(57)【要約】肝細胞は樹立化が困難であるので、増殖手法が確立している間葉系幹細胞、特に、骨髄由来の間葉系幹細胞であるストローマ細胞を用いて、肝細胞に分化させ、肝障害の肝細胞移植治療法に役立つ肝細胞を調製する手段を提供することを課題とする。  薬剤投与を継続することにより慢性の肝障害を起こした哺乳動物、例えば、ラットの肝臓に、ヒト間葉系幹細胞を移植することで、ヒト間葉系幹細胞を肝細胞、成熟肝細胞に分化できることを見出し、間葉系幹細胞から成熟肝細胞へ分化させる手段を開発した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、慢性肝障害組織を用いて肝細胞に分化させる方法。
【請求項２】
慢性肝障害組織が、肝細胞障害性薬剤を哺乳動物に長期間投与することにより哺乳動物の肝臓に生じた慢性肝障害組織である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を肝細胞に分化させる、次の（１）から（３）の工程を含む方法。
（１）肝細胞障害性薬剤を哺乳動物に投与する工程
（２）間葉系細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を当該哺乳動物の肝臓に移植する工程
（３）肝細胞障害性薬剤を継続的に当該哺乳動物に投与する工程
【請求項４】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞がヒト由来の間葉系幹細胞である請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
間葉系幹細胞がヒト由来の間葉系幹細胞である請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞がｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼの触媒活性サブユニット）を導入した間葉系幹細胞である請求項１〜５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
肝細胞障害性薬剤が、アリルアルコールである請求項２〜６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞の移植前に免疫抑制剤を投与する請求項２〜７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
間葉系細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を肝臓に局部注射する請求項２〜８いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がラットである請求項２〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項記載の方法で分化された肝細胞を間葉系幹細胞由来の肝細胞に特異的標識により、分別して回収する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０いずれか１項記載の方法により分化された肝細胞。
【請求項１３】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞から分化した肝細胞を有効成分として含む肝障害治療剤。
【請求項１４】
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を有効成分として含む肝障害治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、間葉系細胞の肝細胞への分化技術に関する。本発明は、更に、肝障害を受けた人を含む動物に対する、肝臓再生医療技術に関する。
【背景技術】  肝臓は、人体の生化学工場とも呼ばれ、体内で栄養に関係深い中間代謝、胆汁生成、血液成分の生成・変換、解毒等多様な生化学機能を持つ、重要な臓器である。
ところが、アルコール、ウイルス、薬物、又は自己免疫疾患等により肝臓に障害が起きると、肝炎、更に肝硬変となり、時に重大な結果を招く。
例えば、アルコール性肝障害では、アルコール性飲料の慢性過剰摂取によって肝臓の細胞に障害が起き、脂肪肝、アルコール性肝炎、さらに終末的な肝硬変と進行する。１日に摂取するアルコール量が６０〜８０ｇ以上あると、脂肪肝が発生する可能性が高く、１日あたり１００〜１２０ｇ以上のアルコールを１０年以上摂取すると肝硬変を発生するといわれている。
従来の肝障害治療においては、（１）肝障害の原因となるアルコールなどの毒物を排除する、（２）ビタミン等の補給により肝細胞の自然再生を待つ、（３）薬剤による治療としては、（ｉ）グリチルリチン製剤（肝臓の働きを守る）、（ｉｉ）小柴胡湯（肝臓の炎症軽減、肝機能改善）、（ｉｉｉ）胆汁酸製剤（胆石や胆汁鬱滞による肝障害に有用）、（４）ウイルス性肝炎への治療薬としては、（ｉ）インターフェロン、（ｉｉ）レベトール（抗ウイルス薬、インターフェロンとの併用：ウイルス量の多いＣ型慢性肝炎用）、（ｉｉｉ）ラミブジン（抗ウイルス薬、Ｂ型肝炎用、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）、及び（５）生体肝移植などの方法がある。
また、アルカリフォスファターゼ陽性ラット幹細胞様セルラインをインビトロで肝細胞系統に分化させたことが非特許文献１に、成人多能細胞からの肝細胞への分化が非特許文献２に報告されている。
さらに、分化誘導剤を用いて、骨髄細胞を肝実質細胞に分化させることについては、特許文献１に記載されている。
