(57)【要約】本発明の目的は、哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、容易に高レベル生産性株を獲得することを可能にする発現ベクターを提供することである。本発明によれば、上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さない薬剤耐性遺伝子を含む、動物宿主細胞において遺伝子組換タンパク質の高生産性を誘導する発現ベクターが提供される。
2004070030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さない薬剤耐性遺伝子を含む、動物宿主細胞において遺伝子組換タンパク質の高生産性を誘導する発現ベクター。
【請求項２】
強発現誘導性プロモーターがヒトサイトメガロウイルスＭａｊｏｒＩｍｍｅｉｄａｔｅｌｙ−Ｅａｒｌｙ抗原プロモーター、ＣＭＶ５プロモーター（合成キメラープロモーター）、β−アクチンプロモーターまたはＳＶ４０初期プロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、コドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、またはブラストサイジン耐性遺伝子である、請求項１または２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
薬剤耐性遺伝子がネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項１から３の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項５】
薬剤耐性遺伝子が大腸菌トランスポゾンＴｎ５に由来するネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項１から４の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項６】
薬剤耐性遺伝子がポリアデニレーションシグナル配列により遮断された強発現誘導性プロモーターの下流に存在することによる読み過ごし効果によって、極微量の薬剤耐性遺伝子のメッセンジャーＲＮＡまたは蛋白質が生成する、請求項１から５の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項７】
薬剤耐性遺伝子の下流にさらに、動物細胞で作動可能なプロモーターを有さないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、請求項１から６の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項８】
薬剤耐性遺伝子の下流にさらに、上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、請求項１から７の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項９】
発現誘導性の低いプロモーターの下流に連結されたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、請求項１から６の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項１０】
発現誘導性の低いプロモーターが、哺乳動物細胞では通常極微量しか発現しない蛋白質遺伝子に由来するプロモーター、哺乳動物に感染しにくいウイルス抗原遺伝子に由来するプロモーター、または上記プロモーターからエンハンサー配列を除去したプロモーターである、請求項７から９の何れかに記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１から６の何れかに記載の発現ベクターの遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトに目的遺伝子を組み込むことによって得られる、組み換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項７から１０の何れかに記載の発現ベクターの遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトに目的遺伝子を組み込むことによって得られる、組み換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１から１０の何れかに記載の発現ベクターあるいは請求項１１または１２に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換体。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の組み換え発現ベクターを宿主動物細胞に導入することを含む、目的遺伝子を高発現する形質転換体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１１または１２に記載の組み換え発現ベククーを宿主動物細胞に導入することによって形質転換体を取得し、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に蛋白質を生産できる形質転換体を取得する方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の組み換え発現ベクターをジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞へ導入し、次いでメトトレキセートの存在下で該細胞を培養することを含む、目的遺伝子の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、動物細胞を宿主として組み換え蛋白質の高レベル生産を実現する動物細胞用ベクターＤＮＡに関する。本発明のベクターは、細菌、真核微生物、昆虫細胞を宿主とした場合には活性型蛋白質を生産できない蛋白質を発現させるのに特に有用である。
【背景技術】  組み換え蛋白質生産用のベクターは多数開発されており、細菌、真核微生物、昆虫細胞を宿主とした発現系では高い収率が期待できる。しかしながら、これらを宿主とする発現系では蛋白質の修飾に問題があったり、哺乳動物蛋白質に固有の特徴が失われたりすることがある。このため、例えば生物学的活性が糖鎖に依存する蛋白質の場合、哺乳動物細胞を宿主としてその蛋白質を生産することが必要になる。こうした要請にも拘わらず、哺乳動物細胞を宿主とする組換蛋白質発現系の生産性は一般に低く、導入遺伝子の安定性にも問題がある場合が多い。
哺乳動物細胞を宿主とした組換蛋白質生産の事例は、エリスロポイエチン（特表２００２−５２９１００）、ＩＦＮ−β（特開平７−２６５０８４）などに見られる。また、遺伝子組み換えモノクローナル抗体の生産に関しても数多くの報告がある（特開平７−６７６４８、特開平６−３０７８８、特開平６−２１７７８６）。
【発明の開示】
哺乳動物細胞を宿主とした組換蛋白質の生産性を向上は、治療用医薬品や診断薬などの製造において非常に重要であるばかりでなく、それらの開発研究にも大いに寄与している。そのため、哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、容易に高レベル生産性株の獲得を可能にするベクターの開発は急務とされている。
容易に高レベル生産性株の獲得を可能にするためには、より多くの目的物質の高レベル生産性株がより少ない形質転換細胞中に存在するようにできれば良い。それにより高レベル生産性クローンの選択が容易となる。
遺伝子発現のレベルは染色体上の位置により著しく異なることが見出されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，６７９頁，１９９０年）。高レベル生産性株の獲得のためには、形質転換に用いるベクターＤＮＡの性質、性能をもって染色体上の遺伝子発現のレベルの高い位置にターゲッティングすることが重用と考えられる。
上記した通り、本発明が解決すべき課題は、哺乳動物細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を宿主として、容易に高レベル生産性株を獲得することを可能にする発現ベクターを提供することである。
本発明者らは、目的とする遺伝子カセットが宿主細胞染色体上の遺伝子発現のレベルの高い位置に組み込まれたものがネオマイシン耐性株として結果として生き残る仕組みをもつベクターを開発した。染色体上の遺伝子発現のレベルの高い位置へのターゲッティングを可能にするためにはネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（以下、ＮＰＴと記載する）遺伝子発現量を極微量にすることが重要である。また、該ベクターはジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと記載する）遺伝子をもち、その発現量を制限する工夫を施すことによりメトトレキセート刺激により効率的な遺伝子増幅を可能にできる。本発明では上記の両者を可能にするベクターを開発した。結果として、高水準で安定的な蛋白質の産生を可能にするベクターを作製でき、本発明を完成した。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さない薬剤耐性遺伝子を含む、動物宿主細胞において遺伝子組換タンパク質の高生産性を誘導する発現ベクター。
（２）  強発現誘導性プロモーターがヒトサイトメガロウイルスＭａｊｏｒＩｍｍｅｉｄａｔｅｌｙ−Ｅａｒｌｙ抗原プロモーター、ＣＭＶ５プロモーター（合成キメラープロモーター）、β−アクチンプロモーターまたはＳＶ４０初期プロモーターである、（１）に記載の発現ベクター。
（３）  薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子、コドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、またはブラストサイジン耐性遺伝子である、（１）または（２）に記載の発現ベクター。
（４）  薬剤耐性遺伝子がネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子である、（１）から（３）の何れかに記載の発現ベクター。
（５）  薬剤耐性遺伝子が大腸菌トランスポゾンＴｎ５に由来するネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子である、（１）から（４）の何れかに記載の発現ベクター。
（６）  薬剤耐性遺伝子がポリアデニレーションシグナル配列により遮断された強発現誘導性プロモーターの下流に存在することによる読み過ごし効果によって、極微量の薬剤耐性遺伝子のメッセンジャーＲＮＡまたは蛋白質が生成する、（１）から（５）の何れかに記載の発現ベクター。
（７）  薬剤耐性遺伝子の下流にさらに、動物細胞で作動可能なプロモーターを有さないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、（１）から（６）の何れかに記載の発現ベクター。
（８）薬剤耐性遺伝子の下流にさらに、上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さないジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、（１）から（７）の何れかに記載の発現ベクター。
（９）  発現誘導性の低いプロモーターの下流に連結されたジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子又はコドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を有する、（１）から（６）の何れかに記載の発現ベクター。
（１０）  発現誘導性の低いプロモーターが、哺乳動物細胞では通常極微量しか発現しない蛋白質遺伝子に由来するプロモーター、哺乳動物に感染しにくいウイルス抗原遺伝子に由来するプロモーター、または上記プロモーターからエンハンサー配列を除去したプロモーターである、（７）から（９）の何れかに記載の発現ベクター。
（１１）  （１）から（６）の何れかに記載の発現ベクターの遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトに目的遺伝子を組み込むことによって得られる、組み換え発現ベクター。
