(57)【要約】本発明は、抗癌活性を発揮する新規化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。本発明のスクリーニング方法は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
【請求項３】
請求項１に記載のスクリーニング方法又は請求項２に記載のスクリーニング用キットを用いて得られる癌の予防・治療剤。
【請求項４】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項５】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項６】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項７】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項８】
癌が膵臓癌である、請求項４又は５に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項９】
癌が膵臓癌である、請求項６に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項１０】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
請求項１０に記載のスクリーニング方法又は請求項１１に記載のスクリーニング用キットを用いて得られるアポトーシス誘導剤。
【請求項１３】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１４】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１５】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１６】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項１７】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、抗癌剤増強剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤のスクリーニング用キット。
【請求項１９】
請求項１７に記載のスクリーニング方法又は請求項１８に記載のスクリーニング用キットを用いて得られる抗癌剤増強剤。
【請求項２０】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を阻害する化合物又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤。
【請求項２１】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤。
【請求項２２】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる抗癌剤増強剤。
【請求項２３】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなる抗癌剤増強剤。
【請求項２４】
癌が膵臓癌である、請求項２０又は２１に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項２５】
癌が膵臓癌である、請求項２２に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項２６】
以下の（ａ）及び（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含有する組換ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを保持する宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収する工程を含む、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩の製造方法。
【請求項３０】
請求項２６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２８に記載の組換ベクターを含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項３１】
請求項２６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２８に記載の組換ベクターを含有してなるアポトーシス誘導剤。
【請求項３２】
請求項２６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項２８に記載の組換ベクターを含有してなる抗癌剤増強剤。
【請求項３３】
哺乳動物に対して、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩、又は上記ペプチド又はその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩の有効量を投与することを特徴とする、癌の予防・治療方法。
【請求項３４】
哺乳動物に対して、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩、又は上記ペプチド又はその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩の有効量を投与することを特徴とする、アポトーシス誘導剤。
【請求項３５】
低酸素によって抗癌剤耐性を誘導された固形癌を有する患者の治療方法であって、
固形癌細胞内のセリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１の発現を抑制することを特徴とする方法。
【請求項３６】
固形癌が膵臓癌である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
低酸素状態によって抗癌剤耐性を誘導された膵臓癌に、ドミナントネガティブＰｉｍ−１を導入することを特徴とする、低酸素状態における膵臓癌の抗癌剤耐性を減少する方法。
【請求項３８】
ドミナントネガティブＰｉｍ−１を膵臓癌細胞に導入することを特徴とする、膵臓癌細胞の腫瘍形成能を減少する方法。
【請求項３９】
ドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントである、固形癌細胞。
【請求項４０】
ドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントである、膵臓管腺癌。
【請求項４１】
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１の活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩と被検物質とを接触させる工程、
セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１のリン酸化活性を検出する工程を含む、方法。
【請求項４２】
リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質の結合に応答して活性化するレポーター遺伝子の発現量の変化を指標として検出する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質のリン酸化された状態を認識する抗体を用いて検出する、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌の治療・予防剤のスクリーニング方法等に関し、更に詳細には、抗癌剤が効かなくなった癌細胞や固形癌に対しても有効な癌の治療・予防剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】  現在、臨床的に用いられている抗癌剤としては多くの種類のものが知られている。このような臨床的に用いられている抗癌剤の多くがかかえる問題点としては、いったんは効果のあった抗癌剤が効かなくなるという獲得耐性癌細胞が出現したり、固形癌に効きにくいということがある。抗癌剤が固形癌に効きにくくなるのは、固形癌が一定以上の大きさになるとその内部が低酸素状態となることが原因と考えられている。
進行性の癌においては、癌細胞内部の増殖速度が周囲の細胞よりも速いため、新しく生成された血管の供給が足りず、血液の供給が不十分となり、低酸素状態となると考えられる。例えば、Ｔｅｉｃｈｅｒ，Ｂ．Ａ．Ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，１３：１３９−１６８，１９９４、Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｇｉａｃｃｉａ，Ａ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｕｎｉｑｕｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ（ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ）ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：１４０８−１４１６，１９９８、Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｍ．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，６：１５７−１６２，２０００、Ｌｕｋ，Ｃ．Ｋ．，Ｖｅｉｎｏｔ−Ｄｒｅｂｏｔ，Ｌ．，Ｔｊａｎ，Ｅ．＆  Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｉ．Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ  Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８２：６８４−６９２，１９９０、Ｓａｋａｔａ，Ｋ．，Ｋｗｏｋ，Ｔ．Ｔ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｊ．，Ｌａｄｅｒｏｕｔｅ，Ｋ．Ｒ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，６４：８０９−８１４，１９９１、Ｓａｎｎａ，Ｋ．＆  Ｒｏｆｓｔａｄ，Ｅ．Ｋ．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，５８：２５８−２６２，１９９４には、低酸素状態にある癌細胞が、高い酸素状態にある癌細胞よりも、化学療法、放射線療法に対して耐性を有しており、低酸素状態が、固形癌細胞において薬剤耐性を誘導することが開示されている。上記文献に記載された結果は、低酸素状態が固形癌細胞において、抗アポトーシス因子を誘導していることを示している。
