(57)【要約】アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または新規部分配列タンパク質を簡便にスクリーニングする方法、及び大腸菌で大量発現可能なブロッキング効率の向上したタンパク質を提供する。アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または部分配列タンパク質をスクリーニングする方法、及びアミノ酸配列改変によってブロッキング効率の向上したことを特徴とするタンパク質、及び該タンパク質の利用方法。
2005003155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法であって、以下の条件を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法：
Ａ．  タンパク質のアミノ酸配列を２分し、それぞれの親水性アミノ酸（Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｈ，Ｒ，Ｙ）と疎水性アミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｐ）の含有率から以下の式を用いて算出された２分された各部分での親水／疎水率の差の絶対値が０．１以上である；
・（親水／疎水率）＝（親水性アミノ酸含有率）／（疎水性アミノ酸含有率）
Ｂ．  親水性部分の親水／疎水率（親水／疎水率の高い方の値）が０．５以上；
Ｃ．  １００残基より多くのアミノ酸よりなる。
【請求項２】
請求項１の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｄの解析工程により得ることができる、以下のＥの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｄ．（１）ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；
（２）ＰＢＳ（−）で２５〜１００倍希釈した正常ヒト血清を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
（３）酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて非特異的にプレートに吸着したＩｇＧ量を発色法を用いた比色法にて比較する工程；
Ｅ    候補タンパク質での発色がウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
【請求項３】
請求項１の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｆの解析工程により得ることができる、以下のＧの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｄ．（１）西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼを候補タンパク質溶液（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）に０．０５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する工程；
（２）上記希釈液をポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する工程；
（３）１時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
（４）テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
（５）発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｇ．候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
【請求項４】
請求項１の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｈの解析工程により得ることができる、以下のＩの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｈ．（１）ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；
（２）０．０５ｍｇ／ｍｌに調製したペルオキシダーゼ溶液を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
（３）１時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
（４）テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
（５）発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｉ．候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
【請求項５】
請求項１に記載の条件Ａ，Ｂ，Ｃを満たすタンパク質または部分配列タンパク質のアミノ酸配列の改変によりブロッキング効率を向上させた新規なタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸配列改変がアミノ酸置換、除去、挿入によるものであることを特徴とする請求項５に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項７】
原核生物もしくは真核生物由来であることを特徴とする請求項５に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項８】
「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」由来であることを特徴とするブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項９】
ＤｎａＫタンパク質由来であることを特徴とする請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１０】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であることを特徴とする請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１１】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１２】
ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１３】
ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなる請求項８に記載のタンパク質
【請求項１４】
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とする請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１５】
ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１６】
ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した請求項８に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
【請求項１７】
１以上の親水性ドメインと１以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質。
【請求項１８】
ブロッキング速度がＢＳＡよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質。
【請求項１９】
３時間のブロッキングにおいてＢＳＡと同等のブロッキング効率を示すようにタンパク質量を揃えた条件において、１０分未満のブロッキング能がＢＳＡよりも優れることを特徴とする請求項１８に記載の改変されたタンパク質。
【請求項２０】
タグ配列を有することを特徴とする請求項２〜１９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２１】
タグ配列がヒスチジンタグ、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、タンデムアフィニティーピュリフィケーションタグから選択されることを特徴とする請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
任意のアミノ酸配列が付加されたことを特徴とする請求項２〜１９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２３】
原核生物を用いて請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２４】
大腸菌を用いて請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２５】
無細胞タンパク質合成法を用いて請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項２６】
加熱工程を経ることを特徴とする請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質の精製方法。
【請求項２７】
請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質をブロッキング、安定化、賦形、フォールディング補助、リフォールディング補助、コーティング、医療用に使用する方法。
【請求項２８】
請求項２〜２２のいずれかに記載のタンパク質を含有するブロッキング試薬、安定化剤、賦形剤、フォールディング補助剤、リフォールディング補助剤、コーティング剤または医療用コーティング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法に関し、更には、本発明はタンパク質のアミノ酸配列を改変することにより、ブロッキング効率の向上したタンパク質に関する。更には、該タンパク質を含有する、ブロッキング試薬、安定化剤、賦形剤、フォールディング補助剤、リフォールディング補助剤、医療用コーティング剤にも関する。本発明は、大腸菌での高発現可能なタンパク質のブロッキング効率を向上させることができ、ブロッキング効率に優れたタンパク質を組換えで大量に生産する場合有用である。
【背景技術】  従来、免疫測定などで用いられるブロッキング剤としては生体成分から直接抽出したタンパク質が多く使用されてきた。特にウシ由来のアルブミンやカゼインなどが広く使用されてきた歴史がある。しかし近年、狂牛病などの問題から、様々な制限が加えられている現状である。一方、組換え体を用いてそれらを製造する方法は、病原体（物質）を排除できる利点はあるが、生産性などの問題点から実用に至っているものは少ない。
よって、大腸菌などに由来するタンパク質を、代替タンパク質として使用するという試みが、生産性という立場からは好ましいと言える。しかし、大量発現できるタンパク質が必ずしもブロッキング効率が良いわけではなく、組換え体で生産できるブロッキング効率に優れたタンパク質を見出さなければならないという問題点があった。
近年、様々な生物の遺伝子配列が明らかとなったが、予想されるアミノ酸配列よりブロッキング効率に優れたタンパク質を見出す法則は未だ知られておらず、そのようなタンパク質を探すには非常な手間が掛かる作業であると思われていた。
このような理由から、組換え体で大量生産できるブロッキング効率に優れた代替タンパク質が求められていた。
【図面の簡単な説明】  図１は、ブロッキング効率測定の概念を示す図である。
図２は、タンパク質の２分割法を示す図である。
図３は、ブロッキング能を示すタンパク質のブロッキング機構を示す図である。
図４は、ＤｎａＫ  ３８４−６０７の立体構造を示す図である。βシート部分がＮ末端、αヘリックス部分がＣ末端に相当する。
図５は、種々のＤｎａＫ変異体の示すブロッキング効率を示す図である。図５において、
Ｂｌａｎｋ：  ブロッキングなし
３８４−６３８：  ＤｎａＫ３８４−６３８
３８４−６０７：  ＤｎａＫ３８４−６０７
３８４−５７８：  ＤｎａＫ３８４−５７８；  αヘリックスの一部の構造が除去された変異体
３８４−５６１：  ＤｎａＫ３８４−５６１；  αヘリックスの約半分の構造が除去された変異体
５０８−６０７：  ＤｎａＫ５０８−６０７；  βシート部分が除去された変異体（αヘリックスからなる）
５２５−６０７：  ＤｎａＫ５２５−６０７；  βシート部分とαヘリックスの一部が除去された変異体（αヘリックスからなる）
ＢＳＡ：  ＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎＶ
図６は、大腸菌ＤｎａＫタンパク質の構造、および作成した変異体の構造を示す図である。
図７は、ＤｎａＫ  ３８１−５５３の立体構造を示す図である。
図８は、疎水ドメインを改変したタンパク質のブロッキング機構を示す図である。
図９は、種々のＤｎａＫ変異体の示すブロッキング効率を示す図である。
３８４−６０７：  ＤｎａＫ３８４−６０７
３８４−６０７（ＶＡＶ）：  ＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）
４１９−６０７：ＤｎａＫ４１９−６０７
ＢＳＡ：  ＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ
Ｂｌａｎｋ：  ブロッキングなし
図１０は、ＤｎａＫ変異体濃度とブロッキング効果の相関を示す図である。
図１１は、ＤｎａＫ変異体のブロッキング速度を示す図である。
図１２は、ＤｎａＫ変異体のＥＬＩＳＡのブロッキングへの応用を示す図である。
図１３は、ブロッキングに頻繁に使用されるタンパク質と疎水性の高いタンパク質の親水性、疎水性アミノ酸の含有率を示す。
図１４は、ＢＳＡ、αカゼイン、リパーゼ、ＤｎａＫ３８４−６０７のＮ末端側とＣ末端側の含有アミノ酸の特徴を示す。｜Δ｜はＮ末端側とＣ末端側の親水疎水率の差の絶対値を示す。
図１５は、ヒスチジンタグなし（ｎａｔｉｖｅ）のＤｎａＫフラグメントのブロッキング効果の比較を示す。ＢＳＡ（フラクションＶ）は１０ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整して、これを高濃度における比較として示す。また、ＢＳＡ（フラクションＶ）は２ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整して、これを低濃度における比較として示す。
図１６は、図１５の高濃度におけるデータを図示したものである。
図１７は、図１５の低濃度におけるデータを図示したものである。
【発明の開示】
本発明の目的は、アミノ酸配列からブロッキング能を有するタンパク質を簡便に見出す方法を提供するとともに、大腸菌等で大量発現可能、かつアミノ酸配列改変によりブロッキング効率を向上させたタンパク質を提供することである。
上のような背景を踏まえ、鋭意検討した結果、ブロッキング能を有するタンパク質に特徴的なアミノ酸配列に関する性質を見出すと共に、そのようにして見出されたタンパク質のアミノ酸配列を改変することによりブロッキング効率を飛躍的に高めることが出来ることを見出し、本発明に至った。
すなわち本発明は、以下の構成からなる。
（１）アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法であって、以下の条件を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法
Ａ．  タンパク質のアミノ酸配列を２分し、それぞれの親水性アミノ酸（Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｈ，Ｒ，Ｙ）と疎水性アミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｐ）の含有率から以下の式を用いて算出された２分された各部分での親水／疎水率の差の絶対値が０．１以上である
・（親水／疎水率）＝（親水性アミノ酸含有率）／（疎水性アミノ酸含有率）
Ｂ．  親水性部分（親水／疎水率の高い方の値）が０．５以上
Ｃ．  １００残基より多くのアミノ酸よりなる
（２）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｄの解析工程により得ることができる、以下のＥの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質
Ｄ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；
２．ＰＢＳ（−）で２５〜１００倍希釈した正常ヒト血清を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
３．酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて非特異的にプレートに吸着したＩｇＧ量を発色法を用いた比色法にて比較する工程；
Ｅ  候補タンパク質での発色がウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（３）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｆの解析工程により得ることができる、以下のＧの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｄ  １．西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼを候補タンパク質溶液（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）に０．０５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する工程；
２．上記希釈液をポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する工程；
３．１時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
４．テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
５．発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｇ  候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（４）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｈの解析工程により得ることができる、以下のＩの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｈ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；
２．  ０．０５ｍｇ／ｍｌに調製したペルオキシダーゼ溶液を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
３．  １時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
４．  テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
５．  発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｉ  候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（５）（１）に記載の条件Ａ，  Ｂ，  Ｃを満たすタンパク質または部分配列タンパク質のアミノ酸配列の改変によりブロッキング効率を向上させた新規なタンパク質
（６）アミノ酸配列改変がアミノ酸置換、除去、挿入によるものであることを特徴とする（５）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（７）原核生物もしくは真核生物由来であることを特徴とする（５）に記載のブロッのブロッキング効率の向上したタンパク質。
（８）「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」由来であることを特徴とするブロッキング効率の向上したタンパク質。
（９）ＤｎａＫタンパク質由来であることを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１０）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であることを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１１）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１２）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１３）ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなる（８）に記載のタンパク質
