(57)【要約】本発明により異種タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を導入したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎのうち、１つ以上の安定同位体により標識された炭素源及び／または窒素源、または２Ｈ２Ｏを含有する培地で培養し、培養液中に前記異種タンパク質を分泌させ、これを回収することを特徴とする安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を導入したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎのうち、１つ以上の安定同位体により標識された炭素源および／または窒素源、および／または２Ｈ２Ｏを含有する培地で培養し、培養液中に前記タンパク質を分泌させ、前記タンパク質を回収することを特徴とする安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【請求項２】
コリネホルム細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１に記載の安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【請求項３】
バチルス属細菌がバチルス・ブレビスである、請求項１に記載の安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【請求項４】
炭素源が、グルコース、グリセロール、シュークロースからなる群より選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【請求項５】
窒素源が、アンモニウム塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【請求項６】
標識された炭素源濃度が１３Ｃ−標識グルコース濃度に換算して５ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌ、および／または標識された窒素源濃度が１５ＮＨ４＋濃度として３０ｍＭ〜１Ｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法に関するものである。より具体的には、異種タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を導入したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を用いて安定同位体で標識されたタンパク質を製造する方法に関するものである。
ＮＭＲを用いて、タンパク質の立体構造解析、相互作用解析、リガンドスクリーニングなどが精力的に行われている。立体構造解析はタンパク質の座標情報に基づくリガンドデザインやタンパク質工学へ結びつき、医薬品や高機能酵素の作成へと発展しうる。さらに、ＮＭＲは、細胞内の情報伝達機構や代謝の解析において相互作用部位や相互作用に伴う構造変化を把握するために利用される上、弱い相互作用であっても検出可能であり、かつ、相互作用部位が明確になることから、リガンドスクリーニングへの応用も進められている。特に近年では、さまざまな種のゲノム情報の開示やｃＤＮＡの蓄積があり、ポストゲノム解析の一環として、これら遺伝子がコードするタンパク質の立体構造解析を網羅的に行なうプロジェクトも進行中である。ここでもＮＭＲが重要な役割を演じている。
ＮＭＲを用いてタンパク質を解析する場合、しばしば安定同位体標識が行われる。ＮＭＲで感度良く検出される核種としては、１Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎなどが挙げられるが、そのうち１Ｈ以外は天然存在比が低い。そこで、ＮＭＲ解析においては、２Ｈ標識することによってタンパク質中の１Ｈシグナル数を減少させ、シグナルの尖鋭化をもたらすことにより解析を容易にする方法（ネガティブ標識法）と、１３Ｃや１５Ｎへと置換して多次元ＮＭＲに利用する方法（ポジティブ標識法）が用いられている。
安定同位体でタンパク質を標識するには、主に大腸菌による発現系を構築した後、標識化合物を添加した培地で組換え体大腸菌を培養することにより行なわれている。標識化合物としては１３Ｃ標識グルコース、１５ＮＨ４Ｃｌ、１３Ｃ標識グリセロール、各種標識アミノ酸などが挙げられる［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１，６２７３．（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９，４６５９．（１９９０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，７１．（２００１）など］。大腸菌を用いた系は構築するのが容易なため広く普及しているが、タンパク質が菌体内に顆粒として蓄積されてしまい、リフォールディングや精製に困難を伴う場合が多い。また、菌体を高密度で培養することができないため、タンパク質の収率が低く、ＮＭＲ試料を準備するために１〜１０リットルもの培養を必要とする。さらに、安定同位体の標識率は、高い場合においても、２Ｈ標識の場合で６０％、１３Ｃについては９５％、１５Ｎについては９０％程度である［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，７１．（２００１）］。
大腸菌のほかに酵母や動物細胞などの発現系を用いた安定同位体標識タンパク質の作製法も利用されており、これらの系では標識タンパク質が活性体として発現されることからリフォールディングの問題は回避されるものの、発現させ得るタンパク質の種類は限定的であり、発現量も低く、安定同位体化合物を多く消費するためにコストがかかるという大きな問題点を有する。この中でも比較的効率の高い、メタノール資化性を付与した酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた安定同位体タンパク質の分泌生産についてはいくつか報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，２５１．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，１７，３３７．（２０００）など］。しかし、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた方法は、標識効率が高いというものの、３００ｍｌスケールの連続培養を行なうために、高価な安定同位体化合物を含む培地を連続供給する必要がある。
高標識率の安定同位体標識タンパク質を得るためには、さらに高濃度の安定同位体化合物を含む培地が必要となるため、コストが嵩む。例えば、およそ８ｍｇの安定同位体標識タンパク質（１３Ｃ安定同位体標識率９８％）を得るために、トータル１５ｇの１３Ｃグルコースと５０ｇの１３Ｃメタノールという大量の安定同位体標識化合物を使用しなければならないことが報告されている［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，２５１．（２００１）］。また、１５Ｎ標識の場合、高い標識率を目指したいときにも、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの場合は（１５ＮＨ４）２ＳＯ４濃度が２０ｇ／Ｌになると発現が低下してしまうという問題点があった。このように発現量が比較的高い酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた安定同位体標識タンパク質の分泌生産法においても、多くの課題を抱えていた。
さらに、無細胞系によって安定同位体標識タンパク質を調製する方法も報告されているが［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ２，１２９．（１９９５）］、凝集体としてタンパク質が合成され、リフォールディングが困難な場合が多い。
