(57)【要約】下記の特性を有し、難分解性タンパク質分解活性を有する酵素を有効成分として含有する、難分解性タンパク質分解剤を開示する：（ａ）作用及び基質特異性：難分解性タンパク質のペプチド結合を加水分解する。（ｂ）分子量：３１，０００（ゲル濃度１２％の均一ゲルを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）（ｃ）等電点：ｐＩ９．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ９．０〜１０．０である。（ｅ）作用至適温度：６０〜７０℃である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特性を有し、難分解性タンパク質分解活性を有する酵素を有効成分として含有する、難分解性タンパク質分解剤：
（ａ）作用及び基質特異性：難分解性タンパク質のペプチド結合を加水分解する。
（ｂ）分子量：３１，０００（ゲル濃度１２％の均一ゲルを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：ｐＩ９．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ９．０〜１０．０である。
（ｅ）作用至適温度：６０〜７０℃である。
【請求項２】
前記酵素が、下記の（ｇ）の特性を更に有する、請求項１に記載の難分解性タンパク質分解剤：
（ｇ）難分解性タンパク質分解活性として２単位／ｇ以上の活性（ケラチンアズール分解活性を指標として）を示す。
【請求項３】
前記酵素が、下記の（ｈ）の特性を更に有する、請求項１又は２に記載の難分解性タンパク質分解剤：
（ｈ）バチルス属に属する微生物由来である。
【請求項４】
下記からなる群より選択される酵素を有効成分として含有する、難分解性タンパク質分解剤：
（Ｘ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む、酵素、
（Ｙ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質分解活性を有する、改変酵素、及び
（Ｚ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質分解活性を有する、相同酵素。
【請求項５】
難分解性タンパク質が病原性プリオンタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の難分解性タンパク質分解剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素又は難分解性タンパク質分解剤と、難分解性タンパク質とを接触させる工程を含む、難分解性タンパク質を分解する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素の、難分解性タンパク質分解剤を製造するための使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素を有効成分として含有する、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物に対する病原性プリオンタンパク質無毒化剤。
【請求項９】
病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物と、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素又は請求項８に記載の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
【請求項１０】
病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物を予め加熱処理することなく、前記処理対象物と、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素又は請求項８に記載の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
【請求項１１】
病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物を予め９０℃以上の加熱処理をすることなく、前記処理対象物と、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素又は請求項８に記載の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素の、病原性プリオンタンパク質無毒化剤を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）の分解剤及び前記難分解性タンパク質を分解する方法に関する。
【背景技術】  ヒツジ若しくはマウスのスクレイピー、ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病〔Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＪＤ）〕、又はウシの牛海綿状脳症〔Ｂｏｖｉｎｅ．Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ（ＢＳＥ）；俗称＝狂牛病〕等の疾病は、いずれも起立・歩行困難などの神経症状を示し、病原性プリオンタンパク質が関与していると考えられている。現在では、ヒトが病原性プリオンタンパク質に汚染された牛肉を食したため、感染し、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病〔ｖａｒｉａｎｔ  Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ（ｖＣＪＤ）〕として発症する可能性が指摘されている。そのため、特にＢＳＥは安全な食肉の供給という観点からも極めて深刻な疾病である。
これらの疾病は、体外より体内へ移行した病原性のプリオンタンパク質が、通常脳内に存在する正常型プリオンタンパク質の立体構造を変化させるため〔「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９４年，第３７０巻，ｐ．４７１（非特許文献１）〕、発症すると考えられている。そのため、病原性プリオンタンパク質感染によるこれら疾病の発症を防ぐには、原因となる病原性プリオンタンパク質を発病しない程度にまで分解し、無毒化する必要がある。
しかしながら、病原性プリオンタンパク質は、通常の滅菌処理（例えば、煮沸など）においても極めて安定なタンパク質であり、それら滅菌処理によってその感染力が低下することは殆どないとされている。また、病原体はタンパク質ではあるが、プロテアーゼで分解しようとしても、従来のプロテアーゼでは完全に分解することが困難であった。そのため、病原性プリオンタンパク質を効果的に分解させ、感染による発症を低減させる方法が待ち望まれていた。
病原性プリオンタンパク質のような難分解性タンパク質の分解の方法としては、例えば、特開平６−４６８７１号公報（特許文献１）において、従来のプロテアーゼでは難分解性であるケラチン含有タンパク質を分解する酵素として、プロテアーゼの１種であるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰＷＤ−１菌株由来のケラチナーゼを用いる方法が提案されている。しかし、前記公報では、前記ケラチナーゼは、ケラチン含有タンパク質（例えば、獣毛、人毛、又は鳥羽毛など）の分解のために用いるとされており、病原性プリオンタンパク質に対して効果があるか否かは言及されていない。
なお、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株由来のケラチナーゼのＤＮＡは既に取得されている〔特表平１０−５００８６３号公報（特許文献２）〕。
また、難分解性の病原性プリオンタンパク質の分解に、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株由来の前記ケラチナーゼを用いることが提案されている［米国特許第６，６１３，５０５号明細書（特許文献３）］。しかし、前記特許明細書に記載の方法においては、病原性プリオンタンパク質を低減若しくは分解するためには、前処理として加熱処理を行った後、酵素による処理を行うという２段階の処理が必要であった。この場合、加熱処理を行う設備が必要であるため、これらを持たない施設にとって前記特許明細書に記載の方法を行うことは容易ではなかった。また、２段処理を行わねばならないため、作業性がよくないという問題があった。
更に、国際公開第０２／０５３７２３号パンフレット（特許文献４）においては、病原性プリオンタンパク質の分解に、熱耐性のプロテアーゼを用いることが提案されている。しかし、前記国際公開パンフレット中の実施例に記載されているバチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｓ  Ｒｏｋｋｏ）菌株由来のプロテアーゼを用いて病原性プリオンタンパク質を分解する場合、前記酵素単独では分解が充分ではなく、ドデシル硫酸ナトリウムが反応混液に存在して初めて、充分に分解が可能であると記載されている。また、前記酵素の活性化のためには中性塩が必要であり、更に金属イオン要求性の性質を有するため、キレート作用のある物質と共存した場合、活性が著しく低下するなどの問題があった。
（非特許文献１）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９４年，第３７０巻，ｐ．４７１
（特許文献１）特開平６−４６８７１号公報
（特許文献２）特表平１０−５００８６３号公報
（特許文献３）米国特許第６，６１３，５０５号明細書
（特許文献４）国際公開第０２／０５３７２３号パンフレット
【発明の開示】
従って、本発明の課題は、公知のプロテアーゼに比べて高い難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を示し、しかも、安価に生産することができる酵素、並びにその酵素を有効成分とする難分解性タンパク質分解剤及び病原性プリオンタンパク質無毒化剤を提供し、それらを用いた難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）の分解方法及び病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法を提供することにある。
本発明者は、今般、バチルス属に属する微生物から、難分解性タンパク質を分解することが報告されている公知の酵素に比べ、極めて高い難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有する酵素を見出した。
本発明に使用する前記酵素は、病原性プリオンタンパク質の分解に使用することが既に報告された酵素、例えば、米国特許第６，６１３，５０５号明細書で報告されているバチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株から調製した酵素（ケラチナーゼ）、及び国際公開第０２／０５３７２３号パンフレットで報告されているバチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ菌株から調製した酵素を用いて比較した結果、いずれにおいても後述する実施例で示されたように遥かに優れた特性を有していた。
