(57)【要約】ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の制御手段、及び該活性の異常に起因する疾患の治療手段を提供すること。生体内において、該ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有した。３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用核酸構築物；該発現用核酸構築物を保持した、哺乳動物細胞における３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用担体；該発現用核酸構築物又は該発現用担体を有効成分として含有した、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤及び治療方法；並びに該疾患の治療用医薬組成物の製造のための該発現用核酸構築物又は発現用担体。
2005019451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、
（ａ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用核酸構築物。
【請求項２】
活性阻害物質をコードする核酸が、
（ｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列
をコードする核酸の下流に作動可能に連結されてなる、請求項１記載の発現用核酸構築物。
【請求項３】
活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラーゼプロモーター支配下に発現する、請求項１又は２記載の発現用核酸構築物。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載の発現用核酸構築物を保持してなる、哺乳動物細胞における３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用担体。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は請求項４記載の発現用担体を有効成分として含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性に起因する疾患の治療剤。
【請求項６】
疾患が、癌である、請求項５記載の治療剤。
【請求項７】
請求項１〜３いずれか１項に記載の発現用核酸構築物の発現産物を有効成分として含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性に起因する疾患の治療剤。
【請求項８】
発現産物が、
（Ｉ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示される配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ＩＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、請求項７記載の治療剤。
【請求項９】
請求項１〜３いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は請求項４記載の発現用担体を、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与する、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法。
【請求項１０】
３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、請求項１〜３いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は請求項４記載の発現用担体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、リン酸化酵素である３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼＰＤＫ−１の活性阻害物質に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体内において、前記ＰＤＫ−１によるタンパク質リン酸化を抑制する活性阻害物質を発現させうる発現用核酸構築物、該ＰＤＫ−１の活性阻害物質の発現用担体、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、該疾患の治療方法等に関する。
【背景技術】  癌の治療には、例えば、抗癌剤等を用いて、癌細胞そのものを殺すことなどが試みられている。
前記抗癌剤によれば、種々の細胞においてアポトーシスが引き起こされることが知られている〔グンジ（Ｇｕｎｊｉ，Ｈ．）ら著、キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），第５１巻，７４１−７４３頁，１９９１；カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．）著，キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．），第４９巻，５８７０−５８７８頁，１９８９〕。しかしながら、例えば、スタウロスポリン等のタンパク質リン酸化酵素阻害剤は、標的となる癌細胞以外にも非特異的にアポトーシスを引き起こす場合があり、抗癌剤としての使用は困難である場合があるという欠点がある。
【発明の開示】
本発明の１つの側面は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼのリン酸化活性を阻害しうる活性阻害物質を発現させること、生体内で該活性阻害物質を発現させること、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼによるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療を必要とする個体内で、該活性阻害物質を発現させること、該活性阻害物質を大量かつ簡便に製造すること等の少なくとも１つを可能にする、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物を提供することにある。また、本発明の他の側面は、前記活性阻害物質を安定して供給すること、該活性阻害物質を生体内で高い効率で発現させること、該活性阻害物質を生体内で高い効率で発現させること、該活性阻害物質を所望の細胞等に特異的に発現させること等の少なくとも１つを可能にする、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性阻害物質の発現用担体を提供することにある。