(57)【要約】誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増幅効率と増幅特異性を有する、高性能なビブリオコレラ及びビブリオミミカス検出・定量・同定用特異遺伝子増幅プライマーを作製すること。本発明者等は、ビブリオコレラ及びビブリオミミカスとその近縁種のｒｐｏＤ遺伝子およびｇｙｒＢ遺伝子の部分塩基配列を決め、その系統関係を明らかにし、ビブリオコレラ及びビブリオミミカスそれぞれに特徴的な塩基を同定し、これを含む高特異性を有するプローブ、及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅用プライマーを設計することを可能とした。
2004055188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）の断片でビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号（塩基番号とも言う）２１、９６、１０７、１２６、１５３、１９０、２５８、２７０、２７９、２８５、３５７、５４３、５５２、５５７、６００、６９０、７０２、７１４、７２９、７３３、７３４、７５９、７７１、７８２、７８６、７９２、７９５又は８８５のいずれかの塩基を含む特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号１で表される遺伝子断片。
【請求項２】
請求項１記載の断片を含む配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号２１、９６、１０７、１２６、１５３、１９０、２５８、２７０、２７９、２８５、３５７、５４３、５５２、５５７、６００、６９０、７０２、７１４、７２９、７３３、７３４、７５９、７７１、７８２、７８６、７９２、７９５又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項３】
請求項１で指定されたビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な位置を２位置以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４】
３‘末端の塩基が該ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な請求項１で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項５】
遺伝子増幅プライマーが
（１）５‘−ｔｙｃａｙｗｃｓｃａａａｃｔｔａｃｃａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｇａａｙｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｃｇａｔｃａａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ｃａｔｒｔａｇｔｔｇｔｔｃａａａｇｔａｃｇｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ｇｇａｔｔｔｙａｃｙｔｃｃｇａａｇａａａｃｙａｇｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（５）５‘−ｙｇｃｃａｇｃｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｒ−３’若しくは対応する相補鎖、
（６）５‘−ｃｇｃｔｔｃｇｃｔｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（７）５‘−ｃａａｔａａｔｃｔｔｃｇａａｃａａａｃｇｔ−３’若しくは対応する相補鎖のいずれかを含む請求項２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項６】
配列表中の配列番号１のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号２１、９６、１０７、１２６、１５３、１９０、２５８、２７０、２７９、２８５、３５７、５４３、５５２、５５７、６００、６９０、７０２、７１４、７２９、７３３、７３４、７５９、７７１、７８２、７８６、７９２、７９５又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオコレラ及びビブリオミミカス検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項７】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号３、２７、６６、６７、７５、９０、１１７、１２３、１４１、１４４、１７７、１７８、１８０、１８６、２２３、２２７、２２８、２３１、２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４、３５０、３５１、３６２、３６９、３７３、３７４、３８０、３９０、４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６、４２３、４２７、４３３、４４４、４４７、５０４、５１０、５１３、５４３、５５６、５５８、６１８、６３８、６４９、６６３、６８５、７１１、７４７、７５７、７６２、７６３、又は７８９のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号２で表される遺伝子の断片。
【請求項８】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号３、２７、６６、６７、７５、９０、１１７、１２３、１４１、１４４、１７７、１７８、１８０、１８６、２２３、２２７、２２８、２３１、２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４、３５０、３５１、３６２、３６９、３７３、３７４、３８０、３９０、４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６、４２３、４２７、４３３、４４４、４４７、５０４、５１０、５１３、５４３、５５６、５５８、６１８、６３８、６４９、６６３、６８５、７１１、７４７、７５７、７６２、７６３、又は７８９のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項９】
請求項８で指定されたビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な位置を２位置以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１０】
３‘末端の塩基が該ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な請求項８で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項８記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１１】
遺伝子増幅プライマーが
（１）５‘−ｇａｔｔｇｃｔｇａｇｔａｔｃｃｔｇｇａａｃｃａｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｇａｙｃｃｔａａｃｇａｃａｔｇｇａａａｃｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ｔｔｃｗｇａｒｃｔｙｔｃｔｇａａｇｃｓ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ａｇａｔｇａｙｇｍｋｇｔｃｇｙｓｇａｒ−３’若しくは対応する相補鎖、
（５）５‘−ｃｇａｃｇｇｔｇａａａｇｙａｇｃｇａｃａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（６）５‘−ｃａａｔｇａａｃｔｇｃｇｃｇｇｙａａｇｔｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（７）５‘−ｇｔｃａｃｇａｃｃａａａｔｔｃａｔｔａａｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（８）５‘−ｇｙｙｔｇａｍｇｃｔｔｃａｇａｗｇｃｔｔｇｒｔｋａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（９）５‘−ｙｇａｒｇｔｒｃｇｃａｇａｇｔｔｔｃａａｃｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１０）５‘−ｃａｔｙａｃｃａａｒｃｇｙｔｃｔｔｇｇ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（１１）５‘−ｃｇｙｔｃａａｃａｇａｃａｇｔｇａｗｇｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖のいずれかを含む請求項８項記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１２】