特に、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株から調製した酵素と比較すれば、本発明に使用する酵素は、遙かに高い病原性プリオンタンパク質分解活性を有することが見出された（実施例７及び８参照）。更に驚くべきことに、前記特許明細書に記載の加熱処理を行なうことなく処理することができることを見出すことができた（実施例７及び８参照）。
また、バチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ菌株から調製した酵素を用いて比較した結果、本発明に使用する酵素は、遙かに高い病原性プリオンタンパク質分解活性を有することが見出された（実施例９〜１１参照）。更に驚くべきことに、ドデシル硫酸ナトリウムの存在の有無にかかわらず、本発明に使用する酵素は、優れた病原性プリオンタンパク質分解活性を有することが見出された（実施例９〜１１参照）。
また、本発明は、見出された酵素を有効成分とする難分解性タンパク質分解剤及び病原性プリオンタンパク質無毒化剤を提供し、更にそれらを用いた難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）の分解方法及び病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法を見出した。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］下記の特性を有し、難分解性タンパク質分解活性を有する酵素を有効成分として含有する、難分解性タンパク質分解剤：
（ａ）作用及び基質特異性：難分解性タンパク質のペプチド結合を加水分解する。
（ｂ）分子量：３１，０００（ゲル濃度１２％の均一ゲルを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：ｐＩ９．３（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ９．０〜１０．０である。
（ｅ）作用至適温度：６０〜７０℃である。
［２］前記酵素が、下記の（ｇ）の特性を更に有する、前記［１］の難分解性タンパク質分解剤：
（ｇ）難分解性タンパク質分解活性として２単位／ｇ以上の活性（ケラチンアズール分解活性を指標として）を示す。
［３］前記酵素が、下記の（ｈ）の特性を更に有する、［１］又は［２］の難分解性タンパク質分解剤：
（ｈ）バチルス属に属する微生物由来である。
［４］下記からなる群より選択される酵素を有効成分として含有する、難分解性タンパク質分解剤：
（Ｘ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む、酵素、
（Ｙ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質分解活性を有する、改変酵素、及び
（Ｚ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質分解活性を有する、相同酵素。
［５］難分解性タンパク質が病原性プリオンタンパク質である、［１］〜［４］の難分解性タンパク質分解剤。
［６］［１］〜［５］の酵素又は難分解性タンパク質分解剤と、難分解性タンパク質とを接触させる工程を含む、難分解性タンパク質を分解する方法。
［７］［１］〜［５］の酵素の、難分解性タンパク質分解剤を製造するための使用。
［８］［１］〜［５］の酵素を有効成分として含有する、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物に対する病原性プリオンタンパク質無毒化剤。
［９］病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物と、［１］〜［５］の酵素又は［８］の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
［１０］病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物を予め加熱処理することなく、前記処理対象物と、［１］〜［５］の酵素又は［８］の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
［１１］病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物を予め９０℃以上の加熱処理をすることなく、前記処理対象物と、［１］〜［５］の酵素又は［８］の病原性プリオンタンパク質無毒化剤とを接触させる工程を含む、病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法。
［１２］［１］〜［５］の酵素の、病原性プリオンタンパク質無毒化剤を製造するための使用。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に使用する精製酵素の３７℃における至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲を示すグラフである。
図２は、本発明に使用する精製酵素のｐＨ９．０における至適温度範囲を示すグラフである。
図３は、本発明に使用する精製酵素による、マウス由来の病原性プリオンタンパク質の分解を示す図面である。
図４は、本発明に使用する酵素組成物Ａによる、マウス由来の病原性プリオンタンパク質の分解を示す図面である。
図５は、本発明に使用する酵素組成物Ａによる、ヒツジ由来の病原性プリオンタンパク質の分解を示す図面である。
図６は、本発明に使用する酵素組成物Ａによる、マウス由来の病原性プリオンタンパク質の分解を示す図面である。
図７は、本発明に使用する酵素組成物Ａ’、又は比較用サモアーゼによる、ハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解を示す図面である。
図８は、ＳＤＳ存在下における本発明に使用する酵素組成物Ａ’、又は比較用サモアーゼによる、ハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解を示す図面である。
図９は、本発明に使用する酵素組成物Ａ’、又は比較用サモアーゼによる、ポリスチレン上に固着したハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に使用する酵素は、難分解性タンパク質の分解活性、すなわち、難分解性タンパク質のペプチド結合を加水分解する活性を有する。
本明細書において、「難分解性タンパク質」とは、一般的なプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ又はトリプシン等）により容易に分解されないタンパク質を意味し、より具体的には、３７℃の条件下で濃度１μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫと１時間反応させても完全には分解されないタンパク質を意味する。前記難分解性タンパク質としては、例えば、病原性プリオンタンパク質、ケラチン、コラーゲン、又はエラスチン等を挙げることができる。
本明細書において、「病原性プリオンタンパク質」とは、スクレイピー、ＣＪＤ、又はＢＳＥなどの発症に関与するタンパク質であって、具体的には、通常脳内に存在する正常型プリオンタンパク質の立体構造が変化したプリオンタンパク質を意味する。その由来としては、例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ウシ、又はヒツジなどを挙げることができる。
正常型プリオンタンパク質と病原性プリオンタンパク質は、アミノ酸配列は同一であるが、タンパク質の立体構造が異なる。具体的には、正常型プリオンタンパク質は、プリオンタンパク質中のポリペプチドがらせん状の形になったα−ヘリックス含有率が高く、ポリペプチドが平らなシートの形になったβ−シートが少ない。それに対し、病原性プリオンタンパク質はβ−シートの含有率が高い（Ｐａｎ，ＰＮＡＳ，９０，１０９６２，１９９３）。また、前記動物由来の各プリオンタンパク質はアミノ酸配列の相同性が高く、正常型プリオンタンパク質の立体構造変化により、難分解性化を示す病原性プリオンタンパク質へ変化する特質も同じである。
前記疾病の病原体と考えられている病原性プリオンタンパク質は、煮沸などの通常の滅菌処理においても極めて安定なタンパク質であり、その感染力が滅菌処理によって低下することは殆どない。また、体内における半減期も、正常型プリオンタンパク質は分解され易く、約２時間であるのに対し、病原性プリオンタンパク質は２４時間以上を必要とし、非常に分解されにくいタンパク質である。実際に、市販のプロテイナーゼＫなどの従来のプロテアーゼにより分解性を評価すると、正常型プリオンタンパク質は、容易に分解され、感受性であるのに対し、病原性プリオンタンパク質は、分解性が低い難分解性であり、抵抗性であることが示されている（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１５１５，１９９１）。この分解の受けやすさの違いは、先述した立体構造の違いが原因であるとされている。
正常プリオンタンパク質と病原性プリオンタンパク質の判別方法としては、例えば、先述したプロテアーゼによる分解性の違いを利用する方法を挙げることができる。すなわち、病原性プリオンタンパク質に感染の恐れのある動物由来の組織をすりつぶして均質化した懸濁液を調製し、一般的なプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫなど）により処理した後、ウェスタンブロッティング法（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１２，１９５，１９８１）により、プリオンタンパク質の存在を検出する。その際、何も検出されない場合は、正常型プリオンタンパク質のみが存在していたことになるが、プロテアーゼ抵抗性を示すタンパク質バンドが検出された場合は、病原性プリオンタンパク質が存在していたことになる。
本明細書において、「難分解性タンパク質分解活性」とは、難分解性タンパク質のペプチド結合を加水分解する活性を意味する。本明細書では、「難分解性タンパク質分解活性」の単位として２種類の単位を使用する。第１の単位は、ｐＨ８．０及び６０℃の条件下で、終濃度０．５％ケラチン粉末［人毛由来；ナカライテスク（株）］懸濁液に酵素を１時間作用させ、この測定系において１分間当たりに１μｍｏｌのグリシンに相当する分解物を生成する酵素量を、「１単位」として定義する。第２の単位は、ｐＨ８．０及び３７℃の条件下で、終濃度０．８％ケラチンアズール（Ｓｉｇｍａ社）懸濁液に酵素を１６時間作用させ、この測定系において１分間当たりに反応混液の上清へ遊離した色素量を、５９５ｎｍの吸光度で測定した時の０．００１の吸光度変化量を、「１単位」として定義する。
