(57)【要約】本発明は、粒子表面に結合可能な官能基を有し、かつ緩衝液、被標識物等の外部の環境の影響を受けないという特徴を有する希土類蛍光錯体を含有する新規なシリカ粒子を提供する。本発明は、希土類蛍光錯体を含有してなるシリカ粒子、より詳細には希土類蛍光錯体をシリカ粒子の内部層に選択的に含有し、かつ表面が実質的にシリカからなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子、該シリカ粒子を含んでなる蛍光標識剤および該シリカ粒子を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法及び蛍光測定法用試薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
希土類蛍光錯体を含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子。
【請求項２】
希土類蛍光錯体が、次式（１）〜（６）
2005023961.tif 000012
2005023961.tif 000013
で表される化合物の少なくとも１種を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項３】
希土類蛍光錯体が、次式
2005023961.tif 000014
で表される化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項４】
希土類蛍光錯体が、次式
2005023961.tif 000015
で表される化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項５】
希土類蛍光錯体が、テルビウム又はユウロピウムの錯体である請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項６】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子が、エマルジョン重合法により製造されたものである請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項７】
希土類蛍光錯体が、主としてシリカ粒子の内部層に選択的に含有されている請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項８】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に標識される物質との結合基が導入されている請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項９】
結合基が、シアノ基である請求の範囲第８項に記載のシリカ粒子。
【請求項１０】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１１】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＲＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１２】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＰＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１３】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子にＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１４】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子にＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１５】
希土類蛍光錯体含有シリカ粒子にＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１６】
インターカレーターが一価性インターカレーターである請求の範囲第１０項〜第１５項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載のシリカ粒子からなる蛍光標識剤。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載のシリカ粒子の表面に核酸プローブが結合してなる蛍光標識化核酸プローブ。
【請求項１９】
核酸がＤＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２０】
核酸がＲＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２１】
核酸がＰＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２２】
請求の範囲第１０項に記載の二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＤＮＡを検出する方法。
【請求項２３】
請求の範囲第１１項に記載の二本鎖ＲＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＲＮＡを検出する方法。
【請求項２４】
請求の範囲第１２項に記載の二本鎖ＰＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＰＮＡを検出する方法。
【請求項２５】
請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２６】
請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２７】
請求の範囲第１５項に記載のＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２８】
請求の範囲第１７項に記載の蛍光標識剤を含有してなる分子種又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカー、及び標的分子測定用の資材を含んでなる標的分子測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、希土類蛍光錯体を含有してなるシリカ粒子、より詳細には希土類蛍光錯体を実質的にシリカ粒子の内部層に選択的に含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子、さらに詳細には希土類蛍光錯体をシリカ粒子の内部層に選択的に含有し、かつ表面が実質的にシリカからなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子、該シリカ粒子を含んでなる蛍光標識剤および該シリカ粒子を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法及び蛍光測定法用試薬に関する。
【背景技術】  従来から、生体試料中の微量分析の分析法として、抗原−抗体反応を利用したイムノアッセイや、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどがよく利用されている。これらの分析方法においては、抗体、ＤＮＡなどを標識する標識剤を使う必要があり、高感度検出を可能にする標識剤として、蛍光による標識、放射性同位体による標識、酵素による標識等がよく用いられている。
放射性同位体による標識は高感度ではあるが、貯蔵、使用、処理に際して危険を伴う欠点がある。また、酵素による標識は、酵素の分子量が大きく、温度などの外的要因による影響を受けやすく不安定であり、再現性に劣るという問題点や、酵素標識剤を被標識物に結合させることにより、酵素および被標識物の活性が低下してしまうという欠点がある。
