(57)【要約】ＴＳＧ遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、ＴＳＧ遺伝子ノックアウトマウスは、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、および、腎低形成を示した。また、ＴＳＧの欠損によって、多数の中胚葉に由来する組織、特に胸腺、脾臓、軟骨および骨に様々な程度の発達障害が起こることが判明した。また、ＴＳＧが哺乳類の免疫−骨発達にとって不可欠であることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患のモデル動物である、請求項１または２に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、請求項３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項６】
ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
【請求項７】
ＴＳＧまたはＴＳＧをコードするＤＮＡを有効成分として含有する、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤。
【請求項８】
中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、請求項７に記載の治療または予防のための薬剤。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＴＳＧに被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＴＳＧと被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＴＳＧと結合する被検化合物を選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する工程
（ｂ）被検化合物がＴＳＧの機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、ＴＳＧの機能を代替する化合物を選択する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＴＳＧに接触させる工程
（ｂ）該ＴＳＧの活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＴＳＧの活性を上昇させる化合物を選択する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
【請求項１３】
ＴＳＧ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法。
【請求項１４】
ＴＳＧ遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法。
【請求項１５】
中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、請求項９〜１４のいずれかに記載の検査方法。
【請求項１６】
ＴＳＧ遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査薬。
【請求項１７】
ＴＳＧに結合する抗体を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査薬。
【請求項１８】
中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、請求項１６または１７に記載の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＴＳＧ遺伝子改変非ヒト哺乳動物に関する。また、本発明は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の治療または予防のための薬剤、その候補化合物のスクリーニング方法、並びに中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法および検査薬に関する。
【背景技術】  トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリーのメンバーであるＢＭＰｓは、重要な発達調節物質である。ＴＧＦ−βファミリーリガンド、受容体、およびＳＭＡＤｓのようなシグナル変換物質における変異は、多くのヒト疾患に関連している。ＴＳＧはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚における背側細胞の運命を支配する接合子遺伝子７個のうちの１個としてショウジョウバエにおいて同定された（非特許文献１）。ＴＳＧは脊椎動物のＢＭＰ−４に対応するデカペンタプレジック（Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）の活性を調節する分泌型のシステインに富む蛋白質をコードし、ＴＳＧに変異が起こると、ショウジョウバエにおいて羊漿膜と呼ばれる背側中心構造の欠損が起こる（非特許文献２）。一方、最終的な造血が起こるＡＧＭ（非特許文献３）領域から産生された必須の可溶性因子を探索するにあたって、本発明者らは、性交後（ｄｐｃ）１０．５日のマウス胚のＡＧＭ領域からのｍＲＮＡを用いて、レトロウイルス媒介シグナル配列捕獲法（非特許文献４）を用いて、ショウジョウバエＴＳＧのマウス相同体を単離した（特許文献１）。
２０００年に、アフリカツメガエルのＴＳＧが、ＢＭＰ−４に直接結合して、ＢＭＰ−４の細胞外利用率を調節することによってＢＭＰ−４シグナル伝達を促進することが判明した（非特許文献５、６）。腹側−背側軸は、ショウジョウバエと脊椎動物とでは逆であり、そして腹側形成因子であるＢＭＰ−４は中胚葉形成（非特許文献７）および造血幹細胞（ＨＳＣ）の生存（非特許文献８）にとって必須であることから、本発明者らは、ＴＳＧが同様に、腹側形成および哺乳類の造血を含む中胚葉由来臓器形成にも関与する可能性があると推測した。そのあいだに、４つのグループが、微細な分子分析によって、ＴＳＧが、ハエ、魚類およびカエルにおいてＴＳＧ、ＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−４アンタゴニストであるコーディンの三元複合体を形成することによって、またはプロテアーゼであるトロイドと協調して、むしろＢＭＰ−４アンタゴニストとして作用すると報告した（非特許文献９〜１２）。このように、ＴＳＧがＢＭＰ−４アゴニストまたはアンタゴニストのいずれとして作用するのかに関しては議論が分かれている。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に記す。
〔特許文献１〕  ＷＯ  ０１／１８２００
〔非特許文献１〕  Ｚｕｓｍａｎ，Ｓ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｅ．Ｆ．Ｗｉｅｓｃｈａｕｓ．１９８５．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１１：３５９−３７１
〔非特許文献２〕  Ｍａｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．８：１４８９−１５０１
〔非特許文献３〕  Ｍｅｄｖｉｎｓｋｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｅ．Ｄｚｉｅｒｚａｋ．１９９６．Ｃｅｌｌ  ８６：８９７−９０６
〔非特許文献４〕  Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ．１９９９．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：４８７−４９０
〔非特許文献５〕  Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：７５７−７６３
〔非特許文献６〕  Ｌａｒｒａｉｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８（２２）：４４３９−４４４７
〔非特許文献７〕  Ｗｉｎｎｉｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．９：２１０５−２１１６
〔非特許文献８〕  Ｂｈａｔｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１１３９−１１４７
〔非特許文献９〕  Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４８３−４８７
〔非特許文献１０〕  Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４７９−４８３
〔非特許文献１１〕  Ｓｃｏｔｔ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４７５−４７８
〔非特許文献１２〕  Ｙｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７（１０）：２１４３−２１５４
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＴＳＧの生体内での機能を解明し、疾患との関連性を見出すことにある。さらに、本発明は、見出された疾患との関連性に基づき、該疾患のモデル動物、該疾患に対する治療または予防のための薬剤、その候補化合物のスクリーニング方法、該疾患の検査方法、および検査薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。ＴＳＧの生体内での機能を解明するために、ＴＳＧ遺伝子ノックアウトマウスを作製し、解析した。その結果、ＴＳＧ遺伝子ノックアウトマウスは、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、および、腎低形成を示した。また、ＴＳＧの欠損によって、多数の中胚葉に由来する組織、特に胸腺、脾臓、軟骨および骨に様々な程度の発達障害が起こることが判明した。興味深いことに、胸腺の増殖および分化は、中胚葉のモルフォゲンとして一般的に機能するＢＭＰ−４によって抑制されることが最近報告されている（Ｇｒａｆ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１６３−１７１）。これらの知見は、ＴＳＧが、ＢＭＰ−４シグナル伝達にとってのアゴニストおよびアンタゴニストの双方として作用すること、また、哺乳類の免疫−骨発達にとって不可欠であることを示している。
