(57)【要約】ＧＰＣＲ−Ｔ４、その塩、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞、または該細胞の膜画分と、サイロキシン、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンド、および試験物質とを接触させ、該リガンドのＧＰＣＲ−Ｔ４への結合量またはＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合と比較することを特徴とするスクリーニング法により、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストが取得できる。ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質は、甲状腺機能の制御、好中球の活性化または活性化の抑制、炎症性疾患の予防または治療、喘息の予防または治療、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療、感染性疾患の予防または治療に用いることができる。
2004063748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該リガンドの該ポリペプチドへの結合量を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該リガンドの該ポリペプチドへの結合量と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。
2004063748.tif 000039
（式ＩＩ中、ｎは６または７の整数である）
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）請求項１の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該リガンドの該ポリペプチドへの結合量を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該リガンドの該ポリペプチドへの結合量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
【請求項５】
ポリペプチドの活性化の程度を以下の（ａ）〜（ｃ）を指標にして測定する請求項３または４に記載のスクリーニング法。
（ａ）グアノシン５’−Ｏ−３−チオトリフォスフェート（ＧＴＰγＳ）のＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
【請求項６】
以下の（ａ）および（ｂ）を構成成分として含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の細胞膜画分
（ｂ）（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンド
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはインバースアゴニストのスクリーニング法。
【請求項８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
【請求項９】
ポリペプチドの構成活性を以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを指標にして測定することを特徴とする、請求項７または８に記載のスクリーニング法。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
【請求項１０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）請求項１の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドを接触させ、細胞の応答を測定することを特徴とする、該ポリペプチドの機能解析法。
【請求項１１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項１２】
サイロキシン、サイロキシンの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項１３】
イソコナゾール、イソコナゾールの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
【請求項１４】
アゴニストまたはアンタゴニストが請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、該化合物の誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩である、請求項１１に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項１５】
アゴニストまたはアンタゴニストが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項１１に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項１６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含有する形質転換体と試験物質とを接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定し、試験物質を接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
プロモーター領域が、配列番号３で表される塩基配列の連続する５０〜５０００塩基からなる塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加または減少させる物質を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項１９】
遺伝子の発現量を減少させる物質が、配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基と相補的な塩基配列もしくは実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した１９〜２５塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項１８に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
【請求項２０】
被検者の組織または細胞における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の転写量を測定し、健常者の組織または細胞における該遺伝子の転写量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
【請求項２１】
被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドの量を測定し、健常者の組織または細胞における該ポリペプチドの量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
【請求項２２】
被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
【請求項２３】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
【請求項２４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウト非ヒト動物を作製し、該動物に試験物質を投与してその症状を観察し、投与しなかった場合の症状と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、サイロキシンに反応するＧ蛋白質共役型受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法、該受容体遺伝子の発現を増加または減少させる物質のスクリーニング法、これらの物質を有効成分として含有する甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤に関する。
【背景技術】  甲状腺ホルモンとして、サイロキシン（３，５，３’，５’−ｔｅｔｒａｉｏｄｏ−１−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ：以下Ｔ４と略す）およびトリヨードサイロニン（３，５，３’−ｔｒｉｉｏｄｏ−１−ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ：以下Ｔ３と略す）が知られている。Ｔ３およびＴ４は核内に存在する甲状腺ホルモン受容体に結合することにより多様な生理活性を発揮する。この活性はＴ３の方がＴ４の１０倍以上強い。核内に存在する甲状腺ホルモン受容体を介した生理活性の発現には、各種遺伝子の発現調節を伴うため、作用の発揮には数時間以上の時間がかかる。
一方、Ｔ３またはＴ４に対する別の受容体が存在することを示唆する報告もある〔Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７６，Ｃ１０１４（１９９９）〕。機能的な甲状腺ホルモン受容体を持たないＨｅＬａ細胞をＴ４で刺激すると、刺激後３０分をピークとして、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ、以下、ＭＡＰＫと略す）のチロシン残基のリン酸化と核内への移行が起こる。この活性はＴ４の方がＴ３より強い。甲状腺ホルモン受容体に対する活性を持たないＴ４の分解物３，３’，５’−トリヨード−１−サイロニンも本活性を有する。３，５，３’，５’−テトラヨードサイロ酢酸はＴ４の活性を阻害した。Ｔ４−アガロースもＴ４と同様の活性を示したことからＴ４は細胞表面の受容体に作用していると考えられた。以上の結果から、ＨｅＬａ細胞の細胞表面にはＴ４に対する未知の受容体が存在し、Ｔ４は該受容体を介してＭＡＰＫを活性化することが示された。ＨｅＬａ細胞をＧＴＰ誘導体であるグアノシン５’−Ｏ−３−チオトリフォスフェート（以下、ＧＴＰγＳと称す）または百日咳毒素で処理しておくとＭＡＰＫの活性化がみられなくなることから、該受容体はＧｉと共役するＧ蛋白質共役型受容体（以下ＧＰＣＲと略す）であると推定された。しかし、該ＧＰＣＲは単離されていない。ＨｅＬａ細胞をインターフェロンγ（以下、ＩＦＮ−γと略す）とＴ４とで処理すると、ＩＦＮ−γの抗ウイルス活性が増強し、この増強作用にはＭＡＰＫの活性化とＭＡＰＫによるＳＴＡＴ１αのリン酸化が必要であった。ＨｅＬａ細胞をＩＦＮ−γで処理するとＨＬＡ−ＤＲ  ｍＲＮＡ量、クラスＩＩトランス・アクチベーターｍＲＮＡ量、およびＨＬＡ−ＤＲ蛋白質量が増加するが、Ｔ４は上記ＩＦＮ−γの作用を増強した。以上の結果から、ＨｅＬａ細胞の細胞表面上には、Ｔ４に対する未知受容体が存在し、Ｔ４は該受容体を介してＭＡＰＫを活性化することにより、ＩＦＮ−γの作用を増強することが示された。
また、Ｔ３またはＴ４の細胞膜上への結合を介した作用と推定されるものとして、心筋のＮａ＋チャンネルの不活性化、赤血球および心筋のＣａ２＋−ＡＴＰアーゼの活性増強、甲状腺のグルコース取り込み増強等が知られている〔Ｔｈｙｒｏｉｄ，６，４９７（１９９６）〕が、細胞膜上の結合分子は単離されていない。
本発明の過程で単離されたＴ４の受容体と９９％一致するアミノ酸配列を有するＧＰＣＲは公知であるが〔ＷＯ  ０１／４２２８７；ＷＯ  ０２／２６８２５；ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３１，４０７−４１４（２００２）〕、これらの文献中には、該ＧＰＣＲがＴ４の受容体として作用することに関しては記載されていない。また、該ＧＰＣＲがリガンド非存在下でも構成的な活性化を示すかどうかについても記載されていない。
【発明の開示】
本発明において「リガンド」は、受容体と特異的に結合する物質を意味する。「アゴニスト」は、受容体と特異的に結合し、その結果、受容体を活性化する物質を意味する。「受容体の活性化」は、受容体の構造変化により、共役するＧ蛋白質のαサブユニットへのＧＴＰの結合の促進、αサブユニットとβγサブユニットの解離およびこれらの解離したサブユニットを介したシグナル情報伝達を起こせるようになることを意味する。「アンタゴニスト」は、受容体と特異的に結合し、アゴニストによりおこる、受容体の活性化を阻害する物質を意味する。「アンタゴニスト」には、受容体の構成活性を阻害する「インバースアゴニスト」と受容体の構成活性は阻害しない「ニュートラルアンタゴニスト」が含まれる。「構成活性型ＧＰＣＲ」は、アゴニスト非存在下においても活性化してシグナル情報伝達をおこすことができるＧＰＣＲを意味し、アゴニスト非存在下においてシグナル情報伝達をおこすことができる活性を「構成活性」と呼ぶ。
本発明は、以下の（１）〜（３）を提供することを目的とする。（１）Ｔ４に反応するＧＰＣＲ（ＧＰＣＲ−Ｔ４）に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質のスクリーニング法。（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、感染性疾患の予防または治療剤。
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）下記の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該リガンドの該ポリペプチドへの結合量を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該リガンドの該ポリペプチドへの結合量と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。
2004063748.tif 000003
（式（ＩＩ）中、ｎは６または７である）
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該リガンドの該ポリペプチドへの結合量を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該リガンドの該ポリペプチドへの結合量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドを発現する細胞、あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法。
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドおよび試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの活性化の程度を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの活性化の程度と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（５）ポリペプチドの活性化の程度を以下の（ａ）〜（ｃ）を指標にして測定する（３）または（４）に記載のスクリーニング法。
（ａ）グアノシン５’−Ｏ−３−チオトリフォスフェート（ＧＴＰγＳ）のＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
（６）以下の（ａ）および（ｂ）を構成成分として含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の細胞膜画分
（ｂ）（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンド
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、該ポリペプチドに対するアゴニストまたはインバースアゴニストのスクリーニング法。
（８）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞あるいは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させ、該ポリペプチドの構成活性を測定し、試験物質を接触させなかった場合の該ポリペプチドの構成活性と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング法。
（９）ポリペプチドの構成活性を以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを指標にして測定することを特徴とする、（７）または（８）に記載のスクリーニング法。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧ蛋白質への結合量
（ｂ）Ｇ蛋白質のＧＴＰａｓｅ活性
（ｃ）細胞の応答の程度
（１０）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞と、（ｉ）サイロキシン、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）（１）の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の化合物の誘導体であって該ポリペプチドと結合する化合物、および（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩からなる群から選ばれるリガンドを接触させ、細胞の応答を測定することを特徴とする、該ポリペプチドの機能解析法。
（１１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１２）サイロキシン、サイロキシンの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１３）イソコナゾール、イソコナゾールの誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
（１４）アゴニストまたはアンタゴニストが（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物、該化合物の誘導体またはいずれかの薬理学的に許容される塩である、（１１）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１５）アゴニストまたはアンタゴニストが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体である、（１１）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１６）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子の連結されたＤＮＡを含有する形質転換体と試験物質とを接触させ、レポーター遺伝子の発現量を測定し、試験物質を接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質のスクリーニング方法。
（１７）プロモーター領域が、配列番号３で表される塩基配列の連続する５０〜５０００塩基からなる塩基配列を有するＤＮＡである、（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を増加または減少させる物質を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（１９）遺伝子の発現量を減少させる物質が、配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した５〜６０塩基と相補的な塩基配列もしくは実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、または配列番号２で表される塩基配列から選ばれる連続した１９〜２５塩基の配列および該配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである、（１８）に記載の甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、あるいは感染性疾患の予防または治療剤。
（２０）被検者の組織または細胞における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の転写量を測定し、健常者の組織または細胞における該遺伝子の転写量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２１）被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドの量を測定し、健常者の組織または細胞における該ポリペプチドの量と比較することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２２）被検者の組織または細胞における、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の変異を検出することを特徴とする、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２３）配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび（１）に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を含有する、甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、または感染防御能の異常の判定方法。
（２４）  ２４．  配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつサイロキシン、イソコナゾールおよび請求項１に記載の式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）で表される化合物からなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のノックアウト非ヒト動物を作製し、該動物に試験物質を投与してその症状を観察し、投与しなかった場合の症状と比較することを特徴とする、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する物質のスクリーニング方法。
以下、式（Ｉ）で表される化合物を化合物Ｉといい、式（ＩＩ）で表される化合物を化合物ＩＩという。化合物ＩＩのうちｎ＝６の化合物を化合物ＩＩａといい、ｎ＝７の化合物を化合物ＩＩｂという。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが、Ｔ４に反応して活性化を受け、Ｇ蛋白質を介したシグナル情報伝達を行うＧＰＣＲ（ＧＰＣＲ−Ｔ４と呼ぶ）であることを見出し、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング系を構築した。ＧＰＣＲ−Ｔ４の発現分布解析、およびＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストであるＴ４やイソコナゾールを用いたＧＰＣＲ−Ｔ４の機能解析の結果、ＧＰＣＲ−Ｔ４が白血球のプライミングや活性化の制御、ならびに甲状腺の機能制御に関与していることを初めて見出した。すなわち、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質は、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、感染性疾患の予防治療剤として有用なことを初めて見出した。以上の一連の研究により、本発明を完成するに至った。
以下詳細に説明する。
１．ＧＰＣＲ−Ｔ４
ＧＰＣＲ−Ｔ４としては、配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号１で表わされるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをあげることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするｃＤＮＡをＧＰＣＲ−Ｔ４  ｃＤＮＡ、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをＧＰＣＲ−Ｔ４  ｍＲＮＡと呼ぶ。リガンドに反応する活性としては、例えばリガンドと結合する活性、リガンドと結合してＧ蛋白質を介したシグナル情報伝達を行う活性などをあげることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４の由来は特に限定されるものではなく、その由来として例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）やニワトリをあげることができるが、特に配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＣＲ−Ｔ４が好ましい。
上記の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−２００２）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法によりを用いて、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入し、変異を導入したＤＮＡを発現させることにより取得することができる。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１〜数十個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個さらに好ましくは１〜５個である。また、アミノ酸の欠失、置換または付加は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１ヵ所に限らず、２ヵ所以上の位置で同時に生じてもよい。
アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、配列番号１と配列番号２４のアミノ酸配列の間で保存されていない、配列番号１の２４番目のセリン、１９３番目のアルギニン、４５７番目のバリン、あるいは配列番号１と配列番号２６のアミノ酸配列を公知のアラインメントソフトウェアを用いて比較したときに、両者で保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアラインメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアラインメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメーターとしては、デフォルト値を用いることができる。
また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端をあげることができる。
置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型を問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、Ｔ４、イソコナゾール化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するためには、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有していることが望ましい。アミノ酸配列の相同性は、２配列間のアラインメント作製ツールＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ〔ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４，２４７（１９９９）〕において、アルゴリズムＢＬＡＳＴ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９６，５８７３（１９９３）〕基づいて開発されたアミノ酸配列間の相同性解析プログラムｂｌａｓｔｐを用いてデフォルトの条件（ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ：１１  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ：１  ｐｅｎａｌｔｙ、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０．０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：３）で解析し、２配列間のアラインメントを作製することによって決定することができる。
また、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドもＧＰＣＲ−Ｔ４に含まれる。アミノ酸配列の相同性は、上記のｂｌａｓｔｐを用いたＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにより決定することができる。
