(57)【要約】本発明者等は、植物の抵抗性増強に関与する諸作用のうち、過敏感反応に注目して鋭意研究を行なった結果、該反応を惹き起こすタンパク質としてＡＡＭ９７７４６．１を見出した。該タンパク質等を用いることにより、植物の耐病性または耐虫性を増強させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する、植物の病原体に対する抵抗性増強のための薬剤；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターを含有する、植物の病原体に対する抵抗性増強のための薬剤；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡが導入された、病原体に対する抵抗性が増強した植物細胞；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターが導入された、病原体に対する抵抗性が増強した植物細胞；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４に記載の植物細胞を含む、病原体に対する抵抗性が増強した形質転換植物体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、病原体に対する抵抗性が増強した形質転換植物体。
【請求項７】
請求項５または６に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項８】
請求項５に記載の形質転換植物体の製造方法であって、植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項９】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の病原体に対する抵抗性増強方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１０】
植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡにより発現が影響される遺伝子のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｆ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｄ）植物細胞に上記ＤＮＡを導入し、該ＤＮＡを発現させる工程、
（ｅ）該植物細胞における遺伝子発現を測定する工程、
（ｆ）上記ＤＮＡを発現させない場合と比較して、発現が上昇している遺伝子を選択する工程。
【請求項１１】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｆ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（ｄ）上記タンパク質に被験化合物を接触させる工程、
（ｅ）上記タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程、
（ｆ）上記タンパク質に結合する化合物を選択する工程。
【請求項１２】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｇ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（ｄ）上記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｅ）上記細胞または上記細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程、
（ｆ）上記細胞または上記細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｇ）被験化合物を投与していない場合と比較して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、病原菌や害虫などの病原体の侵入に対する植物の抵抗性増強に関する。
【背景技術】  病原菌や害虫などの病原体の侵入に対する植物の抵抗性反応として、過敏感反応（Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＨＲ）が知られている。すなわち、植物は、病原体が侵入した際、感染細胞がＨＲを起こすことにより、膨圧を失って速やかに死に、病原体から自己を防御しようとする。この反応により死んだ細胞群は壊死・褐変し、局部病斑（ｌｏｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ）を形成して病原体の拡大を防いでいる。従って、植物のＨＲを増強することは、病原体に対する抵抗性育種にとって重要であると考えられている。
一方、病原体が侵入しなくても壊死斑を引き起こす病斑葉（ｌｅｓｉｏｎ  ｍｉｍｉｃ）変異体が知られており、このような変異体の中には常に植物の抵抗性機構が活性化されているものもある。このような病斑葉変異体として、イネのｃｄｒ１〜３，ｓｐｌ１〜９などが知られている（非特許文献１及び２参照）。
このような病斑葉を引き起こす原因遺伝子の中に、ＨＲを引き起こす遺伝子もあると考えられているが、具体的にＨＲを引き起こす遺伝子は僅かしか単離されていない。このようなＨＲを引き起こす遺伝子として、イネでは、Ｒａｃ及びＧ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｆａ  ｓｕｂｕｎｉｔが知られているのみである（非特許文献３及び４参照）。
また、タバコにおけるＨＲにおいて多くの遺伝子の転写が活性化されることが知られている（非特許文献５〜１０参照）。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｈｓｒ２０１は、その中の１つとして、その転写がＨＲにより誘導される旨が報告されてはいるが（非特許文献６）、該遺伝子の過剰発現がＨＲを誘導するか否かについては知られていなかった。
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ａ，Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｋｅｎｊｉ  Ｈｅｎｍｉ，Ｋａｔｓｕｈｉｋｏ  Ｓｈｉｉ，Ｏｓａｍｕ  Ｋｏｄａｍａ，Ｈｉｋａｒｕ  Ｓａｔｏｈ，Ｋｏ  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ．Ｌｅｓｉｏｎ  ｍｉｍｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｏｆ  ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ（１９９９）１７（５）５３５−５４５．
【非特許文献２】Ｙｉｎ  Ｚ，Ｃｈｅｎ  Ｊ，Ｚｅｎｇ  Ｌ，Ｇｏｈ  Ｍ，Ｌｅｕｎｇ  Ｈ，Ｋｈｕｓｈ  ＧＳ，Ｗａｎｇ  ＧＬ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｒｉｃｅ  ｌｅｓｉｏｎ  ｍｉｍｉｃ  ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｉｃｅ  ｂｌａｓｔ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｌｉｇｈｔ．Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０００  Ａｕｇ；１３（８）：８６９−７６．
