(57)【要約】本発明は、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞と、繊維状タンパク質を含有することを特徴とする細胞含有製剤である。この細胞含有製剤は、癌の成長又は転移等の抑制作用を有するＮＫ４を、より効率的に癌細胞に供給できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞と、繊維状タンパク質を含有することを特徴とする細胞含有製剤。
【請求項２】
細胞が、口腔粘膜上皮細胞、皮膚細胞、線維芽細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の細胞含有製剤。
【請求項３】
繊維状タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の細胞含有製剤。
【請求項４】
繊維状タンパク質の表面上に、細胞が担持されていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項５】
細胞が、形質転換体であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項６】
形質転換体が、組換え発現ベクターで形質転換されたものであることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の細胞含有製剤。
【請求項７】
組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０またはプラスミドである請求の範囲第６項に記載の細胞含有製剤。
【請求項８】
配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるペプチドを生成しうることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項９】
更に生分解性樹脂からなるメッシュシートを有することを特徴とする請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項１０】
生分解性樹脂が、ポリグリコール酸であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の細胞含有製剤。
【請求項１１】
抗癌剤又は癌の転移抑制剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項１２】
卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、グリオーマまたはメラノーマの抗癌剤又は転移抑制剤である請求の範囲第１１項に記載の細胞含有製剤。
【請求項１３】
血管新生抑制剤であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載の細胞含有製剤。
【請求項１４】
哺乳動物に、請求の範囲第１項〜第１３項のいずれかに記載の細胞含有製剤を投与することを特徴とする癌の成長、浸潤並びに転移抑制方法又は血管新生抑制方法。
【請求項１５】
繊維状タンパク質の表面上で細胞を培養し、更に培養された細胞を、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法。
【請求項１６】
生分解性樹脂からなるメッシュシートの上に繊維状タンパク質を被覆することによって繊維状タンパク質シートを作製し、得られた繊維状タンパク質シートの表面上で細胞を培養し、更に培養された細胞を、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法。
【請求項１７】
細胞を配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換し、得られた形質転換細胞と繊維状タンパク質を混合することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＮＫ４をコードするＤＮＡを利用して、癌の成長、浸潤又は転移を予防・治療するためのＮＫ４を供給する細胞含有製剤に関する。より詳しくは、ＮＫ４をコードするＤＮＡを形質転換された細胞から分泌されるＮＫ４を、癌細胞又は癌組織に供給することにより癌の成長、浸潤又は転移を予防・治療する細胞含有製剤及び該製剤を用いて腫瘍の成長、浸潤又は転移を抑制する方法、更には該製剤の製造方法に関する。
【背景技術】  膵臓癌等の転移しやすい癌は、完全治癒が困難で、癌に冒された部分の臓器組織を切除することが、唯一効果のある治療方法とされている。しかしながら、転移しやすい癌は、癌細胞の周囲組織への浸潤速度が速く、切除手術後の予後が不十分であると、非常に高い頻度で転移癌が再発してしまう（例えば非特許文献１又は２参照）。癌で死亡する場合、原発腫瘍が直接の原因でなく、この再発した転移癌が原因である場合が多い。
癌治療には、例えば放射線治療や抗癌剤投与等の化学療法が通常用いられており、特に転移しやすい癌においては、癌再発防止の観点から、上記の臓器組織切除手術ととともに化学療法を補助的に行う治療方法も試みられている。しかしながら放射線治療や抗がん剤投与等の化学療法は、その癌抑制効果が認められているものの、様々な副作用、例えば骨髄抑制、脱毛、心臓・神経障害、消化管・肝臓等の障害が出る危険性があり、必ずしも安全な治療方法とは言えない。
従って癌治療においては、原発腫瘍そのものの増殖を抑制する治療方法のみならず、転移癌の発生を阻止する方法の開発に対する要望も非常に高い。しかもこの両方を満足して、副作用がなく、生体に安全な治療方法は未だ確立されていないのが現状である。
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、α鎖とβ鎖とで構成されるヘテロダイマータンパク質である。ＨＧＦはｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合することにより、マイトゲン活性、モートゲン活性、モルフォゲン活性を発現し、腫瘍細胞の浸潤、転移等を誘発したり、血管新生を誘導する作用を有することが、多数の研究より報告されている（例えば非特許文献３又は４参照）。
ＮＫ４は、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなるペプチドであって、上記のＨＧＦがｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合するのを阻害することにより、ＨＧＦのアンタゴニストとして作用する（例えば非特許文献５又は６参照）。ＮＫ４は、このＨＧＦアンタゴニスト活性により、腫瘍の成長、浸潤又は転移を抑制し、またＨＧＦアンタゴニスト活性を発現するのとは別のメカニズムで、ＨＧＦのみならずＶＥＧＦやｂＦＧＦによる血管新生作用をも抑制することが知られている（例えば非特許文献７参照）。
上記の点から、ＮＫ４を癌組織に供給すると、癌の成長、転移等が抑制される。しかもＮＫ４は生体由来のタンパク質であることから、生体に投与しても安全である。
ＮＫ４を癌組織に供給する方法としては、ＮＫ４そのものを投与する方法、又はＮＫ４をコードする遺伝子を直接癌細胞に導入し、癌細胞内でＮＫ４を産生させる等という遺伝子治療技術を用いた方法等が挙げられる。ＮＫ４そのものを癌細胞等に直接投与する方法は、即効性があり、しかも高い治癒効率を期待できるという点で好ましいが、ＮＫ４を産生しうる細胞等を多量に培養し、細胞からＮＫ４を抽出・精製するプロセスが必要となるため、操作が煩雑となる。
一方、ＮＫ４をコードする遺伝子を癌細胞に導入する方法は、ＮＫ４を別途、製造・精製する必要がない点において有利である。該遺伝子を癌細胞に導入する手段としては、ＮＫ４をコードする遺伝子を、例えばアデノウイルスベクター等に組み込み、該ベクターを癌細胞に感染させる方法が一般的である。
癌治療に有効なタンパク質をコードする遺伝子又は癌治療に有効なタンパク質そのものを癌細胞に導入する方法として、該遺伝子を有するベクター又はタンパク質そのものを光硬化型ゼラチンに含有させ、該ゼラチンで癌組織を覆うことにより、ベクターと癌組織を接触させてベクターを癌細胞に感染させるか、又はタンパク質を癌組織に浸透させる方法がこれまでに開示されている（例えば非特許文献８）。本方法では、タンパク質は効率よく癌細胞に浸透させることができたが、巨大分子であるベクターの癌細胞内への浸透率が低く、有効に遺伝子を癌細胞に導入することは困難であった。この点から、癌細胞にはタンパク質そのものを供給する方が有利であると考えられるが、上述した通り、タンパク質を別途、製造・精製する必要があるため、本方法は、実用化において必ずしも優れた技術とは言えない。
従って、本発明の細胞含有製剤の如く、実用的でかつ効率的にＮＫ４を癌組織に供給できる技術はこれまでに知られていない。つまり本発明の細胞含有製剤は、上記のＮＫ４そのものを投与する方法及びＮＫ４をコードする遺伝子を直接癌細胞に導入して癌細胞内でＮＫ４を産生させる方法の両方の有利な点を有する技術であり、ＮＫ４を別途、製造・精製する必要がなく、癌細胞への浸透効率が高いタンパク質の形でＮＫ４を癌組織に供給することができる。しかも投与部位に適した形状に形成することができ、例えばシート状にした場合には、ターゲットとなる癌組織の領域全体を覆うことができる。しかも手術により癌組織を削除した残余部を覆うことにより、手術により取りきれなかった原発腫瘍が原因となる癌の転移・再発を防止することもできる。
