(57)【要約】ＳＥ  ＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなり、ＳＥ感染鶏及び現在市販のＳＥ不活化ワクチン接種鶏とを血清学的に検査するための抗原処方物及びこれを含む検査キット、並びにこの抗原を含んだストレス反応性の低いＳＥサブユニットワクチンの提供。
2004055045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野外型サルモネラ感染動物とワクチン接種感染動物とを識別するマーカー抗原であって、サルモネラ種のべん毛抗原中に於けるフラジェリン５３ｋＤａ中の発現プロダクト９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を含有することを特徴としたサルモネラ抗原処方物。
【請求項２】
サルモネラ種がサルモネラ・エンテリティディスであることを特徴とした請求の範囲１記載のサルモネラ抗原処方物。
【請求項３】
９ｋＤａポリペプチドの複合物からなる抗原は、９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させた融合蛋白質であることを特徴とした請求の範囲１又は２記載のサルモネラ抗原処方物。
【請求項４】
酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキットであり、該抗体と免疫反応する抗原を支持体上に担持させた抗体検出用キットに於いて、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン希釈液を含み、支持体は請求の範囲１記載のサルモネラ抗原処方物が配されていることを特徴としたサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【請求項５】
支持体は、サルモネラ・エンテリティディスのべん毛抗原中に於ける９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を含有するサルモネラ抗原処方物を配し、サルモネラ・エンテリティディス感染鶏とサルモネラ・エンテリティディス不活化ワクチン接種鶏とを血清学的に検査することを特徴とした請求の範囲４記載のサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【請求項６】
支持体は、フラジェリン５３ｋＤａ中の発現プロダクト９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させた融合蛋白質を含有するサルモネラ抗原処方物が配されていることを特徴とした請求の範囲４又は５記載のサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【請求項７】
請求の範囲１記載の抗原を含んでなる、サルモネラ菌属の感染に対して動物を防御することを特徴としたサルモネラサブユニットワクチン。
【請求項８】
請求の範囲２記載の抗原を含んでなる、サルモネラ・エンテリティディス感染に対して鶏を防御することを特徴としたサルモネラ・エンテリティディスサブユニットワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、サルモネラ抗原処方物、及びこのサルモネラ抗原処方物を使用して野外型感染動物とワクチン接種動物とを識別するするための検査用キット、並びにサブユニットワクチンに関するものである。
【背景技術】  サルモネラ属の細菌は人及び動物の両方に於いて病原性を示すことが知られている。とりわけ、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ以下ＳＥと云う）は、人の食中毒の原因菌の一つとして１９８０年代後半より注目されてきた。このＳＥは多くの研究により、養鶏場に於いて産生される殻付き卵を汚染していることが知られるようになり、養鶏場（採卵場）に於けるＳＥ対策が重要視されている。
近年、養鶏場のＳＥ対策として一般的な衛生管理を向上させることの他に、採卵鶏の若齢期にＳＥ不活化ワクチンを接種することが試みられている。しかしながら、この場合、次のような問題点がある。
（１）ＳＥ不活化ワクチンを接種した場合、ＳＥ特異抗体は産生されるが、この産生されたＳＥ特異抗体は野外型ＳＥの自然感染と血清学的に区別することができない。
（２）現在広く普及しているＳＥ不活化ワクチンは、菌体を不活化した抗原、即ちＳＥの菌体をホルマリンにより死菌としたものを中心抗体として使用しているため、菌体内の毒素（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）を含んでおり、ワクチンを接種することにより様々な副反応（例えば鶏増体重を阻害する）を引き起こすことが知られている。また、不活化ワクチンの内、優れた免疫応答を誘導するものとして知られている油性アジュバントワクチンも、接種鶏にストレスを誘発するという欠点を持っている。
（３）現在、養鶏場ではＳＥ以外のサルモネラ菌属、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・インファンティスなどの汚染があり、ワクチネーションの回数を減らすためにも、サルモネラ菌属の多価ワクチンの開発が要望されているが、多くのサルモネラの菌体を混合することは必要以上のストレスを鶏に与えたり、必要な抗原量を安定的に確保するのが困難であるため、所望される菌体抗原を用いた多価ワクチンは製造上困難とされている。
本発明者らは既に、上記問題点（１）を解決するために、様々なＳＥ表面抗原物質に対し、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏との間に産生される抗体の種類に差があるかどうか調べ、ＳＥ表面抗原の１つであるべん毛抗原に対して、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏と、ＳＥ感染鶏との間に差があることを明らかにしている。
ＳＥの表面抗原としては、繊毛抗原として１４ｋＤａ、１７ｋＤａ及び２３ｋＤａのポリペプチドが知られ、夫々れサブユニットワクチンの抗原として研究されているが、未だワクチンとして効果的な抗原であることの報告はなされていない。