【非特許文献３】Ｏｎｏ  Ｅ，Ｗｏｎｇ  ＨＬ，Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｋｏｄａｍａ  Ｏ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ｋ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｃ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００１  Ｊａｎ  １６；９８（２）：７５９−６４．
【非特許文献４】Ｓｕｈａｒｓｏｎｏ  Ｕ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｙ，Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｉｗａｓａｋｉ  Ｙ，Ｓａｔｏｈ  Ｈ，Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  Ｋ．Ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｃｔｓ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ＧＴＰａｓｅ  Ｒａｃ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００２  Ｏｃｔ  １；９９（２０）：１３３０７−１２．
【非特許文献５】Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｌ，Ｒｏｈｆｒｉｔｓｃｈ  Ｏ，Ｆｒｉｔｉｇ  Ｂ，Ｌｅｇｒａｎｄ  Ｍ．Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｆｕｎｇａｌ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４  Ｎｏｖ；１０６（３）：８７７−８６．
【非特許文献６】Ｃｚｅｒｎｉｃ  Ｐ，Ｈｕａｎｇ  ＨＣ，Ｍａｒｃｏ  Ｙ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｓｒ２０１  ａｎｄ  ｈｓｒ５１５，ｔｗｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｇｅｎｅｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｏｋｅｄ  ｂｙ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６  Ｍａｙ；３１（２）：２５５−６５．
【非特許文献７】Ｈｉｒａｇａ  Ｓ，Ｉｔｏ  Ｈ，Ｙａｍａｋａｗａ  Ｈ，Ｏｈｔｓｕｂｏ  Ｎ，Ｓｅｏ  Ｓ，Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  Ｉ，Ｍａｔｓｕｉ  Ｈ，Ｈｏｎｍａ  Ｍ，Ｏｈａｓｈｉ  Ｙ．Ａｎ  ＨＲ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｔｏ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｏ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ，ｍｅｔｈｙｌ  ｊａｓｍｏｎａｔｅ，ａｎｄ  ｅｔｈｅｐｈｏｎ．Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．２０００  Ｆｅｂ；１３（２）：２１０−６．
【非特許文献８】Ｄｈｏｎｄｔ  Ｓ，Ｇｅｏｆｆｒｏｙ  Ｐ，Ｓｔｅｌｍａｃｈ  ＢＡ，Ｌｅｇｒａｎｄ  Ｍ，Ｈｅｉｔｚ  Ｔ．Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｅｆｏｒｅ  ｏｘｙｌｉｐｉｎ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｌｅａｖｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ｐａｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２０００  Ａｕｇ；２３（４）：４３１−４０．
【非特許文献９】Ｙｏｄａ  Ｈ，Ｏｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ，Ｋｕｓａｎｏ  Ｔ，Ｓａｎｏ  Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＷＲＫＹ−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００２  Ａｐｒ；２６７（２）：１５４−６１．
【非特許文献１０】Ｓａｓａｂｅ  Ｍ，Ｔｏｙｏｄａ  Ｋ，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｔ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｙ，Ｉｃｈｉｎｏｓｅ  Ｙ．ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ：ＮｔＰＤＲ１  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｌｉｃｉｔｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００２  Ｍａｙ  ８；５１８（１−３）：１６４−８．
【発明の開示】
本発明は、新規な、病原体の侵入に対する植物の抵抗性を増強するタンパク質をコードする遺伝子を含有する耐病性または耐虫性増強のための薬剤を提供することを目的とする。また、本発明は、該遺伝子を利用して抵抗性が増強された植物体、該遺伝子を利用した植物体の抵抗性の増強方法をも目的とする。さらに、本発明は、該タンパク質に結合する化合物または該遺伝子の発現を促進する化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、植物の抵抗性増強に関与する諸作用のうち、過敏感反応に注目して鋭意研究を行なった結果、該反応を誘導する遺伝子を見出し、本発明を完成した。
本発明は、より具体的には、
