(57)【要約】生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づけることによって癌を検出する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法。
【請求項２】
前記領域が、配列番号１における塩基番号５２０〜６２８の塩基配列からなる領域であることを特徴とする請求項１記載の癌の検出方法。
【請求項３】
体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
癌が、唾液腺癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、及び直腸癌からなる群から選択される一以上の癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の癌の検出方法。
【請求項５】
癌が、膵癌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の癌の検出方法。
【請求項６】
生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と膵癌の進行度とを関連づける膵癌の進行度の判定方法であって、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、膵癌の進行度の判定方法。
【請求項７】
前記領域が、配列番号１における塩基番号５２０〜６２８の塩基配列からなる領域であることを特徴とする請求項６に記載の膵癌の進行度の判定方法。
【請求項８】
体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする請求項６又は７に記載の膵癌の進行度の判定方法。
【請求項９】
配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、糖転移酵素をコードする遺伝子の特定領域の発現量を測定し、かかる測定値を癌の存否、進展、進行度、予後と関連づける癌の検出方法及び該方法を実施するための癌検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  本明細書においては、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを「ＧｌｃＮＡｃ」と記載する。また、糖及び糖残基の表記に関しては、特記しない限りＤ体を示すものとする。
従来、癌の検出には各種腫瘍マーカなどが指標として使用されていたが、その感度は必ずしも十分とは言えなかった。そこで、一般に腫瘍マーカと呼ばれているもの以外に、遺伝子の発現の変化を癌検出に結びつける試みがなされている。特開２００１−４６０７７号公報及びＬａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２（２００３），１８７−１９７には、α１，４結合でＧｌｃＮＡｃをムチン型糖鎖に転移する酵素及びそのＤＮＡが開示されており、かかる遺伝子の発現が胃癌や膵癌で変化することに基づき癌検出法に応用する技術が開示されている。しかし、このような技術は、その感度は十分とは言えず、実用レベルとするにはさらなる検討が必要な状態であった。
【発明の開示】
【０００３】  上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討した結果、上記の従来技術に開示された、特定の癌の検出に使用できる遺伝子と同一の遺伝子に由来するものの、当該従来技術よりも狭い領域の発現量の検出を行うことで、従来と比して癌検出感度が格段に増加することを見い出し、本発明を完成した。
【０００４】  すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法。
（２）前記領域が、配列番号１における塩基番号５２０〜６２８の塩基配列からなる領域であることを特徴とする（１）の癌の検出方法。
（３）体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする（１）又は（２）の癌の検出方法。
（４）癌が、唾液腺癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、及び直腸癌からなる群から選択される一以上の癌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの癌の検出方法。
（５）癌が、膵癌であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの癌の検出方法。
（６）生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と膵癌の進行度とを関連づける膵癌の進行度の判定方法であって、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、膵癌の進行度の判定方法。
