(57)【要約】本発明の目的は、アポトーシス抑制物質およびアポトーシス促進物質を探索するのに有用なタンパク質、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該ベクターを有する形質転換体を提供することである。本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載のアポトーシス誘導タンパク質が提供される。（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質；又は（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質：【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載のアポトーシス誘導タンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質：
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするアポトーシス誘導遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載のアポトーシス誘導遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子：
【請求項４】
請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から請求項１に記載のタンパク質を採取することを含む、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体を含む、アポトーシス抑制剤。
【請求項９】
請求項２又は３に記載のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項２又は３に記載のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、アポトーシス抑制剤。
【請求項１１】
請求項２又は３に記載のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載の二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、アポトーシス抑制剤。
【請求項１３】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害することを含む、アポトーシスを抑制する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害する物質を含む、アポトーシス抑制剤。
【請求項１５】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大することを含む、アポトーシスを促進する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大する物質を含む、アポトーシス促進剤。
【請求項１７】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能の変化を指標として、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子を有する細胞をＴＧＦ−βと一緒に、被験物質の存在下および非存在下において培養し、被験物質の有無に応じた当該アポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能の変化を指標として、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングする、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アポトーシス誘導遺伝子、より詳細には、ＴＧＦ−βによるアポトーシス誘導の際に高発現する遺伝子に関する。本発明はまた、上記アポトーシス誘導遺伝子を利用した薬剤のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】  アポトーシスは、細胞及び個体の発生、分化、成熟におけるプログラムされた細胞死において、または、種々の状況下に誘導される細胞死において、認められる細胞が死に至る過程を意味する。アポトーシスは、生理学上の種々の条件下に起こるとされている。その形態学的特徴としては、周囲の細胞との接触の欠乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマチンの凝縮及び核凝縮、核の分節化等を挙げることができ、更に細胞表面の微絨毛の消失、細胞表面の平滑化（細胞表面の水泡形成：ｍｅｍｂｒａｎｅｃｅ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ）等も観察される。またエンドヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡが断片化する現象も観察され、アポプティック体の細胞の最終断片は、隣接する細胞により貪食される機構として論じられている［Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，７（４），１１５−１１９（１９８６）］。
アポトーシスは、各種多様な疾患において重要な係わりを有することが明らかにされてきており、細胞のアポトーシスを誘導または抑制することにより、これら疾患の診断、予防及び治療を図る試みが近年種々行なわれている。
アポトーシスとは、プログラム細胞死とも言われ、正常な生理学的過程として多くの組織で起こるある種の細胞死を指し、細胞自身に備わっている遺伝的プログラムの活性化によって引き起こされる。そして、最終的にこれらアポトーシスを起こした細胞は、炎症を起こしたりすることもなく、周辺の食細胞によって取り除かれる（長田重一、（１９９８）実験医学、Ｖｏｌ．１６、１２４２−１２４６）。アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。そこで、上記疾患の治療法としてアポトーシスを誘導または阻害する方法およびこれらの方法に有用な薬剤の開発が切望されている。アポトーシスの誘導メカニズムに関しては、これまでに例えば、Ｆａｓ抗原や腫瘍壊死因子レセプターのリガンドが動物細胞表面に局在するそれらのレセプターと結合することにより、アポトーシスを誘導する過程（Ｎａｇａｔａ，Ｓ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ，８８，３５５−３６５）や、抗癌剤やＸ線照射による癌細胞の殺傷がアポトーシスを誘導する細胞内経路を活性化することによって起こること（Ｈａｌｄａｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，４５０７−４５１１）が詳細に解明された。
【発明の開示】
細胞のアポトーシス誘導時に活性化されて特異的に発現される遺伝子が提供されれば、各細胞でのその発現レベルや構造及び機能解析、並びにその発現産物に関する解析を行なうことにより、アポトーシスまたはその関連疾患の病態を解明したり、その診断および治療方法を確立することが可能になる。
本発明の第一の目的は、アポトーシス抑制物質およびアポトーシス促進物質を探索するのに有用なタンパク質、それをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該ベクターを有する形質転換体を提供することである。
