(57)【要約】本発明は、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、好ましくはＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質を解明し、ＩＰ３Ｒの機能を解明すると共に、ＩＰ３Ｒが関与している各種の異常や疾患などの治療方法や診断方法を確立させることを目的としている。本発明は、細胞内のＣａ２＋の放出機能の制御に関する。より詳細には、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなるイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の作動調節剤、及び炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなる細胞内におけるカルシウム放出の制御剤、並びにそれを用いた制御方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなるイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の作動調節剤。
【請求項２】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）が、少なくとも４５−２９１のアミノ酸配列を有するものである請求の範囲第１項に記載の作動調節剤。
【請求項３】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）が、組換えＣＡＲＰである請求の範囲第１項又は第２項に記載の作動調節剤。
【請求項４】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなる細胞内におけるカルシウム放出の制御剤。
【請求項５】
細胞内におけるカルシウム放出の制御が、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）により誘発されるカルシウムの放出である請求の範囲第４項に記載の制御剤。
【請求項６】
細胞内におけるカルシウム放出の制御が、放出の抑制である請求の範囲第４項又は第５項に記載の制御剤。
【請求項７】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）が、少なくとも４５−２９１のアミノ酸配列を有するものである請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに記載の制御剤。
【請求項８】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）が、組換えＣＡＲＰである請求の範囲第４項〜第７項のいずれかに記載の制御剤。
【請求項９】
炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）を細胞に添加することからなる細胞内におけるカルシウム放出を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、細胞内のＣａ２＋の放出機能の制御に関する。より詳細には、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなるイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の作動調節剤、及び炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなる細胞内におけるカルシウム放出の制御剤、並びにそれを用いた制御方法に関する。
【背景技術】  細胞内シグナル伝達系において脂質が重要な役割を果たしていることが明らかにされてきた。特にホスファチジルイノシトールのリン酸化物によるシグナル伝達についての研究が活発に行われている。
ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、ジアシルグリセロールの残りの水酸基にイノシトールがリン酸エステルとして結合したものである。ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、リン脂質の１種であり、細胞の膜上にも存在しているが、その量は全リン脂質の１０％未満である。ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、大きく分けて２つの役割をになっており、そのひとつは膜に存在したままでリン酸化酵素などの各種のリン酸化反応の足場となることであり、他のひとつはリン酸化イノシトール部分が加水分解されて、セカンドメッセンジャーとしてのリン酸化イノシトールを放出する作用である。
ＰＩのイノシトール部分の水酸基はさらにリン酸化され、イノシトールの３位、４位、若しくは５位、又はこれらの２箇所以上がリン酸化されたイノシトールリン脂質が知られている。とりわけ、４位及び５位がリン酸化されたホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェイト（ＰＩ（４，５）Ｐ２）は、小胞輸送や核への情報伝達の役割をになうホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェイト（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の中間体となるばかりでなく、それ自身でも極めて重要な役割をになっている。
ＰＩ（４，５）Ｐ２は種々のアクチン結合タンパク質と結合することができ、細胞内のアクチンを再編成させることにより細胞の形態を保持し、変化させる役割をになっている。ＰＩ（４，５）Ｐ２の他の重要な役割は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）により、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に加水分解され、これらの分子をセカンドメッセンジャーとして放出することである。放出されたイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）は、細胞の小胞体の表面に存在するＩＰ３レセプター（ＩＰ３Ｒ）に結合し、小胞体内に貯蔵されているＣａ２＋を細胞質に放出させ、Ｃａ２＋依存性の各種の酵素を活性化させる。また、ＤＡＧはＣキナーゼを活性化させる。
