等の種々の方法を用いれば良く、特に限定するものではない。具体的には、例えばＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：５６７２，１９９６；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：５６０７，１９９８；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：４６５，１９９６；特表２０００−５０９２８１号に記載のようにして行うことができる。遺伝子を抗原提示細胞に導入することによって、該遺伝子は細胞中で転写、翻訳等の処理の後、得られたタンパク質がＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩのプロセッシング及び提示経路を経て、部分ペプチドが提示される。
本発明は更に、上記本発明のペプチドを用いてＣＴＬを誘導する方法を提供する。本発明のペプチドを被験者に投与した場合、被験者の体内でＣＴＬが誘導され、腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞を標的とした免疫力が増強される。あるいは、被験者由来の抗原提示細胞及びＣＤ８陽性細胞、または末梢血単核球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のペプチドと接触（刺激）させ、ＣＴＬを誘導してから被験者にもどすｅｘ  ｖｉｖｏの治療方法にも用いることができる。
本発明は更に、本発明のペプチドを用いて誘導される、単離された細胞傷害性Ｔ細胞を提供する。本発明のペプチドを提示した抗原提示細胞による刺激に基づいて誘導された細胞傷害性Ｔ細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキソソーム等を含む、他の医薬と共に抗腫瘍効果を目的として投与することができる。得られた細胞傷害性Ｔ細胞は、本発明のペプチド、好ましくは誘導に用いられたものと同じペプチドを提示する標的細胞に対して特異的に作用する。標的細胞は、ＫＤＲを内在的に発現する細胞であっても、強制的にＫＤＲを発現させた細胞であっても良く、また、本発明のペプチドの刺激によって細胞表面に該ペプチドを提示する細胞であっても攻撃の対象となり得る。
本発明は更に、ＨＬＡ抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示してなる抗原提示細胞を提供する。本発明のペプチド、あるいは本発明のペプチドをコードするヌクレオチドとの接触によって得られる該抗原提示細胞は、好ましくは治療及び／または予防の対象である被験者由来のものであり、単独、または、本発明のペプチド、エキンソーム、細胞傷害性Ｔ細胞等を含む、他の医薬と共にワクチンとして投与することができる。
【実施例】  以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）由来ペプチドの予測−１（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２）
ＫＤＲタンパク質の全アミノ酸配列から、ＢｉｏＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ）により、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２に対する結合親和性の高いものから順に９量体のペプチドを１２種（配列番号１〜１２）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号１３〜２４）予測した（表１）。表１には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のＫＤＲタンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のＣＥ６５２（配列番号２５）はＮｕｋａｙａ  Ｉ．によって報告されている腫瘍抗原ＣＥＡ（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８０，１９９９）。また、陰性対照ペプチドとしてＨＩＶペプチド（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号５５）及びＲＹＬＲＤＱＱＬＬ（配列番号５６））を用いた。
ペプチドは、標準的な固相合成法に従ってＣｌｅａｖｅｄ  ＰｅｐＳｅｔ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＬＡ）で合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ及び質量分析によって、ペプチドの純度（＞９５％）及び種類をそれぞれ決定した。
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［実施例２］  予測したペプチドを用いたＣＴＬ  ｌｉｎｅの樹立
Ｅｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒ  ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞株であるＴＩＳＩ（ＨＬＡ−Ａ２４／２４）とＥＨＭ（ＨＬＡ−Ａ３／３）は宝酒造バイオ研究所より供与された。
健常人の末梢血７ｍｌを採取し、ＨＬＡのｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇを行った。ＨＬＡ−Ａ２４陽性の末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた比重遠沈法にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。
得られたＰＢＭＣを培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，４３０７２）にて１０時間静置し、浮遊細胞を除去した後にＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に２％自己血清を添加した培養液にヒトＧＭ−ＣＳＦ（キリンビールより供与）１，０００Ｕ／ｍｌ、ヒトＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ）１，０００Ｕ／ｍｌを添加しフラスコに付着した細胞を培養した。５日後にＯＫ−４３２（中外製薬より供与）１０μｇ／ｍｌにて４８時間培養し、ＣＴＬの誘導のための抗原提示細胞として使用した。樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ，ＤＣ）はＦＩＴＣラベルした抗ＣｌａｓｓＩＩ，ＣＤ８０，ＣＤ８６抗体及び、ＰＥラベルした抗ＣｌａｓｓＩ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ４０（いずれもＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ８３（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）抗体を反応させてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用したＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて表面抗原の解析を行い、ＤＣであることを確認した。
