(57)【要約】治療を所望する腫瘍に対するヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効、特に抗腫瘍効果を予測するのに有用な遺伝子を提供するため、少なくとも、▲１▼腫瘍細胞を、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤感受性腫瘍細胞と抵抗性腫瘍細胞とに分類する工程、および▲２▼感受性腫瘍細胞ならびに抵抗性腫瘍細胞のそれぞれにおいて、その遺伝子発現様式を調べて、（ｉ）感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは（ｉｉ）感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子を選択する工程を含むヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効予測の指標となり得る遺伝子を得る方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効予測の指標となり得る遺伝子を得る方法であって、少なくとも、
▲１▼腫瘍細胞に対して、インビボにおけるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を調べ、当該腫瘍細胞について、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対して感受性を有する細胞種（感受性腫瘍細胞）と抵抗性を有する細胞種（抵抗性腫瘍細胞）とに分類する工程、および
▲１▼上記工程▲２▼で分類された感受性腫瘍細胞ならびに抵抗性腫瘍細胞のそれぞれにおいて、その遺伝子発現様式を調べて、さらに
（ｉ）感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは
（ｉｉ）感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子
を選択する工程
を含む方法。
【請求項２】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、以下の化学式（Ｉ）：
2004074478.tif 000010
で表される化合物であるかまたはその医薬上許容し得る塩である、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍細胞が前立腺癌、胃癌、または腎臓癌由来のものである、請求の範囲１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求の範囲１に記載の方法で得られた少なくとも１つの遺伝子の発現量を、少なくとも１種の腫瘍細胞において調べることを特徴とする、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する方法。
【請求項５】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、以下の化学式（Ｉ）：
2004074478.tif 000011
で表される化合物であるかまたはその医薬上許容し得る塩である、請求の範囲４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの遺伝子が、感受性細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子である、請求の範囲４または５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの遺伝子が、感受性細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子である、請求の範囲４または５に記載の方法。
【請求項８】
請求項の範囲１に記載の方法で得られた少なくとも１つの感受性細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、および少なくとも１つの感受性細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子の発現量を、少なくとも１種の腫瘍細胞において調べることを特徴とする、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が前立腺癌、胃癌、または腎臓癌由来のものである、請求の範囲４〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効、具体的には抗腫瘍効果を予測するのに有用な遺伝子を得る方法、ならびに当該遺伝子の発現様式を調べることを含む該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効（抗腫瘍効果）を予測する方法に関する。
【背景技術】  近年、患者の個人差を考慮した「オーダーメイド医療」が重要視され、薬剤が効く癌、効かない癌を識別するためのマーカー探索が必要とされている。これは、薬剤が効くという可能性をあらかじめ検証してから患者に投薬することによって、薬剤の奏効率をあげるとともに毒性を回避し、無意味な薬剤使用を抑制することで倫理的・医療的に薬剤治療のコストパフォーマンスを上昇させる試みである。また、癌治療においては、基礎研究と臨床の間の溝を埋める重要な手段となりうるため、抗癌剤の薬効を予測する方法の開発が望まれていた。