細胞の受容体にホルモン、サイトカイン、神経伝達物質などの物質が結合することにより、細胞内にイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）の産生が誘発され、当該ＩＰ３が細胞の小胞体の表面に存在するイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）に結合する。当該ＩＰ３Ｒは、ＩＰ３によるシグナル伝達をＣａ２＋によるシグナル伝達系に変換することにより、さまざまな細胞機能において、胚の発生、細胞の分化、増殖、貪食、顆粒分泌、運動、神経系における作用などのきわめて重要な役割を果たしており、細胞内でＩＰ３Ｒが正常に機能することが細胞の恒常性を維持する上で極めて重要なこととなっている。このように、ＩＰ３Ｒは細胞のシグナル伝達の関与する重要なタンパク質であるばかりでなく、細胞の多彩な機能を調整することができる重要なタンパク質でもある。したがって、ＩＰ３Ｒの機能を調節することにより細胞の各種の作用を調整することも可能となる。
細胞内におけるＩＰ３やＩＰ３Ｒの重要性が明らかにされてくるにつれて、これらについての研究も活発になってきており、ＩＰ３Ｒに対するモノクローナル抗体についての特許出願（先行技術文献１参照）、ＩＰ３を拮抗する方法についての特許出願（先行技術文献２参照）、さらにＩＰ３Ｒに高親和性で結合するポリペプチドについての特許出願（先行技術文献３参照）などの特許出願もなされてきている。
これまでの分子クローニングの研究により、ＩＰ３Ｒファミリーには哺乳動物において少なくとも３つのサブタイプが存在することが知られている（先行技術文献４〜６参照）。これらのＩＰ３Ｒは、構造的、機能的には、リガンド結合ドメイン、調節ドメイン、およびチャネルドメインの３つのドメインから構成されていることが明らかになっている（先行技術文献７参照）。
結合ドメインは、ＩＰ３との結合に係わっており、ＩＰ３ＲのＮ末端部位の約６００個のアミノ酸からなるドメインである。突然変異解析により、この部位の３アミノ酸残基、例えばマウスＩＰ３Ｒタイプ１のＡｒｇ−２６５、Ｌｙｓ−５０８、及びＡｒｇ−５１１が、ＩＰ３との結合にとってきわめて重要であることが分かっている。また、Ａｒｇ−６５８が種々のイノシトールリン酸との特異的な結合を決定することも知られている。
チャネルドメインは、ＩＰ３ＲのＣ末端付近に存在し、６個の膜貫通領域を有し、Ｃａ２＋チャネルに対応している。膜貫通領域の１〜４番目は、ＩＰ３Ｒファミリーにおいて高度な相同性が維持されている。
調節ドメインは、Ｎ末端側の結合ドメインと、Ｃ末端側のチャネルドメインの間に存在し、このドメインは、Ｃａ２＋、Ｃａ２＋−カルモデュリン、ＦＫ５０６結合性蛋白１２Ｋ、ＡＴＰなどのさまざまな調節因子の結合部位、およびｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、蛋白質キナーゼＣによるリン酸化の部位が含まれている。そして、この調節ドメインが、ＩＰ３の結合によりチャネルを開く作用をしていると考えられる。ＩＰ３に誘導されるＣａ２＋の放出は、この調節ドメインによるさまざまな修飾によって精密に制御されていると考えられる。この調節ドメインは、ＩＰ３Ｒファミリー間における相同性がその他の部位に比べて低く、その結果、各々のサブタイプのＩＰ３Ｒ／Ｃａ２＋チャネル機能がそれぞれ異なって調節され、各々のサブタイプに特有なチャネル特性が生じていると考えられる。
このようにＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質により、ＩＰ３Ｒの機能が微妙に調整されていることから、ＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質を解明してゆくことはＩＰ３Ｒの機能を解明し、それが原因となっている各種の疾患に治療や診断に極めて有用なことになる。
一方、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＡＲＰ））は、プルキンエ細胞（小脳皮質の大型神経細胞で、梨状細胞体および葉を横切る平面に配列された樹状突起を有する細胞）に特異的な遺伝子のスクリーニングにより同定されたタンパク質である（先行技術文献８参照）。ＣＡＲＰは２９１個のアミノ酸で構成され、Ｎ末端のアミノ酸５０個の内に１６個のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基および４個のアスパラギン酸（Ａｓｐ）残基からなる酸性アミノ酸クラスターを有している。また、ＣＡＲＰは炭酸脱水酵素の主要なモチーフを有しているが、触媒の亜鉛を配位するための残基を有していないので炭酸脱水酵素活性はない。事実、ＣＡＲＰには炭酸脱水酵素活性がないことが報告されている。ヒトＣＡＲＰ遺伝子についてもクローニングが行われており（先行技術文献９参照）、マウスのそれとアミノ酸で９８％の相同性があり、進化の過程で高度に保存されていることが明らかになっているが、これまでのところ、ＣＡＲＰは小脳のプルキンエ細胞に高度に発現することが分かっているが、ＣＡＲＰの機能は解明されていないし、組織分布についてもこれまでに包括的な解明もなされていない。
この出願の発明に関連する先行技術文献としては次のものがある。
１．  特開平８−１３４０９９号
２．  特表平８−５０２０６８号
３．  特開２０００−１３５０９５号
４．  Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４２，３２−３８
５．  Ｂｌｏｎｄｅｌ，Ｏ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１１３５６−１１３６３
６．  Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｈｉｎｏ，Ｍ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，２，９−２２
７．  Ｆｕｒｕｉｃｈｉ，Ｔ．，Ｋｏｈｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，４，２９４−３０３
８．  Ｋａｒｏ，Ｋ．，（１９９０），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２７１，１３７−４０
９．  Ｓｋａｇｇｓ，Ｌ．Ａ．，Ｂｅｒｇｅｎｈｅｍ，Ｎ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｇｅｎｅ，１２６，２９１−２２１
１０．  Ｂｕｌｔｙｎｃｋ  Ｇ，Ｄｅ  Ｓｍｅｔ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，３５４，４１３−２２
【発明の開示】
本発明は、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）、好ましくはＩＰ３Ｒの調節ドメインに結合する物質を解明し、ＩＰ３Ｒの機能を解明すると共に、ＩＰ３Ｒが関与している各種の異常や疾患などの治療方法や診断方法を確立させることを目的としている。また、本発明は、ＩＰ３Ｒに結合してＩＰ３Ｒの機能を調節することにより細胞の機能を調整するための組成物及びそれを用いた調整方法に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＩＰ３Ｒ１の３つのドメイン及び調節ドメインなどに結合する物質の位置を模式的に示すと共に、本発明で使用した６個のベイトの断片を示す。
