(57)【要約】医薬開発上有用な抗体組成物などの糖蛋白質組成物を生産することが可能な宿主細胞の開発が求められている。本発明は、無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞および該細胞を用いた糖蛋白質組成物の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
【請求項２】
無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子の開始コドンを含むエクソン領域の部分が欠失した、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、請求項４に記載の細胞。
（ａ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項７】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
耐性が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンを含む培地で培養した場合に、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞よりも高い生存率を示すことを特徴とする耐性である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
無血清培地が無蛋白培地である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
糖蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
糖蛋白質が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を有さない糖蛋白質である請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
糖蛋白質が、抗体である請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
抗体のクラスがＩｇＧである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、糖蛋白質組成物を製造する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
【請求項１６】
糖蛋白質組成物を製造する方法が、バッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
培養中に、栄養因子および生理活性物質から選ばれる少なくとも一種を培地に添加する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
栄養因子がグルコース、アミノ酸およびビタミンから選ばれる少なくとも一種である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生理活性物質が、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも一種である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
糖蛋白質組成物が、抗体組成物である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞密度を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌとなるように馴化培地へ接種することを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞の無血清培地への馴化方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法で細胞を無血清培地に馴化させた後、クローン化することを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株を取得する方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載の方法で得られる、無血清培地に馴化したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法で得られる、無血清培地に馴化したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたクローン細胞株。
【請求項２５】
無血清培地が無蛋白培地である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
無血清培地が無蛋白培地である、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２７】
無血清培地が無蛋白培地である、請求項２４に記載のクローン細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、血清を含有しない培地（以下、「無血清培地」と称す）に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞および該細胞を用いた抗体組成物を始めとする糖蛋白質組成物の製造方法に関する。
【背景技術】  花井らは、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加が抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を５０倍以上低下させると言った大きい影響を与えることを報告している［ＷＯ００／６１７３９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８，３４６６，（２００３）］。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしており、糖鎖の構造が変わることでエフェクター機能と関連した薬理浩性が変化することを示している。
一般的に、医薬への応用が考えられている抗体を始めとする糖蛋白質の多くは、遺伝子組換え技術を用いて作製され、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用い製造されている。しかしながら、発現させた糖蛋白質の糖鎖構造は宿主細胞によって異なるため、現状では、必ずしも、最適な薬理活性が発揮できるような糖鎖が付加されているとは限らない。
特に、抗体のように、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加が大きく薬理活性を下げると言うような場合には、フコース修飾のない糖鎖構造を有する抗体分子を適切に調製し提供することが質の高い医療を患者へ提供する上で欠かせない。したがって、このような糖蛋白質の糖鎖構造を制御する技術の開発が望まれている。
糖蛋白質の糖鎖構造は、糖鎖遺伝子、すなわち、糖鎖を合成する糖転移酵素と糖鎖を分解する糖分解酵素の遺伝子によって規定されている。また、糖鎖への糖の供与体となる細胞内糖ヌクレオチドの生合成やゴルジ体への輸送などの機能を担った蛋白質の遺伝子によっても規定されている。これまでに、これらの糖鎖の修飾に係わる遺伝子を導入したり変異を与えたりすることで、その宿主細胞が産生する糖蛋白質の糖鎖構造を制御できる可能性が示されている。
糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変する試みがなされているが、その具体的な例としては、１）ラットのβ−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１３８４８，（１９８９）］、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをマウスＬ細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃ  α１−２Ｇａｌ  β１−）の発現が可能であること［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，１６６８，（１９９１）］、３）β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することでＮ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること［Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，８１３（１９９５）、ＷＯ９９／５４３４２］を報告した例があげられる。ＧｎＴＩＩＩを導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示したが、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されている。
糖鎖の修飾に係わる遺伝子の活性が変化した突然変異体は、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）などのレクチンに耐性を示す株として取得されている［Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１２，５１，（１９８６）］。このような糖鎖の修飾に係わる遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることで、生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されており、その具体的な例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産した報告を挙げることができる［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，３３９３，（１９９８）］。
また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターやＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、ガラクトースの付加のない抗体の発現例が報告されているが、医薬への応用に適するようにエフェクター作用を向上させた抗体の発現には成功していない［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０，３３９３，（１９９８）］。
このような中、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路において、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの活性が低下した株を宿主細胞として用いることで、ＡＤＣＣ活性の高い医薬応用に適した抗体の生産に成功した報告がなされている［ＷＯ００／６１７３９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２６７３３，（２００２）］。これらの報告では、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を示す株、例えば、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＬＣＡ株あるいはＬｅｃ１３株が宿主細胞として用いられている。また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの活性が低下した株としては、この他にも、マウス白血病由来の細胞株ＢＷ５１４７のＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）耐性変異株として樹立されたＰＬＲｌ．３が知られている［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，９９００，（１９８０）］。
しかしながら、これらいずれの株も完全な遺伝子欠損体ではないため、抗体が高いＡＤＣＣ活性を示す原因となっている糖鎖構造、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加をより完全に抑制することは困難である。特に、ＰＬＲ１．３やＬｅｃ１３株などの変異株は、変異剤処理によりランダムに変異を導入することで取得されており、医薬品製造に用いる株として必ずしも適した性質を有しているとは言い難い。一方、宿主細胞の糖鎖修飾に係わる酵素遺伝子を標的とし意図的に標的遺伝子のみを破壊した細胞株を用いて抗体などの糖蛋白質の生産を試みた報告はこれまでにない。
また、動物細胞や組換え動物細胞による糖蛋白質などの生理活性蛋白質の生産において、培養液中に血清が存在すると、血清のロット差が細胞収率や生産性に大きな影響を与える上、ウイルスやプリオン等の病原微生物の最終精製品への混在の可能性を考慮する必要がある。従って、動物細胞を用いて医薬品への適応を目的とした生理活性蛋白質の生産を行う場合、血清を含有しない培地で培養することが望まれている。
【発明の開示】
無血清培地に馴化したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与するゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞、該細胞を用いた糖蛋白質組成物の製造方法、該製造方法で製造された糖蛋白質組成物を提供することを目的とする。本発明の細胞は、糖鎖構造の改変された医薬開発上有用な抗体組成物等の糖蛋白質組成物の製造に有用である。
本発明は、以下の（１）〜（２７）に関する。
（１）  無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
（２）  無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、上記（１）に記載の細胞。
（３）  無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子の開始コドンを含むエクソン領域の部分が欠失した、上記（１）または（２）に記載の細胞。
（４）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼである、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞。
（５）  α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）または（ｂ）から選ばれるＤＮＡがコードする蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（６）  α−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選ばれる蛋白質である、上記（４）に記載の細胞。
（ａ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（ｂ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かっα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質；
（ｃ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
（７）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞。
（８）  耐性が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンを含む培地で培養した場合に、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞よりも高い生存率を示すことを特徴とする耐性である、上記（７）に記載の細胞。
（９）  無血清培地が無蛋白培地である、上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の細胞。
（１０）  糖蛋白質をコードする遺伝子を含む上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の細胞。
（１１）  糖蛋白質が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を有さない糖蛋白質である上記（１０）に記載の細胞。
（１２）  糖蛋白質が、抗体である上記（１０）または（１１）に記載の細胞。
（１３）  抗体のクラスがＩｇＧである、上記（１２）に記載の細胞。
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、糖蛋白質組成物を製造する方法。
（１５）  上記（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
（１６）  糖蛋白質組成物を製造する方法が、バッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養である、上記（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）  培養中に、栄養因子および生理活性物質から選ばれる少なくとも一種を培地に添加する、上記（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載の方法。
（１８）  栄養因子がグルコース、アミノ酸およびビタミンから選ばれる少なくとも一種である、上記（１７）に記載の方法。
（１９）  生理活性物質が、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリンおよびアルブミンから選ばれる少なくとも一種である、上記（１７）に記載の方法。
（２０）  糖蛋白質組成物が、抗体組成物である上記（１４）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）  細胞密度を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌとなるように馴化培地へ接種することを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞の無血清培地への馴化方法。
（２２）  上記（２１）に記載の方法で細胞を無血清培地に馴化させた後、クローン化することを特徴とする、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株を取得する方法。
（２３）  上記（２１）に記載の方法で得られる、無血清培地に馴化したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
（２４）  上記（２２）に記載の方法で得られる、無血清培地に馴化したＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされたクローン細胞株。
（２５）  無血清培地が無蛋白培地である、上記（２１）または（２２）に記載の方法。
（２６）  無血清培地が無蛋白培地である、上記（２３）に記載の細胞。
（２７）  無血清培地が無蛋白培地である、上記（２４）に記載のクローン細胞株。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１０月９日に出願された日本国特許出願２００３−３５０１６６号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書および図面に記載される内容を包含する。
本発明の、無血清培に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞（以下、「本発明の細胞」と表記する）とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素（以下、「α−１，６−フコース修飾酵素」と表記する）の活性が消失するようにゲノム遺伝子が改変された細胞があげられる。
ここで、α−１，６−フコース修飾酵素の活性を消失するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を消失させるように該遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、あるいは該酵素の機能を消失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列に欠失、置換、挿入および／または付加といった塩基配列の改変を行うことをいう。このように改変されたゲノム遺伝子の発現または機能を完全に抑制することをノックアウトするという。ゲノム遺伝子をノックアウトする具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された例があげられる。具体的には、α−１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子において、少なくとも開始コドンを含むエクソンのゲノム領域を染色体上から欠失させること、またはすべての対立遺伝子を欠失させることなどがあげられる。
したがって、本発明の細胞としては、無血清培地に馴化した、α−１，６−フコース修飾酵素の、ゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞、該酵素の少なくとも開始コドンを含むエクソン領域の部分が欠失した細胞などがあげられる。
α−１，６−フコース修飾酵素とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素をいう。Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、該反応に影響を与える酵素も包含される。
α−１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素としては、上述のα−１，６−フコース修飾酵素の活性に影響を与えたり、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
本発明において、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）あるいは（ｈ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）あるいは（ｔ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）  配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）  配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｅ）  配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）  配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）  配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｈ）  配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｉ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｊ）  配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｋ）  配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｌ）  配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｍ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｎ）  配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｏ）  配列番号７で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｐ）  配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｑ）  配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｒ）  配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｓ）  配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質
