(57)【要約】抗腫瘍剤や抗炎症剤として有用な（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、例えば、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を有効成分とする分離剤が充填されている光学活性カラムを用いることにより、（±）−ＤＨＭ２ＥＱから直接、光学分割することができる。前記光学活性カラムを用いた光学分割により得られた（−）−ＤＨＭ２ＥＱまたはその薬理学的に許容される塩は様々な症状を改善するための医薬組成物として有用である。
2004072056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状を改善することを特徴とする医薬組成物。
2004072056.tif 000042
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
2004072056.tif 000043
【請求項３】
前記症状が、腫瘍細胞に起因することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記症状を改善することを特徴とする請求の範囲第３項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することにより、前記症状を改善することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記症状が、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、白血病からなるグループから選ばれる症状であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＮＦ−κＢを活性化させる治療によるＮＦ−κＢの前記活性化を阻害することによって、前記治療の効果を増大させることができる、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
2004072056.tif 000044
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項８】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の医薬組成物。
2004072056.tif 000045
【請求項９】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、抗腫瘍剤を用いた治療であることを特徴とする請求の範囲第７項または第８項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であることを特徴とする請求の範囲第７項または第８項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗腫瘍剤が、有効成分として含有されていることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗腫瘍剤は、カンプトテシンまたはダウノルビシンであることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患を改善することを特徴とする医薬組成物。
2004072056.tif 000046
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項１４】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載の医薬組成物。
2004072056.tif 000047
【請求項１５】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、インスリン抵抗性を伴う疾患であることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、糖尿病に起因する疾患であることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、筋ジストロフィーであることを特徴とする請求の範囲第１３項または第１４項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤。
2004072056.tif 000048
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項１９】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の腫瘍細胞増殖阻害剤。
2004072056.tif 000049
【請求項２０】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、血管内皮細胞の細胞接着を阻害するための細胞接着阻害剤。
2004072056.tif 000050
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２１】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞接着阻害剤。
2004072056.tif 000051
【請求項２２】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤。
2004072056.tif 000052
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２３】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のアポトーシス誘導剤。
2004072056.tif 000053
【請求項２４】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤。
2004072056.tif 000054
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２５】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第２４項に記載のアポトーシス誘導剤。
2004072056.tif 000055
【請求項２６】
さらに、ＴＮＦ−αを有効成分として含有することを特徴とする請求の範囲第２４項または第２５項に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項２７】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する肥満予防・防止剤。
2004072056.tif 000056
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項２８】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載の肥満予防・防止剤。
2004072056.tif 000057
【請求項２９】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する血糖値低下剤。
2004072056.tif 000058
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項３０】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第２９項に記載の血糖値低下剤。
2004072056.tif 000059
【請求項３１】
下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤。
2004072056.tif 000060
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項３２】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第３１項に記載の細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤。
2004072056.tif 000061
【請求項３３】
前記細胞分化誘導の阻害が、ＴＮＦ−αによる筋細胞分化の抑制であることを特徴とする請求の範囲第３１項または第３２項に記載の細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤。
【請求項３４】
式（３）：
2004072056.tif 000062
で表される化合物のラセミ体を直接光学分割することを特徴とする、式（２）：
2004072056.tif 000063
または式（４）：
2004072056.tif 000064
で表される光学活性な化合物を製造する方法。
【請求項３５】
前記光学分割が光学活性カラムを用いて行われる請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３６】
前記光学活性カラムは、下記の式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填されていることを特徴とする請求の範囲第３５項に記載の方法。
2004072056.tif 000065
（式中、Ｒ３〜Ｒ７は、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基である。）
【請求項３７】
前記多糖の芳香族カルバメート誘導体が、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることを特徴とする請求の範囲第３６項に記載の方法。
【請求項３８】
式（３）
2004072056.tif 000066
で表される化合物のラセミ体を、下記の式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤によって直接、光学分割することを特徴とする直接分割方法。
2004072056.tif 000067
（式中、Ｒ３〜Ｒ７は、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基である。）
【請求項３９】
多糖の芳香族カルバメート誘導体が、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることを特徴とする請求の範囲第３８項に記載の直接分割方法。
【請求項４０】
ＮＦ−κＢの活性化を伴う疾患を改善するために下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする治療方法。
2004072056.tif 000068
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項４１】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の治療方法。
2004072056.tif 000069
【請求項４２】
前記症状が、腫瘍細胞に起因することを特徴とする請求の範囲第４０項または第４１項に記載の治療方法。
【請求項４３】
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記疾患を改善することを特徴とする請求の範囲第４２項に記載の治療方法。
【請求項４４】
血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することにより、前記疾患を改善することを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の治療方法。
【請求項４５】
前記疾患が、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、白血病からなるグループから選ばれる疾患であることを特徴とする請求の範囲第４０項に記載の治療方法。
【請求項４６】
ＮＦ−κＢを活性化させる治療を行うステップと、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を投与するステップとを含むことを特徴とする治療方法。
2004072056.tif 000070