第２図は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）の組織分布を調べたウェスタンブロットの結果を示す図面に代わる写真である。可溶性分画（１０μｇ／レーン）について、ドデシル硫酸ナトリウム存在下で５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロースにトランスファーした後、抗ＣＡＲＰポリクローナル抗体２μｇ／ｍｌで検出した。
第３図は、培養したプルキンエ細胞を、抗ＣＡＲＰ抗体（第３図左側、緑色）、及び抗ＩＰ３Ｒ１抗体（第３図の中間、赤色）で免疫染色したもの、並びに両者をマージした（第３図の右側）ものを示す図面に代わるカラー写真である。矢印は、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１の局在の例を示している。
第４図の（Ａ）はマウス小脳の細胞質分画を、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴとともにインキュベートし、結合した蛋白質について、グルタチオンセファロースを用いてプル−ダウンアッセイを行い、グルタチオンにて溶出し、抗ＣＡＲＰ抗体を用いてウェスタンブロット法で解析した結果を示し、第４図の（Ｂ）はマウス小脳ミクロソームの界面活性剤抽出物について、（Ａ）で説明した方法でＧＳＴ−ＣＡＲＰまたはＧＳＴを用いプル−ダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＩＰ３Ｒ１抗体ＫＭ１１１２にて免疫ブロット解析を行った結果を示し、第４図の（Ｃ）は精製されたＣＡＲＰ−Ｈｉｓについて、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴを用いてプル−ダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＣＡＲＰ抗体にて免疫ブロット解析を行った結果を示す図面に代わる写真である。
第５図は、ＣＡＲＰおよびＩＰ３Ｒ１のＮ末端およびＣ末端側の欠失した変異体の構造、及びＣＡＲＰ変異体とＭＤ２、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１変異体間の相互作用を、酵母のツーハイブリッドシステムによるβ−ｇａｌアッセイ（ｎ＝３）で解析した結果を示したものである。β−ｇａｌアッセイは、青色のコロニーが出現するまでの時間で評価し、青色のコロニーが３０分で出現した場合を「＋＋＋」で示し、２時間で出現した場合を「＋＋」で示し、８時間以内に出現した場合を「＋」で示している。
第６図は、ＩＰ３Ｒ１へのＩＰ３の結合に及ぼすＣＡＲＰの阻害作用をスキャッチャードプロットによって行った結果を示している。黒四角印（■）はＣＡＲＰの存在下の場合を、黒丸印（●）はＣＡＲＰの非存在下の場合を示す。ＣＡＲＰの存在下または非存在下で行った３回の実験のＫｄの平均値（Ｋｄ±Ｓ．Ｄ．）は、各々３３．５±２．０７ｎＭおよび１８．２±４．５８ｎＭであった。
【発明を実施するための最良の形態】  イノシトール−１，４，５−３リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）は、細胞内のＩＰ３によって誘発されるＣａ２＋の放出経路であり、ＩＰ３Ｒは種々の物質と結合することにより微妙に細胞内におけるＣａ２＋の放出を制御している。本発明者らは、ＩＰ３Ｒに結合してＩＰ３によるカルシウムの放出の制御している物質を解析したところ、ＩＰ３Ｒに結合性を有する新たなタンパク質を同定した。そして、このタンパク質が炭酸脱水酵素関連蛋白質（ＣＡＲＰ）として知られているタンパク質であることを見出した。
また、本発明者らは、ＩＰ３Ｒを豊富に発現している小脳のプルキンエ（Ｐｕｒｋｉｎｊｅ）細胞のみにＣＡＲＰが発現していることを明らかにすると共に、ＣＡＲＰのＩＰ３Ｒに対する作用を検討し解析した。
したがって、本発明は細胞内におけるカルシウムの放出の機構を制御することを目的とするものであり、さらには細胞内におけるカルシウムが関与しているシグナル伝達を制御することを目的とするものである。また、本発明は、炭酸脱水酵素関連蛋白質（ＣＡＲＰ）による細胞内のカルシウムの放出の制御、ＩＰ３Ｒの作動の調節や作動の診断をすることを目的とするものである。
本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなるイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）の作動調節剤に関する。
また、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなる細胞内におけるカルシウム放出の制御剤、及びそれを用いた制御方法に関する。
ＩＰ３Ｒには、Ｃａ２＋、Ｃａ２＋−カルモデュリン、ＦＫ５０６結合性蛋白１２Ｋ、ＡＴＰ、キナーゼなど、さまざまな調節因子が関与している。これらの多くはＩＰ３Ｒの中央部分に結合したり、またはリン酸化することによりＩＰ３Ｒの機能を調節していると考えられている。
ＩＰ３Ｒの新規な調節因子を探索するために、本発明者らは、ＩＰ３Ｒ１の調節ドメインをベイトとして、酵母のツーハイブリッド法を用いてマウスの脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
第１図にマウスＩＰ３Ｒタイプ１（ｍＩＰ３Ｒ１）のリガンド結合ドメイン、調節ドメイン、およびチャネルドメインを模式的に示す。第１図の中段に示す数字はアミノ酸の番号を示す。第１図の調節ドメインには、ＦＫ５０６結合性蛋白（ＦＫＢＰ）（アミノ酸番号：１４００−１４０１）、Ｃａ２＋−カルモデュリン（ＣａＭ）（アミノ酸番号：１５６４−１５８５）、そして推定としてのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ）（アミノ酸番号：１７７３−１７７８、１７７５−１７８０、及び２０１６−２０２１）、ＰＫＡリン酸化のためのセリン残基（アミノ酸：１５８８、１７５５）のための結合部位が示されている。クロモグラニンＡおよびＢ（ＣＧＡ／Ｂ）の結合部位は、チャネルドメイン（膜貫通部位５番目と６番目の間）に示されている。本発明者らは、この調節ドメインの一部分をベイトとして用いた。第１図に、本発明で用いた６個のベイトに相当する位置がＭＤ１〜ＭＤ６として示されている。
ｍＩＰ３Ｒ１のアミノ酸の１２４５−２２６４番目を、重複する６断片に分割し、それぞれの対応するｃＤＮＡ断片をベイトとして使用した。ＩＰ３Ｒ１調節ドメインのアミノ酸残基１２４５−２２６４番目をマッピングし、これに重複している次のセンス鎖（Ｓ）及びアンチセンス鎖（Ａ）からなるプライマーセットを使用し、ＰＣＲ法により６ベイト構成体（ＭＤ１〜ＭＤ６）を作製した。
2004103393.tif 000002
