(57)【要約】核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて核酸を酵素から保護することができるベクターを提供する。分岐鎖を有するポリマーよりなるベクター。好ましくはベンゼン環に対し３，４又は６分岐鎖が結合している。分岐鎖数は多いほど好ましい。分岐鎖はビニル系アクリル重合体が好ましい。このベクターは、ジチオカルバメート系化合物と分岐鎖用アクリルアミド系モノマーとを反応させることにより合成できる。
2004092388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有するポリマーよりなるベクター。
【請求項２】
請求項１において、特定の分子量範囲で効果が増強され、その範囲が分岐鎖の数によってそれぞれ異なることを特徴とするベクター。
【請求項３】
請求項１において、高分子鎖の数が３であって、分子量が３００００〜６００００であることを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１において、高分子鎖の数が４であって、分子量が３００００〜６５０００であることを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求項１において、高分子鎖の数が６であって、分子量が１００００〜５００００であることを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項１において、該ポリマーの分岐鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合していることを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項１において、多官能性化合物を核として、この核に分岐鎖として複数の高分子鎖が結合しているポリマーよりなるベクターであり、該高分子鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合していることを特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項６において、非イオン性の分子団が芳香族化合物であることを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項６において、非イオン性の分子団が脂肪族化合物であることを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項６において、非イオン性の分子団がポリアクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項６において、非イオン性の分子団がポリメタクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項７において、非イオン性の分子団が芳香族化合物であることを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項７において、非イオン性の分子団が脂肪族化合物であることを特徴とするベクター。
【請求項１４】
請求項７において、非イオン性の分子団がポリアクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
【請求項１５】
請求項７において、非イオン性の分子団がポリメタクリル酸エステルであることを特徴とするベクター。
【請求項１６】
請求項１において、多官能性化合物を核とし、この核に該分岐鎖として複数の高分子鎖が結合していることを特徴とするベクター。
【請求項１７】
請求項２において、高分子鎖の数が２〜１０であることを特徴とするベクター。
【請求項１８】
請求項１において、ベンゼン環、ナフタレン、アントラセン又はピレンを核とし、この核に該分岐鎖として複数の高分子鎖が結合していることを特徴とするベクター。
【請求項１９】
請求項１８において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が２，３，４又は６であることを特徴とするベクター。
【請求項２０】
請求項１８において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が３，４又は６であることを特徴とするベクター。
【請求項２１】
請求項１８において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が４又は６であることを特徴とするベクター。
【請求項２２】
請求項１８において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が６であることを特徴とするベクター。
【請求項２３】
請求項１において、分岐鎖が直鎖状高分子鎖であることを特徴とするベクター。
【請求項２４】
請求項２３において、高分子鎖がランダム共重合体又はブロック共重合体よりなることを特徴とするベクター。
【請求項２５】
請求項１において、高分子鎖がカチオン性であることを特徴とするベクター。
【請求項２６】
請求項２５において、分岐鎖を構成する高分子鎖は基端側に第４級アミンを有し、先端側に第３級アミンを有することを特徴とするベクター。
【請求項２７】
請求項２３において、高分子鎖がビニル系ポリマーであることを特徴とするベクター。
【請求項２８】
請求項２７において、高分子鎖がアクリル系ポリマーであることを特徴とするベクター。
【請求項２９】
請求項２７において、高分子鎖がアクリルアミド系ポリマーであることを特徴とするベクター。
【請求項３０】
請求項２７において、高分子鎖が複数のビニル系モノマーの共重合体であることを特徴とするベクター。
【請求項３１】
請求項１において、分子量が５千〜５０万であることを特徴とするベクター。
【請求項３２】
請求項１において、分子量が５千〜５万であることを特徴とするベクター。
【請求項３３】
請求項２５において、カチオン性ポリマーの正電荷が経時的に失活することを特徴とするベクター。
【請求項３４】
請求項１において、分岐鎖に４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物が導入されていることを特徴とするベクター。
【請求項３５】
請求項３４において、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物がロイコマラカイトグリーンであることを特徴とするベクター。
【請求項３６】
請求項３４において、光照射されたものであることを特徴とするベクター。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は遺伝子導入技術に係るベクターに関する。
発明の背景
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（登録商標）として商品化された、カチオン性脂質であるジオレオイルオキシプロピルトリメチルアンモニウム（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）がある。ベクター用の合成高分子としてはポリエチレンイミンもエキソゲン（Ｅｘｏｇｅｎ）として商品化されている。
