(57)【要約】本発明は、より低コストで短時間に、簡便かつ再現性よく行うことができる化学物質の発癌性スクリーニング方法、並びに前記化学物質の発癌性をスクリーニングする際に好適に用いることができるマイクロアレイ及び遺伝子セットを提供することを課題とする。本発明は、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出する。具体的には、発癌性が既知の化学物質及び発癌性が未知の化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させ、化学物質処理群及び非処理群の哺乳類動物生体の肝細胞からｍＲＮＡを抽出し標的遺伝子の発現量解析を行った後、解析結果を基にクラスタリング解析することにより、前記発癌性が未知の化学物質の発癌性をスクリーニングする。前記標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブからなる遺伝子セット及び前記プローブを搭載したマイクロアレイ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出することを特徴とする化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項２】
発癌性が既知の化学物質及び発癌性が未知の化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させ、化学物質処理群及び非処理群の前記哺乳類動物の肝細胞における肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出し、検出結果を基にクラスタリング解析することにより、前記発癌性が未知の化学物質の発癌性をスクリーニングすることを特徴とする請求項１に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項３】
哺乳類動物がヒト、マウス、ラットのいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項４】
下記表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
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【請求項５】
上記表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも２０種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項４に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項６】
上記表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも５０種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項５に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項７】
下記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
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【請求項８】
上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも２０種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項７に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項９】
上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも５０種類の遺伝子の発現量を検出することを特徴とする請求項８に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項１０】
上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子すべての発現量を検出することを特徴とする請求項９に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
【請求項１１】
哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを搭載したことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１２】
哺乳類動物がヒト、マウス、ラットのいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載のマイクロアレイ。
【請求項１３】
複数種のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１４】
少なくとも２０種類のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１３に記載のマイクロアレイ。
【請求項１５】
少なくとも５０種類のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロアレイ。
【請求項１６】
複数種のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
少なくとも２０種類のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１６に記載のマイクロアレイ。
【請求項１８】
少なくとも５０種類のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
少なくとも１２５種類のプローブを搭載したマイクロアレイであって、各プローブが上記表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１８に記載のマイクロアレイ。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のマイクロアレイに搭載するプローブからなる遺伝子セット。
【請求項２１】
遺伝子の発現量を以下の工程を含む方法を用いて検出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化学物質の発癌性スクリーニング方法。
（１）肝細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として標識された核酸を作製する工程；