更に本発明の細胞含有製剤は、上述した化学療法等を用いた場合に見られるような副作用等を発症する危惧がなく、また患者本人から採取した自家細胞を用いて製剤を作製すれば、より患者に安全な抗癌剤又は癌転移抑制剤となりうる。
【非特許文献１】  武田著、「膵臓癌における化学療法の役割（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）」、ヘパトガストロエンテロロジー（Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、米国、２００１年、第４８巻、第４０号、ｐ．９５３−９５６
【非特許文献２】  シエンヒューゴス（Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ  ＪＡ）、「膵臓カルシノーマにおける術中放射線治療の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」、ヨーロピアンジャーナルオブサージカルオンコロジー（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．）、英国、２０００年、第２６−Ａ巻、Ｓ１３−１５
【非特許文献３】  松本邦夫ら、「肺の形態形成及び癌浸潤における肝細胞増殖因子の役割；上皮−間葉相互作用及び腫瘍−間質相互作用のメディエーターとしての役割（ＨＧＦ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｖａｓｉｏｎ：ｒｏｌｅ  ａｓ  ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｔｒｏｍａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）、キャンサーケモセラピーアンドファーマコロジー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９６年、第３８巻Ｓｕｐｐｌ、Ｓ４２−７
【非特許文献４】  チャンＷ．Ｇ．ら（Ｊｉａｎｇ．Ｗ．Ｇ  ｅｔ  ａｌ．）、ＨＧＦ／スキャッター因子、癌におけるその分子的、細胞的、臨床的影響（ＨＧＦ／ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｔｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、１９９９年、クリティカルレビューオンコロジーヘマトロジー（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第２９巻、ｐ２０９−２４８
【非特許文献５】  伊達ら（Ｄａｔｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）、ＨＧＦアンタゴニストのＮＫ４による癌の成長及び浸潤抑制（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｏｕｒ−ｋｒｉｎｇｌｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＨＧＦ／ＮＫ４）ｆｏｒ  ＨＧＦ）、１９９８年、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第１７巻、第２３号、ｐ３０４５−５４
【非特許文献６】  パーＣら（Ｐａｒｒ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．）、ＨＧＦ／ＳＦにより誘導されるパキシリンのリン酸化、前立腺癌細胞のマトリックス付着及び浸潤が、ＮＫ４（ＨＧＦ／ＳＦ誘導体）により抑制される（Ｔｈｅ  ＨＧＦ／ＳＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｘｉｌｌｉｎ，ｍａｔｒｉｘ  ａｄｈｅｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｅｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ＮＫ４，ａｎ  ＨＧＦ／ＦＳ  ｖａｒｉａｎｔ．）、２００１年、バイオケミカルバイオフィジカルリサーチコミュニケイション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、第２８５巻、第５号、ｐ１３３０−７
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【非特許文献８】  ジェインＲＫら（Ｊａｉｎ  ＲＫ．，ｅｔ  ａｌ．）、固形腫瘍における薬剤障害（Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）、１９９４年、サイエンティフィックアメリカン（Ｓｃｉ  Ａｍ．）、第２７１巻、第５号、ｐ４９８−５０４
【発明の開示】
本発明は、癌の成長又は癌の転移・再発の抑制効果を有し、かつ生体に安全な細胞含有製剤、より詳細には、癌の成長又は転移等の抑制作用を有するＮＫ４を、より効率的に癌細胞に供給できる細胞含有製剤を提供することを目的とする。また本発明は、上記の細胞含有製剤を用いて、癌の成長を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法又は血管新生を抑制する方法を提供すること及び上記細胞製剤の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む細胞を、繊維状タンパク質、例えばコラーゲンとともに成形し、この複合体を癌組織周囲に移植することにより、該複合体の細胞内で産生されたＮＫ４を、より有効にかつ過不足なく癌組織に供給できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて更に検討を重ね、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）  配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞と、繊維状タンパク質を含有することを特徴とする細胞含有製剤、
（２）  細胞が、口腔粘膜上皮細胞、皮膚細胞、線維芽細胞であることを特徴とする前記（１）に記載の細胞含有製剤、
（３）  繊維状タンパク質が、コラーゲンであることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の細胞含有製剤、
（４）  繊維状タンパク質の表面上に、細胞を有していることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（５）  細胞が、形質転換体であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（６）  形質転換体が、組換え発現ベクターで形質転換されたものであることを特徴とする前記（５）に記載の細胞含有製剤、
（７）  組換え発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０またはプラスミドである前記（６）に記載の細胞含有製剤、
（８）  配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるペプチドを生成しうることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（９）  更に生分解性樹脂からなるメッシュシートを有することを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（１０）  生分解性樹脂が、ポリグリコール酸であることを特徴とする前記（９）に記載の細胞含有製剤、
（１１）  抗癌剤又は癌の転移抑制剤であることを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（１２）  卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、グリオーマまたはメラノーマの抗癌剤又は転移抑制剤である前記（１１）に記載の細胞含有製剤、
（１３）  血管新生抑制剤であることを特徴とする前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞含有製剤、
（１４）  哺乳動物に、前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の細胞含有製剤を投与することを特徴とする癌の成長、浸潤並びに転移抑制方法又は血管新生抑制方法、
（１５）  繊維状タンパク質の表面上で細胞を培養し、更に培養された細胞を、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法、
（１６）  生分解性樹脂からなるメッシュシートの上に繊維状タンパク質を被覆することによって繊維状タンパク質シートを作製し、得られた繊維状タンパク質シートの表面上で細胞を培養し、更に培養された細胞を、配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法、
