(57)【要約】二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、少なくともレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドを含むプローブＡと、少なくともレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドを含むプローブＢの二つのプローブからなる蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、少なくともレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドを含むプローブＡと、少なくともレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドを含むプローブＢの二つのプローブからなることを特徴とする蛋白質相互作用解析用プローブ。
【請求項２】
プローブＡは、レニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドとともに  ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチドを含み、プローブＢは、レニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドとともにｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチドを含む請求項１の蛋白質相互作用解析用プローブ。
【請求項３】
レニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドと、レニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドに、各々リンカー配列が結合している請求項１または２のいずれかの蛋白質相互作用解析用プローブ。
【請求項４】
リンカー配列は、３〜２０アミノ酸残基からなるものである請求項３の蛋白質相互作用解析用プローブ。
【請求項５】
レニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドとレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドは、レニラルシフェラーゼをＳｅｒ９１とＴｙｒ９２の間で分割して得られるものである請求項１ないし４の蛋白質相互作用解析用プローブ。
【請求項６】
請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを、セレンテラジンと酸素の存在下で共存させ、発光を測定することを特徴とする蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法。
【請求項７】
請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによりプローブＡを連結した蛋白質ａとプローブＢを連結した蛋白質ｂをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる請求項６の蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法。
【請求項８】
請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＡを連結した蛋白質ａとプローブＢを連結した蛋白質ｂをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる請求項６の蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法。
【請求項９】
請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと請求項１ないし５記載のいずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物。
【請求項１０】
請求項９の非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における蛋白質相互作用を解析する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、生細胞内の、どこで、いつ蛋白質−蛋白質相互作用が生起したかを検出・定量するための蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、生細胞内や個体内における種々の蛋白質−蛋白質相互作用に関わる細胞内シグナル増強／抑制物質を、精度高く、高速にスクリーニングすることを可能とする蛋白質相互作用解析用プローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用解析方法に関するものである。
【背景技術】  生細胞の構築や機能においては、蛋白質−蛋白質相互作用が重要な役割を果たしていることが知られている。また、遺伝子の転写機構や細胞内シグナル伝達などにおいても、蛋白質相互作用が関連することが知られている。
従来、蛋白質−蛋白質相互作用を解析するための方法としては、スプリット酵素法が報告されている（Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．，Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，８４０５−８４１０，１９９７；Ｒｅｍｙ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，５３９４−５３９９，１９９９；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｎ．，Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，６８３−６９０，１９９９；Ｋａｒｉｍｏｖａ，Ｇ．，Ｐｉｄｏｕｘ，Ｊ．，Ｕｌｌｍａｎｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｌａｄａｎｔ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５，５７５２−５７５６）。この方法では、開裂した酵素が蛋白質−蛋白質相互作用により再構築され、それにより復旧された酵素活性を菌や細胞の表現型、あるいは蛍光性酵素基質によって測定して蛋白質−蛋白質相互作用を検出する。
しかし、このようなスプリット酵素法では、酵素反応に時間を要する上、酵素反応により産生された蛍光性酵素基質が安定な物質であり、細胞内において拡散するため、蛋白質相互作用が起きた場所や時を細胞内で特定できないという問題があった。
