(57)【要約】天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼおよびこの耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの調製方法が提供される。天然のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、この耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ中の４位に相当する位置、モチーフ配列２中の４位に相当する位置、またはモチーフ配列３Ｌもしくは３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつこの耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該天然のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項２】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼが、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、または前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項３】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項４】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項５】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼが、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有している、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項６】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼが、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有している、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項７】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列が、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項８】
前記天然のα−グルカンホスホリラーゼが、馬鈴薯およびシロイヌナズナ由来である、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項９】
前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも２つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１０】
前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１１】
前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、Ｉ、ＬおよびＶからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１２】
前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、ＩおよびＬからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１３】
前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１４】
前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がＣ、Ｇ、ＳおよびＶからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１５】
前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、Ｃ、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＷからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１６】
前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基がＣ、Ｉ、ＬおよびＶからなる群より選択される、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１７】
２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の３０％以上である、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１８】
２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６５℃で２分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上である、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項１９】
天然のα−グルカンホスホリラーゼと比較して、保存安定性が向上した請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項２０】
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現させる工程；および
該発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該第一のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、または前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基が、前記第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なる、方法。
【請求項２２】
前記第一のα−グルカンホスホリラーゼが、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一のα−グルカンホスホリラーゼが、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一のα−グルカンホスホリラーゼが馬鈴薯およびシロイヌナズナ由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む、核酸分子。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸分子を含む、細胞。
【請求項２８】
グルカンの合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記反応が、６０℃〜７５℃の温度で行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
グルカンの合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記反応が、６０℃〜７５℃の温度で行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ、グルカンおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
前記反応が、６０℃〜７５℃の温度で行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２Ｌ：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上であり、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する、
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項３５】
天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該天然のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【請求項３６】
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現させる工程；および
該発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該第一のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である、
方法。
【請求項３７】
グルカンの合成方法であって、該方法は、請求項３５に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
グルカンの合成方法であって、該方法は、請求項３５に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
グルコース−１−リン酸の合成方法であって、該方法は、請求項３５に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ、グルカンおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上であり、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する、
耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、耐熱性α−グルカンホスホリラーゼおよびこの耐熱性α−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子に関する。さらに本発明は、耐熱性α−グルカンホスホリラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  α−グルカンホスホリラーゼ（以下、ＧＰともいう）は、例えば、グルコース−１−リン酸（以下、Ｇ−１−Ｐともいう）の合成、グルカン合成などに利用されている酵素である。Ｇ−１−Ｐは例えば、医療用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体）、心臓病の治療薬（アミン塩）、グルカン合成の基質として利用されている。ＧＰは、馬鈴薯塊茎などの植物、ウサギ筋肉などの動物、酵母などの微生物に広く分布している。【０００３】  なかでも植物由来のＧＰは、一般に高分子量のグルカンを合成する能力を有するので有用である。【０００４】  Ｇ−１−Ｐまたはグルカンの製造には、種々のＧＰが用いられ得、中でも馬鈴薯由来のＧＰが用いられることが多い。なぜなら、比較的大量の酵素が得やすいからである。【０００５】  ＧＰを用いたＧ−１−Ｐまたはグルカンの工業的な生産においては、ＧＰ酵素に夾雑する他の酵素活性、特にホスファターゼ活性およびアミラーゼ活性をできるだけ除去する必要がある。ＧＰを大量に製造するために、ＧＰ遺伝子を発現させる宿主としては、大腸菌および枯草菌が望ましい。ところが、図４および図５に示したように、大腸菌はアミラーゼ活性およびホスファターゼ活性を、枯草菌はアミラーゼ活性をそれぞれ菌体内に有している。しかしながら、図４および５に示したように、これら宿主の有する酵素は、５５℃の熱処理で失活させることはできないが、熱処理温度を６０℃にすると、ほぼ失活させることができる。したがって、６０℃の熱処理でも活性を失わないという耐熱性を有する植物由来ＧＰが望まれていた。【０００６】  参考として、種々の細菌（大腸菌ＴＧ−１株、大腸菌ＢＬ２１株、および枯草菌ＡＮＡ−１株）の菌体抽出液中の加熱前および加熱後のアミラーゼ活性およびホスファターゼ活性の具体的な数値を以下の表１に示す。【０００７】
2004113525.tif 000002
【０００８】  しかし、高分子量のグルカンを合成できる植物由来のＧＰで耐熱性を有するもの、特に高温（例えば、６０℃〜７５℃）で充分な活性を維持できるＧＰは知られていない。植物以外の生物由来のＧＰについては、耐熱性の高いＧＰとして、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓなど）のＧＰが報告されている。しかし、このような植物以外の生物由来のＧＰは高分子量のグルカンを合成する能力を有さないため有用性が低い。【０００９】  ＧＰはアミノ酸配列の相同性比較から、２つのグループに分けられる（非特許文献１を参照のこと）。ＧＰは、アミノ酸配列を比較した場合に、馬鈴薯由来のＧＰと３０％以上の同一性を有するＧＰのグループ（グループＡ）と、馬鈴薯由来のＧＰとは３０％未満の同一性しか有さないが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓとは３０％以上の同一性を有するＧＰのグループ（グループＢ）とに分けられる。【００１０】  グループＢに属するＴｈｅｒｍｕｓ由来のＧＰを用いて製造されるグルカンは、グループＡに属する馬鈴薯由来のＧＰを用いて製造されるグルカンに比べて分子量がかなり低い。そのため、Ｔｈｅｒｍｕｓ由来のＧＰを用いた場合では、高分子量のグルカンを得ることができないという問題がある。【００１１】  これらの問題を解決するために、工業的利用に有利な、耐熱性が高い、植物由来のＧＰが必要とされている。【００１２】  一方、一般的な酵素の耐熱化については、プロリンセオリー、酵素の立体構造情報に基づくアミノ酸置換などの理論的方法が試みられているが、必ずしも成功していない。そのため、現在でも依然として、ランダム変異による方法またはランダム変異と理論的方法との組み合わせによる方法が主に行われている。いずれの方法でも、それぞれのタンパク質ごとに試行錯誤的に試す必要がある。【００１３】  ＧＰ以外の酵素に関しては、耐熱化にかかわる特定のアミノ酸の位置を決定できれば、特定した１箇所または複数箇所の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって、酵素を耐熱化できることが報告されている（例えば、非特許文献３〜５を参照のこと）。【００１４】  耐熱化ＧＰの例は、大腸菌マルトデキストリンホスホリラーゼに関して報告されている（非特許文献２を参照のこと）。この文献においては、耐熱性大腸菌マルトデキストリンホスホリラーゼが開示されている。マルトデキストリンホスホリラーゼは、ＧＰの一種である。この耐熱化ＧＰは、天然のＧＰと比較して、１３３位のアスパラギンがアラニンに置換されている。この１３３位のアスパラギンは、活性中心に存在し、酵素反応に必須な補酵素であるピリドキサール５’−リン酸の結合部位である。この耐熱性ＧＰは、天然のＧＰと比較して、耐熱性が約１５℃向上し、反応至適温度が約４５℃から約６０℃へと上昇し、そして約６７℃で変性した。しかし、この大腸菌のＧＰも、Ｔｅｒｍｕｓ由来のＧＰと同様に、高分子量のグルカンを合成する能力を有さない。さらに、この文献に記載される耐熱化ＧＰの至適温度での酵素活性は、天然のＧＰの至適温度での酵素活性よりも低い。つまり、変異により、グルカン��合成する能力が低下している。それゆえ、この文献は、少なくともグルカン合成能の観点では１３３位を置換することが好ましくないことを教示している。【００１５】  通常、酵素タンパク質は、不安定であり、ｐＨ、温度、その他物理的な要因、タンパク質分解酵素の影響を受け、分解されやすい。酵素タンパク質の中には、精製度が高くなるほど、不安定になり、分解されやすくなる酵素もある。そのため、酵素タンパク質の調製をできるだけ低温で行い、かつ使用する度に調製しなければならない。酵素タンパク質を冷凍保存することにより、タンパク質の分解を抑制できる。しかし、凍結した酵素タンパク質を解凍する際にタンパク質が分解されることがあり、酵素タンパク質を冷凍保存し、解凍して使用する際には取り扱いが難しい。一般に、酵素タンパク質が分解されると、立体構造が変化したり、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、反応速度、基質親和性などの酵素の性質が変化したりする。場合によっては、酵素活性が低下したり、失活したりする。このように酵素タンパク質の分解は、酵素反応に及ぼす影響が大きい。それゆえ、酵素を産業利用する上では、できるかぎり安定性に優れた酵素を使用することが望ましい。【００１６】  天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰも分解されやすい酵素であることがわかっており、精製したＧＰを冷蔵保存した場合であっても、精製直後から徐々に分解される。ＧＰタンパク質の分解を抑制できれば、ＧＰを大量調製して長期保存することが可能となり、生産効率が上がり、酵素の保存時および使用時に有利である。それゆえ、長期保存可能な分解が抑制されたＧＰを提供することもまた好ましい。
【非特許文献１】Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｔａｋａｈａら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  α−Ｇｌｕｃａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．、２００１、Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．１、ｐｐ．７１−７８
【非特許文献２】Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｉｅ  β  ｌｅｒら著、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２０００、３４６、ｐｐ．２５５−２６３
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎ  ＬｅｈｍａｎｎおよびＭａｒｋｕｓ  Ｗｙｓｓ著、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００１、１２、ｐｐ．３７１−３７５
【非特許文献４】Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎら著、「Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、２０００、１５４３、ｐｐ．４０８−４１５
【非特許文献５】Ｊｕｎｉｃｈｉ  Ｍｉｙａｚａｋｉら著、「Ａｎｃｅｓｔｒａｌ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ３−Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｘｔｒｅｍｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ａｎｃｅｓｔｏｒ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００１、１２９、ｐｐ．７７７−７８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】  本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、従来のα−グルカンホスホリラーゼよりも耐熱性が高い、植物由来のα−グルカンホスホリラーゼを提供することを目的とする。本発明はより特定の場合には、耐熱性に加えて、保存安定性の優れた、植物由来のα−グルカンホスホリラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】  本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、植物由来のＧＰのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸残基を置換することによって、耐熱性が向上した植物由来のＧＰが得られることを最終的に見出し、これに基づいて本発明を完成させた。【００１９】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該天然のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である。【００２０】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、または前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００２１】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し得る。【００２２】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ得る。【００２３】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼが、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００２４】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００２５】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番���２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択され得る。【００２６】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯およびシロイヌナズナ由来であり得る。【００２７】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも２つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００２８】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００２９】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、Ｉ、ＬおよびＶからなる群より選択され得る。【００３０】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、ＩおよびＬからなる群より選択され得る。【００３１】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列２中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹからなる群より選択され得る。【００３２】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列２中の４位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、Ｃ、Ｇ、ＳおよびＶからなる群より選択され得る。【００３３】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、Ｃ、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＷからなる群より選択され得る。【００３４】  １つの実施形態では、上記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、Ｃ、Ｉ、ＬおよびＶからなる群より選択され得る。【００３５】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性は、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の３０％以上であり得る。【０��３６】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６５℃で２分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性は、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上であり得る。【００３７】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、天然のα−グルカンホスホリラーゼと比較して、保存安定性が向上し得る。【００３８】  本発明の方法は、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを調製する方法であって、
第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；
該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；
該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現させる工程；および
該発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを回収する工程
を包含し、
該第一のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である。【００３９】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、または前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくは前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置におけるアミノ酸残基は、前記第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なり得る。【００４０】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００４１】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり、前記モチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置、前記モチーフ配列２中の４位に相当する位置、および前記モチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、前記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００４２】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは馬鈴薯およびシロイヌナズナ由来であり得る。【００４３】  本発明の核酸分子は、上記の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む。【００４４】  本発明のベクターは、上記の核酸分子を含む。【００４５】  本発明の細胞は、上記の核酸分子を含む。【００４６】  本発明のグルカンの合成方法は、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【００４７】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００４８】  本発明の別のグルカン合成方法は、上記の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【００４９】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００５０】  本発明のグルコース−１−リン酸の合成方法は、請求項１に記載の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ、グルカンおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する。【００５１】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００５２】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、
モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上であり、かつ
