(57)【要約】従来法よりも高純度かつ均質なタンパク質を調製するためのリフォールディング方法、およびそのようなリフォールディング方法によって調製されたタンパク質を提供することを、本発明の課題とする。  本発明によって、可溶化された封入体のような変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、ａ）アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下する工程、を包含する方法、ならびにそのような方法によって調製されたタンパク質、ならびにそのようなタンパク質を含む薬学的組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、以下の工程：
ａ）アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記変性タンパク質およびリフォールディング緩衝液のいずれもが、界面活性剤を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記滴下が、１０〜３００μｌ／分の速度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記滴下が、２０〜３０μｌ／分の速度で行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リフォールディング緩衝液のｐＨが７．５〜９．５の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リフォールディング緩衝液のｐＨが８．０〜８．５の範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リフォールディング緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度が５〜２０ｍＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アルギニンの濃度が１００ｍＭ〜６００ｍＭである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルギニンの濃度が３００ｍＭ〜４００ｍＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの比が、１：５〜１：１０の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記還元型グルタチオンの濃度が１〜２０ｍＭであり、前記酸化型グルタチオンの濃度が０．２〜２ｍＭである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記滴下する変性タンパク質溶液とリフォールディング緩衝液との容量の比が、１：５０〜１：１００である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記滴下する変性タンパク質溶液の滴下後のリフォールディング緩衝液中でのタンパク質濃度が、５〜２５０μｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記滴下する変性タンパク質溶液の滴下後のリフォールディング緩衝液中でのタンパク質濃度が、２０〜２５０μｇ／ｍＬである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変性タンパク質が、変性剤、熱、または照射によって変性されたタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記変性タンパク質が、細菌で発現した封入体タンパク質を、ＳＨ保護試薬および変性剤を含有する可溶化緩衝液を用いて可溶化することによって得られる変性タンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記可溶化の際のタンパク質の濃度が、１〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記可溶化の際のタンパク質の濃度が、２．０〜３．０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記可溶化緩衝液のｐＨが７．０〜９．０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記可溶化緩衝液が、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＳＨ保護試薬がジチオトレイトールである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジチオトレイトールの濃度が５〜２００ｍＭである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジチオトレイトールの濃度が５０〜１００ｍＭである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記滴下工程の後に、溶液を攪拌する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記攪拌工程が、１０〜４８時間行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記攪拌工程が、１０〜１４時間行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１７に記載の方法によって得られる、リフォールディングされたタンパク質。
【請求項２９】
前記封入体タンパク質が細菌細胞で組換え発現された、受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントである、請求項２８に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３０】
前記受容体が、以下の受容体からなる群から選択される、請求項２９に記載のリフォールディングされたタンパク質：
スカベンジャー受容体、インスリン受容体ファミリーに属する受容体、ＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＰＤＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＶＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＦＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＮＧＦ受容体ファミリーの増殖因子受容体、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する受容体、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体ファミリーに属する受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーに属する受容体、およびＧタンパク質共役型受容体ファミリーに属する受容体。
【請求項３１】
前記受容体が、スカベンジャー受容体のＬＯＸ−１である、請求項３０に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３２】
９８％以上の純度である、請求項３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３３】
２．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶を与える純度を有する、請求項３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３４】
固相固定化部位が付加されている、請求項３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３５】
前記固相固定化部位がビオチンまたはタグ配列である、請求項３４に記載のリフォールディングされたタンパク質。
【請求項３６】
前記タグ配列が、以下からなる群から選択されるタグ配列である、請求項３５に記載のリフォールディングタンパク質：
Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｍｙｃタグ、セルロース結合ドメインタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、Ｓタンパク質結合ペプチドタグ、Ｔ７タグまたはこれらの組み合わせ。
【請求項３７】
請求項３４に記載の固相固定化部位を介して固相に固定化されたリフォールディングタンパク質を含有する、受容体チップ。
【請求項３８】
表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、請求項３７に記載の受容体チップ。
【請求項３９】
請求項３８に記載の受容体チップを用いる、変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の受容体チップを含む、検出用キット。
【請求項４１】
請求項３４に記載の固相固定化部位を介して固相に固定化されたリフォールディングタンパク質を含有する、リガンド除去材料。
【請求項４２】
請求項４１に記載のリガンド除去材料を含有する、血中のリガンドを除去するためのリガンド除去材料。
【請求項４３】
請求項４１に記載のリガンド除去材料を含有する、変性ＬＤＬ動態異常に起因する動脈硬化症を処置するための治療用材料。
【請求項４４】
請求項４１に記載のリガンド除去材料を含有する、変性ＬＤＬ動態異常に起因する高脂血症を処置するための治療用材料。
【請求項４５】
ａ＝６．２ｎｍ、ｂ＝６．９ｎｍ、およびｃ＝７．９ｎｍの単位格子定数を有する、Ｐ２１２１２１斜方晶形であるＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結晶形態。
【請求項４６】
請求項３１に記載のリフォールディングされたタンパク質を含む、動脈硬化を予防または処置するための、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規のリフォールディング方法に関する。さらに本発明は、本発明のリフォールディング方法によって得られたタンパク質に関する。本発明のリフォールディング方法によって得られるタンパク質は、高純度、かつ高度に均質であるという特徴を有する。そのため、本発明はまた、本発明のリフォールディング方法によって得られたタンパク質の結晶を提供する。
さらに本発明は、本発明のリフォールディング方法を適用することによって得られる受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントを固相上に固定化することにより調製される受容体チップ、受容体カラムおよびリガンド除去材料、ならびにこのようなリガンド除去材料を含有する治療用材料に関する。
具体的には、例えば、本発明において、受容体フラグメントとして使用するスカベンジャー受容体のリガンド認識部位に関係する領域を細胞内で封入体として発現させた後、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングし、その後、リフォールディングしたタンパク質を固相上に固定化して作製された受容体チップが提供される。例えば、スカベンジャー受容体の細胞外領域、またはＣタイプレクチン様領域（ＣＴＬＤとも略記する）を封入体として細胞内で発現させた後、本発明のリフォールディング方法を適用し、リフォールディングしたタンパク質を固相上に固定化することによって、酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、サクシニルＬＤＬ、およびマロンジアルデヒドＬＤＬ、糖化ＬＤＬなどの変性ＬＤＬ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）異常細胞並びに細菌を検出するための、高感度な受容体チップを提供することができる。
また、本発明のリフォールディング方法を用いて調製されたスカベンジャー受容体の細胞外領域、またはＣＴＬＤは、高純度かつ均質であるため、標的リガンド以外の物質に対する非特異的結合が少ない。従って、そのようなスカベンジャー受容体の細胞外領域、またはＣＴＬＤを用いることによって、血液中の変性ＬＤＬ以外の成分に対して影響を与えることなく、血中の変性ＬＤＬを除去する方法および治療用材料が提供される。
さらに、本発明のリフォールディング方法によって調製されたタンパク質を用いた結晶も提供される。
【背景技術】  所望のタンパク質を大量に調製するための方法として、タンパク質の組換え発現法が周知である。組換え発現によって、天然の供給源からの大量調製が困難であるタンパク質についても、大量に調製することが可能となった。
例えば、細胞表面に存在する受容体は、その受容体に対応するリガンドと特異的に結合し、種々のシグナルを細胞内に伝達するタンパク質であり、細胞あたりの発現量が少ないため、天然の供給源から大量に調製することが困難であるが、組換え発現法を用いれば大量に調製することが可能である。
細胞表面に存在する受容体は多様であり、その対応するリガンドも異なることから、特定のリガンドの検出および／または定量を行うために、そのリガンドに特異的に結合する受容体を大量に調製して用いることは有用である。大量に調製した受容体または受容体フラグメントを固相に固定化して、異常細胞または疾患の診断マーカーをリガンドとする受容体チップを作製することにより、細胞集団中の異常細胞の存在の検出、または、疾患の診断のための有用なツールを提供できることが、予想される。例えば、生体内に蓄積した変性ＬＤＬやアポトーシス細胞や老化赤血球などの異常細胞、並びに生体内に侵入した細菌等を認識して結合する能力のある複数の受容体の存在が発見されている。このような受容体の中には、認識する対象（リガンド）の認識に必要な領域が予想されているものも多い。これらの受容体そのもの、あるいは認識に必要な領域のみを利用すれば、リガンドである変性ＬＤＬ、アポトーシス細胞などの異常な細胞、細菌を簡便に検出できる可能性がある。
