(57)【要約】ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、ハイドロゲル薄膜の強度がハイドロゲルの強度より２倍〜２０倍に増加するように、または、ハイドロゲル薄膜の４００ｎｍにおける吸光度が、ハイドロゲルの７０％〜１０％に減少するように、その乾燥時間を設定して作製する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルを充分乾燥させる工程を経てガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体。
【請求項２】
ハイドロゲルを充分時間乾燥させる工程を経てガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る請求の範囲第１項に記載の細胞培養担体。
【請求項３】
ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、該ハイドロゲル薄膜の厚さが１μｍ〜１ｍｍであることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第２項に記載の細胞培養担体。
【請求項４】
ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、ハイドロゲル薄膜の強度がハイドロゲルより２倍〜２０倍に増していることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第２項に記載の細胞培養担体。
【請求項５】
ハイドロゲルを乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、ハイドロゲル薄膜の４００ｎｍにおける吸光度が、ハイドロゲルの７０％〜１０％に減少していることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第２項に記載の細胞培養担体。
【請求項６】
ハイドロゲル薄膜が乾燥状態で提供されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項７】
ハイドロゲルが１種類以上の高分子の化学結合により形成されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項８】
ハイドロゲルを構成する高分子が、天然物由来高分子もしくは合成高分子のいずれか一方、あるいは両方であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の細胞培養担体。
【請求項９】
天然物由来高分子が細胞外マトリックス成分であることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の細胞培養担体。
【請求項１０】
細胞外マトリックス成分がコラーゲンであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の細胞培養担体。
【請求項１１】
コラーゲンハイドロゲル薄膜の単位面積あたりのコラーゲン含量が１００μｇ／ｃｍ２〜１ｍｇ／ｃｍ２であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の細胞培養担体。
【請求項１２】
コラーゲンハイドロゲル薄膜の乾燥重量が、コラーゲンハイドロゲルの重量の１／５０〜１／１００であることを特徴とする請求の範囲第６項または請求の範囲第１１項に記載の細胞培養担体。
【請求項１３】
ハイドロゲル薄膜が、生理活性物質を透過できることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１４】
ハイドロゲル薄膜が、分子量１万ダルトン以上の生体高分子を透過できることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の細胞培養担体。
【請求項１５】
細胞外マトリックス成分含有のハイドロゲル薄膜が、生理活性物質を含有していることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１６】
ハイドロゲル薄膜に形状を維持するための支持体が付いていることを特徴とする請求の範囲第１項１ないし第５項のいずれかに記載の細胞培養担体。
【請求項１７】
請求の範囲第１項ないし第１６項のいずれかに記載の細胞培養担体を、培養容器に挿入して動物細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１８】
一種類以上の動物細胞をハイドロゲル薄膜の片面あるいは両面に培養できることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の細胞培養方法。
【請求項１９】
ハイドロゲル薄膜のそれぞれの面に異なる動物細胞を培養することを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の細胞培養方法。
【請求項２０】
ハイドロゲル薄膜の片面あるいは両面に細胞を培養することで細胞機能のアッセイを実現することを特徴とする請求の範囲第１７項ないし第１９項のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項２１】
細胞機能のアッセイが、特にハイドロゲル薄膜の一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで上皮間充織相互作用を可能としたアッセイであることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞培養方法。
