(57)【要約】本発明の課題は、新規な組織レニン・アンジオテンシン系の活性化を制御する手段並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療する手段を提供することである。プロレニンプロフラグメント領域における非酵素的プロレニン活性化を阻害する機能を有する物質を含む医薬を用いることによる。具体的には、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド又はその等価ペプチドを含む医薬を用いることにより組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進を制御することができるとともに、組織アンジオテンシンＩＩ産生亢進による又は組織内レニン・アンジオテンシン系を介さない動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療をすることができる。
2004073740.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によっておこる、一次構造変化を伴わない非酵素的プロレニン活性化を阻害する機能を有する物質を含む以下から選ばれる用途に使用される医薬：
１）組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤；
２）組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進により発症する動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤；
３）組織内レニン・アンジオテンシン系を介さない動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤。
【請求項２】
前記物質がレニン阻害活性を保持しない請求の範囲第１項の医薬。
【請求項３】
前記物質がプロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド又はその等価ペプチドからなる請求の範囲第１項又は第２項の医薬。
【請求項４】
前記部分配列が、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される連続した３個から１０個の部分配列である請求の範囲第３項の医薬。
【請求項５】
プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有する前記ペプチドが、配列表の配列番号７から１４、及び配列番号２１に記載のペプチドから選択されるペプチドである請求の範囲第３項の医薬。
【請求項６】
プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有する前記ペプチドが、配列表の配列番号３、配列番号４、及び配列番号１５から２０に記載のペプチドから選択されるペプチドである請求の範囲第３項の医薬。
【請求項７】
前記物質が、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列の情報から設計される低分子化合物である請求の範囲第１項又は第２項の医薬。
【請求項８】
プロレニン活性化を阻害する前記機能が、プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用の拮抗作用によるものである請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１の医薬。
【請求項９】
プロレニン活性化を阻害する前記機能が、プロレニンのプロフラグメント領域に対する特異的結合蛋白とプロレニンとの相互作用を阻害してプロレニン活性化を生体内で阻害することを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１の医薬。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１の医薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号特願２００３−４３２６９号からの優先権を請求する。
【技術分野】  本発明は組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤に関する。
【背景技術】  レニン・アンジオテンシン系は、生体において重要な調節系の中枢的存在であり、血圧、水電解質代謝、細胞増殖に深く関与することが知られている。レニン・アンジオテンシン系には循環血中レニン・アンジオテンシン系と組織レニン・アンジオテンシン系があり、前者は血圧や水電解質バランスにおける急性の変化に対応し調節を行う系であり、後者は発生分化から増殖、又は種々の病態において重要な役割を果たすことが知られている。組織におけるレニン・アンジオテンシン系の活性化は、組織中のアンジオテンシンＩＩの濃度を上昇させ、組織において増加したアンジオテンシンＩＩは、特異的受容体を介して働き高血圧・（糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症を含む）糖尿病合併症、腎疾患、心不全、心筋梗塞・心肥大・心筋症・脳血管障害・動脈硬化の発症と進展に深く関与している。これら疾患に対し、従来はアンジオテンシンＩＩの産生酵素の阻害薬やアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が用いられてきたが、エスケープ現象といわれるアンジオテンシンＩＩ又はアンジオテンシンＩＩ効果の再上昇によって、治療効果には限界が存在した。それゆえ、病態の本質である組織アンジオテンシンＩＩ濃度の確実な抑制のためには、根源である組織レニン・アンジオテンシン系の活性化を抑えることが最重要である。また、上記従来のアンジオテンシンＩＩ産生酵素阻害薬等の薬剤では、組織レニン・アンジオテンシン系を介してしか動脈硬化症等の疾患を治療することができず、組織レニン・アンジオテンシン系非依存性の未知の作用機構による動脈硬化症等の疾患を治療することはできないという限界も存在した。
レニンは主として腎臓において、その前駆体である４０６アミノ酸からなるプレプロレニン（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｒｅｎｉｎ）として生合成され、Ｎ末端の２３個のアミノ酸が切断されてプロレニンが生じ、ついで４３個のアミノ酸がＮ末端からさらに切断されて３４０個のアミノ酸からなるレニンとなる。レニンはアンジオテンシノーゲンを特異的に加水分解してアンジオテンシンＩ（ＡＩ）を生成する蛋白質分解酵素である。しかし、レニンの前駆体であるプロレニンは通常この酵素活性を示さない。そのため、プロレニンの血中存在量はレニンの約１０倍であるにもかかわらず、レニン・アンジオテンシン系における作用物質はレニン、又はプロレニンが加水分解されて生じるレニンであると考えられてきた。