さらに、本発明の他の側面は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患、具体的には、癌等に罹患した個体において、所望の細胞、特に、癌細胞において、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性阻害物質を発現させ、該３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼのリン酸化活性を阻害すること、所望の細胞、特に、癌細胞にアポトーシスを引き起こさせること等の少なくとも１つを可能にする治療剤を提供することにある。また、本発明のさらに他の側面は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患を治療することを可能にする、治療方法を提供することにある。さらに、本発明のさらに別の側面は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物又は発現用担体の使用に関する。
本発明の要旨は、
〔１〕  （Ａ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、
（ａ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用核酸構築物、
〔２〕  活性阻害物質をコードする核酸が、
（ｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列
をコードする核酸の下流に作動可能に連結されてなる、前記〔１〕記載の発現用核酸構築物、
〔３〕  活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラーゼプロモーター支配下に発現する、前記〔１〕又は〔２〕記載の発現用核酸構築物、
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項記載の発現用核酸構築物を保持してなる、哺乳動物細胞における３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性阻害物質の発現用担体、
〔５〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は前記〔４〕記載の発現用担体を有効成分として含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、
〔６〕  疾患が、癌又はウイルス感染症である、前記〔５〕記載の治療剤、
〔７〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の発現用核酸構築物の発現産物を有効成分として含有してなる、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、
〔８〕  発現産物が、
（Ｉ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示される配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ＩＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、前記〔７〕記載の治療剤、
〔９〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は前記〔４〕記載の発現用担体を、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与する、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法、並びに
〔１０〕  ３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の発現用核酸構築物又は前記〔４〕記載の発現用担体の使用、
に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を結合したＰＤＫ−１活性阻害物質の一次構造の概略図を示す。パネルＡは、ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを示し、パネルＢは、Ｌｙｎｓｉｇ−ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを示し、パネルＣは、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを示し、パネルＤは、Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを示す。
図２は、細胞におけるδＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ及びＬｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰそれぞれの発現分布を示す。パネルＡは、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現分布を示し、パネルＢは、Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現分布を示す。図中、スケールバーは、１０μｍを示す。
図３は、細胞におけるδＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰによる細胞の形態変化を示す。パネルＡは、ＧＦＰによる蛍光像を示し、パネルＢは、核染色を行なった結果を示す。図中、スケールバーは、１０μｍを示す。
図４は、ＰＫＢのアクチベーションループのリン酸化におけるδＡＬＰＩＦ−ＧＦＰの影響を調べた結果を示す図である。図中、パネルＡは、抗ＧＦＰ抗体を用いたウエスタンブロット解析、パネルＢは、抗リン酸化ＰＫＢ（Ｔｈｒ３０８）抗体を用いたウエスタンブロット解析を行なった結果を示す。また、各パネルにおいて、レーン１は、ＰＫＢα−ＧＦＰとＧＦＰとを共発現させたＣＯＳ−７細胞から調製したタンパク質試料（２０μｇ）を用いた場合、レーン２は、ＰＫＢα−ＧＦＰとδＡＬＰＩＦ−ＧＦＰとを共発現させたＣＯＳ−７細胞から調製したタンパク質試料（２０μｇ）を用いた場合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、１つの側面では、
（Ａ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（Ｃ）配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、
