(57)【要約】コンドロイチン鎖の重合化に関与する新規遺伝子を見出した。この遺伝子産物は、生体内でコンドロイチン合成酵素と複合体を形成し、コンドロイチンの重合化を促進する作用を有するので、コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）と命名した。このコンドロイチン重合化因子は、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸といった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の人工合成などに利用することができ、産業上有用なものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
配列番号１又は３に示される塩基配列を有する請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
請求項１又は２記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
請求項５記載のタンパク質を含むコンドロイチン重合促進剤。
【請求項７】
請求項５記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させることにより得られた複合体。
【請求項８】
請求項５記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項９】
請求項５記載のタンパク質を用いてコンドロイチン鎖の重合化を促進する方法。
【請求項１０】
請求項５記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させることにより得られた複合体を使用することを特徴とする請求項９記載のコンドロイチン鎖重合化方法。
【請求項１１】
四糖が結合したα−トロンボモジュリン等のコアタンパク質上にコンドロイチン鎖を合成することを特徴とする請求項９又は１０記載のコンドロイチン鎖重合化方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法を用いて製造されたコンドロイチン鎖。
【請求項１３】
請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法を用いて製造されたコンドロイチン硫酸。
【請求項１４】
請求項９〜１１の何れか１項に記載の方法を用いて製造されたデルマタン硫酸。
【請求項１５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子上の変異を検出することにより遺伝子病の有無を判定する方法。
【請求項１６】
ゲノム中のコンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）遺伝子配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の一方又は双方のＣｈＰＦ遺伝子が破壊されたことを特徴とするノックアウト非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン鎖の重合反応を促進する重合化因子（重合促進因子）の同定と、同因子を利用したコンドロイチン糖鎖の合成方法などに関するものである。
【背景技術】  コンドロイチン硫酸は、細胞表面や細胞外マトリックスに広く分布する硫酸化グリコサミノグリカンの一種であり、細胞間相互作用、免疫における細胞認識機構、リンパ球の特異的ホーミング現象、がん細胞の接着と転移等、多方面にわたる生物学的現象に関与すると考えられ、その多彩な生理的機能から、医薬品、化粧品、食品等に広く利用されている。また、コンドロイチン硫酸は、ヘパラン硫酸と同様に、脊椎動物等における脳の神経ネットワーク形成に重要な役割を果たすことが最近の研究から明らかになってきている。
コンドロイチン硫酸の生合成は、コアタンパク質の特定のセリン（Ｓｅｒ）残基にキシロース（Ｘｙｌ）が転移されることにより始まり、続いて２つのガラクトース（Ｇａｌ）およびグルクロン酸（ＧｌｃＡ）が単糖単位で転移され、四糖結合領域（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ）が合成される。その後、結合領域にＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）とグルクロン酸（ＧｌｃＡ）とが交互に繰り返し転移されることによりコンドロイチン鎖の重合反応が起こり、コンドロイチン硫酸の二糖繰り返し領域が形成される。そして、硫酸基転移酵素によって構成糖が硫酸化されてコンドロイチン硫酸となる。
コンドロイチン硫酸を取得する従来方法としては、クジラ軟骨等の天然物から調製する方法が知られていた。しかしながら、クジラ軟骨等から調製できるコンドロイチン硫酸の量は限られている。また、近年、クジラは動物愛護の観点から捕鯨は制限されており、クジラの調達自体が困難となっている。
そこで、コンドロイチン糖鎖の合成技術の開発、さらに得られたコンドロイチン糖鎖を硫酸化してコンドロイチン硫酸を製造する方法の開発が望まれている。コンドロイチン糖鎖の合成については、次のような報告がある。即ち、ヒトの悪性黒色腫Ｇ３６１細胞の培養上清を酵素源とし、四糖結合領域（ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ）で糖鎖の伸長が停止しているパートタイムプロテオグリカンであるα−トロンボモジュリン（α−ＴＭ）を糖受容体基質として用いると、ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡの二糖が交互に繰り返し重合し、重合化した糖鎖は天然のコンドロイチンと同程度の長さにまで伸長することが報告されている（Ｎａｄａｎａｋａ，Ｓ．，Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，Ｇｏｔｏ，Ｆ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｊ．，Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｏｇａｗａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４０，３５３−３５７）。
他方、コンドロイチンの重合化に関与する酵素のｃＤＮＡクローニングは遅れていたが、最近、コンドロイチン鎖の二糖繰り返し領域の合成に関与するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素−ＩＩ（ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ）およびグルクロン酸転移酵素−ＩＩ（ＧｌｃＡＴ−ＩＩ）の両活性をもつコンドロイチン合成酵素（ＣｈＳｙ）のｃＤＮＡがクローニングされた（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｈ．，Ｕｙａｍａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｓｕｇａｈａｒａ，Ｋ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３８７２１−３８７２６）。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて組換え型タンパク質として発現させたＣｈＳｙは、ＧａｌＮＡｃやＧｌｃＡをそれぞれ転移させる活性は示したが、α−ＴＭ上にコンドロイチン鎖を重合させることができず、上記のＧ３６１細胞の培養上清中に検出されたコンドロイチン鎖の重合反応を再現することができなかった。
【発明の開示】
本発明者は、上記の知見から、ＣｈＳｙと共同してコンドロイチン鎖を重合化させるために必須の、未だ同定されていないタンパク性因子が存在するのではないかと予想し、同分子の探索を行った。
本発明の目的は、コンドロイチン鎖の重合化に関与する新規分子を同定すると共に、同分子を利用したコンドロイチン糖鎖の合成方法、さらにはコンドロイチン硫酸の製造方法などを提供することにある。
ごく最近、コンドロイチン硫酸の生合成に関与する糖転移酵素としてＣｈＳｙを含む５つの糖転移酵素が同定された。これらはすべてＣｈＳｙと高い相同性を示すので、コンドロイチン鎖の重合化に関与する因子もＣｈＳｙと相同性を示すのではないかと考え、ＣｈＳｙのアミノ酸配列をもとにデータベースを検索した。得られたデータをもとに解析を進めた結果、７７５アミノ酸からなり、アミノ酸レベルでヒトＣｈＳｙと２３％の相同性を示すヒト新規遺伝子の存在を同定した。さらに機能解析の結果、この遺伝子産物がＣｈＳｙと共同してｉｎ  ｖｉｔｒｏでコンドロイチン鎖の重合化を促進する作用を有すること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、産業上有用な方法・物として、下記Ａ）〜Ｐ）の発明を含むものである。
Ａ）  下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
Ｂ）  配列番号１又は３に示される塩基配列を有する上記Ａ）記載のポリヌクレオチド。
Ｃ）  上記Ａ）又はＢ）記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが、特に限定されるものではない。