本発明の第二の目的は、上記タンパク質を標的として作用するアポトーシス抑制物質またはアポトーシス促進物質をスクリーニングする方法、並びにアポトーシス抑制物質またはアポトーシス促進物質を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、マイクロアレイを用いて、ＴＧＦ−βによって発現誘導される遺伝子の網羅的な単離を進めてきた。その過程において、ＴＧＦ−βにより発現量に有意な差を示す遺伝子として、Ｄ８を同定した。Ｄ８の全長はｈｕｍａｎ  ｔｅｓｔｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙを鋳型としたＰＣＲにより回収し、塩基配列を確認した。その結果、Ｄ８は全長１７１０塩基、５６９アミノ酸からなり、Ｎ末端側にはＲＮＡ結合モチーフであるＫＨドメインが２つ、Ｃ末端側にはユビキチンライゲースＥ３として機能するＲｉｎｇ−ｆｉｎｇｅｒドメイン、中央には機能は未知であるがＳｅｒｉｎｅ  ｒｉｃｈな領域が存在することが判明した。さらに、Ｄ８のＲＮＡｉ効果によってアポトーシスを抑制できることを実証した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載のアポトーシス誘導タンパク質（以下、本発明のタンパク質とも言う）が提供される。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質：
本発明の別の側面によれば、本発明のタンパク質をコードするアポトーシス誘導遺伝子（以下、本発明の遺伝子とも言う）が提供される。本発明の遺伝子は、好ましくは、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載のアポトーシス誘導遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の遺伝子を含有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から本発明のタンパク質を採取することを含む、本発明のタンパク質の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記抗体を含むアポトーシス抑制剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、アポトーシス抑制剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、アポトーシス抑制剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害することを含む、アポトーシスを抑制する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害する物質を含む、アポトーシス抑制剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大することを含む、アポトーシスを促進する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大する物質を含む、アポトーシス促進剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能の変化を指標として、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングする方法が提供される。
好ましくは、本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子を有する細胞をＴＧＦ−βと一緒に、被験物質の存在下および非存在下において培養し、被験物質の有無に応じた当該アポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能の変化を指標として、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１はＤ８ファミリー（ヒト、線虫およびショウジョウバエ）の構造を示す。
図２は、Ｄ８ファミリー（ヒト）の構造を示す。
図３は、Ｄ８ファミリーの２つのＫＨドメインとＲｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒドメインのアライメントを示す。
図４は、ＴＧＦ−β１によるＤ８の発現誘導の結果を示す。
図５は、ＴＧＦ−β１によるＤ８プロモーターの活性化を解析した結果を示す。
図６は、コロニーフォーメーションアッセイによりＤ８の細胞増殖に対する効果を測定した結果を示す。
図７は、ＴＧＦ−β１によって誘導される細胞死（アポトーシス）に対するＤ８の効果を測定した結果を示す。
図８は、ＴＧＦ−β１によって誘導されるアポトーシスに対するＤ８の欠失変異体の効果を示す。
図９は、ＴＧＦ−β１によって誘導されるアポトーシスに対するＤ８のＲＮＡｉ効果を測定した結果を示す。
図１０は、Ｄ８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）アポトーシス誘導タンパク質
本発明のアポトーシス誘導タンパク質は、以下の何れかのタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質；又は
（ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質：
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは」とは、アミノ酸の相同性が少なくとも９５％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上である。
上述の通り、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、アポトーシスを誘導する活性を有する生理活性タンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
従って、配列表の配列番号２に記載したＤ８のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がＤ８の３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がＤ８と同様にアポトーシスを誘導する活性を有する生理活性タンパク質であれば、これらは全て本発明の範囲内に属する。
本明細書で言う「アポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質」とは、ＴＧＦ−βによるアポトーシス誘導を促進できる活性を有するタンパク質を意味し、通常は、ＲＮＡ結合ドメインであるＫＨドメインを２つ有している。
あるタンパク質がＴＧＦ−βによるアポトーシス誘導を促進できる活性を有するか否かは、例えばＴＧＦ−βによってアポトーシスが誘導され得る細胞に、上記タンパク質をコードするＤＮＡを導入して一過性に過剰発現させ、該細胞にＴＧＦ−βを添加してアポトーシスを誘導した際に当該ＤＮＡの過剰発現が、アポトーシスを誘導する細胞の数を増やすか否かを調べることにより検出することができる。
本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず当該タンパク質をコードする遺伝子を入手することが必要である。組み換え遺伝子と好適な発現系を用いて組み換えタンパク質を産生する方法については本明細書中で後記する。
（２）アポトーシス誘導遺伝子
上記（１）で説明したタンパク質をコードする遺伝子は全て本発明の範囲内に属する。本発明の遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；又は
（ｃ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子：
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号２に記載したＤ８遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられる。
本明細書で言う「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、通常の条件下（例えばＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、Ｄ８遺伝子にハイブリダイズする程度であればよい。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９（以下、モレキュラークローニング第２版と略記）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