（１）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含有する、植物の病原体に対する抵抗性増強のための薬剤；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（２）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターを含有する、植物の病原体に対する抵抗性増強のための薬剤；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（３）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡが導入された、病原体に対する抵抗性が増強した植物細胞；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（４）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクターが導入された、病原体に対する抵抗性が増強した植物細胞；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（５）  （３）または（４）に記載の植物細胞を含む、病原体に対する抵抗性が増強した形質転換植物体、
（６）  （５）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、病原体に対する抵抗性が増強した形質転換植物体、
（７）  （５）または（６）に記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（８）  （５）に記載の形質転換植物体の製造方法であって、植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（９）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の病原体に対する抵抗性増強方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（１０）  植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡにより発現が影響される遺伝子のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｆ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｄ）植物細胞に上記ＤＮＡを導入し、該ＤＮＡを発現させる工程、
（ｅ）該植物細胞における遺伝子発現を測定する工程、
（ｆ）上記ＤＮＡを発現させない場合と比較して、発現が上昇している遺伝子を選択する工程、
（１１）  下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｆ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（ｄ）上記タンパク質に被験化合物を接触させる工程、
（ｅ）上記タンパク質と被験化合物との結合を検出する工程、
（ｆ）上記タンパク質に結合する化合物を選択する工程、
（１２）  下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法であって、以下の（ｄ）から（ｇ）の工程を含む方法；
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質、
（ｄ）上記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｅ）上記細胞または上記細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程、
（ｆ）上記細胞または上記細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｇ）被験化合物を投与していない場合と比較して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程、
に関する。
本発明は、植物の過敏感反応を誘導するタンパク質をコードするＤＮＡを含有する植物の病原体に対する抵抗性増強のための薬剤を提供する。
そのようなＤＮＡとしては、（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがある。
上記において、「１または複数」とは、１から５０個であり、好適には、１から１０個であり、より好適には、１から５個であり、より更に好適には、１から３個である。
「置換、欠失、付加、および／または挿入」は、好適には、タンパク質の活性に影響を与えない部位における置換、欠失、付加、および／または挿入（以下、「置換等」という。）である。また、「置換」として好ましくは、保存的置換（生物学的に同等の機能を有するアミノ酸同士の置換）である。
上記において、「ストリンジェントな条件」とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等なストリンジェンシーの条件のことである。ストリンジェントな条件として、好適には、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件である。
本発明のＤＮＡは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、その変異体、誘導体、アレル、バリアント及びホモログを含む。
本発明において、「ＤＮＡ」とは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ等の自然界から得られるＤＮＡ、および、人工的な合成により得られるＤＮＡのことである。本発明のＤＮＡとして、好適には、植物由来のＤＮＡであり、より好適には、単子葉植物由来のＤＮＡであり、より更に好適には、イネ科植物由来のＤＮＡであり、最も好適には、イネ由来のＤＮＡである。上記において、「由来」とは、人工的な改変の有無に関わらず、その植物等から得られたものを意味する。例えば、「植物由来のＤＮＡ」とは、植物から直接得られたＤＮＡまたは該ＤＮＡに人工的な改変を加えたＤＮＡのことである。
ＤＮＡに人工的な変異を加える方法が、当業者周知の手段として知られている。このような変異により、アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡも、そのコードするタンパク質が植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有する限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
また、自然界において、紫外線等の物理的・化学的要因による突然変異等によりＤＮＡの塩基配列が変異し、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することがある。このような変異により、アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡも、そのコードするタンパク質が植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有する限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
更に、上記のＤＮＡの塩基配列の変異には、そのＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列の変異を伴わない場合（縮重変異）もありうるが、このような変異体（縮重変異体）も本発明のＤＮＡに含まれる。
