(57)【要約】本発明の目的は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を利用した分子間相互作用又は分子内構造変化を分析するための新規な蛍光指示薬を提供することである。本発明によれば、分析物質の標的配列の両端にドナー蛍光蛋白質とアクセプター蛍光蛋白質が結合している構造を有し、分析物質が該標的配列に結合又は作用することにより指示薬の立体構造が変化して蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光指示薬において、上記ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質が、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる円順列変異蛍光蛋白質であって、当該円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質であることを特徴とする蛍光指示薬が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物質の標的配列の両端にドナー蛍光蛋白質とアクセプター蛍光蛋白質が結合している構造を有し、分析物質が該標的配列に結合又は作用することにより指示薬の立体構造が変化して蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光指示薬において、上記ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質が、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる円順列変異蛍光蛋白質であって、当該円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質であることを特徴とする蛍光指示薬。
【請求項２】
蛍光蛋白質が、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰ又はそれらの変異体である、請求項１に記載の蛍光指示薬。
【請求項３】
ドナー蛍光蛋白質がＣＦＰ又はその変異体であり、アクセプター蛋白質がＹＦＰ又はその変異体である、請求項１又は２に記載の蛍光指示薬。
【請求項４】
ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質が、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のアミノ酸配列中のβターンに位置するアミノ酸残基においてＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる、円順列変異蛍光蛋白質である、請求項１から３の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項５】
前記βターンに位置するアミノ酸残基が、蛍光蛋白質の蛍光のダイナミックレンジが上昇するような位置のアミノ酸残基である、請求項４に記載の蛍光指示薬。
【請求項６】
アクセプター蛍光蛋白質が、蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓの円順列変異体である、請求項１から５の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項７】
Ｖｅｎｕｓの円順列変異体が、ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、又はｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓである、請求項６に記載の蛍光指示薬。
【請求項８】
蛍光指示薬がさらに標的ペプチド成分とリンカー成分を含み、分析物質の標的配列が標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインをさらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的ペプチド成分とを共有的に結合し、標的配列と標的ペプチド成分がアクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ペプチド成分及びペプチド結合ドメインの相対的位置又は方向の変化を誘導し、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、これにより蛍光共嗚エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効率に変化が生じるが生じる、請求項１から７の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項９】
標的配列が、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、蛋白質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンである、請求項１から８の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１０】
標的配列がカルモジュリンである、請求項９に記載の蛍光指示薬。
【請求項１１】
標的ペプチド成分が、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｋＭＬＣＫｐ）、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍＭＬＣＫ）、カルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、カルデスモン、カルスペルミン、ホスホフルクトキナーゼ、カルシネウリン、ホスホリラーゼキナーゼ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、５９Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、６０Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ニトリックオキシドシンターゼ、Ｉ型アデニリルシクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニリルシクラーゼ、ニューロモジュリン、スペクトリン、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（Ｆ５２）、ｂ−Ａｄｄｕｃｉｎ、ヒートショック蛋白質ＨＳＰ９０ａ、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープグリコプロテイン１６０（ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０）、ブラッシュボーダーミオシン重鎖−Ｉ（ＢＢＭＨＢＩ）、希ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、マストパラン、メリチン、グルカゴン、セクレチン、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ガストリン阻害ペプチド（ＧＩＰ）、又はカルモジュリン結合ペプチド−２（Ｍｏｄｅｌ  ペプチド  ＣＢＰ２）のカルモジュリン結合ドメインである、請求項８に記載の蛍光指示薬。
【請求項１２】
リンカー成分が１から３０アミノ酸残基のペプチド成分である、請求項８に記載の蛍光指示薬。
【請求項１３】
さらに局在化配列を含む、請求項１から１２の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１４】
局在化配列が核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、ゴルジ体局在化配列、又は細胞膜局在化配列である、請求項１から１３の何れかに記載の蛍光指示薬。
【請求項１５】
配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５又は配列番号４６の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光指示薬。
【請求項１６】
試料中の分析物質を検出又は測定する方法であって、
（１）試料と請求項１から１５の何れかに記載の蛍光指示薬とを接触させる工程；
（２）ドナー成分を励起させる工程；及び
（３）試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を測定する工程；
を含む方法。
【請求項１７】
試料が生細胞であり、接触工程が蛍光指示薬を細胞中に取り込ませることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程が、蛍光指示薬の発現をコードする核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１５の何れかに記載の蛍光指示薬をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸又は請求項２０に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を利用した分子間の相互作用を分析するための蛍光指示薬、並びにその利用に関する。より詳細には、本発明は、２分子の蛍光蛋白質が標的配列を介して結合した蛍光指示薬、並びに該蛍光指示薬を用いた分子間の相互作用を分析する方法に関する。
【背景技術】  カメレオン（Ｃａｍｅｌｅｏｎ）は、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）変異体及びカルモジュリン（ＣａＭ）に基づいたＣａ２＋用の遺伝子でコードされた蛍光指示薬である（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．，他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８８２−８８７；及びＴｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）。カメレオンは、ＧＦＰの短波長変異体、カルモジュリン（ＣａＭ）、グリシルグリシンリンカー、ミオシン軽鎖キナーゼのＣａＭ結合ペプチド（Ｍ１３）、及びＧＦＰの長波長変異体から構成されるキメラ蛋白質である。Ｃａ２＋がＣａＭに結合することにより、ＣａＭとＭ１３との間の分子間相互作用が開始し、これによりキメラ蛋白質は、伸長した立体構造からより小型の立体構造へと変化し、短波長変異体ＧＦＰから長波長変異体ＧＦＰへのＦＲＥＴの効率が増大する。黄色カメレオン（ＹＣ）は、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターとしてシアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）と黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）をそれぞれ有している。黄色カメレオン（ＹＣ）は、Ｃａ２＋感知ドメインの組成に基づいて複数のグループに分類されている。例えば、ＹＣ２は野生型のＣａＭを有し、Ｃａ２＋に対して高い親和性を示す。一方、ＹＣ３及びＹＣ４は、ＣａＭドメインのＣａ２＋結合ループに変異が存在するため、低親和性の指示薬である。これらのＹＣは、元のＹＦＰをＥＹＦＰ．１（Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，他、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，２１３５−２１４０）で置換することによって酸性化に対する抵抗が高くなっている。改変したＹＣとしては、ＹＣ２．１及びＹＣ３．１が挙げられる。更に、ｃｉｔｒｉｎｅ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ、Ｏ．，他、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２９１８８−２９１９４）やＶｅｎｕｓ（Ｎａｇａｉ，Ｔ．，他、（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，８７−９０）のようなＹＦＰの特に明るい変異体を用いることによって、より迅速に成熟するように作られたＹＣもある。上記の通り、ＹＣは主にＹＦＰ成分を最適化することにより改良されてきた。