（ａ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｃ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、該ＰＤＫ−１の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有する、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１（以下、「ＰＤＫ−１」という）の活性阻害物質の発現用核酸構築物である。
本発明の発現用核酸構築物は、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列と前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列とをコードする核酸を含有しているため、ＰＤＫ−１の活性阻害物質を発現させることができる。したがって、かかる発現用核酸構築物を、ＰＤＫ−１の活性の異常に起因する疾患の患部に供給することにより、ＰＤＫ−１の活性の異常を是正することができる。また、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療を必要とする個体内、細胞内等において、ＰＤＫ−１のリン酸化活性を阻害しうる活性阻害物質を発現させ、大量かつ簡便に製造することができるという優れた効果を発揮する。
なお、本明細書において、「ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患」とは、ＰＤＫ−１の活性の異常により引き起こされる疾患を意味し、例えば、癌、ウイルス感染症等が挙げられる。前記癌としては、具体的には、例えば、ＰＤＫ−１により活性化されるＰＫＢの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進している癌等が挙げられる。なお、本明細書において、「ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常」とは、健常個体、罹患していない個体、罹患していない状態にあった個体等と比較した場合、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の平均値から逸脱した状態を意味する。
また、本明細書において、「ＰＤＫ−１の活性阻害物質」は、ＰＤＫ−１によりリン酸化される性質を示す物質をいう。
「ＰＤＫ−１の活性の阻害」は、例えば、ＰＤＫ−１によりリン酸化されたアミノ酸残基を特異的に認識する抗体を用いて、この抗体が認識するＰＤＫ−１の基質タンパク質の量が減少することを確認することにより評価されうる。
なお、ＰＤＫ−１の活性阻害物質の親和性は、生体内で、ＰＤＫ−１によるＰＫＢの活性化を抑制し、細胞にアポトーシスを誘導する活性を十分に発揮させる程度であればよい。
ＰＤＫ−１による前記活性阻害物質のリン酸化は、例えば、ＰＤＫ−１によりリン酸化されたアミノ酸残基（主に、スレオニン残基等）を特異的に認識する抗体を用いて、前記活性阻害物質がこの抗体で認識されるかどうかをイムノブロット法等により測定されうる。
また、ＰＤＫ−１と活性阻害物質との親和性は、結合活性によっても評価されうる。前記結合活性は、特に限定されないが、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴測定等により測定されうる。
具体的には、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法の場合、
（１）  活性阻害物質をコードする核酸を、ｐｒｅｙベクターに組込み、ｐｒｅｙプラスミドを得るステップ；
（２）  得られたｐｒｅｙプラスミドを酵母〔ＥＧＹ４８［ｐ８０ｐ  ｌａｃＺ］〕に導入して、ｐｒｅｙプラスミド保持クローンを得るステップ；
（３）  ＰＤＫ−１遺伝子を、ｂａｉｔベクターに組込み、ｂａｉｔプラスミドを得るステップ；
（４）  得られたｂａｉｔプラスミドを、前記ステップ（２）で得られたｐｒｅｙプラスミド保持クローンに導入し、クローンを得るステップ；並びに
（５）  前記（４）で得られたクローンを、ロイシン欠失プレート上で３日間培養し、酵母細胞内における前記活性阻害物質との相互作用をロイシン欠失プレート上でのコロニー形成能により評価するステップ；
を行ない、ロイシン欠失プレート上でコロニーが形成されることを、ＰＤＫ−１と前記活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。
また、共免疫沈降法の場合、
（１）  シグナル配列の下流にＦＬＡＧ配列を有するＰＤＫ−１を発現するＰＤＫ−１−ＦＬＡＧ発現プラスミドを得るステップ；
（２）  Ｎ末側にＨＡ配列を有する前記活性阻害物質を発現しうるＨＡ−活性阻害物質発現プラスミドを得るステップ；
（３）  細胞に、前記ステップ（１）で得られたＰＤＫ−１−ＦＬＡＧ発現プラスミドと前記ステップ（２）で得られたＨＡ−活性阻害物質発現プラスミドとを、一過的にコトランスフェクトして、トランスフェクタントを得るステップ；
（４）  前記ステップ（３）で得られたコトランスファクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；
（５）  前記ステップ（４）で得られた培養細胞から、細胞抽出液を得るステップ；
（６）  前記ステップ（５）で得られた細胞抽出液に抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体を加えて共免疫沈降を行なうステップ；並びに
（７）  共免疫沈降を、ウエスタンブロット解析により検出するステップ；
を行ない、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ＨＡ抗体のいずれを用いた場合においても、複合体の沈降が検出されることを、ＰＤＫ−１と前記活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。
表面プラズモン共鳴解析の場合、ＰＤＫ−１を固定化したチップに、活性阻害物質を含有した溶液を一定の流速で、送液し、光学的（蛍光度、蛍光偏向度等）検出手段、質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ）等の検出手段により、該ＰＤＫ−１と活性阻害物質とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、該ＰＤＫ−１と活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。かかる表面プラズモン共鳴解析によれば、反応速度等も併せて評価されうる。
