(57)【要約】本発明は、プロリン４水酸化酵素の活性を調節する作用を評価するための方法を提供する。また、本発明は、その評価方法を利用するスクリーニング方法を提供する。さらに本発明は、線維症または関節リウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリーニング方法を提供する。  本発明は、シノビオリンによるプロリン４水酸化酵素αサブユニット（Ｐ４ＨＡ１）のユビキチン化活性を調節する作用を検出するための方法に関する。更に本発明は、この方法に基づくシノビオリンのＰ４ＨＡ１のユビキチン化活性を調節する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。このスクリーニングによって見出される化合物は、プロリン４水酸化酵素の活性異常によってもたらされる線維症や関節リウマチなどの疾患の治療や予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
【請求項２】
以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
【請求項３】
シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項１に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
【請求項５】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
【請求項６】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
【請求項７】
以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。
ａ）請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、基質のユビキチン化のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤。
【請求項９】
以下の要素を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
【請求項１０】
更に以下の要素を含む、請求項９に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
【請求項１１】
シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット。
【請求項１２】
以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
【請求項１３】
シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
【請求項１５】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
【請求項１６】
以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。
ａ）請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、シノビオリンと基質の結合のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤。
【請求項１８】
以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
【請求項１９】
以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１８に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
【請求項２０】
シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項１８に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
【請求項２２】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１８に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
【請求項２３】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１８に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
【請求項２４】
請求項１８〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項２５】
以下の要素を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
【請求項２６】
更に以下の要素を含む、請求項２５に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素、
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
【請求項２７】
シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、線維症を治療または予防するための被験化合物のスクリーニングのためのキット。
【請求項２８】
以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
【請求項２９】
シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項２８に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
【請求項３１】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項２８に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
【請求項３２】
請求項２８〜請求項３１に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項３３】
以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程
【請求項３４】
以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項３３に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
【請求項３５】
シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項３３に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
【請求項３７】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項３３に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
【請求項３８】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項３３に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
【請求項３９】
請求項３３〜請求項３８のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項４０】
以下の要素を含む関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
【請求項４１】
更に以下の要素を含む、請求項３９に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素、
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
【請求項４２】
シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、関節リウマチを治療または予防するための被験化合物のスクリーニングのためのキット。
【請求項４３】
以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がブロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程
【請求項４４】
シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項４３に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
【請求項４６】
シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項４３に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
【請求項４７】
請求項４３〜４６に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項４８】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項１に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、基質のユビキチン化のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定されたユビキチン化のレベル結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項１２に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定された結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。
【請求項５１】
請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
【請求項５３】
請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、シノビオリン活性を調節する作用を検出するための方法に関する。
さらに本発明は、線維症やリウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞に存在する膜蛋白質として発見された蛋白質である（ＷＯ  ０２／０５２００７参照）。遺伝子改変動物を用いた研究により、骨・関節の発生および関節症の発症に同因子が直接関与することが明らかとなったことから、シノビオリンは正常な骨形成または四肢の発達に貢献する活性を有する蛋白質と考えられる。また、蛋白質構造予測システムにより、シノビオリンにＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒモチーフの存在が示された。このモチーフは蛋白質の分解に関わるＥ３ユビキチン蛋白質リガーゼに共通に存在することが知られている。実際に、シノビオリンがＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒ型Ｅ３ユビキチン蛋白質リガーゼの特徴である自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（ＷＯ  ０２／０５２００７参照）。
骨・関節の発生および関節症におけるシノビオリンの機能、すなわちシノビオリンはどのような細胞内シグナル伝達経路に関わっているかを解明するには、シノビオリンと結合する因子の探索が有力な手法のひとつである。特に、シノビオリンの基質蛋白質を同定することは、シノビオリンが関与する細胞内シグナル伝達経路を明らかにするための重要な課題である。
シノビオリンと結合する蛋白質、その中でもシノビオリンの基質蛋白質を同定することは、骨・関節の発生および関節症におけるシノビオリンの機能を解明し、新たな関節症の診断および治療法の開発に有用である。しかしながら、シノビオリンの基質は同定されていない。したがって、シノビオリンとその基質との間の相互作用に影響を与える物質も明らかにされていない。
一方、コラーゲンは以下のような特徴を有する重要な生体構成成分である。
結合組織の主成分である、
三重らせん構造のドメインを１つ以上持つ、
超分子集合体を形成する、そして
細胞外マトリックスを構成する
コラーゲンの主要な役割のひとつは組織の構造形成と維持、さらに細胞の足場としての働きである。またコラーゲンは、細胞の移動、分化、増殖、代謝機能にも影響を与えている。コラーゲンの産生細胞は主として線維芽細胞である。まず、プレプロコラーゲンが細胞内で合成され、粗面小胞体でプロコラーゲンとなる。プロコラーゲンのＮ末端およびＣ末端にはプロペプチドが結合している。プロペプチドは、細胞から分泌される直前にプロコラーゲンペプチダーゼによって切り離されて、プロコラーゲンがトロポコラーゲンとなる。分泌されたトロポコラーゲンは膠原線維の基本成分である。分泌後のトロポコラーゲンが相互に架橋されて、コラーゲン線維束が形成される。
プロリン４水酸化酵素は、コラーゲン合成に必須の酵素である。プロリン４水酸化酵素の構造は公知である。すなわちプロリン４水酸化酵素は、それぞれ２つのαサブユニットとβサブユニットが会合して構成された４量体構造を有する。αサブユニットがプロリンの水酸化反応を触媒する作用を、そしてβサブユニットはジスルフィドイソメラーゼ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）活性を有していると考えられている。プロリン４水酸化酵素を構成するαサブユニットを、Ｐ４ＨＡ１と記載する。プロリン４水酸化酵素は、プロコラーゲンの−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ配列上のプロリン残基をヒドロキシル化することによって、安定なコラーゲン三重らせん構造を形成させる（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｃｍｉ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，１９９１，１３，Ｓ２−７参照）。
