(57)【要約】システイン残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規なＷＴ１置換型ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用した癌ワクチンなどを提供すること。  式：Ｘ−Ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号：４）（式中、ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＡｓｎを表し、ＹはＴｙｒまたはＭｅｔを表す）で表されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ペプチドやポリヌクレオチド等を有効成分として含有する癌ワクチン等。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2004026897.tif 000021
（式中、ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＡｓｎを表し、ＹはＴｙｒまたはＭｅｔを表す）で表されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列：
2004026897.tif 000022
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド。
【請求項４】
配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項６記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項８】
請求項７記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜４いずれか記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
請求項１または２記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項１１】
請求項３または４記載のペプチドからなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項１０記載の抗原提示細胞。
【請求項１２】
請求項１または２記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ。
【請求項１３】
請求項３または４記載のペプチドからなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項１２記載のＣＴＬ。
【請求項１４】
請求項１〜４いずれか記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載の発現ベクター、請求項７記載の細胞、請求項１０または１１記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１２または１３記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１５】
癌ワクチンとして使用される、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜４いずれか記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載の発現ベクター、請求項７記載の細胞、請求項１０または１１記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１２または１３記載のＣＴＬにおける、癌ワクチンを製造するための使用。
【請求項１７】
癌を治療または予防するための方法であって、請求項１〜４いずれか記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載の発現ベクター、請求項７記載の細胞、請求項１０または１１記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１２または１３記載のＣＴＬの治療または予防に有効な量を、それを必要としているＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の癌患者に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なＷＴ１置換型ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、システイン残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規なＷＴ１置換型ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などに関する。
【背景技術】  ペプチドに含まれるシステイン残基は溶液中で酸化されジスルフィド結合を生じる場合がある。還元型システイン残基を含むペプチドと酸化を受けたシステイン残基を含むペプチドとでは構造が大きく異なり、それらを癌ワクチンとして用いても、一方に特異的なＣＴＬが他方に全く反応しないことがある（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９７；６：２７３−２８１）。よって、システイン残基を含む癌抗原ペプチドを癌ワクチン療法剤として開発する場合、ペプチドに含まれるシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換したペプチドを代替品として開発することは、一つの有効な手段と考えられる。しかしながら、システイン残基を他のアミノ酸残基へ置換したペプチドが必ずしも癌抗原ペプチドとして機能するとは限らず、その有効性は個々の置換ペプチドによって大きく異なる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８；１６１：６９８５−６９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８；１６０：２０９９−２１０６）。
癌抗原タンパク質ＷＴ１（配列番号：１、Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０）の第２３５位−第２４３位よりなるペプチドであるＷＴ１２３５−２４３（Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ；配列番号：２）は、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有する癌抗原ペプチドである（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：２６２６，２００２、ＷＯ  ００／０６６０２号公報）。このＷＴ１２３５−２４３の第２位のメチオニンをチロシンに改変した改変ペプチド（Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ；配列番号：３、以下当該改変ペプチドをＷＴ１２３５−２４３（２Ｍ→Ｙ）と称する場合もある）は、前記天然型ペプチドに比してＨＬＡ−Ａ２４抗原への高い結合性を有している（ＷＯ  ０２／０７９２５３号公報、国際公開日：２００２年１０月１０日）。これら天然型ペプチドＷＴ１２３５−２４３および改変ペプチドＷＴ１２３５−２４３（２Ｍ→Ｙ）は、いずれも癌免疫療法剤としての開発が期待されている。
【発明の開示】
本発明の目的は、システイン残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規なＷＴ１置換型ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供することにある。
本発明者らは、ＷＴ１２３５−２４３およびＷＴ１２３５−２４３（２Ｍ→Ｙ）（以下本ペプチドを「非置換型ペプチド」とも称する）の第１位のシステイン残基を種々のアミノ酸残基と置換し、イン・ビボでの免疫原性についてＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウス（ＷＯ  ０２／４７４７４号公報、以下ＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスとも称する）を用いて検討した。その結果驚くべきことに、セリン残基（Ｓｅｒ）、アラニン残基（Ａｌａ）、アルギニン残基（Ａｒｇ）、リジン残基（Ｌｙｓ）、ロイシン残基（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、アスパラギン残基（Ａｓｎ）といったシステイン残基と構造・性質の異なるアミノ酸残基に置換した置換型ペプチドが、非置換型ペプチドと同等のＣＴＬ誘導活性（免疫原性）を有することを見出した。更に驚くべきことに、第１位のシステイン残基を、２−アミノ酪酸残基（α−アミノ酪酸残基、Ａｂｕ）、オルニチン残基（Ｏｒｎ）、シトルリン残基（Ｃｉｔ）といった、タンパク質を構成する天然アミノ酸ではないアミノ酸残基（異常アミノ酸残基）に置換した置換型ペプチドも、非置換型ペプチドと同等のＣＴＬ誘導活性（免疫原性）を有することを見出した。これらの知見から、本発明者らは、これら置換型ペプチドは癌ワクチンとして種々の形態で利用可能であるとの確信を得た。これら置換型ペプチドはシステイン残基を含有しないペプチドであるためジスルフィド結合を生じ得ず、よって医薬品としての規格化が容易である等の利点を有する。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
