(57)【要約】本発明の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、酸分離を行う溶離液を貯めたタンク（９）と、前記溶離液を送液するポンプ（１２）と、試料を前記溶離液に注入する試料注入部（１３）と、前記試料注入部（１３）から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラム（１４）を有する系から供給される溶離液と、キノン及び支持電解質が含有されたキノン溶液を貯めたタンク（８）と、前記キノン溶液を送液するポンプ（１１）を有する系から供給されるキノン溶液を混合する液混合部（１５）と、前記試料から分離された前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部（１６）を備えるようにしたものである。このような構成による潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置においては、血液の検査を行うことなく、短時間、かつ簡単、正確に潰瘍性大腸炎の診断を行うことが可能となる。
2005012898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンクと、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプと、試料を前記溶離液に注入する試料注入部と、前記試料注入部から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムとを有する分離系から供給される溶離液と、キノン、及び支持電解質を含むキノン溶液を貯めた溶液タンクと、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプとを有する送液系から供給されるキノン溶液とを混合する液混合部と、
前記液混合部から流出する混合液に含まれる前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部とを備え、
前記酸度測定部は、前記液混合部にて前記キノン溶液に順次混合される前記試料中の短鎖脂肪酸の酸度を連続的に測定する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部は、前記キノン溶液が流れる主管と、前記溶離液が流れる側管とを有し、
前記側管は、その先端部の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように、前記主管内部に貫入されている、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項３】
請求の範囲第２項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部は、前記側管の先端部の断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項４】
請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸度測定部は、前記キノンの電気化学反応が進行する作用電極と、
前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極と、
前記作用電極と対になり電流を流す対極を有し、
前記作用電極の電位が前記参照電極に対して一定となるように電圧を印加し、前記作用電極に流れる前記キノンの電流を測定する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項５】
請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸分離カラムは、イオン交換基と同じ電荷をもつイオンを静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラムである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項６】
請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記溶離液タンクからの流路と溶液タンクからの流路に、前記キノン溶液と前記溶離液中の気泡、及び溶存酸素を除去するデガッサーを備えた、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項７】
請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項８】
請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項９】
請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記溶離液は、０．１ｍＭの過塩素酸を含有した水溶液である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１０】
請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記キノン溶液は、３ｍＭ〜６ｍＭのキノンと、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウムを含有したエタノール溶液である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１１】
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記試料は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の６種類の短鎖脂肪酸を含有する、人の便である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１２】
請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸度測定部の酸度測定感度は、５μＭ〜２ｍＭまで測定できる、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１３】
請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部と前記酸度測定部との間に設けられる流路の長さは、２０ｍｍ〜８０ｍｍである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１４】
一定の流量で酸分離カラムに流出される溶離液に測定試料を注入し、前記酸分離カラムにて、前記測定試料中に含まれる短鎖脂肪酸を分離する酸分離ステップと、
一定の流量で送液されるキノンと支持電解質を含有したキノン溶液に、前記酸分離カラムより流出する前記溶離液を混入する液混合ステップと、
前記液混合ステップにおいて、前記キノン溶液に順次混入される前記測定試料中の短鎖脂肪酸の酸度を、連続的に測定する酸度測定ステップとを備える、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合ステップは、
流路内の前記キノン溶液が流れる主管の流れに、前記溶離液が流れる側管の流れを混入することにより流路を形成し、
前記側管から吐出される前記溶離液を、前記主管内部を流れるキノン溶液に対して平行に吐出することにより、前記溶離液を前記キノン溶液中に均一に拡散する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、潰瘍性大腸炎を発見し、また薬物療法を中心とした治療を適切に行うために、便中に含まれる短鎖脂肪酸を個別に分離し、各々の短鎖脂肪酸を電気化学的方法で測定する潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置及び測定方法に関する。
【背景技術】  潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）は、「主として粘膜と粘膜下層をおかす、大腸とくに直腸の特発性、非特異性の炎症性疾患。３０歳以下の成人に多いが、小児や５０歳以上の者にも見られる。原因は不明で、免疫病理学的機序や心理学的要因の関与が考えられている。通常血性下痢と種々の程度の全身症状を示す。長期にわたり、かつ大腸全体をおかす場合には悪性化の傾向がある。」とされている、炎症性腸疾患の一種である。粘膜を超えて組織が浅く欠損する糜爛（びらん）や、深く欠損する潰瘍が大腸に形成され、下痢、血便、腹痛や発熱などの症状を呈する。この疾患は、良性でありながら、患者のＱＯＬが著しく損なわれる原因不明の難治性疾患で、長期経過例では癌化するリスクが高くなる。わが国では、生活習慣の欧米化に伴い着実に増加を続けている。特定疾患の申請をしている日本の患者数は平成１１年末で特定疾患受給者証の数で約６０６００人であり、最近は年間約４０００人の方が発病していて患者数は増加し続けている。世界的にみると、欧米諸国を中心に患者数が多く、北欧やアメリカの白人、ユダヤ人に特に多いと言われている。また、様々な治療にもかかわらず、８〜９割の人が何回も再発を繰り返すのがこの病気の特徴である。
潰瘍性大腸炎の診断は、細菌性赤痢、アメーバー赤痢、日本住血吸中病、大腸結核などの感染性大腸炎、及び放射性腸炎、虚血性大腸炎、肉芽腫性大腸炎を除きＸ線所見、内視鏡所見、及び生検組織所見などから総合的に判断される。初期的な発見方法としては、潰瘍性大腸炎の症状で最も多く見られる便中の出血を検査する方法が一般的に集団検診等で行われている。便中の出血を調べて潰瘍性大腸炎等を検査する従来の方法は、排便中の潜血成分のヘモグロビンを、採便具により採取して、抗ヘモグロビン抗体を用いて免疫学的測定方法により測定する方法がある。しかし、この検査方法は手軽ではあるが、排便中のヘモグロビンを検便試料として長期間保存するため、保存中にヘモグロビンが分解し、ヘモグロビンを正確に測定できないといった問題が生じていた。ヘモグロビンの分解を抑制するため、ペニシリンや非ペニシリン系抗生物質を添加する方法が、特開平７−７２１５４号公報に開示されているが、上記検査方法は測定に長時間を費やし、また、出血性の排便は、潰瘍性大腸炎に限らず、痔ろう等の慢性疾患でも起こり得るため、便中のヘモグロビンの存在が測定できても、それが痔ろうによる出血なのか、潰瘍性大腸炎等による出血なのかを区別することはできず、測定結果の正確性は低いものであった。このため、免疫学的測定方法とは異なる、新たな潰瘍性大腸炎の検査方法の創出が望まれている。
