(57)【要約】本発明は、フサリウム・プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）を培養し、培養生成物から得られる基質特異性の異なる２種類のフルクトシルアミンオキシダーゼ（ＦＡＯ）を精製することにより得ることができる酵素であって、アマドリ化合物の測定に有用なフルクトシルアミンオキシダーゼを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フサリウム  プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ。
【請求項２】
フサリウム  プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）由来の酵素であって、次に示す理化学的特徴を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ。
▲１▼  フルクトシルバリンに対する活性が、フルクトシルリジンに対する活性とほぼ同等か若しくはそれよりも高い。
▲２▼  酵素反応における至適ｐＨが７．５である。
▲３▼  酵素の安定性に好適な温度が約３０〜４０℃である。
▲４▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約３９ｋＤａであって、ゲル濾過法による分子量が約３９．４ｋＤａである。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ。
【請求項４】
フサリウム  プロリフェラタム由来の酵素であって、次に示す理化学的特徴を有するフルクトシルアミンオキシダーゼ。
▲１▼  フルクトシルリジンに対して検出可能な活性がなく、フルクトシルバリンに対する活性がある。
▲２▼  酵素反応における至適ｐＨが７である。
▲３▼  酵素の安定性に好適な温度が約３０〜４０℃である。
▲４▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約４９ｋＤａであって、ゲル濾過法による分子量が約５８ｋＤａである。
【請求項５】
配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼを生産することを特徴とする、フサリウムプロリフェラタム（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４５１）。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号３又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列からなる請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のＤＮＡで形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項６又は９に記載の微生物又は宿主細胞を培地に培養し、培養物からフルクトシルアミンオキシダーゼを回収することを特徴とする、フルクトシルアミンオキシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれかに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼを用いることを特徴とする、試料中に含まれるアマドリ化合物を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なフルクトシルアミンオキシダーゼに関し、さらに詳しくは、フサリウム  プロリフェラタム由来のフルクトシルアミンオキシダーゼ、その製造方法、及びそれを用いるアマドリ化合物の測定方法に関する。
【背景技術】  アマドリ化合物は、血液や食品中のタンパク質、ペプチド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、例えばグルコースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基とアルデヒド基が非酵素的かつ不可逆的に結合し、アマドリ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関数で表される。従って、その生成量から、それら反応性物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることができることから、アマドリ化合物の分析は、医療分野、食品分野等で有用である。特に医療分野で注目されているのは、糖尿病の診断及び管理の指標としての糖化タンパクである。糖尿病は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害を初め様々な全身症状（合併症）を引き起こす疾患であり、失明や透析導入の最も主要な原因となっている。これらの合併症は、患者の生活や社会活動を制限するばかりか医療費の増加にもかかわっており、深刻な社会問題である。従って、糖尿病の早期発見と発見後の適切な血糖コントロールの重要性が指摘されている。糖尿病における血糖コントロールの指標として、通常、過去約１〜２ヶ月の平均血糖値を反映する糖化ヘモグロビン、過去約２週間の平均血糖値を反映する糖化アルブミン、あるいは血清中の還元能を示す糖化タンパク質を意味するフルクトサミン等が測定される。糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）はヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端バリンのα−アミノ基が糖化されたものであり、ＨｂＡ１ｃの測定は糖尿病患者の血糖コントロールにおいて重要な役割を占めている。
アマドリ化合物の酵素法による分析は、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、生成する過酸化水素量又は消費される酸素量に基づいて、その量を測定することで行われる。該酸化還元酵素の一つであるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼは、通常、微生物から精製されている［例えば特許文献１〜６（特公平６−６５３００号公報、特開平３−１５５７８０号公報、特開平７−２８９２５３号公報（［００３１］、［００３７］）、特開平８−１５４６７２号公報（請求項２、［００２７］）、特開平１１−２４３９５０号公報（［００３７］）、特開平５−１９２１９３号公報）参照］。