一方、セリン／スレオニンキナーゼであるＰｉｍ−１は、最初はマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫内において白血病ウィルスの挿入によってしばしば活性化される遺伝子として同定されたセリン／スレオニンキナーゼである（Ｃｏｍｅｒｆｏｒｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｋａｒｈａｕｓｅｎ，Ｊ．，Ｌｏｕｉ，ｓ  Ｎ．Ａ．，Ｍｏｎｔａｌｔｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｏｌｇａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ１）ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：３３８７−３３９４，２００１、及びＮｉｉｚｅｋｉ，Ｈ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｉ．，Ａｋａｋｕｒａ，Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｈａｍａｄａ，Ｊ．，Ｓｅｔｈ，Ｐ．，Ｋａｔｏｈ，Ｈ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｒａｚ，Ａ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．Ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８６：１９１４−１９１９，２００２）。また、細胞質内のＰｉｍ−１が種々の造血細胞内においてアポトーシスを阻害するための因子として機能することが報告されている（Ｃｕｙｐｅｒｓ，Ｈ．Ｔ．，Ｓｅｌｔｅｎ，Ｇ．，Ｑｕｉｎｔ，Ｗ．，Ｚｉｊｌｓｔｒａ，Ｍ．，Ｍａａｎｄａｇ，Ｅ．Ｒ．，Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ｗ．，ｖａｎ  Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ，Ｐ．，Ｍｅｌｉｅｆ，Ｃ．，Ｂｅｒｎｓ，Ａ．Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｇｅｎｅｓｉｓ：ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，３７：１４１−１５０，１９８４、及びＳｅｌｔｅｎ，Ｇ．，Ｃｕｙｐｅｒｓ，Ｈ．Ｔ．＆  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．Ｐｒｏｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｐｉｍ−１  ｉｎ  ＭｕＬＶ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ，４：１７９３−１７９８，１９８５）。従って、Ｐｉｍ−１を不活性化できる物質があれば、固形癌、及びそれに起因する各種疾患の予防／治療に有効であるといえる。
従って、本発明においては、抗癌活性を発揮する新規化合物をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。また、本発明は、Ｐｉｍ−１を不活性化することにより、癌を予防・治療するための癌の予防・治療剤のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、癌細胞中に多く存在するタンパク質を見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、抗癌剤増強剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を阻害する化合物又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターを提供する。
また、本発明は、上記発現ベクターを保持する宿主細胞を提供する。
また、本発明は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収する工程を含む、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩の製造方法を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図２は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図３は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図４は、各種細胞を低酸素分圧下及び正常酸素分圧下で培養した際のＰｉｍ−１をウェスタンブロット法により検出した結果である。
図５は、各種細胞を低酸素分圧下及び正常酸素分圧下で培養した差異のＰｉｍ−１  ｍＲＮＡをノーザンブロット法により検出した結果である
図６は、Ｐｉｍ−１をウェスタンブロット法により検出した結果である。
図７は、Ｐｉｍ−１をウェスタンブロット法により検出した結果である。
図８は、形質転換細胞のタンパク質電気泳動の結果である。
図９は、形質転換細胞のタンパク質電気泳動の結果である。
図１０は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図１１は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
図１２は、各種細胞を投与した場合の腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。
図１３は、免疫組織化学染色を行った結果を示す写真である。
図１４は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について説明する。
本発明において、「セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１」（以下、本明細書において、「Ｐｉｍ−１」ともいう）とは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するポリペプチドである。また、Ｐｉｍ−１は、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）によって引き起こされたＴ細胞リンパ腫内でＭｕＬＶの挿入によって活性化される遺伝子として同定された（Ｃｏｍｅｒｆｏｒｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｋａｒｈａｕｓｅｎ，Ｊ．，Ｌｏｕｉ，ｓ  Ｎ．Ａ．，Ｍｏｎｔａｌｔｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｃｏｌｇａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ１）ｇｅｎｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：３３８７−３３９４，２００１、及びＮｉｉｚｅｋｉ，Ｈ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｉ．，Ａｋａｋｕｒａ，Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｈａｍａｄａ，Ｊ．，Ｓｅｔｈ，Ｐ．，Ｋａｔｏｈ，Ｈ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｈ．，Ｒａｚ，Ａ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．Ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，８６：１９１４−１９１９，２００２）。
本発明においては、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチドとは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含み、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、Ｐｉｍ−１が有するセリン／スレオニンキナーゼ活性が挙げられる。このキナーゼ活性が同等であるものが好ましい。このキナーゼ活性は、例えばｐ２１タンパク質、ｍｙｂタンパク質等等の基質ペプチドをリン酸化する活性として測定することができる。また、Ｐｉｍ−１は、後述するように、アポトーシス誘導活性を抑制するので、このアポトーシス誘導活性の抑制効果を測定することによって、実質的に同質の活性か否かを判断することができる。
