(57)【要約】本発明の目的は、ユビキチン様タンパクＳＵＭＯを用いて多様な生理活性や酵素活性を発揮しうるタンパク質ポリマーを提供すること、並びにタンパク質コンジュゲイトやタンパク質ポリマーを細菌などの宿主細胞において大量に生産できる系を提供することである。本発明によれば、目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）を主鎖に含むタンパク質ポリマーが提供される。
2004031243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）を主鎖に含むタンパク質ポリマー。
【請求項２】
目的タンパク質がポリマー中に１種又は２種以上含まれる、請求項１に記載のタンパク質ポリマー。
【請求項３】
主鎖が直鎖状、分枝状、環状、又は自己集合によるチューブ形状である請求項１又は２に記載のタンパク質ポリマー。
【請求項４】
アクセプターが、ポリマー中に１種又は２種以上含まれる請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
【請求項５】
アクセプターがＲａｎＧＡＰ１−Ｃ２（Ｒａｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃ２）、ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（Ｒａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２−Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、ＴＤＧ（Ｔｈｙｍｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ＴＯＮＡＳ（Ｔｏｎａｌｌｉ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＳＰ−ｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）である、請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
【請求項６】
下記式（Ｉ）：
2004031243.tif 000037
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ａは２〜１００の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
【請求項７】
下記式（ＩＩ）：
2004031243.tif 000038
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘ、Ｙ、及びＺは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ｂ、ｃ、及びｄは０から１００の平均重合度を示す。但し、ｂ、ｃ、及びｄが同時に０の場合は除く）
で表されるタンパク質ポリマー。
【請求項８】
下記式（ＩＩＩ）：
2004031243.tif 000039
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ａはアクセプター、Ｘは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ｅは２〜１００の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
【請求項９】
下記式（ＩＶ）：
2004031243.tif 000040
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘ、Ｙ、及びＺは目的タンパク質、Ａはアクセプター、太線はイソペプチド結合、ｆ、ｇ、及びｈは０から１００の平均重合度を示す。但し、ｆ、ｇ、及びｈが同時に０の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマー。
【請求項１０】
下記式：Ｘ−ＳＵＭＯ−Ａ−Ｙ
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ａはアクセプター、Ｘ及びＹは目的タンパク質を示す。）
で表されるタンパク質コンジュゲイト。
【請求項１１】
下記の工程：
（ａ）ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）と目的タンパク質の融合体又は結合体を作製する工程；
（ｂ）前記融合体又は結合体をイソペプチド結合により重合する工程；
を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
【請求項１２】
下記の工程：
（ａ）ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）とアクセプターと目的タンパク質の融合体又は結合体を作製する工程；
（ｂ）前記融合体又は結合体をイソペプチド結合により重合する工程；
を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
【請求項１３】
ＳＵＭＯ活性化酵素Ｅ１、ＳＵＭＯ結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、及び金属イオンの存在下に重合反応を行うことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
反応促進物または基盤ペプチド、もしくはその両方の因子をさらに反応系に添加する、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とを宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
【請求項１６】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）がＡｏｓ１とＵｂａとの融合タンパク質であるＡＵであり、結合酵素（Ｅ２）がＵｂｃ９である、請求項１５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１７】
ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及びアクセプターをコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
【請求項１８】
ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はアクセプターをコードするＤＮＡに隣接して１種以上の目的タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプター（このうちの両方又は片方には上記目的タンパク質が融合している）とを個別に宿主内で同時に発現できる、請求項１７に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項１９】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ；及び／又はアクセプターをコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン様タンパク質及び／又はアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる、組み換え発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１又は請求項２に記載の組み換えベクターと、請求項１７又は１８に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とユビキチン様タンパク質とアクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載のベクターを使用し、必要に応じ、ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ又はアクセプターをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とユビキチン様タンパク質とアクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
【請求項２２】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）、目的タンパク質が結合していてもよいユビキチン様タンパク質、及び目的タンパク質が結合していてもよいアクセプターを発現できる形質転換体。
【請求項２３】
請求項１５又は請求項１６に記載の組み換えベクターと、請求項１７又は１８に記載の組み換えベクターとを有する、請求項２２に記載の形質転換体。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体内においてユビキチン様タンパク質とアクセプターとの結合体を産生することを含む、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの結合体の製造方法。
【請求項２５】
ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質を宿主内で発現できる、組み換え発現ベクター。
【請求項２６】
ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及びアクセプターをコードするＤＮＡに隣接して１種以上の目的タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターと目的タンパク質との融合タンパク質を宿主内で発現できる、請求項２５に記載の組み換え発現ベクター。
【請求項２７】
請求項１５又は請求項１６に記載の組み換えベクターと、請求項２５又は２６に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することにより、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）及びユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質を宿主内で同時に発現させることを含む、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質のポリマーの製造方法。
【請求項２８】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記の活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）と融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
【請求項２９】
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質を発現できる形質転換体。
【請求項３０】
請求項１５又は請求項１６に記載の組み換えベクターと、請求項２５又は２６に記載の組み換えベクターとを有する、請求項２９に記載の形質転換体。
【請求項３１】
