(57)【要約】本発明は、膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法。
【請求項２】
膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、培養物又は宿主個体から発芽バキュロウイルスを回収し、得られる回収物から活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の製造方法。
【請求項３】
膜型プロテアーゼ蛋白質がプレセニリンである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
複合体構成因子がニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２である請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体がγ−セクレターゼである請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主が放出する、発芽バキュロウイルス。
【請求項８】
膜型プロテアーゼ蛋白質がプレセニリンである請求項７記載の発芽バキュロウイルス。
【請求項９】
複合体構成因子がニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２である請求項７記載の発芽バキュロウイルス。
【請求項１０】
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を含有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の発芽バキュロウイルス。
【請求項１１】
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体がγ−セクレターゼである請求項１０記載の発芽バキュロウイルス。
【請求項１２】
宿主が昆虫細胞又は昆虫幼虫である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の発芽バキュロウイルス。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の発芽バキュロウイルスから採取される、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体。
【請求項１４】
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体がγ−セクレターゼである請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と相互作用する物質を分析する方法であって、標識された被験物質と請求項１３又は１４記載の複合体とを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを含む前記方法。
【請求項１６】
活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、被験物質と請求項１３又は１４記載の複合体とを接触させた後、当該複合体のプロテアーゼ活性を測定することを含む前記方法。
【請求項１７】
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体がγ−セクレターゼである請求項１５又は１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３又は１４記載の複合体が配列されたプロテインチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、発芽バキュロウィルスを用いた膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法に関する。より詳細には、本発明は、宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型蛋白質複合体を発現させることを特徴とする、プロテアーゼ活性を有する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法に関する。
【背景技術】  バキュロウイルス発現系は、バキュロウイルスの高発現蛋白質、特に多角体蛋白質（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子のプロモーターなどを利用して、目的遺伝子を昆虫細胞（Ｓｆ９細胞など）で組換えを起こさせて大量に発現させる系である。多角体遺伝子に組換えタンパク質をコードする遺伝子を導入し、発現したタンパク質を精製するバキュロウイルス発現系は、大腸菌やイースト菌を用いる発現系に比べ、膜蛋白質などの疎水性領域を多く持つ蛋白質でも発現タンパク質が凝集を作りにくく、また糖鎖の付加や金属イオンの配位等のタンパク質の機能に必要な翻訳後修飾が生じるなど利点が多いため、膜受容体蛋白質の発現系として多用されている（Ｔａｔｅ  ＣＧ，Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ  Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９６，１４，ｐｐ４２６−４３０，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；及び、Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ  Ｒ，Ｔａｔｅ  ＣＧ，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  １９９５，２８，ｐｐ３１５−４２２，Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ）。
バキュロウイルスには、多角体蛋白質を被った多角体ウイルスとなって核内に存在する他に、もう一つの生活環がある。すなわち、ウイルスが増殖して他の細胞や個体に感染するために発芽型のウイルス（Ｂｕｄｄｅｄ  ｖｉｒｕｓ）となり、この発芽型ウイルスがＳｆ９細胞の細胞膜を被って細胞外に出るというものである。この際に、上記の多角体蛋白質に組換えた７回膜貫通型受容体がＳｆ９の細胞膜に発現され、発芽したバキュロウイルスのエンベロープ上に回収されることがＬｏｉｓｅｌらによって報告された（Ｌｏｉｓｅｌ  ＴＰ，Ａｎｓａｎａｙ  Ｈ，Ｓｔ−Ｏｎｇｅ  Ｓ，Ｇａｙ  Ｂ，Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ  Ｐ，Ｓｔｒｏｓｂｅｒｇ  ＡＤ，Ｍａｒｕｌｌｏ  Ｓ，Ｂｏｕｖｉｅｒ  Ｍ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，Ｎｏｖ．１５（１２），ｐｐ１３００−１３０４，Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅｔａ  ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）。宿主細胞に発現された７回膜貫通型受容体は、糖鎖構造など機能的でないものが多いのに対し、ウイルスエンベロープ上に回収される受容体は機能的な蛋白質のみであることが報告されている。
