(57)【要約】神経芽細胞腫の予後診断のためのマイクロアレイであって、予後良好な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号１〜９６の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる９６種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後良好プローブと、予後不良な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号９７〜２００の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる１０４種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後不良プローブ、とを有するマイクロアレイ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
予後良好な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号１〜９６の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる９６種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後良好プローブと、予後不良な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号９７〜２００の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる１０４種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後不良プローブ、とを有するマイクロアレイ。
【請求項２】
請求項１のマイクロアレイを用いて神経芽細胞腫の予後を診断する方法であって、
（ａ）神経芽細胞腫と診断された患者の腫瘍細胞から得た遺伝子転写産物を標識化する工程；
（ｂ）請求項１のマイクロアレイに標識化した遺伝子転写産物を接触させる工程；
（ｃ）マイクロアレイの２５〜４５種以下の予後良好プローブと、２５〜４５種の予後不良プローブにそれぞれハイブリダイズした遺伝子転写産物の標識シグナルを測定する工程；
を含み、
予後良好プローブの２５種以上に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後は良好であると判定し、予後不良プローブの２５種以上に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後が不良であると判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、神経芽細胞腫の予後診断のためのマイクロアレイに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、神経芽細胞腫患者の治療後の予後が良好であるか不良であるかを分子生物学的に診断するためのマイクロアレイと、このマイクロアレイを用いた神経芽細胞腫予後診断方法に関するものである。
【背景技術】  神経芽細胞腫（Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）は小児において最も一般的な充実性腫瘍の一つであり、神経冠の交感神経副腎系列に由来する（Ｂｏｌａｄｅ，１９７４：非特許文献１）。その臨床的行動は不均一であり、乳児の腫瘍はしばしば分化誘導および／またはプログラムされた細胞死により自発的に退行するが、１歳を過ぎた患者において発生した腫瘍は、攻撃的であり、集中的な治療に対し抵抗性を獲得する場合が多い。最近の、進行した段階の神経芽細胞腫に対する治療戦略の進歩は生存率を改善してきたが、長期的にみた結果は依然として非常に不良である。さらに、中間型の群（３または４期、およびＭＹＣＮ遺伝子のシングルコピーを有している）に分類される腫瘍のいくつかは、初期治療に対する完全な応答の後にしばしば再発する。腫瘍間の最終的な予後におけるこのような差異は、遺伝的および生物学的異常における差異によるもので、それが腫瘍における遺伝子およびタンパク質の発現プロファイルに反映されるかもしれないことが考えられる。
予後予測は、神経芽細胞腫の治療開始のための最も切迫した要求の一つである。患者の年齢（１歳より上か下か）は、神経芽細胞腫の自然発達から予測されるように、良好群と不良群群に分類するための重要な因子である（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ  １９７１：非特許文献２）。病期もまた予後の強力な指標である（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９３：非特許文献３）。さらに、基礎研究における最近の進歩は、臨床で役立つ数個を越える分子マーカーを発見してきた。それらはＭＹＣＮ発癌遺伝子の増幅（Ｓｃｈｗａｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３：非特許文献４；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４：非特許文献５）、ＤＮＡの倍数性（Ｌｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，１９９１：非特許文献６，７）、染色体１ｐの欠失（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８：非特許文献８）、およびＴｒｋＡ発現（Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，１９９３：非特許文献９、１０）などであり、そのいくつかはすでに臨床での治療戦略を選択するための予後の指標として用いられている。他の指標は、テロメラーゼ（Ｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５：非特許文献１１）、ＣＤ４４（Ｆａｖｒｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３非特許文献１２）、プレオトロフィン（Ｎａｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５：非特許文献１３）、Ｎ−カドヘリン（Ｓｈｉｍｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：非特許文献１４）、ＣＤＣ  １０（Ｎａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００：非特許文献１５）、およびＦｙｎ（Ｂｅｒｗａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２：非特許文献１６）などである。しかしながら、それらの組合せでも、患者の予後を予測できないことがよくある。したがって、ポストゲノム時代の新規な診断用具が利用できるようになることが期待されてきた。最近、ＤＮＡマイクロアレイ法が、原発性の神経芽細胞腫ならびに細胞系の発現プロファイルを広く説明するべく適用されている。良好および不良のサブセットの間で異なって発現されるいくつかの遺伝子（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２：非特許文献１７；Ｂｅｒｗａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２：非特許文献１６）、またはレチノイン酸誘導性のニューロン分化の間に変化した遺伝子（Ｕｅｄａ，２００１：非特許文献１８）がすでに同定されている。しかしながら、多数の神経芽細胞腫サンプルを用いたマイクロアレイによる予後予測のための研究はまだ報告されていない。
この出願の発明者らは最近、一部は以前に報告されているが、原発性の神経芽細胞腫から生じたｃＤＮＡライブラリーから５，５００個の独立した遺伝子を単離した（Ｏｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ，２００３ｂ：非特許文献１９、２０）。また、これらの遺伝子群の全容について、あるいは神経芽細胞腫の予後良不良の関係について特許出願している（特許文献１−５）
特許文献
１：ＪＰ２００１−２４５６７１Ａ
２：ＪＰ２００１−３２１１７５Ａ
３：国際公開ＰＣＴ／ＪＰ０１６３１号パンフレット
４：国際公開ＰＣＴ／ＪＰ０１６２９号パンフレット
５：ＪＰ２００４−１４７５６３Ａ
非特許文献
１：Ｂｏｌａｎｄｅ，Ｒ．Ｐ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ５，４０９−４２９（１９７４）．
２：Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ２７，３７４−８（１９７１）．
３：Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１，１４６６−７７（１９９３）．