配列表中の配列番号２のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号３、２７、６６、６７、７５、９０，１１７、１２３、１４１、１４４、１７７、１７８、１８０、１８６、２２３、２２７、２２８、２３１、２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４、３５０、３５１、３６２、３６９、３７３、３７４、３８０、３９０、４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６、４２３、４２７、４３３、４４４、４４７、５０４、５１０、５１３、５４３、５５６、５５８、６１８、６３８、６４９、６６３、６８５、７１１、７４７、７５７、７６２、７６３、又は７８９のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項１３】
請求項２−６、又は８−１２のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群を検出、定量又は同定する方法。
【請求項１４】
請求項２−６、又は８−１２のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオコレラ及びビブリオミミカス菌群を検出、定量又は同定するキット。
【請求項１５】
配列表中の配列番号３のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号３で表される遺伝子の断片。
【請求項１６】
配列表中の配列番号３のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項１７】
３‘末端の塩基がビブリオコレラ菌群に特有な請求項１６で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項１６記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１８】
請求項１６で指定されたビブリオコレラ菌群に特有な位置を２以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項１６記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項１９】
遺伝子増幅プライマーが
（１）５‘−ｇｇｔｇｇｔｔａａｃｇｃｇｃｔｙｔｃｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｙｃｇａｔｇａａｃｇｔｇａａｇａａｇａｔａａａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ｔｇａｇａａａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔｔｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ｇｔｔａａａｇｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（５）５‘−ｇｇｇｔａａｇｃｃｗｇｃａａｇａｔｃｃ−３’若しくは対応する相補鎖、のいずれかを含む請求項１６項記載のプライマー。
【請求項２０】
配列表中の配列番号３のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオコレラ菌群検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項２１】
配列表中の配列番号４のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号４で表される遺伝子の断片。
【請求項２２】
配列表中の配列番号４のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項２３】
３‘末端の塩基が該ビブリオコレラ菌群に特有な請求項２２で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項２２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２４】
請求項２２で指定されたビブリオコレラ菌群に特有な位置を２以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項２２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２５】
遺伝子増幅プライマーが、
（１）５‘−ａｔｔｃｔｔｇａｇｃａｇｔｔｔｇａｔｃｇｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｃａｇｇｃｃｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｃｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ｔｇａｇｃｔｔｔｃｔｇａａｇｃｇｇａｔｃｔｃｇｃｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ｇａａｇａｔｇａｔｇｃｔｇｔｃｇｔｃｇａａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（５）５‘−ｇａａｇａｔｇａａｇａｃｇａａｇａｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（６）５‘−ｃｇｇｔａｔｃｇａｃｃｃｔｇａａｃｔｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（７）５‘−ｃａｔｃａａｇｃｔｔｃｔｇａａｇｃｇｔｃａｇａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（８）５‘−ａｃｇｇａａｇａｔａｔｃｃａｒｃａｃｔａａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（９）５‘−ｔｃａａｃｃａａｇｔｇｇｔｃｇａａｔｔｇｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１０）５‘−ｇｃｇａａｃａｃｇａｔｃｃａｔｔｇａａｇｔｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１１）５‘−ｇａｔｇａａｃｇａｔｔｔｃｔｔｃｇｇｃａｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１２）５‘−ａａｇｇａｃｔｔｔａｔｃｃａｇｃｃａｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１３）５‘−ｔｔｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃａｃｇｇａｃｔｔｔｃｇｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１４）５‘−ｔｔｃｔｇａａｔｔｇａａｃｇｇｃｇｇａｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（１５）５‘−ｔｇｔｃｔｃｔｔｇｃｔｃｇａｔｃａｔｔｔｇｔ−３’若しくは対応する相補鎖のいずれかを含む請求項２２記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項２６】
配列表中の配列番号４のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオコレラ菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオコレラ菌群検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項２７】
請求項１６−２０、又は２２−２６のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオコレラ菌群を検出、定量又は同定する方法。
【請求項２８】
請求項１６−２０、又は２２−２６のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオコレラ菌群を検出、定量又は同定するキット。
【請求項２９】
配列表中の配列番号５のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号５で表される遺伝子の断片。
【請求項３０】
配列表中の配列番号３のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項３１】
請求項３０で指定されたビブリオミミカス菌群に特有な位置を２以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項３０記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３２】
３‘末端の塩基が該ビブリオミミカス菌群に特有な請求項３１で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項３０記載の遺伝子増幅プライマー
【請求項３３】