一方、日本公開特許公報特開２００１−１８６８７４号公報には、べん毛をサルモネラワクチンに関する適当な検出可能マーカー抗原とみなし、野生型形態に於いてはべん毛を保持するが、フラジェリン又はべん毛の抗原決定基の少なくとも一つに対する抗体を誘導する能力をもはや有さないサルモネラ属の細菌を利用するものとしたワクチンが記載されている
他方、問題点（２）のアジュバントによる問題に対して、例えば日本公開特許公報特開２００２−８０３９６号公報には、親水性油性アジュバントを使用して水中油中水滴型エマルションとなしたワクチン製剤により解決しようとすることが記載されているが、ＳＥ不活化ワクチンは菌体を死滅させた抗原を大量に含んでいるため、問題点（３）に示すように、サルモネラ属全体の多価ワクチンを作成することは困難とされている。この解決策としては、ＳＥ菌体の中で有効な抗原のみを取り出し、サブユニットワクチンとして多価ワクチンを作成することが有用と考えられるが、これまでサブユニットワクチンとしての有効なＳＥ抗原は報告されていない。
上記したように、ワクチン接種鶏と野外型感染鶏とを容易に識別でき、且つ被検体に対してストレスの少ないサブユニットＳＥ不活化ワクチン或いはＳＥ菌体を含む多価サブユニットＳＥワクチンの開発が強く望まれているが、未だ有効なものは確認されていない。本発明者らは、これに鑑みて鋭意研究を進めたところ、ＳＥべん毛抗原の主体を成すＦｌｉＣ（フラジェリン）である５３ｋＤａポリペプチド（ＳＥ  ＦｌｉＣ）の中の一部９ｋＤａポリペプチドが鶏に接種されたＳＥ不活化ワクチンによる特異抗体を特異的に検出することを見出し、このＳＥ  ＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を用いて、ＳＥ感染鶏及び現在市販のＳＥ不活化ワクチン接種鶏を血清学的に検査するための抗原処方物及び検査キットを提供することを目的とする。
更には、ＳＥのみならず、ＳＥ  ｆｌｉＣと高い相同性を示すべん毛抗原を持つサルモネラ菌属、例えばサルモネラ・ダブリン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎ）の不顕性感染に於いて、上記ＳＥの場合と同様に血清学的検査用の抗原処方物及び検査キットを提供する。
更には、ＳＥ  ＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチドがＳＥ不活化ワクチンの抗原に於いて、免疫組織学的に重要な役割を担っていることから、この抗原を含んだストレス反応の低いＳＥサブユニットワクチン或いはサルモネラサブユニットワクチンを提供する。
【発明の開示】
上記課題を解決するため、本発明では、野外型サルモネラ感染動物とワクチン接種感染動物とを識別するマーカー抗原にサルモネラ抗原処方物を使用するものとなし、該サルモネラ抗原処方物にサルモネラ種のべん毛抗原中に於けるフラジェリン５３ｋＤａ中の発現プロダクト９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を含有させるものとする。これにより、サルモネラ菌に自然感染した動物とワクチン接種により感染した動物とを正確に識別することが可能となる。
また、この際、上記抗原処方物は、サルモネラ種をサルモネラ・エンテリティディスとなしてサルモネラ菌に感染した鶏を識別するものとなしたり、９ｋＤａポリペプチドの複合物からなる抗原を、フラジェリン５３ｋＤａ中の発現プロダクト９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下ＧＳＴと云う）と融合させた融合蛋白質となして支持体上への定着を安定させるようになしたりする。
また、酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出する検査キットに於いて、サルモネラに対する抗体と免疫反応する抗原に上記サルモネラ抗原処方物を使用するものとし、該サルモネラ抗原処方物を担持させた支持体と、該支持体と共に検査反応に使用する種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン（以下ＯＰＤと云う）希釈液とからなる抗体検査キットを作成するものとする。
また、上記ＳＥ  ＦｌｉＣ  ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を一部に含ませたサルモネラサブユニットワクチン或いはＳＥサブユニットワクチンを製造し、サルモネラ菌属の感染に対して鶏やその他の動物を防御するようにする。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明に係る試料のアガロースゲル電気泳動法による７３３〜１００８ｂｐ領域のＰＣＲ像を示す。
図２は、本発明に係るＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドの分子量の確認像を示す。
図３は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＡ及びＥ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す。
図４は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＢ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す。
図５は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＣ及びＤ接種鶏由来血清のＷＢ応成績を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の抗原処方物に使用されるＳＥ  ｆｌｉＣ遺伝子は、ＳＥのべん毛ＦｌｉＣを構成する主要な蛋白質であるフラジェリン（５３ｋＤａ）をコードしており、１５１８塩基対で構成され、５０５個のアミノ酸をコードしている。また、ＳＥのアミノ酸配列と他のサルモネラのＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列及び塩基配列を比較すると、かなり高いホモロジーが存在することが確認された。そこで、本発明では、ＳＥフラジェリンのＳＥ特異的な領域の単離精製を遺伝子工学的に行い、ＳＥ  ＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を以下のようにして生成した。
Ａ．ＳＥ  ｆｌｉＣ遺伝子の単離と解析