（３）本発明の遺伝子の取得
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１及び２に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（本発明の遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、本発明の遺伝子を単離することができる。
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
本明細書中上記した、配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
上述の通り、配列表の配列番号１に記載したＤ８遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体がアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
本明細書中上記した、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつアポトーシスを誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、上述した条件下で、一定のハイブリダイゼーション条件下でコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことにより得ることができる。
（４）組み換えベクター
本発明の組み換えベクターは、本発明の遺伝子を用いて、適当な宿主ベクター系による一般的遺伝子組み換え技術によって調製することができる。即ち、本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
また、組み換えベクターとしては、発現ベクターを用いることもできる。発現ベクターに組み込まれた本発明の遺伝子には、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
発現ベクターにおいて使用するプロモーターは、宿主に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＯＰ系プロモーターが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウイルスプロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター等が、宿主が昆虫細胞である場合には、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーター等がそれぞれ使用できる。
また、本発明の遺伝子は、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーターまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されていてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明の遺伝子、プロモーター、および所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
また、本発明の遺伝子を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このようにして発現させた融合型の本発明のタンパク質は、適当なプロテアーゼを用いて切り出すことが可能である。
（５）本発明の形質転換体
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルス属細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはストレプトマイセス属細菌等のグラム陽性菌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
（６）形質転換体を用いた本発明のタンパク質の製造
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明のタンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（７）アポトーシス誘導タンパク質に対する抗体
本発明のアポトーシス誘導タンパク質に対する抗体、並びにそれを用いたアポトーシス抑制剤も本発明の範囲内である。本発明の抗体としては、上記のアポトーシス誘導タンパク質に特異的に結合できるものであれば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、抗原を免役した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞から本発明のタンパク質を精製するか、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行うことができる。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法等に従い、抗体価を測定することにより調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示す非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源として使用することができる。ポリクローナル抗体は、上記の血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１−７（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］等のマウス由来の株化細胞を用いることができる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ若しくはＧ−カラム、若しくはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
本発明の抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト化抗体を用いることが好ましい。これらのヒト型化抗体やヒト化抗体は、トランスジェニックマウスなどの哺乳動物を用いて作製することができる。ヒト型化抗体については、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）〕、野口浩〔医学のあゆみ  １６７：４５７−４６２（１９９３）〕に記載されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
また、本発明の抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
上記した本発明の抗体は、その特異性を利用して本発明のタンパク質を検出したり、分離精製するために用いることができる。さらに、本発明の抗体のうち、本発明のアポトーシス誘導タンパク質に特異的に結合してその機能を阻害できる抗体については、アポトーシス抑制剤として使用することができる。
本発明の抗体をアポトーシス抑制剤として医薬組成物の形態で使用する場合には、上記抗体を有効成分として使用し、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤（例えば、免疫原性アジュバントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬組成物を調製することができる。本発明の抗体を含むアポトーシス抑制剤は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に製剤化することができる。
患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。本発明の抗体は、アポトーシスを抑制することにより、アポトーシス促進に関連する疾患に対する治療効果を示す。
