(57)【要約】成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチンや免疫機能検査診断薬等を提供するものである。ＨＬＡが一致する同胞ドナーからの造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後に完全寛解を得たＡＴＬ患者の細胞性免疫応答を調査したところ、ＡＴＬ患者のＨＳＣＴ後の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の培養液において、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが、ＨＳＣＴ前にインビトロで構築した自己ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に応答して活発に増殖したＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘ３０１−３０９エピトープにのみ誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。
2004092373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド。
【請求項２】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体。
【請求項６】
請求項４記載のタンパク−ペプチド結合体又は請求項５記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド
（ｂ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド。
【請求項８】
配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘエピトープ。
【請求項１１】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
【請求項１２】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
【請求項１３】
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン。
【請求項１４】
さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を増強するアジュバントが含まれている、請求項８〜１０のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチン。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
【請求項１７】
配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
【請求項１８】
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
【請求項１９】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
【請求項２０】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬。
【請求項２１】
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬。
【請求項２２】
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２３】
抗体がモノクローナル抗体である請求項２２記載の抗体。
【請求項２４】
請求項２２又は２３記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬。
【請求項２５】
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現ベクター。
【請求項２６】
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項２７】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現ベクター。
【請求項２８】
ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項２９】
ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。
【請求項３０】
請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。
【請求項３１】
請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）等のヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）腫瘍に対して抗腫瘍効果を有する細胞傷害活性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチン並びに免疫機能検査診断薬等に関する。
【背景技術】  成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）はヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）感染者の約５％が発症するＴ細胞悪性腫瘍であり、主にＣＤ４＋及びＣＤ２５＋成熟Ｔリンパ球表現型をもつこと、中年又はそれ以降の発症、免疫抑制、及び予後が悪いことを特徴としている（例えば、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４５，２３７−２４３，１９９０；Ｂｌｏｏｄ  ５０，４８１−４９２，１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，６４７６−６４８０，１９８１参照。）。ＡＴＬに対して化学療法を併用した臨床使用により４年生存率は８〜１２％に高まったものの、白血病の他のタイプと比べると依然として低率である（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ  ６，１２８−１４１，１９８８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏ  ６，１０８８−１０９７，１９８８参照。）。最近になって、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が一部のＡＴＬ患者に適用されるようになってきた。自己ＨＳＣＴの初期の研究はＡＴＬ再発が頻繁に起きることを明らかにした（例えば、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２３，８７−８９，１９９９参照。）。しかしながら、より最近の報告によると、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性は同様にあるものの、同種ＨＳＣＴの方がより良い結果を生じうることが明らかになった（例えば、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２７，１５−２０，２００１参照。）。以上の報告は、他のタイプの白血病で観察されたように、レシピエントに対するドナーの細胞性免疫応答、つまり移植片対白血病（ＧＶＬ）効果がＡＴＬ細胞根絶に貢献することを強く示唆している。
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致する同胞から受けた同種ＨＳＣＴはある程度のＧＶＨＤを起こすことが示され、レシピエントのマイナー組織適合抗原（ｍＨＡ）がＧＶＨＤの標的抗原と考えられてきた（例えば、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４，２８１−２８５，１９９６参照。）。男性特異的Ｈ−Ｙ移植抗原（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９，１５８８−１５９０，１９９５参照。）、ＨＡ−１抗原（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，１０５４−１０５７，１９９８参照。）、ＣＤ３１分子（例えば、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４，２８６−２９１，１９９６、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０６，７２３−７２９，１９９９参照。）、及びヒト血小板抗原（ＨＰＡ）（例えば、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０６，７２３−７２９，１９９９、Ｂｌｏｏｄ  ９２，２１６９−２１７６，１９９８参照。）を含むいくつかのｍＨＡがＧＶＨＤに関与すると示唆されてきた。同種ＨＳＣＴ後の白血病再発の可能性は、移植片からＴ細胞を除去した場合又はドナーが遺伝学的に一卵性双生児の場合に増加することが知られており、ＧＶＬ効果が白血病再発を防ぐ為に重要であることを示している（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ７５，５５２−５６２，１９９０参照。）。従って、レシピエントの非造血細胞にではなく造血細胞において発現するｍＨＡ特異的なドナーＴ細胞応答を増加することが、ＧＶＨＤを引き起こさずにＧＶＬ効果を誘導できる戦略の一つとして提案されてきた（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ９３，２３３６−２３４１，１９９９参照。）。腫瘍細胞特異的又は腫瘍細胞において過剰発現するｂｃｒ／ａｂｌ融合タンパク質及びＷＴ−１等の腫瘍抗原もまた、ＧＶＬ効果の標的抗原の候補である（例えば、Ｂｌｏｏｄ  ９５，１７８１−１７８７，２０００、Ｂｌｏｏｄ  ９６，１４８０−１４８９，２０００参照。）。