上述した改良にも拘わらず、ＹＣは依然としてダイナミックレンジが低いという問題がある。ＹＣ２．１２又はＹＣ３．１２などの現在入手可能な最高の変異体でも、インビトロでのＣａ２＋結合の際に示されるＹＦＰ／ＣＦＰ比の変化はせいぜい１２０％である。
これらのＹＣは、シグナルレベルが低いので、特に細胞内小器官あるいは微小領域を標的とする場合は、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が悪化する。これらのダイナミックレンジは、ＹＣの感知ドメインと相互作用すると考えられる内因性のＣａＭ及びＣａＭ結合蛋白質の存在量に応じて、インビボで減衰することが示唆されている。
【発明の開示】
本発明は、蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）を利用した分子間相互作用又は分子内構造変化を分析するための新規な蛍光指示薬を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、高いダイナミックレンジを示す蛍光指示薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、指示薬のダイナミックレンジを増加させるためにアクセプターの修飾を試みた。ＣＦＰとＹＦＰの蛍光団間の相対的方向及び距離をＣａ２＋に依存して大きく変化させることを目的として、ＹＣで用いるリンカーの長さと配列を最適化しても改善は僅かに過ぎないだろうと推測した。そこで、アミノ末端領域とカルボキシル末端領域とを交換し、元の末端の間を短いスペーサーで再結合した円順列変異ＧＦＰ（ｃｐＣＦＰ）を用いるという手法を採用した（Ｂａｉｒｄ，Ｇ．Ｓ．，他、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１１２４１−１１２４６；及びＴｏｐｅｌｌ，Ｓ．，他、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２８３−２８９）。上記の通り、本発明者らは、酸性化に耐性を有し、かつ効率的に成熟するｃｐＹＦＰを用いすることによって、２つの発色団の遷移双極分子の相対的方向を変えることを試みた結果、優れたダイナミックレンジを示す蛍光指示薬が得られることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、分析物質の標的配列の両端にドナー蛍光蛋白質とアクセプター蛍光蛋白質が結合している構造を有し、分析物質が該標的配列に結合又は作用することにより指示薬の立体構造が変化して蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光指示薬において、上記ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質が、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる円順列変異蛍光蛋白質であって、当該円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質であることを特徴とする蛍光指示薬が提供される。
好ましくは、蛍光蛋白質は、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＥＰ、ＢＦＰ又はそれらの変異体である。好ましくは、ドナー蛍光蛋白質はＣＦＰ又はその変異体であり、アクセプター蛋白質がＹＦＰ又はその変異体である。
好ましくは、ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質は、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のアミノ酸配列中のβターンに位置するアミノ酸残基においてＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる、円順列変異蛍光蛋白質である。好ましくは、前記βターンに位置するアミノ酸残基は、蛍光蛋白質の蛍光のダイナミックレンジが上昇するような位置のアミノ酸残基である。
好ましくは、アクセプター蛍光蛋白質は、蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓの円順列変異体である。好ましくは、Ｖｅｎｕｓの円順列変異体は、ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、又はｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓである。
好ましくは、蛍光指示薬がさらに標的ペプチド成分とリンカー成分を含み、分析物質の標的配列が標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインをさらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的ペプチド成分とを共有的に結合し、標的配列と標的ペプチド成分がアクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ペプチド成分及びペプチド結合ドメインの相対的位置又は方向の変化を誘導し、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、これにより蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効率に変化が生じる蛍光指示薬が提供される。
好ましくは、標的配列は、カルモジュリン、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、蛋白質キナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンであり、特に好ましくは、カルモジュリンである。
好ましくは、標的ペプチド成分は、骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｋＭＬＣＫｐ）、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ（ｓｍＭＬＣＫ）、カルモジュリンキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、カルデスモン、カルスペルミン、ホスホフルクトキナーゼ、カルシネウリン、ホスホリラーゼキナーゼ、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ、５９Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、６０Ｋｄａホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ニトリックオキシドシンターゼ、Ｉ型アデニリルシクラーゼ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニリルシクラーゼ、ニューロモジュリン、スペクトリン、ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（Ｆ５２）、ｂ−Ａｄｄｕｃｉｎ、ヒートショック蛋白質ＨＳＰ９０ａ、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープグリコプロテイン１６０（ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０）、ブラッシュボーダーミオシン重鎖−Ｉ（ＢＢＭＨＢＩ）、希ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、マストパラン、メリチン、グルカゴン、セクレチン、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）、ガストリン阻害ペプチド（ＧＩＰ）、又はカルモジュリン結合ペプチド−２（ＭｏｄｅｌペプチドＣＢＰ２）のカルモジュリン結合ドメインである。
好ましくは、リンカー成分は１から３０アミノ酸残基のペプチド成分である。
本発明の蛍光指示薬は、好ましくは、さらに局在化配列を含む。好ましくは、局在化配列は核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、ゴルジ体局在化配列、又は細胞膜局在化配列である。
特に好ましくは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５又は配列番号４６の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光指示薬が提供される。
本発明の別の側面によれば、試料中の分析物質を検出又は測定する方法であって、
（１）試料と本発明の蛍光指示薬とを接触させる工程；
（２）ドナー成分を励起させる工程；及び
（３）試料中の分析物質の濃度や活性に対応した試料中の蛍光共鳴エネルギー転移の程度を測定する工程；
を含む方法が提供される。
好ましくは、試料は生細胞であり、接触工程は蛍光指示薬を細胞中に取り込ませることを含む。好ましくは、細胞へ蛍光指示薬を取り込ませる工程は、蛍光指示薬の発現をコードする核酸配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターを細胞にトランスフェクションすることを含む。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光指示薬をコードする核酸、当該核酸を含む発現ベクター、並びに当該核酸又は発現ベクターを有する形質転換体が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＹＣ３．１２及び新規ＹＣ変異体の構造とスペクトル特性を示す。図１のＡは、元のＮ末端（Ｍｅｔ１）及び新規Ｎ末端（Ｔｈｒ４９、Ｇｌｎ１５７、Ａｓｐ１７３、Ｌｅｕ１９５、及びＩｌｅ２２９）を有するＧＦＰの三次元構造を示す。図１のＢは、ＹＣ３．１２（配列番号４１）、ＹＣ３．２０（配列番号４２）、ＹＣ３．３０（配列番号４３）、ＹＣ３．６０（配列番号４４）、ＹＣ３．７０（配列番号４５）、及びＹＣ３．９０（配列番号４６）のドメイン構造を示す。ＸＣａＭはＸｅｎｏｐｕｓ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎを示す。Ｅ１０４Ｑは、三番目のＣａ２＋結合ループの位置１２における保存された二座グルタミン酸（Ｅ１０４）からグルタミンへの変異を示す。図１のＣは、Ｃａ２＋がゼロ（点線）及び飽和（実線）におけるＹＣ変異体の発光スペクトル（４３５ｎｍで励起）を示す。図１のＤは、Ｃａ２＋がゼロ及び飽和におけるＹＣ変異体（ＹＣ３．１２、ＹＣ３．２０、ＹＣ３．３０、ＹＣ３．６０、ＹＣ３．７０及びＹＣ３．９０）の蛍光異方性を示す。図１のＥは、ｐＨ７．４におけるＹＣ２．６０（三角）、ＹＣ３．６０（丸）及びＹＣ４．６０（四角）のＣａ２＋滴定曲線を示す。図１のＦは、Ｃａ２＋がゼロ及び飽和におけるＹＣ３．６０のｐＨ滴定曲線を示す。