なお、ケラチンアズールは、例えば、羊毛由来のケラチンにアゾ色素が結合した化合物であり、ケラチンのペプチド結合を切断して遊離したアゾ色素結合アミノ酸又はアゾ色素結合ペプチドを分光学的に定量可能なことから、難分解性タンパク質の１つであるケラチンの分解活性（すなわち、ケラチナーゼ活性）を測定するための基質として常用されている化合物である。
また、本明細書において、「病原性プリオンタンパク質分解活性」とは、病原性プリオンタンパク質のペプチド結合を加水分解する活性を意味する。「病原性プリオンタンパク質分解活性」は、例えば、１％のスクレイピー感染マウスの脳組織懸濁液に含まれる病原性プリオンタンパク質の分解を指標として、その活性の程度（強弱）を判定することができる。
より具体的には、病原性プリオンタンパク質に感染したマウス由来の脳組織をすりつぶして均質化した懸濁液を調製し、判定しようとする酵素又は酵素組成物により処理する。その処理物に含まれるタンパク質を電気泳動により分離し、ウェスタンブロッティング法でプリオンタンパク質の存在を検出する。その際、何も検出されない場合は、判定しようとする酵素又は酵素組成物が非常に強い病原性プリオンタンパク質分解活性を有することを示す。また同様に、プロテアーゼ抵抗性を示すタンパク質バンドが検出された場合、そのタンパク質バンドが薄い場合は、ある程度の病原性プリオンタンパク質分解活性があることを、そのタンパク質バンドが濃い場合は、病原性プリオンタンパク質分解活性が弱いことを示す。
難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質
本発明に使用する酵素としては、例えば、以下の理化学的性質を有する酵素を用いることができる。
（ａ）作用及び基質特異性
タンパク質のペプチド結合、特に難分解性タンパク質（例えば、病原性プリオンタンパク質など）のペプチド結合を加水分解する。基質特異性に関しては、病原性プリオンタンパク質の他に、カゼイン、コラーゲン、エラスチン、及びケラチンに対して高い分解活性を有する。
（ｂ）分子量
１２％均一ゲル（すなわち、ポリアクリルアミドの濃度が１２％である均一ゲル）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約３１，０００である。
また、１５％均一ゲル（すなわち、ポリアクリルアミドの濃度が１５％である均一ゲル；例えば、アトー社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約２６，０００である。
（ｃ）等電点
ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による等電点（ｐＩ）は約９．３である。
（ｄ）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
ケラチンアズール分解活性を指標として評価した至適ｐＨは、約９．０〜１０．０である。ｐＨ約７．０〜１２．０の範囲において安定な活性を有し、ｐＨ約８．０〜１０．５において高い活性を有している。
（ｅ）作用至適温度
ケラチンアズール分解活性を指標として評価した作用至適温度は、約６０〜７０℃である。
（ｆ）失活ｐＨ
ケラチンアズール分解活性を指標とした評価では、ｐＨ約５以下で失活した。
本発明に使用する酵素のこれらの性質を、難分解性タンパク質分解活性を有する公知のプロテアーゼ（バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株由来のケラチナーゼ）と比較した結果を、表１に示す。
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本発明の別の態様では、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素、並びにその改変酵素又はその相同酵素を用いることができる。
「配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素」には、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる酵素、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有する融合酵素、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと、融合用パートナーとの融合ポリペプチドであって、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有する融合酵素、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端にプレ配列（シグナル配列）又はその一部が付加されたアミノ酸配列からなる酵素などが含まれる。更には、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＮ末端にプレ配列が付加されたアミノ酸配列に、更に、適当なマーカー配列及び／又は融合用パートナーが付加された融合酵素も、「配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素」に含まれる。
前記プレ配列としては、天然のプレ配列又は人工的に設計されたプレ配列を用いることができる。前記天然のプレ配列としては、バチルス・リケニフォルミス由来のプレ配列（特には、バチルス・リケニフォルミス由来の難分解性タンパク質分解酵素のプレ配列）を用いることができるだけでなく、バチルス・リケニフォルミス以外の生物に由来するプレ配列を用いることもできる。
前記マーカー配列としては、例えば、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧタグ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを用いることができる。
また、前記融合用パートナーとしては、例えば、精製用ポリペプチド［例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の全部又は一部］、検出用ポリペプチド［例えば、ヘムアグルチニン又はβ−ガラクトシダーゼαペプチド（ＬａｃＺ  α）の全部又は一部］、又は発現用ポリペプチド（例えば、シグナル配列）などを用いることができる。
更に、前記融合ポリペプチドにおいては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと前記マーカー配列又は融合用パートナーとの間に、限定分解するタンパク質分解酵素（例えば、トロンビン又はファクターＸａ）で切断することができるアミノ酸配列を適宜導入することもできる。
本明細書における「改変酵素」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は複数個（例えば、１個又は数個）のアミノ酸が欠失、置換、又はは付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質である。ここで、「欠失、置換、又は付加」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜６個である。
また、前記改変酵素には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１又は複数個（例えば、１個又は数個）のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１又は複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、或る疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、或る極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。
具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、又はメチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、又はシステイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、又はリジン等が挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸等が挙げられる。
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８５％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を含み、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴ法（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｎｇｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎより入手）を用いて算出される数値である。
配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素、又はその改変酵素若しくはその相同酵素は、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するが、ケラチンアズール分解活性を指標として、２単位／ｇ以上（より好ましくは２〜５００単位／ｇ、更に好ましくは１０〜５００単位／ｇ、特に好ましくは２０〜５００単位／ｇ）の難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有することが好ましい。ケラチン粉末分解活性を指標とした場合には、１単位／ｇ以上（より好ましくは１〜５０００単位／ｇ、更に好ましくは５〜３０００単位／ｇ）の難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有することが好ましい。
本発明に使用する酵素は、これまで説明した各種理化学的性質を示す酵素であるか、あるいは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素、又はその改変酵素若しくはその相同酵素である限り、その起源は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、又は微生物由来の酵素であることができる。その由来としては、バチルス属に属する微生物により生産された酵素が好ましく、具体的には、バチルス・リケニフォルミスにより生産された酵素がより好ましく、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）により生産された酵素が特に好ましい。また、これらはその変異株であってもよい。
微生物の寄託
バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１４（２００２年）年１０月１６日より国内寄託されたものであり、平成１５年（２００３年）９月１６日から国際寄託に移管されている。国際受託番号（国際受託番号に続く［］内は国内受託番号）は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７［ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０６８］である。
