(57)【要約】分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護する方法。
【請求項２】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質どうしのチオール基を介した重合反応を抑制する方法。
【請求項３】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質の修飾を抑制する方法。
【請求項４】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質のチオール基とタンパク質の分子内又は分子間で形成されたジスルフィド結合との交換反応を抑制する方法。
【請求項５】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、シスチン、ホモシスチン、リポ酸又は酸化型グルタチオンを添加することを特徴とする請求の範囲１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、シスチンを添加することを特徴とする請求の範囲１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物と、同時に又は別々に、分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加することを特徴とする遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護する方法。
【請求項８】
分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、システイン、ホモシステイン、グルタチオン又はジヒドロリポ酸を添加して処理することを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。
【請求項９】
分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、システインを添加して処理することを特徴とする請求の範囲７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質が組換え体タンパク質であることを特徴とする請求の範囲１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質が抗体であることを特徴とする請求の範囲１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
抗体がＦ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求の範囲１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
モノクローナル抗体が可変領域にチオール基を有することを特徴とする請求の範囲１３に記載の方法。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が可変領域に遊離のシステインを有することを特徴とする請求の範囲１３又は１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
モノクローナル抗体が重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む請求の範囲１３から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む請求の範囲１３から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質が無血清培地で培養された細胞を使用して生産されたものであることを特徴とする請求の範囲１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
請求の範囲１８に記載の方法により得られるタンパク質。
【請求項２０】
請求の範囲１９に記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
【請求項２１】
抗腫瘍剤であることを特徴とする請求の範囲２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することによる、効率的で効果的なタンパク質の生成方法に関する発明である。より具体的には、該方法により得られるタンパク質を含有する有用な医薬に関するものである。
【背景技術】  タンパク質に遊離のシステイン残基が存在すると、遊離のシステイン残基のチオール基を介して分子間でジスルフィド結合が形成され、タンパク質どうしの重合が起こることが知られている。また、遊離のシステイン残基のチオール基は、分子内または分子間で形成されたジスルフィド結合と交換反応を起こし易く、更に、遊離のシステイン残基は何らかの修飾を受け易いことも知られている。
これらの重合、修飾又は交換は、タンパク質の好ましい高次構造の形成を妨げたり、タンパク質の活性部位に変化を生じさせるため、タンパク質の活性が低下する原因となりうる。
遊離のシステイン残基による上述のような反応は、タンパク質の精製時や保存時に起こることが多い。従来、このような反応を防ぐために、タンパク質溶液のｐＨを酸性側に保ったり、システイン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アスコルビン酸のような酸化防止剤を添加する方法が行われてきた（東京化学同人  生化学辞典  第３版  ｐ１８２ｂ）。
しかし、タンパク質溶液のｐＨを酸性側に保つためには、タンパク質の精製に用いる溶媒や緩衝液が限定されることとなり、この限定により精製効率の低下を招くことが考えられる。また、精製時や保存時に酸化防止剤を溶媒や緩衝液に添加しても十分な反応抑制効果が得られなかったり、酸化防止剤を除いた後には、重合を抑制できないなどの問題がある。
