(57)【要約】ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換されていることを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。このＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、遺伝子機能の解析に用いられるＲＮＡｉ分子を、任意の時期に、あるいはある特定の組織（臓器）のみで誘導し得るような、条件付きＲＮＡｉ誘導方法に使用することができる。
2004074474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換されていることを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項２】
一部の配列が、転写開始点より−５０〜−１の配列の何れかであることを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項３】
Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列が、ｌｏｘＰ配列であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項４】
ｌｏｘＰ配列の１０〜２５の配列がＴＡＴＡボックスとして機能するような位置にあることを特徴とする、請求項３に記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項５】
プロモーターがＨ１  ＲＮＡ遺伝子又はＵ６  ＲＮＡ遺伝子のプロモーターであることを特徴とする、請求項１乃至４の何れかに記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項６】
プロモーターがマウス又はヒト由来であることを特徴とする、請求項１乃至５の何れかに記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかのプロモーターにおいて、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列，ＰＳＥ，及びＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、遺伝子配列が欠失，付加，置換，挿入されていることを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター
【請求項８】
配列番号１で表されるＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れかに記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することを特徴とする、ＲＮＡ干渉法を利用した遺伝子発現制御方法。
【請求項１０】
請求項１乃至８の何れかに記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することを特徴とする、トランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１１】
請求項１乃至８の何れかに記載のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することを特徴とする、ＲＮＡ遺伝子の発現を制御する方法。
【請求項１２】
ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列を、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換することを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及びその製造方法並びにその使用方法に関する。更に詳しくは、ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（以下「ＰＳＥ」と記載する。）とＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換されていることを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター及びその製造方法並びにその使用方法に関する。
【背景技術】  真核生物においては、共通的にＩ型からＩＩＩ型の３種類のＲＮＡポリメラーゼが存在するが、ＩＩＩ型ポリメラーゼは、運搬ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ；以下「ｔＲＮＡ」と記載する。）や核内低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ；以下「ｓｎＲＮＡ」と記載する。）といった低分子のＲＮＡ遺伝子の合成を行う。ＩＩＩ型ポリメラーゼによるＲＮＡ合成は、転写開始点が厳密に定まっており、ＤＮＡ上の５つの連続したチミジン配列により転写を終結する。加えて、転写終結時に、２から３塩基のアデニル付加を行う。また、ＩＩＩ型ポリメラーゼのプロモーターは、ＴＡＴＡボックスを持つプロモーターと持たないプロモーターの２種類がある。ＴＡＴＡボックスを持つＩＩＩ型ポリメラーゼのプロモーターは、以下に示す通り遺伝子機能の解析などに利用されている。
ポストゲノムシークェンス時代においては、遺伝子機能解析法として、遺伝子の塩基配列がわかればその機能を解析できるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；以下「ＲＮＡｉ」と記載する。）などの逆遺伝学の手法が注目されてきている。ＲＮＡｉは、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる二重鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ；以下「ｄｓＲＮＡ」と記載する。）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象である。
例えば、合成した３０塩基対未満のｄｓＲＮＡからなる短鎖インターフェアＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；以下「ｓｉＲＮＡ」と記載する。）を哺乳類細胞へ導入すると、相同配列を持つｍＲＮＡが分解され、その結果、標的とされたｍＲＮＡが翻訳される蛋白質の発現が著しく低下する。同様に、センス鎖とアンチセンス鎖ＲＮＡを同時に、又は逆方向反復配列のヘアピンＲＮＡ分子（ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；以下「ｈｐＲＮＡ」と記載する。）を発現するＤＮＡベクターを哺乳類細胞へ導入してＲＮＡｉを誘導できることが明らかとなった。このとき、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いた方法が開発されてきている。
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２）２０：４４６−４４８
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２）１９：４９７−５００
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いたＲＮＡ合成方法により、ＲＮＡｉを恒常的に起こす細胞を単離したり、ＲＮＡｉを起こすトランスジェニック（ＴＧ）マウスの作製が遺伝子機能解析の目的で試みることができるようになった。