さらに、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードし、かつＴ４、イソコナゾール化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドもＧＰＣＲ−Ｔ４に含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体的な例としては、フィルター上に固定化したコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、プローブと４２〜６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用いて４２〜６５℃でフィルターを洗浄した結果、同定されるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡがコードするポリペプチドが、Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するためには、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有することが望ましい。塩基配列の相同性は、２配列間のアラインメント作製ツールＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにおいて、アルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて開発された塩基配列間の相同性解析プログラムｂｌａｓｔｎを用いてデフォルトの条件（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ：１、ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ：５  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ：２  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１）で解析し、２配列間のアラインメントを作製することによって決定することができる。
以上の、（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、（２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチド、または（３）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードし、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドであるＧＰＣＲ−Ｔ４の例として、ＷＯ  ０２／２６８２５、ＷＯ  ０１／４２２８７およびＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３１，４０７−４１４（２００２）に記載されている、配列番号２４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、マウスのＧＰＣＲとしてＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０，４４０５−４４１０（２０００）に記載されている、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをあげることができる。配列番号２４で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、２４番目のセリン、１９３番目のアルギニン、４５７番目のバリンがそれぞれ、プロリン、リジン、イソロイシンに置換した配列であり、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９９％の相同性を有する配列である。また、配列番号２６で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と６８％の相同性を有する配列である。
ＧＰＣＲ−Ｔ４が、Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有していることは、２．（１）および２．（２）に後述するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法に記載した方法に準じて、試験物質非存在下におけるリガンドの特異的結合量、あるいは試験物質非存在下におけるＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定することにより確認することができる。
なお、Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有していれば、該リガンドとの結合の強さやＧ蛋白質を介したシグナル情報伝達の強さは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと異なってもよい。
２．リガンドを用いたＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
リガンドを用いたＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法としては、
（Ａ）  ＧＰＣＲ−Ｔ４もしくはその塩、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞、または該細胞の細胞膜画分と、（１）リガンドとを接触させた場合と、（２）リガンドおよび試験物質とを接触させた場合それぞれの場合の、ＧＰＣＲ−Ｔ４もしくはその塩、該細胞、または該細胞の細胞膜画分に対するリガンドの結合量を測定して比較を行ない、試験物質よりＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを選択する方法、
（Ｂ）  ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分と、（１）リガンドとを接触させた場合と、（２）リガンドおよび試験物質とを接触させた場合それぞれの場合の、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定して比較を行ない、試験物質よりＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを選択する方法、
をあげることができる。
（Ａ）の方法だけではアゴニストとアンタゴニストを区別できないが、選択された物質を（Ｂ）の方法で評価することにより区別することができる。（Ｂ）の方法で選択された物質がＧＰＣＲ−Ｔ４に結合することは、（Ａ）の方法で確認することができる。
また、４．に後述するように、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、感染性疾患の予防または治療作用を有する化合物なので、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングする方法は、これらの化合物のスクリーニング法ともなる。
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４へのリガンドの結合量を測定するスクリーニング法
上記方法（Ａ）に用いるＧＰＣＲ−Ｔ４としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドと反応する活性を有するポリペプチドであればいずれものであってもよい。これらのポリペプチドの塩も用いることができる。また、上記方法（Ａ）では該ポリペプチドを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を用いてもよい。該細胞を用いる場合、生きたままの細胞でもよいし、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。
上記のポリペプチド、その塩、および該ポリペプチドを発現する細胞は後述する（３）に記載の方法で取得することができる。細胞膜画分は、該細胞を適当な緩衝液中で破砕し、遠心分離により沈殿した画分として得ることができる。
リガンドとしては、（ｉ）Ｔ４、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）化合物Ｉ、（ｉｖ）化合物ＩＩ、（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの化合物の誘導体でＧＰＣＲ−Ｔ４と結合するものおよび（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）のいずれかの化合物の薬理学的に許容される塩を使用することができる。リガンドのＧＰＣＲ−Ｔ４、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分への結合量の測定のためには、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ等の放射性同位元素で標識されたリガンドを用いることが好ましい。
Ｔ４の誘導体としては、例えば、３，３’，５’−トリヨード−１−サイロニン、３，５，３’−トリヨード−１−サイロニン、３，３’−ジヨードサイロニン、３，５，３’，５’−テトラヨードサイロ酢酸、３，５，３’−トリヨードサイロ酢酸、ＵＳ６，２２１，９１１に記載の甲状腺ホルモン誘導体があげられる。
イソコナゾールの誘導体としては、例えば、エコナゾール、ミコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、オルコナゾール、ブトコナゾール、式（ＩＩＩ）で表される化合物があげられる。
2004063748.tif 000004
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって水素原子、ハロゲン、炭素数１〜３のアルキル、炭素数１〜３のアルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表す。Ｒ３は酸素原子または硫黄原子を表す。）
化合物Ｉの誘導体としては、例えば、式（ＩＶ）で表される化合物があげられる。
2004063748.tif 000005
（式中Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は同一または異なって水素原子、ハロゲン、炭素数１〜３のアルキル、炭素数１〜３のアルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、もしくはヒドロキシメチルを表す。）
化合物ＩＩの誘導体としては、例えば、式（ＩＩ）のｎが３〜５、８〜１０のいずれかである化合物があげられる。
（ｉ）〜（ｖ）の化合物はシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ケムブリッジ・コーポレーション（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、アシネックス（ＡＳＩＮＥＸ）、プレストウィック・ケミカル（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）等のメーカーから市販されており、入手可能である。また、１２５Ｉで標識したＴ４は、アマシャム・バイオサイエンシズ社、パーキンエルマー社から市販されている。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の薬理学的に許容される塩は、例えば薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩などを包含する。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の薬理学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩などがあげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジンなどの付加塩があげられ、薬理学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばリジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの付加塩があげられる。（ｉ）〜（ｖ）の化合物の塩を取得したいとき、（ｉ）〜（ｖ）の化合物が塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、（ｉ）〜（ｖ）の化合物を適当な溶媒に溶解または懸濁し、酸または塩基を加えることにより塩を形成させて単離、精製すればよい。
以下、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の細胞膜画分を用いる場合のリガンドの結合量の測定の具体例を示す。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質と放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドを添加したもの、（ｉｉ）放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドのみを添加したもの、（ｉｉｉ）放射性同位元素で標識した一定の放射能量のリガンドと大過剰の未標識のリガンドを添加したものを用意し、反応させる。反応は約０〜５０℃、望ましくは約４〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行なう。
（ｉ）〜（ｉｉｉ）それぞれを反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−ウエルカウンター等の放射線測定装置で計測する。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの放射能量（全結合量：Ｂ）から（ｉｉｉ）の放射能量（非特異的結合量：ＮＳＢ）を差し引いた値を、（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの特異的結合量として計算する。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるリガンドの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるリガンドの特異的結合量を比較して、リガンドの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして選択することができる。
試験物質としてはいかなるものも使用できるが、例えば、公知の受容体のリガンド、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物や該抽出物由来の精製物、細胞培養上清や該上清由来の精製物などの生体試料、既知蛋白質、組換え技術を用いて生産された組換え蛋白質、微生物の菌体抽出液や該抽出液由来の精製物、微生物培養上清や該上清由来の精製物、既知化合物、コンビナトリアルケミストリーを用いて合成された化合物などがあげられる。公知の受容体のリガンドとしては、例えば、Ｔ３、Ｔ４、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（ピチュイタリ・アデニレート・シクラーゼ・アクチベイティング・ポリペプチド）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、ガストリン放出ペプチド、副甲状腺ホルモン、ＶＩＰ（バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド）、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、αまたはβ−ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＰＦ４、ＩＰ１０、ＧＣＰ−２、ＭＣＰ−１、ＨＣ１４、ＭＣＰ−３、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳなど）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、ウロテンシンＩおよびＩＩ、ニューロペプチドＦＦ、オレキシンおよびメラニン・コンセントレーティング・ホルモンなどをあげることができる。特に、アゴニストであるＴ４、イソコナゾールおよび化合物Ｉのそれぞれの誘導体、ならびにアンタゴニストである化合物ＩＩの誘導体はアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高く、スクリーニングを行うのに適している。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲポリペプチドあるいは他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドあるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いる同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定するスクリーニング法
上記方法（Ｂ）に用いるＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号１で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつＴ４、イソコナゾールおよび化合物Ｉまたは化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドを発現する細胞があげられる。該細胞は、後述する（３）に記載の方法で取得することができる。細胞膜画分は、該細胞を適当な緩衝液中で破砕し、遠心分離により沈殿した画分として得ることができる。
リガンドとしては、（ｉ）Ｔ４、（ｉｉ）イソコナゾール、（ｉｉｉ）化合物Ｉ、（ｉｖ）Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩのいずれかの誘導体で、ＧＰＣＲ−Ｔ４と結合してＧＰＣＲ−Ｔ４を活性化できるものおよび（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの化合物の薬理学的に許容される塩を使用することができる。これらのリガンドは２．（１）に記載の方法で入手できる。
試験物質としては、２．（１）に記載の物質があげられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４にリガンドが結合して活性化すると、ＧＰＣＲ−Ｔ４に共役していた三量体Ｇ蛋白質はＧＴＰａｓｅ活性を有するＧαサブユニットとβγサブユニットに解離し、ＧαにはＧＤＰと交換してＧＴＰが結合する。また、解離したＧαサブユニットまたはβγサブユニットを介したシグナル情報伝達により、種々の細胞応答が起こる。スクリーニング方法（Ｂ）におけるＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度は、（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量、（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性、（ｃ）細胞の応答の程度を指標に測定することができる。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量を測定するスクリーニング法
ＧＴＰγＳのＧαへの結合量は、文献〔Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７，８４８−８５４（１９９５）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法に従って、標識したＧＴＰγＳを、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分へ添加し、ＧＴＰγＳの細胞または細胞膜画分への結合量として測定することができる。ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧαと結合するが、Ｇαによる加水分解を受けないため、結合量を正確に測定できる。標識したＧＴＰγＳとしては、例えば３５Ｓで標識したＧＴＰγＳを用いることができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、一定量のリガンド、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンド、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉｉ）一定量のリガンド、ＧＤＰ、放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳおよび大過剰の未標識のＧＴＰγＳを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行なう。（ｉ）〜（ｉｉｉ）それぞれを反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測する。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの放射能量（全結合量：Ｂ）から（ｉｉｉ）の放射能量（非特異的結合量：ＮＳＢ）を差し引いた値を、（ｉ）および（ｉｉ）それぞれの特異的結合量として計算する。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量を比較して、ＧＴＰγＳの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、ＧＴＰγＳの特異的結合量を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性を測定するスクリーニング法
ＧＴＰａｓｅ活性は、文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ．，２７１，１８５７−１８６０（１９９６）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法に従って、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分へ、γ位リン酸を放射性同位元素で標識したＧＴＰを基質として添加し、測定することができる。γ位リン酸を放射性同位元素で標識したＧＴＰとしては、例えば３２Ｐで標識した［γ−３２Ｐ］ＧＴＰを用いることができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、一定量のリガンドおよびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンドおよびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応は０〜５０℃、望ましくは４〜３７℃で、２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行なう。（ｉ）および（ｉｉ）それぞれを反応後、遠心分離により反応液の上清を回収し、上清に放出された無機リン酸（Ｐｉ）の放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測し、ＧＴＰａｓｅ活性とする。あるいは、反応液をガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、濾過液を回収し、濾過液中の無機リン酸（Ｐｉ）の放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射線測定装置で計測してもよい。（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性とを比較して、ＧＴＰａｓｅ活性を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、ＧＴＰａｓｅ活性を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（ｃ）細胞の応答を検出する方法
細胞の応答としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰＫ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞の増殖、メラニン色素の凝集または拡散、活性酸素産生、一酸化窒素産生あるいはレポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発現量の変動があげられる。これらの細胞の応答は、文献〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８５７（１９９６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，９８（１９９５）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７５，１２７４（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１８２２（１９９７）、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．，１７，５７（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４００（１９９７）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８，１４７１（１９９７）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，１３３４（１９９８）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２５１，４７１（１９９８）、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２５，１３８７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５２，１１５（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ，３５８，３２５（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ，３９３，２７２（１９９８）、Ｃｅｌｌ，９２，５７３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，２７２，２７４９７（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１８，４３０（１９９７）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，２０，３７０（１９９９）、ＷＯ９８／４６９９５〕に記載の方法により測定することができる。
レポーター系を用いて細胞の応答をモニターする場合は、例えば、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現させた細胞に、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化により発現が誘導される遺伝子のプロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを導入することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化をレポーター遺伝子の発現で測定することができる。該プロモーターとしては、例えばＩＣＡＭ−１遺伝子のプロモーター、ｃ−ｆｏｓのプロモーター、Ｋｒｏｘ−２４のプロモーター〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２０，１４５（１９９６）〕などが利用できる。また、該プロモーターは、適当な転写因子の結合配列と基本プロモーターからなる人工プロモーターでもよい。転写因子の結合配列としては、Ｇｉに共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＳＲＥ（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）やＧｉに共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写が抑制されるＣＲＥ（ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）などが利用できる。また、ＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧαｓをＧＰＣＲ−Ｔ４の発現細胞に発現させることにより、本来Ｇｓと共役するＧＰＣＲの活性化に伴い転写を活性化するＣＲＥを含む人工プロモーターからも、Ｇｉが共役するＧＰＣＲの活性化に伴いレポーター遺伝子の発現を誘導することができる。
レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用可能であるが、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子などが利用できる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドを発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。必要に応じて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、（ｉ）試験物質および一定量のリガンドを添加したもの、（ｉｉ）一定量のリガンドのみ添加したものそれぞれを用意し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞の応答（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞増殖活性、メラニン色素の凝集または拡散、活性酸素産生、一酸化窒素産生またはレポーター遺伝子の発現量など）を測定する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加して定量してもよい。
また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞のｃＡＭＰ産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
（ｉｉ）の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（ｉ）の試験物質存在下における細胞の応答の程度を比較して、細胞の応答を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして選択することができる。一方、細胞の応答を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