ＨＴＬＶ−Ｉに対する宿主細胞性免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞の増殖は、無症候性ＨＬＴＶ−１キャリア及びＨＴＬＶ−Ｉ随伴脊髄症／熱帯性痙性対麻痺
（ＨＡＭ／ＴＳＰ）患者のＰＢＭＣ培養液からは頻繁に見い出されるが、ＡＴＬ患者から見い出されることは稀である（例えば、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ５４−５９，１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１０３７−１０４１，１９８４参照。）。ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｐＸ遺伝子産物等のＨＴＬＶ−Ｉ抗原のうち、ｐＸ遺伝子産物であるＴａｘがＨＴＬＶ−Ｉ特異的な細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の優位な標的抗原であることが知られている（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８，２４５−２４８，１９９０、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７６１−７６７，１９９１参照。）。Ｔａｘはまた、細胞成長を促進しアポトーシスを抑制することによってＨＴＬＶ−Ｉの白血病化における重要な役割を果たしていることも知られている（例えば、Ｌａｎｃｅｔ  １，１０８５−１０８６，１９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，７９８１−７９８７，１９９９参照。）。以上の発見からＴａｘ特異的ＣＴＬがＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の白血病化の免疫的監視の役割を果たしうることが示唆されている。
本発明者らは以前にヒトＨＬＡ−Ａ２に拘束されるＣＴＬの主要エピトープを既に見い出している（例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２９２８−２９３３，１９９２参照。）が、ＨＬＡ−Ａ２は日本人の３０〜４０％のみに陽性である。また、最近樹立したＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞リンパ腫瘍のモデル動物において、本発明者らはインビボでのＴａｘ特異的ＣＴＬの抗腫瘍効果を明らかにした（例えば、特開２００２−３７２５３２号公報、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４２８−４３５，２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６０３１−６０４０，１９９９参照。）。このモデルにおいては、ＴａｘをコードするＤＮＡ又はＣＴＬエピトープに対応するペプチドのいずれかを用いたワクチン接種を受けた同系免疫担当ラットから新鮮なＴ細胞を移植することにより、同系ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を接種したヌードラットにおける無処置では致命的となるＴ細胞リンパ腫が根治し得た（例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，９６１０−９６１６，２０００、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３，１７７５−１７８３，２００１参照。）。しかしながら、末梢血でのヒトＡＴＬ細胞におけるＨＴＬＶ−Ｉ発現は非常に低いので、実験動物における上記の観察がヒトに適用できるかどうかは不明である（例えば、非特許文献Ｇａｎｎ  ７３，３４１−３４４，１９８２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５４，５８２−５８８，１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５６２０−５６２４，１９８９参照。）。
ＡＴＬは、日本に多くの保有率を持つＨＴＬＶ−Ｉの感染によって引き起こされる腫瘍性疾患であるが、化学療法剤に抵抗性であるため、極めて予後の悪い悪性腫瘍とされてきた。種々の臨床的観察や動物実験結果から、宿主細胞性免疫、特にＣＴＬの抗腫瘍効果が示唆されているが、ＣＴＬの主要な標的抗原であるＨＴＬＶ−Ｉ  Ｔａｘには腫瘍化促進機能があることが分かっている。従って、より特異的で安全性の高いワクチン開発のためには、ＣＴＬ認識エピトープを特定する必要がある。しかし、ヒトＡＴＬ患者において抗腫瘍効果を持つＣＴＬエピトープは特定されていなかった。本発明の課題は、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍に対して抗腫瘍効果を有するＣＴＬを誘導することができるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドや、該ペプチドをコードするＤＮＡや、これらを利用した免疫応答誘導用ワクチン並びに抗腫瘍免疫能検査診断薬等を提供することにある。
本発明者らは、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に対する、ＨＳＣＴ後の同じ患者の細胞性免疫応答を調査した。これらのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞はＧＶＬ効果の標的を含む、レシピエント由来の抗原を所有すると考えられていた。本発明者らはＨＳＣＴ後のＰＢＭＣが実際にレシピエント由来細胞に応答することを見い出した。しかしながら、応答細胞の大部分はＨＴＬＶ−Ｉ抗原、特に限られた数のＴａｘエピトープに強く反応した。ＨＳＣＴ後のＡＴＬ患者２名から同様の結果を得たが、そのうち１名のドナーはＨＴＬＶ−Ｉ陰性であった。以上の観察から移植片対ＨＴＬＶ−Ｉ応答がＨＳＣＴ後のＡＴＬ患者に生じたことが明らかとなった。かかる研究の過程で、ＨＬＡ−Ａ２４に拘束されるＣＴＬの主要エピトープを見い出し、本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
すなわち本発明は、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（請求項１）や、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（請求項２）や、請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドと、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合ペプチド（請求項３）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体（請求項４）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体（請求項５）や、請求項４記載のタンパク−ペプチド結合体又は請求項５記載のタンパク−ペプチド結合体の４量体と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド
（ｂ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド（請求項７）や、配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡ（請求項８）や、請求項８記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡ（請求項９）に関する。
また本発明は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘエピトープ（請求項１０）や、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン（請求項１１）や、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン（請求項１２）や、請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫応答誘導用ワクチン（請求項１３）や、さらに、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を増強するアジュバントが含まれている、請求項８〜１０のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチン（請求項１４）や、請求項１１〜１４のいずれか記載の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する医薬組成物（請求項１５）や、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬（請求項１６）や、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬（請求項１７）に関する。