本発明において用いられるＰｉｍ−１としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば、１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するペプチド、又はそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質等も含まれる。上記のアミノ酸の挿入、置換、欠失がなされている場合、その挿入、置換、欠失の位置は、とくに限定されない。
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。また、エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素数が１〜６個のアルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素数が３〜８個のシクロアルキル基、フェニル、α−ナフチル等の炭素数が６〜１２個のアリール基、ベンジル、フェネチル等のフェニル−アルキル基、α−ナフチルメチル等のα−ナフチル−アルキル基、炭素数が７〜１４個のアラルキル基、ピバロイルオキシメチル基等が挙げられる。配列番号：１で表わされるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものであってもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が挙げられる。さらに、配列番号：１で表わされるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成されるＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル基等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質などでもよい。
本発明において用いられるＰｉｍ−１の部分ペプチドとしては、前記したタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記したタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
本発明で用いられるＰｉｍ−１又はその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩が挙げられる。本発明で用いられるＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞又は組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできる。また、タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等を用いて抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明において用いられるＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩は合成したものを用いることができ、その合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂等を挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらの塩を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。セリンの水酸基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（炭素数が１〜６個）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される置換基等を用いることができる。また、エーテル化に適する置換基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチル等が用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕等を用いることができる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが挙げられる。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等を用いることが可能である。このような酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤を添加することが有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上述した１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によって除去することできる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化は公知の置換基又は公知の手段から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるＰｉｍ−１の部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。又は、本発明で用いられるＰｉｍ−１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
本発明で用いられるＰｉｍ−１をコードするポリヌクレオチドとしては、Ｐｉｍ−１をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。ＤＮＡが好ましく用いられる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上述した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上述した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等が挙げられる。ライブラリーに用いられるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等が用いられる。また、上述した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。本発明で用いられるＰｉｍ−１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものであってもよい。
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法又はそれに準じる方法に従って行うことができる。例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合には、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１９〜４０ｍＭ、好ましくは１９〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１９ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。
本発明で用いられるＰｉｍ−１の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上述した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれもが用いられる。本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ等が挙げられる。配列番号：２で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、上述したことと同様の意味を示す。ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は上述したものが用いられる。
本発明で用いられるＰｉｍ−１、及びその部分ペプチド（本明細書において、以下、本明細書においては、これらを単にＰｉｍ−１いうこともある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、Ｐｉｍ−１をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅してもよく、又は適当なベクターに組み込んだＤＮＡをＰｉｍ−１の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。Ｐｉｍ−１の発現ベクターは、例えば、（１）Ｐｉｍ−１をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
本発明の癌の予防・治療剤のスクリーニング方法は、上述したＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする。具体的には、本発明の予防・治療剤のスクリーニング方法は、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩と被検物質とを接触させ、Ｐｉｍ−１のリン酸化活性を測定することにより実施することができる。また、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩と被検物質とを接触させ、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩のアポトーシス誘導能の阻害効果を測定することにより実施することができる。