一方、コリネホルム細菌を利用して異種タンパク質を効率良く分泌生産するための研究としては、これまでにコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）（以後、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍと略すことがある）によるヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やリパーゼの分泌［ＵＳ４９６５１９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，１８５４−１８６１（１９９２）］及び、サチライシン等のプロテアーゼの分泌［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１，１６１０−１６１３（１９９５）］、コリネホルム細菌の細胞表層タンパク質の分泌［特表平６−５０２５４８］、これを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３，４３９２−４４００（１９９７）］、変異型分泌装置を利用してタンパク質の分泌を向上させた報告［特開平１１−１６９１８２］等がある。最近になって、コリネホルム細菌を利用して構築されたＥＧＦ（ヒト上皮細胞増殖因子）やＭＴＧ（微生物由来トランスグルタミナーゼ）の発現系［ＷＯ  ０１／２３５９１］については、高い生産量が得られている。
また、コリネホルム細菌の遺伝子操作技術は、プロトプラストによるトランスフォーメーション法の確立［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６−３１１（１９８４）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１，４６３−４６７（１９８５）］、各種ベクターの開発［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，３０６−３１１（１９８４）；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０，２２３７−２２４６（１９８４）；Ｇｅｎｅ，４７，３０１−３０６（１９８６）；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，６５−６９（１９８９）］、遺伝子発現制御法の開発［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４２８−４３０（１９８８）］及びコスミドの開発［Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５）］など、プラスミドやファージを用いた系で発展してきた。またコリネホルム細菌由来の遺伝子クローニング［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，１０１１３−１０１１（１９８６）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，６９５−７０２（１９８６）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，１０５９８（１９８７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１５，３９２２（１９８７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，９８５９（１９８８）；Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，５２５−５３１（１９８８）；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，６３−７２（１９８８）；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８，３３０−３３９（１９８９）；Ｇｅｎｅ，７７，２３７−２５１（１９８９）］についても報告されている。
さらにコリネホルム細菌由来の転移因子についても報告されている［ＷＯ９３／１８１５１；ＥＰ０４４５３８５；特開平６−４６８６７；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９−７４６（１９９４）；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４，５７１−５８１（１９９４）；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４５，３９７−４０５（１９９４）；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１２６，１−６（１９９５）；特開平７−１０７９７６］。
転移因子とは染色体上で転移し得るＤＮＡ断片で、原核生物から真核生物までの広い範囲の生物に存在する事が知られている。転移因子を利用したトランスポゾンが開発され［ＷＯ  ９３／１８１５１；特開平７−１０７９７６；Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４５，３９７−４０５（１９９４）；特開平９−７０２９１］、トランスポゾンで異種遺伝子を発現させることも可能になってきた。
一方、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）を高密度で培養して異種タンパク質を効率よく分泌生産するための研究としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７（特開昭６０−５８０７４、特開昭６２−２０１５８３）の主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷタンパク質（ｍｉｄｄｌｅ  ｗａｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＷＰ））遺伝子のプロモーターおよびその遺伝子にコードされるシグナルペプチド領域を利用した分泌ベクターを作製し、同じくＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７菌を宿主とした系が確立されている。そしてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，１２３９（１９８７））や豚ペプシノーゲン（日本農芸化学会誌、６１，６８（１９８７））の分泌生産に成功している。また、バチルス・ブレビスの中でプロテアーゼの菌体外生産量が少ない菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＨＰＤ３１（別名Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｈ１０２）を分離し、これを宿主として、耐熱性α−アミラーゼの高分泌生産（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２２７９−２２８０（１９８９））やヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の高分泌生産（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３５８９−３５９３（１９８９）、特開平４−２７８０９１）、ヒトインターロイキン−２（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１，１８５８−１８６１（１９９７））やヒトインターロイキン−６（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，６６５−６６９（２０００））などの分泌生産に成功している。なかでもＥＧＦについては１．１ｇ／Ｌと極めて高い分泌蓄積が得られている。
しかしながら、なおコリネホルム細菌やバチルス属細菌を用いて、安定同位体標識タンパク質を分泌生産させた例は未だ報告されていなかった。
【発明の開示】
本発明の目的は、標識率の高い安定同位体標識タンパク質を安価に、高い収率で、高純度で提供することである。
