(57)【要約】記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤として有用な物質を得るためのスクリーニングツール及びスクリーニング方法、前記スクリーニングに使用することのできるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞、並びに新規の記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤を開示する。前記スクリーニングツールは、カルシウム透過型非選択的カチオンチャネル又はそれを発現している細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは
（５）前記ポリペプチド（１）〜（４）の少なくともいずれか１つを発現している細胞
からなる、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツール。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載のスクリーニングツールに試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを活性化させる物質を有効成分とする記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤。
【請求項４】
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド又は細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）製剤化工程を含む、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物の製造方法。
【請求項５】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、又は
（３）配列番号４若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項８に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項５に記載のポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項２に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）を有効成分として含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤。
【請求項１２】
請求項２に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）を治療の必要な患者に投与することを含む、記憶低下、学習能力低下、及び／又は痴呆の予防及び／又は治療方法。
【請求項１３】
請求項２に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）の、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】  プレグネノロン・サルフェート（ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ；以下、ＰＳと称する）は、コレステロールが代謝されて産生するステロイドホルモンの１つであるプレグネノロンの硫酸抱合型である。プレグネノロンは更に代謝されて１７−ヒドロキシプレグネノロン又はプロゲステロンを産生することが知られている（非特許文献１、２）。ＰＳの産生組織は、副腎及び脳であるが、脳で産生されたＰＳは中枢の機能にのみ作用すると考えられている。このように、中枢で機能するステロイドホルモンは、特にニューロステロイドと称されている（非特許文献３）。
脳で記憶及び学習に関与する部位として海馬が知られており、ＰＳの合成に関わる酵素であるシトクロムＰ４５０ｓｃｃは海馬の神経細胞に存在していることが明らかになっている（非特許文献４）。更に、シトクロムＰ４５０ｓｃｃは細胞内のミトコンドリアに存在しており、ミトコンドリアへ運ばれたコレステロールからＰＳが産生されることが明らかになっている。ミトコンドリアへのコレステロール輸送は、細胞内へのカルシウム流入がトリガーとなっていることも明らかになっている（非特許文献３）。従って、細胞内へのカルシウム流入が、ＰＳ合成のトリガーとして機能している。
中枢でのＰＳの機能を明らかにするために、海馬でのＰＳの量を測定したところ、ＰＳ濃度は加齢とともに低下することが明らかになった。更に、このとき、記憶及び学習能力がＰＳの濃度と相関して低下することも明らかになり（非特許文献５）、ＰＳが記憶及び学習に関与していると考えられた。そこで、ＰＳの記憶及び学習への影響を詳細に解析したところ、ＰＳによって、海馬スライスを用いた長期増強（ＬＴＰ）、海馬スパイク頻度の亢進、及び神経末端より放出される神経伝達物質であるアセチルコリンの増加が明らかになった（非特許文献３、６、７）。これらの結果は、ＰＳによる神経伝達の亢進を示していることから、ＰＳが神経伝達の亢進を介して、記憶及び学習に関与していることが明らかになった（非特許文献３）。
実際に、記憶及び学習能力が低下している加齢のラットにＰＳを投与すると、記憶及び学習能力が改善することも明らかになっている（非特許文献５）。
従って、ＰＳは記憶及び学習のメカニズムに深く関与しており、加齢に伴ってＰＳの産生量が低下することによって、記憶及び学習能力の低下を促し、その結果、痴呆症状を示す。
このとき、ＰＳを投与することによって記憶及び学習能力が改善することから、加齢に伴う痴呆患者にＰＳを投与する、あるいは、ＰＳの作用機序を亢進させることで、抗痴呆効果を示すことが期待される。
しかしながら、ＰＳは脳内への移行性が良くないことから、ＰＳ自身を抗痴呆薬として用いることは困難である。また、ＰＳの直接のターゲット分子は明確になっておらず、どのような機序で、上記の海馬ＬＴＰの増強、あるいは、神経伝達物質の放出増加が引き起こされるかは不明である。ＰＳが直接作用して、記憶及び学習の改善を促す未知のターゲット分子の存在を示唆している報告も存在している（非特許文献３）。
一方、ヒト新規メラスチン様タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ＴＲＰＭ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ）チャネルファミリーに含まれるメラスタチン（Ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ）遺伝子に類似したヒト遺伝子である。ヒト新規メラスチン様タンパク質遺伝子の配列は既に公知となっているが、この遺伝子のコードするタンパク質の機能、及び生体内での機能は不明である（特許文献１）。また、ヒトＴＲＩＣＨ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）の配列が知られており、トランスポート、神経、筋肉、免疫、細胞増殖疾患における役割を持つと記載されているが、実験的裏付けはなく、生体内での機能は不明である（特許文献２）。
（非特許文献１）  日本臨床，１９９９年，第５７巻，ｐ．１６２−１６５
（非特許文献２）  日本臨床，１９９９年，第５７巻，ｐ．１６６−１６９
（非特許文献３）  生物物理，２００１年，第４１巻，ｐ．２９０−２９４
（非特許文献４）  「エンドクライノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），２００１年，第１４２巻，ｐ．３５７８−３５８９
（非特許文献５）  「プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，（米国），１９９７年，第９４巻，ｐ．１４８６５−１４８７０
（非特許文献６）  「エピレプシー・リサーチ（Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（オランダ），１９９９年，第３３巻，ｐ．２３−２９
（非特許文献７）  「ブレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（米国），２００２年，第９５１巻，ｐ．２３７−２４２
（特許文献１）  国際公開ＷＯ０１／３２８７０号パンフレット
（特許文献２）  国際公開ＷＯ０２／０７７２３７号パンフレット
【発明の開示】
本発明の課題は、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤として有用な物質を得るためのスクリーニングツール及びスクリーニング方法、並びに前記スクリーニングに使用することのできる新規のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞を提供し、更には、新規の記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤を提供することにある。
本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる各ポリペプチドをコードする新規遺伝子を取得し、前記ポリペプチドが、新規のカルシウム透過型非選択的カチオンチャネルであることを見出した。また、前記遺伝子が、脳、特には、記憶及び学習に関与する海馬で発現していること、更に、前記ポリペプチドが、ＰＳ（神経伝達の亢進を介して、記憶及び学習に関与しており、しかも、その投与によって記憶及び学習能力が改善することが知られているニューロステロイド）により特異的に活性化されることを明らかにし、前記ポリペプチド及びそれを発現する細胞が、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤として有用な物質を得るためのスクリーニングツールとして有用であることを見出し、新規スクリーニング法を提供した。そして、本発明のスクリーニング法により得られた本ポリペプチドの活性化剤が、神経細胞における神経伝達を亢進することより、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆効果を示すことを確認し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは
（５）前記ポリペプチド（１）〜（４）の少なくともいずれか１つを発現している細胞
からなる、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツール；
［２］（ａ）［１］記載のスクリーニングツールに試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法；
［３］［１］（１）〜（４）記載のポリペプチドを活性化させる物質を有効成分とする記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤；
［４］（ａ）［１］記載のポリペプチド又は細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）製剤化工程を含む、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物の製造方法；
［５］（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、又は
