(57)【要約】本発明の目的は、合成された標識化蛋白質を他の標識された蛋白質から分離精製する工程無しに多次元多核ＮＭＲ測定を可能にすることによって、蛋白質の高効率または迅速な立体構造評価あるいは立体構造決定を可能とする手段を提供することである。本発明によれば、目的蛋白質をコードする核酸を鋳型として、基質アミノ酸の一部または全部がＮＭＲ測定が可能なように標識されたものを用いて蛋白質合成を行うときに、合成された標識化蛋白質の９０％以上が目的蛋白質となる条件下で目的蛋白質を合成し、該標識化蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことを含む、タンパク質の分析方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的蛋白質をコードする核酸を鋳型として、基質アミノ酸の一部または全部がＮＭＲ測定が可能なように標識されたものを用いて蛋白質合成を行うときに、合成された標識化蛋白質の９０％以上が目的蛋白質となる条件下で目的蛋白質を合成し、該標識化蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことを含む、タンパク質の分析方法。
【請求項２】
目的蛋白質の合成方法が、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用い、かつ合成された標識化蛋白質から目的蛋白質を分離する工程を行わないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
基質アミノ酸のうち、３種類以上のアミノ酸がＮＭＲ測定が可能なように標識されていることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コムギ胚芽抽出液が、胚乳を含まないように分離されたコムギの胚芽から抽出されたものである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
コムギ胚芽抽出液が、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ｍｌ以下である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
コムギ胚芽抽出液が、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
コムギ胚芽抽出液が、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であり、かつ総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質の分析方法が、蛋白質のフォールディングを同定する方法であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
蛋白質のフォールディングの同定方法が、合成された蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法が、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルの主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有する標識化アミノ酸残基の総数の８０％以上である時に、該蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法が、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルにおいて、主鎖由来のシグナルの持つ水素原子の３０％以上の化学シフトが８．０〜８．５ｐｐｍの範囲外である時に、蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
蛋白質のフォールディングの同定方法が、蛋白質が有する立体構造が単一であることを同定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
蛋白質のフォールディングの同定する方法が、蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定する方法が、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルにおける主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有する標識化アミノ酸残基の総数の８０〜１００％以下である時に、蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、目的蛋白質を標識化蛋白質として合成してＮＭＲ測定することを含む蛋白質の分析方法、及び該蛋白質のフォールディングを解析する方法に関する。
【背景技術】  蛋白質の立体構造を、ＮＭＲやＸ線を用いて決定する方法は広く行われているが、どちらの方法を用いるにせよ、高純度の蛋白質が数十ｍｇのオーダーで必要である。目的の蛋白質をＮＭＲやＸ線を用いて立体構造解析するためには、目的の蛋白質を、大腸菌などの組み換え体蛋白質合成系を用いて大量に調製し、高度に精製する必要がある。また、目的の蛋白質が、規則正しい立体構造を有していること、並びに凝集体を形成していない、即ち単一の立体構造を有するように合成されることが必要である。
蛋白質中の窒素原子を安定同位体でＮＭＲ測定可能な１５Ｎで標識し、ＮＭＲのＨＳＱＣ（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）法を用いて、目的の蛋白質の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定し、得られたシグナルの個数や分散の度合いから目的の蛋白質が規則正しい立体構造を有しているか、あるいは凝集体を形成していないかを調べる立体構造評価の方法が知られている（Ｍｏｎｔｅｌｉｏｎｅ、Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７  Ｓｕｐｐｌ：９８２−９８５．）。この方法を用いれば、ＮＭＲによる立体構造決定のための１３Ｃ／１５Ｎ二重標識蛋白質の調製や、Ｘ線解析による立体構造決定のための蛋白質の結晶化に着手する前に、それらの実験の可否を決定することができる。
【発明の開示】
従来のＮＭＲ測定による蛋白質のフォールディングの同定のためには、目的蛋白質をコードする核酸を鋳型としてＮＭＲ測定可能なように標識された目的蛋白質を大量に合成することが必要である。しかし、通常の生細胞を用いた蛋白質合成方法、あるいは大腸菌などの無細胞蛋白質合成方法を用いて標識化蛋白質を合成した場合、目的蛋白質以外の標識された蛋白質も共に合成されてしまうため、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを観測するためには、目的蛋白質をその他の標識蛋白質から精製する工程が必須であった。例えば、１５Ｎで標識された目的蛋白質を、大腸菌、酵母、培養細胞などの生合成系で合成した場合には、細胞内の他の蛋白質も全て標識されてしまうために、目的蛋白質を精製によって分離しないと、多種類の蛋白質のシグナルが同時に観測されてしまうためにシグナルの判定ができない。また、大腸菌由来の無細胞蛋白質合成系を用いて、１５Ｎ標識された目的蛋白質を合成すると、原理的には目的蛋白質だけが１５Ｎ標識されるはずであるが、実際には他のｍＲＮＡの混入などの問題が避けられず、目的蛋白質以外の蛋白質が標識され（これを、以下「非特異標識蛋白質」と称することがある）、非特異標識蛋白質由来のシグナルが観測されてしまう。また、大腸菌由来の無細胞蛋白質合成系は、蛋白質分解酵素が含まれていることから、室温以上の温度で長時間行うＮＭＲ測定においては、測定中に目的蛋白質が分解されてしまい、正しいシグナルが得られないなどの問題もあった。
通常の合成方法で合成された標識化蛋白質から目的蛋白質を分離精製する工程は煩雑であり、また目的蛋白質の合成効率の問題もある。そこで、上記した従来のＮＭＲ技術における標識化蛋白質調製における問題点を解消する手段、即ち、合成された標識化蛋白質を他の標識された蛋白質から分離精製する工程無しに多次元多核ＮＭＲ測定を可能にすることによって、蛋白質の高効率または迅速な立体構造評価あるいは立体構造決定を可能とする手段が望まれていた。
本発明者らは、酵母ユビキチン蛋白質などを、１５Ｎ標識したアミノ酸を用いてコムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用いて合成し、合成された標識化蛋白質から目的蛋白質を分離精製せずにＨＳＱＣ法によりＮＭＲ解析を行ったところ、大腸菌生細胞で同蛋白質を合成した後に、目的蛋白質を分離精製してＨＳＱＣ法によりＮＭＲ解析を行った場合と同様のスペクトルを取得できること、また、大腸菌細胞抽出液により同蛋白質を合成し、目的蛋白質を他の標識化蛋白質から分離精製せずにＮＭＲ解析を行った場合に出るノイズスペクトルが見られないことを見出した。本発明はこれらの知見により完成したものである。
即ち、本発明によれば、目的蛋白質をコードする核酸を鋳型として、基質アミノ酸の一部または全部がＮＭＲ測定が可能なように標識されたものを用いて蛋白質合成を行うときに、合成された標識化蛋白質の９０％以上が目的蛋白質となる条件下で目的蛋白質を合成し、該標識化蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことを含む、タンパク質の分析方法が提供される。
好ましくは、目的蛋白質の合成方法は、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用い、かつ合成された標識化蛋白質から目的蛋白質を分離する工程を行わない方法である。
好ましくは、目的蛋白質の合成方法は、用いる基質アミノ酸のうち、３種類以上のアミノ酸がＮＭＲ測定が可能なように標識されている方法である。