遺伝子増幅プライマーが
（１）５‘−ｇｇｔａｇｔｇａａｔｇｃｃｃｔｇｔｃａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｃｇｇａｔｇａｇｃｇｔｇａａｇａａｇａｔａａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ｔｇａａａａａｇｔａｔｔｃｃａｃｔｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ｇｔｔｇａａｇｔｇｇａａｔａｃｔｔｔｔ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（５）５‘−ｗｇｇｃａａａｃｃａｇｃｋａｒｒｔｃｔ−３’若しくは対応する相補鎖のいずれかを含む請求項３０記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３４】
配列表中の配列番号５のＤＮＡジャイレースβサブユニットをコードする遺伝子（ｇｙｒＢ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオミミカス菌群検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項３５】
配列表中の配列番号６のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む、特異的な遺伝子増幅プライマー又はプローブの設計に用いることができる配列番号６で表される遺伝子の断片。
【請求項３６】
配列表中の配列番号６のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。
【請求項３７】
請求項３６で指定されたビブリオミミカス菌群に特有な位置を２以上の高頻度で含む領域を用いることを特徴とする請求項３６記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３８】
３‘末端の塩基が該ビブリオミミカス菌群に特有な請求項３６で特定される位置番号の塩基であることを特徴とする請求項３６記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項３９】
遺伝子プライマーが
（１）５‘−ｃａｔｔｃｔｔｇａａｃａｇｔｔｔｇａｃａａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（２）５‘−ｃａｇｇｃａｇａａｇａａｃｔａｃｇｔｃｔｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（３）５‘−ａｇａｒｃｔｃｔｃｔｇａａｇｃｃｇａｔｃｔｃｇｃｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（４）５‘−ｇａａｇａｔｇａｃｇａｇｇｔｃｇｃｇｇａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（５）５‘−ｇａｇｇａｔｇａａｇａｔｇａａｇａｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（６）５‘−ｇｇｇｔａｔｔｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｃ−３’若しくは対応する相補鎖、
（７）５‘−ｔａａｃａａａｇｃａｔｃｔｇａａｇｃｔｔｃａａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（８）５‘−ｇｃｇｇａａｒａｔａｔｃｃａｇｔａｃｃａｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（９）５‘−ｔｃａａｃｃａａａｔｇｇｔｃａａａｔｔｇｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１０）５‘−ａｃｇａａｃａｃｇａｔｃｃａｔｃｇａｇｇｔａ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１１）５‘−ａａｔａａａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇｇｃａｔｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１２）５‘−ｇａｇｙａｃｔｔｔａｔｃｒａｇｃｃａｔ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１３）５‘−ｇｔｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃａｃｇｔａｃｔｔｔｔｔｇ−３’若しくは対応する相補鎖、
（１４）５‘−ｔｇｇａｔｔｇａａｇｇｇｃｇａａｔａ−３’若しくは対応する相補鎖、又は
（１５）５‘−ａｇｔｃｔｃｙｔｇｔｔｃｇａｔｃａｔｃｔｇｍ−３’若しくは対応する相補鎖のいずれかを含む請求項３６記載の遺伝子増幅プライマー。
【請求項４０】
配列表中の配列番号６のＲＮＡポリメレースσ７０因子をコードする遺伝子（ｒｐｏＤ）中で、ビブリオミミカス菌群に特有な次の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４のいずれかの塩基を含む連続する１５塩基以上を含む鎖又はその相補鎖を含むビブリオミミカス菌群検出、定量又は同定用プローブ。
【請求項４１】
請求項３０−３４、又は３６−４０のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオミミカス菌群を検出、定量又は同定する方法。
【請求項４２】
請求項３０−３４、又は３６−４０のいずれか１項に記載のプライマー又はプローブを用いるビブリオミミカス菌群を検出、定量又は同定するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、食品検査、疫学的環境検査、並びに臨床検査における、ビブリオコレラ及びビブリオミミカスの検出・同定・計数方法に関するものである。
【背景技術】  ビブリオコレラは経口感染の後、コレラ毒素を産生し、激しい下痢と嘔吐を引き起こす。場合によっては、極度の脱水症状のため、死亡することもある感染症細菌である。ヒトに対し毒性を示すビブリオコレラは抗０１抗体で凝集する０１コレラのみであり、それ以外の菌は０１非凝集（０１−ｎｏｎ−ａｇｇｌｕｔｉｎａｂｌｅ）ということでＮＡＧ（ナグ）−ビブリオと分類され、人に対する毒性を示さないとされてきた。しかし、１９９５年にインドのベンガル地方で、それまでのコレラと同じ様な症状を起こす０１抗原を持たない新型のビブリオコレラが分離され、０１３９という新しい０抗原を持つことが明らかとなった。この株は、ベンガル株と呼ばれ、従来の０１コレラと同様のコレラ毒素産生遺伝子を持ち、毒素を産生して、コレラ症を惹起することが明らかにされた。このことにより、０１コレラ以外でもヒトに感染しコレラ症の原因となり得ることが示された。実際、０１、０１３９以外のビブリオコレラにもコレラ毒素遺伝子を有する株が存在し、ヒトに対してコレラ症を引き起こす。しかしながら、０１および０１３９以外のビブリオコレラによる症状は行政上感染症として取り扱われない。
一方で、ビブリオコレラの非０１株の中に白糖非分解の株がまれに検出されていたが、Ｄａｖｉｓらが、ビブリオコレラとのＤＮＡ相同性を調べることで、ビブリオコレラとはやや異なることを示しビブリオミミカスとした。このビブリオミミカスはビブリオコレラと非常に近い種であり、生化学的性状では白糖分解能が異なる（ビブリオコレラが陽性、ビブリオミミカスが陰性）が、それ以外の性状は非常に似ていると報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４，６３１−６３９  １９８１）（非特許文献１）。ビブリオミミカスにはビブリオコレラと同様のコレラ毒素遺伝子を有する株が存在することが知られており（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；４２  ８２３−８２８）（非特許文献２）、コレラ症と同様の症状を引き起こす可能性がある。
他方、コレラ毒素遺伝子を持たないビブリオコレラの中に、腸炎ビブリオの病原因子である耐熱性溶血毒素遺伝子（ｔｄｈ）を持つ株（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５２：１２１８−２０，１９８６）（非特許文献３）や、大腸菌の耐熱性エンテロトキシンを産生する株（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：６９７−７０５，１９９０）（非特許文献４）の存在が報告されており、下痢症などの原因となり得る。さらに、ビブリオミミカスにも同様にｔｄｈ遺伝子を有する株が存在することが知られており（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５９：３１９−２３，１９９０）（非特許文献５）コレラ毒素を産生しない場合にも下痢症などの原因となり得る。