該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する。【００５３】  本発明の別の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、該天然のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である。【００５４】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置または７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置において、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００５５】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有し得る。【００５６】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされ得る。【００５７】  １つの実施形態では、上記塩基配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７および配列番号２９からなる群より選択さ���得る。【００５８】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり得る。【００５９】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり得る。【００６０】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択され得る。【００６１】  １つの実施形態では、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯またはシロイヌナズナ由来であり得る。【００６２】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも２つの位置において、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００６３】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置において、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し得る。【００６４】  １つの実施形態では、上記Ｆ３９に相当する位置におけるアミノ酸残基は、イソロイシン、バリンおよびロイシンからなる群より選択され得る。【００６５】  １つの実施形態では、上記Ｆ３９に相当する位置におけるアミノ酸残基は、イソロイシンまたはロイシンであり得る。【００６６】  １つの実施形態では、上記Ｎ１３５に相当する位置におけるアミノ酸残基は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、バリンおよびチロシンからなる群より選択され得る。【００６７】  １つの実施形態では、上記Ｎ１３５に相当する位置におけるアミノ酸残基は、システイン、グリシン、セリンおよびバリンであり得る。【００６８】  １つの実施形態では、上記Ｔ７０６に相当する位置におけるアミノ酸残基は、システイン、イソロイシン、ロイシン、バリンおよびトリプトファンからなる群より選択され得る。【００６９】  １つの実施形態では、上記Ｔ７０６に相当する位置におけるアミノ酸残基は、システイン、イソロイシン、ロイシンおよびバリンであり得る。【００７０】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性は、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の３０％以上であり得る。【００７１】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６５℃で２分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性は、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の１０％以上であり得る。【００７２】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを調製する方法は、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現させる工程；および該発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを回収する工程を包含し、該第一のα−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であり、該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、かつ該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上である。【００７３】  １つの実施形態では、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置または７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置におけるアミノ酸残基は、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なり得る。【００７４】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであり得る。【００７５】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼであり得る。【００７６】  １つの実施形態では、上記第一のα−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯またはシロイヌナズナ由来であり得る。【００７７】  本発明の核酸分子は、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む。【００７８】  本発明のベクターは、上記核酸分子を含む。【００７９】  本発明の細胞は、上記核酸分子を含む。【００８０】  本発明のグルカンの合成方法は、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【００８１】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００８２】  本発明のグルカンの合成方法は、上記の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【００８３】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００８４】  本発明のグルコース−１−リン酸の合成方法は、上記耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ、グルカンおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する。【００８５】  １つの実施形態では、上記反応は、６０℃〜７５℃の温度で行われ得る。【００８６】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有し、該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上であり、かつ該耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する。
【発明の効果】
【００８７】  本発明によって、高温（例えば６０℃以上）での耐熱性に優れた植物由来のＧＰ酵素が得られた。【００８８】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼによれば、天然のＧＰ酵素では反応できない高温条件下（例えば６０℃以上）でのグルカン合成反応が可能である。【００８９】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子（例えば、馬鈴薯由来のＧＰを耐熱化して得られる耐熱化ＧＰをコードする遺伝子）を大腸菌などの中温菌を宿主として高発現させた場合、耐熱性の酵素を含む菌体抽出液を６０℃で加熱することにより、宿主菌由来の夾雑酵素を簡単に除去できるという利点が得られる。特にＧＰ酵素の産業利用上大きな問題となる、アミラーゼ活性とホスファターゼ活性を、熱処理により大幅に削減できた。従って、本発明の方法は、酵素精製において有利となる。【００９０】  本発明の方法は、馬鈴薯由来のＧＰおよびシロイヌナズナ由来のＧＰのみに有効というわけではなく、馬鈴薯由来のＧＰまたはシロイヌナズナ由来のＧＰのアミノ酸配列に対して高い相同性を示す他のグループＡのＧＰの耐熱化にも好適に応用できる。【００９１】  従って、モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、
モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、および
モチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置
からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有する、他の生物種由来の耐熱性ＧＰを得ることができる。【００９２】  配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する他の生物種由来の耐熱性ＧＰを得ることができる。
本発明によってまた、保存安定性が向上した耐熱化ＧＰを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】［図１Ａ］図１Ａは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマルチプルアライメントを用いてアライメントした、種々の植物由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列を示す図である。
［図１Ｂ］図１Ａの続きである。モチーフ配列１および２の位置を示す。
［図１Ｃ］図１Ｂの続きである。
［図１Ｄ］図１Ｃの続きである。
［図１Ｅ］図１Ｄの続きである。
［図１Ｆ］図１Ｅの続きである。
［図１Ｇ］図１Ｆの続きである。モチーフ配列３の位置を示す。
［図１Ｈ］図１Ｇの続きである。
［図１Ｉ］図１Ｈの続きである。
［図２］図２は、プラスミド中でのα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の挿入部位の模式図である。
［図３］図３は、種々の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを６０℃で３０分間または６５℃で２分間インキュベートした場合の残存活性（％）を示すグラフである。
［図４］図４は、種々の細菌（大腸菌ＴＧ−１および大腸菌ＢＬ２１）を５０℃、５５℃、６０℃または６５℃で３０分間加熱した後のホスファターゼの残存活性（％）を示すグラフである。
［図５］図５は、種々の細菌（大腸菌ＴＧ−１、大腸菌ＢＬ２１および枯草菌ＡＮＡ−１）を５０℃、５５℃、６０℃または６５℃で３０分間加熱した後のアミラーゼの残存活性（％）を示すグラフである。
［図６］図６は、耐熱化ＧＰ酵素（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））および天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰ酵素の比活性の経時的変化を示すグラフである。
［図７］図７は、耐熱化ＧＰ酵素（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））および天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰ酵素を用いて３７℃、５０℃、５５℃または６０℃で１８時間保持した場合の、アミロース合成量を示すグラフである。
［図８］図８は、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰおよびＦ３９で各種アミノ酸で置換したＧＰを、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を示すグラフである。
［図９］図９は、天然の馬鈴薯タイプＬＧＰおよびＮ１３５で各種アミノ酸で置換したＧＰを、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を示すグラフである。
［図１０］図１０は、天然の馬鈴薯タイプＬＧＰおよびＴ７０６で各種アミノ酸で置換したＧＰを、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を示すグラフである。
［図１１］図１１は、天然の馬鈴薯タイプＨ  ＧＰおよび三重変異体（Ｙ３６Ｌ＋Ｎ１３３Ｓ＋Ｔ６２８Ｉ）馬鈴薯タイプＨ  ＧＰを５８℃で１０分間、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を示すグラフである。
［図１２］図１２は、天然のシロイヌナズナタイプＨ  ＧＰおよび三重変異体（Ｙ４０Ｌ＋Ｎ１３６Ｓ＋Ｎ６３１Ｉ）シロイヌナズナタイプＨ  ＧＰを５８℃で１０分間、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を示すグラフである。
［図１３］図１３は、精製直後および４℃で５ヶ月間保存した後の、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰおよび７種類の耐熱化ＧＰの分子量を示す、ポリアクリルアミドゲル電気泳動写真である。レーン１は、天然の馬鈴薯タイプＬ（Ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）ＧＰを示し、レーン２は、Ｆ３９Ｌ  ＧＰを示し、レーン３は、Ｎ１３５Ｓ  ＧＰを示し、レーン４は、Ｔ７０６Ｉ  ＧＰを示し、レーン５は、Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ  ＧＰを示し、レーン６は、Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ  ＧＰを示し、レーン７は、Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ  ＧＰを示し、レーン８は、Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ  ＧＰを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９４】  以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【００９５】  （１．α−グルカンホスホリラーゼ）
本明細書において「α−グルカンホスホリラーゼ」および「ＧＰ」は特に示さない限り互換可能に用いられ、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．１に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−１，４−グルカンとから、グルコース−１−リン酸およびα−１，４−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。無機リン酸の量が少ないと、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。【００９６】  全ての既知のα−グルカンホスホリラーゼは、活性のためにピリドキサール５’−リン酸を必要とし、そして類似した触媒機構を共有するようである。異なった起源に由来する酵素は、基質の優先性および調節形態が異なっているが、全てのα−グルカンホスホリラーゼは、多数のα−グルカンホスホリラーゼを含む大きなグループに属する。この大きなグループは、細菌、酵母および動物由来のグリコーゲンホスホリラーゼ、植物由来のデンプンホスホリラーゼ、ならびに細菌由来のマルトデキストリンホスホリラーゼを含む。【００９７】  α−グルカンホスホリラーゼのグルカン合成反応のための最小のプライマー分子はマルトテトラオースであることが報告されている。グルカン分解反応のために有効な最小の基質はマルトペンタオースであることも報告されている。一般に、これらは、α−グルカンホスホリラーゼに共通の特徴であると考えられていた。しかし、近年、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼおよびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒ  ａｌｉｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼは、他のα−グルカンホスホリラーゼとは異なる基質特異性を有すると報告されている。これらのα−グルカンホスホリラーゼについては、グルカン合成についての最小のプライマーがマルトトリオースであり、グルカン分解についての最小の基質がマルトテトラオースである。【００９８】  α−グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。【００９９】  α−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯（ジャガイモともいう）、サツマイモ、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、ソラマメ、エンドウマメ、ダイズ、アズキ、ウズラマメなどの豆類、シロイヌナズナなどの実験植物、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ、藻類などが挙げられる。【０１００】  α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。【０１０１】  本発明の方法に用いられる第一のα−グルカンホスホリラーゼは、天然のα−グルカンホスホリラーゼであり、植物由来であることが好ましい。一般に、植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼは、高分子量のアミロースを合成する能力を有する。しかし、これらのα−グルカンホスホリラーゼは耐熱性が低い。そのため、高温（例えば、約６０℃以上）では反応を触媒できない。そのため、植物（例えば、馬鈴薯）由来のＧＰの反応至適温度に合わせて反応を約３０℃〜約４０℃で行うと、雑菌汚染という問題またはグルカンの老化という問題が生じ、グルカンまたはＧ−１−Ｐを効率よく生産できない。【０１０２】  植物のα−グルカンホスホリラーゼは、グリコーゲンへの親和性によって、タイプＬとタイプＨとに分けられる。タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼとは、グリコーゲンへの親和性が低いα−グルカンホスホリラーゼをいう。一般に、タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼは、基質として、グリコーゲンよりも、マルトデキストリン、アミロースおよびアミロペクチンを好む（Ｈｉｒｏｙｕｋｉ  Ｍｏｒｉら著、「Ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  α−Ｇｌｕｃａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｙｐｅ  Ｌ  ａｎｄ  Ｈ  Ｉｓｏｚｙｍｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３、ｖｏｌ．２６８，Ｎｏ．８，ｐｐ．５５７４−５５８１）。タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼとは、グリコーゲンへの親和性が高いα−グルカンホスホリラーゼをいう。一般に、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼは、グリコーゲンを含め、種々のグルカンについての極めて高い親和性を有する。【０１０３】  例えば、Ｔｏｓｈｉｏ  Ｆｕｋｕｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６、１９８７、２６７−２７６頁によれば、馬鈴薯の葉由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの、グリコーゲンへのＫｍ（ミカエリス定数）は、１．４×１０−３（Ｍ）であり、一方、馬鈴薯の葉由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの、グリコーゲンへのＫｍは、４×１０−６（Ｍ）である。また、馬鈴薯の塊茎由来のα−グルカンホスホリラーゼの主成分の、グリコーゲンへのＫｍは、２．４×１０−３（Ｍ）であり、タイプＬに分類される。副成分のα−グルカンホスホリラーゼの、グリコーゲンへのＫｍは、１×１０−６（Ｍ）であり、タイプＨに分類される。【０１０４】  当該分野で公知のように、ミカエリス定数は、酵素反応における初速度の基質濃度依存性から得られる動力学パラメーターの一つである。ミカエリス定数は、初速度が最大速度Ｖｍａｘの１／２になる時の基質濃度である。ミカエリス定数は、濃度の次元を有する。ミカエリス定数は、それぞれの測定条件下で各酵素に特有の定数である。この定数は、各酵素の基質への親和性を表す尺度となる。ミカエリス定数が小さいほど、基質への親和性は大きい。【０１０５】  タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼとタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼとでは、例えば、以下のような性質の違いを有する。【０１０６】
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【０１０７】  本発明の方法に用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、特定の実施形態では、タイプＬ（Ｔｙｐｅ  Ｌとも示される）α−グルカンホスホリラーゼであることがさらに好ましい。馬鈴薯のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯のタイプＨのグルカンホスホリラーゼと比較して長く、ポリペプチド鎖の中央に、タイプＨには見られない７８残基のアミノ酸配列が挿入されている。そのため、例えば、馬鈴薯の葉由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのサブユニットの分子量は約１０４，０００Ｄａであり、馬鈴薯の葉由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのサブユニットの分子量は約９４，０００Ｄａである。馬鈴薯の塊茎由来のα−グルカンホスホリラーゼの主成分のサブユニットの分子量は約１０４，０００Ｄａであり、馬鈴薯の塊茎由来のα−グルカンホスホリラーゼの副成分のサブユニットの分子量は約９４，０００Ｄａである。特定のα−グルカンホスホリラーゼがタイプＬであるかタイプＨであるかは、実際に親和性を測定せずに、この７８残基のアミノ酸配列と相同な領域を有するか否かによっても推定され得る。【０１０８】  一般に、タイプＬとタイプＨとは、酵素の性質として、酵素活性、分子量、基質特異性、酵素の所在、一次配列の相同性、挿入配列の存在などを総合的に勘案して決定される。従って、一般的には、タイプＬとタイプＨとの境界は明確でない場合もあるが、便宜上、本発明においては、そのα−グルカンホスホリラーゼがタイプＬであるかタイプＨであるかは、α−グルカンホスホリラーゼ中のトランジットペプチドの存在によって決定され得る。トランジットペプチドの配列の特徴は当該分野で公知である。トランジットペプチドの配列をコードしているものがタイプＬであり、トランジットペプチドの配列をコードしていないものがタイプＨである。【０１０９】  タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯（ジャガイモともいう）、サツマイモ、ソラマメ、シロイヌナズナ、ホウレンソウ、トウモロコシ、イネなどが挙げられる。【０１１０】  本発明の方法に用いられる第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼは、別の実施形態では、タイプＨ（Ｔｙｐｅ  Ｈとも示される）α−グルカンホスホリラーゼであることが好ましい。タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯、コムギ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ、イネ、ソラマメ、シロイヌナズナ、サツマイモなどが挙げられる。【０１１１】  馬鈴薯の天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２の１位〜９１６位に示す。【０１１２】  サツマイモの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４の１位〜９１２位に示す。【０１１３】  馬鈴薯の別の天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号６の１位〜８９３位に示す。【０１１４】  ソラマメの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号７に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号８の１位〜９３９位に示す。【０１１５】  シロイヌナズナの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号９に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１０の１位〜９６２位に示す。【０１１６】  ホウレンソウの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１２の１位〜９７１位に示す。【０１１７】  トウモロコシの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１４の１位〜９８３位に示す。【０１１８】  イネの天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１６の１位〜９２８位に示す。【０１１９】  イネの別の天然のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１７に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号１８の１位〜９５１位に示す。【０１２０】  小麦の天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号１９に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２０の１位〜８３２位に示す。【０１２１】  Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号２１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２２の１位〜８４０位に示す。【０１２２】  イネの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号２３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２４の１位〜８４１位に示す。【０１２３】  ソラマメの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号２５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２６の１位〜８４２位に示す。【０１２４】  シロイヌナズナの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号２７に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２８の１位〜８４１位に示す。【０１２５】  馬鈴薯の天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡ配列を配列番号２９に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号３０の１位〜８３８位に示す。【０１２６】  サツマイモの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのｃＤＮＡの部分配列を配列番号３１に示し、そしてそのアミノ酸配列を配列番号３２に示す。サツマイモの天然のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの完全配列は、この部分配列を用いて従来の方法に従って得ることができる。【０１２７】  本発明の方法に用いられる第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼは、植物由来であることが好ましく、馬鈴薯、サツマイモ、ソラマメ、シロイヌナズナ、ホウレンソウ、トウモロコシ、イネ、小麦またはＣｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒに由来することが好ましく、馬鈴薯、サツマイモ、ソラマメ、シロイヌナズナ、ホウレンソウ、トウモロコシまたはイネに由来することがより好ましく、馬鈴薯に由来することが最も好ましい。本発明の方法に用いられる第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼは、タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼであることが好ましい。本発明の方法に用いられる第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼは、馬鈴薯のタイプＬ、Ｌ２もしくはＨ、サツマイモのタイプＬもしくはＨ、ソラマメのタイ��ＬもしくはＨ、シロイヌナズナのタイプＬもしくはＨ、ホウレンソウのタイプＬ、トウモロコシのタイプＬ、イネのタイプＬもしくはＨ、小麦のタイプＨまたはＣｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼであることが好ましく、馬鈴薯のタイプＬもしくはＬ２、サツマイモのタイプＬ、ソラマメのタイプＬ、シロイヌナズナのタイプＬ、ホウレンソウのタイプＬ、トウモロコシのタイプＬまたはイネのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼであることがより好ましく、馬鈴薯のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼであることが最も好ましい。【０１２８】  本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。【０１２９】  馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰの遺伝子は例えば、次の手順により調製できる。【０１３０】  まず、Ｔａｋａｈａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻、１３９１−１３９６頁、１９９３年）が記載しているように、馬鈴薯塊茎より、ｍＲＮＡを周知の方法で調製し、ｃＤＮＡライブラリーを市販のキットなどを用いて作製する。【０１３１】  次に既知のＧＰ遺伝子配列（データベースＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＤ００５２０）を基に、ＰＣＲプライマーを調製し、上述のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲを行う。例えばＰＣＲプライマーとして
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および
