(57)【要約】アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）プロモーター、該プロモーターを含むベクター、及び前記プロモーターを含む形質転換体、並びに該形質転換体を使用する、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬のスクリーニング方法を開示する。また、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症のモデル動物として有用な、ＡＧＦノックアウト動物を開示する。更に、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬、並びに／又は創薬標的分子の同定に有用な、ＡＧＦトランスジェニック動物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含み、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、組換えベクター。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含み、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、形質転換体。
【請求項５】
ｉ）請求項４に記載の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び
ｉｉ）アンジオポエチン関連増殖因子プロモーター活性を測定し、試験物質依存的な前記活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の形質転換体が、請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流にレポーター遺伝子を保持し、アンジオポエチン関連増殖因子プロモーター活性を測定する工程がレポーター遺伝子の発現を分析する工程である、請求項５に記載のスクリーニングする方法。
【請求項７】
アンジオポエチン関連増殖因子をコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損していることを特徴とする、非ヒトノックアウト動物。
【請求項８】
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＡＧプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物又はその子孫であって、染色体上に前記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗肥満薬のスクリーニング方法、及び肥満モデル動物、並びにアンジオポエチン関連増殖因子（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；以下、ＡＧＦと称する）のプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】  肥満の有害性は広く知られているにもかかわらず、近年肥満が顕著に増加している。肥満つまり脂肪組織の過剰蓄積が多彩な疾患の原因となっていることは周知の事実であり、疾患としての肥満症を治療対象にすることが提唱されている。肥満によって発症する疾患として、例えば、腰痛、膝関節痛、及び変形性関節症があり、これらの整形外科学的疾患は肥満による体重増加が直接の原因となる。肥満に伴う脂肪の過剰蓄積は、糖尿病、高脂血症、高血圧、又は動脈硬化性疾患の原因となっている。特に内臓脂肪の蓄積がこれらの疾患の発症に関与していることが明らかにされている（非特許文献１）。【０００３】  基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な実施が困難である。また、運動又は食事療法以外の改善方法としては医薬品の使用があり、現時点では、世界的に見ると、シブトラミンとオルリスタットが主に使用されている。しかし、それらの効果は弱く、どちらも副作用の問題がある。日本ではマジンドールのみが認可されているが、適用が高度肥満者に限定されており、投与期間も限定されている（非特許文献２）。【０００４】  社会の近代化に伴い、日本のみならず世界的に糖尿病患者は急増している。特に、患者数の多いＩＩ型糖尿病は、肥満や脂肪の過剰蓄積が発症に関与していることが知られている。ＩＩ型糖尿病の治療としては、肥満症と同様に運動療法と食事療法があるが、継続的な実施が困難であり、医薬品が使用されている。重度の糖尿病患者ではインスリン療法が行なわれている。しかし、インスリン療法には低血糖の副作用が常にある。経口血糖降下薬として、チアゾリジン系薬剤又はスルホニルウレア（ＳＵ）薬等が多く使用されている。しかしながら、チアゾリジン系薬剤には、肝障害・浮腫・心不全という副作用があり、ＳＵ薬には肥満を助長する副作用が危惧され、安全で、体重増加を伴わないインスリン抵抗性改善薬が強く求められている（非特許文献３）。【０００５】  肥満の糖尿病患者の内臓脂肪に多く含まれる肥大化した脂肪細胞からは、インスリン抵抗性を惹起するようなアディポサイトカイン類が産生及び分泌され、近傍の脂肪細胞及び／又は筋細胞に作用して、インスリン抵抗性を引き起こしていると考えられる。このように、脂肪組織は、糖尿病病態では脂肪細胞が肥大化し、インスリン抵抗性を増強する方向に関わる組織へと変化する（非特許文献４及び５）。【０００６】  肥満や糖尿病の原因となる脂肪組織の蓄積に関与する因子としてはレプチンがよく知られている。レプチンは、体重増加抑制ホルモンであり、レプチンを欠失することで食欲が亢進し、エネルギー消費が減少して肥満となることが知られている。このような脂肪組織の蓄積、及び脂肪細胞の肥大化に関与する因子の発見は、肥満症、糖尿病、又は高脂血症等の疾患の治療薬開発に非常に有用である（非特許文献６）。【０００７】  肥満症又は糖尿病の創薬標的分子を同定したり、治療薬を開発するためには、病態に関与する遺伝子の、遺伝子改変マウスの作製とその表現型解析が重要である。レプチン欠損マウスであるｏｂ／ｏｂマウスは、肥満とインスリン抵抗性が生じ、高インスリン血症と軽度の血糖値上昇を示す。レプチン受容体欠損マウスであるｄｂ／ｄｂマウスは、肥満、高インスリン血症、高レプチン血症、及びインスリン血症を生じ重篤な糖尿病状態となる。これらのマウスは何れもレプチン作用不全によって摂食亢進、及び末梢でのエネルギー消費低下が起こり、肥満となり糖尿病を発症した（非特許文献７）。肥満ＩＩ型糖尿病モデルマウスとして、ＫＫＡｙマウスが汎用されている。ＫＫＡｙマウスはインスリン感受性の低下と肥満を伴い、高血糖を発症するため、糖尿病治療薬の開発研究に利用されている。しかし、ＫＫＡｙマウスのこれらの表現型の原因となっている遺伝子は同定されていない（非特許文献８）。肥満や糖尿病には多くの未知の遺伝子が関与していると考えられている（非特許文献９）。従って、疾患関連遺伝子を見つけ、遺伝子改変マウスを作製して表現型解析することが、肥満症又は糖尿病の医薬品開発、更に、病態解明のために切望されていた。【０００８】  アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）は、Ｎ末端側にコイルドコイル（Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）ドメインを、Ｃ末端側にフィブリノーゲン様（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｌｉｋｅ）ドメインを持つ分泌タンパク質である。ＡＧＦは特許文献１で報告されたＮＬ８と同一であり、ＮＬ８をＣＨＯ細胞に安定発現させて、ヌードマウスに皮下移植すると、ＣＨＯが腫瘍形成能を持つようになることが報告されている。また、ＡＧＦと同一又は類似の配列が、特許文献２〜１６に記載されている。これらの文献には、発現分布（特許文献４及び特許文献５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）刺激による増殖阻害活性（特許文献５）、又は増殖因子処理したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における過剰発現の検出（特許文献６及び特許文献７）が示されており、血管組織等での発現、腫瘍形成能、及び／又はファミリー分子との相同性から、ＡＧＦと同一又は類似のアミノ酸配列からなるポリペプチドが血管新生に関与すると記載されている。
非特許文献１０には、Ｋ１４プロモーターを用いて表皮細胞にＡＧＦを強制発現させたトランスジェニックマウスでは過剰な血管新生が起こっており、皮膚の微細血管が増加、ケラチノサイトの増殖が活性化されたことが示されている。非特許文献１１には、ＡＧＦは表皮細胞の増殖活性があることが記載されている。【０００９】  ＡＧＦレセプターは同定されていないことから、内在性のＡＧＦが作用する組織が不明であり、前記以外のＡＧＦの生理機能に関しては何ら知見がなかった。ＡＧＦの抗肥満、抗糖尿病、又は抗高脂血症の作用に関しても、全く知られてなかった。一方、ＡＧＦプロモーター領域に関する報告はこれまでになかった。【００１０】
【非特許文献１】「メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」，（米国），１９８７年，３６巻，ｐ．５４−５９
【非特許文献２】「日本臨床」，２００３年，６１巻，増刊号６，肥満症，ｐ．６４９−６５４
【非特許文献３】「日本臨床」，２００２年，６０巻，増刊号９，新時代の糖尿病学３，ｐ．３１０−３３１
【非特許文献４】「医学のあゆみ」，２０００年，１９２巻，ｐ．５１３−５１８
【非特許文献５】「医学のあゆみ」，２０００年，１９２巻，ｐ．５４１−５４５
【非特許文献６】「トレンズ・イン・モレキュラー・メディスン（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，（オランダ），２００２年，８巻，９号，ｐ．４４２−４４７
【非特許文献７】ケージーエムエム・アルベルティ、ポール・ズィミット、及びアールエー・デフロンゾ（Ｋ．Ｇ．Ｍ．Ｍ．Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｐａｕｌ  Ｚｉｍｍｅｔ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．ＤｅＦｒｏｎｚｏ）編，シージェー・ベイリー（Ｃ．Ｊ．Ｂａｉｌｅｙ）著，「インターナショナル・テキストブック・オブ・ダイアビーティーズ・メリタス（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ  ＯＦＤＩＡＢＥＴＥＳ  ＭＥＬＬＩＴＵＳ）」，第２版，（米国），ジョン・ワイリー・アンド・ソンズ・インク（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），１９９７年，ｐ．２３．１−２３．２５
【非特許文献８】「日本臨床」，２００２年，６０巻，増刊号１８，ｐ３８−４４
【非特許文献９】「最新医学」，２００２年，５７巻，３月増刊号，ｐ５３６−５４４
【非特許文献１０】「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」，（米国），２００２年１１月５日，１０６巻，１９号，ｐ．ＩＩ−２７６−２７７
【非特許文献１１】血管新生・抑制因子２種−癌増殖・転移防止，「日刊工業新聞」，２００２月１０月２日，ｐ．５
【特許文献１】国際公開第９９／１５６５３号パンフレット
【特許文献２】特開２０００−３００２６３号公報
【特許文献３】特表２００１−５１７４３７号公報
【特許文献４】国際公開第００／３２２２１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第００／５３７５３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０２／００６９０号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０２／０８２８４号パンフレット
【特許文献８】米国特許出願公開第２００３／０１０５０１１号明細書
【特許文献９】米国特許出願公開第２００３／０１０５０１２号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００３／０１０５０１３号明細書
【特許文献１１】米国特許第５９７２３３８号明細書
【特許文献１２】米国特許第６０５７４３５号明細書
【特許文献１３】米国特許第６３５０４５０号明細書
【特許文献１４】米国特許第６４１３７７０号明細書
【特許文献１５】米国特許第６３６８８５３号明細書
【特許文献１６】米国特許第６４２０５４２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  本発明の課題は、抗肥満薬のスクリーニング方法及び肥満モデル動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明者らは鋭意検討した結果、ＡＧＦノックアウト（ＫＯ）マウス及びＡＧＦトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの解析から、ＡＧＦを亢進する物質は抗肥満、抗糖尿、及び／又は抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。すなわち、ＡＧＦノックアウトマウスが顕著な肥満を示すことを見出し、前記マウスが肥満モデル動物になることを見出した（実施例４）。ＡＧＦノックアウトマウスは脂肪組織の重量が増加しており（実施例５）、脂肪細胞が肥大化（実施例６）、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量が増加することを見出した（実施例７）。一方、ＡＧＦトランスジェニックマウス（ＡＧＦを強制発現したマウス）は体重増加が抑制されており（実施例４）、脂肪組織の重量増加が抑制され（実施例５）、脂肪細胞の肥大化は抑制（実施例６）、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量は減少（実施例７）することを見出した。更に、ＡＧＦノックアウトマウスは糖負荷試験により糖尿病症状を示した（実施例８）。これらの知見から、ＡＧＦを亢進する物質は抗肥満、抗糖尿、及び／又は抗高脂血症の作用を有することを明らかにした。【００１３】  更に、本発明者らは、様々な長さのヒトＡＧＦ遺伝子上流配列を取得し試行錯誤した結果、約４００ｂｐ〜約３ｋｂｐの配列ではプロモーター活性を示さなかったにもかかわらず、予想外に約３００ｂｐという短い配列のみがプロモーター活性を有することを見出した。また、前記プロモーター活性を有するＤＮＡを利用したＡＧＦの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法を構築した。前記知見からＡＧＦの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法が抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬をスクリーニングする方法として利用することができることを見出した。
これらの知見により、ＡＧＦノックアウトマウス、ＡＧＦトランスジェニックマウス、ＡＧＦプロモーター、及びＡＧＦ亢進物質をスクリーニングする方法を提供し、本発明を完成させた。【００１４】  すなわち、本発明は、
［１］（ａ）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列において、１〜１０個の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列との相同性が９０％以上である塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、
［２］配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、
［３］［１］又は［２］に記載のＤＮＡを含み、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、組換えベクター、
［４］［１］又は［２］に記載のＤＮＡを含み、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有することを特徴とする、形質転換体、
［５］ｉ）［４］に記載の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び
ｉｉ）アンジオポエチン関連増殖因子プロモーター活性を測定し、試験物質依存的な前記活性の変化を分析する工程
を含むことを特徴とする、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングする方法、
［６］［４］に記載の形質転換体が、［１］又は［２］に記載のＤＮＡの下流にレポーター遺伝子を保持し、アンジオポエチン関連増殖因子プロモーター活性を測定する工程がレポーター遺伝子の発現を分析する工程である、［５］に記載のスクリーニングする方法、
