(57)【要約】本発明は、イネ等の単子葉植物で有効に機能するストレス誘導性プロモーター、及び該プロモーターを用いた環境ストレス耐性植物に関する。すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる、イネ由来のプロモーター：  （ａ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ  （ｂ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス誘導性のプロモーター活性を有するＤＮＡ、及び、前記プロモーターを導入した環境ストレス耐性植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる、イネ由来のプロモーター。
（ａ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス誘導性のプロモーター活性を有するＤＮＡ
【請求項２】
前記ストレスが乾燥ストレス、低温ストレス又は塩ストレスである請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項１又は２記載のプロモーター支配下にさらにストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子を機能しうる態様で含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子がプロリン合成の鍵酵素Ｐ５ＣＳ遺伝子、ガラクチノール合成遺伝子ＡｔＧｏｌＳ３遺伝子、シロイヌナズナ由来転写因子ＤＲＥＢ遺伝子、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子、及びＡＢＡ合成酵素ＮＣＥＤ遺伝子から選ばれる、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子がイネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子である、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のベクターを宿主に導入して得られる形質転換体。
【請求項８】
宿主が植物である、請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
宿主が単子葉植物である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のプロモーターを植物に導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、イネ由来のストレス誘導性プロモーターとその利用方法に関する。
【背景技術】  植物は、乾燥、高温、凍結、塩など、自然界における様々な環境ストレスに対応するための耐性機構を有している。最近では、こうしたストレス耐性機構が分子レベルで明らかになるにつれ、バイオテクノロジー的手法を用いたストレス耐性植物も作出されるようになってきた。例えば、ストレスを受けた細胞内にはＬＥＡタンパク質、水チャネルタンパク質、適合溶質合成酵素などのストレスタンパク質が誘導され、細胞をストレスから防御する。そこで、オオムギのＬＥＡタンパク質やタバコのｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ等の遺伝子、浸透圧調節物質（糖、プロリン、グリシンベタイン等）合成酵素の遺伝子を植物に導入する研究が試みられた。また、細胞膜脂質の修飾酵素であるシロイヌナズナのｗ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅやらん藻のＤ９ｄｅｓａｔｕｒａｓｅの遺伝子等を用いた研究も試みられた。これらの研究では、いずれも一つの遺伝子がカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに結合して植物に導入された。しかし、組換え植物のストレス耐性度が不安定であったり、導入遺伝子の発現レベルが低い等の問題から実用化に至ったものはなかった。
一方、ストレス耐性機構には複数の遺伝子が複雑に関与することがわかってきた（非特許文献１）。そこで、それらの発現を同時に活性化する転写因子の遺伝子を恒常的プロモーターに連結して導入し、植物のストレス耐性を高める研究も試みられた（非特許文献２）。しかし、複数の遺伝子が同時期に活性化されると、宿主植物のエネルギーが該遺伝子産物の生成や、該遺伝子産物に起因する細胞内代謝に向けられるため、植物自体の成長が遅れたり矮化してしまうという問題があった。
これに対し、発明者らはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からストレス応答性エレメントに結合し、該エレメント下流の遺伝子の転写を特異的に活性化する転写因子をコードする遺伝子、ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、ＤＲＥＢ１Ｃ、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ２Ｂを単離した（特許文献１）。そして、これらの遺伝子をストレス誘導性ｒｄ２９Ａプロモーターに連結して植物に導入することにより、矮化しないストレス耐性植物が作製できることを報告した（特許文献２）。
しかし、双子葉植物であるシロイヌナズナ由来のｒｄ２９Ａプロモーターは、単子葉植物中で機能はしてもその活性が弱い。したがって、単子葉植物において強い活性を有するストレス誘導性プロモーターが望まれていた。
【特許文献１】  特開２０００−６０５５８号公報
【特許文献２】  特開２０００−１１６２６０号公報
【非特許文献１】  Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ  Ｋ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）Ｏｃｔ；１１５（２）ｐ３２７−３３４
【非特許文献２】  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，（１９９８）１０：ｐ１３９１−１４０６
【発明の開示】
本発明は、イネ等の単子葉植物において効果的に機能し得るストレス誘導性プロモーターを見出し、該プロモーターを用いて新規な環境ストレス耐性植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、イネゲノムより、強いストレス誘導性プロモーターを単離することに成功した。そして、該プロモーターを用いれば、単子葉植物の環境ストレス耐性を著しく向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明はイネ由来のストレス誘導性プロモーターに関する。該プロモーターは、具体的には以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる。
（ａ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつストレス誘導性のプロモーター活性を有するＤＮＡ
ここで、ストレスとは、乾燥ストレス、低温ストレス又は塩ストレスである。
また、本発明は前記プロモーターを含む組換えベクターを提供する。該ベクターは、本発明のプロモーター支配下に他の構造遺伝子や調節遺伝子を含んでいてもよく、特にストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子を含んでいることが好ましい。
ストレス耐性を向上させる構造遺伝子の好適な例としては、プロリン合成の鍵酵素Ｐ５ＣＳ遺伝子（Ｙｏｓｈｉｂａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）ＢＢＲＣ  ２６１）、ガラクチノール合成遺伝子ＡｔＧｏｌＳ３遺伝子（Ｔａｊｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２９：４１７−４２６）が挙げられる。