ところで、潰瘍性大腸炎に関して、患者の便中細菌とその代謝産物である短鎖脂肪酸との関係が、中村正樹著，日本消化器病学会雑誌，（財）日本消化器病学会，１９８９年８月，第８６巻，第８号，ｐ．１６２７−１６３７において報告されており、前記文献では、潰瘍性大腸炎患者の便中細菌数は健常人と比べ減少すると報告されている。なかでも嫌気性菌数が減少すると共に好気性菌数が増加し、この結果、健常人に比べて、腸内細菌による糖質の代謝産物である短鎖脂肪酸の濃度が便中細菌数に比例して減少し、非揮発性の短鎖脂肪酸である乳酸濃度が、揮発性の短鎖脂肪酸である酢酸、プロピオン酸、吉草酸、イソ吉草酸の濃度の総和に対して高くなると報告されている。また、病変が拡大するほど、そして緩解期より活発期にあたるほど乳酸濃度は増加すると報告されている。
かかる見識に基づけば、健常人では揮発性短鎖脂肪酸に対して乳酸が少ないため、乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率は小さい値をとるが、潰瘍性大腸炎患者の便では短鎖脂肪酸が少なく乳酸が多いため、乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率は相対的に大きな値をとることになる。従って、乳酸と揮発性短鎖脂肪酸の比率を正確に測定することができれば、上述した従来技術とは全く異なる潰瘍性大腸炎測定装置を得ることが可能となる。
このような潰瘍性大腸炎測定装置を実現するためには、非揮発性の乳酸と揮発性短鎖脂肪酸の濃度を正確に測定する必要がある。従来の短鎖脂肪酸の測定方法としては、短鎖脂肪酸の蛍光誘導体化による検出方法が知られている。かかる方法では、便から短鎖脂肪酸を溶液中に抽出した後、９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ（ＡＤＡＭ試薬）と短鎖脂肪酸のカルボキシル基をエステル結合させることで、短鎖脂肪酸を蛍光誘導体化し、高速液体クロマトグラフで分離して蛍光検出を行っている。
しかしながら、上述した蛍光法で短鎖脂肪酸の濃度を測定する場合、短鎖脂肪酸に蛍光物を誘導体化するという測定前準備で２時間程度を要するという欠点があり、また、当該方法を使用した測定装置は、測定装置の精度の指標である測定値のＲＳＤ（相対標準偏差）が大きく、高精度の測定を行なうことができない。  また、上述した蛍光法とは異なり、脂肪酸等の有機酸の酸度を簡易に、しかも短時間で測定する方法として、アンペロメトリーを利用する測定方法が、高村喜代子，楠文代著，「デターミネーション・オブ・ザ・フリー・ファッティ・アシッド・コンテント・イン・ファッツ・アンド・オイルズ・バイ・フロー・インジェクション・アナリシス・ウィズ・エレクトロケミカル・ディテクション（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｉｌｓ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」，アナリティカル・サイエンシイズ（ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ），１９９５年１２月，第１１巻，第６号，ｐ．９７９−９８１において提案されている。これは有機溶媒中に支持電解質と、ビタミンＫ３などのキノンを入れた共存電解液を一定流量で流している送液系に、作用電極と対極と参照極を設け、前記参照極に対して前記作用電極が一定の電位を示すように前記作用電極と前記対極の間に電圧を印加し、この状態で有機酸を含有した測定試料を一定量注入して前記測定試料中の酸度に比例した電流値を得るものである。
このような、短鎖脂肪酸をアンペロメトリーで測定する方法と、高速液体クロマトグラフなどが持つ酸分離カラムを用いて種々の短鎖脂肪酸に分離する方法とを組み合わせて、上述した蛍光法と同じように一般的なポストカラム誘導体化法を利用して、短鎖脂肪酸の濃度を測定することも考えられる。第７図は従来の高速液体クロマトグラフのポストカラム誘導体化法を行なうための装置を示す図である。第７図において、３４は移動相を、３５は誘導体化試薬を、３６は分離カラムを、３７はミキシングデバイスを、３８は紫外・可視吸光検出器をそれぞれ表す。第７図に示す装置においてポストカラム誘導体化法を行なう場合、移動相３４と誘導体化試薬３５を混合し、ミキシングデバイス３７で十分な混合行なった後、移動相３４と誘導体化試薬３５を反応させる必要があり、このため、ミキシングデバイス３７の後段に反応コイルを設ける必要がある。反応コイルは誘導体化反応の種類によってその特性が異なるが、通常の高速液体クロマトグラフ分離系を使用する場合は、内径が０．５〜０．８ｍｍ程度のステンレスやテフロン（登録商標）製のチューブを用いる。ここで、ピーク拡散を最小限に止めるためには、カラム溶出液と反応溶液は１：１の割合で混合するのが良く、また、反応コイルの長さは、必要以上に長くしないのが良いと考えられる。
しかしながら、このような従来の高速液体クロマトグラフの一般的なポストカラム誘導体化法を利用してアンペロメトリーで測定する方法では、反応コイルで移動相３４と誘導体化試薬３５とを、バラツキなく、素早く反応させるための様々な工夫をしても、測定するピークがブロードになってしまい、感度がとれないという問題があった。
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、血液の検査を行うことなく、便中の短鎖脂肪酸濃度を測定して、短時間、簡易、且つ正確に腫瘍性大腸炎を判定するための潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置、及び測定方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明の請求の範囲第１項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンクと、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプと、試料を前記溶離液に注入する試料注入部と、前記試料注入部から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムとを有する分離系から供給される溶離液と、キノン、及び支持電解質を含むキノン溶液を貯めた溶液タンクと、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプとを有する送液系から供給されるキノン溶液とを混合する液混合部と、前記液混合部から流出する混合液に含まれる前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部とを備え、前記酸度測定部は、前記液混合部にて前記キノン溶液に順次混合される前記試料中の短鎖脂肪酸の酸度を連続的に測定することを特徴とするものである。
これにより、便中に含まれる種々の短鎖脂肪酸を、簡易な操作にて、短時間、かつ正確に測定することができ、また、潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の自動化が可能となる。
本発明の請求の範囲第２項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部は、前記キノン溶液が流れる主管と、前記溶離液が流れる側管とを有し、前記側管は、その先端部の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように、前記主管内部に貫入されていることを特徴とするものである。
これにより、主管を流れるキノン溶液中に側管内部を流れる試料をばらつき無く拡散することが可能となり、測定精度の向上を図ることが可能となる。
本発明の請求の範囲第３項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第２項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部は、前記側管の先端部の断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下であることを特徴とするものである。
これにより、主管内部を流れるキノン溶液中に、側管内部を流れる試料をばらつき無く拡散することが可能となり、測定精度の向上を図ることが可能となる。
本発明の請求の範囲第４項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸度測定部は、前記キノンの電気化学反応が進行する作用電極と、前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極と、前記作用電極と対になり電流を流す対極を有し、前記作用電極の電位が前記参照電極に対して一定となるように電圧を印加し、前記作用電極に流れる前記キノンの電流を測定することを特徴とするものである。
これにより、アンペロメトリーで正確に測定することが可能となる。
本発明の請求の範囲第５項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸分離カラムは、イオン交換基と同じ電荷をもつイオンを静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラムであることを特徴とする。
これにより、試料中の種々の短鎖脂肪酸を分離することが容易にできるようになる。
本発明の請求の範囲第６項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記溶離液タンクからの流路と溶液タンクからの流路に、前記キノン溶液と前記溶離液中の気泡、及び溶存酸素を除去するデガッサーを備えたことを特徴とするものである。
これにより、キノン溶液に含まれ、ノイズの原因となる溶存酸素や気泡を除去することができ、測定精度の向上を図ることが可能となる。
本発明の請求の範囲第７項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とするものである。
これにより、種々の短鎖脂肪酸を効率よく分離することができる。
本発明の請求の範囲第８項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とするものである。
これにより、試料中の酸度を正確に測定することができる。