４：Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５，２４５−８（１９８３）．
５：Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｅｅ  ２２４，１１２１−４（１９８４）．
６：Ｌｏｏｋ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１１，２３１−５（１９８４）．
７：Ｌｏｏｋ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９，５８１−９１（１９９１）．
８：Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２７１，３−１５（１９８８）．
９：Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２，１３６４−８（１９９２）．
１０：Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２８，８４７−５４（１９９３）．
１１：Ｈｉｙａｍａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １，２４９−５５（１９９５）．
１２：Ｆａｖｒｏｔ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２９（１９９３）．
１３：Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５，１７９２−７（１９９５）．
１４：Ｓｈｉｍｏｎｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０，９１７−２３（２０００）．
１５：Ｎａｇａｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ  ９２，２６７−７５（２０００）．
１６：Ｂｅｒｗａｎｇｅｒ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２，３７７−８６（２００２）．
１７：Ｙａｍａｎａｋａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２１，８０３−７（２００２）．
１８：Ｕｅｄａ，Ｋ．Ｋｕｒｕｍｅ  Ｍｅｄ  Ｊ  ４８，１５９−６４（２００１）．
１９：Ｏｈｉｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２，５５２６−３６（２００３ａ）．
２０：Ｏｈｉｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １９７，６３−８（２００３ｂ）．
【発明の開示】
神経芽細胞腫の治療後の予後が良好であるか不良であるかを正確に予測することは、患者に対するより良い治療方法を選択する上で極めて重要である。これまでに、そのような予測を可能とする幾つかの分子マーカーが特定されてきている。しかしながら、それらをの分子マーカーを単体で、あるいは組み合わせて用いた場合であっても、神経芽細胞腫の診断予測は必ずしも正確なものではなかった。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、神経芽腫の正確かつ簡便な予後診断を可能とする新しい手段を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決するものとして以下の発明を提供する。
第１の発明は、予後良好な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号１〜９６の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる９６種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後良好プローブと、予後不良な神経芽細胞腫患者において発現亢進する遺伝子転写産物とハイブリダイズし、配列番号９７〜２００の塩基配列またはその一部連続配列もしくはそれらの相補鎖からなる１０４種のポリヌクレオチドから選択される２５〜４５種の予後不良プローブ、とを有するマイクロアレイである。
第２の発明は、請求項１のマイクロアレイを用いて神経芽細胞腫の予後を診断する方法であって、
（ａ）神経芽細胞腫と診断された患者の腫瘍細胞から得た遺伝子転写産物を標識化する工程；
（ｂ）請求項１のマイクロアレイに標識化した遺伝子転写産物を接触させる工程；
（ｃ）マイクロアレイの２５〜４５種以下の予後良好プローブと、２５〜４５種の予後不良プローブにそれぞれハイブリダイズした遺伝子転写産物の標識シグナルを測定する工程；
を含み、
予後良好プローブの２５種以上に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後は良好であると判定し、予後不良プローブの２５種以上に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後が不良であると判定する方法。
すなわち、この出願の発明者らは、神経芽細胞腫に固有の５，３４０遺伝子（非特許文献１９、２０、特許文献１）の発現が解析可能なマイクロアレイを用い、１３６人の神経芽細胞腫患者から単離したｍＲＮＡを対象として、前記５，３４０遺伝子の発現を分析した。発明者らはまた、カーネルベース確率論的分類モデルを構築し、その確率的出力が予後予測のための神経芽細胞腫の分子サインを定義することを見出すとともに、特定遺伝子を対象とする発現レベルの解析が、既知分子マーカーを対象とした従来方法よりも予後予測の点において優れていることを見出して、この発明を完成させた。
具体的には、この発明は、表１に示した２００遺伝子を対象として神経芽細胞腫の予後良好と予後不良を診断する。なお表１において、第１列のＮｏ．１〜２００は配列表の配列番号１〜２００に対応し、Ｎｏ．２０１〜２１２はコントロール配列および水での測定値（第６〜９列の数値。詳細は後述する。）を示す。また配列番号１４０は、１〜９７７塩基配列までが遺伝子名Ｎｂｌａ１２１５１の５’側配列、９８３〜１８６９塩基配列までが３’側配列である。
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なお、この発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が複数個、好ましくは３０個以上結合した分子を言いう。「遺伝子転写産物」とは、ゲノム遺伝子から転写されたｍＲＮＡまたはこのｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを言う。
また「予後の診断」とは、神経芽細胞腫の患者の術後状態が良好であるか不良であるかを予測することを意味する。さらに具体的には、「予後良好」とは、神経芽細胞腫が限局して存在するか、または退縮や良性の交感神経節細胞腫になった状態を指し、例えば、手術後５年以上再発なく生存する場合である。また「予後不良」とは、神経芽細胞腫の進行が認められる状態を指し、例えば、手術後３年以内に死亡する危険性のある状態である。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１  ｔｏ  ４，（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｂ）＆  １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｅ）＆  １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，Ｐａｒｔ  Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、機械学習および交差検定の概略説明図である。初めに１３６例の患者のサンプルが用意された。それらはすべてカプランマイヤー分析に使用された。続く教師付き分類分析では、診断後２４カ月でのその予後がわかっている１１６のサンプルが用いられた。１１６のサンプルは、交差検定のための８７サンプルと、最終テストのための２９サンプルに分けられた。交差検定分析においては、無作為に選んだ９サンプルの結果を、残りの７８サンプルから構築された分類モデルによって予測し、９サンプルのセットを変えることにより、このプロセスを１００回繰り返した。ガウスシアンカーネルのスケールパラメータおよび遺伝子数は、平均予測エラー（検証エラー）を最小にするべく決定された。これらのパラメータ値を用いた分類モデルは、最終テストとして２９サンプルにより査定された。１１６サンプルはまた、リーブワンアウト（ＬＯＯ）分析により再度査定された。
図２は、様々な数の遺伝子ＮについてのガウシアンカーネルＧＰ分類モデルによる識別精度（Ｆ値）を示す。異なるラインタイプは異なるパラメーター値（ガウシアンカーネルに用いられたスケールパラメータ）を示す。青色の円は、スケール＝０．０２（Ｎ＝７０）における最高の精度を示す。
