(57)【要約】パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルス遺伝子を保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルス遺伝子を保持しないパッケージング細胞を用意し、この細胞に、パッケージングシグナルを有するがウイルス複製能力を持たないアンプリコンプラスミドを導入してパッケージング細胞を作製する。このアンプリコン導入パッケージング細胞を溶解感染誘導すると、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターが産生される。
2004050886.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する系を作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失した相同組換え用遺伝子断片をＡｋａｔａ細胞に導入することにより、ＥＢウイルスのパッケージングシグナルを相同組換えにより欠失させ、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む方法。
【請求項２】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する系を作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、該ＥＢウイルスゲノムをＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入し、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む方法。
【請求項３】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する系を作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法であって、
パッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、該ＥＢウイルスゲノムをＥＢウイルス陰性であってＥＢＮＡ１を発現するＡｋａｔａ細胞に導入し、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む方法。
【請求項４】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生するためのアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を製造する方法であって、請求項１−３のいずれかに記載の方法により得られたパッケージング細胞に、パッケージングシグナルを有するがウイルス複製能力を持たないアンプリコンプラスミドを導入する工程を含む方法。
【請求項５】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する方法であって、請求項４記載の方法により製造されるアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス外被に包まれたＥＢウイルスベクターを放出させることを含む方法。
【請求項６】
不死化Ｂリンパ球を製造する方法であって、請求項４記載の方法により製造されるアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス外被に包まれたＥＢウイルスベクターを放出させ、そして得られたＥＢウイルスベクターをＢリンパ球に感染させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＥＢウイルスベクターを産生する方法ならびに該方法に用いるためのパッケージング細胞システムに関する。
【背景技術】  細胞への遺伝子導入において遺伝子を標的細胞へ運ぶ働きをするものを「ベクター」という。ウイルス由来のベクターは、安全のため可能な限り元になる野生型ウイルスの遺伝子を除いたものが良い。エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（以下「ＥＢウイルス」という）は、ヘルペスウイルスの一種であり、ヒトＢリンパ球に感染してその増殖を促進する能力を有する。ＥＢウイルスベクターは現在使用されている他のウイルスに基づくベクターと比較して、１）細胞内に長期間安定して維持される；２）１００ｋｂ以上の大きな外来遺伝子を組み込むことができる；３）静止期のＢリンパ球、特に、初代培養Ｂリンパ球に高率に遺伝子を導入できる；４）抗原提示細胞であるＢリンパ球に遺伝子を導入発現できる；５）遺伝子導入されたＢリンパ球を生体外で増殖させることができる；６）大腸菌の中で組換えウイルスを作製するシステムを使用すれば、ベクターの調整が大変容易になる、などの多くの利点を有している。