好ましくは、コムギ胚芽抽出液は、胚乳を含まないように分離されたコムギの胚芽から抽出されたものである。
好ましくは、コムギ胚芽抽出液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ｍｌ以下のものである。
好ましくは、コムギ胚芽抽出液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下のものである。
好ましくは、コムギ胚芽抽出液は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ミリリットル以下であり、かつ総脂肪酸含有量が０．０３ｇ／１００ｇ以下のものである。
好ましくは、蛋白質の分析方法は、蛋白質のフォールディングを同定する方法である。
好ましくは、蛋白質のフォールディングの同定方法は、合成された蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法である。
好ましくは、蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法は、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルの主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有する標識化アミノ酸残基の総数の８０％以上である時に、該蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法である。
好ましくは、蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法は、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルにおいて、主鎖由来のシグナルの持つ水素原子の３０％以上の化学シフトが８．０〜８．５ｐｐｍの範囲外である時に、蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定する方法である。
好ましくは、蛋白質のフォールディングの同定方法は、蛋白質が有する立体構造が単一であることを同定する方法である。
好ましくは、蛋白質のフォールディングの同定する方法は、蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定する方法である。
好ましくは、蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定する方法は、ＮＭＲ測定によって得られたスペクトルにおける主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有する標識化アミノ酸残基の総数の８０〜１００％以下である時に、蛋白質が有する立体構造が規則正しく、かつ単一であることを同定する方法である。
【図面の簡単な説明】  図１は、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識化酵母ユビキチン蛋白質を合成し、酵母ユビキチン蛋白質を他の標識化蛋白質から精製せずに濃縮し、緩衝液を交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定した結果を示す図である。
図２は、大腸菌生細胞で合成し精製した１５Ｎ標識化酵母ユビキチンの１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣ測定した結果を示す図である。コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成軽を用いた蛋白質合成によれば、合成後目的蛋白質を分離精製しなくても、分離精製した蛋白質を用いた場合と同等の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを取得することができる。
図３は、大腸菌細胞抽出液を用いて１５Ｎ標識化酵母ユビキチンを合成し、目的蛋白質を分離精製せずに濃縮し、緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す。大腸菌細胞抽出液による無細胞蛋白質合成系で標識化蛋白質を合成した場合、目的蛋白質以外の標識化蛋白質が合成されているために、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定により取得されたシグナルには、ノイズのシグナルがでる。
図４は、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質を合成し、酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質を他の標識化蛋白質から分離精製せずに濃縮し、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定した結果を示す図である。
図５は、大腸菌生細胞で合成し精製した１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定した結果を示す図である。酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質を目的蛋白質としても、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成軽を用いた蛋白質合成によれば、合成後目的蛋白質を分離精製しなくても、分離精製した蛋白質を用いた場合と同等の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを取得することができる。
図６は、大腸菌細胞抽出液による無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質を合成し、酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質を他の標識化蛋白質から分離精製せずに濃縮および緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣ測定した結果を示す図である。酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質を目的蛋白質としても、大腸菌細胞抽出液による無細胞蛋白質合成系で標識化蛋白質を合成した場合、目的蛋白質以外の標識化蛋白質が合成されているために、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定により取得されたシグナルには、ノイズのシグナルがでる。
図７は、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す図である。
図８は、大腸菌細胞抽出液を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す図である。
図９は、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す図である。
図１０は、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識ヒトｍｃｍ４蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書で使用する用語は、特に断らない限り以下の意味を有する。
「蛋白質の分析方法」とは、目的蛋白質をコードする核酸を鋳型として、基質のアミノ酸の一部または全部がＮＭＲ測定可能なように標識されたものを用いて蛋白質合成を行うときに、合成された標識化蛋白質の９０％以上が目的蛋白質となる条件下で目的蛋白質を合成し、該蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことを含む分析方法を意味する。本方法による蛋白質の分析内容は、蛋白質についてＮＭＲ測定により行うことができる全ての分析を意味する。このような分析内容として、例えば、蛋白質のフォールディングの同定方法などが挙げられる。蛋白質のフォールディングの同定方法とは、好ましくは、蛋白質が規則正しい立体構造を有することを同定する方法、蛋白質が単一の立体構造を有することを同定する方法、あるいは、蛋白質が規則正しく、かつ単一の立体構造を有することを同定する方法などが挙げられる。
「目的蛋白質」とは、本発明の蛋白質の分析方法の対象となる全ての蛋白質を意味する。蛋白質とは、本明細書中では最も広義の蛋白質を意味し、例えば、立体構造を取り得る長さのポリペプチド、又は生体内に存在する蛋白質の部分ポリペプチドなどに加え、同一または異なる複数のポリペプチド鎖から構成される蛋白質（即ち、複数のサブユニットから構成される蛋白質）なども含むものとする。
「目的蛋白質をコードする核酸」とは、目的蛋白質をコードするＯＲＦ領域のみでなく、本発明の方法に適した蛋白質合成系に鋳型として供することにより、目的蛋白質を生産し得るような塩基配列を有する領域も含む核酸を意味する。これらの核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらの誘導体のいずれでもよい。蛋白質合成系として後述するコムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系を用いる場合には、好ましくは、少なくともＯＲＦ領域の５’上流側にＳＰ６プロモーター、および翻訳活性化配列などが結合した塩基配列を有するＤＮＡを、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどを用いて転写し、さらにエタノール沈殿などで精製したＲＮＡが挙げられる。また、ＯＲＦの３’下流側に、さらに転写終止のための配列や、ＲＮＡの安定化のための非翻訳領域を結合しているものも好ましく用いられる。これらの核酸は、ＤＮＡの場合、環状プラスミドのものでもよいし、直鎖状のものでもよい。直鎖状の目的蛋白質をコードするＤＮＡはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を利用した方法（ＷＯ２００２／１８５８６号公報）を用いて調製することもできる。