また、ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）２、ＨＭＧ−ＣｏＡ（ヒドロキシメチルクルタリルコエンザイムＡ）還元酵素、ＳＣＡＰ（ＳＲＥＢＰ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓ１Ｐ（ｓｉｔｅ  １  ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの小胞体（ＥＲ）膜又はゴルジ体膜に分布する膜蛋白質群（例えば細胞内コレステロールフィードバック調節に関与するもの）も、機能を保ったままウイルスエンベロープ上に発現されることが報告された（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｇ．，Ｓｈｉｒａｉ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｒ．，Ｈａｍａｋｕｂｏ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１５１，ｐ２９０，２０００，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）。さらに、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ；Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、膜貫通ドメインを７つ持ち、３量体Ｇ蛋白質と共役（カップリング）しているが、受容体蛋白質とＧ蛋白質のサブユニットとを発現するウイルスを作成し、発芽ウイルス上で再構成することにより、親和性の高い受容体を得る事が可能であることが報告されている（Ｍａｓｕｄａ  Ｋ，Ｉｔｏｈ  Ｈ，Ｓａｋｉｈａｍａ  Ｔ，Ａｋｉｙａｍａ  Ｃ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｆｕｋｕｄａ  Ｒ，Ｙｏｋｏｍｉｚｏ  Ｔ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｔ，Ｋｏｄａｍａ  Ｔ，Ｈａｍａｋｕｂｏ  Ｔ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３２７８（２７）：２４５５２−２４５６２，Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｎ  ｂｕｄｄｅｄ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｇａｌｐｈａ  ａｎｄ  Ｇａｌｐｈａｏ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｂ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．）。
ところで、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は、大脳皮質の神経細胞の変性・脱落により、記憶を中心に広汎な知的機能の障害を呈する神経変性疾患であり、老年者に生じる痴呆の原因としては最も頻度が高い。ＡＤ脳においては、神経細胞脱落と表裏一体の関係をもってβアミロイドと呼ばれる異常タンパク質が蓄積することが特徴である（Ｓｅｌｋｏｅ  ＤＪ，Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２００１，８１（２）：７４１−７６６．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｇｅｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．）。βアミロイドは、ＡＤ脳に老人斑、血管アミロイドの病理学的形態をとって蓄積し、生化学的には４０〜４２アミノ酸からなるＡβペプチドから構成される。Ａβは前駆体ＡＰＰから２段階の切断を受けて生成され、細胞外に分泌される。この第２段階目において、γ−セクレターゼと呼ばれる酵素の蛋白質分解活性によりＡＰＰのＣ末端断片は膜内部分で切断を受け、Ａβが形成されて細胞外に放出される。その切断部位には多様性があり、ＡβのＣ末端の９０％は４０位、１０％は４２位で生じるが（Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１３３６，１９９４）、βアミロイドとしての凝集性はＡβ４２がより高く、ＡＤ脳においても初期から優先的に蓄積する（Ｉｗａｔｓｕｂｏ  Ｔ，Ｏｄａｋａ  Ａ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｎ，Ｍｉｚｕｓａｗａ  Ｈ，Ｎｕｋｉｎａ  Ｎ，Ｉｈａｒａ  Ｙ．Ｎｅｕｒｏｎ．１９９４，１３（１）：４５−５３，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａ  ｂｅｔａ  ４２（４３）ａｎｄ  Ａ  ｂｅｔａ  ４０  ｉｎ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａ  ｂｅｔａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ａｎ  ｉｎｉｔｉａｌｌｙ  ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｓ  Ａ  ｂｅｔａ  ４２（４３）．）。
家族性ＡＤの主要な病因遺伝子の産物であるプレセニリン蛋白質（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ；ＰＳ）は、膜結合型アスパラギン酸性プロテアーゼであるγ−セクレターゼの触媒サブユニットに一致することが示されている（Ｗｏｌｆｅ  ＭＳ，Ｘｉａ  Ｗ，Ｏｓｔａｓｚｅｗｓｋｉ  ＢＬ，Ｄｉｅｈｌ  ＴＳ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  ＷＴ，Ｓｅｌｋｏｅ  ＤＪ（１９９９）Ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｐａｒｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−１  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ３９８（６７２７）：５１３−５１７；Ｌｉ  ＹＭ，Ｘｕ  Ｍ，Ｌａｉ  ＭＴ，Ｈｕａｎｇ  Ｑ，Ｃａｓｔｒｏ  ＪＬ，ＤｉＭｕｚｉｏ  Ｍｏｗｅｒ  Ｊ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｔ，Ｌｅｌｌｉｓ  Ｃ，Ｎａｄｉｎ  Ａ，Ｎｅｄｕｖｅｌｉｌ  ＪＧ，Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ＲＢ，Ｓａｒｄａｎａ  ＭＫ，Ｓｈｅａｒｍａｎ  ＭＳ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＬ，Ｓｈｉ  ＸＰ，Ｙｉｎ  ＫＣ，Ｓｈａｆｅｒ  ＪＡ，Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ（２０００）Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌａｂｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  Ｊｕｎ  ８，４０５（６７８７）：６８９−９４．）。
また、γ−セクレターゼは、フラグメント型プレセニリンを含む、分子量２５０〜５００キロダルトン以上の巨大膜内複合体を形成し、膜蛋白質である複合体構成因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）と結合してプロテアーゼ活性を発揮することが明らかとなっている。そして、本発明者らは、プレセニリンに加えて、ニカストリン（ＮＣＴ）、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２と呼ばれる３種類の膜蛋白質が共同してγ−セクレターゼ複合体の基本骨格を形成することを明らかにした（Ｔａｋａｓｕｇｉ  Ｎ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｉ，Ｔｓｕｒｕｏｋａ  Ｍ，Ｎｉｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ  Ｇ，Ｉｗａｔｓｕｂｏ  Ｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２２：４３８−４４１  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．）。さらに最近、プレセニリン様の膜蛋白質ファミリー分子が多数報告され、それらのうちひとつが新規プロテアーゼＳＰＰであることが明らかにされ、γ−セクレターゼ同様の膜結合型プロテアーゼが多数存在することが示唆されている（Ｗｅｉｈｏｆｅｎ  Ａ，Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ  Ｂ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３（２）：７１−７８）。
このような状況のもと、γ−セクレターゼはＡＤの治療標的として重視され、その阻害剤開発及び活性測定法の確立が重要と考えられてきた。しかし、膜内で蛋白質分解酵素活性を示し、複数の膜蛋白質からなるプロテアーゼ複合体として形成されるγ−セクレターゼを、活性を保った状態で再構成することは従来困難とされてきた。