（１２）  （７）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターの遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトに目的遺伝子を組み込むことによって得られる、組み換え発現ベクター。
（１３）  （１）から（１０）の何れかに記載の発現ベクターあるいは（１１）または（１２）に記載の組み換え発現ベクターを有する形質転換体。
（１４）  （１１）または（１２）に記載の組み換え発現ベクターを宿主動物細胞に導入することを含む、目的遺伝子を高発現する形質転換体の製造方法。
（１５）  （１１）または（１２）に記載の組み換え発現ベクターを宿主動物細胞に導入することによって形質転換体を取得し、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に蛋白質を生産できる形質転換体を取得する方法。
（１６）  （１２）に記載の組み換え発現ベクターをジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞へ導入し、次いでメトトレキセートの存在下で該細胞を培養することを含む、目的遺伝子の増幅方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、ネオマイシン耐性ベクターｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏ作製のフローチャートを示す。
図２は、ネオマイシン耐性／メトトレキセート耐性ベクターｐＮＤ作製のフローチャートを示す。
図３は、所望の遺伝子発現のためのカセットプラスミドｐＣＢ作製のフローチャートを示す。
図４は、哺乳動物細胞中で活性のある転写プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンを持った外来遺伝子発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２の作製のフローチャートを示す。
図５は、プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンの上流に転写終結のためのｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを配した外来遺伝子発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂの作製のフローチャートを示す。
図６は、翻訳効率向上のためのウサギβグロビン遺伝子イントロンを配した外来遺伝子発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂの作製のフローチャートを示す。
図７は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂのマップを示す。
図８は、ｈＧ−ＣＳＦ発現用ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦの作製のフローチャートを示す。
図９は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂをトランスフェクションしたクローンにより発現されたｈＧ−ＣＳＦのドットブロット法による検出例を示す。
図１０は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂをトランスフェクションした各クローンのｈＧ−ＣＳＦの発現量の分布を示す。
図１１は、実施例４で用いた本発明の発現ベクターｐＮＯＳのマップを示す。
図１２は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ／ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦをトランスフェクションしたクローンにより発現されたｈＧ−ＣＳＦのドットブロット法による検出例を示す。
図１３は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ／ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦをトランスフェクションしたクローンにより発現されたｈＧ−ＣＳＦのドットブロット法による検出例を示す。
図１４は、本発明の発現ベクターｐＮＯＳ／ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦをトランスフェクションした各クローンのｈＧ−ＣＳＦの発現量の分布を示す。
図１５は、ＣＭＶ５プロモーターの作製のフローチャートを示す。
図１６は、ＣＭＶ５プロモーターの作製のフローチャートを示す。
図１７は、ｐＣＭＶ５−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの作製のフローチャートを示す。
図１８は、ルシフェラーゼアッセイによるＣＭＶプロモーターとＣＭＶ５プロモーターの活性アッセイの比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
導入される薬剤耐性遺伝子（例えば、ＮＰＴ遺伝子など）の発現が起こらないかもしくは低すぎると、ベクターＤＮＡが導入された宿主細胞は対応する薬剤（例えば、ネオマイシン（以下、ＮＥＯ）など）に対する耐性を獲得できない。しかしながら、本発明者らがこれまでに行った研究においては、市販のベクターを含み通常のＮＰＴ遺伝子をもつベクターＤＮＡを用いたすべての場合、非常に多くのＮＥＯ耐性株が得られた。このような結果に基づく限り、ベクターＤＮＡから供与されたＮＰＴ遺伝子の発現は、トランスフェクションの結果得られた細胞が形質転換体であるかどうかの選択マーカーとしては寄与しているが、それ以上の効果はないと推定された。
本発明者らは、ＮＰＴ発現の発現誘導を極端に制限的にすることにより、ＮＰＴ遺伝子シストロンが宿主細胞染色体上の遺伝子発現のレベルの高い位置に組み込まれない限りＮＥＯ耐性獲得のために必要なレベルのＮＰＴ発現が起こらないように設計した。このことにより組み込まれるベクターＤＮＡが染色体上の遺伝子発現のレベルの極めて高い位置に導入されない限り形質転換された宿主細胞がＮＥＯに対して耐性の性質を獲得せず、ＮＥＯを一定量以上含んだ培地中では生存できないようにした。ベクターＤＮＡのＮＰＴ遺伝子シストロンに弱いプロモーターを使用した報告はいくつかあるが（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，２５９３頁，１９８６年；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，７，１２９６頁，１９８７年；ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年）、これらの事例において高生産性の形質転換体が有効かつ十分に選択されているとは考え難い。
本発明の原理は、大腸菌トランスポゾンＴｎ５に由来するＮＰＴ遺伝子シストロンを含むＤＮＡ断片を哺乳動物細胞で転写活性を持つプロモーターを持たない状態で、哺乳動物細胞で転写活性を持つプロモーターとそれに引き続いた強い転写終結活性を持つ至適なポリアデニレーションシグナルの下流に配置することにより形質転換された宿主細胞におけるＮＰＴの発現機構を著しく障害させ減衰せしめるものである。本発明の、ＮＰＴ遺伝子シストロンはプロモーターを持たないため、「プロモーターレスＮＰＴ遺伝子シストロン」と定義する。
すなわち、本発明は、上流から順番に強発現誘導性プロモーター、遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト、及びポリアデニレーションシグナル配列を含み、その下流に動物細胞で作動可能なプロモーターを有さない薬剤耐性遺伝子を含む発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、動物宿主細胞において遺伝子組換タンパク質の高生産性を誘導することができる。
本発明において、薬剤耐性遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、またはブラストサイジン耐性遺伝子などを使用でき、特に好ましくは、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子であり、最も好ましくは大腸菌トランスポゾンＴｎ５に由来するネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子である。また、本発明においては、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子におけるコドンの一部またはすべてをＣＨＯ細胞では使用頻度が低いコドンに置き換えることによって構築される配列番号５０に記載の塩基配列を有する弱発現性のネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（これを、コドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ネオマイシン耐性遺伝子とも言う）を薬剤耐性マーカーとして使用することによって、外来遺伝子発現ベクターを構築することもできる。
本発明においては、薬剤耐性遺伝子がポリアデニレーションシグナル配列により遮断された強発現誘導性プロモーターの下流に存在することによる読み過ごし効果によって、極微量の薬剤耐性遺伝子のメッセンジャーＲＮＡまたは蛋白質が生成する。
本発明の発現ベクターの宿主細胞染色体上の強発現性位置への組み込みは薬剤耐性遺伝子シストロンのもつ特性から対応する薬剤を含んだ培地中での生存株の選択により達成されることになるが、染色体上の当該位置における目的蛋白質の発現自体が強力に誘導される必要がある。このため、蛋白質遺伝子を組み込むマルチクローニングサイト（以下、ＭＣＳと記載する）のプロモーターおよびポリアデニレーションシグナル（以下、ｐｏｌｙＡと称する）には最も強い発現誘導性をもつものの中から選択する。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウイルスＩｍｍｅｄｉａｔｅ  Ｅａｒｌｙ（ｈＣＭＶ  ＭＩＥ：Ｃｅｌｌ，４１，５２１頁，１９８５年）プロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，４８３１頁，１９８７年）またはＳＶ４０初期プロモーター等が挙げられる。本発明においては、Ｍａｓｓｉｅ  Ｂらの文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８  Ｍａｒ；７２（３）：２２８９−９６．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ，Ｃｏｕｔｕｒｅ  Ｆ，Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ  Ｌ，Ｍｏｓｓｅｒ  ＤＤ，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ  Ｃ，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ  Ｐ，Ｂｅｌａｎｇｅｒ  Ｆ，Ｌａｎｇｅｌｉｅｒ  Ｙ．）に従って作成した配列番号４９に記載の塩基配列を有するＣＭＶ５プロモーターを該ＣＭＶプロモーターの代替として使用することによって、外来遺伝子発現ベクターを構築することもできる。
ｐｏｌｙＡシグナルにはヒト成長ホルモン由来のｐｏｌｙＡ配列等があげられる。本明細書中ではこの目的とする蛋白質遺伝子を組み込むＭＣＳをもつシストロンを「発現カセット」と称する。
本発明はまた、目的遺伝子を組み込んだ本発明の発現ベクターを宿主に導入した形質転換体、並びに当該形質転換体の製造方法に関する。