いずれの場合においても、被検物質の非存在下における活性と比較して、活性物質の存在を確認することによってスクリーニングを行う。この方法によって、アポトーシス誘導剤のスクリーニングの実施も可能である。また、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害することにより、腫瘍の形成能を阻害することができるので、この方法によって、抗癌剤増強剤のスクリーニングが可能である。
本発明のスクリーニング方法において用いられる被検試料としては、例えば、細胞抽出物、植物抽出物、精製又は粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、遺伝子ライブラリー等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、細胞内で行ってもよいが、試験管内で行うことも可能である。
細胞内で行う場合、Ｐｉｍ−１を生成する細胞を用いて行うことができるが、Ｐｉｍ−１をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターで形質転換された形質転換細胞を用いることもできる。試験管内で行う場合、Ｐｉｍ−１と、Ｐｉｍ−１の基質ペプチドとを、適当な反応バッファー中で混合し、そのリン酸化能を測定することによって実施する。基質ペプチドとしては、Ｐｉｍ−１によってリン酸化されるペプチドであれば特に制限なく用いることができ、反応条件は従来公知のキナーゼにおいて用いられる条件でよい。
次に、上述した組換ベクターについて説明する。
Ｐｉｍ−１をコードするＤＮＡを含有する組換ベクターとしては、Ｐｉｍ−１をコードするヌクレオチド断片（例えば、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド）を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５またはｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＳＨ１９またはｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等のウイルス等の動物ウイルスの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＸＹＬプロモーター、ＨＷＰプロモーター、ＣＷＰプロモーター等が好ましく、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましく、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター等が好ましく用いられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、Ｏｐ１Ｅ２プロモーター等が用いられる。
組換ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｇｄｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することができる。
上記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕およびバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｍ７１およびハンセヌラ・ポリモーファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等が用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。哺乳動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。
また、必要に応じて、宿主細胞に適したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、Ｐｉｍ−１をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加してもよい。宿主細胞としてエシェリヒア属菌を用いる場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞としてバチルス属菌を用いる場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として酵母を用いる場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等のシグナル配列が用いられる。このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
大腸菌等の細菌への組換ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換ベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換ベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法は、上述した形質転換細胞を用いて行うことができる。以下、上述した形質転換細胞を用いて本発明のスクリーニング方法を行なう場合について説明する。
本発明のスクリーニング方法においては、上述した形質転換細胞を、Ｐｉｍ−１の基質ペプチド、及び［３２Ｐ］−ＡＴＰと共に培養し、３２Ｐの基質ペプチドへの取り込みを測定することにより、Ｐｉｍ−１のリン酸化活性を測定する。この測定を被検物質の存在下、及び非存在下で行い、両者を比較し、スクリーニングを行う。すなわち、被検物質の存在下と、非存在下でＰｉｍ−１のリン酸化活性を測定し、被検物質の存在下の方が非存在下よりもリン酸化活性が低い場合は、被検物質はＰｉｍ−１の阻害効果を有するものであることがわかる。
また、本発明のスクリーニング方法は、Ｐｉｍ−１のリン酸化活性を測定することに代え、アポトーシス誘導能を測定することによって実施することができる。すなわち、Ｐｉｍ−１はアポトーシス誘導能を阻害するので、被検物質の存在下と、非存在下でアポトーシス誘導能の阻害効果を測定し、この阻害が減少すれば、被検物質はＰｉｍ−１の活性を阻害し、アポトーシス誘導能を有し、癌の予防・治療、抗癌剤の増強等に有効であることがわかる。
Ｐｉｍ−１は固形癌細胞内に多く存在していることから、Ｐｉｍ−１に対する阻害効果を有する化合物は癌の予防・治療効果、特に固形癌の予防・治療効果を有する化合物であると考えられる。また、この癌治療効果は癌細胞の腫瘍形成能を阻害するものであり、この効果はアポトーシス誘導効果により発揮されるものである。従って、上記スクリーニング方法は、アポトーシス誘導剤をスクリーニングする方法として用いることができる。また、上記スクリーニング方法は、抗癌剤増強剤をスクリーニングする方法として用いることができる。
また、本発明のスクリーニング方法は、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１の活性を促進又は阻害する物質をスクリーニングする方法であって、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩と被検物質とを接触させる工程、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１のリン酸化活性を検出する工程を含む、方法である。
リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質の結合に応答して活性化するレポーター遺伝子の発現量の変化を指標として検出することができる。また、リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質のリン酸化された状態を認識する抗体を用いて検出することができる。
リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質の結合に応答して活性化するレポーター遺伝子の発現量の変化を指標として検出する場合について説明する。
Ｐｉｍ−１によってリン酸化される基質ペプチドの結合配列をレポーター遺伝子の発現ベクターに連結し、これを宿主細胞に導入する。また、同じ宿主細胞に、Ｐｉｍ−１を発現するベクターを導入すると、２つの発現ベクターが導入された細胞が製造される。なお、Ｐｉｍ−１を発現するベクターとしては上述したものが用いられる。
また、上記レポーター遺伝子の発現ベクターは、Ｐｉｍ−１を発現するベクターと同様にして製造することができ、宿主細胞としては、上述したものを特に制限なく用いることができる。
本発明において用いられる、Ｐｉｍ−１によってリン酸化される基質ペプチドとしては、リン酸化されることによって結合配列に結合するものである。このような基質ペプチドとしては、例えばｃ−Ｍｙｂ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ（ＮＦＡＴ）及びＰ２１等が挙げられる例えば、ｃ−ｍｙｂはリン酸化されると、結合配列に結合し、レポーター遺伝子が発現され、そのレポーター遺伝子の発現を検出することにより、ｃ−ｍｙｂがリン酸化されたか否かが検出される。
レポーター遺伝子としては、特に限定されないが、安定でかつ活性の定量が容易なものが好ましい。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＨＩＳ３遺伝子、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）等をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。レポーター遺伝子は、遺伝子本来のプロモータを有するものであってもよいし、プロモータ部分が他の遺伝子由来のものと置換されたものを用いてもよい。レポータ遺伝子は、応答配列の下流に機能的に連結されていればよい。
