(57)【要約】ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子を同定し、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子の遺伝的多型性を指標としたウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とし、この目的を達成するために、血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９において、５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されているか否かを指標として、被験ウシが血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患しているか否かを診断し、エクソン９における置換の有無は、例えば、エクソン９のうち、５番目の塩基ｃを含む領域又はａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列を含む領域を増幅し得るプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片の有無、塩基長又は塩基配列に基づいて検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなり、血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む請求項２記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
下記（ｅ）又は（ｆ）に示すアミノ酸配列において、２９０番目のアミノ酸ＰｈｅがＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、６２番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｌｅｕへの置換、１１４番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、１５５番目のアミノ酸Ｈｉｓのアミノ酸Ａｒｇへの置換、２１９番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、及び６１５番目のアミノ酸Ｖａｌのアミノ酸Ｌｅｕへの置換のいずれか１以上の置換が加えられたアミノ酸配列
【請求項５】
請求項４記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
下記（ｇ）又は（ｈ）に示す塩基配列において、１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列からなるＤＮＡを含む請求項５記載の遺伝子。
（ｇ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列
（ｈ）前記（ｇ）に示す塩基配列において、５１４番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、５３９番目の塩基ａの塩基ｃへの置換、６９５番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、７９０番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、８１９番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、８７１番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、９７９番目の塩基ｃの塩基ｇへの置換、１０１０番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、１０２１番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、１９７８番目の塩基ｃの塩基ａへの置換、２１８５番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、２１９７番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、及び２１９８番目の塩基ｇの塩基ｔへの置換のいずれか１以上の置換が加えられた塩基配列
【請求項７】
請求項２、３、５又は６記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項１又は４記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項１０】
請求項４記載のタンパク質のうち、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列を含む領域に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項１１】
血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９において、５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されているか否かを指標として、被験ウシが血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患しているか否かを診断する工程を含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法。
【請求項１２】
前記エクソン９のうち、５番目の塩基ｃを含む領域又はａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列を含む領域を増幅し得るプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片の有無、塩基長又は塩基配列に基づいて、前記置換の有無を検出する請求項１１記載の診断方法。
【請求項１３】
下記（ｌ）、（ｍ）又は（ｎ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断用キット。
（ｌ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号１記載の塩基配列において１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
【請求項１４】
下記（ｏ）、（ｐ）又は（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断用キット。
（ｏ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号１０記載の塩基配列において４０８番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ウシ血液凝固第ＸＩ因子及び該ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子の遺伝的多型性を指標としたウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットに関する。
【背景技術】  血液凝固は、損傷、化学物質、サイトカイン、炎症等により血管内皮細胞が活性化し、血管細胞由来の組織因子（ＴＦ）に血液が暴露することにより開始される（Ｗｅｉｓｓ  ＨＪら，Ｂｌｏｏｄ．１９８９  Ｍａｒ；７３（４）：９６８−７５）。ＴＦは、セリンプロテアーゼである活性型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と複合体（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａｓｅ）を形成し、この複合体が第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化する（Ｌａｗｓｏｎ  ＪＨら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１  Ｊｕｎ  １５；２６６（１７）：１１３１７−２７）。そして、活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）がトロンビンを産生する。トロンビンはフィブリノーゲンからフィブリンを生成し、血液凝固が誘導される（Ｂｕｔｅｎａｓ  Ｓら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  Ａｕｇ  ２２；２７２（３４）：２１５２７−３３）。また、トロンビンの一部は、血小板や、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）のそれぞれの補因子である第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及び第Ｖ因子（ＦＶ）を活性化する。その一方、トロンビンの一部は、凝固抑制補因子の一つであるトロンボモジュリンと結合する。この作用により、動的な抑制システムが働き、ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａｓｅを不活化するＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐａｓｗａｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）（Ｇｉｒａｒｄ  ＴＪら，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ａｐｒ  ６；３３８（６２１５）：５１８−２０）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を不活化するプロテインＣ（Ｅｓｍｏｎ  ＣＴら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９３；２２２：３５９−８５）、そして、抑制因子を促進するプロテインＳが活動し始める（Ｅｓｍｏｎ  ＣＴ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８７  Ｍａｒ  １３；２３５（４７９４）：１３４８−５２）。
したがって、ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａｓｅが少量の活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）やトロンビンを一旦産生すると、この抑制機構が働き、ＴＦＰＩやプロテインＣによりＴＦ経路は速やかに抑制され、さらなる活性型第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、活性型第Ｘ因子（ＦＸａ）及びトロンビンの産生は妨げられる。その時点で、トロンビンはフィブリン形成を引き起こすのに必要量産生されているが十分ではない。そこで、ＴＦ経路で生成されたトロンビンの一部は正のフィードバック作用により血漿中のＦＸＩを活性化し、活性型第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）は第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を活性化し、以下順次凝固活性を起こし大量のトロンビンが形成されていく（Ｋｅｕｌａｒｔｓ  ＩＭら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１  Ｊｕｎ；８５（６）：１０６０−５，Ｗａｌｓｈ  ＰＮ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００１  Ｊｕｌ；８６（１）：７５−８２）。また、活性型第ＸＩ因子（ＦＸＩａ）は自己活性能を持っており、これがトロンビン−第ＸＩ因子（ＦＸＩ）経路に大きく関与している（Ｍａｒｔｉｎｃｉｃ  Ｄら，Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｎｏｖ  １５；９４（１０）：３３９７−４０４，Ｈｓｕ  ＴＣら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｍａｙ  ２９；２７３（２２）：１３７８７−９３）。この一連の反応により生成されたトロンビンにより、ＴＦ経路の止血反応強化が行われる。
トロンビンのほとんどは血餅形成後にＦＸＩ活性化によるＦＸＩ経路で作られる。つまり、血液凝固はＴＦ経路により開始し、ＦＸＩ経路により維持、継続される。最近、ＦＸＩ経路によって多量に生成されたトロンビンはｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＡＦＩ）と呼ばれるものを活性化することが報告された。この活性化ＴＡＦＩは線溶系因子であるプラスミノーゲンの活性化を抑制し、線溶活性を抑制する。ＴＡＦＩはＦＸＩ依存性因子であり、ＦＸＩは凝固因子としてだけでなく、線維溶解系における抑制因子としても働いている（Ｂｏｕｍａ  ＢＮら，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０００  Ｓｅｐ；７（５）：２６６−７２，Ｂｏｕｍａ  ＢＮら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９８  Ｊｕｌ；８０（１）：２４−７）。