即ち、本発明は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患のモデル動物、該疾患に対する治療または予防のための薬剤、その候補化合物のスクリーニング方法、該疾患の検査方法、および検査薬に関し、以下の〔１〕〜〔１８〕を提供するものである。
〔１〕  ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
〔２〕  ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
〔３〕  中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患のモデル動物である、〔１〕または〔２〕に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
〔４〕  中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、〔３〕に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。
〔５〕  ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
〔６〕  ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞。
〔７〕  ＴＳＧまたはＴＳＧをコードするＤＮＡを有効成分として含有する、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤。
〔８〕  中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、〔７〕に記載の治療または予防のための薬剤。
〔９〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＴＳＧに被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＴＳＧと被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＴＳＧと結合する被検化合物を選択する工程
〔１０〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する工程
（ｂ）被検化合物がＴＳＧの機能を代替しているか否かを判定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、ＴＳＧの機能を代替する化合物を選択する工程
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＴＳＧに接触させる工程
（ｂ）該ＴＳＧの活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＴＳＧの活性を上昇させる化合物を選択する工程
〔１２〕  以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
〔１３〕  ＴＳＧ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法。
〔１４〕  ＴＳＧ遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法。
〔１５〕  中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、〔９〕〜〔１４〕のいずれかに記載の検査方法。
〔１６〕  ＴＳＧ遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査薬。
〔１７〕  ＴＳＧに結合する抗体を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査薬。
〔１８〕  中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患が、矮小発育症、複合型免疫不全症を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、または、腎低形成である、〔１６〕または〔１７〕に記載の検査薬。
本発明者らは、ＴＳＧの生体内での機能を解明するために、ＴＳＧ遺伝子ノックアウトマウスを作出した。その結果、ＴＳＧと中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患との関連が明らかとなった。本発明は、この知見に基づき、ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患のモデル動物として有用である。また、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、薬物による成長抑止の治療や予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法に利用することができる。
本発明のＴＳＧ（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）遺伝子（該遺伝子によってコードされるタンパク質を「ＴＳＧ」と記載）は、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュ等において知られている。各々の配列におけるＴＳＧ配列のアクセッション番号を以下に示す。
ヒト  ＮＣＢＩ，Ｅｎｔｒｅａ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＭ  ０２０６４８
マウス  ＮＣＢＩ，Ｅｎｔｒｅａ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＭ  ０２３０５３
ショウジョウバエ  ＮＣＢＩ，Ｅｎｔｒｅａ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＭ  ０７８５８０
アフリカツメガエル  ＮＣＢＩ，Ｅｎｔｒｅａ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＦ  ２７９２４６
ゼブラフィッシュ  ＮＣＢＩ，Ｅｎｔｒｅａ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＭ  １３１７９７
また、本発明のＴＳＧは上記の例に限定されず、上記ＴＳＧと機能的に同等なタンパク質も含む。機能的に同等なタンパク質には、天然のＴＳＧのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。本発明のＴＳＧと機能的に同等な変異タンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ：Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９８：５０３，１９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０，１９８５、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７，１９８８）を利用する方法が挙げられる。
本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できると期待される。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。また、変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内であり、よりさらに好ましくは２アミノ酸以内である。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて判定することができる。
本発明において、中胚葉に由来する組織としては、胸腺、脾臓、軟骨、骨および腎臓などが例示できるが、これらに限定されない。
本発明において、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患としては、例えば、矮小発育症、複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）を伴う矮小発育症、骨形成不全症、軟骨低形成症、リンパ球減少症、複合型免疫不全症、腎低形成が挙げられる。
本発明において「ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されている」とは、通常、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現が抑制されている状態を指す。正常なＴＳＧタンパク質としての機能が減少または喪失している変異ＴＳＧタンパク質が発現している場合も、この「ＴＳＧ遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑制」には、ＴＳＧ遺伝子の発現が完全に抑制されている場合のほか、該遺伝子の遺伝子対の一方の遺伝子の発現のみが抑制されている場合も含まれる。本発明における遺伝子変異の存在する部位は、該遺伝子の発現が抑制されるような部位であれば特に制限されず、例えばエクソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
本発明においてＴＳＧ遺伝子の改変の対象となる動物が由来する生物種は、通常、ヒト以外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ等のげっ歯類であり、その中でも特にマウスが好ましい。
また、本発明は、ＴＳＧ遺伝子の発現が人為的に抑制されていることを特徴とする遺伝子改変哺乳動物細胞を提供する。このような細胞は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患のモデル細胞として有用である。本発明においてＴＳＧ遺伝子の改変の対象となる細胞が由来する生物種は、特に制限はなく、ヒトを含む種々の生物種由来の細胞である。また、本発明においてＴＳＧ遺伝子の改変の対象となる細胞の種類としては、例えば、体細胞、受精卵、ＥＳ細胞、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物から樹立された細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記遺伝子改変非ヒト哺乳動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法を用いることが可能である。（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）。
