(57)【要約】医薬品等の中間体として有用な光学活性α−メチルシステイン誘導体を、安価で入手容易な原料から、簡便かつ工業的に製造する方法を提供する。  ラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させて加水分解することによるラセミ体または光学活性体のα−メチルシステイン誘導体の製造方法、及びラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させて立体選択的に加水分解することによる光学活性α−メチルシステイン誘導体及び当該化合物とは逆の立体配置を有する光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）；
2004063385.tif 000004
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１から２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７から２０のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数６から２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体または光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させて加水分解することを特徴とする一般式（２）；
2004063385.tif 000005
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体の製造方法。
【請求項２】
Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）及び得られるα−メチルシステイン誘導体（２）が光学活性体である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）及び得られるα−メチルシステイン誘導体（２）がＬ体である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
一般式（１）
2004063385.tif 000006
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１から２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７から２０のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数６から２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させて立体選択的に加水分解することを特徴とする、一般式（２）
2004063385.tif 000007
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表される光学活性α−メチルシステイン誘導体及び当該化合物とは逆の立体配置を有する光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体の製造方法。
【請求項５】
得られる光学活性α−メチルシステイン誘導体（２）がＬ体である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
デカルバミラーゼが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物由来である請求項１から５のいずれか記載の製造方法。
【請求項７】
デカルバミラーゼが、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、リゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）、又はシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来である請求項１から５のいずれか記載の製造方法。
【請求項８】
デカルバミラーゼが、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）由来である請求項１から５のいずれか記載の製造方法。
【請求項９】
デカルバミラーゼを固定化酵素として使用することを特徴とする請求項１から８のいずれか記載の製造方法。
【請求項１０】
Ｒ１が置換基を有していても良い炭素数４から１５の３級アルキル基である請求項１から９のいずれか記載の製造方法。
【請求項１１】
Ｒ１がｔ−ブチル基である請求項１から９のいずれか記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、医薬品等の中間体として有用な、α位に２つの異なる置換基を有するアミノ酸の１種であるα−メチルシステイン誘導体の製造法に関する。より詳細には、ラセミ体あるいは光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させることにより光学活性α−メチルシステイン誘導体および光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体、とりわけＬ−α−メチルシステイン誘導体を製造する方法に関する。
【背景技術】  光学活性α−メチルシステイン誘導体の製造法としては、次の様な方法が知られている。
１）光学活性システインとピバルアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉メチル化による方法（特表２０００−５１５１６６、ＷＯ０１／７２７０２、ＷＯ０１／７２７０３）。
２）光学活性アラニンとベンズアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉チオメチル化による方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９９年、５５巻、１０６８５頁）。
３）システインとシアノベンゼンより得られるチアゾリン化合物のメチル化を行い、得られたラセミ体のチアゾリン化合物をキラルＨＰＬＣにて分離精製する方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ、１９９４年、９巻、７０２頁）。
４）光学活性バリンとアラニンより合成される光学活性ジケトピペラジン化合物を不斉ブロモメチル化し、得られた化合物の臭素原子をアルカリ金属アルキルチオラートで置換する方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、５７巻、５５６８頁）。
５）２−メチル−２−プロペン−１−オールのシャープレス不斉酸化により得られる光学活性な２−メチルグリシドールから光学活性アジリジンを合成し、これにチオールを反応させる方法（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、６０巻、７９０頁）。
６）アミノマロン酸誘導体をメチル化した後に、豚肝臓エステラーゼ（以下ＰＬＥと略す）による非対称化を行い、得られた非対称エステルをチオ酢酸アルカリ金属塩と反応させる方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３年、１１５巻、８４４９頁）。
また、Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体に酵素を作用させることにより加水分解を行い、ラセミ体もしくは光学活性体のα−メチルシステイン誘導体を得る方法はこれまで知られていない。
しかしながら、上記１）〜４）の方法はいずれも、ブチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が必要である。５）の方法では、工程数が長くて煩雑であり高価な試薬を多く使う必要がある。６）の方法ではエステラーゼとしてＰＬＥを用いたジエステルの非対称化をキーとしているが、ＰＬＥは大量生産が困難であるため工業的規模での安定確保は難しく、実用的とは言い難い。このように、いずれの方法においても光学活性α−メチルシステイン誘導体の工業的製造法としては解決すべき課題を有している。