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を用いたときは、以下の条件で遺伝子を増幅できる。【０１３２】  ９４℃で３０秒、５０℃で１分、７２℃で３分を１サイクルとして、３０サイクルのＰＣＲ反応。【０１３３】  なおＰＣＲプライマー１のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰの成熟タンパク質のＮ末端部分の構造遺伝子配列に対応しており、ＰＣＲプライマー２のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰ構造遺伝子の終止コドン直後の塩基配列に対応している。【０１３４】  また、既知のＧＰ遺伝子配列情報をもとに、ｃＤＮＡライブラリー作製をへることなく、化学合成により直接ＧＰ遺伝子を作製することも可能である。遺伝子の合成方法は、例えばＴｅ’ｏら（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９０巻、１３−１９頁、２０００年）などに記載されている。【０１３５】  得られたＧＰ遺伝子は、当業者に周知の方法で、適切なベクターに挿入できる。例えば、大腸菌用のベクターであれば、ｐＭＷ１１８（日本ジーン株式会社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ（株）製）、ｐＫＫ２３３−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ製）、ｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）などが使用でき、枯草菌用のベクターであれば、ｐＵＢ１１０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入可能）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ（株）製）などが使用できる。【０１３６】  例えば、上記のＰＣＲプライマー１および２を用いて遺伝子を増幅した場合、増幅された遺伝子をＳｍａＩであらかじめ切断したプラスミドｐＭＷ１１８に挿入することにより、図２のような配列をもった、プラスミドを選択できる。これを用いて例えば、大腸菌ＴＧ−１を形質転換して、アンピシリン耐性株を選択し、得られた組換えプラスミド保持株を培養し、この菌株からプラスミドを抽出することにより、ＧＰ遺伝子を得ることができる。【０１３７】  （２．α−グルカンホスホリラーゼの耐熱化）
本発明の方法は、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る工程；該第二の核酸分子を含む発現ベクターを作製する工程；該発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現させる工程；および該発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを回収する工程を包含する。【０１３８】  （２．１  第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子の単離）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子もまた、本発明の範囲内にある。このような核酸分子は、本明細書の開示に基づいて、当該分野で公知の方法を用いて得ることができる。【０１３９】  天然のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する植物から直接単離され得る。【０１４０】  例えば、まず、馬鈴薯、シロイヌナズナ、ホウレンソウなどから天然のα−グルカンホスホリラーゼが単離される。馬鈴薯由来のα−グルカンホスホリラーゼについての手順を例示すると、最初に、市販されている馬鈴薯塊茎１．４ｋｇの皮をむく。皮をむいた塊茎をジューサーですりつぶしてすりつぶし液を得る。次いで、このすりつぶし液をガーゼで濾過して濾液を得る。濾液に、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を最終濃度１００ｍＭになるように加えて、酵素液を得る。この酵素液を、５５℃の水浴中で、液温が５０℃に達してからさらに１０分間加熱する。加熱後、この酵素液を、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍにて、２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。【０１４１】  得られた遠心上清に、硫酸アンモニウムを１００ｇ／Ｌになるように加えてから、４℃にて２時間放置し、タンパク質を沈澱させる。次いで、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去し、上清を得る。さらに、得られた上清に硫酸アンモニウムを最終濃度２５０ｇ／Ｌになるように加えてから、４℃にて２時間放置し、タンパク質を沈澱させる。次いで、遠心機（ベックマン社製、ＡＶＡＮＴＩ  Ｊ−２５Ｉ）を用いて、８，５００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質を回収する。【０１４２】  回収された不溶性のタンパク質を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）１５０ｍｌで懸濁する。懸濁した酵素液を同じ緩衝液に対して一晩透析する。透析後のサンプルを、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）に吸着させ、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄する。続いて、４００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、溶出液を回収し、部分精製馬鈴薯塊茎由来グルカンホスホリラーゼ含有溶液とする。【０１４３】  購入した馬鈴薯によっては、この段階でトリプシン処理に用い得るα−グルカンホスホリラーゼ含有溶液になるが、さらなる精製を必要とする場合がある。このような場合、必要に応じて、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア社製）などを用いたゲルフィルトレーションクロマトグラフィーによる分画、Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）などを用いた疎水クロマトグラフィーによる分画を組み合わせることにより、精製馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼ含有溶液を得ることができる。他の植物種からのα−グルカンホスホリラーゼの精製も同様に行い得る。【０１４４】  このようにして得た精製α−グルカンホスホリラーゼをトリプシン処理して、得られるトリプシン処理断片をＨＰＬＣにより分離し、分離されたいずれかのペプチド断片のＮ末端のアミノ酸配列を、ペプチドシークエンサーにより同定する。次いで、同定したアミノ酸配列をもとに作製した合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、適切なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、天然のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子（遺伝子ともいう）を得ることができる。オリゴヌクレオチドプローブおよびＤＮＡライブラリーを調製するための、ならびに核酸のハイブリダイゼーションによりそれらをスクリーニングするための基本的な戦略は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編  １９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編  １９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編  １９８４）を参照のこと。【０１４５】  あるいは、α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列が、既知のある種のα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列に対する相同性に基づいて、この塩基配列の少なくとも一部を含む核酸プローブを用いたハイブリダイゼーションによってｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーなどをスクリーニングして、別種のα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を含む核酸分子を獲得することもできる。このような方法は当該分野で公知である。【０１４６】  あるいは、種々のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列において保存された領域に対応する縮重プライマーを作製し、目的の種のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーなどをテンプレートとしてＰＣＲを行うことによってその種由来のα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を獲得することも可能である。このような方法は当該分野で公知である。【０１４７】  ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする場合、得られた核酸分子は、当業者に周知の方法を用いてサブクローニングされ得る。例えば、目的の遺伝子を含むλファージと、適切な大腸菌と、適切なヘルパーファージとを混合することにより、容易に目的の遺伝子を含有するプラスミドを得ることができる。その後、プラスミドを含有する溶液を用いて、適切な大腸菌を形質転換することにより、目的の遺伝子をサブクローニングし得る。得られた形質転換体を培養して、例えばアルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを得、目的の遺伝子の塩基配列を決定し得る。塩基配列を決定する方法は、当業者に周知である。さらに、ＤＮＡフラグメントの塩基配列を基に合成されたＰＣＲプライマーを用い、馬鈴薯などのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて直接α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を増幅することもできる。【０１４８】  本明細書において「核酸分子」は、天然のヌクレオチドのみからなっていてもよく、非天然のヌクレオチドを含んでもよく、非天然のヌクレオチドのみからなっていてもよい。非天然のヌクレオチドの例としては、誘導体ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログともいう）が挙げられる。「誘導体ヌクレオチド」および「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。【０１４９】  （２．２  第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子の改変）
第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む第一の核酸分子を改変して、改変塩基配列を含む第二の核酸分子を得る。第一の核酸分子は、上記（２．１）のようにして得た、天然のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子であり得る。第一の核酸分子はまた、天然のα−グルカンホスホリラーゼの酵素活性と実質的に同様の酵素活性を有し、天然のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列に対して１もしくは数個またはそれを超えるアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子であり得る。「実質的に同様の酵素活性を有する」とは、改変後のα−グルカンホスホリラーゼを、改変前のα−グルカンホスホリラーゼと同一条件下で測定したときの酵素活性が、改変前のα−グルカンホスホリラーゼの酵素活性の±２０％以内であることをいう。好ましくは±１０％以内、より好ましくは±５％以内である。【０１５０】  改変は、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、部位特異的変異誘発法、変異原を用いた変異誘発法（対象遺伝子を亜硝酸塩などの変異剤で処理すること、紫外線処理を行うこと）、エラープローンＰＣＲを行うことなどによって行われ得る。目的の変異を得やすい点から、部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。部位特異的変異誘発を用いれば、目的とする部位で目的とする改変を導入することができるからである。あるいは、目的とする配列をもつ核酸分子を直接合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。【０１５１】  本発明者らは、植物の天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換することによって、得られるα−グルカンホスホリラーゼの耐熱性が向上することを見出した。このような特定の位置は、以下のモチーフ配列のいずれかまたは配列番号２のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列とをアライメントすることによって決定され得る：
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【０１５２】  モチーフ配列１Ｌ、２および３Ｌは、馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）中に存在する。これらのモチーフ配列は、馬鈴薯タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいて、以下の位置に存在する：モチーフ配列１Ｌ：配列番号２のアミノ酸配列の３６位〜４４位；モチーフ配列２：配列番号２のアミノ酸配列の１３２位〜１３９位；モチーフ配列３Ｌ：配列番号２のアミノ酸配列の７００位〜７０８位。モチーフ配列１Ｈ、２および３Ｈは、イネ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列中に存在する。これらのモチーフ配列は、イネタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいて、以下の位置に存在する：モチーフ配列１Ｈ：配列番号２４のアミノ酸配列の３６位〜４４位；モチーフ配列２：配列番号２４のアミノ酸配列の１３２位〜１３９位；モチーフ配列３Ｈ：配列番号２４のアミノ酸配列の６２５位〜６３３位。一般に、天然のα−グルカンホスホリラーゼは、これらのモチーフ配列またはそれらに対して高い相同性を有する配列を有する。植物由来の他のα−グルカンホスホリラーゼについてのこれらのモチーフ配列の位置は、当業者によって容易に決定され得る。【０１５３】  本発明の方法においては、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように改変される。好ましくは、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置または７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置におけるアミノ酸配列が、上記天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるように改変される。【０１５４】  本明細書中で用いられる「配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置」とは、対象のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列とを相同性が最も高くなるように、必要に応じて一方の配列にギャップを挿入して並べた場合に、配列番号２の３９位のフェニルアラニンと並置される位置をいう。なお、配列番号２にギャップが挿入された場合にそのギャップはアミノ酸残基の数として数えない。より好ましくは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマルチプルアライメントにおいて、デフォルトのスコアテーブルを用い、ＧＡＰ  Ｐｅｎａｌｔｙ（Ｐｅｐｔｉｄｅ）：Ｉｎｓｅｒｔ＝−１０、Ｅｘｔｅｎｄ＝−３、ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ｏｎ  ｔｏｐ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ：設定あり（チェック）、Ｍａｔｃｈ  Ｍｏｄｅ：Ｌｏｃａｌ  Ｍａｔｃｈの条件で配列番号２のアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列とをアライメントした場合に、配列番号２の３９位のフェニルアラニン���並置される位置をいう。アミノ酸についてのデフォルトのスコアテーブルを以下の表３に示す。【０１５５】
2004113525.tif 000007
【０１５６】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマルチプルアライメントは、以下のようなアルゴリズムに基づいている。このアライメントプログラムは、アライメントする対象の全ての配列について総当りで２配列のアライメントを行い（ペアワイズアライメント）、その中から共通する配列の保存割合（ペアワイズアライメントにおけるスコア）が高い組み合わせの配列について、共通の配列から仮想配列（共通部分はそのまま、一致しない部分はどちらか一方の配列を選択する）を作成する。仮想配列を構成する配列を除く全ての配列と仮想配列との総当りを同じ手順で、最後の仮想配列が作られるまで繰り返す。その後、仮想配列が作られるときのＧＡＰの挿入およびずれの情報を、もとの配列に対して適用して全体を構成することによってマルチアライメントを完成させる。このペアワイズアライメントの計算式は以下のとおりである。【０１５７】  配列長がそれぞれｍ、ｎの配列ａ、ｂがあり、それぞれの配列を【０１５８】
2004113525.tif 000008
【０１５９】と表現するとき、ＧＡＰペナルティｇは次の式で表される：
−ｇ＝ｓ（ａｉ，φ）＝ｓ（φ，ｂｊ）。【０１６０】  アライメントのスコアを得るための式は以下のとおりである：【０１６１】
2004113525.tif 000009
【０１６２】  αはＧＡＰ挿入のペナルティであり、βはＧＡＰ伸長のペナルティである。Ｅ、Ｆ、Ｇはスコア行列であり、これを基にパス行列が作成される。【０１６３】  １３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置についても同様に解釈される。【０１６４】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマルチプルアライメントにおいて、上記の条件で、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０を配列番号２とアライメントした。その結果、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置にはフェニルアラニンまたはチロシンが、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置にはアスパラギンが、そして７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置にはトレオニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸が並置された。このアライメントの結果を図１Ａ〜図１Ｉに示す。図１Ａ〜図１Ｉにおいて、「馬鈴薯タイプＬ」は、馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。「馬鈴薯タイプＬ２」は、馬鈴薯由来の第２のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。「サツマイモタイプＬ」は、サツマイモ由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。「ソラマメタイプＬ」は、ソラマメ由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。「シロイヌナズナタイプＬ」は、シロイヌナズナ由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。「ホウレンソウ」は、ホウレンソウ由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。「イネタイプＬ」は、イネ由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。「イネタイプＬ２」は、イネ由来の第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。「トウモロコシタイプＬ」は、トウモロコシ由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。「馬鈴薯タイプＨ」は、馬鈴薯由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。「ソラマメタイプＨ」は、ソラマメ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。「シロイヌナズナタイプＨ」は、シロイヌナズナ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。「イネタイプＨ」は、イネ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。「コムギ」は、コムギ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。「ＣｉｔｒｕｓタイプＨ」は、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。「Ｅｃｏｌｉ  ＭａｌＱ」は、大腸菌由来のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。マルトデキストリンホスホリラーゼは、α−グルカンホスホリラーゼの一種である。【０１６５】  例えば、サツマイモ由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置は、配列番号４のアミノ酸配列の３９位であり、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置は、配列番号４のアミノ酸配列の１３５位であり、そして７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置は、配列番号４のアミノ酸配列の７０２位である。【０１６６】  例えば、馬鈴薯由来の第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号６のアミノ酸配列の１１位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号６のアミノ酸配列の１０７位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号６のアミノ酸配列の６８３位である。【０１６７】  例えば、ソラマメ（Ｆａｖａ  ｂｅａｎ）由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号８のアミノ酸配列の４３位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号８のアミノ酸配列の１３９位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号８のアミノ酸配列の７２９位である。【０１６８】  例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号１０のアミノ酸配列の１０６位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号１０のアミノ酸配列の２０２位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号１０のアミノ酸配列の７５２位である。【０１６９】  例えば、ホウレンソウ由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号１２のアミノ酸配列の１１２位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号１２のアミノ酸配列の２０８位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号１２のアミノ酸配列の７６１位である。【０１７０】  例えば、トウモロコシ由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号１４のアミノ酸配列の９５位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号１４のアミノ酸配列の１９１位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号１４のアミノ酸配列の７７３位である。【０１７１】  例えば、イネ由来のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号１６のアミノ酸配列の４１位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号１６のアミノ酸配列の１３７位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号１６のアミノ酸配列の７１８位である。【０１７２】  例えば、イネ由来の別のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号１８のアミノ酸配列の９１位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号１８のアミノ酸配���の１８７位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号１８のアミノ酸配列の７４１位である。【０１７３】  例えば、コムギ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号２０のアミノ酸配列の３１位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号２０のアミノ酸配列の１２７位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号２０のアミノ酸配列の６２２位である。【０１７４】  例えば、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号２２のアミノ酸配列の４２位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号２２のアミノ酸配列の１３８位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号２２のアミノ酸配列の６３０位である。【０１７５】  例えば、イネ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号２４のアミノ酸配列の３９位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号２４のアミノ酸配列の１３５位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号２４のアミノ酸配列の６３１位である。【０１７６】  例えば、ソラマメ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号２６のアミノ酸配列の４３位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号２６のアミノ酸配列の１３９位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号２６のアミノ酸配列の６３２位である。【０１７７】  例えば、シロイヌナズナ由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号２８のアミノ酸配列の４０位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号２８のアミノ酸配列の１３６位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号２８のアミノ酸配列の６３１位である。【０１７８】  例えば、馬鈴薯由来のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼにおいては、配列番号２のアミノ酸配列のＦ３９に相当する位置は、配列番号３０のアミノ酸配列の３６位であり、Ｎ１３５に相当する位置は、配列番号３０のアミノ酸配列の１３３位であり、そしてＴ７０６に相当する位置は、配列番号３０のアミノ酸配列の６２８位である。【０１７９】  耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置は、９１６アミノ酸残基長の配列番号２とアライメントすることのみならず、上記のモチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ、２、および３Ｌもしくは３Ｈからなる群より選択される１以上の配列とアライメントすることによって決定され得る。これまで公知の植物由来のα−グルカンホスホリラーゼについてアライメントした限り、このようにして決定される位置は、配列番号２を用いた場合も、モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ、２、および３Ｌもしくは３Ｈを用いた場合も、同じ位置となる。【０１８０】  モチーフ配列１Ｌは、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼでよく保存されており、一方、モチーフ配列１Ｈは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼでよく保存されている。配列番号２のアミノ���配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置は、モチーフ配列１Ｌまたは１Ｈ中の４位に相当する位置ということができる。【０１８１】  モチーフ配列２は、タイプＬおよびタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼで共通して保存されている。配列番号２のアミノ酸配列の１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置は、モチーフ配列２中の４位に相当する位置ということができる。【０１８２】  モチーフ配列３Ｌは、タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼでよく保存されており、一方、モチーフ配列３Ｈは、タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼでよく保存されている。