Ｄ）  上記Ａ）又はＢ）記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。ここで、「ポリヌクレオチドが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内にポリヌクレオチド（遺伝子）が発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（線虫、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。
Ｅ）  下記（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列。
Ｆ）  上記Ｅ）記載のタンパク質を含むコンドロイチン重合促進剤。
Ｇ）  上記Ｅ）記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させることにより得られた複合体。
Ｈ）  上記Ｅ）記載のタンパク質に対する抗体。抗体は、タンパク質の全長又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
Ｉ）  上記Ｅ）記載のタンパク質を用いてコンドロイチン鎖の重合化を促進する方法。
Ｊ）  上記Ｅ）記載のタンパク質とコンドロイチン合成酵素とを共発現させることにより得られた複合体を使用することを特徴とする上記Ｉ）記載のコンドロイチン鎖重合化方法。
Ｋ）  四糖が結合したα−トロンボモジュリン等のコアタンパク質上にコンドロイチン鎖を合成することを特徴とする上記Ｉ）又はＪ）記載のコンドロイチン鎖重合化方法。
Ｌ）  上記Ｉ）〜Ｋ）の何れかに記載の方法を用いて製造されたコンドロイチン鎖。
Ｍ）  上記Ｉ）〜Ｋ）の何れかに記載の方法を用いて製造されたコンドロイチン硫酸。
Ｎ）  上記Ｉ）〜Ｋ）の何れかに記載の方法を用いて製造されたデルマタン硫酸。
Ｏ）  配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子上の変異を検出することにより遺伝子病の有無を判定する方法。同タンパク質は、後述のように、ＣｈＳｙと共同してコンドロイチン鎖の重合化に重要な役割を果たすヒト由来コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）であり、その変異によりコンドロイチン硫酸の生合成に異常を生じ、疾患の原因となっている可能性がある。このような疾患については、ＣｈＰＦ遺伝子上の変異を検出することにより当該遺伝子病の有無を判定することができる。
Ｐ）  ゲノム中のコンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）遺伝子配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の一方又は双方のＣｈＰＦ遺伝子が破壊されたことを特徴とするノックアウト非ヒト動物。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に係るヒト由来コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）の配列・構造を、ヒト由来コンドロイチン合成酵素（ＣｈＳｙ）およびヒト由来コンドロイチン・グルクロン酸転移酵素（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ＧｌｃＡＴ）と比較して示す図である。図中、ボックスは膜貫通ドメインを示し、ＣｈＰＦの推定上のＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅは★で示される。
図２は、上記ヒト由来コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）のゲノム構造を、コンドロイチン・グルクロン酸転移酵素（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ＧｌｃＡＴ）と比較して示す図である。図中、ボックスはエキソン、バーはイントロンを示し、白いボックスは非翻訳領域、黒いボックスは翻訳領域を表す。ＡＴＧは開始コドン、ＴＧＡ・ＴＡＧは終止コドンを示す。
図３のＡ・Ｂは、結合領域オリゴ糖、人工基質およびα−トロンボモジュリン（α−ＴＭ）をそれぞれ受容体基質として重合反応を行い、得られたコンドロイチン鎖のサイズを比較検討した実験結果を示すグラフである。
図４のＡ〜Ｃは、（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３やコンドロイチンポリマーを受容体基質として重合反応を行い、得られたコンドロイチン鎖のサイズを比較検討した実験結果を示すグラフである。
図５のＡ・Ｂは、α−ＴＭ上に合成されたコンドロイチン糖鎖に由来する糖−タンパク質結合領域の六糖の分析結果を示すグラフである。
図６は、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法を用いたＣｈＰＦとＣｈＳｙとの相互作用解析の結果を示す図である。
図７は、ＣｈＰＦおよびＣｈＳｙのノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、コンドロイチン合成酵素（ＣｈＳｙ）と共同して、コンドロイチン鎖の重合化を促進する重合化因子およびこれをコードする遺伝子を同定すると共に、その機能を詳細に解析し、この重合化因子を利用したコンドロイチン鎖の合成方法などを提案するものである。そこで以下では、このコンドロイチン重合化因子とその遺伝子（ポリヌクレオチド）の配列、構造について説明し、次いでその機能、利用方法等について説明することにする。
（１）本発明に係るコンドロイチン重合化因子とその遺伝子の配列、構造
ヒトＣｈＳｙのアミノ酸配列をもとにＢＬＡＳＴサーチを行った。その結果、ＣｈＳｙと相同性の高い遺伝子情報（アクセッション番号：ＢＣ０２１２２３）を見出した。しかし、この情報に開示される推定アミノ酸配列は５２２残基からなる短いものであった。本発明者は、得られたデータをもとに解析を進めた結果、７７５アミノ酸からなり、ヒトＣｈＳｙと２３％の相同性を示し、ヒトＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ＧｌｃＡＴとは５７％の相同性を示す新規タンパク質（ＣｈＰＦ）の存在を同定した（図１参照）。
後述のように、この新規タンパク質には、糖供与体であるＵＤＰ−糖の結合モチーフであるＤＸＤモチーフが存在しなかった。このことより、この遺伝子産物はコンドロイチン硫酸の生合成に関与しているが、糖転移活性を保持していないことが予想された。機能解析の結果からも、この遺伝子産物は糖転移酵素ではなく、ＣｈＳｙと共同してコンドロイチンを重合化させる因子であることが判明したので、本発明者は、この新規タンパク質をコンドロイチン重合化因子（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＣｈＰＦ））と名付けた。
配列表の配列番号１には、ヒトＣｈＰＦ遺伝子のｃＤＮＡ配列が示され、配列番号２には、同遺伝子によってコードされるヒトＣｈＰＦのアミノ酸配列が示される。また、配列番号４には、上記ＣｈＰＦの推定膜貫通ドメインを含むＮ末端側から６２個のアミノ酸を他の配列と組換えた可溶性のＣｈＰＦ組換え型タンパク質のアミノ酸配列が示され、配列番号３には、そのｃＤＮＡ配列が示される。後述のように、ＣｈＰＦの機能解析は、この可溶性ＣｈＰＦを発現させることにより行った。
ゲノム情報を検索し解析した結果、図２に示すように、ＣｈＰＦは第２番染色体上で約５ｋｂに広がって存在し、翻訳領域の遺伝子は４つのエキソンから構成されていた。このゲノム構造は、Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ＧｌｃＡＴ遺伝子と類似するものであった。
本発明に係るタンパク質、即ちコンドロイチン重合化因子は、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる可溶性タンパク質、（ｃ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるタンパク質（例えば、融合タンパク質）、（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）の何れかのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（コンドロイチン重合化因子として機能するもの）、のいずれであってもよい。また、ヒト由来に限らず、他の生物由来のコンドロイチン重合化因子であってもよい。
上記「１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、点変異導入法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｄ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）〜（ｃ）の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質としてもよい。また、公知の各種修飾を施してもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
