(57)【要約】本発明は、ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法であって、（ａ）昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するバキュロウイルスベクターで昆虫細胞を形質転換する工程、（ｂ）形質転換された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（ｃ）培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法であって、（ａ）昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するバキュロウイルスベクターで、昆虫細胞に形質導入する工程、（ｂ）形質導入された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（ｃ）培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法。
【請求項２】
ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法であって、（ａ）昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有し、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現ベクターで、昆虫細胞を形質転換する工程、（ｂ）形質転換された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（ｃ）培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法。
【請求項３】
前記昆虫由来の分泌シグナル配列が、ミツバチのメリチン由来シグナル配列である請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、さらに精製用タグ、レポーター遺伝子および／またはエンテロキナーゼの認識部位を含有する請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項５】
請求の範囲第１項および第２項記載の方法により得られるヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２を用いることを特徴とするラクト−Ｎ−ネオテトラオースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２（β３ＧｎＴ２）の製造方法に関する。詳しくは、本発明は、活性を有する組換えヒトβ３ＧｎＴ２の製造方法に関する。
【背景技術】  ２００１年にＥＳＴシーケンスとＰＣＲ法により４種類のヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（β３ＧｎＴ）２〜５がクローニングされた（シライシ（Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ）ら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２７６巻、ｐ．３４９８−３５７０；トガヤチ（Ｔｏｇａｙａｃｈｉ）ら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２７６巻、ｐ．２２０３２−２２０４０参照）。β３ＧｎＴ２はポリラクトサミン受容体に対し高い活性を示し、ポリラクトサミン鎖の伸長に関与していると推測されている。β３ＧｎＴ３およびβ３ＧｎＴ４もポリラクトサミン鎖の伸長に関与する酵素であるが、その酵素活性は、β３ＧｎＴ２の１／１０〜１／２０である。β３ＧｎＴ５は糖脂質上の糖鎖であるラクト、ネオラクト系の糖鎖合成に重要な働きをするラクトアオシルセラミド合成酵素と考えられている。しかしながら、β３ＧｎＴ２〜５については、解析するために十分な量を天然資源から得ることができないため、その詳細な性質は知られていない。
バキュロウイルス遺伝子発現系（ＢＥＳ）は、昆虫細胞中で組換えタンパク質に対する糖鎖付加、リン酸化などの翻訳後修飾が行なわれるため、活性を有するヒト由来の組換えタンパク質の大量生産に適している（アラム（Ａｌａｍ）ら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ  第２４巻、ｐ．３３−４２；ジェイムス（Ｊａｍｅｓ）ら、１９９５年、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１３巻、ｐ．５９２−５９６；ヘリコート（Ｈｅｒｉｃｏｕｒｔ）、第２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、第３４９巻、ｐ．４１７−４２５参照）。しかしながら、ヒト由来β３ＧｎＴ２についてＢＥＳが適用された場合、組換えβ３ＧｎＴ２の発現量が少なく、タンパク質の大量生産には適さなかった（シライシら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２７６巻、ｐ．３４９８−３５７０参照）。
【発明の開示】
本発明は、活性を有するヒト由来β３ＧｎＴ２を大量に得るための方法を提供することを目的とする。
本発明は、ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法であって、（ａ）昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するバキュロウイルスベクターで、昆虫細胞に形質導入する工程、（ｂ）形質導入された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（ｃ）培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法を提供する。
また、本発明は、ヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２の製造方法であって、（ａ）昆虫由来の分泌シグナル配列、および活性部位を含むヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有し、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現ベクターで、昆虫細胞を形質転換する工程、（ｂ）形質転換された昆虫細胞を培養し、該融合タンパク質を培養物中に分泌させる工程、および（ｃ）培養物から該融合タンパク質を採取する工程からなる方法を提供する。
前記各方法において、昆虫由来の分泌シグナル配列はミツバチのメリチン由来シグナル配列であることが好ましい。
前記各方法において、融合タンパク質は、さらに精製用タグ、レポーター遺伝子および／またはエンテロキナーゼの認識部位を含有することが好ましい。
さらに、本発明は、前記各方法により得られるヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２を用いることを特徴とする、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】  図１（ａ）および１（ｂ）は、それぞれ実施例１および２で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果を示す。図１（ａ）および１（ｂ）において、□は細胞内β３ＧｎＴ活性を表わし、■は細胞外β３ＧｎＴ活性を表わす。
図２（ａ）および２（ｂ）は、それぞれ実施例１および２で得られた酵素液中のプロテアーゼ活性を測定した結果を示す。図２（ａ）および２（ｂ）において、○は細胞内プロテアーゼ活性を表わし、●は細胞外プロテアーゼ活性を表わす。