更にプロリン４水酸化酵素は、ヒドロキシル化されていないプロコラーゲンに結合することによって、その小胞体からの分泌を防ぐ作用を持つことも報告された（Ｗａｌｍｓｌｅｙ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（２１），ｐ１４８８４−１４８９２参照）。ヒドロキシル化されていないプロコラーゲンは、未成熟なプロコラーゲンである。したがって、プロリン４水酸化酵素は、生体内におけるコラーゲンの品質管理を担当していると考えられる。
コラーゲンは生体の重要な構成要素であるとともに、線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）などの病的な生体反応の原因にもなっている。たとえば、肺、肝、あるいは腎などの組織におけるコラーゲンの蓄積は、各臓器の線維症の原因となる。リウマチや変形性骨関節症の関節においては、軟骨や滑膜細胞のコラーゲンを含む細胞外マトリックスの異常が見られることが知られている（桑名正隆、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，Ｖｏｌ．３８（８），ｐ９００−９０７参照）。
したがって、コラーゲン産生の制御によって、これらの疾患を治療できる可能性がある。たとえばストレス蛋白質ＨＳＰ４７（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４７）の活性阻害によってコラーゲンの産生を抑制することで、これらの疾患の治療が可能なことが報告されている（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ＫＩ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ．１９９３  Ａｐｒ；２５（２）：１１３−２６．参照）。プロリン４水酸化酵素、およびこの酵素によるコラーゲン産生は、線維症及び関節炎の診断や治療法の開発における重要な標的となるはずである。しかし、プロリン４水酸化酵素の活性調節機構は明らかにされていない。
関節リウマチ（以下、ＲＡあるいはリウマチと記載することがある）は、関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の慢性炎症性疾患である。滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）は、関節の滑膜で１−６層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞で、滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。ＲＡ患者の関節では、滑膜組織の増殖、その結果として引き起こされる多層構造、滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。またＲＡ患者の血清中には、自己のＩｇＧのＦｃ領域に対する自己抗体が存在することから、自己免疫疾患のひとつとして考えられているがその病因については未だに解明されていない。
【発明の開示】
本発明は、プロリン４水酸化酵素の活性調節機構を明らかにすることを課題とする。また本発明は、プロリン４水酸化酵素の活性を調節する作用を評価するための方法の提供を課題とする。あるいは本発明は、その評価方法を利用して、当該作用を有する化合物をスクリーニングするための方法の提供を課題とする。さらに本発明は、関節リウマチまたは線維症の治療または予防に有用な化合物をスクリーニングするための方法の提供を課題とする。
本発明者らは、シノビオリンと結合する蛋白質を同定するため、酵母ツーハイブリッド法を用いてスクリーニングを行った。シノビオリンをベイトとして用い、ヒト軟骨由来ｃＤＮＡライブラリーを酵母ツーハイブリッドシステム（クロンテック社ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステム）によってスクリーニングした。その結果、プロリン４水酸化酵素αサブユニット（Ｐｒｏｌｙｌ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  α  ｓｕｂｕｎｉｔ；Ｐ４ＨＡ１）を得た。次に、ＧＳＴプルダウン解析により、Ｐ４ＨＡ１とシノビオリンの結合を確認した。
更に本発明者らは、Ｐ４ＨＡ１がシノビオリンのユビキチンリガーゼ活性によって、ユビキチン化されることを明らかにした。すなわちＰ４ＨＡ１は、シノビオリンユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の基質ポリペプチドであることが確認された。シノビオリンは、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化によって、プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）によるＰ４ＨＡ１の分解を誘導する。プロリン４水酸化酵素は、コラーゲン合成における重要な酵素（ｋｅｙ  ｅｎｚｙｍｅ）の一つである。したがって、シノビオリンが、プロリン４水酸化酵素活性の制御を介して、個体の発達や骨・関節の発生および関節症の発症に関わる可能性が考えられた。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、シノビオリンとＰ４ＨＡ１の相互作用に干渉する作用を評価するための方法を確立した。またその方法を利用して、当該作用を有する物質のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載の被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法に関する。あるいは本発明は、当該方法を利用してシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
〔２〕以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
〔３〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１に記載の方法。
〔４〕基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項１に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
〔５〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
〔６〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
〔７〕以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。
ａ）請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、基質のユビキチン化のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
〔８〕請求項７に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤。
〔９〕以下の要素を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
〔１０〕更に以下の要素を含む、請求項９に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
〔１１〕シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット。
〔１２〕以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
〔１３〕シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項１２に記載の方法。
〔１４〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
〔１５〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１２に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
〔１６〕以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法。
ａ）請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、シノビオリンと基質の結合のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
〔１７〕請求項１６に記載の方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤。
また、本発明者らは、線維症の治療または予防に有用な化合物のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載のスクリーニング方法、そのためのキット、そしてこの方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する線維症の治療および／または予防のための医薬組成物に関する。
〔１８〕以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
〔１９〕以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１８に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
〔２０〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項１８に記載の方法。
〔２１〕基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項１８に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
〔２２〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１８に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
〔２３〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項１８に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
〔２４〕請求項１８〜請求項２３のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
〔２５〕以下の要素を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
〔２６〕更に以下の要素を含む、請求項２５に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素、
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
〔２７〕シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、線維症を治療または予防するための被験化合物のスクリーニングのためのキット。
〔２８〕以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
〔２９〕シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項２８に記載の方法。
〔３０〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項２８に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
〔３１〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項２８に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
〔３２〕請求項２８〜請求項３１に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
また、本発明者らは、関節リウマチの治療または予防に有用な化合物のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に記載のスクリーニング方法、そのためのキット、そしてこの方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する慢性関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物に関する。
〔３３〕以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程
〔３４〕以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項３３に記載の方法。
ｉ）ユビキチン活性化酵素
ｉｉ）ユビキチン転移酵素、
ｉｉｉ）ユビキチン、および
ｉｖ）アデノシン３リン酸
〔３５〕シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与える請求項３３に記載の方法。
〔３６〕基質のユビキチン化のレベルを、以下のいずれかのレベルを指標として測定する請求項３３に記載の方法。
Ａ）ユビキチン化された基質のレベル
Ｂ）ユビキチン化されなかった基質のレベル、および
Ｃ）プロリン４水酸化酵素αサブユニットの生物学的活性のレベル
