(57)【要約】活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すＧタンパク質共役型受容体からなるか、あるいは、前記ポリペプチドを発現している細胞からなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールを開示する。また、前記細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニング方法を開示する。前記スクリーニングツール及びスクリーニング方法は、インスリン含量を増加させ、糖尿病を予防及び／又は治療するために有用な物質のスクリーニングに有用である。更には、前記スクリーニングで得られる物質を有効成分とする、新規なインスリン含量増加剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール。
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール。
【請求項３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール。
【請求項４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現している細胞からなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項５に記載の細胞の、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングのための使用。
【請求項７】
請求項５に記載の細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニング方法。
【請求項８】
請求項５に記載の細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、並びに、製剤化工程を含む、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性化する物質を有効成分として含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性化する物質を投与することからなる、インスリン産生促進及び／又はインスリン含量増加方法。
【請求項１１】
インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを活性化する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、インスリン産生促進に基づくインスリン含量増加剤のスクリーニングツール及びスクリーニング方法、並びに新規なインスリン含量増加剤に関する。
【背景技術】  「糖尿病」は、インスリン作用の不足による慢性高血糖を主徴とし、種々の特徴的な代謝異常を伴う疾患群であると定義され（非特許文献１）、その成因によって、膵β細胞の破壊性病変によるインスリン欠乏を特徴とする「インスリン依存型（１型）」と、インスリン感受性の低下とインスリン分泌低下の両者を伴う「インスリン非依存型（２型）」に分類される。
特に糖尿病患者の約９割を占める２型糖尿病においては、慢性的な高血糖により、膵β細胞の機能低下、すなわち、インスリン分泌能の低下及びインスリン含量の低下を引き起こすと理解されている（非特許文献２）。今日の臨床においては、インスリン分泌低下が認められる糖尿病患者に対する治療薬の１つとして、スルホニルウレア（ＳＵ）剤が用いられている。この薬剤は、インスリンの生合成を促進することなく、すなわち、インスリン含量を増加させることなく、膵臓からのインスリン分泌を促進させることがわかっている。更に、この薬剤は、膵β細胞の機能障害、特にインスリン欠乏を引き起こしてしまうことが知られている（非特許文献３）。従って、慢性的高血糖又はスルホニルウレア剤の使用などにより低下した膵機能を改善させる薬剤、特にインスリン産生を促進し、インスリン含量を増加させ、糖尿病を予防及び／又は治療する薬剤の開発が望まれている。
膵β細胞のインスリン含量を増加させるためには、インスリン遺伝子の転写及び／又は翻訳の過程を増強させて、インスリン生合成を促進させることが必要と考えられる。インスリンの生合成を促進させるものとして、グルコースやｃＡＭｐが知られており、その作用メカニズムとして、転写の亢進及びｍＲＮＡの安定化によるインスリンｍＲＮＡ量の増加が知られている（非特許文献４〜６）。従って、インスリンｍＲＮＡを増加させる物質（例えば、インスリンプロモーター活性を増強させる物質）は、インスリン含量を増加させる作用を有すると考えられている。
インスリン分泌の制御に関与する分子として、つまり、インスリン分泌促進作用を有する分子として報告されているＧタンパク質共役型受容体が存在する［国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレット（特許文献１）］。しかし、「インスリン産生促進作用」及び「インスリン含量増加作用」についてはこれまで全く知られていない。また、インスリン含量を増加させる物質をスクリーニングするための適したアッセイ方法についても報告はない。
国際公開ＷＯ００／５０５６２号パンフレット（特許文献２）には、国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットに開示されているヒト及びラット受容体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、及びそれがコードするポリペプチドが記載されており、アゴニスト及びアンタゴニストの用途として、同一の多数の疾患（糖尿病を含む）を列挙している。
欧州特許出願公開第１０９２７２７Ａ号明細書（特許文献３）及び特開２００１−１８６８８８号公報（特許文献４）には、前記ヒト受容体と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列、及び国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレット記載の配列に比べ１アミノ酸欠失したアミノ酸配列が記載されており、前記ポリペプチドを調節する物質の用途として、多数の疾患の治療を列挙し、糖尿病治療が好ましいと記載されている。
国際公開ＷＯ０１／３２８６４号パンフレット（特許文献５）、国際公開ＷＯ０１／３６４７３号パンフレット（特許文献６）、国際公開ＷＯ０１／４２２８８号パンフレット（特許文献７）、国際公開ＷＯ０１／８７９２９号パンフレット（特許文献８）、国際公開ＷＯ０２／６４７８９号パンフレット（特許文献９）、及び国際公開ＷＯ０２／６１０８７号パンフレット（特許文献１０）には、前記ヒト受容体と同一のアミノ酸配列が記載されており、前記ポリペプチドを調節する物質の用途として、多数の疾患（糖尿病を含む）の治療を列挙している。また、国際公開ＷＯ００／２２１３１号パンフレット（特許文献１１）、国際公開ＷＯ００／３１２５８号パンフレット（特許文献１２）、及び国際公開ＷＯ０２／１６５４８号パンフレット（特許文献１３）には、前記ヒト受容体と同一のアミノ酸配列が記載されており、前記ポリペプチドを調節する物質の用途として、多数の疾患の治療を列挙している。
しかし、いずれにも、これらの受容体を活性化することによりインスリン産生を促進すること、及びこれらの受容体がインスリン産生促進剤又はインスリン含量増加剤のスクリーニングツールになることの開示も示唆もなく、これらの受容体を用いたインスリン産生促進剤又はインスリン含量増加剤のスクリーニング方法についても開示も示唆もない。
（非特許文献１）  「糖尿病」，１９９９年，第４２巻，第５号，ｐ．３８５−４０４
（非特許文献２）  シー・ロナルド・カーン及びゴードン・シー・ウィアー（Ｃ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｃ．Ｗｅｉｒ）編，金澤康徳，他３名訳，「ジョスリン糖尿病学」，医学書院エムワイダブリュー，１９９５年，ｐ．２４５−２６８
（非特許文献３）  シー・ロナルド・カーン及びゴードン・シー・ウィアー（Ｃ．Ｒｏｎａｌｄ  Ｋａｈｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｃ．Ｗｅｉｒ）編，金澤康徳，他３名訳，「ジョスリン糖尿病学」，医学書院エムワイダブリュー，１９９５年，ｐ．５０５−５２５
（非特許文献４）  「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８５年，第２６０巻，ｐ．１３５８５−１３５８９
（非特許文献５）  「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８５年，第２６０巻，ｐ．１３５９０−１３５９４
（非特許文献６）  「ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」，（米国），１９７７年，第２６巻，ｐ．５３８−５４５
（特許文献１）  国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレット
（特許文献２）  国際公開ＷＯ００／５０５６２号パンフレット
（特許文献３）  欧州特許出願公開第１０９２７２７Ａ号明細書
（特許文献４）  特開２００１−１８６８８８号公報
（特許文献５）  国際公開ＷＯ０１／３２８６４号パンフレット
（特許文献６）  国際公開ＷＯ０１／３６４７３号パンフレット