（１７）  細胞を配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する組換え発現ベクターで形質転換し、得られた形質転換細胞と繊維状タンパク質を混合することを特徴とする細胞含有製剤の製造方法。
に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本発明の細胞含有製剤及びその移植方法の一例を示す模式図を示す図である。
第２図は、組換えアデノウィルスベクターＡｄ−ＮＫ４の模式図を示す図である。
第３図は、本発明の細胞含有製剤の一例のＳＥＭ解析像（断面図）示す図である。
第４図は、Ａｄ−ＮＫ４を導入されたＯＭＥＣのＮＫ４分泌を時間経過とともにモニターした図である。
第５図は、ＯＭＥＣの増殖における、Ａｄ−ＮＫ４導入の影響を示す図である。
第６図は、Ａｄ−ＮＫ４を導入されたＯＭＥＣから分泌されるＮＫ４による、膵臓癌細胞浸潤抑制の効果を示す図である。
第７図は、細胞含有製剤の一例を移植した腫瘍モデルマウスにおける、腫瘍内及び血清中のＮＫ４濃度を示す図である。
第８図は、細胞含有製剤の一例を移植した腫瘍モデルマウスにおける、腫瘍体積の増加抑制効果を示す図である。
第９図は、細胞含有製剤の一例を移植した腫瘍モデルマウスにおける、新生血管数の増加抑制効果を示す図である。
図中の符号１はコラーゲンゲルを、２はバイクリルＴＭメッシュシートを、３はＯＭＥＣを、４はＡｄ−ＮＫ４が導入されたＯＭＥＣを、５は遺伝子産物（ＮＫ４）を、６は癌組織を、７は組織を表す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の細胞含有製剤は、（ａ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有する細胞と、繊維状タンパク質とを含有することを特徴とする。
配列番号：１又は２で表される塩基配列は、ＮＫ４をコードするＤＮＡの一例である。また配列番号：２で表される塩基配列は、配列番号：１で表される塩基配列の３９１番目から４０５番目までの塩基が欠失しているものであって、該ＤＮＡにより産生されるタンパク質も、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有する。
本発明において、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
上記の配列番号：１又は２で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号：１又は２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられ、より具体的には種々の人為的処理、例えば、部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断により、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換、付加等し、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであって、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有するペプチドを産生できるＤＮＡであればよい。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有するＤＮＡ等とは、具体的には、（ａ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の塩基が欠失した塩基配列、（ｂ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列に１又は２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の塩基が付加した塩基配列、（ｃ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、または（ｄ）それらを組み合わせた塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
ＤＮＡの塩基配列の置換等は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
（ａ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列を完全に有するＤＮＡ断片のクローニングの手段としては、（ａ）又は（ｂ）の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマー、例えは公知のＨＧＦプライマー（例えば配列番号５又は６に表される塩基配列を有するＤＮＡ断片）を用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡの中から、標識されたＨＧＦタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーションさせることによって選別することができる。
また、公知のＨＧＦの塩基配列情報から従来公知の方法を用いて化学合成によりクローニングすることもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法が挙げられる。
本発明に用いられるＤＮＡは、細胞内でのＤＮＡの安定性を高めるため、また、もし毒性があるならＤＮＡの毒性をより小さなものにするために修飾されていてもよい。このような修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３等に開示される技術に準じて行ってよい。
また本発明に用いられるＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するため、その核酸の３’末端あるいは５’末端が、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコール等をはじめとした当該分野で公知の保護基により化学修飾されたものであってもよい。
更に該ＤＮＡは５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終始コドンとしてのＴＡＡ，ＴＡＧまたはＴＧＡを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終始コドンは、適当なＤＮＡアダプターを用いて該ＤＮＡに付加することができる。また５’末端側には、ポリアデニル化配列を有していることが好ましい。
ＮＫ４をコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦのアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を発現することができるものであれば、本発明に用いることができ、また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。本発明においては、このようなＲＮＡも、本発明に用いられるＤＮＡに含まれるものとする。
本発明で用いられる細胞は、（ａ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）配列番号：１又は２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有することを特徴とする。
本発明で用いられる細胞への上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡの導入方法は、特に限定されず公知の手段に従ってよい。例えば、プラスミドやウイルス等の組換え発現ベクター又はリポソーム、マイクロカプセル等の人工ベクターに含有させて細胞に導入する方法が挙げられるが、本発明においては、組換え発現ベクターを用いるのが好ましい。組換え発現ベクターを宿主へ導入する方法としては、自体公知の方法であればいずれも用いることができる。例えば、コンピテント細胞法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４（１９７０）］、ＤＥＡＥデキストラン法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６（１９８２）］、インビトロパッケージング法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２，５８１（１９７５）］、ウイルスベクター法［Ｃｅｌｌ，３７，１０５３（１９８４）］、マイクロインジェクション法［Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１５３，３４７（１９８４）］、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１（１９８３）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、プロトプラスト法［特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］に記載の方法等を挙げることができる。