（３）配列番号４若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド；
［６］［５］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
［７］［６］記載のポリヌクレオチドを含むベクター；
［８］［６］記載のポリヌクレオチドを含む細胞；
［９］［６］記載のポリヌクレオチド、［７］記載のベクター、又は［８］記載の細胞を用いることを特徴とする、［５］記載のポリペプチドの製造方法；
［１０］（ａ）［５］記載のポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法；
［１１］［２］記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）を有効成分として含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤；
［１２］［２］記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）を治療の必要な患者に投与することを含む、記憶低下、学習能力低下、及び／又は痴呆の予防及び／又は治療方法；並びに
［１３］［２］記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）の、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物製造のための使用
に関する。
本発明には、［１］（１）〜（４）記載のポリペプチド、又は［１］（５）記載の細胞の記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングにおける使用も含まれる。
【図面の簡単な説明】  図１は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を発現させたＨＥＫ２９３細胞に、ＰＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した場合のカルシウム流入の結果を、蛍光強度（単位＝カウント）の変化で示すグラフである。縦軸はカルシウム流入による蛍光強度の変化、横軸は時間（秒）を、実線が実施例３で得られた形質転換細胞、点線はコントロール細胞の結果を示す。
図２は、ラット大脳皮質由来初代培養神経細胞にＰＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した場合のカルシウム流入の結果を、蛍光強度（単位＝カウント）の変化で示すグラフである。縦軸はカルシウム流入による蛍光強度変化、横軸は時間（秒）、実線はＰＳを添加した結果、点線は生理食塩水を添加した結果を示す。
図３は、ラット大脳皮質由来初代培養神経細胞に化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＰＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した場合のカルシウム流入の結果を、蛍光強度（単位＝カウント）の変化で示すグラフである。縦軸はカルシウム流入による蛍光強度変化、横軸は時間（秒）を示す。
図４は、ラット海馬由来初代培養神経細胞に化合物Ａ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｂ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、Ｄ（１μｍｏｌ／Ｌ）及びＰＳ（１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した場合の、興奮性シナプス後電流（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｃｕｒｒｅｎｔｓ；ｓＥＰＳＣｓ）を示すグラフである。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤはそれぞれ異なる細胞からの応答例である。左から、バッファー、ＰＳ、及び、化合物（Ａ、Ｂ、Ｃ、又はＤ）を添加した結果を、上から、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】［１］本発明の記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツール
本発明のスクリーニングツールには、ポリペプチド型スクリーニングツールと、細胞型スクリーニングツールとが含まれる。
（１）ポリペプチド型スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（ｉ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｉ）（ａ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド［以下、ポリペプチド（ａ）からなるツール用ポリペプチド及びポリペプチド（ｂ）からなるツール用ポリペプチドを併せて、機能的等価改変ツール用ポリペプチドと称する）；又は
（ｉｉｉ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド（以下、相同ツール用ポリペプチドと称する）
を挙げることができる。
以下、本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるこれらの各種ポリペプチドを、総称して、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する。
本明細書において「ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示す」とは、対象となるポリペプチドを発現させた細胞を、ＰＳ刺激又はＰＳ無刺激で、それぞれの細胞の電流応答値又はカルシウム流入量を比較した場合に、ＰＳ刺激した細胞の電流応答値又はカルシウム流入量が、ＰＳ無刺激の細胞の電流応答値又はカルシウム流入量よりも高いことを意味する。電流応答値の比較は、例えば、実施例４に記載の方法に従って、また、カルシウム流入量の比較は、例えば、実施例５又は６に記載の方法に従って確認することができる。電流応答値又はカルシウム流入量の上昇の程度としては、それぞれをＰＳ無刺激の細胞での電流応答値又はカルシウム流入量と有意差検定を行なった際に、Ｐ値が０．０５以下であることが好ましく、Ｐ値が０．０１以下であることがより好ましい。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドは、セシウム、ナトリウム、及びマグネシウムイオン透過型のイオンチャネル活性も示すものがより好ましい。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる、配列番号２、配列番号４、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる各ポリペプチドは、それぞれ、ヒト、マウス、及びラット由来の新規カルシウム透過型非選択的カチオンチャネルである。
配列番号２で表されるアミノ酸配列（１５５４アミノ酸）は、生体内での機能が不明である公知のヒト新規メラスチン様タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子（国際公開ＷＯ０１／３２８７０号パンフレットにおける配列番号２４）から予想されるアミノ酸配列と３アミノ酸が異なる。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列における第１５１７番、第１５３９番、及び第１５５４番におけるグルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、及びアスパラギン（Ａｓｎ）が、それぞれ、ヒト新規メラスチン様タンパク質の遺伝子から予想されるアミノ酸配列においてはアルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、及びトレオニン（Ｔｈｒ）である。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列は、ヒトＴＲＩＣＨの推定アミノ酸配列１７０７残基（国際公開ＷＯ０２／７７２３７号パンフレットにおける配列番号１０）のうち１５４４アミノ酸と一致する。そして、本願優先日後に公開されたＪ．Ｂ．Ｃ，２７８，２０８９０−２０８９７，２００３にも、ｈＴＲＰＭ３の配列として相同性のあるアミノ酸配列が記載されている。しかし、いずれも、ＰＳにより活性化されることや、記憶及び学習に関与することは、開示も示唆もない。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変ツール用ポリペプチドとして、（ａ）配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個（より好ましくは１〜７個、更に好ましくは１〜５個、特に好ましくは１又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチドが好ましい。
また、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチドとして、例えば、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示す限り、含まれる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる相同ツール用ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が、９０％以上であり、９５％以上であるものがより好ましく、９８％以上であるものが更に好ましく、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるものが特に好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いたＣｌｕｓｔａｌＶ法による。
（２）細胞型スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）は、細胞型スクリーニングツールとして用いる際に前記スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、外来遺伝子で形質転換することにより、人為的に前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞であることもできるし、又は、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現している天然の細胞又はその細胞株であることもできる。
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用細胞としては、形質転換細胞が好ましく、例えば、
（ｉ）配列番号２、配列番号４、又は配列番号６で表されるアミノ酸配からなるポリペプチドを発現している形質転換細胞；
（ｉｉ）機能的等価改変ツール用ポリペプチドを発現している形質転換細胞；又は
（ｉｉｉ）相同ツール用ポリペプチドを発現している形質転換細胞
を挙げることができる。
［２］本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチド
本発明のポリペプチドには、
（ｉ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び
（ｉｉ）（ａ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号４若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変ポリペプチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリペプチドとしては、セシウム、ナトリウム、及びマグネシウムイオン透過型のイオンチャネル活性も示すポリペプチドがより好ましい。
機能的等価改変ポリペプチドとして、（ａ）配列番号４若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１０個（更に好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは、（ｂ）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、ＰＳにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチドが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではなく、例えば、「配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチド、又は機能的等価改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
より具体的には、本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列の５０番〜４７１４番の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号３で表される塩基配列の２１８番〜４９９３番の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号５で表される塩基配列の１８２番〜４８８２番の塩基配列からなるポリヌクレオチドが好ましい。
なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
［３］本発明のスクリーニングツール、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び細胞の製造方法
遺伝子組換え技術は、公知の方法（例えば、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９、ＷＯ０２／０５２０００、又はＷＯ０２／０５３７３０）に従って実施することができる。
本発明のポリヌクレオチド、及びスクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、スクリーニングツール用ポリヌクレオチドと称する）の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた方法、（ｂ）常法の遺伝子工学的手法（すなわち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（ｃ）化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。
ＰＣＲを用いた方法［前記製造方法（ａ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドを産生する能力を有する細胞（例えば、ヒト、マウス、又はラット細胞）又は組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、前記ポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことのできる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマーセットを作成する。反応条件（例えば、変性温度又は変性剤添加条件など）を適切に調整して、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行なうことにより、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
また、前記ポリペプチドを産生する能力を有する細胞（例えば、ヒト、マウス、又はラット細胞）又は組織から調製したｍＲＮＡから、逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡ、あるいは、市販のヒト、マウス、若しくはラット細胞又は組織由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを実施することによっても、前記ポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡ又はその一部を得ることができる。
なお、得られたこれらの全長ｃＤＮＡ又はその一部は、適当な発現ベクターに組み込むことにより、宿主細胞で発現させ、前記ポリペプチドを製造することができる。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法［前記製造方法（ｂ）］では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、前記のＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。
次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、又はＪＭ１０９株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７−５８０，１９８３）により実施することができる。また、市販のコンピテント細胞を使用することもできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによるスクリーニング法、又は（２）ＰＣＲにより作製したプローブを用いるハイブリダイゼーションによるスクリーニング法を採用することができる。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡからｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができる。
化学合成法を用いた方法［前記製造方法（ｃ）］では、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを製造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成することができる。
これまで述べた種々の方法により得られるＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，１９８２）等により行なうことができる。
単離された本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを、適当なベクターに再び組込むことにより、宿主細胞（真核生物及び原核生物の各宿主細胞を含む）を形質転換させ、本発明の細胞又はスクリーニングツール用細胞を得ることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。
例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞、又は前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しようとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロモーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができる。
宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。
前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥＴＭ  ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるいは、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等により、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。
また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、本発明のポリヌクレオチド又はスクリーニングツール用ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
また、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを用いることができる。
形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により、細胞膜に貫通した状態で、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた培地を使用することができる。
本発明の形質転換体を培養することにより生産される本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、前記ポリペプチドを含む細胞又は細胞膜画分を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、前記ポリペプチドを精製することができる。
本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、前記ポリペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列と前記ポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。
［４］本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法には、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチド若しくは本発明のポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法と、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法とが含まれる。
（１）本発明のスクリーニングツール用ポリペプチド又は本発明のポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチド又は本発明のポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明のスクリーニングツール用ポリペプチド若しくは本発明のポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）チャネル活性を分析（測定又は検出）する工程、及び