2004026897.tif 000002
（式中、ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＡｓｎを表し、ＹはＴｙｒまたはＭｅｔを表す）で表されるアミノ酸配列を含む、または該アミノ酸配列からなる、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド、好ましくは、以下のアミノ酸配列：
2004026897.tif 000003
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含む、またはからなる前記（Ｉ）記載のペプチド、ならびにこれらペプチドの製造方法、
（ＩＩ）  前記（Ｉ）記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、該発現ベクターを含有する細胞、
（ＩＩＩ）  前記（Ｉ）記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
（ＩＶ）  前記（Ｉ）記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、
（Ｖ）  前記（Ｉ）記載のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬ、
（ＶＩ）  前記（Ｉ）記載のペプチド、前記（ＩＩ）記載のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、前記（ＩＶ）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（Ｖ）記載のＣＴＬと、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、および癌ワクチンとして使用される前記医薬組成物、
（ＶＩＩ）  前記（Ｉ）記載のペプチド、前記（ＩＩ）記載のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、前記（ＩＶ）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（Ｖ）記載のＣＴＬにおける、癌ワクチンを製造するための使用、ならびに
（ＶＩＩＩ）  癌を治療または予防するための方法であって、前記（Ｉ）記載のペプチド、前記（ＩＩ）記載のポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、前記（ＩＶ）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（Ｖ）記載のＣＴＬの治療または予防に有効な量を、それを必要としているＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の癌患者に投与する方法、に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒトＷＴ１由来抗原ペプチド（ＷＴ１２３５−２４３）の第２位をチロシン残基に置換したペプチドＡでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図２は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をセリン残基に置換したペプチドＢでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＢをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図３は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をアラニン残基に置換したペプチドＣでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＣをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図４は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基を２−アミノ酪酸残基に置換したペプチドＤでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＤをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図５は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をアルギニン残基に置換したペプチドＥでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＥをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図６は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をリジン残基に置換したペプチドＦでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＦをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図７は、置換型ペプチドＢによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＡに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＢをパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図８は、置換型ペプチドＣによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＡに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＣをパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図９は、置換型ペプチドＤによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＡに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＤをパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１０は、置換型ペプチドＥによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＡに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＥをパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１１は、置換型ペプチドＦによって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチドＡに対する交差反応性を試験した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬ誘導活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を、また横軸はＥ／Ｔ比を示す。