これらの文献に記載の酵素について簡単に説明すると、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の酵素にはα−アミノ基糖化アミノ酸に特異的であり、フルクトシルリジン（以下、「ＦＬ」と称することもある）には作用しないものがあるが、これは熱安定性が悪く（４５℃、１０分の熱処理で９０％以上失活）実用性に乏しい（特公平６−６５３００号公報）。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の酵素には、ＦＬに対する活性が、フルクトシルバリン（以下、「ＦＶ」と称することもある）に対する活性より低いものがあるが、その糖化タンパク又はその加水分解物に対する作用については不明である（特開平３−１５５７８０号公報参照）。ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）由来の酵素にはαアミノ基が保護された、フルクトシルＮα−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと称することもある）に対して高い特異性を有し、フルクトシルポリリジンに対して活性があるが、フルクトシルバリンには作用しないものがある（特開平７−２８９２５３号公報（［００３１］、［００３７］）参照）。また、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）が産生する酵素にはフルクトシルリジンに対する活性がフルクトシルバリンに対する活性と同等かより高いものがある（特開平８−１５４６７２号公報（請求項２、［００２７］参照）。また、他のフサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）やギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）から産生される酵素にはフルクトシルバリンには作用せず、フルクトシルリジンに特異的なものもある（特開平１１−２４３９５０号公報（［００３７］））。
しかしながら、既存の酵素は、例えば糖化ヘモグロビンの測定における活性等に関して十分に満足できないことから、活性が高く、特異性に優れた酵素が望まれていた。すなわち、これら既存の酵素の場合、プロテアーゼ処理等により断片化処理された糖化アミノ酸や糖化ポリリジンに対する活性は認められるが、α位が糖化された糖化ペプチドに対する活性は殆ど認められない。従って、例えば、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸残基をＮ−末端に有する糖化ヘモグロビンの場合は、Ｎ−末端のフルクトシルバリンを確実に遊離させる必要がある。
一般に、従来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて糖化タンパクを正確に測定するには、該酵素の基質となる糖化アミノ酸を確実に遊離させることが前提となるが、実際には、目的の糖化アミノ酸を確実に遊離させる方法はなく、それを可能にするほど特異性の高いプロテアーゼも提供されていない。この問題を解決する一つの方法は、Ｎ末端が糖化されたペプチドそのものに反応し得るフルクトシルアミンオキシダーゼを使用することである。とりわけ糖尿病のコントロールに重要なヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を正確かつ効率良く測定するには断片化産物としての糖化ペプチドにも活性なフルクトシルアミンオキシダーゼを使用する必要がある。
【発明の開示】
従って、本発明はアマドリ化合物、特に糖化タンパクを正確かつ効率良く測定するために、新規で有用なフルクトシルアミンオキシダーゼ（以下、「ＦＡＯ」と呼称することもある）を提供することを目的するものである。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の菌株が基質特異性において優れたＦＡＯを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、フサリウム  プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）由来のフルクトシルアミンオキシダーゼを提供するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、フサリウムプロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）の培養物の、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク（ＯＤ＝２８０ｎｍ）と活性の溶出パターンを示す図である。
図２は、本発明の酵素の一つであるＦＡＯ−Ｑ１の溶媒中での活性とｐＨとの関係を示すグラフである。
図３は、本発明の酵素の一つであるＦＡＯ−Ｑ２の溶媒中での活性とｐＨとの関係を示すグラフである。
図４は、ＦＡＯ−Ｑ１の溶媒中での活性と温度との関係を示すグラフである。
図５は、ＦＡＯ−Ｑ２の溶媒中での活性と温度との関係を示すグラフである。
図６は、ＦＡＯ−Ｑ１及びＦＡＯ−Ｑ２のゲル濾過法による分子量の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のフルクトシルアミンオキシダーゼは、以下の式（Ｉ）で示される反応における触媒活性を有する。
2004029251.tif 000002
（式中、Ｒ１は−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ（ｎは５又は６である）、Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸２〜１０個のペプチド残基を表す。）
上記の式（Ｉ）において、Ｒ２はアミノ酸残基又はアミノ酸２〜１０個のペプチド残基であり、好ましくは、アミノ酸残基又はアミノ酸２〜６個のペプチド残基、より好ましくはアミノ酸残基又はアミノ酸２〜３個のペプチド残基である。
Ｒ２を構成するアミノ酸は測定すべきアマドリ化合物により異なるが、例えぱ、バリン、リジン、ヒスチジン、ロイシン、セリンを挙げることができる。Ｒ２がペプチド残基である場合は、バリン又はロイシンをＮ−末端に含む２〜１０個のアミノ酸からなるペプチド残基である。バリンをＮ末端に有するアミノ酸数２〜３個のペプチド残基がより好ましく、そのようなペプチドの具体例として、バリン−ヒスチジン、バリン−ヒスチジン−ロイシンが挙げられる。
本発明のＦＡＯがＨｂＡ１ｃの測定に用いられるものである場合、上記のごとく、α−アミノ基が糖化されたバリン、即ちフルクトシルバリン（ＦＶ）、又はＦＶをＮ末端に有するペプチドに対して活性があることが好ましい。一方、糖化アルブミンの測定に用いられるものである場合、糖化アルブミン分子ではリジンのε−アミノ基が糖化されていることから、ε−アミノ基が糖化されたフルクトシルリジン（εＦＬ）又はεＦＬを含むペプチドに対して活性があることが好ましい。
