(57)【要約】ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体。該浮遊担体は低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示す。該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度は、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上である。被浮遊物に対する外力の印加が制限された状態で（例えば、浮遊担体を収容すべき容器壁に、被浮遊物を実質的に接触させずに）、被浮遊物を浮遊させることが可能な浮遊担体および該担体を利用した浮遊・回収方法が提供される。
2004078961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上であることを特徴とする浮遊担体。
【請求項２】
前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度における沈降速度（ａ）と、ゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度における沈降速度（ｂ）との比（ｂ／ａ）が５以上である請求項１に記載の浮遊担体。
【請求項３】
ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上であることを特徴とする浮遊担体。
【請求項４】
３７℃における沈降速度（ｃ）と、１０℃における沈降速度（ｄ）との比（ｃ／ｄ）が５以上である請求項３に記載の浮遊担体。
【請求項５】
前記浮遊担体中で実質的に繊維芽細胞が増殖しない請求項１〜４のいずれかに記載の浮遊担体。
【請求項６】
前記ハイドロゲル形成性の高分子が、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックとが結合した高分子である請求項１〜５のいずれかに記載の浮遊担体。
【請求項７】
前記ゾル−ゲル転移温度が０℃より高く４５℃以下である請求項１〜６のいずれかに記載の浮遊担体。
【請求項８】
更に水を含む請求項１〜７のいずれかにに記載の浮遊担体。
【請求項９】
更に化学仲介物質を含有する請求項１〜８のいずれかに記載の浮遊担体。
【請求項１０】
水と、ハイドロゲル形成性の高分子とを少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し；該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法。
【請求項１１】
ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法。
【請求項１２】
前記被浮遊物が、生体由来の細胞および／又は組織であり、且つ浮遊担体中で生体由来の細胞および／又は組織の培養を行う請求項１０または１１に記載の浮遊・回収方法。
【請求項１３】
前記被浮遊物がＥＳ細胞である請求項１２に記載の浮遊・回収方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法で培養、回収されたことを特徴とするＥＳ細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法で培養、回収されたことを特徴とする胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、好適な浮遊状態（すなわち、被浮遊物に対する外力の印加が制限された状態）において、被浮遊物を浮遊させることが可能な浮遊担体に関する。
本発明の浮遊担体の用途は、例えば、動植物細胞および／又は組織の培養（例えば、未分化な細胞の三次元培養あるいは浮遊培養）のための担体として特に好適に使用可能である。
【背景技術】  本発明の浮遊担体の使用法ないし用途は特に制限されないが、説明の便宜上、最近のトピックスである未分化な動植物細胞および／又は組織の培養に関連する先行技術について述べる。
近年、未分化な動植物の培養方法として、未分化状態を維持し易い点から、液体培養ないしは浮遊培養が広く行われている。植物細胞の培養の場合は、植物体からプロトプラストを単離し、該プロトプラストを培養しカルスあるいは毛状根を再生し育成する技術が開発され、特にプロトプラストの段階で遺伝子導入して目的にあった植物体を育種することが行われている。このプロトプラストの培養は主に液体培養で行われているが、液体培養では攪拌を必要とするためプロトプラストに衝突などの物理的傷害を与える可能性がある。
動物細胞の培養の場合は、個体の全ての細胞に分化する能力を有する胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ＥＳ細胞）が、最近特に注目されている。例えば、マウスＥＳ細胞は、インターロイキン６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ＩＬ−６）ファミリーに属する白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）の共存下では、未分化状態を維持したまま増殖できることが知られている。マウスＥＳ細胞は胚盤胞に注入すると胎盤以外の全ての組識に分化することができる。
このようなインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）と同じ条件をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で作り出すために、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ，ＥＢ）を形成させることが広く行われている。ＥＢからは内胚葉、中胚葉、外胚葉への分化が認められ、内皮系細胞、血液細胞、筋細胞、神経細胞、脂肪細胞が得られることが報告されている（倭  英司ら、細胞工学、Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．７，９８９−９９３（２００１）；非特許文献１）。
上記したＥＢは、ＬＩＦを除いた状態でＥＳ細胞を球状に保ち浮遊培養することで得ることができるが、ＥＳ細胞が容器壁に付着しない状態で培養することが事実上は必須である。これは、ＥＳ細胞が容器壁に付着した場合には、繊維芽細胞様の接着性細胞に分化してしまうという理由による。
このようにＥＳ細胞が容器壁に付着しない状態で培養することを可能とするＥＢの作成方法としては、ＥＳ細胞を含む培養液をシャーレの天井などにつるし三次元的に培養するハンギング・カルチャー（ｈａｎｇｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ）法や、メチルセルロースを含有する高粘度液体培地中でＥＳ細胞を三次元的に培養するメチルセルロース法が知られている（これらのハンギング・カルチャー法およびメチルセルロース法の詳細に関しては、例えば、文献Ｄｅｓｂａｉｌｌｅｔｓ  Ｉ，ｅｔａｌ：Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８５，６４５−６５１（２０００）（非特許文献２）を参照することができる）。
上記ハンギング・カルチャー法では吊された細胞は重力により培養液の滴の下部に集まり、しだいに球形を呈するようになるが、この方法では１滴のカルチャーで１個のＥＢしか作ることができず、大量のＥＢを作成することは困難である。また、このハンギング・カルチャー法では、通常は別個の細胞が凝集してＥＢを作るため、単一のＥＳ細胞が増殖してＥＢを形成したという保証はなく、他の細胞のコンタミネーションが問題となる。
他方、上記メチルセルロース法では、ＥＳ細胞あるいはＥＳ細胞が増殖した細胞塊が徐々に沈降して容器底に付着し、繊維芽細胞等の付着性細胞が発生するという問題がある。更に、メチルセルロース含有培地が高粘度のため、ＥＳ細胞の播種、混和、更にＥＢの回収操作が困難であるという問題もある。
加えて、上記したハンギング・カルチャー法およびメチルセルロース法のいずれにおいても、これらの方法による培養の途中で培地交換が困難であるため、養分の補給や老廃物の除去が出来ず、ＥＢの成長速度が遅いという問題があった。
【非特許文献１】  倭  英司ら、細胞工学、Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．７，９８９−９９３（２００１）
【非特許文献２】  Ｄｅｓｂａｉｌｌｅｔｓ  Ｉ，ｅｔａｌ：Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８５，６４５−６５１（２０００）
【発明の開示】
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消した浮遊担体、および該担体を利用した浮遊・回収方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、被浮遊物に対する外力の印加が制限された状態で（例えば、浮遊担体を収容すべき容器壁に、被浮遊物を実質的に接触させずに）、被浮遊物を浮遊させることが可能な浮遊担体および該担体を利用した浮遊・回収方法を提供することにある。
本発明者は鋭意研究の結果、より低温でゾル化し、より高温でゲル化するゾル−ゲル転移温度を有し、且つ該ゾル−ゲル転移が熱可逆的なハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含む組成物であって、しかも特定の鉄球沈降速度を与えるゲル形成性組成物を浮遊担体として利用することが、上記目的の達成のために極めて効果的なことを見出した。
本発明の浮遊担体は上記知見に基づくものであり、より詳しくは、ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上であることを特徴とするものである。
本発明によれば、更に、ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上であることを特徴とする浮遊担体が提供される。
本発明によれば、更に、水と、ハイドロゲル形成性の高分子とを少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し；該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法が提供される。
本発明によれば、更にハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法。
本発明者は上記知見に基づいて更に研究を進めた結果、上記の浮遊担体を用いた場合には、生体由来の物質（例えば、細胞ないし組織）の培養および回収が極めて容易となることをも見出した。例えば、本発明の遊担体を用いた場合には、ＥＳ細胞等の未分化な細胞を、その未分化な状態を維持したままで増殖させ得ることを見出した。
例えば、上記構成を有する本発明の浮遊担体を水を含むゲル形成性組成物とした場合は、低温（ゾル−ゲル転移温度より低い温度）で流動性のあるゾル状態にあるため、未分化な細胞を容易に播種、混和することができる。このゲル形成性組成物は、高温（ゾル−ゲル転移温度より高い温度；例えば室温あるいは３７℃の培養温度）でそのままでゲル化することができるため、本発明の浮遊担体中で幹細胞や前駆細胞を、生体内と同様の環境下で３次元的に培養することが可能となる。