ＰＣＲ法により得られたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ、またはＳａｌＩ単独のいずれかにより消化し、次にｐＧＢＴ９（クロンテック社）に連結した。このプラスミドのすべてについてシーケンシングを行い、これらのｃＤＮＡのクローニングがフレームに合わせて翻訳され、ＰＣＲに起因するエラーがないことを確認した。
なお、ＭＤ２に対応するｍＩＰ３Ｒ１の１３８７番目から１６４７番目までのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
ベイト断片ＭＤ１、３、４、５、及び６による一次スクリーニングでは、数十個の候補物質が得られたが、非翻訳配列として知られている領域を含んでいたり翻訳フレームシフトをおこしていたりして、ＩＰ３Ｒ１結合蛋白質とは考えられなかった。一方、ＭＤ２断片を用いたスクリーニングでは、１３個のポジティブクローンを得た。ＤＮＡのシーケンシング解析を行ったところ、これらはすべてが炭酸脱水酵素関連蛋白質（ＣＡＲＰ）をコードしていることが明らかになった。これらのクローンは、ＣＡＲＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲの異なる長さを含むものであったが、フレームに基づいて完全長のコーティング領域を含んでいた。
炭酸脱水酵素関連蛋白質（ＣＡＲＰ）のマウスのＣＡＲＰの２９１個のアミノ酸のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。
ＭＤ１およびＭＤ２断片には、ＦＫＢＰ１２結合部位と推測される部位が含まれていたが、今回の酵母ツーハイブリッド法によるスクリーニングでは、ポジティブクローンからＦＫＢＰを見つけることはできなかった。この結果は、ＦＫＢＰ１２がＩＰ３Ｒ１に結合しないという最近の報告を裏付けている可能性がある（先行技術文献１０参照）。別の原因として、ｃＤＮＡライブラリーの大きさ、あるいはＩＰ３Ｒ１へのＦＫＢＰの結合に別の蛋白質が必要であることも可能性として考えられるが、いずれにしても今回の実験においてはＦＫＢＰを見出すことはできなかった。また、ＭＤ２には、カルモデュリン結合部位も含まれているが、ＩＰ３Ｒ１へのカルモデュリン結合はＣａ２＋依存性であるため、今回のスクリーニングではカルモデュリンの結合を検出できなかった。
炭酸脱水酵素関連蛋白質（ＣＡＲＰ）は、小脳のプルキンエ細胞に高度に発現することが知られているが、組織分布についてはこれまで包括的な研究がなされていないので、まず、ウェスタンブロット解析によりＣＡＲＰの組織分布を調べた。
結果を第２図に図面に代わる写真で示す。第２図は、種々の臓器の可溶性分画におけるＣＡＲＰの発現を示している。ＣＡＲＰ蛋白質は、既報のとおり、小脳での発現が顕著であり、また小脳ではＩＰ３Ｒ１も豊富に発現している。大脳、嗅球、嗅上皮、鋤鼻器、肺、顎下腺、肝臓、副腎、胃、小腸、大腸では、発現レベルが低い。心臓、胸腺、脾臓、膵臓、卵巣、子宮、精巣、筋肉には、シグナルが認められなかった。
小脳の免疫組織化学解析では、ＣＡＲＰはＩＰ３Ｒ１と共に、小脳のプルキンエ細胞の細胞質における発現が顕著であることが明らかになった。プルキンエ細胞においてＩＰ３Ｒ１は、豊富かつ広範囲に発現しているが、クラスターが形成されているために、特に樹状突起では均質性が低かった。ＣＡＲＰは細胞質可溶性の蛋白質ではあるが、もしＣＡＲＰがＩＰ３Ｒ１に結合するとすれば、ＣＡＲＰ蛋白質の分布は均質ではなく、ＩＰ３Ｒ１とクラスターを形成して局在化している。プルキンエ細胞におけるＣＡＲＰおよびＩＰ３Ｒ１の細胞内での局在化を明確にするために、プルキンエ細胞の一次培養を行い免疫組織化学解析を行った。第３図は、プルキンエ細胞におけるＣＡＲＰ（緑色）およびＩＰ３Ｒ１（赤色）の発現を二重染色法により示した、図面に代わるカラー写真である。第３図の左側は抗ＣＡＲＰ抗体（緑色）で、左から２番目は抗ＩＰ３Ｒ１抗体（赤色）で免疫染色したものであり、右側はこれらをマージしたものである。第３図の上段は培養したプルキンエ細胞の全体像であり、下段はその拡大図である。矢印は、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１の局在の例を示している。
この結果、双方とも、細胞質、樹状突起、および軸索において発現している（第３図参照）。細胞内での局在により、ＣＡＲＰがＩＰ３Ｒ１とクラスターを形成して局在していることが明らかになった（第３図の矢印参照）。ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１が豊富かつ高特異的に共に発現し、プルキンエ細胞において局在していることから、これらの蛋白質が生理学的にも結合していることが示された。
次に本発明者らは、生化学的方法によりＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１間の相互作用をさらに調べるために、プル−ダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）法により両者の相互作用を調べた。このために、本発明者らはＳｆ９細胞内での発現システムを開発した。ＩＰ３Ｒ１のチャネルドメインを除去してＩＰ３Ｒ１を可溶性にした。ＧＳＴ−ＥＬと命名したこの可溶性ＩＰ３Ｒ１は、リガンド結合ドメインと調節ドメインの双方が含まれ（ｍＩＰ３Ｒ１のアミノ酸の１−２２１７）、そのＮ末端にはＧＳＴがある。マウス小脳の細胞質分画を、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴにてインキュベートし、この組換え蛋白質へのＣＡＲＰの結合を抗ＣＡＲＰ抗体を用い免疫ブロット法により解析した。結果を第４図に図面に代わる写真で示す。第４図の（Ａ）は、マウス小脳の細胞質分画を、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴを用いてインキュベートし、結合した蛋白質について、グルタチオンセファロースを用いてプル−ダウンアッセイを行い、グルタチオンにて溶出し、抗ＣＡＲＰ抗体を用いてウェスタンブロット法で解析した結果を示す。第４図の（Ｂ）は、マウス小脳ミクロソームの界面活性剤抽出物について、前記の（Ａ）で説明したＧＳＴ−ＣＡＲＰまたはＧＳＴを用いたプルダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＩＰ３Ｒ１抗体ＫＭ１１１２にて免疫ブロット解析を行った結果を示す。第４図の（Ｃ）は、精製済みのＣＡＲＰ−Ｈｉｓについて、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴを用いてプルダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＣＡＲＰ抗体にて免疫ブロット解析を行った結果を示す。