（ｔ）  配列番号８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスラェラーゼ活性を有する蛋白質
また、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば配列番号１、２、３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２、３または４で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号５、６、７または８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号５、６、７または８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質をいう。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号５、６、７または８で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号５、６、７または８に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることをいう。
本発明の細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができるが、遺伝子工学的な手法が望ましい。その具体的な手法としては、
（ａ）  α−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
（ｂ）  α−１，６−フコース修飾酵素についての突然変異を導入する手法などがあげられる。
また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する方法を用いることにより、本発明の細胞を選択することができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞（以下、親株細胞とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上である。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
本発明の細胞としては、糖蛋白質を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、これらの細胞の具体的な例としては、後述の２．に記載のものがあげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を産生するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞などがあげられる。好ましくは、抗体などの糖蛋白質の製造に用いられる、上述のミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、ヒト化抗体あるいはヒト抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、ならびにヒト化抗体およびヒト抗体を生産するトランスジェニック植物を製造するために用いる植物細胞などがあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞（以下、親株細胞とも称す）は、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子をノックアウトさせるための手法を施す前の細胞をいう。ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞としては、特に限定はないが、例えば、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のＮＳ０細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳ０細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳ０細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のラットミエローマ細胞株
ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞としては、Ｙ３／Ａｇ１．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
本発明の細胞は、抗体などの糖蛋白質に付加される糖鎖構造のうち、フコースの修飾に関する酵素が欠失する。したがって、本発明の細胞に糖蛋白質をコードする遺伝子を含めた細胞では、生産された糖蛋白質がフコース修飾を受けず、その結果、高い生理活性を有する糖蛋白質組成物を無血清培養で安定に製造することができる。
高い生理活性を有する糖蛋白質組成物とは、受容体との親和性が向上する糖蛋白質組成物、血中の半減期が向上する糖蛋白質組成物、血中投与後の組織分布が変化する糖蛋白質組成物、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用が向上する糖蛋白質組成物などをいう。
したがって、本発明の糖蛋白質組成物としては、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の親株細胞で生産した場合、その産生蛋白質の糖鎖構造にフコースの修飾がある糖蛋白質であればいかなる糖蛋白質組成物も含有される。その具体的な例としては、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩ、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤｎａｓｅＩ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼなどがあげられる。
フコース修飾のない糖鎖構造を有することで、その生理活性が大幅に上昇する糖蛋白質のより具体的な例としては、例えば、抗体組成物があげられる。
したがって、本発明の細胞は、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する抗体組成物より、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物を生産することができる。
また、本発明の細胞は、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞よりも高い抗体組成物を生産することができる。
抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物をいう。
抗体は、重鎖、軽鎖の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。重鎖のＮ末端側の約４分の１と軽鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。可変領域以外の部分の大半は定常領域と呼ばれる。抗体分子は定常領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスは定常領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
重鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシル結合糖鎖）の２種類に大別される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、以下の化学式１に示す基本となる共通のコア構造を有する［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］。
2005035740.tif 000002
化学式１において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、化学式１で示されるのコア構造を有するものがあげられ、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（複合型）、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖としては、前記化学式１で示されるコア構造を含むいかなる糖鎖も包含されるので、抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明の細胞を用いて製造される抗体組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような本発明により得られる抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組成物があげられる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合とは、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全てのＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の合計数に対して、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖とは、フコースが、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにα結合していない糖鎖をいう。具体的には、フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していない糖鎖があげられる。
本発明の抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合としては、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％である抗体組成物があげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する抗体組成物よりもＡＤＣＣ活性が高い抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する抗体組成物の該割合よりも高いものがあげられる。具体的には、該割合が２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上高い抗体組成物があげられ、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の全てが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。
上述の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％である抗体組成物、または抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の全てが、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位が結合していない糖鎖である抗体組成物としては、後述の６．に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。
本発明により得られる抗体組成物において、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する抗体組成物よりも高い場合、本発明により得られる抗体組成物は、親株細胞が生産する抗体分子からなる抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を障害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］で分析することによっても決定することができる。  また、本発明の抗体としては、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８，１９９９）、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８，２０００）などがあげられる。
自己免疫疾患（具体的な例としては、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１，２０００）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベ口毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６，１９９９）などがあげられる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としては、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に生産される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよいが、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体生産トランスジェニック動物あるいはヒト抗体生産トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することもできる。ヒト抗体生産トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスがＩｇＧのヒト抗体が好ましい。
抗体の断片とは、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ  Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のシステインからＣ末端、あるいは２３０番目のプロリンからＣ末端までを意味する。抗体の断片としては、具体的には、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域を有する融合蛋白質としては、抗体のＦｃ領域を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）であればいかなるものでもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞は、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。α−１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどあげられる。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）相同組換え法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、α−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の染色体工学の手法を用い、例えば以下のように行うことができる。
α−１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得する。
取得したｃＤＮＡの塩基配列に基づき、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列に基づき、改変する標的遺伝子（例えば、α−１，６−フコース修飾酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２．に記載の細胞があげられる。
α−１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
α−１，６−フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列、に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、α−１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、α−１，６−フコース修飾酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
次に、調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）；蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
α−１，６−フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、α−１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がα−１，６−フコース修飾酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、α−１，６−フコース修飾酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、α−１，６−フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、α−１，６−フコース修飾酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得したα−１，６−フコース修飾酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−マンノースをα−１，６−フコース修飾酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるα−１，６−フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１、２、３または４に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、α−１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
α−１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られるα−１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号９に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の２．に記載の各種細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
また、α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標として、相同組換え体を取得することもできる。具体的な方法としては、例えば、以下に記載の形質転換体を選択する方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
α−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
また、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた結果生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の６．に記載の方法があげられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等が好ましい。
具体的には、数十μｇ／ｍｌ〜数ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地にで１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の細胞を選択することができる。
（ｂ）ＲＤＯ法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、α−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
α−１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、α−１，６−フコース修飾酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちα−１，６−フコース修飾酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の２．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
α−１，６−フコース修飾酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
α−１，６−フコース修飾酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、α−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」を用いることもできる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｃ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、α−１，６−フコース修飾酵素の活性、あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を、突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするα−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の２．に記載の宿主細胞があげられる。
細胞への遺伝子の導入には、後述の２．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
α−１，６−フコース修飾酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」があげられる。