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．（２００２）９９（８）：５５１５−２０．
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００２）５３２（１−２）：２２７−３０
しかし、ＲＮＡｉは遺伝子発現を抑制する仕組みのため、遺伝子発現を抑制する標的遺伝子によっては、細胞の生育に大きな影響を与え、ＲＮＡｉを起こす細胞のクローニングができなかったり、ＲＮＡｉを誘導するＴＧマウスが胎生期死亡を示すことが予測される。また、抑制遺伝子と表現型の異常の関連をより厳密に証明するために、発生段階や特定の組織（臓器）でのみＲＮＡｉを起こし、遺伝子の機能解析を行う必要が生ずる。
これらのことから、ＲＮＡｉを任意の時期において誘導したり、ある特定の組織（臓器）のみでＲＮＡｉを誘導し得るような条件付きＲＮＡｉ誘導方法の確立が期待されている。
一方、ある条件下又はある組織の中でのみ標的遺伝子が欠損するように制御できる方法としてＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムが開発され、例えばノックアウトマウスなどの作製に用いられている。
特開平１−１１２９８６号
このシステムは、バクテリオファージＰＩのＣｒｅ組換え酵素が、３４塩基からなるｌｏｘＰ配列を認識し、ＤＮＡ組換えを起こして、ｌｏｘＰ配列間領域のループアウトを行うことを利用しているが、このＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは哺乳類動物細胞においても働くことが知られている。このシステムは、プロモーターと目的遺伝子の間に、ｌｏｘＰ配列で囲まれたスタッファー（以下「ｓｔｕｆｆｅｒ」と記載する。）を配した構成を用いると、通常ではスタッファー内の遺伝子のみが発現し、目的の遺伝子は完全に発現が抑制される。しかし、Ｃｒｅ組換え酵素を作用させると、２つのｌｏｘＰ配列間で相同組換えを起こし、その結果、スタッファー遺伝子が除去されて、目的の遺伝子発現が誘導される。
（別冊実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  遺伝子の機能阻害実験法，Ｐ．３３−３７，田辺，２００１）
そこで、本発明者等は、これらのＲＮＡｉ法とＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを組み合わせることを試みたが、目的の遺伝子がＲＮＡｉを誘導する分子を転写する遺伝子である場合、プロモーターと目的遺伝子の間に、ｌｏｘＰ配列で囲まれたｓｔｕｆｆｅｒ配列を導入する上記のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムでは、一方のｌｏｘＰ配列が残されるため、これが目的遺伝子と同時に転写され、ＲＮＡｉ分子内に挿入されてしまい、ＲＮＡｉ分子として不適切な構造を取ってしまう。その結果本来の目的であるＲＮＡｉを起こすことができなかった。
【発明の開示】
本願発明者等は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター内の一部を、転写に必要な配列を崩さぬようにｌｏｘＰ配列で置換することにより、転写によってもｌｏｘＰ配列がＲＮＡｉ分子内に挿入されず、ＲＮＡｉを起こしうることを見いだし、本願発明を完成したものであって、その目的とするところは、遺伝子機能の解析に用いられるＲＮＡｉ分子を、任意の時期に、あるいはある特定の組織（臓器）のみで誘導し得るような、条件付きＲＮＡｉ誘導方法に使用することができる新規ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、トランスジェニック動物の作製に好適に使用される新規ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを提供することである。
以下、本発明を詳細に説明する。
上述の目的は、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換されていることを特徴とする、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって達成される。
本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列を、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換することにより作製することができる。
Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換される配列は、転写開始点より−５０〜−１の配列の何れかであることが好ましい。
本発明において用いられるＣｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列としては、例えばｌｏｘＰ配列やその改変体等が挙げられる。
ｌｏｘＰ配列とは、配列特異的な１３塩基（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ）のインバートリピート配列と、配列非特定な８塩基のスペーサー配列の、３４塩基対からなるものである（第１図（Ｂ））。
その改変体としては、スペーサー配列を置換したもの，あるいは、スペーサー配列とインバートリピート配列の一部を置換したもの等が挙げられ、具体例としては、例えば特開平１１−１９６８８０号公報において示されているようなものが挙げられる。ｌｏｘＰ配列は、ｌｏｘＰ配列の１０〜２５が、置換後のプロモーターにおいて、ＴＡＴＡボックスとして機能するような位置に、置換することが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとは、ｈｐＲＮＡやｓｉＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが、転写開始時に結合する配列であるが、例えば、転写開始点より上流に転写制御領域を持つ、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子のプロモーター及びＵ６  ＲＮＡ遺伝子のプロモーターなどが用いられる。
また、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとしては、ヒト由来又はマウス由来などのプロモーターの何れもが使用できる。
特に好ましい本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとして、以下に示すＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター（ＲＮＡｉ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｈ１  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｏｘＰ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が挙げられる。
以下に、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターを具体例として更に本発明を詳細に説明する。
ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの作製：