また、ストレス耐性を向上させる調節遺伝子の好適な例としては、シロイヌナズナ由来転写因子ＤＲＥＢ遺伝子（特開２０００−６０５５８号公報）、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子（特願２００１−３５８２６８、Ｄｕｂｏｕｚｅｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．ｉｎｐｒｅｓｓ）、及び植物ホルモンＡＢＡの生合成の鍵酵素ＮＣＥＤ遺伝子（Ｉｕｃｈｉ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７：３２５−３３３）等が挙げられる。
特に、シロイヌナズナ由来転写因子ＤＲＥＢ遺伝子、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子が好ましく、イネ由来転写因子ＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましい。
さらに、本発明は本発明のベクターを適当な宿主に導入して得られる形質転換体を提供する。ある態様において、該形質転換体は本発明のベクターを宿主植物に導入して得られるトランスジェニック植物である。この場合、宿主植物としては単子葉植物が望ましく、単子葉植物としてはイネが望ましい。
さらにまた、本発明は、本発明のプロモーターを植物に導入することにより、該植物のストレス耐性を向上させる方法を提供する。本発明のプロモーターは単子葉植物において従来にない強いストレス誘導性プロモーター活性を有するため、単子葉植物のストレス耐性の向上により適している。
【図面の簡単な説明】  図１は、各ストレス負荷時におけるａ００２２（ＬＩＰ９）のノザン解析結果を示す。
図２は、ａ００２２（ＬＩＰ９）のプロモーター領域の塩基配列を示す。
図３は、Ｇｕｓ発現用コンストラクトの構造を示す。
（Ｔｇ７：ｇ７ターミネーター、ＨＰＴ：ハイグロマイシン  フォスフォトランスフェラーゼ、Ｐｎｏｓ：Ｎｏｓプロモーター、Ｔｎｏｓ：Ｎｏｓターミネーター）
図４は、各種プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換タバコ又はイネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ活性を示すグラフである。
図５は、ＬＩＰ９プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、塩ストレス負荷時のＧＵＳ染色結果を示す写真である。
図６は、形質転換イネと野性株における、導入遺伝子及び各標的遺伝子（ＬＩＰ９（ａ００２２）、ＷＳＩ７２４（ａ００６６）、ｓａｌＴ（ａ２６６０）の発現量をノザン法で比較した結果である。図中ａ、ｂ、ｃはそれぞれそれぞれ形質転換体のラインを示す。
図７は、ａ００６６（ＷＳＩ７２４）のプロモーター領域の塩基配列を示す。
図８は、ＷＳＩ７２４プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ活性を示すグラフである（右：乾燥ストレス負荷、左：コントロール）。
図９は、ＷＳＩ７２４プロモーターにＧＵＳ遺伝子を連結して導入した形質転換イネにおける、乾燥ストレス負荷時のＧＵＳ染色結果を示す写真である。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−８０８４７号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のプロモーターは、低温、乾燥、塩などの環境ストレスに対して特異的に誘導されるイネ由来のプロモーターである。
１．  本発明のプロモーターの同定
本発明のプロモーターは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体間で、その発現が著しく異なる遺伝子（ストレス誘導性遺伝子）をスクリーニングし、次いでゲノム情報から該遺伝子のプロモーターと考えられる配列をスクリーニングすることにより同定することができる。
以下、本発明のプロモーターを同定するプロセスについて説明する。
１．１  ｍＲＮＡの調整
まず、ストレス誘導性遺伝子をスクリーニングするための、ｍＲＮＡを調製する。
ｍＲＮＡの供給源としては、葉、茎、根、花など植物体の一部又は全体のいずれであってもよい。また、植物体は、その種子をＧＭ培地、ＭＳ培地、＃３培地などの固体培地に播種し、無菌条件下で生育させた植物体を用いてもよいし、カルスや無菌条件下で育てた植物体の培養細胞を用いてもよい。
本スクリーニングでは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体との間での遺伝子発現量の相違を比較するため、ｍＲＮＡは前記両個体のそれぞれについて調整する必要がある。ストレスの負荷方法は、用いる植物によって適宜設定される。一般には、乾燥ストレスは、２〜４週間、水を与えず育てることにより負荷することができる。また低温・凍結ストレスは、１５〜−１０℃で、１〜１０日間育てることにより負荷することができる。さらにまた、塩ストレスは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌで１時間〜７日間育てることにより負荷することができる。例えば、イネの場合であれば、水耕栽培で生育させたイネを、低温ストレスなら１０〜−４℃、塩ストレスなら１５０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、乾燥ストレスなら脱水状態等に暴露する。
ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体は、それぞれ液体窒素で凍結し、乳鉢などで摩砕後、得られた摩砕物から、グリオキサール法、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法、塩化リチウム−尿素法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法などにより粗ＲＮＡ画分を抽出する。次いで、この粗ＲＮＡ画分から、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロースなどを用いたアフィニティーカラム法、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。必要であれば、さらにショ糖密度勾配遠心法などによりｍＲＮＡを分画して用いてもよい。
１．２  ストレス誘導性遺伝子のスクリーニング
ストレス誘導性遺伝子のスクリーニングは、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体間で、その遺伝子発現量の相違を比較することにより行う。遺伝子発現量の比較方法は、特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、又はクロスハイブリダイゼーション法等の公知の方法を用いることができる。
なかでも、遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ等の固相試料を用いた方法は、数千〜数万の遺伝子の発現を、定性的かつ定量的に、一度で検出することが可能という点で、前記スクリーニングの実施に好適である。
（１）ｃＤＮＡマイクロアレイの調製
前記スクリーニングに用いるｃＤＮＡマイクロアレイは、プロモーターの検出対象である単子葉植物（例えばイネ）のｃＤＮＡがスポットされているものであれば特に限定されず、既成のものを用いてもよいし、公知の方法に基づいて作製してもよい（例えば、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００１）１３：６１−７２  Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ参照）。
ｃＤＮＡマイクロアレイの作製には、まず目的とする植物のｃＤＮＡライブラリーの調製が必要である。ｃＤＮＡライブラリーは、（１）の方法に従って調製したｍＲＮＡを鋳型として、公知の方法により作製することができる。スポットするｃＤＮＡは単子葉植物由来のものであれば特に限定されないが、後のゲノムデータベースの解析の利便性からイネ等のゲノム解析が進んだ単子葉植物のものが好ましい。植物は平常状態（無処理）の植物でもよいが、好ましくは乾燥、塩、低温等のストレスに暴露した植物である。