本発明者等は先に、不活性型レニン前駆体プロレニンは、プロレニンからレニンが生じる際に切断されるＮ末端の４３個のアミノ酸断片（以下「プロフラグメント」又は「ｐｆ」とよぶ）を特異的に認識する抗体とインビトロで結合して免疫複合体を形成すると、生理的条件下で、かつ一次構造が変化することなく非酵素的に、蛋白機能すなわち酵素活性（レニン活性）を発現することを、抗ヒトプロレニンｐｆ抗体を用いて見い出した（特許文献１〜２）。これまでにプロレニンを活性化する手段として、蛋白分解酵素によるレニンへの変換、酸性及び低温状態で一次構造の変化なしに活性化する方法（非特許文献１〜４）及び低分子のレニン阻害剤をプロレニンの三次元構造の深い溝に隠れている酵素活性部位に結合させて開放型とする方法（非特許文献５）などが知られている。しかし、生体内におけるプロレニン活性化のメカニズムならびにその作用は、未だ不明である。
（特許文献１）特開平１０−２７９６００号公報
（特許文献２）アメリカ合衆国特許第５９４５５１２号
（非特許文献１）Ｎａｔｕｒｅ，２８８，７０２−７０５，１９８０
（非特許文献２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２４７２−２４７７，１９８７
（非特許文献３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７，１８１１−１８１９，１９９１
（非特許文献４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１１７５３−１１７５９，１９９２
（非特許文献５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２２８３７−２２８４２，１９９２
【発明の開示】
本発明の課題は、新規な組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤を提供することである。
ここで、糖尿病合併症とは糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症等の公知の疾患を含むものである。
本発明者等は、上記の事情を考慮して研究を進めた結果、プロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドを、組織内アンジオテンシンＩＩ産生が亢進している病態モデル動物の一例としてＳＴＺ糖尿病病態モデル動物に投与することにより組織レニン・アンジオテンシン系の活性化を制御しうることを見い出した。この知見に基づいて、生体内におけるプロレニンの活性化を制御する物質を用いることにより、新規な組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤を提供できることを見い出した。
また、プロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドを、糖尿病性腎症が発症すると予測される病態モデル動物の一例であるＳＴＺ糖尿病病態モデル動物及びＳＴＺ投与アンジオテンシン受容体遺伝子欠損マウスに投与することにより、糖尿病に由来する腎糸球体硬化病変を抑制しうることを見い出した。この知見に基づいて、生体内におけるプロレニンの活性化を制御する物質を用いることにより、新規な糖尿病性腎症の発症予防又は治療剤を提供できることを見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の態様は、
１．プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によっておこる、一次構造変化を伴わない非酵素的プロレニン活性化を阻害する機能を有する物質を含む以下から選ばれる用途に使用される医薬：
１）組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤；
２）組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進により発症する動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤；
３）組織内レニン・アンジオテンシン系を介さない動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤、
２．前記物質がレニン阻害活性を保持しない前項１の医薬、
３．前記物質がプロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド又はその等価ペプチドからなる前項１又は２の医薬、
４．前記部分配列が、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される連続した３個から１０個の部分配列である前項３の医薬、
５．プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有する前記ペプチドが、配列表の配列番号７から１４、及び配列番号２１に記載のペプチドから選択されるペプチドである前項３の医薬、
６．プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有する前記ペプチドが、配列表の配列番号３、配列番号４、及び配列番号１５から２０に記載のペプチドから選択されるペプチドである前項３の医薬、
７．前記物質が、プロレニンのプロフラグメント領域のアミノ酸配列の情報から設計される低分子化合物である前項１又は２の医薬、
８．プロレニン活性化を阻害する前記機能が、プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用の拮抗作用によるものである前項１〜７のいずれか１の医薬、
９．プロレニン活性化を阻害する前記機能が、プロレニンのプロフラグメント領域に対する特異的結合蛋白とプロレニンとの相互作用を阻害してプロレニン活性化を生体内で阻害することを特徴とする前項１〜８のいずれか１の医薬、
１０．前項１〜９のいずれか１の医薬のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】  図１ａは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの体重への影響を示す。図１ｂは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの血圧への影響を示す。図１ｃは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの血中グルコース量への影響を示す。
