(57)【要約】新規な血中癌マーカーの検出による癌の診断方法を提供する。被験試料中の可溶化グリピカン３を検出することにより癌を診断することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の可溶化ＧＰＣ３タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
【請求項２】
可溶化ＧＰＣ３タンパク質が、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドである請求項１記載の癌の診断方法。
【請求項３】
ＧＰＣ３のＮ端ペプチドがＧＰＣ３の第１番目のアミノ酸から第３７４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列中または第１番目のアミノ酸から第３５８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に含まれるペプチド断片である、請求項２記載の癌の診断方法。
【請求項４】
被検試料が血液、血清、血漿のいずれかである請求項１から３のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項５】
肝臓癌である請求項１から４のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項６】
抗ＧＰＣ３抗体を用いることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と標識物質で標識された抗ＧＰＣ３抗体を用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
標識物質がビオチンである請求項７記載の方法。
【請求項９】
抗ＧＰＣ３抗体を含む癌の診断薬。
【請求項１０】
支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と、標識物質で標識された抗体を含むことを特徴とする請求項９記載の診断薬。
【請求項１１】
肝臓癌である請求項９又は１０記載の診断薬。
【請求項１２】
抗ＧＰＣ３抗体がＧＰＣ３のＮ端ペプチドを認識することを特徴とする請求項９から１１のいずれか１項に記載の診断薬。
【請求項１３】
抗ＧＰＣ３抗体を含む診断キット。
【請求項１４】
支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と、標識物質で標識された抗体を含むことを特徴とする請求項１３記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は血中可溶性癌マーカーに関する。具体的には、被検試料中の可溶性グリピカン３（ＧＰＣ３）を検出し、癌を診断する方法に関する。
【背景技術】  細胞表面上に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンの新しいファミリーとしてグリピカンファミリーの存在が報告されている。現在までのところ、グリピカンファミリーのメンバーとして、５種類のグリピカン（グリピカン１、グリピカン２、グリピカン３、グリピカン４およびグリピカン５）が存在することが報告されている。このファミリーのメンバーは、均一なサイズ（約６０ｋＤａ）のコアタンパク質を持ち、特異的でよく保持されたシステインの配列を共有しており、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーにより細胞膜に結合している。
グリピカン３（ＧＰＣ３）は、発生における細胞分裂やそのパターンの制御に深く関わっていることが知られている。又、ＧＰＣ３遺伝子が肝癌細胞において高発現しており、ＧＰＣ３遺伝子が肝細胞癌マーカーとして利用できる可能性があること知られている。
以前、本発明者らは抗ＧＰＣ３抗体がＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有しており肝癌の治療に有用であることを見出し、特許出願を行った（特願２００１−１８９４４３）。
しかしながら、ＧＰＣ３は膜結合タンパク質であり分泌型のＰＧＣ３タンパク質が存在することは報告されておらず、ＧＰＣ３タンパク質自体を血中の癌マーカーとして用いることは検討されていなかった。
【発明の開示】
本発明者らは、グリピカン３（ＧＰＣ３）が３５８番目のアルギニンと３５９番目のセリンの間で切断される事実を見出し、可溶型ＧＰＣ３が肝癌患者の血中に分泌されるという仮説を立て、ＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡ系を確立し、ＧＰＣ３高発現であるヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２の培養上清中に分泌型ＧＰＣ３の存在を明らかにした。さらに、ＨｅｐＧ２を移植したマウス血漿中のみならずヒト肝癌患者血清中の可溶型ＧＰＣ３測定にも成功した。ＧＰＣ３は肝癌マーカーであるＡＦＰよりも早期の肝癌で遺伝子発現が認められるので、ＧＰＣ３の検出は癌の診断として有用であると考えられた。また可溶型ＧＰＣ３はＣ末端断片側を認識する抗ＧＰＣ３抗体では検出しにくい傾向にあることから、分泌型ＧＰＣ３はＮ端断片優位と推定された。従って、Ｎ端を認識する抗ＧＰＣ３抗体を用いるのが好ましいと考え、さらに鋭意検討を行い、本発明を完成させるに至った。
ＧＰＣ３は肝癌細胞株以外に、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、肝癌以外の診断にも適用できる可能性がある。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）被検試料中の可溶化ＧＰＣ３タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法、
（２）可溶化ＧＰＣ３タンパク質が、ＧＰＣ３のＮ端ペプチドである（１）の癌の診断方法、
（３）ＧＰＣ３のＮ端ペプチドがＧＰＣ３の第１番目のアミノ酸から第３７４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列中または第１番目のアミノ酸から第３５８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列中に含まれるペプチド断片である、（２）の癌の診断方法、
（４）被検試料が血液、血清、血漿のいずれかである（１）から（３）のいずれかの診断方法、
（５）肝臓癌である（１）から（４）のいずれかの診断方法、
（６）抗ＧＰＣ３抗体を用いることを特徴とする（１）から（５）のいずれかの方法。
