(57)【要約】高等植物の光合成関連タンパク質（ＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質）の生産を促進することを特徴とする強光ストレス、高塩濃度ストレス、高浸透圧ストレス、低温等の環境ストレスに対する耐性を高める方法、その方法を用いて得られる環境ストレスに対する耐性の高い植物、及びその方法を用いる環境ストレスに対する耐性の高い植物の製造方法に関する。本発明によれば、植物の光合成機能へのダメージが回復され、強光、高塩濃度、高浸透圧（乾燥）、低温等の環境ストレスに対することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高等植物の光合成関連タンパク質の生産を促進することを特徴とする植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項２】
高等植物の光合成関連タンパク質がＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質である請求の範囲１に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項３】
ｓｉｇ５構成遺伝子を生育中に発現させる請求の範囲１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項４】
遺伝子変換法により、ｓｉｇ５構成遺伝子を強く発現する転写調節領域の下流にｓｉｇ５遺伝子を連結して、植物体に組み込むことによりｓｉｇ５構成遺伝子を生育中に発現させる請求の範囲１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項５】
遺伝子変換法により、ｓｉｇ５遺伝子が環境ストレスで強力な誘導を受けるプロモーターの下流にｓｉｇ５遺伝子を連結して、Ｔ−ＤＮＡを介したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による形質転換法によりｓｉｇ５遺伝子を植物体に導入する請求の範囲１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項６】
環境ストレスが強光ストレスである請求の範囲１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項７】
環境ストレスが高塩濃度ストレスである請求の範囲１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項８】
環境ストレスが高浸透圧ストレスである請求の範囲１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項９】
環境ストレスが低温ストレスである請求の範囲１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
【請求項１０】
請求の範囲１乃至９のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法を用いることにより得られる環境ストレスに対する耐性の高い植物。
【請求項１１】
請求の範囲１乃至９のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法を用いることを特徴とする環境ストレスに対する耐性の高い植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、環境ストレス（強光、高塩濃度、高浸透圧、低温など）に対する植物の耐性を高め、種々の条件下で、食用、観賞用等の有用植物を育成することを可能とする技術に関する。
【背景技術】  乾燥、高温、低温または塩などの様々な環境ストレスは、植物の生育を悪化させ、作物植物の収穫量を低下させたり枯死を引き起こす主たる原因である。植物は進化の過程で様々なストレス耐性機構を獲得してきた。例えば、低温耐性植物（シロイヌナズナ、ホウレンソウ、レタス、エンドウ、オオムギ、テンサイなど）は、低温感受性植物（トウモロコシ、イネ、カボチャ、キュウリ、バナナ、トマトなど）よりも、生体膜脂質中の不飽和脂肪酸の含有割合が低く、そのため低温に曝されても生体膜脂質の相転移が起こりにくく、低温障害が生じにくい。これらは植物の長い進化における環境適応であるが、植物の生育に不利な環境（低温地域、乾燥地域など）で作物植物を栽培したり、緑化による砂漠化の防止を行う必要の高まりから、自然な環境適応力を超える環境耐性植物を作出することが強く望まれていた。
植物改良においては、古典的には系統の選抜や交配などの手法が用いられてきたが、選抜法には多くの時間が必要であり、一方、交配法は限られた種間にしか用いることができないため、高い環境ストレス耐性を有する植物の作出は困難であった。しかし、近年の遺伝子工学の進歩に伴い、植物に特定の遺伝子を導入し、発現させる技術などの手法を用いて、乾燥、低温、塩などに耐性の植物の作出が試みられている。