さらに本発明は、請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを有効成分として含有する免疫機能検査診断薬（請求項１８）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬（請求項１９）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分として含有する免疫機能検査診断薬（請求項２０）や、請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬（請求項２１）や、請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体（請求項２２）や、抗体がモノクローナル抗体である請求項２２記載の抗体（請求項２３）や、請求項２２又は２３記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドに特異的に結合する抗体を有効成分として含有するＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断薬（請求項２４）や、請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現ベクター（請求項２５）や、請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項２６）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現ベクター（請求項２７）や、ＨＬＡ−Ａ２４と請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドとの結合体を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項２８）や、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法（請求項２９）や、請求項１又は２記載のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法（請求項３０）や、請求項７〜９のいずれか記載のＤＮＡを発現させることができるベクターを用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣを刺激することを特徴とするＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法（請求項３１）に関する。
（１）本発明により、日本人の６０％以上が有するＨＬＡ−Ａ２４に拘束されるＣＴＬの主要エピトープを見い出された。ＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫応答の検査に本エピトープ部位のペプチドを使用することによって、日本人集団のかなりの部分をカバーできることになる。
（２）現在では、それぞれのＨＬＡについて親和性のあるアミノ酸アンカーモチーフからエピトープの予測が可能である。しかしながら、生体内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。本発明により同定されたエピトープは感染個体から得られたものであり、しかも他のエピトープよりも非常に強い選択性を持って認識されている。
（３）ＡＴＬ患者からＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが誘導されることは稀だが、幹細胞移植後に完全寛解に入ったＡＴＬ症例から、本発明により同定されたエピトープに対するＣＴＬが選択的に誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７（図１ａ）及びドナー＃３６（図１ｂ）のＰＢＭＣ中のＩＬＴ−＃３７細胞に対するＣＴＬ誘導を示す写真である。様々な数のＰＢＭＣを１９日間培養し、その間初日及び１０日目にホルマリンで固定化したＩＬＴ−＃３７で２回刺激を与えた。上記ＰＢＭＣを刺激することなく（○）又はＩＬＴ−＃３７を用いて刺激し（●）、又はＫ５６２を用いて刺激し（×）、１８時間インキュベーションした後、上澄中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ分析により測定した結果を示す図である。値は２回の実験の平均値を示す。
第２図は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７から誘導されたＣＴＬのＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異性とＭＨＣクラスＩ拘束性を示す写真である。
ａ．ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＰＢＭＣ培養液をホルマリンで固定化したＩＬＴ−＃３７で４回刺激し、その細胞傷害性を５１Ｃｒ放出分析を６時間行い調査した。使用した標的細胞はＨＬＡが一致するＩＬＴ−＃３７（●）、ＬＣＬ−＃３６（○）、及びＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ（×）、ＨＬＡ−Ａ２及びＢ４６が一致するＴＣＬ−Ｋａｎ（▲）及びＬＣＬ−Ｋａｎ（△）、及びＨＬＡが一致しないＩＬＴ−Ａｓ−２（◆）及びＬＣＬ−Ａｓ（◇）であった。黒色の記号はＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を表し、白色の記号はＥＢＶ感染細胞を表す。値は３回の実験の細胞障害性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｙｓｉｓ）の平均を表す。
ｂ．ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘを発現する競合細胞によるＩＬＴ−＃３７特異的細胞傷害性の阻害を表す。ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＰＢＭＣ培養液を、ホルマリンで固定したＩＬＴ−＃３７細胞であらかじめ５回刺激し、放射能標識したＩＬＴ−＃３７に対してエフェクター細胞対標的細胞の割合を３０対１として５１Ｃｒ放出分析を行った。上記分析はＨＴＬＶ−ＩのｐＸ遺伝子産物を発現するｒｖｖに感染させた非標識のＬＣＬ−＃３６細胞（ＬＣＬ−＃３６／ｐ２７Ｘ）、又はコントロールｒｖｖで感染させた非標識のＬＣＬ−＃３６細胞（ＬＣＬ−＃３６／ＨＡ）又はＩＬＴ−＃３７細胞の存在下で行い、競合細胞対標的細胞の割合は３０対１とした。
第３図は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７（ケース１）から誘導されたＣＴＬが認識するＨＴＬＶ−ＩのＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘエピトープのマッピングの結果を示す写真である。ＬＣＬ−＃３６細胞を１０ｍＭのＴａｘアミノ酸配列に対応する９−２４塩基長の合成オリゴペプチド３３種類でパルス標識し、ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬに対するそれぞれの感受性を５１Ｃｒ放出分析を用いてエフェクター対標的細胞の割合を１０として測定した。値は３回の実験の細胞障害性の平均値である。
第４図は、ＩＬＴ−＃３７細胞の刺激により誘導された、ＨＳＣＴ前の患者＃３７、ＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６のＰＢＭＣ培養液における細胞傷害性の特徴についての結果を示す写真である。
ａ．エフェクター細胞対標的細胞の割合を３０とし、２回刺激を与え４０日間培養したＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣの細胞傷害性、及び３回刺激を与え４１日間培養したＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６のＰＢＭＣの細胞傷害性を測定した。ＩＬＴ−＃３７に対する細胞傷害性（黒枠）、ＴＬＣ−Ｋａｎに対する細胞傷害性（斜線枠）、及びＬＣＬ−Ｋａｎ（白枠）に対する細胞傷害性をそれぞれ示す。値は３回の実験の平均値である。
ｂ．ＩＬＴ−＃３７で刺激されたＰＢＭＣ中のＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９の４量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す。ＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６のＰＢＭＣ培養液は４６日間培養したものを使用したが、ＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣ培養液は長期培養が不可能だったため３６日間培養したものを使用した。ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ１１−１９特異的細胞株であるＴｃ−Ｍｙｊ（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７６１−７６７，１９９１）を染色して、４量体特異性を確認した。右上の数字は４量体に結合したＰＢＭＣの割合を示す。各ケースとも全部で１００，０００の現象を示している。
第５図は、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７（ケース２）から誘導されたＣＴＬが認識するＨＴＬＶ−ＩのＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘエピトープのマッピングの結果を示す写真である。ＣＤ８＋細胞を豊富に含むＰＢＭＣをホルマリンで固定したＩＬＴ−Ｒ０７細胞で３回刺激し３２日間培養し、Ｔａｘの一連の３３合成オリゴペプチドでパルス標識したＨＬＡ−Ａ２４＋ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株であるＴＯＫとエフェクター対標的の割合を８として混合し、１８時間インキュベーションした後、上澄液中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ分析により測定した。値は２回の実験の平均値である。