また、受容体とその対応するリガンドとの結合が特異的であることから、大量発現した受容体またはそのリガンド結合性フラグメントを固相に固定化し、リガンドを除去する材料を提供することが可能である。例えば、変性ＬＤＬに対する受容体を用いて、血中の変性ＬＤＬを除去することにより、変性ＬＤＬ動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症などの疾患を治療することが可能である。従って、本発明は、変性ＬＤＬリガンド除去材料を含有する治療用材料をも提供する。
タンパク質を組換え発現するために用いる種々の宿主細胞およびベクターが周知である。組換え発現の宿主細胞としては、細菌細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などが挙げられる。なかでも、大腸菌のような細菌細胞は、その増殖速度が速く、かつ操作が比較的簡便であり、かつ調製コストが安いため、宿主細胞として広く利用されており、特に工業的規模での生産に適している。しかし、大腸菌において外来遺伝子を高発現した場合には、産物タンパク質が不溶性物質として細胞内に封入体として蓄積される場合が多い。この封入体は、不溶性であり、かつ封入体タンパク質の立体構造は天然の状態のタンパク質の立体構造とは異なるため、可溶化およびリフォールディングを必要とする。
ところが、従来のリフォールディング方法は、例えば、受容体を樹脂に吸着させた後、吸着させた樹脂を変性剤を含有する緩衝溶液と接触させ、次いで変性剤の濃度を漸次低下させた緩衝溶液と接触させる（特開２００３−１６９６９３）というように、いずれも煩雑な方法であった。さらに、固相に固定化された状態でリフォールディングした場合は、リフォールディング後に固相からの溶出や切り出しなどの工程を経る必要があり、煩雑さを増すと共に収率が低下するなどの問題があった。さらに、界面活性剤を用いる従来のリフォールディング方法（特開２００２−３０６１６３）では、使用した界面活性剤をリフォールディングしたタンパク質から除去することが困難であるという問題も生じる。そのため、従来法では、可溶化およびリフォールディング工程において使用する物質がリフォールディングしたタンパク質中に混入することによる純度の低下、および不完全にリフォールディングされたタンパク質の存在による不均一さが問題となっている。
この純度の低下および不均一さは、天然のタンパク質と比較した場合のリフォールディングしたタンパク質の比活性の低さとして検出することができる。実際に、従来法では、リフォールディングしたタンパク質が必ずしも１００％の比活性を示すことはない（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｌ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、３３９６１〜３３９７１；Ｓｕｎｄａｒｉ，Ｃ．Ｓ．ら、（１９９９）ＦＥＢＳ，Ｌｅｔｔ．、４４３、２１５〜２１９；およびＭａｃｈｉｄａら（２０００）ＦＥＢＳ，Ｌｅｔｔ．、４８６、１３１〜１３５）。
例えば、受容体のリガンド結合フラグメントをリフォールディングし、リガンド検出のための受容体チップとして利用する場合、従来のリフォールディング方法を用いると高純度かつ均質なリフォールディングタンパク質の調製ができないため、定性的検出および定量的検出における感度の低下を生じる。また、受容体のリガンド結合フラグメントをリフォールディングし、例えば、血中に存在するリガンドの除去のための材料として利用する際に、リフォールディングしたタンパク質の純度および均質性が低い場合には、血中の他の因子との相互作用によって、目的とするリガンド以外の物質を除去することとなる。
従って、従来法と比較して、より高純度かつ均質なタンパク質を得るためのリフォールディング方法、特に、封入体からリフォールディングしたタンパク質を調製するための方法が望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】  本発明の目的は、変性タンパク質から、高純度かつ均質な適正に折り畳まれたタンパク質を調製するリフォールディング方法を提供することにある。また、本発明のさらなる目的は、本発明のリフォールディング方法を用いることによって、高純度かつ均質な適正に折り畳まれたタンパク質を提供することにある。
本発明はさらに、封入体タンパク質から、高純度かつ均質な適正に折り畳まれたタンパク質を調製し、そのタンパク質を固相上に固定化することによって受容体チップを作製することを目的とする。また、本発明のさらなる目的は、そのようなチップを用いた、検出キットおよび検出方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、スカベンジャー受容体を用いた受容体チップを作製し、変性ＬＤＬ、異常細胞並びに細菌の検出方法を提供し、また、好適には方向性を有した状態（リガンド結合部位が外側に位置するように）で固相上に固定化可能な可溶性のリガンド認識領域を大量に調製し、そのリガンド認識特性を活かしたセンサー部位を構築し、これを利用して変性ＬＤＬやアポトーシス細胞や老化赤血球などの異常細胞、並びに生体内に侵入した細菌等を検出する方法および検出用キットを提供することである。
また、本発明のさらなる目的は、血中の変性ＬＤＬ、異常細胞並びに細菌を除去するための、スカベンジャー受容体を用いたリガンド除去材料を提供すること、およびそのような材料を用いた、血中の変性ＬＤＬ、異常細胞並びに細菌を除去する方法および材料を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、従来法のリフォールディング法によって調製されたタンパク質と比較して、より高純度であり、かつ均質なタンパク質を提供することにある。さらに、そのようなタンパク質を提供することによって、ワクチン組成物のような治療用組成物の製造に適したタンパク質の製造を可能とすることも、本発明の目的の１つである。
【課題を解決するための手段】  本発明は、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下する工程を用いることによって、上記課題を解決した。本発明はまた、リフォールディングされるタンパク質として、ＬＯＸ−１のリガンド結合性フラグメントを用いることによって、血中の変性ＬＤＬ、異常細胞並びに細菌を除去するための方法および材料を提供するという上記課題を解決した。
従って、本発明は以下を提供する。
１．変性したタンパク質をリフォールディングする方法であって、以下の工程：
ａ）アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下する工程、
を包含する方法。
２．前記変性タンパク質およびリフォールディング緩衝液のいずれもが、界面活性剤を含有しない、項目１に記載の方法。
３．前記滴下が、１０〜３００μｌ／分の速度で行われる、項目１に記載の方法。
４．前記滴下が、２０〜３０μｌ／分の速度で行われる、項目３に記載の方法。
５．前記リフォールディング緩衝液のｐＨが７．５〜９．５の範囲である、項目１に記載の方法。
６．前記リフォールディング緩衝液のｐＨが８．０〜８．５の範囲である、項目５に記載の方法。
７．前記リフォールディング緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有する、項目１に記載の方法。
８．前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度が５〜２０ｍＭである、項目７に記載の方法。
９．前記アルギニンの濃度が１００ｍＭ〜６００ｍＭである、項目１に記載の方法。
１０．前記アルギニンの濃度が３００ｍＭ〜４００ｍＭである、項目９に記載の方法。
１１．前記還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの比が、１：５〜１：１０の間である、項目１に記載の方法。
１２．前記還元型グルタチオンの濃度が１〜２０ｍＭであり、前記酸化型グルタチオンの濃度が０．２〜２ｍＭである、項目１１に記載の方法。
１３．前記滴下する変性タンパク質溶液とリフォールディング緩衝液との容量の比が、１：５０〜１：１００である、項目１に記載の方法。
１４．前記滴下する変性タンパク質溶液の滴下後のリフォールディング緩衝液中でのタンパク質濃度が、５〜２５０μｇ／ｍＬである、項目１に記載の方法。
１５．前記滴下する変性タンパク質溶液の滴下後のリフォールディング緩衝液中でのタンパク質濃度が、２０〜２５０μｇ／ｍＬである、項目１４に記載の方法。
１６．前記変性タンパク質が、変性剤、熱、または照射によって変性されたタンパク質である、項目１に記載の方法。
１７．前記変性タンパク質が、細菌で発現した封入体タンパク質を、ＳＨ保護試薬および変性剤を含有する可溶化緩衝液を用いて可溶化することによって得られる変性タンパク質である、項目１６に記載の方法。
１８．前記可溶化の際のタンパク質の濃度が、１〜５ｍｇ／ｍＬである、項目１７に記載の方法。
１９．前記可溶化の際のタンパク質の濃度が、２．０〜３．０ｍｇ／ｍＬである、項目１７に記載の方法。
２０．前記可溶化緩衝液のｐＨが７．０〜９．０である、項目１７に記載の方法。
２１．前記可溶化緩衝液が、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である、項目２０に記載の方法。
２２．前記ＳＨ保護試薬がジチオトレイトールである、項目２０に記載の方法。
２３．前記ジチオトレイトールの濃度が５〜２００ｍＭである、項目２２に記載の方法。
２４．前記ジチオトレイトールの濃度が５０〜１００ｍＭである、項目２３に記載の方法。
２５．前記滴下工程の後に、溶液を攪拌する工程を包含する、項目１に記載の方法。
２６．前記攪拌工程が、１０〜４８時間行われる、項目２５に記載の方法。
２７．前記攪拌工程が、１０〜１４時間行われる、項目２６に記載の方法。
２８．項目１７に記載の方法によって得られる、リフォールディングされたタンパク質。
２９．前記封入体タンパク質が細菌細胞で組換え発現された、受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントである、項目２８に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３０．前記受容体が、以下の受容体からなる群から選択される、項目２９に記載のリフォールディングされたタンパク質：
スカベンジャー受容体、インスリン受容体ファミリーに属する受容体、ＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＰＤＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＶＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＦＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＮＧＦ受容体ファミリーの増殖因子受容体、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する受容体、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体ファミリーに属する受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーに属する受容体、およびＧタンパク質共役型受容体ファミリーに属する受容体。
３１．前記受容体が、スカベンジャー受容体のＬＯＸ−１である、項目３０に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３２．９８％以上の純度である、項目３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３３．２．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶を与える純度を有する、項目３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３４．固相固定化部位が付加されている、項目３１に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３５．前記固相固定化部位がビオチンまたはタグ配列である、項目３４に記載のリフォールディングされたタンパク質。
３６．前記タグ配列が、以下からなる群から選択されるタグ配列である、項目３５に記載のリフォールディングタンパク質：
Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ｍｙｃタグ、セルロース結合ドメインタグ、セルロース結合ペプチドタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、Ｓタンパク質結合ペプチドタグ、Ｔ７タグまたはこれらの組み合わせ。
３７．項目３４に記載の固相固定化部位を介して固相に固定化されたリフォールディングタンパク質を含有する、受容体チップ。
３８．表面プラズモン共鳴、水晶発振子マイクロバランス、または質量分析計による検出に適合する、項目３７に記載の受容体チップ。
３９．項目３８に記載の受容体チップを用いる、変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法。
４０．項目３８に記載の受容体チップを含む、検出用キット。
４１．項目３４に記載の固相固定化部位を介して固相に固定化されたリフォールディングタンパク質を含有する、リガンド除去材料。
４２．項目４１に記載のリガンド除去材料を含有する、血中のリガンドを除去するためのリガンド除去材料。