請求項２９又は３０に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体内においてユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質のポリマーを産生することを含む、タンパク質ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）のイソペプチド結合性を利用した新規タンパク質ポリマー、及びその製造方法に関するものである。さらに本発明は、細菌などの宿主細胞中でのタンパク質コンジュゲイトもしくはタンパク質ポリマーの高レベルの発現のための組み換えベクターおよびそれを用いたタンパク質コンジュゲイトもしくはタンパク質ポリマーの高レベルの発現方法に関するものである。
【背景技術】  酵素、抗体、受容体などのタンパク質分子は、バイオリアクターやバイオセンサーなどに固定化され、有用物質の生産や分離精製、未知物質の検出や機能解明、薬剤のスクリーニングなどに利用されている。従ってこれらのタンパク質分子をポリマー化することができれば既存のバイオリアクターやバイオセンサーの機能・性能を向上させることができ、また創薬や再生医療、食品加工等に応用できる。
従来からタンパク質分子を重合させる方法としては架橋剤を用いる方法が一般的である。しかしながら、この方法では重合する分子の方向性を制御することが困難であったり、重合させたい分子の活性中心に架橋剤が結合し、その結果、タンパク質の変性や活性損失が起こるなどの問題があった。従って、これまでタンパク質の機能を保ちつつ生化学的に均一なポリマーを合成する手法は存在しない。
一方、ユビキチンは７６個のアミノ酸からなり、酵母からヒトに至るまで非常に良く保存された小さなタンパク質である。ユビキチンは活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、リガーゼ（Ｅ３）から構成される複合酵素系によって標的タンパク質に共有結合する。つまりユビキチンのＣ末端のカルボキシル基が標的タンパク質のリジン残基のε−アミノ基にイソペプチド結合する。さらに、標的タンパク質のリジン残基に結合したユビキチンの４８番目のリジン残基に別のユビキチンのＣ末端がイソペプチド結合を繰り返すことにより、ポリユビキチン鎖が形成される。
また、ＳＵＭＯ（ｓｍａｌｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｅｒ）は小さなユビキチン様タンパク質で、酵母からヒトに至るまで進化上極めてよく保存されており、細胞増殖制御に重要な役割を果たし、核膜孔複合体の近くに多く存在している。ＳＵＭＯもまたユビキチンと同様な機構によりイソペプチド結合を介して他のタンパク質に結合し、ポリマー化が起こることが報告される（Ｍ．Ｈ．Ｔａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７６，ｐ．３５３６８，２００１；Ａ．Ｐｉｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．１０９，２００２；及び、Ｅ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ａ．Ａ．Ｇｕｐｔａ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０６，ｐ．７３５，２００１を参照）。また、ユビチキンと融合したタンパク質は分解されやすいのに対し、ＳＵＭＯと融合したタンパク質は安定になることが知られている（Ｊ．Ｍ．Ｄｅｓｔｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２，ｐ．８６６０，１９９８；及びＴ．Ｂｕｓｃｈｍａｎｎ  ｓｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０１，ｐ．７５３，２０００を参照）。しかしながら、目的タンパク質を融合させたＳＵＭＯをポリマー化させた例は今まで報告がない。
【発明の開示】
本発明の第一の目的は、ユビキチン様タンパクＳＵＭＯを用いて多様な生理活性や酵素活性を発揮しうるタンパク質ポリマーを提供することにある。本発明の第二の目的は、タンパク質コンジュゲイトやタンパク質ポリマーを細菌などの宿主細胞において大量に生産できる系を提供することである。
本発明者らは上記第一の目的を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）を、酵素によるイソペプチド結合反応によりポリマー化することに成功した。さらに本発明者らは、上記第二の目的を解決するために鋭意検討した結果、哺乳動物のＳＵＭＯ化酵素（即ち、ＳＵＭＯ化Ｅ１酵素とＥ２酵素の２種類）とＳＵＭＯとアクセプターとを大腸菌で同時に発現させることにより、菌体内でイソペプチド結合を形成させることに成功し、タンパク質コンジュゲイトやポリマーを多量に生産する技術を開発した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば、以下の（１）〜（３０）の発明が提供される。
（１）  目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）を主鎖に含むタンパク質ポリマー。
（２）  目的タンパク質がポリマー中に１種又は２種以上含まれる、（１）に記載のタンパク質ポリマー。
（３）  主鎖が直鎖状、分枝状、環状、又は自己集合によるチューブ形状である（１）又は（２）に記載のタンパク質ポリマー。
（４）  アクセプターが、ポリマー中に１種又は２種以上含まれる（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
（５）  アクセプターがＲａｎＧＡＰ１−Ｃ２（Ｒａｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃ２）、ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（Ｒａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２−Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、ＴＤＧ（Ｔｈｙｍｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ＴＯＮＡＳ（Ｔｏｎａｌｌｉ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＳＰ−ｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）である（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質ポリマー。
（６）  下記式（Ｉ）：
2004031243.tif 000003
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ａは２〜１００の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
（７）  下記式（ＩＩ）：
2004031243.tif 000004
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘ、Ｙ、及びＺは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ｂ、ｃ、及びｄは０から１００の平均重合度を示す。但し、ｂ、ｃ、及びｄが同時に０の場合は除く）
で表されるタンパク質ポリマー。
（８）  下記式（ＩＩＩ）：
2004031243.tif 000005
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ａはアクセプター、Ｘは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ｅは２〜１００の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマー。
（９）  下記式（ＩＶ）：
2004031243.tif 000006
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘ、Ｙ、及びＺは目的タンパク質、Ａはアクセプター、太線はイソペプチド結合、ｆ、ｇ、及びｈは０から１００の平均重合度を示す。但し、ｆ、ｇ、及びｈが同時に０の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマー。
（１０）  下記式：Ｘ−ＳＵＭＯ−Ａ−Ｙ
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ａはアクセプター、Ｘ及びＹは目的タンパク質を示す。）
で表されるタンパク質コンジュゲイト。
（１１）  下記の工程：
（ａ）ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）と目的タンパク質の融合体又は結合体を作製する工程；
（ｂ）前記融合体又は結合体をイソペプチド結合により重合する工程；
を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
（１２）  下記の工程：
（ａ）ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）とアクセプターと目的タンパク質の融合体又は結合体を作製する工程；
（ｂ）前記融合体又は結合体をイソペプチド結合により重合する工程；
を含むタンパク質ポリマーの製造方法。
（１３）  ＳＵＭＯ活性化酵素Ｅ１、ＳＵＭＯ結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、及び金属イオンの存在下に重合反応を行うことを特徴とする、（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）  反応促進物または基盤ペプチド、もしくはその両方の因子をさらに反応系に添加する、（１１）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とを宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
（１６）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）がＡｏｓ１とＵｂａとの融合タンパク質であるＡＵであり、結合酵素（Ｅ２）がＵｂｃ９である、（１５）に記載の組み換え発現ベクター。
（１７）  ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及びアクセプターをコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
（１８）  ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はアクセプターをコードするＤＮＡに隣接して１種以上の目的タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプター（このうちの両方又は片方には上記目的タンパク質が融合している）とを個別に宿主内で同時に発現できる、（１７）に記載の組み換え発現ベクター。