ＤＮＡと脂質との複合体についてはＦｅｌｇｎｅｒ等、ＰＮＡＳ，８４（１９８７）７４１３に記載されている。
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。
発明の概要
本発明によれば、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて核酸を酵素から保護することができるベクターが提供される。
本発明のベクターは、分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなる。
本発明のベクターは、核酸凝集体と複合体を形成させて生体内へ投与される。
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明のベクターを用いた核酸含有複合体では、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて酵素から保護するので、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。また、ミクロ又はナノオーダーのサイズのカプセルやミセルなどへ核酸複合体を挿入して血管内へ投与するようなことも可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ポリイオンコンプレックスの粒状分布の測定結果を示すグラフである。
図２は、ポリイオンコンプレックスの粒径の経時変化を示すグラフである。
図３は、トランスフェクション実験の結果を示すグラフである。
図４は、カチオン／アニオン比と遺伝子発現効率との関係の測定結果を示すグラフである。
図５は、リンタングステン酸で染色された遺伝子複合体のＴＥＭ写真である。
図６は、酢酸ウランで染色した遺伝子複合体のＴＥＭ写真である。
図７は、１分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図８は、３分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図９は、４分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図１０は、４分岐鎖を有した分子量１万のベクターであって、分岐鎖の先端にジメチルアクリルアミドをブロック重合したものにおいて、ブロック重合体の分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図１１は、このベクターのブロック重合体、分岐体及びＰＥＩの溶液内安定性（遺伝子発現効率の初期値を１００％としたときの経時変化）を示すグラフである。
発明の好ましい形態
本発明で用いるカチオン性ポリマーは分岐鎖を有する。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、特定の分子量範囲で効果が増強され、その範囲が分岐鎖の数によってそれぞれ異なる。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、高分子鎖の数が３であって、分子量（数平均分子量）が３００００〜６００００である。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、高分子鎖の数が４であって、分子量が３００００〜６５０００である。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、高分子鎖の数が６であって、分子量が１００００〜５００００である。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、該ポリマーの分岐鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合している。
本発明の一態様にあっては、ベクターは、多官能性化合物を核として、この核に分岐鎖として複数の高分子鎖が結合しているポリマーよりなるベクターであり、該高分子鎖の先端側に非イオン性の分子団が結合している。この非イオン性の分子団は、芳香族化合物、脂肪族化合物、ポリアクリル酸エステル、又はポリメタクリル酸エステルであってもよい。
本発明の好適な一形態にあっては、分岐鎖が多官能性化合物好ましくはベンゼン環、ナフタレン、アントラセン又はピレンに複数個結合している。ベンゼン環の場合、この結合数は２〜６、特に２，３，４又は６であり、結合数が多い程効果的である。ナフタレンの場合、結合数は８まで可能であり、アントラセン、ピレンは１０まで可能である。また、同一平面内にない芳香族環が複数結合しているビフェニル（この場合も分岐鎖の結合数は１０まで可能）や、シクロヘキサンのようなシクロパラフィン系炭化水素を核とすることも可能である。
分岐鎖を結合させる核となるのはベンゼン環が好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
分岐鎖としては、ビニル系モノマーの単独あるいは共重合体が好適であり、各分岐鎖の長さは同一でも違っていても良い。その鎖の構造はリニアな直鎖状でも樹状に分岐したものでもよい。分岐鎖が単独重合体の場合は、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２の重合体が好ましい。
この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと上記の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−を介して上記ビニル系モノマーの重合体が結合したカチオン性ポリマーが生成する。このベクターの分子量は５千〜５０万、特に５千〜１０万とりわけ１万〜５万程度が好ましい。また、分岐鎖が共重合体の場合は、ランダム共重合体又はブロック共重合体のいずれでもよく、モノマーとしてはカチオン官能性のモノマーを含んでいれば、非イオン性や疎水性モノマーとの共重合体でもよい。非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ＰＥＧ−（メタ）アクリレートなど非イオン性親水性モノマーが好適であり、疎水性モノマーとしては、エチル（メタ）アクリレート、スチレンなどが好適である。このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなるベクターが核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
分岐鎖を構成する高分子鎖は基端側に第４級アミンを有し、先端側に第３級アミンを有するものであってもよい。分岐鎖を結合させる核の近傍を４級アミンにし、その周囲を３級アミンにすれば、細胞傷害性の低減と遺伝子導入の高効率化が期待できる。４級アミンはベクターとして必須の要素であるカチオンではあるが、殺菌剤や抗菌コートなどにも使用されているように細胞傷害性があるので、周囲を３級とすることは細胞傷害性の点で有利である。もちろん、４級と３級の組み合わせ以外に、４級と１級、４級と２級、３級と１級、３級と２級などの組み合わせも可能である。