図３（ａ）および３（ｂ）は、それぞれ実施例１および２で得られた昆虫細胞において発現した融合タンパク質のＧＦＰ蛍光強度を測定した結果を示す。図３（ａ）および３（ｂ）において、◇は細胞内の蛍光強度を表わし、◆は細胞外の蛍光強度を表わす。
図４（ａ）および４（ｂ）は、形質導入体の培養時にプロテアーゼ阻害剤を添加した場合のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果を示す。図４（ａ）は、細胞外に分泌された酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。図４（ｂ）は、細胞破砕液中の酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。
図５（ａ）および５（ｂ）は、形質導入体の培養時にプロテアーゼ阻害剤を添加した場合のプロテアーゼ活性を測定した結果を示す。図５（ａ）は、細胞外の酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した結果である。図５（ｂ）は、細胞破砕液に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した結果である。
図６（ａ）および６（ｂ）は、それぞれ実施例４および５で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果を示す。図６（ａ）および６（ｂ）において、□は細胞内β３ＧｎＴ活性を表わし、■は細胞外β３ＧｎＴ活性を表わす。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のヒト由来β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ２（β３ＧｎＴ２）の製造方法は、少なくとも昆虫由来の分泌シグナル配列および活性部位を含むヒト由来β３ＧｎＴ２からなる融合タンパク質を昆虫細胞で発現させることに特徴を有する。
ヒト由来β３ＧｎＴ２は、配列番号１に示すアミノ酸配列（塩基配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０９２０５１）からなる膜貫通糖タンパク質であって、ラクトースを使用するポリラクトサミン鎖の伸長反応を触媒する酵素である。本明細書においてヒト由来β３ＧｎＴ２は、β３ＧｎＴ２としての酵素活性を失わない限り、たとえば、アミノ酸配列中のアミノ酸残基の数個が生物学的に同等のアミノ酸配列に置換されていてもよく、数個のアミノ酸残基が付加、欠失されていてもよい。また、本発明の製造方法においては、昆虫細胞内でβ３ＧｎＴ２を発現させて細胞外に分泌させるため、ヒト由来β３ＧｎＴ２は膜貫通領域および細胞質領域を欠くもの、たとえばヒトβ３ＧｎＴ２の第２６番〜第３９７番アミノ酸残基からなるものが好ましい。
本明細書において、分泌シグナル配列は、前駆体タンパク質またはポリペプチドの粗面小胞体膜までの選択的な輸送と膜通過のために働くシグナル配列を意味し、前駆体タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に含有されたかたちで合成される。分泌シグナル配列をβ３ＧｎＴ２に融合することによって翻訳後修飾が行なわれ、活性を有するβ３ＧｎＴ２を得ることができる。分泌シグナル配列としては、たとえば、公知のメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２００７）、ｇｐ６４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００１６２３の塩基配列１０８１７９ｂｐ〜１０９７１７１７ｂｐ）およびセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２４）などを挙げることができ、この中でもメリチンがとくに好ましい。しかしながら、これらに限定されるものではなく、使用する昆虫または昆虫細胞の種類によって、分泌シグナル配列を適宜選択することができる。なお、分泌シグナルは、細胞外に分泌されたのちに切断されてもよい。
前記融合タンパク質は、前記β３ＧｎＴ２および前記分泌シグナル配列とは異なるタンパク質またはペプチドをさらに含有してもよい。さらに含有されるタンパク質またはペプチドとしては、たとえば、精製を容易に行なうための精製用タグペプチドおよび検出を容易に行なうためのレポータータンパク質が挙げられる。さらにたとえば、本発明において製造されるヒト由来β３ＧｎＴ２は、エンテロキナーゼの認識部位を含有してもよい。ヒト由来β３ＧｎＴ２がエンテロキナーゼの認識部位を含有する場合、エンテロキナーゼを作用させることによって、ヒト由来β３ＧｎＴ２の精製に利用した精製用タグなどを除去することができる。
精製用タグとしては、たとえば、ヒスチジンタグ、Ｓ・タグ、Ｔｒｘ・タグ、ＣＢＤ・タグ、ＨＳＶ・タグなどが挙げられ、回収率が高いことからヒスチジンタグが好ましい。レポータータンパク質としては、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの変異体（ＧＦＰｕｖ（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ００７８３４）など）、β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼなどが挙げられる。エンテロキナーゼの切断部位としては、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２）からなるペプチド配列を用いることができる。
前記分泌シグナル配列およびヒト由来β３ＧｎＴ２をコードするＤＮＡ配列、また、前記精製用タグ、レポータータンパク質およびエンテロキナーゼの認識部位などをコードするＤＮＡ配列は、従来の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。たとえば、それぞれ公知のＤＮＡ配列に基づき設計したプライマーを用いることによって、所望のＤＮＡ領域をＰＣＲで増幅することができる。ついで各ＰＣＲ産物を連結することにより融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（融合タンパク質遺伝子）を得ることができる。あるいは、適当な制限酵素を用いて切断することにより各ＤＮＡ領域を得、ついでＤＮＡリガーゼによって各ＤＮＡ領域を連結することにより、融合タンパク質遺伝子を得ることができる。なお、分泌シグナル配列は、融合タンパク質のアミノ末端側に融合される。
また、β３ＧｎＴ２については、たとえば、点変異やランダム変異などの従来の遺伝子工学的手法を用いて、数個のアミノ酸残基が置換、付加および／または欠失された変異体をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
本発明において使用する昆虫細胞は、当業者により適宜選択され得るが、たとえば、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、スポドプテラリトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）、スポドプテラエキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）を挙げることができ、スポドプテラフルギペルダおよびトリコプルシア・ニが好ましい。