本発明の発現ベクターはまた、好ましくはＤＨＦＲ遺伝子シストロンを有することができる。この発現ベクターは、宿主細胞としてジヒドロ葉酸還元酵素欠損ＣＨＯ細胞を用い、該ベクターＤＮＡの遺伝子の該宿主細胞への遺伝子導入後にメトトレキセートによる該ベクターＤＮＡ中に含まれる遺伝子の効率的な増幅を可能にする。本発明においては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子におけるコドンの一部またはすべてをＣＨＯ細胞では使用頻度が低いコドンに置き換えることによって構築される配列番号５１に記載の塩基配列を有する弱発現性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（これを、コドン非最適化（ｄｉｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子とも言う）を選択マーカーとして使用することによって、外来遺伝子発現ベクターを構築することもできる。また、配列番号５１に記載の塩基配列を有する弱発現性のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子は、配列番号５０に記載の塩基配列を有する弱発現性のネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子と組み合わせて使用することもできる。
ＤＨＦＲ遺伝子シストロンにおいては、ＮＰＴ遺伝子シストロンに使用するものと同様に哺乳動物細胞中で発現可能なプロモーターを持たない形で強発現誘導性プロモーターを有する遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトとそれに引き続いた至適なポリアデニレーションシグナル配列の下流に配置したものか、あるいはＤＨＦＲ遺伝子シストロンに発現誘導性を低下させたプロモーター、例えばＣＨＯ細胞に対して通常非感染性であるＳＶ４０のウイルス抗原プロモーターからエンハンサー領域を除去したものを連結させて用いる。遺伝子増幅を促進するために本発明者らはＤＨＦＲ遺伝子の発現誘導性を弱くするかまたは抑制的にしておくことにより、培地中に含まれるＭＴＸが宿主細胞染色体に組み込まれたベクターＤＮＡの増幅を促すよう導く方がより効果的と考えた。
本発明はまた、蛋白質遺伝子を組み込んだ上記ＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有するベクターＤＮＡを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させ、宿主細胞染色体に組み込まれたベクターＤＮＡの増幅を行なうことを含む、蛋白質の高レベル生産性細胞クローンを得る方法を提供する。
本発明はさらに、蛋白質遺伝子を組み込んだ上記のベクターＤＮＡを用いた遺伝子導入により宿主細胞を形質転換させ、得られた形質転換体を無血清培地へ馴化させることを含む、無血清培地で安定的に高レベルの蛋白質生産をすることのできる高レベル生産性細胞クローンを得る方法を提供する。
本発明はまた、上記のＤＨＦＲ遺伝子シストロンおよび強発現誘導性プロモーターと至適ポリアデニレーションシグナル間に遺伝子組み込み用マルチクローニングサイトを有するベクターＤＮＡを提供する。このベクターＤＮＡは上記プロモーターレスＮＰＴ遺伝子シストロンを有するベクターＤＮＡの構築のために使用できる。
本発明において「シストロン」とは、プロモーター、構造遺伝子、ポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙＡ）を基本構成とする転写・翻訳により蛋白質を発現する単位を意味するが、これらのいずれかに関連するかもしくは任意のＤＮＡ配列を挿入配列として含んでも良い。「強発現誘導性プロモーター」とは、通常のベクターＤＮＡにおいて、蛋白質発現のために一般的に使用されているプロモーターを意味し、好ましくは、特に発現誘導性が高いヒトサイトメガロウイルスＭａｊｏｒＩｍｍｅｉｄａｔｅｌｙ−Ｅａｒｌｙ抗原プロモーター、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターなどのプロモーターを意味する。
本発明ベクターＤＮＡは、バックボーンベクター上に、ＮＰＴ遺伝子シストロン、発現カセットを組み込むことによって、さらにまた所望によりＤＨＦＲ遺伝子シストロンを組み込むことによって得ることができる。バックボーンベクターとしての制限は特になく、例えば、大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）を有するベクターＤＮＡ（ｐＵＣ系：Ｇｅｎｅ，３３：１０３頁，１９８５年等）が使用できる。
本発明のベクターの使用法として、蛋白質遺伝子を本発明のベクターのＭＣＳに組み込んだ後、カチオン系リポソーム法により宿主細胞に遺伝子導入を行い、ＮＥＯを含んだ培地中での生存株の選択を行い、蛋白質の高レベル生産性細胞クローンを得る方法が挙げられる。ＮＥＯをを含んだ培地中での生存株の選択で得られた細胞の多くは既に相対的に高い発現レベルを達成しているが、その中からさらに高い生産性をもつ細胞を選択するため蛋白質の発現レベルを測定してもよい。得られた高生産性細胞は限界希釈法を繰り返した後、継代して安定化させる。さらに高生産性株を得たい場合は、本発明のベクターとしてＤＨＦＲ遺伝子シストロンも有するベクターを使用し、培地中にＭＴＸを加え、宿主細胞内に組み込まれたＤＨＦＲ遺伝子を刺激することにより遺伝子増幅を行う。
さらに、実施例に記載の本発明の発現ベクター（ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２ＢまたはｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ）のより具体的な利用方法としては、以下の手順によって利用する方法が挙げられる。
（１）目的物質（タンパク質）の遺伝子をクローニングした後、（２）本発明の発現ベクター（ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２ＢまたはｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に組み込んで、発現構築物を作製する。（３）この発現構築物を大腸菌中で増幅させ、（４）ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲネガティブ）にリボフェクチン法またはエレクトロポレーションで遺伝子導入し、（５）培地中にＧ４１８を加え培養することによりＧ４１８耐性細胞をセレクトする。（６）得られた細胞を培養しながらクローニングを繰り返し、（７）目的物質の産生量の高いクローンを選択し、（８）さらに増殖速度が速くなり安定化するまで培養を継続する。（９）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。（１０）高生産性のクローンに対して、培地中にＭＴＸ（１５ｎＭ−１μＭ）を段階的に加えることにより導入された構築物のＤＮＡを増幅させ、（１１）改めて高生産性クローンを選択し、（１２）さらに増殖速度が早くなり安定化するまで培養を継続する。（１３）安定化したクローンの培地をＦＣＳ添加培地から漸次ＦＣＳ量を下げ、無血清培地への馴化を行う。なお培地の無血清化は（９）と（１３）のいずれの段階で行ってもよい。
以下の実施例により本発明の発現ベクターの製造方法および使用方法をさらに具体的に説明する。本実施例で用いられる出発プラスミド、プロモーター等の構成要素を同等のもので置き換えて実施することは当業者にとって容易であり、本発明の範囲は実施例によって限定さてるものではない。
【実施例】実施例１：本発明の発現ベクターの構築
（１）ネオマイシン耐性ベクター［ｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏ］の作製
ＮＥＯベクター［ｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏ］は、プラスミドｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３頁，１９８５年）由来の大腸菌複製オリジン（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）とネオマイシントスフォトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子シストロンを有する。大腸菌複製オリジンをＰＣＲ法にてプラスミドｐＵＣ１８より配列番号１および２に示す塩基配列を有するプライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲは次の条件で実施した。ＰＣＲキットは宝酒造から市販しているものを用い、１０倍濃縮反応緩衝液、ｄＮＴＰ溶液は全て添付品を使用した。まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに１０倍濃縮反応緩衝液、ｄＮＴＰ溶液、１００μＭの配列番号１および２に記載のプライマーそれぞれ１μｌ、鋳型ＤＮＡ１μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌを加えて完全に混合した後、タカラサーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲ反応を実施した。すなわち９４℃、５分間の加熱処理後、変性（９４℃、３０秒）、プライマーアニーリング（５５℃、３０秒）、増幅（７２℃、１分）の３ステップを３５回繰り返し、更に７２℃、５分間の処理をして反応を終了した。以下に記述ののＰＣＲ反応は同様の反応サイクルにて実施した。反応終了後得られた約６００塩基対からなるＰＣＲ産物を製制限酵素（以下に記述の制限酵素は全てＮＥＢ社製）のＳａｃ  ＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）、１μｌとＣｌａ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）、１μｌで３７℃２．５時間切断した。制限酵素処理後反応液の全量を１％アガロースゲルに添加し、６０ｍＡ、２５分間電気泳動を行なった。約６００塩基対からなるＤＮＡバンドをゲルごと回収し、−１３５℃、１０分間の凍結後に遠心分離を行ないその上清にＤＮＡ断片を回収した（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉカセット；３６ｎｇ／μｌ）。以下の制限酵素処理とＤＮＡ断片の回収は同様にして実施した。
次に３μｇのプラスミドｐＳＶ（Ｄ）Ｓ／Ｎｅｏ（特開平１０−１７９１６９）をそれぞれ１μｌの制限酵素Ｓａｃ  ＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）とＣｌａ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）で切断し、エンハンサー部分を除去したサルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターの下流にＮＰＴ遺伝子シストロンを有する約２２００塩基対からなるＤＮＡ断片（ＮＥＯカセット１；２８ｎｇ／μｌ）を調製した。この２つの断片をタカラＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により連結してｐＳＶＮＥＯ／Ｏｒｉ’を作成した。実際には１μｌのＣｏｌＥ１  ｏｒｉカセットと１μｌのＮＥＯカセット１を混合し、そこに混合液と等量のタカラＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを加え１６℃、３０分間反応させＤＮＡを連結させた。次いでルビジウム−クロライド法に従い大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１ＢｌｕｅＴＭコンピーテントセルの中に形質転換した。硫酸カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ；シグマ）を含むＬＢ−寒天（Ｄｉｆｃｏ社）上に得られた大腸菌コロニーを硫酸カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ；シグマ）を含むＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（１リットル中ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）１２ｇ、ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）２４ｇ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ（和光純薬社製）４ｍｌ、ＫＨ２ＰＯ４（和光純薬社製）２．３１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬社製）１２．５ｇを含有する）の中に接種した。約２０時間の培養の後集菌し、ブラスミドをアルカリ−ＳＤＳ法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１−６−３頁，１９８６年）に従い単離し、ｐＳＶＮＥＯ／Ｏｒｉ’を作成した。これ以降に記述するライゲーション、形質転換、ブラスミド単離は全て同様な方法で行なった。