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ｔＲＮＡやｓｎＲＮＡといった低分子ＲＮＡ遺伝子の合成に適する。ＴＡＴＡボックスを持つＩＩＩ型プロモーターは、転写開始点と転写終結点が定まっていることが知られる（背景技術の項、参照）。
的確なＲＮＡ分子の合成が要求されるＲＮＡｉ誘導において、上述のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写特性は、ｓｉＲＮＡ及びｈｐＲＮＡ分子の合成に適切である。
このＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの１つ、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子プロモーターは、プロモーターの構造が良く調べられており、オクタマー（以下「Ｏｃｔａｍｅｒ」と記載する。）配列（−９７から−９０）、スタッフ（以下「Ｓｔａｆ」と記載する。）結合配列（−８８から−６９）、ＰＳＥ配列（−６８から−５１）、ＴＡＴＡボックス（−３０から−２６）が転写に重要な配列であることが示されている（第１図（Ａ））。
特に、ＴＡＴＡボックスとＰＳＥは、この両配列の存在とその転写開始点からの距離が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写を行う際に必須となる。
ｌｏｘＰ配列は、上述したように、配列特異的な１３塩基（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ）のインバートリピート配列と配列非特定な８塩基のスペーサー配列の３４塩基対より構成される（第１図（Ｂ））。
従って、このｌｏｘＰ配列を、Ｈ１プロモーターの−３９から−６に置換することによって、転写に必要な上記４つの配列（Ｏｃｔａｍｅｒ配列，Ｓｔａｆ結合配列，ＰＳＥ配列，ＴＡＴＡボックス配列）を崩さぬように、しかもｌｏｘＰ配列内のＴＡＴＡ配列（１０から１４）が、Ｈ１プロモーター内のＴＡＴＡボックス配列と同位置に置き換えられるため、ＴＡＴＡボックスの機能も損なわずに、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターを作製することができる。
上記ｌｏｘＰ配列について更に説明を加える。
ｌｏｘＰ配列の変換と位置：
ｌｏｘＰ配列は、上述の通り、１３塩基のインバートリピート構造と８塩基のスペーサー配列からなる３４塩基対ＤＮＡ配列である。固定化されているインバートリピート構造に比べて、スペーサー配列は塩基置換が容易である。上述の例ではＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの作成に際し、ｌｏｘＰ配列による置換は、ｌｏｘＰ配列内のＴＡＴＡ配列（１０から１４）を利用し、Ｈ１プロモーターのＴＡＴＡ配列（−３０から−２６）を崩さずに、Ｈ１プロモーターの転写開始点より−３９から−６の位置へ行っている。しかし、スペーサーの配列を変換させたり、ｌｏｘＰ配列内の他のＴＡＴＡ配列（２２から２５）を利用することにより、プロモーターのＴＡＴＡボックス配列の転写開始点からの距離を変えずに、ｌｏｘＰ配列による置換を行うことが可能である。このようなプロモーターは、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターと同様に機能し得る。
尚、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列，ＰＳＥ，及びＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、遺伝子配列が欠失，付加，置換，挿入されているものも含まれる。
本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、以下のように使用することができる。
（１）本発明のｌｏｘＰ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの下流に、スタッファー配列、もう一つのｌｏｘＰ配列とＲＮＡｉ誘導配列の融合配列の順に配した構成を作る。このような構造は、スタッファー内のみを転写し、ＲＮＡｉを誘導するＲＮＡ分子は誘導されない。しかし、Ｃｒｅ組換え酵素（以下「Ｃｒｅ酵素」と記載する。）を作用させると、スタッファー配列が除去され、ＲＮＡｉ分子を誘導することができる。
（２）また、本発明のｌｏｘＰ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの下流に目的のＲＮＡｉ誘導配列を挿入し、更に下流にもう１つのｌｏｘＰ配列を挿入しておく。
このような構造は、もともとＲＮＡｉを誘導することができるが、Ｃｒｅ酵素を反応させ、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＲＮＡｉ誘導配列を除去することによって、ＲＮＡｉを解除することができる。
（３）更に、本発明のｌｏｘＰ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターともう１つのｌｏｘＰ配列により転写産物発現を制御できる系を利用して、ＴＧマウスや細胞株を作製することができる。作製したＴＧマウスや細胞株は、Ｃｒｅ酵素依存的に転写産物の発現を制御することができる。
（４）更に、本発明のｌｏｘＰ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡ遺伝子の発現を誘導することができる。即ち、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ＲＮＡｉ誘導配列を持つ転写産物に限らず、いかなる転写産物も転写可能である。しかも、本発明のｌｏｘＰ配列を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターと、もう１つのｌｏｘＰ配列との間に目的とする転写産物遺伝子を導入することにより、転写の誘導及び解除ができる。
【図面の簡単な説明】第１図は、プロモーター配列とｌｏｘＰ配列を表す図である。
（Ａ）：ヒトＨ１  ＲＮＡ遺伝子プロモーター
（Ｂ）：ｌｏｘＰ配列
（Ｃ）：ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター
第２図は、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド，ｐＵＮＯ１２６，ｐＵＮＯ１３７の各々を導入した場合の、明視野による細胞観察結果を表す図である。
第３図は、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド，ｐＵＮＯ１２６，ｐＵＮＯ１３７の各々を導入した場合の、蛍光視野による細胞観察結果を表す図である。
第４図は、第２図と第３図を重ね合わせた図である。アスタリスク（＊）は、蛍光が認められない細胞を表す。
第５図は、Ｃｒｅ酵素によるＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの反応の概略
第６図は、ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８のＣｒｅ酵素により生じた組換え体（ｐＵＮＯ１４９とｐＵＮＯ１５０）の電気泳動図である。図中、「ｏｒｉ」とは、Ｃｒｅ酵素による組み換え前の全長プラスミドであり、「ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ」とは、Ｃｒｅ酵素による組み換え後のプラスミドである。
