(57)【要約】ホエイの精密濾過保持物、遠心分離処理物および／または硫安沈殿処理物がロタウィルス感染阻害活性を有することを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエイの精密濾過保持液、遠心分離処理液および／または硫安沈殿処理溶液またはその乾燥物であって、ロタウイルス感染防御作用を有する組成物。
【請求項２】
精密濾過膜の孔径が０．００４〜１．４μｍの範囲にある、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
遠心分離処理の重力が３００〜３０，０００ｇの範囲にある、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
硫安沈殿の飽和度が３０〜１００％の範囲にある、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の組成物の有効量を含有する、ロタウイルス感染防御作用を有する食品。
【請求項６】
食品が育児用調製粉乳、高齢者用食品、保健機能食品および病者用食品からなる群より選ばれる請求項５記載の食品。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の組成物の有効量を含有する、ロタウイルス感染防御作用を有する家畜飼料。
【請求項８】
請求項５または６の食品を製造するための請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項９】
請求項７の家畜飼料を製造するための請求項１から４のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗ロタウィルス感染組成物とその製法、および該抗ロタウィルス感染組成物の有効量を含有せしめた抗ロタウィルス感染食品組成物に関する。
【背景技術】  ヒトロタウィルスを原因とする乳幼児冬季下痢症は、おもに２歳以下の幼児に、発熱、嘔吐、下痢、および脱水症状を引き起こす重症の下痢症疾患である。我が国では灰白色の便の性状から白痢とよばれたが、ヒトロタウィルス感染症であることが明らかにされている。アメリカ合衆国では年間で５歳以下の子供の３５０万人の下痢症がロタウィルス感染症と診断され、５万５千人が入院し、２０人が死亡している。全世界では、主に発展途上国において、年間で約６０万人の乳幼児が死亡している。先進国での疫学調査から、衛生状態の改善はロタウィルスの有病率を減少させることはできないとされ、その対策のひとつとして世界的なロタウィルスワクチン開発が進められている。
ＲＲＶ−ＴＶ（ｒｈｅｓｕｓ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ）ワクチンは、先進国、発展途上国の両方でロタウィルスによる重症の下痢症の予防に高い効果を示し、１９９８年８月、米国食品医薬局はＲＲＶ−ＴＶワクチンを世界ではじめてロタウィルスワクチンとして認可した。しかしながら、腸重積症が副反応であることが米国疾病防疫センターから報告され、ＲＲＶ−ＴＶワクチンの投与は中止された（例えば、非特許文献１参照）。
一方、ロタウィルス感染を阻害する食品成分あるいは組成物として、例えば、初乳中の免疫グロブリンおよびその組成物（例えば、特許文献１参照）、ウシκ−カゼイン（例えば、特許文献２参照）、乳ムチン（例えば、非特許文献２参照）、およびバターミルク由来ポリペプチド（例えば、非特許文献３参照）などが提案されているがその評価はこれからであり、未だ、抗ロタウィルス感染効果を有する新たな抗ロタウィルス感染組成物、および該組成物を含有せしめた食品組成物の登場が望まれている。
【非特許文献１】石田真一他、「ロタウイルスワクチン」小児科診療  Ｖｏｌ  ６３，２０００年，ｐ．１０４５−１０４９
【非特許文献２】Ｙｏｌｋｅｎ，Ｒ．Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｌｋ  Ｍｕｃｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，Ｖｏｌ  ９０，１９９２年，ｐ．１９８４−１９９１
【非特許文献３】松本光晴他、「バターミルク由来抗ウシロタウイルスポリペプチド」日畜会報、Ｖｏｌ  ７３，２００２年，ｐ．４９−５６
【特許文献１】特開平３−７２４３２
【特許文献２】特表平１０−５０５８２８
【発明の開示】
本発明は、ロタウィルス感染防御効果を有する新規な食品組成物を提供することを課題とする。また本発明は、該組成物の有効量を含有せしめた食品を提供することを課題とする。さらにまた本発明は、該組成物の有効量を含有せしめた家畜飼料を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討した結果、ホエイの精密濾過（ＭＦ：ｍｉｃｒｏ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）処理により得られる保持物、遠心分離処理により得られる分画物および／または硫安沈殿（硫酸アンモニウム分画法、硫酸アンモニウム塩析法、又は硫酸アンモニウム沈殿法ともいう）処理により得られる分画物に強力なロタウィルス感染阻害活性を見出した。そしてこの保持物あるいは分画物を加熱処理してもロタウィルス感染阻害活性が失われないことを見出した。すなわち本発明は、