上記（ｃ）に記載された本発明のＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する場合がある。ここで、「高い相同性」とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上の同一性のことである。本発明のＤＮＡとして、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との同一性を有するアミノ酸配列をコードしたＤＮＡである。
上述のようなアミノ酸配列や塩基配列の「同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合、例えば、パラメーターをｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２として塩基配列の同一性を解析することができる。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合、例えば、パラメーターをｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３としてアミノ酸配列の同一性を解析することができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いて解析することができる。具体的には、これらの解析は公知の方法に基づいて行うことができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
本発明のＤＮＡとしては、例えば、
配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：２に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＭ９７７４６．１タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子」ということがある。）、
配列番号：４または配列番号：６に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：５に記載のタンパク質（以下、「ＢＡＣ６５９９０．１タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＢＡＣ６５９９０．１遺伝子」ということがある。）、
配列番号：７または配列番号：９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：８に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＧ１２４７９．２タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＧ１２４７９．２遺伝子」ということがある。）、
配列番号：１０または配列番号：１２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：１１に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＧ１２４８６．２タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＧ１２４８６．２遺伝子」ということがある。）、
配列番号：１３または配列番号：１５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：１４に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＬ７５７５０．１タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＬ７５７５０．１遺伝子」ということがある。）、
配列番号：１６または配列番号：１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：１７に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＧ１２４８４．２タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＧ１２４８４．２遺伝子」ということがある。）、
配列番号１９または配列番号：２１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等の配列番号：２０に記載のタンパク質（以下、「ＡＡＧ１２４７８．２タンパク質」ということがある。）をコードするＤＮＡ（以下、「ＡＡＧ１２４７８．２遺伝子」ということがある。）を挙げることができる。
これらのうち、好適には、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子、ＢＡＣ６５９９０．１遺伝子、ＡＡＧ１２４７９．２遺伝子、ＡＡＧ１２４８６．２遺伝子、ＡＡＬ７５７５０．１遺伝子、ＡＡＧ１２４８４．２遺伝子、または、ＡＡＧ１２４７８．２遺伝子であり、更に好適には、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子であり、より好適には、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたは配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
本明細書において、「植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有する」とは、病原菌や害虫などの病原体の侵入に対する植物の抵抗性を増強させる機能のことである。具体的には、病原菌や害虫などの病原体の侵入時に植物の過敏感反応を増強させる機能である。タンパク質がこのような機能を有するか否かは、例えば、植物体の病斑葉の形成やＰａｔｈｏｇｅｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ（以下、「ＰＲ」という。）タンパク質の発現を後述の方法に従って観測することにより判定することができる。
「薬剤」は、本発明のＤＮＡまたはベクター自体、または、本発明のＤＮＡまたはベクターを含有する組成物のことである。前記において、「組成物」は種々の物質を含有することができる。そのような物質は、該組成物が本発明の目的を達成することができるものであれば特に限定はないが、例えば、該ＤＮＡまたはベクターが安定的に存在するための物質、該ＤＮＡまたはベクターの植物細胞内への導入を補助する物質、該ＤＮＡやベクターの計量を容易にする増量のための物質等を挙げることができる。
「植物細胞」は、その形態を問わず、種々の形態の植物細胞のことである。例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片またはカルス等を挙げることができる。
「繁殖材料」とは、植物を繁殖させるための材料となる形態の植物（細胞）のことであり、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等を挙げることができる。
本発明は、本発明のＤＮＡが導入された、植物細胞、該細胞を含む植物体、その子孫およびクローン、並びに、該植物体、その子孫またはクローンからなる繁殖材料を全て含むものである。
（Ｉ）ＤＮＡの調整
ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、当業者周知の方法を利用して調整することができる。
ゲノムＤＮＡは、例えば、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子を有するイネ品種（例えば、Ｋａｓａｌａｔｈ、日本晴、好適には、日本晴）から抽出したゲノムＤＮＡを用いて、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどを利用することができる）を作成し、次いで、これを展開して、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することができる。また、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または配列番号：３記載の塩基配列からなるＤＮＡ）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することもできる。
ｃＤＮＡは、例えば、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子を有するイネ品種（例えば、Ｋａｓａｌａｔｈ、日本晴、好適には、日本晴）から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、次いで、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、または、ＰＣＲを行うことにより調製することができる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするＤＮＡは、当業者によく知られた方法により調製することができる。例えば、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．＆  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．−Ｊ．（１９８７）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：３５０−３６７）に記載の方法に従い調整することができる。
また、植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（１９７５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９８，５０３）またはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１）を利用する方法を挙げることができる。例えば、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子の塩基配列（配列番号：１または配列番号：３）若しくはその一部をプローブとして使用して、当業者周知の方法でハイブリダイゼーションを行うか、または、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子（配列番号：１または配列番号：３）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＰＣＲを行うことにより、イネや他の植物からＡＡＭ９７７４６．１遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することができる。このようにハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により単離したＤＮＡも、そのコードするタンパク質が植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有する限り、本発明のＤＮＡに含まれる。
上記のハイブリダイゼーション法によりＤＮＡを単離する場合には、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。
（ＩＩ）形質転換植物体の作出方法
本発明のＤＮＡは、例えば、病原体に対する抵抗性が増強した形質転換植物体の作出に利用することが可能である。このような形質転換植物体は、本発明のＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞を再生させることにより作製することができる。例えば、ＤＮＡとしてＡＡＭ９７７４６．１遺伝子を任意の品種に導入し発現させることにより当該植物の病原体に対する抵抗性を増強させることができる。本方法による形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で他の方法より有利である。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。本発明において好適には、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターであり、更に好適には、病原菌や害虫などの病原体の進入に対して誘導的に活性化されるベクターである。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等、当業者に周知の方法により達成される。
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に周知の方法で行うことができる（Ｔｏｋｉら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−１５０７参照）。
例えば、イネの形質転換植物体を作製する手法として、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（好適には、インド型イネ品種を用いる）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．（１９９５）Ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  Ｉ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  Ｅｄｓ．）ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（好適には、日本型イネ品種を用いる）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２．）等の技術が当業者に周知である。本発明の形質転換植物体は、これらの方法を用いて作製することができ、好適には、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法を用いる。
本発明の形質転換植物体の子孫は、上記により得られた本発明の形質転換植物体から有性生殖または無性生殖により得ることができる。また、本発明の形質転換植物体の繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）は、該植物体やその子孫またはクローンを用いて、当業者周知の方法により得ることができる。そのようにして得られた子孫や繁殖材料は、本発明の形質転換植物体の大量生産のために使用することができる。
（ＩＩＩ）病原体に対する抵抗性増強機能判定方法