（２）標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを有した３次元マイクロアレイにおいて、前記標識された核酸と前記プローブとを接触させる工程；
（３）前記標識された核酸と前記プローブとの結合強度に基づいて変化するシグナル強度を検出する工程。
【請求項２２】
配列番号１〜１２６のＤＮＡ、又はこれらの何れかに相補的なＤＮＡのうちの少なくとも２のＤＮＡからなるプローブＤＮＡセット。
【請求項２３】
前記ＤＮＡの長さが、１〜１０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【請求項２４】
前記ＤＮＡの長さが、１１〜２０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【請求項２５】
前記ＤＮＡの長さが、２１〜３０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【請求項２６】
前記ＤＮＡの長さが、３１〜４０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【請求項２７】
前記ＤＮＡの長さが、４１〜５０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【請求項２８】
前記ＤＮＡの長さが、５１〜６０ｍｅｒである請求項２２に記載のプローブＤＮＡセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、化学物質の発癌性スクリーニング方法及び該化学物質の発癌性スクリーニング方法に使用するマイクロアレイ及び遺伝子セットに関する。
【背景技術】  新規に合成された種々の化学物質の安全性を評価するために、様々な毒性試験に関するガイドラインが整備され、施行されている。毒性試験の主たる例として、変異原性試験、発癌性試験等が挙げられる。
毒性試験のうち、化学物質の発癌性を実験的に予測することは、該化学物質が人体に及ぼす影響を考える上で極めて重要な課題である。化学物質の発癌性を調べる有力な試験法としては、例えば、ラット等の実験動物を用いた発癌性試験がある。これは、ラット等の実験動物に化学物質を数ヶ月〜数年間投与し、化学物質を投与された実験動物における癌発生を検知することにより、投与した化学物質の発癌性を判断する方法である（例えば、下記文献参照）。
伊藤他、「毒性試験講座１３  発がん性」地人書館、平成３年６月、ｐ．１−２１０。
【発明の開示】
しかしながら、従来の実験動物に化学物質を投与して該化学物質の発癌性を調べる方法においては、数ヶ月〜数年という非常に長い時間と、多大な実験コスト、さらには、病理学者の熟練したスキルが必要である。
したがって、本発明は、より低コストで短時間に、簡便かつ再現性よく行うことができる化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供することを目的とする。また、化学物質の発癌性をスクリーニングする際に好適に用いることができるマイクロアレイ及び遺伝子セットを提供することも目的とする。
かかる課題を解決するため、本発明者らは、化学物質の発癌性を試験するために、摂取された化学物質によって典型的に最初に発生する肝癌に着目して研究を行った。肝癌の発生に関わり、かつ生物学的に有意に発現レベルが変動する遺伝子群は数個〜数百個からなると予想される。
すなわち、本発明は、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、発癌性が既知の化学物質及び発癌性が未知の化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させ、化学物質処理群及び非処理群の哺乳類動物の肝細胞における肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出し、検出結果を基にクラスタリング解析することにより、前記発癌性が未知の化学物質の発癌性をスクリーニングする化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、前記哺乳類動物がヒト、マウス、ラットのいずれかである化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、下記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
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さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも２０種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも５０種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、下記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
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さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも２０種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも５０種類の遺伝子の発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、かかる化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子すべての発現量を検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
さらに、本発明は、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを搭載したマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、前記哺乳類動物がヒト、マウス、ラットのいずれかである前記マイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、複数種のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、少なくとも２０種類のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、少なくとも５０種類のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表１、表２及び表３に示す合計２４０種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、複数種のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、少なくとも２０種類のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、少なくとも５０種類のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが上記の表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、少なくとも１２５種類のプローブを搭載した前記マイクロアレイであって、各プローブが表４及び表５に示す合計１２５種類の遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするマイクロアレイを提供する。