（７）支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と標識物質で標識された抗ＧＰＣ３抗体を用いることを特徴とする（６）の方法、
（８）標識物質がビオチンである（７）の方法、
（９）抗ＧＰＣ３抗体を含む癌の診断薬、
（１０）支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と、標識物質で標識された抗体を含むことを特徴とする（９）の診断薬、
（１１）肝臓癌である（９）又は（１０）の診断薬、
（１２）抗ＧＰＣ３抗体がＧＰＣ３のＮ端ペプチドを認識することを特徴とする（９）から（１１）のいずれかの診断薬、
（１３）抗ＧＰＣ３抗体を含む診断キット、および
（１４）支持体に固定した抗ＧＰＣ３抗体と、標識物質で標識された抗体を含むことを特徴とする（１３）の診断キット。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、被験試料中の可溶化グリピカンを検出することにより癌を検出する方法である。
検出とは、定量的又は非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＧＰＣ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＧＰＣ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、ＧＰＣ３タンパク質の濃度の測定、ＧＰＣ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料とは、ＧＰＣ３タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、特に制限されず、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができるが、好ましいのは肝癌である。
１．抗ＧＰＣ３抗体の作製
本発明で用いられる抗ＧＰＣ３抗体はＧＰＣ３タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。
抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
又、支持体に固定される抗ＧＰＣ３抗体と標識物質で標識される抗ＧＰＣ抗体はＧＰＣ３分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。
エピトープとして認識する部位は特に制限されないが、ＧＰＣ３タンパク質のＮ端側（アミノ酸１番目のＭｅｔ〜３５８番目のＡｒｇまたは１番目のＭｅｔ〜３７４番目のＬｙｓ）に存在するエピトープを認識することが好ましい。
本発明で使用される抗ＧＰＣ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＧＰＣ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＧＰＣ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＧＰＣ３を、Ｌａｇｅ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８８（１９９７），１５１−１５６に開示されたＧＰＣ３（ＭＸＲ７）遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、ＧＰＣ３をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＧＰＣ３タンパク質を公知の方法で精製する。
また、天然のＧＰＣ３を精製して用いることもできる。
次に、この精製ＧＰＣ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＧＰＣ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＧＰＣ遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＧＰＣ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＧＰＣ３の部分は限られないが、Ｎ端側に存在するエピトープを認識する抗体を得ようとする場合は、ＧＰＣ３のアミノ酸１番目のＭｅｔ〜３５８番目のＡｒｇまたは１番目のＭｅｔ〜３７４番目のＬｙｓまでのペプチドを用いればよいし、この部分のエピトープを含むより小さいペプチドを用いることもできる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよく、また例えばＧＰＣ３のＮ端断片に対する抗体を得ようとする場合は、Ｎ端断片をスクリーニング用抗原として用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＰＣ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＧＰＣ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＧＰＣ３を投与して抗ＧＰＣ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＧＰＣ３に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／２５５８５号公報、ＷＯ  ９３／１２２２７号公報、ＷＯ  ９２／０３９１８号公報、ＷＯ  ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＧＰＣ３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗ＧＰＣ３抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗ＧＰＣ３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ  ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ  ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＧＰＣ３に結合する限り、抗体の断片又はその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するベプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＧＰＣ３分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＧＰＣ３を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１ａ（ＨＥＦ１ａ）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１ａプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