（１９）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ；及び／又はアクセプターをコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン様タンパク質及び／又はアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる、組み換え発現ベクター。
（２０）  （１）又は（２）に記載の組み換えベクターと、（１７）又は（１８）に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とユビキチン様タンパク質とアクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
（２１）  （１９）に記載のベクターを使用し、必要に応じ、ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ又はアクセプターをコードするＤＮＡを含む組み換えベクターを組み合わせて使用することを含む、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とユビキチン様タンパク質とアクセプターとを宿主内で同時に発現する方法。
（２２）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）、目的タンパク質が結合していてもよいユビキチン様タンパク質、及び目的タンパク質が結合していてもよいアクセプターを発現できる形質転換体。
（２３）  （１５）又は（１６）に記載の組み換えベクターと、（１７）又は（１８）に記載の組み換えベクターとを有する、（２２）に記載の形質転換体。
（２４）  （２２）又は（２３）に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体内においてユビキチン様タンパク質とアクセプターとの結合体を産生することを含む、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの結合体の製造方法。
（２５）  ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質を宿主内で発現できる、組み換え発現ベクター。
（２６）  ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及びアクセプターをコードするＤＮＡに隣接して１種以上の目的タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターと目的タンパク質との融合タンパク質を宿主内で発現できる、（２５）に記載の組み換え発現ベクター。
（２７）  （１５）又は（１６）に記載の組み換えベクターと、（２５）又は（２６）に記載の組み換えベクターとを組み合わせて使用することにより、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）及びユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質を宿主内で同時に発現させることを含む、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質のポリマーの製造方法。
（２８）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記の活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）と融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター。
（２９）  ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質を発現できる形質転換体。
（３０）  （１５）又は（１６）に記載の組み換えベクターと、（２５）又は（２６）に記載の組み換えベクターとを有する、（２９）に記載の形質転換体。
（３１）  （２９）又は（３０）に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体内においてユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質のポリマーを産生することを含む、タンパク質ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のタンパク質ポリマーがとりうる様々な構造を示す。
図２は、ＧＳＴ−ＳＵＭＯ融合体発現ベクターの構造を示す。
図３は、ＧＳＴ−ＳＵＭＯのポリマー化反応産物をＳＤＳ−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウェスタン法で検出した結果を示す。
図４は、Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体発現ベクターの構造を示す。
図５は、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体発現ベクターの構造を示す。
図６は、Ｅ１、Ｅ２酵素によるＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯのポリマー化反応、ならびに反応産物をＳＤＳ−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウェスタン法で検出した結果を示す。
図７は、改変型ＳＵＭＯ−Ｅ１酵素（ＡＵ）の構造模式図を示す。ＳＵＭＯとアクセプター間にイソペプチド結合を形成する酵素を改変し、大腸菌体内での発現を容易にしたものである。本明細書において、この改変型酵素をＡＵと称する。従来のＳＵＭＯ−Ｅ１はＡｏｓ１とＵｂａ２の２つのサブユニットタンパク質からなる酵素である。Ａｏｓ１とＵｂａ２を遺伝子工学的手法で融合させたタンパク質ＡＵを作製した。このＡＵタンパク質は本発明者らのオリジナルのデザインであり、Ａｏｓ１およびＵｂａ２のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶをドメイン構造を保存する形で融合させてある。Ｃｙｓは酵素活性に必須のシステイン残基の位置を示してある。
図８は、大腸菌体内で目的タンパク質ＸとＹのコンジュゲイトを合成する方法を模式的に示してある。具体的な実験例は実施例３に示した。実施例３において、ＸはＴ７−ｄｏｍａｉｎであり、ＹはＨＩＳ−ｄｏｍａｉｎである。また、アクセプターＡとしてＣ２配列を用いている。
図９は、実施例３で用いた発現ベクターの線図である。
図１０は、実施例３の結果を示す。
図１１は、大腸菌体内で目的タンパク質Ｘのポリマーを合成する方法を模式的に示す。具体的な実験例は実施例４に示した。実施例４おいて、ＸはＧＳＴ−ｄｏｍａｉｎであり、アクセプターＡとしてＣ２配列を用いている。
図１２は、実施例４で用いた発現ベクターの線図である。
図１３は、実施例４の結果を示す。
図１４は、実施例５（各種アクセプター配列を用いた解析）の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明のタンパク質ポリマー
本発明のタンパク質ポリマーは、目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ：ｓｍａｌｌ  ｕｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｅｒ）を主鎮に含むタンパク質ポリマーである。
本発明のタンパク質ポリマーに使用する「ＳＵＭＯ」は、ユビキチン様タンパク質を意味し、ユビキチンと高い相同性を有するモディフィアー群の全てを含む。また、その由来は問わない。哺乳動物由来のものが好ましいが、酵母、昆虫、両生類、ハ虫類、植物など哺乳動物以外のものでもよい。本発明に用いることのできるＳＵＭＯとしては、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−３が挙げられるが、これらに限定はされず、例えばＳＵＭＯタンパク質活性・機能を有する限りにおいて、当該アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入していてもよい。
本発明のタンパク質ポリマーにおける「アクセプター」とは上記のＳＵＭＯとイソペプチド結合可能なリジン残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であって、一般に−Ｆ−Ｌｙｓ−Ｈ−Ｇｌｕ−（Ｆ：疎水性アミノ酸、Ｈ：任意のアミノ酸）で表される。アクセプターとしては、例えば、ＲａｎＧＡＰ１（Ｒａｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（Ｒａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２−Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、ＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）などが使用される。本発明において好適に使用されるＲａｎＧＡＰ１（Ｒａｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は配列番号４のアミノ酸配列を有し、１２１番目のリジン残基がＳＵＭＯとイソペプチド結合する（なお、ＲａｎＧＡＰ１の全長は５８０アミノ酸で、このうちＣ末端領域の３９７から５８０番目のアミノ酸配列がＣ２配列である）。
上記のアクセプターは、単独であってもよいが、２種以上を適宜組み合わせてもよい。２種以上のアクセプターを使用すると、ポリマーの主鎖が枝分かれ構造をとりうる。また、６０度又は１２０度の折れ曲がりを持つ構造配列を有するアクセプターを使用すると、ポリマーの主鎖が三角形や六角形などの環状構造をとりうる。さらに、環状構造をとる場合において、互いに相互作用するタンパク質をアクセプターを介してＳＵＭＯに結合させると、該タンパク質の相互作用により自己集合を起こし、ポリマーの主鎖がチューブ状構造をとりうる。図１は、本発明のタンパク質ポリマーがとりうる様々な構造を示す。
本発明のタンパク質ポリマーにおける「目的タンパク質」としては特に限定はされず、任意のタンパク質であってよいが、例えば酵素、サイトカイン類、ホルモン、抗体、受容体、生理活性ペプチド等を用いることができる。ポリマー中に含まれるこれら目的タンパク質は１種であっても２種以上であってもよい。
酵素としては、例えばリパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、及びラクターゼ等が挙げられる。
サイトカイン類としては、例えばインターフェロン−α、−β、−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン、成長因子（上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、神経細胞成長因子）等が挙げられる。
ホルモンとしては、例えばインシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、卵胞刺激ホルモン等が挙げられる。