更に、本発明の浮遊担体は高温のゲル状態で適度な比重と粘度を有するため、細胞や細胞集合体が該浮遊担体中で実質的に沈降せず、培養容器の底面に付着することを回避できる。更に驚くべきことに、本発明の浮遊担体中では、ＥＳ細胞などの未分化な細胞が未分化な状態を維持したまま増殖することができる。
本発明の浮遊担体では、ハイドロゲル形成性のゲル形成性組成物が高温（培養温度）のゲル状態で実質的に水不溶性を示すため、本発明の浮遊担体の上に液体培地を重層したり（図１）、液体培地中に本発明の浮遊担体を浮遊させて細胞を培養したり（図２）することが容易である。未分化な細胞が増殖する際には大量の養分を必要とするが、本発明の浮遊担体を用いる培養方法では外部の液体培地からその必要な養分を補給することができる。また、細胞が生成する老廃物などの細胞増殖を阻害する物質を外部の液体培地中へ排出することができる。その結果、本発明の浮遊担体を用いる培養方法では従来の細胞培養方法に比べて細胞の増殖を促進することができる。
未分化な細胞を目的の細胞に分化誘導するには、幹細胞や前駆細胞のような細胞のみでなく、その分化や増殖を促す細胞成長因子のような種々の化学仲介物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）が通常は必要である。本発明の浮遊担体は培養温度でゲル化してハイドロゲル形成性高分子が３次元的な網目構造を形成しているため、これらの化学仲介物質を浮遊担体中に長期間にわたって保持しておくことができる。この結果、未分化細胞から目的とする細胞への良好な分化誘導が達成される。
本発明の浮遊担体中で、例えば細胞や器官等を培養した後、再び冷却すれば低温で流動性のあるゾル状態に戻るため、培養された細胞や器官等を容易に且つ傷害を与えることなく回収することができる。また、本発明の浮遊担体はそのゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態では、水により容易に希釈できるため、更に流動性を高くでき、更に培養された細胞や器官等の回収を容易にすることができる。
上記した本発明の浮遊担体および浮遊・回収方法は、例えば、以下のような態様を含む。
［１］  ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上であることを特徴とする浮遊担体。
［２］  前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度における沈降速度（ａ）と、ゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度における沈降速度（ｂ）との比（ｂ／ａ）が５以上である［１］に記載の浮遊担体。
［３］  ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、
該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上であることを特徴とする浮遊担体。
［４］  ３７℃における沈降速度（ｃ）と、１０℃における沈降速度（ｄ）との比（ｃ／ｄ）が５以上である［３］に記載の浮遊担体。
［５］  前記浮遊担体中で実質的に繊維芽細胞が増殖しない［１］〜［４］のいずれかに記載の浮遊担体。
［６］  前記ハイドロゲル形成性の高分子が、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックとが結合した高分子である［１］〜［５］のいずれかに記載の浮遊担体。
［７］  前記ゾル−ゲル転移温度が０℃より高く４５℃以下である［１］〜［６］のいずれかに記載の浮遊担体。
［８］  更に水を含む［１］〜［７］のいずれかに記載の浮遊担体。
［９］  更に化学仲介物質を含有する［１］〜［８］のいずれかに記載の浮遊担体。
［１０］  水と、ハイドロゲル形成性の高分子とを少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し；該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法。
［１１］  ハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体であって；該浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示し、該浮遊担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、３７℃において１ｍｍ／分以下であり、且つ１０℃において５ｍｍ／分以上である浮遊担体を用い；
該浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、
該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、
再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することを特徴とする浮遊・回収方法。
［１２］  前記被浮遊物が、生体由来の細胞および／又は組織であり、且つ浮遊担体中で生体由来の細胞および／又は組織の培養を行う［１０］または［１１］に記載の浮遊・回収方法。
［１３］  前記被浮遊物がＥＳ細胞である［１２］に記載の浮遊・回収方法。
［１４］  前記［１２］に記載の方法で培養、回収されたことを特徴とするＥＳ細胞。
［１５］  前記［１２］に記載の方法で培養、回収されたことを特徴とする胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ、ＥＢ）。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の浮遊担体中で細胞を培養する方法の１態様（実施例２に相当）を示す模式断面図である。
図２は、本発明の浮遊担体中で細胞を培養する方法の他の１態様を示す模式断面図である。
図３は、本発明の浮遊担体中でマウスＥＳ細胞を６日間培養した（実施例１）後の顕微鏡写真（倍率１００倍）である。
図４は、本発明の浮遊担体中でマウスＥＳ細胞を６日間培養した（実施例２）後の顕微鏡写真（倍率１００倍）であり、３日目に重層培地の交換を行ったものである。
図５は、市販のメチルセルロース培地中でマウスＥＳ細胞を６日間培養した（比較例）後の顕微鏡写真（倍率４０倍）である。
図６は、本発明の浮遊担体（ＬＩＦあり）中で培養されたマウスＥＳ細胞のアルカリ性フォスファターゼ染色像（位相差顕微鏡観察倍率１００倍）である。
図７  本発明の浮遊担体（ＬＩＦなし）中で培養されたマウスＥＳ細胞のアルカリ性フォスファターゼ染色像（位相差顕微鏡観察倍率１００倍）
図８  ｆｅｅｄｅｒ細胞上（ＬＩＦあり）で培養されたマウスＥＳ細胞のアルカリ性フォスファターゼ染色像（位相差顕微鏡観察倍率１００倍）
図９  本発明の浮遊担体（ＬＩＦなし）中で培養されたカニクイザルＥＳ細胞のアルカリ性フォスファターゼ染色像（位相差顕微鏡観察倍率４００倍）
図１０  ｆｅｅｄｅｒ細胞上（ＬＩＦなし）で培養されたカニクイザルＥＳ細胞のアルカリ性フォスファターゼ染色像（位相差顕微鏡観察倍率４００倍）
【発明を実施するための最良の形態】  以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
（浮遊担体）
本発明の浮遊担体は、その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性の高分子を少なくとも含むゲル形成性の浮遊担体である。このゲル形成性浮遊担体は、低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、且つ、該ゲル形成性浮遊担体が高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示す。
更に、本発明の浮遊担体は、担体中における鉄球（直径４ｍｍ）の沈降速度が、前記ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度において１ｍｍ／分以下であり、且つゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度において５ｍｍ／分以上である。
本発明において、「浮遊」とは、被浮遊物質が本発明の担体（媒体）中で、該担体を保持ないし収容すべき固体材料（例えば、本発明の担体を収容すべき容器の内壁）に実質的に接触することなく、本発明の担体によって実質的に保持されていることを言う。
（ゾル−ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル−ゲル転移温度の定義および測定は、文献（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａ３１（１），１１３（１９９４））に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ´、弾性項）が損失弾性率（Ｇ”、粘性項）を上回る点の温度をゾル−ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ”＞Ｇ´の状態がゾルであり、Ｇ”＜Ｇ´の状態がゲルであると定義される。このゾル−ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
＜動的弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーターＡＲ５００（ＴＡインスツルメンツ社製）
試料溶液（ないし分散液）の濃度（ただし「ゾル−ゲル転移温度を有する高分子化合物」の濃度として）：１０（重量）％
試料溶液の量：約０．８ｇ
測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、
ギャップ６００μｍ
測定周波数：１Ｈｚ
適用ストレス：線形領域内。
好適なゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲルは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。本発明の浮遊担体を用いて被浮遊物を処理および回収する一連の操作においては、上記したゾル−ゲル転移温度（ｅ℃）を、被浮遊物の処理温度（ｆ℃）と、被浮遊物を分散、混和あるいは回収するための冷却時の温度（ｇ℃）との間に設定することが好ましい。すなわち、上記した３種の温度ｅ℃、ｆ℃、およびｇ℃の間には、ｆ＞ｅ＞ｇの関係があることが好ましい。より具体的には、（ｆ−ｅ）は１〜９０℃、更には２〜５０℃であることが好ましく、また（ｅ−ｇ）は１〜５０℃、更には２〜４０℃であることが好ましい。
（細胞や生体組織の培養に用いる態様）
本発明の浮遊担体を細胞や生体組織の培養に用いる態様においては、細胞や生体組織の熱的損傷を防ぐ点からは、上記ゾル−ゲル転移温度は０℃より高く、４５℃以下であることが好ましく、更には、０℃より高く４２℃以下（特に４℃以上４０℃以下）であることが好ましい。