（ｉｉｉ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程。
本明細書において「チャネルを活性化させる物質」とは、試験物質を接触させることにより、イオンチャネルが活性化する物質をいい、ＰＳのように直接チャネルを活性化させる物質、及び、直接チャネルを活性化させる物質の活性化を促進する物質の両方を含む。
ＰＳ共存下で上記工程を行うことにより、ＰＳによる前記ポリペプチドの活性化を促進させる物質のスクリーニングができ、ＰＳによる前記ポリペプチドの活性化を促進させる物質のスクリーニング方法も上記スクリーニング方法に含まれる。
（２）記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法
記憶改善、学習能力改善、及び抗痴呆効果を有するＰＳが、前記効果を示すメカニズムは、スクリーニングツール用ポリペプチドのイオンチャネルの活性化である。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドのチャネルを活性化させる物質（ＰＳによる前記ポリペプチドの活性化を促進させる物質を含む）を選択することにより、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤をスクリーニングすることができる。
本発明の記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法は、下記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む限り、特に限定されるものではない：
（ｉ）本発明の記憶改善剤、学習能力改善剤及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツール（好ましくは細胞型スクリーニングツール）に試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）チャネル活性を分析（測定又は検出）する工程、及び
（ｉｉｉ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程。
ＰＳ共存下で上記工程を行うことにより、ＰＳによる前記ポリペプチドの活性化を促進させる物質も選択でき、ＰＳによる前記ポリペプチドの活性化を促進させる物質も記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤としてスクリーニングすることができる。
また、本発明のスクリーニング方法には、
（ｉ）本発明のポリペプチド型スクリーニングツールに試験物質を接触させる工程、
（ｉｉ）前記試験物質の前記スクリーニングツールへの結合を分析する工程、及び
（ｉｉｉ）前記スクリーニングツールへ結合する物質を選択する工程
を含む、
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドに結合する物質のスクリーニング方法が含まれる。
このスクリーニング方法で得られた物質が記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤として有効であることの確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、動物を用いた行動試験、脳スライスを用いた海馬ＬＴＰの測定、脳スライス、又は神経細胞を用いた神経伝達の測定が挙げられる（真鍋俊也、森寿、及び片山正寛編、無敵のバイオテクニカルシリーズ  特別編「脳・神経研究の進めかた」、１９９８年、羊土社）。なお、神経細胞を用いた神経伝達の測定については、例えば、後述の実施例１８に記載の方法により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法（すなわち、本発明のポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法、並びに記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法を含む）として、チャネル活性を分析（測定又は検出）するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
（ａ）パッチクランプ（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）法を利用したスクリーニング方法、
（ｂ）放射性同位元素イオンの流入を利用したスクリーニング方法、又は
（ｃ）細胞内Ｃａ２＋検出色素を利用したスクリーニング方法
などを挙げることができる。各スクリーニング方法について以下に説明する。
（ａ）のパッチクランプ法を利用してスクリーニングする場合には、例えば、ホールセルパッチクランプ（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ）法（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，″Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ″，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９９２，Ｓｉｎａｕｅｒ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＩｎｃ．，ＭＡ）を用いて、細胞における全細胞電流を分析（好ましくは測定）することにより、チャネルを活性化させるか否かを分析することができる。
より具体的には、本発明のポリペプチドを発現している細胞又はスクリーニングツール用細胞をホールセルパッチクランプ法により膜電位固定し、前記細胞の全細胞電流を測定する。この場合、細胞外液としては、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ７．４）を含む溶液を使用し、細胞内液としては、１４７ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣｓＣｌ、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ７．２）を含む溶液などを用いることができる。続いて、細胞外液又は細胞内液に試験物質を添加した場合の電流変化を測定することで、本発明ポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドのチャネルを活性化させる物質をスクリーニングすることができる。例えば、試験物質を添加した場合に、前記チャネルの活性化刺激の際に生じる全細胞電流の変化が強くなれば、前記試験物質は、前記チャネルを活性化させる物質であると判定することができる。本方法は，実施例４に記載の条件で実施することが好ましく、チャネルを活性化させる物質としては、ＰＳと同程度の細胞電流変化を生じさせるもの、具体的には実施例４の条件でＥＣ５０が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のものを選択することが好ましい。
（ｂ）の放射性同位元素イオンの流入を利用してスクリーニングする場合には、Ｃａ２＋イオンの各放射性同位元素を指標としてチャネル活性を分析（好ましくは測定）することができる［Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮａｔｈａｎ  Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ″，８８（１），１９８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，３４６−３４７］。この分析方法は、本発明のポリペプチド及びスクリーニングツール用ポリペプチドがＣａ２＋イオンを透過させるとの新規知見（実施例５及び実施例６）に基づくものである。
本発明のポリペプチドを発現している細胞又はスクリーニングツール用細胞において、試験物質により前記細胞の細胞内へ流入する放射活性、あるいは、細胞外に残存する放射活性の量を分析することにより、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドのチャネルを活性化させるか否かを分析することができる。
具体的には、例えば、Ｃａ２＋イオンの放射性同位元素である４５Ｃａ２＋を用いて測定することができる。４５Ｃａ２＋を反応液中に入れておいた状態で、試験物質が前記チャネルを活性化させると、放射性同位体元素が細胞内へ流入することから、細胞外液中の放射活性（すなわち、細胞外液に残存した放射活性）、あるいは、細胞内に流入した放射性同位元素の放射活性をチャネル活性化の指標とすることができる（黒木登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、１９９５年、羊土社）。チャネルを活性化させる物質としては、ＰＳと同程度に細胞内へＣａ２＋を流入させるもの、具体的にはＥＣ５０が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のものを選択するのが好ましい。
（ｃ）の細胞内Ｃａ２＋検出色素を利用してスクリーニングする場合には、細胞内Ｃａ２＋検出色素として、例えば、Ｆｌｕｏ３−ＡＭなどを用いることができる。細胞内Ｃａ２＋検出色素は、本発明のポリペプチド又はスクリーニングツール用ポリペプチドのイオンチャネルの開口に伴う細胞内Ｃａ２＋濃度の変化を光学的に分析（好ましくは測定）することが可能である（工藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、１９９６年、羊土社）。これらの色素を用いることによって前記チャネルの活性を測定することができる。前記チャネル発現細胞において、試験物質不在下と比較して、試験物質存在下で細胞内Ｃａ２＋検出色素が変化することにより、前記チャネルを活性化させる物質であると判定することができる。本方法は、特に限定されるものではないが、例えば、本発明のポリペプチドを発現している細胞又はスクリーニングツール用細胞に細胞内Ｃａ２＋検出色素を取り込ませた後、試験物質による前記細胞における細胞内Ｃａ２＋検出色素の量変化を光学的に測定することにより前記チャネルを活性化させるか否かを分析することができる。
より具体的には、試験物質を添加した場合に、試験物質不在下の場合と比較して、細胞内に流入するＣａ２＋量が増加すれば、前記試験物質は、チャネルを活性化させる物質であると判定することができる。本方法は，実施例６に記載の条件で実施することが好ましく、チャネルを活性化させる物質としては、ＰＳと同程度に細胞内Ｃａ２＋検出色素の量変化を促すもの、具体的には実施例６の条件でＥＣ５０が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のものを選択するのが好ましい。
また、前記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のスクリーニング方法において、前記チャネルを直接活性化しないものについても、前記試験物質を投与後に更に前記チャネルを１００％活性化しない濃度のＰＳを、例えば１０μｍｏｌ／ＬのＰＳを投与した時、前記試験物質を投与していないときよりも強い活性を示すものについては、前記チャネルの活性を促進するものと判定することができる。