本発明の「ポリヌクレオチド（遺伝子）」は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質をコードする配列を有するものであればよく、さらに非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などを含むものであってもよい。
尚、本発明の「ポリヌクレオチド（遺伝子）」には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡやｓｉＲＮＡなどが含まれ、ＤＮＡには、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる。また、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉとして遺伝子発現抑制などに利用できる。
（２）コンドロイチン重合化因子の機能とその利用方法
機能解析の結果、上記コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）には以下の機能が見出されている（詳細は、後述の実施例参照）。１）ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性を保持するＣｈＳｙとＣｈＰＦを同一細胞内で共発現させると、ＣｈＳｙ単独発現時と比べて、ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩの活性が２０倍以上に上昇した。２）α−ＴＭを受容体基質、ＣｈＳｙとＣｈＰＦを共発現させた分泌型タンパク質を酵素源として用い、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＡ共存下で酵素反応を行った結果、天然のコンドロイチン鎖と同程度の長さにまで重合化を起こすことに成功した。３）ＣｈＰＦを用いたコンドロイチン鎖の重合反応には、受容体基質としてα−ＴＭ等のコアタンパク質を用いることが好ましい。４）分泌型タンパク質として共発現させたＣｈＳｙとＣｈＰＦとは複合体を形成し、相互作用していると考えられる。５）ＣｈＰＦは調べた殆どの組織で発現しており、その発現パターンはＣｈＳｙと類似していた。このことより生体内で両者が共同して、コンドロイチン硫酸の生合成に関与していると考えられる。
したがって、上記コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）およびその遺伝子は、生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸）の糖鎖骨格の人工合成に利用することができる。例えば、コンドロイチンはこれまでクジラの軟骨などから調製されたコンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化することによって調製されていたが、ＣｈＳｙとＣｈＰＦとを共発現させ、これを酵素源として用いることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコンドロイチン糖鎖を安定かつ容易に大量生産することが可能となる。
上記コンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）を用いた糖鎖合成において、α−トロンボモジュリン（α−ＴＭ）等のコアタンパク質上にコンドロイチン糖鎖を合成することは好ましい。
さらに、特異性の異なる種々の硫酸化転移酵素を用いることによって、生理活性を有する種々のコンドロイチン硫酸やその異性体であるデルマタン硫酸の合成に利用できる。
その他にも、本発明のコンドロイチン重合化因子およびその遺伝子は、研究用試薬や検査用試薬として利用可能であるほか、コンドロイチン重合化因子の異常に起因する疾患や、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンが関係する疾患の病態解析、並びにその病気への治療薬、治療法、診断薬、および診断法等の開発に利用可能である。
（３）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係るＣｈＰＦ遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
例えば、上記ＣｈＰＦ遺伝子のｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ＣｈＰＦ遺伝子のｃＤＮＡ配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、インシリコ・スクリーニングを行ってもよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、上記ＣｈＰＦ遺伝子の特異性の高い領域の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＣｈＰＦタンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ＣｈＰＦのｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒトのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
本発明に係る上記ＣｈＰＦタンパク質等を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ＣｈＰＦタンパク質又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
上記ＣｈＰＦタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても特に限定されるものではなく、例えば、点変異導入法などの公知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
（４）本発明のＣｈＰＦノックアウト動物
本発明のＣｈＰＦノックアウト動物、即ち、ゲノム中のＣｈＰＦ遺伝子配列の全部または一部を改変することにより得られ、相同染色体上の一方または双方のＣｈＰＦ遺伝子が破壊された非ヒト動物は、遺伝子ターゲッティング法を用いて作製することができる。
ここで「ＣｈＰＦ遺伝子が破壊された」とは、換言すれば、ＣｈＰＦ本来の機能を持った蛋白質が発現されないことを意味する。したがって、ＣｈＰＦ本来の活性を持たないＣｈＰＦ蛋白の一部断片（ポリペプチド）が発現されるものであってもよい。
遺伝子ターゲッティング法は、通常の方法にしたがって行えばよい。一例を挙げれば、まず、相同組換えのためのターゲッティングベクター（ターゲッティングコンストラクト）を構築する。ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製することができ、大略、ＣｈＰＦゲノムＤＮＡクローン、市販のプラスミド、ポジティブセレクション用のマーカー（ＰＧＫ−ｎｅｏカセット等）、およびネガティブセレクション用のマーカー（ＤＴＡ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子等）などの各フラグメントを適切に連結することにより作製することができる。このとき、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるようターゲッティングベクターを設計するとよい。また、ターゲッティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲッティングベクターは環状より直鎖状のほうが好ましいので、直鎖状化のため相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位を設けておくとよい。
上記方法により作製したＣｈＰＦ遺伝子ターゲッティングベクターを、ＥＳ細胞等の対象動物由来の全能性細胞にエレクトロポレーション法等により導入し、その後、目的とする相同組換えが起こった細胞を選別する。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングできる。選別後、目的とする相同組換えが起こった細胞を、サザンブロットやＰＣＲ法などによって確認する。最終的に相同組換えが確認された全能性細胞を、妊娠中の子宮から採取された胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法等により行うことができるが、これに限定されるものではない。
上記胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ＣｈＰＦ遺伝子をホモで持つ野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＣｈＰＦ遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＣｈＰＦ遺伝子が破壊されたホモ接合体を得ることができる。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断し、ＤＮＡを抽出してサザンブロットやＰＣＲ法などによって遺伝子型を調べればよい。また、第２世代（Ｆ２）として、ＣｈＰＦノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ）を得ることができるが、この野生型動物は対照実験に好適に用いることができる。