図２は、ＹＣ３．６０及びＹＣ３．１２を発現するＨｅＬａ細胞中におけるＣａ２＋動態の比較測定を示す。図２のＡ及びＢは、ＹＣ３．６０（Ａ）及びＹＣ３．１２（Ｂ）を用いて得た蛍光画像を示す（励起４９０ｎｍ、発光５３５ｎｍ）。目盛棒は１０μｍ。図２のＣ及びＤは、３０μＭのＡＴＰで誘導したＨｅＬａ細胞中のＹＣ３．６０（Ｃ）及びＹＣ３．１２（Ｄ）を用いて報告されたＣａ２＋の過渡応答を示す。上段：Ｒｍａｘ及びＲｍｉｎ値（それぞれ黒矢頭及び白矢頭で表示）についての発光比（５３５／４８０ｎｍ）の変化。下段：ＣＦＰ及びｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ（Ｃ）、及びＣＦＰ及びＶｅｎｕｓ（Ｄ）の蛍光強度の変化。画像取得間隔は５秒。
図３は、ＹＣ３．６０を用いたＨｅＬａ細胞中の［Ｃａ２＋］ｃ及び［Ｃａ２＋］ｐｍの共焦点画像観察を示す。図３のＡは、［Ｃａ２＋］ｃの伝播を示す一連の共焦点疑似色比率画像を示す。これらの画像はビデオレートで取得した。図３のＢは、ＨｅＬａ細胞の実色画像を示す。上段の細胞には、伝播速度を測定するため６つのＲＯＩを設置した。目盛棒：１０μｍ。図３のＣは、Ｂで表示した６つのＲＯＩ中の［Ｃａ２＋］ｃの変化の時間経過を示す。Ｒｍａｘ及びＲｍｉｎはそれぞれ黒矢頭及び白矢頭で表示する。左側の縦軸は［Ｃａ２＋］ｃをｎＭで目盛付けしている。黒い水平の棒は、Ａにおいて比率画像が示されている間の時間を表示する。図３のＤは、ＹＣ３．６０ｐｍを発現するＨｅＬａ細胞の実色画像を示す。目盛棒：５μｍ。図３のＥは、Ｄにおいて円で表示した周辺領域中の、［Ｃａ２＋］ｐｍのヒスタミンに誘導された変化を示す。Ｒｍａｘ及びＲｍｉｎは、それぞれ黒矢頭及び白矢頭で表示する。左の縦軸は［Ｃａ２＋］ｐｍをｎＭで目盛付けしている。図３のＦは、糸状足構造体中の［Ｃａ２＋］ｐｍの変化を示す一連の共焦点疑似色比率画像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  前記の通り、カメレオン（Ｃａｍｅｌｅｏｎ）及び黄色カメレオン（ＹＣ）は、生体中の神経回路の集合活動を調べる際に有用であると期待されている。元のＹＣ及び改良したＹＣは、インビトロ並びに一過的に遺伝子導入した細胞試料中で明確なＣａ２＋応答を示すが、これらのダイナミックレンジは、インビボではトランスジェニック動物の神経系で有意に減少する。特に、トランスジェニックマウスの脳では、信頼性のあるＣａ２＋測定は成功していない。最近のＹＣ改良体（ＹＣ３．１２）と比較すると、ＹＣ３．６０は明るさは同等であるが、ダイナミックレンジは５〜６倍大きい。このように、ＹＣ３．６０では、Ｓ／Ｎ比が大きく向上し、従来のＹＣでは不可能であったＣａ２＋の画像化実験が可能になった。以下の実施例でも示す通り、例えば、ＹＣ３．６０をＨｅＬａ細胞の原形質膜に局在化させることにより、糸状足構造体膜下における［Ｃａ２＋］ｃの変化を測定することができる。
ｃｐＧＦＰの構造を最初に報告したＢａｉｒｄ，Ｇ．Ｓ．，他は、ドナーＣＦＰとしてＴｙｒ１４５に新たなＮ末端を有するｃｐＣＦＰを使用することにより、ＹＣのダイナミックレンジの改良を試みた（Ｂａｉｒｄ，Ｇ．Ｓ．，他、（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１１２４１−１１２４６．）。しかし、このｃｐＣＦＰでは、Ｃａ２＋依存性の発光比の変化は１５％にまで減少した。本発明者らは、複数のｃｐＹＦＰをアクセプターとして試験することにより、この手法を改良した。ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ及びｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓを、ＹＦＰの明るい変異体であるＶｅｎｕｓから作製した。５種のｃｐＶｅｎｕｓ蛋白質は全て効率的に成熟した。本発明で作成した上記のｃｐＶｅｎｕｓ蛋白質は、発色団合成の酸化反応を大幅に促進する変異であるＦ４６Ｌを含み、Ｎ−末端がβ−バレルの表面露出ループ領域に存在しているためであると考えられる。実際、ｃｐＧＦＰの蛍光の発生速度は、新たなＮ末端及びＣ末端の位置に依存する（Ｔｏｐｅｌｌ，Ｓ．，他、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２８３−２８９）。ＣＰＦとＹＦＰ間のＦＲＥＴに基づいて開発された蛍光指示薬の数は増大しており（Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ４，２９５−３０５）、ＣＦＰとＹＦＰの２種の発色団の間の相対的距離が変えられている。このように、ＣＦＰと組み合わせて用いられるｃｐＶｅｎｕｓは、各用途に対して最適化することができる。また、これをｃｐＣＦＰと組み合わせて使用すると、ドナー及びアクセプター間の２つの遷移双極子の相対的位置の変化を更に増大させることができる。Ｃａ２＋に対するｃｐＧＦＰ系指示薬は数年前に開発されたものであり（Ｎａｋａｉ，Ｊ．，他、（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１３７−１４１；及びＮａｇａｉ，Ｔ，他、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，３１９７−３２０２）、ｃｐＧＦＰ自体は、ＦＲＥＴと相補的な非常に有用な道具になると期待される。以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明の蛍光指示薬は、分析物質の標的配列の両端にドナー蛍光蛋白質とアクセプター蛍光蛋白質が結合している構造を有し、分析物質が該標的配列に結合又は作用することにより指示薬の立体構造が変化して蛍光共嗚エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じる蛍光指示薬であって、上記ドナー蛍光蛋白質及び／又は上記アクセプター蛍光蛋白質が、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる円順列変異蛍光蛋白質であって、当該円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質であることを特徴とするものである。
本発明では、ＦＲＥＴにおいてドナー蛋白質及びアクセプター蛋白質として作用する蛋白質をそれぞれ１種ずつ使用する。即ち、本発明では、２種類の異なる蛍光波長を有する蛍光蛋白質を使用し、これらの蛍光蛋白質の間で起きる蛍光共鳴エネルギートランスファーにより生じる蛍光を測定する。本発明で用いる蛍光蛋白質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＥＰ）、緑色蛋白質（ＧＦＰ）、赤色蛍光蛋白質（ＲＥＰ）、青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）又はそれらの変異体などが挙げられる。
本明細書で言う、シアン蛍光蛋白質、黄色蛍光蛋白質、緑色蛋白質、赤色蛍光蛋白質、青色蛍光蛋白質又はそれらの変異体とは、各々公知の蛍光蛋白質だけでなく、それらの変異体（例えば、上記蛍光蛋白質の蛍光強度を増強した、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＲＦＰ、ＥＢＦＰなど）の全てを包含する意味である。例えば、緑色蛍光蛋白質の遺伝子は単離され配列も決定されている（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９２），“Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３）。その他の蛍光蛋白質又はその変異体のアミノ酸配列も多数報告されており、例えば、Ｒｏｇｅｒ  Ｙ．Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８．６７：５０９−４４、並びにその引用文献に記載されている。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）またはそれらの変異体としては、例えば、オワンクラゲ（例えば、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ））由来のものを使用できる。
ＧＦＰ、ＹＦＰとそれらの変異体の一例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。なお、Ｆ９９Ｓという表示は、９９番目のアミノ酸残基がＦからＳに置換していることを示し、他のアミノ酸置換についても同様の表示に従って示す。
野生型ＧＦＰ；
Ｆ９９Ｓ，Ｍ１５３Ｔ，Ｖ１６３Ａのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｆ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｔ，Ｓ７２Ａ，Ｎ１４９Ｋ，Ｍ１５３Ｔ，Ｉ１６７Ｔのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ２０２Ｆ，Ｔ２０３Ｉのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｔ２０３Ｉ，Ｓ７２Ａ，Ｙ１４５Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｆのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｈのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ，Ｑ６９Ｋ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＥＹＦＰ）；
Ｓ６５Ｇ，Ｓ７２Ａ，Ｋ７９Ｒ，Ｔ２０３Ｙのアミノ酸変異を有するＧＦＰ（ＹＦＰ）；
本発明で用いる蛍光蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は公知である。蛍光蛋白質をコードする遺伝子は市販のものを使用することもできる。例えば、クロンテック社から市販されている、ＥＧＦＰベクター、ＥＹＦＰベクター、ＥＣＦＰベクター、ＥＢＦＰベクターなどを用いることができる。
