(57)【要約】磁性微粒子を取り込んでいない表皮角化細胞と磁性微粒子を取り込んだ表皮角化細胞を２４ウェル超低接着プレートに播種し、ウェルの底面外側にネオジ磁石を設置したあと１日間培養した。その結果、磁性微粒子を取り込んでいないコントロールの表皮角化細胞は、ウェルの底面に接着せず、未分化細胞シートを形成しなかった。これに対して、磁性微粒子を取り込んだ表皮角化細胞は、磁力により底面に吸引されたまま重層化細胞シートを形成した。この細胞シートは、ウェルの底面外側に設置したネオジ磁石を外した後、親水性膜を付着させた磁石を上方から近づけてこの膜を介して磁石に吸引し引き上げることにより、容易に回収することができた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する細胞培養方法であって、
接着依存性の細胞に磁性微粒子を保持させることにより該細胞を磁性化する磁性化工程と、
細胞非接着性の底面を有する培養容器に前記磁性化された細胞を播種する播種工程と、
前記播種工程のあと前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引する吸引工程と、
前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま所定状態になるまで培養する培養工程と、
前記磁性化された細胞が前記所定状態に達したあと前記磁力を除去することにより前記所定状態に達した細胞を前記培養容器の底面から解放する解放工程と
を含む細胞培養方法。
【請求項２】
前記磁性微粒子はリポソームに封入されて磁性微粒子封入正電荷リポソーム（ＭＰＣＬ）を構成し、前記磁性化工程では前記細胞に前記ＭＰＣＬを取り込ませることにより該細胞を磁性化する、請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記磁性微粒子は抗体を固定化したリポソームに封入されて磁性微粒子封入リポソーム（ＡＭＬ）を構成し、前記磁性化工程では前記細胞と該細胞に特異的に結合する抗体を固定化した前記ＡＭＬとを結合させることにより細胞を磁性化する、請求項１に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養方法であって、
前記解放工程のあと前記所定状態に達した細胞を磁力によって回収する回収工程を含む、細胞培養方法。
【請求項５】
前記回収工程では、前記培養容器に懸架用支持膜を入れ該支持膜に前記所定状態に達した細胞を磁力を利用して付着させて引き上げることにより回収する、請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記回収工程では、前記磁力として通電・遮電により励磁・消磁を制御可能な電磁石の磁力を用いる、請求項５に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記接着依存性の細胞は、表皮細胞あるいは網膜色素上皮細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記培養工程では、前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま細胞シートが形成されるまで培養する、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記培養工程では、前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま重層化細胞シートが形成されるまで培養する、請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞培養方法によって製造される細胞シート。
【請求項１１】
細胞層が複数積層した細胞シートであって、
前記細胞層のほぼすべてが未分化細胞層である、細胞シート。
【請求項１２】
磁性微粒子を保持した接着依存性細胞で構成される細胞シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、接着依存性の細胞を培養する細胞培養方法及びそれによって得られる細胞シートに関する。
【背景技術】  近年、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養し、移植用又は試験用の組織として利用される培養組織を作製する技術が注目を浴びている。このような技術は、１９８０年初頭にハワード・グリーンらによって、不活化したマウス３Ｔ３細胞を支持細胞とすることでヒト表皮細胞が培養されたことに始まっている。この種の技術を利用して表皮細胞シートを作製する場合には、表皮細胞を培養してシート化したあとのシートは培養容器の底面に付着しているため、ディスパーゼ等の酵素処理によって表皮細胞シートを培養容器の底面から剥がす工程を行っている。ところが、酵素処理は、細胞表面の接着タンパクを分解させることから、細胞へのダメージが懸念される。
