(57)【要約】細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法、該製造方法で用いられる該ＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＲＮＡまたはＤＮＡを導入したまたは発現させた細胞、該細胞の作製方法および該酵素を抑制する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入させた細胞を用いる抗体組成物の製造方法；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
【請求項２】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコース転移酵素である、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
α１，６−フコース転移酵素が、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求の範囲２に記載の方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
α１，６−フコース転移酵素が、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求の範囲２に記載の方法。
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコース転移酵素活性を有する蛋白質。
【請求項５】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンのいずれか１つに耐性である、請求の範囲５に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項７】
細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
細胞が、下記の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる細胞である、請求の範囲１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
【請求項９】
細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、請求の範囲１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
抗体分子が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、請求の範囲９に記載の方法。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
【請求項１１】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入していない親株細胞が生産する抗体組成物の抗体依存性細胞傷害活性より、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物を製造する、請求の範囲１〜１１のいずれか１項に記載の方法；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
【請求項１３】
高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、請求の範囲１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、請求の範囲１３に記載の方法。
【請求項１５】
高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、請求の範囲１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物である、請求の範囲１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求の範囲１〜１６のいずれか１項に記載の方法で用いられる、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
【請求項１８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコース転移酵素である請求の範囲１７に記載の細胞。
【請求項１９】
配列番号９〜３０のいずれかで表される塩基配列からなる群のＲＮＡから選ばれるＲＮＡを導入または発現させた細胞。
【請求項２０】
以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡ；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
【請求項２１】
請求の範囲２０に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補ＤＮＡ。
【請求項２２】
請求の範囲２０に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
【請求項２３】
請求の範囲２０に記載の二本鎖ＲＮＡを発現させることを特徴とする、請求の範囲２２に記載の組換え体ＤＮＡ。
【請求項２４】
請求の範囲２２または２３に記載の組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項２５】
請求の範囲２０に記載の二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を作製する方法。
【請求項２６】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性が、少なくとも、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、請求の範囲２５に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
【請求項２７】
配列番号９〜３０のいずれかで表される塩基配列からなる群のＲＮＡから選ばれるＲＮＡを用いて、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する方法。
【請求項２８】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコース転移酵素である請求の範囲２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法、該製造方法で用いられる該ＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＲＮＡまたはＤＮＡを導入したまたは発現させた細胞、該細胞の作製方法および該酵素を抑制する方法に関する。
【背景技術】  一般的に、医薬への応用が考えられているヒト化抗体の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞等を宿主細胞として用い製造されているが、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）等の細胞傷害活性をエフェクター細胞に惹起する抗体のエフェクター機能には糖鎖構造、特に抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加が重要な役割を担っていること（ＷＯ０２／３１１４０）、宿主細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違いが観察されることから［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６（２００３）］、より高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な生産細胞の開発が望まれている。
近年、Ｒｉｔｕｘａｎによる非ホジキン白血病患者の治療、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎによる乳癌患者の治療において、該抗体医薬が患者のエフェクター細胞に強いＡＤＣＣ活性を惹起した場合には、より高い治療効果が得られている（Ｂｌｏｏｄ，９９，７５４，２００２；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２１，３９４０，２００３；Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１０，５６５０，２００４）。
細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節し、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する一つの方法として、糖鎖の修飾に係わる酵素の阻害剤を応用することが試みられている。しかしながら、このような阻害剤の特異性は低く、また標的とする酵素を十分に阻害することも難しいため、生産抗体の糖鎖構造を確実に制御することは難しい。
また、糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１３８４８（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１６６８（１９９１）］。β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示した［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］。しかしながら、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すため、抗体医薬の生産には適切ではない。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，３３９３（１９９８）］。最近になって、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの生合成に関与する酵素であるＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（以下、ＧＭＤと表記する）の発現が低下した細胞株、例えばＣＨＯ細胞Ｌｅｃ１３株等を用いて、ＡＤＣＣ活性が有為に上昇した抗体の発現に成功した例が報告された［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３（２００２）］。
変異剤処理によって取得された株の変異は、ランダムに導入されており、目的としない変異の導入が想定されるため、医薬品製造に用いる株として適切ではない。
以上のように、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、哺乳動物では、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）が存在することが知られている［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７２，９０９（１９７６）］。ＦＵＴ８（ＥＣ２．４．１，６８）の遺伝子構造は１９９６年に明らかにされた［ＷＯ９２／２７３０３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２７８１７（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１，６２６（１９９７）］。
このような中、免疫グロブリンＩｇＧのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの結合により、抗体自身のＡＤＣＣ活性が変化することが報告され、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの活性とＡＤＣＣ活性との関係が注目されている［ＷＯ０２／３１１４０、ＷＯ００／６１７３９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６（２００３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３（２００２）］。具体的には、１）α１，６−フコシルトランスフェラーゼを過剰に発現させた細胞株が生産する抗体のＡＤＣＣ活性は低下すること、２）α１，６−フコシルトランスフェラーゼの対立遺伝子の片方を破壊した細胞株が産生する抗体の抗体依存性細胞傷害活性は上昇することが示されている（ＷＯ０２／３１１４０）。
しかしながら、上述の相同組換え法による遺伝子破壊の方法以外に、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を人為的に抑制する方法は知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法、該製造方法で用いられる該ＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＲＮＡまたはＤＮＡを導入したまたは発現させた細胞、該細胞の作製方法および該酵素を抑制する方法を提供することにある。本発明の方法により製造される抗体組成物は高いエフェクター機能を有しており、医薬品として有用である。
本発明は、以下の（１）〜（２９）に関する。
（１）  細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入させた細胞を用いる抗体組成物の製造方法；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（２）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α１，６−フコシルトランスフェラーゼである、（１）に記載の方法。
（３）  α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（４）  α１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）〜（ｌ）からなる群から選ばれる蛋白質である、（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｃ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｄ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｅ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｆ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｇ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｈ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｌ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（５）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞が、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）  以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンのいずれか１つに耐性である、（５）に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（７）  細胞が、酵母、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の方法。
（８）  細胞が、下記の（ａ）〜（ｉ）からなる群から選ばれる細胞である、（１）〜（７）のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
（９）  細胞が、抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体である、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）  抗体分子が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれる分子である、（９）に記載の方法。
（ａ）ヒト抗体；
（ｂ）ヒト化抗体；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を含む抗体断片；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）のＦｃ領域を有する融合蛋白質。
（１１）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）  以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入していない親株細胞が生産する抗体組成物の抗体依存性細胞傷害活性より、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物を製造する、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（１３）  高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、親株細胞が生産する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、（１２）に記載の方法。
（１４）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖である、（１３）に記載の方法。
（１５）  高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物である、（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）  抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる抗体組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体組成物である、（１２）〜（１５）のいずれか１項に記載の方法。
（１７）  （１）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法で用いられる、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞。
（１８）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである（１７）に記載の細胞。
（１９）  配列番号９〜９０のいずれかで表される塩基配列からなる群のＲＮＡから選ばれるＲＮＡを導入または発現させた細胞。
（２０）  以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＲＮＡおよびその相補ＲＮＡで構成される二本鎖ＲＮＡ；
（ａ）配列番号９〜３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｂ）配列番号９〜３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ。
（２１）  （２０）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補ＤＮＡ。
（２２）  （２０）に記載のＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＤＮＡの相補ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（２３）  （２０）に記載の二本鎖ＲＮＡを発現させることを特徴とする、（２２）に記載の組換え体ＤＮＡ。
（２４）  （２２）または（２３）に記載の組換え体ＤＮＡを細胞に導入して得られる形質転換体。
（２５）  （２０）に記載の二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入または発現させることを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞を作製する方法。
（２６）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性が、少なくとも、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選ばれるレクチンの一つに耐性である、（２５）に記載の方法。
（ａ）レンズマメレクチン；
（ｂ）エンドウマメレクチン；
（ｃ）ソラマメレクチン；
（ｄ）ヒイロチャワンタケレクチン。
（２７）  配列番号９〜３０のいずれかで表される塩基配列からなる群のＲＮＡから選ばれるＲＮＡを用いて、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する方法。
（２８）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素がα１，６−フコシルトランスフェラーゼである（２７）に記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は２００３年１０月９日に出願された日本国特許出願２００３−３５０１６７号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載される内容を包含する。
本発明は、細胞を用いて抗体組成物を製造する方法において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いることを特徴とする、抗体組成物を製造する方法、該製造方法で用いられる該ＲＮＡ、該ＲＮＡに対応するＤＮＡおよび該ＲＮＡまたはＤＮＡを導入したまたは発現させた細胞、該細胞の作製方法および該酵素を抑制する方法に関する。
細胞を用いて抗体組成物を製造する方法としては、ハイブリドーマ細胞を用いてモノクローナル抗体を製造する方法、抗体遺伝子を導入した宿主細胞を用いてヒト抗体およびヒト化抗体を製造する方法、抗体遺伝子を導入したヒト以外の動物の胚性幹細胞または受精卵細胞をヒト以外の動物の初期胚へ移植後、発生させたトランスジェニック非ヒト動物を用いてヒト抗体およびヒト化抗体を製造する方法、抗体遺伝子を導入した植物カルス細胞より作製したトランスジェニック植物を用いてヒト抗体およびヒト化抗体を製造する方法等を包含する。
本発明の製造方法で用いられる細胞としては、抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等があげられ、好ましくは動物細胞があげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等があげられる。