抗体としては、ヒト免疫グロブリン等を挙げることができ、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、又はＦａｂ等の活性断片であってもよい。また、抗体としての類似機能をもつ物質、例えば一本鎖状の抗原結合活性をもつ物質、具体的には一本鎖Ｆａｂペプチドであってもよい。
受容体としては、例えばホルモン受容体、サイトカイン受容体、増殖因子に対する受容体、神経伝達物質に対する受容体、抗体受容体（Ｆｃ受容体）、補体受容体等が挙げられる。
生理活性ペプチドとしては、β−アミロイド、アンジオテンシン、エンドセリン、カルシトシン、ニューロペプチドＹ、ニューロキニンＡ、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ等が挙げられる。
上記の目的タンパク質の分子量（ｋＤａ）は、２〜１０００ｋＤａ、好ましくは２〜１００ｋＤａ、特に１０〜５０ｋＤａの範囲であり、目的タンパク質の分子量がこの範囲にあるとＳＵＭＯとの融合体が立体障害を起こさないため好ましい。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（Ｉ）で表される場合、ａで示される平均重合度は２〜１００、好ましくは２〜５０、より好ましくは３〜１０である。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（ＩＩ）で表される場合、ｂ，ｃ，及びｄで表される平均重合度は、０〜１００、好ましくは０〜５０、より好ましくは０〜１０である（但し、ｂ，ｃ，及びｄが同時に０の場合は除く）。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（ＩＩＩ）で表される場合、ｅで示される平均重合度は２〜１００、好ましくは２〜５０、より好ましくは３〜１０である。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（ＩＶ）で表される場合、ｆ，ｇ，及びｈで表される平均重合度は、０〜１００、好ましくは０〜５０、より好ましくは０〜１０である（但し、ｆ，ｇ，及びｈが同時に０の場合は除く）。
また、前記式（ＩＶ）で表されるタンパク質ポリマーにおいて、構成単位であるＸ−Ａ−ＳＵＭＯ、Ｙ−Ａ−ＳＵＭＯあるいはＺ−Ａ−ＳＵＭＯは、それぞれランダムに結合してもよく、またブロック的に結合していてもよい。反応系に最初からＸ−Ａ−ＳＵＭＯ、Ｙ−Ａ−ＳＵＭＯ及び／又はＺ−Ａ−ＳＵＭＯとを仕込むとランダムなポリマーが得られ、最初にＸ−Ａ−ＳＵＭＯ又はＹ−Ａ−ＳＵＭＯ又はＺ−Ａ−ＳＵＭＯのいずれかを仕込み、次いで他の構成単位を順次仕込むとブロック的なポリマーを製造することができる。
さらに、ユビキチン様タンパク質ＳＵＭＯと目的タンパク質Ｘ、およびアクセプターＡと目的タンパク質Ｙの融合タンパク質が結合した、式：Ｘ−ＳＵＭＯ−Ａ−Ｙで表されるタンパク質コンジュゲイトも本発明の範囲内である。ＸおよびＹの種類と数には制限はなく、特にアクセプターに結合させる目的タンパク質（Ｙ）は、アクセプターのアミノ末端側あるいはカルボキシ末端側のいずれに結合していてもよく、両方に結合することもできる。
２．本発明のタンパク質ポリマーの製造方法
（１）反応基質の作製
次に、本発明のタンパク質ポリマーの製造方法について説明する。本発明のタンパク質ポリマーを製造するには、まずモノマーとなる反応基質を作製する。
反応基質を作製する方法としては、ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）、目的タンパク質、アクセプターをコードする遺伝子を連結させて適当な発現系に導入して融合タンパク質として発現させる方法、あるいはそれぞれのタンパク質を別個に作製し、後に架橋剤等を用いて化学的に結合させる方法のいずれであってもよい。
本明細書において「融合体」というときは、遺伝子工学的に融合タンパク質として発現させる方法により作製した反応基質をいい、「結合体」というときは、化学的結合により作製した反応基質をいうものとする。遺伝子工学的に又は化学的結合により作製した反応基質は、いずれもポリマー化のよい基質となる。
融合体を作製するには、ＳＵＭＯ、目的タンパク質、又はアクセプターをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をそれぞれ構築した後、発現ベクターのプロモーターの下流に該ＤＮＡ断片を挿入し、次いで該発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入する。
上記目的タンパク質は、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、ヒスチジンヘキサマー、チオレドキシンなどの遺伝子、あるいは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をはじめとする蛍光タンパク質などのリポーター遺伝子の下流につなぎ、これらとの融合タンパク質として発現されることが好ましい。また、目的タンパク質自体が、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ヒスチジンヘキサマー、チオレドキシン、蛍光タンパク質であってもよい。
ユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）と目的タンパク質との融合体、又はユビキチン様タンパク質（ＳＵＭＯ）とアクセプターと目的タンパク質の融合体（以下、これらを総称してＳＵＭＯ−タンパク質融合体という）を遺伝子工学的に作製する場合、用いる宿主細胞としては、目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
組換えベクターの導入は、用いる宿主細胞に応じて常套的に用いられる方法で行えばよい。
組換えベクターを導入した形質転換体を培地に培養し、培養物中にＳＵＭＯ−タンパク質融合体を生成蓄積させ、該培養物より該ＳＵＭＯ−タンパク質融合体を採取することにより、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体を単離することができる。
形質転換体の培養方法は、通常の方法に従って行うことができる。形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養には天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養形式、培養温度、培養時間、培地ｐＨは、用いる宿主細胞に応じて通常行われる条件を採用すればよい。
上記形質転換体の培養物から本発明のＳＵＭＯ−タンパク質融合体を単離精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。例えば、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティクロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該融合体を回収後、該融合体の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度がタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該融合体を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明で用いるＳＵＭＯ−タンパク質融合体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該融合体を回収することができる。即ち、培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
あるいは、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体の合成は、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を合成させる無細胞蛋白質合成系を用いて行ってもよい。このような無細胞蛋白質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含まれている。
（２）タンパク質ポリマーの製造
次に、得られたＳＵＭＯ−タンパク質融合体からタンパク質ポリマーを製造するには、ＳＵＭＯ−タンパク質融合体をＳＵＭＯ活性化酵素Ｅ１（Ａｓｏ１／Ｕｂａ２）、ＳＵＭＯ結合酵素Ｈ２（Ｕｂｃ９）、ＡＴＰ、及び金属イオンの存在下、反応液中でイソペプチド結合によってポリマー化する。
重合反応は一般に精製した酵素成分を用いて行うのが良いが、ＳＵＭＯのポリマー化反応に関わるＥ１及びＥ２酵素は基質特異性が高いので、精製純度は特別に高くないものでも使用できる。
反応液中の基質の濃度は反応に支障がない限りどのような濃度であってもよいが、好ましくは０．０１ｍＭ〜１Ｍである。反応に用いる酵素濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌである。また、ＡＴＰ濃度は０．０１〜１０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
金属イオンとしては、好ましくはマグネシウムイオン、カルシウムイオン等の二価金属イオンが用いられる。反応液中にマグネシウムイオンを添加する場合、濃度は０．０１〜１０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
また、上記反応系に反応促進物質を適宜添加してもよい。反応促進物質としては、例えばＳＰ−ＲＩＮＧタンパク質又はＳＩＺ／ＰＩＡＳと呼ばれる一群のタンパク質ファミリー、ＲａｎＢＰ２／Ｎｕｐ３５８などが挙げられるがこれらに限定はされない。
反応温度は、Ｅ１及びＥ２の活性を阻害しない温度範囲であればよく、最適温度を含む範囲の温度が好ましい。反応温度は通常１０℃〜６０℃であり、好ましくは３０℃〜４０℃である。
また、上記のポリマー化反応を効率的に行うために基盤タンパク質上で行うことが好ましい。本発明において「基盤タンパク質」とは、ＳＵＭＯのＣ末端とイソペプチド結合可能なリジン残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をいい、例えばＲａｎＧＡＰ１（Ｒａｎ  ＧＴＰａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（Ｒａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ２−Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、ＰＭＬ（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、Ｓｐ１００、ｐ５３などが好適に使用できる。
目的物質を分離定量する方法として、例えば、必要に応じて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を挙げることができる。あるいは、反応生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などで分離した後、適当な抗体を用いてイムノブロット分析を行うことにより基質の減少と反応生成物の増加を検出することができる。