この懸念を解消するために、種々の提案がなされている。例えば、特公平６−１０４０６１号公報には、酵素処理を施さずに環境温度を変化させることで、増殖させた細胞を支持体表面から剥離・回収する技術が開示されている。具体的な実施例としては、ポリスチレン製のペトリ皿の表面をＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミドで被覆して電子線照射で重合させたあと、牛胎児血清（ＦＣＳ）を２０％含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を培地として牛の大動脈の血管内皮細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で培養して十分増殖させ、その後４℃に冷却し放置して酵素処理等を行うことなく付着培養細胞を剥離させたことが記載されている。この結果は、温度を３７℃から４℃に下げることでペトリ皿の表面が疎水性から親水性へと変化したことによると記載されている。
このような温度感応性ポリマーの使用は、培養組織の剥離方法に関する１つの手法として認知されつつあるが、酵素処理を施すことなく培養組織を剥離させる方法としてより多くの選択肢を提供することは技術の発展のために必要なことである。また、温度感応性ポリマーによる方法は、単層のシートを重ねることで重層化組織を構築することができるが、単層のシートを一枚ずつ積層していくのは手間がかかる。
【発明の開示】
本発明は、上述した課題に鑑みなされたものであり、酵素処理を施さずに培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。また、環境温度を大きく変化させることなく培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。更に、簡単に重層化組織を得ることができる細胞培養方法を提供することを目的の一つとする。更にまた、新規な細胞シートを提供することを目的の一つとする。
上述した目的の少なくとも一つを達成するために、本発明は以下の手法を採用した。即ち、本発明は、細胞を培養する細胞培養方法であって、
接着依存性の細胞に磁性微粒子を保持させることにより該細胞を磁性化する磁性化工程と、
細胞非接着性の底面を有する培養容器に前記磁性化された細胞を播種する播種工程と、
前記播種工程のあと前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引する吸引工程と、
前記磁性化された細胞を磁力によって前記培養容器の底面に吸引したまま所定状態になるまで培養する培養工程と、
前記磁性化された細胞が前記所定状態に達したあと前記磁力を除去することにより前記所定状態に達した細胞を前記培養容器の底面から解放する解放工程と
を含むものである。
この細胞培養方法では、細胞非接着性の底面を有する培養容器に磁性化された細胞を播種したあと、該磁性化された細胞を磁力によって培養容器の底面に吸引し、そのまま所定状態になるまで培養し、所定状態に達したあと磁力を除去することにより所定状態に達した細胞を細胞非接着性の底面から解放する。つまり、接着依存性細胞は培養容器の底面に磁力によって吸引され擬似的に接着しているに過ぎないため、磁力を除去すれば培養容器の底面から容易に解放される。したがって、酵素処理を施さずに培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる。また、温度感応性ポリマーを使用する方法に比べて環境温度を大きく変化させることなく培養容器から培養後の細胞を取り出すことができる。
本発明の磁性化工程で用いる接着依存性の細胞（培養面に直接又は間接的に接着したあとその接着面積を広げていき、その後細胞分裂する細胞、足場依存性細胞ともいう）としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞（角膜上皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、羊膜上細胞、網膜色素上皮細胞などを含む）、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞のほか、胚性幹細胞（ＥＳＣ）や間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの幹細胞や接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、細胞非接着性の底面としては、細胞接着依存性の細胞が接着しない又は接着しにくい性質の底面であればどのようなものでもよく、ポリスチレン、ポリプロピレン、フッ素樹脂、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエステルなどを材質とする培養容器の底面（メンブレンでもよい）や、アガロース、寒天、ゼラチン、コラーゲン、フィブリンなどでコーティングされた培養容器の底面（メンブレンでもよい）や、陽性荷電した培養容器の底面などが挙げられる。細胞非接着性の底面を有する容器としては、例えば、コーニング社の超低接着性プレート（商品名）などが挙げられる。なお、接着しにくい性質の底面とは、磁力を除去したときに磁性化された細胞が軽く容器を振れば底面から離れる程度の接着性を持つ底面をいう。
