(57)【要約】本発明者は、脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際には、驚くべきことに、神経伝達物質として知られているセロトニンが深く関わっていることを見出した。本発明は、この知見を原理として用いた、抗肥満剤を提供する発明である。具体的には、本発明は、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する抑制物質を有効成分とする、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤を提供する発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する抑制物質を有効成分とする、脂肪細胞の分化抑制剤。
【請求項２】
脂肪細胞の分化抑制剤が、抗肥満剤である、請求項１記載の分化抑制剤。
【請求項３】
セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する抑制物質が、下記の化学式（１）〜（７）、および、これらの化学式の塩、からなる物質の群から選ばれる１種または２種以上である、請求項１または２記載の脂肪細胞の分化抑制剤。
2004080484.tif 000017
2004080484.tif 000018
2004080484.tif 000019
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤に関する発明である。
【背景技術】  元来、人間は、飢えに抵抗して生き抜くために、エネルギー源となる脂肪を、効率よく脂肪組織として蓄えることが可能な仕組みを獲得している。しかしながら、特に、先進国においては、近年、食料に不自由することはほとんどなくなり、逆に、過剰摂食による肥満が、社会問題化しつつある。
すなわち、肥満は、耐糖能異常（糖尿病）、高脂血症、高血圧と合併することが多く、これが、心筋梗塞等の虚血性疾患のリスクファクターとして働き、個々人の快適な人生設計に暗い影を落とすだけでなく、国家単位で、中高年における医療費を急増させる原因となっている。
そこで、近年、先進諸国では、いかに肥満を防止するかが、国家政策上においても非常に重要な課題となっている。肥満を防止するには、食事や運動による生活改善が、第一段階として挙げられるが、重篤な場合等には、薬剤による治療も重要な選択肢として用いられるべきである。
本発明の課題は、肥満と関連する脂質代謝の働きを深く究明して、この働きを原理として用いる抗肥満剤を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、この課題の解決に向けて、脂肪細胞が、脂肪前駆細胞から分化する際に、どのような要素が関わっているかについて、深く検討を行った。
その結果、本発明者は、脂肪前駆細胞が、脂肪細胞に分化する際には、驚くべきことに、神経伝達物質として知られているセロトニンが深く関わっていることを、下記の過程において見出した。
脂肪細胞への分化とセロトニン受容体の関係
脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際に、どのような因子が働くかを検討するために、脂肪前駆細胞株において脂肪細胞への誘導を行い、誘導の前後におけるｃＤＮＡの配列を比較して、脂肪細胞への分化における特有の遺伝子の検索を行った。
［脂肪前駆細胞株］
脂肪前駆細胞が脂肪細胞に分化する際に、どのような因子が働くかを検討するために、下記の手順で樹立した脂肪前駆細胞株（以下、ＢＩＰ細胞ともいう）を使用した。
ウシの脂肪組織を細断し、５００ｍｇ脂肪組織／ｍｌの比率で、コラゲナーゼ溶液（ＤＭＥＭ，２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ，２％ＢＳＡ）を加え、３７℃で４５分間ゆっくりと攪拌し、上記脂肪組織を、個々の細胞単位に分け、１５０μｍ径のステンレスメッシュで濾過を行い、コラゲナーゼ処理で消化しきれなかった細胞残渣を除いた。次に、このコラゲナーゼ処理物に遠心分離処理（８００×ｇ，１０分間）を施し、遠心分離処理物の上清に認められる油滴を多く含む脂肪細胞を除き、油滴を含まない脂肪前駆細胞を含む沈殿物を、細胞懸濁液（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン，３３μＭビオチン，１７μＭパントテン酸，１ｍＭオクタン酸，１００μＭアスコルビン酸）で懸濁し、φ３５ｍｍディッシュに、１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの細胞密度で培養（５％ＣＯ２・３７℃）した。培養開始から２日後、ディッシュを５回リンスし、脂肪細胞およびディッシュに接着しなかった細胞を除去して、引き続き培養を行った。培養開始６〜７日後に細胞がディッシュ一面に増殖した段階で、トリプシン溶液（ＰＢＳ，０．０４％トリプシン，０．０２％ＥＤＴＡ）で細胞をはがして、新しいφ３５ｍｍディッシュで、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの細胞密度で培養（５％ＣＯ２・３７℃）した。４日毎に、この継代培養を繰り返し、７回目の継代の際に、限界希釈法により、細胞のクローニングを行った。なお、限界希釈法を行う際には、ウシｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂｏｖｉｎｅＦＧＦ）を１０ｎｇ／ｍｌ、培地に添加した。
このようにして得られたクローンから、接触阻害がかかり（接触阻害がかからない癌化細胞等の異常細胞を除去するため）、かつ、高い効率で脂肪細胞に分化するものを選んで、その中の１株を、脂肪前駆細胞株（ＢＩＰ細胞）とした。
［発現遺伝子の検索］
ウシ脂肪前駆細胞における発現遺伝子の検索
上述のようにして得られたＢＩＰ細胞に対して、脂肪細胞への誘導を行い、誘導の前後におけるｃＤＮＡの配列を比較して、脂肪細胞への分化における特有の遺伝子の検索を行った。