本発明に用いられる組換え発現ベクターは、導入された細胞内で（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを発現させ、ＮＫ４を有効に産生する事ができる発現ベクターであることが好ましく、例えば、ＮＫ４をコードする塩基配列を含むＤＮＡ断片を例えばｃＤＮＡから切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
組換え発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等が、枯草菌由来のプラスミド、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等が、酵母由来プラスミド、例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等が、λファージ等のバクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等の動物ウイルス等の他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。中でも、本発明で用いるベクターとしては、ウイルスが好ましく、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はアデノウイルスがより好ましい。
アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型若しくは５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。アデノウイルスは、感染効率が他のウイルスベクターに比べて高いこと、分裂していない細胞に感染することができること及び細胞のゲノムに組み込まれないことが知られており、これらの観点からアデノウイルスベクターを用いることがさらに好ましい。
ウイルスベクターはウイルス遺伝子を完全又はほぼ完全に欠失する複製欠失ウイルスが好ましい。アデノウイルスベクターは少なくともＥ１領域が非機能的であることが好ましい。また、他の領域も改変してよく、特にＥ３領域（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２領域（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４領域（ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７）又は後期遺伝子Ｌ１からＬ５の任意のものを改変することができる。複製欠失ウイルスのような改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により作成することができる。また、改変ウイルスベクターは、自体公知の方法により回収・精製することができる。尚、例えば、特表平１１−５１４８６６、特表平１１−５０６３１１、特表平９−５００５２４、特表平８−５０１７０３、特表平８−５０８６４８又は特開平８−３０８５７５等に記載された改変ウイルスベクターを用いることもできる。
前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、哺乳動物細胞を宿主とする場合は、ラウス肉腫ウイルス（ウイルスＲＳＶ）、ＭＰＳＶ、ポリオマーウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスゲノムから得られるプロモーター、メロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
組換え発現ベクターには、ＮＫ４をコードするＤＮＡを発現させるため、または発現に有利になるように、更に下記する調節配列が付加されているものを用いることができる。各々の調節配列はベクターに対して内在性であっても外来性であってもよい。
このような調節配列としては、シグナル配列、プロモーター、プロペプチド配列、エンハンサー、選択マーカー、ターミネーター等を挙げることができるが、これらに限定されない。調節配列には、ＮＫ４をコードするＤＮＡと調節配列との連結及び／又は上記調節配列同士間の連結が容易となるように、予めリンカーを持たせることもできる。
なお、組換え発現ベクターにシグナル配列を組み込むことにより、宿主細胞内に産生されたＮＫ４が宿主細胞外に積極的に分泌される。その結果、産生されたＮＫ４を目的とする部位に効率よく供給することができ、癌の成長抑制、転移抑制又は血管新生を抑制することができる。
シグナル配列としては、宿主が哺乳動物細胞である場合には、ＨＧＦ・シグナル配列、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列等が利用できるが、特に本発明においては、ヒト由来のＨＧＦシグナル配列を利用するのが好ましい。
シグナル配列を付加する方法としては、自体公知の方法を用いて行うことができ、例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）、特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法が挙げられる。
また高等哺乳動物、例えばヒトの細胞を宿主として用いる場合には、ベクターにエンハンサーを導入することが好ましい。エンハンサーを導入することにより、ベクターに挿入されたＤＮＡの転写が増大する。エンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、ポリオマーエンハンサー、アデノウイルスのエンハンサー等が挙げられる。
選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ＤＨＦＲ−）細胞を用いてＤＨＦＲ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合は、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択することができる。
これらのウイルスベクター等にＮＫ４をコードするＤＮＡ断片等を挿入し、これを宿主細胞に感染又は形質転換することによって、本発明のＮＫ４を産生しうる細胞含有製剤を構成する細胞を作製することができる。
ウイルスベクターの調製法、ウイルスベクターへのＤＮＡ断片の挿入方法は、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社（１９９６）、あるいは、別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社（１９９７）等に記載されている。
本発明の細胞含有製剤に用いられる細胞は、上記組換え発現ベクター等の宿主となりうる細胞であれば特に限定されないが、例えば、動物細胞、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、昆虫細胞等が挙げられる。
動物細胞としては、例えば、ヒト等の哺乳動物の口腔粘膜上皮細胞（以降、ＯＭＥＣと略す）、皮膚細胞、線維芽細胞、各種上皮細胞等を含む体細胞、又はサル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウス細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスＣ１２７細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒト細胞ＨｅＬａ、ヒトＦＬ細胞、ヒト胎児腎臓由来の２９３細胞［実験医学、１２、３１６（１９９４）］、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞等を含む各種細胞株が用いられる。
前記動物細胞は、実験室用に確立された細胞又は生体の組織から分離した細胞等のいずれであってもよい。生体組織から分離した細胞は、例えば、適切な手段で摘出した組織を、Ｄｉｓｐａｓｅ又はＥＤＴＡなどで処理し、ついで、トリプシン処理して単一の細胞まで分離することによって得られる。さらに、得られた単一細胞を適切な培地でコンフルエントになるまで培養し、継代を２〜３回繰り返して細胞を確立する。確立された細胞は、トリプシン処理及びコラゲナーゼ処理することにより、再度単一細胞として採取され、本発明の細胞として用いることができる。細胞の種類によっては、細胞の培養にフィーダーレイヤー法を用いるのがよい。例えば、本発明の細胞にＯＭＥＣ又は皮膚角化表皮細胞を用いる場合には、マウス胎児由来の線維芽細胞（３Ｔ３細胞）をフィーダー細胞として用いるのが好ましい。フィーダーレイヤー法は、公知の手法、例えば［Ｕｅｄａ  Ｍ，Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ．Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．，３５（５），ｐ４９８−５０４（１９９５）］、「Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ  ＪＧ，Ｓｅｒｉａｌ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｋｅｒａｔｉｏｎｏｃｙｔｅｓ：ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｉｚｉｎｇ  ｃｏｌｏｎｅｉｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．，Ｃｅｌｌ．，６（３），ｐ３３１−３４３（１９７５）」等に従ってよい。
