(57)【要約】白血球のホルミルペプチド受容体ＦＰＲとの結合部位であるＭｅｔまたはＮｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、全白血球中の単球、リンパ球への結合率を向上させるＳｅｒまたはＴｈｒからなる結合部分、放射性金属または常磁性金属で標識可能な基、およびこれらを結合する役割を荷うスペーサーから構成される白血球結合性化合物は、生体内外ですべての白血球、すなわち好中球、単球、リンパ球に対して特異的な結合性を示し、かつ放射性金属または常磁性金属で標識可能であり、従って個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＳＰＥＣＴ画像診断、ＰＥＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断などに極めて有用である。
2004029080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−ε（−Ｒ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）    （１）
（式（１）中、Ｚはアミノ基の保護基を表し；
ＹはＭｅｔまたはＮｌｅを表し；
（Ｘ）ｎにおいて、Ｘは１個もしくはそれ以上のアミノ酸および／または有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｎは１または０を表し；
（ＮＨ２）ｍにおいて、ＮＨ２はＬｙｓのα位のカルボキシル基の保護基としてのアミド基、ｍは１または０を表し；
ε（−Ｒ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）において、ＲはＬｙｓのε−アミノ基にアミド結合したＳｅｒまたはＴｈｒ、Ｔは１個もしくはそれ以上のアミノ酸および／または有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｌは１または０、Ｕは金属標識可能な基を表し；
但し、前記ＸとＴは同じでも異なっていてもよい）
で表される白血球結合性化合物。
【請求項２】
式（１）のＵが−Ｃｙｓ−Ａ１−Ａ２（Ａ１およＢＡ２はＣｙｓおよびＰｒｏを除くアミノ酸）で表されるペプチドからなる金属標識可能な基である請求項１記載の白血球結合性化合物。
【請求項３】
式（１）のＵが炭素数８から２０の窒素含有環状化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物の誘導体または炭素数４から１０のアルキレンアミンカルボン酸から構成される金属標識可能な基である請求項１記載の白血球結合性化合物。
【請求項４】
式（１）で表される白血球結合性化合物が、
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
アセチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
カルバミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）および
メチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
よりなる群から選ばれる１である請求項１または２に記載の白血球結合性化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の白血球結合性化合物を放射性金属または常磁性金属で標識してなる標識化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項６】
放射性金属が、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＳＰＥＣＴ画像診断のための請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
放射性金属が、Ｃｕ−６４またはＧａ−６８である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＰＥＴ画像診断のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
常磁性金属がＧｄ、Ｆｅ、ＭｎまたはＣｕである請求項５に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＭＲＩ画像診断を行うための請求項１０に記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
放射性金属が、Ｙ−９０、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
放射性治療のための請求項１２に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、個体の免疫応答反応を伴う疾患を診断もしくは治療するにあたり、異常部位を標的化すると共に、その活動性状態を的確に把握するための白血球結合性化合物とその標識化合物を有効成分とする医薬品組成物に関する。更に詳細には、本発明は生体内および生体外で白血球に対して特異的な結合性を示す化合物であって、放射性金属および常磁性金属によって標識可能であって、哺乳動物体内の感染症、炎症、癌およびアテローム性動脈硬化症の病巣部位を含めた、病理学的病巣部位をイメージするのに有用な新規な白血球結合性化合物、およびその標識化合物を有効成分とする、放射性診断、ＳＰＥＣＴ画像診断、ＰＥＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断あるいは放射性治療などに有用な医薬組成物に関する。
【背景技術】  ヒトを含めた動物は、その個体を取り巻く環境から生命維持活動に影響を及ぼす因子の作用を絶えず受けている。その影響を及ぼす因子には大気や太陽光、食物といった正の作用をもたらすものの他に、微生物の侵襲、有害化学物質、熱、放射線などの負の作用をもたらす因子もある。その負の作用を持つ因子の影響に対し、個体は生命活動を維持させようと様々な防御機構を働かせ対処している。
この防御機構は生物学的には免疫と定義され、免疫に関わる生体内反応を免疫応答反応と言う。その反応を引き起こすものとしては、細菌やマイコプラズマなどの微生物、ウイルス、生体組織もしくは器官の異種移植片、有害化学物質、高温な熱、過度な冷却、高エネルギーをもった放射線、電気的あるいは物理的な組織障害などが知られている。免疫応答反応は炎症反応を含めた個体の「自己」と「非自己」の認識の結果において起こる生体反応であり、発熱、白血球活性化と移動、「自己」以外全ての除去反応など広義の防御機構の作用であり、炎症反応は個体に侵入した異物の除去、侵された組織の破壊、破壊された組織の修復といった免疫応答反応の一部の結果において起こる現象である。
免疫応答反応における重要な因子の一つとして白血球が挙げられる。組織は浸潤する白血球種を特定したり、その程度や期間を調節したりする様々なメディエーターを産出し、また血液を含む体液中に存在するメディエーターや他の分子と結合して応答し得る様々な受容体をそれら細胞膜表面上に有する。受容体は対応するメディエーターと結合することによりその白血球を活性化し、白血球の種別により種々の異なる受容体が発現する、その結果、組織へ浸潤する白血球の種類は存在するメディエーターにより規定される。
一般に炎症などの局部の免疫応答は、組織を破壊する何らかの刺激を受けた後、数時間程度は補体などの免疫関連蛋白質がその刺激の除去に対処する。その後補体の分解物や破壊を受けた組織から放出されるサイトカインなどのメディエーターが血液などの体液に放出され、好中球を主とする顆粒球が受容体を介して活性化され、組織への浸潤をメディエーターの密度勾配を基に開始する。このときのメディエーターは一般的に走化性因子と呼ばれる。顆粒球の浸潤は最初の刺激を受けてから通常十数時間でピークを迎える。続いて単球由来を中心としたマクロファージの浸潤が徐々に増え、顆粒球と共に、刺激を起こす元を取り除く。傷害を受けた組織のほか、活性化された顆粒球やマクロファージからもサイトカインなどが放出され、抗体産生などの免疫応答反応を効率的に行うことのできる、あるいは破壊された組織を修復できる、あるいは免疫応答反応を制御できるＴ細胞やＢ細胞などからなるリンパ球の浸潤が、その後増加し、最初の刺激を受けてから通常数十時間でピークを迎える。
こうした免疫応答反応は個体の生命活動を維持していく上で、極めて大切な作用であるのだが、生命活動の維持を目的とした場合、個体によるその反応の制御が不完全である点において、時には致命的な負の作用をおよぼす。その代表的な事象が自己免疫疾患と呼ばれる疾患群の発症である。この疾患群には、アトピー性皮膚炎、慢性関節リウマチ、ベーチェット病、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、クローン病、橋本病、そのほか膠原病などの疾患が知られている。感染症などの異物の侵襲や火傷などの組織破壊のような炎症では、原因がそれぞれ特定されているが、これら自己免疫疾患は特定された原因因子がないかもしくは未だ見出されておらず、原因不明の難病である。しかしながら、これら疾患群に共通して起こる現象は各疾患固有の組織への白血球の浸潤、特にリンパ球や単球およびマクロファージであることが周知の事実である。
このように自己免疫疾患や慢性化した炎症および感染症ではリンパ球や単球が免疫応答反応における白血球浸潤の中心であり、また普遍的である。したがって、リンパ球や単球および好中球を含む白血球の浸潤の有無を検索あるいは検出しその程度を的確に把握することが、効果的な治療を施し、無駄な投薬等を避け患者の精神的苦痛や費用負担の軽減および医療保険における費用軽減を行う上で極めて重要である。
そこで、白血球の浸潤の有無を検索あるいは検出しその程度を的確に把握するには画像診断が有用であることから、核医学においては種々の放射性薬剤及びその使用が研究された。
ガリウム−６７（６７Ｇａ）クエン酸塩は、炎症シンチグラフィー薬剤として古くから用いられている（例えば、Ｅｂｒｉｇｈｔ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１４２，２４６−２５４（１９８２）参照）。しかし、この化合物は感染症または炎症の部位に特異的でない。また、６７Ｇａのガンマ線の放射エネルギーは、通常のガンマカメラにおいて良好な画像を得るためには十分には適していない。さらに、放射性薬剤の注射からイメージングまでに７２時間程度の待機時間が必要である。
感染部位をイメージングする核医学的方法として、次に、Ｉｎ−１１１標識白血球（以下１１１Ｉｎ−白血球）（例えば、Ｐｅｔｅｒｓ，ＡＭ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３３，６５−６７（１９９２）参照）が用いられた。Ｔｈａｋｕｒらは、生体外における好中球の放射性核種標識とその利用を広範囲にわたり分析して論じている（Ｓｅｍ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，１４，１０−１７（１９８４））。この方法では、個体の好中球を生体外でインジウム−１１１（以下Ｉｎ−１１１）で標識し、その標識好中球を生体外における動力学的研究に、また個体における急性期の炎症性病巣の画像化に使用することができた。
しかし、１１１Ｉｎ−白血球を用いる際、放射性標識化合物の調製が、自己血液の滅菌取出、白血球の血液からの滅菌単離、白血球の滅菌標識および放射性核種標識白血球を患者へ再注射する各段階を要し、この調製には２時間以上というかなりの時間が必要である。また、最適イメージ画像を得るには、この標識白血球の再注射から撮像までに１２ないし４８時間の待機が必要と考えられている。さらに、通常イメージング検討にて実施される白血球数１×１０７個あたり２００μＣｉという放射能量において、Ｉｎ−１１１の放出放射能エネルギーが強いために、白血球種のうち好中球を主とした顆粒球は標識に耐えうるが、リンパ球などは標識後直ちに死滅してしまう（Ｃｈｉａｎｅｌｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍ．，１８，４３７−４５５（１９９７））ために、リンパ球および単球の動態をモニターすることが困難である。さらにまた、被曝線量の見地から投与できる放射能量が制限される結果、イメージの質が悪くなることが多い。
次に、開発されたＴｃ−９９ｍ標識白血球は、上記１１１Ｉｎ−白血球で問題であった撮像までの待機時間を短縮でき、かつリンパ球および単球の動態をモニターすることが可能で、さらにＩｎ−１１１よりもかなり多い放射能量を投与することができる（例えば、Ｖｏｒｎｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０，１３３２−１３３６（１９８９）参照）。しかし、標識安定性が劣るために、非標的の代謝臓器への蓄積が問題となる。また長い調製時間と血液の取り扱いの問題は、１１１Ｉｎ−白血球と変わらない（Ｃｈｉａｎｅｌｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍ．，１８，４３７−４５５（１９９７））。
単球、好中球、顆粒球その他を含めたヒト白血球に対して結合性を示す放射性核種で標識されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体についても開発の試みが行われている。例えば、９９ｍＴｃ標識抗顆粒球モノクローナル抗体（例えば、Ｌｉｎｄ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３１，４１７〜４７３（１９９０）参照）および１１１Ｉｎ標識非特異的ヒト免疫グロブリン（１１１Ｉｎ−ＨＩＧ、例えば、ＬａＭｕｒａｇｌｉａ，ＧＭ．Ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．，１０，２０〜２８（１９８９）参照）は、感染によって起こった炎症の検出について検討を行っている。１１１Ｉｎ−ＨＩＧは、投与と最適イメージ撮像との間に２４〜４８時間を要する点で１１１Ｉｎ−白血球と同様の短所を有する。
また、１１１Ｉｎ−ＨＩＧは、炎症部位に集積し、それを描出することが可能とされる（例えば、Ｒｕｂｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２９，６５１−６５６（１９８８））が、その集積機序は炎症部位へ浸潤する白血球細胞表面上に存在するＦｃ受容体に結合することにより、炎症部位へ集積するとする考え方（Ｆｉｓｃｈｍａｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３１，１１９９−１２０５（１９９０））と、白血球浸潤とは別に、アルブミンなどの蛋白質などと同じような血管透過性亢進による血管外漏出によるものとする考え方（Ｍｏｒｒｅｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０，１５３８−１５４５（１９８９））とがある。
その他の蛋白質を用い、白血球に対して結合作用を示す生体分子を用いた検討もこれまでに報告されている。
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａｋｅｎ，ＣＪ．らは放射性ヨウ素で標識した炎症性サイトカインであるインターロイキン１を報告している（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａｋｅｎ，ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２２，１２４９−１２５５（１９９５））。
Ｓｉｇｎｏｒｅらは放射性ヨウ素標識した炎症性サイトカインであるインターロイキン２を用いた慢性炎症疾患に対する検討を報告している（Ｓｉｇｎｏｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍ．，１３，７１３−７２２（１９９２））。