（１４）ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１５）ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１６）ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１７）１以上の親水性ドメインと１以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質。
（１８）ブロッキング速度がＢＳＡよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質。
（１９）３時間のブロッキングにおいてＢＳＡと同等のブロッキング効率を示すようにタンパク質量を揃えた条件において、１０分未満のブロッキング能がＢＳＡよりも優れることを特徴とする（１８）に記載の改変されたタンパク質。
（２０）タグ配列を有することを特徴とする（２）〜（１９）のいずれかに記載のタンパク質
（２１）タグ配列がヒスチジンタグ、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、タンデムアフィニティーピュリフィケーションタグから選択されることを特徴とする（２０）に記載のタンパク質
（２２）原核生物を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２３）大腸菌を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２４）無細胞タンパク質合成法を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２５）加熱工程を経ることを特徴とする（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法
（２６）（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質をブロッキング、安定化、賦形、フォールディング補助、リフォールディング補助、コーティング、医療用に使用する方法
（２７）（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を含有するブロッキング試薬、安定化剤、賦形剤、フォールディング補助剤、リフォールディング補助剤、コーティング剤または医療用コーティング剤。
【発明を実施するための最良の形態】  ここでいうブロッキングとは、容器や担体などへの成分の非特異的吸着を妨げることを言い、特にプラスチックなどの樹脂へのタンパク質の非特異的吸着を妨げることをいう。様々な測定において、測定対照の成分が非特異的に器壁に吸着することにより、バックグラウンドとして測定を妨げることが問題となる。特に免疫学的測定において、抗体のポリスチレンプレートへの吸着は顕著であり、通常、あらかじめ樹脂等に吸着しやすいタンパク質を添加して、抗体の非特異的吸着を妨げる操作、すなわちブロッキングを行うことが広く行われている。免疫的測定には、タンパク質を器壁に物理的に吸着させることが必須であることから、ポリスチレン等の樹脂で出来たタンパク質の吸着しやすいプレートが広く使われるが、余分な成分の吸着も顕著であるため、より良いブロッキング剤が常に求められているのが現状である。また、臨床用診断薬においても、診断薬用酵素の自動分析機のセルへの非特異吸着が問題となっているものも多い。
本発明では主に、免疫学的測定を念頭に置き、最も非特異吸着が顕著である例として知られているヒト血清中のＩｇＧのポリスチレンプレートへの非特異吸着を測定することで、ブロッキング効果を測定した。すなわち、測定は以下の工程よりなる。
（１）ポリスチレン製９６穴プレートにブロッキング能を調べたいタンパク質溶液を加え、一定時間静置し、プレートをブロッキングする。
（２）（１）の液を除去し、希釈したヒト血清を添加し、インキュベートする。
（３）プレートを洗浄した後、標識抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、インキュベートする。
（４）プレートを洗浄した後、比色法により非特異的に結合したＩｇＧ量を比較する。詳細な方法については以下で述べるが、この方法は本発明を遂行するにあたり非常に有効であった。本方法の概略を図１に示す。
ブロッキング試薬としては、従来ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やウシ乳中のカゼインなどが広く使われて来た。しかし、それらの高いブロッキング能がタンパク質のどの性質から来るのか、理論立てた説明は未だなされておらず、一般にはその疎水性に起因していることが通説のようになっている。
そこで、まず疎水性の高いタンパク質にブロッキング能が備わっているのかを調べる目的で疎水性アミノ酸の含量が高いことが知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼをブロック剤として使用し、そのブロック能を調べた。リパーゼは臨床検査用途などにも使われているが、測定時のセル吸着などが問題となることがあるほどプラスチック表面への吸着能が高いことが知られている。しかし、実験の結果、ブロッキングの効果はほとんど見られないことが明らかとなった。それぞれのタンパク質中の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の比率等を図１３に示したが、比較してみるとＢＳＡやカゼインの疎水性はリパーゼの疎水性に較べ低いことが分かる。このことから考察される事項としては、タンパク質がその疎水性で吸着する現象と、ブロッキング能とは関連はあるが、すべてではないということである。リパーゼのブロッキング能が発揮されなかった理由としては、器壁に吸着したリパーゼにタンパク質が非特異的に吸着したことに起因していると推察される。
ここでいう親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸は教科書等によっては、様々な定義があるが、本発明においては、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンと定義した。
本発明では、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンと定義した。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンと定義したが、親水性アミノ酸でＨｉｓ，Ｔｙｒ、特にＴｙｒは親水性が低く、疎水性アミノ酸でＧｌｙ、Ａｌａ、特にＧｌｙは疎水性が低いと考えられ、更に厳密に厳密性を持たせて予測するためには、ＴｙｒとＧｌｙを除外して計算し、更に好ましくは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａを除外して計算すると良い結果が得られることもある。また、後に示すブロッキング能の改変においても、親水性、疎水性の強弱を念頭において改変を行うことが好ましい。
そこで次に、様々な切り口からそれぞれのアミノ酸の含有率を計算したところ、ブロッキング能を示すＢＳＡ（シグナルペプチドなし）とウシ由来αカゼイン（シグナルペプチドなし）のアミノ酸配列の２分された各部分、例えばＮ末端側とＣ末端側で、親水性アミノ酸含有率と疎水性アミノ酸含有率の傾向が異なることが明らかとなった（図１４）。本発明において、親水性アミノ酸含有率を疎水性アミノ酸含有率で割った値を便宜上「親水／疎水率」と定義するが、ＢＳＡのＮ末端側の親水／疎水率は１．００であるのに対し、Ｃ末端側は０．８３であり、０．１７の差があることがわかる。αカゼインでは、Ｎ末端側０．８８、Ｃ末端側０．６４となりその差は０．２４であった。一方、ブロッキング能を示さないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のリパーゼにおいては、Ｎ末端側０．３９、Ｃ末端側が０．４４とその差が０．０５であり０．１にも満たないことが分かった。このことから、ブロッキング能を示すには、タンパク質分子の中の比較的疎水的な領域に加え、親水的な領域が必要であるということが条件になっていることが推察された。
本発明のタンパク質において、親水性部分、疎水性部分及び全長の親水／疎水率は、以下の範囲が好ましい。
親水性部分の親水／疎水率は０．５〜２．０、より好ましくは０．７〜１．７、さらに好ましくは０．８〜１．５である。
疎水性部分の親水／疎水率は０．２〜１．１、より好ましくは０．３〜１．０、さらに好ましくは０．４〜０．９である。
タンパク質全体の親水／疎水率は０．４〜２．０、より好ましくは０．５〜１．５、さらに好ましくは０．６〜１．０である。
親水性部分と疎水性部分の親水／疎水率の差（絶対値）は好ましくは０．１〜０．６、より好ましくは０．１５〜０．５、さらに好ましくは０．１５〜０．４である。
親水性部分と疎水性部分は、いずれが２分された各部分、例えばＣ末端側（或いはＮ末端側）であってもよい。
また、本発明は、親水性部分と疎水性部分が２分された各部分、例えばＣ末端側或いはＮ末端側に存在すると仮定しているが、Ｎ末端側又はＣ末端側に親水性でも疎水性でもない配列を追加したものも、親水性部分と疎水性部分が存在する限り、本発明に含まれる。
さらに本発明は、図２に示すように親水性部分−疎水性部分−親水性部分や、疎水性部分−親水性部分−疎水性部分、さらには親水性部分−疎水性部分−親水性部分−疎水性部分のような順序で各部分を有するものも本発明に含まれる。
上のことを踏まえると、疎水部分（疎水ドメイン）が器壁に吸着し、親水部分（親水ドメイン）がその上にかぶさるような形態をとり、全体でみると親水部分で器壁を覆うようにして、ブロッキングしていることが推察される。そのモデルを図３に示す。リパーゼがブロッキング能を示さなかったのは、吸着されるが、吸着されたタンパク質が疎水的でありすぎたため、そのタンパク質への更なる非特異的吸着が起きたことが予想される。
器壁に吸着する疎水性部分と、疎水性部分を覆う親水性部分の比率は、疎水性部分１に対し親水性部分０．３〜１０、好ましくは０．５〜５、さらに好ましくは０．７〜２である。疎水性部分が大きすぎると親水性部分により覆うことができなくなり、器壁に吸着された疎水性部分に、さらに他のタンパク質が吸着することになる。また、親水性部分が大きすぎると、疎水性部分が器壁に吸着する面積が小さくなりすぎ、十分強固に吸着できなくなったり、ブロッキングの効率が低下したりする。
なお、本発明において、「２分する」とは、全配列を約５０％ずつ分けることを意味するのではなく、疎水性部分と親水性部分の２つに分けるというだけの意味である。親水性部分と疎水性部分の一方又は両方が複数存在する場合、複数存在する親水性部分／疎水性部分の親水／疎水率は、平均値として計算される。また、親水性部分、疎水性部分は、各々ひとかたまりの部分、好ましくはドメイン構造を有するものであり、各部分は、全体配列の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上である。ただ、タンパク質の構造が分かっていなかったり、予測困難な場合には、アミノ酸配列をＮ末端側とＣ末端側に大きく２分して解析するが好ましく、効果的である。
図１４を見る限りでは、親水／疎水率の親水ドメインと疎水ドメイン間の差はタンパク質間では若干ばらつきがあり、その値の大きさのみがブロッキング能力を詳細まで反映していない可能性もあると思われる。そのファクターの一つは分子量であると思われる。本発明において、「１００残基より多くのアミノ酸よりなる」とは、アミノ酸配列全体のアミノ酸合計数が１００残基以上であることを意味し、好ましくは１５０残基より多くのアミノ酸よりなり、より好ましくは２００残基より多くのアミノ酸よりなる。また、上限は２０００アミノ酸残基であることが好ましく、より好ましい上限は１５００アミノ酸残基、さらに好ましい上限は１０００アミノ酸残基である。親水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６０アミノ酸残基以上、特に好ましくは８０アミノ酸残基以上であり、また、好ましくは１０００アミノ酸残基以下、より好ましくは５００アミノ酸残基以下である。
疎水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６０アミノ酸残基以上、特に好ましくは８０アミノ酸残基以上であり、また、好ましくは１０００アミノ酸残基以下、より好ましくは５００アミノ酸残基以下である。
ここでいうドメインとは、分子の構造上あるいは機能上一つのまとまりをもつ領域のことをいうわけであるが、本発明においては主に、構造上のまとまりのある単位のことをいう。
次に我々は、この仮定が正しいか否か、単純なタンパク質を用いて証明することとした。この実験には、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種であるＨＳＰ７０（ＤｎａＫ）の基質結合ドメインを用いた。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）は、既にＮＭＲ解析で構造が明らかとなっており（図４）、２つの構造的な領域（ドメイン）、すなわちＮ末端側のβシート領域（ドメイン）とＣ末端側のαヘリックス領域（ドメイン）からなっていることが分かっている。また、配列のＮ末端側の親水／疎水率が０．５であり、Ｃ末端側では０．８９で、その差は０．３９と高い値を示すことが計算によって明らかにされた。
そこでまず、このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）がブロッキング能を示すかを確認したところ、ＢＳＡ程ではないがブロッキング能があることが確認され（図５）、本発明の方法の有効性が示された。
そこで次に、ＤｎａＫ３８４−６０７の種々のデリーションミュータントを作製し、ＤｎａＫのどの構造がブロッキングに対して重要な役割を果たしているかを調べた。今回検討した変異体を図６に示した。検討したタンパク質は、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ３８４−５６１、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７の５種類である。これらのタンパク質は大腸菌を宿主として大量発現が可能であり、それぞれのタンパク質のＮ末端側にヒスチジンタグを付加して発現させ、ニッケルキレートカラムを用いて簡便に精製し、実験に用いることができる。今回の実験はヒスチジンタグを付加したタンパク質を用いて検討を行っているが、タグが小さいためその影響は無視した。当然、タグ配列がない場合にも同等の効果が得られることは確認してある（実施例７）。
実験の結果、αヘリックス構造の一部を削ったＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ３８４−５６１とβシート部分を除去しαヘリックス構造のみからなると思われるＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７のブロッキング効率は有意に低下することが分かった（図５）。ＤｎａＫ  ３８４−５６１に関しては、既にそれに近いＤｎａＫ３８１−５５３のＮＭＲによる立体構造が明らかとなっており（図７）、それから類推すると、αヘリックス構造が壊れていることが予想される。これらのことから以下のことが示唆される。すなわち、（１）ブロッキング能を有するタンパク質の親水性部分の縮小や構造破壊によってブロッキング能は損なわれる。（２）親水性部分だけではブロッキング能を示さない。これは、ブロッキング能を発揮するには、疎水性部分に加えて親水性部分が重要であり、ブロッキング能を示すタンパク質は図３に示すように疎水部分でプレートに吸着し、親水性部分でプレート表面を覆う結果ブロッキング効果を発揮していると考えることができるからであると思われる。ＤｎａＫにおいては正に図３の左図のようになっているものと予想される。
一般的に、変性やミューテーションなどにより２次構造が崩壊することで、タンパク質の親水性が失われることが知られており、上のＤｎａＫの例からも親水ドメインを破壊するようにして、部分配列タンパク質を調製することは適切でないことが予想される。それとは逆に図８のように疎水ドメインを破壊することにより、疎水性を向上させることは可能であると思われる。
また、本発明において、ドメインが重要であり、少なくとも１つより多くのドメイン構造が必要であると思われる。そこで、一つの構造ドメインを構成するのに必要とされる１００アミノ酸が目安となる。よって、本発明は少なくとも１００残基より多くのアミノ酸からなる、すなわち一つより多くのドメイン構造を有することが望ましいといえる。
そのような事実を踏まえ、本発明は、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規ブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質をスクリーニングする方法を提供する。詳しくは、以下に示す条件を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法である。
Ａ．  タンパク質のアミノ酸配列を２分し、それぞれの親水性アミノ酸（Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｈ，Ｒ，Ｙ）と疎水性アミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｐ）の含有率から以下の式を用いて算出された２分された各部分での親水／疎水率の差の絶対値が０．１以上である
・（親水／疎水率）＝（親水性アミノ酸含有率）／（疎水性アミノ酸含有率）
Ｂ．  親水性部分（親水／疎水率の高い方の値）が０．５以上
Ｃ．  １００残基より多くのアミノ酸よりなる
上記条件中、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｋはリジン、Ｈはヒスチジン、Ｒはアルギニン、Ｙはチロシン、Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｖはバリン、Ｌはロイシン、Ｉはイソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｗはトリプトファン、Ｐはプロリンを示す。教科書等によっては、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸には様々な定義があるが、本発明においては、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンとした。
本発明でいう部分配列タンパク質とは、野生型タンパク質の一部分のアミノ酸配列からなるタンパク質を示し、好ましくは一つより多くのドメイン構造を有するタンパク質である。
アミノ酸配列を例えばＮ末端側とＣ末端側に２分する場合、必ずしも正確に２分する必要はないがなるべく双方のアミノ酸の数がほぼ均等になるように分割する方が好ましい。また、アミノ酸配列からシグナルペプチドが予想される場合は、その部分は除いて計算すると良い。実際、本発明においても、ＢＳＡ、αカゼイン、リパーゼともにシグナルペプチドを除去した成熟型のアミノ酸配列を用いて計算を行った。
また、図２に示したようなＮ末端側、Ｃ末端側へ二分する以外の分割方法も好ましく用いられる。このような場合、立体構造が明らかになっているタンパク質や立体構造が予測されるタンパク質の方が好ましく応用されうる。
アミノ酸一次配列から、各種アミノ酸含量を算出するには遺伝子・アミノ酸配列解析ソフトを用いることが効果的である。解析ソフトとしては特に限定されないが、本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社）を用いて行った。
また、ソフトウエアの疎水性計算機能を用いてタンパク質の疎水性、親水性をグラフ化することも、スクリーニング作業を効率的に進めるためには効果的である。好ましくは、ｈｏｐｐ＆ｗｏｏｄｓの計算式が用いられる。
また本発明は、上記方法によりアミノ酸配列からスクリーニングされたブロッキング能を有するタンパク質または部分配列タンパク質であって、以下のＤの解析工程により、Ｅの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質である。
Ｄ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（５０〜１００ｍｇ／ｍｌ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程
２．ＰＢＳ（−）で２５〜５０倍希釈した正常ヒト血清を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／  ＰＢＳ（−）にて洗浄する工程
３．酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて非特異的にプレートに吸着したＩｇＧ量を発色法を用いた比色法にて比較する工程
Ｅ．  候補タンパク質での発色がウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは１．５倍以下、さらに好ましくは１．２倍以下、特に１倍以下である。