さらに、本発明は、かかるマイクロアレイに搭載するプローブからなる遺伝子セットを提供する。
さらに、本発明は、前述した化学物質の発癌性スクリーニング方法において、遺伝子の発現量を以下の工程を含む方法を用いて検出する化学物質の発癌性スクリーニング方法を提供する。
（１）肝細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として標識された核酸を作製する工程；
（２）標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを有した３次元マイクロアレイにおいて、前記標識された核酸と前記プローブとを接触させる工程；
（３）前記標識された核酸と前記プローブとの結合強度に基づいて変化するシグナル強度を検出する工程。
更に本発明は、配列番号１〜１２６のＤＮＡ、又はこれらの何れかに相補的なＤＮＡのうちの少なくとも２のＤＮＡからなるプローブＤＮＡセット；並びに、前記プローブＤＮＡセットにおいて前記ＤＮＡの長さが、１〜１０ｍｅｒであるもの、前記ＤＮＡの長さが、１１〜２０ｍｅｒであるもの、前記ＤＮＡの長さが、２１〜３０ｍｅｒであるもの、前記ＤＮＡの長さが、３１〜４０ｍｅｒであるもの、前記ＤＮＡの長さが、４１〜５０ｍｅｒであるもの、及び前記ＤＮＡの長さが、５１〜６０ｍｅｒであるものも提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法に使用した３次元マイクロアレイシステムを示す概略構成図である。
図２は、図１に示す３次元マイクロアレイシステムの一部を拡大した概略断面図である。
図３は、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法におけるクラスタリング解析の結果を示す模式図である。
図４は、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法におけるクラスタリング解析の結果を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】＜化学物質の発癌性スクリーニング方法＞
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法は、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出することを特徴とする。肝臓は、化学物質を摂取した際の消化、吸収経路から、最初に前記化学物質の影響が典型的に現れる場所である。すなわち、肝癌の発生の可能性を予測することができれば前記化学物質が生体へ及ぼす影響の指標となる。また、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出することによって、従来のように病理学的に癌を検知する方法に比べて、短期間且つ低コストで化学物質の発癌性を予側することができる。
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法の具体的な実施方法については、例えば以下のように行うことが好ましい。
最初に、発癌性が既知である化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させる。以下、化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させることを処理と呼ぶ。１つの化学物質について最低１群３匹以上の動物に処理し、後述する遺伝子の発現量解析及びクラスタリング解析の際、その平均値を用いることが好ましい。これは、動物の個体差によるデータのばらつきを低減するためである。原則として１つの動物には１つの化学物質を処理するが、複数の化学物質による発癌性スクリーニングを行うなどの際は、この限りではない。
また、１つの化学物質について発癌性の用量相関を調べることも可能である。この場合、１つの化学物質について、投与量又は作用量を段階的に変えた複数の処理群を設ける。
このようにすることによって、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法は、任意の化学物質について、どの用量でどの程度の発癌性を有しているかということを検出する目的にも適用できる。
前記哺乳類動物は、ヒト、マウス、ラットのいずれかであることが好ましい。これらの動物は、哺乳類動物のなかでも遺伝子情報に関するデータベースの構築が比較的進んでいるからである。
また、被処理動物は離乳後なるべく早い時期であることが好ましく、例えばラットの場合、６週齢以前であることが望ましい。６週齢より高齢であると、処理する化学物質以外の種々の影響が現れてくるなどの弊害が生じる可能性があるからである。
化学物質を哺乳類動物に投与する方法としては、具体的には、化学物質を飼料に混ぜて摂取させる方法や、腹腔内に直接投与する方法などがある。飼料に化学物質を混合して投与する場合、栄養学的観点等も考慮し、該化学物質の濃度が５％以下となるよう混合するのが好ましい。また、化学物質を前記哺乳類動物の肝細胞に作用させる方法としては、例えば、肝組織などを生体から隔離、培養し、この培養した細胞組織に化学物質を直接作用させてもよい。
従来の発癌性試験においては、病理学的に癌の症状が顕著になるまで発癌性を検知できずにいたため、数ヶ月〜数年という実験時間を必要としていたが、本発明においては遺伝子の発現に起因するｍＲＮＡ量を調べるので、投与期間を大幅に縮小できるという効果がある。上記の飼料に混ぜて被実験動物に摂取させる場合は、例えばラットについては１〜２週間でよく、腹腔内に直接投与する場合も、例えばラットについては１〜２週間でよい。培養した肝細胞に化学物質を直接作用させる場合は、化学物質に対する感受性が高いので、例えば、２４時間等の極めて短時間で発癌性のスクリーニングを行うことができる。