本発明の磁性化工程で用いる磁性微粒子としては、細胞に保持されると共に保持されることで細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよいが、例えば、マグネタイトなどの磁性微粒子をリポソームで封入した磁性微粒子封入正電荷リポソーム（ＭＰＣＬ，Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）や抗体を固定化したリポソームで封入した磁性微粒子封入リポソーム（ＡＭＬ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｍａｇｎｅｔｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を構成する磁性微粒子であってもよいし、第一化学製品社のＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）内の磁性マイクロビーズやベリタス社の磁性ナノパーティクル（商品名ＥａｓｙＳｅｐ）などであってもよい。これらの磁性微粒子のうち、ＭＰＣＬやＡＭＬのようにリポソームを含む磁性微粒子は、リポソームの存在によって細胞内に取り込まれるので一つの細胞が多くの磁性微粒子を取り込むことができ、磁力によって培養容器の底面に吸引され得る程度の磁気を容易に持つことができるため、好ましい。
ＭＰＣＬは、図１に一例を示すようにマグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に正電荷脂質を備えた構造を持つ。多くの細胞は負電荷を有しているため正電荷を持つＭＰＣＬと結合しやすく、またＭＰＣＬはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。このため、本発明において磁性微粒子としてＭＰＣＬを採用すれば、種々の細胞の培養に適用することができる。ＭＰＣＬは、例えばＪｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第８７巻第１１７９〜１１８３頁（１９９６年）に記載されたマグネタイト封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ，Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の製造方法を参照して調製すればよい。磁性化工程でＭＰＣＬを採用するときには、ＭＰＣＬを１細胞当り磁性微粒子として１〜１５０ｐｇ、特に２０〜１５０ｐｇ使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とＭＰＣＬとの接触を開始してから０．５〜８時間後、特に３〜５時間後に次工程へ進むことが好ましい。
ＡＭＬは、図２に一例を示すように、マグネタイト等の磁性微粒子をリポソームで封入しリポソーム間に抗体を備えた構造を持つ。抗体としては培養しようとする特定の細胞に特異的に結合するものを選択する。抗体と特異的に結合する部位を持つ細胞はＡＭＬの抗体と結合しやすく、またＡＭＬはリポソームを有しているため細胞内に取り込まれやすい。ＡＭＬは、例えばＪ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊｐｎ．第３４巻第６６〜７２頁（２００１年）に記載された方法を参照して調製すればよい。磁性化工程でＡＭＬを採用するときには、ＡＭＬを１細胞当り磁性微粒子として１〜１５０ｐｇ、特に２０〜１５０ｐｇ使用することが好ましく、また、磁性化工程では培養しようとする細胞とＡＭＬとの接触を開始してから０．５〜８時間後、特に３〜５時間後に次工程へ進むことが好ましい。
本発明の播種工程では、細胞種や目的とする培養組織の大きさなどによって適宜播種密度などを設定すればよいが、１×１０３〜１×１０６個／ｃｍ２の範囲で播種密度を設定するのが一般的である。
本発明の吸引工程では、磁性化した細胞を培養容器の底面に吸引する磁力を加えればよい。例えば、磁性化した細胞を培養容器の底面外側に設置した磁石により培養容器の底面に吸引する場合、磁性微粒子の種類、磁性微粒子が細胞に取り込まれた量、培養容器の底面の材質、その底面の厚さなどに基づいて、適宜磁力を決定する。
本発明の培養工程では、培養対象となる細胞の種類によって液体培地の種類を適宜選定すればよい。例えば、周知のＤＭＥＭやα−ＭＥＭ、Ｍ１９９培地などを選定してもよい。また、ＥＧＦやＦＧＦに代表される成長因子等の添加因子を適宜添加してもよい。この培養工程では細胞が所定状態になるまで培養するが、所定状態とは目的に応じて適宜選定すればよい。例えば、培養細胞により細胞シートが形成されるまで培養してもよく、このとき細胞シートは単層化細胞シートであってもよいし、重層化細胞シートであってもよい。あるいは、継代培養に利用する場合には、継代培養操作のしやすさを考慮して各細胞ごとに分散した状態を選定してもよい。