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項４７】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第４６項に記載の治療方法。
2004072056.tif 000071
【請求項４８】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、抗腫瘍剤の投与であることを特徴とする請求の範囲第４６項または第４７項に記載の治療方法。
【請求項４９】
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療が、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であることを特徴とする請求の範囲第４６項または第４７項に記載の治療方法。
【請求項５０】
ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患を改善するために下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴とする治療方法。
2004072056.tif 000072
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基である。）
【請求項５１】
前記化合物が次式（２）であることを特徴とする請求の範囲第５０項に記載の治療方法。
2004072056.tif 000073
【請求項５２】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、インスリン抵抗性を伴う疾患であることを特徴とする請求の範囲第５０項または第５１項に記載の治療方法。
【請求項５３】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、糖尿病に起因する疾患であることを特徴とする請求の範囲第５０項または第５１項に記載の治療方法。
【請求項５４】
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患が、筋ジストロフィーであることを特徴とする請求の範囲第５０項または第５１項に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
関連文献とのクロスリファレンス
本願は、２００３年２月１４日付けで出願した日本国特願２００３−３７１６７号、２００３年２月１８日付けで出願した日本国特願２００３−３９０９８号、及び２００３年８月６日付けで出願した日本国特願２００３−２８８２８１号に基づく優先権を主張する。これらの文献を本明細書に援用する。
【技術分野】  本発明は、医薬組成物、腫瘍細胞増殖阻害剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導剤、肥満予防・防止剤、血糖値低下剤、分化誘導の阻害を解除する薬剤、及びこれらの医薬組成物・薬剤に有効成分として含有する光学活性を有する化合物、すなわち、５−デヒドロキシメチルエポキシキノマイシンＣの光学活性体の直接分割方法、及び治療方法に関する。
【背景技術】  癌や白血病、およびリュウマチ、膵炎、肝炎、消化器系炎症などの炎症性疾患には効果的な治療薬がなく、新しい機構で働く新規化学療法が期待されている。また、その他、免疫疾患、アレルギー性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、血管新生性疾患などにおいても新しい機構で働く新規化学療法が期待されている。近年ＮＦ−κＢは腫瘍や炎症部位で活性化されることが明らかとなってきた。そして最近発見されたＮＦ−κＢ阻害剤５−デヒドロキシメチルエポキシキノマイシンＣ（通称ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ（ＤＨＭＥＱ））は細胞レベルで強くＮＦ−κＢを阻害し（Ａ．Ａｒｉｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，２４６２５−２４６３０，２００２）、動物の個体レベルでも前立腺癌（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３，Ｊａｎ  １；６３（１）：１０７−１０）や乳癌（２００２年度日本癌学会総会記事，ｐ１５７）の増大を強く抑制し、リュウマチのモデルマウスにおける症状も抑制する（Ｎ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）。ＤＨＭ２ＥＱは、それら腫瘍細胞等に特異性が高く、毒性が低い。そこでＤＨＭ２ＥＱは新規の抗腫瘍剤、抗炎症剤としての役割が期待されている。
ＤＨＭＥＱの光学活性体の従来の製造法を図１に示す。まず、ラセミ体のＤＨＭ２ＥＱ（式（２））のフェノール性水酸基を一旦シリル基で保護した化合物（式（１６））をキラルカラムにより分割して光学活性体の化合物（式（１７）及び式（１８））を得、ついでそれぞれを脱保護することにより目的とした光学活性な（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（２））と（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（４））を得ている。しかし本方法では工程の長さによる収率の損失という問題が指摘されている（Ｎ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）。
そこで、本発明は、医薬組成物に有効成分として含有させるための、優れた薬理作用を有し、かつ特異性の高い化合物を、迅速かつ高い収率で得ることができる方法を提供することを主たる目的とする。また、本発明は、前記化合物を有効成分とする医薬組成物を提供することも目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記問題点を克服するべく鋭意検討した結果、式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を充填した光学活性なカラムを用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、式（３）で表される化合物のラセミ体を光学活性な化合物（式（２），式（４））に直接、光学分割できることを見出した（図２）。
また、本発明者らは、式（３）で表される化合物のラセミ体が有する血管内皮細胞の接着阻害作用より優れた作用を光学活性な化合物（式（２），式（４））が有するか否かを調べるため、式（２）、式（３）、式（４）で表される化合物をそれぞれ用いて、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とヒト急性骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０との接着を調べた。その結果、式（２）で表される化合物が、式（３）及び式（４）で表される化合物より優れた血管内皮細胞の接着阻害作用を示すことを見出した。
さらに、本発明者らは、式（２）で表される化合物が、多発性骨髄腫、甲状腺癌などの腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。
また、本発明者らは、肥大化脂肪細胞を式（２）で表される化合物で処理することにより、肥大化脂肪細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出した。
さらに、本発明者らは、肥満・２型糖尿病モデル動物において、式（２）で表される化合物が、高脂肪食負荷による体重の増加を抑制することを見出した。
また、本発明者らは、培養細胞における筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を式（２）で表される化合物が解除することを見出した。このようにして、本発明者らは本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に係る医薬組成物は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状を改善することを特徴とする。
2004072056.tif 000003
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
また、前記化合物が次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000004
本発明に係る医薬組成物は、腫瘍細胞にアポトーシスをおこすことによって、少なくとも１つの症状を改善することを特徴とし、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することを特徴とする。
前記ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状は、例えば、腫瘍細胞に起因するものであってもよい。前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記症状を改善することを特徴とする。
また、腫瘍細胞と血管内皮細胞との接着を阻害することにより、前記症状を改善することを特徴とする。
なお、前記症状は、例えば、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、血管新生性疾患（腫瘍内の血管新生性疾患）、白血病からなるグループから選ばれる症状である。
前記腫瘍としては、例えば、骨髄腫、甲状腺癌、乳癌、膵癌、悪性腫瘍、前立腺癌などである。
また、本発明に係る医薬組成物は、ＮＦ−κＢを活性化させる治療によるＮＦ−κＢの前記活性化を阻害することにより、前記治療の効果を増大させることができる下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000005
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
また、前記化合物が次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000006
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療は、抗腫瘍剤を用いた治療であってもよいし、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。なお、前記医薬組成物と前記抗腫瘍剤とを有効成分として含有することとしてもよい。前記抗腫瘍剤とは、例えば、カンプトテシンまたはダウノルビシンなどである。
また、本発明に係る医薬組成物は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患を改善することを特徴とする。
2004072056.tif 000007
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。なお、前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
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前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患は、例えば、インスリン抵抗性を伴う疾患、糖尿病に起因する疾患、筋ジストロフィーなどであってもよい。
なお、上述の医薬組成物は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
本発明に係る、腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000009
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
なお、本発明に係る、腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
また、前記化合物が次式（２）であることを特徴としてもよい。