図３は、８７の学習データサンプルについての、２４ヵ月後の予後不良の事後確率、ガウシアンカーネルＧＰ分類モデルによる出力。左パネル：神経芽細胞腫サンプル。右パネル：スケール０．０２およびＮ＝７０のガウシアンカーネルを用いたＧＰ分類モデルによる予測。緑色の円は答えを示す；もしそれが最も右（最も左）の位置にあれば、そのサンプルについての答えは「死亡」（「生存」）である。「＋」印は、サンプルが、１００回の交差検定のトライアルの中にセットされた一つの検定データに属する場合に、ＧＰ分類モデルにより予測される事後値を示しており、赤色の円またはクロスは、かかる検定のトライアル全体の平均を示す。赤色の線は答えと平均（赤色の円またはクロス）との間の差異であり；長いほど分類モデルの予測は不良である。
図４は、２４カ月後の予後不良の事後確率、ガウシアンカーネルＧＰ分類モデルによる出力。２９の新たなサンプルがテストに用いられ、２４カ月の予後が不明の付加的な２０サンプルも示されている。他の情報は図３と同一。
図５は、事後値に基づき階層化された患者の無病生存率を示す。事後確率＞０．５（赤）の神経芽細胞腫サンプル、および事後確率＜０．５（青）のものについてのカプランマイヤーの生存曲線。事後確率は、ガウシアンカーネルＧＰ分類モデルを用いたリーブワンアウト分析により得られた。赤色と青色のラインの間のログランクテストのＰ値は１０−５よりずっと小さかった。
図６は、図と同様に事後値に基づき階層化された患者の無病生存率を示す。事故確率＞０．５（赤色）、事後確率＜０．５（青色）、および全体（緑色）の中間型のサブセット（ＩＩＩ型）の神経芽細胞腫サンプルについてのカプランマイヤーの生存曲線。赤色と青色の間のログランクテストのＰ値は、１０−５よりもずっと小さかった。
図７は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。予後マーカーおよびガウシアンカーネルＧＰ分類モデルの性能が、感度および特異度の二次元平面において示されている。感度（横軸）は良好なサンプル中の正しい予測の割合であり、特異度（縦軸）は不良なサンプル中の正しい予測の割合である。右上の角は感度１００％および特異度１００％を表すことから、そこに位置する分類モデルが理想的である。青色のクロス「ｘ」は、予後マーカーにより達成された感度−特異度の点を示す。青色の「○」は、３つの既存のマーカー、「年齢」、「期」、および「ＭＹＣＮ」の組合せによる予測を示す。ＧＰ分類モデルは、その予測を事後確率、実際の値として出力する。その二者択一の予測、良好か不良かは、域値に依存するため、感度−特異度平面での曲線は、域値を変えることによりプロットされることが可能である。かかる曲線は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と呼ばれる。赤紫色の破線はマイクロアレイのデータのみを用いた予測を示し、緑色の破線はマイクロアレイのデータと「期」のマーカーとを用いた予測を示し、また赤色の実践はマイクロアレイのデータと「年齢」、「ＭＹＣＮ」、および「期」のマーカーとを用いた予測を示している。
図８は、予後の予測に選ばれた７０の遺伝子の実験プロファイルを示す。１３６の神経芽細胞腫サンプルと、ガウシアンカーネルに基づき、選ばれた７０遺伝子との教師なしのクラスタリング。青色；Ｉ型腫瘍、緑色；ＩＩ型腫瘍、赤色；ＩＩＩ型腫瘍。各サンプルにおける各遺伝子の発現は、その遺伝子の全１３６サンプルについての平均の、上（赤色）または下（青色）の標準偏差により表されている。
図９は、図８に示した７０遺伝子の発現による、三つの腫瘍群内のサンプルのクラスタリング。
図１０はマイクロアレイの品質および再現性を示す。標準化されたｌｏｇ発現比の平均からの偏差。各遺伝子スポットについて、青色のドット、赤色の円、および一対の緑色のドットは、１３６サンプルのｌｏｇ発現比、サンプル全体の平均値、およびサンプルの標準偏差（上および下）を各々示している。横軸は遺伝子識別子を示し、重複したスポットは同じ識別子をもつ。もし赤色の円が単一の識別子により標識されたスポット内で大きく変わらなければ、その遺伝子のｌｏｇ発現比は高い再現性をもつ。
図１１もマイクロアレイの品質および再現性を示す。スライド内の８対の重複したスポットのスキャッタープロットであり、各ドットは一つのスライド内の同じ遺伝子についての二つのスポットの発現を示している。横および縦軸は、ｌｏｇ２発現比を示す。各対の２乗平均平方根は約０．２である。
図１２もマイクロアレイの品質および再現性を示す。二つの異なるスライドの間の同じスポットについての再現性。横および縦軸は、ｌｏｇ２発現比を示す。各対の間の２乗平均平方根残差は約０．４である。
図１３は、事後確率の変動および人為的に加えられたガウシアンノイズに対する頑健性を示す。各パネルにおいて、縦軸は事後値を示し、横軸はもとの（ノイズなしの）事後値（緑色）の順に整列されたサンプルを示す。各サンプルについて、ｓｔｄ．：０．５、１．０、１．５、および２．０であって、ｓｔｄ／＝１はノイズスケールがもとのｌｏｇ発現比の標準偏差と同じ大きさであることを意味する、４つのタイプのガウシアンノイズを加えることにより、事後確率を２０回計算した。赤色の点は答えを示し、青色の点は２０回の試験における事後確率を示している。事後値ｙは、確率的予後予測を示しており、その二者択一化されたｙ＜０．５またはｙ．＞０．５は、サンプルが各々良好または不良として予測されることを意味し、ｙが０．５付近の場合は、予測は未確認とされる。もとの事後値（緑色）は予後が実際に良好な患者についてはｙ＜０．５であり、予後が実際に不良についてはｙ＞０．５である。ｓｔｄ．＝０．５のノイズが加えられた場合（右上パネル）、各事後値（小さい青色のドット）はもとの事後確率（緑色）から変化する。しかしながら、それはｙ＝０．５のラインを越えることは、特に分類モデルがもともと予測に確信がある場合にはめったになく、そのことは、加えられたノイズに対する推測の頑健性を示している。ノイズがさらに大きくなると、事後値はｙ＝０．５に近づくが、その二者選択性が間違った推測をもたらすことはほとんどない。さらに、ノイズがきわめて大きく、かつ遺伝子発現が所与のサンプルのものとは異なるパターンを示すとき、この教師付き分類モデルは未確認の事後確率を出力する（右下のパネル）。このような性質は、臨床分野において適用されたような場合に予測を確かなものにする。
【発明を実施するための最良の形態】  配列番号１〜９６の各塩基配列からなるポリヌクレオチドは、予後良好な神経芽細胞腫患者において発現亢進する特定の９６遺伝子（表１参照）のｃＤＮＡであり、配列番号９７〜２００のポリヌクレオチドは予後不良な神経芽細胞腫患者において発現亢進する特定の１０４遺伝子（表１参照）のｃＤＮＡである。第１発明のマイクロアレイは、９６種の予後良好遺伝子の２５〜４５種とそれぞれハイブリダイズする予後良好プローブと、１０４種の予後不良遺伝子転写産物の２５〜４５種とそれぞれハイブリダイズする予後不良プローブとを有するマイクロアレイである。すなわち、このマイクロアレイは、合計２００種の予後良好遺伝子転写産物および予後不良遺伝子転写産物のそれぞれにハイブリダイズする５０〜９０、好ましくは６０〜８０、さらに好ましくは６５〜７５種のプローブを有している。なお、後記の実施例の結果からは、表２に示した７０遺伝子（予後良好遺伝子３３種、予後不良遺伝子３７種）が好ましい検査対象として例示されているが、この発明のマイクロアレイは、これらの遺伝子を対象とすることに限定されるものではない。プローブ数とその種類は、例えば第２発明の診断方法によって得られた結果（後記の実施例参照）と、その後の患者の追跡調査との結果等から、より好ましい対象遺伝子を随時に取捨選択することによって決定されることは、当業者であれば容易に想到し得る事項である。
第１発明のマイクロアレイにおけるプローブは、例えば、予後良好遺伝子および予後不良遺伝子のそれぞれのＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がターゲットとなる場合には、配列番号１〜９６および配列番号９７〜２００のそれぞれのｃＤＮＡまたはそれらの一部連続配列（例えば１５〜５０ｂｐ程度）がプローブとなる。また、予後良好遺伝子ｃＤＮＡおよび予後不良遺伝子ｃＤＮＡを検出ターゲットとする場合には、それぞれのｃＤＮＡの相補鎖ポリヌクレオチドがプローブとなる。
遺伝子ｍＲＮＡをターゲットとするｃＤＮＡプローブは、例えば、ヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として公知の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１６７−１７０，１９８２；Ｊ．Ｇｅｎｅ  ２５，２６３−２６９，１９８３；Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０，１９９４）により調製した全長ｃＤＮＡを用いることができる。あるいは、配列番号１〜２００の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法を用いて合成することもできる。または、ＤＮＡオリゴ合成機によって部分配列を合成し、それを酵素的手法およびサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせる事によっても目的の全長ｃＤＮＡを合成することもできる。さらに、ｃＤＮＡの一部連続配列からなるポリヌクレオチドをプローブとする場合には、得られた全長ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断する方法、あるいはＤＮＡオリゴ合成機や周知の化学合成技術（例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号）によって目的の短鎖ｃＤＮＡを調製することもできる。