第６図は、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７（ケース２）から誘導されたＣＴＬ中のＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９の４量体結合ＣＤ８＋Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析結果を示す写真である。。ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７の培養６７日のＰＢＭＣを使用した。右上の数字は４量体に結合したＰＢＭＣの割合を示しており、全部で１００，０００個の細胞における現象である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチド、すなわち、ＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍に対して特異的に抗腫瘍効果を有するＣＴＬを誘導することができるペプチドとしては、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的にＣＴＬ誘導活性を有するペプチドであれば特に制限されるものではなく（以下、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチド及びこれらアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加により改変されたペプチドをあわせて「本件ペプチド類」ということがある）、ここで、アミノ酸の「置換、欠失若しくは付加」の程度及びそれらの位置などは、改変されたペプチドが、配列番号３又は４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと同様にＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性を有する同効物であれば特に制限されず、アミノ酸配列の改変（変異）は、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあるが、人為的に改変することもできる。本発明においては、このような改変・変異の原因及び手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変ペプチドを包含する。
本発明の本件ペプチド類は、化学的又は遺伝子工学的手法により製造することができる。化学的方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド類の合成は、そのいずれによることもできる。
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。
なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明の本件ペプチド類におけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
本発明の本件ペプチド類は、上記のように化学合成により得られる他、遺伝子工学的手法を用いて常法により製造することもできる。このようにして得られた
本発明の本件ペプチド類は、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。
本発明の融合ペプチドとしては、本件ペプチド類とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチド類は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本件ペプチド類の精製や、本件ペプチド類の検出や、本件ペプチド類に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明のタンパク−ペプチド結合体としては、ＨＬＡ−Ａ２４と本件ペプチド類との結合体であれば特に制限されるものではなく、例えばＨＬＡ−Ａ２４分子と配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドとの結合体など、かかる結合体を認識するＣＴＬに結合できる形態のものが好ましい。また、本発明のタンパク−ペプチド結合体の４量体としては、ＨＬＡ−Ａ２４と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体の４量体であれば特に制限されるものではなく、上記タンパク−ペプチド結合体を、ストレプトアビジンを核として４量体（テトラマー）としたものを例示することができ、例えばＨＬＡ−Ａ２４のＣ末端に酵素Ｂｉｒ−Ａの基質を発現させておき、Ｂｉｒ−Ａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｏｔｉｎｉｌａｔｉｏｎ法でビオチン化したＨＬＡ−Ａ２４と、フィコエリトリン（ＰＥ）標識脱グリコシル化アビジンを４：１で混合することにより得ることができる（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９４−９６，１９９６）。これらタンパク−ペプチド結合体及びその４量体は、化学合成された本件ペプチド類と、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子（アクセッションナンバー  ＡＡＢ６０６５１）やβ−２ミクログロブリン遺伝子（アクセッションナンバー  ＮＭ＿００４０４８）を利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により作製したＨＬＡ−Ａ２４のαドメイン及びβ−２ミクログロブリンとをリフォールディングバッファー中でインビトロで結合させる（Ｇａｒｂｏｃｚｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９：３４２９−３４３３，１９９２）ことにより、あるいは本件ペプチド類をコードするＤＮＡとＨＬＡ−Ａ２４遺伝子やβ−２ミクログロブリン遺伝子とをそれぞれ利用した遺伝子工学的手法を用いて常法により本件ペプチド類とＨＬＡ−Ａ２４のαドメインやβ−２ミクログロブリンとを同一宿主細胞内で共発現させ、精製後にこれらを結合させることにより作製することができる。
本発明の融合タンパク質としては、上記タンパク−ペプチド結合体又はタンパク−ペプチド結合体の４量体とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質類は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用したタンパク−ペプチド結合体の精製や、ＣＴＬの検出や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
本発明の本件ペプチド類に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件ペプチド類を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の本件ペプチド類に特異的に結合する抗体は、例えば、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断に有用であるばかりでなく、本件ペプチド類のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。
本件ペプチド類に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に、該本件ペプチド類、該本件ペプチド類と免疫原性を有するタンパク質との複合体、該本件ペプチド類を膜表面に提示した細胞等を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。
また、本発明のＤＮＡとしては、上記本件ペプチド類をコードするＤＮＡや、配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡや、かかる配列番号７又は８に示される塩基配列若しくはその相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限されるものではない（以下、上記の本発明のＤＮＡを総称して「本件ＤＮＡ群」ということがある。）。上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。これら本発明のＤＮＡ群は、本件ペプチド類を遺伝子工学的手法を用いて常法により作製するときに有利に用いることができる他、特に本発明のＤＮＡ群のアンチセンス鎖は、ＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の診断用プローブとして有用である。
本発明のＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘエピトープとしては、インビボやインビトロにおいてＣＴＬを誘導することができる、上記配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導活性ペプチドからなるエピトープであれば特に制限されるものではない。かかるＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘエピトープを含めた本件ペプチド類や、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクターは、細胞性免疫や体液性免疫等の本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として用いることができる。本発明の免疫応答誘導用ワクチンはＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の治療に用いることができる。
