(57)【要約】本発明はカビや酵母などいわゆる真菌類の感染による真菌症に対する薬剤であり、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質、Ｋ９９−５２７８Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、その培養物中にＫ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質、Ｋ９９−５２７８Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質、Ｋ９９−５２７８Ｃ物質を採取する。得られた物質は新しい抗真菌剤として期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2004033702.tif 000014
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ａ物質、及び下記式［ＩＩ］
2004033702.tif 000015
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ｂ物質、及び下記式［ＩＩＩ］
2004033702.tif 000016
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ｃ物質、とからなる新規Ｋ９９−５２７８物質類。
【請求項２】
ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、その培養物中にＫ９９−５２７８物質類を蓄積せしめ、該培養物からＫ９９−５２７８物質類を採取することを特徴とする新規Ｋ９９−５２７８物質類の製造法。
【請求項３】
前記の物質を生産する能力を有する微生物がストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ９９−５２７８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８）またはそれの変異株である請求の範囲２に記載の新規Ｋ９９−５２７８物質の製造法。
【請求項４】
請求の範囲１に記載の物質を生産する能力を有するストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物。
【請求項５】
上記の物質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス  エスピー  Ｋ９９−５２７８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８）またはそれの変異株である請求の範囲４に記載の微生物。
【請求項６】
Ｋ９９−５２７８Ａ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に対する抗真菌活性を有する請求の範囲１記載の新規Ｋ９９−５２７８物質類。
【請求項７】
Ｋ９９−５２７８Ｂ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に対する抗真菌活性を有する請求の範囲１記載の新規Ｋ９９−５２７８物質類。
【請求項８】
Ｋ９９−５２７８Ｃ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に対する抗真菌活性を有する請求の範囲１記載の新規Ｋ９９−５２７８物質類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、カビや酵母などの真菌類に対する抗真菌活性を有する新規Ｋ９９−５２７８物質類およびその製造法に関する。本発明においてＫ９９−５２７８物質類とはＫ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質およびＫ９９−５２７８Ｃ物質を包含する。
【背景技術】    カビや酵母などいわゆる真菌類の感染による真菌感染症に対する既存の化学療法剤は非常に限れており、特に深在性真菌症などの疾患の治療に用いられるアゾール系化合物、例えばエルゴステロールのＣ−１４脱メチル化反応を阻害する１−［（２，４−ジクロロベンジルオキシ）−２−（２，４−ジクロロフェニル）エチル］イミダゾール（一般名：ミコナゾール、シグマ社製）、２，４−ジフルオロ−α，α−ビス（１Ｈ，１，２，４−トリアゾル−１−イルメチル）ベンジルアルコール（一般名：フルコナゾール、アイシーエヌファーマス−ティカルズ社製）及び（±）−１−Ｓｅｃ−ブチル−４−［Ｐ−［２Ｒ，４Ｓ］−２−（２，４−ジクロロフェニル）−２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−１−イルメチル）１，３−ジオキソラン−４−イル］メトキシ］フェニル］−１−ピペラジニイル］フェニル］−Δ２−１，２，４−トリアゾリン−５−ワン（一般名：イトラコナゾール、協和醗酵社製）、更にポリエン系の細胞膜阻害のアンフォレリシンＢ及びＤＮＡ合成阻害のフルシトシンが実用化されているのみである。
上記のミコナゾール、フルコナゾール、及びイトラコナゾールは、ポリエン系の薬剤に比較して安全性が高く、最も高頻度に使用されている薬剤であることが報告されている（Ａｎａｉｓｓｉｅ  Ｅ．Ｊ．ら、クリニカル  インフェクシアス  ディジーズ、２３巻、９６４−９７２、１９６６年）。
しかしながら、最近これら抗菌剤の長期間または反復投与による耐性菌の出現等が問題となっているため、これらの薬剤とは異なる骨格あるいは異なる作用機構の新しい抗真菌剤の開発が強く望まれている。
【発明の開示】
かかる実情において、カビや酵母などいわゆる真菌類の感染による新しい骨格を有する真菌に対して有効な新しい抗真菌剤が開発されれば、新たな真菌症に対する有効な化学療法剤となり得ることになる。
本発明はこのような期待を満足し得る新規Ｋ９９−５２７８物質類、及びその製造法を提供するものである。
そこで、本発明者らは上記のごとき課題を解決するために微生物の代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌より新たに分離したＫ９９−５２７８菌株の培養物中に抗真菌活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物中から抗真菌活性を示す活性物質を分離、精製した結果、後記の式［Ｉ］、［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］で示される化学構造を有する物質を見出した。これらの化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、本物質を各々Ｋ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質およびＫ９９−５２７８Ｃ物質と称することにし、その総称をＫ９９−５２７８物質類と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式［Ｉ］
2004033702.tif 000002
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ａ物質、および下記式［ＩＩ］
2004033702.tif 000003
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ｂ物質、および下記式［ＩＩＩ］
2004033702.tif 000004