本発明のＦＡＯは、酵素作用を有する限りその起源は特に制限されない。例えば、特定の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドのみを炭素源及び窒素源として含有する培地で成育する微生物により産生され、糖化アミノ酸及び糖化ペプチドを基質として酵素活性を発揮するＦＡＯは本発明に有用である。上記の微生物のスクリーニングに用いる糖化ペプチドとしては、目的の糖化タンパクを断片化した場合に生成されるものが例示される。そのような糖化ペプチドのみを炭素源及び窒素源とする培地で培養した菌体より酵素を精製し、その活性を確認することにより、目的のＦＡＯを得ることができる。後述するように、本発明者らはフルクトシルバリン−ヒスチジン−ロイシン（ＦＶＨＬ）を用いて土壌中の微生物をスクリーニングし、ＦＶＨＬ資化能を有する、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の微生物を見出した。
なお、上記のＦＶＨＬは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端と同じ配列を有していることから、該ペプチドはＨｂＡ１ｃの測定に有用なＦＡＯをスクリーニングするのに好適である。そのような糖化ペプチドは当該技術分野で既知の方法で製造することができる。
従って、本発明のＦＡＯはフサリウム属の菌株を用いて微生物学的に製造することができる。好ましい微生物はフサリウムプロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）又はその変異体である。
フサリウムプロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）は、実施例１に記載の方法により、本発明者らが土壌中から新たに分離した菌株であり、本菌株は茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（微生物の表示：Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．ＧＬ２−１株、受領日：受託日：平成１４年９月９日；受託番号ＦＥＲＭＰ−１９００５）（国際寄託への移管日：平成１５年８月１１日；受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４５１）。本発明のフサリウムプロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）を、以下、「ＧＬ２−１株」とも表記する。
ＧＬ２−１株を元株として、変異体誘導や組換え遺伝子技術などにより、ＦＶＨＬや他の基質に対する活性が高められた派生菌株を得ることができる。そのような変異株も本発明のＦＡＯの供給源である。そのような派生菌株は、人為的に突然変異を誘発されたものや、スクリーニングで得られたもの等を包含する。
本発明のＦＡＯは、グルコース−バリン褐変化培地（以下、ＧＶ褐変化培地と称する）でＦＡＯ産生能を有する微生物を培養すると、生産される。ＧＶ褐変化培地は、グルコースとバリンを温度１２０℃において３０分間、オートクレーブ処理することにより得られる。好ましいＧＶ褐変化培地の例として、グルコース１．５％、Ｌ−バリン０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４０．１％、ＮａＨ２ＰＯ４０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．０１％、酵母エキス０．２％を含有する培地を挙げることができる。
培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは２８℃で行われる。培地のｐＨは４．０〜８．０の範囲であり、好ましくは５．５〜６．０である。しかしながら、これらの条件は、それぞれの菌の状態に応じて適宜調整されものであり、上記に限定されない。
例えば、ＧＬ２−１株をこのような条件下、１２〜３６時間、好ましくは２４時間培養すると、ＦＡＯが菌糸体内に蓄積される。したがって、ろ過により回収した菌糸体を定法に従って遠心分離すれば無細胞抽出液を得ることができる。細胞の磨砕は、機械的手段又は溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧などのいずれでもよい。
酵素の分離精製法も既知であり、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィやゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィなどを、適宜組み合わせて行う。
例えば、培養物を、遠心又は吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、１ｍＭ  ＤＴＴを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ミニビードビータ（ガラスビーズ０．５ｍｍ）で菌糸体を破砕し、遠心分離して得た上清（無細胞抽出液）を硫安分画し、透析した後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィー（アマシャムバイオシステムズ社製）で処理することにより精製する。
あるいは、ＦＡＯが培地中に分泌又は蓄積される場合は、それ自体既知の方法に従い、例えば、イオン交換樹脂処理法、活性炭吸着処理法、有機溶媒沈澱法、減圧濃縮法、凍結乾燥法、結晶化法等を適宜組み合わせて分離精製することができる。
以上に述べた方法で、ＧＬ２−１株の培養物から、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィーで異なる保持時間を示す、少なくとも２種類の、ＧＬ２−１株由来のＦＡＯを得た。１つはフルクトシルバリン（ＦＶ）及びＮ−αフルクトシルリジン（ＦＺＬ）の両方に活性な酵素（以下、「ＦＡＯ−Ｑ１」と称する）であり、他方はＦＶには活性があるが、ＦＺＬには活性を示さない酵素（以下、「ＦＡＯ−Ｑ２」と称する）である。なお、本明細書では、ＧＬ２−１株が産生するＦＡＯ−Ｑ１，ＦＡＯ−Ｑ２についてその製造や同定に関して記載しているが、本発明は特定の起源に限定されず、本発明の目的に適う、下記の特性を有する全ＦＡＯを包含する。
本発明のＧＬ２−１株由来の酵素について以下に詳細に説明する。
ＦＡＯ−Ｑ１
▲１▼  フルクトシルバリンに対する活性が、フルクトシルリジンに対する活性とほぼ同等か若しくはそれよりも高い。
▲２▼  酵素反応における至適ｐＨが７．５である。
▲３▼  酵素の安定性に好適な温度が約３０〜４０℃である。
▲４▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約３９ｋＤａであって、ゲル濾過法による分子量が約３９．４ｋＤａである。
ＦＡＯ−Ｑ２
▲１▼  フルクトシルリジンに対して検出可能な活性がなく、フルクトシルバリンに対する活性がある。
▲２▼  酵素反応における至適ｐＨが７である。
▲３▼  酵素の安定性に好適な温度が約３０〜４０℃である。
▲４▼  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が約４９ｋＤａであって、ゲル濾過法による分子量が約５８ｋＤａである。