〔３７〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項３３に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
〔３８〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項３３に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
〔３９〕請求項３３〜請求項３８のいずれか一項に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
〔４０〕以下の要素を含む関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキット。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログ
〔４１〕更に以下の要素を含む、請求項３９に記載のキット。
（３）ユビキチン活性化酵素、
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸
〔４２〕シノビオリンまたはそのホモログ、およびプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログを発現する細胞と、プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログのユビキチン化のレベルを測定するための手段を含む、関節リウマチを治療または予防するための被験化合物のスクリーニングのためのキット。
〔４３〕以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程
〔４４〕シノビオリンと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有している請求項４３に記載の方法。
〔４５〕プロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログが以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項４３に記載の方法。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
〔４６〕シノビオリンまたはそのホモログが、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドである請求項４３に記載の方法。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
〔４７〕請求項４３〜４６に記載の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
また、本発明者らは、本願発明の方法を用いて被験化合物のスクリーニングを行い、配列番号：５に示されるポリペプチドを単離した。すなわち本発明は、以下に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物に関する。
〔４８〕配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
〔４９〕配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項１に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、基質のユビキチン化のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定されたユビキチン化のレベル結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。
〔５０〕配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、請求項１２に記載の方法において該ポリペプチドを被験化合物として用いたときに、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが該ポリペプチド不存在下において測定された結合のレベルよりも低い、ポリペプチド。
〔５１〕請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔５２〕請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、線維症の治療および／または予防のための医薬組成物。
〔５３〕請求項４８〜５０のいずれか一項に記載のポリペプチドを有効成分として含有する、関節リウマチの治療および／または予防のための医薬組成物。
本発明は、プロリン４水酸化酵素の活性が、シノビオリンによるプロリン水酸化酵素αサブユニットのユビキチン化によって制御されているという新規な知見に基いている。すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がＰ４ＨＡ１またはそのホモログである方法を提供する。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
ユビキチン化とは、少なくとも１つのユビキチンが結合されることを言う。またユビキチン化のレベルとは、結合したユビキチンの数、並びにユビキチンが結合した場所の数のいずれか、または両方を言う。すなわち、あるポリペプチドの特定の部分に結合したユビキチンの数を測定することによって、ユビキチン化のレベルを評価することができる。更に、あるポリペプチドの複数の領域がユビキチン化される場合には、ユビキチン化された領域の数を測定することによって、ユビキチン化のレベルを評価することもできる。
ユビキチン化のレベルを測定する方法は公知である。たとえば、ユビキチンに結合する親和性物質を利用して、ユビキチン化のレベルを測定することができる。親和性物質として、抗ユビキチン抗体を利用することができる。たとえばユビキチンを特異的に認識して結合するモノクローナル抗体が市販されている。ユビキチンに対する親和性物質を標識しておけば、基質に結合した標識物質のレベルに基いて、ユビキチン化のレベルを明らかにすることができる。あるいは予め標識したユビキチンを与え、基質ポリペプチドに結合したユビキチンの量を標識物質のレベルに基いて測定することもできる。
抗体やユビキチンの標識には、一般に用いられる標識技術を応用することができる。具体的には、放射活性物質、酵素活性物質、蛍光活性物質、あるいは発光物質などを標識として利用することができる。また、標識物質を間接的に抗体やユビキチンに結合させるために、結合性のタグを利用することもできる。たとえば、ビオチン化した抗体やユビキチンには、アビジン化した標識物質を結合することができる。更に、結合性のタグを導入したユビキチンを利用し、ユビキチン化された基質を捕捉することもできる。捕捉された基質ポリペプチドのレベルを測定することによって、ユビキチン化のレベルを評価することができる。この方法においては、基質ポリペプチドに対する標識抗体を利用して、ユビキチン化のレベルが測定される。ユビキチン化のレベルの測定を目的として、以下のような標識ユビキチンが市販されている。
フルオレセイン結合ユビキチン：蛍光物質であるフルオレセインを結合したユビキチン。蛍光強度を指標としてユビキチン化のレベルを測定することができる。
ビオチン化ユビキチン：結合性リガンドであるビオチンで標識されたユビキチン。ビオチン化ユビキチンでユビキチン化された基質ポリペプチドは、アビジンカラムに捕捉することができる。あるいはアビジン化された酵素や蛍光物質などを利用して、ユビキチン化のレベルを測定することもできる。
（Ｈｉｓ）６−ユビキチン：ヒスチジンタグで標識したユビキチン。ヒスチジンタグはニッケルカラムに捕捉することができる。つまり、ユビキチン化された基質をユビキチンを介してカラムに捕捉することができる。あるいは、抗ヒスチジンタグ抗体を利用して間接的に標識することもできる。
ユビキチン化のレベルの測定に当たっては、基質を固相化するのが有利である。たとえば、予め基質を固相に結合させておくことができる。具体的には、ビーズや反応容器の内壁に、化学的に基質を共有結合させる、あるいは物理吸着させることができる。ビーズや反応容器には、ポリスチレンなどが利用できる。基質の化学的な結合のために、アミノ基やカルボキシル基などの官能基を導入したポリスチレン誘導体も公知である。
あるいは、先に述べた結合親和性物質で標識したユビキチンを用いて、ユビキチン化された基質を、ユビキチンを介して間接的に捕捉することもできる。逆に、基質に対する抗体や、結合性親和性物質を導入した基質を、固相に捕捉することもできる。いずれにせよ、固相化された基質は、固相に結合しなかった成分と分離され、続いてユビキチン化のレベルが測定される。ユビキチンや基質自身が標識されていない場合には、ユビキチンや基質に対する親和性物質を利用して標識物質を結合させる。たとえばユビキチンに対する抗体が利用される。最終的に、固相上に捕捉された標識（または結合されなかった標識）のレベルを測定して、ユビキチン化のレベルを決定することができる。このようなユビキチン化のレベルの測定の結果、最終的に、ユビキチン化された基質の量を明らかにすることができる。あるいは、ユビキチン化のレベルの測定によって、ユビキチン化されなかった基質の量を明らかにすることもできる。
加えて、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化によって、プロリン４水酸化酵素の生物学的活性が制御されていることが本発明によって明らかにされた。したがって、プロリン４水酸化酵素の生物学的活性のレベルを指標として、ユビキチン化のレベルを測定することもできる。プロリン４水酸化酵素の生物学的活性のレベルは、たとえばトリチウム放出アッセイ（Ｔｒｉｔｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．８２，ｐｐ．２４６−２５９，１９８２）などの方法によって測定することができる。
シノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる順序は任意である。すなわち本発明は、前記工程ａ）、ａ’）、およびａ’’）に記載したいずれかの順序でシノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる工程を含むことができる。被験物質の存在下で三者をインキュベートする場合（ａ）には、シノビオリン（またはそのホモログ）によるユビキチン化反応に与える被験物質の影響を評価することができる。あるいは、シノビオリン（またはそのホモログ）および基質のいずれかに被験物質を接触後にユビキチン化が可能な条件を与えることもできる（ａ’）。この場合には、シノビオリンのユビキチンリガーゼ活性に与える影響、または基質のユビキチン化される機能のいずれかに対する被験物質の影響が評価される。更に、ユビキチン化が可能な条件を与えた後に被験物質を接触させる（ａ’’）ことによって、ユビキチン化された基質に対する被験物質の影響を評価することができる。
本発明においては、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログが基質として利用される。Ｐ４ＨＡ１は、４量体構造のプロリン４水酸化酵素を構成するサブユニットの１つである。αサブユニットは、プロリンの水酸化反応を触媒する作用を有していると考えられている。一方そのホモログとは、Ｐ４ＨＡ１との構造的な類似性を有し、かつシノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチドである。本発明におけるＰ４ＨＡ１またはそのホモログとして、たとえば以下の（ａ）−（ｅ）に示すポリペプチドを用いることができる。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンによってユビキチン化することができるポリペプチド
配列番号：１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して変異を含む塩基配列で構成されるポリヌクレオチドは、当業者によって公知の方法で単離することができる（実験医学別冊・遺伝子工学ハンドブック，ｐｐ２４６−２５１、羊土社、１９９１年発行）。たとえば類似する遺伝子を含むライブラリーを対象に、配列番号：１に示す塩基配列（またはその断片）をプローブとしてスクリーニングすれば、相同性の高い塩基配列を持ったＤＮＡをクローニングすることができる。このようなライブラリーとしては、配列番号：１の塩基配列に対してランダムに変異を入れたもの、ヒト以外の種に由来するｃＤＮＡライブラリー等を示すことができる。
与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、たとえばＤＮＡの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７９：７２５８−７２６０，１９８２）。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入することができる。あるいはまた、目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としてはギャップド  デュプレックス法（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法）等がある（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７，１９８７）。変異を導入すべき遺伝子をクローニングした環状２本鎖のベクターを１本鎖とし、目的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。制限酵素により切断して線状化させたベクター由来の相補１本鎖ＤＮＡを、前記環状１本鎖ベクターにアニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギャップをＤＮＡポリメラーゼで充填し、更にライゲーションすることにより完全な２本鎖環状ベクターとする。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸置換において保存的置換が加えられたポリペプチドであって、Ｐ４ＨＡ１（配列番号：２）と機能的に同等なポリペプチドが含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む）または下降（例えばドミナントネガティブなどを含む）させることも考えられる。