本発明者らは、コリネホルム細菌およびバチルス属細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムおよびバチルス・ブレビスでは天然の菌体外分泌タンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程が簡略化、省略化できるであろうこと、および、コリネホルム細菌は、糖、アンモニアや無機塩等のシンプルな培地で良く生育するため、安定同位体標識を含む培地にかかる費用や培養条件の設定、生産性の点で優れていることに着目した。さらに、コリネホルム細菌およびバチルス属細菌、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムおよびバチルス・ブレビスは菌体密度が高密度で培養が可能であり、高い収率が期待されることから、高価な安定同位体化合物の消費量を低減できるであろう点に着目した。そこで、安定同位体の供給源であるグルコースおよびアンモニウム塩、２Ｈ２Ｏ等を含む培地での高密度培養研究の結果、これらが高濃度で存在する培地においても、標識率の極めて高い安定同位体標識タンパク質を分泌生産することに成功した。より具体的には、培地に１３Ｃ標識グルコース、１５Ｎ標識塩化アンモニウム塩、を添加し、これらを炭素源や窒素源とすることにより、当該タンパク質を高い標識率で、１３Ｃや１５Ｎ標識できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、９０％の２Ｈ２Ｏ中で培養することにより、標識率の極めて高い２Ｈ標識タンパク質を分泌生産できることを見出した。
即ち、本発明は、異種タンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物を導入したコリネホルム細菌またはバチルス属細菌を２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎのうち、１つ以上の安定同位体により標識された炭素源および／または窒素源、および／または２Ｈ２Ｏを含有する培地で培養し、培養液中に前記異種タンパク質を分泌させ、これを回収することを特徴とする安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法である。
特に本発明は、上記方法において、コリネホルム細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。
また、本発明は、上記方法において、バチルス属細菌がバチルス・ブレビスである、安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。
さらに、本発明は、炭素源が、グルコース、グリセロール、シュークロースからなる群より選ばれ、窒素源が、塩化アンモニウム塩または硫酸アンモニウム塩である、上記安定同位体で標識されたタンパク質の製造方法でもある。
なお、本明細書において、タンパク質またはペプチドが「分泌」されるとは、タンパク質またはペプチドの分子が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいい、最終的にそのタンパク質またはペプチド分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合はもちろん、一部のみが菌体外に存在している場合、および菌体表層に存在している場合も含む。
【図面の簡単な説明】  図１は、培地に高濃度の標識化合物を用いることの利点を図解したものである。
図２は、本培養への前培養液の添加量と菌体の生育との関係を示した物である。
図３は、未標識ＥＧＦ、１５Ｎ標識−ＥＧＦ、１３Ｃ，１５Ｎ標識−ＥＧＦのＭＳスペクトルである。
図４は、培地中に分泌された１５Ｎ標識ＥＧＦおよびＭＴＧのＨＳＱＣスペクトルである。
図５は、コリネホルム細菌（ａ）および大腸菌（ｂ）を用いて標識したＭＴＧのＨＳＱＣスペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】  前述したように、安定同位体標識タンパク質を製造するにあたっては、大腸菌を用いる方法が一般的であるが、活性型のタンパク質を得るためにはリフォールディング操作を必要とし、正しいリフォールディングを行うためには多くの試行錯誤と労力を要する。また、産生されたタンパク質を活性型タンパク質として分泌させる方法も知られているが、もっとも効率が良いとされる酵母を用いた製造法においてもなお収率は低く、多くの高価な安定同位体標識化合物を消費する。本発明はこのような問題を克服するものである。以下に本発明の具体的ないくつかの実施態様を例示する。
本発明においては、高密度培養が可能で、異種タンパク質を分泌生産できる微生物、例えば、コリネホルム細菌やバチルス属細菌が使用されることが好ましい。高密度培養が可能で、異種タンパク質を分泌生産できる微生物、特にコリネホルム細菌やバチルス属細菌を使用することの利点は、これまでタンパク質の分泌発現に用いられてきた酵母や昆虫細胞と比べ、菌体外に分泌される目的外のタンパク質が極めて少なく、目的のタンパク質を分泌生産した場合に精製過程を簡略化できることである。
また、例えば昆虫細胞を利用する場合、糖やアミノ酸を豊富に含んだ培地にて生育する必要があるのに対し、このような微生物を利用する場合は、糖、アンモニウム塩などのみを炭素源と窒素源にすればよく、従って安定同位体原子の導入に適している。さらに、このような微生物を利用する場合は、微生物における発現量が高く、高密度培養が可能なため小スケールのバッチ培養にてＮＭＲ試料に十分量のタンパク質を得ることが可能である。従って、安定同位体で標識されたタンパク質を簡易な設備で製造でき、かつ、高価な安定同位体化合物の消費量を酵母に比べて大幅に低減することが可能であることから、これまでの方法と比べて、経済性および生産性が向上する。さらに、このような微生物は高濃度の安定同位体供給源（糖、アンモニウム塩など）培地で培養が可能なため、培地中の安定同位体の濃度が高くなり、９９％以上という安定同位体標識率の極めて高い標識タンパク質を分泌生産することが可能となる。
本明細書において、コリネホルム細菌とはバージェイズマニュアルオブディターミネーティブバクテリオロジー第８版５９９ページ（１９７４）に記載されているように、好気性のグラム陽性かん菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された微生物を含み［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１）］、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。
本発明において使用できるコリネホルム細菌には、例えばＬ−グルタミン酸生産菌に代表されるブレビバクテリウム・サッカロリティクムＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・インマリオフィルムＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１等の野生株、及び、これら野生株より誘導される変異株、例えばグルタミン酸生産性を失った変異株、更にはリジン等のアミノ酸生産変異株、イノシン等の核酸のような他の物質を生産する変異株が含まれる。
本発明で利用できるバチルス属細菌には、例えば、バチルス・ブレビス細菌が含まれる。バチルス・ブレビス細菌とは好気性のグラム陽性かん菌であり、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７（特開昭６０−５８０７４、特開昭６２−２０１５８３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｈ１０２（特開昭６３−５６２７７）が利用できる。好適にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｈ１０２が用いられる。またこれらの変異株も本明細書における「バチルス属細菌」に含まれる。
本発明に使用される遺伝子構築物は、一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドをコードする配列および目的タンパク質をコードする核酸断片、および宿主中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。
