(57)【要約】本発明は、種々の基質に対して、基質による至適ｐＨの変動が小さく、中性付近で高い酵素活性を有する中性フェノールオキシダーゼ及びその生産方法並びに該中性フェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。本発明の中性フェノールオキシダーゼは、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、ｐＨ６．０〜１２．０で培養することによって得ることができる。本発明によれば、繊維や毛髪の染色等を可能とし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特性：
（１）  至適ｐＨ：５．０〜７．０
（２）  基質特異性
ｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、オルト−アミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、１，３−ジヒドロキシナフトール及び４−ヒドロキシインドールそれぞれの酸化による発色反応をｐＨ６．５付近で触媒する
ｉｉ）  リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する
を有する中性フェノールオキシダーゼ。
【請求項２】
下記（３）〜（７）：
（３）２８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜９．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５）  至適温度：３０〜５０℃
（６）  熱安定性：
Ｉ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７）  等電点：約７．４
の特性、又は
下記（３’）〜（７’）：
（３’）  ３５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’）  ｐＨ安定性：ｐＨ７．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７５％の相対残存活性を維持する
（５’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’）  熱安定性：
Ｉ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を有する
（７’）  等電点：約６．８
の特性、又は
下記（３’’）〜（７’’）：
（３’’）  ４５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’’）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５’’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’’）  熱安定性：
Ｉ’’）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’’）  ０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７’’）  等電点：約６．８
の特性
をさらに有する、請求項１記載の中性フェノールオキシダーゼ。
【請求項３】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌が生産する、請求項１又は２記載の中性フェノールオキシダーゼ。
【請求項４】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌が、エノキタケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕に属する担子菌である、請求項１〜３いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼ。
【請求項５】
エノキタケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕に属する担子菌が、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕  ＩＦＯ３０６０１株である、請求項１〜４いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼ。
【請求項６】
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、ｐＨ６．０〜１２．０で培養することを特徴とする、中性フェノールオキシダーゼの生産方法。
【請求項７】
中性フェノールオキシダーゼが、請求項１又は２記載の中性フェノールオキシダーゼである、請求項６記載の生産方法。
【請求項８】
請求項１〜５いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼに対する抗体。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼを含有してなる染色用組成物。
【請求項１０】
染料をさらに含有してなる、請求項９記載の染色用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼの存在下に、染色対象物と染料とを接触させて、該染色対象物を染色することを特徴とする、染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、種々の基質に対して、基質による至適ｐＨの変動が小さく、中性付近で高い酵素活性を有する中性フェノールオキシダーゼ及びその生産方法並びに該中性フェノールオキシダーゼに対する抗体に関する。より詳しくは、繊維や毛髪の染色等に有用な中性フェノールオキシダーゼ及びその生産方法、並びに該中性フェノールオキシダーゼを特異的に認識する抗体に関する。
【背景技術】  フェノール化合物、ポリフェノール化合物等の種々の基質に対して酸化作用を有する酸化酵素は、主に、ペルオキシダーゼとフェノールオキシダーゼとの２つのグループに分類される。
前記ペルオキシダーゼは、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、反応系中に過酸化水素の存在を必要とする。一方、フェノールオキシダーゼは、種々の基質の酸化を触媒し、共通の基質として、分子状酸素の存在を必要とする。
したがって、既知の酸化酵素類の中でも、前記フェノールオキシダーゼは、大気中の酸素の存在下で種々の基質の酸化を触媒することができるため、酸素存在下で中間体としてのラジカル種の生成に起因する発色、脱色、重合、分解等の多様な化学反応に適している。
それゆえ、臨床分析、バイオセンサー、パルプ及び繊維の漂白、合成板の製造、木質の改善、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成、染色及び抜染、洗濯時の色移り防止、廃液中のフェノール及びアニリン化合物の除去、毒性化合物の解毒、内分泌撹乱物質の分解、ジュースの混濁防止、食品の苦渋味の除去、家畜飼料の体内消化の促進、悪臭の抑制、化石燃料の脱硫、有害環境物質の分解処理等の多方面へのフェノールオキシダーゼの幅広い応用が期待されている。
また、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（以下、ＡＢＴＳと略す）、１−ニトロソ−２−ナフトール−３，６−ジスルホン酸（以下、ＮＮＳと略す）等のメディエーターを用いて反応を行なうことにより、従来触媒されにくかった（あるいは、触媒されなかった）反応をも効率よく行なうこともできる〔国際公開第９６／１６１６５号パンフレット〕。
例えば、メディエーターとしてフェノチアジン−１０−プロピオン酸を用いた場合、フェノールオキシダーゼによるインジゴの分解反応を効率よく行なうことができることが知られている。また、フェノールオキシダーゼ含有物と、フェノールオキシダーゼ・メディエーターを含有する組成物とを併用することにより、ダイオキシンの分解を行なうことができることが開示されている〔特開２００１−０３７４６５号公報〕。
多くの潜在的な工業的利用については、反応効率等の観点から、反応ｐＨは中性及びアルカリ性領域が適しており、特に中性での利用は、環境や人体等に対する影響が少ない温和な条件下での反応が可能である等の、数多くの利点を有する。
前記フェノールオキシダーゼとしては、ラッカーゼ、チロシナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ（カテコールオキシダーゼ）アスコルビン酸オキシダーゼ、又はビリルビンオキシダーゼ等が挙げられる。
ただし、チロシナーゼは、モノフェノール化合物、及び、オルト−ジフェノール化合物の直接的な酸化（発色）を触媒するが、パラ−ジフェノール化合物及びパラ−ジアミン（フェニレンジアミン）化合物の酸化を触媒しないという特徴がある〔メイヤー（Ｍａｙｅｒ）及びハレル（Ｈａｒｅｌ），Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．１８，１９３−２１５，１９７９〕。
前記フェノールオキシダーゼは、従来から種々の植物、細菌類及び真菌類等に見出されている。例えば、植物では、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）の分泌性導管、桃類、栗類、マキ科（Ｐｏｄｏｃａｒｐａｃｅａｅ）等において、前記フェノールオキシダーゼが見出されている。真菌類では、不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ペスタロチア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）等；担子菌亜門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属する、プロイロータス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、レンティナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、ポリポラス（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）等；子嚢菌亜門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）に属するポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、モノシリウム（Ｍｏｎｏｃｉｌｌｉｕｍ）等において、前記フェノールオキシダーゼが見出されている。細菌では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾスピリウム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アエロバクタ（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）等において、前記フェノールオキシダーゼが見出されている〔ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ），Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４３，４７２，１８８３〕。
これらの中で、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｓｅｔｅｓ）（木材腐朽菌類等、中でも白色腐朽菌等）であるキノコでは、例えば、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍｃｏｍｍｕｎｅ）、カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｏｃｔｒｅａｔｕｓ）、ベッコウタケ（Ｆｏｍｉｔｅｌｌａｆｒａｘｉｎｅａ）等において、前記フェノールオキシダーゼが見出されている〔ウラー（Ｕｌｌａｈ）及びエバンス（Ｅｖａｎｓ），Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，２３０−２３４，２０００〕。
しかし、フェノールオキシダーゼの多くは、種々の基質に対する酵素活性の至適ｐＨを酸性側に有し、使用用途が限定されるという欠点がある。また、中性やアルカリ性に至適ｐＨを有するフェノールオキシダーゼでも、用いる基質によって至適ｐＨが大きく変動し、中性付近で種々の基質に対して効率よく作用しないという欠点がある。
また、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、オウリキュラリア・ポリトリカ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ  ｐｏｌｙｔｒｉｃｈａ）、ガノデルム・ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍ  ｌｕｃｉｄｕｍ）、コプリナス・ミカセウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｍｉｃａｃｅｕｓ）、ダエダレオプシス・スチラシナ（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ  ｓｔｙｒａｃｉｎａ）及びフラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｔｉｐｅｓ）には、ラッカーゼが見出されており、なかでも、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）のラッカーゼは、ｐＨ６．０付近の反応条件下に、４−アミノアンチピリンとフェノールとを酸化縮合して発色する活性を示すことが見出されている（特開昭６０−１５６３８５号公報）。
しかしながら、前記ラッカーゼは、酸性条件で培養することにより見出される酵素である。
【発明の開示】
本発明は、繊維や毛髪の染色等を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる手段を提供することを目的とする。本発明は、種々の化合物、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物に対して中性付近に至適ｐＨを有すること、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広範囲で高い安定性を示すこと、基質による至適ｐＨの変動が小さいこと等の特性を有するフェノールオキシダーゼ、具体的には、中性フェノールオキシダーゼを提供することを目的とする。また、本発明は、前記中性フェノールオキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる、生産方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記中性フェノールオキシダーゼの回収、精製等を可能にする抗体を提供することを目的とする。また、本発明は、種々の染料、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミン化合物等による染色が可能な染色方法及び取扱いが簡便である染色用組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  以下の特性：
（１）  至適ｐＨ：５．０〜７．０
（２）  基質特異性
ｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、オルト−アミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、１，３−ジヒドロキシナフトール及び４−ヒドロキシインドールそれぞれの酸化による発色反応をｐＨ６．５付近で触媒する
ｉｉ）  リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する
を有する中性フェノールオキシダーゼ、
〔２〕  下記（３）〜（７）：
（３）２８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜９．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５）  至適温度：３０〜５０℃
（６）  熱安定性：
Ｉ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７）  等電点：約７．４
の特性、又は
下記（３’）〜（７’）：
（３’）  ３５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’）  ｐＨ安定性：ｐＨ７．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７５％の相対残存活性を維持する
（５’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’）  熱安定性：
Ｉ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を有する
（７’）  等電点：約６．８
の特性、又は
下記（３’’）〜（７’’）：
（３’’）  ４５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’’）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５’’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’’）  熱安定性：
Ｉ’’）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’’）  ０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７’’）  等電点：約６．８
の特性
をさらに有する、前記〔１〕記載の中性フェノールオキシダーゼ、
〔３〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌が生産する、前記〔１〕又は〔２〕記載の中性フェノールオキシダーゼ、
〔４〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌が、エノキタケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕に属する担子菌である、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼ、
〔５〕  エノキタケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕に属する担子菌が、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕  ＩＦＯ３０６０１株である、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼ、
〔６〕  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、ｐＨ６．０〜１２．０で培養することを特徴とする、中性フェノールオキシダーゼの生産方法、
〔７〕  中性フェノールオキシダーゼが、前記〔１〕又は〔２〕記載の中性フェノールオキシダーゼである、前記〔６〕記載の生産方法、
〔８〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼに対する抗体、
〔９〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼを含有してなる染色用組成物、
〔１０〕  染料をさらに含有してなる、前記〔９〕記載の染色用組成物、並びに
〔１１〕  前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の中性フェノールオキシダーゼの存在下に、染色対象物と染料とを接触させて、該染色対象物を染色することを特徴とする、染色方法、
に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）ＩＦＯ３０６０１株のＤＥＡＥ−セルロース溶出画分の活性染色の結果を示す。図中、レーン１は、パラ−フェニレンジアミンを用いた活性染色の結果、レーン２は、２，６−ジメトキシフェノールを用いた活性染色の結果、レーン３は、オルト−アミノフェノールを用いた活性染色の結果をそれぞれ示す。
図２は、イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図２中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、三角は、４００ｎｍにおける吸光度（Ａ４００）に基づく、各フラクション中の糖質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、十字は、塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。
図３は、中性フェノールオキシダーゼＩのゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図３中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。
図４は、中性フェノールオキシダーゼＩＩのゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図３中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。
図５は、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの精製スキームを示す。
図６は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セルロース）のクロマトグラムを示す。図６中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、直線は、塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。
図７は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース）のクロマトグラムを示す。図７中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示し、直線は、塩化ナトリウム濃度（Ｍ）を示す。