（１）ホエイの精密濾過保持液、遠心分離処理液および／または硫安沈殿処理分画物またはその乾燥物であって、ロタウイルス感染防御作用を有する組成物、
（２）精密濾過膜の孔径が０．００４〜１．４μｍの範囲にある、前記（１）記載の組成物、
（３）遠心分離処理の重力が３００〜３０，０００ｇの範囲にある、請求項１記載の組成物、
（４）硫安沈殿の飽和度が３０〜１００％の範囲にある、請求項１記載の組成物、
（５）前記（１）から（４）のいずれかに記載の組成物の有効量を含有する、ロタウイルス感染防御作用を有する食品、
（６）食品が育児用調製粉乳、高齢者用食品、保健機能食品および病者用食品からなる群より選ばれる前記（５）記載の食品、
（７）前記（１）から（４）のいずれかに記載の組成物の有効量を含有する、ロタウイルス感染防御作用を有する家畜飼料、
（８）前記（５）記載または前記（６）記載の食品を製造するための前記（１）から（４）のいずれかに記載の組成物の使用、
（９）前記（７）記載の家畜飼料を製造するための前記（１）から（４）のいずれかに記載の組成物の使用、
からなる。
ホエイは、スィートホエイ（ｓｗｅｅｔ  ｗｈｅｙ）および酸ホエイ（ａｃｉｄ  ｗｈｅｙ）に分けられる。スィートホエイは熟成型チーズの副産物であり、ｐＨ５．９〜６．３で甘味がある。一方、酸ホエイは非熟成、フレッシュ型チーズの製造で得られ、通常ｐＨ４．４〜４．６で酸味がある。また、カゼイン製造の際のホエイも酸ホエイである。スィートホエイおよび酸ホエイの一般的組成を表１に示す（Ｍｉｌｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１，２００２）。本発明はスィートホエイおよび酸ホエイを含む。
本発明で用いるホエイはウシの各泌乳期の乳、もしくはこれらの濃縮物または乾燥物（以下これらをまとめて乳と記載することがある）を原料として、常法により調製したものである。さらに、本発明においてはヒトおよびウシ以外の他の哺乳動物の乳を用いることもできる。一般にホエイは、原乳を清浄化し、７２〜７５℃で１５秒間加熱殺菌するＨＴＳＴ（Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｓｈｏｒｔ  Ｔｉｍｅ）殺菌および１２０〜１５０℃で１〜３秒間加熱殺菌するＵＨＴ（Ｕｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）殺菌等の殺菌処理を施した後、大きく分けると以下の二つの方法で製造することができる。一つはスィートホエイの製造法であり、殺菌した乳、または殺菌した乳を約３０〜６０℃に加温し数百Ｇ以上の重力をかけて脂肪をクリームとして脱脂した脱脂乳に各種レンネット（動物、微生物および植物起源）を添加する方法である。すなわち、硬質、半硬質または軟質チーズおよびレンネットカゼインを製造するときにホエイを溶液として排出する方法である。もう一つは酸ホエイの製造法であり、上述の方法と同様の方法で得た脱脂乳に酸（酢酸や乳酸などの有機酸または塩酸や硫酸などの無機酸）を添加する方法である。すなわち、脱脂乳のｐＨを酸で４．６に調整し、等電点沈殿したカゼインを濾過や遠心分離などで除去することで酸ホエイが得られる。さらにこれら以外にも脱脂乳に乳酸菌を単独で、あるいは塩化カルシウムと酸の両者を添加し、生じるカゼインの沈殿を遠心分離等で除去した上清も酸ホエイとして利用することができる。
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スィートホエイには全固形分中約８％の脂質が含まれる（表１）。この脂質は、ＷＰＣの風味を損なうことが指摘されている。また、ホエイの脂質は、限外濾過膜（ＵＦ）、逆浸透膜（ＲＯ）などの膜処理効率とも関係があり、ホエイ中に残留脂質が多いほど膜分離中の流束速度が低下する。
本発明では、ホエイを遠心分離／清浄化し、ｐＨを中性付近（６．８〜７．２）に調節した後、ＭＦ膜処理する。さらに保持液に加水→ＭＦ膜処理といった工程を複数回（通常３回）繰り返した後、保持液を常法により乾燥する。
ＭＦ処理は目詰まりが発生し易いため実用化は遅かった。１９８０年半ばにＡＬＦＡ−ＬＡＶＡＬ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ社（現Ｔｅｔｒａ  Ｐａｋ社）により牛乳の膜除菌システム「Ｂａｃｔｏｃａｔｃｈ」が開発されて実用化された。
ＭＦ膜の使用方法には膜面に平行に試料を流す方式（クロスフロー濾過：ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎまたはｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）と膜面に垂直に試料を押す方式（全濾過：ｄｅａｄ  ｅｎｄ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）があり乳業では乳製品の処理にクロスフロー濾過が、無菌タンク用空気除菌等には全濾過が用いられている。