ＥＢウイルスを産生する細胞株としては、Ａｋａｔａ細胞、Ｂ９５−８細胞、Ｐ３ＨＲ−１細胞などが知られている。このうちＡｋａｔａ細胞は核内におよそ２０コピーの環状のＥＢウイルスゲノムを持っており、抗ヒトイムノグロブリン抗体を液体培地中に加えることにより感染性ＥＢウイルス産生を誘導できるため、ＥＢウイルスの大量生産に適した細胞株である（Ｔａｋａｄａ  Ｋ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３，２７−３２（１９８４）；Ｔａｋａｄａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｏｎｏ  Ｙ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３，４４５−４４９（１９８９））。Ａｋａｔａ細胞の長期継代により得られたＥＢウイルスゲノムが脱落したクローン（以下「ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞」という。）は、ＥＢウイルスを再感染することによって、抗ヒトイムノグロブリン抗体処理によるウイルス産生能を再び示すことができる（特開平７−１１５９６６）。また、Ａｋａｔａ細胞内で薬剤マーカー遺伝子を持つ相同組換えＥＢウイルスを作製し、ＥＢウイルス産生を誘導し、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に再感染させて薬剤選択を行うことにより、組換えＥＢウイルスゲノムのみを持つＡｋａｔａ細胞を作製することができる。この細胞は抗ヒトイムノグロブリン抗体処理により、組換えＥＢウイルスを大量に産生する能力を有する（特開平８−００９９７１）。
ＥＢウイルスＢ９５−８株の環状ＥＢウイルスゲノムを大腸菌人工染色体に組み込んだ形で大腸菌内で増殖させる方法が報告されている（米国特許第６，２９１，２４６号）。このシステムを用いることにより、ＥＢウイルスの複製増殖に必須の遺伝子であっても大腸菌内での相同組換えによって効率良く変異を導入できる。また、ドイツの研究グループは大腸菌内でパッケージングシグナルを除去したＥＢウイルスゲノムを胎児の腎臓由来の２９３細胞に導入し、ＥＢウイルスベクターの産生のためのパッケージング細胞として使用する方法を開示している（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ  ＨＪ，Ｐｉｃｈ  Ｄ，Ｈｉｌｓｅｎｄｅｇｅｎ  Ｔ，Ｂａｕｍ  Ｃ，Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，５１８８−５１９３（１９９９））。この２９３細胞に、ＥＢウイルス初期遺伝子ＢＺＬＦ１とアンプリコンプラスミドを同時に外来性に導入し、発現させることでＥＢウイルスベクター産生を誘導するものである。しかし、このシステムはＥＢウイルスベクター産生のための手段が煩雑であり、しかも産生されたＥＢウイルスベクターの力価が大変低いため、ＥＢウイルスベクターの大量生産には適していない。
また、ＥＢウイルスの外被を用いて細胞に外来遺伝子を効率良く導入するためのシステム（Ｄｅｌｅｃｌｕｓｅ  Ｈ．Ｊ，Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄｔ  Ｗ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ：Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０００；５３：２７０−２７９等）、およびヘルパーウイルスを含まない遺伝子ベクターＤＮＡのパッケージング方法（特開平１１−２２１０７３）が報告されている。
本発明の目的は、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを効率良く大量に産生できるシステムを提供することである。
【発明の開示】
ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する系を作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法を提供する。
第１の態様においては、本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失した相同組換え用遺伝子断片をＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入することにより、ＥＢウイルスのパッケージングシグナルを相同組換えにより欠失させ、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む。