【特許文献１】特開２００２−７８４８２号
【非特許文献１】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｖｏｌ．２１，ｐ．４２８−４３６
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１０９，ｐ．１２９１−１３０２
【発明の開示】
肝臓治療の薬物療法は、対症療法にすぎず、十分ではなく、他方、細胞移植治療法に必要な、肝細胞及びＭＡＰＣ（多能性成人前駆細胞：Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）は、樹立化が困難である。
そこで、増殖手法が確立している間葉系幹細胞、特に、骨髄由来の間葉系幹細胞であるストローマ細胞を用いて、肝細胞に分化させ、肝障害の肝細胞移植治療法に役立つ肝細胞を調製する手段を提供することを課題としている。
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、薬剤投与を継続することにより慢性の肝障害を起こした哺乳動物、例えば、ラットの肝臓に移植することで、肝細胞、成熟肝細胞に分化することを見出し、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞から成熟肝細胞へ分化せせる手段を開発した。
本件発明によれば、十分量入手可能な、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を用いて、成熟型の肝細胞を調製することができる。これにより、例えば、個人から調製した間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞から肝細胞を分化させ、個人別の肝細胞遺伝子プロファイルが作成でき、テイラーメイド医療に役立てることもできる。また、肝細胞を多量に調製できるので、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖機構の分析、更には、抗ウイルス剤の作用機序の解析にも用いることができる。更に、従来得られなかったヒト正常成熟肝細胞が多量に得られるので、薬剤スクリーニング、薬剤毒性試験に用いることもできる。又更に、分離され、回収されたヒト肝細胞を用いて、肝不全・先天的代謝肝疾患者に移植する細胞治療若しくは人工肝臓の製造にも用いることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３０３２２９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒト間葉系幹細胞の調製
図２は、慢性肝障害を引き起こすアリルアルコールの投与方法
図３は、ヒト間葉系幹細胞の移植後１４日目の抗体染色
図４は、ヒト間葉系幹細胞の移植後２８日目の抗体染色
図５は、ヒト間葉系幹細胞を移植したラット肝臓中におけるヒトアルブミンの発現
図６は、ヒト間葉系幹細胞を移植したラット肝臓中におけるヒトアルファフィトプロテインの発現
図７は、ヒトアルブミンの生産量
図８は、ヒト間葉系幹細胞、ヒトＣＤ３４＋細胞又は非間葉系細胞／非ＣＤ３４＋細胞をアリルアルコール処理を１回又は継続的に行った場合の、ヒト肝細胞への分化の有無
図９は、ＴＥＲＴ導入ヒト間葉系肝細胞（ＭＳＣ）の肝分化（ＴＥＲＴ導入ＭＳＣの肝分化）
【発明を実施するための最良の形態】  本件発明は、間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ；ＭＳＣとも言う）、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、薬剤投与を継続することにより慢性の肝障害を起こした哺乳動物に移植することで、肝細胞、成熟肝細胞に分化させる、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞の肝細胞への分化方法を提供する。
本発明では、また、間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、急性の肝障害を起こした哺乳動物に移植し、移植後に肝障害性薬剤を継続的に投与することにより、肝障害を慢性化させると共に、移植した間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を成熟肝細胞に分化させる方法を提供する。
［間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞、間葉系細胞］
間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞としては、任意の哺乳類由来の間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を用いることができるが、好適には、ヒト又は、実験動物として常用される、マウス、ラット、サルなどが挙げられる。
間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、血液、臍帯血、更には、種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細胞を用いることができる。また、ＥＳ細胞やテラトーマ細胞からも間葉系幹細胞が分離できることが知られている。ここで、幹細胞とは、全能性を有する全ての細胞に分化できる全能性幹細胞や、胎児性幹細胞のように三胚葉の系統には分化できるが胚外栄養膜細胞への分化は限定的であるｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙである幹細胞、更には、ある組織の多くの細胞に分化することができる多能性幹細胞などがあるが、間葉系幹細胞は、ｐｌｕｉｒｉｐｏｔｅｎｔであると考えられている。