本発明の解放工程において磁力を除去するには、磁性化した細胞が培養容器の底面に吸引しない程度の磁力になるようにすればよい。例えば、磁性化した細胞を培養容器の底面外側に設置した磁石により培養容器の底面に吸引していた場合、磁性微粒子の種類、磁性微粒子が細胞に取り込まれた量、培養容器の底面の材質、その底面の厚さなどに基づいて、その磁石を培養容器底面から離間する距離を決定する。
本発明の細胞培養方法は、解放工程のあと所定状態に達した細胞を磁力によって回収する回収工程を含んでいてもよい。この回収工程では、培養容器に懸架用支持膜を入れ該支持膜に所定状態に達した細胞を磁力を利用して付着させて引き上げることにより回収してもよい。ここで懸架用支持膜とは、所定状態に達した細胞をほぼそのまま懸架できるものであればいずれのものでもよく、編物、織布、不織布、紙、樹脂シートなどが挙げられる。たとえば、滅菌ガーゼ、滅菌和紙、滅菌濾紙、滅菌不織布のほか、ＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）やＰＴＦＥ膜（ポリテトラフルオロエチレン膜）等の親水性膜（表面を親水処理したものを含む）や、シリコーンゴムなどの柔軟性のある高分子材料やポリグリコール酸、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーや寒天培地やコラーゲンゲル、ゼラチンゲルなどのハイドロゲルなどをシート状にしたものなどが挙げられる。また、磁力としては通電・遮電により励磁・消磁を制御可能な電磁石の磁力を用いてもよい。こうすれば、所定状態に達した細胞を回収する作業を自動化しやすいばかりでなく、その後細胞を移動したりパッケージングしたりする作業も自動化しやすいため便利である。
本発明の細胞培養方法によって製造される細胞シートは、培養容器に直接接着させずに磁力によって吸引して培養したため、細胞層が複数積層しているときには細胞層のすべて又は多くが未分化細胞層となる。このような未分化細胞層が豊富な細胞シートはこれまでに知られていなかったため、例えば創傷部分へ移植した時に高い創傷治癒効果が期待される。
【図面の簡単な説明】  図１は、磁性微粒子封入正電荷リポソーム（ＭＰＣＬ）の一例の模式図である。
図２は、抗体が固定化された磁性微粒子封入リポソーム（ＡＭＬ）の一例の模式図である。
図３は、細胞シートの断面写真である。
図４は、培養時間とマグネタイト取り込み量との関係を表すグラフである。
図５は、培養時間と生存細胞数との関係を表すグラフである。
図６は、ヘマトキシリンとエオシンで染色したＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞シートの断面を表す写真である。
図７は、ＲＰＥ細胞シートを移送する様子を表す説明図で、（ａ）はシートがワイヤに付着する前の様子を表し、（ｂ）はシートがワイヤに付着したときの様子を表し、（ｃ）はシートがワイヤから外れたときの様子を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】  実施例１として、表皮細胞（ケラチノサイト）を培養して培養表皮シートを作製する場合について説明する。
（１）使用細胞
正常ヒト表皮角化細胞は研究用として市販されているクラボウ社製のものを用いた。表皮角化細胞の培地としては、増殖用培地として無血清培地ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）を使用し、分化誘導培地としてＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２に塩化カルシウムを添加して総カルシウム濃度を１．０ｍＭに調整したものを使用した。
（２）マグネタイト封入正電荷リポソーム（ＭＣＬ，Ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）の調製
ＭＣＬは、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第８７巻第１１７９〜１１８３頁（１９９６年）に記載された方法により調製した。具体的には、まず３種類のリン脂質、即ちＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル−Ｄ−グルタメート  クロリド（相互薬工社製）、ジラウロイルホスファチジルコリン（シグマケミカル社製）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（シグマケミカル社製）をモル比１：２：２で含むリポソーム膜を作成し、続いて１ｍＬのコロイド状マグネタイト（マグネタイト量２０ｍｇ、マグネタイトは戸田工業社製）を添加して、周知のボルテックス法にてＭＣＬを作成した。マグネタイト濃度はチオシアン酸カリウム法で測定したところ、１８ｍｇ／ｍｌであった。