第２の態様においては、本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、該ＥＢウイルスゲノムをＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入し、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む。
第３の態様においては、本発明の方法は、
パッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを大腸菌を用いて作製し、該ＥＢウイルスゲノムをＥＢウイルス陰性であってＥＢＮＡ１を発現するＡｋａｔａ細胞に導入し、そして
パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞をクローニングする、
の各工程を含む。
別の観点においては、本発明は、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生するためのアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を製造する方法を提供する。該方法は、上述のいずれかの方法により得られたパッケージング細胞に、パッケージングシグナルを有するがウイルス複製能力を持たないアンプリコンプラスミドを導入する工程を含む。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明の方法により製造されるアンプリコンプラスミドを導入したＡｋａｔａパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス外被に包まれたＥＢウイルスベクターを放出させることを含む、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する方法を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、上述の本発明の方法により製造されるアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス外被に包まれたＥＢウイルスベクターを放出させ、そして得られたＥＢウイルスベクターをＢリンパ球に感染させることを含む、不死化Ｂリンパ球を製造する方法を提供する。
本発明にしたがって、パッケージング細胞にアンプリコンプラスミドを導入して作製したアンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを簡便かつ効率よく産生することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のパッケージング細胞の作製方法を示す。
図２は、アンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞によるＥＢウイルスベクターの産生を示す。
図３は、パッケージングシグナル遺伝子（ＴＲ）のクローニングとパッケージングシグナルを破壊するためのターゲット用のプラスミドの構築を示す。
図４は、相同的遺伝子組換えの確認に用いたプライマーの位置を示す。
図５は、野生型ＥＢウイルス脱落確認のための遺伝子増幅に用いたプライマーの位置を示す。
図６は、アンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞中に存在するＴＲ欠損ＥＢウイルスゲノムおよびアンプリコンプラスミドの構造の一例を示す。
図７は、アンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞によるＥＢウイルスベクターの産生を示す。
図８は、ウイルスゲノムを複製できないウイルスの作製と、該ウイルスゲノムを感染導入したパッケージング細胞を用いたウイルスゲノムを複製できないＥＢウイルスベクターの産生を示す。
図９は、ＢＡＬＦ２遺伝子を破壊欠失するためのターゲット用のプラスミドの構築と相同組換えウイルスの検出に用いたプローブを示す。
図１０は、相同組換えによりＢＡＬＦ２遺伝子欠失ウイルスが作製されたことを確認するための遺伝子増幅に用いたプライマーの位置を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する系を作製するために用いられるパッケージング細胞を製造する方法を提供する。
