(57)【要約】検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法およびそれに用いる試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
【請求項２】
水性媒体が、さらに、アルブミンを含有する請求項１記載の方法。
【請求項３】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項３記載の方法。
【請求項５】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項３記載の方法。
【請求項６】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項６記載の方法。
【請求項８】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000044
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000045
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000046
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000047
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項１３】
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項１４】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項１３記載の試薬。
【請求項１５】
さらに、アルブミンを含有する請求項１２〜１４のいずれかに記載の試薬。
【請求項１６】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項１２〜１５のいずれかに記載の試薬。
【請求項１７】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項１６記載の試薬。
【請求項１８】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項１６記載の試薬。
【請求項１９】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１２〜１８のいずれかに記載の試薬。
【請求項２０】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項１９記載の試薬。
【請求項２１】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１２〜１８のいずれかに記載の試薬。
【請求項２２】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000048
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である請求項２１記載の試薬。
【請求項２３】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項１２〜１８のいずれかに記載の試薬。
【請求項２４】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000049
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000050
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000051
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である請求項２３記載の試薬。
【請求項２５】
コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項２６】
胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項２７】
過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項２８】
コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項２９】
胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項３０】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項２８または２９記載のキット。
【請求項３１】
さらに、アルブミンを、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項２５〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項２５〜３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項３２記載のキット。
【請求項３４】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項３２記載のキット。
【請求項３５】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項２５〜３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３６】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項２５〜３４のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000052
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項２５〜３４のいずれかに記載のキット。
【請求項４０】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000053
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000054
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000055
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000056
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000057
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物。
【請求項４２】
一般式（Ｖ）
2004035817.tif 000058
［式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表す］で表される化合物と、一般式（ＶＩ）
2004035817.tif 000059
（式中、Ｗ’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物、または、一般式（ＶＩＩ）
2004035817.tif 000060
（式中、Ｔは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物とを、縮合剤の存在下に反応させることを特徴とする一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000061
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000062
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、検体中の高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）中のコレステロールの測定方法、測定用試薬、測定用キット、新規胆汁酸誘導体および新規胆汁酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】  生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。その中で、ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
従来のＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと略記する）の測定法は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。
近年、上記の問題を解決するための種々の測定法が開発されている。例えば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる測定法として、デキストラン硫酸等のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法（特開平８−１３１１９７号公報）、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特開平８−２０１３９３号公報）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特開平９−２８５２９８号公報）等が知られている。また、血清または血漿を、リポ蛋白分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価陽イオンとの組み合わせ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特開平８−１１６９９６号公報）も知られている。
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるＨＤＬコレステロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷という問題がある。
また、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させない測定法として、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、ＨＤＬコレステロールを酵素的に測定する方法（特開平９−２９９号公報）、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、コール酸等の胆汁酸とを、アルブミンが存在する条件下で接触させ、ＨＤＬコレステロールと当該酵素との反応により消費される化合物または生成される化合物を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの測定方法（国際公開第９７／４０３７６号パンフレット）等が知られている。
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロール測定法においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの不完全な消去や、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
胆汁酸類を用いるＨＤＬコレステロール測定法としては、前記の特開平８−１１６９９６号公報や国際公開第９７／４０３７６号パンフレットに記載された方法の他に、例えば血清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、および、胆汁酸塩もしくは胆汁酸誘導体もしくはジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ中のコレステロールをＨＤＬコレステロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリオキシエチレンオキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、ＨＤＬコレステロールと当該酵素とを反応させ、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別定量する方法（特開昭６２−６９９９９号公報）、血清を、特定のｐＨおよび特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりＨＤＬコレステロールを測定する方法（特開昭６３−１２６４９８号公報）、生体試料を、アルブミンおよび胆汁酸もしくはその塩の存在下に、膵臓由来のコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼに接触させ、ＨＤＬコレステロールを当該酵素と反応させた後、処理された生体試料を微生物由来のコレステロールエステラーゼと接触させ、ＬＤＬコレステロールを当該酵素（微生物由来のコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ）と反応させることにより、ＨＤＬコレステロールおよびＬＤＬコレステロールを測定する方法（特開平１１−９３００号公報）、リポ蛋白を含有する試料を、胆汁酸誘導体および／または両性界面活性剤の存在下に酵素（コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ）と反応させ、ＨＤＬコレステロールを選択的に反応させた後、ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン性界面活性剤を反応液に添加し、ＨＤＬコレステロールを選択的に反応させることにより、ＨＤＬコレステロールおよび／またはＬＤＬコレステロールを測定する方法（特開２０００−３２５０９７号公報）等が知られている。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要する場合があり、また、必ずしも、ＨＤＬコレステロールに特異的な測定法ではなかった。
オキシエチレン基をエステル部分に有するコール酸のエステルは公知であるが（特開平５−２２１９４１号公報）、当該エステルを用いたＨＤＬコレステロールの測定法は知られていない。
エステル化合物の合成方法としては、一般的に、カルボン酸とアルコールとの縮合反応により合成する方法が簡便であり、特に酸触媒を用いる共沸エステル化法がよく利用されている。しかしながら、嵩高い置換基や水溶性基もつ化合物では収率が低いことがある（シー・ケー・インゴールド（Ｃ．Ｋ．Ｉｎｇｏｌｄ）著，「ストラクチャー・アンド・メカニズム・イン・オーガニック・ケミストリー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（英国），第２版，ベル（Ｂｅｌｌ）１９６９年，１５章，ｐ．１１２８−１１７８）。例えば、前記の特開平５−２２１９４１号公報には、酸触媒としてｐ−トルエンスルホン酸を用いたコール酸とジエチレングリコールモノメチルエーテルとの反応によるコール酸エステルの合成方法が記載されているが、７２時間という長時間の加熱還流を行っても、コール酸エステルの収率は２３％と極めて低く、また、後処理操作も複雑で煩雑である。