ここでは、プラスチックプレートへの非特異吸着が顕著であることが知られている、ヒト血清中のＩｇＧの非特異的吸着を目安として、ブロッキング能を測定する。ここでいうポリスチレンイムノタイタープレート（９６ウェルタイプ）とは一般的に免疫測定で使用されるポリスチレン製の９６ウエルタイプのイムノタイタープレートを使用する。候補タンパク質は適切な方法で精製したものを用い、最終的に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で５０〜１００ｍｇ／ｍｌとなるように希釈しておく。同時にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）も同様に調製しておく。ＢＳＡはＳＩＧＭＡ社等から市販されているＦｒａｃｔｉｏｎＶを用いることができる。また同じ性能であるのであれば、特にＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖでなくても良い。ブロッキングは２〜８℃で４〜５時間行った後、液を完全に除去し、洗浄なしで次のステップへ進む。
ここで使用されるヒト血清は正常成人から分離した血清であれば特に限定されず、原液は高濃度であるのでＰＢＳ（−）で２５〜５０倍に希釈して使用するのが良い。血清中のＩｇＧの量は個体差があるので、希釈率を多少変更してもかまわない。プレートへの非特異吸着は３７℃、３０分間行う。また、この時添加する血清の量は正確に測定するために、最初にブロッキングした液量よりも少ない量にすることが好ましい。例えば、ブロッキングを１００μｌで行った場合は、５０μｌの希釈血清溶液を添加する。最後に、正確に１時間反応を行った後、液を除き、十分量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／  ＰＢＳ（−）にて洗浄を行う。洗浄は、３回以上が好ましく、更に好ましくは４回行う。洗浄は、専用のプレート洗浄機を用いても良い。
次に、酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を適切な溶液で適切な濃度にまで希釈し、上記ウェルに添加する。反応時間は３７℃、１時間が適切である。抗体の希釈は、通常免疫学的検出に用いる程度が好ましく、また、抗体の希釈には適切なブロッキング剤（ＢＳＡやカゼイン）が含有されていた方がばらつきが無く良く、更に好ましくは、０．０１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインを用いると良い。標識に用いる酵素としては、ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼが好ましく用いられ、特にペルオキシダーゼが好ましく用いられる。ペルオキシダーゼ用の発色試薬としては、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が好ましく用いられる。また、アルカリホスファターゼの発色基質としては、ＷＴ−１を用いることが出来る。発色時間は、目的となるウェルの吸光度が定量性を失わない程度（０．５〜１．５）に来るようにするのが望ましい。定量域を越えた場合は、正しい値は得られないので、注意する。また、全操作を通じてなるべくプレートを乾燥させないようにしなければ正確な値は得られない。
このようにして得られた値は、低いほどブロッキング効率が高いことを示しており、本発明においては、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示した場合、ブロッキング能を有したと判定した。よって、本発明のブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質は請求項１に示した条件を満たし、かつ、本アッセイでＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示す、すなわちブロッキング能を有するタンパク質である。
また、このアッセイの代替法として、実施例７に示したような方法を用いることも可能である。すなわち、候補タンパク質溶液に段階希釈したペルオキシダーゼを溶解した後、固相へ供し、一定時間吸着させ、ペルオキシダーゼの非特異的吸着を測定する。吸着したペルオキシダーゼの確認法は、上記の方法と同様、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）の発色法が好ましく用いられる。本アッセイにおいても、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示すことがブロッキング能を示す指標となる。また、同様に、あらかじめブロッキングした固相に、希釈ペルオキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を測定しても良い。その場合も、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示すことがブロッキング能を示す指標となる。ここで用いるペルオキシダーゼ溶液の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌが好ましく用いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用するとより正確な評価に繋がる。ペルオキシダーゼの希釈は、ＰＢＳ（−）で行うことが好ましいが、特に限定されない。
このことから、本発明は一つより多くのドメイン構造を有することが好ましいといえるが、この例のように特に疎水側ドメインについては二つのドメインのうち一つのドメイン構造の一部を欠いても良い。本発明のタンパク質又は部分配列タンパク質のアミノ酸の数としては１００以上、好ましくは１５０以上、さらに好ましくは、１８０以上が好ましい。
さらに、本発明は、上記請求項１の条件に合うタンパク質のアミノ酸配列を改変することにより、タンパク質もしくはその部分配列タンパク質のブロッキング効率を更に向上させた新規なタンパク質である。ここでいう新規とは、アミノ酸改変のレベルで新規ということであり、既に知られているタンパク質であっても良い。また、部分配列の場合、今まで知られていない部分配列を有するものも新規とみなされる。
本発明において、アミノ酸配列の改変は、アミノ酸置換、除去（デリーション）、挿入（インサーション）のいずれか、もしくは、重複して行っても良い。変異の方向性としては、疎水領域の疎水性をさらに向上させるような変異や親水性領域の親水性をさらに向上させるような変異が効果的であり、好適に使用される。また、タンパク質の立体構造を変化させるために、アミノ酸配列の除去や挿入なども効果的であり、親水的な領域に埋もれた疎水領域をタンパク質表面に露出されることなどの方法が考えられる。一方、上記の例で示したように、親水ドメインの構造を壊す方のアミノ酸改変は好ましくないと言える。
改変されるタンパク質は原核生物もしくは真核生物由来のものでも良く、大腸菌などを用いて大量調製することを考えると、原核生物由来のタンパク質が好ましく用いられる。更に好ましくは、大腸菌由来のタンパク質が用いられる。用いられるタンパク質はドメインなどの一部分の構造体でも良く、むしろ好適に使用される。
特に、ブロッキング剤は時に酵素等と混合して安定化剤や賦形剤として用いられることが多く、酵素活性の特別な機能を有さないタンパク質が本発明には適しているといえる。また、酵素活性を有するドメインを除去したタンパク質なども好ましく用いられる。
本発明では、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質が好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質が用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＡＴＰａｓｅドメインを除去したＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。ＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインに関しては、既に実施例として上で紹介したものである。
本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はないが、大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在する  Ｓｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在する  Ｓｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在する  Ｂｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在するｍＨｓｐ７０  および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などから選択される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部である。当然、上に列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。
特に、大腸菌のＤｎａＫは良く研究が進んでいることから、アミノ酸改変などの効果予測が比較的容易であるといえる。このタンパク質は６３８アミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成される「ＡＴＰａｓｅ（ＡＴＰ結合）ドメイン」と３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される「基質結合ドメイン」からなっている（図６）。配列番号１にＤｎａＫのタンパク質の配列を、また配列番号２に遺伝子配列を示す。ＨＳＰ７０は新生ポリペプチドや部分的にフォールドしたタンパク質に結合し、自発的にフォールディング出来ないタンパク質のリフォールディングを助けることが知られており、また、タンパク質合成の比較的初期に働くためより豊富な基質を認識することが知られている。
また、ＤｎａＫの基質結合ドメイン自体に、変性したタンパク質のリフォールディングを促す作用があることも知られており  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００２）  ９９，  １５３９８−１５４０３）、この分子を用いることにより、様々な用途展開が可能になると考えられる。
今回の本発明を達成するにあたり、我々はこのＤｎａＫの基質結合ドメインに着目し、様々な検討によって、ブロッキング作用発現のメカニズムに関する様々な知見を得ることが出来、本発明に至ることが出来た。
まず我々は、βシート構造部分に変異を加えることでβシート部分の疎水性を向上させ、ブロッキング効率に優れたタンパク質を作り出す試みを行った。その試みは（１）βシートのＮ末端の一部を除去することで、βシートのより疎水的な部分を露出させる（βシート構造を破壊して疎水性を向上させる）、（２）βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する、というものである。その結果、βシート構造のＮ末端部分を除去したＤｎａＫ  ４１９−６０７と、βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）にブロッキング効率の顕著な向上を認めることができた（図９）。今回特に、ＤｎａＫ  ４１９−６０７に顕著なブロッキング効率の向上を認めることが出来た。このタンパク質は、図８で示したような形でブロッキングを示していると思われる。すなわち、疎水性ドメインの構造が変化したことで、疎水性ドメインの構造が変化し、疎水性ドメインの疎水性が向上したことが、ブロッキング能の向上につながったと考えられる。
本発明でいう、ブロッキング能の向上とは、候補タンパク質にアミノ酸置換、デリーション、挿入などを行い、もととなったタンパク質またはタンパク質部分配列よりもブロッキング能が向上したことを示す。
このブロッキング能の向上は、好ましくは請求項２に示した方法で測定されるのが好ましい。また、ブロッキング能の向上には、長時間のブロッキング能と短時間でのブロッキング能があるが、どちらかもしくは両方においてブロッキング能が向上していれば良い。
ＤｎａＫ  ４１９−６０７での効果が顕著であった理由を更に詳しく考察すると、ＤｎａＫ基質結合ドメインのコの字型の構造のヒンジ部分に隣接するβシート部分を除去したことによりシャペロンの基質としてのペプチドをトラップするための疎水性に富んだコの字構造の内側の一部分が外側へ露出したことに起因していることが推察される。
すなわち、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質である。また、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質である。さらに好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。
また、本発明は、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とするブロッキング効率の向上したタンパク質である。更に詳しくは、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したブロッキング効率の向上したタンパク質である。また更に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質が使用される。
本発明でいう改変されたとは、候補タンパク質のアミノ酸置換、デリーション、挿入などにより、アミノ酸配列が改変されたことを指す。この改変は、候補タンパク質もしくはタンパク質の部分配列を選び出した後、上に示したような考察により、（１）親水ドメインを破壊しないようにする、（２）疎水ドメインを更に疎水性にする、などを意図してアミノ酸を改変することが好ましい。また、本発明では示さなかったが、親水性ドメインを更に親水性にするような方策を当然考えるべきである。
また、本発明においてはブロッキングの速度に関する検討も実施し、本発明の有用性を示した。すなわち、５分、１０分、３０分、３時間ブロッキングした時の、ブロッキング効率を測定した。その結果、今回効果が最も顕著であったＤｎａＫ４１９−６０７は、約５分間のブロッキングでＤｎａＫ３８４−６３８が５８．８％のブロッキング効率であるのに対し、８７．５％の効率でブロッキングが行われていることが判明した。この速度は、３時間後で同等の効果を示すＢＳＡと比べても速く、非常に早い段階でポリスチレンプレートに吸着してブロッキング効果を発揮すると予想される。よって、本発明を用いることで、従来のＢＳＡと同等もしくはそれ以上の性能を有する、新規なブロッキング剤を開発できる可能性が考えられる。
また本発明は、１以上の親水性ドメインと１以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質である。ここでいうドメインとは好ましくは５０アミノ酸以上からなる構造的なアミノ酸のまとまりであり、一部を欠損、付加などされたものについてもドメインとみなす。
また、本発明は、ブロッキング速度についても規定する。すなわち、ブロッキング速度がＢＳＡよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質である。また詳しくは、３時間のブロッキングにおいてＢＳＡと同等のブロッキング効率を示すようにタンパク質量を揃えた条件において、１０分未満のブロッキング能がＢＳＡよりも優れることを特徴とする改変されたタンパク質である。ここで改変されたとは、野生型のタンパク質をコードする遺伝子配列が、アミノ酸置換、デリーション、挿入などによって変換されたということを示している。評価方法としては、特に限定されないが、実施例５および実施例７に示した方法が好ましく用いられ、ＩｇＧやペルオキシダーゼのポリスチレンプレートへの非特異的な吸着を指標に測定される。ＩｇＧを用いる評価方法としては、１〜１０分間、好ましくは２〜１０分間ブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で希釈したヒト血清を添加し、３７℃・６０分間インキュベートした後、洗浄を行い、至適濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体（ペルオキシダーゼ結合）を反応させ、洗浄後、ＴＭＢＺの発色により非特異吸着したＩｇＧ量を測定する。また、ペルオキシダーゼを用いる評価法としては、まず西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼ（東洋紡績（株）製ＰＥＯ−１３１）をブロッキング能を測定したいタンパク質溶液に２ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する。次いで、同溶液によりペルオキシダーゼ溶解液の４０〜３２０倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液１００μｌをポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する。室温で１時間放置した後に溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄する。この洗浄操作を６回繰り返した後、良く洗浄液を取り除く。テトラメチルベンチジンを添加し、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる。この発色はマイクロプレートリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定する。詳しくは、実施例７に記載する。また、同様に、あらかじめブロッキングした固相に、希釈ペルオキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を測定しても良い。ここで用いるペルオキシダーゼ溶液の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌが好ましく用いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用するとより正確な評価に繋がる。ペルオキシダーゼの希釈は、ＰＢＳ（−）で行うことが好ましいが、特に限定されない。
また、この実施例においては、０．７ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ４１９−６０７と３時間後に同等のブロッキング能を示すＢＳＡとして２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；シグマ社製（Ｃｏｄｅ：  Ａ−４５０３））を用いた（タンパク質量はブラッドフォード法にて測定）。検体タンパク質の量はブロッキング能を測定する常識的な範囲で用いられればそれで良いが、好ましくは０．５〜１ｍｇの範囲で用いられることが好ましい。また、本測定に用いるＢＳＡの濃度は、検体タンパク質の３時間目のブロッキング効率と同等のブロッキング効率を示す量を用いるが、これはあらかじめ濃度の検討が必要である。それらのタンパク質を溶解するバッファーとしては、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）やＰＢＳ（−）が好ましく用いられるが、特に限定されない。
本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントはタグを有していても良く、実際、検討にはアミノ末端にヒスチジンタグを付加したものを用いて検討を行った。タグとしては、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトースバインディングプロテイン）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰ（タンデムアフィニティーピュリフィケーション）タグなど、どのタグを採用しても良く、必要に応じて任意のタンパク質を融合して用いても良い。また、既知のタグに任意のアミノ酸配列などを付加しても良い。
さらに当然ではあるが、一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付加しても良い。具体的には、Ｎ末端側を削ったタンパク質の部分配列を用いるときは、当然、Ｎ末端にメチオニン残基を導入する必要がある。また、発現向上や制限酵素サイトの関係から数アミノ酸の付加なども考えられる。例えば実施例７のＤｎａＫ４１９−６０７ＮのＮ末端には、ＭＲＧＳの４アミノ酸が付加されている。また、当然任意のタンパク質との融合タンパク質として発現させても良い。付加する位置は、Ｎ末端側、Ｃ末端側を問わない。
本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法が好ましく、さらには、大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。また、発現ベクターに関しても特に限定されず、一般的に発現に使用されるものであればよい。