上記のように、ＰＳ共存下で上記スクリーニングを行うことにより、ＰＳによる本発明のポリペプチドの活性化を促進させる化合物をスクリーニングすることができる。活性化を促進させる物質としては、ＰＳによる活性を有意に促進させるもの、具体的にはＥＣ５０が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のものを選択することが好ましい。
また、セシウム、ナトリウム、又はマグネシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すスクリーニング用ポリペプチド又は本発明のポリペプチドを用いる場合は、（ｂ）と同様にＣａ２＋の替わりに、セシウム、ナトリウム、又はマグネシウムの放射性同位元素を指標として用いることも可能である。具体的には、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮａｔｈａｎ  Ｏ．Ｋａｐｌａｎ，″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ″，８８（１），１９８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社，３４６−３４７に記載の方法を参考に行なうことができる。この分析方法は、本発明のポリペプチド及びスクリーニング用ポリプペチドがセシウムイオン、ナトリウムイオン、及びマグネシウムイオンを透過させるとの知見（実施例５）に基づくものである。
本発明のスクリーニング方法によって選択対象とする試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物、植物、海洋生物、又は動物由来の天然成分（例えば、培養上清又は組織抽出物）などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）、例えば、Ｎ−［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−イル］−Ｎ’−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ’−フェニルウレア、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピペリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピロリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン、又はＮ−（２−アセチル−３−チエニル）−２−［（２−クロロ−６−フルオロベンジル）スルファニル］アセトアミドを、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
［５］本発明の医薬組成物
本発明には、本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（但し、ＰＳを除く）を有効成分とする記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤、並びに、
（ａ）本発明のスクリーニングツールに試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）製剤化工程を含む、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物の製造方法も含まれる。本発明は、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質を投与する工程を含む、記憶低下、学習能力低下、及び／又は痴呆の予防及び／又は治療方法、並びに、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物の製造の為の本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質の使用も含む。
本発明のスクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質として、例えば、Ｎ−［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−イル］−Ｎ’−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ’−フェニルウレア、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピペリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピロリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン、又はＮ−（２−アセチル−３−チエニル）−２−［（２−クロロ−６−フルオロベンジル）スルファニル］アセトアミドが挙げられる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質［例えば、ＤＮＡ、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ヒト由来ポリヌクレオチドの単離及び発現ベクターの構築
ヒト脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１０ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）用キット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写させ、第一鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを合成した。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造）を用いて、ホットスタート（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）法によるＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号７、アンチセンスプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／５９℃（３０秒間）／７２℃（５分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
このＤＮＡ断片を、クローニングキット（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した後、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンをｐｃＤＮＡ３．１−ＭＬＳＮ２と命名した。なお、前記プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配列を持っており、動物細胞にタンパク質を発現させるために使用することができる。
得られたクローンｐｃＤＮＡ３．１−ＭＬＳＮ２の塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号１で表される塩基配列が得られた。
配列番号１で表される塩基配列は、４６６５塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号１で表される塩基配列における第５０番〜第４７１４番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測される１５５４アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列であった。
実施例２：ヒト脳での発現解析
ヒト脳、特に海馬における実施例１で得られた遺伝子の発現を、シークエンスディテクター（ＰＲＩＳＭ７９００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたリアルタイムＰＣＲで解析した。リアルタイムＰＣＲを行うことで、ｍＲＮＡ中に含まれる目的遺伝子を定量化して測定することができる。
ヒトの全脳及び海馬由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１ｎｇをＤＮアーゼ処理を行なった後、実施例１と同様の方法を用いて第一鎖ｃＤＮＡを得た。この第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として、蛍光試薬（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、そして、アンチセンスプライマーとして配列番号１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９５℃（１０分間）で熱変性を行なった後、９５℃（１５秒間）／５９℃（１分間）からなるサイクルを４５回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子に特異的な配列である。
その結果、全脳及び海馬にて遺伝子断片が増幅された。このことから、配列番号１で表される塩基配列からなるｍＲＮＡは、脳、特に海馬で発現していることが明らかになり、記憶及び学習に関与する海馬で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが機能していることが明らかになった。
実施例３：タンパク質の動物細胞での発現
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのチャネル活性を検出するために、前記実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＭＬＳＮ２を、動物細胞にトランスフェクションすることにより、前記タンパク質を発現させた。実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＭＬＳＮ２と、形質転換用試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ又はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを用いて、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５７３）の形質転換を行ない、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現を誘導した。なお、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥで形質転換した細胞は実施例４及び５で、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００で形質転換した細胞は実施例６、７、及び１６で使用した。
前記操作は、前記形質転換用試薬に添付のプロトコール、及び公知の方法（黒木登志夫、許南浩、及び千田和広編、実験医学別冊「分子生物学研究のための培養細胞実験法」、１９９５年、羊土社）に従って、実施した。
実施例４：電気生理の手法を用いたチャネル活性の検出