［７］アンジオポエチン関連増殖因子をコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損していることを特徴とする、非ヒトノックアウト動物、並びに
［８］（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＣＡＧプロモーターと共に導入した全能性細胞を個体発生して得られる非ヒト動物又はその子孫であって、染色体上に前記ポリヌクレオチドを保有し、体細胞において前記ポリペプチドを発現することを特徴とする、非ヒトトランスジェニック動物
に関する。【００１５】  また、ＡＧＦのｃＤＮＡの上流にＣＡＧプロモーターを連結させたＤＮＡコンストラクトをＥＳ（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ）細胞に導入する工程、ＡＧＦが導入されたクローンを選択する工程、選択したクローンを胚盤胞へ導入する工程、該操作卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）の子宮へ移植する工程、及び該非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）を飼育し、生まれた仔からＡＧＦをコードする、導入したＤＮＡをゲノム中に有する個体を選択する工程を含む、非ヒトトランスジェニック動物（好ましくはマウス）の作製方法も本発明に含まれる。
更に、ＡＧＦ遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）を含むゲノム配列において、その一部を薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）と置換したＤＮＡコンストラクトをＥＳ細胞に導入する工程、該細胞を薬剤（例えば、Ｇ４１８）の存在下で培養し薬剤耐性株を選択する工程、該薬剤耐性株を胚盤胞へ導入する工程、該操作卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物（好ましくはマウス）の子宮へ移植する工程、生まれたキメラ動物（好ましくはマウス）を正常動物（好ましくはマウス）と交配させることによりヘテロ接合体動物（好ましくはマウス）を得る工程、及び得られたヘテロ接合体マウス同士を交配させてホモ接合体動物（好ましくはマウス）を得る工程を含む、非ヒトノックアウト動物（好ましくはマウス）の作製方法も本発明に含まれる。【００１６】  本明細書において、用語「トランスジェニック動物」は、プロモーター及び遺伝子を染色体に導入して、遺伝子を所望の個所で強制発現させた動物を意味し、用語「ノックアウト動物」は、染色体に遺伝子操作することで特定の遺伝子の発現を欠失させた動物を意味するものとして使用する。【００１７】  本発明のトランスジェニック動物作製に用いることのできる配列番号３又は配列番号５に記載のアミノ酸配列であるヒト又はマウスＡＧＦと同一又は相同性のあるポリペプチドが、特許文献１〜１６に記載されている。これらの文献中には、血管組織等での発現、腫瘍形成能、及び／又はファミリー分子との相同性から、配列番号３又は配列番号５に記載のアミノ酸配列であるヒト又はマウスＡＧＦと同一又は相同性のあるポリペプチドが血管新生に関与すると記載されている。特許文献４〜９には、多数列挙された疾患に糖尿病が含まれるが、何ら具体的裏付けはなく、根拠のない記載である。また、非特許文献１０には、Ｋ１４プロモーターを用いて表皮細胞にＡＧＦを強制発現させたトランスジェニックマウスの機能解析が示され、非特許文献１１には、ＡＧＦは表皮細胞の増殖活性があることが記載されている。ＡＧＦをＫ１４プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジェニックマウス等を用いて、ＡＧＦに、血管新生活性、表皮細胞増殖活性、軟骨細胞増殖活性、創傷治癒促進活性、及び組織再生活性があることが、本願優先日後に公開された国際公開第０３／０８３１１４号パンフレット（特許文献１７）及び「プロシディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイティッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，（米国），２００３年，１００巻，ｐ．９４９４−９４９９（非特許文献１２）に示されている。しかしながら、ＡＧＦレセプターは同定されていないことから、内在性のＡＧＦが作用する組織が不明であり、前記以外のＡＧＦの生理機能に関しては何ら知見がなかった。ＡＧＦの抗肥満又は抗高脂血症の作用に関しても、全く知られていなかった。【００１８】  一方、配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列を含む１２９０４８塩基長の配��が配列データベースＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣ０２０９３１に収載されている。しかしながら、該配列がＡＧＦプロモーター活性を有するという記載はおろか、該配列の活性又は用途は全く記載されていない。【００１９】  Ｋ１４プロモーターを用いて表皮細胞に強制発現させたトランスジェニックマウスに関する報告はあるが（非特許文献１０、非特許文献１２、及び特許文献１７）、ＡＧＦノックアウト動物及びＡＧＦを全身性に発現するトランスジェニック動物を作製し、機能解析した報告はこれまでになかった。【００２０】  本発明者らは、ＡＧＦノックアウトマウス及び全身性にＡＧＦを過剰発現するＡＧＦトランスジェニックマウスを初めて作製し、意外にもＡＧＦノックアウトマウスが肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症のモデル動物として有用であること、全身性にＡＧＦを過剰発現するＡＧＦトランスジェニックマウスが肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬並びに創薬標的分子の同定に有用であることを見出した。【００２１】  更に、本発明者らは、ＡＧＦノックアウトマウス及びＡＧＦを全身性に発現するトランスジェニックマウスの解析から、ＡＧＦ又はＡＧＦを亢進する物質が抗肥満、抗糖尿、及び／又は抗高脂血症の作用を有することを初めて明らかにした。ＡＧＦプロモーター活性を有するＡＧＦ遺伝子上流配列を初めて取得し、該配列を利用したＡＧＦの発現を亢進する物質をスクリーニングする方法を構築した。すなわち、ＡＧＦ非ヒトノックアウト動物、ＡＧＦ非ヒトトランスジェニック動物及びＡＧＦプロモーター並びにＡＧＦ亢進物質（すなわち抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬）をスクリーニングする方法は本発明者らによって初めて提供されたものである。
【発明の効果】
【００２２】  本発明のＡＧＦプロモーターによれば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬のスクリーニング系を提供することができる。
本発明のスクリーニング方法により得られるＡＧＦの発現を亢進する物質は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬の有効成分として有用である。
本発明の非ヒトＡＧＦノックアウト動物は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症のモデル動物として有用である。
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬、並びに／又は創薬標的分子を同定することに使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】［１］本発明のＤＮＡ、組換えベクター、及び形質転換体
本発明者らは、ヒトゲノムライブラリーを用いてｈＡＧＦ遺伝子上流の部分配列約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約６００ｂｐ、約８００ｂｐ、約１ｋｂｐ、約１．３ｋｂｐ、及び約３ｋｂｐを得て、それらの塩基配列を決定した（配列番号１で表される塩基配列における２７９０番〜３００１番、２７０５番〜３００１番、２６０４番〜３００１番、２４０６番〜３００１番、２２０６番〜３００１番、２０２１番〜３００１番、１６４０番〜３００１番、及び１番〜３００１番の塩基からなる各配列）。これらのＤＮＡ断片を適当なプラスミド、具体的には、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＧＶ−Ｂ２内にサブクローニングした。これらの融合プラスミドのレポーター遺伝子の発現、すなわち、活性によりルシフェラーゼの発現を検出することによって、得られた上流ＤＮＡ領域がプロモーター活性を有しているかを確認した。この結果、約４００ｂｐ〜約３ｋｂｐの長さのＤＮＡはプロモーター活性を有していなかったが、予想外にもそれより短い約３００ｂｐのＤＮＡがプロモーター活性を有していることを見出した。更に、約３００ｂｐよりも短い約２００ｂｐのＤＮＡはプロモーター活性を有していないことを見出した。前記約３００ｂｐのＤＮＡを使用することによりＡＧＦプロモーター活性を調節する物質のスクリーニングが可能であり、ＡＧＦプロモーター活性を調節する物質、すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬の探索を行うことができる。【００２４】  本発明のＤＮＡには、例えば、
１）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるＤＮＡ、
２）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡ、
３）配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列との相同性が９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上）である塩基配列からなり、かつアンジオポエチン関連増殖因子のプロモーター活性を有するＤＮＡが含まれる。【００２５】  本明細書において「アンジオポエチン関連増殖因子（ＡＧＦ）プロモーター活性」とは、ＡＧＦ遺伝子のプロモーター活性を意味し、より具体的には、配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるＤＮＡの有するプロモーター活性を意味する。或るＤＮＡが「ＡＧＦプロモーター活性」を有するか否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、既知の通常の方法、例えば、前記ＤＮＡの３’下流に適当なレポーター遺伝子ＤＮＡを連結させ、これを有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例１２に記載の方法で確認することができる。【００２６】  本発明のＤＮＡは下記の方法で製造することができるが、これらの方法に限定されない。
（１）ＰＣＲ法を用いた製造
配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列の５’側に該当する塩基配列からなるプライマーと３’側の配列の相補鎖に該当する塩基配列からなるプライマー、好ましくは配列番号４７及び配列番号４６で表される塩基配列からなるプライマーセットを合成し、これらのプライマーとヒトゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるＤＮＡを製造することができる。ヒトゲノムＤＮＡは、通常用いられる方法によりヒトの適当な組織から調製することができる。あるいは、市販品を用いることができる。本発明のＤＮＡは、より具体的には実施例１１に記載の方法で製造することができるが、この方法に限定されず、例えば、用いるプライマーは配列番号４７及び配列番号４６とは異なる制限酵素認識部位を付加することもでき、異なる長さの物を用いることもできる。【００２７】（２）ＤＮＡ合成を用いた製造
配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列の一部分に該当する配列及びその相補鎖を、何本かに分割して化学合成法によって製造し、これらのＤＮＡ断片を結合することによっても製造できる。各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ合成機［例えば、Ｏｌｉｇｏ  １０００Ｍ  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）、あるいは、３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）など］を用いて合成することができる。【００２８】  当業者であれば、天然型に存在するプロモーター配列の塩基配列の一部を他の塩基への置換や塩基の欠失、及び／又は付加などの改変により、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡを調製することが可能である。このように天然型の塩基配列において塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入した塩基配列を有し、天然型のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有するＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。塩基の改変は、例えば、制限酵素又はＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）］、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、あるいは、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ］。【００２９】  上述のように製造したＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、既知の通常の方法、例えば前記ＤＮＡの３’下流に適当なレポーター遺伝子ＤＮＡを連結させ、これを有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例１２に記載の方法で確認することができる。【００３０】  本発明の組換えベクターは、目的に応じ適宜選択したベクターに、本発明のＤＮＡを組み込むことにより製造することができる。ベクターにおいては、発現させる目的の構造遺伝子を含むＤＮＡは本発明のＤＮＡの３’下流に挿入することができる。ここで、構造遺伝子とは、タンパク質をコードしているＤＮＡであれば特に限定されるものではなく、ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）の全部であっても一部であっても良い。例えば、実施例１１に記載したように、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を組み込んだベクターに本発明のＤＮＡ（すなわちＡＧＦプロモーター活性を有するＤＮＡ）を組み込んで製造することが好ましい。「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、又はクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）等が挙げられる。好ましくは実施例１１に記載の方法により製造することができる。���造した組換えベクターがＡＧＦプロモーター活性を有するか否かは、既知の通常の方法に従って確認することができ、具体的には、組換えベクターを有核細胞（好ましくは動物細胞株）に導入して培養し、前記細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例１２に記載の方法で確認することができる。【００３１】  本発明の形質転換体は、目的に応じ適宜選択した宿主細胞に、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターを導入することにより製造することができる。例えば、ｈＡＧＦプロモーター活性を調節する物質のスクリーニング系構築を目的とする場合には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、又はラットなど）由来の細胞、より好ましくはヒト由来の細胞を用いることができる。細胞株としては、通常の細胞内に存在する転写制御因子等を有する細胞であればよく、より具体的には、例えば、市販されている２９３ＥＢＮＡ、ＨＴ−１０８０、又はＨｅｐＧ２などを用いることができる。【００３２】  宿主細胞への導入方法としては、以下に限定されないが、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，１２９５−１３０８］、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法［Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｄ，Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７］、ＦｕＧＥＮＥ６（日本ロシュ社製）を用いた方法、又は電気パルス穿孔法［Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５］等が挙げられる。【００３３】  製造した形質転換体がＡＧＦプロモーター活性を有するか否かは、細胞内のレポーター遺伝子の発現量を測定することにより確認することができる。より具体的には、実施例１２に記載の方法で確認することができる。本発明のＤＮＡを含まない組換えベクターを導入した場合と比較することによって、ＡＧＦプロモーター活性を有する形質転換体を選択することができる。【００３４】［２］本発明のスクリーニング方法