本発明のタンパク質の精製方法は、上記タグを用いた精製方法以外に、粗精製溶液を適当な温度で加熱して、その遠心上清を精製すると効率よく精製できる場合がある。加熱は好ましくは５０℃以上、更に好ましくは７０℃以上で行われる。今回用いたＤｎａＫの基質結合ドメインも熱への耐性があり、７０℃、３０分間という条件では、凝集が認められず、遠心上清画分にタンパク質が残ることを確認している。よって、精製する場合は、この加熱遠心上清を、カラムクロマトすることなどにより、簡単にタンパク質の精製をすることが出来、非常に経済的である。また、加熱工程を経ることにより、共存している酵素類を失活させる効果も期待できる。
本発明のブロッキング効率の向上したタンパク質は、ブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤、コーティング剤、医療用コーティング剤などへ応用可能である。特に、免疫反応を利用した検出システムでのブロッキング剤としての期待が大きく、ＥＬＩＳＡ、免疫組織染色、ウエスタンブロッティングなどへの使用が可能であると予想される。実際、今回の発明を完成させるにあたり、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）への応用の可能性を調べたところ、実際に良好な結果を得ている（図１２）。
本発明の一実施形態は、ＤｎａＫ４１９−６０７を含有するブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤である。
本発明の一実施形態は、ＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ、Ｄ４８１Ｖ）を含有するブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤である。
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
実施例１  候補タンパク質のスクリーニング
アミノ酸配列からの候補タンパク質のスクリーニングには、主に核酸・アミノ酸配列解析ソフト：ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社）を用いて行った。このソフトウエアはタンパク質のアミノ酸一次配列から親水性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の数を算出する機能を有しており便利であった。様々なブロッキング能を示すことの判明しているタンパク質、および大腸菌由来のタンパク質もしくは部分配列のＮ末端側半分とＣ末端側半分の配列に含有される親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の数をＧＥＮＥＴＹＸにて算出し、親水性アミノ酸含有率、疎水性アミノ酸含有率、親水／疎水率および、二分したそれぞれの親水／疎水率の差の絶対値等をまとめたのが図１３および図１４である。ここでは、ＧＥＮＥＴＹＸの定義に従い、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンとした。
実施例２  ＤｎａＫフラグメントのクローニング、発現
ＤｎａＫフラグメントは大腸菌Ｋ−１２株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。具体的にＤｎａＫ  ３８４−６３８の増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号３および４に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよび大腸菌ＤＮＡ  １００ｎｇとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。また同様に、ＤｎａＫ  ３８６−５８６の増幅には配列番号３および４に示したプライマーを用いて増幅を行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩにて消化し、ｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトへクローニングした（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−によって増幅されたＤＮＡ断片は平滑化されているため、増幅断片の下流側についてはそのまま使用した）。クローニングした遺伝子の配列はシーケンス解析により確認した。このベクターにクローニングすることにより目的タンパク質のＮ末端に６×Ｈｉｓ配列（ヒスチジンタグ）を付加することができる。このようにして、発現プラスミドｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６３８を作製した。
タンパク質の発現・精製は、遺伝子を導入したＪＭ１０９をＬＢ培地にて１６時間振とう培養し、菌体を遠心分離法により回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  へ懸濁、超音波破砕を行った後、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間微量高速遠心機を用いて遠心して得られた上清を用いて行った。具体的には、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＣ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ  （ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、精製し、最終的に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  に対して一晩透析し、実験に用いた。タンパク質濃度の測定は、ＢＳＡをスタンダードとしたブラッドフォード法を用いて行った（ＢＩＯＲＡＤ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット；  ５００−０００６）。
実施例３  Ｃ末端除去ＤｎａＫクローンおよびポイントミュータントの作製
Ｃ末端除去ＤｎａＫクローンの作製は、実施例１で作製したｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６３８を鋳型として用いＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて任意の場所にストップコドンを導入することにより作製した。実際にはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、その取り扱い説明書に従って実施した。それぞれの作製クローンとそれに使用したプライマー配列の組み合わせを以下に示す。ＤｎａＫ  ３８４−６０７：配列番号５と６、ＤｎａＫ３８４−５７８：配列番号７と８、ＤｎａＫ３８４−５６１：配列番号９と１０。また、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）はｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６０７を鋳型として用い、配列番号１１と１２を用いて変異導入を実施した。それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列を確認した後、実施例１に記載の方法に従って、タンパク質を調製した。
実施例４  Ｎ末端除去ＤｎａＫクローンの作製
実施例２で作成した、ｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６０７を鋳型として次に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、実施例１に方法に従って、ｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトに導入した。作製したクローンと用いたプライマーのセットは以下のとおりである。ＤｎａＫ  ５０８−６０７：配列番号１３と２、ＤｎａＫ５２５−６０７：配列番号１４と２、ＤｎａＫ  ４１９−６０７：配列番号１５と２。それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列を確認した後、実施例１に記載の方法に従って、タンパク質を調製した。
実施例５  ブロッキング効果
ブロッキング効率は以下の方法を用いて測定した。
ポリスチレンプレートへのヒト血清ＩｇＧの非特異吸着を指標として検討を実施した。
方法としては、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に希釈したＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）および各種変異体ＤｎａＫサンプル  １００μｌをポリスチレン製９６ウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製；  Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ  ８Ｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐ）に添加し、４℃にて４時間静置した（基本的には４時間静置したが、ブロッキング時間を検討する場合は任意の時間を設定した）。その後、プレートから溶液を除去した後、正常人血清をＰＢＳ（−）にて５０倍希釈し、５０μｌを添加、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、各ウェルを２００μｌの洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて４回洗浄し、至適濃度に抗体希釈液（０．０１Ｍ  ＰＢ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）で希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、各ウェルを２００μｌの洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて４回洗浄し、発色試薬（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））を１００μｌ添加、室温で５分間発色させた後、１Ｎ硫酸５０μｌを加え反応を停止させた。発色は、ＥＬＩＳＡリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定した。タンパク質の定量にはブラッドフォード法を用いた。
まず、０．７ｍｇ／ｍｌ  に調製したＢＳＡ、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７について、４時間でのブロッキング効率を測定したところ、図５に示すように、ＢＳＡ、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７以外のものについては、ブロッキング効果が低い結果であった。ブロッキング効果が低かったクローンは、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８については、αヘリックスを削ったクローン、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７はβシートを削ったクローンであり、ＤｎａＫの基質結合ドメインを用いるブロッキングにはαヘリックス構造とβシート構造の両方が必要であることが推察された。
次に、βシート部分の疎水性を向上させる目的で作製した、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）とＤｎａＫ  ４１９−６０７（それぞれ０．７ｍｇ／ｍｌ）と同濃度のＢＳＡとＤｎａＫ  ３８４−６０７をコントロールとして、ブロッキング４時間でのブロッキング効果を比較した。その結果、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）、ＤｎａＫ  ４１９−６０７ともに、同濃度のＢＳＡよりもブロッキング効率が高く、特にＤｎａＫ  ４１９−６０７で顕著であった（図９）。
更に、上記実験で最も効果の高かったＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＢＳＡについて、ブロッキング濃度とブロッキング４時間目でのブロッキング効果について調べた。その結果、０．１５ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ  ４１９−６０７は１２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡよりもブロッキング効果が顕著であり、非常に低濃度でブロッキング剤として使用可能であることが示唆された（図１０）。
最後に、更に、上記実験で最も効果の高かったＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＢＳＡについて、ブロッキング時間とブロッキング効果について検討を行った。タンパク質濃度は、ＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８については０．７ｍｇ／ｍｌとし、ＢＳＡは上記検討で０．７ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ  ４１９−６０７と同等のブロッキング効果を示した２．４ｍｇ／ｍｌで用いた。その結果、ＤｎａＫ  ４１９−６０７のブロッキングに要する時間が飛躍的に短く約１０分程度で十分効果的なブロッキング効果が得られ、３時間後に同等の効果の見られた２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡより早くブロッキング効果を示すことが分かった（図１１）。
実施例６  ブロッキング効果（ＥＬＩＳＡ）
ヒト癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：  ｈＣＥＡ）のＥＬＩＳＡシステムを用いてＤｎａＫフラグメントのブロッキング剤としての有用性を検討した。まず、抗ｈＣＥＡ  ＭｏＡｂを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈後、１００μｌづつポリスチレン製９６ウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製；  Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ  ８Ｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐ）へ添加後、３７℃・１時間静置した。静置後、洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）１５０μｌにて３回ウェルを洗浄した後、ブロック液を２００μｌづつ添加し、４℃・４時間静置した。ブロック液としては、一般的に使用される２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））、および同様の緩衝液に溶解したＤｎａＫ  ４１９−６０７を用い、ブランクは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０で行った。ブロック液廃棄後、０、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌに希釈したｈＣＥＡ溶液（イムノフローラ：東洋紡製）を５０μｌづつ添加し、３７℃にて１時間インキュベート後、１５０μｌの洗浄液にて４回洗浄実施した。その後、至適濃度に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＥＡ抗体（イムノフローラ：東洋紡製）を添加、３７℃・１ｈ反応後、さらに洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）１５０μｌにて３回ウェルを洗浄した。次に、基質溶液（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））  １００μｌを添加し、遮光して３７℃、２０分間発色させた。最後に、反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）  １００μｌを添加し、黄色の発色を４５０ｎｍ／６５０ｎｍで測定した。
その結果、ブランクでは測定の直線性が失われているのに対し、ＤｎａＫ  ４１９−６０７はＢＳＡ同様に直線性の良い結果が得られ、本発明のＤｎａＫ  ４１９−６０７が免疫学的測定にも十分適用し得ることが示された（図１２）。
実施例７  ヒスチジンタグなし（ｎａｔｉｖｅ）のＤｎａＫフラグメントのブロッキング効果の比較
実施例２〜４で構築したＤｎａＫフラグメントはいずれも発現ベクターｐＱＥ３０に由来するヒスチジンタグをＮ末端に有している事より、ＤｎａＫフラグメントの等電点が中性ｐＨへシフトしている。そのため、本来の静電相互作用によるブロッキング能も維持できるようヒスチジンタグを削除したＤｎａＫフラグメントを構築した。
ヒスチジンタグ除去ＤｎａＫクローンの作製は、実施例５で作製したｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７を鋳型として用いＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて開始コドンの後ろからヒスチジンタグを含むＤｎａＫ領域までのアミノ酸を削除して作製した。実際にはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、ヒスチジンタグの上流にＢａｍＨＩサイトを導入した。操作は、その取り扱い説明書に従って実施した。その際の使用したプライマー配列を配列番号１６、１７に示す。実施例２にも示したが、クローニングした遺伝子の上流側にもＢａｍＨＩサイトを設けてある。よって、ＢａｍＨＩで得られたベクターを消化し、再結合することにより、ヒスチジンタグ配列を除去したクローンを得ることができる。
この発現ベクターはｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎと命名した。またｎａｔｉｖｅなＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントの調製は、このｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎにて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した形質転換体を培養して取得した。
すなわち、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎ）を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むトレフィックブロス（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、１７ｍＭリン酸１カリウム、７２ｍＭリン酸２カリウム）に植菌し３２℃で２０時間しんとう培養した。本培養液１Ｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、２００ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液，ｐＨ９．０に懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。本破砕液に終濃度０．１％になるようポリエチレンイミンを添加後６０℃で２時間加温し、遠心分離により上清を回収した。次いで５０％飽和度の硫安を添加し、遠心分離により沈殿物を回収後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で再溶解した。更に、６４℃で１４時間加温処理し遠心分離により上清を回収した。この粗酵素液をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、次いで５０％飽和度の硫安を添加して沈殿を回収後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で再溶解した。同緩衝液で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲルろ過クロマトグラフィーで脱塩した。次にこのＤｎａＫフラグメントを２０％飽和度硫安を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムクロマトグラフィーに供し２０％〜０％飽和度硫安のリニアグラジェントによる溶出を行い、精製ＤｎａＫフラグメント画分を取得した。本精製フラグメント画分を限外ろ過膜で濃縮した後、蒸留水により脱塩して最終精製ＤｎａＫフラグメントを取得した。
ＢＳＡとｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントのブロッキング効率の比較は以下の方法により測定した。