例えば、本発明に使用される遺伝子構築物は一般にプロモーター、適切なシグナルペプチドおよび目的タンパク質をコードする核酸断片、およびコリネホルム細菌またはバチルス属細菌中で目的タンパク質遺伝子を発現させるために必要な制御配列（プロモーターやターミネーター等）を含む適切な配列を適切な位置に有するものである。この構築物のために使用できるベクターは特に制限されず、宿主、例えばコリネホルム細菌またはバチルス属細菌中で機能しえるものであればよく、プラスミドのように染色体外で自律増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであっても良い。宿主に依存してコリネホルム細菌由来またはバチルス属細菌由来のプラスミドは特に好ましい。これらには、例えばこれらには、例えばｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、ｐＨＴ９２６（特願平４−２１６６０５）、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。バチルス・ブレビスを宿主とする場合は、バチルス・サチルスで利用されるｐＵＢ１１０（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３４，３１８−３２９（１９７８））も利用できる。
また、トランスポゾン等も利用することができる。トランスポゾンが使用される場合は相同組換えまたはそれ自身の転移能によって目的遺伝子が染色体中に導入される。使用できるプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドコード遺伝子としては、特に限定されず、宿主で機能するものであればいずれでもよい。
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、宿主微生物内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えばｔａｃプロモーター等のＥ．ｃｏｌｉ由来のプロモーターであってもよい。その中で、ｔａｃプロモーター等の強力なプロモーターがより好ましい。
コリネホルム細菌由来のプロモーターには、例えば、細胞表層タンパク質のＰＳ１、ＰＳ２、ＳｌｐＡの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系、例えばグルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のダルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の２−イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル−ＡＴＰピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（ＤＡＨＰ）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが含まれる。宿主としてバチルス属細菌を用いる場合、特にバチルス・ブレビスを用いる場合は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７あるいはＨ１０２由来のプロモーター、ＳＤ、シグナルペプチドをコードする遺伝子（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，９３５−９４５（１９９８），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，１３１２−１３２０（１９９０））を用いることができる。
本発明によって標識されるタンパク質は特に限定されない。天然で分泌型でないタンパク質を本発明によって安定同位体標識する場合は、上述したように、適切なシグナルペプチドを付加する等により分泌型タンパク質に改変した上で標識することができる。
本発明によって安定同位体標識し得るタンパク質は、本質的には動植物や微生物由来のタンパク質全般が含まれ、特に限定されない。例えば、アルブミン、イムノグロブリン、血液凝固因子などのヒト血漿成分；プロテアーゼ、トランスフェラーゼなどの酵素；成長ホルモン、エリスロポエチンなどのホルモン；細胞増殖、抑制などの細胞増殖因子；細胞分化、誘導、刺激などの免疫反応調節因子；モノカイン、サイトカイン、リンホカインなどの細胞産性生物学的活性タンパク質；等のタンパク質を本発明によって安定同位体標識することができる。以下の実施例においては、本発明の方法により微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）およびヒト上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を安定同位体標識した例が示される。
天然でプレプロペプチドとして発現されるタンパク質を本発明によって標識する場合に、プロタンパク質をコードする遺伝子を使用することもできる、その遺伝子の発現によって得られるタンパク質のプロ構造部は適当な手段、例えばプロテアーゼによって切断すればよく、アミノペプチダーゼ、適切な位置で切断するエンドペプチダーゼ、あるいは、より特異的なプロテアーゼを使用することができる。
本発明において、タンパク質を分泌させるために使用し得るシグナルペプチドは、宿主であるコリネホルム細菌またはバチルス属細菌の分泌性タンパク質のシグナルペプチドが好ましい。例えば、コリネホルム細菌を利用する場合は、コリネホルム細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドが好ましい。コリネホルム細菌の細胞表層タンパク質には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに由来するＰＳ１及びＰＳ２（特表平６−５０２５４８）、及びＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓに由来するＳｌｐＡ（特開平１０−１０８６７５）が含まれる。また、米国特許４９６５１９７によれば、コリネ型細菌由来のＤＮａｓｅにもシグナルペプチドがあると言われており、そのようなシグナルペプチドも利用することができる。バチルス属細菌を利用する場合は、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７（特開昭６０−５８０７４、特開昭６２−２０１５８３）の主要菌体外タンパク質の１種であるＭＷタンパク質やＯＷタンパク質のシグナルペプチド、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼのシグナルペプチドを利用することができる。
シグナル配列は、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。従って、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。これらのシグナルペプチドを使用する場合、目的とするタンパク質をコードする遺伝子は、シグナルペプチドをコードする遺伝子の３’−末端側に接続し、かつ、上記プロモーターにより発現の制御を受けるように配置すればよい。
本発明において、培地中の炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、グリセロールのようなアルコール類、アミノ酸、その他を使用することができる。その中でも比較的安価なグルコース、シュークロース、グリセロールが好ましい。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、アミノ酸、その他が使用できる。その中でも、入手が容易で取り扱いやすい塩化アンモニウムや硫酸アンモニウムが好ましい。安定同位体標識する場合は炭素源や窒素源の種類が少ないことが望ましい。本発明に用いるコリネホルム細菌は、例えば、グルコース、アンモニウム塩のみをそれぞれ炭素源、窒素源とすることができるので好ましい。このとき、グルコースを１３Ｃ標識すれば１３Ｃ標識、アンモニウム塩を１５Ｎ標識すれば１５Ｎ標識される。
培地中の標識炭素源濃度は、１３Ｃ標識−グルコース濃度に換算して５ｇ／Ｌ〜１５０ｇ／Ｌ（約２７ｍＭ〜約０．８１Ｍ）が好ましく、さらに好ましくは、２０ｇ／Ｌ〜６０ｇ／Ｌ（約１０７ｍＭ〜約３２２ｍＭ）、特に好ましくは、３０ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌ（約１６０ｍＭ〜約２６９ｍＭ）である。また、標識窒素源濃度は、アンモニウム塩として用いる場合に１５ＮＨ４＋濃度として３０ｍＭ〜１Ｍが好ましく、より好ましくは、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、特に好ましくは、２００ｍＭ〜４００ｍＭである。