そこで、システイン残基のチオール基を何らかの化合物で修飾して保護する方法が考えられる。タンパク質のシステイン残基のチオール基を修飾する試薬としては、１）５’，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２’（４，４’）−ジピリジルジスルフィド、四チオン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、酸化型グルタチオンなどの酸化剤、２）ｐ−メルクリ安息香酸（ＰＭＢ）、ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸（ＰＭＢＳ）などのメルカプチド形成剤、３）ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）などのアルキル化剤が挙げられる（東京化学同人  生化学辞典  第３版ｐ１８２ｂ）。しかしこれらは、活性にチオール基を必須とするＳＨ酵素などのチオール基を修飾することを目的として用いられるため、このような試薬をタンパク質の活性に関与していない遊離のチオール基の保護という目的で用いると、逆に、タンパク質の高次構造形成を妨げる結果となり、タンパク質の活性に影響を及ぼしてしまうことが多い。一方、タンパク質の活性には影響を及ぼさないが、タンパク質を医薬品として使用する際に、残存した試薬を徹底的に除去しなければならない等の問題を生じることもある。従って、タンパク質の遊離のチオール基を保護するという目的で試薬を用いる際には、可能な限り、医薬品添加物として使用可能なものを用いることが望ましい。
また、医薬品用途に用いる蛋白質を生産する際には、血清を使用しない無血清培養を用いることが望ましいが、動物細胞培養の際に血清を使用しないと、細胞の機能維持に必要とされる成分の補給が十分に行えず、十分な有用蛋白質を確保できない場合が多く、生産される蛋白質が目的蛋白質と物理的、生化学的、生物学的に微妙に変化している場合があり、例えば、重合体が生成され易いなどの問題点がある。
【非特許文献１】東京化学同人  生化学辞典  第３版  ｐ１８２ｂ
【発明の開示】
本発明の課題は、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することによる、効率的で効果的なタンパク質の生成方法の確立と、該タンパク質を含む薬剤を提供することにある。
そこで本発明者らは、鋭意、遊離のシステイン残基の保護剤についての検討、反応条件についての検討を重ね、反応生成物の解析を詳細に行い、かかる問題点を解決することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護する方法。
（２）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質どうしのチオール基を介した重合反応を抑制する方法。
（３）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質の修飾を抑制する方法。
（４）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加して、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することにより、タンパク質のチオール基とタンパク質の分子内又は分子間で形成されたジスルフィド結合との交換反応を抑制する方法。
（５）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、シスチン、ホモシスチン、リポ酸又は酸化型グルタチオンを添加することを特徴とする上記１から４のいずれかに記載の方法。
（６）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、シスチンを添加することを特徴とする上記１から５のいずれかに記載の方法。
（７）分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物と、同時に又は別々に、分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加することを特徴とする遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護する方法。
（８）分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、システイン、ホモシステイン、グルタチオン又はジヒドロリポ酸を添加して処理することを特徴とする上記７に記載の方法。
（９）分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物として、システインを添加して処理することを特徴とする上記７又は８に記載の方法。
（１０）タンパク質が組換え体タンパク質であることを特徴とする上記１から９のいずれかに記載の方法。
（１１）タンパク質が抗体であることを特徴とする上記１から９のいずれかに記載の方法。
（１２）抗体がＦ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする上記１１に記載の方法。
（１３）抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする上記１１又は１２に記載の方法。
（１４）モノクローナル抗体が可変領域にチオール基を有することを特徴とする上記１３に記載の方法。
（１５）モノクローナル抗体が可変領域に遊離のシステインを有することを特徴とする上記１３又は１４のいずれかに記載の方法。
（１６）モノクローナル抗体が重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む上記１３から１５のいずれかに記載の方法。
（１７）モノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む上記１３から１６のいずれかに記載の方法。
（１８）タンパク質が無血清培地で培養された細胞を使用して生産されたものであることを特徴とする上記１から１７のいずれかに記載の方法。
（１９）上記１８に記載の方法により得られるタンパク質。
（２０）上記１９に記載のタンパク質を含有する医薬組成物。
（２１）抗腫瘍剤であることを特徴とする上記２０に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】第１図は、無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制効果とｐＨの影響について示す図である。