実施例３で得られた各細胞を、ホールセル膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法により膜電位固定し、ＰＳを投与したときに生じる全細胞電流を測定した。細胞外液として、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）を含む溶液を使用し、細胞内液として、１４７ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣｓＣｌ、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｃｓ（ｐＨ＝７．２）を含む溶液を用いた。
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＭＬＳＮ２でトランスフェクションされた細胞で、保持電位を−４０ｍＶにし、細胞外からＰＳ（１００μｍｏｌ／Ｌ）を与えると、内向きに流れる電流応答（−５．８±０．９、ｎ＝１０）が測定された。洗浄後、保持電位を＋４０ｍＶにし、ＰＳを与えると大きな外向き電流（１０８．９±１９．３、ｎ＝１０）が流れた。応答が生じているときにランプ波を与え、電流電圧関係を測定したところ、外向き整流性の特徴を示した。一方、発現ベクターなしでトランスフェクション操作を行なった、配列番号２記載のポリペプチドを発現させていないコントロール細胞に、同様にＰＳを与えたが、このような電流は観測されなかった。
以上の結果より、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＰＳによって活性化して、イオンを細胞内外へ透過するイオンチャネルとして機能することが明らかになった。
実施例５：イオン透過性の検討
細胞外液以外は実施例４に記載の方法にて、ＰＳにより活性化した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのチャネル活性のＣａ２＋透過性について検討した。細胞外液のカチオンがすべてＣａ２＋の溶液［１１７ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｃａ（ｐＨ＝７．４）；以下、Ｃａ２＋細胞外液と称する］下でＰＳ（１００μｍｏｌ／Ｌ）を投与すると、実施例４に記載の細胞外液の場合よりも大きな内向き電流が測定された。そのときの電流電圧関係をランプ波で調べてみると、通常外液中と異なり、内向き整流性であった。反転電位も通常外液下では＋１２．５ｍＶであるのが、Ｃａ２＋細胞外液下では＋３０．２ｍＶと正電位側にシフトした。この値からＣｓ＋に対するＣａ２＋の透過係数比を求めると４．１となり、ＰＳにより活性化した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはＣａ２＋の透過性が高いことが分かった。
同様に、ＰＳにより活性化した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのチャネル活性のＭｇ２＋透過性について検討した。細胞外液のカチオンがすべてＭｇ２＋の溶液［１１７ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｍｇ（ｐＨ＝７．４）］下でＰＳ（１００μｍｏｌ／Ｌ）を投与すると、Ｃａ２＋細胞外液と同様に大きな内向き電流が測定された。そのときの反転電位は＋２７．５ｍＶであり、Ｃｓ＋に対するＭｇ２＋の透過係数比を求めると３．４となり、ＰＳにより活性化した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドはＭｇ２＋の透過性も高いことが分かった。
一方、ＰＳによりチャネルが活性化している状態で細胞外液のカチオンを全てチャネル非透過性カチオンであるＮＭＤＧ＋（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）［１５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮＭＤＧ＋及び５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）；以下、ＮＭＤＧ＋細胞外液と称する］に置換すると、内向き電流は完全に抑制され、外向き電流は５倍程度増強された。ＮＭＤＧ＋細胞外溶液下での電流電圧関係は、通常外液中と比べ負電位側にシフトしていることから、Ｃｓ＋が電流の主成分であることが示され、外向き電流成分はＣｓ＋であることが分かった。
次に、Ｎａ＋の透過性を調べるため、ＰＳによりチャネルが活性化している状態で通常細胞外液のＮａ＋濃度を低濃度にした細胞外液［３１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１１６ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮＭＤＧ＋、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４）］に変更したところ、内向き電流は５０％程度に抑制された。この結果は、Ｎａ＋が内向き電流成分であることを示している。
以上の結果から、ＰＳにより活性化した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのチャネルはＮａ＋、Ｃｓ＋、Ｃａ２＋、及びＭｇ２＋を透過させることが明らかとなった。
実施例６：カルシウム感受性蛍光試薬を用いたチャネル活性の検出
実施例３で得られた形質転換細胞（４×１０４細胞）をカルシウム感受性蛍光試薬（Ｆｌｕｏ３−ＡＭ；ＤＯＪＩＮＤＯ社）存在下、３７℃で１時間インキュベートすることにより、カルシウム感受性蛍光試薬を細胞内に取り込ませた後、生理食塩水で洗浄して、細胞に取り込まれなかったカルシウム感受性蛍光試薬を取り除いた。得られた細胞に、ＰＳ（最終濃度＝１０μｍｏｌ／Ｌ）を添加した生理食塩水を加え、経時的に細胞が発する蛍光を測定した。上記の測定は、自動蛍光検出装置（ＦＬＩＰＲ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いた。なお、コントロールとして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をトランスフェクションした、配列番号２で表されるポリペプチドを発現させていないＨＥＫ２９３細胞（コントロール細胞）、あるいは、ＰＳを添加しない生理食塩水を用いて、同様の操作を実施した。
結果を図１に示す。その結果、ＰＳを添加した形質転換細胞では、添加直後から蛍光強度の上昇が検出された（前述の自動蛍光検出装置での測定値で約１０，０００カウント）。一方、コントロール細胞、及びＰＳを添加しない生理食塩水を用いた検討では、いずれも蛍光は検出されなかった（前述の自動蛍光検出装置での測定値で約０カウント）。これは、ＰＳにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが活性化し、細胞内へカルシウムを流入させたことを示している。
これまでの結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒト新規カルシウム透過型非選択的カチオンチャネルタンパク質であって、ＰＳにより活性化して、細胞内へカルシウムを流入させることが明らかになった。
実施例７：イオンチャネル活性のＰＳ特異性
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのイオンチャネル活性が、ＰＳに特異的に誘発されることを、ＰＳ類似物質を用いて解析した。
ＰＳはステロイドホルモンであることから、ＰＳ類似物質として、他のステロイドホルモンが挙げられる。そこで、ステロイドホルモンであるプレグネノロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、１７−ヒドロキシプロゲステロン、アンドロステンジオン、デオキシコルチコステロン、デオキシコルチゾール、テストステロン、コルチコステロン、コルチゾール、エストラジオール、１８−ヒドロキシコルチコステロン、及びアルドステロンを用いて、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる細胞内へのカルシウム流入を、実施例６に記載の方法を用いて検討した。
その結果、すべての物質で細胞内への顕著なカルシウム流入は観察されなかった。この結果から、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＰＳ特異的に活性化することが明らかになった。
実施例８：マウス遺伝子の単離
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対応するマウスポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡを、マウス脳由来のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより取得した。まず、マウス脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１０ｎｇを用い、実施例１と同様に第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１１、アンチセンスプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／５５℃（３０秒間）／７２℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約５．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
このＤＮＡ断片を、クローニングキット（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号３で表される配列が得られた。
配列番号３で表される塩基配列は、４７７６塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号３で表される塩基配列における第２１８番〜第４９９３番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測される１５９１アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９７．１％の相同性を有する。なお、前記相同性の数値は、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いたＣｌｕｓｔａｌＶ法により得られた値である。
実施例９：マウス脳での発現解析
マウス脳における実施例８で得られた遺伝子の発現を、実施例２と同様に解析した。
マウスの脳由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１ｎｇを、センスプライマーとして配列番号１３、アンチセンスプライマーとして配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いること以外は、実施例２と同様に処理した。それぞれのプライマーは、配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子に特異的な配列である。
その結果、脳にて遺伝子断片が増幅された。このことから、配列番号３で表される塩基配列からなるｍＲＮＡは、脳に発現していることが明らかになり、配列番号４で表されるマウスタンパク質は脳で機能していることが明らかになった。
実施例１０：マウス遺伝子断片の単離