Ｈａｙ  ＲＶ．らは放射性ヨウ素標識した炎症性サイトカインであるインターロイキン８を用いた化学起炎炎症に対する検討を報告している（Ｈａｙ  ＲＶ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍ．，１８，３６７−３７８（１９９７））。
これらの放射性標識化合物は、感染症などの急性炎症、あるいは自己免疫疾患などの慢性炎症を描出することに成功している。
しかしながらこのような蛋白質や抗体は、分子量が大きいという点において、急性炎症にみられる血管透過性亢進による血液成分の血管外漏出が問題となる（Ｒｏｉｔｔ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈｅｄｎ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（１９９４））。分子量２０００程度の分子は、血管外に漏出してもその場に長く留まることはないのだが、アルブミン（分子量約６４０００）などの蛋白質は、その分子の大きさのために、低分子よりも留まりやすく、炎症特異的な集積かの判断が難しい（Ｍｏｒｒｅｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３０，１５３８−１５４５（１９８９））。
小さくて、容易に合成できる分子が、日常的に用いる放射性薬剤として好ましい。全血中の白血球に対して選択的に標識することが可能で、患者に直接注射でき、かつ白血球が蓄積する部位を位置決定することによって感染症および炎症の病巣部位をイメージングすることが可能となる低分子量の合成化合物として、放射性核種標識ペプチドが適当と考えられる。
例えば、Ｍｏｙｅｒらは、ヘパリンなどの多硫酸化グリカンと結合する血小板第４因子（ＰＦ−４）カルボキシル末端のペプチドを利用した化合物をＴｃ−９９ｍ標識し、炎症に対する集積性について報告している（Ｍｏｙｅｒ，ＢＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３７，６７３−６７９（１９９６））。この化合物（ＰＦ−４ペプチドヘパリン）はＴｃ−９９ｍキレートアミノ酸配列を含む２３残基のペプチド（分子量約２６００）にヘパリン（分子量約７、０００から２５、０００）が結合した様式を取っており、一つの分子としてその分子量が約１万から３万程度になる。
ＰＦ−４ペプチドヘパリンも蛋白質と同様に分子量が大きいという点で、白血球浸潤部位への集積のみを表す製剤とはいえず、血管透過性亢進による非特異的集積が少ない低分子量の化合物を用いた、真に白血球浸潤のみを表す製剤が必要とされていた。またヘパリンの使用は、ヘパリンが持つ生理的作用により、その使用が制限される場合がありうる。
Ｄａｈｌｍａｎ，Ｔ．ら、あるいはＲｉｎｇｅ，ＪＤ．らは、ヘパリンの副作用として、ヘパリン投与による骨密度の低下および長期投与による骨粗鬆症の発症の危険性を報告している。（Ｂｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ  １９９０  Ｍａｒ，９７，３，２２１−２２８およびＲｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｂｕｒｔｓｈｉｌｆｅ  Ｆｒａｕｅｎｈｅｉｌｋｄ．，５２，７，４２６−４２９（１９９２））。その他にも、抗トロンビン作用、トロンボプラスチンの生成抑制、血小板の凝集抑制などのヘパリンが持つ生理的作用により、副作用のおそれがあり、あるいは、出血している場合や出血する可能性のある疾患、重得な肝障害・腎障害がある場合は慎重な処置が必要であるなどの使用上の注意点が多い。
その他の放射性核種標識ペプチドによる検討では、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニル（ｆＭＬＦ）−含有ペプチドが従来技術において報告されている。
Ｄａｙらは、１２５Ｉで放射性核種標識した走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）を報告している（Ｄａｙ，ＡＲ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．７７，２９１−２９４（１９７７））。
Ｊｉａｎｇらは、１２５Ｉで放射性核種標識した走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）が生体内で炎症に集積することを報告している（例えば、Ｊｉａｎｇ，ＭＳ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｋｌｅａｒｍｅｄｉｚｉｎ，２１，１１０−１１３（１９８２））。
Ｆｉｓｈｍａｎらは、ＤＴＰＡを介した１１１Ｉｎ標識走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）を開示している（特許第２９３１０９７号明細書参照）。
Ｖｅｒｂｅｋｅらは、メルカプトアセチルグリシルグリシンを介したＴｃ−９９ｍ標識走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）に関する報告をしている（例えば、Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７，７６９−７７９（２０００）参照）。
Ｂａｉｄｏｏらは、ジアミノジチオール化合物を介したＴｃ−９９ｍ標識走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）に関する報告をしている（Ｂａｉｄｏｏ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９，２０８−２１７（１９９８）参照）。
また、放射性核種標識走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）の光親和性を介して身体外で白血球を放射性核種標識するための使用に関する報告もある（例えば、米国特許第４，９８６，９７９号明細書参照）。
さらにまた、放射性核種標識可能な走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）に関する報告もある（例えば、米国特許第５，７９２，４４４号明細書参照）。
走化性ホルミル化ペプチド（ｆＭＬＦ）はホルミル化ペプチド受容体（以下、受容体ＦＰＲ）を介して介して白血球に結合するとされ（Ｎｉｅｄｅｌ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５，４４１３，１４１２−１４１４（１９７９））、受容体ＦＰＲを発現した白血球は好中球および単球であるとされる（Ｌｅｗｉｓ，ＳＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，４，３６３−３７５（１９８３））。
ヒトの血液中に存在する白血球の正常な組成は約５０％が好中球、１０％が単球とされる。単球は、好中球の５分の１以下でしかないために、これまでに知られている走化性ホルミル化ペプチドのアナログ体数種が結合する白血球は顆粒球が殆どであり、リンパ球および単球には弱い結合でしかないという知見が報告されている（Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，２７，７６９−７７９（２０００））。
また好中球の浸潤が盛んな菌の感染症などの急性炎症には、放射性核種標識走化性ホルミル化ペプチドは集積を示すもの（Ｂａｂｉｃｈ，ＪＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３４，２１７６−２１８１（１９９３）参照）の、慢性炎症とされる病変への集積を明らかにした報告はこれまでにない。
また、臨床上の診断において、核医学検査やＭＲＩ検査を含めた画像診断が必要とされるのは、インビトロ検査などの初期診断で判断の難しい症例や慢性化した病変を伴った症例において多く使用されている。またこのような症例ではしばしばステロイド剤投与および白血球除去療法などの免疫応答および白血球浸潤を抑制する治療法が行われているために、慢性炎症を含めた免疫応答反応炎症病変を伴う疾患の画像診断が可能な、血管透過性亢進の影響を受けない低分子でかつ、免疫応答反応および白血球浸潤を画像化することのできる製剤が望まれている。
ペプチドおよびポリペプチドをＴｃ−９９ｍで標識する方法は既に知られている（例えば、特開平８−２３１５８７号公報参照）。
【発明の開示】
本発明は、かかる従来技術の状況に鑑み、生体内外で白血球、すなわち好中球、単球、リンパ球等に対して特異的な結合性を示し、かつ放射性金属または常磁性金属で標識可能な化合物、該標識化合物を有効成分とする、個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＳＰＥＣＴ画像診断、ＰＥＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断あるいは放射性治療などに有用な医薬組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、下記式（１）
Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−ε（−Ｒ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）    （１）
（式（１）中、Ｚはアミノ基の保護基を表し；
ＹはＭｅｔまたはＮｌｅを表し；
（Ｘ）ｎにおいて、Ｘは１個もしくはそれ以上のアミノ酸および／または有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｎは１または０を表し；
（ＮＨ２）ｍにおいて、ＮＨ２はＬｙｓのα位のカルボキシル基の保護基としてのアミド基、ｍは１または０を表し；
ε（−Ｒ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）において、ＲはＬｙｓのε−アミノ基にアミド結合したＳｅｒまたはＴｈｒ、Ｔは１個もしくはそれ以上のアミノ酸および／または有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｌは１または０、Ｕは金属標識可能な基を表し；
但し、前記ＸとＴは同じでも異なっていてもよい）
で表される白血球結合性化合物に関する。
さらに、本発明は、上記式（１）で表される白血球結合性化合物を放射性金属または常磁性金属で標識してなる標識化合物を有効成分とする医薬組成物に関するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図２は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
図３は、Ｔｃ−９９ｍペプチドのウサギ血液内分布を示す。
図４は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後２２時間のイメージである。
図５は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後２２時間のイメージである。
図６は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後２２時間のイメージである。
図７は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド８のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図８は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド９のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図９は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後２２時間のイメージである。
図１０は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１３のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１１は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１４のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１２は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１５のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１３は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１６のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１４は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１７のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１５は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１８のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図１６は、各Ｔｃ−９９ｍ−ペプチドの正常ラットにおける尿排泄率の経時変化を示す。
図１７は、各Ｔｃ−９９ｍ−ペプチドの正常ラットにおける小腸への集積の経時変化を示す。
図１８は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチドのヒト血液内分布を示す。
図１９は、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドのラット大腸炎モデル血液内分布を示す。
図２０は、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチド３のラット大腸炎モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後３０分、右側が投与後１２０分のイメージである。
図２１は、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチド６のラット大腸炎モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後３０分、右側が投与後１２０分のイメージである。
図２２は、Ｔｃ−９９ｍ標識白血球のラット大腸炎モデルにおけるイメージを示す。左側が投与後３０分、右側が投与後１２０分のイメージである。
図２３はＴｃ−９９ｍ標識ペプチドのラット大腸炎モデルにおける炎症／臓器比を示す。
図２４は、ラット大腸炎におけるペプチド６のオートラジオグラフィと免疫染色の画像を示す。左側がオートラジオグラフ、中央が顆粒球抗体免疫染色、右側が単球抗体免疫染色である。
図２５は、ラット大腸炎におけるペプチド１４のオートラジオグラフィと免疫染色の画像を示す。左側がオートラジオグラフ、中央が顆粒球抗体免疫染色、右側が単球抗体免疫染色である。
図２６は、ラット大腸炎におけるＴｃ−９９ｍ標識白血球のオートラジオグラフィと免疫染色の画像を示す。左側がオートラジオグラフ、中央が顆粒球抗体免疫染色、右側が単球抗体免疫染色である。
図２７は、ラット大腸炎におけるＴｃ９９ｍ標識ペプチドとＴｃ９９ｍ標識白血球のオートラジオグラフィの炎症／正常組織比を示す。
図２８は、リコンビナントヒト受容体と［３Ｈ］−ＦＭＬＰの結合に対するペプチドの阻害率を示す。
図２９は、ＦＭＬＰ阻害無しのウサギ感染症モデルにおけるＴｃ−９９ｍ標識ペプチド６のイメージを示す。左側が投与後２時間、右側が投与後５時間のイメージである。
図３０は、ＦＭＬＰ阻害有りのウサギ感染症モデルにおけるＴｃ−９９ｍ標識ペプチド６のイメージを示す。