また、本発明のベクター内のカチオン性ポリマーはその正電荷が経時的に失活する性質を有していても良い。このようにベクター内の正電荷が失活することで、ベクターが包囲した核酸凝集体から核酸を放出する機能を付与することができる。この核酸の放出はベクターが細胞膜を透過した後に行われるよう当業者によって適宜条件を設定すれば良い。このような機能を有するカチオン性ポリマーとしては、長鎖状の分岐鎖に４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物が担持されているものが挙げられる。４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）骨格を有する化合物としてはロイコマラカイトグリーンが挙げられ、該化合物を担持したカチオン性ポリマーは光照射によってカチオン化し、経時的に正電荷を失活する性質を有している。
カチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
核酸は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子であってもよく、これらは癌治療に利用できる。
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞、腫瘍細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、ＳＰ細胞、ＥＳ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に、例えば、気管内視鏡を用いて肺胞へ噴霧するなど病変組織内に直接投与することも可能である。
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。また、当業者に良く知られている、核酸複合体を一度体外で使用してから生体へ投与する間接的方法も利用可能である。例えば、生体から採取した、腫瘍細胞傷害性の高いリンパ球などの細胞へ生体外で核酸複合体を作用させて薬剤感受性を与えて培養し、これを生体内へ投与するという方法である。この場合は腫瘍細胞を培養したリンパ球で傷害させ、副作用が確認された場合に薬剤で投与したリンパ球を死滅させることが可能である。
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｇａｕｃｈｅｒ病等）等が挙げられる。
【実施例】  実施例１［１分岐型ベクターの合成］
まず、下記反応式（化１）に従って、ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを合成した。
2004092388.tif 000003
即ち、ナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（１０．３ｇ，４６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を含むエタノール溶液５０ｍｌ中に塩化ベンジル（４．８ｇ，３８ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１２６．５８）を含むエタノール溶液１０ｍｌを窒素雰囲気下０℃で滴下した。反応溶液を室温で２３時間撹拌した後、１５０ｍｌの水を加え、ジエチルエーテルで抽出した（２００ｍｌ×３回）。有機層を水洗いし（１００ｍｌ×３回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレータを用いて減圧下で溶媒を留去し、ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを得た（無色液体）。収量は１７．６ｇ（収率９３％）であり、１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．４０７〜７．２７１ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ，Ａｒ−Ｈ）δ４．５４０ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０８２〜４．０１２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６３ｐｐｍ〜３．６９２ｐｐｍ（ｑ，２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３１１〜１．２５２ｐｐｍ（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）である。
次に、このベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを用い、下記反応式（化２）に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させた。
2004092388.tif 000004
即ち、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３．９ｇ，２４．９６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１５６．２３）とベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート（２３．９４ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２３９．４１）の混合物をメタノールで希釈し、全量２０ｍｌの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去し、高分子を水に溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約１８，０００であり、１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．８〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４３〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．２〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）であった。
実施例２［３分岐型ベクターの合成］
次に、下記反応式（化３）に従ってナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートと２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとを反応させ、２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンを合成した。
