(57)【要約】（１）全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理を実施することにより、全血由来試料を調製する工程；（２）前記工程で得られた全血由来試料を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程；及び（３）続いて、洗浄液をイムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、イムノクロマトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程を含む、イムノクロマトグラフ法を開示する。  前記イムノクロマトグラフ法によれば、迅速簡便かつ安価に全血試料を分析することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理を実施することにより、全血由来試料を調製する工程；
（２）前記工程で得られた全血由来試料を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程；及び
（３）続いて、洗浄液をイムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、イムノクロマトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法。
【請求項２】
前記クロマト展開可能化処理が、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を、可溶化、除去、又は小粒子化する処理である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項３】
全血と界面活性剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する、請求項２に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項４】
全血をフィルター通過させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を除去することによって、全血由来試料を調製する、請求項２に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項５】
全血を音波処理又は高圧破砕処理することにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を小粒子化することによって、全血由来試料を調製する、請求項２に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項６】
全血と有機溶剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する、請求項２に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項７】
（１）イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）界面活性剤を含有する全血希釈液
を含み、前記全血希釈液における前記界面活性剤の濃度が、全血を前記全血希釈液で希釈してイムノクロマトグラフ用試料を調製した場合に、全血が溶血する濃度であることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規のイムノクロマトグラフ法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、血液を被験試料として使用するイムノクロマトグラフ製品が増えている。しかし、全血をそのままイムノクロマトグラフ展開させると、通常、イムノクロマトグラフ展開に支障をきたす。そこで、予め全血から血漿又は血清分離し、血球成分等を除かなければならない。血漿／血清分離法として最も一般的な方法は遠心分離法である。しかし、遠心分離法は遠心機器が必要であり、一般の臨床医が診察室で用いることは少ない。また、フィルターを用いて血漿を分離する方法（例えば、プラズマフィルター；富士フィルム）もあるが、遠心分離法と同様、時間がかかる上、更なるコストも必要となる。また、目詰まりを起こさず、溶血させることなく必要量の血漿量を確保するためには、プラズマフィルターの濾過面積を大きくする必要があるため、大量の全血を必要とする。【０００３】  そこで、最近ではイムノクロマトグラフストリップ自体に各種血漿／血清分離パッドを設置した方法が開発されている。具体的には、イムノクロマトグラフストリップの全血サンプル供給部直下に前記分離パッドを設置し、血球成分を前記分離パッドに保持させ、血球成分を短時間ではイムノクロマトグラフ展開膜に流出しないようにする一方で、血漿成分を先行してイムノクロマトグラフ展開膜へ展開させる方法である。【０００４】  前記方法はいずれも全血中の赤血球の破裂を防ぎ、溶血させずに血漿成分を分離する為の工夫がなされている。例えば、血球捕捉膜にカルボキシメチルセルロース膜を用いた特開２００２−２１４２３６号公報（特許文献１）、プロパノール及び／又はアクリルアミドを用いた特開２００２−３５０４２８号公報（特許文献２）、あるいは、親水性焼結多孔質物質を用いた特許第２９４０９９０号明細書（特許文献３）等、多くの特許が出願又は登録されている。いずれも溶血を防ぐことに特長がある。なぜなら、溶血すると、イムノクロマトグラフ展開膜の判定部分を含む膜全体が赤く着色してしまい、結果として判定が非常に困難になるからである。【０００５】  イムノクロマトグラフ法以外では全血をあえて界面活性剤等で溶血させる試薬（日本光電セルタックケミ）が公知であり、また、溶血式測定法（特許文献４）も公知であるが、それらの測定系は赤色が測定に影響しない為、問題が無い。しかし、赤色に染色することを特徴とする金コロイドイムノクロマトグラフ法を始め、各種発色又は着色基材を用い、目視にて結果判定を行う、イムノクロマトグラフ法を用いた試薬では、溶血による赤色着色は致命的な問題となる。