発明の実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本明細書で用いるアミノ酸は全て一文字記号もしくは三文字記号で記し、特に断りのないかぎり左側をＮ末端側、右側をＣ末端側として表記した。アミノ酸に続くかっこ内は、特に断りのないかぎり側鎖に結合したペプチドならびに有機化合物を表すものである。また、かっこ内のアミノ酸配列は全体構造を把握しやすくするために、右側をＮ末端側、左側をＣ末端側として表記した。さらに、本明細書において、Ｄ体のアミノ酸はＤ−アミノ酸と記載した。
本発明の白血球結合性化合物は、下記式（１）
Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−ε（−Ｒ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）      （１）
で表される。すなわち、白血球の受容体ＦＰＲとの結合部位Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、全白血球中の単球、リンパ球への結合率を向上させるＳｅｒまたはＴｈｒからなる結合部分−Ｒ−、放射性金属、常磁性金属を標識可能な構造−Ｕ−、およびこれらを結合するスペーサー−（Ｘ）ｎ−、−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−および−（Ｔ）ｌ−よりなっている。
具体的には、下記ような白血球結合性化合物が好ましい態様として例示できる。
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸）；
アセチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
カルバミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）；
メチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
を例示できる。
上記式（１）で示される白血球結合性化合物における受容体ＦＰＲとの結合部位であるＺ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−において、Ｚはアミノ基の保護基であって、例えば、ホルミル基、アセチル基などの炭素数１から９のアシル基、ｔ−Ｂｏｃ基などの炭素数２から９のアシルオキシ基、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１から６の低級アルキル基、カルバミル基などが用いられる。ＹのＭｅｔやＮｌｅのＮ末端がホルミル基である場合、ホルミル化ペプチドを認識する白血球の受容体ＦＰＲに対し結合性を示し、ホルミル基よりも大きな分子構造をもつアセチル基やｔ−Ｂｏｃ基も同様に受容体への結合性を示す。
上記式（１）のＺ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−において、Ｙはアミノ酸であるＭｅｔまたはＮｌｅを表す。白血球のうち、好中球ならびに単球の細胞膜上に恒常的に発現している受容体の一つにホルミル化ペプチドと強い結合性を示す受容体ＦＰＲが存在し、Ｍｅｔに対して結合性を示す。Ｍｅｔと空間的構造が極めて似ているＮｌｅもＭｅｔと同様の結合性を示す。
ＬｅｕおよびＰｈｅは、好中球ならびに単球に対する高い結合性を示す。ホルミル化ペプチドと強い結合性を示す受容体ＦＰＲは、ホルミル−Ｍｅｔ、ホルミル−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ、ホルミル−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ、ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕなどのペプチドに対しても結合性を示すがホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅが最も強い結合性を示す。
本発明における最大の特徴は、上記式（１）におけるＺ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−に、スペーサーであるＸ、および−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−のεアミノ基を介して結合したＲであり、Ｒは水酸基を側鎖にもつアミノ酸であるＳｅｒまたはＴｈｒから選ばれる。このＳｅｒまたはＴｈｒの付加した金属標識可能な構造を利用することにより、従来の低分子の白血球結合性化合物ではみられなかった、リンパ球および単球への著明な結合が初めて可能になった。従来の受容体ＦＰＲとの結合部位Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−単独からなるペプチドの白血球への結合は、好中球、単球への結合は見られるものの、リンパ球への結合は殆ど見られなかった。この受容体ＦＰＲとの結合部位Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−と金属標識可能な構造とがＬｙｓのεアミノ基に結合したＳｅｒまたはＴｈｒをを介して結合することにより、単球およびリンパ球への結合率が著しく向上した。この結果、本発明の上記式（１）で示される白血球結合性化合物は、すべての白血球すなわち、好中球、単球およびリンパ球に結合することが可能になったのである。例えば、従来の血球結合性化合物の、全白血球に対するリンパ球および単球への結合の割合はおよそ１２％から３５％の範囲であるのに対し、本発明の血球結合性化合物の全白血球に対するリンパ球および単球への結合の割合はおよそ１８％から６５％にまで上昇する。このことは、白血球浸潤の盛んな部位を標的化することが可能になったことを示しており、本発明の化合物が白血球浸潤を伴う疾患の診断用あるいは治療用医薬としての有用性を示すものある。
本発明の白血球結合性化合物において、受容体ＦＰＲとの結合部位Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、特にリンパ球および単球の受容体との結合部位ＲのＳｅｒまたはＴｈｒおよび放射性金属や常磁性金属の標識部位Ｕのそれぞれの間の距離を、スペーサーであるＸ、−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−のεアミノ基およびスペーサーであるＴを介してそれぞれ結合することにより、適切に取ることができる。このことにより、空間的構造が大きな影響を及ぼす受容体との結合性を保ちつつ、それぞれを結合することができる。すなわちＺ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−のＣ末端に、ＲのＳｅｒまたはＴｈｒのＣ末端とを結合させるためには、Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−のＣ末端部分構造に、側鎖に炭素数４からなるアルキル基にアミノ基が結合しているＬｙｓを付加して、そのεアミノ基にＳｅｒまたはＴｈｒを結合するのが好ましい。さらにより空間的距離を必要とする場合は、スペーサーＸを付加するとよい。
ＸおよびＴは、それぞれ、１もしくはそれ以上のアミノ酸および／または有機合成可能な化合物よりなるスペーサーで、必要に応じて本発明の白血球結合性化合物の分子の構成成分とすることができ、ＸとＹは同じものでも異なっていてもよい。しかし、Ｃｙｓ残基は、スルファニル基が分子内または分子間でジスルフィド結合を形成するために二量体などの多量体を形成しやすく、その構造変化から受容体への結合性に大きく影響するため、ＸまたはＴを構成するアミノ酸としては不適である。さらに、ＸまたはＴがＰｒｏを含む場合は、立体構造が限定されるため、空間自由度が少なく受容体への結合性に好ましくない。したがって、ＸまたはＴを構成する配列構造に含まれるアミノ酸からは、ＣｙｓおよびＰｒｏは除外するのが望ましい。
具体的には、Ｘに用いるアミノ酸としては、受容体への結合性に影響を与えにくいＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどの非荷電性アミノ酸やＮｌｅ、Ｔｙｒ、Ｎｌｅ‐Ｔｙｒ等が例示される。Ｔとしては、受容体との結合部分から放射性金属や常磁性金属を標識した構造との距離をとる場合や、生体内ににおける体内動態を制御する場合や、生体内における代謝への抵抗性を持たせる等の目的で、上記と同様のアミノ酸や、非アミノ酸化合物、あるいはその組み合わせを使用することができる。また、上記以外のＬ体およびＤ体アミノ酸、Ｇｌｙなどの疏水性アミノ酸、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓなどの極性アミノ酸および荷電性アミノ酸（酸性、塩基性）のいずれも適用が可能である。
スペーサーを構成する有機合成可能な化合物としては、メチル基、エチル基、ベンジル基などの疎水性官能基を含む、１，５−ヘキサジエン、トランス−２−メチル−１，３−ペンタジエン、４−メチル３−ニトロアセトフェノンなどの化合物；水酸基、アミド基などの極性官能基を含む、（±）−２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ヘキシレングリコール）、３−メチル−１，３，５−ペンタントリオールなどの化合物；カルボキシル基、アミノ基、イミノ基などの荷電性官能基を含む、メチレンスクシン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドカプロン酸などの化合物などが挙げられる。
金属標識の可能な基であるＵとしては、１個もしくはそれ以上のアミノ酸からなる基または非アミノ酸からなる金属標識可能な基を用いることができる。１個もしくはそれ以上のアミノ酸からなる基としては、−Ｃｙｓ−Ａ１−Ａ２で表されるペプチド（ただし、Ａ１およびＡ２はＣｙｓおよびＰｒｏを除くアミノ酸）が用いられる。例えば、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ、−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ等が例示できる。
非アミノ酸からなる金属標識可能な基としては、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン（Ｄｉｏｘｏｃｙｃａｍ）などの炭素数８から２０の窒素含有環状化合物；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−酪酸、１，４，８，１０−テトラアザシクロドデカン−酪酸などの炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−アミノエチルカルバモイルメチル−４，７，１０−トリス〔Ｒ，Ｓ〕−メチル酢酸（ＤＯ３ＭＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−α，α’，α’’，α’’’−テトラメチル酢酸（ＤＯＴＭＡ）などの炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物の誘導体；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸、エチレングリコール−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などの炭素数４から１０のアルキレンアミンカルボン酸等の化合物から構成される基などが挙げられる。
本発明の白血球結合性化合物を画像診断用の医薬組成物として用いる際、目的とする診断または治療部位に応じて、体内動態を制御して不要代謝物の排泄を速やかに行い、生体への無用な被曝の軽減、画像診断を行う場合のバックグラウンドの影響を少なくして、診断部位のイメージングを速やかに行うことができる。例えば、スペーサーＸ、Ｔの構成に用いるアミノ酸等について、消化管への代謝に移行させるためにはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ等の脂肪族アミノ酸、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ等の芳香族アミノ酸、Ｍｅｔ等の含硫アミノ酸、もしくはメチル基、エチル基、ベンジル基などの疎水性官能基を含む化合物の利用が可能である。尿および腎臓への代謝に移行させるためにはＳｅｒ、Ｔｈｒ等のヒドロキシアミノ酸、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の酸性アミノ酸アミド、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ等の荷電性アミノ酸（酸性、塩基性）を選択したり、合成可能な化合物として、水酸基、アミド基などの極性官能基を含む化合物、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基などの荷電性官能基を含む化合物を選択したりすることにより、荷電性アミノ酸もしくは荷電性官能基を有する化合物の利用が可能である。その他、受容体との結合部分と金属標識された構造との距離をとる必要がある場合は、１個以上のアミノ酸、またはアルキルなどの直鎖の有機合成可能な化合物が利用できる。
金属標識可能な基Ｕに含まれるアミノ酸についても、上記と同様なことが言える。例えば、ＡｓｐまたはＬｙｓを選択した場合、もしくはカルボキシル基またはアミノ基を含む化合物を選択した場合には、最終的に得られる放射性金属標識物の投与後の代謝物の主要な排泄経路を腎臓に制御することができる。また、アミノ酸としてＧｌｙなどの疎水性アミノ酸を選択した場合には、代謝物の主要な排泄経路を消化管に制御することができる。
さらにスペーサーＸ、Ｔの構成に用いるアミノ酸等について，生体内における代謝への抵抗性を持たせるためには、Ｄ体アミノ酸ならびに人工アミノ酸および非アミノ酸の利用が考えられる。Ｄ体アミノ酸から構成されるスペーサーとしては、具体的には、Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ、Ａｒｇ−Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ、Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ、Ａｓｐ−Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｓｅｒ等のアミノ酸配列を挙げることができる。
本発明の白血球結合性化合物は、以下に説明する方法により合成することができる。
（１）全てアミノ酸から構成される場合は、アプライドバイオシステムズ社製ペプチド自動合成機等の汎用的に使用されているペプチド自動合成装置によりＢｏｃ法、あるいはＦｍｏｃ法等により合成することができる。合成された複合体は、固相用樹脂担体に結合した状態から脱保護基と樹脂担体切り放しを同時に行い、その後、逆相系カラム等を用いた高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法という）にて精製することができる。その他、ペプチド液相合成法により調製してもよく、また、動物等から採取してもよい。
（２）非アミノ酸化合物を含んでいる場合は、その多くの場合、上記した同様の方法によって合成できる。例えば、固相用樹脂担体にＬｙｓ残基またはその保護誘導体を結合させ、そのＮ末端にＸのアミノ酸残基またはその保護誘導体、あるいはスペーサーとしての機能を有する化合物またはその保護誘導体、Ｐｈｅまたはその保護誘導体、Ｌｅｕまたはその保護誘導体、Ｙのアミノ酸またはその保護誘導体を順次結合させ、続いて固相用樹脂担体に結合したＬｙｓの側鎖であるεアミノ基を活性化させて、ＲのＳｅｒあるいはＴｈｒまたはその保護誘導体を結合させ、それにスペーサーＴのアミノ酸またはその保護誘導体、あるいはスペーサーとしての機能を有する化合物またはその保護誘導体、次いで、Ｕの金属標識可能な基となりうる化合物またはその保護誘導体を結合させ、その後に樹脂担体から合成された上記式（１）の合成物を切り放すことによって合成できる。