「生体内で、ＰＤＫ−１によるＰＫＢの活性化を抑制し、細胞にアポトーシスを誘導する活性」（アポトーシス誘導活性ともいう）は、クロマチンの凝縮、細胞核の断片化、アポトーシス小体の形成等の形態的変化に基づく検出、細胞死に伴い細胞から漏出する酵素（乳酸脱水素酵素等）の活性の増加の測定、トリパンブルー等による染色、ＴＵＮＥＬ法等により評価されうる。
前記（Ａ）において、配列番号：１に示されるアミノ酸配列は、ＰＫＢ／Ａｋｔのａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐの配列であり、配列番号：２に示されるアミノ酸配列が、δＰＫＣのアミノ酸配列である。本発明の発現用核酸構築物を用いることにより得られる活性阻害物質は、前記配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列を有するため、生体内で、ＰＤＫ−１によるＰＫＢの活性化を抑制するという驚くべき性質を発現する。
なお、本発明においては、前記ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐと実質的に同等の機能、すなわち、ＰＤＫ−１との親和性、アポトーシス誘導活性等を示し、ＰＤＫ−１によりリン酸化され、ＰＤＫ−１の偽基質として働き、ＰＤＫ−１のリン酸化機能を抑えるものであれば、前記配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列の誘導体配列〔例えば、前記（Ｂ）又は（Ｃ）のアミノ酸配列〕であってもよい。
前記（Ｂ）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐと実質的に同等の機能、すなわち、ＰＤＫ−１との親和性、アポトーシス誘導活性等を示し、かつＰＤＫ−１によりリン酸化される範囲で適宜設定されうる。
なお、本明細書において、「少なくとも１個」とは、１若しくは複数個、好ましくは１若しくは数個をいう。
前記（Ｃ）のアミノ酸配列において、配列同一性の算出に用いられるアルゴリズムにおける条件は、例えば、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３が挙げられる。他の値は、通常用いられるデフォルト値であってもよい。
前記（Ｃ）のアミノ酸配列と、配列番号：１又は２に示されるアミノ酸配列との間の配列同一性は、前記ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐと実質的に同等の機能、すなわち、ＰＤＫ−１との親和性、アポトーシス誘導活性等を示し、かつＰＤＫ−１によりリン酸化される範囲であればよく、前記条件にて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより適切にアライメントし、算出した場合、少なくとも２６％、好ましくは、５０％以上、より好ましくは、６０％以上、さらに好ましくは、７０％以上、よりさらに好ましくは、８０％以上、一層好ましくは、９０％以上、より一層好ましくは、９５％以上であることが望ましい。
なお、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のアミノ酸配列においては、配列番号：９に示されるアミノ酸配列（Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ）が保存されていることが望ましい。
また、本発明の発現用核酸構築物を用いることにより得られる活性阻害物質は、前記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれたアミノ酸配列に加え、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有しているため、生体内で、ＰＤＫ−１によるＰＫＢの活性化をより効率よく抑制し、細胞にアポトーシスを誘導するという優れた効果を発揮する。
前記（ａ）のアミノ酸配列において、配列番号：３に示されるアミノ酸配列は、ＰＤＫ−１相互作用断片（ＰＩＦ）の配列である。
前記配列番号：３に示されるアミノ酸配列は、該アミノ酸配列を有するポリペプチドが、ＰＤＫ−１の本来の基質であるＡＧＣキナーゼの１つであるプロテインキナーゼＣ関連キナーゼ−２（ＰＲＫ２）と結合する活性を呈するものであれば、該配列番号：３に示されるアミノ酸配列の誘導体配列〔例えば、前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列〕であってもよい。
前記（ｂ）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記ＰＩＦと実質的に同等の機能、すなわち、ＰＤＫ−１との親和性等を示す範囲で適宜設定されうる。
前記（ｃ）のアミノ酸配列において、配列同一性は、前記ＰＩＦと実質的に同等の機能、すなわち、ＰＤＫ−１との親和性等を示す範囲であればよい。
また、本発明の発現用核酸構築物は、
（ｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号：４に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列
をコードする核酸をさらに含有してもよい。かかる発現用核酸構築物としては、活性阻害物質をコードする核酸が、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれたアミノ酸配列の下流に作動可能に連結された構築物が挙げられる。前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有した発現用核酸構築物によれば、細胞膜に前記活性阻害物質を発現させることができる。
前記（ｉ）のアミノ酸配列において、配列番号：４に示されるアミノ酸配列は、細胞膜に存在するチロシンリン酸化酵素ＬｙｎのＮ末端配列であり、該配列番号：４に示されるアミノ酸配列からなる部分がパルミチン化されることにより、かかるアミノ酸配列を有するポリペプチドが細胞膜に局在化する。
したがって、本発明においては、パルミチン化され、細胞膜への局在化能を呈するものであれば、前記配列番号：４のアミノ酸配列の誘導体配列〔前記（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）のアミノ酸配列〕であってもよい。
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記ＬｙｎのＮ末端配列と同様に、パルミチン化されることにより、細胞膜への局在化能を発揮する範囲で適宜設定されうる。
前記（ｉｉｉ）のアミノ酸配列において、配列同一性は、前記ＬｙｎのＮ末端配列と同様に、パルミチン化されることにより、細胞膜への局在化能を発揮する範囲であればよい。