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物および遺伝子改変哺乳動物細胞において、ＴＳＧ遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、ＴＳＧ遺伝子全体またはその一部を欠損させる方法やＴＳＧ遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりＴＳＧ遺伝子を不活性化する方法である。即ち、本発明の好ましい態様において、遺伝子改変非ヒト哺乳動物および遺伝子改変哺乳動物細胞は、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子が挿入されていることを特徴とする。
本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、以下のようにして遺伝子改変マウスを作製することができる。まず、マウスからＴＳＧ遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポーレーション法などによりマウスのＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、ＰＣＲおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のＥＳ細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子改変を行うことができる。
また、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、即ち、ＴＳＧ遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。
また、本発明は、ＴＳＧまたはＴＳＧをコードするＤＮＡを有効成分として含有する、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、副腎皮質ホルモンなどの薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、副腎皮質ホルモンなどの薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤を提供する。
本発明の薬剤における「ＴＳＧをコードするＤＮＡ」の形態としては、特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらのＤＮＡを含むベクターであってもよい。
また、本発明の薬剤における「ＴＳＧ」は、天然のタンパク質の他、公知の遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。また、本発明の薬剤における「ＴＳＧ」は、その由来する生物に特に制限はない。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来であり、最も好ましくはヒト由来である。天然のタンパク質は、例えばＴＳＧが発現していると考えられる心臓、脳、肺、肝臓、腎臓等の組織の抽出液に対し、ＴＳＧに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。
一方、組換えタンパク質は、当業者においては公知の方法により、例えば組換えポリペプチドとして調製することができる。組み換えポリペプチドは、例えば、ＴＳＧをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいはＴＳＧに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、ＴＳＧをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
上記ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）等で大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールにより判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等が挙げられる。ＴＳＧを生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ等の大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６：ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーター等を持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ等が挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、ＴＳＧを製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）等が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーター等を持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８等）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３等が挙げられる。
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。この動物または植物にＴＳＧをコードするＤＮＡを導入し、動物または植物の体内でＴＳＧを産生させ、回収する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、ＴＳＧをコードするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、ＴＳＧを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、ＴＳＧをコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液からＴＳＧを得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、ＴＳＧをコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉よりＴＳＧを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られたＴＳＧは、宿主細胞内または細胞外（培地等）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製することができる。
なお、本発明のＴＳＧを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼ等が用いられる。
上記抗ＴＳＧ抗体としては特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物にＴＳＧを免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらに遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、ヒト抗体も含まれる。上記抗体は、以下の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、ＴＳＧをウサギなどの小動物に免疫し血清を得て、これをＴＳＧをカップリングさせたアフィニティーカラムにより、ＴＳＧのみを認識する画分を得て、さらにこの画分から免疫グロブリンＧあるいはＭを、プロテインＡ、あるいはプロテインＧカラムにより精製することにより調製することができる。また、モノクローナル抗体であれば、ＴＳＧをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ＴＳＧに対する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＴＳＧをカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。上記抗体は、ＴＳＧの精製や検出に用いられる他、ＴＳＧの機能を制御するための薬剤として用いることが可能である。抗体をヒトのための薬剤として用いる場合には、免疫原性の点で、ヒト抗体またはヒト化抗体が有効である。ヒト抗体またはヒト化抗体は当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、ヒト抗体は、例えば、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＴＳＧを免疫することにより調製することが可能である。また、ヒト化抗体は、例えば、モノクローナル抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニングし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体に移植するＣＤＲグラフト法により調製することが可能である。
上記薬剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
ＴＳＧをコードするＤＮＡを生体内に投与する場合には、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。投与方法としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ法およびｅｘ  ｖｉｖｏ法を例示することができる。
本発明の薬剤自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行うことも可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の薬剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患、副腎皮質ホルモンなどの薬物による骨量減少、骨粗しょう症、骨折、または、副腎皮質ホルモンなどの薬物による成長抑止の治療または予防のための薬剤の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。以下に本発明のスクリーニング方法の態様を例示するが、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されるものではない。
本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、ＴＳＧと結合する化合物のスクリーニングに関するものである。第一の態様においては、まず、ＴＳＧに被検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
第一の態様においては、次いで、該ＴＳＧと被検化合物との結合を検出する。次いで、該ＴＳＧと結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された化合物は、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の治療または予防のための薬剤の候補化合物になりうる。また、後述のスクリーニング方法の被検化合物として使用することもできる。
