(57)【要約】細胞試料に損傷を与えず、細胞を分離するために電圧を加える電極の消失を防ぎ、長時間の分離を行う際に流路の目詰まりを起こさない細胞分析分離装置を提供する。  本発明の細胞分離装置は、細胞分離空間に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段と、細胞を分離して排出することのできる流路を設けることにより、細胞試料に損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にした。この外力をかける手段として、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電界を印加することが好ましい。更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離空間に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部にフィルターを配し不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離空間に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、これらの流路が、細胞分離空間に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置。
【請求項２】
前記外力を加える手段が、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電界を印加することから成る請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有し、細胞分離用空間から流体を排出するための流路を２つ有する請求項１又は２に記載の細胞分離装置であって、前記外力を加えない場合に、該注入用流路の一つから細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ一方の排出流路へ流れ、他の注入用流路から細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ他方の排出流路へ流れるように流路が配置され、該注入流路の一方のみへ細胞を含む流体を流すことを特徴とする細胞分離装置。
【請求項４】
注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設けた請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離空間に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、該注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設け、これらの流路が、細胞分離空間に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置。
【請求項６】
細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有し、細胞分離用空間から流体を排出するための流路を２つ有する請求項５に記載の細胞分離装置であって、前記外力を加えない場合に、該注入用流路の一つから細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ一方の排出流路へ流れ、他の注入用流路から細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ他方の排出流路へ流れるように流路が配置され、該注入流路の一方のみへ細胞を含む流体を流すことを特徴とする細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞分離装置（セルソーター）に関する。
従来技術
培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。
この技術については例えば、セルソーターがある。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（Ｋａｍａｒｃｋ，Ｍ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５１，ｐ１５０−１６５（１９８７））。
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの課題があることから、近年、マイクロ加工技術を用いて作った微細な流路にできた層流中を流れる微粒子を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されているが（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，９８，ｐｐ．７７−８０（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９８）；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７０，ｐｐ．１９０９−１９１５（１９９８））、観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している（特願２００２−２４５９０２）。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞試料に損傷を与えず、細胞を分離するために電圧を加える電極の消失を防ぎ、長時間の分離を行う際に流路の目詰まりを起こさない細胞分析分離装置を提供することを目的とする。
従来の細胞分析分離装置（例えば、特願２００２−２４５９０２）において、試料溶液に直接接する金属電極を用いると、細胞試料に損傷を与える可能性があり、また電圧を長時間加える場合には、電極が電気分解によって消失してしまう可能性があった。更に、細胞の精製を長時間にわたって連続して行う際に、試料溶液に含まれる組織断片やゴミ等の不純物により流路が目詰まりを起こすことを防止する必要があった。そのため、これらの問題の無い細胞分離装置が求められていた。