例えば、式（Ｉ）
2004074478.tif 000002
で表される化合物（以下、化合物Ａとも称する；配列表配列番号１）、特に式（ＩＩ）
2004074478.tif 000003
で表される立体異性体（ＦＫ２２８）が、ヒストンデアセチラーゼ阻害作用を有し、強力な抗腫瘍活性を誘導することが報告されている（例えば特公平７−６４８７２号公報、「エクスペリメンタル  セル  リサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，（米国），１９９８年，第２４１号，ｐ．１２６−１３３参照）。しかしながら、該化合物の抗腫瘍効果を予測できる因子を立証した報告はなく、インビトロでの結果がそのままインビボでも適用できるのか否か、どの腫瘍に対してもインビボで有用な効果を示すのか否か、等解決すべき点が多く残されているのが現状である。
【発明の開示】
本発明の目的は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、特に強力なヒストンデアセチラーゼ阻害作用を有することが知られている化合物Ａの薬効を予測するのに有用な、薬効予測の指標となり得る遺伝子を得る方法ならびに、該遺伝子の発現様式を調べることを特徴とする当該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効を予測する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究を行った結果、腫瘍の種類によって、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果が変動すること、さらに当該変動がある特定の遺伝子や蛋白質の発現様式の変化に連動して観察されることを見出し、これらの特定の遺伝子（タンパク質）を同定し、また腫瘍における、これらの遺伝子の発現様式を観察し、かかる観察をもとにヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効を予測または評価する方法を見出して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効予測の指標となり得る遺伝子を得る方法であって、少なくとも、
▲１▼腫瘍細胞に対して、インビボにおけるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を調べ、当該腫瘍細胞について、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対して感受性を有する細胞種（感受性腫瘍細胞）と抵抗性を有する細胞種（抵抗性腫瘍細胞）とに分類する工程、および
▲２▼上記工程▲１▼で分類された感受性腫瘍細胞ならびに抵抗性腫瘍細胞のそれぞれにおいて、その遺伝子発現様式を調べて、さらに
（ｉ）感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは
（ｉｉ）感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子
を選択する工程
を含む方法。
（２）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、以下の化学式（Ｉ）：
2004074478.tif 000004
で表される化合物であるかまたはその医薬上許容し得る塩である、（１）に記載の方法。
（３）腫瘍細胞が前立腺癌、胃癌、または腎臓癌由来のものである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）（１）の方法で得られた少なくとも１つの遺伝子の発現量を、少なくとも１種の腫瘍細胞において調べることを特徴とする、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する方法。
（５）ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、以下の化学式（Ｉ）：
2004074478.tif 000005
で表される化合物であるかまたはその医薬上許容し得る塩である、（４）に記載の方法。
（６）少なくとも１つの遺伝子が、感受性細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子である、（４）または（５）に記載の方法。
（７）少なくとも１つの遺伝子が、感受性細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子である、（４）または（５）に記載の方法。
（８）（１）に記載の方法で得られた少なくとも１つの感受性細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、および少なくとも１つの感受性細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子の発現量を、少なくとも１種の腫瘍細胞において調べることを特徴とする、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する方法。