前記発癌性が既知である化学物質は、発癌性を誘発する物質と誘発しない物質に分けられるが、前者の例としてｄｉｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ（ＤＥＮ）、２−ａｍｉｎｏ−３，８−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５−ｆ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ（ＭｅＩＱｘ）、ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ（ＰＢ）、ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ、２−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｎｅ、ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ、ｂａｒｂｉｔａｌ、ｂｅｎｚｅｎｅ、ｃａｐｔａｎ、ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ、ｄｉｃｏｆｏｌ、ｄｉｅｔｈｙｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ、ｅｐｉｃｈｌｏｒｏｈｙｄｒｉｎなどが挙げられ、後者の例としてＣａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ、Ｃａｔｅｃｈｏｌ、Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ、Ｇａｒｃｉｎｏｌ、Ｚｅｒｕｍｂｏｎｅ、１’−ａｃｅｔｏｘｙｃｈａｖｉｃｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ（ＡＣＡ）、ａｃｅｔｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ、ａｎｉｌｉｎｅ、ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ、ｂｅｎｚｏｉｎ、ｂｕｓｕｌｆａｎ、ｂｕｔｙｌｕｒｅｔｈａｎｅ、ｃａｐｒｏｌａｃｔａｍ、ｄｉａｚｉｎｏｎ、ｄｉｍｅｔｈｏａｔｅ、ｅｔｈｉｏｎａｍｉｄｅなどがある。
次に、ｍＲＮＡを肝細胞から抽出するが、例えば、生体から肝臓の任意の一部を摘出し、グアニジンチオシアネート法などを用いてｍＲＮＡを抽出すればよい。抽出したｍＲＮＡに基づいて標的遺伝子の発現量を解析するが、ここで、標的遺伝子とは、哺乳類ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子であり、特に好ましい条件について以下に説明する。
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法においては、下記の表６、表７及び表８に示す合計２４０種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出することが好ましい。表６、表７及び表８に示す合計２４０種類の遺伝子は、ラットゲノムに含まれる遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子群であり、肝癌の形成に伴って発現量が変動する遺伝子や薬物代謝に関与する遺伝子などを含んでいる。また、表には各遺伝子のＡＣＣ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）Ｎｕｍｂｅｒ及びシンボル（慣用名）が記載されている。なお、各遺伝子の配列については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから得ることができる。
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発現量を検出する標的遺伝子は、上記の表６、表７及び表８に示す遺伝子のうち、より好ましくは少なくとも２０種類、さらに好ましくは少なくとも５０種類である。本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法において、例えば、マイクロアレイを使用して標的遺伝子の発現量を検出する場合、経済性などを考慮すると２０種類以上の遺伝子についての同時解析を行うことが好ましいからである。また、後に述べるクラスタリング解析の信頼度（ランダム度）を維持するためには、５０種類以上の遺伝子についてその発現量を解析することが望ましいからである。
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法は、さらに好ましくは、下記の表９及び表１０に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、少なくとも１種類の遺伝子の発現量を検出するものである。表９及び表１０に示す合計１２５種類の遺伝子は、前述した肝癌に関連する遺伝子群のうち、肝癌で特異的に発現量が変動するラット遺伝子群である。すなわち、これらの遺伝子は、正常の肝細胞と比較して肝癌細胞で発現量が変動したり、既知の発癌性化学物質投与で発現量が変動したりするものである。発癌性が未知の化学物質について、これらの遺伝子の発現量を定量的に測定すれば、該化学物質の発癌性の程度をより効率良く予測することができる。
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発現量を検出する標的遺伝子は、上記の表９及び表１０に示す合計１２５種類の遺伝子のうち、より好ましくは２０種類以上、さらに好ましくは５０種類以上である。さらに、１２５種類の遺伝子すべてについて、各遺伝子の発現量を検出すれば、より確実に後述するクラスタリング解析を行うことができるので最も好ましい。
なお、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法において、上述した肝癌に関連する遺伝子の他の遺伝子について発現量を検出してもよい。その際、上記の肝癌に関連する遺伝子のうち最低２０種類の遺伝子を含み、これらの遺伝子以外の遺伝子の上限を６０種類となるように構成することが望ましい。
以上、ラットゲノムのうち肝癌に関連する遺伝子を標的遺伝子とする場合について詳細に述べたが、本発明はこれに限定されるものではない。哺乳類動物間のゲノムにはかなりの相同性が存在しており、特定のラット遺伝子から該遺伝子と相同性を有する他の哺乳類動物の遺伝子を特定することは容易である。したがって、本発明に関連する標的遺伝子は肝癌に関連するラット遺伝子のみならず、他の哺乳類動物ゲノムのうち肝癌に関連する遺伝子にも適用できる。なお、先に述べたように、哺乳類動物の中でも遺伝子データの蓄積が比較的進んだヒト、マウスがラットの他に好適である。