配列番号２のアミノ酸配列の７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置は、モチーフ配列３Ｌまたは３Ｈ中の７位に相当する位置ということができる。【０１８３】  このように、耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置はまた、モチーフ配列を用いることによっても特定され得る。耐熱性を向上させるアミノ酸残基の位置は、モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、およびモチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置であり得る。【０１８４】  従って、本発明の方法においては、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子は、改変核酸分子によってコードされる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼが、モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、およびモチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように改変されるということができる。【０１８５】  本明細書中では、「モチーフ配列」とは、複数のタンパク質のアミノ酸配列の間で見られる、共通または高度に保存された部分配列をいう。一般に、モチーフ配列は、特定の機能を有することが多いが、本明細書中では、そのような特定の機能を有さなくとも、複数のアミノ酸配列間で保存されていれば、モチーフ配列と呼ぶ。【０１８６】  「モチーフ配列１Ｌ中の４位の」アミノ酸残基とは、モチーフ配列１ＬのＮ末端（左端）のアミノ酸残基を１位として順番に数えたときに４番目のアミノ酸残基をいう。「モチーフ配列１Ｈ中の４位」、「モチーフ配列２中の４位」、「モチーフ配列３Ｌ中の７位」、「モチーフ配列３Ｈ中の７位」、などについても同様である。【０１８７】  これらのモチーフ配列は、一般に、植物のα−グルカンホスホリラーゼにおいてよく保��されている。モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈおよび３Ｌもしくは３Ｈは、植物のα−グルカンホスホリラーゼにおいてよく保存されているが、動物、微生物などのα−グルカンホスホリラーゼにおいては保存されていない。モチーフ配列２は、植物、動物、微生物などのほぼ全ての生物のα−グルカンホスホリラーゼにおいてよく保存されている。モチーフ配列２は、基質の結合および補酵素であるピリドキサール５’−リン酸の結合に関与すると推定されているアミノ酸残基を含んでおり、活性に必須な領域の一部である。モチーフ配列１Ｌおよび１Ｈの位置、ならびにモチーフ配列２の位置を、図１Ｂに示す。モチーフ配列３Ｌおよび３Ｈの位置を図１Ｇに示す。【０１８８】  本明細書中で用いられる「モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置」とは、対象のアミノ酸配列とモチーフ配列１Ｌもしくはモチーフ配列１Ｈとを相同性が最も高くなるように、ギャップを挿入せず並べた場合に、モチーフ配列１Ｌもしくはモチーフ配列１Ｈ中の４位のアミノ酸残基と並置される位置をいう。より好ましくは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングをギャップなしの条件で実施した際に、モチーフ配列１Ｌもしくはモチーフ配列１Ｈ中の４位のアミノ酸残基と並置される位置をいう。【０１８９】  モチーフ配列２中の４位に相当する位置、およびモチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置についても同様に解釈される。【０１９０】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データとを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力したものである（参考文献：Ｔａｋａｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  ４．５  Ｓ  ＲＮＡ  Ｓｐａｃｉｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。好ましくは、アライメントは、Ｍａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝なし；＊Ｎ＋＝２の条件で行われる。【０１９１】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングを用いて、モチーフ配列１Ｌもしくはモチーフ配列１Ｈに対して、馬鈴薯のタイプＬ（配列番号２）、サツマイモのタイプＬ（配列番号４）、馬鈴薯の第２のタイプＬ（配列番号６）、ソラマメ（Ｆａｖａ  ｂｅａｎ）のタイプＬ（配列番号８）、シロイヌナズナのタイプＬ（配列番号１０）、ホウレンソウのタイプＬ（配列番号１２）、トウモロコシのタイプＬ（配列番号１４）、イネのタイプＬ（配列番号１６）、イネの第２のタイプＬ（配列番号１８）、コムギのタイプＨ（配列番号２０）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒのタイプＨ（配列番号２２）、イネ��タイプＨ（配列番号２４）、ソラマメのタイプＨ（配列番号２６）、シロイヌナズナのタイプＨ（配列番号２８）および馬鈴薯のタイプＨ（配列番号３０）をアライメントした。ただし、マキシマムマッチングの解析は、Ｍａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝０；＊Ｎ＋＝２の条件で行った。【０１９２】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングにおいて、上記の条件で、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０を、各モチーフ配列（モチーフ配列１Ｌ、１Ｈ、２、３Ｌ、または３Ｈ）とアライメントした。その結果、モチーフ配列１Ｌ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ中の４位に相当する位置にはフェニルアラニンまたはチロシンが、モチーフ配列２中の４位に相当する位置にはアスパラギンが、そしてモチーフ配列３Ｌ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ中の７位に相当する位置にはトレオニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸が並置された。モチーフ配列１Ｌ、２および３Ｌは、配列番号２の部分配列であり、モチーフ配列１Ｈ、２および３Ｈは配列番号２４の部分配列である。【０１９３】  配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０のそれぞれについて、配列番号２の全長を用いてライメントした結果と、モチーフ配列１Ｌ、１Ｈ、２、３Ｌおよび３Ｈを用いてアライメントした結果とを比較した。その結果、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０のそれぞれにおいて、配列番号２の３９位に相当する位置と、モチーフ配列１Ｌまたは１Ｈ中の４位に相当する位置とは、同一であった。配列番号２の１３５位に相当する位置と、モチーフ２中の４位に相当する位置とは、同一であった。配列番号２の７０６位に相当する位置と、モチーフ３Ｌまたは３Ｈ中の７位に相当する位置とは、同一であった。このように、モチーフ配列を用いてアライメントを行っても、配列番号２のアミノ酸配列を用いた場合と同じ位置が特定されることが確認された。【０１９４】  配列表の配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。【０１９５】  配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７または配列番号２９に示される塩基配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。【０１９６】  配列表の配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。【０１９７】  本発明において、アミノ酸配列、塩基配列などの配列の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。同一性は、一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定される。同一性パーセントは、アミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）がこの２つの配列間で同一である位置の数を決定し、比較した位置の総数で同一の位置の数を除算し、そしてこれら２つの配列間の同一性パーセントを得るために、得られた結果に１００を掛けることによって算出される。【０１９８】  例示として、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを得るために用いられる天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２の１位〜９１６位、配列番号４の１位〜９１２位、配列番号６の１位〜８９３位、配列番号８の１位〜９３９位、配列番号１０の１位〜９６２位、配列番号１２の１位〜９７１位、配列番号１４の１位〜９８３位、配列番号１６の１位〜９２８位、配列番号１８の１位〜９５１位、配列番号２０の１位〜８３２位、配列番号２２の１位〜８４０位、配列番号２４の１位〜８４１位、配列番号２６の１位〜８４２位、配列番号２８の１位〜８４１位および配列番号３０の１位〜８３８位からなる群より選択されるアミノ酸配列（すなわち、対照アミノ酸配列）と同一、すなわち、１００％同一であってもよく、あるいはこのアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、保存および非保存置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され得る。この変化は対照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシル末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。【０１９９】  本明細書では配列の���一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データとを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋａｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｍｏｎｇ  Ｖａｒｉｏｕｓ  ４．５  Ｓ  ＲＮＡ  Ｓｐａｃｉｅｓ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。【０２００】  ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ  Ｖｅｒ．４．０のマキシマムマッチングを用いて、馬鈴薯のタイプＬ（配列番号２）に対する、サツマイモのタイプＬ（配列番号４）、馬鈴薯の第２のタイプＬ（配列番号６）、ソラマメ（Ｆａｖａ  ｂｅａｎ）のタイプＬ（配列番号８）、シロイヌナズナのタイプＬ（配列番号１０）、ホウレンソウのタイプＬ（配列番号１２）、トウモロコシのタイプＬ（配列番号１４）、イネのタイプＬ（配列番号１６）、イネの第２のタイプＬ（配列番号１８）、コムギのタイプＨ（配列番号２０）、Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒのタイプＨ（配列番号２２）、イネのタイプＨ（配列番号２４）、ソラマメのタイプＨ（配列番号２６）、シロイヌナズナのタイプＨ（配列番号２８）および馬鈴薯のタイプＨ（配列番号３０）を馬鈴薯のタイプＬ（配列番号２）の同一性を算出した結果を表４に示した。ただし、マキシマムマッチングの解析は、Ｍａｔｃｈｅｓ＝−１；Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ＝１；Ｇａｐｓ＝１；＊Ｎ＋＝２の条件で行った。【０２０１】
2004113525.tif 000010
【０２０２】  配列表の配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７および配列番号２９からなる群より選択される塩基配列からなる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子に対して改変を行って得られる改変塩基配列を含む核酸分子は、本発明の範囲内にある。当業者は、所望のα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を容易に選択することができる。【０２０３】  本明細書中で使用する用語「ストリンジェントな条件」とは、特異的な配列にはハイブリダイズするが、非特異的な配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件の設定は、当業者に周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載される。具体的には、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液（０．２％  ＢＳＡ、０．２％  Ｆｉｃｏｌｌ  ４００および０．２％ポリビニルピロリドン）、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄するという条件を用いることにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。【０２０４】  本発明の方法で用いられる改変核酸分子は、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子であってもよい。「第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列を含む核酸分子に対して保存的に改変された核酸分子」とは、第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列がコードするアミノ酸配列と同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸分子をいう。「第一のα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列がコードするアミノ酸配列と本質的に同一のアミノ酸配列」とは、第一のα−グルカンホスホリラーゼと本質的に同じ酵素活性を有するアミノ酸配列をいう。遺伝コードの縮重のため、機能的に同一な多数の塩基配列が任意の所定のアミノ酸配列をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＴはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、ＧＣＡコドンによってアラニンが特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたアラニンを変更することなく、ＧＣＣ、ＧＣＧまたはＧＣＴに変更され得る。同様に、複数のコドンによってコードされ得るアミノ酸に関しては、コドンによってそのアミノ酸が特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされた特定のアミノ酸を変更することなく、そのアミノ酸をコードする任意の別のコドンに変更され得る。このような塩基配列の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての塩基配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント改変を包含する。サイレント変異は、コードする核酸が変化しない「サイレント置換」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合を包含する。ある核酸がアミノ酸をコードする場合、サイレント変異は、サイレント置換と同義である。本明細書において「サイレント置換」とは、塩基配列において、あるアミノ酸をコードする塩基配列を、同じアミノ酸をコードする別の塩基配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という現象に基づき、あるアミノ酸をコードする塩基配列が複数ある場合（例えば、グリシンなど）、このようなサイレント置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成した塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。したがって、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼにおいて、本発明の目的とする改変（モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ中の４位に相当する位置、モチーフ配列２中の４位に相当する位置、もしくはモチーフ配列３Ｌもしくは３Ｈ中の７位に相当する位置、または配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように置換すること）に加えて、塩基配列レベルでは、サイレント置換を含ませることも可能である。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンをコードする唯一のコドンであＡＴＧ、および通常トリプトファンをコードする唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。【０２０５】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列は、発現のために導入される生物におけるコドンの使用頻度にあわせて変更され得る。コドン使用頻度は、その生物において高度に発現される遺伝子での使用頻度を反映する。例えば、大腸菌において発現させることを意図する場合、公開されたコドン使用頻度表（例えば、Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６  第１７号，８２０７頁（１９８８））に従って大腸菌での発現のために最適にすることができる。【０２０６】  （２．３  発現ベクターの作製）
上記のようにして改変された塩基配列を含む核酸分子を用いて、発現ベクターが作製される。特定の核酸配列を用いて発現ベクターを作製する方法は、当業者に周知である。【０２０７】  本明細書において核酸分子について言及する場合、「ベクター」とは、目的の塩基配列を目的の細胞へと移入させることができる核酸分子をいう。そのようなベクターとしては、目的の細胞において自律複製が可能であるか、または目的の細胞の染色体中への組込みが可能で、かつ改変された塩基配列の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。【０２０８】  本明細書において使用される「発現ベクター」とは、改変された塩基配列（すなわち、改変されたα−グルカンホスホリラーゼをコードする塩基配列）を目的の細胞中で発現し得るベクターをいう。発現ベクターは、改変された塩基配列に加えて、その発現を調節するプロモーターのような種々の調節エレメント、および必要に応じて、目的の細胞中での複製および組換え体の選択に必要な因子（例えば、複製起点（ｏｒｉ）、および薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー）を含む。発現ベクター中では、改変された塩基配列は、転写および翻訳されるように作動可能に連結されている。調節エレメントとしては、プロモーター、ターミネーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、発現された酵素を細胞外へ分泌させることが意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列が、改変された塩基配列の上流に正しいリーディングフレームで結合される。特定の生物（例えば、細菌）に導入するために使用される発現ベクターのタイプ、その発現ベクター中で使用される調節エレメントおよび他の因子の種類が、目的の細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【０２０９】  本明細書において使用される「ターミネーター」は、タンパク質コード領域の下流に位置し、塩基配列がｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。【０２１０】  本明細書において使用される「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、また転写頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。【０２１１】  本明細書において使用される「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。【０２１２】  本明細書において使用される「作動可能に連結された（る）」とは、所望の塩基配列が、発現（すなわち、作動）をもたらす転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【０２１３】  改変した核酸配列を、上記調節エレメントに作動可能に連結するために、目的のα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を加工すべき場合がある。例えば、プロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異誘発の導入が挙げられる。【０２１４】  （２．４  耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの発現）
次いで、上記のようにして作製された発現ベクターを細胞に導入して耐熱化α−グルカンホスホリラーゼが発現される。【０２１５】  本明細書において酵素の「発現」とは、その酵素をコードする塩基配列が、インビボまたはインビトロで転写および翻訳されて、コードされる酵素が生産されることをいう。【０２１６】  発現ベクターを導入する細胞（宿主ともいう）としては、原核生物および真核生物が挙げられる。発現ベクターを導入する細胞は、α−グルカンホスホリラーゼの発現の容易さ、培養の容易さ、増殖の速さ、安全性などの種々の条件を考慮して容易に選択され得る。例えば、α−グルカンホスホリラーゼを高分子量のアミロースの合成に用いる場合、α−グルカンホスホリラーゼは、夾雑物としてアミラーゼを含まないことが好ましいので、アミラーゼを産生しないかまたは低レベルでしか発現しない細胞を用いることが好ましい。このような細胞の例としては、細菌、真菌などの微生物が挙げられる。より好ましい細胞の例としては、中温菌（例えば、大腸菌、枯草菌）が挙げられる。本明細書において、「中温菌」とは、生育温度が通常の温度環境にある微生物のことであり、特に生育至適温度が２０℃〜４０℃である微生物をいう。細胞は、微生物細胞であってもよいが、植物、動物などの細胞であってもよい。用いる細胞によっては、本発明の酵素は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。植物としては、例えば、双子葉植物、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシなどの単子葉植物が挙げられるがそれらに限定されない。イネなどの穀物は、貯蔵タンパク質を種子に蓄積する性質を持っており、貯蔵タンパク質系を用いて、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを種子に蓄積するように発現させることが可能である（特開２００２−５８４９２号明細書を参照のこと）。【０２１７】  本発明の方法において、発現ベクターを細胞に導入する技術は、当該分野で公知の任意の技術であり得る。このような技術の例としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。【０２１８】  細胞として植物の細胞を用いる場合、形質転換体を組織または植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法の例は、以下に記載される：Ｒｏｇｅｒｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１８：６２７−６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３−８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ��ｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４（１９８９）；およびＭａｌｉｇａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）。木本植物を形質転換する方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔｓ（Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ）（ｅｄ．Ｓ．Ｍｏｈａｎ  Ｊａｉｎ，Ｓｕｂｈａｓｈ  Ｃ．Ｍｉｎｏｃｈａ）、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（２０００）に記載されている。また、木本植物を形質転換する方法は、例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９９）１９：１０６−１１０に詳細に記載されている。従って、当業者は、目的とするトランスジェニック植物に応じて上記周知方法を適宜使用して、形質転換体を再分化させることができる。このようにして得られたトランスジェニック植物には、目的の遺伝子が導入されており、そのような遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような公知の方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【０２１９】  発現ベクターが導入されて耐熱化されたα−グルカンホスホリラーゼを発現する能力を獲得した細胞（形質転換細胞ともいう）を培養することにより、耐熱化されたα−グルカンホスホリラーゼを細胞に発現させることができる。形質転換細胞の培養条件は、使用する宿主細胞の種類、発現ベクター内の発現調節因子の種類などに応じて、適切に選択される。例えば、通常の振盪培養方法が用いられ得る。【０２２０】  形質転換細胞の培養に用いる培地は、使用する細胞が増殖して目的の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現し得るものであれば特に限定されない。培地には、炭素源、窒素源の他、無機塩、例えば、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋などの塩が必要に応じて、適宜混合して、または単独で用いられ得る。また、必要に応じて形質転換細胞の増殖、目的の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの発現に必要な各種無機物または有機物が添加され得る。【０２２１】  形質転換細胞を培養する温度は、用いる形質転換細胞の増殖に適するように選択され得る。通常１５℃〜６０℃である。形質転換細胞の培養は、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの発現のために十分な時間続行される。【０２２２】  誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合、誘導物質の添加、培養温度の変更、培地成分の調整などにより発現が制御され得る。例えば、ラクトース誘導性プロモーターを有する発現ベクターを使用する場合は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現が誘導され得る。【０２２３】  （２．５  耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの回収）
このようにして発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、次いで回収され得る。例えば発現された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼが形質転換細胞内に生産される場合、このようにして形質転換細胞を培養した後、培養物を遠心分離または濾過することによって細胞を回収する。回収した細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、通常の手段（超音波、フレンチプレス、リゾチーム処理）を用いて破砕し、粗酵素液を得る。さらに、粗酵素液を遠心分離、クロマトグラフィー、膜分画、電気泳動、塩析などの通常の酵素精製手段を適宜組み合わせた方法で精製することによって、比活性が向上した粗酵素液または精製酵素が得られる。α−アミラーゼなどのグルカンを加水分解する酵素が含まれていなければ、粗酵素をそのまま、例えば、高分子量のグルカンの製造に用い得る。【０２２４】  上述のようにして耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを生産することにより、天然のα−グルカンホスホリラーゼの耐熱性を大幅に向上させることが可能となる。また、発現させた耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、その耐熱性を利用して簡便に精製され得る。簡単に述べると、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを含む細胞抽出液を６０℃程度で加熱処理することにより、夾雑酵素が不溶化する。この不溶化物を遠心分離などで除去して透析処理を行うことにより、精製された耐熱化α−グルカンホスホリラーゼが得られる。【０２２５】  （３．耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ）