これまでに、環境ストレス耐性植物の作出に用いられた遺伝子としては、浸透圧調節物質（マンニトール、プロリン、グリシンベタインなど）の合成酵素遺伝子や細胞膜脂質の修飾酵素遺伝子などが挙げられる。具体的には、マンニトール合成酵素遺伝子としては大腸菌由来マンニトール１−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９巻，１９９３年，５０８−５１０頁）、プロリン合成酵素遺伝子としては豆由来Δ１−プロリン−５−カルボキシレートシンテターゼ遺伝子（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０８巻，１９９５，１３８７−１３９４頁）、グリシンベタイン合成酵素遺伝子としては細菌由来コリンデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１２巻，１９９７年，１３３４−１３４２頁）、細胞膜脂質修飾遺伝子としてはシロイヌナズナ由来ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０５巻，１９９４年６０１−６０５頁）やラン藻のΔ９不飽和化酵素遺伝子（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４巻，１９９６年，１００３−１００６頁）が用いられている。しかし、これらの遺伝子の導入植物は、ストレス耐性度が不安定であったり、耐性レベルが低い等の問題から実用化に至ったものは存在しない。
さらに、近年では、乾燥、低温、または塩ストレス耐性の獲得には、複数の遺伝子が働き、その結果、植物はストレス耐性になることが報告されている（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１１５巻，１９９７年，３２７−３３４頁）。そこで、ストレス耐性の獲得に関与する複数の遺伝子の発現を同時に活性化することができる転写因子をコードする遺伝子が植物に導入され、ストレス耐性度の高い植物が作出されている（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１０巻，１９９８年，１−１７頁）。しかし、このように複数の遺伝子の発現を誘導する遺伝子を導入した場合、複数の遺伝子が同時期に活性化されるため、宿主植物のエネルギーは、該遺伝子産物の生成や、該遺伝子産物に起因する細胞内代謝に向けられ、宿主植物は、成長が遅れたり矮化してしまうことが多い。この課題を解決すべく、特定のストレス刺激に応答して発現するストレス応答性プロモーターの下流に、ストレス応答性エレメントに結合し該エレメント下流の遺伝子の転写を制御するタンパク質をコードするＤＮＡが連結された遺伝子を含む、環境ストレス（乾燥ストレス、低温ストレス、塩ストレスなど）に対する耐性が向上し、かつ矮化の起こらないトランスジェニック植物を作出することも報告されている（特開２０００−１１６２５９号公報）。また、植物に導入すると環境ストレス耐性が向上する新たな遺伝子も発見されている（米国特許出願公開第２００２／０１０２６９５号明細書）。
しかしながら、植物生存の根源である光合成系への環境ストレスによるダメージを積極的に改善する方法はこれまで知られていない。
環境ストレスが光合成系に与えるダメージのうち、最も環境ストレスによってダメージを受けるのは、光合成系で最も弱いたんぱく質であるＰＳＩＩ活性中心Ｄ２たんぱく質であることが知られている。
一方、ｓｉｇ５（古くはｓｉｇＥと呼ばれていた。）という遺伝子はＰＳＩＩ活性中心の生産制御を担うことが推定され、ｓｉｇ５は青色光で発現することが知られているが（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，５１６巻，２００２年，２２５−２２８頁）、本発明でいう環境ストレス（強光、高塩濃度、低温等）で発現すること、及びＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質が環境ストレスに応答して生産されることは知られておらず、光合成系への環境ストレスによるダメージを修復機能促進という方法で解決し得ることは、この２点が発見されるまでは予想し得ないことであった。
【発明の開示】
本発明は、植物の強光、高塩濃度、高浸透圧（乾燥）、低温等の環境ストレスに対する耐性を、これらのストレスの光合成機能へのダメージを積極的に回復するという新たな機構により高める方法を提供することを一つの課題とし、またその方法により、一般的に環境ストレス耐性の高い植物を得る方法を提供することを他の課題とする。
本発明者らは、ｓｉｇ５が、強光、高塩濃度、高浸透圧（乾燥）、低温等の環境ストレスにより発現誘導されることを発見した。さらに、光合成系で最も弱いたんぱく質であるＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質が強光、高塩濃度、高浸透圧（乾燥）、低温等の環境ストレスにより生産促進されることを発見した。このことから、ｓｉｇ５が光合成系の環境ストレス応答のキー因子であることを突き止め、この機能をより増強すること、すなわち環境ストレスによる光合成系へのダメージの早期回復を図ることで光合成系の環境ストレス耐性を獲得し得ることを発見した。これらの知見に基づきｓｉｇ５を環境ストレスがかからなくとも高発現させるようにするか、刺激に対してより高発現させるようにするかにより植物の環境ストレス耐性を高めることができ、環境ストレス耐性の高い植物を得ることができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は下記の事項からなる。
１．高等植物の光合成関連タンパク質の生産を促進することを特徴とする植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
２．高等植物の光合成関連タンパク質がＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質である前項１に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
３．ｓｉｇ５構成遺伝子を生育中に発現させる前項１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