また、分子内に水酸基をもつようなカルボン酸では自己エステル化も進行するため、分子内の水酸基を保護してアルコールとのエステル化を行う方法も用いられている。例えば、ウルソデコール酸と２−ヒドロキシエチルオキシグルコシドとを用いたウルソデコール酸エステルの合成方法が知られているが（特開平１１−１９９５９８号公報）、本方法は、１）ウルソデコール酸の水酸基をＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリル）基で保護する工程、２）エステル化工程、および、３）脱保護（ＴＢＤＭＳ基の除去）工程を含有する方法であるため簡便な合成法とは言い難い。
【発明の開示】
本発明の目的は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正確に測定するための方法、ならびに、その方法に使用する測定試薬および測定キットを提供することにある。
本発明は、下記［１］〜［４２］に関する。
［１］  検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
［２］  水性媒体が、さらに、アルブミンを含有する［１］記載の方法。
［３］  コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［１］または［２］記載の方法。
［４］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［３］記載の方法。
［５］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［３］記載の方法。
［６］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である［６］記載の方法。
［８］  胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［９］  両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000002
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である［８］記載の方法。
［１０］  胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１１］  非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000003
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000004
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000005
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である［１０］記載の方法。
［１２］  コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［１３］  コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
［１４］  さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する［１３］記載の試薬。
［１５］  さらに、アルブミンを含有する［１２］〜［１４］のいずれかに記載の試薬。
［１６］  コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［１２］〜［１５］のいずれかに記載の試薬。
［１７］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［１６］記載の試薬。
［１８］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［１６］記載の試薬。
［１９］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１２］〜［１８］のいずれかに記載の試薬。
［２０］  陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である［１９］記載の試薬。
［２１］  胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１２］〜［１８］のいずれかに記載の試薬。
［２２］  両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000006
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である［２１］記載の試薬。
［２３］  胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［１２］〜［１８］のいずれかに記載の試薬。
［２４］  非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000007
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000008
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000009
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である［２３］記載の試薬。
［２５］  コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［２６］  胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［２７］  過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［２８］  コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［２９］  胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
［３０］  さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する［２８］または［２９］記載のキット。
［３１］  さらに、アルブミンを、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する［２５］〜［３０］のいずれかに記載のキット。
［３２］  コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［２５］〜［３１］のいずれかに記載のキット。
［３３］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［３２］記載のキット。
［３４］  化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である［３２］記載のキット。
［３５］  胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［２５］〜［３４］のいずれかに記載のキット。
［３６］  陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である［３５］記載のキット。
［３７］  胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［２５］〜［３４］のいずれかに記載のキット。
［３８］  両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000010
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物である［３７］記載のキット。
［３９］  胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である［２５］〜［３４］のいずれかに記載のキット。
［４０］  非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000011
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す）で表される化合物、または、一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000012
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000013
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物である［３９］記載のキット。
［４１］  一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000014
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000015
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物。
［４２］  一般式（Ｖ）
2004035817.tif 000016
［式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表す］で表される化合物と、一般式（ＶＩ）
2004035817.tif 000017
（式中、Ｗ’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物、または、一般式（ＶＩＩ）
2004035817.tif 000018
（式中、Ｔは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物とを、縮合剤の存在下に反応させることを特徴とする一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000019
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000020
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物の製造方法。
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、ＨＤＬコレステロールを測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等があげられるが、血漿および血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ３１１；東洋紡製社製）、リポプロテインリパーゼ“Ａｍａｎｏ”６（ＬＰＬ６；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ［ＣＯＥ３１３（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製］等があげられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等があげられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等があげられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等があげられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等があげられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等があげられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等があげられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳ、サンブライトＭＥＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ無水酢酸（ＤＴＰＡ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）等があげられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Ａｍａｎｏ”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯ−ＰＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Ａｍａｎｏ”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜１００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオ−ＮＡＤ、チオ−ＮＡＤＰ等があげられる。
本発明において用いられるアルブミンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等があげられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましくあげられる。また、遺伝子工学的な手法により製造されるアルブミンも使用することができる。本発明においては、由来の異なる２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
本発明における胆汁酸誘導体としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする胆汁酸誘導体であれば特に制限はないが、例えば陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体等があげられる。
本発明の胆汁酸誘導体としては、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素等のコレステロール測定酵素を用いたＨＤＬコレステロールの測定の正確性もしくは再現性の点、またはコレステロール測定酵素の保存安定性の点等で特に好ましい。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソリトコール酸もしくはその塩、１２−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、７−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等があげられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等があげられる。陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜３０％であることが好ましく、０．０１〜３％がより好ましい。