本発明の白血球結合性化合物に放射性金属または常磁性金属を標識することにより得られる標識化合物を有効成分とする医薬組成物は、放射性診断剤あるいは放射性治療剤等に用いられ、特に個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位の画像診断、治療に好適に用いられる。すなわち、好中球または単球またはリンパ球あるいは２種類以上の白血球系細胞の浸潤が盛んな活動性部位を有する疾患に対して、その白血球集積部位の検出および集積程度を所定の検出器を用いて検出することができる。
個体の免疫応答反応を伴う疾患としては、哺乳動物体内の感染症、炎症、およびアテローム性動脈硬化症からなる疾患群が挙げられる。すなわち疾患群には、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、膠原病、膠原病以外の自己免疫疾患が含まれる。また、日本人の肝炎の８割はウイルス感染によるウイルス性肝炎であり、その他の多くは自己免疫性肝炎であるため、肝臓における炎症性疾患の多くは好中球の浸潤量に対してリンパ球・単球浸潤が多い疾患である。このような好中球の浸潤が相対的に少ない疾患などの場合において、従来のｆＭＬＦのアナログ体では、リンパ球・単球への結合性が好中球への結合性と比較して弱いために、病変の白血球浸潤を過小評価してしまう可能性が指摘されるが、本発明による白血球結合性化合物は、好中球への結合性のみならずリンパ球や単球への結合性が高いために、多くの自己免疫疾患やリーシュマニア症などの好中球浸潤が殆んど観察されない疾患に対しても白血球浸潤を的確に把握することが可能である。
こうした好中球の浸潤量に対してリンパ球・単球浸潤が多い疾患群、もしくはリンパ球・単球浸潤が白血球浸潤の多数を占める疾患群は、ウイルス感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、膠原病、膠原病以外の自己免疫疾患が含まれる。本発明は白血球浸潤などの免疫応答を伴う疾患群に対して有効と考えられるが、好中球の浸潤量に対してリンパ球・単球浸潤が多い疾患群、もしくはリンパ球・単球浸潤が白血球浸潤の多数を占める疾患群に対して、特に有効であると考えられる。
さらに本発明は、従来技術で示された、好中球に対する結合性を併せ持つことから、リンパ球・単球の浸潤量に対して好中球浸潤が多い疾患群、もしくは好中球浸潤が白血球浸潤の多数を占める疾患群に対してもまた有効である。こうした疾患群としては、細菌性心内膜炎、心筋梗塞、気管支肺炎、大葉性肺炎、浸出性結核、急性胃炎、偽膜性大腸炎、エルシニア感染症、潰瘍性大腸炎、急性虫垂炎、急性胆管炎、胆嚢炎、管内増殖性糸球体腎炎、浸出性糸球体腎炎、急性腎盂腎炎、急性卵管炎、急性頸管炎、急性乳腺炎、急性睾丸炎、急性前立腺炎、アレルギー性血管炎、急性化膿性炎、結核性髄膜炎、化膿性髄膜炎、急性化膿性骨髄炎、急性リンパ節炎、結節性動脈周囲炎等が挙げられる。
放射性診断剤として用いる場合には、本発明の白血球結合性化合物をＴｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｒｅ−１８６などのＳＰＥＣＴ用放射性金属または、Ｃｕ−６４またはＧａ−６８などのＰＥＴ用放射性金属で標識した放射性金属標識化合物が好ましい態様である。放射性治療剤として用いる場合には、該白血球結合性化合物にＹ−９０、Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８などの放射性金属で標識した放射性金属標識化合物が好ましい態様である。ＭＲＩ造影剤として用いる場合には、該白血球結合性化合物にＣｕ、ＦｅまたはＧｄなどの常磁性金属を配位させた常磁性金属標識化合物が好ましい態様である。
Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８で標識する場合は、本発明の白血球結合性化合物を生理食塩液および水性緩衝液等に溶解し、塩化第一スズ等の還元剤を加え、過テクネチウム酸ナトリウム溶液、または過レニウム酸ナトリウム溶液と混合する常套の方法により標識化合物を調製することができる。Ｃｕ、Ｃｕ−６４、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｉｎ−１１１で標識された標識化合物の場合は、本発明の白血球結合性化合物とＣｕ、Ｃｕ−６４、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｉｎ−１１１イオンを含む弱酸性水溶性溶液とを混合することで調製できる。Ｇａ−６７、Ｇａ−６８またはＹ−９０で標識された標識化合物は、該白血球結合性化合物とＧａ−６７、Ｇａ−６８またはＹ−９０イオンを含む弱酸性ないし弱アルカリ性の水溶性溶液とを混合することで調製が可能である。
放射性金属標識化合物を放射性診断剤または放射性治療剤として供する場合、および常磁性金属標識化合物をＭＲＩ造影剤として供する場合は、上述した方法によって調製される標識化合物を更にＨＰＬＣ法により精製し不純物および未反応の過テクネチウム酸イオン、過レニウム酸イオン、Ｉｎ−１１１イオン、Ｃｕイオン、Ｃｕ−６４イオン、Ｇａ−６７イオン、Ｇａ−６８イオン、Ｆｅイオン、Ｍｎイオン、ＧｄイオンおよびＹ−９０イオンを取り除いた後に使用してもよい。
放射性金属または常磁性金属で標識された標識化合物は、薬学的に許容される添加物と混合することにより、放射性診断剤、放射性治療剤またはＭＲＩ造影剤に調製することができる。かかる添加物としては、薬学的に許容されるアスコルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸等の安定化剤、水性緩衝液等のｐＨ調整剤、Ｄ−マンニトール等の賦形剤、および放射化学的純度を改良するのに役立つクエン酸、酒石酸、マロン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコヘプトン酸ナトリウム等が挙げられる。また、これらの添加物を加えた凍結乾燥品である用時調製用キットの形態でも提供が可能であり、本発明の放射性診断剤に特に有用である。
本発明の白血球結合性化合物を放射性金属で標識した標識化合物を含有してなる放射性診断剤、放射性治療剤またはＭＲＩ造影剤は、静脈内投与等の一般的に用いられる非経口手段により投与でき、その投与量は患者の体重、年令、適当な放射線イメージング装置、ＭＲＩ測定装置および対象疾患状態等の諸条件を考慮し、イメージングおよび治療が可能と考えられる放射能および投与量が決定される。
ヒトを対象とする場合、Ｔｃ−９９ｍ標識化合物を用いた診断剤の投与量は、Ｔｃ−９９ｍの放射能量として３７ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑの範囲であり、好ましくは１８５ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑである。Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８標識化合物を用いた治療剤の場合は、放射能量として３７ＭＢｑ〜１８５００ＭＢｑの範囲であり、好ましくは３７０ＭＢｑ〜７４００ＭＢｑである。Ｙ−９０標識化合物を用いた治療剤の場合は、放射能量として３７ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲であり、好ましくは３７ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑの範囲である。他の放射性金属で標識した標識化合物の投与量もほぼ同様である。また、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕなどの常磁性金属で標識した標識化合物を用いた診断剤の投与量は、処置される宿主、ＭＲ画像化装置の感度、画像実験の標的組織、投与の特定の様式および使用の意図される効果に応じて変化する。しかし、特定の患者に対する特定の投薬処方は、使用される特定の試薬の活性（誘導された緩和性）、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、および担当医の判断を包含する種々の因子に依存する。
標識化合物は１日当たり約０．１μｍｏｌ／ｋｇ体重と約１０００μｍｏｌ／ｋｇ体重との間、好ましくは１日当たり約０．５μｍｏｌ／ｋｇ体重と約３００μｍｏｌ／ｋｇ体重との間である投薬レベルが有用である。代表的な調製物は、約１ｍＭ〜１０００ｍＭの間の標識化合物を含む。好ましくは、このような調製物は約１０ｍＭ〜５００ｍＭの間の標識化合物を含む。
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、得られた物質の測定方法、使用した試薬等を下記に示す。
（１）ガンマカウンター：血液内分布の測定用としてオートウェルガンマカウンター（アロカ社製）を用いて測定した。体内分布検討の測定用として、ＮａＩシングルチャンネルアナライザー（応用光研社製）を用いて測定した。
（２）ガンマカメラ：ＧＭＳ−５５０Ｕ（東芝社製）を用いて測定した。
（３）逆相ＨＰＬＣ：逆相カラムＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｐｕｒｅｓｉｌ  ５μｍ  Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ）を用いた。
（４）ペプチド化合物は全て、固相合成法により作製した。
（５）９９ｍＴｃＯ４−：９９Ｍｏ／９９ｍＴｃシェネレーター（メジテック；日本メジフィジックス社製）を用い、生理食塩液として溶出したものを用いた。
（６）試薬はすべて特級試薬以上の製品を用いた。
（７）すべての実験動物は実験に先立ち１週間１２時間毎の明暗サイクル条件下で飼育した。その期間、餌および水は自由に摂取させた。
【実施例１】ペプチドの合成
下記のペプチドを、固相合成法により製造し、以下の実施例に用いた。
本発明の白血球結合性化合物
ペプチド３：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）
ペプチド４：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド５：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）
ペプチド６：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド７：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−シクラムテトラカルボン酸体）
ペプチド８：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド９：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ＤＴＰＡ）
ペプチド１３：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−シクラム酪酸）
ベプチド１４：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−シクラム酪酸）
ペプチド１５：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−シクラム酪酸）
ペプチド１６：アセチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド１７：カルバミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド１８：メチル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
上記のペプチドにおいて、シクラムテトラカルボン酸体は１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸、シクラム酪酸は１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−酪酸を意味する。
対照ペプチド
ペプチド１：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
ペプチド２：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ）
ペプチド１０：ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ）
ペプチド１１：ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｃ−Ｓ−Ｂｚｌ）
ペプチド１２：ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｃ−Ｓ−Ｂｚｌ）
ペプチド３の合成
アプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成機（モデル４３０Ａ）を用い、Ｂｏｃ法によりＭＢＨＡ樹脂（ｐ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌａｍｉｎｅ  Ｒｅｓｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，１％  Ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ−ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）樹脂を用いて０．５ｍＭスケールの条件で合成を行った。この際Ｃ末端、Ｌｙｓ残基の側鎖はＦｍｏｃ基で保護した。ペプチド鎖を伸長、Ｎ末端アミノ基をホルミル化した後、Ｌｙｓ残基の側鎖Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで切断し、側鎖側にペプチド鎖を伸長した。ペプチドの切出しは、無水フッ化水素：ｐ−クレゾール（８０：２０）中、−２℃から−５℃において１．０時間反応させて行った。
精製は、カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３６５−５（３０×２５０ｍｍ）、溶出速度：２０ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ／精製水、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、ＡからＢへの濃度勾配条件の下、液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）を用いて行った。主ピーク分画を集め凍結乾燥して目的のペプチドを得た。得られたペプチドの純度は逆相ＨＰＬＣにて検定した。
なお、ＭＢＨＡ樹脂のかわりにプレロードレジンを用いても同様に合成が可能であった。
さらに、６Ｍの塩酸内にて１１０℃、２２時間の加水分解を行った後、得られた主ピークに対するアミノ酸組成を求め、目的のペプチド３であることを確認した後、アミノ酸組成の一致したピークを凍結乾燥し、目的のペプチド３を得た。また、分子量を求めるためのマススペクトル質量分析（以下、ＥＳＩ−ＭＳ）で、理論値と一致することを確認した。以下に得られたペプチド３のアミノ酸組成の分析値（分子当たりの個数）を示す。丸かっこ内は、目的ペプチドのアミノ酸組成の理論値（分子当たりの個数）を示す。
ペプチド３＝Ａｓｐ：（１）１．０２、Ｓｅｒ：（１）０．９３、Ｇｌｙ：（１）１．０３、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．０１、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（２）２．１０、Ｃｙｓ：（１）０．８６、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８８
また、得られたペプチド３のＥＳＩ−ＭＳの分析値を示す。丸かっこ内は、目的ペプチドの分子量の理論値を示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１１８３．９（１１８４．４）