エシェリヒア属菌の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，ｐ５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，ｐ４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕、ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ，９６，ｐ２３−２８（１９９０）〕、ＤＨ１０Ｂ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７巻，ｐ４６４５−４６４９（１９９０）〕等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。ビフィズス菌としては、例えばＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ等が挙げられる。乳酸菌としては、例えばラクトバチラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）等が挙げられる。
酵母としては、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等が用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
上記動物細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，ｐ４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア属菌にＤＮＡを導入するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）や、Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）等に記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）等に記載の方法に従って行うことができる。
酵母へのＤＮＡの導入は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，ｐ１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，ｐ１９２９（１９７８）等に記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞へのＤＮＡの導入は、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６巻，ｐ４７−５５（１９８８）等に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、ＮＫ４をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入された形質転換体を得ることができる。
本発明は、ＮＫ４をコードするＤＮＡを含む細胞とともに、繊維状タンパク質を有することを特徴とする。繊維状タンパク質は、本発明の細胞含有製剤において、ＮＫ４をコードするＤＮＡを有する細胞の支持担体としての役割を果たす。該繊維状タンパク質を含有することにより、本発明は様々な形状、例えばシート状、球状、チューブ状等となることができ、生体のあらゆる部位に投与が可能となる。繊維状タンパク質としては、コラーゲン、ケラチン、フィブロイン、エラスチン、フィブリン等が挙げられる。本発明においては、この中でも哺乳類の真皮組織や軟骨組織等の主要構成成分であるコラーゲン、特にＩ型コラーゲンが好ましい。繊維状タンパク質は、哺乳動物等の生体由来のタンパク質であることから、生体に安全である。
また本発明に用いる繊維状タンパク質には、その繊維状の構造中に、本発明に用いる細胞を培養するのに適した培地成分が含まれていることが好ましい。繊維状タンパク質に培地成分が含まれることによって、本発明に含有される細胞に栄養を供給することができ、本発明を生体に投与した場合、生体内において細胞を長期に安定な状態で生存させることができ、ＮＫ４の癌組織への供給を安定化及び長期化させることができる。
本発明に用いる細胞を培養するのに適した培地成分と、上記繊維状タンパク質、例えばＩ型コラーゲンを混合し、この混合物を約３０〜３７℃、約１５分〜１時間静置し、所望の形状、例えばシート状、球状、チューブ状等に固化させることにより、培地成分を含むコラーゲンゲルを作製することができる。該培地成分含有コラーゲンゲルを薄厚形状、例えばシート状等にする場合には、その強度の保持及び操作の簡便化のために、培地成分含有コラーゲンゲルを生分解性樹脂からなるメッシュシート等に固定し、コラーゲンゲル複合材料として作製してもよい。コラーゲンゲル複合材料の作製方法は特に限定されないが、生分解性樹脂からなるメッシュシート等の上に、培地成分とコラーゲンとの混合物を流し込み、メッシュシート上でコラーゲンゲルを作製するのがよい。
上記生分解性樹脂製メッシュシートとしては、生分解性高分子材料製の手術用縫合糸等からなるメッシュシート等が好ましい。特に本発明においては、生分解性高分子がポリグリコール酸であることが好ましく、市販の生分解性樹脂製メッシュシートとしては、編糸型バイクリルＴＭメッシュ（ｋｎｉｔｔｅｄ−ｔｙｐｅ  ＶＩＣＲＹＬＴＭ  ｍｅｓｈ；Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）等を挙げることができる。
更に本発明の細胞含有製剤は、通常製剤に添加されることが薬事法上許容されている他の添加成分、例えば徐放性付与剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を含んでいても良いが、これらの種類及び含有量等は、本発明に含まれる細胞の増殖・生存及び／又はＮＫ４の分泌等を阻害しないことが好ましく、本発明の目的を損なわない範囲であることが好ましい。
これらの他の添加成分は、コラーゲンゲルを作製する際に、培地成分中に予め含ませておくのがよい。徐放性付与剤としては、ゼラチン等のタンパク質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。等張化剤としては、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム等を使用することができる。またｐＨ調整剤としては、リン酸塩、アミノ酸等を挙げることができる。
培地成分含有コラーゲン材料は、所望によりその強度を高めるために、更に圧縮されて高密度化されていてもよい。圧縮の方法は特に限定されないが、医療用のゴム製ヘラやゴムカップ等の器具、例えばシリコンカップ等を用いて、固化したコラーゲンゲルの上部より圧力をかける方法等を用いることができる。
本発明は、上記で作製した培地成分含有の繊維状タンパク質、例えば培地成分含有コラーゲンゲルと、ＮＫ４をコードするＤＮＡを含む細胞とを含有することを特徴とするが、培地成分含有コラーゲンゲルとＮＫ４をコードするＤＮＡを含む細胞とは、本発明内において一体化又は非一体化のいずれの状態で存在していてもよい。一体化状態とは、上記コラーゲンゲル中に上記細胞が分散している状態を言い、このような細胞分散型コラーゲンゲルは、上記コラーゲンゲル作製時に、培地成分中に細胞を予め混合させておくことにより作製することができる。非一体化状態とは、上記一体化状態以外の状態、例えばコラーゲンゲル表面上に細胞が層をなして存在している状態を言い、このような細胞上置型コラーゲンゲルは、コラーゲンゲルを作製した後、該コラーゲンゲル表面上に細胞を塗布又は接種して培養することにより作製することができる。本発明においては、細胞とコラーゲンゲルは非一体化状態、特にコラーゲンゲル表面上に細胞が層をなして存在していることが好ましい。細胞の層は、単一層であっても、複層であってもよい。該形状にすることにより、細胞からなる層を直接投与部位に接触させることができ、細胞から分泌されたＮＫ４を癌細胞等に効率的に供給することができる（第１図参照）。
また、本発明に用いられる細胞は、コラーゲンゲルと一体化又は非一体化される前に、予めＮＫ４をコードするＤＮＡが導入されていてもよいし、コラーゲンゲルと一体化又は非一体化された後に、ＮＫ４をコードするＤＮＡが導入されて、ＮＫ４をコードするＤＮＡを有する細胞とされてもよい。
本発明において、細胞とコラーゲンゲルが一体化されている場合には、ＤＮＡの宿主細胞への導入効率を考慮して、細胞には予めＤＮＡが導入されていることが好ましい、また、本発明において好ましい形態である非一体化された形態、つまりコラーゲンゲル表面上に細胞が層をなして存在している形態においては、コラーゲンゲル上で培養され、層をなしている宿主細胞に、ウイルスベクター等を用いてＮＫ４をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。