本発明のＳＵＭＯタンパク質ポリマーはそのままで各種用途に使用することができるが、取扱いを容易にするため、あるいは単位重量当りの反応性を向上させるため、種々の無機化合物担体又は有機化合物担体に担持させた状態で使用することが好ましい。
３．菌体内の生合成システムを用いる本発明のタンパク質コンジュゲイトもしくはポリマーの製造方法
これまでは細菌宿主細胞内でイソペプチド結合によるタンパク質コンジュゲイトを過剰発現させたり蓄積したりすることはできなかった。最も大きな理由は、細菌はイソペプチド結合を触媒する酵素群を体内に持ちあわせていないことがあげられる。本発明者らは、哺乳動物のＳＵＭＯ化酵素（Ｅ１及びＥ２酵素）とＳＵＭＯとアクセプターとを大腸菌で同時に発現させることで、菌体内でイソペプチド結合を形成させることに成功し、タンパク質コンジュゲイトを多量に生産する技術を開発した。
即ち、本発明の方法は、従来は試験管内で行っていた反応を大腸菌体内の生合成システムを用いることで、タンパク質コンジュゲイトもしくはポリマーの過剰発現を可能にした組み換え発現システムに関するものである。
本発明の実施例３及び４においては、２種類の発現ベクターを使用した。第一の発現ベクターはＳＵＭＯとアクセプターと目的タンパク質をコードするベクターであり、第２の発現ベクターは、ＳＵＭＯとアクセプターとをイソペプチド結合する反応を触媒する酵素（Ｅ１及びＥ２酵素）をコードしている。この２種類のベクターを菌体内に取り込ませ、ベクター上の遺伝子群を同時発現させることで、目的タンパク質を含むコンジュゲイトもしくはポリマーを高レベルで発現させることができる。
ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質で、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋存在下、Ｅ１（ＳＵＭＯ活性化酵素）およびＥ２（ＳＵＭＯ結合酵素）と呼ばれる酵素により、ＳＵＭＯのＣ末端のグリシン残基とアクセプター配列中のリジン残基のアミノ基側鎖がイソペプチド結合する。
本来、ＳＵＭＯ−Ｅ１はＡｏｓ１とＵｂａ２と呼ばれる２つのタンパク質のヘテロ複合体よりなる。本明細書に記載する実施例３においては、Ａｏｓ１およびＵｂａ２はＰＣＲによりマウスｃＤＮＡよりクローン化し、その後、２つの断片を直列にライゲーションすることで融合タンパク質をデザインした。このＡｏｓ１−Ｕｂａ２融合遺伝子（ＡＵ遺伝子）をｐＧＥＸ発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＧＳＴ−ＡＵタンパク質を大腸菌で発現させる系を開発した。このｐＧＥＸベクターのＸｂａＩ部位には、ＡＵとは独立に、ＳＵＭＯ−Ｅ２であるＵｂｃ９を導入し、図９に示すようなｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９を作製した。このベクターでは、ＧＳＴ−ＡＵがＴａｑプロモーター下流に連結し、Ｕｂｃ９はＴ７プロモーター下流に連結しており、２つの遺伝子産物がＩＰＴＧにより発現誘導可能となるように設計されている。ここで用いたベクターはｐＢＲ３２２由来の複製起点を持ち、アンピシリン薬剤耐性である。プラスミド名はｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９とした。このプラスミドベクターより発現されるＧＳＴ−ＡＵとＵｂｃ９は、それぞれＥ１およびＥ２の酵素活性を有し、ＳＵＭＯ化反応を触媒する能力を持っている。
一方、ＲａｎＧＡＰ１と呼ばれるタンパク質のＣ末端ドメインＣ２（ＲａｎＧＡＰ１の全長は５８０アミノ酸で、このうちＣ末端領域の３９７から５８０番目のアミノ酸配列がＣ２配列である）が細胞内で特異的にＳＵＭＯ化を受けることが知られている。Ｃ２ドメインに（Ｈｉｓ）６を含むアミノ酸配列を融合したタンパク質ＨＩＳ−ｄｏｍａｉｎ−Ｃ２とＳＵＭＯ−１にＴ７−ｔａｇ配列を含むアミノ酸配列を融合したタンパク質Ｔ７−ｄｏｍａｉｎ−ＳＵＭＯ−１の２つの産物をコードする遺伝子をそれぞれＴ７プロモーター下流に導入した発現ベクターが図９に示してある。ＳＵＭＯ−１はヒトｃＤＮＡより、Ｃ２はアフリカツメガエルのｃＤＮＡよりＰＣＲで得た。ここで用いたベクターはｐＡＣＹＣを改変したもので、ｐ１５Ａ複製起点を持ち、クロランフェニコール薬剤耐性である。２つの遺伝子発現はＩＰＴＧにより誘導できる。プラスミド名はｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２とした。
上述のｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２を同時に宿主（例えば、大腸菌など）に導入する。この２つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフェニコールの両方を含む培地で選別できる。得られたコロニーを別個の液体培地で好適な条件下で培養し、さらにＩＰＴＧを加えて発現を誘導しながら培養する。菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、超音波処理などにより菌体を破砕する。遠心分離の後、上澄み液を取り出し、ニッケルアガロースビーズとインキュベーションし、ビーズに結合したタンパク質を溶出する等の操作により、Ｔ７−ｄｏｍａｉｎ−ＳＵＭＯ−１とＨｉｓ−ｄｏｍａｉｎ−Ｃ２のコンジュゲイトを回収することができる。
上記で用いたベクターを改変することで、様々なタンパク質コンジュゲイトを作製できる。図８に示したように、Ｔ７−ｄｏｍａｉｎに変えて、目的タンパク質Ｘを導入し、Ｈｉｓ−ｄｏｍａｉｎに変えて目的タンパク質Ｙを導入すれば、Ｘ−ＳＵＭＯ−Ｃ２−ＹというＸ−Ｙのコンジュゲイトを作製できる。
また、この実験ではＣ２をアクセプターとして用いているが、Ｃ２以外のアクセプター配列を用いることも可能である。さらに、ＳＵＭＯ−１の他に、ＳＵＭＯ−２やＳＵＭＯ−３といった、関連配列を用いることも可能である。これらの組み合わせに制限はない。
さらに従来においては、細菌宿主細胞内でタンパク質を共有結合させることでポリマー化することはできなかった。タンパク質ポリマーを過剰発現させ蓄積させる技術も開発されていない。本発明においては、哺乳動物のＳＵＭＯ関連因子を大腸菌で発現させることで、菌体内でイソペプチド結合を形成することに成功し、タンパク質ポリマーを多量に生産する技術を提供することが可能になった。
本明細書に記載する実施例４においては、Ｘ−Ａ−ＳＵＭＯのＸとしてＧＳＴタンパク質（２７ｋＤａ）、Ａ配列としてＲａｎＧＡＰ１と呼ばれるタンパク質のＣ末端ドメインＣ２を用いている（ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１）。ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１をベクターはｐＡＣＹＣに組み込んで、このプラスミドをｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯと呼ぶ（図１２を参照）。
上述のｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯを同時に宿主（例えば、大腸菌など）に導入する。この２つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフェニコールの両方を含む培地で選別できる。得られたコロニーを別個の液体培地で好適な条件下で培養し、さらにＩＰＴＧを加えて発現を誘導しながら培養する。菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、超音波処理などにより菌体を破砕する。遠心分離の後、上澄み液を取り出し、グルタチオンセファロースビーズとインキュベーションし、ビーズに結合したタンパク質を溶出する等の操作により、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯがポリマー化したＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯポリマーを回収することができる。
上記で用いたベクターを改変することで、ＧＳＴの代わりに様々なタンパク質Ｘをポリマーに導入できる。すなわち、図１１に示したように、様々な目的タンパク質ＸをＣ２−ＳＵＭＯの融合タンパク質として導入することで、Ｃ２−ＳＵＭＯを基軸とするＸのポリマーを大腸菌で多量に生産できる。
また、この実験ではアクセプターとしてＣ２を用いているが、Ｃ２以外のアクセプター配列を用いることも可能である。さらに、ＳＵＭＯ−１の他に、ＳＵＭＯ−２やＳＵＭＯ−３といった、関連配列を用いることも可能で、ポリマーの基軸の形を改変することも可能である。アクセプターとＳＵＭＯとの組み合わせに特に制限はない。
以下、菌体内の生合成システムを用いる本発明のタンパク質コンジュゲイトもしくはポリマーの製造方法の実施方法（以下、本方法とも称する）についてさらに詳細に説明する。
（１）Ｅ１酵素及びＥ２酵素
ユビキチン、ＳＵＭＯ，ＮＥＤＤ８／Ｒｕｂ１，Ａｐｇ１２などのユビキチン様の構造を持つタンパク質群はユビキチンファミリーと呼ばれている。これらユビキチンファミリータンパク質は活性化酵素（Ｅ１）および結合酵素（Ｅ２）により、別のタンパク質のアクセプター部位にイソペプチド結合する性質を持つ。ユビキチンＥ１としてＵｂａ１が、ＳＵＭＯ−Ｅ１としてＡｏｓ１／Ｕｂａ２ヘテロダイマーが、ＮＥＤＤ８−Ｅ１としてＡＰＰ−ＢＰ１／Ｕｂａ３ヘテロダイマーが、Ａｐｇ１２のＥ１としてＡｐｇ７が知られている。ユビキチンＥ２としてＵｂｃ１〜８，１０，１１，１３が、ＳＵＭＯ−Ｅ２としてＵｂｃ９が、ＮＥＤＤ８−Ｅ２としてＵｂｃ１２が、Ａｐｇ１２のＥ２としてＡｐｇ１０が知られている（田中啓二・大隈良典（編集）、実験医学「タンパク質分解の最前線２００１」Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ２，２００１を参照）。
本方法では特にＥ１酵素として、図７に示すようなＡｏｓ１及びＵｂａ２の融合タンパク質であるＡＵを使用することが好ましく、Ｅ２酵素としてＵｂｃ９を使用することが好ましい。
（２）ユビキチン様タンパク質、アクセプター、及び目的タンパク質、
本方法で使用するユビキチン様タンパク質は、ユビキチン様タンパク質を意味し、ユビキチンと高い相同性を有するモディフィアー群の全てを含み、その具体例としては、ユビキチン、ＳＵＭＯ，ＮＥＤＤ８／Ｒｕｂ１，Ａｐｇ１２などが挙げられる。また、その由来は限定されず、哺乳動物由来のものが好ましいが、酵母、昆虫、両生類、ハ虫類、植物など哺乳動物以外のものでもよい。本発明に用いることのできるＳＵＭＯとしては、例えば配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−１、配列番号２のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−２、配列番号３のアミノ酸配列を有するＳＵＭＯ−３が挙げられるが、これらに限定はされず、例えばＳＵＭＯタンパク質活性・機能を有する限りにおいて、当該アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は挿入していてもよい。