「パッケージング細胞」とは、パッケージングシグナルを欠失するが、ウイルス粒子を作るのに必要なウイルス蛋白質を発現することができるＥＢウイルスゲノムを有する細胞である。パッケージングシグナルとは、遺伝子がＥＢウイルス粒子中にパッケージされるために必要なシス作用配列であり、ＴＲ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）とも称される。ここで、「欠失している」とは、パッケージングシグナルの全部が欠失している場合、およびパッケージングシグナルの一部が欠失または変異していることによりパッケージングシグナルとしての機能を失っている場合の両方を含む。
「ＥＢウイルスベクター」とは、ＥＢウイルスの外被をまとい、ヒトＢリンパ球に感染する能力を有するウイルス粒子を意味する。ＥＢウイルスベクターは外来遺伝子を含んでいてもよい。「ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクター」とは、宿主細胞に感染し、その細胞中でゲノムの複製をすることはできるが、その細胞を溶解感染誘導したときに、ウイルス外被をまとったウイルス粒子として放出されることがないベクターを意味する。
本発明で用いるＡｋａｔａ細胞は既知のヒトリンパ球であり、環状ＥＢウイルスゲノムを核内におよそ２０個保有しており、相同組換え法により組換えＥＢウイルスを作製することができる（特開平８−００９９７１）。また、Ａｋａｔａ細胞は長期継代によりＥＢウイルスゲノムが脱落したクローンを分離できる（特開平７−１１５９６６）ことより、同様の方法により組換えＥＢウイルスゲノムのみを保持し、野生型ＥＢウイルスゲノムは脱落した細胞クローンを分離できる。さらに、Ａｋａｔａ細胞は抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理することにより、大量のＥＢウイルスを産生することができる（Ｔａｋａｄａ  Ｋ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３３，：２７−３２（１９８４）；Ｔａｋａｄａ  Ｋ  ａｎｄ  Ｏｎｏ  Ｙ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３，４４５−４４９（１９８９））。
本発明の方法の第１の態様の概略が図１に示される。まず、ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞中においてＥＢウイルスのパッケージングシグナルを相同組換えにより欠失させる。この工程は、パッケージングシグナルを挟む領域を有し、かつパッケージングシグナルが欠失している相同組換え用遺伝子断片をＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入することにより行われる。相同組換え用遺伝子断片は、好ましくは３０ｋｂ以下の長さ、より好ましくは２０ｋｂ以下の長さである。このような遺伝子断片は、既知のＥＢウイルス遺伝子配列に基づいて大腸菌系において作成することができる。遺伝子の導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、遺伝子銃法等により行うことができる。次に、薬剤耐性を利用して、パッケージングシグナルを欠失したＡｋａｔａ株ＥＢウイルスゲノムと野生型ＥＢウイルスゲノムの両方を持つＡｋａｔａ細胞クローンを分離する。図１においては、組換えウイルスの選択にネオマイシン耐性遺伝子を使用しているが、Ａｋａｔａ細胞で機能するどのような選択マーカーを利用してもよい。次に、分離した細胞クローンをヒドロキシウレアで処理し、再び細胞クローンに分けることにより、野生型ウイルスが脱落し、パッケージングシグナルを欠失したウイルスのみを保持するパッケージング細胞を分離することができる。ヒドロキシウレアを用いずに、継代培養して限界希釈することによりクローニングすることもできる。
本発明の方法の第２の態様においては、ＥＢウイルスのパッケージングシグナルを相同組換えにより欠失させる工程は、ＥＢウイルスＤＮＡを大腸菌人工染色体に組み込んで大腸菌に導入し、大腸菌菌体内で遺伝子組換えによりパッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを作製し、これをＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に導入することにより行う。ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞はＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞より外来性遺伝子の導入効率が高く、かつ安定に増殖することができるためである。