（７）前記領域が、配列番号１における塩基番号５２０〜６２８の塩基配列からなる領域であることを特徴とする（６）の膵癌の進行度の判定方法。
（８）体液が、血液又はリンパ液であることを特徴とする（６）又は（７）の膵癌の進行度の判定方法。
（９）配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キット。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】健常人（ＨＶ）、慢性膵炎患者（ＣＰ）、及び膵癌患者（ＰＣ）におけるα４ＧｎＴ遺伝子の発現量（縦軸）の分布を示す図である。星印は有意差が確認された組み合わせを示す。なお、＊はＰ＝０．０１５、＊＊はＰ＝０．００４６を表わす。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】  以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
１．本発明の検出方法
本発明の検出方法は、生体から採取された体液中のα１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素遺伝子の発現量を測定し、該測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づける癌の検出方法であって、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの塩基配列からなる領域を検出することによって前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする、癌の検出方法である。【０００７】  本発明の検出方法における「体液」とは、唾液、血液、リンパ液、胃液、膵液、腸液が好ましく、特に血液及びリンパ液が好ましく、血液が最も好ましい。血液を「体液」として使用した場合には、血液から有核細胞成分を分画し、かかる画分から全ＲＮＡを抽出した後に逆転写酵素等を用いて常法に従ってｃＤＮＡを調製し、このｃＤＮＡを用いて定量を行うことが好ましい。【０００８】  α１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン転移酵素（以下、「α４ＧｎＴ」とも記載する）遺伝子としては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。また、人種によって遺伝子に塩基置換が生じることも考えられるため、α４ＧｎＴ遺伝子は、ＧｌｃＮＡｃ転移活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。なお、ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
本発明の検出方法において、α４ＧｎＴ遺伝子の発現量の測定は、配列番号１の塩基配列のうち、任意の連続した塩基数７０〜１３９ｂｐの領域を検出することによって行うことが好ましく、任意の連続した塩基数８０〜１２９ｂｐの領域を検出することによって行うことがより好ましく、任意の連続した塩基数９０〜１１９ｂｐの領域を検出することによって行うことが更に好ましく、任意の連続した塩基数１００〜１０８ｂｐの領域を検出することによって行うことが最も好ましい。本発明の検出方法に使用する、上記の領域としては、例えば配列番号１記載の塩基配列における塩基番号５２０〜６２８からなる領域が例示される。【０００９】  本発明検出方法における「α４ＧｎＴ遺伝子の発現量の測定」とは、体液中に存在する細胞におけるα４ＧｎＴ遺伝子の発現量、すなわち、α４ＧｎＴのｍＲＮＡの量を測定することをいう。測定法として、具体的には、例えば、体液から常法により抽出されたｍＲＮＡまたはｔｏｔａｌＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した後に、ポリメラーゼ  チェイン  リアクション法（ＰＣＲ法）などを用いて前記領域を増幅して検出する方法、または、前記領域に対応するプローブを使用して、ＤＮＡチップなどにより前記領域を検出する方法などが挙げられる。この中でもＰＣＲ法が好ましく、蛍光プローブを用いた定量ＰＣＲ法を使用してもよい。ただし、これらに限定はされず、上記遺伝子の発現量の測定（定量）が可能な限り他の方法も使用することができる。
上記定量方法を用いて測定した生体から採取された体液におけるα４ＧｎＴ遺伝子の発現量と、癌の存否、進展、進行度又は予後とを関連づけることで、癌の検出を容易に行うことが可能である。【００１０】  本発明検出方法における「測定値と癌の存否、進展、進行度又は予後との関連づけ」とは、α４ＧｎＴ遺伝子の発現量を、癌の有無、転移の有無、進行度、治癒の程度などの癌に関する定性的又は定量的な指標とすることを意味する。