あらかじめ誘導しておいたＤＣに、実施例１で結合親和性が高いとして予測された９量体のペプチド１２種類（配列番号１〜１２）（２０μｇ／ｍｌ）を３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０℃、４時間パルスし、その後ＤＣをＰＢＭＣから磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−４５０とＤｅｔａｃｈａｂｅｄｓ）にて選択されたＣＤ８陽性細胞に対して１：２０または１：２の比で、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−７（Ｇｅｎｚｙｍｅ）存在下で４８  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて混合培養を行った。３日後に最終１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（ＳＩＧＭＡ）を加えた。７日後、１４日後に同様のＤＣにて刺激を加えてＣＴＬ誘導を行い、２０日後にペプチドをパルスしたＴＩＳＩ細胞を標的として各ｗｅｌｌの細胞傷害活性を測定し、陽性ｗｅｌｌのみをアロのＰＢＭＣ、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞株（ＥＨＭ）及び抗ＣＤ３抗体３０ｎｇ／ｍｌにて刺激する方法で培養し、その１４日後にＣＴＬの機能解析を行った。
細胞傷害活性は４時間５１Ｃｒ遊離法にて測定した。ペプチドをパルスする標的細胞は２０μｇ／ｍｌの濃度にて一晩パルスを行った。標的細胞を１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４にて３７℃、１時間ラベルした後ＲＰＭＩ１６４０にて３回洗浄し、９６穴Ｕ型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に標的細胞（１×１０４／１００μｌ）と種々の濃度の効果細胞を１００μｌ加え、総量２００μｌとして４時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌより上清を１００μｌ採取し、γカウンターにて測定した。自然解離は標的細胞と培地で、最大解離は標的細胞と１Ｍ  ＨＣＬで得られる放射活性とした。細胞傷害活性（特異的溶解のパーセンテージ）は次式により算出した。
細胞傷害活性（％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
＝（実験解離−自然解離）／（最大解離−自然解離）×１００
その結果、表２に示すように６種類のＣＴＬ  ｌｉｎｅが樹立でき、配列番号２（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１３１８）、配列番号３（ＫＤＲ２２０）、配列番号５（ＫＤＲ１８９）、配列番号８（ＫＤＲ１６９）、配列番号１１（ＫＤＲ８２６）、及び配列番号１２（ＫＤＲ９９８）に示すノナペプチドがエピトープペプチドとして特に有効であることが示された。
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［実施例３］  予測したペプチドから誘導されるＣＴＬクローンの樹立
実施例２において樹立した６種類のＣＴＬ  ｌｉｎｅを９６穴Ｕ型プレートに０．３、１、または３  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように希釈した。そこにアロのＰＢＭＣ  ７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，ＥＨＭ  １×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，抗ＣＤ３抗体  ３０ｎｇ／ｍｌ，ＩＬ−２  １２５Ｕ／ｍｌとなるようにして、ＡＩＭ−Ｖに５％自己血清を添加して合計１５０μｌ／ｗｅｌｌになるようにした。１０日後にＩＬ−２が最終濃度１２５Ｕ／ｍｌになるように調節したＩＬ−２添加ｍｅｄｉｕｍを５０μｌ／ｗｅｌｌにて加えた。１４日目にＣＴＬの機能解析を行い、活性のあるものを大量培養した。
その結果、配列番号８（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）、配列番号５（ＫＤＲ１８９）、配列番号３（ＫＤＲ２２０）、配列番号２（ＫＤＲ１３１８）、及び配列番号１１（ＫＤＲ８２６）の５種のノナペプチドよりそれぞれ８種類（Ｃ１３−１６９、Ｃ１９−１６９、Ｃ２９−１６９、Ｃ５３−１６９、Ｃ７２−１６９、Ｃ６１−１６９、Ｋ５−１６９及びＫ２５−１６９）、２種類（Ｃ１２−１８９及びＣ１８−１８９）、１１種類（ＫＷＣ３、２３、２５、２６、３６、４２、４６、５８、６１、７０及び７７）、１種類（Ｃ７−１３１８）、１種類（Ｃ６５−８２６）のＣＴＬクローンを樹立した（表３）。
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［実施例４］  樹立したＣＴＬクローンの細胞傷害活性の測定
実施例３において樹立した１０種類のＣＴＬクローンの細胞傷害活性の強度を、標的細胞との比率（Ｅ：Ｔ比）を変化させて検討した（図１）。
その結果、配列番号８のノナペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）から誘導されたＣ５３−１６９が最も強力な細胞傷害活性を示した。
［実施例５］  樹立したＣＴＬクローンのＨＬＡ−テトラマー解析
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２と配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）でＨＬＡ−テトラマーを合成した。すなわち、Ｈ鎖（約３５ｋＤａ）とＬ鎖（約１１ｋＤａ）を発現するプラスミドベクターをそれぞれ作製し、大腸菌を用いてこれらの組換えタンパク質を発現させた。Ｈ鎖のプラスミドベクターは細胞外ドメインのみで構成され、カルボキシル末端側はビオチン化酵素認識配列に置換してある。Ｈ鎖およびＬ鎖は抗原ペプチドと共にリフォールディングすることにより、ＨＬＡペプチド複合体を形成する。ＨＬＡペプチド複合体をビオチン化酵素によりビオチン化し，ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより過剰のビオチンを除去し，ビオチン化ＨＬＡペプチド複合体を分離精製した。得られたビオチン化ＨＬＡペプチド複合体をストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；ＳＡ）と４：１のモル比で反応させて四量体化し、ＨＬＡ−テトラマーを合成した。試料を解析する場合には，フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）で蛍光標識したＳＡ（ＳＡ−ＰＥ）を使用し四量体化した。ＣＤ８分子はＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃの一部を除き，α３ドメインの２４５番目の一アミノ酸であるアラニンに結合することが解っており、そこでアラニンをバリンへ置換した変異導入ＨＬＡ−テトラマーを作製することで，ＣＤ８分子とα３ドメインの結合に依存しないＨＬＡペプチド複合体に対し高いａｖｉｄｉｔｙをもつＣＴＬを選択的に検出することが可能である変異導入ＨＬＡ−テトラマーを合成した。