図２ａは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの尿蛋白排出量への影響を示す。図２ｂは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎糸球体障害への影響をＰＡＳ法を用いて示す。図２ｃは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎糸球体障害への影響をＴｙｐｅ  ＩＶコラーゲン染色法を用いて示す。図２ｄは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎糸球体障害率への影響を示す。
図３ａは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの血漿レニン活性への影響を示す。図３ｂは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの血漿アンジオテンシンＩ量への影響を示す。図３ｃは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの血漿アンジオテンシンＩＩ量への影響を示す。図３ｄは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓アンジオテンシンＩ量への影響を示す。図３ｅは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓アンジオテンシンＩＩへの影響を示す。図３ｆは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓レニンｍＲＮＡレベルへの影響を示す。図３ｇは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓ＡＣＥ  ｍＲＮＡレベルへの影響を示す。図３ｈは、ｐ４ペプチド投与による糖尿病マウスの腎臓アンジオテンシノーゲンｍＲＮＡレベルへの影響を示す。
図４ａは、ｐ４ペプチド投与によるアンジオテンシンＩＩ受容体欠損の糖尿病マウスの腎糸球体障害への影響を示す。図４ｂは、ｐ４ペプチド投与によるアンジオテンシンＩＩ受容体欠損の糖尿病マウスの腎糸球体障害率への影響を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、それらを引用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものとして導入される。
本発明者等は、ラットプロレニンをインビトロで活性化し得る上記抗ラットｐｆ抗体の抗原である、ラットプロレニンプロフラグメント由来の部分ペプチドを合成してＳＴＺラットに投与した。これらのペプチドは、ヒトｐｆペプチドが抗ヒトｐｆ抗体によるインビトロでのヒトプロレニン活性化を阻害するのと同様に、抗ラットｐｆ抗体によるインビトロでのラットプロレニン活性化を拮抗阻害できる。すなわちこれらのペプチドは、蛋白質間相互作用によっておこる、ラットプロレニンの一次構造変化は伴わないが高次構造変化を伴う活性化を阻害できる。ＳＴＺラットにこれらのペプチドを投与すると、実験例１及び２に示すように腎臓内アンジオテンシンＩＩの減少に有意の効果が得られた。しかし、正常ラットにこれらのペプチドを投与してもアンジオテンシンＩＩは変動しなかった。また実験例２及び３に示すように、上記ペプチドを投与すると、投与されていないＳＴＺラットにおいて著明である腎糸球体硬化病変が抑制され、正常ラットにほぼ近い状態になった。上記ペプチドの投与で得られるこれらの効果は、上記ペプチドにより、生体内におけるラットプロレニンの蛋白質間相互作用による構造変化を伴う活性化が阻害されることにより、又はラットプロレニンもしくは活性化されたラットプロレニンとその作用部位との結合が阻害されることにより得られたものと推測される。
以上の結果から、ＳＴＺラットではプロレニンが、プロレニン結合性蛋白質と相互作用することにより糖尿病合併症を発症している可能性が示唆された。プロレニンのｐｆペプチドは、レニン・アンジオテンシン系が活性化されることによる組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進を制御するとともにレニン・アンジオテンシン系非依存性の経路を制御し、例えば糖尿病合併症等の種々の疾患に対して、予防治療作用を示すことが判明した。
ラットプロレニンのｐｆペプチドはヒトプロレニンｐｆペプチドとアミノ酸残基数は同じであるが構成アミノ酸が異なる。それにも拘わらず、上記のように、インビトロでヒトプロレニンを活性化し得る抗ヒトｐｆ抗体のエピトープペプチドであるヒトｐｆペプチドと一次構造上のアミノ酸配列順序において同一部位のラットｐｆペプチドが、ＳＴＺ投与ラット高血糖病態モデルでアンジオテンシンＩＩ減少効果及び糖尿病性腎症の抑制効果を示した。従って、組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進に関与するプロレニンの薬理作用、プロレニン活性化に係わるその構造上の部位、及びその活性化のメカニズムには種差がないといえる。つまり、上記ペプチドのアンジオテンシンＩＩ減少効果はラット病態モデル動物で認められたものであるが、ヒトプロレニンのｐｆペプチドのアミノ酸配列を考慮して適当なペプチドを選択することにより、むろんヒトの組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進性疾患、例えば糖尿病合併症においても同様の効果を期待できる。
（プロレニン活性化を阻害する物質の選別方法）
本発明に係るプロレニン活性化を阻害する物質の選別方法は、プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によるプロレニン活性化の調節能を指標として行うことを特徴とする。ここで、プロレニンのプロフラグメント領域における蛋白質間相互作用によるプロレニン活性化とは、ｐｆ領域における蛋白質間相互作用により生じる、プロレニンの一次構造変化は伴わないが高次構造変化を伴う酵素活性部位の開放を意味する。従って、該蛋白質間相互作用により活性化されたプロレニンは、活性化される前のプロレニンの一次構造と同一のアミノ酸配列は保持しているが、レニン様の酵素活性を示し得るものである。ｐｆ領域における蛋白質間相互作用を有する蛋白質としては、ｐｆペプチドを認識して活性化する抗体、生体内におけるプロレニン又は活性化したプロレニンの作用部位である蛋白質、及びプロレニンと相互作用してこれを活性化させ得る蛋白質などが例示される。