（９）腫瘍細胞が前立腺癌、胃癌、または腎臓癌由来のものである、（４）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＦＫ２２８のヒト前立腺癌（（ａ）；ＰＣ−３）および腎臓癌（（ｂ）；ＡＣＨＮ）に対する抗腫瘍効果を示すグラフである。縦軸は腫瘍増殖率を、横軸は初回投与後の経過日数を示している。腫瘍増殖率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効、特に抗腫瘍効果を予測する指標となる遺伝子を得る方法を提供する。かかる方法により得られる遺伝子の腫瘍細胞における発現様式を解析することにより、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤がその治療に有用であるか否か、あるいは対象とする癌が該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に有効であるか否か等の情報を得ることができ、「オーダーメイド医療」に貢献することが可能となる。また、標的とする腫瘍細胞において抗腫瘍効果を発揮することができるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、実際に人体に投与することなく見出すことが可能となる。
「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」とは、ヒストンデアセチラーゼの活性部位に基質と競合して結合する化合物、またはヒストンデアセチラーゼの活性部位とは別の部位に結合してヒストンデアセチラーゼの酵素活性を変える作用を有する化合物を意図し、既にヒストンデアセチラーゼ阻害剤として、その用途が公知の化合物を含め、ヒストンデアセチラーゼ阻害活性を有することが報告されている全ての化合物（合成、天然を問わない）ならびに今後報告されるであろう全ての化合物を含む。具体的には、上述の化合物Ａまたはその塩やその誘導体（例えば、化合物Ａをアセチル化したものやＳ−Ｓ結合を還元したチオール体等）が挙げられる。さらにトリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）、ＭＳ−２７５、Ｃｙｃｌｉｃ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ−ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ、Ａｐｉｃｉｄｉｎ、Ｔｒａｐｏｘｉｎ等もヒストンデアセチラーゼ阻害活性が報告されている化合物である。
化合物Ａは、不斉炭素原子および二重結合に基づく光学異性体または幾何異性体等の立体異性体を有することがあるが（例えばＦＫ２２８）、これらすべての異性体及びそれらの混合物もこの発明において用いられるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の範囲に含まれる。
さらに、化合物Ａ、ＦＫ２２８またはそれらの塩の溶媒和化合物（例えば包接化合物（例えば水和物等））もこの発明の範囲に含まれる。
本明細書中、特に断りのない限り、単に化合物Ａという場合には式（ＩＩ）で表される化合物（ＦＫ２２８）も含む、立体異性を問わない化合物群を意味する。
化合物Ａまたはその塩は、公知の物質であり、入手可能である。例えば、化合物Ａの立体異性体の一つであるＦＫ２２８は、それを生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株を好気性条件下に培養、当該培養ブロスから当該物質を回収することによって得ることができる。ＦＫ２２８を生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株としては、例えばクロモバクテリウム・ビオラセウムＷＢ９６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９６８）が挙げられる。ＦＫ２２８はより具体的には特公平７−６４８７２号（対応米国特許４９７７１３８号）公報に記載のとおりにして当該生産菌から得ることができる。ＦＫ２２８は、より容易に入手できるという点で、ＦＫ２２８を生産しうるクロモバクテリウム属に属する菌株からの回収が好ましいが、さらなる精製工程が不要あるいは少なくてすむという点で、合成あるいは半合成のＦＫ２２８もまた有利である。同様にＦＫ２２８以外の化合物Ａについても、従来公知の方法により半合成、全合成することができる。より具体的にはＫｈａｎ  Ｗ．Ｌｉ，らによって報告されている方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１１８，７２３７−７２３８（１９９６））に準じて製造することができる。
化合物Ａの塩としては、無機塩基との塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）、有機塩基との塩（例えばトリエチルアミン塩、ジイソプロピルエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、エタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩）、無機酸付加塩（例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機カルボン酸・スルホン酸付加塩（例えばギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等）、塩基性あるいは酸性アミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）との塩等の、塩基との塩または酸付加塩が挙げられる。