そこで、この出願の発明者らは、あらゆる蛋白質について高い精度で簡便に蛋白質−蛋白質相互作用を解析できるプローブとして、蛋白質相互作用により生起するプロテインスプライシングにより発光酵素やＧＦＰが生成され、発光酵素などの酵素活性やＧＦＰのフルオロフォアが再生される蛋白質相互作用解析用プローブを作成し、報告している（特願２０００−２２４９３９；ＰＣＴ／ＪＰ００／０９３４８）。
しかし、酵素の蛍光性生成物やＧＦＰなどのフルオロフォアは拡散性であるため、このような蛋白質相互作用解析用プローブでも、蛋白質−蛋白質相互作用がいつ、どの部位で生じたのかを特定することは困難であったのが実情である。
そこで、この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、生細胞内の、どこで、いつ蛋白質−蛋白質相互作用が生起したかを検出・定量するためのプローブと、それを用いた蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法を提供することを課題としている。
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、少なくともレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドを含むプローブＡと、少なくともレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドを含むプローブＢの二つのプローブからなることを特徴とする蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
この出願の発明は、第２には、前記の蛋白質相互作用解析用プローブに関連して、ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチドとレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドを含むプローブＡと、ｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチドとレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドを含むプローブＢの二つのプローブからなる蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
この出願の発明は、また、第３には、レニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドと、レニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドに、各々リンカー配列が結合している前記いずれかの蛋白質相互作用解析用プローブを、第４には、リンカー配列が３〜２０アミノ酸残基からなるものである前記の蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
さらに、この出願の発明は、第５には、レニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチドとレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチドが、レニラルシフェラーゼを  Ｓｅｒ９１とＴｙｒ９２の間で分割して得られるものである前記いずれかの蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
この出願の発明は、さらに、第６には、前記いずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと前記いずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを、セレンテラジンと酸素の存在下で共存させ、発光を測定することを特徴とする蛋白質相互作用の解析方法を提供する。
また、この出願の発明は、第７には、前記いずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと前記いずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによりプローブＡを連結した蛋白質ａとプローブＢを連結した蛋白質ｂをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる蛋白質相互作用の解析方法を提供する。
この出願の発明は、第８には、前記いずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと前記いずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてプローブＡを連結した蛋白質ａとプローブＢを連結した蛋白質ｂをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる蛋白質相互作用の解析方法を提供する。
さらに、この出願の発明は、第９には、前記いずれかのプローブＡを連結した蛋白質ａと前記いずれかのプローブＢを連結した蛋白質ｂを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物またはその子孫動物を提供する。
そして、第１０には、前記非ヒト動物またはその子孫動物に検査試料を導入し、該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における蛋白質相互作用を解析する物質のスクリーニング方法をも提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブの一例とその作用原理を表す概略模式図である。
図２は、この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブの別の例とその作用原理を表す概略模式図である。
図３は、この出願の発明の実施例において使用されたレニラルシフェラーゼのアミノ酸配列と分割部位を示した概略模式図である。
図４は、この出願の発明の実施例において使用されたスプリットレニラルシフェラーゼ融合蛋白質（ｓＲＬ）のプラスミドの構成を示した図である。（ａ：ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ、ｂ：ｓＲＬ、ｃ：ｓＲＬ９１のＮ−末端側、ｄ：ｓＲＬ９１のＣ−末端側、ｅ：ｓＲＬ９１Ｆ）