後述の実施例４〜実施例１０に示すように、ＡＧＦは抗肥満、抗糖尿、及び／又は抗高脂血症の作用を有する。従って、ＡＧＦプロモーター活性を促進する物質をスクリーニングすることにより、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症に有効な物質を取得することができる。
具体的には、ｉ）本発明の形質転換体に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）ｈＡＧＦプロモーター活性を測定し、試験物質依存的な前記活性の変化を分析（検出又は測定）する工程を含むことを特徴とする、本発明のスクリーニング方法により、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。
より好ましくは、ｉ）本発明のＤＮＡ（好ましくは、配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるｈＡＧＦプロモーター領域）と融合されたレポーター遺伝子により形質転換された細胞に試験物質を接触させる工程、及び、ｉｉ）レポーター遺伝子の発現を指標として試験物質依存的なレポーター活性の変化を分析する工程を含むことを特徴とする、本発明のスクリーニング方法により、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。【００３５】  レポーター遺伝子アッセイ（田村ら、転写因子研究法、羊土社、１９９３年）は、レポーター遺伝子の発現をマーカーとして遺伝子の発現調節を分析（検出又は測定）する方法である。一般に遺伝子の発現調節はその５’上流域に存在するプロモーター領域と呼ばれる部分で制御されており、転写段階での遺伝子発現量はこのプロモーターの活性を測定することで推測することができる。試験物質がプロモーターを活性化すれば、プロモーター領域の下流に配置されたレポーター遺伝子の転写を活性化する。このようにプロモーター活性化作用すなわち発現亢進作用をレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。従って、ＡＧＦプロモーター領域を用いたレポーター遺伝子アッセイにより、ＡＧＦの発現調節に対する試験物質の作用はレポーター遺伝子の発現に置き換えて検出することができる。本発明のＤＮＡ（好ましくは配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列からなるｈＡＧＦのプロモーター領域）と融合される「レポーター遺伝子」は、一般に用いられるものであれば特に限定されないが、定量的測定が容易な酵素遺伝子などが好ましい。例えば、バクテリアトランスポゾン由来のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）、ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、又はクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）等が挙げられる。レポーター遺伝子は、本発明のＤＮＡ（好ましくは配列番号１の第２７０５番目〜３００１番目で表される塩基配列からなるｈＡＧＦのプロモーター領域）と機能的に融合されていればよい。本発明のＤＮＡ（好ましくはｈＡＧＦのプロモーター領域）と融合されたレポーター遺伝子を細胞（例えば、動物細胞又は酵母）に安定あるいは一過性に発現させる。ついで形質転換された細胞に試験物質を培養液中で接触した場合と接触しなかった場合のレポーター遺伝子の発現量を比較することにより、試験物質依存的なプロモーター活性の変化を分析することができる。【００３６】  形質転換細胞の作製方法は前記［１］に記載のものを用いることができる。また、レポーター遺伝子の発現量の解析方法としては、前記レポーター遺伝子がコードするタンパク質により適宜選択される。例えば、レポーター遺伝子が蛍光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする場合、導入細胞を適当な方法により溶解し、この細胞溶解液の上清中に基質となるルシフェリンを添加した後、適当な蛍光検出器（例えば、ＭＬ３０００；ダイナテックラボラトリーズ社等）を用いて蛍光を測定し、レポーター遺伝子の発現量とすることができる。また、こ��反応は適当な市販の検出キット、具体的には、例えば、ルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）等を用いて行うこともできる。【００３７】  前記工程を実施することにより、ＡＧＦの発現を亢進する物質、すなわち、抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬のスクリーニングを実施することができる。具体的なスクリーニング法としては、実施例１２に記載の方法が好ましく、プロモーター活性を促進する物質としては、化合物無添加時の１．５倍以上のプロモーター活性化能を有する物質を選択することが好ましい。【００３８】  本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔら，Ｊ．Ｓｔｅｅｌｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，第５１巻，第８１３５−８１７３頁，１９９５年）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。【００３９】［３］本発明の非ヒトノックアウト動物及び非ヒトトランスジェニック動物
本発明の非ヒトノックアウト動物は、ＡＧＦをコードするポリヌクレオチドの遺伝子機能が染色体上で欠損している限り、特に限定されるものではなく、ノックアウト動物の製造において一般に使用される方法［例えば、『最新動物細胞実験マニュアル』ＬＩＣ発行，第７章第３６１〜４０８頁（１９９０）等参照］に従って、ＡＧＦ遺伝子のＯＲＦを含むゲノム配列又はＡＧＦ遺伝子の周辺の配列を含むゲノム配列を利用し、作製することができる。前記ゲノム配列としては、作製する動物（種）に応じた配列を利用することができ、例えば、マウスの場合、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号ＡＣ０７３７７５．２の配列を利用することができる。又は、ランダムミュータジェネシスの方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３９２，６０８−６１１，１９９８参照）によって作製されたマウスから、ＡＧＦ遺伝子機能が欠損したマウスを選択することで、ＡＧＦノックアウト動物を得ることもできる。【００４０】  本発明の非ヒトノックアウト動物は、具体的には、例えば、実施例１に記載の方法に従って作製することができる。すなわち、ＡＧＦ遺伝子のＯＲＦを含むゲノム配列において、その一部を薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）と置換したＤＮＡコンストラクトを作製し、得られたＤＮＡコンストラクトをＥＳ細胞へ導入し、適当な薬剤（例えば、Ｇ４１８）の存在下で培養することにより、耐性株を取得する。続いて、例えば、サザンブロット解析により、所望の相同組換えが起きているクローンを選択し、それを胚盤胞へマイクロインジェクションし、その操作卵を子宮へ移植することにより、キメラマウスを出産させることができる。前記キメラマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロ接合体マウスを得る。更に、得られたヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、メンデルの法則に従いホモ接合体マウスが得られる。【００４１】  ＥＳ細胞を用いず、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法；米国特許第４，８７３，１９１号公報）、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し卵に感染させる方法、あるいは、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法［Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５７（５）：７１７−７２３（１９８９）］等も公知であり、本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジェニック動物）の作製に当たって利用することができる。【００４２】  本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジェニック動物）は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作製することができる。具体的には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、又はウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたノックアウト動物が作り出されており、本発明の非ヒトノックアウト動物もこれらの種を含む。本発明の非ヒトノックアウト動物（又は後述の本発明の非ヒトトランスジェニック動物）としては、げっ歯類が好ましく、特にマウスが好ましい。【００４３】  本発明の非ヒトノックアウト動物は、実施例���示すように、顕著な肥満を示し（実施例４）、脂肪組織の重量が増加しており（実施例５）、脂肪細胞が肥大化し（実施例６）、骨格筋及び肝臓組織中トリグリセリド量が増加し（実施例７）、糖負荷試験により糖尿病症状を示す（実施例８）。このような表現型は、肥満者、糖尿病患者、又は高脂血症患者の症状と類似していることから、本発明の非ヒトノックアウト動物は肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症のモデル動物として有用である。すなわち、本発明の非ヒトノックアウト動物は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症等の治療又は予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、これらの疾患のメカニズムの解明、及びスクリーニングされた医薬品の安全性試験にも使用することができる。ＡＧＦ非ヒトノックアウト動物の肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症モデル動物としての使用も本発明に含まれる。【００４４】  本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、導入遺伝子として、下記（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド、並びに
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列との相同性が９５％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチド
からなる群から選んだポリペプチド（以下、トランスジェニック動物作製用ポリペプチドと称する）をコードするポリヌクレオチドを、ＣＡＧ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ＣＭＶ−ＩＥ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）プロモーター［ＧＥＮＥ，１０８（１９９１）１９３−２００］が連結された状態で用いること以外は、本発明の非ヒトノックアウト動物と同様にして作製することができる。【００４５】  前記トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとしては、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列からなるヒトＡＧＦ、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列からなるマウスＡＧＦが好ましい。【００４６】  配列番号３で表されるアミノ酸配列は、ヒトＡＧＦ前駆体のアミノ酸配列である。ヒトＡＧＦは、Ｎ末端にシグナル配列（−２０〜−１）を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列からなるヒト成熟ＡＧＦが、生理活性を有する。
同様に、配列番号５で表されるアミノ酸配列は、マウスＡＧＦ前駆体のアミノ酸配列である。マウスＡＧＦは、Ｎ末端にシグナル配列（−２４〜−１）を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列からなるマウス成熟ＡＧＦが、生理活性を有する。【００４７】  トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリペプチド（ｂ）、すなわち、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列において、１〜１０個（例えば、１〜数個）のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドとしては、前記各配列において、好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドを挙げることができる。【００４８】  ポリペプチドの機能を維持するために、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、以下に示すような各グループに属するアミノ酸は、そのグループ内で互いに似た性質を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸をグループ内の他のアミノ酸に置換しても、タンパク質の本質的な機能は損なわれないことが多い。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプチドの機能を保持しつつアミノ酸配列を変換するための手法として公知である。
非極性アミノ酸：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐ
非荷電性アミノ酸：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ
酸性アミノ酸：Ａｓｐ及びＧｌｕ