一方、遺伝子ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡをターゲットとする場合のプローブは、各ｃＤＮＡの全長または一部連続配列に相補的なポリヌクレオチドであって、これらは前記と同様のＤＮＡオリゴ合成機や周知の化学合成技術によって調製することができる。
第１発明のマイクロアレイは、前記のとおりのプローブを用い、通常のＤＮＡマイクロアレイと同様にして作製することができる。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したプローブを固相基体表面に固定する方法とが知られているが、この発明のマイクロアレイは後者の方法で作製することが好ましい。予め調製したプローブを固相基体表面に固定する場合には、官能基を導入したプローブを合成し、表面処理した固相基体表面にプローブを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。プローブは、一般的には、表面処理した固相基体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこにプローブを共有結合させる方法（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９１３，１９９６）、あるいはポリＬ−リジンを被覆した固相基体にぷローブを結合する方法（ＪＰ  ２００１−１８６８８０Ａ）も知られている。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化プローブを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１１９−１１２３，１９９７）。この発明のマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。また、プローブを固相基体表面に滴下させてスポッティングを行う場合には、ピン方式（例えば米国特許第５，８０７，５２２３号）によって行うこともできるが、ＪＰ２００１−１１６７５０Ａ公報やＪＰ  ２００１−１８６８８１Ａ公報に開示されているインクジェット方式を採用することが、均一で一定形状のスポット形成のために好ましい。また、このインクジェット方式では、個々のプローブスポットに含まれるプローブ数を等しくすることができるため、プローブ長の違いによるハイブリダイゼーションの違いを正確に測定することができる。さらに、ＪＰ  ２００１−１８６８８０Ａ公報に開示されているような、スポッティング重ね打ちを行うこと、あるいはＷＯ  ０３／０３８０８９  Ａ１号パンフレットに開示された組成からなるプローブ溶液（保湿性物質を含む溶液）を使用することも、好ましいスポット形成のために推奨される。
スポッティングの後は、冷却、スポットに対する水分付加（湿度〜８０％程度に一定時間保持）、焼成乾燥による固定化処理等を行うことによって、各スポットを固相基体上に固定するし、マイクロアレイを完成することができる。
なお、マイクロアレイの固相基体は、通常のマイクロアレイに使用されるガラス（スライドガラス）の他、プラスチック、シリコーン、セラミック等を使用することもできる。
第２発明の神経芽細胞腫予後診断は、以上のとりのマイクロアレイを用いて行う。すなわちこの診断方法は、以下のステップ（ａ）〜（ｃ）を含む方法である。
（ａ）神経芽細胞腫と診断された患者の腫瘍細胞から得た遺伝子転写産物を標識化する工程。
（ｂ）請求項１のマイクロアレイに標識化した遺伝子転写産物を接触させる工程。
（ｃ）マイクロアレイの２５〜４５種以下の予後良好プローブと、２５〜４５種の予後不良プローブにそれぞれハイブリダイズした遺伝子転写産物の標識シグナルを測定する工程。
例えば、検出ターゲットとなる遺伝子転写産物がｃＤＮＡの場合には、ステップ（ａ）において、被験者から単離したゲノム遺伝子またはトータルＲＮＡからのＰＣＲ産物としてｃＤＮＡを調製する。このＰＣＲ増幅の際に、標識プライマー（例えばシアニン系有機色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５などを結合したプライマー）を取り込ませて標識化ｃＤＮＡとする。ステップ（ｂ）では、標的化ｃＤＮＡをマイクロアレイに接触させ、マイクロアレイのプローブにハイブリダイズさせる。また検出ターゲットとなる遺伝子転写産物がｍＲＮＡの場合には、被験者の細胞から抽出したトータルＲＮＡを市販の標識化キット（例えば、ＣｙＳｃｒｉｂｅＴＭＲＮＡラベリングキット：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等を用いて標識化する。
ステップ（ｂ）におけるハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注した標識化ｃＤＮＡ水性液をマイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、１〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ポリヌクレオチドを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。そして、ステップ（ｃ）において、プローブにハイブリダイズした標識化遺伝子産物より得られるシグナルを測定する。
この第２方法の診断方法は、以上のとおりにして得られたシグナルから、予後良好プローブの２５種以上（２５〜４５、好ましくは３０〜４０、さらに好ましくは３２〜３８）に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後は良好であると判定し、予後不良プローブの２５種以上（２５〜４５、好ましくは３０〜４０、さらに好ましくは３２〜３８）に有意な標識シグナルが得られた場合に、患者の予後が不良であると判定する。
以下、実施例として、この発明のマイクロアレイや診断方法の対象となる遺伝子を同定した実験結果を示してこの発明を詳しく説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】１．材料および方法
１−１．患者および腫瘍標本
腫瘍標本は、日本の多くの病院から千葉県癌センター研究局生化学部（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ，Ｃｈｉｂａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）へ送られた新鮮凍結組織を用いた。インフォームドコンセントは各研究所および病院において得られた。ほとんどの標本は、手術前の生体組織検査または外科手術により、化学療法または放射線療法なしに切除された。手術後、患者は文献（Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｄ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，１−７（１９９８））に記述された共通のプロトコールにしたがって処置された。ＭＹＣＮ遺伝子のコピー数、ＴｒｋＡ遺伝子発現、およびＤＮＡの倍数性を含めた各腫瘍についての生物学的情報は、発明者らの研究室において分析された。腫瘍はすべて、国際神経芽細胞腫病期分類システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮＳＳ））にしたがって以下のとおりに分類された
１および２期：限局性の神経芽細胞腫
３および４期；局所および局部性の増殖および遠隔転移性神経芽細胞腫
４Ｓ期：１歳齢未満の小児における神経芽細胞腫（転移は皮膚、肝臓、および骨髄に限られ、通常は自然に退行する）（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３：非特許文献３）。
日本では、１９８５年以降、６ヵ月齢の乳児のための集団検診プログラムが行なわれている。このスクリーニングによって発見された患者は、ほとんど病気の初期に分類されたが、予後不良の患者が少数存在した（Ｓａｗａｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ２，２７１−３（１９８４））。分析した１３６例の腫瘍のうち、６８例はこのスクリーニングによって発見された。神経芽細胞腫の診断はすべて外科切除された腫瘍標本についての組織化学的評価により確認した。