上記プロレニン活性化を阻害する物質の選別方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、プロレニンとプロレニンを活性化し得る抗ｐｆ抗体とを用いて、プロレニンと該抗ｐｆ抗体の結合を測定することにより、プロレニン活性化を阻害する物質を選別できる。また、例えば、プロレニンとプロレニンを活性化し得る抗ｐｆ抗体とを用いて、活性化されたプロレニンの酵素活性を測定することにより、プロレニン活性化を阻害する物質、又はプロレニンの酵素活性を阻害する物質を選別できる。むろん、選別方法はこれらに限定されない。また、上記のように、プロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列の構成アミノ酸は種により異なるため、ヒトプロレニン活性化制御物質の選別は、ヒトプロレニンと、例えばヒトプロレニンのｐｆペプチドに対する抗体とを用いて行うことが好ましい態様の１つである。
具体的には例えば、特開平１０−２７９６００号公報及びアメリカ合衆国特許第５９４５５１２号の記載に準じて調製した、ヒトプロレニン、及びヒトプロレニンｐｆペプチドを特異的に認識してヒトプロレニンを活性化し得る抗体を利用して、スクリーニングシステムを構築できる。
上記プロレニン活性化を阻害する物質の選別方法で、選別される対象となる物質としては、低分子化合物、天然物由来の化合物、又はペプチドなど、自体公知の医薬品スクリーニングシステムで使用している選別の対象となる候補物質を広く利用できる。
また、プロレニンとくにヒトプロレニンのｐｆ領域のアミノ酸配列情報を基にして設計されるペプチド及び低分子化合物も選別される対象とすることができる。
ヒトプロレニンのｐｆ領域のアミノ酸配列は既知であり、特開平８−２８５８５２に示す４３個のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）からなる。プロレニンのｐｆペプチドのアミノ酸配列は、プロレニン活性化制御物質を選別する対象となる物質の設計に有用な情報となる。とくにプロレニンｐｆ領域のＮ末端より１番目〜１９番目（ｐｆ１−１９）、とりわけ５番目〜１９番目（ｐｆ５−１９）、及び２７番目〜４１番目（ｐｆ２７−４１）のアミノ酸配列の、少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個の連続するアミノ酸配列の情報は、プロレニン活性化制御物質の設計のために有用である。ヒト由来ｐｆ１−１９、ヒト由来ｐｆ５−１９、ヒト由来ｐｆ２７−４１、ラット由来ｐｆ１−１９、ラット由来ｐｆ５−１９、及びラット由来ｐｆ２７−４１のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号２、３、４、６、７、及び８に示す。以下、ｐｆ領域のＮ末端より例えばＭ番目〜Ｎ番目のペプチドを、ｐｆＭ−Ｎと記載する。
上記のように、プロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列は種が異なってもアミノ酸残基数は同一であるがその構成アミノ酸が異なる。実験例では、ラットプロレニンのｐｆペプチドのアミノ酸配列（配列表の配列番号５）を、プロレニン活性化制御物質を選別するための対象物質の設計に有用な情報として例示した。実施例では、ラットプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列断片である、ｐｆ１−１１（配列表の配列番号９）、ｐｆ５−１９（配列表の配列番号７）、ｐｆ１−４（配列表の配列番号１０）、ｐｆ１−７（配列表の配列番号１１）、ｐｆ５−１１（配列表の配列番号１２）、ｐｆ１２−１９（配列表の配列番号１３）、ｐｆ１１−１５（配列表の配列番号１４）、及びｐｆ２７−４１（配列表の配列番号８）を合成し、それらのプロレニン活性化抑制によるアンジオテンシンＩＩ減少効果を確認したが、必ずしもこの配列に限定されない。当業者であれば、自体公知の手法により、適宜少なくとも３個のペプチドを合成し、その合成ペプチドをもとに選別の対象となる物質を設計し合成できる。
なお、ラットｐｆペプチドと一次構造上のアミノ酸配列順序が同一のヒトプロレニンｐｆペプチドが、ヒトにおいて同様の効果をもたらすことは容易に推定できる。好ましい態様の１つとして、ヒトプロレニンのｐｆペプチドを、選別の対象となる物質を設計するための情報とする。
選別の対象となる物質は、ペプチドであれば、上記のようにプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列の情報をもとに適宜設計され、選択のために提供され得る。該ペプチドを構成するアミノ酸は、必ずしもプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列と同一である必要はなく、該ペプチドと同様の機能を有するものであれば、該ペプチドのアミノ酸配列に、適宜、欠失、置換、付加、挿入などの変異を導入したペプチドであってもよい（以下、等価ペプチドと呼ぶこともある）。
また、選別の対象となる物質は、ｐｆ領域のアミノ酸配列の二次及び／又は三次構造に基づく情報により、その構造的相補性をもとにしてドラッグデザインした低分子化合物であってもよい。
ｐｆ領域のアミノ酸配列から選択された部分配列を有するペプチド、既知の糖尿病治療予防剤などをもとに情報を集積し、また動物モデルを使用した実験などにより、得られた物質から、組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御効果を有する物質並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤を選択できる。
（プロレニン活性化を阻害する物質）
かくして本発明は、プロレニンのｐｆ領域における蛋白質間相互作用に基づくプロレニン活性化を阻害し得るプロレニン活性化を阻害する物質からなる組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤を提供する。
本発明の１つの態様は、ヒトプロレニン活性化を阻害し得るプロレニン活性化阻害物質からなる組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤である。
本発明のもう１つの態様は、ヒトプロレニン活性化を阻害し得るプロレニン活性化阻害物質からなる動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤である。
本発明に係るプロレニン活性化阻害物質は、プロレニンを活性化する蛋白質間相互作用を競合的に阻害するもの、プロレニンもしくは活性化されたプロレニンの作用部位において拮抗的にその結合を阻害するもの、又はプロレニンもしくは活性化されたプロレニンの作用部位に作用し、プロレニンもしくは活性化されたプロレニンの作用を阻害するものなどであり得る。