具体的には、まず、ＥＢウイルスゲノム由来の遺伝子断片にｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）由来の大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター断片を挿入した相同組換え用遺伝子断片を作製し、これを野生型の環状ＥＢウイルスゲノムを持つＡｋａｔａ細胞に導入して、相同組換えを起こしたクローンを選択する。次に、このクローンから調製したゲノムＤＮＡで大腸菌をトランスフォームすることにより、ＢＡＣとＡｋａｔａ細胞由来ＥＢウイルスゲノムとを含むプラスミドを得る。大腸菌遺伝子組換え系においてこのプラスミド上のＥＢウイルスゲノムの任意の部位を欠失、変異させることができる。このようにして作製したパッケージングシグナルを欠失させたＢＡＣ−ＥＢウイルスＤＮＡをＡｋａｔａ細胞に導入して、Ａｋａｔａ細胞内で相同組換えを生じさせることができる。
本発明の方法の第３の態様においては、ＥＢウイルスのパッケージングシグナルを相同組換えにより欠失させる工程は、ＥＢウイルスＤＮＡを大腸菌人工染色体に組み込んで大腸菌に導入し、大腸菌菌体内で遺伝子組換えによりパッケージングシグナルが欠失したＥＢウイルスゲノムを作製し、これをＥＢウイルス陰性であってＥＢＮＡ１を発現するＡｋａｔａ細胞に導入することにより行う。ＥＢＮＡ１を発現するＡｋａｔａ細胞は、ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞に、ＥＢＮＡ１遺伝子と適当な抗生物質耐性遺伝子とを連結した直鎖状ＤＮＡをトランスフェクションした後、この抗生物質で選択を行うことによりクローニングすることができる。ＥＢＮＡ１蛋白質はＥＢウイルスが細胞核内においてエピゾームとして複製・維持されるために必須の蛋白質であり、ＥＢＮＡ１を発現するＡｋａｔａ細胞ではエピゾーム形成の効率が高いと考えられる。
本発明はまた、上述の方法により製造されるパッケージング細胞を提供する。本発明のパッケージング細胞にパッケージングシグナルを含む外来遺伝子（アンプリコン）を導入して作製したアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞において溶解感染誘導すると、ＴＲ（−）ＥＢウイルスゲノムに由来するＥＢウイルス遺伝子産物を利用して、アンプリコンのＤＮＡのみがウイルスの外被をまとってＥＢウイルスベクターとして産生される。すなわち、本発明のパッケージング細胞は、外来遺伝子を含みウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生するためのヘルパー機能を有する。
すなわち、別の観点においては、本発明は、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生するためのアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を製造する方法を提供する。この方法の概略が図２に示される。パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスゲノムを保持するがパッケージングシグナルを有する野生型ＥＢウイルスゲノムを保持しないパッケージング細胞に、アンプリコンプラスミドを導入し、適当な薬剤で選択することにより、アンプリコンプラスミドを含有するＡｋａｔａパッケージング細胞をクローニングする。アンプリコンプラスミドの導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、遺伝子銃法等により行うことができる。
「アンプリコンプラスミド」とは、ウイルス由来の遺伝子を含むが、ウイルス産生能を欠失したプラスミド（環状ＤＮＡ）をいう。アンプリコンプラスミドは、パッケージングシグナルおよびウイルスの複製開始点を含み、ウイルス複製に必須な蛋白質をコードする遺伝子の１またはそれ以上を欠失している環状ＤＮＡである。好ましくは、アンプリコンプラスミドは選択のためのマーカー遺伝子を有する。特に好ましくは、アンプリコンプラスミドは、パッケージングシグナル、ＥＢウイルス潜伏感染期の複製開始点ｏｒｉＰ、ＥＢウイルス溶解感染誘導期の複製開始点ｏｒｉＬｙｔ、ＥＢＮＡ１を有する。さらに、ＥＢウイルスベクターを外来遺伝子導入の目的で用いる場合には、アンプリコンプラスミドはさらに導入すべき所望の外来遺伝子を有する。
図２においては、アンプリコンプラスミドはマーカーとしてピューロマイシン耐性遺伝子を有しており、ピューロマイシンによりアンプリコンが導入されたアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞の選択を行っているが、この細胞で機能するどのような選択マーカーを利用してもよい。好ましくはパッケージング細胞の作製に使用した選択マーカーとは異なる選択マーカーを用いる。