本発明において、インビボ、インビトロとは通常、当分野で用いられている用語どおりであり、すなわち、「インビボ」とは、対象とする生体の機能や反応が生体内で発現される状態を意味し、「インビトロ」とは当該機能や反応が試験管内（組織培養系、細胞培養系、無細胞系等）で発現されることを意味する。
本発明のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する指標となり得る遺伝子を得る方法は、少なくとも以下の工程を含む。
▲１▼腫瘍細胞に対して、インビボにおけるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を調べ、当該腫瘍細胞について、該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対して感受性を有する細胞種（感受性腫瘍細胞）と抵抗性を有する細胞種（抵抗性腫瘍細胞）とに分類する工程、および
▲２▼上記工程▲１▼で分類された感受性腫瘍細胞ならびに抵抗性腫瘍細胞のそれぞれにおいて、その遺伝子発現様式を調べて、さらに
（ｉ）感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは
（ｉｉ）感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子
を選択する工程。
本発明において使用する試験対象となる腫瘍細胞（以下、単に試験細胞とも称する）としては、ヒストンデアセチラーゼを有する細胞であれば特に限定されないが、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果、特に該阻害剤の腫瘍部位特異性を評価することも本発明の課題の一つであることから、使用する試験細胞は、その効果を調べたい腫瘍由来の細胞であることが好ましい。例えば、前立腺癌への効果を評価する場合には、ヒト前立腺培養癌細胞であるＰＣ−３細胞等が用いられ、腎臓癌への効果を評価する場合には、ヒト培養腎臓癌細胞であるＡＣＨＮ細胞等が用いられる。これらの癌細胞を含め試験細胞として使用する各種培養ヒト癌細胞は、市販されているかあるいは、種々の細胞バンク等から入手可能である。また、長期的な治療効果、あるいは個々の患者に対する有効性、すなわちオーダーメイド医療を鑑みる上で、患者の腫瘍から得られる癌細胞を培養し、当該癌細胞を試験細胞として用いることも可能である。
腫瘍細胞に対して、インビボにおけるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を調べる工程は、例えば以下のような手順で行う。
まず、試験対象となる腫瘍細胞をマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット等の試験動物に移植して実験的に腫瘍を形成させる系を作製する。かかる系において、腫瘍移植後にヒストンデアセチラーゼ阻害剤を投与し腫瘍の増殖率を測定することによってヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を評価する。増殖率の測定は簡便には形成される腫瘍のサイズを測定することにより行う。
試験動物への腫瘍細胞の移植は当分野で通常行われているようにして実施することができる。例えばヌードマウスで継代増殖させた固形腫瘍の一部をマウスに移植する方法が挙げられる。また、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の投与も通常、その抗腫瘍効果を期待して投与されるのと同様な量が、同様な方法で投与され得る。即ち、腹腔内、静脈内、筋肉内または経口投与による適用が挙げられ、また、投与量は投与すべき試験動物の種類、体重、移植した癌の種類によっても異なるが、通常マウスに静脈内投与する場合であれば、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ程度を投与する。
また、試験動物への投与を目的として、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を溶液にする場合の溶媒はヒストンデアセチラーゼ阻害剤を溶解することが可能で、且つ、試験対象となる腫瘍細胞あるいは試験動物に対し毒性を示さない限り特に制限はなく、通常、エタノール、ＰＥＧ４００、１０％ＨＣＯ−６０溶液、ジメチルスルホキシド等、およびそれらの混合溶媒等で濃縮液を調製してから、生理食塩水等の生理的緩衝液で所望の濃度に希釈して使用する。
所定のヒストンデアセチラーゼ阻害剤をある任意の投与量投与した場合に、増殖抑制率が７０％以上（好ましくは８０％以上）の強い増殖抑制効果が認められた腫瘍細胞を、そのヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対する「感受性腫瘍細胞」に、増殖抑制率が３０％以下（好ましくは２０％以下）の弱い増殖抑制効果が認められた腫瘍細胞を、そのヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対する「抵抗性腫瘍細胞」に、それぞれ分類する。