これら２つの酵素の一般的な特性は以下の通りである。
１．一般的な誘導特性
いずれもＦＶＨＬによって誘導される酵素であり、ＦＶＨＬを唯一の炭素源及び窒素源とする培地で誘導される。
２．反応特異性及び基質特異性
ＧＬ２−１株の培養物から部分精製した酵素は、実施例２（１）に記載されているように、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィーにおいて、異なる保持時間を示す活性な画分Ｑ１、Ｑ２を含んでおり、各画分は、それぞれ、本明細書中で「ＦＡＯ−Ｑ１」及び「ＦＡＯ−Ｑ２」と呼称する酵素を含有していた。上で述べたように、ＦＡＯ−Ｑ１はＦＶ及びＦＺＬの両方に同程度の活性を有し、かつＦＶＬにも活性であり、他方、ＦＡＯ−Ｑ２はＦＶには活性であり、ＦＶＨ、ＦＶＨＬというＮ−末端バリンが糖化されたペプチドにも活性を示したが、ＦＺＬには活性を示さなかった。
３．ｐＨ及び温度の条件
至適ｐＨの検討
前記活性測定法方法に準じ、ｐＨ３．５から１０．０の範囲の各ｐＨ条件により酵素反応を行った。
ただし、使用したバッファーはｐＨ３．５から６．０の範囲では１００ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ６．０から８．０の範囲では１００ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０から９．０の範囲では１００ｍＭトリス−塩酸バッファー、ｐＨ９．０から１０．０の範囲では１００ｍＭグリシン−ＮａＯＨバッファーであった。
図２及び図３に示す通り、本発明の酵素ＦＡＯ−Ｑ１の至適ｐＨは、３０℃において約７．５であることが、ＦＡＯ−Ｑ２の至適ｐＨは、３０℃において約７．０であることが判明した。
酵素の安定性に好適な温度の検討
酵素の温度条件は、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で３０〜６５℃の温度条件にＦＡＯ−Ｑ１又はＦＡＯ−Ｑ２を加え、１０分間インキュベートした後、通常の条件で活性を測定し、判定した。測定結果を図４及び図５に示す。
これらの図より、酵素の安定性に好適な温度範囲は３０℃から４０℃であることが判明した。
４．力価の測定
酵素の力価測定は、例えば、実施例１（３）に記載されている、当該技術分野で既知の方法（速度法）で行うことができる。この方法では、ＦＡＯと糖化アミノ酸又は糖化ペプチドとの反応によって生成する過酸化水素を、該過酸化水素の存在下で生成するキノン色素による吸光度（５０５ｎｍ）に基づいて測定する。キノン色素の分子吸光係数５．１６×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とする。
なお、活性の測定は上記の方法に限定されず、その他の方法（終末法、又は酸素吸収量を測定する方法等）を用いても同様に本発明のＦＡＯの酵素活性を測定することができる。
ミハエリス定数の測定
上記の力価測定法において、酵素濃度、ｐＨ、温度などの条件を一定に保ち，基質の濃度だけを変化させながら反応の初速度を測定し、各基質に対するミハエリス定数を求めることができる。
本発明のＦＡＯのうち、ＦＡＯ−Ｑ１はＦＶ及びＦＺＬにほぼ同程度の活性を示すことから、広くアマドリ化合物の分析に有用である。一方、ＦＡＯ−Ｑ２はＦＶには活性であるがＦＺＬには活性を示さないことから、糖化ヘモグロビンを選択的に分析するのに有用である。しかも、ＦＡＯ−Ｑ２は、糖化ヘモグロビンのＮ−末端配列であるＦＶＨ，ＦＶＨＬにも活性を示すことから、該酵素を用いれば、糖化ヘモグロビン内部の糖化（ε位）を測定することなく、Ｎ末端の糖化のみを測定することができるため、より正確にＨｂＡ１ｃの測定が行える。
本発明のＦＡＯを用いて糖化タンパク等のアマドリ化合物を分析するには、既知の方法に従い、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明のＦＡＯとを接触させ、酸素の消費量又は過酸化水素の発生量を測定すればよい。任意の試料を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿又は血清）、尿等に代表される生体由来の試料の他、醤油等の食品が挙げられる。特に好ましいのは血液である。
本発明のＦＡＯの使用に際して、反応溶液のｐＨ及び温度は、それぞれ、使用する酵素に適した条件とする。即ち、ＦＡＯ−Ｑ１の場合、ｐＨ約６．５〜１２、好ましくは約７〜８、より好ましくは約７．５、温度約３０〜４０℃で行う。
また、ＦＡＯ−Ｑ２の場合、ｐＨ約６〜１０、好ましくは約６．５〜８、より好ましくは約７、温度約３０〜４０℃で行う。但し、基質や他の反応条件により適宜変更が可能であり、上記に限定されない。
ＦＡＯの使用量は、それぞれ、使用する測定法に応じて適宜選択することができるが、通常、０．１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは１〜１００ユニット／ｍｌである。緩衝液としてはＴｒｉｓ−ＨＣｌ等を用いる。
本発明のＦＡＯで糖化タンパクを分析するには、あらかじめ断片化処理し、糖が結合したアミノ酸残基又はペプチドを遊離させてから行うことが好ましい。そのような方法は化学的な方法、酵素を用いる方法を含めて、当該技術分野で既知である。しかしながら、本発明のＦＡＯ、特にＦＡＯ−Ｑ２の場合は、糖化アミノ酸のみならず糖化タンパクの分解産物としての糖化ペプチドにも活性があるため、上記の断片化処理が完璧でなくても良好な精度で測定することができる。
従って、本発明はまた、上記のＦＡＯ（ＦＡＯ−Ｑ１又はＦＡＯ−Ｑ２）を用いて、試料中に含まれるアマドリ化合物を測定する方法を提供するものである。
本発明の測定方法に用いるＦＡＯは、該ＦＡＯを産生するフサリウム  プロリフェラタムＦＥＲＭＢＰ−８４５１を栄養培地で培養し、培養物から、産生された本発明のＦＡＯを分離精製することにより製造することができる。このようにして得られる、いわゆる天然のＦＡＯは、本発明の目的に適う限り、自然に起こりうる修飾や変異を有していてもよく、また測定の精度、信頼性に影響しないことを条件として、培養物からの分離、精製工程で混入しうる酵素以外の物質を伴っていてもよい。
また、本発明のＦＡＯは遺伝子組換え技術によっても製造することができる。即ち、配列番号４又は配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、常法により、それぞれ、ＦＡＯ−Ｑ１及びＦＡＯ−Ｑ２に対応する組換タンパク質を得ることができる。
従って、本発明は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列を有するＦＡＯを提供するものである。
なお本明細書中、「ＦＡＯ（ＦＡＯ−Ｑ１、ＦＡＯ−Ｑ２を含む）」というときは、特記しない限り天然の微生物起源から分離した酵素と、組換型酵素の両方を包含するものとする。