この結果、ＣＡＲＰがＧＳＴ−ＥＬに特異的に結合し、ＧＳＴ単独には結合しないことが示された。相互実験では、マウス小脳ミクロソームの界面活性剤抽出物について、ＧＳＴ−ＣＡＲＰを用いたプルダウンアッセイを行い、ＩＰ３Ｒ１の結合を抗ＩＰ３Ｒ１抗体にて分析した。第４図の（Ｂ）に示されるように、ＩＰ３Ｒ１とＧＳＴ−ＣＡＲＰとの相互作用はあったが、ＧＳＴとの相互作用はなかった。ＩＰ３Ｒ１へのＣＡＲＰの結合が直接的であるか否かを確認するため、精製済みＨｉｓタグ付きＣＡＲＰについて、ＧＳＴ−ＥＬを用いプルダウンアッセイを行った。第４図の（Ｃ）に示されるように、ＣＡＲＰ−ＨｉｓはＧＳＴ−ＥＬに特異的に結合し、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１間の相互作用が直接的であることが示された。
以上の結果を総合すると、これらの知見は、ＣＡＲＰが新たなＩＰ３Ｒ１結合性の蛋白質であることが示された。
次に、本発明者らは、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１の相互作用のドメインを確定することにした。そのために、双方の遺伝子をトランケートした変異体を作製し、酵母のツーハイブリッド法により解析した。
第５図は、ＣＡＲＰ（第５図の上の段）およびＩＰ３Ｒ１（第５図の下の段）のＮ末端およびＣ末端を欠失させた変異体の遺伝子の構造を示している。ＣＡＲＰ変異体とＭＤ２、ＣＡＲＰとＩＰ３Ｒ１変異体間の相互作用を、酵母のツーハイブリッド法により分析した。作製した変異体と、酵母のツーハイブリッド法によるβ−ｇａｌアッセイ（ｎ＝３）の結果を第５図に示す。β−ｇａｌアッセイは、青色のコロニーが出現するまでの時間で評価した。すなわち青色のコロニーが、３０分（＋＋＋）、２時間（＋＋）および８時間（＋）以内に出現している場合を＋としている。
この結果、ＣＡＲＰのＮ末端のアミノ酸４４個が欠失した場合には弱いが結合活性が見られたが、その他の部位が欠失した場合にはＩＰ３Ｒ１への結合が失われた。これは、ＩＰ３Ｒ１へのＣＡＲＰの最小限の結合部位が、４５−２９１のアミノ酸であることを示している。ＩＰ３Ｒ１の場合には、１３８７−１６４７のアミノ酸がＣＡＲＰとの結合に必要であることが示された。
次に、ＩＰ３の結合に及ぼすＣＡＲＰの作用について検討した。
プルキンエ細胞におけるＩＰ３誘導によるＣａ２＋の放出は、その他の組織や単離されたＩＰ３Ｒ１（ＥＣ５０＝１００ｎＭ〜１μＭ）に比べて、はるかに高濃度のＩＰ３（ＥＣ５０≧１０μＭ）を必要とすることが知られている。本発明者らの前記して実験結果によれば、ＣＡＲＰはプルキンエ細胞においてＩＰ３Ｒ１と共に顕著に発現し、ＩＰ３Ｒ１に結合することが示された。そして、プルキンエ細胞ではＩＰ３に対するＩＰ３Ｒ１の感受性が低下しいることが知られており、この原因として、プルキンエ細胞におけるＣＡＲＰの発現があると推測された。そこで、本発明者らは、ＩＰ３結合に及ぼすＣＡＲＰの阻害作用について検討した。
精製されたＩＰ３Ｒ１を用いて結合アッセイを行い、ＩＰ３Ｒ１へのＩＰ３の結合親和性に対するＣＡＲＰの作用を評価した。精製されたＩＰ３Ｒ１を、精製組換えＣＡＲＰの存在または非存在下で、種々の濃度の〔３Ｈ〕ＩＰ３を用いてインキュベートし、スキャッチャードプロットにより解析した。
第６図は、ＣＡＲＰの存在下（第６図の■印）または非存在下（第６図の●印）でのＩＰ３Ｒ１に対するＩＰ３による特異的〔３Ｈ〕ＩＰ３結合の阻害に関するスキャッチャードプロット解析の結果を示す。第６図の横軸は結合したＩＰ３量（ｐｍｏｌ／ｍｇ）を示し、縦軸は結合したＩＰ３量／結合していないＩＰ３量（ｐｍｏｌ／ｍｇ／ｎＭ）を示す。
この結果、ＣＡＲＰの存在または非存在下でのＩＰ３Ｒ１に対するＩＰ３結合の解離定数の平均値（Ｋｄ±Ｓ．Ｄ．）は、各々３３．５±２．０７ｎＭおよび１８．２±４．５８ｎＭであることがわかった。そして、ＣＡＲＰの存在または非存在下でのＢｍａｘ値は、各々１６３０±１０８ｐｍｏｌ／ｍｇおよび１７２０±２３４ｐｍｏｌ／ｍｇであることから、ＩＰ３の結合部位の最大数はＣＡＲＰの存在によって変化しないことが示された。これらの結果は、ＣＡＲＰが拮抗作用ではなく、親和性を低下させることによって、ＩＰ３Ｒ１に対するＩＰ３結合を阻害していることを示している。これは、ＣＡＲＰの結合により、ＩＰ３Ｒ１の立体配座が変化し、このためにＩＰ３に対する感受性が低下するものと推測される。
プルキンエ細胞でのＩＰ３誘導によるＣａ２＋の放出におけるＩＰ３に対する感受性の低下の原因のひとつとして、ＩＰ３Ｒ１の高密度化がこれまで報告されていた（Ｏｇｄｅｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｐｉｏｄ，Ｔ．（１９９７），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０９，７４１−５６）。この説明に加え、プルキンエ細胞におけるＩＰ３Ｒ１へのＩＰ３結合に及ぼすＣＡＲＰの阻害作用の結果としてＩＰ３に対する感受性の低下が生じているという新たな知見を本発明は提供するものである。
本発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）レセプター（ＩＰ３Ｒ）として、マウスのものを用いて説明してきたが、本発明のＩＰ３Ｒはマウスに限定されるものではなく、例えば線虫、ショウジョウバエなどの動物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、イヌ、ウサギなどの哺乳動物であればよい。また、前記してきた説明ではＩＰ３Ｒのサブタイプとしてサブタイプ１を用いて説明してきたが、他のサブタイプについても同様にして結合を確認することは可能である。したがって、特別の事情の無い限り本発明はＩＰ３Ｒの全てのサブタイプをも包含するものである。好ましいサブタイプとしては、前記で説明してきたサブタイプ１が挙げられる。
本発明の炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）としては、天然のものであってもよいし、遺伝子の情報に基づいて組換え技術により製造されたものであってもよい。また、本発明のＣＡＲＰは前記の説明で用いられてきたマウス由来のものに限定されるものではなく、例えば線虫、ショウジョウバエなどの動物、好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、イヌ、ウサギなどの哺乳動物であればよい。本発明のＣＡＲＰは、使用されるＩＰ３Ｒと同種の動物のＣＡＲＰを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。さらに、本発明のＣＡＲＰは、全長のものであってもよいが、ＩＰ３Ｒとの結合に必要とされる最小限のアミノ酸配列、例えばマウスの例では、少なくとも４５−２９１のアミノ酸配列を有するものであればよい。好ましいＣＡＲＰとしては、天然のアミノ酸配列を有するものが挙げられるが、ＩＰ３Ｒとの結合性を有するものであれば、天然のアミノ酸配列のうちの１個以上のアミノ酸は欠失し、付加し、及び／又は他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。