ＢａｃｔｏｃａｔｃｈはクロスフローＭＦ（ＣＦＭＦ）濾過方式であり、ＭＦ膜（フランスＳＣＴ社製Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ）はアルミナセラミックス製でカゼインミセルを透過して細菌を阻止するために孔径は１．４μｍを採用している。Ｂａｃｔｏｃａｔｃｈの最大の特徴は、透過流束を制御して、モジュール全体の膜間差圧を０．０４ＭＰａ（０．１  ＭＰａ≒１気圧）程度の均一膜間差圧（ＵＴＰ：ｕｎｉｆｏｒｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）で運転することを可能にした点である。これにより目詰まりを防止することが可能となった。その結果、脱脂乳では、除菌率９９．９％以上を保ちつつ、温度５０℃で５００Ｌ／Ｈの透過流束を７時間安定して得られる（Ｏｌｓｅｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，４４（８）：ｐ．４７６，１９８９）。Ｂａｃｔｏｃａｔｃｈシステムで除菌した牛乳を原料とすることによりＥＳＬ（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｈｅｌｆ  ｌｉｆｅ）牛乳の製造が可能となった。また、チーズ原料の胞子除去にもこのＢａｃｔｏｃａｔｃｈシステムが利用されている。本発明においても、ホエイのＭＦ処理に、このＢａｃｔｏｃａｔｃｈシステムを含むクロスフロー濾過方式の装置の利用が考えられる。さらにホエイのＭＦ処理に全濾過方式の装置を使用することも可能である。またＭＦ膜には平膜型および中空糸型などの形状の違い、樹脂膜およびセラミック膜などの材質の違いがあり、これらを適宜使用することができる。
ホエイ中の脂肪は遠心分離では完全に除去できず、０．０５％ほど残留する。このホエイよりタンパク質含量８０％のＷＰＣ粉末を製造すると脂肪含量は５〜８％に達する（Ｊ．Ｌ．Ｍａｕｂｏｉｓ：Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＤＦ  ３２０：３７−４０，１９９７）。この脂質は、ＷＰＣの機能性や風味を損なう原因になることが指摘されている（Ｃ．Ｖ．Ｍｏｒｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｙ．Ｗ．Ｈａ：ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．，３３：ｐ．４３１，１９９３；Ｊ．Ｎ．ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｇ．Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋ  ａｎｄ  Ｍ．Ａｄａｍｓｅ：Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．，４０，ｐ．４１，１９８６；Ｍ．Ｔ．Ｐａｔｅｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｋｉｌａｒａ：Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７３：ｐ．２７３１，１９９０）。また、ホエイの脂質は限外濾過（ＵＦ）、逆浸透（ＲＯ）などの膜処理効果とも関連があり、ホエイ中に残留脂質が多いほど膜分離中の流束速度は低下する（Ｊ．Ｎ．ｄｅ  Ｗｉｔ  ａｎｄ  Ｒ．ｄｅ  Ｂｏｅｒ：Ｎｅｔｈ．Ｍｉｌｋ  Ｄａｉｒｙ  Ｊ．，２９，ｐ．１９８，１９７５）。この脂肪の主体はリン脂質である。この脂肪はホエイを０．１μｍのＭＦで処理することにより大半除去される（Ｐ．Ｄｅｊｉｍｅｋ  ａｎｄ  Ｂ．Ｈａｌｌｓｔｒｏｅｍ：食品膜技術懇談会，第５回春期研究例会講演要旨集，ｐ．３６−４５，１９９３；Ａ．Ｎｉｅｌｓｅｎ：Ｄａｎｉｓｈ  Ｄａｉｒｙ  ＆  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄ．Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，１０：７２−７３，１９９６）。
一般的に、孔径が０．２〜０．４５μｍ程度のＭＦ膜を用いることで透過液を無菌にすることができる。細菌の大きさは脂肪球（脂肪球の大きさは直径０．１〜１７μｍの範囲にあり、平均３．４μｍである）とほぼ同じである。一般にＭＦ膜の孔径は０．０１μｍから１２μｍである。本発明に用いるＭＦ膜の孔径は、実用的に０．１〜１．４μｍの範囲にあると考えられるが、孔径の最適化は、当業者の通常の実験のなかで確認可能である。
またより簡便には原乳から生クリームを分離するように、特にスィートホエイを約３０〜６０℃で遠心分離処理して得られるホエイクリームを再度遠心分離処理して得られる水相もＭＦ保持液と同様に利用することができる。
さらに上記遠心分離処理の変法として、９５℃で３０分間加熱処理した脱脂乳から得られる酸ホエイ、いわゆるプロテオース・ペプトンを硫安沈殿と遠心分離を組み合わせた方法で処理して得られる分画物もＭＦ保持液と同様に利用することができる。