血液凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ）は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、高分子キニノゲン（ＨＫ）とともに内因性凝固系の開始に関与する接触相に関与している。肝実質細胞で合成され、その血中濃度は２〜７μｇ／ｍＬ（平均４μｇ／ｍＬ）で、新生児期はこの半分、血中半減期は４０〜８０時間である（Ｓａｉｔｏ  Ｈ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１９８７  Ｊａｎ；１３（１）：３６−４９）。血中でＨＫと非共有結合の形で複合体を形成しており、単独では異物面に吸着せず、ＨＫを介して結合する（斎藤英彦，日本臨床５３広範囲血液・尿化学検査・免疫学的検査（中巻）８４−８６，１９９５）。
ヒト血液凝固第ＸＩ因子（ヒトＦＸＩ）は、分子量８０ｋＤａの２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合した分子量１６０ｋＤａの２量体の糖タンパク質で（斎藤英彦，「日本臨床」，１９９９年増刊号，第５７巻，ｐ．６１９−６２１；藤川和雄ら，「医学のあゆみ」，１９９２年，第１６０巻，ｐ．５４２−５４５）、各単量体は６０７アミノ酸からなり、ＦＸＩＩａ、トロンビン、ＦＸＩａ等の作用により、Ａｒｇ３６９−Ｉｌｅ３７０間が開裂して活性化し、セリンプロテアーゼであるＦＸＩａとなる。ヒトＦＸＩは、２つの重鎖（５０ｋＤａ）と２つの軽鎖（３０ｋＤａ）から構成され、Ｎ末端に位置する重鎖は、アップルドメインと呼ばれる９０又は９１アミノ酸からなる４回繰り返し構造を持ち（Ａ１〜Ａ４）、Ｃ末端に位置する軽鎖は活性中心のセリン残基をもつ（フジカワ（Ｆｕｊｉｋａｗａ）Ｋら，「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，１９８６年，第２５巻，ｐ．２４１７−２４参照）。重鎖にある４つのアップルドメインのうちＡ１にはＨＫ及びトロンビンとの結合サイトが存在し、Ａ２、Ａ３にはＦＩＸとの結合サイトが存在し、Ａ４にはＦＸＩＩａとの結合サイト、２量体形成のサイトが存在する。また、Ａ３には血小板やヘパリンとの結合に関与するサイトも存在する。
ヒトＦＸＩ遺伝子は、全長約２３ｋｂあり、第４番染色体上の長椀４ｑ３５に存在する（カトー（Ｋａｔｏ）Ａら，「サイトジェネティックス  アンド  セル  ジェネティックス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，１９８９年，第５２巻，ｐ．７７−８参照）。１５個のエクソンと１４個のイントロンとからなり、エクソン１は５’非翻訳領域、エクソン２からエクソン１５の途中までが転写領域である。ＦＸＩは分泌性タンパク質であり、ヒトＦＸＩ遺伝子のうち、エクソン２は疎水性アミノ酸を多く含むシグナルペプチドをコードしている。シグナルペプチドはＦＸＩが細胞外に放出される際に切断されるので（ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ＰＮ．ら，「トロンボシス  アンド  ハエモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」，２００１年，第８６巻，ｐ．７５−８２参照）、成熟ＦＸＩをコードする領域はエクソン３からエクソン１５の途中までである。アップルドメインはイントロンにより分離されており、アップルドメイン内には１つのイントロンがある。このイントロンの位置は４つのアップルドメインに共通であることから、ヒトＦＸＩの重鎖をコードするＤＮＡはアップルドメインの遺伝子重複により生じたと推定される（ガイラニ（Ｇａｉｌａｎｉ）Ｄら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９７年，第９０巻，ｐ．１０５５−６４；アサカイ（Ａｓａｋａｉ）Ｒら，「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９８７年，第２６巻，ｐ．７２２１−８参照）。
ＦＸＩはヒトの他、ウサギやウシ、ブタ、イヌ、マウス等の哺乳動物の血漿に含まれるが、クジラ、サメ類、カエル、トリ類には含まれず、ウマではその含量は低い。ウシ、ブタ、マウスでもホモ２量体を形成するが、ウサギでは単量体の形で存在する（ガイラニ（Ｇａｉｌａｎｉ）Ｄら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９７年，第９０巻，ｐ．１０５５−６４参照）。
先天性血液凝固第ＸＩ因子欠乏症（先天性ＦＸＩ欠乏症）は１９５３年にＲｏｓｅｎｔｈａｌらによりヒトで最初に報告され、続いて１９６９年にＫｏｃｉｂａらによりウシ（ホルスタイン）で（コチバ（Ｋｏｃｉｂａ）ＧＪら，「ジャーナル  オブ  ラボラトリー  アンド  クリニカル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９６９年，第７４巻，ｐ．３７−４１参照）、１９７１年にＤｏｄｄｓらによりイヌで報告されている（ドッズ（Ｄｏｄｄｓ）ＷＪら，「ジャーナル  オブ  ラボラトリー  アンド  クリニカル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９７１年，第７８巻，ｐ．７４６−５２参照）。
ヒトにおける症状は、基本的に外傷や外科的手術による異常出血であり、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠乏症）や血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症）のような紫斑、鼻出血、血尿、消化管出血、関節内血腫等の自然出血はごく稀である（朝海怜，「医学のあゆみ」，１９９２年，第１６０巻，ｐ．５４２−５４５参照）。出血の程度は無症状の者から輸血や、凝固因子製剤の補充療法を必要とするような重度のものまで幅が広い（ボルトン−マッグス（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｍａｇｇｓ）ＰＨ，「ハエモフィア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）」，２０００年，第１巻，ｐ．１００−９；ボルトン−マッグス（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｍａｇｇｓ）ＰＨ，「ハエモフィア（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）」，１９９８年，第４巻，ｐ．６８３−８参照）。その多様性の原因として遺伝子変異の間の差によるものが挙げられる。
ＦＸＩ欠乏症に関し、現在までに数百例が報告されているが、そのほとんどがアシュケナージ系（ドイツ、ポーランド、ロシア）ユダヤ人であり、少ないが日本人、韓国人、イタリア人、中国人、ドイツ人等の報告もある。また、イギリスでは地域的な多発が報告されている。アシュケナージ系ユダヤ人では１／１９０人が重度のＦＸＩ欠乏症であり、１／８人が保因者（キャリア）である。そして、少なくとも以下の４タイプの変異が確認されている。（朝海怜，「医学のあゆみ」，１９９２年，第１６０巻，ｐ．５４２−５４５；長尾大，「別冊日本臨床領域別症候群２１」，１９９８年，ｐ．４４５−４４８；セリグソン−（Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ）Ｕら，「トロンボシス  アンド  ハエモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」，１９９４年，第２４巻，ｐ．８１−５；セリグソン（Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ）Ｕら，「トロンボシス  アンド  ハエモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」，１９９３年，第７０巻，ｐ．６８−７１；アサカイ（Ａｓａｋａｉ）Ｒら，「プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，１９８９年，第８６巻，ｐ．７６６７−７１；アストリド（Ａｓｔｒｉｄ）ら，「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ハエマトロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」，２００１年，第１１４巻，ｐ．８７５−８７７；メイジェルス（Ｍｅｉｊｅｒｓ）ＪＣら，「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９２年，第７９巻，ｐ．１４３５−４０参照）。
（ｉ）ｔｙｐｅＩ変異：ｍＲＮＡのプロセッシングの異常をきたしたものである。スプライシング供与部のイントロン配列は常にＧＴ−ＡＧでイントロン除去機構に必要だが、最終イントロンのＧＴがＡＴに置換し、そのためイントロンが除去されず異常蛋白が生成される。
（ｉｉ）ｔｙｐｅＩＩ変異：ナンセンス変異である。１１７番目のグルタミン酸に対応する暗号ＧＡＡのＧがＴに置換したため終止コドンのＴＡＡに変わっている。このｍＲＮＡが翻訳されるとアップルドメインがほぼ１個半の短いポリペプチド鎖が合成される。
（ｉｉｉ）ｔｙｐｅＩＩＩ変異：ミスセンス変異である。４番目のアップルドメインに含まれる２８３番目のフェニルアラニンに対応する暗号ＴＣＣの３’末端塩基Ｃが、Ｔに置換してロイシンの暗号ＴＣＴに変わったものである。この変異によってＡ４の２量体形成不全が起こりＦＸＩの活性が低下したものと考えられる。
（ｉｖ）ｔｙｐｅＩＶ変異：最終イントロンのスプライシング供与部領域で１４ｂｐの欠失を起こしているものである。
血液凝固第ＸＩ因子欠乏症は、外傷、手術後の異常出血や、部分活性トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の延長等で発見されることが多い。ＦＸＩ活性が１５％以下の重度欠乏症例では、極端なＡＰＴＴの延長が見られるが、ヘテロ接合体のＡＰＴＴは正常のことがあり、ＡＰＴＴによるスクリーニングは難しい。また、ヘテロ接合体のＦＸＩ活性の平均値は正常平均値より有意に低いが、ＦＸＩ活性が正常範囲の者も多いので、ＦＸＩ活性による保因者の診断は難しい。そこで、ヒトにおけるＦＸＩ診断はＤＮＡマーカーを用いた遺伝子診断により行われており、これによりホモ接合体とヘテロ接合体とが確実に診断されている。
ウシ（ホルスタイン種）におけるＦＸＩ欠乏症は、ヒトと同様に常染色体劣性遺伝であるが、その原因となる変異は同定されていない（ジェントリー（Ｇｅｎｔｒｙ）ＰＡら，「ジャーナル  オブ  デイリー  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」，１９８０年，第６３巻，ｐ．６１６−２０参照）。また、無症状から出血傾向を示すものまで様々である（ジェントリー（Ｇｅｎｔｒｙ）ＰＡら，「カナディアン  ベテリナリー  ジャーナル（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，１９７５年，第１６巻，ｐ．１６０−３参照）。出血症状としては、関節内血腫が疑われている橈骨手根関節の腫大（コチバ（Ｋｏｃｉｂａ）ＧＪら，「ジャーナル  オブ  ラボラトリー  アンド  クリニカル  メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９６９年，第７４巻，ｐ．３７−４１参照）、肺、腸、腸間膜、大脳、脊椎の出血、除角後の出血、各臓器における点状出血、産後の子宮内血腫、筋肉出血等が数例報告されている（ジェントリー（Ｇｅｎｔｒｙ）ＰＡら，「カナディアン  ベテリナリー  ジャーナル（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，１９９４年，第５８巻，ｐ．２４２−７参照）。その上、繁殖に関する症例も報告されている。ＦＸＩ欠乏症の雌牛では、胎子や仔牛の生存率の低下や、リピートブリーダー、発情周期の遅延等が認められている。流産や死産、生後４８時間以内での死亡が発生しているが、その原因は明らかとなっていない。発情周期は正常牛（２２．９±３．０日）に比べ、２４．７±２．１日と遅延し、これは卵胞発育遅延（正常：４．０５±０．６３日、発症：５．１４±０．６９日）に起因していることが明らかとなっている（リプトラプ（Ｌｉｐｔｒａｐ）ＲＭら，「ベテリナリー  リサーチ  コミュニケイションズ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９５年，第１９巻，ｐ．４６３−７１参照）。また、ＦＸＩ欠乏症のウシは、乳房炎、慢性肺炎、慢性皮膚炎等の感染症にかかり易く、これは好中球表面での接触活性系の機能の多様性に関係していると考えられている（コンバー（Ｃｏｏｍｂｅｒ）ＢＬら，「ベテリナリー  イムノロジー  アンド  イムノパソロジー（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」，１９９７年，第５８巻，ｐ．１２１−３１．参照）。
ウシにおけるＦＸＩ欠乏症の診断は、ヒトと同様に血液検査を行うことにより、凝固遅延に基づき診断されることが多い。やはり、ウシにおいてもヘテロ個体は、そのＡＰＴＴ及びＦＸＩ活性が正常範囲とオーバーラップしており、それらにより確実に診断することは困難である（ジェントリー（Ｇｅｎｔｒｙ）ＰＡ，「カナディアン  ジャーナル  オブ  コンパラティブ  メディシン（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，１９８４年，第４８巻，ｐ．５８−６２参照）。上述したように、ヒトＦＸＩ遺伝子の塩基配列は既に同定されており、遺伝子診断も可能となっているが、ウシＦＸＩ遺伝子は未だ同定されていない。したがって、ウシＦＸＩ欠乏症の候補遺伝子であるＦＸＩ遺伝子を同定するとともに、ＦＸＩ遺伝子おいてウシＦＸＩ欠乏症の原因となる変異を同定し、ウシＦＸＩ欠乏症の遺伝子診断方法を開発することが求められている。