すなわち、上述したスクリーニング方法においては、被検物質がＰｉｍ−１を阻害する活性を有している場合、レポーター遺伝子の発現が抑制又は阻害されるので、そのレポーター遺伝子の発現を検出することにより、被検物質がＰｉｍ−１の活性を促進又は阻害するか否かを検出することが可能となる。
次に、リン酸化活性の検出を、セリン／スレオニンキナーゼＰｉｍ−１によってリン酸化される基質のリン酸化された状態を認識する抗体を用いて検出する場合について説明する。
抗体を用いる場合、例えば、Ｐｉｍ−１によってリン酸化される基質のリン酸化された状態を認識する抗体（一次抗体）をプレートに固相化させる。これとは別に、Ｐｉｍ−１とＰｉｍ−１によってリン酸化される基質ペプチドとを、被検物質の存在下又は非存在下に緩衝液中で混合し、通常は２〜４時間インキュベートしておく。この操作により、基質ペプチドはＰｉｍ−１によってリン酸化される。次いで、この基質ペプチドを含む緩衝液をプレートの穴に入れ、一定時間インキュベーションする。この操作により、リン酸化された基質ペプチドは一次抗体と結合し、リン酸化されていない基質ペプチドは一次抗体と結合しない。
リン酸化された基質ペプチドは一次抗体と結合しているので、次いで、基質プチドに対する別の抗体（二次抗体）との結合を調べることにより、基質ペプチドがリン酸化されているか否かを調べることができる。
二次抗体の結合の検出には、例えば、放射性同位元素を結合したものを用いた場合、液体シンチレーション等を用いて検出する。二次抗体に酵素を結合したものを用いる場合には、基質の酵素的変化、例えば発色の程度を吸光度計により検出する。また、二次抗体に蛍光物質を結合したものを用いる場合には、蛍光光度計により検出する。これらの結果を、被検物質の存在下の場合と非存在下の場合とを比較することにより、被検物質がＰｉｍ−１のリン酸化活性を促進するか阻害するかを調べることができる。
用いられる基質としては、例えば、Ｐ２１タンパク質等が挙げられる。
なお、用いる抗体としては、リン酸化された基質タンパク質、又はリン酸化されていない基質タンパク質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。該抗体は、例えばＰ２１タンパク質（リン酸化されているもの、及びされていないもの）を抗原として用い、従来公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
次に、本発明のスクリーニング用キットについて説明する。
本発明のスクリーニング用キットは、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有する。本発明のスクリーニング用キットは、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物をスクリーニングするために用いられる。
本発明のスクリーニング用キットには、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩、Ｐｉｍ−１の基質ペプチド、該基質ペプチドをリン酸化するためのリン酸基供与体を含有することが好ましい。
また、本発明のスクリーニング用キットは、上述した、発現ベクター、又は形質転換体を含有する。発現ベクター、又は形質転換対を含有するスクリーニング用キットにおいても、Ｐｉｍ−１の基質ペプチド、該基質ペプチドをリン酸化するためのリン酸基供与体を含有することが好ましい。これらのスクリーニング用キットを用いることにより、上記スクリーニング方法を実施することができる。
Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物は、アポトーシスを誘導する薬剤の候補となり、癌の治療・予防への応用、抗癌剤の増強剤としての応用が考えられる。
本発明の癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤は、Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる。Ｐｉｍ−１もしくはその部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて検索することができる。
Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物の具体例としては、例えば配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列よりなるポリペプチドがｘ挙げられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するＰｉｍ−１のキナーゼ活性ドメインを欠失したポリペプチドであり、配列番号：１の１〜８０番目のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドである。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、キナーゼ活性ドメインを欠失したポリペプチドであり、このポリペプチドが存在すると、Ｐｉｍ−１の活性が阻害され、その結果、このポリペプチドは癌治療・予防剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤として用いることができる。また、Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物としては、Ｐｉｍ−１に対する抗体が挙げられる。また、Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物としては、Ｐｉｍ−１をコードする遺伝子、すなわち配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡ（以下、本明細書においてＳｉＲＮＡともいう）、アンチセンスヌクレオチドが挙げられる。また、二本鎖ＲＮＡとしては、２１〜２３塩基対のｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡが好ましい。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一なポリペプチドは、合成ポリペプチドであってもよい。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば、１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するペプチド、又はそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質等も含まれる。上記のアミノ酸の挿入、置換、欠失がなされている場合、その挿入、置換、欠失の位置は、とくに限定されない。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。また、エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素数が１〜６個のアルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素数が３〜８個のシクロアルキル基、フェニル、α−ナフチル等の炭素数が６〜１２個のアリール基、ベンジル、フェネチル等のフェニル−アルキル基、α−ナフチルメチル等のα−ナフチル−アルキル基、炭素数が７〜１４個のアラルキル基、ピバロイルオキシメチル基等が挙げられる。配列番号：１で表わされるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものであってもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が挙げられる。さらに、配列番号：３で表わされるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成されるＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル基等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質などでもよい。
配列番号：３で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、塩の形態であってもよく、このような塩としては、Ｐｉｍ−１について説明したものと同様である。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、公知のペプチド合成法によって合成することもできる。ペプチド合成については、Ｐｉｍ−１について説明した方法と同様な方法が挙げられる。
また、上述したＰｉｍ−１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
また、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものであってもよい。
配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、上述した方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件とは、上述した通りである。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅してもよく、又は適当なベクターに組み込んだＤＮＡを配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、上述した通りである。ＤＮＡの塩基配列の変換についてでも、上述した通りである。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する組換ベクターは、上記ポリヌクレオチド断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。ベクター及びプロモーターは、上述したものが用いられる。