一方、本発明者らは上記課題を解決する手段として、ラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にヒダントイナーゼを作用させてＤ体選択的に環化させることにより、Ｎ−カルバミル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体及びＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体を得、さらに得られたＮ−カルバミル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体を化学的に加水分解することによりα−メチル−Ｌ−システイン誘導体を得る方法を見出した（特願２００２−１６４５９８）。しかしながら、この方法はＮ−カルバミル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体を加水分解する工程において多量の酸又はアルカリを必要とし、また反応時間が長く、更に改良の余地があった。
【発明の開示】
本発明の目的は、医薬品の中間体として有用な光学活性α−メチルシステイン誘導体を安価で入手容易な原料からより簡便に製造でき、工業的生産に対して実用的な方法を提供することにある。
本発明者らはかかる課題を解決するため、鋭意検討を行った結果、ラセミ体又は光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させることにより加水分解させ、ラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体を得る方法、及びラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させることにより立体選択的に加水分解させ、光学活性体のα−メチルシステイン誘導体及び光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、一般式（１）；
2004063385.tif 000002
（式中、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１から２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７から２０のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数６から２０のアリール基を表す）で表されるラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させ加水分解することを特徴とする、一般式（２）；
2004063385.tif 000003
（式中、Ｒ１は前記と同じ）で表されるラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体の製造方法に関する。
また本発明は、上記式（１）で表されるラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にデカルバミラーゼを作用させ立体選択的に加水分解することを特徴とする上記式（２）表される光学活性α−メチルシステイン誘導体および当該化合物とは逆の立体配置を有する光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体の製造方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）において、Ｒ１は置換基を有していても良い炭素数１から２０のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数７から２０のアラルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数６から２０のアリール基を表す。
炭素数１から２０のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基等の直鎖アルキル基もしくはイソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基等の分枝アルキル基が挙げられる。炭素数７から２０のアラルキル基としては、例えばベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。また、炭素数６から２０のアリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
上記アルキル基、アラルキル基、又はアリール基は無置換であってもよく、また置換基を有していてもよい。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、フェニル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、ハロゲン原子等が挙げられる。
上記の中でも、脱保護の容易さの点から、Ｒ１としては置換基を有していても良い炭素数４から１５の３級アルキル基、又は置換基を有していても良い炭素数７から２０のアラルキル基が好ましい。具体的には、ｔ−ブチル基、ｔ−ペンチル基、ｔ−ヘキシル基、ベンジル基等が挙げられ、さらに好ましくはｔ−ブチル基である。
前記式（１）で表されるラセミ体Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体は、例えばＢｕｃｈｅｒｅｒ法によりチオアセトンをヒダントインに誘導した後、これを加水分解することによりα−メチルシステイン誘導体とし（Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１，３５，５３−５８，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８８，９，２３１−２３５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，１９９７，２９１３−２９２０）、次いでシアン酸カリウムで処理することにより取得することができる。
また、前記式（１）で表される光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体は、例えばラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体にヒダントイナーゼ（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＩＦＯ１２９９６由来のヒダントイナーゼ等）を作用させてＤ体選択的に環化させ、生成したＮ−カルバミル−α−メチル−Ｌ−システイン誘導体とＤ−５−メチル−５−チオメチルヒダントイン誘導体を、晶析などによって分離することにより取得することができる。
次にラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）をデカルバミラーゼによって加水分解し、ラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）を製造する方法、及びラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）をデカルバミラーゼによって立体選択的に加水分解し、光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）を製造する方法について説明する。
ここでデカルバミラーゼとは、Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸誘導体を加水分解してα−アミノ酸誘導体を生成する活性を有する酵素を表す。