図８は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの精製スキームを示す。
図９は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。図９中、菱形は、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）に基づく、各画分中のタンパク質量の変化を示し、四角は、４７０ｎｍにおける吸光度（Ａ４７０）に基づく、各画分中の酵素活性の変化を示す。
図１０は、中性フェノールオキシダーゼＩの至適ｐＨの結果を示す。図１０において、最大活性を１００とした場合の相対活性で示す。また、図１０において、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、オルト−アミノフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示し、パネルＤは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。
図１１は、中性フェノールオキシダーゼＩＩの至適ｐＨの結果を示す。図１１において、最大活性を１００とした場合の相対活性で示す。また、図１１において、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、オルト−アミノフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示し、パネルＤは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。
図１２は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの至適ｐＨの結果を示す。図１２において、最大活性を１００とした場合の相対活性で示す。また、図１２において、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、オルト−アミノフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示し、パネルＤは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。
図１３は、中性フェノールオキシダーゼＩのｐＨ安定性の結果を示す。なお、図１３において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図１３中、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図１３中、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
図１４は、中性フェノールオキシダーゼＩＩのｐＨ安定性の結果を示す。なお、図１４において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図１４中、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図１４中、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
図１５は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのｐＨ安定性の結果を示す。なお、図１５において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図１５中、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図１５中、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
図１６は、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ、及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの等電点電気泳動の結果を示す。
図１７は、中性フェノールオキシダーゼＩの至適温度の結果を示す。なお、図１７において、最大活性を１００とした相対活性で示す。また、図１７中、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
図１８は、中性フェノールオキシダーゼＩＩの至適温度の結果を示す。なお、図１８において、最大活性を１００とした相対活性で示す。また、図１８中、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
図１９は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの至適温度の結果を示す。なお、図１９において、最大活性を１００とした相対活性で示す。また、図１９中、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
図２０は、中性フェノールオキシダーゼＩの熱安定性の結果を示す。なお、図２０において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図２０中、パネルＡ及びＢは、ｐＨ７．０における熱安定性を示し、パネルＣ及びＤは、ｐＨ９．０における熱安定性を示す。さらに、図２０中、パネルＡ及びＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
図２１は、中性フェノールオキシダーゼＩＩの熱安定性の結果を示す。なお、図２１において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図２１中、パネルＡ及びＢは、ｐＨ７．０における熱安定性を示し、パネルＣ及びＤは、ｐＨ９．０における熱安定性を示す。さらに、図２１中、パネルＡ及びＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
図２２は、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの熱安定性の結果を示す。なお、図２２において、インキュベーション前の酵素活性を１００とした場合の、相対残存活性で示す。また、図２２中、パネルＡ及びＢは、ｐＨ７．０における熱安定性を示し、パネルＣ及びＤは、ｐＨ９．０における熱安定性を示す。さらに、図２２中、パネルＡおよびＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の中性フェノールオキシダーゼは、以下の特性：
（１）至適ｐＨ：５．０〜７．０
（２）基質特異性
ｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、オルト−アミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、１，３−ジヒドロキシナフトール及び４−ヒドロキシインドールそれぞれの酸化による発色反応をｐＨ６．５付近で触媒する
ｉｉ）  リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する
を有するフェノールオキシダーゼである。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、基質の種類による至適ｐＨの変動が小さいという優れた性質を有する。したがって、本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、多基質に対し、実質的に同一の反応ｐＨ条件での反応を行なうことができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、複数の化合物を基質として用いる場合でも、反応ｐＨ条件の変更の工程を簡略化させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、繊維や毛髪の染色等に用いることにより、反応ｐＨ条件の変更の工程を簡略化することができる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、より具体的には、前記（１）及び（２）の特性に加え、下記（３）〜（７）：
（３）２８ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜９．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５）  至適温度：３０〜５０℃
（６）  熱安定性：
Ｉ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７）  等電点：約７．４
の特性、又は
下記（３’）〜（７’）：
（３’）  ３５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’）  ｐＨ安定性：ｐＨ７．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７５％の相対残存活性を維持する
（５’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’）  熱安定性：
Ｉ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を有する
（７’）  等電点：約６．８
の特性、又は
下記（３’’）〜（７’’）：
（３’’）  ４５ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出）
（４’’）  ｐＨ安定性：ｐＨ８．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する
（５’’）  至適温度：３０〜６０℃
（６’’）  熱安定性：
Ｉ’’）  ０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’’）  ０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
（７’’）  等電点：約６．８
の特性
をさらに有する、中性フェノールオキシダーゼである。なお、本明細書においては、前記（１）及び（２）と（３）〜（７）との特性を有する中性フェノールオキシダーゼを、「中性フェノールオキシダーゼＩ」といい、前記（１）及び（２）と（３’）〜（７’）との特性を有する中性フェノールオキシダーゼを「中性フェノールオキシダーゼＩＩ」といい、前記（１）及び（２’）と（３’’）〜（７’’）との特性を有する中性フェノールオキシダーゼを「中性フェノールオキシダーゼＩＩＩ」という。
本明細書において、「フェノールオキシダーゼ」とは、酸素存在下で、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミン化合物、複素環化合物等を基質として、触媒的に直接酸化する酸化酵素をいう。より具体的には、前記「フェノールオキシダーゼ」とは、パラ−フェニレンジアミン、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ＡＢＴＳ、シリンガルダジンを直接酸化するが、Ｌ−チロシンを直接酸化しないフェノールオキシダーゼをいう。
また、本明細書において、「中性フェノールオキシダーゼ」とは、至適ｐＨ５．０〜７．０、好ましくは、至適ｐＨ５．５〜７．０のフェノールオキシダーゼをいう。
前記フェノール化合物としては、例えば、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ピロガロール、没食子酸、没食子酸プロピル、１−ナフトール、カテキン等が挙げられる。また、前記アミノフェノール化合物としては、例えば、オルト−アミノフェノール、パラ−アミノフェノール等が挙げられる。さらに、前記ジアミン化合物としては、例えば、オルト−フェニレンジアミン、パラ−フェニレンジアミン等が挙げられる。前記複素環化合物としては、４−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール等が挙げられる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼの酵素活性は、基質に対する酸化活性、染料に対する脱色活性等を測定することにより評価されうる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼによる基質に対する酸化活性は、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミン化合物等を水素供与体として用いて酸素分子を還元する、基質の直接的な酸化反応を測定することによって求められうる。水素供与体としては、例えば、２，６−ジメトキシフェノール、オルト−アミノフェノール、パラ−フェニレンジアミン等を挙げることができる。前記酸化活性は、例えば、シリンガルダジン（５３０ｎｍ）、２，６−ジメトキシフェノール及びパラ−フェニレンジアミン（４７０ｎｍ）、オルト−アミノフェノール（４２０ｎｍ）における吸光度の変化により測定される。
具体的には、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８９６ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得る。この基質溶液と中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの酵素溶液  ０．００４ｍｌとを混合して、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を開始させる。ついで、この２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定することによって、前記酸化活性を求められうる。前記酸化活性は、各基質に応じた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義される。
また、本発明の中性フェノールオキシダーゼによる染料に対する脱色活性は、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの存在下、染料の吸収スペクトルの極大値（λｍａｘ）の減少を測定することによって求められうる。前記染料としては、例えば、アシッドバイオレッド１７、エバンスブルー、アシッドブルー８０等を挙げることができる。染料の脱色活性は、例えば、アシッドバイオレッド１７（５５０ｎｍ）、エバンスブルー及びアシッドブルー８０（６３０ｎｍ）における吸光度の減少により測定される。
具体的には、アシッドバイオレッド１７を用いる場合、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを含む酵素溶液  ０．８ｍｌに、１．０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを添加し、ついで、０．２ｍｇ／ｍｌのアシッドバイオレッド１７水溶液  ０．１ｍｌを混合して、得られた混合液について、５５０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することによって、脱色活性を求められうる。なお、前記脱色反応に関する酵素活性は、各染料に応じた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義される。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩは、ゲル濾過法により算出した場合、いずれも約７２ｋＤａの分子量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより算出した場合、中性フェノールオキシダーゼＩは、２８ｋＤａの分子量、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、３５ｋＤａの分子量を有する。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、ゲル濾過法により算出した場合、約４５ｋＤａの分子量について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより算出した場合、４５ｋＤａの分子量を有する。本明細書において、前記分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過法又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により算出された値をいう。前記分子量は、例えば、目的のタンパク質を、ゲル濾過クロマトグラフィーに供して、一定流速の下での溶出液量を測定し、得られた測定値又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に供して、移動度を測定し、得られた測定値と、分子量が既知である分子量マーカーを用いて作成された検量線とを比較することにより算出されうる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、いずれもｐＨ５．０〜７．０の範囲で、高い酵素活性を有し、かかるｐＨの範囲において、最大活性に対して、少なくとも５０％の相対活性を示す。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、前記ｐＨ範囲で優れた酵素活性を示すため、水ベースの反応溶液を用いることができ、効率よく酵素反応を行なうために特別なｐＨ調整が必要とされないという優れた効果を発揮する。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼは、水ベースの反応溶液を用いることができ、具体的には、例えば、特別なｐＨ調整を行なっていない基質と酵素との水溶液でも効率よく反応を行なうことができるため、反応溶液による人体、環境への影響が少ないという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の中性フェノールオキシダーゼは、種々の基質、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物のいずれに対しても至適ｐＨに大きな変動がなく、中性付近のｐＨで効率よく基質を酸化させることができる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物を基質とする酸化反応において、中性付近、具体的には、ｐＨ５．０〜７．０、好ましくは、ｐＨ５．５〜７．０に至適ｐＨを有する。
より具体的には、中性フェノールオキシダーゼＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約７．０であり、オルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．５であり、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．５であり、さらに至適な範囲として、約５．５〜約６．０であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．５、特に、約６．５である。一方、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約７．０、さらに至適な範囲として、約５．５〜約６．０であり、オルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．０であり、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．５、さらに至適な範囲として、約５．５〜約６．０であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜約７．０、より至適な範囲として、約５．５〜約６．５である。また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜約７．０、より至適な範囲として約５．５であり、オルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜７．０であり、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜７．０、より至適な範囲として、約５．０〜６．０であり、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜７．０であり、より至適な範囲として、約６．０である。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、いずれも、
ｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、オルト−アミノフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、１，３−ジヒドロキシナフトール及び４−ヒドロキシインドールそれぞれの酸化による発色反応をｐＨ６．５付近で触媒する
ｉｉ）  リグニンアルカリ抽出物の酸化的重合反応を触媒する
という基質特異性を示す。具体的には、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩは、いずれも、中性（ｐＨ６．５）条件下で、下記基質特異性：
１）  オルト−フェニレンジアミン、パラ−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミン、トリレン−３，４−ジアミン、パラ−アミノジフェニルアミン、２−クロロ−１，４−フェニレンジアミン、２，５−ジアミノトルエン等のジアミン化合物の酸化反応を触媒し、特に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミンの酸化反応を強く触媒する
２）  オルト−アミノフェノール、パラアミノフェノール、５−アミノ−２−メチルフェノール等のアミノフェノール化合物の酸化反応を触媒し、特に、オルト−アミノフェノールの酸化反応を強く触媒する
３）  ２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、プロトカテク酸等のフェノール化合物の酸化反応を触媒し、特に、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を強く触媒する