また、選択された物質について、他のＧＰＣＲを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分をＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアッセイを行うことにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかを確認することができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞およびＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの調製
（ａ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の調製
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する哺乳動物の細胞または組織から調製することができる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入した形質転換細胞として得ることができる。（１）および（２）に記載したスクリーニングを感度よく行うため、また３．に後述するＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用したスクリーニングを行うためには、ＧＰＣＲ−Ｔ４を大量に発現する形質転換細胞を用いるのが好ましい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する細胞または組織としては、ｍＲＮＡレベルでＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量の見られる、多形核白血球、Ｔ細胞、単球、骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤、肺、気管、リンパ節、骨格筋、精巣、脊髄、胎児肝臓、胎児肺等の細胞や組織、ＨＬ−６０やＨｕｔ７８等の細胞株があげられる。特に、多形核白血球、骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤が好ましい。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ＤＮＡを造成し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞を取得することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡは、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡであればいかなるＤＮＡでもよく、具体例として、（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＴ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよび化合物ＩＩからなる群から選ばれるリガンドに反応する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡなどをあげることができる。
上記（ａ）に相当するＤＮＡとしては、例えばｃＤＮＡクローンｃ−ｈｅｐ１５３７４（ヘリックス研究所）をあげることができる。また、配列番号２で表される塩基配列の５’末端２０〜４０塩基の配列を３’端に含むＤＮＡ、３’末端２０〜４０塩基の配列と相補的な配列を３’端に含むＤＮＡをそれぞれＤＮＡ合成機で合成し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する組織や細胞からｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを鋳型とし、２種類の合成ＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより上記（ａ）に相当するＤＮＡを増幅し単離することができる。組織や細胞からの染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡの調製、およびＰＣＲはモレキュラー・クローニング第３版に記載の方法に従って行うことができる。
上記（ｃ）のストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＴ４に反応する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記（ａ）に記載のＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体的な例として、フィルター上に固定化したコロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、プローブと４２〜６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液を用いて４２〜６５℃でフィルターを洗浄した結果、同定されるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、２配列間のアラインメント作製ツールＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにおいて、塩基配列間の相同性解析プログラムｂｌａｓｔｎを用いてデフォルトの条件（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ：１、ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２、ｏｐｅｎ  ｇａｐ：５  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ：２  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ、ｇａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０、ｅｘｐｅｃｔ：１０、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１）で解析し、２配列間のアラインメントを作製したときに、上記の配列番号２で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをあげることができる。このようなＤＮＡの具体的な例として、配列番号２で表される塩基配列と９９．８％の相同性を有する配列番号２５で表される塩基配列（配列番号２４で表されるアミノ酸配列をコードするヒトのｃＤＮＡのコード領域の配列）を含むＤＮＡ、配列番号２で表される塩基配列と７４％の相同性を有する配列番号２７で表される塩基配列（配列番号２６で表されるアミノ酸配列をコードするマウスのｃＤＮＡのコード領域の配列）を含むＤＮＡをあげることができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現できるものであればいずれも用いることができるが、該形質転換細胞が発現するＧＰＣＲ−Ｔ４が高次構造を保ち、リガンドとの結合性や機能性を保持するためには、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞などで発現させるのが好ましい。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規受容体遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＥ４２０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７、（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３０〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製〕、ｐＧＫＡ２〔形質転換大腸菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−６７９８）より調製〕、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９）、ｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）、ｐＥＴ（ノバジェン社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＫＫ２２３−２（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）ｐＭＡＬ−ｃ２（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の原核細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。またＧＰＣＲの発現に適した変異株や改変Ｇα蛋白質を発現させた酵母〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４８７（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，６１８８（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４７００（１９９６）〕などを宿主として利用することもできる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＣＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３等を例示することができる。特に誘導発現用のベクター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（Ｇａｌ４−ＥＲ）〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を発現する宿主細胞に導入した場合に、１７β−エストラジオールの添加により発現誘導が可能となるｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄ等が好ましい。また、複製開始点として、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有するｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＧａｌ９−ｄ、ｐＡＧａｌ９−ｎｄ等のベクターは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞等のエプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子を発現するＢ細胞株を宿主細胞としたときに、染色体外にプラスミド状態で安定に存在するため、高い発現を示す形質転換株を容易に得ることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＧＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株、カエルの卵母細胞およびカエルのメラニン細胞等をあげることができる。
さらにマウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、モレキュラー・バイオロジー第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する昆虫細胞を得ることができる。
すなわち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現する昆虫細胞を得ることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてインビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１〔（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ  Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等を、あげることができる。また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する植物細胞を得ることができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
（ｂ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの調製
ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドは、上記のＧＰＣＲ−Ｔ４を天然に発現する哺乳動物の細胞または組織から公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。例えば哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより単離・精製することができる。
また、（１）で得られるＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入した形質転換細胞を、通常の培養方法に従って培養し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を生成蓄積させ、該培養物よりＧＰＣＲ−Ｔ４を採取することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を調製することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核微生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変イーグル培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ４００、ＥＸ−ＣＥＬＬ  ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシズ社製）、グレースの昆虫培地〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養条件はｐＨ６〜７、培養温度は２５〜３０℃、培養時間は通常１〜５日間が好ましい。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、分泌蛋白質または融合蛋白質として発現させることもできる。融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（蛋白）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合蛋白質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。これらの蛋白質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に付加する精製や検出用のタグとしても利用できる。タグは任意の場所に付加することができるが、哺乳動物細胞で発現させる場合、細胞外領域または細胞内領域に付加するのが好ましい。
ＧＰＣＲ−Ｔ４の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
宿主細胞外へ分泌発現させる場合、あるいは宿主細胞膜上に発現させる場合は、必要に応じて宿主に合ったシグナル配列を、ＧＰＣＲ−Ｔ４のＮ端末側に付加する。ＧＰＣＲ−Ｔ４のＮ末端を一部欠失させた上で、上記分泌シグナルを付加した方がよい場合もある。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
また動物細胞を宿主として用いる場合は、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する形質転換細胞の培養物から、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドを単離・精製するには、通常のポリペプチドの単離・精製法を用いることができる。
例えば、ＧＰＣＲ−Ｔ４がＧＰＣＲ−Ｔ４発現形質転換細胞の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャム・バイオシエンシズ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４がＧＰＣＲ−Ｔ４発現形質転換細胞の細胞膜上に蓄積する場合には、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離やろ過により膜画分を得たのち、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を用いてＧＰＣＲ−Ｔ４を膜から可溶化した後、上記と同様の単離・精製法により精製標品を得ることができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法によりＧＰＣＲ−Ｔ４を回収後、ＧＰＣＲ−Ｔ４の不溶体を変性剤で可溶化する。該可溶化液を、変性剤を含まないあるいは変性剤の濃度がＧＰＣＲ−Ｔ４が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離・精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外にＧＰＣＲ−Ｔ４が分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離・精製法と同様の手法により、ＧＰＣＲ−Ｔ４の精製標品を得ることができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３２０１に記載の方法に準じて、ＧＰＣＲ−Ｔ４をプロテインＡとの融合蛋白質として生産し、ＩｇＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をＦＬＡＧペプチドとの融合蛋白質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
さらに、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２（１９８８）、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてＧＰＣＲ−Ｔ４を生産することもできる。
さらに、ＧＰＣＲ−Ｔ４は、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）法、ｔＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）法等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスト・ケムテック社、パーキン・エルマー社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
上記の方法で得られるＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
（４）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キットには、（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分および（ｉｉ）リガンドとが含まれる。
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は、上記（３）に記載の方法で調製することができる。該細胞の膜画分は、上記（３）に記載の方法で調製した該細胞を適当な緩衝液中で破砕し、遠心分離により沈殿した画分として得ることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドもしくはその塩は上記（３）に記載の方法で調製することができる。ただし、スクリーニング方法が、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量または（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性で測定する方法の場合は、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその塩ではなく、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分を用い、ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を（ｃ）細胞の応答の程度を指標に測定する方法でスクリーニングする場合は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を用いる。
（ｉｉ）リガンド
（ａ）Ｔ４、（ｂ）イソコナゾール、（ｃ）化合物Ｉ、（ｄ）化合物ＩＩ、（ｅ）（ａ）〜（（ｄ）のいずれかの化合物の誘導体でＧＰＣＲ−Ｔ４と結合するもの、および（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかの化合物の薬理学的に許容される塩を使用することができる。ただし、スクリーニング方法が、ＧＰＣＲ−Ｔ４へのリガンドの結合量を測定する方法の場合は、１２５Ｉ等の放射性同位体で標識したリガンドおよび非標識のリガンドの両方を調製する。これらのリガンドは（１）に記載した方法で調製できる。
キットには、これ以外に、（ｉｉｉ）測定の際の試薬の調製や洗浄等に用いる適当な緩衝液、（ｉｖ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞の培養に用いる培地、（ｖ）測定に用いるマルチウェルプレート、（ｖｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度（ＧＴＰγＳのＧαへの結合量、ＧＴＰａｓｅ活性、細胞の応答）を測定するのに必要な試薬等をさらに含んでもよい。
以下に、ＧＰＣＲ−Ｔ４へのリガンドの結合量を測定する方法によるキットの試薬の具体的な例と、そのキットの測定方法を記載する。
（ａ）キットの試薬
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現させたＣＨＯ細胞。
（ｉｉ）標識リガンド
１２５Ｉで標識したＴ４の水溶液。４℃あるいは−２０℃にて保存する。用時に（ｄ）の測定用緩衝液にて１μｍｏｌ／Ｌに希釈する。
（ｉｉｉ）リガンド標準液
０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで調製した、１ｍｍｏｌ／Ｌの非標識のＴ４溶液。−２０℃で保存する。
（ｉｖ）測定用緩衝液
０．０５％のＢＳＡを含むハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ’Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｅ）測定法
（ｉ）ＧＰＣＲ−Ｔ４発現ＣＨＯ細胞を、１２ウェル組織培養用プレートに５×１０５個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で２日間培養する。測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各ウェルに加える。
（ｉｉ）１０−３〜１０−１０ｍｏｌ／Ｌの試験物質溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。最大結合量の測定のために、試験物質を加えずに、標識リガンドのみ加える。非特異的結合量を知るためには試験物質のかわりに１０ｍｍｏｌ／Ｌのリガンド標準液を５μｌ加えておく。試験物質としては、上記（１）に記載した物質を使用することができる。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞を溶解液（０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）で溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターと混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンターを用いて放射活性を測定し、最大結合量に対するパーセント（Ｐｅｒｃｅｎｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｂｉｎｄｉｎｇ：ＰＭＢ）を下記式で求める。
ＰＭＢ＝（Ｂ−ＮＳＢ）÷Ｂ０×１００
Ｂ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０：最大結合量
（１）または（２）記載のスクリーニング方法または（４）記載のスクリーニング用キットを用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを取得することができる。
３．構成活性を利用したスクリーニング法
本発明者らは、本研究においてＧＰＣＲ−Ｔ４が構成活性型ＧＰＣＲであることを初めて見出した。ＧＰＣＲ−Ｔ４は構成活性型ＧＰＣＲであるため、リガンドの非存在下でも、Ｇ蛋白質を介したシグナルを流すことができる。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用すれば、２．（２）に記載したＧＰＣＲ−Ｔ４の活性化の程度を測定するスクリーニング法において、リガンドを添加しなくとも、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはインバースアゴニストをスクリーニングすることができる。
また、４．に後述するように、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニスト（インバースアゴニストが含まれる）は、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または活性化抑制作用、炎症性疾患の予防または治療作用、喘息の予防または治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療作用、あるいは感染性疾患の予防または治療作用を有する化合物なので、アゴニストまたはインバースアゴニストをスクリーニングできる方法は、これらの化合物のスクリーニング法ともなる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞は２．（２）に記載の細胞を用いることができる。細胞膜画分は、２．（２）に記載と同様にして調製できる。
（ａ）ＧＴＰγＳのＧαへの結合量を測定するスクリーニング法
ＧＴＰγＳのＧαへの結合量は、２．（２）に記載と同様して測定することができる。具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質、ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉ）ＧＤＰおよび放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳを添加したもの、（ｉｉｉ）ＧＤＰ、放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰγＳおよび大過剰の未標識のＧＴＰγＳを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応、測定および特異的結合量の計算は２．（２）の記載と同様にして行う。
（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰγＳの特異的結合量を比較して、ＧＴＰγＳの特異的結合量を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、ＧＴＰγＳの特異的結合量を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
（ｂ）ＧＴＰａｓｅ活性を測定するスクリーニング法
ＧＴＰａｓｅ活性は、２．（２）に記載と同様にして測定することができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、（ｉ）試験物質およびγ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰを添加したもの、（ｉｉ）γ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放射能量のＧＴＰのみを添加したものをそれぞれ用意し、反応させる。反応およびＧＴＰａｓｅ活性を２．（２）に記載と同様にして測定する。（ｉｉ）の試験物質非存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性と、（ｉ）の試験物質存在下におけるＧＴＰａｓｅ活性とを比較して、ＧＴＰａｓｅ活性を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、ＧＴＰａｓｅ活性を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
（ｃ）細胞の応答を検出する方法
細胞の応答は２．（２）に記載と同様にして測定することができる。