凍結組織はグアニジニウムイソチオシアネート中でホモジナイズし、トータルＲＮＡはＡＧＰＣ法を用いて各サンプルから抽出した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．＆  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６２，１５６−９（１９８７））。ＲＮＡの完全性、質および量は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）を用いて、アジレントＲＮＡ６０００ナノチップ上の電気泳動により査定した。
１−２．ｃＤＮＡマイクロアレイ実験
３つの型の神経芽細胞腫のオリゴキャッピングｃＤＮＡライブラリー（良好、不良、４期の神経芽細胞）から単離された〜１０，０００個から、高度に重複した遺伝子を除いた５，３４０個のｃＤＮＡクローンを選択し、神経芽細胞腫に特異的なｃＤＮＡマイクロアレイ（ＣＣＣ−ＮＢ５０００−Ｃｈｉｐ  ｖｅｒ．１と命名）を作成した。すなわち、ｃＤＮＡクローンからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりインサートＤＮＡ（遺伝子ｃＤＮＡ部分）を増幅し、エタノール沈殿により精製し、インクジェットプリント装置（ＮＧＫ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ，Ｌｔｄ．社製）により、スライドガラス上に高密度式にスポットした。神経芽細胞腫の予後の指標のための候補として公知の付加的な８０個のｃＤＮＡも、アレイ上にスポットした。
１０μｇの各々のトータルＲＮＡは、ＣｙＳｃｒｉｂｅＴＭＲＮＡラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて標識し、続いてＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅＴＭＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。４つの神経芽細胞腫細胞系（ＮＢ６９、ＮＢＬＳ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ）からの等量のＲＮＡの混合物をリファレンスとして用いた。原発性神経芽細胞腫組織から抽出されたＲＮＡと、リファレンス混合物のそれは、各々Ｃｙ３およびＣｙ５色素で標識し、抑制のための酵母ｔＲＮＡおよびポリＡとともにターゲット分子として使用した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、文献（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２，２２０３−９（２００２）；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７５，５３２−７（２０００））記載の方法に従って行った。ハイブリダイゼーション処理後のマイクロアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５０５Ａ共焦点レーザースキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）を用いてスキャンし、蛍光強度をＧｅｎｅＰｉｘＴＭ  Ｐｒｏマイクロアレイ分析ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．社製）により定量した。
１−３．データプロセシング
マイクロアレイシステムのバイアスを除去ために、ＬＯＷＥＳＳノーマライゼーション（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ，Ｊ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ３２，４９６−５０１（２００２））を使用した。一つのクローンについてのＣｙ３またはＣｙ５の強度が３より小さいとき、それは異常に小さいとみなし、対応するクローンのｌｏｇ発現比はミッシングバリュー（欠損値）として処理した。このようなミッシングエントリの割合は１％未満であった。５，３４０（遺伝子）×１３６（サンプル）のｌｏｇ発現マトリックスのノーマライゼーションおよび欠損値の除去の後、各々のミッシングエントリは見積もり値へ入力した（Ｏｂａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００３））。
すなわち、ノーマライゼーションはスライド上の不均一なｃＤＮＡ量、二つの蛍光色素の間の効率の差等の種々のアーチファクトを除去するために必要である。いくつかの報告は、ｌｏｇ  Ｃｙ３−Ｃｙ５比が各々の遺伝子の蛍光強度に有意に依存することを示唆している。このようなシステマティックバイアスを除去するべく、強度依存性バイアスを除去するための局所重み付き最小二乗法（ＬＯＷＥＳＳ）ノーマライゼーション（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ，２００２）を用いた。ノーマライズされた遺伝子ｉのｌｏｇ発現比ｙｉは、
ｙｉ＝ｌｏｇＣｙ３ｉ−ｌｏｇＣｙ５ｉ−ｆ（ｌｏｇＣｙ３ｉ＋ｌｏｇＣｙ５ｉ）
で得られ、Ｃｙ３ｉおよびＣｙ５ｉは、各々遺伝子ｉのＣｙ３およびＣｙ５蛍光強度である。ｆ（ｘ）はノーマライゼーションの関数であり、強度−比率（Ｉ−Ｒ）バイアスを表し、一つのスライド上のすべてのスポットを用いて推定される。この場合、スライドを横切るノーマライゼーションは考えなかった。
５，３４０×１３６のｌｏｇ発現比マトリックスのため、ＬＯＷＥＳＳノーマライゼーションおよび疑わしいｌｏｇ比値の除去の後、各ミッシングエントリーは、発明者らが先に提案し（Ｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）ベイズＰＣＡ補完法（ＢＰＣＡｆｉｌｌ）により推定値へ補完した。発現マトリックスへ人工的に加えられた１％欠測値についてＢＰＣＡｆｉｌｌを査定することにより、ＢＰＣＡｆｉｌｌ予測による平均平方予測誤差は０．２と推定され、それは複製された遺伝子の複製標準偏差０．３と矛盾しない。
１−４．教師付き機械学習および交差検定
新規な患者の予後を予測する教師付き分類モデルをトレーニングするために、２４ヵ月後の予後がチェックされた１１６のサンプルを使用した。分類に関係づけられる遺伝子の選択は、信頼できる予測のための重要なプレプロセスである。したがって、その１１６スライドの標準偏差が０．５より小さかった遺伝子を省いた後、Ｎ個の遺伝子を選んだが、Ｎはペアワイズ相関法に基づき、交差検定法により決定した。
すなわち、もし５，３４０遺伝子のすべてを用いて教師付きの分類モデルを構築するとすれば、新たなサンプルについての予測は信頼できるものではない。このことは、一般に遺伝子数がサンプルのそれよりもずっと大きいマイクロアレイ分析の典型的な問題である。したがって、分類（識別）に関係づけられる遺伝子を選択することは、信頼できる予測にとって重要である。
まず、１１６スライドの標準偏差が０．５より小さい遺伝子を省いた。その後、以下の基準に基づきＮ個の遺伝子を選択したが、その場合Ｎは交差検定法により決定される。統計的パターン認識の分野においては、ｔ統計量、並べ替えｐ値、またはその他に基づく一変数の特徴抽出が用いられてきた。ここでは、一変数の特徴抽出は、遺伝子間の相互関係を無視した即遺伝子的（ｇｅｎｅ−ｗｉｓｅ）な選択に相当する。一方、ペアワイズ法（Ｂｏ，Ｔ，＆  Ｊｏｎａｓｓｅｎ，Ｉ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ３，（２００２））によれば、遺伝子選択においてペアワイズな相互関係が考慮され、したがってより高い識別精度はより少数の遺伝子を用いて得られる。オリジナルな研究（Ｂｏ  ＆  Ｊｏｎａｓｓｅｎ，２００２）ではｔ統計量が用いられたが、以下のペアワイズＦスコアを遺伝子選択に使用した。
単一遺伝子の発現比を用いての、クラス１（ｎ１個のサンプル）およびクラス２（ｎ２個のサンプル）の間の、二者択一的な識別の問題では、識別域値を決定することが必要とされる。ｐ１およびｐ２は、各々クラス１および２におけるサンプルについての識別精度を意味すると仮定する。次いでこの単一遺伝子のＦ値は、ｐ１およびｐ２の調和平均により与えられる：Ｆ＝２ｐ１ｐ２／（ｐ１＋ｐ２）。Ｆ値が識別域値に関して最大化されるとき、それはその遺伝子のＦスコアと呼ばれる。Ｆ値は、アウトライナーが存在する場合および／またはｎ１とｎ２との間に不均衡が存在する場合には特に、ｔ統計量よりもさらに頑健である。単一遺伝子のＦ値と同様に、遺伝子ペアのＦ値を定義する。二つの遺伝子、ｉとｊを用いて、遺伝子ｉとｊの発現比により構成される二次元空間に、リニアディスクリミネータを構築する。二次元空間においてリニアディスクリミネータを最適化することにより、遺伝子ペア（ｉ，ｊ）についてＦ値が得られる。ペアワイズＦ値（ＰＦ）のスコアは、以下の方法により計算される。