このような好適なゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲルは、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。本発明の浮遊担体を用いて細胞を培養する一連の操作においては、上記したゾル−ゲル転移温度（ｅ℃）を細胞の培養温度（ｆ℃）と、細胞を播種、混和あるいは回収するための冷却時の温度（ｇ℃）との間に設定することが好ましい。すなわち、上記した３種の温度ｅ℃、ｆ℃、およびｇ℃の間には、ｆ＞ｅ＞ｇの関係があることが好ましい。より具体的には、（ｆ−ｅ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であることが好ましく、また（ｅ−ｇ）は１〜４０℃、更には２〜３０℃であることが好ましい。
（鉄球の沈降速度）
本発明の浮遊担体は、被浮遊物（細胞等）の沈降を回避するために、適度な比重と粘度を有する。本発明の浮遊担体が、このような好適な比重と粘度を有することは、例えば、以下の方法で本発明の浮遊担体中における鉄球の沈降速度を測定することによって判別できる。
＜鉄球の沈降速度の測定＞
鉄球（ボールベアリング用ステンレス鋼球）：直径４ｍｍ、質量：０．２６ｇ
試料の量：５ｍＬ
測定器具：透明ガラス製５ｍＬメスシリンダー（１ｍＬの目盛り間隔が約１４ｍｍ）
透明ガラス製５ｍＬメスシリンダーに測定対象試料（浮遊担体）約５ｍＬを入れ、恒温器内で所定温度になるまで静置（約２時間）する。所定温度で鉄球（直径４ｍｍ、質量：０．２６ｇ）を前記メスシリンダー中の試料上に静かに置く。恒温器内で所定温度に保ちながら、鉄球の沈降速度を測定する。
より具体的には例えば、鉄球の上端がメスシリンダーの４ｍＬの目盛りを通過した時点から鉄球の上端が３ｍＬの目盛りを通過するまでの時間を測定（Ｔ分間）し、４ｍＬの目盛りと３ｍＬの目盛りの間隔（Ｄｍｍ）を除して鉄球の沈降速度（Ｖｍｍ／分）を求める。
Ｖ＝Ｄ／Ｔ
本発明の浮遊担体は、ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度における上記鉄球の沈降速度Ｖ＋１６が１ｍｍ／分以下である。この沈降速度Ｖ＋１６は、好ましくは０．１ｍｍ／分以下、より好ましくは０．０１ｍｍ／分以下、更に好ましくは０．００１ｍｍ／分以下である。ゾル−ゲル転移温度より１６℃高い温度における浮遊担体中の上記鉄球の沈降速度Ｖ＋１６がこの範囲を超えると、高温ゲル状態で細胞培養中に浮遊担体中で被浮遊物が沈降し易くなり、該被浮遊物が容器底面に付着し易くなる傾向が生ずる。
また、本発明の浮遊担体は、ゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度における上記鉄球の沈降速度Ｖ−６が５ｍｍ／分以上である。この沈降速度は、好ましくは１０ｍｍ／分以上、より好ましくは５０ｍｍ／分以上、更に好ましくは５００ｍｍ／分以上である。ゾル−ゲル転移温度より６℃低い温度における浮遊担体中の上記鉄球の沈降速度Ｖ−６がこの範囲を下回ると、低温ゾル状態での被浮遊物の分散、混和あるいは回収操作が困難となる傾向が生ずる。
また、本発明の浮遊担体では、Ｖ−６／Ｖ＋１６が５以上、更には５０以上、特に好ましくは５００以上（更には５０００以上）であることが好ましい。
（生体由来材料に用いる態様）
生体由来材料に用いる態様においては、本発明の浮遊担体は、３７℃における上記鉄球の沈降速度Ｖ３７が１ｍｍ／分以下であることが好ましい。この沈降速度Ｖ３７は、より好ましくは０．１ｍｍ／分以下、更に好ましくは０．０１ｍｍ／分以下、特に好ましくは０．００１ｍｍ／分以下である。３７℃における浮遊担体中上記鉄球の沈降速度Ｖ３７がこの範囲を超えると、高温ゲル状態で細胞培養中に浮遊担体中で細胞が沈降し易く、培養容器底面に付着し易くなるので好ましくない。
生体由来材料に用いる態様においては、本発明の浮遊担体は、１０℃における上記鉄球の沈降速度Ｖ１０が５ｍｍ／分以上であることが好ましく、より好ましくは１０ｍｍ／分以上、更に好ましくは５０ｍｍ／分以上、特に好ましくは５００ｍｍ／分以上である。１０℃における浮遊担体中上記鉄球の沈降速度Ｖ１０がこの範囲を下回ると、低温ゾル状態での細胞の播種、混和あるいは回収操作が困難となるので好ましくない。
また、本発明の浮遊担体では、Ｖ１０／Ｖ３７が５以上、更には５０以上、特に好ましくは５００以上、更には５０００以上であることが好ましい。
（沈降速度の調整）
本発明の浮遊担体中における浮遊物（固体又は液体の場合；鉄球を含む）の沈降速度を低下させるには、１）浮遊担体の比重を上げる、２）ハイドロゲル形成性高分子の濃度を増大させる、３）ハイドロゲル形成性高分子の分子量を増大させる、４）ゾル−ゲル転移温度を低くする、５）ハイドロゲルの架橋点を増加させるなどの手段を用いることができる。
一方、本発明の浮遊担体中における浮遊物（固体又は液体の場合；鉄球を含む）の沈降速度を増大させるには、１）浮遊担体の比重を下げる、２）ハイドロゲル形成性高分子の濃度を減少させる、３）ハイドロゲル形成性高分子の分子量を低下させる、４）ゾル−ゲル転移温度を高くする、５）ハイドロゲルの架橋点を減少させるなどの手段を用いることができる。
（浮遊担体の動作に対する追従性）
本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルは、その細胞増殖に伴う細胞集塊の形態変化への追従性のバランスの点から、より高い周波数に対しては固体的な挙動を示し、他方、より低い周波数に対しては液体的な挙動を示すことが好ましい。より具体的には、該ハイドロゲルの動作に対する追従性は以下の方法で好適に測定することが可能である。
（動作に対する追従性の測定方法）
ハイドロゲル形成性の高分子を含む本発明の浮遊担体（ハイドロゲルとして１ｍＬ）をゾル状態（ゾル−ゲル転移温度より低い温度）で内径１ｃｍの試験管に入れ、該浮遊担体のゾル−ゲル転移温度よりも充分高い温度（たとえば該ゾル−ゲル転移温度よりも約１０℃高い温度）とした水浴中で上記試験管を１２時間保持し、該ハイドロゲルをゲル化させる。
次いで、該試験管の上下を逆にした場合に溶液／空気の界面（メニスカス）が溶液の自重で変形するまでの時間（Ｔｍ）を測定する。ここで１／Ｔｍ（ｓｅｃ−１）より低い周波数の動作に対しては該ハイドロゲルは液体として振舞い、１／Ｔｍ（ｓｅｃ−１）より高い周波数の動作に対しては該ハイドロゲルは固体として振舞うことになる。本発明のハイドロゲルの場合にはＴｍは１分〜２４時間、好ましくは５分〜１０時間である。
（定常流動粘度）
本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルのゲル的性質は、定常流動粘度の測定によっても好適に測定可能である。定常流動粘度η（イータ）は、例えばクリープ実験によって測定することができる。
クリープ実験では一定のずり応力を試料に与え、ずり歪の時間変化を観測する。一般に粘弾性体のクリープ挙動では、初期にずり速度が時間とともに変化するが、その後ずり速度が一定となる。この時のずり応力とずり速度の比を定常流動粘度ηと定義する。この定常流動粘度は、ニュートン粘度と呼ばれることもある。ただし、ここで定常流動粘度は、ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で決定されなければならない。
具体的な測定方法は、測定装置としてストレス制御式粘弾性測定装置ＣＳＬ型レオメーター（ＣＳＬ５００、米国キャリーメド社製）を、測定デバイスにアクリル製円盤（直径４ｃｍ）を使用し、試料厚み６００μｍとして少なくとも５分間以上の測定時間クリープ挙動（遅延曲線）を観測する。サンプリング時間は、最初の１００秒間は１秒に１回、その後は１０秒に１回とする。
適用するずり応力（ストレス）の決定にあたっては、１０秒間ずり応力を負荷して偏移角度が２×１０−３ｒａｄ以上検出される最低値に設定する。解析には５分以降の少なくとも２０以上の測定値を採用する。本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルは、そのゾル−ゲル転移温度より約１０℃高い温度において、ηが５×１０３〜５×１０６Ｐａ・ｓｅｃであることが好ましく、更には８×１０３〜２×１０６Ｐａ・ｓｅｃ、特に１×１０４Ｐａ・ｓｅｃ以上、１×１０６Ｐａ・ｓｅｃ以下であることが好ましい。
上記ηが５×１０３Ｐａ・ｓｅｃ未満では短時間の観測でも流動性が比較的高くなり、ゲルによる細胞や組織の３次元的な保持が不十分となり、浮遊担体として機能し難くなる。他方、ηが５×１０６Ｐａ・ｓｅｃを超えると、長時間の観測でもゲルが流動性をほとんど示さなくなる傾向が強まり、生物体組織の再生に伴う動きに追従することの困難性が増大する。また、ηが５×１０６を超えるとゲルが脆さを呈する可能性が強まり、わずかの純弾性変形の後、一挙にもろく破壊する脆性破壊が生起しやすい傾向が強まる。
（動的弾性率）
本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルのゲル的性質は、動的弾性率によっても好適に測定可能である。該ゲルに振幅γ０、振動数をω／２πとする歪みγ（ｔ）＝γ０ｃｏｓωｔ（ｔは時間）を与えた際に、一定応力をσ０、位相差をδとするσ（ｔ）＝σ０ｃｏｓ（ωｔ＋δ）が得られたとする。｜Ｇ｜＝σ０／γ０とすると、動的弾性率Ｇ’（ω）＝｜Ｇ｜ｃｏｓδと、損失弾性率Ｇ”（ω）＝｜Ｇ｜ｓｉｎδとの比（Ｇ”／Ｇ’）が、ゲル的性質を表す指標となる。
本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルは、ω／２π＝１Ｈｚの歪み（速い動作に対応する）に対しては固体として挙動し、且つ、ω／２π＝１０−４Ｈｚの歪み（遅い動作に対応する）に対しては固体として挙動する。より具体的には、本発明の浮遊担体に基づくハイドロゲルは、以下の性質を示すことが好ましい（このような弾性率測定の詳細については、例えば、文献：小田良平ら編集、近代工業化学１９、第３５９頁、朝倉書店、１９８５を参照することができる）。
ω／２π＝１Ｈｚ（ゲルが固体として挙動する振動数）の際に、（Ｇ”／Ｇ’）ｓ＝（ｔａｎ  δ）ｓが１未満であることが好ましい（より好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．５以下）。
ω／２π＝１０−４Ｈｚ（ゲルが液体として挙動する振動数）の際に、（Ｇ”／Ｇ’）Ｌ＝（ｔａｎ  δ）Ｌが１以上であることが好ましい（より好ましくは１．５以上、特に好ましくは２以上）。
上記（ｔａｎ  δ）ｓと、（ｔａｎ  δ）Ｌとの比｛（ｔａｎ  δ）ｓ／（ｔａｎ  δ）Ｌ｝が１未満であることが好ましい（より好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．５以下）。
＜測定条件＞
ハイドロゲル形成性高分子の濃度：約８質量％  温度：浮遊担体のゾル−ゲル転移温度より約１０℃高い温度  測定機器：ストレス制御式レオメータ（機種名：ＣＳＬ  ５００、米国キャリーメド社製）
（ハイドロゲル形成性の高分子）