合成した変異型ＨＬＡ−Ａ２４  ＫＤＲ１６９−テトラマーにより、樹立したＣＴＬクローンを検出した。その結果、図２に示すように、樹立したＣＴＬクローンはテトラマー陽性かつＣＤ８陽性のフラクションに強く染色するＣＴＬであり、本発明のペプチド及びＨＬＡ抗原の複合体を特異的に認識するものであることが明らかになった。尚、テトラマー陰性かつＣＤ８陰性のフラクションのシグナルはフィーダー細胞によるものである。
［実施例６］  ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）由来ペプチドの予測−２（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）
実施例１と同様にして、ＫＤＲタンパク質の全アミノ酸配列から、ＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｋｅｎ＿ｐａｒｋｅｒ＿ｃｏｍｂｏｆｏｒｍ）によりＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する結合親和性の高いものから順に、９量体のペプチドを１５種（配列番号２６〜４０）、１０量体のペプチドを１２種（配列番号４１〜５２）予測した（表４）。表４には、９量体及び１０量体のそれぞれについて結合親和性の高い順に、そのＮ末端のＫＤＲタンパク質のアミノ酸配列における位置と共に挙げた。尚、表中のＣＥＡ５８８（配列番号５３）はＴａｎａｋａ，Ｈ．らによって報告されている腫瘍抗原ＣＥＡ（癌胎児性抗原）のエピトープの一つである（ポスター発表、ＡＡＣＲ＃３６６９，ｖｏｌ．４２，ｐ６８１−６８２，Ｍａｒｃｈ２００１）。
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［実施例７］  ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープペプチドの決定
実施例６において予測された９量体または１０量体のベプチド１６種類（配列番号２６〜４１）を、ヒトＨＬＡ（Ａ０２０１）を発現するトランスジェニックマウス（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ａｕｇ．；６１（８）：７６４−７９  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｂｏｏｋｓ，Ｌｉｎｋｏｕｔ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＴＬ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ＨＬＡＡ＊０２０１／ＤＲ１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ（Ｈ）ｒｅｓｐｏｎｓｅ．，ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ  Ｌ．，  Ｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｒ．，Ｌｏｎｇｍａｔｅ  Ｊ．，Ａｕｇｅ  Ｃ．，Ｌｏｗ  Ｌ．，Ｐｒｉｍｕｓ  Ｊ．，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＤＪ．に記載）を用い、ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ法にてＣＴＬの誘導を行った。
６−８週令ＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスは日本クレア株式会社から手に入れた。Ａ２／Ｋｂ  トランスジェニックマウス（ＴＧＭ）はＦ  Ｊｉｍ  Ｐｒｉｍｕｓ  Ｐｈ．Ｄ．Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ−Ｉｎｇｒａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒより供与された。またＴ２細胞（ＴＡＰ欠損細胞、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性）は三重大学第三内科珠玖洋教授より供与された。
マウス大腿骨、脛骨より骨髄を採取し、抗ＣＤ４，ＣＤ８，Ｇｒ−１（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｂ２２０（バイオサイエンス）抗体、及びウサギ補体（ＰｅＬ−Ｆｒｅｅｚ）にてリンパ球及び顆粒球を除去した。細胞は６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにて培養し、翌日浮遊細胞を回収して別の６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１０％ＰＢＳを加えた培溶液にマウスＧＭ−ＣＳＦ（キリンビールより供与）１，０００Ｕ／ｍｌ，マウスＩＬ−４（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ）１，０００Ｕ／ｍｌを添加し培養した。その３日後に上記培養液にてｈａｌｆ  ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｎｇｅを行い、その２日後にＯＫ−４３２  １０μｇ／ｍｌにて２０時間培養し、浮遊細胞をＤＣとして使用した。ＤＣはＦＩＴＣラベルした抗ＣｌａｓｓＩＩ，ＣＤ４０抗体及び、ＰＥラベルした抗ＣｌａｓｓＩ，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ８０，ＣＤ８６（いずれもＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）抗体を反応させてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用したＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて表面抗原の解析を行い、ＤＣであることを確認した。
次いで、各ペプチド１００μｇ、ＨｂｃＡｇ１２０−１４０  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １４０μｇ、ＩＦＡ  １００μｌを混和（計２００μｌ）し、ｄａｙ  ０に右側腹部にｄａｙ１１に左側腹部に皮下摂取した。Ｄａｙ  ２１にワクチン接種したマウスの脾臓を採取し、赤血球をｒｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｓｉｇｍａ）にて溶血除去し、その細胞の一部をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙのｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌとして使用した。また、残りの細胞は２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにてフィーダー細胞と３：１の比率にて再刺激を加え、５日後に細胞傷害活性を測定した。フィーダー細胞は同種別マウスの赤血球を除去した脾細胞をｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）２５μｇ／ｍｌ存在下で３日間培養したものを使用した。