４）  １−ナフトール、１，３−ジヒドロキシナフトール、１，５−ジヒドロキシナフトール等のナフトール化合物の酸化反応を触媒し、特に、１，３−ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒する
５）  ４−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール等のインドール化合物の酸化反応を触媒する
６）  カテキン（緑茶抽出物）、リグニンアルカリ抽出物（稲由来）、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）等の化合物（抽出物）の酸化反応を触媒する
を示す。なお、前記基質特異性に関して、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合、中性（ｐＨ６．５）条件及びアルカリ性（ｐＨ９．０）条件の両方で同等の強い触媒活性がみられ、その他のジアミン化合物、アミノフェノール化合物、フェノール化合物、ナフトール化合物、インドール化合物、カテキン（緑茶抽出物）及びリグニンアルカリ抽出物（稲由来）のそれぞれを基質とした場合、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いという特性を有する。一方、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩＩは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹）を基質とした場合以外は、様々な基質において、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いという特性を有する。また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、様々な基質に対して、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いという特性を有する。
また、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、いずれも、フェノールオキシダーゼ・メディエーターであるＡＢＴＳ、ＮＮＳを基質として酸化する。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、中性ｐＨから弱アルカリ性ｐＨまでの広範囲で高いｐＨ安定性を示すという優れた性質を有する。具体的には、中性フェノールオキシダーゼＩは、ｐＨ７．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも２５％の相対残存活性、好ましくは、ｐＨ８．０〜９．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する。一方、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、ｐＨ４．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも５０％の相対残存活性、ｐＨ７．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７５％の相対残存活性を維持する。また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、ｐＨ７．０〜１１．５において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大活性に対し、少なくとも３０％以上の相対残存活性、好ましくは、ｐＨ８．０〜１０．０において、３０℃で２０時間のインキュベーション条件下、最大活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を維持する。
本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、それぞれ、３０〜５０℃の範囲、３０〜６０℃の範囲及び３０〜６０℃の範囲で、高い酵素活性を示す。すなわち、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、前記温度範囲において優れた酵素活性を有するため、特別な温度条件に調整することなく、日常の生活温度（室温、水温、体温、気温等）で高い酵素活性を示す。したがって、本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、染色、廃液処理、高分子化合物の合成等を簡便に行なうことができる。具体的には、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩは、
Ｉ）  ０℃〜４０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも５０％の相対残存活性を維持し、好ましくは、０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュペーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ）  ０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも５０％の相対残存活性を維持し、好ましくは、０℃〜３０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
という熱安定性を示す。一方、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩＩは、
Ｉ’）  ０℃〜６０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも１５％の相対残存活性を維持し、０℃〜５０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
ＩＩ’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも７０％の相対残存活性を維持し、好ましくは、０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
という熱安定性を示す。
また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、
Ｉ’’）０℃〜５０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも５０％の相対残存活性を維持し、好ましくは、０℃〜３０℃において、ｐＨ７．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも８０％以上の相対残存活性を維持する
ＩＩ’’）  ０℃〜５０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも４０％の相対残存活性を維持し、好ましくは、０℃〜４０℃において、ｐＨ９．０で１時間のインキュベーション条件下、インキュベーション前の活性に対し、少なくとも９０％の相対残存活性を維持する
という熱安定性を示す。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、具体的には、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌により生産される。前記フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌としては、具体的には、エノキタケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕に属する担子菌が挙げられ、より具体的には、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕ＩＦＯ３０６０１株が挙げられる。本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、特に、前記エノキダケより得ることができるため、供給源の入手が容易であり、取扱いの容易性にも優れる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を培養することによって生産することができる。かかる中性フェノールオキシダーゼの生産方法も本発明に含まれる。
本発明の生産方法は、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、ｐＨ６．０〜１２．０で培養することを１つの特徴とする。
本発明の生産方法においては、担子菌をｐＨ６．０〜１２．０で培養するため、本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩが誘導され、驚くべく効率よくかつ高い収率で本発明の中性フェノールオキシダーゼをえることができるという優れた効果を発揮する。
本発明の生産方法としては、具体的には、１）  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、ｐＨ６．０〜１２．０で培養する工程、及び
２）  前記工程１）で得られた培養物の培養液上清又は該培養物より得られた抽出物から中性フェノールオキシダーゼを分離する工程、
を含む方法が挙げられる。
前記培地のｐＨは、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を十分に生育させ、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを生産するに適したｐＨであればよく、ｐＨ６．０〜１２．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜１１．０、更に好ましくはｐＨ８．０〜１０．０に調製し、滅菌して使用することが望ましい。
なお、本発明においては、中性フェノールオキシダーゼの生産量を向上させる観点から、前記工程１）において、
ｉ）  担子菌の菌糸体を増やすための培養工程、及び
ｉｉ）  前記培養工程ｉ）で得られた菌糸体中において、酵素の発現を誘導して生産量を増やすための培養工程
を行なってもよい。この場合、前記培養工程ｉ）において、菌糸体の増殖に適したｐＨ、具体的には、例えば、ｐＨ２．０〜１３．０、好ましくは、ｐＨ４．０〜１０．０、特に好ましくは、ｐＨ５．２での培養を行ない、ついで、前記培養工程ｉｉ）において、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを生産するに適したｐＨ、具体的には、ｐＨ６．０〜１２．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜１１．０、更に好ましくはｐＨ８．０〜１０．０での培養を行なってもよい。また、前記培養工程ｉ）においては、菌糸体の培養量をスケールアップする操作を適宜行なってもよい。
前記工程１）において、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌は、液体培養、又は固体培養のいずれにおいても培養することができる。
フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌の培養には、この菌が生育可能な、通常の液体培地又は固体培地のいずれを用いてもよい。
なお、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を液体培養する場合は、通気培養又は振盪培養が望ましい。
炭素源としては、例えば、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌が同化しうるものであれば何でもよく、グルコース、ショ糖、糖蜜、でんぷん等の糖類、ふすま、みかんパルプ等が挙げられ、前記炭素源は、単独で、又は、２種類以上を組み合わせて用いることができる。また、窒素源としては、例えば、おから、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、酵母エキス、麦芽エキス、脱脂大豆粉、コーンスティープリカー、尿素等の有機窒素源のほか、硝酸カリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素等も挙げられ、単独で、又は、２種類以上を組み合わせて用いることができる。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩを生産するための培地には、必要に応じて、リン酸塩、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、カリウム、カルシウム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト等の無機塩類、ビタミン類等を添加してもよい。これらの培地中における前記炭素源、窒素源等の濃度は、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を十分に生育させ、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれを生産するに適した濃度であればよく、炭素源は０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％、窒素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％である事が望ましい。
培養温度は、糸状菌が生育する温度であればよく、実用上、１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃であることが望ましい。
培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通気培養の場合は、通常２〜１０日間が望ましい。また、前記培養時間は、培養液の酵素活性値が最大になることを指標として、設定することもできる。
前記工程１）の具体例としては、例えば、
−  フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部  水  （ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振盪培養（１５０往復／分）を行ない、得られた培養液全量を、２Ｌ容の三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振盪培養（１００往復／分）を行なう工程（前記培養工程ｉ）に対応）、及び
−  得られたペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、上清の培養液を除去し、残部の菌糸体に、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％  グルコース、０．１重量％  酵母エキス、０．１４重量％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３６重量％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２重量％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１０重量％  ミネラル混合液（組成：１．０重量％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０重量％  ＺｎＣｌ２、０．７重量％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕５００ｍｌを添加し、さらに２５℃で３日間培養する工程（前記培養工程ｉｉ）に対応）
を行なうこと等が挙げられる。
ついで、前記工程１）で得られた培養物の培養液上清又は該培養物より得られた抽出物から中性フェノールオキシダーゼを分離する工程〔工程２）〕を行なう。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積される。したがって、前記工程２）において、前記工程１）で得られた培養物から、菌体等の不溶物を遠心分離、濾紙又は濾布等による濾過等により除去し、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを包含する培養上清を得ることができる。
また、前記工程２）において、フラムリナ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）属に属する担子菌の菌床、又は栽培後の廃菌床から抽出し、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれを包含する抽出物を得ることもできる。
得られた培養上清又は抽出物を、脱色、濃縮、塩析（例えば、硫安分画）、透析、各種クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の一般に用いられるタンパク質の精製法に供することにより、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを分離精製することができる。
例えば、得られた培養上清又は抽出物を凍結乾燥し、再度溶解させ、得られた産物を濾過することによって不溶物を取り除き、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等に順次供試することにより、精製され、かつ高い比活性を有する本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを含有する画分が得られる。
具体的には、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩは、例えば、
−  得られた培養液のｐＨを７．５に調整し、ｐＨ調整後の培養液  １Ｌに対して、５ｇ（乾燥重量）のＤＥＡＥ−セルロース〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕担体を添加して、タンパク質を吸着させ、
−  該担体に吸着したタンパク質を、３倍容量の１Ｍ  塩化ナトリウムを含有した０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で溶出させ、得られたタンパク質溶液を凍結乾燥させ
−  得られた凍結乾燥物を０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、
−  得られた溶液を、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｑ−セファロースカラム〔２．６×１０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、０〜１Ｍ  塩化ナトリウムによる勾配溶出法で中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩそれぞれを溶出し、それぞれ凍結乾燥させ、
−  得られた凍結乾燥物を、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、
−  得られた産物を、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：セファクリル  Ｓ−１００  ＨＲカラム〔１．６×６０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、溶出を行なうこと
により、得られうる。
一方、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、例えば、
−  前記培養液を濃縮し、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し
−  得られた濾液を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、２．６×６０ｃｍ〕に供し、
−  ０〜１Ｍ  塩化ナトリウムによる勾配溶出法で、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出し、
−  得られた画分を、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して４℃で一晩透析し、
−  得られた溶液を、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｑ−セファロースカラム〔２．６×１０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供し、０．２〜０．５Ｍ  塩化ナトリウムによる勾配溶出法で中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出し、
−  得られた画分を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃、３時間透析し、
−  得られた溶液を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、１．５×５．５ｃｍ〕に供し、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出させること
により得られうる。
本発明において、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの精製度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びこれらの電気泳動後のゲルを用いた活性染色により評価されうる。
本発明において、前記ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの際、共に、泳動用サンプルを加熱せずに電気泳動を行なう。
ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行なった後に、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いる活性染色を行なう場合、例えば、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後に得られたゲルを、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間振盪撹拌し、その後、０．００１Ｍ  パラ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で５分間振盪撹拌することによって行なえばよい。
ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行なった後、クーマシーブリリアントブルーによりタンパク質の染色を行なう場合、例えば、０．５ｇのクーマシーブリリアントブルー  Ｒ２５０を、５００ｍｌのメタノールと１００ｍｌの酢酸との混合溶液（全６００ｍｌ）に溶解し、蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整して得られた染色用溶液に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なえばよい。その後、２５０ｍｌのメタノールと７０ｍｌの酢酸との混合溶液（３２０ｍｌ）を蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整して得られた脱色用溶液で、脱色を行なう。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、パラ−フェニレンジアミンにより活性染色を行なう場合、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に得られたゲルを、２．５ｗ／ｖ％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間振盪撹拌し、その後、０．００１Ｍ  パラ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でゲルを５分間振盪撹拌することによって行なえばよい。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、クーマシーブリリアントブルーによるタンパク質の染色を行なう場合、例えば、０．５ｇのクーマシーブリリアントブルーＲ２５０を、５００ｍｌのメタノールと１００ｍｌの酢酸との混合溶液（全６００ｍｌ）に溶解し、蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整して得られた染色用溶液に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なえばよい。その後、２５０ｍｌのメタノールと７０ｍｌの酢酸との混合溶液（３２０ｍｌ）を蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整して得られた脱色用溶液で、脱色を行なう。
本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色による純度の評価において、それぞれ実質的に均一な精製度を示すため、本発明により、該中性フェノールオキシダーゼに対する抗体も提供される。
本発明の抗体は、本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩに特異的に結合する能力を有するものであればよく、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、本発明の中性フェノールオキシダーゼである中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのそれぞれについて、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）発行〕等に記載の方法にしたがい、ウサギ、マウス等の動物を免疫し、慣用の方法で精製することにより、容易に作製されうる。
また、本発明においては、本発明の中性フェノールオキシダーゼに結合するものであれば、前記モノクローナル抗体の一部、すなわち、抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ等が挙げられる。かかる抗体断片は、例えば、ペプチダーゼ等により、モノクローナル抗体を消化することにより得られうる。例えば、Ｆａｂフラグメントは、前記モノクローナル抗体をパパインにより処理することにより得られ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、前記モノクローナル抗体をペプシンにより処理することにより得られうる。
本発明の抗体は、例えば、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれに対する結合性、親和性等について、ＥＬＩＳＡ法、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ法、免疫電気泳動法等により測定することにより評価されうる。
本発明の抗体は、本発明の中性フェノールオキシダーゼの精製のためのアフィニティークロマトグラフィー、該中性フェノールオキシダーゼのスクリーニング等に用いることができる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、種々の染料、色素等と共に用いることにより、ケラチン繊維等の染色を行なうことができる。したがって、本発明により、染色方法及び染色用組成物が提供される。
また、本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、該中性フェノールオキシダーゼの存在下で、染色対象物と染料とを接触させることにより、染色を行なうことができる。本発明の中性フェノールオキシダーゼによれば、繊維や毛髪の染色等において、特別な温度条件、ｐＨ条件に調整することなく、外界環境条件下において行なうことができ、人体、環境等への影響を低減させることができるという優れた効果を発揮する。
本発明の染色方法を適用しうる染色対象物としては、例えば、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーエン、テンセル、トリアセテート、毛皮、獣皮、皮革、絹又はウール製の布帛、糸、繊維、衣料、フィルム、木材、毛髪等が挙げられる。
前記染料としては、医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料やインドリン及びインドール化合物等が挙げられ、かかる染料は、単独又は複数を組み合わせて用いることができる。また、カップリング剤を用いることもできる。また、直接染料も用いられうる。
インドリン及びインドリン化合物としては、具体的には、インドリン、５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−エチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、Ｎ−ブチル−５，６−ジヒドキシインドリン、４−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−７−メトキシインドリン、６，７−ジヒドロキシインドリン、４，５−ジヒドキシインドリン、４−メトキシ−６−ヒドロキシインドリン、Ｎ−ヘキシル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、３−メチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、４−ヒドロキシインドリン、２，３−ジメチル−５，６−ジヒドロキシインドリン、２−メチル−５−エチル−６−ヒドロキシインドリン、２−メチル−５−ヒドロキシ−６−β−ヒドロキシエチルインドリン、４−ヒドロキシプロピルインドリン、２−ヒドロキシ−３−メトキシインドリン、６−ヒドロキシ−５−メトキシインドリン、６−ヒドロキシインドリン、５−ヒドロキシインドリン、７−ヒドロキシインドリン、７−アミノインドリン、５−アミノインドリン、４−アミノインドリン、５，６−ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１−メチル−５，６−ジヒドキシインドリン、並びにこれらの塩類等を例示されうる。
インドール化合物として、具体的には、４−ヒドロキシインドール、５−ヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール、５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−トリ（ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）インドール、５，６−ジ（ｔ−ブトキシカルボニルオキシ）インドール、５−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−６−ヒドロキシインドール、６−ｔ−ブトキシカルボニルオキシ−５−ヒドロキシインドール、５，６−ジ（エトキシカルボニルオキシ）インドール、５，６−ジ（エチルカルバモイルオキシ）インドール、１−ピバロイル−５−（ピバロイルオキシメトキシ）−６−ピバロイルオキシインドール、１−ピバロイル−５−ピバロイルオキシメトキシ−６−ヒドロキシインドール、５，６−（オキシカルボニルメトキシ）インドール等が挙げられる。
医薬部外品原料規格に収載されている酸化染料としては、具体的に、５−アミノ−ｏ−クレゾール、ｏ−アミノフェノール、ｍ−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、２，６−ジアミノピリジン、５−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−２−メチルフェノール、Ｎ，Ｎ−ビス（β−ヒドロキシ）−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−ニトロ−２’，４’−ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン−２，５−ジアミン、５−アミノ−ｏ−クレゾール・硫酸塩、ｐ−アミノフェノール・硫酸塩、ｏ−クロロ−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、４，４’−ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、ｐ−メチルアミノフェノール・硫酸塩、ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｍ−フェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン−２，５−ジアミン・塩酸塩、ｍ−フェニレンジアミン・塩酸塩、２，４−ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３’−イミノジフェノール、ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ−フェニル−ｐ−フェニレンジアミン・酢酸塩、１，５−ジヒドキシナフタレン、トリレン−３，４−ジアミン、ｐ−メチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ’−ビス（４−アミノフェニル）−２，５−ジアミノ−１，４−キノンジイミン、ｏ−アミノフェノール・硫酸塩、２，４−ジアミノフェノール・硫酸塩、ｍ−アミノフェノール・硫酸塩等を例示されうる。
また、本発明においては、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、１−アミノ−４−メチルアミノアントラキノン、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン・塩酸塩、１，４−ジアミノアントラキノン、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２−アミノ−５−ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｏ−フェニレンジアミン・硫酸塩、ｐ−ニトロ−ｍ−フェニレンジアミン・硫酸塩等の直接染料も用いられうる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの存在下における染色対象物と染料との接触は、例えば、染料と該中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩとを使用時に混合して染色対象物と接触するか、あるいは嫌気性条件下で保存した染料と該中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩとの混合物を使用時に大気中で染色対象物と接触することにより行なわれる。本発明の染色方法は、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、染色用組成物として用いることにより行なわれうる。
本発明の染色用組成物としては、本発明の中性フェノールオキシダーゼと染料とを含有した組成物；本発明の中性フェノールオキシダーゼを含有した組成物Ａと染料等を含有した組成物Ｂとの組み合わせ等が挙げられる。
本発明の染色用組成物には、酵素活性を阻害しない範囲で、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン等の還元剤を配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲で、前記成分の他に、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、香料等を適宜配合することもできる。
本発明の中性フェノールオキシダーゼは、高い安定性を示し、種々の基質、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物のいずれに対しても至適ｐＨに大きな変動がなく、中性付近のｐＨで効率よく基質と作用するという優れた効果を奏する。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼの生産方法によれば、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の抗体によれば、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、簡便に、回収、精製できるという優れた効果を奏する。また、本発明の染色方法によれば、種々の染料、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物等により、簡便に、効率よく、繊維や毛髪を染色することができ、さらには、環境、人体等への影響が低減するという優れた効果を奏する。さらに染色用組成物は、取扱いが簡便であり、簡便に、効率よく、繊維や毛髪を染色することができ、さらには、環境、人体等への影響が低減するという優れた効果を奏する。
以下、実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により、何ら限定されるものではない。
実施例１  エノキダケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕  ＩＦＯ３０６０１株のフェノールオキシダーゼの検索及び調製
（１）  培養条件の検討
フェノールオキシダーゼの誘導のための培養条件のうち、培養ｐＨ条件の検討を例として挙げる。
ラッカーゼの製造法については、特公昭６０−１５６３８５号公報において、イルベックス・ラリテウス  ＡＴＣＣ２０１２３を用い、ｐＨ６．０で３日間培養を行なうことにより、至適ｐＨが４．５付近の酸性ラッカーゼを得る方法が開示されている。
本実施例においては、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株において、フェノールオキシダーゼを誘導する培養方法の決定するために、培地のｐＨを４．０から９．０の範囲で任意に調整し、培養を行なうことにより、培養ｐＨ条件を検討した。
以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作をクリーンベンチ内で行なった。
固体培養用寒天培地〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２．０重量％  寒天、残部  水〕  １０ｍｌを含む滅菌シャーレに、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株を１白金耳相当量播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分け、小片を得た。
前記小片  １０片を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部  水；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振盪培養（１５０往復／分）を行なった。なお、前記液体培養用培地１として、ｐＨを４．０から９．０の範囲で任意に調整された培地のそれぞれを用いた。
それぞれ培養ｐＨの異なる培養液サンプルを毎日サンプリングし、その酵素活性の変化を求めることにより、培養ｐＨ条件による酵素誘導の違いを明らかにした。
酵素活性（酸化活性）は、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）又はトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を緩衝液とし、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いて、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定した。
具体的には、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｅｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．２Ｍ  緩衝液  ０．１ｍｌに、０．０２５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液  ０．０８ｍｌを添加し、基質溶液を調製した。この基質溶液と各サンプリングした培養液  ０．０２ｍｌとを混合して、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を、Ｍｕｌｔｉ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ〔大日本製薬株式会社製、商品名：Ｖｉｅｎｔｏ〕を用いて測定することにより、酵素活性を求めた。なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
各培養ｐＨ条件で７日間培養を行なった結果、ｐＨ５．０及びｐＨ８．０のそれぞれの反応ｐＨにおける酵素活性測定は、共に、培養日数が７日目で酵素活性が最も高く、すべての培養ｐＨ条件で、培養日数の経過により、酵素活性の増加を示した。
ｐＨ５．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ４．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性がみられなかった。具体的には、最も高い酵素活性を示したのは、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液だったが、反応開始から１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、わずか０．１２であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．０６であった。
一方、ｐＨ８．０にて酵素活性を測定した結果、ｐＨ５．０から９．０のｐＨ範囲で培養した各培養液において、すべて明確な酵素活性が示された。なお、ｐＨ４．０で培養することにより得られた培養液は、明らかな酵素活性を示さなかったが、培養日数による酵素活性の増加はみられた。
また、培養ｐＨがより高いｐＨである培養液ほど、高い酵素活性を示した。最も高い酵素活性を示した培養液は、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液で、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、１．２７であった。また、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液について、１７時間後の４７０ｎｍにおける吸光度の変化は、０．７８であった。
以上の結果から、フラムリナ  ベルティペス〔Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株において、前記培養条件により誘導されるフェノールオキシダーゼは、中性フェノールオキシダーゼであり、また、酸性側に至適ｐＨを有する酸性ラッカーゼ又は酸性フェノールオキシダーゼは誘導されないことがわかった。また、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株においては、前記培養条件により、多量の酵素が誘導され、ｐＨ８．０での酵素活性では、ｐＨ９．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性は、ｐＨ６．０の培養ｐＨ条件で７日間培養することにより得られた培養液の酵素活性と比較して、約１．６倍も高くなることがわかった。
このように、前記培養条件により、中性フェノールオキシダーゼを誘導することができ、該中性フェノールオキシダーゼを収率よく生産することができる。
（２）  培養法の検討
以下に示す播種、菌糸体の切り分け、及び培地の添加の各操作をクリーンベンチ内で行なった。なお、かかる培養では、まず、菌体を生育させる培養を行ない、ついで、酵素生産量を増加させる培養を行なう方法を検討した。
固体培養用寒天培地〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、２．０重量％  寒天、残部  水〕  １０ｍｌを含む滅菌シャーレに、エノキダケ〔フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）〕  ＩＦＯ３０６０１株を１白金耳相当量播種し、２５℃で１０日間培養した。その後、寒天培地全体に成長した菌糸体を、滅菌した白金耳にて５ｍｍ四方に切り分けた。