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞分離装置は、細胞分離空間に外部から細胞に外力を加えて細胞を移動させる手段と、細胞を分離して排出することのできる流路を設けることにより、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にした。更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離空間に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
即ち、本発明は、細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離空間に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、これらの流路が、細胞分離空間に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置である。
この細胞分離装置においては、細胞分離空間に外部から細胞に外力を加えるため、電極等が直接細胞を含む溶液に接することがなく、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことができる。
この外力を加える手段として、静電気力、誘電電気泳動力、磁力、超音波放射圧、光放射圧等が挙げられるが、静電気力を用いるのが簡便である。
静電気力を用いる場合、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電界を印加することにより行うことができる。
この電解質としては、アガロースゲル、アミノペクチン、コラーゲンなどの一般的なゲルを用いることができる。
また、印加する電圧は、対象とする細胞にも依存するが、実際の細胞を流してみて分離できるよう設定することが好ましく、例えば、アガロースゲルを用いて電極間距離が１０〜１５μｍの場合、白血球細胞（５μｍ程度）を４０Ｖ程度で分離することができる。
この細胞分離装置は、更に、注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設けてもよい。
また、本発明は、細胞分離用空間、それに細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、それから流体を排出するための少なくとも２つの流路及び該細胞分離空間に外部から細胞に外力を加える手段から成る細胞分離装置であって、該注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設け、これらの流路が、細胞分離空間に外部から外力を加えた場合と加えない場合に、細胞が該細胞分離用空間からそれぞれ異なる流路へ排出されるよう配置されたことを特徴とする細胞分離装置である。
更に、この細胞分離装置は、細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有し、細胞分離用空間から流体を排出するための流路を２つ有する請求項１又は２に記載の細胞分離装置であって、前記外力を加えない場合に、該注入用流路の一つから細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ一方の排出流路へ流れ、他の注入用流路から細胞分離用空間へ流入した流体はほぼ他方の排出流路へ流れるように流路が配置され、該注入流路の一方のみへ細胞を含む流体を流すことを特徴とするものであってもよい。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明のセルソーターの構成の１例を示す模式図である。
第２図は、本発明のセルソーターの流路の構成の１例を示す模式図である。
第３図は、本発明のセルソーターのフィルター部の構成の１例を示す模式図である。
第４図は、本発明のセルソーターの細胞分離部の構成の１例を示す顕微鏡写真を示す。
第５図は、本発明のセルソーターのセルソーティングの過程の１例を示す模式図である。
第６図は、本発明の細胞分離手順を説明した顕微鏡写真を示す。矢印は細胞を示す。
図中の符号の説明
１０１  チップ
１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９  穴
２０１  細胞を含む溶液の注入口
２０２  細胞を含まない溶液の注入口
２０６、２０７  電極用穴
２１１、２１２  細胞取り出し口
２０３  フィルター
２０４、２０５、４０１，４０２、５０１、５０２  マイクロ流路
２０８、２０９  電極（電解質で満たされた空間）
２１０  細胞分離用空間
３０１、３０４  細胞
３０２、３０５  ゴミ
３０３  柱状構造（フィルター）
４０３、４０４  ゲル電極
４０５、４０６  微小な連絡穴
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の細胞分離装置の実施形態について説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
第１図に、本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す。このセルソーターはチップ１０１中に流路として構成されている。チップの底面にはガラス基板１１０が貼り付けられており、このガラス基板のすぐ上にマイクロ流路が配置されている。このとき、ガラス基板の厚さは、光学計測をするために可能な限り薄いものを用いる。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いる場合には、ガラス基板の厚さは０．２ｍｍ以下であることが望ましい。チップ１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料溶液を導入する穴１０２、細胞を含まない溶液を導入する穴１０３、ゲル電極に電極を挿入する穴１０４、１０５、１０６、１０７、そして分離精製した細胞を回収する穴１０８、１０９がそれぞれ開けられている。
第２図は、第１図で説明したセルソーターの流路の構成の一例を模式的に示したものである。穴２０１に導入された細胞を含む溶液は、マイクロ流路２０４を通過して、細胞分離部２１０まで導入される。ここで、マイクロ流路２０４の上流には、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター部２０３が配置されている。他方、穴２０２に導入された細胞を含まない溶液は流路２０５を通過して、同様に細胞分離部２１０まで導入される。細胞分離部２１０の流路２０４側、流路２０５側にはそれぞれ、電解質を含むゲルで満たされたマイクロ構造（空間）２０８、２０９が接触しており、穴２０６、２０７に差し込まれた電極を通じて細胞分離部２１０に電場を印加することができる。