第７図は、ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４９、ｐＵＮＯ１４８とｐＵＮＯ１５０のＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター転写開始点近傍のＤＮＡ配列を表す図である。
第８図は、ｐＵＮＯ１４８のみ，あるいはｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時に導入した場合の、蛍光視野による細胞観察結果を表す図である。
第９図は、ｐＵＮＯ１４８のみ，あるいはｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時に導入した場合の、明視野による細胞観察結果を表す図である。
第１０図は、第８図と第９図を重ね合わせた図である。アスタリスク（＊）は、蛍光が認められない細胞を表す。
第１１図は、Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した肝臓を示す図である。
第１２図は、ＥＧＦＰ蛋白質を恒常的に発現するトランスジェニックマウス（ｅＧＦＰマウス）へ、リンゲル溶液を注入した肝臓を示す図である。
第１３図は、ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９を１００マイクログラム注入した肝臓を示す図である。
第１４図は、ｅＧＦＰマウスへ、ｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミド（８０マイクログラム）とｐＵＮＯ１４８（２０マイクログラム）を注入した肝臓を示す図である。
第１５図は、第１１〜１４図に関する、マウス生体におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
本発明に用いた細胞とマウスは以下のようにして入手した。
ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子とＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）融合蛋白質を発現しているＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞は、愛媛大学より供与を受けた。ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ；以下「ｅＧＦＰマウス」と記載する。）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．より購入した。
【実施例１】（１）プラスミドの作製：
（ヒトＨ１プロモーターの作製）
ヒトＨ１プロモーターは、ヒトゲノムＤＮＡより、次のＤＮＡプライマー（ｈＨ１／＃３  ５’−ｇｇａａｔｔｃｔｔａｔａｇｇｇａｇｃｔｇａａｇｇｇａａｇｇ、ｈＨ１／＃２  ５’−ｇｇｇａｔｃｃｇａａｇａｃｔａｔｇｇｇａａａｇａｇｔｇｇｔｃｔｃａｔａｃａｇ）を用いて、ＰＣＲにて増幅した。増幅した断片は、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＥｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした（ｐＵＮＯ１１５）。
（プラスミドｐＵＮＯ１２６の作製）
Ｈ１プロモーターに依存し、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすプラスミドｐＵＮＯ１２６を作製するために、以下のＤＮＡプライマー（ＨＢ−ＥＧＦ＿ＫＯ２  ５’−ｃａｇｇｇｃｃｃａａａａａａｇｃｔｃｔｔｔｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｔｔｃｔｃｔｔｇａａａｃｔｇｃａｇｃｃａｇａａａｇａｇｃｔｇｇｇａａａｇａｇｔｇｇｔｃｔｃ、ｈＨ１／＃５  ５’−ｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔａｇｇｇａｇｃｔｇａａｇｇｇａａｇｇ）とｐＵＮＯ１１５を用いて、ＰＣＲを行い、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＶ部位へクローニングした。
（プラスミドｐＵＮＯ１３７の作製）
ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターに依存し、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすプラスミドｐＵＮＯ１３７を作製するために、ＤＮＡプライマー（ＨＬＸ  ５−ｇｇｇａｔｃｃａａａａａａｇｃｔｃｔｔｔｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｔｔｔｃｔｃｔｔｇａａａａｃｔｇｃａｇｃｃａｇａａａｇａｇｃｔｇｇｇａａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｃａｇａａｃｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔａａｔｃｃａａａｇａｃａｔｔｔｃａｃ、ｈＨ１／＃４  ５’−ｇａｃｔａｇｔｔｔａｔａｇｇｇａｇｃｔｇａａｇｇｇａａｇｇ）とｐＵＮＯ１１５を用いて、ＰＣＲを行い、制限酵素Ｓｐｅ  ＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ．）のＳｐｅ  ＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした。
（プラスミドｐＵＮＯ１４７の作製）
Ｃｒｅ酵素に依存し、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすプラスミドｐＵＮＯ１４７は、次のように作製した。
はじめに、ＤＮＡプライマー（Ｌ／Ｈ  ５’−ｃｃｔｇｃａｇｇｇｇａａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｃ、ｈＨ１／＃５  ５’−ｇｃｔｃｇａｇｔｔａｔａｇｇｇａｇｃｔｇａａｇｇｇａａｇｇ）とｐＵＮＯ１３７を用いて、ｐＵＮＯ１３７のプロモーター部位のみをＰＣＲ増幅し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＶ部位へクローニングした。
塩基配列を読み、Ｌ／Ｈプライマーの配列がｐＺＥｒＯ  ＩのＰｓｔ  Ｉ部位の隣に位置するクローンを単離した（ｐＵＮＯ１４２）。
更に、ＤＮＡプライマー（Ｌ−Ｓｐ  ５’−ａｃｔａｇｔｃａｔｇａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｇｔｔｃｔｇ、Ｍ１３ｒ  ５’−ｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃ）とｐＵＮＯ１３７を用いて、ｐＵＮＯ１３７のｌｏｘＰ配列とＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導配列をＰＣＲ増幅し、制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＳｐｅ  Ｉで切断し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＢａｍ  ＨＩとＳｐｅ  Ｉ部位へクローニングした（ｐＵＮＯ１４４）。