本発明の、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞は、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する。
従って、本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の抗体組成物を製造することができる細胞であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞があげられ、具体的には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する、ハイブリドーマ細胞、ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック非ヒト動物を製造する胚性幹細胞および受請卵細胞、ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック植物を製造する植物カルス細胞、ミエローマ細胞、トランスジェニック非ヒト動物由来の細胞等があげられる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来のミエローマ細胞はハイブリドーマ細胞を製造する際に融合細胞として用いることができる。また、トランスジェニック非ヒト動物に抗原を免疫し該動物の脾臓細胞を用いて公知の方法でハイブリドーマ細胞を作製することもできる。
レクチンに耐性な細胞とは、培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞培養を行ったときにも、生育が阻害されない細胞をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、親株細胞に用いる細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍＬである。親株細胞にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した場合のレクチンの有効濃度とは、該親株細胞が正常に生育できない濃度以上の濃度であり、好ましくは該親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍の濃度、さらに好ましくは１０倍の濃度、最も好ましくは２０倍以上の濃度をいう。
親株細胞とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入する前の細胞をいう。
親株細胞としては特に限定はないが、具体例として、以下に示す細胞があげられる。
ＮＳ０細胞の親株細胞としては、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６９（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳ０細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳ０細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株等もあげられる。
ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞の親株細胞としては、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、アメリカンタイプカルチャーコレクション（以下、ＡＴＣＣとも表記する）に登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）等もあげられる。
チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞の親株細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞等があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｔ１１６１９）、あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株等もあげられる。
ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞の親株細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を生育可能な様々な培地に馴化させた亜株等もあげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンも包含される。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与がする酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、具体的には、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ等があげられる。
本発明において、α１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）〜（ｈ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｉ）〜（ｔ）の蛋白質等があげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
（ｈ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
または、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｊ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｌ）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｏ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｐ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｑ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｒ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｓ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｔ）配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以土の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、配列番号１、２、３または４のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ等のＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２、３または４のいずれかで表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号５、６、７または８のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号５、６、７または８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質を意味する。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号５、６、７または８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号５、６、７または８のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつα１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質である。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡの長さとしては、１０〜４０、好ましくは１０〜３５、より好ましくは１５〜２９の連続した以下に示すＲＮＡがあげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列中、連続した５塩基以上のアデニンあるいはチミジンを含まない部分の中で、連続した１６〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列中、連続した５塩基以上のアデニンあるいはチミジンを含まない部分の中で、連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列中、連続した５塩基以上のアデニンあるいはチミジンを含まない部分の中で、連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
（ｄ）配列番号４で表される塩基配列中、連続した５塩基以上のアデニンあるいはチミジンを含まない部分の中で、連続した１０〜４０の塩基配列で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するＲＮＡ；
具体的には、
（ｅ）配列番号９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｆ）配列番号９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｇ）配列番号１０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｈ）配列番号１０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｉ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｊ）配列番号１１で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｋ）配列番号１２で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｌ）配列番号１２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｍ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｎ）配列番号１３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｏ）配列番号１４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｐ）配列番号１４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｑ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｒ）配列番号１５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｓ）配列番号１６で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｔ）配列番号１６で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｕ）配列番号１７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｖ）配列番号１７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｗ）配列番号１８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｘ）配列番号１８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（ｙ）配列番号１９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（ｚ）配列番号１９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ａ）配列番号２０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｂ）配列番号２０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｃ）配列番号２１で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｄ）配列番号２１で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｅ）配列番号２２で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｆ）配列番号２２で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｇ）配列番号２３で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｈ）配列番号２３で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｉ）配列番号２４で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｊ）配列番号２４で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｋ）配列番号２５で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｌ）配列番号２５で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｍ）配列番号２６で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｎ）配列番号２６で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｏ）配列番号２７で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｐ）配列番号２７で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｑ）配列番号２８で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｒ）配列番号２８で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｓ）配列番号２９で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｔ）配列番号２９で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；
（Ｕ）配列番号３０で表される塩基配列からなるＲＮＡ；
（Ｖ）配列番号３０で表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有するＲＮＡ；があげられる。
配列番号９〜３０でそれぞれ表される塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列としては、塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された結果生じる二本鎖ＲＮＡは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制する活性を有する限り、一方の鎖にのみ塩基が欠失、置換、挿入および／または付加されていてもよく、即ち、該二本鎖ＲＮＡは必ずしも完全な相補鎖でなくてもよい。
本発明において、抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物をいう。
抗体は、重鎖および軽鎖（以下、それぞれ「Ｈ鎖」および「Ｌ鎖」と表記する）の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。Ｈ鎖のＮ末端側の約４分の１とＬ鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域（以下、「Ｖ領域」と表記する）と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。Ｖ領域以外の部分の大半は定常領域（以下、「Ｃ領域」と表記する）と呼ばれる。抗体分子はＣ領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスはＣ領域の相同性により、例えばヒトにおいてはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
Ｈ鎖はＮ末端側より抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨと表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域１（以下、ＣＨ１と表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域２（以下、ＣＨ２と表記する）、抗体Ｈ鎖Ｃ領域３（以下、ＣＨ３と表記する）の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合型糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体等が結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体等の糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニン等と結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。
本発明において、Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の化学式１で示される。
2005035778.tif 000002
化学式１において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、化学式１で示されるのコア構造を有するものであればいかなるものでもよいが、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミン等の構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型等があげられる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、化学式１で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在する。
したがって、本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞を用いて製造した抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合（以下、「本発明の糖鎖の割合」と表記する）とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。本発明の糖鎖の割合が高いほど、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が高くなる。
ＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、本発明の糖鎖の割合が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％である抗体組成物があげられる。
また、本発明は、親株細胞が生産する抗体組成物よりＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物の製造方法に関する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原等に結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を傷害する活性をいう［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子を含有する組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化等の公知の方法［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６，１５７７（１９８３）］等によって分析することによっても決定することができる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質等があげられる。
抗体としては、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほかにも、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等があげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等をあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体等があげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、「ＨＶ」または「ＶＨ」とも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、「ＬＶ」または「ＶＬ」とも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、「ＣＨ」とも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、「ＣＬ」とも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハ厶スター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、「ｈＩｇ」と表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体トランスジェニック動物あるいはヒト抗体トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。ヒト抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルまたはウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