本発明の請求の範囲第９項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記溶離液は、０．１ｍＭの過塩素酸を含有した水溶液であることを特徴とするものである。
これにより、試料中の種々の短鎖脂肪酸を分離することができる。
本発明の請求の範囲第１０項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記キノン溶液は、３ｍＭ〜６ｍＭのキノンと、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウムを含有したエタノール溶液であることを特徴とするものである。
これにより、試料中の酸度を正確に測定することができる。
本発明の請求の範囲第１１項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記試料は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の６種類の短鎖脂肪酸を含有する、人の便であることを特徴とするものである。
これにより、乳酸と揮発性酸である酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の総和との比を簡便に求めることができる。
本発明の請求の範囲第１２項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸度測定部の酸度測定感度は、５μＭ〜２ｍＭまで測定できることを特徴とするものである。
これにより、短鎖脂肪酸の酸度を幅広い範囲で測定できる。
本発明の請求の範囲第１３項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１項ないし第１２項のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部と前記酸度測定部との間に設けられる流路の長さは、２０ｍｍ〜８０ｍｍである  ことを特徴とするものである。
これにより、ノイズが発生せず、ピークがブロードにならない測定ができる。
本発明の請求の範囲第１４項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法は、一定の流量で酸分離カラムに流出される溶離液に測定試料を注入し、前記酸分離カラムにて、前記測定試料中に含まれる短鎖脂肪酸を分離する酸分離ステップと、一定の流量で送液されるキノンと支持電解質を含有したキノン溶液に、前記酸分離カラムより流出する前記溶離液を混入する液混合ステップと、前記液混合ステップにおいて、前記キノン溶液に順次混入される前記測定試料中の短鎖脂肪酸の酸度を、連続的に測定する酸度測定ステップとを備えることを特徴とするものである。
これにより、従来の方法に比べ便中の種々の短鎖脂肪酸を前処理することなく測定することができ、短時間で正確な測定ができる。
本発明の請求の範囲第１５項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求の範囲第１４項に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合ステップは、流路内の前記キノン溶液が流れる主管の流れに、前記溶離液が流れる側管の流れを混入することにより流路を形成し、前記側管から吐出される前記溶離液を、前記主管内部を流れるキノン溶液に対して平行に吐出することにより、前記溶離液を前記キノン溶液中に均一に拡散することを特徴とするものである。
これにより、主管のキノン溶液中に側管の試料がばらつき無く拡散することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の外観図である。
第２図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の概略図である。
第３図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の液混合部の断面図である。
第４図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の酸度測定部の電極詳細図である。
第５（ａ）図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置に試料を採取するためのツールを示す分解図である。
第５（ｂ）図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置に試料を採取するためのツールを示す組立断面図である。
第６図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置で便中の短鎖脂肪酸量を酸度測定部で測定した場合の、試料を注入してからの保持時間と還元電流との相関図である。
第７図は、従来の高速液体クロマトグラフのポストカラム誘導体化法を行なうための装置を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
実施の形態１．
第１図は、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の外観図である。
第１図において、１は本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置を内部に納める筐体、２は分離カラムを交換するためのドア、３は測定過程および測定結果を表示するディスプレー、４は測定試料を注入するための試料注入部、５は各種操作を行うための操作ボタン、６はトグルスイッチ、７は測定中に溜まった廃液を廃棄するための廃棄ドアである。
第２図は、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の構成を表す概略図である。
第２図において、８は電気化学的酸度測定を行うための電解液を溜めておくための溶液タンクである。電解液は、溶媒としてエタノールを、支持電解質として過塩素酸リチウムを、キノンとしてビタミンＫ３（以降ＶＫ３と呼ぶ）を含有するものを使用している。ここで、過塩素酸リチウムの濃度が薄いとキノン溶液の抵抗が大きくなると共にノイズである充電電流の変動が大きくなり、また、その濃度が高いと塩の析出が生じてしまう。このため、過塩素酸リチウムの濃度は、５０ｍＭ〜１５０ｍＭとするのが好ましい。また、本発明においては、後述する酸度測定部１６において、キノンの濃度に対する微量の酸を測定することとしているため、キノンの濃度については、溶媒との関係における溶解可能な範囲で、測定対象である酸の濃度よりも十分濃い必要がある。このため、エタノールを溶媒として使用する場合のキノン濃度は、３ｍＭ〜６ｍＭとするのが好ましく、本実施の形態１においては、キノン濃度を３ｍＭとしている。なお、上記溶媒は、エタノールの他に、メタノールやプロパノール、あるいはメタノール、エタノール、プロパノールの２〜３種混合系を使用しても良く、支持電解質は、上記過塩素酸リチウムの他に、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、過塩素酸テトラメチルアンモニウム、過塩素酸テトラエチルアンモニウムを使用しても良く、また、キノンは、ＶＫ３の他に、３，５−ジ−ｔ−ブチル１，２ベンゾキノン（ＤＢＢＱ）、テトラブロモ１，２ベンゾキノンを使用しても良い。
９は酸分離を行うための溶離液を貯めておくための溶離液タンクである。溶離液は０．１ｍＭの過塩素酸水溶液を使用している。ここで、溶離液としての過塩素酸の濃度を、例えば１ｍＭ程度まで濃くすると、後述する酸度測定部１６におけるベースライン電流が増加し、測定結果にノイズが多く重畳されることになる。また、過塩素酸の濃度を例えば０．０１ｍＭのように極端に薄くすると、短鎖脂肪酸が酸分離カラムから溶出しなくなり、ピークとして出現しなくなる。このため、過塩素酸の濃度は、０．０７ｍＭ〜０．３ｍＭ程度の濃度とするのが好ましい。なお、本実施の形態１では、後述するように酸分離カラム１４としてイオン排除型カラムを使用しており、使用する溶離液は、上記過塩素酸水溶液の他に、リン酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸を使用しても良い。また、酸分離カラムとして逆相カラムを使用する場合は、水とメタノール、エタノール、アセトニトリル、プロパノールの２〜４種混合系が適しており、イオン交換カラムを使用する場合は、過塩素酸水溶液、リン酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸が適する。
１０は電解液と溶離液中の気泡や溶存酸素を除去するためのデガッサーである。１１はキノン溶液を送液するポンプＡであり、流量１ｍｌ／分でキノン溶液を液混合部１５まで供給する。ここで、前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎになるようにする。これは、酸度測定部１６におけるキノン溶液の流速が上記流速よりも遅い場合は、分離した酸が拡散してしまうので、酸度測定時のピークがブロードになり測定誤差が生じることになり、また、上記流速より早い場合は、電極２４での還元反応のスピードが間に合わなくなるため、電極反応の応答性が悪くなり、測定誤差が生じることによる。
１２は溶離液を送液するポンプＢであり、流量０．６ｍｌ／分で溶離液を液混合部１５まで供給する。ここで、前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎになるようにする。これは、酸分離カラム１４の溶離液の流量が上記流速よりも遅い場合、測定時間がかかるのみならず、分離した酸が拡散してしまうので、酸度測定時のピークがブロードになり測定誤差が生じ、また、上記流速より早い場合は、酸を分離することができなくなることによる。なお、ポンプＡ１１、及びポンプＢ１２は、ＪＩＳ  Ｋ０１２４  高速液体クロマトグラフ分析通則４．２分離部（２）ポンプで規定されるポンプの使用が望ましい。
１３は試料を溶離液中に注入するための試料注入部である。１４は試料注入部１３で注入された試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムである。本実施の形態１では、酸分離カラム１４として、イオン交換基と同じ電荷をもつイオン（共通イオン）を静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラム（島津製ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（２５０ｍｍ×７．８ｍｍ  ｉ．ｄ．））を使用する。酸分離カラム１４は、上記イオン排除型カラムの他に、サンプルの２相間（移動相と固定相）の分配平衡の差によって目的試料を分離するＯＤＳなどの逆相カラムや、イオン交換基と反対の電荷をもつイオン（対イオン）を静電的な親和力の差によって目的試料を分離するイオン交換カラムを使用することも可能であるが、測定精度を高めるためには、イオン排除型カラムの使用が望ましい。