４．遺伝子変換法により、ｓｉｇ５構成遺伝子を強く発現する転写調節領域の下流にｓｉｇ５遺伝子を連結して、植物体に組み込むことによりｓｉｇ５構成遺伝子を生育中に発現させる前項１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
５．遺伝子変換法により、ｓｉｇ５遺伝子が環境ストレスで強力な誘導を受けるプロモーターの下流にｓｉｇ５遺伝子を連結して、Ｔ−ＤＮＡを介したアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による形質転換法によりｓｉｇ５遺伝子を植物体に導入する前項１または２に記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
６．環境ストレスが強光ストレスである前項１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
７．環境ストレスが高塩濃度ストレスである前項１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
８．環境ストレスが高浸透圧ストレスである前項１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
９．環境ストレスが低温ストレスである前項１乃至５のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法。
１０．前項１乃至９のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法を用いることにより得られる環境ストレスに対する耐性の高い植物。
１１．前項１乃至９のいずれかに記載の植物の環境ストレスに対する耐性を高める方法を用いることを特徴とする環境ストレスに対する耐性の高い植物の製造方法。
以下、本発明について詳細に説明する。
σ因子は、ＤＮＡ依存型のＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ合成を受け持つ酵素部分（コア酵素）に結合して、ゲノム上のプロモーターの認識・転写開始を行う因子である。σ因子があって始めてたんぱく質生産の最初の段階であるＤＮＡ→ＲＮＡへの転写が行われる。σ因子は各種の遺伝子の発現を転写の段階で制御しているたんぱく質群である。
葉緑体は光合成を行う細胞内小器官として知られ、独自のゲノムと遺伝子発現系を持っている。葉緑体ゲノム上には真性細菌型ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＥＰ）がコードされており、主として光合成関連遺伝子の発現に関わっている。このＰＥＰのコア酵素サブユニットにプロモーター認識特異性を与えるσ因子の遺伝子は核染色体に存在する。
この葉緑体ＰＥＰに結合するσ因子は６種（ｓｉｇ１〜ｓｉｇ６、古くはｓｉｇＡ〜ｓｉｇＦと呼ばれていた。）存在することが明らかになっている。σ因子は生物間で保存性が高く、植物（シロイヌナズナ）で発見された６種は、他の高等植物でもほぼ同じであり、その機能も同じであろうと推定される。
σ因子の機能は一部明らかにされつつあるが、本出願対象であるｓｉｇ５の機能はほとんど知られていなかった。
ｓｉｇ５は、植物（シロイヌナズナ）で発見された６種σ因子のうちの一つであるが、本発明者らは、この遺伝子が強光、高塩濃度（高浸透圧）、低温など植物にとってストレスとなる環境刺激で、高発現することを発見した。
同じく、環境ストレスによってダメージを受けやすいたんぱく質（ＰＳＩＩ活性中心）の遺伝子発現も、環境ストレスによって促進されることを発見した。
ｓｉｇ５の高発現の結果、光合成関連遺伝子のうちＰＳＩＩ活性中心の遺伝子発現が促進されることが証明された。この作用によりストレスによりダメージを受けた光合成経路を修復することで環境耐性を獲得する働きをしていることを発見した。
すなわち、ｓｉｇ５を環境刺激の有無に関わらず常に高発現するような改変を施すことにより、環境ストレスに対して本質的に耐性の高い植物を作出することができる。
σ因子の機能が高等植物に共通していることから、本発明による耐ストレス植物の作出原理は高等植物一般に適用できる。
一般的なｓｉｇ５の発現方法及び遺伝子変換方法等について説明する。
本発明において環境ストレスとは植物体に何らかの障害をもたらすストレスを意味し、光や酸素といった通常の植物生育環境に存在するものをも含む。
本発明において、強光とは自然環境に存在するもので、植物に障害を与える光を意味し、植物の種類により異なるが、例えば、ある植物の通常生育環境の２倍以上の光量、すなわち、通常２５μＥ／ｍ２・ｓの光量で十分生育する植物にとっては５０μＥ／ｍ２・ｓ以上（マイクロアインシュタイン／平米・秒）である。
本発明において、高塩濃度とは、植物に障害を与える塩濃度を意味し、植物の種類により異なるが、ある植物の通常生育環境より高い濃度であれば制限は無い。
本発明において、低温とは植物に障害を与える低い温度を意味し、例えば、ある植物が通常生育する環境より１０℃以上低い温度である。
本発明において用いられるｓｉｇ５遺伝子は、登録番号ＡＢ０２１１２０として、遺伝子番号に登録されている。化学合成によって、または本遺伝子のｃＤＮＡないしゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、ｓｉｇ５遺伝子を得ることができる。
ｓｉｇ５遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる程度に類似したｓｉｇ５も、当該ＤＮＡがコードするタンパク質がＰＥＰに結合してＲＮＡポリメラーゼを活性化する機能を有する限り、本発明に用いることができる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ホルムアミド濃度が３０〜５０％、好ましくは５０％であり、温度が３７〜５０℃、好ましくは４２℃での条件をいう。