また、本発明は、本発明のＦＡＯをコードするＤＮＡを提供するものである。
本発明のＤＮＡは、好ましくは、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列で表されるタンパク質をコードしており、より好ましくは、配列番号３又は配列番号５に記載のヌクレオチド配列を有する。
遺伝子組換技術による組換タンパク質の製造方法は当該技術分野で既知であり、例えば、本発明のＤＮＡを適当な宿主に導入し、得られた形質転換体を培養し、ついで培養物から本発明のＦＡＯを分離・精製することにより、所望の活性を有する組換えタンパク質を得ることができる。なお、このような方法で得られる本発明の組換型ＦＡＯは、配列番号４及び配列番号６に記載のアミノ酸配列に限定されず、上記の定義に従う限り、該配列から常法に従って導かれるアミノ酸配列を有するタンパク質、並びに配列番号４及び配列番号６に示したアミノ酸配列の、所望の酵素活性を有するそのフラグメントをも包含することは当業者ならば容易に理解しうることである。
組換え型ＦＡＯの製造は既知の方法で行うことができ、例えば、ＦＡＯをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して様々な宿主内でＦＡＯを発現する発現ベクターを構築する。次いで、この発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、微生物［原核生物（細菌、例えば大腸菌や枯草菌等）、真核生物（例えば酵母）］、動物細胞又は培養植物細胞が挙げられる。それぞれの宿主に関して適当な宿主−ベクター系が知られており、文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）記載の方法や既知の方法で発現させることができる。
発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、前掲）記載か当業者既知の方法で行うことができる。
得られた形質転換体の培養も、それぞれの宿主に適した培地を選択するか、新たに調製したして実施することができる。通常、培地には炭素源（例えばグルコース、メタノール、ガラクトース、フルクトース等）及び無機また有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸等）を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養源（例えば無機塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム）、ビタミン類（例えばビタミンＢ１）、抗生物質（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等））を加えてもよい。哺乳動物細胞の培養には、イーグル培地が適当である。
形質転換体の培養は、通常、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ７．０、２５〜４０℃（好ましくは３０〜３７℃）で８〜４８時間行えばよい。生産されたＦＡＯが培養溶液、培養濾液（上澄み）中に存在しているときは、培養物を濾過又は遠心分離する。培養濾液から、ＦＡＯを天然又は合成のタンパク質の精製、単離に一般的に用いられる常法（例えば透析、ゲル濾過、抗ＦＡＯモノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムクロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）によって精製できる。
生産されたＦＡＯが培養形質転換体のペリプラズム及び細胞質中に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集め、それらの細胞壁及び／又は細胞膜を、たとえば超音波及び／又はリゾチーム処理によって、破壊して、デブリス（細胞破砕物）を得る。デブリスを適当な水溶液（例えばトリス−塩酸緩衝液）に溶解させる。この溶液から、上記の方法に準じてＦＡＯを精製することができる。酵素活性を有するフラグメントが必要であれば、例えば制限酵素処理やエキソヌクレアーゼ処理等により断片を得る。このように、組換技術を利用することにより、任意の宿主細胞を用いてＦＡＯを効率よく製造することが可能となる。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
実施例１  ＦＡＯを生産する微生物のスクリーニングと同定
（１）ＦＡＯを生産する微生物のスクリーニング
糖化ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端配列を持つフルクトシルバリン−ヒスチジン−ロイシン（ＦＶＨＬ）を、ＶＨＬのグリコシル化により調製した。そのような方法は当業者に既知である。
このＦＶＨＬを単一の炭素源及び窒素源とする培地（ＦＶＨＬ培地）を用いて、土壌よりＦＶＨＬ資化性菌を分離した。試験管（１６．５ｍｍ径）にＦＶＨＬ培地５ｍｌを入れ、採取した土壌を添加して３０℃で４８時間、振盪（３００ｒｐｍ）培養した。
（ＦＶＨＬ培地）
ＦＶＨＬ                      ５  ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                  １  ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４                １  ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ０．５ｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ          ０．１ｇ
ビタミン混合物＊              ０．１％（ｖ／ｖ）
金属溶液＊＊                  １．０％（ｖ／ｖ）
蒸留水                          適量
全量                    １，０００ｍｌ
（＊ビタミン混合物）
チアミンＨＣｌ                １    ｍｇ
リボフラビン                  ２
パントテン酸カルシウム        ２
ピリドキシンＨＣｌ            ２
ビオチン                      ０．１
ｐ−アミノ安息香酸            １
ニコチン酸                    ２
葉酸                          ０．１
蒸留水                        適量
全量                      １００    ｍｌ
（＊＊金属溶液）
ＭｎＳＯ４・３Ｈ２Ｏ          １．７  ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ          ２．２