次にｐＳＶＮＥＯ／Ｏｒｉ’をそれぞれ１μｌの制限酵素Ａｐａ  Ｉ（１０００Ｕ／μｌ）とＣｌａ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）で切断、精製して得られた約２８００塩基対からなるＤＮＡ断片（３８ｎｇ／μｌ）に新しく合成した配列番号３および４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングして得られるマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ｐＳＶＮＥＯリンカー）をライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経てｐＳＶＮＥＯ／Ｏｒｉを作成した。リンカー作製は配列番号３および４に記載のオリゴヌクレオチド（１００μＭ）を５０μｌずつをミクロチューブ（１．５ｍｌ；トレフ社製）に取り、ヒートブロックで７０℃、５分間加熱後、約１時間かけて２５℃まで冷ますことで実施した。これ以降のリンカー作製は同様にして実施した。
一方、プラスミドｐＳＶ２Ｎｅｏ（ストラタジーン社製）より配列番号５および６に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにてＮＰＴ遺伝子シストロンの大腸菌における発現誘導を司るプロモーター配列を含むＤＮＡ断片増幅させた。ＰＣＲキットは宝酒造から市販しているものを用い、１０倍濃縮反応緩衝液、ｄＮＴＰ溶液、１０倍濃縮塩化マグネシウム溶液は全て添付品を使用した。まず、滅菌蒸留水３１．５μｌに５μｌの１０倍濃縮反応緩衝液、５μｌのｄＮＴＰ溶液、５μｌの１０倍濃縮塩化マグネシウム溶液、１００μＭの配列番号５および６に記載のプライマーそれぞれ１μｌ、鋳型ＤＮＡ１μｌ、ＬＡタックＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）０．５μｌを加えて完全に混合した後、タカラサーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲ反応を実施した。以下のＬＡタックＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応は同様の混合比率にて行なった。得られた約４００塩基対からなるＰＣＲ産物をアガロースゲルにて展開、分離、精製した後（ＧＫＴ断片；５８ｎｇ／μｌ）、ＰＣＲ産物クローニング用プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）（５０ｎｇ／μｌ；ノバジェン社製）とライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経てｐＴ７Ｂ−ＧＫＴを作成した。
次に６μｇのｐＳＶＮＥＯ／Ｏｒｉを１μｌの制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で切断して得られた大腸菌複製オリジン、エンハンサー部分を除去したＳＶ４０初期プロモーター、ＮＰＴ遺伝子シストロンの部分配列を持つ約２８００塩基対からなる断片（３８ｎｇ／μｌ）と６μｇのｐＴ７Ｂ−ＧＫＴをＰｓｔ  Ｉで切断し得られたＮＰＴ遺伝子シストロンの部分配列を持つ約４００塩基対からなる断片（ＧＫＴカセット；９ｎｇ／μｌ）をライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏを作成した。［ｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏ］作製のフローチャートを図１に示す。
（２）ネオマイシン耐性／メトトレキセート耐性ベクター［ｐＮＤ］の作製
前述のｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏの５μｇをそれぞれ１μｌの制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）とＣｌａ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）で切断し、アガロースゲルにて展開、分離、精製し約３０００塩基対からなる断片ｐＳＶ／ＧＫＴ−Ｎｅｏカセット（４４ｎｇ／μｌ）を得た。また、ｐＳＶＰ（Ｄ）Ｓ／ＤＨＦＲ（特開平１０−１７９１６９）よりそれぞれ１μｌの制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）とＣｌａ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）での切断により得られたエンハンサー部分を除去したＳＶ４０初期プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子シストロンを持つ約１８００塩基対からなる断片（ＤＨＦＲカセット；２５ｎｇ／μｌ）を得た。ｐＳＶ／ＧＫＴ−ＮｅｏカセットとＤＨＦＲカセットをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経ててｐＮＤを得た。［ｐＮＤ］作製のフローチャートを図２に示す。
（３）所望の遺伝子発現のためのカセットプラスミド［ｐＣＢ］の作製
本ベクターはプロモーター、目的とするタンパク質遺伝子組み込み用マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）およびポリアデニレーションシグナルで構成する。プロモーターには、最も強力な発現誘導性をもつプロモーターの一つとされているヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）ＭＩＥ抗原プロモーターを由来として使用する（ＰＣＭＶ）。また、ｐｏｌｙＡシグナルにも高生産性でかつ再現性に優れているとの報告のあるウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル（ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡ）を採用した。
まず、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）より配列番号７および８に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製した約６５０塩基対からなるＰＣＭＶ断片をプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＴ７Ｂ−ＰＣＭＶを作成した。一方ｐＲｃ／ＣＭＶより配列番号９および１０に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅させた約６５０塩基対からなるｂＧＨ−ｐｏｌｙＡ断片をアガロースゲルにて展開、分離、精製した後プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ににライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＴ７Ｂ−ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを作成した。他方、５μｇのプラスミドｐＵＣ１８をそれぞれ１μｌの制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）で切断し、新しく合成した配列番号１１および１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングして得られるマルチプルな制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＣＢリンカー）を連結しｐＵＣ１８−ＣＢ−ｌｉｎｋｅｒを作成した。
次に、４．５μｇのｐＵＣ１８−ＣＢ−ｌｉｎｋｅｒをそれぞれ１μｌの制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）で開裂させた約２７００塩基対からなるＤＮＡ断片をアガロースゲルにて展開、分離、精製しｐＵＣ１８−ＣＢ−ｌｉｎｋｅｒカセットとした（２６ｎｇ／μｌ）。また、４．７μｇのｐＴ７Ｂ−ＰＣＭＶをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製しＰＣＭＶを含む約６５０塩基対からなるＤＮＡ断片（ＰＣＭＶカセット；１２ｎｇ／μｌ）を得た。さらに１．３μｇのｐＴ７Ｂ−ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＢａｍＨ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し約６５０塩基対からなるｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを含むＤＮＡ断片（ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡカセット；２ｎｇ／μｌ）を得た。ｐＵＣ１８−ＣＢ−ｌｉｎｋｅｒカセット、ＰＣＭＶカセット、ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡカセットをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て［ｐＣＢ］を完成させた。所望の遺伝子発現のためのカセットプラスミド［ｐＣＢ］の作製のフローチャートを図３に示す。
（４）哺乳動物細胞中で活性のある転写プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンを持った外来遺伝子発現ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２］の作製
５μｇのｐＣＢをそれぞれ１μｌの制限酵素ＢａｍＨ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）で開裂、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約２７００塩基対からなるＤＮＡ断片ｐＣＢカセット（３１ｎｇ／μｌ）を得た。次いで配列番号１３および１４に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼにより増幅させたＮＰＴ遺伝子シストロンを含むＰＣＲ産物をそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＮｈｅ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）で切断後アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約２７００塩基対からなるＤＮＡ断片ＮＥＯカセット２（３９ｎｇ／μｌ）を得た。ｐＣＢカセットとＮＥＯカセット２をライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経てｐＣＢ／ＧＫＴ−Ｎｅｏを得た。さらに、３μｇのｐＣＢ／ＧＫＴ−Ｎｅｏをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）とＥｃｏＲ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、ＰＣＭＶ、ＮＰＴ遺伝子、ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを含む約１０００塩基対からなるＤＮＡ断片（ＣＮＢカセット；１１ｎｇ／μｌ）を得た。