本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなるＩＰ３Ｒの作動調節剤を提供するものであり、本発明の作動調節剤は、ＣＡＲＰ単独であってもよいし、緩衝液などの生物学的に許容される担体を含有する組成物となっていてもよい。また、本発明の作動調節剤は、ＣＡＲＰの存在しない場合に比べてＩＰ３に対するＩＰ３Ｒの作動が変動、亢進または抑制されるものであればよい。前記で説明してきたマウスの例では抑制される例が示されている。使用されるＣＡＲＰの濃度については、ＩＰ３Ｒの作動が変動できる濃度であればよい。
また、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）からなる細胞内におけるカルシウム放出の制御剤を提供するものであり、本発明の制御剤は、ＣＡＲＰ単独であってもよいし、緩衝液などの生物学的又は製薬的に許容される担体を含有する組成物、例えば医薬組成物などとなっていてもよい。また、本発明の制御剤は、ＣＡＲＰの存在により細胞内のカルシウムの放出量を制御できる、減少又は増加できるものであればよい。使用されるＣＡＲＰの濃度については、特に制限はなく、副作用や毒性が生じない範囲で細胞内のカルシウムの放出量を制御できる濃度であればよい。本発明の細胞内のカルシウムの放出の制御は、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）により誘発されるカルシウムの放出であることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。
さらに、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）を細胞に添加することからなる細胞内におけるカルシウム放出を制御する方法を提供するものである。本発明のこの方法における細胞としては、生体を構成している細胞であって、好ましくはＩＰ３Ｒを有する細胞である。本発明のこの方法は細胞内におけるセカンドメッセンジャーとしてのＩＰ３の作用を解析するためや、細胞内におけるＩＰ３Ｒの作動を検査するためだけでなく、治療や診断にも広く適用可能な方法である。
また、本発明は、炭酸脱水酵素関連タンパク質（ＣＡＲＰ）がＩＰ３Ｒ、好ましくはＩＰ３Ｒ１に特異的に結合する物質であることを明にするものであり、当該ＣＡＲＰによりＩＰ３Ｒの検出や同定をすることも本発明に包含されている。このような目的のためには、適当な方法でＣＡＲＰを標識化し、このような標識化されたＣＡＲＰによりＩＰ３Ｒを検出、同定、又は定量することも可能となる。
なお、特願２００３−１４１０８３明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
【実施例】  以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
以下の実施例における、酵母のツーハイブリッドアッセイは、メーカーのプロトコール（米カリフォルニア州パロアルト、クロンテック社）に従い、ＭＡＴＣＨＪＭＡＫＥＲＴＭ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄシステムを使用して行った。
実施例１  （ベイト構築体の設計と合成）
第１図に示されるＩＰ３Ｒ１の調節ドメインの一部をベイトとして使用し、６種のベイトを構築した。
マウスＩＰ３Ｒ１（ｍＩＰ３Ｒ１）のアミノ酸の１２４５−２２６４番目を、重複する６断片に分割し、それぞれの対応するｃＤＮＡ断片をベイトとして使用した。ＩＰ３Ｒ１調節ドメインのアミノ酸残基１２４５−２２６４番目をマッピングし、これに重複している次のセンス鎖（Ｓ）及びアンチセンス鎖（Ａ）からなるプライマーセットを使用し、ＰＣＲ法により６ベイト構成体（ＭＤ１〜ＭＤ６）を作製した。
2004103393.tif 000003
2004103393.tif 000004
ＰＣＲ法により得られたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ、またはＳａｌＩ単独のいずれかにより消化し、次にｐＧＢＴ９（クロンテック社）に連結した。このプラスミドのすべてについてシーケンシングを行い、これらのｃＤＮＡのクローニングがフレームに合わせて翻訳され、ＰＣＲに起因するエラーがないことを確認した。
実施例２  （ｃＤＮＡライブラリーの構築）
マウス脳ｃＤＮＡライブラリーを、ｐＧＡＤ−ＧＬ（クロンテック社）を用いて構築した。即ち、マウス脳（６週齢ｄｄＹマウス；日本国浜松市、日本エスエルシー株式会社）からの全ＲＮＡについて、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・クロマトグラフィーを用いて、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ発現を濃縮した。ランダムな６量体をプライマーとして使用し二本鎖ｃＤＮＡを作製し、アダプターＥｃｏＲＩに連結した。ＥｃｏＲＩで消化後、４００ｂｐを超えるｃＤＮＡを、セファロースＣＬ２Ｂ（米ニュージャージー州ピスカタウェイ、アマシャム  バイオサイエンス株式会社）を用いて分別して回収した。これらをｐＧＡＤ  ＧＬのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ（米カリフォルニア州ラホーヤ、ストラタジーン社）により、約５×１０５の独立したクローンを作製し、１回増幅した後、プラスミドＤＮＡを単離した。
実施例３  （抗体の調製）
文献に記載の方法により（Ｍａｅｄａ，Ｎ．，Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５１，１７２４−１７３０；Ｍａｅｄａ，Ｎ．，Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，６１−６７；Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｙａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３５４，１４９−１５４）、ｍＩＰ３Ｒ１、４Ｃ１１、１８Ａ１０およびＫＭ１１１２に対するモノクローナル抗体を調製した。炭酸脱水酵素ファミリーの中で異なっているマウスＣＡＲＰのアミノ酸残基２６７−２７９（ＣＤＧＩＬＧＤＮＦＲＰＴＱ）に対応するペプチドを合成し、このペプチドを、ＭＢＳ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステルを使用し、Ｎ末端のＣｙｓ残基を通じてアオガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））にコンジュゲートさせた。ポリクローナル抗体をウサギ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、日本国北海道、ホクドー洞爺免疫研究所）から作製した。この抗体を、標準プロトコールに従い抗原性のペプチド結合ビーズを用いて、抗血清から精製した。