また図中、黒丸はペプチドＦをパルスした標的細胞を用いた結果を、黒四角はペプチドＡをパルスした標的細胞を用いた結果を、また白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１２は、ＷＴ１２３５−２４３の第１位のシステイン残基をセリン残基に置換したペプチドＧでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＧをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１３は、ＷＴ１２３５−２４３の第１位のシステイン残基をアラニン残基に置換したペプチドＨでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＨをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１４は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をオルニチン残基に置換したペプチドＩでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＩをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１５は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をシトルリン残基に置換したペプチドＪでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＪをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１６は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をロイシン残基に置換したペプチドＫでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＫをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１７は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をフェニルアラニン残基に置換したペプチドＬでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＬをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
図１８は、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をアスパラギン残基に置換したペプチドＭでＨＬＡ−Ａ２４発現トランスジェニックマウスを免疫し、特異的ＣＴＬが誘導されることを示したグラフである。図中、縦軸は傷害活性（％  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）を示し、横軸はＥ／Ｔ比を示す。また黒丸はペプチドＭをパルスした標的細胞を用いた結果を、白丸はペプチド非パルス細胞を用いた結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書および図面において、アミノ酸残基を略号で表示する場合、次の略号で記述する。
Ａｌａ：アラニン残基
Ａｒｇ：アルギニン残基
Ａｓｎ：アスパラギン残基
Ａｓｐ：アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：システイン残基
Ｇｌｎ：グルタミン残基
Ｇｌｕ：グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：ヒスチジン残基
Ｉｌｅ：イソロイシン残基
Ｌｅｕ：ロイシン残基
Ｌｙｓ：リジン残基
Ｍｅｔ：メチオニン残基
Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：プロリン残基
Ｓｅｒ：セリン残基
Ｔｈｒ：トレオニン残基
Ｔｒｐ：トリプトファン残基
Ｔｙｒ：チロシン残基
Ｖａｌ：バリン残基
Ａｂｕ：２−アミノ酪酸残基（α−アミノ酪酸残基とも言う）
Ｏｒｎ：オルニチン残基
Ｃｉｔ：シトルリン残基
前記アミノ酸残基に関し光学異性体があり得る場合は、Ｌ体、Ｄ体のいずれであっても良いが、Ｌ体が好ましい。
本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は常法に従って、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。
（Ｉ）本発明のペプチド
本発明のペプチドは、ヒトＷＴ１（Ｃｅｌｌ．，６０：５０９，１９９０、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＰ＿０３４４１８、配列番号：１）に由来し、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性（免疫原性）を有する。
本発明のペプチドは、抗原提示細胞内にて要すればプロセッシングを受け、生じた癌抗原ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原と結合して抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬを誘導するという特性を有するものである。当該特性は、ＷＯ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることなどにより調べることができる。
本発明のペプチドは、
2004026897.tif 000004
（式中、ＸはＳｅｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｃｉｔ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＡｓｎを表し、ＹはＴｙｒまたはＭｅｔを表す）で表されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドである。すなわち本発明のペプチドは、以下に示すペプチドを意味する：
2004026897.tif 000005
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチド。このうち配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドが、好ましい。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、本発明ペプチド由来の癌抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬを誘導するという特性を有する限り、何ら制限されないが、その長さは通常連続する９〜１００個、好ましくは連続する９〜５０個、より好ましくは連続する９〜３０個、さらに好ましくは連続する９〜２０個、そしてさらに好ましくは連続する９〜１１個のアミノ酸残基である。ここに、癌抗原ペプチドとは、ＨＬＡ抗原と結合して抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義される。
本発明ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ  ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
また本発明のペプチドは、本発明ペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。当該ＤＮＡ合成や各種プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収などの操作は、当業者に周知の方法、文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））、あるいは後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
以下、本発明のペプチドについてより詳細に説明する。
本発明は前述のように、ＷＴ１由来の天然ペプチドであるＷＴ１２３５−２４３（配列番号：２）、またはその第２位の改変ペプチドであるＷＴ１２３５−２４３（２Ｍ→Ｙ）（配列番号：３）の第１位のシステイン残基を、セリン残基、アラニン残基、アルギニン残基、リジン残基、ロイシン残基、フェニルアラニン残基、アスパラギン残基、２−アミノ酪酸残基（α−アミノ酪酸残基）、オルニチン残基あるいはシトルリン残基に置換した置換型ペプチドが、イン・ビボにてＣＴＬ誘導活性を有するという新たな知見を得たことに基づく。これら置換型ペプチドのいずれかを含有する本発明のペプチドは、癌免疫療法におけるＣＴＬ誘導剤の有効成分として、また癌ワクチンの有効成分として有用である。
本発明のペプチドとして、より具体的には以下の（１−１）〜（１−４）に挙げるペプチドを例示することができる。
（１−１）配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド
本発明のペプチドの具体例として、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドを例示することができる。ここで配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとは、より具体的には以下に示すペプチドを指す：
2004026897.tif 000006
のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド。
このうち配列番号：５に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：６に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：７に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：８に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：９に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１０に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１１に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１２に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１３に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１４に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１５に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド、配列番号：１６に示すアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドが、好ましい。
これらのペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、ＷＯ  ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−２）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含み、モチーフ構造を保持する癌抗原ペプチド
ＨＬＡ分子には多くのサブタイプが存在し、結合できる抗原ペプチドのアミノ酸配列にはそれぞれのタイプについて規則性（結合モチーフ）が存在することが知られている。ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフとしては、８〜１１アミノ酸からなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸残基がチロシン残基（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、メチオニン残基（Ｍｅｔ）またはトリプトファン残基（Ｔｒｐ）であり、Ｃ末端のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）、ロイシン残基（Ｌｅｕ）、イソロイシン残基（Ｉｌｅ）、トリプトファン残基（Ｔｒｐ）またはメチオニン残基（Ｍｅｔ）となることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５，ｐ４３０７，１９９４）。
従って、この規則性に基づいた本発明のペプチドとして、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を含み、モチーフ構造を保持する癌抗原ペプチドが挙げられる。すなわち、配列番号：４に示されるペプチドのＣ末端に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１０アミノ酸からなるペプチド、あるいは当該１０アミノ酸からなるペプチドのＣ末端にさらにＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１１アミノ酸からなるペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有する当該ペプチド、が例示される。
具体的には、以下に示される９アミノ酸からなるペプチド；
2004026897.tif 000007
のＣ末端に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１０アミノ酸からなるペプチド、あるいは当該１０アミノ酸からなるペプチドのＣ末端にさらにＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１１アミノ酸からなるペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有する当該ペプチド、が例示される。
好ましくは、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６に示されるペプチドのＣ末端に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１０アミノ酸からなるペプチド、あるいは当該１０アミノ酸からなるペプチドのＣ末端にさらにＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔを付加した１１アミノ酸からなるペプチドであって、ＣＴＬ誘導活性を有する当該ペプチド、が例示される。
これらのペプチドも、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、ＷＯ  ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−３）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含むエピトープペプチド
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープを連結した約３０ｍｅｒのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。
またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，１：７５１，１９９４）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、ＣＴＬエピトープ（メラノーマ抗原ｇｐ１００の第２８０位〜２８８位からなる癌抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Ｔヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）。
従って、前記（１−１）や（１−２）に記述したような本発明の癌抗原ペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であってイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここに、エピトープペプチドとは、▲１▼複数のＣＴＬエピトープ（癌抗原ペプチド）を連結したペプチド、若しくは▲２▼ＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結したペプチドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた癌抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義される。
本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがＣＴＬエピトープの場合、用いるＣＴＬエピトープとしては、ＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ１，−Ａ０２０１，−Ａ０２０４，−Ａ０２０５，−Ａ０２０６，−Ａ０２０７，−Ａ１１，−Ａ２４，−Ａ３１，−Ａ６８０１，−Ｂ７，−Ｂ８，−Ｂ２７０５，−Ｂ３７，−Ｃｗ０４０１，−Ｃｗ０６０２などに拘束性のＣＴＬエピトープが挙げられる。これらＣＴＬエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのＣＴＬエピトープの長さとしては、各種ＨＬＡ分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４１：１７８，１９９５）、８〜１４アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明の癌抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