「ＮＭＲ測定が可能なように標識されたアミノ酸」とは、後述する本発明において用いられるＮＭＲ測定法のいずれかで測定可能なように標識されたアミノ酸を意味する。ＮＭＲ測定法として、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定法を用いる場合には、少なくとも主鎖の窒素原子の１つが１５Ｎに置き換わったものが用いられる。
本発明の方法において用いられる基質アミノ酸は、そのすべてがＮＭＲ測定が可能なように標識されている（以下、これを「標識化されている」と称することがある）必要はなく、少なくとも３種のアミノ酸が標識化されていればよい。本発明の方法は、より多くの標識化アミノ酸を基質として用いて合成した蛋白質において、より大きな効果を有するものである。
「標識化蛋白質」とは、ＮＭＲ測定が可能なように標識されたアミノ酸を構成要素として有する蛋白質を意味する。標識化蛋白質であって、さらに目的蛋白質を「標識化目的蛋白質」とする。
「ＮＭＲ測定」とは、通常の異種核溶液ＮＭＲに用いられるすべての方法を意味する。通常は、サンプルに対して回転させない状態で測定することが多い。具体的には、異種核多次元ＮＭＲ測定法のいずれでもよく、異種核多次元ＮＭＲ測定法としては、ＨＳＱＣ、ＨＭＱＣ、ＣＨ−ＣＯＳＹ、ＣＢＣＡＮＨ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＯ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ、ＨＮＨＡ、Ｈ（ＣＡＣＯ）ＮＨ、ＨＣＡＣＯ、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ／１５  Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、１３Ｃ／１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ、１５Ｎ／１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＳＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡＣＢ、ＨＮ（ＣＡ）ＣＢ、ＨＮ（ＣＯＣＡ）ＣＢ（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６（１９９４）１１６５５−１１６６６）、Ｈ（ＣＣＯ）ＮＨ、Ｃ（ＣＯ）ＮＨ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，Ｂ１０１（１９９３）１１４−１１９）、ＣＲＩＰＴ、ＣＲＩＮＥＰＴ（Ｒｉｅｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６（１９９９）４９１８−４９２３）、ＨＭＢＣ、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ（Ｅｖａｎｓ  Ｊ．Ｎ．Ｓ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）７１）、ＩＮＥＰＴ（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０１（１９７９）７６０−７６２）、ＨＮＣＡＣＢ（Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｂ１０１（１９９３）２０１）、ＨＮ（ＣＯ）ＨＢ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．９６（１９９２）２１５−２２２．）、ＨＮＨＢ（Ａｒｃｈｅｒ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，９５（１９９１）６３６−６４１）、ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡ）ＮＨ（Ｗａｎｇ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，Ｂ１０５（１９９４）１９６−１９８．）、ＨＮ（ＣＡ）ＨＡ（Ｋａｙ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，９８（１９９２）４４３−４５０）、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，８８（１９９０）４２５−４３１）、ＴＲＯＳＹ（Ｐｅｒｖｕｓｈｉｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４（１９９７）１２３６６−１２３７１）、１３Ｃ／１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ（Ｊｅｒａｌａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１０８（１９９５）２９４−２９８）、ＨＮ（ＣＡ）ＮＨ（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１２４（１９９７）２１４２１７）、およびＨＮ（ＣＯＣＡ）ＮＨ（Ｇｒｚｅｓｉｅｋ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏ．ＮＭＲ，３（１９９３）６２７−６３８．）等の測定法が含まれるが、これらに限らない。これらの中でも本発明におけるＮＭＲ測定としては、ＨＳＱＣおよびＨＭＱＣ法が好ましく用いられる。
本発明の方法は、目的蛋白質をコードする核酸を鋳型として、基質アミノ酸の一部または全部がＮＭＲ測定が可能なように標識されたものを用いて蛋白質合成を行うときに、合成された標識化蛋白質の９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上が目的蛋白質となる条件下（以下、これを単に「条件」と称することがある）で目的蛋白質を合成し、該標識化蛋白質を用いてＮＭＲ測定を行うことを含む蛋白質の分析方法である。
蛋白質の合成方法としては、上記の条件を満たす方法であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系が挙げられる。該蛋白質合成系を用いて標識化目的蛋白質を合成すれば、該合成系において合成される全ての標識化蛋白質の９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上が目的蛋白質となるため、標識化蛋白質の中から目的蛋白質を分離精製する工程を行う必要がなく、操作性が非常に高まる効果を有する。
「コムギ胚芽抽出液による無細胞蛋白質合成系」は、上記の条件を満たすものであれば如何なるものでもよいが、好ましくは、以下に説明するものを用いることができる。
本発明で用いるコムギ胚芽抽出液としては、鋳型核酸、アミノ酸、エネルギー源等を供給することにより無細胞蛋白質合成を行なうことができるものであればその製造方法は特に限定されない。本発明で用いるコムギ胚芽抽出液として好ましくは、コムギ種子中の胚芽を胚乳を除去するように分離して、該胚芽から抽出して精製したものを用いることができる。このようなコムギ胚芽抽出液は、コムギ種子から以下のようにして調製したものか、あるいは市販のものを用いることができる。市販の細胞抽出液としては、コムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。
コムギ胚芽抽出液の作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）、あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０等に記載の方法を用いることができるが、以下にさらに詳細に説明する。
本発明で用いるコムギ胚芽抽出液の製造においては、先ず、コムギの胚芽以外の成分、特に胚乳をほぼ完全に除去することが好ましい。このような胚芽の調製方法としては、通常、まず、コムギ種子に機械的な力を加えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分（胚芽を主成分とし、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。コムギ種子に加える力は、コムギ種子から胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。具体的には、公知の粉砕装置を用いて、植物種子を粉砕することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得る。
コムギ種子の粉砕は、通常公知の粉砕装置を用いて行うことができるが、ピンミル、ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力を加えるタイプの粉砕装置を用いることが好ましい。粉砕の程度は、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ４ｍｍ以下、好ましくは最大長さ２ｍｍ以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られたコムギ種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用いて粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ０．５ｍｍ〜２．０ｍｍ、好ましくは０．７ｍｍ〜１．４ｍｍの粗胚芽画分を取得する。さらに、必要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を利用して除去してもよい。