【発明の開示】
本発明は、第一に、ウシ血液凝固第ＸＩ因子、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びウシ血液凝固第ＸＩ因子に対する抗体又はその断片を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子の遺伝的多型性を指標としたウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体又はその断片、並びにウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットを提供する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなり、血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（２）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すアミノ酸配列において、２９０番目のアミノ酸ＰｈｅがＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、６２番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｌｅｕへの置換、１１４番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、１５５番目のアミノ酸Ｈｉｓのアミノ酸Ａｒｇへの置換、２１９番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、及び６１５番目のアミノ酸Ｖａｌのアミノ酸Ｌｅｕへの置換のいずれか１以上の置換が加えられたアミノ酸配列
（５）前記（４）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（６）下記（ｇ）又は（ｈ）に示す塩基配列において、１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列からなるＤＮＡを含む前記（５）記載の遺伝子。
（ｇ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列
（ｈ）前記（ｇ）に示す塩基配列において、５１４番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、５３９番目の塩基ａの塩基ｃへの置換、６９５番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、７９０番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、８１９番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、８７１番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、９７９番目の塩基ｃの塩基ｇへの置換、１０１０番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、１０２１番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、１９７８番目の塩基ｃの塩基ａへの置換、２１８５番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、２１９７番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、及び２１９８番目の塩基ｇの塩基ｔへの置換のいずれか１以上の置換が加えられた塩基配列
（７）前記（２）、（３）、（５）又は（６）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（８）前記（７）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）前記（１）又は（４）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（１０）前記（４）記載のタンパク質のうち、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列を含む領域に反応し得る抗体又はその断片。
（１１）血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９において、５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されているか否かを指標として、被験ウシが血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患しているか否かを診断する工程を含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法。
（１２）前記エクソン９のうち、５番目の塩基ｃを含む領域又はａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列を含む領域を増幅し得るプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片の有無、塩基長又は塩基配列に基づいて、前記置換の有無を検出する前記（１１）記載の診断方法。
（１３）下記（ｌ）、（ｍ）又は（ｎ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断用キット。
（ｌ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号１記載の塩基配列において１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（１４）下記（ｏ）、（ｐ）又は（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断用キット。
（ｏ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号１０記載の塩基配列において４０８番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
【図面の簡単な説明】  図１は、ＦＸＩ遺伝子の構造と、ウシＦＸＩ遺伝子及びヒトＦＸＩ遺伝子の各イントロンのサイズを示す図である。
図２は、ウシＦＸＩ遺伝子において確認された多型（１塩基置換、１塩基置換＋１５塩基挿入）を示す図である。
図３は、Ａ県の黒毛和種における止血スクリーニング検査結果とＦＸＩ遺伝子診断結果を示す図である。
図４は、Ｂ県の黒毛和種における止血スクリーニング検査結果とＦＸＩ遺伝子診断結果を示す図である。
図５は、Ｃ県の黒毛和種における止血スクリーニング検査結果とＦＸＩ遺伝子診断結果を示す図である。
図６は、Ｄ県（図６（Ａ））及びＥ県（図６（Ｂ））の黒毛和種における止血スクリーニング検査結果とＦＸＩ遺伝子診断結果を示す図である。
図７は、正常個体、キャリア個体及びＦＸＩ欠乏症発症個体において、ＦＸＩ遺伝子のエクソン９の１５塩基挿入部位を含む領域を増幅させて得られた増幅断片の電気泳動結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の第一のタンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなり、血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、血液凝固第ＸＩ因子活性を有するウシ血液凝固第ＸＩ因子である。本発明において「血液凝固第ＸＩ因子活性」とは、活性化血液凝固第ＸＩ因子が血液凝固第ＩＸ因子を活性化する作用を意味し、血液凝固第ＸＩ因子活性は、例えば、ウシクエン酸血漿がヒト血液凝固第ＸＩ因子欠乏血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間を補正する効果を、ウシ標準血漿の希釈系列を用いた場合の補正効果と比較して、その比率（％）で表示することができる。
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、血液凝固第ＸＩ因子活性が保持される限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜５０個、好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１〜１０個である。このとき、変異が加えられたアミノ酸配列は、配列番号２記載のアミノ酸配列と通常９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有する。
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、血液凝固第ＸＩ因子活性が保持される限り特に限定されるものではない。例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列において、６２番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｌｅｕへの置換、１１４番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、１５５番目のアミノ酸Ｈｉｓのアミノ酸Ａｒｇへの置換、２１９番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、及び６１５番目のアミノ酸Ｖａｌのアミノ酸Ｌｅｕへの置換のいずれか１以上の置換を加えることができる。また、配列番号２記載のアミノ酸配列において１〜１８番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであるので、１〜１８番目のアミノ酸配列が欠失しても血液凝固第ＸＩ因子活性は保持される。
配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質には、配列番号２記載のアミノ酸配列に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、ウシにおいて遺伝的多型性によって生じ得るタンパク質が挙げられる。なお、上記に例示した置換は、ウシにおいて遺伝的多型性によって生じ得る置換である。
本発明の第二のタンパク質は、下記（ｅ）又は（ｆ）に示すアミノ酸配列において、２９０番目のアミノ酸ＰｈｅがＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（ｅ）配列番号２記載のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２記載のアミノ酸配列において、６２番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｌｅｕへの置換、１１４番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、１５５番目のアミノ酸Ｈｉｓのアミノ酸Ａｒｇへの置換、２１９番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、及び６１５番目のアミノ酸Ｖａｌのアミノ酸Ｌｅｕへの置換のいずれか１以上の置換が加えられたアミノ酸配列
本発明の第二のタンパク質において、シグナルペプチド（配列番号２記載のアミノ酸配列のうち１〜１８番目のアミノ酸配列）が欠失していてもよい。
本発明の第二のタンパク質は、血液凝固第ＸＩ因子活性を有しないウシ血液凝固第ＸＩ因子である。血液凝固第ＸＩ因子活性を有しない血液凝固第ＸＩ因子のみを産生し、血液凝固第ＸＩ因子活性を有する血液凝固第ＸＩ因子を産生し得ないウシは、血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患する。
本発明の第一及び第二のタンパク質には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、本発明の第一及び第二のタンパク質には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
本発明の第一又は第二のタンパク質をコードする遺伝子は、例えば、ウシの細胞又は組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、ウシの細胞又は組織（例えば、肝臓等）から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等を使用できる。
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等を使用できる。
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１記載の塩基配列に基づいて設計できる。
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。
本発明の第一又は第二のタンパク質をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームとその３’末端に位置する終止コドンとを含む。また、本発明の第一又は第二のタンパク質をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５’末端側又は終止コドンの３’末端側に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