まず西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼ（東洋紡績（株）製ＰＥＯ−１３１）をＢＳＡまたはｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントを含むＰＢＳ緩衝液に２ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した。その際、市販品ＢＳＡ（フラクションＶ）は２または１０ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．１または０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。次いで、同溶液によりペルオキシダーゼ溶解液の４０〜３２０倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液１００μｌをポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注した。室温で１時間放置した後に溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで洗浄した。この洗浄操作を６回繰り返した後、良く洗浄液を取り除いた。次いで、１００μｌのテトラメチルベンチジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を添加し、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、１Ｎの硫酸１００μｌを添加し反応停止並びに発色させた。この発色はマイクロプレートリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定した。
その結果を図１５〜図１７に示したが、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントはＢＳＡの１／２０の濃度でＢＳＡと同等の非特異発色抑制を示した事より、ＢＳＡの約２０倍のブロッキング能を示す事が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または部分配列タンパク質を簡便にスクリーニングできるようになり、また、大腸菌で大量発現可能なブロッキング効率の向上したタンパク質の生産が可能となった。本発明によって得られたタンパク質はブロッキング能が高く、従来法に比べ、簡便かつ確実な結果が得られる。本発明は、免疫的測定を応用する臨床診断や、医療などの分野に大きな寄与を与える。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2005003155.tif 000026
【図１６】
2005003155.tif 000027
【図１７】
2005003155.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月5日(2006.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
請求項１の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｆの解析工程により得ることができる、以下のＧの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｆ．（１）西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼを候補タンパク質溶液（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）に０．０５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する工程；
（２）上記希釈液をポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する工程；
（３）１時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
（４）テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
（５）発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｇ．候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。  
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法に関し、更には、本発明はタンパク質のアミノ酸配列を改変することにより、ブロッキング効率の向上したタンパク質に関する。更には、該タンパク質を含有する、ブロッキング試薬、安定化剤、賦形剤、フォールディング補助剤、リフォールディング補助剤、医療用コーティング剤にも関する。本発明は、大腸菌での高発現可能なタンパク質のブロッキング効率を向上させることができ、ブロッキング効率に優れたタンパク質を組換えで大量に生産する場合有用である。
【背景技術】
【０００２】
従来、免疫測定などで用いられるブロッキング剤としては生体成分から直接抽出したタンパク質が多く使用されてきた。特にウシ由来のアルブミンやカゼインなどが広く使用されてきた歴史がある。しかし近年、狂牛病などの問題から、様々な制限が加えられている現状である。一方、組換え体を用いてそれらを製造する方法は、病原体（物質）を排除できる利点はあるが、生産性などの問題点から実用に至っているものは少ない。
【０００３】
よって、大腸菌などに由来するタンパク質を、代替タンパク質として使用するという試みが、生産性という立場からは好ましいと言える。しかし、大量発現できるタンパク質が必ずしもブロッキング効率が良いわけではなく、組換え体で生産できるブロッキング効率に優れたタンパク質を見出さなければならないという問題点があった。
【０００４】
近年、様々な生物の遺伝子配列が明らかとなったが、予想されるアミノ酸配列よりブロッキング効率に優れたタンパク質を見出す法則は未だ知られておらず、そのようなタンパク質を探すには非常な手間が掛かる作業であると思われていた。
【０００５】
このような理由から、組換え体で大量生産できるブロッキング効率に優れた代替タンパク質が求められていた。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、アミノ酸配列からブロッキング能を有するタンパク質を簡便に見出す方法を提供するとともに、大腸菌等で大量発現可能、かつアミノ酸配列改変によりブロッキング効率を向上させたタンパク質を提供することである。
【０００７】
上のような背景を踏まえ、鋭意検討した結果、ブロッキング能を有するタンパク質に特徴的なアミノ酸配列に関する性質を見出すと共に、そのようにして見出されたタンパク質のアミノ酸配列を改変することによりブロッキング効率を飛躍的に高めることが出来ることを見出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の構成からなる。
（１）アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質候補をスクリーニングする方法であって、以下の条件を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法
Ａ．  タンパク質のアミノ酸配列を２分し、それぞれの親水性アミノ酸（Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｈ，Ｒ，Ｙ）と疎水性アミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｐ）の含有率から以下の式を用いて算出された２分された各部分での親水／疎水率の差の絶対値が０．１以上である
・（親水／疎水率）＝（親水性アミノ酸含有率）／（疎水性アミノ酸含有率）
Ｂ．  親水性部分（親水／疎水率の高い方の値）が０．５以上
Ｃ．  １００残基より多くのアミノ酸よりなる
（２）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｄの解析工程により得ることができる、以下のＥの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質
Ｄ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに（１）の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；
２．ＰＢＳ（−）で２５〜１００倍希釈した正常ヒト血清を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
３．酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて非特異的にプレートに吸着したＩｇＧ量を発色法を用いた比色法にて比較する工程；
Ｅ  候補タンパク質での発色がウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（３）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｆの解析工程により得ることができる、以下のＧの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｆ  １．西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼを候補タンパク質溶液（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）に０．０５ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する工程；
２．上記希釈液をポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する工程；
３．１時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
４．テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
５．発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｇ  候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（４）（１）の方法によってスクリーニングされたブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質であって、以下Ｈの解析工程により得ることができる、以下のＩの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質：
Ｈ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに（１）の条件を満たす候補タンパク質（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ：ＰＢＳ（−）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程；  
２．  ０．０５ｍｇ／ｍｌに調製したペルオキシダーゼ溶液を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートをＰＢＳ（−）（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄する工程；
３．  １時間、２５℃で放置した後に、溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）で洗浄する工程；
４．  テトラメチルベンチジン溶液を添加し、３７℃でインキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる工程；
５．  発色をマイクロプレートリーダーにて測定する工程；
Ｉ  候補タンパク質での測定値が、ウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下である。
（５）（１）に記載の条件Ａ，  Ｂ，  Ｃを満たすタンパク質または部分配列タンパク質のアミノ酸配列の改変によりブロッキング効率を向上させた新規なタンパク質
（６）アミノ酸配列改変がアミノ酸置換、除去、挿入によるものであることを特徴とする（５）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（７）原核生物もしくは真核生物由来であることを特徴とする（５）に記載のブロッのブロッキング効率の向上したタンパク質。
（８）「ＨＳＰ７０ファミリータンパク質」由来であることを特徴とするブロッキング効率の向上したタンパク質。
（９）ＤｎａＫタンパク質由来であることを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１０）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であることを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１１）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１２）ＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１３）ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなる（８）に記載のタンパク質
（１４）ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とする（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１５）ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１６）ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換した（８）に記載のブロッキング効率の向上したタンパク質。
（１７）１以上の親水性ドメインと１以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質。
（１８）ブロッキング速度がＢＳＡよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質。
（１９）３時間のブロッキングにおいてＢＳＡと同等のブロッキング効率を示すようにタンパク質量を揃えた条件において、１０分未満のブロッキング能がＢＳＡよりも優れることを特徴とする（１８）に記載の改変されたタンパク質。
（２０）タグ配列を有することを特徴とする（２）〜（１９）のいずれかに記載のタンパク質
（２１）タグ配列がヒスチジンタグ、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）タグ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、タンデムアフィニティーピュリフィケーションタグから選択されることを特徴とする（２０）に記載のタンパク質
（２２）原核生物を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２３）大腸菌を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２４）無細胞タンパク質合成法を用いて（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の生産方法
（２５）加熱工程を経ることを特徴とする（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質の精製方法
（２６）（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質をブロッキング、安定化、賦形、フォールディング補助、リフォールディング補助、コーティング、医療用に使用する方法
（２７）（２）〜（２１）のいずれかに記載のタンパク質を含有するブロッキング試薬、安定化剤、賦形剤、フォールディング補助剤、リフォールディング補助剤、コーティング剤または医療用コーティング剤。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ここでいうブロッキングとは、容器や担体などへの成分の非特異的吸着を妨げることを言い、特にプラスチックなどの樹脂へのタンパク質の非特異的吸着を妨げることをいう。様々な測定において、測定対照の成分が非特異的に器壁に吸着することにより、バックグラウンドとして測定を妨げることが問題となる。特に免疫学的測定において、抗体のポリスチレンプレートへの吸着は顕著であり、通常、あらかじめ樹脂等に吸着しやすいタンパク質を添加して、抗体の非特異的吸着を妨げる操作、すなわちブロッキングを行うことが広く行われている。免疫的測定には、タンパク質を器壁に物理的に吸着させることが必須であることから、ポリスチレン等の樹脂で出来たタンパク質の吸着しやすいプレートが広く使われるが、余分な成分の吸着も顕著であるため、より良いブロッキング剤が常に求められているのが現状である。また、臨床用診断薬においても、診断薬用酵素の自動分析機のセルへの非特異吸着が問題となっているものも多い。
【００１０】
本発明では主に、免疫学的測定を念頭に置き、最も非特異吸着が顕著である例として知られているヒト血清中のＩｇＧのポリスチレンプレートへの非特異吸着を測定することで、ブロッキング効果を測定した。すなわち、測定は以下の工程よりなる。
（１）ポリスチレン製９６穴プレートにブロッキング能を調べたいタンパク質溶液を加え、一定時間静置し、プレートをブロッキングする。
（２）（１）の液を除去し、希釈したヒト血清を添加し、インキュベートする。
（３）プレートを洗浄した後、標識抗ヒトＩｇＧ抗体を添加し、インキュベートする。  
（４）プレートを洗浄した後、比色法により非特異的に結合したＩｇＧ量を比較する。  
詳細な方法については以下で述べるが、この方法は本発明を遂行するにあたり非常に有効であった。本方法の概略を図１に示す。
【００１１】
ブロッキング試薬としては、従来ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やウシ乳中のカゼインなどが広く使われて来た。しかし、それらの高いブロッキング能がタンパク質のどの性質から来るのか、理論立てた説明は未だなされておらず、一般にはその疎水性に起因していることが通説のようになっている。
【００１２】
そこで、まず疎水性の高いタンパク質にブロッキング能が備わっているのかを調べる目的で疎水性アミノ酸の含量が高いことが知られているＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のリパーゼをブロック剤として使用し、そのブロック能を調べた。リパーゼは臨床検査用途などにも使われているが、測定時のセル吸着などが問題となることがあるほどプラスチック表面への吸着能が高いことが知られている。しかし、実験の結果、ブロッキングの効果はほとんど見られないことが明らかとなった。それぞれのタンパク質中の親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の比率等を図１３に示したが、比較してみるとＢＳＡやカゼインの疎水性はリパーゼの疎水性に較べ低いことが分かる。このことから考察される事項としては、タンパク質がその疎水性で吸着する現象と、ブロッキング能とは関連はあるが、すべてではないということである。リパーゼのブロッキング能が発揮されなかった理由としては、器壁に吸着したリパーゼにタンパク質が非特異的に吸着したことに起因していると推察される。
【００１３】
ここでいう親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸は教科書等によっては、様々な定義があるが、本発明においては、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンと定義した。
【００１４】
本発明では、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンと定義した。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンと定義したが、親水性アミノ酸でＨｉｓ，Ｔｙｒ、特にＴｙｒは親水性が低く、疎水性アミノ酸でＧｌｙ、Ａｌａ、特にＧｌｙは疎水性が低いと考えられ、更に厳密に厳密性を持たせて予測するためには、ＴｙｒとＧｌｙを除外して計算し、更に好ましくは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａを除外して計算すると良い結果が得られることもある。また、後に示すブロッキング能の改変においても、親水性、疎水性の強弱を念頭において改変を行うことが好ましい。
【００１５】