間葉系幹細胞として、好適には、骨髄の初期培養を行い、カルチャーディッシュの底面に付着した間質細胞から取得する幹細胞を用いることができる。
間葉系細胞の前駆細胞とは、間葉系幹細胞から分化し、間葉系細胞への分化の途上にある細胞のことを意味する。
間葉系細胞は、間葉系幹細胞の分化により生じ、幹細胞のように多方面に分化する能力はないが、ある方向への分化能力と増殖能力を有している細胞である。正常の状態ではＧ０期に止まっているが、刺激によりＧ１期（分裂開始）に移行できる細胞である。間葉系細胞は、例えば、ストローマ細胞、ストローマ細胞の性質を有する細胞も包含している。間葉系細胞は、皮下組織、肺、肝等あらゆる臓器に存在しており、骨、軟骨、脂肪、腱、骨格筋、骨随間質と言った間葉系組織に存在している。
更に、本件発明においては、不死化遺伝子、例えば、テロメラーゼ又はテロメラーゼの発現又は活性を調節する遺伝子、好適には、ヒトテロメラーゼ又はヒトテロメラーゼ触媒活性サブユニット（ｈＴＥＲＴ）を用いて、不死化した上記間葉系幹細胞、間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を用いることができる。
不死化遺伝子を、ストローマ細胞等、間葉系幹細胞等への導入方法としては、公知の種々の方法を用いることができるが、例えば、不死化遺伝子をプラスミドベクターに組み込み、当該ベクターをカルシウムーリン酸の存在下でストローマ細胞のような間葉系細胞、間葉系幹細胞等に導入して、形質転換する方法、或いは不死化遺伝子をリポソームの様なベシクルとともに、間葉系細胞又は間葉系幹細胞に接触させ導入する方法、更に、不死化遺伝子の存在下でエレクトロポレーションにより導入する方法、又は不死化遺伝子を各種ウイルスベクターに組み込み、間葉系細胞若しくは間葉系幹細胞等に感染させて導入する方法などを用いることができる。
ウイルスベクターを用いる導入方法としては、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスを用いる方法があり、レトロウイルスベクターとしては、ＭｏＭＬＶウイルスを用いる方法などがある。好適には、ｐＢａｂｅベクターを用いることができる。
更に、不死化した細胞をヒトの治療に用いる場合、不死化遺伝子などの外来遺伝子はできるだけ除去しておいた方が安全性が高いと考えられ、既に確立した技術により、細胞に導入した不死化遺伝子を除去することができる。例えば、好適には、不死化遺伝子がｌｏｘＰ配列またはｌｏｘＰ様配列にはさまれて、Ｃｒｅリコンビナーゼなどのリコンビナーゼ処理により特異的に除去する手法を用いることができる。
ヒト間葉系幹細胞としては、好適には、骨髄由来の間葉系幹細胞を用いることができる。
［移植対象動物、慢性肝障害手段］
以下、間葉系幹細胞について説明するが、間葉系前駆細胞、間葉系細胞を用いても同様に、肝細胞に分化させることができる。
間葉系幹細胞の肝細胞への分化に有効な環境を与える慢性肝障害組織を提供する、哺乳動物（以下移植対象動物と呼ぶ）としては、種々の実験動物を用いることができるが、例えば、好適には、マウス、ＳＣＩＤマウス、ラット等、特に好適には、ＳＤラットを用いることができる。なお、ラットに関しては、なるべく週齢の若いもの、例えば、４週から６週齢のものが好適である。
肝障害性薬剤としては、肝障害を与える種々の薬物を用いることができ、例えば、ｃｈｏｌｉｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＣＤ）ｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ（ＤＭＮ）、Ｊｏ２抗体（抗Ｆａｓ抗体；アポトーシス誘導）が肝臓障害剤として知られており、好適には、アリルアルコール（Ａｌｌｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ）、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、四塩化炭素（ＣＣｌ４）及び２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ（２−ＡＡＦ）を組み合わせて、又は肝部分切除し２−ＡＡＦを用いることができ、特に好適には、アリルアルコール（Ａｌｌｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ）用いることが望ましい。アリルアルコールは、特に門脈周囲の肝細胞をネクローシスにより傷害する効果がある。
間葉系幹細胞の由来哺乳動物と、移植対象哺乳動物とが同じ動物でない場合は、移植における免疫反応の低減のために、免疫抑制剤を予め、好適には、間葉系幹細胞の移植１〜２日前に、移植対象動物に投与することが望ましい。
移植対象動物への移植方法としては、例えば、間葉系細胞含有溶液を上記対象動物の肝臓に局部注射、門脈内注射、尾静脈注射を採用することができる。
肝障害剤により肝障害を慢性化させる場合、間葉系幹細胞の移植時期としては、肝障害性薬剤の影響があるので、早くとも最初の肝障害性薬剤を対象動物に投与後２４時間後から３日以内に、好適には、１日後に移植することができる。
なお、既に慢性の肝障害を有する肝臓、例えば、ウイルソン病肝硬変モデルであるＬＥＣラットや高チロシン血症による肝障害をきたすＦＡＨ−／−マウスの肝臓に移植することもできる。
移植対象動物において、肝障害を慢性化させる手段としては、間葉系幹細胞を移植対象動物に移植後、肝障害性薬剤の投与を続けて肝障害を慢性化する方法がある。