また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通常胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。洗浄処理としては、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下に冷却した水又は水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することが好ましい。また、通常１０℃以下、好ましくは４℃以下で、界面活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散・懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましく、非イオン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適なものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Ｂｒｉｊ）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）等が例示される。なかでも、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、例えば０．５％の濃度で使用することができる。水又は水溶液による洗浄処理及び界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方でもよいし、両方実施してもよい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理との組み合わせで実施してもよい。
本発明においては、上記のようにコムギ種子を粉砕して得られた粉砕物からコムギ胚芽を選別した後洗浄して得られた無傷（発芽能を有する）の胚芽を抽出溶媒の存在下に細分化した後、得られるコムギ胚芽抽液を分離し、更に精製することにより無細胞蛋白質合成用コムギ胚芽抽出液を得ることができる。
抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はチオール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、カルシウムイオン、Ｌ型アミノ酸等をさらに添加してもよい。例えば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液や、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎらの方法を一部改変した溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、塩化カルシウム、Ｌ型アミノ酸及び／又はジチオスレイトールを含む溶液）を抽出溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞蛋白質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽１ｇに対して、通常０．１ミリリットル以上、好ましくは０．５ミリリットル以上、より好ましくは１ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽１ｇに対して、１０ミリリットル以下、好ましくは５ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたものを用いてもよいし、凍結させていないものを用いてもよいが、凍結させていないものを用いるのがより好ましい。
細分化の方法としては、摩砕、圧砕、衝撃、切断等、粉砕方法として従来公知の方法を採用することができるが、特に衝撃または切断により胚芽を細分化することが好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官（オルガネラ）、細胞膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕又は圧砕と比べて最小限に止めうる条件で植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすものであれば特に限定されないが、例えば、ワーリングブレンダーのような高速回転する刃状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常１０００ｒｐｍ以上、好ましくは５０００ｒｐｍ以上であり、また、通常３００００ｒｐｍ以下、好ましくは２５０００ｒｐｍ以下である。刃状物の回転時間は、通常５秒以上、好ましくは１０秒以上である。回転時間の上限は特に限定されないが、通常１０分以下、好ましくは５分以下である。細分化する際の温度は、好ましくは１０℃以下で操作が可能な範囲内、特に好ましくは４℃程度が適当である。
このように衝撃または切断により胚芽を細分化することにより、胚芽の細胞核や細胞壁を全て破壊してしまうのではなく、少なくともその一部は破壊されることなく残る。即ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることがないため、それらに含まれるＤＮＡや脂質等の不純物の混入が少なく、細胞質に局在する蛋白質合成に必要なＲＮＡやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から抽出することができる。
このような方法によれば、従来の植物胚芽を粉砕する工程と粉砕された植物胚芽と抽出溶媒とを混合してコムギ胚芽抽出液を得る工程とを同時に一つの工程として行うことができるため効率的にコムギ胚芽抽出液を得ることができる。上記の方法を、以下、「ブレンダー法」と称することがある。
次いで、遠心分離等によりコムギ胚芽抽出液を回収し、ゲルろ過等により精製することによりコムギ胚芽抽出液を得ることができる。ゲルろ過としては、例えば予め溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ジチオスレイトール又はＬ型アミノ酸を含む溶媒）で平衡化しておいたゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中の各成分の組成・濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用すればよい。
ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞蛋白質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入の可能性のある微生物が除去可能なものであれば特に制限はないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の枯草菌の胞子のサイズは０．５μｍｘ１μｍであることから、０．２０マイクロメーターのフィルター（例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＭｉｎｉｓａｒｔＴＭ等）を用いるのが胞子の除去にも有効である。ろ過に際して、まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、次に混入の可能性のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ましい。
このようにして得られた細胞抽出液は、原料細胞自身が含有する又は保持する蛋白質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、翻訳蛋白質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いたコムギ胚芽抽出液のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
このような細胞抽出液は、上記のごとく低分子の蛋白質合成阻害物質（以下、これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含有しているため、細胞抽出液の構成成分から、これら低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画排除する。排除されるべき物質（低分子阻害物質）の分子量は、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成に必要な因子よりも小さいものであればよい。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものが挙げられる。
低分子合成阻害物質の細胞抽出液からの排除方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法（透析法）が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。以下、透析法を用いる場合を例に詳細に説明する。
透析に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の排除分子量を有するものが挙げられる、具体的には排除分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｓａｌｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ製）や、排除分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＬＡＢＯＴＲＡＴＯＲＩＥＳ  ＩＮＣ．，ＣＡ，ＵＳＡ製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の上記細胞抽出液を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