標識化合物を含む培地にて菌体を培養する（本培養）前に、実施例１に示すように前培養を行なうと菌体の生育が良い。本培養液に添加する前培養液の量は少ないほど標識率が高まるので好ましいが、一方、添加する前培養液の量が少なすぎると菌の生育に悪影響を及ぼす。一般に、菌の良好な生育のためには本培養液に添加する前培養液の割合は０．５％以上が好ましく、標識率を高めるためには後述するようにこの割合を高々１０％程度にすることが好ましい。本発明の一実施態様においては、本培養液に添加する前培養液の割合は２．５％（ｖ／ｖ）程度が最適であることが示されている。
本培養液を構成する標識化合物の濃度が高いことにより、タンパク質の標識率を向上させることができる（図１参照）。添加する前培養液に未標識のグルコースがＡｇ／Ｌ残存し、これを２．５％本培養液に添加すると仮定する。従来、大腸菌を培養して標識タンパク質を取得する場合のように本培養液の１３Ｃグルコース濃度が２ｇ／Ｌとすると、前培養液に含まれる未標識グルコースが１．２５×Ａ％取り込まれてしまう。一方、本発明のように高濃度の１３Ｃグルコース、例えば６０ｇ／Ｌの１３Ｃグルコースを用いた場合には、未標識グルコースは０．０４２×Ａ％しか取り込まれず、高い標識率を達成することが可能となる。同様なことが２Ｈや１５Ｎについても言える。従って、本培養液に添加する前培養液の割合は厳密に制限されるわけではないが、菌の良好な生育を保証しつつ高い標識率を得るためには前記の割合は０．５％〜１５％（ｖ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは、１％〜１０％（ｖ／ｖ）であり、特に標識率の高いタンパク質を製造する場合は１．５％〜５％（ｖ／ｖ）が好ましい。培地中の安定同位体で標識された炭素源および／または窒素源の濃度は本培養液に添加する前培養液の割合に応じて変化させることもできる（図１参照）。
大腸菌などを用いた場合、培地に含まれる安定同位体標識されたグルコースや塩の濃度が高すぎると生育に支障が生じるが、バチルス属細菌、特にバチルス・ブレビスやコリネホルム細菌ではこれらのことは問題とならない。また、高濃度のグルコースやアンモニウム塩を用いたとしても、これらの微生物の培養量が少なくてすみ、コストが高くなるおそれもない。
このように高濃度の標識化合物を含む培地中で培養することにより、本発明の一実施態様では、標識率が１００％に極めて近い安定同位体標識タンパク質を得ることができる（例えば、実施例３）。実施例３では、２０ｍｌスケールのフラスコ培養を示した。このように小容量、高密度培養でかつ高収率で目的タンパク質が得られるため、例えば、安定同位体標識タンパク質の量として、標識グルコースを使用する場合に０．８ｇ〜１．２ｇ、塩化アンモニウム塩を使用する場合に０．３５ｇ〜０．６ｇという少量使用するだけで、およそ２ｍｇ〜９ｍｇの安定同位体タンパク質を分泌生産することができる。従って、酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの場合が８ｍｇのタンパク質を生産するために、グリセロール１５ｇ、メタノール５０ｇを消費することと比較して、安価に目的標識タンパク質を製造することが可能である［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，２５１．（２００１）］。
また、グルコース、コハク酸等を２Ｈ標識した上で２Ｈ２Ｏ溶媒を含む培地にて培養することによって、２Ｈ標識タンパク質を作成することが可能である。本発明の別の実施態様においては、高価な２Ｈ標識グルコースやアミノ酸を使用しなくとも、２Ｈ２Ｏで作成した培地で培養することにより、９０％という高い標識率で目的の安定同位体標識タンパク質を分泌生産することができる（実施例４）。さらに、これらの安定同位体で標識された化合物を組み合わせて培地中に添加することによって２種類あるいは３種類の核種について安定同位体標識されたタンパク質を得ることができる。
２Ｈ標識タンパク質を作成する場合は、２Ｈ２Ｏ溶媒を含む培地を必要とするため、通常の方法では多量の２Ｈ２Ｏを必要とするが、本発明では、高密度培養であるため２Ｈ２Ｏを用いた培地の容量が少なくてもよい。標識率についても、大腸菌の６０％程度と比較しても、遥かに高い２Ｈ標識が可能である［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌ  ＮＭＲ，２０，７１．（２００１）］。酵母については正確な標識率が記載された例はないが、連続培養であるため、大量の２Ｈ２Ｏを必要とする。
本発明において、培地には菌の発育およびタンパク質分泌生産を促進するために、アミノ酸やビタミンを添加してもよい。炭素源と窒素源に加え、無機イオンとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養は宿主の生育に適した温度およびｐＨ、例えば、ｐＨ５．０〜８．５、１５℃〜３７℃の適切な範囲にて好気的条件下で行ない、１〜７日間程度行なえばよい。このような条件下で形質転換体を培養することにより、目的タンパク質を菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌させることができる。用いる菌にアミノ酸要求がある場合には、菌の生育やタンパク質の発現量を向上させるためにアミノ酸を添加することもできる。この場合、培地中の他の物質を標識した安定同位体と同じ安定同位体で標識されたアミノ酸を用いることが好ましい。
本発明によって培地中に分泌された安定同位体標識タンパク質は、よく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、このようにして得られた安定同位体標識タンパク質は、良く知られた方法によって、ＮＭＲスペクトルやＭＳスペクトルを測定することが可能である。特に、本発明においては、培養後の培地中に夾雑タンパク質がほとんど存在しないため、菌体を遠心分離等により除去した後、透析による低分子化合物の除去及び限外ろ過によるタンパク質の濃縮の操作だけでもＮＭＲスペクトルの測定が可能である。
本発明は以下の実施例によって更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例】参考例１．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６より細胞表層タンパク質（ＰＳ２）遺伝子破壊株の作製
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９より既にストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性株ＡＪ１２０３６が育種されており、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでの遺伝子組換え用の一つの宿主として使用されている（米国特許第４，８２２，７３８号）。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（旧名称Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＪ１２０３６は昭和５９年３月２６日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−７５５９として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、昭和６０年３月１３日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４としてブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
ＡＪ１２０３６株は細胞表層タンパク質（ＰＳ２）を少量、培地中に分泌していることが確認されたので、完全にＰＳ２を生成しないように遺伝子破壊を行なえばタンパク質の分泌効率をさらに向上させることができるのではないかと考えられる。そこで以下のように相同組換え法を用いてＰＳ２遺伝子完全欠損株の作製を行なった。
斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３）］により調製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡから、下記に示したプライマーを合成し、配列番号１と２および配列番号３と４の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行なった。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子配列は米国特許第５，５４７，８６４号に記載されている。
次に増幅したそれぞれの断片と配列番号１と３のプライマーの組み合わせでＣｒｏｓｓｏｖｅｒ−ＰＣＲを行い、ＰＳ２遺伝子のプロモーター領域およびコーディング領域のＮ末端側を欠損させたΔＰＳ２断片を増幅させた。この断片をｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位にクローン化し、ｐＵΔＰＳ２を構築した。ｐＵΔＰＳ２をＫｐｎＩとＸｂａＩ消化してΔＰＳ２断片を切り出し、プラスミドｐＨＭ１５１９由来の温度感受性プラスミドベクターであるｐＨＳ４（米国特許第５，６１６，４８０号）のＫｐｎＩ−ＸｂａＩ部位に挿入することにより、ｐＨＳΔＰＳ２を構築した。プラスミドｐＨＳ４で形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＪ１２５７０はＦＥＲＭ  Ｐ−１１７６２として、平成２年１０月１１日付けで通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６、郵便番号３０５−８５６６）に寄託され、平成３年８月２６日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２３としてブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
（配列番号１）５’−ａｃｔ  ｇｇｇ  ａｇｇ  ｃｔａ  ｔｃｔ  ｃｃａ  ｔｔ−３’
（配列番号２）５’−ａｔｃ  ｇａｔ  ｃｔｇ  ａｔｃ  ａｃｇ  ｔｔａ  ｃａ−３’
（配列番号３）５’−ｔｇｔ  ａａｃ  ｇｔｇ  ａｔｃ  ａｇａ  ｔｃｇ  ａｔｔ  ｃａｃ  ｔｇｇ  ｔｃｇ  ａｃａ  ｃｃｇ  ｔｔｇ  ａ−３’
（配列番号４）５’−ａｃｇ  ｇａａ  ｇｃｔ  ａｃｃ  ｔｔｃ  ｇａｇ  ｇｔ−３’
【配列表フリーテキスト】配列番号１〜４：ＰＣＲプライマー
次にｐＨＳΔＰＳ２をＡＪ１２０３６株にエレクトロポレーションにより導入し、日本特許第２７６３０５４号に記載した相同組換え法によりＰＳ２遺伝子完全欠損株を取得した。本株をＹＤＫ０１０株と命名した。
参考例２．Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質のシグナル配列を有するｈＥＧＦ遺伝子の構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］。この配列を参考にして配列番号５と配列番号６に示したプライマーを合成し、斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．，７２，６１９（１９６３）］により調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とシグナル配列を含むＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いており、反応条件は添付のプロトコールに従った。配列番号５に示したプライマーは５’端側にプラスミドへ挿入するために必要な制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を含んでいる。
（配列番号５）５’−ＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＡＴＴＴＡＧ−３’
（配列番号６）５’−ＧＴＴＧＡＡＧＣＣＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡ−３’
【配列表フリーテキスト】配列番号５、６：ＰＣＲプライマー
一方、配列番号７と配列番号８に示したプライマーを合成し、ｈＥＧＦ遺伝子の配列を含んでいるプラスミドｐＴ１３ＳΔｈＩＬ２−ＫＳ−ｈＥＧＦ（Ｈ３）（特開昭６４−２５８３）からｈＥＧＦをコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。また当該遺伝子を含むプラスミドｐＴ１３Ｓ△ｈＩＬ２−ＫＳ−ｈＥＧＦ（Ｈ３）を形質転換した大腸菌ＡＪ１２３５４は昭和６２年１１月２０日付けでＦＥＲＭ  Ｐ−９７１９として、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に寄託され、平成１４年３月１８日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−７９６６としてブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されている。
配列番号７に示したプライマーはＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域との融合遺伝子を構築するためにＰＳ２のシグナル配列Ｃ末端側のアミノ酸をコードする遺伝子配列を含んでいる。
（配列番号７）５’−ＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴ−３’
（配列番号８）５’−ＣＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧ−３’
【配列表フリーテキスト】配列番号７、８：ＰＣＲプライマー
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＰＳ２に相当するタンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域のＰＣＲ反応液１μｌと、やはり増幅させたｈＥＧＦの遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号５と配列番号８を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質の５’−上流域とＮ末端側アミノ酸を４４残基コードする領域に接続されたｈＥＧＦの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により約０．９ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩ（宝酒造社製）により切断し、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により精製し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドｐＰＫ４のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入することによって、ｐＰＫＥＧＦを得た。ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７７（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
参考例３．ｈＥＧＦ生産株の作製
実施例２で作製したｈＥＧＦ発現プラスミドｐＰＳＥＧＦを用いて、実施例１で作製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０株をエレクトロポレーション法により形質転換し、カナマイシン耐性株を取得した。得られた株を２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩４５０μｇ、ビオチン４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）でそれぞれ３０℃、３日間振とう培養した。菌体を遠心除去した培養上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。市販ｈＥＧＦ（ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨＥＣ  ＬＴＤ）を標準品として同時に泳動し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果、同移動度の位置にバンドを検出した。培養上清中に他の不純タンパク質はほとんど検出されなかった。