実施例４  （ＣＡＲＰの発現のウェスタンブロット解析）
種々の臓器におけるＣＡＲＰの発現を、ウェスタンブロット法により解析した。マウスから切断した各臓器に、ホモジナイズ用バッファー（０．３２Ｍスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤（０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭ  Ｅ−６４）、および１０ｍＭトリス−ＨＣＬ  ｐＨ７．４）を加え、ガラス−テフロン（登録商標）製ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。心臓、肝臓、腎臓、副腎、精巣、筋肉については、これら臓器をハサミで小片に細切した後にホモジナイズした。このホモジネートを４℃にて２０分間、１００，０００×ｇで遠心した。この遠心上清液（１０μｇ）を使用し、ドデシル硫酸ナトリウム存在下で５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロースにトランスファーした後、抗ＣＡＲＰ抗体にて免疫検出した。
結果を第２図に示す。
実施例５  （免疫組織化学）
一次培養を行った小脳プルキンエ細胞の調製および免疫組織化学解析は、文献（Ｙｕｚａｋｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｉｋｏｓ  ｈｉｂａ，Ｋ．，（１９９２），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，４２５３−６３．）に記載の方法に準じて行った。一次抗体および二次抗体を組み合わせた後、ウサギ抗ＣＡＲＰポリクローナル抗体、ＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ抗体、抗ＩＰ３Ｒ１モノクローナル抗体、１８Ａ１０およびＴｅｘａｓＲｅｄ結合抗ラットＩｇＧ抗体を使用して二重染色を行った。
結果を第３図に示す。
実施例６  （Ｓｆ９細胞におけるＩＰ３Ｒ１のチャネルドメインの欠失した組換え体の発現）
マウスＩＰ３Ｒ１のＮ末端部位（残基１−２２５）をコードするＤＮＡを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクターｐＧＥＸ−ＫＧにインサートした。ＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１（１−２２５）断片を、バキュロウイルストランスファーベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（インビトロジェン社）にサブクローニングした。ＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１（１−２２５）のＳｍａＩ部位から下流の３’−部位を、マウスＩＰ３Ｒ１のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片（残基７９−２２１７に対応）と交換し、ＧＳＴ−ＩＰ３Ｒ１（１−２２１７）を構築した（ＧＳＴ−ＥＬと呼ぶ）。メーカーのプロトコールに従い、Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅＴＭトランスフェクション・キット（インビトロジェン社）により、ＧＳＴ−ＥＬをもつ組換えバキュロウイルスを作製した。感染多重度５で組換えバキュロウイルスを感染させることにより、２×１０８個のＳｆ９細胞にＧＳＴ−ＥＬを発現させ、４８時間インキュベートした。ＧＳＴ−ＥＬを発現している細胞に、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、２−メルカプトエタノール  １ｍＭ、０．１％  トリトンＸ−１００、およびプロテアーゼ阻害剤を加え、ガラス−テフロン（登録商標）製ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。このホモジネートを３０分間、２０，０００×ｇで遠心した。ベンダーの推奨に従って、グルタチオンセファロース４Ｂ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）を用い、この遠心上清液からＧＳＴ−ＥＬを精製した。
実施例７  （大腸菌における組換えＣＡＲＰの発現）
完全長ＣＡＲＰ  ｃＤＮＡを、ｐＥＴ２３ａベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに、転写のフレームを合わせてクローニングした。これによってＨｉｓ−タグが組換えＣＡＲＰのＣ末端に導入された。ＣＡＲＰ発現ベクターにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一コロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地１．５ｍｌで、３７℃で１０時間インキュベートした。この培養菌１ミリリットルを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地１リットルに接種し、Ａ６００＝０．７に達するまで２５℃でインキュベートした後、培養菌にイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドを添加した（最終濃度、０．５ｍＭ）。２５℃で８時間、インキュベーションを続け、遠心分離器を用いて細胞を採取し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌにて洗浄後、ＰＢＳ  ５０ｍｌで４℃で超音波処理した。不溶性物質を遠心除去した後、上清をハイトラップ−キレートカラム（アマシャム  バイオサイエンス社）に載せた。組換えＣＡＲＰ蛋白質を、まずメーカーのプロトコールに従って精製、次にＭｏｎｏ  Ｑを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（アマシャム  バイオサイエンス社）で精製し、最後に複合体共沈法（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験）またはＩＰ３結合実験で使用するバッファーに対して透析し、バッファーを交換した。
ＧＳＴ融合組換えＣＡＲＰについては、完全長ＣＡＲＰ  ｃＤＮＡをｐＧＥＸ−ＫＧのＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩサイトにクローニングしてＧＳＴ−ＣＡＲＰを構築した。ＧＳＴ−ＣＡＲＰを大腸菌に発現させ、上記のようにグルタチオンセファロースを用いて精製した。
実施例８  （ＩＰ３Ｒ１へのＣＡＲＰ結合の生化学解析）