抗体断片は、上記の抗体のＦｃ領域の一部または全部を含んだ抗体断片である。
本発明の抗体断片組成物としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどの抗体断片組成物であって、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体Ｆｃ領域の一部または全部を含む抗体断片組成物があげられるが、該抗体断片組成物に抗体のＦｃ領域の一部または全部を含まない場合は、該抗体断片と、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体Ｆｃ領域の一部または全部との融合蛋白質とすればよいと融合させるか、または該Ｆｃ領域の一部または全部を含む、蛋白質との融合蛋白質組成物とすればよい。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、上記の抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、上記の抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、上記のＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、上記の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、上記の抗体のＶＨ組成物およびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、上記の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、上記の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
以下、本発明の製造方法を詳細に説明する。
１．  本発明の製造に用いる細胞の作製
本発明の、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞は、例えば、以下のように作製することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分を含む適当な長さのＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトを設計する。
該ＲＮＡｉ遺伝子を細胞内で発現させるために、調製したＤＮＡの断片、または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより形質転換体を得る。
導入したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、本発明の細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の第２項に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、設計したＲＮＡｉ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。具体的には、ポリメラーゼＩＩＩにより転写が行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の第２項に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、後述の第２項に記載の各種宿主細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡおよびゲノ厶ＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡまたはｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］等があげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いる方法等があげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＣＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０８８［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＹ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［Ｇｅｎｅ，１３８，１７１（１９９４）；Ｇｅｎｅ，２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］を行うことにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪ等の塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１、２、３または４に記載の塩基配列が挙げられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法が挙げられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等を用いることにより、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、例えば、以下の方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下した細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖蛋白質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖蛋白質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法等があげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を測定する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法等が挙げられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の４．に記載の方法が挙げられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、好ましくはレンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等があげられる。
具体的には、１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜２ｍｇ／ｍＬの濃度の上述のレクチンを含む培地に１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の細胞を選択することができる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の遺伝子のｍＲＮＡ量を抑制するためのＲＮＡｉ遺伝子は、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＮＡｉ遺伝子のコンストラクトは、［Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１５５０２，（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ，３９５，８５４，（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，５０４９，（１９９９）、Ｃｅｌｌ，９５，１０１７，（１９９８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４５１，（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，１３９５９，（１９９８）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０，（２０００）、Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４，（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，９７４２，（２００１）］等の記載に従って設計することができる。
また、発現ベクターを用いず、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の塩基配列に基づいて設計した二本鎖ＲＮＡを、直接宿主細胞に導入することで、本発明の細胞を得ることもできる。
二本鎖ＲＮＡは、常法またはＲＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。具体的には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの相補ＲＮＡ塩基配列のうち、連続した１〜４０塩基、好ましくは５〜４０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、さらに好ましくは１５〜２９塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情報に基づき、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を合成することで調製することができる。該オリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ独立に合成してもよいし、二本鎖ＲＮＡ形成に支障のないようなスペーサーヌクレオチドでつながれていてもよい。
オリゴヌクレオチドとしては、オリゴＲＮＡおよび該オリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる［細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。
２．抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞として、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができるが、好ましくは動物細胞があげられる。
抗体分子のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺伝子工学的な手法を用いて導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を宿主細胞として用いることもできる。
本発明の抗体組成物の製造方法に用いられる宿主細胞としては、上記１．で作製した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素の機能を抑制するＲＮＡを導入した細胞をあげることができる。
発現ベクターとしては、上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体分子をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
ｃＤＮＡは、上記第１項に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウ厶法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐＣＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐＣＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４．７４１３（１９８７）］、インジェクション法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏ  ｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウ厶（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭、６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウ厶、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３〜９に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養等の培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいけ宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，８２２７（１９８９）；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）；Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質等を挙げることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法について記すが、他の抗体組成物を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、「ｈＣγ１」と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、「ｈＣκ」と表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデ厶型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単雕する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＣＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体ＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２のＡの（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項２のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２のＡの（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、本項２のＡの（５）および（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項２のＡの（５）および（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項２のＡの（４）および（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞等があげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（曰水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ礼製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９９８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ（１９９３）］等で測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭＰｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＣＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］およびＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素等で消化後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
本項２のＢの（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞等があげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記第１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（曰水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ２．１（１９９５）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体組成物およびＦｃ融合蛋白質の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有している場合には、前記１．に記載の方法を用いて抗体分子を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物を製造することができる。
３．抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ，Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
４．抗体組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコース等の中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミン等のアミノ糖、シアル酸等の酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法等を用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏＮ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５（１），２８３（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬等と分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これら結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等の質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
５．本発明により得られる抗体組成物の利用
本発明により得られる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー等の免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１１９７，１９９８］、本発明の抗体組成物は単独で高い抗腫瘍効果を有するため、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー等の免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化等があげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＣＡ１２５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗１７−１Ａ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗インテグリンαｖβ３抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ３３抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ２２抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＨＬＡ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ２０抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ１９抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＥＧＦ受容体抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ１０抗体［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４３８６（１９８２）］、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＣＤ５２抗体［Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ＦＧＦ８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗インスリン様増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＭＳＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗血管内皮細胞増殖因子抗体［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）］等が挙げられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＩｇＥ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ２３抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ１１ａ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＲＴＨ２抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８（１９９９）］、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）、抗インターロイキン６抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６（１９９９）］、抗ケモカイン抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９（１９９４）］または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］または抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］等が挙げられる。