パッケージング細胞へのアンプリコンプラスミドの導入はまた、ウイルスゲノムを複製できないウイルスの感染による方法を用いてもよい。この方法の概略が図８に示される。ＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞中においてＥＢウイルスゲノムの複製に重要な遺伝子を相同組換えにより欠失させる。図８においては相同組換えウイルスの選択にハイグロマイシン耐性遺伝子を使用している。分離した相同組換えウイルスと野生型ウイルスの両方を持つＡｋａｔａ細胞クローンを抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理することにより、欠失したＥＢウイルス遺伝子産物が野生型ウイルスから供給されて、相同組換えウイルスと野生型ウイルスの両方が産生される。産生されたウイルス液をパッケージング細胞に感染させ、パッケージング細胞の作製に使用した選択マーカー（ネオマイシン）とウイルスゲノムを複製できないウイルスの作製に使用した選択マーカー（ハイグロマイシン）で選択すると同時に、細胞をクローニングすることにより、パッケージングシグナルを欠失したＴＲ（−）ＥＢウイルス遺伝子とウイルスゲノムの複製に重要な遺伝子を欠失したＥＢウイルス遺伝子のみを含有するアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を分離する。このようにして得られた、ウイルスゲノムの複製に重要な遺伝子を欠失したＥＢウイルス遺伝子をアンプリコンとして含有するＡｋａｔａパッケージング細胞を抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理することにより、ＥＢウイルスの外被をまとったアンプリコンプラスミドのみがＥＢウイルスベクターとして放出される。
本発明はまた、上述の方法により製造される、導入されたアンプリコンプラスミドを持つＡｋａｔａパッケージング細胞を提供する。本発明のアンプリコンプラスミドを持つＡｋａｔａパッケージング細胞は、抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理することにより、ＥＢウイルスの外被をまとったアンプリコンプラスミドＤＮＡをＥＢウイルスベクターとして産生する能力を有する。ＥＢウイルスのゲノムはローリングサークル形式で伸長複製されるが、パッケージングシグナルを欠失していると切り出されず、従ってウイルス粒子に取り込まれない。一方、アンプリコンプラスミドの遺伝子もローリングサークル形式で伸長し、アンプリコンはコンカテマーを作って、パッケージングシグナルの部分で切断され、ＥＢウイルスゲノムの大きさであるおよそ１７０ｋｂのサイズでパッケージングされる（図７を参照）。すなわち、ＥＢウイルスの外被をまとったアンプリコンプラスミドのみがＥＢウイルスベクターとして放出される。好ましくは、本発明の方法により製造されるアンプリコンプラスミドを持つＡｋａｔａパッケージング細胞は、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを最大で従来の方法の１，０００倍以上の効率で産生し、かつ野生型ＥＢウイルスを産生しない。
すなわち、別の観点においては、本発明は、上述の本発明の方法により製造されるアンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞を溶解感染誘導することにより、ウイルス外被に包まれたＥＢウイルスベクターを放出させることを含む、ウイルス複製能力を持たないＥＢウイルスベクターを産生する方法を提供する。アンプリコンプラスミド導入Ａｋａｔａパッケージング細胞の溶解感染誘導は、抗イムノグロブリン抗体で処理することにより容易に行うことができる。
さらに、本発明はまた、上述の方法にしたがって製造されるＥＢウイルスベクターを提供する。このＥＢウイルスベクターは、ＥＢウイルス粒子中にアンプリコンプラスミドを含有しており、Ｂリンパ球に感染してこれを不死化する能力を有するが、自身をウイルス粒子として複製する能力を有しない。したがって、所望の抗体を産生するＢリンパ球に本発明のＥＢウイルスベクターを感染させ、これを不死化してインビトロで増殖させることにより、ヒト抗体を容易に製造することができる。すなわち、本発明はまた、本発明のＥＢウイルスベクターを用いて不死化Ｂリンパ球を製造する方法、ならびに本発明の方法により製造される不死化Ｂリンパ球を提供する。また、アンプリコンプラスミドに所望の遺伝子を組み込んでおくことにより、従来困難だった末梢血静止期Ｂリンパ球への遺伝子導入が可能となる。静止期Ｂリンパ球においてのみ遺伝子の発現が可能なプロモーターを使用することにより、Ｂリンパ球特異的かつ高レベルな遺伝子発現が期待できる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００２−３４９４６７号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例では図１の方法に基づいてＡｋａｔａ株ＥＢウイルスのパッケージングシグナルの破壊をおこなった。