上述したような熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す（すなわち、ゾル−ゲル転移温度を有する）限り、本発明の浮遊担体に使用可能なハイドロゲル形成性の高分子は特に制限されない。生体由来材料に用いる態様、すなわち本発明の担体が生理的温度（０〜４２℃程度）において好適なゾル−ゲル変化を示すことが容易な点からは、例えば、該ハイドロゲル形成性の高分子中の曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックの曇点、両ブロックの組成および両ブロックの疎水性度、親水性度、および／又は分子量等をそれぞれ調整することによって達成することが好ましい。
その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（Ｋ．Ｒ．Ｈｏｌｍｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，３８２８（１９９１））等が知られている。
ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体として、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合したプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（商品名、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．製）ゲルが開発されている。このプルロニックＦ−１２７の高濃度水溶液は、約２０℃以上でハイドロゲルとなり、これより低い温度で水溶液となることが知られている。しかしながら、この材料の場合は約２０質量％以上の高濃度でしかゲル状態にはならず、また約２０質量％以上の高濃度でゲル化温度より高い温度に保持しても、更に水を加えるとゲルが溶解してしまう。また、プルロニックＦ−１２７は分子量が比較的小さく、約２０質量％以上の高濃度のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容易に透過するため、細胞・組織に悪影響を及ぼす可能性がある。
一方、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等に代表されるエーテル化セルロースの場合は、通常は、ゾル−ゲル転移温度が高く約４５℃以上である（Ｎ．Ｓａｒｋａｒ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４，１０７３，１９７９）。これに対して、生体の体温は通常３７℃近辺の温度であるため、上記エーテル化セルロースはゾル状態であり、該エーテル化セルロースを本発明の浮遊担体として用いることは事実上は困難である。
上記したように、その水溶液がゾル−ゲル転移点を有し、且つ該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の問題点は、１）ゾル−ゲル転移温度より高い温度で一旦ゲル化しても、更に水を添加するとゲルが溶解してしまうこと、２）ゾル−ゲル転移温度が生体の体温（３７℃近辺）よりも高く、体温ではゾル状態であること、３）ゲル化させるためには、水溶液の高分子濃度を非常に高くする必要があること、等である。
これに対して、本発明者らの検討によれば、好ましくは０℃より高く４２℃以下であるゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性の高分子（例えば、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなり、その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、且つ、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子）を用いて本発明の浮遊担体を構成した場合に、上記問題は解決されることが判明している。
（好適なハイドロゲル形成性の高分子）
本発明の浮遊担体として好適に使用可能な疎水結合を利用したハイドロゲル形成性の高分子は、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。該親水性のブロックは、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高い温度では水に不溶性に変化するために、曇点より高い温度で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合からなる架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度に対応する。
ただし、該曇点とゾル−ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成される点からは、ハイドロゲル形成性の高分子が「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
一方、上記ハイドロゲル形成性の高分子中の親水性ブロックは、前述したように、該ハイドロゲル形成性の高分子がゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高い温度で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
（曇点を有する複数のブロック）
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度−温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体とＮ−置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル−ゲル転移温度を４℃より高く４０℃以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
本発明に使用可能なポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。
ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン；ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド。
上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。従って、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
（親水性単量体）
上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（疎水性単量体）
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミド等のＮ−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（親水性のブロック）
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。
曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック  Ｆ−１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるハイドロゲル形成性の高分子を得ることができる。
この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるため、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高い温度に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高い温度に加温された際）でも水溶性であるため、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を有するハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明の高分子は、再び完全な水溶液となる。このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル−ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるため、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。
（ゲルの溶解性）
上述したように水溶液中でゾル−ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明のハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル−ゲル転移温度より高い温度（ｈ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル−ゲル転移温度より低い温度（ｉ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
上記した高い温度（ｈ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｈ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
一方、上記した低い温度（ｉ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｉ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記ハイドロゲル形成性の高分子の水溶液が、一旦（ゾル−ゲル転移温度より高い温度において）ゲル化された後においても、ゾル−ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０〜３，０００センチポイズ（更には５０〜１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
粘度計：ストレス制御式レオメータ（機種名：ＣＳＬ  ５００、米国  キャリーメド社製）
ローター直径：６０ｍｍ
ローター形状：平行平板
測定周波数：１Ｈｚ（ヘルツ）
本発明のハイドロゲル形成性の高分子の水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記浮遊担体の上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
すなわち、本発明のハイドロゲル形成性の高分子０．１５ｇを、上記ゾル−ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０Ｗ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｊグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍＬ中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｋグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明のハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｊ−ｋ）／ｊが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