前記小片  １０片を、液体培養用培地１〔組成：２．４重量％  ポテトデキストロースブロス〔ディフィコ（Ｄｉｆｃｏ）社製〕、残部  水  （ｐＨ５．２）；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕に播種し、２５℃で７日間、往復振盪培養（１５０往復／分）を行なった。
得られた培養液全量を、２Ｌ容の三角フラスコ中５００ｍｌの前記液体培養用培地１に添加し、２５℃で３週間、往復振盪培養（１００往復／分）を行なった。
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、培養液を取り去り、残部の菌糸体に、液体培養用培地２〔組成：１．０重量％  グルコース、０．１重量％  酵母エキス、０．１４重量％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３６重量％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２重量％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１０重量％  ミネラル混合液（組成：１．０重量％  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．０重量％  ＺｎＣｌ２、０．７重量％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５重量％  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、ｐＨ９．２；１２１℃で１５分間滅菌したもの〕  ５００ｍｌを添加し、さらに２５℃で３日間培養した。
その後、成長したペレット状の菌糸体を静置沈殿させ、デカンテーションにより培養液を回収した。
回収された培養液は、淡黄色若しくは黄褐色の清澄又は濁った液体であった。回収された培養液は、全容量３０６０ｍｌ、総力価１３１００Ｕ、総タンパク質量７７８ｍｇ、比活性１６．８Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
（３）  粗酵素液の調製
前記（２）で回収された培養液を減圧濾過し、濾液を得た。
前記濾液のｐＨを１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液により７．５に調整した。ｐＨ調整後の濾液１Ｌに対して、５ｇ（乾燥重量）のＤＥＡＥ−セルロース〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕担体を添加し、４℃で３０分間振盪撹拌した。その後、１０分間静置し、上清を除去した。
回収されたＤＥＡＥ−セルロース担体を、該担体の３倍容量の１Ｍ  塩化ナトリウムを含有した０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に添加した。得られた混合溶液を５分間振盪撹拌して、ＤＥＡＥ−セルロース担体に吸着したタンパク質を溶出させた。得られたＤＥＡＥ−セルロース溶出液を、減圧濾過にて回収し、４℃で脱イオン水に対して透析し、得られた産物を凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た（全重量６３０ｍｇ、総力価７３２６Ｕ、総タンパク質量１１０ｍｇ、比活性６６．４Ｕ／ｍｇタンパク質）。なお、凍結乾燥物の力価は、該凍結乾燥物  １ｍｇに対して、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌに溶解させ、ついで、得られた溶液  ０．０１ｍｌと、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．０８９ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール  ０．１ｍｌ（終濃度０．００５ｍＭ）を添加して得られた基質溶液とを混合し、得られた混合物について、前記（１）に記載の手法と同様に、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を求めた。また、前記凍結乾燥物の水溶液について、Ｆｏｌｍ−Ｌｏｗｒｙ法により、タンパク質量を定量した。
前記ＤＥＡＥ−セルロースで得られた凍結乾燥物を再度溶解させた溶液を、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動後に得られたゲルを、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２０分間振盪撹拌した。その後、０．００５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール、０．００５Ｍ  オルト−アミノフェノール及び０．００１Ｍ  パラ−フェニレンジアミンのいずれかを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でゲルを５分間振盪撹拌することにより活性染色を行なった。活性染色の結果を図１に示す。
図１に示すように、活性染色の結果より、フラムリナ  ベルティペス（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株を前記（２）に示される培養方法にしたがって培養することによって生産される培養液には、少なくとも３つの中性フェノールオキシダーゼが含まれることがわかった。
（４）  中性フェノールオキシダーゼの精製〔イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースカラム）〕
前記（３）で得られた凍結乾燥物６３０ｍｇを、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに溶解させ、商品名：ＤＩＳＭＩＣ−１３Ｐ〔アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製〕を用いて、遠心濾過により不溶物を除去し、濾液を得た。
前記濾液  ４９ｍｌを、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｑ−セファロースカラム〔２．６×１０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供した。塩化ナトリウム水溶液を０から１Ｍの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼのうちの２種（中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩ）を溶出した。中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分は、得られた各溶出画分について、４７０ｎｍにおける２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性と、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．８９６ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と、溶出画分  ０．００４ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。
イオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムを図２に示す。図２において、２８０ｎｍにおける吸光度（図２中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４００ｎｍにおける吸光度（図２中、Ａ４００）の変化は、各フラクション中の糖質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図２中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの各画分について、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色は単一のバンドを示したが、ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色では、複数のバンドがみられた。得られた中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩのそれぞれの画分を回収し、透析後、凍結乾燥を行なった。
得られた中性フェノールオキシダーゼＩの画分は、全容量７．５ｍｌ、総力価２５０５Ｕ、総タンパク質量５．４ｍｇ、比活性４６３．９Ｕ／ｍｇタンパク質であった。また、中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分は、全容量１０．５ｍｌ、総力価３６３０Ｕ、総タンパク質量４１．０ｍｇ、比活性８８．５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
（５）  中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの精製〔ゲル濾過クロマトグラフィー〕
前記（３）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩの凍結乾燥物を、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．５ｍｌに溶解させた。得られた産物を、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：セファクリル  Ｓ−１００  ＨＲカラム〔１．６×６０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供した。ついで、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼＩを溶出させた。
中性フェノールオキシダーゼＩについて、ゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図３に示す。図３において、２８０ｎｍにおける吸光度（図３中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図３中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
中性フェノールオキシダーゼＩの画分は、得られた画分について、４７０ｎｍにおける２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性の測定と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色とを行なうことにより決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラフェニレンジアミンによる活性染色及びクーマシーブリリアントブルー染色の結果、単一のバンドを示した。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．８９６ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と中性フェノールオキシダーゼＩの画分  ０．００４ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより求めた。
酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を、中性フェノールオキシダーゼＩとして回収した。得られた中性フェノールオキシダーゼＩの画分は、全容量１０ｍｌ、総力価１５３０Ｕ、総タンパク質量１．６ｍｇ、比活性９５６．３Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
一方、前記（３）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩの凍結乾燥物を、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．５ｍｌに溶解させた。得られた産物を、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：セファクリル  Ｓ−１００  ＨＲカラム〔１．６×６０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供した。ついで、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、前記カラムに吸着された本発明の中性フェノールオキシダーゼＩＩを溶出した。
中性フェノールオキシダーゼＩＩについて、ゲルクロマトグラフィーのクロマトグラムを図４に示す。図４において、２８０ｎｍにおける吸光度（図４中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図４中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
本発明の中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分は、得られた画分について、４７０ｎｍにおける２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性の測定と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色とを行なうことにより決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色、及び、クーマシーブリリアントブルー染色の結果、単一のバンドを示した。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）０．８９６ｍｌに０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分  ０．００４ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化により測定することにより求めた。
酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を、中性フェノールオキシダーゼＩＩとして回収した。得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分は、全容量１１．５ｍｌ、総力価７４２Ｕ、総タンパク質量５．３ｍｇ、比活性１４０Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
上記の抽出・精製のスキームを図５に示す。また、各精製工程における中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの精製度、比活性を表１に示す。
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（６）中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの精製〔イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−セルロースカラム）〕
前記実施例１の（２）に記載の方法と同様に、培養液を回収した。回収された培養液は、全容量４０００ｍｌ、総力価２６８００Ｕ、総タンパク質量１１８８ｍｇ、比活性２２．５Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
回収された培養液を、透析膜〔商品名：Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｉｚｅ３６（和光純薬（ＷＡＫＯ）社製）〕に、２５０ｍｌずつ入れた。得られたチューブを、ビニール袋に入れ、該チューブに、約１２０ｇのポリエチレングリコール２００００〔和光純薬株式会社製〕をまぶした後、該チューブが入ったビニール袋を氷中で約４８時間保持して、培養液を濃縮した。濃縮培養液を、小型高速冷却遠心機〔トミー（ＴＯＭＹ）社製、ローターＮｏ．８．１〕を用いて４℃、１０，０００回転にて２０分間遠心分離して、沈殿を除去した。得られた培養液濃縮物は、全容量２２９ｍｌ、総力価９８１４Ｕ、総タンパク質量１９３．６ｍｇ、比活性５０．７Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
前記培養液濃縮物を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析した。小型高速冷却遠心機〔トミー（ＴＯＭＹ）社製、ローターＮｏ．８．１〕を用いて４℃、１２０００回転にて３０分間遠心分離した上清を、商品名：Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ〔セルロースアセテート、０．４５μｍ、アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製〕を用いて濾過して、不溶物を除去し、それにより、濾液を得た。
前記濾液  ２２９ｍｌを、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、２．６×６０ｃｍ〕に供した。塩化ナトリウムを０から１Ｍの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出した。中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、得られた溶出画分について、４７０ｎｍにおける２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを図６に示す。図６において２８０ｎｍにおける吸光度（図６中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図６中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８９５ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分０．００５ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。
得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、全容量１８ｍｌ、総力価１１０２Ｕ、総タンパク質量３．６ｍｇ、比活性３０３Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
（７）中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの精製〔イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースカラム）〕
得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分を回収し、得られた画分を、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して４℃で一晩透析した。商品名：Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ〔セルロースアセテート、０．４５μｍ、アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製〕を用いて濾過して、不溶物を除去し、それにより、濾液を得た。
前記濾液  ２１．５ｍｌを、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化された商品名：Ｑ−セファロースカラム〔２．６×１０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供した。塩化ナトリウムを０．２から０．５Ｍの濃度範囲で用いた勾配溶出法により、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出した。中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、得られた溶出画分について、４７０ｎｍにおける２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色とを行なうことにより決定された。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを図７に示す。図７において２８０ｎｍにおける吸光度（図７中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図７中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８９５ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分０．００５ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。
得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、全容量１８ｍｌ、総力価１１５Ｕ、総タンパク質量１ｍｇ、比活性１１７．４Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