１．すべての遺伝子についてＦスコアを計算し、その個々のＦスコアが最大である５００個の遺伝子のプールに選び入れる。非選択遺伝子のＰＦスコアをゼロと仮定する。
２．プール内の５００遺伝子の全ペアについてＦスコアを計算する。
３．Ｆスコアが最も大きいペアをプールから選び、二つの遺伝子のＦスコアをそのペアのＦスコアと同じとする。
４．プール内に遺伝子がなくなるまで段階３を繰り返す。
発明者らは、遺伝子選択におけるＮ個の遺伝子選択に、ＲＦスコアを使用した。
次に、教師付き分類としてＧＰ分類モデルを用いた。１１６サンプルのうち、２９のテストサンプルを選び、それらの予後因子が１１６のサンプルと同様の分布を有するようにした。残りの８７のトレーニングサンプルは、さらに７８の学習サンプルおよび９の確認サンプルに分けた。教師付きＧＰ分類モデルは、学習サンプルによりトレーニングされ、確認サンプルにより査定された。発明者らは、学習およびトレーニングサンプルを変えることにより、このプロセスを１００回繰り返し（図１参照）、平均識別精度を得た。ここで、ペアワイズ相関法に基づく遺伝子選択が、各学習データについて実行された。このアセスメントは種々のマイクロアレイ研究においてしばしば無視されるが、このように、遺伝子選択法もまた査定された。
ＧＰ分類モデル用に、二つのタイプのカーネル関数（多項式カーネルおよびガウシアンカーネル）を用意してそれらを比較した。多項式カーネルは多項式の次数を有しており、ガウシアンカーネルにはスケール（分散）がある。これらのパラメーターに適した値および適切な遺伝子数は、交差検定法により測定された。ガウシアンカーネルは、スケールパラメーター０．０２および７０遺伝子で最良のＦ値を示し、多項式カーネルは、次数１および１６０遺伝子でその最良の０．８３を示した。多項式カーネルＧＰ分類モデルが不良の予測を出力した場合でも、その事後確率はしばしばほぼ０または１となり、すなわち、この分類モデルがかかる不良の予測に高度に確信をもっていたことになる。ガウシアンカーネルＧＰ分類モデルにより予測が不良であった場合は、その予後値はわずかである傾向がある（確信が低い）。ガウシアンカーネルのこの特徴は、低い予後値は予測が他の臨床因子を取り入れる必要があることを示しているため、現実の結果の臨床予測には有利である。さらに、選択された遺伝子数はガウシアンカーネルではより少なく、このことは分類モデルを安定化するかもしれない。
以上のとおり、多項式カーネルおよびガウシアンカーネルを比較するための分析からは、遺伝子数が小さかったこと、アウトカム予測の精度が高かったこと、およびガウシアンカーネルでのノイズに対してより安定であったことから、ガウシアンカーネルの方が好適であった。したがって発明者らは、神経芽細胞腫のアウトカム予測においては、ガウシアンカーネルの方が多項式カーネルよりも好適であると結論し、この発明においては前者を選択した。
１−５．クラスタリング分析および生存分析
教師なしのクラスタリングにもガウシアンカーネル関数を使用した。発明者らは、教師付き分類プロセスを通して得られたガウシアンカーネルに基づき、距離計測を定義した（前記文参照）。各サンプルは、カーネル関数により定義される特徴ベクトルにより表わされ、二つの特徴ベクトル間の距離は、ベクトルのピアソンの相関として測定された。カーネル空間におけるこのクラスタリングは、通常の階層的クラスタリングによるものよりも、さらに頑健なクラスター構造を示すことが可能であった。
患者の生存を比較するため、カプラン−マイヤーの生存分析をも実施した。選ばれた遺伝子発現と、患者の臨床的結果との関連を査定するために、ログランクテストによる統計的ｐ値を算出した。
２．結果
２−１．神経芽細胞腫固有のｃＤＮＡマイクロアレイおよび１３６例の原発性腫瘍における遺伝子発現
発明者らはこれまでに、予後の良好な３例の原発性神経芽細胞腫（１期、高ＴｒｋＡ発現、およびＭＹＣＮのシンングルコピー）、予後の不良な３例の腫瘍（３または４期、低ＴｒｋＡ発現、およびＭＹＣＮ増幅）、および１例の４ｓ期の腫瘍（迅速な退行の直前）から調製したオリゴキャップｃＤＮＡライブラリーの混合物から、５，５００個の遺伝子を得ている（Ｏｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ，２００３ｂ：非特許文献１９、２０）。発明者らは次に、インクジェットスポッティング方式を用いて、一つのスライドグラス上に５，３４０個の遺伝子のスポットを含む神経芽細胞腫固有のｃＤＮＡマイクロアレイを作成した。このｃＤＮＡマイクロアレイは、ピンスポッティングにより生じる、アレイ上の個々のスポットの量的なむらまたは形状変化といった問題を克服していた。１３６例の原発性神経芽細胞腫の凍結組織から抽出された各々１０μｇのトータルＲＮＡはＣｙ３色素により標識した。共通リファレンスとして、シングルコピーのＭＹＣＮをもつ４つの神経芽細胞腫の細胞系（ＮＢ６９，ＮＢＬＳ，ＳＫ−Ｎ−ＡＳ，およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ）から得られたトータルＲＮＡの混合物はＣｙ５色素で標識した。神経芽細胞腫組織バンクより腫瘍サンプルを無作為に選び、１期４１例、２期２１例、３期３４例、４期２８例、および４ｓ期１２例からなる１３６例の腫瘍細胞からの標識化ＲＮＡをハイブリダイズさせた。４ｓ期の神経芽細胞腫は、特異なパターンの臨床的行動を示し、その皮膚、肝臓、および骨髄への広範囲な転移は自然消失する。６８例の腫瘍は、生後６ヵ月での尿中カテコールアミン代謝物の集団検診により発見された。追跡調査の期間は、診断後３〜２３９ヵ月（中央値：３２ヵ月、平均：５０．６カ月）に及んだ（図３参照）。
まず、ＣＤＮＡマイクロアレイの品質を査定した。各遺伝子スポットのｌｏｇＣｙ３／Ｃｙ５蛍光比は、強度依存性のバイアスを除去するべくノーマライズされた。ｃＤＮＡマイクロアレイは２６０個の重複または多重の遺伝子を包含することから、そのような重複遺伝子の発現比は多数のスポットの平均値で表された。欠損値についての推定パフォーマンスおよび重複遺伝子の再現性の分散に基づくと、単一遺伝子のｌｏｇ−比の標準偏差は約０．２〜０．３であったが、それは充分に小さかった（図１０）。１３６の実験における重複遺伝子スポット間のｌｏｇ  Ｃｙ３／Ｃｙ５蛍光比のスキャッタープロット、および反復実験間のそれらもまた、スポッティングおよび実験の再現性を示した（図１１および１２）。これらのことから、作成したｃＤＮＡマイクロアレイ定量性および再現性が極めて良好であることが確認された。
２−２．教師付き分類
腫瘍をもつ新患の予後を予測する統計的手段を開発するべく、教師付き分類を取り入れた。追跡期間の変動は教師付き分類においてノイズを生じるため、予測されるべきターゲットラベルとして診断後２４ヵ月での患者の結果（死または生）を用いた。１３６サンプルのうち２０例の結果は診断後２４ヵ月で不明であったため、残りの１１６サンプルのデータをそれ以降用いた（図１）。バックグラウンドのノイズレベルは約０．３であったことから（上記参照）、まず１１６スライドについての標準偏差が０．５未満の遺伝子を省いた。次いで、以下の基準に基づきＮ個の遺伝子を選んだが、数値Ｎは交差検定法により決定された。遺伝子の選択は、ペアワイズ相関法（Ｂｏ  ＆  Ｊｏｎａｓｓｅｎ，２００２）の変法にしたがって行い、より少数の遺伝子を用いてより高い識別精度を得た（図１３参照）。
教師付き分類にはガウシアンカーネルのガウスプロセス（ＧＰ）分類モデルを用いた。ＧＰ分類モデルは、カーネルベース分類モデルの一つである（ＭａｃＫａｙ．Ｄ．Ｊ．Ｃ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，１３３−１６５（１９９８））。これはサポートベクトルマシン（ＳＶＭ）分類モデルに似ているが、確率モデルに基づいており、アウトプットを解釈する際に利点をもつ。
２−３．テストおよび交差検定
１１６サンプルはあらかじめ、教師付き分類モデルを計算するために使用される８７のトレーニングサンプルと、得られた分類を評価するための２９のテストサンプルに分けられた（図１）。トレーニングフェーズでは、２９のテストサンプルを決して使わなかった。トレーニングサンプルはさらに、学習サンプル（〜９０％）および確認サンプル（〜１０％）に分けられ、遺伝子の選択およびパラメーターの決定は交差検定法により査定された。
ＧＰ分類モデルは各サンプルの事後確率（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）を出力するが、それは患者の予後が不良であることの予測確率を表わす。事後確率が閾値０．５より大きいかどうかに基づいて二者択一（ｂｉｎａｒｙ）の予後予測がおこなわれる場合、精度は正確な予測の割合を表わす。Ｆ値は、良好および不良の神経芽細胞腫サンプルについての精度の調和平均値である（図１３参照）。図２は、様々な遺伝子数ＮについてのガウシアンカーネルＧＰ分類モデルによるＦ値を示している。このようにして遺伝子の最良数は、交差検定法によりＮ＝７０と決定された。