参考例４．コリネバクテリウム・グルタミカムＹＤＫ０１０を用いるＭＴＧの分泌生産
参考例１で作製したＹＤＫ０１０株にプロ構造改変型トランスグルタミナーゼ分泌発現プラスミドであるｐＰＫＳＰＴＧ１１（特許公開ＷＯ  ０１／２３５９１）とセリンプロテアーゼ（ＳＡＭＰ４５）発現プラスミドであるｐＶＳＳ１（特許公開ＷＯ  ０１／２３５９１）を導入し、形質転換体を得た。５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む上記ＣＭ２Ｓ寒天培地で生育した菌株を選択した。次に、選択したｐＶＳＳ１とｐＰＫＳＰＴＧ１１を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０株を、５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールと２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＭＭＴＧ液体培地（グルコース６０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ、硫酸アンモニウム３０ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩４５０μｇ、ビオチン４５０μｇ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．５に調整）で３０℃、７０時間培養した。
培養終了後１０μｌの培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９形質変換体を用いて分泌生産、精製したトランスグルタミナーゼ（特許公開ＷＯ  ０１／２３５９１）を標準品として同時に泳動し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行った結果、同移動度の位置にバンドを検出した。培養上清中に他の不純タンパク質はほとんど検出されなかった。その結果ＳＡＭＰ４５が正常に分泌発現し、やはり分泌されているプロ構造部付きトランスグルタミナーゼのプロ構造部が切断され、天然型の成熟トランスグルタミナーゼとほぼ同じ分子量を有するトランスグルタミナーゼの分泌が認められた。
実施例１．前培養液の添加量の検討
本培養液に添加する前培養液の量が多すぎると安定同位体標識率の低下原因となる。一方、本培養液に添加する前培養液の添加量が少なすぎると菌体の生育が低下してしまう。そこで、最適な前培養液添加量を検討することとした。
参考例３で作成したＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、検討を行った。まず、グルコース５ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、イーストエクストラクト１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２となるように調整し、さらに、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ液体培地を作成し１６時間、前培養を行った。
続いて、グルコース６０ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム３０ｇ／Ｌ、ＤＬ−メチオニン０．１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩４５０ｍｇ／Ｌ、ビオチン４５０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５となるように調整し、さらに、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む冷ＭＭＭ液体培地を作成した。前培養液の添加量を、０．１％、０．５％、１．０％、２．５％、５．０％、１０％とした上で、３０℃にて２４時間本培養を実施した。本培養液の吸光度（ＯＤ５６２ｎｍ）を図２に示す。
図２から、前培養液の本培養液への添加量は約０．５％〜約１０％でよく、特に約２．５％程度とすることが最適であることが示された。
実施例２．コリネホルム細菌によるＥＧＦの安定同位体標識
参考例３で作成したＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、安定同位体標識蛋白質を調製することとした。実施例１と同様にＣＭ２Ｇ液体培地を作成し１６時間、前培養を行った。１５Ｎ標識−塩化アンモニウム（ＣＩＬ）、１３Ｃグルコース（ＣＩＬ）については、標識率がそれぞれ９９％、９９％のものを使用し、下記の実験を行った。
１５Ｎ標識標識用培地調製
グルコース６０ｇ／Ｌ、１５Ｎ標識−塩化アンモニウム３０ｇ／Ｌ、１５Ｎ標識−Ｌ−メチオニン０．１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩４５０ｍｇ／Ｌ、ビオチン４５０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５となるように調整し、さらに、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加することにより１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地を作成した。また、この他に、グルコースと１５Ｎ標識−塩化アンモニウムの量を４０ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌおよび２０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ（１００ｍＭ）の１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地を作成した。
１３Ｃ、１５Ｎ標識用培地調製
１３Ｃグルコース６０ｇ／Ｌ、１５Ｎ標識−塩化アンモニウム３０ｇ／Ｌ、１３Ｃ，１５Ｎ標識−Ｌ−メチオニン０．１５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩４５０ｍｇ／Ｌ、ビオチン４５０ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム５０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．５となるように調整し、さらに、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを添加することにより１３Ｃ，１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地を作成した。また、この他に、グルコースと１５Ｎ標識−塩化アンモニウムの量を４０ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌおよび２０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ（９４ｍＭ）の１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地を作成した。
ＥＧＦ産生菌株について、実施例１と同様な手順に従って前培養を実施した後、本培養液２０ｍｌに対して、２．５％あるいは１０％の前培養液を、２０ｍｌの１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地、あるいは１３Ｃ，１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地の入った５００ｍｌ容坂口フラスコへ添加し３０℃にて２４時間振とう培養を行った。対照として、未標識グルコース、未標識塩化アンモニウムを含む同様な培地にても培養を行い、１５Ｎ標識率および１３Ｃ標識率を算出することとした。未標識培地にて得られたＥＧＦに対し、１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地、および１３Ｃ，１５Ｎ標識ＭＭＭ液体培地にて調製したＥＧＦを、それぞれ１５Ｎ−ＥＧＦ、１３Ｃ，１５Ｎ−ＥＧＦと呼ぶ。
実施例３．１５Ｎ−ＥＧＦおよび１３Ｃ，１５Ｎ−ＥＧＦの標識率の算出