【請求項２２】
ハイドロゲル薄膜を介して上皮間充織モデルを再構築して生体内における細胞機能を外挿することで、動物実験を代替することを特徴とする請求の範囲第２０項または第２１項に記載の細胞培養方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１７項ないし第２０項のいずれかに記載の細胞培養方法により動物細胞を三次元培養して再構築した生体外組織モデル。
【請求項２４】
請求の範囲第１７項ないし第１９項のいずれかに記載の細胞培養方法により培養した動物細胞を保持する細胞移植担体。
【請求項２５】
請求の範囲第２３項に記載の生体外組織モデル、または請求の範囲第２４項に記載の細胞移植担体を、動物に移植することを特徴とする細胞移植方法。
【請求項２６】
移植する動物が哺乳動物であることを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の細胞移植方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１項に記載の細胞培養担体が、哺乳動物由来の細組織切片を含んでいることを特徴とする細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、乾燥によるガラス化技術を適用して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体に関するものである。さらに詳しくは、培養系において、強度と形状維持力を有した培養担体と、当該担体上で様々な細胞を培養することで細胞特性を解析する機能アッセイを実現する培養方法、上皮間充織をはじめとする組織や器官のモデルを再構築する動物細胞の培養方法、およびその培養担体上で培養した細胞の移植方法に関するものである。
【背景技術】  培養下における動物細胞は、その培養環境を工夫することで、医薬品等の生理活性物質の開発研究やその製造手段、あるいは培養臓器の作製やその移植へと活用領域が拡大している。このような状況下、従来より、動物由来の機能細胞に目的とする能力を発揮させるために、動物細胞用の様々な培養担体が開発されている。このように、培養担体の素材と形状を創意工夫することで、細胞の接着、伸展、移動、浸潤、増殖、分化、極性、自己組織化、器官様構造体（オルガノイド）形成等の細胞挙動、さらには細胞と培養液の相互作用機構を制御することができる（Ｔａｋｅｚａｗａ  Ｔ．Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｂｅｈａｖｉｏｒ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２４，２２６７，２００３．）。
これまでの培養担体の素材は、天然物由来素材、人工素材、および天然物由来素材と人工素材のハイブリッドに分類することができ、それらの形状は、支持体への吸着体、支持体の被膜、フィルム、膜、プレート、シャーレ、フラスコ、中空糸、糸および／またはその織成体、ゲル、ビーズ等さまざまである。
上記天然物由来素材としては、コラーゲン、ファイブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、あるいはマトリゲル（ＥＨＳ腫瘍から抽出して再構成された基底膜；Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５，３１２，１９８６．）等の動物組織から抽出した細胞外マトリックス構成成分、動物組織から調製した無細胞真皮マトリックス（Ｌｉｖｅｓｅｙ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｄｅｒｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，６０，１，１９９５．）、イガイ由来の接着蛋白質、絹、あるいは綿等が培養担体として開発されている。また、人工素材としては、ナイロン等の生体非吸収性の合成高分子、ポリグリコール酸等の生体吸収性の合成高分子、あるいはセラミックス等が培養担体として開発されている。
一般に、動物細胞の培養は、培養担体としてプラスチックシャーレを用いて２次元培養を行うが、特に初代培養細胞では、継代維持を繰り返すことにより、元来の細胞の機能発現を維持できなくなることがある。これに対して、上述の様な種々の素材と形状の培養担体を用いて細胞を３次元的に培養すると、その細胞が有している組織特異的機能を向上させ、維持できることが知られている。
このような３次元培養を行う手段としては、細胞外マトリックス構成成分のゲル上ないしはゲル内で培養する方法、中空糸を利用して細胞を多層化培養する方法（Ｋｎａｚｅｋ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ：Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１７８，６５，１９７２．）、多数のビーズ担体の周囲に細胞を培養する方法（ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏ−ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２１６，６４，１９６７．）、ＰＵＦをはじめとするスポンジ担体の多孔質内で細胞を凝集培養する方法（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｅｒｏｉｄｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｒｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎ  ｆｏａｍ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．