２．ＧＰＣ３の検出
本発明において検出するＧＰＣ３は、特に限定されず、全長ＧＰＣ３でも、その断片でもよい。ＧＰＣ３断片を検出する場合には、Ｎ端断片でもＣ端断片でもよいが、好ましくはＮ端断片である。又、ヘパラン硫酸などが付加されたＧＰＣ３タンパク質でも、ＧＰＣ３コアタンパク質でもよい。
被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＧＰＣ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗ＧＰＣ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＧＰＣ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＧＰＣ３抗体とＧＰＣ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＧＰＣ３抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＧＰＣ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗ＧＰＣ３抗体とＧＰＣ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＧＰＣ３タンパク質と抗ＧＰＣ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法においては、ＧＰＣ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＧＰＣ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＧＰＣ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＧＰＣ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
抗ＧＰＣ３抗体を介して支持体に結合したＧＰＣ３タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＧＰＣ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
抗ＧＰＣ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＧＰＣ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＧＰＣ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＧＰＣ３抗体及びアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＧＰＣ３タンパク質を検出する。
本発明のＧＰＣ３タンパク質検出方法の他の態様として、ＧＰＣ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体、及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ＧＰＣ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＧＰＣ３タンパク質を、一次抗ＧＰＣ３抗体及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＧＰＣ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、一次抗ＧＰＣ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次いで一次抗体を特異的に認識する二次抗体を加える。適度なインキュベーションの後、洗浄して、プレートに残った二次抗体を検出する。二次抗体の検出は前述の方法により行うことができる。
本発明のＧＰＣ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＧＰＣ３抗体を感作した担体を用いてＧＰＣ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料を混合し、一定時間攪拌した後に、試料中にＧＰＣ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＧＰＣ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
本発明のＧＰＣ３タンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＧＰＣ３タンパク質と抗ＧＰＣ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＧＰＣ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＧＰＣ３抗体に結合するＧＰＣ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、癌の診断のための被検試料中のＧＰＣ３タンパク質を検出するための診断薬またはキットの提供をも目的とするが、該診断薬またはキットは少なくとも抗ＧＰＣ３抗体を含む。該診断薬またはキットがＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐを用いたＧＰＣ３  ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す図であり、図１ＡはＧＰＣ３の発現を、図１Ｂはアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現を示す。横軸のＮＬ、ＣＨ、ＬＣ、ＷＤ、ＭＤおよびＰＤはそれぞれ正常肝臓、肝炎症部位、肝硬変部位、高分化癌、中分化癌および低分化癌を示す。
図２は、精製ヘパラン硫酸付加型のＧＰＣ３及びＧＰＣ３コアタンパク質のＣＢＢ染色像を示す図である。
図３は、ヒト肝臓癌におけるＧＰＣ３遺伝子の発現を示す図である。
図４は、抗ＧＰＣ３抗体を用いて行った可溶型コアタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図５は、抗ＧＰＣ３抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を示す図である。