（３）表皮角化細胞へのＭＣＬの取り込み
表皮角化細胞を増殖用培地に懸濁して細胞懸濁液を調整し、組織培養皿（旭テクノグラス社）に１×１０４個／ｃｍ２となるように播種した。細胞が細胞培養皿の底面に接着するまで静置した後、増殖用培地を加えてＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養は３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿空気環境下で行った。１回目の培地交換では、馴化期間を過ぎ、対数増殖期にある表皮角化細胞の培地を交換したが、この際、交換用の新鮮な増殖用培地にはＭＣＬを含ませたものを使用した。ＭＣＬ濃度は表皮角化細胞の細胞数に対して１細胞当りマグネタイトとして５０ｐｇになるように添加した。この後、ＭＣＬ含有増殖用培地で培養することによって、ＭＣＬを表皮角化細胞に取り込ませた。
（４）磁石を用いた細胞培養方法
ＭＣＬを取り込んだ表皮角化細胞がほぼコンフルエント状態に至ったあと、トリプシン処理によって組織培養皿の底面から細胞を剥離し、非接着性の底面を有する２４ウェル超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に播種した。播種細胞数は２×１０６個／ウェルとなるように播種した。一方、コントロールとしてＭＣＬを取り込ませていない表皮角化細胞を２４ウェル超底接着プレートに２×１０６個／ウェルとなるように播種した。
播種後、各ウェルの底面外側にネオジ磁石（外形３．０ｃｍφ、表面磁束密度０．４５Ｔ）を設置したあと１日間培養し、表皮角化細胞がシート化して未分化細胞シートを形成するか否かを観察した。更に培地を分化誘導培地に交換したあとネオジ磁石を設置したままの状態で１日間培養し、表皮角化細胞が分化して重層化細胞シートを形成するか否かを観察した。その結果、ＭＣＬを取り込んでいないコントロールの表皮角化細胞は、ウェルの底面に接着せず、未分化細胞シートを形成しなかった。これに対して、ＭＣＬを取り込んだ表皮角化細胞は、５層に重層化した未分化細胞シートを形成した（図３（ａ）参照）。この未分化細胞シートは、ウェルの底面外側に設置したネオジ磁石を外した後、親水処理したＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）を先端に付着させた棒状のアルニコ磁石（外形１．０ｃｍφ、残留磁束密度１．２７Ｔ）を上方から培養液面に近づけることで磁力によって細胞シートを培養液面に浮上させＰＶＤＦ膜を介して磁石に吸引しそのまま引き上げることにより、容易に回収することができた。また、未分化細胞シートを分化誘導培地で更に１日間培養したところ、未分化細胞の一部が分化した１０層の重層化細胞シートを形成した（図３（ｂ）参照）。この重層化細胞シートは、分化によってシートが収縮しており、ウェルの底面外側に設置したネオジ磁石を外すと培地中に浮遊し、容易にウェルの底面から剥離した。また、この重層化細胞シートは、ピンセットを用いて扱うことができるほどの強度を持っていた。
ところで、図３（ｃ）はグリーンらの培養方法により得られた従来の細胞シートの断面図であり、書籍「人体再生」（立花隆著、中央公論新社、２０００年６月１０日発行）の２２９頁に掲載されているものである。このグリーンらの培養方法では、細胞が容器底面に接着することで自動的に分化が発生し、図３（ｃ）のような角化した層の多い重層化細胞シートが得られたものと考えられる。これに対して、上述した実施例では、培養容器に直接接着させずに磁力で吸引して培養したため未分化のまま細胞同士が重層化したものと考えられる。ちなみに、図３（ａ）ではほぼすべての細胞層が未分化細胞層であり、図３（ｂ）でも図３（ｃ）に比べて多くの細胞層が未分化細胞層となっている。
【実施例２】  実施例２として、網膜色素上皮細胞（Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ，以下ＲＰＥ細胞という）を培養してシートを作製する場合について説明する。
（１）使用細胞等
正常なヒトＲＰＥ細胞として、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のＡＲＰＥ−１９細胞を用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿空気環境下で行った。また、培地として、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓＦ１２に１０％のウシ胎児血清と抗生物質（濃度１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと濃度０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を添加したものを使用した。
（２）ＭＣＬの調製
ＭＣＬは、上述した実施例１の（２）と同様にして調製した。