そこで次に、様々な切り口からそれぞれのアミノ酸の含有率を計算したところ、ブロッキング能を示すＢＳＡ（シグナルペプチドなし）とウシ由来αカゼイン（シグナルペプチドなし）のアミノ酸配列の２分された各部分、例えばＮ末端側とＣ末端側で、親水性アミノ酸含有率と疎水性アミノ酸含有率の傾向が異なることが明らかとなった（図１４）。本発明において、親水性アミノ酸含有率を疎水性アミノ酸含有率で割った値を便宜上「親水／疎水率」と定義するが、ＢＳＡのＮ末端側の親水／疎水率は１．００であるのに対し、Ｃ末端側は０．８３であり、０．１７の差があることがわかる。αカゼインでは、Ｎ末端側０．８８、Ｃ末端側０．６４となりその差は０．２４であった。一方、ブロッキング能を示さないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ由来のリパーゼにおいては、Ｎ末端側０．３９、Ｃ末端側が０．４４とその差が０．０５であり０．１にも満たないことが分かった。このことから、ブロッキング能を示すには、タンパク質分子の中の比較的疎水的な領域に加え、親水的な領域が必要であるということが条件になっていることが推察された。
【００１６】
本発明のタンパク質において、親水性部分、疎水性部分及び全長の親水／疎水率は、以下の範囲が好ましい。
【００１７】
親水性部分の親水／疎水率は０．５〜２．０、より好ましくは０．７〜１．７、さらに好ましくは０．８〜１．５である。
【００１８】
疎水性部分の親水／疎水率は０．２〜１．１、より好ましくは０．３〜１．０、さらに好ましくは０．４〜０．９である。
【００１９】
タンパク質全体の親水／疎水率は０．４〜２．０、より好ましくは０．５〜１．５、さらに好ましくは０．６〜１．０である。
【００２０】
親水性部分と疎水性部分の親水／疎水率の差（絶対値）は好ましくは０．１〜０．６、より好ましくは０．１５〜０．５、さらに好ましくは０．１５〜０．４である。
【００２１】
親水性部分と疎水性部分は、いずれが２分された各部分、例えばＣ末端側（或いはＮ末端側）であってもよい。
【００２２】
また、本発明は、親水性部分と疎水性部分が２分された各部分、例えばＣ末端側或いはＮ末端側に存在すると仮定しているが、Ｎ末端側又はＣ末端側に親水性でも疎水性でもない配列を追加したものも、親水性部分と疎水性部分が存在する限り、本発明に含まれる。
【００２３】
さらに本発明は、図２に示すように親水性部分−疎水性部分−親水性部分や、疎水性部分−親水性部分−疎水性部分、さらには親水性部分−疎水性部分−親水性部分−疎水性部分のような順序で各部分を有するものも本発明に含まれる。
【００２４】
上のことを踏まえると、疎水部分（疎水ドメイン）が器壁に吸着し、親水部分（親水ドメイン）がその上にかぶさるような形態をとり、全体でみると親水部分で器壁を覆うようにして、ブロッキングしていることが推察される。そのモデルを図３に示す。リパーゼがブロッキング能を示さなかったのは、吸着されるが、吸着されたタンパク質が疎水的でありすぎたため、そのタンパク質への更なる非特異的吸着が起きたことが予想される。
【００２５】
器壁に吸着する疎水性部分と、疎水性部分を覆う親水性部分の比率は、疎水性部分１に対し親水性部分０．３〜１０、好ましくは０．５〜５、さらに好ましくは０．７〜２である。疎水性部分が大きすぎると親水性部分により覆うことができなくなり、器壁に吸着された疎水性部分に、さらに他のタンパク質が吸着することになる。また、親水性部分が大きすぎると、疎水性部分が器壁に吸着する面積が小さくなりすぎ、十分強固に吸着できなくなったり、ブロッキングの効率が低下したりする。
【００２６】
なお、本発明において、「２分する」とは、全配列を約５０％ずつ分けることを意味するのではなく、疎水性部分と親水性部分の２つに分けるというだけの意味である。親水性部分と疎水性部分の一方又は両方が複数存在する場合、複数存在する親水性部分／疎水性部分の親水／疎水率は、平均値として計算される。また、親水性部分、疎水性部分は、各々ひとかたまりの部分、好ましくはドメイン構造を有するものであり、各部分は、全体配列の２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上である。ただ、タンパク質の構造が分かっていなかったり、予測困難な場合には、アミノ酸配列をＮ末端側とＣ末端側に大きく２分して解析するが好ましく、効果的である。
【００２７】
図１４を見る限りでは、親水／疎水率の親水ドメインと疎水ドメイン間の差はタンパク質間では若干ばらつきがあり、その値の大きさのみがブロッキング能力を詳細まで反映していない可能性もあると思われる。そのファクターの一つは分子量であると思われる。本発明において、「１００残基より多くのアミノ酸よりなる」とは、アミノ酸配列全体のアミノ酸合計数が１００残基以上であることを意味し、好ましくは１５０残基より多くのアミノ酸よりなり、より好ましくは２００残基より多くのアミノ酸よりなる。また、上限は２０００アミノ酸残基であることが好ましく、より好ましい上限は１５００アミノ酸残基、さらに好ましい上限は１０００アミノ酸残基である。
【００２８】
親水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６０アミノ酸残基以上、特に好ましくは８０アミノ酸残基以上であり、また、好ましくは１０００アミノ酸残基以下、より好ましくは５００アミノ酸残基以下である。
【００２９】
疎水性の部分またはドメインのアミノ酸数は、好ましくは３０アミノ酸残基以上、より好ましくは５０アミノ酸残基以上、さらに好ましくは６０アミノ酸残基以上、特に好ましくは８０アミノ酸残基以上であり、また、好ましくは１０００アミノ酸残基以下、より好ましくは５００アミノ酸残基以下である。
【００３０】
ここでいうドメインとは、分子の構造上あるいは機能上一つのまとまりをもつ領域のことをいうわけであるが、本発明においては主に、構造上のまとまりのある単位のことをいう。
【００３１】
次に我々は、この仮定が正しいか否か、単純なタンパク質を用いて証明することとした。この実験には、大腸菌のヒートショックタンパク質の一種であるＨＳＰ７０（ＤｎａＫ）の基質結合ドメインを用いた。このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）は、既にＮＭＲ解析で構造が明らかとなっており（図４）、２つの構造的な領域（ドメイン）、すなわちＮ末端側のβシート領域（ドメイン）とＣ末端側のαへリックス領域（ドメイン）からなっていることが分かっている。また、配列のＮ末端側の親水／疎水率が０．５であり、Ｃ末端側では０．８９で、その差は０．３９と高い値を示すことが計算によって明らかにされた。
【００３２】
そこでまず、このタンパク質（ＤｎａＫ３８４−６０７）がブロッキング能を示すかを確認したところ、ＢＳＡ程ではないがブロッキング能があることが確認され（図５）、本発明の方法の有効性が示された。
【００３３】
そこで次に、ＤｎａＫ３８４−６０７の種々のデリーションミュータントを作製し、ＤｎａＫのどの構造がブロッキングに対して重要な役割を果たしているかを調べた。今回検討した変異体を図６に示した。検討したタンパク質は、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ３８４−５６１、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７の６種類である。これらのタンパク質は大腸菌を宿主として大量発現が可能であり、それぞれのタンパク質のＮ末端側にヒスチジンタグを付加して発現させ、ニッケルキレートカラムを用いて簡便に精製し、実験に用いることができる。今回の実験はヒスチジンタグを付加したタンパク質を用いて検討を行っているが、タグが小さいためその影響は無視した。当然、タグ配列がない場合にも同等の効果が得られることは確認してある（実施例７）。
【００３４】
実験の結果、αへリックス構造の一部を削ったＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ３８４−５６１とβシート部分を除去しαへリックス構造のみからなると思われるＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７のブロッキング効率は有意に低下することが分かった（図５）。ＤｎａＫ  ３８４−５６１に関しては、既にそれに近いＤｎａＫ３８１−５５３のＮＭＲによる立体構造が明らかとなっており（図７）、それから類推すると、αへリックス構造が壊れていることが予想される。これらのことから以下のことが示唆される。すなわち、（１）ブロッキング能を有するタンパク質の親水性部分の縮小や構造破壊によってブロッキング能は損なわれる。（２）親水性部分だけではブロッキング能を示さない。これは、ブロッキング能を発揮するには、疎水性部分に加えて親水性部分が重要であり、ブロッキング能を示すタンパク質は図３に示すように疎水部分でプレートに吸着し、親水性部分でプレート表面を覆う結果ブロッキング効果を発揮していると考えることができるからであると思われる。ＤｎａＫにおいては正に図３の左図のようになっているものと予想される。
【００３５】
一般的に、変性やミューテーションなどにより２次構造が崩壊することで、タンパク質の親水性が失われることが知られており、上のＤｎａＫの例からも親水ドメインを破壊するようにして、部分配列タンパク質を調製することは適切でないことが予想される。それとは逆に図８のように疎水ドメインを破壊することにより、疎水性を向上させることは可能であると思われる。
【００３６】
また、本発明において、ドメインが重要であり、少なくとも１つより多くのドメイン構造が必要であると思われる。そこで、一つの構造ドメインを構成するのに必要とされる１００アミノ酸が目安となる。よって、本発明は少なくとも１００残基より多くのアミノ酸からなる、すなわち一つより多くのドメイン構造を有することが望ましいといえる。
【００３７】
そのような事実を踏まえ、本発明は、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規ブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質をスクリーニングする方法を提供する。詳しくは、以下に示す条件を満たすタンパク質もしくは部分配列タンパク質をスクリーニングする方法である。
Ａ．  タンパク質のアミノ酸配列を２分し、それぞれの親水性アミノ酸（Ｄ，Ｅ，Ｋ，Ｈ，Ｒ，Ｙ）と疎水性アミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｐ）の含有率から以下の式を用いて算出された２分された各部分での親水／疎水率の差の絶対値が０．１以上である
・（親水／疎水率）＝（親水性アミノ酸含有率）／（疎水性アミノ酸含有率）
Ｂ．  親水性部分（親水／疎水率の高い方の値）が０．５以上
Ｃ．  １００残基より多くのアミノ酸よりなる
上記条件中、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｋはリジン、Ｈはヒスチジン、Ｒはアルギニン、Ｙはチロシン、Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｖはバリン、Ｌはロイシン、Ｉはイソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｗはトリプトファン、Ｐはプロリンを示す。教科書等によっては、親水性アミノ酸、疎水性アミノ酸には様々な定義があるが、本発明においては、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンとした。
【００３８】
本発明でいう部分配列タンパク質とは、野生型タンパク質の一部分のアミノ酸配列からなるタンパク質を示し、好ましくは一つより多くのドメイン構造を有するタンパク質である。
【００３９】
アミノ酸配列を例えばＮ末端側とＣ末端側に２分する場合、必ずしも正確に２分する必要はないがなるべく双方のアミノ酸の数がほぼ均等になるように分割する方が好ましい。また、アミノ酸配列からシグナルペプチドが予想される場合は、その部分は除いて計算すると良い。実際、本発明においても、ＢＳＡ、αカゼイン、リパーゼともにシグナルペプチドを除去した成熟型のアミノ酸配列を用いて計算を行った。
【００４０】
また、図２に示したようなＮ末端側、Ｃ末端側へ二分する以外の分割方法も好ましく用いられる。このような場合、立体構造が明らかになっているタンパク質や立体構造が予測されるタンパク質の方が好ましく応用されうる。
【００４１】
アミノ酸一次配列から、各種アミノ酸含量を算出するには遺伝子・アミノ酸配列解析ソフトを用いることが効果的である。解析ソフトとしては特に限定されないが、本発明においては、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社）を用いて行った。
【００４２】
また、ソフトウエアの疎水性計算機能を用いてタンパク質の疎水性、親水性をグラフ化することも、スクリーニング作業を効率的に進めるためには効果的である。好ましくは、ｈｏｐｐ＆ｗｏｏｄｓの計算式が用いられる。
【００４３】
また本発明は、上記方法によりアミノ酸配列からスクリーニングされたブロッキング能を有するタンパク質または部分配列タンパク質であって、以下のＤの解析工程により、Ｅの条件を満たすタンパク質または部分配列タンパク質である。
Ｄ  １．ポリスチレン製イムノタイタープレートのそれぞれのウェルに請求項１の条件を満たす候補タンパク質（５０〜１００ｍｇ／ｍｌ：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．０）に希釈）および同様に調製したウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）を添加し、２℃〜１０℃で４〜５時間ブロッキングし、液を廃棄する工程
２．ＰＢＳ（−）で２５〜５０倍希釈した正常ヒト血清を添加し、３７℃にて１時間放置した後に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／  ＰＢＳ（−）にて洗浄する工程
３．酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて非特異的にプレートに吸着したＩｇＧ量を発色法を用いた比色法にて比較する工程
Ｅ．  候補タンパク質での発色がウシ血清アルブミンの発色の２．５倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは１．５倍以下、さらに好ましくは１．２倍以下、特に１倍以下である。
【００４４】
ここでは、プラスチックプレートへの非特異吸着が顕著であることが知られている、ヒト血清中のＩｇＧの非特異的吸着を目安として、ブロッキング能を測定する。ここでいうポリスチレンイムノタイタープレート（９６ウェルタイプ）とは一般的に免疫測定で使用されるポリスチレン製の９６ウエルタイプのイムノタイタープレートを使用する。候補タンパク質は適切な方法で精製したものを用い、最終的に２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で５０〜１００ｍｇ／ｍｌとなるように希釈しておく。同時にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）も同様に調製しておく。ＢＳＡはＳＩＧＭＡ社等から市販されているＦｒａｃｔｉｏｎＶを用いることができる。また同じ性能であるのであれば、特にＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖでなくても良い。ブロッキングは２〜８℃で４〜５時間行った後、液を完全に除去し、洗浄なしで次のステップへ進む。
【００４５】
ここで使用されるヒト血清は正常成人から分離した血清であれば特に限定されず、原液は高濃度であるのでＰＢＳ（−）で２５〜５０倍に希釈して使用するのが良い。血清中のＩｇＧの量は個体差があるので、希釈率を多少変更してもかまわない。プレートへの非特異吸着は３７℃、３０分間行う。また、この時添加する血清の量は正確に測定するために、最初にブロッキングした液量よりも少ない量にすることが好ましい。例えば、ブロッキングを１００μｌで行った場合は、５０μｌの希釈血清溶液を添加する。最後に、正確に１時間反応を行った後、液を除き、十分量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／  ＰＢＳ（−）にて洗浄を行う。洗浄は、３回以上が好ましく、更に好ましくは４回行う。洗浄は、専用のプレート洗浄機を用いても良い。
【００４６】
次に、酵素標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を適切な溶液で適切な濃度にまで希釈し、上記ウェルに添加する。反応時間は３７℃、１時間が適切である。抗体の希釈は、通常免疫学的検出に用いる程度が好ましく、また、抗体の希釈には適切なブロッキング剤（ＢＳＡやカゼイン）が含有されていた方がばらつきが無く良く、更に好ましくは、０．０１Ｍ  リン酸バッファー（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼインを用いると良い。標識に用いる酵素としては、ペルオキシダーゼとアルカリホスファターゼが好ましく用いられ、特にペルオキシダーゼが好ましく用いられる。ペルオキシダーゼ用の発色試薬としては、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が好ましく用いられる。また、アルカリホスファターゼの発色基質としては、ＷＴ−１を用いることが出来る。発色時間は、目的となるウェルの吸光度が定量性を失わない程度（０．５〜１．５）に来るようにするのが望ましい。定量域を越えた場合は、正しい値は得られないので、注意する。また、全操作を通じてなるべくプレートを乾燥させないようにしなければ正確な値は得られない。
【００４７】
このようにして得られた値は、低いほどブロッキング効率が高いことを示しており、本発明においては、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示した場合、ブロッキング能を有したと判定した。よって、本発明のブロッキング能を有する新規なブロッキング用タンパク質または部分配列タンパク質は請求項１に示した条件を満たし、かつ、本アッセイでＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示す、すなわちブロッキング能を有するタンパク質である。
【００４８】
また、このアッセイの代替法として、実施例７に示したような方法を用いることも可能である。すなわち、候補タンパク質溶液に段階希釈したペルオキシダーゼを溶解した後、固相へ供し、一定時間吸着させ、ペルオキシダーゼの非特異的吸着を測定する。吸着したペルオキシダーゼの確認法は、上記の方法と同様、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）の発色法が好ましく用いられる。本アッセイにおいても、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示すことがブロッキング能を示す指標となる。また、同様に、あらかじめブロッキングした固相に、希釈ペルオキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を測定しても良い。その場合も、ＢＳＡの値の２．５倍以下の値を示すことがブロッキング能を示す指標となる。ここで用いるペルオキシダーゼ溶液の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌが好ましく用いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用するとより正確な評価に繋がる。ペルオキシダーゼの希釈は、ＰＢＳ（−）で行うことが好ましいが、特に限定されない。
【００４９】
このことから、本発明は一つより多くのドメイン構造を有することが好ましいといえるが、この例のように特に疎水側ドメインについては二つのドメインのうち一つのドメイン構造の一部を欠いても良い。本発明のタンパク質又は部分配列タンパク質のアミノ酸の数としては１００以上、好ましくは１５０以上、さらに好ましくは、１８０以上が好ましい。
【００５０】
さらに、本発明は、上記請求項１の条件に合うタンパク質のアミノ酸配列を改変することにより、タンパク質もしくはその部分配列タンパク質のブロッキング効率を更に向上させた新規なタンパク質である。ここでいう新規とは、アミノ酸改変のレベルで新規ということであり、既に知られているタンパク質であっても良い。また、部分配列の場合、今まで知られていない部分配列を有するものも新規とみなされる。
【００５１】
本発明において、アミノ酸配列の改変は、アミノ酸置換、除去（デリーション）、挿入（インサーション）のいずれか、もしくは、重複して行っても良い。変異の方向性としては、疎水領域の疎水性をさらに向上させるような変異や親水性領域の親水性をさらに向上させるような変異が効果的であり、好適に使用される。また、タンパク質の立体構造を変化させるために、アミノ酸配列の除去や挿入なども効果的であり、親水的な領域に埋もれた疎水領域をタンパク質表面に露出されることなどの方法が考えられる。一方、上記の例で示したように、親水ドメインの構造を壊す方のアミノ酸改変は好ましくないと言える。
【００５２】
改変されるタンパク質は原核生物もしくは真核生物由来のものでも良く、大腸菌などを用いて大量調製することを考えると、原核生物由来のタンパク質が好ましく用いられる。更に好ましくは、大腸菌由来のタンパク質が用いられる。用いられるタンパク質はドメインなどの一部分の構造体でも良く、むしろ好適に使用される。