この細胞分離部２１０において、流れは層流となっているため、流路２０４の上流から流れてきた細胞は、電場を受けない場合には、下流の細胞溜の穴２１１に、電場を受ける場合には、下流の細胞溜の穴２１２に誘導される。このとき、溶液の流れの速度は、例えば、穴２０１、２０２、２１１、２１２に導入された溶液の量、即ち、溶液液面の高さの差によって制御することができる。また、この実施例のように、ゲル電極をセルソーターの微細構造中に導入する場合には、従来の金属電極の場合のように、金属電極を蒸着した面とのアライメントを揃える手間は不要である。
第３図ａは、第２図で説明した、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター部の構造の１例を模式的に示したものである。このフィルター部は、セルソーターのチップ内に微細な柱状構造３０３が周期的に配置して直接埋め込まれており、マイクロ流路の上流から流れてくる細胞３０１と、ゴミ３０２のうち、ゴミ３０２は、この柱状構造３０３によって捕獲され、下流のマイクロ流路が目詰まりすることを防いでいる。第３図ｂは実際に、セルソーターのチップにフィルター部を組み込んだ一例の光学顕微鏡写真である。この写真では、チップ内に直接組み込まれた柱状構造３０４によってゴミ３０５が捕獲されている。このフィルター部の構造は、マイクロ流路の幅に対して十分に広い幅となっており、柱状構造にゴミが捕獲されても、流路の流れが妨げれられることはない。
第４図は、セルソーターに組み込まれるゲル電極の構造を示した光学顕微鏡画像である。第４図ａは、セルソーターの細胞分離部を拡大して観察したものである。２つのマイクロ流路４０１、４０２に対して、それぞれゲル電極４０３、４０４が配置されている。第４図ｂは、実際にゲル電極に蛍光色素を導入して、蛍光顕微鏡で観察したものである。ゲル電極は、微小な連絡穴４０５、４０６によって流路４０１、４０２とつながっている。本実施例の場合、１％（ｗ／ｖ）アガロースをゲル電極として用い、塩化ナトリウムをアガロースに溶解させた電解質として用いた。また、陰極側のｐＨを酸性（ｐＨ６．０）に、陽極側のｐＨを塩基性（ｐＨ８．０）にすることで、電極で発生する気体の発生を抑制することができる。
第５図は、実際に電場を印加したときに細胞のセルソーティングがなされる過程を模式的に示した図である。第５図ａのように電場を印加しない場合には、流路５０１、５０２それぞれの流れにおいて、流路５０１中を流れている細胞は、そのまま、流路５０１の下流に流れてゆく。他方、第５図ｂのように、電場を印加した場合には、流路５０１を流れる細胞は、流路５０２に移動する。
第６図は、実際に、セルソーター中で細胞を選択的に２つの流路のいずれかに流した例を示す顕微鏡写真である。第６図の１〜３の連続写真は、電場を印加しないとき、細胞が同一のマイクロ流路をそのまま上流から下流に流れてゆく姿を示している。他方、第６図の４〜６は、電場を印加することで、細胞が別のマイクロ流路に移動する姿を示す。
【図１】
2004101731.tif 000002
【図２】
2004101731.tif 000003
【図３】
2004101731.tif 000004
【図４】
2004101731.tif 000005
【図５】
2004101731.tif 000006
【図６】
2004101731.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月17日(2004.9.17)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
細胞分離用空間、前記細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、前記細胞分離用空間から流体を排出するための少なくとも２つの流路及び前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極から成る細胞分離装置であって、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えた場合と加えない場合に、細胞が前記細胞分離用空間から前記少なくとも２つの流路の異なる流路へ選択的に排出されることを特徴とする細胞分離装置。
【手続補正００２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
前記ゲル電極が、前記細胞分離用空間の側壁に設けられた微小な連絡穴を介して前記細胞を含む流体と接するものであるとともに、この２つの連絡穴が流体の流下方向に対して相対的に位置をずらして配置された請求項１に記載の細胞分離装置。
【手続補正００３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
前記細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有する請求項１又は２に記載の細胞分離装置。
【手続補正００４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
前記細胞を含む流体の注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ前記細胞分離用空間より上流にフィルターを設けた請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【手続補正００５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法。
【手続補正００６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞分離装置を用いて、その細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、及び前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法。