（特許文献７）  国際公開ＷＯ０１／４２２８８号パンフレット
（特許文献８）  国際公開ＷＯ０１／８７９２９号パンフレット
（特許文献９）  国際公開ＷＯ０２／６４７８９号パンフレット
（特許文献１０）  国際公開ＷＯ０２／６１０８７号パンフレット
（特許文献１１）  国際公開ＷＯ００／２２１３１号パンフレット
（特許文献１２）  国際公開ＷＯ００／３１２５８号パンフレット
（特許文献１３）  国際公開ＷＯ０２／１６５４８号パンフレット
【発明の開示】
本発明の課題は、インスリン産生を促進することにより、インスリン含量を増加させ、糖尿病を予防及び／又は治療するために有用な物質のスクリーニングに役立つツール、スクリーニング法及び新規なインスリン産生促進剤及び／又は含量増加剤を提供することにある。
インスリン産生を促進するか否かは、インスリンプロモーター遺伝子の活性化を指標に判断することができる。インスリンプロモーター遺伝子を活性化する物質の中には、例えば、細胞内でインスリンプロモーターに直接結合して活性化する因子を介するものや、細胞膜表面上にあるタンパク質［例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）］に直接作用して、その活性を制御することにより、インスリンプロモーター活性を増強させる物質が含まれる。インスリンプロモーター活性を上げるような薬剤のうち、細胞内で作用する物質は、細胞膜（更には核膜）を通過する必要があるが、細胞膜表面のタンパク質が標的である場合は、細胞膜の通過は必要ない。現在知られている薬の約半数以上が、細胞膜表面にあるタンパク質を標的としていることから、この種のタンパク質は医薬品の標的として魅力的であり、創薬上可能性の高い標的となり得ると考える。従って、細胞膜に存在するタンパク質で、インスリンプロモーター遺伝子の活性を制御することのできる分子（創薬標的分子）の発見は、インスリン含量を増加させるという糖尿病治療薬開発にとって非常に重要であり、糖尿病の予防と治療に貢献するものと考えられる。
本発明者は、鋭意研究の結果、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲが活性化されることにより、インスリンプロモーター活性を上昇させ、インスリン産生促進が増加することを見出し、これに基づき、前記ＧＰＣＲを用いたインスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤のスクリーニング法を提供した。また、本発明のスクリーニング法で得られた、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＧＰＣＲを活性化する物質が、確かにインスリンプロモーター活性を上昇させることを確認し、新たなインスリン産生促進剤を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列、あるいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール；
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール；
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール；
［４］配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドからなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール（以下、［１］〜［４］に記載のインスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールを、総称して、ポリペプチド型スクリーニングツールと称する）；
［５］［１］〜［４］に記載のポリペプチドを発現している細胞からなる、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール（以下、細胞型スクリーニングツールと称する）；
［６］請求項１〜４に記載のポリペプチド又は請求項５に記載の細胞の、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングのための使用；
［７］［５］に記載の細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び［１］〜［４］に記載のポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニング方法；
［８］［５］に記載の細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及び請求項１〜４に記載のポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、並びに、製剤化工程を含む、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物の製造方法；
［９］［１］〜［４］に記載のポリペプチドを活性化する物質を有効成分として含む、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤；
［１０］［１］〜［４］に記載のポリペプチドを活性化する物質を投与することからなる、インスリン産生促進及び／又はインスリン含量増加方法；並びに
［１１］インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物製造のための、［１］〜［４］に記載のポリペプチドを活性化する物質の使用に関する。
本明細書において、「スクリーニングツール」とは、スクリーニングに用いるための物（具体的には、スクリーニングに用いるためのポリペプチド又はポリペプチドを発現している細胞）を意味する。「インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツール」とは、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤をスクリーニングするために、試験物質を接触させる対象として用いるためのポリペプチド又は細胞である。「インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤」とは、インスリン産生促進剤、インスリン含量増加剤、及び、インスリン産生促進に基づくインスリン含量増加剤を意味する。
【図面の簡単な説明】  図１は、プラスミドＩｎｓＰｒｏと一緒に、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ  ＳＳＦ−ＮＡ又はコントロールベクター（プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ）を遺伝子導入されたマウス膵β細胞株ＮＩＴ１細胞における、ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。縦軸は、ルシフェラーゼ活性を表わす。
図２は、プラスミドＩｎｓＰｒｏを遺伝子導入したマウス膵β細胞株ＮＩＴ１細胞を、２−（ピリジン−４−イル）エチル  チオベンゾエート（以下、化合物Ａと称する）処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ活性、横軸は化合物濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を表わす。
図３は、プラスミドＩｎｓＰｒｏを遺伝子導入したマウス膵β細胞株ＮＩＴ１細胞を、４−｛５−［（Ｅ）−（１，３−ジエチル−５−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝安息香酸（以下、化合物Ｂと称する）、（２Ｚ）−２，３−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）アクリロニトリル（以下、化合物Ｃと称する）、４−［（Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル］ピリジン（以下、化合物Ｄと称する）、又は５−｛［４−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）ベンジル］チオ｝−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−アミン（以下、化合物Ｅと称する）で処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果を示すグラフである。縦軸はルシフェラーゼ活性、記号「Ｒ」はコントロールを表わす。
図４は、化合物Ａを腹腔内投与した、または、化合物Ａ無添加ＳＤラットにおける、グルコース経口負荷後の血漿中インスリン濃度の経時変化を示すグラフである。縦軸は血漿中インスリン（ｎｇ／ｍＬ）、横軸はグルコース経口負荷後の時間（分）を表す。
図５は、化合物Ａを腹腔内投与した、または、化合物Ａ無添加ＳＤラットにおける、グルコース経口負荷後の血糖値の経時変化を示すグラフである。縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）、横軸はグルコース経口負荷後の時間（分）を表す。