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ          ０．４
ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ          ０．２８
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ      ０．２６
Ｈ３ＢＯ３                    ０．４
ＫＩ                          ０．０６
蒸留水                        適量
全量                        １，０００    ｍｌ
その結果、ＦＶＨＬを資化する１３株を得た。それらを下記の培養、活性確認に供し、ＦＡＯ活性を有する物質を産生する菌株をさらに選抜した。
（２）培養及び無細胞抽出液の調製
上記（１）で得た１３株をグルコースーバリン（ＧＶ）褐変化培地で培養し、粗酵素液を調製した。
（ＧＶ褐変化培地）
グルコース              １．５  ％（ｗ／ｖ）
Ｌ−バリン              ０．５
Ｋ２ＨＰＯ４            ０．１
ＮａＨ２ＰＯ４          ０．１
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ０．０５
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ    ０．０１
酵母エキス              ０．２
試験管（１６．５ｍｍ径）にＧＶ褐変化培地５ｍｌを入れ、３０℃で２４時間、振盪培養（３００ｒｐｍ）した。次いで、フィルターでろ過して菌糸体を回収し、ミニビードビータ（ガラスビーズ０．５ｍｍ）で菌糸体を破砕し、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）して無細胞抽出液を調製し、粗酵素液として使用した。
（３）ＦＡＯ活性の測定
粗酵素液のＦＡＯ活性を前記の速度法で測定した。即ち、以下の混合物中で生成する過酸化水素を比色法で経時的に測定し、ＦＡＯ活性を確認した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１００  μｍｏｌ
４−アミノアンチピリン                  ４．５μｍｏｌ
フェノール                              ６  μｍｏｌ
ＦＶ                                    ５  μｍｏｌ
パーオキシダーゼ                        ６  ｕｎｉｔｓ
粗酵素液（無細胞抽出液）                １  ｍｌ
全量                                  ３  ｍｌ
酵素液以外の混合物（全量３ｍｌ）を３０℃で平衡化した後、酵素液を添加し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生成するキノン色素の分子吸光係数（５．１６×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）とした。その結果、ＦＡＯを有する１つの株を得た。
（４）株の同定
菌学的性質
ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）、オートミール寒天（ＯＡ）、及び２％麦芽寒天培地（ＭＥＡ）の各プレートに播種後、２５℃で最長８週間培養し、菌学的特性を観察した。コロニーの色調に関する記述はＫｏｍｅｒｕｐ  ＆  Ｗａｎｓｃｈｅｒ（１９７８）に従った。
（コロニーの巨視的特徴の観察）
・全縁が滑らかで僅かに、凸状の盛り上がりを示した。
気中菌糸（ａｅｒｉａｌ  ｈｙｐｈａ）は綿毛状で、コロニー表面の色調は当初より、Ｗｈｉｔｅ−ｒｅｄｄｉｓｈ  ｗｈｉｔｅ（１１Ａ１−２）を示した。その後、８週間経過後も明らかな呈色度合いの変化、及び分生子（ｃｏｎｉｄｉａ）の着生による表面色調の変化は観察されなかった。
・コロニー裏面の色調は表面とほぼ同等で、ＰＤＡ、ＭＥＡ培地における長期間の培養では、若干ｐａｌｅ  ｒｅｄ（１１Ａ３）呈色が観察された。また、ＰＤＡ、ＯＡプレートからは，僅かに透明な滲出液（ｅｘｕｄａｔｅ）の産生が認められた。
（コロニーの微視的観察）
・小型分生子（ｍｉｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ）と大型分生子（ｍａｃｒｏｃｏｎｉｄｉａ）の両方が観察された。
・小型分生子は、フィロア型（ｐｈｉａｌｉｄｉｃ）でＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属様の分生子柄（ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ）の構造であった。分生子柄はほぼ単生で時折り２軸に分枝し、気中菌糸の全般にかけて生じた。１〜２細胞性で粘性を持っており、柄先端より塊状となった。形状は楕円形（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌ）から紡錘形（ｆｉｓｉｆｏｒｍ）で、表面は平滑（ｓｍｏｏｔｈ）からやや粗面（ｓｌｉｇｈｔｌｙ  ｒｏｕｇｈ）であった。
・大型分生子はＦｕｓａｒｉｕｍ属の大型分生子の形態で、３〜６細胞性で三日月型（ｌｕｎｉｆｏｒｍ）で、表面は平滑、脚胞（ｆｏｏｔｃｅｌｌ）を有した。気中菌糸部に中厚からやや細く、短いものが多く観察された。また、細胞壁が脆弱で、大半の大型分生子は表面が欠損していた。
Ａｒｘ（１９７４）、Ｄｏｍｉｓｈ（１９９３）及びＭａｌｌｏｃｈ（１９８１）に記載されている分類体系に基づいて、上記の結果を考察し、本菌体はＦｕｓａｒｉｕｍ属に帰属すると推定された。同様の形態を示すものにＣｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ、Ｃａｎｄｅｌａｂｒｅｌｌａ、Ｍｏｎａｃｒｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｏｒｏｎ等が挙げられるが、本菌体は大型分生子が三日月型であること、気中菌糸が輪（ｒｉｎｇ）を形成しないこと、また、小型分生子を形成すること、等からこれらとは区別され、“Ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ”（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）に記載のＦｕｓａｒｉｕｍ属の定義に合致するものである。
この菌株は「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．ＧＬ２−１株」との表記の下、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４５１で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