第２図は、無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制効果と反応温度の影響について示す図である。
第３図は、無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制効果とシスチン濃度の影響について示す図である。
第４図は、ＧＡＨホール抗体の活性化前の陽イオン交換クロマトグラムについて示す図である。
第５図は、精製ＧＡＨホール抗体の活性化後の陽イオン交換クロマトグラムについて示す図である。
第６図は、精製ＧＡＨホール抗体の重合抑制処理後の陽イオン交換クロマトグラムについて示す図である。
第７図は、精製ＧＡＨホール抗体の重合抑制処理後脱塩・濃縮した精製ＧＡＨホール抗体の陽イオン交換クロマトグラムについて示す図である。
第８図は、精製Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の陽イオン交換クロマトグラムについて示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において分子内にジスルフィド結合を有し、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物としては、シスチン、ホモシスチン、リポ酸、酸化型グルタチオン又はグルタチオンジスルフィドが挙げられ、好ましくはシスチンが挙げられる。また、本発明において、分子内にチオール基を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を、同時に又は別々に添加する方法も挙げられる。
本発明において分子内にチオール基を有しタンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物としては、システイン、ホモシステイン、グルタチオン又はジヒドロリポ酸が挙げられ、システインが特に好ましい。
本発明において、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさないとは、タンパク質の活性を上昇又は低下させないことである。例えば、タンパク質が抗体の場合、抗原抗体反応の反応性が上昇又は低下しないことが挙げられる。
本発明においてタンパク質とは、その分子構造内に遊離のシステイン残基を有していることが特徴である。ここで遊離とは、システイン残基が不対電子を有し、不安定で、反応性に富んだ状態を指す。さらに、該システイン残基のチオール基が反応性に富むことがより好ましい。
本発明においてチオール基とは、タンパク質の活性に直接的又は間接的に関与している場合が挙げられ、直接的に関与していることがより好ましい。ここで、タンパク質の活性とは、例えば抗原抗体反応における反応性、酵素反応における反応性が挙げられる。直接的に関与している例としては、該チオール基を修飾試薬などで修飾するとタンパク質の活性の低下を招く場合が挙げられる。一方、間接的に関与している例としては、該チオール基の修飾により高次構造の形成が妨げられることによりタンパク質の活性が低下する場合が挙げられる。
本発明において保護とは、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼす重合、修飾又は交換を抑制することが挙げられ、より具体的には、タンパク質どうしのチオール基を介したジスルフィド結合の形成による重合の生成抑制、遊離のシステイン残基の修飾の抑制、又は遊離のシステイン残基のチオール基による分子内若しくは分子間で形成されたジスルフィド結合との交換反応の抑制が挙げられ、タンパク質どうしのチオール基を介したジスルフィド結合の形成による重合の生成抑制がより好ましい。この場合において、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基にシスチンのようなジスルフィド結合を有する化合物が反応し、次式のようにチオール−ジスルフィド交換反応が起こる。
Ｐｒ−ＳＨ＋Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ→Ｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ＋Ｒ−ＳＨ    式（Ｉ）
（Ｐｒはタンパク質を示す。Ｒは官能基以外の残基を示す。）
従って、反応により生成するＰｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒは、Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒを除去した後でも安定的に存在し、タンパク質どうしの重合などＰｒ−ＳＨを介した反応は抑制される。
また、このような方法においては、タンパク質生産時のいずれの段階で分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物を添加しても良い。例えば、後述の実施例で示したＧＡＨ抗体で行う場合には、Ｆ（ａｂ’）２化された最終精製品（実施例１から３）やホール抗体の活性化直後（実施例４から６）にシスチンを添加する方法が挙げられる。
本発明の方法に溶媒が用いられる。その溶媒は特に限定されるものではないが、タンパク質のシステイン残基のチオール基とシスチンのジスルフィドの交換が起こる液が好ましい。具体的には、弱酸性〜アルカリ性の緩衝液、好ましくは、中性から弱アルカリ性の緩衝液が適当である。
添加する分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物の濃度は特に限定されるものではないが、シスチンを例として挙げると、タンパク質のシステイン残基のチオール基とシスチンのジスルフィドの交換が起こるシスチン濃度が好ましい。具体的には、０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭが適当である。