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本発明に係る、血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分子発現抑制剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000011
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
なお、本発明に係る、血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分子発現抑制剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
また、前記化合物が次式（２）であることを特徴としてもよい。
2004072056.tif 000012
本発明に係る、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000013
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
なお、本発明に係る、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
前記化合物が次式（２）であることを特徴としてもよい。
2004072056.tif 000014
本発明に係る、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
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式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000016
なお、本発明に係る、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。また、本発明に係る、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤は、さらに、ＴＮＦ−αを有効成分として含有することとしてもよい。
本発明に係る肥満予防・防止剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000017
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000018
なお、本発明に係る肥満予防・防止剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
本発明に係る血糖値低下剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
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式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000020
なお、本発明に係る血糖値低下剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
本発明に係る、細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤は、下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
2004072056.tif 000021
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000022
なお、前記細胞分化誘導の阻害は、例えば、ＴＮＦ−αによる筋細胞分化の抑制であってもよい。また、本発明に係る、細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤は、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を有効成分として含有することを特徴としているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
また、本発明は、式（３）：
2004072056.tif 000023
で表される化合物のラセミ体を直接光学分割することにより、式（２）：
2004072056.tif 000024
または式（４）：
2004072056.tif 000025
で表される光学活性な化合物を製造する方法を提供することができる。前記光学分割は、光学活性カラムを用いることとしてもよい。
前記光学活性カラムは、下記の式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填されているものであればよい。
2004072056.tif 000026
式中、Ｒ３〜Ｒ７は、水素原子、または炭素数１〜８のアルキル基であってもよいし、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、またはハロゲン原子などであってもよい。
前記多糖の芳香族カルバメート誘導体は、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることとしてもよいし、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることとしてもよい。特に、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を有効成分とする分離剤が充填されたＤＡＩＣＥＬ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（ダイセル化学工業（株））が好ましい。
本発明の方法により、効率よく、大量に、光学活性なＤＨＭＥＱを製造することができる。
本発明の方法により、式（２）または（４）で表される光学活性なＤＨＭＥＱを製造することができるが、これらの光学活性体のうち、式（２）で表される化合物の方が式（４）で表される化合物より生物学的活性（薬理活性）が高いことが後述の実施例で示されている。
また、本発明に係る直接分割方法は、式（３）
2004072056.tif 000027
で表される化合物のラセミ体を、下記の式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤によって直接、光学分割することを特徴としてもよい。
2004072056.tif 000028
式中、Ｒ３〜Ｒ７は、水素原子、または炭素数１〜８のアルキル基であってもよいし、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、またはハロゲン原子などであってもよい。
前記多糖の芳香族カルバメート誘導体は、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることとしてもよいし、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）であることとしてもよい。
本発明に係る治療方法には、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状を改善するための下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることとする。
2004072056.tif 000029
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
また、前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000030
本発明に係る治療方法は、腫瘍細胞にアポトーシスを起こすことによって、少なくとも１つの症状を改善することとしてもよいし、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないで、腫瘍細胞に起因する少なくとも１つの症状を改善することとしてもよい。
前記ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状は、例えば、腫瘍細胞に起因するものであってもよい。
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、前記症状を改善することとしてもよいし、腫瘍細胞と血管内皮細胞との接着を阻害することにより、前記症状を改善することとしてもよい。
なお、前記症状は、例えば、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、血管新生性疾患（腫瘍内の血管新生性疾患）、白血病からなるグループから選ばれる症状である。
前記腫瘍としては、例えば、骨髄腫、甲状腺癌、乳癌、膵癌、悪性腫瘍、前立腺癌などである。
また、本発明に係る治療方法には、ＮＦ−κＢを活性化させる治療によるＮＦ−κＢの前記活性化を阻害することにより、前記治療の効果を増大させることができる下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有すること医薬組成物を使用することとする。
2004072056.tif 000031
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
また、前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000032
前記ＮＦ−κＢを活性化させる治療は、抗腫瘍剤を用いた治療であってもよいし、腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。なお、前記医薬組成物と前記抗腫瘍剤とを有効成分として含有することとしてもよい。前記抗腫瘍剤とは、例えば、カンプトテシンまたはダウノルビシンなどである。
また、本発明に係る治療方法には、ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患を改善するために下記の一般式（１）で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることとする。
2004072056.tif 000033
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。なお、前記化合物は次式（２）であることが好ましい。
2004072056.tif 000034
前記ＴＮＦ−αによって引き起こされる疾患は、例えば、インスリン抵抗性を伴う疾患、糖尿病に起因する疾患、筋ジストロフィーなどであってもよい。
なお、上述の治療方法には、優れた薬理作用を有する（−）−体の化合物を用いることとしているが、実質的に（＋）−体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＤＨＭ２ＥＱの光学活性体の従来の製造法の反応スキームを示す図である。
図２は、本発明の光学活性なＤＨＭ２ＥＱ（式（２），式（４））の製造方法の反応スキームを示す図である。
図３は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱおよび（＋）−ＤＨＭ２ＥＱのＨＰＬＣプロフィールを示す図である。
図４は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱがＨＵＶＥＣとＨＬ−６０細胞の接着に及ぼす抑制効果を示す図である。
図５は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが骨髄腫モデルマウスに及ぼす抗腫瘍効果を示す図である。
図６は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが甲状腺癌モデルマウスに及ぼす抗腫瘍効果を示す図である。
図７は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱの肥大化脂肪細胞に対するアポトーシス誘導作用の解析結果を示す図である。
図８は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが肥満型糖尿病モデルマウスに及ぼす体重増加抑制作用を示す図である。
図９は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を解除する効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
