(57)【要約】安全かつ効果的な止血剤を提供する。有効成分としてトロンビンを固定化することを特徴とする生体吸収性合成不織布、及び当該生体吸収性合成不織布からなる止血剤に関する。当該トロンビン固定化生体吸収性不織布は、生体吸収性合成不織布をトロンビンを含む溶液に浸漬する工程、及び該工程で得られた不織布を凍結乾燥する工程を含む工程により製造することができる。本発明のトロンビン固定化生体吸収性合成不織布を用いると、迅速かつ確実な止血が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてトロンビンが固定化されることを特徴とする生体吸収性合成不織布。
【請求項２】
当該生体吸収性合成不織布の材料が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸と乳酸との共重合体からなる群より選択される請求項１記載の生体吸収性合成不織布。
【請求項３】
当該生体吸収性合成不織布の材料がポリグリコール酸である請求項２に記載の生体吸収性合成不織布。
【請求項４】
トロンビンがヒト血液由来トロンビンまたは遺伝子組換え技術により生産される組換えヒトトロンビンである請求項１ないし３のいずれかに記載の生体吸収性合成不織布。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の生体吸収性合成不織布を用いる止血剤。
【請求項６】
生体吸収性合成不織布をトロンビンを含む溶液に浸漬する工程、及び該工程で得られた不織布を凍結乾燥する工程を含むトロンビン固定化生体吸収性合成不織布の製造方法。
【請求項７】
当該生体吸収性合成不織布の材料が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコール酸と乳酸との共重合体からなる群より選択される請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
当該生体吸収性合成不織布の材料がポリグリコール酸である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
トロンビンがヒト血液由来トロンビンまたは遺伝子組換え技術により生産される組換えヒトトロンビンである請求項６ないし８のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は有効成分としてトロンビンが固定化されたことを特徴とする生体吸収性合成不織布、その製造方法及び当該不織布からなる止血剤に関する。
【背景技術】  医療分野において止血管理は極めて重要な分野である。生体の血管が損傷を受けた場合、その局所では種々の凝固因子が活性化され最終的にフィブリンが形成されて止血に至る。その際、重要な酵素としてトロンビンが存在し、トロンビンがフィブリノーゲンに作用しフィブリンへ変換される。フィブリノーゲンは血液中に存在するが、そのままでは止血効果はなく、トロンビンの作用によってはじめて止血効果を発揮する。つまり、トロンビンが生体の止血反応の重要な役割を果たしている。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
従来のトロンビン製剤は液状あるいは粉末であるが、出血局所で流されてしまいトロンビンの止血効果が十分発揮されていないことが多い。それを克服する目的で、生体吸収性材料にトロンビンを固定化したシートに関する種々の報告がある（例えば、国際公開第９０／１３３２０号パンフレット及び特公昭６１−５９７３７号公報）。ゼラチン製のシート素材に血液由来のトロンビンを固定化したものもその一例であるが、後述の実施例で示されるように十分な止血効果は認められず、かつ製造の困難性や実際の使用上の問題等から、実用化に至った例はほとんどない。また、牛ゼラチンに牛トロンビンを混合したゲルタイプの止血剤があるがＢＳＥなどの危険性や圧迫性の面で問題が残る。
また、トロンビンとその他の凝固因子を組み合わせたフィブリン接着剤もある。フィブリン接着剤は、トロンビンとフィブリノーゲンを主成分としており、フィブリノーゲンがトロンビンによりフィブリンに変換されることを利用した生体組織接着剤で、接着、止血、閉鎖を目的とし広く臨床の場で使用されている。しかしながら、術場においてトロンビン液、フィブリノーゲン液などをそれぞれ溶解して調製する手間がかかるため、緊急時には非常に不便である。