図６は、Ｍ６Ｂ１およびＭ１８Ｄ４を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示す図である。
図７は、ＧＰＣ３の構造を示す模式図である。
図８は、ＥＬＩＳＡにおける抗ＧＰＣ３抗体の組み合わせを示す図である。
図９は、様々な組み合わせの抗ＧＰＣ３抗体を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡ系のスタンダードカーブを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本願明細書記載の実施例において、以下の材料を用いた。
可溶型ＧＰＣ３、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質の発現ベクターとして、ｐＣＡＧＧＳにＤＨＦＲ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだｐＣＸＮＤ２、ｐＣＸＮＤ３を用いた。
ＤＸＢ１１はＡＴＣＣより購入した細胞を用い、培養には５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １００９９−１４１，ＬＯＴ＃  Ａ０２７５２４２）／Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ（＋））（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５７１−０７１）／１％  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １５１４０−１２２）を用いた。ＤＸＢ１１を用いた発現株の選抜には、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １０１３１−０２７）／５％  ＦＢＳ／αＭＥＭ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １２５６１−０５６）（αＭＥＭ（−））／ＰＳあるいは同培地に終濃度２５ｎＭとなるようにＭＴＸを加えたものを用いた。
ＨｅｐＧ２はＡＴＣＣより購入した細胞を用い、１０％  ＦＢＳ／ダルベッコの改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃  １１９９５−０６５）／ＰＳで培養を行った。
ハイブリドーマは１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０／１  ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃  Ｈ−０２６２）／０．５  ｘ  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １０８８９４７）で培養した。
実施例１  ヒトＧＰＣ３（ＧＰＣ３）ｃＤＮＡのクローニングおよび発現解析
ヒトグリピカン３（以下ＧＰＣ３）をコードする全長ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＧＰＣ３をコードする全長ｃＤＮＡは、大腸癌細胞株Ｃａｃｏ２より常法により調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社  Ｃａｔ．Ｎｏ．８４３０−１）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。すなわち、２μｌのＣａｃｏ２由来ｃＤＮＡ、１μｌのセンスプライマー（配列番号１）、１μｌのアンチセンスプライマー（配列番号２）、５μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ２  １０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１．２５ｍＭ）、１．０μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘを含む５０μｌの反応液を、９４℃で１分、６３℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回行った。ＰＣＲ反応による増幅産物は（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）を用いてＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙに挿入した）ＡＢＩ３１００  ＤＮＡシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトＧＰＣ３の全長をコードするｃＤＮＡを単離した。配列番号３で表される配列はヒトＧＰＣ３遺伝子の塩基配列を、配列番号４で表される配列はヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列を示す。
2004038420.tif 000002
ＧｅｎｅＣｈｉｐを用いたヒトＧＰＣ３  ｍＲＮＡ発現解析
２４例の肝臓癌腫瘍部（高分化癌：ＷＤ、中分化癌：ＭＤ、低分化癌：ＰＤ）、１６例の肝臓癌非癌部（肝炎部位：ＣＨ、肝硬変部位：ＬＣ）、８例の正常肝臓：ＮＬ（インフォームドコンセント取得済み、東京大学医学部及び埼玉癌センターにおいて入手）におけるｍＲＮＡ発現解析をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＵＧ−９５Ａ  Ｔａｒｇｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）を用いて行った。すなわち、上記各組織よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いてトータルＲＮＡを調製した後、それぞれ１５μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを使用し、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。
その結果、図１に示すようにヒトＧＰＣ３遺伝子（Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＩＤ：３９３５０＿ａｔ）は肝癌の分化の程度に関わらず多くの症例においてｍＲＮＡの発現量が正常肝組織に比べ明らかに高いことが確認された。さらに、現在最もよく肝癌の診断マーカーとして使用されているアルファフェトプロテイン（Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  ＩＤ：４０１１４＿ａｔ）のｍＲＮＡ発現と比較した結果、アルファフェトプロテインのｍＲＮＡ発現がほとんどみられない高分化癌においてもＧＰＣ３は十分なｍＲＮＡの発現の亢進が認められ、かつｍＲＮＡ発現亢進している割合がＧＰＣ３において高いことが明らかとなった。以上のことより、ＧＰＣ３の検出は肝癌の早期診断法として有用と考えられる。