１．ＰＣＲ法によるｆｌｉＣの増幅及びクローニング
既知の塩基配列を基に、ＰＣＲ用プライマーＳＥＦ及びプライマーＳＥＲを設計し、ＳＥ  Ｎｏ．１５の菌体よりゲノムＤＮＡを精製し、これをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの条件は、変性９４℃、３０秒間、アニーリング６０℃、３０秒間、増幅７２℃、９０秒間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。また、増幅されたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動法（１％アガロースゲル）により確認した（図１参照）。この増幅したＰＣＲ断片（ＤＮＡ）中の不純なＤＮＡを除去して精製するために、増幅した遺伝子をｐＣＲ２．１Ｔベクターにサブクローニングした後、大腸菌内で複製し、クローニングを試みた。
２．ｆｌｉＣ遺伝子の塩基配列の決定
クローニング後、単離した４クローンの内１クローンをテンプレートとし、プライマーＳＥＦ、ＳＥＲ、ＳＥＲ３、ＳＥＲ４を用い、塩基配列の決定を試みた。塩基配列の決定には、ＤＮＡオートシークエンサーＡＢＩ３１０（Ａｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ−ｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用い、ダイターミネーター法により行った。サイクルシークエンス反応条件は変性９６℃、１０秒間、アニーリング５０℃、５秒間、増幅７２℃、４分間を１サイクルとして２５サイクル繰り返した。
Ｂ．融合蛋白質の発現及び精製
３．発現クローンの作製
ＳＥ特異的であるｆｌｉＣ遺伝子の塩基配列中７３５ｂｐから１０１０ｂｐの領域のクローニングを試みた。７３３ｂｐから１００８ｂｐを増幅させるａｔｔＢアダプタープライマーをａｔｔＢ１ＳＥＦｅｐｉ及びａｔｔＢ２ＳＥＲｅｐｉを設計し、ｆｌｉＣ遺伝子の塩基配列を決定したクローンを鋳型にし、変性９４℃、３０秒間、アニーリング５５℃、３０秒間、増幅７２℃、３０秒間を１サイクルとして３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。得られたＤＮＡフラグメントをａｔｔＰサイトを含むドナーベクター（ｐＤＯＮＲＴＭ）に接続した。その後、大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換し、エントリークローンが構築されたことを確認し、このエントリークローンをデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴＴＭ１５）に移し換え、大腸菌（ＢＬ２１−Ｓ１ＴＭ）に形質転換して、発現クローンを作製した（図２参照）。上記ベクター及び大腸菌はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のものを使用した。
４．融合蛋白質の大量発現
次に、融合蛋白質を大量に発現させ、精製することを試みた。
形質転換体のオーバーナイトカルチャーを１ｍｌ作製し、これをＬＢ液体培地１００ｍｌに添加し、３７℃でＯＤ６００が０．５になるまで約６時間培養したあと、引き続き終濃度が０．３Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加し、３０℃で１２時間培養した。
５．融合蛋白質の精製
上記培養液を集菌し、プロテアーゼインヒビター（ＳＩＧＭＡ製）を２５０μｌ加え、これに終濃度０．２％となるようにトライトンＸ−１００を加え、エタノールバス及びウォーターバス（６０℃）にて３回凍結融解を繰り返し、菌を破砕した。破砕した菌を遠心分離し（１３，５００ｒｐｍ、１０分、４℃）、その遠心上清をＧＳＴｒａｐ  ＦＦ  ５ｍｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通し、融合蛋白質をカラム内の担体に結合させた後、１０ｍＭ還元型グルタチオン（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍｌで溶出した。溶出した融合蛋白質はＰＢＳで透析し精製標品とした。
本発明に於ける検査キットは、酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又はその他の流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキットであり、上記サルモネラ抗原処方物でコーティングされた支持体の他に、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びＯＰＤ希釈液で構成される。コントロール血清としては、サルモネラ陽性及びサルモネラ陰性の非交差反応血清が使用される。とりわけサルモネラ抗体定量用に有利なのは、フィールドインフェクション又はワクチネーションにより免役されたサルモネラ陽性の動物から得られたコントロール血清である。
本発明に於けるサブユニットワクチンは、上記ＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチド抗原或いはその複合物からなる抗原性物質と医薬上許容される担体とから構成される。
以下、上記サルモネラ抗原処方物をＥＬＩＳＡ法に用いるものとして、各試薬、試料を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに特に制限されるものではなく、他の酵素抗体法に用いてもよい。
支持体（以下ＥＬＩＳＡプレートと云う）は、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチド抗原をマイクロプレートにコーティングさせたものである。即ち、ＥＬＩＳＡプレートは、上記の如く精製したＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを融解後、蛋白濃度で０．０５μｇ／ウエルとなるようコーティング緩衝液で希釈し、マイクロプレートウエルに２〜５℃で１晩コーティングを行い、１％牛アルブミン−ＰＢＳ（滅菌リン酸緩衝生理食塩水）を用いて室温で１時間ブロッキング行い、その後ブロッキング液を除去してウエルを充分に乾燥させシールすることにより作製した。使用したコーティング緩衝液は、１０００ｍｌ中に炭酸水素ナトリウム２．９３ｇ、炭酸ナトリウム１．５９ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇを含有し、ｐＨ９．４〜９．６に調整されたものである。