３６，３２４，１９９１．）、温度感受性培養担体（Ｔａｋｅｚａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏ−ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０１，４９５，１９９２．）等の機能性培養担体を利用した多細胞性球状凝集塊（スフェロイド）培養法、ガーゼ等の通液性培養担体（Ｔａｋｅｚａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｖｉａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．３，３２９，１９９７．）を用いた多細胞性再構築体の培養法、生体内臓器の細胞の足場である細胞外マトリックスを、連続的３段階灌流法により培養担体に改変して、臓器をまるごと培養する器官工学の技術を利用した培養法（Ｔａｋｅｚａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｏｒｇａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．６，６４１，２０００．）、および生体の組織を複雑な構造とその構成成分を保持している動物組織の切片から成る培養担体上で細胞を培養する方法（Ｔａｋｅｚａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｎ  ｔｈｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６，１８４７，２００２．）等が知られている。これらの３次元培養法は、上述の様な細胞挙動の誘導に活用され、ライフサイエンスのみならずバイオメディカルの分野の基礎研究に大きく寄与してきた。
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述したような３次元培養の手法は、２次元培養の手法の様に単純ではなく、その実現には熟練を要することから、専門分野の基礎研究者たちには利用されてきたものの、スピード、コストを要求される医薬品をはじめとする化学品開発の分野（医薬品探索研究、薬効試験、毒性・安全性試験）に普及するには至っていない。つまり、産業分野にはその実現の困難さから未だ普及していない。
さらに、上述したような３次元培養法では、２次元培養細胞に比べて個々の細胞の顕微鏡観察が困難、もしくは不可能であるという欠点があった。また、従来から、２種以上の細胞からなる器官様構造体（オルガノイド）を再構築するという概念はあったが、その方法として、ハイドロゲル薄膜の両面に細胞を培養するという概念はこれまでにはないものである。
すなわち、上述したような種々の３次元培養法の中でも、特にコラーゲンやマトリゲル等の細胞外マトリックス構成成分を用いた培養方法は、細胞の分化誘導に優れているのみならず、上皮間充織細胞からなる皮膚等のオルガノイド（Ｂｅｌｌ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｖｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ａｓ  ｓｋｉｎ−ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１１，１０５２，１９８１．）を再構築できること、血管内皮細胞による血管新生モデルを構築できること（Ｂｌａｃｋ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ａ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２，１３３１，１９９８．）、ガン細胞によるガン浸潤モデルを構築できること（Ａｌｂｉｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｒａｐｉｄ  ｉｎｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７，３２３９，１９８７．）から、その有用性が実証されてきた。
しかしながら、これらのコラーゲンゲルやマトリゲルなどの様なハイドロゲルから成る３次元培養担体は、その調製作業の操作も煩雑であり、それを用いた３次元培養、さらに培養細胞の観察も困難であるという欠点があった。すなわち、コラーゲンゲルやマトリゲルは、その調製時に、塩濃度、ｐＨおよび温度の管理が必須であるが、特に温度は、ピペッティング操作などの際に低温を維持することが難しく、操作中にピペット内でゲル化が始まるなどの困難さがあった。
また、コラーゲンゲルやマトリゲルに動物細胞を播種して３次元培養を開始する手段としては、ゲル化する前の冷たいゾルに細胞を懸濁し、保温することで細胞をゲル内に培養する方法と、あらかじめゲル化した後に、細胞をゲル上に播種する方法が開発されてきた。
しかしながら、前者においては、ゲル調製時と同様の問題、すなわちピペッティング操作の際にゲル化が始まってしまうという問題があった。さらに、前者後者ともに、ゲルが柔らかいことからその取扱いが困難であり、またゲル培養を維持するための培養液の交換が困難であった。さらに、特にゲル収縮を誘導する細胞を播種した際には、顕微鏡観察の際に光の透過性が悪くなり、ゲル内構成細胞の顕微鏡による観察が全くできなくなることもあった。それゆえに、細胞外マトリックス構成成分をはじめとするハイドロゲル培養担体は、基礎研究においては活用されてきたが、産業分野には普及するには至っていなかった。