図６は、化合物Ａを経口投与した、または、化合物Ａ無添加ＧＫラットにおける、グルコース経口負荷後の血糖値の経時変化を示すグラフである。縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）、横軸はグルコース経口負荷後の時間（分）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】１．本発明のスクリーニングツール
本発明のインスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールには、ポリペプチド型スクリーニングツールと、細胞型スクリーニングツールとが含まれる。
（１）ポリペプチド型スクリーニングツール
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるポリペプチドとしては、例えば、
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）
を挙げることができる。以下、本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるこれらの各種ポリペプチドを、総称して、スクリーニングツール用ポリペプチドと称する。
スクリーニングツール用ポリペプチドの１つである、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、３３５個のアミノ酸残基からなるヒト由来のＧタンパク質共役型受容体である。また、スクリーニングツール用ポリペプチドの１つである、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、３３５個のアミノ酸残基からなるラット由来のＧタンパク質共役型受容体である。配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来のポリペプチドと、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるラット由来のポリペプチドとは、アミノ酸配列の比較において８０．６％の相同性を示す。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）により得られた値を意味し、アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて決定することができる。具体的には、ＢＬＡＳＴパッケージ（ｓｇｉ３２ｂｉｔ版，バージョン２．０．１２；ＮＣＢＩより入手）のｂｌ２ｓｅｑプログラム（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ及びＴｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４，２４７−２５０，１９９９）を用い、デフォルトパラメーターに従って算出することができる。ペアワイズ・アラインメント・パラメーターとして、プログラム名「ｂｌａｓｔｐ」を使用し、Ｇａｐ挿入Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｇａｐ伸長Ｃｏｓｔ値を「０」で、Ｑｕｅｒｙ配列のフィルターとして「ＳＥＧ」を、Ｍａｔｒｉｘとして「ＢＬＯＳＵＭ６２」をそれぞれ使用して得られる「同一性」を意味する。
配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるこれらのポリペプチドは、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性（以下、インスリン産生促進活性と称することがある）を示す。
本明細書において、或るポリペプチドが「活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性」を示すか否かは、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法（好ましくは、後述の実施例３に記載の方法）により確認することができる。すなわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、前記ポリヌクレオチドを含まないコントロール用発現ベクターとで、それぞれ、細胞を形質転換する。この際、前記の各発現ベクターに加え、インスリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を連結したプラスミドと一緒に、細胞を形質転換する。形質転換後、所定時間（例えば、２４時間）培養した後、培地を除去し、細胞溶解液で細胞を溶解し、溶解液中のレポーター活性をそれぞれ測定する。コントロール用発現ベクターで形質転換した細胞（コントロール細胞）における溶解液中のレポーター活性に比べて、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した細胞（試験細胞）における溶解液中のレポーター活性が上昇していれば、前記ポリペプチドが「活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性」を示すと判定することができる。
本明細書において、Ｇタンパク質共役型受容体であるスクリーニングツール用ポリペプチドが「活性化」された状態とは、リガンドとの結合の有無に関わらず、Ｇタンパク質共役型受容体の下流にシグナルが伝達されている状態を意味する。活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が一定量を越えた場合に、これらのポリペプチドは活性化される。
Ｇタンパク質共役型受容体は、不活性型と活性型との間の平衡状態にあり、リガンドがＧタンパク質共役型受容体に結合することにより、平衡が活性型にシフトする。Ｇタンパク質共役型受容体を過剰に発現させた場合にも、活性型Ｇタンパク質共役型受容体の絶対量が増えるため、リガンド非存在下であっても、活性化され、下流にシグナルが伝達されることが知られている（Ｍｉｌａｎｏ，Ｃ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４，５８２−５８６，１９９４）。すなわち、Ｇタンパク質共役型受容体は、リガンドが特定されていない場合であっても、Ｇタンパク質共役型受容体を細胞に過剰発現させることにより、その受容体からのシグナルを検出することが可能な場合がある。後述の実施例３に記載の実験では、スクリーニングツール用ポリペプチドに対するリガンド非存在下であっても、これらのポリペプチドを過剰発現させることにより、アゴニストの結合による活性化と同じ状態に活性化されている。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる機能的等価改変体は、天然に存在する配列であるか、人工的に製造した配列であるかを問わず、その起源も特に限定されるものではない。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのラットにおける変異体が含まれるだけでなく、ヒト及びラット以外の生物（例えば、マウス、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体も本発明に含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわち、ヒト又はラット由来の変異体、あるいは、ヒト及びラット以外の生物由来の機能的等価改変体）、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列を、遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドなども、前記機能的等価改変体に該当する限り、本発明に含まれる。なお、本明細書において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。
機能的等価改変体としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、全体として１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、インスリン産生促進活性を示すポリペプチドがより好ましい。
配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、インスリン産生促進活性を示すポリペプチドとして、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）も、インスリン産生促進活性を示す限り、含まれる。
前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げることができる。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできる相同ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、インスリン産生促進活性を示すポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。
本発明のポリペプチド型スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用ポリペプチドは、種々の公知の方法によって得ることができ、例えば、国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットに記載の方法に従って製造することができる。
（２）細胞型スクリーニングツール