これらのホエイのＭＦ保持液、遠心分離処理液および／または硫安沈殿処理分画物あるいはその乾燥物は、後述する実施例に示すように抗ロタウイルス感染活性を示す。また、これらを加熱しても抗ロタウイルス感染活性を保持している。ＭＦ保持液あるいはその乾燥物は、ＭＦおよびＵＦの組み合わせで製造されるホエイタンパク分離物（ＷＰＩ）の副産物として得られる。ホエイの遠心分離処理液あるいはその乾燥物は、バターオイルの副産物として得られる。このようにして製造されるホエイのＭＦ保持液および遠心分離処理液あるいはその乾燥物中にはリン脂質が濃縮されている。
本発明の組成物は加熱処理が可能で食品（とりわけ育児用調製粉乳や仔ウシの飼料）にその有効量を混合することにより、ヒト乳児、仔ウシ、仔ウマなどにおけるロタウイルスが原因の下痢症を予防または治療するのに有効であることが期待できる。本発明の組成物の有効量は最終製品に対して０．１〜５０重量％の範囲にあると推定されるが、ヒトあるいは家畜による試験で決定されるべきである。
ロタウィルスは小腸絨毛の先端部約１／３の上皮細胞で増殖する。感染後、絨毛は矮小化し、微絨毛の配列の乱れや欠落などの病変を起こす。その結果、生理機能が低下し、水の吸収が阻害され下痢を起こす。ロタウィルスの感染は標的細胞への接着から始まり、侵入、定着という多段階の過程を含んでいる。
本発明のホエイのＭＦ保持液、遠心分離処理液および／または硫安沈殿処理分画物あるいはその乾燥物の抗ロタウィルス感染活性は、ロタウィルスが標的細胞へ接着することを阻害することによるものと推定されるが、今後の作用機作解明を要する。
ロタウィルス感染における食品成分の抗ロタウィルス感染効果を検定・評価する方法は多岐にわたり、万全の検定・評価系はない。これまでにさまざまな抗ロタウィルス感染効果の検定・評価法が報告されている。例えば本発明で用いた方法以外に、実験動物（マウス）にロタウィルスおよび食品成分を投与し、下痢の発症および消化管粘膜へのロタウィルスの結合量を測定するなどの検定・評価系があげられる（Ｄｕｆｆｙ  Ｌ．Ｃ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．３５：６９０−６９５（１９９４））。本発明者は、これらの系を適切に用いて、該組成物の抗ロタウィルス感染活性をさらに詳細に調べることが可能である。
本発明において用いる乳由来の組成物は長い食経験の中で安全性は確立されている。したがってヒトによる試験で本発明品の有効性および有効量の確認が可能である。
乳由来の該組成物を抗ロタウィルス感染組成物として用いる場合、それ自身（液状または粉末状）で、また、他の活性物質と共に、あるいは他の薬理学的な活性物質と共に用いることができる。形態は、例えば、錠剤、もしくは被覆錠、カプセル、溶液、シロップ、乳液または分散性粉末を包含する。摂取量は、年齢、身体状態等に依存して変化するが１日当たり０．００１〜１０ｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜２ｇ／ｋｇ体重である。
乳由来の該組成物は、ロタウィルス感染に対する防御能の発達が未熟な乳幼児の育児用調製粉乳、あるいはロタウィルス感染に対する防御能の低下した高齢者向けの食品にその有効量を添加して抗ロタウィルス感染食品組成物とすることができる。育児用調製粉乳とは、０〜１２か月の乳児を対象とする乳児用調製粉乳、６〜９か月以降の乳児および年少幼児（３歳まで）を対象とするフォローアップミルク、出生時の体重が２５００ｇ未満の新生児（低出生体重児）を対象とする低出生体重児用調製粉乳、牛乳アレルギーや乳糖不耐症等の病的状態を有する児の治療に用いられる各種治療用ミルクなどを指す。さらに、該組成物を保健機能食品や病者用食品に適用することができる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたもので、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。さらに、該組成物を家畜用飼料にその有効量を添加して抗ロタウィルス感染組成物とすることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００）カラムを用いた抗ロタウィルス感染組成物の活性成分の分画パターンを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の効果を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるものではない。
［実施例１］ホエイからの抗ロタウィルス感染組成物およびその加熱処理物の調製
〈材料および方法〉
搾乳した未加熱の原乳１００ｋｇを７２℃で１５秒殺菌し、常法にしたがってモザレラチーズを調製し、生成したホエイのｐＨを６Ｎ  ＮａＯＨで６．８とした。遠心分離してクリーム画分と微細なカゼイン粒子を除去した。クリーム画分およびカゼインを除去したホエイを精密濾過装置（日本ポール株式会社、ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ、孔径０．１μｍ、入口圧３．０ｋｇ／ｃｍ２、温度２５℃）で処理後、保持液を採取した。得られた保持液に脱塩水を添加し、再度精密濾過装置に供する操作を３回繰り返した。得られた保持液をスプレードライ法により乾燥した。