また、２種類の細胞を細胞外マトリックス構成成分のハイドロゲル培養担体を用いて共培養する手段としては、両方の細胞をゲル内に包埋培養する方法、一方の細胞をゲル内に培養し他方の細胞をゲル上に培養する方法、さらに両方の細胞をゲル上に共培養する方法が開発されてきたが、ハイドロゲルの表面と裏面に異なる細胞を共培養する方法は、片面に細胞を播種した後にハイドロゲル培養担体を裏返すことが困難であるがゆえに、これまで開発されていなかった。
そこで、竹澤等は細胞外マトリックス成分含有の溶液を保持体と共にゲル化させ、さらに乾燥させてガラス化し、次いで再水和することで保持体と一体化した細胞外マトリックス含有ハイドロゲル薄膜を作製する技術を既に開発してきた（日本国特許第３０８１１３０号）。すなわち、この特許技術は、細胞外マトリックス成分をはじめとするハイドロゲル培養担体が、柔らかく、取扱いが難しいこと等の問題点があることを解決すべく、ハイドロゲルよりも強度を高め、さらに支持体をつけることでその取扱いを簡便にしたものである。
しかしながら、この技術では、細胞外マトリックス含有ハイドロゲル薄膜を再現性良く作製するための条件が設定できておらず、また、充分な透明性を持たせることができていなかった。すなわち、日本国特許第３０８１１３０号公報に示された方法では、ハイドロゲル薄膜の強度をハイドロゲルよりも２倍程度上昇させることには成功していたものの、両面培養等の操作、もしくは細胞播種済みの状態での移動には、その強度は未だ不十分なものであった。また、顕微鏡観察にはハイドロゲル薄膜の透明性が必要であるが、日本国特許第３０８１１３０号公報に示された方法では、ハイドロゲル薄膜に濁りが残るという問題点があった。
［発明の目的］
本発明の目的は、コラーゲンやマトリゲルをはじめとするハイドロゲルからなる３次元培養担体を、用事調製の必要がない状態で提供し、かつ３次元培養に伴う動物細胞播種の困難さを克服し、２次元細胞の播種と同様の手段で３次元培養を実現できる培養担体を提供し、さらに、細胞による極度なハイドロゲルの収縮が起きないゲル担体であり、さらに培養液の交換が容易であるハイドロゲルからなる培養担体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、当該培養担体上での細胞特性を解析する機能アッセイ、上皮間充織をはじめとする組織や器官のモデルの再構築、および当該培養担体上で培養した細胞の移植方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、動物細胞の培養担体となる細胞外マトリックス成分等のハイドロゲル薄膜を、再現性良く安定した物性を伴って製作する工程を確立し、また、当該培養担体の一方の面に上皮細胞、他方の面に間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用の細胞機能アッセイを可能とした再構築体の作製方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明は、ハイドロゲルを充分乾燥させてガラス化した後に、再水和して作製されるハイドロゲル薄膜から成る細胞培養担体であって、ハイドロゲル薄膜の強度がハイドロゲルの強度より２倍〜２０倍に増加するように、または、ハイドロゲル薄膜の４００ｎｍにおける吸光度が、ハイドロゲルの７０％〜１０％に減少するように、その乾燥時間を設定して作製することにより、２次元細胞の播種と同様の手段で３次元培養を実現できる培養担体を提供し、さらに、細胞による極度なハイドロゲルの収縮が起きないゲル担体であり、さらに培養液の交換が容易であるハイドロゲルからなる培養担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ドーナツ状支持体の構成を示す平面図であり、図２は、ゲル化直後のコラーゲンハイドロゲルの位相差顕微鏡写真であり、図３は、乾燥７２日後のコラーゲンハイドロゲル薄膜の位相差顕微鏡写真であり、図４は、強度測定試験の結果を示したグラフであり、図５は、透明度試験の結果を示したグラフであり、図６は、両面培養を行った場合の位相差顕微鏡写真であり、図７は、両面培養を行った場合の蛍光顕微鏡写真であり、図８は、実施例６のマトリゲルハイドロゲル薄膜を示す写真であり、図９は、実施例８のスライドグラス上のコラーゲンゲル薄膜に薄切片が移し取られた状態を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者等は、ハイドロゲル薄膜を作製する際のガラス化の工程に特に着目し、ガラス化の工程における乾燥時間の違いが、ハイドロゲル薄膜の圧縮破壊強度、透明度等に及ぼす影響について鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至ったものである。
なお、本明細書において、「ハイドロゲル」とは、高分子が化学結合によって網目状構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を指し、より具体的には、上記天然物由来素材や人工素材等の培養担体をインキュベーターでゲル化させたものをいう。また、「ハイドロゲル乾燥体」とは、上記「ハイドロゲル」を以下に述べる種々の方法で乾燥させたものをいい、「ハイドロゲル薄膜」とは、上記「ハイドロゲル乾燥体」を再水和させたものをいうものとする。