また、上記関連付けにより健常な状態の測定値と比して測定値が変化した状態を意味し、例えば、「癌が存在する、進展している、癌がＩＩ期以上に進行している、又は癌が進展又は退縮しており予後が悪化或いは良好」と判定することができる。
ここで「測定値」とは、例えば、ＰＣＲ法におけるＤＮＡの複製数またはハイブリダイズ法におけるハイブリダイズしたＤＮＡの量などの絶対量であってもよいが、これに限らず、例えば内部標準を設け、内部標準との比を測定値として使用しても良い。内部標準としては一般的に用いられているグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＡＰＤＨ」とも記載する）の遺伝子を用いることができる。【００１１】  本発明検出方法における「変化」とは、測定値の「増加」であることが好ましい。健常人におけるα４ＧｎＴ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量の比（α４ＧｎＴ遺伝子の測定値／ＧＡＰＤＨ遺伝子の測定値）は１２×１０−７未満となるため、この値がかかる比の値（１２×１０−７）（臨界値）よりも高い場合に「癌が存在する」とすることができる。かかる臨界値は検出感度など必要に応じて調整することが可能である。また、例えば同一患者の異なる時点のサンプルを比較して、上記比の値が大きくなっている場合に癌が進展（進行）し、減少している場合に癌が治癒に向かっている、予後が悪化或いは良好などとすることも可能である。【００１２】  本発明検出方法で検出される「癌」は、消化器及びその付随器官の「癌」であることが好ましく、特に唾液腺癌、食道癌、胃癌、膵癌、胆嚢癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌のいずれかであることが好ましい。この中でも特に胃癌、膵癌、小腸癌、大腸癌であることが好ましく、特に胃癌、膵癌であることが好ましく、膵癌であることが極めて好ましい。【００１３】  ところで、従来癌の検出に用いられていた癌胎児抗原（以下「ＣＥＡ」とも記載する）やシアリルルイスＡ（以下、「ＣＡ１９−９」とも記載する）等の癌マーカーは、早期癌（ＩＩ期以前）の検出には不向きで、早期癌の検出は、これらの癌マーカーと血清エラスターゼの測定との併用でスクリーニングを行っていた。
しかし、本発明検出方法はＩＩ期の癌においても極めて優れた検出感度を示すことが明かであり、本発明検出方法単独の実施で早期の癌の検出が可能である。
このことから、本発明検出方法は早期癌（ＩＩ期）の検出に極めて有用であることが明かとなり、早期癌の検出方法に使用することも可能である。【００１４】  更に、特に膵癌の患者において、本発明の検出方法による測定で、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期の癌の進行時期毎に測定値が変化することが明かとなり、かかる変化に基づき、本発明検出方法を膵癌の進行度を判定する方法として使用することも可能であることが明かとなった。すなわち体液、特に好ましくは末梢血を用いて、α４ＧｎＴ遺伝子と内部標準遺伝子としてのＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を測定し、これらの比を１０７倍した値を算出した場合に、測定値が例えば３５以上の場合をＩＶ期、１５〜３５の場合をＩＩＩ期、１３〜１５の場合をＩＩ期とすることが可能である。かかる比の数値範囲（臨界値）は必要に応じて適宜調整することが可能である。【００１５】  なお、一般的に臨床において膵炎と膵癌の鑑別診断は困難であることが知られているが、本発明検出方法を用いると、膵炎患者と膵癌（癌）患者との間では明らかに測定値が相違するため、本発明検出方法は膵炎と膵癌との鑑別に用いることも可能である。【００１６】２．本発明キット
本発明キットは、配列番号１記載の塩基配列における任意の連続した、塩基数７０〜１３９ｂｐの核酸（ポリヌクレオチド）を増幅するためのプライマーを含む、癌検出キットである。プライマーの長さは上記核酸を増幅できる長さであれば特に制限されないが、例えば、２０〜２６塩基が好ましく、２２〜２５塩基がより好ましい。
本発明キットは、本発明の検出方法を実施するためのキットである。
本発明キットにおける「塩基数７０〜１３９ｂｐの核酸」は、配列番号１記載の核酸の一部であって連続した塩基数７０〜１３９ｂｐからなる核酸である限りにおいて特に限定はされないが、その中でも特に配列番号１における塩基番号５２０〜６２８からなる塩基配列の核酸であることが好ましい。【００１７】  本発明キットにおける「プライマー」は、上記「塩基数７０〜１３９ｂｐ」の塩基配列」を増幅することができる限りにおいて特に限定はされないが、例えば上記好ましい例の一つである「配列番号１における塩基番号５２０〜６２８からなる塩基配列の核酸」を増幅するためのプライマーとしては配列番号３の５’プライマー及び配列番号４の３’プライマーが挙げられる。【００１８】  本発明キットは、上記「プライマー」以外に、かかるプライマーを用いて増幅して得られる増幅産物を検出するためのプローブ（例えば配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ）、逆転写酵素やＤＮＡポリメラーゼなどの試薬、測定値を入力すると疾病の検出結果を表示するソフトウェアなどを更に含んでいても良い。