自己免疫疾患、例えば、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１（２０００）］、抗ＣＤ１１ａ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＩＣＡＭ３抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ８０抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ２抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ３抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗インテグリンα４β７抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＣＤ４０Ｌ抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］、抗ＩＬ−２受容体抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３（２０００）］等が挙げられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３６，３７３（１９９３）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
【図面の簡単な説明】第１図は、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーを用いた有効ｓｉＲＮＡ標的配列の探索によって得た１５９クローンの標的配列の分布を示した図である。図中のＡからＪで示される部分は標的配列として選択した領域である。
第２図は、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入により取得したレクチン耐性株およびその親株のＦＵＴ８遺伝子の発現量を示した図である。ＦＵＴ８遺伝子の発現量は、β−アクチン遺伝子発現量で標準化した親株のＦＵＴ８遺伝子発現量を１００として示した。
第３図は、ヒトＵ６プロモーター、クローニングサイトおよびターミネーター発現カセットを含むプラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍの構築を示した図である。
第４図は、ヒトＵ６プロモーター、クローニングサイトおよびターミネーター発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有するプラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍの構築を示した図である。
第５図は、ヒトＵ６プロモーターを用いたＦＵＴ８を標的としたショートヘアピンＲＮＡ発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有するプラスミドＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲおよびＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲの構築を示した図である。
第６図は、ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター、クローニングサイトおよびターミネーター発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有するプラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）の構築を示した図である。
第７図は、ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーターを用いたＦＵＴ８を標的としたショートヘアピンＲＮＡ発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有するプラスミドｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（−）およびｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（−）の構築を示した図である。
第８図は、ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーターを用いたＦＵＴ８を標的としたショートヘアピンＲＮＡ発現カセットおよびピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを有するプラスミドｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（＋）およびｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（＋）の構築を示した図である。
第９図は、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターの導入により取得したレクチン耐性プール株およびその親株のＦＵＴ８遺伝子の発現量を示した図である。ＦＵＴ８遺伝子の発現量は、β−アクチン遺伝子発現量で標準化した親株のＦＵＴ８遺伝子発現量を１００として示した。
第１０図は、無血清培地に馴化したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株を用いた無血清フェドバッチ培養における培養開始後の各時点における生細胞密度を示した図である。横軸に培養日数を、縦軸に生細胞密度を対数でそれぞれ示した。
第１１図は、無血清培地に馴化したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株を用いた無血清フェドバッチ培養における培養開始後の各時点における細胞生存率を示した図である。横軸に培養日数を、縦軸に細胞生存率をそれぞれ示した。
第１２図は、無血清培地に馴化したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株を用いた無血清フェドバッチ培養における培養開始後の各時点における培養上清中の抗ＣＣＲキメラ抗体濃度を示した図である。横軸に培養日数を、縦軸にＥＬＩＳＡ法により定量した抗体濃度をそれぞれ示した。
第１３図は、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合［Ｆｕｃｏｓｅ（−）％］が既知の標準抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した。横軸に各標準抗体のＦｕｃｏｓｅ（−）％、縦軸に各標準抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を表すＥＬＩＳＡ法のＯＤ４１５実測値をそれぞれ示した。
第１４図は、無血清培地に馴化したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株を用いた無血清フェドバッチ培養における培養開始後の各時点における培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合［Ｆｕｃｏｓｅ（−）％］を示した図である。横軸に培養日数を、縦軸にｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を表すＥＬＩＳＡ法の結果から求めたＦｕｃｏｓｅ（−）％をそれぞれ示した。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】［実施例１］
ＦＵＴ８を標的としたＳｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ（ｓｉ）ＲＮＡ発現ベクターライブラリーを用いたレクチン耐性株取得に有効なｓｉＲＮＡ標的配列の探索
１．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲの作製
（１）ＣＨＯ細胞由来ＦＵＴ８をコードするｃＤＮＡ配列の取得
ＷＯ００／６１７３９の記載に従って、チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より調製した１本鎖ｃＤＮＡより、以下の手順でチャイニーズハ厶スター由来ＦＵＴ８をコードするｃＤＮＡをクローニングした。
まず、マウスＦＵＴ８のｃＤＮＡ塩基配列［ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＢ０２５１９８］より、５’側非翻訳領域に特異的なフォワードプライマー（配列番号３１に示す）および３’側非翻訳領域に特異的なリバースプライマー（配列番号３２に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の１本鎖ｃＤＮＡ  １μＬを含む２５μＬの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、４％ＤＭＳＯ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記特異的プライマー（配列番号３１および配列番号３２）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。
ＰＣＲ後、該反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２Ｋｂの増幅断片を回収した。該増幅断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）用いて、添付の説明書に従ってプラスミドｐＣＲ２．１と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性コロニーのうちｃＤＮＡが組み込まれた８クローンから、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、それぞれのプラスミドＤＮＡを単離した。
単離したそれぞれのプラスミドの塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、全てのプラスミドに挿入されたｃＤＮＡが、チャイニーズハムスターのＦＵＴ８のＯＲＦ全長をコードするｃＤＮＡであることを確認した。配列を決定したプラスミドＤＮＡの挿入ｃＤＮＡうち、ＰＣＲに伴う塩基の読み誤りを含まないプラスミドＤＮＡを選択した。以下、本プラスミドをＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１と称す。このようにして決定したチャイニーズハ厶スターのＦＵＴ８  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示した。
（２）ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ％現ベクターライブラリーの調製
本項（１）で得られたＣＨｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１を用いて、ＷＯ０３／４６１８６実施例１３に記載の方法と同様にして、ＦＵＴ８を標的としたヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター型ｓｉＲＮＡ％現ベクターライブラリーを作製した。尚、アンチセンスコードＤＮＡとセンスコードＤＮＡとの間のＬｏｏｐ配列としては制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を用い、ｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をベクターとして用いた。以下、作製したライブラリーをＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂと称す。
滅菌シャーレ［２４３ｍｍ×２４３ｍｍ×ｌ８ｍｍ（Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ社製）］を用いて１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を作製し、シャーレ１枚当たり５０μＬのＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂのグリセロールストックを播種した。３７℃にて一晩静置培養した後、プレート上の菌体を滅菌水に懸濁して回収し、菌体からＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、プラスミドライブラリーを回収した。以下、回収したプラスミドライブラリーをＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲと称す。
２．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ライブラリーを導入したレクチン耐性株の取得
本実施例第１項で得られたＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ライブラリープラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを、参考例に記載の方法で得られたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞とする抗ＣＣＲ４キメラ化抗体生産株の１つである３２−０５−１２株へ導入し、α１，６−フコースを特異的に認識するレクチンであるＬＣＡに耐性を有する株を、以下のようにして取得した。
本実施例第１項で得られたプラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した１０μｇのプラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲを１．６×１０６個の３２−０５−１２株へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］で導入した後、基本培地［１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、および５００ｎｍｏｌ／Ｌメソトレキセート（以下、ＭＴＸと称す；ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＩＭＤＭと称す；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）３枚へ８ｍＬずつ播種した。この時、同一の条件で１０回の遺伝子導入を行い、合計３０枚の培養用１０ｃｍディッシュにおいて、以下のように培養を行った。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で、およびＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換し、さらに６〜８日間の培養を行い、レクチン耐性クローンを取得した。
３．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡＭ現プラスミドの標的配列の解析
（１）レクチン耐性株ゲノムＤＮＡ上のｓｉＲＮＡ発現カセットの単離
本実施例第２項で得られたレクチン耐性株に対し、以下のようにしてゲノムＤＮＡよりｓｉＲＮＡ発現カセットの単離を行った。
レクチン耐性クローンを、公知の方法［Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９３）］に従って接着細胞用平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ採取し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２枚の接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。このうち１枚のプレートをレプリカプレートとする一方、残りの１枚のプレートをマスタープレートとして凍結保存した。レプリカプレートは、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１週間培養した後、公知の方法［Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々３０μＬのＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ］に一晩溶解した後、ＤＮＡ濃度が０．０５μｇ／μＬの濃度となるように滅菌水で希釈した。
また、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲの、ｓｉＲＮＡ発現カセットのｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター領域の上流に結合するフォワードプライマー（配列番号３３）およびｓｉＲＮＡ発現カセットのターミネーター配列の下流に結合するリバースプライマー（配列番号３４）をそれぞれ設計した。
ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、上記で調製した各クローンのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、各クローンについて、上記のゲノ厶ＤＮＡ溶液を５μＬ含む５０μＬの反応液［ＫＯＤ  Ｂｕｆｆｅｒｌ（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（配列番号３３および配列番号３４）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９７℃で１０秒間、６８℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして、２５サイクル行った。
ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ｓｉＲＮＡ発現カセットを含む約３００ｂｐの増幅断片を回収した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片を回収した。
上記で得られた約３００ｂｐの増幅断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片と、制限酵素ＰｖｕＩＩ共存下において連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた複数のアンピシリン耐性コロニーから、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、それぞれプラスミドＤＮＡを単離した。
（２）ｓｉＲＮＡ発現ユニットに含まれる標的配列の解析
本項（１）で得られたプラスミド中のｓｉＲＮＡ発現カセットに含まれるＦＵＴ８に対する標的配列の解析を行った。
まず、本項（１）で得られた各プラスミドＤＮＡに挿入されたｓｉＲＮＡ発現カセットの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析した。決定した１５９クローンの塩基配列のうち、ＦＵＴ８に対する標的配列について、ＣＨＯ細胞ＦＵＴ８  ｃＤＮＡ配列（配列番号１）との相同性を比較し、配列番号１に示される塩基配列における各標的配列の分布および各標的配列の配列番号１に示される塩基配列における開始点および終止点を第１図に示した。
2005035778.tif 000003
2005035778.tif 000004
１５９クローンの標的配列のうち、代表的であった領域を図中のＡからＪで示した。ＡからＪの領域に対応するＦＵＴ８の塩基配列は、それぞれ領域Ａは配列番号９、領域Ｂは配列番号１０、領域Ｃは配列番号１１、領域Ｄは配列番号１８、領域Ｅは配列番号１２、領域Ｆは配列番号１７、領域Ｇは配列番号１３、領域Ｈは配列番号１４、領域１は配列番号１５、領域Ｊは配列番号１６にそれぞれ示した。尚、本項（１）で得た各プラスミドのうち、配列番号９に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１／ｐＰＵＲ，配列番号１０に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲ、配列番号１１に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ、配列番号１２に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲ、配列番号１３に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ５／ｐＰＵＲ、配列番号１４に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲ、配列番号１５に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ７／ｐＰＵＲ、配列番号１６に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲ、配列番号１７に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲ、配列番号１８に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡ発現プラスミドを以下ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１０／ｐＰＵＲとそれぞれ称す。
（３）ｓｉＲＮＡ発現ユニットに含まれる標的配列のマウス、ラットおよびヒトのホモログ配列の検索
本項（２）で得られた配列番号９〜１８で示され他領域に相当する配列をマウス、ラットおよびヒトのＦＵＴ８の配列中から、以下のようにして検索した。
配列番号２はマウスのＦＵＴ８を、配列番号３はラットのＦＵＴ８を、配列番号４はヒトのＦＵＴ８の配列をそれぞれ示す。該配列中より、本項（２）で得られた配列番号９〜１８で示される標的配列に相当する配列を検索した。このとき、配列番号９〜１８で示される標的配列と完全に一致する配列は除外した。
以下に、選択した配列の配列番号をそれぞれ示す。配列番号１０に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号１９、配列番号１０に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２０、配列番号１１に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２１、配列番号１２に対応するヒト、マウスおよびラットＦＵＴ８の配列は配列番号２２、配列番号１３に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号２３、配列番号１３に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２４、配列番号１３に対応するラットＦＵＴ８の配列は配列番号２５、配列番号１４に対応するマウスおよびラットＦＵＴ８の配列は配列番号２６、配列番号１４に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２７、配列番号１５に対応するマウスＦＵＴ８の配列は配列番号２８、配列番号１５に対応するヒトＦＵＴ８の配列は配列番号２９、配列番号１７に対応するラットＦＵＴ８の配列は配列番号３０にそれぞれ示した。