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、人為的に合成された、または天然に存在するポリペプチドを含む。ここで「複数のアミノ酸」とは、典型的には５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このように自然に存在するポリペプチドであって、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、本発明に利用することができる。
あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に利用することができる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。
この他、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログであるタンパク質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：１に示すようなＰ４ＨＡ１をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはＰ４ＨＡ１またはそのホモログであるタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば７０％以上、望ましくは９０％以上の同一性を示すことができる。
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるＰ４ＨＡ１のホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするＰ４ＨＡ１のホモログは、本発明における機能的に同等なタンパク質を構成する。
本発明によるポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
ヒトＰ４ＨＡ１（配列番号：２）に変異を導入して得たタンパク質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、通常、ヒトＰ４ＨＡ１（配列番号：２）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のウェブサイトの相同性検索（Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）のページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ］。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えばＮＣＢＩのホームページのウェブサイトのＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆  Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９６，２６６：４６０−４８０：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）］
本発明においては、シノビオリンまたはそのホモログがユビキチンリガーゼ（Ｅ３）として利用される。シノビオリンは、ＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒモチーフを有するポリペプチドである。そのアミノ酸配列（配列番号：４）と、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号：３）は明らかにされている。一方そのホモログとは、シノビオリンとの構造的な類似性を有し、かつＰ４ＨＡ１をユビキチン化することができるポリペプチドである。本発明におけるシノビオリンまたはそのホモログとして、たとえば以下の（Ａ）−（Ｅ）に示すポリペプチドを用いることができる。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをユビキチン化する活性を有するポリペプチド
既知のアミノ酸配列情報、および塩基配列情報に基いて、機能的に同等なポリペプチドを得るための方法は、既に述べた。また、ホモログとして望ましい構造的な条件も先に述べたとおりである。このようにして得ることができるホモログは、シノビオリンと同様に本発明に用いることができる。たとえばＷＯ  ０２／０５２００７には、各種のシノビオリンホモログが開示されている。これらのホモログは、Ｐ４ＨＡ１をユビキチン化する作用を有する限り、本発明の方法に用いることができる。
配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、人為的に合成された、または天然に存在するポリペプチドを含む。ここで「複数のアミノ酸」とは、典型的には５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、１アミノ酸）であり、数個のアミノ酸である。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このように自然に存在する蛋白質であって、かつ配列番号：４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、本発明に利用することができる。
あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象とは、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。多型現象は、異なる遺伝子が見出される割合とは無関係である。
この他、シノビオリンまたはそのホモログであるタンパク質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：３に示すような本発明によるシノビオリンをコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを単離するのである。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはシノビオリンまたはそのホモログであるタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば７０％以上、望ましくは９０％以上の同一性を示すことができる。
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種におけるシノビオリンのホモログをコードするポリヌクレオチドの単離が可能である。ヒト以外の動物種、すなわちマウス、ラット、ウサギ、ブタ、あるいはヤギ等の動物種から得ることができるポリヌクレオチドがコードするシノビオリンのホモログは、本発明における機能的に同等なタンパク質を構成する。
本発明によるポリヌクレオチドは、その由来を問わない。すなわち、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのほか、合成によって得ることもできる。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
ヒトシノビオリン（配列番号：４）に変異を導入して得たタンパク質や、上記のようなハイブリダイゼーション技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、通常、ヒトシノビオリン（配列番号：４）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）において、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる［例えば日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のウェブサイトの相同性検索（Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）のページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ］。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えばＮＣＢＩのホームページのウェブサイトのＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．＆  Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９６，２６６：４６０−４８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）］
実際に本発明者らは、ＷＯ  ０２／０５２００７において、シノビオリンを構成するアミノ酸配列に対して、１アミノ酸を欠失したクローンを明らかにした。このようなアミノ酸配列に変異を含む蛋白質は、本発明に必要な機能を有する限り、本発明におけるシノビオリンのホモログに含まれる。本発明者らが確認した１アミノ酸を欠失した変異体は、配列番号：３における１２９３−１２９５に相当するｇｃａを欠損している。その結果、配列番号：４における４１２位のＡｌａを欠損している。
本発明において、ある蛋白質がＰ４ＨＡ１をユビキチン化する作用を有することは、先に述べたユビキチン化が可能な条件において当該蛋白質と基質を接触させて、基質のユビキチン化を検出することによって確認することができる。
次に本発明において、基質またはそのホモログのユビキチン化が可能な条件下とは、シノビオリンによるＰ４ＨＡ１のユビキチン化が可能な条件をいう。このような条件は、インビトロで、あるいはインビボで構成することができる。たとえば以下の成分の共存により、基質のユビキチン化が可能な条件が与えられる。
（ｉ）ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、
（ｉｉ）ユビキチン転移酵素（Ｅ２）、
（ｉｉｉ）ユビキチン、および
（ｉｖ）アデノシン３リン酸
一般に、生体内において、蛋白質のユビキチン化は、以下のようにして進行すると考えられている。まず蛋白質のユビキチン化には上記４つの成分に加えて、ユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）が必要である。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン転移酵素（Ｅ２）、およびユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）は、ユビキチンシステムと呼ばれる複合酵素系を構成している。場合により、Ｅ２によって基質がユビキチン化される場合もあるが、Ｐ４ＨＡ１は、シノビオリン（Ｅ３）によってユビキチン化される。
ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）は、ユビキチン転移酵素（Ｅ２）を活性化する。一方、ユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）は、基質蛋白質を認識して捕捉する。そして、活性化されたユビキチン転移酵素（Ｅ２）のユビキチンを用いて、捕捉した基質蛋白質をユビキチン化する。ユビキチンシステムにおいて、ユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）は、基質となる蛋白質を識別する重要な役割を有している。すなわち、ユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）による基質の選択は、基質蛋白質の運命の終わりを意味している。
ユビキチンシステムにおいて、基質を識別するユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）と基質の組み合わせは重要である。したがって、本発明における基質は、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログが用いられなければならない。他方、ユビキチン連結酵素（リガーゼ／Ｅ３）は、シノビオリンまたはそのホモログである必要がある。しかしその他の酵素は、基質のユビキチン化が可能な任意の酵素とすることができる。
たとえば実施例においては、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）には、酵母由来の酵素が用いられた。またユビキチン転移酵素（Ｅ２）には、ヒト由来のＵｂｃＨ５ｃが用いられた。しかし本発明におけるユビキチン活性化酵素（Ｅ１）は、酵母由来の酵素に限定されない。たとえば、ラット由来のユビキチン活性化酵素（Ｅ１）を本発明に利用することができる。同様にユビキチン転移酵素（Ｅ２）も、ヒト由来の酵素に限定されない。Ｅ１あるいはＥ２は、天然の酵素であっても遺伝子組み換え体であっても良い。遺伝子組み換え体は、Ｅ１やＥ２がその活性を維持している限り、構造の改変が許容される。構造の改変には、アミノ酸配列の置換、欠失、挿入、あるいは付加が含まれる。たとえば以下に述べる実施例においては、ヒト由来のＵｂｃＨ５ｃをＧＳＴ融合蛋白質として大腸菌で発現させたＥ２を用いている。このような遺伝子組み換え体は、本発明におけるＥ２に含まれる。
上記成分（ｉ）−（ｉｖ）を用いて、基質のシノビオリンによるユビキチン化が可能な条件を与えるとき、当業者は、ユビキチン化に必要なその他の条件をデザインすることができる。具体的には、インキュベーションのための条件や、各成分の使用量を、当業者は決定することができる。これらの条件を例示すれば、各成分はたとえば、以下のような濃度で利用される。
シノビオリン（Ｅ３）：  ５００ｎｇ
ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１：  ８００ｎｇ