そこで赤血球が破砕又は溶血しない緩やかな条件で、血漿分離パッドに血球成分を保持するような工夫を施す為、イムノクロマトグラフ展開に至るまで時間がかかることが多い。また、その展開する血漿量は全血試料の粘性に大きく影響される為、定量性を損なうことも多い。更に、全血試料の粘性等マトリックスの影響によって、血漿の分離溶出速度が大きく異なることも多かった。故に、全血試料滴下後の時間ではなく、あえて血漿分離パッドによる血漿分離後の展開時間を計測し、その後の染色度の補正測定を行う機器（ロシュ）さえ発売されている。【０００６】  更に、血球成分を長時間、完全に血漿分離パッドに保持することは技術的��難しく、血球成分はある程度、イムノクロマトグラフ展開膜まで到達してしまう。故に、酵素イムノクロマトグラフ法等のように被験試料をイムノクロマトグラフ展開させた後、被験試料液とは別の、例えば、洗浄液や酵素基質液など更に展開させる場合、血漿分離パッドから染みだしてイムノクロマトグラフ展開膜に到達した血球成分が、後から展開してくる前記成分の展開を阻害してしまい、結果として正常なイムノクロマトグラフ法による測定をすることは出来なかった。【０００７】  一方、特殊な例ではあるが、赤血球上の抗原を測定するイムノクロマトグラフ法で、孔径が非常に大きいイムノクロマトグラフ展開膜（５〜１００μｍ）を用い、あえて赤血球を破砕しないままイムノクロマトグラフ展開膜を展開させる試薬（特許文献５）が公知である。しかし、これも前記通常のイムノクロマトグラフ法等同様、赤血球成分を破砕しないことを特徴としている。【０００８】  イムノクロマトグラフ法は、その簡便、迅速かつ安価な面が大きな特長であり、手間のかかる遠心分離機を用いる方法や、高価な血漿分離プレフィルターを用いて予め分離する方法はイムノクロマトグラフ法の長所を損なうものであった。その点、イムノクロマトグラフストリップに予め設置した血漿分離パッドはその要望に応えるものだったが、迅速性や再現性に改善余地を残し、また、例えば、酵素イムノクロマトグラフ法のように、被験試料の後から別の液体を流す方法の場合、適用することが難しかった。【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２１４２３６号公報
【特許文献２】特開２００２−３５０４２８号公報
【特許文献３】特許第２９４０９９０号明細書
【特許文献４】特開平１０−２２１３３４号公報
【特許文献５】特開２０００−１１１５５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  このように、血液（全血）を試料とするイムノクロマトグラフ法の場合、従来は予め血清血漿分離するか、あるいは、イムノクロマトグラフストリップ上で血漿分離パッドを用いて血球成分のイムノクロマトグラフ展開膜への展開を遅らせる方法が取られていた。いずれも全血中の赤血球を破壊せず、赤色色素を流出させないことを前提とした工夫がなされている。しかし、予め血清血漿分離する方法は手間やコスト的に不利な点が多く、また、イムノクロマトグラフストリップ上で血漿分離パッドを用いた方法は、全血試料の粘性により測定時間等の再現性に問題があり、特に被験試料とは別の液体を後から展開させる一部のイムノクロマトグラフ法においては、応用が難しかった。
従って、本発明の課題は、全血試料を迅速簡便な方法で処理し、そして、全血試料が溶血し、イムノクロマト展開膜が一時的に赤色に着色しても影響のないイムノクロマトグラフ法と組み合わせることにより、迅速簡便かつ安価に全血試料を分析することのできる、イムノクロマトグラフ法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  前記課題は、本発明による、（１）全血を溶血させると共に、クロマト展開可能化処理を実施することにより、全血由来試料を調製する工程（以下、全血由来試料調製工程と称する）；
（２）前記工程で得られた全血由来試料を、イムノクロマトグラフ展開膜上で展開させる工程（以下、展開工程と称する）；及び
（３）続いて、洗浄液をイムノクロマトグラフ展開膜上で展開させることにより、イムノクロマトグラフ展開膜上の赤血球由来赤色色素を除去する工程（以下、赤色色素除去工程と称する）
を含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法により解決することができる。
本発明方法の好ましい態様によれば、前記クロマト展開可能化処理が、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を、可溶化、除去、又は小粒子化する処理である。【００１２】  本発明方法の更に好ましい態様によれば、全血と界面活性剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の別の好ましい態様によれば、全血をフィルター通過させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を除去することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、全血を音波処理又は高圧破砕処理することにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を小粒子化することによって、全血由来試料を調製する。
本発明方法の更に別の好ましい態様によれば、全血と有機溶剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。
また、本発明は、（１）イムノクロマトグラフ用ストリップ、及び
（２）界面活性剤を含有する全血希釈液
を含み、前記全血希釈液における前記界面活性剤の濃度が、全血を前記全血希釈液で希釈してイムノクロマトグラフ用試料を調製した場合に、全血が溶血する濃度であることを特徴とする、イムノクロマトグラフ法用キットに関する。
【発明の効果】
