(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製能を阻害する方法を提供する。  ＨＣＶ−ＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項２】
ＨＣＶのＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項３】
ＨＣＶのＲＮＡの５’非翻訳領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項４】
遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶの遺伝子配列において、同一性の高い領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項５】
二本鎖ＲＮＡである請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項６】
鎖長が１９〜２３ｂｐである、請求項１に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
【請求項７】
配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列において連続する１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０に記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または請求項１１に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
【請求項１３】
請求項１〜１０に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、該オリゴヌクレオチドを発現するベクター、これらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤、並びに該オリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡに結合させてウイルスの複製能を阻害する方法に関する。
【背景技術】  Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」という）は、輸血後の非Ａ非Ｂ型肝炎の主要な原因ウイルスであり、その遺伝子のｃＤＮＡは１９８９年にクローニングされた。これまでにクローニングされた遺伝子ｃＤＮＡを用いてＨＣＶに関する多くの研究が行われており、特に感染予防ならびに診断法の確立など社会的に重要な成果が達成され、現在では輸血後のＨＣＶ感染はほとんど認められない状況に至っている。しかしながら、世界中のＨＣＶ感染者数は全人口の数％にもおよぶとされている。
ＨＣＶ感染に起因する肝炎は長期慢性化する特徴があり、これに伴い慢性肝炎を引き起こし、その後肝硬変、さらに肝癌に移行する割合が非常に高いことが知られており、ＨＣＶ感染後の肝炎の確実な治療が重要な課題となっている。
Ｃ型慢性肝炎の治療法については、インターフェロン（ＩＦＮ）療法が広く施行されているが、有効率が約３０％であること、高頻度に発熱などの副作用が誘導されること、高薬価であることなどの問題が存在している。ＩＦＮの種類、用法・用量の検討もなされ、コンセンサスＩＦＮの開発などにより有効率の向上も期待され、また、ＩＦＮとリバビリンなどの抗ウイルス剤の併用による治療も試みられているが、現在までのところいずれも確実な治療法には至っていない。
一方、近年、動物の生体内における細胞内での特定の遺伝子の発現を抑制する方法として、標的遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡを用いて標的遺伝子の発現を抑制する方法が見出された（Ｆｉｒｅ  Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９８年  ３９１巻  ｐ．８０６−８１１）。この方法はＲＮＡインターフェアランス（ＲＮＡｉ）と呼ばれ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入した際に、そのＲＮＡ配列に対応する細胞内のｍＲＮＡが特異的に分解され、そのｍＲＮＡによってコードされる蛋白質が発現されなくなる現象をいう。ＲＮＡｉは、新規遺伝子の機能を遺伝子発現阻害により調べる上で有効な方法であり、線虫、ショウジョウバエなどで遺伝子機能解析に盛んに用いられている。
しかし、ＲＮＡｉが病気の治療、特にＣ型肝炎などのウイルス性疾患の治療に有効であるか否かは不明であった。
【発明の開示】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、ＨＣＶのＲＮＡ（ＨＣＶ−ＲＮＡ）に対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチド（以下「オリゴＲＮＡ」ということもある）またはペプチド核酸が、ＨＣＶの複製を阻害することを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下の（１）〜（１３）を提供する。
（１）  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（２）  ＨＣＶのＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（３）  ＨＣＶのＲＮＡの５’非翻訳領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（４）  遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶの遺伝子配列において、同一性の高い領域の配列とハイブリダイズすることを特徴とする、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（５）  二本鎖ＲＮＡである、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（６）  鎖長が１９〜２３ｂｐである、上記（１）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸。
（７）  配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴリボヌクレオチド。