図５は、この出願の発明の実施例において、レニラルシフェラーゼの分割箇所と、蛋白質相互作用により生起した発光の関係を示した図である。（ａ：インスリンの存在下における発光とインスリンの非存在下における発光の比、ｂ：全長レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ）による発光強度に対する各蛋白質相互作用解析用プローブの相対発光強度）
図６は、この出願の発明の実施例において、ｓＲＬ９１Ｆを用いた際のインスリン存在下および非存在下での発光強度を示した図である。（ａ：ｓＲＬ９１Ｆ、ｂ：ｓＲＬ９１のＮ−末端側のみ、ｃ：ｓＲＬ９１ＦのＣ−末端側のみ）
図７は、この出願の発明の実施例において、ｓＲＬ９１を用いた際のインスリンの添加量とＹ９４１とＳＨ２ｎの間の相互作用の経時変化を示した図である。
図８は、この出願の発明の実施例において、ｓＲＬ９１を用いた際のインスリン添加後のＹ９４１とＳＨ２ｎの相互作用の経時変化をイムノブロッティングにより示した図である。
図９は、この出願の発明の実施例において、ＣＨＯ−ＩＲ細胞の顕微鏡像を示す写真である。（ａ：ｓＲＬ９１を発現したＣＨＯ−ＩＲ細胞においてインスリン刺激の非存在下、ｂ：１０−７Ｍインスリン刺激の存在下、ｃ：全長レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ）を発現したＣＨＯ−ＩＲ細胞）
図１０は、アダプタープロテインＳｈｃとＧｒｂの相互作用機構を示した概略模式図である。
図１１は、この出願の発明の実施例において、Ｓｈｃの３カ所のチロシン基をフェニルアラニン基に、ＰＴＢドメイン内のセリン基をプロリン基に置換した各種変異体とＧｒｂ２との相互作用を定量的に評価した結果を示した図である。（ａ：ＥＧＦ、ｂ：Ｅ２、ｃ：ＤＨＴ、ｄ：ＤＥＳ添加）
なお、図中の各符号は次のものを示す。
１  蛋白質相互作用解析用プローブ
１ａ  プローブＡ
１ｂ  プローブＢ
１ｃ  プローブＣ
１ｄ  プローブＤ
２  レニラルシフェラーゼ
２ａ  Ｎ−スプリットレニラルシフェラーゼ
２ｂ  Ｃ−スプリットレニラルシフェラーゼ
３ａ  蛋白質ａ
３ｂ  蛋白質ｂ
４  生物発光
５ａ  リンカー配列
５ｂ  リンカー配列
６ａ  ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド
６ｂ  ｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド
Ｉ  共存
ＩＩ  相互作用
ＩＩＩ  再構成
ＩＩＩ’  切り出し
ＩＶ  酸化分解
Ｖ  発光
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブは、標識物質としてレニラルシフェラーゼを用いることを特徴とするものである。
レニラルシフェラーゼ（Ｌｏｒｅｎｚ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，４４３８−４４４２（１９９１）．）（配列番号１）は、ホタルルシフェラーゼの約半分の分子量（３６ｋＤａ）を有するモノマー蛋白質であり、哺乳類細胞内で容易に発現することが知られている。また、レニラルシフェラーゼの結晶構造は不明であるが、ルミネッセンス活性のためにはＮ−末端といくつかのシステイン残基が重要であり（Ｐａｕｌｍｕｒｕｇａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，１５６０８−１３（２００２）；Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２０３，１４１−１４８（１９９７）．）、レニラルシフェラーゼの酵素反応は、ホタルルシフェラーゼの場合とは異なり、ＡＴＰを必要としない（Ｌｉｕ，Ｊ．＆  Ｅｓｃｈｅｒ，Ａ．Ｇｅｎｅ  ２３７，１５３−１５９（１９９９）．）ことが知られている。さらに、ルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンは哺乳類の細胞膜を貫通し、細胞基質中に急速に拡散することも知られている（Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．＆  Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４，２３５−２６０（２００２）；Ｇｒｅｅｒ，Ｌ．Ｆ．＆  Ｓｚａｌａｙ，Ａ．Ａ．Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １７，４３−７４（２００２）．）。
レニラルシフェラーゼは、溶存酸素存在下においてセレンテラジンの励起状態化合物（オキシセレンテラジンモノアニオン）への酸化を触媒し、組織透過性を有する近赤外線領域（４００ｎｍ〜６３０ｎｍ）の広いバンドのルミネッセンスを発し、セレンテルアミドと二酸化炭素を生じさせる。
この出願の発明者らは、このようなレニラルシフェラーゼの酵素反応に着目し、生細胞のどこで、いつ蛋白質相互作用が起こったのかを精度高く検出できるプローブを実現することを目的として鋭意研究を進めた結果、本願発明に至ったのである。
図１および図２にこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブの構成と作用原理を示した。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ（１）は、図１に示されるように、少なくともレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチド（２ａ）を含むプローブＡ（１ａ）と、少なくともレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチド（２ｂ）を含むプローブＢ（１ｂ）からなるものである（以下、このように分割されたレニラルシフェラーゼのＮ−およびＣ−末端をＮ−スプリットレニラルシフェラーゼ、Ｃ−スプリットレニラルシフェラーゼと呼ぶことがある。）。
そして、この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブを用いて蛋白質相互作用を解析するには、プローブＡ（１ａ）およびプローブＢ（１ｂ）を各々、その相互作用を調べたい二つの蛋白質ａおよびｂ（３ａおよび３ｂ）に結合し、これらをセレンテラジンと溶存酸素の存在下で共存させる（Ｉ）。このとき、蛋白質（３ａ）および（３ｂ）が相互作用する（ＩＩ）と、プローブＡ（１ａ）およびＢ（１ｂ）におけるＮ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａ）とＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ｂ）が近位に並置され、レニラルシフェラーゼ（２）の再構成が起こる（ＩＩＩ）。そして、このレニラルシフェラーゼ（２）が発光触媒酵素として作用し、瞬時に、セレンテラジンを酸化分解し（ＩＶ）、生成される励起カルボニル基が基底状態に戻るときのエネルギーが生物発光（４）として放出されるのである（Ｖ）。したがって、この生物発光（４）を検出することにより蛋白質−蛋白質相互作用を解析することが可能となる。