［実施例２］
ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入によるレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製と該細胞のＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の定量
１．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得
実施例１第３項（１）において得られたｓｉＲＮＡ発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ５／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ７／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲおよびＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１０／ｐＰＵＲを、それぞれ以下のようにして参考例に記載の３２−０５−１２株へ導入し、ＬＣＡ耐性株を取得した。
上記の各ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを、制限酵素ＦｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で消化して線状化し、線状化した１０μｇの各ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを１．６×１０６個の３２−０５−１２株へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入した後、基本培地［１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）４枚へ８ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養した後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で、およびＬＣＡ（ＶＥＣＴＯＲ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地８ｍＬに培地交換し、さらに６〜８日間の培養を行い、レクチン耐性クローンを取得した。さらに６〜８日間の培養を行い、レクチン耐性株を取得した。以下、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ１、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ２、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ３、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ４、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ５／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ５、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ６、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ７／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ７、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ８、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ９、ｓｉＲＮＡ発現プラスミド
ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ１０／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ１０とそれぞれ称す。
２．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株におけるＦＵＴ８のｍＲＮＡ量の定量
本実施例第１項で得られたレクチン耐性株１２−ｌｉｂ１、１２−ｌｉｂ２、１２−ｌｉｂ３、１２−ｌｉｂ４、１２−ｌｉｂ５、１２−ｌｉｂ６、１２−ｌｉｂ７、１２−ｌｉｂ８、１２−ｌｉｂ９、１２−ｌｉｂ１０、および該レクチン耐性株の親株である３２−０５−１２株に対し、ＦＵＴ８のｍＲＮＡ量の定量を行った。
上記レクチン耐性株をそれぞれ、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地［１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）、および５００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に３×１０５個／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ２５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に播種して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、３日間培養した後、トリプシン処理を施した。トリプシン処理により得られた各細胞懸濁液を３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を除去し、ダルベッコＰＢＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁した。再度３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を２回行った後、−８０℃で凍結した。また、親株である３２−０５−１２株についても、ピューロマイシンを含まない基本培地を用いて同様に培養を行い、細胞を回収した。
上記で得られた各細胞を室温で融解後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、添付の説明書に従い、全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを４５μＬの滅菌水に溶解し、ＤＮａｓｅ処理を行い、各試料中に混入したゲノ厶ＤＮＡを分解した。反応後、ＲＮＡｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により各全ＲＮＡを再精製し、４０μＬの滅菌水に溶解した。
得られた各全ＲＮＡ３μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写反応を行うことにより、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
競合的ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子の転写量およびβ−アクチン遺伝子の転写量の定量を、以下のように行った。
上記の１本鎖ｃＤＮＡを含む該反応液を滅菌水にて５０倍に希釈した水溶液を、各々使用するまで−８０℃で保管した。ＷＯ００／６１７３９実施例８に記載の方法に従い、各細胞株由来全ｃＤＮＡを鋳型とした競合的ＰＣＲを実施し、各細胞株由来全ＲＮＡ中のＦＵＴ８のｍＲＮＡ量およびβ−アクチンのｍＲＮＡ量を測定した。異なる細胞間でβ−アクチンｍＲＮＡ量は均一であると考え、β−アクチンのｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８のｍＲＮＡ量の相対値を算出した結果、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入により得られたレクチン耐性株では親株と比較してＦＵＴ８のｍＲＮＡ量が低下していた。
［実施例３］
ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得と該細胞を用いた抗体組成物の生産
１．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得および培養
（１）ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得
実施例２第２項において得られたレクチン耐性株は、該細胞株を取得する際に、導入したｓｉＲＮＡ発現プラスミドの標的配列毎に耐性株の出現頻度に差が認められた。そこで、耐性株の出現頻度が高い標的配列について、詳細な解析をするために以下の検討を行った。
実施例１第３項（１）において得られたＦＵＴ８に対するｓｉＲＮＡの標的配列から、配列番号１０に示される３１塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲ、配列番号１０に含まれる５’末端側の２６塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲ、配列番号１１に示される３３塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ、配列番号１２に含まれる３４塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲ、配列番号１４に含まれる２８塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲ配列番号１６に含まれる２６塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲ配列番号１７に示される３４塩基を標的配列とするｓｉＲＮＡの発現プラスミドＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲをそれぞれ実施例１第３項（１）に記載の方法に従って作製した。作製したプラスミドは、それぞれ実施例２第１項に記載の方法に従って参考例に記載の３２−０５−１２株へ導入し、ＬＣＡ耐性株を取得した。
（２）レクチン（ＬＣＡ）耐性株の拡大培養
本項（１）において得られたＬＣＡ耐性株を以下の手順で拡大培養した。
出現したレクチン耐性コロニーを、実体顕微鏡観察下にてピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて掻き取って吸い込み、接着細胞用Ｕ底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ採取した。トリプシン処理を行なった後、接着細胞用平底９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ各クローンを播種し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃の条件下で一週間培養した。培養後、各ｓｉＲＮＡ発現プラスミドあたり５クローンについて、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて拡大培養を行なった。
拡大培養に供した細胞株について、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ２−１、１２−ｌｉｂ２−２、１２−ｌｉｂ２−３、１２−ｌｉｂ２−４、１２−ｌｉｂ２−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ２Ｂ−１、１２−ｌｉｂ２Ｂ−２、１２−ｌｉｂ２Ｂ−３、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４、１２−ｌｉｂ２Ｂ−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ３−１、１２−ｌｉｂ３−２、１２−ｌｉｂ３−３、１２−ｌｉｂ３−４、１２−ｌｉｂ３−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ４−１、１２−ｌｉｂ４−２、１２−ｌｉｂ４−３、１２−ｌｉｂ４−４、１２−ｌｉｂ４−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ６−１、１２−ｌｉｂ６−２、１２−ｌｉｂ６−３、１２−ｌｉｂ６−４、１２−ｌｉｂ６−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ８−１、１２−ｌｉｂ８−２、１２−ｌｉｂ８−３、１２−ｌｉｂ８−４、１２−ｌｉｂ８−５と、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲを導入したレクチン耐性株を１２−ｌｉｂ９−１、１２−ｌｉｂ９−２、１２−ｌｉｂ９−３、１２−ｌｉｂ９−４、１２−ｌｉｂ９−５と、それぞれ命名し、後述の本実施例第２項の解析に供した。尚、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４株および１２−ｌｉｂ３−５株は、平成１６年７月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００５２およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１００５３としてそれぞれ寄託されている。
２．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株におけるＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の定量
（１）全ＲＮＡの調製
本実施例第１項で得られたＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株および該レクチン耐性株の親株である３２−０５−１２株からの全ＲＮＡ調製、並びに１本鎖ｃＤＮＡの合成は実施例２第２項に記載の方法に従って行なった。尚、培養は接着細胞用６ｃｍディッシュ（ファルコン社製）で行い、調製した全ＲＮＡは４０μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量は、以下の手順で行なった。なお、ＦＵＴ８定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のＦＵＴ８スタンダードプラスミドを０．０５１２ｆｇ／μＬ、０．２５６ｆｇ／μＬ、１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬの濃度に希釈したものを、β−アクチン定量の内部コントロールとしては、ＷＯ０２／３１１４０実施例９記載のβ−アクチンスタンダードプラスミドを１．２８ｆｇ／μＬ、６．４ｆｇ／μＬ、３２ｆｇ／μＬ、１６０ｆｇ／μＬ、８００ｆｇ／μＬ、４０００ｆｇ／μＬの濃度に希釈したものそれぞれを使用した。また、ＰＣＲプライマーとしては、ＦＵＴ８の増幅には配列番号３６に示すフォワードプライマーおよび配列番号３７に示すリバースプライマーを、β−アクチンの増幅には配列番号３８に示すフォワードプライマーおよび配列番号３９に示すリバースプライマーをそれぞれ使用した。
Ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｒ−ＰＣＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社製）を用いて、本項（１）で合成し滅菌水で５０倍希釈した１本鎖ｃＤＮＡ溶液あるいは各濃度の内部コントロールプラスミド溶液を各々５μＬ含む２０μＬの反応液［Ｒ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、２．５ｍＭ  Ｍｇ２＋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ社製）、０．３μＭフォワードプライマー、０．３μＭリバースプライマー、２×１０−５倍に希釈したＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（タカラバイオ社製）、１単位ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｒ−ＰＣＲ］を調製した。調製した反応液を９６−ｗｅｌｌ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（ファルコン社製）の各ウェルへ分注し、Ｐｌａｔｅ  ｓｅａｌｅｒ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてプレートをシールした。ＰＣＲ反応および解析には、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、添付マニュアルに従ってＦＵＴ８のｍＲＮＡ量およびβ−アクチンのｍＲＮＡ量の測定を行なった。
内部コントロールプラスミドでの測定結果から検量線を作成し、ＦＵＴ８のｍＲＮＡ量およびβ−アクチンのｍＲＮＡ量を数値化した。さらに、細胞株間において、β−アクチンのｍＲＮＡ転写量は均一であるものと考え、β−アクチンのｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８のｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を第２図に示した。ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミド導入により得られた細胞株ではいずれも、親株と比較して最大約５％までＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量が低下していた。
ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入により得られた細胞株のうち、１２−ｌｉｂ２−３株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４株、１２−ｌｉｂ３−５株、１２−ｌｉｂ４−１株、１２−ｌｉｂ６−３株、１２−ｌｉｂ８−４株、１２−ｌｉｂ９−１株について、以下の第３項の解析に供した。
３．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入したレクチン耐性株による抗体組成物の製造および抗体組成物の単糖組成分析
（１）抗体組成物の製造
本実施例第１項において取得したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現ベクター導入レクチン耐性株である１２−ｌｉｂ２−３株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４株、１２−ｌｉｂ３−５株、１２−ｌｉｂ４−１株、１２−ｌｉｂ６−３株、１２−ｌｉｂ８−４株、１２−ｌｉｂ９−１株および該レクチン耐性株の親株である３２−０５−１２株をそれぞれ用いて、以下の手順で抗体組成物を製造した。
３２−０５−１２株は基本培地、ｓｉＲＮＡ発現ベクター導入レクチン耐性株はピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着細胞用Ｔ１８２フラスコ（グライナー社製）に２５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で５日間培養後、培養上清を除去し、２０ｍＬのダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）で２回洗浄を行なった後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を５０ｍＬ注入した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で７日間培養後、培養上清を回収し、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従って、抗体組成物を精製した。
（２）抗体組成物の単糖組成分析
本項（１）で得られた抗体に対し、公知の方法［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６，１５７７（１９８３）］に従って、単糖組成分析を行なった。
各抗体の単糖組成比より計算される、全複合型糖鎖に占めるフコースを持たない複合型糖鎖の割合を第２表に示した。
2005035778.tif 000005
親株である３２−０５−１２株の生産する抗体のフコースを持たない糖鎖の割合が９％であったのに対し、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ導入レクチン耐性株が生産する抗体のフコースを持たない糖鎖の割合は３０〜７９％に上昇しており、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡＲ現ベクターＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ２Ｂ／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ３／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ４／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ６／ｐＰＵＲ、ＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ８／ｐＰＵＲ、あるいはＦＵＴ８ｓｈＲＮＡ／ｌｉｂ９／ｐＰＵＲの導入により、宿主細胞の生産する抗体の複合型糖鎖へのα１，６−フコース付加を抑制する効果が得られることが示された。尚、実施例１第３項（１）において得た他のｓｉＲＮＡ分子の発現プラスミドを用いて同様の試験を行なった場合にも、同様の効果が得られた。
［実施例４］
ＦＵＴ８を標的とした有効ｓｉＲＮＡの異なるｓｉＲＮＡ発現システムでのＲＮＡｉ活性の比較
１．ＦＵＴ８を標的としたヒトＵ６プロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
配列番号１０に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡおよび配列番号１８に示される配列を標的配列として含むｓｉＲＮＡについて、以下の手順でヒトＵ６プロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。
