(57)【要約】本発明は、脂質過酸化や活性酸素の指標としての、生物学的試料中のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）等のアルデヒドの検出を行うための、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、リン酸を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、リン酸を含む、アルデヒド検出用組成物。
【請求項２】
アルデヒドが、ホルムアルデヒド又はマロンジアルデヒドである、請求の範囲第１項記載の組成物。
【請求項３】
生物学的試料における測定に用いる、請求の範囲第１項又は第２項記載の組成物。
【請求項４】
生物学的試料が、尿である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
過酸化脂質の測定に用いる、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
活性酸素の測定に用いる、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の組成物を含む容器、指示書を含むアルデヒド検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、脂質過酸化や活性酸素の指標としての、生物学的試料中のアルデヒドの検出を行うための組成物に関する。
【背景技術】  生体に酸化ストレスの障害が与えられると、まずターゲットとなるのが細胞の生体膜を構成する不飽和脂肪酸である。活性酸素の攻撃によって生じる連鎖反応によって、不飽和脂肪酸から種種の低分子アルデヒドが生成される。生成された低分子アルデヒドは、反応性が高く、タンパク質、核酸、脂質等の生体成分を攻撃し、修飾することによって生体に障害を与える。
上記のアルデヒドとしては、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）が知られている。ＭＤＡは、生体内の抗酸化機構によって代謝され、血液を経て尿中に排泄される。
したがって、生物学的試料、例えば尿中のＭＤＡ濃度を測定することによって、活性酸素の生成レベルを推定することができる。また、日常の食生活のバランスや抗酸化物質のレベルなどを判断することができる。
別のアルデヒドとしては、アクロレインが知られている。アクロレインは、食用油の加熱、タバコの燃焼などによって発生する非常に反応性の高いアルデヒドで、強い細胞毒性、変異原性を有することが報告されている。近年、インビトロにおける脂質の過酸化反応によってアクロレインが生成されることが証明され、さらにヒトの動脈硬化症病巣においてもその存在が確認されており、生体内における脂質酸化損傷のマーカーとして有用性が期待されている。
また、脂質は、核酸やタンパク質よりも酸化を受けやすく、ヒドロペルオキシドを生成する。ヒドロペルオキシドは、さらにタンパク質の求核部位と反応して複雑な修飾物を形成し、タンパク質の劣化を引き起こす。したがって、ヒドロペルオキシドは、酸化ストレスマーカーとしても近年関心を集めている。
したがって、生物学的試料中のＭＤＡ濃度を測定することによって、脂質の過酸化のレベルを知ることができる。
生物学的試料における従来のアルデヒド検出方法としては、ＨＰＬＣやＧＣ−ＭＡＳ等の機器分析による方法があるが、高価な機器や高度な技術を必要とし、また操作が複雑であるという問題があった。
生物学的試料におけるアルデヒド類の簡易な検出方法としては、シッフ試薬（塩基性フクシン及び亜硫酸水素ナトリウム、及び場合により塩酸を含む）を用いる方法が知られている。
公知のシッフ試薬は、古くから染料として用いられているマジェンダに、亜硫酸ガスを通じて脱色したもので、アルデヒドの検出又は過ヨウ素酸シッフ染色法（ＰＡＳ）に用いられている。
しかし、公知のシッフ試薬は、生物学的試料、例えば、尿に対する反応性が極めて弱いか又は無反応性であり、また、ホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）やマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）を検出することができなかった。