この際、ＦｌｉＣ  ９ｋＤａポリペプチドをＧＳＴと融合させた抗原処方物を使用することにより、該抗原処方物をマイクロプレート上にコーティングし易く、また作製されたＥＬＩＳＡプレートも良好な安定性及び均一性並びに高感度のコーティングを得るものとなった。また、ＥＬＩＳＡプレートは、検出精度を維持するために、使用時まで２〜５℃の暗所にて保存することが好ましい。
サルモネラ陽性血清は、ＳＥ不活化ワクチン（レイヤーミューンＳＥ）で免役した鶏より作製する。２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏にレイヤーミューンＳＥを１．０ドース皮下接種し、アイソレーターの中で飼育する。ワクチン接種４週間後に採血し、血清分離を行い、５６℃で３０分間非動化する。市販のひな白痢診断用抗原により凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を行い、凝集価８倍を示す血清を５００倍希釈する。このものは、使用時まで−４０℃で保存するのが好ましいが、凍結乾燥させても良い。
サルモネラ陰性血清は、２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏より調整する。採血後、上記サルモネラ陽性血清と同様に血清分離及び非動化を行い、ＰＤ−ＲＰＡで陰性であることを確認してプールし、牛胎児血清を用いて１０倍希釈する。このものを５ｍｌ容のバイアル瓶に１００μｌずつ分注して凍結乾燥する。また、使用時まで２〜５℃の暗所に保存することが好ましい。
血清希釈液は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと云う）に牛胎児血清１０ｍｌ、ポリソルベート２０を１ｍｌ、アジ化ナトリウム０．０２ｇ、１％フェノールレッド０．３ｍｌ、ゲンタマイシン１ｍｌを加えて１０００ｍｌに調整し、スターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃で保存する。
コンジュゲート希釈液は、ＰＢＳにポリソルベート２０を２ｍｌ、牛胎児血清１ｍｌ、マラカイトグリーン０．０５ｇを加えて１０００ｍｌに調整し、血清希釈液と同様にスターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃で保存する。
ＯＰＤ希釈液は、蒸留水にクエン酸−水和物２１．０１ｇ、無水リン酸−水素ナトリウム２８．４０ｇ、３０％過酸化水素水１ｍｌを加えて１０００ｍｌに調整し、溶解後、２〜５℃で保存する。
上記の如く調整した試薬を用いたＥＬＩＳＡ法による検査手順を以下に示す。この際、各試薬は使用する前に室温に戻しておく。
まず、検査用試料を準備する。
試料としては鶏の血清或いは卵黄を用いたりする。該試料を１ｍｌシリンジで０．６ｍｌをマイクロテストチューブに取り、等量の血清希釈液を加えてよく混合し、試料の１次希釈液を作製する（２倍希釈）。次いで、試料希釈用マイクロプレート（ＦＡＬＣＯＮ製の組織培養用マイクロテストプレート平底、低蒸発タイプ、９６穴の蓋付きもの）にＡ段の１〜８列を除いて、血清希釈液を２５０μｌ／ウエルずつ分注し、試料の１次希釈液を４μｌ／ウエルずつ分注して、２０分間プレートミキサーで充分に攪拌して試料の２次希釈液を調整しておく（１２５倍希釈）。
１．１次血清との反応（試料との反応）
上記希釈用マイクロプレートのＡ段の１〜４列にサルモネラ陰性血清（５００倍希釈）、５〜８列にサルモネラ陽性血清（１０００倍希釈）を分注する。一方、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチド抗原を担持させたＥＬＩＳＡプレートのＡ段１〜８列を除いた全てのウエルに血清希釈液を７５μｌずつ分注し、上記試料の２次希釈液を２５μｌずつ加える（最終希釈が５００倍となる）。更に、該ＥＬＩＳＡプレートのＡ段１〜４列にサルモネラ陰性血清、５〜８列にサルモネラ陽性血清を夫々れ１００μｌずつ分注し、室温で３０分間、抗原と反応させる。
２．２次血清との反応（コンジュゲートとの反応）
１の反応が終了後、反応液を捨て、蒸留水でウエルを３回洗浄し、水分を除去した後、酵素で標識された抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ血清をコンジュゲート希釈液で３０００倍希釈となしたものを、全てのウエルに１００μｌずつ分注し、室温で３０分間反応させる。
３．基質との反応（発色）
２の反応が終了後、反応液を捨て、蒸留水でウエルを３回洗浄し、水分を除去した後、オルトフェニレンジアミンをＯＰＤ希釈液で適宜希釈したものを０．０５ｍｇ／ウエルとなるように各ウエルに分注し、１０分間室温で反応させる。
４．反応の停止
３の反応が終了後、３規定硫酸を全てのウエルに１００μｌずつ分注し発色を停止させる。
５．抗体価の決定
４の反応停止後、プレートリーダーで各試料の吸光度を（ＯＤ）を４９０ｎｍで測定し、ｍ−ＯＤ値（修正ＯＤ値）を次式により計算する。
ｍ−ＯＤ値＝（Ｓ−ＮＣ）／（ＰＣ−ＮＣ）  （Ｓ：試料のＯＤ値、ＰＣ：サルモネラ陽性血清のＯＤ値、ＮＣ：サルモネラ陰性血清のＯＤ値を示す）
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例１】  ・マーカー検出系としての試み及びｍ−ＯＤ値における陽性基準の設定
ＳＥ不活化ワクチン接種群を３群とし、以下の通り試料を採取した。
（１）８１〜９３日齢で市販のＳＥ不活化ワクチン（レイヤーミューンＳＥ−ＮＢ）を接種した１９２日齢の鶏群より鶏卵１８個、（２）４９〜５４日齢及び７０〜８９日齢でレイヤーミューンＳＥを接種した４２０日齢の鶏群より鶏卵１９個、（３）５７，５８日齢及び９６〜９９日齢でレイヤーミューンＳＥを接種した６９０日齢の鶏群より鶏卵２２個を採取した。従来のＳＥ抗体検出試験法として使用される市販のＣＡＦ−ＳＥエリーザ（弊社製）及びひな白痢診断用抗原を用いた急速平板凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を９ｋＤａポリペプチドをコーティングした本発明のＥＬＩＳＡ法と共に行った。結果を表１〜３に示す（表１：１９２日齢、表２：４２０日齢、表３：６９０日齢）。