低分子合成阻害物質の排除を行う際、細胞抽出液に不溶性成分が生成される場合には、これを阻害する（以下、これを「細胞抽出液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出液（以下、これを「処理後細胞抽出液」と称することがある）の蛋白質合成活性が高まる。細胞抽出液の安定化の具体的な方法としては、上記した低分子阻害物質の排除を行う際に、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等を含む溶液中で行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
これらの成分（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液中で低分子阻害物質の排除を行う場合は、細胞抽出液に予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の排除工程に供してもよい。低分子合成阻害物質の排除に透析法を用いる場合は、細胞抽出液だけでなく透析外液にも安定化成分を添加して透析を行い低分子阻害物質の排除を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、細胞抽出液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出液に添加し、適当な時間の後に低分子阻害物質の排除工程を行い、取得された処理後細胞抽出液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出液を用いて無細胞蛋白質合成を行い、上記の条件を満たすか否かを検定することが挙げられるが、得られたものの中から単に蛋白質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上記の選択方法において、細胞抽出液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出液中の不溶性成分量や、得られた細胞抽出液の蛋白質合成活性等により選択する方法も挙げられる。
このようにして選択された細胞抽出液の安定化条件の例として、具体的には、ブレンダー法を用いて調製したコムギ胚芽抽出液で、透析法により低分子阻害物質の排除工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、蛋白質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
細胞抽出液への安定化成分の添加方法は、特に制限はなく、低分子阻害物質の排除工程の前に添加しこれを適当時間インキュベートして安定化を行った後、低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよいし、安定化成分を添加した細胞抽出液、及び／または安定化成分を添加した該排除工程に用いるための緩衝液を用いて低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよい。
本発明の方法で用いるコムギ胚芽抽出液としては、ＤＮＡ含有量および／または総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量が低いものが好ましく、例えば、（ａ）２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時のＤＮＡ含有量が２３０μｇ／ｍｌ以下であるもの、あるいは（ｂ）２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が９０の時の総脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸及びリノール酸）含有量の合計量が０．０３ｇ／１００ｇ以下であるものが好ましく、さらに上記（ａ）及び（ｂ）の両方の条件を満たすものが特に好ましい。
上記のコムギ胚芽抽出液は、これをそれぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入し、蛋白質合成を行うことができる。蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，Ｈａｍｅｓ，１７９−２０９，Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４））のように、該細胞抽出液に無細胞蛋白質合成に必要なエネルギー源やアミノ酸、あるいはｔＲＮＡを添加して行う方法や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３公報：以下これを「不連続ゲルろ過法」と称することがある）等を用いることができる。
このような合成反応において、反応溶液の組成としては、例えば、反応溶液の組成としては、上記細胞抽出液、翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が含まれる。また翻訳鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、更に、転写反応に必要なＲＮＡ合成の基質、及びＲＮＡポリメラーゼ等を含むことができる。これらは目的蛋白質や、用いる蛋白質合成系の種類によって適宜選択して調製される。基質となるアミノ酸は、蛋白質を構成する２０種類のアミノ酸で、後述するＮＭＲ解析に適当な標識を付加されたものが用いられる。具体的には、１５Ｎ標識された２０種類のアミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）が好ましい。これらアミノ酸の濃度は０．０５〜０．４ｍＭの範囲が適当である。またエネルギー源としては、ＡＴＰ、またはＧＴＰが挙げられ、ＡＴＰは１．０〜１．５ｍＭ、ＧＴＰは０．２〜０．３ｍＭ添加することが好ましい。各種イオン、及びその適当な反応溶液中の濃度としては、６０〜１２０ｍＭの酢酸カリウム、１〜１０ｍＭの酢酸マグネシウム等が挙げられる。緩衝液としては、１５〜３５ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、あるいは１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸等が用いられる。またＡＴＰ再生系としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ、またはクレアチンリン酸（クレアチンホスフェート）とのクレアチンキナーゼの組み合わせが挙げられる。核酸分解酵素阻害剤としては、反応溶液１μｌあたり０．３〜３．０Ｕのリボヌクレアーゼインヒビターや、０．３〜３Ｕのヌクレアーゼインヒビター等が挙げられる。
このうち、リボヌクレアーゼインヒビターの具体例としては、ヒト胎盤由来のＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＯＹＯＢＯ社製等）等が用いられる。ｔＲＮＡは、Ｍｏｎｉｔｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，４３，１（１９６０）等に記載の方法により取得することができ、または市販のものを用いることもできる。還元剤としては、０．１〜３．０ｍＭのジチオスレイトール等が挙げられる。抗菌剤としては、０．００１〜０．０１％のアジ化ナトリウム、又は０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌのアンピシリン等が挙げられる。核酸安定化剤としては、０．３〜０．５ｍＭスペルミジン等が用いられる。更に、ＲＮＡポリメラーゼとしては翻訳鋳型に含まれるプロモーターに適したものが用いられる。具体的には、例えば、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼやＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等を用いることができる。これらの添加量は適宜選択して合成反応液を調製することができる。
上記反応方法のうち、バッチ法では蛋白質合成を長時間行うと反応が停止することがあるため、後者のアミノ酸やエネルギー源の連続、または不連続供給系を使用することにより、反応を長時間維持させることができ、更なる効率化が可能となる。ここで、ブレンダー法によりコムギ胚芽抽出液を調製した場合にはｔＲＮＡを充分に含んでいるため通常これを添加する必要が無い。
バッチ法により蛋白質合成を行う場合には、例えば翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後に翻訳鋳型を添加してインキュベートすること等により行うことができる。コムギ胚芽抽出液を用いた場合、上記プレインキュベートは１０〜４０℃で５〜１０分間、インキュベートは同じく１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で行う。反応時間は、反応が停止するまでの時間であるが、バッチ法では通常１０分〜７時間程度である。
透析法により蛋白質合成を行う場合には、合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器（第一化学社製：透析カップ１２，０００等）や、透析用チューブ（三光純薬社製：１２，０００等）が挙げられる。透析膜は、透析される蛋白質の分子量より小さい分子量限界を有するものが用いられるが、６，０００〜１２，０００ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