タンパク質濃度は特に限定されるものではないが、タンパク質のシステイン残基のチオール基と分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物のジスルフィドの交換が起こる濃度が好ましい。具体的には、０．０１〜１０００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍＬが適当である。
反応温度は特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質のシステイン残基のチオール基と分子内にジスルフィド結合を有し、かつ、タンパク質の活性に実質的な影響を及ぼさない化合物であるシスチンのジスルフィドの交換が起こる温度が好ましい。具体的には、−２０〜６０℃、好ましくは０℃〜５０℃が適当である。
また、このような方法においては、タンパク質とともにシステインのようなチオール基を有する化合物が存在しても、過剰のシスチンを添加することで式（Ｉ）の反応は起こる。例えば、ＷＯ０３／０４８３５７公報で示されているように無血清培地にて生産されたタンパク質は、タンパク質産生細胞の機能維持に必要とされる成分の補給が十分に行えず、十分な活性を有するタンパク質を確保できない場合がある。このような場合には、システイン等にてタンパク質の活性化処理をする場合があるが、後述の実施例で示したようにＧＡＨ抗体の重合抑制を、システインによるホール抗体の活性化の直後に行うこともできる（実施例４）。
本発明において重合とは、チオール基を介してタンパク質が分子間ジスルフィド結合を形成することによる、タンパク質の高次構造変化、タンパク質の活性の変化、２量体、３量体などの生成が挙げられる。好ましくはタンパク質の活性の変化、２量体、３量体の生成が挙げられ、より好ましくは２量体、３量体の生成が挙げられる。
本発明において修飾とは、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基に活性に実質的な影響を及ぼすような化合物が結合することによる、タンパク質の高次構造変化、タンパク質の活性の変化などが挙げられる。好ましくはタンパク質の活性の変化が挙げられる。
本発明において交換とは、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基とタンパク質の分子内又は分子間で形成されたチオール−ジスルフィド結合が形成することによる、タンパク質の高次構造変化、タンパク質の活性の変化などが挙げられる。好ましくはタンパク質の活性の変化が挙げられる。
本発明において組換え体タンパク質とは、抗体、酵素、増殖因子、サイトカインなどが挙げられ、より好ましくは抗体が挙げられる。
本発明において抗体とは、ホール抗体（全長抗体、抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体））又は抗体誘導体が挙げられ、より好ましくはＦ（ａｂ’）２化抗体が挙げられる。
本発明においてモノクローナル抗体とは、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列番号１、２及び３ならびに配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。超可変領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、抗原との結合活性（反応性）を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明において使用できるモノクローナル抗体に含まれる。
より具体的には、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、すなわちＧＡＨ抗体が挙げられる。ＧＡＨ抗体とは、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされた癌に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体であり（ＥＰ５２６７００号公開公報又はＥＰ５２０４９９号公開公報）、この抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができるし、遺伝子工学的な手法により作製することもできる（ＥＰ５２０４９９号公開公報）。
かかるＧＡＨ抗体においては公知のヒトアミノ酸配列におけるシステインの位置と比較して、配列表の配列番号７における３２番目のシステインに特徴がある。即ち、これは分子内でのジスルフィド結合形成には関与しない遊離のシステインと推定される。該システイン残基は配列表の配列番号１に示した配列中の４番目に相当し、重鎖の超可変領域に位置することから抗原との結合に関与していると考えられる。
本発明において無血清培地とは、培地成分中に牛（胎児）血清などの血清を含まない培地が挙げられる。一例として、本実施例に記載のような無血清培地ＣＤＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）などが挙げられる。
本発明は、前述の抗体をはじめ、本発明の方法で得られた蛋白質を有効成分として含有する医薬、例えば上記物質と薬学的に許容しうる担体とからなる医薬組成物を提供し、種々の形態の治療用製剤を提供する。薬学的に許容しうるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などがおきないことを意味する。さらに、本発明の蛋白質に例えば毒素等の物質を結合させた抗体も医薬品として使用可能である。例えば、ドキソルビシン等の抗腫瘍剤等の薬剤を封入したリポソーム等に抗体等の蛋白質を結合させたものを挙げることもできる（ＥＰ５２６７００号公開公報、ＥＰ５２０４９９号公開公報及びＥＰ１１７４１２６号公開公報）。抗体が結合した腫瘍性物質含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法（ＷＯ８８０６４４１号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９９３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等により製剤化することができ、血管内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例には限定されない。