上記プロレニン活性化阻害物質が、プロレニンのｐｆ領域における蛋白質間相互作用に基づくプロレニン活性化を阻害する機能を有し、かつレニン阻害活性のないプロレニン活性化阻害物質であることは好ましい態様の１つである。すなわち、上記プロレニン活性化阻害物質は、その作用メカニズムとしてレニンへの直接的な阻害作用を示さない。そのため、生体の生命維持機構に重要な役割を担っているレニン・アンジオテンシン系をレニン阻害剤などの様に阻害することなく、病態時に活性化するプロレニンの活性化を阻害できる。このことは本発明に係るプロレニン活性化阻害物質からなる組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤の重要な特徴である。
具体例としては、プロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド、該ペプチドの等価ペプチド、及びプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列の情報から設計される低分子化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい態様の１つとして、上記ペプチドはヒトプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列から選択される部分配列を有するペプチド又は該ペプチドの等価ペプチドである。例えば、ヒトプロレニンｐｆ領域のアミノ酸配列に由来するペプチドとして、以下のペプチドを例示できる。
ｈｐ１：ヒトプロレニンｐｆ１−１１（配列表の配列番号１５）
ｈｐ２：ヒトプロレニンｐｆ５−１１（配列表の配列番号１６）
ｈｐ３：ヒトプロレニンｐｆ５−１９（配列表の配列番号３）
ｈｐ４：ヒトプロレニンｐｆ１−４（配列表の配列番号１７）
ｈｐ５：ヒトプロレニンｐｆ１−７（配列表の配列番号１８）
ｈｐ６：ヒトプロレニンｐｆ１２−１９（配列表の配列番号１９）
ｈｐ７：ヒトプロレニンｐｆ１１−１５（配列表の配列番号２０）
ｈｐ８：ヒトプロレニンｐｆ２７−４１（配列表の配列番号４）
プロレニン活性化を制御するとき、これらのペプチドのうち１種類を使用してもよく、２種類以上を混合して使用することもできる。
（製剤化）
本発明の組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤の製剤化には、ペプチド又は低分子化合物の物性に応じて適宜公知の方法が適用できる。例えば、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリンなどの包接体などの製剤化方法が利用できる。
散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、ＰＥＧなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液又は、塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
リポソーム化は例えば、リン脂質を有機溶媒（クロロホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振盪、超音波処理及び遠心分離した後、上清を濾過処理して回収することにより行い得る。
脂肪乳剤化は例えば、当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油などの植物油、ＭＣＴなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば、高圧噴射型、超音波型など）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリン、糖顆（例えば、ブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。
シクロデキストリン包接化は例えば、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿を濾過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
本発明の組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制御剤並びに動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症の発症予防又は治療剤の投与量は、患者の病状、性別、年齢、体重に応じて適宜選択できる。投与経路としては、経口、非経口のいずれでもよい。好ましい態様の１つは、経口剤の形態となし、経口投与することである。その投与量としては、１日当たり、１〜１，０００μｇ程度が例示される。
【実施例】  以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【実施例１】（ラットプロレニンｐｆ領域由来のペプチドの作成）
ラットプロレニンのｐｆ領域の配列に由来する下記ペプチドを固相法により常法どおり合成した。
ｐ１：ｐｆ１−１１（配列表の配列番号９）
ｐ２：ｐｆ５−１９（配列表の配列番号７）
ｐ３：ｐｆ２７−４１（配列表の配列番号８）
ｐ１ａ：ｐｆ１−４（配列表の配列番号１０）
ｐ１ｂ：ｐｆ１−７（配列表の配列番号１１）
ｐ１ｃ：ｐｆ５−１１（配列表の配列番号１２）
ｐ２ａ：ｐｆ１２−１９（配列表の配列番号１３）
ｐ２ｂ：ｐｆ１１−１５（配列表の配列番号１４）
また、ｐ１、ｐ２、及びｐ３を等量混合し、Ｐｍｉｘとした。
【実施例２】（ラットプロレニンｐｆ領域由来のペプチドｐ４の作成）
ラットプロレニンのｐｆ領域の配列に由来する下記ペプチドｐ４を固相法により常法どおり合成した。
ｐ４：ｐｆ１０−１９（配列表の配列番号２１）
このペプチドｐ４は”ｈａｎｄｌｅ”領域と呼ばれるｐｆ領域の１１番目〜１５番目までのペプチド配列を含有し、この”ｈａｎｄｌｅ”領域は非酵素的プロレニンの活性化に重要な役割を担うと考えられている。
（実験例１）
（ｐｆペプチド（実施例１）によるアンジオテンシンＩＩ減少効果の検討）
組織中には、組織（プロ）レニンに結合しその活性化を起こすレニン受容体が存在する（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１４１７−１４２７，２００２）。レニン受容体との結合部位に相当する（プロ）レニンのアミノ酸配列に相似したアミノ酸配列を持ったペプチド（組織プロレニン活性化阻害因子）を上記実施例１により合成し、組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進病態モデルラットへ投与し組織アンジオテンシンＩＩ濃度を測定した。このようなペプチドはレニン受容体に結合し、（プロ）レニンとレニン受容体との結合を阻害するいわばデコイのような働きをし、結果としてレニン・アンジオテンシン系の活性化は抑制され組織アンジオテンシンＩＩ濃度は低下することが予想された。