繊維状タンパク質材料に含まれる培地としては、宿主細胞が動物細胞である場合、動物細胞の培養に通常用いられる培地であれば特に制限されないが、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕等が用いられる。細胞を培養する場合、培養時におけるｐＨは、約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。なお、培養における温度、酸素濃度、二酸化炭素濃度などの条件は、細胞に応じて適宜設定することができる。
宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である場合、培養に使用される培地としては、生育に必要な炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地であれば特に限定されないが、例えば、ＬＢ培地（日水製薬）、グルコース及びカザミノ酸等を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７２〕等が好ましい。ＮＫ４をコードするＤＮＡを有するベクターのプロモーターを効率よく働かせるために、必要により、例えば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である場合、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，ｐ４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，ｐ５３３０（１９８４）〕等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である場合、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５巻，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
本発明の細胞含有製剤は、用いる宿主細胞内にＮＫ４をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを有することにより、ＮＫ４を産生することを特徴とする。本発明の細胞含有製剤で産生されるＮＫ４としては、（ａ）配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡ又は（ｂ）配列番号：１若しくは配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるペプチドであって、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用等を有するタンパク質が挙げられる。特に好ましいタンパク質として、（ｃ）配列番号：３又は４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド又は（ｄ）配列番号：３又は４で表されるアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同一なペプチド、特にそのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用を有するペプチドが挙げられる。
なお、本発明における遺伝子工学又は生物工学の基本操作については、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル  講談社、高木康敬編  遺伝子操作実験法  講談社、モレキュラー・クローニング第３版、メッソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４（１９９１）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法  羊土社（１９９４）等に記載された方法に従って行うことができる。
本発明の細胞含有製剤は、支持担体として繊維状タンパク質、例えばコラーゲン等を含有することにより、投与部位に適した様々な形状、例えばシート状、球状、チューブ状等に成形することができ、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。例えば、シート状にした場合、癌組織そのものを覆うことができ、癌組織全体の個々の細胞に過不足なくＮＫ４を供給することができる。更には外科的手術により癌組織を取り除いた部位に、該部位を覆う形で投与することにより、術後の癌の転移や再発を防止することもできる。
本発明の細胞含有製剤の投与量は、治療目的の疾患の種類、患者の症状、年齢、体重、投与部位等により適宜調整されるが、通常癌患者（体重６０ｋｇとして）においては、一般にＮＫ４をコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の細胞含有製剤は、癌又は／及び血管新生による疾患の予防・治療剤として、及び、癌の転移防止剤として使用することができる。従って、本発明の細胞含有製剤は腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。また、本発明の細胞含有製剤を用いて、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導又は／及び血管新生抑制方法を提供することができる。
本発明の対象疾患の癌としては、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、グリオーマ等が挙げられるが、なかでも卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、メラノーマ又はグリオーマが好ましく、特に、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌が好ましい。
血管新生による疾患としては、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、老人黄班部変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、又はペルオーシス等）、血管繊維腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫等）、白血病を含む造血器腫瘍、固形腫瘍、腫瘍
また、本発明の細胞含有製剤は、外科的療法や放射線療法又は他の化学療法と組み合わせて用いることもできる。外科的療法としては、上述した腫瘍の切削等が挙げられる。放射線療法としては、ガンマ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子線照射等が挙げられる。また他の化学療法としては、抗腫瘍剤の投与等が挙げられる。抗腫瘍剤としては、例えばアルキル化剤、各種代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、抗腫瘍性植物成分、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質）等が挙げられる。
本発明の細胞含有製剤の抗癌剤、癌転移抑制剤等としての効果、つまり本発明が有するＨＧＦアンタゴニスト活性及び血管新生抑制作用の測定は、公知の方法、例えば後に記載する測定方法等に準じて行うことができる。
【実施例】  以下、本発明の実施例を説明するが、以下の開示は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。
（製造例）細胞含有製剤の作製
（１）  ＮＫ４ｃＤＮＡの作製
Ｗｉｓｔｅｒラットの皮下組織細胞又はＯＭＥＣから、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｍＲＮＡを単離し、これを使用してＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＮＫ４ｃＤＮＡを単離した。具体的には、ｍＲＮＡ溶液０．５μｌ（１５０ｎｇ）、１０×ＲＴ−ＰＣＲ溶液［５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー：１（１０ｍＭ）２μｌ、プライマー：２（１０ｍＭ）２μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）０．５μｌ、ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５μｌ、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）０．５μｌ及びＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ  ３５．２μｌを混合し、４２℃  ３０分、９５℃  ５分で逆転写反応を行い、９４℃  ３０秒、５５℃  １分、７２℃  １分のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃で７分間反応させてＮＫ４ｃＤＮＡを得た。このようにして得られたＮＫ４ｃＤＮＡをＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｐＣＲＩＩＴＭベクターにクローニングし、ｐＣＲＩＩ／ＮＫ４を得た。なお、プライマーには、配列番号５又は６に表されるＤＮＡ断片を用いた。