また、５μｇのｐＮＤをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｓａｃ  ＩＩ（２００００Ｕ／μｌ）、ＥｃｏＲ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）および１．５μｌの制限酵素Ｎａｅ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、ＣｏｌＥ１−Ｏｒｉとエンハンサー部分を除去したＳＶ４０初期プロモーターを持ったＤＨＦＲ遺伝子シストロンを含む約２３００塩基対からなるＤＮＡ断片（ＤＨＦＲカセット２；３３ｎｇ／μｌ）を得た。
更に、新しく合成した配列番号１５および１６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをアニーリングして制限酵素切断サイトを有するリンカー（ＨＳリンカー）を得た。それぞれ１μｌのＣＮＢカセット、ＤＨＦＲカセット２、ＨＳリンカーをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２］を作成した。哺乳動物細胞中で活性のある転写プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンを持った外来遺伝子発現ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２］の作製のフローチャートを図４に示す。
（５）プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンの上流に転写終結のためのｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを配した外来遺伝子発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂの作製
ｐＮＯＷ３（特開平１０−１７９１６９）より配列番号１７および１８に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約２００塩基対からなるＤＮＡ断片（ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡ；４２ｎｇ／μｌ）を得た。これをｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）とライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＴ７Ｂｌｕｅ／ＢＧＨｐＡを作成した。２．２μｇのｐＴ７Ｂｌｕｅ／ＢＧＨｐＡをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＮｈｅ  Ｉ（５０００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを含む約２００塩基対からなるＤＮＡ断片ｂＧＨ−ｐｏｌｙＡカセット２（３ｎｇ／μｌ）を得た。また、５μｇのｐＮＯＳ−ＧＫＴ２をそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＸｂａ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で開裂させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約４２００塩基対からなるＤＮＡ断片ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２カセット（１３ｎｇ／μｌ）を得た。それぞれ１μｌのｂＧＨ−ｐｏｌｙＡカセット２とｐＮＯＳ−ＧＫＴ２カセットをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂを作成した。プロモーターを持たないＮＰＴ遺伝子シストロンの上流に転写終結のためのｂＧＨ−ｐｏｌｙＡを配した外来遺伝子発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂの作製のフローチャートを図５に示す。
（６）翻訳効率向上のためのウサギβグロビン遺伝子イントロンを配した外来遺伝子発現ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ］の作製
ウサギゲノムＤＮＡ（ＣＨ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）より配列番号１９および２０に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼにを用いたＰＣＲにより増幅させたウサギβグロビン遺伝子のスプライスドナーとスプライスアクセプター配列を含んだイントロンをコードする領域（ｇｌｏＳＡ）のＰＣＲ産物（断片長約６００塩基対）をアガロースゲルにて展開、分離、精製し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）とライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＴ７Ｂ−ｇｌｏＳＡを作成した。
５μｇのｐＴ７Ｂ−ｇｌｏＳＡをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＸｈｏ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、ｇｌｏＳＡを含む約６００塩基対からなるＤＮＡ断片（ｇｌｏＳＡカセット；２２ｎｇ／μｌ）を得た。また、５μｇのｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂを制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＳａｌ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で開裂させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約４４００塩基対からなるＤＮＡ断片（ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂカセット；１３ｎｇ／μｌ）を得た。それぞれ１μｌのｇｌｏＳＡカセットとｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂカセットをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒを作成した。
翻訳効率向上のためのウサギβグロビン遺伝子イントロンを配した外来遺伝子発現ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ］の作製のフローチャートを図６に示す。また、［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ］の構造を図７に、全塩基配列を配列番号２１に示す。
実施例２：本発明の発現ベクターを用いたヒト顆粒球コロニー刺激因子の生産試験
発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒによるヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）遺伝子導入とＧ４１８耐性初期クローンの確立目的物質として、コロニー刺激因子の一種であるｈＧ−ＣＳＦを選択した。この蛋白質は糖鎖を有しており、大腸菌や酵母を宿主とした生産では正常な形の組み換え蛋白質は得られない。
（１）ｈＧ−ＣＳＦ発現用ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦ］の作製
ヒト脾臓ｃＤＮＡより配列番号２２および２３に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＬＡタックＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約６００塩基対からなるｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含む断片（ｈＧ−ＣＳＦ断片；１３ｎｇ／μｌ）を得た。これをｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）にライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｈＧ−ＣＳＦを作成した。ｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｈＧ−ＣＳＦをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＸｂａ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で切断、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約６００塩基対からなるｈＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片（ｈＧ−ＣＳＦカセット；６ｎｇ／μｌ）を得た。また、ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒをそれぞれ１μｌの制限酵素Ｎｏｔ  Ｉ（１００００Ｕ／μｌ）とＸｂａ  Ｉ（２００００Ｕ／μｌ）で開裂させ、アガロースゲルにて展開、分離、精製し、約５０００塩基対からなるＤＮＡ断片（ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒカセット；１９ｎｇ／μｌ）を得た。それぞれ１μｌのｈＧ−ＣＳＦカセットとｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒカセットをライゲーションにより連結し、形質転換、プラスミド単離を経て、ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂを作成した。ｈＧ−ＣＳＦ発現用ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦ］の作製のフローチャートを図８、全塩基配列を配列番号２４に示す。
（２）ｈＧ−ＣＳＦ発現用ベクター［ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦ］の哺乳動物細胞への導入とＧ４１８による形質導入株の選択
１μｇのｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦをリポフェクチン法（キアゲン社製エフェクテントランスフェクション試薬を使用）を用いて２５ｃｍ２のカルチャーフラスコ中の１５０００００個のＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株；Ｄｒ．Ｇａｉｌ  Ｕｒｌａｕｂから譲受；Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２，５５５頁，１９８６年）に遺伝子導入した。導入方法は製造業者の使用説明書に従った。４８時間後トリプシン処理により細胞を剥がし、細胞数の計測の後、３０００００個の細胞を１００ｍｌの０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄａｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ培地ににて希釈後、９６ウエルマイクロタイタープレート１０枚（９６０ウエル）中に播き、５％炭酸ガス存在下で３７℃、約３週間培養したところ、１１７ウエルにのみ細胞の生存が見られた（Ｇ４１８耐性株）。生存細胞のうちから任意に６１株のＧ４１８耐性クローンを選択し、１ｍｌの０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む１０％透析ウシ胎児血清添加Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄａｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ培地とともに２４ウエルプレートに移しコンフルエントになるまで培養した。培養上清を廃棄した後ＰＢＳ（インビトロジェン社製）１ｍｌを各ウェルに加えふたたびこれを廃棄した。これに０．５ｍｌのＣＨＯ細胞用無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（インビトロジェン社製）を加えて５％炭酸ガス存在下で３７℃、７２時間培養した。続いて培養上清中のｈＧ−ＣＳＦの生産量の検討を行なった。