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできる細胞（以下、スクリーニングツール用細胞と称する）は、細胞型スクリーニングツールとして用いる際に前記ポリペプチドを発現している限り、特に限定されるものではなく、前記発現ベクターで形質転換された細胞であることもできるし、あるいは、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現することが知られている天然の細胞又はその細胞株（例えば、膵臓β細胞株、好ましくはＮＩＴ１細胞）であることもできる。
本発明の細胞型スクリーニングツールとして用いることのできるスクリーニングツール用細胞としては、形質転換細胞がより好ましく、例えば、
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現している形質転換細胞；
（ｉｉ）機能的等価改変体を発現している形質転換細胞；及び
（ｉｉｉ）相同タンパク質を発現している形質転換細胞
を挙げることができる。
スクリーニングツール用細胞は、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、宿主細胞（好ましくは真核生物、特に好ましくは２９３−ＥＢＮＡ細胞）を形質転換させることにより取得することができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれめ宿主細胞においてポリペプチドを発現させることが可能である。
発現ベクターで形質転換された細胞としては、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるいは、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。スクリーニングツール用細胞は、例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができ、より具体的には、例えば、国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットに記載の方法に従って製造することができる。
２．インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニング方法
スクリーニングツール用ポリペプチド又はスクリーニングツール用細胞を用いると、スクリーニングツール用ポリペプチドの活性を制御可能な物質、特には、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（すなわち、アゴニスト）をスクリーニングすることができる。先に述べたように、スクリーニングツール用ポリペプチドは、活性化されることにより、インスリン産生を促進する活性を有する。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質は、インスリン産生を促進することのできるインスリン含量増加剤の有効成分として有用である。従って、スクリーニングツール用ポリペプチドそれ自体、あるいは、スクリーニングツール用細胞それ自体を、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤のスクリーニングツールとして使用することができる。
本明細書において、「インスリン産生促進」とは、コントロール群に対して有意にインスリン産生促進活性が増加しており、かつ、コントロール群に対する試験物質処理群のインスリン産生促進活性が、１．５倍以上（好ましくは５倍以上）である場合を意味する。
本発明のスクリーニングツールを用いてスクリーニングにかけることのできる試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作製されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、徴生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のインスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤スクリーニングツールにより選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、受容体として機能するようにスクリーニングツール用ポリペプチドを発現しているスクリーニングツール用細胞又はその細胞膜と試験物質とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定されるものではないが、前記ポリペプチドの活性化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
１）細胞内ｃＡＭＰ濃度の変動を指標とするスクリーニング方法（以下、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法と称する）、
２）ＧＴＰγＳ結合法を利用するスクリーニング方法（以下、ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法と称する）、
３）リガンド結合アッセイ法を利用するスクリーニング方法（以下、リガンド結合型スクリーニング方法と称する）、及び
４）インスリンプロモーター活性を指標とした方法（以下、インスリンプロモーター活性型スクリーニング方法と称する）
を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法は、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法（特には実施例４に記載の方法）又はインスリンプロモーター活性型スクリーニング方法（特には実施例５に記載の方法）を用いることが好ましく、ｃＡＭＰ型スクリーニング方法（特には実施例４に記載の方法）及びインスリンプロモーター活性型スクリーニング方法（特には実施例５に記載の方法）を組み合わせて用いることがより好ましい。
また、形質転換細胞でなく、天然の細胞又はその細胞株を用いてスクリーニングを行なった場合には、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の形質転換細胞をスクリーニングツールとして用い、前記スクリーニングで得られた物質がスクリーニングツール用ポリペプチドを活性化することを確認することが望ましい。
１）ｃＡＭＰ型スクリーニング方法
細胞内ｃＡＭＰ濃度の変動を指標として、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤の有効成分として有用な、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（すなわち、アゴニスト）をスクリーニングする場合には、スクリーニングツール用細胞と、試験物質とを接触させ、前記細胞内のｃＡＭＰ濃度の変化を直接的又は間接的に分析（すなわち、測定又は検出）することにより、前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する。すなわち、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変動を指標とする本発明のｃＡＭＰ型スクリーニング方法では、スクリーニングツール用細胞と試験物質とを接触させる工程、及び前記細胞内におけるｃＡＭＰ濃度の変化を分析する工程を含む。より具体的には、後述の実施例４に記載の方法により実施することが好ましい。例えば、試験物質を一定時間作用させ、細胞内ｃＡＭＰ濃度の上昇を指標に、コントロール細胞に対して、スクリーニングツール用細胞において１．５倍以上（好ましくは５倍以上）の活性上昇を示す試験物質をアゴニスト活性を有する物質として選択することができる。
ｃＡＭＰ濃度の変化は、例えば、市販のｃＡＭＰ測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできるし、あるいは、後述の実施例４に示すように、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子］の転写活性を分析することにより、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することもできる。
スクリーニングツール用細胞と試験物質とを接触させた場合に、前記細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇すれば、前記試験物質は、スクリーニングツール用ポリペプチドに対するアゴニストであると判定することができる。なお、コントロール細胞として、スクリーニングツール用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドが発現されていない宿主細胞、あるいは、空ベクターで形質転換した形質転換細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質によりこれらのコントロール細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇しないことを確認することが好ましい。