上述の如く、血清型が０１及び０１３９（ベンガル）であり、コレラ毒素を産生するビブリオコレラが検出された場合には、“感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律”の定める措置の対象となる。さらに、０１コレラ及びベンガルコレラ以外のビブリオコレラにもコレラ毒素産生株が存在し、コレラ症と同様の症状を引き起こす。他方に、コレラ毒素非産生株であっても、コレラ症の原因とは成り得ないが、そのことが非病原性であることを意味するわけでは無く、コレラ毒素以外の毒素を産生することにより急性胃腸炎、下痢症などを惹起する。従って、ビブリオコレラ菌群を迅速かつ正確に検出することが求められる。
一方で、ビブリオミミカスにおいても、コレラ症の原因となり得るコレラ毒素を産生する株及びコレラ毒素以外の毒素を産生することにより急性胃腸炎、下痢症などの原因となり得る。故に、ビブリオミミカス菌群を迅速かつ正確に検出することも求められる。
生化学的手法を用いた従来の検査方法は、熟練した技術と多大な労力と時間を必要とする。この欠点を補うために、正確かつ迅速・簡便なビブリオコレラおよびビブリオミミカスの検出・同定を目的とした遺伝子による検査方法が試みられている。
コレラ症の原因であるコレラ毒素をコードする遺伝子を検出するプライマーが既に存在する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３；２５８，１３７２２−１３７２６）（非特許文献６）。しかしながら、当該プライマーでは、コレラ毒素遺伝子を有さずに別の毒素を産生するビブリオコレラ及びビブリオミミカスを検出することは出来ない。
一方、ビブリオコレラとビブリオミミカスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を全長で比較すると、１，４５６塩基のうち６塩基しか異ならない（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４４，４１６−４２６  １９９４）（非特許文献７）ために、明確に区別することは不可能であることから、ビブリオコレラとビブリオミミカスの１６Ｓ−２３Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｓｐａｃｅｒ  Ｒｅｇｉｏｎを比較し、ビブリオコレラとビブリオミミカスが分類可能であることを示し、ビブリオコレラのみを検出可能なプライマーを作成した報告（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５，２２０２−２２０８  １９９９）（非特許文献８）も存在しているが、当該プライマーを用いた場合に、ビブリオミミカスを誤って検出してしまうとの報告も存在する（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７，２３６０−２３６４  ２００１）（非特許文献９）。
【発明の開示】
以上の様に、既存の遺伝子検出方法では、ビブリオコレラ及びビブリオミミカスを精度よく検出することができない。
従来の遺伝子検査方法に共通しているのは、細菌の「種」が遺伝的な多様性を内包する集団である事を無視している点に有る。ある細菌集団のメンバーと推測される１菌株の塩基配列を、その集団共通の、あるいは代表する配列として用いる事は、中立的変異を速やかに蓄積する遺伝子の分子進化の性質上大変危険である。即ち、本来検出されるべき菌株がプライマー領域の僅かな変異の為に増幅が阻害されて検出されなかったり、プライマーの特異性が十分でないために検出されるべきでない近縁株が検出されるといった誤判定の原因になる事が危惧される。そこで、特異性のバックグラウンドが証明されており、誤判定の可能性が低く、かつ実用上十分な増幅効率と増幅特異性を有する、高性能なビブリオコレラおよびビブリオミミカスの検出・同定・定量用特異遺伝子増幅プライマー、さらにビブリオコレラ、ビブリオミミカスをそれぞれ特異的に検出・同定・定量する遺伝子増幅プライマーの作成が必要とされていた。
細菌のある系統群の遺伝子を特異的に検出する方法を作成する為には、検出しようとする生物群、ならびにその系統的に近縁な生物群の塩基配列をなるべく多数収集する必要がある。また、特異検出のターゲットとする遺伝子は、最も近縁の生物とも判別可能なように、十分に異なる塩基配列を有している必要がある。この為には、十分に早い進化速度を有していなくてはならない。また、高頻度に水平伝播する遺伝子（たとえば腸炎ビブリオの毒素遺伝子）の様に、系統とは無関係に存在する遺伝子は用いる事が出来ない。本発明でターゲットとして用いたｇｙｒＢ遺伝子及びｒｐｏＤ遺伝子がコードするタンパク質は、生存に必須なタンパク質である。この為、水平伝播し難く、また適度な進化速度を有しているため、細菌の系統解析に適している（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８；４８，８１３−８１９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９；４９，８７−９５）。発明者らは、既にｇｙｒＢ遺伝子及びｒｐｏＤ遺伝子のＰＣＲダイレクトシーケンス法による簡便な塩基配列の決定方法を開発している（特開平０７−２１３２２９、特開平０８−２５６７９８）。さらに、発明者らは、既に多数のビブリオコレラを単離しており、他方に、公知のビブリオミミカス保存株及び、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列に基づく解析により本菌に近縁であることが報告されているＬｉｓｔｏｎｅｌｌａ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ，Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ，Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ，Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ，Ｖ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ，Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ，Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５１，１４４９−１４５６（２００１））について、表１に示される菌株のｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の部分塩基配列を解析し、その配列に基づいた分子系統解析を行い、その系統関係を明らかとした。
2004055188.tif 000003
即ち、供試菌株を２％ＮａＣｌ添加ブレインハートインフュージョン培地で増菌培養した後に、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型として、ｇｙｒＢ増幅ユニバーサルプライマーＵＰ−１ＥおよびＡｐｒＵを用いて約９００ｂｐ（大腸菌Ｋ−１２株上の塩基配列上のポジション３３１−１２１２；アミノ酸配列ではポジション１１１から４０４に相当する領域）のｇｙｒＢ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。また同様にｒｐｏＤ増幅ユニバーサルプライマー７０Ｆ−Ｍ１３および７０Ｒ−Ｍ１３を用いて約８００ｂｐ（大腸菌Ｋ−１２株上の塩基配列上のポジション３３４−１１２５；アミノ酸配列ではポジション１１２から３７５に相当する領域）のｒｐｏＤ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルで電気泳動後、臭化エチジュウムで染色し紫外線照射下でその存在を確認した後にＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製しシーケンス反応の鋳型とした。シーケンス反応は、ユニバーサルプライマーに予め付加してあるＭ１３Ｒ、Ｍ１３−２１配列をプライマーとして用いＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてサイクルシーケンス反応を行い、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて配列を解析した。決定した塩基配列を用いて分子系統解析を行うにあたり、ビブリオコレラおよびミミカスの近傍をより正確に把握することを目的として、ｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子部分配列を結合させ解析を実施した。得られた塩基配列を、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗコンピュータープログラムで多重アラインメント解析を行った後、ＰＨＹＬＩＰコンピュータープログラムパッケージを用い、木村の２パラメーターモデルで算出した遺伝的距離に基づいて近隣結合法により分子系統樹を作成した。この結果、ビブリオコレラ及びミミカスが他のビブリオ属細菌とは異なった単一の系統に属することが明らかとなった。さらに、ビブリオコレラ及びミミカスもそれぞれが独立した系統群を形成していることが示された。（図１）そこで、ビブリオコレラ及びミミカス菌群のみを検出可能な遺伝子検査法を確立するために、まず、近縁種間の塩基配列の差異を明らかとした。