以上のとおりのこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ（１）において、プローブＡ（１ａ）とプローブＢ（１ｂ）は、各々、Ｎ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼのみからなるものであってもよいが、それぞれさらに、ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド（６ａ）とｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド（６ｂ）を含有していてもよい。
すなわち、この場合、図２に示されるように、蛋白質相互作用解析用プローブ（１）において、プローブＡは、ｉｎｔｅｉｎのＮ−末端側のポリペプチド（６ａ）とレニラルシフェラーゼのＮ−末端側のポリペプチド（２ａ）を含むもの（以下プローブＡ’と呼ぶ）（１ｃ）となり、プローブＢは、ｉｎｔｅｉｎのＣ−末端側のポリペプチド（６ｂ）とレニラルシフェラーゼの残るＣ−末端側のポリペプチド（２ｂ）を含むもの（以下プローブＢ’と呼ぶ）（１ｄ）となる。
このような蛋白質相互作用解析用プローブを用いて蛋白質相互作用解析を解析するには、プローブＡ’（１ｃ）およびプローブＢ’（１ｄ）を各々相互作用を調べたい蛋白質ａおよびｂ（３ａおよび３ｂ）に結合し、共存させる（Ｉ）。このとき、蛋白質（３ａおよび３ｂ）が相互作用すれば（ＩＩ）、スプライシングが起こり、各スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａ、２ｂ）が連結してレニラルシフェラーゼ（２）が再構成される（ＩＩＩ）。
このとき、系内にセレンテラジンと酸素が共存していると、切り出された（ＩＩＩ’）レニラルシフェラーゼ（２）を発光触媒酵素として、瞬時に、膜透過性基質であるセレンテラジンの酸化分解が起こり（ＩＶ）、励起カルボニル基が基底状態に戻るときのエネルギーが生物発光（４）として放出される（Ｖ）。したがって、この生物発光（４）を検出することにより蛋白質−蛋白質相互作用を解析することが可能となる。
一方、蛋白質ａ（３ａ）と蛋白質ｂ（３ｂ）が相互作用（ＩＩ）しなければ、ｉｎｔｅｉｎのスプライシングが起こらないため、レニラルシフェラーゼ（２）は再構成（ＩＩＩ）されず、生物発光（４）に顕著な変化が現れない。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブにおいて使用されるｉｎｔｅｉｎとしては、種々の生物由来の公知物質が適用できる。例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）Ｓｃｅ  ＶＭＡ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉａｌｌｉｓ（ガンジタ菌）Ｃｔｒ  ＶＭＡなどに代表される真核生物由来のもの、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）Ｍｔｕ  ｒｅｃＡなどの真正細菌由来のもの、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｓｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（サーモプラスマアシドフィラム）Ｔａｃ  ＶＭＡなどの古細菌由来のもの等が挙げられる。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ（１ｃ、１ｄ）において、蛋白質ａ（３ａ）と蛋白質ｂ（３ｂ）の相互作用によりｉｎｔｅｉｎが自動的に切り出されるためには、ｉｎｔｅｉｎは、部位特異的エンドヌクレアーゼであることが好ましい。さらに、この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ（１ｃ、１ｄ）において、ｉｎｔｅｉｎのスプライシングが有効に起こるためには、蛋白質前駆体において、スプライシングに関与する二つの部位が隣接するように、正しく折り畳まれ、かつ、各部位が正確に並べられなければならない（Ｄｕａｎ，Ｘ．，Ｇｉｍｂｌｅ，Ｆ．Ｓ．ａｎｄ  Ｑｕｉｏｃｈｏ，Ｆ．Ａ．，Ｃｅｌｌ  ８９，５５５−５６４，１９９７）。したがって、ｉｎｔｅｉｎとしては、生物由来のものをそのまま用いてもよいが、一部のアミノ酸残基を変換したり、削除したり、適当なリンカー配列を導入したりして、スプライシングが起こりやすいように設計されてもよい。
以上のとおりのこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブでは、プローブＡ（１ａ）およびプローブＢ（１ｂ）は、各々、Ｎ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼのみからなるものであってもよいが、それぞれの末端にリンカー配列（５ａ、５ｂ）を有していてもよい。このようにリンカー配列（５ａ、５ｂ）を有する場合には、プローブＡ（１ａ）とプローブＢ（１ｂ）はこれらのリンカー配列（５ａ、５ｂ）を介して蛋白質（３ａ、３ｂ）と結合する。リンカー配列（５ａ、５ｂ）としては、各種のものが例示され、とくに限定されないが、例えば３〜２０アミノ酸残基からなるもの、具体的には、グリシン−アラニン繰り返し配列を有するもの等が挙げられる。
また、同様に、プローブＡ’（１ｃ）およびプローブＢ’（１ｄ）は、各々、ｉｎｔｅｉｎのＮ−またはＣ−末端側のポリペプチド（６ａ、６ｂ）とＮ−またはＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａ、２ｂ）のみからなるものであってもよいが、これら以外に、前記と同様のリンカー配列（５ａ、５ｂ）等を含んでいてもよい。つまり、プローブＡ’（１ｃ）およびプローブＢ’（１ｄ）においてｉｎｔｅｉｎのポリペプチド（６ａ、６ｂ）とスプリットレニラルシフェラーゼ（２ａ、２ｂ）は、直接結合されていてもよいし、リンカー配列（５ａ、５ｂ）を介して結合されていてもよいのである。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ（１）において、用いられるＮ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａおよび２ｂ）とは、レニラルシフェラーゼを適当な位置で分割したＮ−末端側と残るＣ−末端側を意味するが、これらＮ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａおよび２ｂ）は、蛋白質ａおよびｂ（３ａ、３ｂ）の相互作用（ＩＩＩ）により、あるいは、蛋白質ａおよびｂ（３ａ、３ｂ）の相互作用により生じるｉｎｔｅｉｎ（６）のスプライシングにより、直接ペプチド結合し、再構成（ＩＶ）されるものである。