組換ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｇｄｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することができる。
上述した組換ベクターを宿主細胞に形質転換する方法については上述した通りである。また、宿主細胞としては、上述したものを用いることができる。
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。この方法については上述した通りである。
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収する工程を含む。
具体的には、上述した宿主細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせことによる公知のタンパク質の精製方法によって実施することができる。
得られたポリペプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができる。また、塩として得られた場合には、公知の方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。
本発明の、上記配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、及び抗癌剤増強剤として用いることができる。
例えば、癌の患者等に対して、（イ）上記ポリヌクレオチドを標的細胞内で機能し得るプロモーターの制御下においた発現ベクターを該患者に投与して生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）取り出した細胞に本発明のポリヌクレオチドを上記と同様に導入し、上記ポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、上記効果を発揮させる。上記リヌクレオチドを上記目的に使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与してもよい。
配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡは、同じ配列を有する遺伝子の発現を抑制し、従って、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現を抑制するため、Ｐｉｍ−１の発現が抑制され、Ｐｉｍ−１の活性を阻害することができる。このような二本鎖ＲＮＡとしては、２１〜２３塩基対のｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡが好ましい。二本鎖ＲＮＡの調製法としては、従来公知の方法を特に制限なく用いることができ、例えば、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉ  ＲＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて製造することができる。
配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、配列番号：９で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａｕｇａｕｇａａｇｕｃｇａａｇａｇａｕｃｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）と、配列番号：１０で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａｇａｕｃｕｃｕｕｃｇａｃｕｕｃａｕｃａｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）とからなる二本鎖ＲＮＡ、配列番号：１１で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａａｕｃｕａａｕｇａｇａｕｇｃｕｇａｃａｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）と、配列番号：１２で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａｕｇｕｃａｇｃａｕｃｕｃａｕｕａｇａｕｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）とからなる二本鎖ＲＮＡ、配列番号：１３で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａａｕｃｃａｕｇｇａｕｇｇｕｕｃｕｇｇａｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）と、配列番号：１４で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（５’−ａａｕｃｃａｇａａｃｃａｕｃｃａｕｇｇａｕｃｃｕｇｕｃｕｃ−３’）とからなる二本鎖ＲＮＡが挙げられる。
上述した、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド等の、Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、投与できる。上記ポリペプチドを癌の予防・治療、アポトーシス誘導、又は抗癌剤増強剤として使用する場合は、好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上に精製されたポリペプチドを使用することが好ましい。上記ポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいはエアロゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。
例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
上記ポリヌクレオチドが挿入された組換ベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができ、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、又は抗癌剤増強剤として用いることができる。
上記癌治療・予防剤、抗癌剤増強剤の対象となる癌としては、例えば、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液腫瘍等が挙げられ、また、細胞内の酸素濃度が低下している固形癌に特に有効である。
本発明の癌治療・予防剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤を用いる場合、患者に直接投与する以外に、公知の製剤学的方法によって製剤化して投与を行うことが可能である。例えば、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化して投与することができる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【実施例】  以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】  低酸素分圧及び正常酸素分圧下における、固形癌細胞の抗癌剤に対する感受性を調べた。細胞としては、３種類の固形膵臓癌細胞系（ＰＣＩ−３５細胞、ＫＭＰ−４細胞及びＰＣＩ−４３細胞）を用いた。各細胞２×１０３個を、５０μｇ／ｍｌのシスプラチンの存在下で低酸素分圧下（１％酸素、５％二酸化炭素、以下、本実施例において同じ）、又は正常酸素分圧下（２０％酸素、５％二酸化炭素、以下、本実施例において同じ）で６時間培養を行った。培養を行った後、生理加リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で２回洗浄を行い、試料を調整した。なお、培養に用いた培地はＤｕｌｃｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｆ−１２である（以下、本明細書において特に限定しない限り、同一の培地を用いるものとする）。
上記細胞について、プロピジウムヨーダイド（ＰＩ）及びＦＩＴＣを結合した抗アネキシンＶで染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）でＦＡＣＳ解析を行った。
ＦＡＣＳ解析の結果を図１に示す。図１において、Ｎｏｒｍｏｘｉａは正常酸素分圧下を意味し、Ｈｙｐｏｓｉａは低酸素分圧下を意味する（以下、本明細書において同じ）。本実施例におけるＦＡＣＳ解析について説明すると、細胞は、ＰＩ及び抗アネキシンＶで染色され、それぞれの染色の強弱によって分割され、図１にしめすように分布する。この図においては、右下段が早期アポトーシス細胞を示し、右上段が後期アポトーシス細胞を示す。また、左下段は生細胞を示す。右下段及び右上段の総計をアポトーシス細胞として、図中に割合を％で示した。以下、本明細書におけるＦＡＣＳ解析は同様である。
図１に示すように、３種類の固形膵臓癌細胞系においては、シスプラチンの存在下、正常酸素分圧下で培養することにより、低酸素分圧下に比べ、約２倍のアポトーシスが誘導された。すなわち、上記３種類の固形膵臓癌細胞系においては、低酸素分圧下においては、正常酸素分圧下よりもアポトーシス誘導が阻害されることがわかった。
【実施例２】  ＰＣＩ−４３細胞について、実施例１と同一条件にて２４時間まで培養を行い、培養開始前、１２時間培養後、及び２４時間培養後の試料を用いて同様に解析を行った。結果を図２に示す。図２に示すように、時間の経過と共にシスプラチンによってアポトーシスは誘導されたが、低酸素分圧下における培養においては、正常酸素分圧下の場合の約１／２であった。