（２）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の細胞は、α−１，６−フコース修飾酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
α−１，６−フコース修飾酵素としては、具体的には、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼなどがあげられる。
具体的には、１）突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（１９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、α−１，６−フコース修飾酵素の活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」があげられる。
２．抗体組成物を例とした糖蛋白質の製造方法
抗体組成物の製造を例に、本発明の細胞を用いた糖蛋白質の製造方法を示す。
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように抗体分子をコードする遺伝子を導入する宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調整した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
ｃＤＮＡは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって所望の糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する酵母、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
以下に、抗体組成物の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体およびＦｃ融合蛋白質の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物等の糖蛋白質を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いるこどができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得。
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオ口酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  ＥＸｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ，ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２のＡの（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項２のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのみをヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域では、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２のＡの（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２のＡの（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、本項２のＡの（５）及び（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項２のＡの（５）及び（６）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２のＡの（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項２のＡの（４）及び（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（曰水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の各種添加物を添加した培地等をいることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１  βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設定し、ＰＣＲ法を行いＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設定する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１．項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にインスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体およびＦｃ融合蛋白質の組成物の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、抗体分子等の糖蛋白質を発現する能力を有している細胞の場合には、上記１．に記載の方法を用いて糖蛋白質生産細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体組成物や糖蛋白質組成物を精製することにより、本発明の抗体組成物や糖蛋白質組成物を製造することができる。
３．無血清培養による本発明の糖蛋白質組成物の製造法
本発明の細胞は、さらに無血清培地へ馴化させる必要がある。本発明の細胞を用いて、糖蛋白質の製造を行なうことにより、無血清あるいは無蛋白培地の糖蛋白質組成物の製造が可能である。
本発明の無血清培地への馴化方法としては、血清を含有する培地で継代したα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を、市販の無血清培地等へ直接馴化させる方法や連続馴化させる方法（Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ＪＯＨＯＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ  ２Ｃ：１）等があげられる。以下に、その具体的な例をあげる。
無血清馴化中には細胞の生存率が一時的に低下し、細胞が死滅してしまうことがある。このため、細胞の生存率を戻し、あるいは高く維持するためには、無血清馴化培地への細胞接種時に細胞密度を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種することが好ましい。例えば、直接馴化法では、培地中に細胞を接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでのバッチ培養等、通常の動物細胞の培養方法を用いて培養し、細胞濃度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達したら、無血清培地中に細胞を接種し、同様な条件で培養を繰り返す。
無血清培地にα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を１×１０５〜１０×１０５細胞／ｍｌ、好ましくは４×１０５〜６×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、通常の動物細胞の培養方法を用いて４〜７日後に、細胞密度が１０×１０５〜４０×１０５細胞／ｍｌに達した細胞を無血清培地に馴化した細胞として選択する。
無血清培地に馴化した細胞は、細胞濃度が下記のバッチ培養で用いられる培地中に１０×１０５〜３０×１０５細胞／ｍｌとなるように接種し、下記のバッチ培養で用いられる培養条件で３〜５日間培養して、継代培養を行うことができる。なお、継代培養の期間中、無血清培地に馴化した細胞の生存率は、９０％以上に維持しておくことが望ましい。また、α−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼのゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞または該細胞の形質転換細胞について、無血清培地に馴化した細胞が所望の糖蛋白質の生産性を維持するためには、アルブミンを好ましくは０．１〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５〜３ｇ／Ｌとなるように無血清培地へ添加しておくとよい。
本発明の無血清培地への馴化方法を用いて細胞を無血清馴化させた後、９６ウエルプレートによる限界希釈方法、コロニー形成方法等を用いることにより、クローン（単一細胞）化した細胞株を調製することができる。
以下に、限界希釈法を用いたクローン化した細胞株を調製する方法を示す。
細胞懸濁液を希釈し、ひとつのウエルに１個以下の確率で細胞が入るように接種し、市販の無血清培地などを用いて、３０〜４０℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で数週間培養する。培養終了後、細胞増殖の認められた細胞の培養上清中の所望の糖蛋白質の濃度を調べ、該糖蛋白質の生産性の高い細胞を選択する。
コロニー形成方法を用いてクローン化する方法は以下のとおりである。
付着性細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、シャーレに細胞を接種して培養後、コロニーの形成を確認する。ペニシリンキャップ等のリングでコロニーを分離し、トリプシン等の酵素で細胞を分離後、適当な培養器に移し、所望の糖蛋白質の生産量を調べ、該糖蛋白質の生産性の高い細胞を選択する。
浮遊細胞の場合は、細胞懸濁液を希釈し、軟寒天中に細胞を接種して培養し、生じたコロニーを顕微鏡下でピックアップした後、静置培養に戻して所望の糖蛋白質の生産量を調べ、生産性の高い細胞を選択する。
上記方法を繰り返して行なうことで、無血清に馴化され、かつ目的とする細胞特性を持ったクローン化されたα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株を選択することができる。
上記方法により、無血清培地に馴化したα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株を得ることができる。
無血清培地に馴化したα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株は、上記の無血清培地に馴化した細胞を継代培養する方法で継代培養することができる。本発明の無血清培地への馴化方法を用いて無血清培地に馴化したα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞としては、ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３７）、ＷＫ７０４−２８７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３６）、ＷＫ７０４−２７６０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３５）を無血清培地に馴化した細胞などがあげられる。
なお、本発明の無蛋白培地での細胞の馴化方法についても、上述の無血清培地での細胞の馴化方法と同様の方法で行うことができる。
本発明の細胞を培養する方法としては、所望の糖蛋白質組成物を効率よく生産できる培養方法であれば、通常用いられる動物細胞の培養法のいずれでも用いることができる。例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養、パーフュージョン培養等があげられるが、所望の糖蛋白質の生産性を高めるにはフェドバッチ培養またはパーフュージョン培養が好ましい。
（１）バッチ培養
本発明の細胞の培養方法において用いられる無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され、かつ動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な栄養因子、生理活性物質等を添加する。これらの添加物は、培養前に予め培地に含有させる。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられ。
生理活性物質としては、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸の濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜１６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜２０００（好ましくは１００〜１５００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン５〜１００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜７５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１５０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜３０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物２〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン５〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンの濃度は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜０．３ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．００１〜１０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜７．５ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０１〜３００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０１〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１０．０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．００５〜２．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１．５ｍｇ／Ｌ）、チアミンー塩酸０．００５〜２０．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜１５．０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５．０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３．０ｍｇ／Ｌ）である。
生理活性物質の濃度は、例えば、インスリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、インスリン様増殖因子１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜３００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは７００〜４０００ｍｇ／Ｌである。
バッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
（２）フェドバッチ培養
本発明の細胞の培養方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地（Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、予め培養前に培地に含有させるか、または必要に応じて、培養中に培養液へ適宜追加供給する。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
培地または培養液中への栄養因子の最終添加量として、グルコースは２００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜５０００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸は、例えば、Ｌ−アラニン１〜９６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜６４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜６０００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜４０００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５３〜１２０００（好ましくは５５〜８０００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１３〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１４〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜６００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜４００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜１２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜８００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜２４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物８〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜１２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１２〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは１２〜１２００ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンは、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜２．４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜１．６ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１１〜６０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１１〜４０ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１１〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．１１〜６０ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜１８００ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜１２００ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜８０ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜９０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０３〜６０ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜１２ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜９８ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜１２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜８０ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／Ｌ）である。
培地または培養液中への生理活性物質の最終添加量として、例えば、インスリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、インスリン様増殖因子１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン１０〜３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１〜２０００ｍｇ／Ｌ、アルブミン２００〜３６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２２０〜２４０００ｍｇ／Ｌである。
本発明の細胞の培養方法において物質の「最終添加量」は、フェドバッチ培養中に添加する濃縮培養液を最終的に添加し終わった後、培地に含まれる該物質の重量と培養液中に添加した該物質の重量との合計量を、培地量と添加した濃縮培養液量との合計量で除した値として表わされる。
フェドバッチ培養においては、生理活性物質、栄養因子等は通常に使用される濃度よりも高い濃度で添加することが好ましい。例えば、培養液量の１／３０〜１／３好ましくは１／２０〜１／５を一回分として添加する。培養液中に添加する場合は、培養期間中、連続的にまたは数回〜十数回に分けて追加供給することが好ましい。生理活性物質、栄養因子等を連続的、または間欠的に少量づつ追加供給する上記フェドバッチ培養法は、細胞の代謝効率が高く、培養液中の老廃物が蓄積されることによる培養細胞の到達細胞密度の低下を防止することができ、また、回収された培養液中の所望の糖蛋白質の濃度はバッチ培養法に比べて高濃度であるため、該糖蛋白質の分離・精製が容易になり、バッチ培養に比べ、培地当りの該糖蛋白質の生産量を増大させることができる。
フェドバッチ培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃で、３〜１２日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
（３）パーフュージョン培養
本発明の細胞の培養方法において使用される無血清培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる基礎培地に血清の代わりに、各生理活性物質、栄養因子が添加され且つ通常動物細胞が同化しうる炭素源、窒素源等を含有させたものが用いられる。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕、Ｆ１２培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）〕、ＩＭＤＭ培地〔Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）〕等があげられるが、好ましくは、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地等が用いられる。上記培地以外に、バッチ培養で記載した無血清培地を用いてもよい。