前記パルミチン化は、細胞を細胞膜成分と細胞質成分とに分画し、細胞膜成分に多くＰＤＫ−１活性阻害物質が発現していることをイムノブロット法により検出することにより評価されうる。また、細胞膜への局在化能は、ＧＦＰを融合したＬｙｎ付加ＰＤＫ−１活性阻害物質がＬｙｎ付加しているかＰＤＫ−１物質に比べ、細胞膜に、より多く局在することを蛍光顕微鏡下で観察することにより評価されうる。
本発明の発現用核酸構築物に用いられる活性阻害物質をコードする核酸は、配列表に記載のアミノ酸配列を基に、対応する核酸を合成すること、ＰＫＢ又はＰＫＣ  ｄｅｌｔａをコードする核酸を鋳型としてＰＣＲを行なうこと等により得られうる。
また、本発明の発現用核酸構築物においては、テロメラーゼプロモーター等のプロモーターの支配下に、前記活性阻害物質をコードする核酸を発現させることにより、癌細胞に特異的に前記活性阻害物質を発現させることができる。具体的には、例えば、
１．  活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラーゼプロモーター等の下流に作動可能に連結された構築物、
２．  テトラサイクリントランスアクチベーターをコードする核酸が、テロメラーゼプロモーター等のプロモーターの下流に作動可能に連結された構築物と、前記活性阻害物質をコードする核酸が、前記トランスアクチベーターに活性化されるプロモーターの下流に作動可能に連結された構築物との組み合わせ
等が挙げられる。
本明細書において、「作動可能に連結された」とは、所望の機能を発揮するポリペプチドが、正常に発現するように、連結された状態をいう。例えば、「核酸が、プロモーターの下流に作動可能に連結された」とは、プロモーターの制御下に核酸から発現産物が生じることを意味する。
前記トランスアクチベーター及び該トランスアクチベーターにより活性化されるプロモーターとしては、テトラサイクリントランスアクチベーター及びＴｅｔＯｐプロモーター等が挙げられる。前記テトラサイクリントランスアクチベーター及びＴｅｔＯｐプロモーターを用いた場合、発現用核酸構築物による活性阻害物質の発現を停止させることができるため、活性阻害物質の時期特異的発現制御、例えば、適度に働くように、発現を停止させる場合、ある一定の期間のみに発現させる場合等に好適である。
なお、前記発現用核酸構築物により発現される活性阻害物質としては、特に限定されないが、
（Ｉ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列、
（ＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示される配列において、少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び
（ＩＩＩ）配列番号：５又は配列番号：７に示されるアミノ酸配列に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１，Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １，ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０，ｗｏｒｄｓｉｚｅ  ３）によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも２６％であるアミノ酸配列、
からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド等が挙げられる。
本発明の発現用核酸構築物は、細胞等への核酸の導入に適した担体に保持させることにより、安定して活性阻害物質を発現させることができる。したがって、本発明の発現用核酸構築物によれば、活性阻害物質を安定して供給することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の発現用核酸構築物によれば、より効率よく、個体、細胞等に導入し、前記活性阻害物質を個体内、細胞内等で高い効率で発現させることができ、該活性阻害物質を所望の細胞等により特異的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。
したがって、本発明の他の側面は、前記発現用核酸構築物を保持した、哺乳動物細胞におけるＰＤＫ−１の活性阻害物質の発現用担体である。
細胞等への核酸の導入に適した担体としては、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の哺乳動物細胞用ベクター、プラスミドベクターを含有するリポソーム、プラスミドベクターを付着した金粒子等が挙げられる。なかでも、細胞における発現効率の観点から、好ましくは、一過性発現能を有するウイルスベクターが望ましい。
また、本発明の発現用核酸構築物及び発現用担体は、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療に用いられうる。
したがって、本発明の別の側面は、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤である。
本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を含有するため、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体において、所望の細胞内で前記活性阻害物質を発現させ、該ＰＤＫ−１のリン酸化活性を阻害し、ＰＤＫ−１によるターゲティング機構を抑制し、所望の細胞にアポトーシスを引き起こさせることができるという優れた効果を発揮する。
したがって、本発明の治療剤は、ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患、より具体的には、アポトーシス誘導が治療効果につながる疾患の治療に好適である。
ＰＤＫ−１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患としては、前記と同様であり、例えば、癌、例えば、癌、特に、ＰＤＫ−１により活性化されるＰＫＢの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進している癌、ウイルス感染症等が挙げられる。前記癌としては、例えば、特に、ＰＤＫ−１により活性化されるＰＫＢの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進されうる乳癌等が挙げられる。
本発明の治療剤は、標的細胞、標的組織、標的臓器等に応じた投与経路により投与されうる。前記投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内、局所等が挙げられる。