肝障害性薬剤の投与量としては、第一回目の投与は、肝臓に急性に障害を与えるが、動物の生存に影響しない程度に十分な程度の量を選択することができ、例えば、アリルアルコールをラットに用いる場合は、０．５ｍｍｏｌ／Ｋｇ〜０．７ｍｍｏｌ／Ｋｇ程度、好適には、０．６ｍｍｏｌ／Ｋｇ程度の量を採用することができる。第２回目以降の投与は、肝障害性薬剤が肝障害を慢性化するために十分な量とすることができ、例えば、アリルアルコールを用いる場合は、０．３ｍｍｏｌ／Ｋｇとすることができる。
肝障害性薬剤の投与形態としては、その薬剤により好適な投与方法を選択することができるが、例えば、経口投与、静脈注射、腹腔注射によることができ、アリルアルコールをラットに投与する場合は、好適には腹腔注射によることができる。
肝障害性薬剤の投与期間は、肝障害を慢性化させるのに十分な期間投与する。好適には、間葉系幹細胞が成熟肝細胞に分化するのに必要な期間、例えば、２週間〜３月間、好適には３〜５週間、更に好適には、４週間投与数することができる。例えば、肝障害薬剤としてアリルアルコールを用い、ヒト間葉系幹細胞をラットに移植する場合には、０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの腹腔内注射を、週３回、１月間続けることことができる。
［肝細胞への分化の確認］
未分化肝細胞（未熟肝細胞）のマーカー（標識）としては、ＧＳＴ−Ｐ、サイトケラチン１９、α−フェトプロテインがあり、これらマーカーの検出には、これらマーカーに対する抗体、又はマーカーをコードする遺伝子特異的なプライマー若しくはプローブを用いることができる。又、更に、γ−ＧＴＰ染色により、未分化肝細胞（未熟肝細胞）を分別することもできる。
成熟肝細胞のマーカー（標識）としては、アルブミン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、ＣＫ１８、ＡＧＰＲ等があり、これらマーカーは、該マーカーに対する抗体又マーカーをコードする遺伝子特異的なプライマー若しくはプローブを用いて検出することができる。
なお、抗アルブミン抗体、抗ＡＦＰ（αフィトプロテイン）抗体、抗ＣＫ１９抗体（ＣＫはサイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）の略。  以下同じ。）、抗ＣＫ１８抗体、抗ＡＧＰＲ抗体（ＡＧＰＲは、アシアログリコプロテイン  レセプター（ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の略。以下同じ。）等との反応性の比較により、未分化、成熟の検討ができる。
更に、間葉系幹細胞が由来する動物とは異なる動物の肝臓へ、間葉系幹細胞を移植した場合、例えば、ヒト間葉系幹細胞をラットの肝障害肝臓へ移植する場合は、間葉系細胞由来の動物特異的捏上記成熟肝細胞マーカー特異的な抗体、ヒトアルブミン特異的抗体を用いて、免疫染色法、免疫酵素染色法、サンドイッチ抗体法などの方法により確認することができる。
又マーカー特異的プライマーを用いる場合は、遺伝子増幅法、例えば、ＰＣＲを用いることができる。
［分化した肝細胞の回収］
例えば、実験動物から肝臓を摘出し、肝細胞に分離し、間葉系細胞が由来する動物に特異的でかつ成熟肝細胞特異的である蛍光標識した抗体や細胞表面マーカー（ＨＬＡなど）に対する抗体で処理し、蛍光細胞分別機（ＦＡＣＳ）で、間葉系幹細胞から分化した成熟肝細胞を単離することができる。
ヒトテロメラーゼを導入して、不死化したＴＥＲＴ導入ＭＳＣを上述の方法で肝に分化させ、灌流分離したものを培養する。ラット由来の肝細胞は通常一週間程度で死滅することから、残存した細胞が間葉系幹細胞から分化した成熟肝細胞である。これを適当な培地で培養増殖させる。
［分化した肝細胞の利用］
個人から調製した間葉系幹細胞から分化させた肝細胞を回収し、個人別の肝細胞遺伝子プロファイルが作成でき、テイラーメイド医療に役立てることもできる。また、肝細胞を多量に調製できるので、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖機構の分析、更には、抗ウイルス剤の作用機序の解析にも用いることができる。更に、従来得られなかったヒト正常成熟肝細胞が多量に得られるので、薬剤スクリーニング、薬剤毒性試験に用いることもできる。
又更に、分離され、回収されたヒト肝細胞を用いて、肝不全・先天的代謝肝疾患者に移植する細胞治療若しくは人工肝臓の製造にも用いることができる。
［間葉系幹細胞を用いた細胞治療剤］
又、間葉系幹細胞は、慢性肝炎の細胞治療に、適切な担体と共に、肝臓疾患部に直接投与する、細胞治療剤として用いることもできる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、実施例は本発明の一態様にすぎず、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】［間葉系幹細胞から肝細胞への分化］
１−１  間葉系幹細胞（ＭＳＣ）：
健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、比重遠心法により単核球を採取、１０％非働化胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭにて一晩培養。翌日より付着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を培養する。２週後にＴ−Ｅ（トリプシンーＥＤＴＡ）にて細胞を回収したものを初代間葉系幹細胞とし凍結保存した。初代培養の間葉系幹細胞は、１０％非働化胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭで継代培養し、初代培養からＰＤ６から９（６から９回の世代分裂ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇを経た時期）で、以下の実験に使用した（図１）。