無血清培地には、必要に応じて動物細胞の生育に必要な生理活性物質、栄養因子等を添加する。これらの添加物は、培養前の培地または培養液中に供給する培地に含有させておくとよい。
栄養因子としては、グルコース、アミノ酸、ビタミン等があげられる。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。
生理活性物質としては、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等があげられる。
栄養因子の濃度として、グルコースの濃度は５００〜６０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００〜２０００ｍｇ／Ｌにコントロールされる。
栄養因子としては、アミノ酸、ビタミン等があげられる。他の生理活性物質または栄養因子の添加量は、例えば、インスリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、インスリン様増殖因子４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、トランスフェリン４〜５６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３６０ｍｇ／Ｌ、アルブミン８０〜６５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは２８０〜４５００ｍｇ／Ｌである。
アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。アミノ酸濃度は、例えば、Ｌ−アラニン１〜２００ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜１６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アルギニン一塩酸１０〜１１４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０〜９４０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン一水和物１０〜２５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜２００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−アスパラギン酸５〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン二塩酸１０〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン酸５〜３２０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン５０〜３３００（好ましくは１００〜１８００ｍｇ／Ｌ）、グリシン２〜１４８ｍｇ／Ｌ（好ましくは５〜１２３ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−イソロイシン４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−ロイシン１０〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１３〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン一塩酸１０〜５３０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２０〜４８０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−メチオニン４〜１５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜１２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−フェニルアラニン４〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは４〜２６０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２１０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−セリン５〜２７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜２２０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−スレオニン５〜３５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１０〜３００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン１〜６５ｍｇ／Ｌ（好ましくは２〜５５ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物４〜４７０ｍｇ／Ｌ（好ましくは８〜３７０ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−バリン１０〜４５０ｍｇ／Ｌ（好ましくは１１〜３５０ｍｇ／Ｌ）である。
ビタミンとしては、ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミン、ＤＬ−α−トコフェロール等があげられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。ビタミンの最終添加量は、例えば、ｄ−ビオチン０．００１〜０．４４ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜０．３４ｍｇ／Ｌ）、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０１〜１６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１４ｍｇ／Ｌ）、塩化コリン０．１〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは３０．２〜１６ｍｇ／Ｌ）、葉酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、ｍｙｏ−イノシトール０．０５〜３１０ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０５〜２１１ｍｇ／Ｌ）、ナイアシンアミド０．０２〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ）、ピリドキサール一塩酸０．０２〜２１ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０２〜１６ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン０．０１〜２．６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２．１ｍｇ／Ｌ）、チアミン一塩酸０．０１〜２６ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．０１〜２１ｍｇ／Ｌ）、シアノコバラミン０．００１〜５ｍｇ／Ｌ（好ましくは０．００２〜３ｍｇ／Ｌ）である。
本発明の細胞の培養方法において培養液は、通常使われている培養液と細胞を分離する装置により効率的に分離され、濃縮された細胞液が元の培養槽に戻り、減少した分の新鮮培地が新たに供給される。このことにより常に培養環境が良好に保たれる。
本発明の細胞の場合、新鮮培地での培地交換率とは別に、増殖する細胞を細胞の増殖率に合わせて、培養系の外へ捨てることによって培養系を安定させ、所望の糖蛋白質の生産性を高めることができる。例えば、細胞を系外へ捨てる速度を細胞増殖率に合わせて、目的とする細胞密度が維持されるよう細胞の倍加時間に培養槽にある全細胞の２／５〜３／５を系外に出すことにより生産性の高い培養が可能となる。
本発明において培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃等の条件下で１０〜４０日間行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御、攪拌などは通常の動物細胞の培養に用いられる方法に準じて行うことができる。
上記のとおり、本発明のα−１，６−フコース修飾酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を培養し、所望の糖蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該糖蛋白質を採取することにより、該糖蛋白質を製造することができる。
本発明の細胞の培養方法において、細胞を増殖させる場合には、培養液中のインスリン濃度を１０ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以上に維持して培養することが好ましい。一方、所望の糖蛋白質を生産させる場合には、例えば培養液中のインスリン濃度を、１０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｍｇ／Ｌ以下に維持して培養することが好ましい。なお、前培養において培地中にインスリンが含まれていれば、抗体の生産性を高めるために、インスリンは添加しなくてよいが、通常は培養液中にインスリン濃度を０．０１〜１０ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜５ｍｇ／Ｌになるように維持することが好ましい。
培養液中のインスリン濃度を調節する方法は、インスリンの濃度調整が可能である培養、例えばフェドバッチ培養、パーフージョン培養等の培養方法において、好適に用いられる。
なお、細胞の培養方法についても、血清、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、アルブミン等の蛋白質を添加しない培地を用いて、上述の方法に従って、無血清培地での培養方法と同様の方法を行なうことができる。当該培養方法により、所望の糖蛋白質組成物を製造することができる。
４．糖蛋白質組成物の活性評価
精製した糖蛋白質組成物の蛋白量、受容体との親和性、血液中での半減期、血液投与後の組織への分布、あるいは薬理活性発現に必要な蛋白質相互作用の変化を測定する方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（１９９５）、日本生化学会編  新生化学実験講座１９動物実験法，東京化学同人（１９９１）、日本生化学会編新生化学実験講座８  細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（１９９０）、日本生化学会編  新生化学実験講座９  ホルモンＩペプチドホルモン，東京化学同人（１９９１）、実験生物学講座３  アイソトープ実験法，丸善株式会社（１９８２）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）、酵素免疫測定法第３版，医学書院（１９８７）、改訂版  酵素抗体法，学際企画（１９８５）等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、精製した糖蛋白質組成物をラジオアイソトープなどの化合物で標識し、標識した糖蛋白質組成物の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合反応の強さを定量的に測定する方法があげられる。また、Ｂｉａｃｏｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅシリーズなどの各種装置を用いて、蛋白質蛋白質相互作用を測定することもできる（Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９（１９９１）、実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズタンパク質の分子間相互作用実験法，羊土社（１９９６））。
標識した糖蛋白質を体内に投与することで、血液中での半減期あるいは血液投与後の組織への分布を知ることができるが、標識体の検出には、標識物質を検出する方法と検出の対象となる糖蛋白質特異的な抗体抗原反応を組み合わせた系が好ましい。
５．抗体組成物の活性評価
糖蛋白質組成物が抗体組成物である場合、精製した抗体組成物の蛋白量、抗原との結合性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
６．糖蛋白質組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた糖蛋白質組成物の糖鎖構造は、通常の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、ＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
糖蛋白質組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
糖蛋白質組成物の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、糖蛋白質組成物をヒドラジン分解して糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
７．糖蛋白質組成物の利用
本発明により製造される糖蛋白質組成物は、フコースが結合していない糖鎖構造を有しており、例えば、受容体との親和性の向上、血中半減期の向上、血中投与後の組織分布の改善、または薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用の向上などの効果が期待でき高い生理活性を示す。特に、抗体組成物の場合は、高いエフェクター機能、すなわちＡＤＣＣ活性を有している。これら生理活性の高い糖蛋白質、特に高いＡＤＣＣ活性を有する抗体組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。しかし、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明により製造される抗体組成物は高い抗腫瘍効果を有するため、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起されるため、高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高い抗体依存性細胞障害活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８，１９９９）、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８，２０００）などがあげられる。
自己免疫疾患（具体的な例としては、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１，２０００）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐｌ２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベ口毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６，１９９９）などがあげられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明の糖蛋白質組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができ、糖蛋白質製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒痢、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、糖蛋白質組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該糖蛋白質組成物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該糖蛋白質組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該糖蛋白質組成物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサーリサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
【図面の簡単な説明】図１は、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築を示した図である。
図２は、プラスミドｐＢｓ−２Ｂ８Ｌの構築を示した図である。
図３は、プラスミドｐＢｓ−２Ｂ８ＨおよびプラスミドｐＢｓ−２Ｂ８Ｈｍの構築を示した図である。
図４は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐの構築を示した図である。
図５は、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト株より精製した抗ＣＤ２０キメラ抗体のヒトＢリンパ球培養細胞株Ｒａｊｉに対するＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞障害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。
図６は、無蛋白培地馴化細胞を無蛋白培地で継代した際の、生細胞密度、生存率の推移を示したものである。
図７は、無蛋白培地馴化細胞のフェドバッチ培養における、生細胞密度、生存率の推移を示したものである。
図８は、無血清培地に馴化したＭｓ７０４／ＣＤ２０株を用いて浮遊撹拌リアクター無血清フェドバッチ培養を行った際の、生細胞密度（Ａ）、細胞生存率（Ｂ）、累積生細胞密度（Ｃ）、抗体濃度（Ｄ）の推移を示した図である。各グラフの構軸は、培養開始後の培養日数を示す。
図９は、精製した２種類の抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の、ヒト末梢血中でのＢ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に、リンパ球画分中のＣＤ２陰性ＣＤ１９陽性ヒトＢ細胞の比率、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○は無血清培地に馴化したＭｓ７０４／ＣＤ２０株を用い浮遊撹拌リアクター無血清フェドバッチ培養法にて製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体）、●は親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（ＤＧ４４／ＣＤ２０抗体）の活性をそれぞれ示す。
図１０は、精製した２種類の抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の、ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。○はＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体、●はＤＧ４４／ＣＤ２０抗体の活性をそれぞれ示す。
図１１は、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体に０〜３００ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を添加して調製した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体組成物の、ＷＩＬ２−Ｓ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性、横軸に添加したＤＧ４４／ＣＤ２０抗体の抗体濃度をそれぞれ示す。図中の※は、フコース非結合型糖鎖を有する抗体の割合が２０％以上の抗体組成物を示す。
図１２は、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体のみからなる抗体組成物と、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体に９倍量のＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を混合した抗体組成物の、ＷＩＬ２−Ｓ細砲に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を示した図である。グラフ縦軸に細胞傷害活性を示す。グラフ横軸に示した数値は、上段からＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体の濃度、添加したＤＧ４４／ＣＤ２０抗体の濃度、総抗体濃度をそれぞれ示す。□はＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体のみからなる抗体組成物、■はＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体に９倍量のＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を混合した抗体組成物の活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１  ゲノム上に存在する全てのＦＵＴ８遺伝子を破壊したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を以下の手順で造成した。
１．チャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏの構築。
ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載の方法により構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８ＰｕｒｏおよびプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）を用いて、以下の様にしてプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを構築した。
プラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＤＴ（Ｌｅｘｉｃｏｎ社製）１．０μｇを１６単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットを含む約１．６ＫｂのＡｓｃＩ断片を回収した。