したがって、このようなＮ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（２ａおよび２ｂ）が再構成（ＩＶ）前（個々のとき）には発光活性を示さず、再構成により酵素活性を取り戻すようにするために、活性中心を２つに分割するような分け方をする必要がある。具体的には、レニラルシフェラーゼをシステイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、またはチロシン（Ｔｙｒ）の位置で分割することを試みた。
なお、後述の実施例にも示されるとおり、発明者らの研究によれば、プローブＡ（またはＡ’）におけるＮ−スプリットレニラルシフェラーゼを、ルシフェラーゼをＳｅｒ９１とＴｙｒ９２の間で分割して得られるＮ−スプリットレニラルシフェラーゼとし、残るＣ−末端側を、プローブＢ（またはＢ’）におけるＣ−スプリットレニラルシフェラーゼとすることにより、とくに精度高い検出が可能となる。
この出願の発明では、以上のとおりの蛋白質相互作用解析用プローブが提供されるが、これを用いて蛋白質−蛋白質相互作用を解析するには、前記のとおり、一方のプローブ（例えばプローブＡ）を相互作用を確かめたい一方の蛋白質ａに連結させ、もう一方のプローブ（プローブＢ）を相互作用を確認したいもう一方の蛋白質ｂに連結して両者を共存させ、生物発光（４）を検出、測定すればよい。なお、このとき、各蛋白質（３ａ、３ｂ）とプローブ（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）の連結方法は、蛋白質やプローブに影響を及ぼさなければどのような方法であってもよい。例えば、通常用いられる化学的、生物化学的、あるいは、遺伝子工学的手法等が適用できる。
この出願の発明では、以上のとおりの蛋白質相互作用解析用プローブをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる方法としては、蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａおよび１ｂ、または１ｃおよび１ｄ）を各々相互作用を確認した蛋白質ａおよびｂ（３ａ、３ｂ）に結合させ、それらをセレンテラジンを含有する溶液に添加して共存させる方法があげられる。このような方法で蛋白質−蛋白質相互作用を解析をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出・定量できる。
また、この出願の発明では、蛋白質相互作用解析用プローブ（１）におけるプローブＡ（１ａ）を連結した蛋白質ａとプローブＢ（１ｂ）を連結した蛋白質ｂ、または蛋白質相互作用解析用プローブＡ’（１ｃ）を連結した蛋白質ａ（３ａ）とプローブＢ’（１ｄ）を連結した蛋白質ｂ（３ｂ）を組み込んだ発現ベクターを、個々の培養細胞に導入する方法により、蛋白質ａおよびｂ（３ａ、３ｂ）をセレンテラジンおよび酸素と共存させることができる。なお、酸素は細胞内に存在する濃度で十分であり、新たに酸素を供給する必要はない。
このとき、発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。このように、蛋白質相互作用解析用プローブ（１ａと１ｂ、または１ｃと１ｄ）を連結した蛋白質（３ａと３ｂ）を組み込んだ発現ベクターを細胞に導入する方法を用いることにより、細胞内で蛋白質相互作用解析用プローブ（１）、蛋白質（３）、セレンテラジンおよび酸素が共存でき、細胞を破壊することなく、蛋白質−蛋白質相互作用を検出・定量するｉｎ  ｖｉｖｏ法が可能となる。
さらに、この出願の発明の蛋白質相互作用の解析方法では、蛋白質相互作用解析用プローブＡ（１ａ）を連結した蛋白質ａ（３ａ）とプローブＢ（１ｂ）を連結した蛋白質ｂ（３ｂ）、または蛋白質相互作用解析用プローブＡ’（１ｃ）を連結した蛋白質ａ（３ａ）とプローブＢ’（１ｄ）を連結した蛋白質ｂ（３ｂ）を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において蛋白質相互作用解析用プローブ（１）、蛋白質（３）、セレンテラジンおよび酸素を共存させることもできる。このとき、酸素は、生体内に存在する濃度で十分であり、新たに添加する必要はない。
なお、この出願の発明では、このようにして得られるトランスジェニック非ヒト動物をも提供する。トランスジェニック非ヒト動物は、公知の作成法（例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０）に従って作成することができる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞に蛋白質相互作用解析用プローブ（１）と蛋白質（３）を保有しているため、例えば、その体内に医薬品や毒物などの試料物質を導入し、細胞および組織における蛋白質相互作用を解析することによって、蛋白質−蛋白質相互作用に関わる細胞内シグナル増強／抑制物質を精度高くスクリーニングすることができる。
この出願の発明の蛋白質−蛋白質相互作用の解析方法では、前記のとおりの作用原理および操作により発せられるルミネッセンス（生物発光）（４）を検出することにより蛋白質−蛋白質相互作用が起こったことを確認できる。また、レニラルシフェラーゼによる生物発光は組織透過性であることから、細胞内での発光を観察して画像化すれば、蛋白質−蛋白質相互作用が起こったタイミングのみならず、部位をも特定できる。さらに、特定の試料の添加や濃度など、条件を変化させた際の発光強度の変化を測定することにより、蛋白質−蛋白質相互作用を定量することもできる。さらにまた、発光強度の変化を経時的に測定することにより、蛋白質−蛋白質相互作用の開始から終了までを追跡することもできる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】  蛋白質のリン酸化に伴って、Ｙ９４１ペプチド（配列番号２）とＮ−末端ＳＨ２ドメイン（ＳＨ２ｎ）の間で生じる、公知の蛋白質−蛋白質相互作用（Ｏｚａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５１６−２５２１（２００１）；Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，２８７−２９４（２００２）；Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７１，３９４８−３９５４（１９９９）．）について、本願発明の蛋白質相互作用解析用プローブを用いて可視化した。