本発明における形質導入において使用される組換えウイルスベクターは、通常の方法でバキュロウイルスベクターＤＮＡに前記融合タンパク質遺伝子を導入することによって得ることができる。ついで、得られた組換えウイルスベクターを昆虫細胞に感染させることによって、形質導入を実施する。
前記組換えウイルスベクターによる昆虫細胞の形質導入は、従来の方法により当業者が適宜実施することができる。たとえば、昆虫細胞を培養液から分離し、約５％の血清を含有する適当量の培地において適当な感染多重度（ＭＯＩ）の組換えウイルスと昆虫細胞を混合し、２７℃で１〜２時間温和な条件で撹拌培養を行なうことによって、実施することができる。
前記ＭＯＩは、たとえば１〜１００であり、感染効率が良いという理由から、ＭＯＩ１０〜５０が好ましい。
本発明はまた、ウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子を含有しない昆虫細胞用発現ベクター（以下、ノンウイルス系発現ベクターと略称する）を用いて該融合タンパク質を発現させることができる。
本発明において使用するノンウイルス系発現ベクターとは、昆虫細胞内で働くプロモーターをもつプラスミドであり、そのプラスミドの下流に目的遺伝子を挿入することによって昆虫細胞に目的遺伝子を組み込み、目的遺伝子を発現することができるベクターであって、かつウイルス由来のプロテアーゼ遺伝子を含有しない発現ベクターを意味する。このようなノンウイルス系発現ベクターとしては、たとえば、ｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８、ｐＩＢ／Ｈｉｓ、ｐＩＺ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＭＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯなどがある。
前記融合タンパク質のノンウイルス系発現ベクターによる昆虫細胞の形質転換は、従来の方法により当業者が適宜実施することができる。たとえば、目的遺伝子を発現プラスミドに挿入して発現ベクターを得る。この発現ベクターに組み込まれた目的遺伝子により昆虫細胞を形質転換するためには一般的にリポフェクション法を用いることが多い。リポフェクション法は、発現ベクター、昆虫細胞の染色体に遺伝子を挿入することのできるヘルパープラスミドおよびカチオン性脂質からなる混合物を昆虫細胞の培養液に滴下し、一定条件下でインキュベーションすることにより実施することができる。リポフェクション後、抗生物質入りの約５％の血清を含有する培地または無血清培地を適当量用いて形質転換された昆虫細胞を単離する。単離のための培養は一般的に２６〜２８℃で２〜４週間行う。
本発明のヒト由来β３ＧｎＴ２の製造方法においては、目的の融合タンパク質の正しい高次構造形成を助ける目的で、本発明の融合タンパク質と共に分子シャペロンを染色体に組み込み共発現することが好ましい。このような分子シャペロンとしては、たとえばＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０などのファミリーが知られている。具体的には、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、カルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）などがあげられる。シャペロン遺伝子を染色体に組み込む方法としては、前記融合タンパク質のノンウイルス系発現ベクターによる昆虫細胞の形質転換と同様に行なうことができる。目的の融合タンパク質遺伝子とシャペロン遺伝子による昆虫細胞の形質転換は、同一の発現ベクターにより行なってもよく、また、別々の発現ベクターにより、順次行なってもよい。
本発明のヒト由来β３ＧｎＴ２の製造方法においては、培地中に融合タンパク質を分泌させるために、前記形質導入によって得られた形質導入体または前記形質転換によって得られた形質転換体を培養する。培養は通常の方法にしたがって適宜実施し得る。培養の際にはプロテアーゼの阻害剤を添加してもよく、プロテアーゼの阻害剤を培地に添加する場合は、たとえば、１〜７日間、好ましくは２〜４日間、２７℃で旋回培養することによって実施することができる。プロテアーゼの阻害剤を培地に添加しない場合は、たとえば１〜５日間、好ましくは１〜２日間、２７℃で旋回培養することができる。
前記プロテアーゼの阻害剤としては、ウイルス由来のプロテアーゼ阻害剤およびカルボキシルプロテアーゼの阻害剤を用いることが好ましい。ウイルス由来のプロテアーゼ阻害剤としては、たとえば、ロイペプチンおよびＥ６４を使用することができる。カルボキシルプロテアーゼ阻害剤としては、たとえば、ペプスタチンＡを使用することができる。
前記形質導入体または形質転換体の培養によって分泌された融合タンパク質は、従来の方法にしたがって、培養物から採取することができる。たとえば、培養物から細胞を除去し、得られた培養液をアフィニティーカラムによって精製することにより採取することができる。あるいは、培養液に硫酸アンモニウムを添加することにより培養液中のタンパク質を沈殿させ、タンパク質を可溶化したのちに、ＤＥＡＥなどのタンパク質吸着カラムによって精製することにより採取することができる。
本発明のヒト由来β３ＧｎＴ２の製造方法に従って得られるヒト由来β３ＧｎＴ２を用いて、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを製造することができる。ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの製造は、たとえば、ラクトースを基質（出発物質）として前記ヒト由来β３ＧｎＴ２存在下でウリジン５′−二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンと反応させ、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩまで変換し、得られたラクト−Ｎ−トリオースＩＩとガラクトースβ１，４−デキストロースにβガラクトシダーゼ（安価な酵素）を作用させることにより実施できる。この際、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの製造には、ヒト由来β３ＧｎＴ２と同様に前記融合タンパク質を用いることもできる。
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
製造例１
（融合タンパク質遺伝子の取得）
活性部位を含むβ３ＧｎＴ２のＤＮＡ領域は、Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅＴＭヒト胎児脳ｃＤＮＡ（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック製）を用い、ＰＣＲ法により増幅させた。すなわち、Ｑｕｉｃｋ−ＣｌｏｎｅＴＭヒト胎児脳ｃＤＮＡ１ｎｇ、ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック製）１．２５Ｕ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（東洋紡績（株）製）、下記フォワードプライマー１およびリバースプライマー１を各２０ｐｍｏｌならびに蒸留水を混合し、全量５０μｌのＰＣＲ用反応液を調製した。ついで、ＰＣＲ用反応溶液を、９５℃で５分間インキュベーションしたのち、９５℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で２．５分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行ない、ついで７２℃で３分間インキュベーションすることによりＰＣＲを実施した。使用したプライマーを以下に示す。