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（Ｉ）
2004035817.tif 000021
［式中、Ｒ１は、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ基であり、Ｒ２は、水素原子または水酸基である］で表される化合物［以下、化合物（Ｉ）という］等があげられる。以下、Ｒ２が水素原子である化合物（Ｉ）をＣＨＡＰＳと、Ｒ２が水酸基である化合物（Ｉ）をＣＨＡＰＳＯとよぶ。両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜３０％であることが好ましく、０．０１〜３％がより好ましい。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（ＩＩ）
2004035817.tif 000022
（Ｘは、水素原子または水酸基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル、または、置換もしくは非置換のアルカノイルを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩ）という］等があげられる。化合物（ＩＩ）におけるアルキル基、アルカノイル基に共通のアルキルとしては、直鎖または分枝状の炭素数１〜１０の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等があげられる。化合物（ＩＩ）中の置換アルキル基および置換アルカノイル基における置換基としては、例えば水酸基、ハロゲン原子等があげられる。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。化合物（ＩＩ）のうち、Ｒ３およびＲ４が共に、
2004035817.tif 000023
（以下、置換基Ａという）である化合物が好ましい。以下、Ｘ、Ｒ３およびＲ４がそれぞれ、水素原子、置換基Ａおよび置換基Ａである化合物をｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、水酸基、置換基Ａおよび置換基Ａである化合物をＢＩＧＣＨＡＰという。
また、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式（ＩＩＩ）
2004035817.tif 000024
｛式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、Ｑは、酸素原子またはＮＨを表し、Ｗは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式（ＩＶ）
2004035817.tif 000025
［式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表し、ｍは、０または１を表す］で表される基［以下、置換基（ＩＶ）という］を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す｝で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ）という］もあげることができる。
化合物（ＩＩＩ）は、例えば一般式（Ｖ）
2004035817.tif 000026
［式中、Ｘ、ＹおよびＺは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ（＝Ｏ）基を表す］で表される化合物［以下、化合物（Ｖ）という］と、一般式（ＶＩ）
2004035817.tif 000027
（式中、Ｗ’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＶＩ）という］、または、一般式（ＶＩＩ）
2004035817.tif 000028
（式中、Ｔは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、ｎは、３〜４００の整数を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＶＩＩ）という］とを、縮合剤の存在下、溶媒中で反応させることにより製造（合成）することができる。本反応においては、必要に応じて塩基を共存させることもできる。
Ｘ，ＹおよびＺは水素原子、水酸基またはオキソ基を表すが、Ｘ，Ｙ，Ｚのうち少なくとも１つは水酸基であることが好ましい。Ｘ’，Ｙ’およびＺ’は水素原子、水酸基またはオキソ基を表すが、Ｘ’，Ｙ’，Ｚ’のうち少なくとも１つは水酸基であることが好ましい。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるアルキル基、アルカノイル基に共通のアルキル基としては、直鎖または分岐状の炭素数１〜１８の、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、オクチル基、イソオクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、イソデシル基、ウンデシル基、イソウンデシル基、ドデシル基、イソドデシル基、トリデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、イソテトラデシル基、ペンタデシル基、イソペンタデシル基、ヘキサデカシル基、イソヘキサデカシル基、ヘプタデシル基、イソヘプタデシル基、オクタデカシル基、イソオクタデカシル基等があげられ、メチル基、エチル基、プロピル基、ノニル基、ドデシル基等が好ましい。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるアルケニル基、アルケノイル基に共通のアルケニル基としては、直鎖または分岐状の炭素数２〜８の、例えばビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等があげられる。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるアルキニル基、アルキノイル基に共通のアルキニル基としては、直鎖または分岐状の炭素数２〜８の、例えばエチニル基、プロピニル基、プロパルギル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等があげられる。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるシクロアルキル基としては、炭素数３〜８の、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等があげられる。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるシクロアルケニル基としては、炭素数４〜８の、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基等があげられる。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩ）におけるアリール基としては、炭素数６〜１５の、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ビフェニル基等があげられる。化合物（ＩＩＩ）における置換アリール基の置換基としては、例えばアルキル基等があげられる。該アルキル基としては、例えば前述のアルキル基が挙げられる。
化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩＩ）における置換アミノアルキル基としては、例えばＮ−一置換アミノアルキル基、Ｎ，Ｎ−二置換アミノアルキル基等が挙げられる。Ｎ，Ｎ−二置換アミノアルキル基における窒素原子上の２つの置換基は同じでも異なっていてもよい。Ｎ−一置換アミノアルキル基およびＮ，Ｎ−二置換アミノアルキル基における窒素原子上の置換基としては、例えば前述のアルキル基等が挙げられる。Ｎ−一置換アミノアルキル基としては、例えば２−（Ｎ−メチルアミノ）エチル基、２−（Ｎ−エチルアミノ）エチル基、２−（Ｎ−プロピルアミノ）エチル基、２−（Ｎ−ブチルアミノ）エチル基、３−（Ｎ−メチルアミノ）プロピル基、３−（Ｎ−エチルアミノ）プロピル基、３−（Ｎ−プロピルアミノ）プロピル基、３−（Ｎ−ブチルアミノ）プロピル基、４−（Ｎ−メチルアミノ）ブチル基、４−（Ｎ−エチルアミノ）ブチル基、４−（Ｎ−プロピルアミノ）ブチル基、４−（Ｎ−ブチルアミノ）ブチル基等を具体的に挙げることができる。Ｎ，Ｎ−二置換アミノアルキル基としては、例えば２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル基、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピル基、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ブチル基等を具体的に挙げることができる。化合物（ＩＩＩ）および化合物（ＶＩＩ）における非置換アミノアルキル基としては、２−アミノエチル基、３−アミノプロピル基、４−アミノブチル基等を具体的に挙げることができる。
ｎは、エステル部分におけるオキシエチレン基の平均重合度を表す。平均重合度は、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする範囲であれば特に制限はないが、３〜４００が好ましく、８〜３００がより好ましく、１５〜２００が特に好ましい。
化合物（Ｖ）としては、例えばコール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等があげられる。
Ｗが、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基および置換もしくは非置換のアミノアルキル基からなる群より選ばれる基である化合物（ＩＩＩ）［以下、化合物（ＩＩＩａ）という］を合成する場合には、化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）の化合物（Ｖ）に対する当量比は、０．５〜１．５が好ましく、１〜１．２がより好ましい。Ｗが、一般式（ＩＶ）で表される基である化合物（ＩＩＩ）［以下、化合物（ＩＩＩｂ）という］を合成する場合には、化合物（Ｖ）の化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）に対する当量比は、１．３〜４．１が好ましく、１．７〜２．２がより好ましい。
化合物（ＩＩＩ）を合成する際の反応温度としては、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３５℃がより好ましい。化合物（ＩＩＩ）を合成する際の反応溶媒としては、化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩ）との縮合反応を妨げないような溶媒であれば特に制限はないが、例えば有機溶媒があげられる。該有機溶媒としては、例えばトルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、酢酸エチル等の脂肪族エステル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒等があげられる。
化合物（ＩＩＩ）を合成する際に使用する縮合剤としては、化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）との縮合反応を進行させるものであれば特に制限はないが、例えばカルボジイミド類、ピリジニウム塩、（ベンゾ）チアゾリウム塩、（ベンゾ）オキサゾリウム塩、イソシアナート類、カルボニル試薬等があげられるが、カルボジイミド類が好ましい。カルボジイミド類としては、例えば１，３−ジシクロヘキシルカルボジミド、１，３−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）カルボジミド、１，３−ジイソプロピルカルボジミド、水溶性カルボジイミド等があげられるが、水洗浄除去の簡便さから、特に水溶性カルボジミドが好ましい。水溶性カルボジミドとしては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドまたはその塩等があげられる。該塩としては、例えば塩酸塩、沃化メチル塩等があげられる。ピリジニウム塩としては、例えば２−クロロメチルピリジニウムヨード塩、２−ブルモメチルピリジニウムヨード塩等があげられる。（ベンゾ）オキサゾリウム塩としては、例えば２−クロロベンゾオキサゾリウムフッ化ホウ素塩等があげられる。（ベンゾ）チアゾリウム塩としては、例えば２−クロロベンゾチアゾリウムフッ化ホウ素塩等があげられる。イソシアナート類としては、例えばクロロスルホニルイソシアナート等があげられる。カルボニル試薬としては、例えば１，１−カルボニルジイミダゾール等があげられる。
縮合反応における縮合剤の当量数としては、化合物（ＩＩＩａ）を合成する場合には、化合物（Ｖ）に対して１．０〜５．０当量が好ましく、１．１〜２．５当量がより好ましく、化合物（ＩＩＩｂ）を合成する場合には、化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）に対して１．０〜５．０当量が好ましく、１．１〜２．５当量がより好ましい。
化合物（ＩＩＩ）を合成する際に必要に応じて使用する塩基としては、例えばピリジン類縁体があげられる。該ピリジン類縁体としては、例えばピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、４−ピコリン、２−エチルピリジン、３−エチルピリジン、４−エチルピリジン、２−プロピルピリジン、３−プロピルピリジン、４−プロピルピリジン、２，６−ルチジン、２，３−ルチジン、２，４−ルチジシ、２，５−ルチジン、３，４−ルチジン、３，５−ルチジン、２，４，６−コリジン、２，３，５−コリジン、２−ジメチルアミノピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロリジノピリジン、４−ピペリジノピリジン等があげられ、特に４−ジメチルアミノピリジン、４−ピロリジノピリジン、４−ピペリジノピリジンが好ましい。ピリジン類縁体の当量としては、化合物（Ｖ）に対して０．０１〜２．５当量が好ましく、０．７〜１．２当量がより好ましい。
化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）との縮合反応の後処理としては、例えば水または水と有機溶媒との混合溶媒を反応溶液に加え、生成した反応混合物から化合物（ＩＩＩ）［化合物（ＩＩＩａ）または化合物（ＩＩＩｂ）］を有機溶媒で抽出し、抽出した溶液に含まれる水を乾燥剤で除去した後、該乾燥剤をろ過し、得られたろ液中の溶媒を常圧下または減圧下で留去する、という一連の操作があげられる。また、化合物（ＩＩＩ）を含有する抽出溶液を酸で洗浄し、該抽出溶液中の塩基性物質（縮合剤、縮合剤由来物質、塩基）を除去してもよい。酸で洗浄された抽出溶液は、さらに水または食塩水で洗浄されることが好ましい。反応溶液中に加えられる有機溶媒は、反応に使用される有機溶媒と同じでも異なってもよいが、同じであることが好ましい。また、反応溶液中に加えられる有機溶媒と抽出に使用される有機溶媒とは同じでも異なってもよい。反応溶液中に加えられる有機溶媒や抽出に使用される有機溶媒としては、例えば前述の有機溶媒があげられ、中でもジクロロメタン、酢酸エチル等が好ましい。