塩基性アミノ酸：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓ【００４９】  或るポリペプチドが体重増加抑制活性を有するか否かの判定方法は、特に限定されるものではないが、例えば、実施例４に記載の方法によって確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードする遺伝子を用いて作製したトランスジェニック動物を、標準食又は高脂肪食で飼育し、その体重変動を野生型動物と比較することによって確認することができる。【００５０】  トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリペプチド（ｃ）における「ストリンジェントな条件」としては、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ）液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、４０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、３７℃オーバーナイト」程度の条件であり、より厳しい条件としては「５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハート液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」程度の条件である。また、洗浄のための条件として、緩い条件としては「５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、４２℃」であり、通常の条件として「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。なお、５ＸＳＳＰＥの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．７５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、及び５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡであり、５ＸＳＳＣの組成は、０．７５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ及び７５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）である。【００５１】  トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとして用いることのできる前記ポリペプチド（ｄ）における前記相同性は、少なくとも９５％以上であるが、９７％以上の相同性を示すことが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版、バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂ１２ｓｅｑプログラム［Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）］を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ  アラインメント  パラメーターとして、プログラム名ｂｌａｓｔｐ、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を０、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を０、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとしてＳＥＧ、ＭａｔｒｉｘとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用することができる。【００５２】  トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとしては、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のＮ末端側にシグナル配列を含むものが好ましい。シグナル配列としては、ポリペプチドの膜通過を先導する配列であれば限定されず、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８（３），９２３−９３０，１９８９に記載のシグナル配列を用いることができる。より好ましくは、前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のＮ末端側に、配列番号３で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列（−２０〜−１）又は配列番号５で表されるアミノ酸配列におけるシグナル配列（−２４〜−１）を含むものが好ましく、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号５で表されるアミノ酸配列が最も好ましい。【００５３】  前記トランスジェニック動物作製用ポリペプチドの起源は、ヒト又はマウスに限定されない。前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）のいずれかに該当する限り、例えば、ヒト又はマウス以外の生物由来のポリペプチドも、また、配列番号３で表されるアミノ酸配列における１番〜４５０番のアミノ酸からなる配列、又は配列番号５で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列を基にして、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも、トランスジェニック動物作製用ポリペプチドとして用いることができる。【００５４】  前記ポリペプチド（ａ）〜（ｄ）をコードするポリヌクレオチド、すなわち、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いることのできるポリヌクレオチドには、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、ＤＮＡであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列における６１番〜１４１０番の塩基からなる配列、又は配列番号４で表される塩基配列における７３番〜１３７１番の塩基からなる配列を含み、かつ体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。好ましくは、配列番号２で表される塩基配列又は配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号２で表される塩基配列における６１番〜１４１０番の塩基からなる配列、又は配列番号４で表される塩基配列における７３番〜１３７１番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドである。【００５５】  本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、具体的には、例えば、実施例２に記載の方法に従って作製することができる。すなわち、ＡＧＦのｃＤＮＡの上流にＣＡＧプロモーターを連結させたＤＮＡコンストラクトを作製し、得られたＤＮＡコンストラクトをＥＳ細胞へ導入し、例えば、ウエスタンブロット解析によりＡＧＦが発現しているクローンを選択し、それを胚盤胞へマイクロインジェクションし、その操作卵を子宮へ移植することにより、キメラマウスを出産させることができる。前記キメラマウスを正常マウスと交配させることによりトランスジェニックマウスを得ることができる。【００５６】  本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬、並びに／又は創薬標的分子を同定することに使用することができる。より具体的には、任意の遺伝子Ｘを改変した動物（例えば、マウス）と、本発明の非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ＡＧＦトランスジェニックマウス）とを交配させることにより、両遺伝子が改変した産仔を作出することができ、その産仔の表現型解析を行うことができる。両遺伝子改変動物に抗肥満、抗糖尿病、及び／又は抗高脂血症作用がなくなっていた場合、前記遺伝子Ｘに抗肥満、抗糖尿病、及び／又は抗高脂血症作用があることが判り、遺伝子Ｘ及び／又は遺伝子Ｘに対する機能促進剤が肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の治療薬となることが判る。【００５７】  また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物で発現変動��ている遺伝子は、肥満、糖尿病、及び／又は高脂血症の創薬標的分子となり、前記遺伝子又はそのアゴニスト若しくはアンタゴニストは、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬となる。本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、新たな創薬標的分子を同定するための材料（例えば、組織や血液）の供給源として有用である。
【実施例】
【００５８】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９年など）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には、市販品の指示書に従って実施可能である。【００５９】  ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製については、特に断りがない場合は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｈｏｇａｎ，Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｆ．Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｅ．Ｌａｃｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４に従って、ＥＳ細胞を用いたキメラマウス作製については、ＡＬ  Ｊｏｙｎｅｒ：Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ，１９９３又はバイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング  ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，相沢慎一／著，羊土社，１９９４に従って実施可能である。【００６０】《実施例１：ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製》
（１）ターゲッティングベクターの作製
マウスＡＧＦ遺伝子の５’側のゲノム配列（５’ｌｏｎｇ  ａｒｍ）、ｐｇｋプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、マウスＡＧＦ遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎ）２の一部とエクソン３を含むゲノム配列（３’ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ）、及びＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を順にもつターゲッティングベクターを以下の方法で作製した。【００６１】  すなわち、ＷＯ０３／０８３１１４号公報の実施例１と同様に作製したマウスＡＧＦのタンパク質コード領域全長に対応するｃＤＮＡをプローブとして、添付マニュアルに従ってマウスゲノミックライブラリー（Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ，１２９  ＳＶＪ  Ｌｉｂｒａｒｙ；ストラタジーン社）のスクリーニングを行い、約１７．９ｋｂｐの配列（ＡＧＦ遺伝子を含む、ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列ＡＣＯ７３７７５．２の９０６４４〜１０８５４４）を持つファージクローンを単離し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社）にサブクーニングした。このプラスミドクローン（ｐＢＮ２）を制限酵素ＳａｌＩ及びＭｆｅＩで切断することで、約６．２ｋｂｐの５’ロングアーム（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列ＡＣＯ７３７７５．２の９０６６４〜９６９００を含む）を切り出した。また、前記プラスミドｐＢＮ２を鋳型にして、配列番号６（ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧ人工配列）及び配列番号７（ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＴＡＣ人工配列）で表される塩基配列からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、約２．０ｋｂｐの３’ショートアーム（ｍｏｕｓｅ−ｐｕｂ−ｇｅｎｏｍｅ配列ＡＣＯ７３７７５．２の１０５９０３〜１０７９１４を含む）を得た。５’ロングアーム及び３’ショートアームを、それぞれ、プラスミドｐＰＮＴ（Ｃｅｌｌ，１９９１，６５（７），１１５３−１１６３）のＸｈｏＩサイト及びＸｂａＩサイトへ挿入してターゲッティングベクターを完成した。【００６２】（２）相同組み換えＥＳ細胞の取得
得られたターゲッティングベクターを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＥＳ細胞株Ｒ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ  ９０，８４２４−８４２８，１９９３）へ電気穿孔法で導入した。Ｇ４１８を含んだ培地でＥＳ細胞を培養し、耐性株を得た。ＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、相同組み換えのみが起きているクローンをサザンブロット解析によって同定した。具体的には、ＡＧＦのエクソン４とエクソン５を含む、配列番号８（ＧＣＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＣＴＧＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＣＧＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＣＴＣＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＣＴＧＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＴＡＴＴＣＴＧマウス）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＤＮＡを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、野生型の４．６Ｋｂに対して相同組換えでは６．５ＫｂのＤＮＡ断片を検出することができた。【００６３】（３）ＡＧＦ  ＫＯマウスの作製
得られたＥＳ細胞株を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＤＢＡ／２マウス交雑第２代であるＢＤＦ２マウスより得た胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作卵を子宮へ移植した。操作卵を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによって、ＡＧＦの開始コドンを欠失した変異アレルを持つヘテロ接合体マウス（以下、ＡＧＦヘテロＫＯマウスと称する）を得た。ＡＧＦヘテロＫＯマウス同士の交配によってホモ接合体マウス（以下、ＡＧＦホモＫＯマウスと称する）を得た。仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、マウスの遺伝子型を、ＰＣＲによって生じるＤＮＡ断片のサイズによって確かめた。尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（以下、ＴＥ溶液と称する）に溶解した。ネオマイシン耐性遺伝子配列及びターゲッティングによって欠失するゲノム配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ネオマイシン耐性遺伝子）
2004108920.tif 000002
（ゲノムＤＮＡ）
2004108920.tif 000003