具体的には、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。培養後、必要に応じて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、（ｉ）試験物質を添加したもの、（ｉｉ）試験物質を添加しないものそれぞれを用意し、一定時間インキュベートする。インキュベート後、細胞の応答を２．（２）（ｃ）の記載と同様にして測定する。（ｉｉ）の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（ｉ）の試験物質存在下における細胞の応答の程度を比較して、細胞の応答を減少させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。また、細胞の応答を増加させる物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択することができる。
４．ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニストならびにこれらの物質の利用法
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニスト
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとしては、Ｔ４、イソコナゾール、化合物Ｉおよびこれらの化合物の薬理学的に許容される塩をあげることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとしては、化合物ＩＩおよび化合物ＩＩの薬理学的に許容される塩をあげることができる。
また、Ｔ４の誘導体、イソコナゾールの誘導体、化合物Ｉの誘導体または化合物ＩＩの誘導体は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストである可能性が高い。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を試験物質として、２．（２）または３．に記載のスクリーニング法に従って評価することにより、アゴニストとして働く抗体、アンタゴニストとして働く抗体を選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体は、下記（５）に記載の方法に従い、取得することができる。
（２）機能解析への利用
上記２および３記載のスクリーニング方法で取得できる、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現している組識や細胞に接触させ、細胞の応答を測定することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の機能を明らかにすることができる。細胞の応答としては、例えばアラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ減少、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質（例えば、ＣＲＥＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＴＡＴ６、ＭＡＰＫ、ＡＴＦ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、Ｉκ−Ｂα、Ｉκ−Ｂβ、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８等）のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの変動、細胞の増殖、活性酸素産生、一酸化窒素産生あるいはレポーター遺伝子やマーカー遺伝子の発現量があげられる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとしては、例えばＴ４、イソコナゾールまたは化合物Ｉを用いることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとしては、例えば化合物ＩＩを用いることができる。
（３）疾患の治療、予防への利用
ＧＰＣＲ−Ｔ４はヒト末梢多形核白血球で高発現している。また、実施例８に示すように、ヒト末梢多形核白血球をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストであるＴ４またはイソコナゾールで刺激すると、定常状態またはＧＭ−ＣＳＦ刺激時のＥＲＫ  ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制される。好中球においては、ＥＲＫ  ＭＡＰＫの活性化によりプライミングや活性化が起こることが知られていることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストは、好中球の活性化抑制剤として、またアンタゴニストは、好中球の活性化促進剤として有用と考えられる。炎症における好中球の過度の活性化は、組織障害の原因となることが知られている。また、喘息や慢性閉塞性肺疾患においては、炎症や感染に由来する好中球の活性化が肺組識の障害を引き起こし、疾患を悪化させることが知られている。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストは、好中球による組織障害の抑制、炎症性疾患の予防や治療、喘息の予防や治療、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防や治療にも有用と考えられる。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストは、好中球を活性化することにより、感染性疾患の予防や治療にも有用と考えられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は甲状腺においても高発現していることから、甲状腺から生産されるＴ４は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を介して甲状腺の機能を制御していると考えられる。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、甲状腺機能の制御に有用と考えられる。
（４）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストを有効成分として含有する医薬
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、（３）に記載した疾患の治療薬または予防薬として単独で用いることも可能ではあるが、通常は各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物または人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩を単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路としては、予防または治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または例えば静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、例えば錠剤、注射剤等があげられる。
経口投与に適当な例えば錠剤等は、乳糖、マンニット等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。また、これらの非経口剤においても経口剤で例示した賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤および希釈剤、防腐剤、フレーバー類などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
上記の活性成分またはその薬理学的に許容される塩は、上記の目的で用いる場合、通常、全身的または局所的に、経口または非経口の形で投与される。投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により異なるが、通常経口の場合、成人１人あたり、１回につき０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５００ｍｇの範囲で、１日１回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、通常成人一人当り０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜３００ｍｇを一日一回ないし数回投与するか、または１日１〜２４時間の範囲で静脈内に持続投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
（５）ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体の調製
（Ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上記２．（３）に記載の方法により取得したＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチド、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞または該細胞の膜画分、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合するポリクローナル抗体を作製することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の連続する５〜５０残基の配列からなるペプチド等をあげることができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の部分ペプチドは、ペプチド合成機によって合成することができる。
該抗原を投与する動物としては、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等をあげることができる。抗原の投与は動物の皮下、静脈内または腹腔内に抗原をそのまま投与してもよいが、抗原性の高いキャリア蛋白質を抗原に結合させて投与する、あるいは適当なアジュバントとともに抗原を投与することが好ましい。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。キャリア蛋白質としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン、ウシチログロブリン等があげられ、アジュバンドとしては、フロイントの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン等があげられる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することをＥＬＩＳＡ〔酵素免疫測定法  第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した上記動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ＩＩ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いたＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの部分ペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示した上記動物を抗体産生細胞の供給源として供することができる。
該抗体価を示した上記動物に抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ  １６４０培地に１．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに１５μｇ／ｍＬ  ８−アザグアニンを加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（１．８３ｇ／Ｌリン酸二ナトリウム、０．２１ｇ／Ｌリン酸一カリウム、７．６５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール−１０００  ２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬを混合した溶液を０．２〜１ｍＬ添加し、さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地に０．１ｍｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン、１５μｍｏｌ／Ｌチミジンおよび０．４μｍｏｌ／Ｌアミノプテリンを加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。
該懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法により、培養上清中にＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法は以下のようにして行うことができる。免疫の際、抗原に用いたＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドまたはその部分ペプチドを９６ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマの培養上清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に酵素との反応により発色する試薬を用いた反応を行なう。
選択されたハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を生産するハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ、２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得したハイブリドーマ株５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
５．ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質、および該物質のスクリーニング法
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する物質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させることにより、細胞でのＧＰＣＲ−Ｔ４の量を増加または減少させ、ＧＰＣＲ−Ｔ４を介して発揮される細胞機能を制御することが可能である。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写過程、あるいは転写産物から蛋白質への翻訳過程を促進または抑制する物質は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するリガンドが有する生理活性を増強または抑制することができるので、該リガンドの活性を増強または抑制する医薬組成物として有用である。したがって、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質は、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化抑制剤、好中球による組織障害の抑制剤、炎症性疾患の予防や治療剤、喘息の予防や治療剤、あるいは慢性閉塞性肺疾患の予防や治療剤の有効成分として有用である。また、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を減少させる物質は、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化促進剤、あるいは感染性疾患の予防や治療剤の有効成分として有用である。
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質としては、（２）に後述する方法で選択される物質があげられる。また、配列番号２で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基の配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕、トリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０，１３２（１９９２）〕、リボザイム技術〔Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，４３８（１９９８）〕に基づいてＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術に基づいて該オリゴヌクレオチドがＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するためには、翻訳開始点（配列番号２で表される塩基配列の４３８番目の塩基に相当する）を含む領域あるいは翻訳開始点近傍の領域と相補的な配列を含む塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。実質的に相補的な塩基配列とは、配列番号２で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基の配列に相補的な配列と９０％以上の相同性を有し、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするような塩基配列をいう。
また配列番号３で表される塩基配列の連続する５〜６０塩基の配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、デコイＤＮＡ法〔日本臨床，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，５，４２９（１９９７）、日本臨床，５４，２５８３（１９９６）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの誘導体があげられる。誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる［横山和尚，細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡの塩基配列中の連続する１９〜２５塩基に相当する配列および該配列と相補的な配列を含む二本鎖ＲＮＡ〔以下、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）とよぶ〕または該配列および該配列と相補的な配列を含みヘアピン構造を形成するＲＮＡ〔以下、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）とよぶ〕を用いて、ＲＮＡ干渉（以下、ＲＮＡｉとよぶ）〔Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４（２００１）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現の抑制に用いるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（以下それぞれ、ＧＰＣＲ−Ｔ４  ｓｉＲＮＡ、ＧＰＣＲ−Ｔ４  ｓｈＲＮＡともよぶ）は、以下のようにして作製することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするｃＤＮＡの塩基配列中からＡＡで始まる２１〜２７塩基の配列〔ＡＡ（Ｎ）１９−２５、Ｎは任意の塩基〕、好ましくはＡＡ（Ｎ）１９ＴＴからなる配列を選択する。選択する配列は、翻訳領域中の開始コドンより５０塩基以上下流の領域中にあり、ＧＣ含量が３０〜７０％、好ましくは５０％前後の配列であって、他の遺伝子の塩基配列と一致せず、ＧＰＣＲ−Ｔ４  ｃＤＮＡに特異的な配列がさらに好ましい。選択した配列の末端のＡＡを除いた１９〜２５塩基の配列またはＡＡおよびＴＴを除いた１９塩基の配列（ただし配列中のＴはＲＮＡではＵとする、以下、配列Ｘとよぶ）、および該配列Ｘと相補的な配列それぞれの３’端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のＴ（ＤＮＡ）またはＵ（ＲＮＡ）を付加した配列を有する２本のＲＮＡ（ただし、Ｔの部分はＤＮＡ）を作製する。作製した２本のＲＮＡをアニーリングすることによりｓｉＲＮＡを作製できる。アニーリングは、２本のＲＮＡを適当なバッファー（例えば、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解した後、ヒートブロックまたはサーマサイクラーで９０〜９５℃で１〜５分間加熱した後、２５℃まで４５〜６０分間かけて冷却することにより行うことができる。
ｓｈＲＮＡとしては、上記配列Ｘと該配列Ｘと相補的な配列とを、３〜１５塩基からなる適当なスペーサー配列でつないで、３’末端に２〜４個のヌクレオチド、好ましくは２個のＴ（ＤＮＡ）またはＵ（ＲＮＡ）を付加した配列を有するＲＮＡ（ただし、Ｔの部分はＤＮＡ）を作製する。スペーサー配列の５’端はＴＴ（ＤＮＡ）またはＵＵ（ＲＮＡ）が好ましい。配列Ｘと配列Ｘと相補的な配列の位置はどちらが先でもよい。
上記のｓｉＲＮＡに用いる２本のＲＮＡおよびｓｈＲＮＡはＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。また、サイレンサー（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ）ｓｉＲＮＡ作製キット等を利用して、Ｔ７プロモーター配列および作製するＲＮＡの配列を有する２本鎖ＤＮＡを作製し、このＤＮＡを鋳型としたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写系によっても、調製することができる。あるいは、以下のようにして作製できるＧＰＣＲ−Ｔ４  ｓｉＲＮＡ発現用ベクターを、培養細胞または生体内の細胞に導入することにより、細胞内でｓｉＲＮＡを発現させ、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現を抑制することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４  ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、Ｕ６プロモーターあるいはＨ１プロモーター等ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターを含むｓｉＲＮＡ発現用ベクターに、上記配列Ｘ、ＴＴからはじまる３〜１５塩基からなるスペーサー配列、配列Ｘと相補的な配列およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターとなる４〜６個のＴからなる配列を含むＤＮＡを挿入して作製することができる。細胞内で、Ｕ６プロモーターからのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ反応により、配列Ｘおよび相補的な配列を含むｓｈＲＮＡが合成され、このｓｈＲＮＡが細胞内で切断を受けてｓｉＲＮＡに変換される。ｓｉＲＮＡ発現用ベクターとしては、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  １．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ３．０（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳＵＰＥＲ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社製）等をあげることができる。レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを利用したｓｉＲＮＡ発現用ベクター〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６，５５０（２００２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１００，１８４４（２００３）；Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３，４０１（２００３）〕を用いることもできる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質を有効成分として含有する医薬は、４．（４）に記載の医薬と同様にして調製することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質のスクリーニング法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質は、以下（ａ）〜（ｃ）に示す方法により取得できる。
（ａ）試験物質の存在下、天然にＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を用いて測定、比較し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
ＧＰＣＲ−Ｔ４に対する抗体を用いた測定法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等〔酵素免疫測定法  第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ．Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、別冊  実験医学，ザ・プロトコールシリーズ，免疫染色・ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション，羊土社（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５０，５，（１９９２）〕を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）試験物質の存在下、天然にＧＰＣＲ−Ｔ４を発現する細胞を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物量を、ノーザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）またはＰＣＲ〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕等の方法を用いて測定、比較し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択し取得する方法。
（ｃ）ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記２．（３）に記載の方法に準じて動物細胞に導入し、形質転換体を取得する。試験物質の存在下、該形質転換体を、上記２．（３）に記載の培養法で２時間から１週間培養し、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を公知の方法〔東京大学医科学研究所  制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤社（１９９３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定、比較し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する方法。
レポーター遺伝子としては、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子またはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子等をあげることができる。
（ｃ）の方法で用いるＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域としては、哺乳動物細胞においてＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。具体的には、例えば、ヒトの好中球、好酸球、好塩基球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、骨髄、脾、胎盤、甲状腺、肺、リンパ節、胎児肝、胎児肺または気管において、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写に関与するプロモーター領域をあげることができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域は、ＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所  制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３年）〕により取得することが可能である。
また、ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域は、染色体遺伝子でＧＰＣＲ−Ｔ４  ｍＲＮＡに転写される領域よりも上流に存在するので、ＧＰＣＲ−Ｔ４  ｃＤＮＡの塩基配列（例えば配列番号２で表される塩基配列）と、ＧｅｎＢａｎｋ等の塩基配列データベースに登録されているヒト染色体遺伝子の配列とを比較することによりＧＰＣＲ−Ｔ４のプロモーター領域を決定することができる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４染色体遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡの具体的例としては、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。プロモーター領域は配列番号３で表される塩基配列の連続する５０〜５０００ｂｐの領域と考えられる。
６．疾患の判定方法