市販のｃＡＭＰ測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社等）を用いて、直接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質をスクリーニングする場合には、例えば、以下の手順により実施することができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した細胞を、遺伝子導入した後、２０時間培養し、続いて、培地を吸引した後、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）／ＤＭＥＭ４００μＬを加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１０分間インキュベートする。更に、１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＩＢＭＸ／ＤＭＥＭ１００μｌで希釈した試験物質（例えば、化合物、ペプチド、又は抗体等）を添加し、更に３０分間インキュベートする。培地を吸引し、得られた細胞におけるｃＡＭＰ量を、市販のｃＡＭＰ測定キット［例えば、ｃＡＭＰ酵素免疫アッセイ系（ｃＡＭＰ  ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社）］を用いて測定する。試験物質存在下における特異的なｃＡＭＰ量の上昇が観察された試験物質を、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、すなわち、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤としてスクリーニングすることができる。
ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を分析し、間接的にｃＡＭＰ濃度の変化を分析することにより、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質をスクリーニングする場合には、例えば、後述の実施例４に示すように、以下の手順により実施することができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドをコードする遺伝子と、ｃＡＭＰ濃度に依存して転写量が調節される遺伝子［例えば、ルシフェラーゼの遺伝子の上流にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を挿入した遺伝子；例えば、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）］とを導入した細胞を、遺伝子導入した後、１８〜２０時間培養し、培地で希釈した試験物質を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で５〜６時間インキュベートする。培地を吸引し、細胞溶解液で溶解した後、そのルシフェラーゼ活性を測定する。試験物質存在下における特異的なレポーター活性の上昇が観察された物質等を、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、すなわち、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤としてスクリーニングすることができる。
２）ＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法
ＧＴＰγＳ結合法（Ｌａｚａｒｅｎｏ，Ｓ．及びＢｉｒｄｓａｌｌ，Ｎ．Ｊ．Ｍ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０９，１１２０−１１２７，１９９３）を利用して、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤の有効成分として有用な、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（すなわち、アゴニスト）をスクリーニングする場合には、例えば、以下の手順により実施することができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現させた細胞膜を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ２、及び５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＧＤＰ混合溶液中で、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ（４００ｐｍｏｌ／Ｌ）と混合する。試験物質存在下と試験物質不在下とでインキュベートした後、反応液をガラスフィルター等で濾過し、フィルターに残存するＧＴＰγＳの放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。試験物質存在下における特異的なＧＴＰγＳ結合の上昇を指標に、スクリーニングツール用ポリペプチドに対するアゴニスト、すなわち、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤をスクリーニングすることができる。
ＧＴＰγＳ結合法を利用する本発明のＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法では、３５Ｓで標識されたＧＴＰγＳ存在下において、スクリーニングツール用細胞の細胞膜と試験物質とを接触させる工程、及び前記細胞膜と結合したＧＴＰγＳと、未結合のＧＴＰγＳとを分離し、分離されたいずれか一方に含まれる放射活性を分析する工程を含む。
３）リガンド結合型スクリーニング方法
リガンド結合アッセイ法を利用して、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤の有効成分として有用な、スクリーニングツール用ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする場合には、例えば、以下の手順により実施することができる。すなわち、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現させたスクリーニングツール用細胞、若しくはその細胞膜、又はスクリーニングツール用ポリペプチド（好ましくはその精製標品）を調製する。緩衝液、イオン、及び／又はｐＨのようなアッセイ条件を最適化し、最適化したバッファー中で、前記ポリペプチドを発現させた形質転換細胞若しくはその細胞膜、又は前記ポリペプチドと、例えば、前記ｃＡＭＰ型スクリーニング方法及び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法で取得することができる物質（すなわち、アゴニスト）の標識体とを、試験物質と共に一定時間インキュベーションする。反応後、ガラスフィルター等で濾過し、適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で測定する。得られた標識体の結合阻害を指標に、スクリーニングツール用ポリペプチドのリガンドを選択することができる。なお、このリガンドが、アゴニスト又はアンタゴニストであるかについては、前記ｃＡＭＰ型スクリーニング方法及び／又はＧＴＰγＳ結合型スクリーニング方法などにより確認することができる。
４）インスリンプロモーター活性型スクリーニング方法
インスリンプロモーター活性を指標として、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤の有効成分として有用な、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質（すなわち、アゴニスト）をスクリーニングする場合には、スクリーニングツール用細胞と、試験物質とを接触させ、前記細胞内のインスリンプロモーター活性の変化を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する。
インスリンプロモーター活性の変化は、例えば、後述の実施例５に示すように、インスリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を連結したプラスミドを用いて、その転写活性を分析することにより、インスリンプロモーター活性の変化を分析することができる。
より具体的には、例えば、インスリンプロモーターの下流にレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を連結したプラスミドを、スクリーニングツール用細胞に導入した後、１８〜２０時間培養し、培地で希釈した試験物質を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間インキュベートする。培地を吸引し、細胞溶解液で溶解した後、そのレポーター活性（例えば、ルシフェラーゼ活性）を測定する。試験物質存在下における特異的なレポーター活性の上昇が観察された物質等を、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質、すなわち、インスリン産生促進剤及び／又はインスリン含量増加剤としてスクリーニングすることができる。なお、コントロール細胞として、スクリーニングツール用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現していない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質によりこれらのコントロール細胞では、インスリンプロモーターレポーター活性が上昇しないことを確認することが好ましい。