【００１３】  本発明のイムノクロマトグラフグラフ法によれば、従来法で必要であった全血試料を溶血させない為の工夫が不要となり、簡便な全血試料処理とイムノクロマトグラフ展開により、安価で、しかも、全血の粘性のバラツキの影響を受けにくい、全血試料を被験試料とする簡便且つ短時間のイムノクロマトグラフ測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  本発明方法では、全血を溶血（例えば、赤血球の溶解又は破砕による）し、例えば、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を、例えば、可溶化又は小粒子化するか、あるいは、取り除くことにより、全血由来試料をイムノクロマトグラフ展開膜の孔（ポア）に目詰まりしないで展開させ、前記全血由来試料に続いて、別の液体試料を展開させることで、イムノクロマトグラフ展開膜上の赤色溶血成分（主にヘモグロビン）を洗い流すことで、前記課題を解決することができる。【００１５】  通常イムノクロマトグラフ法に利用される展開膜の孔径は２〜２０μｍ程度であるが、直径が約８μｍ程度の赤血球、それ以上の大きさの白血球、又はやや小さい血小板等の血球成分や、リン脂質やフィブリン由来の凝集体等を、例えば、界面活性剤を用い、溶解すると同時に可溶化することで、前記膜中の孔に目詰まりしないで展開させることが可能である。前記全血由来試料はイムノクロマトグラフ展開膜を赤色に着色させてしまうが、例えば、洗浄液や、酵素法の場合の基質液等で前記溶血した全血由来の赤色成分を洗い流すことで赤色成分を除くことが可能で、免疫反応及び酵素反応等により着色した本来の目的染色ラインを観察することができる。本発明は、このような知見に基づくものである。【００１６】  本発明方法の全血由来試料調製工程において、全血由来試料を調製する方法は、全血を溶血させることができ、しかも、クロマト展開可能化処理を実施することができる限り、特に限定されるものではない。
本明細書において「クロマト展開可能化処理」とは、後述の展開工程におけるイムノクロマトグラフ展開膜上でのクロマト展開を可能とするための処理を意味し、より具体的には、これに限定されるものではないが、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径（好ましくは孔径の下限値）よりも大きな全血中成分［例えば、各種血球成分（例えば、赤血球、白血球、又は血小板等）、溶血後の血球膜（赤血球膜、各種白血球膜、及び血小板膜等を含む）、又はフィブリン若しくはリン脂質等由来の凝集塊など］等を、例えば、可溶化、除去、又は小粒子化する処理を意味する。【００１７】  全血由来試料を調製する方法としては、例えば、界面活性剤を用いる方法、フィルターを用いる方法、音波処理若しくは高圧破砕処理を利用する方法、有機溶剤を用いる方法などを挙げることができる。全血由来試料調製工程では、これらの方法のいずれか一つを単独で、あるいは、２つ以上を組み合わせて実施することができる。【００１８】  界面活性剤を用いる方法では、採血した全血と界面活性剤とを接触させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することによって、全血由来試料を調製する。界面活性剤を用いる方法では、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分が、界面活性剤によって可溶化されることにより、後述の展開工程においても、イムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなく全血由来試料を展開させることができる。【００１９】  界面活性剤とは、２物質間の界面に集まりやすい性質を持ち、その２物質間の界面の性質を著しく変えるものである。このような性質を持つために界面活性剤分子は、親油基と親水基の相反する性質の部分からなっている。本発明で用いることのできる界面活性剤は、このような性質を持った物質であれば使用可能であり、例えば、イオン型による分類でいう、非イオン界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、又は両性界面活性剤のいずれも使用可能である。【００２０】  非イオン界面活性剤として、具体的には、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル、ポリオキシエチレン誘導体、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、又はアルキルアルカノールアミド等を挙げることができる。
陰イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルフォン酸塩、アルキルナフタレンスルフォン酸塩、又はアルキルスルホコハク酸塩等を挙げることができる。
陽イオン性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルアミン塩、又は第４級アンモニウム塩等を挙げることができる。
両性界面活性剤として、具体的には、例えば、アルキルベタイン、アミンオキサイド、又はジメチルアンモニオプロパンスルホン酸等を挙げることができる。【００２１】  更に、前記分類の他に、膜タンパク質可溶化剤として知られる、例えば、ステロイド骨格を有するコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム等も本発明で使用可能な界面活性剤である。