例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤が化合物Ａの場合、化合物Ａ感受性腫瘍細胞と化合物Ａ抵抗性感受性細胞とに分類する。
化合物Ａ感受性腫瘍細胞とは、化合物Ａによって前述の基準による腫瘍細胞の強い増殖抑制効果が認められるタイプの腫瘍細胞をいい、例えば、後述する実施例からも示されるように前立腺癌細胞ＰＣ−３が挙げられる。また、他に胃癌の細胞であるＳＣ−６も化合物Ａ感受性腫瘍細胞の１種である。一方化合物Ａ抵抗性腫瘍細胞とは、前述の基準による化合物Ａによる腫瘍細胞の弱い増殖抑制効果しか認められないタイプの腫瘍細胞をいい、例えば、後述する実施例からも示されるように腎臓癌細胞ＡＣＨＮが挙げられる。また、他に腎臓癌細胞であるＡ４９８も化合物Ａ抵抗性腫瘍細胞の１種である。
分類された感受性腫瘍細胞ならびに抵抗性腫瘍細胞のそれぞれにおいて、その遺伝子発現様式を調べて、さらに（ｉ）感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子、あるいは（ｉｉ）感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子（以下、当該遺伝子を総称して、抗腫瘍効果予測遺伝子とも称する）を選択する工程は、本明細書中に記載される各技術ならびに当分野で通常実施される方法を用いて行うことができる。好ましくは、一度に大量の遺伝子の発現様式が解析できるという利点から遺伝子チップを用いた技術を用いる。
腫瘍細胞における抗腫瘍効果予測遺伝子の発現様式を解析することは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を患者に投与することなくインビトロの試験によって該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効を予測する有力な手段となり得る。
本発明は、抗腫瘍効果予測遺伝子の発現量を少なくとも１種、好ましくは２種以上の腫瘍細胞において調べることを特徴とするヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果を予測する方法を提供する。
遺伝子の発現様式を解析する方法もまた、当分野で通常実施される方法を用いて行うことができる。例えば以下のような手順が挙げられる。
（１）試験対象となる腫瘍細胞から遺伝子、特にｍＲＮＡ、または蛋白質を抽出する。
かかる工程は、通常当分野で用いられる方法によって行うことができ、また、必要な試薬等を含めたキットも利用することができる。腫瘍細胞からの遺伝子あるいは蛋白質の抽出は、適当にコンフルエントになった腫瘍細胞から抽出してもよいが、より多量に抽出できるので、マウス等の動物で継代し、さらに移植・増大させた腫瘍片から抽出することが好ましい。
（２）特定の遺伝子（または特定の蛋白質）に特異的に親和性を有する物質を用いて、該特定の遺伝子（または特定の蛋白質）の存在を検出する。ここで、特定の遺伝子（または特定の蛋白質）としては、上記したヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効予測の指標となり得る遺伝子あるいは、該遺伝子がコードする蛋白質であり、具体的には後述する表１〜３に挙げられる遺伝子である。
本発明において測定する特定の遺伝子（または特定の蛋白質）は、１種類の測定でも充分に有用であるが、より詳細な抗腫瘍効果を知る必要がある場合には、２種以上の特定の遺伝子（または特定の蛋白質）を同時に測定することが好ましい。より好ましくは、感受性腫瘍細胞で発現が高く抵抗性腫瘍細胞で発現が低い遺伝子の群、あるいは感受性腫瘍細胞で発現が低く抵抗性腫瘍細胞で発現が高い遺伝子の群の、それぞれの群から少なくとも１種ずつの発現を解析することが好ましい。
特定の遺伝子または特定の蛋白質に特異的に親和性を有する物質としては、それらの試験細胞中での発現が検出できる程度の感度を有するものであれば特に制限されない。ここで、「特異的親和性」とは目的の遺伝子または蛋白質にのみハイブリダイズまたは結合する性質を意味する。特定の遺伝子を検出するための当該物質としては、当該遺伝子の全部もしくは一部に完全相補的なものか、もしくは上記性質を満たす範囲で１乃至数個のミスマッチを含んでいるものが挙げられる。具体的には当該遺伝子の塩基配列の全部もしくは一部、ならびにそれらの相補配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチド等が挙げられ、検出すべき遺伝子の形態に応じて適宜選択する。かかる物質は当該遺伝子との特異的親和性を有している限りはその由来は特に限定されず、合成されたものであっても、当該遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行なわれる方法によって精製されたものであってもよい。これらはまた蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。特定の蛋白質を検出するための当該物質としては、例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体またはその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体またはその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によってつくられる。これらの抗体またはその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