（８）  上記（７）に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
（９）  配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列において連続する１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴリボヌクレオチド。
（１０）  上記（９）に記載のオリゴリボヌクレオチドと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴリボヌクレオチド。
（１１）  （１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチドを発現するベクター。
（１２）  （１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチド若しくはペプチド核酸、または（１１）に記載のベクターを有効成分とするＣ型肝炎治療剤。
（１３）  （１）〜（１０）に記載のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸をＨＣＶ−ＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０１６７５０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＣＶ−ＲＮＡの５’側の非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。
図２は、ＨＣＶ−ＲＮＡの３’側の非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。
図３Ａは、ＨＣＶの分離株ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−ＪのＲＮＡの５’側の非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図３Ｂは、ＨＣＶの分離株Ｒ６、Ｒ２４、Ｓ１４ＪのＲＮＡの５’側の非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図３Ｃは、ＨＣＶの分離株ＨＣＪ６、ＪＦＨ１、ＪＣＨ１のＲＮＡの５’側の非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図３Ｄは、ＨＣＶの分離株ＪＣＨ３及びＨＣＪ８のＲＮＡの５’側の非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図４Ａは、各種ＨＣＶの５’非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのマルチプルアライメントの結果の一部を示す。
図４Ｂは、各種ＨＣＶの５’非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのマルチプルアライメントの結果（図４Ａの続き）を示す。
図４Ｃは、各種ＨＣＶの５’非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのマルチプルアライメントの結果（図４Ｂの続き）を示す。
図５Ａは、ｐＨ７７Ｊ６Ｓ、Ｒ６、Ｒ２４Ｌ、Ｒ２４ＳのＲＮＡの３’側の非翻訳領域についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図５Ｂは、ＨＣＪ６ＣＨ、ＪＦＨ１、ＪＣＨ１、２ｂ＿ＡＢ０３０９０７のＲＮＡの３’側の非翻訳領域についてのｃＤＮＡ配列を示す。
図６は、ｓｉＲＮＡ添加とＲｚ−ＨｅｐＭ６細胞株が産生するＨＣＶコアタンパク量との関係を示す。
図７は、ｓｉＲＮＡ添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。
図８は、ダイサー処理で調製したｓｉＲＮＡの添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。
図９は、ダイサー処理で調製したｓｉＲＮＡの添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。
発明を実施するための形態
本発明のＨＣＶ−ＲＮＡに対して配列特異的に結合するオリゴＲＮＡは、糖としてリボースを有するオリゴヌクレオチドであり、塩基としては、天然のＲＮＡ中に存在するアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルの他、チミン、並びに他の修飾塩基等を含むものも包含する。本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡであれば特に制限されないが、ＨＣＶの複製能を阻害するオリゴＲＮＡであることが好ましい。ＨＣＶ−ＲＮＡに配列特異的に結合可能なオリゴＲＮＡとしては、例えば、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列と相補的な配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列と相補的な配列と高い同一性を示す配列を有するオリゴＲＮＡ、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列を有するＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なオリゴＲＮＡ等を挙げることができる。尚、本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、本発明の好ましい一態様であるｓｉＲＮＡは、細胞内で標的遺伝子にハイブリダイズしてダイサーを介して標的遺伝子を切断するものであり、標的遺伝子は１９〜２３ｎｔの長さに切断されると考えられている。一方、本発明の他の態様であるアンチセンス核酸は、標的遺伝子にハイブリダイズしてＩＦＮを誘導し、ＲＮａｓｅを活性化することによって標的遺伝子を分解すると考えられる。あるいは、結合によって標的ＲＮＡの構造変化を起こして翻訳を阻害すると考えられている。また、本発明において、ＨＣＶ−ＲＮＡの配列とは、ＨＣＶのゲノムＲＮＡ（−鎖）の配列、ゲノムＲＮＡから転写されたｍＲＮＡ（＋鎖）の配列のいずれでも良いが、好ましくは＋鎖の配列である。