本発明方法では、これらの界面活性剤を、１種類のみ単独で、あるいは、２種類以上を組み合わせて使用することができるが、ここに例示した界面活性剤に限定されるものではない。また、補助的な処理、例えば、塩類、尿素、及び／又は有機溶剤を共存させたり、あるいは、後述の濾過処理（フィルター通過）又は音波処理若しくは高圧破砕処理と併用する方法も考えられる。【００２２】  これらの各種界面活性剤を適用するにあたっては、使用する濃度を適時設定することができる。具体的に適用可能な濃度は、使用する界面活性剤によって異なるが、使用する界面活性剤の持つセルミセル濃度付近、あるいは、セルミセル濃度以上に界面活性剤を添加する条件が好適に使用することができる。これらの濃度調整した界面活性剤を、以下、界面活性剤液と称するが、界面活性剤液中の界面活性剤濃度は、その界面活性剤の特性にもよるが、濃度が高くすぎると、全血そのものよりも粘性が高くなり、全血との混合が難しく、全血中成分の可溶化に支障をきたす場合がある。また、逆に界面活性剤液中の界面活性剤濃度が低すぎると、全血中成分の可溶化が遅く、あるいは不可能となり、結果として正常なイムノクロマトグラフ展開がなされない場合がある。【００２３】  具体的には、非イオン性界面活性剤に分類されるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの１つであるポリオキシエチレンモノラウレート（商品名Ｔｗｅｅｎ２０；シグマ社製）を単独で用いる場合、溶血反応系における最終濃度として（以下、同様）、好ましくは２〜３０％、より好ましくは３〜２０％、更に好ましくは１０〜２０％となる範囲で使用することができる。
非イオン性界面活性剤に分類されるポリオキシエチレンアルキルエーテルの１つであるポリエチレングリコール  モノ−パラ−イソ−オクチルフェニルエステル（商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；シグマ社製）を単独で用いる場合、好ましくは０．１〜３０％、より好ましくは０．３〜２０％、更に好ましくは０．５〜１０％となる範囲で使用することができる。
非イオン性界面活性剤に分類されるポリオキシエチレンアルキルエーテルの１つであるポリオキシエチレンラウリルエーテル（商品名エマルゲン１０８；花王社製）等の場合、好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは１〜２０％、更に好ましくは２．５〜１０％となる範囲で使用することができる。【００２４】  陰イオン界面活性剤に分類されるアルキル硫酸エステル塩の１つであるドデシル硫酸ナトリウムを単独で用いる場合、好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．０５〜７％、更に好ましくは０．０５〜５％、特に好ましくは０．１〜２．５％となる範囲で使用することができる。【００２５】  陽イオン界面活性剤に分類される第四級アンモニウム塩の１つである塩化パラミチルトリメチルアンモニウム［商品名ＰＢ４０（塩化パラミチルトリメチルアンモニウムの４０％溶液）；日本油脂社製］を単独で用いる場合、好ましくは０．１〜３０％、より好ましくは０．３〜２０％、更に好ましくは０．５〜５％となる範囲で使用することができる。【００２６】  両性界面活性剤として分類されるステアリルベタイン（商品名アンヒトール８６Ｂ；花王社製）又は３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（商品名ＣＨＡＰＳ；同仁化学社製）をそれぞれ単独で用いる場合、好ましくは０．１〜３０％、より好ましくは０．３〜２０％、更に好ましくは０．５〜１０％となる範囲で使用することができる。【００２７】  また、前記濃度範囲より低濃度でも、複数の界面活性剤を組み合わせることで、前記条件と同様の効果を得ることができる。例えば、実施例１に記載のとおり、単独使用では０．１％濃度（溶血反応系における最終濃度として）により全血の可溶化、イムノクロマト染色、及び展開ができなかった５種類の界面活性剤（エマルゲン１０８、トライトン  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、アンヒトール８６Ｂ、及びＣＨＡＰＳ）を、実施例３に記載のとおり、それぞれ０．１％濃度ずつ計５種類混合することで、可溶化、イムノクロマト染色、及び展開が可能である。【００２８】  逆に、前記濃度範囲より高濃度でも、例えば、予め水等で希釈されて販売されている界面活性剤の場合は、前記条件と同様の効果を得ることができる。例えば、ポリエチレングリコール  モノ−パラ−イソ−オクチルフェニルエステルが、１０％水溶液の形態で、例えば「界面活性剤Ｘ」と命名されて発売されている場合、その界面活性剤Ｘを希釈等することなくそのまま全血と等量混合して使用すると、界面活性剤Ｘの最終濃度は５０％となるが、それは実質上ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の最終濃度５％品と同様の効果が得られる。
また、界面活性剤を希釈する溶媒は必ずしも１００％の水溶液である必要は無く、有機溶剤を含んだ溶媒でも溶血させ、イムノクロマト展開させることは可能である。例えば、前記ＰＢ４０は塩化パラミチルトリメチルアンモニウムの４０％溶液であり、溶媒中には２０〜３０％のイソプロピルアルコールが存在している。
更に、例えば、全血試料の前処理、前記の補助的な手段の組み合わせ、更には、イムノクロマトグラフテストの特性により、好適濃度は大幅に異なるため、ここに挙げた界面活性剤濃度に限定されるものではない。【００２９】  前記界面活性剤液を全血と混合する比率も、正常なイムノクロマトグラフ展開にとって重要な要素である。まず、界面活性剤液の比率が低すぎると、全血中成分が充分に可溶化されず、正常なイムノクロマトグラフ展開を阻害する場合がある。加えて、展開時間をより短く、安定して行う為には、界面活性剤液の割合を高くすることが望ましい。しかし、一方で界面活性剤液の比率が高すぎると、相対的に全血比率が下がり、結果として測定感度が弱まってしまう場合がある。適用可能な比率は、使用する界面活性剤種又は濃度によって異なるが、全血に対する界面活性剤液量は好ましくは１／１０倍量以上が望ましい。【００３０】  なお、界面活性剤液の濃度と全血との混合比率は、前記で述べた影響に加え、イムノクロマトグラフ上の反応に阻害を与えたり、あるいは、非特異的染色由来のバックグラウンドを高くしてしまう場合もある。従って、測定方法、測定項目、又は測定時間等によって、最適な界面活性剤種、濃度、全血との混合比率、又は混合時間を個別に選定することが好ましい。