１５は酸分離カラム１４から流出する溶離液とポンプＢ１２で送液されるキノン溶液とを混合する液混合部であり、その詳細な構成について第３図を用いて説明する。第３図は、液混合部１５の断面図である。
第３図において、２１はキノン溶液が流れる主管であり、２２は分離された短鎖脂肪酸を含む溶離液が流れる側管であり、２３は側管２２の先端部である。第３図に示すように、液混合部１５では、主管２１の一部に側管２２を突き刺して、側管２２の先端部２３を主管２１の内部に挿入し、更に、側管先端部２３を主管２１の中央の位置で位置決めする。この際に、側管先端部２３が主管２１内部のキノン溶液流出方向に対して平行であり、かつ側管先端部２３の開口面が、主管２１の内径面に対して平行になるようにする。以上の構成により、主管２１内部の流れに側管２２の流れを混入させて流路を形成し、側管２２内部を流れる溶離液を、主管２１内部のキノン溶液の流れに対して平行に吐出させる。なお、本実施の形態１においては、側管先端部２３の開口面の面積が、主管２１の内部断面積に対して、１／３になるように設計しているが、側管先端部２３の半径と主管２１の内部断面積との関係は上記の値に限られるものではなく、側管２２が主管２１の内部に入ることができるものであれば良い。
ここで、液混合部１５にてキノン溶液に混入した短鎖脂肪酸は、後述する酸度測定部１６に送液されるが、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路においても短鎖脂肪酸を分離した溶離液とキノン溶液の混合が行なわれるため、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さが短いと、十分な混合が行なわれず、ピークが低くなる。一方で、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さが長いと酸が拡散するため、短鎖脂肪酸のピーク幅が広がり、ピーク高さが低下する。このため、最も良好なピーク高さを得るためには、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路の長さを４０〜６０ｃｍとするのが好ましい。なお、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路は、２０〜８０ｃｍであれば良好なピーク高さを得ることができるため、装置の設計に応じて、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さを変更することが可能である。
１６は分離された短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部であり、その詳細な構成を第４図を用いて説明する。第４図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の酸度測定部の電極詳細図である。
第４図において、２４はキノン溶液中のキノンの電気化学反応が進行する作用電極であり、グラッシーカーボンを用いる。２５は前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極であり、飽和カロメロ電極（以降ＳＣＥと呼ぶ）を用いる。２６は作用電極と対になり電極を流す対極である。対極２６は流路を囲むように形成されており、材料はステンレスを使用している。２７はキノン溶液の通路を確保するためのスペーサ、２８は電極中を流れていく電解液である。酸度測定部１６では、作用電極２４の電位が参照電極２５に対して一定となるように電位制御装置（ポテンシオスタット）を用いて電圧を印加し、作用電極２４に流れるキノンの電流を測定する。
１７は測定後のキノン溶液と溶離液を貯蔵する廃液槽であり、１８はこの装置の電源を供給する電源ボックスであり、１９はこの装置を制御する制御基板であり、２０は種々の短鎖脂肪酸の酸度に対する還元電流値を表示するディスプレーである。
以上のように構成される潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の動作につき、以下説明する。
まず、測定試料を準備するため、第５（ａ）図、及び第５（ｂ）図に示す採取便ツール２９を用いて、便を採取する。第５（ａ）図は、採取便ツール２９の分解図を表し、第５（ｂ）図は、採取便ツール２９の組立断面図を表す。採取便ツール２９の先端のぎざぎざ部３０にて便を採取し、第５（ｂ）図に示すように、３％のフェノール水溶液で構成された殺菌水３２で満たされる採取容器３１に保管する。短鎖脂肪酸は、保管中に便中の殺菌水３２中に抽出されており、短鎖脂肪酸が抽出された殺菌水３２から固形物をメンブレンフィルターなどでフィルタリングする。なお、フィルタリングされた殺菌水３２中の短鎖脂肪酸の濃度が０．００５ｍＭ〜２ｍＭになるように便の量、及び殺菌水３２の量をコントロールする。
次に、潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置を起動させる。溶離液は、ポンプＢ１２により、流量０．６ｍｌ／分で溶離液タンク９からデガッサー１０を通って酸分離カラム１４へ送られ、酸分離カラム１４を通過後、液混合部１５に到達する。また、キノン溶液は、ポンプＡ１１により、流量１ｍｌ／分で溶液タンク８からデガッサー１０を通って液混合部１５まで供給される。
次に、殺菌水３２の中から試料として２０μＬを取り出し、試料注入部１３に注入する。試料に含まれる短鎖脂肪酸は、溶離液に混入し、酸分離カラム１４に運ばれる。
酸分離カラム１４では、試料に含まれる複数の短鎖脂肪酸が分離され、分離した短鎖脂肪酸は順次液混合部１６に送られる。
液混合部１５は、上述のように、側管２２の側管先端部２３が主管２１の中央に位置し、かつ側管先端部２３の開口面が、主管の内径面に平行になるよう構成しているので、主管２１内の電解液の流れにより側管先端部２３の出口部分の圧力が低圧になり、このため、側管２２内を通過してきた溶離液は側管２２の出口で圧力が開放され、第３図に示すように、溶離液は側管２２出口で霧状に拡散しながらキノン溶液に混入していく。液混合部１５にて溶液に混入した短鎖脂肪酸は、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路においてさらにキノン溶液と混合されながら酸度測定部１６に送液される。
酸度測定部１６に送られた混合溶液は、第４図に示すように、スペーサ２７によって形成された流路を矢印の方向に流れていく。参照電極２５に対して作用電極２４の電位が−０．５３Ｖになるように作用電極２４と対極２６の間に電圧が印加されており、これにより、試料より分離された短鎖脂肪酸を含むキノン溶液が酸度測定部１６を通過すると、短鎖脂肪酸の酸度に比例する電流が得られる。短鎖脂肪酸を含むキノン溶液は、酸分離カラムから短鎖脂肪酸が分離される毎に液混合部１５を経て酸度測定部１６に供給されるため、酸度測定部１６は、試料に含まれる短鎖脂肪酸の酸度に比例する電流を連続的に検出していく。
第６図は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置で便中の短鎖脂肪酸量を酸度測定部１６で測定した場合の、試料を注入してからの保持時間と還元電流との相関図である。第６図において、横軸は試料を注入してからの保持時間、縦軸は酸度測定部で測定したＶＫ３の還元電流値を示す。乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸を含有した標準液を予め作成し、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断及び予後試験用測定装置で測定して保持時間に従う各種短鎖脂肪酸のピーク発生位置を予め確認しておけば、測定試料に含まれる各種の短鎖脂肪酸を特定することができる。なお、短鎖脂肪酸の標準溶液を用いて検量線を作成したところ、酸度測定の感度が５μＭ〜２ｍＭの範囲においてよい直線関係が得られる。本実施の形態１では、キノン溶液を３ｍＭとして測定するので、酸が５μＭ以下では検出の限界となり、２ｍＭより濃い濃度では、ピークが頭打ちになる。
以上のように、本実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置によれば、酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンク９と、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプ１２と、試料を前記溶離液に注入する試料注入部１３と、前記試料注入部１３から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラム１４を有する系から供給される溶離液と、キノン及び支持電解質が含有されたキノン溶液を貯めた溶液タンク８と、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプ１１を有する系から供給されるキノン溶液を混合する液混合部１５と、前記試料から分離された前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部１６とを備えるようにしたので、保管された殺菌水から得られた試料を試料注入部から注入することで簡単に揮発性短鎖脂肪酸の総和と乳酸の濃度を求めて乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率を算出することができ、これにより、潰瘍性大腸炎を高精度で発見することが可能となる。
また、酸度測定部１６において電気化学的測定法により試料中の揮発性短鎖脂肪酸の総和と乳酸の濃度を測定することとしたので、試料が少なくても迅速に測定することができる。