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（比較例１）
約１年前に環境からＳＥが分離された農場より採取した１００個の卵の卵黄について、実施例１と同様に抗体の検出を行った。結果を表４に示す。
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ここに、上記したｍ−ＯＤ値における陽性基準は、ＳＥ不活化ワクチン接種群の中で６５０〜７２０日齢の鶏群由来の卵黄を用いた試験に於いて５０％以上の陽性率となること、且つＳＥ汚染農場由来の卵黄及び購入したＳＰＦ鶏群由来の卵黄（ＳＰＡＦＡＳ社より購入した鶏卵より採取）を用いた試験に於いて全て陰性となることを条件とした。
・成績及び考察
ＣＡＦ−ＳＥエリーザを用いた卵黄中のＳＥ特異抗体検出率は、日齢と共に低下することが明らかとなり、ＰＤ−ＲＰＡ法では、１９２日齢鶏群由来の卵黄で１例の陽性が認められたのみであるが、本発明のＥＬＩＳＡプレートに於いては、ｍ−ＯＤ値で０．１以上を陽性とした場合、１９２日齢及び４２０日齢鶏群由来卵黄を用いた場合約９５％の陽性率、６９０日齢鶏群由来卵黄でも陽性率は約７０％であった。また、ＳＥ分離農場からの卵黄では、本発明のＥＬＩＳＡプレートに於いてｍ−ＯＤ値０．１以上を示す検体は１例もなく、１００検体の最大ｍ−ＯＤ値は、０．０７であった。また、表には示さなかったが、購入したＳＰＦ鶏群由来卵黄は、本発明のＥＬＩＳＡプレートでは全て陰性であった。また、卵黄の代わりに血清を用いた場合もほぼ同様の結果が得られた。
以上により、本発明のＥＬＩＳＡプレートは、マーカー検出としての使用を可能にするものと考察し、ｍ−ＯＤ値０．１以上を陽性基準に設定される。
【実施例２】  ・産卵中のＳＥ投与鶏を用いた各種抗体検出法による抗体応答の経時的観察
過去５年間、ＳＥ分離歴のない農場の２４０日齢ハイライン系ホワイトレグホン２０羽を用いて、ＳＥ投与試験を２回行った（各試験につき、投与群と非投与対照群を５羽ずつ設定し、同時に試験を行った）。感染鶏舎内へ鶏を導入する前に鶏舎内及び鶏群のプール盲腸便についてＳＥ分離を行い、夫々れ陰性であることを確認した後、次の投与試験を行った。ＳＥ  Ｎｏ．１５株を３×１０９〜１０１０ＣＦＵ／羽となるように、２日開けて２回経口投与し、接種３日後、１週間後、２週間後、４週間後、６週間後、８週間後、１０週間後にクロアカスワブ、卵及び血液を採取してＳＥ分離を行った。結果を表５〜７に示す（表５：クロアカスワブ、表６：卵内容、表７：血液）。また、試験最終日に剖検を行い、盲腸内容、肝臓、脾臓及び輸卵管を採取してＳＥ分離を行った。結果を表８に示す。また、採取した血液及び卵を用いて、ＣＡＦ−ＳＥエリーザ、本発明のＥＬＩＳＡプレートでの反応性を調べると共に、ひな白痢診断用抗原を用いた急速平板凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を行った。結果を表９〜１２に示す（表９：試験Ｎｏ．１における血液中の経時的な抗体検査成績、表１０：試験Ｎｏ．１における卵黄中の抗体検査成績、表１１：試験Ｎｏ．２における血液中の抗体検査成績、表１２：試験Ｎｏ．２における卵黄中の抗体検査成績）。
尚、各検体からのＳＥ分離は以下の方法により行った。
クロアカスワブ、血液及び卵は約１０倍量のハーナテトラチオン酸塩基礎培地（ＨＴＢ）に採取し、３７℃で４８時間培養後にそれをＭＬＣＢに画線塗抹し、４８時間培養後にＳＥ陽性を判定し、そこで得られたコロニーをトリプトソーヤ寒天培地に移植して２４時間培養後、サルモネラ免疫血清Ｏ９群との反応を行い凝集性の有無を確認した。剖検時に無菌的に採取した輸卵管は、片方を結紮し形成中の卵を取り除いた後、もう一方からＨＴＢを加え内容物をよくもんで取り出し、その洗浄液を試料とした。肝臓及び脾臓は夫々れ５ｇずつを無菌的に採取した後、約１０倍量のＨＴＢを加えてホモゲナイズしたものを試料とした。これらを３７℃で４８時間増菌培養した後ＭＣＬＢに画線塗抹し、更に４８時間後にＳＥ陽性を判定した。そこで得られたコロニーをトリプトソーヤ寒天培地に移植して２４時間培養後、サルモネラ免疫血清Ｏ９群との反応を行い凝集性の有無を確認した。
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・成績と考察
各試料からのＳＥ分離を行った結果、クロアカスワブからは表５に示すとおり、試験Ｎｏ．１及び２において接種群の全ての鶏より少なくとも１度はＳＥ分離が認められたが、２週間後以降からＳＥ分離が認められない個体が、試験Ｎｏ．１では２羽、試験Ｎｏ．２では１羽存在した。
卵内容物及び血液からは、表６及び７に示すとおり、何れの時期に於いてもＳＥ分離は認められなかった。
盲腸内容、肝臓、脾臓及び輸卵管からは、表８に示すとおり、盲腸内容からのみ試験Ｎｏ．１の５羽中２羽においてＳＥ分離が認められた。尚、対照群に於いては全ての試料について陰性であった。
また、血液及び卵黄中の抗体を調べた結果、表９〜１２に示すとおり、ＣＡＦ−ＳＥエリーザに於いては、２群の検体Ｎｏ．１３，１４及び１５の血液が１，２，４週後の時点で陽性を示し、検体Ｎｏ．１１，１４及び１５の卵黄が血液で陽性が見られたのよりもやや遅れて２，４，６週後の時点で陽性を示した。一方、本発明の９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでは、全ての検体が陰性を示した。
以上より、ＳＥ投与産卵鶏に於いてもＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートの抗体検出法は、血清及び卵黄共に全てに陰性を示すことから、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏の血清及び卵黄を用いた検査に於いてマーカー検出法に適していると判断される。
【実施例３】  ・市販されているＳＥ不活化ワクチン接種鶏由来血清を用いた試験
市販のＳＥ不活化ワクチンが５３ｋＤａポリペプチドに対する抗体産生能を有しているかどうかについて検討した。