なお、以下の実施例において、試薬は次のものを使用した。
制限酵素、修飾酵素およびリガーゼは  Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（東京、日本）から購入した。
哺乳類において最も頻繁に用いられるコドンを含むレニラルシフェラーゼをコードする、合成レニラルシフェラーゼ遺伝子ベクター（ｈＲＬ−ＣＭＶ）およびレニラルシフェラーゼアッセイキットはＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。
哺乳類の発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）およびｐＩＲＥＳは、それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、オランダ）およびＣｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）より入手した。
Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。
抗ｍｙｃ抗体、抗ｆｌａｇ抗体および抗リン酸化チロシン抗体（ＰＹ２０）はＳａｎｔａ  ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）より購入した。
アルカリホスファターゼ標識化抗ウサギおよび抗マウス抗体は、Ｊａｃｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＡ）より購入した。
ニトロセルロース膜はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、イギリス）より入手した。
ＣＤＰ−ＳＴＡＲの化学ルミネッセンス基質はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）より購入した。
＜実施例１＞  蛋白質相互作用解析用プローブの最適化
インスリン受容体基質−１（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１：以下、ＩＲＳ１）由来のＹ９４１ペプチド内の９４１チロシン残基は、インスリン刺激されると、インスリン受容体によりリン酸化され、チロシンホスファターゼにより脱リン酸化される（Ｓａｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７１，３９４８−３９５４（１９９９）；Ｐｒａｔｉｐａｎａｗａｔｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，２５７２−２５７８（２００１）．）。また、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼのｐ８５サブユニット（ｐ８５  ３３０−４２９）由来のＳＨ２ｎは、ＩＲＳ１内部のリン酸化された９４１−チロシン残基に結合する（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，９２９−９３６（１９９７）；Ｇｏｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１２７５，４２８３−４２８９（２０００）．）。
（１）プラスミドの構築
レニラルシフェラーゼの遺伝子をシステイン、セリンおよびチロシン近傍の８箇所で分割し、２個の不活性なフラグメント（Ｎ−スプリットレニラルシフェラーゼ、Ｃ−スプリットレニラルシフェラーゼ）にした。
配列番号１および図３にレニラルシフェラーゼのアミノ酸配列と分割部位を示した。なお、本実施例においては、レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ）の１２４−システイン残基がアラニンに置換され、ルミネッセンス活性が増大されたレニラルシフェラーゼ変異体（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ：配列番号３）（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ２０３，１４１−１４８（１９９７）．）を用いた。
Ｎ−スプリットレニラルシフェラーゼ（ｈＲＬｎ）およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼ（ｈＲＬｃ）を、それぞれ蛋白質（Ｙ９４１とＳＨ２ｎ）に結合させた。各スプリットレニラルシフェラーゼ融合蛋白質（ｓＲＬ）のプラスミドの構成を図４に示した。なお、これらのプラスミドは、いずれも開始コドン上流にＣＭＶ−プロモーター配列を有するものとした。
Ｙ９４１のアミノ酸配列はＴＥＥＡＹＭＫＭＤＬＧＰＧ（配列番号２）であり、これはＩＲＳ１内部のチロシンリン酸化ドメインとなっている。ＳＨ２ｎはウシホスファチジルイノシトールのｐ８５サブユニットのＮ−末端ＳＨ２ドメインである。また、図４において、点線部分はリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を示す。さらに、ｓＲＬは、いずれも（翻訳終了コドン）−（リボソーム内部進入部位）−（翻訳開始コドン）より構成されるカセットを有するものとした。
さらに、蛋白質−蛋白質相互作用が生じた際に、Ｎ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼが確実に近接するようにするために、Ｎ−スプリットレニラルシフェラーゼとＹ９４１の間に、Ｇ−Ａリピートを含む柔軟な１８アミノ酸残基からなるリンカー配列（配列番号４）を、ＳＨ２ｎとＣ−スプリットレニラルシフェラーゼの間に同様のリンカー配列（配列番号５）を挿入した。さらに、ＭｙｃおよびＦＬＡＧエピトープをＮ−およびＣ−スプリットレニラルシフェラーゼの下流に挿入した。
なお、全てのプラスミド構築サブクローニングの微生物宿主としては、大腸菌株ＤＨ５αを用いた。また、プラスミドは、全てジーンアナライザーＡＢ１  ｐｒｉｓｍ  ３１０（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、東京、日本）を用いた配列解析により確認した。
（２）細胞培養と形質移入
ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞の生育は、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｆｉｌｔｒｏｎ）、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地中で行った。形質移入はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００を用いて行った。