【実施例】
【００１９】  以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
インフォームドコンセントの得られた膵癌患者５５名（総合的な診断により膵癌と診断された患者）、慢性膵炎患者１０名（総合的な診断により慢性膵炎と診断された患者）及び健常人７０名について、採取した５ｍｌの末梢血から有核細胞成分を分画し、常法に従って全ＲＮＡを抽出して、ＤＮａｓｅＩ（アンビィオン社製）２Ｕを添加した後、逆転写酵素（インビトロゲン社製）２００Ｕを加えて５５分間インキュベートしてｃＤＮＡの合成を行なった。【００２０】  かかるｃＤＮＡと、配列番号３の５’プライマー、配列番号４の３’プライマー、及び配列番号５のプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ：蛍光色素（５’−ＦＡＭ）とクエンチャー（３’−ＴＡＭＵＲＡ）とが結合している（アプライドバイオシステムズジャパン社製））を用いてＱｕａｎｔａｔｉｖｅ−ＰＣＲ法をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００（アプライドバイオシステムズジャパン社製）で行なった。【００２１】  定量は上記プライマー及びプローブを用いて増幅されるα４ＧｎＴ遺伝子の一部分と共に内部標準遺伝子としてグリセルアルデヒド−三リン酸デヒドロゲナーゼ（以下「ＧＡＰＤＨ」とも記載する）のｃＤＮＡも増幅して測定を行うｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ法によって行い、「α４ＧｎＴの増幅産物のコピー数／ＧＡＰＤＨのコピー数」を１０７倍した数値を「α４ＧｎＴの発現量」と定義づけた（以下単に「発現量」と記載する）。【００２２】  上記発現量を用いてｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｃｕｒｖｅを作成したところ、膵癌患者群と健常人群とがカット・オフ値１２で明確に区別されることが明かとなった。そこで、１２以下を健常人、それよりも高値の者を膵癌の疑いのある群として、分析を行なった。【００２３】  その結果、膵癌患者群全体の陽性率は７６．４であり、その発現量は３５．７±４．９であった。更に膵癌における各病期別の陽性患者数は、０期（癌細胞が上皮内に限局している状態（上皮内癌））０／１例（０％）、ＩＩ期２／３例（６６．７％）、ＩＩＩ期６／８例（７５．０％）、ＩＶ期３４／４３（７９．１％）であり、また発現量はＩＩ期２４．８±１２．５、ＩＩＩ期２９．９±９．２、ＩＩ期３８．３±５．９と、病期の進行と共に増加の傾向にあった（表１）。また、同時に血清中のＣＥＡ及びＣＡ１９−９も測定し、膵癌患者群全体ではそれぞれ４４．４％、７４．６％が陽性となったが、ＩＩ期膵癌患者ではＣＥＡ及びＣＡ１９−９のいずれの方法でも陰性となった（表１）。このことから、従来の膵癌マーカによる膵癌の検出と比して、本発明検出方法を用いるとより早期に膵癌を検出できることが明かとなった。【００２４】［表１］
2005001089.tif 000002
【００２５】  一方、膵内における腫瘍の占拠部位別の検討を行ったところ、膵頭部癌と膵体尾部癌の両群間で有意な差は見られなかった。また更に、切除可能な膵癌症例２４例に対する病理組織学的な検討では、発現量と、脈管侵襲の有無、リンパ節転移の有無及び癌細胞の分化度との間にいずれも有意な差は認められなかった。【００２６】  健常人における発現量は７．２±０．９であり、膵癌患者に比較して有意に低値であった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定によるとＰ＝０．００４６）。また慢性膵炎患者群における発現量は１７．８±６．９であり、膵癌に比較して有意に低値であった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検定によるとＰ＝０．０１５）（図１）。従って、本発明検出方法により、膵癌の検出を行うことができると共に、膵癌と慢性膵炎との鑑別診断を行うことができることが判明した。
産業上の利用の可能性【００２７】  本発明により、新たな癌検出方法、膵癌の進行度を検出する方法、及び癌検出キットが提供される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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