加熱物の調製は、得られた粉末を蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解後、８０℃３０分間加熱処理した後、常法により凍結乾燥することにより行った。
［実施例２］ウシ常乳由来の組成物のリン脂質含量の測定
〈材料および方法〉
牛乳を用いて前述した実施例１と同一の方法により製造した乳由来組成物のリン脂質含量を測定した。はじめに試料１０ｇに５％  ＮａＣｌ溶液５０ｍｌを加え溶解後、メタノール１００ｍｌを添加した。次に、クロロホルム１００ｍｌを加え撹拌後、静置し、クロロホルム層を回収した。同様の操作をさらに２回繰り返した。得られたクロロホルム層を減圧乾固したものをｎ−ヘキサン３０ｍｌに溶解した。ｎ−ヘキサン飽和１％含水メタノール５０ｍｌを加え撹拌後、静置し、メタノール層を回収した。同様の操作をさらに２回繰り返した。得られたメタノール層を減圧乾固したものをクロロホルム：メタノール（２：１）に溶解し、リン脂質測定用試料を得た。得られた試料中のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）濃度をＨＰＬＣ法により測定することで、試料中のリン脂質含量を求めた。
〈結果と考察〉
リン脂質の測定結果（重量％）はＰＥ  ０．６９％、ＰＣ  １．３６％、ＳＭ  ０．８５％であった。牛乳中のリン脂質の含量は０．０４〜０．０５％であることが報告されている（乳の科学、上野川修一編、朝倉書店、１９９６）。したがって、ホエイのＭＦ膜保持物には牛乳中のリン脂質が高濃度で濃縮されていることが確認された。
［実施例３］ウシ常乳由来の組成物、およびその加熱処理物のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
牛乳を用いて前述した実施例１と同一の方法により製造した乳由来組成物、またはその加熱処理物のロタウィルス感染阻害活性を測定した。
ウシ常乳由来の組成物、およびその加熱処理物を試料として、ヒトロタウィルスＭＯ株の感染阻害活性を以下のように測定した。１０６  ＦＣＦＵ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｃｕｓ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）／ｍｌのヒトロタウィフレスＭＯ株０．４ｍｌと２０μｇ／ｍｌのトリプシン０．４ｍｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。予め１０％ウシ胎児血清を含むイーグル培地にて各種濃度に希釈調製された試料５０μｌ（試料溶液は０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌）を分注した０．５ｍｌエッペンドルフチューブに、調製したウィルス溶液をそれぞれ５０μｌずつ加えて３７℃で１時間培養した。
なお、空試験用としては、前記試料５０μｌに代えて、１０％ウシ胎児血清を含むイーグル培地５０μｌを用いた。この培養液が入った各エッペンドルフチューブにそれぞれ２×１０５／ｍｌのアカゲザル腎臓由来ＭＡ−１０４細胞を１００μｌ添加し、混合後、各混合液の２０μｌをそれぞれ対応するスライドグラスに移し、３７℃で４５時間培養した。これをアセトンで固定し、ヒトロタウィルス感染細胞数を、一次抗体としてハトロタウィルスＰＯ−１３株のＶＰ６を特異的に認識するモノクローナル抗体、および二次抗体として蛍光標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いた間接蛍光抗体法で検出した。
なお、感染阻害活性の評価は、下記の式から求められる値（阻害率）が５０％以上の時、感染阻害活性ありと判断し、感染阻害活性がある最も低い試料濃度を最小阻害活性とした
１００×［１−（試料添加時の感染細胞数）／（空試験の感染細胞数）］
〈結果と考察〉
ウシ常乳由来の組成物、およびその加熱処理物の最小阻害活性は順に３３、および３５μｇ／ｍｌ（ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度）であった。この結果から、該組成物が抗ロタウィルス感染活性を有すること、加熱処理後も抗ロタウィルス活性がほとんど変化しないことが判明した。なお、他の出発原料および方法により製造した本発明の組成物についても、ほぼ同様の結果が得られた。したがって、ウシ乳より精密濾過膜による分離で得られる該組成物には抗ロタウィルス感染活性が存在すること、該組成物の抗ロタウィルス感染活性は耐熱性を有することが明らかとなった。
ロタウィルスの感染は標的細胞への接着から始まり、侵入、定着という多段階の過程を含んでいる。今回、該組成物を予めロタウィルスと混合してから標的細胞と反応させたところ、ロタウィルスの感染が阻害されたことから、該組成物の抗ロタウィルス感染活性は標的細胞へのロタウィルスの接着を阻害することにより発揮されていることが示唆された。
［実施例４］牛乳を用いて前述した実施例１と同一の方法により製造した乳由来組成物を、０．５％配合した下記処方の乳児用調製粉乳を調製した。