細胞を６ウェルの培養プレート上に播種し、前記いずれかのプラスミドを２ｎｇ用いて形質移入を行った。形質移入の６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥを含む培地をＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地に置換し、４０時間インキュベートして各蛋白質相互作用解析用プローブを発現させた。
（３）免疫沈降およびイムノブロット分析
ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞を、１００ｎＭインスリンを用いて３７℃で５分間刺激し、氷冷した２ｘ免疫沈降緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＦ、０．２ｍＭオルソバナジン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチン、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、２％  ＩＧＥＰＡＬＣＡ６３０、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）により機械的に破砕した。
Ｎ−融合蛋白質は抗ｍｙｃ抗体により４℃で１時間処理し、ＣＨＯ−ＨＩＲ細胞の全細胞破砕液から免疫沈降した。この免疫沈降物を、蛋白質Ｇセファロース４ＦＦビーズを用いて吸着し、次いで氷冷した免疫沈降緩衝液を用いて５回洗浄した。
試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、Ｙ９４１リン酸化については抗リン酸化チロシン抗体（１：５００）を用いて、Ｎ−末端蛋白質の評価には抗ｍｙｃ抗体（１：５００）を用いて、Ｃ−末端蛋白質の評価には抗ｆｌａｇ抗体（１：１０００）を用いて分析した。
（４）発光測定
３７℃でＣＨＯ−ＨＩＲ細胞のインスリン刺激を行った。また、発光強度はレニラルシフェラーゼアッセイキットを用いて測定した。
次に冷ＰＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、破砕した。破砕液を４℃で１５，０００ｇ、３０秒間遠心分離し、上澄の一部について、Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６照度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）を用いて発光強度を１０秒間測定した。上澄中の蛋白質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
（５）結果
レニラルシフェラーゼの分割箇所と、蛋白質相互作用により生起した発光（インスリンの存在下における発光とインスリンの非存在下における発光の比）の関係を図５（ａ）に示した。また、全長レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ）による発光強度に対する各蛋白質相互作用解析用プローブの相対発光強度を図５（ｂ）に示した。
なお、各測定は、培養プレートの異なるウェルを用いて３回行った。
レニラルシフェラーゼがＳｅｒ９１とＴｙｒ９２の間で分割された蛋白質相互作用解析用プローブ（ＳＲＬ９１）を発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞は、１０−７Ｍインスリン存在下において、非存在下の場合と比べて２５倍の発光強度を示した。
一方、レニラルシフェラーゼが他の位置で分割された蛋白質相互作用解析用プローブでは、１０−７Ｍインスリン存在下で２〜４倍の増加が確認された。
【実施例２】  実施例１において、ｓＲＬ９１を発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞でのレニラルシフェラーゼの補完が蛋白質のリン酸化に起因する蛋白質−蛋白質相互作用により引き起こされたものであることを確認するために、ｓＲＬ９１におけるＹ９４１ペプチド中の９４１番目のチロシン残基のリン酸化部位をフェニルアラニン残基に変換し、ｓＲＬ９１変異体（ｓＲＬ９１Ｆを作成した。Ｎ−末端側およびＣ−末端側プローブを各々配列番号６および７に示した。
このｓＲＬ９１Ｆを用いて実施例１と同様の操作を行い、インスリン刺激の存在下および非存在下での発光強度を測定した。同様に、図４（ｃ）および図４（ｄ）のプラスミドを用いてｓＲＬ９１のＮ−末端側およびＣ−末端側のみを個別にＣＨＯ−ＨＩＲ細胞に発現させ、各々の発光強度を測定した。
結果を図６に示した。
ｓＲＬ９１Ｆを発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞においては、インスリン刺激時の酵素活性の増加は見られなかった。また、ｓＲＬ９１のＮ−末端側およびＣ−末端側のみを個別に発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞では、インスリンの非存在下のみならず存在下においても、ルミネッセンス活性が完全に消失していた。
以上より、Ｙ９４１とＳＨ２ｎ間の蛋白質−蛋白質相互作用により、レニラルシフェラーゼの補完が起こることが確認された。したがって、レニラルシフェラーゼをＳｅｒ９１とＴｙｒ９２の間で分割したスプリットレニラルシフェラーゼを含む本願発明のプローブ（ｓＲＬ９１）が蛋白質相互作用解析用プローブとして有効であることが示された。
＜実施例３＞  蛋白質−蛋白質相互作用の経時変化測定
前記の方法によりｓＲＬ９１を発現した細胞を、１００ｎＭまたは１０ｐＭインスリンを添加した培地において、１分、５分、１０分、３０分および６０分間、３７℃でインキュベートし、直ちにルミネッセンスを測定した。
Ｙ９４１とＳＨ２ｎの間の相互作用の経時変化を図７に示した。
発光強度はインスリン刺激の５分後に増加し、以後は漸減した。
さらに、ｓＲＬ９１を発現した細胞を、１０−７Ｍインスリンを添加した培地において、１分、５分、１０分、３０分および６０分間、３７℃でインキュベートし、抗ｍｙｃ抗体を用いて全細胞の破砕液の免疫沈降を行った。抗リン酸化チロシン抗体と抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。なお、抗体染色の可視化は、ＣＤＰ−ＳＴＡＲを用い、ＬＡＳ−１０００とイメージアナライザ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  Ｃｏ．、東京、日本）により行った。
得られた結果を図８に示した。
発光強度の経時変化とイムノブロッティングの結果は一致し、蛋白質相互作用の時間依存性は、チロシンのリン酸化および脱リン酸化によるものであることが示唆された。