具体的には、ＢＩＰ細胞を、８．５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でディッシュに播き、細胞増殖用培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で継代培養を、上記と同条件で行った。この継代培養により得られるＢＩＰ細胞を、２．１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でディッシュに播き、前記の増殖用培地で２日間培養を行った。次いで、培地を分化誘導培地（前記の増殖用培地に、５０ｎｇ／ｍｌインシュリン，０．２５μＭデキサメタゾン，１〜５ｍＭオクタン酸，１０ｍＭ酢酸を添加した培地：一般的な脂肪分化誘導培地として、例えば、ＦＲＡＮＣＩＮＥ  Ｍ．ＧＲＥＧＯＩＲＥ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡ）ＲＥＶＩＥＷＳ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．３，７８３−８０９，１９９８に具体的に記載されている）で、上記と同条件で培養し、脂肪細胞への分化誘導を行った。
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導後４日目の脂肪細胞との間で、発現に違いが認められる遺伝子の検索を、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法を用いて行った。すなわち、ＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて行った。
具体的には、下記のＦｉｒｓｔ  ＳｃｒｅｅｎｉｎｇとＳｅｃｏｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇを行った。
（１）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、それぞれを”ｄｒｉｖｅｒ”および”ｔｅｓｔｅｒ”として用いた。２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡは２等分し、それぞれに異なるアダプターをライゲーションした。
次に、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡと”ｄｒｉｖｅｒ”ｃＤＮＡを、２回ハイブリダイズし、ハイブリダイズしたｃＤＮＡ（”ｔｅｓｔｅｒ”と”ｄｒｉｖｅｒ”のどちらでも発現している遺伝子が、互いにハイブリダイズする）を除去した。
ここで、ハイブリダイズせずに残ったｃＤＮＡが、”ｔｅｓｔｅｒ”と”ｄｒｉｖｅｒ”のそれぞれにおいてのみ発現している遺伝子である。この中から、”ｔｅｓｔｅｒ”に特異的に発現する遺伝子を増幅するために、ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＰＣＲを行った。ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＰＣＲは、”ｔｅｓｔｅｒ”ｃＤＮＡにのみライゲーションしたアダプターの塩基配列を基に、２回のＰＣＲを行い、”ｔｅｓｔｅｒ”に特異的に発現する遺伝子のみを増幅する。
このようにして得られた”ｔｅｓｔｅｒ”特異的に発現する遺伝子群を、さらに、３００ｂｐ以上の遺伝子断片にサイズセレクションした。
これらの遺伝子断片をクローニングベクターに組み込み、これを用いて大腸菌を形質転換して、クローニングを行った。
（２）Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
前記の増殖培養２日目の脂肪前駆細胞と、分化誘導後４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットを行い、分化誘導後４日目の脂肪細胞でのみ発現または発現増強している遺伝子を選択した。
（３）全長遺伝子のクローニング
さらに、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により得られた遺伝子断片についての知見を基に、全長遺伝子のクローニングを行った。
すなわち、分化誘導後４日目の脂肪細胞から、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、λＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリーを作製した。ここから２ｎｄ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇにより得られた遺伝子配列をプローブとして、公知のプラークハイブリダイゼーション法により、全長のｃＤＮＡを含む組み換えファージをクローニングした。λＺＡＰＩＩ（ＳＴＲＡＴＧＥＮＥ社）は、ｅｘｃｉｓｉｏｎすることにより、ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔクローニングベクターに組み込まれ、大腸菌に形質転換した状態で得ることができる。
このようにして得られた形質転換大腸菌から、公知の方法により、ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを精製し、ｃＤＮＡの塩基配列を解析した。
解析した塩基配列を基に、データベース上でホモロジー検索を行った結果、６−３と命名したクローンが、ウシのセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの全長（配列番号１）をコードしていることが判明した。
この結果により、脂肪前駆細胞が、脂肪細胞に分化する際には、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａが発現することが明らかとなり、脂肪細胞への分化と神経伝達物質等として知られているセロトニンが、深い関わりを持っていることが推察された。
ヒト脂肪前駆細胞における発現遺伝子の検索