（３）ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦ形質導入細胞クローンによるｈＧ−ＣＳＦの生産量の検定
生産量の検定はドットブロット法にて実施した。ナイロンメンブレン（ナイトラン０．４５μｍ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）上に７２時間培養上清１μｌと市販の組み換えｈＧ−ＣＳＦ（ペプロテック社製）のＣＨＯ細胞用無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩによる２倍希釈系列（８〜０．１２５ｎｇ／μｌ）とＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩそれぞれ１μｌをドットし、１時間の風乾、ブロックエースによるブロッキングの後１μｇ／μｌの濃度の抗ｈＧ−ＣＳＦ抗体（ペプロテック社製）とそれに引き続いてホースラッディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製）を反応させた。反応した抗体はスーパーシグナルウエストピコ試薬（ピアス社製）にてＨＲＰの活性を検出する方法でルミノキャプチャー（アトー社製）を用いて行なった。図９にドットブロット法にて得られた結果を示す。
（４）ｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂ−Ｒ／ｈＧ−ＣＳＦ形質導入細胞クローンによるｈＧ−ＣＳＦの生産量
本発明の発現ベクターｐＮＯＳ−ＧＫＴ２Ｂにより発現されたｈＧ−ＣＳＦの各クローンごとの発現量の分布を図１０に示す。
６１株のＧ４１８耐性株をｈＧ−ＣＳＦのところ約３分の２（３９株）はｈＧ−ＣＳＦを有意に高いレベル（０．２５μｇ／μｌ以上）で産生していた。また、６１株のうち３３株（５４．１％）は１μｇ／μｌ以上であった。さらに驚くべきことに１２株（１９．７％）は８μｇ／μｌ以上であった。最も高い産生レベルを示したもの１７８μｇ／ｍｌ／３ｄａｙｓであった。これは文献等で報告されている代表的な発現ベクターによる遺伝子増幅前の初期クローンのデータと比較して最も高い水準であった（ＤＮＡ，７，６５１頁，１９８８年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０．１４５５頁，１９９２年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，６６２頁，１９９０年；Ｇｅｎｅ，７６，１９頁，１９８９年；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６４頁，１９９１年）。
遺伝子増幅による組換細胞のスクリーニングには通常６ヶ月から１年を要しかつ培養条件や増幅刺激剤濃度による差異が大きいため、発現ベクターのプライマリーな性能比較は増幅前の初期クローンの発現レベルで行うのが適当と考えられる。これにより本発明の発現ベクターの性能は極めて高いことが判明した。この結果、「強力なポリアデニレーションシグナルに遮断されたプロモーターレスＮＰＴ遺伝子シストロンをもつ発現ベクター」は、得られるＧ４１８耐性株の数が極めて低い一方、非常に高い効率で目的物質タンパク質の高生産性細胞株の確立を可能にすることが確かめられた。これにより、本発明の発現ベクターは非常に高いタンパク質発現レベルを可能にすることが証明された。
実施例３：Ｇ４１８耐性細胞株の遺伝子増幅
Ｇ４１８耐性細胞株のうち、ｈＧ−ＣＳＦ産生が７７μｇ／ｍｌ／３ｄａｙｓであったクローンを継代培養し安定化させた後に、ＭＴＸによる遺伝子増幅を行った。始めに１５ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、６０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、２５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で２週間、１μＭのＭＴＸを含む培地でさらに２週間増幅させたところ、ｈＧ−ＣＳＦの産生レベルは培地当たり１１７μｇ／ｍｌ／３ｄａｙｓに上昇した。遺伝子増幅に用いるＭＴＸ濃度は一般に１０ｎＭ〜１０μＭの間の多段階とされ、最終濃度としては１０μＭがよく用いられるが、細胞に対する毒性の問題から高濃度暴露は安定な組換細胞株の樹立には問題がある。このため低濃度ＭＴＸで高生産性が達成できることも重要な評価基準となり、本実験では１μＭまでとした。また通常セレクションを含めたＭＴＸ暴露期間は６−１２ヶ月とされるのに対して、本実験では約８週間で行った。こうした実験条件にも拘わらず有効なｈＧ−ＣＳＦの産生量増加がみられ、遺伝子増幅系に関しても本発現ベクターの高い性能が確かめられた。
実施例４：ｐＮＯＳを使用した組み換えｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦの発現
（１）ｐＮＯＳ／ｈＧ−ＣＳＦ発現ベクターの作製
ＮＥＯ耐性遺伝子として大腸菌由来のＴｎ５をそのまま使用し、ＢＧＨｐＡの代わりにＨＧＨｐＡを使用する以外は、実施例１と同様にして発現ベクターをｐＮＯＳを構築した。また、実施例２（１）に記載の方法に準じて、クローニング部位にヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）遺伝子を挿入して、発現ベクターｐＮＯＳ／ｈＧ−ＣＳＦを構築した。ｐＮＯＳ／ｈＧ−ＣＳＦの構造を図１１に、全塩基配列を配列番号２５に示す。
（２）ｐＮＯＳを使用した組み換えｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦの発現量の測定
２５ｃｍ２フラスコで培養しているＣＨＯ細胞が４０〜８０％Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ状態の時に、Ｑｉａｇｅｎ会社から販売されているトランスフェクション試薬を用いて、ｐＮＯＳ−ｈｕｍａｎＧ−ＣＳＦ発現ベクターをＣＨＯ細胞に組み込んだ。２日後、トリプシン処理を行い培養フラスコから細胞を剥がし、血球計算版により細胞数を確認、細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌ／１００ｍｌになるように９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ×１０枚にまいた。２週間後、出現コロニーを数えたところ、１４６個のコロニーが確認できた。その９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ×１０枚中に出現していたシングルコロニー７２個を２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移す。２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移したクローンがＣｏｎｆｌｕｅｎｔになった時に、１×ＰＢＳで１回洗浄、その後、無血清培地を添加し３日後の培養上清を回収した。
メンブレンに３日後培養上清と希釈系列ｓｔａｎｄａｒｄを各々１μｌずつスポットした。１時間の風乾後、ブロッキングした。その後、ＴＢＳ／Ｔで１回洗浄した。洗浄終了後、１μｇ／ｍｌのｒａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ  ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ抗体による一次抗体反応を行なった。再度、ＴＢＳ／Ｔで３回洗浄した。ＨＲＰ−ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧによる二次抗体反応を行なった。再度、ＴＢＳ／Ｔで３回洗浄後、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｒｅａｇｅｎｔによる発光反応によりｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦの発現量を確認した。本発明の発現ベクターｐＮＯＳ／ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦにより発現されたｈＧ−ＣＳＦのドットブロット法による検出例を図１２および図１３に示す。また、ｐＮＯＳ／ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦにより発現されたｈＧ−ＣＳＦの各クローンごとの発現量の分布を図１４に示す。
ｐＮＯＳ発現ベクターを使用したｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ発現量をドットブロットにより確認した結果（濃度検定を実施したクローンは４６個）、ｐＮＯＳは１μｇ／ｍｌを越すクローンが６５％以上の確率で得られ、さらにそのうちの３３％は８μｇ／ｍｌを越す発現量を示した。
実施例５：ＣＭＶ５  ｐｒｏｍｏｔｅｒの作製（図１５及び図１６）
（Ｉ−１）  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２  ｇｅｎｏｍｅ１μｌよりＬ１領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ１領域のセンスプライマー［配列番号２６］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号２７］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラ゜ゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ４０ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−２）  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２  ｇｅｎｏｍｅ１μｌよりＬ２領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ２領域のセンスプライマー［配列番号２８］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号２９］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ７０ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−３）  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２  ｇｅｎｏｍｅ１μｌよりＬ３領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ３領域のセンスプライマー［配列番号３０］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３１］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ２００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−４）  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ２  ｇｅｎｏｍｅ１μｌよりＲ１，２，３領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｒ１，２，３領域のセンスプライマー［配列番号３２］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３３］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９８℃１分間の加熱処理後、９８℃５秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃２分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ１００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−５）  ｐＣＭＶＴｎＴ（１０ｎｇ／μｌ）１μｌを鋳型としてＣＭＶプロモーター領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰ・ＭｇＣｌ２はすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３１．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ，１０  ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、ＣＭＶプロモーターのセンスプライマー［配列番号３４］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３５］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・ＬＡ−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ６５０ｂｐ近辺にバンドが確認できた。［配列番号４１］