製造例１  無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体
（１）無血清培養によるＧＡＨ抗体のホール抗体（以下、ＧＡＨホール抗体と称する）の培地中への生産
無血清培地ＣＤ  ＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）１Ｌにそれぞれ４ｍｍｏｌのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍｇのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍボトルトップフィルター（コーニング・コースター社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調製した。調製した細胞培地を予め高圧蒸気滅菌器（サクラ精機社）で滅菌しておいた１Ｌスピンナーフラスコ（Ｂｅｌｃｏ社）に無菌的に仕込み培養制御装置（バイオット社）に設置し、温度３７℃、溶存酸素濃度３．０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．４、攪拌回転数６０ｒｐｍに調製を行った。
予めローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ社）で培養しておいた遺伝子組換ＧＡＨ抗体産生ＣＨＯ細胞１−６Ｒ（ＥＰ５２０４９９号公開公報実施例参照）にトリプシンを作用させ細胞を剥離し、遠心後上清を廃棄し、それぞれの無血清培地で細胞を２回洗浄して、種細胞とした。その後、それぞれの無血清培地に懸濁し、無菌的に１Ｌスピンナーフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。播種後、サンプリングを行い血球計数盤で生細胞密度、生存率を測定したところ、それぞれＣＤ  ＣＨＯ：１．０９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ８２．３％、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ：０．８７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ８４．１％であった。
播種後３５３ｈｒで培養を終了し、培養液を回収した。培養液は、遠心（３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）後０．２２μｍボトルトップフィルターでろ過し、約８００ｍｌの未精製バルクを得た。
（２）無血清培養により得られた未精製バルクからのＧＡＨホール抗体の精製
（１）で得られた未精製バルクそれぞれ約８００ｍｌをそれぞれ２回に分け、ＸＫ１６カラム（ｉ．ｄ．１６ｍｍ、アマシャム・バイオサイエンス社製）にＰｒｏｓｅｐ−Ａ樹脂（ミリポア社製）を１４．３ｍｌ充填したカラムクロマトで精製を行った。流速は、１４．３ｍｌ／ｍｉｎで実施し、アプライ、洗浄はｄｏｗｎｆｌｏｗ、溶出、再生はｕｐｆｌｏｗで未精製バルク及び緩衝液をカラムに供給した。洗浄、溶出、再生の緩衝液組成は、４０ｍＭ  ＮａＣｌを含む４０ｍＭ酢酸緩衝溶液でありｐＨはそれぞれ６．０、４．０、２．７である。
ＣＤ  ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの未精製バルクより、それぞれ４７．２ｍｌ、５０．８ｍｌのホール抗体含有液（ｐＨ４．０）を得た。この溶液の抗体含有量は、紫外吸光度法で測定を行ったところそれぞれ５７ｍｇ、４８ｍｇであった。
（３）ＧＡＨホール抗体の活性化処理
活性化処理方法については、ＷＯ０３／０４８３５７公報を参考とすることが出来る。
（２）により取得した、ＣＤ  ＣＨＯ培地及びＥＸＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地それぞれを用いたＧＡＨホール抗体溶液各々２０ｍｇをセントリコン３０（アミコン社）を用いて約１．７ｍＬに濃縮した。この液２５０μＬ（３ｍｇ相当）に最終１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＬ−システイン、１２ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約１０ｍｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。セントリコン３０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。
（４）活性化処理後のホール抗体のペプシン消化によるＦ（ａｂ’）２化及び精製
（３）で得られた活性化処理済試料を、ｐＨを４．０に調整後、ペプシン消化を行った。すなわちペプシン（ＳＩＧＭＡ社）を１．２ｍｇ／ｇ−ＧＡＨとなる様に加えて、マイレクスフィルター（ミリポア社、０．２２μｍ）で無菌濾過し、３７℃で加温しながら穏やかに１７時間攪拌を行った。
ペプシン消化後、陽イオン交換カラムクロマト法を用いてＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体を精製した。すなわち、ＸＫ１６カラムに陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャム・バイオサイエンス社）を１５．３ｍｌ充填し、ペプシン消化後の抗体含有液を供した。その後、２０ｍＭ  ＮａＣｌ含有４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄を行い、塩濃度を徐々に高めながら、抗体のピークを分取した。流速は、１．５８ｍｌ／ｍｉｎである。ＣＤ  ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの試料の体積はそれぞれ１０．５ｍｌ、１１．６ｍｌであった。
実施例１  無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制（反応ｐＨの影響）