本発明のエピトープペプチドとして、より具体的には例えば、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの１種または２種以上とヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドを挙げることができる。より具体的には、例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの１種または２種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：２５）とを連結させたエピトープペプチドや、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上とＡｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：２６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたエピトープペプチドなどが挙げられる。
このような複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））や後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドは、ＷＯ  ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
（１−４）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含み、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基が修飾されたペプチド
前記（１−１）〜（１−３）に例示したような本発明のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能である。
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
以上のような本発明のペプチドは、例えば、▲１▼後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、また▲２▼後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
（ＩＩ）本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターおよび形質転換細胞
本発明はまた、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
このような本発明のポリヌクレオチドとは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。具体的には、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。このうち配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、ＣＴＬ誘導活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましい。
具体的には、前記（１−３）に記述したような配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のいずれかのアミノ酸配列を含むエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの１種または２種以上とヘルパーペプチドとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの１種または２種以上と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：２５）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの１種または２種以上とＧｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：２６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
以上のような本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターをＷＯ  ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に記述のヒトモデル動物に供すること等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターは、例えば、▲１▼後述する本発明のペプチドの製造において、▲２▼後述する遺伝子治療において、また▲３▼後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
（ＩＩＩ）本発明の抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりＣＴＬ誘導活性を有するペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。このうち配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体がより好ましい。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ，Ｈ，Ｄ．ら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）。
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、ＷＴ１遺伝子が発現している癌、すなわち胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の診断において有効である。
（ＩＶ）本発明の抗原提示細胞
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞を提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞であれば良い。具体的には、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりＣＴＬ誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。このうち配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が樹状細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞が好ましい。
細胞療法（ＤＣ療法）において用いられる抗原提示細胞は、癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
本発明の抗原提示細胞は、例えば癌患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を体外でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、癌患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合はＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６やＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６などを参考できる。
以上のようにして作製された本発明の抗原提示細胞は、後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
（Ｖ）本発明のＣＴＬ
本発明は、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。
後述の実施例において、本発明のペプチド投与によりＣＴＬ誘導活性が認められた。これは、末梢血単核球中に、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が存在し、そして、この複合体の提示された細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
本発明のＣＴＬは、本発明のペプチド由来の癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するものであれば良いが、具体的には、配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなりＣＴＬ誘導活性を有するペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬを挙げることができる。このうち配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を特異的に認識するＣＴＬが好ましい。