ＴＳＧを用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＴＳＧをコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＴＳＧのＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＴＳＧを発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＴＳＧの性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＴＳＧに結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＴＳＧ、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＴＳＧに対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＴＳＧに対する抗体は、例えば、ＴＳＧをコードするＤＮＡを適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＴＳＧの部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＴＳＧを、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＴＳＧの抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＴＳＧに結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、ＴＳＧを用いて、該ＴＳＧに結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＴＳＧと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＴＳＧと上記フィルターとを反応させ、ＴＳＧと結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＴＳＧを標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＴＳＧ又はＴＳＧに融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＴＳＧまたはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＴＳＧと結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＴＳＧと結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＴＳＧに結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ＴＳＧと結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＴＳＧをアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＴＳＧと結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物を適用した後、カラムを洗浄し、ＴＳＧに結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、ＴＳＧに結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＴＳＧに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＴＳＧに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＴＳＧと被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。
また、本発明におけるスクリーニング方法の第二の態様は、ＴＳＧの機能を代替する化合物のスクリーニングに関するものである。第二の態様としては、まず、被検化合物を本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与する。本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的または非経口的に行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に該遺伝子を導入することも可能である。第二の態様としては、次いで、被検化合物がＴＳＧの機能を代替しているか否かを判定する。次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、ＴＳＧの機能を代替する化合物を選択する。
例えば以下のような場合に、被検化合物がＴＳＧの機能を代替しているものと判定される。鼻肛長（鼻と肛門の距離）をノギス等により測定し、被検化合物を投与した遺伝子改変非ヒト動物の体長が投与しないものに比べて長い場合、末梢血中の白血球数をＳｙｓｍｅｘにより計測し、別途作成したメイ・ギムザ染色を施した末梢血の塗抹標本を顕微鏡下に観察して白血球百分比を算出、両者を掛け合わせてリンパ球数を算出し、被検化合物を投与した遺伝子改変非ヒト動物の末梢血中リンパ球が投与しないものに比べて多い場合、非ヒト動物を安楽死後、胸腺または脾臓を摘出して天秤にて重量を測定し、被検化合物を投与した遺伝子改変非ヒト動物の胸腺または脾臓重量が投与しないものに比べて重い場合等である。
本発明におけるスクリーニング方法の第三の態様は、ＴＳＧの活性を上昇させる化合物のスクリーニングに関するものである。第三の態様としては、まず、被検化合物をＴＳＧに接触させる。第三の態様に用いられるＴＳＧの状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
ＴＳＧの精製は周知の方法で行うことができる（羊土社  タンパク質実験ノート  下  一次構造の決定まで１０−１３頁）。また、ＴＳＧが発現している細胞としては、内在性のＴＳＧを発現している細胞、または外来性のＴＳＧを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＴＳＧを発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
また、上記外来性のＴＳＧを発現している細胞は、例えば、ＴＳＧをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＴＳＧを有する細胞は、例えば、ＴＳＧをコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＴＳＧが導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
また、ＴＳＧが発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＴＳＧをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
また、本発明において「接触」は、ＴＳＧの状態に応じて行う。例えば、ＴＳＧが精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＴＳＧが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＴＳＧが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
第三の態様では、次いで、上記ＴＳＧの活性を測定する。ＴＳＧの活性の測定は、例えば、ＢＭＰ−４との結合能を指標にすることで行うことができる（Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：７５７−７６３）。
第三の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＴＳＧの活性を上昇させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第四の態様は、ＴＳＧ遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物のスクリーニングに関するものである。第四の態様としては、まず、ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＴＳＧ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＴＳＧをコードするＤＮＡもまた含まれる。
第四の態様においては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、ＴＳＧ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、ＴＳＧを含む画分を定法に従って回収し、該ＴＳＧの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＴＳＧに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＴＳＧの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
第四の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
本発明は、ＴＳＧ遺伝子の発現量を測定する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法を提供する。ここで、「ＴＳＧ遺伝子の発現」には、ＴＳＧｍＲＮＡの発現だけでなく、ＴＳＧの発現もまた含まれる。該検査方法によって、ＴＳＧ遺伝子の発現が減少している場合に、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患にすでに罹患していると判定される。
以下に、本発明の検査方法の態様を例示するが、本発明の検査方法はそれらに限定されるものではない。上記検査方法の一つの態様としては、まず、被検者のＲＮＡ試料を調製する。ＲＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から抽出することができる。
本方法においては、次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＴＳＧをコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。このような方法としては、ノーザンブロッティング法、ＤＮＡアレイ法、または、ＲＴ−ＰＣＲ法等を例示することができる。