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて、製造例１に従い得られた活性化処理後のＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体について、重合抑制を試みた。
濃度約５ｍｇ／ｍＬになるように調製したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体溶液に最終濃度で１ｍＭになるようにシスチン溶液を加えた。このとき、シスチン溶液は０．５Ｎ塩酸にシスチンを４０ｍＭになるように溶解したものを使用した。
この溶液を２つに分け、一方には４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、一方には何も加えず（最終ｐＨ４．７）、それぞれをシスチン添加ｐＨ７．５処理溶液及びシスチン添加ｐＨ４．７処理溶液とした。
これらのシスチン添加溶液及びシスチン無添加溶液を３７℃で３時間放置し、その後、分子量分画３０Ｋカットの限外ろ過膜を用いて、シスチンを除去し、溶媒を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）に置換した。この時点をイニシャルとして、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。次に、これらの溶液に４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、３７℃で４５分間放置し、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ条件）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：２１５ｎｍ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（内径約８ｍｍ×長さ約３０ｃｍ）東ソー社品
プレカラム：ＴＳＫｇｅｌ  ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎＳＷＸＬ（内径約６ｍｍ×長さ約４ｃｍ）東ソー社品
カラム温度：２５℃付近の一定温度
移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ硫酸ナトリウム
流量：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。
結果を図１に示す。イニシャルでは、シスチン無添加溶液、シスチン添加ｐＨ４．７処理溶液及びシスチン添加ｐＨ７．５処理溶液いずれもモノマー含量が８６〜８７％であった。これら３種類の溶液をｐＨ７．５にして、３７℃で４５分間放置したところ、シスチン無添加溶液はモノマー含量が７３％まで低下したのに対して、シスチン添加ｐＨ４．７処理溶液は７８％と若干の重合抑制が見られた。また、シスチン添加ｐＨ７．５処理溶液は８７％と完全に重合を抑制した。
この結果より、シスチン添加時の反応ｐＨは酸性側よりも中性側の方が良いことが分かった。
実施例２  無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制（反応温度の影響）
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて、製造例１に従い得られた活性化処理後のＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体について、重合抑制を試みた。
濃度約５ｍｇ／ｍＬになるように調製したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体溶液に最終濃度で１ｍＭになるようにシスチン溶液を加えた。このとき、シスチン溶液は０．５Ｎ塩酸にシスチンを４０ｍＭになるように溶解したものを使用した。
この溶液に４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、２つに分け、一方は３７℃で３時間、他方は４℃で一昼夜放置した。それぞれをシスチン添加３７℃処理溶液及びシスチン添加４℃処理溶液とした。
これらの２種類の溶液及びシスチン無添加溶液を分子量分画３０Ｋカットの限外ろ過膜を用いて、シスチンを除去し、溶媒を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）に置換した。この時点をイニシャルとして、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。次に、これら３種類の溶液に４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、３７℃で４５分間放置し、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ条件）
実施例１と同じ。
結果を図２に示す。イニシャルでは、シスチン無添加溶液、シスチン添加３７℃処理溶液及びシスチン添加４℃処理溶液いずれもモノマー含量が８６〜８７％であった。これらの溶液をｐＨ７．５にして、３７℃で４５分間放置したところ、シスチン無添加溶液はモノマー含量が７３％まで低下したのに対して、シスチン添加３７℃処理溶液は８７％、シスチン添加４℃処理溶液は８６％といずれも完全に重合を抑制した。
この結果より、シスチン添加時の反応温度は３７℃と４℃のいずれでも良いことが分かった。
実施例３  無血清培養によるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の重合抑制（シスチン濃度の影響）
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて、製造例１に従い得られた活性化処理後のＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体について、重合抑制を試みた。
濃度約５ｍｇ／ｍＬになるように調製したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体溶液に最終濃度で１ｍＭ又は０．５ｍＭになるようにシスチン溶液を加えた。このとき、シスチン溶液は０．５Ｎ塩酸にシスチンを４０ｍＭ又は２０ｍＭになるように溶解したものを使用した。