2004048562.tif 000002
増幅させたＤＮＡ断片は１，２６４ｂｐであり、β３ＧｎＴ２のアミノ酸２６〜３９７残基までをコードする領域およびその３′非翻訳領域を含む。ついで、６×ヒスチジンタグ、ＧＦＰ、エンテロキナーゼの認識部位およびＣＡＴを順にコードするプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２−ＧＦＰｕｖ／ＣＡＴ（チャー（Ｃｈａ）ら、１９９９年、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６９，ｐ９−１７）から制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＣＡＴ遺伝子を取り除くことによって構築されたプラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２−ＧＦＰｕｖのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位に、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理した前記ＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を構築した。
ついで、ヒスチジンタグをコードするＤＮＡ配列の５′側にミツバチのメリチン由来の分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ領域を挿入するために、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を鋳型とするＰＣＲを行なった。すなわち、０．１μｇのｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績（株）製）１．２５Ｕ、２．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（東洋紡績（株）製）、フォワードプライマー２および前記リバースプライマー１を各２０ｐｍｏｌならびに蒸留水を混合し、全量５０μｌのＰＣＲ用反応液を調製した。ついで、ＰＣＲ用反応溶液を、９５℃で５分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で２．５分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行ない、ついで７２℃で３分間インキュベーションすることによりＰＣＲを実施した。なお、フォワードプライマー２のＤＮＡ配列は、ミツバチのメリチン由来分泌シグナル配列をコードする遺伝子を含有する。使用したフォワードプライマー２を以下に示す。
2004048562.tif 000003
ＰＣＲの結果、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ領域をさらに含むＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合遺伝子（配列番号６）が増幅された。
得られたＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合遺伝子を、エントリーベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製）に挿入し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２とした。
製造例２
（組換えウイルスベクターの製造）
製造例１で得られたｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２、ならびにポリヘドリンプロモーターを含有するドナーベクターｐＤＥＳＴ８（インビトロジェン製）およびＧＡＴＥＷＡＹ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（インビトロジェン製）を用いて、双方のベクターの組換えによってプラスミドｐＤＥＳＴ８／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を構築した。さらにｐＤＥＳＴ８／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を用いるＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（インビトロジェン製）により、ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合遺伝子をもつ組換えオートグラファ・カルフォルニカ多角体ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２）を作製した。ＰＣＲ法で得られたすべてのＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
製造例３
（融合タンパク質の発現ベクターの製造）
ＧＡＴＥＷＡＹ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（インビトロジェン製）を用いることにより、製造例１で得られたｐＥＮＴＲ／Ｄ／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２の融合タンパク質遺伝子を、ノンウイルス系発現ベクタープラスミドｐＸＩＮＳＥＣＴ−ＤＥＳＴ３８にサブクローニングした。
製造例４
（シャペロン分子遺伝子を組み込んだ発現ベクターの製造）
ヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリー（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック製）からＰＣＲによりカルネキシン遺伝子（シャペロン遺伝子）を増幅した。すなわち、鋳型としてヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリー１ｎｇ、ＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡績（株）製）１．２５Ｕ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（東洋紡績（株）製）、および下記フォワードプライマー３およびリバースプライマー３を各２０ｐｍｏｌ、ならびに１ｍＭのＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲバッファー（東洋紡績（株）製）を混合し、全量５０μｌのＰＣＲ用反応液を調製した。ついで、ＰＣＲ用反応溶液を、９５℃で３分間インキュベーションしたのち、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で２分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行ない、ついで７２℃で５分間インキュベーションすることによりＰＣＲを実施した。使用したプライマーを以下に示す。
2004048562.tif 000004
増幅させたＤＮＡ断片（カルネキシン遺伝子）を、ノンウイルス系発現ベクターｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン製）と混合し、２２℃で３０分間反応させることにより、該ＤＮＡ断片を該ベクターに挿入し、シャペロン分子発現ベクタープラスミドｐＩＢ／ＣＮＸを構築した。
【実施例１】（形質導入体の獲得）