【００５３】
特に、ブロッキング剤は時に酵素等と混合して安定化剤や賦形剤として用いられることが多く、酵素活性の特別な機能を有さないタンパク質が本発明には適しているといえる。また、酵素活性を有するドメインを除去したタンパク質なども好ましく用いられる。
【００５４】
本発明では、ＨＳＰ７０ファミリータンパク質由来のタンパク質が好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＤｎａＫタンパク質由来のタンパク質が用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰａｓｅドメインを除去したＨＳＰ７０ファミリータンパク質の基質結合ドメインが好ましく用いられ、更に好ましくは大腸菌のＡＴＰａｓｅドメインを除去したＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインが用いられる。ＤｎａＫタンパク質の基質結合ドメインに関しては、既に実施例として上で紹介したものである。
【００５５】
本発明に用いるＨＳＰ７０ファミリーに属するタンパク質としては、特に指定はないが、大腸菌のＤｎａＫ、酵母細胞質に存在する  Ｓｓａ１ｐ、酵母ミトコンドリアに存在する  Ｓｓｃ１ｐ、酵母小胞体に存在するＫａｒ２ｐ、哺乳類細胞質に存在するＨＳＰ７０，哺乳類小胞体に存在する  Ｂｉｐ、哺乳類ミトコンドリアに存在する  ｍＨｓｐ７０  および熱ショックの有無に関わらず恒常的に発現しているＨＳＰ７０のホモログであるＨＳＣ７０などから選択される。ＨＳＰ７０ファミリーには数多くのホモログが知られており、上に挙げたものはそのうちの一部である。当然、上に列挙した以外のホモログにも同様の効果が期待できることは容易に予想可能である。
【００５６】
特に、大腸菌のＤｎａＫは良く研究が進んでいることから、アミノ酸改変などの効果予測が比較的容易であるといえる。このタンパク質は６３８アミノ酸から構成され、１〜３８５番目のアミノ酸より構成される「ＡＴＰａｓｅ（ＡＴＰ結合）ドメイン」と３８６〜６３８番目のアミノ酸より構成される「基質結合ドメイン」からなっている（図６）。配列番号１にＤｎａＫのタンパク質の配列を、また配列番号２に遺伝子配列を示す。ＨＳＰ７０は新生ポリペプチドや部分的にフォールドしたタンパク質に結合し、自発的にフォールディング出来ないタンパク質のリフォールディングを助けることが知られており、また、タンパク質合成の比較的初期に働くためより豊富な基質を認識することが知られている。
【００５７】
また、ＤｎａＫの基質結合ドメイン自体に、変性したタンパク質のリフォールディングを促す作用があることも知られており  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００２）  ９９，  １５３９８−１５４０３）、この分子を用いることにより、様々な用途展開が可能になると考えられる。
【００５８】
今回の本発明を達成するにあたり、我々はこのＤｎａＫの基質結合ドメインに着目し、様々な検討によって、ブロッキング作用発現のメカニズムに関する様々な知見を得ることが出来、本発明に至ることが出来た。
【００５９】
まず我々は、βシート構造部分に変異を加えることでβシート部分の疎水性を向上させ、ブロッキング効率に優れたタンパク質を作り出す試みを行った。その試みは（１）βシートのＮ末端の一部を除去することで、βシートのより疎水的な部分を露出させる（βシート構造を破壊して疎水性を向上させる）、（２）βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する、というものである。その結果、βシート構造のＮ末端部分を除去したＤｎａＫ  ４１９−６０７と、βシート上の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）にブロッキング効率の顕著な向上を認めることができた（図９）。今回特に、ＤｎａＫ  ４１９−６０７に顕著なブロッキング効率の向上を認めることが出来た。このタンパク質は、図８で示したような形でブロッキングを示していると思われる。すなわち、疎水性ドメインの構造が変化したことで、疎水性ドメインの構造が変化し、疎水性ドメインの疎水性が向上したことが、ブロッキング能の向上につながったと考えられる。
【００６０】
本発明でいう、ブロッキング能の向上とは、候補タンパク質にアミノ酸置換、デリーション、挿入などを行い、もととなったタンパク質またはタンパク質部分配列よりもブロッキング能が向上したことを示す。
【００６１】
このブロッキング能の向上は、好ましくは請求項２に示した方法で測定されるのが好ましい。また、ブロッキング能の向上には、長時間のブロッキング能と短時間でのブロッキング能があるが、どちらかもしくは両方においてブロッキング能が向上していれば良い。
【００６２】
ＤｎａＫ  ４１９−６０７での効果が顕著であった理由を更に詳しく考察すると、ＤｎａＫ基質結合ドメインのコの字型の構造のヒンジ部分に隣接するβシート部分を除去したことによりシャペロンの基質としてのペプチドをトラップするための疎水性に富んだコの字構造の内側の一部分が外側へ露出したことに起因していることが推察される。
【００６３】
すなわち、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４７２番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質である。また、本発明は少なくともＮ末端から３８７番目まで、多くとも４１８番目までのアミノ酸配列を除去したことを特徴とするブロッキング効率の向上したＤｎａＫタンパク質である。さらに好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の４１９〜６０７番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００６４】
また、本発明は、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部の親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したことを特徴とするブロッキング効率の向上したタンパク質である。更に詳しくは、ＡＴＰａｓｅドメインもしくはその一部を除去したＤｎａＫタンパク質の一部のアミノ酸配列を除去したタンパク質であって、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したブロッキング効率の向上したタンパク質である。また更に好ましくは、ＤｎａＫタンパク質の３８４〜６０７番目のアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号４７９と４８１のアスパラギン酸をバリンに置換したタンパク質が使用される。
【００６５】
本発明でいう改変されたとは、候補タンパク質のアミノ酸置換、デリーション、挿入などにより、アミノ酸配列が改変されたことを指す。この改変は、候補タンパク質もしくはタンパク質の部分配列を選び出した後、上に示したような考察により、（１）親水ドメインを破壊しないようにする、（２）疎水ドメインを更に疎水性にする、などを意図してアミノ酸を改変することが好ましい。また、本発明では示さなかったが、親水性ドメインを更に親水性にするような方策を当然考えるべきである。
【００６６】
また、本発明においてはブロッキングの速度に関する検討も実施し、本発明の有用性を示した。すなわち、５分、１０分、３０分、３時間ブロッキングした時の、ブロッキング効率を測定した。その結果、今回効果が最も顕著であったＤｎａＫ４１９−６０７は、約５分間のブロッキングでＤｎａＫ３８４−６３８が５８．８％のブロッキング効率であるのに対し、８７．５％の効率でブロッキングが行われていることが判明した。この速度は、３時間後で同等の効果を示すＢＳＡと比べても速く、非常に早い段階でポリスチレンプレートに吸着してブロッキング効果を発揮すると予想される。よって、本発明を用いることで、従来のＢＳＡと同等もしくはそれ以上の性能を有する、新規なブロッキング剤を開発できる可能性が考えられる。
【００６７】
また本発明は、１以上の親水性ドメインと１以上の疎水性ドメインを有するブロッキング用タンパク質であって、疎水性ドメインが器壁に吸着可能であり、親水性ドメインが器壁に吸着した疎水性ドメインを覆うことが可能であるブロッキング用タンパク質である。ここでいうドメインとは好ましくは５０アミノ酸以上からなる構造的なアミノ酸のまとまりであり、一部を欠損、付加などされたものについてもドメインとみなす。
【００６８】
また、本発明は、ブロッキング速度についても規定する。すなわち、ブロッキング速度がＢＳＡよりも向上していることを特徴とする改変されたタンパク質である。また詳しくは、３時間のブロッキングにおいてＢＳＡと同等のブロッキング効率を示すようにタンパク質量を揃えた条件において、１０分未満のブロッキング能がＢＳＡよりも優れることを特徴とする改変されたタンパク質である。ここで改変されたとは、野生型のタンパク質をコードする遺伝子配列が、アミノ酸置換、デリーション、挿入などによって変換されたということを示している。評価方法としては、特に限定されないが、実施例５および実施例７に示した方法が好ましく用いられ、ＩｇＧやペルオキシダーゼのポリスチレンプレートへの非特異的な吸着を指標に測定される。ＩｇＧを用いる評価方法としては、１〜１０分間、好ましくは２〜１０分間ブロッキングを行った後、ＰＢＳ（−）で希釈したヒト血清を添加し、３７℃・６０分間インキュベートした後、洗浄を行い、至適濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体（ペルオキシダーゼ結合）を反応させ、洗浄後、ＴＭＢＺの発色により非特異吸着したＩｇＧ量を測定する。また、ペルオキシダーゼを用いる評価法としては、まず西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼ（東洋紡績（株）製ＰＥＯ−１３１）をブロッキング能を測定したいタンパク質溶液に２ｍｇ／ｍｌになるよう溶解する。次いで、同溶液によりペルオキシダーゼ溶解液の４０〜３２０倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液１００μｌをポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注する。室温で１時間放置した後に溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄する。この洗浄操作を６回繰り返した後、良く洗浄液を取り除く。テトラメチルベンチジンを添加し、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、１Ｎの硫酸を添加し反応停止並びに発色させる。この発色はマイクロプレートリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定する。詳しくは、実施例７に記載する。また、同様に、あらかじめブロッキングした固相に、希釈ペルオキシダーゼ溶液を添加して、その非特異吸着を測定しても良い。ここで用いるペルオキシダーゼ溶液の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍｌが好ましく用いられるが、常識的な範囲で測定できるように、調整して使用するとより正確な評価に繋がる。ペルオキシダーゼの希釈は、ＰＢＳ（−）で行うことが好ましいが、特に限定されない。
【００６９】
また、この実施例においては、０．７ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ４１９−６０７と３時間後に同等のブロッキング能を示すＢＳＡとして２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；シグマ社製（Ｃｏｄｅ：  Ａ−４５０３））を用いた（タンパク質量はブラッドフォード法にて測定）。検体タンパク質の量はブロッキング能を測定する常識的な範囲で用いられればそれで良いが、好ましくは０．５〜１ｍｇの範囲で用いられることが好ましい。また、本測定に用いるＢＳＡの濃度は、検体タンパク質の３時間目のブロッキング効率と同等のブロッキング効率を示す量を用いるが、これはあらかじめ濃度の検討が必要である。それらのタンパク質を溶解するバッファーとしては、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）やＰＢＳ（−）が好ましく用いられるが、特に限定されない。
【００７０】
本発明に用いるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントはタグを有していても良く、実際、検討にはアミノ末端にヒスチジンタグを付加したものを用いて検討を行った。タグとしては、ヒスチジンタグ、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、ＭＢＰ（マルトースバインディングプロテイン）タグ、Ｆｌａｇタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰ（タンデムアフィニティーピュリフィケーション）タグなど、どのタグを採用しても良く、必要に応じて任意のタンパク質を融合して用いても良い。また、既知のタグに任意のアミノ酸配列などを付加しても良い。
【００７１】
さらに当然ではあるが、一般的に知られていないタグや、任意のアミノ酸配列を付加しても良い。具体的には、Ｎ末端側を削ったタンパク質の部分配列を用いるときは、当然、Ｎ末端にメチオニン残基を導入する必要がある。また、発現向上や制限酵素サイトの関係から数アミノ酸の付加なども考えられる。例えば実施例７のＤｎａＫ４１９−６０７ＮのＮ末端には、ＭＲＧＳの４アミノ酸が付加されている。また、当然任意のタンパク質との融合タンパク質として発現させても良い。付加する位置は、Ｎ末端側、Ｃ末端側を問わない。
【００７２】
本タンパク質の発現方法は特に限定されないが、原核生物を用いて発現させる方法が好ましく、さらには、大腸菌を用いて発現させる方法がさらに好ましい。また、発現ベクターに関しても特に限定されず、一般的に発現に使用されるものであればよい。
【００７３】
本発明のタンパク質の精製方法は、上記タグを用いた精製方法以外に、粗精製溶液を適当な温度で加熱して、その遠心上清を精製すると効率よく精製できる場合がある。加熱は好ましくは５０℃以上、更に好ましくは７０℃以上で行われる。今回用いたＤｎａＫの基質結合ドメインも熱への耐性があり、７０℃、３０分間という条件では、凝集が認められず、遠心上清画分にタンパク質が残ることを確認している。よって、精製する場合は、この加熱遠心上清を、カラムクロマトすることなどにより、簡単にタンパク質の精製をすることが出来、非常に経済的である。また、加熱工程を経ることにより、共存している酵素類を失活させる効果も期待できる。
【００７４】
本発明のブロッキング効率の向上したタンパク質は、ブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤、コーティング剤、医療用コーティング剤などへ応用可能である。特に、免疫反応を利用した検出システムでのブロッキング剤としての期待が大きく、ＥＬＩＳＡ、免疫組織染色、ウエスタンブロッティングなどへの使用が可能であると予想される。実際、今回の発明を完成させるにあたり、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）への応用の可能性を調べたところ、実際に良好な結果を得ている（図１２）。
【００７５】
本発明の一実施形態は、ＤｎａＫ４１９−６０７を含有するブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤である。
【００７６】
本発明の一実施形態は、ＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ、Ｄ４８１Ｖ）を含有するブロッキング剤、賦形剤、安定化剤、リフォールディング補助剤である。
【００７７】
以下に、本発明の実施例を例示することによって、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００７８】
実施例１  候補タンパク質のスクリーニング
アミノ酸配列からの候補タンパク質のスクリーニングには、主に核酸・アミノ酸配列解析ソフト：ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社）を用いて行った。このソフトウエアはタンパク質のアミノ酸一次配列から親水性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基の数を算出する機能を有しており便利であった。様々なブロッキング能を示すことの判明しているタンパク質、および大腸菌由来のタンパク質もしくは部分配列のＮ末端側半分とＣ末端側半分の配列に含有される親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸の数をＧＥＮＥＴＹＸにて算出し、親水性アミノ酸含有率、疎水性アミノ酸含有率、親水／疎水率および、二分したそれぞれの親水／疎水率の差の絶対値等をまとめたのが図１３および図１４である。ここでは、ＧＥＮＥＴＹＸの定義に従い、親水性アミノ酸として、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、チロシンとした。また、疎水性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンとした。
【００７９】
実施例２  ＤｎａＫフラグメントのクローニング、発現
ＤｎａＫフラグメントは大腸菌Ｋ−１２株より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いて目的遺伝子断片を増幅し、クローニングした。遺伝子のＰＣＲ増幅には東洋紡製のＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を用いた。具体的にＤｎａＫ  ３８４−６３８の増幅には、５０μｌの反応液中、反応用バッファー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、配列番号３および４に示すプライマーを１５ｐｍｏｌｅ、ポリメーラーゼ１ｕｎｉｔおよび大腸菌ＤＮＡ  １００ｎｇとなるように調製し、９４℃・２分間の後、９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・１分のサイクルを２５回行った。また同様に、ＤｎａＫ  ３８６−５８６の増幅には配列番号３および４に示したプライマーを用いて増幅を行った。増幅したＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩにて消化し、ｐＱＥ３０のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトへクローニングした（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−によって増幅されたＤＮＡ断片は平滑化されているため、増幅断片の下流側についてはそのまま使用した）。クローニングした遺伝子の配列はシーケンス解析により確認した。このベクターにクローニングすることにより目的タンパク質のＮ末端に６×Ｈｉｓ配列（ヒスチジンタグ）を付加することができる。このようにして、発現プラスミドｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６３８を作製した。
【００８０】
タンパク質の発現・精製は、遺伝子を導入したＪＭ１０９をＬＢ培地にて１６時間振とう培養し、菌体を遠心分離法により回収し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  へ懸濁、超音波破砕を行った後、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間微量高速遠心機を用いて遠心して得られた上清を用いて行った。具体的には、ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＣ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ  （ＳＩＧＭＡ社製）を用いて、精製し、最終的に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）  に対して一晩透析し、実験に用いた。タンパク質濃度の測定は、ＢＳＡをスタンダードとしたブラッドフォード法を用いて行った（ＢＩＯＲＡＤ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット；  ５００−０００６）。
【００８１】
実施例３  Ｃ末端除去ＤｎａＫクローンおよびポイントミュータントの作製