以上より、ｓＲＬ９１の発光強度の変化が生細胞中で進行する蛋白質−蛋白質相互作用を直接的に反映することが確認された。
【実施例４】  以上のような発光は、膜透過性基質であるセレンテラジンの存在下で、蛋白質−蛋白質相互作用が起こり、レニラルシフェラーゼが補完されることにより生じる。
そこで、次に本願発明の蛋白質相互作用解析用プローブを用いて生細胞内における特定の蛋白質−蛋白質相互作用の発生部位および時間について非侵襲的に画像化することを検討した。
そこで、ｓＲＬ９１を発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞におけるＹ９４１とＳＨ２ｎの間の蛋白質−蛋白質相互作用を画像化した。なお、細胞は、カールツァイス社のＡｘｉｏｖｅｒｔｓ１００顕微鏡に、４０倍の油浸対物レンズを付けたＴｉｌｌ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｖ３．０２（ＰＨＯＴＯＮＩＣＳ，Ｐｌａｎｅｇｇ，ドイツ）により制御された冷却装置付きカメラＭｉｃｒｏＭａｘ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を取り付け、室温下で画像化した。
図９に、ｓＲＬ９１を発現したＣＨＯ−ＩＲ細胞の１０−７Ｍインスリン刺激の非存在下（ａ）および存在下（ｂ）における顕微鏡像と全長レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ）を発現したＣＨＯ−ＩＲ細胞の顕微鏡像を示した。
なお、撮影はＣＣＤカメラを用い、２０％セレンテラジン基質緩衝液を添加したＰＢＳ中で、露出時間をそれぞれ３００秒（ａ、ｂ）および６０秒（ｃ）として実施した。発光強度はカラースケールで表した。
補完されたレニラルシフェラーゼにより放出された発光の増強は、インスリン刺激時には細胞膜下においてのみ見られた（図９ｂ）。一方、インスリン非存在下では、このような鮮やかな対照は見られなかった。
以上より、インスリン刺激によるＹ９４１とＳＨ２ｎの間の相互作用が細胞膜下においてのみ生じることが示された。
さらに、全長レニラルシフェラーゼ（ｈＲＬ１２４Ｃ／Ａ）を発現したＣＨＯ−ＨＩＲ細胞では、細胞全体において均一にルミネッセンスが放出された（図９ｃ）ことから、図９ｂの結果が細胞膜直下におけるセレンテラジンの過剰蓄積によるものではないことが示された。
【実施例５】  スプリットレニラルシフェラーゼを用いて、リン酸化されたアダプタープロテインＳｈｃとＧｒｂ２の相互作用（図１０）を定量的に検出することに成功した。
その結果、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）、ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＴ）およびｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ（ＤＥＳ）により細胞外から刺激した場合、Ｓｈｃのリン酸化部位およびＧｒｂ２との相互作用部位に多くの選択性があることが示された。
リセプター型キナーゼに対する刺激、すなわちＥＧＦ添加の場合、３１７番目のチロシン基がリン酸化されてＧｒｂ２と結合し、その結合にはＰＴＢドメイン内のセリンが必要であることが示された。これは、ＳｈｃがＰＴＢドメイン内のセリンの存在によりリセプター型キナーゼに結合するためであると考えられる。
一方、Ｅ２添加の場合、２３９および２４０番目のチロシン基がリン酸化してＧｒｂ２と結合するためには、ＰＴＢドメイン内のセリンの存在が必要であることが示された。一方、３１７番目のチロシンのリン酸化によるＧｒｂ２との結合は、セリン存在下では起こらないことが示された。
また、ＤＨＴ添加およびＥｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒに対するアゴニストとして知られるＤＥＳ添加の場合も、同様の結果が得られた（図１１）。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、生細胞における蛋白質−蛋白質相互作用を直接可視化できる蛋白質相互作用解析用プローブが提供される。このような蛋白質相互作用解析用プローブは、蛋白質−蛋白質相互作用によるレニラルシフェラーゼの補完を用いるものであるが、他の補完酵素系で用いられる拡散性の生成物（Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，２１８−２２（２０００）；Ｒｏｓｓｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，８４０５−８４１０（１９９７）；Ｒｅｍｙ，Ｉ．＆  Ｍｉｃｈｎｉｃｋ，Ｓ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，５３９４−５３９９（１９９９）；Ｇａｌａｒｎｅａｕ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６１９−６２２（２００２）；Ｗｅｈｒｍａｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，３４６９−３４７４（２００２）．）とは異なり、補完レニラルシフェラーゼによる生物発光は、生細胞や生物内において、蛋白質−蛋白質相互作用が発生した部位と時間を特定できる点で有用性が高い。
【配列表】
2004104222.tif 000002
2004104222.tif 000003
2004104222.tif 000004
2004104222.tif 000005
2004104222.tif 000006
2004104222.tif 000007
2004104222.tif 000008
【図１】
2004104222.tif 000009
【図２】
2004104222.tif 000010
【図３】
2004104222.tif 000011
【図４】
2004104222.tif 000012
【図５】
2004104222.tif 000013
【図６】
2004104222.tif 000014
【図７】
2004104222.tif 000015
【図８】
2004104222.tif 000016
【図９】
2004104222.tif 000017
【図１０】
2004104222.tif 000018
【図１１】
2004104222.tif 000019
【国際調査報告】
2004104222.tif 000020
2004104222.tif 000021
2004104222.tif 000022
2004104222.tif 000023
2004104222.tif 000024