対数増殖期（２〜３個／ｍｌ）のＳｆ−９細胞（インビトロジェン製）を用い、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で製造例２において製造したＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を感染させた。
（融合タンパク質の発現）
前記形質導入体の培養は、１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロジェン製）を含有するＳｆ−９００ＩＩ培地（インビトロジェン製）２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角フラスコを用いる旋回培養（２７℃、回転数１００ｒｐｍ）で行なった。感染から１、２、３または４日後に培養液を回収し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間）によって、融合タンパク質（配列番号９）を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群４本用いた。
（融合タンパク質の精製）
前記フラスコ４本分の培養上清液（８０ｍｌ）に対し、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン製）を０．５ｍｌの割合で加え、氷中で１時間穏やかに攪拌した。融合タンパク質にはＮｉ２＋に特異的に結合するヒスチジンタグが付加されているため、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロース樹脂により該融合タンパク質が特異的に吸着される。ついで樹脂をカラムに充填し、樹脂の３倍量（１．５ｍｌ）の１５０ｍＭ塩化ナトリウムと４０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。その後、樹脂の３倍量（１．５ｍｌ）の１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２００ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で融合タンパク質を溶出させることにより、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。
（ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質の性質）
酵素液１５μｌに、エンテロキナーゼ１Ｕを添加し、２１℃で１６時間保温した。その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い、融合タンパク質の切断を確認した。また別途、酵素液２．５μｌに変性条件下で１ｍＵのグリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（タカラバイオメディカル製）を加え、３７℃で１６時間反応させた後、分子量の変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。タンパク質濃度はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  ＩＩ（バイオ−ラッド製）を用いて測定した（ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ），１９７６）。
その結果、β３ＧｎＴ２とその他のヒスチジンタグとＧＦＰｕｖの２個に切断されることが確認された。
また、糖鎖付加を確認するために融合タンパク質をＰＮＧａｓｅ処理したところ、分子量が７〜８ｋＤａ減少した。これは、β３ＧｎＴ２は糖付加部位をもっていることを示唆している。
【実施例２】（形質導入体の獲得）
対数増殖期（２〜３個／ｍｌ）のＴｎ−５Ｂ１−４細胞（インビトロジェン製）を用い、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で製造例２において製造したＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を感染させた。
（融合タンパク質の発現）
前記形質導入体の培養は、１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロジェン製）を含有するＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角フラスコを用いる旋回培養（２７℃、回転数１００ｒｐｍ）で行なった。感染から１、２、３または４日後に培養液を回収し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間）によって、融合タンパク質を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群４本用いた。
（融合タンパク質の精製）
前記培養液上清を用いたほかはすべて実施例１と同様の方法により、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。
試験例１
（β３ＧｎＴ活性測定試験）
実施例１および２において組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液および培養液上清を試料としてβ３ＧｎＴ活性を測定した。なお、細胞破砕液は、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で細胞を処理することによって調製した。
β３ＧｎＴ反応は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ塩化マンガン、１９ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、２２ｍＭのＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ｐＮＰ、試料５μｌを含有する全量２５μｌ液を調製したのち、３７℃で２４時間インキュベーションすることによって行なった。
β３ＧｎＴ反応終了後、５μｌの反応液を分取し、１９５μｌの蒸留水を添加した。さらに５分間煮沸し、０．４５μｍニトロセルロースフィルターでろ過し、生成物をＨＰＬＣによって検出した。ＨＰＬＣは、カラムとしてＭｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８（Ｈ）ＧＰ１５０−４．６（関東化学（株）製）を用い、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃で行なった。生成物は、１０％メタノールを用い、吸光度３００ｎｍで検出した。１ユニットは１分間に１μｍｏｌのＧｌｃＮＡｃを転移させる酵素量と定義した。
各β３ＧｎＴ活性を図１（ａ）および１（ｂ）に示す。図１（ａ）は、実施例１で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。図１（ｂ）は、実施例２で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。
β３ＧｎＴ活性はＳｆ−９とＴｎ−５Ｂ１−４の両細胞において細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かった。Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞においては感染後３日で劇的にβ３ＧｎＴ活性が減少した。それとは反対にＳｆ−９細胞では細胞外のβ３ＧｎＴ活性は感染後４日間で上昇した。最大のβ３ＧｎＴ活性はＳｆ−９細胞では０．８６ｍＵ／ｍｌ、Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞では０．６８ｍＵ／ｍｌであった。