ＮＦ−κＢは、生体防御反応に関与する中心的な転写因子であり、ＮＦ−κＢにより誘導される遺伝子は免疫グロブリン以外にサイトカイン（ＩＬ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）−αなど）、細胞接着因子（Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−１、ＶＣＡＭ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−１など）、一酸化窒素（ＮＯ）合成酵素、Ｆａｓリガンド等の免疫応答や炎症反応に深く関わっているものが多いことが知られている（Ｃｅｌｌ，８７，１３−２０，１９９６）。また、膀胱癌、乳癌、メラノーマなどで報告されているＮＦ−κＢの恒常的活性化は、アポトーシスの抑制、細胞増殖の促進、細胞分化の抑制等をはじめとする腫瘍形成の様々な面に関与し、腫瘍形成を促進すると考えられている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，２４１−２４６，２００１）。一方、ＮＦ−κＢの活性化阻害タンパク質ＩκＢの遺伝子導入により特異的に細胞死が誘導されることが報告されているので、ＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有する化合物は、抗炎症作用や抗腫瘍活性を有する医薬品や薬剤として期待されている。
ＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有する化合物としては、従来、サリチル酸アミド誘導体（ＷＯ０１／１２５８８  Ａ１）、パネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ；Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２６，２１４−２２１，１９９６），シクロエポキシドン（ｃｙｃｌｏｅｐｏｘｙｄｏｎ；Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５１，４５５−４６３，１９９８），ＳＮ−５０（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８，１９９５）などが知られている。
上述のサリチル酸アミド誘導体は、毒性のない抗生物質エポキシクイノマイシン（ｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ）の構造をもとに新しくデザインされたものであるが、近年、本発明者らは、この化合物のラセミ体が抗炎症作用、免疫抑制作用、抗腫瘍活性、抗動脈硬化作用、腫瘍転移抑制作用、抗悪疫質作用、抗アレルギー作用、及び血管新生抑制作用などを有することを明らかにしている。
ラセミ体には２つのエナンチオマー（（＋）−体及び（−）−体）が混在して、一般的にそれらのエナンチオマーは、沸点、融点などの物理的な性質がほとんど同じである。しかしながら、（＋）−体及び（−）−体の化合物は、通常生体に対する作用を異にする場合がある。例えば、「サリドマイドの悲劇」のように、一方のエナンチオマーは睡眠作用や鎮静作用を有するのに対して、もう一方のエナンチオマーは催奇作用（胎児奇形誘発作用）を有することが知られている。また、医薬品や農薬などにおいては、ラセミ体より、一方のエナンチオマーを有効成分として含有させた薬剤を用いることにより、より優れた効果が得られ、副作用が少ないことが知られている。従って、医薬品等に対しては、光学的に純粋な化合物を調製することが極めて重要な課題となっている。
本発明者らは、既に前記サリチル酸アミド誘導体のラセミ体を（＋）−体及び（−）−体の化合物に分割することを試みている（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）。しかしながら、前記化合物の分割方法は、前記化合物のラセミ体のフェノール性水酸基を一旦シリル基で保護した化合物を作製しなければならなかった。そこで、本発明者らは、様々な誘導体を有効成分とする分離剤を担持する光学活性カラムを用いて前記化合物のラセミ体を（−）−体及び（＋）−体の化合物に直接分割できるかどうかを調べた。その結果、式（６）
2004072056.tif 000035
で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を用いることにより、前記化合物のラセミ体を（−）−体及び（＋）−体の化合物に直接、光学分割できることを見出した。
なお、置換基が分子の形に変化を与えたり、置換基自体の持つ物理的化学的特性及び置換基が芳香族環のπ電子系に与える電子的影響などが複雑に組み合わさっていたりすることから、分離や吸着の特性の著しい変化と置換との関係を考慮に入れると、下記の一般式（５）
2004072056.tif 000036
で表される置換基（−Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、及び−Ｒ７）を水素原子、または炭素数１〜８のアルキル基としても、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、またはハロゲン原子などとしてもよい。
多糖の芳香族カルバメート誘導体の原料となる多糖は、合成多糖、天然多糖、及び天然変性多糖のいずれかを問わないが、光学活性を有する多糖が好ましく、高純度の多糖が容易に得られるアミロースやセルロースなどがより好ましい。その他、高純度の多糖が容易に得られるものとして、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、β−１，４−キシラン、イヌリン、カードランなどを原料とすることとしてもよい。また、本実施例においては、多糖の芳香族カルバメート誘導体として、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を用いて、本発明の直接分割方法を行っているが、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を適用することとしてもよい。
ここでは、分離剤に有効成分として含有される多糖のカルバメート誘導体について説明したが、その他、エステル誘導体やエーテル誘導体、芳香族カルバメート以外のカルバメート誘導体などの多糖誘導体を用いることとしてもよい。
これらの分離剤を担持する担体としては、有機担体または無機担体が一般的に用いられるが、無機担体がより好ましい。このような無機担体としては、例えば、シリカゲル、アルミナ、マグネシア、酸化チタン、ガラス、ケイ酸塩、カオリンなどがある。担体の粒径は使用するカラムのサイズにより異なるが、一般に０．５μｍ〜１０ｍｍであり、好ましくは１μｍ〜３００μｍであり、より好ましくは５μｍ〜２０μｍである。また、その性状は多孔質であることが好ましく、その場合孔の平均細孔径は１０Å〜１００μｍであることが好ましく、５０Å〜５００００Åであればより好ましい。前記多糖の芳香族カルバメート誘導体を担体に担持する方法としては、例えば、多糖の芳香族カルバメート誘導体を溶剤に溶解してドープとし、これを攪拌しながらゆっくりと担体に滴下して、担体に均一にコーティングさせる方法、等の一般的な方法を用いることができる。
また、上記直接分割方法を適用することにより、式（３）で表される化合物のラセミ体から簡便に光学活性な化合物（式（２）及び式（４））を製造することも可能である。以下、その製造方法について詳述する。
＝＝＝式（２）及び式（４）で表される化合物の製造方法＝＝＝
一般式（１２）で表される化合物は、ｗｉｐｆらの合成法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１２号，１５４９−５６１頁，１９９５年）に準じて製造することができる。
一般式（１２）で表される化合物の製造方法の一例を下記の反応工程式に基づいて説明する。
下記の反応工程式において、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。Ｒ２はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、Ｘはハロゲン原子であり、ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が特に好ましい。
2004072056.tif 000037
工程（ａ）：Ｎ−（２−アルカノイルベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンの調製
２，５−ジメトキシアニリンを溶媒（例えば、ピリジンなど）に溶解させ、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、式（７）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドの酢酸エチル溶液を加えて、攪拌しながら反応させる。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮、及び真空乾燥することにより式（８）で示されるＮ−（２−アルカノイルベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリン化合物が得られる。この化合物は精製せず、次の工程に使用できる。
工程（ｂ）：３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノン化合物の調製
上記で得られた式（８）の化合物を溶媒（例えば、メタノール、エタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、ジアセトキシヨードベンゼンを加え、室温で攪拌しながら反応させる。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え、重曹水、食塩水で順次洗浄し、溶媒層を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、式（９）で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノン化合物が得られる。
工程（ｃ）：５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物の調製
式（９）の化合物を溶剤（例えば、テトラヒドロフラン、メタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、過酸化水素水及び水酸化ナトリウムを加え、攪拌しながら反応させる。反応液に酢酸エチルを加え、塩酸溶液、チオ硫酸ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄し、大気中で乾燥した後、真空乾燥する。残存する原料化合物を除去するため、残渣をアセトンに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌して原料化合物を分解する。メタノールを減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄する。酢酸エチル層を乾燥して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、式（１０）で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物が得られる。
工程（ｄ）：５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンの調製
式（１０）の化合物を溶剤（例えば、塩化メチレンなど）に溶解させ、氷冷下で無機酸または有機酸（例えば、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体など）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を濃縮した後、得られた残渣をメタノールで洗浄して式（１１）で示される５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオン化合物が得られる。