尚、本明細書において、ｓｉＲＮＡとは、オリゴＲＮＡの中でも、その長さが１９〜２３ｎｔ（１９〜２３ｂｐ）のものをいう。ｓｉＲＮＡが二本鎖を形成している場合、一方または双方が突出末端を有していても良い。
本発明において高い同一性とは、７０％以上の同一性であり、好ましくは８０％以上の同一性であり、さらに好ましくは９０％以上の同一性（例えば９５％以上の同一性）である。塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）等によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られた技術であり（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９、など）、ストリンジェントな条件も当業者であれば適宜選択することが可能である。ストリンジェントな条件の例としては、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のオリゴＲＮＡは一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、又、さらに二本以上の複数の鎖から形成されていてもよいが、好ましいのは二本鎖である。二本鎖は独立した２本の鎖から形成されていてもよいし、又、自己相補的な一本鎖ＲＮＡ中で形成される二本鎖であってもよく、この場合、一分子でステムーループ構造を形成することができる。オリゴＲＮＡが二本鎖の場合、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域（例えば両末端又は片方の末端など）が一本鎖等の他の構造を形成していてもよい。
本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶ−ＲＮＡへの配列特異的結合能を有していればよく、その長さは限定されない。本発明のオリゴＲＮＡの長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
本発明において好ましいオリゴＲＮＡは、配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡであり、特に好ましいものとして配列番号２０〜２５に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡが挙げられる。また、本発明において好ましい他のオリゴＲＮＡとして、配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡが挙げられる。
本発明において好ましい更に他のオリゴＲＮＡとして、例えば上記配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列を有するオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡ、及び上記配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列で示されるオリゴＲＮＡと相補的な配列を有するＨＣＶのＲＮＡ領域、あるいは該オリゴリボヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴＲＮＡが挙げられる。当業者であれば、これらのオリゴＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＨＣＶのＲＮＡ領域を任意のＨＣＶ種において容易に決定することができる。これらのオリゴＲＮＡの例として、例えば上記配列番号２０〜３４に示すヌクレオチド配列、あるいは上記配列番号４７〜５５に示すヌクレオチド配列における連続した１９〜２３塩基からなるヌクレオチド配列において、７個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは３個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＨＣＶのＲＮＡとハイブリダイズすることによってＨＣＶの複製を阻害し得るものが挙げられる。
また、本発明において好適に使用できるペプチド核酸として、本発明において好適に使用できるオリゴＲＮＡと対応する塩基配列を有するペプチド核酸が挙げられる。
ＨＣＶのＲＮＡは、約３４０ヌクレオチドの５’側の非翻訳領域（５’非翻訳領域）、約９４００ヌクレオチドからなるオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、約５０ヌクレオチドからなる３’側の非翻訳領域（３’非翻訳領域）で構成されている。このＲＮＡ配列中、本発明のオリゴＲＮＡがターゲットとする部位は特に限定されず、どの部位でもよいが、好ましくは５’非翻訳領域〜ＯＲＦの５’末端領域（例えば、配列番号１〜１１に示す塩基配列を有する領域）、３’非翻訳領域（例えば、配列番号１２〜１９に示す塩基配列を有する領域）であり、特に好ましくは５’非翻訳領域である。
ＨＣＶ−ＲＮＡの５’非翻訳領域には、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）やステムループを形成するステム領域などが存在する。ＨＣＶの５’非翻訳領域やＩＲＥＳ、ステム領域については既に多くの報告がある（Ｋａｔｏ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７，９５２４−９５２８，（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８，２４５１−２４５５，（１９９１）、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５，１１０５−１１１３，（１９９１）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．，７２，２６９７−２７０４，（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８，３３１−３４１，（１９９２）、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ．Ｋｏｈａｒａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１４７６−１４８３，（１９９２）、Ｈｏｎｄａ  Ｍａｓａｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，１１６５−１１７４，（１９９９）、Ｈｏｎｄａ  Ｍａｓａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２（１０），９５５−９６８，（１９９６）、Ｓａｓａｎｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｆ．Ｓｅｒ．，９，３９５−３９６，（１９９８）、Ｉｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，８７８９−８７９６，（１９９８）、Ｋａｍｏｓｈｉｔａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．，２３３，９−１８，（１９９７）、など）。図１及び図２に、ＨＣＶ−ＲＮＡの５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域における一般的な二次構造を示す。
また、ＨＣＶには遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶが存在する。そのようなＨＣＶの例としては、例えば、ＨＣＪ６、ＨＣＪ８、ＨＣＶ−１、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＪＣＨ１、ＪＣＨ３、ＪＦＨ１、Ｒ２４、Ｒ６、Ｓ１４Ｊ、ｐＨ７７Ｊ６Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ１７７０３９）、ＨＣＪ６ＣＨ、２ｂ＿ＡＢ０３０９０７などが挙げられる。このような遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ−ＲＮＡに対応する為には、遺伝子型の異なる複数種のＨＣＶ遺伝子配列の中で同一性が高い領域をターゲットにすることが好ましい。ここで、遺伝子型の異なる複数のＨＣＶ遺伝子配列の中で同一性が高い領域とは、複数種のＨＣＶのＲＮＡ配列がお互いに８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を有する領域である。そのような領域は、１０塩基以上の長さを有していることが好ましく、さらに好ましくは１５塩基以上、特に好ましくは２０塩基以上の長さを有する。ここで、複数種のＨＣＶとは、通常、３種類以上のＨＣＶ、好ましくは５種類以上、特に好ましくは１０種類以上のＨＣＶのことをいう。遺伝子配列の同一性は、対象となる複数種の遺伝子の配列を比較し、上述したアルゴリズム等を用いて計算することができる。
本発明で用いられるオリゴリボヌクレオチドは、修飾されていない通常のＲＮＡの構成を有するものの他に、リン酸ジエステル部や糖部などを修飾した修飾ＲＮＡなどを用いることも可能であり、特に限定されるものではない。又、本発明のオリゴＲＮＡは、その一部分にデオキシリボヌクレオチドなどのリボヌクレオチドでない分子を含んでいてもよい。
また、本発明においては、オリゴＲＮＡの代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）などを用いてもよい。ＰＮＡは当業者によく知られた技術であり（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐｅｔｅｒ  Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０８，３−２６，（２００２）、Ｂｒａａｓｃｈ  Ｄｗａｉｎｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４），４５０３−４５１０，（２００２）、Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ  Ｕｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３５９−３７４，（２００１）、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐｅｔｅｒ  Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３４０，３２９−３４０，（２００１））、上記オリゴＲＮＡと同様に、配列特異的にＨＣＶ−ＲＮＡに結合し得るものを製造できる。本発明において好適なペプチド核酸の長さとしては、例えば、５〜１０００塩基（二本鎖の場合には、５〜１０００ｂｐ）であり、好ましくは１０〜１００塩基（二本鎖の場合には、１０〜１００ｂｐ）であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基（二本鎖の場合には、１５〜２５ｂｐ）であり、特に好ましくは１９〜２３塩基（二本鎖の場合には、１９〜２３ｂｐ）である。
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸は当業者に公知の方法で作製することが可能である。
本発明のオリゴＲＮＡを継続的に発現させる場合には、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを作製してもよい。ベクターは当業者に公知の方法で作製することが可能である。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２）１９，４９７−５００に記載されたもの等の公知のベクターに本発明のオリゴＲＮＡをコードする遺伝子を導入することにより作製することが可能である。本発明のオリゴＲＮＡの発現のために好適なプロモーターとしては、特に限定するものではないが、Ｔ７プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター等が挙げられる。
本発明のオリゴＲＮＡは、ＨＣＶの複製を阻害し、ＨＣＶの増殖を抑制することが可能であるので、Ｃ型肝炎の治療剤として有用である。この場合、複数種類のＨＣＶに対応するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を提供することで、臨床の場において患者が感染しているウイルスの型を同定することなく治療でき、また複数種のオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸を混合して用いる必要もなくなるので好ましい。