本発明ではＧＦＰ変異体であるＣＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ又はそれらの変異体を使用することが好ましく、例えば、ＹＦＰ変異体であるＶｅｎｕｓを用いることができる。Ｖｅｎｕｓについては、Ｎａｇａｉ，Ｔ．他（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ２０，８７−９０を参照できる。Ｖｅｎｕｓは、ＹＦＰの４６番目のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより得られる蛍光蛋白質であり、従来のＧＦＰと比較して、大腸菌内で３０〜１００倍、ほ乳類の細胞内で３〜１００倍の明るさを達成し、通常の装置でも十分検出可能な蛍光を提供することができる。
本発明で使用できる他の蛍光分子としては、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ株Ｙ−１由来の黄色蛍光蛋白質、Ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．由来蛋白質）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓなどの海洋シアノバクテリア由来のｐｈｙｃｏｂｉｌｉ蛋白質（例えば、フィコエリスリン及びフィコシアニンなど）、又はフィコエリスロビリンで再構築したオート麦由来のオートフィトクロムなどが挙げられる。これらの蛍光蛋白質はＢａｌｄｗｉｎ，Ｔ．Ｏ．，他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：５５０９−５５１５（１９９０），Ｍｏｒｒｉｓ，Ｂ．Ｊ．，他，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：６７３−６７７（１９９４），及びＷｉｌｂａｎｋｓ，Ｓ．Ｍ．，他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６−１２３５（１９９３），及びＬｉ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：７９２３−７９３０（１９９５）などに記載されている。
本発明で用いることができるドナー蛋白質／アクセプター蛋白質の組み合わせとしては、ＣＦＰ／ＹＦＰ、又はＢＦＰ／ＧＦＰなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛍光蛋白質が融合蛋白質をコードする遺伝子の構築は、当業者に公知の通常の遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。
本発明においては、ドナー蛋白質及び／又はアクセプター蛋白質として、野生型蛍光蛋白質又はその変異体蛋白質のＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより得られる円順列変異蛍光蛋白質であって、当該円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質を使用することを特徴とする。
即ち、円順列変異蛍光蛋白質は、Ｎ末端側からＣ末端側に、以下のアミノ酸配列を順番に有するものである：
（１）元の蛍光蛋白質のＮ末端からｎ番目のアミノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ｎは２以上の整数を示す）；
（２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配列；及び
（３）元の蛍光蛋白質のＮ末端の１番目からｎ−１番目のアミノ酸配列：
元の蛋白質に対して、上記のようにＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることにより蛋白質の構造を変化させることを、円順列変異（サーキュラーパーミュテーション）とも称する。本発明では、上記した各種蛍光蛋白質に円順列変異（サーキュラーパーミュテーション）を施すことによって、ＦＲＥＴにおいて高いダイナミックレンジを有する新規な蛍光指示薬を作製することに成功したものである。
リンカー配列のアミノ酸配列は、作製される融合蛍光蛋白質がカルシウムイオン指示薬として所望の効果を発揮する限り、特に限定されないが、側鎖が比較的小さいアミノ酸配列を主として含むことが好ましく、また親水性の側鎖を有するアミノ酸が好ましい。アミノ酸の個数は通常２〜２０個程度であり、好ましくは３〜１０個程度であり、特に好ましくは５〜１０個程度である。リンカー配列の具体例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ等が挙げられるが、これらに限定されるものでもない。
円順列変異（サーキュラーパーミュテーション）を施す位置は、得られる円順列変異蛍光蛋白質が、円順列変異を施す前の蛍光蛋白質と実質的に同一の蛍光ピーク波長を有する蛍光蛋白質であれば特に限定されないが、好ましくは、元のアミノ酸配列中のβターンに位置するアミノ酸残基においてＮ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えることが好ましい。さらに、前記βターンに位置するアミノ酸残基は、円順列変異蛍光蛋白質の蛍光のダイナミックレンジが、円順列変異を施す前の蛍光蛋白質のダイナミックレンジより向上するような位置のアミノ酸残基であることが特に好ましい。
本発明で用いる蛍光蛋白質の具体例としては、蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓの円順列変異体である、本明細書の実施例で作製したｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、又はｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、又はｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓではそれぞれ、蛍光蛋白質Ｖｅｎｕｓのアミノ酸番号４９のＴｈｒ４９、アミノ酸番号１５７のＧｌｎ、アミノ酸番号１７３の１７３、アミノ酸番号１９５のＬｅｕ、及びアミノ酸番号２２９のＩｌｅにおいて、Ｎ末端側のアミノ酸配列とＣ末端側のアミノ酸配列を入れ替えられている。
また、本発明の蛍光指示薬の具体例としては、本明細書の実施例で作製したＹＣ３．２０（配列番号４２）、ＹＣ３．３０（配列番号４３）、ＹＣ３．６０（配列番号４４）、ＹＣ３．７０（配列番号４５）、及びＹＣ３．９０（配列番号４６）が挙げられる。
本発明の蛍光指示薬の具体的な構成としては、
蛍光指示薬がさらに標的ペプチド成分とリンカー成分を含み、分析物質の標的配列が標的ペプチド成分を結合するためのペプチド結合ドメインをさらに含み、
リンカー成分が分析物質の標的配列と標的ペプチド成分とを共有的に結合し、標的配列と標的ペプチド成分がアクセプター蛍光分子成分又はドナー蛍光分子成分の何れかに共有的に結合し、
標的配列に結合した分析物質が標的ペプチド成分及びペプチド結合ドメインの相対的位置又は方向の変化を誘導し、次いでドナー分子及びアクセプター分子成分の相対的位置又は方向に変化が生じ、これにより蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の効率に変化が生じるような蛍光指示薬を作製することができる。
本発明では、標的配列としてＣａ２＋によって構造変化を起こすドメインのＮ末端とＣ末端に蛍光分子を結合させたものを作製し、蛍光指示薬を作製した。このような蛍光指示薬を用いることにより、細胞内Ｃａ２＋濃度の変化をモニターすることが可能になる。
「共有的に結合」とは、共有結合又は２分子間の他の共有的連結を意味する。共有的な連結としては、２分子を連結する二価成分が挙げられる。
「標的配列」とは、分析物質と結合できるアミノ酸配列を意味する。好ましい標的配列は、分析物質と結合すると立体構造が変化する。
「標的ペプチド」は標的配列と結合できるペプチドを意味する。標的ペプチドは、標的配列と結合するペプチドの部分配列である。
「分析物質」は、標的配列に結合する溶液中の分子又はイオンを意味し、標的配列の立体構造を変化させるものである。分析物質は標的配列に可逆的に結合しても非可逆的に結合してもよい。
蛍光分子成分は標的配列成分のアミノ末端及びカルボキシ末端に共有的に結合していることが好ましい。これにより、ドナー蛍光分子成分及びアクセプター蛍光分子成分は、分析物質が結合した際に互いに密接に移動できる。あるいは、ドナー及びアクセプター成分は、分析物質の結合の際に互いに離れるように移動してもよい。一例としては、アクセプター成分は、標的配列成分に結合している標的ペプチド成分に共有的に結合し、標的ペプチド成分はリンカー成分を介して標的配列成分に共有的に結合している。リンカー成分はフレキシブルなもので、標的ペプチド成分が標的配列成分に結合することができる。ドナー成分は、ドナー成分の励起スペクトル内の適当な強さの光によって励起される。ドナー成分は吸収したエネルギーを蛍光として放出する。アクセプター蛍光分子成分が励起状態のドナー成分を消光できる位置に存在する場合、蛍光エネルギーはアクセプター成分に転移されて、蛍光が放出される。
ドナー及びアクセプター蛍光分子成分間のＦＲＥＴの効率は、２つの蛍光分子が相互作用する能力を調節することによって調節することができる。標的配列成分、標的ペプチド成分及びリンカー成分の性質もＦＲＥＴ及び分析物質に対する指示薬の応答に影響する。通常、大きな立体構造変化が標的配列成分に生じることが望ましい。
標的配列成分は、分析物質の結合に際して立体構造が変化する蛋白質又はその一部である。そのような蛋白質の例としては、カルモジュリン（ＣａＭ）、ｃＧＭＰ−依存性蛋白質キナーゼ、ステロイドホルモン受容体（又はそのリガンド結合ドメイン）、プロテインキナーゼＣ、イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体、又はレコベリンなどが挙げられる（例えば、Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｊ．Ａ．＆  Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５２９−５３６（１９９６），及びＡｍｅｓ，Ｊ．Ｂ．，他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：４３２−４３８（１９９６）を参照）。標的配列成分は好ましくは、分析物質以外に標的ペプチドにも結合する。
標的ペプチド成分は以下の表１に記載の任意のアミノ酸配列またはその一部を含むことができる。但し、標的ペプチドは標的配列成分に結合できなくてはならない。標的ペプチドは、カルモジュリン結合ドメインの部分配列でもよい。表１に挙げた標的ペプチド成分は標的配列成分ＣａＭによって認識される（例えば、Ｃｒｉｖｉｃｉ，Ａ．＆  Ｉｋｕｒａ，Ｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２４：８４−１１６（１９９５）を参照）。標的ペプチド成分を改変して、分析物質に対する蛍光指示薬の応答を増強してもよい。他の標的配列に対する他の標的ペプチド成分も当業者には既知である。
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略号の説明
ＡＣ，アデニリルシクラーゼ；
ＢＢＭＨＣＩ，ｂｒｕｓｈ−ｂｏｒｄｅｒ  ミオシン重鎖−Ｉ；