前記中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して４℃、３時間透析した。商品名：Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ〔セルロースアセテート、０．４５μｍ、アドバンテック（ＡＤＶＡＮＴＥＣ）社製〕を用いて濾過し、不溶物を除去して濾液を得た。得られた濾液を、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製、１．５×５．５ｃｍ〕に供した。ついで、１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、前記カラムに吸着された中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出させた。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、得られた画分について、２，６−ジメトキシフェノールに対する酵素活性の測定と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色とを行うことにより決定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のパラ−フェニレンジアミンによる活性染色の結果では、メジャーな一本のバンドと、マイナーな二本のバンドが認められた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のクーマシーブリリアントブルー染色の結果、単一のバンドを示した。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、９６穴のマイクロプレート〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、Ｃｏｓｔｅｒ（登録商標）３３６８〕のウェル内で、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）  ０．１７８ｍｌに０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．０２ｍｌを添加して、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分  ０．００２ｍｌとを混合し、その結果得られた混合物の色の変化を、目視によって確認した。
酵素活性を示し、活性染色により染色された画分を、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩとして回収した。得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分は、全容量３．３ｍｌ、総力価２４２Ｕ、総タンパク質量０．６ｍｇ、比活性４２３．３Ｕ／ｍｇタンパク質であった。
上記の中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの抽出、精製のスキームを図８に示す。また、各精製工程における中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの精製度、比活性を表２に示す。
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実施例２  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの分子量
実施例１で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩのそれぞれ分子量を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過法により測定した。
ゲル濾過クロマトグラフィーには、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：セファクリル  Ｓ−１００  ＨＲカラム〔１．６×６０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いた。
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの溶液  ３ｍｌを、ＦＰＬＣシステム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕を用いて、０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した商品名：セファクリル  Ｓ−１００ＨＲカラム〔１．６×６０ｃｍ、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕に供した。０．１Ｍ  塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、前記カラムでゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを溶出させ、溶出液量を測定した。なお、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩは、それぞれ別々に、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分子量を決定した。また、前記と同じ条件下で、分子量マーカーとして、分子量既知の４種のタンパク質（分子量約６７ｋ、４３ｋ、２５ｋ、及び１３．７ｋＤａ）をそれぞれ単独で添加し、それぞれの溶出液量を測定した。
中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの溶出時間と、分子量マーカーの溶出液量から得られた検量線とにより、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩのそれぞれの分子量を決定した。
その結果、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの分子量は、共に、約７２ｋＤａであった。
また、実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの分子量を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いたゲル濾過法により測定した。
前記実施例１の（７）で得られたＱ−セファロースカラム後の中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分（全容量１２ｍｌ、総力価２６２Ｕ、総タンパク質量３．８ｍｇ、比活性６９Ｕ／ｍｇタンパク質）を、商品名：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＭＣ３０，０００ＮＭＷＬ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ〔ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）社製〕を用いて遠心濾過することにより濃縮した。
得られた濃縮液  ０．８５５ｍｌを、商品名：セファデックスＧ−１００〔アマシャム  バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を充填し、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラム（２．６×６０ｃｍ）に供した。ついで、０．０５Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩを溶出させ、溶出液量を測定した。また、前記と同じ条件で、分子量マーカーとして、分子量既知の５種のタンパク質（分子量約７３ｋＤａ、６１ｋＤａ、４７ｋＤａ、３７ｋＤａ、および２４ｋＤａ）をそれぞれ単独で添加し、それぞれの溶出液量を測定した。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、ゲル濾過クロマトグラフィーのクロマトグラムを図９に示す。図９において２８０ｎｍにおける吸光度（図９中、Ａ２８０）の変化は、各画分中のタンパク質量の変化を示し、４７０ｎｍにおける吸光度（図９中、Ａ４７０）の変化は、各画分中の酵素活性の変化を示す。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性は、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．８９５ｍｌに、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌを添加し、基質溶液を得、得られた基質溶液と溶出画分０．００５ｍｌとを混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、算出した。
その結果、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの分子量は約４５ｋＤａであった。
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのそれぞれの溶液  ５μｌと、分子量マーカー〔アマシャム  バイオサイエンシーズ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ）社製、商品名：ＬＭＷ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）１５μｌとを同時に１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルを、２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間振盪撹拌し、その後、１ｍＭ  パラフェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中でゲルを５分間振盪撹拌することによって活性染色を行なった。その後、蒸留水で５分間洗浄し、染色用溶液〔０．５ｇのクーマシーブリリアントブルー  Ｒ２５０を、５００ｍｌのメタノールと１００ｍｌの酢酸との混合溶液（６００ｍｌ）に溶解し、得られた混合溶液を蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整〕に、電気泳動後のゲルを浸すことにより染色を行なった。その後、脱色用溶液〔２５０ｍｌのメタノールと７０ｍｌの酢酸との混合溶液（３２０ｍｌ）を蒸留イオン交換水で全量を１０００ｍｌに調整〕で、脱色を行なった。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれは、単一のバンドを示した。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの分子量は、それぞれ２８ｋＤａ、３５ｋＤａ及び４５ｋＤａであった。
実施例３  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの至適ｐＨ
中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩと各基質との反応において、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．２Ｍ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５、１０．５及び９．５）、０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０、９．０、８．０及び７．０）、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、７．０、６．５、６．０及び５．５）、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５、５．０、４．５、４．０及び３．５）、０．２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５、３．０及び２．０）を用いた。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合、前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分  ０．０２ｍｌと、前記緩衝液のいずれか  ０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
また、オルト−アミノフェノールを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の評価法において、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  オルト−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液を用い、同様の操作を行ない、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の評価法において、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用い、同様の操作を行ない、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
シリンガルダジンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の評価法において、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．００５Ｍ  シリンガルダジンのエタノール溶液を用い、同様の操作を行ない、５３０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、各基質に対して適切な波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）とした。
中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩそれぞれの至適ｐＨの結果を、図１０及び図１１にそれぞれ示す。なお、図１０及び図１１において、最大活性を１００とした場合の相対活性で示す。また、図１０及び図１１のそれぞれにおいて、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、オルト−アミノフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示し、パネルＤは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。
その結果、図１０に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜７．０、オルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜７．０、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜６．０、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約６．５であることがわかった。
また、図１１に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜６．０、オルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜７．０、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５〜６．０、シリンガルダジンを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約６．５であることがわかった。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩと各基質との反応において、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．２Ｍ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５、１１、１０．５、１０及び９．５）、０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０、９．５、９、８．５、８、７．５及び７）、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５、７、６．５、６、５．５及び５）、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５、５、４．５、４及び３．５）、０．２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ４、３．５、３、２．５及び２）を用いた。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０４ｍｌと、前記緩衝液のいずれか０．８６ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて充分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
また、オルト−アミノフェノールを基質とした場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．００５ｍｌと、前記緩衝液のいずれか０．８９５ｍｌと、０．０５Ｍ  オルト−アミノフェノールのジメチルスルホキシド溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて充分混合し、得られた混合物について、４２０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０１ｍｌと、前記緩衝液のいずれか０．８９ｍｌと、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット中にて充分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
シリンガルダジンを基質とした場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０２ｍｌと、前記緩衝液のいずれか０．９６ｍｌと、０．００５Ｍ  シリンガルダジンのエタノール溶液  ０．０２ｍｌとをマイクロキュベット中にて充分混合し、得られた混合物について、５３０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、各基質に対して適切な波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）とした。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの至適ｐＨの結果を、図１２に示す。なお、図１２において、最大活性を１００とした場合の相対活性で示す。また、図１２におけるパネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、オルト−アミノフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示し、パネルＤは、シリンガルダジンを基質とした場合を示す。
その結果、図１２に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、至適ｐＨは、約５．５、オルト−アミノフェノールを用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜７．０、パラ−フェニレンジアミンを用いた場合、至適ｐＨは、約５．０〜６．０、シリンガルダジンを用いた場合、至適ｐＨは、約６．０であることがわかった。
実施例４  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれのｐＨ安定性
中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれと各基質との反応において、緩衝液として、ｐＨに応じて、０．２Ｍ  グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．５）、０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ１０．０、９．０及び８．０）、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０及び６．０）、０．２Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０及び４．０）、０．２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０及び２．０）を用いた。
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの画分  ０．０２ｍｌと、前記緩衝液のいずれか  ０．１８ｍｌとを混合して、３０℃で１時間又は２０時間インキュベートすることにより、前処理を行なった。
ついで、前処理後の精製酵素液  ０．０２ｍｌと前記緩衝液  ０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合において、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用い、同様の操作を行ない、同じく、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、各基質で定めた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素活性を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれのｐＨ安定性の結果を、図１３、図１４及び図１５にそれぞれ示す。なお、図１３、図１４及び図１５それぞれにおいて、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図１３、図１４及び図１５それぞれにおいて、パネルＡ及びＢは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＣ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。さらに、図１３、図１４及び図１５それぞれにおいて、パネルＡ及びＣは、１時間後のｐＨ安定性を示し、パネルＢ及びＤは、２０時間後のｐＨ安定性を示す。
その結果、図１３に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩは、１時間処理の場合、ｐＨ７．０〜１０．０で安定であり、最大活性に対し、７５％以上の相対残存活性が保持されていた。また、２０時間処理の場合、ｐＨ８．０〜９．０で安定であり、最大活性に対し、７０％以上の相対残存活性が保持されていた。
また、図１４に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、１時間処理の場合、ｐＨ６．０〜１０．０で安定であり、最大活性に対し、７５％以上の相対残存活性が保持されていた。また、２０時間処理の場合、ｐＨ７．０〜１０．０で安定であり、最大活性に対し、７５％以上の相対残存活性が保持されていた。