４３．項目４１に記載のリガンド除去材料を含有する、変性ＬＤＬ動態異常に起因する動脈硬化症を処置するための治療用材料。
４４．項目４１に記載のリガンド除去材料を含有する、変性ＬＤＬ動態異常に起因する高脂血症を処置するための治療用材料。
４５．ａ＝６．２ｎｍ、ｂ＝６．９ｎｍ、およびｃ＝７．９ｎｍの単位格子定数を有する、Ｐ２１２１２１斜方晶形であるＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結晶形態。
４６．項目３１に記載のリフォールディングされたタンパク質を含む、動脈硬化を予防または処置するための、薬学的組成物。
さらに、本発明は、所望のリガンドに特異的に結合する受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントを高純度かつ均質な状態で調製し、そのフラグメントを固相に結合することによって、その所望のリガンドを高感度で検出する受容体チップを提供する。本発明はまた、そのような受容体チップを用いて、その所望のリガンドを検出する方法を提供する。
本発明は、所望のリガンドに特異的に結合する受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントを高純度かつ均質な状態で調製し、そのフラグメントを固相に結合することによって、その所望のリガンドを特異的に除去するためのリガンド除去材料を提供する。本発明はまた、その所望のリガンドを血中から除去する方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する：
（１）被検体の血液を得る工程；および
（２）該血液を、血中の所望のリガンドとリガンド除去材料が特異的に結合する条件下で、リガンド除去材料と接触させる工程。
１つの局面において、上記方法で処理された血液は、被検体に戻される。
さらに、本発明においては、試料中の細菌および／またはウイルスなどの病原体を除去するための方法であって、以下の工程を包含する方法が提供される：
（１）病原体を除去するための試料を得る工程；および
（２）該試料を、試料中の病原体とリガンド除去材料が特異的に結合する条件下で、リガンド除去材料と接触させる工程。
１つの局面において、上記方法で処理された試料は、被検体に注入される。
さらに本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域を細胞内で発現させて得た組換えタンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。
また本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域をビオチン化タンパク質として細胞内で発現させた後、発現させたビオチン化タンパク質をアビジンまたはストレプトアビジンを介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるリガンドの検出方法を提供する。
また本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域をタグ化タンパク質として細胞内で発現させた後、発現させたタグ化タンパク質をそのタグと特異的に結合する因子を介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるリガンドの検出方法を提供する。
本発明はさらに、大腸菌内に蓄積した受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成して得た再構成タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。
また本発明は、大腸菌内に蓄積した受容体のビオチン化細胞外領域またはビオチン化リガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成した後、再構成したビオチン化タンパク質をアビジンまたはストレプトアビジンを介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。
また本発明は、大腸菌内に蓄積した受容体のタグ化細胞外領域またはタグ化リガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成した後、再構成したタグ化タンパク質をタグと特異的に結合する因子を介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。
本発明はまた、大腸菌内に凝集体として蓄積した受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を変性剤により構造を解きほぐした後、正しい立体構造にリフォールディングしたタンパク質を含む変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出用キットを提供する。
本発明はまた、種々の疾患（例えば、動脈硬化）を処置するためのワクチン組成物を製造するためのタンパク質を提供する。例えば、動脈硬化を処置するためのワクチン組成物は、例えば、変性ＬＤＬのようなリポタンパク質、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体ファミリーに属する受容体、およびＬＯＸ−１のようなスカベンジャー受容体のようなタンパク質を含み得る。
【発明の効果】  本発明によって、新規のリフォールディング方法、およびその方法によって得られたタンパク質が提供される。本発明のリフォールディング方法によって、高純度かつ均質なリフォールディングタンパク質を得ることが可能となる。
さらに、本発明のリフォールディング方法を用いることによって、所望のリガンドに対する高感度の受容体チップセンサーもまた提供される。
また、本発明のリフォールディング方法を用いることによって、従来法のリフォールディング法によって調製されたタンパク質と比較して、より高純度であり、かつ均質なタンパク質を調製することが可能となる。そのため、本発明のリフォールディング方法によって、ワクチン組成物のような治療用組成物の製造に適したタンパク質の製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のリフォールディング方法で得たタンパク質が、従来法の環状糖質サイクロアミロースによるリフォールディング方法よりも分子量の幅が狭く、従ってより高い純度で精製されていることを示す。
図２は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質が従来法の環状糖質サイクロアミロースによりリフォールディング方法よりも夾雑物が少なく高純度に精製されていることを示す。
図３は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質が単一の分子種としてリフォールディングしているのに対して、従来法で得たタンパク質は、不完全なリフォールディングタンパク質が混在していることが示される。
図４は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質には不完全なリフォールディングタンパク質の混在が無いことを示す。
図５は、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングされたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤが酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが示す。
図６は、ＬＯＸ−１の細胞外ドメイン全長を本発明のリフォールディング方法でリフォールディングした結果得られたタンパク質が、細胞表層にあるＬＯＸ−１の存在様式と同様に２量体であることを示す。図中、βＭｅ（＋）は、βメルカプトエタノールを添加したことを示す。βＭｅ（−）は、βメルカプトエタノールを添加しなかったことを示す。
図７は、センサーチップにａｐｏＢ１００抗体を介して固定したアセチル化ＬＤＬに対して、二量体構造を形成したＬＯＸ−１細胞外ドメイン全長、単量体として存在するリガンド結合ドメインＣＴＬＤをそれぞれ相互作用させた実験の結果を示す。アセチル化ＬＤＬ認識には、リガンド結合ドメインが二量体構造を取ることが必要であることが示された。
発  明  の  詳  細  な  説  明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。
受容体フラグメントを用いる場合には、受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位を用いる。受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位は、以下のように同定することができる。ホモロジーやドメイン検索により相同性や機能上の類似点の高いタンパク質の構造からリガンド認識領域を推定することができる。例えば、同一のリガンドに特異的に結合する、異なる受容体分子のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて算出した場合、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上の相同性を示す領域が、リガンド認識領域として推定される。
さらに欠損変異やアミノ酸置換などを導入した変異受容体をコードする遺伝子を動物細胞などに一過性発現させ、その機能に必須の領域を決定することも、当業者は容易になし得る。
本明細書において使用される用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。
本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタ���ティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において使用する場合、好ましくは、受容体「フラグメント」は、全長受容体が特異的に結合し得るリガンドに特異的に結合する。レクチン様酸化ＬＤＬ受容体の好ましいフラグメントは、Ｃ−タイプレクチン様領域（ＣＴＬＤ）を含むフラグメントである。
本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する原核生物である細菌を培養し、細菌中に組換え受容体タンパク質を封入体として蓄積させ、その宿主細菌を破壊することによって、そのポリペプチドを得る方法が挙げられる。
大腸菌内でタンパク質をビオチン化するためのビオチン化モチーフのアミノ酸配列としては：
「ＭＫＬＫＶＴＶＮＧＴＡＹＤＶＤＶＤＶＤＫＳＨＥＮＰＭＧＴＩＬＦＧＧＧＴＧＧＡＰＡＰＡＡＧＧＡＧＡＧＫＡＧＥＧＥＩＰＡＰＬＡＧＴＶＳＫＩＬＶＫＥＧＤＴＶＫＡＧＱＴＶＬＶＬＥＡＭＫＭＥＴＥＩＮＡＰＴＤＧＫＶＥＫＶＬＶＫＥＲＤＡＶＱＧＧＱＧＬＩＫＩＧＤＬＥＬ」（配列番号５）が挙げられる。アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号６）もまたビオチン化モチーフとして利用可能である。これら配列において、実際にビオチン化を受けるＫ（リジン）残基以外に変異を導入しても、ビオチン化活性に大きな影響はないので、リジン残基以外を置換した配列もまた、ビオチン化モチーフとして使用することができる。また、実際にビオチン化を受けるＫを含んだ「ＫＩＧ，ＫＩ，ＫＩＡ，ＫＩＥ，ＫＩＧＤＰ（配列番号７），ＫＬＷＳＩ（配列番号８），ＫＬＧ，ＫＶＧ」などをＣ末側に付加することによるビオチン化も可能である。
また、エンドプロテイナーゼであるＦａｃｔｏｒＸａの認識配列「ＩＥＧＲ」（配列番号９）やエンテロキナーゼの認識配列「ＤＤＤＤＫ」（配列番号１０）などをこれらビオチン化モチーフと発現される外来タンパク質との間に挿入し、ＦａｃｔｏｒＸａまたはエンテロキナーゼによる切断により外来タンパク質を精製することも可能である。例えば、ＣＴＬＤを発現する場合、これらビオチン化モチーフとＣＴＬＤとの間にアミノ酸配列「ＩＥＧＲ」を挿入し、ＣＴＬＤのみの精製をすることも可能である。
「形質転換体」とは、宿主細胞を形質転換することによって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
形質転換体を得るための宿主細菌細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細菌細胞を用いることができる。原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
本発明において得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
本明細書中において、槻能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、細菌宿主細胞において自律複製が可能である、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーターおよび、選択マーカーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細菌細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核宿主細胞において自立複製が可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ  Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰＡＮ，ＰＡＣ（ａｖｉｄｉｔｙ社製）などが例示される。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
本明細書において使用される「固相」とは、抗体のような分子が固定され得る支持体をいう。固相の形状は、平面状、球状、またはその他の形状であってもよい。また、本発明の固相は、ゲル状であってもよい。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。