治療に用いる場合、細胞内でそのまま機能し得る形態で投与することもできる。この場合、オリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の長さは１９〜２３塩基程度とすることが最適である。また細胞内のプロセシングを経て機能し得るものを投与することもできる。この場合には、目的とする配列を含むより長い配列を有するオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を投与することができる。細胞内に取り込まれた二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれる酵素によって２１ｍｅｒ前後に分解されてｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）となり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体を作り、ゲノムから転写された特定の塩基配列を持ったＲＮＡを破壊すると考えられている（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６，２００１；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３−２９６，２０００）。あるいはまた、市販のダイサーを用いて予めｓｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製して用いることもできる。
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸を有効成分とするＣ型肝炎治療剤は、必要に応じて、製薬上許容される賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤などの医薬組成物として調製することができ、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。又、本発明のオリゴＲＮＡを発現するベクターを投与することも可能である。
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与経路は特に限定するものではないが、好ましくは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高める封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、特に限定するものではない。
本発明は更に、上記本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸をＨＣＶのＲＮＡに結合させて、ＨＣＶの複製能を阻害する方法を提供する。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの双方でＨＣＶを含むか、または含むおそれのあるサンプルと本発明のオリゴＲＮＡまたはペプチド核酸とを接触させることを含む。ＨＣＶの複製能の阻害の有無は、当分野で通常用いられる方法によって検出することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１  ｓｉＲＮＡの標的とする領域の決定
Ｃ型肝炎ウイルスの多くの分離株の中で遺伝子を構成している塩基配列、特に５’側の非翻訳領域からコア領域および３’側の非翻訳領域において相同性が高い領域を見出すために、配列の比較を行った。
図３にＨＣＶの分離株であるＨＣＶ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｍ６２３２１）、ＨＣＶ−ＢＫ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｍ５８３３５）、ＨＣＶ−Ｊ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｄ９０２０８）、Ｒ６（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＹ０４５７０２）、Ｒ２４、Ｓ１４Ｊ、ＨＣＪ６、ＪＦＨ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４７６３９）、ＪＣＨ１（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４７６４０）、ＪＣＨ３（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０４７６４２）、ＨＣＪ８（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｄ１０９８８）のＲＮＡの５’側の非翻訳領域からコア領域の５００塩基についてのｃＤＮＡ配列を示す。これらの塩基配列について、当分野において通常行われる方法を用いてマルチプルアライメントを行った。結果を図４に示す。また、ＨＣＶの５’側の少なくとも１０種の型のＨＣＶにおいて同一性が９５％以上である領域から、この領域を標的として配列特異的に結合し得るｓｉＲＮＡを設計した。
同様に、図５に示したｐＨ７７Ｊ６Ｓ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ１７７０３９）、Ｒ６、Ｒ２４Ｌ、Ｒ２４Ｓ、ＨＣＪ６ＣＨ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＦ１７７０３６）、ＪＦＨ１、ＪＣＨ１、２ｂ＿ＡＢ０３０９０７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０３０９０７）の配列から、同様に３’側の非翻訳領域についてマルチプルアライメントを実施し、少なくとも８種の型のＨＣＶにおいて同一性が９５％以上である領域から、この領域を標的として配列特異的に結合し得るｓｉＲＮＡを設計した。
尚、ｓｉＲＮＡは、上記配列同一性を考慮して設計する他、翻訳開始部位直前で設計することが好ましい。更に、標的となるＨＣＶ  ＲＮＡの二次構造をも考慮して設計することが好ましい。特に、５’及び３’ＵＴＲのループ構造及びその近傍を標的とすることができる。
実施例２  ｓｉＲＮＡ合成