３．インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物
本発明には、例えば、本発明のスクリーニング方法で選択することのできる、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質［例えば、ＤＮＡ、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とするインスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物が包含される。有効成分として、例えば、実施例６に記載した、２−（ピリジン−４−イル）エチル  チオベンゾエート、４−｛５−［（Ｅ）−（１，３−ジエチル−５−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝安息香酸、（２Ｚ）−２，３−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）アクリロニトリル、４−［（Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル］ピリジン、及び５−｛［４−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）ベンジル］チオ｝−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−アミンなどが挙げられる。
また、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物の品質規格の確認試験において、（１）スクリーニングツール用細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを接触させる工程、及びスクリーニンツール用ポリペプチドが活性化されるか否かを分析する工程、あるいは、（２）スクリーニングツール用細胞、又はその細胞膜と、試験物質とを、スクリーニングツール用ポリペプチドの標識アゴニスト存在下で、接触させる工程、及び前記細胞又はその細胞膜への標識アゴニストの結合量の変化を分析する工程からなる分析を行ない、次いで、分析した物質を製剤化することからなる、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
また、前記工程による分析を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質を製剤化することからなる、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物における有効成分としては、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質を用いることができ、前記活性化物質は、例えば、本発明のスクリーニング方法により選択することができる。本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法で得られた物質を有効成分とする医薬組成物に限定されず、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質を有効成分とするインスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物であれば全て包含される。
なお、インスリン産生及びインスリン含量の増加の確認は、当業者に公知の方法、あるいは、それを改良した方法を用いることにより実施することができる。例えば、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質を糖尿病モデル動物に連続投与し、膵臓中のインスリンｍＲＮＡ又はインスリンタンパク質の量を測定することにより確認することができ、更には、前述の条件のもと、常法に従って随時血糖低下作用を確認することにより、あるいは、経口糖負荷試験後の血糖上昇抑制作用の確認を行なうことにより、糖尿病治療効果の有無を判定することができる。
スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質［例えば、ＤＮＡ、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物］を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる薬理学上許容される担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて、医薬組成物として調製することができる。本発明には、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質を、インスリン産生促進及び／又はインスリン含量増加の必要な対象に、有効量で投与する工程を含む、インスリン産生促進及び／又はインスリン含量の増加方法が含まれる。また、本発明には、スクリーニングツール用ポリペプチドを活性化する物質の、インスリン産生促進用及び／又はインスリン含量増加用医薬組成物を製造するための使用が含まれる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注若しくは筋注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、又はポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に断らない限り、公知の方法（″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２等）に従って実施した。
実施例１：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む発現ベクターの製造
国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットの実施例１に記載の手順に従って、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを取得し、ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドに導入した（以下、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＮＡと称する）。次いで、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現させるために、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする全長ＤＮＡを導入したｐＥＦ−ＢＯＳシグナルシークエンスフラッグプラスミド（以下、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ  ＳＳＦ−ＮＡと称する）を製造した。これは、目的とするポリペプチドのＮ末端にシグナルシークエンスを付加することができる発現ベクターを用いることにより、目的ポリペプチドを細胞膜に高頻度に発現させるためである。
実施例２：ヒトインスリンプロモーターレポータープラスミドの構築
ヒトのインスリン遺伝子の５’発現制御領域は、塩基配列が同定されており（Ｎａｔｕｒｅ，２８４，２６−３２，１９８０）、転写因子結合部位として知られる複数のシス（ｃｉｓ）エレメントは、マウスやラットのインスリン遺伝子の５’発現制御領域にも共通に存在している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４４，１００２−１００４，１９９５）。これらの種を越えて共通のシスエレメントを含み、且つプロモーター活性を示すのに充分と考えられる領域（本実施例では、−３４２から＋３７の領域を使用した。なお、数字の＋１は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５，１１５７２−１１５７７，１９９８に示された想定上の転写開始点を表す）を、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０−１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて５’側にＨｉｎｄＩＩＩサイト、３’側にＮｃｏＩサイトができるようにしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、プラスミドｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ４５５００１，ＴＡクローニングシステム；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。
具体的なＰＣＲの増幅条件は次の通りである。ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、１サイクル当たり、９４℃で３０秒間、２本鎖ＤＮＡを熱変性し、５５℃で３０秒間、プライマーを変性した１本鎖ＤＮＡにアニーリングさせ、引き続き、７２℃で１分間、ＤＮＡ伸長反応させた。これを３０サイクル繰り返した。ＰＣＲに用いたプライマー［Ｉｎｓ１７（ｈ）及びＩｎｓ１９（ｈ）］の塩基配列を配列番号５及び６に示す。