【発明の開示】
本発明は、バキュロウイルスと昆虫細胞発現システムを用いて、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させるための方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、γ−セクレターゼ複合体の構成分子であるプレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２を発現するウイルスを作成し、発芽ウイルス（Ｂｕｄｄｅｄ  ｖｉｒｕｓ）上で再構成することにより、活性型γ−セクレターゼ複合体を得ることに成功した。このとき共感染によりγ−セクレターゼ複合体構成因子を発現させたＳｆ９細胞の膜画分では不活性型の蛋白質が大量に発現されているため、再構成された活性を測定しにくいという可能性があった。ところが、発芽型ウイルスには、活性型γ−セクレターゼ複合体が選択的に集積していた。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との複合体を発現させることを特徴とする、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の発現方法。
（２）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、培養物又は宿主個体から発芽バキュロウイルスを回収し、得られる回収物から活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の製造方法。
（３）上記（１）又は（２）記載の発明において、膜型プロテアーゼ蛋白質としてはプレセニリンが挙げられ、複合体構成因子としてはニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が挙げられる。これらのプロテアーゼ及び複合体構成因子により形成される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体は、γ−セクレターゼである。
また、上記（１）又は（２）記載の方法において、宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が使用される。
（４）膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウイルスを感染させた宿主が放出する、発芽バキュロウイルス。
ここで、膜型プロテアーゼ蛋白質としては、プレセニリンが挙げられ、複合体構成因子としてはニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が挙げられる。
上記発芽バキュロウイルスは、膜型プロテアーゼ蛋白質及び複合体構成因子により形成される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）を含有する。
また、宿主として昆虫細胞又は昆虫幼虫が使用される。
（５）上記発芽バキュロウイルスから採取される、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体。膜型プロテアーゼ蛋白質複合体としては、例えばγ−セクレターゼが挙げられる。
（６）活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）と相互作用する物質を分析する方法であって、標識された被験物質と上記複合体とを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することを含む前記方法。
さらに、本発明は、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、被験物質と上記複合体とを接触させた後、当該複合体のプロテアーゼ活性を測定することを含む方法を提供する。
（７）上記活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）が配列されたプロテインチップ。
【図面の簡単な説明】  図１は、発芽型バキュロウイルスを用いて活性型膜型プロテアーゼ蛋白質を回収する概要を示す。
図２は、ヒトプレセニリン１発現のタイムコース（抗ヒトプレセニリン１抗血清ウェスタンブロット）を示す。
図３は、ＢＶ画分における各抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。
図４は、ＢＶ画分に再構成されたγ−セクレターゼ複合体の免疫共沈法による解析の結果を示す。
図５は、Ｓｆ９膜画分及びＢＶ画分におけるフラグメント型プレセニリン発現量の比較（各抗体によるウェスタンブロット）を示す。
図６は、可溶化されたＢＶ画分におけるインビトロγ−セクレターゼ活性の比較を示す。
図７は、ＢＶ画分に再構成されたγ−セクレターゼ活性の酵素学的解析結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明は、膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含むバキュロウィルスを感染させた宿主を培養又は飼育し、該宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させることを特徴とするものである。
図１に示すように、膜型プロテアーゼをコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をバキュロウイルスにトランスフェクトし、これを昆虫細胞（例えばＳｆ９）又は昆虫に感染させると、感染細胞内又は感染昆虫の体内にプロテアーゼが蓄積される。感染細胞等に蓄積されるプロテアーゼには活性型と不活性型が含まれているのに対し、感染細胞等から発芽するウイルス中に含まれるプロテアーゼを採取すると、採取されたプロテアーゼは活性型のもののみとなる（不活性型のプロテアーゼが含まれていたとしてもごくわずかである）。本発明は、発芽型のバキュロウイルス中に活性型となるプロテアーゼが含まれている点に着目して完成されたものであり、発芽型バキュロウイルスにプロテアーゼ蛋白質複合体を発現させることを特徴とし、また、発芽型バキュロウイルスから活性型プロテアーゼ蛋白質複合体を採取することを特徴とする。
膜型プロテアーゼ蛋白質の中には、特定の蛋白質と複合体を形成して活性化するものが存在する。このように、プロテアーゼ蛋白質と複合体を形成する蛋白質を、本発明において「複合体構成因子」という。複合体構成因子及び膜型プロテアーゼ蛋白質は、複合体構成因子同士で、あるいは複合体構成因子と膜型プロテアーゼ蛋白質との間で、それぞれ相互作用して膜型プロテアーゼ蛋白質の機能を発揮（つまり活性化）させる。
本発明では、複合体構成因子等の複数種類の蛋白質を共発現させて得られる蛋白質複合体（例えばγ−セクレターゼ）を含む。複数種類の蛋白質を共発現させる場合は、これらの蛋白質をコードする遺伝子を同一のバキュロウイルス中に含めてもよいし、異なるバキュロウイルス中に含めてもよい。
本発明においては、上記膜型プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子、及び複合体構成因子をコードする遺伝子（１種又は複数種）をバキュロウィルスに導入して組換えバキュロウイルスを作製し、これを昆虫細胞又は昆虫に感染させて培養又は飼育する。これらの宿主から放出される発芽バキュロウイルス中に膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を発現させる。そして、培養物又は宿主個体から発芽バキュロウイルスを回収する。さらに、バキュロウイルスから当該複合体を採取することで、活性化された膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を得ることができる。
ここで、本発明において「膜型」とは、対象の蛋白質が膜、例えば細胞膜、ウイルス膜及び細胞内小器官（例えば、小胞体やゴルジ体等）の形質膜に存在することを広く意味する。また、「プロテアーゼ」とは蛋白質を加水分解する能力を有する酵素を広く意味する。そして、「活性型」とは、プロテアーゼとしての機能を有することを意味する。「発芽バキュロウイルス中」とは、発芽バキュロウイルスの内部だけでなく、ウイルス膜上も意味する。
２．膜型プロテアーゼ蛋白質複合体
膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との組み合わせは特に限定されず、例えば、膜型プロテアーゼ蛋白質であるプレセニリンと、複合体構成因子であるニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２と呼ばれる３種の蛋白質とにより構成される複合体が挙げられる。この複合体はγ−セクレターゼと呼ばれている。すなわち、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２がプレセニリンと複合体を形成することによってγ−セクレターゼとなり、プレセニリンのプロテアーゼとしての機能が発揮される。
プレセニリンは、家族性アルツハイマー病の原因遺伝子として同定された膜蛋白質であり、γ−セクレターゼの活性中心サブユニットであると考えられている。（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｒ，Ｒｏｇａｅｖ  ＥＩ，Ｌｉａｎｇ  Ｙ，Ｒｏｇａｅｖａ  ＥＡ，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  Ｇ，Ｉｋｅｄａ  Ｍ，Ｃｈｉ  Ｈ，Ｌｉｎ  Ｃ，Ｌｉ  Ｇ，Ｈｏｌｍａｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９５，３７５（６５３４）：７５４−７６０）。ヒトプレセニリン１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ヒトプレセニリン１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ヒトプレセニリン２をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に、ヒトプレセニリン２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
プレセニリンは、細胞内でニカストリン、ＡＰＨ−１、ＰＥＮ−２と共役して活性化され、プロセシングを受けてフラグメントとなる。（Ｔａｋａｓｕｇｉ  Ｎ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｉ，Ｔｓｕｒｕｏｋａ  Ｍ，Ｎｉｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ  Ｇ，Ｉｗａｔｓｕｂｏ  Ｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２２：４３８−４４１  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．）。このフラグメント型プレセニリンが活性型γ−セクレターゼの活性中心サブユニットを構成しているものと考えられている（Ｌｉ  ＹＭ，Ｘｕ  Ｍ，Ｌａｉ  ＭＴ，Ｈｕａｎｇ  Ｑ，Ｃａｓｔｒｏ  ＪＬ，ＤｉＭｕｚｉｏ  Ｍｏｗｅｒ  Ｊ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｔ，Ｌｅｌｌｉｓ  Ｃ，Ｎａｄｉｎ  Ａ，Ｎｅｄｕｖｅｌｉｌ  ＪＧ，Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ＲＢ，Ｓａｒｄａｎａ  ＭＫ，Ｓｈｅａｒｍａｎ  ＭＳ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＬ，Ｓｈｉ  ＸＰ，Ｙｉｎ  ＫＣ，Ｓｈａｆｅｒ  ＪＡ，Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５：６８９−６９４  Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌａｂｅｌ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １．）。
ニカストリンは、プレセニリン結合分子の一つとして同定された蛋白質である（Ｙｕ  Ｇ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｍ，Ａｒａｗａｋａ  Ｓ，Ｌｅｖｉｔａｎ  Ｄ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｔａｎｄｏｎ  Ａ，Ｓｏｎｇ  ＹＱ，Ｒｏｇａｅｖａ  Ｅ，Ｃｈｅｎ  Ｆ，Ｋａｗａｒａｉ  Ｔ，Ｓｕｐａｌａ  Ａ，Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  Ｌ，Ｙｕ  Ｈ，Ｙａｎｇ  ＤＳ，Ｈｏｌｍｅｓ  Ｅ，Ｍｉｌｍａｎ  Ｐ，Ｌｉａｎｇ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  ＤＭ，Ｘｕ  ＤＨ，Ｓａｔｏ  Ｃ，Ｒｏｇａｅｖ  Ｅ，Ｓｍｉｔｈ  Ｍ，Ｊａｎｕｓ  Ｃ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ，Ｆａｒｒｅｒ  ＬＳ，Ｓｏｒｂｉ  Ｓ，Ｂｒｕｎｉ  Ａ，Ｆｒａｓｅｒ  Ｐ，Ｓｔ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｈｙｓｌｏｐ  Ｐ  Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｏｔｃｈ／ｇｌｐ−１  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｔａＡＰＰ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０７（６８００）：４８−５４．）。ヒトニカストリンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に、ヒトニカストリンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２は、線虫を用いた遺伝学的スクリーニングにより、γ−セクレターゼ活性に必須の蛋白質をコードする遺伝子として同定されたものである（Ｇｏｕｔｔｅ  Ｃ，Ｔｓｕｎｏｚａｋｉ  Ｍ，Ｈａｌｅ  ＶＡ，Ｐｒｉｅｓｓ  ＪＲ（２００２）ＡＰＨ−１  ｉｓ  ａ  ｍｕｌｔｉｐａｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２  Ｊａｎ  ２２，９９（２）：７７５−７７９；Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｒ，ＭｃＧｒａｔｈ  Ｇ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｒｕｄｄｙ  ＤＡ，Ｓｙｍ  Ｍ，Ａｐｆｅｌｄ  Ｊ，Ｎｉｃｏｌｌ  Ｍ，Ｍａｘｗｅｌｌ  Ｍ，Ｈａｉ  Ｂ，Ｅｌｌｉｓ  ＭＣ，Ｐａｒｋｓ  ＡＬ，Ｘｕ  Ｗ，Ｌｉ  Ｊ，Ｇｕｒｎｅｙ  Ｍ，Ｍｙｅｒｓ  ＲＬ，Ｈｉｍｅｓ  ＣＳ，Ｈｉｅｂｓｃｈ  Ｒ，Ｒｕｂｌｅ  Ｃ，Ｎｙｅ  ＪＳ，Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄ（２００２）ａｐｈ−１  ａｎｄ  ｐｅｎ−２  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｎｏｔｃｈ  ｐａｔｈｗａｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｂｅｔａＡＰＰ，ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ３：８５−９７）。ヒトＡＰＨ−１ａをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に、ヒトＡＰＨ−１ａのアミノ酸配列（２５１個のアミノ酸配列を有するもの：「２５１型」という）を配列番号８に示す。
ここで、ＡＰＨ−１ａには、そのＣ末端部分が選択的スプライシングにより生じた変異体（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）が存在する。この変異体は２４７個のアミノ酸配列（「２４７型」という）及び２６５個のアミノ酸配列（「２６５型」という）を有している。２４７型をコードする遺伝子を配列番号９に、２４７型のアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、２６５型をコードする遺伝子を配列番号１１に、２６５型のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