ｓｉｇ５遺伝子を遺伝子工学的手法を用いて植物宿主に導入することにより、環境ストレス、特に強光、光塩濃度、高浸透圧（乾燥）、低温ストレスなどに対して抵抗性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。遺伝子の植物宿主への導入方法としては、アグロバクテリウム感染法などの間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などの直接導入法などが挙げられる。アグロバクテリウム感染法を用いる場合は、以下のようにしてトランスジェニック植物を作製することができる。
（１）植物導入用組換えベクターの作製及びアグロバクテリウムの形質転換
植物導入用組換えベクターは、前記ｓｉｇ５を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入することにより得ることができる。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合は、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・チュメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入用に用いる。
上記の方法以外にも、本発明においては、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によってｓｉｇ５遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば、ｐＲＫ２０１３など）を保有する大腸菌、及びアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシン及びカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
ｓｉｇ５遺伝子は、葉緑体ＰＥＰを活性化し、光合成系で最も弱いたんぱく質であるＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質の生産速度を高める。ｓｉｇ５は葉緑体中でＰＳＩＩ活性中心Ｄ２タンパク質をはじめとする特定の遺伝子の発現制御を行っている因子であるため、不特定多数の遺伝子が活性化され、それに伴うエネルギー消費の増大や代謝の活性化により植物自身の生育が抑制されることはない。しかし、環境ストレスとなる刺激を受けた際にのみ発現し、ｓｉｇ５遺伝子をストレス応答性プロモーターの下流に連結することが考えられる。そのようなプロモーターとしては、例えば、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６，２５１−２６４（１９９４））、ｒｄ２９Ｂ遺伝子プロモーター（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，６，２５１−２６４（１９９４））、ｒｄ１７遺伝子プロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１５，１２８７（１９９７））、ｒｄ２２遺伝子プロモーター（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４７，３９１−３９８（１９９５））、ＤＲＥＢ１Ａ遺伝子プロモーター（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，２５０，１６１−１７０（１９９８））、ｃｏｒ６．６遺伝子プロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８，６１９−６３４（１９９５））、ｃｏｒ１５ａ遺伝子プロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４，７０１−７１３（１９９４））、ｅｒｄ１遺伝子プロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１２，８５１−８６１（１９９７））、ｋｉｎ１遺伝子プロモーター（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８，６０５−６１７（１９９５））等がある。これらのプロモーターは、該プロモーターを含むＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅反応によって得ることができる。
また、必要に応じて転写終結を指令するターミネーターをＤＲＥＢ遺伝子の下流に連結することもできる。ターミネーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子ターミネーターなどが挙げられる。但し、これに限定されるものではなく、植物体内で機能することが知られているターミネーターであればよい。
また、必要に応じてプロモーター配列とｓｉｇ５遺伝子の間に、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列、例えばトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ１）のイントロン（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１，１１８３−１２００（１９８７））を導入することができる。
さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子をｓｉｇ５遺伝子と併用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。ｓｉｇ５遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
（２）植物宿主へのｓｉｇ５遺伝子の導入
本発明において、植物宿主とは、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、種子等）、または植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）のいずれをも意味するものである。植物宿主として用いることができる植物としては、シロイヌナズナ、タバコ、イネ、トウモロコシなどが挙げられる。ｓｉｇ５遺伝子は、採取した植物切片にｓｉｇ５遺伝子を含むベクターをアグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、またはポリエチレングリコール法などで、上記植物宿主に導入することができる。あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法によりｓｉｇ５遺伝子を含むベクターを導入することもできる。
アグロバクテリウム感染法により遺伝子を導入する場合は、目的の遺伝子を含むプラスミドを保有するアグロバクテリウムを植物宿主に感染させる工程が必要である。この工程は、バキュームインフィルトレーション法（ＣＲ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６，１１９４（１９９３））により行うことができる。すなわち、ｓｉｇ５遺伝子を含むプラスミドを含むアグロバクテリウムの培養液に直接植物宿主を浸し、これをデシケーターに入れバキュームポンプで６５〜７０ｍｍＨｇになるまで吸引後、５〜１０分間、室温に放置する。鉢をトレーに移しラップで覆い湿度を保つ。翌日ラップを取り、植物をそのまま生育させ種子を収穫する。
次いで、目的遺伝子保有個体を選択するために、様々な株由来の種子を適切な抗生物質を加えたＭＳ寒天培地に播種する。この培地で生育した植物を鉢に移し、生育させることにより、本発明に用いる遺伝子が導入されたトランスジェニック植物を得ることができる。
一般に、植物に導入した遺伝子は、宿主植物のゲノム中に組み込まれるが、その場合、導入されるゲノム上での位置が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。導入遺伝子がより強く発現している形質転換体は、導入遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして用いるノーザン法により宿主植物中に発現しているｍＲＮＡレベルを検定することによって選抜することができる。
本発明に用いる遺伝子を導入したトランスジェニック植物及びその次世代に目的の遺伝子が組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、公知のＰＣＲ法またはサザン分析を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
（３）ｓｉｇ５遺伝子の植物組織での発現レベル及び発現部位の分析
ｓｉｇ５遺伝子を導入したトランスジェニック植物における該遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、公知のＲＴ−ＰＣＲ法またはノーザン分析を用いてｓｉｇ５遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。
（４）ｓｉｇ５遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体内における各種遺伝子のｍＲＮＡレベルの変化
ｓｉｇ５遺伝子が導入されたトランスジェニック植物体内において、ｓｉｇ５の作用により、発現レベルが変化したと考えられる遺伝子はノーザン分析によって同定することができる。ノーザン分析においては、ｓｉｇ５遺伝子が導入されたトランスジェニック植物と導入されていない植物とを用いて、標的遺伝子と考えられる遺伝子のｍＲＮＡレベルを常法に従って、比較することによって検定することができる。
例えば、ＧＭ寒天培地などで育てた植物に、所定期間（例えば、１〜２週間）の環境ストレスを与える。このとき、強光ストレスは５０μＥ／ｍ２・ｓ（マイクロアインシュタイン／平米・秒）、好ましくは５００μＥ／ｍ２・ｓの強度の光を照射することで与えることができる。高塩濃度ストレスは、通常のＭＳ培地に、２５０ｍＭの塩化ナトリウムを添加することで与えることができる。高浸透圧ストレスは、通常のＭＳ培地に、２５０ｍＭのマンニトールを添加することで与えることができる。一方、低温ストレスの負荷は、１５℃〜−４℃、好ましくは４℃に１０分〜２４時間保持することにより与えることができる。ストレスを与えないコントロール植物とストレスを与えた植物から全ＲＮＡを調製して電気泳動を行い、ノーザン分析またはＲＴ−ＰＣＲによって発現している遺伝子を検定する。
（５）トランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性の評価