本発明の第一のタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血液凝固第ＸＩ因子活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列は、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは３５６〜３５８番目の塩基配列に位置し、終止コドンは２２３１〜２２３３番目の塩基配列に位置し、シグナルペプチドは３５６〜４０９番目の塩基配列にコードされる。本発明の第一のタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、本発明の第一のタンパク質をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列に限定されるものではない。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。具体的には、配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列において、５１４番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、５３９番目の塩基ａの塩基ｃへの置換、６９５番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、７９０番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、８１９番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、８７１番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、９７９番目の塩基ｃの塩基ｇへの置換、１０１０番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、１０２１番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、１９７８番目の塩基ｃの塩基ａへの置換、２１８５番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、２１９７番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、及び２１９８番目の塩基ｇの塩基ｔへの置換のいずれか１以上の置換が加えられた塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
本発明の第二のタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、下記（ｇ）又は（ｈ）に示す塩基配列において、１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
（ｇ）配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜２２３０番目の塩基配列
（ｈ）前記（ｇ）に示す塩基配列において、５１４番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、５３９番目の塩基ａの塩基ｃへの置換、６９５番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、７９０番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、８１９番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、８７１番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、９７９番目の塩基ｃの塩基ｇへの置換、１０１０番目の塩基ａの塩基ｇへの置換、１０２１番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、１９７８番目の塩基ｃの塩基ａへの置換、２１８５番目の塩基ｃの塩基ｔへの置換、２１９７番目の塩基ｔの塩基ｃへの置換、及び２１９８番目の塩基ｇの塩基ｔへの置換のいずれか１以上の置換が加えられた塩基配列
１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されることにより、２９０番目のアミノ酸ＰｈｅがＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列に置換される。
本発明の第一又は第二のタンパク質をコードする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
アミノ酸配列又は塩基配列に対する欠失、置換、付加等の変異の人為的な導入は、例えば、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて行うことができる。この際、市販の変異導入用キット、例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いることができる。
本発明の第一又は第二のタンパク質は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１等の大腸菌や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ  １１４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ２０７−２１等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を使用できる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉＮ４等が挙げられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ  Ｆ１２培地、Ｈａｍ  Ｆ１２Ｋ培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる形質転換体の培養は、通常２７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等が挙げられる。
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
こうして得られるタンパク質は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
本発明の第一又は第二のタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
本発明の抗体又はその断片は、本発明の第一又は第二のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片である。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体の断片」には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が含まれる。
本発明の第二のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片は、本発明の第二のタンパク質のうち、Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅで示されるアミノ酸配列を含む領域に反応し得ることが好ましい。このような抗体又はその断片を利用することにより、血液凝固第ＸＩ因子活性を有しないウシ血液凝固第ＸＩ因子を特異的に検出することができる。
本発明の抗体又はその断片は、本発明の第一又は第二のタンパク質を免疫用抗原として利用することより作製できる。免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）本発明の第一又は第二のタンパク質を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）遺伝子組換え技術を用いて、本発明の第一又は第二のタンパク質をコードする遺伝子を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を使用できる。
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できる。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは４日〜３週間間隔で、合計２〜８回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終免疫日から３〜１０日後に、本発明の第一又は第二のタンパク質に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：１〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングできる。
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
本発明のウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法は、血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９において、５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されているか否かを指標として、被験ウシが血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患しているか否かを診断する工程を含む。
血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９は、配列番号１又は１０記載の塩基配列のうち、それぞれ１２２１〜１３８３番目、４０４〜５６６番目の塩基配列に相当し、エクソン９の５番目の塩基ｃは、配列番号１又は１０記載の塩基配列のうち、それぞれ１２２５番目、４０８番目の塩基に相当する。
配列番号１０記載の塩基配列は、血液凝固第ＸＩ因子をコードするウシゲノムＤＮＡの一部に相当し、配列番号１０記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン７の一部に、２０１〜３１０番目の塩基配列がエクソン８に、３１１〜４０３番目の塩基配列がイントロン８に、４０４〜５６６番目の塩基配列がエクソン９に、５６７〜６５５番目の塩基配列がイントロン９に、６５６〜７６２番目の塩基配列がエクソン１０に、７６３〜９６２番目の塩基配列がイントロン１０の一部に相当する。
血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９において、５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されることにより、血液凝固第ＸＩ因子は不活性化する。血液凝固第ＸＩ因子欠乏症は、いずれの相同染色体にコードされる血液凝固第ＸＩ因子も不活性化することにより発症する。
被験ウシのいずれの相同染色体においても、血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９の５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換されている場合、被験ウシは、不活性化した血液凝固第ＸＩ因子のみを産生し、活性を有する血液凝固第ＸＩ因子を産生し得ないので、血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患していることとなる。
また、このような置換が被験ウシの一方の相同染色体のみに生じている場合、被験ウシは、活性を有する血液凝固第ＸＩ因子を産生し得るので、血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患していないこととなる。但し、この場合、被験ウシはキャリア個体であり、その被験ウシを親とするウシは血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患するおそれがある。
また、このような置換が被験ウシのいずれの相同染色体においても生じていない場合、被験ウシは正常なウシであり、血液凝固第ＸＩ因子欠乏症に罹患していないこととなる。
血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９における置換の有無は、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用して検出できる。
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、下記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用でき、遺伝子増幅技術を利用する際には、下記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。