その他のペプチドの合成
その他のペプチドも、同様にして合成し同定した。ペプチド１、ペプチド１０、ペプチド１１およびペプチド１２はＣ末端がアミド化されていないペプチドであるため、ＭＢＨＡ樹脂の替わりにＨＭＰ（４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｐｈｅｎｏｘｙ  Ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−１％Ｄｉｖｉｎｙｌ−Ｂｅｎｚｅｎｅ  Ｒｅｓｉｎ）樹脂を用いてペプチド３の合成で示した同様の方法にて合成した。それぞれの同定のためのアミノ酸組成分析値およびＥＳＩ−ＭＳ分析値を以下に示した。ペプチド１およびペプチド１０はアミノ酸組成のみ記載した。
ペプチド１＝Ｇｌｕ：（１）１．０４、Ｌｅｕ（１）０．９９、Ｔｙｒ：（１）０．９８、Ｐｈｅ：（１）０．９９、Ｌｙｓ：（１）１．００、Ｃｙｓ：（１）０．９７、Ｎｌｅ（２）２．０３
ペプチド２＝Ａｓｐ：（２）２．００、Ｌｅｕ（１）０．８６、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．０１、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（２）１．９４＋Ｎｌｅ（２）２．８４、Ｃｙｓ：（１）０．８８、Ｎｌｅ（２）２．１０、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１１５５．０（１１５５．４）
ペプチド４＝Ａｓｐ：（２）２．００、Ｓｅｒ：（１）０．９０、Ｔｙｒ：（１）０．９９、Ｐｈｅ：（１）１．０１、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．１０、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８４、Ｃｙｓ：（１）０．９２、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１２４３．０（１２４３．４）
ペプチド５＝Ａｓｐ：（１）１．００、Ｓｅｒ：（１）０．９０、Ｇｌｙ：（１）１．０１、Ｔｙｒ：（１）０．９７、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０３、ＮＨ３（１）１．１８、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８６、Ｃｙｓ：（１）０．９１、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１１８５．１（１１８５．４）
ペプチド６＝Ａｓｐ：（３）３．１９、Ｓｅｒ：（１）０．９７、Ｔｙｒ：（１）０．９７、Ｐｈｅ：（１）０．９８、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．２０、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８０、Ａｒｇ：（１）１．０６、Ｃｙｓ：（１）０．９２、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１５１４．４（１５１４．７）
ペプチド７＝Ｓｅｒ：（１）０．９２、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．０２、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．１５、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８９、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１３２４．３（１３２４．６）
ペプチド８＝Ａｓｐ（３）２．９４，Ｓｅｒ：（２）１．８０、Ｌｅｕ：（１）１．０１、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０１、ＮＨ３（２）２．１０、Ｎｌｅ（１）０．９５、Ｃｙｓ（１）１．０１，ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１３２４．１（１３２４．５）
ペプチド９＝Ｓｅｒ：（１）０．９１、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）０．９９、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．２３、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８７、Ａｒｇ（１）１．００，ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１４４１．４（１４４１．６）
ペプチド１０＝Ｇｌｙ：（２）１．８８、Ｍｅｔ：（１）０．９８、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０２、Ｌｅｕ（１）１．０４
ペプチド１１＝Ｇｌｙ：（２）１．９４、Ｍｅｔ：（１）０．９１、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０２、Ｌｅｕ（１）１．０１、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝８４２．５（８４２．４）
ペプチド１２＝Ａｓｐ：（１）０．９４、Ｇｌｙ：（１）０．９２、Ｍｅｔ：（１）０．９６、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０１、Ｌｅｕ（１）１．００、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝９０１．５（９０２．１）
ペプチド１３＝Ｓｅｒ：（１）０．９２、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．０１、Ｌｙｓ：（１）１．０１、ＮＨ３（１）１．１１、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８８、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１１７８．３（１１７８．５）
ペプチド１４＝Ａｓｐ（１）１．０１，Ｓｅｒ：（１）０．９１、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０１、ＮＨ３（１）１．０６、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８９、Ａｒｇ（１）１．００，ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１４４９．６（１４４９．８）
ペプチド１５＝Ａｓｐ（１）１．０１，Ｓｅｒ：（２）１．７７、Ｔｙｒ：（１）０．９８、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．０１、ＮＨ３（２）２．０９、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８７、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１３７９．５（１３７９．７）
ペプチド１６＝Ａｓｐ（３）３．０２，Ｓｅｒ：（１）０．９３、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．１０、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８６、Ａｒｇ：（１）１．０１、Ｃｙｓ：（１）１．０７、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１５２８．３（１５２８．７）
ペプチド１７＝Ａｓｐ（３）２．９５，Ｓｅｒ：（１）０．９１、Ｔｙｒ：（１）１．００、Ｐｈｅ：（１）１．００、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．７９、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．５８、Ａｒｇ：（１）１．００、Ｃｙｓ：（１）１．００、ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１５２９．４（１５２９．７）
ペプチド１８＝Ａｓｐ（３）２．９９，Ｓｅｒ：（１）０．９２、Ｔｙｒ：（１）０．８８、Ｐｈｅ：（１）０．９７、Ｌｙｓ：（１）０．９７、ＮＨ３（１）１．１２、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（１）１．８５、Ａｒｇ：（１）１．００、Ｃｙｓ：（１）１．０３、ＭｅＮｌｅ（１）０．９５，ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝１５００．５（１５００．７）
【実施例２】ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６、ペプチド７、ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１０、ペプチド１３、ペプチド１４、ペプチド１５、ペプチド１６、ペプチド１７、ペプチド１８のＴｃ−９９ｍ標識
（１）方法
グルコヘプトン酸４０．３μｍｏｌ／３００μＬと塩化第一スズ溶液１３０ｎｍｏｌ／５０μＬの混合液を含有するバイアル中にＴｃ−９９ｍ−過テクネチウム酸ナトリウム（以下９９ｍＴｃＯ４−）溶液１．１〜３．０ＧＢｑを加え、全量を１．３５ｍＬとした。時折転倒させることにより撹拌しながら室温で３０分間反応させ、その一部を取り、セルロースアセテート膜電気泳動法にてＴｃ−９９ｍ−グルコヘプトン酸のＴｃ−９９ｍ標識率が９５％以上であることを確認した。次に、実施例１で得た１６種のペプチドを、それぞれジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ついで純水または０．９％ＮａＣｌを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液ｐＨ７．４（以下ＰＢＳ）、あるいは１０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．０（以下ＣＢ）を用い０．２５〜１２．５ｎｍｏｌ／２００μｌの濃度に調製した。この溶液に、Ｔｃ−９９ｍグルコヘプトン酸溶液２００μｌを各々加え、混合攪拌し、１００℃から１２０℃に加熱して１０分間反応させた。標識後、その一部を取り、ＨＰＬＣにより各Ｔｃ−９９ｍ標識率を求めた。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。カラム：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｐｕｒｅｓｉｌ  ５μｍ  Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ）、溶出速度：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ、放射能検出器：ＮａＩシングルチャンネルアナライザー、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡ）／精製水、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、濃度勾配：０分（２０％Ｂ）→２０分（５０％Ｂ）。
（２）結果
表１に１６種のＴｃ−９９ｍ標識ペプチドの標識率を示す。得られた標識化合物のＨＰＬＣ分析の代表的クロマトグラムとしてを図１にペプチド４、図２にペプチド６の結果を示す。いずれのペプチドも単一の標識生成物を認めた。表１に示した標識率の結果から上記による標識条件で、８０％以上の高いＴｃ−９９ｍ標識が可能であることが示された。
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【実施例３】ウサギ血液内分布
（１）実施例２においてＴｃ−９９ｍ標識したペプチド３、ペプチド４、ペプチド６、ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１３、ペプチド１４、ペプチド１５、ペプチド１６、ペプチド１７およびペプチド１８を、実施例２と同じＨＰＬＣ条件の逆相ＨＰＬＣにて未標識のペプチドと標識ペプチドの分離精製を行った。グラジエント設定は２０％→５０％（０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水）：０→２０分で行った。続いてＰｅｒｃｏｌｌ比重勾配液を作製した。Ｐｅｒｃｏｌｌ（ファルマシアバイオテク社製）原液（比重１．１３０ｇ／ｍＬ）９０ｍＬに１．５ＭＮａＣｌ  １０ｍＬを添加し、生理食塩液と等浸透圧とした。この溶液を生理食塩液で希釈し、１．０９６、１．０７７、１．０６３ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液を調製した。調製した１．０９６、１．０７７、１．０６３ｇ／ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液を１５ｍＬ管に各々１ｍＬずつ重層した。比重マーカービーズ（赤：１．０６２、青：１．０７５、橙：１．０８７、緑：１．０９８）により目的の相度であることを確認した。試験に用いる血液は、病原菌の接触の無いＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）でかつ健康なニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系ウサギ雄２ｋｇ前後の耳静脈より採血を行い、検討に供した。
また、急性炎症である感染症を伴ったウサギ血液における血液内分布を確認するため、健康なウサギの血液の代わりに、黄色ブドウ球菌にて起炎されたウサギの血液を用いて行った。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の約１０８個の生菌を生理食塩液１ｍＬに懸濁させ、その内の１００μｌをニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系ウサギ雄２ｋｇ前後の右ふくらはぎに筋肉内投与した。その２４時間後にウサギの耳静脈より血液採血を行い、検討に供した。
さらに慢性炎症である潰瘍性大腸炎モデルウサギの血液における血液内分布を確認するため、健康なウサギの血液の代わりに、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）にて起炎されたウサギの血液を用いて行った。アンソニーらの方法（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．，７６，２１５−２２４（１９９５））に基づいて、ウサギ潰瘍性大腸炎モデルを作製した。即ち、ＴＮＢＳ  ３６０ｍｇを純水４ｍＬに溶解し、その後エタノール３．２ｍＬ加え、５０．０ｍｇ／ｍＬ４６％エタノール／生理食塩液とした。１日前に絶食を行ったネンブタール麻酔下のニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ７週齢（１．３〜１．４ｋｇ）雄の肛門部より、チューブを約１５ｃｍ挿入し、空気を３ｍＬ注入した。次に、ＴＮＢＳ／４６％エタノール／生理食塩液を０．８ｍＬ注入し、２分間マッサージおよび体位変更を行った。４〜５日後にウサギの耳静脈より血液採血を行い、検討に供した。