以下、上記の標的遺伝子の発現量を、マイクロアレイを用いて検出する場合について説明する。マイクロアレイを用いれば複数の遺伝子についてその発現量を同時解析できるという効果がある。
マイクロアレイは、例えば、スライドガラス上にプローブが固相化された２次元マイクロアレイ（以下、２次元マイクロアレイ）を用いてもよいが、３次元マイクロアレイを用いることが好ましい。３次元マイクロアレイは、３次元的液体を収容し得る微笑な液体収容部を２次元的に複数配置してなるものである。以下、３次元マイクロアレイを用いて標的遺伝子の発現量解析を行う際のより好ましい条件等について説明する。
３次元マイクロアレイを用いて標的遺伝子の発現量解析を行う際は、以下の工程を含むことが好ましい。すなわち、（１）肝細胞から抽出されたｍＲＮＡを鋳型として標識された核酸を作製する工程、（２）標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを有した３次元マイクロアレイにおいて、前記標識された核酸と前記プローブとを接触させる工程、（３）前記標識された核酸と前記プローブとの結合強度に基づいて変化するシグナル強度を検出する工程、である。
ｍＲＮＡを鋳型として標識された核酸を作製する工程（１）において、核酸とはＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡの何れをも意味するが、後述するハイブリダイゼーションにおける安定性などの観点からｃＤＮＡであることが好ましい。標識方法としては、ＲＩ標識、蛍光色素標識、蛍光を発する半導体微粒子や金属のコロイド粒子による標識、ビオチン標識などを用いることが可能である。蛍光標識が最も一般的で簡便、安全であるため好ましい。蛍光物質の例として、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ｄＵＴＰ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰなどが挙げられ、これらの核酸をｍＲＮＡからｃＤＮＡへ逆転写する際織り込むことによって蛍光標識された核酸を得ることができる。
次いで、標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを有した３次元マイクロアレイにおいて、前記標識された核酸と前記プローブとを接触させる工程（２）において、前記プローブは、ｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを用いると、塩基配列に特異的な検出が可能となるので好ましい。以下、オリゴＤＮＡプローブをプローブと称する。プローブの塩基長としては、２０〜７０ｍｅｒであることが好ましく、より好ましくは４０〜６０ｍｅｒである。前記塩基長が２０ｍｅｒ未満の場合、非特異的なハイブリッド形成が増加する傾向にあり、７０ｍｅｒを超えると、プローブの合成に要する時間、費用の観点から好ましくない。
前記３次元マイクロアレイは自家蛍光の少ない材質からなることがより好ましい。液体収容部に適する材質の例として、酸化アルミニウムが挙げられる。ここで、液体収容部は、プローブを固相化するための最小単位であり、プローブスポットとも呼ばれる。
３次元マイクロアレイは、前述した２次元マイクロアレイに比べて、多量のプローブを固相化することができる。また、従来の２次元マイクロアレイでは、プローブを定量的に固相化することが困難なため、各プローブの固相化量に、ばらつきが生じることが多かった。これに対し、３次元マイクロアレイは、定量的なプローブの固相化が可能なため、発現量の解析などの定量的な実験に好適である。
前記標識された核酸と前記プローブとを接触させる際、例えば、以下のように行うことが望ましい。前述したｍＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡを、例えば、滅菌蒸留水などに溶解させた液体試料を作製する。この際、後段で説明するが、プローブとのハイブリッド形成を容易にする目的で、適宜、塩などを添加することができる。
上記の液体試料を前記３次元マイクロアレイ内外で流動させて、ターゲットとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。ここで、ターゲットとは液体試料に含まれる核酸のことであり、ハイブリッドとは、相補的な塩基配列を持つ核酸が形成する２本鎖のことである。３次元マイクロアレイの内外に液体試料を流動させることによって、各液体収容部の空間に、容易にターゲットを含む液体試料を流動させることができるため、確実にターゲット分子とプローブ分子とが接触でき、ハイブリッド形成を短時間で行うことができる。
ターゲットとプローブとのハイブリッドを形成させる際、例えば、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液中で行うことが好ましい。つまり、上記範囲の塩濃度となるように、ＳＳＰＥ溶液を液体試料に添加して、ハイブリダイゼーション反応を行う。ここで、ＳＳＰＥ溶液は、例えばＳＳＰＥ溶液（２０倍）を希釈して調製することができる。ＳＳＰＥ溶液（２０倍）の組成は、３．０Ｍ  塩化ナトリウム、０．２Ｍ  リン酸ナトリウム、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である。ＳＳＰＥ溶液の塩濃度は希釈の程度を表し、例えば、塩濃度が６倍であるＳＳＰＥ溶液とは、ＳＳＰＥ溶液（２０倍）を２０分の６倍に希釈したものである。ＳＳＰＥ溶液の塩濃度については、塩濃度が高いほうが、ハイブリッド形成が行われ易いためシグナル強度の増大に寄与するが、塩濃度が６倍を超えると、その増加率が減少する傾向にある。一方、塩濃度が低いほうがハイブリッド形成の特異性は上昇するが、塩濃度が０．１倍未満の場合、反応時間を長くする必要がある。
また、液体試料とプローブとを接触させる際、液体試料を間欠的に３０〜２００回流動させることが好ましい。３０回未満の場合、標識された核酸分子とプローブ分子との接触頻度が不十分なため、ハイブリッド形成反応が十分に行われないことが多い。一方、２００回を超えると、反応時間が長くなる割にハイブリッド形成の効率が低下する傾向にある。
さらに、液体試料をプローブに接触させる前に、予め、液体試料を６０〜１００℃で１〜１０分間、より好ましくは７０〜９５℃で２〜５分間加熱することが好ましい。また、液体試料を加熱後、急冷を行うことがさらに好ましい。液体試料を加熱することによって、その中に含まれるターゲット分子のもつれ（分子内結合及び／又は分子間結合）が解け、また、急冷することによって、前記もつれが再発生するのを防ぐ。このように前処理されたターゲットを含む液体試料をハイブリダイゼーションに用いることによって、非特異的なハイブリッドの形成が抑制される。