次に、プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ  １．０μｇを１６単位の制限酵素ＡｓｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて３７℃で２時間反応させた。消化反応後、大腸菌Ｃ１５株由来Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（宝酒造社製）を用いて、添付の説明書に従い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化させた。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を用いて、ＤＮＡ断片を回収した。
上記で得たプラスミドｐＫＯＳｅｌｅｃｔＮｅｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１．６Ｋｂ）０．１μｇとプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ由来のＡｓｃＩ断片（約１０．１Ｋｂ）０．１μｇに滅菌水を加えて５μＬとし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５μＬを加えて１６℃で３０分間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する図１に示したプラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを得た。該プラスミドはＣＨＯ細胞のＦＵＴ８遺伝子ノックアウト細胞を作製するためのターゲティングベクターとして用いた。
２．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子を１コピー破壊したＣＨＯ細胞の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ導入株の取得
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５，１９８６］に対し、実施例１の１項で構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８ゲノム領域ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏを以下の様にして導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｎｅｏ  ２８０μｇを４００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間反応させて直線状化した後、４μｇを１．６×１０６細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［透析ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）［透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地］１０ｍＬに培地交換した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、Ｇ４１８耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断
本項（１）で取得したＧ４１８耐性クローンに対し、ゲノムＰＣＲによる相同組換えの診断を以下の様にして行った。
９６穴プレートに得たＧ４１８耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、２倍量の凍結培地［２０％  ＤＭＳＯ、４０％  ウシ胎児血清、４０％  ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ播種してレプリカプレートとする一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
レプリカプレート上のネオマイシン耐性クローンは、６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）を用いて１週間培養した後、細胞を回収し、回収した細胞から公知の方法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２０１，３３１（１９９２）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ］３０μＬに一晩溶解した。
ゲノムＰＣＲに用いるプライマーは以下のように設計した。まず、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域（配列番号９）のうち、ターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１０または配列番号１１）およびベクター内配列に結合するプライマー（配列番号１２または配列番号１３）を調製した。それらを用いて、以下のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。即ち、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液を各々１０μＬ含む２５μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（フォワードプライマーは配列番号１０または配列番号１１、リバースプライマーは配列番号１２または配列番号１３）］を調製し、９４℃で３分間の加熱の後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとした条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ後、反応液を０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、ＣＨＯ細胞ゲノム領域とターゲティングベクター相同領域との境界部を含む約１．７Ｋｂの特異的増幅が認められるものを陽性クローンと判定した。
（３）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（２）で陽性が確認されたクローンに対し、ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を以下の様にして行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、本項（２）で見出された陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置後、陽性クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（グライナー社製）へ播種した。６００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（グライナー社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ］１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により取得したＦＵＴ８ゲノム領域（配列番号９）のうち、ターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１４および配列番号１５）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により構築したプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１４および配列番号１５）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本項（２）で取得した陽性クローンである５０−１０−１０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片のみが検出された。一方、陽性クローン５０−１０−１０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片に加え、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片が検出された。両断片の量比は１：１であったことから、５０−１０−１０４株は、ＦＵＴ８対立遺伝子のうち１コピーが破壊されたヘミノックアウトクローンであることが確認された。
３．ゲノム上のＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の作製
（１）ターゲティングベクターｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ導入株の取得
実施例１の２項（２）で得たＦＵＴ８ヘミノックアウトクローン５０−１０−１０４に対し、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１３の１項に記載の方法により構築したチャイニーズハムスターＦＵＴ８遺伝子エクソン２ターゲティングベクタープラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏを以下の様にして導入した。
プラスミドｐＫＯＦＵＴ８Ｐｕｒｏ  ４４０μｇを８００単位の制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で５時間反応させて直線状化した後、４μｇを１．６×１０６細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）に懸濁し、接着細胞培養用１０ｃｍデッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ播種した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養後、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに培地交換した。
この培地交換作業を７日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、薬剤耐性クローンを取得した。
（２）ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断
本項（ｌ）で得た薬剤耐性クローンに対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断を行った。
ピューロマイシン耐性クローンが出現した１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍＬを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（旭テクノグラス社製）へ各クローンを播種し、ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１））を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを２５単位の制限酵素ＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行った。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１６および配列番号１７）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１２に記載の方法により構築したプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥｘＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１６および配列番号１７）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
５０−１０−１０４株から本項（１）に記載の方法により取得したピューロマイシン耐性クローンの１っであるＷＫ７０４株のゲノムＤＮＡを本法により解析した。ＷＫ７０４株では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子由来の約２５．５Ｋｂの断片が消失し、相同組換えされた対立遺伝子に特異的な約２０．０Ｋｂの断片のみが検出された。この結果からＷＫ７０４株は、ＦＵＴ８両対立遺伝子が破壊されたクローンであることが確認された。
４．ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトした細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去
（１）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの導入
実施例１の３項で作製したＦＵＴ８ダブルノックアウトクローンのうちＷＫ７０４に対し、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＢＳ１８５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を以下の様にして導入した。
プラスミドｐＢＳ１８５  ４μｇを１．６×１０６細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）１０ｍＬに懸濁し、さらに同培地を用いて２万倍希釈した。該希釈液を接着細胞培養用１０ｃｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製）７枚へ播種後、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で１０日間の培養を行い、コロニーを形成させた。
（２）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得
ＷＫ７０４に対し遺伝子導入して得たコロニーより任意のクローンを以下の手順で採取した。まず、１０ｃｍディッシュより培養上清を除去し、リン酸緩衝液７ｍＬを注入した後、実体顕微鏡下に移した。次にピペットマン（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いてコロニーを掻き取って吸い込み、丸底９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ採取した。トリプシン処理を行った後、接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ各クローンを播種し、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて１週間培養した。
培養後、上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、２倍量の凍結培地［２０％  ＤＭＳＯ、４０％ウシ胎児血清、４０％  ＩＭＤＭ］と混和した。このうち半量を接着細胞用平底９６穴プレート（岩城硝子社製）へ播種してレプリカプレートを作製する一方、残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。
次にレプリカプレートを、Ｇ４１８を６００μｇ／ｍＬ、ピューロマイシンを１５μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）を用いて７日間培養した。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現によりｌｏｘＰ配列に挟まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、Ｇ４１８およびピューロマイシン存在下で死滅する。本ネガティブ選択法により陽性クローンを選択した。
（３）ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断
本項（２）で見出された陽性クローン（４−５−Ｃ３）に対し、以下の手順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。
本項（２）で凍結保存したマスタープレートのうち、上記陽性クローンを含む９６穴プレートを選択し、５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で１０分間静置した。静置後、上記クローンに該当するウェルから細胞を接着細胞用平底２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて１週間培養した後、接着細胞用平底６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。該プレートより公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従って各クローンのゲノムＤＮＡを調製し、各々ＴＥ−ＲＮａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）１５０μＬに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ  １２μｇを２０単位の制限酵素ＮｈｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で一晩消化反応を行った。該反応液よりエタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０μＬに溶解し、０．６％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従い、ナイロン膜ヘゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対し８０℃で２時間の熱処理を行い、固定化した。
一方、サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。まず、ＦＵＴ８ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合するプライマー（配列番号１６および配列番号１７）を用いて、以下のＰＣＲを行った。即ち、実施例１の１項（２）で得たプラスミドｐＦＵＴ８ｆｇＥ２−２  ４．０ｎｇを含む２０μＬの反応液［ＤＮＡポリメラーゼＥＸＴａｑ（宝酒造社製）、ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１６および配列番号１７）］を調製し、９４℃で１分間の加熱の後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応を１サイクルとした２５サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後、反応液を１．７５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約２３０ｂｐのプローブＤＮＡ断片を精製した。得られたプローブＤＮＡ溶液５μＬに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。まず、上記のナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［５×ＳＳＰＥ、５０×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に、３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で暴露し現像した。
前述の制限酵素ＮｈｅＩ処理により、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子から約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じる。また、同制限酵素処理により、ターゲティングベクターとの相同組換えが起こった対立遺伝子から約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。さらに、相同組換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）またはピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去された場合には、同処理により約８．０ＫｂのＤＮＡ断片が生じた。
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、本実施例の２項に記載の５０−１０−１０４株、本実施例の３項に記載のＷＫ７０４株、およびＷＫ７０４株から本項（２）に記載の方法により取得した薬剤感受性クローンの１つである４−５−Ｃ３株のゲノムＤＮＡを、本法により解析した。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞では、野生型ＦＵＴ８対立遺伝子に由来する約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。また、５０−１０−１０４株やＷＫ７０４株では、相同組換えが起こった対立遺伝子に由来する約９．５ＫｂのＤＮＡ断片が認められた。一方、４−５−Ｃ３株では、相同組換えが起こった対立遺伝子からさらに、ネオマイシン耐性遺伝子（約１．６Ｋｂ）およびピューロマイシン耐性遺伝子（約１．５Ｋｂ）が除去されて生じる約８．０ＫｂのＤＮＡ断片のみが検出された。この結果から４−５−Ｃ３株は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより薬剤耐性遺伝子が除去されたことが確認された。
薬剤耐性遺伝子の除去されたＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローン（以下、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞と表記する）は、４−５−Ｃ３株以外にも複数株取得された。
実施例２  ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における抗体分子の発現
１．抗ＣＤ２０キメラ抗体発現ベクターの作製
（１）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１８）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＬの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、および２５の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃ｌ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行ない、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で２時間反応させた。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する図２に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌを得た。
（２）抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