ＣａＭＫＩＩ，カルモジュリンキナーゼＩＩ；
ＣＢＰ２，カルモジュリン結合ペプチド−２；
ＧＩＰ，ガストリン阻害ペプチド；
ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０，ヒト免疫不全ウイルスエンベロープ糖蛋白質１６０；
ＨＳＰ，ヒートショック蛋白質；
ＭＡＲＣＫＳ，ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質；
ＭＨＣ，ミオシン重鎖；
ＮＯＳ，ニトリックオキシドシンターゼ；
ＰＤＥ，ホスホジエステラーゼ；
ＰＦＫ，ホスホフルクトキナーゼ
ＰｈＫ，ホスホリラーゼキナーゼ；
ｓｋ−，ｓｍＭＬＣＫ，骨格筋及び平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼ；
ＶＩＰ，血管作動性腸ペプチド
リンカー成分の長さは、ＦＲＥＴ及び、分析物質の結合により立体構造変化の速度及び特異性を最適化するように選択する。リンカー成分は、標的配列成分と標的ペプチド成分とが自由に相互作用して分析物質濃度に応答できるような長さと柔軟さを有することが好ましい。ＦＲＥＴ効果を最適化するために、ドナー及びアクセプター蛍光分子成分の平均距離は、好ましくは約１ｎｍから約１０ｎｍであり、より好ましくは約１ｎｍから約６ｎｍであり、特に好ましくは１ｎｍから約４ｎｍである。リンカー分子が短すぎたり堅固すぎると、ドナー及びアクセプター分子成分は容易に位置を変えることができない。リンカー成分が長すぎると、標的ペプチド成分は効率的に標的配列成分に結合できない。リンカー成分は好ましくはペプチド成分である。好ましいリンカー成分は、１〜３０アミノ酸残基、好ましくは１〜１５アミノ酸残基のペプチドである。リンカーの一例は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−リンカーである。
リンカー成分はフレキシブルなスペーサーアミノ酸配列を含んでもよい。リンカー成分については、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，他，ＰＮＡＳ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８），Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．，他，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９８９−９９５（１９９３），及びＮｅｗｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５：５４５−５５３（１９９６）などに記載されている。
標的配列は、分析物質が結合又は作用して指示薬の立体構造を変化させるものであればよく、例えば、酵素によって認識されて切断される配列でもよい。例えば、標的配列としてプロテアーゼの基質部位を使用することができる。プロテアーゼとしてカスペース３を用いる場合は、標的配列のアミノ酸配列としてＤＥＶＤを使用することができる。
蛍光指示薬には局在化配列が含まれていてもよい。局在化配列により、指示薬は、好適な細胞内小器官標的シグナル又は局在化宿主蛋白質と融合することにより細胞内の特定の部位に運ばれる。局在化配列又はシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを蛍光指示薬をコードするポリヌクレオチドの５’末端に連結又は融合することができ、これによりシグナルペプチドは生じる融合ポリヌクレオチド又はポリペプチドのアミノ末端に位置することができる。
真核細胞の場合、シグナルペプチドは融合ポリペプチドを小胞体を経由して輸送する機能を有すると考えられている。分泌蛋白質は次いでゴルジ体に運ばれ、分泌小胞及び細胞外空間、そして好ましくは外部環境に運ばれる。本発明で使用できるシグナルペプチドは、蛋白質分解酵素認識部位を含むプレプロペプチドでもよい。
局在化配列は核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列、又は局在化蛋白質でもよい。局在化配列は、例えば、″Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ″，３５章、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  ｅｄ．）．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９５に記載されている標的配列でもよい。局在化配列は、局在化蛋白質でもよい。局在化配列の具体例としては、核を標的とする配列（ＫＫＫＲＫ）（配列番号３２）、ミトコンドリアを標的とする配列（アミノ末端がＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩＬＲＬＱＳＴ−）（配列番号３３）、小胞体を標的とする配列（ＫＤＥＬ（配列番号３４）、Ｃ−末端に）（シグナル配列はＮ末端に存在する）、ペルオキシソームを標的とする配列（ＳＫＬ（配列番号３５）、Ｃ−末端に）、細胞膜へのプレニレーション又は挿入を標的とする配列（［ＣａａＸ］ＣＡＡＸ（配列番号３６），ＣＣ（配列番号３７），ＣＸＣ（配列番号３８），又はＣＣＸＸ（配列番号３９）、Ｃ−末端に）、細胞膜の細胞質側を標的とする配列（ＳＮＡＰ−２５への融合）、又はゴルジ体を標的とする配列（ｆｕｒｉｎへの融合）などが挙げられる。
蛍光指示薬は組み換えＤＮＡ技術により融合蛋白質として製造できる。蛍光蛋白質の組み換え生産は、蛋白質をコードする核酸の発現により行う。蛍光蛋白質をコードする核酸は、当業者に既知の方法で入手できる。例えば、蛋白質をコードする核酸は、オワンクラゲ緑色蛍光蛋白質のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを用いてオワンクラゲ由来ｃＤＮＡのＰＣＲによって単離することができる。蛍光蛋白質の各種変異体は、蛍光蛋白質をコードする核酸の部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発によって作製することができる。ランダム変異誘発は、０．１ｍＭ  ＭｎＣｌを用いたりヌクレオチド濃度のバランスを崩してＰＣＲを行うことにより行うことができる
発現ベクターの構築及びトランスフェクションした細胞での遺伝子の発現は、当業者に公知の分子クローニング手法に従って行うことができる。これらの詳細は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｐｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他，ｅｄｓ．，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｍｏｓｔ  ｒｅｃｅｎｔ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）に記載されている。
ポリペプチドの発現をコードする配列で細胞をトランスフェクションするために使用する核酸は一般に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクターである。ここで言う″ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列″とは、ｍＲＮＡの転写及び翻訳により、ポリペプチドを産生する配列を言う。例えば、イントロンを含む配列もこれに含まれる。ここで言う″発現調節配列″とは、それが作動的に連結している核酸の発現を調節する核酸配列を言う。発現調節配列が核酸配列の転写及び翻訳を調節および制御する際に、発現調節配列は核酸配列に作動的に連結している。発現調節配列は、好適なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、蛋白質コード遺伝子の前の開始コドン（即ち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどを含むことができる。
当業者に周知の方法を使用して、蛍光指示薬のコード配列と、適当な転写・翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、インビボ組み換え・遺伝組み換えなどが挙げられる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載の技術を参照）。組み換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は当業者に周知の慣用技術によって行うことができる。宿主細胞が大腸菌などの原核細胞である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞は、対数増殖期後に回収し、当業者に周知のＣａＣｌ２法で処理した細胞を用いて作製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２又はＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを作成後、またはエレクトロポレーションにより行うことができる。
宿主細胞が真核細胞である場合、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム又はウイルスベクターに封入したプラスミドの挿入などのＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。真核細胞は、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの適当な表現型をコードする外来ＤＮＡ分子とを一緒にトランスフェクションすることができる。サルウイルス４０（ＳＶ４０）又はウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過的に感染または形質転換して蛋白質を発現させることもできる（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｄ．，１９８２を参照）。好ましくは、真核細胞宿主を宿主細胞として使用する。
微生物又は真核細胞で発現させた本発明のポリペプチドの単離及び精製方法は任意の慣用方法を使用することができ、例えば、プレパラティブクロマトグラフィー分離及び免疫学的分離（モノクローナル又はポリクローナル抗体又は抗原を使用することを含むものなど）などが挙げられる。
蛍光指示薬をコードする配列を発現させるために、各種の宿主／発現ベクター系を使用することができる。例えば、蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞、又は蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞；蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系：あるいは、蛍光指示薬をコードする配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