さらに、ハイブリッドを形成させる好ましい条件として、所定の温度範囲とすることが好ましいが、温度条件については後段で詳しく説明する。
前記標識された核酸と前記プローブとの結合強度に基づいて変化するシグナル強度を検出する工程（３）においては、液体試料とプローブとを接触させる工程を終了した後に、より好ましくは、例えば、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液をマイクロアレイ内外で流動させることにより洗浄を行う。これは、非特異的ハイブリッドを解離することを目的としているが、ＳＳＰＥ溶液の塩濃度が０．１倍未満の場合、特異的ハイブリッド形成をも解離させる可能性があり、６倍を超えると、液体試料に含まれる未反応の標識された核酸と、プローブとの間で、非特異的なハイブリッドを形成する可能性が高くなる。
このように、ハイブリッド形成反応終了後に、０．１〜６倍の塩濃度のＳＳＰＥ溶液をマイクロアレイ内外で流動させることによって、非特異的ハイブリッド及び未反応の液体試料を取り除き、より正確な測定を実施することができるので望ましい。
また、ハイブリッド形成反応、及びシグナル強度を検出する際の温度条件が、３０℃〜７０℃であることが好ましく、より好ましくは３７〜６０℃である。ハイブリッド形成反応の観点から言えば、反応温度が３０℃未満の場合、非特異的なハイブリッド形成が増加する傾向にある。また、反応温度を高く設定したほうが、ハイブリダイゼーション反応の特異性が増すため好ましいが、高く成りすぎると、ハイブリッド形成に要する時間が長くなる、若しくは、特異的なハイブリッド形成までもが阻害されてしまう可能性がある。
また、シグナル強度の検出の観点から言えば、３０℃未満の場合、非特異的ハイブリッド形成を解離させることが困難となる。また、７０℃を超えると、非特異的ハイブリッド形成だけではなく、特異的なハイブリッド形成までも解離させてしまう可能性があり、全体的にハイブリダイゼーション強度が低下する傾向にある。すると、全体的なシグナル強度が弱くなるため、シグナルの検出が困難となってしまう。ここで、シグナルとは、プローブ分子にハイブリダイズしている核酸分子に付加している標識から発せられる蛍光、放射能、化学発光などや、誘電体粒子を標識としたときの散乱光などであり、これらの中でも、費用と取り扱いの良さから蛍光が好ましい。また、シグナルは定量的に測定できることが好ましい。
最後に、標的遺伝子の発現量の検出結果に基づき、クラスタリング解析を行う。クラスタリング解析の方法としては、例えばＳｔｅｅｎ  Ｋｎｕｄｓｅｎ著、”Ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｄａｔａ”（塩島聡、松本治、辻本豪三  監訳「わかる！  使える！  ＤＮＡマイクロアレイデータ解析入門」、羊土社、２００２年）に記載の方法により、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇなどの解析ソフトを使用して行うことができる。
クラスタリング解析方法は、クラスター分け工程と、クラスタ分けされた結果を表示する工程を含むものであり、前者の工程により必要とされる程度にまでクラスタリングが行えた場合に後者の工程に移り、一方、１回のクラスタリングでは必要とされる程度にまでクラスタリングが達成できなかった場合には、再び同一のクラスター分け工程を繰返してクラスタ分けを行う。
クラスター分け工程を行うには、階層的クラスター化法と非階層的クラスター化法とを利用することができる。
階層的クラスター化法は、解析する遺伝子間の距離を計算し、それを系統立てて階層的にグループ化する方法である。この方法においては、遺伝子をＮ個の要素からなるベクトルとして捉え、それぞれの遺伝子を、Ｎ次元長空間内の１つの点としてプロットし、２つの遺伝子間の距離を、それぞれのデータ間のユークリッド距離（各次元での距離の２乗の和の平方根）として計算するものである。この方法においては、全ての遺伝子について距離行列を作ることによって、遺伝子間の距離を計算する。そして互いに空間内で最も近い遺伝子をグループ化するのが合理的であると判断して、遺伝子の組合せからなるクラスターを形成する。距離範囲を広げてゆき、既に形成されたクラスターと、ある遺伝子との距離がその範囲に入るとき、当該「ある遺伝子」を当該クラスターに加える。遺伝子とクラスターとの間の距離を計算するには、当該クラスター内で最も近いものまでの距離を計算してもよいが、クラスター内にあるメンバーの真中にある点（セントロイド：クラスターの重心であり、ＵＰＧＭＡ又はａｖｅｒａｇｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄと同じである）までの距離を計算する方が好ましい。解析対象の全ての遺伝子を含むところまで当該距離を広げてクラスター化を終了する。そして最後にクラスター間を結んで階層型クラスター化法を終了する。これらのクラスター化工程は、コンピュータアルゴリズムを利用することができる。階層型クラスター化法は、遺伝子数が多くない場合に有効であるが、有意な差異を示さない遺伝子を解析対象から外すことにより、有効性を上げることも可能である。
もう一方の非階層型クラスター化法は、対象遺伝子数が非常に多い場合、例えば遺伝指数が数千以上に及ぶ場合に好適な方法である。この方法においては、遺伝子の集団を幾つかのクラスターに分割することを試みる。具体的には、分析者が分割数ｍを決定する。コンピュータが無作為に全遺伝子をそれぞれのクラスターに割り当てる。割り当て後の各遺伝子と各クラスターの中心（セントロイド）との間の距離を計算し、ある遺伝子が現在割り当てられているクラスターの中心よりも、他のクラスターの中心に近い場合、当該他のクラスターへ割り当てを変更する。全ての遺伝子が最も近いクラスターに割り当てられた後、再度、各クラスターのセントロイドを計算する。これらの操作を何度か繰り返すことにより、クラスターのセントロイドは変動しなくなり、アルゴリズムは停止する。この方法では分析者が要求した数のクラスターが得られるだけなので、クラスター間の互いの関係は示されない。従って、上記の分割によるクラスター分けよりも、クラスター化が改善される、新たなクラスター化の方向を探索し、分割をやり直す。この改善の程度が、十分に小さいかどうかを判定し、十分に小さいと判断できる場合にクラスター化の改善を停止する。非階層化クラスター方法の具体的なものとしては、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスター化法や自己組織化マップを挙げることができる。