工程（ｅ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（１１）の化合物を、溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦなど）に懸濁し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加えて反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチル、塩化メチレンなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮して、メタノールで懸濁、攪拌、洗浄して、式（１２）で示される５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。
なお、式（７）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドとして、Ｏ−アセチルサリチロイルクロリドを用い、工程（ｂ）において式（８）の化合物を溶解させる溶媒として、メタノールを用いることにより、式（３）で表される化合物（（±）−ＤＨＭ２ＥＱ；なお、「ＤＨＭ２ＥＱ」を「ＤＨＭＥＱ」と称する場合がある。）を製造することができる。
式（３）の化合物の光学分割は、光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりおこなう。これにより、式（２）及び（４）の化合物が得られる。光学活性カラムとして、一般式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤、例えば、ＤＡＩＣＥＬ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（１０ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ  ２５０ｍｍ）を用いることができる。ＤＡＩＣＥＬ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤを用いる場合、０．１〜０．９ｖ／ｖ％酢酸添加メタノールを移動相（例えば、流速：０．５〜２．５ｍｌ／ｍｉｎ）にして、式（３）の化合物のメタノール溶液（例えば、濃度５〜２０ｍｇ／ｍｌ）を調製し、これを５０〜２００μｌずつ、５〜２０回にわけてインジェクトし、式（２）及び（４）の化合物を分取するとよい。
式（２）及び（４）の化合物の施光度をＪＡＳＣＯ  ＤＩＰ−３６０旋光計で測定することにより、光学純度を算出することができる。なお、式（２）に示される化合物の旋光性は左旋性であるので、これを（−）−体と記載する。また、式（４）に示される化合物の旋光性は右旋性であるので、これを（＋）−体と記載する。
＝＝＝式（２）で表される化合物の薬理作用について＝＝＝
（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状、具体的には、乳癌、膵癌、リンパ系悪性腫瘍、前立腺癌、甲状腺癌、骨髄腫等の腫瘍細胞に起因する症状や、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、血管新生性疾患（特に腫瘍内の血管新生性疾患）、白血病（特に成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））などの症状、インスリン抵抗性を伴う疾患、糖尿病に起因する疾患、及び筋ジストロフィーを改善（予防や進行抑制を含む）することができ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより優れた効果を有する。
従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、腫瘍細胞増殖阻害剤、接着分子の発現抑制剤、アポトーシス誘導剤、肥満予防・防止剤、血糖値低下剤、分化誘導の阻害を解除する薬剤などに用いられる際、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより有用である。
また、腫瘍細胞に起因する症状の改善には、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しても寄与しなくてもよい。アポトーシスが寄与しない場合とは、例えば、細胞接着阻害による腫瘍転移阻害、アポトーシスを伴わない腫瘍増殖阻害、がん悪疫質改善、血管新生阻害による腫瘍細胞壊死などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。なお、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないとは、（−）−ＤＨＭ２ＥＱを患部に投与しても、その効果が、その患部における腫瘍細胞のアポトーシスに依存しないことを意味するが、アポトーシスが依存しない効果とは別に、腫瘍細胞のアポトーシスが生じていてもかまわない。
以下、（−）−ＤＨＭ２ＥＱの各作用効果に付き、詳細に説明する。
＜細胞接着阻害作用＞
炎症性刺激や物理的刺激などが血管内皮細胞に加わると、血管内皮細胞膜上の細胞接着分子の発現が増強し、白血球が血管内皮細胞表面上に接着し、血管外へ移動する。これは、血管内皮細胞内で、転写因子であるＮＦ−κＢが活性化されることにより、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンなどの接着分子の発現を高めるからである。白血球の血管壁への接着は脂質の蓄積などを介して動脈硬化を誘導するため、従来、白血球と血管内皮細胞との接着を阻害することができれば、動脈硬化の予防／抑制につながると考えられてきた。
また、腫瘍細胞の接着は血管からの浸出、転移を引き起こすことが知られている。例えば、転移能の高い大腸癌ではＥ−セレクチンのリガンドであるシアリルルイス−Ｘが高発現していることが報告されており、血管内皮細胞でＮＦ−κＢが活性化されると、血管内皮細胞膜上でのＥ−セレクチンの発現が増強し、大腸癌細胞が血管内皮細胞表面上に接着して血管外へ浸出しやすくなり、転移が促進されると考えられている。
もし、血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することができれば、動脈硬化や腫瘍転移の予防や抑制につながる可能性があり、そのようなＮＦ−κＢ阻害剤は動脈硬化や腫瘍細胞の転移の予防や抑制に有用であり得ると考えられる。
そこで、本発明者らは、上記製造方法により得られた、式（２）の化合物（以下、「（−）−ＤＨＭ２ＥＱ」と称する。）及び式（４）の化合物（以下、「（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ」と称する。）、並びに式（３）の化合物（以下、「（±）−ＤＨＭ２ＥＱ」）を用いて、それらの化合物がヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞接着活性に与える影響を調べた。ＴＮＦ−αにより刺激した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着に与える各化合物の影響を調べたところ、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（＋）−ＤＨＭ２ＥＱより約１０倍強く、また、（±）−ＤＨＭ２ＥＱに比べて約３倍強く、血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着を阻害した。こうして、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（±）−ＤＨＭ２ＥＱより優れた血管内皮細胞接着阻害作用を有することが明らかとなった。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（±）−ＤＨＭ２ＥＱより血管内皮細胞接着阻害剤としてより有用であり、抗動脈硬化剤や腫瘍転移抑制剤としてもより有用である。
＜抗炎症作用及び免疫疾患抑制作用＞
本発明者らは、タイプＩＩコラーゲンにより関節炎を誘発させた慢性関節リウマチモデルマウスに（±）−ＤＨＭ２ＥＱを投与し、症状を観察したところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが関節炎の症状の抑制に有効であることを明らかにしている。このことは、おそらく（±）−ＤＨＭ２ＥＱがＮＦ−κＢの活性阻害を通じて効果を示していると考えられるが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより数倍〜十数倍以上強い活性阻害効果を有する（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、関節炎の症状に対して抗炎症剤としてさらに予防／抑制に有効であると考えられる。
以上のことから、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、免疫疾患、炎症性疾患（アレルギー性炎症疾患も含む）などの症状に対して有用な免疫疾患抑制剤及び抗炎症剤であると期待できる。
＜腫瘍細胞増殖阻害作用及び抗腫瘍作用＞
近年、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＮＦ−κＢが活性化しているホジキンリンパ腫細胞の増殖は阻害するが、ＮＦ−κＢが活性化していない骨髄球系の白血病細胞の増殖は阻害しないことを明らかにしている。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはＮＦ−κＢの活性化している腫瘍細胞の増殖阻害剤として有用であり、ＮＦ−κＢの抑制を通じて作用すると考えられる。
また、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス非依存的にヒト乳癌細胞の増殖を抑制することを明らかにしている。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、乳癌の予防・治療剤として有用であると考えられる。
また、本発明者らは、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが、骨髄腫モデルマウスに対して腫瘍の増殖を抑制することを明らかにしている（実施例３参照）。多発性骨髄腫は、骨破壊による痛みを伴い、苦痛が激しく、現在においては根本的な治療法がない。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、多発性骨髄腫などの骨髄腫に対する抗腫瘍剤として期待できる。
さらに、本発明者らは、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが、甲状腺癌モデルマウスに対して腫瘍の増殖を阻害することを明らかにしている（実施例４参照）。甲状腺癌は難治性のがんの一つで、現在のところ効果的な治療方法は全くない。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、甲状腺癌に対する抗腫瘍剤として期待できる。
以上のことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、より優れた腫瘍細胞増殖阻害剤として期待することができる。なお、本発明に適用される腫瘍細胞としては、例えば、甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、悪性腫瘍細胞、膵癌細胞などを挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではなく、ＮＦ−κＢが活性化している腫瘍細胞であれば何でもよい。なお、前記悪性腫瘍細胞としてはリンパ系悪性腫瘍細胞が治療対象として好ましく、その中でもホジキンリンパ腫細胞、骨髄腫細胞が特に好ましい。また、ホルモン療法を対象としないホルモン非感受性の腫瘍も治療の対象になり得ることから、この点はホルモン療法に比べ大きな利点となる。
＜アポトーシス誘導作用、並びに、抗肥満作用及び抗インスリン抵抗性作用＞
近年、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＮＦ−κＢが活性化している白血病細胞のアポトーシスを誘導することを明らかにしている。このことから、ＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（±）−ＤＨＭ２ＥＱに比べ、より優れたアポトーシス誘導作用を有することが期待できる。