以上説明した遺伝子ターゲッティング法は、あくまでその一例を示すものであって、公知の種々の変更が可能であることはいうまでもない。
ＣｈＰＦノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましく、近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが、特に好ましい。また、全能性細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞、体性幹細胞のような培養細胞を対象とすることができる。
本発明のＣｈＰＦノックアウト動物は、ＣｈＰＦの機能解析などに有用である。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。尚、各実施例における詳しい実験方法については、最後の項においてまとめて説明する。
〔実施例１：ＣｈＰＦのクローニング〕
ヒトのＣｈＳｙのアミノ酸配列を用いたＢＬＡＳＴサーチの結果、ＣｈＳｙと相同性のある新規遺伝子が存在することが判明した。この遺伝子は２３６ｂｐの５’非翻訳領域、７７５個のアミノ酸をコードする２３２５ｂｐの翻訳領域（図１および配列番号１・２）と、約５００ｂｐの３’非翻訳領域から構成されていた。その翻訳開始領域と予想される配列はＫｏｚａｋ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列に従っていた。また、この遺伝子から翻訳されるタンパク質は、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓより、Ｎ末端側に２３個のアミノ酸からなる膜貫通ドメインを１つ持つ、ゴルジ体に局在する糖転移酵素に特徴的なＩＩ型膜蛋白質であることが同定され、さらに３カ所のＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅを保持していた。この遺伝子はＣｈＳｙとアミノ酸配列レベルで２３％の相同性を示し、ヒトＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ＧｌｃＡＴとは５７％の相同性を示した（図１）。しかしながら、糖供与体であるＵＤＰ−糖の結合モチーフであるＤＸＤモチーフが存在しなかった。このことより、この遺伝子産物は、コンドロイチン硫酸の生合成に関与しているが、糖転移活性を保持していないことが予想された。機能解析の結果からも、この遺伝子産物は糖転移酵素ではなく、ＣｈＳｙと共同してコンドロイチン（以下、略して「Ｃｈｎ」という。）を重合化させる因子であることが判明したので、本発明者は、この新規タンパク質をコンドロイチン重合化因子（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ（ＣｈＰＦ））と名付けた。
解析の結果、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓやＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいても上記ＣｈＰＦのｏｒｔｈｏｌｏｇが存在することがわかり、それぞれ２７および２５％の相同性があった。
〔実施例２：ＣｈＰＦの遺伝子構造と染色体マッピング〕
図２に示すように、ＣｈＰＦは第２番染色体上で約５ｋｂに広がって存在し、翻訳領域の遺伝子は４つのエキソンから構成されていた。それぞれのイントロン／エキソンの境界はＧＴ／ＡＧ  ｒｕｌｅに適合していた。
〔実施例３：ＣｈＰＦの発現と機能解析〕
ＣｈＰＦの機能を解析するために、ＣｈＰＦの膜貫通ドメインを含むＮ末端側から６２個のアミノ酸を、細胞外分泌シグナルであるｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｅａｄｅｒおよびｐｒｏｔｅｉｎ  ＡのＩｇＧ−結合ドメインのシークエンスと組換えることにより、ＣＯＳ−１細胞でｐｒｏｔｅｉｎ  Ａが融合した分泌型タンパク質を発現させた。このＣｈＰＦ組換え型タンパク質を酵素源に用い、Ｃｈｎを糖受容体基質にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃあるいはＵＤＰ−ＧｌｃＡを糖供与体として糖転移活性を測定したが、糖転移活性はほとんど検出できなかった（下記表１）。
そこで、ＣｈＰＦは糖転移酵素ではなく重合化因子であると考え、Ｃｈｎ鎖の二糖繰り返し領域を合成する糖転移活性をもつＣｈＳｙをＣｈＰＦと同一細胞内で共発現させた。その結果、ＣｈＰＦをＣｈＳｙと共発現させたものを酵素源に用いた場合では、ＣｈＳｙ単独時よりもＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性は２０倍以上に上昇した（表１）。また、ＣｈＳｙとＣｈＰＦをそれぞれ単独に発現させた組換え型タンパク質を混合したものでは、糖転移活性の上昇は見られなかった。このことより、ＣｈＳｙとＣｈＰＦが細胞内で複合体を形成することが示唆された。さらに、複合体は単独で発現させたときには形成されず、同一細胞内でＣｈＳｙとＣｈＰＦを共発現させることにより、複合体が形成されると考えられた。
2004078969.tif 000002
〔実施例４：様々な糖受容体基質を用いた重合化反応〕
前述のように、組換え型タンパク質として発現させたＣｈＳｙはＧａｌＮＡｃとＧｌｃＡのそれぞれを単糖で転移させるＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ両活性を保持しているにもかかわらず、α−ＴＭ上にＣｈｎ鎖を重合させる活性は保持していなかった。
そこで、ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたものに糖転移活性の上昇が見られたことより、ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたものがＣｈｎ鎖を重合させる活性を保持しているのではないかと考えた。この点について解析するため、ＣｈＳｙとＣｈＰＦを共発現させた組換え型タンパク質を酵素源として、α−ＴＭ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ、四糖結合領域にα−ＴＭ由来のペプチドが結合したＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、四糖結合領域にβ−ｇｌｙｃａｎとよばれるプロテオグリカン（ＰＧ）由来のペプチドが結合したＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙおよび人工基質であるＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを糖受容体基質として用い、重合活性を測定した。その結果が図３のグラフＡ、Ｂに示される。
図３の説明：Ａ．Ｃｈｎ鎖の重合反応の基質としてＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ（●）、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（×）、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（△）、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ（◇）、α−ＴＭ（○）を用いた。［３Ｈ］標識重合反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより分析した。α−ＴＭを受容体基質に用いた場合には、［３Ｈ］標識重合反応生成物をアルカリ還元処理した後、分析に用いた。矢印はＣｈｎ由来八糖〜十糖の溶出位置を示す。Ｖｔはフラクション（Ｆｒ．）６０付近である。Ｂ．重合反応によりα−ＴＭ上で合成された糖鎖（○）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラム（１．６×６０ｃｍ）を用いて分析した。ゲルろ過クロマトグラフィー後の溶出液の放射活性を測定した。分子量スタンダードとしてＣｈｎポリマーについても分析し、溶出液の２１０ｎｍにおける紫外吸収を測定した（●）。
図３に示すように、用いた様々な基質上にＣｈｎ鎖の重合が起ったが、α−ＴＭ上には最も効率よく、より長くＣｈｎ鎖が伸長した。
また、既に糖鎖が伸長したＣｈｎ鎖にもＣｈＳｙとＣｈＰＦを共発現させた融合タンパク質により、Ｃｈｎ鎖が伸長されるかを確かめるため、Ｃｈｎ由来の六糖（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３およびＣｈｎポリマーを受容体基質として、Ｃｈｎ鎖の重合反応を行った。その結果が図４のグラフＡ〜Ｃに示される。