（Ｉ−６）  （Ｉ−１）のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると４０ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬ１（抽出濃度＝８２ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−７）  （Ｉ−２）のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると７０ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬ２（抽出濃度＝１０４ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−８）  （Ｉ−３）のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると２００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬ３（抽出濃度＝８８ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−９）  （Ｉ−４）のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると１００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＲ１２３とした。
（Ｉ−１０）  （Ｉ−５）のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると６５０ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＰＣＭＶ（抽出濃度＝５４ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−１１）  Ｉ−６，７，８の抽出物それぞれ１μｌを使用してＬ１２３領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰ・ＭｇＣｌ２はすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水２９．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ，１０  ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ１領域のセンスプライマー［配列番号２６］（１００μＭ）１μｌとＬ３領域のアンチセンスプライマー［配列番号３１］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ合計３μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・ＬＡ−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ３００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−１２）  Ｉ−１１のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると３００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬ１２３（抽出濃度＝８０ｎｇ／μｌ）とした。［配列番号４２］
（Ｉ−１３）  Ｉ−９の抽出物を使用しＲ１２３’領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｒ１２３領域のセンスプライマー［配列番号３２］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３６］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９８℃１分間の加熱処理後、９８℃５秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃２分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ１５０ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−１４）  Ｉ−１３のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると１５０ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＲ１２３−１（抽出濃度＝１０７ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−１５）  Ｉ−１４の抽出物を使用しＲ１２３’’領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｒ１２３領域のセンスプライマー［配列番号３２］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３７］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９８℃１分間の加熱処理後、９８℃５秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃２分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ１５０ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−１６）  Ｉ−１５のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると１５０ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＲ１２３−２（抽出濃度＝９５ｎｇ／μｌ）とした。［配列番号４３］
（Ｉ−１７）  Ｉ−１２のＰＣＲ由来抽出物（抽出濃度＝ｎｇ／μｌ）１μｌとｐＴ７Ｂｌｕｅ  １μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社・５０ｎｇ／μｌ）を混合。そこに等量のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１２℃・２時間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換体を得た。その後シークエンスを行い塩基置換の無いプラスミドを選択し、これより得られたプラスミドをｐＴ７Ｂ−Ｌ１２３とした。
（Ｉ−１８）  Ｉ−１６のＰＣＲ由来抽出物（抽出濃度＝ｎｇ／μｌ）１μｌとｐＴ７Ｂｌｕｅ  １μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社・５０ｎｇ／μｌ）を混合。そこに等量のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１２℃・２時間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換体を得た。その後シークエンスを行い塩基置換の無いプラスミドを選択し、これより得られたプラスミドをｐＴ７Ｂ−Ｒ１２３とした。
（Ｉ−１９）  Ｉ−１０のＰＣＲ由来抽出物（抽出濃度＝ｎｇ／μｌ）１μｌとｐＴ７Ｂｌｕｅ  １μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社・５０ｎｇ／μｌ）を混合。そこに等量のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１２℃・２時間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換体を得た。その後シークエンスを行い塩基置換の無いプラスミドを選択し、これより得られたプラスミドをｐＴ７Ｂ−ＣＭＶとした。
（Ｉ−２０）  Ｉ−１７のｐＴ７Ｂ−Ｌ１２３（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型としＬ１２３’領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ１２３領域のセンスプライマー［配列番号２６］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号３８］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ３００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−２１）  Ｉ−１８のｐＴ７Ｂ−Ｒ１２３（１０ｎｇ／μｌ）を鋳型としＲ１２３−ＩｇＧ３’領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰはすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水３６．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，１０  ｘ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｒ１２３領域のセンスプライマー［配列番号３９］（１００μＭ）１μｌとアンチセンスプライマー［配列番号４０］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ  １μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９４℃５分間の加熱処理後、９５℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃５分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ２００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。
（Ｉ−２２）  Ｉ−２０のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると３００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０ＸＩＩ間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬ１２３−１（抽出濃度＝８７ｎｇ／μｌ）とした。［配列番号４４］
（Ｉ−２３）  Ｉ−２１のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると３００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチューデに移した。この得られた抽出物をＲ１２３−ＩｇＧ３（抽出濃度＝７９ｎｇ／μｌ）とした。［配列番号４５］