また、本発明の免疫応答誘導用ワクチンとしては、さらに細胞性の又は局所的な免疫を増強する種々のアジュバントを含むものがより好ましく、かかるアジュバントとしては、例えば、効率よくペプチド特異的なＣＴＬを誘導することができる樹状細胞、ＣｐＧモチーフを含むＩＳＳ−ＯＤＮ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３，８４９−８５４，１９９７）、細胞傷害性Ｔ細胞を刺激するＱＳ２１（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡより商業的に入手可能）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、油性エマルジョン、サポニン、ビタミンＥ溶解物等を具体的に挙げることができる。アジュバントを用いる場合、アジュバントとなる種々の菌体成分や毒素等と、前記本発明の本件ペプチド類とを連続してコードするＤＮＡから作製した組換え融合タンパクあるいは組換え融合ペプチドとして用いることもできる。
また、上記本発明の免疫応答誘導用ワクチンを有効成分として含有する本発明の医薬組成物は、医薬的に容認可能な担体又は希釈剤、免疫賦活剤、添加剤等を含んでいてもよく、かかる担体又は希釈剤としては、例えば、ＳＰＧＡなどの安定化剤や、ソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン等の炭水化物や、アルブミン、カゼイン等のタンパク質や、ウシ血清、スキムミルク等のタンパク質含有物質や、リン酸緩衝液、生理食塩水、水等の緩衝液などを具体的に挙げることができる。免疫賦活剤としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子α（ＴＨＦ−α）等のサイトカインを具体的に例示することができ、添加剤としては、低分子量のポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、グルコース又はデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、蛋白質安定化剤、微生物増殖阻止若しくは抑制剤等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。
また、本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下、筋肉内等により投与することができる形態のものが好ましい。投与すべき有効量は、医薬品や医薬組成物の種類・組成、投与方法、患者の年齢や体重等を考慮して適宜決定することができ、これらを１日あたり１〜数回投与することが好ましい。また、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。この際、製剤に用いることができる担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。またこれらの製剤は、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
さらに、本発明の本件ペプチド類は、ＨＴＬＶ−Ｉの感染予防及び／又はＨＴＬＶ−Ｉ関連疾患の症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。
本発明の免疫機能検査診断薬としては、本件ペプチド類、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクター、ＨＬＡ−Ａ２４と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体、又は該タンパク−ペプチド結合体の４量体を有効成分とし、免疫機能、特にＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫機能を検査・診断しうるものであれば特に制限されるものではないが、通常は、本件ペプチド類の標識体、発現産物が標識体となる本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクター、ＨＬＡ−Ａ２４と本件ペプチド類とが結合したタンパク−ペプチド結合体の標識体、又は該タンパク−ペプチド結合体の４量体の標識体を用いることが好ましい。標識体とするために用いられる標識化物質しては、上記のマーカータンパク質やペプチドタグの他、放射性同位元素を用いることができる。本発明の免疫機能検査診断薬を用いた免疫機能検査診断は、対象被験者の末梢血白血球（リンパ球）に本発明の免疫機能検査診断薬を接触させ、本件ペプチド類等におけるエピトープを認識するＴ細胞と結合させることによりＨＴＬＶ−Ｉ  Ｔａｘ特異的Ｔ細胞を識別することができる。免疫機能検査診断薬の中でも、上記タンパク−ペプチド結合体の４量体のＰＥ等の蛍光標識体はフローサトメトリーによるＣＴＬの検出・定量を可能にするため、免疫機能検査診断薬の他、ワクチン効果判定に特に有用である。例えば、ヘパリン末梢血検体から単核球分画を分離し、ＰＥ標識テトラマー（タンパク−ペプチド結合体の４量体）と、ＦＩＴＣやＣｙ５で標識したＣＤ８抗体等の活性化マーカー抗体とで２重染色し、フローサイトメーターでＣＤ８陽性テトラマー陽性の細胞数を計算することにより、対象被験者の免疫機能の検査・診断を行うことができる。また、新鮮血液検体ではテトラマー陽性細胞数が非常に少ないことがよくあることから、新鮮血液検体だけでなく、本件ペプチド類やその発現細胞などで一回刺激をした後、数日〜１週間培養後に同様の染色解析をすることもできる。
本発明の発現ベクターとしては、本件ペプチド類や、ＨＬＡ−Ａ２４（αドメイン及び／又はβ−２ミクログロブリン）と本件ペプチド類との結合体を発現することができるものであればどのようなものでもよく、使用される発現系としては、上記本件ペプチド類を細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができるが、中でもウイルス系ベクターが好ましい。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。また、読み枠を変えて翻訳することができる発現ベクターシリーズも有利に用いることができる。本発明の発現ベクターは、本発明の免疫応答誘導用ワクチンにおける有効成分として有用である。
本発明の宿主細胞としては、本件ペプチド類や、ＨＬＡ−Ａ２４（αドメイン及び／又はβ−２ミクログロブリン）と本件ペプチド類との結合体を発現することができる発現系を含む細胞であればどのようなものでもよく、使用される宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。また、本件ペプチド類を発現することができる発現系の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。これら本発明の宿主細胞は、本件ペプチド類のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法としては、ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を用いて、同種のＨＬＡタイプ、すなわちＨＬＡ−Ａ２４タイプのドナー由来のＨＳＣＴ後の同じ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＣＴＬを誘導する方法や、本件ペプチド類を用いて、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法や、本件ＤＮＡ群を発現させることができるベクターを用いて、例えばＰＢＭＣ中の抗原提示細胞に遺伝子工学的にペプチドを発現させるなど、ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＡＴＬ患者のＰＢＭＣをインビトロ、インビボ又はエクスビボで刺激するＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬの誘導方法であれば特に制限されるものではなく、かかる誘導方法により得られるＨＴＬＶ−Ｉ認識ＣＴＬは、養子免疫療法としてＡＴＬ等のＨＴＬＶ−Ｉ腫瘍の治療に用いることができる他、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ誘導の活性機構や分子機構を明らかにする上で有用である。
【実施例】  以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
Ａ［方法と材料］
Ａ−１（レシピエント／ドナー組み合わせ及び血液サンプル）
２名の急性型ＡＴＬ患者である＃３７（ケース１）及びＲ０７（ケース２）、並びに、それぞれの患者のＨＬＡが一致する同胞ドナーである＃３６及びＤ０７から末梢血サンプルを得た。患者＃３７はＨＳＣＴ後４週間で一過性再発を起こしたものの、いずれのケースもＨＳＣＴ後２ヶ月で完全寛解を得た。ヘパリン処置した血液を、移植１２日前及び移植１８３日後に患者＃３７から、移植３０日前及び移植２５５日後に患者Ｒ０７から、それぞれ採取した。彼らの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール・ハイパックプラス勾配遠心法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）により単離し、使用するまで一部を液体窒素で保存した。
Ａ−２（細胞株）