従来の化学療法は細胞に普遍的な増殖機構を広く標的としているため、腫瘍細胞のみならず正常細胞に対する影響も大きく、必ずしも有効な治療手段となっていなかった。しかしながら、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが白血病細胞のアポトーシスを誘導するのと同じ濃度でヒト正常白血球のアポトーシスを全く誘導しないという実験結果を得ており、腫瘍細胞に対する特異性が高いことを明らかにした。従って、さらに比活性の高い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、白血病細胞などのリンパ系悪性腫瘍細胞に対する特異性がさらに高く、正常細胞に対する副作用はさらに少ないと考えられる。このように、本発明に係るアポトーシス誘導剤は、悪性リンパ腫細胞、白血病細胞又は骨髄腫細胞のアポトーシス誘導に好適に使用でき、悪性リンパ腫、白血病又は骨髄腫に対して特異性が高いため、優れた治療効果が期待できる。
なお、治療対象となるリンパ系悪性腫瘍としては、悪性リンパ腫、白血病又は骨髄腫などが挙げられる。前記悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等が含まれ、骨髄腫には、多発性骨髄腫等の形質細胞性腫瘍等が含まれ、白血病には、急性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、慢性リンパ性白血病等が含まれる。
また、（−）−ＤＨＭ２ＥＱで肥大化脂肪細胞を処理すると、アポトーシスを誘導することができる。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤として用いることができる。
一方、詳細なメカニズムはまだ明らかでないが、肥満などにより肥大（大型）化した脂肪細胞から血液中に炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αが分泌され、このＴＮＦ−αがインスリン受容体を通じたシグナル伝達系を阻害することにより、インスリン抵抗性（インスリン感受性の低下）が生じることが知られている。インスリン受容体を通じたシグナル伝達系は、普段は骨格筋細胞内に存在している糖輸送担体（ＧＬＵＴ）を急速に細胞膜上に移動させ、骨格筋細胞内への糖（グルコースなど）の取り込みを促進する機能も有するため、インスリン抵抗性を生じる一つの原因として、ＴＮＦ−αが、糖輸送担体の細胞膜上への移動を阻害することにより、糖の細胞内取り込みを阻害することが考えられている。
従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導すると、脂肪細胞から血液中に分泌されるＴＮＦ−αの量が減少し、糖の細胞内取り込み作用の阻害を防止すること等により、肥満予防・防止剤、血糖値低下剤として有効であるばかりでなく、インスリン抵抗性を伴う疾患、あるいは糖尿病に起因する疾患などの症状の改善がもたらされる。インスリン抵抗性を伴う疾患には、例えば、２型糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、肥満、高血圧、動脈硬化性疾患などがあり、また、糖尿病に起因する疾患としては、例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などがあるが、（−）−ＤＨＭ２ＥＱには、これらの症状に対して優れた治療効果が期待できる。
＜抗ＡＴＬ作用＞
本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを用いて、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬ）細胞のＮＦ−κＢの活性化に与える影響を調べたところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＡＴＬ細胞のＮＦ−κＢの活性化を阻害することを明らかにした。また、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを用いて、ＡＴＬ細胞の増殖に与える影響を調べたところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、正常細胞の増殖を阻害することはなく、ＡＴＬ細胞の増殖を特異的に阻害できることを明らかにした。さらに、ＡＴＬ細胞のアポトーシスの誘導に与える影響を調べたところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは正常細胞のアポトーシスは誘導せずにＡＴＬ細胞のアポトーシスを誘導できることを明らかにしている。これらのことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは抗ＡＴＬ活性（作用）を有するものと考えられる。
以上のことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、抗ＡＴＬ剤としてより有用であると考えられる。
＜抗悪疫質作用＞
悪疫質（ｃａｃｈｅｘｉａ；悪液質とも表記される。）は、悪性腫瘍、結核、糖尿病、血液疾患、内分泌・代謝疾患などの慢性病において、食欲不振、進行する体重減少、貧血、皮膚乾燥、浮腫などを主症状とする全身不良を呈する疾患である。特に悪性腫瘍の末期患者などに、よくみられる症状であり、体重の減少・貧血などを中心とした全身機能の低下を示す。癌患者が悪疫質を発症すると、合併症のリスクが高くなり、化学療法に対する反応が悪くなる。さらに、全身の衰弱のため、癌に対する化学療法や放射線治療の副作用も大きくなり、悪疫質のため死に至ることもある。
これまで、悪疫質が発症する詳細なメカニズムは、完全には解明されていないが、近年になって、インターロイキン６（ＩＬ−６）や腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）など、幾つかのサイトカインの関与を含め、ようやく、そのメカニズムに関する手がかりが得られるようになってきた（最新医学  １９９９年  ５４巻１０号  ２５０２−２５０７頁）。例えば、癌悪疫質における様々な症状の発現機序としては、悪疫質によって発現が誘導され過剰発現したサイトカインが、中枢神経系に作用し、摂食減少、発熱、低血圧、無気力状態などの症状を引き起こし、また糖質、タンパク質、脂質の異化の亢進状態を招くとされる。
このような悪疫質における症状を抑制するのにステロイド投与が有効である。悪疫質患者にステロイドを投与すると、ステロイドの免疫反応抑制作用やそれによる抗炎症作用、さらに悪疫質誘導サイトカインの産生抑制作用により、癌悪疫質の代謝異常が是正され、体重減少、食欲不振、無気力、味覚異常、貧血などの悪疫質症状が軽減、改善される。しかし、ステロイドの長期服用は、その重篤な副作用が大きな問題となる。ステロイドは、本来自己の持つホルモンであるため、摂取したステロイドは過剰なホルモンと同様の作用効果を示し、例えば、腎臓における塩の再吸収に関与することにより、副作用として浮腫や高血圧が現われることがある。
一方、オメガ３不飽和脂肪酸が、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生を抑制したり、急性期反応蛋白の合成に影響することを利用して、ＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）の投与が悪疫質の改善に一定の効果を上げている。しかし、このような栄養製剤は、作用が間接的であるため、顕著で確実な効果は期待しにくい。
したがって、ステロイドのような広範な作用を有する薬剤とは異なり、悪疫質に特異的で、効果の顕著な薬剤の開発が求められるようになった。このような要請の下、本発明者らは、悪疫質の症状を誘発したモデルマウスに（±）−ＤＨＭ２ＥＱを投与し、症状を観察したところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが悪疫質の症状の予防／改善に有効であることを明らかにしている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、悪疫質の症状に対して予防／改善に、より有効であると考えられる。
＜血管新生抑制作用＞
（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することができるため、ＮＦ−κＢの活性化により起こるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の遺伝子発現を阻害することができると考えられる。また、シクロオキシゲナーゼ−２の遺伝子発現を阻害することから、ＣＯＸ−２の下流にあるプロスタグランジンの合成も阻害することができると考えられる。腫瘍内において、ＮＦ−κＢの活性化はプロスタグランジンの合成促進を通じ血管新生を盛んに起こしているが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＮＦ−κＢの活性化阻害を通じ、プロスタグランジンにより促進される腫瘍血管の新生を阻害することができると考えられる。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、腫瘍内における血管新生を阻害し、腫瘍への酸素や栄養分の供給を阻害することにより抗腫瘍作用を呈するがん治療薬としても有用であると考えられる。
以上のことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、腫瘍内における血管新生の阻害剤としてより有効であると考えられる。
＜抗筋ジストロフィー作用＞
本発明者らは、（−）−ＤＨＭ２ＥＱを用いることにより、筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を解除することができることを明らかにした。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を解除する薬剤として用いることができる。また、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害により発症する筋ジストロフィーの改善に対して有用であり、優れた治療効果が期待できる。
＜本発明に係る医薬組成物とＮＦ−κＢを活性化させる治療との併用効果＞
従来、腫瘍の治療方法として化学療法や放射線療法などが知られている。しかしながら、化学療法や放射線療法を用いると、腫瘍細胞においてＮＦ−κＢが活性化され、がん治療の効果が減少する（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７，２４１−２４６，２００１）。例えば、放射線治療は、腫瘍細胞を殺すために行われるが、放射線照射による酸化ストレスによってＮＦ−κＢが活性化され、腫瘍細胞はアポトーシスを起こしにくくなって放射線治療に抵抗するようになる。このように、腫瘍細胞に放射線を照射していると、次第に放射線が効きにくくなることがある。従って、このようながん治療に対する抵抗性を解除する方法の開発が望まれている。
近年、本発明者らは、化学療法や放射線療法などのＮＦ−κＢを活性化させる腫瘍治療に（±）−ＤＨＭ２ＥＱを用いることにより、この腫瘍治療の効果が増大することを明らかにしている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりＮＦ−κＢの活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、化学療法や放射線療法などのＮＦ−κＢを活性化させる治療と併用させることにより、この治療の効果をさらに増強させるのに有用であると考えられる。
上記化学療法に用いられる抗腫瘍剤としては、少なくともＮＦ−κＢを活性化させるものであればどのようなものでもよく、例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ）やダウノマイシン（成分名：ダウノルビシン；ＤＮＲまたはＤＭ）などの抗腫瘍剤がある。