本方法で用いる「アクセプター」とは上記のユビキチン様タンパク質とイソペプチド結合可能なリジン残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であって、一般に−Ｆ−Ｌｙｓ−Ｈ−Ｇｌｕ−（Ｆ：疎水性アミノ酸、Ｈ：任意のアミノ酸）で表される。アクセプターとしては、本明細書中上記の「１．本発明のタンパク質ポリマー」の項目に記載したものを使用することができる。アクセプターとしては中部にＳＵＭＯ結合部位が１つである場合と複数個ある場合の大きくわけると２つのグループがある。１つの場合（例えばＲａｎＧＡＰ１−Ｃ２やＴＤＧ）は直鎖状に、複数ある場合（例えばＲａｎＢＰ２−ＩＲやＴＯＮＡＳ）は積層、あるいは房状のポリマーが形成されると考えられる。
本発明で用いる「目的タンパク質」としては特に限定はされず、任意のタンパク質であってよい。「目的タンパク質」としては、本明細書中上記の「１．本発明のタンパク質ポリマー」の項目に記載したものを使用することができる。
（３）発現ベクター
本発明は；
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）とを宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター；
ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ及びアクセプターをコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター；
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ；ユビキチン様タンパク質をコードするＤＮＡ；及び／又はアクセプターをコードするＤＮＡを含み、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、ユビキチン様タンパク質及び／又はアクセプターとを個別に宿主内で同時に発現できる、組み換え発現ベクター；
ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、ユビキチン様タンパク質とアクセプターとの融合タンパク質を宿主内で発現できる、組み換え発現ベクター；並びに
ユビキチン様タンパク質を活性化する酵素（Ｅ１）をコードするＤＮＡ、ユビキチン様タンパク質とアクセプターの結合酵素（Ｅ２）をコードするＤＮＡ、及びユビキチン様タンパク質とアクセプターと所望により目的タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、上記の活性化酵素（Ｅ１）と結合酵素（Ｅ２）と融合タンパク質を宿主内で同時に発現できる組み換え発現ベクター；
に関するものである。
上記した各種の組み換え発現ベクターは、通常の発現ベクター中の適当な導入遺伝子挿入部位に所望の遺伝子を挿入することにより構築することができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記した目的とする塩基配列を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。発現ベクターとしては、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＱＩＡＧＥＮ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、宝酒造社などから市販されている各種の発現ベクターを使用できる。
（４）形質転換体とそれを用いたユビキチン様タンパク質とアクセプターとの結合体及びタンパク質ポリマーの生産
本発明において上記（３）に記載の発現ベクターを導入するために用いる宿主細胞としては、目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、細菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。本発明では、上記の中でも細菌（例えば、エッシェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌）を使用することが好ましく、大腸菌を使用することが特に好ましい。
組換え発現ベクターの導入は、用いる宿主細胞に応じて常套的に用いられる方法で行えばよく、例えば、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法などが挙げられる。
組換え発現ベクターを導入した形質転換体を培地に培養し、培養物中にＳＵＭＯ−タンパク質融合体を生成蓄積させ、該培養物より該ユビキチン様タンパク質−タンパク質融合体を採取することにより、ユビキチン様タンパク質−タンパク質融合体を単離することができる。
形質転換体の培養方法、形質転換体の培養物から本発明のユビキチン様タンパク質−タンパク質融合体の単離精製、並びに目的物質の分離定量については、本明細書中上記２．に記載した通り行うことができる。
（５）ユビキチン様タンパク質／アクセプター結合体、およびユビキチン様タンパク質／アクセプターのポリマー（タンパク質ポリマー）
上記（４）の方法により、ユビキチン様タンパク質／アクセプター結合体またはユビキチン様タンパク質／アクセプターのポリマー（タンパク質ポリマー）を生産・単離することができる。
ユビキチン様タンパク質／アクセプター結合体の具体例としては、アクセプター（Ａ）とＳＵＭＯに目的タンパク質ＸとＹをそれぞれ結合させた融合タンパク質を用いることができる。これによりＸ−ＳＵＭＯ−Ｙ−Ａというコンッジュゲイトができる。ＳＵＭＯやアクセプターに結合させるＸおよびＹの種類と数には制限はなく、特にアクセプターに結合させる目的タンパク質は、アクセプターのアミノ末端側あるいはカルボキシ末端側のいずれであってもかまわないし、両方に取り付けてもかまわない。
本発明の方法で生産されるタンパク質ポリマーは、目的タンパク質が直接またはアクセプターを介して結合したユビキチン様タンパク質（例えば、ＳＵＭＯ：ｓｍａｌｌ  ｕｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｄｉｆｅｒなど）を主鎖に含むタンパク質ポリマーである。
タンパク質ポリマーの一例としては、下記式（ＩＩＩ）：
2004031243.tif 000007
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ａはアクセプター、Ｘは目的タンパク質、太線はイソペプチド結合、ｅは２〜１００の平均重合度を示す。）
で表されるタンパク質ポリマーが挙げられる。
タンパク質ポリマーの別の例としては、下記式（ＩＶ）：
2004031243.tif 000008
（式中、ＳＵＭＯはユビキチン様タンパク質、Ｘ、Ｙ、及びＺは目的タンパク質、Ａはアクセプター、太線はイソペプチド結合、ｆ、ｇ、及びｈは０から１００の平均重合度を示す。但し、ｆ、ｇ、及びｈが同時に０の場合は除く）。
で表されるタンパク質ポリマーが挙げられる。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（ＩＩＩ）で表される場合、ｅで示される平均重合度は２〜１００、好ましくは２〜５０、より好ましくは３〜１０である。
本発明のタンパク質ポリマーが、前記式（ＩＶ）で表される場合、ｆ，ｇ，及びｈで表される平均重合度は、０〜１００、好ましくは０〜５０、より好ましくは０〜１０である（但し、ｆ，ｇ，及びｈが同時に０の場合は除く）。
また、前記式（ＩＶ）で表されるタンパク質ポリマーにおいて、構成単位であるＸ−Ａ−ＳＵＭＯ、Ｙ−Ａ−ＳＵＭＯあるいはＺ−Ａ−ＳＵＭＯは、それぞれランダムに結合してもよく、またブロック的に結合していてもよい。式（ＩＩＩ）のタンパク質ポリマーを製造する場合は、Ｘ−Ａ−ＳＵＭＯ、Ｙ−Ａ−ＳＵＭＯあるいはＺ−Ａ−ＳＵＭＯをコードするＤＮＡを同一又は異なる発現ベクターに組み込んで組み換え発現ベクターを作製し、それを宿主に導入して発現させることにより行なうことができる。形質転換宿主内に最初からＸ−Ａ−ＳＵＭＯ、Ｙ−Ａ−ＳＵＭＯ及び／又はＺ−Ａ−ＳＵＭＯを発現させるとランダムなポリマーが得られ、最初にＸ−Ａ−ＳＵＭＯ又はＹ−Ａ−ＳＵＭＯ又はＺ−Ａ−ＳＵＭＯのいずれかを発現させ、次いで他の構成単位を順次発現させていくとブロック的なポリマーを製造することができる。
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
【実施例】（実施例１）ＳＵＭＯ−目的タンパク質融合体を構成単位とするタンパク質ポリマーの製造
（１）ＳＵＭＯ−目的タンパク質融合体の作製
ＧＳＴ（グルタチオン結合蛋白質：２７ｋＤａ）、及びＳＵＭＯをコードするＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲを用いて合成し、発現ベクター、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシア）に連結した（図２）。組換えプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉから抽出物を調製し、グルタチオン結合カラムにのせ、リン酸緩衝液生理食塩水で平衡化した。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、ＧＳＴ−ＳＵＭＯ融合体を２０ｍＭ還元型グルタチオンを含む同じ緩衝液で溶出し、セファデックスＧ−７５カラムでゲル濾過させた。
（２）ＳＵＭＯ−目的タンパク質融合体のポリマー化
上記で得られたＧＳＴ−ＳＵＭＯ融合体は約５０ｋＤａであった。このＧＳＴ−ＳＵＭＯ融合体０．２μｇを、０．０２μｇＥ１、０．０２μｇＥ２、５ｍＭ  ＡＴＰの存在下、２０μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中で３７℃にて１０分間反応させた。反応産物をＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で分離した後、タンパク質をニトロセルロース膜に移行させ、ＧＳＴ抗体によりＧＳＴ−ＳＵＭＯを検出したところ、階段状のバンドが高分子領域に向かって複数検出された（図３）。このバンドは約５０ｋＤａの間隔で存在しており、この分子量の差はＧＳＴ−ＳＵＭＯの１分子にほぼ一致するものであった。このことから、階段状のバンドは、ＧＳＴ−ＳＵＭＯ分子（ｎ＝１）のＣ末端が別のＧＳＴ−ＳＵＭＯ分子内のリジン残基にイソペプチド結合し（ｎ＝２）、さらにこの反応が２回（ｎ＝３）、３回（ｎ＝４）と繰り返した反応産物と考えられた。すなわち、この反応によって、ＧＳＴ−ＳＵＭＯの繰り返し構造を有する新規の蛋白質ポリマーが合成したことが示された。この反応条件下においては、ｎ＝４程度のポリマーの合成が可能であることが示された。
（実施例２）ＳＵＭＯ−アクセプター−目的タンパク質融合体を構成単位とするタンパク質ポリマーの製造
（１）目的タンパク質（ＧＳＴ）−アクセプター（Ｃ２）−ＳＵＭＯ融合体の作製