また、液混合部１５において、前記溶離液が流れる側管２２をキノン溶液が流れる主管２１の内部に挿入し、側管２２の先端部２３の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように位置決めすることとしたので、作用電極２４の表面にできるだけ乱流を発生させずに、溶離液をキノン溶液に混入することができ、これにより、酸度測定部１６においてブロードにならないピーク波形を得ることが可能となる。また、各種短鎖脂肪酸の量を比較する場合にはノイズ成分が一定であるため、見かけ上ノイズが影響のない状態とすることができる。
【産業上の利用可能性】    本発明の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置及び測定方法は、血液の検査を行うことなく、短時間、かつ簡単、正確に短鎖脂肪酸を測定することにより、潰瘍性大腸炎を発見し、治療中の薬物療法を適切に行うことができる点において有用である。
【図１】
2005012898.tif 000003
【図２】
2005012898.tif 000004
【図３】
2005012898.tif 000005
【図４】
2005012898.tif 000006
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【図６】
2005012898.tif 000009
【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月27日(2006.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンクと、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプと、試料を前記溶離液に注入する試料注入部と、前記試料注入部から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムとを有する分離系から供給される溶離液と、キノン、及び支持電解質を含むキノン溶液を貯めた溶液タンクと、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプとを有する送液系から供給されるキノン溶液とを混合する液混合部と、
前記液混合部から流出する混合液に含まれる前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部とを備え、
前記酸度測定部は、前記液混合部にて前記キノン溶液に順次混合される前記試料中の短鎖脂肪酸の酸度を連続的に測定する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部は、前記キノン溶液が流れる主管と、前記溶離液が流れる側管とを有し、
前記側管は、その先端部の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように、前記主管内部に貫入されている、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項３】
請求項２に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部は、前記側管の先端部の断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸度測定部は、前記キノンの電気化学反応が進行する作用電極と、
前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極と、
前記作用電極と対になり電流を流す対極を有し、
前記作用電極の電位が前記参照電極に対して一定となるように電圧を印加し、前記作用電極に流れる前記キノンの電流を測定する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項５】
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸分離カラムは、イオン交換基と同じ電荷をもつイオンを静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラムである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記溶離液タンクからの流路と溶液タンクからの流路に、前記キノン溶液と前記溶離液中の気泡、及び溶存酸素を除去するデガッサーを備えた、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項７】
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記溶離液は、０．１ｍＭの過塩素酸を含有した水溶液である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記キノン溶液は、３ｍＭ〜６ｍＭのキノンと、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウムを含有したエタノール溶液である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１１】
請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記試料は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の６種類の短鎖脂肪酸を含有する、人の便である、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１２】
請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記酸度測定部の酸度測定感度は、５μＭ〜２ｍＭまで測定できる、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１３】
請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、
前記液混合部と前記酸度測定部との間に設けられる流路の長さは、２０ｃｍ〜８０ｃｍである、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置。
【請求項１４】
一定の流量で酸分離カラムに流出される溶離液に測定試料を注入し、前記酸分離カラムにて、前記測定試料中に含まれる短鎖脂肪酸を分離する酸分離ステップと、
一定の流量で送液されるキノンと支持電解質を含有したキノン溶液に、前記酸分離カラムより流出する前記溶離液を混入する液混合ステップと、
前記液混合ステップにおいて、前記キノン溶液に順次混入される前記測定試料中の短鎖脂肪酸の酸度を、連続的に測定する酸度測定ステップとを備える、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法において、
前記液混合ステップは、
流路内の前記キノン溶液が流れる主管の流れに、前記溶離液が流れる側管の流れを混入することにより流路を形成し、
前記側管から吐出される前記溶離液を、前記主管内部を流れるキノン溶液に対して平行に吐出することにより、前記溶離液を前記キノン溶液中に均一に拡散する、
ことを特徴とする潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、潰瘍性大腸炎を発見し、また薬物療法を中心とした治療を適切に行うために、便中に含まれる短鎖脂肪酸を個別に分離し、各々の短鎖脂肪酸を電気化学的方法で測定する潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）は、「主として粘膜と粘膜下層をおかす、大腸とくに直腸の特発性、非特異性の炎症性疾患。３０歳以下の成人に多いが、小児や５０歳以上の者にも見られる。原因は不明で、免疫病理学的機序や心理学的要因の関与が考えられている。通常血性下痢と種々の程度の全身症状を示す。長期にわたり、かつ大腸全体をおかす場合には悪性化の傾向がある。」とされている、炎症性腸疾患の一種である。粘膜を超えて組織が浅く欠損する糜爛（びらん）や、深く欠損する潰瘍が大腸に形成され、下痢、血便、腹痛や発熱などの症状を呈する。この疾患は、良性でありながら、患者のＱＯＬが著しく損なわれる原因不明の難治性疾患で、長期経過例では癌化するリスクが高くなる。わが国では、生活習慣の欧米化に伴い着実に増加を続けている。特定疾患の申請をしている日本の患者数は平成１１年末で特定疾患受給者証の数で約６０６００人であり、最近は年間約４０００人の方が発病していて患者数は増加し続けている。世界的にみると、欧米諸国を中心に患者数が多く、北欧やアメリカの白人、ユダヤ人に特に多いと言われている。また、様々な治療にもかかわらず、８〜９割の人が何回も再発を繰り返すのがこの病気の特徴である。
【０００３】
潰瘍性大腸炎の診断は、細菌性赤痢、アメーバー赤痢、日本住血吸中病、大腸結核などの感染性大腸炎、及び放射性腸炎、虚血性大腸炎、肉芽腫性大腸炎を除きＸ線所見、内視鏡所見、及び生検組織所見などから総合的に判断される。初期的な発見方法としては、潰瘍性大腸炎の症状で最も多く見られる便中の出血を検査する方法が一般的に集団検診等で行われている。便中の出血を調べて潰瘍性大腸炎等を検査する従来の方法は、排便中の潜血成分のヘモグロビンを、採便具により採取して、抗ヘモグロビン抗体を用いて免疫学的測定方法により測定する方法がある。しかし、この検査方法は手軽ではあるが、排便中のヘモグロビンを検便試料として長期間保存するため、保存中にヘモグロビンが分解し、ヘモグロビンを正確に測定できないといった問題が生じていた。ヘモグロビンの分解を抑制するため、ペニシリンや非ペニシリン系抗生物質を添加する方法が、特開平７−７２１５４号公報に開示されているが、上記検査方法は測定に長時間を費やし、また、出血性の排便は、潰瘍性大腸炎に限らず、痔ろう等の慢性疾患でも起こり得るため、便中のヘモグロビンの存在が測定できても、それが痔ろうによる出血なのか、潰瘍性大腸炎等による出血なのかを区別することはできず、測定結果の正確性は低いものであった。このため、免疫学的測定方法とは異なる、新たな潰瘍性大腸炎の検査方法の創出が望まれている。
【０００４】
ところで、潰瘍性大腸炎に関して、患者の便中細菌とその代謝産物である短鎖脂肪酸との関係が、中村正樹著，日本消化器病学会雑誌，（財）日本消化器病学会，１９８９年８月，第８６巻，第８号，ｐ．１６２７−１６３７において報告されており、前記文献では、潰瘍性大腸炎患者の便中細菌数は健常人と比べ減少すると報告されている。なかでも嫌気性菌数が減少すると共に好気性菌数が増加し、この結果、健常人に比べて、腸内細菌による糖質の代謝産物である短鎖脂肪酸の濃度が便中細菌数に比例して減少し、非揮発性の短鎖脂肪酸である乳酸濃度が、揮発性の短鎖脂肪酸である酢酸、プロピオン酸、吉草酸、イソ吉草酸の濃度の総和に対して高くなると報告されている。また、病変が拡大するほど、そして緩解期より活発期にあたるほど乳酸濃度は増加すると報告されている。