（１）ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットのクローニング
以下の手順で、ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを取得した（第３図）。
まず、ヒトＵ６プロモーター配列［ＧｅｎＢａｎｋ，Ｍ１４４８６］に結合する塩基配列の５’末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶの認識配列を付加したフォワードプライマー（以下ｈＵ６ｐ−Ｆ−Ｈｉｎｄ３／ＥｃｏＲＶと称し、配列番号３９に示す）および、ヒトＵ６プロモーター配列に結合する塩基配列の５’末端に、制限酵素ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＶの認識配列、ターミネーター配列に相当する連続した６塩基のアデニン、さらに後の合成オリゴＤＮＡ挿入のための制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｃＩの認識配列を付加したリバースプライマー（以下ｈＵ６ｐ−Ｒ−ｔｅｒｍ−Ｘｂａ１／ＥｃｏＲＶと称し、配列番号４０に示す）をそれぞれ設計した。
次に、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、鋳型としてＷＯ０３／８５１１８実施例１２記載のＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏを４０ｎｇ含む６０μＬの反応液［ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４μＭ  ｈＵ６ｐ−Ｆ−Ｈｉｎｄ３／ＥｃｏＲＶプライマー、０．４μＭ  ｈＵ６ｐ−Ｒ−ｔｅｒｍ−Ｘｂａ１／ＥｃｏＲＶプライマー］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で１５秒間、６５℃で５秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル行った。
ＰＣＲ後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約３００ｂｐの増幅断片を回収した。該ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩ  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間消化反応を行った。反応終了後、該反応液に対してフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈澱を行った。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来の約２．９ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片を回収した。
上記で得られた約３００ｂｐのＰＣＲ増幅断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）由来の約２．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてそれぞれプラスミドを単離した。単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、目的のプラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍを取得したことを確認した。
（２）ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットのｐＰＵＲへの連結
以下の手順で、本項（１）で得られたプラスミドｐＢｓ−Ｕ６ｔｅｒｍに含まれるヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを、発現ベクターｐＰＵＲへ連結した（第４図）。
まず、本項（１）で作製したプラスミドｐＢＳ−Ｕ６ｔｅｒｍを制限酵素ＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを含む、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をＡｌｋｌａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片を回収した。
上記で得られたヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを含む約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ｋｂのＰｖｕＩＩ断片と、連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、それぞれプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間消化反応を行った。該反応液をアガロースゲル電処泳動に供し、目的とする挿入断片の有無および挿入方向を確認した。
さらに、単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、挿入ＤＮＡのうちヒトＵ６プロモーター領域の配列がＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ１４４８６の配列と一致し、ヒトＵ６プロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットの増幅に用いたプライマー領域の配列および各連結部の配列に間違いが無いことを確認した。得られたプラスミドのうち、挿入したｈＵ６プロモーターの方向が、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットと同方向であるプラスミドを選択し、以下、該プラスミドをｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍと称す。
（３）合成オリゴＤＮＡのプラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍへの挿入
以下の手順で、実施例１第３項（１）において得られたＦＵＴ８に対するＲＮＡｉの標的配列のうち、配列番号１０に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡおよび配列番号１８に示される配列を標的配列として含むｓｉＲＮＡを発現させる二本鎖ＤＮＡカセットを形成する合成オリゴＤＮＡを設計し、本項（２）にて取得したｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍのクローニングサイトへの挿入を行った（第５図）。
二本鎖ＤＮＡカセットを形成する合成オリゴＤＮＡの設計は以下の手順で行なった。二本鎖ＤＮＡカセットは５’末端から順に、制限酵素ＳａｃＩ切断により生じる３’突出末端、センスコードＤＮＡ、ヒトｍｉＲ−２３−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−１９ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ，ＡＦ４８０５５８）の１０塩基のループ配列、アンチセンスコードＤＮＡおよび制限酵素ＫｐｎＩ切断により生じる３’突出末端を有する。また、該二本鎖ＤＮＡカセットを形成する合成オリゴＤＮＡの５’末端はリン酸化した。配列番号１０に含まれる標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下、Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４２、アンチセンス鎖（以下、Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号４３、配列番号１８を含む標的配列について設計した合成オリゴＤＮＡのセンス鎖（以下、Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−Ｆと称す）の塩基配列を配列番号４４、アンチセンス鎖（以下、Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−Ｒと称す）の塩基配列を配列番号４５にそれぞれ示した。該合成オリゴＤＮＡの５’末端はリン酸化したものを以下において用いた。
合成オリゴＤＮＡのアニーリングを以下の手順で行った。合成オリゴＤＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖各２００ｐｍｏｌを、アニーリングバッファー［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］１０μＬに溶解し、２分間煮沸した。その後、約３時間かけて室温まで徐々に冷却し、滅菌水で１５倍希釈した。
一方、プラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍから、実施例１第３項（１）に記載の方法と同様にして、プラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍ由来の約４．５ＫｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得た二本鎖合成オリゴ溶液を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ−Ｕ６ｔｅｒｍ由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンについて、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、挿入された合成オリゴＤＮＡの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、合成オリゴＤＮＡ  Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ、合成オリゴＤＮＡ  Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲと称す。
２．ＦＵＴ８を標的としたヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構築
配列番号１０に含まれる配列を標的配列とするｓｉＲＮＡおよび配列番号１８に示される配列を標的配列として含むｓｉＲＮＡについて、以下の手順でヒトｔＲＮＡプロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。
（１）ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットのクローニング
以下の手順で、ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットを取得した（第６図）。
まず、実施例１に記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂより、ヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター配列取得の鋳型として用いるためのプラスミドＤＮＡを以下の手順で調製した。
ｓｉＲＮＡ発現ベクターライブラリーＦＵＴ８ｓｈＲＮＡｌｉｂ／ｐＰＵＲ／ＤＨ１０Ｂの大腸菌グリセロールストックを適当な濃度に希釈して１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に播種した。３７℃で一晩培養し、得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液に対して、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱を行った。単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて解析した。以下、本プラスミドをｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐと称す。
次に、プラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐを鋳型とし、ｈｕｍａｎ  ｔＲＮＡｖａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列に結合するフォワードプライマーの５’末端に制限酵素ＰｖｕＩＩの認識配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（以下、ｔＲＮＡ−ＰｖｕＩＩ−Ｆと称し、配列番号４６に示す）、および、ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐに結合するリバースプライマーの５’末端に制限酵素ＰｖｕＩＩの認識配列、ターミネーター配列に相当する連続した６塩基のアデニン、さらに合成ＤＮＡ挿入のための制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩの認識配列を付加した合成オリゴＤＮＡ（以下、ｔＲＮＡ−ＰｖｕＩＩ−Ｒと称し、配列番号４７に示す）をプライマーとしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、鋳型としてｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐを５０ｎｇ含む５０μｌの反応液［ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．４μｍｏｌ／ＬプライマーｔＲＮＡ−ＰｖｕＩＩ−Ｆ、０．４μｍｏｌ／ＬプライマーｔＲＮＡ−ＰｖｕＩＩ−Ｒ］を調製し、９４℃で２分間の加熱の後、９４℃で１５秒間、６５℃で５秒間、７４℃で３０秒間からなる反応を１サイクルとして３０サイクル行った。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約２００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を回収した。回収液に対しエタノール沈澱を行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で３時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液に対してフェノール／クロロホル厶抽出処理およびエタノール沈澱を行った。
一方、ｐＰＵＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、本実施例第１項（２）に記載の方法と同様にして、プラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片を回収した。
上記で得られた約２００ｂｐのＤＮＡ断片を、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（インビトロジェン社製）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性クローンから、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて解析し、挿入されたＤＮＡの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、本プラスミドをｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）と称す。尚、ｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）は、ｐＰＵＲのＰｖｕＩＩサイトへｔＲＮＡｖａｌプロモーター−クローニングサイト−ターミネーター配列発現カセットがピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットと逆の向きに挿入されていた。
（２）合成オリゴＤＮＡのプラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）への挿入
以下の手順で、本項（１）にて得られたｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）への、本実施例第１項（３）にて設計した合成オリゴＤＮＡの挿入を行った（第７図）。
まず、プラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）を制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５（タカラバイオ社製）を用いて、３７℃で１時間脱リン酸化反応を行った。反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）由来の約４．５ＫｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
本実施例第１項（３）で得られたＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒをアニーリングした二本鎖合成オリゴ溶液またはＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−Ｒをアニーリングした二本鎖合成オリゴ溶液を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ−ｔＲＮＡｐ−ｔｅｒｍ（−）由来の約４．５ＫｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片と、連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（インビトロジェン社製）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンから、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてそれぞれプラスミドＤＮＡを単離した。
単離したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、挿入された合成オリゴＤＮＡの配列および連結部に間違いが無いことを確認した。以下、合成オリゴＤＮＡ  Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｂ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（−）、合成オリゴＤＮＡ  Ｆｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−ＦおよびＦｔ８−ｄｓＲＮＡ−Ｒ−Ｒからなる二本鎖ＤＮＡが挿入されたプラスミドをｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（−）と称す。
（３）ｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ型ｓｉＲＮＡ発現ベクター（＋）の構築
本項（２）で得られたｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（−）およびｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（−）より、以下の手順でｐＰＵＲのＰｖｕＩＩサイトへヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−ショートヘアピンＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットがピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットと同じ向きに挿入されたヒトｔＲＮＡプロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した（第８図）。
ｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（−）あるいはｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（−）に制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で一晩消化反応を行った。消化反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＰＵＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、本実施例第１項（２）に記載の方法と同様にして、プラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片を回収した。
上記で得られた約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いてプラスミドｐＰＵＲ由来の約４．３ＫｂのＰｖｕＩＩ断片連結反応をい、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（インビトロジェン社製）を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンについて、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、各プラスミドＤＮＡに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間消化反応を行った。消化反応後、該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、目的とする挿入断片の有無および挿入方向を確認し、挿入断片のヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−ショートヘアピンＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットがピューロマイシン耐性遺伝子発現ユニットと同じ向きに挿入されているクローンを選択した。選択したプラスミドの塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って、反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７を用いて解析し、該プラスミドの挿入ＤＮＡの配列および各連結部の配列に間違いが無いことを確認した。以下、ｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（−）のヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−ショートヘアピンＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットを含むプラスミドをｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（＋）、ｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（−）のヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーター−ショートヘアピンＲＮＡ−ターミネーター配列発現カセットを含むプラスミドをｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（＋）とそれぞれ称す。