また、蛍光による標識法としては、有機蛍光色素による標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロライドなど）が知られているが、励起光の散乱によるバックグラウンドノイズやサンプル中に存在する他の共存物質の蛍光に由来するバックグラウンドノイズにより標識剤からの蛍光検出が大きく阻害され、高感度の測定が困難になるという欠点がある。
蛍光による標識方法としては、この他に、希土類蛍光錯体による標識が知られている。希土類蛍光錯体は、長い蛍光寿命（通常の有機の蛍光物質が持つ数ナノ秒の蛍光寿命に比べ、希土類蛍光錯体は数十から数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ）、大きなストークスシフト、シャープな蛍光発光ピークという特性を有している。この特性を生かし時間分解測定を用いて、励起光や共存物質に由来する短寿命のバックグラウンドノイズを除去することで高感度測定が可能になる。かかる特性により、希土類蛍光錯体を標識剤とした時間分解測定法が既に開発されている。
本発明者らはすでに多くの希土類蛍光錯体標識剤を開発し、それらを用いた時間分解測定法への応用を検討してきた。しかし、被標識物との結合基を有する錯体の合成は反応ステップが多くなり、困難を伴い、合成された錯体は結合基の性質によって大きく変化する場合もある。また、錯体のキレート力が十分でない場合には、使用できる緩衝液の種類に制限があるという欠点がある。さらに、被標識物の結合部位が少ない場合には被標識物の分子当たりの希土類蛍光錯体標識剤の分子数は制限され、感度の向上には限界がある。
一方、ＤＮＡの分析においては、ＤＮＡプローブ法がよく用いられている。この方法は２種あるいはそれ以上の標識剤を用いて標準試料と検体とを標識し、これらを同一プローブＤＮＡに与え、競合的ハイブリダイゼーションの結果によって検体中のＤＮＡ量を定量している。しかしこの方法では、検体に対し標識剤を導入する必要があり、この操作の結果として検体中のターゲット配列の存在比が変化する可能性が生じる。また、標識剤の導入によってＤＮＡの二本鎖形成能が低下し、遺伝子の変異や多型の診断に間違った結果を与えるおそれがある。
また、蛍光発光体はプラズマディスプレイパネル（ＰＤＰ）などの３原色の発光体として、希土類金属だけでなく、カルシウム、亜鉛、マンガンなどの金属イオンが使用されている。これらの発光体はパネル用のものであるから、蛍光発光強度だけでなく機械的な強度や持続性が必要とされるためにいろいろな工夫がなされている。例えば、粒子径が５〜２０μｍで比表面積が１００〜８００ｍ２／ｇのシリカ粒子の表面をこれらの蛍光性の金属イオンによるケイ酸塩として使用する蛍光発光体（特許文献１参照）、酸化亜鉛微粒子をシリカ粒子に内包させた蛍光発光体（特許文献２参照）、比表面積が１００ｍ２／ｇ以下で、アルコキシシランを加水分解してなるシリカ粒子に有機カルボン酸を含有させてなる蛍光発光体（特許文献３参照）、シリカなどの無機物質の表面に蛍光体を担持されたもの（特許文献４参照）、発光体粒子の表面を屈折率が１．４３５以上のシリカ膜で被覆したもの（特許文献５及び６参照）、シリカの３次元構造の少なくとも一部を有機物質で置換した有機−無機複合型マトリックス構造に、ＥｕやＴｂなどの希土類錯体をゾル−ゲル法により導入してなる蛍光体（特許文献７参照）などが報告されている。
また、シリカ粒子自体は、ＤＮＡやタンパク質などの担体としても広く利用されており、例えば、シリカなどの無機微粒子の表面を架橋された樹脂で被覆し、これにＤＮＡなどを固定化する方法（特許文献８参照）などがある。さらに、標識用の錯体の配位子をシリカなどの個体支持体の表面に固定化し、これに金属類を結合させる方法（特許文献９参照）などが報告されている。
しかしながら、特許文献１〜７に記載の蛍光体は、粒子全体に蛍光体が分布しているものであり、蛍光体の寿命や機械的強度などの改善を目的としたＰＤＰなどの蛍光体として利用されるものである。このような蛍光体は、蛍光体物質が粒子の表面まで分布しており、緩衝液などの外部の環境の影響を受けやすく、また粒子表面にＤＮＡやタンパク質などを担持させるため反応性の官能基の存在が少ないので、標識用の蛍光粒子としては適さないものであった。
本願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがあり、これは参照して本明細書中に取り込まれる。
１．特開２００３−２１３２５４号
２．特開２００３−２０１４７３号
３．特開２００３−１５５４７８号
４．特開２００２−１８００４１号
５．特開２００２−６９４４２号
６．特開２００１−５５５６７号
７．特開平０９−２２７８６１号
８．特開２００１−１８３３７８号
９．特表平０９−５０５０６１号
【発明の開示】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、内部に多数の希土類蛍光錯体を含み、緩衝液、被標識物等の外部の環境の影響を受けないという特徴を有する新規なシリカ粒子と、該シリカ粒子を含んでなる蛍光標識剤および該シリカ粒子を標識剤として用いる蛍光標識方法、並びに、該蛍光標識剤を用いた蛍光測定法等を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明のＢＰＴＡ−Ｔｂ錯体を含むシリカ粒子の蛍光スペクトルを示す図である。分散液中のシリカ粒子の濃度＝０．１ｍｇ／ｍｌ、水中。励起波長＝３２０ｎｍ
第２図は、本発明のＢＰＴＡ−Ｔｂ錯体を含むシリカ粒子（第２図の右側）、及びＢＰＴＡ−Ｔｂ錯体の溶液の各種ｐＨ緩衝液中における蛍光強度に与える影響を調べた結果を示すものである。
第３図は、本発明のＢＴＴＡ−Ｅｕ錯体を含むシリカ粒子の蛍光スペクトルを示す図である。分散液中のシリカ粒子の濃度＝０．１ｍｇ／ｍｌ、水中。励起波長＝３４０ｎｍ
第４図は、本発明のシリカ粒子で標識化されたＤＮＡの時間分解蛍光測定で得られた蛍光強度を示す図である。
第５図は、本発明のＢＴＴＡ−Ｅｕ錯体を含むシリカ粒子の走査型電子顕微鏡写真である。粒子は白金パラジウムを用いて被覆してある。
第６図は、本発明の表面修飾をしていないシリカ粒子で標識化されたＤＮＡの時間分解蛍光測定で得られた蛍光強度を示す図である。
第７図は、本発明の表面に二価性インターカレーターを導入したシリカ粒子で標識化されたＤＮＡの時間分解蛍光測定で得られた蛍光強度を示す図である。
第８図は、本発明の表面に一価性インターカレーターを導入したシリカ粒子で標識化されたＤＮＡの時間分解蛍光測定で得られた蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、シリカ粒子の内部に選択的に蛍光物質が存在し、蛍光物質が存在する内部構造の外側に実質的にシリカからなる表面層を有する構造からなる蛍光物質を内包するシリカ粒子を簡便な手法で得られることを見出した。
即ち、本発明は、希土類蛍光錯体を含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子、より詳細には希土類蛍光錯体を実質的にシリカ粒子の内部層に選択的に含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子、さらに詳細には、本発明は、希土類蛍光錯体を実質的にシリカ粒子の内部層に選択的に含有し、且つ表面が実質的にシリカからなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に関する。また、本発明は、テトラアルコキシオルトシリケートを希土類蛍光錯体の存在下で、エマルジョン重合させてなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の製造方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子からなる蛍光標識剤、当該希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の表面に核酸プローブが結合してなる蛍光標識化核酸プローブ、当該希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＤＮＡを検出する方法、及び前記した本発明の蛍光標識剤又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカー、及び標的分子測定用の資材を含んでなる標的分子測定用キットに関する。