なお、（−）−ＤＨＭ２ＥＱと併用する薬剤は抗がん剤に限らず、投与によりＮＦ−κＢが活性化され、そのため治療に対する抵抗性を生じる薬剤であれば何でもよい。例えば、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、感染症疾患、アレルギー疾患、免疫疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化、血管新生性疾患（特に腫瘍内の血管新生性疾患）、白血病（特に成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））などの疾患に対して用いられる治療と併用することにより、治療の効果を増大させることも期待できる。投与の時期に関しては、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＮＦ−κＢを活性化させる治療と同時に投与してもよいが、ＮＦ−κＢを活性化させる治療の後にＮＦ−κＢの活性化を阻害するために用いることとしてもよい。また、ＮＦ−κＢの活性化を阻害するために、予め投与してもよい。治療対象としては、上記疾患を伴うヒト及びヒト以外の哺乳類動物が考えられる。
＝＝＝式（１３）で表される化合物のラセミ体の製造方法＝＝＝
上述においては、式（３）で表される化合物のラセミ体を直接分割することにより、光学活性な（−）体及び（＋）体の化合物を製造する方法について説明したが、式（１３）
2004072056.tif 000038
で表される化合物のラセミ体（（±）−ＤＨＭ３ＥＱ）も同様に直接分割して、式（１４）
2004072056.tif 000039
で表される（−）−体の化合物（（−）−ＤＨＭ３ＥＱ）や式（１５）
2004072056.tif 000040
で表される（＋）−体の化合物（（＋）−ＤＨＭ３ＥＱ）を製造することも可能である。以下に、式（１３）で表される化合物のラセミ体の製造方法について、下記の反応式を用いて説明する。なお、下記の反応式において、Ｒ２はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。
2004072056.tif 000041
工程（ｆ）：３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミドシクロヘキセンの調製
式（１６）で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合溶媒に溶解し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（水素化ホウ素ナトリウムなど）を加え、攪拌しながら反応させる。この反応液に溶剤（酢酸エチルなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、カラムクロマトグラフィーなどで精製して、式（１７）で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミドシクロヘキセン化合物を得る。
工程（ｇ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（式（１３），ＤＨＭ３ＥＱ）の調製
式（１７）の化合物を溶剤（アセトンなど）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を乾燥し、減圧濃縮して、精製して、式（１３）の５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−サリチロイルアミド−２−シクロヘキセノン（ＤＨＭ３ＥＱ）を得ることができる。
このようにして製造された（±）−ＤＨＭ３ＥＱも、式（５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填された光学活性カラムを用いたり、バッチ式で前記分離剤を用いたりすることにより、（＋）−ＤＨＭ３ＥＱと（−）−ＤＨＭ３ＥＱとに直接、光学分割することが可能である。光学活性カラムとしては、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを（＋）−ＤＨＭ２ＥＱと（−）−ＤＨＭ２ＥＱとに直接、光学分割することができるカラムを用いることが好ましく、分離剤としては、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを（＋）−ＤＨＭ２ＥＱと（−）−ＤＨＭ２ＥＱとに直接、光学分割することができる分離剤を用いることが好ましい。
なお、このようにして精製された、（−）−ＤＨＭ３ＥＱ（式（１４））または（＋）−ＤＨＭ３ＥＱ（式（１５））は、（−）−ＤＨＭ２ＥＱと同様にラセミ体の化合物より優れた薬理作用を有し、ＮＦ−κＢの活性化を伴う症状を改善するのにより有用であるものと考えられる。
＝＝＝その他の実施の形態＝＝＝
上述においては、一般式（１）で表される化合物のＲ１がアセチル基である化合物の薬理作用について説明したが、一般式（１）で表される化合物のＲ１が水素原子、プロピオニル基、若しくはブタノイル基、またはこれらの異性体基である化合物も同様の薬理作用を有するものと考えられる。
なお、本発明の化合物は、薬理学的に許容される塩、例えば、第４級アンモニウム塩などの有機塩、あるいはアルカリ金属などの金属塩、のような形態としてもよい。このような化合物の塩は、公知の方法で製造することができる。
【実施例１】  上述した方法により、（±）−５−デヒドロキシメチルエポキシキノマイシンＣ（ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ  Ｃ；ＤＨＭ２ＥＱ）を合成した。得られた（±）−ＤＨＭ２ＥＱの光学分割は、０．５ｖ／ｖ％酢酸添加メタノールを移動相（流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ）にして、ＤＡＩＣＥＬ  ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ（１０ｍｍ  ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（検出波長：３１５ｎｍＵＶ、カラム温度：４０℃）によりおこなった。（±）−ＤＨＭ２ＥＱ  ２０ｍｇを２ｍｌのメタノールに溶解し、これを１００μｌずつ２０回にわけてインジェクトし、３．８分と５．７分のピークの所を分取したところ、８５％の回収率で（−）−ＤＨＭ２ＥＱおよび（＋）−ＤＨＭ２ＥＱを得た。分離の様子を図３に示す。
この様にして得られた両物質の旋光度（（−）−ＤＨＭ２ＥＱ：［α］２０Ｄ−２４１°（ｃ０．１  ＭｅＯＨ），（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ：［α］２０Ｄ＋２３９°（ｃ０．１  ＭｅＯＨ））は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）に記載のものと一致し、光学純度（ｅｅ）は９９％以上であった。
【実施例２】  本実施例においては、ＴＮＦ−αにより刺激した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着に対する（−）−及び（＋）−ＤＨＭ２ＥＱの効果を調べた。
（１）細胞培養
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａｋｅ  Ｋｉｒｌａｎｄ，ＷＡ）は、Ｉ型コラーゲン（株式会社高研，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でコートしたプラスチックフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を使用し、非働化した１０％子牛胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、１０μｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  ＥＣ  ＬＴＤ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）を含むＭＣＤＢ−１３１培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で培養した。ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）は、非働化した１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬株式会社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーター中で培養した。
（２）細胞接着実験
ＨＵＶＥＣを４８ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に４．０×１０４細胞／ウエル（５００μｌ／ウエル）でまき一晩培養した。翌日、培養したＨＵＶＥＣを、各種濃度に希釈した（−）−ＤＨＭ２ＥＱ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ、または（＋）−ＤＨＭ２ＥＱで処理し、３７℃、５％  ＣＯ２で２時間インキュベートした。その後、さらに１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２で２時間インキュベートした（コントロールとしては、ＴＮＦ−α無処理とした。）。６時間後、３７℃に温めたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ；リン酸緩衝生理食塩水）で各ウエルを２回洗い、新たに培地を各ウエルに加えた（２００μｌ／ウエル）。続いて、各ウエルにＨＬ−６０細胞を６．０×１０４細胞／ウエル（２０μｌ／ウエル）の濃度でまき、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。次に、３７℃に温めたＰＢＳで各ウエルを３回洗い、未接着のＨＬ−６０細胞を除去し、新たに培地（２００μｌ／ウエル）を加えた。その後、ＨＵＶＥＣに接着したＨＬ−６０細胞を顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内の接着細胞数を測定することで細胞接着能を評価した。その結果を図４に示す。なお、図中にそれぞれのＤＨＭ２ＥＱを用いた時のＩＣ５０を示す。図４に示すように、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ及び（±）−ＤＨＭ２ＥＱより細胞接着阻害活性がそれぞれ１０倍及び３倍強いことが明らかとなった。
【実施例３】  次に、多発性骨髄腫に対する（−）−ＤＨＭ２ＥＱによる抗腫瘍効果を調べた。４×１０７個の多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１２−ＰＥ（Ｏｈｔｓｕｋｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７３，１９９−２０４，１９８９）を０．２ｍｌのＰＢＳに溶解し、これをＣＢ１７／ｌｃｒ−ＳＣＩＤマウスの左背部に皮下注射し腫瘤を形成させ、その腫瘍片５ｍｍ立方を１０匹のマウスに移植した。腫瘍を移植後、１６日間観察し、腫瘍片の生着、増殖傾向を確認後、５匹のマウスに（−）−ＤＨＭ２ＥＱの溶液（ＲＰＭＩ１６４０培地）を８ｍｇ／ｋｇ−体重で腹腔内に投与した（（−）−ＤＨＭ２ＥＱ）。投与は、１４日間毎日行った。対照群のマウス５匹には同量の溶媒を投与した（コントロール）。腫瘍径の計測は、週に２回行った（腫瘍容量＝（短径）２×（長径）×０．５２）。その結果、図５に示すように、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、コントロールに比べて有意に腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。