好中球や甲状腺におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量またはＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が健常者のレベルと比較して増加または減少している場合、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の変異により、正常なＧＰＣＲ−Ｔ４と比較してＧＰＣＲ−Ｔ４としての機能が低下または亢進したＧＰＣＲ−Ｔ４変異体が生産されたり、またはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量が健常者のレベルと比較して増加あるいは減少したりする場合、甲状腺機能の異常、好中球機能の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪または炎症性疾患の増悪等が起こると考えられる。したがって、以下の方法により上記の疾患や疾患の状態の判定を行うことができる。
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量が変動する疾患の判定方法
ノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第３版）、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）〕、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法〔Ｊｕｎｋｏ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，実験医学（増刊），１５，４６（１９９７）〕等の方法により、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量を測定することができる。定量的ＰＣＲ法やＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法は定量性に優れている点で好ましい方法である。被検者の組織または細胞におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量を定量し、健常者の同じ組織や細胞のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写量と比較することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４の転写量が増加あるいは減少している疾患、例えば甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪、炎症性疾患の増悪を判定することができる。組織または細胞としては、多形核白血球または甲状腺をあげることができる。
オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基でアプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が変動する疾患の判定方法
ＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等〔酵素免疫測定法  第３版，医学書院（１９８７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、別冊  実験医学，ザ・プロトコールシリーズ，免疫染色・ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション，羊土社（１９９７）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５０，５，（１９９２）〕により、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量を測定することができる。被検者の組織または細胞におけるＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量を定量し、健常者の同じ組織や細胞のＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチド量と比較することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの量が増加あるいは減少している疾患、例えば甲状腺機能の異常、好中球の活性化の異常、感染防御能の異常、喘息の増悪、慢性閉塞性肺疾患の増悪、炎症性疾患の増悪を判定することができる。組織または細胞としては、多形核白血球または甲状腺をあげることができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の変異を検出する疾患の判定方法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子または該遺伝子の発現制御領域の変異または多型の検出は、該遺伝子または該制御領域の塩基配列情報を用いて行うことができる。具体的には、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、サザンブロット、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子の変異や多型を検出することができる〔臨床検査，４２，１５０７−１５１７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５−１５７０（１９９８）〕。オリゴヌクレオチドは、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基でアプライド・バイオシステムズ社等より市販さているＤＮＡ合成機により合成することができる。
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、配列番号２で表される塩基配列の連続した５〜６０塩基または配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列の連続した５〜６０塩基からなる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドあるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に結合する抗体を含む判定薬は、これらの成分を含む適当な緩衝液として調製される。さらに転写量やポリペプチドまたは変異を検出するのに必要な薬剤を添付してもよい。
７．ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物を用いたスクリーニング法
ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物とは、染色体上の該遺伝子を全部もしくは一部の欠失またはＤＮＡ断片の挿入等により破壊することにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現できなくなり、ＧＰＣＲ−Ｔ４の機能が欠損した非ヒト動物である。該動物は、ＧＰＣＲ−Ｔ４ポリペプチドの発現異常に起因する種々の疾患、例えば、甲状腺の機能異常、好中球機能の異常、感染防御能の異常、喘息、慢性閉塞性肺疾患、炎症疾患等の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。したがって、該動物、または該動物の臓器、組織または細胞は、甲状腺機能の制御作用、好中球の活性化促進作用または抑制作用、好中球による組織障害の促進作用または抑制作用、炎症性疾患の予防や治療作用、喘息の予防や治療作用、慢性閉塞性肺疾患の予防や治療作用、あるいは感染性疾患の予防や治療作用を有する化合物、機能性食品、健康食品等のスクリーニングや評価に用いることができる。
該動物は、以下のようにして作製できる。まず、ＧＰＣＲ−Ｔ４のゲノム遺伝子の配列に対し、正常なＧＰＣＲ−Ｔ４が発現しないように、欠失またはＤＮＡ断片の挿入をして破壊した配列を有するＤＮＡ（以下、破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子という）を含むベクターを用い、公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により、目的とする動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞において、染色体上のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子を、ベクター上の破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子と置換した変異胚性幹細胞クローンを作製する〔Ｎａｔｕｒｅ，３５０，２４３（１９９１）〕。このようにして作製した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作製する。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上片方のアレルのＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の配列が破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の配列に置換したヘテロ個体を得ることができ、さらにそのヘテロ個体の掛け合わせにより相同染色体の双方のＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子が破壊ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子に置換したホモ個体を得ることができる。このホモ個体は、ＧＰＣＲ−Ｔ４を発現しない、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子のノックアウト非ヒト動物である。
以下、具体的な実施例、参考例をあげて本発明を説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】  第１図  Ｔ４のＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト活性を示す。図中ＧＰＣＲ−Ｔ４は、アッセイ細胞１を用いた場合、ベクターはコントロール細胞１を用いた場合、縦軸はＴ４刺激をしない場合のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性をそれぞれ１としたときの活性倍率を表す。
第２図  イソコナゾールのＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト活性を示す。図中ＧＰＣＲ−Ｔ４は、アッセイ細胞１を用いた場合、ベクターはコントロール細胞１を用いた場合、縦軸はイソコナゾール刺激をしない場合のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性をそれぞれ１としたときの活性倍率を表す。
第３図  ３５種のヒト臓器におけるＧＰＣＲ−Ｔ４転写物の発現量を示す。矢印はＧＰＣＲ−Ｔ４転写物由来の増幅断片（４０５ｂｐ）の位置を示している。各レーンのサンプルは以下の通りである。
１：副腎、２：全脳、３：尾状核、４：海馬、５：黒質、６：視床、７：腎臓、８：膵臓、９：脳下垂体、１０：小腸、１１：骨髄、１２：扁桃体、１３：小脳、１４：脳梁、１５：胎児脳、１６：胎児腎臓、１７：胎児肝臓、１８：胎児肺、１９：心臓、２０：肝臓、２１：肺、２２：リンパ節、２３：乳腺、２４：胎盤、２５：前立腺、２６：唾液腺、２７：骨格筋、２８：脊髄、２９：脾臓、３０：胃、３１：精巣、３２：胸腺、３３：甲状腺、３４：気管、３５：子宮、Ｍ：分子量マーカー
第４図  各種ヒト末梢血画分およびＨｅＬａ細胞におけるＧＰＣＲ−Ｔ４転写物の発現量を示す。矢印はＧＰＣＲ−Ｔ４転写物由来の増幅断片（４０５ｂｐ）の位置を示している。図の各レーンのサンプルは以下の通りである。
１：ＨｅＬａ、２：単核球、３：多形核白血球、４：ＣＤ４＋Ｔ細胞、５：ＣＤ８＋Ｔ細胞、６：Ｂ細胞、７：単球、８：水、Ｍ：分子量マーカー
第５図  各種ヒト細胞株におけるＧＰＣＲ−Ｔ４転写物の発現量を示す。矢印はＧＰＣＲ−Ｔ４転写物由来の増幅断片（４０５ｂｐ）の位置を示している。図の各レーンのサンプルは以下の通りである。
１：Ｊｕｒｋａｔ、２：Ｍｏｌｔ−３、３：Ｍｏｌｔ−４、４：Ｈｕｔ７８、５：Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、６：Ｄａｕｄｉ、７：Ｒａｊｉ、８：ＨＬ−６０、９：Ｕ−９３７、１０：ＴＨＰ−１、Ｍ：分子量マーカー
第６図  多形核白血球を、Ｔ４またはイソコナゾールで２分間、９分間、または２９分間刺激した際のＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化の強度を示す。上段（Ｐ−ＭＡＰＫ）は抗リン酸化ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体を用いた染色、下段（ＭＡＰＫ）は抗ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体を用いた染色の結果を示す。
第７図  多形核白血球を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下、各種濃度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ）のＴ４またはＴ３で刺激した際のＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化の強度を示す。上段（Ｐ−ＭＡＰＫ）は抗リン酸化ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体を用いた染色、下段（ＭＡＰＫ）は抗ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体を用いた染色の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】実施例１  ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストのスクリーニング
（１）アッセイ細胞の調製
参考例１（３）で造成したＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（４μｇ）を、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、参考例６（２）で選択した１．６×１０６細胞のＧＢＣＲＣ６に導入した。該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株（ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１と呼ぶ）を取得した。
同様にして、参考例１（２）で造成したコントロールプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄ（４μｇ）をＧＢＣＲＣ６に導入し、安定形質転換株（コントロール細胞１と呼ぶ）を取得した。ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１およびコントロール細胞１は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストのスクリーニング
ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１およびコントロール細胞１を９６ウェルプレート（住友ベークライト社製）にそれぞれ分注し（約１×１０４個／ウェル）、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ、シグマ−アルドリッチ社製、以下、Ｅ２と略す）を添加し、さらに１日間培養した。試験物質を添加して６時間培養後、セレンテラジンｈ（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ、モレキュラー・プローブズ社製）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘ  マルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）またはＦＤＳＳ６０００（浜松ホトニクス社製）を用いた。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。
ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して増加する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストの候補として選択した。コントロール細胞１を用いたアッセイにおいて、該候補物質を添加した際の活性と、該候補物質を添加しない場合の活性とがほぼ等しい場合、該物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして選択した。
各種の生体内物質を試験物質としてアッセイした結果、Ｔ４（プレストウィック・ケミカル社製）がＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストであることが明らかになった。アッセイ細胞１またはコントロール細胞１に各種濃度のＴ４を添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性倍率（Ｔ４を添加しない時のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を１とした時の活性の倍率）を第１図に示す。一方、既知の甲状腺ホルモン受容体に強いアゴニスト活性を示すＴ３は、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対しては非常に弱いアゴニスト活性（Ｔ４の１／１００程度の活性）しか示さなかった。
参考例７の方法にしたがって、各種ＧＰＣＲ〔Ａ−２、ＡＧＲ９、ＣＫＲＸ、ＥＴＢＲ−ＬＰ−２、Ｇ２Ａ、ｇ１０ｄ、ＧＰＲ１、ＧＰＲ３、ＧＰＲ４、ＧＰＲ６、ＧＰＲ７、ＧＰＲ８、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１８、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ２２、ＧＰＲ２３、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ２８、ＧＰＲ３０、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ４０、ＧＰＲ４１、ＧＰＲ４３、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ５２、ＧＰＲ５５、ＧＰＲ５８、ＧＰＲ６５、Ｐ２Ｙ１０、ＰＮＲ、ＲＥ２：Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１，３１（２００１）〕の誘導発現プラスミドを作製し、実施例１の方法にしたがって、各ＧＰＣＲのアッセイ細胞を構築した。Ｔ４は、これらのアッセイ細胞にはアゴニスト活性を示さなかったことから、Ｔ４はＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的なリガンドと考えられた。以上の結果から、Ｔ４はＧＰＣＲ−Ｔ４の生体内のリガンドであり、ＧＰＣＲ−Ｔ４は甲状腺ホルモン受容体とは異なるＴ４の受容体であると考えられた。
また、各種物質を試験物質としてアッセイした結果、イソコナゾール（プレストウィック・ケミカル社製）がＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストであることが明らかになった。アッセイ細胞１またはコントロール細胞１に各種濃度のイソコナゾールを添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性倍率（イソコナゾールを添加しない時のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を１とした時の活性の倍率）を第２図に示す。イソコナゾールは、上記の他のＧＰＣＲを導入したアッセイ細胞には作用しなかったことから、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対する受容体特異性は高いと考えられた。
実施例２  Ｔ４を用いた、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
（１）アッセイ細胞の構築
参考例１（３）で造成したＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（４μｇ）を、実施例１（１）に記載の方法に準じて、参考例５（６）で選択した１．６×１０６細胞のＧＢＣＣ１３に導入し、安定形質転換株（以下、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２と呼ぶ）を取得した。
（２）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
（１）で構築したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を、９６ウェル白色プレート（コーニング社製）に１ウェルあたり１×１０５個ずつ播種し、ＧＰＣＲ−Ｔ４を誘導発現するために、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬになるようにＥ２を培地で希釈したものを加えた。ただしバックグラウンド測定用にＥ２を添加しないものも設けた。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。各ウェルに５００ｎｍｏｌ／ＬのＴ４（シグマ−アルドリッチ社製）と試験化合物を添加し、コントロール用のウェルには、試験化合物は添加せず５００ｎｍｏｌ／ＬのＴ４のみを添加した。Ｅ２を添加しないバックグラウンド測定用のウェルには何も添加しなかった。それぞれをさらに７時間培養して反応させた後、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）の基質溶液を添加して反応を停止し、トップカウント（パッカード社製）を用いて１秒あたりのカウント数すなわち発光量を測定し、ホタル・ルシフェラーゼ活性とした。
試験化合物の活性（拮抗作用）は、下の式に示す試験化合物添加時と非添加時の１秒あたりのカウント数をもとに算出した阻害率で表した。
阻害率（％）＝［１−｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝］×１００
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは各々以下の意味を表す。
Ａ：Ｅ２、Ｔ４および試験化合物を添加時の１秒あたりのカウント数
Ｂ：Ｅ２、Ｔ４および試験化合物非添加時（バックグラウンド測定用）の１秒あたりのカウント数
Ｃ：Ｅ２とＴ４のみ添加、試験化合物非添加時（コントロール用）の１秒あたりのカウント数
阻害率が正の場合、すなわち試験化合物非添加時の発光量（Ｃ−Ｂ）と比較して、試験化合物添加時の発光量（Ａ−Ｂ）が減少する場合は、試験化合物をアンタゴニストとして選択した。また、阻害率が負の場合、すなわち試験化合物非添加時の発光量（Ｃ−Ｂ）と比較して、試験化合物添加時の発光量（Ａ−Ｂ）が増加する場合は、試験化合物をアゴニストとして選択した。
スクリーニングの結果、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストとして、化合物Ｉ（ケムブリッジ・コーポレーション社製）が取得され、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアンタゴニストとして、化合物ＩＩａ（アシネックス社製）および化合物ＩＩｂ（アシネックス社製）が取得された。試験化合物の濃度が３μｍｏｌ／Ｌの場合の、化合物Ｉ、化合物ＩＩａおよび化合物ＩＩｂの阻害率（％）を第１表に示す。
2004063748.tif 000006
アンタゴニストとして取得された化合物ＩＩａおよびＩＩｂについて、濃度０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μｍｏｌ／Ｌでの阻害率を測定し、Ｌｏｇｉｔ−Ｌｏｇ変換法の線形近似解析法によって、ＩＣ５０値を算出した。その結果、化合物ＩＩａのＩＣ５０は９１ｎｍｏｌ／Ｌ、化合物ＩＩｂのＩＣ５０は１２７ｎｍｏｌ／Ｌであった。
化合物Ｉのアゴニスト活性を、リガンドとしてＴ４の代わりに化合物Ｉを用いるアッセイ法で測定した。上記と同様に、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を９６ウェル白色プレートに１ウェルあたり１×１０５個ずつに播種し、終濃度１０ｎｍｏｌ／ＬになるようにＥ２を添加し、２４時間培養した。ただしバックグラウンド測定用にＥ２を添加しないものも設けた。ウェルに各種濃度の化合物Ｉを添加した。コントロール用のウェルおよびＥ２を添加しないバックグラウンド測定用のウェルには、化合物Ｉは添加しなかった。それぞれをさらに７時間培養して反応させた後、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍの基質溶液を添加して反応を停止し、トップカウント（パッカード社製）を用いて１秒あたりのカウント数すなわち発光量を測定した。
化合物Ｉの活性（アゴニスト作用）は、下の式に示す化合物Ｉ添加時と非添加時の１秒あたりのカウント数をもとに算出した活性化率で表した。
活性化率（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）｝×１００
式中、Ａ、Ｂ、Ｃは各々以下の意味を表す。
Ａ：Ｅ２および化合物Ｉ添加時の１秒あたりのカウント数
Ｂ：Ｅ２および化合物Ｉともに非添加時（バックグラウンド測定用）の１秒あたりのカウント数
Ｃ：Ｅ２のみ添加、化合物Ｉ非添加時（コントロール用）の１秒あたりのカウント数
結果を第２表に示す。
2004063748.tif 000007
以上の結果より、本発明のアッセイ系を用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストおよびアンタゴニストを取得できることが示された。
また、他のＧＰＣＲ（例えば、ＧＰＲ４またはＯＧＲ−１）を誘導発現する細胞（ＷＯ０３／０８７３６６）をアッセイ細胞として用いて、同様のアッセイを行った際には、化合物Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂは活性を示さなかった。このことから、化合物Ｉ、ＩＩａ、ＩＩｂはＧＰＣＲ−Ｔ４に特異的に作用することが示された。
なお、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２の代わりに、実施例１で構築したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を用いることによっても同様のスクリーニングを行うことができる。
実施例３  ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストを用いた、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
実施例１または２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１または２と、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストであるＴ４またはイソコナゾールを用いて、以下のようにしてＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングを行うことができる。
実施例１で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を約１×１０４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。試験物質とＴ４またはイソコナゾールを添加して６時間培養後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。
または、実施例２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を約１×１０４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへＥ２（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養する。試験物質とＴ４またはイソコナゾールを添加して６時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。
アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して増加する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して減少する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４のアンタゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
上記試験物質としては、任意の物質を使用することができるが、Ｔ４またはイソコナゾールの誘導体や類似化合物を用いることにより、ＧＰＣＲ−Ｔ４のアゴニストまたはアンタゴニストを効率的に探索することができる。
実施例４  ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性の測定
実施例１（１）で調製したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１およびコントロール細胞１を９６ウェルプレートにそれぞれ約１×１０４個／ウェルずつ分注し、３７℃で１日間培養した。各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してさらに１日間培養後、セレンテラジンｈを添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。