【手続補正００７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記細胞分離用空間に回収する細胞が流れる際にのみ前記２つのゲル電極に所定の電圧を加える請求項５又は６に記載の細胞分離方法。
【手続補正００８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
て、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している（特願２００２−２４５９０２）。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞試料に損傷を与えず、細胞を分離するために電圧を加える電極の消失を防ぎ、長時間の分離を行う際に流路の目詰まりを起こさない細胞分析分離装置を提供することを目的とする。
従来の細胞分析分離装置（例えば、特願２００２−２４５９０２）において、試料溶液に直接接する金属電極を用いると、細胞試料に損傷を与える可能性があり、また電圧を長時間加える場合には、電極が電気分解によって消失してしまう可能性があった。更に、細胞の精製を長時間にわたって連続して行う際に、試料溶液に含まれる組織断片やゴミ等の不純物により流路が目詰まりを起こすことを防止する必要があった。そのため、これらの問題の無い細胞分離装置が求められていた。
【課題を解決するための手段】
本発明の細胞分離装置は、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電圧を印加することにより細胞を移動させる手段と、細胞を分離して排出することのできる流路を設けることにより、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にした。更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離用空間に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
即ち、本発明は、細胞分離用空間、前記細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、前記細胞分離用空間から流体を排出するための少なくとも２つの流路及び前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極から成る細胞分離装置であって、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えた場合と加えない場合に、細胞が前記細胞分離用空間から前記少なくとも２つの流路の異なる流路へ選択的に排出されることを特徴とする細胞分離装置である。


【手続補正００９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
この細胞分離装置においては、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電圧を印加するため、電極等が直接細胞を含む溶液に接することがなく、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことができる。
この電解質としては、アガロースゲル、アミノペクチン、コラーゲンなどの一般的なゲルを用いることができる。
また、印加する電圧は、対象とする細胞にも依存するが、実際の細胞を流してみて分離できるよう設定することが好ましく、例えば、アガロースゲルを用いて電極間距離が１０〜１５μｍの場合、白血球細胞（５μｍ程度）を４０Ｖ程度で分離することができる。
この細胞分離装置は、更に、注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設けてもよい。
また、本発明は、ゲル電極が、前記細胞分離用空間の側壁に設けられた微小な連絡穴を介して前記細胞を含む流体と接するものであるとともに、この２つの連絡穴が流体の流下方向に対して相対的に位置をずらして配置された上記の細胞分離装置である。
更に、この細胞分離装置は、細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有するものであってもよい。
また、本発明は、細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、及び前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法である。
この細胞分離用空間に回収する細胞が流れる際にのみ前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えてもよい。




【手続補正書】
【提出日】平成17年7月27日(2005.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分離用空間、前記細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、前記細胞分離用空間から流体を排出するための少なくとも２つの流路及び前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極から成る細胞分離装置であって、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えた場合と加えない場合に、細胞が前記細胞分離用空間から前記少なくとも２つの流路の異なる流路へ選択的に排出されることを特徴とする細胞分離装置。
【請求項２】
前記ゲル電極が、前記細胞分離用空間の側壁に設けられた微小な連絡穴を介して前記細胞を含む流体と接するものであるとともに、この２つの連絡穴が流体の流下方向に対して相対的に位置をずらして配置された請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有する請求項１又は２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記細胞を含む流体の注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ前記細胞分離用空間より上流にフィルターを設けた請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞分離装置を用いて、その細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、及び前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法。