透析外液としては、上記合成反応液から翻訳鋳型を除いたものが用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度、及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては通常１０〜４０℃、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で１０分〜１２日間行うことができる。
重層法を用いて蛋白質合成を行う場合には、合成反応液を適当な容器に入れ、該溶液上に、上記透析法に記載した透析外液を界面を乱さないように重層することにより蛋白質合成を行うことができる。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応相とする。容器としては、例えばマイクロタイタープレート等が挙げられる。この反応相の上層に上記透析法に記載した透析外液（供給相）を界面を乱さないように重層して反応を行う。
両相の界面は必ずしも重層によって水平面状に形成させる必要はなく、両相を含む混合液を遠心分離することによって、水平面を形成することも可能である。両相の円形界面の直径が７ｍｍの場合、反応相と供給相の容量比は１：４〜１：８が適当であるが、１：５が好適である。両相からなる界面面積は大きいほど拡散による物質交換率が高く、蛋白質合成効率が上昇する。従って、両相の容量比は、両相の界面面積によって変化する。合成反応は静置条件下で、反応温度、及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては１０〜４０℃で、好ましくは１８〜３０℃、さらに好ましくは２０〜２６℃で、通常１０〜１７時間行うことができる。また、大腸菌抽出液を用いる場合、反応温度は３０〜３７℃が適当である。
不連続ゲルろ過法を用いて蛋白質合成を行う場合には、合成反応液により合成反応を行い、合成反応が停止した時点で、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を供給し、合成物や分解物を排出することにより蛋白質合成を行う。具体的には例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な容器に入れ反応を行う。容器としては、例えばマイクロプレート等が挙げられる。この反応下では、例えば容量の４８％容のコムギ胚芽抽出液を含む反応液の場合には反応１時間で合成反応は完全に停止する。このことは、アミノ酸の蛋白質への取りこみ測定やショ糖密度勾配遠心法によるポリリボソーム解析（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００））により確認することができる。
合成反応の停止した上記反応溶液を、予め上記透析法に記載の透析外液と同様の組成の供給液により平衡化したゲルろ過カラムを通す。このろ過溶液を再度適当な反応温度に保温することにより、合成反応が再開し、蛋白質合成は数時間に渡って進行する。以下、この反応とゲルろ過操作を繰り返す。反応温度、及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、コムギ胚芽抽出液を用いた系においては２６℃で約１時間ごとにゲルろ過を繰り返すのが好ましい。
かくして得られた蛋白質は、それ自体既知の方法により確認することができる。具体的には例えば、アミノ酸の蛋白質への取りこみ測定や、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分離とクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色、オートラジオグラフィー法（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９７，５５９−５６４（２０００））等を用いることができる。
本発明における蛋白質合成に適した条件を満たす、上記したような合成方法により合成された標識化蛋白質は、これを他の標識化蛋白質から分離精製せずにＮＭＲ測定を行っても、目的蛋白質由来のシグナル以外のノイズシグナルが見られない。ただし、本発明における蛋白質合成に適した条件下で合成を行ったものでも、得られた反応溶液を緩衝液交換等の目的でゲル濾過カラムを通す場合があるが、このような方法は目的蛋白質を他の標識化蛋白質から分離精製する工程には含まれない。
ＮＭＲ測定法の詳細を以下に説明する。蛋白質を上述の条件下で合成した後、これを他の標識化蛋白質から分離精製する工程無しにＮＭＲ測定を行う。このとき、上記合成反応液をそのまま用いることもできるが、好ましくは１００μＭ以上に、それ自体既知の通常用いられる方法により濃縮して、さらに、該濃縮液を、あらかじめＮＭＲ測定用緩衝液、例えば５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ等で平衡化されたゲル濾過カラムを通すことにより緩衝液を交換してＮＭＲ測定用試料とする。ゲル濾過カラムとしては、Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｇ−２５ゲル濾過カラム（アマシャム社製）等が好ましく用いられる。この工程の後も、該合成反応液中には合成された蛋白質以外に細胞抽出液由来の蛋白質も混在するが、異種核ＮＭＲ測定を行うことにより目的蛋白質のシグナルのみが得られる。
ＮＭＲ測定方法は、上記の方法により行うことができるが、例えば、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣと呼ばれるＮＭＲ測定法等が好ましく用いられる（Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣは、蛋白質中のペプチド結合における水素原子と窒素原子との相関スペクトル、すなわち１Ｈ−１５Ｎ相関スペクトルであり、主鎖由来の１Ｈ−１５Ｎシグナルから個々の残基の情報を得ることができる。本発明によるＮＭＲ測定方法により、目的とする蛋白質の標的高分子物質の立体構造解析が可能となる。
かくして得られるスペクトルのうち、主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有するアミノ酸残基の総数の８０〜１５０％、好ましくは８０〜１３０％、さらに好ましくは８０〜１１０％である時に、合成反応液中に含まれる蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定することができる。また、得られたスペクトルのうち、主鎖由来のシグナルの持つ水素原子の３０％以上の化学シフトが８．０〜８．５ｐｐｍの範囲外である時も合成された蛋白質が規則正しい立体構造を有していると同定することができる。さらに、得られたスペクトルのうち主鎖由来のシグナルの数が、蛋白質が有するアミノ酸残基の総数の８０〜１００％以下である時に、合成された蛋白質のフォールディングが単一の立体構造であると同定することができる。
合成された蛋白質が規則正しい立体構造を有し、かつその立体構造が単一のものであると同定された場合、かくなる方法で合成された蛋白質はＮＭＲ測定によりその立体構造を特定する試料として適したものであると判断することができる。すなわち、生体内に存在している目的蛋白質と同等の立体構造を有していると同定することができる。また、かくなる方法で合成された蛋白質は、これを公知の方法の組み合わせにより結晶化し、これをＸ線解析によりその立体構造を特定する試料として適したものであると判断することができる。逆に、取得されたスペクトルが、上記した範囲外である場合、合成された蛋白質は、その立体構造を解析する試料として適さないと判断することができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得るための一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産のチホク小麦（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製Ｒｏｔｏｒ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍｉｌｌ  ｐｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ  １４型）に添加し、回転数７０００ｒｐｍで種子を温和に破砕した。この破砕処理を４回繰り返して行った。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７１ｍｍ〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液［四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１（容量比）］を用いた重液選別によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機ＢＬＭ−３００Ｋ（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／ｍ２となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのＣＣＤラインセンサー（２０４８画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を排除するために、ベージュ色のベルトを取り付け、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、濃緑色のベルトに取り替えて胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
上記によって得られた小麦胚芽５０ｇを４℃の蒸留水中に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次に、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄器を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄して胚乳分を除去した小麦胚芽を得た。