ＨＳＣＴ前の患者＃３７及び患者Ｒ０７のそれぞれに由来するＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株であるＩＬＴ−＃３７及びＩＬＴ−Ｒ０７を、下記の手順で樹立した。ＰＢＭＣからダイナビーズＭ４５０−ＣＤ８（Ｄｙｎａｌ社製、Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いてＣＤ８＋細胞を除去した後に１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−Ｐ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で刺激し、次に１０％熱不活性ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＳＩＧＭＡ社製）と、１０Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（塩野義製薬社製、大阪、日本）又は１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１５（ＳＩＧＭＡ社製）とを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で５％の二酸化炭素と共に３７℃で２ヶ月以上維持した。エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞株であるＬＣＬ−＃３６は、ＥＢＶを含むＢ９５−８細胞（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４，１０４５−１０４９，１９８０）の上澄を用いて感染させたドナー＃３６のＣＤ１９＋ＰＢＭＣからインビトロで樹立した。ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株であるＴＣＬ−Ｋａｎ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３４，２２１−２２８，１９８４）及びＩＬＴ−Ａｓ−２（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７６１−７６７，１９９１）、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株であるＬＣＬ−Ｋａｎ，ＬＣＬ−Ａｓ、及びＴＯＫ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２９２８−２９３３，１９９２）、及び赤芽球様細胞株であるＫ５６２（Ｂｌｏｏｄ  ４５，３２１−３３４，１９７５）もまた使用した。
Ａ−３（ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの誘導）
ＨＳＣＴ後の患者＃３７及びＲ０７の全細胞又はＣＤ８＋細胞を豊富に含む１００万個のＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐで刺激し、次に１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで前処理した同数のＩＬＴ−＃３７又はＩＬＴ−Ｒ０７細胞と混合した。これらのＴ細胞を１０％ＦＣＳ及び１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を添加したＡＩＭ−ＶＴＭ培地（ＧＩＢＣＯ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で維持し、１０日から１４日の間隔をあけて定期的にそれぞれのＩＬＴ細胞で刺激をあたえた。
Ａ−４（合成ペプチド）
本発明者らはＨＴＬＶ−ＩのＴａｘタンパク質の配列すべてを網羅するために全部で３８のペプチド（９〜２４塩基長）を調製した。いくつかのペプチドは従前の方法に従って合成し（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３，１７７５−１７８３，２００１；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２９２８−２９３３，１９９２）、他のすべての９塩基長のペプチドは株式会社ホクドー（北海道、日本）より購入した。ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘのうちＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ２４と結合する可能性のあるペプチドを同定するために、コンピュータを利用したプログラムであるＢＩＭＡＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｌ／ｈｌａ＃ｂｉｎｄ／）を文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，１６３−１７５，１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３９１３−３９２４，１９９４）記載の方法に従い使用した。
Ａ−５（ＣＴＬ分析）
様々なエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ／Ｔ）割合において文献（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３，１７７５−１７８３，２００１；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，７０１０−７０１９，２００２）記載の方法に従い、５１Ｃｒ放出分析を６時間行い、細胞傷害活性を測定した。特異的細胞傷害性を式（［実験により得られた５１Ｃｒ放出量−自発性の５１Ｃｒ放出量］／［最大５１Ｃｒ放出量−自発性の５１Ｃｒ放出量］×１００％）により算出した。エフェクター細胞が産生するＩＦＮ−γを測定するために、様々なＥ／Ｔ割合において標的細胞と１８時間インキュベーションした後に、ＥＬＩＳＡ法（ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット，Ｅｎｄｏｇｅｎ社製、Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて２回測定した。
Ａ−６（組み換えワクシニアウイルス）
ＨＴＬＶ−ＩのｐＸ遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ｒｖｖ）ＷＲ−ｐ２７Ｘ及びＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子をもたないＷＲ−ＨＡはＤｒ．Ｈｉｓａｔｏｓｈｉ  Ｓｈｉｄａ（北海道大学、日本）（Ｃｅｌｌ  ５５，１９７−２０９，１９８８）から供与されたものを用い、文献（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，７６１−７６７，１９９１；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３，１７７５−１７８３，２００１）記載の方法に従い感染効率（ＭＯＩ）を５０にして使用した。
Ａ−７（ＥＬＩＳＰＯＴ分析）
文献（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９１，１３１−１４２，１９９６；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６，８５９−８６５，１９９７）記載の方法で、ＩＦＮ−γ特異的ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行い、ＩＦＮ−γを産生する抗原特異的Ｔ細胞数を計測した。簡潔に述べると、抗ＩＦＮ−γモノクロナール抗体である１−Ｄ１Ｋ（ＭＡＢＴＥＣＨ社製，Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であらかじめ３回コーティングした９６ウェルのＰＶＤＦプレート（ＥＬＩＳＩＰ１０ＳＳＰ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に、５×１０４細胞／ウェルの刺激細胞又は１０μｇ／ｍｌのペプチドと共に、１×１０５細胞／ウェルのＰＢＭＣを３７℃で一晩静置した。翌日に細胞を除去し、ウェルをビオチン標識した抗ＩＦＮ−γモノクロナール抗体である７−Ｂ６−１ビオチン（ＭＡＢＴＥＣＨ社製）と共に２時間インキュベーションした後、ストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（ＭＡＢＴＥＣＨ社製）と共にさらに１時間インキュベーションした。ＢＩＣＰ／ＮＢＴアルカリフォスファターゼ基質（ＳＩＧＭＡ社製）と１０分間反応させた後、乾燥させた膜上の染色箇所数をＫＳ−ＥＬＩＳＰＯＴ光学顕微鏡システム（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製、Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。
Ａ−８（４量体染色）
フィコエリトリン（ＰＥ）複合型ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ；配列番号１）４量体およびフィコエリトリン（ＰＥ）複合体ＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９（ＳＦＨＳＬＨＬＬＦ；配列番号４）４量体は、ＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉｖ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｙｅｒｋｓ（Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）に合成を委託し提供を受けた。リンパ球を、Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ複合型抗ＣＤ８抗モノクロナール抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を用いて３０分間染色した後、４量体を用いてさらに６０分間４℃で染色し、次にＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで２色解析を行った（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，１７６５−１７７１，１９９９）。
Ｂ［結果］
Ｂ−１（ＨＳＣＴ前のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞と反応するＨＳＣＴ後のレシピエントからのＣＴＬ誘導）