また、本明細書において、「ガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、鶏卵のタンパク質（白身）を熱変性させたもの（ハイドロゲル）を、風乾することで固くて透明な物質に変えるガラス化技術（Ｔａｋｕｓｈｉ  Ｅ．，Ｅｄｉｂｌｅ  ｅｙｅｂａｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｓｈ．Ｎａｔｕｒｅ３４５，２９８，１９９０）で定義される。
（乾燥時間）
ハイドロゲルを充分に乾燥させる時間は、それぞれの物質毎で異なり、また、同じコラーゲンを用いた場合でも、その含有水分量の違いによって必要な乾燥時間は異なるが、ハイドロゲル薄膜の圧縮破壊強度、透明度、重量の変化を検討した結果、（ａ）ハイドロゲル薄膜の圧縮破壊強度が、ハイドロゲルの２倍〜２０倍に増加する範囲、（ｂ）ハイドロゲル薄膜の４００ｎｍにおける吸光度が、ハイドロゲルの７０％〜１０％に減少する範囲、（ｃ）コラーゲンハイドロゲル薄膜の乾燥重量が、コラーゲンハイドロゲルの重量の１／５０〜１／１００に減少する範囲となるように乾燥時間を設定することにより、強度及び透明性に優れたハイドロゲル薄膜を作製することができることが判明した。
（乾燥方法）
乾燥方法としては、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。
なお、上記風乾の方法としては、１０℃４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、もしくは無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等といった方法がある。さらに、風乾後は無菌状態を保ったままで、室温もしくは４℃で無菌的に保管する。後述するように、本発明においては、この保管時間が１ヶ月以上になると、強度・透明度が有意に上昇することが確認された。
（天然物由来高分子）
本発明でハイドロゲルの作製に用いられる天然物由来高分子としては、細胞外マトリックス成分、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース等が挙げられる。さらに、前記細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、ラミニン、コンドロネクチン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどが挙げられ、それぞれのゲル化に至適な塩成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。
特に、細胞外マトリックスとしてコラーゲンゲルを用いた場合には、至適な塩濃度を与える溶媒が、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、基礎培溶液、無血清培養液、あるいは血清含有培養液などであってもよい。また、コラーゲンハイドロゲル薄膜の単位面積あたりのコラーゲン含有量は、１００μｇ／ｃｍ２〜１ｍｇ／ｃｍ２が望ましく、２５０μｇ／ｃｍ２が最適濃度である。コラーゲン含有量が１００μｇ／ｃｍ２以下だと、コラーゲンの濃度が薄すぎてゲル化が弱く、充分な強度のコラーゲンゲル薄膜を作製することができない。さらに、コラーゲンゲル化の際の溶液のｐＨは、６から１０が好ましい。この範囲外であるとコラーゲンゲル化しにくくなる。
（合成高分子）
また、ハイドロゲルの作製に用いられる合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。
（生理活性物質の添加）
また、ハイドロゲル薄膜が、ゲル構成要素である高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、またはゲル化しない細胞外マトリックス成分としてファイブロネクチン、ビトロネクチン、エンタクチン、オステオポエチン等が挙げられる。また、これらを複数含有させることも可能である。
上記の様な生理活性物質を含んだハイドロゲル薄膜は、まずゲル化する前のゲル構成高分子溶液に、含有させたい生理活性物質を混合し、その後、ゲル化・ガラス化等のハイドロゲル薄膜の作製工程を経て作製することができる。これにより、細胞増殖・分化・接着などに必要な因子をハイドロゲル薄膜側から供給することができるので、より良い培養環境を実現することができる。また、含有させた生理活性物質の細胞に対する影響を調べる試験を行うのに非常に有用である。
（ハイドロゲル薄膜の作製方法）
上述した高分子を、各高分子に固有の至適塩濃度、ｐＨに調製し、各至適温度でゲル化する。なお、このゲル化の条件は、用いる高分子によって異なるが、当業者にとっては自明の事実である。続いて、このゲル体を風乾等で乾燥させ、ガラス化する。本発明においては、このガラス化工程において、充分時間乾燥することにより、透明度、強度を安定的に上昇させることを実現したものである。このようにして作製されたハイドロゲル乾燥体を再水和することで、強度のあるハイドロゲル薄膜を得ることができる。
また、本発明によれば、ハイドロゲル薄膜の厚みを１μｍ〜１ｍｍの範囲で作製することができる。なお、ハイドロゲル薄膜の厚みが１μｍより薄いと、必要な強度を得られない。一方、乾燥前のゲルの量を増やすことで、１ｍｍ以上の厚みのハイドロゲル薄膜を作製することは可能であるが、コラーゲンの場合、可溶化濃度は０．５％が限界であるため、０．５％濃度のコラーゲン水溶液を大量に使用しなくてはならず、乾燥させるのに長時間を要する。
（物質透過作用）
上記のような方法で作製されたハイドロゲル薄膜について物質透過試験を行ったところ、コラーゲンゲル薄膜の場合、分子量１万ダルトン以上のタンパクを透過することが確認された。つまり、本発明の方法で作製されたハイドロゲル薄膜は、分子量の大きな生理活性物質を透過することが可能であり、それにより、このハイドロゲル薄膜の異なる２つの面に播種された各々の細胞の間での生理活性物質を介した相互作用の試験・研究に大きく貢献できると考えられる。