本発明の治療剤における前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体の含有量は、疾患、患者の年齢及び体重等に応じて適宜設定することができるが、生体内で、前記活性阻害物質が発現して、ＰＤＫ−１によるターゲティング機構をより効率よく抑制し、細胞にアポトーシスを誘導するに十分な量（治療上有効量）であればよい。
本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体の他、薬理学的に許容されうる助剤、例えば、核酸を安定に保持しうる緩衝液、賦形剤、結合剤、安定剤、溶解補助剤、等張剤等をさらに含有してもよい。
本発明の治療剤の投与法としては、リン酸−カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いた直接注入法、リポソームによる遺伝子導入法、パーティクル銃で細胞に移入する方法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。
本発明の治療剤について、例えば、癌の場合、以下のような動物実験により薬理評価を行なうことができる。腫瘍の形成が確認されたヌードマウスの癌モデルに適切な用量の治療剤を適切な投与回数投与し、同時に、腫瘍径の変化を観察する。なお、対照群として、治療剤を投与しなかったマウス、又は他の治療法を用いて治療したマウス等が挙げられる対照群に比べ、投与群において、より腫瘍の退縮が見られた場合、動物実験レベルで癌の治療ができたことを示す指標となる。また、組織、細胞等について、アポトーシスの検出を行なってもよい。さらに、本発明の治療剤によるヒトへの臨床試験は、例えば、癌細胞の場合、腫瘍の定期的な観察（写真撮影等）、ＣＴスキャン、ＭＲＩ等での記録により、腫瘍径を測定し、直交する長径と短径から推定腫瘍体積を算出し腫瘍の増殖を計算する。治療効果は、腫瘍の種類に応じた評価指標に基づき評価されうる。また、アポトーシスの有無を組織、細胞等の形態学的観察により評価してもよい。
さらに、本発明は、さらに他の側面では、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与することを特徴とする、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法である。
本発明の治療方法は、前記治療剤を個体に投与する場合と同様に行なわれる。また、かかる治療方法による治療効果の評価は、前記治療剤の薬理評価及び臨床試験と同様に行なわれうる。
また、本発明によれば、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物又は発現用担体の使用も提供される。本発明の発現用核酸構築物又は発現用担体によれば、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療方法の開発が可能になる。
以下、本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明は、下記実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】  ３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ（「ＰＤＫ−１」という；配列番号：１）のアクチベーションループ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐ）に対応する部分と、ＰＤＫ−１相互作用フラグメント（「ＰＩＦ」という；配列番号：３）とをコードする核酸を２コピー有する核酸構築物（ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ）を作製した。また、前記核酸構築物（ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ）の発現産物のＣ末端側に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が配置されるように、該核酸構築物の下流に、ＧＦＰをコードする核酸を配置させ、核酸構築物（ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）を得た。
ついで、前記ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦを、哺乳動物細胞用発現ベクターｐＴＢ７０１のＳＶ４０プロモーターの下流に組み込み、ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ発現用組換えベクターを得た。また、前記ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを、前記哺乳動物細胞用発現ベクターｐＴＢ７０１のＳＶ４０プロモーターの下流に組み込み、ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ発現用組換えベクターを得た。
さらに、細胞膜に存在するチロシンリン酸化酵素ＬｙｎのＮ末端領域のアミノ酸配列（配列番号：４）からなるペプチドをコードする核酸を、該ペプチドが、核酸構築物（ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ）の発現産物及び核酸構築物（ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）の発現産物のそれぞれのＮ末端側に付加されるように、各核酸構築物に連結させ、核酸構築物（Ｌｙｎｓｉｇ−ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ）及び核酸構築物（Ｌｙｎｓｉｇ−ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）のそれぞれを得た。
また、ＰＫＢ／Ａｋｔと同様にＰＤＫ−１の基質であるδＰＫＣのアクチベーションループ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐ）に対応する部分とδＰＫＣのＰＩＦとをコードする核酸を２コピー有する核酸構築物（δＡＬ−ＰＩＦ）を作製した。また、前記核酸構築物（δＡＬ−ＰＩＦ）の発現産物のＣ末端側に、ＧＦＰが配置されるように、該核酸構築物の下流に、ＧＦＰをコードする核酸を配置させ、核酸構築物（δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）を得た。