【請求項７】
前記細胞分離用空間に回収する細胞が流れる際にのみ前記２つのゲル電極に所定の電圧を加える請求項５又は６に記載の細胞分離方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞分離装置（セルソーター）に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。細胞の比重の違いで細胞を分離する場合には速度沈降法によって分離することができる。しかし、未感作の細胞と感作した細胞とを見分けるような、細胞の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ分離する必要がある。
この技術については例えば、セルソーターがある。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中の細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である（非特許文献１）。
【０００３】
しかし、この技術は高価であること、装置が大型であること、数千ボルトという高電界が必要であること、試料が多量に必要であること、液滴を作成する段階で細胞に損傷を与える可能性があること、直接試料を観察できないことなどの課題があることから、近年、マイクロ加工技術を用いて作った微細な流路にできた層流中を流れる微粒子を直接顕微鏡観察しながら分離するセルソーターが開発されているが（非特許文献２、３）、観察手段に対する試料分離の応答速度が遅く、実用化するためには、試料に損傷を与えず、かつ、より応答の速い処理方法が必要であった。
本発明者らは、このような問題点を解消するため、マイクロ加工技術を活用して、試料の微細構造と試料中の蛍光分布に基づいて試料を分画し、回収する試料に損傷を与えることなく、簡便に細胞試料を分析分離することのできる細胞分析分離装置を出願している(特願2002-245902)。
【０００４】
【非特許文献１】Kamarck,M.E., Methods Enzymol. Vol.151, p150-165 (1987)
【非特許文献２】Micro Total Analysis, 98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998)
【非特許文献３】Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞試料に損傷を与えず、細胞を分離するために電圧を加える電極の消失を防ぎ、長時間の分離を行う際に流路の目詰まりを起こさない細胞分析分離装置を提供することを目的とする。
従来の細胞分析分離装置(例えば、特願2002-245902)において、試料溶液に直接接する金属電極を用いると、細胞試料に損傷を与える可能性があり、また電圧を長時間加える場合には、電極が電気分解によって消失してしまう可能性があった。更に、細胞の精製を長時間にわたって連続して行う際に、試料溶液に含まれる組織断片やゴミ等の不純物により流路が目詰まりを起こすことを防止する必要があった。そのため、これらの問題の無い細胞分離装置が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞分離装置は、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電圧を印加することにより細胞を移動させる手段と、細胞を分離して排出することのできる流路を設けることにより、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことを可能にした。更に、本発明の細胞分離装置は、細胞分離用空間に導入される試料を含む流体が導入される流路の上流部で不純物を捕獲して流路の目詰まりを防ぐ手段を有することができる。
即ち、本発明は、細胞分離用空間、前記細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入するための少なくとも一つの流路、前記細胞分離用空間から流体を排出するための少なくとも２つの流路及び前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極から成る細胞分離装置であって、前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えた場合と加えない場合に、細胞が前記細胞分離用空間から前記少なくとも２つの流路の異なる流路へ選択的に排出されることを特徴とする細胞分離装置である。
【０００７】
この細胞分離装置においては、電解質を含むゲル電極を用いて細胞分離用空間に電圧を印加するため、電極等が直接細胞を含む溶液に接することがなく、細胞試料の損傷を防ぎ、電極の電気分解による消失を防ぐことができる。
この電解質としては、アガロースゲル、アミノペクチン、コラーゲンなどの一般的なゲルを用いることができる。
また、印加する電圧は、対象とする細胞にも依存するが、実際の細胞を流してみて分離できるよう設定することが好ましく、例えば、アガロースゲルを用いて電極間距離が１０〜１５μｍの場合、白血球細胞（５μｍ程度）を４０Ｖ程度で分離することができる。
この細胞分離装置は、更に、注入流路において、細胞を含む流体の注入点より下流かつ細胞分離用空間より上流にフィルターを設けてもよい。
【０００８】
また、本発明は、ゲル電極が、前記細胞分離用空間の側壁に設けられた微小な連絡穴を介して前記細胞を含む流体と接するものであるとともに、この２つの連絡穴が流体の流下方向に対して相対的に位置をずらして配置された上記の細胞分離装置である。
更に、この細胞分離装置は、細胞分離用空間に流体を注入するための流路を２つ有するものであってもよい。
また、本発明は、細胞分離用空間に細胞を含む流体を注入すること、前記細胞分離用空間の対向する側壁のそれぞれに設けられた２つのゲル電極に選択的に所定の電圧を印加すること、及び前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えたか否かによって前記流体中の細胞を前記細胞分離用空間に結合された少なくとも２つの排出用流路の異なる流路へ選択的に排出することから成る細胞分離方法である。