Ｃ末端除去ＤｎａＫクローンの作製は、実施例２で作製したｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６３８を鋳型として用いＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて任意の場所にストップコドンを導入することにより作製した。実際にはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、その取り扱い説明書に従って実施した。それぞれの作製クローンとそれに使用したプライマー配列の組み合わせを以下に示す。ＤｎａＫ  ３８４−６０７：配列番号５と６、ＤｎａＫ３８４−５７８：配列番号７と８、ＤｎａＫ３８４−５６１：配列番号９と１０。また、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）はｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６０７を鋳型として用い、配列番号１１と１２を用いて変異導入を実施した。それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列を確認した後、実施例２に記載の方法に従って、タンパク質を調製した。
【００８２】
実施例４  Ｎ末端除去ＤｎａＫクローンの作製
実施例２で作成した、ｐＱＥ−ＤｎａＫ３８４−６０７を鋳型として次に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、実施例２に方法に従って、ｐＱＥ３０ベクターのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩサイトに導入した。作製したクローンと用いたプライマーのセットは以下のとおりである。ＤｎａＫ  ５０８−６０７：配列番号１３と２、ＤｎａＫ  ５２５−６０７：配列番号１４と２、ＤｎａＫ  ４１９−６０７：配列番号１５と２。それぞれ作製した変異体はシーケンス解析により配列を確認した後、実施例２に記載の方法に従って、タンパク質を調製した。
【００８３】
実施例５  ブロッキング効果
ブロッキング効率は以下の方法を用いて測定した。
ポリスチレンプレートへのヒト血清ＩｇＧの非特異吸着を指標として検討を実施した。
【００８４】
方法としては、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に希釈したＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）および各種変異体ＤｎａＫサンプル  １００μｌをポリスチレン製９６ウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製；  Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ  ８Ｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐ）に添加し、４℃にて４時間静置した（基本的には４時間静置したが、ブロッキング時間を検討する場合は任意の時間を設定した）。その後、プレートから溶液を除去した後、正常人血清をＰＢＳ（−）にて５０倍希釈し、５０μｌを添加、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、各ウェルを２００μｌの洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて４回洗浄し、至適濃度に抗体希釈液（０．０１Ｍ  ＰＢ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  カゼイン）で希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）５０μｌを各ウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、各ウェルを２００μｌの洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて４回洗浄し、発色試薬（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））を１００μｌ添加、室温で５分間発色させた後、１Ｎ硫酸５０μｌを加え反応を停止させた。発色は、ＥＬＩＳＡリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定した。タンパク質の定量にはブラッドフォード法を用いた。
【００８５】
まず、０．７ｍｇ／ｍｌ  に調製したＢＳＡ、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７について、４時間でのブロッキング効率を測定したところ、図５に示すように、ＢＳＡ、ＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＤｎａＫ  ３８４−６０７以外のものについては、ブロッキング効果が低い結果であった。ブロッキング効果が低かったクローンは、ＤｎａＫ  ３８４−６０７、ＤｎａＫ  ３８４−５７８については、αへリックスを削ったクローン、ＤｎａＫ  ５０８−６０７、ＤｎａＫ  ５２５−６０７はβシートを削ったクローンであり、ＤｎａＫの基質結合ドメインを用いるブロッキングにはαへリックス構造とβシート構造の両方が必要であることが推察された。
【００８６】
次に、βシート部分の疎水性を向上させる目的で作製した、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）とＤｎａＫ  ４１９−６０７（それぞれ０．７ｍｇ／ｍｌ）と同濃度のＢＳＡとＤｎａＫ  ３８４−６０７をコントロールとして、ブロッキング４時間でのブロッキング効果を比較した。その結果、ＤｎａＫ  ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）、ＤｎａＫ  ４１９−６０７ともに、同濃度のＢＳＡよりもブロッキング効率が高く、特にＤｎａＫ  ４１９−６０７で顕著であった（図９）。
【００８７】
更に、上記実験で最も効果の高かったＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＢＳＡについて、ブロッキング濃度とブロッキング４時間目でのブロッキング効果について調べた。その結果、０．１５ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ  ４１９−６０７は１２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡよりもブロッキング効果が顕著であり、非常に低濃度でブロッキング剤として使用可能であることが示唆された（図１０）。
【００８８】
最後に、更に、上記実験で最も効果の高かったＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８、ＢＳＡについて、ブロッキング時間とブロッキング効果について検討を行った。タンパク質濃度は、ＤｎａＫ  ４１９−６０７とＤｎａＫ  ３８４−６３８については０．７ｍｇ／ｍｌとし、ＢＳＡは上記検討で０．７ｍｇ／ｍｌのＤｎａＫ  ４１９−６０７と同等のブロッキング効果を示した２．４ｍｇ／ｍｌで用いた。その結果、ＤｎａＫ  ４１９−６０７のブロッキングに要する時間が飛躍的に短く約１０分程度で十分効果的なブロッキング効果が得られ、３時間後に同等の効果の見られた２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡより早くブロッキング効果を示すことが分かった（図１１）。
【００８９】
実施例６  ブロッキング効果（ＥＬＩＳＡ）
ヒト癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｉｏｎｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：  ｈＣＥＡ）のＥＬＩＳＡシステムを用いてＤｎａＫフラグメントのブロッキング剤としての有用性を検討した。まず、抗ｈＣＥＡ  ＭｏＡｂを５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈後、１００  μｌづつポリスチレン製９６ウェルイムノプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製；  Ｅ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ  ８Ｗｅｌｌ  Ｓｔｒｉｐ）へ添加後、３７℃・１時間静置した。静置後、洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）１５０μｌにて３回ウェルを洗浄した後、ブロック液を２００μｌづつ添加し、４℃・４時間静置した。ブロック液としては、一般的に使用される２．４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０））、および同様の緩衝液に溶解したＤｎａＫ  ４１９−６０７を用い、ブランクは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０で行った。ブロック液廃棄後、０、２．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌに希釈したｈＣＥＡ溶液（イムノフローラ：東洋紡製）を５０μｌづつ添加し、３７℃にて１時間インキュベート後、１５０μｌの洗浄液にて４回洗浄実施した。その後、至適濃度に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ｈＣＥＡ抗体（イムノフローラ：東洋紡製）を添加、３７℃・１ｈ反応後、さらに洗浄液（ＰＢＳ（−），  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）１５０μｌにて３回ウェルを洗浄した。次に、基質溶液（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ：  ３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ））  １００μｌを添加し、遮光して３７℃、２０分間発色させた。最後に、反応停止液（１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４）  １００μｌを添加し、黄色の発色を４５０ｎｍ／６５０ｎｍで測定した。
【００９０】
その結果、ブランクでは測定の直線性が失われているのに対し、ＤｎａＫ  ４１９−６０７はＢＳＡ同様に直線性の良い結果が得られ、本発明のＤｎａＫ  ４１９−６０７が免疫学的測定にも十分適用し得ることが示された（図１２）。
【００９１】
実施例７  ヒスチジンタグなし（ｎａｔｉｖｅ）のＤｎａＫフラグメントのブロッキング効果の比較
実施例２〜４で構築したＤｎａＫフラグメントはいずれも発現ベクターｐＱＥ３０に由来するヒスチジンタグをＮ末端に有している事より、ＤｎａＫフラグメントの等電点が中性ｐＨへシフトしている。そのため、本来の静電相互作用によるブロッキング能も維持できるようヒスチジンタグを削除したＤｎａＫフラグメントを構築した。
【００９２】
ヒスチジンタグ除去ＤｎａＫクローンの作製は、実施例４で作製したｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７を鋳型として用いＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて開始コドンの後ろからヒスチジンタグを含むＤｎａＫ領域までのアミノ酸を削除して作製した。実際にはＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、ヒスチジンタグの上流にＢａｍＨＩサイトを導入した。操作は、その取り扱い説明書に従って実施した。その際の使用したプライマー配列を配列番号１６、１７に示す。実施例２にも示したが、クローニングした遺伝子の上流側にもＢａｍＨＩサイトを設けてある。よって、ＢａｍＨＩで得られたベクターを消化し、再結合することにより、ヒスチジンタグ配列を除去したクローンを得ることができる。
【００９３】
この発現ベクターはｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎと命名した。またｎａｔｉｖｅなＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントの調製は、このｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎにて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した形質転換体を培養して取得した。
【００９４】
すなわち、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＱＥ−ＤｎａＫ４１９−６０７Ｎ）を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むトレフィックブロス（１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、１７ｍＭリン酸１カリウム、７２ｍＭリン酸２カリウム）に植菌し３２℃で２０時間しんとう培養した。本培養液１Ｌ分の菌体を遠心分離により集菌し、２００ｍｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液，ｐＨ９．０に懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。本破砕液に終濃度０．１％になるようポリエチレンイミンを添加後６０℃で２時間加温し、遠心分離により上清を回収した。次いで５０％飽和度の硫安を添加し、遠心分離により沈殿物を回収後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で再溶解した。更に、６４℃で１４時間加温処理し遠心分離により上清を回収した。この粗酵素液をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲルろ過クロマトグラフィーに供し、次いで５０％飽和度の硫安を添加して沈殿を回収後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で再溶解した。同緩衝液で緩衝化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲルろ過クロマトグラフィーで脱塩した。次にこのＤｎａＫフラグメントを２０％飽和度硫安を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ９．０で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムクロマトグラフィーに供し２０％〜０％飽和度硫安のリニアグラジェントによる溶出を行い、精製ＤｎａＫフラグメント画分を取得した。本精製フラグメント画分を限外ろ過膜で濃縮した後、蒸留水により脱塩して最終精製ＤｎａＫフラグメントを取得した。
【００９５】
ＢＳＡとｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントのブロッキング効率の比較は以下の方法により測定した。
【００９６】
まず西洋ワサビ由来の標識用ペルオキシダーゼ（東洋紡績（株）製ＰＥＯ−１３１）をＢＳＡまたはｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントを含むＰＢＳ緩衝液に２ｍｇ／ｍｌになるよう溶解した。その際、市販品ＢＳＡ（フラクションＶ）は２または１０ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．１または０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した。次いで、同溶液によりペルオキシダーゼ溶解液の４０〜３２０倍まで希釈系列を作成し、それぞれの希釈液１００μｌをポリスチレン製９６穴マイクロプレートに分注した。室温で１時間放置した後に溶液を除去し、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液２００μｌで洗浄した。この洗浄操作を６回繰り返した後、良く洗浄液を取り除いた。次いで、１００μｌのテトラメチルベンチジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を添加し、３７℃で正確に１０分間インキュベートした後、１Ｎの硫酸１００μｌを添加し反応停止並びに発色させた。この発色はマイクロプレートリーダーにて主波長４５０ｎｍ、副波長６５０ｎｍにて測定した。
【００９７】
その結果を図１５〜図１７に示したが、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントはＢＳＡの１／２０の濃度でＢＳＡと同等の非特異発色抑制を示した事より、ＢＳＡの約２０倍のブロッキング能を示す事が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、アミノ酸配列情報を元にブロッキング能を有する新規タンパク質または部分配列タンパク質を簡便にスクリーニングできるようになり、また、大腸菌で大量発現可能なブロッキング効率の向上したタンパク質の生産が可能となった。本発明によって得られたタンパク質はブロッキング能が高く、従来法に比べ、簡便かつ確実な結果が得られる。本発明は、免疫的測定を応用する臨床診断や、医療などの分野に大きな寄与を与える。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、ブロッキング効率測定の概念を示す図である。
【図２】図２は、タンパク質の２分割法を示す図である。
【図３】図３は、ブロッキング能を示すタンパク質のブロッキング機構を示す図である。
【図４】図４は、ＤｎａＫ  ３８４−６０７の立体構造を示す図である。βシート部分がＮ末端、αへリックス部分がＣ末端に相当する。
【図５】図５は、種々のＤｎａＫ変異体の示すブロッキング効率を示す図である。図５において、    Ｂｌａｎｋ：  ブロッキングなし    ３８４−６３８：  ＤｎａＫ３８４−６３８    ３８４−６０７：  ＤｎａＫ３８４−６０７    ３８４−５７８：  ＤｎａＫ３８４−５７８；  αへリックスの一部の構造が除去された変異体    ３８４−５６１：  ＤｎａＫ３８４−５６１；  αへリックスの約半分の構造が除去された変異体    ５０８−６０７：  ＤｎａＫ５０８−６０７；  βシート部分が除去された変異体（αへリックスからなる）    ５２５−６０７：  ＤｎａＫ５２５−６０７；  βシート部分とαへリックスの一部が除去された変異体（αへリックスからなる）    ＢＳＡ：  ＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎＶ
【図６】図６は、大腸菌ＤｎａＫタンパク質の構造、および作成した変異体の構造を示す図である。
【図７】図７は、ＤｎａＫ  ３８１−５５３の立体構造を示す図である。
【図８】図８は、疎水ドメインを改変したタンパク質のブロッキング機構を示す図である。
【図９】図９は、種々のＤｎａＫ変異体の示すブロッキング効率を示す図である。    ３８４−６０７：  ＤｎａＫ３８４−６０７    ３８４−６０７（ＶＡＶ）：  ＤｎａＫ３８４−６０７（Ｄ４７９Ｖ，  Ｄ４８１Ｖ）    ４１９−６０７：ＤｎａＫ４１９−６０７    ＢＳＡ：  ＢＳＡ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ    Ｂｌａｎｋ：  ブロッキングなし
【図１０】図１０は、ＤｎａＫ変異体濃度とブロッキング効果の相関を示す図である。
【図１１】図１１は、ＤｎａＫ変異体のブロッキング速度を示す図である。
【図１２】図１２は、ＤｎａＫ変異体のＥＬＩＳＡのブロッキングへの応用を示す図である。
【図１３】図１３は、ブロッキングに頻繁に使用されるタンパク質と疎水性の高いタンパク質の親水性、疎水性アミノ酸の含有率を示す。
【図１４】図１４は、ＢＳＡ、αカゼイン、リパーゼ、ＤｎａＫ３８４−６０７のＮ末端側とＣ末端側の含有アミノ酸の特徴を示す。│Δ│はＮ末端側とＣ末端側の親水／疎水率の差の絶対値を示す。
【図１５】図１５は、ヒスチジンタグなし（ｎａｔｉｖｅ）のＤｎａＫフラグメントのブロッキング効果の比較を示す。ＢＳＡ（フラクションＶ）は１０ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整して、これを高濃度における比較として示す。また、ＢＳＡ（フラクションＶ）は２ｍｇ／ｍｌ、ｎａｔｉｖｅ  ＤｎａＫ４１９−６０７フラグメントは０．１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整して、これを低濃度における比較として示す。
【図１６】図１６は、図１５の高濃度におけるデータを図示したものである。
【図１７】図１７は、図１５の低濃度におけるデータを図示したものである。
【国際調査報告】
2005003155.tif 000029
2005003155.tif 000030
2005003155.tif 000031
2005003155.tif 000032
2005003155.tif 000033
2005003155.tif 000034