ＨＳＣＴ前のレシピエント由来の造血細胞に対するＨＳＣＴ後のレシピエントの免疫応答を調べるために、本発明者らはＨＳＣＴ前の患者＃３７及びＲ０７それぞれから、ＩＬ−２又はＩＬ−１５の存在下でＰＨＡの刺激を受けたＰＢＭＣを２ヶ月以上維持することにより、Ｔ細胞株であるＩＬＴ−＃３７及びＩＬＴ−Ｒ０７を樹立した。どちらの細胞株もＣＤ４や、ＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ、ｐ１９等のＨＴＬＶ−Ｉ抗原に陽性であった。
ＩＬＴ−＃３７細胞に対するＨＳＣＴ後の患者＃３７のＰＢＭＣにおけるＴ細胞応答を、造血細胞がドナー由来の造血細胞に完全に置換されたＨＳＣＴの１８３日後に調べた。ドナー＃３６はＨＴＬＶ−Ｉキャリアだったので、ドナー＃３６のＩＬＴ＃３７に対するＴ細胞応答も調べてみた。培養開始１９日後に、インビトロでＩＬ−２の存在下においてホルムアルデヒド処理したＩＬＴ−＃３７で２回刺激したＨＳＣＴ後の患者＃３７のＰＢＭＣとドナー＃３６のＰＢＭＣを調べ、ＩＬＴ−＃３７及びＫ５６２細胞に対するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生能力を測定した。一晩インキュベーションした後、ＩＬＴ−＃３７に対してはＨＳＣＴ後の＃３７及びドナー＃３６両方の培養からＩＦＮ−γが産生されたが、Ｋ５６２細胞に対しては産生されなかった（図１）。ＩＦＮ−γ産生応答の規模はドナー＃３６の培養液よりもＨＳＣＴ後の＃３７の培養液においてはるかに大きかった。細胞増殖もまた、ドナー＃３６の培養液よりもＨＳＣＴ後の患者＃３７の培養液において速かった。本発明者らは、ＨＳＣＴ後の患者＃３７のエフェクター細胞のほとんどがＩＬＴ−＃３７細胞を死滅させる能力のあるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）であることを５１Ｃｒ放出分析により確認した。
Ｂ−２（ＨＳＣＴ後の患者から誘導したＣＴＬのＨＴＬＶ−Ｉ特異性）
次に、ＩＬＴ−＃３７細胞の刺激に対する、ＨＳＣＴ後の患者＃３７由来のＣＴＬの特異性を調べた。ＩＬＴ−＃３７に対して顕著なレベルの細胞傷害性を観察したが、ＰＨＡで刺激を受けたＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣに対しては観察できなかった（図２ａ）。この結果は、どちらの標的細胞もＨＳＣＴ前の患者＃３７から由来するものの、ＣＴＬの主な標的抗原は好ましくはＩＬＴ−＃３７で発現する抗原であり、ＰＨＡで刺激を受けたＰＢＭＣで発現する抗原ではないということを明示している。さらに、ＣＴＬはＨＬＡ−Ａ２及びＢ４６を共有する同種ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＴＣＬ−Ｋａｎ細胞を効果的に死滅させたが、ＨＬＡ不一致のＨＴＬＶ−Ｉ感染ＩＬＴ−Ａｓ−２、ＨＬＡが一致するドナー＃３６由来のＥＢＶ感染ＬＣＬ−＃３６、ＬＣＬ−Ｋａｎ、ＬＣＬ−Ａｓ細胞は死滅させなかった。以上の結果は、ＩＬＴ−＃３７に応答するＨＳＣＴ後の患者＃３７から樹立したＣＴＬ株（ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ株）がＨＴＬＶ−Ｉ抗原特異的であることを強く明示した。
放射標識したＩＬＴ−＃３７に対するＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ株の細胞傷害性は顕著であったが、Ｔａｘを含むＨＴＬＶ−ＩのｐＸ遺伝子産物を発現するワクシニア組換え体で感染させた非標識のＬＣＬ−＃３６（ＬＣＬ−＃３６／ｐ２７Ｘ）によって部分的に抑制され（図２ｂ）、ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ株がＩＬＴ−＃３７細胞を溶解することのできる大量のＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬを含むことが示された。
さらに本発明者らは、アンカーモチーフに基づきコンピュータプログラムによってＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘエピトープである可能性が最も高いと予測されたＴａｘアミノ酸配列に対応する１５から２４塩基長のオリゴペプチドのパネルと、５種の９塩基長のペプチドを用いてＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ株が認識したＨＴＬＶ−ＩのＴａｘにおけるエピトープを調べた。オリゴペプチドＴａｘ１−２４（ＭＡＨＦＰＧＦＧＱＳＬＬＦＧＹＰＶＹＶＦＧＤＣＶ；配列番号２）及びＴａｘ１１−１９（ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ；配列番号１）でパルスされたＬＣＬ−＃３６細胞は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ株によって選択的に死滅させられた。以上の結果は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＣＴＬ培養液中のＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬの主な集団が、ＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘ１１−１９エピトープに導かれることを明らかにした（図３）。なお、かかるＨＬＡ−Ａ２拘束性Ｔａｘ１１−１９エピトープについては、本発明者らは以前にヒトＨＬＡ−Ａ２に拘束されるＣＴＬの主要エピトープとして既に報告している（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２９２８−２９３３，１９９２）。
Ｂ−３（ＨＳＣＴ前の患者、ＨＳＣＴ後の患者、及びドナー間での異なるＨＴＬＶ−Ｉ特異的応答）
次に、ＨＳＣＴ前の＃３７、ＨＳＣＴ後の＃３７及びドナー＃３６間で、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答が質的又は量的に異なるかどうかを調べてみた。インビトロ培養による実験的なバイアスを受けずに、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ前駆体細胞数を調べるために、冷凍保存したＰＢＭＣを直ちにＥＬＩＳＰＯＴ分析にかけ、ＩＦＮ−γ産生を調べた。ＩＬＴ−＃３７又はＴａｘエピトープに応答するレシピエント＃３７及びドナー＃３６の非培養ＰＢＭＣ中のＣＴＬ前駆体についての結果を表１に示す。冷凍貯蔵されていたＨＳＣＴ前及びＨＳＣＴ後の患者＃３７の非培養ＰＢＭＣ及びドナー＃３６の非培養ＰＢＭＣを直接解凍し、上記Ａ［方法と材料］で述べたように、ホルマリン処理したＩＬＴ−＃３７、合成オリゴペプチドＴａｘ１１−１９及びＴａｘ３０７−３１５、又はコントロール培地と共に一晩インキュベーションした後、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴ分析を行い、１０５あたりのＩＦＮ−γ産生細胞の数を測定した。値は３回の実験の平均値±ＳＤである。また、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果はＰＢＭＣ１０５あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）で表わされている。その結果、一晩ＩＬＴ−＃３７で刺激を受けた結果生じたＩＦＮ−γ産生細胞数は、ＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６でほぼ同じであった。しかしながらＴａｘ１１−１９ペプチドに応答するＩＦＮ−γ産生細胞数は、ＨＳＣＴ後の＃３７の方がドナー＃３６よりも多かった。ＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣにおいては、ＩＦＮ−γ産生細胞数は刺激がないときであっても一般的に高く、ＩＬＴ−＃３７細胞又はＴａｘ１１−１９ペプチドで刺激を受けるとさらに増加した。
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次に、ＩＬ−２の存在下でＩＬＴ−＃３７細胞により定期的に刺激を与え、ＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣを培養した。ＨＳＣＴ後の患者＃３７のＰＢＭＣと異なり、ＨＳＣＴ前のＰＢＭＣは増殖せず、７週間以上維持することができなかった。この細胞株の培養開始４０日後の細胞傷害能力を示す（図４ａ）。同じように培養した培養４６日後のＨＳＣＴ後の＃３７及びドナー＃３６のＰＢＭＣと対照的に、ＨＳＣＴ前の患者＃３７の培養液はＨＴＬＶ−Ｉ特異的細胞傷害性の有意なレベルを示さなかった。また、本発明者らはこれらの培養したＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９の４量体で染色した。ＣＤ８＋細胞中のＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９＋細胞の割合はドナー＃３６よりもＨＳＣＴ後の患者＃３７において著しく高かった（図４ｂ）。ＨＳＣＴ前の患者＃３７の培養液は主にＣＤ８陰性細胞で構成されていた。以上の観察から、ＨＳＣＴ後の＃３７及びドナー＃３６のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬはインビボでＩＬＴ−＃３７の刺激に応答して増殖することができるが、ＨＳＣＴ前の＃３７のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬは増殖できないこと、及びＴａｘ１１−１９特異的ＣＴＬはＨＳＣＴ後の患者＃３７において選択的に活性化されることが明らかとなった。
Ｂ−４（ＨＴＬＶ−Ｉ陰性ドナーからのＨＳＣＴ後のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの誘導）