本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子は、従来のゾル−ゲル法などの方法によって製造される蛍光発光体のように、シリカ粒子の全体にほぼ均一に蛍光物質が配合されているシリカ粒子とは異なり、シリカ粒子の内部に多くの希土類蛍光錯体が選択的に取り込まれているものであり、粒子の表面付近は実質的にシリカがそのまま存在しているものである。このために、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子は、内部の蛍光錯体が外部環境の影響を受けないこと、また、粒子の表面に標識される物質（被標識物）と結合できる活性置換を容易に導入することができること、さらに粒子の表面にインターカレーター分子を導入することで二本鎖ＤＮＡを直接標識可能なものである。
本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子は、実質的に希土類蛍光錯体を含有する内部層と、実質的にシリカからなり希土類蛍光錯体を実質的に含有していないシリカ表面層の２層構造を有することを特徴とするものである。希土類蛍光錯体は、シリカ粒子の内部又は表面などの粒子中のいかなる場所に存在してもよいが、希土類蛍光錯体が蛍光錯体としての機能を発揮する部位がシリカ粒子の内部であることが好ましい。本発明においては希土類蛍光錯体が、シリカ粒子の内部層で蛍光錯体としての機能を発揮できる場合を、実質的に希土類蛍光錯体がシリカ粒子の内部層に存在するという。
本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子は、前記したような２層構造を形成できる各種の手法で製造することができ、例えば、テトラアルコキシオルトシリケートなどのシリカ材料を希土類蛍光錯体の存在下で、エマルジョン重合させる方法が簡便で、かつ効率的に目的の２層構造を形成させることができ、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の好ましい製造方法としてあげることができる。
例えば、水非混和性の有機溶媒及び水の混合系に、界面活性剤を加え、テトラアルコキシオルトシリケートなどのシリカ材料を加えて、超音波処理などにより乳化させる。このようにして得られる乳化液をＩ液とする。そして、ＩＩ液として、触媒及び希土類蛍光錯体を含有する乳化液を同様に調製する。そして、Ｉ液とＩＩ液とを混合して、エマルジョン重合させて製造することができる。
Ｉ液における水非混和性の有機溶媒としては、界面活性剤の存在下で水と乳化液を形成できるものであればよいが、さらにテトラアルコキシオルトシリケートなどのシリカ材料の溶媒となるものが好ましい。Ｉ液における水非混和性の有機溶媒の例としては、シクロヘキサン、ヘキサン、オクタン、ヌジョールなどの炭化水素系溶媒、ヘキサノール、ヘプタノールなどの脂肪族アルコールなどの１種又は２種以上の混合物が挙げられる。乳化するための界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤のいずれでもよいが、トリトンＸ、ベリジュ（Ｂｒｉｊ．）などの非イオン性界面活性剤が好ましい。界面活性剤の使用量は乳化に必要な量であればよい。
Ｉ液は、水非混和性の有機溶媒及び界面活性剤の混合液に水を加えて、乳化し、これにテトラアルコキシオルトシリケートなどのシリカ材料を加えて調製される。使用されるシリカ材料としては、触媒の存在下にエマルジョン重合によりシリカ粒子を形成できるものであれば、特に制限はないが、テトラアルコキシオルトシリケートが好ましいシリカ材料として挙げられる。テトラアルコキシオルトシリケートのアルコキシ基としては炭素数１〜８、好ましくは炭素数１〜５程度の分枝状又は直鎖状の低級アルコキシ基が好ましい。テトラアルコキシオルトシリケートにおける４個のアルコキシ基は同じであるのが好ましいが、必ずしも同じものである必要はない。好ましいアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基などが挙げられ、具体的には、テトラエトキシオルトシリケート、テトラメトキシオルトシリケートなどが挙げられる。
ＩＩ液は、希土類蛍光錯体と触媒を含有する乳化液であり、Ｉ液と同様な組成の乳化液が好ましい。Ｉ液と同様な方法により乳化液とすることができ、例えば、希土類蛍光錯体と触媒の水溶液と、前記Ｉ液で示した水非混和性の有機溶媒及び界面活性剤の混合液を混合し、これを撹拌や超音波処理などにより乳化するのが好ましい。この場合の水非混和性の有機溶媒や界面活性剤は、前記したＩ液と同じものを使用するのが好ましい。
Ｉ液とＩＩ液の混合法は、Ｉ液にＩＩ液を徐々に添加する方法が好ましい。この方法によれば、シリカ材料の乳化液中に希土類蛍光錯体と触媒とが少量ずつ添加されることになり、希土類蛍光錯体の取り込みとオルトシリケートの重合が、大過剰のアルコキシオルトシリケートの中の界面で行われるために、本発明のシリカ粒子を簡便に、かつ小粒子径（ナノオーダー）で得ることができる。
ここで使用される触媒としては、酸又は塩基でシリカ材料を重合させることができるものであれば特に制限はないが、希土類蛍光錯体と安定に共存できるものが好ましい。このような触媒としては、具体的には、アンモニア、水酸化ナトリウムなどの無機塩基や、塩酸、硫酸などの無機酸が挙げられる。
本発明の希土類蛍光錯体としては、希土類金属を中心元素として蛍光を発するものであれば特に制限はないが、長い蛍光寿命（通常の有機の蛍光物質が持つ数ナノ秒の蛍光寿命に比べ、希土類蛍光錯体は数十から数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ）、大きなストークスシフト、シャープな蛍光発光ピークという特性を有し、標識剤として時間分解測定法が利用できる希土類蛍光錯体が好ましい。好ましい希土類蛍光錯体としては、次の一般式（１）〜（６）
2005023961.tif 000002
2005023961.tif 000003
（式（１）〜（６）中、ｎは１〜４の整数を示し、Ｒは置換基を有してもよいアリール基を示し、Ｒ’は水素原子、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、又はイソチオシアネト基を示す。）
で示される配位子や、次に挙げられる
2005023961.tif 000004
構造を有する配位子などと希土類元素からなる希土類蛍光錯体などが挙げられる。また、次式
2005023961.tif 000005
で表される化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を配位子とすることもできる。
本発明は、前記してきた化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を、本発明の希土類蛍光錯体の配位子として使用することを特徴のひとつとするものでもある。
本発明の希土類蛍光錯体における希土類金属としては、テルビウム又はユウロピウム、より詳細にはテルビウムイオン又はユウロピウムイオンが挙げられる。