アクセプターとしてＣ２と呼ばれるＲａｎＧＡＰ１（ＲａｎＧＴＰａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）のＣ末端領域を選択した。ＲａｎＧＡＰ１は低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｎの加水分解を促進する活性を持つタンパク質で、核−細胞質間の物質輸送に関わる。Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体を得るために、Ｃ２、及びＳＵＭＯをコードするＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲを用いて合成し、発現ベクター、ｐＥＴ２８（ノバジェン）に連結した（図４）。組換えプラスミドで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から抽出物を調製し、Ｎｉ（ニッケル）カラムにのせ、リン酸緩衝液生理食塩水で平衡化した。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体を２５０ｍＭイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶出し、セファデックスＧ−７５カラムでゲル濾過させた。
上記で得られたＣ２−ＳＵＭＯ融合体、及びＧＳＴ（グルタチオン結合蛋白質：２７ｋＤａ）、をコードするＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲを用いて合成し、発現ベクター、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシア）に連結した（図５）。組換えプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉから抽出物を調製し、グルタチオン結合カラムにのせ、リン酸緩衝液生理食塩水で平衡化した。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体を２０ｍＭ還元型グルタチオンを含む同じ緩衝液で溶出し、セファデックスＧ−７５カラムでゲル濾過させた。
（２）目的タンパク質（ＧＳＴ）−アクセプター（Ｃ２）−ＳＵＭＯ融合体のポリマー化
上記で得られたＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体は約６０ｋＤａであった。ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体０．２μｇを、０．１μｇＥ１、０．１μｇＥ２、５ｍＭ  ＡＴＰの存在下、２０μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中で３７℃にて１０分間反応させた。反応産物をＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、階段状のバンドが高分子領域に向かって複数検出された（図６）。このバンドは約６０ｋＤａの間隔で存在しており、この分子量の差はＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯの１分子にほぼ一致するものであった。このことから、階段状のバンドは、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ分子（ｎ＝１）のＣ末端が別のＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ分子のＣ２配列内のアクセプターリジン残基にイソペプチド結合し（ｎ＝２）、さらにこの反応が２回（ｎ＝３）、３回（ｎ＝４）と繰り返した反応産物と考えられた。この反応条件下においては、ｎ＝１１程度のポリマーの合成が可能であることが示された。
（実施例３）ＳＵＭＯとアクセプターとの結合体の生産
（１）Ｅ１およびＥ２酵素を発現する発現ベクターの構築
マウスＡｏｓ１及びＵｂａ２のｃＤＮＡをクローニングするために、先ず、ＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）検索を行い、マウスＡｏｓ１とＵｂａ２のｃＤＮＡを見出した（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号：ＮＭ−０１９７４８（マウスＡｏｓ１）及びＮＭ−０１６６８２（マウスＵｂａ２））。Ａｏｓ１とＵｂａ２のコード領域を、鋳型としてＢＡＬＢ／ＭＫマウス上皮ケラチノサイトｃＤＮＡライブラリーを使用し、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅した。
2004031243.tif 000009
2004031243.tif 000010
増幅したＰＣＲ断片をｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、得られたプラスミド構築物をそれぞれｐＧＥＸ−Ａｏｓ１及びｐＧＥＸ−Ｕｂａ２と命名した。Ｍｏｕｓｅ  Ａｏｓ１  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示し、Ｍｏｕｓｅ  Ｕｂａ２の塩基配列を配列番号６に示す。
Ａｏｓ１−Ｕｂａ２キメラ構築物を作製するために、Ａｏｓ１及びＵｂａ２を以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅した。
2004031243.tif 000011
増幅した断片をＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩでそれぞれ切断し、ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＩで消化ｐＧＥＸベクターに挿入した。得られたプレスミドｐＧＥＸ−ＡＵはＧＳＴ−Ａｏｓ１−Ｕｂａ２融合タンパク質をコードしている。マウスＡＵ  ｃＤＮＡの塩基配列を（ＧＡＡＴＴＣはＡｏｓ１とＵｂａ２の結合領域）を配列番号７に示す。
Ｘｅｎｏｐｕｓ（アフリカツメガエル）のＵｂｃ９（塩基配列を配列番号８に示す）をクローニングしｐＴ７−７ｖｅｃｔｏｒに挿入した（Ｓａｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ９４，３７３６−３７４１，１９９７）。ちなみに、アフリカツメガエルのＵｂｃ９のアミノ酸配列はヒトおよびマウスのＵｂｃ９のアミノ酸配列と１００％相同である。以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
2004031243.tif 000012
増幅したＤＮＡ断片をＮＨｅＩで切断後、ＸｈｏＩで処理したｐＧＥＸ−ＡＵとライゲーションした。作製されたプラスミドを解析したところ、図８に示すように、それぞれの配列がＮ末端からＣ末端に向かう形で順向きにタンデムに並ぶ構造をしていた。このプラスミドベクターをＰＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９と名付けた。ＧＳＴ−ＡＵタンパク質はｔａｃプロモーターの、Ｕｂｃ９はＴ７プロモーターの制御を受け、ＩＰＴＧにより誘導される。
（２）Ｔ７−ｄｏｍａｉｎ−ＳＵＭＯ−１を発現する発現ベクターのｐＴ−ＳＵＭＯ−１／Ｃ２プラスミドベクターの作製
ｈｕｍａｎ  ＳＵＭＯ−１  ｃＤＮＡ（塩基配列を配列番号９に記載する）と以下のプライマーを用いて、Ｔ７−ＳＵＭＯ−１をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。このタンパク質はＴ７−ｔａｇ配列（ｍｅｔ−ａｌａ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｎ−ｇｌｎ）（配列番号２０）がＳＵＭＯ−１のＮ末端にある融合タンパク質である。
2004031243.tif 000013
増幅断片をＮｄｅＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、同じくＮｄｅＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩで処理したｐＴ−Ｔｒｘ（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．＆  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４，１１４１−１１５６，１９７８；Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５３２８−２５３３１，１９９５）とライゲーションする。得られたプラスミドをｐＴ−Ｔ７−ＳＵＭＯ−１と呼ぶ。
アクセプターとしてＣ２と呼ばれるＲａｎＧＡＰ１（ＲａｎＧＴＰａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）のＣ末端領域を選択した。ＲａｎＧＡＰ１は低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｎの加水分解を促進する活性を持つタンパク質で、核−細胞質間の物質輸送に関わる。Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体を得るために、Ｃ２、及びＳＵＭＯをコードするＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲを用いて合成し、発現ベクターｐＥＴ２８（ノバジェン）に連結した。このプラスミドベクターをｐＥＴ２８−Ｈｉｓ−Ｃ２と称する。このプラスミドはＨｉｓ−Ｃ２融合タンパク質をコードしている。Ｃ２配列のＮ末端上流に以下の配列が融合している。
2004031243.tif 000014
このプラスミドを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
2004031243.tif 000015
増幅断片をＢｇｌＩＩで切断後、同じくＢｇｌＩＩで処理した上述のｐＴ−Ｔ７−ＳＵＭＯ−１とライゲーションした。得られたプラスミドｐＴ−ＳＵＭＯ−１／Ｃ２は、Ｔ７プロモターをＩＰＴＧで誘導することで、Ｈｉｓ−Ｃ２とＴ７−ＳＵＭＯ−１の２種類の融合タンパク質を同時に発現するようにデザインされている。
（３）大腸菌での発現とタンパク質の部分精製
上述のｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２を同時に大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入する。２つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフェニコールの両方を含む培地で選別できる。これとは独立に、ｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２のみを導入したものをクロランフェニコール培地で選別する。
それぞれの培地で得られたコロニーを別個のＬＢ液体培地１Ｌで３７℃で１６時間震盪培養する。０．０２ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、２５℃でさらに１６時間震盪培養する。
菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、１０ｍｌのＰＢＳバッファーに懸濁した後、超音波処理により菌体を破砕する。遠心分離の後、上澄み液を取り出し、ニッケルアガロースビーズ１ｍｌと１時間４℃でインキュベーションする。ビーズをＰＢＳで洗浄後、２５０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳでビーズに結合したタンパク質を溶出する。タンパク質は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン法で解析する。
図１０のレーン１にはｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２を同時に大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入したもの、レーン２にはｐＴ−ＳＵＭＯ／Ｃ２を導入したものを示してある。前者では４０ｋｄａのタンパク質が、後者では２５ｋｄａのタンパク質がクマシ−ブル−染色で明瞭に観察される。前者のバンドはＨｉｓ抗体およびＳＵＭＯ−１抗体に反応性を示すが、後者はＨｉｓ抗体のみに反応性がある。４０ｋｄａタンパク質は１Ｌの培養から約０．２ｍｇ得ることができる。
これらの結果は、前者において、Ｔ７−ｄｏｍａｉｎ−ＳＵＭＯ−１とＨｉｓ−ｄｏｍａｉｎ−Ｃ２のコンジュゲイトが大腸菌体内で大量に生産されたことを示している。
（実施例４）ＳＵＭＯとアクセプターを構成単位とするポリマーの生産
（１）ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１を発現するｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１プラスミドベクターの作製
Ｃ２−ＳＵＭＯ融合体、及びＧＳＴ（グルタチオン結合蛋白質：２７ｋＤａ）、をコードするＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲを用いて合成し、発現ベクターｐＧＥＸ（アマシャムファルマシア）に連結した。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１と称する。このｐＧＥＸ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１を鋳型ＤＮＡとして、以下のプライマーを用いてＰＣＲで、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１の断片を増幅した。
2004031243.tif 000016
増幅断片をＮｏｔＩで切断後、同じくＮｏｔＩで処理したｐＴ−Ｔｒｘ（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．＆  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４，１１４１−１１５６，１９７８；Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５３２８−２５３３１，１９９５）とライゲーションする。得られたプラスミドｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯ−１は、Ｔ７プロモーターをＩＰＴＧで誘導することで、ＧＳＴとＣ２とＳＵＭＯ−１の融合タンパク質を発現するようにデザインされている。
（２）大腸菌での発現とタンパク質の部分精製
上述のｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯを同時に大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入する。２つのプラスミドを同時に取り込んだ菌体はアンピシリンとクロランフェニコールの両方を含む培地で選別できる。これとは独立に、ｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯのみを導入したものをクロランフェニコール培地で選別する。
それぞれの培地で得られたコロニーを別個のＬＢ液体培地１Ｌで３７℃で１６時間震盪培養する。０．０２ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、２５℃でさらに６時間または１２時間震盪培養する。
菌体を遠心分離器で沈澱させ、その後、１０ｍｌのＰＢＳバッファーにけんだく後、超音波処理により菌体を破砕する。遠心分離の後、上澄み液を取り出し、グルタチオンセファロースビーズ１ｍｌと１時間４℃でインキュベーションする。ビーズをＰＢＳで洗浄後、２０ｍＭグルタチオンを含むＰＢＳでビーズに結合したタンパク質を溶出する。タンパク質は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン法で解析する。
図１３のレーン１にはｐＧＥＸ−ＡＵ／Ｕｂｃ９およびｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯを同時に大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入し１２時間発現誘導したもの、レーン２には６時間発現誘導したものを示してある。コントロールとして、レーン３にはｐＴ−ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯのみを１２時間誘導発現したものを示してある。レーン１および２では約６０ｋｄａの階段状のバンドがクマシ−ブル−染色で明瞭に観察されるが、レーン３ではこれらが認められない。前者のバンドはＳＵＭＯ−１抗体に反応性を示すことから、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯがポリマー化したバンドであると考えられる。こうしたタンパク質は１Ｌの培養から約０．１ｍｇ得ることができる。以上の結果は、ＧＳＴ−Ｃ２−ＳＵＭＯポリマーが大腸菌体内で大量に生産されたことを示している。
（実施例５）各種アクセプター配列を用いた解析
アクセプター配列Ｃ２に加えて、Ｔｈｙｍｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＴＤＧ），ＴＯＮＡＳ１，ＲａｎＢＰ２−ＩＲのアクセプター配列としての性質を解析した。即ち、ＴＤＧ（Ｔｈｙｍｉｎｅ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）（アミノ酸配列は配列番号２８に示す）、ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  Ｒａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）（アミノ酸配列は配列番号２９に示す）、ＴＯＮＡＳ（Ｔｏｎａｌｌｉ  ｒｅｌａｔｅｄ  ＳＰ−ｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（アミノ酸配列は配列番号３０に示す）をＧＳＴのＣ末端に結合した形の融合タンパク質（ＧＳＴ−ＴＤＧ，ＧＳＴ−ＢＰ２−ＩＲ，ＧＳＴ−ＴＯＮＡＳ）をＳＵＭＯ酵素Ｅ１およびＥ２，ＡＴＰ，ＳＵＭＯ−１と３０℃で３０分反応させた。コントロールとして酵素を加えずに反応させた。反応後ＧＳＴビーズを加えて反応物を精製し、電気泳動に供し、染色し、タンパク質を検出した。結果を図１４に示す。具体的には以下の通り行った。
（１）ＧＳＴ−ＴＤＧ
ＧＳＴ−ＴＤＧ（７０ｋＤａ）１μｇを１μｇ  ＳＵＭＯ−１、１μｇ  Ｅ１、１μｇ  Ｅ２、５ｍＭ  ＡＴＰ存在下、１００μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中で３０℃にて３０分間反応させた。反応後、反応溶液中に３０μｌのグルタチオンビーズを加え、室温にて３０分間反応させた。ビーズに結合した蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、９０ｋＤａの位置にバンドが確認された（図１４のＡ）。このバンドと反応前のＧＳＴ−ＴＤＧの分子量の差は約２０ｋＤａで一分子のＳＵＭＯ−１にほぼ一致するものであった。このことから、ＴＤＧはＣ２と同様に１分子のＳＵＭＯ−１を結合するアクセプターと考えられる。
（２）ＧＳＴ−ＲａｎＢＰ２−ＩＲ
ＧＳＴ−ＲａｎＢＰ２−ＩＲ（７０ｋＤａ）１μｇを１μｇ  ＳＵＭＯ−１、１μｇ  Ｅ１、１μｇ  Ｅ２、５ｍＭ  ＡＴＰ存在下、１００μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中で３０℃にて３０分間反応させた。反応後、反応溶液中に３０μｌのグルタチオンビーズを加え、室温にて３０分間反応させた。ビーズに結合した蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、階段状にバンドが確認された（図１４のＢ）。このことから、ＲａｎＢＰ２−ＩＲは複数分子のＳＵＭＯ−１を結合するアクセプターと考えられる。このアクセプターは枝分かれタイプあるいは積層タイプのポリマーを構築する可能性が高い。
（３）ＧＳＴ−ＴＯＮＡＳ１ｄｅｌｔａ
ＧＳＴ−ＴＯＮＡＳ１ｄｅｌｔａ（６０ｋＤａ）１μｇを１μｇ  ＳＵＭＯ−１、１μｇ  Ｅ１、１μｇ  Ｅ２、５ｍＭ  ＡＴＰ存在下、１００μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＤＴＴ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２溶液中で３０℃にて３０分間反応させた。反応後、反応溶液中に３０μｌのグルタチオンビーズを加え、室温にて３０分間反応させた。ビーズに結合した蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル電気泳動で解析したところ、階段状にバンドが確認された（図１４のＣ）。このことから、ＴＯＮＡＳは複数分子のＳＵＭＯ−１を結合するアクセプターと考えられる。このアクセプターは枝分かれタイプあるいは積層タイプのポリマーを構築する可能性が高い。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、複数種のタンパク質の導入も可能で、多様な生理活性や酵素活性を発揮しうるタンパク質ポリマーが提供される。本発明のタンパク質ポリマーは、バイオリアクター、バイオセンサー等に利用すれば有用タンパク質の生産、微量化学物質の認識を効率的に行うことができ、食品製造、医薬品製造分野等において有用である。また、本発明のタンパク質ポリマーは、免疫、情報伝達、神経伝達、癌細胞の増殖などの各種の生体機構に関与する分子の機能解明や制御など、分子生物学全般の基礎研究、あるいは再生医療・癌治療に応用できる。さらに本発明によれば、タンパク質コンジュゲイトやタンパク質ポリマーを細菌などの宿主細胞において大量に生産できる系を提供することが可能になる。
本願が主張する優先権の基礎となる日本特許出願である特願２００２−２８８５６６号及び特願２００３−６４７１３号に記載の内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用により取り込まれるものとする。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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