本明細書において使用される「基板」とは平面状の固相であって、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板は固相の概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の受容体が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の受容体のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる受容体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの受容体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される受容体は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の受容体が固定され得る。
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の生体分子（例えば、受容体）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える生体分子が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子である受容体のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞と特異的に結合する因子は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある基板または固相に作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。本明細書において、生体分子は、受容体、受容体のフラグメント、または受容体の改変体である。
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
各々のアドレスを定める大きさは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子の大きさおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
マイクロアレイについては、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、Ｍ．Ｆ．Ｔｅｍｐｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，７（１５），８１５−８２２（２００２）に広く概説されている。
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。この場合、まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、メチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。この単分子膜に、直径数μｍから１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射する。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。スポット内に導入された反応性官能基を使ってストレプトアビジン、アビジンなどのビオチンと特異的に結合するタンパク質を固定化するか、またはタグと特異的に結合する因子を固定化する。最後に受容体タンパク質のビオチン化部位またはタグ部分を介して受容体タンパク質を固定化することにより、化学的処理を経ずに穏やかな条件下で方向性を保った状態での、受容体タンパク質の固定化が完了する。例えば、カルボキシル基含有スポットの場合には、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換し、アビジンやストレプトアビジンなどを固定化させた後、微量の生体分子含有溶液を各スポットに滴下することで、固定化を行うことができる。スポット周囲に形成させた疎水性の単分子膜は、溶液の拡散を抑えるために有効である。スポット周囲のバックグラウンド領域と分析物との非特異的な相互作用を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質、ポリエチレングリコールのような親水性高分子でブロッキングを行う。
ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインチップなどを使った分析技術の進歩を見ても明らかなように、マイクロアレイは、一枚の基板上で多数の検体に対してハイスループット分析が可能であるため、きわめて有効な分析手段である。本発明は、このようなマイクロアレイの考え方を、多種類の生体分子−細胞間相互作用を迅速に計測するために応用する。この場合、きわめて多くの検体を同時に分析したり、分析に必要な生体分子および細胞の量をできる限り少なくするためには、マイクロアレイの集積化が重要である。しかし一方で、マイクロアレイ上の細胞に関する情報を取得する場合、ある程度以上の細胞数からなる集団を対象とした測定を行わない限り、誤差の大きいデータしか得ることができない。このような観点から、マイクロアレイを構成する各スポットの大きさは、少なくとも数十〜数千個程度の細胞が相互作用することのできる大きさであることが望ましく、例えば、円形のスポットの場合、その直径はおおよそ数μｍから１ｍｍ程度である。
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルライブラリ化合物など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書において好ましい生体分子は、受容体および受容体フラグメント、ならびにそれらのリガンドである。
本明細書において使用される場合、「ビオチンと特異的に結合する因子」とは、ビオチンと特異的に結合し得る任意の因子をいう。ビオチンと特異的に結合する因子とビオチンとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。ビオチンと特異的に結合する因子としては、アビジン、およびストレプトアビジン、ならびにこれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書においで使用される場合、「タグと特異的に結合する因子」とは、タグと特異的に結合し得る任意の因子をいう。タグと特異的に結合する因子とタグとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。タグと特異的に結合する因子は、タグの種類に応じて異なり、当該分野において周知である。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、グルタチオンである；ｍｙｃタンパク質をタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、抗ｍｙｃ抗体である；６残基の連続するヒスチジン残基をタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、ニッケルキレートカラムである；配列番号１１のような、セルロース結合ドメインタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、セルロースである；配列番号１２のような、カルモジュリン結合ペプチドタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、カルモジュリンである；配列番号１３のような、Ｓタンパク質結合ペプチドタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、Ｓタンパク質である；配列番号１４のような、Ｔ７タグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、抗Ｔ７抗体である。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属表面に生じた表面プラズモン（弾性波）と、全反射した電磁波によって発生するエバネッセント波（光波）との間で起こる相互作用である。プラズモン波とエバネッセント波の波数と波動ベクトルが近似的に一致する条件を与える光の入射角θにおいて共鳴が起こり、エバネッセント波が表面プラズモンの励起に使われるため反射光強度が低下する。表面プラズモン共鳴を得るためには、高屈折率媒体からなるプリズムを配置し（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）、レーザー光およびＬＥＤ光を入射する方法がとられる。ここで、プリズムとは反対側の金属表面に接触する媒体の誘電率の変化によって、プラズモン波の波数が変化する。すなわち、金属表面上に物質が接近することによって、表面プラズモン共鳴を与える光の入射角がシフトする。このことを利用して、金属表面の物質による被覆をセンシングすることが可能となる。この測定法は、表面鉛直方向の分解能に優れており（０．１ｎｍのオーダー）、表面に存在する物質量をｎｇ〜ｐｇ／ｃｍ２のオーダーでリアルタイムに観測することが可能である。また、水媒体中で測定できることもタンパク質のような生体分子の挙動を調べる上で大きな利点である。これを利用した測定装置が生体分子間相互作用測定装置として開発され、タンパク質およびＤＮＡなどの相互作用の分析に応用されている。
水晶発振子マイクロバランスは、周波数変換素子の電極上に化学的に結合対の一方を結合・固定化し、その周波数変換素子を水中に浸漬し、その結合対と対応する結合対との特異的に結合により生じる質量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定して、結合の有無を検出するものである（例えば、特開平６−９４５９１）。この周波数変換素子としては、例えば水晶発振子、表面弾性波素子（ＳＡＷ）などが挙げられる。
本発明の受容体チップはまた、質量分析計のための質量分析チップとしても使用され得る。一般的に、質量分光測定による分析は、レーザービームを含む、レーザーなどの高エネルギー源を用いた少量のサンプルの気化およびイオン化を伴っている。物質はレーザービームによって、質量分析チップ先端の表面からガスあるいは気相に気化され、このプロセス中に、個々の分子の一部は陽子を取り込んで、イオン化される。これら正の電荷にイオン化された分子は、次に、短い高圧電界で加速され、高真空度チェンバーに導かれ（ドリフト）、その先で、感度の高い検出装置の表面に衝突する。飛行時間はイオン化された分子の質量の関数であるから、イオン化と衝突との間に経過する時間は、その分子の質量の判定に用いることができ、その分子質量は、次に特定の質量の既知の分子が存在しているかどうかの判定に用いることができる（飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ））。また、イオン化されたサンプルに含まれる特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）のイオンだけが安定な振動状態になることを利用して、直流成分と高周波の交流成分の電圧を加えることにより、特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を有するイオンのみを通過させる質量フィルターを用いて（必要であれば、フラグメントイオンを生成させて）、サンプル（またはサンプルのフラグメントイオン）の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を検出することもできる（タンデム質量分析法）。
気相イオンの生成方法としては、粒子のサンプルへの衝撃から得られる脱着／イオン化法などがある。この方法には、高速原子衝撃法（ＦＡＢ−揮発性マトリクスに懸濁したサンプルに中性粒子（ｎｅｕｔｒａｌ）を衝撃する）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ−ｋｅＶ一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する）、液体ＳＩＭＳ（ＬＳＩＭＳ−一次種がイオンであることを除いてＦＡＢと同様）、プラズマ脱着質量分析法（ＭｅＶ一次イオンを用いることを除いてＳＩＭＳと同様）、大量クラスタ衝撃法（ＭＣＩ−大きいクラスタの一次イオンを用いてＳＩＭＳと同様）、レーザ脱着／イオン化法（ＬＤＩ−レーザ光を用いて、表面から種を脱着／イオン化する）、マトリクス補助型レーザ脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着／イオン化することを除いてＬＤＩと同様）などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ）を用いる方法が挙げられる。
質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を結合した質量分析チップを用いる測定方法は、例えば以下のように、特表平９−５０１４８９に開示される：
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子（例えば、リガンドを含む混合物）の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと；前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと；前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと；前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと；このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子（例えば、受容体に特異的に結合するリガンド）のイオンの質量を検出することができる。