（２）  組換え発現ベクターの構築
（１）で作製したｐＣＲＩＩベクターに組み込まれたＮＫ４ｃＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ／ＳｐｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）処理により切断末端を平滑化させた。得られたＮＫ４ｃＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩで処理し、切断末端を平滑化しておいたヒトアデノウイルスベクターＶ型（Ｅ１ａ欠損、Ｅ３部分欠損）と混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで結合してＮＫ４発現ベクターＡｄ−ＮＫ４（第２図）を得た。
（３）ＯＭＥＣの確立
３〜６週令のＷｉｓｔｅｒラットから、口腔内組織を取り出して細分化し、これを抗生物質（ペニシリンＧカリウム１０００Ｕ／ｍｌ、カナマイシン１ｍｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ  ２．５μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４．４、Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に２回浸漬した。浸漬後の組織を、０２％ディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に再度浸漬した。次いで０．２５％トリプシン及び５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液を用いて室温で３０分間処理後、１０％のＦＢＳ（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含むＤＭＥＭ培地で洗浄した。得られた検体組織を、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で３０分間攪拌して個々の細胞を遊離させ、ポアサイズ５０μｍのフィルターを用いてろ過することにより、遊離ＯＭＥＣを得た。
Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞（Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ；Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、４μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で２時間処理した後、１０％ＣＯ２含有ＥＦＭ培地［ＤＭＥＭ培地：Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ培地（Ｎｉｈｏｎｓｅｉｙａｋｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）＝３：１］を有する６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）の各ウェルに、１×１０５個ずつ接種した。上記１０％ＣＯ２含有ＥＦＭ培地には、５％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌインシュリン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、５μｇ／ｍｌトランスフェリン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２×１０−９Ｍトリヨードチロシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、１０ｎｇ／ｍｌコレラ毒（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）、０．５μｇ／ｍｌハイドロコルチゾン（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌカナマイシン及び０．２５ｍｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを補填した。
次いで遊離ＯＭＥＣを、各ウェルに１×１０５個ずつ接種した。細胞の接種後３日目に、各ウェルに表皮細胞増殖因子（Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）１０ｎｇ／ｍｌを添加した。７〜１０日後、ＯＭＥＣがコンフルエント状態になったのを確認後、継代培養した。継代培養２又は３代目の細胞を、確立細胞として取得した。
（４）  コラーゲンゲルの作製
編糸型バイクリルＴＭメッシュシート（ｋｎｉｔｔｅｄ−ｔｙｐｅ  ＶＩＣＲＹＬＴＭ  ｍｅｓｈ；ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ  ９１０；Ｎｉｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を、２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のウェルに設置し、その上に、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地０．５ｍｌと、同培地に懸濁したＩ型コラーゲン（０．３質量％；ＣＥＬＬＧＥＮ，Ｋｏｋｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）０．５ｍｌとの混合液を流し込んだ。３７℃で３０分間静置し、コラーゲンゲルバイクリルＴＭメッシュ複合材料を作製した。該複合材料上のコラーゲンゲルをシリコンカップを用いて圧縮し、高密度化した。
（５）  コラーゲンゲル付着ＯＭＥＣシートの作製
上記（３）で得られた確立ＯＭＥＣを、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて遊離細胞とした。得られた遊離細胞を、（４）で作製したコラーゲンゲル表面上に、２×１０５個／ｃｍ２なるように接種した。３７℃で２〜３日培養し、コラーゲンゲル表面上にＯＭＥＣ層を作製した。第３図は、作製したコラーゲンゲル付着ＯＭＥＣシートのＳＥＭ（走査型電子顕微鏡）断面像である。第３図より、コラーゲンゲル付着ＯＭＥＣシートが、ＯＭＥＣの細胞層、コラーゲンゲル層及びバイクリルＴＭメッシュシート層の３層からなることが確認された。ＳＥＭ解析には、ＪＯＥＬ社製ＪＳＭ−８４０Ａを用いた。
（６）  ＯＭＥＣへのＡｄ−ＮＫ４の導入
（５）で得られたコラーゲンゲル付着ＯＭＥＣが入った２４穴プレートの各ウェルに、２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を５００μｌ添加し、（２）で作製したＡｄ−ＮＫ４を、培地５００μｌ当り１０〜２００ＭＯＩ（感染多重度）で、３７℃、２時間感染させた。感染後、培養上清を取り除き、細胞含有製剤（製造例１）を得た。尚、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子を発現するＥ１ａ、Ｅ１ｂ及びＥ３欠損型アデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌａｃＺ：Ｈ．Ｕｅｎｏ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を、上記と同様にコラーゲンゲル付着ＯＭＥＣに感染させ、比較例１を作製した。
（試験例１）  ＮＫ４をコードするＤＮＡが導入されたＯＭＥＣのＮＫ４生産能の確認
Ｉ型コラーゲンをコートした１２穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の各ウェルに、ＯＭＥＣを２×１０５個接種した。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１ｍｌ添加後、７２時間培養し、次いで、培地５００μｌに対して１０、５０，１００又は２００ＭＯＩでＡｄ−ＮＫ４を感染させた（Ａｄ−ＮＫ４導入ＯＭＥＣ）。感染後、培養上清を取り除き、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ１ｍｌを各ウェルに添加した。感染後４８時間毎の培養上清を分取し、培養上清中のＮＫ４分泌量を測定した。対照として、Ａｄ−ＮＫ４で感染させないＯＭＥＣ（Ａｄ−ＮＫ４非導入ＯＭＥＣ）も同様に培養し、ＮＫ４分泌量を測定した。ＮＫ４の濃度は、ＩＭＭＵＮＵＳ  ｈｕｍａｎ  ＨＧＦ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。
結果を第４図に示す。Ａｄ−ＮＫ４導入ＯＭＥＣでは、感染後４日目に、ＭＯＩ１００又は２００において分泌量が最多となり、その後、ＭＯＩに関係なく徐々に低下した。Ａｄ−ＮＫ４非導入ＯＭＥＣでは、ＮＫ４の分泌は見られなかった。尚、各測定値は、平均値±ＳＤで表した。