市販のＳＥ不活化ワクチンＡを２６日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｂを３１日齢のＳＰＦ鶏１０羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｃを３３日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．５ｍｌ／羽接種、Ｄを３３日齢のＳＰＦ鶏５羽に０．２５ｍｌ／羽接種、Ｅを３３日齢のＳＰＦ鶏４羽に０．２５ｍｌ／羽接種し、夫々れ接種４週後に得られた血清を用いて、ＣＡＦ−ＳＥエリーザ及び本発明のＥＬＩＳＡプレートによるＥＬＩＳＡ反応及び５３ｋＤａポリペプチド並びにＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを抗原としたＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ＷＢ）反応を行い、夫々れ抗原に対する抗体産生性を確認した。ＷＢ法では２種類のポリペプチドを用いて１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、それをニトロセルロース膜に転写し、各試験血清１μｌと室温で９０分間反応させた後に２次血清として抗ニワトリＩｇＧウサギ血清を２０００倍希釈したものを用いて室温で９０分間反応させた。最後に基質として４−クロロ１−ナフトールを使用した。結果を表１３に示す。
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・成績と考察
ＥＬＩＳＡ法では、ＳＥ不活化ワクチンＣ、Ｄ、Ｅは用法用量で規定されている量の半量を接種したため、低い抗体価を示す鶏群もあったが、ＷＢ法に於いては５３ｋＤａポリペプチド及びＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを抗原とした両方の場合で全ての検体でバンドが認められたため（図３〜５参照）、市販のＳＥ不活化ワクチンは５３ｋＤａポリペプチド及び９ｋＤａポリペプチドに対する抗体産生を誘導するものと考えられる。
以上より、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏について、５３ｋＤａ或いは９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いた検出法（ＥＬＩＳＡ法）、及びこれら抗原を用いたＷＢ法によりＳＥ感染鶏と区別することができた。
【実施例４】  ・ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドの細胞への接着性確認試験
ＳＥ  ｆｌｉＣの一部である９ｋＤａポリペプチドがＳＥのコロニー形成の最初のステップとなる上皮細胞への接着作用を持つかどうかの確認を行った。
ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたプレート、対照抗原として市販のＳＥエリーザプレート（ＣＡＦ−ＳＥエリーザ）、ＮＤエリーザプレート及び１％牛アルブミンＰＢＳ液を０．１ｍｌ／ウエルずつ分注し、１時間室温に置いた後、液を捨てた状態のプレートに夫々れ１．９×１０４個／ウエルとなるようＭＥＭで調整したＨｅＬａ細胞を分注して、３７℃で１時間反応後、液を捨てＭＥＭでウエルを洗浄し細胞の接着状態を観察した。
・成績と考察
ＨｅＬａ細胞と各プレートとの反応は、牛アルブミンのみを分注したプレートでは接着（−）、市販のＳＥエリーザプレート（ＣＡＦ−ＳＥエリーザ）では（＋）、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドをコーティングしたプレートでは（＋＋）、市販のＮＤエリーザプレートでは（＋＋＋）となり、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドはＨｅＬａ細胞に接着する抗原であることがわかった。
よって、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドはＳＥ  ｆｌｉＣの中でも上皮細胞に接着することによりコロニー形成に重要な役割を果たす抗原であると考えられる。
【産業上の利用可能性】  以上の如く構成した本発明により、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏との間に血清学的なマーカーとなりうる違いを確認できることが明らかとなった。これにより、ＦｌｉＣ９ｋＤａのポリペプチド又はその複合物を用いて、ＳＥ不活化ワクチン接種鶏とＳＥ感染鶏とを容易に識別することができるものとなる。また、ＦｌｉＣ９ｋＤａのポリペプチド又はその複合物がＳＥ不活化ワクチンの抗原の中で免疫組織学的に重要な役割を担っていることから、この抗原をサブユニットワクチンとして多価ワクチンを製造することができる。更に、この抗原処方物はＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチドからなるべん毛抗原を持つサルモネラ菌属全ての不顕性感染にとって有効であることから、ＳＥに限らず他のサルモネラ菌属の検出にも適用できるものとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月25日(2004.10.25)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキットであり、支持体上にサルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン希釈液とからなり、野外型感染鶏とワクチン接種鶏とを血清学的に検査するものとなしたことを特徴とするサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【請求項２】
ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原は、該９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと融合させた融合蛋白質となしたことを特徴とする請求の範囲１に記載のサルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キット。
【請求項３】
サルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を含んでなる、サルモネラ・エンテリティディスの感染に対して鶏を防御するものとなしたことを特徴とするサルモネラサブユニットワクチン。