（ｉ）ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）：  ６０ｎｇ
（ｉｉ）ユビキチン転移酵素（Ｅ２）：  ０．３ｍｇ
（ｉｉｉ）ユビキチン（３２Ｐ−標識  Ｈｉｓ−ユビキチン）：  ０．７５μｇ
上記組成を以下の反応緩衝液に加えて反応液量を３０μＬとする。この混合液を３７℃で１時間インキュベートすることによって、基質のユビキチン化が可能な条件とすることができる。各成分の濃度は、必用に応じて適宜調節することができる。たとえば上記の使用量の１／１０から１０倍の間で、調節することができる。
反応緩衝液の組成
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液  ｐＨ７．４
５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２ｍＭ  ＮａＦ
１０ｎＭ  オカダ酸
２ｍＭ  ＡＴＰ（ｉｖ）
０．６ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）
あるいは、本発明におけるユビキチン化が可能な条件は、インビボにおいて構成することもできる。すなわち、シノビオリンまたはそのホモログと基質とを発現する細胞内で基質をユビキチン化することによって、基質のユビキチン化が可能な条件を与えることができる。シノビオリンと基質とを発現する細胞としては、たとえば滑膜細胞を用いることができる。
あるいは、シノビオリン（またはそのホモログ）と基質とを遺伝子工学的に強制発現させた細胞によって、基質のユビキチン化が可能な条件を与えることもできる。外来遺伝子としてシノビオリン（またはそのホモログ）あるいは基質をコードする遺伝子を導入した細胞においては、誘導発現が可能な発現システムを利用することによって、シノビオリンや基質の発現時期を調節することができる。生きている細胞は、ユビキチンシステムを持っている。すなわち上記成分（ｉ）−（ｉｖ）を細胞内に備えている。したがって、シノビオリンと基質とを存在させれば、本発明におけるユビキチン化が可能な条件を構築することができる。
シノビオリンとその基質であるＰ４ＨＡ１をコードする塩基配列は公知である。当業者は、公知の遺伝情報に基いて、その発現系をデザインすることができる。強制発現させるための宿主細胞には、動物細胞、昆虫細胞、あるいは酵母などを利用することができる。
細胞内でユビキチン化された基質は、細胞を破壊して回収することができる。更に、ユビキチンや基質に対する親和性物質を利用して、目的の基質を単離することができる。なお細胞内には、目的としている基質以外にもユビキチン化された蛋白質が多く存在する。したがって、細胞内で基質をユビキチン化した場合には、目的とする基質蛋白質のユビキチン化を特異的に測定することが望ましい。
そのためには、たとえば、基質蛋白質に対する抗体を使って基質蛋白質を特異的に捕捉する方法を利用することができる。あるいは基質蛋白質を、ヒスチジンタグなどのタグペプチドとの融合蛋白質として発現させ、タグをマーカーとして基質蛋白質を単離することもできる。こうして細胞から回収された基質蛋白質は、先に述べたような方法によってそのユビキチン化のレベルが測定される。
たとえば、タグ付きのユビキチン、並びにシノビオリン（またはそのホモログ）およびＰ４ＨＡ１（またはそのホモログ）の両方あるいはいずれかを共形質転換した細胞をユビキチン化が可能な条件として利用することができる。ユビキチン化のレベルは、タグに対する抗体を使った免疫沈降の後に、沈降分画のＰ４ＨＡ１のレベルを測定することによって、決定することができる。沈降分画のＰ４ＨＡ１のレベルは、Ｐ４ＨＡ１に対する抗体を利用して免疫学的に測定することができる。あるいは、免疫沈降の後に、沈降しなかったＰ４ＨＡ１のレベルを測定することによって、ユビキチン化されなかった基質を測定することもできる。
更に、タグ付きのユビキチンおよびシノビオリン（またはそのホモログ）を、Ｐ４ＨＡ１を発現している細胞に共形質転換することによって、ユビキチン化が可能な条件を構築することができる。抗Ｐ４ＨＡ１抗体で免疫沈降した後に、タグに対する抗体またはユビキチンに対する抗体を用いて、ユビキチン化のレベルを測定することができる。Ｐ４ＨＡ１を発現している細胞としては、たとえば滑膜細胞などを利用することができる。
また本発明は、以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。
ａ）本発明によるシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、基質のユビキチン化のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法について、より具体的な方法を以下に例示する。
シノビオリンとＰ４ＨＡ１との相互作用に影響を与える物質の選択に当っては、最も一般的には、被験化合物の存在下で、酵素であるシノビオリンとその基質であるＰ４ＨＡ１とを反応させ、その反応量を測定すればよい。この場合、対照として、被験化合物の非存在下でシノビオリンとＰ４ＨＡ１とを反応させた結果とを比較すればより客観的な選択が可能である。
シノビオリンは、Ｐ４ＨＡ１をユビキチン化する反応を触媒する。従って、反応量の測定のためには、前記反応をユビキチンの存在下で行い、ユビキチン化されたＰ４ＨＡ１を測定すればよい。ユビキチン化されたＰ４ＨＡ１の量、すなわちＰ４ＨＡ１に結合したユビキチンの量を測定する方法としては、ユビキチンに対して特異的に結合する物質、例えばユビキチンに対する抗体を使用する方法が挙げられる。ユビキチンに対する抗体は、定法に従って得ることができる。例えば、免疫原であるユビキチンを免疫動物に注射し、そしてその動物の血液から血清を採取すればよい。免疫動物には、マウス、ラット、あるいはウサギなどを用いることができる。また、抗体としてモノクローナル抗体を利用することもできる。モノクローナル抗体を得るための方法は公知である。
さらに、ユビキチンの測定のためには、ユビキチン自体を標識し、それを検出又は測定することもできる。このための標識としては、常用の種々の標識を用いることができる。具体的には、放射能標識、酵素標識、ビオチン等が標識としてあげられる。例えば、ユビキチンを３２Ｐにより標識した場合には、オートラジオグラフィーにより検出することができる。あるいは、シンチレーションカウンターで３２Ｐの放射活性を測定することもできる。また、ビオチンにより標識した場合には、標識したアビジンにより検出することができる。
具体的な方法としては、例えば次のような方法を例示することができる。
方法１．
まずタグ付きＰ４ＨＡ１を調製し、これとＥ１、Ｅ２、ＡＴＰ、シノビオリン、ユビキチン及び被験化合物をインキュベートし、Ｐ４ＨＡ１−ユビキチンの複合体を生成させる。次にＰ４ＨＡ１に付したタグに対する抗体を反応させ、免疫沈降によって、前記複合体と未反応のユビキチンとを分離する。更に前記複合体を形成したユビキチンを、ユビキチンに対する抗体により検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるユビキチンの結合量を比較する。
方法２．
Ｐ４ＨＡ１、Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＰ、シノビオリン、［３２Ｐ］標識ユビキチン、及び被験化合物を一緒にインキュベートし、Ｐ４ＨＡ１−ユビキチンの複合体を生成させる。次に電気泳動などにより、前記の複合体と未反応のユビキチンとを分離する。更に前記複合体を形成したユビキチンを、オートラジオグラフィーにより検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるユビキチンの結合量を比較する。
なお、上記の方法において、３２Ｐに代えて、ビオチン標識したユビキチンを利用することもできる。この場合、標識アビジンでユビキチンが検出または測定される。標識には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、蛍光等を利用することができる。
方法３．
シノビオリン、Ｅ１、Ｅ２、ＡＴＰ、液体シンチランを含むビーズに結合したＰ４ＨＡ１、［３３Ｐ］または［３２Ｐ］標識ユビキチン、及び被験化合物を反応させ、標識ユビキチンがＰ４ＨＡ１に結合したときに生じる励起光を液体シンチレーションカウンターにより検出又は測定する。被験化合物を含まない反応系により、上記と同じ検出又は測定を行い、被験化合物の有無によるユビキチンの結合量を比較する。
方法１〜３において、被験化合物がシノビオリンの活性、即ちシノビオリンとＰ４ＨＡ１との相互作用を阻害する物質（アンタゴニスト）である場合、被験化合物の存在下でのユビキチンの結合量が被験化合物の非存在下でのそれに比べて少なくなる。被験化合物がシノビオリンとＰ４ＨＡ１との相互作用を活性化する物質（アゴニスト）である場合、結果は逆になる。したがって、上記の実験の結果により、被験化合物がアゴニスト（活性化物質）であるかアンタゴニスト（阻害物質）であるかを決定することができる。
本発明者らによって、シノビオリンがＰ４ＨＡ１に結合し、ユビキチン化することが明らかにされた。したがって、両者の結合に干渉する作用を検出することによって、シノビオリンによるＰ４ＨＡ１のユビキチン化作用を調節する作用を評価することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法であって、基質がＰ４ＨＡ１またはそのホモログである方法に関する。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルと違うときに、被験化合物のシノビオリンによる基質のユビキチン化作用を調節する活性が検出される工程
シノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる順序は任意である。すなわち本発明は、前記工程ａ）、ａ’）、およびａ’’）に記載したいずれかの順序でシノビオリン（またはそのホモログ）、基質、および被験物質を接触させる工程を含むことができる。被験物質の存在下で三者をインキュベートする場合（ａ）には、シノビオリン（またはそのホモログ）と基質の結合に与える影響を評価することができる。あるいは、シノビオリン（またはそのホモログ）および基質のいずれかに被験物質を接触後に両者の結合が可能な条件を与えることもできる（ａ’）。この場合には、シノビオリン、または基質の結合能に対する被験物質の影響が評価される。更に、シノビオリンと基質の結合が可能な条件を与えた後に被験物質を接触させる（ａ’’）ことによって、シノビオリンと基質の結合体に対する被験物質の影響を評価することができる。
上記方法において、シノビオリンまたはそのホモログと基質のいずれかが固相に結合されているか、または固相に結合可能な標識を有していることが望ましい。固相に結合可能な標識とは、たとえば結合性リガンドを示すことができる。結合性リガンドにはビオチンなどが含まれる。ビオチンは、アビジンセファロースなどの固相に捕捉することができる。固相への結合により、両者の結合生成物を容易に分離することができる。
一方、固相化しなかった他方の成分は、検出を容易にするために標識しておくことができる。シノビオリン、そのホモログ、あるいは基質は、蛋白質を標識するための公知の方法により標識することができる。具体的には、放射活性物質、酵素活性物質、蛍光活性物質、あるいは発光物質などを標識として利用することができる。また、標識物質を間接的に蛋白質に結合させるために、結合性のタグを利用することもできる。たとえば、ビオチン化した蛋白質には、アビジン化した標識物質を結合することができる。
本発明の方法において、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログは、シノビオリンとの結合活性を有する任意の蛋白質を用いることができる。具体的には、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログは、以下の（ａ）−（ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、シノビオリンと結合することができるポリペプチド、および
（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、シノビオリンと結合することができるポリペプチド
また本発明の方法において、シノビオリンまたはそのホモログは、Ｐ４ＨＡ１との結合活性を有する任意の蛋白質を用いることができる。具体的には、シノビオリンまたはそのホモログは、以下の（Ａ）−（Ｅ）のいずれかに記載のポリペプチドを含む。
（Ａ）配列番号：３に記載の塩基配列によってコードされるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｃ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド、および
（Ｅ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合するポリペプチド
与えられたアミノ酸配列に対して、任意の変異を導入するための方法は既に述べた。あるいは、人為的にまたは天然に存在する変異体をコードするポリヌクレオチドから、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによって、構造的に類似のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法も公知である。当業者は、このようにして得ることができる各種の変異体の中から、シノビオリンあるいはＰ４ＨＡ１との結合活性を有するポリペプチドを選択することができる。たとえば、ある蛋白質が固定化されたシノビオリンに捕捉されるとき、その蛋白質はシノビオリンとの結合活性を有すると判定される。また、ある蛋白質が固定化されたＰ４ＨＡ１に捕捉されるとき、その蛋白質はシノビオリンとの結合活性を有すると判定される。