３．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の取得および培養
本実施例第１項において構築したＦＵＴ８を標的としたヒトＵ６プロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲおよびＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ、本実施例第２項において構築したＦＵＴ８を標的としたヒトｔＲＮＡｖａｌプロモーターを用いたショートヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＢ／ｐＰＵＲ（＋）およびｔＲＮＡ−ＦＵＴ８ｓｈＲ／ｐＰＵＲ（＋）、並びにＷＯ０３／８５１１８実施例１２記載のＦＵＴ８を標的としたヒトＵ６プロモーターを用いたタンデ厶型ｓｉＲＮＡ発現ベクターＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｂ＿ｐｕｒｏおよびＵ６＿ＦＵＴ８＿Ｒ＿ｐｕｒｏを、実施例２第１項に記載の方法に従って、それぞれ３２−０５−１２株へ導入し、ＬＣＡ耐性株の取得した。その結果、いずれのｓｉＲＮＡ発現システムを用いた場合にもレクチン耐性株が取得された。
４．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の拡大培養およびＦＵＴ８ｍＲＮＡ発現解析
（１）全ＲＮＡの調製
３２−０５−１２株および本実施例第３項で得られたレクチン耐性株からの全ＲＮＡ調製、並びに１本鎖ｃＤＮＡの合成は、実施例２第２項と同様の手順で行なった。尚、培養は接着細胞用６ｃｍディッシュ（ファルコン社製）で行い、調製した全ＲＮＡは４０μＬの滅菌水に溶解した。
（２）ＳＹＢＲ−ＰＣＲによるＦＵＴ８遺伝子転写量の定量
実施例３第２項（３）に記載の方法と同様にして、ＦＵＴ８遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量およびβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量の定量を行なった。さらに、細胞株間でのβ−アクチン遺伝子由来のｍＲＮＡ転写量は均一であると考え、β−アクチンｍＲＮＡ量に対するＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量の相対値を算出し、その値を比較した結果を第９図に示した。
いずれのｓｉＲＮＡ発現システムを用いた場合のレクチン耐性株においても、親株と比較してＦＵＴ８  ｍＲＮＡ量が低下していることが示された。従って、親株をレクチン耐性株へと変換することが可能なＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ活性は、いずれのｓｉＲＮＡ発現システムを用いた場合にも認められることが示された。
［実施例５］
ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清フェドバッチ培養
１．ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の無血清培地への馴化
３２−０５−１２株、実施例３第１項で取得したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株１２−ｌｉｂ２Ｂ−１株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４株、１２−ｌｉｂ３−４株、１２−ｌｉｂ３−５株の無血清培地への馴化を、以下の手順で行なった。
３２−０５−１２株は基本培地、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株はピューロマイシン（ＳＩＧＭ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地を用いて、それぞれ３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で懸濁し、接着培養用７５ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に１５ｍＬずつ播種した。５％ＣＯ２、３７℃の条件下で３日間培養し、トリプシン処理により各細胞懸濁液を回収し、懸濁液に対し１０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行なって上清を除去した。３２−０５−１２株は、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、３，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏ−Ｌ−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と称す）を用いて、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株はピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１２μｇ／ｍＬの濃度で含む無血清培地を用いて、それぞれ回収した細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で懸濁し、該細胞懸濁液１５ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。３〜４日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増殖可能な細胞株を取得した。以下、無血清培地へ馴化した３２−０５−１２株を３２−０５−１２ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ｌｉｂ２Ｂ−１株を１２−ｌｉｂ２Ｂ−１ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ｌｉｂ２Ｂ−４株を１２−ｌｉｂ２Ｂ−４ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ｌｉｂ３−４株を１２−ｌｉｂ３−４ＡＦ、無血清培地へ馴化した１２−ｌｉｂ３−５株を１２−ｌｉｂ３−５ＡＦと称す。
２．無血清培地に馴化したＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株を用いた無血清フェドバッチ培養
本実施例第１項で無血清培地に馴化した３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−１ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４ＡＦ株、１２−ｌｉｂ３−４ＡＦ株、および１２−ｌｉｂ３−５ＡＦ株を用いて、以下の手順で無血清フェドバッチ培養を行った。
フェドバッチ培養には、ＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で、３，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏ−Ｌ−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（インビトロジェン社製）を０．１％の濃度で、Ｄ（＋）−グルコース（ナカライテスク社製）を５０００ｍｇ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清フェドバッチ培養培地と称す）を、フィード用の培地としては、通常の添加濃度よりも高濃度に調製したアミノ酸（Ｌ−アラニン０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．５９３ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．６４６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．５３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５．８４ｇ／Ｌ、グリシン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．０３１ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．４６６ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２８３ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．６７１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１１３ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウ厶二水和物０．７３５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．６６４ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０９１８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２８３ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２８３ｇ／Ｌ、葉酸０．０２８３ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０５０９ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２８３ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２８３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０９１８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．３１４ｇ／Ｌから構成された培地（以下、フィード培地と称す）を用いた。
３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−１ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４ＡＦ株、１２−ｌｉｂ３−４ＡＦ株、および１２−ｌｉｂ３−５ＡＦ株を、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で無血清フェドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液を２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に４０ｍＬずつ播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。培養開始後３日目、６日目、９日目、１２日目に、アミノ酸等の消費量を補う目的でフィード培地を３．３ｍＬ添加し、グルコース濃度を制御する目的で２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、１４日目に培養液を２〜４ｍＬ採取し、生細胞密度と細胞生存率をトリパンブルー染色により、各培養上清中に含まれる抗体濃度を本実施例第３項（１）に記載のＥＬＩＳＡによる抗体濃度の定量法によりそれぞれ測定した。培養開始後の各時点における生細胞密度、細胞生存率、および培養上清中の抗体濃度の結果を第１０図〜第１２図に示した。
３．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を指標とした、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖を持つ抗体の定量
本実施例第２項で採取した３２−０５−１２ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−１ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４ＡＦ株、１２−ｌｉｂ３−４ＡＦ株、および１２−ｌｉｂ３−５ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養サンプルに含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を、参考例２に記載の可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａと表記）に対する結合活性を指標として、以下の手順で測定した。
（１）ＥＬＩＳＡによる抗体濃度の定量
培養上清中の抗体濃度の定量は以下の手順で行なった。
１ｍＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社製）７５０ｍＬに溶解し、５０μＬずつＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分注した。４℃にて一晩放置した後、溶液を除去し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを１００μＬずつ各ウェルへ加え、室温に約一時間放置した後、−２０℃にて保存した。抗体量測定時にプレートを室温で溶解し溶液を除去した後に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを用いて希釈した培養上清溶液を５０μＬずつ各ウェルに添加した。室温にて１〜２時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳバッファーで洗浄した。洗浄液の水分を除去した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーを用いて２０００倍希釈したＧｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体として５０μＬずつ各ウェルに添加した。室温にて１〜２時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳバッファーで洗浄した後、さらにレジン水により洗浄した。洗浄液の水分を除去した後０．１％Ｈ２Ｏ２を加えたＡＢＴＳ基質液を５０μＬずつ各ウェルに添加し発色させた。約１５分放置し、適当な発色が得られた時点で５％ＳＤＳ溶液を５０μＬずつ各ウェルに添加し反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて波長４１５ｎｍの吸収を対照として４９０ｎｍの吸光度を測定した。各希釈試料の抗体濃度の算出は、標準抗体精製標品を用いた検量線シグモイドカーブの直線領域を使用して行なった。得られた希釈試料の抗体濃度に希釈率を乗じて、培養上清の抗体濃度を算出した。
（２）Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合の異なる抗体の調製
参考例１に記載の、ＹＢ２／０細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１、およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＫＭ３０６０を用い、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体の割合（以下、抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％と称す）が異なる標準品抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物を調製した。ＫＭ２７６１−１とＫＭ３０６０、および両者を混合して調製した９サンプルを含む計１１サンプルの標準品について、実施例３第３項（２）に記載の単糖組成分析により抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％を測定したところ、ＫＭ２７６０−１は９０％、ＫＭ３０６０は１０％であり、両者を混合して調製した９サンプルの標準品はそれぞれ８２％、７４％、６６％、５８％、５０％、４２％、３４％、２６％、１８％であった。
（３）抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の評価
参考例１第２項で作製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応する配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドのＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｍｉｎ）コンジュゲートを、１μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、本項（１）に記載のＥＬＩＳＡによる抗体濃度の定量法により測定した抗体濃度をもとに５．０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した各培養上清溶液、あるいは、本項（２）で調製し、蛋白質濃度が５．０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％の標準品を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した参考例２に示される方法で作製されたｓｈＦｃγＲＩＩＩａ溶液を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて０．１μｇ／ｍＬに調製したＨｉｓ−ｔａｇに対するＨＲＰ標識マウス抗体Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
第１３図に、本項（２）で調製した、抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％の標準品のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した。抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％に比例する、抗体組成物のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の検量線が得られた。
本実施例第２項で採取した無血清フェドバッチ培養サンプルに含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示すＯＤ４１５値から、各培養サンプル中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％を、第１４図に示される検量線を用いて求めた。３２−０５−１２ＡＦ株由来のサンプルは、培養期間を通じて生産される抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％は約１０％であった。一方、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入したレクチン耐性株の１２−ｌｉｂ２Ｂ−１ＡＦ株、１２−ｌｉｂ２Ｂ−４ＡＦ株、１２−ｌｉｂ３−４ＡＦ株、および１２−ｌｉｂ３−５ＡＦ株由来のサンプルは、培養期間を通じて生産される抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％は４０〜７０％であり、ＦＵＴ８を標的としたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを導入することにより、高い抗体組成物のＦｕｃｏｓｅ（−）％を有する抗体組成物を生産できることが示された。
（参考例１）
Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の調製
１．ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた抗体生産細胞の作製
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対し、ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定生産細胞を以下のように作製した。
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍＬのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（旭テクノグラス社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２３７℃、、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現量を本参考例第２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（旭テクノグラス社製）に０．５ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を５００ｎｍｏｌ／Ｌに上昇させ、最終的にＭＴＸを５００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能。かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換株３２−０５−１２株を得た。
２．抗体ＣＣＲ４部分ペプチドに対する結合活性（ＥＬＩＳＡ法）
抗ＣＣＲ４キメラ抗体が反応するヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして、配列番号３５で示されるアミノ酸配列の化合物１を使用した。化合物１をＥＬＩＳＡ法の抗原として用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製した。