【００６４】  得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについて、前記プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＥｘＴａｑ；Ｔａｋａｒａ社）を用いて、９５℃（５分間）の熱変性を行った後、９５℃（１分間）、６０℃（１分間）、及び７２℃（１分間）からなるサイクルを３０サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。変異アレルがある場合は、ネオマイシン耐性遺伝子を検出するＰＣＲにおいて５４５ｂｐのバンドが検出され、野生型アレルがある場合は、マウスＡＧＦエクソン１を含むゲノムＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２２ｂｐのバンドが検出される。これらの結果より、マウスの遺伝子型を判定した。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルのバンドが検出され、野生型アレルのバンドが検出されず、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルのバントと野生型アレルのバンドが共に検出され、野生型マウス［以下、リターメイト（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）ＷＴマウスと称する］では変異アレルのバンドが検出されず、野生型アレルのバンドが検出された。【００６５】  また、前記実施例１（２）のサザンブロット解析を行なうことでも、マウスの遺伝子型を調べた。その結果、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバンドが検出され、ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、変異アレルの６．５ｋｂｐのバントと野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが共に検出され、リターメイトＷＴマウスでは野生型アレルの４．６ｋｂｐのバンドが検出された。【００６６】  更に、ＡＧＦ  ＫＯマウスから採血した血液を３７℃に３０分間静置後、遠心し、その上清から血清を得た。血清をリシス（ｌｙｓｉｓ）バッファー［０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２），１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０％グリセロール，１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ４Ｐ２Ｏ７，０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４，４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８），０．０５ｍｇ／ｍＬアプロチニン，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ，０．１ｍｍｏｌ／Ｌロイペプチン，０．０２５ｍｍｏｌ／ＬペプスタインＡ］で２０倍希釈したものを２×ＳＤＳサンプルバッファーで倍量希釈した。１レーン当たり２０μＬを１０％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行い、ウエスタンブロッティングを行なった。ウエスタンブロッティングは、ブロッキング剤として５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＴＢＳ−Ｔ［２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］を、１次抗体として抗マウスＡＧＦ抗体（ＷＯ０３／０８３１１４号公報）を、２次抗体として抗ラビット抗体（ＡＬＩ３４０４；ＢＩＯ  ＳｏｕｒＣＥ社）を３％ＢＳＡ含有ＴＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈したものを各々使用した。ＡＧＦホモＫＯマウスでは、ＡＧＦのバンドが欠失していることよりＡＧＦの欠損を確認した。【００６７】《実施例２：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの作製》
本実施例では、ＣＡＧ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ＣＭＶ−ＩＥ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）プロモーター［ＧＥＮＥ，１０８（１９９１）１９３−２００］制御下に全身にマウスＡＧＦを強制発現させたＡＧＦトランスジェニックマウス（以下、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと称する）を作製した。プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトに、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、ブラストサイジン遺伝子（ｂｓｒ）、ポリＡシグナル配列（０．５ｋｂ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）を順に挿入したプラスミドを以下の方法で作製した。【００６８】  ＷＯ０３／０８３１１４号公報と同様に作製したマウスＡＧＦ全長ｃＤＮＡを鋳型に、配列番号１３（ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＡＣ人工配列）及び配列番号１４（ＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＡＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＣＧＧＧＴＣ人工配列）で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとしてＰＣＲ（９５℃で１０分間の反応後、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で２分間からなる反応を４５サイクル実施）を行い、得られたＰＣＲ産物をｐＺＥｒＯ−２クローニングベクター（インビトロジェン社）にサブクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（ストラタジーン社）のＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩサイトへ挿入してマウスＡＧＦ全長遺伝子をもつプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦを作製した。次に、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦにＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を導入するために、この遺伝子を持つプラスミドｐＵ−Ｓａｎ（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８：３８７−３９６  １９９９）を制限酵素ＳａｌＩとＢｇｌＩＩで切断してＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ遺伝子を切り出し、ｐＢＳ−ｍＡＧＦのＢｇｌＩＩとＳａｌＩサイトへ挿入し、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列を持つプラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。【００６９】  ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、及びポリＡシグナル配列を持つプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７；２５（４）：８６８−８７２）の、ポリＡシグナルの３’側に、ｌｏｘＰ配列を挿入して、ｂｓｒとｐｏｌｙＡシグナルをｌｏｘ７１配列とｌｏｘＰ配列で挟んだ構造を持つプラスミドを作製した。すなわち、ｌｏｘＰを含むリン酸化（ｋｉｎａｔｉｏｎ）処理した８１ｂｐの断片（配列番号１５：ＧＡＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＴＴＡＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＧＧＴＣＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣ：人工配列）を、制限酵素ＳｍａＩでの切断後ＢＡＰ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理したプラスミドｐＣＡＧｌｏｘ７１ｂｓｒへ挿入し、プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を作製した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｐｘ７１に挿入されたｌｏｘＰ配列を確認するために、Ｔ３プライマー（配列番号１６：ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ）を用いてシークエンシングを行い、挿入したｌｏｘＰ配列を含む領域の塩基配列を調べた。その結果、Ｔ３プライマーで読んだ塩基配列が、前記配列番号１５で表される塩基配列と一致し、ｌｏｘＰとｌｏｘ７１が同じ方向であることを確認した。プラスミドｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１を制限酵素ＳｐｅＩで切断し、得られたＣＡＧプロモーター、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列、及びｌｏｘＰ配列を含む断片を、プラスミドｐＢＳ−ｍＡＧＦ−βｇｅｏのＳｐｅＩサイトへ挿入し、目的のプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏを作製した。得られたプラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を図１に示す。このプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、直鎖ＤＮＡ断片［ＣＡＧプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ｌｏｘ７１配列、ｂｓｒ、ポリＡシグナル配列（ｐＡ）、ｌｏｘ  Ｐ配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（ｐＡ）を含む］を得た。【００７０】  ＴＴ２  ＥＳ細胞［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１４（１）：７０−７６］に電気穿孔法で前記直鎖ＤＮＡ断片を導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。４μｇ／ｍＬブラストサイジン存在下でＥＳ細胞を培養して、遺伝子が導入された細胞を選択し、２０クローンを樹立した。これらの細胞にＣＡＧ−Ｃｒｅベクター（Ｂｌｏｏｄ，１３２６−１３３３，Ｖｏｌ１００，２００２）をサークルのまま電気穿孔法で導入した（０．８Ｖ，３μＦ）。【００７１】  ＣＡＧプロモーターによって発現したＣｒｅリコンビナーゼが、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間の遺伝子を除去すれば、ＡＧＦ及びβ−ｇｅｏがＣＡＧプロモーター活性によって発現する。そこで、β−ｇｅｏ発現クローンを選択するために、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）存在下でＥＳ細胞を培養し、ｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去された遺伝子構造を持つ細胞を選択した。この段階で選ばれた１５クローンの細胞は、ＣＡＧプロモーター（１．７ｋｂ）、ｌｏｘ７１配列、マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列、及びＩＲＥＳ−β−ｇｅｏ−ポリＡ配列（４．５ｋｂ）をもち、ＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているＥＳ細胞となる。ＣＡＧ−Ｃｒｅベクターを導入する前のｌｏｘ７１−ｌｏｘＰ間が除去されていない各クローンのＥＳ細胞をネガティブコントロールとして、選ばれた１５クローンのＥＳ細胞でＡＧＦが発現していることを、実施例１（３）と同様の抗ＡＧＦ抗体を用いたウエスタンブロッティングで確認した。すなわち、ＥＳ細胞をリシスバッファー及び２×ＳＤＳサンプルバッファーで２倍希釈したものをサンプルとしてウエスタンブロッティングを行い、ＡＧＦが発現していることを確認した。ＡＧＦの発現を確認したＥＳ細胞の中から、８−１、８−２、及び９−１の３ラインを選び、これを胚盤胞へマイクロインジェクションし、操作卵を子宮へ移植した。操作卵を移植し妊娠したマウスより、キメラマウスを出産させた。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによってＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているトランスジェニックマウスを得た。トランスジェニックマウスを同定するため、仔マウスの尻尾より単離したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。尻尾をプロテイナーゼＫで処理し、ＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出した。抽出したＤＮＡは、イソプロパノール沈殿及びエタノール沈殿によって回収し、ＴＥ溶液に溶解した。【００７２】  マウスＡＧＦ  ｃＤＮＡ配列及びＬａｃＺ配列に基づいて次の塩基配列からなるプライマーをデザインした。
（ＡＧＦ）
2004108920.tif 000004
（ＬａｃＺ）
2004108920.tif 000005
このプライマーを用いてＰＣＲを行うと、導入遺伝子からは、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲにおいて３２５ｂｐ断片が増幅され、ＬａｃＺを検出するＰＣＲにおいては３２０ｂｐ断片が増幅され、マウスゲノムＤＮＡからはこれらのサイズの断片は増幅されないはずである。前記プライマーを用いて、得られた仔マウス由来ゲノムＤＮＡについてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼ（ＥｘＴａｑ；Ｔａｋａｒａ社）を用いて、９４℃（５分間）熱変性を行った後、９４℃（１分間）、６２℃（１分３０秒間）、及び７２℃（１分３０秒間）からなるサイクルを２８サイクル実施し、更に７２℃（７分間）の伸長反応を行い、増幅される断片のサイズを調べた。その結果、３ラインとも、ＡＧＦ  ｃＤＮＡを検出するＰＣＲ及びＬａｃＺを検出するＰＣＲ共にバンドが確認された。すなわち、３ラインともジャームライントランスミッションを確認し、それぞれＣＡＧプロモーターの制御下にＡＧＦが恒常的に発現しているトランスジェニックマウスであることが確認された。【００７３】《実施例３：ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスのＡＧＦ遺伝子発現》
実施例２で作製したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで、ＡＧＦ遺伝子がどの程度発現しているかを調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及び同腹の野生型マウス（リターメイトＷＴマウス）の白色脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、大脳、小脳、視床下部、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、骨格筋、及び膵臓の各組織よりトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを調製した。市販のＲＮＡ精製試薬（ＲＮｅａｓｙ；キアゲン社）及びＤＮアーゼ（キアゲン社）を用いて総ＲＮＡをＤＮアーゼ処理及びクリーンアップした。ＤＮアーゼ処理した総ＲＮＡ０．５μｇを、スーパースクリプト・ファーストストランドシステム（ＲＴ−ＰＣＲ用）（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用いてｃＤＮＡに変換した。【００７４】  ＡＧＦ及び内部標準の１８ＳリボゾーマルＲＮＡ（１８ＳｒＲＮＡ）の発現量は定量ＰＣＲ法で行なった。定量ＰＣＲは、シークエンスディテクションシステム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、リアルタイムの蛍光量を計測することで測定した。鋳型としてｃＤＮＡを、プライマーとして各遺伝子毎にデザインしたプライマー及びタックマンプローブ（Ｔａｑ  Ｍａｎ  ｐｒｏｂｅ）を使用した。ＡＧＦ遺伝子の発現量測定には、プライマーとして配列番号２１（ＴＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＴマウス）と配列番号２２（ＣＡＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＣＡマウス）を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲを行った。１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現量測定には、プライマーとして配列番号２３（ＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡＧマウス）と配列番号２４（ＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＴマウス）を、タックマンプローブとして配列番号２５（ＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＣＧＡＡＴＧマウス）を用い、ＰＣＲ試薬として市販の試薬（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；アプライドバイオシステムズ社）を使用してＰＣＲを行った。【００７５】  ＰＣＲの反応は、９５℃（１０分間）の初期変性反応を実施した後、９４℃（１５秒間）と６０℃（６０秒間）からなるサイクル反応を４５回繰り返すことにより実施した。遺伝子発現量算出の標準曲線は、上記ｃＤＮＡ又はマウスゲノムＤＮＡを鋳型として用いて同様の反応を行ない、遺伝子の発現量はサンプル間の相対値で算出した。