試験細胞からの遺伝子、特にｍＲＮＡの抽出、ならびに蛋白質の抽出は、当分野で通常実施されている方法を用いて、また適宜組み合わせて実施することができる。ｍＲＮＡを抽出した場合には、上記した特定の遺伝子に特異的親和性を有する物質を用いてノザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ法等の当分野で通常行なわれる手法を用いてその発現様式を調べる。一方、蛋白質を抽出した場合には、上記した特定の蛋白質に特異的親和性を有する物質（抗体またはその断片等）を用いてイムノブロット、ウエスタンブロット等の当分野で通常行なわれる手法を用いてその発現様式を調べる。
また、当該遺伝子の発現様式の解析は、上述の方法に加え、好ましくは、一度に大量の遺伝子の発現様式が解析できるという利点から遺伝子チップを用いた技術を用いる。
抗腫瘍効果予測遺伝子の発現様式を解析することにより、試験したヒストンデアセチラーゼ阻害剤が試験した腫瘍細胞に効果的に抗腫瘍活性を示すか否かを予測することができる。例えば感受性腫瘍細胞の方が抵抗性腫瘍細胞に比べて発現が２倍以上高い遺伝子群（抗腫瘍効果予測遺伝子Ａ）ならびに抵抗性腫瘍細胞の方が感受性腫瘍細胞に比べて発現が２倍以上高い遺伝子群（抗腫瘍効果予測遺伝子Ｂ）に分類した場合、抗腫瘍効果予測遺伝子Ａの発現が高い腫瘍細胞、および／または抗腫瘍効果予測遺伝子Ｂの発現が低い腫瘍細胞に対しては、当該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果が期待できる。
また、遺伝子チップを用いる場合には、以下のような操作を行って薬効を予測することができる。
１．化合物Ａ投与前の癌患者から腫瘍組織の一部を採取する。
２．腫瘍組織よりＲＮＡを抽出する。
３．抽出したＲＮＡより、ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡの合成、ｃＲＮＡの断片化を行なう。
４．遺伝子チップでハイブリダイゼーションを行なう。
５．遺伝子チップを洗浄、染色し、スキャンする。
６．感受性腫瘍の薬効予測候補遺伝子群の発現パターン＊）との相同性を検討する（＊）解析画面において、発現量が高い遺伝子（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄａｔａが１以上）は赤、発現量が低い遺伝子（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄａｔａが１未満）は青で表示される）。
７．相同性が高い腫瘍ほど薬効発現の可能性が高いと判断する。
臨床的に腫瘍細胞を患者から採取したものを試験細胞として用いた場合には、個々の患者による個体特異性をも反映した抗腫瘍効果の予測が可能となる。
本発明では、上述したようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤の抗腫瘍効果の評価方法を利用して、腫瘍の部位（種類）特異的な抗腫瘍活性を有するヒストンデアセチラーゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供することができる。対象となる腫瘍由来の試験細胞を用い、また、その効果を調べようとするヒストンデアセチラーゼ阻害剤で処理し、上述の方法に従ってその抗腫瘍効果の有無を調べることにより、個々の阻害剤の腫瘍の部位特異性を判断することができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例にて具体的且つ詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【実施例１】化合物Ａ感受性腫瘍および化合物Ａ抵抗性腫瘍の評価
（１）薬剤調製
ＦＫ２２８を必要量計り、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）を加え、超音波をかけ溶解する。陽性対照物質パクリタキセルは、試験に先立って２４ｍｇ／ｍＬとなるようＣｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ／ｅｔｈａｎｏｌ（１：１）液に溶解し、冷蔵保存した。用時、９倍量の生理食塩水を加えて希釈し２．４ｍｇ／ｍＬ（溶媒成分：５％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ−５％ｅｔｈａｎｏｌ−９０％ｓａｌｉｎｅ）とした。
（２）実験動物
薬剤の抗腫瘍試験には、日本チャールスリバーよりＢＡＬＢ／ｃＡＮｎＮＣｒｊ−ｎｕ／ｎｕマウス（雄、６週齢）を購入し、一週間以上の馴化飼育の後、実験に用いた。マウスはＳＰＦ環境下飼育し、水と餌を自由に摂取させた。
（３）実験腫瘍
ヒト培養腎臓癌細胞株１系（ＡＣＨＮ：ＡＴＣＣより入手）、ヒト培養前立腺癌細胞株１系（ＰＣ−３：ＡＴＣＣより入手）を２〜３×１０７個ヌードマウス皮下に移植し、増殖した固形腫瘍を３代以上継代後、実験に用いた。
（４）実験移植および群分け