本発明に使用する酵素の具体例として、サチライシン類（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎｓ）が挙げられ、特にサチライシンＤＹ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ＤＹ）（国際公開第９８／３０６８２号パンフレット）が好ましい。
本発明に使用する酵素は、例えば、実施例１に記載のように微生物から単離及び精製することにより得ることができる。また、後述のように遺伝子組換え技術により本発明に使用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離及び精製することによっても得ることができる。
本発明に使用する酵素を生産する微生物から、本発明に使用する酵素を取得するためには、その微生物に適した条件で培養を行ない、本発明に使用する酵素を含む培養上清、菌体、又は培養物（ｂｒｏｔｈ）から公知のタンパク質精製方法を用いることにより、本発明に使用する酵素を調製することができる。以下、本発明に使用する酵素を生産する微生物として、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）を例にとって、微生物の培養及びタンパク質の精製の手順を説明する。
１％ポリペプトン、０．２％イーストエクストラクト、及び０．１％硫酸マグネシウム・七水塩（ｐＨ７．０）からなる培地を常法により加熱滅菌した後、この培地にバチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）を接種し、３７〜５０℃で通気及び攪拌しながら２４〜７２時間培養する。得られた培養液を遠心分離機にて遠心分離（約３０００Ｇ）し、本発明に使用する酵素を含んだ培養上清を得る。次いで、必要に応じて、分画分子量５，０００〜３０，０００の限外濾過膜にて２〜５０倍まで濃縮し、本発明に使用する酵素を含んだ培養上清濃縮液を得る。
前記培養上清又は培養上清濃縮液は、本発明に使用する酵素の他に、多くの夾雑物を含むため、例えば、以下の手順により本発明に使用する酵素を精製することができる。
前記培養上清又は培養上清濃縮液を、孔径約０．４５μｍの精密濾過膜を用いて除菌濾過する。この除菌濾過液に終濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるように硫酸アンモニウムを添加すると同時に、終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ及びｐＨ８．５となるように緩衝剤（トリス−塩酸緩衝液）で調製する。次いで、疎水クロマトグラフィーを行なうために、フェニル・セファロースカラムに前記調製液を吸着させ、トリス−塩酸緩衝液中に硫酸アンモニウムを１ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌの濃度で含むリニアグラジェント溶出を行ない、本発明に使用する酵素を含む画分を分取する。この画分を分画分子量５，０００〜１０，０００の限外濾過膜にて２０〜３０倍まで濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィーを行なって更に精製する。ゲルろ過クロマトグラフィーには、例えば、スーパーデックス７５（ファルマシア社製）ゲルを用いることができる。このゲルに前記濃縮液を、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）を溶離液として通過させ、本発明に使用する酵素を分取する。以上の精製操作により、電気泳動的にほぼ１本のバンドにまで精製することが可能である。
難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明で用いる酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、以下の手順により取得することができる。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明に使用する酵素をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
本発明で用いる酵素をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド）、
（ｉｉ）配列番号１で表わされる塩基配列において、１又は複数個（例えば、１個又は数個）の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列を含み、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいは、
（ｉｉｉ）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
前記（ｉｉ）のポリヌクレオチドにおいて、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数は、具体的には１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、更に好ましくは１〜９個である。
ここで、前記（ｉｉｉ）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号１で表される塩基配列を含むプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株由来のケラチナーゼ（米国特許第６，６１３，５０５号明細書）、あるいは、バチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ菌株由来のプロテアーゼ［例えば、サモアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｅ）］とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。
より具体的には、例えば、プローブとして標識化した配列番号１で表される塩基配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の添付の操作方法に従って、４２℃で１時間のプレハイブリダイゼーションの後、前記プローブを添加し、４２℃で１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、０．４％ＳＤＳ及び６ｍｏｌ／Ｌ尿素添加０．４倍以下の濃度のＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ；１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸三ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で４２℃にて２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度のＳＳＣで室温にて１０分間の洗浄を２回行うような条件が挙げられる。
本発明で用いる酵素をコードするポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものであってもよい。前記ポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）のゲノミックライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
発現ベクター及び形質転換された微生物
本発明で用いる配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素、又はその改変酵素若しくは相同酵素は、前記酵素をコードする塩基配列を宿主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターにより調製することができる。前記発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、前記発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。前記発現ベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
前記発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、本発明で用いる酵素をコードするポリヌクレオチドの他に、その発現を制御する塩基配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター、又はシグナルペプチドをコードする塩基配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。また、前記遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子、又は栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
本発明で用いる酵素は、前記発現ベクターによって形質転換された微生物により調製することができる。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、又は糸状菌などを用いた系、あるいは、それらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その宿主細胞又は培養物から前記の本発明に使用する酵素を単離して得ることができる。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物について慣用されている条件のそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的の酵素を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
また、本発明に使用される酵素の最も好適な製造方法として、バチルス属に属する微生物を用いる方法が好ましく、具体的には、バチルス・リケニフォルミスを用いる方法がより好ましく、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）はその変異株を用いる方法が特に好ましい。
酵素組成物並びに難分解性タンパク質分解剤及び病原性プリオンタンパク質無毒化剤
本発明に使用する酵素剤は、上述の理化学的性質を有する酵素、微生物を培養することにより得られるその酵素、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含む酵素又はその改変酵素若しくは相同酵素、又は前記宿主細胞を培養することにより得られる酵素（以下、これらの一つ又はそれ以上の酵素を「本発明に使用する酵素」と称する）のいずれか一つ又はそれ以上を含む。