また、上記検査方法は、ＴＳＧの発現量を測定することにより、下記の如く実施することができる。まず、被検者からポリペプチド試料を調製する。ポリペプチド試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から調製することができる。
本方法においては、次いで、該ポリペプチド試料に含まれるＴＳＧの量を測定する。次いで、測定されたＴＳＧの量を対照と比較する。このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにＴＳＧに結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
また、本発明は、ＴＳＧ遺伝子領域における変異を検出する工程を含む、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患の検査方法を提供する。該検査方法によって、ＴＳＧ遺伝子領域に変異が生じている場合に、中胚葉に由来する組織の発達不全を伴う疾患にすでに罹患していると判定される。
本発明において、ＴＳＧ遺伝子領域とは、ＴＳＧ遺伝子および該遺伝子の発現に影響する領域を意味する。該遺伝子の発現に影響する領域としては、特に制限はないが、例えば、プロモーター領域などが例示できる。
また、本発明における変異は、細胞の増殖異常または分化異常を引き起こす変異であれば、その種類、その数、その部位などに制限はない。上記変異の種類としては、例えば、欠失、置換または挿入変異などが挙げられる。
以下、ＴＳＧ遺伝子領域に生じた変異を検出する工程を含む検査方法の好ましい態様を記載するが、本発明の方法はそれらの方法に限定されるものではない。
上記検査方法の好ましい態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手術により採取あるいは切除した組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
本方法においては、次いで、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを単離する。該遺伝子領域の単離は、例えば、該遺伝子領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本発明において、対照とは、正常な（野生型の）ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを言う。一般に健常人のＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡの配列は正常であるものと考えられることから、上記「対照と比較する」とは、通常、健常人のＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡの配列と比較することを意味する。
本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造変異）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ａｌｕ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２  Ｊａｎ  １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１  Ａｕｇ  １；６（８）：１３１３−１３１８．、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ−ＳＳＣＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ．、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１９９５  Ａｐｒ  １；４（５）：２７５−２８２．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異の存在を検出することができる。
具体的には、まず、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
さらに別の方法においては、まず、被検者から調製したＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡ、および、該ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板、を提供する。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドプローブを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドプローブを固定することができれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常ｉｎ  ｓｉｔｕで合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＴＳＧ遺伝子領域の変異を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、該遺伝子領域を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ｂｐであり、好ましくは１０〜５０ｂｐであり、さらに好ましくは１５〜２５ｂｐである。
本方法においては、次いで、該ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡと該基板を接触させる。この過程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本方法においては、次いで、該ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡと該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、さらに、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子変異の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられる。
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これとＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法等により検出することができる。
また、本発明においては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１０６−１１７、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０００）：１８：７７−８４）、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ．（１９９９）１４：１４３−１４９）、Ｉｎｖａｄｅｒ法（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ９４−１０５、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）１０：３３０−３４３）、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）１０：１０３−１１０）、ＡｃｙｃｌｏＰｒｉｍｅ法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）９：４９２−４９８）、ＳＮｕＰＥ法（Ｒａｐｉｄ  Ｖｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０００）１４：９５０−９５９）等も使用することができる。
さらに、本発明は、本発明の検査方法に使用するための検査薬を提供する。その一つの態様としては、ＴＳＧ遺伝子領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。ここで、オリゴヌクレオチドには、ポリヌクレオチドが含まれる。
該オリゴヌクレオチドは、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡ（正常型ＤＮＡまたは変異型ＤＮＡ）に特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法におけるプローブ（該プローブが固定された基板を含む）やプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは変異部分を含むＴＳＧ遺伝子領域の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＴＳＧ遺伝子領域を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明の検査薬の別の態様は、ＴＳＧに結合する抗体を含む検査試薬である。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、胚および成体マウスにおけるＴＳＧ発現パターンを示す写真である。Ａ〜Ｄは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる１１．５ｄｐｃマウス胚の矢状断面を示す。白い点は、ハイブリダイゼーションシグナルを表す。Ａ、ＴＳＧのセンス鎖ＲＮＡによってプロービングする。Ｂ〜Ｄ、ＴＳＧのアンチセンス鎖によってプロービングする。Ｃ、Ｄ、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色によるＢの部分的拡大図。Ｖ、脊椎が現れつつある領域；Ａ、大動脈；ＧＭ、性腺−中腎。Ｅ、成体マウスからの多数の組織のＴＳＧ  ｃＤＮＡプローブによるノザンブロット分析。
図２は、１７．５ｄｐｃ野生型マウス胎仔の肺、胸腺、腎臓におけるＴＳＧ発現を示す写真である。各組織切片に対して、ＴＳＧアンチセンスまたはセンスリボプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、ＨＥ染色した。スケールバーは１００μｍを示し、全てのパネルを同じ拡大率で示している。