ウサギ血液２ｍＬを３７℃湯浴中にて５分加温した。続いてＨＰＬＣ精製を行ったＴｃ−９９ｍ−ペプチド４種の試料液３μＬ（１１１ＭＢｑ／ｍＬ、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチドとして１．８×１０−１１ｍｏｌ／ｍＬ）を加えた後、３０分インキュベーションを行った。その血液試料を調製したＰｅｒｃｏｌｌ比重勾配液に静かに重層した。２０００ｒｐｍ（８００×ｇ）１５分間の遠心分離を行い、分離後チューブを凍結させた後、各画分をカッターで切断し、それぞれをオートウェルガンマカウンターにて放射能量を測定し、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４種の血液に占める各成分の放射能分布を求めた。
（２）結果
ウサギの血液学的パラメーターから白血球数１０００〜８０００ｃｅｌｌ／μＬ、文献でみられる受容体ＦＰＲ数１００，０００〜１２０，０００／ｃｅｌｌの数値を基に、ウサギ血液の受容体ＦＰＲの推定量は０．１７〜１．６×１０−１２ｍｏｌ／ｍＬと計算され、ウサギにおけるペプチド／受容体比は０．０１〜０．１１であった。全血液中の放射能量に対する各血液成分の放射能量の百分率を示した結果を図３に示す。また、全白血球の放射能量に対する顆粒球画分の放射能量とリンパ球および単球画分の放射能量の百分率を示した結果を表２および表３に示す。
健康なＳＰＦウサギ血液において、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３およびＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２は、顆粒球画分ならびにリンパ球および単球画分への分布は共に全血液中の放射能の５％以下で、強い結合はみられなかった。
黄色ブドウ球菌による感染症を伴ったウサギ血液においては、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能量の１０．７８％が分布し、リンパ球および単球画分には１０．２２％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は５０．２２％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は４９．７８％であった。Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能量の１８．２７％が分布し、リンパ球および単球画分には２０．２１％分布した。また全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は４７．６５％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は５２．３５％であった。ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１３、ペプチド１４、ペプチド１５、ペプチド１６ペプチド１７およびペプチド１８の各Ｔｃ−９９ｍ標識化合物は、全血液中の放射能量の１０％以上が白血球に分布し、またリンパ球および単球画分には全白血球の放射能量に対して約２７％から約７７％の範囲で分布していた。
比較対照のＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の３９．７３％が分布し、リンパ球および単球画分には８．８９％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は８１．５８％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は１８．４２％であった。これらの結果から、本発明の一部であるペプチド４、ペプチド６、ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１３、ペプチド１４、ペプチド１５、ペプチド１６、ペプチド１７およびペプチド１８の各Ｔｃ−９９ｍ標識化合物は、黄色ブドウ球菌による感染症を伴ったウサギ血液において従来技術のペプチドＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２よりもリンパ球および単球画分により多く分布していたことが明らかとなった。
一方、ＴＮＢＳによる潰瘍性大腸炎モデルのウサギ血液においては、図３に示されたように、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の１８．４４％が分布し、リンパ球および単球画分には１５．９４％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は表３に示されたように、５３．７２％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は４６．２８％であった。Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の４５．４４％が分布し、リンパ球および単球画分には１２．６０％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は７８．２７％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は２１．７３％であった。比較対照のＴｃ−９９ｍ標識ペプチド１２は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の１５．１０％が分布し、リンパ球および単球画分には８．３４％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は６４．６６％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は３５．３４％であった。
これらの結果から、本発明の一部であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド３およびＴｃ−９９ｍ−ペプチド６は、ＴＮＢＳによる潰瘍性大腸炎モデルのウサギ血液において従来技術のペプチドＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２よりもリンパ球および単球画分により多く分布していたことが明らかとなった。
以上のことから、本発明のペプチドが、従来技術であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２と比べて、顆粒球への結合よりもリンパ球および単球により強く結合することが示され、リンパ球および単球が多く浸潤する慢性炎症に本発明のペプチドが有効であることが確認された。
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【実施例４】ペプチド３、ペプチド４、ペプチド６、ペプチド１２のＴｃ−９９ｍ標識化合物のウサギ感染症モデルによるイメージング、急性期および亜急性期炎症に対する有用性
（１）方法
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の約１０８個の生菌を生理食塩液１ｍＬに懸濁させ、その内の１００μｌをニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系ウサギ２ｋｇ前後の右ふくらはぎに筋肉内投与し、２４時間経過後、明らかに炎症が認められたモデルウサギにペントバルビタール麻酔を施し、実施例２で得られたＴｃ−９９ｍで標識したペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６、ペプチド７、ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１３、ペプチド１４、ペプチド１５、ペプチド１６、ペプチド１７、およびペプチド１８の３７〜７４ＭＢｑを耳静脈内投与し、投与後５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間及び２２時間にガンマカメラにてイメージを撮像した。投与後５分から５時間までの時間点は起炎開始後約２４時間から２９時間であり、急性期炎症に相当する。また投与後２２時間は起炎開始後約４６時間であり、亜急性期炎症に相当する。
（２）結果
得られた結果の代表図を、図４、図５、図６、図７、図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３、図１４、及び図１５に示す。イメージ上に関心領域を設定し、全身カウントに対する各関心領域１０００画素あたりのカウントの割合（％投与量／Ｋｐｉｘｅｌ）を求めた結果を表４に示す。また、その割合から〔炎症〕／〔正常筋肉〕比（［Ａ］／［Ｍ］比）を求めた結果を表５に示す。
その結果、従来技術のＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２は、投与後２時間（起炎後２６時間、急性期炎症）の［Ａ］／［Ｍ］比は１０．３４±３．３４（以下平均値±標準誤差の順で示す）（ｎ＝３）、投与後２２時間（起炎後４６時間、亜急性期炎症）の［Ａ］／［Ｍ］比は３３．９４±２０．７６（ｎ＝３）を示したが、炎症部位への集積は投与後２時間（起炎後２６時間）の１．６６±０．６３％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌから、投与後２２時間（起炎後４６時間）では０．９０±０．２９％投与量／Ｋｐｉｘｅｌと減少した。
これに対し、本発明であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド３は、投与後２時間（起炎後２６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は６．５５±２．０６（ｎ＝５）、投与後２２時間（起炎後４６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は５４．１６±３２．８６（ｎ＝５）を示し、さらに炎症への集積は投与後２時間（起炎後２６時間）の０．９３±０．３１％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌから、投与後２２時間（起炎後４６時間）では３．７０±２．６７％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌと増大した。また、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４は、投与後２時間（起炎後２６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は６．７５±２．７１（ｎ＝３）、投与後２２時間（起炎後４６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は２９．０７±１９．９７（ｎ＝３）を示し、従来技術のＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２よりも低い値を示したが、炎症への集積は投与後２時間（起炎後２６時間）の１．０９±０．２２％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌから、投与後２２時間（起炎後４６時間）では１．８５±０．３４％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌと増大した。また、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、投与後２時間（起炎後２６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は１４．２５±０．３１（ｎ＝３）、投与後２２時間（起炎後４６時間）の［Ａ］／［Ｍ］比は４３．８４±１２．５８（ｎ＝３）を示し、炎症への集積は投与後２時間（起炎後２６時間）の１．２２±０．０５％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌから、投与後２２時間（起炎後４６時間）では１．７７±０．０７％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌと増大した。
一般的に、感染後およそ２４時間程度までは炎症巣へ浸潤する白血球の多くが好中球（顆粒球の大部分を占める）から構成されるが、その後徐々に減少し、浸潤する白血球の主体はマクロファージをはじめとする単球およびリンパ球となる。臨床上、核医学検査を必要とする炎症の多くは、単球およびリンパ球の浸潤が顕著となった亜急性期以降の炎症である。この検討の結果により、本発明のペプチドが起炎後２６時間（投与後２時間）の急性期のみならず、亜急性期にあたる起炎後４６時間（投与後２２時間）でも極めて有用であることが示された。
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【実施例５】ペプチド３、ペプチド４、ペプチド６、ペプチド１２のＴｃ−９９ｍ標識化合物の体内動態
（１）方法
実施例２で得たＴｃ−９９ｍ−ペプチド３、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６及びＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２の４種のＴｃ−９９ｍ標識化合物のラット体内分布実験を行った。体内分布実験は、当業者の行う通常の方法で行った。即ち、試料の３．０〜３．７ＭＢｑを非絶食下のＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（体重１４０〜２００ｇ）にラボナール麻酔下尾静脈より投与し、投与後５分、３０分、６０分及び１８０分にラットを腹部大動脈より放血屠殺し、各臓器を摘出しそれぞれの臓器の放射能カウントをＮａＩシングルチャンネルアナライザーにて測定した。また、重量を測定し、これらにより体内分布を算出した。各臓器の放射能の割合を、臓器あたりの値（％ＩＤ／臓器）、またはグラムあたりの値（％ＩＤ／ｇ臓器）で表した。
（２）結果
表６、表７、表８及び表９にその結果を示す。また、表６、表７、表８及び表９の結果から尿および小腸の経時変化をそれぞれ図１６および図１７に示す。
表６、表７、表８、表９、図１６および図１７より、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドの正常ラット体内分布は、ＺおよびＷのアミノ酸残基の違いで大きく体内動態が異なることが認められた。即ち、従来技術のＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２の代謝経路は、投与後５分における肝臓への高い集積、各時間点における胃への他ペプチドに対する高い集積、小腸への各時間点における高い集積、小腸から続く盲腸への１８０分点での高い集積がみられることから、肝胆道系排泄経路が主流であった（図１７）。また小腸への集積が高いことは、炎症性腸疾患などの腹部炎症を描出することは困難である。
これに対し、本発明のペプチドのうち、請求項１記載の式におけるＴおよびＵを荷電性アミノ酸および酸性アミノ酸アミドなどの親水性アミノ酸に変更あるいは付加したペプチド３、ペプチド４およびペプチド６のＴｃ−９９ｍ標識化合物は、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２でみられる動態とは異なり、尿への排泄が促進された（図１６）。特にＴｃ−９９ｍ−ペプチド６でその傾向が顕著であった。この特徴は、炎症性腸疾患などの腹部炎症を描出することにおいて極めて重要であり、本発明によるペプチドは、従来技術であるペプチド１２に比べて、腹部、特に小腸への分布が低く、腹部の白血球浸潤が起こっている部位などをみる上で、より有効となることが示唆された。
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【実施例６】ラット潰瘍性大腸炎モデルにおける体内動態、慢性炎症に対する有用性
（１）方法