また、１７β―エストラジオールを添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。１７β−エストラジオールを添加した場合の活性を添加しない場合の活性で割った値を誘導倍率とした。コントロール細胞１における誘導倍率は約１であった。一方、ＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１の誘導倍率は約１２倍であった。ＧＰＣＲ−Ｔ４は、誘導発現するだけでシグナルを流すことから、構成活性型ＧＰＣＲであることがわかった。
実施例５  ＧＰＣＲ−Ｔ４の構成活性を利用した、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストのスクリーニング
実施例１または２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１または２を用いて、以下のようにしてＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストのスクリーニングを行うことができる。
実施例１で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞１を約１×１０４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）と試験物質を添加し、さらに１日間培養する。その後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定する。
または、実施例２で取得したＧＰＣＲ−Ｔ４アッセイ細胞２を約１×１０４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）と試験物質を添加し、さらに１日間培養する。その後、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。また、試験物質を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定する。
実施例３で示されたように、ＧＰＣＲ−Ｔ４は、アゴニストが存在しない状態でも構成活性を示すので、アッセイ細胞を用いたアッセイにおいて、試験物質を添加した際の活性が、試験物質を添加しない場合の活性に対して減少する場合、該試験物質をＧＰＣＲ−Ｔ４に対するインバースアゴニストとして選択することができる。ＧＰＣＲ−Ｔ４の代わりに別のＧＰＣＲを発現させたアッセイ細胞を用いて同様の実験を行うことにより、該選択物質の受容体特異性を調べることができる。
実施例６  ＧＰＣＲ−Ｔ４が共役するＧ蛋白質の解析
ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（２μｇ）、ならびに参考例５（４）で構築したＧαｓのＣ末端５アミノ酸をＧαｉのＣ末端５アミノ酸に置換したキメラＧαｓ（以下、Ｇαｓ−ｉと呼ぶ）の発現用プラスミドでもある、ホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ（２μｇ）を、エレクトロポレーション法により、参考例２（２）で取得した１．６×１０６細胞のＫＪＭＧＥＲ８に導入した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株（以下、Ｇαｓ−ｉ発現アッセイ細胞と呼ぶ）を取得した。
同様にして、ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４（２μｇ）および参考例３（１）で構築したホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃ（２μｇ）をＫＪＭＧＥＲ８に導入し、安定形質転換株（コントロールアッセイ細胞と呼ぶ）を取得した。Ｇαｓ−ｉ発現アッセイ細胞およびコントロールアッセイ細胞は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
Ｇαｓ−ｉ発現アッセイ細胞およびコントロールアッセイ細胞をそれぞれ約１×１０４個／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注し、３７℃で１日間培養した後、各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。１００ｎｍｌ／ＬのＴ４を添加して６時間培養後、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）の試薬を添加し、トップカウント（パッカード社製）を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。また、１００ｎｍｏｌ／ＬのＴ４を添加しないで同様の実験を行い、ホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。
Ｇαｓ−ｉ発現アッセイ細胞を用いたアッセイにおいては、Ｔ４を添加した際の活性は、Ｔ４を添加しない場合の活性に対して５．３倍増加した。一方、コントロールアッセイ細胞を用いたアッセイにおいては、ほとんど差がなかった（１．１倍）。すなわち、Ｔ４で活性化されるＧＰＣＲ−Ｔ４からのシグナルを検出するためにはＧαｓ−ｉの発現が必須であることが明らかになった。
コントロールアッセイ細胞には、ＣＲＥ制御下にホタル・ルシフェラーゼ遺伝子が発現するレポータープラスミドが導入されているので、ＧＳに共役するＧＰＣＲがリガンド刺激により活性化を受けた場合、ＧＳを介してＣＲＥ制御下のレポーター遺伝子の発現が上昇する。Ｇαｓ−ｉを共発現させたＧαｓ−ｉ発現アッセイ細胞においては、Ｇｉに共役するＧＰＣＲがリガンド刺激により活性化を受けた場合でも、Ｇαｓ−ｉを介してＣＲＥ制御下のレポーター遺伝子の発現が上昇する。したがって、上記の結果は、ＧＰＣＲ−Ｔ４はＧｓには共役しないが、Ｇｉには共役することを示している。ＧＰＣＲ−Ｔ４は、リガンド刺激により、Ｇｉを介してシグナルを流すことが判明した。
実施例７  ヒトの各種細胞や組識におけるＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物の発現解析
ＧＰＣＲ−Ｔ４転写産物の定量は、半定量的ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により行った。
また、どの細胞でも同程度発現していると考えられるβ−アクチン遺伝子の転写産物の定量も同時に行い、細胞間でのｍＲＮＡ量の違いや、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率に大差ないことを確認した。β−アクチン転写産物の定量は、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕により行った。
（１）各種細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
ヒト細胞株としては、Ｔ細胞株〔ＭＯＬＴ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５５２）、ＭＯＬＴ−４（ＪＣＲＢ９０３１）、ＨＵＴ７８〕、Ｂ細胞株〔Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、Ｄａｕｄｉ（ＪＣＲＢ９０７１）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８６）〕、顆粒球／単球系細胞株〔ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４０）、Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５９３．２）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−２０２）〕、血管内皮細胞株〔ＩＶＥＣ、ＨＵＶＥＣ〕、メラノーマ細胞株（ＷＭ２６６−４、ＷＭ１１５）、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１０）、肺癌細胞株〔ＰＣ−９、ＨＬＣ−１、ＱＧ９０〕、前立腺癌細胞株ＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４３５）、胃癌細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ、膵臓癌細胞株〔Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７９）、Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−８０）〕、大腸癌細胞株〔Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０〕、上皮様細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２）を用いた。ＱＧ９０およびＳＷ１１１６は愛知癌センターより入手した。ＨＬＣ−１は大阪大学癌研究所より入手した。ＫＡＴＯ  ＩＩＩおよびＰＣ−９は免疫生物研究所株式会社より入手した。ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）は倉敷紡績株式会社より入手した。ＩＶＥＣ〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１５７，４１（１９９３）〕はＮ．Ｔ．Ｌ．ＦＲＡＮＣＥ社より入手した。ＭＯＬＴ−４、ＤａｕｄｉはＪＣＲＢより入手した。それ以外の細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手した。
各細胞の全ＲＮＡは常法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕にしたがって調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、インビトロジェン社製）を用いて行った。細胞株については５μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（２）末梢白血球細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。次いで、常法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）〕にしたがって、取得した単核球より単球およびリンパ球を分離取得した。
次いで、ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）、ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）、およびＣＤ１９  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を知いて、取得したリンパ球より、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＢ細胞を分離取得した。
上記で取得した多形核白血球、単核球、単球、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＢ細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを調製した。一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、インビトロジェン社製）を用いて行った。５μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（３）ヒト各種組識由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
ヒトの３５種類の組識（副腎、全脳、尾状核、海馬、黒質、視床、腎臓、膵臓、脳下垂体、小腸、骨髄、扁桃体、小脳、脳梁、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、肝臓、肺、リンパ節、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮）由来のｍＲＮＡ（クロンテック社製）から同様にして一本鎖ｃＤＮＡを合成した。１μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、水で２４０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（４）β−アクチン遺伝子の転写産物定量用スタンダードの調製
ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄのそれぞれのｃＤＮＡ部分を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれβ−アクチンの転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、１μｇ／ｍＬの酵母のｔＲＮＡを含む水で段階的に希釈して使用した。
（５）ＰＣＲ法を用いたＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物の定量
上記（１）〜（３）記載の一本鎖ｃＤＮＡ  ５μＬに、フォワード・プライマーとして配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡを１０ｐｍｏｌ、リバース・プライマーとして配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡを１０ｐｍｏｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ混合液を１．６μＬ、ジメチルスルホキシドを１μＬ、５単位／μＬのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．１μＬ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を２μＬ添加し、滅菌水を加えて全量を２０μＬに調製した。サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪリサーチ社製）を用い、９４℃で３分間の熱処理によりＤＮＡを変性させ後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を２５〜３３サイクル行った。該反応液の一部（８μＬ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｔａｉｎ（モレキュラー・プローブス社製）で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ  ＳＩ、モレキュラー・ダイナミクス社製）で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。より正確な転写産物の定量を行なうため、ＰＣＲのサイクル数を変えて同様のＰＣＲを行った。スタンダードの量はＰＣＲのサイクル数に応じて変化させた。
β−アクチン遺伝子の転写産物の定量については既報〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平６−１８１７５９〕と同様に行った。
第３図にＰＣＲのサイクル数が３０のときのヒトの各種組織についての結果を示した。ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の転写産物は、ヒト正常組織では骨髄、脾臓、甲状腺、胎盤で多く発現しており、次いで肺、気管、リンパ節で多く発現していた。骨格筋、精巣、脊髄、胎児肝臓、胎児肺でも発現がみられた。第４図にＰＣＲのサイクル数が２８のときのヒトの各種末梢白血球細胞およびＨｅＬａ細胞についての結果を示した。ヒト末梢血においては多形核白血球において、非常に強い発現がみられた。ＨｅＬａ細胞でもわずかに発現がみられた。Ｔ細胞や単球でも発現がみられた。第５図にＰＣＲのサイクル数が３０のときのヒトの各種培養細胞株での結果を示した。ヒト培養細胞株では、前骨髄系細胞株（ＨＬ−６０）、Ｔ細胞株（Ｈｕｔ７８）で発現がみられた。
Ｔ４（甲状腺ホルモン）の新規受容体であるＧＰＣＲ−Ｔ４は甲状腺で高発現していることから、甲状腺で生産されたＴ４はオートクラインに作用し、甲状腺ホルモン分泌の制御等、甲状腺機能の制御に関与していると考えられる。
ＧＰＣＲ−Ｔ４は多形核白血球（好中球を多く含む）で高発現していることから、好中球機能の制御に関与していると考えられる。また、Ｔ細胞、単球、リンパ節でも発現していることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４は炎症や免疫機能を調節する活性を有していると考えられる。
実施例８  ヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化に対するＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストの作用
（１）ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストによるヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化の抑制
実施例６に記載したように、ＧＰＣＲ−Ｔ４は好中球が多く含まれるヒト末梢多形核白血球画分で高発現している。そこで、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対してアゴニスト活性を示したＴ４またはイソコナゾールでヒト末梢多形核白血球を刺激して、ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫの活性化状態の変動を調べた。
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球を分離取得した。取得した多形核白血球を氷冷したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｔｉｏｎ：インビトロジェン社製）に懸濁後、１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に２×１０６細胞ずつ分注した。該細胞を３７℃で５分間プレインキュベーションした後、１μｍｏｌ／ＬのＴ４またはイソコナゾールを添加し、３７℃で２分間、９分間、または２９分間インキュベーションした。その後、９０×ｇで１分間遠心して細胞を取得した。
上記細胞に３０μＬの細胞溶解バッファー〔５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）（和光純薬社製）、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（和光純薬社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ（和光純薬社製）、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  １，４−ジチオ−ＤＬ−スレイトール（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌフェニルメチルスルフォニルフルオライド（シグマ社製）、１０μｍｏｌ／Ｌロイペプチン（シグマ社製）、２ｍｍｏｌ／Ｌバナジン酸ナトリウム（シグマ社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化ナトリウム（シグマ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロリン酸（和光純薬社製）〕を添加し、氷上で１０分間静置した。該溶解液を１３０×ｇ、７分間遠心して上清を取得した。該上清中の蛋白質濃度を、プロテインアッセイ染色液（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて測定し、２０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルとしては１０％均一ゲルＮＰＵ−Ｒ１０Ｌ（アトー社製）を、分子量マーカーとしてはプレシジョン・プロテイン・スタンダーズ・アンステインド・ブロード・レンジ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ、バイオラッド社製）を用いた。電気泳動は２０ｍＡで７０分間行った。
電気泳動後、蛋白質をイモビロン・トランスファー・メンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ミリポア社製）にブロッティングし、一次抗体として抗リン酸化ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体（２００倍希釈したＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製のＰｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）または抗ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体（２００倍希釈したＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ社製のｐ４４／４２  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製：１０００倍希釈）を用いて抗体染色を行った。発色および検出にはＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）およびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）を用いた。
上記の溶解液の調製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングは常法〔タンパク質実験ノート下巻，羊土社（１９９９）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１７，１１３（２００１），Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１６，７０（２００２），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３３８４７（２００１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１４８９（２０００），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７，７０４（１９９６）〕に従って行った。
上記解析の結果、１μｍｏｌ／ＬのＴ４刺激または１μｍｏｌ／Ｌのイソコナゾール刺激により、ヒト末梢多形核白血球中のＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制されることが明らかになった（第６図）。この結果は、Ｔ４またはイソコナゾール、あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストを用いて、好中球におけるＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫの活性化を抑制できることを示している。
（２）ＧＭ−ＣＳＦ刺激によるヒト末梢多形核白血球のＭＡＰＫの活性化に対するＧＰＣＲ−Ｔ４アゴニストによる抑制
好中球をＧＭ−ＣＳＦで刺激すると、ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫがリン酸化（活性化）されることが知られている。そこで、ＧＭ−ＣＳＦ刺激によるヒト末梢多形核白血球におけるＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫの活性化に及ぼすＴ４の影響を調べた。
健康な成人の末梢血よりＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社製）を用いて多形核白血球を分離取得した。取得した多形核白血球を氷冷したＨＢＳＳ（インビトロジェン社製）に懸濁後、１．５ｍＬチューブ（エッペンドルフ社製）に２×１０６細胞ずつ分注した。該細胞を３７℃で５分間プレインキュベーションした後、５ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下、各種濃度（１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ）のＴ４を添加し、３７℃で４分間インキュベーションした。その後、９０×ｇで１分間遠心して細胞を取得した。また、コントロールとして、Ｔ４の代わりにＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト活性がＴ４に比較して１／１００程度弱いＴ３を用いて同様の操作を行い、細胞を取得した。
上記細胞を用いて、（１）と同様にして、抗リン酸化ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体または抗ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。その結果、１μｍｏｌ／ＬのＴ４刺激により、ＧＭ−ＣＳＦによるＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）が抑制されることが明らかになった（第７図）。一方、Ｔ３刺激では、ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化（活性化）の抑制はみられなかった。
以上の結果は、Ｔ４あるいはＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストを用いて、ＧＭ−ＣＳＦ刺激またはＧＭ−ＣＳＦと同様のシグナルを流すサイトカイン刺激による好中球におけるＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫの活性化を抑制できることを示している。
好中球においては、ＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫの活性化により、好中球のプライミングや活性化が起こることが知られていることから、ＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニスト（例えばＴ４、イソコナゾールまたは化合物Ｉ）またはアンタゴニスト（例えば化合物ＩＩａまたはＩＩｂ）を用いて、好中球のプライミングや活性化を制御することが可能と考えられる。
参考例１  ＧＰＣＲ−Ｔ４誘導発現プラスミドの造成
（１）ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃおよびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃの造成
ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。
ＸｈｏＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＫｐｎＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＫｐｎＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片を結合することにより、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３を造成した。
ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３をＢｇｌＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）をＸｈｏＩとＮｓｉＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、エプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰ配列を含む２．２ｋｂのＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を取得した。ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ切断部位を消失させたｐｃＤＮＡ３由来のＢｇｌＩＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＭｏＥＲＣ３Ｓｃ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｓｉＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＸｈｏＩとＮｃｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、アンピシリン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片およびｐＳＥＯｌｕｃ２のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＮｃｏＩ（平滑末端）断片を結合することにより、プラスミドｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１を造成した。
ｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１をＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．１１ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。上記のｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＳｄ１−ｌｕｃ１由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合し、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１を造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１をＸｈｏＩとＫｐｎＩで切断し、ＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を取得した。配列番号６、７、８、および９で表される塩基配列を有する４種のＤＮＡを合成した。該合成ＤＮＡをそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化後、混合してアニールさせることにより、ポリアデニル化シグナルを有する二本鎖ＤＮＡとした。該二本鎖ＤＮＡとｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１由来のＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を結合することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡを造成した。
ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＦＲ−ｌｕｃ（ストラタジーン社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、０．１４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐｃＤＮＡ３−ｏｒｉＰ−Ｓｄ１−ｐＡ由来のＸｈｏＩ（平滑末端）断片、およびｐＦＲ−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩ（平滑末端）断片を結合し、プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１を作製した。ｐＡＧａｌＳｄ１は、Ｇａｌ４ｐ応答配列を５回繰り返した配列を有するプロモーターを含有している。
ｐＡＧａｌＳｄ１をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。またｐＳＥＯｌｕｃ２（ＷＯ９８／１４４７４）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理することにより、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片およびｐＳＥＯｌｕｃ２由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＳａｃＩ（平滑末端）断片を結合することにより、ホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃ内に存在する二つのＨｉｎｄＩＩＩサイトのうち、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子からより離れたＨｉｎｄＩＩＩサイトのみをＫｌｅｎｏｗ処理により消失させることにより、ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃをＡｓｐ７１８で切断後、ＳｔｕＩで部分消化しｐＡＧａｌＳｄ４−ｌｕｃ由来の９．５ｋｂのＡｓｐ７１８−ＳｔｕＩ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ処理し、自己結合させることによりホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃを造成した。
ｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃおよびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃは転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（以下、Ｇａｌ４−ＥＲとよぶ）を発現する宿主細胞に導入した形質転換体において、１７β−エストラジオールの添加により、ホタル・ルシフェラーゼの発現が誘導される。
（２）誘導発現ベクターｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄの造成
（１）で造成した発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、ｏｒｉＰを含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｄのスタッファー配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ−ｎｄ（特開２００１−２１１８８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を取得した。上記のｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片、およびｐＡＭｏ−ｎｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を結合することにより、ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ中のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分をｐＡＭｏ−ｎｄのスタッファー配列と置き換えたプラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｄおよびｐＡＧａｌ９−ｎｄは転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、スタッファー配列の代わりに任意のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入することにより、該ポリペプチドを誘導発現するためのプラスミドを造成することができる。
（３）ＧＰＣＲ−Ｔ４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４の造成
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＧＰＣＲ−Ｔ４をコードするｃＤＮＡクローンであるｃ−ｈｅｐ１５３７４を用いて、ＧＰＣＲ−Ｔ４の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４を造成した。ｃ−ｈｅｐ１５３７４  ｃＤＮＡは、特許（ＥＰ１１９５４３４  Ａ１）に記載の方法にしたがって発現ベクターｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース登録番号ＡＢ００９８６４）を用いて作製された肝臓癌細胞株ＨＥＰＧ２由来の完全長ｃＤＮＡライブラリーから取得された。ｃ−ｈｅｐ１５３７４  ｃＤＮＡの配列を配列番号２８に示した。
ｃ−ｈｅｐ１５３７４  ｃＤＮＡを含むプラスミドをＳｔｕＩとＮｏｔＩで切断することにより、ｃ−ｈｅｐ１５３７４  ｃＤＮＡを含む約２．７ｋｂのＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｄをＰｍａＣＩとＮｏｔＩで切断し、ｏｒｉＰ配列を含むＰｍａＣＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｃ−ｈｅｐ１５３７４  ｃＤＮＡを含む約２．７ｋｂのＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片とｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＰｍａＣＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりプラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４を造成した。
ｐＡＧａｌ９−ＧＰＣＲ−Ｔ４は転写因子Ｇａｌ４ｐに対する応答配列を有するプロモーターを含むため、Ｇａｌ４−ＥＲを発現する宿主細胞に導入した形質転換体において、１７β−エストラジオールの添加により、ＧＰＣＲ−Ｔ４の発現が誘導される。
参考例２  Ｇａｌ４−ＥＲを発現する宿主細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
（１）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２の造成
ブラストサイジン（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ）耐性遺伝子を有するベクターｐＳＶ２ｂｓｒ（科研製薬社製）をＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して２．６ｋｂのＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片を取得した。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の転写因子Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合領域とエストロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質（以下、Ｇａｌ４−ＥＲとよぶ）をコードするＤＮＡ〔Ｃｅｌｌ，５４，１９９（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１６５７（１９９３）〕を含有するＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ（東京大学の加藤茂明先生より分与）をＡａｔＩＩとＮｄｅＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理して、ＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＳＶ２ｂｓｒ由来のＰｖｕＩＩ（平滑末端）−ＥｃｏＲＩ（平滑末端）断片、およびＥＲαＡＦ２  ｉｎ  ｐＭ由来のＡａｔＩＩ（平滑末端）−ＮｄｅＩ（平滑末端）断片を結合することにより、Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を造成した。
（２）Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２をＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞の染色体ＤＮＡに組み込んた細胞株ＫＪＭＧＥＲ８の造成
Ｇａｌ４−ＥＲ発現プラスミドｐＧＥＲｂｓｒＲ２を、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液〔１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン４酢酸〕に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、該プラスミドをＮａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞は、ＥＢＮＡ−１遺伝子を発現する無血清馴化したＢ細胞株である。
該形質転換体を、８ｍＬのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地〔ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）に、１／４０量の７．５％  ＮａＨＣＯ３、３％  ２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（インビトロジェン社製）、０．５％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、５０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３μｇ／ｍＬインシュリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１２５ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、１ｍｄ／ｍｌガラクトースを添加した培地〕に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２４時間培養した。
培養後、ブラストサイジンＳ（ＫＫ−４００、科研製薬社製）を２．０μｇ／ｍｌになるように添加し、９６ウェルプレートに５００〜２０００細胞／ウェルずつ分注して培養を行い、ｐＧＥＲｂｓｒＲ２が染色体ＤＮＡに組み込まれた安定形質転換株（シングルクローン）を多数取得した。各形質転換株は、２．０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
以下に示す方法により上記安定形質転換株から、誘導倍率が高く、かつ非誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
各形質転換株に参考例１（１）で造成したホタル・ルシフェラーゼの誘導発現プラスミドｐＡＧａｌＳｄ１−ｌｕｃをエレクトロポレーション法により導入し、２日間培養した。培養後、１７β−エストラジオール（Ｅ８８７５：シグマ社製）（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに２４時間培養後、ホタル・ルシフェラーゼ活性の測定を行った。
活性の測定は、ルミノメーターＬＢ９５３（ベルトールド社製）を用い、細胞溶解用緩衝液〔１％トリトンＸ−１００、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール〕１００μｌを、上記培養液に自動注入後、基質溶液〔２５ｍｍｏｌ／Ｌグリシルグリシン（ｐＨ７．８）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ、０．３３ｍｍｏｌ／Ｌルシフェリン〕３００μｌを自動注入し、１０秒間の発光量を測定し、ルシフェラーゼ活性とした。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
１７β−エストラジオール添加条件下のルシフェラーゼ活性と１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性を比較することにより、遺伝子発現の誘導倍率を算出し、該誘導倍率が高く、かつ１７β−エストラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンとして、ＫＪＭＧＥＲ８細胞を選択した。
参考例３  Ｇａｌ４−ＥＲを発現し、かつＣＲＥ制御下でホタル・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣ７の造成
（１）ホタル・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃの造成
ハイグロマイシン耐性遺伝子およびエプスタイン・バー・ウイルスのｏｒｉＰを有し、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタル・ルシフェラーゼを発現するレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを以下の方法で造成した。
ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕をＣｌａＩで部分消化し、１カ所切断されたＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をＭｌｕＩで部分消化し、９．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）〕をＣｌａＩおよびＭｌｕＩで切断し、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含む１．５ｋｂのＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＡＭｏ由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片、およびｐＡＧＥ２４８由来のＣｌａＩ−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏｈを造成した。
ｐＡＭｏｈをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＳａｌＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｏｒｉＰ、Ｇａｌ４ＵＡＳを含むＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈ由来のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を結合することにより、プラスミドｐＡＧａｌ９ｈを造成した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（ストラタジーン社製）をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断した後、アルカリホスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃ７５由来、宝酒造社製）を用いて脱リン酸化処理し、アンピシリン耐性遺伝子を含むＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。配列番号１０および１１で表される塩基配列を有す合成ＤＮＡをアニールさせることにより、ＣＲＥ配列を２つ含む二本鎖ＤＮＡを調製した。該二本鎖ＤＮＡとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋由来の上記ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を２つ含むプラスミドｐＢＳ−ＣＲＥＩを造成した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩは、該二本鎖ＤＮＡが、ＳａｌＩ切断部位およびＸｈｏＩ切断部位が再生する方向に組み込まれたプラスミドであり、上記切断部位をそれぞれ１つずつ有している。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩ由来ＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を４つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＩ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を８つ含むｐＢＳ−ＣＲＥＩＶを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＸｈｏＩで切断し、ファージｆ１のｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶをＳｃａＩおよびＳａｌＩで切断し、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉを含むＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＩＶ由来のＳｃａＩ−ＸｈｏＩ断片およびＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片を結合し、ＣＲＥ配列を１６個含むｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩを造成した。
ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩをＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、１６個のＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片を取得した。参考例１（１）で造成したｐＡＧａｌＳｄ１をＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１．４ｋｂのＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＧａｌ９ｈをＸｂａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＭｌｕＩで切断することによりＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を取得した。ｐＢＳ−ＣＲＥＶＩＩＩ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ（平滑末端）断片、ｐＡＧａｌＳｄ１由来のＭｌｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびｐＡＧａｌ９ｈ由来のＸｂａＩ（平滑末端）−ＭｌｕＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｈを造成した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｈをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＲＥ配列を含むＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。
ｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＣＲＥｈ由来のＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を結合することによりホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＸｈｏＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片、およびホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片をそれぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来の上記２種のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端）−ＸｈｏＩ断片を結合することにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃ中のＣＲＥ配列上流のＨｉｎｄＩＩＩサイトが消失したプラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＨを作製した。
ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒベクター（プロメガ社製）をＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａＩで切断し、ｌｕｃ＋遺伝子（改変型のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより、ＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりｌｕｃ＋遺伝子を含むレポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃを作製した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥｐｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＣＲＥｐｌｕｃ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＨｐａＩ、ＳｐｅＩまたはＢａｌＩで切断したｐＡＣＲＥｐｌｕｃを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、参考例２（２）で造成した細胞株ＫＪＭＧＥＲ８に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換細胞を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに７日間培養した。生細胞数を確認後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびＫＪＭＧＥＲ８を１×１０５細胞／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルプレートに分注（平均３０細胞／ウェル）して培養を行い、実際に１ウェル当たり１コロニーを形成したウェルを選択し、４２０個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（３）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣ７の選択
上記（２）で取得した各クローンを９６ウェルプレートにまき（１〜２×１０４細胞／ウェル）、２ａ型アデノシン受容体（Ａ２ａ）に対するアゴニストである５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ、シグマ−アルドリッチ社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。Ａ２ａはＫＪＭＧＥＲ８のようなＢ細胞で内因性に発現しているＧＰＣＲであり、Ａ２ａのアゴニスト刺激によりアデニレートシクラーゼが活性化され、細胞内のｃＡＭＰ濃度が上昇するため、ＣＲＥを有するプロモーターからの転写が誘導される。
培養後、参考例２（２）に記載の方法に従って各ウェルのホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。ただし、測定器としてはルミノメーターＬＢ９５３に代わってＭｉｃｒｏ  Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐ（ベルトールド社製）を使用した。活性の高かった１７クローンを選択した。
該１７クローンを４８ウェルプレート１ウェルあたり１×１０５細胞ずつ分注し、ＮＥＣＡを終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌになるように添加し、ＣＯ２インキュベーター中で５時間培養した。培養後、参考例２（２）に記載の方法に従ってホタル・ルシフェラーゼ活性測定をおこなった。ＮＥＣＡ刺激しない場合と比較し、ＮＥＣＡ刺激した場合にルシフェラーゼ活性が６０倍以上上昇した８クローンを選択した。
該８クローンに、Ｇαｓと共役する構成活性型ＧＰＣＲであるＧＰＲ１２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２（下記参考例５参照）を、上記エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、参考例２（２）と同様の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。１７β−エストラジオールを添加した際のルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった３クローン（ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７）を選択した。ＧＢＣ５、ＧＢＣ６、ＧＢＣ７における該上昇率は、それぞれ５６、１９３、および３６４倍であった。
該３クローンに、上記ｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２と同様の方法でＧαｓと共役する２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２（下記参考例６参照）を導入して安定形質転換株を取得し、１７β−エストラジオール刺激によりＶ２を誘導発現させた後に、バソプレッシン刺激した際のルシフェラーゼ活性を調べた。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合のルシフェラーゼ活性、およびバソプレッシン刺激しない場合のルシフェラーゼ活性を調べた。その結果、１７β−エストラジオールで刺激した時にのみバソプレッシンに反応して高いルシフェラーゼ活性（５９９倍）を示したＧＢＣ７を優良株として選択した。
参考例４  Ｇａｌ４−ＥＲを発現し、かつＣＲＥ制御下でウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣＲ２の造成
（１）ウミシイタケ・ルシフェラーゼをレポーターとするレポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃの造成
ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター（プロメガ社製）をＸｂａＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ処理後、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片を取得した。参考例３（１）で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃＨをＮｏｔＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで切断することによりＣＲＥを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＲＬ−ＳＶ４０ベクター由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ（平滑末端）断片、およびｐＡＣＲＥｌｕｃＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を結合することによりプラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃを造成した。