式（２）、及び式（４）〜式（６）におけるアリール基としては、１個又は２個以上の単環、多環、又は縮合環式の５又は６員の芳香環からなる基であり、当該芳香環は１個以上の窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子からなる異種原子を環中に有することもできる基である。好ましいアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ピリジル基、イミダゾリル基などが挙げられる。これらのアリール基の置換基としては、炭素数１〜８、好ましくは炭素数１〜５程度の分枝状又は直鎖状の低級アルキル基、炭素数１〜８、好ましくは炭素数１〜５程度の分枝状又は直鎖状の低級アルコキシ基、塩素、フッ素、臭素などのハロゲン、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、スルホン酸基などが挙げられる。また、式（３）におけるＲ’基は、ピリジン環の置換基であり、置換基を有する場合には、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、イソチオシアネト基などの置換基を有することもできる。
さらに、具体的には、例えば、希土類蛍光錯体として、テルビウムイオンと有機配位子Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−［２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−フェニルピリジン］テトラキス酢酸（Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−［２，６−ｂｉｓ（３’−ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−１’−ｐｙｒａｚｏｌｙｌ）−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ］ｔｅｔｒａｋｉｓ（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））（前記一般式（２）の置換基Ｒがフェニル基のもの。以下、ＢＰＴＡと略す。）とからなるテルビウム蛍光錯体蛍光（以下、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋と略す。）が挙げられ、ＢＰＴＡ、及びそれのＮ−ヒドロキシ琥珀酸イミドモノエステル（ＮＨＳ−ＢＰＴＡと略す）の合成は、本発明者らの報告した方法（Ｊ．Ｙｕａｎ，Ｇ．Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｍａｊｉｍａ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，７３，１８６９）に準じて行うことができる。ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋の化学構造を次に示す。
2005023961.tif 000006
ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋を含有する本発明のシリカ粒子の蛍光特性を、シリカ粒子の分散液の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌで励起波長が３２０ｎｍで調べた結果を第１図に示す。第１図の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。その結果、本発明のシリカ粒子は、導入したＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋とほぼ同様の蛍光スペクトルを示すことがわかった。
次に、本発明のシリカ粒子の安定性について検討した。ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋を含有する本発明のシリカ粒子を１５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５ｍＭトリス−塩酸５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１×ＳＳＣ、１×ＰＢＳ、１×ＴＥ、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）などの各種のｐＨの緩衝液に分散し、１．０ｍｇ／ｌの分散液をそれぞれ調製し、これらの分散液の時間分解蛍光測定を行った。対照として同じ緩衝液におけるＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋溶液を用いた。結果を第２図に示す。第２図縦軸は蛍光強度を示し、横軸の左側はＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋溶液の場合を示し、右側は本発明のシリカ粒子の場合を示す。各６本の棒グラフは、左側から、（ｉ）１５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）（黒塗り）、（ｉｉ）１５ｍＭトリス−塩酸５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（ドットで示される灰色部分）、（ｉｉｉ）１×ＳＳＣ緩衝液（濃い灰色）、（ｉｖ）１×ＰＢＳ緩衝液（右下斜線）、（ｖ）１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）（少し薄い灰色）、（ｖｉ）１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）（波線模様）をそれぞれ示す。測定条件は励起波長＝３２０ｎｍ、測定波長＝５４５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．５ｍ秒、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．４ｍ秒、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍ秒であった。
この結果、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋溶液（第２図に左側）では、特に１×ＰＢＳ、１×ＴＥ、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で蛍光強度の急激な減少が観測されたが、本発明のシリカ粒子の蛍光はほぼ一定の値を示し、希土類蛍光錯体が粒子内部に存在し、緩衝液等の外部環境の影響から完全に保護されていることが示された。
また、ユウロピウムイオンと次式、
2005023961.tif 000007
で表される前記式（２）のＲ基がビフェニル基である、２，２’，２’’，２’’’−［４’−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）四酢酸（以下、ＢＴＴＡと略す。）を有機配位子とする次式、
2005023961.tif 000008
で表される蛍光錯体蛍光（以下、ＢＴＴＡ−Ｅｕ３＋と略す。）が挙げられる。
ＢＴＴＡ−Ｅｕ３＋を含有する本発明のシリカ粒子の蛍光特性を、シリカ粒子の分散液の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌで励起波長が３４０ｎｍで調べた結果を第３図に示す。第３図の横軸は波長（ｎｍ）を示し、縦軸は蛍光強度を示す。その結果、本発明のシリカ粒子は、導入したＢＴＴＡ−Ｅｕ３＋とほぼ同様の蛍光スペクトルを示すことがわかった。
本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の表面は、実質的にシリカからなり、内部の希土類蛍光錯体を外部環境から保護すると同時に、シリカ粒子の表面には各種の化合物と結合可能な官能基を有していることを特徴とするものである。このような官能基を使用して標識される物質（被標識物）を直接結合させることも可能であるが、シリカ粒子の表面の官能基に標識される物質との結合基を導入して結合させることもできる。このような結合基としては、シアノ基、アルキルアミノ基、アルカンチオール基、アルキルカルボキシル基、アルキルアルデヒド基などの各種の官能基が挙げられる。これらのアルキル基を有する官能基類は、シリカ粒子の表面のケイ素原子とアルキル基を介して、Ｓｉ−アルキルアミンや、Ｓｉ−アルカンチオールのような構造でシリカ粒子の表面に結合している。