本発明に使用する酵素組成物は、本発明に使用する酵素を有効成分として含有する限り、特に限定されるものではなく、酵素組成物を調製するのに一般的に用いることのできる担体及び／又は希釈剤、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、又はソルビトール等）、界面活性剤、又は防腐剤などと共に混合し、製造することができる。また、本発明に使用する酵素組成物は、所望により、適当な形状、例えば、粉末又は液体状等に適宜調製することができる。
酵素組成物中の酵素含量は、その使用目的に応じて充分な酵素活性が発揮可能である限り、特に限定されるものではないが、例えば、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
また、難分解性タンパク質分解活性として、２単位／ｇ以上（より好ましくは２〜５００単位／ｇ、更に好ましくは１０〜５００単位／ｇ、特に好ましくは２０〜５００単位／ｇ）の活性（ケラチンアズール分解活性を指標として）を示す量で、あるいは、１単位／ｇ以上（より好ましくは１〜５０００単位／ｇ、更に好ましくは５〜３０００単位／ｇ）の活性（ケラチン粉末分解活性を指標として）を示す量で、本発明に使用する酵素を含有することが好ましい。この酵素量は、スクレイピー感染マウスの１％脳組織懸濁液１ｍＬ中に含まれる病原性プリオンタンパク質を分解するのに充分な量である。
本発明に使用する酵素組成物は、本発明に使用する酵素に加え、更に本発明に使用する酵素以外の酵素、例えば、プロテアーゼ（例えば、ケラチナーゼ）、リパーゼ、セルラーゼ、又はキシラナーゼの少なくとも１つを含むことができる。本発明に使用する酵素以外の酵素を併用することにより、本発明に使用する酵素を単独で含む酵素組成物に比べて、病原性プリオンタンパク質の分解効率をより一層向上させることが期待される。
本発明に使用する酵素は、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）を分解する活性を有する。従って、本発明に使用する酵素、又はそれを含有する本発明に使用する酵素組成物は、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解剤の有効成分として、あるいは、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物に対する病原性プリオンタンパク質無毒化剤の有効成分として有用である。
本発明の分解剤又は無毒化剤は、有効成分である本発明に使用する酵素を単独で含有することもできるし、あるいは、有効成分である本発明に使用する酵素と一緒に、適当な担体及び／又は希釈剤を含有することもできる。前記担体又は希釈剤としては、有効成分である本発明に使用する酵素の酵素活性を抑制又は阻害することがない限り、タンパク質分解剤又は無毒化剤の担体又は希釈剤として一般的に用いられている担体又は希釈剤、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、又はソルビトール等）、界面活性剤、又は防腐剤を用いることができる。
本発明の分解剤又は無毒化剤の形状としては、特に限定はされないが、本剤を水に投入した場合に発泡しながら速やかに溶解する発泡製剤が好ましい。発泡製剤の配合及び製法は、特に限定はされず、既知の方法を用いることができる。例えば、重曹又は過炭酸ナトリウム等にクエン酸、リンゴ酸、又はコハク酸等の酸を配合したもの、あるいは、それらの配合原料に更に無水ケイ酸等の流動化剤又は他の結合剤を配合したものを用いることができる。
難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）を分解する方法
本発明に使用する酵素又は酵素組成物を、それ単独で、あるいは、本発明の分解剤又は無毒化剤の形で用いることにより、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）を分解することができるし、あるいは、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物において、病原性プリオンタンパク質を無毒化することができる。
すなわち、本発明に使用する酵素又は酵素組成物を用いる、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）を分解する方法、そして、本発明に使用する酵素又は酵素組成物を用いる、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物における病原性プリオンタンパク質を無毒化する方法も、本発明に含まれる。
本発明の分解方法は、本発明に使用する酵素又は酵素組成物と、難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）又はそれを含む可能性のある分解処理対象物とを接触させる工程を少なくとも含む。また、本発明の無毒化方法は、本発明に使用する酵素又は酵素組成物と、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある無毒化処理対象物とを接触させる工程を少なくとも含む。
前記分解処理対象物又は無毒化処理対象物（以下、併せて、単に「処理対象物」と称する）としては、例えば、病原性プリオンタンパク質を含有する可能性のある飼料（例えば、肉骨粉又は堆肥など）、病原性プリオンタンパク質が表面に付着している可能性のある器具（例えば、屠殺器具、検査用具、又は手術用具など）、あるいは、病原性プリオンタンパク質が存在する可能性のある場所（例えば、屠殺場、ＢＳＥ発生牛舎、又は感染実験施設など）を挙げることができる。
前記処理対象物は、本発明に使用する酵素と接触させる前に、加熱処理（例えば、約１００℃以上、好ましくは９５℃以上、より好ましくは９０℃以上、特に好ましくは８０℃以上）を実施することなく用いることもできるし、あるいは、加熱処理を実施した後、用いることもできる。本発明方法では、加熱処理を実施しなくても充分な分解又は無毒化を達成することができるため、本発明に使用する酵素と接触させる前に、処理対象物を加熱処理（例えば、約１００℃以上、９５℃以上、９０℃以上、８０℃以上）することなく用いるのが好ましい。加熱処理を実施しない場合、特別な加熱処理設備が不要であり、しかも、作業手順を簡略化することができるからである。
本発明に使用する酵素又は酵素組成物と処理対象物とを接触させる方法としては、処理対象物に含まれる可能性のある難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）を、本発明に使用する酵素の難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性により、分解することが可能な方法である限り、特に限定されるものではなく、処理対象物に応じて適宜選択することができる。
例えば、処理対象物が、病原性プリオンタンパク質を含有する可能性のある飼料である場合には、例えば、本発明に使用する酵素又は酵素組成物と飼料とを均一に混合するか、あるいは、本発明に使用する酵素を含有する水溶液を飼料に散布することにより接触させることができる。
また、処理対象物が、病原性プリオンタンパク質が表面に付着している可能性のある器具である場合には、例えば、本発明に使用する酵素を含有する水溶液中に前記器具を浸漬させる方法、本発明に使用する酵素を含有する水溶液を前記器具に散布する方法、あるいは、本発明に使用する酵素を含有する水溶液を含有する洗浄用用具（例えば、布、スポンジ、又はブラシなど）で前記器具の表面を拭く方法などを挙げることができる。
また、処理対象物が、病原性プリオンタンパク質が存在する可能性のある場所である場合には、例えば、本発明に使用する酵素を含有する水溶液を散布する方法などを挙げることができる。
本発明方法において、本発明に使用する酵素又は酵素組成物と処理対象物とを接触させる場合には、本発明に使用する酵素がその難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）分解活性を充分に発揮することができる条件下で接触させることが好ましい。例えば、ｐＨとしては、７〜１２の範囲で接触させることが好ましい。また、温度としては、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは４０〜８０℃の範囲で接触させることができる。
また、その使用量も、処理対象物に含まれる難分解性タンパク質（特には、病原性プリオンタンパク質）の量に応じて適宜決定することができる。例えば、スクレイピー感染マウスの１％脳組織懸濁液１ｍＬ中に含まれる病原性プリオンタンパク質を分解するためには、本発明に使用する酵素量として０．５〜１０μｇを用いるか、あるいは、難分解性タンパク質分解活性として、２単位／ｇ以上（より好ましくは２〜５００単位／ｇ、更に好ましくは１０〜５００単位／ｇ、特に好ましくは２０〜５００単位／ｇ）の活性（ケラチンアズール分解活性を指標として）又は１単位／ｇ以上（より好ましくは１〜５０００単位／ｇ、更に好ましくは５〜３０００単位／ｇ）の活性（ケラチン粉末分解活性を指標として）を有する本発明に使用する酵素組成物を用いることが好ましい。本発明に使用する酵素量として０．５μｇ未満、あるいは、本発明に使用する酵素組成物に含まれる難分解性タンパク質分解活性が２単位／ｇ未満（ケラチンアズール分解活性を指標として）又は１単位／ｇ未満（ケラチン粉末分解活性を指標として）の場合には、前記含量の病原性プリオンタンパク質を完全に分解することが困難となる場合がある。また、前記含量の病原性プリオンタンパク質を完全に分解する目的で、酵素１０μｇを超える量で、あるいは、難分解性タンパク質分解活性が５００単位／ｇを超える量（ケラチンアズール分解活性を指標として）又は５０００単位／ｇを超える量（ケラチン粉末分解活性を指標として）である酵素組成物を用いることは、生産コストを勘案すれば、現実的ではない。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：精製酵素の調製
本実施例では、本発明に使用する精製酵素を得るために、下記の手順により培養及び精製を行なった。
まず、培地Ａ［１％ポリペプトン（和光純薬工業社製）、０．２％イーストエクストラクト（ディフコ社製）、及び０．１％硫酸マグネシウム・七水塩（和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）］を常法により加熱滅菌した後、この培地Ａ（２００ｍｌ）にバチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）を接種し、３７℃で通気及び攪拌しながら７２時間培養した。得られた培養液を遠心分離機にて遠心分離（３０００Ｇ，２０分間）し、本発明に使用する酵素を含んだ培養上清を得た。