上記結果より、各種細胞は、低酸素分圧下でシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに対して、正常酸素分圧下よりも耐性であることを示す。
【実施例３】  ゲムシタビン、アドリアマイシン及びシスプラチンを用い、細胞はＰＣＩ−４３細胞を用い、実施例１と同様にして測定を行った。なお、ゲムシタビン、アドリアマイシンの濃度は、それぞれ０．１〜１μｍｏｌ、０．１〜５μｍｏｌとした。測定結果から、ＩＣ５０を以下のようにして算出した。
各種濃度の抗癌剤で４８時間処理した後の生細胞数を測定し、各種抗癌剤を加えない場Ｅの半分の生細胞数になる抗癌剤の濃度をＩＣ５０とした。結果を表１に示す。
2004090158.tif 000002
表１に示すように、ゲムシタビン及びアドリアマイシンによる５０％アポトーシス誘導には、シスプラチンと同様、低酸素分圧下の方が、ゲムシタビン、アドリアマイシンともに正常酸素状態よりも高濃度の抗癌剤が必要であった。
【実施例４】  ＰＣＩ−４３細胞について、シスプラチンに代え、抗Ｆａｓ抗体２μｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様に培養を行い、解析を行った。解析は培養開始前及び２４時間培養後に行った。結果を図３に示す。
図３に示すように、ＰＣＩ−４３細胞は、低酸素分圧下で抗Ｆａｓ抗体によって誘導されるアポトーシスに対して、正常酸素分圧下よりも感受性を示すことがわかった。
【実施例５】  各種の癌細胞を、低酸素分圧及び正常酸素分圧下で１６時間培養し、それぞれの細胞内におけるＰｉｍ−１タンパク質、及びＰｉｍ−１ｍＲＮＡの解析を行った。
用いた細胞は、ＨＣＴ１１６（大腸癌細胞株）、ＨｅＰＧ２（肝癌細胞株）、ＫＭＰ−４（膵臓癌細胞株）、ＰＣＩ−１０（膵臓癌細胞株）、ＰＣＩ−３５（膵臓癌細胞株）及びＰＣＩ−４３（膵臓癌細胞株）である。各細胞を、低酸素分圧下（１％酸素、５％二酸化炭素）、又は正常酸素分圧下（２０％酸素、５％二酸化炭素）で１６時間培養を行った。培養が終了した細胞について、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いてＲＮＡ抽出を行い、蛋白抽出は１％  ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｕＭ  Ｔｒｉｓ  ＰＨ７．５，１５０ｎＭ  ＮａＣｌ，２ｕＭ  ＥＤＴＡ，１ｕＭ  ＥＧＴＡ，５０ｕＭ  ＮａＦ，１ｕＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｕＭ  ＰＭＳＦ）を用いて行った。
タンパク質の検出はウェスタンブロットにより行った。すなわち、上記試料を１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。膜をブロッキングバッファー（５％スキムミルク、生理加Ｔｗｅｅｎ−リン酸バッファー中）でブロッキングし、抗Ｐｉｍ−１抗体と１時間反応し、次いで、ペロオキシダーゼを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体でインキュベートし、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。
結果を図４に示す。図４は、各種細胞を低酸素分圧下及び正常酸素分圧下で培養した際のＰｉｍ−１をウェスタンブロット法により検出した結果である。図４において、Ｎは正常酸素分圧下、Ｈは低酸素分圧下による培養を行った試験結果である。図４に示すように、試験を行った細胞株全てにおいて、Ｐｉｍ−１は、正常酸素分圧下で培養した場合よりも、低酸素分圧下で培養した方がＰｉｍ−１の量が多いことがわかる。
次いで、ノーザンブロット解析を行い、各種細胞におけるＰｉｍ−１  ｍＲＮＡの検出を行った。Ｐｉｍ−１検出用のｃＤＮＡフラグメントをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ノーザンブロット解析用プローブとして用いた。ＰＣＲプライマーとしては以下のものを用いた。
2004090158.tif 000003
結果を図５に示す。図５は、各種細胞を低酸素分圧下及び正常酸素分圧下で培養した差異のＰｉｍ−１  ｍＲＮＡをノーザンブロット法により検出した結果である。また、図５の下部に示すグラフは、上部のウェスタンブロットによる解析結果をスキャナーで読みとり、その強度比を示すものである。図５に示すように、試験を行った細胞株全てにおいて、Ｐｉｍ−１  ｍＲＮＡは、正常酸素分圧下で培養した場合よりも、低酸素分圧下で培養した方がＰｉｍ−１  ｍＲＮＡ量が多いことがわかる。
上記結果より、癌細胞においては、正常酸素分圧下よりも低酸素分圧下で培養した場合に、Ｐｉｍ−１が大量に生産されることがわかる。
【実施例６】  各種膵臓癌細胞を低酸素分圧下に曝した場合のＰｉｍ−１タンパク質の発現を時間経過を追って観察した。細胞としては、ＨＣＴ１１６、ＰＣＩ−１０及びＰＣＩ−４３を用いた。培養開始前、低酸素分圧下に細胞を曝して２時間経過後、４時間経過後に細胞をサンプリングし、実施例５と同様に操作を行い、ウェスタンブロット解析を行った。結果を図６に示す。図６において、β−ａｃｔｉｎは、発色のコントロールとして用いたものである。図６に示すように、用いた３種類の細胞全てにおいて、低酸素分圧下に曝してからの時間の経過とともにＰｉｍ−１の量が増加していることがわかった。
【実施例７】  正常酸素分圧下において、Ｐｉｍ−１がプロテアーゼによって分解されているか否かを調べた。ＰＣＩ−４３細胞を、低酸素分圧下、及び正常酸素分圧下にて培養した。低酸素分圧下で培養した細胞については、培養前、培養開始４時間、１２時間及び２４時間経過後にサンプリングし、実施例５と同様に操作を行い、ウェスタンブロット解析を行った。また、正常酸素分圧下における培養においては、培地中にプロテアソーム阻害剤であるＮ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−Ｌ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎａｌ（ＡＬＬＮ）を５０μＭ濃度加えて培養を行った。正常酸素分圧下における培養においては、培養開始前、培養開始６時間、及び１２時間経過後にサンプリングし、実施例５と同様に操作を行い、ウェスタンブロット解析を行った。結果を図７に示す。図７に示すように、低酸素分圧下における培養においては、低酸素分圧に曝してからの時間経過に伴い、Ｐｉｍ−１の量が増加しており、正常酸素分圧下においても時間経過に伴いＰｉｍ−１の量が増加していた。これは、プロテアソーム阻害剤のない状況においては、Ｐｉｍ−１タンパク質が分解されていることを示す。
【実施例８】  ＰＣＩ−４３細胞を、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮの存在下、正常酸素分圧下にて培養した。培養を６時間行い、サンプリングし、ユビキチンを免疫沈降させた後、ウェスタンブロット法により解析を行った。一次抗体として、抗ユビキチン抗体、及び抗Ｐｉｍ−１抗体を用いる以外は実施例５と同様に操作を行った。ＡＬＬＮの濃度は、０、５０及び１００μＭで行った。結果を図８に示す。図８において、左側は一次抗体として抗Ｐｉｍ−１を用いた結果であり、右側は一次抗体として抗ユビキチンを用いた結果である。図８に示すように、サンプルは抗Ｐｉｍ−１抗体と反応することから、免疫沈降したユビキチンにＰｉｍ−１が結合していることがわかる。すなわち、Ｐｉｍ−１は、最初ユビキチン化され、プロテアソームがユビキチンを指標としてプロテアソームによってＰｉｍ−１が分解されることがわかった。
【実施例９】  実施例１〜３で、癌細胞中で低酸素分圧下において各種抗癌剤によって誘導されるアポトーシス誘導能が低下することが明らかとなった。また、実施例４において、低酸素分圧下で培養した癌細胞中にＰｉｍ−１が大量に存在することが明らかになったので、Ｐｉｍ−１の役割りを明らかにするため、ドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントを確立した。Ｐｉｍ−１トランスフェクタントは、野生型Ｐｉｍ−１のキナーゼ活性ドメインを欠如したペプチド、すなわち配列番号：３で表わされるペプチドを生産するものである。
キナーゼ活性ドメインを欠失した、ドミナントネガティブＰｉｍ−１のｃＤＮＡは、ＰＣＩ−１０細胞から精製されたｍＲＮＡのＲＴ生成物から増幅し、ＰＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングした。プラスミドの配列決定は、ＡＢＩ３７７自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行った。クローニングされたフラグメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合した。なお、ＲＴ−ＰＣＲの方法を以下に簡単に説明する。
７５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、２μＭ  ランダムプライマー、及び１０００Ｕ  ＡＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む反応混合物中で３７℃、１時間インキュベーションすることにより、各ＲＮＡ試料（５μｇ）からｃＤＮＡの増幅を行った。ｃＤＮＡののＰＣＲ増幅は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、１０μＭ  各特異的プライマー、及び１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢｒＬ）を含む反応混合物中で行った。ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）中で、３５サイクル（９４℃、１分、６０℃、１分、７２℃、２分）行った。