実施例１の結果に基づいて、目的のＨＣＶ全ゲノムに対して２１ｎｔの長さでｓｉＲＮＡの配列を設計し、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  ｃａｔ．ｎｏ．１６２０）のプロトコールに従い、３’末端にＴ７プロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドを合成した。鋳型となる各オリゴヌクレオチドを１００μＭに調製後、Ｔ７プライマーとハイブリダイズさせ、その後Ｋｌｅｎｏｗ酵素にて２本鎖ＤＮＡとしてＴ７プロモーターを用いて転写させた。合成されたＲＮＡを各々の相補鎖とアニーリングさせて２本鎖ＲＮＡとした後、残存する１本鎖の突出末端をＲＮａｓｅにより切断し、ｓｉＲＮＡを作成した。最終的に合成された１５〜３０μｇ／ｒｅａｃｔｉｏｎのｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅの水にて１０μＭに調製し、１２％アクリルアミドゲル電気泳動にて２０〜２２塩基の二本鎖ＲＮＡを確認後、使用時まで−８０℃に保存した。
合成したｓｉＲＮＡ配列を以下に示す。尚、これらの配列が対応するＨＣＶ（Ｒ６株）の配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＹ０４５７０２、配列番号５６）中のヌクレオチド番号を併せて示す。
１）５’−ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ
2004078974.tif 000002
２）３’−ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ
2004078974.tif 000003
実施例３  ＨＣＶのコアタンパク質の発現に対する効果
本発明者等はこれまでにＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムによりＨＣＶ全ゲノムをスイッチング発現する系を確立しており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，９００１−６．（１９９８））、今回Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅによりＨＣＶ全ゲノム（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  １ｂ，ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｎｏ．１〜９６１１ｎｔ）を持続発現するヒト由来肝細胞株Ｒｚ−ＨｅｐＭ６を構築し、これを標的とした。Ｒｚ−ＨｅｐＭ６細胞を１０％ウシ胎児血清（ＲＥＨＡＴＵＩＮ  ｃａｔ．ｎｏ．１０２０−９０）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＥＡＧＬＥ  ＭＥＤＩＵＭ（ＮＩＳＳＵＩ  ｃａｔ．ｎｏ．０５９１５）に懸濁し、２４穴プレートに１ウェルあたり１０５個の細胞で蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で一夜培養した。細胞密度が５０〜７０％のときにｓｉＲＮＡの導入を行なった。すなわち、２．０μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．Ｎｏ．１２２５２−０１１）と５．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ．Ｎｏ．２２６００）を加えよく攪拌し、室温にて１０分間放置した。その後、５．０μｌの合成した１０μＭ  ｓｉＲＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ１  ４０μｌに希釈し、最終２００ｎＭになるように加えた。室温にて２０分間放置した後、あらかじめ培養液を２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１に交換した細胞に、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を加えたｓｉＲＮＡを直接加え３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
ｓｉＲＮＡ添加４時間後、３倍濃度にあたる３０％のウシ胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＥＡＧＬＥ  ＭＥＤＩＵＭ  １２５μｌを加え３７℃、５％ＣＯ２で培養する。血清添加２４時間後、細胞をｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％  ＳＤＳ，０．５％  ＮＰ４０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５ＭｍＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ：ｐＨ７．４）２０μｌにて回収し、ＨＣＶコア定量キット（国際試薬ｃａｔ．Ｎｏ．１４８６１）を用いてＨＣＶコアタンパク質を定量した。
図６に、ｓｉＲＮＡ添加とＲｚ−ＨｅｐＭ６細胞株が産生するＨＣＶコアタンパク量との関係を示す。２００μＭの各ｓｉＲＮＡ（Ｒ１−ｓｉＲＮＡ、Ｒ２−ｓｉＲＮＡ、Ｒ３−ｓｉＲＮＡ、Ｒ５−ｓｉＲＮＡ、Ｒ１ｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ、Ｒ２ｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ、Ｒ３ｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ、及びＲ５ｍｕｔ−ｓｉＲＮＡ）を添加後、ウイルス粒子を構成するコアタンパク質をＥＬＩＳＡ法で定量した。添加した全てのｓｉＲＮＡはコアタンパク質の合成を阻害したが、特にＲ３、Ｒ５はその作用が強く、また塩基配列の特異性も高いことが観察された。また、これらの変異導入配列であるＲ３ｍｕｔとＲ５ｍｕｔはコアタンパク質の発現抑制効果が減弱された。
実施例４  レプリコンアッセイ