上記の方法において、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定法により、分析対象物分子の質量を測定することが可能であり、この方法においては、分析対象物の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物と一緒にエネルギー吸収物質（例えば、シナピン酸、シンナムアミド、シンナミル臭化物、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いることができる。
質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を固定化した質量分析チップを用いるさらなる測定方法は、特表平１１−５１２５１８に開示される。この開示される方法においては、一般にヒドロゲル、およびさらに詳細には、カルボキシメチル化デキストランなどの多糖のヒドロゲルを有する支持体表面に受容体のような親和性結合分子をチップに固定化し、その分析物（例えば、リガンド）をその支持体と接触させた後、親和性結合分子に結合した分析物の有無およびその質量等について解析する。
本明細書において使用する受容体としては、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）を含むスカベンジャー受容体、インスリン受容体ファミリーに属する受容体、ＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＰＤＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＶＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＦＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＮＧＦ受容体ファミリーなどの増殖因子受容体、ならびに、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体ファミリーの受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体、およびＧタンパク質共役型受容体ファミリーの受容体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい受容体は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体に属するＬＯＸ−１である。
本明細書において、「ＬＯＸ−１」とは、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１の略称をさし、スカベンジャー受容体の一種であるＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体を指す。ＬＯＸ−１は、非常に誘導のかかりやすい遺伝子であり、動脈硬化を促進するような高血圧、高脂血症、糖尿病などの条件下で発現が誘導される。また、酸化ＬＤＬがＬＯＸ−１を介して血管内皮細胞に働くと、活性酸素の産生や、それに伴うＮＯ放出の低下が引き起こされる。また細胞接着分子やケモカインの発現も誘導され、いわゆる内皮機能不全の状態が引き起こされるといわれている。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）の細胞外領域の塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に、ｈＬＯＸ−１のＣＴＬＤの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号３および４に、それぞれ示す。
本明細書において、「ＬＤＬ」とは、低密度リポタンパク質をいい、動脈硬化の促進因子である血清タンパク質の一種をいう。血清中に約３００ｍｇ／ｄｌ含まれ、コレステロールを約５０％含み、アポＢとよばれるタンパク質を２０％含む。
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングは、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下することによって、行われる。好ましくは、変性タンパク質およびリフォールディング緩衝液のいずれもが、界面活性剤を含有しない。
本明細書においてタンパク質に関して使用する場合、用語「変性」とは、タンパク質の一次構造は変化せずに、高次構造のみが破壊され、天然での状態と物性が変化することをいう。
本明細書において使用する場合、用語「変性剤」とは、タンパク質の変性を起こす薬剤をいう。変性剤としては、グアニジン塩酸塩、尿素、ジオキサン、アルコール、エチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。グアニジン塩酸塩を用いる濃度は、好ましくは、４〜８Ｍ、より好ましくは、６Ｍである。
本明細書において使用する場合、用語「リフォールディング」とは、変性したタンパク質から、もとの立体構造、生物活性などを回復したタンパク質を得ることをいう。受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントの場合、その生物活性とは、例えば、リガンド結合活性である。
本明細書において使用する場合、用語「封入体」とは、大腸菌のような細菌において外来遺伝子を大量に組換え発現する場合に生成される、タンパク質が不溶性物質として細胞内に蓄積した構造体をいう。
本明細書において使用する場合、封入体の「可溶化」とは、変性剤を用いて、不溶性の封入体を変性して、水溶液に溶解した形態を生じさせることをいう。
本明細書において使用する場合、用語「ＳＨ保護試薬」とは、タンパク質内のチオール基（ＳＨ基）が、ＳＨ基と反応性の物質と反応することを妨げる試薬をいう。ＳＨ保護試薬としては、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、グルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングを、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下することによって行う場合、好ましくは、この滴下速度は、１０〜３００μｌ／分の速度であり、より好ましくは、２０〜３０μｌ／分の速度である。リフォールディング緩衝液のｐＨは、好ましくは、７．５〜９．５の範囲であり、より好ましくは、８．０〜８．５の範囲であるが、リフォールディングするタンパク質の性質に応じて、適切なｐＨを変化させることは、当該分野において周知である。１つの実施形態において、このリフォールディング緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有し、好ましくは、このＴｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は５〜１００ｍＭである。
リフォールディング緩衝液中に含まれるアルギニンの濃度は、好ましくは１００ｍＭ〜６００ｍＭであり、より好ましくは、３００ｍＭ〜４００ｍＭである。
本発明のリフォールディング方法において、好ましくは、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの比は、１：５〜１：１２、より好ましくは、１：５〜１：１０、最も好ましくは、１：５である。さらに好ましくは、還元型グルタチオンの濃度は１〜２０ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０．２〜２ｍＭである。
本発明のリフォールディング方法において、滴下する変性タンパク質溶液とリフォールディング緩衝液との容量の比は、好ましくは、１：５０〜１：１００である。また、好ましくは、滴下する変性タンパク質溶液の滴下後のリフォールディング緩衝液中でのタンパク質濃度は、５〜５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、５〜２５０μｇ／ｍＬであり、なお好ましくは、２０〜２５０μｇ／ｍＬである。
本発明のリフォールディング方法に用いられる変性タンパク質は、変性剤、熱、または紫外線照射、放射線照射のいずれかによって変性されたタンパク質であるが、好ましくは、変性剤によって変性されたタンパク質である。
本発明のリフォールディング方法に用いられる変性タンパク質は、好ましくは、細菌で発現した封入体タンパク質を、ＳＨ保護試薬および変性剤を含有する可溶化緩衝液を用いて可溶化することによって得られる変性タンパク質である。好ましくは、変性タンパク質を得るための可溶化は、１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を用いて行われる。より好ましくは、変性タンパク質を得るための可溶化は、２．０〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を用いて行われる。また、好ましくは、可溶化緩衝液のｐＨは７．０〜９．０であり、１つの局面において、可溶化緩衝液は、５〜１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。
本発明において、好ましくは、ＳＨ保護試薬はジチオトレイトールであり、さらに好ましくは、ジチオトレイトールの濃度は５〜２００ｍＭであり、なおより好ましくは、ジチオトレイトールの濃度は５０〜１００ｍＭである。
本発明のリフォールディング方法においては、好ましくは、変性タンパク質溶液をリフォールディング緩衝液に滴下した後に、溶液を攪拌する工程が行われる。より好ましくは、この攪拌工程は、１０〜４８時間行われ、なおより好ましくは、この攪拌工程は、１０〜１４時間行われる。この攪拌は、４℃〜室温で行うことができるが、好ましくは、４℃で行われる。
本発明のリフォールディング方法を用いることによって、従来のリフォールディング方法を用いて調製されたタンパク質よりも高純度かつ均質なタンパク質を得ることができる。例えば、本発明のリフォールディング方法を用いることによって、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の純度のタンパク質が得られる。また、本発明のリフォールディング方法を用いることによって得られたタンパク質を質量分析法によって分析した場合、ＭＳスペクトルによるｍ／ｚの幅が、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下の純度のタンパク質を得ることができる。
また、本発明のリフォールディング方法を用いることによって得られたタンパク質を用いて、４．０オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．２オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．０オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、２．８オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、２．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、が得られる。
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
本明細書において使用する場合、「ワクチン」とは、疾患に対する免疫学的予防を提供する薬剤をいう。そのような免疫学的予防は、体液性免疫であっても、細胞性免疫であってもよい。ワクチン組成物は、例えば、疾患に関連した免疫応答を惹起する抗原を含み得る。ワクチン組成物に含まれる抗原としては、タンパク質、ペプチド、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、アミノ酸、糖類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、ワクチンに含まれる好ましい抗原は、タンパク質抗原であり、より好ましくは、本発明の方法によってリフォールディングされたタンパク質である。
本発明のワクチンにおいて治療され得る疾患としては、動脈硬化、癌、および感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の薬学的組成物、その他の薬剤、およびキャリアを含む製品をいう。
本明細書において使用される場合、「被検体」とは、本発明の薬学的組成物が投与される対象であり、ヒト、マウス、ウシ、ニワトリなどの動物が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント。
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
本明細書において「候補化合物」とは、目的とする疾患または障害を処置するために使用され得る化合物の候補をいう。したがって、ある化合物は、目的とする疾患または障害について効果があると予測される場合は、候補化合物と呼ばれ得る。
本明細書において「化合物種」とは、ある化合物の集合において、特定の目的とする活性を有するなど、所望の性質を有する１種の化合物についていう。例えば、ＬＯＸ−１の活性を調節する化合物の集合において、ＬＯＸ−１の活性を調節する化合物が特定される場合、そのような化合物は、化合物種と称され得る。本明細書では、単に化合物とも称される。
本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための化合物などの一定の集合をいう。ライブラリーは、同様の性質を有する化合物の集合であっても、ランダムな化合物の集合であってもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予測される化合物の集合が使用されるが、それに限定されない。