まず、ｐＵＣ１１９に８ｋｂのＡｋａｔａ株ＥＢウイルスのＢａｍ−Ｎｈｅｔ領域をクローニングし、ｐＵＣ１１９Ｎｈｅｔを作製した（図３ａ）。クローニングしたＢａｍ−Ｎｈｅｔ領域にはパッケージングシグナル（ＴＲ）が１個のみ存在した。次に、ｐＵＣ１１９ＮｈｅｔのＢｓｐＨＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位の間にネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｒ）と赤色色素遺伝子（ＤｓＲｅｄ）を挿入することにより、ＴＲが破壊された遺伝子破壊用のプラスミドｐＵＣＮｈｅｔｎｅｏＲｅｄを作製した（図３ｂ）。このプラスミドＤＮＡをＥＢウイルス陽性のＡｋａｔａ細胞に電気穿孔法で遺伝子導入を行った。
続いてＡｋａｔａ細胞のネオマイシン選択を行い、耐性となった約５００個のクローンに対してＤＮＡハイブリダイゼーション法を行い、相同組換えが起こった場合に出現するサイズのＤＮＡバンドを持つＡｋａｔａ細胞クローンをスクリーニングした。制限酵素ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ断片を、ネオマイシン耐性遺伝子をプローブとして反応させ、予想される１１．６ｋｂのバンドを検出した。
次に、相同組換えが起こっているか否かを遺伝子増幅法で調べた。ＡＮＣ  Ｆ１およびＡＮＣ  Ｒ２はそれぞれ組換え部位の５’端および３’端外側で設計したプライマーであり、ＡＮＣ  Ｒ１およびＡＮＣ  Ｆ２はｎｅｏｒの内部で設計したプライマーである。図４にそれぞれのプライマーのおおよその位置と方向を示す。相同組換えが起こっている場合はＡＮＣ  Ｆ１とＡＮＣ  Ｒ１のプライマーペアによって、５．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅され、ＡＮＣ  Ｆ２とＡＮＣ  Ｒ２のプライマーペアによって、１０．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅される。相同組換えが起こっていない場合は何も増幅されない。この方法で１２個のクローンが相同組換えＥＢウイルスを保持していることを確認した。
次に、相同組換えによってパッケージングシグナルが破壊されたＴＲ（−）ウイルスゲノムのみを持つＡｋａｔａ細胞の分離をおこなった。ＴＲ（−）ＥＢウイルスゲノムを保持しているクローンである１１９細胞を選択培地（５０％ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞培養上清，０．３５ｍｇ／ｍｌＧ４１８，５０μＭヒドロキシウレア）で１０日培養後、ヒドロキシウレアを除いてさらに１０日培養した。９６穴プレートに１穴あたり０．５個の細胞が入るように希釈して培養を行い、増殖してきたクローンからＴＲの外側で設計したプライマーペアによる遺伝子増幅を行い、野生型のバンド（２．０ｋｂ）が脱落し、組換え型のバンド（５．７ｋｂ）のみが認められるＡｋａｔａ細胞クローンを分離した。さらにサザンブロット法によるＤＮＡ制限酵素切断パターンの変化から、パッケージングシグナルを欠失したＥＢウイルスのみを持つパッケージング細胞が分離されたことを確認した。
【実施例２】  本実施例ではアンプリコンプラスミドを作製した。アンプリコンプラスミドとしてはパッケージングシグナル（ＴＲ）を持った構造が必要である。さらに、ＥＢウイルス潜伏感染期の複製開始点ｏｒｉＰとｏｒｉＰをトランスに活性化するＥＢＮＡ１遺伝子を持っていることが導入細胞内でのプラスミドの維持に重要であり、ＥＢウイルス溶解感染誘導期の複製開始点ｏｒｉＬｙｔを持っていることが、抗ヒトイムノグロブリン抗体刺激によるアンプリコンプラスミド導入パッケージング細胞からのＥＢウイルスベクターの産生に必要である。図６ｂに作製したアンプリコンプラスミドを示す。ＥＢウイルスの遺伝子としてはＥＢＮＡ−１，ｏｒｉＰ，ＴＲ，ｏｒｉＬｙｔのみを含み、さらにレポーターとして用いる緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子とアンプリコンプラスミドが細胞で維持されるための選択用のピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだ２１ｋｂのアンプリコンプラスミド（ｐＰｓｉ）である。ヘルパーウイルスのゲノムはローリングサークル形式で伸長複製されるが、ＴＲを欠いているので切り出されない。従ってウイルス粒子に取り込まれることはない。一方、アンプリコンプラスミドの遺伝子もローリングサークル形式で伸長し、アンプリコンはコンカテマーを作って、ＴＲの部分で切断され、ＥＢウイルスゲノムの大きさであるおよそ１７０ｋｂのサイズでパッケージングされる（図７）。すなわち、アンプリコンプラスミドの遺伝子を持つＥＢウイルスが放出される。