図３は、ＴＳＧの標的化破壊を示す図および写真である。Ａ、ＴＳＧ座（上段）、ターゲティング構築物（中央）、およびターゲティング座（下段）のマップ。制限酵素はＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＢａｍＨＩ（Ｂ）、およびＮｈｅＩ（Ｎ）である。ターゲティングベクターは、４．８および１．６ｋｂ  ＴＳＧゲノム断片、ｐＭＣ１ＮｅｏＰｏｌｙＡ（ストラタジーン社）に由来するネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）カセット、ｐＭＣ１ＮｅｏＰｏｌｙＡと同じプロモーターを含む単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子カセットから成る。Ｂ、マウスからの尾ＤＮＡのサザンブロット分析。ＥｃｏＲＩによって消化したゲノムＤＮＡを５’隣接プローブとハイブリダイズさせた。８．１および７．４ｋｂのバンドはそれぞれ、野生型および変異対立遺伝子を表す。ブロットをＮｅｏプローブと再度ハイブリダイズさせると、７．４ｋｂのバンドのみが検出され、３’隣接エキソンプローブによってプロービングしたＢａｍＨＩ消化物はさらに、相同的組み換えが適切であることの確証となる（データは示していない）。
図４は、成体ＴＳＧ＋／＋マウスあるいは成体ＴＳＧ−／−マウスの肝臓および腎臓からの総ＲＮＡに対する３’ＴＳＧ  ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション、及び、ヒトグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プローブを用いた再ハイブリダイゼーションによるノザンブロット分析を示す写真である。写真左にＲＮＡラダーマーカー（ｋｂ）（プロメガ社）を示す。
図５は、マウスにおける発育遅滞を示す図および写真である。Ａ、１５日齢でのＴＳＧ＋／＋およびＴＳＧ−／−同腹子マウスの外観。バーは１ｃｍを表す。Ｂ、Ｃ、ＴＳＧ＋／＋、ＴＳＧ＋／−、およびＴＳＧ−／−マウスの日齢による成長プロフィール。ＴＳＧ−／−マウスは二つの群に分類した；外観上健康と病気。極めて小さいマウスは全て生後１ヶ月以内に死亡したか、または非常に病気に見えた時点で屠殺した。Ｄ、日齢によるＴＳＧ＋／＋、ＴＳＧ＋／−、およびＴＳＧ−／−マウスの生存率。死亡前に屠殺した病気のマウスはデータから除外した。
図６は、ＴＳＧ−／−マウスの縮れた尾を示す写真である。Ａ、２６日齢のＴＳＧ−／−マウスの縮れた尾。Ｂ、Ａにおいて示したＴＳＧ−／−マウスとＴＳＧ＋／＋同腹子の尾のＸ線画像。Ｃ、Ｂの部分的拡大図。矢印は石灰化を伴う椎間板の部分的消失を示す。
図７は、２２日齢のＴＳＧ−／−マウスおよびＴＳＧ＋／＋同腹子のＸ線画像を示す写真である。−／−マウスは＋／＋マウスよりも骨が細くなっている。
図８は、アリザリンレッドおよびアリューシャンブルーによって染色した２７日齢ＴＳＧ−／−マウスと同腹子の骨格を示す写真である。
図９は、ＴＳＧ−／−マウスにおける軟骨内骨化遅延を伴う矮小発育症と腎臓の糸球体の未成熟構造を示す写真である。Ａ、Ｂ、１７日齢ＴＳＧ＋／−およびＴＳＧ−／−マウスの大腿骨の遠位骨端のＨＥ染色切片。バー＝２５０μｍ。Ｃ、Ｄ、骨幹端軟骨成長板を示すＡおよびＢのそれぞれ部分的拡大図。成長板の休止（Ｒ）、増殖（Ｐ）、肥大（Ｈ）層を示す。バー＝１００μｍ。Ｅ、Ｆ、３２日齢でのＴＳＧ＋／＋およびＴＳＧ−／−マウスの腎臓からのＨＥ染色切片。バー＝４０μｍ。
図１０は、ＴＳＧ＋／＋、ＴＳＧ＋／−、およびＴＳＧ−／−マウスの骨密度を示す図である。右大腿骨と腰椎Ｌ２−４の骨ミネラル密度をＤＣＳ−６００ＥＸ−ＩＩ（アロカ社）を用いたＸ線撮影によって測定した。＋／＋はｎ＝７、＋／−はｎ＝３、−／−はｎ＝９である。３匹の−／−雄性マウス（１８９日齢が１匹、２２４日齢が２匹）および１６匹の雌性マウス（その他）について分析した。Ａは大腿骨を、Ｂは腰椎を示す。
図１１は、ＴＳＧ−／−マウスの末梢血におけるリンパ欠損を示す図である。Ａ、ＴＳＧ−／−およびＴＳＧ＋／＋同腹子における末梢血の分析。ＷＢＣ、白血球；ＲＢＣ、赤血球；Ｈｂ、ヘモグロビン；ＰＬＴ、血小板。１２〜２８日齢での典型的に病気に見える重度の矮小発育症−／−マウス３例、軽度の矮小発育症を示す健康に見える−／−マウス４例、および＋／＋同腹子４例を、その末梢血に関して分析した。それぞれのバーの模様とマウスの亜群の対応はＢと同じである。Ｂ、ＷＢＣｓの血球像算定。Ａにおいて用いた同じ試料を分析した。
図１２は、ＴＳＧ−／−マウスにおけるリンパ系発達の欠損を示す図および写真である。Ａ、Ｂ、２７日齢のＴＳＧ−／−マウスおよびＴＳＧ＋／＋同腹子から新しく単離した脾臓と胸腺。バー＝Ａでは５ｍｍ、Ｂでは３ｍｍ。１５日齢ＴＳＧ−／−マウス（Ｄ）およびＴＳＧ＋／＋同腹子（Ｃ）からの胸腺のＨＥ染色切片。バー＝３０μｍ。Ｅ、Ｆ、ＴＳＧ＋／＋、ＴＳＧ＋／−、およびＴＳＧ−／−マウスにおける日齢による脾細胞数と胸腺細胞数の比較。
図１３は、ヨウ化プロピジウム（赤）により可視化させた細胞に対するフルオレセイン−ｄＵＴＰ（緑）を用いたＴＵＮＥＬ分析の結果を示す写真である。Ａは図１２Ｃと同じパラフィン包埋検体由来である。Ｂと図１２Ｄの切片についても、同様である。
図１４は、２７日齢のＴＳＧ−／−マウスおよびＴＳＧ＋／＋同腹子からの胸腺細胞と骨髄細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。胸腺細胞（Ｔｈｙ）、骨髄細胞（ＢＭ）を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）によって分析した。独立した４実験の典型的なパターンを示す。
図１５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＳＧ欠損リンパ球の増殖を示す図である。２６日齢ＴＳＧ＋／＋およびＴＳＧ−／−同腹子からの胸腺細胞（Ａ）および脾細胞（Ｂ）は、様々なポリクローナルアクティベーターによって２４時間刺激して、３Ｈ−チミジン取り込みを、パルス標識後に測定した。
図１６は、ＴＳＧ−／−胸腺細胞におけるＲＵＮＸ１転写産物の増加を伴うＳＭＡＤ１のリン酸化促進を示す写真である。Ａ、抗リン酸化ＳＭＡＤ１抗体を用いて１０日齢の＋／＋および−／−同腹仔の胸腺細胞をウエスタンブロット解析した。新鮮な単離胸腺細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏと標記）を、回収前にヒトＢＭＰ−４を１００ｎｇ／ｍｌ加えた７．５％ノックアウト血清代用（ＫＳＲ）培地（ＢＭＰ−４と表記）、ヒトＢＭＰ−４を１００ｎｇ／ｍｌとマウスＴＳＧを１μｇ／ｍｌ加えた７．５％ＫＳＲ培地（ＢＭＰ−４＋ＴＳＧと表記）で４５分間培養した。各レーンに１．５×１０５細胞に相当する細胞可溶化液をロードした。結果を２種類の独立した写真で示した。左の写真はｉｎ  ｖｉｖｏでの胸腺細胞の結果のみ示している。Ｂ、３７日齢の＋／＋および−／−マウスの胸腺細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＲＵＮＸ１  ｍＲＮＡは、２９２ｂｐのＰＣＲ産物として検出された。ＲＮＡの整合性は３７３ｂｐのβ２−ミクログロブリン（β２−ＭＧ）転写物の検出によって確認した。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）  ＴＳＧの遺伝子ターゲティング
ターゲティングベクターはＴＳＧゲノムクローン（λファージ（ストラタジーン社）にクローン化されたＥＳ１２９／ＳｖＪ株ＤＮＡ（ストラタジーン社）に由来する）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ストラタジーン社）にサブクローン後、最初のＡＴＧの２０ｂｐ下流のエキソン内ＮｈｅＩ部位をＳａｌＩ部位に変換後、同部位にｐＭＣ１ＮｅｏＰｏｌｙＡ（ストラタジーン社）の１．１ｋｂ  ＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片をアンチセンス方向に挿入することによって構築した。ＨＳＶ  ｔｋカセットも同様に、陰性選択のためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩのＮｏｔＩ部位に挿入した。ベクターを左腕の５’末端で直線にして、Ｅ１４−１胚性幹（ＥＳ）細胞に電気穿孔した。相同的組み換えに関するサザンブロット分析のスクリーニングは文献に記述通り実施した（Ｎｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：８００−８０２）。ターゲティング効率は５〜１０％であった。マウスは全て、特定病原体不含条件で維持した。
（２）  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
タンパクコード配列のほとんどの部分を含む、ｃＤＮＡ開始部位からＥｃｏＲＶ部位までの０．６ｋｂマウスＴＳＧ  ｃＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。センスＲＮＡプローブはＥｃｏＲＶ消化ＤＮＡ鋳型からＴ３  ＲＮＡポリメラーゼによって、アンチセンスＲＮＡプローブはＢａｍＨＩ消化鋳型からＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって、３５Ｓ−ＵＴＰを用いて、各々作製した。ハイブリダイゼーションは記載通りに（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１５８１７−１５８２５）実施した。
（３）  ノザンブロット
マウスの多数の組織ブロットは、クロンテック社から購入して、４．０ｋｂマウスＴＳＧ完全長ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた後、既に記述されているように（Ｎｏｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：４７５４−４７６５）マウスβアクチンプローブと再度ハイブリダイズさせた。
（４）  胸腺と脾細胞の増殖アッセイ
１試料あたり３サンプルずつの胸腺細胞（５×１０４）を、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の代わりに１０％ノックアウト血清代用培地（ＫＳＲ）（インビトロジェン社）の存在下で、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、２０μｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ  Ａ＋ＩＬ−２（１０単位／ｍｌ）、Ｃｏｎ  Ａ＋ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、抗−ＣＤ３ε抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、１０μｇ／ｍｌ）＋ホルボル１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）、または抗−ＣＤ３ε抗体＋ＰＭＡ＋ＩＬ−７のいずれかによって２４時間刺激した後、３Ｈ−チミジン０．５μＣｉを１４時間パルスして、３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。脾細胞は、ＫＳＲまたはＫＳＲ＋リポ多糖類（ＬＰＳ、１０μｇ／ｍｌ）によって同様に分析した。