で表される化合物であるＫ９９−５２７８Ｃ物質、からなる新規Ｋ９９−５２７８物質類を提供することにある。
本発明はさらに、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ９９−５２７８物質類を蓄積せしめ、該培養物からＫ９９−５２７８物質類を採取することを特徴とする新規Ｋ９９−５２７８物質類の製造法を提供することにある。
本発明はまた、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス  エスピー  Ｋ９９−５２７８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ９９−５２７８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８）であるＫ９９−５２７８物質類の製造法を提供することにある。
本発明はまた、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物を提供することにある。更に本発明は、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物が、ストレプトミセス  エスピー  Ｋ９９−５２７８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ９９−５２７８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８）である微生物を提供することにある。
本発明はＫ９９−５２７８Ａ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＦ２６に対する抗真菌活性を有するＫ９９−５２７８物質類を提供することにある。
本発明はＫ９９−５２７８Ｂ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＦ２６に対する抗真菌活性を有するＫ９９−５２７８物質類を提供することにある。
本発明はＫ９９−５２７８Ｃ物質が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＫＦ２６に対する抗真菌活性を有するＫ９９−５２７８物質類を提供することにある。
前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］で表されるＫ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する微生物（以下「Ｋ９９−５２７８物質生産菌」と称する）は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属するが、例えば本発明者らが新たに東京都港区の土壌から分離したストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ９９−５２７８菌株は、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。
本発明のストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ９９−５２７８菌株の菌学的性状を示すと、以下のとおりである。
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はイースト・麦芽エキス寒天培地、オートミール寒天培地で豊富に着生し、白から茶褐色の色調を呈する。顕微鏡下の観察では気菌糸上に２０ケ以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は直鎖状で、胞子の大きさは約１．２×０．８μｍの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のう及び遊走子は見出されない。
（ＩＩ）各種培地上での培養性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を以下に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察結果である。
2004033702.tif 000005
2004033702.tif 000006
2004033702.tif 000007
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天                                    陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天                      陰性
（ハ）トリプトン・イースト液                          陰性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃）                陰性
（２）硝酸塩の還元                                        陽性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）（単純ゼラチン培地）  陰性
（４）スターチの加水分解                                  陽性
（５）脱脂乳の凝固（２７℃）                              陰性
（６）脱脂乳のペプトン化（２７℃）                        陽性
（７）生育温度範囲                                １９〜３５℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する    ：Ｄ−グルコース、メリビオース
やや利用する：Ｌ−アラビノース、ラフィノース
利用しない  ：Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクト
ース、Ｌ−ラムノース、ｍｙｏ−イノシトール、
シュークロース
（９）セルロースの分解                                    陰性
（ＩＶ）細胞壁組成
細胞壁のジアミノピメリン酸は、ＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ６，８）である。
（Ｖ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ６，８）である。胞子連鎖の形態は直鎖状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸はうすい黄色から茶色の色調を呈し、気菌糸は白色からグレー系の色調を呈する。メラニン色素は産生しないが、黄色の可溶性色素を産生する。
これらの結果から本菌株はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌種であり、プリドハムとトレスナーの分類（バージス・マニュアル・オブ・デタミナーティブ・バクテリオロジー、第８版、７４８〜８２９頁、１９７４年）によるグレーシリーズに属する菌種であると考えられる。本菌株はストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ９９−５２７８として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］に所在する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に平成１４年（２００２）９月２７日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８が付与された。