本実施例においては、ＣＴＬの誘導能をＩＦＮ−γを産生する細胞が作るＳＰＯＴで評価するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いた。９６穴平坦底マルチスクリーンプレートＭＡＨＡＳ４５（ミリポア）を４℃、一晩抗マウスＩＦＮ−γ単クローン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）にて処理し、翌日０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含んだＰＢＳにて洗浄し、室温で２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒと反応させた。その後、ペプチドをパルスしたＴ２細胞とパルスしていないＴ２細胞を各ｗｅｌｌに１０５ｃｅｌｌ／１００μｌずつ散布した。そこに、ワクチンしたマウスの碑細胞を最大４×１０６ｃｅｌｌ／１００μｌ散布して、全２００μｌとして一晩３７℃で培養した。翌日、各ｗｅｌｌを洗浄後、ビオチン化したラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と２時間反応させ、十分に洗浄し、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎを加えて２時間室温で反応させた。プレートを洗浄後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を加えて５分間室温で放置し、ＩＦＮ−γの産生による青色班をＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｒｅｌｅａｓｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）にて計測した。そして
特異的青色班＝（ＴＩＳＩ（＋）ＳＰＯＴ−ＴＩＳＩ（−）ＳＰＯＴ）
で決定し、
ＴＩＳＩ（＋）ＳＰＯＴ／ＴＩＳＩ（−）ＳＰＯＴ≧２を満たしたものを有効とした。
その結果、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて５種類のエピトープペプチド、配列番号２９（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７５）、配列番号３０（ＫＤＲ７７３）、配列番号３３（ＫＤＲ７７２）、配列番号３４（ＫＤＲ１３２８）及び配列番号４０（ＫＤＲ１９０）を得た（表５）。
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［実施例８］  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果の確認１
ヒトＨＬＡ−Ａ２４０２とアンカーモチーフが同じである６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．）の骨髄を採取し、実施例７と同様にＧＭ−ＣＳＦ（キリンビール）（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号５のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１８９）をパルスしたもの（１×１０６／マウス）をＢＡＬＢ／ｃマウス９匹に７日間隔で２回右下腹部に投与し、その７日後に結腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６（大鵬薬品株式会社）（５×１０５個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
まず、ＫＤＲの発現をＲＴ−ＰＣＲで確認したところ、図３に示すように、Ｃｏｌｏｎ２６細胞系単独ではＫＤＲを発現していないが、Ｃｏｌｏｎ２６を接種したマウスの腫瘍組織からＫＤＲの発現が確認できた。すなわち、腫瘍血管が腫瘍組識に出現し、腫瘍を形成していることが確かめられた。
図３にＣｏｌｏｎ２６を接種されたマウスの生存曲線を示す。対照であるＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）のみ（１００μｌ）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、９匹中２匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では９匹中５匹の生存であったが、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全９匹が生存していた。
図４にマウスにおけるＣｏｌｏｎ２６由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号５のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
［実施例９］  本発明のペプチドのホモロジー検索
本発明のペプチド（配列番号２（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１３１８）、配列番号３（ＫＤＲ２２０）、配列番号５（ＫＤＲ１８９）、配列番号８（ＫＤＲ１６９）、配列番号１１（ＫＤＲ８２６）、配列番号３０（ＫＤＲ７７３）、及び配列番号４０（ＫＤＲ１９０））のホモロジー検索をＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）にて行った結果、いずれのペプチドにおいても配列が完全に一致したものは認められなかった（表６）。実施例４において強いＣＴＬ活性を誘導できた配列番号８の９量体ペプチド（ＫＤＲ１６９）に関しては、２個のミスマッチ配列が１つ（７７．８％  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、３個のミスマッチ配列が２つ（６６．７％ｈｏｍｏｌｏｇｙ）あるのみであった。実施例８においてｉｎ  ｖｉｖｏにおける顕著な抗腫瘍効果が認められたペプチド配列番号５のペプチド（ＫＤＲ  １８９）に関しては、３個のミスマッチ配列が１つ（６６．７％  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）あるのみであった。
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［実施例１０］  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果の確認２
ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１を発現する６〜８週齢の雄Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウス（ＴＧＭ）の骨髄を採取し、実施例８と同様にＧＭ−ＣＳＦ（キリンビール）（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して培養して、樹状細胞を調製した。この樹状細胞に配列番号３０（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７３）のペプチドをパルスしたもの（１×１０６／マウス）をＡ２／Ｋｂトランスジェニックマウス１２匹に７日間隔で２回左下腹部に投与し、その７日後にＢ１６メラノーマ細胞（ＡＴＣＣ）（１×１０６個）を右腹部に接種し、マウスの生存と腫瘍増殖を検討した。
図５にＢ１６を接種されたマウスの生存率を示す。対照であるＨＢＳＳのみ（１００μｌ）の投与の場合、腫瘍接種から３５日後において、１２匹中８匹の生存、ペプチドをパルスしない樹状細胞の接種では１２匹中１１匹の生存であったが、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の接種の場合には全１２匹が生存していた。
図６にマウスにおけるＢ１６マウス由来の腫瘍の増殖に対する効果を示す。対照と比較して、樹状細胞を接種した場合に腫瘍増殖に対する抑制効果が認められ、配列番号３０のペプチドでパルスした樹状細胞の場合に顕著な抑制効果が認められた。
［実施例１１］  ＫＤＲを強制発現させた細胞に対する細胞障害活性
Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，１３２０−１３２４（１９９６）に記載の方法に従い、ＨＬＡ−Ａ２４陽性であるヒト大腸癌ＨＴ２９株（ＡＴＣＣ）にアデノウイルスを用いてＫＤＲ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｏｃｔ  ２８；２６９（４３）：２６９８８−９５参照）を強制発現した。具体的には、ヒト２９３細胞のプラークアッセイによって決定した力価に基いて、細胞を特定の多重度で感染させた。ＨＴ２９細胞を６０ｍｍのディッシュ中に１０５個の細胞密度で接種し、２４時間インキュベートした。次の日、培地を捨て、新しい培地で連続希釈したウイルス２００μｌと交換した。３７℃で１時間インキュベーションした後、増殖培地を添加し、細胞を４８時間培養して標的細胞として使用した。対照としてＥＧＦＰ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９９９  Ａｐｒ；１３（４）：６０５−１３参照）をアデノウイルスにて強制発現したＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＴ２９株を用いた。ＫＤＲとＥＧＦＰを強制発現したＨＴ２９株は、細胞表面に各々その部分ペプチドを提示している可能性がある。
ＨＬＡ−Ａ２４に結合する配列番号８のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）から誘導された実施例３に記載のＣＴＬクローンＣ２９−１６９を用い、ＫＤＲ強制発現ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＴ２９細胞に対する殺細胞効果をクロムリリースアッセイにて測定した。結果を図７に示す。
細胞障害活性は４時間５１Ｃｒ遊離法にて測定した。標的細胞は６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にて２４時間培養し、ＫＤＲ又はＥＧＦＰを導入したアデノウイルス（Ａｄ−ＫＤＲ又はＡｄ−ＥＧＦＰ）をＭＯＩ  ５０にて感染させ、４８時間後に使用した。標的細胞を１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４にて３７℃、１時間ラベルした後、ＲＰＭＩ１６４０にて３回洗浄し、９６穴Ｕ型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に標的細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）と種々の濃度の効果細胞を１００μｌ加え、総量２００μｌとして４時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌより上清を１００μｌ採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
その結果、図７に示すように、ＣＴＬクローンＣ２９−１６９は、ＫＤＲを強制発現したＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＴ２９に対し、ＥＧＦＰを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
［実施例１２］  内因的にＫＤＲを発現している細胞に対する細胞障害活性
ＫＤＲを内因的に発現しているＨＬＡ−Ａ２４陽性ヒト臍帯血管内皮細胞由来ＨＵＶＥＣ  ＫＴ５株に対する実施例３に記載のＣＴＬクローンＣ２９−１６９の殺細胞効果について、ＫＤＲ陽性、ＨＬＡ−Ａ２４陰性ＨＵＶＥＣ株Ｐ８を対照として検討した。これらの細胞はＫＤＲの部分ペプチドを細胞表面に提示する。
細胞障害活性は４時間５１Ｃｒ遊離法にて測定した。標的細胞を１００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４にて３７℃、１時間ラベルした後ＲＰＭＩ１６４０にて３回洗浄し、９６穴Ｕ型マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に標的細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ）と種々の濃度の効果細胞を１００μｌ加え、総量２００μｌとして４時間、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌより上清を１００μｌ採取し、γカウンターにて測定し、実施例２と同様にして細胞障害活性を算出した。
図８の結果から明らかなように、ＣＴＬクローンＣ２９−１６９は、内在的にＫＤＲを発現しているＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＵＶＥＣに対して殺細胞効果を示し、ＨＬＡ−Ａ２４陰性ＨＵＶＥＣに対しては低い殺細胞効果を示した。
［実施例１３］  ＨＬＡ−Ａ０２０１結合性ペプチドを用いたＣＴＬクローンの樹立
実施例７のＥＬＩＳＰＯＴ解析において有効とされたＨＬＡ−Ａ０２０１に結合する配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１９０）、配列番号３０のペプチド（ＫＤＲ７７３）のＮ末端から２番目のアミノ酸をロイシンに変換したペプチドＫＤＲ７７３−２Ｌ（配列番号５４）、配列番号２９のペプチド（ＫＤＲ７７５）、配列番号３４のペプチド（ＫＤＲ１３２８）、及び配列番号３３（ＫＤＲ７７２）を用いて、実施例３と同様にして、それぞれ２種類（ＫＷＣ１４−１９０、ＫＷＣ６５−１９０）、４種類（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ、ＫＷＣ７６−７７３−２Ｌ、ＫＷＣ１２９−７７３−２Ｌ、ＫＷＣ１３４−７７３−２Ｌ）、２種類（ＫＷＣ８１−７７５、ＫＷＣ８５−７７５）、１２種類（ＫＷＣ１６、ＫＷＣ２１、ＫＷＣ２２、ＫＷＣ４７、ＫＷＣ５１、ＫＷＣ１０８、ＫＷＣ１１７、ＫＷＣ１３２、ＫＷＣ１５１、ＫＷＣ１５３、ＫＷＣ１５６、ＫＷＣ１５９）、１種類（ＫＷＣ７２−７７２）のＣＴＬクローンを得た。それぞれの細胞傷害活性を表７に示す。