化合物（Ｖ）と化合物（ＶＩ）または化合物（ＶＩＩ）との縮合反応の後処理により得られる化合物（ＩＩＩ）を含有する反応混合物は、そのままでもＨＤＬコレステロールの測定に使用できるが、適宜、分離・精製操作により精製されたものも使用することもできる。該分離・精製方法としては、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、蒸留、分留、再結晶等があげられる。
非イオン性界面活性を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜３０％であることが好ましく、０．０１〜３％がより好ましい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等があげられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
以下に、本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを具体的に説明する。
（ＨＤＬコレステロールの測定方法）
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法があげられる。
測定方法１
（１）検体と、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法２
（１）検体と、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法３
（１）検体と、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検最線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
測定方法４
（１）検体と、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
本測定法においては、（１）の反応は、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間反応を行う。
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素測定用試薬により測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等があげられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体があげられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等があげられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等があげられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等があげられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等があげられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００〜５００ｎｍが好ましく、３３０〜４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等があげられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬があげられる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等があげられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等があげられる。
（ＨＤＬコレステロニル測定用試薬）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬があげられる。
試薬１
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬３
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬４
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬５
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬６
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬７
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬８
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬９
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬１０
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬１１
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬１２
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬においては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法においてあげられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
（ＨＤＬコレステロール測定用キット）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれであってもよいが、２試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好ましい。胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。また、アルブミンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
具体的には、例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット１
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット２
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット３
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット４
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット５
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット６
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット７
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット８
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット９
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１０
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１１
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１２
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１３
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１４
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１５
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１６
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット１７
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１８
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット１９
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット２０
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット２１
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット２２
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット２３
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット２４
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法においてあげられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等があげられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等があげられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等があげられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類といったものがあげられる。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＨＤＬコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜８００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．０２〜４００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜３０％となる含量が好ましく、０．０１〜１０％となる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜１０％となる含量が好ましく、０．０１〜５％となる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬および酵素を使用した。
ＨＥＰＥＳ（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；オリエンタル社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＬＰＬ３１１（コレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）、ＬＰＬ６（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＣＨＥ２（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＣＯＥ３１３（化学修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素；東洋紡績社製）、ＣＯＯ３２１（コレステロールオキシダーゼ；東洋紡績社製）、コール酸ナトリウム（ＡＣＲＯＳ社製）、タウロコール酸ナトリウム（東京化成社製）、ＢＩＧＣＨＡＰ（同仁化学社製）、ＣＨＡＰＳ（同仁化学社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万；ファルマシア社製）。
また、本実施例において、胆汁酸誘導体の同定に際して、下記の分析機器を用いて各種データを取得した。
核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ，１３Ｃ−ＮＭＲ）：ＪＥＯＬ  ＧＳＸ−４００（日本電子社製）
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定においては、テトラメチルシランを内部標準として用い、テトラメチルシランを基準とした化学シフト（δ）を表す。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル測定においては、ＣＤＣｌ３由来の３本のピークの中心のピークを７７．０ｐｐｍとした時の各ピークの化学シフト（δ）を表す。
赤外吸収スペクトル（ＩＲ）：Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＮＥＸＵＳ４７０（ニコレー社製）
ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）：
システム：ＴＯＳＯＨ  ＨＬＣ−８１２０ＧＰＣ（東ソー社製）
ＧＰＣカラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｈ−ＲＣ（低分子分析用）（東ソー社製）２本を直列接続した。
カラム保持温度：４０℃
展開溶媒：テトラヒドロフラン
流速：０．５ｍＬ／分
検出器：ＲＩ（屈折率）
検量線作成用標準物質：ポリエチレングリコール
【発明を実施するための最良の形態】参考例１  化学修飾ＬＰＬ３１１（化学的に修飾されたＬＰＬ３１１）の調製
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５，０．１５ｍｏｌ／Ｌ）に、ＬＰＬ３１１を３３ｇ／Ｌとなるように加え５℃に冷却した後、サンブライトＶＦＭ−４１０１またはサンブライトＡＫＭ−１５１０またはサンブライトＭＥＡＣ−５０ＨＳ（いずれも日本油脂社製）を３３０ｇ／Ｌとなるように加え、さらに３時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾ＬＰＬ３１１として使用した。
参考例２  化学修飾ＣＨＥ２（化学的に修飾されたＣＨＥ２）の調製
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５，０．１５ｍｏｌ／Ｌ）に、ＣＨＥ２を５０ｇ／Ｌとなるように加え５℃に冷却した後、サンブライトＶＦＭ−４１０１（日本油脂社製）を２００ｇ／Ｌとなるように加え、さらに３時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾ＣＨＥ２として使用した。
実施例１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                      ７．０ｇ／Ｌ