その結果、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織では、ＷＴマウスの組織に比べてＡＧＦ遺伝子の発現量が上昇していることが判った。特に、骨格筋、ＢＡＴ、心臓での発現上昇が顕著であった。【００７６】《実施例４：遺伝子改変マウスの体重変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの体重変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスをＣ５７ＢＬ／６に２世代戻し交配し、Ｆ２のＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスを得た。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスを標準食（ＣＥ−２；日本クレア社）で通常に飼育した。６週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１５．７ｇ±０．８ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは１７．８ｇ±０．５ｇ（ＳＤ）であり、１２週齢の雌マウスの体重を比較したところ、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは１９．５ｇ±０．７ｇ（ＳＤ）、ＷＴマウスは２３．５ｇ±２．５ｇ（ＳＤ）であり、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が体重が少ないことが判った。【００７７】  次に、同じマウスを引き続き高脂肪食負荷して体重の変動を調べた。高脂肪食（ＨＦＤ−３２；日本クレア社）で通常に１２週間飼育し、体重の変動を調べた。その結果、１２週間での体重増加量が、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスは、７．１ｇ±１ｇ（ＳＤ）であったのに対して、ＷＴマウスは２１．８ｇ±４ｇ（ＳＤ）であった。これらのことより、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは、標準食での体重増加抑制、高脂肪食での顕著な体重増加抑制があることが判り、ＡＧＦに体重増加抑制作用があることが判った。【００７８】（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化
ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスを標準食で通常に飼育した。１週間毎に２４週齢まで各マウスの体重を測定した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、約１２週齢より、ＷＴマウスに比べて体重が重くなり始め、その後も体重増加が続き、顕著な肥満となることが判った。ＡＧＦヘテロＫＯマウスでは、ＡＧＦホモＫＯマウスとリターメイトＷＴマウスの中間的な表現型となった。【００７９】《実施例５：遺伝子改変マウスの臓器重量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの臓器重量変化
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスでは体重増加が抑制されていることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。標準食で飼育した１２週齢のマウスと、高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したマウスで調べた。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓では、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスとＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪（白色脂肪組織）は、標準食飼育及び高脂肪食飼育共に、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの方が、ＷＴマウスよりも体重当たりの組織重量が減少していた。すなわち、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスで体重増加が抑制されていたのは、白色脂肪組織の重量増加が抑制されていたためであることが示された。すなわち、ＡＧＦは、他の臓器重量には何ら影響を与えず、肥満などに伴う脂肪組織重量の増加を抑制する作用があることが判った。白色脂肪組織に関する結果を図３（標準食）及び図４（高脂肪食負荷）に示す。【００８０】（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの臓器重量変化
ＡＧＦ  ＫＯマウスでは体重が増加していることが判ったが、その原因を明らかにするために、臓器の重量を測定した。標準食で飼育した２０週齢雌のＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びリターメイトＷＴマウスの、生殖器脂肪（ＷＡＴ）、褐色脂肪（ＢＡＴ）、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓の各組織を採取し、体重当たりの組織重量を計測した。その結果、褐色脂肪、肝臓、心臓、腎臓、及び脾臓は、ＡＧＦホモＫＯマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＷＴマウスで組織重量の変化はなかった。一方、生殖器脂肪は、ＡＧＦホモＫＯマウスの方が、ＷＴマウスよりも、マウス個体当たり及び体重当たりの組織重量が増加していた。ＡＧＦヘテロＫＯマウスは、ＡＧＦホモＫＯマウスとＷＴマウスの中間的な組織重量となった。すなわち、ＡＧＦ  ＫＯマウスで体重が増加していたのは、生殖器脂肪組織等の白色脂肪組織の重量が増加していたためであることが示された。このことより、ＡＧＦ  ＫＯマウスは、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが明らかとなり、ＡＧＦの生理活性として他の臓器重量には影響を与えずに脂肪組織の重量増加抑制作用があることが明らかとなった。生殖器脂肪組織（白色脂肪組織）に関する結果を図５（白色脂肪組織重量）及び図６（白色脂肪組織重量／体重）に示す。【００８１】《実施例６：遺伝子改変マウスの脂肪細胞形態変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞形態変化
高脂肪食負荷することで白色脂肪組織の重量が増大し、更に脂肪細胞が肥大化することが知られている。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られている（医学のあゆみ，１９２，５１３−５１８，２０００；医学のあゆみ，１９２，５４１−５４５，２０００）ため、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を調べた。高脂肪食で１２週齢〜２４週齢の１２週間飼育したＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液（Ｗａｋｏ）で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシレンーエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図７に示す。リターメイトＷＴマウス（ＮＴＧ）では、脂肪細胞が肥大化していたが、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（ＴＧ）では、脂肪細胞の肥大化が抑制されて、ほぼ正常の大きさに維持されていた。【００８２】（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞形態変化
糖尿病モデルマウスや肥満モデルマウスでは、脂肪組織の重量増大に伴って脂肪細胞が肥大化していることが知られている［Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１４（３），１４１−１４８，１９７８］。脂肪細胞の肥大化は糖尿病の悪性化と関連があることが知られているため、ＡＧＦ  ＫＯマウスの脂肪細胞の形態を調べた。ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの生殖器脂肪組織（ＷＡＴ）及び褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定し、パラフィン包埋後、薄切切片の作製及びヘマトキシレンーエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行なった。結果を図８（ＡＧＦホモＫＯマウス）及び図９（リターメイトＷＴマウス）に示す。リターメイトＷＴマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が正常の大きさであったが、ＡＧＦホモＫＯマウスのＷＡＴは、脂肪細胞が肥大化していることが判った。更に、ＡＧＦホモＫＯマウスではリターメイトＷＴマウスに比べてＢＡＴでの脂肪の蓄積が観察された。【００８３】《実施例７：遺伝子改変マウスの組織中トリグリセリド含量変化》
（１）ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織中トリグリセリド含量変化
肥満では、脂肪組織の増大に加えて、骨格筋や肝臓中でのトリグリセリド（ＴＧ）含量の増加が起きることが知られている（日本臨床、１９９５年、５３巻、１９９５年特別号、肥満症、ｐ３５４−ｐ３５８）。そこでＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（Ｔｇ）及びリターメイトＷＴマウス（ＷＴ）を高脂肪食（ＨＦＤ−３２；日本クレア社）で１箇月間及び３箇月間飼育し、各マウスの骨格筋及び肝臓組織から、クロロホルム−メタノール溶液を用いて、組織中のＴＧを抽出した（生化学実験講座３、脂質の化学、東京化学同人）。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１０（肝臓）及び図１１（骨格筋）に示す。骨格筋と肝臓共にＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスはＷＴマウスに比べて、組織中のＴＧ含量が減少していることが判った。このことより、肥満によって増加することが知られている骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を、ＡＧＦが減少させる活性があることが明らかとなった。【００８４】（２）ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量
ＡＧＦ  ＫＯマウスの骨格筋（腓腹筋）及び肝臓組織中のＴＧ含量を調べた。ＡＧＦ  ＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの骨格筋及び肝臓組織から前記（１）の方法で、組織中のＴＧを抽出した。抽出したＴＧの濃度をキット（トリグリセライドＥテストワコー；和光純薬工業社）を用いて測定し、組織中のＴＧ含量を求めた。結果を図１２に示す。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＷＴマウスに比べて、骨格筋及び肝臓組織中のＴＧ含量が顕著に増加していることが判った。ＡＧＦ  ＫＯマウスはＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスと逆の表現型となることが判り、ＡＧＦの生理活性として、骨格筋や肝臓中のＴＧ含量を減少させる活性があることが明らかとなった。【００８５】《実施例８：ＡＧＦ  ＫＯマウスの血糖値及び血中インスリン濃度変化》
ＡＧＦホモＫＯマウス及びリターメイトＷＴマウスの糖負荷試験を行い、血糖値及び血中インスリン濃度を調べた。マウスを１６時間絶食後、１ｇ／ｋｇのＤ−グルコースを腹腔内注射（ｉｐ）による投与し、投与前、並びに投与後１５、３０、６０、及び１２０分後に眼静脈より採血した。グルテストエース（三和化学研究所）を用いて血糖値を、ＲＩＡ２抗体法（ＳＲＬ社）を用いて血中インスリン濃度を測定した。結果を図１３（血糖値）及び図１４（血清インスリン）に示す。【００８６】  ＷＴマウスは、糖負荷により上昇した血糖値が投与後３０分後から減少し始めるのに対して、ＡＧＦホモＫＯマウスは、糖負荷によって血糖値がより大きく上昇し、投与後６０分後でも血糖値は減少し始めなかった。これらのことより、ＡＧＦホモＫＯマウスでは耐糖能異常が起きていることが判った。血中インスリン濃度は、ＷＴマウスでは、糖負荷によりインスリン濃度が上昇したが、ＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖負荷前から血中インスリン濃度が顕著に高値であり、高インスリン血漿の状態にあることが判った。これらのことより、ＡＧＦ遺伝子を欠失したＡＧＦホモＫＯマウスでは、糖尿病が惹起されることが判り、ＡＧＦに抗糖尿病作用があることが明らかとなった。【００８７】《実施例９：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスの酸素消費量を測定した。酸素消費量測定装置（ＯＸＹＭＡＸ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、絶食下で、マウスの酸素消費量を２４時間に渡り計測した。計測方法は酸素消費量測定装置に添付の取扱説明書に従った。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウス各１４匹の、酸素消費量を計測し、明期の１２時間（７：００〜１９：００）、暗期の１２時間（１９：００〜７：００）、及び２４時間の酸素消費量を求め、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスとＷＴマウス間で比較した。結果を図１５に示す。何れの時間帯においても、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量（ＶＯ２）がＷＴマウスに比較して多いことが判った。この結果、ＡＧＦには酸素消費量を亢進する活性があることがわかった。酸素消費量とエネルギー消費量は相関するので、酸素消費量が亢進することで、抗肥満の作用がある［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４９１（１−２）：１５４−１５８，２００１］。ＡＧＦには酸素消費量を亢進する活性があることが判ったので、ＡＧＦには抗肥満作用があることが裏付けられた。【００８８】《実施例１０：ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織中の遺伝子発現変動》
ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び骨格筋での、ＵＣＰ（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子及びＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子の発現変動を調べた。ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス及びリターメイトＷＴマウスのＢＡＴ及び骨格筋組織から、実施例３と同様の方法で、総ＲＮＡを調製し、ＤＮアーゼ処理後、ｃＤＮＡ合成した。ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−δ、及びβ−アクチンの発現量は定量ＰＣＲ法で行なった。定量ＰＣＲは、実施例３に記載の方法と同様の方法で実施した。各遺伝子の定量ＰＣＲで用いたプライマーとしては表１に記載のプライマーを用いた。また、市販のＰＣＲ試薬として、β−アクチンについてはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を、ＵＣＰ１、ＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δについては、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用した。【００８９】
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【００９０】  その結果、ＣＡＧ−ＡＧＦ  ＴｇマウスのＢＡＴではＵＣＰ１が発現誘導していること、ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの骨格筋ではＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δが発現誘導していることが判った。すなわち、ＡＧＦは、ＢＡＴではＵＣＰ１を発現誘導させ、骨格筋ではＵＣＰ３、ＰＰＡＲ−α、及びＰＰＡＲ−δを発現誘導させることが判った。このことより、ＡＧＦによる熱消費を亢進させるＵＣＰの発現亢進、熱消費や脂質代謝を亢進させるＰＰＡＲの発現亢進が、ＡＧＦによる酸素消費量の亢進、体重増加抑制、及び脂肪組織重量増加抑制等の作用のメカニズムの一つであることが明らかとなった。【００９１】《参考例１：マウスＡＧＦとヒトＡＧＦの発現及び精製》
ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦをＷＯ０３／０８３１１４号公報（実施例１９）に記載の方法に従って発現し、精製した。すなわち、ＰＣＲにより得られた約１．４ｋｂｐ（ヒト）又は約１．３ｋｂｐ（マウス）のＤＮＡ断片をプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｓｉｇｎａｌ−ＦＬＡＧに挿入して得られた発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。ヒトＡＧＦ及びマウスＡＧＦの発現細胞株の培養上清を、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体アガロースアフィニティーゲル（ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ；Ｓｉｇｍａ社）を用いてアフィニティー精製してヒト及びマウスのリコンビナントＡＧＦタンパク質を得た。【００９２】《参考例２：骨格筋分化Ｃ２Ｃ１２細胞へのＡＧＦ刺激による遺伝子発現変動》
Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣより入手）をコンフルエントまで培養後、培養培地を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有のＤＭＥＭから、２．５％ウマ血清含有のＤＭＥＭに置換して、８日間培養を継続し、細胞を骨格筋細胞へ分化させた。骨格筋分化したＣ２Ｃ１２細胞へ、１２時間のスターベーション後、３μｇ／ｍＬのヒト又はマウスＡＧＦリコンビナントタンパク質を添加又は未添加し、添加後、４、８、１２、及び２４時間反応した。ＡＧＦ無刺激及びＡＧＦ刺激した細胞から総ＲＮＡを調製し、ＤＮアーゼ処理後、ｃＤＮＡ合成した。ＰＰＡＲ−α、ＰＧＣ−１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）、及びＣＹＰ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）の遺伝子発現量は、前記実施例１０に記載した方法で定量ＰＣＲを行うことで測定した。定量ＰＣＲには、表１及び表２に記載のプライマーを用いた。また、市販のＰＣＲ試薬として、ＣＹＰについてはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を、ＰＰＡＲ−α及びＰＧＣ−１αについては、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用した。ＬＣＡＤ（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の遺伝子発現量は、市販のアッセイシステム（Ａｓｓａｙ  ｏｎ  ｄｅｍａｎｄ；アプライドバイオシステムズ社）及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を利用して測定した（Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｍｍ００５９９６６０＿ｍｌ）。測定は前記実施例１０に記載した方法に準じて行なったが、プライマー及びＰＣＲ反応液は、前記アッセイシステムで購入した反応液を使用し、添付のプロトコールに従って実施した。【００９３】
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【００９４】  その結果、ヒト又はマウスＡＧＦ刺激により、ＰＰＡＲ−α、ＰＧＣ−１α、及びＬＣＡＤの各遺伝子が発現誘導されることが判った。このことより、ＡＧＦにより、骨格筋細胞で、熱消費の亢進及び脂肪酸酸化の亢進が引き起こされることが判った。ＰＰＡＲ−α及びＰＧＣ−１αが脂質代謝や熱消費を亢進させることが知られている［Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ．１７８（４）：４２５−４３４，２００３；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２４（１）：７８−９０，２００３］。ＡＧＦが、ＰＰＡＲ−α、ＬＣＡＤ、及びＰＧＣ−１αを発現誘導したことから、ＡＧＦには抗肥満作用があることが裏付けられた。【００９５】《実施例１１：ｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域上流配列のクローニング》
（１）ｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域上流の約２００、約３００、約４００、約６００、及び約８００（ｂｐ）のクローニング
ヒトゲノム（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型にし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ｔａｑＴＭ；宝酒造社）を用い、９５℃２分間の後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃１分間のサイクルを４０回、続いて７２℃５分間の条件でＰＣＲを行った。プライマーセットとしては、（配列番号４５、配列番号４６）、（配列番号４７、配列番号４６）、（配列番号４８、配列番号４６）、（配列番号４９、配列番号４６）、及び（配列番号５０、配列番号４６）で表される塩基配列からなる５種類のプライマーセットを用いた。それぞれのプライマーセットを用いて得られた約２００、約３００、約４００、約６００、及び約８００ｂｐの断片をクローニングベクター（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）に各々サブクローニングした。ここで得られた各サブクローンを制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで処理し、配列番号１で表される塩基配列の２７９０番〜３００１番、２７０５番〜３００１番、２６０４番〜３００１番、２４０６番〜３００１番、及び２２０６番〜３００１番で表される各塩基配列を含む断片を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｅｈＩで処理したルシフェラーゼアッセイシステム用ベクターｐＧＶ−Ｂ２（ＰｉｃａＧｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  ２ベーシックベクター；東洋インキ社）に挿入し、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ２００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ４００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ６００（Ｎ６）、及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ８００（Ｎ６）を得た。【００９６】  このようにして、配列番号１で表される塩基配列の２７９０番〜３００１番、２７０５番〜３００１番、２６０４番〜３００１番、２４０６番〜３００１番、及び２２０６番〜３００１番で表される各塩基配列、すなわち、ヒトＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域の上流の約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約６００ｂｐ、及び約８００ｂｐの領域をクローニングし、そのプロモーター活性の測定が可能なプラスミドを作製した。【００９７】（２）ｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域上流の約１ｋ、約１．３ｋ、及び約３ｋ（ｂｐ）のクローニングｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域上流の約１ｋ及び約１．３ｋのクローニングはＰＣＲを用いて行なった。約１ｋｂの領域のクローニングには、フォワードプライマーとして、配列番号５１で表される塩基配列からなるＤＮＡを、リバースプライマーとして、配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡを使用し、約１．３ｋｂの領域のクローニングには、フォワードプライマーとして、配列番号５３で表される塩基配列からなるＤＮＡを、リバースプライマーとして配列番号５２で表される塩基配列からなるＤＮＡを使用した。ヒトゲノム（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型にし、これらのプライマーセット並びにＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ｔａｑＴＭ；宝酒造社）を用い、９５℃２分間の後、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、及び７２℃３分間のサイクルを４５回、続いて７２℃５分間の条件でＰＣＲを行った。得られた約１ｋｂｐ及び１．３ｋｂｐの断片をクローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にサブクローニングした。各サブクローンをＫｐｎＩ及びＮｈｅＩ処理し、得られた断片（すなわち、配列番号１で表される塩基配列の２０２１番〜３０２８番、及び１６４０番〜３０２８番で表される各塩基配列を含む断片）を、ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩ処理したｐＧＶ−Ｂ２に挿入し、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１ｋ（Ｎ４）及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ４）を得た。【００９８】  更に、フォワードプライマーとして配列番号５４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、リバースプライマーとして配列番号５５で表される塩基配列からなるＤＮＡを使用し、ヒトゲノム（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ；クロンテック社）を鋳型にしてＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ｔａｑＴＭ；宝酒造社）を用い、９５℃２分間の後、９４℃３０秒間、６３℃３０秒間、及び７２℃２分３０秒間のサイクルを４５回、続いて７２℃５分間の条件でＰＣＲを行った。【００９９】  得られた約２ｋｂの断片を、クローニングベクター（ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）へサブクローニングした。ここで得られたサブクローンをＫｐｎＩ及びＸｍａＩ処理し、配列番号１で表される塩基配列の１番〜１７６８番で表される塩基配列を含む断片を得た。ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ４）には、ｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域上流配列中とｐＧＶ−Ｂ２ベクターのクローニングサイト中との２箇所にＸｍａＩ制限酵素サイトが存在する。８．７μｇのｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ４）を５ユニットのＸｍａＩ制限酵素で１〜１０分間処理することで、ＸｍａＩが、０、１、又は２箇所切断されたプラスミドを作製した。１箇所のみ切断したプラスミドを電気泳動で分離抽出した。更にＫｐｎＩ処理を行い、電気泳動により６．１ｋｂｐのサイズに分離される断片を得ることで、ｐＧＶ−Ｂ２ベクターのクローニングサイト中のＸｍａＩサイトが切断されず、ｈＡＧＦプロモーター領域の配列中のＸｍａＩサイトのみが切断されたプラスミドを得た。このプラスミドに、先に述べた方法（ＫｐｎＩとＸｍａＩ処理）で得た、配列番号１で表される塩基配列の１番〜１７６８番で表される各塩基配列を含む断片を挿入して、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３ｋ（Ｎ４）を得た。【０１００】  ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ８００（Ｎ６）をＳｎａＢＩ及びＸｂａＩ処理し、約２ｋｂｐの断片（Ｎ６断片）を得た。ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１ｋ（Ｎ２）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ４）、及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３ｋ（Ｎ４）をＳｎａＢＩ及びＸｂａＩ処理して、切り出される約２ｋｂｐの断片を除去した。これらに、Ｎ６断片を挿入することで、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｈＡＧＦｐｒｏ１ｋ（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ６）、及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３ｋ（Ｎ６）を得た。これらのプラスミドは、レポータープラスミド中に、配列番号１で表される塩基配列の２０２１番〜３００１番、１６４０番〜３００１番、及び１番〜３００１番で表されるｈＡＧＦのプロモーター領域の塩基配列をそれぞれ持つ。【０１０１】  このようにして、配列番号１で表される塩基配列の２０２１番〜３００１番、１６４０番〜３００１番、１番〜３００１番で表される塩基配列であるｈＡＧＦ  ｍＲＮＡ転写領域の上流の約１ｋｂｐ、１．���ｋｂｐ、及び約３ｋｂｐの領域をクローニングし、そのプロモーター活性の測定が可能なプラスミドを作製した。【０１０２】《実施例１２：ヒトＡＧＦプロモーター領域ＤＮＡ配列の解析》
ｉ）ｐＧＶ−Ｂ２（空ベクター）、実施例１１で得られたプラスミドｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ２００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ４００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ６００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ８００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１ｋ（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ６）、及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３ｋ（Ｎ６）、並びにｉｉ）β−ｇａｌ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０；アマシャムファルマシアバイオテック社）を、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ−６；日本ロッシュ社）を用い、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養していた２９３ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社）に導入した。通常の培養条件で４８時間培養後のルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット（ＰｉｃａＧｅｎｅ発色キット；東洋インキ社）を用いて測定した。この際、測定値は同時導入したβ−ｇａｌ発現プラスミドより発現したβ−ｇａｌの活性値で補正した。β−ｇａｌ活性の測定は市販の測定キット（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓキット；ロシュ社）を用いた。その結果、約４００ｂｐ〜約３ｋｂｐのＤＮＡを含むプラスミド［ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ４００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ６００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ８００（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１ｋ（Ｎ６）、ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ１．３ｋ（Ｎ６）、及びｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３ｋ（Ｎ６）］を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性の上昇は観察されなかった。意外にも、それらより短い領域である約３００ｂｐのＤＮＡを含むプラスミド［ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３００（Ｎ６）］を導入した細胞では、空ベクターを導入した細胞では認められないルシフェラーゼ活性の明らかな上昇が観察された（図１６）。また、更に短い約２００ｂｐのＤＮＡを含むプラスミド［ｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ２００（Ｎ６）］を導入した細胞では、ルシフェラーゼ活性の上昇は観察されなかった（図１７）。このことは、配列番号１で表される塩基配列の２７０５番〜３００１番で表される約３００ｂｐの領域内にプロモーター活性が存在することを示している。更に、この約３００ｂｐのプロモーター活性を持つ領域の上流の配列中に、プロモーター活性を減弱させるサイレンサーが存在することを示している。【０１０３】  配列番号１で表される塩基配列における２７０５番〜３００１番の塩基からなる配列で表される約３００ｂｐのＤＮＡ配列を利用したレポーターアッセイを構築することができ、前記領域にＡＧＦプロモーター活性が含まれることを見出した。本アッセイ系において、好ましくはｐＧＶ−ｈＡＧＦｐｒｏ３００（Ｎ６）導入後の細胞に試験化合物を添加し、ルシフェラーゼ活性の変化を分析することにより、ＡＧＦ遺伝子のプロモーター活性を促進しＡＧＦの発現を亢進する物質である抗肥満薬、糖尿病治療薬、及び／又は抗高脂血症治療薬をスクリーニングすることができる。【０１０４】《参考例３：マウスＡＧＦのクローニング》