養子免疫療法において用いられるＣＴＬは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９，１９０：１６６９）。
以上のようにして作製された本発明のＣＴＬは、癌ワクチンの有効成分として、養子免疫療法において有効に用いられる。
（ＶＩ）癌ワクチンとしての医薬組成物
以上に記載した本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の抗原提示細胞、および本発明のＣＴＬは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、ＣＴＬの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
（６−１）本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、ＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗癌作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、癌の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原にペプチド（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原とペプチドとの複合体に特異的なＣＴＬが増殖して癌細胞を破壊することができ、従って、癌の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のＣＴＬエピトープ（例えば配列番号：５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる癌抗原ペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，１６１：３１８６−３１９４には、癌抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，−Ａ３，−Ａ１１，Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。このようにして癌の治療または予防が達成される。
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７：２７７−２８９，１９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
（６−２）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれを含有する発現ベクターもまた、癌の治療または予防のためのＤＮＡワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。また、本発明は別の態様として、本発明のＤＮＡワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者に投与することにより、癌を治療または予防するための方法を提供する。
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，１６２：３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドを癌ワクチン（ＤＮＡワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ  ｖｉｖｏ法がより好ましい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
以上のような本発明のポリヌクレオチドの癌患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の癌抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、癌細胞を破壊する。以上のようにして、癌の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
（６−３）本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、癌患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（ＤＣ療法）が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：ｐ５６０７，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：ｐ４６５，１９９６）。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、癌を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
（６−４）本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９，１９９４）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで癌抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、癌抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と癌抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して癌特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のＣＴＬを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＷＴ１陽性の患者の体内でＣＴＬによる癌細胞の傷害作用が促進され、癌細胞を破壊することにより、癌を治療することができる。本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＷＴ１遺伝子の発現レベルの上昇を伴う癌、例えば白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫などの血液性の癌や、胃癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌等の固形癌の予防または治療のために使用することができる。
【実施例】  以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】システイン残基置換型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性（１）
ＷＴ１のアミノ酸配列（配列番号：１）の第２３５位−２４３位よりなるペプチド（ＷＴ１２３５−２４３、配列番号：２）の第２位のメチオニン残基をチロシン残基に置換したペプチドＡの、第１位のシステイン残基をセリン残基、アラニン残基、２−アミノ酪酸残基、アルギニン残基またはリジン残基に置換した置換型ペプチド（ペプチドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）を合成し、イン・ビボでの免疫原性を検討した。以下に、置換前のペプチドＡ（非置換型ペプチドとも言う）および置換型ペプチドＢ〜Ｆのアミノ酸配列を示す。
2004026897.tif 000008
イン・ビボでの免疫原性の検討は、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて行った。当該トランスジェニックマウスの作製およびイン・ビボ免疫原性の測定については、ＷＯ  ０２／４７４７４号公報およびＩｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０（２００２）に詳細に記述されており、当該文献に記載の方法に準じて実施した。
１）ペプチドの薬剤調製と投与
前記非置換型ペプチドおよび置換型ペプチドはＦｍｏｃ法により合成した。各合成ペプチドをそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌにＤＭＳＯにて調整し、さらに滅菌水で２．４ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、１．２７倍量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＳＡ５１）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製し、２００μｌの当該薬剤をＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾底部の皮下に免疫した。
２）脾細胞の調製