【手続補正００２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【技術分野】
この発明は、サルモネラ抗原処方物を使用して野外型感染鶏とワクチン接種鶏とを識別するための検査用キット、並びにサブユニットワクチンに関するものである。
【背景技術】
サルモネラ属の細菌は人及び動物の両方に於いて病原性を示すことが知られている。とりわけ、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ以下ＳＥと云う）は、人の食中毒の原因菌の一つとして１９８０年代後半より注目されてきた。このＳＥは多くの研究により、養鶏場に於いて産生される殼付き卵を汚染していることが知られるようになり、養鶏場（採卵場）に於けるＳＥ対策が重要視されている。
近年、養鶏場のＳＥ対策として一般的な衛生管理を向上させることの他に、採卵鶏の若齢期にＳＥ不活化ワクチンを接種することが試みられている。しかしながら、この場合、次のような問題点がある。
（１）ＳＥ不活化ワクチンを接種した場合、ＳＥ特異抗体は産生されるが、この産生されたＳＥ特異抗体は野外型ＳＥの自然感染と血清学的に区別することができない。
（２）現在広く普及しているＳＥ不活化ワクチンは、菌体を不活化した抗原、即ちＳＥの菌体をホルマリンにより死菌としたものを中心抗体として使用しているため、菌体内の毒素（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）を含んでおり、ワクチンを接種することにより様々な副反応（例えば鶏増体重を阻害する）を引き起こすことが知られている。


【手続補正００３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
り出し、サブユニットワクチンとして多価ワクチンを作成することが有用と考えられるが、これまでサブユニットワクチンとしての有効なＳＥ抗原は報告されていない。
上記したように、ワクチン接種鶏と野外型感染鶏とを容易に識別でき、また鶏に対してストレスの少ないＳＥ不活化ワクチン或いはＳＥの有効な抗原を含む単価或いは多価サブユニットサルモネラワクチンの開発が強く望まれているが、何れについても未だ有効なものは確認されていない。本発明者らは、これに鑑みて鋭意研究を進めたところ、ＳＥべん毛抗原の主体を成すＦｌｉＣ（べん毛の主要抗原）であるＳＥ５３ｋＤａポリペプチド（ＳＥＦｌｉＣ）の中の一部９ｋＤａポリペプチドが鶏に接種されたＳＥ不活化ワクチンにより産生された抗体を特異的に検出できる抗原であることを見出し、このＳＥＦｌｉＣ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を用いて、現在市販のＳＥ不活化ワクチン接種鶏を血清学的に検出するための抗原処方物を使用した検査キットを提供することを目的とする。
更には、ＳＥ９ｋＤａポリペプチドを鶏に接種した場合、鶏はＳＥに感染する免疫学的に防御能を誘導することから、この抗原を含んだストレス反応の低いＳＥサブユニットワクチン或いはサルモネラサブユニットワクチンを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題を解決するため、本発明では、酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又は体液及び組織抽出液からなる流動体試科内のサルモネラに対する抗体を検出する検査キットを、支持体上にサルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を担持させた支持体と、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びオルトフェニレンジアミン（以下ＯＰＤと云う）希釈液とから構成し、該サルモネラ抗原処方物を使用した抗体検査キットを、野外型感染鶏とワクチン接種鶏


【手続補正００４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
とを血清学的に検査するために使用されるものとなしたことを特徴とする。これにより、サルモネラ菌に自然感染した野外型感染鶏とＳＥ不活化ワクチン接種により感染したワクチン接種鶏とを血清学的に正確に識別することが可能となる。
また、この際、上記ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原は、該９ｋＤａポリペプチドをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下ＧＳＴと云う）と融合させた融合蛋白質となして支持体上への定着を安定させるようになしたりする。
また、上記サルモネラ種のべん毛抗原の主要抗原である５３ｋＤａポリペプチド中のＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物からなる抗原を含ませたサルモネラサブユニットワクチン成いはＳＥサブユニットワクチンを製造し、サルモネラ菌属の感染に対して鶏を防御するようにする。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係る試料のアガロースゲル電気泳動法による７３３〜１００８ｂｐ領域のＰＣＲ像を示す。
図２は、本発明に係るＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドの分子量の確認像を示す。
図３は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＡ及びＥ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す。


【手続補正００５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
図４は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＢ接種鶏由来血清のＷＢ反応成績を示す。
図５は、本実施例に於けるＳＥ不活化ワクチンＣ及びＤ接種鶏由来血清のＷＢ応成績を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の抗原処方物に使用されるＳＥ  ｆｌｉＣ遺伝子は、ＳＥのべん毛を構成する主要な蛋白質であるＦｌｉＣ（５３ｋＤａ）をコードしており、１５１８塩基対で構成され、５０５個のアミノ酸より構成されている。また、ＳＥのアミノ酸配列と他のサルモネラのＮ末端とＣ末端のアミノ酸配列及び塩基配列を比較すると、かなり高いホモロジーが存在することが確認された。そこで、本発明では、ＳＥＦｌｉＣの特異的な領域（９ｋＤａポリペプチド部分）の単離精製を遺伝子工学的に行い、ＳＥ９ｋＤａポリペプチド又はその複合物を以下のようにして精製した。