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［実施例５］ホエイからの抗ロタウィルス感染組成物およびその加熱処理物の調製
搾乳した未加熱の原乳１００ｋｇを７２℃で１５秒殺菌し、常法にしたがってゴーダチーズを調製し、生成したホエイのｐＨを６Ｎ  ＮａＯＨで６．８とした。同様にＨＴＳＴ殺菌処理をした原乳１００ｋｇから常法にしたがってエメンタールチーズを調製し、生成したホエイのｐＨを６Ｎ  ＮａＯＨで６．８とした。これらのホエイを混合後、遠心分離してクリーム画分と微細なカゼイン粒子を除去した。こうして得られたホエイを固形分が１．７％となるように水で希釈してから精密濾過装置（Ｅｘｅｋｉａ製のセラミックフィルター、孔径０．１μｍ、入口圧７．５ｋｇ／ｃｍ２、温度５０℃）で処理後、固形分８％の保持液を回収した。得られた保持液はさらに減圧濃縮した後、スプレードライ法により乾燥した。
加熱物の調製は、得られた粉末を蒸留水に１、５および１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解後、１４１℃５秒間加熱処理した後、常法により凍結乾燥することにより行った。なお、１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したものについては別途１００℃５分間および８０℃３０分間加熱処理したものを調製し、常法により凍結乾燥した。
［実施例６］ホエイからの抗ロタウィルス感染組成物およびその加熱処理物のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例５と同一の方法により製造した乳由来組成物、またはその加熱処理物のロタウィルス感染阻害活性を実施例３と同一の方法により測定した。
すなわち、１０６  ＦＣＦＵ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｆｏｃｕｓ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）／ｍｌのヒトロタウィルスＭＯ株０．４ｍｌと２０μｇ／ｍｌのトリプシン０．４ｍｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。予め１０％ウシ胎児血清を含むイーグル培地にて各種濃度に希釈調製された試料５０μｌ（試料溶液は０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌）を分注した０．５ｍｌエッペンドルフチューブに、調製したウィルス溶液をそれぞれ５０μｌずつ加えて３７℃で１時間培養した。なお、空試験用としては、前記試料５０μｌに代えて、１０％ウシ胎児血清を含むイーグル培地５０μｌを用いた。この培養液が入った各エッペンドルフチューブにそれぞれ２×１０５／ｍｌのアカゲザル腎臓由来ＭＡ−１０４細胞を１００μｌ添加し、混合後各混合液の２０μｌをそれぞれ対応するスライドグラスに移した。３７℃で４５時間培養した後、アセトンで固定し、ヒトロタウィルス感染細胞を間接蛍光抗体法（一次抗体としてハトロタウィルスＰＯ−１３株のＶＰ６を特異的に認識するモノクローナル抗体、二次抗体として蛍光標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ血清を使用）で検出した。活性は実施例３と同様に最小阻害濃度で表した。
〈結果と考察〉
ホエイからの抗ロタウィルス感染組成物に各種食品の製造時の殺菌条件である加熱処理を加えても表３に示すようにその活性はほとんど低下しなかったことから、本活性は最終製品においても維持される可能性が高いと考えられた。
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［実施例７］ホエイから各種孔径の精密濾過膜を用いて調製した抗ロタウィルス感染組成物
搾乳した未加熱の原乳１００ｋｇに遠心分離処理（８０００ｇ、１５分間、４℃）を行い、クリームを分離して脱脂乳を得た。この脱脂乳を加温（２０〜２５℃）し、０．５Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨ４．６とした。この状態で１５〜３０分間保持した後、遠心分離処理（３０００ｇ、１５分間、４℃）を行い、カゼインを分離して酸ホエイを得た。この酸ホエイに０．５Ｎ  ＮａＯＨを添加してｐＨ６．０とした後、各種孔径（０．１、０．２、０．３、０．４５、０．６５、０．８、１．０μｍ）の精密濾過膜（セルロース混合エステルタイプ、アドバンテック東洋社製）を用いて酸ホエイの精密濾過処理を実施した。この時の処理条件は入口圧３．０ｋｇ／ｃｍ２、温度２０〜２５℃であった。最初に酸ホエイを精密濾過膜で５倍濃縮し、次に濃縮液に加水しながら透析濾過を精密濾過膜の透過液のＢｒｉｘ値が２％未満となるまで行った。最後に得られた精密濾過膜の保持液を常法により凍結乾燥し、さらにγ線滅菌処理をして試験試料とした。
［実施例８］ホエイから各種孔径の精密濾過膜を用いて調製した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例７と同一の方法により製造した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性を実施例６と同一の方法により測定した。