（薬学的組成物）
本発明のリフォールディングされたタンパク質は、動脈硬化の処置、予防、診断または予後のための薬学的組成物の成分としても使用することが可能である。
本明細書において薬剤の「有効量」とは、その薬剤が目的とする薬効が発揮することができる量をいう。本明細書において、そのような有効量のうち、最小の濃度を最小有効量ということがある。そのような最小有効量は、当該分野において周知であり、通常、薬剤の最小有効量は当業者によって決定されているか、または当業者は適宜決定することができる。そのような有効量の決定には、実際の投与のほか、動物モデルなどを用いることも可能である。本発明はまた、このような有効量を決定する際に有用である。
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
本明細書において「指示書」は、本発明の治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、放射線治療直後または直前（例えば、２４時間以内など）に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】  ［実施例１］
（ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質を発現した大腸菌の培養
以下の配列を有するヒトＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ（１４３−２７３）をＮｏｖａｇｅｎ社製ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に組み込んだものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し大量発現を行なった：
ＰＣＰＱＤＷＩＷＨＧＥＮＣＹＬＦＳＳＧＳＦＮＷＥＫＳＱＥＫＣＬＳＬＤＡＫＬＬＫＩＮＳＴＡＤＬＤＦＩＱＱＡＩＳＹＳＳＦＰＦＷＭＧＬＳＲＲＮＰＳＹＰＷＬＷＥＤＧＳＰＬＭＰＨＬＦＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩＱＲＧＡＶＹＡＥＮＣＩＬＡＡＦＳＩＣＱＫＫＡＮＬＲＡＱ（配列番号４）。
ＬＯＸ−１発現ベクターで形質転換を行った大腸菌は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９最小培地８Ｌにて３７℃で培養を行い、６６０ｎｍのＯＤ値が０．５になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えてさらに３７℃で４時間培養を続け、３，５００×ｇで３０分間遠心を行なって菌体を回収した。
（２）ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質の不溶性封入体の回収
回収した菌体を、菌体１ｇあたり５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），４００ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁し、ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉプロテアーゼインヒビター（ロシュ社製、菌体１ｇあたり０．５タブレット使用）を加えて、４℃にてアストラソン社製超音波破砕機を用いて菌体を破砕し、遠心（１０，０００×ｇ，３０分，４℃）にてペレットを回収した。得られたペレットを溶解緩衝液で再懸濁、超音波処理、遠心操作を２回繰り返してよく洗浄し、不溶性封入体として回収し、次の可溶化操作を行なうまで−８０℃で保存した。
（３）ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
不溶性封入体を、３０ｍｇ（ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質量として）を１０ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し（タンパク質終濃度３ｍｇ／ｍｌ）、遠心して沈殿を除去し、室温にて４時間静置した。
その後、ＤＴＴを終濃度  ５０ｍＭになるよう加え、１Ｌのリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）に攪拌しながらＦＰＬＣ送液ポンプを使用して２０−３０μｌ／ｍｉｎの速度で４℃でゆっくり滴下した。滴下終了後、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加え、さらに４℃で１２時間攪拌し、タンパク質のリフォールディングを行なった。
（４）リフォールディングしたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質の回収、精製
リフォールディングしたタンパク質溶液  １Ｌについて、０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、１０Ｌの透析緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に４℃で２４時間透析し、緩衝液を交換してさらに２４時間透析し、変性剤、アルギニン、グルタチオンを除去した。透析した溶液は０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、Ｎｉ−キレーティングセファロースカラム（ファルマシア社製）に通し、タンパク質をカラムに吸着させた。その後カラム平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄し、イミダゾール濃度を５００ｍＭまで直線的勾配で上昇させてタンパク質を溶出させた。溶出させたタンパク質溶液はセントリコン−１０（ミリポア社製）で２ｍｌまで濃縮し、１ｍｇタンパク質あたり１０切断単位の牛スロンビンプロテアーゼを加えて４℃で５時間反応させてヒスチジンタグを切断し、その後ベンザミジンセファロースカラム（ファルマシア社製）に通してスロンビンを除去し、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加えてプロテアーゼ反応を停止させた。タンパク質溶液は次にゲル濾過カラム平衡化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ５０ｍＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、正しい分子量のフラクションを分取した。
［実施例２］
（ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメイン封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質を発現した大腸菌の培養
ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイン（６１−２７３）（配列番号２）をＮｏｖａｇｅｎ社製ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に組み込んだものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し大量発現を行なった。以降の培養に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。
（２）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の不溶性封入体の回収
不溶性封入体の回収に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。
（３）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
可溶化、リフォールディング操作に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。
（４）リフォールディングしたＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の回収、精製
リフォールディングしたＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の回収、精製に関しては、透析緩衝液の組成を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌに、ゲル濾過カラム平衡化緩衝液の組成を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ４００ｍＭに、さらにＮｉ−キレーティングセファロースカラムから溶出させたタンパク質溶液を濃縮する際に終濃度４００ｍＭになるようにＮａＣｌを加えてから行なうことを除いては、ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。
［実施例３］
（ｈＬＯＸ−１のビオチン化細胞外領域封入体、並びにビオチン化ＣＴＬＤ封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ビオチン化ポリペプチドとｈＬＯＸ−１の細胞外領域、もしくはＣＴＬＤとの融合タンパク質発現系の構築
ｈＬＯＸ−１の細胞外領域、もしくはＣＴＬＤをコードするＤＮＡ断片はＰＣＲ法による常法により調製した。それらの両端には、５’側にＮｒｕＩ、３’側にＥｃｏＲＶの制限酵素サイトを付加した。ＰＣＲ産物を抽出後、両制限酵素により処理した後、クローニング用ベクターであるｐＢＳに挿入し、遺伝子配列に誤りがないかＤＮＡシークーエンサーにより確認した。ｈＬＯＸ−１の細胞外領域の塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に、ｈＬＯＸ−１のＣＴＬＤの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号３および４に、それぞれ示す。配列を確認した当該タンパク質をコードした遺伝子を、制限酵素により切り出し、大腸菌内においてビオチン化を受けることが知られているポリペプチドをコードしているプラスミドベクターＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の上記制限酵素サイトに挿入した。次いで、発現宿主である大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した後、正しく目的遺伝子を取り込んだ形質転換体を選抜した。
（２）ビオチン化タンパク質の誘導方法
目的プラスミドにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のコロニーを最終濃度でで１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、並びに２μＭのビオチンを含むＬＢ培地５ｍｌに接種し、３７℃で一晩撹拝しながら培養した。続いて、この培養液を最終濃度で１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、並びに２μＭのビオチンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に１：１００（容量比）の割合で接種し、１時間培養した後、最終濃度で１００μＭになるようにＩＰＴＧを添加し、目的融合タンパク質の発現を誘導し、さらに４時間撹拝しながら培養した。
（３）ビオチン化細胞外領域、ビオチン化ＣＴＬＤの検出と発現状態の確認
上記誘導処理後の培養液１００μｌを１．５ｍｌの遠心チューブに入れ、１５，０００ｒｐｍで数分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理にて破砕後、２０，０００ｇで３０分間遠心して得られた上清（可溶性面分）と沈殿（不溶性面分）をそれぞれＳＤＳサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で４分間処理した。次いで、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにてタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。
転写後のニトロセルロース膜は、ポンソーＳによる染色で、タンパク質バンドの位置を確認した後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中にて室温で穏やかに６０分間攪拌した。次に、ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼ中にて室温で３０分間反応させた。続いて、反応後のニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｅｎにて洗浄した後、アルカリフォスファターゼの基質であるＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を添加し、ビオチン化タンパク質のバンドが検出されるまで室温で反応させた。その結果、不溶性画分には、ビオチン化細胞外領域、およびビオチン化ＣＴＬＤの分子量に相当する位置にビオチン化タンパク質の顕著なバンドが検出された。
（４）ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
不溶性封入体を、３０ｍｇ（ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質量として）を１０ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），６Ｍグアニジン塩酸塩，５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し（タンパク質終濃度３ｍｇ／ｍｌ）、遠心して沈殿を除去し、室温にて４時間静置した。