次に、分画分子量５，０００の限外濾過膜にて２０倍まで濃縮し、本発明に使用する酵素を含んだ培養上清濃縮液を得た。この培養上清濃縮液を孔径０．４５μｍの精密濾過膜を用いて除菌濾過した。この除菌濾過液に終濃度１ｍｏｌ／Ｌとなるように硫酸アンモニウムを添加し、更に、終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌ及びｐＨ８．５となるように緩衝剤（トリス−塩酸緩衝液）で調製した。次いで、疎水クロマトグラフィーを行なうために、フェニル・セファロースカラムに前記調製液を吸着させ、トリス−塩酸緩衝液中に硫酸アンモニウムを１ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌの濃度で含むリニアグラジェント溶出を行ない、本発明に使用する酵素を含む画分を分取した。この画分を分画分子量５，０００の限外濾過膜にて２０倍まで濃縮した後、ゲルろ過クロマトグラフィーを行なった。ゲルろ過クロマトグラフィーには、スーパーデックス７５（ファルマシア社製）ゲルを用いた。このゲルに前記濃縮液を、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（０．０２５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）を溶離液として通過させ、本発明に使用する酵素を分取した。以上の精製操作により、本発明に使用する精製酵素（２０μｇ）を取得した。
実施例２：酵素の理化学的性質の確認
（１）作用及び基質特異性
実施例１で得た精製酵素の各種基質（カゼイン、コラーゲン、エラスチン、及びケラチン）に対する活性を調べた。結果を表２に示す。
表２に示すように、いずれの基質に対しても高い分解活性を示したが、特にケラチンに高い分解活性を示した。なお、表２における分解活性とは、基質濃度０．５％、ｐＨ９．０、及び６０℃の条件下において、１分間に１μｍｏｌ／Ｌのグリシンに相当するニンヒドリン発色力を有する酵素量を１単位（Ｕ）として比較したものである。
2004042049.tif 000003
（２）分子量
実施例１で得た精製酵素の分子量を決定するため、１２％均一ゲル（テフコ社製）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。その結果、病原性プリオンタンパク質分解酵素の分子量は約３１，０００と算出された。
また、別のゲル（１５％均一ゲル；アトー社製）を用いて、実施例１で得た精製酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なったところ、病原性プリオンタンパク質分解酵素の分子量は約２６，０００と算出された。なお、本試験に用いた標準マーカーは、プロテインスタンダード（バイオ・ラド社製）を用いた。
（３）等電点
実施例１で得た精製酵素の等電点（ｐＩ）を決定するため、ＬＫＢ両性等電点電気泳動装置を用いてポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動を行なった。その結果、病原性プリオンタンパク質分解酵素の等電点は９．３と算出された。なお、この試験に用いた標準サンプルの等電点は、表３のとおりである。
2004042049.tif 000004
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ
実施例１で得た精製酵素の３７℃における至適ｐＨについて、ケラチンアズール（Ｓｉｇｍａ社）分解活性を指標として測定した結果、図１に示すように、ｐＨ９．０〜１０．０であった。また、３７℃における安定ｐＨは、図１に示すように、ｐＨ７．０〜１２．０、好ましくは８．０〜１０．５であった。
（５）至適温度
実施例１で得た精製酵素の至適温度について、ケラチンアズール分解活性を指標として、至適ｐＨであるｐＨ９．０で測定した結果、図２に示すように、６０〜７０℃であった。
実施例３：酵素遺伝子のクローニング及びアミノ酸配列の決定
本実施例では、実施例１で得た精製酵素のアミノ酸配列を決定するために、前記酵素をコードする遺伝子をクローニングし、その塩基配列を決定することによりアミノ酸配列を確認した。
前記酵素の精製のため、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）を、培地Ａ（実施例１参照）に植菌し、３７℃で３日間培養し、遠心分離により培養上清を得た。この上清を、ペリコンＸＬ（ｃｕｔ５０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で約２０倍まで濃縮し、１ｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム及び０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）溶液となるよう調製した。これを、フェニルセファロースカラム（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ；ｌｏｗ  ｓｕｂ，２６Ｘ３００ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．５）中、１ｍｏｌ／Ｌ〜０ｍｏｌ／Ｌの直線濃度勾配で溶出し、硫酸アンモニウム濃度０ｍｏｌ／Ｌで溶出される画分を回収した。この画分はペリコンＸＬ（ｃｕｔ５０００）、次いでウルトラフリー１５（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  １５；ｃｕｔ５０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ；１６Ｘ６００ｍｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に供し、０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸及び０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）で溶出し、分子量約３１ｋＤａの画分を回収した。この画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、分子量約３１ｋＤａのタンパク質を単一に含んでいた。
精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＳＱ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロット後、水洗して風乾した。これをプロテインシーケンサーＭｏｄｅｌ  ４９２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアミノ酸配列を解析した。その結果、以下に示すアミノ酸配列が得られた。
Ｎ末端アミノ酸配列：ＡＱＴＶＰＹＧＩＰＬＩ（配列番号２で表されるアミノ酸配列における１番〜１１番のアミノ酸からなる配列）
この配列は、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１由来ケラチナーゼ［Ｌｉｎ，Ｘ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）６１，１４６９−１４７４］及びバチルス・リケニフォルミス由来サチライシン・カールスバーグ（Ｓｕｂｔｉｌｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）［Ｊａｃｏｂｓ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８５）１３，８９１３−８９２６］と同一の配列であることが判明した。そこで、ＰＣＲにより部分断片を増幅し、これをプローブに遺伝子をクローニングした。
バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）のゲノムＤＮＡは、Ｗｉｌｓｏｎらの方法（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８５）１６３，４４５−４５３）に従って調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型に、以下の配列からなるプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲにより異常プリオン分解酵素遺伝子の部分断片を増幅した。ＰＣＲ用酵素はタカラＴａｑ（ＴａｋａｒａＴａｑ；タカラバイオ）を用い、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、及び６８℃で２分間のステップを３０サイクル繰り返すことにより目的のＤＮＡを増幅させた。
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その結果、約７００ｂｐの断片が増幅された。そこで、この断片をプローブにバチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）のゲノムライブラリーから目的とする遺伝子の全長をクローニングした。
まず、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）のゲノムＤＮＡを制限酵素ＳａｕＩＩＩＡ１で部分的に消化し、ＥＭＢＬＩＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と連結し、市販のパッケージングキット（ＭａｘＰｌａｘ  Ｌａｍｂｄａ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてファージ粒子を形成させた。このファージライブラリーから、市販のスクリーニングキット（ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング＆デテクションスターターキット；ロッシュ）を用いてスクリーニングを行い、約１００００プラークから１００種の陽性クローンを得た。この内、１０種の陽性ファージからＤＮＡを精製し、これらの内、４種に共通に含まれる約４．１ｋｂのＳｐｈＩ断片をｐＵＣ１１９にサブクローニングした（以下、ｐＵＣ−ＰＤＥ４と称する）。このＳｐｈＩ断片の大きさは、ＰＣＲ産物をプローブに、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）のサザン解析を行った結果と一致していた。このプラスミドｐＵＣ−ＰＤＥ４を用いて、ＤＮＡシーケンサーｍｏｄｅｌ  ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたショットガンシーケンス法により配列を決定した。その結果、異常プリオン分解酵素遺伝子の全長が含まれており、その翻訳領域の塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列のとおりであった。
その結果、実施例１で得た精製酵素は、サチライシンＤＹ（国際公開第９８／３０６８２号パンフレット）とアミノ酸配列が完全に一致することが確認された。また、これ以外として最も相同性が高いものは、バチルス・リケニフォルミス由来のｋｅｒＡ遺伝子の８１％であった（ＢＬＡＳＴ検索による）。
実施例４：酵素組成物の調製