（ｌ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｍ）配列番号１記載の塩基配列のうち１２２５番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｎ）配列番号１記載の塩基配列において１２２５番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｏ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃに隣接する領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｐ）配列番号１０記載の塩基配列のうち４０８番目の塩基ｃを含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
（ｑ）配列番号１０記載の塩基配列において４０８番目の塩基ｃがａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列に置換された塩基配列のうち、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列の一部又は全部を含む領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
上記（ｌ）又は（ｏ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおいて、「塩基ｃに隣接する」とは、塩基ｃとの距離が通常０〜１０００塩基長、好ましくは０〜５００塩基長、さらに好ましくは０〜２００塩基長であることを意味する。
上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常１０〜５０塩基、好ましくは１０〜３０塩基である。また、上記（ｌ）〜（ｑ）に示すポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは２００〜８００塩基である。
上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、所定領域に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１又は１０記載の塩基配列に基づいて設計でき、その５’末端又は３’末端には制限酵素認識配列、タグ、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加できる。
血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子のエクソン９における置換の有無は、例えば、エクソン９のうち、５番目の塩基ｃを含む領域又はａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで示される塩基配列を含む領域を増幅し得るプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片の有無、塩基長又は塩基配列に基づいて検出できる。
核酸増幅反応としては、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅反応を利用できる。増幅の際、被験ウシのゲノムＤＮＡを鋳型とする場合には、上記（ｏ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。また、被験ウシのｃＤＮＡを鋳型とする場合には、上記（ｌ）〜（ｎ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。なお、被験ウシのｃＤＮＡは、被験ウシの細胞又は組織から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することにより得られる。
上記（ｌ）又は（ｏ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用する場合、エクソン９における置換の有無にかからわず、増幅断片を得ることができる。エクソン９における置換の有無によって、増幅断片の塩基長及び塩基配列が異なるので（例えば、エクソン９に置換が生じていると、置換が生じてない場合と比較して、増幅断片の塩基長が１５塩基長くなる）、増幅断片の塩基長又は塩基配列に基づいて、エクソン９における置換の有無を検出できる。増幅断片の塩基長の相違は電気泳動、サザンブロット法等を利用して検出できる。また、増幅断片の塩基配列の相違はプローブとのハイブリダイズの有無に基づいて検出できる。この際、プローブとしては、上記（ｍ）、（ｎ）、（ｐ）又は（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを利用できる。また、増幅断片の塩基配列の相違は、制限酵素による切断断片の塩基長の相違（制限断片長多型）に基づいて検出できる。
上記（ｍ）又は（ｐ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用する場合、エクソン９に置換が生じていない場合にのみ増幅断片が得られ、置換が生じている場合には増幅断片が得られないので、増幅断片の有無に基づいて、エクソン９における置換の有無を検出できる。
上記（ｎ）又は（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用する場合、エクソン９に置換が生じている場合にのみ増幅断片が得られ、置換が生じていない場合には増幅断片が得られないので、増幅断片の有無に基づいて、エクソン９における置換の有無を検出できる。
本発明のウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断用キットは、上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。本発明の診断用キットは、上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのうち、１種類のみを含んでいてもよいし、２種類以上を含んでいてもよい。本発明の診断用キットは、上記（ｌ）〜（ｑ）に示すオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。本発明の診断用キットは、例えば、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の検出に必要な試薬（例えば、ＲＩ、蛍光色素等）、電気泳動に必要な器具及び試薬、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
〔実施例１〕ウシ血液凝固第ＸＩ因子遺伝子（ウシＦＸＩ遺伝子）のクローニング
１．材料と方法
（１）プローブの作製
スクリーニング用プローブとして、マウスＦＸＩｃＤＮＡ断片（５’側４０５ｂｐ）を用いた。この断片はマウスのＥＳＴ配列に基づいて作製されたクローン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−中で維持されていた。このクローンを制限酵素ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、０．７％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、目的の断片をゲルから取り出した。そして、フェノール処理、クロロフォルム処理及びエタノール沈澱により精製した。精製したｃＤＮＡ断片は電気泳動した後、濃度を測定して２５ｎｇ／μｌに希釈し、ハイブリダイゼーション用プローブとして用いた。
（２）フィルターの作製
ｃＤＮＡライブラリーとして、Ｕｎｉ−Ｚａｐ  ＸＲベクターにより構築されたウシ（ホルスタイン）肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いた。宿主菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）は、ＬＢ寒天培地（１５ｎｇ／μｌ：テトラサイクリン）で線画培養し、さらに０．２％マルトース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍｌのＬＢ培地で培養した後、遠沈して上清を取り除き、１０ｍｌの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４に懸濁した。
０．３ｍｌの宿主菌と０．３ｍｌのファージ液（３×１０５ｐｆｕ：ｐｌａｑｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）を混合し、３７℃で１５分間静置してファージを宿主菌に感染させた。これを５０℃に温めておいた８ｍｌのＮＺＣＹＭトップアガー（０．７％Ａｇｅｒ）に加え、１５０ｍｍプレートのＮＺＣＹＭ寒天培地に播種した。このプレートを１０枚作製し、３７℃で６〜８時間培養した後、４℃で１時間程冷却した。その後、プラーク上にＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）を置き、２分間プラークを吸着させた。プラークを吸着させた面を上にしてフィルターを順次０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液に１〜２分間、０．４Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液に２〜３分間、２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液に３〜４分間浸漬し、ＤＮＡを変性させた。ろ紙上で乾燥させた後、８０℃で２時間ＤＮＡを固定した。
（３）プラークハイブリダイゼーション
プローブのラベリングは、ランダムプライミングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ランダムプライム法により行った。マウスＦＸＩｃＤＮＡ断片を、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて３７℃で１〜２時間放射線標識し、スピンカラムＳ−３００ＨＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて未反応の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを分離した。
約３０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド）を電子レンジで熱処理した後、氷中で冷却し、プラークが吸着したフィルター１０枚を入れたハイブリダイゼーション用ビニールバックに加え、４２℃で振とうさせながら２時間以上反応させた。新たなプレハイブリダイゼーション溶液２０ｍｌにラベリングしたプローブ溶液を加え、ハイブリダイゼーション溶液とし、１００℃で５分間熱変性させた後、冷却した。ハイブリダイゼーション用ビニールバックからプレハイブリダイゼーション溶液を取り除いた後、ハイブリダイゼーション溶液を加えて、４２℃で振とうさせながら１２時間反応させた。反応終了後、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて室温で３０分間振とうしながら、フィルターの洗浄を２回繰り返した。次に、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液に移して４２℃で１時間振とうしながら洗浄した後、さらに０．１×ＳＳＣ溶液にて軽くすすぎ、ろ紙上で余分な水分を取り除いてから、増感紙に挟んで−８０℃でＸ線フィルムに露光させた。
１次スクリーニングより得られた陽性シグナルの位置をプレートと照らし合わせ、パスツールピペットを用いてそのポジティブプラークを含むトップアガーを採取し、１ｍｌ  ＳＭバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０１％ゼラチン）に懸濁し、４℃で１２〜１６時間静置してファージを溶出させた。このファージ溶液の力価を測定し、ＳＭバッファーで希釈した０．３ｍｌのファージ溶液（５×１０３ｐｆｕ）と０．３ｍｌの宿主菌の混合液を３７℃で１５分間反応させ、１次スクリーニングの場合と同様に、ＮＺＣＹＭ寒天培地に播種した後、フィルターにファージＤＮＡを固定し、ハイブリダイゼーションを行った。この２次スクリーニングで得られた陽性シグナルを、３次スクリーニングでは５×１０２ｐｆｕに、４次スクリーニングでは１×１０２ｐｆｕになるように希釈し、全クローンが陽性シグナルを示すまでスクリーニングを行った。
（４）ファージミドＤＮＡの抽出
スクリーニングにより得られたファージをヘルパーファージに感染させ、ファージミドＤＮＡを抽出した。ポジティブプラークを含むトップアガーを、パスツールピペットを用いて採取し、０．５ｍｌ  ＳＭバッファー、２０μｌクロロフォルム溶液に懸濁し、４℃で１２〜１６時間静置してファージを溶出させた。宿主菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）を５０ｍｌのＬＢ液体培地で培養した後、遠沈し、上清を捨て、ＯＤ６００＝１．０になるように１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４で懸濁した。
上記ファージ液２５０μｌ、宿主菌２００μｌ及びＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（＞１×１０６ｐｆｕ／μｌ）１又は１０μｌを１５ｍｌポリプロピレンチューブに加え、３７℃で１５分間静置して、ファージを宿主菌に感染させた。次いで、３ｍｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１２〜１６時間振とうし、６５〜７０℃で２０分間加熱し、２５００回転で１５分間遠心した後、インサートＤＮＡを持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋／−）ファージミドベクターを含む上清を新しいチューブに移した。この上清に含まれるファージミドベクターをクローニングするために、コンピテントセル（ＳＯＬＲ）に形質転換した。コンピテントセル（ＳＯＬＲ）は、ＬＢ寒天培地（７５ｎｇ／μｌ：カナマイシン）で線画培養し、０．２％マルトース及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍｌのＬＢ培地で培養した後、遠沈し、上清を捨て、ＯＤ６００＝１．０になるように１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４で懸濁した。