１−２  実験動物：
日本チャールズリバーより購入したＳｐｒａｇｎｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（５週齢，雌もしくは雄）を使用した。
１−３  肝障害モデルとＭＳＣ投与法：
ＭＳＣ投与前々日（ｄａｙ−１）よりサイクロスポリンＡ、（ＣｙＡ、サンディミュンＳａｎｄｉｍｍｕｎ：ノバルティスファーマより購入）１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで腹腔内投与を開始した。さらに翌日（ｄａｙ−０）肝障害を起こすためにＹａｖｏｒｋｏｖｓｋｙら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １９９５；２１：１７０２−１７１２）の報告に基づきａｌｌｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（ＡＡ）（０．６２ｍｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内投与した。翌々日（ｄａｙ  １）、２ｘ１０６細胞／３００ｕｌに調整したＭＳＣ（間葉系幹細胞）を２３Ｇ注射器を用いてラット肝臓に直接局所注入した。その後、ＡＡ（０．３ｍｍｏｌ／ｋｇ）週３回投与による慢性肝障害を行った（図２）。
２  肝細胞への分化の確認
ヒト肝細胞への分化の確認は、１）ヒト特異的な肝特異マーカーによる染色すること，２）ヒト特異的なアルブミン（Ａｌｂ）及びアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のｍＲＮＡを検出すること，並びに３）ヒト特異的なアルブミン蛋白の産生をＥＬＩＳＡ法での検出により、行った。
２−１  ヒト肝臓特異マーカーによる染色：
ＭＳＣ投与から１４日目（ｄａｙ  １４）と２８日目（ｄａｙ  ２８）に屠殺し、肝臓を４％パラホルムアルデヒドで灌流固定しＯＴＣ  ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋後、凍結切片（６μｍ）を作製した。これらを予めラット肝臓組織と交差反応しない事を確かめた抗ヒトＡｌｂ（アルブミン）抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ６６８４），抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８４５２），抗ヒトＣＫ１９抗体（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ６９３０），抗ヒトＣＫ１８抗体（ＰＲＯＧＥＮ社，ＲＣＫ１０６），ＡＧＰＲ抗体（Ｋｏｈｇｏら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １９９３；１２．５９１−５９８）とコントロール抗体で染色を用いて免疫染色した。
図３にＭＳＣ移植後１４目の結果を４００倍の倍率で示す。図３の上段，中段に示すように、径２０−２５μｍ程度の抗ヒトＡＦＰ抗体，坑ヒトＣＫ１９抗体，坑ヒトＡｌｂ抗体，坑ヒトＣＫ１８抗体，又は抗ＡＧＰＲ抗体の陽性細胞が同一切片上で５０から８０個程度のクラスター状に認められた。コントロール抗体では染色は認められなかった。下段に示す蛍光免疫染色では，赤で示されるローダミン（Ｒｏｄａｍｉｎｅ）標識抗ヒトＡＦＰ抗体（左側）と緑で示されるＦＩＴＣ標識抗ヒトＡｌｂ抗体（中央）で染色され、右側に示すこれらの重ね合わせ（マージ）像では、黄色に見えることから、これらの移植ＭＳＣはＡＦＰとＡｌｂを発現しているものと考えられた。これらの染色パターンは比較的未分化なヒト肝細胞であることを示している。
図４にＭＳＣ移植後２８日後の免疫染色の結果を示す。１４日後と同様に４００倍の倍率であるが、上段，中段に示すように、径２５−３０μｍの坑ヒトＡｌｂ抗体，坑ヒトＣＫ１８抗体，又はＡＧＰＲ抗体の陽性細胞が同一切片上で３００個以上のクラスター状に認められた。一方，坑ヒトＡＦＰ抗体，又は抗ヒトＣＫ１９抗体の陽性細胞はわずかに散見されるのみであった。下段に示す蛍光免疫染色では、同様に赤で示されるＲｏｄａｍｉｎｅ標識抗ヒトＡＦＰ抗体陽性細胞が一部に認められＦＩＴＣ標識抗ヒトＡｌｂ抗体では全体に染色された（中央）。右側に示すマージ像では，ＡＦＰ抗体陽性細胞部分は黄色に見えることから、これらの移植ＭＳＣのほとんどはＡｌｂを発現しているが一部にＡＦＰの発現も残存しているものと考えられた。これらの染色パターンはヒト成熟肝細胞を示すものである。
２−２ヒト特異的なアルブミン（Ａｌｂ），ならびにアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）のｍＲＮＡの検出
肝組織からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型にして、ヒト特異的Ａｌｂ、ＡＦＰについて、対応するプライマーを用いてＰＣＲを行い、バンドの増幅をアガロースゲル電気泳動にて確認した。