本発明に使用する酵素組成物を得るために、実施例１に記載の培地Ａ（２００ｍＬ）に、バチルス・リケニフォルミスＭＳＫ−１０３菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４８７）を接種し、３７℃で通気及び攪拌しながら４８時間培養した。得られた培養液を遠心分離機にて遠心分離（３０００Ｇ，３０分間）し、本発明に使用する酵素を含んだ培養上清を得た。次に、分画分子量５，０００の限外濾過膜にて３０倍まで濃縮し、培養上清濃縮液を得た。この培養上清濃縮液を孔径０．４５μｍの精密濾過膜を用いて除菌濾過し、本発明に使用する酵素を含んだ酵素組成物溶液Ａを得た。この酵素組成物Ａのケラチンアズール分解活性は、２８５単位／ｇであった。次いで、酵素組成物溶液Ａを凍結乾燥し、酵素組成物粉末Ａ’を得た。
一方、培地Ｂ［０．０１％イーストエクストラクト（ディフコ社製）、１％フェザーミール（伊藤忠飼料社製）、０．０１％塩化マグネシウム（和光純薬工業社製）、０．０４％リン酸水素二カリウム（和光純薬工業社製）、０．０３％リン酸水素一カリウム（和光純薬工業社製）、０．０５％塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）、及び０．０５％塩化アンモニウム（和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）］を加熱滅菌した後、この培地Ｂ（４０ｍＬ）に、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１（ＡＴＣＣ−５３７５７）菌株を接種し、３７℃で通気及び攪拌しながら４８時間培養した。得られた培養液を遠心分離機にて遠心分離（３０００Ｇ，３０分間）し、培養上清を得た。次に、分画分子量５，０００の限外濾過膜にて１８倍まで濃縮し、培養上清濃縮液を得た。この培養上清濃縮液を孔径０．４５μｍの精密濾過膜を用いて除菌濾過し、比較用の酵素組成物溶液Ｂを得た。
実施例５：精製酵素を用いたマウス由来病原性プリオンタンパク質の分解
本実施例では、実施例１で述べた方法に従って調製した本発明に使用する精製酵素と、市販されているプロテアーゼ〔サチライシン・カールスバーグ（Ｓｕｂｔｉｌｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）；Ｓｉｇｍａ社製〕とを用いて、本発明に使用する酵素の病原性プリオンタンパク質分解能を、酵素標品〔プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）；和光純薬社製〕による分解能を基準として評価した。
本実施例においては、基質として、病原性プリオンタンパク質感染マウス〔「クリニカル・アンド・ディアグノスティック・ラボラトリー・イムノロジー（ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」，（米国），アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｓｍ）），１９９５年３月，ｐ．１７２−１７６〕の脳から５％ホモジネート〔２％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）〕を調製し、そのホモジネートを最終濃度１％になるように５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）で希釈したものを用いた。
酵素反応は、前記１％脳ホモジネートを、等容量の精製酵素溶液、市販プロテアーゼ溶液、又は酵素標品溶液と混和した後、３７℃で１時間インキュベートする方法により実施した。精製酵素、市販プロテアーゼ、及び酵素標品の濃度は、酵素反応時の反応混液における最終濃度として、１μｇ／ｍＬ及び０．２μｇ／ｍＬの２段階とした。
酵素反応の終了した反応混液の一部を、電気泳動装置（ＡＴＴＯ社製）とＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１０％ゲル；ＡＴＴＯ社製）とを用い、電気泳動〔Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）〕した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のポリアクリルアミドゲル中のタンパク質を、転写装置（ＡＴＴＯ社製）にて、添付のプロトコールに従い、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写した。この膜に結合した病原性プリオンタンパク質に対し、抗プリオンタンパク質−ウサギ抗体を１次抗体、抗ウサギＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を２次抗体として、抗原抗体法により標識した。その後、市販の標識及び検出システム（ＥＣＬ＋Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；アマシャム・バイオサイエンス社製）により、添付のプロトコールに従って、病原性プリオンタンパク質の検出を実施した。
なお、１次抗体として用いた抗プリオンタンパク質−ウサギ抗体は、ヒツジスクレイピープリオンタンパク質のコアフラグメントＰ２７−３０のＮ末端配列にシステイン（Ｃｙｓ）を付加した２０アミノ酸からなるペプチド（ＰｒＰ９４−１１２）を合成し、このペプチドにスカシガイヘモシアニン〔Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）〕を付加したものを免疫原としてウサギに免疫し、得られた抗血清からプロテインＡカラムを用いて精製することにより調製した。この抗体は、ヒツジプリオンタンパク質だけでなく、ハムスター、マウス、及びウシの各プリオンタンパク質とも反応する。
結果を図３に示す。図３に示すように、基準となるプロテイナーゼＫ、あるいは、市販プロテアーゼのサチライシン・カールスバーグでは、１μｇ／ｍＬの濃度でも病原性プリオンタンパク質の存在を示すプロテアーゼ抵抗性のバンドが検出された。なお、これらのバンドの分子量は、全く分解を受けていないバンドが３２ｋＤａであり、部分的に分解されたバンド（３本）が３０ｋＤａ、２５〜２６ｋＤａ、及び２０〜２１ｋＤａであった。それに対して、本発明に使用する精製酵素においては、０．２μｇ／ｍＬでバンドが検出されたが、１μｇ／ｍＬの濃度では、１％の脳ホモジネートに含まれる病原性プリオンタンパク質をほとんど分解することが可能であった。
実施例６：酵素組成物を用いたマウス由来病原性プリオンタンパク質の分解
実施例４で述べた方法に従って調製した本発明に使用する酵素組成物溶液Ａを用いて、マウス由来の病原性プリオンタンパク質分解能を評価した。その際、酵素標品（プロテイナーゼＫ；和光純薬社製）による分解能を基準とした。また、基質としては、実施例５で用いたものと同じ基質（すなわち、病原性プリオンタンパク質感染マウス由来の１％脳ホモジネート）を使用した。
酵素反応は、前記１％脳ホモジネートを等容量の酵素組成物溶液又は酵素標品溶液と混和した後、３７℃で１時間インキュベートする方法により実施した。酵素標品の濃度は、最終濃度として５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、及び６．２５μｇ／ｍＬの４段階とし、酵素組成物Ａについては、前記組成物溶液を１、１／２、１／４、１／８、及び１／１６に希釈したものを用いた。なお、前記組成物の各希釈物のケラチンアズール分解活性は、それぞれ、２８５単位／ｇ、１４３単位／ｇ、７１単位／ｇ、３６単位／ｇ、及び１８単位／ｇであった。
酵素反応の終了した反応混液の一部を、実施例５で述べた方法に従って、病原性プリオンタンパク質の検出を実施した。
結果を図４に示す。図４に示すように、基準となるプロテイナーゼＫでは、５０μｇ／ｍＬの高濃度においても、病原性プリオンタンパク質の存在を示す、プロテアーゼ抵抗性のタンパク質のバンドが検出された。それに対して、本発明に使用する酵素組成物においては、１８単位／ｇのケラチンアズール分解活性を有する酵素組成物（１／１６希釈物；培養上清の１．８７５倍濃縮液）でわずかにバンドが検出されたが、３６単位／ｇ（１／８希釈物；培養上清の３．７５倍濃縮液）以上のケラチンアズール分解活性を有する酵素組成物では、完全に分解されることが明らかとなった。
実施例７：酵素組成物を用いたヒツジ由来病原性プリオンタンパク質の分解
実施例４で述べた方法に従って調製した本発明に使用する酵素組成物溶液Ａ及び比較用の酵素組成物溶液Ｂ（バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１由来ケラチナーゼ含有）を用いて、ヒツジ由来の病原性プリオンタンパク質分解能を、酵素標品（プロテイナーゼＫ；和光純薬社製）による分解能を基準として評価した。
基質としては、病原性プリオンタンパク質感染ヒツジの脳から５％ホモジネート〔２％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム，１０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）〕を調製し、そのホモジネートを最終濃度１％になるように５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）で希釈したものを用いた。
酵素反応は、前記１％脳ホモジネートを等容量の酵素組成物溶液又は酵素標品溶液と混和した後、３７℃で１時間インキュベートする方法により実施した。酵素標品の濃度は、最終濃度として５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、及び０．４μｇ／ｍＬとした。一方、本発明に使用する酵素組成物Ａは、ケラチンアズール分解活性として２８５単位／ｇ、１４３単位／ｇ、７１単位／ｇ、及び３６単位／ｇのもの（希釈倍率として１、１／２、１／４、及び１／８）を、比較用酵素組成物Ｂは、３７単位／ｇ、１９単位／ｇ、９単位／ｇ、及び５単位／ｇのもの（希釈倍率として１、１／２、１／４、及び１／８）を用いた。
酵素反応の終了した反応混液の一部は、実施例５で述べた方法に従って、病原性プリオンタンパク質の検出を実施した。
結果を図５に示す。図５に示すように、基準となるプロテイナーゼＫでは、１０μｇ／ｍＬ以下の濃度において、病原性プリオンタンパク質の存在を示す、プロテアーゼ抵抗性のタンパク質のバンドが検出された。また、比較用の酵素組成物Ｂは、いずれの濃度においても、病原性プリオンタンパク質は分解されなかった。それに対し、本発明に使用する酵素組成物Ａにおいては、いずれの濃度においてもほぼ完全に分解されることが明らかとなった。また、病原性プリオンタンパク質の由来が異なり、アミノ酸配列が若干異なる場合でも、本酵素には病原性プリオンタンパク質を分解する能力があることが明らかとなった。
実施例８：酵素組成物を用いたマウス由来病原性プリオンタンパク質の分解
バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１菌株を実施例４に記載の本発明に使用する酵素組成物Ａと同様の方法（すなわち、培地Ａを用いて）で培養した後、実施例４に記載の酵素組成物Ａと同様の方法で、比較用の酵素組成物Ｃを調製した。
また、バチルス・リケニフォルミスＤＳＭ−８７８２菌株を実施例４に記載の酵素組成物Ａと同様の方法（すなわち、培地Ａを用いて）で培養した後、実施例４に記載の酵素組成物Ａと同様の方法で、比較用の酵素組成物Ｄを調製した。