ＷＯ９４／１１０２６に記載されている抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８のＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号１９）をＰＣＲ法を用いて以下の様にして構築した。
まず、ＷＯ９４／１１０２６記載のＶＨの塩基配列の５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する様にする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、実際には、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、および３１の６本の合成ＤＮＡを作製（ＧＥＮＳＥＴ社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μＭとなる様に、５０μＬの反応液［ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍ４（宝酒造社製）、０．５μＭ  Ｍ１３  ｐｒｉｍｅｒ  ＲＶ（宝酒造社製）］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７４℃にて１分間のサイクルを２５サイクル行い、更に７２℃にて１０分間反応させた。該反応液２５μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４９ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴＡＫＡＲＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造社製）７．５μＬ，制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析した。こうして目的の塩基配列を有する図３に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを得た。
次に、１４番目のアミノ酸残基をＡｌａからＰｒｏへ置換するために、配列番号３２で示した合成ＤＮＡを設計し、ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ  ｆｏｒ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲ法により、以下の様に塩基の置換を行った。上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ上記の変異導入用プライマー（配列番号３２、ＧＥＮＳＥＴ社製）］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを２５サイクル行なった。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４４ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。また、同様に、上記のプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈを１ｎｇ含む５０μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｎＭ  Ｔ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）、５０ｎＭ  ＭＵＴ  Ｂ１  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）］のＰＣＲ反応を行った。該反応液３０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を回収し、３０μＬの水溶液とした。続いて、上記で得られた０．４４ｋｂのＰＣＲ産物と０．６３ｋｂのＰＣＲ産物を０．５μＬずつ４７．５μＬの反応液［ＬＡ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（宝酒造社製）、０．４１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭ塩化マグネシウム］に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、９０℃にて１０分間加熱した後、６０分間かけて３７℃まで冷却した後、３７℃で１５分間保持することによってＤＮＡをアニーリングさせた。２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（宝酒造社製）を添加して７２℃にて３分間反応させた後、１０ｐｍｏｌずつのＴ３  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＴ７  ＢｃａＢＥＳＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を添加して反応液を５０μＬとし、９４℃にて３０秒間、５５℃にて２分間、７２℃にて１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行った。該反応液２５μＬをＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて精製した後、半量を１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位の制限酵素ＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．５９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収し��。
次に、ｐＢｌｕｅｓｅｃｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｇを１０単位の制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造社製）と１０単位のＳａｃＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約２．９ｋｂのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片を回収した。
上記で得られたＰＣＲ産物由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片とプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）由来のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７により塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する図３に示したプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを得た。
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７，１０３５，２０００）と本項（１）および（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８ＬおよびｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍを用いて抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、抗ＣＤ２０キメラ抗体と表記する）の発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを以下の様にして構築した。
本項（１）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌの２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４１ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の２μｇを１０単位の制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて５５℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１２．７５ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｌ由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、図４に示したプラスミドｐＫＡＮＴＢＸ２Ｂ８−Ｌを得た。
次に、本項（２）で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍの２μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約０．４５ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌの３μｇを１０単位の制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた後、更に１０単位の制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）を用いて３７℃で１時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約１３．１６ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
次に、上記で得られたプラスミドｐＢＳ−２Ｂ８Ｈｍ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８−Ｌ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを用いて、添付の説明書に従って連結した。この様にして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製した。
得られたプラスミドを用い、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を同社のＤＮＡシークエンサー３７７を用いて塩基配列の解析を行った結果、目的のＤＮＡがクローニングされている図４に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐが得られたことを確認した。
２．抗ＣＤ２０キメラ抗体の発現
実施例１第５項の（２）で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、本実施例第１項で得た抗ＣＤ２０抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを導入した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８ＰのＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐ  １０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距雕２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐを取得した。なお、ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐ株はＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐの株名で、平成１５年３月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３７として寄託されている。
３．抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体の発現
実施例１第５項の（２）で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、抗ガングリオシドＧＤ３キメラ抗体発現ベクタープラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１を導入し、抗ＧＤ３キメラ抗体の安定的発現株を作製した。ｐＫＡＮＴＥＸ６４１は、ＷＯ００／６１７３９記載の抗ＧＤ３キメラ抗体発現ベクタープラスミドｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４およびヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］より構成された誘導体であり、ｐＣｈｉ６４１ＬＨＧＭ４より得たタンデム型抗体発現ユニットを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＫＡＮＴＥＸ９３より得た複製起点を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片へ連結したものである。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１のＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ６４１  １０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２８７１を取得した。なお、ＷＫ７０４−２８７１株はＷＫ７０４−２８７１の株名で、平成１５年３月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３６として寄託されている。
４．抗ＣＣＲ４キメラ抗体の発現
実施例１第５項の（２）で作製したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４に対し、ＷＯ０１／６４７５４記載の抗ＣＣＲ４キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、抗ＣＣＲ４キメラ抗体の安定的発現株を作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８ＰのＷＫ７０４への遺伝子導入はエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］に準じて以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０  １５μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）１００μｌに溶解し、４０単位の制限酵素ＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を加えて３７℃で２時間消化反応を行うことにより線状化した。該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収した線状化プラスミドを１μｇ／μｌ水溶液とした。一方、ＷＫ７０４をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２］に懸濁して８×１０７個／ｍｌとした。細胞懸濁液２００μｌ（１．６×１０６個）を上記線状化プラスミド４μｌ（４μｇ）と混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）および１倍濃度のＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）へ播種した。５％  ＣＯ２、３７℃の条件下で２４時間培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）１０ｍｌを注入した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら１５日間の培養を行い、形質転換株ＷＫ７０４−２７６０を取得した。なお、ＷＫ７０４−２７６０株はＷＫ７０４−２７６０の株名で、平成１５年３月２０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−８３３５として寄託されている。
５．培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）（インビトロジェン社製）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡを１％の濃度で含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、または培養上清から精製した抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度で含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム（和光純薬社製）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以示、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
６．抗体分子の精製
本実施例第２項で得た抗ＣＤ２０抗体発現株ＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐを、１０％ウシ胎児透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ３×１０５個／ｍｌの密度で懸濁後、接着細胞培養用Ｔ１８２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）１０本へ計３００ｍｌ播種した。同様にして、本実施例第３項で得た抗ＧＤ３抗体発現株ＷＫ７０４−２８７１および本実施例第４項で得た抗ＣＣＲ４抗体発現株ＷＫ７０４−２７６０を播種した。３日間の培養後、各株の上清全量を除去し、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）へ交換した。これらを３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養後、各細胞懸濁液を回収した。回収した各細胞懸濁液に対し３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径５００ｍｌ容ＰＥＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（旭テクノグラス社製）を用いて濾過した。
０．８ｃｍ径のカラムにＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍｌを充填し、精製水３．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌを順次通筒した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）２．０ｍｌおよび０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１．５ｍｌで順次洗浄することによって担体の平衡化を行った。次に、上記培養上清３００ｍｌをカラムに通筒した後、０．２ｍｏｌ／ｌホウ酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．０ｍｌで洗浄した。洗浄後、０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１．２５ｍｌを用いて担体に吸着した抗体の溶出を行った。初めに溶出する２５０μｌの画分を廃棄し、次に得られる溶出画分１ｍｌを回収して２ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２００μｌと混合して中和した。取得した溶出液に対し、１０ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．１５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて４℃で一昼夜透析を行った。透析後、抗体溶液を回収し、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過した。
実施例３  ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生する抗体組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）
実施例２第６項で精製した抗ＣＤ２０抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害活性を評価するため、以下の記述に従いＡＤＣＣ活性を測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したヒトＢリンパ球培養細胞株Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を遠心分離操作および懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（ＦＣＳを５％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで上記（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２０：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ２０キメラ抗体を各最終濃度０．３〜３０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を５１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  ＮｏＮ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。標的細胞自然遊離ＬＤＨ量は、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。全標的細胞破壊にともなう全遊離ＬＤＨ量は、抗体溶液、エフェクターター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。これらの値を用いて下式（ＩＩ）により、ＡＤＣＣ活性を求めた。
2005035740.tif 000003
図５に各抗ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性を示した。ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４−２Ｂ８Ｐより得た抗体は、いずれの抗体濃度においても市販ＲｉｔｕｘａｎＴＭより高いＡＤＣＣ活性を示し、最高細胞障害活性値も高かった。ＲｉｔｕｘａｎＴＭは、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されていないＣＨＯ細胞を宿主細胞として製造された抗ＣＤ２０キメラ抗体である。また、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンＷＫ７０４−２８７１株、ＷＫ７０４−２７６０株より得たそれぞれの抗体に関してＡＤＣＣ活性を測定したところ、抗ＣＤ２０抗体の場合と同様に、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されてない通常のＣＨＯ細胞株が産生する抗体に比べて高い細胞障害活性を示した。以上の結果より、ＦＵＴ８対立遺伝子を破壊した宿主細胞を用いることにより、ＦＵＴ８遺伝子が破壊されていない宿主細胞を用いた場合より、細胞障害活性の高い抗体の生産が可能となることが分かった。