本発明のハイドロゲル形成性の高分子の水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高い温度でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１〜１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニックＦ−１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）｝×１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なハイドロゲル形成性の高分子を用いることが好ましい。
（液体成分）
上記したハイドロゲル形成性の高分子とともに、本発明の担体（ゲル形成性の組成物）を構成する際に使用可能な液体成分（ないし分散媒）は、上記したように、ゲル形成性を有する浮遊担体が低温でゾル状態、高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示し、該ゲル形成性浮遊担体が高温のゲル状態で実質的に水不溶性を示す限り、特に制限されない。この液体成分は、本発明の担体をゾル状態で使用すべき温度において、実質的に液体状態を示すものである。
このような液体成分としては、種々の無機液体、有機液体、およびこれらの２種以上の組合せないし混合物を使用することができる。本発明の担体を生体由来の成分に使用すべき態様においては、この液体成分は、親水性ないし水溶性の液体であることが好ましく、更には、含水液体（特に、水を８０質量％以上含有する液体）であることが好ましい。
（他の成分）
本発明の浮遊担体は、上記したゾル−ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含むものであるが、必要に応じて他の成分を含んでいてもよい。このような態様における「他の成分」としては、例えば、抗生剤、抗癌剤、コラーゲン等のＥＣＭ、後述の局所性化学仲介物質、インスリン、細胞成長因子等のホルモン類、外来遺伝子等が挙げられる。
（被浮遊物質）
本発明において、上記した浮遊担体により浮遊させるべき被浮遊物質は、特に制限されない。すなわち、該被浮遊物質は、生体由来であっても、生体由来でなくてもよい。この被浮遊物質の好ましい態様は、以下の通りである。
比重：ゾル状態の本発明の担体中で、遠心分離（例えば、５００〜１０，０００ｒｐｍ、１００〜１０，０００Ｇ、５〜３０分間程度の条件）で、該担体から実質的に分離可能な程度の比重を有すること。
上記被浮遊物質としては、例えば、以下のものが挙げられる。
細胞、コロイド粒子（親水性および／又は疎水性）、液体、気体。
（繊維芽細胞の増殖性）
未分化細胞を未分化状態のまま増殖させることを目的として本発明の担体を生体由来の成分に使用すべき態様においては、該担体を構成するハイドロゲル形成性高分子が形成するハイドロゲルにおいては、該ゲル内で実質的に繊維芽細胞が増殖しないことが好ましい。繊維芽細胞は通常、細胞培養ディッシュ（プレート）上の単層培養やコラーゲンゲル内での培養において、繊維芽細胞に特徴的な樹枝状の形態変化を伴った著しい増殖が認められる。一方、本発明のハイドロゲル内では繊維芽細胞は単細胞の形態を保ったままで実質的に増殖を示さない。
繊維芽細胞の増殖性は、例えば以下の方法により評価できる（吉川剛司、月川賢、聖マリアンナ医科大学雑誌、２８巻、第４号、１６１−１７０（２０００）参照）。本発明の浮遊担体を構成するハイドロゲル形成性高分子を培養液、例えばＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）に低温（例えば４℃）下で攪拌溶解し、正常ヒト肺繊維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＮＨＬＦ、宝酒造（株）社製））を６ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度になるように分散させる。このＮＨＬＦ分散液０．２ｍＬを２４−ウェルプレート（材料：プラスチック製、ウェル１個の大きさは縦１５ｍｍ、横１５ｍｍ、深さ２０ｍｍ程度；市販品では、例えばＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製の商品名：Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）の各ウェル中に注入し、３７℃でゲル化させた後、培養液０．４ｍＬを添加して３７℃、５％ＣＯ２大気圧下で培養する。繊維芽細胞の増殖の様子は経日的に（例えば、０、１、３、７日）位相差顕微鏡による観察で確認する。
（繊維芽細胞の増殖率）
更に以下の酵素活性を利用する方法により培養期間中の繊維芽細胞の増殖率を測定可能である。本発明の浮遊担体中で繊維芽細胞を所定期間培養後、該浮遊担体をそのゾル−ゲル転移温度より低い温度（例えば、ゾル−ゲル転移温度より１０℃低い温度）に下げることによって該浮遊担体を溶解した後、各ウェル中にコハク酸脱水素酵素活性測定用試薬たるＷＳＴ−８試薬（同仁化学（株）製）５０μＬを添加する。この２４−ウェルプレートを、３７℃で１０時間反応させた後、約４℃に１時間保存し完全に均一な水溶液の状態にする。該水溶液を９６−ウェルプレートに２００μＬづつ分注し、マイクロプレート用比色計を用いて４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で吸光度（ＯＤ（４５０））を測定する。このＯＤ（４５０）と、生細胞数とは比例関係にあることが確かめられている（例えば、文献Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，”Ｈｉｇｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｇｅｇｅｌ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｉｓｔｏｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ＭＴＴ  ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔ”，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５１：４８９、１９９２を参照）。すなわち、繊維芽細胞の増殖率は培養開始時の吸光度（ＯＤ（４５０））と培養後の吸光度（ＯＤ（４５０））の比により求められる。
本発明において、３日間３７℃で培養した後の繊維芽細胞の増殖率は７０％から２００％、更には８０％から１５０％の範囲、より好ましくは９０％から１２０％の範囲であることが望ましい。
（化学仲介物質）
未分化細胞の増殖や分化には、前駆細胞のような細胞のみでなく、その分化や増殖を促す細胞成長因子のような種々の化学仲介物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）が通常は必要である。これらの化学仲介物質は通常細胞自身から分泌されるが、再生を効率良く進めるために本発明の浮遊担体に予めこれらの化学仲介物質を含有させて外部から補給することが効果的である。
この化学仲介物質としては、１）細胞のごく近傍でしか作用しない局所性化学仲介物質（ｌｏｃａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）、２）神経細胞から分泌され有効作用距離がごく短い神経伝達物質（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）、３）内分泌細胞から分泌され血流等を通じて全身の標的細胞に作用するホルモン（ｈｏｒｍｏｎｅ）等が挙げられる。
この１）の局所性化学仲介物質としては、神経細胞成長因子等のタンパク、走化性因子等のペプチド、ヒスタミン等のアミノ酸誘導体、プロスタグランジン等の脂肪酸誘導体等が挙げられる。
上記２）の神経伝達物質としては、グリシン等のアミノ酸、ノルアドレナリン、アセチルコリン、エンケファリン等の低分子ペプチド等の低分子量物質が挙げられる。
上記３）のホルモンとしては、線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）等の細胞成長因子、インスリン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）等のタンパク、または糖タンパク、ＴＳＨ放出因子、バソプレシン、ソマトスタチン等のアミノ酸誘導体、コルチゾール、エストラジオール、テストステロン等のステロイド等が挙げられる。
（浮遊・回収方法）
本発明においては、上記した本発明の浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として、該浮遊担体に被浮遊物を添加し、該ゾル−ゲル転移温度より高温のゲル状態で被浮遊物を保持し、その後、再度該ゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態として保持後の被浮遊物を回収することができる。この回収の際には、必要に応じて、公知の分離手段（例えば、遠心分離）を使用することができる。
上記以外の条件は、後述する生体由来成分の浮遊・回収方法を参照しつつ、被浮遊物の性質・性状等に応じて、適宜修正することができる。
（生体由来成分の浮遊・回収方法）
本発明の浮遊担体中に幹細胞や前駆細胞あるいはそれらを含有する組織等を播種、混和するには、本発明の浮遊担体を構成するハイドロゲル形成性高分子を培養液、例えばＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）に低温（例えば４℃）下で攪拌溶解し、本発明の浮遊担体をそのゾル−ゲル転移温度以下の水溶液（ゾル）の状態として該細胞や組織を添加、懸濁させれば良い。ここで用いる培養液には特に制限はなく、目的の幹細胞や前駆細胞が増殖・分化し易いものを適宜選択して用いれば良い。またこの培養液に目的の幹細胞や前駆細胞の増殖・分化を促進する前述の化学仲介物質を含有させることは効果的である。
本発明の浮遊担体中で細胞を培養するには、上記懸濁液を本発明の浮遊担体のゾル−ゲル転移温度以上の温度（室温あるいは３７℃）に昇温してゲル化させた後、該温度（室温あるいは３７℃）で幹細胞や前駆細胞あるいはそれらを含有する組織等を培養する。
本発明の浮遊担体では、ハイドロゲル形成性のゲル形成性組成物が高温のゲル状態（培養温度）で実質的に水不溶性を示すため、本発明の浮遊担体の上に液体培地を重層したり、液体培地中に本発明の浮遊担体を浮遊させて細胞を培養したりすることができる。未分化な細胞が増殖する際には大量の養分を必要とするが、本発明の浮遊担体では外部の液体培地からその必要な養分を補給することができる。また、細胞が生成する老廃物などの細胞増殖を阻害する物質を外部の液体培地中へ排出することができる。その結果、本発明の浮遊担体では従来の細胞培養方法に比べて細胞の増殖を促進することができる。