東洋紡株式会社よりヒト脂肪前駆細胞を購入し、前駆細胞分化誘導培地（東洋紡株式会社）を用いて脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導前と分化誘導後３，６，９，１２日目にｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにより、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａをコードする遺伝子の増幅を、既知のヒトセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａをコードする遺伝子の塩基配列の一部に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、常法により行い、脂肪細胞への分化の過程における、このセロトニン受容体サブタイプの発現を検討した。その結果を示す、遺伝子増幅産物の電気泳動像を第１図に示す［第１図において、左端はマーカー、続いて、分化誘導前、分化誘導後３日目、分化誘導後６日目、分化誘導後９日目、分化誘導後１２日目、のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａをコードする遺伝子の増幅産物（４４０ｂｐ）のバンドを示している。マーカーの分子量は、上から、８００、６００、４００、２００ｂｐである］。
第１図に示す結果より、ヒトにおいても、脂肪前駆細胞の分化誘導後に、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの発現が誘導されていることが確認できた。すなわち、ヒトの場合においてもＢＩＰ  ｃｅｌｌ，３Ｔ３−Ｌ１  ｃｅｌｌと同様、脂肪細胞への分化に、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａが関与していることがわかる。
なお、第１図の分化誘導前のレーンにも、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの存在を示すバンドが、わずかながら認められる。これは、購入したヒト脂肪前駆細胞において、分化誘導前から細胞内に油滴が存在している細胞が観察されることから、このヒト脂肪前駆細胞の市販品が、完全な脂肪前駆細胞ではなく、すでに脂肪細胞に分化しかけた細胞が混入している細胞集団であることを示している。よって、このような脂肪細胞の脂肪前駆細胞中における混入が、分化誘導前においてもセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの発現が微量検出される原因となっていると考えられる。
これらの結果より、本発明者は、脂肪分化の際に脂肪前駆細胞において、セロトニン受容体サブタイプの一つであるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの発現が誘導され、このセロトニン受容体サブタイプを介した何らかの作用が、セロトニンにより脂肪前駆細胞におよぼされ、脂肪細胞への分化が促進されることを見出した。
本発明の抗肥満剤
上述した知見から、本発明者は、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きを阻害するアンタゴニストは、脂肪前駆細胞から、脂肪細胞への分化を抑制し、抗肥満剤の有効成分として用い得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する抑制物質を有効成分とする、抗肥満剤として用い得る、脂肪細胞の分化抑制剤（以下、本抑制剤ともいう）を提供する発明である。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ヒト脂肪前駆細胞が脂肪細胞へ分化する際のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法で検討した結果を示す写真である。
第２図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を検討した結果を示す図面である。
第３Ａ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、無添加誘導群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｂ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、セロトニン添加群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｃ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ添加群を検討した結果を示す写真である。
第３Ｄ図は、脂肪細胞分化の過程におけるセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストの調整作用を、位相差顕微鏡を用いて目視により、非誘導群を検討した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  本抑制剤の有効成分となり得る、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの脂肪前駆細胞における働きを抑制する性質を有する「抑制物質」の、受容体の働きの抑制の態様は、この性質を有している限りにおいて限定されない。すなわち、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａにおけるアンタゴニストであることも可能であり、セロトニン自体の不活性化剤であってもよい。また、抑制物質は、天然物質（生物工学的手法により製造された組換え蛋白質等を含む）であっても、化学合成物質であってもよい。
さらに、抑制物質は、既知のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制物質であってもよく、スクリーニングにより、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制作用が、新たに見出された物質であってもよい。