組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進制病態モデルの代表として、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１００−１５０ｇ）にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）６５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した高血糖モデルラットを作成した。さらに組織プロレニン活性化抑制因子を、浸透圧ミニポンプを用い、０．１，１，１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与速度で１ヵ月間皮下投与した。対照ラットには、浸透圧ミニポンプを用いて生理食塩水を以下１ヵ月間皮下投与した。１ヵ月後、無麻酔断頭屠殺し摘出腎臓内アンジオテンシンＩとアンジオテンシンＩＩを測定した。
ホモジネートした腎臓抽出物におけるアンジオテンシンＩとアンジオテンシンＩＩは、従来の報告（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２７：６５８−６６２，１９９６）のように、固相抽出法とラジオイムノアッセイを組み合わせて測定した。抽出した腎臓は、被膜を剥離した後に重量を測定し、５ｍｌ氷冷メタノール入りのシンチレーションバイアルに入れ組織粉砕器でホモジネートした後、３，０００回転４℃１０分遠心し上清を回収した。この上清をバリアン社製Ｃ１８逆相ボンドエルートカラム（１２１０−２０３２）で抽出した後、エバポレータでメタノールを除き、アンジオテンシンアッセイ用バッファーで検体を再構築した。この検体に含まれるアンジオテンシンＩとアンジオテンシンＩＩ濃度は、１２５Ｉ−アンジオテンシンＩ、１２５Ｉ−アンジオテンシンＩＩ（ＮＥＮライフサイエンス社、ＮＥＸ−１０５）と抗アンジオテンシンＩ抗体、抗アンジオテンシンＩＩ抗体（フェニックス薬品、ＲＡＢ−００２−１２）用いラジオイムノアッセイで測定した。
統計には、ｏｎｅ−ｗａｙ  ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ＡＮＯＶＡ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔｓを用い、Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。
（結果）
表１に示すように、ＳＴＺ投与高血糖ラットにおける腎臓内アンジオテンシンＩは１２９．３±５６．１ｆｍｏｌ／ｇであり、アンジオテンシンＩＩは１４７±１２．１ｐｇ／ｇであった。同モデルラットを組織プロレニン活性化抑制因子０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで同時に治療した群における腎臓内アンジオテンシンＩは７６．２±４１ｆｍｏｌ／ｇであり有意ではないものの減少傾向を示し、腎臓内アンジオテンシンＩＩは７７．２±８．３ｐｇ／ｇと有意に減少した。また、同モデルラットを組織プロレニン活性化抑制因子１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで同時に治療したラットにおける腎臓内アンジオテンシンＩは１４．６ｆｍｏｌ／ｇであり減少傾向を示し、腎臓内アンジオテンシンＩＩも８９ｐｇ／ｇと減少傾向を示した。同モデルラットを組織プロレニン活性化抑制因子１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで同時に治療した群における腎臓内アンジオテンシンＩは５８．３±１５．９ｆｍｏｌ／ｇであり有意ではないものの減少傾向を示し、腎臓内アンジオテンシンＩＩは７３．７±１１．８ｐｇ／ｇと有意に減少した。
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（実験例２）
（ｐ４ペプチドによる糖尿病性腎症の発症・進展の抑制効果の検討）
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重１００〜１５０ｇ）の左の腎臓を摘出し、半分腎臓が摘出されたラットを作成した。これらのラットの４週令に、生理食塩水、ストレプトゾトシン６５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、それぞれ対照群（Ｃ）、糖尿病群（ＤＭ）を作成した。さらに各群の一部に実施例２により合成したｐ４ペプチドを浸透圧ミニポンプを用いて持続皮下注し（０．１ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ＋ｐ４群、ＤＭ＋ｐ４群を作成した。浸透圧ミニポンプは２８日間用のものを用いて２８日毎に入れ替えた。ラットの１２，２０，２８週令に各群について６匹のラットを無麻酔下で断頭堵殺し、血液と右の腎臓を摘出し以下の実験例２−１〜４を行った。
（統計分析）
グループ内の統計比較は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｌｕｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ試験に従って複数回の測定値に対してｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによりおこなった。二つのグループ間の差はＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｌｕｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ試験で組み合わされた複数回の測定値に対してｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡにより評価した。Ｐ＜０．０５を有意差ありと判定した。データは平均±ＳＥＭとして示した。
（実験例２−１）
（ｐ４によるラットの代謝に対する影響の検討）
４，８，１２，１６，２０，２４，２８週令のラットの体重、動脈の収縮期圧、及び血中グルコース濃度を測定した。収縮期圧はテイルカットプレスチモグラフィーにより測定した。血液は尾の静脈から回収しグルコース量をグルコースＣ試験キット（和光純薬工業）で分析した。
（結果）