本発明の浮遊担体中で目的の組織・器官が誘導され、これらを本発明の浮遊担体から回収するには、目的の組織・器官を含む本発明の浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度以下の温度（例えば４℃）に冷却して本発明の浮遊担体をゾル状態に戻し、遠心分離等の方法で目的の組織・器官と本発明の浮遊担体を分離すれば良い。また、本発明の浮遊担体はそのゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態では、水により容易に希釈できるので更に流動性を高くでき、更に培養された細胞や器官等の回収を容易にすることができる。
本発明の浮遊担体は繊維芽細胞の増殖を抑え、幹細胞や前駆細胞の増殖や分化を促す特徴を有するので本発明の浮遊担体中で目的とする組織・器官を効率よく形成させることができる。
（回収されたＥＳ細胞および／又は胚様体）
上記した本発明の浮遊担体（生体由来物質に適用する態様）を用いることにより、容器壁に付着させずに浮遊状態で培養させる必要がある動植物細胞（例えばプロトプラスト、ＥＳ細胞やＥＢなど）を容易に播種、混和することができるのみならず、好適に回収することができる。これは、本発明によれば、培養中は該動植物細胞を容器壁に付着させずに浮遊状態で培養可能であり、且つ、培養途中での培地交換が可能で、培養終了後は増殖あるいは分化した細胞ないし細胞塊を容易に回収できるからである。
したがって、本発明の浮遊担体を用いることにより、例えば、ＥＳ細胞および／又は胚様体を好適に培養および回収することができる。
ＥＳ細胞の臨床応用に際しては、未分化性を維持したまま大量に培養することが使用の前提条件になる。マウスＥＳ細胞に関してはＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）の使用により未分化性の維持が可能であることが明らかとなったが、ヒトを含めた霊長類ＥＳ細胞では未分化性維持機構は解明されていない（実験医学、２１巻、第８号（増刊）、「幹細胞研究の最先端」、編集：岡野栄之、中辻憲夫、２００３年、羊土社発行、参照）。
現在マウス線維芽細胞をｆｅｅｄｅｒとして用いることにより、経験的に霊長類ＥＳ細胞の未分化性維持が可能であるとの報告（Ｎａｋａｔｓｕｊｉ  Ｎ，Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｊｕｎ  ２６；２（６）：１７６２（２００２））がある。この報告によれば、カニクイザルＥＳ細胞はＬＩＦを含まない液体培地を用い、マウス線維芽細胞をｆｅｅｄｅｒとして用いた平面培養により、一層の島状のコロニーを作って未分化性を維持したまま増殖するとされている。しかしながら、このような他種動物細胞（繊維芽細胞）との共培養はヒトへの臨床応用に際して重大な問題となる。
一方、本発明の浮遊担体を用いることにより、ＬＩＦおよびｆｅｅｄｅｒ細胞を用いずに、マウスＥＳ細胞やカニクイザル、ヒトなどの霊長類ＥＳ細胞を未分化状態を維持して培養することができる。このように他種動物の細胞との共培養を必要としないことはＥＳ細胞の臨床応用において極めて有利である。また、本発明の浮遊担体中では繊維芽細胞が増殖しないという特徴もあるので、もし、他の動物の繊維芽細胞が混入していたとしても、ＥＳ細胞のみを選択的に増殖させることが可能となる。
このように本発明の浮遊担体を用いて培養および回収されたＥＳ細胞ないしは胚様体は、以下のような好適な特性を有する。
＜回収されたＥＳ細胞の特性＞
通常、ＥＳ細胞はＬＩＦ存在下では未分化状態を維持しながら増殖するが、ＬＩＦ非存在下では神経や血球、筋肉などの成熟細胞に分化してしまう。しかし、本発明の浮遊担体を用いて培養および回収されたＥＳ細胞は、ＬＩＦ非存在下の培養でも未分化な状態を維持することができるという特性を有する。
未分化な状態を維持していることは、遺伝子発現状態をＤＮＡチップ（マイクロアレイ）によって解析することによって確認できる。培養前のＥＳ細胞の遺伝子発現と比較して、培養後の細胞の遺伝子発現が変わらない、あるいは変化が小さければ未分化状態を維持していると判断される。また、培養後のＥＳ細胞集合体の遺伝子発現が培養前のＥＳ細胞の遺伝子発現と比較して変わらない、あるいは変化が小さければ、他の細胞へ分化した細胞のコンタミネーションも無いか、あるいは少ないと判断される。
また未分化な状態を維持していることは、回収したＥＳ細胞をフィーダー細胞上で培養した時、アーモンド形のコロニーを形成することからも確認できる。また未分化な状態を維持していることは、ノックアウトマウス（キメラマウス）の作成によっても確認できる。
また、ＥＳ細胞が未分化な状態を維持していることはアルカリ性フォスファターゼの活性を観測することによっても確認できる。アルカリ性フォスファターゼ活性が高ければ、細胞をＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＶＥＣＴＯＲ製）を用いて染色した際に赤く染まる。
上記した特性確認方法については文献「再生医学−ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで−」監訳代表：大野典也、相澤益男、発行者：吉田  隆、発行所：株式会社エヌ・ティー・エス、２００２年、（東京）を参照することができる。
本発明において回収されたＥＳ細胞が未分化な状態を維持しているので、さらにＥＳ細胞（万能細胞）として利用できる。回収されたＥＳ細胞が未分化な状態を維持しているので、種々の化学仲介物質などを用いて目的の細胞や器官に分化誘導することができる。本発明の浮遊担体はこのような化学仲介物質などを用いたＥＢの分化誘導工程に利用することもできる。
＜回収された胚様体（ＥＢ）の特性＞
本発明の浮遊担体を用いて培養および回収されたＥＢは、未分化な状態を維持することができるという特性を有する。ＥＢが未分化な状態を維持していることは、上記のＥＳ細胞の場合と同様の方法で確認できる。またＥＢが未分化な状態を維持していることの確認方法は、文献「再生医学−ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで−」監訳代表：大野典也、相澤益男、発行者：吉田  隆、発行所：株式会社エヌ・ティー・エス、２００２年、（東京）を参照することもできる。
本発明において回収されたＥＢが未分化な状態を維持しているので、種々の化学仲介物質などを用いて目的の細胞や器官に分化誘導することができる。本発明の浮遊担体はこのようなＥＢの分化誘導工程に利用することもできる。
ＥＢの作成に前述したハンギングカルチャー法を採用する場合は、別個のＥＳ細胞が液滴の下部で集合してＥＢが形成されるので、単一のＥＳからＥＢが形成されているとは限らない。一方、本発明の浮遊担体を用いて培養および回収されたＥＢは、単一の（１個の）細胞が増殖してＥＢを形成することができるので、純粋なＥＢを形成することができる。このようにＥＢが純粋であることは上記と同様に遺伝子発現の解析によって確認できる。
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は特許請求の範囲により限定されるものであり、以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】製造例１
ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体（プロピレンオキサイド／エチレンオキサイド平均重合度約６０／１８０、旭電化工業（株）製：プルロニックＦ−１２７）１０ｇを乾燥クロロホルム３０ｍＬに溶解し、五酸化リン共存下、ヘキサメチレンジイソシアネート０．１３ｇを加え、沸点還流下に６時間反応させた。溶媒を減圧留去後、残さを蒸留水に溶解し、分画分子量３万の限外濾過膜（アミコンＰＭ−３０）を用いて限外濾過を行い、高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。得られた水溶液を凍結して、Ｆ−１２７高重合体およびＦ−１２７低重合体を得た。
上記により得たＦ−１２７高重合体（本発明のハイドロゲル形成性高分子、ＴＧＰ−１）を、氷冷下、８質量％の濃度で蒸留水に溶解した。この水溶液をゆるやかに加温していくと、２１℃から徐々に粘度が上昇し、約２７℃で固化して、ハイドロゲルとなった。このハイドロゲルを冷却すると、２１℃で水溶液に戻った。この変化は、可逆的に繰り返し観測された。一方、上記Ｆ−１２７低重合体を、氷点下８質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、６０℃以上に加熱しても全くゲル化しなかった。
製造例２
トリメチロールプロパン１モルに対し、エチレンオキサイド１６０モルをカチオン重合により付加して、平均分子量約７０００のポリエチレンオキサイドトリオールを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリオール１００ｇを蒸留水１０００ｍＬに溶解した後、室温で過マンガン酸カリウム１２ｇを徐々に加えて、そのまま約１時間、酸化反応させた。固形物を濾過により除いた後、生成物をクロロホルムで抽出し、溶媒（クロロホルム）を減圧留去してポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体９０ｇを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体１０ｇと、ポリプロピレンオキサイドジアミノ体（プロピレンオキサイド平均重合度約６５、米国ジェファーソンケミカル社製、商品名：ジェファーミンＤ−４０００、曇点：約９℃）１０ｇとを四塩化炭素１０００ｍＬに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２ｇを加えた後、沸点還流下に６時間反応させた。反応液を冷却し、固形物を濾過により除いた後、溶媒（四塩化炭素）を減圧留去し、残さを真空乾燥して、複数のポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−２）を得た。これを氷冷下、１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約１６℃であった。
製造例３
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（イーストマンコダック社製）９６ｇ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（国産化学（株）製）１７ｇ、およびｎ−ブチルメタクリレート（関東化学（株）製）７ｇをクロロホルム４０００ｍＬに溶解し、窒素置換後、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル１．５ｇを加え、６０℃で６時間重合させた。反応液を濃縮した後、ジエチルエーテルに再沈（再沈殿）した。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、７８ｇのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。
上記により得たポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）に、過剰のイソプロピルアミンを加えてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。このポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）の水溶液の曇点は１９℃であった。