また、界面活性剤の種類によっては、イムノクロマトグラフ展開を可能とする濃度であっても、イムノクロマトグラフ上で起こる抗原抗体反応等の各種結合反応、酵素反応、あるいは、金コロイド等の性状を阻害する場合もある。よって、その至適濃度を決めるに当たっては、各イムノクロマトグラフ法及び／又は各測定項目において、個々に充分な至適条件を検討することが好ましい。【００３１】  フィルターを用いる方法では、採血した全血をフィルター通過させることにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を除去することによって、全血由来試料を調製する。フィルターを用いる方法では、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分が、フィルターによって除去されることにより、後述の展開工程においても、イムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなく全血由来試料を展開させることができる。【００３２】  本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできるフィルターとしては、例えば、シリンジフィルターを挙げることができる。採血管から、適当なシリンジ、例えば、１ｍＬ容量シリンジ（テルモ社）により全血を吸引し、前記シリンジの先端にシリンジフィルターを勘合させ、圧力をかけることでシリンジ中の全血をシリンジフィルターで濾過することができる。濾過時の圧力により、血球等は破砕され、フィルターの孔径よりも大きな塊、例えば、破砕された赤血球の膜断片や、脂質等の凝集塊は除去され、フィルター孔径よりも小さな粒子のみ、濾液中に回収される。フィルターの孔径は、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径（好ましくは孔径の下限値）よりも小さいことが好ましく、例えば、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径平均が５μｍである場合、フィルターの孔径は５μｍ未満であることが好ましい。また、イムノクロマトグラフ展開膜のポアサイズが５〜８μｍである場合、フィルターの孔径は５μｍ以下であることが好ましい。なお、前記ポアサイズは、全孔径の概ね８０％が含まれる範囲を示し、フィルター孔径は、最大孔径を意味する。【００３３】  音波処理又は高圧破砕処理を利用する方法では、採血した全血を音波処理又は高圧破砕処理することにより、全血を溶血させると共に、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を小粒子化することによって、全血由来試料を調製する。この方法では、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分が、音波処理又は高圧破砕処理によって小粒子化されることにより、後述の展開工程においても、イムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなく全血由来試料を展開させることができる。【００３４】  本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできる音波処理としては、通常の細胞破砕に用いられる超音波処理を挙げることができる。また、高圧破砕処理としては、例えば、圧力負荷機器（例えば、フレンチプレス等）を用いる方法を挙げることができる。フレンチプレスは、試料に高い圧力をかける一方で、一部試料を回収する際、急激に圧力を減らすことで、細胞破砕することが可能であり、全血中の、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分の破砕分散に��有効である。
その他、全血を溶血させ、前記全血中成分を可溶化、小粒子化、又は除去することが可能であれば、全血由来試料の調製手段は特に限定されるものではない。【００３５】  全血由来試料調製工程で用いることのできる有機溶剤としては、全血を溶血させることができ、しかも、イムノクロマトグラフ展開膜の孔径よりも大きな全血中成分を可溶化することのできる有機溶剤である限り、特に限定されるものではない。前記有機溶媒としては、例えば、ケトン類（例えば、アセトン等）、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、又は２−プロパノール等）、又はアセトニトリル等を挙げることができる。前記有機溶剤の使用濃度は、界面活性剤で先述したのと同様に、例えば、有機溶剤の種類又は各種条件（例えば、全血との混合条件、又はイムノクロマトグラフ法若しくは測定方法の実施条件など）に応じて適宜決定することができる。【００３６】  本発明方法における展開工程は、前記全血由来試料調製工程で得られた試料を用いること以外は、通常のイムノクロマトグラフ法における展開工程と同様に実施することができる。本展開工程で用いる全血由来試料は、イムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりする可能性のある全血中成分が予め可溶化、除去、又は小粒子化されているので、イムノクロマトグラフ展開膜の孔に目詰まりすることなく、イムノクロマトグラフ展開が可能である。【００３７】  但し、そのままでは破砕した全血中の赤血球から溶出した赤色色素がイムノクロマトグラフ展開膜を赤く着色したままとなり、判定ラインの染色等を観察することが困難である。そこで全血由来試料を展開した後、本発明方法における赤色色素除去工程では、別の液体を展開することにより、前記赤色色素をイムノクロマトグラフ展開膜上から排除する。