ヌードマウスで継代した固形腫瘍を、約３ｍｍ角の腫瘍組織片としてマウスの右背部皮下に移植した。腫瘍移植後、腫瘍体積（１／２×長径×短径２）が１００〜３００ｍｍ３に達した時点で、１群を６匹に、腫瘍のばらつきが無くなるように群分けした。
（５）投与
投与は群分け当日（Ｄａｙ０）に開始した。ＦＫ２２８投与群には４日毎に３回（ｑ４ｄ×３）、ＦＫ２２８を静脈内投与した（３．２および１．８ｍｇ／ｋｇ）。陽性対照物質パクリタキセル投与群には５日間連続（ｑｄ×５）でパクリタキセルを静脈内投与した（２４ｍｇ／ｋｇ）。対照群には、溶媒（１０％ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ）のみを投与した（ｑ４ｄ×３）。各投与液量は０．１ｍＬ／１０ｇ体重を投与日に測定した体重をもとに算出した。なお、ＦＫ２２８の３．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑ４ｄ×３）およびパクリタキセルの２４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ（ｑｄ×５）はそれぞれのＭＴＤ量である。
（６）腫瘍サイズおよび体重の測定
腫瘍サイズ（長径、短径）および体重をＤａｙ０より週２回測定した。
（７）抗腫瘍効果の評価
腫瘍の増殖程度は腫瘍増殖率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）により評価した。増殖抑制率は、Ｄａｙ０における腫瘍体積を１としたときの、それ以後の腫瘍体積の相対的割合で表した。
結果を図１に示す。ＦＫ２２８は３．２ｍｇ／ｋｇの投与量でＰＣ−３に強い抗腫瘍作用を示した（図１（ａ））が、ＡＣＨＮ（図１（ｂ））に対して抗腫瘍作用を示さなかった。
【実施例２】化合物Ａ感受性腫瘍および化合物Ａ抵抗性腫瘍の評価
〈材料・手順〉
（１）実験材料
薬剤  化合物Ａ（ＦＫ２２８）
投与量：３．２ｍｇ／ｋｇ
投与容量：１０ｍＬ／ｋｇ
溶媒：１０％  ＨＣＯ−６０／ｓａｌｉｎｅ溶液
剤形：溶液（用時調製）
腫瘍細胞  ヒト前立腺癌ＰＣ−３（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト胃癌ＳＣ−６；財団法人実験動物中央研究所より入手（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト腎臓癌ＡＣＨＮ（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト腎臓癌Ａ４９８；ＡＴＣＣより入手（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
継代動物  雄性  ＢＡＬＢ  ｃ／  ｎｕ／ｎｕ
（２）手順と結果
実施例１に示した方法によりヌードマウスの皮下に３ｍｍ角の腫瘍片（ヒト前立腺癌ＰＣ−３、ヒト胃癌ＳＣ−６、ヒト腎臓癌ＡＣＨＮおよびヒト腎臓癌Ａ４９８）を移植し、腫瘍体積がおよそ１００〜３００ｍｍ３（長径９ｍｍ、短径８ｍｍ）になった時点でＦＫ２２８  ３．２ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した場合の腫瘍増殖抑制率はそれぞれ９８％、８４％、２０％および２９％であった。この結果から、ＰＣ−３およびＳＣ−６を化合物Ａ感受性腫瘍、ＡＣＨＮおよびＡ４９８を化合物Ａ抵抗性腫瘍とした。
【実施例３】遺伝子チップによる化合物Ａ感受性腫瘍ならびに化合物Ａ抵抗性腫瘍における遺伝子発現様式の解析
実施例２でその感受性あるいは抵抗性が確認された腫瘍における遺伝子発現様式を調べた。
（１）実験材料
腫瘍細胞  ヒト前立腺癌ＰＣ−３（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト胃癌ＳＣ−６；財団法人実験動物中央研究所より入手（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト腎臓癌ＡＣＨＮ（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
ヒト腎臓癌Ａ４９８；ＡＴＣＣより入手（腫瘍片  ３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ／マウス  移植部位  ｓ．ｃ．）
継代動物  雄性  ＢＡＬＢ  ｃ／  ｎｕ／ｎｕ
ＲＮＡ抽出  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ）
ＲＮａｓｅ，ＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＤＮＡ合成  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
エタチンメイト（ニッポンジーン）
Ｔ７−（ｄＴ）２４  Ｐｒｉｍｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｃＲＮＡ合成  ＢｉｏＡｒｒａｙ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
ｃＲＮＡ断片化  Ｔｒｉｚｍａ  Ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ）
氷酢酸（ＳＩＧＭＡ）