2004092388.tif 000005
即ち、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（２ｇ，４．０２ｍｍｏｌ，Ｍｗ．３９８．９８）にエタノール（１００ｍｌ）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（５．４３ｇ，２４．１２ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始２４時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンを得た（白色固体）。収量は３．０３ｇ（収率９８．４％）であり、１Ｈ−ＮＭＲ：δ４．４４７ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０８６〜４．０１５ｐｐｍ（ｑ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７４６〜３．６７６ｐｐｍ（ｑ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ２．４２１ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ，Ａｒ−ＣＨ３）、δ１．３２４〜１．２２２ｐｐｍ（ｍ，１８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）であった。
この２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンに対し、下記反応式（化４）に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて３分岐型ベクターを合成した。
2004092388.tif 000006
即ち、２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレン（２０．１４ｍｇ，１．６７ｍｍｏｌ，Ｍｗ．６０４．０８）をクロロホルム（３００μｌ）に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（１．６２２４ｇ，１０．３８ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１５６．２３）に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量２０ｍｌの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約１８，０００であった。また、１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．７〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．３ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．３〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）であった。
実施例３［４分岐型ベクターの合成］
まず、下記反応式（化５）に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。
2004092388.tif 000007
即ち、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼン（１ｇ，２．２２ｍｍｏｌ，Ｍｗ．４４９．８３）にエタノール（１００ｍｌ）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（４ｇ，１７．７６ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始４８時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量１．４８ｇ（収率９１．４％）。１Ｈ−ＮＭＲ測定をした結果、δ７．４８７ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、δ４．５７３ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０６５〜３．９９４ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７６５〜３．６８７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３０４〜１．２５６ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）であった。
次に、下記反応式（化６）に従い、この１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて４分岐型ベクターを合成した。
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即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１８．０８ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，Ｍｗ．７２３．３０）をクロロホルム（３００μｌ）に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（１．３２６ｇ，８．４９ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１５６．２３）に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量２０ｍｌの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約１８，０００であった。また、１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．８〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．２〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）であった。
実施例４［６分岐型ベクターの合成］
まず、下記反応式（化７）に従って、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。