使用する宿主／ベクター系に応じて、適当な転写及び翻訳要素（例えば、構成的又は誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなど）を発現ベクター中で使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ，他，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４，１９８７を参照）。例えば、細菌系にクローニングする場合、バクテリオファージλ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）のｐＬなどの誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系にクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスロングターミナルリピート；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターなど）を使用することができる。組み換えＤＮＡ又は合成技術で作製したプロモーターを使用して蛍光指示薬をコードする挿入配列を転写させることもできる。
細菌系では、発現する蛍光指示薬の意図する用途に応じて多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量の蛍光指示薬を産生させる場合には、容易に精製される融合蛋白質産物の高量の発現を指令するベクターが望ましい。蛍光指示薬の回収を助ける切断部位を含むように加工したものが好ましい。
酵母では、構成的又は誘導性のプロモーターを含む多数のベクターを使用することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ，他，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３，１９８８；Ｇｒａｎｔ，他．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，３１９８７，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５３，ｐｐ．５１６−５４４，１９８７；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３，１９８６；並びに、Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．６７３−６８４，１９８７；及びＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ他．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，１９８２などを参照することができる。ＡＤＨ又はＬＥＵ２などの構成的酵母プロモーターあるいはＧＡＬなどの誘導性プロモーターを使用することができる（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｃｈ．３，Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  Ｉｎ：ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌ．１１，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｄ．ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，１９８６）。あるいは、酵母の染色体への外来ＤＮＡの組み込みを促進するベクターを使用することもできる。
植物の発現ベクターを使用する場合、蛍光指示薬をコードする配列の発現は、プロモーターにより促進することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡ及び１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターなどのウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ，他，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４，１９８４）、又はＴＭＶに対するコート蛋白質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，他，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１，１９８７）を使用できる。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉ，他，１９８４，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，１９８４）などの植物プロモーター、又はヒートショックプロモーター（例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ，他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５，１９８６）など）を使用してもよい。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって植物に導入することができる。これらの技術については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３，１９８８；及びＧｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９，１９８８などに記載されている。
昆虫系を使用して蛍光指示薬を発現することも可能である。例えば、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用して外来遺伝子を発現することができる。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で生育する。蛍光指示薬をコードする配列をこのウイルスの非本質領域（例えば、多角体病遺伝子）中にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーターの制御下に置く。蛍光指示薬をコードする配列を正しく挿入した場合、多角体病遺伝子は不活化し、未閉塞の組み換えウイルスが産生する。これらの組み換えウイルスを使用してＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させ、その細胞内で挿入した遺伝子を発現させることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ，他，Ｊ．Ｖｉｏｌ．４６：５８４，１９８３；及び米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
真核細胞系、好ましくは哺乳動物細胞の発現系を使用することにより、発現した哺乳動物の蛋白質の適切な翻訳後修飾を行うことが可能になる。一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、及び遺伝子産物の分泌のための細胞機構を有する真核細胞を、蛍光指示薬の発現のための宿主細胞として使用することが好ましい。そのような宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、並びにＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
組み換えウイルス又はウイルス要素を利用して発現を指令する哺乳動物細胞系を構築することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、蛍光指示薬をコードする配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体（例えば、後期プロモーター及び３つのリーダー配列など）に連結することができる。このキメラ遺伝子をインビトロ又はインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非本質領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）への挿入により感染宿主で生存可能で蛍光指示薬を発現することができる組み換えウイルスが得られる（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９，１９８４を参照）。あるいは、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５−７４１９，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ，他，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７−８６４，１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉ，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４９２７−４９３１，１９８２を参照）。染色体外要素として複製する能力を有するウシパピローマウイルスに基づくベクターを使用することも可能である（Ｓａｒｖｅｒ，他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：４８６，１９８１）。このＤＮＡをマウス細胞に導入した直後に、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピー複製する。挿入したｃＤＮＡの転写には、プラスミドが宿主の染色体に組み込まれることは必要ではなく、これにより高レベルの発現が生み出される。これらのベクターは、ｎｅｏ遺伝子などの選択マーカーをプラスミド中に含めることによって安定した発現のために使用することができる。あるいは、レトロウイルスゲノムを改変して、宿主細胞内での蛍光指示薬遺伝子の発現を誘導及び指令することができるベクターとして使用することができる（Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６３４９−６３５３，１９８４）。高レベルの発現は、メタロチオニンＩＩＡプロモーター及びヒートショックプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用することによって達成することができる。