プライマー配列としては、ヒトアルブミン用のプライマーセンス鎖（Ｈｕ−Ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓ））として５’−ｃｔｔｃｇｔｃｔｇｃｃａａａｃａｇａｇａｃｔｃａ−３’（２４ｍｅｒ）を、ヒトアルブミン用プライマーアンチセンス鎖（Ｈｕ−Ａｌｂｕｍｉｎ（ＡＳ））として５’−ａｃａｇａｇｔａａｔｃａｇｇａｔｇｃｃｔｔｃｔｔｇ−３’（２５ｍｅｒ）を、ヒトアルファフィトプロテイン用プライマーセンス鎖（Ｈｕ−ＡＦＰ（Ｓ））として５’−ｔｔｇｇａｇａａｇｔａｃｇｇａｃａｔｔｃａｇａｃｔ−３’（２５ｍｅｒ）を、及びヒトアルファフィトプロテイン用プライマーアンチセンス鎖（Ｈｕ−ＡＦＰ（ＡＳ））として５’−ｇａｃｔｃａｇｔｔｔａｇｔａａｃａｇｔｔａｔｇｇｃｔ−３’（２６ｍｅｒ）を用いた。ＤＮＡ試料は９４度で５分間変性し、９４度で１分（変性）、６５度で１分（アニーリング）、更に７２度で３０秒（伸長）からなるサイクルを４０サイクルし増幅した。増幅産物は、２．５％アガロースゲル電気泳動上でエチジウムブロマイド染色でＡｌｂは４８２ｂｐ，ＡＦＰは４２０ｂｐのバンドとして可視化される（図５，６）。
Ａｌｂの発現を検討した図５では、１；肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞（ポジテイブコントロール）、２；ラット肝臓（ネガテイブコントロール）、３；ＭＳＣを肝局注後，週三回のＡＡ投与したもの、４；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、５；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、６；ＭＳＣを肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、７；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、及び８；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、を示している。ＭＳＣ投与後１４日目（Ｄａｙ  １４）及び２８日目（Ｄａｙ  ２８）ではＭＳＣを肝局注後、週三回のＡＡ投与したもののみヒトＡｌｂのバンドが示された。
ＡＦＰの発現を検討した図６では、１；肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞（ポジテイブコントロール）、２；ラット胎児肝臓（ネガテイブコントロール）、３；ＭＳＣを肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、４；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、５；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、６；ＭＳＣを肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、７；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、及び８；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、を示している。Ｄａｙ  １４ではＭＳＣを肝局注後、週三回のＡＡ投与したもののみヒトＡＦＰのバンドが示されたが、Ｄａｙ  ２８では認めなかった。
２−３  ヒト特異的なアルブミン蛋白の産生をＥＬＩＳＡ法で検出
次に移植ヒトＭＳＣが実際にヒトＡｌｂを産生しているか、すなわち機能しているか（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌなものであるか）どうかを確認するためＭＳＣ局注部の肝組織１０ｍｇを採取し、そのホモジェネイトを用いてヒト特異的なＡｌｂ蛋白を検出可能なヒトアルブミンＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｔｅｘａｓ）で検討した。
Ａｌｂの産生を検討した図７では、右から順に１；ヒト肝組織（ポジテイブコントロール）、２；ラット肝臓（ネガテイブコントロール）、３；ＭＳＣを肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、４；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、週三回のＡＡ投与したもの、５；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後，週三回のＡＡ投与したもの、６；ＭＳＣを肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、７；コントロールとしたＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、及び８；コントロールとしたＭＳＣとＣＤ３４を除いたＮｏｎ−ＭＳＣ／ｎｏｎ−ＣＤ３４＋細胞を肝局注後、一度のみＡＡ投与したもの、を示している。
ＭＳＣ移植ＡＡ持続投与肝障害ラットでは移植後１４日目にヒトＡｌｂの産生が４ｎｇ／ｍｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ／ｍｌ，移植後２８日後の肝組織中に７．６ｎｇ／ｍｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ／ｍｌと他のコントロールと比較し有意に増加しヒト肝組織に近いヒトＡｌｂの産生を確認した。
３．結論
アリルアルコール（ＡＡ）を用いた肝障害においては、急性肝炎群ではなくＡＡを週３回投与する慢性肝障害モデルにおいてＭＳＣの肝分化が示された。このことはＡＡによる持続肝障害がＭＳＣの肝臓への分化誘導に好適な環境であることを示すものと考えられた。