最終的に、ｐＵＮＯ１４７は、ｐＵＮＯ１４２を制限酵素Ｐｓｔ  ＩとＰｖｕ  ＩＩで切断し、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターを含む配列を、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ  ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ．）のＰｓｔ  ＩとＰｖｕ  ＩＩ部位へクローニングし（ｐＵＮＯ１４３）、更に、ｐＵＮＯ１４４を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＸｂａ  Ｉで切断したｌｏｘＰ配列を含む断片を、ｐＵＮＯ１４３のＮｈｅ  ＩとＢｇｌ  ＩＩ部位へ挿入した。
（プラスミドｐＵＮＯ１４８の作製）
また、Ｃｒｅ酵素に依存して、ＹＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすプラスミドｐＵＮＯ１４８は、ＤＮＡオリゴマー（ＥＧＬＸ＿（ＡＳ）５’−ｃｇａｇａｔｃｔａａａａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｔｇａａｃａｃｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｇｔｇｇｇ、ＥＧＬＸ＿（Ｓ）５’−ｃｇｔｃａｔｇａａｔａａｃｔｔｃｇｔａｔａａｇｔｔｃｔｇｔｔａｔａｃｇａａｇｔｔａｔｔｔｃｃｃａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃ）を合成、アニーリング、ＰＣＲ増幅し、ｐＺＥｒＯ  Ｉの制限酵素部位Ｅｃｏ  ＲＶへクローニングした。塩基配列を読み、ＥＧＬＸ＿（ＡＳ）プライマーの配列がｐＺＥｒＯ  ＩのＢａｍ  ＨＩ部位の隣に位置するクローンを単離した（ｐＵＮＯ１４５）。
ｐＵＮＯ１４５を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩとＸｂａ  Ｉで切断したｌｏｘＰ配列を含む断片を、ｐＵＮＯ１４３のＮｈｅ  ＩとＢｇｌ  ＩＩ部位へ挿入した。
（マウスＵ６プロモーターの作製）
マウスＵ６プロモーターは、マウスゲノムＤＮＡと次のＤＮＡプライマー（ＤＮＡプライマー（ｍＵ６／＃１  ５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｔａ、ｍＵ６／＃２  ５’−ｇｇｇａｔｃｃｇａａｇａｃｃａｃａａａｃａａｇｇｃｔｔｔｔｃｔｃｃａａ）を用いて、ＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした（ｐＵＮＯ１１７）
（プラスミドｐＵＮＯ１２９の作製）
Ｕ６プロモーターに依存して、ＹＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすプラスミドｐＵＮＯ１２９を作製するために、ＤＮＡプライマー（ＥＧＦＰ＿ＫＯ１  ５’−ｃｇｇａｔｃｃａａａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｔｇａａｃａｃｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｇａａａｃａａｇｇｃｔｔｔｔｃｔｃ，ｍＵ６／＃１  ５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｔａ）とｐＵＮＯ１１７を用いて、ＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした。
（２）トランスフェクション：
ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞は、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子とＹＦＰ遺伝子の融合蛋白質を発現している。様々なプラスミドは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ．）で、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞へ遺伝子導入された。
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（３．０マイクロリットル）は、１００マイクロリットルのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）へ希釈し、５分間室温に置いた。ＤＮＡ（１．６マイクログラム）を、１００マイクロリットルＯｐｔｉ−ＭＥＭへ希釈した。これらの溶液を混合し、２０分間室温に置いた。そして、混合液を１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと１２ｗｅｌｌプレートの細胞へ加えた。４時間後、ＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液は除き、培養液へ置き換えた。
（３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え反応：
ｐＵＮＯ１４７あるいはｐＵＮＯ１４８のＣｒｅ組換え反応は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．より購入したＣｒｅ組換え酵素を用いて行った。２００ｎｇのプラスミドを、１マイクロリットルＣｒｅ酵素、２マイクロリットル１０ｘバッファー、２マイクロリットルＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）の加わった２０マイクロリットル反応溶液中で、室温で１５分間反応させた。反応後、７０℃で、酵素を失活させるために、５分間保温した。
（４）マウスへの遺伝子導入：
１００マイクログラムのプラスミドＤＮＡを３ｍｌのリンゲル溶液（１４７ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，１．１３ｍＭ  ＣａＣｌ２）へ希釈した。尾静脈注入を、２７−ｇａｕｇｅ針を通して、７秒で行った。
以下にＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターを使用して行った試験結果を例示する。
（１）ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターによるＲＮＡｉ誘導：
設計したＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターがＲＮＡｉを誘導するか否かを確かめるために、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターあるいはＨ１プロモーターの下流に、ヒトＨＢ−ＥＧＦに対するＲＮＡｉ誘導配列（ｈｐＲＮＡ）を挿入した。Ｈ１プロモーターよりｈｐＲＮＡが転写されるように設計したｐＵＮＯ１２６，及びＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターよりｈｐＲＮＡが転写されるように設計したｐＵＮＯ１３７，そして対照として、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを、各々ＨＢ−ＥＧＦ−ＹＦＰ融合蛋白質を発現しているＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰへ導入した。