Ｋ−ｍｅａｎｓクラスター化法においては、分類数ｋを分析者が決定し、次に属性空間におけるｋ個の適当な点（分類中心）を決定する。各遺伝子を最も近い分類中心に割り当てて、暫定的にｋ個のクラスターを形成する。次に各クラスターの重心を求め、これを新たな分類中心へと更新する。更新前の分類中心と更新後の分類中心のズレを求める。このズレが十分に小さいときは操作を終了し、不十分である場合には、更新後の分類中心を用いて再び全遺伝子を最も近い分類中心に割り当てる。
自己組織化マップは、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスター化法とはことなり、セントロイドが多次元空間を自由に移動するのではなく、二次元格子内を移動することを特徴とする。アルゴリズムは、この格子内でデータに最もよく適合するようにそれ自身を組織化する。
上記の方法において各遺伝子間の距離を測定しているが、距離の測定には、ユークリッド距離やその他の距離係数（コサイン係数、Ｐｅａｒｓｏｎ係数）を用いることができ、必要な場合には、標準化を行う。
以上のクラスター化工程の後、例えば樹状図などによりクラスタリングの結果を表示する。
すなわち、上記のクラスター解析により、前述した標的遺伝子の各々につき、前記化学物質処理による個体ごとの遺伝子の発現変化を化学物質処理群ごとにパターン化し、最後に、このパターンに基づいて化学物質の系統分類をすることができる。このようにして得られた化学物質の系統分類は、発癌性の強い化学物質と弱い化学物質を両端とし、その他の化学物質を発癌性の強さに応じて配列するものである。
同様に、発癌性が未知である化学物質を哺乳類動物に投与、又はその肝細胞に作用させ、上述した標的遺伝子の肝細胞における発現量を検出する。この検出結果を発癌性が既知である化学物質の同遺伝子の発現量の検出結果とともにクラスタリング解析することによって、前記発癌性が未知である化学物質が、前記発癌性が既知である化学物質と比べてどの程度の発癌性を有しているかを検知することができるようになっている。
＜遺伝子セット＞
以上、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを搭載したマイクロアレイについて詳細に述べたが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明の遺伝子セットは、肝癌に関連する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブからなり、本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法においては、マイクロアレイ以外の方法を用いて前記標的遺伝子の発現量の検出を行ってもよい。例えば、定量ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＡＴＡＣ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ボディマップ等の方法を用いて、前述した肝癌に関連する遺伝子の発現状態を検出することも可能である。このように、本願発明のマイクロアレイで使用されるプローブは、マイクロアレイから離れても、配列番号１〜１２６のＤＮＡ、又はこれらの何れかに相補的なＤＮＡのうちの少なくとも２のＤＮＡからなるプローブＤＮＡセットとして有効に利用することができるものであり、更には、当該ＤＮＡの長さを適宜、１〜１０ｍｅｒ、１１〜２０ｍｅｒ、２１〜３０ｍｅｒ、３１〜４０ｍｅｒ、４１〜５０ｍｅｒ、５１〜６０ｍｅｒと調節することにより、種種の目的に利用することができる。
標的遺伝子の発現状態を解析するために、プローブを固相化することができる基板は、種々の形態のものを適用することができる。３次元マイクロアレイ以外に、例えば、シリコンウエハやガラスのような２次元基板、マイクロタイタープレート、種々のガラスビーズや樹脂ビーズ、種々の多孔質基板、種々のゲルを適用することができる。
【実施例】［実施例１］
下記に示す各濃度（質量％）になるように発癌性物質４種及び非発癌性物質６種を基礎食（オリエンタルＭＦ粉末飼料）に混ぜて６週齢のＦ３４４ラットに２週間自由に摂取させた。１つのラットには１種類の化学物質を投与し、各化学物質を３匹に投与した。また、コントロールとして、化学物質を含まない基礎食を同様に３匹のＦ３４４ラットに２週間摂取させた。すなわち合計３×１１（１０の化学物質投与群＋１つの化学物質非投与群）匹のラットを用いた。
なお、各化学物質の濃度については、化学物質ごとにＬＤ５０（半数致死量）等の毒性が異なるため、これを考慮して調整した。
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その後、体重測定の後、剖検屠殺し、肝臓の一部を−８０℃で凍結保存すると共に、ホルマリン固定をし、病理組織学的に検索した。次いで、凍結した肝臓から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをグアニジンチオシアネート法により抽出し、ＤＮａｓｅ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）処理後、３０μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡを得、ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ及び逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＦＩＴＣ標識した。このＦＩＴＣ標識されたｃＤＮＡを６×ＳＳＰＥ５０μｌに溶解したものをサンプル溶液（液体試料）とした。このサンプル溶液に対して以下の３次元マイクロアレイシステム（オリンパス（株）製）を使用し遺伝子の発現量を検出した。
図１は、３次元マイクロアレイシステム（オリンパス（株）製）を示す概略構成図である。
図１に示す前記３次元マイクロアレイシステムは、３次元ＤＮＡマイクロアレイを収容した反応容器２と、該反応容器２におけるハイブリダイゼーション反応を観察するための顕微鏡３と、前記反応容器２を支持するためのステージ４と、前記顕微鏡３により観察された前記３次元ＤＮＡマイクロアレイにおける蛍光画像を撮像するためのＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラ５を有している。また、前記ステージ４は、前記顕微鏡３により観察される視野を変更するためのモータ６に連結しており、前記モータ６は、これを制御するステージコントローラ７に接続されている。前記反応容器２は、核酸サンプル液を攪拌し、３次元マイクロアレイ内外に流動させるためのポンプ及びポンプドライバ８と、ＤＮＡマイクロアレイの温度を調整するためのヒータ及び温度コントローラ９に接続されている。このマイクロアレイシステムは、更に、前述した顕微鏡３、ＣＣＤカメラ５、ステージコントローラ７、温度コントローラ９、並びにポンプドライバ８を全て制御するコンピュータ１０、モニタ１１及び入力部１２が具備されている。