【０００５】
かかる見識に基づけば、健常人では揮発性短鎖脂肪酸に対して乳酸が少ないため、乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率は小さい値をとるが、潰瘍性大腸炎患者の便では短鎖脂肪酸が少なく乳酸が多いため、乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率は相対的に大きな値をとることになる。従って、乳酸と揮発性短鎖脂肪酸の比率を正確に測定することができれば、上述した従来技術とは全く異なる潰瘍性大腸炎測定装置を得ることが可能となる。
【０００６】
このような潰瘍性大腸炎測定装置を実現するためには、非揮発性の乳酸と揮発性短鎖脂肪酸の濃度を正確に測定する必要がある。従来の短鎖脂肪酸の測定方法としては、短鎖脂肪酸の蛍光誘導体化による検出方法が知られている。かかる方法では、便から短鎖脂肪酸を溶液中に抽出した後、９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ（ＡＤＡＭ試薬）と短鎖脂肪酸のカルボキシル基をエステル結合させることで、短鎖脂肪酸を蛍光誘導体化し、高速液体クロマトグラフで分離して蛍光検出を行っている。
【０００７】
しかしながら、上述した蛍光法で短鎖脂肪酸の濃度を測定する場合、短鎖脂肪酸に蛍光物を誘導体化するという測定前準備で２時間程度を要するという欠点があり、また、当該方法を使用した測定装置は、測定装置の精度の指標である測定値のＲＳＤ（相対標準偏差）が大きく、高精度の測定を行なうことができない。
【０００８】
また、上述した蛍光法とは異なり、脂肪酸等の有機酸の酸度を簡易に、しかも短時間で測定する方法として、アンペロメトリーを利用する測定方法が、高村喜代子，楠文代著，「デターミネーション・オブ・ザ・フリー・ファッティ・アシッド・コンテント・イン・ファッツ・アンド・オイルズ・バイ・フロー・インジェクション・アナリシス・ウィズ・エレクトロケミカル・ディテクション（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｉｌｓ  ｂｙ  Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」，アナリティカル・サイエンシィズ（ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ），１９９５年１２月，第１１巻，第６号，ｐ．９７９−９８１において提案されている。これは有機溶媒中に支持電解質と、ビタミンＫ3などのキノンを入れた共存電解液を一定流量で流している送液系に、作用電極と対極と参照極を設け、前記参照極に対して前記作用電極が一定の電位を示すように前記作用電極と前記対極の間に電圧を印加し、この状態で有機酸を含有した測定試料を一定量注入して前記測定試料中の酸度に比例した電流値を得るものである。
【０００９】
このような、短鎖脂肪酸をアンペロメトリーで測定する方法と、高速液体クロマトグラフなどが持つ酸分離カラムを用いて種々の短鎖脂肪酸に分離する方法とを組み合わせて、上述した蛍光法と同じように一般的なポストカラム誘導体化法を利用して、短鎖脂肪酸の濃度を測定することも考えられる。図７は従来の高速液体クロマトグラフのポストカラム誘導体化法を行なうための装置を示す図である。図７において、３４は移動相を、３５は誘導体化試薬を、３６は分離カラムを、３７はミキシングデバイスを、３８は紫外・可視吸光検出器をそれぞれ表す。図７に示す装置においてポストカラム誘導体化法を行なう場合、移動相３４と誘導体化試薬３５を混合し、ミキシングデバイス３７で十分な混合行なった後、移動相３４と誘導体化試薬３５を反応させる必要があり、このため、ミキシングデバイス３７の後段に反応コイルを設ける必要がある。反応コイルは誘導体化反応の種類によってその特性が異なるが、通常の高速液体クロマトグラフ分離系を使用する場合は、内径が０．５〜０．８ｍｍ程度のステンレスやテフロン（登録商標）製のチューブを用いる。ここで、ピーク拡散を最小限に止めるためには、カラム溶出液と反応溶液は１：１の割合で混合するのが良く、また、反応コイルの長さは、必要以上に長くしないのが良いと考えられる。
【００１０】
しかしながら、このような従来の高速液体クロマトグラフの一般的なポストカラム誘導体化法を利用してアンペロメトリーで測定する方法では、反応コイルで移動相３４と誘導体化試薬３５とを、バラツキなく、素早く反応させるための様々な工夫をしても、測定するピークがブロードになってしまい、感度がとれないという問題があった。
【００１１】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、血液の検査を行うことなく、便中の短鎖脂肪酸濃度を測定して、短時間、簡易、且つ正確に腫瘍性大腸炎を判定するための潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置、及び測定方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の請求項１に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンクと、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプと、試料を前記溶離液に注入する試料注入部と、前記試料注入部から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムとを有する分離系から供給される溶離液と、キノン、及び支持電解質を含むキノン溶液を貯めた溶液タンクと、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプとを有する送液系から供給されるキノン溶液とを混合する液混合部と、前記液混合部から流出する混合液に含まれる前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部とを備え、前記酸度測定部は、前記液混合部にて前記キノン溶液に順次混合される前記試料中の短鎖脂肪酸の酸度を連続的に測定することを特徴とするものである。
これにより、便中に含まれる種々の短鎖脂肪酸を、簡易な操作にて、短時間、かつ正確に測定することができ、また、潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の自動化が可能となる。
【００１３】
本発明の請求項２に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部は、前記キノン溶液が流れる主管と、前記溶離液が流れる側管とを有し、前記側管は、その先端部の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように、前記主管内部に貫入されていることを特徴とするものである。
これにより、主管を流れるキノン溶液中に側管内部を流れる試料をばらつき無く拡散することが可能となり、測定精度の向上を図ることが可能となる。
【００１４】
本発明の請求項３に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項２に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部は、前記側管の先端部の断面積が、前記主管の内部断面積に対して１／３以下であることを特徴とするものである。
これにより、主管内部を流れるキノン溶液中に、側管内部を流れる試料をばらつき無く拡散することが可能となり、測定精度の向上を図ることが可能となる。
【００１５】
本発明の請求項４に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸度測定部は、前記キノンの電気化学反応が進行する作用電極と、前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極と、前記作用電極と対になり電流を流す対極を有し、前記作用電極の電位が前記参照電極に対して一定となるように電圧を印加し、前記作用電極に流れる前記キノンの電流を測定することを特徴とするものである。
これにより、アンペロメトリーで正確に測定することが可能となる。
【００１６】
本発明の請求項５に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸分離カラムは、イオン交換基と同じ電荷をもつイオンを静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラムであることを特徴とする。
これにより、試料中の種々の短鎖脂肪酸を分離することが容易にできるようになる。
【００１７】
本発明の請求項６に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記溶離液タンクからの流路と溶液タンクからの流路に、前記キノン溶液と前記溶離液中の気泡、及び溶存酸素を除去するデガッサーを備えたことを特徴とするものである。
これにより、キノン溶液に含まれ、ノイズの原因となる溶存酸素や気泡を除去することができ、測定精度の向上を図ることが可能となる。
【００１８】
本発明の請求項７に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とするものである。
これにより、種々の短鎖脂肪酸を効率よく分離することができる。
【００１９】
本発明の請求項８に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎであることを特徴とするものである。
これにより、試料中の酸度を正確に測定することができる。
【００２０】
本発明の請求項９に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記溶離液は、０．１ｍＭの過塩素酸を含有した水溶液であることを特徴とするものである。
これにより、試料中の種々の短鎖脂肪酸を分離することができる。
【００２１】