タンパク質が植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有するか否かは、当業者に周知の方法であればいかなる方法で確認してもよいが、例えば、ウイルスのエンハンサー領域の下流に挿入された当該タンパク質をコードする遺伝子を導入した植物体が病斑葉を示すかどうかを調べることにより確認することができる。すなわち、あるタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより病斑葉を示した場合、当該タンパク質は、植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有すると判定することができる。
また、タンパク質がこのような機能を有することを確認する別の方法としては、一般的な病害抵抗性に関与することが知られているＰＲタンパク質の発現量を測定する方法も挙げることができる。詳細には、目的タンパク質をコードする遺伝子を導入していない植物細胞（または植物体）と導入した植物細胞（または植物体）におけるＰＲタンパク質の発現量を比較し、導入した植物細胞（または植物体）の発現量が多い場合、当該タンパク質が植物の病原体に対する抵抗性を増強させる機能を有すると判定することができる。
本発明のスクリーニング方法は、当業者に周知の方法であればいかなる方法で行ってもよい。例えば、本発明のＤＮＡにより発現が促進若しくは抑制される遺伝子は、上記に準じて本発明のＤＮＡを導入した細胞と導入していない細胞、または、本発明のタンパク質を添加した細胞と添加していない細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の発現量を測定し、それらを比較することにより判定することができる。
例えば、ｍＲＮＡの発現量から判定する方法として、ディファレンシャルクローニング法（Ｌａｕ，Ｌ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４，３１４５−３１５１）、ディファレンシャルディスプレー法（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５７，９６７−９７１；辻本豪三ら、「ゲノム機能研究プロトコール」第１版、羊土社、２０００年、４月１０日、ｐ．８４−９８；辻本賀英ら、「新アポトーシス実験法」、改訂第２版、羊土社、１９９９年８月１０日、ｐ．２８９−２９４）、サブトラクティブクローニング法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８８）１６，１０９３７）又はシリアルアナリシスジーンエクスプレッション法（ＳＡＧＥ法）（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｖ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２７０，４８４−４８７）等を使用することができる。
また、ＤＮＡチップを用いた発現解析法も使用することができる。例えば、ある遺伝子の発現が本発明のＤＮＡより変化したか否かは、本発明のＤＮＡを導入した細胞から取得したｃＤＮＡと導入していない細胞から取得したｃＤＮＡをそれぞれ別の蛍光色素で標識し、これらの混合物をＤＮＡチップと反応させ、各々の色素の蛍光強度を測定することにより判定することができる。（榊佳之ら、「ゲノムサイエンスの新たなる挑戦」、共立出版、２００１年１２月１０日、ｐ．２６２６−２６２９）
（ＩＶ）本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法
標記本発明のスクリーニング方法は、以下の工程からなる。
（ｉ）本発明のタンパク質に被験化合物を接触させる工程、
（ｉｉ）本発明のタンパク質と被験化合物との結合を検出する工程、
（ｉｉｉ）本発明のタンパク質に結合する化合物を選択する工程。
上記において「被験化合物」としては、特に制限はないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験化合物は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
上記において、接触は、本発明のタンパク質と被験化合物が触れることができる条件であれば、当業者周知の方法を使用することができるが、好ましくは、本発明のタンパク質の状態に応じて行う。例えば、本発明のタンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被験化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、本発明のタンパク質が発現している細胞へ導入することにより行うこともできる。
本発明のタンパク質と被験化合物との結合の検出は、タンパク質と結合した化合物を検出する方法であれば、当業者周知の方法を使用することができるが、例えば、被験化合物に予め標識を付しておき、上記に従い本発明のタンパク質と結合させた後、本発明のタンパク質を分離・精製し、本発明のタンパク質に結合した被験化合物に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）により行うことができる。
上記に従い、検出した化合物の中から、本発明のタンパク質に結合すると判定された化合物を選択することにより、本方法の目的の化合物を得ることができる。
（Ｖ）本発明の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニング方法
標記本発明のスクリーニング方法は、以下の工程からなる。
（ｉ）上記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｉｉ）上記細胞または上記細胞抽出液に被験化合物を接触させる工程、
（ｉｉｉ）上記細胞または上記細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｉｖ）被験化合物を投与していない場合と比較して、上記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程。
上記において、「機能的に結合した」とは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液は、当業者に周知の方法で調製することができる。
接触は、本発明のレポーター遺伝子を有する細胞と被験化合物が触れることができる条件であれば、当業者周知の方法を使用することができる。例えば、該レポーター遺伝子が細胞内で発現する場合、細胞の培養液に被験化合物を添加することにより行うことができる。また、該レポーター遺伝子が細胞抽出液内で発現する場合、細胞抽出液に被験化合物を添加することにより行うことができる。被験化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、本発明のタンパク質が発現している細胞へ導入することにより行うこともできる。