実施例２  抗ＧＰＣ３抗体の作製
可溶型ヒトＧＰＣ３の作製
抗ＧＰＣ３抗体作製のための材料として、Ｃ末端側の疎水性領域を欠損させた可溶型ＧＰＣ３タンパク質を作製した。
東大先端研より供与された完全長ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを用い、可溶型ＧＰＣ３  ｃＤＮＡ発現プラスミドＤＮＡを構築した。Ｃ末端側の疎水領域（５６４−５８０アミノ酸）を除くように設計した下流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＡＣ  ＣＧＴ  ＧＣＧ  Ｃ−３’（配列番号５））とＥｃｏＲＩ認識配列、Ｋｏｚａｋ配列を加えた上流プライマー（５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  Ｃ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ断片（１７１１ｂｐ）をｐＣＸＮＤ２−Ｆｌａｇにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＣＨＯ細胞ＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い可溶型ＧＰＣ３高発現ＣＨＯ株の大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０７０９−０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファーにより溶出した。次に、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃Ａ−２２２０）を用いてアフィニティー精製を行った。溶出は２００μｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチドにより行った。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃４３０４）による濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−１０８８−０１）によるゲルろ過を行いＦＬＡＧペプチドを除去した。最後にＤＥＡＥ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムを用いて濃縮し、同時にＴｗｅｅｎ２０を含まないＰＢＳ（５００ｍＭのＮａＣｌを含む）で溶出を行うことによりバッファー置換を行った。
可溶型ヒトＧＰＣ３コアタンパク質の作製
上記野生型ヒトＧＰＣ３  ｃＤＮＡをテンプレートとし、アッセンブリーＰＣＲ法によって４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させたｃＤＮＡを作製した。この際、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されるようにプライマーを設計し、得られたｃＤＮＡをｐＣＸＮＤ３ベクターにクローニングした。作製された発現プラスミドＤＮＡをＤＸＢ１１株へ導入し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎでの選抜により、可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質高発現ＣＨＯ株を得た。
１７００ｃｍ２ローラーボトルを用い大量培養を行い、培養上清を回収し精製を行った。培養上清をＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５１０−０１）にチャージし、洗浄後、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。次に、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０５７５−０１）を用いてアフィニティー精製を行った。１０〜１５０ｍＭのイミダゾールでグラジエント溶出を行った。最後にＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて濃縮し、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むリン酸バッファーにより溶出した。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、５０〜３００ｋＤａのスメアなバンドと、約４０ｋＤａのバンドが得られた。図２に電気泳動の結果を示す。ＧＰＣ３は６９ｋＤａのＣ末端にヘパラン硫酸付加配列を有するプロテオグリカンである。スメアなバンドはヘパラン硫酸修飾を受けたＧＰＣ３であると考えられた。約４０ｋＤａのバンドはアミノ酸シークエンスの結果、ＧＰＣ３のＮ末端側断片を起点としており、ＧＰＣ３は何らかの切断を受けていることが予想された。
以下のハイブリドーマのスクリーニングにおいてヘパラン硫酸に対する抗体を排除するため、ヘパラン硫酸付加シグナル配列である４９５番目と５０９番目のＳｅｒをＡｌａに置換させた可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を作製した。同様にＣＨＯ高発現株を構築し、培養上清よりＨｉｓタグを利用したアフィニティー精製を行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果、７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａの３つのバンドが得られた。アミノ酸シークエンスの結果、３０ｋＤａのバンドはＧＰＣ３のＣ末端側断片であることが判明し、ＧＰＣ３は３５８番目のアルギニンと３５９番目のセリンの間で何らかの酵素的な切断を受けていることが示された。ヘパラン硫酸付加型ＧＰＣ３でこの３０ｋＤａのバンドが見られなかったのは、ヘパラン硫酸が付加しているためスメアなバンドになっていたためと思われる。ＧＰＣ３が特定のアミノ酸配列で酵素的な切断を受けることは新しい知見であり、生物学的意義に関しては明らかにされていない。