既知のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制物質
例えば、下記の化学式（１）〜（７）からなる物質の群から選ばれる１種または２種以上を挙げることができる。
2004080484.tif 000002
この化学式（１）で表される物質は、化学名が、３−［２−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅｄｉｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｌｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１，３０１−３１４（１９８２）等］。また、この物質（１）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、その酒石酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＫＥＴＡＮＳＥＲＩＮ  ＴＡＲＴＲＡＴＥ：ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．８３８４６−８３−７）。
2004080484.tif 000003
この化学式（２）で表される物質は、化学名が、６−Ｍｅｔｈｙｌ−１−（１−ｍｅｔｈｌｅｔｈｙｌ）−ｅｒｇｏｌｉｎｅ−８−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ（８β）−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ  ｅｓｔｅｒであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２７，３２７−３３２（１９８３）等］。また、この物質（２）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、そのマレイン酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＬＹ−５３，５８７  ＭＡＬＥＡＴＥ：ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．６０６３４−５１−７）。
2004080484.tif 000004
この化学式（３）で表される物質は、化学名が、６−［２［４［ｂｉｓ（４−Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−７−ｍｅｔｈｙｌ−５Ｈ−ｔｈｉａｚｏｌｏ［３，２−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−５−ｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｎｅｗ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３，１（１９８８）等］。また、この物質（３）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（３）は、シグマ社から入手可能である（ＲＩＴＡＮＳＥＲＩＮ：ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．８７０５１−４３−２）。
2004080484.tif 000005
この化学式（４）で表される物質は、化学名が、１−（１−Ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｇｌｅｎｎｏｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２９，２３７５−２３８０（１９８６）］。また、この物質（４）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されず、例えば、その塩酸塩が、シグマ社から入手可能である（ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．５７５３６−８６−４（ｆｒｅｅ  ｂａｓｅ））。
2004080484.tif 000006
この化学式（５）で表される物質は、化学名が、１−［２−［４−（６−ｆｌｕｏｒｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌ９−３，６−ｄｉｈｙｄｒｏ−１Ｈ，４Ｈ−［１，２，５］ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｏ［４．３．２−ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−２，２−ｄｉｏｘｉｄｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストとして知られている［Ｐｕｌｌａｒ，Ｉ．Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０７，３９（２０００）］。また、この物質（４）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（４）は、シグマ社から入手可能である（ＬＹ−３６７，２６５）。
2004080484.tif 000007
この化学式（６）で表される物質は、化学名が、３−［２−［４−（４−Ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ−［１，２−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−ｏｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストとして知られている［Ｆｉｏｒｅｌｌａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１１９，２２２−２３０（１９９５）］。また、この物質（５）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（５）は、シグマ社から入手可能である（Ｐｉｒｅｎｐｅｒｏｎｅ：ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．７５４４４−６５−４）。