ＨＣＶ−ＲＮＡのコピー数を定量するためにＨＣＶ−ＲＮＡの中にレポーター遺伝子としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子を導入したものを構築した。Ｋｒｉｅｇｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，４６１４−２４（２００１））の方法に従い、ＨＣＶ遺伝子のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ（ＩＲＥＳ）の直下にネオマイシン耐性遺伝子と融合する形でルシフェラーゼ遺伝子を導入した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで当該ＲＮＡを合成後、エレクトロポレーション法でＨｕｈ７細胞（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に導入しＧ４１８耐性クローンとして単離した。ホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（Ｈｕｈ−３−１）を５％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｃａｔ．ｎｏ．ＳＨ３００７１．０３）を含むダルベッコＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ．ｎｏ．１０５６９）に懸濁し９６穴プレートに５０００細胞／Ｗｅｌｌで蒔き、５％ＣＯ２，３７℃で一夜培養した。約２０時間後、希釈したｓｉＲＮＡをＷｅｌｌあたり１０μｌ加え、さらに３日間培養した。アッセイプレートは２系統用意し、１つは白色プレート、他はクリアープレートでアッセイを行った。
培養終了後、白色プレートはＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ．ｎｏ．Ｅ２５２０）に用いた。すなわち、Ｗｅｌｌあたり１００μｌの試薬を入れ、３〜４回ピペットで混ぜ、５分間放置後に１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴＲＩＬＵＸ（ＷＡＬＬＡＣ）にてルミネッセンスを測定した。
合成したｓｉＲＮＡは以下の方法でＨＣＶレプリコン細胞に導入した。すなわち、９６穴プレートに細胞を、１ウェルあたり１００００個蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で一夜培養した。細胞密度が５０〜７０％のときにｓｉＲＮＡの導入を行なった。すなわち、１．５μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＲ２１５０）と２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ１（ｃａｔａ  ｎｏ．３１９８５）を激しく攪拌後、２０分間静置し、０．１２５〜１．２５μｌのｓｉＲＮＡを混ぜ、緩やかに攪拌後さらに２０分間静置した。この溶液を９６穴プレート中の１００μｌの細胞に静かに加え、緩やかに攪拌後３７℃、５％ＣＯ２で一夜培養した。この細胞を用いてレプリコンアッセイを行なった。ｓｉＲＮＡを終濃度１ｎＭ，１０ｎＭ，３０ｎＭ，１００ｎＭになるように加え、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬にて導入後２４時間後にＨＣＶレプリコン活性をレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ活性）を指標に測定した。細胞未添加の値をバックグランドとして全ての値から差し引き、ｓｉＲＮＡ未添加の活性を１００％として、各ｓｉＲＮＡの活性を算出した。
図７にｓｉＲＮＡ添加とＨＣＶレプリコンが複製する活性との関係を示す。配列Ｒ３，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は容量依存的にレプリコンの活性を阻害した。また、これらの塩基配列の一部置換体である配列Ｒ３ｍｕｔ，Ｒ５ｍｕｔ，Ｒ６ｍｕｔ，Ｒ７ｍｕｔはその効果が減弱されたため、配列Ｒ３，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は塩基配列特異的な抗ウイルス作用を示すと考えられる。
実施例５  ＲＮＡトランスフェクション効率の算定
Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  ｃａｔ  ｎｏ．１６３２）を用いてプロトコールに従ってＣｙ３でｓｉＲＮＡを標識した。すなわち、Ｒ７−ｓｉＲＮＡ  １０μＭ（１９．２μｌ）に７．５μｌのＣｙ３ラベリング試薬を加え、５０μｌ中で３７℃、１時間遮光した状態で標識を行なった。５μｌの５Ｍ  ＮａＣｌと２．５倍量の９９．５％エタノールを加えて−２０℃でエタノール沈殿を行なった。４℃、１５０００回転／分の遠心でＣｙ３標識のｓｉＲＮＡを回収した。標識されたｓｉＲＮＡの定量はＣｙ３の吸収極大と分子吸光係数から算定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ａｐｐｅｎｄ／ｂａｓｅ＿ｄｙｅ．ｈｔｍｌ）。
得られたＣｙ３標識ｓｉＲＮＡをＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬を用いて細胞に導入し、２４時間後に蛍光顕微鏡にて観察した。初めに位相差顕微鏡の視野で細胞の位置を確認した後、蛍光顕微鏡でＣｙ３染色された細胞を観察した。このとき用いた波長は励起波長５１０ｎｍ、吸収波長５５０ｎｍであった。Ｃｙ３で標識された細胞は全体の約９０％であり、非常に高いトランスフェクション効率であることが明らかとなった。
実施例６  ダイサーによるｓｉ−ＲＮＡの調製
ＨＣＶ  Ｒ６遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＹ０４５７０２、配列番号５６）を鋳型とし、表１及び２に示す各組み合わせのプライマーを用いて定法によりＰＣＲ反応を行った。プライマーは、複数種のＨＣＶ間でホモロジーのある領域、あるいはＨＣＶの複製機能に重要な領域を選んで設計した。得られたＰＣＲ産物をゲルから切り出して精製した後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７，Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．ｃａｔ＃１３３４）を用いて転写反応（２０μｌ  ｖｏｌ  ｘ  ４時間）を行ってＲＮＡを合成し、アガロースゲル電気泳動で目的となる大きさの二本鎖ＲＮＡを確認した（前駆体ｓｉＲＮＡ−１〜前駆体ｓｉＲＮＡ−９、配列番号４７〜５５）。次いでＤＮａｓｅＩを用いて１５分間反応させた後、ＬｉＣｌ沈殿し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  ２０μｌに溶解し、吸光度にてＲＮＡ量を測定した（ｔｏｔａｌ  約３０〜６０μｇ  ｄｓＲＮＡ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）。