たとえば、Ｐ４ＨＡ１のｃＤＮＡを断片化したＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込んで発現させることによって、Ｐ４ＨＡ１の断片蛋白質を得ることができる。断片蛋白質のライブラリーについて上記のようにしてシノビオリンとの結合活性を確認すれば、シノビオリンとの結合に必要な領域を決定することができる。このようにして決定された領域を含むシノビオリンの断片は、本発明の方法におけるシノビオリンのホモログとして利用することができる。更に当該領域を構成するアミノ酸配列を保存している他の種に由来するＰ４ＨＡ１のカウンターパートや、その断片配列からなるポリペプチドも、本発明の方法におけるＰ４ＨＡ１のホモログとして利用することができる。
本発明の、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法は、シノビオリンと基質との結合への干渉によって、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する作用を有する化合物のスクリーニング方法に有用である。すなわち本発明は、以下の工程を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する被験化合物のスクリーニング方法に関する。
ａ）前記の被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法によって、被験化合物のシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する工程、および
ｂ）対照と比較して、シノビオリンと基質の結合のレベルに差がある被験化合物を選択する工程
本発明によるシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出する方法については既に述べたとおりである。当該方法によって、各種の被験化合物についてその活性を評価し、対照と比較することによって、目的の活性を有する被験化合物を選択することができる。本発明において対照としては、目的とする活性のレベルが予め確認されている任意の化合物を用いることができる。たとえば目的とする活性がないことが明らかな化合物は、陰性対照として利用できる。また、被験化合物を加えない場合のユビキチン化のレベルを陰性対照として比較しても良い。あるいは、一定の活性を有する物質を対照として用いれば、その活性レベルを超える物質をスクリーニングすることもできる。
木発明のスクリーニングに用いる被験化合物は特に制限されない。たとえば、無機化合物、有機化合物、ペプチド、蛋白質、天然または合成低分子化合物、天然または合成高分子化合物、組織または細胞抽出液、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などを被験化合物とすることができる。遺伝子ライブラリーの発現産物または発現ｃＤＮＡライブラリーなどを被験化合物として用いることもできる。
本発明のスクリーニング方法によって、Ｐ４ＨＡ１に対するシノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を有する化合物を選択することができる。そのような化合物には、関節リウマチまたは線維症の治療用薬剤が含まれる。本発明において、ユビキチン化作用を調節する活性とは、活性の刺激と抑制が含まれる。蛋白質のユビキチン化は、ＡＴＰ依存性プロテアーゼによる当該蛋白質の選択的な分解を誘導する。生体内においては、異常な蛋白質や不要となった蛋白質の除去のためにユビキチン化が行われていると推定されている。したがって、Ｐ４ＨＡ１に対するシノビオリンのユビキチン化作用の調節によって、プロリン４水酸化酵素の活性を調節することができる。
Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化が促進されれば、当該酵素の活性レベルが上昇する。たとえば、関節リウマチ患者の滑膜細胞においては、シノビオリンの発現が上昇している。その結果、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化が促進され、当該酵素の活性レベルが上昇する。Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化によって、異常な分子が特異的に分解され、正常な蛋白質の割合が高まることが、そのメカニズムとして予測される。異常な蛋白質としては、たとえば次のような蛋白質を示すことができる。
−異常な修飾を受けた蛋白質
−蛋白質のフォールディングに異常を持つ蛋白質
逆にＰ４ＨＡ１のユビキチン化が阻害された場合には、異常な蛋白質の蓄積が進むため、プロリン４水酸化酵素活性が低下する。異常な蛋白質は、それ自身の酵素活性が低下の原因となるばかりでなく、正常な蛋白質と他のサブユニットとの会合、あるいは酵素分子と基質との会合に対しても阻害的に働く。
シノビオリンによる、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化作用の調節作用を有する化合物は、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤として有用である。すなわち本発明は、本発明の方法によって選択することができる化合物を有効成分として含有する、シノビオリンによる基質のユビキチン化の調節剤を提供する。本発明のユビキチン化の調節剤は、プロリン４水酸化酵素活性の異常に起因する疾患の治療や予防に有用である。プロリン４水酸化酵素は、コラーゲン代謝をつかさどる酵素である。したがって、コラーゲン合成の異常を伴う疾患を、シノビオリンによるユビキチン化の調節によって治療あるいは予防することができる。
実際に、本発明者らは、遺伝子工学的にシノビオリンを欠失させたマウスの細胞において、正常細胞と比べてプロリン４水酸化酵素の活性（図６）、およびコラーゲンの産生量（図５）が低下することを実験的に確認している。この細胞におけるＰ４ＨＡ１の蛋白質量には、正常細胞との有意な差が見られなかった（図４）。つまり、シノビオリンによるＰ４ＨＡ１のユビキチン化が、プロリン４水酸化酵素の活性上昇をもたらしていると考えられた。したがって、シノビオリンの作用を抑制すればコラーゲンの過剰な産生を抑制することができる。あるいはシノビオリンの作用を増強することによって、コラーゲン産生を刺激することができる。
より具体的には、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化作用に対する影響を指標として見出されたシノビオリンの阻害剤は、線維細胞の蓄積が原因とされている疾患あるいは病態の治療や予防に有用である。たとえば、肺線維症、あるいは肝線維症などの疾患を、線維細胞の蓄積を原因とする疾患、あるいは病態として示すことができる（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ＫＩ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ．１９９３  Ａｐｒ；２５（２）：１１３−２６．）。
本発明において線維症とは、組織の修復や障害に対する反応として線維の形成と蓄積が増加する病態を有する疾患を言う。先に示した肺線維症、あるいは肝線維症は、線維症の代表的な疾患である。これらの疾患の病因には、様々なメカニズムが関与する可能性が指摘されている。しかしいずれにせよ、組識の線維化によって、組織の機能が損なわれることは共通している。たとえば肺線維症においては呼吸機能が損なわれる。肝線維症は肝臓の血流を妨げ、肝機能障害の原因となる。したがって、線維症を改善することができれば、これらの疾患の症状を治療、治癒、あるいは予防することができる。
肝線維症のような線維症の進行がコラーゲン産生の阻害によって抑制されることは公知である（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ＫＩ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ．１９９３  Ａｐｒ；２５（２）：１１３−２６．）。
本発明による、線維症の治療または予防のための化合物のスクリーニング方法は、先に述べたシノビオリンによるＰ４ＨＡ１のユビキチン化作用を調節する化合物のスクリーニング方法と同様の操作によって実施することができる。
したがって本発明によって、以下の工程を含む線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法が提供される。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
あるいは本発明は、以下の工程を含む、線維症を治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法に関する。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を線維症を治療または予防するための化合物として選択する工程
また、リウマチにおけるコラーゲンの産生過剰は、リウマチの代表的な病態の１つである。したがって、シノビオリンによるＰ４ＨＡ１活性の調節を制御し、コラーゲンの産生を抑制することは、リウマチの治療戦略として有効である（Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ  ＫＩ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ．１９９３  Ａｐｒ；２５（２）：１１３−２６．）。
したがって本発明によって、以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法が提供される。
ａ）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、被験化合物の存在下で基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれか一方を被験化合物と接触後に基質のユビキチン化が可能な条件下で他方とインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質を、基質のユビキチン化が可能な条件下でインキュベート後に被験化合物と接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、基質のユビキチン化のレベルを測定する工程、および
ｃ）基質のユビキチン化のレベルが、被験化合物不存在下において測定されたユビキチン化のレベルよりも低い被験化合物を選択する工程
また、本発明は、以下の工程を含む、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法であって、基質がプロリン４水酸化酵素αサブユニットまたはそのホモログである方法に関する。
ａ）被験化合物の存在下でシノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、
ａ’）シノビオリン若しくはそのホモログ、および基質のいずれかを被験化合物と接触後にシノビオリンと基質との結合が可能な条件下でインキュベートする工程、または
ａ’’）シノビオリンまたはそのホモログと基質との結合が可能な条件下でインキュベートした後に被験化合物を接触させる工程、
ｂ）前記ａ）、ａ’）、およびａ’’）のいずれかの工程の後に、シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合レベルを測定する工程、および
ｃ）シノビオリンまたはそのホモログと基質の結合のレベルが、被験化合物不存在下において測定された結合のレベルよりも低い被験化合物を関節リウマチを治療または予防するための化合物として選択する工程
一方、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化作用に対する影響を指標として見出されたシノビオリンの活性化剤は、コラーゲンの補充療法において有用である。たとえば加齢、紫外線照射、あるいはストレスなどによって減少するコラーゲンを、シノビオリンの活性化剤の投与によって補充することができる。
加えて本発明は、以下の要素を含む、シノビオリンのユビキチン化作用を調節する活性を検出するためのキット、ならびに線維症及び関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニングのためのキットに関する。本発明のキットに必要な下記要素（１）および（２）は、既に述べたようにして得ることができる。
（１）シノビオリンまたはそのホモログ、および
（２）Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログ
本発明のキットにおいて、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログは、予め標識されていても良い。あるいは標識するための手段を組み合わせることもできる。たとえば、Ｐ４ＨＡ１またはそのホモログを認識して結合する標識抗体を組み合わせることができる。
本発明のキットには、更に付加的に以下の要素を組み合わせることができる。これらの要素も先に述べたとおりである。
（３）ユビキチン活性化酵素
（４）ユビキチン転移酵素、
（５）ユビキチン、および
（６）アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）
上記構成要素のうち、ユビキチンについては予め標識しておくことができる。あるいは、ユビキチンを標識するための手段を組み合わせることができる。たとえば、ユビキチンを認識して結合する標識抗体を組み合わせることができる。
本発明のキットを構成するＰ４ＨＡ１は、ビーズなどの固相に結合させておくことができる。特に液体シンチランを含むビーズは、３２Ｐ標識したユビキチンとＰ４ＨＡ１との結合を簡便に検出することができるので有利である。したがって、液体シンチランを含むビーズに結合されたＰ４ＨＡ１と放射活性標識されたユビキチンを含むキットは、本発明のキットとして好ましい。
本発明のキットには、細胞を培養するための容器や培地を組み合わせることもできる。本発明のキットは、既に述べた本発明の方法を実施するために用いることができる。