そして、４８時間後に、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現抑制効果を、ＹＦＰ蛋白質の発光の蛍光顕微鏡観察により確認した。
第２図は、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド，ｐＵＮＯ１２６，ｐＵＮＯ１３７の各々を導入した場合の、明視野による細胞観察結果である。
第３図は、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド，ｐＵＮＯ１２６，ｐＵＮＯ１３７の各々を導入した場合の、蛍光視野による細胞観察結果である。
ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ融合蛋白質の存在が緑色の発光によって観察された。
第４図は、第２図と第３図を重ね合わせたものである。
（Ｃ）では、ほぼすべての細胞がＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ蛋白質を発現していることが確認された。
（Ｆ）では、アスタリスク（＊）で示した細胞において、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ由来の緑色の発光が認められなかった。
（Ｉ）においても、アスタリスク（＊）で示す様に、ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ由来の緑色の発光が認められない細胞が観察された。
これは、ｐＵＮＯ１２６によって、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子発現が抑制されたことを示す。したがって、Ｈ１プロモーターより転写されるｈｐＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことが確認された。
また、ＹＦＰ遺伝子に対するｈｐＲＮＡ分子をＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターより転写するように設計したプラスミドｐＵＮＯ１５０のＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞への遺伝子導入は、ＹＦＰ遺伝子に対するｈｐＲＮＡ分子をマウスＵ６  ＲＮＡ遺伝子プロモーターより転写するように設計したプラスミドｐＵＮＯ１２９のＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞への遺伝子導入と同様にＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰの存在量を減少させ、ＲＮＡｉ効果を示した。
ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターに依存して、ｈｐＲＮＡ分子を転写するように設計したプラスミド（ｐＵＮＯ１３７とｐＵＮＯ１５０）のＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞への遺伝子導入により、目的遺伝子産物のＲＮＡｉ効果が認められたので、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（Ｈ１プロモーターとＵ６プロモーター）同様に、ＲＮＡｉの誘導に有効に働き、ｈｐＲＮＡ分子の転写合成に適切であることを示している。
（２）ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターのＣｒｅ酵素による組換え反応：
設計したＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターがＣｒｅ酵素によるｌｏｘＰ配列特異的組換え反応を行うかを確かめるために、ｐＵＮＯ１４７及びｐＵＮＯ１４８プラスミドを作製した。
ｐＵＮＯ１４７は、ＳＶ４０／Ｚｅｏ２の制限酵素部位Ｐｖｕ  Ｉから制限酵素部位Ｐｓｔ  Ｉの方向へＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターを挿入し、更に、制眼酵素部位Ｎｈｅ  Ｉから制限酵素部位Ｂｇｌ  ＩＩの方向へＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター配列の−３９から−１に一致する配列（ｌｏｘＰ配列＋ｔｔｃｃｃ）とＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するｈｐＲＮＡ配列との融合配列を挿入し作製した（第５図）。
尚、ｐＵＮＯ１４８は、ｐＵＮＯ１４７のＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するｈｐＲＮＡの代わりに、ＹＦＰ遺伝子に対するｈｐＲＮＡを挿入することによって作製した。
ｐＵＮＯ１４７と１４８を精製Ｃｒｅ酵素と反応させた。反応後、未反応プラスミドを減らすため、制限酵素Ｓａｌ  ＩとＢａｍ  ＨＩにより反応させた後に、大腸菌へ形質転換し、シングルクローンを得た。
得られたクローンは、アンピシリン培地とゼオシン培地へ、爪楊枝で広げることにより、スクリーニングを行った。
ｐＵＮＯ１４８とｐＵＮＯ１４７は、アンピシリン耐性遺伝子とゼオシン耐性遺伝子を持ち、これらのクローンは両抗生物質に対して耐性である。しかし、組換え体は、アンピシリン耐性遺伝子しか持たず、ゼオシン培地での増殖は行えない。
スクリーニングの結果、８３％のクローンがアンピシリン耐性かつゼオシン感受性であった。したがって、このようなクローンは、ｐＵＮＯ１４９やｐＵＮＯ１５０に示すようなゼオシン耐性遺伝子を失った組換え体であることが期待される（第５図）。
ゼオシン耐性を失ったクローンが、ｌｏｘＰ配列特異的に組換え反応を起こし、ゼオシン耐性遺伝子を含むｌｏｘＰ配列間領域（１．１ｋｂｐ）をループアウトした結果であるかを確かめるために、プラスミドを抽出し解析した。
第６図は、組換え反応により、ゼオシン耐性を失ったクローンよりプラスミドを抽出し解析した結果である。ゼオシン耐性を失ったクローンは、組換え反応前のプラスミドの長さに比べて、プラスミドの長さが短くなっていた。これは、Ｃｒｅ酵素により、ｌｏｘＰ配列間でループアウトを行った結果であることが期待される。
最終的に、Ｃｒｅ反応により得られた組換え体のＤＮＡ配列を調べた（第７図）。Ｃｒｅ酵素反応前、転写開始点にはｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２由来の配列が認められる。しかし、Ｃｒｅ酵素反応後、転写開始点には、新たにＲＮＡｉ誘導配列が挿入されていた。また、ｌｏｘＰ配列間のゼオシン耐性遺伝子を含む領域のＤＮＡ配列は認められなかった。したがって、Ｃｒｅ酵素に依存し、ゼオシン耐性遺伝子を含むｌｏｘＰ配列間領域は、ループアウトし、ＲＮＡｉ誘導配列が転写開始点に配置されたといえる。
これらの結果は、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターが、Ｃｒｅ酵素により、ｌｏｘＰ配列特異的組換え反応を起こすことができることを示している。
（３）Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え反応によるＲＮＡｉ誘導：
ｐＵＮＯ１４８が、細胞内でＣｒｅ酵素に依存して組換え反応を起こし、ＲＮＡｉを誘導するかを確かめるために、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞へ、ｐＵＮＯ１４８とＣｒｅ酵素を発現するｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時導入し、４８時間後に、ＹＦＰの発光を蛍光顕微鏡で観察することにより、ＲＮＡｉ効果を確かめた。