（試験例２）  ＮＫ４をコードするＤＮＡが導入されたＯＭＥＣのコラーゲンゲル上での増殖能確認
Ｉ型コラーゲンをコートした２４穴プレートの各ウェルに、ＯＭＥＣを５×１０４個接種した。７２時間培養後、１００ＭＯＩでＡｄ−ＮＫ４を感染させた（Ａｄ−ＮＫ４導入ＯＭＥＣ）。感染後、培養上清を取り除き、ＦＥＭ培地５００μｌを各ウェルに添加した。２４又は４８時間後、０．０５％−ＥＤＴＡを用いて細胞を分離し、細胞数を、細胞計数分析装置（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ：Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて計測した。対照として、Ａｄ−ＮＫ４で感染させないＯＭＥＣ（Ａｄ−ＮＫ４非導入ＯＭＥＣ）も同様に培養し、細胞数を計測した。尚、各測定値は、平均値±ＳＤで表した。
結果を第５図に示す。Ａｄ−ＮＫ４導入ＯＭＥＣとＡｄ−ＮＫ４非導入ＯＭＥＣは、そのコラーゲンゲル上での増殖能には殆ど差がなかった。上記試験例１の結果と合わせると、ＯＭＥＣがウイルスベクターにより形質転換されていても、またＮＫ４を分泌しても、コラーゲンゲル上での増殖能には、殆ど影響がないことが確認された。
（試験例３）  ＮＫ４をコードするＤＮＡが導入されたＯＭＥＣから産生されるＮＫ４による癌浸潤抑制効果の確認
Ｉ型コラーゲンをコートした１２穴プレートの各ウェルに、ＯＭＥＣを１×１０５個接種した。７２時間培養後、１００ＭＯＩでＡｄ−ＮＫ４を感染させた（Ａｄ−ＮＫ４導入ＯＭＥＣ）。感染後、培養上清を取り除き、２％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ１ｍｌを各ウェルに添加した。感染３日又は４日後の培養上清を分取し、この上清（ＮＫ４−ｓｕｐ）を浸潤抑制試験に用いた。浸潤抑制試験には、２４穴ウェルマトリゲルインベイジョンダブルチャンバー（２４−ｗｅｌｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｈａｍｂｅｒ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｌｄ，ＭＡ）を用いた。
ＨＧＦを産生するヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５：ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）を、上記マトリゲルインベイジョンダブルチャンバーのアウターカップに含まれる１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに、１．５×１０５個／ｃｍ２になるよう接種した。２４時間培養後、培養液を２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換した。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（対照）又は上記ＮＫ４−ｓｕｐに懸濁した膵臓癌細胞（ＳＵＩＴ−２又はＡｓＰＣ−１：Ｈ．Ｉｇｕｃｈｉ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｙｕｓｈｕ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）を、マトリゲルインベイジョンダブルチャンバーのインナーカップに５×１０４個／カップとなるよう接種した。２４時間培養後、ヘマトキシン−エオシン染色を行い、浸潤した膵臓癌細胞数を計測した。浸潤細胞数は、無作為に顕微鏡下５視野を選択し、その平均値±ＳＤで表した。
結果を第６図に示す。２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（対照）に懸濁した膵臓癌細胞及びＮＫ４−ｓｕｐに懸濁した膵臓癌細胞ともに、ＭＲＣ−５非存在下（ＭＲＣ−５（−））では、膵臓癌細胞の種類に関係なく浸潤は殆ど見られなかったが、ＭＲＣ−５存在下（ＭＲＣ−５（＋））では、ＭＲＣ−５非存在下（ＭＲＣ−５（−））に比べ、膵臓癌細胞の浸潤が見られ、その浸潤細胞数の増加はＳＵＩＴ−２細胞において顕著であった。これに対し、ＮＫ４−ｓｕｐに懸濁した膵臓癌細胞では、ＳＵＩＴ−２及びＡｓＰＣ−１ともに、浸潤細胞数の増加が著しく抑制された。
（実施例１）  細胞含有製剤のＮＫ４産生
４週令のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ，Ｋｙｕｄｏ  Ｃｏ．，Ｌｙｄ．，ｓａｇａ，Ｊａｐａｎ）の左わき腹筋肉内に、ＤＭＥＭ５０μｌに懸濁したＡｓＰＣ−１細胞３×１０６個を移植し、腫瘍を形成した。ＡｓＰＣ−１細胞移植１４日後、上記製造例で作製した製造例１（製造例１群：ｎ＝３）又は比較例１（比較例１群：ｎ＝３）を、第１図に示す形態で、腫瘍形成部位の皮下に移植した。対照として、ＡｓＰＣ−１細胞を移植したのみの群（対照群：ｎ＝３）を作製した。製造例１又は比較例１の移植後４日目に、ヌードマウスの腫瘍を周辺組織とともに採取した。各群から採取した腫瘍をＰＢＳで１回洗浄後、ＲＩＰＡバッファー「１％ＲＩＰＡ（ＵＰＳＴＡＴＥ，ＮＹ）、１ｍＭオルトバナジウム酸Ｎａ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ：Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）」を用いてホモジナイズし、それぞれの腫瘍から抽出液を得た。この腫瘍抽出液中のＮＫ４含有量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。また、製造例１群から血清を採取し、血清中のＮＫ４含有量も同様に測定した。尚、各測定値は、平均値±ＳＤで表した。
結果を第７図に示す。対照群及び比較例１群からの腫瘍抽出液中のＮＫ４は０．３ｎｇ／総タンパク量（ｇ）以下であったのに対し、製造例１群からの腫瘍抽出液中のＮＫ４は、１５５．８５±６０．８３ｎｇ／総タンパク量（ｇ）であった。また製造例１群の血清中には、ＮＫ４は検出されなかった。このことから、製造例１を移植されたマウスの腫瘍には、製造例１から分泌されたＮＫ４が供給されており、しかも目的の腫瘍に局所的かつ効率的に供給されていることが確認された。
（実施例２）  細胞含有製剤を用いた癌の成長抑制
実施例１と同様に、ヌードマウスに腫瘍を形成した。ＡｓＰＣ−１細胞移植３日後、上記製造例で作製した製造例１（製造例１群：ｎ＝５）又は比較例１（比較例１群：ｎ＝５）を、第１図に示す形態で、腫瘍形成部位の皮下に移植した。対照として、ＡｓＰＣ−１細胞を移植したのみの群（対照群：ｎ＝５）を作製した。製造例１又は比較例１の移植後３日及び５日目に、ヌードマウスの腫瘍体積を、測径器（キャリパー）を用いて測定した。腫瘍体積は、以下の式▲１▼を用いて特定した。尚、各測定値は、平均値±ＳＤで表した（＊；ｐ＜０．０５）。
式▲１▼：腫瘍体積（ｍｍ２）＝０．５２×（幅［ｍｍ］）２×（長さ［ｍｍ］）
結果を第８図に示す。比較例１群及び対照群において、時間の経過とともに、腫瘍体積は著しく増加した。これに対し、製造例１群では、腫瘍体積の増加が抑制された。このことから、製造例１は、腫瘍の増殖抑制効果を有することが明らかとなった。
（実施例３）  細胞含有製剤を用いた血管新生抑制
実施例１と同様に、ヌードマウスに腫瘍を形成した。ＡｓＰＣ−１細胞移植３日後、上記製造例で作製した製造例１（製造例１群：ｎ＝４）又は比較例１（比較例１群：ｎ＝４）を、第１図に示す形態で、腫瘍形成部位の皮下に移植した。対照として、ＡｓＰＣ−１細胞を移植したのみの群（対照群：ｎ＝３）を作製した。ＡｓＰＣ−１細胞移植１４日後、各群より採取した腫瘍を免疫組織化学的染色し、新生した血管数を計測した。免疫組織化学染色法を以下に述べる。各群より採取した組織片をパラフィン固定し、該組織片にフォンビルブラント因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ：ＤＡＫＯ  Ｃｏ．，ＣＡ）に対するウサギポリクローナル抗体を付着後、ＤＡＢペルオキシダーゼ複合体（ＤＡＢ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を用いて染色した。顕微鏡下（×２００倍）で新生血管数を計測した。尚、各測定値は、平均値±ＳＤで表した。（＊；ｐ＜０．０５）
結果を第９図に示す。比較例１群及び対照群において、著しい血管の新生が見られた。これに対し、製造例１群では、新生血管数の増加が抑制された。このことから、製造例１は、血管新生抑制効果を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明の細胞含有製剤は、原発腫瘍又は癌の転移抑制に対して有効でかつ生体に安全な治療剤であって、より詳細には癌の成長又は転移等の抑制作用を有するＮＫ４を、より効率的に癌細胞に供給することができる。更に本発明の細胞含有製剤を用いて、原発腫瘍の成長を抑制する方法、癌の転移を抑制する方法又は血管新生を抑制する方法を提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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