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即ち、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン（１ｇ，１．５７ｍｍｏｌ，Ｍｗ．６３５．６８）にエタノール（２００ｍｌ）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（６．３６ｇ，２８．２３ｍｍｏｌ，Ｍｗ．２２５．３１）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始４日後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケーターにて真空乾燥させてヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量は１．４８ｇ（収率９０．２％）であり、１Ｈ−ＮＭＲ：δ４．５６５ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ）、δ４．０１２〜３．９８８ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ３．７３１〜３．７０８ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，−Ｎ−ＣＨ２−）、δ１．３０７〜１．２６１ｐｐｍ（ｍ，３６Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ３）であった。
次に、下記反応式（化８）に従い、このヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて６分岐型ベクターを合成した。
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即ち、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（１７．４３ｍｇ，０．８３ｍｍｏｌ，Ｍｗ．１０４５）を少量のクロロホルムに溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３．９ｇ，２４．９６ｍｏｌ，Ｍｗ．１５６．２３）に加えた。この混合物をクロロホルムで希釈し、全量２０ｍｌの溶液を調整した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量１ｍＷ／ｃｍ２）を照射した。紫外光照射３０分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、ＧＰＣにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約１８，０００であった。また、１Ｈ−ＮＭＲ：δ７．８〜７．４ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ）、δ３．４３〜３．０ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．４〜２．２ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ２）、δ２．２〜２．１ｐｐｍ（ｂｒ，６Ｈ，−Ｎ−ＣＨ３）、δ１．８〜１．５ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）であった。
（核酸含有複合体の形成）
各ベクター（２．３６ｍｇ，Ｍ．ｗ．１８，０００）をそれぞれトリス−ＨＣｌ−バッファー（２ｍｌ）に溶解した。この溶液を５０μｌ採取し、トリス−ＨＣｌ−バッファーを加えて希釈し、全量５００μｌのベクター溶液とした。別に、ｐＧＬ３コントロールプラスミド（０．２μｇ／μｌ，９０μｌ）に２×バッファー溶液（４５０μｌ）を加え、全量５４０μｌのＤＮＡ溶液を調製した。ＤＮＡ溶液（１００μｌ）にベクター溶液（６７μｌ）を加え（カチオン性高分子の正電荷量とＤＮＡの負電荷量の比は１：１）、３７℃で２４時間静置させ、核酸含有複合体を形成させた。動的光散乱測定によりポリイオンコンプレックスの粒径測定を行なった結果を図１に示す。また、この平均粒径の経時変化を図２に示す。
図１，２に示すように、各カチオン性高分子はＤＮＡと混合直後にポリイオンコンプレックスを形成した。キュムラント解析による粒径では約２５０ｎｍのナノ粒子を生成しており、２４時間後も安定であるとわかった。
２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ上で培養１日目のＣＯＳ−１細胞に、１ｗｅｌｌ当たり２５μｌのポリイオンコンプレックス溶液を添加し、５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養３時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１ｗｅｌｌ当たり１ｍｌのＤＭＥＭを加え、再度５％ＣＯ２インキュベータ内で培養した。培養２日後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｌｙｓｉｓ５×Ｒｅａｇｅｎｔを１ｗｅｌｌ当たり２００μｌ加え、静置させた。３０分後、細胞をエッペンドルフ型チューブに移し、遠心分離した（４℃、１５０００ｒｐｍ、１ｍｉｎ）。遠心後、上清を４μｌずつマイクロプレートに採取し、ルミノメータでルシフェラーゼ活性を測定した。また、遠心後の上清を５μｌ採取し、蛋白定量を行なった。
分岐数の異なる高分子ベクターを用いてトランスフェクション実験を行なうと、Ｃ／Ａ比が１０の場合、図３に示すように、高分子の分岐数が増加するにつれて遺伝子発現効率は大幅に増加した。また、最も高い遺伝子発現効率を示した６分岐型カチオン性高分子を用いて、Ｃ／Ａ比（カチオン／アニオン比）を変化させたときの遺伝子発現効率への影響ついても調べた。図４に示すように、Ｃ／Ａ＝４０のとき、最も高い遺伝子発現効率を示した。
以上の通り、本発明によると、核酸を凝集体とし、この凝集体の周囲にカチオン性ポリマーを含むベクターを配置させて核酸を酵素から保護することができるベクターが提供される。
図５，６は、ＰＧＬ３プラスミドと上記の６分岐型ベクターとを混合した遺伝子複合体のＴＥＭ写真であり、図５は、リンタングステン酸で染色したもの、図６は、酢酸ウランで染色したものである。
図７は、１分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図８は、３分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図９は、４分岐鎖を有するベクターの分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフである。
図１０は、４分岐鎖を有した分子量１万のベクターであって、分岐鎖の先端にジメチルアクリルアミドをブロック重合したものにおいて、ブロック重合体の分子量と遺伝子発現効率との関係を示すグラフであり、図１１は、このベクターのブロック重合体、分岐体及びＰＥＩの溶液内安定性（遺伝子発現効率の初期値を１００％としたときの経時変化）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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