（細胞培養担体としての利用）
上記のような方法で作製されたハイドロゲル薄膜は、培養容器に挿入して動物細胞を培養する細胞培養担体として用いることができる。培養する動物細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、受精卵、およびそれらの細胞に外来遺伝子を導入した細胞が挙げられる。さらにそれらの細胞が、未分化な幹細胞、分化過程にある細胞、終末分化した細胞、および脱分化した細胞であっても良い。また、それらの細胞の培養を開始する手段としては、細胞懸濁液、細切組織片、受精卵、または三次元再構築した多細胞性凝集塊の播種が挙げられる。つまり、既存の方法で培養できる接着性の細胞は本ハイドロゲル薄膜上で培養することが可能である。
また、上述したような動物細胞を、ハイドロゲル薄膜の片面はもちろんのこと、両面に１種類以上の細胞を培養することが可能である。さらに、両面培養においては、各々の面に異種の細胞を培養することが可能である。特に、ハイドロゲル薄膜の一方の面には上皮系細胞、他方の面には間充織細胞を培養することで、上皮間充織相互作用を有した経皮吸収モデルや腸管吸収モデルなど、また、一方の面には血管内皮細胞、他方の面にはガン細胞を培養することで、血管新生モデルやガン浸潤モデルなどの細胞機能アッセイを可能とする。
（動物実験の代替）
さらに、本発明に係る培養担体を用いて培養した上皮間充織相互作用のある再構築体を、動物実験の代替モデル、培養臓器の開発および培養臓器の移植に適応することができる。上記日本国特許第３０８１１３０号公報に示したように、ハイドロゲル培養担体のみで、臓器癒着防止に応用可能であるが、さらにハイドロゲル薄膜の片面もしくは両面に細胞を培養し、かつその透明性を生かした角膜上皮細胞を播種した後、ハイドロゲル薄膜を角膜欠損患者へ移植する方法、あるいは高齢化社会に伴い、数回に渡る開腹手術により腹膜中皮組織が欠損し、腸管臓器癒着から腸閉塞等の合併症を引き起こす問題が起きているが、これに対し本培養担体上で腹膜のみならず胸膜、心膜の中皮を培養して、潤滑成分（ヒアルロン酸等）を分泌する優れた培養担体を移植することが可能となる。
【実施例】  以下、さらに詳しくコラーゲン、ＥＨＳ腫瘍から抽出した基底膜成分及びアガロースを例とする実施例を示し、この発明の構成並びに作用効果について説明する。
［実施例１：支持体付きコラーゲンハイドロゲル薄膜の作製］
図１に示したような外径３３ｍｍ、内径２４ｍｍの円形の支持体をナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ１７８２Ｂ）を切り抜いて作製し、滅菌処理後、疎水性ポリスチレン製培養用シャーレ（φ３５ｍｍ：ＩＷＡＫＩ＃３０００−０３５Ｘ）に入れた。氷上で冷却した５０ｍｌ容量の滅菌コニカルチューブ（ＩＷＡＫＩ＃２３４２−０５０）に２．５ｍｌの細胞培養液（１０％非動化ウシ胎児血清、２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ＃１５６３０−０２３）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン・１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ＃１５１４０−０３１）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ＃１１８８５−０８４））と２．５ｍｌの０．５％Ｉ型コラーゲン水溶液（ＣＥＬＬＧＥＮＩ−ＡＣ  高研製）を加え、均一に混和した。最終濃度０．２５％のコラーゲン混合液を先の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに２．０ｍｌ入れた後、５％ＣＯ２／９５％空気存在下の３７℃の保湿インキュベーターで２時間維持してゲル化した。この終濃度０．２５％コラーゲンゲルを、１０℃４０％湿度の条件下のクリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に２日間完全に乾燥することでガラス化させた。これに３ｍｌのＰＢＳを加えることで、ガラス化したコラーゲンハイドロゲル乾燥体を再水和した。さらに数回３ｍｌのＰＢＳでリンスした。さらにこのコラーゲンゲル薄膜を、１０℃４０％湿度の条件下のクリーンベンチ内でふたをはずした状態で無菌的に２日間完全に乾燥させた。その後、室温で無菌的に保管維持した。さらに、使用前にＰＢＳもしくは使用する培養液で水和し、シャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞることで、支持体がついた強度のあるコラーゲンハイドロゲル薄膜としてシャーレより脱着回収できた。
図２は、ゲル化直後のコラーゲンハイドロゲルの位相差顕微鏡写真であり、図３は、乾燥７２日後のコラーゲンハイドロゲル薄膜の位相差顕微鏡写真である。これらの位相差顕微鏡写真から明らかなように、ゲル化直後のコラーゲンハイドロゲルには、太い繊維構造が観察されたが、乾燥７２日後のコラーゲンハイドロゲル薄膜にはそれが観察されず、全体に粒状構造が観察された。この結果より、乾燥工程において、なんらかの構造変化が起きていることが示唆された。
［実施例２：コラーゲンハイドロゲル薄膜の強度測定試験］