本発明で使用されるＫ９９−５２７８物質生産菌としては、前述のストレプトミセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）Ｋ９９−５２７８菌株が好ましい例として挙げられるが、菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプトミセス属に属し、前記の式［Ｉ］、［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］で表されるＫ９９−５２７８物質類を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。
本発明のＫ９９−５２７８物質類を製造するにあたっては、先ずストレプトミセス属に属するＫ９９−５２７８物質生産菌を培地に培養することにより行われる。本発明のＫ９９−５２７８物質類生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他Ｋ９９−５２７８物質類の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。培養温度は、本Ｋ９９−５２７８物質生産菌が本Ｋ９９−５２７８物質類を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は１９〜３５℃、好ましくは２７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は６〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は７日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積されるＫ９９−５２７８物質類は、通常は培養菌体中に存在する。培養菌体から目的とするＫ９９−５２７８物質類を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。すなわち、例えば、ろ過、遠心分離、透析、濃縮、乾燥、凍結、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば沈殿、結晶化、再結晶、転溶、向流分配等）、クロマトグラフィー等の手段が用いられる。
本Ｋ９９−５２７８物質類を分離、採取するには菌体抽出液から採取すればよい。例えば菌体よりアセトン、エタノールあるいはメタノールなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後クロロホルムや酢酸エチルなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後シリカゲルカラムクロマトグラフイー、セファデックスＬＨ−２０、ＯＤＳカラムクロマトグラフイー等によって本Ｋ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質をそれぞれ単離することができる。
本発明のＫ９９−５２７８物質類の理化学的性状は次のとおりである。
［１］Ｋ９９−５２７８Ａ物質
（１）性状    ：淡黄色粉末
（２）融点    ：１６０℃
（３）分子式  ：Ｃ３０Ｈ４８Ｏ８、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］
計算値５５９．３２４６、実測値５５９．３２４７
（４）分子量  ：５３６
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとおりであり、λｍａｘ３０６ｎｍ、３１９ｎｍ、３３４ｎｍ、３５２ｎｍに特徴的な吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示すとおりであり、λｍａｘ３４１５、２９３７、１７２６、１０１０ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す
（７）比旋光度：［α］Ｄ２３＝−１５．９°（ｃ＝０．１、メタノール）
（８）溶剤に対する溶解性：ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、水に不溶
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性物質
（１０）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、水素の化学シフト（ｐｐｍ）を第１表に示す
（１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、炭素の化学シフト（ｐｐｍ）を第１表に示す
2004033702.tif 000008
2004033702.tif 000009
以上のように、Ｋ９９−５２７８Ａ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本Ｋ９９−５２７８Ａ物質は式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
［ＩＩ］Ｋ９９−５２７８Ｂ物質
（１）性状    ：淡黄色粉末
（２）融点    ：１５５℃
（３）分子式  ：Ｃ３２Ｈ５２Ｏ８、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］
計算値５８７．３５５９、実測値５８７．３５６１
（４）分子量  ：５６４
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは第３図に示すとおりであり、λｍａｘ３０６ｎｍ、３１９ｎｍ、３３５ｎｍ、３５２ｎｍに特徴的な吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第４図に示すとおりであり、λｍａｘ３４０５、２９３７、１７２６、１００６ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す
（７）比旋光度：［α］Ｄ２３＝−６３．９°（ｃ＝０．１、メタノール）、
（８）溶剤に対する溶解性：ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、水に不溶
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性物質
（１０）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、水素の化学シフト（ｐｐｍ）を第２表に示す
（１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、炭素の化学シフト（ｐｐｍ）を第２表に示す
2004033702.tif 000010
2004033702.tif 000011
以上のように、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本Ｋ９９−５２７８Ｂ物質は式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
［ＩＩＩ］Ｋ９９−５２７８Ｃ物質
（１）性状    ：淡黄色粉末
（２）融点    ：１５６℃