組み換え蛋白質の長期間の高収量の生産のためには、安定な発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は、適当な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニレーション部位など）および選択マーカーで調節された蛍光指示薬ｃＤＮＡで形質転換することができる。組み換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞が染色体にプラスミドを安定に組み込み、成長してコロニーを形成し、これをクローニングして細胞株として樹立することができる。例えば、外来ＤＮＡの導入後、組み換え細胞を富裕培地で１〜２日間増殖させ、その後に選択培地に切り替えることができる。多数の選択系を使用することができるが、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，他，Ｃｅｌｌ，１１：２２３，１９７７）、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６，１９６２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，他，Ｃｅｌｌ，２２：８１７，１９８０）遺伝子をそれぞれ、ｔｋ−，ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ細胞で使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，他，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７，１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅ，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：１５２７，１９８１）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２，１９８１）、アミノグルコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１，１９８１）、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，他，Ｇｅｎｅ，３０：１４７，１９８４）遺伝子の選択の基礎として使用することができる。
近年、さらに別の選択遺伝子が報告されている。例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを使用することを可能にするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを使用することを可能にするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０４７，１９８８）、並びに、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチンに対する耐性を付与するＯＤＣ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  Ｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄ．，１９８７）などが挙げられる。
本発明の蛍光指示薬ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞にＤＮＡ導入することによりインビトロで発現することができる。即ち、本発明の組み換え蛍光蛋白質は、大腸菌などの原核細胞、又は酵母や哺乳動物細胞などの真核細胞において核酸を発現することによって作製することができる。
構築物は、蛍光指示薬の単離を簡単にするためのタグを含んでいてもよい。例えば、６個のヒスチジン残基からなるポリヒスチジンタグを蛍光蛋白質のアミノ末端に付加することができる。ポリヒスチジンタグにより、ニッケルキレートクロマトグラフィーにより一回の操作で蛋白質を簡単に単離することが可能になる。
好ましくは、本発明の蛍光指示薬は、組み換えＤＮＡ技術で作製した融合蛋白質である。ここで、シングルポリペプチドは、ドナー成分、ペプチドリンカー成分及びアクセプター成分を含む。ドナー成分は、ポリペプチド中のアクセプター成分に対してアミノ末端側に位置することができる。そのような融合蛋白質は通常以下のような構造を有する：（アミノ末端）ドナー蛍光蛋白質−ペプチドリンカー成分−アクセプター蛍光蛋白質（カルボキシ末端）。あるいは、ドナー成分は、融合蛋白質中のアクセプター成分に対してカルボキシ末端に位置してもよい。そのような融合蛋白質は通常以下の構造を有する：（アミノ末端）アクセプター蛍光蛋白質−ペプチドリンカー成分−ドナー蛍光蛋白質（カルボキシ末端）。さらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に付加的なアミノ酸配列（例えば、ポリヒスチジンタグなど）を含む融合蛋白質も本発明に包含される。
組み換え核酸によってコードされる蛍光指示薬は、ドナー蛍光蛋白質、アクセプター蛍光蛋白質及びペプチドリンカー成分の発現をコードする配列を含む。各構成要素は、融合蛋白質への発現により、ドナー成分が励起する際にドナー及びアクセプター成分がＦＲＥＴを示すように選択される。組み換え核酸は、組み換え核酸に作動的に連結した発現調節配列を含む発現ベクター内に組み込むことができる。発現ベクターは、適当なプロモーター、複製配列、マーカーなどを含むことによって原核細胞または真核細胞で機能するように構成することができる。
発現ベクターは、組み換え核酸の発現のために宿主細胞にトランスフェクションすることができる。宿主細胞は、蛍光指示薬融合蛋白質を精製するために高レベルの発現のために選択することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はこの目的に有用である。あるいは、宿主細胞は、その他の原核細胞でも真核細胞でもよい。細胞は培養細胞でもインビボの細胞でもよい。以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】Ａ．方法
（１）遺伝子の構築
ｃｐＶｅｎｕｓ変異体の５’領域のｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩ部位を含有するセンスプライマー及び天然のＮ−及びＣ−末端の間にリンカー（ＧＧＳＧＧ）をコードする配列を含むリバースプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにより、これらの３’領域のｃＤＮＡは、リンカーをコードする配列により５’末端を、ＥｃｏＲＩ部位を含む配列により３’末端を、ＰＣＲにより伸長した。ｃｐＶｅｎｕｓ変異体の完全なｃＤＮＡは、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ含有プライマーを有する２種のＰＣＲ産物の混合物を用いて増幅した。制限処理された産物を、ｐＲＳＥＴＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にインフレームでクローニングし、ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、及びｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓを作製した。次いで、ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ又はｃｐ２２９ＶｅｎｕｓのｃＤＮＡの５’末端をＰＣＲにより修飾して、ＳａｃＩ部位を導入した。ＳａｃＩ認識部位によりコードされるこのＮ−末端ＥＬ（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）配列の後ろには、５種の変異体において、Ｍｅｔ残基、次いでそれぞれＴｈｒ４９、Ｇｌｎ１５７、Ａｓｐ１７３、Ｌｅｕ１９５及びＩｌｅ２２９が続いている。ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ断片をＹＣ３．１２／ｐＲＳＥＴＢ中のＶｅｎｕｓをコードしている遺伝子と置換して、それぞれＹＣ３．２０、ＹＣ３．３０、ＹＣ３．６０、ＹＣ３．７０、及びＹＣ３．９０を作製した。ＹＣ２．６０及びＹＣ４．６０は、ＣａＭドメインを交換することにより、ＹＣ３．６０から作製した。哺乳動物での発現のため、ＹＣ３．１２及びＹＣ３．６０のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。ＹＣ３．６０を原形質膜下に局在させるため、Ｋｉ−ＲａｓのＣＡＡＸボックスを、リンカー配列（ＧＴＧＧＳＧＧＧＴＧＧＳＧＧＧＴ）（配列番号４０）を介してＹＣ３．６０のカルボキシル末端に融合させた。
（２）蛋白質発現、インビトロ分光法、Ｃａ２＋及びｐＨ滴定
Ｎ−末端にポリヒスチジンタグを持つ組み換えＹＣ蛋白質を、既報の通り（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．，他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８８２−８８７）、室温でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［ＪＭ１０９（ＤＥ３）］に発現させ、精製し、分光学的に同定した。ＢＥＣＯＮ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、４４０ＤＦ２０励起フィルター及び５３５ＤＦ２５発光フィルターを使用して、定常状態の蛍光分極を測定した。Ｃａ２＋滴定は、０，０９ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ９，Ｎ９四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ９，Ｎ９三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）又はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いて調製したＣａ２＋フリー及びＣａ２＋飽和の緩衝液の相互希釈により実施した。ｐＨ滴定は、既報の通り（Ｎａｇａｉ，Ｔ，他、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，３１９７−３２０２）、ｐＨ５．８〜８．４で調製した一連の緩衝液を用いて行った。
（３）細胞培養及びトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地で増殖させた。細胞に、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＹＣ３．６０又はＹＣ３．１２をコードする発現ベクターをトランスフェクションした。
（４）画像化
トランスフェクション後２〜４日間、Ｈａｎｋの平衡塩溶液緩衝液（ＧＩＢＣＯ）中のＨｅＬａ細胞を画像化した。ＵＡｐｏ４０ｘ，１．３５ＮＡ油浸対物レンズを用いたＩＸ−７０倒立顕微鏡（オリンパス）上で、広視野蛍光観察を行った。ＹＣによる二重発光画像化は、４４０ＤＦ２０励起フィルター、４５５ＤＲＬＰダイクロイックミラー及び、２個の発光フィルター（ＣＦＰに対して４８０ＤＦ３０、ＹＦＰに対して５３５ＤＦ２５）を、フィルター交換装置（Ｌａｍｂｄａ  １０−２，Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて交互に使用して行なった。干渉フィルターはＯｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌから入手した。ＹＣからの蛍光発光を、冷却ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ｆｘ，Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて画像化した。画像の取得及び解析はＭｅｔａｍｏｒｐｈ／Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ５．０ソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて行なった。共焦点ＦＲＥＴビデオ画像は、ＰｌａｎＡｐｏ６０ｘ，１．４ＮＡ油浸対物レンズを備えたＩＸ−７１（オリンパス）、回転円盤型共焦点装置（ＣＳＵ２１，横河）、ダイオードポンプ固体レーザー（４３０ｎｍ，日立）、及び３ＣＣＤカラーカメラ（ＯＲＣＡ−３ＣＣＤ、浜松ホトニクス）を用いて取得した。画像の取得と解析はＡｑｕａｃｏｓｍｏｓ  ２．５ソフトウェア（浜松ホトニクス）を用いて行なった。