種の同定  （リボゾームの塩基配列の解析）
上記ＧＬ２−１株の１８ＳリボソームＤＮＡ（１８ＳｒＤＮＡ）配列を調べることにより同定を試みた。
上記（２）に記載の培養方法に従ってＧＬ２−１株をＧＶ培地で培養し、得られた菌糸体から常法によりＤＮＡを調製した。その後、このＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲでｒＤＮＡの内部転写スペーサー（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ）配列を増幅し、塩基配列を解析した（Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ  Ｖｏｌ．１４０  Ｐ３５〜４９  １９９７参照）。その結果、配列番号１に示す塩基配列が確認された。この塩基配列をホモロジー検索したところ、フサリウム  プロリフェラタムと１００％のホモロジーがあることが判明した。
実施例２  ＧＬ２−１株を用いるＦＡＯの生産と同定
（１）ＦＡＯの部分精製
１）培養と無細胞抽出液の調製
実施例１で同定したＧＬ２−１株を、実施例１（２）に記載のＧＶ褐変化培地１００ｍｌを用いて、同様の培地組成、培養条件下で培養した。
培養後、培養液をフィルターでろ過して菌糸体を回収し得られた菌糸体０．６ｇに１ｍＭ  ＤＴＴを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、続いてミニビードビータ（ガラスビーズ０．５ｍｍ）により菌糸体を破砕後、遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）し、上清を無細胞抽出液とした。
２）硫安分画
１）で得た無細胞抽出液を、硫酸アンモニウム濃度３０〜８０％飽和画分を１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で一晩透析した。
３）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィー
以下の条件で透析後の硫安画分のクロマトグラフィーを行った。
分析条件
カラム（容量）：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１ｍｌ）（アマシャムバイオシステムズ社製）
流速          ：１ｍｌ／ｍｉｎ
緩衝液Ａ      ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）＋１ｍＭ  ＤＴＴ
緩衝液Ｂ      ：  緩衝液Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ
溶出条件
０〜５ｍｉｎ：    緩衝液Ｂ  ０％
５〜３５ｍｉｎ：  緩衝液Ｂ  ０〜５０％
３５〜４０ｍｉｎ：緩衝液Ｂ  ５０〜１００％
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラムクロマトグラフィーにおけるタンパク（ＯＤ＝２８０ｎｍ）と活性の溶出パターンを図１に示す。ＦＶを基質としたＦＡＯ活性で活性をモニターしたところ、２つの画分（Ｑ１、Ｑ２）に反応性が認められた。活性の測定は実施例１（３）に記載の方法に準じて行った。これらの画分に含有されるＦＡＯを本明細書中、ＦＡＯ−Ｑ１、ＦＡＯ−Ｑ２と呼称する。
2004029251.tif 000003
（２）ＦＡＯ−Ｑ１及びＦＡＯ−Ｑ２の基質特異性の比較
上記の（１）、３）で分離した２つの画分に含有される酵素（ＦＡＯ−Ｑ１，ＦＡＯ−Ｑ２）の基質特異性を調べた。酵素液として、上記２つの画分を用い、実施例１（３）に記載の方法に従って、ＦＡＯ活性を測定した。基質として、ＦＶ、ＦＶＨ、ＦＶＨＬ、ＦＶＬ、ＦＶＬＳ、ＦＺＬを用いた。結果を表２に示す。
2004029251.tif 000004
表２から、ＦＡＯ−Ｑ１はＦＶ及びＦＺＬの両方に同程度の活性を有し、かつＦＶＬにも活性を示すこと、ＦＡＯ−Ｑ２はＦＶには活性があるがＦＺＬには活性を示さず、ＦＶＨ、ＦＶＨＬというＮ−末端バリンが糖化されたペプチドにも活性を示すことが明らかである。
（３）Ｋｍ値の測定
ＦＶ又はＦＺＬを基質として、実施例１（３）に記載の方法に従い、ＦＡＯ−Ｑ１及びＦＡＯ−Ｑ２の存在下で測定し、ＦＶ又はＦＺＬに対するＫｍ値（ミカエリス定数）を求めた。結果を表３に示す。
2004029251.tif 000005
ＦＶに対するＫｍ値は、ＦＡＯ−Ｑ１、ＦＡＯ−Ｑ２でほぼ同程度であった。一方、ＦＡＯ−Ｑ１のＦＺＬに対するＫｍ値はＦＶに対するＫｍ値より小さく同酵素は、ＦＶに比べてＦＺＬに対する親和性が高いことが分った。
１）ＳＤＳ電気泳動法による測定
常法に従ってＳＤＳ電気泳動法（ゲル濃度１０〜１５ｗ／ｖ％のグラジエントゲル使用）により分子量の測定を行った。分子量既知の標準蛋白質としてアマシャム  バイオシステムズ社製の分子量マーカー（ホスホリラーゼｂ：９７ｋＤａ、牛血清アルブミン：６８ｋＤａ、オボアルブミン：４５ｋＤａ、カルボニックアンヒドラーゼ：３２ｋＤａ、トリプシンインヒビター：２０．１ｋＤａ、α−ラクトアルブミン：１４．４ｋＤａ）を使用して測定したところ、ＦＡＯ−Ｑ１の分子量は約３９ｋＤａであり、ＦＡＯ−Ｑ２の分子量は約４９ｋＰａであった。
２）ゲル濾過法による測定
常法に従ってゲル濾過法による分子量の測定を行った。カラムサイズが１×３０ｃｍのスーパーデックス２００（アマシャム  バイオシステムズ社製）を用い、分子量既知の標準蛋白質として、ロシュ・ダイアグノスティックス（株）社製の分子量マーカー（アルドラーゼ  １５０ｋＤａ、牛血清アルブミン  ６８ｋＤａ、オボアルブミン  ４５ｋＤａ、キモトリプシノーゲンＡ  ２５ｋＤａ、チトクロームＣ  １２．５ｋＤａ）を使用して検量線を作成し、本発明酵素の分子量を算出した。結果を図２に示す。これより、ＦＡＯ−Ｑ１の分子量は約３９．４ｋＤａであり、ＦＡＯ−Ｑ２の分子量は約５８ｋＤａであることが判明した。
（５）部分アミノ酸の解析
Ｎ末端アミノ酸配列を決定するため、精製したＦＡＯ−Ｑ２酵素を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約４０ｎｇをＮ末端配列分析用の試料とした。Ｎ末端配列はプロテインシーケンサー・モデル４７６Ａ（アプライドバイオシステムズ社製、米国）を用い、Ｎ末端から１０残基まで分析した。Ｎ末端から得られたＦＡＯ−Ｑ２の配列は、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列であることが判明した。一方ＦＡＯ−Ｑ１は、Ｎ末端がブロックされており、この方法では決定できなかった。
実施例３  ＦＡＯｃＤＮＡのクローニング
ＧＬ２−１株のゲノムＤＮＡを調製し、それを鋳型としてＰＣＲ法でＦＡＯｃＤＮＡを得た。
（１）ＧＬ２−１株のゲノムＤＮＡの調製