実施例４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                      ７．０ｇ／Ｌ
実施例５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＢＩＧＣＨＡＰ                                ４．５ｇ／Ｌ
実施例６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＢＩＧＣＨＡＰ                                ４．５ｇ／Ｌ
実施例７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ                                    ６．０／Ｌ
実施例８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ                                    ６．０ｇ／Ｌ
比較例１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０／Ｌ
実施例１０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例１１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５Ｕ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                      ７．０ｇ／Ｌ
実施例１２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム                      ７．０ｇ／Ｌ
実施例１３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＢＩＧＣＨＡＰ                                ４．５ｇ／Ｌ
実施例１４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＢＩＧＣＨＡＰ                                ４．５ｇ／Ｌ
実施例１５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ                                    ６．０ｇ／Ｌ
実施例１６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ                                    ６．０ｇ／Ｌ
比較例３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
比較例４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＬＰＬ６                                      ０．０５ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
実施例１７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＣＨＥ２（ＶＦＭ−４１０１で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例１８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＭＥＡＣ−５０ＨＳで修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例１９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＡＫＭ−１５１０で修飾したもの）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例２０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
ＣＯＥ３１３                                  １．０ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ３．０ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                            ６．０ｇ／Ｌ
実施例２１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットを用いて、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＨＤＬコレステロール濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）および血清（ＨＤＬコレステロール濃度：６０．０ｍｇ／ｄＬ）を、キットとして実施例１のキットを用いて、日立７１７０型自動分析装置により、ＨＤＬコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１およびＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（３μＬ）と第一試薬（０．２４ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０８ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体と実施例１のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
（３）ヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度の測定
（２）で算出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。
実施例２２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例７のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例８のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例２のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例２９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例９のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１０のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１１のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１２のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１３のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１４のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１５のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１６のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例３のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例４のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１７のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１８のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例３９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例１９のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例４０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例２０のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
一方、実施例２１〜４０および比較例５〜８の測定において用いたヒト血清３０検体を用いて、クリニカルケミストリー第４５巻、１０号（１９９９年）に記載されたＤＣＭ法（Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）により当該検体中のＨＤＬコレステロールを測定し、各測定法と比較した。
実施例２１〜４０および比較例５〜８それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表１に示す。
2004035817.tif 000029
実施例２１〜２８の結果から明らかなように、コレステロールエステル加水分解酵素として化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた場合には、アルブミンの有無にかかわらず、コール酸、タウロコール酸、ＢＩＧＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳのいずれの胆汁酸誘導体の存在下でも、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が認められたが、比較例５および６に示されているように、胆汁酸誘導体の非存在下では、アルブミンの有無にかかわらず、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が認められなかった。
一方、実施例２９と実施例３０、実施例３１と実施例３２、実施例３３と実施例３４、実施例３５と実施例３６との比較から、コレステロールエステル加水分解酵素として無修飾の酵素を用いた場合には、胆汁酸誘導体としてコール酸またはタウロコール酸を存在させた条件下では、アルブミンを添加した方がＤＣＭ法による測定との間の相関が良好であったが、胆汁酸誘導体としてＢＩＧＣＨＡＰまたはＣＨＡＰＳを存在させた条件下では、アルブミンの有無にかかわらず、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。
また、実施例２１と実施例３７との比較より、化学修飾ＬＰＬ３１１以外の化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定においても、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。さらに、実施例２１と実施例３８との比較、および、実施例２１と実施例３９との比較より、化学修飾剤として、ＶＦＭ−４１０１以外の修飾剤を用いて調製した化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた場合においても、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。また、実施例２１と実施例４０との比較より、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として市販品を用いた場合においても、ＤＣＭ法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。
実施例４１  コール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−１）］の合成
滴下装置、攪拌装置、温度計、冷却管および窒素ガス導入管を備えたフラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量２０００、アルドリッチ社製）１１０ｇ（５５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）６．７ｇ（５５ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン１００ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）２０．４ｇ（５０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）１０．５ｇ（５５ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン２００ｍＬ、水３００ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸２００ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水３００ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル５００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−１）１１５ｇ（収率９６％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000030
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６９（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．４０（ｍ，２７Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｂｓ，１７９Ｈ），３．９７（ｓ，２Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，２２．５，２３．２，２６．４，２７．５，２８．３，３０．４，３０．８，３１．１，３４．７，３５．２，３５．３，３９．５，３９．６，４１．５，４１．７，４６．４，４７．０，５９．０，６３．４，６８．２，６９．１，７０．５，７０．９，７１．７，７１．９，７２．９，１７４．２．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８７，１７３４，１４６８，１３４３，１１４９，１１１１，１０６０，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２３９０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０５）．