ｃＤＮＡライブラリーの作製では、まず市販のキット（ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等）を用いて、ｍＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡに適切な制限酵素切断部位を含むアダプターを付加した後、ラムダファージベクターのクローニング部位に挿入する。これを市販のキット（例えば、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングし、宿主大腸菌に感染・増幅すれば、目的とするｃＤＮＡライブラリーが得られる。
ｃＤＮＡライブラリーが作製されたら、このｃＤＮＡ、あるいは該ｃＤＮＡのうち特異性の高い部分（例えば、３’側の反復配列を含まないＵＴＲ領域）をＰＣＲ増幅し、アレイ固定用プローブを作製する。この作業を繰り返して目的とする全ての遺伝子のプローブが調製できたら、これらを市販のスポッター（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製など）を用いてスライドグラス上にスポッティングする。かくして、目的とするｃＤＮＡマイクロアレイが得られる。
（２）遺伝子発現量の検出
ｃＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現量の検出は、サンプルｍＲＮＡ（或いはｃＤＮＡ）を適当な試薬でラベルし、これをアレイ上のｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせたときのシグナル強度として測定することができる。遺伝子の発現量は、通常アレイ上にスポットされたｃＤＮＡプローブ量のばらつきを考慮し、適当なコントロールとの比較値、あるいは比較する２サンプル間の発現量比として求めることが望ましい。本スクリーニングの場合であれば、ストレスを負荷しない無処理の植物由来のｍＲＮＡをコントロールとして、ストレスを付加した植物由来のｍＲＮＡの相対的発現量を検出すればよい。
検出は、コントロールとサンプルのｍＲＮＡ（あるいはそのｃＤＮＡ）を、それぞれ異なる蛍光色素（例えば、Ｃｙ３とＣｙ５）でラベルし、アレイ上のｃＤＮＡプローブと共にハイブリダイズさせることにより行う。例えば、ストレスを負荷した個体よりｍＲＮＡを抽出し、Ｃｙ５標識ｄＣＴＰ存在下逆転写してＣｙ５標識ｃＤＮＡを調製する。次に、ストレスを負荷しない無処理の個体よりｍＲＮＡを抽出し、同様の方法でＣｙ３標識ｃＤＮＡを調製する。Ｃｙ５標識ｃＤＮＡ（サンプル）とＣｙ３標識ｃＤＮＡ（コントロール）を等量ずつ混合し、アレイ上のｃＤＮＡとハイブリダイズさせる。なお、標識用色素はサンプルにＣｙ３を、コントロールにＣｙ５を利用してもよいし、その他の適当な標識試薬を用いてもよい。
得られた蛍光強度を蛍光シグナル検出機で読み取り、数値化すれば、この値はコントロールに対するサンプルの遺伝子発現量比に相当する。スキャナーで読み取った蛍光強度は必要に応じて、誤差の調整や各試料毎のばらつきの正規化を行ってもよい。正規化は、ハウスキーピング遺伝子等各サンプルで共通に発現している遺伝子を基準に行うことができる。さらに、信頼性限界ラインを特定して、相関性の低いデータを除いてもよい。
（３）ストレス誘導性遺伝子の選択
ストレス誘導性遺伝子は、上記アレイによる解析の結果、ストレスを負荷した植物個体と負荷しない植物個体との間で発現量が著しく異なる遺伝子として特定される。ここで、「著しく異なる」とは、例えば、インテンシティー１０００以上で、両者の発現量が少なくとも３倍以上異なることを意味する。
（４）ノザン・ブロッティングによる発現解析
こうして選択された遺伝子は、さらにノザン解析等により、ストレス誘導性に当該遺伝子の発現が高まることを確認する。例えば、前述した方法で、様々なレベルの塩、乾燥、温度等のストレスに植物を暴露する。そして、該植物からＲＮＡを抽出し、これを電気泳動にかけて分離する。分離されたＲＮＡはニトロセルロース膜に転写し、前記遺伝子に特異的な標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせれば、その発現量を検出することができる。
選択された遺伝子が、ストレス依存的に発現が向上していれば、該遺伝子はストレス誘導性であることが確認できる。こうして、イネｃＤＮＡライブラリーより選択されたストレス誘導性遺伝子の例として、本発明にかかるａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）及びａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）を挙げることができる。なお、ａ００２２及びａ００６６はマイクロアレイ上に固定されているｃＤＮＡのＩＤ  Ｎｏ．である。
１．３  プロモーター配列のスクリーニング
（１）遺伝子データベースからの推定
次に、既存の遺伝子データベース（例えば、ＤＤＢＪのデータベース等）を基に検索ソフト（例えば、Ｂｌａｓｔ等）を用いてストレス誘導性遺伝子のプロモーター配列を検索する。イネのように、ほとんどのゲノムが解読されている植物では、特定されたストレス誘導性遺伝子を支配するプロモーター配列の探索は既存のデータベースを用いてすべて可能となる。プロモーター配列は、ゲノム上で前記ストレス誘導性遺伝子（ｃＤＮＡ）と相同性の高いゲノム遺伝子の上流領域から、プロモーターと考えられる領域として選ばれる。例えば、ストレス誘導性遺伝子のゲノム情報に基づき、これらの遺伝子の開始コドンと推定される位置から約１〜２ｋｂ上流付近をプロモーター領域と推定する。
ところで、公知のストレス誘導性プロモーターの中には、その配列中に該プロモーター活性に関わるシスエレメント；例えば、乾燥ストレス応答性エレメント（ＤＲＥ；ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、アブシジン酸応答性エレメント（ＡＢＲＥ；ａｂｓｃｉｓｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、低温ストレス応答性エレメントなど、
を有するものがある。このシスエレメントにストレス誘導性の転写因子が結合すると、前記プロモーターが活性化され、その支配下にあるストレス耐性付与遺伝子を発現させる。したがって、検索した上流領域に前記シスエレメントが含まれていれば、その領域はストレス誘導性プロモーターである可能性が非常に高いといえる。
かくして、前述のａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）と相同性が高い遺伝子のゲノム情報が得られ、その１．１ｋｂ上流領域より推定ＬＩＰ９プロモーター配列（配列番号１）がスクリーニングされた。同様にして、ａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）と相同性が高い遺伝子の上流領域より推定ＷＳＩ７２４プロモーター配列（配列番号１０）がスクリーニングされた。
（２）ストレス誘導性プロモーターの機能確認
次に推定プロモーター配列について、ストレス負荷時における該プロモーター活性の変化により、その機能の確認を行う。
まず、前項で推定されたプロモーター配列を基にプライマーを作製し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、プロモーターのクローニングを行う。次に、該プロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結して作製したレポータープラスミドを植物に導入し、該植物（好ましくはそのＴ２世代）のストレス負荷時におけるレポーターの発現を調べる。なお、レポーターとしては、例えばβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ：ｐＢＩ１２１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社等）、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられるが、活性が数値で与えられること、染色によって発現が視覚的に観察できるという点でＧＵＳが好ましい。
１．４  本発明のプロモーター
以上の結果、イネゲノム由来のＬＩＰ９プロモーター配列（配列番号１）は、乾燥、低温、塩等の各ストレス依存的に高い発現を示すストレス誘導性プロモーターであることが確認された。
このように、ＬＩＰ９プロモーターはすべてのストレスに対して特異的に誘導されるプロモーターである。以下にその構造的、機能的特徴を挙げる。
１）ＬＩＰ９プロモーターは、その構造中に乾燥ストレス誘導に関与するシスエレメントＤＲＥを２つ含む（図２参照）。