本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の表面に、前記したような結合基を介して、又は直接各種の分子を結合させることができる。このような分子種としては、抗体、抗原、受容体、核酸プローブなどの特異的結合が可能な分子種が挙げられる。例えば、核酸プローブとして、１０〜５０塩基、１０〜３０塩基、又は１０〜２５塩基程度の長さのＤＮＡ又はＲＮＡ分子を本発明のシリカ粒子の表面に結合させておき、被検出核酸とハイブリダイズさせることにより、ハイブリダイズした核酸プローブを蛍光標識により検出ことができる。したがって、本発明は、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の表面にＤＮＡやＲＮＡなどの核酸プローブが結合してなる蛍光標識化核酸プローブを提供するものである。
また、シリカ表面にインターカレーター分子を直接又は前記したような結合基を用いて導入することができる。このようなインターカレーター分子は、核酸類の二本鎖ハイブリッドに特異的にインターカレーションでき、二本鎖になったＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ＰＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＰＮＡ／ＲＮＡを特異的に標識することが可能になる。例えば、被検出ＤＮＡとプローブＤＮＡをハイブリダイズさせ、本発明のシリカ粒子又はインターカレーターが導入されたシリカ粒子を添加することにより、ハイブリダイズが生起したか否かを容易に検出することが可能になる。したがって、本発明は本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子又はインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、核酸類の二本鎖ハイブリッドを検出する方法を提供するものである。
このようなインターカレーター分子としては、以下のような分子を例示することができる。
2005023961.tif 000009
前記式中のＲ基は、シリカ粒子に結合するためのリンカー部分を示す。このようなリンカーとしては、ポリエーテル、ポリエチレンポリアミン類、アルキレン基などが挙げられる。より詳細には例えば、次式で示されるリンカーを有するインターカレーター分子が挙げられる。
2005023961.tif 000010
このインターカレーター分子を、結合基としてシアノ基を用いて、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋を含有する本発明のシリカ粒子の表面に固定化した。このシリカ粒子１ｍｇを緩衝液に分散させ、これを２本鎖ＤＮＡが固定されているマイクロタイタープレートに加え、時間分解蛍光測定をした。対照として２本鎖ＤＮＡが固定化されていないマイクロタイタープレートをブランクとして用いた。結果を第４図に示す。第４図の左側２本は、２本鎖ＤＮＡが固定されているマイクロタイタープレートの場合を示し、右側の２本はブランクの場合を示す。第４図の縦軸は蛍光強度（ａ．ｕ．）を示す。測定条件は励起波長＝３２０ｎｍ、測定波長＝５４５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．５ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．４ｍｓ、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍｓであった。
この結果、本発明のシリカ粒子にインターカレーター分子を結合させた蛍光標識によりハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡを極めて明瞭に検出することができることがわかった。
このように、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子は、当該希土類蛍光錯体含有シリカ粒子の表面に標識される物質（被標識物）を結合させるための結合基や、インターカレーター分子などを結合させることができ、したがって、本発明は、本発明のシリカ粒子の表面に前記した結合基やインターカレーター分子が導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を提供するものである。
さらに、粒子との反応部位を２箇所有する二価性のインターカレーターと比べ、反応部位が１箇所のみの一価性のインターカレーター分子用いることで、非特異的吸着によるバックグラウンドノイズを減少させることが出来る。このようなインターカレーター分子としては次式で示されるインターカレーター分子が挙げられる。
2005023961.tif 000011
本発明は、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子をそのまま、又は前記した結合基を介して特異的結合をすることが可能な各種の分子種と結合させることができ、これらの分子種の蛍光標識剤として使用できる。したがって、本発明は、前記した本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子からなる蛍光標識剤を提供するものである。
本発明の蛍光標識剤は、通常の蛍光標識剤と同様に使用することができるが、表面が実質的にシリカであるシリカ粒子であるから、固定化用の担体としての機能も有するものであるが、粒子としての流動性も有するものである。
さらに、本発明の希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を含有してなる蛍光標識剤は、抗体、抗原、受容体、核酸プローブなどの特異的結合が可能な分子種と結合させて、マーカー、詳細には蛍光マーカーとして使用することができる。
そして、本発明の蛍光標識剤を含有してなる分子種又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカーを用いて、標的分子を測定することができる。このような測定方法としては、通常の蛍光測定法や、希土類蛍光錯体の特性を生かした時間分解測定法などが挙げられる。また、本発明の蛍光標識剤を含有してなる分子種又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカーを用いた標的分子の測定に必要となる、緩衝液や容器などの標的分子測定用の資材を合わせて標的分子測定用のキットとすることができる。したがって、本発明は、蛍光標識剤を含有してなる分子種又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカー、及び標的分子測定用の資材を含んでなる標的分子測定用キットを提供するものである。
なお、特願２００３−３１６００６明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【実施例】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−｛２，６−ビス（３’−アミノメチル−１’−ピラゾリル）−４−フェニルピリジン｝四酢酸（ＢＰＴＡと略す。）テルビウム錯体を含むシリカ粒子の合成