その後、ＤＴＴを終濃度  ５０ｍＭになるよう加え、１Ｌのリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）に攪拌しながらＦＰＬＣ送液ポンプを使用して２０−３０μｌ／ｍｉｎの速度で４℃でゆっくり滴下した。滴下終了後、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加え、さらに４℃で１２時間攪拌し、タンパク質のリフォールディングを行なった。
（５）リフォールディングしたビオチン化タンパク質の回収、精製
リフォールディングしたタンパク質溶液  １Ｌについて、０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、１０Ｌの透析緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に４℃で２４時間透析し、緩衝液を交換してさらに２４時間透析し、変性剤、アルギニン、グルタチオンを除去した。透析した溶液は０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除いた。タンパク質溶液をセントリコン−１０（ミリポア社製）で２ｍｌまで濃縮した。タンパク質溶液は次にゲル濾過カラム平衡化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ５０ｍＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、正しい分子量のフラクションを分取した。
（参考例１）
本発明と比較検討する対象として、従来法である、環状糖質サイクロアミロースと界面活性剤を用いるリフォールディング方法によってリフォールディングしたタンパク質を、以下のとおり調製した。
（１）ビオチン化細胞外領域、ビオチン化ＣＴＬＤの可溶性タンパク質への再構成
封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の界面活性剤溶液（０．１％ＣＴＡＢもしくはＳＢ３−１４、最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＰＢＳ（−）溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、反応液２４ｍｌを取り出し、３％ＣＡ溶液６ｍｌを加えさらに１時間室温で反応させた。
この溶液を２０，０００ｇで１０分間遠心し、得られた上清（可溶性画分）をリフォールディング溶液とした。リフォールディングされたタンパク質の存在を確認したところ、８０％以上が可溶性面分に回収されていることが確認され、効率的にリフォールディングされていることが示された。
リフォールドされたビオチン化細胞外領域、ビオチン化ＣＴＬＤをストレプトアビジンビーズ上に固定化し、リガンドの一つであるアセチル化ＬＤＬを蛍光標識したＤｉＩＡｃＬＤＬの結合を確認したところ、リフォールディングしたビオチン化細胞外領域、もしくはビオチン化ＣＴＬＤ領域を固定化したビーズ上に蛍光が観察され、どちらもリガンド結合能を回復していることが示された。
［実施例４］
（リフォールディングしたタンパク質のゲルろ過による純度検定）
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに同じ緩衝液に溶解したＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。
本発明のリフォールディング方法を用い実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質から、実施例１（４）に記載した手順でタグを取り除いたタンパク質の純度をゲルろ過によって確認したところ、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法によって調製したタンパク質よりも分子量の幅が狭かった。この結果は、本発明のリフォールディング方法が従来法よりも高い純度のタンパク質を調製する方法であることを示している（図１）。
ゲルろ過による純度検定の結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥでの純度検定の結果（データ示さず）を考慮すると、本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質の純度が約９９％以上であることを示す。
（２）質量分析法による純度検定
上記（１）と同様に、ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質からタグを取り除いたタンパク質を、０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解し、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を添加して混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。
リフォールディングしたＬＯＸ−１のＣＴＬＤの質量分析によるタンパク質純度の検定結果。本発明のリフォールディング方法によって得た、タグを除去したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質は、約５０のｍ／ｚ比（質量／荷電）という狭い幅の質量分析スペクトルを与えた。この狭い幅の結果は、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法よりも夾雑物が少なく高純度に精製されていることを示す（図２）。
（３）ＮＭＲ分析法による純度検定
実施例１で得られたタンパク質からタグを除去し、０．１ｍＭの濃度になるように２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌに可溶化し、６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器により１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）２次元相関スペクトルの測定を、２５℃で行った。
本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ２次元相関スペクトル上にてタンパク質の主鎖に由来する１Ｈシグナルが７ｐｐｍから１１ｐｐｍの広い範囲に分布しているのに対し、シクロアミロースを利用してリフォールディングしたタンパク質では、７ｐｐｍ〜８．５ｐｐｍの狭い範囲で、お互いのシグナルが重なるように分布しており、かつ個々のシグナルの線幅が適正にリフォールディングされたタンパク質よりも広かった。
主鎖１Ｈシグナル分布の以上の結果から、本発明のリフォールディング方法でリフォールディングしたタンパク質は、適切なタンパク質構造を形成していることが理解できる。これに対して、従来法（シクロアミロース法）を用いたリフォールディングでは、不完全にリフォールディングされた構造を有するタンパク質が混入していることが理解できる。
［実施例５］
（リフォールディングしたタンパク質の結晶化）
タンパク質を結晶化するためには、非常に高純度のタンパク質を調製する必要があることは周知である。本発明のリフォールディング方法を用いて調製されたタンパク質が、結晶化が可能な程度の純度を有することを、実証した。
試料としてＣＴＬＤを用いた。ＣＴＬＤの結晶化は、１μＬの８ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＤ溶液（タンパク質を溶解する緩衝液として、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸亜鉛を用いた）に対して、１μＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜４．０）を添加し、この溶液を０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜４．０）に対して、２〜４日間蒸気拡散することによって、得られた。
得られた結晶は、ａ＝６．２ｎｍ、ｂ＝６．９ｎｍ、およびｃ＝７．９ｎｍの単位格子定数を有する、Ｐ２１２１２１斜方晶形であった。また、この結晶から、約２．５オングストロームの分解能を持つＸ線回折像が得られた（図４）。
以上の結果が示すように、本発明のリフォールディング方法で得られたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは結晶化が可能な程度の高純度であった。
［実施例６］
（リフォールディングしたタンパク質の機能測定）
本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングした、ヒスチジンタグ化タンパク質およびビオチンタグ化タンパク質の各々について、リガンド結合能を確認した。
（１）リフォールディングしたヒスチジンタグ化タンパク質のリガンド結合能の確認
リフォールディングに成功したヒスチジンタグ化細胞外領域、もしくはヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを変性ＬＤＬなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へ各ヒスチジンタグ化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を検討した。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅを使用した。
（１．１）実施例１で調製した、リフォールディングしたヒスチジン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化した。具体的には、ＮＴＡセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）表面を、０．３５Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄後、５００μＭ  ＮｉＣｌ２をインジェクトして、センサーチップ上にタンパク質を固定化した。このチップ上に、実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを固定化した。なお、固定化量は、１０００ＲＵ以下になるように、インジェクトするタンパク質量を調整した。
（１．２）変性ＬＤＬとして、アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを以下のように調製した。
酸化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬおよび硫酸銅の濃度がそれぞれ３ｍｇ／ｍＬおよび７５μＭとなる様に調製した溶液をＣＯ２インキュベーター内で２０時間インキュベートした。ついでＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液にて透析し、酸化ＬＤＬを得た。
アセチル化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬに対して最終濃度が５０％になるように酢酸ナトリウム溶液を加え、０℃に冷却した。このとき全量を１ｍＬにした。氷上で攪拌しながら無水酢酸１μＬを１０分間隔で５回加えさらに３０分間冷却攪拌を続け反応を完結させた。
（１．３）受容体チップに対する各種ＬＤＬの結合を、以下のとおりに検出した。流速２０μＬ／分で、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬ）を２分間インジェクトして、センサーグラムの変化を記録した。表面プラズモン共鳴の原理を利用した機器の場合、リガンドの結合をレゾナンスユニット：ＲＵの増加を示すセンサーグラムの変化として検出することになる。その後、１Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を３０秒間インジェクトし、結合したＬＤＬを剥離することによって、センサーチップを再生した。このサイクルを５回繰り返し、センサーチップのベースラインおよびセンサーグラムの応答レベルが再現性よく安定していることを確認したうえで、センサーグラムの変化から、結合定数および結合量を算出した。
その結果、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングされたヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して、天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが確認された（図５）。なお、リフォールディングされたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは、ＬＤＬに対して、変性ＬＤＬの場合よりも２桁低い結合能を示した（データ示さず）。
（２）リフォールディングしたビオチンタグ化タンパク質のリガンド結合能の確認
リフォールディングに成功したビオチンタグ化細胞外領域、もしくはビオチンタグ化ＣＴＬＤを変性ＬＤＬなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチンタグ化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を検討した。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅを使用した。