他方ＭＳＣ以外の骨髄分画を局注した系ではいずれの肝障害モデルにおいても肝への分化が認められなかった。このことは、これまでの報告（Ｗａｎｇ  Ｘら．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００２；１６１：５６５−５７４．）で示されているように、ＨＳＣ（造血幹細胞：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）や骨髄細胞を用いた肝分化には放射線（ｒａｄｉａｔｏｎ）による骨髄細胞の除去（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｂｌａｔｉｏｎ）を行い移植細胞の骨髄生着をさせることが必須であることを裏付ける結果であると考えられる。
【実施例２】ＴＥＲＴ導入ＭＳＣの肝分化
ｋａｗａｎｏら（Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１，５３２−４０）の方法に基づき、以下の参考例１に記載の方法で、調製したｈＴＥＲＴを導入したＭＳＣ（ＴＥＲＴ−ＭＳＣ）を作製し、実施例１の方法で肝に局注後２８日後に観察した。
その結果、図９に示されるように、正常のラット肝組織中にヒトアルブミンの発現を呈する細胞が確認され、成熟肝細胞に分化したものと考えられた。
【実施例３】間葉性幹細胞由来肝細胞様細胞の灌流による分離
（１）  ｈＴＥＲＴ遺伝子の導入された間葉性幹細胞由来（ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ）を肝臓内に局注したラット（実施例２）を、局注後２８日に深麻酔下に剃毛後開腹し、門脈より３７℃  ＥＧＴＡ液（Ｈａｎｋｓ液  ５００ｍＬ＋ＨＥＰＥＳ  １．１９ｇ＋ＥＧＴＡ  ０．１ｇにて調整）を灌流する。肝臓の腫大を確認した後、肝の上下の下大静脈を切断し、１０ｍＬ／ｍｉｎの速度にて１０分間灌流する。次に、３７℃コラゲナーゼ液（（Ｈａｎｋｓ液  ５００ｍＬ＋ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ  ０．２３５ｇ＋ＨＥＰＥＳ  １．１９ｇ＋ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｙａｋｕｌｔ）１００ｍｇ（１００Ｕ／ｍＬ）を１０ｍＬ／ｍｉｎの速度にて１０分間灌流する。肝表面に白点が出現していることを確認したのち、ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣを局注した部位を鉗子にて切断し、冷却したＨａｎｋｓ液内にて摂子および鉗子を用いて細切し、１００μｍおよび７０μｍフィルターにて濾過する。続いて、５０ｇにて１分間遠心し、上清を除去後、再び冷却したＨａｎｋｓ液内にて懸濁し、５０ｇにて１分間遠心する。これを３回繰り返したのち細胞数を数える。その結果約２ｘ１０８個の細胞が回収される。
（２）  間葉性幹細胞由来肝細胞様細胞の培養
続いて、上記の灌流によって得られた細胞を培養する。１．４×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２にてＬ１５ｍｅｄｉｕｍ（０．２％ＢＳＡおよび５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン，１００ｎＭデキサメタゾンおよび０．５ｍｇ／Ｌインスリンを加えたＬ１５  ５００ｍＬ）に接種する。３時間後にＨＣＭ培地（ＨＣＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（宝酒造））に変え、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養する。
Ｒａｔ肝細胞は約１週間で死滅することから、これを約１週間観察しコロニーの形成されたものがｈＴＥＲＴ−ＭＳＣ由来ヒト肝細胞である。
〔参考例１〕
ｈＴＥＲＴ−ＭＳＣの調製
１．間葉系幹細胞の分離  健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、比重遠心法により単核球を採取、１０％非働化胎児ウシ血清含有ＤＭＥＭにて一晩培養。翌日より付着細胞（ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ）を培養する。２週後にＴ−Ｅ（トリプシンーＥＤＴＡ）にて細胞を回収したものを初代間葉系幹細胞とし凍結保存した。
２．ｈＴＥＲＴ間葉系幹細胞に導入する遺伝子として、ヒトテロメラーゼの触媒活性サブユニット（ｈＴＥＲＴ）をコードする遺伝子を用いた。ｈＴＥＲＴの配列は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７，ｐ．９５５−９５９に記載されている。
３．間葉系幹細胞への遺伝子導入に用いるベクター（図１）
ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴ（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇより供与）は、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴはＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９５，ｐｐ．１４７２３−１４７２８中に記載されているとおり、ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ−ＨＡよりＰＣＲにて得たｈＴＥＲＴ  ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔをｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏにｃｌｏｎｉｎｇしたものである。