図１５に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、１時間処理の場合、ｐＨ７．０〜１１．５で安定であり、最大活性に対し、５０％以上の相対残存活性が保持されていた。また、２０時間処理の場合、ｐＨ８．０〜１０．０で安定であり、最大活性に対し、７０％以上の相対残存活性が保持されていた。
実施例５  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの等電点
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの等電点を調べるため、ポリアクリルアミドゲルを用いて等電点電気泳動を行なった。具体的には、終濃度２％になるように、商品名：Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ３−１０；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）をアクリルアミド中に溶解し、過硫酸アンモニウム及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を添加することにより、終濃度５％のポリアクリルアミドゲルを調製した。電極液としては、１．０Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液を陰極液として、０．５Ｍ  酢酸を陽極液として用いた。５０Ｖの定電圧で６時間泳動を行なった。ゲル上の活性染色は、０．００１Ｍ  パラ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、泳動後のゲルを浸潰し、振盪撹拌することにより行なった。等電点の測定は、泳動後、ゲル上の試料を泳動していない部分の両端を、２．５ｍｍの幅で切り出し、得られた小片を脱イオン水に浸して、４℃で抽出した液のｐＨを測定することにより行なった。
中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの等電点電気泳動の結果を図１６に示す。
その結果、図１６に示されるように、ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動により、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの等電点は、それぞれ、７．４、６．８及び６．８と決定された。
実施例６  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの至適温度
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、それぞれの酵素活性を、種々の温度条件（２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて、それぞれ別々に測定した。
具体的には、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いる場合、マイクロセントリフュージチューブ〔ポレックスバイオプロダクツインコーポレティッド（ＰｏｒｅｘＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｃ．）社製〕中、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌと、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分０．０２ｍｌとを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて５分間反応を行なった。その後、得られた反応液に、２Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）０．１ｍｌを添加することにより、酵素反応を停止させた。
また、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の酵素活性の測定法において、２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用いて同様に操作を行なった。
ついで、得られた反応産物について、分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕により、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合及びパラ−フェニレンジアミンを基質とした場合共に、４７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの至適温度の結果を、図１７及び図１８にそれぞれ示す。なお、図１７及び図１８において、最大活性を１００とした相対活性で示す。また、図１７及び図１８のそれぞれにおいて、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
その結果、図１７に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩの至適温度は、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、２０〜５０℃で、最大活性に対し、８０％以上の相対活性を有しており、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、３０〜６０℃で最大活性に対し、６０％以上の相対活性を有していることがわかった。
また、図１８に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩの至適温度は、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、３０〜６０℃で、最大活性に対し、７０％以上の相対活性を有しており、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、４０〜７０℃で、最大活性に対し、８０％以上の相対活性を有していることがわかった。
一方、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、種々の温度条件（２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて測定した。
具体的には、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いる場合、キュベット中で、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとを混合し、得られた混合物について、各反応温度にて１０分間加温したものを、基質溶液とした。
実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分を、蒸留イオン交換水で１０倍に希釈し、酵素溶液を得た。得られた酵素溶液  ０．０２ｍｌを、前記基質溶液に添加し、十分混合した。
得られた混合物について、各反応温度にて５分間反応を行なった。ついで、得られた反応産物について、４７０ｎｍにおける吸光度を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合における、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用い、同様の操作を行い、同じく、４７０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１増加させる酵素活性を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの至適温度の結果を、図１９に示す。なお、図１９において、最大活性を１００とした相対活性で示す。また、図１９において、パネルＡは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
その結果、図１９に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの至適温度は、２，６−ジメトキシフェノールを基質として用いた場合、２０〜５０℃で最大活性に対し、７０％以上の相対活性を有しており、パラ−フェニレンジアミンを基質として用いた場合、２０〜６０℃で最大活性に対し、６０％以上の相対活性を有していることがわかった。
実施例７  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの熱安定性
ｐＨ７．０及びｐＨ９．０のそれぞれにおいて、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの熱安定性を調べた。
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分  ０．００５ｍｌを、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて、０．０４５ｍｌの０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（全量０．００５ｍｌ）中で、種々の時間（５、１０、２０、４０、及び６０分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合、前処理を行なった酵素溶液  ０．０２ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとを、マイクロキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
また、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の評価法において、２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用いて同様に操作を行ない、同じく、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩのそれぞれのｐＨ９．０における熱安定性を求める場合、前記ｐＨ７．０における前処理の代わりに、前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分  ０．０４８ｍｌを、種々の温度（３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて、０．０１２ｍｌの０．５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、種々の時間（５、１０、２０、４０、及び６０分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。
中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩの熱安定性の結果を、図２０及び図２１にそれぞれ示す。なお、図２０及び図２１において、最大活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図２０及び図２１のそれぞれにおいて、パネルＡ及びＢは、ｐＨ７．０における熱安定性を示し、パネルＣ及びＤは、ｐＨ９．０における熱安定性を示す。さらに、図２０及び図２１のそれぞれにおいて、パネルＡ及びＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
その結果、図２０に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩのｐＨ７．０における熱安定性は、１時間後の結果において、３０℃まで、最大活性に対して、８０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼＩのｐＨ９．０における熱安定性は、１時間後の結果において、３０℃まで、最大活性に対して、９０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。
また、図２１に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩのｐＨ７．０における熱安定性は、１時間後の結果において、５０℃まで、最大活性に対して、９０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、中性フェノールオキシダーゼＩのｐＨ９．０における熱安定性は、１時間後の結果において、５０℃まで、最大活性に対して、７０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。
また、ｐＨ７．０及びｐＨ９．０のそれぞれにおいて、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの熱安定性を調べた。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのｐＨ７．０における熱安定性を調べる場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０１２５ｍｌを、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて、０．０３７５ｍｌの０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（全量０．０５ｍｌ）中で、種々の時間（５、１０、２０、４０、及び６０分間）インキュベートすることにより、前処理を行った。
２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合、前処理を行なった酵素溶液  ０．０２ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８８ｍｌ、０．０５Ｍ  ２，６−ジメトキシフェノール水溶液  ０．１ｍｌとをキュベット中にて十分混合し、得られた混合物について、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合、前記２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合の評価法において、２，６−ジメトキシフェノール水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  パラ−フェニレンジアミン水溶液を用いて同様に操作を行ない、同じく、４７０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、４７０ｎｍにおける吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのｐＨ９．０における熱安定性を求める場合、前記ｐＨ７．０における前処理の代わりに、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０１２５ｍｌを、種々の温度（２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び８０℃）下にて、０．０３７５ｍｌの０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）（全量０．０５ｍｌ）中で、種々の時間（５、１０、２０、４０、及び６０分間）インキュベートすることにより、前処理を行なった。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの熱安定性の結果を、図２２に示す。なお、図２２において、インキュベーション前の酵素活性を１００とした相対残存活性で示す。また、図２２のパネルＡ及びＢは、ｐＨ７．０における熱安定性を示し、パネルＣ及びＤは、ｐＨ９．０における熱安定性を示す。さらに、図２２において、パネルＡ及びＣは、２，６−ジメトキシフェノールを基質とした場合を示し、パネルＢ及びＤは、パラ−フェニレンジアミンを基質とした場合を示す。
その結果、図２２に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのｐＨ７．０における熱安定性は、１時間後の結果において、３０℃まで、インキュベーション前の酵素活性に対して、８０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩのｐＨ９．０における熱安定性は、１時間後の結果において、４０℃まで、インキュベーション前の酵素活性に対して９０％以上の相対残存活性を有していることがわかった。
実施例８  本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの基質特異性
本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの基質特異性を調べるために、パラ−フェニレンジアミン、４−ヒドロキシインドール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、パラ−アミノフェノール、オルト−アミノフェノール、シリンガルダジン、ビリルビン、ＡＢＴＳ、ＮＮＳ、及びＬ−チロシンを基質として用い、基質特異性を調べた。
本発明の中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩそれぞれについて、パラ−フェニレンジアミン、４−ヒドロキシインドール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ＡＢＴＳ、ＮＮＳを基質として用いた場合、前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの画分  ０．０２ｍｌと、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８８ｍｌと、０．０５Ｍ  基質水溶液  ０．１ｍｌとをマイクロキュベット内で十分混合し、得られた混合物について、各基質で定めた波長における吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：Ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−アミノフェノール又はオルト−アミノフェノールを基質とする場合、前記酵素活性の評価法において、前記０．０５Ｍ  基質水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  ジメチルスルホキシド溶液を用いて同様に操作を行ない、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
シリンガルダジンを基質とした場合、前記酵素活性の評価法において、前記０．０５Ｍ  基質水溶液の代わりに、０．００５Ｍ  シリンガルダジンのエタノール溶液を用い、前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩそれぞれの画分  ０．０２ｍｌと、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．９６ｍｌと、０．００５Ｍ  シリンガルダジンエタノール溶液  ０．０２ｍｌとをマイクロキュベット内で十分混合し、得られた混合物について、５３０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
ビリルビンを基質とする場合、前記酵素活性の評価法において、前記０．０５Ｍ  基質水溶液の代わりに、０．０１Ｍ  ジメチルスルホキシド溶液を用いて、同様に操作を行ない、４５０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
Ｌ−チロシンを基質とした場合、前記酵素活性の評価法において、前記０．０５Ｍ  基質水溶液の代わりに、０．００１Ｍ  Ｌ−チロシンを含む０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用い、前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩそれぞれの画分  ０．０２ｍｌと、０．００１Ｍ  Ｌ−チロシンを含む０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液  ０．９８ｍｌとをマイクロキュベット内で十分混合し、得られた混合物について、４９０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、パラ−フェニレンジアミン、４−ヒドロキシインドール、２−メトキシフェノール、２，６−ジメトキシフェノール、カテコール、ＡＢＴＳを基質として用いた場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０４ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８６ｍｌと、０．０５Ｍ  基質水溶液  ０．１ｍｌとをキュベット中で十分混合し、得られた混合物について、各基質で定めた波長における吸光度の変化を分光光度計〔ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）社製、商品名：ｖ−５３０〕を用いて測定することにより、酵素活性を評価した。
パラ−アミノフェノール又はオルト−アミノフェノールを基質として用いた場合、前記酵素活性の評価法において、前記０．０５Ｍ  基質水溶液の代わりに、０．０５Ｍ  基質のジメチルスルホキシド溶液を用いて同様に操作を行ない、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
ＮＮＳを基質として用いた場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０４ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．９４ｍｌと、０．００５Ｍ  ＮＮＳ水溶液  ０．０２ｍｌとをキュベット中で十分混合し、得られた混合物について、４１０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
シリンガルダジンを基質として用いた場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０４ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．８６ｍｌと、０．００５Ｍ  シリンガルダジンのエタノール溶液  ０．１ｍｌとをキュベット中で十分混合し、得られた混合物について、５３０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