シクロヘキサン７．５ｍｌ、ｎ−ヘキサノール１．８ｍｌ、界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３．５４ｍｌを混合し、これにイオン交換水３４０μｌを加え超音波照射しエマルションを形成させた。これにテトラエチルオルトシリケート５０μｌを加え、Ｉ液とした。ＢＰＴＡ２．０ｍｇ、塩化テルビウム六水和物１．５ｍｇをイオン交換水２８０μｌ、アンモニア水６０μｌに溶解した。これをシクロヘキサン７．５ｍｌ、ｎ−ヘキサノール１．８ｍｌ、界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）３．５４ｍｌの混合溶液に加え超音波照射しエマルションを形成させ、ＩＩ液とした。Ｉ液にＩＩ液を撹拌しながら滴下し、その後さらに室温で２０時間撹拌した。反応混合液にアセトンを加え、遠心分離により粒子を得た。この粒子をエタノール及び水でそれぞれ３回ずつ洗浄し、残留した界面活性剤及び表面に吸着した錯体を完全に除去した。減圧乾燥して白色の粒子１０ｍｇを得た。
［実施例２］
２，２’，２’’，２’’’−［４’−ビフェニル−２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６，６’’−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）四酢酸（ＢＴＴＡと略す。）ユウロピウム錯体を含むシリカ粒子の合成
シクロヘキサン７．５ｍｌ、ｎ−ヘキサノール１．８ｍｌ、界面活性剤（Ｂｒｉｊ−９７）１．３４ｇを混合し、これにイオン交換水１．３６ｍｌを加え超音波照射しエマルションを形成させた。これにテトラエチルオルソシリケート１００μｌを加え、Ｉ液とした。ＢＴＴＡ１２ｍｇ、塩化テルビウム六水和物８．０ｍｇをイオン交換水１．２４ｍｌ、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１２０μｌに溶解した。これをシクロヘキサン７．５ｍｌ、ｎ−ヘキサノール１．８ｍｌ、界面活性剤（Ｂｒｉｊ−９７）１．３４ｇの混合溶液に加え超音波照射しエマルションを形成させ、ＩＩ液とした。Ｉ液を撹拌し、これにＩＩ液を滴下し、その後室温で２０時間撹拌した。反応混合液にアセトンを加え、遠心分離により粒子を得た。この粒子をエタノール及び水でそれぞれ３回ずつ洗浄し、残留した界面活性剤及び表面に吸着した錯体を完全に除去した。減圧乾燥して白色の粒子１０ｍｇを得た。
［実施例３］
実施例１で得られたシリカ粒子を１５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５ｍＭトリス−塩酸５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１×ＳＳＣ緩衝液、１×ＰＢＳ緩衝液、１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に分散し、１．０ｍｇ／ｌの分散液をそれぞれ調製した。これらの溶液をマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、蛍光測定を行った。
対照実験として、ＢＰＴＡ−Ｔｂ３＋を１５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１５ｍＭトリス−塩酸５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１×ＳＳＣ緩衝液、１×ＰＢＳ緩衝液、１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に１０−８Ｍとなるように調製し、これらの溶液をマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、蛍光測定を行った。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＡＲＶＯ−ＳＸ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ｗａｌｌａｃ社製）であり、測定条件は励起波長＝３２０ｎｍ、測定波長＝５４５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．５ｍ秒、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．４ｍ秒、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍ秒であった。
以上の、この測定で得られた蛍光強度を第２図に示した。第２図の左側は対照実験の結果を示し、右側は本発明のシリカ粒子の場合を示す。対照例においては、特に１×ＰＢＳ緩衝液、１×ＴＥ緩衝液、１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．１）中で蛍光強度の減少が観測された。一方でシリカ粒子の蛍光はほぼ一定の値を示し、希土類蛍光錯体が粒子内部に存在し、緩衝液等の外部環境の影響から保護されていることが示された。
［実施例４］  シリカ粒子の蛍光特性の評価
実施例１及び２で得られたシリカ粒子をイオン交換水に分散し、０．１ｍｇ／ｍｌの分散液を調製した。この溶液を用いて蛍光スペクトルを、それぞれ第１図及び第３図に示した。得られたスペクトルは、導入した希土類蛍光錯体のスペクトルとほぼ同様であり、溶液中の特徴を保持したまま粒子中に取り込まれていることがわかった。
［実施例５］  シリカ粒子表面へのシアノ基の導入
実施例１及び２で得られたシリカ粒子を２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液９．０ｍｌに分散させ、これに臭化シアン１．０ｇのアセトニトリル溶液０．５ｍｌを加え、室温で１０分間撹拌した。遠心分離により粒子を分離した後、冷水及びＰＢＳ緩衝液でそれぞれ２回ずつ洗浄し、白色の粒子を得た。
［実施例６］  シリカ粒子表面へのインターカレーターの導入
実施例５で得られたシアノ化したシリカ粒子をＰＢＳ緩衝液１ｍｌに分散し、これに１０Ｍインターカレーター（Ｎ，Ｎ’−ビス（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）−１，４，５，８−テトラカルボキシジイミドナフタレントリフルオロ酢酸塩）のＰＢＳ溶液１０ｍｌを加え、室温で１５時間放置した。その後、遠心分離により反応液を除去し、０．１ＭグリシンＰＢＳ溶液１．０ｍｌを加え、室温で１時間撹拌した。遠心分離により粒子を分離した後、ＰＢＳ緩衝液で２回ずつ洗浄し、淡茶色の粒子を得た。
［実施例７］  本発明に係るシリカ粒子を用いたＤＮＡの標識
実施例６で得られたシリカ粒子を用いて９６穴マイクロタイタープレート上に固定したＤＮＡの標識実験を行った。具体的な操作法は次の通りである。
（ｉ）ＤＮＡの固定化：二本鎖ＤＮＡ（ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ）を固定用緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１５０ｍＭ  塩化マグネシウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に溶解し、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を調製した。マイクロタイタープレートの各ウェルにＤＮＡ溶液を１００μｌずつ加え、室温で一晩置いた。固定用緩衝液で一回洗浄した後、固定を確実にするためにＵＶ照射（２５４ｎｍ、１６００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。
（ｉｉ）マイクロタイタープレートのブロッキング：ブロッキング溶液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％アジ化ナトリウム）をマイクロタイタープレートの各ウェルに１００ｍｌずつ加え、遮光下室温で１時間置いた後、０．０１×ＳＳＣ緩衝液で３回洗浄した。