２００μｌのコンピテントセルと１０又は１００μｌの上清とを混合し、３７℃で１５分インキュベートした後、そのうち２００μｌをＬＢ寒天培地（３７．５ｎｇ／μｌ：アンピシリン）に播種し、３７℃で１２〜１６時間培養した。培養後、コロニーを３ｍｌのＬＢ液体培地（２５ｎｇ／μｌ：アンピシリン）に移し、３７℃で１２時間振とう培養した。
ファージミドＤＮＡはアルカリ−ＳＤＳ法により抽出した。培養した菌体１．５ｍｌを１．５ｍｌチューブに加え、４℃、１２０００回転の条件で２０秒間遠心分離し、上清を取り除き、再び残りの菌体１．５ｍｌを加え、４℃、１２０００回転の条件で２０秒間遠心分離し、完全に上清を取り除き、菌体を遠沈した。１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を加えてよく懸濁し、次に２００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ−ＩＩ（０．２Ｎ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ）を加えて軽くまぜ、氷上に５分間置いた。次に１５０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、１１．５％氷酢酸）を加えて軽く撹拌し、氷上に５分間置いた。４℃、１２０００回転の条件で５分間遠心分離し、上清を別のチューブに移し、等量のフェノール／クロロフォルム液を加えて撹拌した。４℃、１２０００回転の条件で５分間遠心分離し、上清を回収し、２倍量のエタノールを加えて室温にて５分間静置した後、４℃、１２０００回転の条件で５分間遠心分離し、ファージミドＤＮＡを沈澱させた。沈澱を７０％エタノール洗浄して乾燥し、２０μｌのＴＥ（２０ｎｇ／μｌ  ＲＮａｓｅを含む）に溶解して３７℃で２時間ＲＮａｓｅ処理をした。同時に抽出したファージミドＤＮＡの一部をＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩにて処理し、電気泳動によりｃＤＮＡ断片が組み込まれていることを確認した。
塩基配列の解析のために、ファージミドＤＮＡをポリエチレングリコール沈澱法により精製した。２０μｌのファージミドＤＮＡ溶液に３０μｌの２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えてよく撹拌し、氷上に１０分間静置した。４℃、１２０００回転の条件で５分間遠心分離した後、上清を取り除き、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、２０μｌのＴＥに溶解してシークエンス反応の鋳型ＤＮＡ溶液とした。
（５）塩基配列の決定
塩基配列の決定は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、ジデオキシターミネーター法により行った。上記操作により抽出したファージミドＤＮＡ（８００μｇ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクター用プライマー（Ｍ１３−２０又は、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー）２ｐｍｏｌ、各塩基のプレミックスシークエンス反応液及び滅菌蒸留水をあわせて計８μｌに調整し、９４℃で３０秒間、５７℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を１サイクルとし、２７サイクルのＰＣＲを行った。反応終了後、２μｌのホルムアミド色素液を加え、減圧乾燥により約２μｌまで反応液を濃縮した。
このシークエンス用サンプルをＤＮＡシークエンサー（ＳＱ５５００、ＨＩＴＡＣＨＩ）により解析した。２５ｍｌの６％Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ（１２％ＬｏｎｇＲａｎｇｅｒ、７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ）を５分間脱気し、２５μｌのＴＥＭＥＤ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）と１２５μｌの１０％過硫酸アンモニウムを加え、ゲルを作製した。予備泳動を１時間行った後、濃縮した泳動用のサンプルをゲル中にて３７℃、１４００Ｖの条件で８時間泳動させた。泳動後の塩基配列のデータ解析は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ（ソフトウェア株式会社）によって行った。
（６）デレーションミュータントの作製
スクリーニングにより約３ｋｂのｃＤＮＡ断片を組み込んだファージミドＤＮＡが単離された。このｃＤＮＡ断片の全長塩基配列を決定するのに、Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｃＤＮＡ断片をさまざまに削減したデレーションミュータントを作製した。
ファージミドＤＮＡ（１０μｇ）をｃＤＮＡ側が５’末端突出、ベクター側が３’末端突出になるよう、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩで消化し、環状ＤＮＡを１本鎖にした。等量のＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を入れ、遠心して上清を回収した後、等量のクロロフォルム／イソアミルアルコールを加え、遠心して上清を回収した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールとを加え、沈澱物を回収した。この沈澱物を１００μｌのＥｘｏＩＩＩ  Ｂｕｆｆｅｒで溶解し、１μｌ（１８０Ｕ）のＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩを加えてよく撹拌し、３７℃にて静置した。そして、４５秒毎に１０μｌずつ取り出し、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ反応を止めるために、１００μｌのＭＢ  Ｂｕｆｆｅｒの中に順次入れていき、６５℃で５分間静置してＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩを失活してから、３７℃に戻した。２μｌ（５０Ｕ）のＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを加え、３７℃で１５〜３０分間静置した後、フェノール／クロロフォルム処理、クロロフォルム処理を行い、５０μｌのＫｌｅｎｏｗ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解させた。１μｌのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で１５分間静置し、この溶液１０μｌと１２μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂとを１００μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａに加えてよく撹拌した後、１６℃で１２〜１６時間静置した。１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、エタノール沈澱、７０％エタノール洗浄を行った後、乾燥させ、ＴＥで溶解した。
次に、コノピテントセル（ＤＨ５α）２００μｌを氷中で速やかに溶かし、上記溶液を加えて氷中に３０分間置いた後、４２℃で正確に５０秒間静置して、すぐに２分間氷中に入れた。これを１ｍｌのＳＯＣ液体培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコース）に加え、３７℃で１時間培養した。培養液を室温、５０００回転の条件で５分間遠心分離して濃縮し、４％Ｘ−ｇａｌ及び０．１Ｍ  ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地（３７．５ｎｇ／μｌ：アンピシリン）に播種し、３７℃で１３〜１６時間培養した。その後、少量培養し、アルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを抽出し、ポリエチレングリコール沈澱法で精製した。シークエンスはジデオキシ法により行い、データは、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ（ソフトウェア開発株式会社）によって解析した。
２．結果
マウス横隔膜ｍＲＮＡに由来するＦＸＩｃＤＮＡをプローブとして、ウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、５個の陽性クローンが得られ、そのうち４個のクローンは、ヒトＦＸＩｃＤＮＡと高い相同性を有しており、ウシＦＸＩｃＤＮＡであると考えられた。その中の１つにＦＸＩｃＤＮＡ全域を含むと考えられる約３ｋｂのｃＤＮＡ断片を持つクローンが存在していた。そこで、このファージミドＤＮＡに組み込まれたＦＸＩｃＤＮＡの全塩基配列を決定するために、ＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅＩＩＩを用いて、５’末端側から３’末端の酵素削減により、様々な大きさのデレーションミュータント（３ｋｂｐ、２．８ｋｂｐ、２．６ｋｂｐ、２．１ｋｂｐ、１．８ｋｂｐ、１．６ｋｂｐ、１．２ｋｂｐ）を作製した。これにより約３ｋｂのｃＤＮＡ断片全領域をカバーするクローンが作製され、ウシＦＸＩｃＤＮＡの塩基配列が明らかとなった。
ウシＦＸＩｃＤＮＡはエクソン１〜エクソン１５を含み、全長２０４０ｂｐであり、そのうちアミノ酸をコードする領域はエクソン２〜エクソン１５の１８７５ｂｐの領域であった。
配列決定された約３ｋｂｐのｃＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１記載の塩基配列のうち、１９４〜３５５番目の塩基配列がエクソン１に、３５６〜４１０番目の塩基配列がエクソン２に、４１１〜５７３番目の塩基配列がエクソン３に、５７４〜６８０番目の塩基配列がエクソン４に、６８１〜８４０番目の塩基配列がエクソン５に、８４１〜９５０番目の塩基配列がエクソン６に、９５１〜１１１０番目の塩基配列がエクソン７に、１１１１〜１２２０番目の塩基配列がエクソン８に、１２２１〜１３８３番目の塩基配列がエクソン９に、１３８４〜１４９０番目の塩基配列がエクソン１０に、１４９１〜１６５９番目の塩基配列がエクソン１１に、１６６０〜１８３５番目の塩基配列がエクソン１２に、１８３６〜１９３１番目の塩基配列がエクソン１３に、１９３２〜２０７１番目の塩基配列がエクソン１４に、２０７２〜２２３３番目の塩基配列がエクソン１５に相当する。
エクソン２の５’末端（配列番号１記載の塩基配列の３５６〜３５８番目）には開始コドンが位置し、エクソン１５の３’末端（配列番号１記載の塩基配列の２２３１〜２２３３番目）には終止コドンが位置する。
ウシＦＸＩｃＤＮＡにコードされるタンパク質（ウシＦＸＩ）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。配列番号２記載のアミノ酸配列のうち１〜１８番目のアミノ酸配列はシグナルペプチドであり、シグナルペプチドは配列番号１記載の塩基配列のうち３５６〜４０９番目の塩基配列にコードされる。
ウシ、ヒト及びマウスにおいて、ＦＸＩｃＤＮＡの塩基配列及びＦＸＩのアミノ酸配列を比較したところ、ウシＦＸＩｃＤＮＡは、ヒトＦＸＩｃＤＮＡ及びマウスＦＸＩｃＤＮＡとそれぞれ８３．８％、７８．２％の相同性を有しており、ウシＦＸＩは、ヒトＦＸＩ及びマウスＦＸＩとそれぞれ８０．８％、７２．８％の相同性を有していた。
３．考察
上述にように、ウシＦＸＩｃＤＮＡがウシ肝臓ｃＤＮＡライブラリーより単離され、ヒトＦＸＩｃＤＮＡ及びマウスＦＸＩｃＤＮＡと高い相同性が認められた。また、ウシＦＸＩのアミノ酸配列を重鎖と軽鎖に分け、それぞれヒトＦＸＩとの相同性を調べたところ、重鎖における相同性は７６．２％であるのに対し、軽鎖における相同性は８８．２％であり、軽鎖のおいて非常に高い相同性が認められた。軽鎖における異種間の高い保存性は、軽鎖が機能的に重要性の高い部位であることを意味し、これよりウシＦＸＩとヒトＦＸＩの構造が非常に類似していることが推察された。また、タンパク質の天然構造を安定化させているジスルフィド結合は、ウシＦＸＩのアミノ酸配列においても完全に保存されていた。つまり、ウシＦＸＩにおいてもＮ末端からシグナルペプチド、アップルドメイン１〜４、そしてセリンプロテアーゼ活性を持つ活性部位が存在することが示唆された。
〔実施例２〕血液凝固第ＸＩ因子欠乏症ウシにおける突然変異の検索
ヒトやマウスにおいてＦＸＩ遺伝子が血液凝固第ＸＩ因子（ＦＸＩ欠乏症）の原因遺伝子として単離されてから現在に至るまでに、ＦＸＩ遺伝子における様々な変異が報告されていることから、ＦＸＩ欠乏症ウシにおいてもＦＸＩ遺伝子に変異が生じていると考えられる。ホルスタイン種の白血球粘着不全症や、黒毛和種の第ＸＩＩＩ因子欠乏症ではヒトと共通する変異がウシの遺伝子に存在しているが、ＦＸＩ欠乏症においてもヒトと共通する変異がウシの遺伝子に存在しているとは限らない。