本発明で用いるデカルバミラーゼとしては、Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）を加水分解できるものであれば、動物、植物、又は微生物由来のいずれでも使用できるが、工業的な利用には、入手若しくは調製の容易さの点から微生物由来のものが好ましい。
酵素源となる微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できる。例えば公知のものとして、特公昭５７−１８７９３号、特公昭６３−２０５２０号、特公平１−４８７５８号および特開平６−２３３６９０号に開示されたアクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブラストバクター（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｕｍ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、又はスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属に属する微生物などが挙げられる。
好ましくは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブラストバクター（Ｂｌａｓｔｏｂａｃｔｅｒ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、又はリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物由来の酵素が挙げられる。
さらに好ましくは、アグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、リゾビウム・スピーシーズ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）、又はシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来の酵素が挙げられる。
上記微生物は野生株であってもよく、また、変異処理によってデカルバミラーゼ活性が高められた変異株であってもよい。さらに、遺伝子組換え等の方法を用いて、上記微生物由来のデカルバミラーゼを高生産するように作成された形質転換微生物であってもよい。
なお、アグロバクテリウム・スピーシーズ  ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）株は昭和６３年５月３１日に、リゾビウム・スピーシーズ  ＫＮＫ１４１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）は平成５年９月２２日に、シュードモナス・スピーシーズ  ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）株は平成２年１２月１日に、それぞれ上記の受託番号にて、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
また、デカルバミラーゼを効率良く高生産する形質転換微生物は、例えばＷＯ９２／１０５７９記載のように、デカルバミラーゼ活性を示す菌株からデカルバミラーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換えＤＮＡ技術については当該分野において周知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）に記載されている。
このようにして得られた、デカルバミラーゼを高生産する形質転換微生物としては、ＷＯ９２／１０５７９記載のアグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＡＤ１０８）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８４）、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（ｐＰＤ３０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８３）およびＷＯ９４／０３６１３記載の遺伝子改変により耐熱性の向上したアグロバクテリウム・スピーシーズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）などを挙げることができる。
なお、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ｐＡＤ１０８）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８４）株及びエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ｐＰＤ３０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８３）株は平成２年１２月１日に、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）株は平成５年７月２２日に、それぞれ上記の受託番号にて、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
デカルバミラーゼの生産は、前述のデカルバミラーゼ活性を示す微生物、或いは形質転換微生物を通常の方法で培養することにより行い得る。培養は、通常液体栄養培地で行われるが、固体表面培養によっても行うことができる。培地には通常資化し得る炭素源、窒素源、各種微生物の生育に必須の無機塩栄養素を含有させる。更にｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、フェニルグリシン等のアミノ酸；Ｎ−カルバミル−メチオニン、Ｎ−カルバミル−フェニルアラニンなどのＮ−カルバミル−α−アミノ酸；５−ｐ−ヒドロキシフェニルヒダントイン、５−フェニルヒダントイン等の５置換ヒダントイン類；ウラシル、ジヒドロウラシル、β−ウレイドプロピオン酸等のピリミジン代謝物；尿素；Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｂｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ａｌ３＋、Ｌｉ＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｓ＋等の金属イオン類を少量添加してデカルバミラーゼの生産を増強することが好ましい。これらデカルバミラーゼ生産増強物質の培地中濃度は、金属イオン類で０．１ｍＭ以上、１０ｍＭ以下、その他の物質で０．０１重量％以上、１重量％以下の範囲から選ばれる。
培養は通常、温度として２０℃以上、８５℃以下の範囲、好ましくは２５℃以上、６０℃以下の範囲、ｐＨとしては４以上、１１以下の範囲、好ましくはｐＨ５以上、９以下の範囲が用いられ、通気攪拌によって微生物の生育を促進することもできる。
本発明において、前述の微生物によって生産されたデカルバミラーゼは、酵素自体として用いることができるほか、本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物としても用いることができる。ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。
更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化して得た固定化酵素として用いられ得る。固定化は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。なお、酵素を固定化して安定化することで、酵素反応を、より過酷な温度域で行うことなどが可能となり、反応をより効率的に進行させることができる。さらに、酵素の反復使用が可能となること、製造プロセスが簡略化できるなどによる製造コストの低減等のメリットも期待できる。