ヒトＡＰＨ−１ｂをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１３に、ヒトＡＰＨ−１ｂのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。また、ヒトＰＥＮ−２をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１５に、ヒトＰＥＮ−２のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。
プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２をコードする遺伝子の塩基配列、並びにこれらの蛋白質のアミノ酸配列の配列番号を表１にまとめた。
2005038023.tif 000002
ここで、本発明においては、表１の配列番号に示すアミノ酸配列のみならず、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が複合体を形成したときに活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体としての機能を有する限り、これらのアミノ酸配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４又は１６）において１個又は数個（例えば１個〜１０個、好ましくは１個〜５個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列（変異型アミノ酸配列）を含むものであってもよい。「活性型膜型プロテアーゼ蛋白質としての機能」とは、疎水性環境にある膜内配列を切断するプロテアーゼ機能（特にγ−セクレターゼ機能）を意味する。
さらに、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２のアミノ酸配列をそれぞれコードする遺伝子に限らず、上記表１の配列番号に示す塩基配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５）に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プレセニリン、ニカストリン、ＡＰＨ−１及びＰＥＮ−２が複合体を形成したときに膜型プロテアーゼ蛋白質としての活性を有するときのそれぞれの蛋白質をコードする遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件」とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が２５０〜４５０ｍＭであり、温度が６８℃での条件（ハイブリダイズ後の洗浄時の条件）をいう。
上記変異型アミノ酸配列は、通常の部位特異的突然変異誘発法によって変異を導入することができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法やＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
本発明において、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とその触媒の対象となる物質との間の相互作用として、プレセニリン複合体と基質（ＡＰＰ、Ｎｏｔｃｈ、ＥｒｂＢ４、カドヘリンなど）との相互作用、プレセニリン複合体と結合蛋白質（カテニン、ＫＣｈｉＰなど）との相互作用、ＳｐｏＩＶＦＢと結合蛋白質（ＢｏｆＡ，ＳｐｏＩＶＦＡなど）との相互作用などが挙げられる。（Ｕｒｂａｎ  Ｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｍ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ．１２（５）：５１２−５１８．）（Ｗｅｉｈｏｆｅｎ  Ａ，Ｍａｒｔｏｇｌｉｏ  Ｂ．Ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３（２）：７１−７８）
上記相互作用は、例えばＳｆ９細胞に未知の分子をコードするｃＤＮＡを感染させ、細胞内でプレセニリン複合体と相互作用ないし何らかの活性化を促進または阻害して、得られたバキュロウイルス中の活性を変化させる物質について検討すればよい。
３．組換えウイルスの作製及びプロテアーゼの発現
本発明において、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を取得するために、プロテアーゼ蛋白質をコードする遺伝子及び複合体構成因子をコードする遺伝子を含む少なくとも１種の組換えバキュロウィルスを使用することができる。バキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡを遺伝子としてもつエンベロープウイルスであり、昆虫に感染して病気を起こすウイルスである。そして、鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感受性を示す。バキュロウイルスの中で、感染細胞の核内に多角体（ポリヒドラ）と呼ばれる封入体を大量に作る一群のウイルスが核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）である。多角体は、分子量３１ｋＤａのポリヘドリンタンパクより構成されており、感染後期に大量に作られ、その中に多数のウイルス粒子を埋め込んでいる。多角体はウイルスが自然界で生存するためには必須であるが、ウイルスの増殖そのものには必要ないため、多角体遺伝子の代わりに発現させたい外来遺伝子を挿入してもウイルスは全く支障なく感染し増殖する。
本発明で用いられるバキュロウイルスとしては、ＮＰＶのキンウワバ亜科のオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、カイコのボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ）などが挙げられ、これらのウイルスをベクターとして用いることができる。
ＡｃＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ細胞）などが挙げられ、ＢｍＮＰＶの宿主（感染、継代細胞）としてはＢｍＮ４細胞などが挙げられる。Ｓｆ細胞は、ＢｍＮ４細胞などに比べ増殖速度が速いこと、また、ＡｃＮＰＶはヒト肝細胞およびヒト胎児腎細胞などにも感染する能力を有することから、Ｓｆ−ＡｃＮＰＶ系の宿主−ベクターが好ましい。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞系統のＳｆ９およびＳｆ２１は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ幼虫の卵巣組織から確立しており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社若しくはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又はＡＴＣＣなどから入手可能である。さらに、生きている昆虫幼虫（例えばカイコ）を宿主細胞系として使用することもできる。
本発明で用いる組換えウイルスを構築する方法は、常法に従って行えばよく、例えば次の手順で行うことができる。先ず、発現させたい蛋白質の遺伝子をトランスファーベクターに挿入して組換えトランスファーベクターを構築する。トランスファーベクターの全体の大きさは一般的には数ｋｂ〜１０ｋｂ程度であり、そのうちの約３ｋｂはプラスミド由来の骨格であり、アンピシリン等の抗生物質耐性遺伝子と細菌のＤＮＡ複製開始のシグナルを含んでいる。通常のトランスファーベクターではこの骨格以外に、多角体遺伝子の５’領域と３’領域をそれぞれ数ｋｂずつ含み、トランスフェクションを行った際に、この配列間で目的遺伝子と多角体遺伝子との間で相同組換えが引き起こされる。
また、トランスファーベクターには蛋白質遺伝子を発現させるためのプロモーターを含むことが好ましい。プロモーターとしては、多角体遺伝子のプロモーター、ｐ１０遺伝子のプロモーター、キャプシド遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