この赤色色素除去用液体は、イムノクロマトグラフ展開膜上を展開することにより、赤色色素を押し流すことにより除去することのできる液体である限り、特に限定されるものではない。前記赤色色素除去用液体として、例えば、赤色成分を押し流すだけの単なる洗浄液（例えば、水又は緩衝液など）を用いることもできるし、あるいは、例えば、一部の酵素イムノクロマトグラフ法などのように、酵素発色基質を後から展開する系の場合は、前記基質液を赤色色素除去用液体として兼用し、前記赤色成分を押し流す役割も果たすことも可能である。【００３８】  前記赤色色素除去用液体は、全血由来試料が充分に展開されたところで、赤色色素を除去することができる限り、その展開の開始は特に限定されるものではない。例えば、全血由来試料の展開開始後に、赤色色素除去用液体の展開を開始することが一般的だが、展開開始位置の工夫によっては全血由来試料を展開開始する直前に赤色色素除去用液体の展開を開始することもできる。【００３９】  本発明のイムノクロマトグラフ法用キットは、少なくとも、（１）イムノクロマトグラフ用ストリップと、（２）界面活性剤を含有する全血希釈液とを含む。前記界面活性剤としては、本発明方法の全血由来試料調製工程において用いることのできる界面活性剤を使用することができる。前記全血希釈液における界面活性剤の濃度は、全血を全血希釈液で希釈してイムノクロマトグラフ用試料（すなわち、全血由来試料）を調製した場合に、全血が溶血する濃度である限り、特に限定されるものではない。
全血希釈液は、所望により、被験試料（すなわち、全血）中の分析対象物質と特異的に結合する結合物質（例えば、抗体又は抗原等）、及び／又は、試薬安定化の為の安定化剤（例えば、タンパク質、糖、又は高分子化合物等）を更に含むことができる。
【実施例】
【００４０】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】  本実施例では、以下に示す手順に従って、界面活性剤を用いて溶血及び可溶化した全血試料を調製し、酵素イムノクロマトグラフ法により特異ＩｇＥを測定した。【００４１】（１）酵素法イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
（１−１）アレルゲン固定化膜の作製
ニトロセルロース膜（ＨＦ１８０；ポアサイズ５〜８μｍ；ミリポア社製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに切断した。膜の一端（上流方向）から１５ｍｍの位置に、ダニアレルゲン抽出タンパク質水溶液（ヤケヒョウヒダニ抽出物；グリア社製）［濃度１ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈後、透析した水溶液］を幅１ｍｍの直線状に塗布した。
そのまま、室温下で１時間静置し、続いて、３７℃で３０分間静置して、ダニ抽出タンパク質を固定化した。シリカゲルデシケーター内に保存し、室温下で一夜乾燥させることにより、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。【００４２】（１−２）酵素標識化抗ＩｇＥ抗体の調製
抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体をペプシン処理した後、２−メルカプトエチルアミンにより還元し、ゲル濾過により精製Ｆａｂ’フラグメント１ｍｇを調製した。
一方、これとは別に、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ２ｍｇを、２ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液で希釈した後、透析し、７．５ｍｍｏｌ／Ｌに調製したＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）１００μＬを加えた。４℃にて５時間反応させた後、リン酸緩衝液で透析してピリジルジチオプロピオネート（ＰＤＰ）導入アルカリフォスファターゼを調製した。
前記抗ＩｇＥ抗体Ｆａｂ’と前記ＰＤＰ導入アルカリフォスファターゼとを１ｍＬずつ等量混合してから、１ｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミン４０μＬを添加した。４℃で３日間反応させた後、ゲル濾過カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ；東ソー社製）を用いてゲル濾過し、未反応の抗ＩｇＥ抗体Ｆａｂ’及びＰＤＰ導入アルカリフォスファターゼを除去し、酵素標識化抗ＩｇＥ抗体水溶液を作製した。【００４３】（１−３）酵素標識化抗体パッドの作製
実施例１（１−２）で調製した酵素標識化抗ＩｇＥ抗体水溶液を、抗体１μｇ量となるように、５．０％ショ糖を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で希釈した後、その希釈液１０μＬを５ｍｍ×５ｍｍに切断した吸収パッド（ＰＲＥＭ１４２０；ポール社製）に塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦１００ｍｍＨｇ）乾燥して、酵素標識化抗体パッドを作製した。【００４４】（１−４）試料添加パッドの作製
グラスファイバーパッドを５ｍｍ×１８ｍｍに切断し、０．５％ショ糖、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％ポリビニールアルコール（重合度＝約５００）を含む水溶液に浸した後、過剰の水溶液を除去し、風乾して、試料添加パッドを作製した。【００４５】（１−５）吸収パッドの作製
セルロースパッド（ＡＰ２５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに切断し、吸収パッドとした。【００４６】（１−６）イムノクロマトグラフグラフ用ストリップの作製
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに切断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、展開方向に関して上流側から下流側に向かって、実施例１（１−４）で作製した試料添加パッド、実施例１（１−３）で作製したＡＰ標識化抗体パッド、実施例１（１−１）で作製したダニアレルゲン固定化膜、及び実施例１（１−５）で作製した吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ程度重ね合わせて貼付することにより、イムノクロマトグラフグラフ用ストリップを作製した。【００４７】（２）溶血及び可溶化処理した全血試料の調製とイムノクロマトグラフ測定