上記（実施例１）に示した方法で作製したハイドロゲル薄膜（以下、薄膜Ａという）について、室温で無菌的に保管する時間を８日〜１３３日と種々変えた複数のサンプル（Ａ１〜Ａ９）と、日本国特許第３０８１１３０号公報に示した方法に従って作製したハイドロゲル薄膜（以下、薄膜Ｂという）の乾燥１日目のサンプルのそれぞれについて、以下のようにして強度測定試験を行った。強度測定試験は、日本電産工業株式会社製の強度測定機（デジタルフォースゲージ）に、接触面積１．１３ｃｍ２の円形アダプターを取りつけ、９ｍｍ／ｍｉｎの速度で各薄膜を押し、薄膜破断時の最大負荷を測定した。
図４は、強度測定試験の結果を示したものである。すなわち、充分に乾燥がなされていない薄膜Ｂ（図中、△）の強度は約１０９．３ｇであり、一方、充分に乾燥された薄膜Ａ（図中、▲）の強度は、その乾燥時間に比例して、１００．９〜８１３．０ｇと上昇した。すなわち、両者を比較すると、薄膜Ａの方が薄膜Ｂよりも１倍〜８倍の強度を有していることが分かった。特に、乾燥時間が４０日以降で、強度の上昇が著しいことが分かった。
また、ガラス化していないハイドロゲル（図中、●）の強度は約４１．４ｇであり、ガラス化したハイドロゲル薄膜は、ガラス化していないハイドロゲルよりも２倍〜２０倍の強度を有していることが分かった。
上述した日本国特許第３０８１１３０号公報に示した方法では、乾燥時間に関する規定がなく、短い乾燥時間であったため、強度にばらつきが見られたが、図４から明らかなように、本発明に係るハイドロゲル薄膜では、充分時間乾燥することで強度を安定的に上昇させることができた。
このように、ハイドロゲルを充分に乾燥させることによりハイドロゲル薄膜の強度が向上する理由は、ハイドロゲル中に含まれていた水分が抜けていくことが関係していると考えられる。また、乾燥時間が４０日を経過するとさらに強度が向上する理由は、結合水が抜けていっている可能性があると考えられる。
なお、本実施例では、コラーゲンを例に説明したが、コラーゲン以外の細胞外マトリックス構成成分を用いて同様にハイドロゲル薄膜を作製することができる。その場合、その物質ごとに必要な乾燥時間は異なることは多言を要しない。例えば、ＥＨＳ腫瘍から抽出した基底膜成分（本明細書の実施例では、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標：ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー製）を用いた）を用いた場合には、以下のようにしてＭＡＴＲＩＧＥＬハイドロゲル薄膜を作製することができる。すなわち、ＭＡＴＲＩＧＥＬを培養液（ＤＭＥＭ）で希釈し、１０ｍｇ／ｍｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ溶液を作製する。この溶液２ｍｌを３５ｍｍ培養皿に添加した後、３７℃のインキュベーターの中で３０分間維持してゲル化させる。その後、クリーンベンチ内で２日間乾燥させた後に、再水和することでＭＡＴＲＩＧＥＬのハイドロゲル薄膜を作製することができる。また、乾燥時間を長くするに従って、コラーゲンハイドロゲル薄膜と同様に強度と透明度が向上する。
また、アガロースを用いた場合には、以下のようにしてアガロースハイドロゲル薄膜を作製することができる。すなわち、１０ｍｌのＰＢＳに粉末アガロース０．１ｇを加え、オートクレーブにかけ溶解して１％アガロースを作製する。この溶液２ｍｌを３５ｍｍ培養皿に添加した後、室温で３０分間維持してゲル化させる。その後、クリーンベンチで一昼夜乾燥させた後に再水和することでアガロースハイドロゲル薄膜を作製することができる。
［実施例３：コラーゲンハイドロゲル薄膜の透明度試験］
上記（実施例２）と同様にして調製した薄膜Ａ（Ａ１〜Ａ９）と薄膜Ｂのそれぞれについて、以下のようにして透明度試験を行った。透明度試験は、支持体の付いた各ハイドロゲル薄膜およびガラス化されていないハイドロゲルについて、４００ｎｍにおける吸光度を、分光光度計（日本分光株式会社製）で測定した。
図５は、透明度試験の結果を示したものである。すなわち、４００ｎｍにおける吸光度が、充分に乾燥された薄膜Ａ（図中、▲）では０．１１５〜０．２０８であり、ガラス化していないハイドロゲル（図中、●）の吸光度（０．３４２）の３３％〜６０％に減少した。特に、乾燥時間が４０日以降で、吸光度の低下、換言すれば透明度の向上が著しいことが分かった。また、充分に乾燥がなされていない薄膜Ｂ（図中、△）の吸光度は０．２０４であり、ガラス化していないハイドロゲルの約６０％に減少した。
上述した日本国特許第３０８１１３０号公報に示した方法では、乾燥時間に関する規定がなく、短い乾燥時間であったため透明度にばらつきが見られたが、図５から明らかなように、本発明に係るハイドロゲル薄膜では、充分時間乾燥することで、透明度を安定的に上昇させることができた。
このように、ハイドロゲルを充分に乾燥させることによりハイドロゲル薄膜の透明度が向上する理由は、上記（実施例２）に示したと同様に、ハイドロゲル中に含まれていた水分が抜けていくことが関係していると考えられる。また、乾燥時間が４０日を経過するとさらに透明度が向上する理由は、結合水が抜けていっている可能性があると考えられる。
［実施例４：物質透過試験］
薬剤添加槽と薬剤透過槽とを膜を介して設定することができるガラス器具であるパームセル（ビードレックス製）を用い、ハイドロゲル薄膜の血清タンパク質の透過性を検討した。薬剤添加槽に３０％ＦＢＳ／ＰＢＳを入れ、薬剤透過槽の溶液を１回当たり１００μｌずつ採取して、７日間にわたってサンプリングした。採取したサンプルを電気泳動し、銀染色でタンパクを染色したところ、１１万ダルトン以上のタンパクがハイドロゲル薄膜を透過していることが確認された。
［実施例５：コラーゲンハイドロゲル薄膜培養担体を用いた細胞培養］