そこで、実施例２では、ＦＸＩ欠乏症と診断された黒毛和種のＦＸＩ遺伝子の塩基配列を同定し、正常なＦＸＩ遺伝子と比較することにより、塩基の置換、欠損、挿入等の変異の検索を試みた。本来、このような変異を検索する場合、ＦＸＩ欠乏症発症個体のｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ＦＸＩ欠乏症発症個体のｃＤＮＡをクローニングし、塩基配列を決定する。しかし、今回、ＦＸＩ欠乏症発症個体のｍＲＮＡが入手できなかったため、ＦＸＩ欠乏症発症個体のゲノムＤＮＡからエクソン１〜１５を増幅し、塩基配列を決定する方法を採用した。そのため、実施例１で決定したホルスタイン種のＦＸＩｃＤＮＡの塩基配列を基に、１４個のイントロンをそれぞれ挟むようにプライマーを設定し、黒毛和種のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片の塩基配列を決定した。次に、決定した各イントロンの塩基配列を基に１５個のエクソンをそれぞれ挟むようにプライマーを設定し、発症個体ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、増幅断片の塩基配列を決定した。正常個体ゲノムＤＮＡについても同様の操作を行い、この両者の比較を行った。
１．材料と方法
（１）イントロン配列の決定
実施例１で得られたホルスタイン種のＦＸＩｃＤＮＡの塩基配列を基に、ＦＸＩ遺伝子の１４個のイントロンを増幅できるように１４組のプライマーを設定した。使用したプライマーの配列を以下に示す。なお、エクソン１とエクソン２の間に存在するイントロンをイントロン１とする（図１参照）。
2004072114.tif 000002
2004072114.tif 000003
ＰＣＲ反応液は、２０ｎｇのウシ（褐毛和種）ゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑバッファー、０．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び滅菌蒸留水を含む合計１０μｌに調整した。この反応液を１つのイントロンにつき８つ作製し、総計８０μｌを用いた。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で５分間の熱変性の後、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応物は、エタノール沈澱した後、０．７％低融点アガロースゲルを用いて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を切り出した。次いで、フェノール／クロロフォルム処理、クロロフォルム処理及びエタノール沈澱により精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。アルカリ−ＳＤＳ法を用いて、１つのイントロンにつき少なくとも５つのクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
（２）ＦＸＩ欠乏症発症個体のＦＸＩ遺伝子の同定及び正常個体のＦＸＩ遺伝子との比較
上記（１）で得られたイントロン配列を基に、ウシゲノムＤＮＡから１５個のエクソンを増幅できるように以下に示す１５組のプライマーを設定した。ＦＸＩ欠乏症発症個体としてはＦＸＩ活性値が５％以下の個体（黒毛和種）を用い、正常個体としてはＦＸＩ活性値が９０％以上の個体（黒毛和種）を用い、これらのゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。
2004072114.tif 000004
2004072114.tif 000005
ＰＣＲ反応液は、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑバッファー、０．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び滅菌蒸留水を含む合計１０μｌに調整した。この反応液を１つのイントロンにつき８つ作製し、総計８０μｌを用いた。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で５分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応物は、エタノール沈澱した後、０．７％低融点アガロースゲルにて電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を切り出した。次いで、フェノール／クロロフォルム処理、クロロフォルム処理及びエタノール沈澱により精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。アルカリ−ＳＤＳ法を用いて、１つのエクソンにつき少なくとも５つのクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
正常個体についても同様の操作を行い、塩基配列を決定した。
正常個体及びＦＸＩ欠乏症発症個体の塩基配列のデータは、Ｇｅｎｅｔｉｘ−Ｍａｃによって解析し、変異の検索を行った。
２．結果
（１）イントロン配列の決定
実施例１で得られたホルスタイン種のＦＸＩｃＤＮＡの塩基配列を基に、黒毛和種のイントロンの領域をＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定したところ、各イントロンの塩基配列のヒトとの相同性は高くなかったが、図１に示すように、各イントロンの大きさはヒトと比較的類似していた。イントロンを含んだ黒毛和種のＦＸＩ遺伝子の全長は約２０ｋｂで、ヒトの２３ｋｂと比較しても大差は見られなかった。
黒毛和種のＦＸＩ遺伝子について、５’ＵＴＲとエクソン１とイントロン１の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号３に、イントロン１の一部とエクソン２とイントロン２の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号４に、イントロン２の一部とエクソン３とイントロン３の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号５に、イントロン３の一部とエクソン４とイントロン４の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号６に、イントロン４の一部とエクソン５とイントロン５の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号７に、イントロン５の一部とエクソン６とを含む領域の塩基配列を配列番号８に、イントロン６の一部とエクソン７とイントロン７の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号９に、イントロン７の一部とエクソン８とイントロン８とエクソン９とイントロン９とエクソン１０とイントロン１０の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号１０に、イントロン１０の一部とエクソン１１とイントロン１１の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号１１に、イントロン１１の一部とエクソン１２とイントロン１２の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号１２に、イントロン１２の一部とエクソン１３とイントロン１３の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号１３に、イントロン１３の一部とエクソン１４とイントロン１４の一部とを含む領域の塩基配列を配列番号１４に、イントロン１４の一部とエクソン１５とを含む領域の塩基配列を配列番号１５に示す。
配列番号３記載の塩基配列のうち、１〜１９３番目の塩基配列が５’ＵＴＲ、１９４〜３５５番目の塩基配列がエクソン１、３５６〜５５６番目の塩基配列がイントロン１の一部に相当する。配列番号４記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン１の一部、２０１〜２５５番目の塩基配列がエクソン２、２５６〜４５５番目の塩基配列がイントロン２の一部に相当する。配列番号５記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン２の一部、２０１〜３６３番目の塩基配列がエクソン３、３６４〜５６７番目の塩基配列がイントロン３の一部に相当する。配列番号６記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン３の一部、２０１〜３０７番目の塩基配列がエクソン４、３０８〜５０７番目の塩基配列がイントロン４の一部に相当する。配列番号７記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン４の一部、２０１〜３６０番目の塩基配列がエクソン５、３６１〜５６２番目の塩基配列がイントロン５の一部に相当する。配列番号８記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン５の一部、２０１〜３１０番目の塩基配列がエクソン６に相当する。配列番号９記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン６の一部、２０１〜３６０番目の塩基配列がエクソン７、３６１〜５６０番目の塩基配列がイントロン７の一部に相当する。配列番号１０記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン７の一部、２０１〜３１０番目の塩基配列がエクソン８、３１１〜４０３番目の塩基配列がイントロン８、４０４〜５６６番目の塩基配列がエクソン９、５６７〜６５５番目の塩基配列がイントロン９、６５６〜７６２番目の塩基配列がエクソン１０、７６３〜９６２番目の塩基配列がイントロン１０の一部に相当する。配列番号１１記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン１０の一部、２０１〜３６９番目の塩基配列がエクソン１１、３７０〜５６９番目の塩基配列がイントロン１１の一部に相当する。配列番号１２記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン１１の一部、２０１〜３７６番目の塩基配列がエクソン１２、３７７〜４６５番目の塩基配列がイントロン１２の一部に相当する。配列番号１３記載の塩基配列のうち、１〜１４９番目の塩基配列がイントロン１２の一部、１５０〜２４５番目の塩基配列がエクソン１３、２４６〜４４５番目の塩基配列がイントロン１３の一部に相当する。配列番号１４記載の塩基配列のうち、１〜２００番目の塩基配列がイントロン１３の一部、２０１〜３４０番目の塩基配列がエクソン１４、３４１〜５４０番目の塩基配列がイントロン１４の一部に相当する。配列番号１５記載の塩基配列のうち、１〜２０２番目の塩基配列がイントロン１４の一部、２０３〜３６４番目の塩基配列がエクソン１５に相当する。なお、配列番号１の２０６２番目の塩基と配列番号１４の３３１番目の塩基とが対応しており、配列番号１の２０６２番目の塩基はｃであるのに対して、配列番号１４の３３１番目の塩基はｔとなっているが、これは遺伝的多型性によるものである。
（２）ＦＸＩ欠乏症発症個体のＦＸＩ遺伝子の同定、及び正常個体のＦＸＩ遺伝子との比較
イントロン配列を基に、ＦＸＩ欠乏症発症個体及び正常個体のゲノムＤＮＡを鋳型として用い、各エクソンをＰＣＲにより増幅し、塩基配列を決定した。ホルスタイン、正常個体、ＦＸＩ欠乏症発症個体の間で塩基配列の比較を行ったところ、図２に示すように、１４ヶ所において１塩基置換が確認され、エクソン９において１塩基の１６塩基への置換（１塩基置換＋１５塩基挿入）が確認された。
１塩基置換が確認された部位は、ウシＦＸＩｃＤＮＡにおいて開始コドンａｔｇのａを＋１としたとき、−３６、１５９、１８４、３４０、４３５、４６４、５１６、６２４、６５５、６６６、１６２３、１８３０、１８４２、１８４３で表される部位であり、配列番号１記載の塩基配列において、３１９、５１４、５３９、６９５、７９０、８１９、８７１、９７９、１０１０、１０２１、１９７８、２１８５、２１９７、２１９８番目の塩基に相当する。
これらの１塩基置換のうち、５ヶ所（置換部位：１８４、３４０、４６４、６５５、１８４３）はアミノ酸置換（配列番号２記載Ｉのアミノ酸配列において、６２番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｌｅｕへの置換、１１４番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、１５５番目のアミノ酸Ｈｉｓのアミノ酸Ａｒｇへの置換、２１９番目のアミノ酸Ｍｅｔのアミノ酸Ｖａｌへの置換、６１５番目のアミノ酸Ｖａｌのアミノ酸Ｌｅｕへの置換）を導くものであり、それらのうち、３ケ所（１１４番目のアミノ酸の置換、１５５番目のアミノ酸の置換、２１９番目のアミノ酸の置換）は正常個体で確認され、残りの２ケ所（６２番目のアミノ酸の置換、６１５番目のアミノ酸の置換）はＦＸＩ欠乏症発症個体で確認された。