Ａ．ＳＥ  ｆｌｉＣ遺伝子の単離と解析
１．ＰＣＲ法によるｆｌｉＣの増幅及びクローニング
既知の塩基配列を基に、ＰＣＲ用プライマーＳＥＦ及びプライマーＳＥＲを設計し、ＳＥ  Ｎｏ．１５株の菌体よりゲノムＤＮＡを精製し、これをテンプレートとしてＰＣＲ法により増幅した、ＰＣＲの条件は、変性９４℃、３０秒間、アニーリング６０℃、３０秒間、増幅７２℃、９０秒間を１サイクルとして３０サイクル繰り返した。また、増輻されたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動法（１％アガロースゲル）により確認した（図１参照）。この増幅したＰＣＲ断片（ＤＮＡ）中の不純なＤＮＡを除去して精製するために、増幅した遺伝子をｐＣＲ２．１Ｔベクターにサブクローニングした後、大腸菌内で複製し、クローニングを試みた。
２．ｆｌｉＣ遺伝子の塩基配列の決定
クローニング後、単離した４クローンの内１クローンをテンプレートとし、プライマーＳＥＦ、ＳＥＲ、ＳＥＲ３、ＳＥＲ４を用い、塩基配列の決定を試みた。塩


【手続補正００６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
バス及びウォーターバス（６０℃）にで３回凍結融解を繰り返し、菌を破砕した。破砕した菌を遠心分離し（１３，５００ｒｐｍ、１０分、４℃）、その遠心上清をＧＳＴｒａｐ  ＦＦ  ５ｍｌカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）に通し、融合蛋白質をカラム内の担体に結合させた後、１０ｍＭ還元型グルタチオン（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５ｍｌで溶出した。溶出した融合蛋白質はＰＢＳで透析し精製標品とした。
本発明に於ける検査キットは、酵素抗体法により、血清試料、卵黄試料又はその他の流動体試料内のサルモネラに対する抗体を検出するためのキットであり、上記サルモネラ抗原処方物でコーティングされた支持体の他に、種々のコントロール血清、血清希釈液、コンジュゲート希釈液及びＯＰＤ希釈液で構成される。コントロール血清としては、サルモネラ陽性及びサルモネラ陰性の鶏血清が使用される。とりわけサルモネラ抗体定量用に有利なのは、フィールドインフェクション又はワクチネーションにより免役されたサルモネラ陽性の鶏から得られたコントロール血清である。
本発明に於けるサブユニットワクチンは、上記ＳＥ９ｋＤａポリペプチド抗原或いはその複合物からなる抗原性物質と医薬上許容される担体とから構成される。
以下、上記サルモネラ抗原処方物をＥＬＩＳＡ法に用いるものとして、各試薬、試料を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに特に制限されるものではなく、他の酵素抗体法に用いてもよい。
支持体（以下ＥＬＩＳＡプレートと云う）は、ＧＳＴ９ｋＤａポリペプチド抗原をマイクロプレートにコーティングさせたものである。即ち、ＥＬＩＳＡプレートは、上記の如く精製したＧＳＴ９ｋＤａポリペプチドを融解後、蛋白濃度で０．０５μｇ／ウエルとなるようコーティング緩衝液で希釈し、マイクロプレートウエルに２〜５℃で１晩コーティングを行い、１％牛アルブミン  ＰＢＳ（滅菌リン酸緩衝生理食塩水）を用いて室温で１時聞ブロッキング行い、その後ブロッキング液を除去してウエルを充分に乾燥させシールすることにより作製した。使用したコーテ


【手続補正００７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ィング緩衝液は、１０００ｍｌ中に炭酸水素ナトリウム２．９３ｇ、炭酸ナトリウム１．５９ｇ、アジ化ナトリウム０．２ｇを含有し、ｐＨ９．４〜９．６に調整されたものである。
この際、ＳＥ９ｋＤａポリペプチドをＧＳＴと融合させた抗原処方物を使用することにより、該抗原処方物が安定化すると共にマイクロプレート上にコーティングし易く、且つ作製されたＥＬＩＳＡプレートも良好な安定性及び均一性並びに高感度のコーティングを得るものとなった。また、ＥＬＩＳＡプレートは、検出精度を維持するために、使用時まで２〜５℃の暗所にて保存することが好ましい。
サルモネラ陽性血清は、ＳＥ不活化ワクチン（レイヤーミューンＳＥ）で免役した鶏より作製する。２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏にレイヤーミューンＳＥを１．０ドース皮下接種し、アイソレーターの中で飼育する。ワクチン接種４週間後に採血し、血清分離を行い、５６℃で３０分間非動化する。市販のひな白痢診断用抗原により凝集反応（ＰＤ−ＲＰＡ）を行い、凝集価８倍を示す血清を５００倍希釈する。このものは、使用時まで−４０℃で保存するのが好ましいが、凍結乾燥させても良い。
サルモネラ陰性血清は、２１〜７０日齢のＳＰＦ鶏より調整する。採血後、上記サルモネラ陽性血清と同様に血清分離及び非動化を行い、ＰＤ−ＲＰＡで陰性であることを確認してプールし、牛胎児血清を用いて１０倍希釈する。このものを５ｍｌ容のバイアル瓶に１００μｌずつ分注して凍結乾燥する。また、使用時まで２〜５℃の暗所に保存することが好ましい。
血清希釈液は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと云う）に牛胎児血清１０ｍｌ、ポリソルベート２０を１ｍｌ、アジ化ナトリウム０．０２ｇ、１％フェノールレッド０．３ｍｌ、ゲンタマイシン１ｍｌを加えて１０００ｍｌに調整し、スターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃で保存する。
コンジュゲート希釈液は、ＰＢＳにポリソルベート２０を２ｍｌ、牛胎児血清１ｍｌ、マラカイトグリーン０．０５ｇを加えて１０００ｍｌに調整し、血清希釈液と同様にスターラーを用いて溶解し、濾過滅菌後、滅菌容器に小分けして２〜５℃




【国際調査報告】
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