次いで、以下の操作を４℃で行い、胚芽抽出物含有液を得た。まず、洗浄した小麦胚芽を抽出溶媒（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）８０ｍＭ、酢酸カリウム２００ｍＭ、酢酸マグネシウム２ｍＭ、塩化カルシウム４ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．６ｍＭ及びジチオスレイトール８ｍＭ）１００ｍｌとともにワーリングブレンダーに入れ、回転数５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕した。ブレンダー内壁に付着した胚芽等をかき落とした後再び５０００乃至２００００ｒｐｍで３０秒粉砕する作業を２回行った。得られた胚芽粉砕物の粒径分布をレーザー散乱方式粒度分布装置（堀場製作所製ＬＡ−９２０）を用いて測定した。
得られた抽出液と粉砕胚芽の混合物を遠心管に移し３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取した。これをさらに３００００ｇ、３０分間の遠心をかけ上清を採取する操作を５回繰り返し濁りのない上清を得た。これをあらかじめ溶液（ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）４０ｍＭ、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム５ｍＭ、Ｌ型アミノ酸２０種類各０．３ｍＭ及びジチオスレイトール４ｍＭ）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られた液を３００００ｇ、１２分間の遠心をかけ上清を採取し、これを小麦胚芽抽出物含有液とした。試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）（Ａ２６０）が８０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．５）になるように抽出溶媒で調整した。
実施例２：酵母ユビキチン蛋白質のＮＭＲ解析
（１）ｍＲＮＡの合成
酵母ユビキチンの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ０１４７４）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株よりＨｅｒｅｆｏｒｄ法（Ｈｅｒｅｆｏｒｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８，１２６１−１２７１（１９７９））により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型とした配列番号１および２に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法を用いて増幅し、プラスミドｐＥＵ３ｂ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）のＳｐｅＩとＳａｌＩの部位に導入した。１６ｍＭのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを鋳型として、酵母ユビキチンのｍＲＮＡをＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で転写し、合成した。
（２）コムギ胚芽抽出液を用いた酵母ユビキチン蛋白質合成
上記（１）で合成したｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、コムギ胚芽抽出液（ＰｒｏｔｅｉｏｕｓＴＭ、ＴＯＹＯＢＯ社製）と混合した（１ｍｌ）。その混合液を、１５Ｎ標識された２０種類のアミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を含む透析緩衝液に対して、２日間反応を行い、透析緩衝液を交換しさらに２日間の蛋白質合成反応を行った。１ｍｌの反応液は、ミリポア製のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３限外濾過濃縮装置で２５０μｌまで濃縮した。この濃縮液中の酵母ユビキチン蛋白質は１２０μＭとなった。濃縮液を、あらかじめＮＭＲ測定用緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化されたアマシャム社製Ｍｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通すことにより、測定用緩衝液に交換し、ＮＭＲ測定試料とした。
（３）大腸菌の生細胞および大腸菌由来の無細胞蛋白質合成系を用いた蛋白質合成
上記（１）で増幅した酵母ユビキチン遺伝子ＤＮＡをプラスミドｐＥＴ２４ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩとＳａｌＩの部位に導入したプラスミドを鋳型として用い、大腸菌の生細胞（ＢＬ２１（ＤＥ３）株：ノバジェン社製）を用いた坂本らの方法（Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８，１１６３４−１１６４２）に従って１５Ｎ標識された塩化アンモニウム（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を用いて酵母ユビキチン蛋白質の合成を行った。得られた蛋白質は、ＳＰセファロースＦＦカラムを用いて精製した。また、上記（１）で増幅した酵母ユビキチン遺伝子ＤＮＡをプラスミドｐＩＶＥＸ２．３−ＭＣＳ（ロッシュ社製）のＮｄｅＩとＳａｌＩの部位に導入したプラスミドを鋳型として、ＲＴＳ５００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹキット（ロッシュ社製）を用い、これに添付されたマニュアルに記載の方法によって１５Ｎ標識された２０種類のアミノ酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて蛋白質を合成した。
（４）ＮＭＲ測定
ＮＭＲ測定には、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−５００スペクトロメーターを用い、測定試料には磁場の安定性を保つためのＮＭＲロック用に１０％Ｄ２Ｏを添加し、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣの測定を行った。測定温度は３０℃とした。
（５）結果
コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンを合成し、濃縮、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図１に示した。また、大腸菌生細胞で合成し精製した１５Ｎ標識酵母ユビキチン（正しい立体構造と機能を持つことを確認済）の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図２に示した。図から明らかなように、小麦胚芽無細胞蛋白質合成系により得られた試料を精製せずにＮＭＲ測定した場合、大腸菌で合成し、精製したものと全く同様のスペクトルが得られた。さらに、大腸菌細胞抽出液を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンを合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図３に示した。図中○で囲んだスペクトルは、不純物によるシグナルであり、大腸菌細胞抽出液により合成した試料からのみ認められ、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系から得られた試料からは認められなかった。よって、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系により合成した蛋白質は、これを精製せずに標識しても、目的蛋白質だけが標識され、しかも、正しい立体構造を持っていることがわかった。
また、このＨＳＱＣスペクトルは、試料を３０℃４日間保温した後、再び測定しても全く同じスペクトルが得られた。よって、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて、合成した１５Ｎ標識蛋白質は、測定に十分な時間、分解を受けることなく安定に存在することがわかった。
実施例３：酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質のＮＭＲ解析
（１）ｍＲＮＡの合成
酵母ユビキチンヒドロラーゼ１の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００１１４２）は、上記実施例２の（１）と同様の方法で調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３および４に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅したＤＮＡと、同じ鋳型を用いて配列番号５および６に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅したＤＮＡを混合し、さらにこれらのＤＮＡを鋳型として配列番号３および６に記載の塩基配列からなるプライマーを用いて増幅したＤＮＡをプラスミドｐＥＵ３ｂ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）のＳｐｅＩとＳａｌＩの部位に導入した。１６ｍＭのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを鋳型として、酵母ユビキチンヒドロラーゼ１のｍＲＮＡをＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で転写し、合成した。