実施例４２  コール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−２）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量４００、日本油脂社製ユニオックスＭ−４００）４．８ｇ（１２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．４６ｇ（１２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン３０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン２０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル１００ｍＬを加え、１０％食塩水１００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−２）７．８ｇ（収率９５％）を無色油状物質として得た。
2004035817.tif 000031
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．３１（ｍ，２７Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｂｓ，１Ｈ），３．５５（ｂｓ，２Ｈ），３．６５（ｂｓ，３２Ｈ），３．８５（ｂｓ，１Ｈ），３．９６（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，２２．５，２３．２，２６．３，２７．５，２８．２，３０．４，３０．９，３１．２，３４．７，３４．８，３５．３，３９．５，４１．５，４１．６，４６．４，４７．０，５９．０，６３．４，６８．４，６９．２，７０．６，７１．８，７１．９，７３．０，１７４．３．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２９３１，２８６８，１７３４，１４５１，１３７５，１２９９，１２５１，１１１０，１１１１，１０４５，９５０，８５６．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ８２０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０４）．
実施例４３  コール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−３）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量１０００、日本油脂社製ユニオックスＭ−１０００）１２ｇ（１２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．４６ｇ（１２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン３０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水２００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−３）１３．２ｇ（収率９５％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000032
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．４５（ｍ，２７Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４６（ｂｓ，１Ｈ），３．５５（ｂｓ，２Ｈ），３．６４（ｂｓ，８４Ｈ），３．８４（ｂｓ，１Ｈ），３．９６（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，２２．５，２３．２，２６．４，２７．５，２８．３，３０．４，３０．８，３１．２，３４．８，３５．３，３９．５，４１．５，４１．７，４６．４，４７．０，５９．０，６３．４，６８．３，６９．１，７０．５，７０．９，７１．８，７１．９，７２．９，１７４．２．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８７０，１７３２，１４６６，１３４５，１１１２，９５０，８４４．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ１４３０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０４）．
実施例４４  コール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−４）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量５０００、アルドリッチ社製）５５ｇ（約１１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．４６ｇ（１２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン１００ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル３００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−４）４８．５ｇ（収率９０％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000033
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６９（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．４３（ｍ，２７Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｂｓ，４７３Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．２，２２．５，２３．１，２６．４，２７．４，２８．３，３０．４，３０．８，３１．０，３４．６，３４．７，３５．１，３５．３，３９．５，３９．６，４１．５，４１．６，４６．３，４６．８，５８．９，５９．０，６１．４，６３．３，６７．９，６９．０，６９．６，７０．２，７０．５，７０．７，７１．０，７１．３，７１．５，７１．８，７２．５，１７４，０．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８８，１７３４，１４６８，１３４３，１２８１，１１１２，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ５３７０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０４）．
実施例４５  デオキシコール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−５）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量２０００、アルドリッチ社製）２２ｇ（１１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．３４ｇ（１１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にデオキシコール酸３．９３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−５）２４．２ｇ（収率９９％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000034
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．４５（ｍ，２８Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｂｓ，１Ｈ），３．６５（ｂｓ，１７８Ｈ），３．８０（ｂｓ，１Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．７，１７．３，２３．２，２６．１，２７．１，２７．４，２８．７，３０．４，３０．８，３１．１，３３．６，３４．１，３５．１，３５．３，３６．０，３７．０，４２．０，４６．４，４７．２，４８．２，５９．０，６１．６，６３．４，６９．１，７０．３，７０．５，７０．９，７１．２，７１．９，７２．６，７２．９，１７４．１．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８９，１７３５，１４６８，１３４３，１２８１，１１１２，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２５１０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０８）．
実施例４６  ウルソデオキシコール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−６）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコールメチル  エーテル（平均分子量２０００、アルドリッチ社製）２２ｇ（１１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．３４ｇ（１１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にウルソデオキシコール酸３．９３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−６）２３．７ｇ（収率９９％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000035
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ），０．９６−２．４５（ｍ，２８Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｂｓ，１８０Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．１，１８．４，２３．４，２６．９，２８．５，３０．３，３０．９，３１．１，３４．０，３５．０，３５．２，３７．１，３７．３，３９．１，４０．１，４２．４，４３．７，５４．９，５５．８，５９．０，６１．６，６３．３，６９．１，７０．３，７０．５，７０．８，７１．０，７１．１，７１．９，７２．５，１７４．０．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８９，１７３６，１４６８，１３４３，１２８１，１１１２，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２５３０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０８）．
実施例４７  ケノデオキシコール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−７）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール  メチル  エーテル（平均分子量２０００、アルドリッチ社製）２２ｇ（１１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．３４ｇ（１１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にケノデオキシコール酸３．９３ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−７）２３．２ｇ（収率９７％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000036
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６６（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｓ，３Ｈ），０．９２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．９２−２．４３（ｍ，２８Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｂｓ，１８０Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１１．８，１８．３，２２．８，２３．６，２８．１，３０．６，３０．９，３１．０，３２．８，３４．７，３５．０，３５．３，３５．４，３９．４，３９．６，３９．８，４１．５，４２．６，５０．４，５５．７，５９．０，６１．６，６３．３，６８．２，６９．１，６９．６，７０．３，７０．５，７０．８，７１．４，７１．７，７１．９，７２．６，１７４．１．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８９，１７３６，１４６８，１３４３，１２８１，１１１１，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２５６０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０９）．
実施例４８  リトコール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−８）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコールメチル  エーテル（平均分子量２０００、アルドリッチ社製）２２ｇ（１１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．３４ｇ（１１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にリトコール酸３．７７ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−８）２３．３ｇ（収率９８％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000037
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６４（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．９２（ｓ，３Ｈ），０．９２−２．４１（ｍ，２９Ｈ），３．３８（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｂｓ，１７９Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．０，１８．３，２０．８，２３．４，２４．２，２６．４，２７．２，２８．１，３０．５，３０．９，３１．１，３４．５，３５．３，３５．４，３５．８，３６．４，４０．１，４０．４，４２．０，４２．７，５５．９，５６．４，５９．０，６１．６，６３．３，６９．１，６９．７，７０．３，７０．５，７０．６，７０．７，７０．８，７１．１，７１．５，７１．９，７２．６，１７４．１．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８８，１７３６，１４６８，１３４３，１２８１，１１１１，９６３，８４２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２６４０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０６）．