【実施例４】  ＦＵＴ８対立遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞が産生する抗体組成物の単糖組成分析
実施例２第６項で取得した、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンが生産した抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＤ３抗体および抗ＣＣＲ４抗体の中性糖・アミノ糖組成分析を、以下の様にして行った。
抗体を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、２．０−４．０ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸溶液を加えて１００℃、２−４時間酸加水分解を行い、タンパク質から中性糖・アミノ糖を遊離した。トリフルオロ酢酸溶液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解してＤｉｏｎｅｘ社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析を行った。ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用い、溶離液として１０−２０ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液、洗浄液として５００ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液を使用して、以下の溶出プログラムで分析した。
2005035740.tif 000004
得られた中性糖・アミノ糖成分のピーク面積から、Ｎ−アセチルグルコサミン比を４とした場合の各成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。
各抗体の単糖組成比をもとに、全複合型糖鎖に占めるフコースを持たない複合型糖鎖の割合を計算した結果、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトクローンが生産した抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＤ３抗体および抗ＣＣＲ４抗体の複合型糖鎖には、フコースが結合していないことが示された。
実施例５  ＦＵＴ８遺伝子をダブルノックアウトしたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無蛋白培地への馴化
実施例１で作製したＦＵＴ８ダブルノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞である４−５−Ｃ３株の無蛋白培地への馴化を行った。
ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）に１％（ｖ／ｖ）ＨＴサプルメント（インビトロジェン社製）及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ｄＦＢＳ；インビトロジェン社製）を含有してなる血清添加培地（以下、「基本血清培地」という）を作製した。該培地を用い４−５−Ｃ３株を２〜４×１０５細胞／ｍＬの細胞密度でＴ型フラスコに接種し、継代期間を２〜４日間として、３７℃で５％ＣＯ２濃度で静置培養を行った。継代時には、遠心分離により培養液から新鮮培地への全量交換を実施した。
上記継代培養で得られた細胞を用い、ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５ＰＦ（ＪＲＨ社製）に１％（ｖ／ｖ）ＨＴサプルメント（インビトロジェン社製）及び６ｍＭグルタミン（インビトロジェン社製）を含有してなる無蛋白培地（以下、「基本無蛋白培地」という）により６継代２９日間の静置継代培養を行った。培養は、血清培養時と同様、Ｔ型フラスコを用い３７℃で５％ＣＯ２濃度の条件で行った。引き続き基本無蛋白培地にて、三角フラスコを用いた浮遊旋回培養を６継代２０日間行った。培養温度は３５℃、旋回速度は９０〜１００ｒｐｍとし、継代の際には、培養容器の４倍量以上の５％濃度ＣＯ２を培地上面に通気し、三角フラスコ中の空気を置換して継代した。
上述の基本無蛋白培地を用いた継代培養により、培養初期には細胞凝集し増殖しなかった細胞を、最終的には基本無蛋白培地で継代可能な馴化細胞に変換することができた。
次に、取得した無蛋白培地に馴化させた４−５−Ｃ３株を、限界希釈法により、以下のようにクローニングした。
基本無蛋白培地を用いて取得した馴化細胞を希釈し、９６ウエルプレートに０．５細胞／ウエルで、１ウエルあたり０．０５ｍＬずつ接種した。続いて、滅菌フィルターを用いて滅菌処理を施した馴化細胞株の培養上清（コンデイションメディウム）を１ウエルあたり０．０５ｍＬずつ加えた。合計７６８ウエルに播種し１〜２週間培養した結果、単一のコロニー増殖を確認した４９クローンを得た。取得した４９クローンを２４ウエルプレート、６ウエルプレートへと拡大培養し、取得した個々のクローン増殖性を考慮し、増殖性の良い１７クローンを選択した。選択された１７クローンを混合し、無蛋白培地馴化細胞とした。
得られた無蛋白培地馴化細胞を無蛋白培地で継代した際の、生細胞密度、生存率の推移を示した。結果を図６に示す。
図６に示される通り、上記方法で得られた無蛋白培地馴化細胞は、低い細胞密度で培地に培養した後、２〜３日間で３倍の細胞量に増殖している。このことは、親株である無蛋白培地馴化前の細胞株とは異なり、基本無蛋白培地を用いて培養しても安定して継代培養を行うことができるように変換されていることを示している。
実施例６  無蛋白培地に馴化した、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の無血清フェドバッチ培養
実施例５で取得した無蛋白培地馴化細胞を用いて、フェドバッチ培養を行った。
基本無蛋白培地を用いて２×１０５細胞／ｍＬの細胞密度に無蛋白培地馴化細胞を調製した。１２５ｍＬの三角フラスコに調製した無蛋白培地馴化細胞を１５ｍＬ加え、培養温度３５℃、旋回速度１００ｒｐｍで３日間培養した。なお、細胞播種の際には、５００ｍＬ以上の５％濃度ＣＯ２を培地上面に通気し、三角フラスコ中の空気を置換した。３日間の培養で得られた細胞を種細胞として、基本無蛋白培地を用いて３×１０５細胞／ｍＬの細胞密度に調製後、１２５ｍＬの三角フラスコに３０ｍＬ播種し、培養温度３５℃旋回速度１００ｒｐｍでフェドバッチ培養を開始した。細胞を播種する際には、１Ｌ以上の５％濃度ＣＯ２を培地上面に通気することでフラスコ内の空気を置換した。フェドバッチ培養開始後、アミノ酸などの消費量を補う目的で培養３日目、６日目に３．３ｍｌずつ以下に示す組成のフィード培地を添加した。また、培養３日目に、グルコースの終濃度が５０００ｍｇ／Ｌとなるよう、２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を添加した。その結果を図７に示す。細胞は培養開始から３日目後まで増殖し、３〜６日目まではその細胞密度がほぼ維持された。培養６日目の生細胞密度は２×１０６細胞／ｍｌまで達した。培養開始から６日を過ぎると生存率が急速に低下し、９日目には細胞生存率が５０％を切り、フェドバッチ培養を終了した。
なお、フェドバッチ培養に用いたフィード培地は、通常の培地にアミノ酸（Ｌ−アラニン０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．５９３ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．６４６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．５３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５．８４ｇ／Ｌ、グリシン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．０３１ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．４６６ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２８３ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．６７１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１１３／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．７３５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．６６４ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０９１８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２８３ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２８３ｇ／Ｌ、葉酸０．０２８３ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０５０９ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２８３ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２８３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０９１８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．３１４ｇ／Ｌを添加した培地であった。
実施例７  無蛋白培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ／ＤＧ４４細胞による抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の製造とその生物活性
実施例６記載の無蛋白培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞を用いて、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の安定生産細胞を樹立し、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の生産性ならびに生産された抗体の生物活性を評価した。その際、無蛋白培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞による高ＡＤＣＣ活性抗体製造の優位性を示す目的で、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞の親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、Ｓｔａｎｌｅｙらによって樹立されたＣＨＯ細胞のＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ変異株Ｌｅｃ１３細胞（Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２，５１（１９８６））、およびラット−ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＲＬ−１６６２）からも抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体生産株を樹立して比較を行った。Ｌｅｃ１３およびＹＢ２／０細胞では、フコースが結合していない糖鎖の割合が高い高ＡＤＣＣ活性抗体の発現が可能であることが報告されているため比較対照とした（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，３０，２６７３３，（２００２）；ＷＯ０２／３１１４０）。
１．抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体安定生産株の造成
実施例６記載の無蛋白培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｅ１３細胞に、実施例２の２項に記載の方法に従って抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２Ｂ８Ｐを導入し、９６ウェルカルチャープレート（グライナー社製）に播種して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、ｌ〜２週間培養した。ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で増殖が認められたウェルの形質転換株については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体産生量を増加させる目的で、ＭＴＸ（シグマ社製）を５０ｎｍｏｌ／Ｌ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に交換してさらに１〜２週間培養した。５０ｎｍｏｌ／ＬのＭＴＸに耐性を示す形質転換株については、ＭＴＸ濃度をさらに上昇させて培養を続けた。培養上清中への抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の発現を実施例２の５項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定し、最終的にＭＴＸを２００、５００または１０００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を選抜した。ＹＢ２／０細胞については、ＷＯ０３／０５５９９３に記載の方法に従って抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を選抜した。
次に、このようにして得られた抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を実施例５に記載の方法に準じて無血清培地に馴化した。無蛋白培地馴化ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＬｅｃ１３細胞から樹立した各形質転換株の無血清培地への馴化には、ＭＴＸを２００、５００または１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍＭの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と表記）を用いた。ＹＢ２／０細胞から樹立した形質転換株の無血清培地への馴化には、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）（以下、無血清培地と表記）を用いた。このようにして無蛋白培地馴化ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より樹立した形質転換株をＭｓ７０４／ＣＤ２０株、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より樹立した形質転換株をＤＧ４４／ＣＤ２０株、Ｌｅｃ１３細胞より樹立した形質転換株をＬｅｃ１３／ＣＤ２０株、ＹＢ２／０細胞より樹立した形質転換株をＹＢ／ＣＤ２０株と名付けた。なお、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０株は、平成１６年８月１３日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９２として寄託されている。
２．三角フラスコ無血清フェドバッチ培養による抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の製造
本実施例の１項で樹立したＭｓ７０４／ＣＤ２０株、ＤＧ４４／ＣＤ２０株、Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株およびＹＢ／ＣＤ２０株を用い、三角フラスコでの無血清フェドバッチ培養を行い、各株による抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の製造を行った。
（１）三角フラスコでの無血清フェドバッチ培養
フェドバッチ培養の基礎培地には、前項の無血清培地に２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように追添加した培地を使用した（以下、無血清フェドバッチ培養培地と表記）。フィード培地には、各種のアミノ酸（Ｌ−アラニン０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．５９３ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．６４６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．５３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５．８４ｇ／Ｌ、グリシン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．０３１ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．４６６ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２８３ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．６７１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１１３ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．７３５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．６６４ｇ／Ｌ）、各種のビタミン（ｄ−ビオチン０．０９１８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２８３ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２８３ｇ／Ｌ、葉酸０．０２８３ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０５０９ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２８３ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２８３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０９１８ｍｇ／Ｌ）、およびインシュリン０．３１４ｇ／Ｌを含有する培地を用いた。
Ｍｓ７０４／ＣＤ２０株、ＤＧ４４／ＣＤ２０株、Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株およびＹＢ／ＣＤ２０株を、３×１０５細胞／ｍＬの密度で無血清フェドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液４０ｍＬを２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２ガスを通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、回転数９０〜１００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃にて培養を行った。培養開始後３日目、６日目、９日目、１１日目に、アミノ酸などの消費を補う目的で上記のフィード培地を３．３ｍＬ添加し、グルコース濃度を制御する目的で２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。また培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１１日目、１３日目に培養液約２ｍＬを採取し、トリパンブルー染色法により生細胞密度と細胞生存率を、実施例３の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により各培養上清中に含まれる抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体濃度をそれぞれ測定した。
フェドバッチ培養は、それぞれの細胞株の細胞生存率が６０％以下となった時点で終了した。培養開始後の各時点におけるＭｓ７０４／ＣＤ２０株の生細胞密度、細胞生存率はＤＧ４４／ＣＤ２０株と同等以上であった。一方、Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株は、増殖性が遅く最高細胞到達密度も低かった。また、ＹＢ／ＣＤ２０株は最高細胞到達密度に達した後急激に細胞生存率が低下し長期のフェドバッチ培養は困難であった。また、抗体生産量については、いずれの株においても累積生細胞密度に比例して抗体蓄積量が増加し、培養終了時に最高生産量に達した。従って、ＦＵＴ８遺伝子を破壊した細胞株においても、親株に比べて細胞増殖性や培養ストレスによる生存能力に差は見られず、他のフコースが結合していない糖鎖の割合が高い高ＡＤＣＣ活性抗体の発現が可能な株に比べて良い培養挙動を示すことが明らかとなった。
（２）無血清フェドバッチ培養において製造された抗体組成物の生物活性の解析
上記（１）の無血清フェドバッチ培養で、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０株、ＤＧ４４／ＣＤ２０株、Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株およびＹＢ／ＣＤ２０株から経日的に採取した培養液を用い、それぞれの培養液中に含まれる抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体組成物のフコースが結合していない糖鎖の割合を解析した。フコースが結合していない糖鎖の割合は、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７，６１８，（２００４）に記載の公知の方法に基づき、可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａと表記）に対する結合活性を指標にしたＥＬＩＳＡ法により測定した。フコースが結合していない糖鎖の割合が既知の標準抗体としては、ＷＯ０３／０８５１１９の実施例４の５項に記載のＫＭ２７６０−１（フコースが結合していない糖鎖の割合：９０％）、およびＫＭ３０６０（フコースが結合していない糖鎖の割合：１０％）を用いた。上記（１）で各株から採取した培養液および標準抗体は１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、５μｇ／ｍＬの抗体溶液に調製し評価サンプルとした。