本発明の試験またはスクリーニング方法により同定された化合物は、シノビオリンとプロリン４水酸化酵素が関与する疾患に対する医薬の候補となり、その予防または治療に利用することができる。このような疾患として、たとえば線維症または関節リウマチを示すことができる。これらの化合物は、有効成分以外に適宜他の溶質や溶媒と組み合わせて医薬組成物とすることができる。本発明のスクリーニング方法により単離される化合物を医薬品として用いる場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。
例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。化合物の含有率は適宜決定すればよい。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、経口投与、関節内注入、その他の当業者に公知の方法により行いうる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、症状などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般的な投与量は、薬剤の有効血中濃度や代謝時間により異なるが、１日の維持量として約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１．０ｍｇ／ｋｇであると考えられる。投与は１回から数回に分けて行うことができる。また、該化合物がポリヌクレオチドによりコードされうるものであれば、該ポリヌクレオチドを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いたスクリーニングに用いたベイトのコンストラクションの構造を示す図である。
図２は、〔３２Ｐ］標識したＦｌａｇ−Ｐ４ＨＡ１融合タンパク質とＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ及びＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧ融合タンパク質との結合を示すオートラジオグラフの写真である。
図３は、シノビオリン各蛋白質：Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ、Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ（Ｃ３０７Ｓ）、Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ（ｄＲＩＮＧ）、Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧによるＧＳＴ蛋白質、またはＧＳＴ融合Ｐ４ＨＡ１蛋白質のユビキチンアッセイの結果を示すオートラジオグラフの写真である。
図４は、各種マウス胎児線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ１発現量を示すウエスタンブロット法の結果を示す写真である。
図５は、各種マウス胎児線維芽細胞の培養上清に含まれるコラーゲン含量を示すグラフである。図中、縦軸はコラーゲン含量の比（０．０９μｇコラーゲン／ｍｇ蛋白質を１とする）を、また横軸はマウスの細胞の種類を示す。
図６は、各種マウス胎児線維芽細胞におけるプロリン４水酸化酵素活性を示すグラフである。図中、縦軸はＳｙｎｏ＋／＋の実測値を１とする３Ｈ−Ｈ２Ｏの産生量の比を、また横軸はマウスの細胞の種類を示す。
図７は、肝硬変の病理組織におけるシノビオリンの発現を示す顕微鏡写真（２００倍）である。
左上：抗シノビオリン抗体による染色
右上：ヘマトキシリン核染色
左下：マウスＩｇＧによる染色（対照）
図８は、結節性筋膜炎の病理組織におけるシノビオリンの発現を示す顕微鏡写真（２００倍／右および４００倍／左）である。上から順に、マウスＩｇＧ、抗シノビオリン抗体、および抗シノビオリン抗体＋ブロッキングペプチドによる染色結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  次に、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
実施例１．酵母ツーハイブリッド法によるＰ４ＨＡ１のスクリーニング
酵母ツーハイブリッドシステムとして、クロンテック社のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステムを用い、酵母形質転換法（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８８：９５７８−９５８２，１９９１）によりシノビオリンの基質タンパク質のスクリーニングを行なった。シノビオリンｃＤＮＡの７０６ｂｐから１８５４ｂｐ及び８０５ｂｐから１２６０ｂｐの末端をＥｃｏＲ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉで修飾し、ｐＧＢＴ９ベクターのＥｃｏＲ  Ｉ／Ｘｈｏ  Ｉサイトに挿入した。以下、シノビオリンの７０６ｂｐから１８５４ｂｐのフラグメントをＳｙｎｏ  ｄＴＭ、８０５ｂｐから１２６０ｂｐをＳｙｎｏ  ＲＩＮＧと呼ぶ（図１）。
シノビオリンの基質タンパク質のスクリーニングに用いるライブラリーはヒト軟骨由来のｃＤＮＡをｐＡＣＴ２ベクターに挿入したものを用いた（ｐＡＣＴ２−Ｙ）。４２℃、１５分のヒートショックの後、酵母株Ｙ１９０にｐＧＢＴ９−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ又はｐＧＢＴ９−Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧ（２．０μｇ）、ｐＡＣＴ２−Ｙ（２０μｇ）を導入した。各ベクターを導入した酵母Ｙ１９０をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）緩衝液（ＴＥ緩衝液）で洗浄後、ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ＨｉｓプレートにＴＥ緩衝液で希釈した酵母Ｙ１９０の溶液を広げ３０℃で１０日培養した。現れてきたコロニーに対し、０．５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを基質とするβガラクトシダーゼフィルターアッセイを行ない陽性クローンを検出した。
陽性クローンをＳＤ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地にて３０℃で１０日振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：１６９−１８２，１９９１）にて酵母ＤＮＡを抽出した。抽出した酵母ＤＮＡを大腸菌株ＨＢ１０１に形質転換し、Ｍ９プレート（−Ｌｅｕ）に広げ３７℃で２日培養した。現れてきたコロニーを２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地で３７℃、１６時間震盪培養しアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出したプラスミドＤＮＡに挿入されているヒト軟骨由来のｃＤＮＡ断片の解析にはアプライド・バイオシステムズ社のＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。
配列をＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）により解析した結果、コラーゲン産生において必須であるプロコラーゲンのプロリン残基の水酸化を触媒する酵素であるプロリン４水酸化酵素のαサブユニット（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ−ｐｒｏｌｉｎｅ，２−ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ  ４−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ｐｒｏｌｉｎｅ  ４ｈｙｄｒａｘｙｌａｓｅ），ａｌｐｈａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．ＸＭ＿０３２５１１Ｐ４ＨＡ１）を得た。
実施例２．シノビオリンとＰ４ＨＡ１の結合
ＴＮＴ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）及びｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｐ４ＨＡ１を用い、〔３５Ｓ〕標識したＦｌａｇ−Ｐ４ＨＡ１融合タンパク質を作成し、これとＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ、ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧ及びＧＳＴタンパク質を２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ，０．２ｍＭ  ＮａＶＯ４，５ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む結合バッファーに加え、４℃で１６時間反応させた。その反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開後、イメージアナライザー（ＢＡＳ２０００，Ｆｕｊｉｘ）で放射活性を検出した。ＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ及びＧＳＴ−Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧ融合タンパク質と〔３５Ｓ〕ｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｐ４ＨＡ１では、結合が観察された。またコントロールであるＧＳＴタンパク質とｐｃＤＮＡ３−Ｆｌａｇ−Ｐ４ＨＡ１との結合は認められなかった（図２）。この結果から、シノビオリンとＰ４ＨＡ１は、結合することが明らかとなった。
実施例３．シノビオリンのユビキチンリガーゼ（Ｅ３）としての基質の同定
ユビキチンは、活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）及びリガーゼ（Ｅ３）から成るユビキチン系酵素により標的蛋白質（基質）に共有結合し、この反応が繰り返されることにより形成されるポリユビキチン鎖が、基質のプロテアソームによる分解マーカーとして作用する。Ｅ３は基質を選択する最も重要な酵素である。シノビオリンの基質蛋白質を同定することは、シノビオリンが関与するシグナル伝達経路を決定する上で重要な手係りになると考えられる。酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングで得られたシノビオリンと結合する蛋白質はシノビオリンユビキチンリガーゼ（Ｅ３）の基質候補となる。
そこで、インービトロでのユビキチンリガーゼ活性測定系を用いて検討した。Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ、Ｓｙｎｏ  ＲＩＮＧ、シノビオリンの３０７番目のシステインをセリンに置換したＳｙｎｏ  ｄＴＭ（Ｃ３０７Ｓ）、２９１番目から３２９番目のアミノ酸を欠損したＳｙｎｏ  ｄＴＭ（ｄＲＩＮＧ）およびＰ４ＨＡ１の全領域を含むｃＤＮＡを、ＧＳＴ融合蛋白質のベクター（ｐＧＥＸ４Ｔ−１）に挿入し、大腸菌での融合蛋白質の産生を行った。大腸菌の可溶化上清から得られた各融合蛋白質はグルタチオン  セファロースＴＭ４Ｂビーズ（アマシャム  バイオサイエンス社）に結合させた。
次に、各シノビオリン融合蛋白質ビーズをプロテアーゼの一種、トロンビンによってＧＳＴ部分を除き、シノビオリン蛋白質を得た。あらかじめＰＫＡサイトを挿入したＨｉｓ−ユビキチン蛋白質は〔３２Ｐ−γ〕ＡＴＰで標識した。Ｅ１（酵母由来）、Ｅ２（ＵｂｃＨ５ｃ）、ＡＴＰ、〔３２Ｐ−γ〕標識ユビキチン、ＧＳＴ融合Ｐ４ＨＡ１蛋白質ビーズ及び各シノビオリン蛋白質を混合し、３７℃にて６０分間反応させた。反応後の各サンプルに４ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、５分間煮沸した後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で展開させた。
展開したゲルをイメージアナライザー（ＢＡＳ２０００，Ｆｕｊｉｘ）によりイメージングし、ユビキチン化されたバンドを検出した。結果として、Ｓｙｎｏ  ｄＴＭおよびＳｙｎｏ  ＲＩＮＧにより、Ｐ４ＨＡ１がユビキチン化されることが明らかとなった（図３）。しかし、Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ（Ｃ３０７Ｓ）およびＳｙｎｏ  ｄＴＭ（ｄＲＩＮＧ）ではＰ４ＨＡ１はユビキチン化されなかった。従って、Ｐ４ＨＡ１はシノビオリンの基質であることが明らかとなった。
実施例４．  シノビオリンとコラーゲン産生
各種マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）におけるＰ４ＨＡ１発現量およびコラーゲン産生量
胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を２ｘ１０５個まき、３日間培養後に回収した。Ｐ４ＨＡ１発現量は、抗Ｐ４ＨＡ１抗体（抗ｈＰＨ（α）、精製ＩｇＧ、第一ファインケミカル（株））を用いたウエスタンブロット法により定量した。同時に、抗シノビオリン抗体（モノクローナル抗体、１０  Ｄａ）および抗βアクチン抗体（モノクローナル抗−β−アクチン、クローン  ＡＣ−１５，シグマ）により、シノビオリンおよびβアクチンの発現量も比較した。コラーゲンはＳｉｒｃｏｌ  ＴＭ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社）を用いて定量した。データはＭＥＦ（ｓｙｎｏ  ＋／＋）細胞中のコラーゲン含量（０．０９μｇコラーゲン／ｍｇ蛋白質）を１として処理した。