イン・シチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション染色に用いるプローブを作成するため、配列番号３で表される塩基配列からなるマウス遺伝子の断片を単離した。
配列番号３で表される塩基配列からなるマウス遺伝子の断片は、マウス脳由来のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより取得した。まず、マウス脳ｍＲＮＡ（１０ｎｇ）を、実施例１と同様に処理した。但し、センスプライマーとして配列番号１５、アンチセンスプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。その結果、約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
このＤＮＡ断片を、実施例８と同様にクローニングし、得られたクローンをｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｍｏｕｓｅＭＬＳＮ２と命名した。ｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｍｏｕｓｅＭＬＳＮ２の塩基配列を解析したところ、配列番号３で表されるマウス遺伝子配列の第３２８１番目〜第３７６８番目の塩基配列と同じであった。
実施例１１：マウス胎児脳における遺伝子イン・シチュ・ハイブリダイゼーション染色
マウス脳における実施例８で得られた遺伝子の発現部位を特定するために、マウス胎児脳を用いたイン・シチュ・ハイブリダイゼーション染色を行なった。
妊娠１７日後のマウスから１０％中性緩衝液ホルマリンによる還流固定後に胎児を採取し、パラフィン包埋を行い、マウス胎児パラフィンブロックを作成した。得られたマウス胎児パラフィンブロックを６μｍの厚さで薄切し、イン・シチュ・ハイブリダイゼーション染色用のサンプルとした。
実施例１０で得られたプラスミドｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｍｏｕｓｅＭＬＳＮ２を鋳型として、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写法によるジゴキシゲニン標識ＲＮＡアンチセンスプローブを作成した。なお、ジゴキシゲニン標識には市販試薬（ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ；ロシュ社）を用いて、添付のプロトコールに従って実施した。また、ネガティブコントロールとして、同様の方法を用いて、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡセンスプローブも作成した。
上記で得られたサンプル及びプローブを用いて、イン・シチュ・ハイブリダイゼーション染色を実施した。抗体には、アルカリフォスファターゼ標識した抗ジコキシゲニン抗体（ロシュ社）、発色基質にはＮＢＴ／ＢＣＩ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルリン酸とニトロブルーテトラゾリウム塩との混合液）を使用し、発色後、ケルネヒトロートにより核染色を行なった。
その結果、アンチセンスプローブを用いた検討では、マウス胎児脳の海馬に強い発色が見出された。なお、センスプローブを用いた検討では、染色は見られなかった。これらの結果から、配列番号３で表される塩基配列からなる遺伝子は、マウス脳の海馬で発現していることが明らかになった。
実施例１２：ラット遺伝子の単離
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対応するラットポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡを、ラット脳由来のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより取得した。まず、ラット脳ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）１０ｎｇを用い、実施例１と同様に第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１７、アンチセンスプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／５７．５℃（３０秒間）／７２℃（６分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。その結果、約５．１ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
このＤＮＡ断片を、クローニングキット（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、得られたクローンの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７００  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析したところ、配列番号５で表される配列が得られた。
配列番号５で表される塩基配列は、４７０１塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番号５で表される塩基配列における第１８２番〜第４８８２番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーディングフレームから予測される１５６６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、配列番号６で表されるアミノ酸配列であり、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９７．９％、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９８．９％の相同性を有する。なお、前記相同性の数値は、ＭｅｇＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いたＣｌｕｓｔａｌＶ法により得られた値である。
実施例１３：ラット脳由来初代培養神経細胞の調製
妊娠ラットをジエチルエーテルにて麻酔し、胸部（心臓）切開により失血死させた後、腹部を切開し、子宮を摘出した。クリーンベンチ内で胎児を消毒用アルコールにより滅菌し、全脳を取り出し、神経細胞用培養液（ＳＵＭＩＬＯＮ；住友ベークライト社）の入ったシャーレ中に回収し、実体顕微鏡下で精密ピンセットにより大脳皮質及び海馬を摘出した。大脳皮質及び海馬をそれぞれ５０ｍＬチューブに移し、静置により組織を沈降させ、上清を吸引除去し、細胞分散溶液［１％パパイン、１５０Ｕ／ｍＬ−ＤＮアーゼＩ、０．０２％Ｌ−システイン、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．５％グルコースを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）］を加え、３７℃にて１５分間インキュベートの後に、遠心した（１０００ｒｐｍ、４℃、５分間）。更に、上清を吸引除去し、無血清培地１０ｍＬを加え、ピペッティング操作を数回行ない、その後、フィルターを用いて細胞塊を除き、細胞浮遊液とした。
実施例１４：ラット脳由来初代培養神経細胞でのＰＳによるカルシウム流入
本実施例は、以下で具体的に記載した操作以外は、公知の方法（工藤佳久編、実験医学別冊「細胞内カルシウム実験プロトコール」、１９９６年、羊土社）に従って実施した。
実施例１３で得られたラット脳（大脳皮質）由来初代培養神経細胞（４×１０４細胞）を１週間培養して用い、ＰＳの最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌ又は５０μｍｏｌ／Ｌであること以外は、実施例６に記載の方法で、経時的に細胞が発する蛍光を測定した。なお、コントロールとして、ＰＳを添加しない生理食塩水にて、同様の操作を実施した。
その結果、ＰＳを添加した細胞では、１０μｍｏｌ／Ｌ又は５０μｍｏｌ／Ｌのいずれの場合にも、添加直後から蛍光強度の上昇が検出されたが、コントロールでは検出されなかった。ＰＳの最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌである場合について、結果を図２に示す。この結果は、初代培養神経細胞に存在するカルシウム透過型のイオンチャネルがＰＳによって活性化して、細胞内へカルシウムを流入させたことを示している。
実施例１５：ラット脳由来初代培養神経細胞でのラット遺伝子の発現解析
ラット脳（大脳皮質及び海馬）由来初代培養神経細胞における実施例１２で得られたラット遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。
実施例１３で得られたラット大脳皮質及び海馬由来の各初代培養神経細胞から、それぞれ、ＲＮＡ分離試薬（ＩＳＯＧＥＮ；東洋紡）を用いて、総ＲＮＡを取得した。なお、前記操作は、前記ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従って、実施した。
得られたそれぞれの総ＲＮＡ（５ｎｇ）を用い、実施例１と同様に第一鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号１９、アンチセンスプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて実施し、最初に９８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒間）／５９℃（３０秒間）／７２℃（１分間）からなるサイクルを３５回繰り返した。それぞれのプライマーは、配列番号５で表される塩基配列からなるラット遺伝子に特異的な配列である。
その結果、それぞれのｃＤＮＡから約０．５ｋｂｐの遺伝子断片が増幅された。この結果から、ラット脳（大脳皮質及び海馬）由来初代培養神経細胞にて、配列番号５で表される塩基配列からなるラット遺伝子が発現していることが明らかになった。
実施例１６：本発明ポリププチド活性化剤スクリーニング
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物（活性化剤）のスクリーニングを行なった。活性化の指標として、カルシウム感受性蛍光試薬を用いた細胞内へのカルシウム流入の検出を行ない、具体的には実施例６に記載の方法を用いた。スクリーニングの基準として、ＥＣ５０が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のものをヒットとした。