ついで、前記δＡＬ−ＰＩＦを、前記哺乳動物細胞発現ベクターｐＴＢ７０１のＳＶ４０プロモーターの下流に組み込み、δＡＬ−ＰＩＦ発現用組換えベクターを得た。また、前記δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを、哺乳動物細胞発現ベクターｐＴＢ７０１のＳＶ４０プロモーターの下流に組み込み、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ発現用組換えベクターを得た。
さらに、細胞膜に存在するチロシンリン酸化酵素ＬｙｎのＮ末端領域のアミノ酸配列（配列番号：４）からなるペプチドをコードする核酸を、該ペプチドが、核酸構築物（δＡＬ−ＰＩＦ）の発現産物及び核酸構築物（δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）の発現産物のそれぞれのＮ末端側に付加されるように、各核酸構築物に連結させ、核酸構築物（Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ）及び核酸構築物（Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ）のそれぞれを得た。
得られた各組換えベクターを、エレクトロポレーション法により、それぞれ、哺乳動物細胞ＣＯＳ−７株（理化学研究所細胞バンク供給）に導入した。
得られた発現産物のうち、ＧＦＰ結合発現産物の一次構造の概略図を図１に示す。
また、前記核酸構築物のそれぞれを用い、相同組換法により、組換えアデノウイルスを作製した。なお、組換えアデノウイルスの作製には、ストラタジーン社製、商品名：ｐＡｄＥＡＳＹ  Ｓｙｓｔｅｍ、商品名：ＡｄＥａｓｙ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた。
ＨＥＫ  ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を、１００ユニット／ｍｌ  ペニシリンＧナトリウムと１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンと１０重量％  ウシ胎仔血清とを含むα−ＭＥＭ上、６０ｍｍ  培養プレートあたり細胞数２〜５×１０５（約１００細胞／ｍｍ２）になるように接種し、５体積％  ＣＯ２を含む加湿気相中、３７℃で培養した。
１２〜２４時間後、得られた組換えアデノウイルスベクターで、ＨＥＫ  ２９３細胞をトランスフェクションした。４〜７日後、プレートから剥離した細胞を、培養液中の細胞を、１５００×ｇで５分間遠心分離して、ウイルス上清を得た。
得られた組換えアデノウイルス上清について、ウイルスタイター値を測定した。
その結果、前記核酸構築物の発現アデノウイルスベクターを得た。
【実施例２】  前記実施例１で得られた発現ベクターのうち、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現プラスミドベクター及びＬｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現プラスミドベクターのそれぞれを、エレクトロポレーション法により、サル腎臓癌細胞ＣＯＳ−７に導入した。
導入２４時間後、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰ発現細胞及びＬｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞のそれぞれについて、ＧＦＰによる蛍光を指標として観察した。結果を図２に示す。
その結果、図２に示されるように、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現産物は、主に細胞質に発現が見られ、Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現産物は、主に細胞膜に発現が見られた。
導入４８時間後、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞及びＬｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞のそれぞれについて、ＧＦＰによる蛍光を指標として観察した。
その結果、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞及びＬｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞共に、球形に形態変化を起こした。また、それぞれの細胞について、ヘキスト３３３４２を用いて、染色した結果、形態変化を示した細胞は、いずれもクロマチンの凝集と核の分断化を示し、アポトーシスを起こしていることがわかった。なお、図３に、代表例として、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現細胞の場合の結果を示す。
したがって、実施例１で得られた発現ベクターにより発現される核酸構築物の発現産物は、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性を阻害し、アポトーシスを誘導することがわかった。
【実施例３】  テロメラーゼプロモーターの支配下にテトラサイクリントランスアクチベーターを連結させ、癌細胞特異的にテトラサイクリントランスアクチベーターを発現させるためのベクター１を作製する。
また、実施例１の核酸構築物の上流にＴｅｔＯｐ最小プロモーターを連結し、実施例１と同様に発現ベクターを作製する（ベクター２）。
得られたベクター１とベクター２とを樹立された癌細胞及び樹立されていない癌細胞のそれぞれを導入する。
その結果、細胞が、球形に形態変化を起こし、クロマチン凝集、核の分断化を示すことを指標として、核酸構築物の発現産物の効果を評価する。
【実施例４】  実施例３で得られたベクター１とベクター２とを、固形癌モデルに、血管内投与又は該モデルの癌細胞に局所的に注入する。
その結果、固形癌の大きさの変化を指標として、癌に対する発現産物の効果を評価する。
【実施例５】  ＣＯＳ−７細胞において、ＰＫＢα−ＧＦＰと、δＡＬＰＩＦ−ＧＦＰ又は対照としてＧＦＰとを共発現させた。
ついで、抗ＧＦＰ抗体又はＰＫＢのａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐのリン酸化スレオニンを認識する抗リン酸化ＰＫＢ（Ｔｈｒ３０８）抗体を用い、ウエスタンブロット解析を行なった。結果を図４に示す。
図４のパネルＡに示されるように、発現させた目的のタンパク質が、それぞれ目的のサイズを保持していることがわかる。また、ＰＫＢα−ＧＦＰの発現量は、ＰＫＢα−ＧＦＰとＧＦＰとを共発現させたＣＯＳ−７細胞及びＰＫＢα−ＧＦＰとδＡＬＰＩＦ−ＧＦＰとを共発現させたＣＯＳ−７細胞の間でほぼ等しいことがわかる。