炎症モデル作製：アンソニーらの方法（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．，７６，２１５−２２４（１９９５））に基づいて、ラット潰瘍性大腸炎モデルを作製した。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）３６０ｍｇを純水４ｍＬに溶解し、その後エタノール３．２ｍＬ加え、５０．０ｍｇ／ｍＬ４６％エタノール／生理食塩液とした。２４時間前に絶食を行ったエーテル麻砕下のＳＤ系ラット（Ｓｐｌａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）雌７週齢（１６４〜１７７ｇ）の肛門部より、チューブを７〜８ｃｍ挿入し、空気を０．１ｍＬ注入した。次に、ＴＮＢＳ／４６％エタノール／生理食塩液を０．２ｍＬ注入し、２分間マッサージおよび本位変更を行った５日後に実験に供した。
実施例２で得られたＴｃ−９９ｍ−ペプチド３、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６および比較対照として従来技術のＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２それぞれ１匹あたり約７．４ＭＢｑを尾静脈内投与し、５分後、３０分後、６０分後、１８０分後に屠殺し各臓器の放射能分布をＮａＩシングルチャンネルアナライザーにて測定し、各臓器あたりの％投与量、臓器１ｇあたりの％投与量を求めた。起炎個所をもつ直腸を炎症部位として、臓器１ｇあたりの％投与量を基に［直腸（炎症）］／［筋肉］比（［Ａ］／［Ｍ］比）および［直腸（炎症）］／［血液］比（「Ａ］／［Ｂ］比）を求めた。
（２）結果
結果を、表１０、表１１、表１２および表１３に示す。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３は、投与後５分では［Ａ］／［Ｍ］比３．３６±０．５８、投与後１８０分では７．９１±１．１６を示し、非炎症部位である筋肉に対して炎症部位は高い放射能を示すとともに［Ａ］／［Ｍ］比の経時的増加傾向を示した。また投与後６０分以降、［Ａ］／［Ｂ］比は１を超え、投与後１８０分では２．００±１．５０を示し、増加傾向がみられた。これは血流増加を反映した非特異的集積ではなく、炎症への特異的集積によるものと考えられる。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４は、投与後５分では［Ａ］／［Ｍ］比４．３７±０．６８、投与後１８０分では９．２９±２．８２を示し、非炎症部位である筋肉に対して炎症部位は高い放射能を示すとともに［Ａ］／［Ｍ］比の経時的増加傾向を示した。また投与後６０分以降、［Ａ］／［Ｂ］比は１を超え、投与後１８０分では１．５１±０．４１を示し、増加傾向がみられた。これは血流増加を反映した非特異的集積ではなく、炎症への特異的集積によるものと考えられる。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、投与後５分では［Ａ］／［Ｍ］比４．４１±０．９７、投与後１８０分では１６．５０±１１．０８を示し、非炎症部位である筋肉に対して炎症部位は高い放射能を示すとともに［Ａ］／［Ｍ］比の経時的増加傾向を示した。また投与後３０分以降、［Ａ］／［Ｂ］比は１を超え、投与後１８０分では２．７４±１．７２を示し、増加傾向がみられた。これは血流増加を反映した非特異的集積ではなく、炎症への特異的集積によるものと考えられる。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２は投与後５分では［Ａ］／［Ｍ］比４．６６±３．１３、投与後１８０分では６．２２±４．６１を示し、本発明のペプチドと比較して低い［Ａ］／［Ｍ］比であった。
また［Ａ］／［Ｍ］比は投与後６０分で最大値１１．１０±１２．３３を示したものの、その後減少した。［Ａ］／［Ｂ］比では、投与後６０分で、１．８９±２．３９を示したものの、その後減少し、投与後１８０分では１．００±０．８９であった。
本検討から、従来技術のペプチド１２よりも、リンパ球および単球の浸潤が多い慢性期の炎症部位への集積性および滞留性などの点でも本発明のペプチドが優れ、潰瘍性大腸炎などの慢性炎症に対しても有用であることが示された。
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【実施例７】Ｔｃ−９９ｍ標識されたペプチド３、ペプチド６のヒト血液内分布
（１）方法
本発明がヒトを対象とした臨床においても有効であるかを確認するため、ヒト血液を用いた検討で、本発明のペプチド２種について白血球に対する結合性を確認した。実施例２にてＴｃ−９９ｍ標識されたペプチド３、ペプチド６を、実施例２と同じＨＰＬＣ条件の逆相ＨＰＬＣにて未標識のペプチドと標識ペプチドの分離精製を行った。グラジエント設定は２０％→８０％（０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水）：０→２０分で行った。（ペプチド６の精製後の放射能量は１１１ＭＢｑ／ｍＬであった。）
また従来技術のペプチドとして、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１１、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２の調製を行った。ペプチド１１とペプチド１２をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、濃度０．１ｍｇ／５００μＬに調製した。酒石酸／ＰＢＳ液（５ｍｇ／２００ｍＬ）にＳｎＣｌ２／１０ｍＭ塩酸溶液（５ｍｇ／１０ｍＬ）５０ｍＬを添加し、ペプチド溶液を加えて直ちに９９ｍＴｃＯ４−溶液（２７３８ＭＢｑ／ｍＬ）を０．２５ｍＬ注入した。数秒振盪後１２０℃１０分の標識反応を行った。終濃度は〜８５５．６ＭＢｑ／１２５ｍｇ／ｍＬであった。分取精製および放射化学的純度の測定をＨＰＬＣを用い行った。分析条件は、実施例２と同様の条件で、グラジエント設定は２０％→５０％（０．１％ＴＦＡアセトニトリル／０．１％ＴＦＡ水）：０→２０分で行った。精製後の放射能濃度は２８７〜３１１ＭＢｑ／ｍＬであった。
続いて、実施例３に記載された方法に基づいてＰｅｒｃｏｌｌ比重勾配液を作製した。
４０歳までの成人ボランティアより２０〜３０ｍＬの血液を採取した。続いてＴｃ−９９ｍ標識ペプチドそれぞれを３０μＬ（１１１ＭＢｑ／ｍＬ、Ｔｃ−ペプチドとして１．８×１０−１１ｍｏｌ／ｍＬ）加えた後、３０分インキュベーションを行った。その血液試料２〜３ｍＬを抜き取り、調製したＰｅｒｃｏｌｌ比重勾配液に静かに重層した。２０００ｒｐｍ（８００×ｇ）１５分間の遠心を行い、チューブを凍結させた後、各画分をカッターで切断し、それぞれをオートウェルガンマカウンターにて放射能量を測定し各血液成分中のＴｃ−９９ｍ標識ペプチドの放射能分布を求めた。
（２）結果
ヒトの血液学的パラメーターから白血球数４１００〜６１００ｃｅｌｌ／ｍＬ、文献でみられる受容体ＦＰＲ数１００，０００〜１２０，０００／ｃｅｌｌの数値を基に、ヒト血液の受容体ＦＰＲの推定量は０．６８〜１．２×１０−１２ｍｏｌ／ｍＬと計算され、ヒトにおけるペプチド／受容体比は０．０３〜０．０１であった。Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４種及び陰性対照（Ｔｃ−９９ｍ−グルコヘプトン酸）のヒト血液内分布の結果を図１８に示す。また、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド４種の全白血球の放射能量に対する顆粒球画分の放射能量とリンパ球および単球画分の放射能量の百分率を示した結果を表１４に示す。Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１１、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２のｎ数は１、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６のｎ数は３である。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の２１．９１％が分布し、リンパ球および単球画分には３９．９８％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は３５．４１％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は６４．５９％であった。この結果から、本発明の一部であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド３は、健常なヒト血液において従来技術のペプチドＴｃ−９９ｍ−ペプチド１１およびペプチドＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２よりもリンパ球および単球画分により多く分布していたことが明らかとなった。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の２９．４５％が分布し、リンパ球および単球画分には６．５９％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は８１．９４±８．６７％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は１８．０７±８．６７％であった。この結果から、本発明の一部であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド６は、健常なヒト血液において従来技術のペプチドＴｃ−９９ｍ−ペプチド１１よりもリンパ球および単球画分により多く分布していたことが明らかとなった。
一方、陰性対照のＴｃ−９９ｍ−グルコヘプトン酸は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の１．１１％が分布し、リンパ球および単球画分には２．５２％分布した。血漿画分には９５．３９％が分布した。白血球結合の起こらない陰性対照であるため、全白血球の放射能量に対する顆粒球画分ならびにリンパ球および単球画分の放射能量の割合は算出しない。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１１はヒト血液において、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の５８．７０％が分布し、リンパ球および単球画分には８．０２％が分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は８７．９８％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は１２．０３％であった。
Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１２はヒト血液において、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の２５．０９％が分布し、リンパ球および単球画分には１３．７７％が分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は６４．５７％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は３５．４３％であった。
以上の結果から、本発明のペプチドは、陰性対照のＴｃ−９９ｍ−グルコヘプトン酸および従来技術であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド１１あるいはＴｃ−９９ｍ−ペプチド１２と比べて、顆粒球への結合よりもリンパ球および単球により強く結合することが示された。また、実施例４および実施例６の結果を勘案しても、リンパ球および単球が多く浸潤する慢性炎症に本発明のペプチドが有効であることが確認された。
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【実施例８】Ｔｃ−９９ｍ標識されたペプチド３、ペプチド６のラット血液内分布
（１）方法
炎症モデル作製：アンソニーらの方法（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．，７６，２１５−２２４（１９９５））に基づいて、ラット潰瘍性大腸炎モデルを作製した。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）３６０ｍｇを純水４ｍＬに溶解し、その後エタノール３．２ｍＬ加え、５０．０ｍｇ／ｍＬ４６％エタノール／生理食塩液とした。２４時間前に絶食を行ったエーテル麻酔下のＳＤ系ラット（Ｓｐｌａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）雌７週齢（１６４〜１８４ｇ）の肛門部より、チューブを７〜８ｃｍ挿入し、空気を０．１ｍＬ注入した次に、ＴＮＢＳ／４６％エタノール／生理食塩液を０．２ｍＬ注入し、２分間マッサージおよび体位変更を行った。これを３日連続して行い、最終投与日の４日後に実験に供し、血液を採取した。採取した血液２ｍＬを３７℃湯浴中にて５分加温した。続いてＨＰＬＣ精製を行ったＴｃ−９９ｍ−ペプチド３，Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６の試料液３μＬ（１１１ＭＢｑ／ｍＬ、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチドとして１．８×１０−１１ｍｏｌ／ｍＬ）を加えた後、３０分インキュベーションを行った。その血液試料を調製したＰｅｒｃｏｌｌ比重勾配液に静かに重層した。２０００ｒｐｍ（８００×ｇ）１５分間の遠心分離を行い、分離後チューブを凍結させた後、各画分をカッターで切断し、それぞれをオートウェルガンマカウンターにて放射能量を測定し、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３，Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６の血液に占める各成分の放射能分布を求めた。
（２）結果
ラット雌の血液学的パラメーターから白血球数６６００〜１２６００ｃｅｌｌ／μＬ、文献でみられる受容体ＦＰＲ数１００，０００〜１２０，０００／ｃｅｌｌの数値を基に、ラット血液の受容体ＦＰＲの推定量は１．１〜２．５×１０−１２ｍｏｌ／ｍＬと計算され、ラットにおけるペプチド／受容体比は０．０２〜０．０５であった。全血液中の放射能量に対する各血液成分の放射能量の百分率を示した結果を図１９に示す。また、全白血球の放射能量に対する顆粒球画分の放射能量とリンパ球および単球画分の放射能量の百分率を示した結果を表１５に示す。ＴＮＢＳによる潰瘍性大腸炎モデルのラット血液において、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド３は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の７．８２％が分布し、リンパ球および単球画分には１０．００％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は４３．６９％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は５６．３１％であった。Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、３０分のインキュベーション後顆粒球画分に全血液中の放射能の１８．３４％が分布し、リンパ球および単球画分には６．５７％分布した。また、全白血球の放射能量に対して顆粒球画分の放射能量は７４．０８％であり、リンパ球および単球画分の放射能量は２５．９２％であった。
これらの結果から、本発明の一部であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド３およびＴｃ−９９ｍ−ペプチド６は、ＴＮＢＳによる潰瘍性大腸炎モデルのラット血液において、リンパ球および単球画分にも多く分布していたことが明らかとなった。
以上のことから、本発明のペプチドが、リンパ球および単球が多く浸潤する慢性炎症に本発明のペプチドが有効であることが確認された。