この細胞分離用空間に回収する細胞が流れる際にのみ前記２つのゲル電極に所定の電圧を加えてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の細胞分離装置の実施形態について説明するが、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
図１に、本発明の細胞分離装置（セルソーター）のシステム構成の１例を模式的に示す。このセルソーターはチップ１０１中に流路として構成されている。チップの底面にはガラス基板１１０が貼り付けられており、このガラス基板のすぐ上にマイクロ流路が配置されている。このとき、ガラス基板の厚さは、光学計測をするために可能な限り薄いものを用いる。例えば、開口数１．４、倍率１００倍の対物レンズを用いる場合には、ガラス基板の厚さは０．２ｍｍ以下であることが望ましい。チップ１０１の上面には、マイクロ流路に細胞を含む試料溶液を導入する穴１０２、細胞を含まない溶液を導入する穴１０３、ゲル電極に電極を挿入する穴１０４、１０５、１０６、１０７、そして分離精製した細胞を回収する穴１０８、１０９がそれぞれ開けられている。
【００１０】
図２は、図１で説明したセルソーターの流路の構成の一例を模式的に示したものである。穴２０１に導入された細胞を含む溶液は、マイクロ流路２０４を通過して、細胞分離部２１０まで導入される。ここで、マイクロ流路２０４の上流には、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター部２０３が配置されている。他方、穴２０２に導入された細胞を含まない溶液は流路２０５を通過して、同様に細胞分離部２１０まで導入される。細胞分離部２１０の流路２０４側、流路２０５側にはそれぞれ、電解質を含むゲルで満たされたマイクロ構造（空間）２０８、２０９が接触しており、穴２０６、２０７に差し込まれた電極を通じて細胞分離部２１０に電場を印加することができる。
【００１１】
この細胞分離部２１０において、流れは層流となっているため、流路２０４の上流から流れてきた細胞は、電場を受けない場合には、下流の細胞溜の穴２１１に、電場を受ける場合には、下流の細胞溜の穴２１２に誘導される。このとき、溶液の流れの速度は、例えば、穴２０１、２０２、２１１、２１２に導入された溶液の量、即ち、溶液液面の高さの差によって制御することができる。また、この実施例のように、ゲル電極をセルソーターの微細構造中に導入する場合には、従来の金属電極の場合のように、金属電極を蒸着した面とのアライメントを揃える手間は不要である。
【００１２】
図３ａは、図２で説明した、マイクロ流路の目詰まりを防ぐために、チップ中に直接微細構造として組み込まれたフィルター部の構造の1例を模式的に示したものである。このフィルター部は、セルソーターのチップ内に微細な柱状構造３０３が周期的に配置して直接埋め込まれており、マイクロ流路の上流から流れてくる細胞３０１と、ゴミ３０２のうち、ゴミ３０２は、この柱状構造３０３によって捕獲され、下流のマイクロ流路が目詰まりすることを防いでいる。図３ｂは実際に、セルソーターのチップにフィルター部を組み込んだ一例の光学顕微鏡写真である。この写真では、チップ内に直接組み込まれた柱状構造３０４によってゴミ３０５が捕獲されている。このフィルター部の構造は、マイクロ流路の幅に対して十分に広い幅となっており、柱状構造にゴミが捕獲されても、流路の流れが妨げれられることはない。
【００１３】
図４は、セルソーターに組み込まれるゲル電極の構造を示した光学顕微鏡画像である。図４ａは、セルソーターの細胞分離部を拡大して観察したものである。２つのマイクロ流路４０１、４０２に対して、それぞれゲル電極４０３、４０４が配置されている。図４ｂは、実際にゲル電極に蛍光色素を導入して、蛍光顕微鏡で観察したものである。ゲル電極は、微小な連絡穴４０５、４０６によって流路４０１、４０２とつながっている。本実施例の場合、１％(w/v)アガロースをゲル電極として用い、塩化ナトリウムをアガロースに溶解させた電解質として用いた。また、陰極側のｐHを酸性（ｐH６．０）に、陽極側のｐHを塩基性（ｐH８．０）にすることで、電極で発生する気体の発生を抑制することができる。
【００１４】
図５は、実際に電場を印加したときに細胞のセルソーティングがなされる過程を模式的に示した図である。図５ａのように電場を印加しない場合には、流路５０１、５０２それぞれの流れにおいて、流路５０１中を流れている細胞は、そのまま、流路５０１の下流に流れてゆく。他方、図５ｂのように、電場を印加した場合には、流路５０１を流れる細胞は、流路５０２に移動する。
【００１５】
図６は、実際に、セルソーター中で細胞を選択的に2つの流路のいずれかに流した例を示す顕微鏡写真である。図６の１〜３の連続写真は、電場を印加しないとき、細胞が同一のマイクロ流路をそのまま上流から下流に流れてゆく姿を示している。他方、図６の４〜６は、電場を印加することで、細胞が別のマイクロ流路に移動する姿を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のセルソーターの構成の１例を示す模式図である。
【図２】本発明のセルソーターの流路の構成の１例を示す模式図である。
【図３】本発明のセルソーターのフィルター部の構成の１例を示す模式図である。
【図４】本発明のセルソーターの細胞分離部の構成の１例を示す顕微鏡写真を示す。
【図５】本発明のセルソーターのセルソーティングの過程の１例を示す模式図である。
【図６】本発明の細胞分離手順を説明した顕微鏡写真を示す。矢印は細胞を示す。
【符号の説明】
【００１７】
１０１  チップ
１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９  穴
２０１  細胞を含む溶液の注入口
２０２  細胞を含まない溶液の注入口
２０６、２０７  電極用穴
２１１、２１２  細胞取り出し口
２０３  フィルター
２０４、２０５、４０１，４０２、５０１、５０２  マイクロ流路
２０８、２０９  電極（電解質で満たされた空間）
２１０  細胞分離用空間
３０１、３０４  細胞
３０２、３０５  ゴミ
３０３  柱状構造（フィルター）
４０３、４０４  ゲル電極
４０５、４０６  微小な連絡穴
【国際調査報告】
2004101731.tif 000008
2004101731.tif 000009
2004101731.tif 000010
2004101731.tif 000011