2004078974.tif 000004
2004078974.tif 000005
2004078974.tif 000006
次にＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｉｎｃ．のＤｉｃｅｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎキット（Ｃａｔ  ＃Ｔ５１０００１）を用い、１０〜２０μｇの各ｄｓＲＮＡをキットのＤｉｃｅｒタンパク質１０ｕｎｉｔ（２０μｌ）にて反応（反応液量１００μｌ，１６〜２０時間）した。Ｄｉｃｅｒにて切断された短鎖の二本鎖ＲＮＡ混合物（ｄ−ｓｉＲＮＡ）を３％アガロースゲル電気泳動にて確認後、キットに付属のカラムにて脱塩ならびに非切断ＲＮＡを除去した後、最終的に２２ｂｐのｄ−ｓｉＲＮＡをアガロースゲルで確認した。吸光度にて濃度を測定して、滅菌水にて５μＭに調整後、使用時まで−８０℃で保存した。
実施例７  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（１）
実施例６で二本鎖の前駆体ｓｉＲＮＡ−１〜前駆体ｓｉＲＮＡ−６から調製したｓｉＲＮＡを、実施例４に記載したＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＲ２１５０）を用いて１〜５０ｎＭの濃度で実施例４で用いたホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（Ｈｕｈ−３−１）に導入し、２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、抗ウイルス活性を求めた。結果を図８に示す。尚、ｓｉＲＮＡ−ｐ５３は、癌遺伝子ｐ５３をダイサー処理したｓｉＲＮＡを添加した結果を示し、対照は滅菌水を添加した結果を示す。
その結果、ダイサーで調製したｓｉＲＮＡは濃度依存的にＨＣＶレプリコンの複製活性を阻害し、抗ウイルス活性を有することが示された。
実施例８  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション（２）
実施例６で二本鎖の前駆体ｓｉＲＮＡ−７〜前駆体ｓｉＲＮＡ−９から調製したｓｉＲＮＡを、実施例４に記載したＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＩＲ２１５０）を用いて３ｎＭまたは１０ｎＭの濃度でホタル・ルシフェラーゼＨＣＶレプリコン細胞（Ｈｕｈ−３−１）に導入し、３０時間または５４時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、抗ウイルス活性を求めた。結果を図９に示す。
その結果、実施例７と同様に、ダイサーで調製したｓｉＲＮＡが濃度依存的にＨＣＶレプリコンの複製活性を阻害し、抗ウイルス活性を有することが示された。
【産業上の利用の可能性】
以上詳述したように、本発明によって、ＨＣＶ−ＲＮＡに対して配列特異的に結合し、ＨＣＶの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸、及びこれらを有効成分とするＣ型肝炎治療剤が提供され、ＨＣＶの新規かつ確実な治療法の提供が可能となった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
2004078974.tif 000007
2004078974.tif 000008
2004078974.tif 000009
2004078974.tif 000010
2004078974.tif 000011
2004078974.tif 000012
2004078974.tif 000013
2004078974.tif 000014
2004078974.tif 000015
2004078974.tif 000016
2004078974.tif 000017
2004078974.tif 000018
2004078974.tif 000019
2004078974.tif 000020
2004078974.tif 000021
2004078974.tif 000022
2004078974.tif 000023
2004078974.tif 000024
2004078974.tif 000025
2004078974.tif 000026
2004078974.tif 000027
2004078974.tif 000028
2004078974.tif 000029
2004078974.tif 000030
2004078974.tif 000031
2004078974.tif 000032
2004078974.tif 000033
2004078974.tif 000034
2004078974.tif 000035
2004078974.tif 000036
2004078974.tif 000037
2004078974.tif 000038
2004078974.tif 000039
2004078974.tif 000040
2004078974.tif 000041
【図１】
2004078974.tif 000042
【図２】
2004078974.tif 000043
2004078974.tif 000044
2004078974.tif 000045
2004078974.tif 000046
2004078974.tif 000047
2004078974.tif 000048
2004078974.tif 000049
2004078974.tif 000050
2004078974.tif 000051
2004078974.tif 000052
【図６】
2004078974.tif 000053
【図７】
2004078974.tif 000054
【図８】
2004078974.tif 000055
【図９】
2004078974.tif 000056
【国際調査報告】
2004078974.tif 000057
2004078974.tif 000058
2004078974.tif 000059
2004078974.tif 000060
2004078974.tif 000061
2004078974.tif 000062
2004078974.tif 000063
2004078974.tif 000064
2004078974.tif 000065