2004080484.tif 000008
この化学式（７）で表される物質は、化学名が、８−Ｃｈｌｏｒｏ−１１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ−５Ｈ−ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｅ］［１，４］ｄｉａｚｅｐｉｎｅであり、セロトニン受容体５−ＨＴ２等に対するアンタゴニストとして知られている［Ｏｌｅｓｅｎ，Ｏ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．６２２，３９（１９９３）］。また、この物質（７）の塩は、薬学上許容される塩であれば特に限定されない。なお、物質（７）は、シグマ社から入手可能である（Ｎ−Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｃｌｏｚａｐｉｎｅ：ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｏ．６１０４−７１−８）。
未知のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制物質
セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制物質のうち、未知のもののスクリーニングは、このセロトニン受容体サブタイプへの結合と、その既知の働きの抑制を確認することにより行うことができるが、本抑制剤が、脂肪前駆細胞の、脂肪細胞への分化を抑制するものである故に、被験物質を、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに接触させることによる、当該受容体５−ＨＴ２Ａの変化を検出して、当該変化を、被験物質の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の抑制作用として同定して、当該作用を有する被験物質をスクリーニングする方法を用いることが好適である。
被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａを介した脂肪前駆細胞等への作用の同定方法は、特に限定されず、当業界周知のアッセイ法を用いて測定することができる。例えば、脂肪細胞内の油滴中に蓄積された中性脂肪（トリグリセライド）を定量する方法、細胞内の油滴を染色する方法（例えば、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色等）、脂肪細胞の分化マーカーとして知られている遺伝子、または、これに基づく蛋白質（ＰＰＡＲγ２，ａＰ２，ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ等）を検出する方法等を挙げることができる。
被験物質における、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａを介した脂肪前駆細胞等への作用を同定する代表的な手段の一つとして、被験物質の、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する結合性を指標とする手段を挙げることができる。
この手段を用いる場合、例えば、被験物質の精製セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａへの結合は、表面プラズモン共鳴を測定原理とした装置［例えばＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（アマシャムファルマシア社）］で直接測定することができる（例えばＢｏｒｉｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１１３８４−１１３９１，１９９７に記載された方法を例示できる）。また、被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａへの結合は、標識した被験物質を用いて直接試験することも可能であり、また、上述したように、標識した公知のリガンド（例えば、［３Ｈ］標識セロトニン）の結合の阻害を指標に測定することもできる（例えば、Ｂｏｉｅ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１８９１０−１８９１６，１９９５に記載された方法を例示できる）。
この手段により、被験物質に、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対する結合性が認められれば、被験物質が、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａを介した脂肪前駆細胞の脂肪細胞の分化に対して、何らかの作用を及ぼす調整物質である可能性が高くなる。
また、被験物質のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａを介した脂肪前駆細胞に対する働きを検出することにより、所望する調整作用を有する被験物質を選別することができる。
例えば、何らかの調整物質として選別された被験物質による、ｉｎ  ｓｉｔｕの状態の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化の抑制を検出することにより、被験物質の脂肪前駆細胞に対する、負の働きを検出することができる。上述したように、この場合、脂肪前駆細胞の細胞株を樹立して、この細胞株を用いて、上記の負の作用を検出することが好適である。
この手段において、被験物質により、ｉｎ  ｓｉｔｕの状態の脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化が抑制されることが認められれば、被験物質が、脂肪細胞への分化を抑制する、アンタゴニスト等としてスクリーニングされる。