前記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）１０ｇ、および両末端アミノ化ポリエチレンオキサイド（分子量６，０００、川研ファインケミカル（株）製）５ｇをクロロホルム１０００ｍＬに溶解し、５０℃で３時間反応させた。室温まで冷却した後、イソプロピルアミン１ｇを加え、１時間放置した後、反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル中に沈澱させた。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイドとが結合した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を得た。
このようにして得たＴＧＰ−３を氷冷下、１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約２１℃であった。
製造例４
（滅菌方法）
上記した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）の２．０ｇを、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌バッグ（ホギメディカル社製、商品名：ハイブリッド滅菌バッグ）に入れ、ＥＯＧ滅菌装置（イージーパック、井内盛栄堂製）でＥＯＧをバッグに充填し、室温にて一昼夜放置した。更に４０℃で半日放置した後、ＥＯＧをバッグから抜き、エアレーションを行った。バッグを真空乾燥器（４０℃）に入れ、時々エアレーションしながら半日放置することにより滅菌した。
この滅菌操作により高分子のゾル−ゲル転移温度が変化しないことを、別途確認した。
製造例５
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３７ｇと、ｎ−ブチルメタクリレート３ｇと、ポリエチレンオキサイドモノアクリレート（分子量４，０００、日本油脂（株）製：ＰＭＥ−４０００）２８ｇとを、ベンゼン３４０ｍＬに溶解した後、２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．８ｇを加え、６０℃で６時間反応させた。得られた反応生成物にクロロホルム６００ｍＬを加えて溶解し、該溶液をエーテル２０Ｌ（リットル）に滴下して沈澱させた。得られた沈殿を濾過により回収し、該沈澱を約４０℃で２４時間真空乾燥した後、蒸留水６Ｌに再び溶解し、分画分子量１０万のホローファイバー型限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１００−４３）を用いて１０℃で２ｌまで濃縮した。該濃縮液に蒸留水４ｌを加えて希釈し、上記希釈操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）６０ｇを得た。
上記により得た本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２５℃であった。
製造例６
製造例３の本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、３７℃におけるηを測定したところ、５．８×１０５Ｐａ・ｓｅｃであった。一方、寒天を２質量％の濃度で蒸留水に９０℃で溶解して、１０℃で１時間ゲル化させた後、３７℃におけるηを測定したところ、そのηは機器の測定限界（１×１０７Ｐａ・ｓｅｃ）を越えていた。
製造例７
（繊維芽細胞の増殖性評価）
製造例３で作製した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を製造例４の方法によって滅菌した後、該ポリマーの最終濃度が約８％になるように２０％の胎児牛血清（ＦＣＳ；Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製、商品名：Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）および抗生剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、商品名：ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ；最終濃度１０，０００Ｕ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）中に、４℃で２４時間、撹拌下に溶解した。この操作は無菌的に実施した。
上記の本発明の浮遊担体（ＴＧＰ−３／ＲＰＭＩ）に正常ヒト肺繊維芽細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＮＨＬＦ、宝酒造（株）社製））を６ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度になるように分散させた。このＮＨＬＦ分散液を２４ｗｅｌｌプレート［ｆｌａｔ  ｂｏｔｔｏｍ  ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ）］の各ｗｅｌｌに０．２ｍＬずつ分注し、３７℃でゲル化させた後、培養液０．４ｍＬを添加して３７℃、５％ＣＯ２大気圧下で培養した。２４ｗｅｌｌプレートは顕微鏡観察用と繊維芽細胞増殖率測定用の各２枚を０，１，３，７日目用分合計８枚用意した。これとは別に比較用としてＴＧＰ−３を用いないで上記の培養液に６ｘ１０４個／ｍＬの細胞密度になるように分散させたＮＨＬＦ分散液を調製し、同様にして２４ｗｅｌｌプレート８枚を用意して同様の培養試験を行った。
位相差顕微鏡により経日的（０，１，３，７日）に観察した結果、比較例の培養では１日後から繊維芽細胞に特徴的な樹枝状の増殖が見られ、７日後にはコンフルエントの状態となったのに対し、本発明の浮遊担体中では７日後まで繊維芽細胞が単細胞の形態を保ったままで増殖の様子は認められなかった。
所定培養日数の経過後、２４ｗｅｌｌプレートを４℃に下げることによって該浮遊担体を溶解した後、各ウェル中にコハク酸脱水素酵素活性測定用試薬たるＷＳＴ−８試薬（同仁化学（株）製）５０μＬを添加した。この２４ｗｅｌｌプレートを３７℃で１０時間反応させた後４℃に冷却して完全に均一な水溶液の状態にした。該水溶液を９６−ウェルプレートに２００μＬづつ分注し、マイクロプレート用比色計を用いて４５０ｎｍ（参照波長６２０ｎｍ）で吸光度（ＯＤ（４５０））を測定した。繊維芽細胞の増殖率は培養開始時（０日）の吸光度（ＯＤ（４５０））と培養後（１、３、７日後）の吸光度（ＯＤ（４５０））の比により求めた。本発明の浮遊担体中では１、３、７日後の繊維芽細胞の増殖率がそれぞれ１０５％、１２０％、１２５％であったのに対し、比較例では１、３、７日後の繊維芽細胞の増殖率がそれぞれ１７０％、３７０％、４２０％であった。
【実施例１】  製造例３で作製した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を製造例４の方法によって滅菌した後、該ポリマーの最終濃度が９．１％になるように１５％仔牛胎児血清、４５０ｍＭモノチオグリセロール、１０ｍｇ／Ｌ  インスリンを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ，ＧＩＢＣＯ社製）培地に溶解した。
この水溶液（本発明の浮遊担体）のゾル−ゲル転移温度は２０℃であった。また３７℃におけるこの水溶液中の鉄球（直径４ｍｍ）沈降速度Ｖ３７は０．００１ｍｍ／分以下、１０℃におけるこの水溶液中の鉄球（直径４ｍｍ）沈降速度Ｖ１０は５００ｍｍ／分以上であった。
上記本発明の浮遊担体にマウスＥＳ細胞（１２９ＳＶ、大日本製薬（株）製）を５×１０３細胞／ｍＬの濃度で播種し、あらかじめ３７℃に温めておいたバクテリア用培養皿（直径１００ｍｍ）へ２ｍＬ滴下して島状になるようにした。５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下に３０分間静置することでゲル化した。蓋をかぶせてそのまま５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下で６日間培養しＥＢを調製した（図３）。本発明の浮遊担体では、細胞は播種時の位置関係が保存され、単細胞であるＥＳ細胞からのＥＢ誘導が観察できた。
培養後、２０〜３０ｍＬのＰＢＳを加え氷上に３〜５分間静置した後、手で軽くゆするとゲルが容易に希釈できた。この希釈液を遠心分離することでＥＢを回収することができた。
【実施例２】  製造例３で作製した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を製造例４の方法によって滅菌した後、該ポリマーの最終濃度が９．１％になるように、１５％仔牛胎児血清、４５０ｍＭモノチオグリセロール、１０ｍｇ／Ｌ  インスリンを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ，ＧＩＢＣＯ社製）培地に溶解した。
上記本発明の浮遊担体にマウスＥＳ細胞（１２９ＳＶ、大日本製薬（株）製）を５×１０３細胞／ｍＬの濃度で播種し、あらかじめ３７℃に温めておいたバクテリア用培養皿（直径１００ｍｍ）へ２ｍＬ滴下して島状になるようにした。５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下に３０分間静置することでゲル化した。そのゲルの上にそのゲルを覆うように３７℃に温めた２０ｍＬの１５％仔牛胎児血清含有ＩＭＤＭ培地を重層した。蓋をかぶせてそのまま５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下で３日間培養した後、重層したＩＭＤＭ培地を３７℃に雰囲気を保ったまま吸引除去し、３７℃に温めた２０ｍＬの１５％仔牛胎児血清含有ＩＭＤＭ培地をあらためて重層し、新鮮な培地に交換した。蓋をかぶせてそのまま５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下で更に３日間培養した（図４）。重層培地および培地交換の効果により、実施例１よりもＥＢの成長速度が速かった。
重層したＩＭＤＭ培地を３７℃に雰囲気を保ったまま吸引除去し、２０〜３０ｍＬのＰＢＳを加え氷上に３〜５分間静置した後、手で軽くゆするとゲルが容易に希釈できた。この希釈液を遠心分離することでＥＢを回収することができた。
比較例１
市販のメチルセルロース含有ＩＭＤＭ培地（ＥＳ−Ｃｕｌｔ（商標）、Ｍ３１２０，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、メチルセルロース濃度２．５％）を１５％仔牛胎児血清、４５０ｍＭモノチオグリセロール、１０ｍｇ／Ｌ  インスリンを添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ，ＧＩＢＣＯ社製）培地で希釈し、メチルセルロース濃度が１％となるように調製した。この浮遊担体は０℃〜４５℃の範囲にゾル−ゲル転移温度を有していなかった。また３７℃におけるこの浮遊担体中の鉄球（直径４ｍｍ）沈降速度Ｖ３７は５００ｍｍ／分以上（沈降が速すぎて、測定困難）であり、１０℃におけるこの水溶液中の鉄球（直径４ｍｍ）沈降速度Ｖ１０も５００ｍｍ／分以上であった。