上記のような方法によって得られた本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、モチーフ配列１Ｌ：Ｈ−Ａ−Ｅ−Ｆ−Ｔ−Ｐ−Ｖ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置もしくはモチーフ配列１Ｈ：Ｈ−Ａ−Ｑ−Ｙ−Ｓ−Ｐ−Ｈ−Ｆ−Ｓ中の４位に相当する位置、モチーフ配列２：Ａ−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｌ−Ｇ中の４位に相当する位置、およびモチーフ配列３Ｌ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｆ−Ｉ−Ｔ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置もしくはモチーフ配列３Ｈ：Ｒ−Ｉ−Ｖ−Ｋ−Ｌ−Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｖ中の７位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。【０２２６】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、これらの位置でのアミノ酸残基の置換に加えて、天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでもよい。【０２２７】  １つの実施形態では、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、植物由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。【０２２８】  本発明の酵素はまた、植物由来の天然のα−グルカンホスホリラーゼを改変して得られる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼであって、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有する。【０２２９】  本発明の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも２つの位置において天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有することが好ましい。本発明の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置の全ての位置において、天然のα−グルカンホスホリラーゼとは異なるアミノ酸残基を有することが最も好ましい。【０２３０】  天然のα−グルカンホスホリラーゼの上記の３つの位置は、α−グルカンホスホリラーゼの立体構造の中で、周囲のアミノ酸と相互に作用し、酵素を不安定にする立体的部分構造を形成していると考えられる。これらの位置の残基を、別のアミノ酸残基に変更することによって、酵素が安定化され、耐熱性が向上する。また、これらの位置の残基は周囲のアミノ酸残基と立体構造的に相互作用しているので、そのアミノ酸残基を置換することに重要な意義がある。例えば、馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの場合は、Ｆ３９の位置のＦをそれ以外に置換することに重要な意義がある。また、例えば、馬鈴薯由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼにおいては、Ｆ３９に相当する位置のアミノ酸はＹであるが、Ｙを他のアミノ酸に置換することに重要な意義がある。【０２３１】  本発明の酵素においては、モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ中の４位またはＦ３９に相当する位置におけるアミノ酸残基は、天然のα−グルカンホスホリラーゼに見出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列１Ｌもしくは１Ｈ中の４位またはＦ３９に相当する位置におけるアミノ酸残基は、脂肪族アミノ酸または複素環式アミノ酸であることが好ましく、脂肪族アミノ酸であることがより好ましく、分枝アミノ酸（すなわち、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であることが特に好ましく、イソロイシンまたはロイシンであることが殊に好ましく、ロイシンであることが最も好ましい。【０２３２】  本発明の酵素においては、モチーフ配列２中の４位またはＮ１３５に相当する位置におけるアミノ酸残基は、天然のα−グルカンホスホリラーゼに見出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列２中の４位またはＮ１３５に相当する位置におけるアミノ酸残基は、脂肪族アミノ酸または複素環式アミノ酸であることが好ましく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、バリンまたはチロシンであることがより好ましく、システイン、グリシン、セリンまたはバリンであることが特に好ましい。【０２３３】  本発明の酵素においては、モチーフ配列３Ｌもしくは３Ｈ中の７位またはＴ７０６に相当する位置におけるアミノ酸残基は、天然のα−グルカンホスホリラーゼに見出されるアミノ酸残基以外のアミノ酸であり得る。モチーフ配列３Ｌもしくは３Ｈ中の７位またはＴ７０６に相当する位置におけるアミノ酸残基は、脂肪族アミノ酸であることが好ましく、分枝アミノ酸（すなわち、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または含硫アミノ酸（すなわち、システイン、シスチン、メチオニン）であることがより好ましく、システイン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンであることが特に好ましく、システイン、イソロイシン、ロイシン、またはバリンであることが特に好ましく、イソロイシンであることが最も好ましい。【０２３４】  本発明の方法において、耐熱化α���グルカンホスホリラーゼを作製するために、本発明の目的の改変（配列番号２のアミノ酸配列の３９位フェニルアラニン（Ｆ３９）に相当する位置、１３５位アスパラギン（Ｎ１３５）に相当する位置および７０６位トレオニン（Ｔ７０６）に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置において、該天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を有するように置換すること）に加えて、アミノ酸の置換、付加、欠失または修飾を行うことができる。アミノ酸の置換とは、１つのアミノ酸を別の１つのアミノ酸に置き換えることをいう。アミノ酸の付加とは、もとのアミノ酸配列中のどこかの位置に、１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を挿入することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのアミノ酸配列から１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を除去することをいう。アミノ酸修飾の例としては、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、ペプチド合成方法によって合成されてもよく、このような場合、置換または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであってもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【０２３５】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、α−グルカンホスホリラーゼとしての酵素活性を有する、酵素アナログであってもよい。本明細書において使用される用語「酵素アナログ」とは、天然の酵素とは異なる化合物であるが、天然の酵素と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、酵素アナログには、もとの天然の酵素に対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。酵素アナログは、その機能（例えば、α−ホスホリラーゼ活性または耐熱性）が、もとの天然の酵素の機能と実質的に同様またはそれよりも良好であるように、このような付加または置換がされている。そのような酵素アナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、酵素アナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。本明細書において「酵素」は、特に言及しない限り、この酵素アナログを包含する。【０２３６】  本明細書において、「アミノ酸」は、天然のアミノ酸であっても、非天然アミノ酸であっても、誘導体アミノ酸であっても、アミノ酸アナログであってもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【０２３７】  用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体で���るが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。【０２３８】  用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。【０２３９】  「誘導体アミノ酸」とは、アミノ酸を誘導体化することによって得られるアミノ酸をいう。【０２４０】  「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。【０２４１】  アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。【０２４２】  目的の改変に加えて、天然のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して１もしくは数個またはそれを超える複数のアミノ酸の置換、付加または欠失による改変を含む耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、本発明の範囲内にある。そのような１もしくは数個またはそれを超えるアミノ酸の置換、付加または欠失を含む耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。【０２４３】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、当該分野において周知の方法を利用して製造され得る。例えば、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。部位特異的変異誘発の手法は、当該分野では周知である。例えば、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．６４８７−６５００（１９８２）を参照のこと。【０２４４】  本明細書において、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼについて用いられるとき「１もしくは数個またはそれを超える複数のアミノ酸の置換、付加または欠失」または「少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加または欠失」とは、α−グルカンホスホリラーゼの酵素活性が喪失しない、好ましくはその酵素活性が基準となるもの（例えば、天然のα−グルカンホスホリラーゼ）と同等以上となるような程度の数の置換、付加または欠失をいう。当業者は、所望の性質を有する耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを容易に選択することができる。あるいは、目的とする耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを直接化学合成してもよい。そのような化学合成の方法は、当該分野において周知である。【０２４５】  このようにして作製された本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、第一の（天然の）α−グルカンホスホリラーゼ（好ましくは、馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼ）のアミノ酸配列に対して、好ましくは約４０％、より好ましくは約４５％、より好ましくは約５０％、より好ましくは約５５％、より好ましくは約６０％、より好ましくは約６５％、より好ましくは約７０％、より好ましくは約７５％、より好ましくは約８０％、より好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９９％の同一性を有する。【０２４６】  上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【０２４７】  あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当��られている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【０２４８】  本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換が挙げられるがこれらに限定されない：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。【０２４９】  （３．２  耐熱性の評価方法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の２０％以上であることを１つの特徴とする。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性は、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の約２０％以上であることが好ましく、約２５％以上であることがより好ましく、約３０％以上であることがより好ましく、約４０％以上であることがより好ましく、約５０％以上であることがより好ましく、約５５％以上であることが好ましく、約６０％以上であることがより好ましく、約６５％以上であることがさらに好ましく、約７０％以上であることがいっそう好ましく、約８０％以上であることが特に好ましく、約９０％以上であることが最も好ましい。【０２５０】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６５℃で２分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性が、該加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性の約４０％以上であることが好ましく、約４５％以上であることがより好ましく、約５０％以上であることがさらに好ましく、約５５％以上であることがいっそう好ましく、約６０％以上であることが特に好ましく、約６５％以上であることが最も好ましい。【０２５１】  （３．２．１  α−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）活性測定法）
このＧＰ酵素活性測定法は、Ｇ−１−Ｐから生じた遊離の無機リン酸（Ｐｉ）を定量する。【０２５２】  （ｉ）２００μｌの反応液（１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２．５ｍＭ  Ｇ−１−Ｐ、１％デキストリンおよび酵素液を含む）を３７℃に１５分間インキュベートする。【０２５３】  （ｉｉ）８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸亜鉛）を加え、攪拌し反応を停止する。【０２５４】  （ｉｉｉ）２００μｌの５６８ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ５．８）を加え、混合する。【０２５５】  （ｉｖ）３７℃に１５分間インキュベートした後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定する。【０２５６】  （ｖ）濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。【０２５７】  （ｖｉ）この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−１−リン酸の量は定量されない。本明細書において、１単位のα−グルカンホスホリラーゼ活性とは、この測定法で測定して、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸（Ｐｉ）を生成する活性を１単位（Ｕ）とする。【０２５８】  （３．２．２耐熱性の測定法）
耐熱性は、以下の手順に従って測定される。【０２５９】  （ｉ）０．２Ｕ／ｍｌの酵素液（２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中）を５５℃、６０℃または６５℃で０〜６０分間インキュベートする。【０２６０】  （ｉｉ）各時間で取り出した酵素液を氷中に保持する。【０２６１】  （ｉｉｉ）（ｉｉ）の酵素液を１０倍希釈し、ＧＰ活性測定法に従って酵素活性を測定する。２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で６０℃で１０分間加熱した後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性Ａ後の割合は、加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの３７℃における酵素活性Ａ前から、（Ａ後）÷（Ａ前）×１００（％）によって算出される。加熱前の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの酵素活性Ａ前に対する加熱後の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの酵素活性Ａ後の割合を、残存活性ともいう。【０２６２】  （３．３アミロースを合成する能力の評価方法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、重量平均分子量が、好ましくは約６０ｋＤａ以上、より好ましくは約１００ｋＤａ以上、さらに好ましくは約１５０ｋＤａ以上、さらに好ましくは約２００ｋＤａ以上、さらに好ましくは約２５０ｋＤａ以上、さらに好ましくは約３００ｋＤａ以上、さらに好ましくは約３５０ｋＤａ以上、さらに好ましくは約４００ｋＤａ以上、さらに好ましくは約４５０ｋＤａ以上、さらに好ましくは約５００ｋＤａ以上、さらに好ましくは約５５０ｋＤａ以上、さらに好ましくは約６００ｋＤａ以上、最も好ましくは約６５０ｋＤａ以上のグルカン（特にアミロース）を合成する能力を有することを１つの特徴とする。重量平均分子量が約５ｋＤａ〜約５９９ｋＤａのグルカンは水に溶けにくいのに対し、重量平均分子量が約６００ｋＤａ以上のグルカンは特に、水溶性であるという利点を示す。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼによって合成されるグルカンの重量平均分子量には、特に上限はないが、例えば、１０００ｋＤａまで、１万ｋＤａまで、１０万ｋＤａまでのグルカンが良好な生産性で合成され得る。【０２６３】  「重量平均分子量６０ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する」とは、４０μＭマルトテトラオース、２５０ｍＭグルコース−１−リン酸、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、４Ｕ／ｍｌ反応液の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ（精製酵素）を用いて、３７℃にて１８時間インキュベートすることによってアミロースを合成したときに合成されるアミロースの重量平均分子量が６０ｋＤａ以上であることをいう。他の重量平均分子量のアミロースを合成する能力についても同様に定義され、例えば、「重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースを合成する能力を有する」とは、この条件で合成されるアミロースの重量平均分子量が６００ｋＤａ以上であることを有する。【０２６４】  アミロースの重量平均分子量は、例えば、以下の方法で測定され得る。【０２６５】  まず、合成したアミロースを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、アミロース約３０〜３００μｇ分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより平均分子量を求める。【０２６６】  詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ（昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いる。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いる。得られるシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求める。【０２６７】  （３．４保存安定性の評価方法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、好ましくは、天然のα−グルカンホスホリラーゼと比較して、保存安定性が向上している。本明細書中で「保存安定性が向上した」とは、天然のα−グルカンホスホリラーゼと比較して、保存中に分解されにくいことをいう。【０２６８】  １つの局面では、保存安定性とは、４℃で保存したときの安定性をいう。この場合、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、精製後、４℃にて一定期間保存したとき、酵素タンパク質の分子量が、精製直後とほぼ同等である。一般に、天然のα−グルカンホスホリラーゼは、４℃にて長期間保存すると、分解して、酵素タンパク質の分子量が、精製直後よりも低下する。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、好ましくは４℃にて１ヶ月間保存した後、より好ましくは４℃にて３ヶ月間保存した後、最も好ましくは４℃にて５ヶ月間保存した後、精製直後とほぼ同等の分子量を有する。【０２６９】  別の局面では、保存安定性とは、３７℃で保存したときの安定性をいう。この場合、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、精製後、３７℃にて一定期間保存したとき、酵素タンパク質の分子量が、精製直後とほぼ同等である。一般に、天然のα−グルカンホスホリラーゼは、３７℃にて長期間保存すると、分解して、酵素タンパク質の分子量が、精製直後よりも低下する。別の形態では、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、好ましくは３７℃にて４日間保存した後、より好ましくは３７℃にて７日間保存した後、最も好ましくは３７℃にて１０日間保存した後、精製直後とほぼ同等の分子量を有する。【０２７０】  もちろん、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、通常保存に用いられる任意の温度で保存され得る。保存に用いられる温度は、例えば、約４℃〜約３７℃の間の任意の温度（例えば、約４℃、約５℃、約１０℃、約２０℃、約２５℃、約３７℃など）であり得る。【０２７１】  保存安定性は、当該分野で公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、精製直後の酵素タンパク質と、所定の温度にて一定期間保存した後の酵素タンパク質とを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）によって泳動し、これらの酵素タンパク質の分子量を比較することによって評価され得る。【０２７２】  （４．本発明の酵素を用いたグルカンの製造法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、グルカンの合成方法において有利に用いられ得る。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いるグルカンの合成方法は、当該分野で公知の任意のグルカンの合成方法であり得るが、スクロースとプライマーにスクロースホスホリラーゼとα−グルカンホスホリラーゼを同時に作用させる方法（ＳＰ−ＧＰ法ともいう）において用いることが好ましい。ＳＰ−ＧＰ法は、安価な基質を用いて直鎖状グルカンを製造できるという利点を有する。【０２７３】  本発明のグルカンの合成方法は、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【０２７４】  本発明のグルカンの合成方法は、もちろん、ＳＰ−ＧＰ法によらない方法であってもよい。このような方法の場合、本発明のグルカンの合成方法は、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液を反応させて、グルカンを生産する工程を包含する。【０２７５】  本明細書中では「グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする、糖であって、α−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。グルカンは、直鎖状、分岐状または環状の分子であり得る。直鎖状グルカンとα−１，４−グルカンとは同義語である。直鎖状グルカンでは、α−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。α−１，６−グルコシド結合を１つ以上含むグルカンは、分岐状グルカンである。グルカンは、好ましくは、直鎖状の部分をある程度含む。分岐のない直鎖状グルカンがより好ましい。【０２７６】  グルカンは、場合によっては、分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）が少ないことが好ましい。このような場合、分岐の数は、代表的には０〜１００００個、好ましくは０〜１０００個、より好ましくは０〜５００個、さらに好ましくは０〜１００個、さらに好ましくは０〜５０個、さらに好ましくは０〜２５個、さらに好ましくは０個である。【０２７７】  本発明のグルカンでは、α−１，６−グルコシド結合を１としたときのα−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比は、好ましくは１〜１００００であり、より好ましくは２〜５０００であり、さらに好ましくは５〜１０００であり、さらに好ましくは１０〜５００である。【０２７８】  α−１，６−グルコシド結合は、グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。【０２７９】  グルカンは、Ｄ−グルコースのみから構成されていてもよいし、グルカンの性質を損なわない程度に修飾された誘導体であってもよい。修飾されていないことが好ましい。【０２８０】  グルカンは、代表的には約８×１０３以上、好ましくは約１×１０４以上、より好ましくは約５×１０４以上、さらに好ましくは約１×１０５以上、さらに好ましくは約６×１０５以上の分子量を有する。グルカンは、代表的には約１×１０���以下、好ましくは約３×１０７以下、より好ましくは約１×１０７以下、さらに好ましくは約５×１０６以下、さらに好ましくは約１×１０６以下の分子量を有する。本発明ではグルカンの分子量とは、特に制限がない限り重量平均分子量をいう。【０２８１】  当業者は、本発明の製造方法で用いられる基質の量、酵素の量、反応時間などを適宜設定することによって所望の分子量のグルカンが得られることを容易に理解する。【０２８２】  生産効率の良いＳＰ−ＧＰ法は、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載される。【０２８３】  本発明の製造法では、例えば、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸と、緩衝剤と、それを溶かしている溶媒とを主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。本発明の製造方法では、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を用いることができる。枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素は、目的とするグルカンの構造に応じて、本発明の製造方法の最初から反応溶液中に添加してもよく、途中から反応溶液中に添加してもよい。【０２８４】  本明細書中では、「スクロースホスホリラーゼ」とは、スクロースのα−グリコシル基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：【０２８５】
2004113525.tif 000011