２）ＬＩＰ９プロモーターは、シスエレメントＤＲＥに結合してその下流の遺伝子の転写を活性化させるイネ由来の転写因子：ＯｓＤＲＥＢ１遺伝子（特願２００１−３５８２６８号）の過剰発現体で高発現している。
３）ＬＩＰ９プロモーターにはＯｓＤＲＥＢ１遺伝子が結合するＤＲＥ配列が存在することからＯｓＤＲＥＢ遺伝子の過剰発現の最適プロモーターであることが予測される。
一方、ＷＳＩ７２４プロモーターも、その構造中にＤＲＥ配列が２つ含まれていること、及びａ００６６のストレス負荷時の発現パターン（乾燥、塩、低温誘導性で、低温による誘導性が乾燥、塩に比べて遅い）から、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子のターゲットになっていることが予想された。
なお、本発明のプロモーターは配列番号１又は配列番号１０で示される塩基配列を有するＤＮＡに限定されず、配列番号１又は配列番号１０で表される塩基配列からなるＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡも、ストレス誘導性プロモーター活性を有する限り、本発明のストレス誘導性プロモーターに含まれる。ここで、ストリンジェントな条件とは、ホルムアミド濃度が３０〜５０％、３７〜５０℃、６×ＳＳＣの条件、好ましくはホルムアミド濃度が５０％、４２℃、６×ＳＳＣの条件をいう。
２．  組換えベクター
本発明の組換えベクターは、本発明のプロモーターを含むベクターである。該ベクターは、本発明のプロモーターの下流に他の構造遺伝子又は調節遺伝子を機能しうる態様で含んでいてもよい。そのような遺伝子の好適な例は、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子である。なお、「機能しうる態様」とは、他の構造遺伝子又は調節遺伝子が本発明のプロモーターの支配下で適切に発現されるような態様を意味する。
ここで、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子とは、乾燥ストレス、低温ストレス又は塩ストレス等の環境ストレスに対する植物の耐性を高める機能を担うタンパクをコードする遺伝子であって；例えば、ＬＥＡタンパク質、水チャネルタンパク質、適合溶質合成酵素、タバコのｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ、浸透圧調節物質（糖、プロリン、グリシンベタイン等）合成酵素、細胞膜脂質の修飾酵素であるシロイヌナズナのｗ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ、らん藻のＤ９ｄｅｓａｔｕｒａｓｅの遺伝子、プロリン合成の鍵酵素であるＰ５ＣＳ、ガラクチノール合成遺伝子ＡｔＧｏｌＳ３遺伝子を挙げることができる。
また、ストレス耐性を向上させる調節遺伝子とは、ストレス誘導性プロモーターの活性や、ストレス耐性を付与する遺伝子の発現を調節することにより、植物のストレス耐性を向上させる遺伝子であって；例えば、シロイヌナズナ由来の転写因子：ＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ２Ａ、ＤＲＥＢ１Ｂ、及びＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（特開２０００−６０５５８号公報参照）、イネ由来の転写因子：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、及びＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子（特願２００１−３５８２６８号）、ならびに植物ホルモンＡＢＡの生合成の鍵酵素であるＮＣＥＤ遺伝子等を挙げることができる。
特に、本発明のプロモーターが特定のシスエレメントを含む場合は、該シスエレメントに結合し、そのプロモーター活性を向上させる転写因子の遺伝子を、プロモーター下流に連結させることが好ましい。
前述のように、本発明にかかるＬＩＰ９プロモーターはその構造内にＤＲＥ配列を２つ含む。したがって、ＬＩＰ９プロモーターの下流に連結させる遺伝子としては、ＤＲＥＢ遺伝子又はＯｓＤＲＥＢ遺伝子（例えば、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、ＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ遺伝子）が好ましく、特にＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましい。
また、ＷＳＩ７２４プロモーターもＤＲＥ配列を２つ含み、ＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていることが予想されていることから、その下流に連結させる遺伝子としては、ＤＲＥＢ遺伝子又はＯｓＤＲＥＢ遺伝子（例えば、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｂ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｃ、ＯｓＤＲＥＢ１Ｄ、ＯｓＤＲＥＢ２Ａ遺伝子、ＯｓＤＲＥＢ２Ｂ遺伝子）が好ましく、特にＯｓＤＲＥＢ遺伝子が最も好ましいと考えられる。
本発明のベクターは、適当なベクターに本発明のプロモーターあるいは、該プロモーターと他の調節遺伝子や構造遺伝子を機能しうる態様で連結（挿入）して構築される。プロモーターを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられる。又はジＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスをベクターとして用いてもよい。
本発明のプロモーターのベクターへの挿入は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、これをベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結すればよい。
本発明の組換えベクターは、さらに、所望によりスプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有してもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などを用いることができる。
３．  形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、プロモーター活性が発現し得る態様で宿主中に導入することにより構築することができる。ここで、宿主は本発明のプロモーターが機能しうるものであれば特に限定されないが、植物が好ましく、特にイネ等の単子葉植物がより好ましい。
植物や植物細胞を宿主とする場合、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジンなどから株化した細胞や該植物から調製したプロトプラストが用いられる。植物への組換えベクターの導入方法としては、Ａｂｅｌらのポリエチレングリコールを用いる方法［Ａｂｅｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５：４２１−４２７（１９９４）］やエレクトロポレーション法などが挙げられる。
４．ストレス耐性トランスジェニック植物
（１）トランスジェニック植物の作製
本発明のプロモーターの支配下に、ストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子を機能しうる態様で連結して植物に導入することにより、環境ストレス、特に、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレスなどに対して抵抗性が向上されたトランスジェニック植物を作出することができる。宿主植物としては、特に単子葉植物が好ましい。
植物宿主への本発明のプロモーター等の導入方法としては、アグロバクテリウム感染法などの間接導入法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、リポソーム法、マイクロインジェクション法などの直接導入法などが挙げられる。従来、イネのような単子葉植物では、アグロバクテリウム感染法を用いたトランスジェニック植物の作製は困難といわれてきたが、アセトシリンゴンを加えることによってアグロバクテリウムがイネに感染可能となり、単子葉植物においても利用可能となってきた。