【実施例３】  本実施例では作製したアンプリコンプラスミドｐＰｓｉをパッケージング細胞に電気穿孔法により遺伝子導入し、０．３５μｇ／ｍｌピューロマイシン，５０％ＥＢウイルス陰性Ａｋａｔａ細胞培養上清，０．３５ｍｇ／ｍｌＧ４１８で選択培養を行った。その結果得られた７２個のピューロマイシン耐性クローンはすべてＧＦＰ陽性であった。そのうち１個のクローンを抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理し、ＥＢウイルスの構成蛋白質であるキャプシド抗原（ＶＣＡ）が発現していること、その上清に野生型ウイルスが存在しないことを確認した。さらに、上清中の組換えＥＢウイルスをＥＢウイルス陰性Ｄａｕｄｉ細胞に感染させたところ、２０％弱の細胞が組換えＥＢウイルスに感染して、ＧＦＰを発現することが確認された。
【実施例４】  本実施例では図８の方法に基づいてＡｋａｔａ株ＥＢウイルスのＥＢウイルス一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質をコードするＢＡＬＦ２遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子で置換することにより破壊欠失させた。まず、ｐＵＣ１１９にＡｋａｔａ株ＥＢウイルスのＥｃｏ−ＤｈｅｔおよびＥｃｏ−Ｊ領域の１１，４２９塩基対のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をクローニングし、２，５００塩基対のＣｌａ  Ｉ−Ｅｃｏ  ＲＶ領域を除去し、１，８５３塩基対のハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入置換することにより、ＢＡＬＦ２遺伝子が破壊された遺伝子破壊用のプラスミドｐＵＣ１１９  ＥｃｏＤ−ＪＨｙｇを作製した（図９ａ）。このプラスミドＤＮＡの７，８０７塩基対のＳａｃ  Ｉ−Ｂｇｌ  ＩＩ断片をＥＢウイルス陽性Ａｋａｔａ細胞に電気穿孔法で遺伝子導入を行った。
続いてＡｋａｔａ細胞のハイグロマイシン選択を行い、耐性となった約１，０００個のクローンに対してＤＮＡハイブリダイゼイション法を行い、相同組換えが起こった場合に出現するサイズのＤＮＡバンドを持つＡｋａｔａ細胞クローンをスクリーニングした。制限酵素ＮｃｏＩで消化したＤＮＡ断片を、図９ｂに示したハイグロマイシン耐性遺伝子をプローブとして反応させ、予想される４．８ｋｂのバンドを５個のＡｋａｔａ細胞クローンから分離したＤＮＡで検出した。
次に、遺伝子増幅法を用いて相同組換えが起こっていることを確認した。Ｆ１およびＲ２はそれぞれ組換え部位の５’端および３’端外側で設計したプライマーであり、ＨｙｇＦおよびＨｙｇＲはそれぞれハイグロマイシン耐性遺伝子の内部で設計したプライマーである。図１０にそれぞれのプライマーのおおよその位置と方向を示す。相同組換えが起こっている場合はＦ１とＨｙｇＲのプライマーペアによって、４，１１２塩基対のＤＮＡ断片が増幅され、ＨｙｇＦとＲ２のプライマーペアによって、４，５３４塩基対のＤＮＡ断片が増幅される。相同組換えが起こっていない場合は何も増幅されない。この方法で２個のクローンが相同組換えＥＢウイルスを保持していることを確認した。
次に、相同組換えＥＢウイルスを保持しているクローンを抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理し、組換え型と野生型の両方が混合したウイルスを産生させた。産生されたウイルス液を実施例１で作製したパッケージング細胞に感染させ、ネオマイシンとハイグロマイシンの存在下に細胞をクローニングすることにより、ＢＡＬＦ２遺伝子を欠失したＥＢウイルスゲノムとヘルパーであるＴＲ（−）ＥＢウイルスゲノムのみを含有し、野生型ウイルスゲノムを持たないＡｋａｔａパッケージング細胞を分離した。このＡｋａｔａパッケージング細胞を抗ヒトイムノグロブリン抗体で処理し、ＢＡＬＦ２遺伝子欠損ＥＢウイルスのみからなるＥＢウイルスベクターを回収した。産生されたＢＡＬＦ２遺伝子欠損ＥＢウイルスの１０倍段階希釈液をそれぞれ１００μｌずつ５ｘ１０５個の腑帯血由来リンパ球に感染させ４週間培養した。その結果、およそ１０５ＴＤ５０／ｍｌのトランスフォーミング活性を持つが、増殖不能なＥＢウイルスベクターが産生されたことを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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