（２−１）界面活性剤液の調製
脱イオン水、生理食塩水（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム液）、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）を調製し、また、トライトンＸ−１００（シグマ工業株式会社）、Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社製）、ドデシル硫酸ナトリウム、エマルゲン１０８（花王社製）、ＰＢ４０（日本油脂社製）、アンヒトール８６Ｂ（花王社製）、又はＣＨＡＰＳ（同仁化学社製）を前記リン酸緩衝液でそれぞれ、０．２、１．０、５．０、又は２０％濃度となるよう調製した。【００４８】（２−２）全血と界面活性剤液の等量混合試料の作製と溶血観察
ヘパリン抗凝固剤入り採血管にて採血したヒトの全血と前記各種濃度界面活性剤液とを１００μＬずつ等量混合した試料を作製した。なお、混合１０分後に目視にて観察を行い、溶血の有無を調べた。ここで言う溶血とは、赤血球膜が可溶化され、赤血球中のヘモグロビン等赤色成分が溶出することで、より透明色になった状態を指す。【００４９】（２−３）酵素イムノクロマトグラフ測定
前記イムノクロマトグラフ用ストリップを、試料添加パッドを下にして、前記全血を溶血可溶化した試料５０μＬを予め分注しておいたマイクロプレートウェルに差し込んで立て掛け、毛細管現象により検体をクロマト展開させた。その後、前記クロマト展開の開始から１０分経過後に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）水溶液２００μＬを更にクロマト展開させた。
なお、前記検体としては、検体１（ダニ特異的ＩｇＥ＝０ＩＵ／ｍＬ）、検体２（ダニ特異的ＩｇＥ＝３ＩＵ／ｍＬ）、及び検体３（ダニ特異的ＩｇＥ＝１０ＩＵ／ｍＬ）を使用した。各検体中のダニ特異的ＩｇＥ量は、従来の定量測定法（アラスタット特異的ＩｇＥ抗体測定キット；ヤトロン社販売，米国ＤＰＣ社製）にて測定した値であり、国際標準単位であるＩＵ／ｍＬで表記した。【００５０】  クロマト展開終了後、アレルゲン固相領域（１ｍｍ幅バンド）における着色程度を目視判定した結果を表１〜表８に示す。表１〜表８及び後述の表９〜表１９に示す各記号「−」、「±」、「＋」、及び「＋＋」は、それぞれ、着色無し、微弱な着色、明確な着色、及び強い着色を意味する。なお、表中の界面活性剤濃度は、実施例１（２−２）で使用した界面活性剤液の濃度を示しており、溶血反応系における界面活性剤の最終濃度は、表に示す濃度の１／２である。【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【実施例２】
【００５９】  本実施例では、以下に示す手順に従って、界面活性剤を用いて溶血可溶化した全血試料を調製し、金コロイドイムノクロマトグラフ法により特異ＩｇＥを測定した。【００６０】（１）金コロイドイムノクロマトグラフ用ストリップの作製
（１−１）アレルゲン固定化膜の作製
実施例１（１−１）に記載の通り、ニトロセルロース膜にダニアレルゲン抽出タンパク質水溶液を幅１ｍｍの直線状に塗布し、ダニアレルゲン固定化膜を作製した。【００６１】（１−２）金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体の調製
抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体１ｍｇを、０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにリン酸緩衝液（２ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）で希釈した後、透析した。続いて、金コロイド懸濁液（ＧＯＬＤ  ＣＯＬＬＯＩＤ  ２０；Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを撹拌しながら、前記抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナル抗体水溶液１０ｍＬをゆっくり滴下し、室温下で１０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ウシ血清アルブミン（Ａ−７８８８；Ｓｉｇｍａ製；以下、ＢＳＡと称する）水溶液１０ｍＬをゆっくり滴下した後、室温下で更に１０分間撹拌した。この水溶液に５％ショ糖と０．２％Ｔｗｅｅｎ２０とを含む水溶液１５ｍＬを加え、混和した後、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。【００６２】  沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍＬに再懸濁し、１０℃にて１６，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識化抗体を、０．５％ショ糖及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むボラックス緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した後、粒子密度が約１０１３／ｍＬ（波長５２０ｎｍにおける吸光度＝約１４）になるように濃度調整し、金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体懸濁液とした。【００６３】（１−３）金コロイド標識化抗体パッドの作製
酵素標識化抗ＩｇＥ抗体水溶液の代わりに、実施例２（１−２）で調製した金コロイド標識化抗ＩｇＥ抗体懸濁液を用いること以外は、実施例１（１−３）の操作を繰り返すことにより、金コロイド標識化抗体パッドを作製した。【００６４】（１−４）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