脂肪細胞への分化を抑制するアンタゴニストは、脂肪組織の増大を抑制する抗肥満剤の有効成分として有用と考えられる。
本抑制剤の態様
本抑制剤には、上述のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａの働きの抑制物質を有効成分として、各種医薬用途に有用な製剤とすることができる。この製剤には、上述の抑制物質と共に、適当な医薬製剤担体を配合して、製剤組成物の形態に調製される。医薬製剤担体としては、使用形態に応じた製剤を調製するために慣用されている、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等を、必要に応じて用いることができる。
製剤組成物の形態は、上述の抑制物質を効果的に含有する形態であれば、特に限定されず、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤、液剤、懸濁剤、乳液剤等、とすることが可能である。
本抑制剤は、その形態に応じた適当な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬製剤は、経口ないし経腸投与により、投与され得る。
本抑制剤中の有効成分の量および製剤の投与量は、有効成分の種類、製剤の投与方法、投与形態、使用目的、これが適用される者の肥満度等の症状に応じて適宜選択されるべきものであり、特に限定されない。また、投与は、１日１〜４回程度の頻度が好適である。
【実施例】  以下、実施例により、本発明を、さらに具体的に説明する。
［セロトニンのアンタゴニストの脂肪細胞への分化の抑制作用の検討］
セロトニンのアンタゴニストの脂肪細胞への分化の抑制作用について検討するために、脂肪細胞へと分化することが知られている、マウス由来の細胞株（３Ｔ３−Ｌ１細胞：ＡＴＣＣから購入）を用いた。
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、増殖培地［ＤＭＥＭ，１０％ＣＳ（ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］で、５％ＣＯ２、３７℃下で培養後、細胞がディッシュ一面に増殖してから２日後に、分化誘導培地［ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１〜１０μｇ／ｍｌインシュリン，１μＭデキサメタゾン，０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ），１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］と、培地交換を行い、同条件で２日間培養した。次いで、分化維持培地［ＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ，１〜１０μｇ／ｍｌインシュリン，１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン］と培地交換を行い、引き続き、培養を継続した。
本試験は、上記の３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化誘導時に、分化誘導培地に、セロトニン受容体５−ＨＴ２に対するアンタゴニストであるＫｅｔａｎｓｅｒｉｎ（シグマ社製）もしくはセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストであるＬＹ−５３８５７（シグマ社製）を、それぞれ１μＭ添加した培地を用いた群、また、ポジティブコントロールとして、セロトニンを５μＭ添加した培地を用いた群、ネガティブコントロールとして、誘導培地への交換を行わない群において、培地交換６日後、９日後、１２日後の細胞内におけるトリグリセリドの蓄積量を、トリグリセライドＧテストワコー（和光純薬社製）により定量し、比較検討を行った。その結果を第２図と第３Ａ図〜第３Ｄ図に示す。第２図の結果により、上記のセロトニン受容体５−ＨＴ２Ａに対するアンタゴニストを添加した群は、トリグリセリドの細胞内の蓄積が少なくなっており、脂肪細胞への分化が抑制されていることが判明した。また、第３Ａ図〜第３Ｄ図［第３Ａ図：無添加誘導群、第３Ｂ図：セロトニン添加群、第３Ｃ図：Ｋｅｔａｎｓｅｒｉｎ添加群、第３Ｄ図：非誘導群］は、分化誘導６日目の細胞を、位相差顕微鏡（５０倍）を用いて、目視による検討を行った結果を示す図面である。この結果も、第２図に示した結果を裏付けている。
これらの結果により、セロトニン受容体５−ＨＴ２Ａは、脂肪前駆細胞の脂肪細胞分化時において、分化促進に向けて働いていることが明らかになり、さらに、この働きは、セロトニン受容体のアンタゴニストにより抑制されることが明らかになった。すなわち、当該セロトニン受容体サブタイプに対すアンタゴニストは、脂肪細胞への分化に対する抑制作用等を有し、脂肪細胞の蓄積を抑制する抗肥満剤の有効成分として有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、肥満と関連する脂質代謝の働きが深く究明され、この働きを原理として用いる抗肥満剤が提供される。
【配列表】
2004080484.tif 000009
2004080484.tif 000010
2004080484.tif 000011
2004080484.tif 000012
2004080484.tif 000013
2004080484.tif 000014
2004080484.tif 000015
2004080484.tif 000016
【図１】
2004080484.tif 000020
【図２】
2004080484.tif 000021
2004080484.tif 000022
【国際調査報告】
2004080484.tif 000023
2004080484.tif 000024
2004080484.tif 000025
2004080484.tif 000026