（３）分子式  ：Ｃ３３Ｈ５４Ｏ８、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｎａ］
計算値６０１．３７１６、実測値６０１．３７１７
（４）分子量  ：５７８
（５）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとおりであり、λｍａｘ３０６ｎｍ、３１９ｎｍ、３３５ｎｍ、３５２ｎｍに特徴的な吸収極大を示す
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第６図に示すとおりであり、λｍａｘ３３９０、２９３５、１７２７、１００８ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す
（７）比旋光度：［α］Ｄ２３＝−１５．９°（ｃ＝０．１、メタノール）、
（８）溶剤に対する溶解性：ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、メタノールに可溶、ヘキサン、酢酸エチル、クロロホルム、水に不溶
（９）塩基性、酸性、中性の区別：中性物質
（１０）１Ｈ−プロトン核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、水素の化学シフト（ｐｐｍ）を第３表に示す
（１１）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）の測定には、日本国、バリアン社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定し、炭素の化学シフト（ｐｐｍ）を第３表に示す
2004033702.tif 000012
2004033702.tif 000013
以上のように、Ｋ９９−５２７８Ｃ物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、本Ｋ９９−５２７８Ｃ物質は式［ＩＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
次に、本発明のＫ９９−５２７８物質類の生物学的性状について以下に詳しく説明する。
（１）ペーパーディスク法（ろ紙円板法）による抗真菌活性の測定
Ｋ９９−５２７８物質類の抗カビ活性の測定は、試験菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３（ＡＴＣＣ６２７５）、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３（ＩＦＯ４５８１）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６を用いた。ＧＹ寒天培地（グルコース１．０％、イースト  エクストラクト０．５％、寒天０．８％、ｐＨ６．０）にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３（ＡＴＣＣ６２７５）及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩは０．２％、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３（ＩＦＯ４５８１）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６は０．３％植菌した。活性はペーパーディスク法（厚手６ｍｍ：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、日本国）により評価し、２７℃２４時間培養後に阻止円を測定した。その結果は以下のとおりであった。
本発明によるＫ９９−５２７８Ａ物質は１０μｇで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３（ＡＴＣＣ６２７５）に１８ｍｍ、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３（ＩＦＯ４５８１）に９ｍｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩに９ｍｍ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に１２ｍｍの阻止円を示した。
本発明によるＫ９９−５２７８Ｂ物質は１０μｇで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３（ＡＴＣＣ６２７５）に１６ｍｍ、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３（ＩＦＯ４５８１）に９ｍｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩに７ｍｍ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に１２ｍｍの阻止円を示した。
本発明によるＫ９９−５２７８Ｃ物質は１０μｇで、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３（ＡＴＣＣ６２７５）に１５ｍｍ、Ｍｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３（ＩＦＯ４５８１）に８ｍｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩに８ｍｍ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６に９ｍｍの阻止円を示した。
（２）液体培養法による抗真菌活性の測定
本発明のＫ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質及びＫ９９−５２７８Ｃ物質の液体培地における抗カビ活性は、以下のようにして測定した。
１）試験菌としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６を用いた。９６穴マイクロプレートにＤＭＳＯに溶解したサンプルを適当量それぞれ供与し、減圧下にて溶媒を留去した。培地（グルコース１．０％、イースト・エクストラクト０．５％、ｐＨ６．０）にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＦ２６を０．３％植菌した懸濁液を２００μｌ／ｗｅｌｌづつ加え、２７℃、２４時間培養した。培養後、吸光度計を用い、波長５５０ｎｍで濁度を測定した。活性は薬剤無添加の値を１００％とし、５０％の濁度を示す濃度をＩＣ５０値とした。
その結果、Ｋ９９−５２７８Ａ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は７．２μｇ／ｍｌ、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質の生育に対するＩＣ５０値は１１．８μｇ／ｍｌ及びＫ９９−５２７８Ｃ物質の生育に対するＩＣ５０値は１６．６μｇ／ｍｌであった。
２）試験菌としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３を用いた。９６穴マイクロプレートにＤＭＳＯに溶解したサンプルを適当量それぞれ供与し、減圧下にて溶媒を留去した。培地（グルコース１．０％、イースト・エクストラクト０．５％、ｐＨ６．０）にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ＫＦ１０３を０．３％植菌した懸濁液を２００μｌ／ｗｅｌｌづつ加え、２７℃、４８時間培養した。培養後、吸光度計を用い、波長５５０ｎｍで濁度を測定した。活性は薬剤無添加の値を１００％とし、５０％の濁度を示す濃度をＩＣ５０値とした。