免疫７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部に前記抗原ペプチド薬剤を１００μｇ／ｍｌで１時間パルスし、７×１０５個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、ペプチド非パルスの７×１０６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で５−６日間イン・ビトロで刺激培養した。この際の培地として、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを加えたものを用いた。
３）細胞傷害性試験
常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細胞（Ｔ）として、ＥＬ−４細胞（大日本製薬株式会社、カタログＮｏ．０６−０３９）にＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂをコードする遺伝子発現ベクターを導入して得られたＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞、および当該ＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞にペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦをパルスした細胞を用いた。なおＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞は、ＷＯ  ０２／４７４７４号公報に記載のＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞と同様にして調製した。
これらの細胞は３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベルし、ペプチドパルスは１００μｇ／ｍｌで１時間実施した（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを添加）。イン・ビトロで刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）として標的細胞と各種の比率で混合することにより５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；１５９：４７５３）を実施し、エフェクター細胞の傷害活性を測定した。結果を図１〜６に示す。縦軸は傷害活性を示し、横軸の値はＥ／Ｔ比を示す。
この図から明らかな通り、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をセリン残基、アラニン残基、２−アミノ酪酸残基、アルギニン残基またはリジン残基に置換したペプチドは、非置換型ペプチドと同等の免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有していることが明らかとなった。
【実施例２】システイン残基置換型ペプチドによる細胞傷害活性
置換型ペプチド（ペプチドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）によって誘導されたエフェクター細胞の非置換型ペプチド（ペプチドＡ）に対する交差反応性を試験した。ペプチドＢ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦをマウスに免疫することにより誘導されたエフェクター細胞（Ｅ）に対して、ペプチドＢ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦをパルス、非置換型ペプチドＡをパルス、あるいはペプチド非パルスのＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞を標的細胞（Ｔ）として作用させ、エフェクター細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。結果を図７〜１１に示す。
この図から明らかな通り、ペプチドＡの第１位のシステイン残基をセリン残基、アラニン残基、２−アミノ酪酸残基、アルギニン残基またはリジン残基へ置換したペプチドＢ〜Ｆで誘導したＣＴＬは、非置換型ペプチドＡに交差反応性を示した。
【実施例３】システイン残基置換型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性（２）
ＷＴ１の第２３５位−２４３位よりなる天然型ペプチド（ＷＴ１２３５−２４３、配列番号：２）の第１位のシステイン残基をセリン残基またはアラニン残基に置換した置換型ペプチド（ペプチドＧ、Ｈ）、および、前記ペプチドＡ（ＷＴ１２３５−２４３の第２位のメチオニン残基をチロシン残基に置換したペプチド、配列番号：３）の第１位のシステイン残基をオルニチン残基またはシトルリン残基に置換した置換型ペプチド（ペプチドＩ、Ｊ）を合成し、イン・ビボでの免疫原性を検討した。以下に、置換型ペプチドＧ〜Ｊのアミノ酸配列を示す。
2004026897.tif 000009
イン・ビボでの免疫原性の検討は、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて行った。
１）ペプチドの薬剤調製と投与
前記置換型ペプチドはＦｍｏｃ法により合成した。各合成ペプチドをそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌにＤＭＳＯにて調整し、さらに１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で２．４ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した。このとき、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔｓ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を０．２４ｍｇ／ｍｌで添加した。次に、ガラスシリンジを用いて、１．２７倍量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＳＡ５１）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製し、２００μｌの当該薬剤をＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾底部の皮下に免疫した。
２）脾細胞の調製
免疫７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部に前記抗原ペプチド薬剤を１００μｇ／ｍｌで１時間パルスし、７×１０５個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、ペプチド非パルスの７×１０６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で５−６日間イン・ビトロで刺激培養した。この際の培地として、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール、３０Ｕ／ｍｌ組み換えヒトＩＬ−２を加えたものを用いた。
３）細胞傷害性試験
常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細胞（Ｔ）として、ＥＬ−４細胞（大日本製薬株式会社、カタログＮｏ．０６−０３９）にＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂをコードする遺伝子発現ベクターを導入して得られたＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞、および当該ＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞にペプチドＧ、ＩまたはＪをパルスした細胞を用いた。またＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞（ＷＯ  ０２／４７４７４号公報）、および当該Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞にペプチドＨをパルスした細胞を用いた。
これらの細胞は３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベルし、ペプチドパルスは２０μｇ／ｍｌで０．５時間実施した。イン・ビトロで刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）として標的細胞と各種の比率で混合することにより５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；１５９：４７５３）を実施し、エフェクター細胞の傷害活性を測定した。結果を図１２〜１５に示す。縦軸は傷害活性を示し、横軸の値はＥ／Ｔ比を示す。この図から明らかな通り、ペプチドＧ、Ｈ、ＩおよびＪは全て免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有していることが明らかとなった。