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【実施例９】ペプチド３、ペプチド６のＴｃ−９９ｍ標識化合物のラット大腸炎モデルによるイメージング、慢性期炎症に対する有用性
（１）方法
炎症モデル作製：アンソニーらの方法（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．，７６，２１５−２２４（１９９５））に基づいて、ラット潰瘍性大腸炎モデルを作製した。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）３６０ｍｇを純水４ｍＬに溶解し、その後エタノール３．２ｍＬ加え、５０．０ｍｇ／ｍＬ４６％エタノール／生理食塩液とした。２４時間前に絶食を行ったエーテル麻酔下のＳＤ系ラット（Ｓｐｌａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）雌７週齢（１６４〜１８４ｇ）の肛門部より、チューブを７〜８ｃｍ挿入し、空気を０．１ｍＬ注入した。次に、ＴＮＢＳ／４６％エタノール／生理食塩液を０．２ｍＬ注入し、２分間マッサージおよび体位変更を行った。これを３日連続して行い、最終投与日の４日後に実験実験に供した。実施例２で得られたＴｃ−９９ｍ−ペプチド３、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６をそれぞれ１匹あたり約３７ＭＢｑの放射能量で尾静脈内投与し、５分後、３０分後、６０分後、１２０分後にガンマカメラにてイメージを撮像した。比較対照として、ヒトにおいて潰瘍性大腸炎を診断するのに利用されるＴｃ−９９ｍ標識白血球をロカらの方法（Ｍ．Ｒｏｃａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  １９９８  ２５，７９７−７９９）を基に調製して、これを１匹あたり約３７ＭＢｑの放射能量で尾静脈内投与し、５分後、３０分後、６０分後、１２０分後にガンマカメラにてイメージを撮像した。Ｔｃ−９９ｍ標識白血球は、顆粒球、リンパ球および単球などの全ての白血球を含んで調製された。また撮像終了後、つまり投与後１３０分にて腹部大動脈より脱血した後、各臓器を取り出し、重量および放射能量をそれぞれ測定し、組織１ｇあたりの放射能量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。さらに算出された数値を用いて〔炎症〕／〔筋肉〕比（［Ａ］／［Ｍ］比），〔炎症〕／〔血液〕比（［Ａ］／［ＢＬ］比），〔炎症〕／〔骨〕比（［Ａ］／［ＢＯ］比），〔炎症〕／〔盲腸〕比（［Ａ］／［ＡＰ］比），〔炎症〕／〔結腸〕比（［Ａ］／［Ｃ］比），〔炎症〕／〔直腸〕比（［Ａ］／［Ｒ］比）を求めた。
（２）結果
得られた結果の代表図を、図２０、図２１及び図２２に示す。イメージ上に関心領域を設定し、全身カウントに対する各関心領域１画素あたりのカウントの割合（％投与量／ｐｉｘｅｌ）を求めた結果を表１６に示す。また、その割合から〔炎症〕／〔腹部バックグラウンド〕比（［Ａ］／［ＢＧ］比）を求めた結果を表１７に示す。さらに解剖の結果得られた炎症の％ＩＤ／ｇ，［Ａ］／［Ｍ］比，［Ａ］／［ＢＬ］比，［Ａ］／［ＢＯ］比，［Ａ］／［ＡＰ］比，［Ａ］／［Ｃ］比，［Ａ］／［Ｒ］比を表１８および図２３に示した。その結果、比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球は、投与後３０分の％投与量／ｐｉｘｅｌは０．１１１±０．０２５（以下平均値±標準誤差の順で示す）（ｎ＝５）、［Ａ］／［ＢＧ］比は３．２１±１．９６（ｎ＝５）を示した。また投与後１３０分に脱血し解剖を行った結果得られた炎症１ｇあたりの放射能量（％ＩＤ／ｇ）は０．７１±０．３３であったが、［Ａ］／［ＢＯ］比は２．０８±１．３７を示し、また［Ａ］／［ＢＬ］比は０．２５±０．１７を示し、炎症よりも血液に多く分布していた。
これに対し、本発明であるＴｃ−９９ｍ−ペプチド３は、投与後３０分の％投与量／ｐｉｘｅｌは０．０４３±０．０１５（ｎ＝５）、［Ａ］／［ＢＧ］比は２．２３±０．７７（ｎ＝５）を示した。また投与後１３０分に脱血し解剖を行った結果得られた炎症１ｇあたりの放射能量（％ＩＤ／ｇ）は０．１３±０．１２であったが、［Ａ］／［ＢＯ］比は３．４０±２．７８を示し、また［Ａ］／［ＢＬ］比は２．３３±２．２２を示した。これは血液よりも炎症部位により多く放射能が分布していることを示している。また、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６は、投与後３０分の％投与量／ｐｉｘｅｌは０．０９３±０．０４８（ｎ＝５）、［Ａ］／［ＢＧ］比は２．１５±０．５３（ｎ＝５）を示した。また投与後１３０分に脱血し解剖を行った結果得られた炎症１ｇあたりの放射能量（％ＩＤ／ｇ）は０．５５±０．５１であったが、［Ａ］／［ＢＯ］比は４．４４±２．７４を示し、また［Ａ］／［ＢＬ］比は２．８８±１．６１を示した。これはペプチド３と同様に血液よりも炎症部位により多く放射能が分布していることを示している。これらのことより比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球よりも、血液の影響を受けやすい、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、脳、骨などの血流の多い臓器において特に炎症の描出に優れていると判断された。特にペプチド６は、［Ａ］／［Ｍ］比，［Ａ］／［ＢＬ］比，［Ａ］／［ＢＯ］比，［Ａ］／［ＡＰ］比，［Ａ］／［Ｃ］比，［Ａ］／［Ｒ］比において，比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球よりも優れた数値を示し，本発明のペプチドが、慢性炎症である潰瘍性大腸炎においても優れていることが確認された。
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【実施例１０】ペプチド６、ペプチド１４のＴｃ−９９ｍ標識化合物のラット大腸炎モデルによるオートラジオグラフィ、慢性期炎症に対する有用性
（１）方法
アンソニーらの方法（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．，７６，２１５−２２４（１９９５））に基づいて、ラット潰瘍性大腸炎モデルを作製した。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）３６０ｍｇを純水４ｍＬに溶解し、その後エタノール３．２ｍＬ加え、５０．０ｍｇ／ｍＬ４６％エタノール／生理食塩液とした。２４時間前に絶食を行ったエーテル麻酔下のＳＤ系ラット（Ｓｐｌａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ）雌７週齢（１６４〜１８４ｇ）の肛門部より、チューブを７〜８ｃｍ挿入し、空気を０．１ｍＬ注入した。次に、ＴＮＢＳ／４６％エタノール／生理食塩液を０．２ｍＬ注入し、２分間マッサージおよび体位変更を行った。これを３日連続して行い、最終投与日の４日後に実験実験に供した。実施例２で得られたＴｃ−９９ｍ−ペプチド６、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド１４をそれぞれ１匹あたり約７４ＭＢｑの放射能量で尾静脈内投与し、１２０分後に脱血および屠殺を行った。直ちに大腸を摘出し、内容物を取り除いた後、肉眼的評価にて炎症部位と判断される個所を凍結切片作製用のメディウムに包埋した。その後直ちに液体窒素内に容器と共に数十秒間浸して、大腸炎切除部位を含むメディウムを凍結した。−２０℃の冷凍庫に数十分間静置した後、クリオスタットにて凍結切片の作成を行った。切片作製後、オートラジオグラフィ用イメージングプレート（富士フィルム社製）に１２から１９時間密着した。続いてイメージングアナライザーＢＡＳ２５００（富士フィルム社製）にて放射能分布を画像化した。また、同様に作製した凍結切片を顆粒球抗体および単球抗体の免疫組織化学染色を行い、顆粒球および単球の組織への浸潤を確認した。
（２）結果
得られた結果の代表的な図を図２４、図２５、図２６に示す。また、オートラジオグラフィの結果から得られたイメージ上に関心領城を設定し、各関心領域１画素あたりのカウントを求め、それを基に〔炎症〕／〔正常組織〕比（［Ａ］／［Ｎ］比）を求めた結果を図２７に示す。
起炎を施したラットは、直腸部に２ｃｍから４ｃｍ幅の炎症が腸管全周に形成されており、全てのラットに炎症部位があることを確認した。免疫組織化学染色の結果、炎症部位に顆粒球および単球の著しい浸潤が観察され、顆粒球および単球は炎症部に一致した分布を示した。比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球は、免疫染色像による顆粒球と単球の分布と一致した放射能の分布がみられた。
一方、Ｔｃ−９９ｍ標識されたペプチド６とペプチド１４はどちらも比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球と同様に、免疫染色像による顆粒球と単球の分布と一致した放射能の分布がみられた。同一の切片内で得た［Ａ］／［Ｎ］比を比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６およびＴｃ−９９ｍ−ペプチド１４で比較すると、Ｔｃ−９９ｍ−ペプチド６およびＴｃ−９９ｍ−ペプチド１４は比較対照のＴｃ−９９ｍ標識白血球よりも高い［Ａ］／［Ｎ］比を示し、本発明のペプチドが、慢性炎症である潰瘍性大腸炎においても優れていることが確認された。
【実施例１１】ペプチド３、ペプチド４、ペプチド６、ペプチド８、ペプチド９、ペプチド１６ペプチド１７、ペプチド１８のリコンビナントヒト受容体結合阻害アッセイ）
（１）方法
ＣＨＯ細胞由来リコンビナント受容体ＦＰＲ（６．２４ｐｍｏｌ／ｍＬ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１％ＢＳＡ，Ｂｉｏ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｃ．アマシャムバイオサイエンス）および［３Ｈ］−ＦＭＬＰ（ｆＭＬＦ，９．２５ＭＢｑ／２．８８〜６．２５ｎｍｏｌ，第一化学薬品（株））．を用いて実施した。一定量の受容体ＦＰＲ（０．０５ｎＭ，２００μＬ／ｗｅｌｌ）に各ペプチドを１０−４〜１０−１４Ｍの濃度範囲で加えた後，一定量の［３Ｈ］ＦＭＬＰ（０．３ｎＭ，２５μＬ／ｗｅｌｌ）を加えた。反応後にＧＦ／Ｃフィルターにて受容体ＦＰＲ未結合の［３Ｈ］−ＦＭＬＰと受容体ＦＰＲ結合の［３Ｈ］−ＦＭＬＰとを分離し，受容体ＦＰＲ結合の［３Ｈ］−ＦＭＬＰの放射能量を測定することにより、［３Ｈ］ＦＭＬＰの受容体ＦＰＲへの結合量を求めた。［３Ｈ］ＦＭＬＰの結合を５０％に阻害する各ペプチド濃度（ＩＣ５０）を解析ソフト「Ｘｌｆｉｔ  ｖｅｒ  ３．０．３（ＣＴＣラボラトリーシステムズ（株））」により求め、さらに［３Ｈ］ＦＭＬＰのＫｄ値から阻害定数（Ｋｉ）を求めた。試験を３回行い、各試験では測定を３回行い、平均値を求めた。
（２）結果
得られた結果を図２８に示す。また算出されたＩＣ５０値およびＫｉ値を表１９に示す。比較対照であるＦＭＬＰはＫｉ値が（２．３３±０．４５）×１０ｅ−１０Ｍと算出された。これに対し、ペプチド３はＫｉ値が（６．５０±１．８４）×１０ｅ−９Ｍ，ペプチド４はＫｉ値が（８．３６±３．７４）×１０ｅ−１０Ｍ，ペプチド６はＫｉ値が（２．８３±１．０７）×１０ｅ−１０Ｍ，ペプチド８はＫｉ値が（２．３３±０．９１）×１０ｅ−９Ｍ，ペプチド９はＫｉ値が（１．２８±０．６９）×１０ｅ−１０Ｍと算出された．またＮ末端のホルミル基をアセチル基に変えたペプチド１６、カルバミル基に変えたペプチド１７、メチル基に変えたペプチド１８のそれぞれのＫｉ値は、（３．７４±３．５３）×１０ｅ−６Ｍ、（４．２４±３．６０）×１０ｅ−７Ｍ、（３．８３±１．１２）×１０ｅ−５Ｍを示し、本発明によるペプチドは、受容体ＦＰＲに対する親和性を有しており、受容体ＦＰＲを発現する白血球を介した炎症診断に有用であることが確認された。
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【実施例１２】ペプチド６のＴｃ−９９ｍ標識化合物のウサギ感染症モデルによる阻害イメージング、生体内での白血球結合の確認
（１）方法
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の約１０８個の生菌を生理食塩液１ｍＬに懸濁させ、その内の１００μｌをニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系ウサギ２ｋｇ前後の右ふくらはぎに筋肉内投与し、２４時間経過後、明らかに炎症が認められたモデルウサギにペントバルビタール麻酔を施した。実施例２で得られたテクネチウム−９９ｍで標識したペプチド６を約７４ＭＢｑの投与放射能量で耳静脈内投与し、投与後５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間にガンマカメラにてイメージを撮像した。ペプチド６の炎症集積が、ＦＭＬＰにより阻害されるか確認するために設定したＦＭＬＰプレ投与群では、推定受容体最大量０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの約１万倍に相当するＦＭＬＰ１ｍｇを５％ＤＭＳＯ／生理食塩水に溶解し、これをＦＭＬＰ溶液として、テクネチウム−９９ｍで標識したペプチド６の投与の５分前に耳静脈より投与した。ＦＭＬＰを投与していない群と同様に投与後５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間にガンマカメラにてイメージを撮像した。
（２）結果
得られた結果の代表図を、図２９及び図３０に示す。イメージ上に関心領域を設定し、全身カウントに対する各関心領域１０００画素あたりのカウントの割合（％投与量／Ｋｐｉｘｅｌ）を求めた結果を表２０に示す。また、その割合から〔炎症〕／〔正常筋肉〕比（［Ａ］／［Ｍ］比）を求めた結果を表２１に示す。その結果、ＦＭＬＰ阻害無しのＴｃ−９９ｍ−ペプチド６は、投与後２時間の炎症部位への集積は１．７７±０．２５％投与量／Ｋｐｉｘｅｌ（以下平均値±標準誤差の順で示す）（ｎ＝３）であり、投与後５時間では２．６２±０．２５％投与量／Ｋｐｉｘｅｌと増加し、［Ａ］／［Ｍ］比も投与後２時間の１２．７８±６．１４から投与後５時間の２１．３９±５．３９と増加していた。一方、ＦＭＬＰ阻害有りのＴｃ−９９ｍ−ペプチド６は、［Ａ］／［Ｍ］比は投与後２時間の３．９３±０．６０と「ＦＭＬＰ阻害無し」と比べて低く、投与後５時間の９．０５±３．１０と増加していたものの、炎症部位への集積は投与後２時間の０．４１±０．１０％投与量／Ｋｐｉｘｅｌから、投与後５時間では０．３０±０．０４％投与量／Ｋｐｉｘｅｌと減少した。
このことは、本発明の一部であるペプチド６が白血球に存在する受容体ＦＰＲに結合することにより、炎症部位を描出していることが確認され、本発明のペプチドの集積は白血球浸澗を伴う炎症が起きていることを示していると考えられた。
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【産業上の利用の可能性】
本発明により、生体内外ですべての白血球、すなわち好中球、単球、リンパ球に対して特異的な結合性を示し、かつ放射性金属または常磁性金属で標識可能な化合物、該標識化合物を有効成分とするＳＰＥＣＴ画像診断、ＰＥＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断に有用な医薬組成物の提供が可能となり、個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行う画像診断が可能となった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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