測定の結果、ＤＧ４４／ＣＤ２０株のサンプルは、いずれもｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性がほとんど認められず、フコースが結合した糖鎖構造を有する抗体組成物を含むことが判明した。Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株とＹＢ／ＣＤ２０株のサンプルは、培養初期にはフコースが結合していない糖鎖の割合が高い抗体組成物を含むが、培養期間が長くなるにつれてフコースが結合した糖鎖構造を有する抗体組成物の割合が高くなることが判明した。Ｌｅｃ１３／ＣＤ２０株のフェドバッチ培養終了時のサンプルに含まれる抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のフコースが結合してない糖鎖の割合は、６０％以下であった。一方、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０株のサンプルは、培養期間を通じて安定してｓｈＦｃγＲＩＩＩａへの強い結合活性を示した。Ｍｓ７０４／ＣＤ２０株のサンプルに含まれる抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のフコースが結合していない糖鎖の割合を、標準抗体でのＥＬＩＳＡの吸光度をもとに算出したところ、培養期間を通じて１００％に保たれていると見積もられた。
以上の結果から、無血清培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞は、三角フラスコを用いた無血清フェドバッチ培養において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を持つ抗体組成物を安定に生産できることが判明した。
３．浮遊撹拌リアクター無血清フェドバッチ培養によるフコースが結合していない糖鎖を有する抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の製造
本実施例の２項で無血清培地に馴化したＭｓ７０４／ＣＤ２０株が、抗体医薬の商業的な生産に用いられる浮遊撹拌リアクター無血清フェドバッチ培養においても、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体の安定製造が可能か否かを検討した。
（１）シード細胞の拡大培養
リアクター培養に至るまでの拡大培養を行う培地として、ＭＴＸを５００ｎＭ、Ｌ−グルタミンを１．７５ｇ／Ｌの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（以下、拡大培養用培地と表記）を用いた。１２５ｍＬ、２５０ｍＬまたは１０００ｍＬ容量の三角フラスコ（コーニング社製）に約１０〜３０％量の拡大培養用培地を入れ、３×１０５細胞／ｍＬとなるように細胞懸濁液を播種し、３７℃で４日間培養した。リアクター培養の播種に必要な細胞数が得られるまで複数回継代を繰り返した。
（２）リアクター培養
リアクター培養の基本培地として、（１）の拡大培養用培地にＭＴＸを５００ｎＭ、Ｌ−グルタミンを１．７５ｇ／Ｌとなるように追添加した培地（以下、リアクター培養用培地と表記）を用いた。
上記の拡大培養により必要な細胞数を獲得したところで、リアクター培養用培地７００ｍＬを満たした１Ｌバイオリアクター（ＡＢＬＢ社製）に３×１０５細胞／ｍＬとなるように細胞を播種し、３５℃、ｐＨ７．１、ＤＯ  ５０％の条件下で１７日間培養した。フィード培地には、アミノ酸（Ｌ−アラニン０．１４ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．４７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１６ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．１７ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．５１ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．４２ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン７．３ｇ／Ｌ、グリシン０．１７ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２４ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．５９ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．５９ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸０．８２ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．１７ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．３７ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２２ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２４ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．５３ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．０９ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．５８ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．５３ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０７３ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２２ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２２ｇ／Ｌ、葉酸０．０２２ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０４０ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２２ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２２ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２２ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２２ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０７３ｍｇ／Ｌ）、リコンビナントヒトインスリン０．３１ｇ／Ｌ（ＪＲＨ社製）、エタノールアミン０．０２５ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、２−メルカプトエタノール０．００９８ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、大豆加水分解物ＨＹ−ＳＯＹ  ８ｇ／Ｌ（クウェストインターナショナル社製）、亜セレン酸ナトリウム１６．８マイクロｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）、コレステロール脂質濃縮溶液２ｍＬ／Ｌ（２５０×水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩０．０５ｇ／Ｌ（シグマ−アルドリッチ社製）からなる培地を用い、培養３、５、７、９、１１日目に初発培地量の８．３％を添加した。また、培養３日目以降のグルコース濃度が約４ｇ／Ｌとなるように、５００ｇ／Ｌグルコース溶液を適宜添加した。
培養開始から培養終了まで培養液を毎日１回ずつ採取し、生細胞密度（細胞／ｍＬ）および細胞生存率を０．４％トリパンブルー溶液（インビトロジェン社製）を用いた色素排除法により、抗体濃度（ｍｇ／Ｌ）をＨＰＬＣによりそれぞれ測定した。
比抗体生産速度を以下の式より算出した。なお累積生細胞密度（細胞／ｍＬ×日）は、各測定時点で生細胞密度（細胞／ｍＬ）と単位時間（日）の積を計算し、それらを合計した値とした。本実施例では、生細胞密度を１日１回測定したので、各時点の生細胞密度×１日を合計して累積生細胞密度とした。
比抗体生産速度（ｐｇ／細胞／日）＝抗体濃度（ｍｇ／Ｌ）÷累積生細胞密度（細胞／ｍＬ×日）
浮遊撹拌リアクター無血清フェドバッチ培養を行った結果を図８に示した。生細胞密度は培養１３日目に最大に達した。細胞生存率は培養開始から培養１３日目まで９０％以上の高い値を維持し、その後は徐々に低下して培養１７日目では１２％となった。累積生細胞密度は１７日間で５．６×１０７細胞／ｍＬ×日、培養終了時の抗体濃度は１．７ｇ／Ｌに達し、比抗体生産速度は３０ｐｇ／細胞／日を示した。この結果は、標準的な抗体医薬の製造力価である０．５〜１．０ｇ／Ｌを超えるものであった。また、培養開始後５、７、１４、１７日目に採取した培養液より精製した抗体からＮ−グリカナーゼＦにてアスパラギン結合型糖鎖を遊離した。除蛋白、イオン交換樹脂による脱塩の後、質量分析計にて糖鎖構造を解析した。培養開始後５、７、１４、１７日目のいずれの時点においてもフコースが結合した糖鎖は検出限界以下であり、フコースが結合していないＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体が安定して製造されていた。
以上の結果から、無血清培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞は、抗体医薬の商業的な生産に用いられる浮遊撹拌リアクターでの無血清フェドバッチ培養においても、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を持つ抗体組成物を安定的に高生産できることを確認した。
４．無血清フェドバッチ培養により製造されたフコースが結合していない抗体組成物の生物活性
本実施例の３項で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体とも称す）の生物活性を測定し、本製造法で製造した抗体組成物の優位性を確認した。比較対照としては、市販抗体の生産にも用いられているＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いて製造した本実施例の２項記載の抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体（以下、ＤＧ４４／ＣＤ２０抗体とも称す）を用いた。
（１）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のＣＤ２０抗原発現細胞株に対する抗原結合活性
ＷＯ０３／０５５９９３の実施例２の１項に記載の蛍光抗体法に従って測定した結果、ＦＡＣＳ解析によるＲａｊｉ細胞への抗体染色強度に差は観察されず、本実施例の３項で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体と、本実施例の２項記載のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いて製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体の抗原結合活性に相違は観察されなかった。従って、無血清培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞を用いて製造を行っても、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で製造した抗体組成物と同等の抗原結合活性を有することを確認した。
（２）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
本実施例の３項で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体と、本実施例の２項記載のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いて製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のヒト末梢血中でのＡＤＣＣ活性を、以下の様にして測定した。
２４ウェル平底プレート（グライナー社製）の各ウェルに、ダルベッコＰＢＳ（インビトロジェン社）で希釈したＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体およびＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を、１００μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、健常人から採取しヘパリンナトリウム（清水製薬社製）を加えたヒト末梢血を５００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、一晩培養した。反応後の各ウェルから１５０μＬずつ反応液を分取し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後に、ＦＩＴＣ標識マウス抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ベックマン・コールター社製）およびＰＥ標識マウス抗ＣＤ２モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）を加えて室温、暗所で３０分間反応させた。ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）で赤血球除去および細胞固定処理を行い、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄後、固定した細胞を５００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁してセルストレーナー（ファルコン社製）で濾過し解析サンプルとして調製した。フローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）で１サンプルあたり約５，０００個のリンパ球画分を測定し、ＣＤ２陰性ＣＤ１９陽性のＢ細胞の、全細胞に占める比率を求めた。
図９に結果を示した。Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体添加条件では、ＤＧ４４／ＣＤ２０抗体添加条件よりもＢ細胞の割合が低下しており、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体のＢ細胞に対する高いＡＤＣＣ活性が示された。この結果から、無血清培地に馴化したＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞を用いて製造した抗体組成物は、親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で製造した抗体組成物よりもヒト血漿中において高い細胞傷害活性を有することを確認した。
（３）抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）
本実施例の３項で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体と、本実施例の２項記載の親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で製造した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣ活性を、実施例３に記載の方法に準じ、ヒトＣＤ２０抗原を発現するヒトＢリンパ球培養細胞株ＷＩＬ２−Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８８８５）を標的細胞に用いて測定した。
図１０に結果を示した。いずれの抗体濃度においても、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体添加条件では、ＤＧ４４／ＣＤ２０抗体添加条件よりもＷＩＬ２−Ｓ細胞に対する高いＡＤＣＣ活性が示された。
次に、一定量のＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体にＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を添加することで、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体の割合を変化させた抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体組成物を調製し、そのＡＤＣＣ活性を測定した。具体的には、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体に０〜３００ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を添加した抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体組成物を調製した。
図１１に結果を示した。３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体にさらにＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体を添加すると、総抗体濃度の増加に伴ってＡＤＣＣ活性の上昇が観察されたが、３．７ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体にさらにＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を添加しても、総抗体濃度が増加するにも関わらず調製した抗体組成物のＡＤＣＣ活性は逆に低下した。このことは、フコースが結合する糖鎖を有する抗体分子が、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子のＡＤＣＣ活性を阻害することを示している。また、フコースが結合する糖鎖を有する抗体分子とフコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子が混合された抗体組成物においても、フコースが結合していない糖鎖を有する抗体の割合が２０％以上の抗体組成物では、該割合が２０％未満の抗体組成物に比べ顕著に高いＡＤＣＣ活性を示した。
さらに、１ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体サンプルと、１ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体に９倍量の９ｎｇ／ｍＬのＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を加えた抗体のＡＤＣＣ活性を測定した。
図１２に結果を示した。Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性はＤＧ４４／ＣＤ２０抗体を加えることで大幅に低下した。また、Ｍｓ７０４／ＣＤ２０抗体とＤＧ４４／ＣＤ２０抗体の存在比が１対９のまま抗体組成物の抗体濃度を１００倍以上に上昇させても、１ｎｇ／ｍＬのＭｓ７０４／ＣＤ２０抗体サンプルのＡＤＣＣ活性には及ばなかった。
以上のことから、フコースが結合した糖鎖を有する抗体分子が、フコースが結合しない糖鎖を有する抗体分子のＡＤＣＣ活性を阻害していること、従来の抗体組成物では、本発明の抗体組成物と同等のＡＤＣＣ活性を発揮することはできないことが明らかとなった。
なお、本発明の製造法で製造した他の抗体組成物においても同様の結果が得られた。
【産業上の利用可能性】  本発明により、無血清培地に馴化した、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞、該細胞を用いた糖蛋白質組成物の製造方法および該製造方法で製造された糖蛋白質組成物が提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
2005035740.tif 000005
2005035740.tif 000006
2005035740.tif 000007
2005035740.tif 000008
2005035740.tif 000009
2005035740.tif 000010
2005035740.tif 000011
2005035740.tif 000012
2005035740.tif 000013
2005035740.tif 000014
2005035740.tif 000015
2005035740.tif 000016
2005035740.tif 000017
2005035740.tif 000018
2005035740.tif 000019
2005035740.tif 000020
2005035740.tif 000021
2005035740.tif 000022
2005035740.tif 000023
2005035740.tif 000024
2005035740.tif 000025
2005035740.tif 000026
2005035740.tif 000027
2005035740.tif 000028
2005035740.tif 000029
2005035740.tif 000030
2005035740.tif 000031
2005035740.tif 000032
2005035740.tif 000033
2005035740.tif 000034
2005035740.tif 000035
2005035740.tif 000036
2005035740.tif 000037
2005035740.tif 000038
2005035740.tif 000039
2005035740.tif 000040
2005035740.tif 000041
2005035740.tif 000042
2005035740.tif 000043
2005035740.tif 000044
【図１】
2005035740.tif 000045
【図２】
2005035740.tif 000046
【図３】
2005035740.tif 000047
【図４】
2005035740.tif 000048
【図５】
2005035740.tif 000049
【図６】
2005035740.tif 000050
【図７】
2005035740.tif 000051
【図８】
2005035740.tif 000052
【図９】
2005035740.tif 000053
【図１０】
2005035740.tif 000054
【図１１】
2005035740.tif 000055
【図１２】
2005035740.tif 000056
【国際調査報告】
2005035740.tif 000057
2005035740.tif 000058
2005035740.tif 000059
2005035740.tif 000060