さまざまな化合物を検討した結果、蛍光強度の上昇が検出されるものとして、Ｎ−［３−（２，６−ジクロロフェニル）−５−メチルイソオキサゾール−４−イル］−Ｎ’−エチル−Ｎ−メチル−Ｎ’−フェニルウレア（ｃｏｄｅ  ｎｏ．ＳＰＢ  ０００７１；ＭＡＹＢＲＩＤＧＥ社）、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピペリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン（ｃｏｄｅ  ｎｏ．ＭＳ  １３６８；ＭＥＲＬＩＮ社）、３−（２，６−ジフルオロフェニル）−４−（ピロリジン−１−イルメチル）−１，３−チアゾール−２（３Ｈ）−チオン（ｃｏｄｅ  ｎｏ．ＭＳ  １３７０；ＭＥＲＬＩＮ社）、及びＮ−（２−アセチル−３−チエニル）−２−［（２−クロロ−６−フルオロベンジル）スルファニル］アセトアミド（ｃｏｄｅ  ｎｏ．ＧＫ  ００６７８；Ｒｙａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）（以下、それぞれ化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称する）が見出された。各化合物の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する活性化は、それぞれＥＣ５０が９．８μｍｏｌ／Ｌ、６．８μｍｏｌ／Ｌ、１．９μｍｏｌ／Ｌ、及び３．５μｍｏｌ／Ｌであった。一方、これらの化合物は、配列番号２で示されるポリペプチドを発現していないＨＥＫ細胞（ネガティブ・コントロール細胞）を用いた検討では、いずれも蛍光強度の上昇は検出されなかった。
これらの結果から、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化し、細胞内へカルシウムを流入させる作用を持つことがわかった。
実施例１７：ラット大脳皮質由来初代培養神経細胞における本発明ポリペプチド活性化剤の効果
実施例１３で得られたラット大脳皮質由来初代培養神経細胞に化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ、並びにＰＳを投与し、神経細胞内へのカルシウム流入を測定した。具体的には、細胞数を１×１０５細胞で用いた以外は、実施例１４に記載の方法で行なった。
その結果、化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ、並びにＰＳを最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した細胞では、添加直後から蛍光強度の上昇が検出された。各化合物の結果を図３に示す。
この結果から、本発明ポリペプチドの活性化剤である化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ、並びにＰＳは神経細胞にカルシウムを流入させる作用を持つこと、活性化した本発明ポリプチドを介し、神経細胞へのカルシウム流入が生じることがわかった。更に、実施例１４で示したＰＳによる神経細胞内へのカルシウム流入も、活性化した本発明ポリペプチドを介していることが確認された。
実施例１８：ラット海馬由来初代培養神経細胞における本発明ポリペプチド活性化剤の影響
以下、本発明に係る記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆効果を、神経細胞を用いた実験系での試験結果により示した。
記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆効果を検証するために、神経細胞における神経伝達の亢進作用を、実施例１６で見出された配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの投与により検討した。具体的には、実施例１３で得られたラット海馬由来初代培養神経細胞での自発的な興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣｓ）に対する化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの影響をホールセルパッチクランプ法を用いて検討した。ｓＥＰＳＣｓとは、神経細胞末端に存在するシナプス小胞が自発的に開口放出して神経伝達物質を放出し、その結果、放出された神経伝達物質を受容した神経細胞に発生する電流変化である。従って、ｓＥＰＳＣｓを測定することで、神経細胞間の神経伝達を測定することが可能になる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，７６，３１５９−３１６８，１９９６；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９，５３１１−５３２１，１９９９）。また、このｓＥＰＳＣｓを阻害することで、神経伝達が抑制されることが既に知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７２，１１６−１２４，２００３）。
具体的には、実施例１３で得られた細胞を、直径３５ｍｍの培養皿当たり約１×１０５個まき、１週間〜５週間培養した後、実験に供した。培養液は神経細胞用培養液（住友ベークライト）を用い、その他の培養操作は公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．２，Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｐ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｎｎ  ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９０）に従って実施した。ホールセル膜電位固定法により膜電位を−６０ｍＶに固定し、ＰＳ及び各化合物を投与したときに生じる全細胞電流を測定した（新パッチクランプ実験技術法、岡田泰伸  編、吉岡書店、２００１）。細胞外液は、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、１５ｍｍｏｌ／Ｌ−グルコース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．４）、２０μｍｏｌ／Ｌ−ビククリン（ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ）、及び１μｍｏｌ／Ｌ−ストリキニーネ（ｓｔｒｙｃｈｎｉｎｅ）を含む溶液を使用した。また、細胞内液は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−グルコン酸カリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＡＴＰ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２ＧＴＰ、及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ＝７．２５）を含む溶液を用いた。
その結果、化合物Ａ、Ｂ、及びＣの終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌ、並びに化合物Ｄの終濃度が１μｍｏｌ／Ｌになるように添加した神経細胞では、ｓＥＰＳＣｓの亢進が検出された。なお、ポジティブ・コントロールとしてＰＳの影響を検討したところ、上記の結果と同様にｓＥＰＳＣｓを亢進することが確認された。各化合物及びＰＳの結果を図４に示す。
以上の結果より、本発明ポリペプチドの活性化剤である化合物Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤは神経細胞における神経伝達の亢進を促すことが明らかになり、活性化した本発明ポリプチドを介し、神経細胞における神経伝達が亢進することが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明のスクリーニングツール又はスクリーニング方法によれば、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤として有用な物質をスクリーニングすることができる。また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞は、前記スクリーニング系を構築するのに有用である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月28日(2005.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、あるいは
（５）前記ポリペプチド（１）〜（４）の少なくともいずれか１つを発現している細胞
からなる、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤スクリーニングツール。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載のスクリーニングツールに試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを活性化させる物質を有効成分とする記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤。
【請求項４】
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド又は細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）製剤化工程を含む、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物の製造方法。
【請求項５】
（１）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（２）配列番号２、配列番号４、若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド、又は
（３）配列番号４若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列における１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、プレグネノロン・サルフェートにより活性化され、カルシウムイオン透過型のイオンチャネル活性を示すポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項９】
請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載のベクター、又は請求項８に記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項５に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項５に記載のポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（ｂ）チャネル活性を分析する工程、及び
（ｃ）チャネルを活性化させる物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドを活性化させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項２に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）を有効成分として含む、記憶改善剤、学習能力改善剤、及び／又は抗痴呆剤。
【請求項１２】
請求項２に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質（但し、プレグネノロン・サルフェートを除く）の、記憶改善、学習能力改善、及び／又は抗痴呆用医薬組成物製造のための使用。
【国際調査報告】
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