実施例４９  両末端コール酸エステル［化合物（ＩＩＩｂ−１）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール（第一工業製薬社製、ＰＥＧ  ２０００）１０ｇ（５ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）２．６８ｇ（２２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）４．６ｇ（２４ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩｂ−１）１３．２ｇ（収率９４％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000038
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，６Ｈ），０．９０（ｓ，６Ｈ），０．９９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，６Ｈ），０．９２−２．６７（ｍ，５４Ｈ），３．６５（ｂｓ，１８０Ｈ），３．９６（ｂｓ，２Ｈ），４．２２（ｂｓ，４Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，２２．４，２３．２，２６．３，２７．５，２８．２，３０．３，３０．８，３１．２，３４．７，３５．３，３９．５，４１．５，４１．６，４６．４，４６．５，４６．９，６１．６，６３．４，６８．３，６９．１，６９．７，７０．２，７０．４，７０．５，７０．６，７０．８，７１．３，７１．７，７２．６，７２．９，１７４．２．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：２８８５，１７３４，１４６８，１３４５，１２８１，１１１３，９６４，８４２ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２９４０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０５）．
実施例５０  コール酸エステル［化合物（ＩＩＩａ−９）］の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール（第一工業製薬社製、ＰＥＧ  ６００）１２ｇ（２０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．５ｇ（１２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−９）７．７ｇ（収率９０％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000039
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，３Ｈ），０．９２−２．５０（ｍ，２７Ｈ），３．１５（ｂｓ，１Ｈ），３．４４（ｂｓ，１Ｈ），３．６６（ｂｓ，５４Ｈ），３．８４（ｂｓ，１Ｈ），３．９６（ｂｓ，１Ｈ），４．２３（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，２２．５，２３．２，２６．３，２７．５，２８．２，３０．３，３０．８，３１．２，３４．７，３４．８，３５．３，３５．４，３９．５，４１．５，４６．４，４７．０，６１．５，６３．４，６８．３，６９．１，６９．７，７０．２，７０．５，７１．８，７２．６，７３．０，１７４．３．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：３４０４，２９２９，２８６８，１７３２，１４５３，１３５２，１２５１，１１０３，９５１．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ１０５０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０５）．
実施例５１  コール酸アミド［化合物（ＩＩＩｂ−２）］の合成
フラスコ内に、ポリオキシエチレンジアミン（平均分子量２０００、川研ファインケミカル社製ＰＥＯアミン＃２０００）１０ｇ（５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）２．５６ｇ（２１ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）４．６ｇ（２４ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。有機層を０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸５０ｍＬにて洗浄し、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル２００ｍＬを加え、１０％食塩水３００ｍＬで３回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩｂ−２）１２．４ｇ（収率８８％）を白色のロウ状固体として得た。
2004035817.tif 000040
１Ｈ−ＮＮＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，６Ｈ），０．８９（ｓ，６Ｈ），０．９９（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，６Ｈ），１．１２−２．２８（ｍ，４８Ｈ），２．７２（ｂｓ，６Ｈ），３．３１（ｂｓ，２Ｈ），３．３４（ｂｓ，４Ｈ），３．６５（ｍ，１７６Ｈ），３．９６（ｂｓ，４Ｈ），４．２２（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．４，２２．５，２３．３，２６．３，２７．６，２８．１，２９．１，３０．３，３１．７，３３．２，３４．８，３５．４，３７．５，３９．４，４１．５，４６．３，４６．５，６８．３，６９．７，７０．１，７０．２，７０．５，７０．８，７１．７，７３．０，１７４．１．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｄｉｓｋ，ｃｍ−１）：３４４２，２９１２，２８７１，１６４８，１４５６，１３５２，１２５１，１１０７，９５２．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ２９９０（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０７）．
実施例５２  コール酸アミド［化合物（ＩＩＩａ−１０）］の合成
フラスコ内に、ポリオキシエチレンジアミン（平均分子量１０００、川研ファインケミカル社製ＰＥＯアミン＃１０００）１５ｇ（１５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（広栄化学工業社製）１．４６ｇ（１２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン５０ｍＬを加え、溶解した。その溶解液にコール酸（ミクニ化学産業社製）４．０８ｇ（１０ｍｍｏｌ）、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジミドの塩酸塩（アイバイツ社製）２．３ｇ（１２ｍｍｏｌ）を加えた。窒素雰囲気下で１２時間室温攪拌し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水５０ｍＬを加え、抽出した。分離した有機層に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２２ｍＬおよび水５０ｍＬを加えて洗浄し、さらに、１０％食塩水５０ｍＬで２回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去し、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて８０℃で２時間減圧乾燥し、化合物（ＩＩＩａ−１０）１１．９ｇ（収率８６％）を薄黄色の粘稠な液体として得た。
2004035817.tif 000041
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，４００ＭＨｚ）：０．６８（ｓ，３Ｈ），０．８９（ｓ，３Ｈ），０．９９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，３Ｈ），０．９８−２．２８（ｍ，２４Ｈ），２．８９（ｂｓ，３Ｈ），３．２９（ｂｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｂｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５３（ｂｓ，１Ｈ），３．６４（ｂｓ，８４Ｈ），３．８３（ｂｓ，２Ｈ），３．９６（ｂｓ，２Ｈ），４．２２（ｓ，２Ｈ），７．２８（ｂｓ，１Ｈ），７．８５（ｂｓ，２Ｈ）．１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，１００ＭＨｚ）：１２．５，１７．３，１７．４，２２．４，２３．３，２６．３，２６．５，２７．６，２８．１，２９．１，３０．３，３１．７，３３．１，３４．７，３４．８，３５．４，３７．３，３９．２，３９．５，４１．６，４６．３，４６．５，６８．２，６９．３，６９．４，６９．６，７０．０，７０．１，７０．２，７０．３，７０．４，，７０．８，７１．７，７３．０，１７４．１．ＩＲ（ＫＢｒ  Ｎｅａｔ，ｃｍ−１）：３３７２，２８６７，１６４８，１４６４，１３５０，１２９８，１２５１，１１１０，９５０．ＧＰＣ（平均分子量）：Ｍｗ１４００（Ｍｗ／Ｍｎ  １．０６）．
実施例５３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−１）                        ６．０ｇ／Ｌ
実施例５４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
．第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−２）                        ０．１５ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
実施例５５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−３）                        １．５ｇ／Ｌ
実施例５６  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩｂ−２）                        １．０ｇ／Ｌ
実施例５７  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−５）                        ０．５ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
実施例５８  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−１）                        ６．０ｇ／Ｌ
実施例５９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−１）                        ６．０ｇ／Ｌ
実施例６０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩｂ−２）                        １．０ｇ／Ｌ
実施例６１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−２）                        ０．１５ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
実施例６２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−３）                        １．５ｇ／Ｌ
実施例６３  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−１）                        ６．０ｇ／Ｌ
実施例６４  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩｂ−２）                        １．０ｇ／Ｌ
実施例６５  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−３）                        １．５ｇ／Ｌ
比較例９  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
比較例１０  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
比較例１１  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
比較例１２  ＨＤＬコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
・第一試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３ｇ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ２．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）    １．０ｇ／Ｌ
・第二試薬
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                      １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                              ２０ｋＵ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ−４１０１で修飾）
０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＯＯ３２１                                  ５．０ｋＵ／Ｌ