以下の工程に従い、ＧＬ２−１株からゲノムＤＮＡを得た。
１．菌株を１５ｍｌのＤＰ培地（１％デキストン（Ｄｅｘｔｏｎｅ）、１％ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ）、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で３０℃にて２−３日間液体培養する。
２．ガラスフィルター（３ＧＬ）で集菌し、菌体（湿重量０．３ｇ）を得る。
３．得られた菌体を液体窒素が入った乳鉢と乳棒で破砕し、さらに乳鉢などで粉状にした後、コーニング管に集める。
４．氷冷した２ｍｌ  ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、軽くボルテックスする。
５．２ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ溶液を加え、数回転倒撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートする。
６．遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）する。
７．上清をフェノール−クロロホルムによる処理（３回）に供する（但し、撹拌は転倒撹拌による。）。
８．２．５容のエタノールを加え、数回転倒撹拌する。この段階で糸状のＤＮＡが確認できる。
９．軽く遠心（３，０００ｒｐｍ、５分間）して沈降させるが、糸状にならない場合は通常のエタノール沈殿法に従い遠心する。
１０．沈殿を４００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）（以下同様）に溶かし、エッペンドルフチューブに移し、５μｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、３０分間インキュベートする。
１１．フェノール−クロロホルムによる処理を２回行った後、２．５容エタノールを加え、十分に転倒撹拌する。
１２．糸状のＤＮＡをつまようじで新しいチューブに移す（余分なエタノールを除く）。
１３．５０−１００μｌのＴＥに溶解する。（緩やかにピペッティングし、ボルテックスはしない。）。
１４．ＤＮＡを定量する。１μｇをアガロース電気泳動にかけてバンドを確認した。
（２）ＰＣＲによるｃＤＮＡの取得
１）部分配列（約２００ｂｐフラグメント）の取得
既に明らかになっている糸状菌由来のＦＡＯＤの全アミノ酸配列を用いて相同性が高い領域を検索し、その情報を基に以下のプライマーを設計した。
プライマー：
2004029251.tif 000006
上記ゲノムＤＮＡを鋳型に用い、Ｔａｑポリメラーゼ（＝ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（（宝酒造社製））を用いる標準的な反応液組成でＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応の条件：
プライマー（配列番号７）                          ：０．２μＭ
プライマー（配列番号８）                          ：０．２μＭ
１０Ｅｘ  Ｔａｑ  ＰＣＲバッファー（宝酒造社製）  ：１０μｌ
塩化マグネシウム                                  ：２．５ｍＭ
Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）                  ：２．５Ｕ
Ｄ．Ｄ．Ｗ．（二重脱イオン水）を加えて全量を１００μｌとする。
９４℃、１分間を１サイクル；９４℃、１分間、５０℃１分間、７２℃、１分間を３５サイクル；７２℃、３分間を１サイクル。
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動に反応液１０μｌを供したところ、２００ｂｐに目的の断片と思われるバンドが確認された。そこでこのバンドを切り出して、インビトロジェン社製のＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔにて、該キットに添付の指示書に従って処理し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換株を任意に２０株選択し、プラスミド抽出を行った。それぞれのプラスミドに対し制限酵素処理を行い、適当なサイズのＤＮＡが挿入されているプラスミドを選択し、配列を決定した。配列決定は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｋｉｔと、シーケンサーとしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。
その結果、２つのアイソザイム（ＦＡＯ−Ｑ１とＦＡＯ−Ｑ２）に相当するであろう２種類の塩基（ポリヌクレオチド）が得られた。決定した塩基配列より予想されるアミノ酸配列に、精製酵素から決定したアミノ酸配列が確認された。このことより、上記ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片には、ＦＡＯ−Ｑ１をコードする遺伝子の一部、ＦＡＯ−Ｑ２をコードする遺伝子の一部が存在することがわかった。
２）上流及び下流の部分配列、及び全長ＤＮＡの取得
上記１）で得た２種類の２００ｂｐフラグメントから上流及び下流に位置するＤＮＡ配列を、ＴａＫａＲａＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用し、解析した。得られたＦＡＯ−Ｑ１とＦＡＯ−Ｑ２の塩基配列をそれぞれ配列番号３及び配列番号５に、これらによってコードされている推定のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び６に示す。
産業上の利用分野
本発明によって新規なＦＡＯが提供され、これらはアマドリ化合物の分析方法の発展に寄与することが期待される。特に、本発明のＦＡＯのうち、糖化アミノ酸のみならず糖化ペプチドに対しても活性を有する酵素を用いることにより、糖化タンパクの分解が不完全な場合であっても糖化タンパクをより正確に測定することが可能となる。その結果、糖尿病における血糖値コントロールに重要なＨｂＡ１ｃを正確に測定することができ、延いては糖尿病患者の治療や合併症の予防に貢献しうる。また、本発明の新規なフルクトシルアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡは、遺伝子組換え技術を用いる酵素の効率的な大量生産を可能にし、マドリ化合物の分析法の開発を促進すると期待される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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