【０２８６】  スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｍｏｎｉｌｉａ  ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ  ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられるがこれらに限定されない。【０２８７】  スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼを産生する任意の生物由来であり得る。スクロースホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、単独で存在する場合の耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、スクロースホスホリラーゼを４％のスクロース存在下で５５℃にて３０分間加熱した場合に加熱前のスクロースホスホリラーゼの活性の２０％以上の活性を保持するものであることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａからなる群より選択される細菌由来であり得、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＯｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉからなる群より選択される細菌由来であり得、そしてさらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来し得る。【０２８８】  スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製��階のものとして提供されてもよい。【０２８９】  本発明の製造法に用いられる耐熱化α−グルカンホスホリラーゼおよびスクロースホスホリラーゼはそれぞれ、精製酵素または粗酵素を問わず、固定化されたものでも反応に使用し得、反応の形式は、バッチ式でも連続式でもよい。固定化の方法としては、担体結合法、（例えば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）が使用され得る。【０２９０】  プライマーの例としては、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、プルラン、カップリングシュガー、澱粉およびこれらの誘導体が挙げられる。【０２９１】  本明細書中において、無機リン酸とは、ＳＰの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロース加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。本発明において、無機リン酸は好ましくは、リン酸の任意の金属塩であり、より好ましくはリン酸のアルカリ金属塩である。無機リン酸の好ましい具体例としては、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウム、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウムなどが挙げられる。【０２９２】  無機リン酸は、反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。【０２９３】  無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。【０２９４】  本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。【０２９５】  グル���ース−１−リン酸は反応開始時のＳＰ−ＧＰ反応系において、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。【０２９６】  本発明のグルカン製造法において、α−１，６−グルコシド結合を含有する出発材料を用いる場合などの、生成物に分岐が生じる場合には、必要に応じて、枝切り酵素を用いることができる。【０２９７】  本発明で用いられ得る枝切り酵素は、α−１，６−グルコシド結合を切断し得る酵素である。枝切り酵素は、アミロペクチンおよびグリコーゲンにともによく作用するイソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）と、アミロペクチン、グリコーゲンおよびプルランに作用するα−デキストリンエンド−１，６−α−グルコシダーゼ（プルラナーゼともいう）（ＥＣ  ３．２．１．４１）との２つに分類される。【０２９８】  枝切り酵素は、微生物、細菌、および植物に存在する。枝切り酵素を産生する微生物の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．が挙げられる。枝切り酵素を産生する細菌の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウダイコンなどが挙げられる。枝切り酵素を産生する生物はこれらに限定されない。【０２９９】  本発明の方法において、生成物に分岐を生じさせることが所望される場合には、必要に応じて、ブランチングエンザイムを用いることができる。【０３００】  本発明で用いられ得るブランチングエンザイムは、α−１，４−グルカン鎖の一部をこのα−１，４−グルカン鎖のうちのあるグルコース残基の６位に転移して分枝を作り得る酵素である。ブランチングエンザイムは、１，４−α−グルカン分枝酵素、枝つくり酵素またはＱ酵素とも呼ばれる。【０３０１】  ブランチングエンザイムは、微生物、動物、および植物に存在する。ブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｌｉｃ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ���Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｒｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｂａｍｅｎｓｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、酵母などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する動物の例としてはヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する植物の例としては、藻類、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。ブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。【０３０２】  本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、４−α−グルカノトランスフェラーゼを用いることができる。【０３０３】  本発明で用いられ得る４−α−グルカノトランスフェラーゼは、ディスプロポーショネーティングエンザイム、Ｄ−酵素、アミロマルターゼ、不均化酵素などとも呼ばれ、マルトオリゴ糖の糖転移反応（不均一化反応）を触媒し得る酵素である。４−α−グルカノトランスフェラーゼは、供与体分子の非還元末端からグルコシル基あるいは、マルトシルもしくはマルトオリゴシルユニットを受容体分子の非還元末端に転移する酵素である。従って、酵素反応は、最初に与えられたマルトオリゴ糖の重合度の不均一化をもたらす。供与体分子と受容体分子とが同一の場合は、分子内転移が生じ、その結果、環状構造をもつ生成物が得られる。【０３０４】  ４−α−グルカノトランスフェラーゼは、微生物および植物に存在する。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する微生物の例としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓなどが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する植物の例としては、馬鈴薯、サツマイモ、ヤマイモ、キャッサバなどの芋類、トウモロコシ、イネ、コムギ、などの穀類、えんどう豆、大豆、などの豆類などが挙げられる。４−α−グルカノトランスフェラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。【０３０５】  本発明の方法において、生成物に環状構造を生じさせる場合には、必要に応じて、グリコーゲンデブランチングエンザイムを用いることができる。【０３０６】  本発明で用いられ得るグリコーゲンデブランチングエンザイムは、α−１，６−グルコシダーゼ活性と、４−α−グルカノト��ンスフェラーゼ活性との２種類の活性をもつ酵素である。グリコーゲンデブランチングエンザイムが持つ、４−α−グルカノトランスフェラーゼ活性により、環状構造を持つ生成物が得られる。【０３０７】  グリコーゲンデブランチングエンザイムは、微生物および動物に存在する。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する微生物の例としては、酵母などが挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類が挙げられる。グリコーゲンデブランチングエンザイムを産生する生物はこれらに限定されない。【０３０８】  本発明の製造法に用いる溶媒は、スクロースホスホリラーゼおよびα−グルカンホスホリラーゼの酵素活性を損なわない溶媒であれば任意の溶媒であり得る。【０３０９】  なお、グルカンを生成する反応が進行し得る限り、溶媒が本発明の製造法に用いる材料を完全に溶解する必要はない。例えば、酵素が固体の担体上に担持されている場合には、酵素が溶媒中に溶解する必要はない。さらに、スクロースなどの反応材料も全てが溶解している必要はなく、反応が進行し得る程度の材料の一部が溶解していればよい。【０３１０】  代表的な溶媒は、水である。溶媒は、上記スクロースホスホリラーゼまたはα−グルカンホスホリラーゼを調製する際にスクロースホスホリラーゼまたはα−グルカンホスホリラーゼに付随して得られる細胞破砕液のうちの水分であってもよい。【０３１１】  α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを含む溶液中には、スクロースホスホリラーゼとスクロースとの間の相互作用およびα−グルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、α−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。【０３１２】  これらの材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。【０３１３】  本発明の製造法においては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、固体状のスクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、α−グルカンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、スクロース、プライマー、または無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸をそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、α−グルカンホスホリラーゼと、スクロースホスホリラーゼと、スクロースと、プライマーと、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸とのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じて枝切り酵素、ブランチングエンザイム���４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。【０３１４】  次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約３０℃〜約７５℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼおよびα−グルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約２０％以上、好ましくは約３０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約５５℃〜約７５℃であり、より好ましくは約６０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは約６０℃〜約７０℃、特に好ましくは約６０℃〜約６５℃である。【０３１５】  反応時間は、反応温度、反応により生産されるグルカンの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。【０３１６】  このようにして、グルカンを含有する溶液が生産される。【０３１７】  （５．本発明の酵素を用いたグルコース−１−リン酸の合成方法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、グルコース−１−リン酸の合成方法においても有利に用いられ得る。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いるグルコース−１−リン酸の合成方法は、当該分野で公知の任意のグルコース−１−リン酸の合成方法であり得る。【０３１８】  本発明のグルコース−１−リン酸の合成方法は、本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ、グルカンおよび無機リン酸を含む反応溶液を反応させて、グルコース−１−リン酸を生産する工程を包含する。【０３１９】  本発明のグルコース−１−リン酸の合成方法において用いられるグルカンおよび無機リン酸の定義は、上記４と同様である。【０３２０】  グルコース−１−リン酸の合成方法に用いられる材料の使用量は、公知であり、当業者によって適切に設定され得る。【０３２１】  本発明のグルコース−１−リン酸の合成方法においては、まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、α−グルカンホスホリラーゼと、グルカンと、無機リン酸とを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、α−グルカンホスホリラーゼ、グルカン、または無機リン酸をそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、α−グルカンホスホリラーゼと、グルカンと、無機リン酸とのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じて枝切り酵素を添加してもよい。【０３２２】  次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約７５℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの活性の約２０％以上、より好ましくは約３０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約５５℃〜約７５℃であり、より好ましくは約６０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは約６０℃〜約７０℃、特に好ましくは約６０℃〜約６５℃である。【０３２３】  反応時間は、反応温度および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。【０３２４】  このようにして、グルコース−１−リン酸を含有する溶液が生産される。【０３２５】  （６．本発明の酵素を用いたその他の製造法）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、上記の製造法以外にも、α−グルカンホスホリラーゼを使用する、当該分野で公知の任意の製造法において使用され得る。これらの製造法に本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを利用することは当業者に容易に行われ得る。【０３２６】  （７．本発明の製造法によって得られたグルカンの用途）
本発明の製造法によって得られたグルカンは、グルカンについて当該分野で公知の用途に使用され得る。グルカンのなかでも特に、不溶性のアミロースには、食物繊維と同様の働きが予想され、健康食品への利用も期待できる。さらに、アミロースは、例えばヨウ素、脂肪酸などを分子内に包接し得る特徴を持つことから、医薬品、化粧品、サニタリー製品分野での用途が期待される。アミロースはまた、アミロースと同様の包接能力を持つシクロデキストリンおよびシクロアミロースの製造用原料に利用できる。さらに、アミロースを含有したフィルムは、汎用プラスチックに劣らない引張強度を持ち、生分解性プラスチックの素材として非常に有望である。このようにアミロースには、多くの用途が期待されている。【０３２７】  （８．本発明の合成方法によって得られたグルコース−１−リン酸の用途）
本発明の合成方法によって得られたグルコース−１−リン酸は、グルコース−１−リン酸について当該分野で公知の用途に使用され得る。グルコース−１−リン酸は、例えば、医療用抗菌剤、抗腫瘍剤（白金錯体）、心臓病の治療薬（アミン塩）、グルカン合成の基質として利用されている。【０３２８】  以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０３２９】  （１．測定方法および計算方法）
本発明における各種物質は、以下の測定方法によって測定した。【０３３０】  （１．１グルコースの定量）
グルコースを、市販されている測定キットを用いて定量した。グルコースＡＲ−ＩＩ発色試薬（和光純薬社製）を用いて測定する。【０３３１】  （１．２フルクトースの定量）
フルクトースを、市販されている測定キットを用いて定量した。Ｆ−キットＤ−グルコース／Ｄ−フルクトース（ロシュ社製）を用いて測定する。【０３３２】  （１．３グルコース−１−リン酸の定量）
グルコース−１−リン酸を、以下の方法により定量した。３００μｌの測定試薬（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、３ｍＭ  ＮＡＤＰ、１５ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５μＭグルコース−１，６−二リン酸、６μｇ／ｍｌホスホグルコムターゼ、６μｇ／ｍｌグルコース−６−リン酸脱水素酵素）に、適切に希釈したグルコース−１−リン酸を含む溶液６００μｌを加えて攪拌し、得られた反応混合物を３７℃で３０分間反応させる。その後、分光光度計を用いて３４０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知のグルコース−１−リン酸ナトリウムを用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中のグルコース−１−リン酸濃度を求める。通常は、１分間に１μｍｏｌのグルコース−１−リン酸を生成する活性を１単位とする。この定量法では、グルコース−１−リン酸のみが定量され、無機リン酸の量は定量されない。【０３３３】  （１．４無機リン酸の定量）
無機リン酸を、リン酸イオンとして以下の方法により求めた。無機リン酸を含む溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、得られた反応混合物を３７℃で３０分間反応させる。その後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。この定量法では、無機リン酸の量が定量され、グルコース−１−リン酸の量は定量されない。【０３３４】  （１．５グルコース−１−リン酸から製造したグルカンの収率の計算方法）
スクロースホスホリラーゼを用いず、α−グルカンホスホリラーゼおよび出発物質としてグルコース１−リン酸を用いて製造したグルカン（例えば、アミロース）の収率は、反応終了後の溶液中の無機リン酸、グルコースの量から、以下の式により求められる。【０３３５】
2004113525.tif 000012
【０３３６】  （１．６スクロースから製造したグルカンの収量の計算方法）
ＳＰ−ＧＰ法において出発物質として無機リン酸を用いて製造したグルカン（例えば、アミロース）の収量は、反応終了後の溶液中の、グルコース、フルクトース、およびグルコース−１−リン酸の量から、以下の式により求められる。【０３３７】
2004113525.tif 000013
【０３３８】  この式は、以下の原理に基づく。【０３３９】  本発明の方法では、まず、以下の式の反応（Ａ）が起き得る。【０３４０】
2004113525.tif 000014
【０３４１】  この反応は、スクロースホスホリラーゼにより触媒される。この反応では、スクロースと無機リン酸とが反応して、同じモル量のグルコース−１−リン酸とフルクトースとが生じる。生じたフルクトースはそれ以上他の物質と反応しないので、フルクトースのモル量を測定することによって生じたグルコース−１−リン酸のモル量がわかる。【０３４２】  スクロースホスホリラーゼは、上記の反応（Ａ）の他に、以下の反応（Ｂ）のスクロースの加水分解も副反応として触媒し得る。【０３４３】
2004113525.tif 000015
【０３４４】  グルカンに取り込まれたグルコース量は以下によって計算される。【０３４５】
2004113525.tif 000016
【０３４６】  反応（Ｂ）で生成するフルクトースを考慮すると、反応（Ａ）により生成されたフルクトースの量は、以下によって算出される：【０３４７】
2004113525.tif 000017
【０３４８】  したがって、グルカンの収量は、以下の式により求められる。【０３４９】
2004113525.tif 000018
【０３５０】  出発物質として、グルコース−１−リン酸を用いて製造したグルカンの収量は、初発のグルコース−１−リン酸の量、ならびに反応終了後の溶液中のグルコース、フルクトースおよびグルコース−１−リン酸の量から、以下の式により求められる。【０３５１】
2004113525.tif 000019
【０３５２】  この式は以下の原理に基づく。【０３５３】  反応溶液中では、初発のグルコース−１−リン酸に加えて、反応（Ａ）によって、グルコース−１−リン酸が生成される。つまり、初発のグルコース−１−リン酸と生成されたグルコース−１−リン酸とが、グルカンの合成に使われ得る。グルカンの合成に使われ得るグルコース−１−リン酸の量から、反応終了後に反応溶液に残存するグルコース−１−リン酸の量を差し引くことによって、反応に使用されたグルコース−１−リン酸の量、すなわち、グルカンに取り込まれたグルコースの量を算出できる。したがって、グルカンに取り込まれたグルコースの量は上記に示す式により求められる。なお、この式は、ＳＰ−ＧＰ反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース−１−リン酸とを併用した場合にも適用できる。【０３５４】  （１．７  スクロースから製造したグルカンの収率の計算方法）
出発物質として無機リン酸を用いて製造した場合のグルカンの収率は、以下の式によって求められる。【０３５５】
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【０３５６】  出発物質としてグルコース−１−リン酸を用いて製造した場合のグルカンの収率は、以下の式によって求められる。【０３５７】
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【０３５８】  なお、この式は、ＳＰ−ＧＰ反応系において出発材料として無機リン酸とグルコース−１−リン酸とを併用した場合にも適用できる。【０３５９】  （実施例１：耐熱化馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼの作製、スクリーニングおよび配列決定）
概略を述べると、馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子にランダム変異を導入し、ランダム変異の導入された遺伝子を大腸菌に導入して、ランダム変異の導入されたα−グルカンホスホリラーゼを発現させ、発現されたα−グルカンホスホリラーゼのうち、６０℃で１０分間加熱した後、グルカンを合成する能力を有する耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌を選択し、この大腸菌から耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を単離してその配列を決定した。【０３６０】  詳細には、以下の通りである。【０３６１】  まず、馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）の遺伝子を調製した。Ｔａｋａｈａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻、１３９１−１３９６頁、１９９３年）の記載に従って、馬鈴薯塊茎より、ｍＲＮＡを周知の方法で調製し、ｃＤＮＡライブラリーを市販のキットを用いて作製した。【０３６２】  次に、既知のＧＰ遺伝子配列（データベースＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＤ００５２０）を基に、ＰＣＲプライマー１およびＰＣＲプライマー２を設計した。上述のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲプライマー１および２として
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および
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を用いてＰＣＲを行い、馬鈴薯由来のＧＰの遺伝子を増幅した。ＰＣＲの条件は、９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとして、３０サイクルというＰＣＲ反応であった。なおＰＣＲプライマー１のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰの成熟タンパク質のＮ末端部分の構造遺伝子配列に対応しており、ＰＣＲプライマー２のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰ構造遺伝子の終止コドン直後の塩基配列に対応している。【０３６３】  増幅されたＧＰ遺伝子を、ＳｍａＩであらかじめ切断したプラスミドｐＭＷ１１８（日本ジーン株式会社製）に挿入し、図２のような配列をもった、プラスミドを選択した。このプラスミドを、リン酸カルシウム沈澱法によって大腸菌ＴＧ−１に導入し、アンピシリン耐性株を選択し、このアンピシリン耐性株を培養し、このアンピシリン耐性株からプラスミドを回収することにより、馬鈴薯由来のタイプＬ  ＧＰ遺伝子を得た。【０３６４】  得られた馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰ遺伝子に対して、当業者に公知のエラープローンＰＣＲ法（参考文献Ｌｅｕｎｇら（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １，１１−１５，１９８９）およびＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２，２８−３３，１９９２））により、ＰＣＲプライマー３およびＰＣＲプライマー４として
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および
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を用いて、９４℃３０秒間の後、９４℃３０秒間、６８℃３分間を１サイクルとして２５サイクル、その後、６８℃１分間のＰＣＲ反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片には平均２〜３ヶ所の塩基置換が導入された。なおＰＣＲプライマー３のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰの成熟タンパク質のＮ末端部分の構造遺伝子配列に対応しており、ＰＣＲプライマー４のアンダーラインの部分が、タイプＬ  ＧＰ構造遺伝子の終止コドン直後の塩基配列に対応している。【０３６５】  ランダム変異の導入されたＧＰ遺伝子増幅断片を、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したプラスミドｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）に挿入し、ランダム変異の導入された耐熱性ＧＰのスクリーニングのためのプラスミドライブラリーを作製した。このプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、１．５％  アガロース、ｐＨ７．３）に、独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３０℃で２４時間培養した。得られたプレート上のコロニーをナイロンメンブレンフィルターにうつしとった。コロニーが付着したフィルターの表面を充分乾かした後、このフィルターを２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中で、６０℃１０分間インキュベートした。コロニーをうつしとった後のプレートをさらに３７℃で数時間インキュベートし、その後、マスタープレートとして４℃で保存した。熱処理したフィルターをグルカン合成の基質を含むゲル（０．０５％  デキストリン、５０ｍＭ  Ｇ−１−Ｐ、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）、０．７％  アガロースを含む）にコロニー付着面がゲル表面と密着するように合わせ、５０℃で２時間インキュベートした。ゲルからはがしたフィルターをヨウ素液（０．１％  ヨウ化カリウム、０．０１％  ヨウ素）にひたし、フィルター上に合成されたグルカンをヨウ素デンプン反応で検出した。青く染まったスポットに対応するコロニーをマスタープレートから単離した。【０３６６】  このようにして得られた各々の大腸菌から当該分野で公知の方法に従ってプラスミドを回収し、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ社製）を用いてこのプラスミド中の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。【０３６７】  この耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、天然の馬鈴薯タイプＬの（すなわち、変異させる前の）α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列と比較したところ、天然の馬鈴薯タイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの３９位、１３５位、または７０６位のアミノ酸の位置に変異が導入されており、それぞれＦ３９→Ｌ、Ｎ１３５→Ｓ、Ｔ７０６→Ｉにアミノ酸置換されていた。また、Ｆ３９においてＬ以外のアミノ酸、Ｎ１３５においてＳ以外のアミノ酸、Ｔ７０６においてＩ以外のアミノ酸に変異したものについても耐熱化が見られた。【０３６８】  （実施例２−１Ａ：部位特異的変異誘発による耐熱化馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの作製）