以下にアグロバクテリウムを用いたトランスジェニック植物の作製について説明する。
まず、本発明のプロモーターとストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子とを含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断後、必要に応じて適切なリンカーを連結し、植物細胞用のクローニングベクターに挿入して植物導入用組換えベクターを作製する。クローニング用ベクターとしては、ｐＢＩ２１１３Ｎｏｔ、ｐＢＩ２１１３、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＧＡ４８２、ｐＧＡＨ、ｐＢＩＧ等のバイナリーベクター系のプラスミドやｐＬＧＶ２３Ｎｅｏ、ｐＮＣＡＴ、ｐＭＯＮ２００などの中間ベクター系のプラスミドを用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、Ｃ５８Ｃ１ＲｉｆＲ、ＥＨＡ１０５等に、凍結融解法、エレクトロポレーション法等により導入して、植物への形質導入用に用いる。
上記の方法以外に、三者接合法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４）］によっても植物導入用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えばｐＲＫ２０１３など）を保有する大腸菌、及びアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培養して植物導入用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、構造遺伝子の後に、植物用のターミネーターなどを配置させる必要がある。本発明において利用可能なターミネーター配列としては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来やノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターなどが挙げられる。但し、植物体内で機能することが知られているターミネーターであればこれらのものに限定されるものではない。
さらに、効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、有効な選択マーカー遺伝子を使用することが好ましい。その際に使用する選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）、抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｔｐ）遺伝子及びビアラホス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）遺伝子等から選ばれる１つ以上の遺伝子を使用することができる。本発明のプロモーター及び選択マーカー遺伝子は、単一のベクターに一緒に組み込んでも良いし、それぞれ別個のベクターに組み込んだ２種類の組換えＤＮＡを用いてもよい。
こうして調製したアグロバクテリウムを採取した植物切片に感染させれば、目的とするトランスジェニック植物が作製できる。
トランスジェニック植物は、適切な抗生物質を加えた培地に播種し、目的のプロモーターや遺伝子を保有する個体を選択する。選択された個体は、ボンソル１号や黒土等の入った鉢に植え替えてさらに生育させる。一般に、導入遺伝子は宿主植物のゲノム中に同様に導入されるが、その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なるポジションイフェクトと呼ばれる現象が見られる。そこで、プローブとして導入遺伝子のＤＮＡ断片を用いたノザン法で検定することによって、より導入遺伝子が強く発現している形質転換体を選抜することができる。
（２）ストレス耐性の確認
本発明のプロモーターやストレス耐性を向上させる構造遺伝子及び／又は調節遺伝子が、トランスジェニック植物及びその次世代に組み込まれていることの確認は、これらの細胞及び組織から常法に従ってＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はサザン分析等を用いて導入した遺伝子を検出することにより行うことができる。
また、トランスジェニック植物における導入遺伝子の発現レベル及び発現部位の分析は、該植物の細胞及び組織から常法に従ってＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノザン解析を用いて導入した遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行うことができる。あるいは、導入した遺伝子の転写産物を、抗体を用いたウエスタン分析等により直接、分析してもよい。
本発明のプロモーターを導入したトランスジェニック植物の環境ストレスに対する耐性は、例えばバーミキュライト、パーライト、ボンソルなどを含む土を入れた植木鉢にトランスジェニック植物を植え、或いは水耕栽培を行い、各種環境ストレスを負荷した場合の生存を調べることによって評価することができる。環境ストレスとしては、低温、乾燥、塩等が挙げられる。例えば、乾燥ストレスに対する耐性は、２〜４週間、水を与えずその生存を調べることにより評価することができる。また低温・凍結ストレスに対する耐性は、１５〜−１０℃に、１〜１０日間おいた後、２日〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。また、塩ストレスは１００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌで１時間〜７日間おいた後、１〜３週間、２０〜３５℃で生育させその生存率を調べることにより評価することができる。かくして、本発明のプロモーターを用いれば、植物（特に単子葉植物）を矮化させることなくそのストレス耐性を著しく向上させることができる。
（３）トランスジェニック植物の好適な例
本発明にかかるトランスジェニック植物の好適な例として、ＬＩＰ９あるいはＷＳＩ７２４プロモーター支配下にＯｓＤＲＥＢ遺伝子を機能しうる態様で連結したベクターをイネ、コムギ等の単子葉植物に導入したトランスジェニック植物を挙げることができる。ＬＩＰ９プロモーターにはＤＲＥ領域が２つ含まれているため、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子は該シスエレメントに結合することにより、効果的にそのストレス耐性効果を示すことができる。同様に、ＷＳＩ７２４プロモーターにもＤＲＥ領域が２つ含まれているため、ＯｓＤＲＥＢ遺伝子の発現を高めて、植物のストレス耐性を向上させることができる。
【実施例】  以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕イネのストレス誘導性遺伝子の同定
ｃＤＮＡマイクロアレイとノザン解析により、イネのストレス誘導性遺伝子を探索した。
１．イネｃＤＮＡマイクロアレイの作製
２〜３週間水耕栽培したイネ（日本晴）をそれぞれ乾燥、塩、低温処理を行った。乾燥処理は室温で風乾し、塩処理は２５０ｍＭのＮａＣｌ溶液で栽培し、低温処理は４℃で栽培した。各ストレス処理を行ったイネは液体窒素で凍結後、グアニジンチオシアネート−塩化セシウム法により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムを用いてｍＲＮＡを調製した。得られたｍＲＮＡを鋳型にして、ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１  ファージミドベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ切断部位に挿入し、クローニングした。このファージミドＤＮＡをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてパッケージングした。得られた、ｃＤＮＡを含むラムダファージ粒子を宿主大腸菌に感染させ増幅した後、ファージ懸濁液として回収した。