マウスＡＧＦの増幅には、フォワードプライマーとして配列番号５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号５７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、パイロベストＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、５％ホルムアミド存在下で９８℃（２０秒）／６４℃（３０秒）／７４℃（３分）のサイクルを３５回繰り返した。その結果、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。この断片をｐＣＲ２．１プラスミド（インビトロジェン社）を用いてクローニングし、プラスミドｐＣＲ２．１−ｍＮｅｗを得た。得られたクローンの塩基配列はダイデオキシターミネーション法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；アプライドバイオシステムズ社）を用いて解析した。明らかになった配列を配列番号５８に示す。同配列は１３７４塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号５８の１番〜１３７４番）を持っている。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（４５７アミノ酸）を配列番号５９に示す。マウスＡＧＦは、Ｎ末端にシグナル配列（−２４〜−１）を持ち、細胞外に分泌発現される際にシグナル配列が切断される。シグナル配列が切断された配列番号５９で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなるマウス成熟ＡＧＦが、生理活性を有する。【０１０５】  配列番号５９で表されるアミノ酸配列における１番〜４３３番のアミノ酸からなる配列（マウス）は、ヒトＮＬ８／ＮＥＷ、アンジオポエチン様６（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ６）、又はアンジオポエチン関連タンパク質５（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５）として公知のヒトＡＧＦアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＰ＿１１４１２３における２１番〜４７０番）と７６％の相同性を有していた。特に、アンジオポエチンファミリーに属するタンパク質の活性において重要であることが知られるＣ末端側のフィブリノーゲンドメイン［Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｎ．Ｐｒｏｃｏｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０１９６−３０２０１（１９９９）］においては８９％という高い相同性を有する。このように活性を維持する上で重要と予想される領域の相同性が高いことから、配列番号５８で表されるマウスＡＧＦはヒトＡＧＦのカウンターパートであり、マウスＡＧＦとヒトＡＧＦとは同等の活性を有するものと予測された。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定した。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版、バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム［Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）］を用い、デフォルトパラメーターに従って算出した。ペアワイズ  アラインメント  パラメーターとして、プログラム名ｂｌａｓｔｐ、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を０、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を０、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとしてＳＥＧ、ＭａｔｒｉｘとしてＢＬＯＳＵＭ６２を使用した。【０１０６】《参考例４：ＡＧＦ発現ＯＰ９細胞株の作製》
参考例３で作製したプラスミドｐＣＲ２．１−ｍＮｅｗを制限酵素ＸｂａＩ及びＳｐｅＩで切断し、１．４ｋｂのマウスＡＧＦ遺伝子を含む断片を得た。この断片を、ＸｂａＩで切断してＢＡＰ処理したｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏ［Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，＆  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２（１９９０）］に挿入して、マウスＡＧＦの発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍＡＧＦを作製した。フュージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ６）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、添付プロトコールに従い、ＯＰ９細胞［Ｎａｋａｎｏ  Ｔ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（３），１９７−２０３，１９９５］にｐＥＦ−ＢＯＳ−ｍＡＧＦをトランスフェクションした。３００μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）存在下で、トランスフェクションした細胞を培養することで、マウスＡＧＦの安定発現株（ＯＰ９／ＡＧＦ）を得た。更に、ネガティブコントロール用として、マウスＡＧＦ遺伝子を含まないｐＥＦ−ＢＯＳ−ｎｅｏベクターのみをトランスフェクションしたＯＰ９細胞株（ＯＰ９／ｖｅｃｔｏｒ）を得た。【０１０７】《参考例５：ＡＧＦの軟骨細胞増殖活性》
ＡＧＦの軟骨細胞増殖活性をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で調べた。レトロウイルス発現系で利用することができる緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）の発現ベクターであるｐＥＧＦＰＭＹ［Ｏｎａｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６（６），２０７４−２０８０，２０００］をマウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５［Ａｔｓｕｍｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３０（２），１０９−１１６，１９９０］に導入した。レトロウイルスの作製及びＡＴＤＣ５へのインフェクションは、Ｍｉｙａｍｏｔｏらの方法［Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９８（８）、２５４４−２５５４、２００１］に従って実施した。【０１０８】  インフェクションした細胞をＡＴＤＣ５培養培地［ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５％ＦＣＳ、５μｇ／ｍＬインスリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、３×１０８ｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム］で培養し、コンフルエントになる前にトリプシン処理により培養プレートより剥がして細胞を分散した。分散した細胞を、細胞分離装置（ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）にかけて、ＧＦＰの蛍光を持つＡＴＤＣ５を分離回収して、ＧＦＰを発現するＡＴＤＣ５を得た。得られたＧＦＰを発現するＡＴＤＣ５を培養及び増殖させ、もう一度同様に上記の細胞分離装置によるＧＦＰを発現する細胞の分離回収を実施し、安定的にＧＦＰを発現するＡＴＤＣ５（ＡＴＤＣ５／ＧＦＰ）を得た。参考例４で作製したＡＧＦ安定発現ＯＰ９細胞株（ＯＰ９／ＡＧＦ）及びコントロール用ＯＰ９細胞株（ＯＰ９／ｖｅｃｔｏｒ）を１２ウエルプレートでコンフルエントになるまで培養した。このプレートに、ＡＴＤＣ５／ＧＦＰを５０細胞／ウエルとなるように撒き、ＡＴＤＣ５培養培地で１４日間培養した。蛍光顕微鏡でＡＴＤＣ５／ＧＦＰの増殖を調べた。【０１０９】  その結果、コントロール用ＯＰ９細胞株（ＯＰ９／ｖｅｃｔｏｒ）をフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）細胞とした場合は、ＡＴＤＣ５／ＧＦＰのコロニーは全く形成されておらず、ＡＴＤＣ５／ＧＦＰは増殖していなかった。一方、ＡＧＦ安定発現ＯＰ９細胞株（ＯＰ９／ＡＧＦ）をフィーダー細胞とした場合は、ＡＴＤＣ５／ＧＦＰのコロニーが、１ウエル当たり約１６コロニーと多数形成されており、ＡＴＤＣ５／ＧＦＰが顕著に増殖していた。ＯＰ９／ＡＧＦは、リコンビナントＡＧＦタンパク質を発現するので、リコンビナントＡＧＦにＡＴＤＣ５／ＧＦＰの細胞増殖活性があること、すなわち、リコンビナントＡＧＦに軟骨細胞増殖活性があることが判った。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】  本発明のＡＧＦプロモーター又はスクリーニング方法並びに本発明の非ヒトノックアウト動物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬のスクリーニングの用途に適用することができる。また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、抗肥満薬、抗糖尿病薬、及び／又は抗高脂血症薬の開発の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】［図１］プラスミドｐＢＳ−ｌｏｘＰ−ｌｏｘ７１−ｍＡＧＦ−βｇｅｏの構造を模式的に示す図面である。記号「ｐｒｏ．」及び「ｐｒｉ．」は、それぞれ、プロモーター及びプライマーを意味する。
［図２］ＡＧＦ  ＫＯマウスの体重変化を示すグラフである。横軸は週齢（週）を、縦軸は体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
［図３］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（標準食）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
［図４］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウス（高脂肪食負荷）の生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
［図５］ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
［図６］ＡＧＦ  ＫＯマウスの生殖器脂肪（白色脂肪組織）重量変化（白色脂肪組織重量／体重）を示すグラフである。縦軸は、白色脂肪組織重量（ｇ）／体重（ｇ）を示す。また、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ＡＧＦヘテロＫＯマウス、及びＡＧＦホモＫＯマウスを意味する。
［図７］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面である。
［図８］ＡＧＦホモＫＯマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面である。
［図９］リターメイトＷＴマウスの脂肪細胞の形態を顕微鏡で観察した結果を示す図面である。
［図１０］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（肝臓）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
［図１１］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの組織（骨格筋）中ＴＧ含量を示すグラフである。横軸は高脂肪食負荷（箇月間）を、縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
［図１２］ＡＧＦ  ＫＯマウスの組織中ＴＧ含量を示すグラフである。縦軸はＴＧ含量（ｍｇ／ｇ組織）を示す。また、横軸の記号「Ｌ」及び「ＳＭ」は、それぞれ、肝臓及び骨格筋を意味し、記号「ＷＴ」、「ＨＴＲ」、及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス、ヘテロＫＯマウス、及びホモＫＯマウスを意味する。
［図１３］ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血糖値）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
［図１４］ＡＧＦ  ＫＯマウスの糖負荷試験の結果（血清インスリン）を示すグラフである。横軸は時間（分）を、縦軸は血清インスリン（ｎｇ／ｍＬ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「ＨＭ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びホモＫＯマウスを意味する。
［図１５］ＣＡＧ−ＡＧＦ  Ｔｇマウスの酸素消費量を示すグラフである。横軸において、レーン１は「明期」、レーン２は「暗期」、レーン３は「２４時間」であり、縦軸はＶＯ２（ｍＬ／ｋｇ／ｍｉｎ）を示す。また、記号「ＷＴ」及び「Ｔｇ」は、それぞれ、ＷＴマウス及びＴｇマウスを意味する。
［図１６］ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ／β−ｇａｌを示す。
［図１７］ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ／β−ｇａｌを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。配列番号６、７、９、１０、１３、１４、１６、１９、２０、４５〜５３、及び５６の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、配列番号１５の配列で表される各塩基配列は、ｌｏｘＰを含む配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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