試験例２
（プロテアーゼ活性測定試験）
実施例１および２において組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液および培養液上清を試料として、試料に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した。なお、細胞破砕液は、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で細胞を処理することによって調製した。
反応は次のようにして実施した。試料７０μｌと４３０μｌのＡＵＥバッファー（０．２％アゾカゼイン、３Ｍ尿素、５ｍＭシステイン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ５．４）を混合することによりプロテアーゼ反応液を調製し、３７℃で１時間インキュベーションした。ついで、５００μｌの２０％トリクロロ酢酸を反応停止液として反応液に添加し、プロテアーゼ反応を停止させた。反応停止液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、５分間）し、反応液の吸光度を４０５ｎｍで測定した。１ユニットは１時間で４０５ｎｍの吸光度値を１上昇させる酵素量と定義した。
各プロテアーゼ活性を図２（ａ）および２（ｂ）に示す。図２（ａ）は、実施例１で得られた酵素液中のプロテアーゼ活性を測定した結果である。図２（ｂ）は、実施例２で得られた酵素プロテアーゼ活性を測定した結果である。
感染３日後の細胞外プロテアーゼ活性についてＴｎ−５Ｂ１−４細胞の方がＳｆ−９細胞に比べて５倍高く、これがＴｎ−５Ｂ１−４細胞の急激な活性の低下の原因であると考えられる。
試験例３
（プロテアーゼの影響の確認試験）
実施例１および２で得られた酵素液について、プロテアーゼの影響を確認するために、細胞外ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でその緑色蛍光により観察した。Ｓｆ−９細胞では低分子量のバンド（プロテアーゼで切断されている融合タンパク質）が感染３日後から現われはじめるが、まだ高分子量の融合タンパク質も存在した。一方Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞では、低分子量のバンドは感染後２日目から現われはじめ、３日目ではすべてが低分子量のバンドに分解され、ほとんどがプロテアーゼによって切断された。プロテアーゼで切断されていない融合タンパク質のバンドの減少はβ３ＧｎＴ活性の減少と一致していた。
試験例４
（ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による組換えタンパク質の分子量の確認および蛍光イメージの分析）
実施例１および２において組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液、培養液上清および精製酵素を試料として１０％または１２％のポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうことにより、ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合遺伝子の発現とそのＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質の精製具合を確認した（リームリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），１９７０）。なお、細胞破砕液は、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で細胞を処理することによって調製した。ゲル上のＧＦＰ由来緑色蛍光バンドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）製）を用いて検出した。非特異的なバンドは、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ−２５０（ＩＣＮバイオメディカル製）でゲルを染色してから検出した。特異的な緑色蛍光バンドを検出する場合、サンプルはサンプルバッファーを混合後、煮沸なしにそのまま電気泳動を行なった。
その結果、精製された融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約７７ｋＤａと推定された。Ｓｆ−９細胞（実施例１）とＴｎ−５Ｂ１−４細胞（実施例２）との培養液から精製された融合タンパク質の分子量の差は認められなかった。
また、各酵素液の蛍光強度の経時変化を図３（ａ）および３（ｂ）に示す。図３（ａ）は、実施例１で得られた昆虫細胞の蛍光強度を測定した結果である。図３（ｂ）は、実施例２で得られた昆虫細胞の蛍光強度を測定した結果である。
Ｓｆ−９とＴｎ−５Ｂ１−４の両細胞において最大細胞内蛍光強度は最大細胞外蛍光強度の２〜４倍高かった。
【実施例３】（形質導入体の獲得）
対数増殖期（２〜３個／ｍｌ）のＴｎ−５細胞（インビトロジェン製）を用い、Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で製造例２において製造したＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を感染させた。
（融合タンパク質の発現）
前記形質導入体の培養は、１％のａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロジェン製）を含有するＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）２０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角フラスコを用いる旋回培養（２７℃、回転数１００ｒｐｍ）で行なった。感染から１日後、培地１ｍｌ当たり０、０．２５、１．０または２．５μｇのロイペプチン塩酸塩（Ｗａｋ５９８−０６４７１、和光純薬製）を添加して、培養を継続した。感染から１（ロイペプチン添加直前）、２、３または４日後に培養液を回収し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間）によって、融合タンパク質を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群４本用いた。
（融合タンパク質の精製）
前記培養液上清を用いたほかはすべて実施例１と同様の方法により、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。
試験例５
（プロテアーゼ阻害剤のβ３ＧｎＴ活性への影響）
実施例３で得られた酵素液を用いたほかはすべて試験例１と同様にして、酵素液のβ３ＧｎＴ活性を測定した。
結果を図４（ａ）および４（ｂ）に示す。図４（ａ）は、細胞外に分泌された酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。図４（ｂ）は、細胞破砕液中の酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。
図４（ａ）および４（ｂ）に示されるように、プロテアーゼ阻害剤を０．２５μｇ／ｍｌ以上添加することによって、β３ＧｎＴ活性は３倍程度上昇した。
（プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ活性への影響）
実施例３で得られた酵素液を用いたほかはすべて試験例２と同様にして、酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した。