本発明者らは、この結果より肝癌患者においても膜上のＧＰＣ３が切断を受け、可溶型としてＧＰＣ３が血中に分泌されるという仮説を立てた。ＧＰＣ３は肝癌腫瘍マーカーであるＡＦＰと比較してより早期肝癌患者で遺伝子の発現が高値であることを見出した（図１）ので、ＡＦＰより臨床的有用性の高い新しい腫瘍マーカーとしての可能性について検討するため、実施例２以降に記載のように、抗ＧＰＣ３抗体を作製し、サンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。
抗ＧＰＣ３抗体の作製
ヒトＧＰＣ３とマウスＧＰＣ３のホモロジーはアミノ酸レベルで９４％の高い相同性を示すため、通常のマウスに免疫しても抗ＧＰＣ３抗体を得難い可能性を考え、自己免疫疾患マウスであるＭＲＬ／ｌｐｒマウスを免疫動物として用いた。ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（ＣＲＬ）５匹に可溶型ＧＰＣ３を免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計５回行った。最終免疫については５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。ＧＰＣ３コアタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＧＰＣ３に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。９６穴培養プレートに播種し、翌日よりＨＡＴ培地で選択後培養上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養を行い培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、ＧＰＣ３コアタンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗ＧＰＣ３抗体を６クローン得た。
抗体の精製はＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出は中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに行い直ちに中和した。抗体画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。
抗ＧＰＣ３抗体の解析
抗体濃度はヤギ抗マウス  ＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ６２−６６００）とアルカリフォスファターゼ−ヤギ抗マウス  ＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ６２−６６２２）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、市販の精製マウスＩｇＧ１抗体（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃０２−６１００）をスタンダードとして定量した。
抗ＧＰＣ３抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果全てＩｇＧ１タイプであった。
ＧＰＣ３コアタンパク質を用いたウエスタンブロッティングにより抗ＧＰＣ３抗体のエピトープ分類を行った。１００ｎｇ／レーンとなるように可溶型ＧＰＣ３コアタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（ＴＥＦＣＯ  ＣＡＴ＃０１−０７５）にチャージし、電気泳動（６０Ｖ  ３０ｍｉｎ，１２０Ｖ  ９０ｍｉｎ）後、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてイモビロン−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＣＡＴ＃ＩＰＶＨ  Ｒ８５  １０）ヘトランスファーした（１５Ｖ  ６０ｍｉｎ）。ｍｅｍｂｒａｎｅをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０，ＴＢＳ）で軽く洗った後、５％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで１時間（室温）あるいは一晩（４℃）振とうした。ＴＢＳ−Ｔで約１０分間振とうした後、１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで０．１〜１０μｇ／ｍＬに希釈した各抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ−Ｔで洗い（１０分間ｘ３回）、１％スキムミルク入りＴＢＳ−Ｔで１．１０００に希釈したＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃ＮＡ９３１）で１時間振とう後、ＴＢＳ−Ｔで洗った（１０分ｘ３回）。発色はＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ２１３２）を用いて行い、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  ＲＰＮ２１０３Ｋ）を用いて現像した。図４にウエスタンブロット解析の結果を示す。４０ｋＤａのバンドに反応する抗体はＮ末端にエピトープを有し、３０ｋＤａのバンドに反応する抗体はＣ末端にエピトープを有すると判断し分類した。Ｎ末端側を認識する抗体としてＭ６Ｂ１、Ｍ１８Ｄ４、Ｍ１９Ｂ１１、Ｃ末端側を認識する抗体としてＭ３Ｃ１１、Ｍ１３Ｂ３、Ｍ３Ｂ８を得た。ＢＩＡＣＯＲＥを用いた解析の結果、各抗体のＫＤ値は０．２〜１７．６ｎＭであった。
実施例３  可溶性ＧＰＣ３の検出
マウス異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデル
６週令雌性のＳＣＩＤマウス（Ｆｏｘ  ＣＨＡＳＥ  Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ  Ｊｃｌ、日本クレア株式会社）およびヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ、日本クレア株式会社）の腹部皮下へヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を３００万個移植した。腫瘤が充分に形成された５３日後にＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウス＃１，３，４の後大静脈より全採血し、ＥＤＴＡ−２Ｎａとアプロチニン存在下（ニプロネオチューブ真空採血管、ＮＩＰＲＯ、ＮＴ−ＥＡ０２０５）で血漿を調製し、測定日まで−２０℃で保管した。なお、ＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウス＃２はＨｅｐＧ２移植６２日後に、ＨｅｐＧ２移植ヌードマウス＃１，２は移植６６日後に後大静脈より全採血した。対照として、同週令の正常ＳＣＩＤマウスから同様の操作で血漿を調製した。