成体マウス小脳を、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ、スクロース  ３２０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、２−メルカプトエタノール  １ｍＭ、およびプロテアーゼ阻害剤を加えてホモジナイズし、そのホモジネートを１０分間、１，０００×ｇで遠心した。この遠心上清液を、６０分間、１００，０００×ｇで遠心して細胞質分画（上清）および未精製のミクロソーム分画（小球）を得た。この細胞質分画にＮａＣｌ１００ｍＭを加え、ＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴ２０μｇにより４℃で２時間、インキュベートした。グルタチオンセファロース１０μｌを加え、さらに２時間インキュベートした後、この樹脂を洗浄バッファー（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）１０ｍＭ、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、２−メルカプトエタノール１ｍＭ、および０．０１％トリトンＸ−１００）にて５回洗浄し、結合した蛋白質をグルタチオン２０ｍＭにて溶出した。溶出した蛋白質を、抗ＣＡＲＰ抗体を用いてウェスタンブロット法で解析した。
未精製のミクロソームに１％トリトンＸ−１００を加え可溶化し、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、２−メルカプトエタノール１ｍＭ、およびプロテアーゼ阻害剤に４℃で３０分間溶解し、３０分間、２０，０００×ｇで遠心した。この遠心上清液について、先に説明したとおりＧＳＴ−ＣＡＲＰまたはＧＳＴ１０μｇを用いてプルダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＩＰ３Ｒ１抗体ＫＭ１１１２を用いて免疫ブロット解析を行った。
直接的な結合アッセイについては、洗浄バッファーにて精製済みのＣＡＲＰ−Ｈｉｓ（５μｇ）に対し、先に説明したとおりＧＳＴ−ＥＬまたはＧＳＴ２０μｇを用いてプルダウンアッセイを行い、結合した蛋白質について、抗ＣＡＲＰ抗体を用いて免疫ブロット解析を行った。結果を確認するため、実験を少なくとも３回反復した。
結果を第４図に示す。
実施例９  （酵母のツーハイブリッドアッセイによる結合サイトの同定）
結合サイトを確認するため、ｐＧＢＴ９およびｐＧＡＤ−ＧＬを各々用いて、ＩＰ３Ｒ１およびＣＡＲＰ構成体のいずれかをトランケートした。トランケート型ＩＰ３Ｒ１構成体には、次のアミノ酸が含まれている：
ｐＧＢＴ９−ΔＩ１（ｍＩＰ３Ｒ１：アミノ酸の１３８７−１４６４）、
ｐＧＢＴ９−ΔＩ２（ｍＩＰ３Ｒ１：アミノ酸の１３８７−１５２０）、
ｐＧＢＴ９−ΔＩ３（ｍＩＰ３Ｒ１：アミノ酸の１３８７−１５９８）、
ｐＧＢＴ９−ΔＩ４（ｍＩＰ３Ｒ１：アミノ酸の１５１３−１５９８）、
ｐＧＢＴ９−ΔＩ５（ｍＩＰ３Ｒ１：アミノ酸の１５１３−１６４７）。
トランケート型ＣＡＲＰ構成体には、次のアミノ酸が含まれている：
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ１（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−１２７）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ２（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−１４７）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ３（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−１７０）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ４（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−１８０）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ５（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−２１７）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ６（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１−２３４）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ７（ＣＡＲＰ；アミノ酸の４５−２９１）、
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ８（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１２１−２９１）、および
ｐＧＡＤ−ＧＬ−ΔＣ９（ＣＡＲＰ；アミノ酸の１８４−２９１）。
このプラスミド構成体のすべてについてシーケンシングを行い、適切なｃＤＮＡのクローニングが転写のフレームに合わせて行われたことを確認した。
結果を第５図に示す。
実施例１０  （〔３Ｈ〕ＩＰ３結合アッセイ）
ＩＰ３Ｒ１に結合する〔３Ｈ〕ＩＰ３について、ＣＡＲＰ存在または非存在下で、ポリエチレングリコールを用いた沈殿法によるアッセイを文献（Ｍａｅｄａ，Ｎ．，Ｎｉｉｎｏｂｅ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，６１−６７）に記載の方法に準じて行った。０．５μｇの精製されたＩＰ３Ｒ１を、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、９．６ｎＭ〔３Ｈ〕ＩＰ３、および種々の濃度のＩＰ３を含む溶液５０μｌ中で、１０μｇの精製されたＨｉｓ−ＣＡＲＰの存在下、又は非存在下に、４℃で１０分間インキュベートした。非特異的結合を、１０μＭのＩＰ３の存在下で測定した。
結果を第６図に示す。
【産業上の利用可能性】  本発明は、ＩＰ３Ｒに結合し得る新たな物質を提供するものであり、ＩＰ３Ｒの作動による細胞内のカルシウムの放出を制御する手段を提供するものである。本発明の調節剤によりＩＰ３により誘発される細胞内のカルシウムの放出を制御することができ、カルシウムの放出の異常に起因する各種の疾患の治療や診断に有用であるばかりでなく、細胞内におけるセカンドメッセンジャーとしてのＩＰ３の作用を解析するための有力な手段を提供するものである。
また、本発明はその機能が解明されていなかったＣＡＲＰの新たな機能を明らかにしたものであり、ＣＡＲＰの細胞内におけるカルシウムの放出の制御という新たな用途を提供するものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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