図２は、上記反応容器２に収容された３次元ＤＮＡマイクロアレイ及び核酸サンプル液を攪拌、流動するポンプの概略構成を示す拡大図である。
ＤＮＡマイクロアレイの基板２４は、多孔質の３次元構造を有している。圧力伝達触媒質を入れたチューブ２１を解してシリンジピストンポンプ２２が反応容器２に接続されている。サンプル溶液２３を反応容器２に入れた後に、シリンジピストンポンプ２２を上下に動かすと基板２４の上下にサンプル溶液２３が移動して攪拌が起こり、ハイブリダイゼーション反応の効率が劇的に上昇し、高速に反応させることができる。
下記の表１１及び表１２に示す合計１２５種類の遺伝子のそれぞれに特異的な塩基配列に基づいて、６０ｍｅｒのオリゴＤＮＡプローブを１２５個設計した。また、これら１２５種類の遺伝子に対応するプローブの他に、インターナルコントロール遺伝子（ＩＣ）として、ＧＡＰＤＨ、及びネガティブコントロール遺伝子として、ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡに対応するオリゴヌクレオチドプローブ（各６０ｍｅｒ）を使用した。これら１２７種類のオリゴＤＮＡプローブを各々１スポットずつ前述した３次元マイクロアレイに固相化した。これら１２７個のオリゴＤＮＡプローブの塩基配列を配列表に示す。なお、ＧＡＰＤＨに対応するプローブの配列は配列番号１２６に、ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡに対応するプローブの配列は配列番号１２７に示す。
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次いで、このオリゴＤＮＡプローブが固相化された３次元マイクロアレイを、図１に示す反応容器２に収容し、前述したサンプル溶液２３を上記３次元マイクロアレイの反応容器２に入れ、シリンジピストンポンプ２２を用いて１５０回液体駆動させ、ハイブリッド形成を行った。なお、ヒータ及び温度コントローラ９によってこのときの反応温度を５０℃に設定した。反応終了後、６×ＳＳＰＥ溶液５０μｌを３回更新させながら、シリンジピストンポンプ２２を用いて各々１回ずつ液体駆動させて洗浄を実施した。洗浄終了後、蛍光顕微鏡３に搭載したＣＣＤカメラ５を用い、ＷＩＢＡフィルターカセット（オリンパス光学工業株式会社製）を使用して蛍光画像を取得した。
Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ（ＰＢ）などの発癌性化学物質を投与したラット群においては、肝癌細胞において発現の上昇が予側されるＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ１、ＧＳＴ  Ｙａといった遺伝子に対応するプローブスポットのシグナル強度が、非発癌性物質を投与したラット群及び化学物質非投与群に比べて明らかに増大していることが明瞭であった。
ハイブリダイゼーション後に得られた個々のプローブスポットのシグナル強度を、コンピュータ１０によって数値化し、ＧＡＰＤＨ（ＩＣ）を補正スポットとして、化学物質非投与群との発現量比に置き換えた。この数値をＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇを用いて階層的クラスタリング解析した。結果を図３に示す。
図３において、上方に示す系統図は前述したクラスタリング解析を行った遺伝子を発現変化の近似性によって分類したものである。この遺伝子の系統にしたがって各化学物質投与群の遺伝子発現比をパターン化（図３において省略）し、さらに、そのパターンに基づいて前述した１０の化学物質を分類したのが左方の系統図である。具体的には、ＡＣＡとＰｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌを両端とし、ＡＣＡ側がより発癌性のない化学物質であり、Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ側がより発癌性のある化学物質であることがわかった。
［実施例２］
実施例１と同様に０．０５質量％Ａｕｒａｐｔｅｎｅを飼料に混ぜ３匹のＦ３４４ラットに２週間投与し、肝臓における標的遺伝子の発現量を３次元マイクロアレイを用いて解析した。この遺伝子の発現量を基に、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇを用いて、前述した発癌性が既知である化学物質投与群の同遺伝子の発現量とともにクラスタリング解析した。結果を図４に示す。
図４に示すようにＡｕｒａｐｔｅｎｅはＺｅｒｕｍｂｏｎｅとＣａｆｆｅｉｃａｃｉｄの間に分類され、発癌性のない物質であることが確認された。以上のことから、ラットに対して２週間という短期間の化合物の投与で、肝臓における遺伝子発現変化からその化学物質の発癌性の予測が可能となった。
産業上の利用性
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法は、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子の発現量を検出するものであるので、従来技術のように動物に化学物質を投与し、病理学的に癌を検知する方法に比べて短時間、低コストで化学物質の発癌性スクリーニングを行うことができる。さらに具体的には、発癌性が未知である化学物質及び発癌性が既知である化学物質による前記遺伝子の発現量の検出結果を基に、クラスタリング解析することによって、前記発癌性が未知である化学物質が、前記発癌性が既知である化学物質と比較してどの程度の発癌性を有しているかが分かるようになる。
また、本発明のマイクロアレイは、哺乳類動物ゲノムに包含される遺伝子のうち、肝癌に関連する遺伝子から転写されるｍＲＮＡの塩基配列、又は前記ｍＲＮＡの相補配列とハイブリダイズするプローブを搭載したものであるので、化学物質の発癌性スクリーニングに好適に用いることができる。この際、３次元マイクロアレイを用いれば、遺伝子の発現量解析の再現性が良く、かつ効率的である。また、上記のプローブからなる遺伝子セットは、これを用いてマイクロアレイ以外の種々の方法による化学物質の発癌性スクリーニングに適用できる。
本発明の化学物質の発癌性スクリーニング方法は、発癌性が未知である化学物質について、発癌性が既知である化学物質と比べてどの程度の発癌性を有しているかを評価することができる。また、本発明のマイクロアレイ及び遺伝子セットは、化学物質の発癌性をスクリーニングする際好適に用いることができるものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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