〈結果と考察〉
各試料の抗ロタウィルス活性の測定結果を表４に示した。実験試料の最小阻害濃度は、ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度で示した。
その結果、ＭＦ膜の孔径が０．８μｍ以上になると、ＭＦ保持物の抗ロタウィルス活性の低下が顕著になった。したがって、抗ロタウィルス感染組成物をホエイから調製するためには、用いる精密濾過膜の孔径を０．６５μｍ以下にすることが望ましいと考えられた。
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［実施例９］ホエイから遠心分離処理で調製した抗ロタウィルス感染組成物
搾乳した未加熱の原乳１００ｋｇを６３℃で３０分間殺菌し、常法にしたがってカマンベールチーズを調製し、生成したホエイ（ｐＨ６．０）を分離した。このホエイを加温し、遠心分離処理（３０００ｇ、２０分間、４０℃）を行い、ホエイクリームを得た。さらにこのホエイクリームを再び５０℃に加温し、遠心分離処理（３０００ｇ、２０分間、５０℃）を行った。こうして得られた水相部分（以下、ｗｈｅｙ  ｃｒｅａｍ  ｓｅｒｕｍと略）を常法により凍結乾燥し、試験試料とした。
［実施例１０］ホエイから遠心分離処理で調製した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例９と同一の方法により製造した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性を実施例６と同一の方法により測定した。なお、比較のためにウシラクトフェリン（ＤＭＶ社）を対照試料として用いた。
〈結果と考察〉
各試料の抗ロタウィルス活性の測定結果を表５に示した。実験試料の最小阻害濃度は、ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度で示した。
ｗｈｅｙ  ｃｒｅａｍ  ｓｅｒｕｍはウシラクトフェリンを上回る強力な抗ロタウィルス活性を示した。
以上より、抗ロタウィルス感染組成物はホエイから遠心分離処理のみで調製可能なことが明らかとなった。
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［実施例１１］９５℃で３０分間加熱処理した脱脂乳から得られるホエイを硫安沈殿と遠心分離処理して調製した抗ロタウィルス感染組成物
搾乳した未加熱の原乳１０ｋｇに遠心分離処理（８０００ｇ、１５分間、４℃）を行い、クリームを分離して脱脂乳を得た。この脱脂乳を加熱処理（９５℃、３０分間）し、０．５Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨ４．６とした。この状態で１５〜３０分間保持した後、遠心分離処理（５０００ｇ、３０分間、４℃）を行い、カゼインを分離して酸ホエイを得た。この酸ホエイに硫酸アンモニウムを加え、３５％飽和の状態とした。この溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して沈殿物を除去した。沈殿除去した溶液に再度硫酸アンモニウムを加え、５５％飽和の状態とした。この溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して再び沈殿物を除去した。得られた溶液にさらに硫酸アンモニウムを加え、９０％飽和の状態とした。最後にこの溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して沈殿物を回収した。９０％飽和で得られた沈殿物は蒸留水に溶解後、蒸留水に対して透析し、常法により凍結乾燥し、試験試料とした。
［実施例１２］９５℃で３０分間加熱処理した脱脂乳から得られるホエイを硫安沈殿と遠心分離処理して調製した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例１１と同一の方法により製造した抗ロタウィルス感染組成物のロタウィルス感染阻害活性を実施例６と同一の方法により測定した。
〈結果と考察〉
９０％飽和沈殿物は５０μｇ／ｍｌ（ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度）の最小阻害濃度を示した。
９５℃で３０分間加熱処理した脱脂乳から得られるホエイ、いわゆるプロテオース・ペプトンの硫安沈殿処理画分が抗ロタウィルス活性を有することが明らかとなった。
［実施例１３］ゲル濾過カラムと硫安を用いた抗ロタウィルス感染組成物の活性成分の分画
原乳を用いて前述した実施例５と同一の方法により製造した乳由来組成物の活性成分をさらに分画した。