即ち、ビブリオコレラ及びミミカス群内では保存され、他のビブリオ属細菌とは異なっている塩基の位置を同定した。具体的には、ビブリオコレラ及びミミカスが属する系統群のコンセンサス配列を求めると共に、分子系統解析の結果から本系統に近縁であることが判明した図１中Ｃ１〜Ｃ３の系統のコンセンサス配列を比較し、系統特異的情報図を作成した（図２、３）。図２より、ｇｙｒＢ遺伝子においては、配列表中の配列番号１の位置番号（以下塩基番号とも言う）２１、９６、１０７、１２６、１５３、１９０、２５８、２７０、２７９、２８５、３５７、５４３、５５２、５５７、６００、６９０、７０２、７��４、７２９、７３３、７３４、７５９、７７１、７８２、７８６、７９２、７９５又は８８５の位置、図３より、ｒｐｏＤ遺伝子においては配列表中の配列番号２の位置番号３、２７、６６、６７、７５、９０、１１７、１２３、１４１、１４４、１７７、１７８、１８０、１８６、２２３、２２７、２２８、２３１、２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４、３５０、３５１、３６２、３６９、３７３、３７４、３８０、３９０、４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６、４２３、４２７、４３３、４４４、４４７、５０４、５１０、５１３、５４３、５５６、５５８、６１８、６３８、６４９、６６３、６８５、７１１、７４７、７５７、７６２、７６３、又は７８９の位置がビブリオコレラ及びミミカスが属する系統に特異的であることが明らかとなった。これら特徴的塩基を含む本系統に特異的な配列を用いることにより、高特異性を有するプローブ及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅プライマーを設計することが可能となる。例えば、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢ及びｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上４０塩基以下の連続するｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列を含むプライマーを設計することが可能となる。同様に、近縁種と塩基が相違する位置を必ず含むように、当該近縁種と相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上で１００塩基以下の連続するｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列を含むようにプローブを設計することが可能となる。さらに、当該プライマー及びプローブの作成には、上記相違塩基を２以上の高頻度で含む領域、例えば、ｇｙｒＢ遺伝子においては、９６、１０７を含む領域、２５８、２７０、２７９、２８５のいずれかの位置を２以上含む領域、５４３、５５２、５５７のいずれかの位置を２以上含む領域、６９０、７０２、７１４のいずれかの位置を２以上含む領域、７２９，７３３，７３４のいずれかの位置を２以上含む領域、７５９、７７１を含む領域、７８２、７８６、７９２、７９５のいずれかの位置を２以上含む領域、ｒｐｏＤ遺伝子においては、６６、６７、７５、９０のいずれかの位置を２以上含む領域、１７７、１７８、１８０、１８６のいずれかの位置を２以上含む領域、２２３、２２７、２２８、２３１のいずれかの位置を２以上含む領域、２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４のいずれかの位置を２以上含む領域、３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４のいずれかの位置を２以上含む領域、３６２、３６９、３７３、３７４、３８０のいずれかの位置を２以上含む領域、４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６のいずれかの位置を２以上含む領域、４２３、４２７、４３３、４４４、４４７のいずれかの位置を２以上含む領域、５０４、５１０、５１３のいずれかの位置を２以上含む領域、５４３、５５６、５５８のいずれかの位置を２以上含む領域、７４７、７５７、７６��、７６３のいずれかの位置を２以上含む領域が好適に使用できる。また、プライマーの場合、３‘末端がビブリオコレラ及びミミカス菌群に特異的な塩基であることが望ましい。本件発明は、これらプライマー及びプローブを他の試薬と組み合わせたビブリオコレラおよびミミカスの検出、定量又は同定用のキットを包含するものである。
他方、ビブリオコレラ及びミミカス菌群はさらに、ビブリオコレラ菌群とビブリオミミカス菌群が独立した系統を形成した（図１）ことから、ビブリオコレラ及びミミカス菌群をそれぞれ検出可能な遺伝子検査法を確立するために、先と同様に、ビブリオコレラ及びミミカス群内でそれぞれ保存された領域、及び互いに異なっている塩基の位置を同定した。具体的には、ビブリオコレラ及びミミカスが属する各系統群のコンセンサス配列を、互いに比較することで系統特異的情報図を作成した（図４、５、６、７）。ビブリオコレラが属する系統においては、ｇｙｒＢ遺伝子の場合、図４より、配列表中の配列番号３の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５の位置、ｒｐｏＤ遺伝子においては図５より配列表中の配列番号４の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４の位置が特異的であることが明らかとなった。また、ビブリオミミカスが属する系統においては、ｇｙｒＢ遺伝子の場合、図６より、配列表中の配列番号５の位置番号１５、３６、３９、４２、４５、４８、５１、９０、１１１、１３３、２２６、２８５、２９１、３０６、３３０、３８４、３９０、３９９、５０７、７０８、７５６、８３７、８６７、８７３、８７９、８８２、又は８８５の位置、ｒｐｏＤ遺伝子においては、図７より、配列表中の配列番号６の位置番号１２、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、１２６、１３２、１４１、１５６、１９８、２０１、２１６、２２２、２３１、２４０、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４、２７６、２８５、２９１、３２７、３３３、３４２、３４５、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６、４４８、４５０、４５３、４６８、４８９、４９５、５０１、５１９、５２２、５２５、５４０、５４９、５７０、５８５、５９１、６００、６０３、６０６、６３９、６４５、６５４、６５７、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３、７２９、７３２、７４１、７５０、７６５、７６８、７９５又は８０４の位置が特異的であることが明らかとなった。これら特徴的塩基を含むビブリオコレラ又はビブリオミミカスが属する系統に特異的な配列を用いることにより、高特異性を有するプローブ及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅プライマーを設計することが可能となる。例えば、ビブリオコレラとビブリオミミカスの塩基が相違する位置を必ず含むように、当該２菌種が相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上４０塩基以下の連続するｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列を含むプライマーを設計することが可能となる。同様に、ビブリオミミカスとビブリオコレラの塩基が相違する位置を必ず含むように、当該２菌種が相違する塩基を含む連続する１５塩基以上のｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列、好適には２０塩基以上、更に好適には２０塩基以上で１００塩基以下の連続するｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の塩基配列を含むプローブを設計することが可能となる。さらに、当該プライマー及びプローブの作成には、上記相違塩基を２以上の高頻度で含む領域、例えば、ｇｙｒＢ遺伝子においては、３６、３９、４２、４５、４８、５１のいずれかの位置を２以上含む領域、２８５、２９１、３０６のいずれかの位置を２以上含む領域、３８４、３９０、３９９のいずれかの位置を２以上含む領域、８６７、８７３、８７９、８８２、８８５のいずれかの位置を２以上含む領域、ｒｐｏＤ遺伝子においては、９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７のいずれかの位置を２以上含む領域、１２６、１３２、１４１のいずれかの位置を２以上含む領域、２１６、２２２、２３１、２４０のいずれかの位置を２以上含む領域、２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４のいずれかの位置を２以上含む領域、２７６、２８５、２９１のいずれかの位置を２以上含む領域、３２７、３３３、３４２、３４５のいずれかの位置を２以上含む領域、４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６のいずれかの位置を２以上含む領域、４４８、４５０、４５３、４６８のいずれかの位置を２以上含む領域、４８９、４９５、５０１のいずれかの位置を２以上含む領域、５１９、５２２、５２５、５４０のいずれかの位置を２以上含む領域、５８５、５９１、６００、６０３、６０６のいずれかの位置を２以上含む領域、６３９、６４５、６５４、６５７のいずれかの位置を２以上含む領域、６６６、６７５、６７９、６８０、６８１、６８７のいずれかの位置を２以上含む領域、７０２、７０５、７０８、７１４、７２０、７２３のいずれかの位置を２以上含む領域、７２９、７３２、７４１、７５０のいずれかの位置を２以上含む領域が好適に使用できる。また、プライマーの場合、３‘末端がビブリオコレラ又はビブリオミミカスに特異的な塩基であることが望ましい。