ｓｉｇ５遺伝子を導入したトランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性は、バーミキュライト、パーライトなどを含む土を入れた植木鉢にトランスジェニック植物を植え、強光、高塩濃度、高浸透圧、低温などの各種ストレスを負荷した場合の生存と葉の色調を調べることによって評価することができる。ストレスによって光合成系に異常を来たした場合、葉色の緑が明らかに薄く変化する。例えば、強光ストレスに対する耐性は、２〜４週間、強光下でその生存を調べることにより、また低温ストレスに対する耐性は、４℃に、５〜１０日間置いた後、５〜１０日間、２０〜２５℃で生育させることにより評価することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例２の方法に従い、塩ストレスを負荷した植物体中のｓｉｇ５及びｐｓｂＤの発現を解析した結果を、塩ストレスを負荷しない対照の結果（図中「−ＮａＣｌ」）と共に示す。
図２は、実施例２の方法に従い、低温ストレスを負荷した植物体中のｓｉｇ５及びｐｓｂＤの発現を解析した結果を示す。
図３は、実施例２の方法に従い、高浸透圧ストレスを負荷した植物体中のｓｉｇ５の発現を解析した結果を示す。
図４は、実施例２の方法に従い、強光ストレスを負荷した植物体中のｓｉｇ５及びｐｓｂＤの発現を解析した結果を示す。
図５は、実施例４の方法に従いｐＥｐ由来の１．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入して得たｓｉｇ発現解析用プラスミド（ｐＥ−ＧＵＳ）を示す。
図６は、塩ストレス処理を行った実施例４のシロイズナズナのＧＵＳ染色によるｓｉｇ５プロモータ発現結果を、塩ストレスを負荷しない対照の結果（図中「−ＮａＣｌ」）と共に示す。
図７は、実施例５によるｓｉｇ発現解析用プラスミド（ｐＥ−ＯＸ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何等限定されるものではない。
実施例１：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（Ｌ．）Ｈｅｙｎｔｈ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ（Ｃｏｌ））の培養
目的に合わせて下記２種のいずれかの方法を選択した。
Ａ：固形培地培養
基本的に（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４１，１１１９−１１２８（２０００））に従った。シロイヌナズナ種子は必要量を分取し、７０％（ｖ／ｖ）エタノールと３％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで滅菌処理を行った上で０．４％（ｗ／ｖ）ゲルライト（Ｗａｋｏ）を含む１％Ｓｕｃｒｏｓｅ−ＭＳプレート（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５，４７３−４９７（１９６２））またはＪｉｆｆｙ−７（ＡＳ  Ｊｉｆｆｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上に播種した。４℃、暗条件で２４時間低温処理した後、２３℃、恒明条件（５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）で生育を行った。
Ｂ：液体培養
１％Ｓｕｃｒｏｓｅ−ＭＳ液体培地にて、２３℃、連続白色光（５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）照射条件下で振とう培養した。
実施例２：環境ストレスの負荷
実施例１の方法に従い、連続白色光下（５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）で生育させた１０日目の植物体に対して処理を行った。記述した条件以外は、ストレス処理前後で同一とした。
Ａ：塩ストレス処理
ＭＳ液体培地で培養した植物体に、最終濃度が２５０ｍＭとなるようＮａＣｌを加えて、生育を観察し、経時的にサンプリングした。
Ｂ：強光ストレス処理
５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓの白色光下で生育させた植物体を、５００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓの白色光下に移し、経時的にサンプリングした。
Ｃ：低温ストレス処理
固体培地上、２３℃で生育させた植物体を４℃に移した後、経時的にサンプリングした。
Ｄ：浸透圧ストレス処理
液体培地で培養した植物について、最終濃度が２５０ｍＭとなるようマンニトールを加えた後、経時的にサンプリングした。
実施例３：環境ストレスに応答した遺伝子発現解析
ノザンハイブリダイゼーションにより行った。
植物体からのＲＮＡ調製は、植物体を液体窒素中で凍結・破砕した後、ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。方法はキットのプロトコールに従った。抽出した全ＲＮＡの定量にはスペクトロフォトメーターＤＵ６４０（ＢＥＣＫＭＡＮ）を用いた。
ノーザンハイブリダイゼーションの操作は、文献に従った（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４０，８３２−８４２（１９９９））。各遺伝子検出用のプローブは、ｓｉｇ５は対応するｃＤＮＡを鋳型にして、ｐｓｂＤはシロイヌナズナ全ＤＮＡを鋳型にして、配列番号１〜４に示すプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅し、ＤＩＧラベルして調製した。ＰＣＲはＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、９５度で３０秒、５５度で３０秒、７２度で１分を２５サイクル行った。増幅される断片の大きさは、ｓｉｇ５が５００ｂｐ、ｐｓｂＤが５４９ｂｐである。