１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００μＬに、１００μＬの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（ＳＩＧＭＡ社製）−ＤＭＳＯ溶液を撹拌しながら滴下し、３０分間ゆるやかに攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムに１ｍＬの反応液をアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させ、溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０μＬのＰＢＳを加え、次いで２５０μＬのジメチルスルフォキシド（ＤＭＦ）を加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）を撹拌しながら添加し、添加後３時間攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウ厶を添加して、０．２２μｍフィルターでろ過滅菌した。以下、該溶液をＢＳＡ−化合物１溶液と称す。
９６穴のＥＩＡ用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上記のＢＳＡ−化合物１溶液を０．０５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルを０．０５％ＴＷｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）をプレートリーダーＢｅｎｃｈｍａｒｋ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。本参考例第１項で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体は、ＣＣＲ４に対する結合活性を示した。
３．ラットミエローマＹＢ２／０細胞を用いた生産細胞の作製
抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）へエレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により導入後、４０ｍＬのＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）［ＦＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ社製）を５％含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、Ｇ４１８をｌｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を上記第２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定し、ＣＣＲ４に対する結合活性を示すことを確認した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、Ｇ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換株の増殖が認められたウェルの培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の抗原結合活性を上記第２項記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的にＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（５）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株について、２回の限界希釈法によるクローン化を行い、得られた形質転換細胞クローンをＫＭ２７６０＃５８−３５−１６と名付けた。
４．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の精製
（１）ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
上記第１項で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞株３２−０５−１２株をＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳバッファーにて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍＬ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて７日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体はＫＭ３０６０と名付けた。
（２）ＹＢ２／０細胞由来の生産細胞の培養および抗体の精製
上記第３項で得られた抗ＣＣＲ４キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローンＫＭ２７６０＃５８−３５−１６を２００ｎｍｏｌ／Ｌ  ＭＴＸ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬製）を５％の濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（インビトロジェン社製）培地に２×１０５細胞／ｍＬとなる様に懸濁し、スピナーボトル（岩城硝子社製）を用いて３７℃の恒温室内でＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ攪拌培養した。８−１０日間培養して回収した培養上清より、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（ミリポア社製）カラ厶およびゲルろ過法を用いて、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲ４キメラ抗体をＫＭ２７６０−１と名づけた。
ＫＭ２７６０−１およびＫＭ３０６０のＣＣＲ４に対する結合活性を上記第２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した結果、同等の結合活性を示した。
（参考例２）
可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の作製
１．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質の発現ベクターアの構築
（１）ヒト末梢血単核球ｃＤＮＡの作製
健常人の静脈血３０ｍＬにヘパリンナトリウム（武田薬品社製）を加え穏やかに混合した。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（第一化学薬品社製）を用いて使用説明書に従って単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０培地で１回、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地で１回遠心分離して洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ（１０）中に懸濁した２×１０６個／ｍＬの末梢血単核球懸濁液を調製した。該末梢血単核球懸濁液の５ｍＬを室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、５ｍＬのＰＢＳに懸濁した。室温下８００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った後、上清を除去し、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付の説明書に従い、全ＲＮＡを抽出した。
得られた全ＲＮＡ２μｇに対し、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして逆転写反応を行うことにより、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質をコードするｃＤＮＡの取得
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ蛋白質（以下、ｈＦｃγＲＩＩＩａと表記する）のｃＤＮＡの取得は、以下のようにして行った。
まず、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７０，４８１（１９８９）］より、翻訳開始コドンを含む特異的なフォワードプライマー（配列番号４８に示す）および翻訳終止コドンを含む特異的なリバースプライマー（配列番号４９に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（１）で調製したヒト末梢血単核球由来のｃＤＮＡ溶液の２０倍希釈液５μＬを含む５０μＬの反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号４８および４９）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。
ＰＣＲ後、該反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＰＣＲ由来の約８００ｂｐの断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）２．５μｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２．９ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得られたヒト末梢血単核球ｃＤＮＡ由来の約８００ｂｐの断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）由来の約２．９ｋｂｐの断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を決定した。本法により配列決定した全ての挿入ｃＤＮＡが、ｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡのＯＲＦ全長配列をコードすることを確認した。結果として配列番号４６に示した塩基配列を有するｈＦｃγＲＩＩＩａをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドとしてｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３を得たことを確認した。配列番号５０の塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号５１に示す。
（３）可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａをコードするｃＤＮＡの取得
ｈＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（配列番号５１の１〜１９３番目）とＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇ配列を持つ可溶性ｈＦｃγＲＩＩＩａ［以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａと表記する］をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、配列番号５０に示されるｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡの塩基配列より、細胞外領域に特異的なプライマーＦｃｇＲ３−１（配列番号５２に示す）を設計した。
次にＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）を用いて、本項（２）で作製したプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３をテンプレートとして含む反応液［１倍濃度のＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭプライマーＦｃｇＲ３−１、１μＭプライマーＭ１３Ｍ４（宝酒造社製）］を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間、７２℃にて６０秒間からなる反応を１サイクルとして、３５サイクル行った。ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、滅菌水２０μＬに溶解した。制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１１０ｂｐの特異的増幅断片を回収した。
一方、プラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約３．５ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｈＦｃγＲＩＩＩａのｃＤＮＡ由来の約１１０ｂｐの特異的増幅断片とプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ５−３由来の約３．５ｋｂｐの断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調整し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシークエンサー３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、ｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３が得られたことを確認した。
決定したｓｈＦｃγＲＩＩＩａの全長ｃＤＮＡ配列を配列番号５３、それに対応するシグナル配列を含むアミノ酸配列を配列番号５４にそれぞれ示す。
（４）ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現ベクターの構築
ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現ベクターは、以下のようにして構築した。
本項（３）で得られたプラスミドｐＢＳＦｃγＲＩＩＩａ＋Ｈｉｓ３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約６２０ｂｐの各断片を回収した。
一方、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）およびＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１０．７ｋｂｐの断片を回収した。
上記で得たｓｈＦｃγＲＩＩＩａ）のｃＤＮＡを含む約６２０ｂｐの各断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来の約１０．７ｋｂｐの断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．０（宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調整し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐａｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシークエンサー３７７により各プラスミドに挿入されたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、目的のｓｈＦｃγＲＩＩＩａｃＤＮＡを含む発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓが得られたことを確認した。
２．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの安定生産細胞の作製
上記第１項で構築したｓｈＦＣγＩＩＩａの発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈｉｓを参考例１第３項に記載の方法と同様にして、ラットミエローマＹＢ２／０細胞［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）］に導入し、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの安定生産細胞を作製した。尚、培養上清中のｓｈＦｃγＲＩＩＩａの発現量を後述する本参考例の第４項に示すＥＬＩＳＡ法により測定した。最終的にＧ４１８を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａを高生産する形質転換株を得た。得られた形質転換株に対して、２回の限界希釈法によるクローン化を行った。ｓｈＦｃγＲＩＩＩａを生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７が得られた。
３．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの精製
本参考例の第２項で得られたｓｈＦｃγＲＩＩＩａを生産する形質転換細胞クローンＫＣ１１０７をＧ４１８を１ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎｍｏｌ／Ｌで含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ−ＧＦ（５）［５％Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬社製）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）］に３×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１８２ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０ｍＬ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４日間培養後、培養上清を回収した。培養上清よりＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａを精製した。
４．ｓｈＦｃγＲＩＩＩａの検出（ＥＬＩＳＡ法）
培養上清中あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａの検出、定量は、以下に示すＥＬＩＳＡ法により行った。
Ｈｉｓ−ｔａｇに対するマウス抗体Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をＰＢＳを用いて５μｇ／ｍＬに調製した溶液を９６ウェルのＥＬＩＳＡ用のプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃、１２時間以上反応させた。反応後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清あるいは精製したｓｈＦｃγＲＩＩＩａの各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍に希釈したビオチン標識マウス抗ヒトＣＤ１６抗体溶液（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識Ａｖｉｄｉｎ  Ｄ溶液（ｖｅｃｔｏｒ社製）を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、５分後に５％ＳＤＳ溶液を５０μＬ／ウェルで加えて反応を停止させた。その後、ＯＤ４１５を測定した。
【配列表フリーテキスト】配列番号１０−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＲＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2005035778.tif 000006
2005035778.tif 000007
2005035778.tif 000008
2005035778.tif 000009
2005035778.tif 000010
2005035778.tif 000011
2005035778.tif 000012
2005035778.tif 000013
2005035778.tif 000014
2005035778.tif 000015
2005035778.tif 000016
2005035778.tif 000017
2005035778.tif 000018
2005035778.tif 000019
2005035778.tif 000020
2005035778.tif 000021
2005035778.tif 000022
2005035778.tif 000023
2005035778.tif 000024
2005035778.tif 000025
2005035778.tif 000026
2005035778.tif 000027
2005035778.tif 000028
2005035778.tif 000029
2005035778.tif 000030
2005035778.tif 000031
2005035778.tif 000032
2005035778.tif 000033
2005035778.tif 000034
2005035778.tif 000035
2005035778.tif 000036
2005035778.tif 000037
2005035778.tif 000038
2005035778.tif 000039
2005035778.tif 000040
2005035778.tif 000041
2005035778.tif 000042
2005035778.tif 000043
【図１】
2005035778.tif 000044
【図２】
2005035778.tif 000045
【図３】
2005035778.tif 000046
【図４】
2005035778.tif 000047
【図５】
2005035778.tif 000048
【図６】
2005035778.tif 000049
【図７】
2005035778.tif 000050
【図８】
2005035778.tif 000051
【図９】
2005035778.tif 000052
【図１０】
2005035778.tif 000053
【図１１】
2005035778.tif 000054
【図１２】
2005035778.tif 000055
【図１３】
2005035778.tif 000056
【図１４】
2005035778.tif 000057
【国際調査報告】
2005035778.tif 000058
2005035778.tif 000059