具体的には、ビブリオコレラ及びミミカス菌群を検出、定量又は同定用のプライマーとしては、
（１）ｇｙｒＢ遺伝子については、配列番号１の位置番号９６、１０７の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号２５８、２７０、２７９、２８５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号５４３、５５２、５５７のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号６９０、７０２、７１４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号７２９、７３３、７３４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖含む遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号７５９、７７１の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号１の位置番号７８２、７８６、７９２、７９５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。より具体的には、５‘−ｔｙｃａｙｗｃｓｃａａａｃｔｔａｃｃａ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｇａａｙｔｃｔｇｇｃｇｔｇｔｃｇａｔｃａａｇ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｃａｔｒｔａｇｔｔｇｔｔｃａａａｇｔａｃｇｇ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｇｇａｔｔｔｙａｃｙｔｃｃｇａａｇａａａｃｙａｇｃ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｙｇｃｃａｇｃｔｔｃｔｃａｔｔｃａｔｒ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｃｇｃｔｔｃｇｃｔｔｇｇｇｔｔｔｔｃｃ−３’又は対応する相補鎖、及び５‘−ｃａａｔａａｔｃｔｔｃｇａａｃａａａｃｇｔ−３’又は対応する相補鎖のいずれかである遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
（２）ｒｐｏＤ遺伝子については、配列番号２の位置番号６６、６７、７５、９０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号１７７、１７８、１８０、１８６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号２２３、２２７、２２８、２３１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号２５０、２５１、２５５、２５７、２５９、２６４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号３００、３０１、３０２、３０３、３０５、３１３、３１４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号３６２、３６９、３７３、３７４、３８０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号４００、４０２、４０９、４１０、４１５、４１６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号４２３、４２７、４３３、４４４、４４７のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号５０４、５１０、５１３のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号２の位置番号５４３、５５６、５５８のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、又は配列番号２の位置番号７４７、７５７、７６２、７６３のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。より具体的には、５‘−ｇａｔｔｇｃｔｇａｇｔａｔｃｃｔｇｇａａｃｃａｔｃ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｇａｙｃｃｔａａｃｇａｃａｔｇｇａａａｃｃ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｔｔｃｗｇａｒｃｔｙｔｃｔｇａａｇｃｓ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ａｇａｔｇａｙｇｍｋｇｔｃｇｙｓｇａｒ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｃｇａｃｇｇｔｇａａａｇｙａｇｃｇａｃａｇ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｃａａｔｇａａｃｔｇｃｇｃｇｇｙａａｇｔｔ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｇｔｃａｃｇａｃｃａａａｔｔｃａｔｔａａｃ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｇｙｙｔｇａｍｇｃｔｔｃａｇａｗｇｃｔｔｇｒｔｋａ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｙｇａｒｇｔｒｃｇｃａｇａｇｔｔｔｃａａｃｃ−３’又は対応する相補鎖、５‘−ｃａｔｙａｃｃａａｒｃｇｙｔｃｔｔｇｇ−３’又は対応する相補鎖、及び５‘−ｃｇｙｔｃａａｃａｇａｃａｇｔｇａｗｇｔｃ−３’又は対応する相補鎖のいずれかである遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
ビブリオコレラ用プライマーとしては、
（１）ｇｙｒＢについては、配列番号３の位置番号３６、３９、４２、４５、４８、５１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号３の位置番号２８５、２９１、３０６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号３の位置番号３８４、３９０、３９９のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号３の位置番号８６７、８７３、８７９、８８２、８８５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。より具体的には、５‘−ｇｇｔｇｇｔｔａａｃｇｃｇｃｔｙｔｃｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｙｃｇａｔｇａａｃｇｔｇａａｇａａｇａｔａａａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｇａｇａａａｇｔｃｔｔｃｃａｃｔｔｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｔｔａａａｇｔｇｇａａｇａｃｔｔｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、及び５‘−ｇｇｇｔａａｇｃｃｗｇｃａａｇａｔｃｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