実施例６６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５３のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例６７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５４のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例６８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５５のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例６９  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５６のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７０  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５７のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７１  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５８のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７２  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例５９のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７３  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６０のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７４  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６１のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７５  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６２のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７６  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６３のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７７  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６４のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
実施例７８  ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに実施例６５のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１３    ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例９のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１４    ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１０のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１５    ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１１のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
比較例１６    ＨＤＬコレステロールの測定
実施例１のキットの代わりに比較例１２のキットを用いる以外は実施例２１の測定法と同様にして、日立７１７０型自動分析装置によりヒト血清３５検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。一方、実施例６６〜７８および比較例１３〜１６の測定において用いたヒト血清３５検体を用いて、ＤＣＭ法により当該検体中のＨＤＬコレステロールを測定し、各測定法と比較した。実施例６６〜７８および比較例１３〜１６それぞれの測定法と、ＤＣＭ法による測定法との相関係数を表２に示す。
2004035817.tif 000042
実施例６６〜７０と比較例１３より、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル類または胆汁酸アミド類を用いた場合において、ＤＣＭ法による測定との間に良好な相関が得られた。また、実施例７１と比較例１４、実施例７２〜７５と比較例１５、実施例７６〜７８と比較例１６との対比から、ＢＳＡまたはデキストラン硫酸を添加した条件下、もしくは両化合物を添加した条件下においても、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル類または胆汁酸アミド類を用いた場合においてＤＣＭ法による測定との間に良好な相関係数が得られることが判明した。
試験例１  各種胆汁酸誘導体（陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤）がコレステロール測定酵素の安定性へ及ぼす影響
ＨＤＬコレステロール測定用キットの第二試薬として使用される下記組成１〜８からなる試薬を調製し、それぞれ４０℃にて４８時間（２日）、１２０時間（５日）保存した。調製直後の組成１〜８からなる各試薬、４０℃にて２日間保存した各試薬および４０℃にて５日間保存した各試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素（ＬＰＬ３１１）およびコレステロール酸化酵素（ＣＯＯ３２１）それぞれの酵素活性を測定し、調製直後の各試薬における酵素活性に対する保存後の各試薬における酵素活性の比率（酵素活性残存率）（％）を求めた。
酵素活性は以下の方法により求めた。
（１）コレステロールエステル加水分解酵素活性測定法
測定試薬
０．１５ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）
トリトンＸ−１００          ２ｇ／Ｌ
フェノール                  ０．１５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ            ２０ｋＵ／Ｌ
コレステロール酸化酵素      ５ｋＵ／Ｌ
４−アミノアンチピリン      ０．２ｇ／Ｌ
測定基質溶液
コレステロールリノレート  イソプロパノール溶液（６ｇ／Ｌ）
操作法
測定試薬３ｍＬを石英セルに添加し、調製直後の組成１〜８からなる各試薬をそれぞれ０．０５ｍＬ添加する。３７℃にて５分加温後、反応液に測定基質溶液を０．１ｍＬ添加し、さらに３７℃にて加温する。測定基質溶液を添加して５分後および６分後のそれぞれの反応液の５００ｎｍにおける吸光度を測定し、当該両吸光度から、組成１〜８からなる各試薬における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。一方、組成１〜８からなる各試薬の代わりに精製水を用いて同様の測定を行い、精製水における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。組成１〜８からなる各試薬における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）から精製水における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を差し引いて算出された値（ΔΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を、コレステロール加水分解酵素の安定化の指標とする。
同様の一連の操作を、調製直後の組成１〜８からなる各試薬の代わりに、組成１〜８からなる各試薬を４０℃にて２日間保存した各試薬、および、組成１〜８からなる各試薬を４０℃にて５日間保存した各試薬を用いて測定を行い、各試薬における吸光度変化量（ΔΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。
（２）コレステロール酸化酵素活性測定法
測定試薬
０．１５ｍｏｌ／Ｌリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）
トリトンＸ−１００        ２ｇ／Ｌ
フェノール                ０．１５ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ          ２０ｋＵ／Ｌ
４−アミノアンチピリン    ０．２ｇ／Ｌ
測定基質溶液
コレステロール  イソプロパノール溶液（５ｇ／Ｌ）
操作法
測定試薬３ｍＬを石英セルに添加し、調製直後の組成１〜８からなる各試薬を精製水で６倍希釈した溶液をそれぞれ０．０５ｍＬ添加する。３７℃にて５分加温後、反応液に測定基質溶液を０．１ｍＬ添加し、さらに３７℃にて加温する。測定基質溶液を添加して５分後および６分後のそれぞれの反応液の５００ｎｍにおける吸光度を測定し、当該両吸光度から、組成１〜８からなる各試薬における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。一方、組成１〜８からなる試薬の代わりに精製水を用いて同様の測定を行い、精製水における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。組成１〜８からなる各試薬における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）から精製水における５００ｎｍでの１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を差し引いて算出された値（ΔΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を、コレステロール酸化酵素の安定化の指標とする。
同様の一連の操作を、調製直後の組成１〜８からなる各試薬の代わりに、組成１〜８からなる各試薬を４０℃にて２日間保存した各試薬、および、組成１〜８からなる各試薬を４０℃にて５日間保存した各試薬を用いて測定を行い、各試薬における吸光度変化量（ΔΔＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出する。
組成１
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
組成２
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
コール酸ナトリウム                              ６．０ｇ／Ｌ
組成３
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
ＣＨＡＰＳ                                      ６．０ｇ／Ｌ
組成４
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
ＢＩＧＣＨＡＰ                                  ４．５ｇ／Ｌ
組成５
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−１）                          ６．０ｇ／Ｌ
組成６
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−２）                          ０．４５ｇ／Ｌ
組成７
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩａ−３）                          ４．５ｇ／Ｌ
組成８
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）                        １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                          ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ                                ２０ｋＵ／Ｌ
塩化カルシウム二水和物                          ０．１ｇ／Ｌ
化学修飾ＬＰＬ３１１（ＶＦＭ４１０１で修飾）    ０．２ｋＵ／Ｌ
化合物（ＩＩＩｂ−２）                          １．０ｇ／Ｌ
測定結果を表３に示す。
2004035817.tif 000043
表３から明らかなように、胆汁酸誘導体として、陰イオン性型胆汁酸誘導体（具体的には、コール酸）および両性型胆汁酸誘導体（具体的には、ＣＨＡＰＳ）を含有する試薬に比較して、非イオン性型胆汁酸誘導体［具体的には、ＢＩＧＣＨＡＰ、化合物（ＩＩＩａ−１）、化合物（ＩＩＩａ−２）、化合物（ＩＩＩａ−３）および化合物（ＩＩＩｂ−２）］を含有する試薬の方が、コレステロール測定用酵素（具体的には、ＬＰＬ３１１およびＣＯＯ３２１）の安定性が良好であった。一般に、酵素等の４０℃等の高温での保存安定性は、４℃または室温等の保存安定性を反映することが知られている。従って、本発明の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬もしくはキットにおいて、胆汁酸誘導体として、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体を用いることにより、長期間保存された試薬を用いた場合であっても、また、保存温度が４０℃に晒されたおそれの有る試薬を用いた場合であっても、より正確に高密度リポ蛋白中のコレステロールが測定できることがわかる。
【産業上の利用可能性】  本発明により、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正確に測定する方法およびその方法に使用する試薬、ならびに、長期間の保存においても酵素活性が安定に保持される高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するための試薬およびキットが提供される。
【国際調査報告】
2004035817.tif 000063
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