（２）酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質合成およびＮＭＲ解析
上記（１）で得られたｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、実施例２（２）、（３）と同様の方法でコムギ胚芽抽出液、大腸菌生細胞、および大腸菌細胞抽出液を用いて酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質を合成した。
コムギ胚芽抽出液、および大腸菌細胞抽出液を用いて合成した酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質は、濃縮して緩衝液をＮＭＲ解析用に交換した後に実施例２（４）と同様の方法でＮＭＲ解析を行った。また、大腸菌生細胞を用いて合成した酵母ユビキチンヒドラーゼ１蛋白質はＳＰセファロースＦＦカラムを用いて精製した後に実施例２（４）と同様の方法でＮＭＲ解析を行った。
（３）結果
コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質を合成し、濃縮、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図４に示した。また、大腸菌生細胞で合成し精製した１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１（正しい立体構造と機能を持つことを確認済）の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図５に示した。図から明らかなように、小麦胚芽無細胞蛋白質合成系により得られた試料を精製せずにＮＭＲ測定した場合、大腸菌で合成し、精製したものと全く同様のスぺクトルが得られた。さらに、大腸菌細胞抽出液を用いて１５Ｎ標識酵母ユビキチンヒドロラーゼ１蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図６に示した。図中○で囲んだスペクトルは、不純物によるシグナルであり、大腸菌細胞抽出液により合成した試料からのみ認められ、上記酵母ユビキチン蛋白質の測定と同様、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系から得られた試料からは認められなかった。
実施例４：大腸菌チオレドキシン蛋白質のＮＭＲ解析
（１）ｍＲＮＡの合成
大腸菌チオレドキシンの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ５４８８１）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株より、ＭａｇＰｒｅｐ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）により調製した大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７および８に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅し、プラスミドｐＥＵ３ｂ（ＷＯ０１／２７２６０号公報、Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（２３），１４６５２−１４６５７（２００２））のＳｐｅＩとＳａｌＩの部位に導入した。１６ｍＭのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを鋳型として、大腸菌チオレドキシンのｍＲＮＡをＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で転写し、合成した。
（２）大腸菌チオレドキシン蛋白質合成およびＮＭＲ解析
上記（１）で得られたｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、実施例２（２）、（３）と同様の方法でコムギ胚芽抽出液、および大腸菌細胞抽出液を用いて大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成した。
コムギ胚芽抽出液、および大腸菌細胞抽出液を用いて合成した大腸菌チオレドキシン蛋白質は、濃縮して緩衝液をＮＭＲ解析用に交換した後に実施例２（４）と同様の方法でＮＭＲ解析を行った。
（３）結果
コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、濃縮、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図７に示した。また、大腸菌細胞抽出液を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、精製せずに濃縮および緩衝液交換をした後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図８に示した。図中○で囲んだスペクトルは、不純物によるシグナルであり、大腸菌細胞抽出液により合成した試料からのみ認められ、上記酵母ユビキチン蛋白質の測定と同様、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系から得られた試料からは認められなかった。
実施例５：ＮＭＲ測定による蛋白質のフォールディング同定
（１）ｍＲＮＡの合成
ヒトｍｃｍ４遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０３０２７３）のうちアミノ酸番号１から１４７までをコードする部分（以下、これを「ヒトｍｃｍ４遺伝子」と称することがある）は、ＱｕｉｃｋＣｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、配列番号９および１０に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。また、大腸菌チオレドキシンの遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ５４８８１）は、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株より、ＭａｇＰｒｅｐ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）により調製した大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７および８に記載の塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅した。これらのＤＮＡを、プラスミドｐＥＵ３ｂ（ＷＯ０１／２７２６０号公報、Ｓａｗａｓａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９９（２３），１４６５２−１４６５７（２００２））のＳｐｅＩとＳａｌＩの部位に導入した。１６ｍＭのマグネシウムイオン存在下で上記プラスミドを鋳型として、ヒトｍｃｍ４および大腸菌チオレドキシンのｍＲＮＡをＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で転写し、合成した。
（２）蛋白質合成およびＮＭＲ解析
上記（１）で得られたｍＲＮＡを１００μｇ／１３０μｌに成るように濃縮し、実施例２（２）、（３）と同様の方法でコムギ胚芽抽出液を用いてヒトｍｃｍ４蛋白質（アミノ酸番号１から１４７まで）および大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成した。合成した蛋白質を濃縮して緩衝液をＮＭＲ解析用に交換した後に、実施例２（４）と同様の方法でＮＭＲ解析を行った。
（３）結果
コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識大腸菌チオレドキシン蛋白質を合成し、濃縮、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図９に示した。また、コムギ胚芽無細胞蛋白質合成系を用いて１５Ｎ標識ヒトｍｃｍ４蛋白質を合成し、濃縮、緩衝液交換した後、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを測定した結果を図１０に示した。図９に示したＮＭＲシグナルは、主鎖由来のシグナルの持つ水素原子の３０％以上の化学シフトが８．０〜８．５ｐｐｍの範囲外であり、一方、図１０に示したＮＭＲシグナルは、その範囲内であった。これらのことから、上記の蛋白質合成法により合成された大腸菌チオレドキシン蛋白質は、規則正しい立体構造を有していて、ヒトｍｃｍ４蛋白質は、規則正しい立体構造を有していないと同定することができた。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法によれば、蛋白質を合成後、目的蛋白質をその他の標識化蛋白質から分離精製することなくＮＭＲ測定が可能になる。このＮＭＲ測定による蛋白質のフォールディングの同定によれば、本発明の方法により、合成された目的蛋白質がＮＭＲ解析や、公知の方法の組み合わせにより結晶化し、Ｘ線解析によりその立体構造を特定する試料として適したものであるかを判断することができる。従って、本発明の方法によれば、結果としてハイスループットな蛋白質の立体構造評価、および蛋白質相互作用解析が可能になる。
本出願は、２００３年２月１０日付けの日本特許出願（特願２００３−３２３８１）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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