【実施例４】  ヒト甲状腺癌に対する（−）−ＤＨＭ２ＥＱによる抗腫瘍効果を調べた。未分化のヒト甲状腺癌細胞浮遊液ＦＲＯ（５×１０６細胞；２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０）を８週齢のオスＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ社製）の横腹に皮下注射した。その後、キャリパーを用いて腫瘍サイズを一日おきに測定し、腫瘍容量＝（ａ；腫瘍の短径）２×（ｂ；ａに対する垂直径）×０．４により腫瘍容量を算出した。腫瘍容量が１００ｍｍ３に達した、皮下注射から１４日後を０日として、９匹のマウス群に（−）−ＤＨＭ２ＥＱの溶液（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ（ＢＡＳＦ社）：ＰＢＳ：ＤＭＳＯ（２：１：１））を１０ｍｇ／ｋｇ−体重で腹腔内に１０日間毎日投与した（○：（−）−ＤＨＭ２ＥＱ）。対照群のマウス９匹には同量の溶媒を投与した（■：コントロール）。その結果、図６に示すように、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、コントロールに比べて有意に腫瘍の増殖を阻害することが明らかとなった。
【実施例５】  インスリン抵抗性を伴う疾患は、上述したように、肥大化脂肪細胞から分泌されるＴＮＦ−αに起因すると考えられている。そこで、（−）−ＤＨＭ２ＥＱが肥大した脂肪細胞のアポトーシスを誘導できるかを確認するため、前駆脂肪細胞を長期培養して分化誘導させて得られる肥大化脂肪細胞に対する（−）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。
前駆脂肪細胞株３Ｔ３−Ｌ１（７．５×１０４細胞；１ｍｌの１０％  ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ）を１２ウエルプレート中のカバーグラス上に蒔き、コンフルエントに達してから２，３日後に、５００μＭ  ＩＢＭＸ（３−イソブチルイル−１−メチルキサンチン）、１μＭ  Ｄｅｘ（デキサメタゾン）、及び１μｇ／ｍｌインスリンを含んだ培地に交換した。３日間培養後、１μｇ／ｍｌインスリンを含んだ培地に交換し、更に３日間培養して通常の培地（１０％  ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ）に交換した。以後３日おきに５０日まで、培地交換を続けた。
分化誘導５０日目に培地交換し、２４時間後に肥大化脂肪細胞を（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（１０μｇ／ｍｌ）で３０分前処理し、続いてＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）をさらに添加して刺激した（コントロールとして、（−）−ＤＨＭ２ＥＱ無添加、ＴＮＦ−α無添加、及び両方共無添加の各条件で実験を行った。）。さらに２４時間後、培地を除いて、肥大脂肪細胞を蛍光抗体用ＰＢＳ（８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．４５ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．２８ｇ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４）５００μｌで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド５００μｌで４℃で１５分間固定した。その後、蛍光抗体用ＰＢＳ５００μｌで３回洗浄し、０．２％  ＢＳＡ、及び０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含んだ蛍光抗体用ＰＢＳで１５分間処理した。
その後、５００μｌ蒸留水で３回洗浄し、遮光した１５０ｍｍ２シャーレ中のパラフィンシート上にカバーガラスを細胞面を上にして置いた。また、その上からＴＵＮＥＬ溶液（ＴｄＴ  ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ／ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ／ＴｄＴ＝４５μｌ／２．５μｌ／２．５μｌ）を４５μｌずつ滴下し、３７℃で１時間インキュベートした。最後にカバーガラスを遮光した１２ウエルプレートに戻し、１ｍｌの蛍光抗体用ＰＢＳで３回洗浄した後、カバーガラスを取り出してスライドグラスに５０％グリセロールで固定し、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、図７に示すように、あらかじめ１０ｍｇ／ｍｌ（−）−ＤＨＭ２ＥＱで処理された肥大化脂肪細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αの刺激により、アポトーシスを誘導することが明らかとなった。なお、１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−α又は１０ｍｇ／ｍｌ（−）−ＤＨＭ２ＥＱの一方でのみ処理された肥大化脂肪細胞はアポトーシスを誘導しなかった。
以上のことから、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、ＴＮＦ−αを分泌する肥大化脂肪細胞に起因するインスリン抵抗性症候群（例えば、２型糖尿病、高インスリン血症、脂質代謝異常、肥満、高血圧、動脈硬化性疾患など）の改善（予防、治療を含む）に有用であると考えられる。また、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、肥満予防剤、ダイエット剤、血糖値低下剤としても有用であると考えられる。さらには、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、糖尿病に起因する疾患（例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害など）の改善（予防、治療を含む）にも有用であると考えられる。
【実施例６】  次に、肥満・２型糖尿病モデル動物ＫＫＡｙマウスを用いて、糖尿病に対する（−）−ＤＨＭ２ＥＱの効果を調べた。
４週齢のメスのＫＫＡｙマウスを２群（（−）−ＤＨＭ２ＥＱ投与群５匹，コントロール群４匹）に分け、高脂肪食（ＣＲＦ−１，オリエンタル酵母（株））を基本飼料として、無添加群（○：（−）−ＤＨＭ２ＥＱなし）、（−）−ＤＨＭ２ＥＱ投与群（●：（−）−ＤＨＭ２ＥＱ添加）を自由摂取にて４週間与え、毎週体重を測定した。なお、マウスに投与の（−）−ＤＨＭ２ＥＱは乳鉢で細かくすりつぶし、０．５％ＣＭＣ溶液を加えて懸濁または溶解し、これを高脂肪食に添加した。その結果、図８に示すように、無添加群は、高脂肪食負荷によって著名な体重増加を呈していたが、（−）−ＤＨＭ２ＥＱ群は高脂肪食下でも体重の増加が抑制されていた。以上のことから、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは抗肥満剤（抗肥満予防・防止剤（ダイエット剤を含む））、抗糖尿病剤として有用であると考えられる。
【実施例７】  デュシエンヌ型をはじめとする筋ジストロフィー患者における筋ジストロフィー疾患の進展は、筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害による筋細胞の再生不良がひとつの発症機構と考えられている（医学のあゆみ、１９９：１０４５−１０４８，２００１）。デュシエンヌ型筋ジストロフィーのモデル動物であるｍｄｘマウスは、ヒトのデュシエンヌ型筋ジストロフィーの患者と同様にジストロフィンの発現を欠損しているのにも関わらず、筋再生が活発に行われているためほとんど筋力低下が見られない。その理由として、ヒト患者においては、一旦破壊された筋細胞の再生の過程で、ＴＮＦ−αなどの炎症性因子が筋分化を阻害しているからであると考えられている。
そこで、本発明者らは、筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の分化誘導系を用いて、（−）−ＤＨＭ２ＥＱの添加がＴＮＦ−αによる筋分化阻害反応を解除できるかどうかを調べた。
１０％  ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ（培養用培地）を用いて、マウス骨格筋由来の筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２（理研細胞バンクから購入）を７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、カバーガラス（松浪硝子工業株式会社，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を敷いたプラスチック製１２ウエルプレートの各ウエルにそれぞれ１ｍｌずつ播種した。その後、各ウエルにおいて細胞がコンフルエントになるまで増殖した時、培地を、２％  ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍを含んだＤＭＥＭ（分化用培地）に交換した。ＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）及び／又は（−）−ＤＨＭＥＱ（３μｇ／ｍｌ）を作用させるものについては、この時点で各薬剤を添加した。６日後、多核の筋細胞の出現という、筋細胞が分化した指標を確認して、培地を除去した。なお、コントロールとして、６日目にちょうどコンフルエントになるように、培養用培地で培養した細胞を用意した。
これらの細胞をＰＢＳ−（Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋−ｆｒｅｅ  ＰＢＳ；８．０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ  ＫＣｌ，２．３ｇ／ｌ  ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，０．２ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４）で２回洗浄した後でカバーガラスをウエルから取り出し、冷風ドライヤーを用いて細胞を乾燥させた。その後、カバーガラスを再び１２ウエルプレートのウエルに入れ、そこにＭａｙ−Ｇｒ▲ｕ▼ｎｗａｌｄ液（Ｍｅｒｃｋ社，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を約３００μｌずつ入れてガラス上の細胞を浸し、２〜３分そのまま静置して固定・染色した。２〜３分経過後、すばやくｐＨを６．７に調整したＰＢＳ−を各ｗｅｌｌに等量加え、各ウエルの溶液に空気を吹き込みながら、細胞をさらに２〜３分固定・染色した。そして、カバーガラスをウエルから取り出した後、水洗し、ドライヤーの冷風でガラスを乾燥させた。
カバーガラスを再び１２ウエルプレートのウエルに入れ、ギムザ染色液（１ｍｌのＰＢＳ−（ｐＨ：６．７）に４５μｌのＧｉｅｍｓａ液（Ｍｅｒｃｋ）を加えた溶液）を入れてカバーガラスを浸した。その後、各ウエルの溶液に再び空気を吹き込みながら、１０〜１５分間核を染色した。その後、上記と同様にカバーガラスをウエルから取り出し、水洗し、ドライヤーの冷風で乾燥させた。
以上のようにして作製したサンプルをスライドガラスにのせ、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＵＦＸ−ＤＸ；位相差用４０倍の対物レンズ，Ｐｈ２とセットした。）を用いて４００倍の倍率で写真を撮影した。その結果、図９に示すように、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αは筋芽細胞から筋細胞への分化誘導を抑制したが、１〜３μｇ／ｍｌの（−）−ＤＨＭ２ＥＱはこの分化誘導の阻害を解除することが明らかとなった。なお、分化誘導しなかったＣ２Ｃ１２細胞の分化率は０％であった。
これらのことから、デュシエンヌ型をはじめとする筋ジストロフィー患者に（−）−ＤＨＭ２ＥＱを投与することにより、ＴＮＦ−αによる筋分化阻害を解除して筋再生を誘導し、筋ジストロフィー疾患を改善することが期待される。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、免疫疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍転移、悪疫質、動脈硬化などの症状に有用な医薬組成物、及び医薬組成物に有効成分として含有させる光学活性な化合物の製造方法や直接分割方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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