トランスファーベクターの種類は特に限定されるものではなく、例えばＡｃＮＰＶ系又はＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターを使用することができる。
ＡｃＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、例えばｐＥＶｍＸＩＶ２、ｐＡｃＳＧ１、ｐＶＬ１３９２／１３９３、ｐＡｃＭＰ２／３、ｐＡｃＪＰ１、ｐＡｃＵＷ２１、ｐＡｃＤＺ１、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＡｃＵＷ５１、ｐＡｃＡＢ３、ｐＡｃ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ，Ｂ，Ｃ、ｐＶＴ−Ｂａｃ３３、ｐＡｃＵＷ１、ｐＡｃＵＷ４２／４３などが挙げられ、ＢｍＮＰＶ系トランスファーベクターとしては、例えばｐＢＫ２８３、ｐＢＫ５、ｐＢＢ３０、ｐＢＥ１、ｐＢＥ２、ｐＢＫ３、ｐＢＫ５２、ｐＢＫｂｌｕｅ、ｐＢＫｂｌｕｅ２、ｐＢＦシリーズなどが挙げられる。これらのトランスファーベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フナコシ株式会社、藤沢薬品工業株式会社等から容易に入手可能である。
次に、組換えウイルスを作製するために、上記の組換えトランスファーベクターをウイルスと混合した後（トランスフェクション）、宿主として用いる培養細胞に移入するか、あるいは予めウイルスで感染させた宿主として用いる培養細胞に上記のトランスファーベクターを移入し、組換えトランスファーベクターとウイルスゲノムＤＮＡとの間に相同組み換えを起こさせ、組み換えウイルスを構築する。
ここで宿主として培養細胞を用いる場合は、通常、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞やＢｍＮ細胞など）が採用される。培養条件は、当業者により適宜決定されるが、具体的にはＳｆ９細胞を用いるときは、１０％ウシ胎児血清を含む培地で、２８℃前後で培養することが好ましい。このようにして構築された組み換えウイルスは、常法、例えばプラークアッセイなどによって精製することができる。なお、このようにして作製された組換えウイルスは、核多角体病ウイルスの多角体蛋白質の遺伝子領域に外来のＤＮＡが置換または挿入されており、多角体を形成することができないため、非組換えウイルスと容易に区別することが可能である。
本発明の方法では、前記の組換えバキュロウイルスを、上記の適当な宿主（Ｓｆ９およびＳｆ２１などの培養細胞）に感染させ、一定時間後（例えば、７２時間後等）に培養物から細胞外発芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ  ｖｉｒｕｓ，ＢＶ）を遠心などの分離操作によって回収することにより、その発芽バキュロウイルス画分中に含有される目的蛋白質複合体を得ることができる。「培養物」とは、培養上清及び細胞のいずれをも意味する。なお、組換えバキュロウイルスは１種類のみ感染させてもよいし、２種類以上の組換えバキュロウイルスを組み合わせて共感染させてもよい。
細胞外発芽バキュロウイルスの回収は、例えば、以下のように行うことができる。先ず感染細胞の培養液を５００〜１，０００ｇで遠心分離して、細胞外発芽バキュロウイルスを含む上清を回収する。この上清を約３０，０００〜５０，０００ｇで遠心分離して細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を得ることができる。上記のようにして回収される発芽バキュロウイルスは、生理活性を有する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を含むものである。なお、当該発芽バキュロウイルス自体も本発明の範囲内である。
この細胞外発芽バキュロウイルスを含む沈殿物を適当な緩衝液に懸濁し、再度、適当な濃度勾配（例えば、スクロースの連続勾配等）の上にウイルスの懸濁物を重ね、１００，０００ｇで遠心分離して分画する。得られた画分の中から所望の蛋白質複合体を含む画分を採取することができる。
さらに、発現させた蛋白質複合体を可溶化した形態で得る場合には、感染細胞の培養液から例えば４０，０００ｇで遠心分離することにより細胞外発芽ウイルスを回収する。この回収されたペレットを適当な緩衝液に懸濁し、ＣＨＡＰＳＯ等の溶解剤で処理し、さらに３０，０００ｒｐｍで遠心分離を行うことにより上清と沈澱に分離する。可溶化された目的蛋白質複合体は上清中から得ることができる。
宿主として昆虫（例えばカイコ幼虫）を用いる場合は、組換えウイルスを例えば５齢カイコ幼虫に接種して感染させ、４〜６日後にカイコの個体の体液中に分泌したプロテアーゼ蛋白質複合体を採取・分離し、精製すればよい。プロテアーゼ蛋白質複合体は、絹糸腺と呼ばれる器官から大量に得ることができる。
上記発現蛋白質複合体（特にＣＨＡＰＳＯ等の溶解剤で処理した後の蛋白質複合体）は、その活性化形態として採取される。本発明の蛋白質複合体は、好ましくは少なくとも５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上が活性化形態である。
本発明の蛋白質複合体は、適当な精製手段、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを単独で又は適宜組み合わせてさらに精製することも可能である。このようにして採取又は精製した活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体も、本発明に含まれる。採取又は精製された蛋白質複合体が目的のものであることの確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。
なお、このような活性化形態の膜プロテアーゼ蛋白質複合体を高い割合で得ることは従来法では極めて困難であった。
４．相互作用の分析
本発明はさらに、標識された被験物質（例えばリガンド又は基質）と活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とを接触させた後、当該被験物質のシグナルを検出することによって、前記蛋白質複合体と相互作用する物質を分析する方法を提供する。
蛋白質複合体は、バキュロウイルス中に存在する膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を使用することも可能であるが、バキュロウイルスから採取した活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を使用することが好ましい。
膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と被験物質との相互作用の測定方法は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、標識したリガンドを用いてリガンド結合能を測定する。標識は、蛍光標識、放射標識のいずれを採用してもよい。蛍光物質としては、例えばＡｌｅｘａ系、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、ローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ５などが挙げられる。放射標識物質としては、３Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、３２Ｐ等が挙げられる。
具体的には、上記標識物質で標識したリガンドを含む緩衝液（結合に適した緩衝液を使用）に、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を含む発芽バキュロウイルス、又は前記の通り回収若しくは精製した活性型膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を接触（反応）させる。なお、反応条件はプロテアーゼとリガンドとの組み合わせの種類により適宜選択する。反応後の反応液を適当なフィルター等の固相担体に吸着ろ過させて反応を停止し、当該固相担体を洗浄および乾燥させ、複合体のみを固相担体上に固定する。シンチレーションカウンターを用いて固相担体の放射活性を測定し、又は蛍光光度計を用いて蛍光強度を測定することにより、膜型プロテアーゼ蛋白質複合体とリガンドとの相互作用（即ち、リガンド結合能）を測定することができる。