上記ｃＤＮＡクローンの塩基配列をシークエンスして約１５００個の独立したクローンを選抜した。選抜したクローンをＰＣＲ法で増幅させ、ＧＴＭＡＳＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｌａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｃｏａｔｅｄマイクロスライドグラス（ｍｏｄｅｌ  Ｓ７４４４；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）にスタンピングした後、ＵＶクロスリンクによって固定し、イネｃＤＮＡマイクロアレイを作製した（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（２００１）１３：６１−７２  Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ）。
２．マイクロアレイ解析
前項と同様の乾燥、塩、低温の各ストレス処理、又は１００μＭのアブシジン酸処理（５時間又は１０時間）を行ったイネ、ならびに無処理のイネの各々からｍＲＮＡを精製した。無処理のイネ由来のｍＲＮＡをコントロール、各ストレス又はアブシジン酸処理したイネ由来のｍＲＮＡをサンプルとして、それぞれＣｙ３、Ｃｙ５を用いた二蛍光標識法を用いて、ｃＤＮＡマイクロレイ解析を行った。マイクロアレイ解析の結果、インテンシティー：１０００以上で、コントロールに比較して３倍以上の発現量が認められた遺伝子をストレス誘導性遺伝子の候補として選択した。かくして、ａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）及びａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）がストレス誘導性遺伝子として選択された。
３．ノザンハイブリダイゼーションによる発現解析
前項で選択された遺伝子の発現特性をノザンハイブリダイゼーションにより解析した。まず、イネをアブシジン酸、乾燥、低温、塩、水の各ストレスに暴露し、それぞれ０，１，２，５，１０時間ごとにサンプリングした。なお、アブシジン酸、乾燥、低温、塩ストレスは、１．と同様の方法で付与し、水ストレスは純水に浸すことにより付与した。それぞれのサンプルから全ＲＮＡを調製し、電気泳動を行い、ノザン法により各遺伝子の発現を見た。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、ａ００２２はアブシジン酸、乾燥、低温，塩の各ストレスにより発現が誘導され、特にアブシジン酸、乾燥、塩では早い時間帯に発現の上昇がみられ、低温では遅いに時間帯に発現の上昇がみられた。また、ａ００６６は、そのストレス負荷時の発現パターン（乾燥、塩、低温誘導性で、低温による誘導性が乾燥、塩に比べて遅い）からＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていることが予想された。
〔実施例２〕プロモーター配列の解析
１．イネゲノムデータベースのスクリーニング
実施例１でストレス誘導性遺伝子として選択されたｃＤＮＡ：ａ００２２（ＬＩＰ９：配列番号２）について、ＤＤＢＪのイネゲノムデータベースを利用し、ｂｌａｓｔにより相同部位の検索を行った。その結果、相同性が認められた遺伝子の開始コドンから５’側に向かって、１．１ｋｂ上流の配列をプロモーター配列（配列番号１）として選択した。また、ａ００６６（ＷＳＩ７２４：配列番号８）についても同様の検索を行い、そのプロモーター配列（配列番号１０）が選択された。
図２にＬＩＰ９のプロモーター領域の構造を示す。図２から明らかなように、ＬＩＰ９はその構造中に２ヶ所のシス配列ＤＲＥ（（Ａ／Ｇ）ＣＣＧＡＣ）を持つことが確認された。また、図７にＷＳＩ７２４のプロモーター領域の構造を示す。ＷＳＩ７２４プロモーターについても、その構造中に２ヶ所のシス配列ＤＲＥ（（Ａ／Ｇ）ＣＣＧＡＣ）を持つことが確認された。
２．クローニング
選択されたプロモーター配列を基にプライマーを設計し、イネのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、クローニングを行った。用いたプライマー配列及びＰＣＲ条件は以下のとおりである。
ＬＩＰ９プロモーター用プライマー配列：
2004085641.tif 000002
ＷＳＩ７２４プロモーター用プライマー配列：
2004085641.tif 000003
ＰＣＲ条件：９５度１分  ５５度１分  ６８度２分  ３０サイクル
〔実施例３〕ストレスに対するＬＩＰ９プロモーター活性
（１）トランスジェニック植物の作製
ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔのプロモーター部位をトウモロコシのユビキチンプロモーターに置換して作られたＧ−ｕｂｉプラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様に切断したＬＩＰ９プロモーターの断片と連結した。ＬＩＰ９プロモーターを組み込んだプラスミドをＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断し、同様にｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで切断し切り出したＧｕｓ遺伝子と連結しＧｕｓ発現コンストラクト（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を作製した（図３）。プラスミドＧ−ＬＩＰ９：ＧＵＳを、培養後１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を作製した。このアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を以下のようにしてイネに感染させ、形質転換体を作製した。
イネの種子を７０％エタノールで１分浸漬し、さらに２％次亜塩素酸ナトリウムに１時間浸漬することにより滅菌し、次いで滅菌水により水洗後、Ｎ６Ｄ固形培地（１リットル当たり：ＣＨＵ［Ｎ６］Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｓｉｇｍａ社製）３．９８ｇ、スクロース３０ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、カザミノ酸３００ｍｇ、Ｌ−プロリン２８７８ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸１ｍｇ、２，４−Ｄ  ２ｍｇ、ゲルライト４ｇ、ｐＨ５．８）のプレートに９粒ずつ播種し、２４日間培養してカルスを誘導した。形成された種子約２０粒分のカルスを、新たなＮ６Ｄ固形培地に移植し、さらに３日間培養した。
一方、上記アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ＬＩＰ９：ＧＵＳ）を５ｍｌのリファンピシリン１００ｍｇ／ｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｌを含むＹＥＰ培地（１リットル当たり：Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ  １０ｇ、Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ４０６ｍｇ、ｐＨ７．２）で２８℃で２４時間培養した。このアグロバクテリウムを２０ｍｇ／ｌのアセトシリンゴンを含むＡＡＭ培地（１リットル当たり：ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ３ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ２５０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２５μｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２５μｇ、ＫＩ  ７５０μｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １５０ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２５０ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ  ４０ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  １５０ｍｇ、ニコチン酸１ｍｇ、チアミン塩酸１０ｍｇ、ピリドキシン塩酸１ｍｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、Ｌ−アルギニン１７６．７ｍｇ、グリシン７．５ｍｇ、Ｌ−グルタミン９００ｍｇ、アスパラギン酸３００ｍｇ、ＫＣｌ  ３ｇ、ｐＨ５．２）でＯ．Ｄ．６６０が０．１になるようにうすめ、２０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を作製した。