そのような不便性を考慮して、出血部位に直接的にシートで圧迫するタイプのフィブリン接着剤も実用化されている。しかしながら、現行のシートタイプの接着剤の構成成分は、基材が馬コラーゲンであり、かつトロンビンは牛由来であり、ヒト以外の動物成分が使用されているため、異種タンパクに対する抗体の出現やプリオン病等の人畜共通感染症の危険性が存在するため理想的なものとはいい難い。つまり、現状の局所止血剤は使用性や安全性の面で十分とはいえない。
これらの問題を解決するには、ヒトと同じ成分で感染因子の存在しない凝固因子から成り、さらに止血効果を十分に発揮するために厳選工夫された素材によるシートタイプで、しかもその材質も生体に安全であることが求められる。
（その解決方法）
そこで、本発明者らは上記の諸問題に鑑み、鋭意検討した結果、局所止血剤に関する本発明を完成した。すなわち、本発明は、生体吸収性材料の中でも特に不織布に加工された生体吸収性合成不織布に、止血の有効成分であるトロンビンが固定化された生体吸収性合成不織布、その製造方法及び当該不織布からなる止血剤に関する。
（従来技術より有効な効果）
本発明によるトロンビン固定化生体吸収性合成不織布は以下のような性質を有しており、理想的な局所止血剤である。
・止血効果が優れている。
・緊急時の取り扱いが容易である。
・安全性に優れている。
・経時的に吸収される。
・伸縮性・柔軟性に優れている。
・広範囲に亘る止血も可能となる。
・炎症反応が軽微であるかまたは全く惹起しない。
したがって、本発明は、外科手術のさまざまな分野で組織の閉鎖を必要とする手術において、安全に止血を行うことのできる生体吸収性合成不織布からなる止血剤を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に使用される生体吸収性合成不織布は、生体吸収性の合成繊維からなる不織布であれば、特に限定されるものではない。また、本発明の不織布は、いかなる患部にも確実に被覆可能なように適度な柔軟さを有することが好ましい。例えば、そのような不織布を形成しうる合成繊維として、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、またはグリコール酸及び乳酸の共重合体などを不織布に加工したものが使用可能である。中でも、ポリグリコール酸を不織布に加工した生体吸収性合成不織布は、本発明の目的に極めて好ましい素材である。
当該不織布の形状としては特に限定されるものではないが、種々の用途への適用しやすさの観点からシート状であることは好ましい形状の一つである。
トロンビンとしては、ヒト血液由来のトロンビン、または遺伝子組換え技術により得られる組換えヒトトロンビンのいずれも使用可能である。また、当該トロンビンに加え、薬学的に許容しうる安定剤及び添加剤を添加してもよい。そのような安定剤及び添加剤の例として、例えば、アルブミン、ポリエチレングリコール、アルギニン、ヒアルロン酸ナトリウム、グリセリン、マンニトール及び塩化カルシウムなどがある。
本発明のトロンビン固定化生体吸収性合成不織布は、例えば下記のようにして製造することができる。
トロンビンを生理食塩水または緩衝液に溶かし、さらに選択的にそのトロンビン溶液に安定化剤や添加剤として、アルブミン、ポリエチレングリコール、アルギニン、ヒアルロン酸、グリセリン、マンニトールや塩化カルシウム等を適宜加える。当該溶液に生体吸収性合成不織布を浸漬し、−８０℃、２時間凍結後、乾燥することにより得られる。
出血局所を本発明のトロンビン固定化生体吸収性不織布で圧迫すると、圧迫効果により血液の流出を防ぎ、さらにシート中のトロンビンが血液中のフィブリノーゲンと即座に反応しフィブリンに変換することにより、局所での止血効果が発揮される。また、形成されたフィブリンは周辺組織と接着する。
ポリグリコール酸を材料とする生体吸収性不織布は既に医療用として使用されており、生体に吸収され水と二酸化炭素に分解されることから、安全性も実証されている。
【産業上の利用の可能性】
このように本発明のトロンビン固定化生体吸収性不織布は、局所出血に簡便かつ早急に対処が可能であり、圧迫止血と血液凝固反応により効果的な止血を可能とする。しかも、いずれの成分も生体に安全なものを用いているため医療現場で安心して利用できる。
以下、本発明の実施例を示し本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
《実施例１：組換えトロンビンの調製》
組換えトロンビンは特願２００１−２０６９１９に準じて調製された。簡潔に記載すると、ヒトプレトロンビン遺伝子を導入された動物細胞を培養して、その培養液からプレトロンビンを精製する。一方、エカリン遺伝子を導入された動物細胞の培養液からエカリンを精製して、そのエカリンにより、プレトロンビンを活性化して、トロンビンを精製することができる。