本実施例では、実施例１で耐熱化に寄与することが判明した位置の置換を１つのみ有する耐熱化ＧＰと、いずれか２つの組み合わせで有する耐熱化ＧＰと、３つ全てを有する耐熱化ＧＰとを作製した。例として、３つすべての変異を有する耐熱化ＧＰ（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）のアミノ酸配列を配列番号３４に、そしてそれをコードする塩基配列を配列番号３３に示す。また、比較のために、３９位、１３５位および７０６位のアミノ酸は置換せず、かつ、これらのアミノ酸位置と全く関係のない位置のアミノ酸を置換したＧＰ（４６７位のリジンのみをアスパラギンに置換したＧＰおよび７１１位のトレオニンのみをアラニンに置換したＧＰ）を作製した。アミノ酸置換の方法は多数公開されている（参考文献：Ｋｉｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９９５），Ｖａｎｄｅｙａｒ，Ｍ．ら，Ｇｅｎｅ，６５：１２９−１３３（１９８８），Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｍ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７９：３０９−３１１（１９８９），Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．およびＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：８７６４（１９８５），Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．およびＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１６：２７９−３０３（１９９２））が、本発明ではＱｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を使用した。実施例１で示した、プラスミドｐＭＷ−１１８中に挿入された馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰ遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、Ｆ３９Ｌ、Ｎ１３５Ｓ、Ｔ７０６Ｉ、Ｋ４６７ＤまたはＴ７１１Ａという変異を導入するために、それぞれの変異導入位置を中心に約３５ｂｐ程度の相補的なそれぞれ１組の変異導入プライマーを作製して用い、ＰＣＲをすることによって部位特異的変異誘発を行った。このようにして得られた耐熱化ＧＰをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＭＷ−ＰＧＰを作製した。このプラスミドで、大腸菌ＴＧ−１を形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、１．５％  アガロース、ｐＨ  ７．３）に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３７℃で一晩培養した。このアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有する。このようにして、耐熱化ＧＰを発現する大腸菌が作製できた。なお、本実施例で得られた大腸菌に含まれるプラスミドが、目的の変異を有する耐熱化ＧＰをコードする変異ＧＰ遺伝子を有することを、得られたそれぞれの大腸菌からプラスミドを抽出し、ＧＰをコードする遺伝子の配列決定をすることによって確認した。【０３６９】  本実施例で得られた大腸菌が発現するＧＰが耐熱化されていることは、以下の通りに確認した。導入したプラスミドを保持する大腸菌ＴＧ−１をアンピシリン含有ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ  ７．３）に植菌し、まず３７℃で対数中期まで増殖させたあと温度を２２℃程度にまで下げ、遺伝子発現誘導物質であるイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドを終濃度０．１ｍＭになるように、そして塩酸ピリドキシンを終濃度１ｍＭになるように添加して２２℃で約２０時間培養した。培養液を遠心分離することにより、菌体を回収し、菌体を緩衝液に懸濁し、超音波処理することにより、菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を６０℃で３０分処理することにより、ＧＰ標品を得た。【０３７０】  得られたＧＰ標品を用いて、スクロースおよびプライマーにスクロースホスホリラーゼとα−グルカンホスホリラーゼとを作用させる方法（国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載された方法）により、グルカン製造を行ったところ、いずれの耐熱化α−グルカンホスホリラーゼについても、高い収率で高分子グルカンを得ることができた。【０３７１】  一方、耐熱化に無関係な位置のアミノ酸を置換したＧＰは、６０℃で３０分間の処理によって失活し、グルカンを製造することができなかった。【０３７２】  （実施例２−１Ｂ：種々のアミノ酸で置換された改変体馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの作製）
Ｆ３９、Ｎ１３５およびＴ７０６をそれぞれ１箇所ずつ、別のアミノ酸残基に置換するように設計したプライマーを用いたこと以外は実施例２−１Ａと同様にして、改変体α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、そして種々の改変体ＧＰ標品を得た。【０３７３】  これらの改変体ＧＰ標品の耐熱性については、以下の実施例３−１（３−１）において詳細に検討した。【０３７４】  （実施例２−２Ａ：部位特異的変異誘発による耐熱化馬鈴薯タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの作製）
馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子の代わりに馬鈴薯由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子を用いたこと以外は実施例２−１Ａと同様にして、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、そしてＧＰ標品を得た。本実施例では、実施例１で耐熱化に寄与することが判明した位置の置換のうち、馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列のＮ１３５ＳまたはＴ７０６Ｉに相当する位置（それぞれ、馬鈴薯タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列の１３３位および６２８位）の置換を１つのみ有する耐熱化ＧＰを作製した。【０３７５】  これらのＧＰ標品を用いて、実施例２−１Ａと同様に６０℃で３０分間処理した後グルカン製造を行ったところ、いずれの耐熱化α−グルカンホスホリラーゼについても、天然の馬鈴薯タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼと同様に高分子グルカンを得ることができた。【０３７６】  （実施例２−２Ｂ：部位特異的変異誘発による耐熱化馬鈴薯タイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの作製）
馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子の代わりに馬鈴薯由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子を用い、Ｆ３９に相当する位置（Ｙ３６）、Ｎ１３５に相当する位置（Ｎ１３３）およびＴ７０６に相当する位置（Ｔ６２８）のアミノ酸残基をそれぞれ、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）およびイソロイシン（Ｉ）に置換するように設計した変異導入プロモーターを用いたこと以外は実施例２−１Ａと同様にして、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、そして三重変異体（Ｙ３６Ｌ＋Ｎ１３３Ｓ＋Ｔ６２８Ｉ）のＧＰ標品を得た。本実施例では、実施例１で耐熱化に寄与することが判明した３箇所全ての位置の置換を有する耐熱化ＧＰを作製した。【０３７７】  これらの改変体ＧＰ標品の耐熱性については、以下の実施例３−２（２）において詳細に検討した。【０３７８】  （実施例２−２Ｃ：部位特異的変異誘発による耐熱化シロイヌナズナタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼの作製）
まず、シロイヌナズナ由来のタイプＨ  α−グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）の遺伝子を市販のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来ｃＤＮＡ（ＰＣＲ  Ｒｅａｄｙ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ、和光純薬工業株式会社製）を用いて作製した。【０３７９】  詳細には、既知のシロイヌナズナＧＰ遺伝子配列（データベースＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションナンバー  ＡＬ１３３２９２；ＣＡＢ６１９４３．１）を基に、ＰＣＲプライマー５および６を設計した。上述のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来ｃＤＮＡを鋳型とし、
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および
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を用いてＰＣＲを行い、シロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃３０秒間、６０℃１分間、７２℃３分間を１サイクルとして３０サイクルであった。なお、ＰＣＲプライマー１のアンダーラインの部分はシロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子の成熟タンパクのＮ末端部分の構造遺伝子に対応しており、ＰＣＲプライマー２のアンダーラインの部分はシロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子の成熟タンパクのＣ末端部分の構造遺伝子に対応している。【０３８０】  増幅されたシロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子を、ＳｍａＩであらかじめ切断したプラスミドｐＭＷ１１８（日本ジーン株式会社製）に挿入し、このプラスミドをコンピテントセル法によって大腸菌ＴＧ−１に導入し、アンピシリン耐性株を選択し、このアンピシリン耐性株を培養し、このアンピシリン耐性株からプラスミドを回収することによりシロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子を得た。【０３８１】  得られたシロイヌナズナ由来のタイプＨ  ＧＰ遺伝子を、馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの遺伝子の代わりに用い、Ｆ３９に相当する位置（Ｙ４０）、Ｎ１３５に相当する位置（Ｎ１３６）およびＴ７０６に相当する位置（Ｎ６３１）のアミノ酸残基をそれぞれ、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）およびイソロイシン（Ｉ）に置換するように設計した変異導入プロモーターを用いたこと以外は実施例２−１Ａと同様にして、耐熱化α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むプラスミドを作製し、そして三重変異体（Ｙ４０Ｌ＋Ｎ１３６Ｓ＋Ｎ６３１Ｉ）のＧＰ標品を得た。本実施例では、実施例１で耐熱化に寄与することが判明した３箇所全ての位置の置換を有する耐熱化ＧＰを作製した。【０３８２】  これらの改変体ＧＰ標品の耐熱性については、以下の実施例３−２（２）において詳細に検討した。【０３８３】  （実施例３−１：各種耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの大量調製および耐熱性比較）
（１）酵素の大量調製
上記実施例２−１Ａおよび２−１Ｂで作製した、耐熱化ＧＰを発現する大腸菌をそれぞれ、ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（ＧＩＢＣＯ）４７ｇ／Ｌ、グリセロール４ｍｌ／Ｌおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で３７℃で５時間培養し、最終濃度が０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１ｍＭ塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にＩＰＴＧおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに２２℃で２４時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸緩衝液で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を２０ｍＭクエン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、予め平衡化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中、０．１Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出する、耐熱化ＧＰ含有画分を回収した。回収した酵素画分を、予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液中１７．５％から７．５％の飽和硫安濃度勾配で溶出する、耐熱化ＧＰ含有画分を回収した。回収した酵素画分を、予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＨＱＰカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液中、０．１Ｍから０．４ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、活性画分を回収した。得られた活性画分をさらに、予め平衡化されたＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑのカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液中、０．１Ｍから０．４ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、精製酵素含有活性画分を回収した。【０３８４】  得られた精製酵素含有活性画分を、約１μｇのネイティブＰＡＧＥ（Ｎａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。その結果、耐熱化ＧＰを発現するいずれの大腸菌についても、分子量約２１０ｋＤａのところに単一のバンドが認められ、他の場所にはバンドが見られなかった。ＧＰは、アミノ酸配列から分子量が約１０４ｋＤａであると推定されるので、ダイマー構造をとっていると考えられる。このようにして、耐熱化ＧＰが均質に精製されたことが示された。【０３８５】  （２）精製された耐熱化ＧＰの活性測定
上記（１）で精製された耐熱化ＧＰの活性を測定した。測定は、以下の通りに行った。まず、２００μｌの反応液（１００ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２．５ｍＭ  Ｇ−１−Ｐ、１％デキストリンおよび酵素液を含む）を３７℃に１５分間インキュベートした。次いで、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ  モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ  酢酸亜鉛）を加え、攪拌し反応を停止させた。次いで、２００μｌの５６８ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ５．８）を加え、混合し、３７℃に１５分間インキュベートした後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、本実施例において、ＧＰ酵素活性はＧ−１−Ｐから生じた遊離の無機リン酸を定量することによって測定された。１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。【０３８６】  （３−１）実施例２−１Ａで作製された耐熱化ＧＰの６０℃および６５℃での耐熱性比較
実施例２−１Ａで作製され、上記（１）で大量調製および精製されたそれぞれの耐熱化ＧＰの６０℃および６５℃での耐熱性を比較した。対照として、同じ方法で精製した天然の（変異させていない）馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを用いた。【０３８７】  まず、０．２Ｕ／ｍｌの精製酵素液（２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中）を６０℃または６５℃で０〜３０分間インキュベートした。０、２、１０、２０、３０分などの各時間で酵素液の一部を取り出し、氷中に保持した。氷中に保持された酵素液を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で１０倍希釈し、上記（２）に記載の活性測定法に従い酵素活性を測定した。酵素の耐熱性を、６０℃または６５℃にインキュベートする前の酵素の３７℃における酵素活性を１００％としたときの、インキュベート後の酵素の３７℃における酵素活性の割合（すなわち、残存活性）によって判断した。６０℃でインキュベートした場合の結果を以下の表５に示す。６５℃でインキュベートした場合の結果を以下の表６に示す。【０３８８】
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【０３８９】
2004113525.tif 000030
【０３９０】  上記の表５および表６において、天然の馬鈴薯タイプＬとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを示す。Ｆ３９Ｌとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの３９位のフェニルアラニンがロイシンに置換されたものを示す。Ｔ７０６Ｉとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの７０６位のトレオニンがイソロイシンに置換されたものを示す。Ｎ１３５Ｓとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの１３５位のアスパラギンがセリンに置換されたものを示す。Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの３９位のフェニルアラニンがロイシンに置換され、かつ７０６位のトレオニンがイソロイシンに置換されたものを示す。Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの１３５位のアスパラギンがセリンに置換され、かつ７０６位のトレオニンがイソロイシンに置換されたものを示す。Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの３９位のフェニルアラニンがロイシンに置換され、かつ１３５位のアスパラギンがセリンに置換されたものを示す。Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの３９位のフェニルアラニンがロイシンに置換され、かつ、１３５位のアスパラギンがセリンに置換され、かつ、７０６位のトレオニンがイソロイシンに置換されたものを示す。表５および表６の結果のうち、６０℃で３０分間の加熱の結果および６５℃で２分間加熱の結果を図３にグラフとして示す。【０３９１】  この結果、本発明の耐熱化ＧＰが天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰと比較して耐熱性が非常に向上していることがわかった。耐熱性の劣ったものから、耐熱性の優れたものまで順に並べると次のようになる：天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰ＜Ｆ３９Ｌ＜Ｔ７０６Ｉ＜Ｎ１３５Ｓ＜Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ＜Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ＜Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＜Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ。耐熱性に寄与する３箇所のアミノ酸残基は、１箇所置換されるだけでも耐熱性が向上した。さらに、これらのアミノ酸残基が多重置換されることによって、耐熱性が劇的に向上することがわかった。【０３９２】  （３−２）実施例２−１Ｂで作製された改変体ＧＰの６０℃および６５℃での耐熱性比較
実施例２−１Ｂで作製され、実施例３−１（１）で大量調製および精製されたそれぞれの改変体ＧＰの６０℃および６５℃での耐熱性を比較した。対照として、同じ方法で精製した天然の（変異させていない）馬鈴薯由来タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを用いた。【０３９３】  まず、０．２Ｕ／ｍｌの精製酵素液（２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）中）を６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートした。所定の時間（１０分間または２分間）で酵素液の一部を取り出し、氷中に保持した。氷中に保持された酵素液を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で１０倍希釈し、上記（２）に記載の活性測定法に従い酵素活性を測定した。酵素の耐熱性を、６０℃１０分間または６５℃２分間インキュベートする前の酵素の３７℃における酵素活性を１００％としたときの、インキュベート後の酵素の３７℃における酵素活性の割合（すなわち、残存活性）によって判断した。結果を以下の表７および図８〜１０に示す。【０３９４】
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【０３９５】  上記の表７において、ＷＴとは、天然の馬鈴薯由来のタイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを示す。各列において１文字略語で示したアミノ酸は、改変体において置換されているアミノ酸を示す。例えば、左端の、Ｆ３９との標記された列においてＩと記載されたものは、３９位のフェニルアラニン（Ｆ）がイソロイシン（Ｉ）に置換された改変体ＧＰを示す。他の列の改変体ＧＰについても同様である。【０３９６】  アミノ酸の１文字略語は、当業者に周知であり、以下の通りである：Ａ  アラニン；Ｃ  システイン；Ｄ  アスパラギン酸；Ｅ  グルタミン酸；Ｆ  フェニルアラニン；Ｇ  グリシン；Ｈ  ヒスチジン；Ｉ  イソロイシン；Ｋ  リジン；Ｌ  ロイシン；Ｍ  メチオニン；Ｎ  アスパラギン；Ｐ  プロリン；Ｑ  グルタミン；Ｒ  アルギニン；Ｓ  セリン；Ｔ  トレオニン；Ｖ  バリン；Ｗ  トリプトファン；Ｙ  チロシン。【０３９７】  この結果、３９位、１３５位および７０６位のアミノ酸は、上記実施例２−１Ａで置換された特定のアミノ酸以外に置換された場合にも、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰの耐熱性を向上させることがわかった。【０３９８】  ６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性を見ると、３９位のフェニルアラニンをイソロイシン、ロイシンまたはバリンに置換した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。３９位の置換については、ロイシンに置換した場合（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性６１．２％）が最も耐熱性が優れていた。１３５位のアスパラギンをアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、バリンまたはチロシンに置換した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。１３５位の置換については、アラニン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性７６．２％）、システイン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性８５．０％）、グリシン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性８５．２％）、イソロイシン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性６０．０％）、セリン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性６５．４％）、トレオニン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性７３．４％）またはバリン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性８２．８％）に置換した場合、特に耐熱性が優れていた。７０６位のトレオニンをシステイン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンに置換した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。７０６位の置換については、システイン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性６５．４％）、イソロイシン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性７０．５％）またはバリン（６０℃で１０分間インキュベートした後の残存活性６８．７％）に置換した場合、特に耐熱性が優れていた。【０３９９】  ６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性を見ると、３９位のフェニルアラニンをイソロイシン、ロイシンまたはバリンに置���した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。３９位の置換については、ロイシンに置換した場合（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性６１．２％）が最も耐熱性が優れていた。１３５位のアスパラギンをアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、バリンまたはチロシンに置換した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。１３５位の置換については、アラニン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性７９．０％）、システイン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性７６．９％）、グリシン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性５８．４％）、メチオニン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性５２．６％）、セリン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性８６．５％）、トレオニン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性６２．４％）またはバリン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性７９．３％）に置換した場合、特に耐熱性が優れていた。７０６位のトレオニンをシステイン、イソロイシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンに置換した場合、改変体ＧＰの耐熱性は、天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰよりも優れていた。７０６位の置換については、ロイシン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性５７．８％）またはバリン（６５℃で２分間インキュベートした後の残存活性５９．２％）に置換した場合、特に耐熱性が優れていた。【０４００】  この結果、本発明の改変体ＧＰが天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰと比較して耐熱性が非常に向上していることがわかった。【０４０１】  （実施例３−２：耐熱化タイプＨ  ＧＰ酵素の調製）
（１）酵素の大量調製
上記実施例２−２Ｂおよび２−２Ｃで作製した、耐熱化馬鈴薯タイプＨ  ＧＰを発現する大腸菌および耐熱化シロイヌナズナタイプＨ  ＧＰを発現する大腸菌をそれぞれＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（ＧＩＢＣＯ）４７ｇ／Ｌ、グリセロール４ｍｌ／Ｌおよび５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）で３７℃で５時間培養し、最終濃度が０．１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび１ｍＭ  塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にＩＰＴＧおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに２２℃で２４時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロマトグラフィーを用いて精製し、ネイティブＰＡＧＥ（Ｎａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で単一のバンドを示す精製酵素含有活性画分を回収した。【０４０２】  （２）耐熱化タイプＨ  ＧＰ酵素の耐熱性比較
（１）で精製されたそれぞれの耐熱化ＧＰの６０℃および６５℃での耐熱性を比較した。対照として、同じ方法で精製した天然の（変異させていない）馬鈴薯タイプＨ  ＧＰおよびシロイヌナズナタイプＨ  ＧＰを用いた。【０４０３】  ０．２Ｕ／ｍｌの精製酵素液（２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートしたのち、氷中に保持した。氷中に保持された酵素液を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で１０倍希釈し、実施例３−１（２）に記載の活性測定法に従い酵素活性を測定した。酵素の耐熱性を、５８℃で１０分間、６０℃で１０分間または６５℃で２分間インキュベートする前の酵素の３７℃における酵素活性を１００％としたときの、インキュベート後の酵素の３７℃における酵素活性の割合（すなわち、残存活性）によって判断した。耐熱化馬鈴薯タイプＨ  ＧＰおよび天然の馬鈴薯タイプＨ  ＧＰについての結果を以下の表８および図１１に示す。耐熱化シロイヌナズナタイプＨ  ＧＰおよび天然のシロイヌナズナタイプＨ  ＧＰについての結果を、以下の表９および図１２に示す。【０４０４】