ビリルビンを基質として用いた場合、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．０４ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．９４ｍｌと、０．０００５Ｍ  ビリルビンのジメチルスルホキシド溶液  ０．０２ｍｌとをキュベット中で十分混合し、得られた混合物について、４５０ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、各基質で定められた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれについて、各基質における測定波長及び結果を、表３、表４及び表５に示す。
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表３、表４及び表５のそれぞれの結果より、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、フェノールオキシダーゼ活性を有することがわかった。より詳しくは、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、共にシリンガルダジン及びＡＢＴＳの直接酸化（発色）反応を触媒することから、ラッカーゼ活性を有し、加えて、ビリルビンの直接酸化による分解反応を触媒することから、ビリルビンオキシダーゼ活性をも有することが示される。しかし、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩは、共にＬ−チロシンの直接酸化（発色）反応を触媒しないことから、チロシナーゼ活性は有していない。
また、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、フェノールオキシダーゼ・メディエーターであるＡＢＴＳ、ＮＮＳを基質として酸化することから、これらの基質をメディエーターとして仲介することによる、酵素反応の増強や、従来触媒されにくかった（触媒されなかった）反応をも効率よく行なうこと等ができる。
実施例９  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの基質特異性（直接的酸化反応）
上記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩのそれぞれについて、種々の化合物に対する基質特異性（直接的酸化反応）を、基質の酸化重合による発色反応で測定した。
基質としては、ジアミン化合物、アミノフェノール系化合物、フェノール化合物及びその他の化合物（抽出物）を用いた。基質溶液として、１．０％（Ｖ／Ｖ）〔パラ−アミノフェノール、トリメチルヒドロキノン、ナフトール化合物、及びインドール化合物は、１０％（Ｖ／Ｖ）〕のジメチルスルホキシドを含む０．０１Ｍ  基質水溶液（その他の化合物については、２．０ｍｇ／ｍｌの基質水溶液）を用いた。
詳細には、前記酵素を含む酵素水溶液  ０．８ｍｌに、１．０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌ又は１．０Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．１ｍｌを添加し、得られた混合物に、０．０１Ｍ  基質溶液（その他の化合物については、２．０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを混合した。ついで、得られた混合物について、紫外可視分光光度計（島津製作所社製、商品名：ＵＶ−２４５０）を用いて、吸光度の変化を測定し、酵素活性（発色活性）を調べた。なお、酵素活性は、吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ；ユニット）として定義した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼについても、同様に、ｐＨ６．５及び９．０それぞれにおける基質特異性を調べた。
実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの、種々の化合物に対する基質特異性（直接的酸化反応）を、基質の酸化重合による発色反応で測定した。
基質としては、ジアミン化合物、アミノフェノール化合物、フェノール化合物、ナフトール化合物、インドール化合物及びその他の化合物（抽出物）を用いた。基質溶液として、１％（Ｖ／Ｖ）〔パラ−アミノフェノール、トリメチルヒドロキノン、ナフトール化合物、及びインドール化合物は１０％（Ｖ／Ｖ）〕のジメチルスルホキシドを含む０．０１Ｍ  基質水溶液（その他の化合物については、２．０ｍｇ／ｍｌの基質水溶液）を用いた。
具体的には、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．００５ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）又は０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．５ｍｌと、蒸留イオン交換水  ０．３９５ｍｌと、前記基質水溶液  ０．１ｍｌと十分混合した。得られた混合物について、紫外可視分光光度計〔島津製作所社製、商品名：ＵＶ−２４５０〕を用いて、各基質で定めた波長における吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を評価した。
なお、酵素活性は、各基質で定めた波長における吸光度を、１分間で１増加させる酵素量を１単位（Ｕ：ユニット）として定義した。
直接的酸化反応の結果を、比活性で表６に示す。
2004078958.tif 000007
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その結果、表６に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、中性条件（ｐＨ６．５）下で、ジアミン化合物、アミノフェノール化合物、フェノール化合物等の様々な基質の酸化反応を強く触媒した。
また、中性フェノールオキシダーゼＩは、以下に示すような基質特異性を示した：
１）    ジアミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミンの酸化反応を強く触媒した。
２）    アミノフェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、オルト−アミノフェノールの酸化反応を強く触媒した。
３）    フェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を強く触媒した。
４）    ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、１，３−ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒した。
５）    インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
６）    その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
さらに、中性フェノールオキシダーゼＩは、中性（ｐＨ６．５）条件下とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性を比較した場合、様々な基質において、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いことがわかった。
また、中性フェノールオキシダーゼＩは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合、中性（ｐＨ６．５）条件下でも強い触媒活性を示したが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下でも同等の強い触媒活性がみられた。
また、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼは、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性とを比較した場合、ジアミン化合物及びカテコール以外の基質では、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性よりもアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性が高く、前記中性フェノールオキシダーゼＩとは大きく異なっていることがわかった。
中性フェノールオキシダーゼＩＩは、以下に示すような基質特異性を示した：
１）    ジアミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−パラ−フェニレンジアミンの酸化反応を強く触媒した。
２）    アミノフェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、オルト−アミノフェノールの酸化反応を強く触媒した。
３）    フェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を強く触媒した。
４）    ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。この中でも特に、１，３−ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒した。
５）    インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
６）    その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
さらに、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性とを比較した場合、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合以外は、様々な基質において、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いことがわかった。
また、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、リグニンアルカリ抽出物（針葉樹由来）を基質とした場合、中性（ｐＨ６．５）条件下でも強い触媒活性を有していたが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下でさらに強い触媒活性がみられた。
一方、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼは、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性とを比較した場合、ジアミン化合物及びカテコール以外の基質では、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性よりもアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性が高く、中性フェノールオキシダーゼＩＩとは大きく異なっていることがわかった。
また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、以下に示すような基質特異性を示した。
（１）    ジアミン化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、２−クロロ−１，４−フェニレンジアミンの酸化反応を強く触媒した。
（２）    アミノフェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、オルト−アミノフェノールの酸化反応を強く触媒した。
（３）    フェノール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、２，６−ジメトキシフェノールの酸化反応を強く触媒した。
（４）    ナフトール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。なかでも、特に、１，３−ジヒドロキシナフタレンの酸化反応を強く触媒した。
（５）    インドール化合物を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
（６）    その他の化合物（抽出物）を基質とした場合、いずれの基質に対しても、中性（ｐＨ６．５）条件下で、基質の酸化反応を触媒した。
さらに、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、中性（ｐＨ６．５）条件下とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性を比較した場合、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性のほうが、アルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性よりも高いことがわかった。
一方、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼは、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性とアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性とを比較した場合、ジアミン化合物及びカテコール以外の基質では、中性（ｐＨ６．５）条件下での比活性よりもアルカリ性（ｐＨ９．０）条件下での比活性が高く、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩとは大きく異なっていることがわかった。
前記フラムリナ  ベルティペス〔Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ  ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）  ＩＦＯ３０６０１株の中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩによれば、所望の基質に対する反応に応じて反応ｐＨ条件を変更することなく、中性条件下で様々な基質を効率よく酸化させることができる。これにより、環境、人体等に対する影響が少ない温和な条件下での反応が可能であり、前記中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、フェノール樹脂の製造、人工漆塗料の製造、接着剤の製造、有機化合物の合成、染色、廃液処理、毒性化合物の解毒、木質の改善、合成版の製造、土壌の改良等の多方面への幅広い応用が期待される。
実施例１０  中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩそれぞれの脱色活性
前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、種々の染料に対する脱色活性を、染料が持つ紫外可視吸収スペクトルの極大値の変化により測定した。
詳細には、前記前記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを含む酵素水溶液  ０．８ｍｌに１．０Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．１ｍｌを添加し、得られた混合物に、０．２ｍｇ／ｍｌ  染料水溶液  ０．１ｍｌを混合した。ついで、得られた混合物について、紫外可視分光光度計（島津図製作所社製、商品名：ＵＶ−２４５０）を用いて、吸光度の変化を測定し、酵素活性（脱色活性）を調べた。
前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩについて、種々の染料に対する脱色活性を、染料が持つ紫外可視吸収スペクトルの極大値の変化により測定した。
詳細には、前記実施例１の（７）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩＩＩの画分  ０．００５ｍｌと、蒸留イオン交換水  ０．３９５ｍｌと、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．５ｍｌと、０．２ｍｇ／ｍｌ  染料水溶液  ０．１ｍｌとを十分混合し、得られた混合物について紫外可視分光光度計〔島津製作所社製、商品名：ＵＶ−２４５０〕を用いて吸光度の変化を測定し、酵素活性（脱色活性）を調べた。
なお、酵素活性は、吸光度を、１分間で１増加させる酵素活性を１単位（Ｕ；ユニット）として定義した。比較のために、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼについても、同様に、脱色活性を調べた。
各染料の測定波長及び脱色活性の結果を、比活性で表７に示す。
2004078958.tif 000011
その結果、表７に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩは、ナチュラルオレンジ６、アシッドバイオレット１７、エバンスブルー及びアシッドブルー８０に対して、脱色活性を示した。
また、表７に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩは、アシッドバイオレット１７、エバンスブルー及びアシッドブルー８０に対して、脱色活性を示した。
また、表７に示されるように、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、エバンスブルー及びアシッドブルー８０に対して、脱色活性を示した。
さらに、中性フェノールオキシダーゼＩは、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩと比較して、ナチュラルオレンジ６に対する脱色活性が異なっていることがわかった。
また、中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩと比較して、アシッドバイオレット１７に対する脱色活性が異なっていることがわかった。
一方、ミロセシウム属菌類由来ビリルビンオキシダーゼは、前記中性フェノールオキシダーゼＩとは、ナチュラルオレンジ６、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルーＲ、エバンスブルーにおいて大きく異なっていた。また、前記中性フェノールオキシダーゼＩＩとは、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルーＲ、エバンスブルーにおいて大きく異なっていた。また、前記中性フェノールオキシダーゼＩＩＩとは、アシッドオレンジ８、レマゾールブリリアントブルーＲ、エバンスブルーにおいて大きく異なっていた。
中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、中性条件下で染料を効率よく脱色することができる。これにより、前記中中性フェノールオキシダーゼＩ、中性フェノールオキシダーゼＩＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩＩは、廃液処理、脱色、洗濯時の色移り防止等の多方面への幅広い応用が期待される。
実施例１１  中性フェノールオキシダーゼＩ及び中性フェノールオキシダーゼＩＩによる染毛試験
上記実施例１の（５）で得られた中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを用いた染毛試験は、パラ−フェニレンジアミンを染料として用いて、ヤク毛束及び羊毛布を酸化重合によって染色することにより行なった。
詳細には、染毛試験においては、染料としてパラ−フェニレンジアミン  ０．５ｇと、増粘剤としてヒドロキシエチルセルロース  ０．７５ｇと、界面活性剤として硬化ヒマシ油  １．０ｇと、高級アルコールとしてセタノール  ０．２５ｇと、ミリスチルアルコール  ０．２５ｇとを添加し、得られた混合物のｐＨを、乳酸  ０．５ｇとモノエタノールアミンとにより、７．０に調整し、イオン交換水により重量を５０ｇとすることにより得られた組成物を用いた。また、ヤク毛束１ｇと羊毛布１枚（２×３ｃｍ）に対して、この組成物を２ｇと、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩの酵素液をｐＨ７．０においてパラ−フェニレンジアミンに対して合計１．０Ｕになるように添加した混合物を塗布し、３０℃で１時間保持した。
その結果、ヤク毛束及び羊毛布は、中性フェノールオキシダーゼＩ又は中性フェノールオキシダーゼＩＩを用いることにより、黒く染色された。
【産業上の利用可能性】  本発明の中性フェノールオキシダーゼは、安定的に、種々の基質、特に、フェノール化合物、アミノフェノール化合物及びジアミン化合物に対して、中性付近のｐＨで効率よく反応させる際に用いられうる。また、本発明の中性フェノールオキシダーゼの生産方法によれば、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、効率よく、簡便に、安価に、かつ大量に得ることができる。さらに、本発明の抗体によれば、本発明の中性フェノールオキシダーゼを、簡便に、回収、精製できる。また、本発明の染色方法によれば、種々の染料、具体的には、フェノール化合物、アミノフェノール化合物、ジアミノフェノール化合物等による、簡便で、効率よい繊維や毛髪の染色を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる。さらに染色用組成物によれば、簡便で、効率のよい、繊維や毛髪の染色を可能にし、さらには、環境、人体等への影響を低減させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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