図３は、交差検定によりそのパラメーターが最適に処理された、ＧＰ分類モデルによる８７トレーニングサンプルの事後確率を示している。交差検定により査定されたトレーニングサンプルの精度は８７％（７６／８７）であった。図４は、２９のテストサンプルの予後がＧＰ分類モデルにより予測された時の結果を示している。Ｆ値および精度は、各々０．８０および９３％であった。Ｓ１１３（事後確率：０．３２；４期、２２カ月齢、シングルコピーのＭＹＣＮ、ＴｒｋＡ低発現、診断後１２カ月で死亡）およびＳ０８１（事後確率：０．８６；３期、６ヵ月齢、シングルコピーのＭＹＣＮ、ＴｒｋＡ低発現、診断後６２カ月生存）を除き、すべてのテストサンプルについての予後は正しく予測された（２７／２９，９３％）。
図５は、ＧＰ分類モデルによる事後確率＜０．５（良好）および事後確率＞０．５（不良）の患者についての生存曲線を示す。前者の５年生存率は９０％であるのに対し、後者のそれは２３％である（ｐ＜１０−５）。このシステムをさらに評価するため、通常はその予後が予測されにくい神経芽細胞腫の中間型のサブセット（３または４期、ＭＹＣＮの増幅なし）について、事後値を計算した。図６に示されたように、生存曲線ははっきりと二群にわかれた。事後確率＜０．５の患者の５年生存率は８６％であり、一方事後確率＞０．５の患者のそれは４０％であった（ｐ＜１０−５）。これらの結果は、発明者らの教師付き分類モデルにより得られた事後値が、中間型の神経芽細胞腫のものであっても、神経芽細胞腫の予後を非常に効率よく分類することができることを示している。
１−４．ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ分析法
他の通常のマーカーに比べて、予後の予測に事後値がいかに有用であるかを評価するため、全１１６例の患者の予後予測にｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ交差検定法を導入した。図７は、ＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、受信者動作特性）曲線を示しており、それは個々のＧＰ分類モデルまたは組合せの性能と、他の臨床的ならびに分子的予後因子（年齢、期、ＴｒｋＡ発現、ＭＹＣＮ増幅、ＤＮＡ倍数性、および集団検診により発見された腫瘍）とを、感度（生存するサンプル内の正しい予測の割合）および特異度（死亡したサンプル内の正しい予測の割合）からなる二次元平面において示す。マーカーは、高感度または高特異度のいずれかにおいて予後を予測するのに好適である。これまでの報告とうまく一致して、年齢（１歳未満）、期（１、２、および４ｓ）、高ＴｒｋＡ発現、高２倍性（異数性）、および集団検診により発見された腫瘍は、各々８０％、９７％、９７％、９２％、および９３％という高感度を示したのに対し、その特異度は各々７６％、６９％、６６％、３７％、および５８％であった。一方ＭＹＣＮ増幅は、感度７２％および特異度９７％を示した。通常のマーカーに比較して、ＧＰ分類モデルによる予測は感度（９６％）および特異度（９０％）の間に良好なバランスを示し、ことごとく他のマーカーよりも優れていた。さらに、教師付き分類と三つの典型的な予後マーカー（年齢、期、およびＭＹＣＮ増幅）との組合わせは、感度９２％および特異度９６％をも達成した。
１−５．クラスタリング分析
臨床的に定義された神経芽細胞腫のサブセットと、ペアワイズ相関法に基づきトップスコアとして選ばれた７０個の遺伝子との間の関係を査定するべく、教師なしのクラスタ分析をカーネル空間において行なった（図８、９）。結果のよりよい理解のため、神経芽細胞腫サブセットのボーダーの（Ｂｏｒｄｅｕｒ’ｓ）分類を導入した：Ｉ型（１、２、または４ｓ期、シングルコピーのＭＹＣＮ；図３、４、８および９で青色のマーク）、ＩＩ型（３または４期、シングルコピーのＭＹＣＮ；図図３、４、８および９で緑色のマーク）、およびＩＩＩ型（全期、ＭＹＣＮの増幅；図図３、４、８および９で赤色のマーク）（Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９？）。図８は、ＩＩＩ型腫瘍の多くが、７０個の約半数において高度に発現された遺伝子（遺伝子群ＵＦ、不良な予後と強い相関関係がある遺伝子群）と、残りの半分において低く発現された遺伝子（遺伝子群Ｆ、良好な予後と強い相関関係がある遺伝子群）をもつ群にクラスターされた。一方、Ｉ型腫瘍は、不均質の遺伝子クラスターをもつ幅広い発現パターンを形成した。興味深いことに、ＩＩ型腫瘍は一律にはクラスターされず、ＩおよびＩＩＩの腫瘍の間に分布された。臨床的な視点からさらに理解するため、教師なしのクラスタリングを各々の型に応じて再編成した（図９）。興味深いことに、予後の不良な患者のＩＩ型腫瘍の一部は、ＩＩＩ型のものと類似の発現パターンを示し、彼等の多くは死亡した。一方、ＩＩ型腫瘍の残りの発現プロファイルは、予後結果の良好なＩ型腫瘍のものと同様に不均質であるように思われた。ＴｒｋＡの高度の発現および高倍数性をもつ腫瘍のほとんど、ならびに集団検診の腫瘍は、後者の群に包含された。したがってＩＩ型の中間型の群は、予後の良好および不良の二つの亜群に大まかに分けられた。図８、９のクラスタリングパターンがやや複雑であることもまた、発明者らの予後予測が選ばれた遺伝子の大半による決定に基づくという事実を支持しているのかもしれない。
表２は、７０個のトップスコア遺伝子と、ログランクテストにおけるそれらのｐ値との一覧表を示している。最もスコアの高い遺伝子はｔｕｂｕｌｉｎ  ａｌｐｈａ（ＴＵＢＡ１）であった。上記のクラスタリングに基づき、７０個の遺伝子は二つの群（Ｆ群およびＵＦ群）に分けられた（図図８、９および表２）。Ｆ群の遺伝子はＩ型腫瘍において高い発現レベルを示す傾向があったのに対し、ＵＦ群のものはＩＩＩ型腫瘍において高レベルに発現された。これらの遺伝子の、神経芽細胞腫のサブセット間での差異発現は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりさらに確認された（結果の一部はＯｈｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ：非特許文献１９に報告されている）。Ｆ群の遺伝子は、ニューロンの分化に関係するもの［ｔｕｂｕｌｉｎ  ａｌｐｈａ、ｐｅｒｉｐｅｒｉｎ、ＨＭＰ１９、およびｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ（ＧＡＰ４３）］およびカテコールアミン代謝に関係するもの［ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）およびｄｏｐａ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＤＤＣ）］を含んでいた。一方、ＵＦ群の遺伝子はタンパク質合成に関するもの（リボソームタンパク質遺伝子、伸長因子遺伝子、ＥＥＦ１Ａ、ＧおよびＥ１Ｆ３Ｓ５など）、および代謝に関係するもの［ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ  ｅｎｏｌａｓｅ  １（ＥＮＯ１）およびｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（ＴＫＴ）など］の多くの遺伝子を包含する。ＭＹＣＮ遺伝子もまた、予期されたとおりＵＦ群の一員であった。双方がしばしば同時翻訳されるＭＹＣＮおよびＤＤＸ−１の非常に高い発現レベルは、予後の不良なＩＩＩ型腫瘍に見られた。Ｆ群の３３個の遺伝子のうち２４個、およびＵＦ群の３７個の遺伝子のうち３０個における、ログランクｐ値は０．０５未満であり、有意なｐ値をもつ５４個の遺伝子すべてが原発性神経芽細胞腫の独立した予後因子となり得ることを示している。
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３．考察
この実験的研究は、マイクロアレイ分類モデルが、神経芽細胞腫の予後予測のための予後因子の中で、感度（９６％）と特異度（９０％）の最高のバランスをもつことを証明した。さらに、それが、臨床における診断手段としてすべてが現在使用されている診断時の年齢、病期、およびＭＹＣＮの増幅と関連付けられる時、特異度は９６％まで増大した。さらに、通常は長期間の予後を予測することが困難な、神経芽細胞腫の中間型のサブセット（ＩＩ型）もまた、マイクロアレイにより予後の良好および不良の群に分けられた。