本発明の酵素反応は以下の方法で行うことができる。基質として前記式（１）で表されるラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体を用い、前述のデカルバミラーゼ存在下、水性媒体中で反応を行う。基質の仕込み濃度は０．１％（ｗ／ｖ）以上、９０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上、６０％（ｗ／ｖ）以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は１０℃以上、８０℃以下、好ましくは２０℃以上、６０℃以下の適当な温度で調節し、ｐＨ４以上、９以下、好ましくはｐＨ５以上、８以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法または連続方式で行い得る。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との２層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。
かくして、ラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）は加水分解され、ラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）に変換される。また、本酵素反応が立体選択的に進行する場合には、ラセミ体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）から光学活性α−メチルシステイン誘導体（２）とその逆の立体配置を有する光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）が生成する。
酵素の入手の容易さや反応効率の観点からは、Ｌ体の化合物（１）を加水分解するか、若しくは、ラセミ体の化合物（１）をＬ体選択的に加水分解することにより、Ｌ体のα−メチルシステイン誘導体（２）を製造するのが好ましく、基質の調製の容易さからは、ラセミ体の化合物（１）をＬ体選択的に加水分解するのがより好ましい。
立体選択的な加水分解を行う場合、Ｌ体選択的なデカルバミラーゼとしては、アグロバクテリウム・スピーシーズ  ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）、リゾビウム・スピーシーズ  ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）、又はシュードモナス・スピーシーズ  ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）由来の酵素が好ましく、これら微生物若しくはその処理物を好適に用いることができる。また、前述のごとく、上記微生物由来のデカルバミラーゼを生産するように改変されたエシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ｐＡＤ１０８）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８４）、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９（ｐＰＤ３０４）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８３）又はエシェリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）等の形質転換微生物若しくはその処理物も好適に使用でき、エシェリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）の菌体若しくはその処理物がより好ましい。
生成したラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）とラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）は、通常の分離方法、例えば抽出、濃縮、晶析、またはカラムクロマトグラフィーなどの分離方法やそれらの組み合わせにより分離、精製することができるが、以下の方法によりより容易に行うことができる。
ラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）の水に対する溶解度が中性付近のｐＨ域では極めて低いのに対し、ラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）は水に対して比較的良好な溶解度を有する。したがって酵素反応終了後に反応液ｐＨを中性付近に調整することにより、ラセミ体又は光学活性体のα−メチルシステイン誘導体（２）の結晶が析出し、ろ過によりラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）と容易に分離することができる。このときのｐＨとしては４以上、１０以下が好ましく、より好ましくは６以上、８以下である。
また、上記処理後に得られたラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）を含むろ液は、ｐＨを酸性にすることでラセミ体又は光学活性体のＮ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）の結晶が析出し、ろ過により容易に分離することができる。用いる酸としては特に制限されるものではないが、酢酸、硝酸、硫酸、塩酸等が挙げられ、価格、取り扱いの容易さから塩酸が好ましい。ｐＨは１以上、５以下の範囲が好ましく、あまり低いと化学的に環化してヒダントインとなってしまうため、特に好ましくは２以上、４以下の範囲である。
さらに、得られた光学活性Ｎ−カルバミル−α−メチルシステイン誘導体（１）は、化学的に、若しくは脱カルバミル活性を有する酵素を用いてカルバミル基を除去することにより、容易に、上記α−メチルシステイン誘導体とは逆の立体配置を有する光学活性α−メチルシステイン誘導体（２）に導くことができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１）ラセミ体５−メチル−５−ｔ−ブチルチオメチルヒダントインの製法
窒素風船を備えた反応容器に、５ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液９．６ｇ、ｔ−ブチルメルカプタン１．１３ｍｌを０℃で混合し、１０分間攪拌した。クロロアセトン０．７９ｍｌを加え、室温に昇温し２時間反応させた。このとき反応溶液は淡黄色で二相分離していた。反応容器にジムロート型冷却管を備え、シアン化ナトリウム５８８ｍｇ、炭酸水素アンモニウム２．７７ｇ、３０ｗｔ％アンモニア水３．１ｍｌを加え、均一な溶液とした後、５５−６０℃に昇温した。６時間加熱攪拌した後、０℃に冷却し、反応溶液に濃塩酸を加えｐＨ７．０〜７．６に調整した。生成した白色結晶１．８４ｇを濾別した（収率８４．８％）。１Ｈ−ＮＭＲ分析により目的物であることを確認した。
（参考例２）ラセミ体Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの製法
ラセミ体５−メチル−５−チオメチルヒダントイン４．７７ｇを１０ｗｔ％水酸化ナトリウム水溶液７５ｇに溶解し、７２時間還流させた。室温まで放冷後反応液を一部抜き取り、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用した分析にてラセミ体Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインの生成を確認した。濃塩酸にてｐＨを８に調整した後、溶液を７０℃に加熱、シアン酸カリウム２．０７ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解した溶液を２０分かけて滴下した。滴下終了後、５時間攪拌した後、反応液の一部を抜き取りＨＰＬＣにて分析したところ未反応のアミノ酸が認められたので、さらにシアン酸カリウム４．１４ｇを蒸留水２０ｍｌに溶かした溶液を２０分かけて滴下した。滴下終了後、さらに１時間攪拌し室温まで放冷、濃塩酸にてｐＨを２とし、析出した固体をろ取した。得られた固体を水洗、乾燥させた後、１Ｈ−ＮＭＲで分析し、目的物であることを確認した（３．３８ｇ、収率６６％）。