図４の説明：Ａ．Ｃｈｎ鎖の重合反応の受容体基質としてＣｈｎ由来のオリゴ糖（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３を用いた。［３Ｈ］標識重合反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーにより分離し、溶出液の放射活性を測定した（●）。矢印はＣｈｎ由来八糖〜十糖の溶出位置を示す。ＶｔはＦｒ．６０付近である。Ｂ．Ｃｈｎポリマーを受容体基質としてＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたもの（○）およびＣｈＳｙ単独のもの（●）を酵素源に用い重合反応を行い、［３Ｈ］重合反応生成産物をゲルろ過クロマトグラフィーにより単離した。単離した［３Ｈ］標識重合反応生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（１．６×６０ｃｍ）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶出液の放射活性を測定した。矢印は分子量マーカーとして用いたデキストランにより求めたそれぞれの分子量における溶出位置を示している。Ｃ．上記Ｂで単離した反応生成物をＣＳａｓｅＡＣＩＩ消化し、消化後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによって分離し、液体シンチレーションカウンターで測定した。ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたものを酵素源に用いたときの反応生成物のＣＳａｓｅ消化後（○）およびＣｈＳｙ単独で発現させたものを酵素源に用いたときの反応生成物のＣＳａｓｅ消化後（●）のクロマトグラムを示す。矢印はＣｈｎ由来の二糖およびＧａｌＮＡｃの溶出位置を示す。
図４に示すように、Ｃｈｎ由来の六糖（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３を受容体基質として使用した場合は八〜十糖の位置にピークが検出されたことより、二糖〜四糖程度の糖鎖の伸長が起ったと予想された（同図Ａ）。Ｃｈｎポリマーを受容体基質とした場合、伸長した糖鎖の長さは、ｃｏｎｔｒｏｌとしてＣｈＳｙのみを酵素源として得られた生成物と比べて、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析で大きな差異は見られなかった（同図Ｂ）。しかし、ＣＳａｓｅＡＣＩＩ消化の結果、ＣｈＳｙを用いて調製した反応生成物からは単糖の位置のみに放射活性のあるピークが検出されたのに対して、ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたものを酵素源に用いた場合の反応生成物からは、二糖の位置にも顕著なピークが検出された（同図Ｃ）。このことより、ＣｈＳｙ単独時よりも、Ｃｈｎポリマー基質上に少なくとも数糖程度の糖鎖の伸長反応が起ったことが明らかになった。
〔実施例５：α−ＴＭの四糖結合領域に重合したＣｈｎ鎖の分析〕
次に、α−ＴＭの四糖結合領域をプライマーとしてＣｈｎ鎖の伸長反応が起ったかを確認した。その結果が図５のグラフＡ、Ｂに示される。
図５の説明：Ａ．α−ＴＭを受容体基質として重合反応を行い、［３Ｈ］標識重合反応生成物をゲルろ過により単離した。単離した［３Ｈ］標識重合反応生成物をアルカリ処理した後、２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＡＢ）により蛍光標識した。蛍光標識した糖鎖をＣＳａｓｅＡＢＣで完全に消化し、不飽和二糖標準品としてΔＤｉ−０Ｓを添加し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分画し、溶出液の放射活性（●）を測定した。矢印は不飽和二糖（ΔＨｅｘ  α  １−３ＧａｌＮＡｃ）の溶出位置を示す。Ｂ．結合領域を含む放射標識された画分（グラフＡのＦｒ．１）を回収し、陰イオン交換カラムを用いたＨＰＬＣで分析した。Ｆｒ．１のｃｈｏｎｄｒｏ−ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｄａｓｅによる消化前（○）および消化後（●）のクロマトグラムを示す。溶出液の放射活性を測定した。矢印は２−ＡＢで標識された結合領域五糖と六糖の溶出位置を示す。波線はＮａＨ２ＰＯ４の濃度勾配を示す。
図５Ａに示すように、放射標識された糖鎖がＣＳａｓｅＡＢＣにより消化され、結合領域を含むＦｒ．１および二糖を含むＦｒ．２を得た。Ｆｒ．１とＦｒ．２の放射活性の比は１：４７であるため、合成されたＣｈｎ鎖は平均約百糖から成っていると予想された。
その後、Ｆｒ．１を陰イオン交換ＨＰＬＣで分析したところ、放射活性をもった１本のピーク（図５Ｂの矢印２）が検出され、その溶出位置は、結合領域六糖標準品ΔＨｅｘＡ  α  １−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ−２−ＡＢのものと一致した。また、このピークはｃｈｏｎｄｒｏ−ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｄａｓｅによる消化によって非還元末端のΔＨｅｘＡが消化され、ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌ−２−ＡＢの溶出位置（図５Ｂの矢印１）へ移動した。これらの結果より、糖鎖の伸長はα−ＴＭの結合領域四糖上で起ったことが示された。
興味深いことに、ＣｈＳｙとＣｈＰＦの複合体がＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ、ＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性だけでなく、結合領域に最初にＧａｌＮＡｃを転移するＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性をも保持していることが明らかとなった。この結果は、以前報告された、ヒトの悪性黒色腫Ｇ３６１細胞の培養上清中に見出した重合活性と同様の結果であった。
〔実施例６：ＣｈＰＦとＣｈＳｙの相互作用解析〕
以上の結果より、ＣｈＳｙとＣｈＰＦを同じ細胞内で共発現させると、糖転移活性の上昇およびＣｈｎ鎖の重合が起こることが明らかとなった。さらに、それぞれを単独に発現させた融合タンパク質を混合したものでは、糖転移活性の上昇は見られなかった。このことより、単独で発現させたときには複合体は形成されず、同じ細胞内でＣｈＳｙとＣｈＰＦを共発現させることにより、複合体が形成されることが示唆された。そこで、ＣｈＳｙとＣｈＰＦが実際に複合体を形成しているかを確認するため、ＣｈＰＦおよびＣｈＳｙを６×Ｈｉｓあるいはｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとの分泌型融合タンパク質として同一細胞内で共発現させ、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法によりＣｈＰＦおよびＣｈＳｙ間の相互作用を調べた。その結果が図６に示される。
図６の説明：まず、ＣｈＰＦおよびＣｈＳｙを６×Ｈｉｓあるいはｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとの分泌型融合タンパク質として単独および同一細胞内で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅを用いたｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｓｓａｙを行った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとの融合タンパク質をＩｇＧ抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより検出した。Ｌａｎｅ１ではｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＰＦの大きさと予想される約１１０ｋＤａのバンドが検出された。Ｌａｎｅ４ではｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＳｙの大きさと予想される約１２０ｋＤａのバンドが検出された。各レーンのサンプルは以下のとおりである。Ｌａｎｅ１：ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＰＦ／Ｈｉｓ−ＣｈＳｙ、ｌａｎｅ２：Ｈｉｓ−ＣｈＳｙ、ｌａｎｅ３：ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＳｙ＋Ｈｉｓ−ＣｈＰＦ（単独に発現させたタンパク質を混合したもの）、ｌａｎｅ４：ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＳｙ／Ｈｉｓ−ＣｈＰＦ、ｌａｎｅ５：Ｈｉｓ−ＣｈＰＦ。
このように、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＰＦ／Ｈｉｓ−ＣｈＳｙおよびｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＳｙ／Ｈｉｓ−ＣｈＰＦの組合せでＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させたものでは、それぞれｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＰＦ（約１１０ｋＤａ）およびｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＣｈＳｙ（約１２０ｋＤａ）と予想されるバンドが検出された。しかし、単独で発現させたものや、単独で発現させそれぞれのタンパク質を混合したものでは、バンドは検出されなかった。このことより、ＣｈＰＦおよびＣｈＳｙは同一細胞内で相互作用していることが示された。