（２．１）実施例３で調製した、リフォールディングしたビオチン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化した。具体的には、センサーチップＳＡ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）表面を、固定化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化した後、固定化緩衝液中に調製した７０μｇ／ｍＬのビオチン化ＬＯＸ−１タンパク質を、１０μＬ／分でインジェクトした。５０μＬのビオチン化ＬＯＸ−１をインジェクトした時点で、約３０００ＲＵを与える量のタンパク質が固定化されたことを確認して、タンパク質の固定化を終了した。その後、固定化緩衝液を２０μＬ／分で流して、チップに結合しなかったタンパク質を洗浄して取り除いた。６００分間の洗浄を行っても、ＲＵ値の低下は、５％以下であった。このセンサーチップを用いて、上記（１．２）および（１．３）と同様にして、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬの結合について試験した。
その結果、ビオチン化ＣＴＬＤの場合も、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して、天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが確認された。
［実施例７］
（リフォールディングしたタンパク質は二量体を形成する）
天然のＬＯＸ−１タンパク質は、二量体を形成する。そこで、本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングしたＬＯＸ−１が二量体を形成するか否かについて、ゲルろ過、ＰＡＧＥ，および質量分析を用いて確認した。この実施例では、実施例２の方法に従って得た細胞外ドメイン全長（６１−２７３）にヒスチジンタグを付けて発現した後リフォールディングを行い、その後に、ヒスチジンタグを除いたタンパク質を使用した。
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより、分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに、平衡化に使用した緩衝液と同一の緩衝液に溶解した、実施例２で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。
（２）質量分析による純度検定
０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解した実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインに、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。
（３）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明のリフォールディング方法によって得られたＬＯＸ−１タンパク質に２０％  β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））を加え、１００℃で５分間煮沸した試料を、還元状態の試料とした。一方、上記の試料緩衝液からβ−メルカプトエタノールを除いた試料緩衝液を加えて、３０分間室温において反応させた試料を、非還元状態の試料とした。各々の試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて染色した。
（化学架橋実験）
リフォールディング方法によって得られたＬＯＸ−１タンパク質溶液（３００μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、化学架橋剤ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を、０．２、０．４、０．８、１．６、３．２ｍＭとなるように添加し、室温で３０分間架橋反応を行った。反応後すぐに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、２０％  β−メルカプトエタノール）を添加して、１００℃で５分間過熱し、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色して、添加した化学架橋の量に依存して増加する２量体タンパク質の変化量を観測した。
（二量体実験のまとめ）
以上の実験の結果、ＬＯＸ−１の細胞外ドメイン全長を本発明のリフォールディング方法でリフォールディングした結果得られたタンパク質が、細胞表層にあるＬＯＸ−１の存在様式と同様に２量体であることが示された（図６）。
［実施例８］
（蛍光サンドイッチ法による変性ＬＤＬの検出）
実施例３で調製したビオチン化タグをＮ末端に付けたＬＯＸ−１を、ストレプトアビジンでコートされたマイクロプレート（バイオコート（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｃｅ社）上に、ビオチンを介して固定化する。不要な血液凝固を避けるためにヘパリンを含んだ試験管に採血を行って（ヘパリン採血）得られたヒト血漿から遠心分離によって得られたＬＤＬ分画を分注して、４℃で１時間放置する。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５  ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して、ストレプトアビジン化された量子ドット（登録商標）（Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、住商バイオサイエンス株式会社）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間放置後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０  ＴＢＳで３回洗浄する。その後、ウェルからの５２５ｎｍの蛍光を観測して、蛍光強度に基づいて、血液中に存在する結合したＬＤＬの量を算出する。
［実施例９］
（蛍光磁器トラップ法による変性ＬＤＬの検出）
実施例３で調製したビオチン化タグをＮ末端に付けたＬＯＸ−１を、ストレプトアビジンでコートされた磁器ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン、株式会社ベリタス）上に結合させる。ヘパリン採血で得られたヒト血漿から遠心分離によって得られたＬＤＬ分画を１００μＬに対して、磁器ビーズと結合したＬＯＸ−１タンパク質を１０μＬ添加して、１時間４℃で放置する。磁器ビーズを磁石で固定化し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．５  ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して、ストレプトアビジン化された量子ドット（登録商標）（Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、住商バイオサイエンス株式会社）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間放置後、再度０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０  ＴＢＳで３回洗浄する。洗浄後の磁器ビーズからの５２５ｎｍの蛍光を観測して、蛍光強度に基づいて、血液中に存在する結合したＬＤＬの量を算出する。
［実施例１０］
（表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によるＬＯＸ−１蛋白質のリガンド結合アッセイ）
ＬＯＸ−１のリガンドであるアセチル化ＬＤＬをＬＤＬ抗体でＳＰＲチップ上に固定化し、そこにＬＯＸ−１タンパク質を流し、それにより生じるＳＰＲシグナルを観測することでＬＯＸ−１のアセチル化ＬＤＬに対する結合活性を調べた。ＳＰＲ測定装置にはＢｉａｃｏｒｅ社製Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システムを用いた。
ヤギ抗ＡｐｏＢ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＢｉａｃｏｒｅ社製ＣＭ３チップにアミンカップリング法を用いて固定化し、そこにアセチル化ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社）を添加して抗体に結合させた。ＣＭ３チップへのアセチル化ＬＤＬの結合量は３，０００  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｕｎｉｔ程度になるよう添加量を調節した。その後、測定用緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）でチップを平衡化し、同じ緩衝液に懸濁したＬＯＸ−１細胞外ドメインおよびＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ（蛋白質濃度は１０ｎＭ〜２０μＭ）を流速２０μｌ／ｍｉｎで加え、ＳＰＲシグナルを観測した。得られたデータを基にＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ社）を用いて反応速度定数を算出した。
センサーグラムの結果と、算出されたＫａおよびＫｄの値を図７に記載する。
ＬＯＸ−１細胞外ドメインのアセチル化ＬＤＬに対する結合定数は、天然のＬＯＸ−１の場合とほぼ同程度であることから、本発明のリフォールディング方法によってリフォールディング方法されたタンパク質は、天然のタンパク質と実質的に同一の構造を有すると考えられる。
ＣＴＬＤをセンサー上に固定化した場合、ＣＴＬＤとアセチル化ＬＤＬとの結合が観察された。この結合能は、ＬＯＸ−１とアセチル化ＬＤＬとの結合の場合と同程度であった。逆に、アセチル化ＬＤＬを固定化した場合には、ＣＴＬＤとアセチル化ＬＤＬとの結合が観察されなかった。この結果から、以下のことが理解できる。
ＬＯＸ−１細胞外ドメインは溶液中では、ＳＳ結合で結ばれた二量体構造をとるが、ＣＴＬＤ単独では溶液中で単量体として存在している。
従って、ＬＯＸ−１のＣＴＬＤをセンサー上に固定化した場合に、ＣＴＬＤとアセチル化ＬＤＬとの結合が観察されたのは、センサー上でＣＴＬＤが周密化することにより、ＣＴＬＤが、ＬＯＸ−１細胞外ドメインと同様に二量体を形成したことが理由であると考えられる。これに対して、溶液中ではＣＴＬＤは単量体として存在するため、アセチル化ＬＤＬに結合しなかったものと考えられる。従って、これらの結果から、アセチル化ＬＤＬへの結合にはＣＴＬＤが二量体化することが必須であるといえる。
細胞外領域全長はＳＳ結合により安定なホモ二量体を形成しており、アセチル化ＬＤＬに対する結合活性を示すが、その結合活性は、細胞上に存在するＬＯＸ−１よりも低い。一方、既に説明したように、ＣＴＬＤのアセチル化ＬＤＬへの結合には、ＣＴＬＤの二量体化が必須であるが、その結合活性は、ただ単にＣＴＬＤが二量体化するだけでは十分ではなく、ただ単に二量体化したＣＴＬＤの結合能は、細胞上に存在するＬＯＸ−１の結合能に比べて、４桁程度低い。これらのことから細胞上ではＬＯＸ−１細胞外ドメインどうしがさらに会合して共同的にアセチル化ＬＤＬに結合するものと考えられる。実際に細胞上でＬＯＸ−１は最低４分子からなる（二量体×２）会合体を形成していることがわかっている。
従って、これらの実験結果から、血液中の酸化ＬＤＬ含量測定、酸化ＬＤＬの血液からの除去、ワクチン利用などの応答を想定した場合、単量体としてのＣＴＬＤは、アセチル化ＬＤＬに対する結合能を有さないため、使用することができないこと、および、今回のリフォールディングで得られる二量体構造が最低の単位として必要であることが示される。
しかしながら、溶液中では単量体であるＣＴＬＤであっても、または、細胞上に存在するＬＯＸ−１よりも低い結合能を示すＬＯＸ−１の細胞外領域全長であっても、ＳＰＲセンサーのような基盤に周密化状態で固定化することによって、天然のＬＯＸ−１と同等の結合能を示す。
【発明の効果】
本発明のリフォールディング方法によって、高純度かつ均質なリフォールディングタンパク質を得ることが可能となった。また、本発明のリフォールディング方法によって得られたタンパク質を用いることによって、高感度の受容体チップの作製が可能となる。また、本発明のリフォールディング方法によって得られたタンパク質を用いることによって、非特異的結合を従来よりも低減したリガンド除去材料を提供することが可能となる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【配列表】
2005033307.tif 000002
2005033307.tif 000003
2005033307.tif 000004
2005033307.tif 000005
2005033307.tif 000006
2005033307.tif 000007
2005033307.tif 000008
2005033307.tif 000009
2005033307.tif 000010
2005033307.tif 000011
2005033307.tif 000012
2005033307.tif 000013
【図１】
2005033307.tif 000014
【図２】
2005033307.tif 000015
【図３】
2005033307.tif 000016
【図４】
2005033307.tif 000017
【図５】
2005033307.tif 000018
【図６】
2005033307.tif 000019
【図７】
2005033307.tif 000020
【国際調査報告】
2005033307.tif 000021
2005033307.tif 000022
2005033307.tif 000023
2005033307.tif 000024