ＨＰＬＣ分析条件；
使用カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、移動相：１０ｍＭリン酸／リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝９７／３、カラム温度：４０℃、測定波長：２１０ｎｍ、流速：１．０ｍｌ／分。
（実施例１）アグロバクテリウム属細菌を用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
アグロバクテリウム・スピーシーズ  ＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）を試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地Ａ（ポリペプトン１０ｇ、肉エキス１０ｇ、イーストエキス５ｇ、グリセリン５ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、リン酸水素二ナトリウム５ｇ、水１１、滅菌前ｐＨ６．５）に接種し、３０℃で２４時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを、坂口フラスコ内で滅菌した１００ｍｌの培地Ｂ（グリセリン２５ｇ、シュークロース５ｇ、イーストエキス４ｇ、リン酸二水素カリウム５ｇ、リン酸水素二ナトリウム５ｇ、リン酸マグネシウム七水和物１ｇ、塩化マンガン四水和物０．０１ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ６．５）に接種し、更にろ過滅菌した尿素０．２ｇ、Ｎ−カルバミル−Ｄ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン０．２ｇを添加して、３３℃にて３６時間振とう培養した。得られた培養液１６．５ｍｌから遠心分離により得られた菌体を０．２Ｍ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１．５ｍｌに懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン７５ｍｇと７５％システアミン水溶液０．２μｌを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、窒素雰囲気下、４０℃で２５時間攪拌した。途中、６Ｎ塩酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物をＨＰＬＣを用いて分析した結果、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインが変換率１０．０％、光学純度３３．７％ｅｅで生成していた。また、得られたＳ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインがＬ体であることを、別途合成した標品とのＨＰＬＣ分析による保持時間の比較により確認した。
ＨＰＬＣ分析条件（変換率測定）；
使用カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライテスク社製）、移動相：１０ｍＭリン酸／リン酸二水素カリウム緩衝液（ｐＨ２．０）／アセトニトリル＝８／２、カラム温度：４０℃、測定波長：２１０ｎｍ、流速：１．０ｍｌ／分。
ＨＰＬＣ分析条件（Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン光学純度測定）；
使用カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）、移動相：２ｍＭ硫酸銅水溶液／アセトニトリル＝８５／１５、カラム温度：２３℃、測定波長：２５４ｎｍ、流速：１．５ｍｌ／分。
（実施例２）リゾビウム属細菌を用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
実施例１と同様の方法により培養したリゾビウム・スピーシーズ  ＫＮＫ１４１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９）の培養液３６ｍｌから遠心分離により得られた菌体を０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１．５ｍｌに懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン７５ｍｇと７５％システアミン水溶液０．２μｌを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、窒素雰囲気下、４０℃で２５時間攪拌した。途中、６Ｎ塩酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物を実施例１と同様にして分析した結果、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインが変換率９．５％、光学純度２．４％ｅｅで生成していた。
（実施例３）シュードモナス属細菌を用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
シュードモナス・スピーシーズ  ＫＮＫ００３Ａ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１）を試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地Ｃ（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種し、４５℃で２７時間振とう培養した。この培養液１ｍｌを、坂口フラスコ内で滅菌した１００ｍｌの培地Ｄ（グリセリン１０ｇ、イーストエキス０．０３ｇ、リン酸二水素カリウム３．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ、リン酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、塩化マンガン四水和物０．０２ｇ、硫酸第一鉄七水和物０．０１ｇ、炭酸カルシウム１ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種し、更に別途滅菌したグルコース０．５ｇ、ろ過滅菌したＮ−カルバミル−Ｄ−アラニン０．２ｇを添加して、４５℃で６１時間振とう培養した。得られた培養液３０ｍｌから遠心分離により得られた菌体を０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１．５ｍｌに懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン７５ｍｇと７５％システアミン水溶液０．２μｌを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、窒素雰囲気下、４０℃で２０時間攪拌した。途中、６Ｎ塩酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物を実施例１と同様にして分析した結果、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインが変換率４．２％、光学純度１１．７％ｅｅで生成していた。
（実施例４）形質転換微生物エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）を用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