また、本発明は、被験物質と本発明の複合体とを接触させた後、複合体のプロテアーゼ活性を測定することにより、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の酵素活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法を提供する。
スクリーニングに供される被験物質としては、例えばペプチド、ポリペプチド、合成化合物、微生物発酵物、生物体（植物又は動物の組織、微生物、又は細胞などを含む）からの抽出物、あるいはそれらのライブラリーが挙げられる。ライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。スクリーニングに供される化学物質は、天然物でも合成物でもよく、また候補となる単一の化学物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる化学物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。また、細胞抽出物のような混合物を分画したものについてスクリーニングを行い、分画を重ねて、所望の活性を有する物質を単離することも可能である。
さらに、本発明においては、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に作用する分子ないしリガンド様の物質が、その複合体のうちどの分子に作用しているかについて、バキュロウイルス上の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を用いてアッセイすることも可能である。
これらの被験物質は、膜型プロテアーゼ蛋白質（複合体）と基質との相互作用、あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促進又は阻害することが予想される物質であることが好ましい。本発明のスクリーニング方法により、膜型プロテアーゼ蛋白質または膜型プロテアーゼ蛋白質複合体に対する阻害薬または活性化薬物をスクリーニングすることが可能である。本発明のスクリーニング方法により得られる、膜型プロテアーゼ蛋白質（複合体）と基質との相互作用、あるいは膜型プロテアーゼ蛋白質と複合体構成因子との相互作用を促進又は阻害する物質も本発明の範囲内である。
５．プロテインチップ
本発明のバキュロウイルスから採取される膜型プロテアーゼ蛋白質複合体の中には、活性型のものが含まれている。この活性型蛋白質複合体を基板上に固定すると、プロテインチップを得ることができる。このようにして作製されたプロテインチップは、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体と相互作用する物質をスクリーニングするために使用することができる。活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体を、イオン交換樹脂や金属イオンなどをコーティングしたチップに結合させ、スクリーニングの対象となる試料をチップに添加し、質量分析器（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型、ＥＳＩ／Ｑ−ＴＯＦ型のもの等）を使用して質量を測定する。質量の変化により、相互作用した物質を同定することが可能である。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】  γ−セクレターゼ構成因子（ヒトプレセニリン１、ヒトニカストリン、ヒトＡＰＨ−１ａ、ヒトＰＥＮ−２）を発現する組換えバキュロウイルスの調製
（１）細胞の培養と感染、および発芽型バキュロウイルスの収集
ヒトプレセニリン１全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ＴＭベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に、Ｃ末端側にタグを人工的に付加したヒトニカストリン又はヒトＡＰＨ−１ａ全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に、ヒトＰＥＮ−２全長ｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａへ組み込み、それぞれｐＢｌｕｅＢａｃ−ＰＳ１、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＮＣＴ−Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＡＰＨ−１ａ−ｍｙｃ／ＨｉｓおよびｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｈｉｓ−ＰＥＮ−２を作製した。Ｓｆ９細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は完全培地（１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＧｒａｃｅ’ｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｍｅｄｉａ  （ＧＩＢＣＯＢＲＬ））で２７℃で１０ｃｍ径ディッシュに継代培養した。大量培養は、５００ｍＬ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）にて完全培地に０．００１％ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を添加して行なった。組み換えバキュロウイルスの作製は説明書（Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い、Ｓｆ９細胞にＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ（ＡｐＭＮＰＶ由来）と、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＰＳ１、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＮＣＴ−Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＡＰＨ−１−ｍｙｃ／Ｈｉｓ又はｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｈｉｓ−ＰＥＮ−２とを共感染させ、組み換えウイルスを作製した。
本実施例では、タグの付加に関し、以下の通り行った。
（ｉ）ヒトプレセニリン１は、タグ付加はせず、そのままｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。
（ｉｉ）ヒトニカストリンは、ｐＥＦ６−ＴＯＰＯ／Ｖ５／Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｃ末側にベクター由来のＶ５／Ｈｉｓタグを含んだｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。ヒトニカストリンの遺伝子には、Ｖ５タグ部分
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Ｖ５タグ部分の塩基配列：
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（ｉｉｉ）ヒトＡＰＨ−１ａは、ｐＥＦ４／ｍｙｃ／ＨｉｓＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｃ末側にベクター由来のｍｙｃ／Ｈｉｓタグを含んだｃＤＮＡをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。なお、ヒトＡＰＨ−１ａは、２５１型を使用した。
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ヒトニカストリン及びヒトＡＰＨ−１ａは、終始コドン（ＴＡＧ）を省き、タグを付加したものをｐＢｌｕｅＢａｃ４．５に組み込んだ。
（ｉｖ）ヒトＰＥＮ−２は、Ｎ末側付加したＨｉｓタグはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２のベクター由来のものを使用した。ヒトＰＥＮ−２については、開始コドン（ＡＴＧ）を省き、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａに組み込んだ。