レポーター遺伝子の発現レベルの測定は、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することによりレポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、該遺伝子からコードされる本発明のタンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該本発明のタンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルとして遺伝子の発現レベルを測定することもできる。また、遺伝子の翻訳レベルは、本発明のタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施し、該本発明のタンパク質の発現を検出することにより、測定することもできる。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。該抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。
上記に従い、検出した化合物の中から、本発明の遺伝子の発現レベルを上昇させると判定された化合物を選択することにより、本方法の目的の化合物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】図１は、アクチベーションタギングベクターの概念図である。
図２は、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子の塩基配列の一例を示す図である。（配列番号：１）
図３は、ＡＡＭ９７７４６．１タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
図４は、次世代２９個体について、Ｔ−ＤＮＡの存在をサザンブロット解析により確認したもの（図４ａ）、ＡＡＭ９７７４６．１遺伝子（配列番号：１）の存在をサザンブロット解析（図４ｂ）およびノーザンブロット解析（図４ｄ）により確認したもの、並びに、病斑葉の発生（図４ｃ）を示す写真および図である。
図５は、次世代のうち、病斑葉を示した５個体について、ＰＲタンパク質の転写活性を示す写真である。
図６は、いもち病菌接種（噴霧法）６日後の病斑数を示す図である。
図７は、ｐＳＭＡＢ−ＡＴ１の構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕病斑葉誘導タンパク質の取得
カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター由来のエンハンサー領域（ＥＮ）４コピーを、３５Ｓプロモーターのコア領域の上流にタンデムに連結し、Ｔ−ＤＮＡ中に挿入した。図１に示すアクチベーションタギングベクターをイネ（日本晴）にアグロバクテリウム法（種子法）を用いて導入し、アクチベーションタギングラインを作製した。薬剤選抜マーカーＰＡＴの働きによる５μｇ／ｍｌビアラフォスにおける抵抗性を標識として、遺伝子導入個体８，０００系統を取得した。
取得した遺伝子導入個体の中から病斑葉を示すものを１系統得た。この変異体の形質転換当代よりゲノムＤＮＡを抽出しサザンブロット解析を行った結果Ｔ−ＤＮＡが１個挿入されていることが示された（図４ａ）。次世代２９個体を解析し、病斑葉を示すものを２１個体得た（図４ｃ）。病斑葉を示した個体には、全てＴ−ＤＮＡの挿入が認められた。この結果から、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたことにより、病斑葉を引き起こしている可能性が強く示唆された。
次にＴ−ＤＮＡのＲＢ側に隣接するゲノム領域をＴＡＩＬ−ＰＣＲ法によりクローニングし、塩基配列を決定した（図２）。更にＴ−ＤＮＡ挿入領域の下流４８２ｂｐの位置に推定タンパク質（ＡＡＭ９７７４６．１；ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が存在していることが確認された（図３）。
〔実施例２〕ＡＡＭ９７７４６．１の過敏感反応活性測定
実施例１で得られた、次世代の２９個体よりｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出しノーザン解析を行った。その結果ＡＡＭ９７７４６．１を発現している植物体では全て病斑葉がみられ、発現の強さと病斑の強さに正の相関が認められた（図４ｃおよびｄ）。以上のことからＡＡＭ９７７４６．１の過剰発現が病斑葉を引き起こすことが確認された。
更に、病斑葉を示す植物体で、Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ（ＰＲ）タンパク質遺伝子の発現の変化をノーザンブロット解析で調べた（図５）。すると病斑が強い葉ほどＰＲタンパク質遺伝子の発現が高いことが確認された。
〔実施例３〕いもち病抵抗性試験
実施例１で得られていた病斑葉（擬似病斑）を示す変異体を以後Ｌｍｍ１（Ｌｅｓｉｏｎ  ｍｉｍｉｃ  １）と称する。実施例２の過敏感反応活性測定の結果Ｌｍｍ１で病害抵抗性関連遺伝子の発現が増加していたため（図５）、いもち病菌を接種することにより実際に抵抗性が認められることを確認した。
植物体は第６葉展開時（播種後約４０日）のＷＴ（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ）およびＬｍｍ１変異体の次世代（擬似病斑をはっきり示すもの）各６個体を用いた。いもち病菌はＫｙｕ８９−２４６（ＭＡＦＦ１０１５０６）、レース００３．０を用いた。いもち病菌の培養はオートミール培地（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎｎ．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ  ６３：３１６−３２３）で２５℃１２日行い、蛍光灯下で３日間照射して胞子形成を行った後、植物体に１０ｘ１００００個／ｍｌで３ｍｌ噴霧接種した。接種６日後に罹病性の病斑数を数えた。
その結果、第６葉（Ｌ６）、５葉（Ｌ５）、４葉（Ｌ４）の調べた全ての葉においてＷＴに比べてＬｍｍ１で罹病性病斑数が少なく、いもち病抵抗性が認められた（図６）。
〔実施例４〕再導入実験
実施例２の過敏感反応活性測定の結果ＡＡＭ９７７４６．１をコードする遺伝子の発現量と病斑（擬似病斑）の強さに正の相関が認められていたため（図４）、ＡＡＭ９７７４６．１をコードする遺伝子を過剰発現ベクターに連結後、ＷＴのイネに再導入することにより、この遺伝子の過剰発現が擬似病斑の原因であることを確認した。
ＡＡＭ９７７４６．１をコードする図２に示した配列を過剰発現ベクターに連結しｐＳＭＡＢ−ＡＴ１を作製した（図７）。このベクターを日本晴に実施例１と同様に導入した。
ビアラフォス抵抗性植物体７１個体を得たところ６３個（約９０％）で擬似病斑が認められた。この結果ＡＡＭ９７７４６．１の過剰発現が擬似病斑の原因であることが証明された。
産業上の利用の可能性
植物は、本発明により提供されたＤＮＡがコードするタンパク質によって、過敏感反応を起こすことにより、病原体に対する抵抗性を増す。従って、本発明の薬剤または植物細胞等は、植物の耐病性、耐虫性を増強させることができ、植物の病原体に対する抵抗性育種に有用である。また、本発明の遺伝子を用いる植物の品種育成は、短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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