次に、増幅断片がクローニングされたプラスミドを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）及びＮｃｏＩ（宝酒造）を用いて消化することによりプラスミドから増幅断片を切り出し、ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド（Ｃａｔ．Ｎｏ．３０６−０４８３１，ルシフェラーゼベクターｐＧＶ−Ｂ２；東洋インキ）のルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンのＮｃｏＩサイトとその５’上流に位置するＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間にクローニングした。クローニングしたヒトインスリンプロモーターの塩基配列は、ジデオキシターミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）法によりＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。決定した塩基配列を配列番号７に示す。
このようにして、ヒトインスリンプロモーターレポータープラスミドｐＩｎｓ−Ｌｕｃ３８０（以下、プラスミドＩｎｓＰｒｏと称する）を構築した。なお、このプラスミドを細胞に導入し、このプラスミドに含まれるインスリンプロモーター部分が活性化されれば、ルシフェラーゼ遺伝子が生合成される。このルシフェラーゼ活性を測定することにより、インスリンプロモーター活性を測定することができる。
実施例３：配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの過剰発現によるインスリンプロモーターレポーター活性の変化
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのセカンドメッセンジャーの１つは、ｃＡＭＰであることが知られている（国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットの実施例４参照）。
本実施例では、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの過剰発現によるインスリンプロモーター活性に与える影響を検討した。
９６穴プレートに、マウス膵β細胞株ＮＩＴ１細胞（４×１０４細胞／ウエル；ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２０５５）を播種し、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＦ−１２培地中で一晩培養した後、トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて、前記細胞にプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ  ＳＳＦ−ＮＡ（１０ｎｇ）と実施例２で作製したプラスミドＩｎｓＰｒｏ（１ｎｇ）とを遺伝子導入した。なお、コントロールとして、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロール用の空ベクター）とプラスミドＩｎｓＰｒｏとを遺伝子導入した。遺伝子導入した後、更に２４時間培養し、培地を吸引した後、細胞溶解液（細胞溶解液ＬＣβ；東洋インキ）で溶解し、そのルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット（ピッカジーン発光キット；東洋インキ）及び測定装置（ＭＬ３０００  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。
結果（平均値±標準誤差，ｎ＝４）を図１に示す。図１に示すように、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ  ＳＳＦ−ＮＡを導入した細胞では、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳを導入した細胞と比較して、有意なインスリンプロモーター活性の上昇が確認された。スチューデントのｔ−テストによれば、Ｐ＝０．００１８であった。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを過剰発現させることにより、すなわち、活性化させることにより、インスリンプロモーター活性が上昇することが判明した。
以上の結果より、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化してインスリンプロモーター活性を上昇させることにより、インスリン生合成が増加し、結果としてインスリン含量が増えると考えられた。従って、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの「アゴニスト」は、糖尿病の予防及び／又は治療薬、特には、インスリン含量（生合成）増加薬となると考えられた。ここでいう「アゴニスト」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのシグナルを増強させ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの作用を増強させる、すなわち、このポリペプチドを活性化させる、物質の総称である。
実施例４：細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を指標とした、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を修飾する物質のスクリーニング
本実施例では、宿主細胞として、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。
コラーゲンコートした９６穴プレートに２９３−ＥＢＮＡ細胞（１×１０４細胞／ウエル）を播種し、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で一晩培養した後、トランスフェクション試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いて、前記細胞にプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＮＡ又はプラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ（コントロール用の空ベクター）０．０１ｎｇとｐＣＲＥ−Ｌｕｃベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）５ｎｇとを遺伝子導入した。遺伝子導入した後、更に１８〜２０時間培養し、培地で希釈した試験物質を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で５〜６時間インキュベートした。培地を吸引し、細胞溶解液（細胞溶解液ＬＣβ；東洋インキ）で溶解した後、そのルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット（ピッカジーン発光キット；東洋インキ）及び測定装置（ＭＬ３０００  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。
プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳを導入した細胞における試験物質処理によるレポーター活性値の上昇に対し、試験物質処理により、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＮＡを導入した細胞で１．５倍（好ましくは５倍）以上のレポーター活性値の上昇を確認することができれば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化させる作用を有する化合物として選択することができる。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを発現させた細胞を用いて、試験物質処理後の細胞内ｃＡＭＰ量を既存の方法により直接測定することによっても試験物質の活性を測定することができる。
本実施例に記載の方法は、実施例５により選択される化合物が、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物であるか否かの確認にも利用することができる。
実施例５：インスリンプロモーターレポーター活性を指標としたスクリーニング法
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する物質は、前記ポリペプチドを発現していない細胞に、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及びプラスミドＩｎｓＰｒｏを導入し、スクリーニングすることも可能である。また、本実施例で示すように、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対応するマウス由来ポリペプチドが発現していることが知られている（国際公開ＷＯ０２／４４３６２号パンフレットの実施例２及び３参照）膵β細胞株にプラスミドＩｎｓＰｒｏを導入し、化合物を評価することも可能である。
本実施例に示すスクリニーング法は、実施例４で選択される化合物のインスリンプロモーター活性増強作用の確認としても使用することができる。