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表７の結果から明らかなように、配列番号２９、３３、３４、または４０に示すペプチド、及び配列番号３０に示すペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシンである配列番号５４に示すペプチドのいずれも、顕著な細胞傷害活性を有するＣＴＬを誘導することができ、エピトープペプチドとして有効であることが示された。
【実施例１４】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号２９のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７５）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号２９のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図９に示すように、ＣＴＬクローンＣ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５）は、配列番号２９のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１腸性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号２９のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【実施例１５】  ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２に対するＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてＥＧＦＰを強制発現させたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２を用いた。
その結果、図１０に示すように、ＣＴＬクローンＣ８５−７７５（ＫＷＣ８５−７７５）は、ＫＤＲペプチドを表面に提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対し、ＥＧＦＰペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【実施例１６】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号３４のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１３２８）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図１１に示すように、ＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１）は、配列番号３４のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３４のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【実施例１７】  ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２に対するＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてＥＧＦＰを強制発現させたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２を用いた。
その結果、図１２に示すように、ＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１）は、ＫＤＲペプチドを表面に提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対し、ＥＧＦＰペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【実施例１８】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号３０の２番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４のペプチド（ＫＤＲ７７３−２Ｌ）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３４のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。結果を図１３に示す。
その結果、図１３に示すように、ＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ）は、ＫＤＲ７７３−２Ｌを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、ＫＤＲ７７３−２Ｌを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【実施例１９】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号３０の２番目のペプチドをロイシンに変換した配列番号５４に示すペプチド（ＫＤＲ７７３−２Ｌ）より得られたＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ））のクロムリリースアッセイでの殺細胞効果を、標的細胞としてＴ２に改変していない配列番号３０に示すペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７３）をパルスしたもので検討した。
その結果、図１４に示すように、改変したペプチドで刺激し、得られたＣＴＬクローンは改変前のペプチドを認識し、傷害することができた。
【実施例２０】  ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２に対するＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ））の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてＥＧＦＰを強制発現させたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２を用いた。