実施例５で保持液をスプレードライして得られた粉末を蒸留水に５％となるように溶解後、９５℃３０分間の加熱処理を加えた。この溶液の一部を下記のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に対して一晩透析し、ゲル濾過試料とした。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲを約４８０ｍｌ取り、数回のデカンテーションにより溶媒をＭｉｌｌｉ−Ｑ水（超純水）に置き換えた。ゲルを均一になるように攪拌し、リザーバーを装着したカラム（２．６×６０ｃｍ）に静かに流し込んだ後、空気が入らないようリザーバーにＭｉｌｌｉ−Ｑ水を充たし蓋をした。カラムをＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０  Ｃ（アマシャムファルマシアバイオテク）に接続し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を流してゲルを十分に沈積させた後、リザーバーを外してアダプターを装着した。このカラムをｐＨ８．０の０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．０２％  ＮａＮ３）により平衡化した。上述の試料をカラムに１１ｍｌ添加してから流速１．３ｍｌ／分で溶出させた。この際、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度の変化を調べ、ほとんど素通りしてくる画分Ｃ１を回収した。このＣ１画分を蒸留水に対して一晩透析後、一部は常法により凍結乾燥し、試験試料とした。残りは実施例１１と同様に硫安を用いてさらに分画した。すなわち、このＣ１画分溶液に硫酸アンモニウムを加え、３５％飽和の状態とした。この溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して沈殿物を除去した。沈殿除去した溶液に再度硫酸アンモニウムを加え、５５％飽和の状態とした。この溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して再び沈殿物を除去した。得られた溶液にさらに硫酸アンモニウムを加え、９０％飽和の状態とした。最後にこの溶液を遠心分離処理（７０００ｇ、３０分間、４℃）して沈殿物を回収した。９０％飽和で得られた沈殿物は蒸留水に溶解後、蒸留水に対して透析し、常法により凍結乾燥し、試験試料とした。
［実施例１４］抗ロタウィルス感染組成物をゲル濾過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００）カラムと硫安で分画して得た成分のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例１３と同一の方法により製造した成分のロタウィルス感染阻害活性を実施例６と同一の方法により測定した。
〈結果と考察〉
各試料の抗ロタウィルス活性の測定結果を表６に示した。実験試料の最小阻害濃度は、ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度で示した。
ゲル濾過カラム後の硫安塩析により活性成分が濃縮されることが明らかとなった。
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［実施例１５］遠心分離および限外濾過処理による抗ロタウィルス感染組成物の活性成分の分画
原乳を用いて前述した実施例５と同一の方法により製造した乳由来組成物の活性成分をさらに分画した。
実施例５で保持液をスプレードライして得られた粉末を蒸留水に１０％となるように溶解後、０．５Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨ４．６とした。この状態で１５〜３０分間保持した後、遠心分離処理（６０００ｇ、２０分間、４℃）を行い、沈殿画分と上清画分に分けた。沈殿画分は再度蒸留水に分散させた後、常法により凍結乾燥して試験試料Ａとした。上清画分は分画分子量１万の限外濾過膜（日本ミリポア社製）を用いて限外濾過処理に供した。処理温度は２０〜２５℃であった。最初に上清画分を限外濾過膜で１／４に濃縮し、次に濃縮液を４倍に加水希釈し、その後再び容量が１／４になるように透析濾過を行った。最後に得られた限外濾過膜の保持液を常法により凍結乾燥して試験試料Ｂとした。
［実施例１６］抗ロタウィルス感染組成物を遠心分離および限外濾過処理で分画して得た成分のロタウィルス感染阻害活性の測定
〈材料および方法〉
原乳を用いて前述した実施例１５と同一の方法により製造した成分のロタウィルス感染阻害活性を実施例６と同一の方法により測定した。なお、比較のために未分画の試料を対照試料として用いた。
〈結果と考察〉
各試料の抗ロタウィルス活性の測定結果を表７に示した。実験試料の最小阻害濃度は、ウシ血清アルブミンで換算した場合のタンパク質濃度で示した。
遠心分離および限外濾過処理により活性成分が濃縮されることが明らかとなった。
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【産業上の利用の可能性】
本発明により新たなロタウィルス感染防御作用を有する組成物が提供される。該組成物は、その有効量を育児用調製粉乳に配合することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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