発明者らの知る限りでは、今回と同様の方法で癌の予後を予測するためのマイクロアレイ分析については、いくつかの報告があるにすぎない。ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ４１５，５３０−６（２００２））は最近、初期にはリンパ節転移のない７８例の患者において、遠隔転移までの短い間隔を予測する乳癌のサインに対し、教師付き分類を適用している。彼等の交差検定分析法は７０個の遺伝子を分類モデルとして選び、それは７８例の患者のうち６５例（８３％）について現実の予後結果を正確に予測した。Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １，２０３−９（２００２））は、５２例の患者を用いて前立腺癌の予後を予測する遺伝子を決定するため、マイクロアレイ発現分析を使用した。統計学的に再発と関連づけられる単一遺伝子はなかったが、二つのニアレストネイバーをもつ５遺伝子のモデルは、リーブワンアウト交差検定を通じた再発の予測において９０％の精度に達した。Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｍｅｄ９，４１６−２３（２００３））もまた、２０サンプルをトレーニング用に、残り２０をテスト用とした転移予測モデルを用いて、肝細胞癌の転移および生存を予測した。彼等の教師付き機械学習アルゴリズムは、１５３個の有意な遺伝子を同定した。これらの結果は、転移または再発といった注目を集めているいくつかの問題における、臨床での診断手段としてのマイクロアレイのフィージビリティ（可能性）を示唆している。これらの分析とは対照的に、今回の研究では、腫瘍のサブセットを選択してはいないが、日本全国の病院から収集された組織バンクから無作為に抽出され、かつグループ研究により提案された治療プロトコールの管理下に処理された全１３６例の腫瘍サンプルを包含していた。ＧＰ分類モデルによる精度は、交差検定術により７０個の遺伝子をベストな数として決定した。８７個のトレーニングサンプルが交差検定により査定される場合、精度は８７％である。さらに著しくは、２９個の新たなテストサンプルについての予後が９３％（２７／２９）まで正確に予測され、それは先の報告（ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）と比べてきわめて高い。明らかに誤診された２例の腫瘍のうちの一つ（図３のＳ０８１）は、事後値０．８６を示したが、患者は診断後６２カ月にわたり生存している。しかしながら、この患者の原発腫瘍は３期にあり、かつ低レベルのＴｒｋＡ発現を示していることから、さらなる長期間の追跡の後に再発する危険性を有している。高い精度に加えて、この発明の方法は、適切な治療用プロトコールを選ぶための実用的な利点を有する。事実、事後値が充分に大きい（不良）か、または充分に小さい（良好）場合、予後結果の予測はほぼ完璧である（図３および４）。さらに、ＧＰ分類モデルによる確率出力は、事後確率として、ノイズの存在下に非常に安定であることがわかった。見積もられたマイクロアレイのノイズ分散と同程度にその分散が大きい人工ノイズが発現プロファイルデータに加えられた場合でも、予後予測はひどく低下することはない（図１３）。この頑健性は、ノイズ分散が実際の再生ノイズレベル０．６より充分大きい１．０まで及ぶ場合に確認される（図１０〜１２）。事後確率として表される予測信頼度は、ノイズレベルが増大するにつれて衰退するが、不確実な予測はマイクロアレイに包含されるかもしれない大きいノイズを反映することから、この性質は臨床的適用に適している。したがってこの結果は、この発明のマイクロアレイシステムが神経芽細胞腫の予後の予測にきわめて有力であることを示唆している。
この発明のシステムの高い予測精度は、多数の理由に帰せられるものである。神経芽細胞腫の組織バンクのシステムは確率されており、かつ腫瘍組織の取扱いは、インフォームドコンセントの獲得とともにすべての病院においてかなり均一であることから、腫瘍サンプルの質は高い，また作成したマイクロアレイは、高度に定量性ならびに再現性のあるシグナルを発生した。非接触スポッティング法は、スポットの形状をほぼ完全な円形にする。結果として、スポットはシグナルの均一性において卓越する。さらに、カーネルベースの教師付き分類を導入し、トップスコアの７０個の遺伝子を選び、多数の決定かまたは票決により予後を診断した。２倍の特徴抽出、ペアワイズ相関法に基づく遺伝子選択、およびガウシアンカーネルによる低次元の遺伝子発現類似性の抽出は、テストサンプルに含まれるノイズに対し分類モデルを頑健にする。腫瘍の部位について顕微解剖を行なっていないが、神経芽細胞腫ではシュワン細胞などの間質成分が腫瘍の生物学を特徴づけるために非常に重要であることはすでに知られている（総説として、Ａｍｂｒｏｓ，Ｊ．Ｍ．＆  Ａｍｂｒｏｓ，Ｐ．Ｆ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，４２９−３４（１９９５）；Ａｍｂｒｏｓ，Ｉ．Ｍ．＆  Ａｍｂｒｏｓ，Ｐ．Ｆ．Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，２２９−２４３（２０００）参照のこと）。したがって、これらの手法の好適な組合せまたは選択が、レベルの高いアウトカムの予期性をもたらしたといってよい。
選ばれた７０個の遺伝子のうち、最もスコアの高い遺伝子はｔｕｂｕｌｉｎ  ａｌｐｈａ（ＴＵＢＡ１）であり、これは神経芽細胞腫における予後因子としての他の報告はない。その予後的重要性もまた、原発腫瘍におけるＲＴ−ＰＣＲによって確証されている。ニューロン細胞におけるＴＵＢＡ１の高度の発現は、発生を通じた軸索の成長、ならびに成体動物における軸索切断後の軸索退化と関係づけられる（Ｋｎｏｏｐｓ，Ｂ．＆  Ｏｃｔａｖｅ，Ｊ．Ｎ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８，７９５−８（１９９７））。そのファミリー遺伝子ＴＵＢＡ３もまたトッ７０にランクインされている。ＴＵＢＡ３の発現は、付着性の形態学的に分化したニューロンおよびグリア細胞に限定されると報告されている（Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｌ．＆  Ｃｏｗａｎ，Ｎ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １３，２０７−２３（１９８５））。進行した神経芽細胞腫においてしばしばＭＹＣＮと同時に増幅されるＤＤＸ１遺伝子（Ｇｏｄｂｏｕｔ，Ｒ．＆  Ｓｑｕｉｒｅ，Ｊ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，７５７８−８２（１９９３）；Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １５，１２９−３３（１９９６））もまた、ＭＹＣＮよりも高いスコアにランクされている。このことは、ＭＹＣＮのｍＲＮＡ発現がそのゲノム増幅よりも弱い予後マーカーであるという先の報告（Ｓｌａｖｃ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０，１４５９−６３（１９９０））と合致するといってよい。もう一つの重要な予後因子ＴｒｋＡはトップ７０遺伝子には含まれておらず、１２０以内であるが、それはおそらくそのｍＲＮＡ発現レベルが他の遺伝子のものと比較して低いためであろう。ＴｒｋＡ発現の予後への影響は、ＴｒｋＡの細胞内シグナリングにより影響または調節される他の遺伝子により補償されるのかもしれない。注目すべきことには、各々の遺伝子のログランクテストは、１３６の原発性神経芽細胞腫が使用された場合に、７０個の遺伝子のうち５４個がマイクロアレイ上で０．０５未満のｐ値を有することを示し（表１）、予後結果の重要なマーカーとなり得る多数の遺伝子が同定されたことを示している。事実、これらの大部分の遺伝子の予測因子としての重要性は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより確証されてきている。７０個の遺伝子の発現プロファイルに関しては、それらを発現プロファイルのパターンによってではなく教師付き分類によって選んだことから、それは比較的不均質である。それにもかかわらず、予後の不良な腫瘍は、選ばれた遺伝子において典型的な差次発現のパターンを示す。興味深いことに、予後の不良な中間型の神経芽細胞腫の一部もまた同様のパターンを示しており、攻撃的なポテンシャルをもつ腫瘍が予測可能であること示唆している。一方、良好な時期にある神経芽細胞腫のクラスタリングパターンはむしろ不均質であり、それは腫瘍細胞の分化およびプログラムされた細胞死の、異なる段階にある混合集団であることによるのかもしれない。
ＲＯＣ曲線（図７）は、予後因子の中でもマイクロアレイ単独で最も有力な予後の指標となり得ることを明らかに示している。さらに、それらは年齢、期、およびＭＹＣＮ増幅とのマイクロアレイの組合せが、臨床での神経芽細胞腫に確信のある予後予測を与えるはずであることを示した。事後値は治療法の決定を助けることができ、事後値に基づくアウトカムの予測は可能性のあるノイズに対してきわめて強健である。したがって、高度に適性化されたｃＤＮＡマイクロアレイの臨床への適用は、癌患者のよりよい治療を可能にするためのテーラーメイド医療へ導く現実性をもたらすといってよい。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、神経芽細胞腫の術後の予後状態を極めて簡便かつ高精度で診断することが可能となる。正確な診断は、予後良好な患者に対する過剰な治療行為を排除し、また予後不良を疑われる患者に対する十分な治療行為を可能とする。従って、この出願の発明は、医療行為に関する産業分野において極めて有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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