第８図は、ｐＵＮＯ１４８のみ，あるいはｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時に導入した場合の、蛍光視野による細胞観察結果である。
第９図は、ｐＵＮＯ１４８のみ，あるいはｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時に導入した場合の、明視野による細胞観察結果である。
第１０図は、第８図と第９図を重ね合わせたものである。
ｐＵＮＯ１４８を導入した細胞は、ほぼすべてに蛍光が認められたので、ＹＦＰ蛋白質はほぼすべての細胞に存在している。一方、ｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドを同時導入した細胞は、明視野で確認した細胞の８０％は蛍光が観察されたが、その２０％は蛍光が観察されなかった（第８図（Ｄ），第９図（Ｅ），第１０図（Ｆ））。
プラスミド導入により蛍光を失った細胞は、ｐＵＮＯ１４８を導入した細胞に比べ、ｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅを同時導入した細胞において明らかに多かった。
この結果は、ｐＵＮＯ１４８導入細胞はＲＮＡｉ効果を起こさないが、ｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅの同時導入細胞はＲＮＡｉ効果を起こすことを示している。
従って、ｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅの同時導入細胞において、ｐＵＮＯ１４８は、ｐＭＣ−Ｃｒｅより発現するＣｒｅ酵素により、第５図で示したようなＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え反応が起こり、ＲＮＡｉ誘導組換体へ変化したことを示している。
（４）マウス生体におけるＲＮＡｉ効果：
上述の通り、細胞内では、Ｃｒｅ酵素によりｐＵＮＯ１４８からＲＮＡｉ効果を誘導できた。
次に、同様のことが、マウス生体においても観察できるかを確かめた。
ＥＧＦＰ遺伝子を発現するトランスジェニック（ＥＧＦＰ  ＴＧ；以下「ｅＧＦＰ」と記載する。）マウスの尾の静脈より、１００マイクログラムのプラスミドを含む３ｍｌのリンゲル溶液を注入し、７２時間後に、肝臓に紫外線を当て、ＥＧＦＰ蛋白質の存在を観察した。
更に、肝臓を摘出し、以下の方法で、ＥＧＦＰ蛋白質量を定量した。
それぞれの肝臓を、ＰＢＳ溶液中でホモジェナイズし、１０００ｒｐｍで遠心し、上清を分離し、抽出液を得た。蛋白質量を測定し、それぞれの肝臓から得た抽出液中の蛋白濃度を合わせた。蛋白質中に含まれるＥＧＦＰ量は、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、蛍光強度を測定し、ｅＧＦＰマウスへ、リンゲル溶液のみを注入した肝臓からの試料の蛍光強度を１００とした場合の、各資料の蛍光強度の相対値で表した。
対照として、ｅＧＦＰマウスにリンゲル溶液のみを注入したマウスでは、Ｃ５７ＢＬ（野生型；以下「ＷＴ型」と記載する。）マウスにリンゲル溶液のみを注入した肝臓（第１１図）と比較して、明らかにＥＧＦＰの存在が確認できた（第１２図）。
次に、ｐＵＮＯ１２９プラスミドは、前述の如く、ＹＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果を誘導するプラスミドであるが、その誘導に際して認識する配列は、ＥＧＦＰ遺伝子の転写産物内にも存在する。そこで、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを、ｅＧＦＰマウスに注入したところ、ＥＧＦＰの発現の低下を肝臓（中間葉）にて観察できた（第１３図）。
また、ＥＧＦＰ量を定量した時、ｐＵＮＯ１２９を注入したｅＧＦＰマウスの肝臓におけるＥＧＦＰ量は、リンゲル溶液のみを注入したｅＧＦＰマウスの肝臓におけるＥＧＦＰ量と比べて、４９％低下していた（第１５図）。
同様に、ｐＵＮＯ１４８は、前述の如く、ｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミドと共に用いた場合に、ＹＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉ効果を誘導するプラスミドであるが、その誘導に際して認識する配列も、ＥＧＦＰ遺伝子の転写産物内に存在する。そこで、ｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−ＣｒｅプラスミドをｅＧＦＰマウスに同時注入した。この場合の肝臓は、ドット状に、ＥＧＦＰ蛋白質による発光が失われ（第１４図）、ＥＧＦＰ量は６７％低下した（第１５図）。
この結果は、ＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ培養細胞において、ｐＵＮＯ１４８がＣｒｅ酵素によりＲＮＡｉ誘導プラスミドへ組換えられた結果（第８〜１０図）と同様に、マウス肝臓において発現したＣｒｅ酵素が、ｐＵＮＯ１４８プラスミドをＲＮＡｉ誘導プラスミドへ組換え、ＥＧＦＰ遺伝子の発現抑制を行ったことを示すものと考えられる。
これらの結果は、ｌｏｘＰ配列を含むＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターは、マウス生体においても、Ｃｒｅ酵素に依存して、ＲＮＡｉ効果を誘導できることを示している。
以下、図面について説明する。
（第１図：プロモーター配列とｌｏｘＰ配列）
（Ａ）ヒトＨ１  ＲＮＡ遺伝子プロモーター
−９７から−９０はＯｃｔａｍｅｒ配列、−８８から−６９はＳｔａｆ結合領域、−６８から−５１はＰＳＥ配列、−３０から−２６はＴＡＴＡ−ｂｏｘ、＋１は転写開始点を示す。数字は、転写開始点からの塩基数を示す
（Ｂ）ｌｏｘＰ配列
１から１３と２２から３４に対応する１３塩基のインバートリピート構造を持つ。下線はｌｏｘＰ配列内の８塩基からなる可変スペーサー配列を示す。数字は、塩基数を示す。
（Ｃ）ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター
ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターは、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子プロモーターを基盤として改変した。Ｈ１プロモーターの−３９から−６番目を、（Ｂ）で示したｌｏｘＰ配列と置換した。ｌｏｘＰ配列は大文字で示し、下線はｌｏｘＰ配列の可変スペーサーに一致する。Ｏｃｔａｍｅｒ配列（−９７から−９０）、Ｓｔａｆ結合領域（−８８から−６９）、ＰＳＥ配列（−６８から−５１）、ＴＡＴＡ−ｂｏｘ（−３０から−２６）、＋１の転写開始点は（Ａ）と同じである。
（第１図（Ｃ）の配列中、大文字はｌｏｘＰ配列を表す。下線部は、ｌｏｘＰ配列の可変スペーサーを表す。＋１は、転写開始点を表す。）
（第２〜４図：ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターから合成されたｈｐＲＮＡによるＨＢ−ＥＧＦ遺伝子発現抑制）
ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（第２図（Ａ），第３図（Ｂ），第４図（Ｃ））、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導配列ｈｐＲＮＡをＨ１プロモーターから合成するプラスミドｐＵＮＯ１２６（第２図（Ｄ），第３図（Ｅ），第４図（Ｆ））、又はＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導配列ｈｐＲＮＡをＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターから発現するプラスミドｐＵＮＯ１３７（第２図（Ｇ），第３図（Ｈ），第４図（Ｉ））を、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子とＹＦＰ遺伝子の融合蛋白質を恒常発現するＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞へ各々遺伝子導入し、４８時間後に明視野（第２図）あるいは蛍光視野（第３図）で観察した。第４図は、第２図と第３図を重ね合わせ、蛍光が認められない細胞をアスタリスク（＊）で示したものである。
（第５〜７図：ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターのＣｒｅ酵素による反応）
第５図：Ｃｒｅ酵素によるＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの反応の概略
ｐＵＮＯ１４７は、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター、スタッファー配列（Ｚｅｏｃｉｎｅ耐性遺伝子を含む１．１ｋｂｐの配列）、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター配列の−３９から−１に一致する配列（ｌｏｘＰ配列＋ｔｔｃｃｃ）とＨＢ−ＥＧＦ遺伝子に対するｈｐＲＮＡ合成配列の融合配列を持つ。
ｐＵＮＯ１４８は、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター、スタッファー配列（Ｚｅｏｃｉｎｅ耐性遺伝子を含む１．１ｋｂｐの配列）、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター配列の−３９から−１に一致する配列（ｌｏｘＰ配列＋ｔｔｃｃｃ）とＹＦＰ（又はＥＧＦＰ）遺伝子に対するｈｐＲＮＡ合成配列の融合配列を持つ。
ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８は、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの転写開始点に、ｈｐＲＮＡ合成配列を持たない。
ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８は、Ｃｒｅ酵素反応により、スタッファー配列がループアウトし、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの転写開始点に、ｈｐＲＮＡ合成配列を持つプラスミドｐＵＮＯ１４９とｐＵＮＯ１５０にそれぞれが変化する。
ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８は抗生物質アンピシリンとゼオシンに対する耐性遺伝子を持つが、ｐＵＮＯ１４９とｐＵＮＯ１５０はアンピシリン耐性遺伝子しか持たない。図中には、制限酵素部位、Ｐｖｕ  ＩＩ，Ｐｓｔ  Ｉ，Ｓａｌ  Ｉ，ＢａｍＨＩ，Ｎｈｅ  ＩとＢｇｌ  ＩＩを示した。また、図中の矢印は、ＲＨ−ｌｏｘＰプロモーターの転写の方向性を示す。
第６図：ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８のＣｒｅ酵素により生じた組換え体（ｐＵＮＯ１４９とｐＵＮＯ１５０）の電気泳動図
ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４８を、各々試験管内でＣｒｅ酵素と反応させた。制限酵素Ｓａｌ  ＩとＢａｍ  ＨＩを用いて反応した後に、大腸菌へ形質転換し、クローンを得た。スクリーニングにより、抗生物質アンピシリン耐性かつ抗生物質ゼオシン感受性のクローンを得て、それぞれのクローンよりプラスミドを抽出し、０．８％アガロースゲルを用いて、電気泳動解析した。
レーン１はＣｒｅ酵素未反応のｐＵＮＯ１４７、レーン２はｐＵＮＯ１４７をＣｒｅ酵素反応して得た組換え体ｐＵＮＯ１４９、そして、レーン３はｐＵＮＯ１４８をＣｒｅ酵素反応して得た組換え体ｐＵＮＯ１５０を示す。
第７図：ｐＵＮＯ１４７とｐＵＮＯ１４９、ｐＵＮＯ１４８とｐＵＮＯ１５０のＲＨ−ｌｏｘＰプロモーター転写開始点近傍のＤＮＡ配列
ＤＮＡプライマー（Ｍ１３（−２０）Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ）を用いて、ＤＮＡ配列を解析した。転写開始点には＋１を示した。また、四角で囲った部分はｈｐＲＮＡ内の相同配列、下線部はｈｐＲＮＡ内のループ構造、二重下線部は転写終結配列を示す。
（第８〜１０図：Ｃｒｅ酵素で誘導されるｈｐＲＮＡによるＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ遺伝子発現抑制）
ｐＵＮＯ１４８（Ａ〜Ｃ），又はｐＵＮＯ１４８とｐＭＣ−Ｃｒｅ（Ｃｅｌｌ，１９９３，７３，１１５５−１１６４）（Ｄ〜Ｆ）をＨＢ−ＥＧＦ遺伝子とＹＦＰ遺伝子の融合蛋白質を恒常発現するＨＴ１０８０／ＨＢ−ＥＧＦ〜ＹＦＰ細胞へ遺伝子導入し、４８時間後に蛍光視野（Ａ，Ｄ）あるいは明視野（Ｂ，Ｅ）で観察した。（Ｃ，Ｆ）は、明視野と蛍光視野にて観察した同一視野の図を重ね合わせ、蛍光が認められない細胞をアスタリスク（＊）で示したものである。
（第１１〜１４図：マウス生体におけるＣｒｅ酵素で誘導されるｈｐＲＮＡ発現によるＥＧＦＰ遺伝子発現抑制）
マウスの尾静脈よりリンゲル溶液で調節したプラスミドを注入し、７２時間後に肝臓を観察した。
第１１図は、Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した肝臓を示す。
第１２図は、ＥＧＦＰ蛋白質を恒常的に発現するトランスジェニックマウス（ｅＧＦＰマウス）へ、リンゲル溶液を注入した肝臓を示す。
第１３図は、ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９を１００マイクログラム注入した肝臓を示す。
第１４図は、ｅＧＦＰマウスへ、ｐＭＣ−Ｃｒｅプラスミド（８０マイクログラム）とｐＵＮＯ１４８（２０マイクログラム）を注入した肝臓を示す。
下は明視野による観察、上は紫外線ランプ照射による観察である。
【産業上の利用可能性】    本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することにより、適宜、ＲＮＡｉを誘導あるいは解除することができる。また、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することにより、適宜、ＴＧマウスや細胞株を作製することができ、作製したＴＧマウスや細胞株は、Ｃｒｅ酵素依存的に転写産物の合成を制御することができる。更に、本発明のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを使用することにより、適宜、ＲＮＡ遺伝子の発現を誘導することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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