（３）ＲＰＥ細胞へのＭＣＬの取り込み
ＡＲＰＥ−１９細胞を培地に懸濁して細胞懸濁液を調製し、組織培養皿（旭テクノグラス社）に６×１０５個／ｃｍ２となるように播種した。２４時間培養したのち、ＭＣＬ（マグネタイト濃度２５ｐｇ／ｃｅｌｌ又は５０ｐｇ／ｃｅｌｌ）を含む培地に交換し、再び培養した。マグネタイト取り込みの分析を行うため、定期的にサンプリングし、チオシアン酸カリウム法で鉄分濃度を測定すると共にトリパンブルーを利用した色素排除法により生存細胞数を確認した。
ＡＲＰＥ−１９細胞によるマグネタイトの取り込みは急速に起こった。ＭＣＬを含む培地による培養開始から８時間後、マグネタイト濃度２５ｐｇ／ｃｅｌｌ、５０ｐｇ／ｃｅｌｌの培地において、細胞のマグネタイト濃度はそれぞれ１０ｐｇ／ｃｅｌｌ、２７ｐｇ／ｃｅｌｌと最高値に達した（図４参照）。その後、細胞のマグネタイト濃度は細胞増殖によって希釈し、培養開始から４８時間後には濃度がわずかに薄くなった。
また、ＭＣＬを含む培地（マグネタイト濃度２５ｐｇ／ｃｅｌｌ、５０ｐｇ／ｃｅｌｌ）におけるＡＲＰＥ−１９細胞の増殖と、ＭＣＬを含まない培地におけるＡＲＰＥ−１９細胞の増殖を比較し、ＡＲＰＥ−１９細胞に対するＭＣＬの有害性を調べた。しかし、いずれの濃度においても、ＭＣＬがＡＲＰＥ−１９細胞の増殖を抑制することはなかった（図５参照）。したがって、その後の実験においてＡＲＰＥ−１９細胞にマグネタイトを取り込ませる際には、マグネタイト濃度５０ｐｇ／ｃｅｌｌの培地で行った。
（４）磁石を用いた細胞培養方法
磁力によりＡＲＰＥ−１９細胞を集積させた状態で培養することにより４ｍｍ２以下の重層化細胞シートを作製した。具体的には以下の手順により細胞シートを作製し、評価した。即ち、ＭＣＬを添加してから４時間後、細胞数３×１０４の細胞を２４ウェル超低接着プレート（コーニング社）の中央に配した２．４ｍｍ径のクローニングリング（高さ１０ｃｍ、内部面積４ｍｍ２、旭テクノグラス社）の内側に播種した。なお、細胞密度に換算すると、８×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２となり、これはコンフルエント状態の細胞を十重にした密度に相当する。プレートの表面は親水性ヒドロゲル層である。次に超低接着プレートの表面の裏側中央に、円柱状ネオジ磁石（直径２２ｍｍ、高さ１０ｍｍ、４０００ガウス）を配置し、プレート底面に対し垂直な磁力が発生している状態で１日培養したところ、１ｍｍ２のシート状構造を形成していた。得られたＲＰＥ細胞シートが重層化していることを確認するためその断面を観察すると、ＭＣＬを含むＡＲＰＥ−１９細胞が厚さ６０μｍで１５層に重層していることがわかった（図６参照）。また、ヘマトキシリン染色とエオシン染色では、ＲＰＥ細胞シート内に目立った壊死部分は見られなかった。
なお、ＭＣＬを含まないＡＲＰＥ−１９細胞を用いた場合や、ＭＣＬを取り込んだＡＲＰＥ−１９細胞をプレート下の磁石なしで培養した場合には、細胞シートは形成されず、クローニングリングを取り除くと細胞が分散してしまった。
（５）磁石を利用した回収と移送
培養開始から１日で、２４ウェル超低接着プレートの裏面の磁石を取り除いた。すると、ＲＰＥ細胞シートがウェルの底面から剥離した。次に、移送機器として、図７に示すように、円柱状ネオジ磁石１０（直径３０ｍｍ、高さ１５ｍｍ、４０００ガウス）の中央に磁力で引きつけられている鉄のワイヤ１２（直径２ｍｍ、長さ４０ｍｍ）を用意した。このワイヤ１２の先端を培地の表面に付けると、磁力によってＲＰＥ細胞シート１４が表面まで破壊されることなく浮上し、ワイヤ１２の先端に付着した。なお、ワイヤ１２の先端の磁束密度は１１００ガウスであった。そして、このワイヤ１２に付着したＲＰＥ細胞シート１４を、１０ｍｌの培養液の入った１００ｍｍ径の組織培養皿（旭テクノグラス社）に移し、そこで磁石１０をワイヤ１２から外しワイヤ１２を軽く叩くと、ＲＰＥ細胞シートがワイヤから離れて培養液の表面に落ちた。この結果から、この移送機器によってＲＰＥ細胞シートの回収や移送が可能であると判断した。その後、その組織培養皿でＲＰＥ細胞シートを培養した。１日培養したのちには、ＲＰＥ細胞シートは組織培養皿に付着した。その後更にＲＰＥ細胞シートを培養すると、１６日後には細胞シートから出てきた細胞が活発に増殖していた。
なお、本発明は上記実施例に何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
【産業上の利用の可能性】
本発明は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で細胞を培養する細胞培養技術において利用可能であり、例えば細胞シートのような身体の各部分のための代替物を医療用具とする医療機器産業に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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