その結果、図１５に示すように、ＣＴＬクローンＫＤＲ  Ｃ４４−７７３−２Ｌ（ＫＷＣ４４−７７３−２Ｌ）は、ＫＤＲペプチドを表面に提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対し、ＥＧＦＰベプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【実施例２１】  ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２に対する配列番号３４のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＤＲ  Ｃ５１−１３２８（ＫＷＣ５１））の殺細胞効果が各種抗体でブロックされるかどうかについて検討した。
その結果、図１６に示すように、標的細胞が提示するＨＬＡ抗原に対する抗ＨＬＡＣｌａｓｓＩ抗体と、細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーとなるＣＤ８に対する抗ＣＤ８抗体がその作用を阻害した。
［実施例２２］  Ｄｏｒｓａｌ  Ａｉｒ  Ｓａｃ  ａｓｓａｙ（ＤＡＳ）による血管新生阻害活性の検討
ペプチドエピトープの実際の血管新生阻害活性をマウスでＤＡＳアッセイ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．５，２１８５−２１９１，Ａｕｇｕｓｔ  １９９９；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，６１１６−６１２３，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １，２００２参照）にて評価した。
チャンバーリングの両面にメンブレンフィルターを固定し、エチレンオキサイトガスで滅菌した。Ｂ１６メラノーマ細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／０．１５ｍｌに調整し、チャンバー内に注入した。マウス（Ａ２／ｋｂトランスジェニックマウス（Ｂ１６由来））を腹臥位として固定し、マウス背部皮下にシリンジにて５〜１０ｍｌの空気を注入しａｉｒ  ｓａｃを作製した。Ｓａｃ下部を約１ｃｍ切開し、細胞浮遊液で満たされたチャンバーリングを背部皮下に移植し、皮膚をスキンステープラで閉じた。移植日より６日目にマウス皮膚をチャンバーごと剥皮し、伸展させた状態で固定した。黒色ゴムリングでマーキングし、実態顕微鏡を用いて新生血管を計測した。悪性腫瘍細胞から放出される血管新生因子によって新たに形成される血管は、ジグザグに進行する特徴があり、本来存在するバックグラウンドの血管とは形態学的に異なっている。従って、新生血管の判定はゴムリング内の蛇行走行を示す血管で、長さが３ｍｍ以上のものとし、血管新生指数（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｄｅｘ（ＡＩ））としてカウントした。ＡＩは蛇行血管数に応じて０〜５までの６段階で評価し、蛇行血管が５本以上のものはすべて５とした。
ワクチン接種はチャンバー移植の１４日前にＨＢＳＳ、ＤＣ単独、ＤＣにペプチドパルスしたものをそれぞれ５×１０４ｃｅｌｌｓ尾静脈に注入し、それを１週間後に再度行い、計２回接種した。結果を図１７及び以下の表８に示す。
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図１７及び表８の結果から明らかなように、ＤＣに配列番号４０に示すペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１９０）、配列番号３３に示すペプチド（ＫＤＲ７７２）、配列番号３０に示すペプチド（ＫＤＲ７７３）、配列番号５４に示すペプチド（ＫＤＲ７７３−２Ｌ）、配列番号２９に示すペプチド（ＫＤＲ７７５）、及び配列番号４６に示すペプチド（ＫＤＲ１０８４）をワクチン接種した群において、ＤＣ単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
尚、これらのエピトープペプチドを用いたワクチン接種による正常な生理的血管新生に対する悪影響を観察するために、ワクチン接種したマウスにおける創傷治癒及び受精能を解析した。しかしながら、ワクチン接種したマウスにおいて有意な悪影響はなかった。更に、ＫＤＲペプチドを認識するＣＴＬクローンを用いて非増殖性または増殖性内皮細胞に対する細胞傷害性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、ヒトにおける悪影響を検討したところ、これらのクローンは非増殖性内皮細胞よりも増殖性内皮細胞に対して強い活性を示した。
【実施例２３】  ヒトＨＬＡ−Ａ０２０１を発現するＡ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて大腸癌株ＭＣ３８移植担癌マウスに対する配列番号３０（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７３）と配列番号３４（ＫＤＲ１０８４）ペプチドを不完全フロイントアジュバントと混合させてそれぞれｄａｙ３，１３に投与した場合の腫瘍体積の変化を示した。
実施例２２と同様のワクチン接種方法でＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープペプチド（ＫＤＲ７７３）による治療モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を腫瘍面積により評価した。その結果、図１８から明らかなように、配列番号３０のペプチド及び配列番号３４のペプチドのワクチン接種により、有意な腫瘍増殖抑制効果が確認できた。
【実施例２４】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号４０のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１９０）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号４０のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＷＣ６５−１９０）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図１９に示すように、ＣＴＬクローンＫＷＣ６５−１９０は、配列番号４０のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号４０のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【実施例２５】  ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性Ｔ２株に配列番号３３のペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ７７２）を加えて標的細胞とし、実施例１３で配列番号３３のペプチドから得られたＣＴＬクローン（ＫＷＣ７２−７７２）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２０に示すように、ＣＴＬクローンＫＷＣ７２−７７２は、配列番号３３のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、配列番号３３のペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く殺細胞効果が見られなかった。