サンドイッチＥＬＩＳＡ
血中の可溶型ＧＰＣ３を検出するため、ＧＰＣ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。９６ウェルプレートにコートする抗体にはＭ６Ｂ１を、Ｍ６Ｂ１に結合したＧＰＣ３を検出する抗体としてビオチンで標識したＭ１８Ｄ４を用いた。発色には高い検出感度を達成するためＤＡＫＯ社のＡＭＰＡＫを用いた。
９６ウェルイムノプレートに１０μｇ／ｍＬとなるように抗ＧＰＣ３抗体をコーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６），０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）で希釈したものをコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、２００μＬの希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．１），１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３，１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を加えブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、マウス血漿、あるいは培養上清を希釈バッファーで適当に希釈したものを加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのＲＢで３回洗浄後、希釈バッファーで１０μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識した抗ＧＰＣ３抗体を加え１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ウェルのＲＢで３回洗浄後、希釈バッファーで１／１０００に希釈したＡＰ−ストレプトアビジン（ＺＹＭＥＤ）を加え、１時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＡＭＰＡＫ（ＤＡＫＯ  ＣＡＴ＃Ｋ６２００）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。
抗体のビオチン化にはＲｏｃｈｅ社のＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＣＡＴ＃  １  ４１８  １６５）を用いた。また、サンプル中の可溶型ＧＰＣ３濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｌａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｖｅｒ．３．０）を用いて解析した。図５に本実施例のサンドイッチＥＬＩＳＡの原理を示す。
精製可溶型ＧＰＣ３を用いてスタンダードカーブを作製した結果、検出限界が数ｎｇ／ｍＬの系を構築することができた。図６にＭ６Ｂ１およびＭ１８Ｄ４を用いたＧＰＣ３サンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示した。この系を用い、前述のＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中の分泌型ＧＰＣ３の検出を試みた。コントロールの培地、及びコントロールマウス血清では可溶型ＧＰＣ３は検出限界以下であったのに対し、ＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中に可溶型ＧＰＣ３が検出された。精製可溶型ＧＰＣ３の濃度に換算すると、ＨｅｐＧ２培養上清では１．２μｇ／ｍＬ、マウス血清でも２３〜９０ｎｇ／ｍＬであった（表１）。
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分泌型ＧＰＣ３の構造
先に立てた仮説通りＧＰＣ３が３５８番目のアルギニンと３５９番目のセリンとの間で切断を受けて分泌されているかについて検討を行った。分泌型ＧＰＣ３がＮ末端断片であった場合、Ｎ末端認識抗体とＣ末端認識抗体の組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡでは検出できないと考えられる。Ｎ末端断片を認識する抗体及びＣ末端側断片を認識する抗体それぞれ３種ずつを用いて、様々な組み合わせのサンドイッチＥＬＩＳＡ系を構築した。図７に分泌可溶化型ＧＰＣ３の構造を、図８に抗体の組み合わせを示す。図９にこのサンドイッチＥＬＩＳＡのスタンダードカーブを示す。表１に測定結果を示すが、表１に示すようにＨｅｐＧ２の培養上清、及びヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を移植したマウス血清中の分泌型ＧＰＣ３の検出はＮ末端側断片認識抗体同士の組み合わせでは高い値を示し、Ｃ末端断片認識抗体を含む系では多くのマウスで検出限界以下であった。このことから、今回明らかになった分泌型ＧＰＣ３はＮ末端断片が優位であることが予想された。
【産業上の利用可能性】  実施例に示したように、肝癌細胞で高発現しているＧＰＣ３は一部分泌型として血液中に存在する可能性が示された。ＧＰＣ３は肝癌マーカーであるＡＦＰよりも早期の癌で遺伝子発現が認められるので、ＧＰＣ３の検出は癌の診断として有用であると考えられる。ＧＰＣ３は肝癌細胞株以外に、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫などの癌細胞株においても発現が確認されているので、肝癌以外の診断にも適用できる可能性がある。
また、分泌型のＧＰＣ３はアミノ酸３５８番目のアルギニンと３５９番目のセリンの間で切断されたＮ末端断片が優位である可能性が示された。このことから診断用抗体としてはＮ末端断片認識抗体が有用と考えられる。また、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を有する肝癌治療用抗体としてはＣ末端断片認識抗体を用いれば、血中の分泌型ＧＰＣ３にトラップされること無く効率的に肝癌細胞に到達することが可能であると考えられる。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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