ＨＳＣＴの２番目のケースでは、ＨＳＣＴ前の患者Ｒ０７から由来するＩＬＴ−Ｒ０７に対して、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７（ＨＳＣＴ２５５日後）の細胞性免疫応答を同様に調査した。インビトロでの培養３週間後に、ホルムアルデヒド処理したＩＬＴ−Ｒ０７で刺激を受けたＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７のＣＤ８＋細胞を豊富に含むＰＢＭＣは、ＨＬＡ−Ａ２４を共有するＩＬＴ−Ｒ０７及び同種ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に対する顕著なレベルの細胞傷害性及びＩＦＮ−γ産生を示した。このように、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７のＰＢＭＣ培養液中に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが存在することが強く示唆された。続いてこれらのＣＴＬのエピトープのマッピングを行った。ＨＬＡ−Ａ２４拘束性エピトープである可能性が最も高いとコンピュータプログラムが予測したＴａｘの１５から２４塩基長のオリゴペプチドのパネル及び５種の９塩基長のオリゴペプチドのうち、Ｔａｘ３０１−３１５（ＳＦＨＳＬＨＬＬＦＥＥＹＴＮＩ；配列番号３）及びＴａｘ３０１−３０９（ＳＦＨＳＬＨＬＬＦ；配列番号４）が応答細胞と選択的に反応した（図５）。また、本発明者らはこれらの培養ＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９の４量体で染色した。ＣＤ８＋細胞中のＨＬＡ−Ａ＊２４０２／Ｔａｘ３０１−３０９＋細胞の割合は３割を超えていた（図６）。以上の観察から、選択的なＴａｘエピトープに対するＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答が、ＨＳＣＴ後の患者＃３７においてもみられたように、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７においても誘導されることが明らかにされた。
Ｃ［考察］
２名のＡＴＬ患者において、ＨＬＡが一致する同胞からの骨髄非破壊性ＨＳＣＴ後に、限られた数のエピトープに対するＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬ応答が見い出された。ＨＳＣＴ後の患者＃３７の培養ＰＢＭＣは、ＨＴＬＶ−Ｉキャリアであるドナー＃３６のＣＴＬ株よりもはるかに大量のＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｔａｘ１１−１９の４量体で染色されるＣＴＬを含有していた（図４ｂ）。これは、ＨＳＣＴ後の患者のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答とドナーにおけるＣＴＬ応答とがＣＴＬの量だけではなく質的にも異なることを意味している。ドナーにおいては、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的Ｔ細胞免疫応答は一次的なＨＴＬＶ−Ｉ感染に対して取得した宿主防御応答として誘引されなければならなかった。それに対して、ＨＳＣＴ後のレシピエントにおいては、Ｔ細胞免疫はＨＴＬＶ−Ｉが持続的に感染している状態において導入された。移植後レシピエントに観察されたと同様のＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬのオリゴクローナル（ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ）増殖が、ウイルス量が通常高いＨＡＭ／ＴＳＰ患者にも観察されることは興味深いことであり（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７，１３９−１４６，１９９６；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，１８３０−１８３９，１９９４）、ＨＳＣＴ後のＡＴＬ患者に観察されるＨＴＬＶ−Ｉ特異的応答の特定のパターンは、インビボでの豊富な抗原提示が原因でありうることが示唆された。非感染ドナーからのＨＳＣＴであった２番目のケースでは、ＨＳＣＴ後の患者Ｒ０７から誘導されたＣＴＬもまた限られたエピトープ、つまりＨＬＡ−Ａ２４拘束性Ｔａｘ３０１−３０９エピトープを特異的に認識し、選択的ＣＴＬ応答の原因がドナー側ではなくレシピエント側にあることを明示している。
ＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６の非培養ＰＢＭＣをＨＴＬＶ−Ｉ抗原で一晩刺激後、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行い、ほぼ同量の含有ＩＦＮ−γ産生細胞数を検出した（表１）。特に、ＨＳＣＴ前の患者＃３７のＰＢＭＣは刺激を受けなくても自発的にＩＦＮ−γを産生する、かなりの数の細胞を含んでいた。しかしながら、ＩＬＴ−＃３７細胞による刺激を受けたインビトロ培養後には、ＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬはＨＳＣＴ後の患者＃３７及びドナー＃３６からは誘導されたものの、ＨＳＣＴ前の患者＃３７からは誘導され得なかった（図４ａ、ｂ）。この結果はＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬの増殖はＡＴＬ患者においては稀であるという従前の観察と一致するものである（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ８  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ５４−５９，１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，１０３７−１０４１，１９８４；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７，１５６７−１５７３，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，７５６８−７５７３，１９９８；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２，１７６５−１７７１，１９９９）。ＡＴＬ患者においてＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが増殖できない理由は未だ不明であるが、本発明者らが得た結果によって、ＨＳＣＴ後の免疫再構築は抗原刺激により、記憶状態にあるＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬを増殖可能にならしめることが明示された。
ＧＶＨＤに関与することが示唆されてきたいくつかのｍＨＡ（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４，２８１−２８５，１９９６；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，１０５４−１０５７，１９９８；Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １０６，７２３−７２９，１９９９；Ｂｌｏｏｄ  ９２，２１６９−２１７６，１９９８）はＧＶＬ標的の候補である。ＨＳＣＴ前のＡＴＬ患者に由来するＩＬＴ−＃３７及びＩＬＴ−Ｒ０７細胞株は、ＨＴＬＶ−Ｉ抗原と共にレシピエント由来の抗原も所有していた。ＩＬＴ−＃３７に対するＨＳＣＴ後の患者＃３７から樹立したＣＴＬ株の細胞傷害性は、非標識のＴａｘ発現細胞を用いても完全には競合されなかったので（図２ｂ）、Ｔａｘ特異的抗原以外の他の抗原を認識するＣＴＬも同時に存在すると思われる。ＧＶＬ効果の正確な標的抗原及びＧＶＬ効果に対するＨＴＬＶ−ＩのＴａｘ特異的ＣＴＬの貢献度は充分には解明されていない。しかし、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者において同様に観察されたように、強力で選択的なＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬ応答が、ＨＬＡ一致の同胞からの同種ＨＳＣＴ後にＡＴＬ患者に樹立されたことは、患者体内でＣＴＬエピトープが強く発現されていたことを意味し、本発明のＣＴＬエピトープがワクチン抗原として有用であることを示す。このワクチン抗原を用いると、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の増殖をインビボで抑制するＣＴＬを誘導することが可能となる。
【産業上の利用可能性】（１）本発明により、日本人の６０％以上が有するＨＬＡ−Ａ２４に拘束されるＣＴＬの主要エピトープを見い出された。ＨＴＬＶ−Ｉに対する免疫応答の検査に本エピトープ部位のペプチドを使用することによって、日本人集団のかなりの部分をカバーできることになる。
（２）現在では、それぞれのＨＬＡについて親和性のあるアミノ酸アンカーモチーフからエピトープの予測が可能である。しかしながら、生体内の病原体に対する宿主の免疫反応は必ずしもこの予測と一致しない。本発明により同定されたエピトープは感染個体から得られたものであり、しかも他のエピトープよりも非常に強い選択性を持って認識されている。
（３）ＡＴＬ患者からＨＴＬＶ−Ｉ特異的ＣＴＬが誘導されることは稀だが、幹細胞移植後に完全寛解に入ったＡＴＬ症例から、本発明により同定されたエピトープに対するＣＴＬが選択的に誘導された。これは、患者体内でこのエピトープが強く発現されていたことを意味し、本エピトープがワクチン抗原として有用であることを示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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