したがって、生物学的試料におけるアルデヒド類の簡易な検出方法に用いることができる安価な組成物の開発が待たれていた。
本発明者は、塩酸の代わりに緩衝能を有するリン酸を使用することによって、驚くべきことに、組成物の安定性を高めることができ、かつ、アルデヒド類の検出感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の開示】
本発明は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム、リン酸を含む、アルデヒド検出用組成物に関する。
より具体的には、本発明は、塩基性フクシン０．１〜０．５重量％、リン酸０．５〜５重量％、亜硫酸水素ナトリウム１〜５重量％を含む、アルデヒド検出用組成物に関する。
公知のシッフ試薬の組成物は、塩基性フクシン及び亜硫酸水素ナトリウム塩酸、及び場合により塩酸を含む。これに対して、本発明の組成物は、塩基性フクシン、亜硫酸水素ナトリウム及びリン酸を含むことを特徴とする。
公知のシッフ試薬では、ホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）又はマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に対する反応性が、非常に低い。また、生物学的試料、例えば、尿に対する反応性が低いか又は反応性を有しないのに対し、本発明の組成物は、ＨＣＨＯ及びＭＤＡに対する反応性が高く、また、生物学的試料、例えば、尿に対する反応性を有し、その感度も高い。
公知のシッフ試薬で用いられている塩酸の代わりにリン酸を用いたのは、下記の理由による。
カルボニル化合物とＲＮＨ２誘導体との縮合（Ｃ＝ＯＨ＋Ｈ２Ｎ−Ｒ→Ｃ＝Ｎ−Ｒ＋Ｈ２Ｏ）には、通常、酸性触媒が必要である。
この縮合反応の速度は、酸濃度に依存し、ｐＨを上げていくと反応速度は、あるｐＨで最大となる。反応速度が最大となるｐＨの値は、Ｒ−ＮＨ２のＲの性質に大きく依存する。
速度に最大値があるのは、ＲＮＨ２とカルボニル化合物との間の平衡（ＲＮＨ２＋Ｈ＋⇔ＲＮＨ３＋）によって理解される。ここで、ＲＮＨ２の窒素の非共有電子対にプロトンが付くと、カルボニル基の炭素を攻撃できなくなってしまう。一方、カルボニル基がプロトン化されると、求核試薬に対する反応性が大きくなる（ＲＣ＝Ｏ＋Ｈ＋⇔ＲＣ＝ＯＨ＋）。
したがって、最適なｐＨは、共役酸であるカルボニル化合物を適切な濃度とし、ＲＮＨ２が完全にＲＮＨ３＋にはならないが、反応が進行するｐＨである。
よって、濃塩酸（ｐＫａ＝−８）よりリン酸（ｐＫａ＝２．１４）の方がこの反応系を促進していると考えられる。
また、リン酸は、緩衝能を有し、液のｐＨ値に対する安定性を保つことができる。さらに、生物学的試料において適応することができる。
本発明の組成物によって検出されるアルデヒドは、好ましくは、マロンジアルデヒド、アクロレイン及び／又はホルムアルデヒドである。
本発明の組成物は、例えば、下記の方法によって得ることができる。
塩基性フクシン３００ｍｇを水１００ｍｌに溶解し、これに亜硫酸水素ナトリウム３．０ｇを入れて完全に溶解するまで振り混ぜる。その後、８５％リン酸２．０ｇを加える。この液に活性炭１．０ｇを加え濾過したものを使用する。
本発明の組成物は、生物学的試料におけるアルデヒド検出に用いることができる。
生物学的試料は、好ましくは、尿である。
本発明の組成物は、過酸化脂質や活性酸素の測定に用いることができる。
また、本発明は、上記のアルデヒド検出組成物を含む容器、指示書を含むアルデヒド検出用キットにも関する。
本発明の組成物は、体内の酸化状態を簡易に測定することができ、健康の維持のための重要な指標を提供することができる。
本発明の組成物を用いることによって、従来のシッフ試薬では検出することができなかった、尿中に排泄されたＭＤＡ等のアルデヒドを簡便かつ迅速に検出することができる。
本発明の組成物を用いて得られたデータは、生体内の酸化ストレス状態の指標とすることができ、また、栄養摂取指導や抗酸化剤の補助効果等の目安とすることができる。
【図面の簡単な説明】  図１Ａ及びＢは、生活習慣とＭＤＡレベルとの関連を示す。