本発明の請求項１０に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記キノン溶液は、３ｍＭ〜６ｍＭのキノンと、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの過塩素酸リチウムを含有したエタノール溶液であることを特徴とするものである。
これにより、試料中の酸度を正確に測定することができる。
【００２２】
本発明の請求項１１に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記試料は、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の６種類の短鎖脂肪酸を含有する、人の便であることを特徴とするものである。
これにより、乳酸と揮発性酸である酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸の総和との比を簡便に求めることができる。
【００２３】
本発明の請求項１２に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記酸度測定部の酸度測定感度は、５μＭ〜２ｍＭまで測定できることを特徴とするものである。
これにより、短鎖脂肪酸の酸度を幅広い範囲で測定できる。
【００２４】
本発明の請求項１３に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置は、請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置において、前記液混合部と前記酸度測定部との間に設けられる流路の長さは、２０ｃｍ〜８０ｃｍであることを特徴とするものである。
これにより、ノイズが発生せず、ピークがブロードにならない測定ができる。
【００２５】
本発明の請求項１４に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法は、一定の流量で酸分離カラムに流出される溶離液に測定試料を注入し、前記酸分離カラムにて、前記測定試料中に含まれる短鎖脂肪酸を分離する酸分離ステップと、一定の流量で送液されるキノンと支持電解質を含有したキノン溶液に、前記酸分離カラムより流出する前記溶離液を混入する液混合ステップと、前記液混合ステップにおいて、前記キノン溶液に順次混入される前記測定試料中の短鎖脂肪酸の酸度を、連続的に測定する酸度測定ステップとを備えることを特徴とするものである。
これにより、従来の方法に比べ便中の種々の短鎖脂肪酸を前処理することなく測定することができ、短時間で正確な測定ができる。
【００２６】
本発明の請求項１５に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法は、請求項１４に記載の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定方法において、前記液混合ステップは、流路内の前記キノン溶液が流れる主管の流れに、前記溶離液が流れる側管の流れを混入することにより流路を形成し、前記側管から吐出される前記溶離液を、前記主管内部を流れるキノン溶液に対して平行に吐出することにより、前記溶離液を前記キノン溶液中に均一に拡散することを特徴とするものである。
これにより、主管のキノン溶液中に側管の試料がばらつき無く拡散することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、ここで示す実施の形態はあくまでも一例であって、必ずしもこの実施の形態に限定されるものではない。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の外観図である。
図１において、１は本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置を内部に納める筐体、２は分離カラムを交換するためのドア、３は測定過程および測定結果を表示するディスプレー、４は測定試料を注入するための試料注入部、５は各種操作を行うための操作ボタン、６はトグルスイッチ、７は測定中に溜まった廃液を廃棄するための廃棄ドアである。
【００２８】
図２は、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の構成を表す概略図である。
図２において、８は電気化学的酸度測定を行うための電解液を溜めておくための溶液タンクである。電解液は、溶媒としてエタノールを、支持電解質として過塩素酸リチウムを、キノンとしてビタミンＫ3（以降ＶＫ3と呼ぶ）を含有するものを使用している。ここで、過塩素酸リチウムの濃度が薄いとキノン溶液の抵抗が大きくなると共にノイズである充電電流の変動が大きくなり、また、その濃度が高いと塩の析出が生じてしまう。このため、過塩素酸リチウムの濃度は、５０ｍＭ〜１５０ｍＭとするのが好ましい。また、本発明においては、後述する酸度測定部１６において、キノンの濃度に対する微量の酸を測定することとしているため、キノンの濃度については、溶媒との関係における溶解可能な範囲で、測定対象である酸の濃度よりも十分濃い必要がある。このため、エタノールを溶媒として使用する場合のキノン濃度は、３ｍＭ〜６ｍＭとするのが好ましく、本実施の形態１においては、キノン濃度を３ｍＭとしている。なお、上記溶媒は、エタノールの他に、メタノールやプロパノール、あるいはメタノール、エタノール、プロパノールの２〜３種混合系を使用しても良く、支持電解質は、上記過塩素酸リチウムの他に、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、過塩素酸テトラメチルアンモニウム、過塩素酸テトラエチルアンモニウムを使用しても良く、また、キノンは、ＶＫ3の他に、３，５−ジ−ｔ−ブチル  １，２ベンゾキノン（ＤＢＢＱ）、テトラブロモ  １，２ベンゾキノンを使用しても良い。
【００２９】
９は酸分離を行うための溶離液を貯めておくための溶離液タンクである。溶離液は０．１ｍＭの過塩素酸水溶液を使用している。ここで、溶離液としての過塩素酸の濃度を、例えば１ｍＭ程度まで濃くすると、後述する酸度測定部１６におけるベースライン電流が増加し、測定結果にノイズが多く重畳されることになる。また、過塩素酸の濃度を例えば０．０１ｍＭのように極端に薄くすると、短鎖脂肪酸が酸分離カラムから溶出しなくなり、ピークとして出現しなくなる。このため、過塩素酸の濃度は、０．０７ｍＭ〜０．３ｍＭ程度の濃度とするのが好ましい。なお、本実施の形態１では、後述するように酸分離カラム１４としてイオン排除型カラムを使用しており、使用する溶離液は、上記過塩素酸水溶液の他に、リン酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸を使用しても良い。また、酸分離カラムとして逆相カラムを使用する場合は、水とメタノール、エタノール、アセトニトリル、プロパノールの２〜４種混合系が適しており、イオン交換カラムを使用する場合は、過塩素酸水溶液、リン酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸が適する。
【００３０】
１０は電解液と溶離液中の気泡や溶存酸素を除去するためのデガッサーである。１１はキノン溶液を送液するポンプＡであり、流量１ｍｌ／分でキノン溶液を液混合部１５まで供給する。ここで、前記キノン溶液の流量は、８９１ｍｍ／ｍｉｎ〜５１０２ｍｍ／ｍｉｎになるようにする。これは、酸度測定部１６におけるキノン溶液の流速が上記流速よりも遅い場合は、分離した酸が拡散してしまうので、酸度測定時のピークがブロードになり測定誤差が生じることになり、また、上記流速より早い場合は、電極２４での還元反応のスピードが間に合わなくなるため、電極反応の応答性が悪くなり、測定誤差が生じることによる。
【００３１】
１２は溶離液を送液するポンプＢであり、流量０．６ｍｌ／分で溶離液を液混合部１５まで供給する。ここで、前記酸分離カラムの溶離液の流量は、７．９６ｍｍ／ｍｉｎ〜６０．２ｍｍ／ｍｉｎになるようにする。これは、酸分離カラム１４の溶離液の流量が上記流速よりも遅い場合、測定時間がかかるのみならず、分離した酸が拡散してしまうので、酸度測定時のピークがブロードになり測定誤差が生じ、また、上記流速より早い場合は、酸を分離することができなくなることによる。なお、ポンプＡ１１、及びポンプＢ１２は、ＪＩＳ  Ｋ０１２４  高速液体クロマトグラフ分析通則４.２分離部（２）ポンプで規定されるポンプの使用が望ましい。
【００３２】
１３は試料を溶離液中に注入するための試料注入部である。１４は試料注入部１３で注入された試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラムである。本実施の形態１では、酸分離カラム１４として、イオン交換基と同じ電荷をもつイオン（共通イオン）の静電的な斥力の差によって目的試料を分離するイオン排除型カラム（島津製ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（２５０ｍｍ×７．８ｍｍ  ｉ．ｄ．））を使用する。酸分離カラム１４は、上記イオン排除型カラムの他に、サンプルの２相間（移動相と固定相）の分配平衡の差によって目的試料を分離するＯＤＳなどの逆相カラムや、イオン交換基と反対の電荷をもつイオン（対イオン）の静電的な親和力の差によって目的試料を分離するイオン交換カラムを使用することも可能であるが、測定精度を高めるためには、イオン排除型カラムの使用が望ましい。
【００３３】
１５は酸分離カラム１４から流出する溶離液とポンプＢ１２で送液されるキノン溶液とを混合する液混合部であり、その詳細な構成について図３を用いて説明する。図３は、液混合部１５の断面図である。
【００３４】
図３において、２１はキノン溶液が流れる主管であり、２２は分離された短鎖脂肪酸を含む溶離液が流れる側管であり、２３は側管２２の先端部である。図３に示すように、液混合部１５では、主管２１の一部に側管２２を突き刺して、側管２２の先端部２３を主管２１の内部に挿入し、更に、側管先端部２３を主管２１の中央の位置で位置決めする。この際に、側管先端部２３が主管２１内部のキノン溶液流出方向に対して平行であり、かつ側管先端部２３の開口面が、主管２１の内径面に対して平行になるようにする。以上の構成により、主管２１内部の流れに側管２２の流れを混入させて流路を形成し、側管２２内部を流れる溶離液を、主管２１内部のキノン溶液の流れに対して平行に吐出させる。なお、本実施の形態１においては、側管先端部２３の開口面の面積が、主管２１の内部断面積に対して、１／３になるように設計しているが、側管先端部２３の半径と主管２１の内部断面積との関係は上記の値に限られるものではなく、側管２２が主管２１の内部に入ることができるものであれば良い。