酢酸マグネシウム（ＳＩＧＭＡ）
酢酸カリウム（ＳＩＧＭＡ）
ハイブリダイゼーション  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＩＧＭＡ）
ＭＥＳ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ）
ＭＥＳ  Ｆｒｅｅ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ）
Ｈｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｏｌｎ．（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
使用ｃｈｉｐ  ＨｕＧｅｎｅ  ＦＬアレイ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
（２）細胞調製とＲＮＡ抽出
ヌードマウスの皮下に３ｍｍ角の腫瘍片（ヒト前立腺癌ＰＣ−３、ヒト胃癌ＳＣ−６、ヒト腎臓癌ＡＣＨＮおよびヒト腎臓癌Ａ４９８）を移植し、腫瘍体積がおよそ１００〜３００ｍｍ３（長径９ｍｍ、短径８ｍｍ）になった時点で腫瘍を摘出し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（５０）（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡを定量し、電気泳動で確認した。
（３）ｃＲＮＡの合成
ＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第２章〜第４章、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔおよびＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔのマニュアルに従い、ＲＮＡの精製、ｃＤＮＡの合成、ｃＲＮＡの合成、ｃＲＮＡの断片化を行った。
（４）ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニング
ハイブリダイゼーション、洗浄−染色、スキャンニングはＧｅｎｅＣｈｉｐマニュアルの第５章〜第７章に従って行った。
（５）解析
ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（マイクロアレイデータ解析ソフト：Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて解析を行った。
解析条件は以下の通りである。
解析条件
・Ｒａｗ  ｄａｔａが少なくとも４つの腫瘍細胞のうち１つの腫瘍で１００以上である。
・化合物Ａ感受性腫瘍間、または化合物Ａ抵抗性腫瘍間のｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄａｔａの差が２倍以内である。
・化合物Ａ感受性腫瘍と化合物Ａ抵抗性腫瘍のｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｄａｔａの差が２倍以上である。
結果、化合物Ａ感受性腫瘍の方が化合物Ａ抵抗性腫瘍より２倍以上発現が高い遺伝子を２７個（表１）、化合物Ａ抵抗性腫瘍の方が化合物Ａ感受性腫瘍より２倍以上発現が高い遺伝子を４９個（表２〜３）得た。
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表２〜３：化合物Ａ感受性腫瘍（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｔｕｍｏｒ）で発現が低く化合物Ａ抵抗性腫瘍（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｔｕｍｏｒ）で発現が高い遺伝子
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【産業上の利用可能性】  本発明の方法によって得られるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効、特に抗腫瘍効果の指標となり得る遺伝子は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効との相関性、ならびに該ヒストンデアセチラーゼ阻害剤への感受性あるいは抵抗性との相関性が示唆される遺伝子であり、これらの遺伝子がヒストンデアセチラーゼ阻害剤の薬効予測マーカーとして利用できる可能性が示された。
【配列表フリーテキスト】配列番号１：Ｘａａは式ＮＨ２Ｃ（ＣＨＣＨ３）ＣＯＯＨで表されるアミノ酸である。
式ＣＯＯＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨＣＨＣ２Ｈ４ＳＨ）ＯＨのカルボキシル基が１番目のアミノ酸であるＶａｌのアミノ基と結合し、水酸基が４番目のアミノ酸であるＶａｌのカルボキシル基と結合し、ＳＨ基が２番目のアミノ酸であるＣｙｓのＳＨ基とジスルフィド結合している。
本出願は、日本で出願された特願２００３−０４１７９０を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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