《実施例２：トロンビン固定化シートの作製》
本発明のトロンビン固定化シートの作製は以下の方法に従って行った。
０．００１〜０．０１％ヒアルロン酸ナトリウム（ナカライ化学：１８２３７−４１）または０．５〜２％グリセリン（ナカライ化学：１７０−１８）を含む溶液に、マンニトール（ナカライ化学：２１３−０３）を最終濃度０．５〜１．５％、塩化カルシウムを４０ｍＭ加え、組換えトロンビンを最終濃度１０００Ｕ／ｍＬの濃度で添加する。この溶液をポリグリコール酸からなる生体吸収性合成不織布３ｃｍ×３ｃｍ（製品名：ネオベール／グンゼ（株），厚さ：０．１５ｍｍ）に１ｃｍ２当たり０．０５ｍＬを滴下する。このシートを−８０℃で２時間凍結後、乾燥させたものを組換えトロンビン固定化シートのサンプルとする。また、組換えトロンビンの代わりにヒト血液由来のトロンビンを用いて、同様に血液由来トロンビン固定化シートを作製する。
対照のシートとして、トロンビン処理なしの生体吸収性合成不織布、国際公開第９０／１３３２０号パンフレットの実施例の記載に従って作製したゼラチン製止血スポンジ、また、市販のシート状フィブリン接着剤を使用した。
＜第１群：血液由来トロンビン固定化シート＞
ポリグリコール酸製不織布にヒト血液由来トロンビン５０Ｕ／ｃｍ２を固定化したシートを用いた。
＜第２群：組換えトロンビン固定化シート＞
ポリグリコール酸製不織布に組換えトロンビン５０Ｕ／ｃｍ２を固定化したシートを用いた。
＜第３群：トロンビン非固定化シート＞
ポリグリコール酸製不織布をトロンビンを含まない条件で第１群と同様に処理したシートを用いた。
＜第４群：トロンビン固定化止血スポンジ＞
国際公開第９０／１３３２０号パンフレットの実施例に記載された方法に従って調製したトロンビン（ヒト血液由来）を含むゼラチン製止血スポンジ（製品名：スポンゴスタン／ジョンソン＆ジョンソン社）を用いた。
＜第５群：シート状フィブリン接着剤＞
コラーゲンシートにフィブリン糊が固定化されたシート状フィブリン接着剤（製品名：タココンブ／鳥居薬品（株）：フィブリノーゲン及びトロンビン等の成分をスポンジ状のウマコラーゲンのシートを支持体とし、シートの片面に真空乾燥により固着されたもの）を用いた。
《実施例３：滲出性出血に対する止血試験》
動物の止血モデルとしてはウサギを用いた。ウサギを開腹し、肝臓の一部を切除して、その出血部位に、実施例２で作製した各群の止血剤を創面全体にあて、１分間圧迫した。具体的な評価方法を以下に示す。
▲１▼ネンブタール麻酔下でウサギを開腹。
▲２▼ヘパリンを３００Ｕ／ｋｇ静脈内投与。
▲３▼肝臓の右葉、内側左葉または外側左葉表面を、直径１．５ｃｍの円形に４ｍｍの厚さに切除。
▲４▼切除創からの出血を１０秒間ガーゼに吸収して重量を測定。切除創作成後の出血量は、約０．５０ｇであった。
▲５▼上述の各種方法で止血を試みた。それぞれの処置は駆血をせず血液が流出した状態で行った。
▲６▼それぞれの止血処置時間を含め５分間の出血をガーゼに吸収して重量を測定した。５分間経った時点で創面からの出血がみられた場合には、それぞれの止血処置と出血量の測定を繰り返し行った。
▲７▼止血処置は最大４回まで実施し、止血までに要した止血処置の回数と、止血処置開始から止血までの出血の総重量で評価した（表１）。
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表１に示されるように、本発明のトロンビン固定化シートは、血液由来トロンビン（第１群）および組換えトロンビン（第２群）のいずれを使用した場合も、対照のシートと比較して、優れた止血効果が認められた。トロンビン処理をしていない不織布（第３群）だけでは殆ど止血効果は認められなかったが、国際公開第９０／１３３２０号パンフレットに記載されたトロンビン固定化ゼラチン製止血スポンジ（第４群）よりも止血効果は優れていた。この結果は公知の生体吸収性材料の中でも特に本発明において基材として使用された生体吸収性不織布が止血目的に好適な材料であることを示すものである。さらにこの不織布にトロンビンが固定化された止血剤により迅速かつ確実な止血が可能となることが明らかになった。さらに、コラーゲンを基材とするシート状フィブリン接着剤（第５群）も、本比較試験の結果、本発明のトロンビン固定化シートと比べて、はるかに止血効果は劣った。
【国際調査報告】
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