（Ｉ−２４）  Ｉ−２２，２３の抽出物それぞれ１μｌを使用してＬ１２３−Ｒ１２３−ＩｇＧ３’領域のＰＣＲを行った。（ＰＣＲ  ｋｉｔは宝酒造から販売されているものでｂｕｆｆｅｒ・ｄＮＴＰ・ＭｇＣｌ２はすべて添付品を使用した。）まず、滅菌蒸留水２９．５μｌに２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ，１０  ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを加え、Ｌ１領域のセンスプライマー［配列番号１］（１００μＭ）１μｌとＲ１２３−ＩｇＧ３’のアンチセンスプライマー［配列番号１５］（１００μＭ）１μｌ，ＤＮＡ合計３μｌを鋳型とし、そこにＤＮＡポリメラーゼ・ＬＡ−Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）を０．５μｌ加えてピペッティングを行い完全に混合し、次の条件でＰＣＲを行った。すなわち、９８℃１分間の加熱処理後、９８℃５秒、５５℃２０秒、７２℃１５秒間の３ステップを３５回繰り返してから、７２℃２分間の処理をして反応を終了した。ＰＣＲ終了後、１％アガロースゲルを用いて電気泳動により目的遺伝子領域の増幅確認を行ったところ５００ｂｐ近辺にバンドが確認できた。［配列番号４６］
（Ｉ−２５）  Ｉ−２４のＰＣＲ反応液に３Ｍ  ＮａｏＡｃ・５μｌと１００％エタノール・１２５μｌを加え１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。遠心終了後ペレットを確認し静かに上清を除いた。そこに１ｘＤＳＢを１０μｌ加えペレットを完全に溶解。１％アガロースゲルにこの溶液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると５００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収し、−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬＲ１２３（抽出濃度＝５６ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−２６）  Ｉ−２５のＰＣＲ由来抽出物（抽出濃度＝ｎｇ／μｌ）１μｌとｐＴ７Ｂｌｕｅ  １μｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ社・５０ｎｇ／μｌ）を混合。そこに等量のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１２℃・２時間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換体を得た。その後シークエンスを行い塩基置換の無いプラスミドを選択し、これより得られたプラスミドをｐＴ７Ｂ−ＬＲ１２３とした。
（Ｉ−２６）  Ｉ−２５で得られたプラスミド・２．５μｇを使用し、制限酵素（ＮＥＢ社）ＢａｍＨ  Ｉ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）とＥｃｏＲ  Ｉ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）で２５℃・Ｏ／Ｎ消化しＬＲ１２３を切り出した。制限酵素処理後１％アガロースゲルに反応液１μｌをアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動した結果、ＤＮＡマーカーと比較すると２８００ｂｐと４００ｂｐ辺りにバンドが確認できた。再度１％アガロースゲルに反応液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動後に４００ｂｐ辺りに確認できるバンドを回収。回収したゲル抽出物を−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＬＲ１２３  ｄｉｇｅｓｔ（抽出濃度＝１６ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−２８）  Ｉ−１９で得られたプラスミド・２．５μｇを使用し、制限酵素（ＮＥＢ社）Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）とＢｇｌ  ＩＩ  １μｌ（１００００Ｕ／ｍｌ）で２５℃・Ｏ／Ｎ消化しＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒを切り出した。制限酵素処理後１％アガロースゲルに反応液１μｌをアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動した結果、ＤＮＡマーカーと比較すると２８００ｂｐと６５０ｂｐ辺りにバンドが確認できた。再度１％アガロースゲルに反応液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動後に６５０ｂｐ辺りに確認できるバンドを回収。回収したゲル抽出物を−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｇｅｓｔ（抽出濃度＝１４ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−２９）  ｐＣＢ・２．５μｇを使用し、制限酵素（ＮＥＢ社）Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）とＮｏｔ  Ｉ  １μｌ（１００００Ｕ／ｍｌ）で２５℃・Ｏ／Ｎ消化した。制限酵素処理後１％アガロースゲルに反応液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると３５００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収。回収したゲル抽出物を−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をｐＣＢ  ｄｉｇｅｓｔ（抽出濃度＝３０ｎｇ／μｌ）とした。
（Ｉ−３０）  Ｉ−２９で得られたｐＣＢ  ｄｉｇｅｓｔ（３０ｎｇ／μｌ）１μｌ，Ｉ−２６で得られたＬＲ１２３  ｄｉｇｅｓｔ（１６ｎｇ／μｌ）１μｌ，Ｉ−２７で得られたＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｉｇｅｓｔ（１４ｎｇ／μｌ）１μｌを混合し、これと等量（３μｌ）のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１６℃・３０分間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換を行い形質転換体を得た。形質転換体より得られたプラスミドをｐＣＭＶ５とした。［配列番号４７］
実施例６：ｐＣＭＶ５−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの作製（図１７）
（ＩＩ−１）  ｐＣＭＶ５・２．５μｇを使用し、制限酵素（ＮＥＢ社）Ｎｏｔ  Ｉ  １μｌ（１００００Ｕ／ｍｌ）とＸｂａ  Ｉ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）で２５℃・Ｏ／Ｎ消化した。制限酵素処理後１％アガロースゲルに反応液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動。ＤＮＡマーカーと比較すると４０００ｂｐ辺りにバンドが確認できたのでそのバンドを回収。回収したゲル抽出物を−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物をｐＣＭＶ５  ｄｉｇｅｓｔ（抽出濃度＝１９ｎｇ／μｌ）とした。
（ＩＩ−２）  ｐＣＢ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ・２．５μｇを使用し、制限酵素（ＮＥＢ社）Ｎｏｔ  Ｉ  １μｌ（１００００Ｕ／ｍｌ）とＸｂａ  Ｉ  １μｌ（２００００Ｕ／ｍｌ）で２５℃・Ｏ／Ｎ消化した。制限酵素処理後１％アガロースゲルに反応液１μｌをアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動した結果、ＤＮＡマーカーと比較すると３５００ｂｐと１６００ｂｐ辺りにバンドが確認できた。再度１％アガロースゲルに反応液全量をアプライ、５０ｍＡ・２５分間電気泳動後に１６００ｂｐ辺りに確認できるバンドを回収。回収したゲル抽出物を−１３５℃・１０分間凍結。その後１４０００ｒｐｍ・１０分間ほど遠心。この遠心分離上清を新しい１．５ｍｌエッペンドルフチュープに移した。この得られた抽出物ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｇｅｓｔ（抽出濃度＝２７ｎｇ／μｌ）とした。［配列番号４８］
（ＩＩ−３）  ＩＩ−１で得られたｐＣＭＶ５  ｄｉｇｅｓｔ（１９ｎｇ／μｌ）１μｌ，ＩＩ−２で得られたｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｄｉｇｅｓｔ（２７ｎｇ／μｌ）１μｌを混合し、これと等量（２μｌ）のｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（宝酒造株式会社）を加え１６℃・３０分間ライゲーション反応を行い、その後、大腸菌の形質転換を行い形質転換体を得た。形質転換体より得られたプラスミドをｐＣＭＶ５−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとした。
実施例７：ルシフェラーゼアッセイによるＣＭＶ５  ｐｒｏｍｏｔｅｒの活性測定
（ＩＩＩ−１）  ＣＭＶ５  ｐｒｏｍｏｔｅｒの活性をＣＨＯ  ＤＧ４４−ＳとＨＥＫ２９３ＲＴで測定するために、それぞれ２５ｃｍ２  ｆｌａｓｋで培養した。ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ当日に２５ｃｍ２  ｆｌａｓｋで培養していた細胞を１５ｍｌ遠心管にて遠心。遠心後、培養上清を廃棄し、一方に１００ｍＭヒポキサンチン，１０ｍＭチミジンを含んだＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地（ＧＩ  ＢＣＯ社）５ｍｌ添加。もう一方にＦｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社）５ｍｌを添加。共に細胞数を計測した後、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにそれぞれ２．５  ｘ  １０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞を添加した。
（ＩＩＩ−２）  １ｗｅｌｌ辺り１６６ｎｇのＤＮＡ（ｐＣＭＶ５−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を含んだトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ社）６１μｌにそれぞれの培地を０．３５ｍｌ添加し、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加え４８時間培養した。
（ＩＩＩ−３）  ４８時間後に１．５ｍｌチューブに細胞を集め上清を廃棄。そこにＰＬＤ−３０（ピッカジーンデュアルシーパンジーｋｉｔに添付されている試薬、東洋インキ製造株式会社）を１００μｌ添加し、軽く撹拌後に１５分静置。１５分後、２００ｘｇにて１０分間遠心。遠心上清５μｌを１９５μｌ  ＰＬＤ−３０試薬に添加し、蛍光測定装置（ＡＴＴＯ社：ルミネッセンサーＰＳＮ・Ｒ）にてｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙを行ったところＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒより強い活性が確認できた。結果を図１８に示す。
【産業上の利用可能性】  本発明により、哺乳動物細胞を宿主として高水準の遺伝子組換タンパク質生産を可能にする発現ベクターを提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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