上記（実施例１）で作製したシャーレに挿入されたハイドロゲル薄膜の片面に、ＰＫＨ２６で染色された２ｍｌのＣＡＣＯ−２細胞懸濁液（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を播種して、５％ＣＯ２／９５％空気存在下の３７℃保湿インキュベータ内で培養した。４日間培養の後、シャーレの内壁をピンセットでなぞることで、片面にＣＡＣＯ−２が培養されたハイドロゲル薄膜を剥がし、回収した。回収されたハイドロゲル薄膜を、中心部分に３ｍｌの培養液を入れた体外受精用のシャーレ（ｆａｌｃｏｎ＃３６５３）に細胞培養面が下になるように置き、上面にＰＫＨ２で染色されたヒト真皮由来繊維芽細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ／３５０μｌ）を播種して、５％ＣＯ２／９５％空気存在下の３７℃保湿インキュベーター内で２時間培養した。その後、２ｍｌの培養液を加えられた細胞培養用の表面処理の施されていないシャーレに、両面に細胞を播種したハイドロゲル薄膜を移し、上記と同様に３日間培養した。その後、位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡で観察した結果、それぞれの面に異種の細胞を培養できることが確認された（図６、図７）。さらに、両面に細胞を播種したコラーゲンゲル薄膜の垂直な凍結切片を作製した結果、ハイドロゲル薄膜の厚みは約５０μｍであった。
［実施例６：ＭＡＴＲＩＧＥＬハイドロゲル薄膜の作製］
図１に示したような外径３３ｍｍ、内径２４ｍｍの円形の支持体をナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ１７８２Ｂ）を切り抜いて作製し、無菌処理後、疎水性ポリスチレン製培養用シャーレ（φ３５ｍｍ：ＩＷＡＫＩ＃３０００−０３５Ｘ）に入れた。１９．２ｍｇ／ｍｌマトリゲル溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃３５４２３４）２ｍｌを先の支持体を入れた疎水性ポリスチレン製培養用シャーレに入れた後、５％ＣＯ２／９５％空気存在下の３７℃の保湿インキュベーターで１時間維持してゲル化した。この１９．２ｍｇ／ｍｌのマトリゲルを、室温でふたをはずした状態で無菌的に一昼夜完全に乾燥することで、ガラス化させた。これに３ｍｌのＰＢＳを加えることで、ガラス化したマトリゲルハイドロゲル薄膜を水和した。さらに数回３ｍｌのＰＢＳでリンスした。さらにこのマトリゲル薄膜を、室温でふたをはずした状態で無菌的に一昼夜完全に乾燥させた。その後、室温で無菌的に保管維持した。さらに、使用前にＰＢＳもしくは使用する培養液で水和し、シャーレの内壁を周囲に沿って先の鋭敏なピンセットでなぞることで、支持体に支持された強度のあるマトリゲル薄膜としてシャーレより脱着回収できた（図８参照）。
［実施例７：各分子量タンパクの物質透過速度］
薬剤添加槽と薬剤透過槽を、膜を介して設定することができるガラス器具であるパームセル（ビードレックス製）を用い、ハイドロゲル薄膜の各分子量タンパク質の透過性を検討した。薬剤添加槽に各分子量タンパク質を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに溶かした溶液を、薬物透過槽に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを加え、一回あたり２００μｌずつ採取して７日間にわたってサンプリングを行った。各分子量タンパク質としては、グルコース（分子量；１８０）インターロイキン８（分子量９，０００）インターロイキン６（分子量２３，２００）を用い、それぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌを薬剤添加槽に添加した。採取したサンプル中に含まれるグルコース、インターロイキン８、インターロイキン６を定量したところ、それぞれ２２．４ｍｇ／ｈ、３０．４１ｐｇ／ｈ、１６．５４ｐｇ／ｈの平均速度で透過していた。タンパクの分子量に依存して、そのタンパク透過速度が変化することが確認された。
［実施例８：哺乳動物由来の組織切片を含んでいるコラーゲンゲル薄膜］
実施例１と同様に、外径２４ｍｍ、内径１６ｍｍの円形のナイロンメンブレンを支持体として用いてコラーゲンゲル薄膜を作製し、再水和後、それをスライドグラス上で乾燥させた。一方、ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラ精機、Ｃｏｄｅ＃４５８３）で包埋した未固定の凍結組織切片を、クリオスタット（ＬＥＩＣＡ、Ｃｏｄｅ＃ＣＭ３０５０Ｓ）の試料ホルダーに取り付け、ミクロトームで薄切し、組織の薄切片を得た。通常は、得られた薄切片をスライドグラスに貼付するが、本実施例では、図９に示すように、上記のようにして得られたスライドグラス上のコラーゲンゲル薄膜に薄切片を移し取ることができた。なお、組織切片を含んでいるコラーゲンゲル薄膜を７０％エタノール中で保存したが、組織切片ははがれなかった。
【産業上の利用可能性】  ２次元細胞の播種と同様の手段で３次元培養を実現できる培養担体を提供することができるので、専門分野の基礎研究者のみならず、医薬品をはじめとする化学品開発の分野での利用が極めて容易なものとなる。
また、本発明に係る培養担体上での細胞特性を解析する機能アッセイ、上皮間充織をはじめとする組織や器官のモデルの再構築、および当該培養担体上で培養した細胞の移植を容易なものとしたので、３次元培養による器官様構造体の作製、培養臓器の開発、もしくは培養臓器の移植の分野の試験・研究に大きく貢献し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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