【実施例２６】  ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させた肝細胞癌株ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２に対するＣＴＬクローン（ＫＷＣ７２−７７２）の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてＥＧＦＰを強制発現させたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＨｅＰＧ２を用いた。
その結果、図２１に示すように、ＣＴＬクローンＫＷＣ７２−７７２は、ＫＤＲペプチドを表面に提示したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞に対し、ＥＧＦＰペプチドを提示した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【実施例２７】  ＨＬＡ−Ａ２４陽性であるヒトＢ−リンパ芽球細胞系Ａ２４−ＬＣＬ（ＨＬＡ−Ａ２４／２４、宝酒造製）に配列番号２（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１３１８）、３（ＫＤＲ２２０）、５（ＫＤＲ１８９）、及び１１（アミノ酸開始位置ＫＤＲ８２６）のペプチドを加えて標的細胞とし、実施例３に記載のＣＴＬクローンＣ７−１３１８、ＫＷＣ４６、Ｃ１８−１８９、及びＣ６５−８２６の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。
その結果、図２２〜２５に示すように、ＣＴＬクローンＣ７−１３１８、ＫＷＣ４６、Ｃ１８−１８９、及びＣ６５−８２６は、それぞれ配列番号２、３、５、及び１１のペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞に対して明らかに殺細胞効果を示した。これに対して、各ペプチドを提示しない対照細胞に対しては、全く、またはほとんど殺細胞効果が見られなかった。
【実施例２８】  実施例１１と同様にして、ＫＤＲをアデノウイルスで強制発現させたヒト大腸癌ＨＴ２９株（ＡＴＣＣ）に対する実施例３に記載のＣＴＬクローンＣ７−１３１８、ＫＷＣ４６、Ｃ１８−１８９、及びＣ６５−８２６の殺細胞効果をクロムリリースアッセイを用いて検討した。対照としてＥＧＦＰを強制発現させたＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＴ２９株を用いた。
その結果、図２６〜２９に示すように、ＣＴＬクローンＣ７−１３１８、ＫＷＣ４６、Ｃ１８−１８９、及びＣ６５−８２６は、いずれもＫＤＲを強制発現したＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＴ２９に対し、ＥＧＦＰを強制発現した細胞と比較して顕著に高い殺細胞効果を示した。
【実施例２９】  実施例２２と同様にして、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてｃｏｌｏｎ２６細胞によって誘導される血管新生応答に対するペプチドエピトープの血管新生阻害活性をＤＡＳアッセイにて評価した。
図３０及び３１の結果から明らかなように、ＤＣに配列番号５に示すペプチド（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１８９）及び配列番号１１に示すペプチド（ＫＤＲ８２６）をワクチン接種した群において、ＤＣ単独投与群と比較して、蛇行血管の形成が明らかに抑制され、統計学的有意さをもって血管新生阻害効果があった。
【実施例３０】  癌患者のＰＢＭＣを用いて、各種エピトープペプチド（ＨＬＡ−２４結合親和性の高いペプチドとして配列番号８（アミノ酸開始位置ＫＤＲ１６９）、配列番号５（ＫＤＲ１８９）、配列番号３（ＫＤＲ２２０）、配列番号１１（ＫＤＲ８２６）、及び配列番号１７（ＫＤＲ１３１８）、並びにＨＬＡ−Ａ０２０１結合親和性の高いペプチドとして配列番号４０（ＫＤＲ１９０）、配列番号３３（ＫＤＲ７７２）、配列番号３０（ＫＤＲ７７３）、配列番号２９（ＫＤＲ７７５）、及び配列番号３４（ＫＤＲ１３２８））で刺激した後の各ペプチドに対するＣＴＬ応答を調べた。
Ｍａｅｄａ，Ｙ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７，７９６−８０４（２００２）に報告されている方法を用いてＰＢＭＣ中のペプチド特異的ＣＴＬを検出した。まず、患者から採取したＰＢＭＣ（１×１０５個）を２００μｌの培地を入れたｕ底型の９６ウェルプレートのウェルで各ペプチド１０μＭと共にインキュベートした。培地は４５％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％のＡＩＭ−Ｖ培地、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）、及び０．１μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液から構成される。３日ごとに培地の半分を除去し、対応するペプチド（２０μＭ）を含有する新しい培地と交換した。１２日間のインキュベーション後、細胞を回収して各ペプチドに応答したＩＦＮ−γ産生能を試験した。対応するペプチドに応答してペプチドで刺激したＰＢＭＣによって産生されるＩＦＮ−γの量が対照であるＨＩＶペプチドに応答して産生される量の２倍以上多い場合には陽性と判定した。
その結果、ＨＬＡ−Ａ２及び−Ａ２４の癌患者においても、健康なドナーと同様にＣＴＬ前駆体が産生されることが示された（表９）。表中、患者Ａ、Ｂ及びＣはＨＬＡ−Ａ２４型の患者であり、患者ＤはＨＬＡ−Ａ０２型の患者である。また患者Ａ及び患者Ｄは結腸癌患者、患者Ｂ及び患者Ｃはメラノーマ患者である。尚、ＣＭＶは陽性対照として用いたサイトメガロウイルス由来ペプチドであり、該ペプチドについてはＡ−２４結合親和性の高いものは、例えばＫｕｚｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００１，９８（６）：ｐ１８７２−１８８１に、Ａ−２結合親和性の高いものは、例えばＳｏｌａｃｈｅ  Ａ．ら，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６３（１０）；ｐ５５１２−５５１８にそれぞれ記載されている。
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更に、実施例１４等と同様にして標準的な４時間の５１Ｃｒ遊離法を行い、これらのＣＴＬ前駆体からＣＴＬ系を確立した（図３２）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、広範囲にわたる腫瘍組織に形成される内皮細胞を標的として細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、癌ワクチンとして非常に有効な新規ペプチド、及びこれを含有する腫瘍の治療及び予防のための医薬が提供される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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