その結果、シノビオリン欠損マウス（ｓｙｎｏ  −／−）ＭＥＦｓにおいては、Ｐ４ＨＡ１の蛋白質レベルは野生型マウス（ｓｙｎｏ  ＋／＋）のＭＥＦｓの場合とほぼ同様であった（図４）。一方ｓｙｎｏ  −／−のＭＥＦｓ培養上清中のコラーゲン含量は、ｓｙｎｏ  ＋／＋のそれより少ないことが観察された（図５）。この二つの所見から、シノビオリンはＰ４ＨＡ１をユビキチン化することによって、細胞中のプロリン４水酸化酵素蛋白質の品質を管理している可能性が示唆された。
各種ＭＥＦにおけるプロリン４水酸化酵素活性の比較
プロリン４水酸化酵素活性は以下の論文を参考にして測定した。
１）Ｇｒｉｂｂｌｅ  ＴＪ，Ｃｏｍｓｔｏｃｋ  ＪＰ，Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ  Ｓ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｈａｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｌ−９２９  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６９  Ｊａｎ；１２９（１）：３０８−１６
２）Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＬ，Ｌｕｋｅｎｓ  ＬＮ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７１  Ｄｅｃ；１４７（２）：６１２−８．
３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．８２（１９８２）ｐ２４７−２６５．
コラーゲン産生細胞である正常滑膜細胞の培地にα，α’−ジピリジルを添加することにより、細胞中のヒドロキシラーゼによる水酸化反応を停止させ、その後培養上清中に［２，３−３Ｈ］プロリンを加え、合成された３Ｈ−プロトコラーゲンを抽出した。また、ｓｙｎｏ  −／−のＭＥＦ培養細胞とｓｙｎｏ  ＋／＋のＭＥＦ培養細胞からＰ４Ｈが含まれるライセートを回収し、３Ｈ−プロトコラーゲンを水酸化する活性（３Ｈ−Ｈ２Ｏの産生量）を測定した。
その結果、３Ｈ−Ｈ２Ｏの産生量は、Ｓｙｎｏ＋／＋では３９．２８ｃｐｍ／μｇ全細胞抽出物、Ｓｙｎｏ−／−では２７．５８ｃｐｍ／μｇ全細胞抽出物であった。Ｓｙｎｏ＋／＋の実測値を１として３Ｈ−Ｈ２Ｏの産生量の比を図６に示した。ｓｙｎｏ  −／−のＭＥＦｓにおけるＰ４Ｈの酵素活性はｓｙｎｏ  ＋／＋のＭＥＦｓに比べて低いことが分かった（図６）。
実施例５．  肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織におけるシノビオリンの発現
線維化を伴う疾患において、シノビオリンの発現部位を確認するために、肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織を用いて、抗シノビオリン抗体による組織免疫染色を行った。
肝硬変および結節性筋膜炎の病理組織はインフォームド・コンセントを行ない入手した。組織は定法によりホルマリン固定をした後、パラフィンに抱埋をしてミクロトームにて薄切し、組織検体として使用した。組織切片はキシレン各５分ずつ３回の処理で完全にパラフィンを除き、１００％エチルアルコールから１０％ずつ濃度を下げた５０％までの６段階下降系列のアルコール溶液をくぐらせた後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にて３０分間ブロッキングした。
ブロッキング終了後の組織に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で希釈した１次抗体溶液（抗シノビオリンモノクローナル抗体）を、室温にて６０分反応させた。次いで、その組織をＰＢＳにて５分間、５回洗浄した後、１％ＢＳＡ溶液にて希釈した２次ＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体を室温３０分間反応させた。反応終了後ＰＢＳにて５分間、５回洗浄して更に発色試薬（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）を反応させた。適度な発色が得られた後に組織を水洗して顕微鏡で観察した。
また、対比染色としてヘマトキシリン核染色を行い、顕微鏡にて観察した。更に、対照として染色に用いた抗シノビオリンモノクローナル抗体のエピトープのアミノ酸配列からなるブロッキングペプチドとともに反応させた試料も顕微鏡で観察した。
その結果、肝硬変の病理組織においては、肝臓の実質細胞、特に、細胞増殖性の高い部分にシノビオリンの高い発現が見られた（図７）。筋膜の線維芽細胞の腫瘍様増殖を特徴とする結節性筋膜炎の病理組織においても、細胞増殖性の高い結節部分において、シノビオリンの高い発現が見られた（図８）。
実施例６．  シノビオリンとＰ４ＨＡ１の結合を阻害する化合物のスクリーニング法
シノビオリンとその基質であるＰ４ＨＡ１との結合を阻害する化合物を、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）する方法を検討した。シノビオリンをＨｉｓタグとの融合蛋白質として発現し、Ｐ４ＨＡ１もＧＳＴとの隔虫合蛋白として発現して、シノビオリンとＰ４ＨＡ１が結合すれば、ＸＬ６６５標識した抗Ｈｉｓ抗体とＥｕ（Ｋ）標識した抗ＧＳＴ抗体との間でエネルギートランスファーが起こり、蛍光が検出される系を考案した。
１）ＭＢＰ−Ｓｙｎｏ  ｄＴＭ−Ｈｉｓの作製
ＭＢＰシノビオリンｄＴＭ−Ｈｉｓｘ１２は、細胞膜貫通部分（ＴＭ）を欠損させたシノビオリン（シノビオリンｄＴＭ）をＭＢＰと融合させたものである。ＭＢＰシノビオリンｄＴＭ−Ｈｉｓｘ１２は、大腸菌で融合タンパク質を産生し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社）で精製することにより調製した。
２）Ｈｉｓ−Ｅ２の作製
Ｈｉｓ−Ｅ２はＵｂｃＨ５ｃの全領域を含むｃＤＮＡをＨｉｓタグ融合タンパク質のベクター（ｐＥＴ）に挿入し、大腸菌で融合タンパク質を産生し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（キアゲン社）で精製することより得た。
３）ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１の作製
Ｐ４ＨＡ１の全領域を含むｃＤＮＡを、ＧＳＴ融合蛋白質のベクター（ｐＧＥＸ  ４Ｔ−１）に挿入し、大腸菌での融合蛋白質の産生を行った。大腸菌の可溶化上清から得られた融合蛋白質はグルタチオン  セファロースＴＭ  ４Ｂビーズ（アマシャム  バイオサイエンス社）で精製することにより調製した。
４）シノビオリンとＰ４ＨＡ１との結合阻害活性の測定
３８４穴プレートを用い、１５μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液中に６０ｎｇ  ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ、１０ｎｇ  ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．３％ＤＭＳＯ及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。反応は５μＬのＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１を含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液添加で開始した。室温、３０分反応後、Ｅｕ（Ｋ）標識した抗ＧＳＴ抗体（２００００  Ｂ  ｃｏｕｎｔｓ、ＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ＸＬ６６５標識した抗Ｈｉｓ抗体（０．０２５μｇ、ＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）及び１Ｍ  ＫＦを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液５μＬを添加し、室温で一晩静置後、蛍光をルビースターＴＭで測定した。
一部改変したシノビオリンの部分ペプチド（配列番号５）について阻害活性を調べたところ、１６７μｇ／ｍｌのＩＣ５０でシノビオリンとＰ４ＨＡ１との結合を抑制した。
実施例７．  シノビオリンのＰ４ＨＡ１ユビキチン化活性を阻害する化合物のスクリーニング法
１）ＸＬ６６５−Ｅｕ（Ｋ）のエネルギートランスファー（ＨＴＲＦ法）を用いたユビキチン化活性を阻害する化合物のスクリーニング法
シノビオリンのＰ４ＨＡ１ユビキチン化活性を阻害する化合物を、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）する方法を検討した。ＧＳＴとの融合蛋白として発現させたＰ４ＨＡ１を基質とし、Ｅｕ（Ｋ）標識したユビキチンによるユビキチン化を行って、Ｐ４ＨＡ１がＥｕ（Ｋ）標識したユビキチン化されれば、ＸＬ６６５標識した抗ＧＳＴ抗体とＥｕ（Ｋ）標識したユビキチンとの間でエネルギートランスファーが起こり、蛍光が検出される系を考案した。
３８４穴プレートを用い、１５μＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液中に６０ｎｇ  ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ、１５ｎｇ  ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１、１５ｎｇ  Ｅ１（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）、２００ｎｇ  Ｈｉｓ−Ｅ２、６．２５ｎＭ  Ｅｕ（Ｋ）標識したユビキチン（ＣＩＳ  ｂｉｏ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＢＳＡ、０．３％ＤＭＳＯ及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。３７℃で３０分反応後、５μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。これにＸＬ６６５標識した抗Ｈｉｓ抗体（０．０２５μｇ）及び１Ｍ  ＫＦを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液５μＬを添加し、室温で一晩静置後、蛍光をルビースターＴＭで測定した。
一部改変したシノビオリンの部分ペプチド（配列番号５）は、結合を阻害する１／２０の濃度でＰ４ＨＡ１のユビキチン化を阻害した。
２）ＥＬＩＳＡ法を用いたユビキチン化活性を阻害する化合物のスクリーニング法
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートを抗ＧＳＴ抗体で４℃で一晩吸着後、使用するまで室温下、５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブロッキングした。プレートは使用前に０．３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳＡ）で３００μＬで２回洗浄した。
反応用チューブで３０μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）溶液中に８０ｎｇ  ＭＢＰ−シノビオリン−Ｈｉｓ、４０ｎｇ  ＧＳＴ−Ｐ４ＨＡ１、１５ｎｇ  Ｅ１、２００ｎｇ  Ｈｉｓ−Ｅ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％ＢＳＡ、０．３％ＤＭＳＯ及び被験化合物を含む標準反応液を作製した。室温で３０分反応後、７０μＬの７０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液を添加して反応を停止させた。この３０μＬをあらかじめ７０μＬ  ＰＢＳＡを添加したプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。３００μＬ  ＰＢＳＡで３回洗浄後、ＰＢＳＡで５０００倍稀釈したマウス抗ユビキチン抗体溶液１００μＬを添加し、室温で１時間インキュベートした。３００μＬ  ＰＢＳＡで３回洗浄後、ＰＢＳＡで１００００倍稀釈したパーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ溶液１００μＬを添加し室温で１時間インキュベートした。３００μＬ  ＰＢＳＡで３回洗浄後、１００μＬ  ＴＭＢ溶液を添加し室温でインキュベーションした。発色が充分認められた時点で、１Ｍリン酸を加え反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
一部改変したシノビオリンの部分ペプチド（配列番号５）は、Ｐ４ＨＡ１のユビキチン化を５５μｇ／ｍｌのＩＣ５０で阻害した。
産業上の利用の可能性
本発明によって、シノビオリンによるプロリン４水酸化酵素のαサブユニットのユビキチン化作用を調節する活性を評価することができる。更に本発明の方法に基いて、シノビオリンによるプロリン４水酸化酵素のαサブユニットのユビキチン化作用を調節する活性を有する化合物のスクリーニング方法が提供された。また、本発明によって、関節リウマチを治療または予防するための化合物のスクリーニング方法が提供された。
シノビオリンがαサブユニットのユビキチン化によって、プロリン４水酸化酵素の活性を調節していることは本発明者らによって明らかにされた新規な知見である。プロリン４水酸化酵素は、生体内のコラーゲン合成において重要な役割を果たす酵素である。したがって、本発明の方法によって選択することができる化合物は、プロリン４水酸化酵素の活性異常によってもたらされる疾患の治療や予防に有用である。たとえば、コラーゲンの蓄積によってもたらされる各種の線維症または関節リウマチを、本発明によって得ることができる化合物によって、治療あるいは予防することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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