［実施例１］  ＴＳＧの標的化破壊
本発明者らがマウス大動脈−性腺−中腎（ＡＧＭ）領域から単離したマウスＴＳＧ  ｃＤＮＡ（アクセッション番号：ＮＣＢＩ  ＮＯ．ＢＤ０１３０３５）は、長さが４．０ｋｂでＴＳＧ蛋白質（アクセッション番号：ＮＣＢＩ  ＮＯ．ＡＡＧ００６０５）のアミノ酸２２２個をコードし、これは他のグループ（Ｇｒａｆ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １２４：５５４−５６０、Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４７９−４８３、Ｓｃｏｔｔ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４７５−４７８）によって公表された蛋白質と同一である。１１．５−ｄｐｃマウス胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＴＳＧ  ｍＲＮＡが、脊椎が発達する領域，大動脈壁，性腺−中腎領域、および間質組織全般に存在することが判明した（図１Ａ〜Ｄ）。成体マウス組織のノザンブロット分析から、心臓、肺、肝臓、および腎臓に４．１ｋｂ  ＴＳＧ転写物（図１Ｅ）が存在することが判明した。肺、胸腺、および腎臓の１７．５ｄｐｃ切片におけるＴＳＧ  ｍＲＮＡの発現も調べた（図２）。ＴＳＧ  ｍＲＮＡは、肺の肺胞および気管支上皮細胞、胸腺の間質、特に髄質、および腎臓の尿細管周囲の細胞で発現していた。哺乳類の発達におけるＴＳＧの生理的役割を調べるために、遺伝子ターゲティングによってＴＳＧ欠損マウスを作製した。本発明者らは、第一のコードエキソンを破壊するＴＳＧターゲティングベクターを構築して、ＴＳＧ遺伝子発現を完全に抑えた（図３Ａ）。構築物をＥ１４−１  ＥＳ細胞に電気穿孔して、独立した三つのクローンを得、それをＣ５７ＢＬ／６胞胚に注入してキメラマウスを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配させて、ヘテロ接合（＋／−）マウスを作製し、＋／−マウスを繁殖させてホモ接合変異体（−／−）マウスを作製した。子孫１００例の遺伝子タイピング（図３Ｂ）により、野生型（＋／＋）マウス２７例、＋／−マウス４７例、および−／−マウス２６例が得られた；この予想比（１：２：１）は、胚致死性がないことを示した。野生型ＴＳＧのｍＲＮＡが存在しないことは、ノザンブロット解析によって確認した（図４）。
［実施例２］  ＴＳＧ欠損マウスにおける成長遅延
−／−マウスの１２．５％が出生日に死亡し、−／−マウスの残りは出生時健康に見えたが、それらは＋／＋および＋／−の同腹子より１０〜２０％小さく（後述する）、この差は、日齢と共に大きくなった（図５Ａ）。半数以上の−／−マウスに重度の発育遅滞を認め、その後病的外観およびその後の死亡が起こり、または数例では突然死を認めた（図５Ｂ〜Ｄ）。病気の−／−マウスの何例かは、３週齢になっても眼が開かず、ぎくしゃくした歩行を示し、全身の振せんを示して死亡した。ＴＳＧ−／−マウスの死因は、衰弱を除いて統一できなかった。新生児−／−マウスは全て、＋／＋または＋／−同腹子と同等の大きさの乳白色斑を示し、このことは、授乳が適切であったことを示している。剖検により、病気のマウス数例が、胸腺と脾臓の発達不全（後述）の他に肺繊維症、腹部内またはくも膜下出血を有することが判明した。病的な外観の存在とは無関係に、ほぼ半数の−／−マウスが明らかに縮れた尾を示した（図６）。ＢＭＰ−７ヌルマウス（Ｄｕｄｌｅｙ，Ａ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９：２７９５−２８０７、Ｊｅｎａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２３０：２８−３７、Ｌｕｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９：２８０８−２８２０）を含む遺伝子破壊マウスの数例において報告されている縮れた尾は、ＴＳＧ−／−マウスの出生後４日目より認められた。Ｘ線写真によって、−／−マウスの縮れた尾では椎間板が部分的に消失し、骨化していることが判明した（図６）。
［実施例３］  ＴＳＧ欠損マウスにおける骨形成遅延と腎形成遅延
＋／＋、＋／−、および−／−同腹子のＸ線写真（図７に典型型を示す）および剖検と共に、それらのアリューシャンブルー（軟骨に関して）よびアリザリンレッド（無機質に富む骨に関して）によって染色した骨格標本（図８）から、ＴＳＧ−／−マウスでは脚の骨が短く薄い構造であり、頭蓋骨も非常に薄いことが判明したが、２７日齢ではそれらの無機質化領域に差を認めなかった。大腿骨における遠位骨幹端軟骨成長板の組織学的分析から、軟骨細胞の薄い増殖層、肥大層と拡大した休止層が明らかにされ、骨端（二次）骨化が＋／−同腹子と比較して−／−マウスでは著しく遅れており（図９Ａ〜Ｄ）、このことは−／−マウスの軟骨内骨化が減少していることを示した。さらに、−／−マウスにおける大腿の索状の皮質骨の増殖は、１７〜３２日齢で＋／−同腹子と比較して遅れていた（データは示していない）。３２日齢での重度の矮小発育症を有する−／−マウスの大腿骨と腰椎の骨密度は、＋／＋同腹子のほぼ半分であり、長く生存している−／−マウスの骨密度の減少傾向は緩やかであることも示された（図１０）。これらの表現型は、骨芽細胞系列特異的プロモーターによって駆動されるドミナントネガティブＩＢタイプＢＭＰ受容体を発現するトランスジェニックマウスの表現型と類似である（Ｚｈａｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５７：１０４９−１０６０）。これらの知見は、ＴＳＧ欠損によって、ＢＭＰシグナル伝達の減弱に基づいて、膜内骨化の減少と共に、軟骨細胞の休止状態から増殖状態への移行の遮断による軟骨内骨化の遅延により矮小発育症と骨減少症が起こることを示している。骨形成障害の他に、−／−マウスはまた、＋／＋同腹子と比較して糸球体が小さく未成熟な、組織学的に未発達な腎を示した（図９Ｅ、Ｆ）。この知見は、ＢＭＰ−７欠損マウスにおける腎発達障害を思い起こさせるが、中胚葉誘導物質としてのＢＭＰ−７の活性はホモダイマーよりＢＭＰ−４とのヘテロダイマーのほうが高いことと矛盾しない（Ｓｕｚｕｋｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３２：１５３−１５６）。このように、ＴＳＧは、骨格系および腎臓の発達の際にＢＭＰ−４アゴニストとして作用する可能性が高い。
［実施例４］  ＴＳＧ欠損マウスにおけるリンパ系細胞の枯渇
本発明者らは、ＡＧＭ領域からマウスＴＳＧ  ｃＤＮＡを単離した。ＢＭＰ−４はまた、ヒトＡＧＭ領域において発現されることが判明した（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｂｌｏｏｄ  ９６：１５９１−１５９３）。ＢＭＰ−４は、その上流の調節物質であるソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）（Ｂｈａｒｄｗａｊ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１７２−１８０）とは異なり、多能性造血細胞を増殖させることはできないが、それらを維持することができる（Ｂｈａｔｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１１３９−１１４７）。したがって、本発明者らは、造血に及ぼすＴＳＧ欠損の影響に関心を持った。−／−マウスからの末梢血血球数および塗沫標本は、リンパ様細胞数の重度の減少、血小板の中等度の減少、および赤血球の中等度の減少を示した。一方、顆粒球と単球の相対的割合は増加した（図１１）。これと一致して、半数以上の−／−マウスでは胸腺および脾臓の発達が非常に不良であった。これらの臓器は、その体重が＋／＋または＋／−同腹子の体重より２〜５倍異なるに過ぎない何例かの−／−マウスでは、３０００倍減少のような極めて少数の細胞しか含まないことが判明した（図１２Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）。発育遅滞とリンパ系欠損レベルには正の相関を認め、リンパ系の欠損が二次的な事象である可能性が生じた。しかし、−／−マウスの出生時の胸腺と脾細胞はそれぞれ、＋／＋または＋／−同腹子と比較して既に２〜４倍および２〜８倍減少しており（図１２Ｅ、Ｆ）、リンパ系欠損が、単純に出生後の衰弱によるものではないことを示唆している。組織学的に、−／−の脾臓では白脾髄領域は減少し（データは示していない）、−／−胸腺のほとんどの細胞がアポトーシス外観を呈したのに対し、＋／＋胸腺はアポトーシス様外観を示さなかった（図１２Ｃ、Ｄ）。ＴＵＮＥＬ分析によると、病気の−／−マウスの多くの胸腺細胞が様々な程度でＤＮＡ断片化を起こしたが、＋／＋マウスの胸腺細胞はそうならないことが判明した（図１３）。胸腺のフローサイトメトリー分析から、＋／＋同腹子と比較して、−／−マウスではＣＤ４−およびＣＤ８−単陽性細胞の割合が増加して二重陽性細胞が減少したことが判明した（図１４、上のパネル）。骨髄細胞の総数は、数例を除いて体格によって標準化すると、−／−マウスではあまり大きく減少しなかった。骨髄細胞のＣＤ４３／Ｂ２２０およびＢ２２０／ＩｇＭ二重染色によって、＋／＋同腹子と比較して−／−マウスでは、プロＢ（ＣＤ４３＋Ｂ２２０ｌｏｗＩｇＭ−）、プレＢ（ＣＤ４３−Ｂ２２０ｌｏｗＩｇＭ−）、および未成熟Ｂ（ＣＤ４３＋Ｂ２２０ｌｏｗＩｇＭ＋）細胞が劇的に減少したのに対し、成熟Ｂ細胞（ＣＤ４３−Ｂ２２０ｈｉｇｈＩｇＭ＋）は保持されたことが証明された（図１４、中央の４つのパネル）。これらの知見は、ＴＳＧ−／−マウスでは前駆体ＢおよびＴ細胞の増殖が障害されるが、リンパ系の分化そのものは遮断されないことを示唆している。しかし、−／−マウスからの脾細胞および胸腺細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで正常な分裂活性を示し、それらは、ＫＳＲ培地（すなわち、ウシ胎仔ＴＳＧの非存在下で）によって培養すると、リポ多糖類（ＬＰＳ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、および抗ＣＤ３抗体プラスホルボルミリスチルアセテート（ＰＭＡ）のようなポリクローナル活性化剤、またはＩＬ−７による刺激によって、＋／＋マウスからの脾細胞および胸腺細胞と比較して、同等またはむしろ増強されたレベルで増殖した（図１５）。このように、ＴＳＧ−／−マウスのリンパ系欠損は、Ｂ−およびＴ−細胞における内因性の欠損が原因ではないように思われ、間質細胞のような微小環境の異常およびサイトカイン産生または分布の異常が原因であると考えられた。また、ＴＳＧは結合組織増殖因子と弱い相同性を有することにも注目しなければならない。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋骨髄細胞の割合は、−／−骨髄細胞において増加し、成熟顆粒球に富むことを示している（図１４、下のパネル）。７月齢でのマウス（＋／＋，ｎ＝３；−／−，ｎ＝３）の骨髄細胞のクローン培養アッセイによって、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）コロニー、巨核球（Ｍｅｇ）コロニー、赤血球系（Ｅ）バースト、赤血球−巨核球コロニー、および混在性造血コロニー（ＧＭ／Ｍｅｇ，ＧＭ／Ｅ，あるいはＧＭ／Ｅ／Ｍｅｇ）の形成が、ＴＳＧ欠損マウスでは全て減少することが示された（表１）。