ＰＣＲプライマーとしては以下のものを用いた。
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得られたベクターを、ＰＣＩ−４３細胞に、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて発現ベクターに形質導入した。トランスフェクタントを、１，２００μｇ／ｍｌのＧ−４１８で選択した後、限界希釈法でクローニングし、ドミナントネガティブトランスフェクタントｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０を得た。次いで、トランスフェクタントを６００μｇ／ｍｌのＧ−４１８の存在下、維持した。
得られた形質転換細胞について、タンパク質の電気泳動を行った。試料の調製は、１％ＮＰ−４０  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０μＭ  Ｔｒｉｓ  ＰＨ７．５，１５０ｎＭ  ＮａＣｌ，２μＭ  ＥＤＴＡ，１μＭ、ＥＧＴＡ，５０μＭ  ＮａＦ，１μＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１μＭ  ＰＭＳＦ）を用いておこなった。
コントロールとして、ベクターを形質転換したものについても行った。
結果を図９に示す。図９は、形質転換細胞のタンパク質電気泳動の結果である。図９に示すように、ｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０は、キナーゼドメインを欠失したＰｉｍ−１の存在を表すピークが検出された（図９におけるｄｎＰｉｍ−１）。ベクターのみを形質転換したもの（ｖ３及びｖ４）については、このピークは検出されなかった。
【実施例１０】  実施例９で得られたｄｎｐ３、ｄｎｐ４、ｄｎｐ１０及びベクターのみを形質転換した細胞ｖ３について、実施例１と同様にしてアポトーシス誘導能を測定した。結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ｖ３については、シスプラチンの存在下、正常酸素分圧下で培養することにより、低酸素分圧下に比べ、約２倍のアポトーシスが誘導された。これに対し、ドミナントネガティブＰｉｍ−１であるｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０については、正常酸素分圧下及び低酸素分圧下において差は認められなかった。
【実施例１１】  シスプラチンに代え、抗Ｆａｓ抗体２μｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例１と同様に培養を行い、解析を行った。解析は培養開始前及び２４時間培養後に行った。結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ｖ３、ｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０について低酸素分圧下及び正常酸素分圧下において、抗Ｆａｓ抗体によって誘導されるアポトーシスに対して、感受性は等しかった。
実施例９及び実施例１０の結果から、Ｐｉｍ−１の機能を阻害することによって、抗癌剤により誘導されるアポトーシスに対する感受性は回復するが、低酸素状態で抗Ｆａｓ抗体によって誘導されるアポトーシスに対する感受性を回復せず、このことは、Ｐｉｍ−１が膵臓癌細胞において抗癌剤に対する耐性と相関があることを示す。
【実施例１２】  ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｖ３、ｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０を、それぞれ５×１０６個づつ皮下注射した。皮下注射後、３日毎に２１日目まで腫瘍の大きさを観察した。腫瘍の大きさの測定は腫瘍の大きさの測定は短径及び長径をノギスを用いて測定し、以下の計算式にて体積を算出し、腫瘍の大きさとした。
（短径）×（短径）×（長径）／２
結果を図１２に示す。図１２は、各種細胞を投与した場合の腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。図１２のグラフにおいて、横軸は皮下注射後の経過日数であり、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ３）である。図１２のグラフは、ＳＣＩＤマウス５匹を用いて行った実験における平均、及び標準偏差を示す。図１２に示すように、ｖ３を投与した群においては、日数の経過とともに腫瘍の大きさは増加した。これに対し、ドミナントネガティブＫＰｉｍ−１であるｄｎｐ３、ｄｎｐ４及びｄｎｐ１０を投与した群においては、投与後６日目から腫瘍の大きさが減少した。このことより、ドミナントネガティブＰｉｍ−１が腫瘍形成能を欠失していることがわかる。
【実施例１３】  実施例１１で用いたマウスについて、皮下注射後６日経過したマウスから腫瘍細胞を切除し、ＰＣＮＡアポトーシス及びタネル染色の免疫組織化学染色を行った。結果を図１３に示す。
図１３において、ａはＶ３を皮下注射したマウスの腫瘍細胞のＰＣＮＡ染色像であり、ｂはｄｎＰ４を皮下注射したマウスの腫瘍細胞のＰＣＮＡ染色像であり、ｃはＶ３を皮下注射したマウスの腫瘍細胞のタネル染色像であり、ｄはｄｎＰ４を皮下注射したマウスの腫瘍細胞のタネル染色像である。図１３に示すように、ｖ３のＰＣＮＡ染色陽性細胞は、ｄｎＰ４のＰＣＮＡ染色細胞に比較して優位に多く、逆に、タネル染色陽性細胞はｄｎＰ４にのみ認められた。
これらの結果より、Ｐｉｍ−１の機能がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて膵臓癌の形成に必要であることが示された。
【実施例１４】  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｓｉ  ＲＮＡ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号：９で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるＳｉＲＮＡ、配列番号：１１で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号：１２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるＳｉＲＮＡ、配列番号：１３で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドと、配列番号：１４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドとからなるＳｉＲＮＡを作成した（それぞれを、Ｐｉｍ−１−ＲＮＡＳｉ−３７９、Ｐｉｍ−１−ＲＮＡＳｉ−７８４及びＰｉｍ−１−ＲＮＡＳｉ−８４８とした）。また、コントロールとして、配列番号：１５で表わされる塩基配列からなるＳｉＲＮＡを用いた（これを、ＧＦＰ−ｃｏｎｔｒｏｌとした）。ＰＣＩ−４３細胞（２×１０５細胞）を６穴のプレートにまき、１２時間インキュベートした。次いで、この細胞にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳｉＲＮＡを導入し、２４時間インキュベートし、５０μＭのシスプラチンとともに低酸素分圧下、及び正常酸素分圧下にて４８時間培養を行い、実施例１と同様にＦＡＣＳ解析を行った。
ＦＡＣＳ解析の結果を図１４に示す。図１４に示すように、コントロールについては、シスプラチンの存在下、正常酸素分圧下で培養することにより、低酸素分圧下に比べ、約２倍のアポトーシスが誘導された。これに対し、ＳｉＲＮＡの存在下で培養した場合には、正常酸素分圧下及び低酸素分圧下において差は認められなかった。
【実施例１５】  ｐＴＡＬ−Ｌｕｃベクターにｃ−Ｍｙｂの結合配列（配列番号：１６で表わされる塩基配列を有する、５’−ＴＡＡＣＧＧＴＴ−３’）を５個直列に継ぎ、作製したｃ−Ｍｙｂルシフェラーゼ発現ベクターと、ｐｃＤＮＡ３．１に全長のｃ−Ｍｙｂを結合した発現ベクターを導入したヒト胎児腎細胞２９３細胞株にｐｃＤＮＡ３．１−Ｐｉｍ−１発現ベクターと候補となる化合物を混合して、インキュベートした。インキュベートした後、デュアルルシフェラーゼ定量試薬（プロメガ株式会社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、候補となる化合物としては、実施例９で得られたドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントを用いた。
結果は図示しないが、ドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントを混合した時は、ルシフェラーゼ活性が阻害されており、この系によって、Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物を検索することが可能であることが確認された。
以上詳述した通り、低酸素分圧下に曝された種々の癌細胞においては、Ｐｉｍ−１の量が増加しており、正常酸素分圧下においてはＰｉｍ−１は分解されていた。ドミナントネガティブＰｉｍ−１によってＰｉｍ−１遺伝子の機能を阻害することにより、抗癌剤耐性が低下し、腫瘍形成能が低下した。
これらのことより、Ｐｉｍ−１タンパク質、又はＰｉｍ−１遺伝子の機能を阻害することにより、癌の治療、アポトーシス誘導、抗癌剤増強効果を発揮することが可能であり、従って、ドミナントネガティブＰｉｍ−１及びＰｉｍ−１の機能を阻害する化合物は癌の治療等に有効である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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