これらの溶液に４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、それぞれを１ｍＭ処理及び０．５ｍＭ処理とした。
これらの２種類の溶液及びシスチン無添加溶液を４℃で一昼夜放置し、その後、分子量分画３０Ｋカットの限外ろ過膜を用いて、シスチンを除去し、溶媒を２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７）に置換した。この時点をイニシャルとして、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。次に、これらの溶液に４分の１容の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を加え（最終ｐＨ７．５）、３７℃で４５分間放置し、ゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行なった。
（ゲルろ過ＨＰＬＣ条件）
実施例１と同じ。
結果を図３に示す。イニシャルでは、シスチン無添加溶液、シスチン１ｍＭ添加溶液はモノマー含量が８６〜８７％であったのに対し、シスチン０．５ｍＭ添加溶液ではモノマー含量が８４％と少し低めであった。これらの溶液をｐＨ７．５にして、３７℃で４５分間放置したところ、シスチン無添加溶液はモノマー含量が７３％まで低下したのに対して、シスチン１ｍＭ添加溶液は８６％、シスチン０．５ｍＭ添加溶液は８４％といずれもイニシャルからの変化は無かった。
この結果より、シスチン添加濃度は１ｍＭの方が０．５ｍＭより若干重合抑制効果が高いことが分かった。
製造例２  無血清培養によるＧＡＨホール抗体作成
（１）無血清培地によるＧＡＨホール抗体の培地中への生産
無血清培地ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）を３０Ｌになるようにミリ−Ｑ水に溶解し、４ｍＭのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１．６ｇ／ｌの炭酸水素ナトリウム（インビトロジェン社）、１０ｍｇ／ｌのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍミリパック４０フィルター（ミリポア社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調整した。調整した細胞培地のうち４Ｌを予め高圧蒸気滅菌器（サクラ精機社）で滅菌しておいた５０Ｌ培養槽（バイオット社）に無菌的に仕込み、培養制御装置（バイオット社）に接続した。
予め７Ｌ（ワーキングボリューム：６Ｌ）スピンナーフラスコ（Ｂｅｌｃｏ社）で無血清培地ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦを使用して培養しておいた遺伝子組換ＧＡＨ抗体産生ＣＨＯ細胞１−６Ｒ（ＷＯ０３／０４８３５７号公報実施例参照）を無菌的に５０Ｌ培養槽に全量播種した。その後、１日後に無血清培地ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦを５Ｌ、２日後に１５Ｌ、４日後１Ｌを追加し培養を行った。
播種後３０７ｈｒで培養を終了し、培養液を回収した。培養液は、プロスタック（ミリポア社）で細胞分離を行い、０．２２μｍミリパック４０でろ過を行い約２６Ｌの未精製バルクを得た。
（２）無血清培養により得られた未精製バルクからのＧＡＨホール抗体の精製
（１）で得られた未精製バルクの内１７Ｌを、ＸＫ１６カラム（ｉ．ｄ．１６ｍｍ、アマシャム・バイオサイエンス社製）にＰｒｏｓｅｐ−Ａ樹脂（ミリポア社製）を１４．３ｍｌ充填したカラムクロマトで１２回に分けて精製を行い、約１．７ｇのＧＡＨホール抗体を得た。
実施例４  ＧＡＨホール抗体の活性化処理および重合抑制処理
製造例２により取得したＧＡＨホール抗体溶液のうち６４０ｍｌを４０ｍＭ塩化ナトリウム含有４０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）で、抗体濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈を行った。この抗体溶液に最終１．０Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＬ−システイン、１２ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）なる組成になる様に試薬を添加した。この液を５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調製した後、室温にて穏やかに３時間攪拌を行い活性化反応を終了した。少量分取し、残りの抗体溶液に最終４ｍＭシスチンとなるよう試薬を添加した。その後、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調製した後、室温にて穏やかに２時間攪拌を行い重合抑制処理を施した。その後６Ｎ塩酸でｐＨ４．０に調製し、分画分子量３０ｋＤａ  ｃｕｔの限外ろ過膜（Ｈｙｄｒｏｓａｌｔ、ザルトリウス社）を用いて電気伝導度０．６Ｓ／ｍ以下になるまで脱塩・濃縮を行った。活性化反応後分取した試料は、重合抑制処理を施さずに分画分子量３０ｋＤａ  ｃｕｔの限外ろ過膜（ザルトコン、ザルトリウス社）で脱塩・濃縮を行った。
実施例５  ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる理化学分析
実施例４で得られたＧＡＨホール抗体溶液を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行い、重合抑制処理の前後でクロマトグラムを比較した。
操作条件：
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ×長さ７．５ｃｍ）東ソー社品
カラム温度：３０℃付近の一定温度
移動相Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