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興味深いことに、Ｂ−リンパ球コロニー形成は−／−で減少しなかった（表１）。この結果は図１５と矛盾しない。同様のアッセイを２５〜２８日齢でのマウス（＋／＋，ｎ＝３；−／−，ｎ＝３）でも行ったところ、同様の結果が得られた（データは示していない）。コロニーアッセイに用いたウシ胎仔血清に存在する可能性があるウシＴＳＧがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＳＧ−／−細胞の増殖および分化を増強するように作用した可能性は除外できないが（ＫＳＲはコロニー形成効率が非常に低いために用いなかった）、アッセイは、ＴＳＧ−／−骨髄が＋／＋骨髄と同等のレベルでＢ−リンパ球前駆体細胞を含むことを示している。一方、他系列の前駆体細胞は全て減少していることを示す。
［実施例５］  ＴＳＧ欠損胸腺細胞におけるＳＭＡＤ１のリン酸化の促進に伴うＲＵＮＸ１転写産物の増加
ＴＳＧ機能の分子メカニズムを解明するために、ＢＭＰ−４シグナル伝達の下流で起こる現象について調べた。１０日齢の＋／＋および−／−同腹仔の胸腺細胞におけるＳＭＡＤ１のセリンリン酸化について調べた。図１６Ａに示されるように、ＳＭＡＤ１はインビボにおいては、胸腺細胞中で既にリン酸化されており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、組み換えＴＳＧの存在あるいは非存在下でのＢＭＰ−４によるさらなる細胞の刺激は、ＳＭＡＤ１のリン酸化にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、インビボにおけるＳＭＡＤ１のリン酸化の程度は、＋／＋細胞より−／−細胞の方が有意に高かった。これらの結果は、インビボにおける胸腺細胞中でのＳＭＡＤ１のリン酸化という面からは、ＴＳＧがＢＭＰ−４アンタゴニストとして機能することを示す。これと一致して、インビボにおいては、ＲＵＮＸ１（その遺伝子産物はＳＭＡＤ１と機能的に結合し（Ｈａｎａｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１５７７−３１５８２）、ＲＵＮＸ１自身の転写を刺激すると予測される）の発現は、＋／＋胸腺細胞と比較して−／−胸腺細胞では上昇していた（図１６Ｂ）。
［実施例６］  ＴＳＧ欠損マウスの表現型の重症度の変動
ＴＳＧ欠損マウスの表現型は、個体によって変化する；生存して子孫を生じるマウスもあるが（雄性および雌性ＴＳＧ−／−マウスはいずれも念性である）、ＴＳＧ欠損マウスの半数以上が、骨化の遅延による重度の矮小発育症、リンパ系前駆細胞の枯渇を伴うリンパ系欠損、腎発達の遅延、ならびに衰弱および／または免疫不全によっておそらく引き起こされた肺繊維症のようなさらなる疾患により出生後１ヶ月以内に死亡する。ＴＳＧ−／−マウスの表現型が多様である理由は、ＴＳＧの非存在下での微小環境におけるＢＭＰｓおよびコーディンを含む可溶性因子の確率論的分布の異常、および遺伝的背景の差によるＢＭＰシグナル伝達の差に由来する可能性がある。母親からのＴＳＧが子宮内で異なる局所利用率で−／−胚を救出するとの推測がある。しかし、軽度の表現型を示す生存ＴＳＧ−／−マウス同士を交配させると、＋／−の親に由来する−／−の仔と出生時に表現型を区別することができない−／−の仔を生じることから、この可能性は除外された（表２）。
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軽度の表現型を示す−／−の親は、軽度の表現型を示す−／−マウスのみならず、生後に重度の表現型を示す−／−マウスを生じた（データは示していない）。
ＴＳＧはＡＧＭ領域において発現され、ＴＳＧ欠損マウスは中等度の血小板減少症と軽度の貧血を伴うリンパ系発達欠損を示した。低濃度のＢＭＰ−４は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−ヒトＨＳＣｓの増殖および分化を誘導することが知られているが、より高濃度のＢＭＰ−４はＨＳＣｓの生存を促進する（Ｂｈａｔｉａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１１３９−１１４７）。したがって、ＴＳＧは、造血の初期段階で中胚葉誘発物質ＢＭＰ−４のアゴニストとして機能すると推測される。しかし、造血のＢＭＰ−４媒介調節は、より複雑である。ＢＭＰ−４の上流の調節物質であるＳｈｈが、胸腺間質によって産生され、その受容体であるパッチド＆スムースンドが、二重陰性（ＤＮ）胸腺細胞において発現され、Ｓｈｈが胸腺細胞の分化をＤＮ段階で停止させることが示された（Ｏｕｔｒａｍ，Ｓ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：１８７−１９７）。最近、胸腺間質によって産生されたＢＭＰ−４も同様に、胸腺細胞の増殖および分化を阻害することが示され、その胸腺細胞における発現がＴ細胞受容体シグナル伝達によって誘導されるＴＳＧが、ＢＭＰ−４媒介胸腺発達阻害効果を遮断するようにコーディンと相乗作用を示すことが証明された（Ｇｒａｆ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：１６３−１７１）。したがって、ＢＭＰ−４アンタゴニストとしてのＴＳＧは胸腺細胞の発達の正の調節物質であるように思われる。出生前後のＴＳＧ−／−マウスにおける胸腺の発達障害に関する本発明者らの知見は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらの結果と一致する。それにもかかわらず、ＴＳＧは、繊維芽細胞に対するＴＧＦ−β作用の下流の媒介物質である細胞分裂促進性ペプチドである結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）（Ｂｒａｄｈａｍ，Ｄ．Ｍ．．ｅｔ  ａｌ，１９９１．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４：１２８５−１２９４）に対して弱い相同性を有することから（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ，Ｇ．Ｒ．１９９７．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：１７１−１７９）、ＴＳＧはＢＭＰ−４シグナル伝達を調節することによって機能するのみならず、間質機能に影響を及ぼす特定されていない標的にとっての増殖／分化因子として機能する可能性もある。
ＴＳＧは最近、ＢＭＰシグナル伝達に対して時期に応じてアゴニストおよびアンタゴニスト機能の双方を発揮することが提唱されている；第一に、ＴＳＧはＢＭＰおよび完全長のコーディンと三元複合体を形成し、ＢＭＰのその受容体への結合を妨害する、そして第二に、全てのコーディンがゾロイド（ヒトＢＭＰ−１、ショウジョウバエトロイド）によって切断されると、ＴＳＧはＢＭＰとの結合に関して、なおも抗ＢＭＰ活性を保持しているコーディン断片と競合することによってＢＭＰシグナル伝達を促進する。このように、ＢＭＰシグナル伝達のスイッチのオン・オフが、ＴＳＧによって鋭敏に行われる（Ｌａｒｒａｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：４４３９−４４４７）。ＴＳＧ−／−マウスにおける本発明者らの知見は、分子スイッチとしてのＴＳＧによるＢＭＰ活性の微細な制御が多数の臓器の適切な発達にとって必須であることを示唆している。双機能ＴＳＧが、ＢＭＰ、コーディン、ＴＳＧ、ゾロイド、および他の関連分子の局所濃度に応じて、異なる動物種の発達の際に異なるＢＭＰシグナル伝達を誘発する可能性がある。ＴＳＧ欠損マウスは、ヘッジホッグ−ＢＭＰ−ＳＭＡＤシグナル伝達、および／または推定のＢＭＰ−無関係シグナル伝達によって調節される、初期造血前駆細胞、胸腺、脾臓、軟骨、骨、および腎臓の発達の分子メカニズムを解明するために用いることができる。
ヒトＴＳＧ遺伝子は、染色体バンド１８ｐ１１にマッピングされ、これには免疫−骨疾患はこれまで連鎖していない（Ｓｃｏｔｔ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：４７５−４７８）。病気のＴＳＧ−／−マウスの表現型は、ＳＣＩＤを伴うヒト早期致死性短肢骨格異常の表現型と類似である（Ｇａｔｔｉ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９６９．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．７５：６７５−６８４）。ほとんどのヒト免疫−骨疾患の病因は、まだ分子的に明らかにされていないが、ＴＳＧ欠損マウスはまた、これらの疾患の発病の基礎となるメカニズムを解明するために有用となるであろう。
要約すると、ＴＳＧ欠損マウスにおける構造的に未成熟な腎臓を有する矮小発育症とリンパ系欠損の表現型は、インビボでのＴＳＧの双機能（骨格−腎形成に関するＢＭＰ−４アゴニストと、胸腺発達に関するＢＭＰ−４アンタゴニスト）を示唆している。同様に、ＣＴＧＦファミリーとしてのＴＳＧのもう一つの機能は、今後の研究において解明されなければならない。いずれにせよ、哺乳類のＴＳＧは、中胚葉臓器の適切な発達にとって必須である。
【産業上の利用の可能性】
本発明の産業上の有用性の第一点は、本発明の動物で観察される矮小成長やリンパ球造血不全などの形質を病態として呈する諸疾患に対して、ＴＳＧ蛋白、ＴＳＧ遺伝子およびＴＳＧと同様の生物活性を有する化合物を治療薬または予防薬として適用できる点にある。第二点は該動物およびＴＳＧ遺伝子改変哺乳動物細胞を利用した、ＴＳＧと同様の生物活性を有する化合物および内因性ＴＳＧの活性を修飾する化合物のスクリーニング法を提供できることにある。第三点は、ＴＳＧ遺伝子または蛋白の発現量測定により上記疾患の検査方法や検査薬を提供できる点にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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