実施例２で培養した未標識ＥＧＦ、１５Ｎ−ＥＧＦおよび１３Ｃ，１５Ｎ−ＥＧＦの培養上清をＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｃ１８，径４．６ｍｍ  ×  長さ２５０ｍｍ）、バッファー０．１％  ＴＦＡ、０．１％  ＴＦＡ／９０％アセトニトリルを用いて分離精製し、Ｑ−ＴＯＦ（マイクロマス社）にて分子量を測定した結果を図３に示す。また、培地中の炭素源および窒素源としてのグルコース、塩化アンモニウム濃度と添加した前培養液の量と標識率について表１にまとめた。
2004029254.tif 000002
グルコース濃度４０ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム濃度１７．５ｇ／Ｌで、前培養液添加量が２．５％の場合、使用した安定同位体標識化合物量は、グルコースで０．８ｇ、塩化アンモニウムで０．３５ｇという少量でＥＧＦの場合およそ２ｍｇ（ＭＴＧの場合およそ９ｍｇ）の安定同位体標識タンパク質を分泌生産することができた。
質量分析の結果、ＥＧＦの分子量は６２１５．６であり、全培養液添加量２．５％のときの、１５Ｎ標識ＥＧＦの分子量は６２８８．０、１３Ｃ，１５Ｎ標識ＥＧＦの分子量は６５５３．７であった。１５Ｎ標識率および１３Ｃ，１５Ｎ標識率が１００％の時の分子量がそれぞれ６２８８．５と６５５６．５であることから、１５Ｎ標識率、１３Ｃ標識率ともに９９％以上の標識率が達成されたことが示される。
以上の結果、窒素源として塩化アンモニウム、炭素源としてグルコースのみをいずれも少量利用するだけで、標識率の極めて高い１５Ｎ標識蛋白質および１３Ｃ，１５Ｎ標識蛋白質を調製できることが示された。
実施例４．２Ｈ標識ＥＧＦの分泌生産
参考例３で作成したＥＧＦ遺伝子を含むプラスミドを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０形質転換体のカナマイシン耐性株を利用し、２Ｈ安定同位体標識蛋白質を調製することとした。実施例１に示した本培養用の培地成分のうち、Ｄ，Ｌ−メチオニンを除いたものを２Ｈ２Ｏで調製し、２Ｈ２Ｏ中にて菌体が生育するか確認することにした。なお、２Ｈ２Ｏについては、標識率が９８％のものを使用した。ＥＧＦ産生菌株について実施例１と同様な前培養を行ったのち、２０ｍｌの２Ｈ２Ｏで作成した本培養液に、２ｍｌの前培養液を添加して、３０℃、２４時間培養を行った。
その結果、吸光度（ＯＤ５６２ｎｍ）は３８．４（１００倍希釈して測定）となり、十分成育した。さらに、４８時間培養し、その上清を参考例３に記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにてＥＧＦの発現を確認した。続いて、実施例３と同じＨＰＬＣで精製を行い、質量分析測定を実施して、安定同位体標識率を算出した。その結果、分子量が６４８９．５であり、標識率９１％と非常に高いことが明らかとなった。
実施例５．標識ＭＴＧの分泌生産
参考例４で作成したＭＴＧ遺伝子を含むプラスミドを導入したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＹＤＫ０１０形質転換体のカナマイシン耐性およびクロラムフェニコール耐性株を利用し、安定同位体標識蛋白質を調製することとした。実施例１と同様にＣＭ２Ｇ液体培地を作成し１６時間、前培養を行った。１５Ｎ標識−塩化アンモニウム（ＣＩＬ）、１５Ｎ標識−Ｌ−メチオニン（Ｂｅｒｌｉｎ  ｃｈｅｍｉｅ）については、標識率がそれぞれ９９％、９５％のものを使用し、実施例２と同様の実験を行った。
実施例６．１５Ｎ標識ＥＧＦおよびＭＴＧのＮＭＲ測定
実施例２および実施例５で作成した培養上清２０ｍｌを分子量３５００（ＥＧＦの場合）または分子量６，０００（ＭＴＧの場合）のポアサイズをもつ透析膜に注入し、２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６への透析を繰り返すことによって分子量３５００または６，０００以下の低分子を取り除いた。その後、セントリプレップ（ミリポア）を用いて約１０倍にまで濃縮し、ＮＭＲロックのために５％２Ｈ２Ｏを添加したものをＮＭＲ試料とした。
ＮＭＲ測定には３重核トリプルグラジェントプローブが装備されたＢｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ６００  ＮＭＲ装置を用いた。ＭＴＧとＥＧＦの測定温度はそれぞれ３５℃と３０℃とし、得られたデータについては、ＸＷＩＮＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ）によってフーリエ変換を行った。ＨＳＱＣスペクトルについては、３−９−１９パルスを用いたＷＡＴＥＲＧＡＴＥシークエンス［Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｅｒ．Ａ，１０２，２４１−２４５．（１９９３）］を組み込み、水シグナルの消去を行った。１Ｈのスペクトル幅を１０，０００Ｈｚ、１５Ｎのスペクトル幅を２，４００Ｈｚとし、ｔ２方向に１，０２４、ｔ１方向に２５６ポイント取り込んだ。
ＥＧＦとＭＴＧについて得られた結果を図４ａと図４ｂに示す。図４ａおよび図４ｂから分かるように、１５Ｎ標識−塩化アンモニウムが取り込まれたことにより、１Ｈ−１５Ｎ由来のシグナルが多数観測された。また、精製せずともＥＧＦやＭＴＧ由来のシグナルが一部観測できた。
さらに実施例５と同様の手順にてＭＴＧ産生菌株を２０ｍｌ培養し、ＣＭセファロースにより１５Ｎ標識ＭＴＧを精製した。２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６へ透析を繰り返したのち、セントリプレップ（ミリポア）を用いて７００μｌにまで濃縮し、ＮＭＲロックのために５％２Ｈ２Ｏを添加したものをＮＭＲ試料とした。得られたＨＳＱＣスペクトルを図５ａに示す。また、大腸菌によって１５Ｎ標識させたＭＴＧについても同様なスペクトルを測定した（図５ｂ）。両者のスペクトルはほぼ等しく、コリネホルム細菌によってＮＭＲ解析可能な試料を調製できることが示された。
本発明により、安定同位体標識タンパク質を安価に、かつ簡便に生産するための手段が提供される。すなわち、本発明により、高濃度の標識化合物を含む培地において、コリネ型細菌およびバチルス・ブレビスを高密度に培養することにより、目的タンパク質を多量に産生させ、かつ効率よく菌体外に分泌させることにより、高い標識率の安定同位体標識タンパク質を活性型の状態で得ることができる。
特にコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌に好適とされるカビ、酵母やバチルス属細菌と比べて、天然にはきわめてわずかにしかタンパク質を菌体外に分泌していないため、本発明により分泌生産された安定同位体標識タンパク質の精製過程を簡略化および／または省略化でき、そのままＮＭＲなどの構造解析に用いることができる。更に、タンパク質分解酵素の菌体外分泌が極めて少ないため、分泌された安定同位体標識タンパク質はコリネ型細菌自身のタンパク質分解酵素による分解を受けにくく、効率よく安定同位体標識タンパク質を培養液中に蓄積させることができる。また、コリネ型細菌およびバチルス属細菌は糖、アンモニアや無機塩等を成分とする安価な完全合成培地において培養可能であり、従ってグルコースやアンモニウム塩等の安価な標識化合物のみで、標識率の高いタンパク質を生産することができる。さらには、培養液中に培地由来のタンパク質も少なく、精製が更に容易になる。また、コリネ型細菌およびバチルス属細菌は、高濃度の糖、アンモニウム塩濃度の培地で培養することが可能であり、従って培地中の安定同位体元素濃度が高くなることから、標識率の高い安定同位体を製造することが可能となる。さらには、高密度培養が可能であることから、少量の培地で標識率の高い安定同位体標識タンパク質を大量に製造することが可能であり、従ってこれらを安価に製造することができる。
参考文献
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２．特開平１１−１６９１８２号公報
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６．特開平４−２７８０９１号公報
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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