遺伝子改変により耐熱性の向上したアグロバクテリウム・スピーシーズＫＮＫ７１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００）由来のデカルバミラーゼ遺伝子を含有するエシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）を試験管内で滅菌した１０ｍｌの培地Ｃ（トリプトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、水１ｌ、滅菌前ｐＨ７）に接種し、更に別途ろ過滅菌したアンピシリンナトリウム塩１ｍｇを添加して、３７℃で１２時間振とう培養した。この培養液３．５ｍｌを、坂口フラスコ内で滅菌した３５０ｍｌの培地Ｃに接種し、更に別途ろ過滅菌したアンピシリンナトリウム塩３５ｍｇを添加して、３７℃で３０時間振とう培養した。得られた培養液３．６ｍｌから遠心分離により得られた菌体を０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１．５ｍｌに懸濁し、ラセミ体のＮ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン７５ｍｇと７５％システアミン水溶液０．２μｌを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、窒素雰囲気下、４０℃で２０時間攪拌した。途中、６Ｎ塩酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物をＨＰＬＣを用いて分析した結果、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインが変換率４．２％、光学純度１１．７％ｅｅで、Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインが変換率６１．８％、光学純度６．１％ｅｅで生成していた。また、得られたＮ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステインがＤ体であることを、別途合成した標品とのＨＰＬＣ分析による保持時間の比較により確認した。
ＨＰＬＣ分析条件（Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン光学純度測定）；
使用カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＳ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ダイセル化学社製）、移動相：ヘキサン／イソプロパノール／トリフルオロ酢酸＝８５／１５／０．１、カラム温度：３０℃、測定波長：２１０ｎｍ、流速：０．５ｍｌ／分。
（実施例５）固定化デカルバミラーゼを用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
ＷＯ９４／０３６１３記載の培養方法に従い、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１  ｐＮＴ４５５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）を培養、集菌後、ＷＯ９２／２２６４３記載の固定化酵素の調製方法に従い超音波破砕して得た酵素液に固定化用担体である陰イオン交換樹脂、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ａ−５６８を添加して酵素を吸着させ、さらにグルタルアルデヒドで架橋処理することで固定化デカルバミラーゼを得た。次にラセミ体Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチルシステイン７５ｍｇに０．２Ｍ  ＨＥＰＥＳ／水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）１．５ｍｌと７５％システアミン水溶液０．２μｌを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整した。この溶液に、上記固定化デカルバミラーゼ７５ｍｇ（湿重量）を加えて、窒素雰囲気下、４０℃で２７時間攪拌した。途中、６Ｎ塩酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物を実施例１および４と同様の方法により分析したところ、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインが変換率６４．６％、光学純度２９．１％ｅｅで、Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｄ−システインが変換率３５．４％、光学純度２１．１％ｅｅで生成していた。
（実施例６）形質転換微生物エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）を用いたＳ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインの製造
実施例４と同様の方法により培養したエシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１（ｐＮＴ４５５３）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８）の培養液６０ｍｌから遠心分離により得られた菌体を１ｍＭシステアミン水溶液１０ｍｌに懸濁し、Ｎ−カルバミル−Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システイン（光学純度９９．６％ｅｅ）５００ｍｇを加え、更に１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ６．５に調整し、窒素雰囲気下、４０℃で２５時間攪拌した。途中、２ｗｔ％硫酸の添加によりｐＨを６．５付近に保った。反応終了後、生成物を実施例４と同様の方法により分析した結果、Ｓ−ｔ−ブチル−α−メチル−Ｌ−システインが変換率９８．７％で生成していた。
【産業上の利用可能性】  以上述べたように、本発明によれば、安価で入手容易な原料から簡便かつ工業的に実施可能な方法によって、医薬品等の中間体として有用な光学活性α−メチルシステイン誘導体を製造することができる。
生物材料寄託機関
下記の表示は発明の詳細な説明中に記載された微生物又は生物材料に関連している。
寄託機関の名称：独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）
住所：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６
（１）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９００
寄託の日付：  昭和６３年（１９８８）５月３１日
（２）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４４１９
寄託の日付：  平成５年（１９９３）９月２２日
（３）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８１
寄託の日付：  平成２年（１９９０）１２月１日
（４）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３６８
寄託の日付：  平成５年（１９９３）７月２２日
（５）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８４
寄託の日付：  平成２年（１９９０）１２月１日
（６）受託番号  ：  ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−３１８３
寄託の日付：  平成２年（１９９０）１２月１日
【国際調査報告】
2004063385.tif 000008
2004063385.tif 000009
2004063385.tif 000010