（２）ｒｐｏＤについては、配列番号４の位置番号９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号１２６、１３２、１４１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号２１６、２２２、２３１、２４０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号２７６、２８５、２９１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号３２７、３３３、３４２、３４５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号４４８、４５０、４５３、４６８のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号４８９、４９５、５０１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号５１９、５２２、５２５、５４０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号５８５、５９１、６００、６０３、６０６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号６３９、６４５、６５４、６５７のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号６７９、６８０、６８１、６８７、７０２のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号７０５、７０８、７１４、７２０、７２３のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号４の位置番号７２９、７３２、７４１、７５０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、が挙げられる。より具体的には、５‘−ａｔｔｃｔｔｇａｇｃａｇｔｔｔｇａｔｃｇｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｃａｇｇｃｃｇａａｇａｇｃｔａｃｇｔｃｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｇａｇｃｔｔｔｃｔｇａａｇｃｇｇａｔｃｔｃｇｃｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａａｇａｔｇａｔｇｃｔｇｔｃｇｔｃｇａａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａａｇａｔｇａａｇａｃｇａａｇａｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｃｇｇｔａｔｃｇａｃｃｃｔｇａａｃｔｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｃａｔｃａａｇｃｔｔｃｔｇａａｇｃｇｔｃａｇａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｃａａｃｃａａｇｔｇｇｔｃｇａａｔｔｇｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ａｃｇｇａａｇａｔａｔｃｃａｒｃａｃｔａａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｃｇａａｃａｃｇａｔｃｃａｔｔｇａａｇｔｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａｔｇａａｃｇａｔｔｔｃｔｔｃｇｇｃａｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ａａｇｇａｃｔｔｔａｔｃｃａｇｃｃａｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｔｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃａｃｇｇａｃｔｔｔｃｇｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｔｃｔｇａａｔｔｇａａｃｇｇｃｇｇａｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、及び５‘−ｔｇｔｃｔｃｔｔｇｃｔｃｇａｔｃａｔｔｔｇｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
ビブリオミミカス用プライマーとしては、
（１）ｇｙｒＢについては、配列番号５の位置番号３６、３９、４２、４５、４８、５１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号５の位置番号２８５、２９１、３０６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号５の位置番号３８４、３９０、３９９のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号５の位置番号８６７、８７３、８７９、８８２、８８５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。より具体的には、５‘−ｇｇｔａｇｔｇａａｔｇｃｃｃｔｇｔｃａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｃｇｇａｔｇａｇｃｇｔｇａａｇａａｇａｔａａｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｇａａａａａｇｔａｔｔｃｃａｃｔｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｔｔｇａａｇｔｇｇａａｔａｃｔｔｔｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、及び５‘−ｗｇｇｃａａａｃｃａｇｃｋａｒｒｔｃｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
（２）ｒｐｏＤについては、配列番号６の位置番号９３、９６、１０５、１１４、１１５、１１６、１１７、のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号１２６、１３２、１４１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号２１６、２２２、２３１、２４０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号２５２、２５４、２５５、２６０、２６１、２６４のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号２７６、２８５、２９１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号３２７、３３３、３４２、３４５のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー。配列番号６の位置番号４２４、４２６、４３２、４４１、４４５、４４６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号４４８、４５０、４５３、４６８のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号４８９、４９５、５０１のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、位置番号５１９、５２２、５２５、５４０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号５８５、５９１、６００、６０３、６０６のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号６３９、６４５、６５４、６５７のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号６７９、６８０、６８１、６８７、７０２のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号７０５、７０８、７１４、７２０、７２３のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、配列番号６の位置番号７２９、７３２、７４１、７５０のいずれか２以上の位置の塩基を含む連続する１５塩基以上の鎖又はその相補鎖を含む遺伝子増幅プライマー、が挙げられる。