【００３５】
ここで、液混合部１５にてキノン溶液に混入した短鎖脂肪酸は、後述する酸度測定部１６に送液されるが、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路においても短鎖脂肪酸を分離した溶離液とキノン溶液の混合が行なわれるため、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さが短いと、十分な混合が行なわれず、ピークが低くなる。一方で、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さが長いと酸が拡散するため、短鎖脂肪酸のピーク幅が広がり、ピーク高さが低下する。このため、最も良好なピーク高さを得るためには、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路の長さを４０〜６０ｃｍとするのが好ましい。なお、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路は、２０〜８０ｃｍであれば良好なピーク高さを得ることができるため、装置の設計に応じて、液混合部１５と酸度測定部１６の間の長さを変更することが可能である。
【００３６】
１６は分離された短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部であり、その詳細な構成を図４を用いて説明する。図４は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の酸度測定部の電極詳細図である。
【００３７】
図４において、２４はキノン溶液中のキノンの電気化学反応が進行する作用電極であり、グラッシーカーボンを用いる。２５は前記作用電極の電位制御の基準となる参照電極であり、飽和カロメロ電極（以降ＳＣＥと呼ぶ）を用いる。２６は作用電極と対になり電流を流す対極である。対極２６は流路を囲むように形成されており、材料はステンレスを使用している。２７はキノン溶液の通路を確保するためのスペーサ、２８は電極中を流れていく電解液である。酸度測定部１６では、作用電極２４の電位が参照電極２５に対して一定となるように電位制御装置（ポテンシオスタット）を用いて電圧を印加し、作用電極２４に流れるキノンの電流を測定する。
【００３８】
１７は測定後のキノン溶液と溶離液を貯蔵する廃液槽であり、１８はこの装置の電源を供給する電源ボックスであり、１９はこの装置を制御する制御基板であり、２０は種々の短鎖脂肪酸の酸度に対する還元電流値を表示するディスプレーである。
【００３９】
以上のように構成される潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の動作につき、以下説明する。
まず、測定試料を準備するため、図５（ａ）、及び図５（ｂ）に示す採取便ツール２９を用いて、便を採取する。図５（ａ）は、採取便ツール２９の分解図を表し、図５（ｂ）は、採取便ツール２９の組立断面図を表す。採取便ツール２９の先端のぎざぎざ部３０にて便を採取し、図５（ｂ）に示すように、３％のフェノール水溶液で構成された殺菌水３２で満たされる採取容器３１に保管する。短鎖脂肪酸は、保管中に便中の殺菌水３２中に抽出されており、短鎖脂肪酸が抽出された殺菌水３２から固形物をメンブレンフィルターなどでフィルタリングする。なお、フィルタリングされた殺菌水３２中の短鎖脂肪酸の濃度が０．００５ｍＭ〜２ｍＭになるように便の量、及び殺菌水３２の量をコントロールする。
【００４０】
次に、潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置を起動させる。溶離液は、ポンプＢ１２により、流量０．６ｍｌ／分で溶離液タンク９からデガッサー１０を通って酸分離カラム１４へ送られ、酸分離カラム１４を通過後、液混合部１５に到達する。また、キノン溶液は、ポンプＡ１１により、流量１ｍｌ／分で溶液タンク８からデガッサー１０を通って液混合部１５まで供給される。
【００４１】
次に、殺菌水３２の中から試料として２０μＬを取り出し、試料注入部１３に注入する。試料に含まれる短鎖脂肪酸は、溶離液に混入し、酸分離カラム１４に運ばれる。
【００４２】
酸分離カラム１４では、試料に含まれる複数の短鎖脂肪酸が分離され、分離した短鎖脂肪酸は順次液混合部１５に送られる。
【００４３】
液混合部１５は、上述のように、側管２２の側管先端部２３が主管２１の中央に位置し、かつ側管先端部２３の開口面が、主管の内径面に平行になるよう構成しているので、主管２１内の電解液の流れにより側管先端部２３の出口部分の圧力が低圧になり、このため、側管２２内を通過してきた溶離液は側管２２の出口で圧力が開放され、図３に示すように、溶離液は側管２２出口で霧状に拡散しながらキノン溶液に混入していく。液混合部１５にて溶液に混入した短鎖脂肪酸は、液混合部１５と酸度測定部１６の間の流路においてさらにキノン溶液と混合されながら酸度測定部１６に送液される。
【００４４】
酸度測定部１６に送られた混合溶液は、図４に示すように、スペーサ２７によって形成された流路を矢印の方向に流れていく。参照電極２５に対して作用電極２４の電位が−０．５３Ｖになるように作用電極２４と対極２６の間に電圧が印加されており、これにより、試料より分離された短鎖脂肪酸を含むキノン溶液が酸度測定部１６を通過すると、短鎖脂肪酸の酸度に比例する電流が得られる。短鎖脂肪酸を含むキノン溶液は、酸分離カラムから短鎖脂肪酸が分離される毎に液混合部１５を経て酸度測定部１６に供給されるため、酸度測定部１６は、試料に含まれる短鎖脂肪酸の酸度に比例する電流を連続的に検出していく。
【００４５】
図６は、本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置で便中の短鎖脂肪酸量を酸度測定部１６で測定した場合の、試料を注入してからの保持時間と還元電流との相関図である。図６において、横軸は試料を注入してからの保持時間、縦軸は酸度測定部で測定したＶＫ3の還元電流値を示す。乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸を含有した標準液を予め作成し、本発明の実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断及び予後試験用測定装置で測定して保持時間に従う各種短鎖脂肪酸のピーク発生位置を予め確認しておけば、測定試料に含まれる各種の短鎖脂肪酸を特定することができる。なお、短鎖脂肪酸の標準溶液を用いて検量線を作成したところ、酸度測定の感度が５μＭ〜２ｍＭの範囲においてよい直線関係が得られる。本実施の形態１では、キノン溶液を３ｍＭとして測定するので、酸が５μＭ以下では検出の限界となり、２ｍＭより濃い濃度では、ピークが頭打ちになる。
【００４６】
以上のように、本実施の形態１に係る潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置によれば、酸分離を行う溶離液を貯めた溶離液タンク９と、前記溶離液を送液する少なくとも１つのポンプ１２と、試料を前記溶離液に注入する試料注入部１３と、前記試料注入部１３から注入された前記試料中の短鎖脂肪酸を分離する酸分離カラム１４を有する系から供給される溶離液と、キノン及び支持電解質が含有されたキノン溶液を貯めた溶液タンク８と、前記キノン溶液を送液する少なくとも１つのポンプ１１を有する系から供給されるキノン溶液を混合する液混合部１５と、前記試料から分離された前記短鎖脂肪酸の酸度を測定する酸度測定部１６とを備えるようにしたので、保管された殺菌水から得られた試料を試料注入部から注入することで簡単に揮発性短鎖脂肪酸の総和と乳酸の濃度を求めて乳酸濃度／揮発性短鎖脂肪酸濃度の比率を算出することができ、これにより、潰瘍性大腸炎を高精度で発見することが可能となる。
【００４７】
また、酸度測定部１６において電気化学的測定法により試料中の揮発性短鎖脂肪酸の総和と乳酸の濃度を測定することとしたので、試料が少なくても迅速に測定することができる。
【００４８】
また、液混合部１５において、前記溶離液が流れる側管２２をキノン溶液が流れる主管２１の内部に挿入し、側管２２の先端部２３の開口面が前記主管の内径面に対して平行になるように位置決めすることとしたので、作用電極２４の表面にできるだけ乱流を発生させずに、溶離液をキノン溶液に混入することができ、これにより、酸度測定部１６においてブロードにならないピーク波形を得ることが可能となる。また、各種短鎖脂肪酸の量を比較する場合にはノイズ成分が一定であるため、見かけ上ノイズが影響のない状態とすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置及び測定方法は、血液の検査を行うことなく、短時間、かつ簡単、正確に短鎖脂肪酸を測定することにより、潰瘍性大腸炎を発見し、治療中の薬物療法を適切に行うことができる点において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の外観図である。
【図２】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の概略図である。
【図３】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の液混合部の断面図である。
【図４】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置の酸度測定部の電極詳細図である。
【図５（ａ）】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置に試料を採取するためのツールを示す分解図である。
【図５（ｂ）】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置に試料を採取するためのツールを示す組立断面図である。
【図６】本発明の実施の形態１における潰瘍性大腸炎診断・予後試験用測定装置で便中の短鎖脂肪酸量を酸度測定部で測定した場合の、試料を注入してからの保持時間と還元電流との相関図である。
【図７】従来の高速液体クロマトグラフのポストカラム誘導体化法を行なうための装置を示した図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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