実験例２−１の結果を図１ａ〜ｃに示す。図１ａに示すように、糖尿病ラットにおいては体重増加の抑制が著しかった。ｐ４ペプチド投与群では糖尿病ラットの２４及び２８週令において体重増加を引き起こしたが、それ以外は対照ラットにおいても糖尿病ラットにおいても全く影響は見られなかった。図１ｂに示すように収縮期圧は糖尿病ラットにおいても対照ラットにおいても差はなく、ｐ４ペプチド投与による影響も見られなかった。図１ｃに示すように、血中グルコース濃度は糖尿病ラットにおいて著しく上昇したが、ｐ４ペプチド投与による影響は全くみられなかった。
＊はＣ群とＤＭ群との間で有意差があることを示す。＋はｐ４処理ありの群とｐ４処理なしの群との間で有意差があることを示す。
（実験例２−２）
（ｐ４によるラットの尿蛋白排出に対する影響、及び腎糸球体の形態学的、免疫組織学的変化）
２４時間代謝ケージにあるラットの尿を瓶に集め、尿蛋白質排出及びクレアチニンをＭｉｃｒｏ  ＴＰ試験キット（和光純薬工業）とクレアチニンＨＡ試験キット（和光純薬工業）で測定した。
各群のラットから除去した腎臓の一部をリン酸緩衝液中の１０％ホルマリンで固定した。パラフィン包埋切片を過ヨウ素酸−シッフ法（ＰＡＳ法）で染色した。
免疫組織学的染色にあたり、パラフィンのない切片を蛋白質分解酵素Ｋで前処理し、その切片をクエン酸緩衝液中で電子レンジで沸騰させ、抗原性部位を露出させ、内因性のビオチンをＢｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ダココーポレーション：Ｘ０５９０）でブロックした。次に、切片をメタノール中の３％Ｈ２Ｏ２に浸して内因性のペルオキシダーゼを阻害し、リン酸緩衝液生理食塩水中の１％無脂肪乳で満たして非特異的結合をブロックした。ウサギポリクローナル抗体（Ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲンの抗ａ２（ＩＶ）、抗ａ４（ＩＶ）、抗ａ５（ＩＶ）鎖）のカクテル（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒａｇｈｕｒａｍ  Ｋｌｌｕｒｉ博士より提供）を第一抗体として切片に付与し、第２抗体としてのビオチン結合抗ウサギＩｇＧ抗体で切片をインキュベートした。抗体反応を製造者の指示に従ってＶｅｃｔａｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣ標準キット（ベクターラボラトリーズ）とＡＥＣ標準キット（ダココーポレーション）で可視化した。２００倍の倍率でＭａｃ顕微鏡により各糸球体の免疫反応性Ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲンポジティブ領域を定量的に測定し、それを糸球体の全断面領域の百分率として表した。最終的な総合値をラットの群あたり１００糸球体の値の平均として計算した。
（結果）
実験例２−２の結果を図２ａ〜ｄに示す。図２ａに示すように、糖尿病ラットにおいては尿蛋白の排出が著しく増加し、ｐ４ペプチド投与は糖尿病ラットにおけるこの尿蛋白の排出の開始と進行を抑制した。図２ｂに示すように、糖尿病ラットにおいては２０週令以後で糖尿病性腎糸球体硬化の発症と進展が著明であるが、ｐ４ペプチド投与は糖尿病ラットにおけるこの糖尿病性腎糸球体硬化の発症を抑制した。図２ｃに示すように、糖尿病ラットにおいては２０週令以後で腎糸球体Ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲンが増加するが、ｐ４ペプチド投与は糖尿病ラットにおける腎糸球体Ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲン増加を抑制した。図２ｄに示すように糖尿病ラットにおいては２８週令で腎糸球体Ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲンポジティブ領域が増加し、これはｐ４ペプチド投与により阻害された。
＊はＣ群とＤＭ群との間で有意差があることを示す。
（実験例２−３）
（ｐ４によるラットアンジオテンシンＩ（ＡＩ）とアンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）のペプチド量に対する影響）
各群のマウスを断頭堵殺した直後に３ｍｌの血液を３０μｌのＥＤＴＡ（５００ｍＭ）、１５μｌのｅｎａｌａｐｒｉｌａｔ（１ｍＭ）、３０μｌのｏ−フェナンスロリン（２４．８ｍｇ／ｍｌ）及びペプスタチン（０．２ｍＭ）の入った試験管に集めた。その後遠心分離して血漿試料を得た。血漿レニン活性はｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｃｏａｔｅｄ−ｂｅａｄ  ｋｉｔ（ダイナボットラジオアイソトープインスティテュート）で測定した。除去した腎臓の半分の重さを測定し、氷冷メタノール（１０％ｗ／ｖ）中に置き、冷えたガラスホモジナイザーで磨砕し、遠心した。上清を乾燥させて、１％アルブミンを含むリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌ）４ｍｌ中に懸濁した。血漿及び腎臓からの試料をボンドエルートカラムに通して抽出し、抽出液を蒸発させて乾燥し、アンジオテンシンペプチド分析希釈液に溶かした。ＡＩおよびＡＩＩはウサギ抗ＡＩ抗血清およびウサギ抗ＡＩＩ抗血清を用いてラジオイムノアッセイによって定量的に測定した。
（結果）
実験例２−３の結果を図３ａ〜ｅに示す。図３ａに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて血漿レニン活性は低かったが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。図３ｂに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて血漿ＡＩレベルは低かったが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。図３ｃに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて血漿ＡＩＩレベルは低かったが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。図３ｄに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて腎臓ＡＩレベルが高く、ｐ４ペプチド投与は糖尿病ラットにおけるこの腎臓ＡＩレベルの上昇を対照ラットと同じレベルにまで抑制した。図３ｅに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比べて腎臓ＡＩＩレベルが高く、ｐ４ペプチド投与は糖尿病ラットにおけるこの腎臓ＡＩＩレベルの上昇を対照ラットと同じレベルにまで抑制した。