（ｉｉｉ）ＤＮＡの標識：実施例４で得られたテルビウム錯体を含むシリカ粒子１ｍｇを１×ＳＳＣ緩衝液６００μｌに分散させ、これをマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、遮光下室温で２時間置いた後、１×ＳＳＣ緩衝液で７回洗浄し、蛍光測定に用いた。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＡＲＶＯ−ＳＸ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ｗａｌｌａｃ社製）であり、測定条件は励起波長＝３２０ｎｍ、測定波長＝５４５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．５ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．４ｍｓ、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍｓであった。
以上の測定で得られた蛍光強度とブランクとしてＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を第４図に示した。
［実施例８］
実施例２で得られた粒子の形状を走査型電子顕微鏡で観察した。粒子の大きさはほぼ８０ｎｍであった。得られた画像を第５図に示した。
［実施例９］  シリカ粒子表面へのインターカレーターの導入（２）
実施例５で得られたシアノ化したシリカ粒子を０．１Ｍ炭酸緩衝液５ｍｌに分散し、これに２００ｍＭインターカレーター（Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）−Ｎ’−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−１，４，５，８−テトラカルボキシジイミドナフタレントリフルオロ酢酸塩）の０．１Ｍ炭酸緩衝液２５０ｍｌを加え、室温で１５時間放置した。その後、遠心分離により反応液を除去し、１ＭグリシンＰＢＳ溶液１．０ｍｌを加え、室温で１時間撹拌した。遠心分離により粒子を分離した後、ＰＢＳ緩衝液で２回ずつ洗浄し、淡黄色の粒子を得た。
［実施例１０］  本発明に係るシリカ粒子を用いたＤＮＡの標識（１）
実施例１で得られたシリカ粒子を用いて９６穴マイクロタイタープレート上に固定したＤＮＡの標識を行った。具体的な操作法は次の通りである。
（ｉ）ＤＮＡの固定化：二本鎖ＤＮＡ（ｓａｌｍｏｎ  ｔｅｓｔｅｓ）を固定用緩衝液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１５０ｍＭ  塩化マグネシウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に溶解し、２５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を調製した。マイクロタイタープレートの各ウェルにＤＮＡ溶液を１００μｌずつ加え、室温で一晩置いた。固定用緩衝液で一回洗浄した後、固定を確実にするためにＵＶ照射（２５４ｎｍ、１６００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。一本鎖ＤＮＡは、上述の二本鎖ＤＮＡを固定用緩衝液に溶解したものを、９５度、１０分間加熱し、急冷することで熱変性を行った試料を用いて二本鎖ＤＮＡと同様の操作で固定した。
（ｉｉ）マイクロタイタープレートのブロッキング：ブロッキング溶液（１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、２％牛血清アルブミ（ＢＳＡ）、１％アジ化ナトリウム）をマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、遮光下室温で１時間置いた後、０．０１×ＳＳＣ緩衝液で３回洗浄した。
（ｉｉｉ）アルカリ変性：一本鎖ＤＮＡについては、ブロッキングの操作の後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を各ウェルに１００ｍｌずつ加え、室温で２０分間放置した後、４度に冷却した１×ＳＳＣ緩衝液で３回洗浄した。
（ｉｖ）ＤＮＡの標識：実施例６で得られたテルビウム錯体を含むシリカ粒子１ｍｇを１×ＳＳＣ緩衝液６００ｍｌに分散させ、これをマイクロタイタープレートの各ウェルに１００ｍｌずつ加え、遮光下室温で５分間置いた後、１×ＳＳＣ緩衝液で７回洗浄し、蛍光測定に用いた。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＡＲＶＯ−ＳＸ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ｗａｌｌａｃ社製）であり、測定条件は励起波長＝３２０ｎｍ、測定波長＝５４５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．５ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．４ｍｓ、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍｓであった。
以上の測定で得られた蛍光強度を第６図に示した。
［実施例１１］  本発明に係るシリカ粒子を用いたＤＮＡの標識（２）
実施例６で得られたシリカ粒子を用いて９６穴マイクロタイタープレート上に固定したＤＮＡの標識を行った。具体的な操作法は実施例１０と同様である。測定で得られた蛍光強度とブランクとしてＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を第７図に示した。
［実施例１２］  本発明に係るシリカ粒子を用いたＤＮＡの標識（３）
実施例９で得られたシリカ粒子を用いて９６穴マイクロタイタープレート上に固定したＤＮＡの標識を行った。具体的な操作法は次の通りである。
（ｉ）ＤＮＡの固定化：二本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８  ＲＦ  ＤＮＡ、タカラバイオ株式会社）又は一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ、タカラバイオ株式会社）を固定用緩衝液（２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液、１５０ｍＭ  塩化マグネシウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）に溶解し、１０μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を調製した。マイクロタイタープレートの各ウェルにＤＮＡ溶液を１００μｌずつ加え、３７度で一晩置いた。固定用緩衝液で一回洗浄した後、固定を確実にするためにＵＶ照射（２５４ｎｍ、１６００ｍＪ／ｃｍ２）を行った。
（ｉｉ）ＤＮＡの標識：実施例９で得られたユウロピウム錯体を含むシリカ粒子１ｍｇを１×ＳＳＣ緩衝液２．５ｍｌに加え、超音波照射を５分間行い分散させ、これをマイクロタイタープレートの各ウェルに１００μｌずつ加え、遮光下室温で１０分間置いた後、１×ＳＳＣ緩衝液で９回、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液で９回洗浄し、蛍光測定に用いた。
本測定に用いた時間分解蛍光測定装置はＡＲＶＯ−ＳＸ  １４２０時間分解蛍光測定装置（ｗａｌｌａｃ社製）であり、測定条件は励起波長＝３４０ｎｍ、測定波長＝６１５ｎｍ、遅延時間（Ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ）＝０．１ｍｓ、ウインドウ時間（Ｗｉｎｄｏｗ  ｔｉｍｅ）＝１．５ｍｓ、サイクル時間（Ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）＝２．０ｍｓであった。
以上の測定で得られた蛍光強度とブランクとしてＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を第８図に示した。