この浮遊担体（メチルセルロース培養担体）にマウスＥＳ細胞（１２９ＳＶ、大日本製薬（株）製）を５×１０３細胞／ｍＬの濃度で播種し、あらかじめ３７℃に温めておいたバクテリア用培養皿（直径１００ｍｍ）へ２ｍＬ滴下して、５％  ＣＯ２、３７℃の培養条件下で６日間培養しＥＢを調製した（図３）。メチルセルロース培養担体は、高粘度の液体であるため次第に成長していくＥＢは早い段階で沈降し、培養皿底面に接着し、ＥＳ細胞由来繊維芽細胞様の接着性細胞の発生が認められた。
培養後、２０〜３０ｍＬのＰＢＳを加え氷上に３〜５分間静置した後、手で軽くゆすったが、メチルセルロース培養担体は容易に希釈できなかった。更にピペットを使って、吸引と排出を繰り返したが、液体培地を重層していないために、メチルセルロース培地の乾燥が進み、希釈は容易ではなかった。また回収されたＥＢにはＥＳ細胞由来繊維芽細胞様の接着性細胞のコンタミネーションが避けられなかった。
【実施例３】  あらかじめマウスＥＳ細胞用培地として、ＬＩＦあり培地とＬＩＦなし培地それぞれを用意した。ＬＩＦあり培地としては、ＥＳ細胞用調製済培地（大日本製薬製）を使用した。ＬＩＦなし培地としては、ＥＳ細胞用Ｄ−ＭＥＭ液（大日本製薬製）にＥＳ細胞用血清１５％、ＥＳ細胞用ヌクレオシド液（１００×）、ＥＳ細胞用非必須アミノ酸液（１００×）、１００×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ製）を各１％、βＭＥ（ｓｉｇｍａ製）１１０μＭを添加したものを使用した。
製造例３で作成した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を製造例４の方法によって滅菌した後、該ポリマーの最終濃度が９．１％になるように、ＬＩＦあり培地とＬＩＦなし培地それぞれに４℃で溶解し、本発明の浮遊担体（ＬＩＦあり）と本発明の浮遊担体（ＬＩＦなし）を調製した。
マウスＥＳ細胞（１２９ＳＶ、大日本製薬製）を８×１０３個／ｍｌになるように本発明の浮遊担体（ＬＩＦあり）と本発明の浮遊担体（ＬＩＦなし）それぞれに４℃で分散させた。該分散液それぞれを４℃のまま６ウェルプレートの各ウェルに５００μＬずつ分注し、３７℃インキュベーター中に１５分間静置して本発明の浮遊担体をゲル化させた。各ＥＳ細胞分散ゲル（ＬＩＦありおよびＬＩＦなし）に、３７℃に加温した各ＥＳ細胞用培地（ＬＩＦありおよびＬＩＦなし）をそれぞれ４ｍｌずつ重層し、３７℃インキュベーター中培地交換なしで５日間培養した。
重層培地を除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を４ｍｌ加え、氷中で冷やしながら１５分程度振とうしゲルを溶解した。完全にゲルが溶解した後、ウェル中の細胞塊（スフェロイド）を沈降させて集め、集めた細胞塊を含む約８０μＬを別に用意した６ｗｅｌｌプレート中の４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液（ＰＦＡ，ＷＡＫＯ製）４ｍｌに加えて１０分間室温で固定した。ウェル中の細胞塊（スフェロイド）を集め、集めた細胞塊を含む約８０μＬを別に用意した６ｗｅｌｌプレート中のＰＢＳ４ｍｌに加えて洗浄した。
ウェル中のスフェロイドを集め（約４０μＬ）、１．５ｍＬの遠心チューブに入れたアルカリ性フォスファターゼ染色液（４００μＬ）に移し３５分間室温暗所に静置して染色した。アルカリ性フォスファターゼ染色液の調製は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＶＥＣＴＯＲ製）を使用し、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２）５ｍｌにＲｅａｇｅｎｔ１を２滴加えて良く撹拌した後、Ｒｅａｇｅｎｔ２液を２滴加えて撹拌、さらにＲｅａｇｅｎｔ３液を２滴加えて良く撹拌した。染色後、８０００×ｇ、３分間遠心分離を行い、沈殿しているスフェロイド（約１２０μＬ）をＰＢＳ（４ｍｌ）に再分散させ位相差顕微鏡（倍率１００倍）にて観察した。
ＬＩＦあり培地で培養したマウスＥＳ細胞（図６）も、ＬＩＦなし培地で培養したマウスＥＳ細胞（図７）もアルカリ性フォスファターゼ染色により赤色に染色され、本発明の浮遊担体を用いて培養されたＥＳ細胞はアルカリ性フォスファターゼ活性が高いこと、すなわち、未分化性を維持していることが示された。特に図７に示すＬＩＦなし培地で培養したマウスＥＳ細胞の方が強く赤色に染まり、より未分化性の高いことが示唆された。
比較例２
培養フラスコ（ＦＡＬＣＯＮ、培養面積２５ｃｍ２）の底面をＥＳ細胞用０．１％ゼラチン液（大日本製薬）２ｍｌでなじませ室温４時間静置後、ＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄し風乾した。初代マウス胚繊維芽細胞（ハイグロマイシン耐性、マイトマイシンＣ処理済）（大日本製薬）を１フラスコあたり１．２×１０６個を播種し、培地として１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）含有ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に１００×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｌｉｑｕｉｄ（ＧＩＢＣＯ）を１％添加したものを加え、１日間培養して、これをｆｅｅｄｅｒ細胞とした。ｆｅｅｄｅｒ細胞の培地を除去し、ＥＳ細胞用調製済培地（大日本製薬）に置き換え、マウスＥＳ細胞（大日本製薬）（１２９ＳＶ：継代数１５〜３０）を１フラスコあたり１×１０６個播種した。毎日培地を交換し３日間培養した後、培地を除去し、ＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液（ＰＦＡ，ＷＡＫＯ製）２ｍｌを加えて１０分間室温で固定した。ＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄した後、実施例３と同じアルカリ性フォスファターゼ染色液２ｍｌを加えて３５分間室温暗所に静置して染色した。ＰＢＳ２ｍｌで２回洗浄した後、位相差顕微鏡（倍率１００倍）にて観察した。ｆｅｅｄｅｒ細胞上ＬＩＦ共存下で培養したマウスＥＳ細胞をアルカリ性フォスファターゼ染色した結果、図８に示すように薄く赤色に染色された。これはｆｅｅｄｅｒ細胞上で培養したにもかかわらず、ＥＳ細胞の未分化性は実施例３の本発明の浮遊担体中（ＬＩＦなし）よりも低いことを示している。
【実施例４】  製造例３で作成した本発明のハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を製造例４の方法によって滅菌した後、該ポリマーの最終濃度が９．１％になるように、カニクイザルＥＳ用培地（ＥＳ細胞用培地添加物（ＥＳＭＳ−２０１、旭テクノグラス製）を添加したカニクイザルＥＳ用基本培地（ＥＳＢＭ−１０１、旭テクノグラス製））に溶解した。この本発明の浮遊担体０．５ｍｌにカニクイザルＥＳ細胞（ＣＭＥＳ−００１、旭テクノグラス製）１ｘ１０５個を分散させ、６ｗｅｌｌプレート中心に該細胞を含む浮遊担体０．５ｍｌをドロップ状に配した後、３０分間培養器内で３７℃に保ち、浮遊担体がゲル化した後に上記カニクイザルＥＳ用培地１０ｍｌを重層し３次元培養を行った。重層培地は隔日で交換し、１週間の培養により、カニクイザルＥＳ細胞は平面培養と全く異なるマウスＥＳ細胞におけるＥＢ様の球体状の細胞塊を形成した。
さらにこの球状細胞塊を実施例３と同様に回収し、未分化性の確認の為アルカリフォスファターゼ染色を行い、位相差顕微鏡（倍率４００倍）にて観察した。その結果、回収されたカニクイザルＥＳ細胞塊は図９に示すように強く赤色に染色され、本発明の浮遊担体を用いて培養されたカニクイザルＥＳ細胞はアルカリ性フォスファターゼ活性が高いこと、すなわち、未分化性を維持していることが示された。本発明浮遊担体を用いることにより、霊長類ＥＳ細胞においても他種動物繊維芽細胞（ｆｅｅｄｅｒ細胞）を用いずに未分化性を維持した培養が可能であった。
比較例３
マウス胎児繊維芽細胞（旭テクノグラス製）をフィーダー培地（フィーダー細胞用培地添加物（旭テクノグラス）を添加したフィーダー細胞用基本培地（ＤＭＥＭ、旭テクノグラス））に１×１０５個／ｍｌになるように分散させ、ＥＳ細胞用ゼラチンコートＤＩＳＨ（直径６０ｍｍ、旭テクノグラス）１ディッシュあたり５ｍｌずつ播種した。１日間培養して、これをｆｅｅｄｅｒ細胞とした。ｆｅｅｄｅｒ細胞の培地を除去し、カニクイザルＥＳ用培地に分散させたカニクイザルＥＳ細胞（ＣＭＥＳ−００１、旭テクノグラス製）を播種した。培地交換なしで５日間培養した後、比較例２と同様にしてアルカリフォスファターゼ染色を行い、位相差顕微鏡（倍率４００倍）にて観察した。その結果、図１０に示すように薄く赤色に染色された。これはｆｅｅｄｅｒ細胞上で培養したにもかかわらず、カニクイザルＥＳ細胞の未分化性は実施例４よりも低いことを示している。
【産業上の利用可能性】  上述したように、本発明の浮遊担体は低温でゾル状態、体温でゲル化するハイドロゲル形成性の高分子から構成されるため、低温のゾル状態で本発明の浮遊担体中に被浮遊物（例えば、未分化幹細胞や前駆細胞あるいはそれらを含有する組織等）を播種ないしは分散、混和することができ、そのまま適当な処理（例えば培養）温度で本発明の浮遊担体をゲル化させることによって、該浮遊担体をゲル状態として、被浮遊物（例えば未分化幹細胞）を、浮遊担体を収容する容器壁に接触させずに処理（例えば培養）できる。
本発明の浮遊担体では、ハイドロゲル形成性のゲル形成性組成物が高温のゲル状態（処理温度）で実質的に水不溶性を示すため、本発明の浮遊担体の上に液体成分（例えば液体培地）を重層したり、液体成分中に本発明の浮遊担体を浮遊させて処理（例えば、細胞培養）したりすることができる。
生体由来成分に本発明の担体を使用する態様において、未分化な細胞が増殖する際には大量の養分を必要とするが、本発明の浮遊担体では外部の液体培地からその必要な養分を補給することができる。また、細胞が生成する老廃物などの細胞増殖を阻害する物質を外部の液体培地中へ排出することができる。その結果、本発明の浮遊担体では従来の細胞培養方法に比べて細胞の増殖を促進することができる。
本発明の浮遊担体中で目的の処理（例えば、組織・器官の誘導）を行った後、これらを本発明の浮遊担体から回収するには、目的の被浮遊物を含む本発明の浮遊担体を該ゾル−ゲル転移温度以下の温度（例えば４℃）に冷却して、本発明の浮遊担体をゾル状態に戻し、遠心分離等の方法で目的の被浮遊物と本発明の浮遊担体を分離すれば良い。また、本発明の浮遊担体はそのゾル−ゲル転移温度より低温のゾル状態では、水により容易に希釈できるため、更に流動性を高くでき、被浮遊物の回収を更に容易にすることができる。
生体由来成分に本発明の担体を使用する態様において、本発明の浮遊担体は繊維芽細胞の増殖を抑え、幹細胞や前駆細胞の増殖や分化を促す特性を有することができるため、本発明の浮遊担体中で目的とする組織・器官を効率よく形成させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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