結果を図５（ａ）および５（ｂ）に示す。図５（ａ）は、細胞外の酵素液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した結果である。図５（ｂ）は、細胞破砕液中に含有される昆虫細胞由来のプロテアーゼ活性を測定した結果である。
図５（ａ）および５（ｂ）に示されるように、プロテアーゼ阻害剤を０．２５μｇ／ｍｌ以上添加することによって、細胞外プロテアーゼ濃度は１／１０程度減少した。一方、細胞内のプロテアーゼ活性には、ほとんど影響がなかった。
【実施例４】（形質転換体の獲得）
製造例３で製造した融合タンパク質の発現ベクタープラスミド９８０ｎｇおよびネオマイシン耐性遺伝子含有プラスミドｐＢｍＡ：ｎｅｏ（インビトロジェン製）２０ｎｇを用い、対数増殖期（２〜３×１０５個／ｍｌ）のＴｎ−５細胞（インビトロジェン製）を２４ウエルプレートに移し、４μｌのセルフェクチン（インビトロジェン製）を用いてリポフェクション法により形質転換を行った。形質転換した細胞をＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）１ｍｌに入れ、７２時間２７℃で培養した。その後抗生物質ジェネティシン（インビトロジェン製）７００μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）に交換した。抗生物質耐性細胞を得るために以後３〜４日毎に培地（抗生物質ジェネティシン（インビトロジェン製）７００μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地）を交換し、１４日間２７℃で培養した。ここで得られた細胞を抗生物質ジェネティシン（インビトロジェン製）７００μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地に入れ、１ｍｌスケールから５ｍｌスケールにまで３０日間２７℃で培養した。
（融合タンパク質の発現）
前記形質転換体の培養は、Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）２０ｍｌを入れた１００ｍｌフラスコに初期細胞濃度５×１０５個／ｍｌとなるよう形質転換体を播種し、ついで旋回培養（２７℃、回転数１００ｒｐｍ）することにより実施した。培養から１、２、３、４、５、６または７日後に培養液を回収し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間）によって、融合タンパク質（配列番号９）を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群４本用いた。
（融合タンパク質の精製）
前記培養液上清を用いたほかはすべて実施例１と同様の方法により、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。
（ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質の性質）
前記酵素液を用いたほかはすべて実施例１の「ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質の性質」と同様の方法により、酵素の分子量を測定した。
その結果、β３ＧｎＴ２とその他のヒスチジンタグとＧＦＰｕｖの２個に切断されることが確認された。
また、糖鎖付加を確認するために融合タンパク質をＰＮＧａｓｅ処理したところ、分子量が７〜８ｋＤａ減少した。これは、β３ＧｎＴ２は糖付加部位をもっていることを示唆している。
【実施例５】  対数増殖期の実施例４で得られた融合タンパク質発現細胞（５×１０５個／ｍｌ）を２４ウエルプレートに移し、１０μｌのセルフェクチン（インビトロジェン製）を用いてリポフェクション法により、製造例４で製造したシャペロン分子発現ベクタープラスミドｐＩＢ／ＣＮＸ  ５００ｎｇを用いて形質転換を行った。形質転換した細胞をＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）５００μｌに入れ、７２時間２７℃で培養した。その後抗生物質ブラストサイジン（インビトロジェン製）５０μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）に交換した。ブラストサイジン耐性細胞を得るために以後３日毎に培地（ブラストサイジン（インビトロジェン製）５０μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地）を交換し、７２時間２７℃で培養した。ここで得られた細胞をブラストサイジン（インビトロジェン製）５０μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地に入れ、１ｍｌスケールから５ｍｌスケールにまで３０日間２７℃で培養した。
（融合タンパク質の発現）
前記形質転換体の培養は、ブラストサイジン（インビトロジェン製）５０μｇ／ｍｌを含むＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地（インビトロジェン製）２０ｍｌを入れた１００ｍｌフラスコに初期細胞濃度５×１０５個／ｍｌとなるよう形質転換体を播種し、ついで旋回培養（２７℃、回転数１００ｒｐｍ）することにより実施した。培養から７日後に培養液を回収し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、５分間）によって、融合タンパク質（配列番号９）を含む培養液上清を分取した。サンプル数は各群４本用いた。
（融合タンパク質の精製）
前記培養液上清を用いたほかはすべて実施例１と同様の方法により、融合タンパク質を得た。融合タンパク質を含有する溶出液を、以下の試験に用いる酵素液とした。
試験例６
（β３ＧｎＴ活性測定試験）
実施例４または５で得られた形質転換体について、該細胞の破砕液および培養液上清を試料として用いたほかはすべて試験例１と同様にして、β３ＧｎＴ活性を測定した。
酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果を図６（ａ）および６（ｂ）に示す。図６（ａ）は、実施例４で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。図６（ｂ）は、実施例５で得られた酵素のβ３ＧｎＴ活性を測定した結果である。
実施例４において、β３ＧｎＴ活性は細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かった。β３ＧｎＴ活性は、細胞内で最大１．１９ｍＵ／ｍｌ、細胞外で最大３．７４ｍＵ／ｍｌであった。実施例５において、β３ＧｎＴ活性は細胞内外で認められ、細胞外の方が細胞内よりも高かった。β３ＧｎＴ活性は、細胞内で最大８．３３ｍＵ／ｍｌ、細胞外で最大２２．４ｍＵ／ｍｌであった。
比較例１
（シグナル配列非含融合遺伝子の発現）
製造例１と同様の方法で、分泌シグナル配列を含有しないｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２を構築した。
ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２／ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２とＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン製）を用いて、シグナル配列を含有しないＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２遺伝子を持つ組換えウイルス（ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２（−ｓｉｇ））を作製した。