【産業上の利用可能性】  本発明は、被標識物（例えば、生体由来物質、生理活性物質等）との結合基を表面に有し、内部に希土類蛍光錯体を含むシリカ粒子からなる標識試薬を提供するものである。該粒子内の錯体は外部の環境からの影響を受けず、被標識物との結合基はシリカ表面に導入できるため、これまで、結合基の導入の困難さ、結合基の導入による蛍光強度の極端な低下、キレート力の不足による希土類金属の解離などの要因により標識剤として使用できなかった希土類蛍光錯体をも標識剤として利用することが可能となる。さらに、粒子中に多くの蛍光錯体を含むため、錯体を直接標識する場合に比べ強い蛍光強度がえられる。
また、本発明に係るインターカレーターを導入した蛍光標識剤は、二本鎖ＤＮＡを特異的に標識することができＤＮＡチップ等に直接応用可能である。
本発明は、蛍光標識をシリカ粒子の内部に閉じこめた蛍光標識用の蛍光物質含有シリカ粒子を提供するものである。本発明のシリカ粒子からなる蛍光標識剤は、各種の蛍光測定用の蛍光標識剤として使用することができるものであり、従来の蛍光標識剤と同様に使用できるだけでなく、シリカ粒子としての担体としての機能も有し、かつ蛍光物質がシリカ粒子の内部に閉じこめられているために、標識用の蛍光物質は外部の環境に左右されず安定に存在することができる。
したがって、本発明のシリカ粒子、及びそれを用いた蛍光標識剤、それを用いた測定方法等は、各種の蛍光測定用標識剤として有用であり産業上の利用性を有するものである。
【図１】
2005023961.tif 000016
【図２】
2005023961.tif 000017
【図３】
2005023961.tif 000018
【図４】
2005023961.tif 000019
【図５】
2005023961.tif 000020
【図６】
2005023961.tif 000021
【図７】
2005023961.tif 000022
【図８】
2005023961.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月7日(2005.7.7)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】シリカ粒子の内部に多くの希土類蛍光錯体が選択的に取り込まれており、粒子の表面付近は実質的にシリカがそのまま存在している希土類蛍光錯体を含有してなる希土類蛍光錯体含有シリカ粒子。
【請求項２】希土類蛍光錯体が、次式（１）〜（６）
2005023961.tif 000024
2005023961.tif 000025
で表される化合物の少なくとも１種を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項３】希土類蛍光錯体が、次式
2005023961.tif 000026
で表される化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項４】希土類蛍光錯体が、次式
2005023961.tif 000027
で表される化合物群から選ばれる少なくとも１種の化合物を配位子として含有するものである請求の範囲第１項に記載のシリカ粒子。
【請求項５】希土類蛍光錯体が、テルビウム又はユウロピウムの錯体である請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項６】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子が、エマルジョン重合法により製造されたものである請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項７】（削除）
【請求項８】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に標識される物質との結合基が導入されている請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項９】結合基が、シアノ基である請求の範囲第８項に記載のシリカ粒子。
【請求項１０】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１１】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＲＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１２】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子に二本鎖ＰＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１３】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子にＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１４】希土類蛍光錯体含有シリカ粒子にＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１５】希士類蛍光錯体含有シリカ粒子にＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１６】インターカレーターが一価性インターカレーターである請求の範囲第１０項〜第１５項のいずれかに記載のシリカ粒子。
【請求項１７】請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載のシリカ粒子からなる蛍光標識剤。
【請求項１８】請求の範囲第１項〜第１６項のいずれかに記載のシリカ粒子の表面に核酸プローブが結合してなる蛍光標識化核酸プローブ。
【請求項１９】核酸がＤＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２０】核酸がＲＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２１】核酸がＰＮＡである請求の範囲第１８項に記載の核酸プローブ。
【請求項２２】請求の範囲第１０項に記載の二本鎖ＤＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＤＮＡを検出する方法。
【請求項２３】請求の範囲第１１項に記載の二本鎖ＲＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＲＮＡを検出する方法。
【請求項２４】請求の範囲第１２項に記載の二本鎖ＰＮＡと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、二本鎖ＰＮＡを検出する方法。
【請求項２５】請求の範囲第１３項に記載のＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２６】請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＤＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２７】請求の範囲第１５項に記載のＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドと特異的に結合するインターカレーターが導入されている希土類蛍光錯体含有シリカ粒子を用いて、ＲＮＡ／ＰＮＡの二本鎖ハイブリッドを検出する方法。
【請求項２８】請求の範囲第１７項に記載の蛍光標識剤を含有してなる分子種又は当該蛍光標識剤を含有してなるマーカー、及び標的分子測定用の資材を含んでなる標的分子測定用キット。




【国際調査報告】
2005023961.tif 000028
2005023961.tif 000029
2005023961.tif 000030
2005023961.tif 000031