図２Ａ及びＢは、本発明の組成物とＦＲＴキットを用いて得られた吸光度の強さを示す。
図３Ａは、本発明の組成物を用いて得られた吸光度値と尿中に含まれているＭＤＡ値との相関性を示す。
図３Ｂは、ＦＲＴキットを用いて得られた吸光度値と尿中に含まれているＭＤＡ値との相関性を示す。
【実施例】  以下、本発明を実施例により詳細に説明をするが、これらに制限されるものではない。
１．標準物質であるＭＤＡ、ＨＣＨＯに対する反応性
１−１．標準物質の調製
ＭＤＡは、１，１，３，３−テトラ−エトキシプロパン（ＴＥＰ）をＨＣｌで加水分解して得た。精製水を用いて、０．０５、０．１及び１ｍＭのＭＤＡ溶液を調製し、ＭＤＡ標準液とした。
ＨＣＨＯは、市販の試薬ホルムアルデヒドを精製水で希釈し、０．０５、０．１及び１ｍＭのＨＣＨＯ溶液を調製し、ＨＣＨＯ標準液とした。
１−２．ＦＲＴ液による検出
ＦＲＴ液は、原産国−米国で、日本食養科学株式会社から入手した。反応は、ＦＲＴ液：ＭＤＡ又はＨＣＨＯ標準液＝１：１０の割合で行った。
その結果を下記に示す。
2004111635.tif 000002
１−３．本発明の組成物による検出
方法は、本発明組成物：ＭＤＡ又はＨＣＨＯ標準液＝１：１０の割合で行った。
その結果を下記に示す。
2004111635.tif 000003
ＭＤＡに対する反応性はＦＲＴ液では非常に低い呈色を示すのに対して、本発明組成物では高い呈色結果を示した。また、本発明組成物のＭＤＡに対する反応性は、ＭＤＡの濃度に依存的に高くなる傾向が観察された。
２．生体物尿に対する反応性
２−１．ＦＲＴによる反応性
健常ヒト（ｎ＝２０）の早朝尿（起床して最初の尿）を収集した。反応は、  ＦＲＴ：尿＝１：１０の割合で行い、その呈色反応を検出した。
その結果を下記に示す。
2004111635.tif 000004
ＯＤ値は、室温にて尿液：ＦＲＴキット＝１０：１との割合で反応をさせ、５分間後反応液１５０μｌを９６穴プレートに速やかに入れ、マイクロプレートリーダーで波長５３２ｎｍにて吸光度を測定した値である。
レベル          目視法          ＯＤ範囲
−：        尿の色（黄色）
±：        微発色              ０．０５＜±≦０．１
＋：        薄ピンク            ０．１＜＋≦０．４
＋＋：      やや赤色            ０．４＜＋＋≦０．７
＋＋＋：    赤色                ０．７＜＋＋＋≦１．２
＋＋＋＋：  濃赤色              ＋＋＋＋＞１．２
上記表に示したように、ＦＲＴキットを用いた各個体における５分間の発色度は、非常に高く、各個体に対する多様性を検出することができなかった。
周知のように、生体内（血液及び尿中）のＭＤＡは、生体成分である不飽和脂肪酸の酸化分解生成物である。生体内で生成されたＭＤＡの正常値は、まだ不明であるが、測定方法によって値が異なるのが現状である。
文献では正常ヒトの場合は、血液中のＭＤＡ量がおよそ１０ｎｍｏｌＭＤＡ／ｍｌ以下であることが記載されている。ＦＲＴキットの尿に対する反応は、非常に強く、濃く発色する。しかし、尿中のＭＤＡ量を正確に反映しているか否かは疑問であり、反応結果の信用性は、非常に低いと考えられる。
２−２．本発明の組成物のヒト尿に対する反応性
健常ヒト（ｎ＝２０）の早朝尿（朝起床して最初の尿）を収集した。反応は、本発明の組成物：尿＝１：１０の割合で行い、その呈色反応を検出した。
その結果を下記に示す。
2004111635.tif 000005
ＯＤ値は、室温にて尿液：本発明組成物液＝１０：１との割合で反応をさせ、５分間後反応液１５０μｌを９６穴プレートに速やかに入れ、マイクロプレートリーダーで波長５３２ｎｍにて吸光度を測定した値である。
レベル          目視法          ＯＤ範囲
−：        尿の色（黄色）
±：        微発色              ０．０５＜±≦０．１
＋：        薄ピンク            ０．１＜＋≦０．４
＋＋：      やや赤色            ０．４＜＋＋≦０．７
＋＋＋：    赤色                ０．７＜＋＋＋≦１．２
＋＋＋＋：  濃赤色              ＋＋＋＋＞１．２