その結果、Ｋ９９−５２７８Ａ物質の試験菌に対するＩＣ５０値は０．３２μｇ／ｍｌ、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質の試験菌に対するＩＣ５０値は０．５３μｇ／ｍｌ及びＫ９９−５２７８Ｃ物質の試験菌に対するＩＣ５０値は０．７５μｇ／ｍｌであった。
３）試験菌としてＭｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３を用いた。９６穴マイクロプレートにＤＭＳＯに溶解したサンプルを適当量それぞれ供与し、減圧下にて溶媒を留去した。培地（グルコース１．０％、イースト・エクストラクト０．５％、ｐＨ６．０）にＭｕｃｏｒ  ｒａｃｅｍｏｓｕｓ  ＫＦ２２３を０．３％植菌した懸濁液を２００μｌ／ｗｅｌｌづつ加え、２７℃、２４時間培養した。培養後、吸光度計を用い、波長５５０ｎｍで濁度を測定した。活性は薬剤無添加の値を１００％とし、５０％の濁度を示す濃度をＩＣ５０値とした。
その結果、Ｋ９９−５２７８Ａ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は１５μｇ／ｍｌ、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は２５μｇ／ｍｌ及びＫ９９−５２７８Ｃ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は３５μｇ／ｍｌであった。
４）試験菌としてＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩを用いた。９６穴マイクロプレートにＤＭＳＯに溶解したサンプルを適当量それぞれ供与し、減圧下にて溶媒を留去した。培地（グルコース１．０％、イースト・エクストラクト０．５％、ｐＨ６．０）にＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＫＦＩを０．３％植菌した懸濁液を２００μｌ／ｗｅｌｌづつ加え、２７℃、２４時間培養した。培養後、吸光度計を用い、波長５５０ｎｍで濁度を測定した。活性は薬剤無添加の値を１００％とし、５０％の濁度を示す濃度をＩＣ５０値とした。
その結果、Ｋ９９−５２７８Ａ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は６１μｇ／ｍｌ、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は１００μｇ／ｍｌ及びＫ９９−５２７８Ｃ物質の試験菌の生育に対するＩＣ５０値は１４０μｇ／ｍｌであった。
以上詳しく述べたように、本発明のＫ９９−５２７８物質類は生物学的性状から明らかな如く新しい骨格を有する真菌に対して有効な新しい抗真菌剤として有用であると期待される。
【図面の簡単な説明】    第１図は本発明のＫ９９−５２７８Ａ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第２図は本発明のＫ９９−５２７８Ａ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第３図は本発明のＫ９９−５２７８Ｂ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第４図は本発明のＫ９９−５２７８Ｂ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
第５図は本発明のＫ９９−５２７８Ｃ物質の紫外部吸収スペクトル（メタノール中）を示したものである。
第６図は本発明のＫ９９−５２７８Ｃ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム法）を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】    次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
５００ｍｌ容試験管にグルコース０．１％、スターチ２．４％、ペプトン０．３％、ミートエキストラクト０．３％、ＣａＣＯ３０．４％を含む培地（ｐＨ７．０に調整）を各１０ｍｌ仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、セイノアガー（スターチ１％、Ｎ−Ｚアミン０．３％、イーストエキス０．１％、肉エキス０．１％、ＣａＣＯ３０．３％、アガー１．２％）に生育させたストレプトミセス  Ｋ９９−５２７８株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｋ９９−５２７８  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９８）を滅菌的に接種し、２７℃で４日間振とう培養し、種培養液を得た。
一方、５００ｍｌ容三角フラスコ１５０本にグリセロール１．５％、マル特脱脂胚芽（日清製粉社製、日本国）１．０％、ＣａＣＯ３０．３％を含む培地（ｐＨ７．０に調整）を各１００ｍｌ仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、前記の種培養液１ｍｌを無菌的に移植し、２７℃で５日間振とう培養した。得られた培養液に各１００ｍｌのアセトンを加え、よく攪拌した後、減圧濃縮し、これを再び酢酸エチルで抽出後、減圧濃縮して粗製物２．４ｇを得た。
次にこの粗製物２．４ｇをクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフイー（１００ｇ、７０−２３０ｍｍ、メルク社製、米国）を行い、クロロホルム、クロロホルム：メタノールが１００：１、５０：１、１０：１、５：１、１：１で、各５００ｍｌずつ溶出させた。活性成分はクロロホルム：メタノールが５：１の画分に４０１ｍｇ得られた。これを更にシリカゲルカラムクロマトグラフイー（３０ｇ、２３０−４００ｍｍ、メルク社製、米国）を行い、クロロホルム：メタノール＝５：１で溶出させ、１９〜２７フラクションに活性成分を得た。
これを更に高速液体クロマトグラフイーにより分離、精製を行った。装置はＳＳＣ−５４１０（センシュー科学社製、日本国）を用い、カラムはＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ（ＯＤＳ系樹脂、４．６×２５０ｍｍ、センシュー科学社製、日本国）を用い、溶媒系は５０％アセトニトリル水を用い、検出はＵＶ３２０ｎｍ、流速１．０ｍｌ／分で行った。その結果、本Ｋ９９−５２７８Ａ物質を１２．８ｍｇ、本９９−５２７８Ｂ物質を２２．４ｍｇ、及び本９９−５２７８Ｃ物質を８．９ｍｇそれぞれ単離した。
産業上の利用分野
以上に説明したように、ストレプトミセス属に属し、Ｋ９９−５２７８物質類を生産する能力を有するストレプトミセス  エスピー  Ｋ９９−５２７８を培地に培養し、その培養物中にＫ９９−５２７８物質類を蓄積せしめ、該培養物から採取した本発明のＫ９９−５２７８Ａ物質、Ｋ９９−５２７８Ｂ物質およびＫ９９−５２７８Ｃ物質は、深在性真菌症を含む真菌症に有効な医薬品としての効果が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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