＊はＣ群とＤＭ群との間で有意差があることを示す。＋はｐ４処理ありの群とｐ４処理なしの群との間で有意差があることを示す。
（実験例２−４）
（ｐ４によるラットの腎臓レニン、アンジオテンシノーゲン変換酵素（ＡＣＥ）、アンジオテンシノーゲンｍＲＮＡに対する影響の分析）
Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン株式会社）で各群の腎臓の一部から総ＲＮＡを抽出した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析をＴａｑＭａｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔを用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ＨＴ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）で、レニン、ＡＣＥ、アンジオテンシノーゲンに関して内部標準にＧＡＰＤＨを用いて行った。以下の各プライマーとプローブ（配列表の配列番号２２から３３に示す）を用いた。
レニン：
2004073740.tif 000004
ＡＣＥ：
2004073740.tif 000005
アンジオテンシノーゲン：
2004073740.tif 000006
ＧＡＰＤＨ：
2004073740.tif 000007
（結果）
実験例２−４の結果を図３ｆ〜ｈに示す。図３ｆに示すように糖尿病ラットにおいては対照ラットに比較して２０週令までは腎臓レニンｍＲＮＡレベルが低かったが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。図３ｇに示すように対照ラット及び糖尿病ラットの両方において２８週令で腎臓ＡＣＥ  ｍＲＮＡのレベルは低下したが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。図３ｈに示すように、対照ラット及び糖尿病ラットの両方において、加齢に伴い腎臓アンジオテンシンｍＲＮＡレベルが低下したが、ｐ４ペプチド投与は対照ラット及び糖尿病ラットのいずれにも一切影響を与えなかった。
＊はＣ群とＤＭ群との間で有意差があることを示す。
（実験例３）
（ｐ４によるアンジオテンシンＩＩ非依存性機序の糖尿病性腎症の発症・進展抑制効果の検討）
４週令雄のアンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子欠損（ＡＴ−ＫＯ）マウスまたは野生型（Ｗｉｌｄ）マウスに生理食塩水、ストレプトゾトシン６５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与し、それぞれ対照（Ｃ）群、糖尿病（ＤＭ）群を作成した。さらにＤＭ群の一部にマウスプロレニンプロフラグメント”ｈａｎｄｌｅ”領域を含むｐ４ペプチドを浸透圧ミニポンプを用いて持続皮下注入し、ＤＭ＋ｐ４群を作成した。浸透圧ミニポンプは２８日間用のものを用いて２８日毎に入れ替えた。上記処置後２４週を経過した時点で、マウスを無麻酔下で断頭堵殺し腎臓を摘出し上記ＰＡＳ染色法により病理組織を検討した。
（結果）
図４ａに示すように、腎組織所見はＡＴ−ＫＯマウス、Ｗｉｌｄマウスのいずれにおいても、Ｃ群で正常であり、ＤＭ群で腎糸球体硬化病変が顕著であり、ＤＭ＋ｐ４群で腎糸球体硬化病変は抑制されほぼ正常に近い状態であった。腎糸球体１０個あたりの硬化病変の面積を測定しＷｉｌｄ（Ｃ）を１とした場合の各群（ｎ＝６匹）における比を図４ｂに示す。Ｗｉｌｄ（Ｃ）と比べてＷｉｌｄ（ＤＭ）は１９．２±２．３と有意に増加し、Ｗｉｌｄ（ＤＭ＋ｐ４）では１．５±０．８とＷｉｌｄ（Ｃ）と同等レベルまで有意に抑制された。ＡＴ−ＫＯ（Ｃ）は０．９±０．３であり、ＡＴ−ＫＯ（ＤＭ）は１３．９±１．８とＷｉｌｄ（ＤＭ）と比べて小さかったがＡＴ−ＫＯ（Ｃ）と比べて有意に増加しており、ＡＴ−ＫＯ（ＤＭ＋ｐ４）では１．４±０．７とＡＴ−ＫＯ（Ｃ）と同等レベルまで有意に抑制された。
＊はＣ群とＤＭ群との間で有意差があることを示す。＋はＡＴ−ＫＯ群とＷｉｌｄ群との間で有意差があることを示す。
【産業上の利用可能性】  組織アンジオテンシンＩＩが循環血中レニン・アンジオテンシン系とは独立して機能を有し（Ｊ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１０：Ｓ１３−Ｓ２６，１９９２）、高血圧・（糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症を含む）糖尿病合併症・腎疾患・心不全・心筋梗塞・心肥大・心筋症・脳血管障害・動脈硬化の発症と進展に深く関与することは、従来の数多くの報告によって明らかな事実である（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１３：Ｓ１７３−Ｓ１７８，２００２）。組織プロレニン活性化阻害因子の皮下投与は、組織アンジオテンシンＩＩ濃度を統計学的有意に低下させ、糖尿病合併症の１つである糖尿病性腎症を完全に抑制した。それゆえ、本発明による組織プロレニン活性化阻害因子は、組織内アンジオテンシンＩＩ産生亢進に関係する各種疾患、例えば高血圧・（糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症を含む）糖尿病合併症・腎疾患・心不全・心筋梗塞・心肥大・心筋症・脳血管障害・動脈硬化の発症と病態進展を抑制する効果が期待できる薬剤であると考えられる。
さらに本発明によれば、組織プロレニン活性化阻害因子の皮下投与は、野生型マウスのみならずアンジオテンシンＩＩ受容体遺伝子欠損マウスにおいても、糖尿病性腎症を完全に抑制した。このことから、従来より上記疾患に用いられてきたレニン・アンジオテンシン系依存性の阻害薬（ＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシンＩＩ阻害薬）に比べて、本発明の組織プロレニン活性化阻害因子は、レニン・アンジオテンシン非依存性の未知の作用機構をも抑制して上記疾患を予防・治療することが期待できる薬剤であると考えられる。すなわち、本発明の物質により、組織アンジオテンシンＩＩ依存性のみならず、非依存性の動脈硬化症、心・脳血管疾患及び／若しくは糖尿病合併症に対する広く適用可能な発症予防又は治療剤が提供された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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