本発明組成物を用いた各個体における５分間の発色度は、様々なレベルに分布し、非常に多様性に富み、ＦＲＴキットより信用性が高いと考えられた。
３．各個体における生活習慣との関連
健常者２０人、喫煙者かつ飲酒者１０名、非喫煙者かつ非飲酒者１０名の早朝尿を集め、本発明組成物を用いて、測定を行った。その結果を図１に示した。
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喫煙者かつ飲酒習慣のある個体群では、赤発色の高いレベル（＋＋＋）のヒトの割合は５０％、中間発色レベル（＋＋）の割合は４０％、低い発色レベル（＋）の割合は１０％であるのに対し、喫煙かつ飲酒習慣のない個体群では、最高レベル（＋＋＋＋）の割合は１０％で、次に発色度の高いレベル（＋＋＋）の割合は３０％で、中間発色レベル（＋＋）の割合は２０％で、低い発色レベル（＋）の割合は３０％で、また非常に低い発色レベル又は無発色（±）に近いヒトの割合は１０％であった。
また、発色度「＋」以下を低レベル、「＋＋」及び「＋＋」以上を高レベルとすると、喫煙者かつ飲酒者では低レベルの割合は１０％、高レベルの割合は９０％を占めた。
これに対して、非喫煙者かつ非飲酒者では低レベルの割合は４０％、高レベルの割合は６０％を占めた。喫煙かつ飲酒習慣のない個体群に比べて喫煙かつ飲酒習慣のある群において本発明組成物を用いた結果は高いことが明らかとなった。
酸化ストレスは喫煙や飲酒、過度な運動等で生じることが明らかにされている。喫煙は活性酸素種（ＲＯＳ：Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）生成の一因となり、ＤＮＡや蛋白質、脂質に対して癌、心血管疾患など疾病に関連のある酸化的傷害を誘発する畏れがある。
４．本発明の組成物及びＦＲＴキットを用いて得られた吸光度とＭＤＡ値との相関性について
本発明の組成物及びＦＲＴキットを用いて得られた吸光度値と尿中に含まれているＭＤＡ値との相関性を比較するために、更に１５検体を追加して上記と同様な方法によって、本発明組成物及びＦＲＴキットを用いて各検体について吸光度を測定した。
また、尿中ＭＤＡ値を、文献（Ｗ．Ｇ．Ｎｉｅｈａｕｓ，Ｊｒ．ａｎｄ  Ｂ．Ｓａｍｕｅｌｅｓｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６，１２６（１９６８）；Ｅ．Ｄ．Ｗｉｌｌｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３，３１５（１９６９））の方法にしたがって測定した。
測定値は、ＴＥＰを標準物として用いた場合の相当値をＭＤＡとした。それぞれについて得られた吸光度と尿中ＭＤＡ値との相関性を求めた。
その結果、発明組成物を用いた場合には、発色レベル（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）、（±）に属する検体数が、それぞれ１５（４３％）、１２（３４％）、７（２０％）、１（３％）であった。
これに対して、ＦＲＴキットを用いた場合には、発色レベル（＋＋＋）、（＋＋）、（＋）、（±）に属する検体数が、それぞれ、３０（８６％）、４（１１％）、１（３％）、０（０％）検体であった。
ＦＲＴキットを用いた場合には、呈色反応が非常に強く、各検体における多様性を検出できなかった。これに対して、本発明の組成物を用いた場合には、呈色の程度（得られたＯＤ値の範囲）は、レベル「＋＋＋」、「＋＋」、「＋」、「±」と「−」に属する割合が、多様性に富み、濃度依存性が高く、より信頼性の高い検出ができることを示した（図２）。
本発明の組成物及びＦＲＴキットを用いて得られた吸光度とＭＤＡ値との相関係数を求めた。その結果、本発明の組成物を用いて得られた吸光度とＭＤＡ値との相関係数は、０．４５であるのに対し、ＦＲＴキット用いて得られた吸光度とＭＤＡ値との相関係数は、０．３１であり、本発明の組成物がＦＲＴキットに比べてより高い相関性が認められた（図３）。
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【国際調査報告】
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