更に、バチルス・リケニフォルミスＤＳＭ−８７８２菌株を実施例４に記載の比較用酵素組成物Ｂと同様の方法（すなわち、培地Ｂを用いて）で培養した後、実施例４に記載の酵素組成物Ｂと同様の方法で、比較用の酵素組成物Ｅを調製した。
表４に、各酵素組成物と菌株及び培地との関係を示す。なお、培地Ｂは、ケラチナーゼ誘導培地（特開平６−４６８７１号公報）である。
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このようにして調製した本発明に使用する酵素組成物Ａ及び比較用の４種類の酵素組成物Ｂ〜Ｅについて、各酵素組成物の最終濃度を培養上清の１８倍濃縮としたこと以外は、実施例７に記載の手順に従って、マウス由来の病原性プリオンタンパク質分解能を比較した。
結果を図６に示す。図６に示すように、比較用の酵素組成物Ｂ〜Ｅにおいては、病原性プリオンタンパク質を分解することはできなかった。しかし、本発明に使用する酵素組成物Ａでは、完全に分解されることが明らかとなった。
実施例９：サモアーゼとの比較試験（１）
実施例４で述べた方法に従って調製した本発明に使用する酵素組成物Ａ′と、比較用の酵素として国際公開第０２／０５３７２３号パンフレットに記載の菌株であるバチルス・サーモプロテオリティクス・ロッコ菌株由来の酵素、サモアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏａｓｅ）（大和化成株式会社）とを用いて、ハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解能を評価した。
基質としては、ハムスター型病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）に感染し、脳内にＳｃ２３７株型の病原性プリオンタンパク質が蓄積したマウスの脳から１％脳ホモジネート〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）〕を調製したものを用いた。
酵素溶液は、前記酵素組成物Ａ′及びサモアーゼを５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）にそれぞれ溶解して調製した。酵素組成物溶液又は酵素溶液の濃度は、いずれもケラチン粉末分解活性を指標として、最終濃度４、８、１６、又は３２単位／ｍＬのものを用いた。
酵素反応は、前記１％脳ホモジネートを等容量の酵素組成物溶液又は酵素溶液と混和した後、３７℃で２０時間インキュベートする方法により実施した。
酵素反応の終了した反応混液の一部を用いて、実施例５で述べた方法に従って、病原性プリオンタンパク質の検出を実施した。
結果を図７に示す。図７に示すように、サモアーゼの酵素溶液においては、いずれの酵素濃度においても、病原性プリオンタンパク質の存在を示す、プロテアーゼ抵抗性のタンパク質のバンドが検出された。それに対して、本発明に使用する酵素組成物においては、全ての濃度で病原性プリオンタンパク質は、ウェスタンブロッティング法では検出することができないレベルまで完全に分解されることが明らかとなった。
実施例１０：サモアーゼとの比較試験（２）
国際公開第０２／０５３７２３号パンフレットにおいて、サモアーゼはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下で、タンパク質（ＢＳＥ由来の病原性プリオンタンパク質）分解活性が上がるとの記載があるため、そのような条件下でのハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解能を評価した。
実施例４で述べた方法に従って調製した本発明に使用する酵素組成物Ａ′と、実施例９で用いたのと同じサモアーゼの溶液とを用いて、ハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解能を評価した。
基質としては、ハムスター型病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）に感染し、脳内にＳｃ２３７株型の病原性プリオンタンパク質が蓄積したマウスの脳から１％脳ホモジネート〔ＳＤＳを０．１、１、又は４％の割合で添加した５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）（ＳＤＳ終濃度＝０．０５、０．５、又は２％）〕を調製したものを用いた。
酵素反応は、前記１％脳ホモジネートを等容量の酵素組成物溶液又は酵素溶液と混和した後、３７℃で２０時間インキュベートする方法により実施した。酵素組成物溶液又は酵素溶液の濃度は、いずれもケラチン粉末分解活性を指標として、最終濃度４単位／ｍＬのものを用いた。
酵素反応の終了した反応混液の一部を、実施例５で述べた方法に従って、病原性プリオンタンパク質の検出を実施した。
結果を図８に示す。図８において、レーン１はサモアーゼ（４Ｕ／ｍＬ；０．０５％ＳＤＳ）の結果であり、レーン２はサモアーゼ（４Ｕ／ｍＬ；０．５％ＳＤＳ）の結果であり、レーン３はサモアーゼ（４Ｕ／ｍＬ；２％ＳＤＳ）の結果であり、レーン４は酵素組成物Ａ′溶液（４Ｕ／ｍＬ；２％ＳＤＳ）の結果である。
図８に示すように、サモアーゼの酵素溶液は、ＳＤＳ終濃度２％においても４単位／ｍＬの酵素濃度で病原性プリオンタンパク質の存在を示す、プロテアーゼ抵抗性のタンパク質のバンドが検出された。それに対して、本発明に使用する酵素組成物は、全ての濃度で病原性プリオンタンパク質は、ウェスタンブロッティング法では検出することができないレベルまで完全に分解されることが明らかとなった。
以上のことから、ＳＤＳ存在下においても本酵素の病原性プリオンタンパク質の分解作用は、サモアーゼと比較して優れていることが明らかとなった。
実施例１１：マイクロプレートを用いた洗浄モデル試験
病原性プリオンタンパク質に汚染された器具に対する洗浄効果について検討を行うため、モデル実験系として下記のような実験を実施した。
実施例４で述べた方法に従って調製した本発明に使用する酵素組成物Ａ′溶液と、実施例９で用いたのと同じサモアーゼ溶液とを用いて、ポリスチレン上に固着したハムスター由来の病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）の分解能を評価した。
基質としては、ハムスター型病原性プリオンタンパク質（Ｓｃ２３７株）に感染し、脳内にＳｃ２３７株型の病原性プリオンタンパク質が蓄積したマウスの脳から１％脳ホモジネート〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）〕を調製したものを用いた。また、対照処理として、異常プリオンタンパク質に感染していない正常脳からも１％脳ホモジネート〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）〕を調製した。
このようにして調製した正常又はＳｃ２３７感染ハムスター１％脳ホモジネートをポリスチレン製のマイクロプレート（ＩＭＭＵＮＯ  ＭＯＤＵＬＥ；Ｎｕｎｃ社製）に各２５μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で１日完全に乾燥させた。
上述したようにして準備したマイクロプレートに対して酵素溶液を用いた洗浄処理を行うため、酵素組成物Ａ’及びサモアーゼを、ケラチン粉末分解活性を指標として７．５及び１５単位／ｍＬになるように５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）で希釈したものをそれぞれ洗浄溶液Ａ（７．５単位／ｍＬ）及び洗浄溶液Ｂ（１５単位／ｍＬ）として調製した。
酵素反応のため、１００μＬ／ウェルの割合でそれぞれの洗浄溶液を注ぎ、１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、インキュベーションを行った。その後、洗浄溶液を除去し、約３００μＬのＰＢＳで２回洗浄を行った。
１００μＬ／ウェルの６ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン（和光純薬社製）を注ぎ、室温で１時間静置することにより変性処理を行った。その後、塩酸グアニジンを除去するため、約３００μＬのＰＢＳで３回洗浄を行った。次に、３００μＬ／ウェルの割合で５％スキムミルク（アマシャム社製）を注ぎ、室温で１時間静置することによりブロッキングを行った。その後、約３００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで２回洗浄を行った。
このマイクロプレートに結合した病原性プリオンタンパク質に対し、抗プリオンタンパク質−マウス抗体（３Ｆ４；ケミコン  インターナショナル社製）を１次抗体として、抗マウスＩｇＧ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ社）を２次抗体として、抗原抗体法により標識した。その後、マイクロプレートのウェル内に残存するプリオンタンパク質を、市販の標識及び検出システム（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ；アマシャム・バイオサイエンス社製）により、添付のプロトコールに従って発光反応を行った。この発光量を撮影装置（ライトキャプチャーＡＥ−６９６２型；ＡＴＴＯ社製）を用いて撮影し、その画像を画像解析ソフトウェア（ＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＡＴＴＯ社製）を用いて画像解析を行った。
結果を図９に示す。図９に示すように、本発明に使用する酵素組成物においては、７．５単位／ｍＬの濃度で、病原性プリオンタンパク質の残存率は１０％未満であり、また、１５単位／ｍＬの濃度では、病原性プリオンタンパク質の残存率は約１％未満であった。それに対し、サモアーゼは、いずれの濃度においても、病原性プリオンタンパク質の残存率は４０％以上であり、本酵素の病原性プリオンタンパク質の洗浄能力が高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明に使用する酵素は、公知のプロテアーゼに比べて、難分解性タンパク質、特に病原性プリオンタンパク質に対して高い分解活性を有する。従って、本発明に使用する酵素又はそれを含有する本発明に使用する酵素組成物によれば、病原性プリオンタンパク質を効果的に分解することができる。また、本発明に使用する酵素は、安価に生産することができる。
従って、前記酵素又は酵素組成物を使用することで、病原性プリオンタンパク質に汚染された可能性のある処理対象物の汚染を除去することができる。また、前記酵素は、本発明の病原性プリオンタンパク質分解剤又は汚染除去剤の有効成分として有効である。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配列は、プライマーＰＤＥ−２であり、配列表の配列番号４の配列で表される塩基配列は、プライマーＰＤＥ−５である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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