また、パネルＢに示されるように、δＡＬＰＩＦ−ＧＦＰを共発現させた場合（レーン２）、ＧＦＰを共発現させた場合（レーン１）に比べ、ＰＫＢα−ＧＦＰのバンドが薄く認識されており、δＡＬＰＩＦ−ＧＦＰがＰＫＢα−ＧＦＰのアクチベーションルーペのリン酸化を抑制していることがわかる。なお、この抗体は、δＡＬＰＩＦ−ＧＦＰのリン酸化も認識している。
【実施例６】  前記実施例１で得られた発現ベクターのうち、偽基質δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現プラスミドベクター及び偽基質Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現プラスミドベクターのそれぞれを、エレクトロポレーション法により、癌由来培養細胞（ＣＯＳ−７細胞及びＰＣ−１２細胞）に導入した。
また、前記偽基質の発現プラスミドベクターと、ＧＳＴとＰＤＫ−１との融合タンパク質（ＧＳＴ−ＰＤＫ−１）の発現プラスミドベクターとを、エレクトロポレーション法により、癌由来培養細胞（ＣＯＳ−７細胞及びＰＣ−１２細胞）に導入した。
なお、前記ＧＳＴ−ＰＤＫ−１の発現プラスミドベクターは、ヒトＰＤＫ−１をコードするｃＤＮＡの５’側に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするｃＤＮＡを付加し、得られた核酸構築物を、前記実施例１の場合と同様のプラスミドベクターに連結することにより作製したベクターである。
対照として、前記偽基質の発現ベクターの代わりに、ＧＦＰの発現ベクターを、前記ＣＯＳ−７細胞及びＰＣ−１２細胞それぞれに導入した。
遺伝子導入４８時間後に、ＧＦＰに由来する蛍光を呈する細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞を計数し、アポトーシス誘導率を算出した。なお、アポトーシス誘導細胞は、細胞核を慣用の方法で染色し、蛍光顕微鏡下、クロマチン凝集と核の分断化とを指標として判定した。
また、ＣＯＳ−７細胞での結果を表１に、ＰＣ−１２細胞での結果を表２に示す。なお、表中、＊は、ｐ＜０．０５  ｖｓ  ＧＦＰ〔Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ〕、＃は、ｐ＜０．０５  ｖｓ  偽基質のみ、＃＃は、ｐ＜０．０１  ｖｓ  偽基質のみ〔ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ〕を示す。また、結果は、３連の平均を示す。
2005019451.tif 000003
2005019451.tif 000004
その結果、表１及び表２に示されるように、対照であるＧＦＰのみを発現した細胞と比較すると、ＣＯＳ−７細胞及びＰＣ−１２細胞のいずれにおいても、δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現によりアポトーシスを示す細胞の割合（％）は有意に増加した。
また表１及び表２に示されるように、Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰを発現させた場合、対照であるＧＦＰのみを発現した細胞と比較して、ＣＯＳ−７細胞においては、有意にアポトージスを示す細胞の割合の増加を引き起こし、ＰＣ−１２細胞においても、アポトーシス誘導細胞数は増加した。
したがって、偽基質δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現及び偽基質Ｌｙｎｓｉｇ−δＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰの発現により、癌由来培養細胞において、有意にアポトーシスを誘発することがわかった。
さらに、前記偽基質とともにＧＳＴ−ＰＤＫ−１を発現させた場合、表１及び表２に示されるように、ＧＳＴ−ＰＤＫ−１とδＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰとの共発現により、アポトーシスはＣＯＳ−７細胞及びＰＣ−１２細胞の両方で有意に抑制された。
まかかる結果より、外因的にＰＤＫ−１を過剰発現させることにより、偽基質の効果が弱まると考えられたので、前記偽基質によるアポトーシスは、内因性のＰＤＫ−１を介して起こっていることが示唆された。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：１は、ＰＫＢ／Ａｋｔのａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐの配列である。
配列番号：２は、δＰＫＣのａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐの配列である。
配列番号：３は、ＰＤＫ−１相互作用断片（ＰＩＦ）の配列である。
配列番号：４は、Ｌｙｎの配列である。
配列番号：５は、ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦから産生したＰＤＫ−１の阻害剤の配列である。
配列番号：６は、ＰＫＢＡＬ−ＰＩＦ−ＧＦＰから産生したＰＤＫ−１のＧＦＰ結合阻害剤の配列である。
配列番号：７は、δＡＬ−ＰＩＦから産生したＰＤＫ−１の阻害剤の配列である。
配列番号：８は、δＡＬ−ＰＩＦから産生したＧＦＰ結合阻害剤の配列である。
配列番号：９は、ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｌｏｏｐの部分配列である。
【産業上の利用可能性】  本発明により、３−ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１の活性の異常に起因する疾患、癌等への治療手段の開発を行なうことができる。
【配列表】
2005019451.tif 000005
2005019451.tif 000006
2005019451.tif 000007
2005019451.tif 000008
2005019451.tif 000009
2005019451.tif 000010
2005019451.tif 000011
【図１】
2005019451.tif 000012
【図２】
2005019451.tif 000013
【図３】
2005019451.tif 000014
【図４】
2005019451.tif 000015
【国際調査報告】
2005019451.tif 000016
2005019451.tif 000017
2005019451.tif 000018
2005019451.tif 000019
2005019451.tif 000020
2005019451.tif 000021
2005019451.tif 000022
2005019451.tif 000023