酵素標識化抗体パッドの代わりに、実施例２（１−３）で調製した金コロイド標識化抗体パッドを用いること以外は、実施例１（１−６）の操作を繰り返すことにより、金コロイドイムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。【００６５】（２）溶血及び可溶化処理した全血試料の調製とイムノクロマトグラフ測定
（２−１）界面活性剤液調製と全血との混和及び溶血観察
実施例１（２−１）と同様に、各種溶液を調製し、実施例１（２−２）と同様に、ヒトの全血と前記各種溶液を１００μＬずつ等量混合した試料を作製し、溶血の有無を調べた。【００６６】（２−２）金コロイドイムノクロマトグラフ測定
酵素法イムノクロマトグラフストリップの代わりに、実施例２（１−４）で作製した金コロイドイムノクロマトグラフ用ストリップを用い、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）水溶液の代わりにリン酸緩衝液をクロマト展開させる以外は、実施例１（２−３）の操作を繰り返すことにより、金コロイドイムノクロマトグラフ法の展開を行った。【００６７】  クロマト展開終了後、アレルゲン固相化領域（１ｍｍ幅バンド）における着色程度を目視判定した結果を表９〜表１６に示す。【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【実施例３】
【００７６】  本実施例では、以下に示す手順に従って、５種類の界面活性剤を等濃度で含有する界面活性剤混合液を用いて、溶血可溶化した全血試料を調製し、酵素イムノクロマトグラフ法により特異ＩｇＥを測定した。【００７７】（１）酵素法イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
実施例１（１）に記載の操作を繰り返すことにより、酵素法イムノクロマトグラフストリップを作製した【００７８】（２）界面活性剤混合液の調製、全血との混和、及び溶血観察
５種類の界面活性剤（トライトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、エマルゲン１０８、アンヒトール８６Ｂ、及びＣＨＡＰＳ）をそれぞれ等濃度（０．０４、０．２、１、又は４％濃度）で含むように、濃度の異なる４種類の界面活性剤混合液（各混合液における５種類の界面活性剤の総濃度として、０．２、１．０、５．０、又は２０％濃度）を、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５，１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）を用いて調製した。実施例１（２−２）と同様に、ヒトの全血と前記界面活性剤混合液とを１００μＬずつ等量混合した試料を作製し、溶血の有無を調べた。【００７９】（３）酵素法イムノクロマトグラフ測定
実施例１（２−３）に記載の方法と同様に、イムノクロマトグラフ測定を行い、目視判定を行った。結果を表１７に示す。なお、表中の界面活性剤濃度は、実施例３（２）で使用した界面活性剤混合液における５種類の各界面活性剤の各々の濃度である。【００８０】
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【実施例４】
【００８１】  本実施例では、以下に示す手順に従って、シリンジフィルターを用いて、全血を溶血させると共に、フィルターの孔径よりも大きな全血中成分を除いた全血由来試料を調製し、酵素イムノクロマトグラフ法により特異ＩｇＥを測定した。【００８２】（１）酵素法イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
実施例１（１）に記載の操作を繰り返すことにより、ニトロセルロース膜としてＨＦ１８０（ポアサイズ５〜８μｍ）を用いるイムノクロマトグラフストリップを作製した。また、前記ＨＦ１８０の代わりにＨＦ２４０（ポアサイズ３〜５μｍ）を用いること以外は、実施例１（１）に記載の操作を繰り返すことにより、ニトロセルロース膜としてＨＦ２４０（ポアサイズ３〜５μｍ）を用いるイムノクロマトグラフストリップも作製した。なお、前記ポアサイズは、全孔径の概ね８０％が含まれる範囲を示している。【００８３】（２）フィルター処理した全血試料の調製とイムノクロマトグラフ測定
（２−１）各種シリンジフィルターによる全血濾過液の調製
抗凝固剤（ヘパリン）入りの採血管にて採血したヒトの全血を、５μｍフィルター（ザルトリウス社）、３μｍフィルター（アドバンテック社）、１．２μｍフィルター（ザルトリウス社）、０．８μｍ（アドバンテック社）、又は０．２μｍ（アドバンテック社）（いずれも２６ｍｍΦシリンジフィルター）で濾過し、その濾液を回収した。なお、濾過後、目視にて観察を行い、溶血の有無を調べた。なお、各フィルターの前記孔径は、最大孔径を意味する。【００８４】（２−２）酵素イムノクロマトグラフ測定
実施例４（１）で調製した２種類の酵素イムノクロマトグラフグラフ用ストリップを用い、実施例１（２−３）に記載の方法にて、前記各種濾液をイムノクロマト展開させた。
その後、実施例１（２−３）に記載の通り、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）２００μＬを更にクロマト展開させた。なお、検体は、実施例１（２−３）に記載の検体と同等品を用いた。
クロマト展開終了後、アレルゲン固相化領域（１ｍｍ幅バンド）における着色程度を目視判定した結果を表１８及び表１９に示す。【００８５】
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【００８６】
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【産業上の利用可能性】
【００８７】  本発明のイムノクロマトグラフグラフ法は、全血試料の分析の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【国際調査報告】
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