４．レトロウイルス産生細胞の作製とそれによるウイルスの感染は「別冊実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  遺伝子導入＆発現解析実験法（斎藤  泉  菅野  純夫編  羊土社）」に準じておこなった（Ｐ５８−６２）。
具体的には、ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６，１９９３）を用いて、次のように、ΨＣＲＩＰパッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３５３９−３５４３，１９９３）を作成した。
４−１．組み換えレトロウイルスベクター産生細胞の作製
（ｉ）ＢＯＳＣ２３細胞を１０ｃｍ  ｄｉｓｈにトランスフェクションの１８〜２４時間前に５．５ｘ１０６個播いた。
（ｉｉ）１５μｇのＤＮＡ（レトロウイルスベクター）にＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を８００μｌ静かに加え、攪拌しＡ液を調製した。
（ｉｉｉ）滅菌されたチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭを７５０μｌ採り、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（２ｍｇ／ｍｌ  Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を５０μｌ加えてゆっくり混ぜＢ液を調製した。
（ｉｖ）Ａ液を静かにＢ液に混ぜＣ液を調製し、室温で３０〜４５分放置した。
（ｖ）ＢＯＳＣ２３細胞を抗生剤，ＦＢＳを除いた３７℃の培地で１度洗った。
（ｖｉ）Ｃ液（１．６ｍｌ）を静かにＢＯＳＣ２３細胞に加えた。
（ｖｉｉ）更に、２．４ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを加えた。
（ｖｉｉｉ）５時間，５％ＣＯ２下でインキュベートした。
（ｉｘ）４ｍｌの２０％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭを加え、１晩インキュベートした。
（ｘ）１０％胎児ウシ血清を含む３７℃の培地に換え、同時にパッケージング細胞であるΨＣＲＩＰを１０ｃｍ  ｄｉｓｈに１〜２ｘ１０６個播いた。
（ｘｉ）２４時間後，ＢＯＳＣ２３細胞の培地を０．４５または０．２０μｍのシリンジフィルターで濾過し、ΨＣＲＩＰの培地を５ｍｌの濾過した培地に交換した。同時にポリブレン（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ，ＳＩＧＭＡ  Ｈ−９２６８）を８μｇ／ｍｌになるように加えた。
（ｘｉｉ）４〜２４時間培養後、５ｍｌの培地を加え、さらに一晩培養した。
（ｘｉｉｉ）薬剤選択を行い、レトロウイルスを産生するΨＣＲＩＰ細胞が作成される。
次に、上記のベクターを、レトロウイルス産生細胞（ψＣＲＩＰ／Ｐ１３１）で増殖させ、間葉系幹細胞は次のように遺伝子導入（感染）された。
まず、感染を行う前日に、間葉系幹細胞を５ｘ１０４ｃｅｌｌ／１０ｃｍ  ｄｉｓｈとなるように播きなおし、レトロウイルスを産生するψＣＲＩＰ／Ｐ１３１の培地を１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭから１２．５％非働化ウマ血清１２．５％非働化胎児ウシ血清／２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ／ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ含有α−ＭＥＭの培地に代えて培養する。当日に培養上清を０．２０μｍフィルターで濾過してポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を最終濃度８μｇ／ｍｌになるように加えた。次に上清に産生された組み換えレトロウイルスベクターを間葉系幹細胞に感染させた。４時間後培養上清を新しい培地に換えてさらに２日間培養した。その後、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴはハイグロマイシン１００μｇ／ｍｌで５日間、薬剤選択を行った。
感染には、レトロウイルスベクターを、（１）コントロール、（２）ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴベクターのみで感染させた。
なおこれらのウイルスおよび細胞は、発明者らが保管しており、特許後いつでも分譲できる状態にある。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願の内容をそのまま引用により本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明は、細胞分化、細胞培養、医薬開発、人工臓器開発などの産業に利用できるほか、更には、肝臓再生医療の技術に関する産業分野で利用することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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