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【０４０５】
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【０４０６】  これらの結果から、本発明の耐熱化馬鈴薯タイプＨ  ＧＰは、６５℃で２分間加熱した後も３４．５％の残存活性を有した。一方、天然の馬鈴薯タイプＨ  ＧＰは、６５℃で２分間加熱した後の残存活性は０％であった。このことから、本発明の耐熱化馬鈴薯タイプＨ  ＧＰが、天然の馬鈴薯タイプＨ  ＧＰと比較して高い耐熱性を有することがわかった。【０４０７】  また、本発明の耐熱化シロイヌナズナタイプＨ  ＧＰは、６５℃で２分間加熱した後も２９．２％の残存活性を有した。一方、天然のシロイヌナズナタイプＨ  ＧＰは、６５℃で２分間加熱した後の残存活性は０．５％であった。このことから、本発明の耐熱化シロイヌナズナタイプＨ  ＧＰが、天然のシロイヌナズナタイプＨ  ＧＰと比較して高い耐熱性を有することがわかった。【０４０８】  （実施例４：耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いた、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロースの合成）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いて、重量平均分子量６００ｋＤａ以上のアミロース合成が可能であることを調べた。耐熱化α−グルカンホスホリラーゼとして、上記実施例３−１（１）で調製された各種耐熱化ＧＰ（一重変異体Ｆ３９Ｌ、一重変異体Ｎ１３５Ｓ、一重変異体Ｔ７０６Ｉ、二重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ）、二重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ）、二重変異体（Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）および三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）のうちのいずれかを用いた。【０４０９】  対照として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓとも示す）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓとも示す）を用いた。【０４１０】  アミロース合成反応を、以下の表１０に記載の組成の反応系を用いて５０℃で１８時間行った。【０４１１】
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【０４１２】  この反応によって合成されたアミロースの収率を上記の「１．測定方法および計算方法」の１．５に記載の計算方法により計算した。【０４１３】  この反応によって合成されたアミロースの重量平均分子量を以下の方法により測定した。この反応によって合成されたアミロースを１Ｎ水酸化ナトリウムで完全に溶解し、適当量の塩酸で中和した後、アミロース約３０〜３００μｇ分を、示差屈折計と多角度光散乱検出器を併用したゲル濾過クロマトグラフィーに供することにより重量平均分子量を求めた。【０４１４】  詳しくは、カラムとしてＳｈｏｄｅｘ  ＳＢ８０６Ｍ−ＨＱ（昭和電工製）を用い、検出器としては多角度光散乱検出器（ＤＡＷＮ−ＤＳＰ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および示差屈折計（Ｓｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１、昭和電工製）をこの順序で連結して用いた。カラムを４０℃に保ち、溶離液としては０．１Ｍ硝酸ナトリウム溶液を流速１ｍＬ／分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（商品名ＡＳＴＲＡ、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析することにより、重量平均分子量を求めた。この方法を、ＭＡＬＬＳ分析法ともいう。【０４１５】  このようにして求められた、合成されたアミロースの収率および分子量を、以下の表１１に示す。【０４１６】
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【０４１７】  以上のように、本発明の耐熱化ＧＰは、重量平均分子量約６００ｋＤａ以上の高分子量のアミロースを合成し得ることがわかった。また、本発明の耐熱化ＧＰは、アミロースの収率が約４０％以上であることがわかった。比較例として用いたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔ  ｈｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ  ＧＰとＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＧＰとは耐熱性を有する酵素であるが高分子量のアミロースを合成することはできなかった。【０４１８】  （実施例５：耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いたスクロースからのアミロース合成）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いてスクロースを原料としてアミロースを合成した。耐熱化α−グルカンホスホリラーゼとして、上記実施例３−１（１）で調製された各種耐熱化ＧＰ（一重変異体Ｆ３９Ｌ、一重変異体Ｎ１３５Ｓ、一重変異体Ｔ７０６Ｉ、二重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ）、二重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ）、二重変異体（Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）および三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））のうちのいずれかを用いた。【０４１９】  アミロース合成反応を、以下の表１２に記載の組成の反応系を用いて５０℃で１８時間行った。【０４２０】
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【０４２１】  この反応によって合成されたアミロースの収率（％）を、上記の「１．測定方法および計算方法」の１．７に記載の計算式により計算した。【０４２２】  この反応によって合成されたアミロースの重量平均分子量を上記実施例４と同様の方法により測定した。このようにして求められた、合成されたアミロースの収率および重量平均分子量を以下の表１３に示す。【０４２３】
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【０４２４】  以上のように、本発明の耐熱化ＧＰは、天然のＧＰと同様にスクロースを原料としたアミロースを合成した場合も、約６００ｋＤａの高分子量のアミロースを合成しうることがわかった。また、アミロース収率も天然のＧＰと同様に約４０％以上と高いことがわかった。【０４２５】  （実施例６：高温条件下（５０℃、５５℃および６０℃）での耐熱化ＧＰを用いた、グルコース−１−リン酸からのグルカン合成）
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸を原料として、高温条件下でアミロースを合成した。実施例３−１（１）で調製された耐熱化ＧＰ（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））を用い、対照として同じ方法で精製された天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた。【０４２６】  Ｇ−１−Ｐ６．１ｇ／Ｌ、マルトテトラオース（Ｇ４）０．３ｇ／Ｌ、ＧＰ２０Ｕ／Ｌを含む反応液を３７℃、５０℃、５５℃または６０℃に１８時間保持することによって、アミロース合成反応を行った。反応生成物中のアミロース合成量を経時的に調べた。アミロース合成量（ｇ／Ｌ）を、以下の式に基づいて計算した。【０４２７】
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【０４２８】  １８時間反応後のアミロース合成量を以下の表１４および図７に示す。【０４２９】
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【０４３０】  耐熱化ＧＰを用いた場合、３７℃、５０℃および５５℃では約３ｇ／Ｌのアミロースが合成され、６０℃でも、約１．５ｇ／Ｌのアミロースが合成できた。一方、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた場合、３７℃、５０℃および５５℃ではアミロースが合成されたが、６０℃ではアミロースはまったく合成されなかった。これは、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰは、６０℃では、反応の初期段階にＧＰが失活したためと考えられる。一方、耐熱化ＧＰは６０℃でも安定に酵素活性を保持していたため、アミロース合成反応が充分行われたと考えられる。また、３７℃、５０℃、５５℃および６０℃の各温度において、耐熱化ＧＰを用いた場合、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた場合よりもアミロース合成量が多かった。耐熱化ＧＰを用いた場合のアミロース合成量は、反応時間が延長されるとさらに増加すると考えられる。以上のように、本発明の耐熱化ＧＰは、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰでは反応できない６０℃において、グルカン合成が可能であることがわかった。【０４３１】  （実施例７  ６５℃および７０℃での耐熱化ＧＰを用いたグルコース−１−リン酸からのグルカン合成）
実施例６と同様に実施例３−１（１）で調製された耐熱化ＧＰ（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））を用いて、さらに高温条件下でのグルコース−１−リン酸からのグルカン合成を行った。対照として天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた。【０４３２】  Ｇ−１−Ｐ１５．２ｇ／Ｌ、マルトテトラオース（Ｇ４）２．７ｇ／Ｌ、ＧＰ２００Ｕ／Ｌを含む反応液を３７℃、６５℃または７０℃に４時間保持することによって、アミロース合成反応を行った。アミロース合成量を、実施例６と同様に計算した。反応４時間後、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた場合、６５℃および７０℃ではアミロースはまったく合成されなかったが、耐熱化ＧＰを用いた場合、１５．２ｇのＧ−１−Ｐから、６５℃では約５．６ｇ／Ｌのアミロースが、７０℃では約０．３ｇ／Ｌのアミロースが合成された。この結果、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰは、６５℃〜７０℃ではアミロースを合成できないが、耐熱化ＧＰは７０℃という高温でもＧＰ活性を保持しており、アミロース合成能を有することがわかった。【０４３３】  実施例６および７の結果から、本発明の耐熱化ＧＰは、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰではまったく反応できない高温条件下において、アミロース合成能を有することがわかった。【０４３４】  （実施例８：加熱処理による夾雑タンパク質の除去の確認）
加熱処理によって耐熱化α−グルカンホスホリラーゼの精製が容易にできることを以下の方法で確認した。【０４３５】  実施例２−１Ａで作製した耐熱化ＧＰ（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）遺伝子を発現する大腸菌（ＴＧ−１）を、実施例２−１Ａと同様にＬＢ培地で培養した。コントロールとして天然の馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌（ＴＧ−１）を、実施例２−１Ａと同様にＬＢ培地で培養した。培養液を遠心分離することにより、菌体を回収し、菌体を緩衝液に懸濁し、超音波処理することにより、菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を６０℃の水浴中で０〜６０分間加熱後、遠心分離することにより不溶性のタンパク質を除去し、上清を得た。この上清のＧＰ活性およびタンパク量を測定し、ＧＰ酵素の比活性を求めた。ＧＰ活性は実施例３−１（２）に記述した活性測定方法を用いて測定し、タンパク量はブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８〜２５４（１９７６）を用いて測定した。ブラッドフォード法は溶液中に含まれる全てのたんぱく質に発色性基質を結合させる、比色検定法である。ここでは、プロテインアッセイキット（日本バイオラッドラボラトリーズ（株））を用いウシグロブリンを標準として測定した。【０４３６】  以下の方法でＧＰ酵素の比活性を算出した。【０４３７】  比活性（Ｕ／ｍｌ）
＝（α−グルカンホスホリラーゼ活性）／（上清中に含まれるタンパク質の質量ｍｇ）
図６に耐熱化ＧＰ酵素（図６において耐熱化ＧＰ（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉと示す））および天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰ酵素の比活性の経時的変化を示した。【０４３８】  図６に示したように耐熱化ＧＰは６０℃の加熱により、比活性が約１０倍になった。夾雑タンパク質はほとんど熱変性し除去された。これに比べて天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰの比活性は、経時的に低下した。これは夾雑タンパク質だけでなくＧＰタンパク質も変性したためと考えられる。このように耐熱化ＧＰは熱処理により簡便に精製され得ることがわかった。【０４３９】  （実施例９：加熱処理による夾雑タンパク質の除去の確認）
実施例８と同様に、耐熱化ＧＰ（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））遺伝子を発現する大腸菌（ＴＧ−１）を培養した後、菌体抽出液を調製した。この菌体抽出液を用いて、６０℃の熱処理により、アミラーゼ活性およびホスファターゼ活性を、アミロースまたはＧ−１−Ｐの工業的な生産に利用できるレベルに低下させることができることを確認した。【０４４０】  実施例８と同様に、菌体抽出液を６０℃の水浴中で３０分間加熱後、遠心分離することにより不溶性のタンパク質を除去し、上清を得た。この上清のホスファターゼ活性およびアミラーゼ活性を測定した。【０４４１】  ホスファターゼ活性は、この上清１００μｌと５０ｍＭグルコース−１−リン酸１００μｌを含む反応液を３７℃６０分間保持した後、反応液中のグルコース１リン酸から生じた遊離の無機リン酸を（１．測定方法および計算方法）に記述された方法で定量することにより測定した。１分間に１μｍｏｌの無機リン酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。アミラーゼ活性は上清２５μｌと０．５％アミロース（重量平均分子量約５０ｋＤａ）２５μｌとを含む反応液を３７℃６０分間保持した後、１ｍｌのヨウ素液（（０．１％  ヨウ化カリウム、０．０１％）を加え、反応液中のアミロースの低分子化に伴うヨウ素呈色の減少率を測定することにより求めた。１分間にＡ６６０の吸光度を１０％低下させる活性を１Ｕとした。【０４４２】
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【０４４３】  以下の表１５に菌体抽出液中のホスファターゼ活性ならびにアミラーゼ活性の残存率を示した。【０４４４】  表１５に示したように菌体抽出液の加熱前の各活性を１００％としたときのホスファターゼ活性ならびにアミラーゼ活性は、６０℃加熱後、ホスファターゼ活性が約３％、アミラーゼ活性が約０．３％と、これら２つの夾雑タンパク質はほとんど失活した。【０４４５】
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【０４４６】  このように本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、６０℃の熱処理でも活性を失わない植物ＧＰ酵素であり、６０℃での熱処理を行うことにより、アミラーゼ活性およびホスファターゼ活性をほとんど含まない、優れたＧＰを容易に製造することが可能であるとわかった。【０４４７】  （実施例１０：ＧＰタンパク質の安定性）
天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰタンパク質は分解されやすいことが報告されている。これらのＧＰは、精製後に冷蔵保存しても、保存中に徐々に分解されていく。一般に、酵素は、分解されると、構造の変化、酵素の性質の変化、活性低下などが起こる。ＧＰタンパク質の安定性を高めることができれば、これらの影響を低減することができ、酵素の保存時および使用時に有利である。【０４４８】  天然の馬鈴薯由来タイプＬ  ＧＰタンパク質および実施例３−１（１）で調製した７種類の耐熱化ＧＰタンパク質（一重変異体Ｆ３９Ｌ、一重変異体Ｎ１３５Ｓ、一重変異体Ｔ７０６Ｉ、二重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ、二重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ、二重変異体Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ、三重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）を４℃に保存し、５ヶ月間ＧＰタンパク質の分子量を経時的に調べた。また、３７℃に１０日間保存した場合のＧＰタンパク質の分子量も同様に調べた。精製直後および４℃で５ヶ月間保存後に、分子量をポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）により調べた結果を図１３に示す。ゲルにロードしたタンパク質量は、全てのＧＰタンパク質について等しかった。【０４４９】  この結果、精製直後の天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰおよび７種類の耐熱化ＧＰは、すべて、分子量約２１０ｋＤａ（ＧＰの単量体は分子量約１０４ｋＤａであり、二量体を形成する）の位置にバンドを示した。他方、４℃で５ヶ月保存した後の天然の馬鈴薯タイプＬＧＰおよびＮ１３５Ｓ変異体は、分子量が約１４０ｋＤａであり、精製直後よりも小さかった。このことは、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰおよび一重変異体１３５Ｓが、保存中に分解されたことを示す。天然の馬鈴薯タイプＬＧＰおよびＮ１３５Ｓ変異体は、３７℃で１０日間保存した場合も、保存中に分解された。４℃で５ヶ月保存した後の他の６種類の耐熱化ＧＰ（一重変異体Ｆ３９Ｌ、一重変異体Ｔ７０６Ｉ、二重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ、二重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｔ７０６Ｉ、二重変異体Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ、三重変異体Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ）は、分子量が約２１０ｋＤａであり、精製直後と同じであり、タンパク質の分解は認められなかった。また、これら６種類の耐熱化ＧＰは、３７℃で１０日間保持した後も分子量の変化はなく、ＧＰタンパク質の分解は認められなかった。このことは、これらの耐熱化ＧＰが、４℃〜３７℃の間で、天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰよりも、分解耐性に優れ、安定性が高いことを示す。このことから、Ｆ３９位での置換およびＴ７０６位での置換が、耐熱性向上効果だけでなく、分解抑制効果をＧＰタンパク質に与えることがわかった。【０４５０】  （実施例１１：グルコース−１−リン酸の合成）
（１）６５℃で耐熱化ＧＰを用いたＧ−１−Ｐの合成
本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルカンおよび無機リン酸を原料として、６５℃でＧ−１−Ｐを合成した。実施例３−１（１）で調製された耐熱化ＧＰ（三重変異体（Ｆ３９Ｌ＋Ｎ１３５Ｓ＋Ｔ７０６Ｉ））を用い、対照として同じ方法で精製された天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた。３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｇ／Ｌデキストリン、いずれかのＧＰを１０００Ｕ／Ｌを含む反応液を３７℃または６５℃に１８時間保持し、Ｇ−１−Ｐ合成反応を行った。Ｇ−１−Ｐの合成量を、上記の「１．測定方法および計算方法」の１．３に記載されたグルコース−１−リン酸の定量法により求めたＧ−１−Ｐ濃度（ｍＭ）にＧ−１−Ｐの分子量２６０を乗じて計算した。反応後のＧ−１−Ｐ合成量を以下の表１６に示す。【０４５１】
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【０４５２】  天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いた場合、６５℃ではＧ−１−Ｐは合成されなかった。しかしながら、耐熱性ＧＰを用いた場合、６５℃においてもＧ−１−Ｐの製造が可能であった。【０４５３】  （２）７０℃で耐熱化ＧＰを用いたＧ−１−Ｐの合成
上記実施例１１（１）と同様に、本発明の耐熱化ＧＰまたは天然の馬鈴薯タイプＬ  ＧＰを用いて、グルカンおよび無機リン酸を原料として、７０℃でＧ−１−Ｐを合成した。３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｇ／Ｌデキストリン、いずれかのＧＰを１０，０００Ｕ／Ｌを含む反応液を７０℃に４時間保持し、Ｇ−１−Ｐ合成を行った。Ｇ−１−Ｐの合成量を、上記実施例と同様に計算した。【０４５４】  天然の馬鈴薯タイプＬＧＰを用いた場合、７０℃ではＧ−１−Ｐはまったく合成されなかったが、耐熱化ＧＰを用いた場合、約１ｇのＧ−１−Ｐが合成された。【０４５５】  以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０４５６】  本発明によって、高温（例えば６０℃以上）での耐熱性に優れた植物由来のＧＰ酵素が得られる。本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼは、天然のＧＰ酵素では反応できない高温条件下（例えば６０℃以上）でのグルカン合成反応に有用である。【０４５７】  本発明の耐熱化α−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子（例えば、馬鈴薯由来のＧＰを耐熱化して得られる耐熱化ＧＰをコードする遺伝子）を大腸菌などの中温菌を宿主として高発現させた場合、耐熱性の酵素を含む菌体抽出液を６０℃で加熱することにより、宿主菌由来の夾雑酵素を簡単に除去できる。特にＧＰ酵素の産業利用上大きな問題となる、アミラーゼ活性とホスファターゼ活性を、熱処理により大幅に削減できる。従って、本発明の酵素は、酵素精製において特に有用である。【０４５８】  本発明の方法は、馬鈴薯由来のＧＰおよびシロイヌナズナ由来のＧＰのみに有効というわけではなく、馬鈴薯由来のＧＰまたはシロイヌナズナ由来のＧＰのアミノ酸配列に対して高い相同性を示す他のグループＡのＧＰの耐熱化にも好適に応用できる。本発明の方法を用いることにより、馬鈴薯およびシロイヌナズナ以外の生物種由来の耐熱性ＧＰを作製することができる。【０４５９】  本発明によってまた、酵素タンパク質の分解が抑制された、保存安定性が向上した耐熱化ＧＰが提供される。【０４６０】  （配列表の説明）
配列番号１：馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２：馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号３：サツマイモのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号４：サツマイモのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号５：馬鈴薯の第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号６：馬鈴薯の第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号７：ソラマメ（Ｆａｖａ  ｂｅａｎ）のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号８：ソラマメ（Ｆａｖａ  ｂｅａｎ）のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号９：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号１０：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号１１：ホウレンソウのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号１２：ホウレンソウのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号１３：トウモロコシのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号１４：トウモロコシのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号１５：イネのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号１６：イネのタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号１７：イネの第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号１８：イネの第２のタイプＬのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号１９：コムギのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２０：コムギのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号２１：Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２２：Ｃｉｔｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｕｌｔｉｖａｒのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号２３：イネのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２４：イネのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号２５：ソラマメのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２６：ソラマメのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号２７：シロイヌナズナのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号２８：シロイヌナズナのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号２９：馬鈴薯のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号３０：馬鈴薯のタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号３１：サツマイモのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼの塩基配列の部分配列；
配列番号３２：サツマイモのタイプＨのα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号３３：耐熱化馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列；
配列番号３４：耐熱化馬鈴薯タイプＬ  α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号３５：大腸菌のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列；
配列番号３６および３７：図２に示す、プラスミドｐＭＷ１１８との連結部付近の塩基配列；
配列番号３８：ＰＣＲプライマー１の塩基配列；
配列番号３９：ＰＣＲプライマー２の塩基配列；
配列番号４０：ＰＣＲプライマー３の塩基配列；
配列番号４１：ＰＣＲプライマー４の塩基配列；
配列番号４２：ＰＣＲプライマー５の塩基配列；
配列番号４３：ＰＣＲプライマー６の塩基配列；
配列番号４４：モチーフ配列１Ｌのアミノ酸配列；
配列番号４５：モチーフ配列１Ｈのアミノ酸配列；
配列番号４６：モチーフ配列２のアミノ酸配列；
配列番号４７：モチーフ配列３Ｌのアミノ酸配列；
配列番号４８：モチーフ配列３Ｈのアミノ酸配列。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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