前記ＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２（−ｓｉｇ）を用いたほかはすべて実施例１と同様にして、融合タンパク質を含有する溶出液を得た。
（β３ＧｎＴ活性の測定試験）
組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞について、該昆虫細胞の破砕液、培養液上清および酵素液を試料として、試験例１と同様の方法でβ３ＧｎＴ活性を測定した。しかしながら、各試料については、β３ＧｎＴ活性が認められなかった。
（考察）
実施例１において感染後２日で培養液を採取して得た酵素液に関し、試験の結果をまとめて表１に示す。
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酵素の活性と比活性は活性測定に用いる基質や測定条件が異なるため一概には比較できないが、本発明の方法により得られたヒト由来β３ＧｎＴ２の活性は、以前の報告（免疫グロブリン由来のシグナルを使用した前掲のシライシらの文献）の１０〜１５倍の活性を示し、マウス由来のβ３ＧｎＴとほぼ同程度の活性を示した（イガン（Ｅｇａｎ）ら、２０００年、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １７：８６７−８７５）。また、精製酵素の比活性は、隋膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）由来の組換えＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ブリクト（Ｂｌｉｘｔ）ら、１９９９年、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１０６１−１０７１）よりも約１７倍高かった。
さらにＧＦＰと融合させることにより、ウェスタンブロットやＥＬＩＳＡなどの煩雑な作業を省くことができる。
また、β３ＧｎＴ２をＧＦＰｕｖと融合させることにより、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰｕｖの緑色蛍光を観察することによってβ３ＧｎＴ２の発現を簡単に確認することができた。たとえば、組換えウイルスＡｃＭＮＰＶ−ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２をＳｆ−９細胞に感染させたときは１８〜２０時間、Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞では１６〜１８時間で細胞内に緑色蛍光が観察され始めた。細胞内では細胞膜の内側に沿って、強い緑色蛍光が観察された。感染後２〜４日後、細胞内全体に緑色蛍光が観察されると同時に細胞外にも観察された。細胞外の蛍光強度はＴｎ−５Ｂ１−４細胞の方がＳｆ−９細胞よりも高かったが、β３ＧｎＴ活性はその逆であった。
Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞では細胞外のプロテアーゼ活性が感染後３日で最大となるが、それがβ３ＧｎＴ活性の減少に関連し、またＴｎ−５Ｂ１−４の細胞外プロテアーゼ活性はＳｆ−９に比べて３倍高かった。高いプロテアーゼ活性が、Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞におけるβ３ＧｎＴ活性の低さの原因と推測される。ＢＥＳ内に存在するプロテアーゼが３種類発見されている。Ｓｆ−９細胞内ではウイルス感染に関わらず存在する４０ｋＤａのプロテアーゼが発見されている。
ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質をＰＮＧａｓｅで処理したとき、分子量が７〜８ｋＤａ減少した。このことから融合タンパク質は３〜４個Ｎ型糖鎖が結合していると推測される。７〜８ｋＤａという差は以前に報告された１．５ｋＤａおよび４ｋＤａよりも大きい（前掲のシライシらの文献、２００１年）。また、発現させた融合タンパク質のβ３ＧｎＴ領域の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥから４５ｋＤａと推定されたが、実際は４３，０６５．４９Ｄａであり、その差は約２ｋＤａであった。
ノンウイルス発現系において細胞外β３ＧｎＴ活性がバキュロウイルスを用いる発現系に比べ、５．５倍高い結果が得られた。また、ノンウイルス発現系では細胞外β３ＧｎＴ活性はプロテアーゼ阻害剤を添加した結果よりさらに１．９倍上昇した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による生化学的な解析の結果、ノンウイルス発現系の場合、プロテアーゼによって切断されたと考えられる低分子タンパク質は殆ど確認できなかった。このことから、細胞外にＧＦＰ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質を分泌生産するためにノンウイルス発現系は非常に有効であると考えられる。さらに、ノンウイルス発現系においてシャペロン遺伝子を共発現させた場合は、シャペロン遺伝子を共発現させていない場合と比較して細胞外β３ＧｎＴ活性は、約６倍上昇した。
【産業上の利用可能性】  本発明により、活性を有するヒト由来β３ＧｎＴ２を効率的に大量生産する方法が提供された。β３ＧｎＴ２は母乳などの主な成分であるラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬｎＮＴ）の産生に非常に重要な役割を有しており、本発明で得られたβ３ＧｎＴ２を用いれば、母乳の代わりに乳幼児に与えるミルクの主成分を工業的に得ることができるようになる。したがって、本発明のヒト由来β３ＧｎＴ２の製造方法は極めて優れた効果を有する。
さらに、本発明の方法により製造されたヒト由来β３ＧｎＴ２がＧＦＰを含有する場合には、蛍光顕微鏡を用いてその発現を迅速に確認できるうえ、タンパク質の精製や回収に極めて効果的である。さらに、蛍光顕微鏡によるＧＦＰの観察はバキュロウイルス感染後のタンパク質分泌経路の解析にも応用することができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号２：エンテロキナーゼの切断部位のアミノ酸配列
配列番号３：活性部位を含むβ３ＧｎＴ２をコードするＤＮＡ配列を得るためのフォワードプライマー
配列番号４：活性部位を含むβ３ＧｎＴ２をコードするＤＮＡ配列を得るためのリバースプライマー
配列番号５：ミツバチのメリチン由来分泌シグナル配列との融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を得るためのフォワードプライマー
配列番号６：ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合遺伝子をコードするＤＮＡ配列
配列番号７：カルネキシン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を得るためのフォワードプライマー
配列番号８：カルネキシン遺伝子をコードするＤＮＡ配列を得るためのリバースプライマー
配列番号９：ＧＦＰｕｖ−β３ＧｎＴ２融合タンパク質のアミノ酸配列
【配列表】
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【国際調査報告】
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