より具体的には、５‘−ｃａｔｔｃｔｔｇａａｃａｇｔｔｔｇａｃａａｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｃａｇｇｃａｇａａｇａａｃｔａｃｇｔｃｔｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ａｇａｒｃｔｃｔｃｔｇａａｇｃｃｇａｔｃｔｃｇｃｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａａｇａｔｇａｃｇａｇｇｔｃｇｃｇｇａｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａｇｇａｔｇａａｇａｔｇａａｇａｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｇｇｔａｔｔｇａｃｃｃｔｇａｇｃｔｃ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔａａｃｃａａｇｃａｔｃｔｇａａｇｃｔｔｃａａｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｃａａｃｃａａａｔｇｇｔｃａａａｔｔｇｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｃｇｇａａｒａｔａｔｃｃａｇｔａｃｃａｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ａｃｇａａｃａｃｇａｔｃｃａｔｃｇａｇｇｔａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ａａｔａａａｔｇａｔｔｔｃｔｔｔｇｇｃａｔｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇａｇｙａｃｔｔｔａｔｃｒａｇｃｃａｔ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｇｔｃｔｔｃｔｔｇｃｔｃａｃｇｔａｃｔｔｔｔｔｇ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、５‘−ｔｔｇｇａｔｔｇａａｇｇｇｃｇａａｔａ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、及び５‘−ａｇｔｃｔｃｙｔｇｔｔｃｇａｔｃａｔｃｔｇｍ−３’又は対応する相補鎖からなる遺伝子増幅プライマー、並びに上記配列からなる鎖又は相補鎖を含む遺伝子増幅プライマーが挙げられる。
上記した領域、上記した配列からなる鎖又はその相補鎖自体をプライマーとして用いることができるほか、必要に応じ、アダプター配列等の他の配列をプライマーに含めることができる。
本件発明は、これらプライマー及びプローブを他の試薬と組み合わせたビブリオコレラ又はミミカスの検出、定量又は同定用のキットを包含するものである。
本発明で用いる遺伝子増幅方法は、ＰＣＲ法に限定されない。プライマーの特異性に基づく特異増幅方法、あるいは増幅の特異的阻害方法に用いる事が可能である。また、同様に特異増幅プライマーと標識特異プローブの組み合わせによる定量増幅反応にも用いる事が出来る。また、プローブ配列は単独で用いる事も可能である。その使用方法は、固相あるいは液相に限定されない。サイバーグリーンなどの増幅した二本鎖ＤＮＡを検出する試薬を用いて行うリアルタイムＰＣＲやＦＲＥＴ等を応用したリアルタイムＰＣＲを行う際のプライマー及びプローブとしても利用可能である。
本発明で得られた塩基配列の系統間特異性情報（図２、３、４）を用いる事によって、高特異性を有するプローブ、及び高特異性を有しかつ増幅効率に優れた遺伝子増幅用プライマーを設計する事が可能となった。本発明で得られたビブリオコレラまたはビブリオミミカス特異的塩基情報（図２、３、４）を基に作成したＰＣＲプライマーの配列を表２に示す。
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また、系統群としての情報を得ているため、解析した配列上のほぼ全長にわたって、この様な特異プライマーあるいはプローブを設計する事が可能である。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。実施例はその１様体であり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３６２８７８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子の部分配列を繋ぎ合わせた後に分子系統解析を行った結果を示した図。この図が近隣結合法による分子系統樹であり、ビブリオコレラ及びミミカスが他のビブリオ属細菌とは異なった単一の系統に属していることを示している。さらに、ビブリオコレラ及びミミカスもそれぞれが独立した系統群を形成していることを示している。
図２は、図１で示したビブリオコレラおよびミミカスが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図１中のＣ１，２，３）のｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオコレラおよびミミカスに特異的な塩基であることを示す。
図３は、図１で示したビブリオコレラおよびミミカスが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（上段）と近縁のクラスター（図１中のＣ１，２，３）のｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオコレラおよびミミカスに特異的な塩基であることを示す。
図４は、図１で示したビブリオコレラが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（上段）とミミカスが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオコレラに特異的な塩基であることを示す。
図５は、図１で示したビブリオコレラが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（上段）とミミカスが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオコレラに特異的な塩基であることを示す。
図６は、図１で示したビブリオミミカスが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（上段）とビブリオコレラが属するクラスターのｇｙｒＢ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオミミカスに特異的な塩基であることを示す。
図７は、図１で示したビブリオミミカスが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（上段）とビブリオコレラが属するクラスターのｒｐｏＤ遺伝子のコンセンサス配列（下段）を決定し比較した図。●で示した部位がビブリオミミカスに特異的な塩基であることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】  本発明により得られた、ビブリオコレラおよびミミカスに特異的である領域を用いて設計した表２に示された遺伝子増幅用プライマーを用いた実施例を示す。尚、請求項５の（２）、請求項５の（３）、請求項１１の（２）、および請求項１１の（７）に記載のプライマーはそれぞれ表２中のＣＭｇＦ、ＣＭｇＲ、ＣＭｒＦおよびＣＭｒＲに相当する。供試菌株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲはＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、合計２０μｌの反応液で行った。サーマルサイクラーの条件は、９５℃１０分の加熱後に９４℃１分、アニール（アニール温度は表５参照）１分、７２℃１分を３５サイクル行い、最後に７２℃１０分の伸長反応を行った。反応後のサンプルは、１％アガロースゲルで電気泳動後、臭化エチジュウムで染色し紫外線照射下で遺伝子の増幅の有無を確認した。ｇｙｒＢ遺伝子を標的としたＣＭｇＦとＣＭｇＲ、ｒｐｏＤ遺伝子を標的としたＣＭｒＦとＣＭｒＲのどちらの組み合わせにおいても、ビブリオコレラ及びミミカスに属するとされた菌株由来のＤＮＡからのみ増幅産物が確認された（表６）。
【実施例２】  本発明により得られた、ビブリオコレラまたはミミカスに特異的である領域を用いて設計した表３、４に示された遺伝子増幅用プライマーを用いた実施例を示す。尚、請求項１９の（１）、請求項１９の（３）、請求項１９の（４）、請求項１９の（５）、請求項２５の（１）および請求項２５の（１４）に記載のプライマーはビブリオコレラ特異的プライマーであって、それぞれ表３中のＣＦ１、ＣＦ２、ＣＲ２、ＣＲ１、ＣｒＦ１およびＣｒＲ１に、さらに請求項３３の（１）、請求項３３の（３）、請求項３３の（４）、請求項３３の（５）、請求項３９の（７）および請求項３９の（１３）に記載のプライマーはビブリオミミカス特異的であってそれぞれ表４中のＭＦ１、ＭＦ２、ＭＲ２、ＭＲ１、ＭｒＦ１およびＭｒＲ１に相当する。
実施例１と同様に、供試菌株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行った（アニール温度は表５参照）。いずれの場合も、ビブリオコレラに特異的なプライマーはビブリオコレラのみを、ビブリオミミカスに特異的なプライマーはビブリオミミカスのみから増幅産物が検出された（表６）。
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本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本件発明のｇｙｒＢおよびｒｐｏＤ遺伝子プライマー及びプローブは、ビブリオコレラおよびビブリオミミカスの系統関係を把握した上で設計したものであるため、特異性を向上させる検討が行われており、検出精度という点で優れている。従って、食品、臨床検体などから菌を単離せず、近縁細菌種が供雑している状況で直接検出する場合に有利になる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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