〔実施例７：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔによるＣｈＰＦの発現パターン解析〕
ＣｈＰＦの発現パターンを調べるため、ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を行った。その結果が図７に示される。
図７の説明：ヒトの様々な組織から抽出したｍＲＮＡを用いて、ＣｈＰＦ（上段）およびＣｈＳｙ（下段）の発現を調べた。各レーンのサンプルは以下のとおりである。
Ｌａｎｅ１，ｂｒａｉｎ；ｌａｎｅ２，ｈｅａｒｔ；ｌａｎｅ３，ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ；ｌａｎｅ４，ｃｏｌｏｎ；ｌａｎｅ５，ｔｈｙｍｕｓ；ｌａｎｅ６，ｓｐｌｅｅｎ；ｌａｎｅ７，ｋｉｄｎｅｙ；ｌａｎｅ８，ｌｉｖｅｒ；ｌａｎｅ９，ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ；ｌａｎｅ１０，ｐｌａｃｅｎｔａ；ｌａｎｅ１１，ｌｕｎｇ；ｌａｎｅ１２，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ。
図７に示すように、ｍＲＮＡのサイズは約３．４ｋｂであり、末梢白血球を除き調べた組織全てに発現が認められた。このことは、コンドロイチン硫酸がほとんどすべての組織に発現しているという結果と一致した。しかし、組識により発現レベルは異なり、胎盤および心臓では発現がもっとも強く、続いて脳、骨格筋、腎臓および肝臓で強い発現が見られた。さらに、ＣｈＰＦはＣｈＳｙのｍＲＮＡの発現パターンと非常に類似していた。このことより、両者が共同してコンドロイチン硫酸の生合成に関与していることが示された。
〔実験方法〕
（１）ＣｈＰＦの機能解析のためのｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍの発現プラスミドの作製
内在性の糖転移酵素の混入をさけるために、培養上清中に可溶性の組換え型タンパク質としてＣｈＰＦを発現させるための発現プラスミドを作製した。ＣｈＰＦのＮ末端側から膜貫通ドメインと予想される最初の６２アミノ酸を除いた配列をＰＣＲ法によって増幅させた。５’−Ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’を、３’−ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧ−３’を用いた。ＰＣＲはＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使い、鋳型としてヒト悪性黒色腫細胞株Ｇ３６１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４２４）由来ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ５０ｎｇを使用した。反応は、５％ＤＭＳＯ存在下で９４℃，３０ｓｅｃ；５５℃，３０ｓｅｃ；６８℃，１８０ｓｅｃを３２ｃｙｃｌｅ行った。増幅したｆｒａｇｍｅｎｔをＢａｍＨＩで消化し、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰベクターに組込み発現プラスミドとした（ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＰＦ）。
（２）培養細胞への遺伝子の導入と組換えタンパク質の精製
上記発現プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＰＦ  ６．０μｇをＦｕＧＥＮＥＴＭ６ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いてアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。共発現の場合には、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＰＦとｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＳｙを３．０μｇずつ同様にＦｕＧＥＮＥＴＭ６ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＣＯＳ−１細胞に両方のプラスミドを導入した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ培地で２日間、３７℃／５％  ＣＯ２の条件でｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、培養上清をＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと４℃で１時間混合し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとの融合タンパク質を結合させた。その後、１，０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し上清を除き、沈殿した樹脂を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。これを３回繰り返し、精製された融合タンパク質／ＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを酵素源とした。
（３）糖転移酵素活性の測定条件
（３−１）ＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩ活性の測定
最終濃度として、５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、８．５７μＭ  ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃ（３．６０ｘ１０５ｄｐｍ）を加えた条件で１７１μｇのＣｈｎを糖受容体基質として加えた。酵素源は上記方法（２）で精製したものを使用した。この反応溶液を３７℃で２時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。シリンジカラムを用いて反応産物から遊離のアイソトープを除去し、溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
（３−２）ＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性の測定
最終濃度として、５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１４．３μＭ  ＵＤＰ−［１４Ｃ］ＧｌｃＡ（１．４６ｘ１０５ｄｐｍ）を加えた条件で１７１μｇのＣｈｎを糖受容体基質として加えた。酵素源は上記方法（２）で精製したものを使用した。この反応溶液を３７℃で２時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。シリンジカラムを用いて反応産物から遊離のアイソトープを除去し、溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
（３−３）Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ活性の測定
最終濃度として１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２５０μＭ  ＵＤＰ−［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃ（５０．０ｘ１０５ｄｐｍ）、２５０μＭ  ＵＤＰ−ＧｌｃＡを加えた条件で１ｎｍｏｌのα−ＴＭ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、１００ｎｍｏｌ  ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、１０ｎｍｏｌ（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３または１７１μｇ  Ｃｈｎをそれぞれ糖受容体基質として加えた。酵素源は上記方法（２）で精製したものを使用した。この反応溶液を３７℃で１２時間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。
（４）Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔの同定
（４−１）α−ＴＭを糖受容体基質に用いた際のｐｒｏｄｕｃｔの同定
α−ＴＭの重合反応後の精製物を、シリンジカラムを用いて、遊離のアイソトープを除去することにより単離した。α−ＴＭ上の［３Ｈ］ＧａｌＮＡｃで標識された糖鎖を０．５Ｍ  ＬｉＯＨを用いたアルカリ処理によりコアタンパク質より切り出し、４分の１をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、分画した画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。アルカリ処理した残りの４分の３を２−ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ（ＡＢ）により蛍光標識した。得られた蛍光標識された糖鎖を５０ｍＩＵのＣＳａｓｅＡＢＣを用いて１時間、完全に消化した。このＣＳａｓｅＡＢＣによる消化物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、２−ＡＢで標識された結合領域六糖と考えられる画分を分取し、ポリアミン結合シリカカラム（ＰＡ−０３）を用いたＨＰＬＣで分析した。また、ｃｈｏｎｄｒｏ−ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｄａｓｅによる消化を行い、ＨＰＬＣで分析した。反応生成物の同定は２−ＡＢで標識された結合領域六糖標準品および結合領域五糖標準品とのｃｏ−クロマトグラフィーにより行った。