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実施例２の方法に従い、環境ストレスを負荷した植物体中のｓｉｇ５及びｐｓｂＤの発現を解析した。結果を図１〜４に示す（図１：塩ストレス、図２：低温ストレス、図３：高浸透圧ストレス、図４：強光ストレス）。結果から明らかに、ｓｉｇ５及びｐｓｂＤは各種の環境ストレスに応答して、特異的に高発現することが判った。
実施例４：環境ストレスに応答したｓｉｇ５の植物体内での発現
さらにｓｉｇ５−プロモーター領域：ｕｉｄＡ融合遺伝子の構築、形質転換植物の作製、ＳＵＧ染色により評価した。
シロイヌナズナ第５染色体のＰ１クローンＭＬＥ８（かずさＤＮＡ研究所より分与）に対し、配列番号５〜６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、２．５ｋｂの増幅断片を得た。それをＰｍａＣＩとＢａｍＨＩで消化して得られた１．８ｋｂ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入しｐＥｐを得た。ｐＥｐ由来の１．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位に導入しｐＥ−ＧＵＳを得た（図５）。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８株に導入したのち、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に浸潤法で形質転換した。得られた種子についてカナマイシン耐性株を選抜し、２０ラインを得て解析に用いた。ＧＵＳ染色は文献に従った（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４０，８３２−８４２（１９９９））。
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上記２０ラインの植物体を、実施例２に従って塩ストレス処理を行い、処理後の植物体をＧＵＳ染色して発現を観察した。ＭＳプレート上にろ紙を置き、その上に播種して通常条件で１４日培養を行った。２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＭＳプレート上にろ紙ごと植物体を移し、そのまま１２時間の培養を行った。染色は文献（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４０，８３２−８４２（１９９９））に従った。塩処理を施した植物では、ｓｉｇ５プロモーターが高い発現を示していることが観察された（図６）。
実施例５：ｓｉｇ５過剰発現植物の作製とストレス耐性試験
ｓｉｇ５  ｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号７〜８に示すプライマーで実施例３と同じ条件でＰＣＲ増幅を行い、ｓｉｇ５  ＯＲＦ全長を含む断片を得た。
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これをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドにクローン化した後、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片として切り出した。これをｐＢＩ１２１のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位にクローン化することで、ｐＥ−ＯＸを得た（図７）。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８株に導入したのち、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に浸潤法で形質転換した。得られた種子についてカナマイシン耐性株を選抜し、ｓｉｇ５が高発現しているラインを選んで解析に用いた。コントロールとしては、植物への導入ベクターであるｐＢＩ１２１により形質転換した植物体を用いた。
塩ストレスに対する試験は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを添加したＭＳプレートに播種し、通常の生育条件で発芽の状態を観察した。その結果、コントロール株では殆どの子葉が白化するのが観察されるのに対し、ｓｉｇ５高発現株では半分以上が緑色の子葉を形成していた。
強光ストレスに対する試験は、ＭＳプレートに播種した後に、２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓの白色光照射下で培養を行った。コントロール株が培養当初から黄緑色となり約１ヶ月程度で枯死するのに対し、ｓｉｇ５高発現株では緑色も濃く、枯死することもなかった。
乾燥に対する試験は、Ｊｉｆｆｙ−７上に播種し、約３週間通常の生育条件で栽培した後に、水を与えるのを止め、枯死するまでの期間を比較した。コントロール株が一週間程度で枯死するのに対し、ｓｕｇ５高発現株では数日の延命効果が見られた。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法によれば、植物生存の根源である光合成系への環境ストレスによって引き起こされるダメージを積極的に改善することができ、環境ストレスによって引き起こされる光合成機能の低下による観葉植物等の枯死や作物や収量低下などを回避することができる。さらには、この方法によって環境ストレスに対して耐性を持つ植物を作出することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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