【実施例４】システイン残基置換型ペプチドによるＣＴＬ誘導活性（３）
ペプチドＡ（ＷＴ１２３５−２４３の第２位のメチオニン残基をチロシン残基に置換したペプチド、配列番号：３）の第１位のシステイン残基をロイシン残基、フェニルアラニン残基またはアスパラギン残基に置換した置換型ペプチド（ペプチドＫ、Ｌ、Ｍ）を合成し、イン・ビボでの免疫原性を検討した。以下に、置換型ペプチドＫ〜Ｍのアミノ酸配列を示す。
2004026897.tif 000010
イン・ビボでの免疫原性の検討は、ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて行った。
１）ペプチドの薬剤調製と投与
置換型ペプチドはＦｍｏｃ法により合成した。各合成ペプチドをそれぞれ４０ｍｇ／ｍｌにＤＭＳＯにて調整し、さらに生理食塩水で２．４ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈した。次に、ガラスシリンジを用いて、１．２７倍量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＳＡ５１）と混合することによりｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌエマルションを作製し、２００μｌの当該薬剤をＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂトランスジェニックマウスの尾底部の皮下に免疫した。
２）脾細胞の調製
免疫７日後に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分にて擦り破壊し、脾細胞を回収・調製した。ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理した脾細胞の一部に前記抗原ペプチド薬剤を１００μｇ／ｍｌで１時間パルスし、７×１０５個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、ペプチド非パルスの７×１０６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下で５−６日間イン・ビトロで刺激培養した。この際の培地として、ＲＰＭＩ−１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ  ２−メルカプトエタノールを加えたものを用いた。
３）細胞傷害性試験
常法に従って細胞傷害性試験を行った。標的細胞（Ｔ）として、ＥＬ−４細胞にＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋｂをコードする遺伝子発現ベクターを導入して得られたＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞、および当該ＥＬ４−Ａ２４０２／Ｋｂ細胞にペプチドＫ、ＬまたはＭをパルスした細胞を用いた。
これらの細胞は３．７ＭＢｑ／１０６個で５１Ｃｒラベルし、ペプチドパルスは１００μｇ／ｍｌで１時間実施した（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを添加）。イン・ビトロで刺激培養した脾細胞をエフェクター細胞（Ｅ）として標的細胞と各種の比率で混合することにより５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９７；１５９：４７５３）を実施し、エフェクター細胞の傷害活性を測定した。結果を図１６〜１８に示す。縦軸は傷害活性を示し、横軸の値はＥ／Ｔ比を示す。この図から明らかな通り、ペプチドＫ、ＬおよびＭは全て免疫原性（ＣＴＬ誘導活性）を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、システイン残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規なＷＴ１置換型ペプチド、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドを含む癌ワクチンなどが提供される。本発明の癌ワクチンは多くの癌患者を処置することができ、また医薬品としての規格化が容易であるといった利点を有する。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列の第１番目のＸａａアミノ酸残基はセリン残基（Ｓｅｒ）、アラニン残基（Ａｌａ）、２−アミノ酪酸残基（Ａｂｕ）、アルギニン残基（Ａｔｇ）、リジン残基（Ｌｙｓ）、オルニチン残基（Ｏｒｎ）、シトルリン残基（Ｃｉｔ）、ロイシン残基（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン残基（Ｐｈｅ）またはアスパラギン残基（Ａｓｎ）であり、第２番目のＸａａアミノ酸残基はチロシン残基（Ｔｙｒ）またはメチオニン残基（Ｍｅｔ）である。
配列番号：５に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：７に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基は２−アミノ酪酸残基（Ａｂｕ）である。
配列番号：８に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：９に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１０に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基はオルニチン残基（Ｏｒｎ）である。
配列番号：１１に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基はシトルリン残基（Ｃｉｔ）である。
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基は２−アミノ酪酸残基（Ａｂｕ）である。
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：１９に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基はオルニチン残基（Ｏｒｎ）である。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸残基はシトルリン残基（Ｃｉｔ）である。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。
【配列表】
2004026897.tif 000011
2004026897.tif 000012
2004026897.tif 000013
2004026897.tif 000014
2004026897.tif 000015
2004026897.tif 000016
2004026897.tif 000017
2004026897.tif 000018
2004026897.tif 000019
2004026897.tif 000020
【図１】
2004026897.tif 000023
【図２】
2004026897.tif 000024
【図３】
2004026897.tif 000025
【図４】
2004026897.tif 000026
【図５】
2004026897.tif 000027
【図６】
2004026897.tif 000028
【図７】
2004026897.tif 000029
【図８】
2004026897.tif 000030
【図９】
2004026897.tif 000031
【図１０】
2004026897.tif 000032
【図１１】
2004026897.tif 000033
【図１２】
2004026897.tif 000034
【図１３】
2004026897.tif 000035
【図１４】
2004026897.tif 000036
【図１５】
2004026897.tif 000037
【図１６】
2004026897.tif 000038
【図１７】
2004026897.tif 000039
【図１８】
2004026897.tif 000040
【国際調査報告】
2004026897.tif 000041
2004026897.tif 000042
2004026897.tif 000043
2004026897.tif 000044
2004026897.tif 000045