つぎに、前述の３日間培養したカルスにアグロバクテリウム懸濁液を加え、１分間混合した。その後このカルスを滅菌したペーパータオルに置き、余分なアグロバクテリウム懸濁液を除去した後、滅菌した濾紙を敷いた２Ｎ６−ＡＳ固形培地（１リットル当たり：ＣＨＵ［Ｎ６］  Ｂａｓａｌ  Ｓａｌｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ３．９８ｇ、スクロース３０ｇ、グルコース１０ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、カザミノ酸３００ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸１ｍｇ、２，４−Ｄ  ２ｍｇ、アセトシリンゴン１０ｍｇ、ゲルライト４ｇ、ｐＨ５．２）の上で２５℃３日間、暗黒下で培養した。３日間の培養後、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌを含む３％スクロース水溶液で白濁しなくなるまで十分に洗浄し、カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン１０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地上で１週間培養した。その後カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ及びハイグロマイシン５０ｍｇ／ｌを含んだＮ６Ｄ固形培地に移植して、１８日間培養した。さらにこのカルスを再分化培地（１リットル当たり：ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）４．６ｇ、スクロース３０ｇ、ソルビトール３０ｇ、カザミノ酸２ｇ、ミオイノシトール１００ｍｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸０．１ｍｇ、ＮＡＡ  ０．２ｍｇ、カイネチン２ｍｇ、カルベニシリン２５０ｍｇ、ハイグロマイシン５０ｍｇ、アガロース８ｇ、ｐＨ５．８）に移植した。１週間ごとに新しい培地に移植し直し、再分化して芽が１ｃｍ程度に生長したものはホルモンフリー培地（１リットル当たり：ムラシゲ・スクーグ培地用混合塩類（日本製薬社製）４．６ｇ、スクロース３０ｇ、グリシン２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸０．５ｍｇ、チアミン塩酸０．１ｍｇ、ハイグロマイシン５０ｍｇ、ゲルライト２．５ｇ、ｐＨ５．８）に移植した。ホルモンフリー培地上で８ｃｍ程度に生長した植物体を合成粒状培土ボンソル１号（住友化学社製）を入れた植木鉢に移し、形質転換植物体の種子を得た。
同様にして、ｒｄ２９Ａプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１７，２８７−２９１）、又は３５Ｓプロモーター、ｓａｌＴプロモーター（配列番号５）をＧＵＳ遺伝子上流に結合したコンストラクトを作製し、イネ及び／又はタバコに導入した。
なお、ｓａｌＴプロモーターは、ＬＩＰ９プロモーターと同様のスクリーニングによってイネゲノム中より単離されたストレス誘導性プロモーターである。ｓａｌＴプロモーターに対応するマイクロアレイ上のｃＤＮＡのＩＤ  Ｎｏ．は、ａ２６６０である。ｓａｌＴプロモーターは、その構造中に特別なシス配列はもたないが、アブシジン酸、乾燥、低温、塩の各ストレスにより発現が誘導されることが確認されている（特願２００２−３７７３１６号参照）。
（２）乾燥ストレスに対するプロモーター活性
得られたＧＵＳ発現形質転換イネのＴ２世代は２週間水耕栽培し、実施例１と同様にして乾燥ストレスに暴露した。
Ｇｕｓ発現形質転換タバコの場合、Ｔ１世代は再生してきた植物体をプラントコーン内で３〜５週間生育させ、生長した葉を２等分し、一方をコントロールとし片方を室温で風乾し乾燥ストレスに暴露した。
各形質転換イネ及びタバコについて、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの分解による蛍光強度の変化からＧＵＳ活性を測定した。図４に、乾燥ストレス負荷時における各種プロモーター導入形質転換植物のＧＵＳ活性を示す。
図４から明らかなように、単子葉植物であるイネでは、ｒｄ２９ＡプロモーターよりもｓａｌＴプロモータやＬＩＰ９プロモーターがより強いストレス誘導性を示した。特に、ＬＩＰ９プロモータはｓａｌＴの約２倍という、強い活性を示した。ＬＩＰ９プロモーターは双子葉植物であるタバコでもストレス誘導性プロモーター活性を示したが、イネに比較してその活性は弱かった。
（３）塩ストレスに対するプロモーター活性
次に、ＬＩＰ９プロモーター−ＧＵＳコンストラクト導入イネの植物体全体を塩水に浸し、ＧＵＳ染色を行ったところ、植物体全体が染色された（図５）。このことから、ＬＩＰ９プロモーターは、ストレスを負荷された植物体全体で機能することが確認された。
〔実施例４〕ストレスに対するＷＳＩ７２４プロモーター活性
実施例３と同様にして、ＷＳＩ７２４プロモーターで形質転換したイネを作製し、そのストレス耐性を確認した。
（１）トランスジェニック植物の作製
ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔのプロモーター部位をトウモロコシのユビキチンプロモーターに置換して作られたＧ−ｕｂｉプラスミドをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様に切断したＷＳＩ７２４プロモーターの断片と連結した。ＷＳＩ７２４プロモーターを組み込んだプラスミドをＢａｍＨＩで切断して末端を平滑化した後、ｐＢＩＧベクターのＳｍａＩで切断した部位に連結してＧＵＳ発現コンストラクト（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）を作製した。次いで、プラスミドＷＳＩ７２４：ＧＵＳを、培養後１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）を作製した。このアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（ＷＳＩ７２４：ＧＵＳ）をイネに感染させ、形質転換体を作製した。
（２）乾燥ストレスに対するプロモーター活性
得られたＧＵＳ発現形質転換イネを実施例３と同様にして乾燥ストレスに暴露し、４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅの分解による蛍光強度の変化からＧＵＳ活性を測定した。その結果、乾燥ストレスを負荷（切り取って２４時間放置）した形質転換イネの葉では、コントロール（切り取ってすぐに凍結）の葉に比較して、高いＧＵＳ活性が認められた。また、乾燥ストレス（２４時間）負荷後の形質転換イネをＧＵＳ染色したところ、根と葉の両方でＧＵＳ活性が認められた。
〔実施例５〕形質転換イネ中の導入遺伝子とＬＩＰ９及びＷＳＩ７２４遺伝子の発現
実施例３と同様にして、トウモロコシのユビキチンプロモーター、又は３５Ｓプロモーター支配下にＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子（配列番号６）又はＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（配列番号８）をイネに導入した形質転換体を作製した。そして、形質転換体の導入遺伝子ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＤＲＥＢ１Ｃと、導入遺伝子が発現を変化させたと考えられるＬＩＰ９（ａ００２２）、ＷＳＩ７２４（ａ００６６）、ｓａｌＴ（ａ２６６０）のｍＲＮＡレベルをノザン解析により調べた。