（２）レポータープラスミドｐＡＣＲＥＲｌｕｃをＫＪＭＧＥＲ８の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
参考例３（２）で記載した方法に準じて、ｐＡＣＲＥＲｌｕｃを細胞株ＫＪＭＧＥＲ８に導入し、９６個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（３）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＲ２の選択
ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、参考例３（３）に記載した方法に準じ、上記（２）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。
上記（２）で取得した各クローンを９６ウェルプレートにまき（１〜２×１０４細胞／ウェル）、ＮＥＣＡ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してＣＯ２インキュベーター中で６時間培養した。その後、セレンテラジンｈ（モレキュラー・プローブズ社製）（終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。活性測定には、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯｓｘマルチラベルカウンタ（ワラック・ベルトールド・ジャパン社製）を用いた。活性の高かった９クローンを選択した。
該９クローンについて、ＮＥＣＡ刺激し、ＮＥＣＡ刺激しない時と比較し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性が１８倍以上上昇した２クローンを選択した。該２クローンをそれぞれＧＢＣＲ１およびＧＢＣＲ２と命名した。
該２クローンにｐＡＧａｌ９−ＧＰＲ１２を導入し、安定形質転換株を取得した。該形質転換株を１７β−エストラジオールで２４時間刺激後、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。比較のために、１７β−エストラジオール無添加条件下でのウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性も測定した。１７β−エストラジオールを添加した際のウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性の上昇率が高かった１クローンＧＢＣＲ２を優良株として選択した。該上昇率は３６４倍であった。
参考例５  Ｇａｌ４−ＥＲおよびキメラＧαｓを発現し、かつＣＲＥ制御下でホタル・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＧＢＣＣ１３の造成
（１）Ｇαｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４の造成
Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて全ＲＮＡを取得した。鋳型として該全ＲＮＡを５μｇ用い、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。該一本鎖ｃＤＮＡを水で５０倍希釈し、ＰＣＲの鋳型として使用した。
上記一本鎖ｃＤＮＡ（１０μｌ）に、Ｇαｓ４遺伝子特異的プライマー（各２０ｐｍｏｌ）、２．５ｎｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰ混合液を４μｌ、ジメチルスルホキシドを２．５μｌ、５単位／μｌ  Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を０．２５μｌ、１０×反応緩衝液（宝酒造社製）を５μｌ添加し、滅菌水を加えて全量を５０μｌに調製した。Ｇαｓ４遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号１２および１３で表される配列を有する合成ＤＮＡを用いた。これらプライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトまたはＡｓｐ７１８サイトが導入されている。サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を３０サイクルの条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。参考例３（１）で造成したプラスミドｐＡＭｏｈをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断後、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。ＰＣＲ断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＭｏｈ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｇαｓ４の発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４を造成した。
（２）Ｇαｓ−ｑ発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑの造成
上記（１）で構築したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩとＡｓｐ７１８で切断することによりｏｒｉＰを含むＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。また、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４をＸｂａＩで切断後、ＳｐｈＩで部分消化することにより、Ｃ末端を欠失したＧαｓ４をコードするＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を取得した。配列番号１４および１５で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｑのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｑのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧαｓ（以下、Ｇαｓ−ｑとよぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑを造成した。
（３）Ｇαｓ−ｉ発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉの造成
配列番号１６および１７で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化後、アニールさせることにより、ＧαｉのＣ末端５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡを取得した。該二本鎖ＤＮＡ、ならびに上記（２）で取得したｐＡＭｏｈ−Ｇｓ４由来のＸｂａＩ−Ａｓｐ７１８断片およびＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片を結合することにより、ＧαｓのＣ末端の５アミノ酸をＧαｉのＣ末端の５アミノ酸に置換したキメラＧαｓ（以下、Ｇαｓ−ｉとよぶ）発現プラスミドｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉを造成した。
（４）Ｇαｓ−ｑおよびＧαｓ−ｉを共発現するためのプラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉの造成
参考例３（１）で造成したｐＡＣＲＥｌｕｃをＣｌａＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＣｐｏＩで切断することにより、ｏｒｉＰおよびＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子部分を含むＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｉをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＧＥ２４８〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０（１９９４）〕をＸｈｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏ処理し、さらにＢｓｓＨＩＩで切断し、モロニー・マウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター（以下、Ｍｏプロモーターと略す）配列の一部を含むＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片、ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｑをＢｓｓＨＩＩおよびＣｐｏＩで切断し、Ｇαｓ−ｑをコードするＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片を取得した。ｐＡＭｏｈ−Ｇｓ−ｉ由来のＢｓｓＨＩＩ−ＣｐｏＩ断片、ならびに上記で取得したｐＡＣＲＥｌｕｃ由来のＣｐｏＩ−ＣｌａＩ（平滑末端）断片およびｐＡＧＥ２４８由来のＸｈｏＩ（平滑末端）−ＢｓｓＨＩＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉを、ＮａｅＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＭｏプロモーターを含むＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ＣｐｏＩおよびＢｓｓＨＩＩで切断しＧαｓ−ｉをコードするＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑを、ＮｈｅＩおよびＣｐｏＩで切断しＣＲＥ−ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含むＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片を、ＮｈｅＩおよびＮａｅＩで切断しＧαｓ−ｑをコードするＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片を、それぞれ取得した。ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｉ由来のＮａｅＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片およびＣｐｏＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片、ならびにｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑ由来のＮｈｅＩ−ＣｐｏＩ断片およびＮｈｅＩ−ＮａｅＩ断片の４断片を結合し、プラスミドｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉプラスミドをＳａｌＩおよびＮｏｔＩで消化後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、ＳａｌＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ（平滑末端）断片を取得した。該断片をセルフライゲーションすることにより、ｐＡＣＲＥｌｕｃＭｏＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉからＣＲＥレポーターユニットを除去したプラスミドｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＣｐｏＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含まないＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ（クロンテック社製）をＢａｍＨＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ処理し、さらにＡｓｅＩで切断することにより、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含むＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片を取得した。ｐＰＵＲ由来のＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＡｓｅＩ断片、および上記ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ由来のＣｐｏＩ（平滑末端化）−ＡｓｅＩ断片を結合し、ｐＡＭｏｈＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のハイグロマイシン耐性遺伝子を、ピューロマイシン耐性遺伝子で置き換えたｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを造成した。
ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを導入した細胞では、ＧαｉまたはＧαｑに共役するＧＰＣＲのシグナル情報伝達についても、Ｇαｓを介したＧＰＣＲのシグナル情報伝達と同じく、ＣＲＥ制御下の遺伝子の転写の活性化を指標に検出することができる。
（５）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉをＧＢＣ７の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉ中のｏｒｉＰ内に１個所存在する制限酵素であるＳｐｅＩで切断したｐＡＭｏＰＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した後、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕により、参考例３（３）で造成したＧＢＣ７に、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換細胞を得た。
該形質転換株を、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（シグマ−アルドリッチ社製、２．０μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに７日間培養した。
培養後、該形質転換株の生細胞数を確認し、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびＫＪＭＧＥＲ８（１×１０６細胞／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で、該形質転換株が１５０細胞／ｍＬになるように希釈し、９６ウェルプレートに３０細胞／ウェルずつ分注して培養を行い、９３個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（６）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＣ１３の選択
上記（５）で取得した９３クローンを１〜２×１０４細胞／ウェルずつ９６ウェルプレートにまき、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｒｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）２０００（インビトロジェン社製）を用いて、ＧαｉまたはＧαｑと共役する１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１（下記参考例９参照）を各クローンに導入し、形質転換株を取得した。遺伝子導入の具体的方法はリポフェクトアミン２０００の説明書に従って行い、１ウェル当たりプラスミドを０．３μｇ、リポフェクトアミン２０００を０．８μｌ使用した。
該形質転換株を１日培養した後に、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で７日間培養した。各ウェルへ１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに１日間培養した。各ウェルへアンジオテンシンＩＩ（ペプチド研究所社製）（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、６時間培養後、参考例２（２）の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を調べた。以上の結果、アンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性を示した１０クローンを選択した。
該１０クローンに、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を上記エレクトロポレーション法により、１．６×１０６細胞あたり４μｇ導入し、形質転換株を取得した。
該形質転換株を８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。培養後、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。
該形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、ピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）、およびジェネティシン（５００μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
各形質転換株に１７β−エストラジオール（終濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加して２４時間培養後、アンジオテンシンＩＩ（終濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌ）を添加し、さらに６時間培養後、上記の方法を用いてホタル・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いホタル・ルシフェラーゼ活性（８５倍）を示したＧＢＣＣ１３を優良株として選択した。
参考例６  Ｇａｌ４−ＥＲおよびキメラＧαｓを発現し、かつＣＲＥ制御下でウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現する宿主細胞株ＣＢＣＲＣ６の造成
（１）プラスミドｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを細胞株ＧＢＣＲ２の染色体ＤＮＡに組み込んだ安定形質転換株の造成
参考例５（５）で記載した方法に準じて、ｐＡＭｏｐＧｓ−ｑＭｏＧｓ−ｉを参考例４（３）で造成した細胞株ＧＢＣＲ２に導入することにより、９４個の安定形質転換株（シングルクローン）を取得した。各形質転換株は、ブラストサイジンＳ（２．０μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）、およびピューロマイシン（２．０μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（２）優れた性質を有する安定形質転換株（シングルクローン）ＧＢＣＲＣ６の選択
上記（１）で取得したクローンの中から優れた性質を有するクローンの選択を行った。ホタル・ルシフェラーゼの活性を測定する代わりにウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性を測定する以外は、参考例５（５）に記載した方法に準じた。ウミシイタケ・ルシフェラーゼの活性は、参考例４（３）に記載した方法に準じて測定した。
上記（１）で取得した各クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、アンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。アンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を示した１３クローンを選択した。
該１３クローンにｐＡＧａｌ９−ＡＴ１をエレクトロポレーション法により導入し、形質転換細胞を取得した。各形質転換細胞を１７β−エストラジオールで処理後、アンジオテンシンＩＩで刺激してウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を測定した。同時に、１７β−エストラジオール刺激しない場合の活性、およびアンジオテンシンＩＩ刺激しない場合の活性を測定した。１７β−エストラジオールで刺激した時にのみアンジオテンシンＩＩに反応して高いウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性（１３２倍）を示したＧＢＣＲＣ６を優良株として選択した。
参考例７  ＧＰＲ１２の誘導発現プラスミドの造成
鋳型として、ヒト脳梁由来のｍＲＮＡ（１μｇ、クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、ＧＰＲ１２遺伝子特異的プライマーとして配列番号１８および１９で表される配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＧＰＲ１２遺伝子を取得した。酵素としては、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）を用いた。ＰＣＲを行う際の緩衝液としては、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに付加された１０倍濃度の緩衝液を使用した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪリサーチ社製）を用い、９５℃で５分間の処理後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を３５サイクル行った。
ＧＰＣＲ１２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＮｏｔＩサイトが導入されている。増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断後、ＧＰＣＲ１２遺伝子を含む断片をアガロースゲル電気泳動法により回収した。該切断断片を、プラスミドｐＡＧａｌ９−ｎｄの対応する制限酵素サイト（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ）間へ組み込むことにより、誘導発現プラスミドを構築した。
プラスミドに組み込んだＤＮＡ断片の配列を以下のようにして決定し、ＧＰＣＲ１２をコードしていることを確認した。ｐＡＧａｌ９−ｎｄ中の配列に特異的なプライマー（配列番号２０および２１で表される配列を有する合成ＤＮＡ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、パーキン・エルマー社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ：アプライド・バイオシステムズ社）を使用した。
参考例８  ２型バソプレッシン受容体（Ｖ２）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２の造成
鋳型として、ヒト腎臓由来のｍＲＮＡ（１μｇ、クロンテック社製）から調製した一本鎖ｃＤＮＡを、Ｖ２遺伝子特異的プライマーとして、配列番号１６および１７で表される配列を有する合成ＤＮＡを用い、ＰＣＲによりＶ２遺伝子を取得した。Ｖ２遺伝子特異的プライマーには、それぞれＨｉｎｄＩＩＩサイトおよびＡｓｐ７１８サイトが導入されている。
得られたＶ２遺伝子増幅断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。参考例１（２）で造成したプラスミドｐＡＧａｌ９−ｄをＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。上記Ｖ２遺伝子増幅断片由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片、およびｐＡＧａｌ９−ｄ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、Ｖ２の誘導発現プラスミドｐＡＧａｌ９−Ｖ２を造成した。
参考例９  １型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）発現プラスミドｐＡＧａｌ９−ＡＴ１の造成
プラスミドｐＡＲ１．８〔Ｎａｔｕｒｅ，３５１，２３０（１９９１）〕をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ウシＡＴ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。参考例１（１）で造成したｐＡＧａｌ９−ｌｕｃをＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで切断し、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含まないＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＡＲ１．８由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片、およびｐＡＧａｌ９−ｌｕｃ由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を結合し、ｐＡＧａｌ９−ＡＴ１を造成した。
【産業上の利用可能性】  本発明によりＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング法、ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加または減少させる物質のスクリーニング法、およびＧＰＣＲ−Ｔ４に対するアゴニストまたはアンタゴニストあるいはＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子の発現量を増加させる物質または減少させる物質を有効成分として含有する、甲状腺機能の制御剤、好中球の活性化剤または活性化抑制剤、炎症性疾患の予防または治療剤、喘息の予防または治療剤、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤、感染性疾患の予防治療剤が提供される。
【配列表フリーテキスト】配列番号１−発明者：佐伯  智；河合  宏紀；夏目  歩
発明者：小畑  長英；佐々木  克敏
配列番号４−ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子転写産物の定量用のフォワード・プライマー
配列番号５−ＧＰＣＲ−Ｔ４遺伝子転写産物の定量用のリバース・プライマー
配列番号６−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号７−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号８−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号９−ポリアデニル化シグナルを含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号１０−２つのＣＲＥ配列を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号１１−２つのＣＲＥ配列を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ
配列番号１２−ＧαＳ４遺伝子特異的プライマー
配列番号１３−ＧαＳ４遺伝子特異的プライマー
配列番号１４−ＧαｑのＣ末５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ配列番号１５−ＧαｑのＣ末５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ配列番号１６−ＧαｉのＣ末５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ配列番号１７−ＧαｉのＣ末５アミノ酸をコードする領域を含む二本鎖ＤＮＡ構築用の合成ＤＮＡ配列番号１８−ＧＰＲ１２遺伝子特異的プライマー
配列番号１９−ＧＰＲ１２遺伝子特異的プライマー
配列番号２０−ｐＡＧａｌ９−ｎｄの配列に特異的なプライマー
配列番号２１−ｐＡＧａｌ９−ｎｄの配列に特異的なプライマー
配列番号２２−Ｖ２遺伝子特異的プライマー
配列番号２３−Ｖ２遺伝子特異的プライマー
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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