移動相Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．５Ｍ塩化ナトリウム
移動相の送液：濃度勾配制御（以下、表１）
2004056872.tif 000002
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
精製したＧＡＨホール抗体について、活性化反応前、活性化反応終了後、重合抑制処理後、脱塩・濃縮後の試料から得られたクロマトグラムを比較した結果を図４〜図７に示した。
活性化前のクロマトは、図４に示す様にヘテロジェナイティに由来する数多くの分子種が存在し不活性型であるが、活性反応を施すと図５に示すように活性型ＧＡＨのクロマトとなる。その後、本発明の処理を施した後のクロマトでは図６に示す様に活性化反応後のクロマトとの違いが見られない。さらに、脱塩・濃縮処理を行っても図７に示すように変化がみられない。
これらの結果より、本発明の処理は、ＧＡＨ抗体の活性に影響を与えないことがクロマトグラムの比較より解る。
実施例６  ＧＡＨホール抗体のゲルろ過ＨＰＬＣによる重合量分析
実施例４で得られたＧＡＨホール抗体溶液を用いてゲルろ過ＨＰＬＣ分析を行い、重合抑制処理の前後で抗体の単量体量を比較した。操作条件は、実施例１と同じである。
精製したＧＡＨホール抗体について、本発明の処理を施したものと、施さなかったものについて活性化反応前、活性化反応終了後、重合抑制処理後、脱塩・濃縮後の試料から得られた結果を表２に示した。
2004056872.tif 000003
本発明の処理を施さなかった精製ＧＡＨホール抗体は、脱塩・濃縮工程で大量に重合体を形成する。一方本発明の処理を施した精製ＧＡＨホール抗体は、活性反応後より単量体の含量がわずかながらではあるが増加し、脱塩・濃縮工程で重合体を形成することはない。
この結果より、本発明の処理は、単量体の含量を高めると同時に重合体形成を抑制することが明らかになった。
実施例７  活性化反応および重合抑制処理（本発明の処理）後のホール抗体のペプシン消化によるＦ（ａｂ’）２化および精製
実施例４で得られた溶液のうち１５０ｍｌを分取し、これにペプシン消化を行った。すなわちペプシン（ＳＩＧＭＡ社）を１．２ｍｇ／ｇ−ＧＡＨとなる様加えて、ボトルトップフィルター（コーニング・コースター社、０．２２μｍ）で無菌濾過し、３７℃で加温しながら穏やかに約１９時間攪拌を行った。
ペプシン消化後陽イオン交換カラムクロマト法を用いてＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体を精製した。すなわち、ＸＫ１６カラムに陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ  ＨＰ（アマシャム・バイオサイエンス社）を１５．３ｍｌ充填し、ペプシン消化後の抗体含有液を供した。その後、２０ｍＭ  ＮａＣｌ含有４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄を行い、塩濃度を徐々に高めながら、抗体のピークを分取した。流速は、４．１７ｍｌ／ｍｉｎである。
その後、分画分子量３０ｋＤａ  ｃｕｔザルトコンを用いて、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．０）にバッファー置換を行い、ｐＨ７．０に調製した後、陰イオン交換カラムクロマト方を用いてＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体を精製した。すなわち、ＸＫ１６カラムに陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャム・バイオサイエンス社）を３１ｍｌ充填し、バッファー置換後の抗体含有溶液を供し、抗体のピークを分取した。その後ｐＨを４．０に調製し、分画分子量３０ｋＤａ  ｃｕｔのザルトコンを用いて抗体濃度を約５ｍｇ／ｍｌに調製し精製ＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２化抗体を得た。
実施例８  ＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２化抗体のＨＰＬＣによる理化学分析ならびに重合体量の測定
実施例７により得られたＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２化抗体を、ＴＳＫｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ，長さ７．５ｃｍ；東ソー社品）に供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例４に示したものと同じである。
結果を図８に示した。
この結果より、得られた抗体は活性型であり、精製工程を通じて本発明の処理が抗体活性に影響を及ぼさないことが確認された。
また、実施例７により得られたＧＡＨ  Ｆ（ａｂ’）２化抗体を、ゲルろ過ＨＰＬＣ法を使用して単量体量の測定を行った。
操作条件は、実施例１と同じである。
この結果、単量体含量は９３．８％であり、精製規格を充分に満足した抗体が得られたことが明らかとなった。さらに、精製工程全体に渡って本発明の処理が重合体の生成を抑制していることが確認され、精製収率の大幅な向上が達成されたことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、遊離のシステイン残基を有するタンパク質のチオール基を保護することによる、効率的で効果的なタンパク質の生成方法の確立と、該タンパク質を含む薬剤の提供が可能である。
なお、本出願は、日本特許出願  特願２００２−３７０８２２号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2004056872.tif 000009
【図５】
2004056872.tif 000010
【図６】
2004056872.tif 000011
【図７】
2004056872.tif 000012
【図８】
2004056872.tif 000013
【国際調査報告】
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