プローブとしては、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子（配列番号６）、ＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子（配列番号７）、ＬＩＰ９遺伝子（ａ００２２：配列番号２）、ＷＳＩ７２４遺伝子（ａ００６６：配列番号８）、ｓａｌＴ遺伝子（ａ２６６０：配列番号９）を用いた（配列番号６、７については、配列表中の各コーディング領域の配列をプローブとして使用）。なお、コントロールとして、ベクターのみを形質転換したイネを同様に解析した。
形質転換イネは、５日間３０ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む０．１％ベンーレート溶液中で選抜した後、ボンソル１号の入った鉢に植え替えて１２日間育てた。野性株も同様に育てた。各植物から全ＲＮＡを調製して、電気泳動を行い、実施例１と同様にノザン法で各遺伝子の発現を見た。結果を図６に示す。図中、ａ、ｂ、ｃはそれぞれ形質転換体のラインを示す。
この結果、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ、ＤＲＥＢ１Ｃ遺伝子を導入された形質転換イネでは、プロモーター領域にＤＲＥ配列を持つＬＩＰ９の発現は誘導されたが、プロモーター領域にＤＲＥ配列を持たないｓａｌＴの発現は導入遺伝子（ＯｓＤＲＥＢ１ＡやＤＲＥＢ１Ｃ）の発現と一致しなかった。また、ＬＩＰ９と同様にプロモーター領域にＤＲＥ配列を持ち、ＯｓＤＲＥＢのターゲットになっていると予想されているＷＳＩ７２４遺伝子の発現も、これら形質転換体で誘導された。
ＬＩＰ９やＷＳＩ７２４プロモーター上にはＤＲＥ配列が存在し、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子の過剰発現体ではＬＩＰ９遺伝子やＷＳＩ７２４遺伝子が高発現している。ＬＩＰ９やＷＳＩ７２４はＯｓＤＲＥＢ１ＡをはじめとするＯｓＤＲＥＢ遺伝子の標的遺伝子と考えられ、したがってＬＩＰ９やＷＳＩ７２４プロモーターはＯｓＤＲＥＢ遺伝子を過剰発現するための最適なプロモーターと推定された。
〔参考例１〕ｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ，Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａの作製
まず、Ｇ−ｕｂｉ，Ｇ３５Ｓ−ＳｈΔは以下のように作製した。まずｐＢＩＧプラスミド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：２０３（１９９０））をＢａｍＨＩで切断・平滑化処理した後、連結してＢａｍＨＩ切断部位をつぶし、さらにＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断した。この断片とｐＢＥ２１１３Ｎｏｔプラスミドを同様に切断して得られる約１．２ｋｂの断片とを連結して、ｐＢＩＧ２１１３Ｎｏｔプラスミドを作製した。
つぎにｐＢＩＧ２１１３ＮｏｔをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断し、同様に切断されたｒｄ２９Ａプロモーターの断片（約０．９ｋｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２８７−２９１（１９９９））と連結して、ｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔプラスミドを作製した。さらにこのｐＢＩＧ２９ＡＰＨＳＮｏｔプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断後、同様に切断されたトウモロコシのユビキチン遺伝子（Ｕｂｉ−１）のプロモーターの断片（約２．０ｋｂ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８：６７５−６８９（１９９２））又はｐ３５Ｓ−ｓｈΔ−ｓｔｏｐのＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターとトウモロコシのスクロースシンターゼ遺伝子（Ｓｈ１）のイントロンの一部を含んだ断片（約１．６ｋｂ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ  ９６：１５３４８−１５３５３（１９９９））と連結してＧ−ｕｂｉプラスミド又はＧ３５Ｓ−ＳｈΔプラスミドを作製した。
前記ｐＢＥ２１１３Ｎｏｔ，Ｇ−ｕｂｉ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔはそれぞれＢａｍＨＩで切断した後、同様に切断したイネの転写因子をコードするＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子断片とｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて連結し、得られた連結物により大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体を培養後、該培養物からプラスミドｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ，Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ及びＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａをそれぞれ精製した。次いで、これらの塩基配列を決定し、ＯｓＤＲＥＢ１Ａ遺伝子がセンス方向に結合したものを選抜した。
上記のプラスミドｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａを持つ大腸菌ＤＨ５αとヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を持つ大腸菌ＨＢ１０１及びアグロバクテリウムＣ５８を共に、ＬＢ寒天培地を用いて２８℃で２４時間混合培養した。生成したコロニーを掻き取り、１ｍｌのＬＢ培地に懸濁した。この懸濁液１０μｌをリファンピシリン１００ｍｇ／ｌ、及びカナマイシン２０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、２８℃で２日間培養して、接合体アグロバクテリウムＣ５８（ｐＢＥ３５Ｓ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）を得た。一方上記のプラスミドＧ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１ＡとＧ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａのプラスミドを、培養後１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌで洗浄したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５にエレクトロポレーション法によって導入し、アグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ−ｕｂｉ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）とアグロバクテリウムＥＨＡ１０５（Ｇ３５Ｓ−ＳｈΔ：ＯｓＤＲＥＢ１Ａ）をそれぞれ得た。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、単子葉植物において有効に機能しうるストレス誘導性プロモーターが提供される。該プロモーターはＤＲＥ配列を含み、したがって、その支配下にＯｓＤＲＥＢ遺伝子等を連結して植物に導入すれば、イネ等の単子葉植物において、強いストレス耐性トランスジェニック植物を作出することができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号１１−人工配列の説明：プライマー
配列番号１２−人工配列の説明：プライマー
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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