エクソン９における１塩基の１６塩基への置換（１塩基置換＋１５塩基挿入）は、エクソン９の５番目の塩基ｃ（配列番号１０記載の塩基配列の４０８番目の塩基ｃ）が、ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔａで表される塩基配列に置換されたものであり、ＦＸＩ欠乏症発症個体で確認された。エクソン９における１塩基の１６塩基への置換によって、１５塩基がＰｈｅ（配列番号２記載のアミノ酸配列において２９０番目のアミノ酸）をコードするコドン中に挿入されるため、Ｐｈｅが６アミノ酸（Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ）に置換される。なお、エクソン９における１塩基の１６塩基への置換は、エクソン９の４番目の塩基ｔと５番目の塩基ｃとの間への１５塩基（ａｔａｔｇｔｇｃａｇａａｔａｔ）の挿入、及びエクソン９の５番目の塩基ｃの塩基ａへの置換、すなわち１塩基置換＋１５塩基挿入として捉えることもできる。
３．考察
ヒトＦＸＩ遺伝子内の変異の報告は、現在までに少なくとも２０例に達する。それらの変異とウシＦＸＩ遺伝子の変異とは、全く異なるものであり、ヒトＦＸＩ遺伝子における変異が、ウシＦＸＩ遺伝子においては存在しなかった。
ホルスタイン、正常個体、ＦＸＩ欠乏症発症個体の間で塩基配列の比較を行ったところ、１４ケ所で１塩基置換が同定され、そのうちの９ケ所はアミノ酸置換を伴わないサイレント変異であり、結果として、ＦＸＩポリペプチド鎖を全く変化させないので、ＦＸＩ欠乏症を引き起こす原因となる変異ではない。一方、１３ケ所の一塩基置換のうち５ケ所はアミノ酸置換を導くもので、そのうち３ケ所は正常個体でのみ確認されたので、疾患の原因であるとは考えにくい。残りの２ケ所はＦＸＩ欠乏症発症個体でのみ確認されたので、ＦＸＩ欠乏症の原因となる変異である可能性がある。また、エクソン９において１塩基の１６塩基への置換（１塩基置換＋１５塩基挿入）が確認され、この変異によってＰｈｅが６アミノ酸に置換されるので、ＦＸＩ欠乏症の原因となる変異である可能性がある。ヒトにおいてエクソン９は第４アップルドメインをコードしており、この領域の欠損により、細胞内での２量体形成が阻害され、分泌能が低下するという報告がされている。ウシにおいても同じような障害が考えられることから、この変異がＦＸＩ欠乏症の原因として最も有力な変異であることが示唆される。
また、エクソン９における置換がどのようにして起きたのか、エクソン９の周辺塩基配列を検索したところ、２６ｂｐ上流から７ｂｐの配列が挿入配列の７ｂｐと同じ配列をとっていた。また、挿入配列の下流２ｂｐから上流に向けて８ｂｐと、挿入配列の最初から８ｂｐとはほぼパリンドローム構造（逆向き反復配列）になっており、この両者の存在が挿入の原因に起因していることが考えられる。
エクソン３、エクソン９及びエクソン１５のアミノ酸を伴う塩基置換が同定されたが、どの変異がＦＸＩ欠乏症の直接の原因であるかは明らかになっていない。そこで、以下の実施例３において、これらの変異のうち、どの変異がＦＸＩ欠乏症の原因となる変異であるかを明らかにした。
〔実施例３〕黒毛和種における血液凝固第ＸＩ因子欠乏症遺伝子診断法の確立
１９８２年以来南九州の黒毛和腫牛に散発する出血性疾患について、止血スクリーニング検査でＡＰＴＴ（部分活性トロンボプラスチン時間）のみが著しく延長する個体が報告され、このウシについて、各種凝固因子活性を測定したところ、ＦＸＩ活性が重度に低下しており、ＦＸＩ欠乏症である疑いがもたれた。また、系統調査によって、疾患牛は兵庫県の系統である田尻系及び菊美系である安美土井又は菊照土井の子孫であることが判明した。田尻系及び菊美系は全国有数の系統であり、全国的に子孫が多く生産されており、ＦＸＩ欠乏症の全国レベルでの発生が強く疑われている。黒毛和種におけるＦＸＩ欠乏症の臨床的研究はあまり進んでおらず、症状等もあまり調査されていなが、ホルスタイン種で報告されている繁殖に関する症状が、もし黒毛和種においても確認され、全国的に伝播しているとすれば、黒毛和種の肉牛生産において大きな影響を与えているはずである。したがって、ＦＸＩ欠乏症の原因遺伝子を保有するウシ（ＦＸＩ欠乏症発症個体及びキャリア個体）を集団から排除することは重要である。
実施例２で同定されたエクソン３、エクソン９及びエクソン１５のアミノ酸を伴う塩基置換のうち、いずれかの変異がＦＸＩ欠乏症に関与している可能性は高いが、いずれの変異がＦＸＩ欠乏症発症個体に特異的なものであるのか否かは確認されていない。エクソン３の変異が存在する部分は制限酵素Ｍｓｌ  Ｉの認識部位、エクソン１５の変異部分はＳｃａ  Ｉの認識部位であり、これらの制限酵素で消化することで検出が可能である。また、エクソン９の変異はＰＣＲで検出できる。そこで、実施例３では、全国各地の黒毛和種のゲノムＤＮＡを用いて、どの変異がＦＸＩ欠乏症発症個体に特異的な変異であるかを、ＦＸＩ活性値と対応させることにより確認するとともに、その変異を検出することにより遺伝子診断が可能であるか否かについて検討した。
１．材料と方法
黒毛和種のゲノムＤＮＡは、Ａ県の繁殖牛３１頭（図３参照）、Ｂ県の検定・繁殖牛３５頭（図４参照）、Ｃ県の検定・繁殖牛４０頭（図５参照）、Ｄ県の種雄牛２頭（図６（Ａ）参照）、Ｅ県の検定牛１１頭（図６（Ｂ）参照）、合計１１９頭の血液から抽出して用いた。遺伝子型と対応させる止血スクリーニング検査とＦＸＩ活性値測定は、東京大学大学院小川研究室の池田美穂氏に依頼した。各ウシの止血スクリーニング検査の結果は図３〜６に示す通りであった。なお、図３〜６において、「ＰＴ」はプロトロンビン時間を、「ＡＰＴＴ」は活性化部分トロンボプラスチン時間を表す。
（１）新鮮血液からのＤＮＡ抽出
３．８％クエン酸ナトリウムを含んだ血液１０ｍｌを２０００回転、４℃の条件で１５分間遠心分離し、血漿と赤血球の中間層に位置する白血球層を丁寧にとり、１５ｍｌチューブに移した。０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、２×ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ  １．５ｍｌとプロテアーゼＫ（１５．１ｍｇ／ｍｌ）２７μｌの入った１５ｍｌポリプロピレンチューブに少しずつ加え、５５℃で１２時間反応させた。１／２０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、３ｍｌのフェノール／クロロフォルムを加え、１０分間ゆっくりと振とうし、２０００回転、室温の条件で１０分間遠心分離した。水層を１５ｍｌのチューブに回収し、３ｍｌのクロロフォルムを加え、１０分ゆっくりと振とうし、２０００回転、室温の条件で１０分間遠心分離した。水層を１５ｍｌチューブに回収し、２倍量のエタノールを加え、軽く撹拌し、ＤＮＡの凝集塊をすくいとって、１ｍｌの７０％エタノールを含む１．５ｍｌチューブに移した。１２０００回転、４℃の条件で２０分間遠心分離し、上清を捨て、減圧乾燥した。４００μｌのＴＥに溶解して濃度を測定し、５０ｎｇ／μｌに希釈した後、ゲノムＤＮＡとして用いた。
（２）凍結血液からのＤＮＡ抽出
血液を解凍し、０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液と血液とを５：１の割合で混合し、２２００回転、室温の条件で１０分間遠心分離した。上清を捨て、０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、２２００回転、室温の条件で１０分間遠心分離した後、再度上清を捨て、約１．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁し、２×ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒ  １．５ｍｌ及びプロテアーゼＫ（１５．１ｍｇ／ｍｌ）２７μｌの入った１５ｍｌポリプロピレンチューブに少しずつ加え、５５℃で１２時間反応させた。以降は新鮮血液のＤＮＡ抽出と同様の操作を行い、ゲノムＤＮＡとして用いた。
（３）エクソン３における塩基置換の多型解析
実施例２で設定したエクソン３を増幅できるプライマーを用いた。ＰＣＲ反応液は、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．５μＭの各プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１×Ｔａｑバッファー、０．５Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び滅菌蒸留水を含む合計１０μｌに調整した。ＰＣＲ反応の条件は、９５℃で５分間の熱変性後、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを４０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応物（３μｌ）、１×ＮＥＢ２  Ｂｕｆｆｅｒ、５Ｕ  Ｍｓｌ  Ｉを含む溶液を調整し、３７℃で４時間以上反応を行った。その後、３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ３：１  ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）にて４０分電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液により染色した。
（４）エクソン１５における塩基置換の多型解析
実施例２で設定したエクソン１５を増幅できるプライマーを用いた。このプライマーを用い、上記と同様の方法でＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応物（３μｌ）、１×Ｓｃａ  Ｉ  Ｂｕｆｆｅｒ、５Ｕ  Ｓｃａ  Ｉを含む溶液を調整し、３７℃で４時間以上反応を行った。その後、３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ３：１  ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）にて４０分電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液により染色した。
（５）エクソン９における塩基置換の多型解析
１５塩基挿入部分を挟み、泳動距離によって１５塩基の差をはっきりと検出するために、ＰＣＲ産物のサイズをできるだけ小さくするようにプライマーを設定した。
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このプライマーを用い、上記と同様の方法でＰＣＲ反応を行い、３％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ３：１  ａｇａｒｏｓｅ（ＢＭＡ）にて４０分間電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液により染色した。
２．結果
（１）エクソン３における塩基置換の多型解析
ＰＣＲ増幅断片をＭｓｌＩで処理した結果、正常個体では１１８ｂｐ、１０２ｂｐ、７５ｂｐのバンド、ＦＸＩ欠乏症発症個体では１９３ｂｐ、１０２ｂｐのバンド、キャリア個体では１９３ｂｐ、１１８ｂｐ、１０２ｂｐ、７５ｂｐのバンドが検出された。黒毛和種１１９頭について、エクソン３の遺伝子型とＦＸＩ活性値とを対応させたところ、矛盾する個体が多数認められた。
（２）エクソン１５における塩基置換の多型解析
ＰＣＲ増幅断片をＳｃａＩで処理した結果、正常個体では３５８ｂｐのバンド、ＦＸＩ欠乏症発症個体では２８０ｂｐ、７８ｂｐのバンド、キャリア個体では３５８ｂｐ、２８０ｂｐ、７８ｂｐのバンドが検出された。黒毛和種１１９頭について、エクソン１５の遺伝子型とＦＸＩ活性値とを対応させたところ、矛盾する個体が多数認められた。
（３）エクソン９における塩基置換の多型解析
ＰＣＲの結果、正常個体９５ｂｐ、発症個体１１０ｂｐ、キャリア個体では９５ｂｐ、１１０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅され、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ３：１ａｇａｒｏｓｅ電気泳動によりこの２種類のバンドがはっきりと検出された（図７参照）。黒毛和種１１９頭のゲノムＤＮＡについて、エクソン９の遺伝子型とＦＸＩ活性値とを対応させたところ、完全に一致していた（図３〜６参照）。なお、図３〜６の「ＦＸＩ遺伝子診断」において、「−／−」は、「ＦＸＩ遺伝子のエクソン９における塩基置換がいずれの相同染色体にも存在する」との診断結果を、「＋／−」は、「ＦＸＩ遺伝子のエクソン９における塩基置換がいずれか一方の相同染色体に存在する」との診断結果を、「＋／＋」は、「ＦＸＩ遺伝子のエクソン９における塩基置換がいずれの相同染色体にも存在しない」との診断結果を表す。
以上に示す結果から、エクソン９の遺伝子型、すなわち、エクソン９における１塩基の１６塩基への置換（１塩基置換＋１５塩基挿入）の有無に基づいて、正常個体、ＦＸＩ欠乏症発症個体、キャリア個体を識別できることが明らかとなった。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、ウシ血液凝固第ＸＩ因子、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及びウシ血液凝固第ＸＩ因子に対する抗体又はその断片が提供される。また、本発明によれば、ウシ血液凝固第ＸＩ因子をコードする遺伝子の遺伝的多型性を指標としたウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットが提供される。本発明のウシ血液凝固第ＸＩ因子欠乏症の診断方法及び診断用キットによれば、被験ウシが正常個体、ＦＸＩ欠乏症発症個体又はキャリア個体のいずれに該当するかを診断することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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