マウス膵β細胞株ＮＩＴ１（４×１０４細胞）に、トランスフェクション試薬（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社又はＦｕＧＥＮＥ６；Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を用いて、実施例２で作製したプラスミドＩｎｓＰｒｏ（１〜１０ｎｇ）を導入し、９６穴プレートに播種した。培地としては、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＦ−１２培地を用いた。播種後、１８〜２０時間培養し、培地で希釈した試験物質を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を吸引し、細胞溶解液（細胞溶解液ＬＣβ；東洋インキ）で溶解した後、そのルシフェラーゼ活性を、市販の測定キット（ピッカジーン発光キット；東洋インキ）及び測定装置（ＭＬ３０００  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。試験物質処理により、コントロール（溶媒のみ）に対し有意なレポーター活性の上昇を確認することができた場合、インスリンプロモーター活性化作用を有する化合物と判断することができる。更に、コントロール細胞として、スクリーニングツール用細胞の代わりに、スクリーニングツール用ポリペプチドを発現していない細胞を用いて同様の操作を行ない、前記試験物質によりこれらのコントロール細胞では、インスリンプロモーターレポーター活性が上昇しない場合、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化する化合物として判断することができる。
以上、実施例４又は実施例５単独で、あるいはこれらを組み合わせて行なうことにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化させ、インスリンプロモーター活性を上昇させる化合物を選択することができる。
実施例６：細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化及びインスリンプロモーターレポーター活性を指標とした、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性を修飾する物質のスクリーニング
実施例４に記載の方法で化合物スクリーニングを行った結果、２−（ピリジン−４−イル）エチル  チオベンゾエート（ＬＴ−１  Ｚ  ００５９５１９；ＬａｂｏＴｅｓｔ社、以下、化合物Ａと称する）を取得することができた。また、細胞播種３時間後に遺伝子導入する点以外は実施例４に準じて化合物スクリーニングを行った結果、４−｛５−［（Ｅ）−（１，３−ジエチル−５−オキソ−２−チオキソイミダゾリジン−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝安息香酸（ＡＮ−４６５／１４４５８０３２；ＳＰＥＣＳ社、以下、化合物Ｂと称する）、（２Ｚ）−２，３−ビス（３，４−ジメトキシフェニル）アクリロニトリル（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４８，４２２２−４２３２，１９８３、以下、化合物Ｃと称する）、４−［（Ｅ）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）ビニル］ピリジン（ＢＡＳ  １５５０２７７；ＡＳＩＮＥＸ社、以下、化合物Ｄと称する）、及び５−｛［４−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾール−５−イル）ベンジル］チオ｝−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−アミン（Ｈ−０６６０２８；ＳＣＩＥＸＣＨ社、以下、化合物Ｅと称する）を取得することができた。各化合物Ａ〜Ｅは、それぞれ、１０μｍｏｌ／Ｌで、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳを導入した細胞におけるレポーター活性値の上昇に対し、プラスミドｐＥＦ−ＢＯＳ−ＮＡを導入した細胞で、化合物Ａ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅは３倍以上、化合物Ｂ及び化合物Ｃは５倍以上のレポーター活性値の上昇を確認することができ、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化させる作用を有する化合物として選択した。
次に、実施例５に準じて化合物Ａから化合物Ｅを評価した。但し、９６穴プレートは、コラーゲンコートされた９６穴プレートを使用し、培地は、ＤＭＥＭを用いた。また、化合物処理を化合物Ａは３１時間、化合物Ｂから化合物Ｅは２４時間行った。結果（平均値±標準誤差、ｎ＝６）を図２及び図３に示す。化合物Ａ（３０μｍｏｌ／Ｌ）又は化合物Ｂから化合物Ｅ（いずれも１０μｍｏｌ／Ｌ）処理群のレポーター活性値は、いずれもコントロール（すなわち、化合物濃度０μｍｏｌ／Ｌ群）のレポーター活性値よりも１．５倍以上と有意に大きかった。図２及び図３に示す記号「＊＊」は、コントロール群［すなわち、化合物Ａから化合物Ｅ無添加群］に対する有意差が、ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定）であることを意味する。
以上、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを活性化させる化合物Ａから化合物Ｅは、インスリンプロモーター活性を上昇させること、すなわち、インスリン産生促進活性を有し、インスリン含量を増加させることがわかった。
参考例：ＳＤラット及びＧＫラットを用いた単回経口糖負荷試験
ＳＤラット（４週齢；日本クレア社）は、一晩絶食させ、グルコース２ｇ／ｋｇを経口投与した。なお、グルコース負荷５分前に、化合物Ａ１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。グルコース負荷後、０分間、３０分間、６０分間、及び１２０分間経過後に適量採血し、血糖値及び血漿中インスリン濃度の測定に供した。
血糖値の測定には、血液と０．３３ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸とを混合（血液：０．３３ｍｏｌ／Ｌ過塩素酸＝１：１０）した後、遠心分離（３０００×ｇ，１０分間，４℃）した上澄液を用いた。血漿中インスリン濃度の測定には、血液を遠心分離（３０００×ｇ，１０分間，４℃）した上澄液を用いた。また、血糖値の測定には、グルコースＣテストワコー（Ｗａｋｏ社）を用いた。また、血漿中インスリン濃度の測定には、ラット−インスリンアッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた。
結果を図４及び図５に示す。図４は、グルコース経口負荷後の血漿中インスリン濃度（単位＝ｎｇ／ｍＬ）の経時変化を示し、図５は、グルコース経口負荷後の血糖値（単位＝ｍｇ／ｄＬ）の経時変化を示す。図４及び図５に示す記号「＊」は、化合物Ａ無添加群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）であることを意味する。
図４に示すように、化合物Ａ１００ｍｇ／ｋｇ投与により、グルコース負荷後３０分間経過後において、血漿中インスリン濃度の有意な上昇が認められた。また、グルコース負荷後３０分間経過後において、化合物Ａ１００ｍｇ／ｋｇ投与群で、糖負荷による血糖値の上昇が有意に抑制された。
従って、糖負荷ＳＤラットにおいて、化合物Ａの血漿中インスリン量増加作用、及び血糖低下作用が確認された。
次に、ＧＫ（Ｇｏｔｏ−Ｋａｋｉｚａｋｉ）ラット（インスリン分泌不全２型糖尿病モデル、７週齢；日本チャールスリバー社）を用いた単回経口糖負荷試験を行なった。なお、ＧＫラットは、１９７５年東北大学医学部後藤由夫名誉教授らによって、Ｗｉｓｔａｒ系ラットにおける経口糖負荷試験時の耐糖能の悪さを指標に、選択交配により確立された系統である。
経口糖負荷試験は、化合物Ａを経口投与（ｐ．ｏ．）したこと以外は、ＳＤラットの場合と同様に行なった。
グルコース経口負荷後の血糖値（単位＝ｍｇ／ｄＬ）の経時変化を、図６に示す。図６に示す記号「＊」は、化合物Ａ無添加群に対する有意差が、ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）であることを意味し、記号「＊＊」は、前記有意差がｐ＜０．０１であることを意味する。
図６に示すように、グルコース負荷後３０分間及び６０分間経過後において、化合物Ａ１００ｍｇ／ｋｇ投与により、血糖値の上昇が有意に抑制され、化合物Ａの有効性が糖尿病モデルラットでも確認できた。
【産業上の利用可能性】  本発明のスクリーニングツール又はスクリーニング方法によれば、インスリン産生を促進することのできるインスリン含量増加剤をスクリーニングすることができる。前記インスリン含量増加剤は、糖尿病予防及び／又は治療に有効な物質である。
【配列表フリーテキスト】  配列表の配列番号５及び６の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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