（２）発芽型バキュロウイルスにおけるプロテアーゼ発現のウエスタンブロットによる解析
Ｓｆ９細胞を５００ｍＬ容量のスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ）に２×１０６個／ｍｌ濃度で２５０ｍｌ培養し、上記（１）で作製した組み換えウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）＝５で感染させ、７２時間後の培養液を実験に用いた。培養液を１，０００×ｇで１０分間遠心し、沈澱及び上清に分離した。沈澱は細胞破砕緩衝液（１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）））に懸濁しホモジェナイザーにて破砕後、１，５００×ｇ、１０分遠心した。さらに上清を１００，０００×ｇ、１時間超遠心し、沈澱をＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁しＳｆ９細胞膜画分とした。１，０００×ｇの遠心後の上清を４０，０００×ｇで３０分遠心し、沈澱をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した後、さらに４０，０００×ｇ、３０分遠心した。沈澱を１，０００×ｇで１０分遠心し、上清をさらに４０，０００×ｇ、３０分遠心し、沈澱をＰＢＳに懸濁して発芽型ウイルス画分（ＢＶ画分）とした。
組み換えウイルス感染後のＳｆ９細胞培養液について、０から９６時間まで２４時間毎に培養液を採取し、細胞膜画分および１，０００×ｇで遠心したＢＶ画分の上清画分を調製し、時間経過におけるプロテアーゼ発現量の変化を確認した（図２）。各時間における細胞膜画分（図２「ｃｅｌｌ」）１μｇ及び上清画分（図２「ＢＶ」）２００μｌを用いて、ヒトプレセニリン１を認識する抗ＰＳ１抗血清（図２「Ｇ１Ｎｒ２」）によるウェスタンブロットを行った。結果を図２に示す。図２の左端の数字は分子量（ｋＤ）を表す。その結果、細胞膜および上清画分いずれにおいても４８時間後からヒトプレセニリン１（ＰＳ１ｗｔ）の発現を確認した（図２の矢頭印）。この結果は、４８時間後の培養液中にプロテアーゼを含むウイルスが発現することを示す。
【実施例２】  発芽型バキュロウイルスにおけるγ−セクレターゼ複合体構成蛋白質の共発現
（１）γ−セクレターゼ複合体構成蛋白質の共感染
ヒトプレセニリン１、ヒトニカストリン、ヒトＡＰＨ−１ａ、ヒトＰＥＮ−２の各発現組み換えウイルスを、２×１０６細胞／ｍｌ濃度のＳｆ９細胞２００ｍｌに、さまざまな組み合わせにより各ウイルスあたりＭＯＩ＝２で感染させ、７２時間後にＢＶ画分を調製した。ＢＶ画分におけるγ−セクレターゼ構成因子の発現量は、ヒトプレセニリン１を認識する抗ＰＳ１抗血清、ヒトニカストリンに付加したＶ５タグを認識する抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗ｍｙｃ抗体（ＲｏｃｈｅまたはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヒトＰＥＮ−２を認識する抗ＰＥＮ−２抗体を用いたウェスタンブロットにより確認した（図３）。図３において、各蛋白質の組合せを「＋」印で示す。図３において、「Ｇ１Ｎｒ２」および「Ｇ１Ｌ３」はヒトプレセニリンに対する抗体、「Ｖ５」はヒトニカストリンに付加したＶ５タグを認識する抗体、「ｍｙｃ」はＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗体、「ＰＮＴ−３」はヒトＰＥＮ−２に対する抗体を示す。
４種類の各発現組み換えウイルスをすべてＳｆ９細胞に感染させると、活性型プレセニリンとして考えられているフラグメント型プレセニリンを生じることが観察されたが（図３「ＰＳ１  ＮＴＦ」および「ＰＳ１  ＣＴＦ」）、他のいずれの組み合わせによってもフラグメント型プレセニリンを生じることはなかった。またこのＢＶ画分を１％ＣＨＡＰＳＯにより可溶化し、それぞれの特異抗体によって免疫沈降（ＩＰ）した後、各抗体でウェスタンブロット解析した。その結果、いずれの分子も相互作用していることが明らかとなった（図４）。図４において、「ａｎｔｉ−Ｇ１Ｌ３」はヒトプレセニリン１（ヒトプレセニリン１のフラグメント型であるＰＳ１  ＣＴＦ）に対する抗体、「ａｎｔｉ−Ｖ５」はニカストリン（ＮＣＴ）に付加したＶ５タグを認識する抗体、「ａｎｔｉ−ｍｙｃ」はＡＰＨ−１ａに付加したｍｙｃタグを認識する抗体、「ａｎｔｉ−ＰＮＴ３」はヒトＰＥＮ−２に対する抗体を示す。
４分子を共発現させたＳｆ９細胞の膜画分とそれ由来のＢＶ画分を同時にウェスタンブロット解析したところ、Ｓｆ９細胞においては発現させたヒトプレセニリン１のほとんどが不活性型である全長型（図５「ＰＳ１  ＦＬ」）にとどまっていたのに対し（図５「Ｓｆ９  ｃｅｌｌｓ」）、ＢＶ画分においては全長型プレセニリンはほとんど見られず（図５「Ｂｕｄｄｅｄ  Ｖｉｒｕｓ」）、選択的に活性型であるフラグメント型プレセニリンが集積しているのが観察された（図５「ＰＳ１  ＮＴＦ」）。
共感染により生じた各ＢＶ画分を１％ＣＨＡＰＳＯにより可溶化し、人工基質を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  γ−セクレターゼアッセイ系により、γ−セクレターゼ活性をｄｅｎｏｖｏ合成されたＡβの集積を指標に用いて測定した（Ｔａｋａｓｕｇｉ  Ｎ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｉ，Ｔｓｕｒｕｏｋａ  Ｍ，Ｎｉｉｍｕｒａ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ  Ｇ，Ｉｗａｔｓｕｂｏ  Ｔ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２２：４３８−４４１  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｉ，Ｔｏｍｉｎａｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｕｌｉｎｄａｃ  ｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓ  ａ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｇａｍｍａ  ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｓ  Ａｂｅｔａ  ４２  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３  Ｍａｒ  ２００３，：１０，）。
その結果、４分子を共感染させたＢＶ画分においてのみ人工基質の切断活性が観察された（図６）。この活性は既知のγ−セクレターゼ阻害剤（Ｌ−６８５，４５８およびＤＡＰＴ）によって阻害されたこと、またプレセニリンの活性に必須であると考えられている３８５番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した変異体（図７「ＰＳ１Ｄ３８５Ａ」）においては活性が失われていたことなどから、活性を持つγ−セクレターゼ複合体がＳｆ９細胞中で再構成され、選択的にＢＶ画分中に集積したことを表すものと考えられた（図７）。
産業上の利用の可能性
本発明により、活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質又は活性型の膜型プロテアーゼ蛋白質複合体をバキュロウイルスに発現させることができる。本発明によれば、複合体を形成して機能する膜型プロテアーゼ（例えばプレセニリン等）の活性型蛋白質複合体を選択的に発現することが可能となり、基質との結合を阻害又は促進する物質のスクリーニングに使用することができる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１７：Ｖ５タグペプチド配列
配列番号１８：Ｖ５タグヌクレオチド配列
配列番号１９：Ｈｉｓタグペプチド配列
配列番号２０：Ｈｉｓタグヌクレオチド配列
配列番号２１：ｍｙｃタグペプチド配列
配列番号２２：ｍｙｃタグヌクレオチド配列
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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