Ｂ．結果
（１）ＹＣ３．１２及び新規ＹＣ変異体の構造とスペクトル特性（図１）
野生型のＮ末端及びＣ末端を結合するためのＧＧＳＧＧペプタペプチドリンカーを用いて、Ｖｅｎｕｓに対して円順列変異を行なった。新末端は、β−バレルの表面に露出したループ領域に導入した。ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ、及びｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓは、それぞれＴｈｒ４９、Ｇｌｎ１５７、Ａｓｐ１７３、Ｌｅｕ１９５及びＩｌｅ２２９の新たなＮ末端を有する。細菌及び哺乳類培養細胞で発現した場合、これらの蛋白質は、効率的に成熟し、酸性化に対する耐性は親蛋白質Ｖｅｎｕｓと同程度であった。Ｍｅｔ１、Ｔｈｒ４９、Ｇｌｎ１５３、Ａｓｐ１７３、Ｌｅｕ１９５及びＩｌｅ２２９はβ−バレルの異なる部位に存在するので、Ｖｅｎｕｓに加えてこれらのｃｐＶｅｎｕｓ蛋白質を使用することにより、ＹＣ複合体中でＹＦＰの相対的な空間方向に顕著な変化をもたらすことができる。特に、Ｔｈｒ４９及びＡｓｐ１７３は、他の残基からβ−バレルの他端に移動している（図１Ａ）。
親ＹＣとしては、単相性のＣａ２＋感度のために、ＹＣ３．１２（Ｎａｇａｉ，Ｔ．，他、（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，８７−９０）を初めに使用した。これは、ＣａＭの三番目のＣａ２＋結合部位中に保存されたグルタミン酸（Ｅ１０４）の変異を有し、ＹＣ３グループに属する。ＹＣ３．１２中のＶｅｎｕｓを、ｃｐ４９Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１５７Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓ、ｃｐ１９５Ｖｅｎｕｓ及びｃｐ２２９Ｖｅｎｕｓで置換して、ＹＣ３．２０、ＹＣ３．３０、ＹＣ３．６０、ＹＣ３．７０及びＹＣ３．９０を作製した（図１Ｂ）。これらの新規ＹＣは全て、ＹＣ３．１２と同様に、細菌中で効率的に発現し、フォールディングする。次に、インビトロ実験でこれらのＣａ２＋感度を試験した。意外にも、ＹＣ３．６０では、Ｃａ２＋が０と飽和濃度の間でＣＦＰに対するＹＦＰの放射比が数倍増加し、ＹＣ３．３０、ＹＣ３．７０及びＹＣ３．９０ではＹＣ３．１２と同様のダイナミックレンジを示した。ＹＣ３．２０はＣａ２＋に僅かな応答のみを示した（図１Ｃ）。Ｖｅｎｕｓの代わりにｃｐ１７３Ｖｅｎｕｓに置換すると、一般的にはＣＦＰからのＦＲＥＴに好適であったが、この効果は、複合体のＣａ２＋欠乏型（Ｒｍｉｎ：０．８７（ＹＣ３．１２）対１．４（ＹＣ３．６０））の場合よりも複合体のＣａ２＋飽和型（Ｒｍａｘ：１．８（ＹＣ３．１２）対９．３（ＹＣ３．６０））の場合の方が顕著であった（表２Ａ）。ＣＦＰとＹＦＰの発色団の間の相対角度を試験するために、ＣＦＰの４４０ｎｍにおける励起と、ＹＦＰの５３５ｎｍにおける発光により、定常状態の偏光度（異方性）を測定した。Ｃａ２＋依存性の異方性の減少は、ＣＦＰに対するＹＦＰの発光比の増加と相関していた（図１Ｄ）。
ＹＣ３．６０の発光比（５３５／４８０）は、見掛けの解離定数（Ｋ’ｄ）が０．２５μＭ，Ｈｉｌｌ定数（ｎ）が１．７と共に単相性のＣａ２＋依存性を示した（図１Ｅ、丸）。ＹＣ３．６０のＣａ２＋親和性を変化させるために、変異型ＣａＭを野生型ＣａＭ又は一番目のＣａ２＋結合ループに変異を含有するＣａＭ（Ｅ３１Ｑ）の何れかで置換した（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．，他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８８２−８８７）。得られたＹＣは、ＹＣ２及びＹＣ４グループに属し、それぞれＹＣ２．６０及びＹＣ４．６０と称する。ＹＣ２．６０はほぼ単相性の応答を示した（Ｋ’ｄ，４０ｎＭ；ｎ，２．４）。０．２〜０．３μＭにおいて、滴定曲線に小さな窪みがあり（図１Ｅ、三角）、元のＣａＭ−Ｍ１３ハイブリッド蛋白質の二相性のＣａ２＋感度が連想させる（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．，他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８８２−８８７；及びＰｏｒｕｍｂ，Ｔ．，他、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７，１０９−１１５）。既報の通り（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．，他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，８８２−８８７；及びＰｏｒｕｍｂ，Ｔ．，他、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７，１０９−１１５）、ＹＣ４．６０中のＥ３１Ｑは、明白な二相性の応答（Ｋ’ｄ，５８ｎＭ；ｎ，１．７；Ｋ’ｄ，１４．４μＭ；ｎ，０．８７）と共に著しく低いＣａ２＋親和性を示した（図１Ｅ、四角）。ＹＣ３．６０で達成された高いダイナミックレンジ（５７０％）はＹＣ２．６０で維持されたが、ＹＣ４．６０（ダイナミックレンジ、３６０％）においては若干減衰した。ＹＣ４．６０の高親和性成分及び低親和性成分は、応答の４１％及び５９％に寄与していた。ｃｐＶｅｎｕｓ蛋白質は、ＥＹＦＰ−Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ（ＥＹＦＰ．１）又はＶｅｎｕｓと同様の酸感度（ｐＫａ＝６．０）を示したので、ＹＣ３．６０は、ＹＣ３．１及びＹＣ３．１２と同じｐＨ耐性であることが期待された。図１ＦのｐＨ滴定曲線は、生理的なｐＨ範囲（６．５〜８．２）においてＣａ２＋の存在下及び非存在下においてＹＦＰ／ＣＦＰ比が有意に変化しないことを示している。しかし、ＹＣ３．１及びＹＣ３．１２と比較すると、ＹＣ３．６０はｐＨ変化によってノイズを圧倒する大きなＣａ２＋依存性応答を示し、Ｓ／Ｎ比が著しく向上する。ＹＣの変異体の特性を表２Ａ及び２Ｂに示す。表２のＡは、従来のＹＣ変異体及び新規のＹＣ変異体のＣａ２＋応答を示す。表２のＢは、ＹＣ３．６０及びその誘導体の対Ｃａ２＋親和性を示す。
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（２）ＹＣ３．６０及びＹＣ３．１２を発現しているＨｅＬａ細胞中のＣａ２動態の比較測定（図２）
ＹＣ３．１２よりもＹＣ３．６０が優位であることは、ＨｅＬａ細胞の細胞質内の遊離Ｃａ２＋の濃度（［Ｃａ２＋］ｃｓ）を観察した実験において、明暸に実証された。ＹＣ３．６０又はＹＣ３．１２をコードする同量のｃＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞は、細胞質内区画において明るさの等しい蛍光シグナルを産生した（それぞれ図２Ａ及び２Ｂ）。図２Ｃ及び２Ｄは、それぞれＹＣ３．６０及びＹＣ３．１２を発現しているＨｅＬａ細胞由来の空間平均ＹＦＰ／ＣＦＰ比の時間経過を示す。ＹＣ３．６０は、ＹＣ３．１２よりも、超極大量のＡＴＰ（３０μＭ）に対する応答が非常に大きく、Ｒｍｉｎに対するＲｍａｘの比率はほぼ６倍大きかった。この比較は、２種のＹＣ間でのＣａ２＋親和性の差異も示している（ＹＣ３．６０ではＫ’ｄ＝０．２５μＭであるのに対し、ＹＣ３．１２ではＫ’ｄ＝１．２５μＭ）。ＹＣ３．６０のＲｍａｘ値及びＲｍｉｎ値は共に、ＹＣ３．１２では対応する値において細胞間でのバラつきが見られるのに対して、図３Ａに示した３種の細胞及びＨｅＬａ細胞においては、同じ顕微鏡システムで実施した４回の他の実験において変化しなかった。（Ｒｍａｘ，８．０６±０．１６，ｎ＝１２；Ｒｍｉｎ，１．３７±０．１０，ｎ＝１２）。
（３）ＹＣ３．６０を用いたＨｅＬａ細胞中の［Ｃａ２＋］ｃおよび［Ｃａ２＋］ｐｍの共焦点画像化
ＹＣ３．６０の大きなダイナミックレンジと明るさは、［Ｃａ２＋］ｃ画像化の時間的及び空間的な両方の解像度の実質的な改良を可能にする。ＹＦＰとＣＦＰの画像を迅速かつ同時に得るために、３個のＣＣＤチップ（ＲＧＢ：赤、緑及び青）及びプリズ厶で構成されるカラーカメラを用いた。画像化のために、ＹＦＰおよびＣＦＰ画像は、それぞれＧ及びＢチップで捕捉した。また、ｚ軸に沿う空間解像度を改良するために、カメラの前に回転ディスクユニットを置いた。ＹＣ３．６０を発現するＨｅＬａ細胞の共焦点の実色画像を図３Ｂに示す。蛍光は細胞質内区画に均一に分布したが、ミトコンドリア並びに核からは除外されていた。ビデオ速度で得た一連の疑似色の比率画像（図３Ａ）は、ヒスタミンによる刺激後に、［Ｃａ２＋］ｃの増加が個々の細胞内に出現して増加していく様子を示す。増殖速度は、一個の細胞内の６列に並んだ関心領域（ＲＯＩ）の［Ｃａ２＋］ｃの時間経過から３０μｍ／ｓであると計算された（図３Ｂ及び３Ｃ）。
ＹＣ３．６０の利点を実証するために、Ｋｉ−Ｒａｓの膜アンカー配列を指示薬のＣ−末端に融合させすることにより、ＹＣ３．６０を原形質膜へターゲッティングさせた（ＹＣ３．６０ｐｍ）。同様の膜ターゲッティング手法を用いた場合、従来のＹＣでは原形質膜下のＣａ２＋動態を観察できなかった。ＹＣ３．６０ｐｍの蛍光は周辺構造及び糸状足構造まで分布していた（図３Ｄ）。原形質膜下の遊離Ｃａ２＋度（［Ｃａ２＋］ｐｍ）を定量的に測定した（図３Ｅ）。ヒスタミンの適用前の［Ｃａ２＋］ｐｍは［Ｃａ２＋］ｃの基礎量より僅かに高かった。これは、顕微鏡では見えない環境中に高［Ｃａ２＋］のマイクロドメインが存在することを示唆している可能性がある（Ｍａｒｓａｕｌｔ，Ｒ．，他、（１９９７）ＥＭＢＯ  Ｊ．１６，１５７５−１５８１）。［Ｃａ２＋］ｐｍにおける同様の変化が糸状足構造体においても観察された（図３Ｆ）。
【産業上の利用可能性】  本発明の蛍光指示薬においては、円順列突然変異を施した蛍光蛋白質を用いることにより、エネルギー供与体とエネルギー受容体との相対的位置関係について多様化させることができるようになった。その結果、様々な蛍光指示薬において、ダイナミックレンジを増大することが可能になった。さらに本発明の蛍光指示薬は、細胞又は生体への遺伝子導入によりｉｎ  ｓｉｔｕで作製することができるため、大量の可溶性組み換え蛋白質を発現及び精製し、それをインビトロで精製及び標識し、細胞にマイクロインジェクションで戻す必要がない。また、本発明の蛍光指示薬は、細胞構造を標的とすることができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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