（４−２）糖鎖または糖ペプチドを受容体基質に用いた際のｐｒｏｄｕｃｔの同定
重合反応後の生成物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって分離し、分画した溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
（４−３）Ｃｈｎポリマーを受容体基質に用いた際のｐｒｏｄｕｃｔの同定
重合反応後の生成物を、シリンジカラムを用いて遊離のアイソトープを除去することにより単離した。その後、精製物をそのままＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分析した。また、単離した精製物をＣＳａｓｅＡＣＩＩ消化し、消化後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅカラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行うことによって分離し、分画した画分の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
（５）ＣｈＰＦとＣｈＳｙの相互作用解析
（５−１）相互作用解析用のＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質発現プラスミドの作製
ＣｈＰＦとＣｈＳｙとの相互作用を確認する際、内在性の糖転移酵素の影響を除去するため、培養上清中にＨｉｓ−ｔａｇされたＣｈＰＦおよびＣｈＳｙを分泌型組換えタンパク質として発現させるための発現プラスミドを作製した。ＣｈＰＦおよびＣｈＳｙの膜貫通ドメイン以降の配列をＰＣＲ法によって以下のように増幅した。
ａ）ＣｈＰＦ：５’−Ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＣ−３’を、３’−ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＢａｍＨＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧ−３’を用い、上記方法（１）と同条件でＰＣＲを行った。増幅したｆｒａｇｍｅｎｔをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）ベクターに組込み発現プラスミドとした｛ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）−ＣｈＰＦ｝。
ｂ）ＣｈＳｙ：５’−Ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＸｂａＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＡＧ−３’を、３’−ｐｒｉｍｅｒは５’末端にＸｂａＩ  ｓｉｔｅ（下線）を含む５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＣＴＴＡＡＡＧＧＡＧＴＣＣＴＡＴＧＴＡ−３’を用い、上記方法（１）と同条件でＰＣＲを行った。増幅したｆｒａｇｍｅｎｔをＸｂａＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）に組込み発現プラスミドとした｛ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）−ＣｈＳｙ｝。
（５−２）培養細胞への遺伝子の導入と組換えタンパク質の精製
上記ａ）およびｂ）で調製した発現プラスミド６．０μｇをＦｕＧＥＮＥＴＭ６ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いてＣＯＳ−１細胞に遺伝子導入した。共発現の場合には、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）−ＣｈＳｙとｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＰＦあるいはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｓ．ｌｅａｄｅｒ＋６×Ｈｉｓ）−ＣｈＰＦとｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＰ−ＣｈＳｙを３．０μｇずつ同様にＦｕＧＥＮＥＴＭ６ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、ＣＯＳ−１細胞に両方のプラスミドを導入した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ培地で２日間、３７℃／５％  ＣＯ２の条件でｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした後、培養上清をＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅと４℃で１時間混合し、Ｈｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質を結合させた。その後、１，０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し上清を除き、沈殿した樹脂を０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄した。
（５−３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析によるタンパク質相互作用の確認
上記方法で得たＨｉｓ−ｔａｇ融合タンパク質／Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅを１．３ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）の存在下で９４℃、５分間ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎした。その後、５，０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心し、上清をサンプルとした。そのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、分離されたタンパク質を電気的にＰＶＤＦ膜に移行させた。１次抗体にはｐｒｏｔｅｉｎ  Ａと高親和性を持つマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ３（ＭＳＷ１１３）、２次抗体にはｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）が結合したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを用い、ＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｋｉｔのプロトコールに従い、目的タンパク質を検出した。
（６）ＣｈＰＦのｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析
メンブランはＨｕｍａｎ１２−Ｌａｎｅ  ＭＴＮＴＭ  ｂｌｏｔ用い、ｐｒｏｂｅは、ＣｈＰＦが組込まれたプラスミドを鋳型として、ＰＣＲ法により増幅し、増幅したフラグメントをＢｇｌＩＩ消化することにより、ＣｈＰＦに特異的な８４０ｂｐのフラグメントを精製したものを用いた。上記方法（１）と同条件でＰＣＲを行い、５’−ｐｒｉｍｅｒは５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧ−３’を、３’−ｐｒｉｍｅｒは５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧ−３’を用いた。Ｐｒｏｂｅの標識は［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用し、ランダムプライム法に基づくｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔを用いて行った。次に、メンブランをプレハイブリダイゼーションし、３２Ｐ標識ｐｒｏｂｅを加え、６８℃で２４時間ハイブリダイゼーションを行った。メンブランを洗浄した後、ＢＩＯＭＡＸＴＭ  ＭＡ（Ｋｏｄａｋ社）に１週間露光し、検出した。
（７）酵素活性の測定方法
（７−１）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｓｕｐｒｅｄｅｘ  ７５、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００の各種カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィー
酵素反応後のサンプルを遠心する事によって夾雑物を取り除き、予め０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化しておいたカラムにアプライした。０．４ｍｌ／ｍｉｎの流速でゲルろ過クロマトグラフィーを行い、０．４ｍｌずつ分画した画分の放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定した。
（７−２）シリンジカラムアッセイ
１ｍｌのシリンジ（０．４５ｘ６．８ｃｍ）に０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）を充填し、１５０ｇｘ５ｍｉｎ、続いて９００ｇｘ５ｍｉｎ遠心して、ゲル内の溶媒を除去した。０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を３０μｌ加え、全量５０μｌとしたサンプルをこの樹脂に添加して９００ｇｘ５ｍｉｎで遠心し、さらに０．２Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３を５０μｌ加えてもう１度、９００ｇｘ５ｍｉｎで遠心し、未反応のＵＤＰ−糖を取り除き、その溶出液の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
〔実験結果の考察〕
ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｈｎ鎖の重合化が可能になることを明らかにした。ＣｈＰＦ自身はＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性をほとんど保持していないにも関わらず、ＣｈＰＦは今までに同定されている他の５つのコンドロイチン硫酸（ＣＳ）の生合成に関与している糖転移酵素と高い相同性を示す。それゆえ、ＣｈＰＦはＣＳの生合成に関与する６番目の遺伝子ファミリー（ＣｈＳｙ  ｆａｍｉｌｙ）のｍｅｍｂｅｒであると考えられる。
以前、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトの悪性黒色腫Ｇ３６１細胞培養上清を酵素源に用い、α−ＴＭ上にＣｈｎ鎖の重合化がおこることが報告されている。さらに基質阻害実験により、この推定されるｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは３つの糖転移活性を保持していることが予想された。１つはＣＳ合成の開始に関与する四糖結合領域に最初のＧａｌＮＡｃを転移するＧａｌＮＡｃＴ−Ｉ活性、２つ目および３つ目はＣＳ鎖を伸長させるＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ活性である。今回、ＣｈＰＦとＣｈＳｙを共発現した組換えタンパク質を酵素源とした際に、α−ＴＭの四糖結合領域上にＣｈｎ鎖の重合化が起こったことより、Ｃｈｎの重合化は単独のタンパク質により担われるのではなく、ＣｈＰＦとＣｈＳｙの複合体により担われていることが示唆された。Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ法による相互作用解析からも、ＣｈＰＦとＣｈＳｙが同一細胞内で複合体を形成していることが強く示唆された（図６）。さらに、Ｇ３６１細胞の培養上清から部分精製した酵素活性の分子量は１６０ｋＤａであり、今回クローニングしたＣｈＰＦおよびＣｈＳｙの分泌型のタンパク質の分子量は、それぞれ約８０ｋＤａであり、両者が１：１で複合体を形成していることが示唆された。
以前の報告と同様に、ＣｈＳｙはＣｈｎポリマーやＣｈｎ由来のオリゴ糖に対して低い糖転移活性しか示さなかった（表１）。しかし、ＣｈＳｙとＣｈＰＦを可溶性の融合タンパク質として共発現させると、ＣｈＳｙ単独時よりもＧａｌＮＡｃＴ−ＩＩおよびＧｌｃＡＴ−ＩＩ両活性は２０倍以上に上昇した（表１）。このことから、ＣｈＳｙが十分な活性を発揮するためにはＣｈＰＦが必要であると考えられる。
さらに、Ｃｈｎ鎖の重合化にはコアタンパク質が重要な役割を果たしていることが示唆された。ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−（Ｇｌｙ）Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｘｙｌβ１−Ｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ、（ＧｌｃＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ）３、およびＣｈｎポリマーを受容体基質に用いたときと比較し、α−ＴＭを受容体基質に用いたときの方がより長く効率よくＣｈｎ鎖の重合化が起った（図３）。これに関連して、以前、ＰＧであるｄｅｃｏｒｉｎのコアタンパク質の様々な欠失変異体では短いＧＡＧ鎖しか合成されず、その理由としてコアタンパク質と糖転移酵素間の親和性が低下したためであるとの報告がある。それ故、今回の結果はＣｈｎ鎖の長さが、受容体となるコアタンパク質によって影響を受け、ＣｈＳｙとＣｈＰＦの複合体がコアタンパク質と相互作用し、ＧＡＧ鎖の長さを調節していることが示唆された。
動物細胞においてβ−Ｄ−ｘｙｌｏｓｉｄｅをプライマーとしてＧＡＧが合成されることが知られており、このことより疎水的な性質を保持しているｘｙｌｏｓｉｄｅのアグリコン部分はコアタンパク質を模倣することが示唆されている。実際、ＣｈＰＦとＣｈＳｙの組換え型タンパク質を同一細胞内で共発現させたものを酵素源とし、ＧｌｃＡβ１−３Ｇａｌβ１−Ｏ−Ｃ２Ｈ４ＮＨ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを受容体とした際、Ｃｈｎ鎖の重合反応が起った（図３）。しかし、α−ＴＭを受容体に用いたときよりも短いＣｈｎ鎖しか重合しなかった（図３）。このことは疎水的なアグリコンがＧＡＧ鎖の付加するコアタンパク質の最小限の性質を保持しており、ＣｈＳｙとＣｈＰＦの複合体と相互作用することが可能であることを示唆している。
これまでの研究では、通常、重合化反応と硫酸化修飾は同じＧｏｌｇｉ区画で起り、硫酸化修飾と糖鎖の伸長および停止との間には密接な相関があると考えられている。伸長しているＣＳ鎖の硫酸化は糖鎖の重合化に影響を与えるといわれているが、今回の結果よりｉｎ  ｖｉｔｒｏではＣｈｎ鎖の重合化には硫酸化修飾は必須ではないことが示された。
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析により、ＣｈＰＦは末梢白血球を除いて調べた組織ほとんど全てに発現が認められた。また、ＣｈＰＦはＣｈＳｙのｍＲＮＡの発現パターンと非常に類似していたことより、両者が共同してＣＳの生合成に関与していることが強く示唆された（図７）。
今回、組換え型タンパク質として共発現させたＣｈＳｙとＣｈＰＦの複合体を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｈｎ鎖の重合化を起こすことができた。この知見は、ＣＳの生合成機構の解明およびその機能解析にも役立つと考えられる。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、次に記載する特許請求の範囲内で、様々に変更して実施することができる。
【産業上の利用の可能性】
以上のように、本発明のコンドロイチン重合化因子（ＣｈＰＦ）は、コンドロイチン合成酵素（ＣｈＳｙ）と複合体を形成し、コンドロイチン糖鎖の重合化を促進する作用を有するので、前述したとおり、コンドロイチン硫酸やデルマタン硫酸といった有用生理活性を有する硫酸化グリコサミノグリカンの糖鎖骨格の人工合成などに利用することができるほか、種々の有用性を有するものである。
【配列表】
2004078969.tif 000003
2004078969.tif 000004
2004078969.tif 000005
2004078969.tif 000006
2004078969.tif 000007
2004078969.tif 000008
2004078969.tif 000009
2004078969.tif 000010
2004078969.tif 000011
2004078969.tif 000012
2004078969.tif 000013
2004078969.tif 000014
2004078969.tif 000015
2004078969.tif 000016
2004078969.tif 000017
【図１】
2004078969.tif 000018
【図２】
2004078969.tif 000019
【図３】
2004078969.tif 000020
【図４】
2004078969.tif 000021
【図５】
2004078969.tif 000022
【図６】
2004078969.tif 000023
【図７】
2004078969.tif 000024
【国際調査報告】
2004078969.tif 000025
2004078969.tif 000026
2004078969.tif 000027
2004078969.tif 000028
2004078969.tif 000029
2004078969.tif 000030