（８）オリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明によって明らかにされたＤ８遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより、各種のヒト組織におけるＤ８遺伝子の発現を検出することができる。Ｄ８遺伝子の発現の検出は、ノザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ等の常法により行うことができる。本発明のＤ８遺伝子は細胞のアポトーシスの誘導に関与する遺伝子である。後述する通り、アポトーシスは種々の疾患に関与しているため、Ｄ８遺伝子の発現を検出することによりアポトーシス関連疾患を診断することができる。
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、本発明のＤ８遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、配列番号１および２に記載の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、Ｄ８遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列中の連続した１０〜６０残基、好ましくは１０〜４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
上記したオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機を用いて常法により製造することができる。該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等を挙げることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしては、それぞれの融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドであって、１０〜６０塩基程度のものが挙げられる、１０〜４０塩基程度のものが好ましい。また、本発明においては、上記したオリゴヌクレオチドの誘導体を用いることも可能であり、例えば、該オリゴヌクレオチドのメチル体やフォスフォロチオエート体等を用いることもできる。
さらに本発明では、上記したアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入してＤ８遺伝子の転写や翻訳を抑制することにより細胞のアポトーシスを抑制することができる。即ち、本発明によれば、Ｄ８遺伝子の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、アポトーシス抑制剤が提供される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入方法は、組換えベクターの導入方法と同様にして行うことができる。また、細胞のアポトーシス検出法としては特に限定されないが、顕微鏡観察、ＴＵＮＥＬ法、ＤＮＡラダー検出法、ＤＮＡの断片化率の定量、細胞のサイズ分布測定等が挙げられる。
顕微鏡観察では、アポトーシスに特徴的な細胞形態変化、例えば核の濃縮、クロマチンの凝縮、細胞小器官の萎縮、アポトーシス小体の形成、細胞全体の収縮等を観察する。ＴＵＮＥＬ法は、アポトーシスによって生ずるＤＮＡの切断末端をｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）を用いてビオチンやジゴキシゲニンで標識することにより検出する方法である。ＤＮＡラダー検出法は、アポトーシスによっておこるクロマチンＤＮＡの断片化を、細胞からＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動をすることにより検出する方法で、断片化したＤＮＡがラダー（はしご）状に検出される。ＤＮＡの断片化率の定量は、断片化した低分子ＤＮＡのみを抽出し、ジフェニルアミンを用いてＤＮＡの定量を行う方法である。細胞サイズ分布測定は、アポトーシスにより細胞の収縮や断片化がおこり小さなサイズの細胞が増加するのを、コールター・マルチサイザー（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ）等の粒子サイズ測定装置を利用して測定する方法である。これらの方法により、細胞がアポトーシスをおこしているかどうかを検出することができる。
上記した本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Ｄ８遺伝子の転写および／または翻訳を抑制してアポトーシスを抑制することにより、アポトーシスの促進が病態に関与している疾患（例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患など）を治療することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞への取り込みを助けるために使用される、細胞膜との親和性の高い適当な担体（例えばリポソームやコレステロール等）と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてアポトーシスを抑制することにより、上記疾患を治療することができる。有効成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
（９）ＲＮＡｉによるアポトーシス抑制
さらに本発明では、上記（８）に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する代わりにＲＮＡｉを利用してアポトーシスを抑制することも可能である。
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
即ち、本発明によれば、本発明のアポトーシス誘導遺伝子（Ｄ８遺伝子）の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡが提供される。二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、アポトーシス誘導遺伝子（Ｄ８遺伝子）またはその部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（Ｄ８遺伝子）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’−Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ−１Ｘｎ−３’
３’−Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ−１Ｙｎ−５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’−ＹｎＹｎ−１．．．．．．Ｙ２Ｙ１−３’
３’−ＸｎＸｎ−１．．．．．．Ｘ２Ｘ１−５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介した配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、一般的には、０ｂｐから７００ｂｐであり、好ましくは０〜３００ｂｐ程度、より好ましくは０〜１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
本発明では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込むことにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができる。本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
さらに本発明によれば、上記した二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを含むアポトーシス抑制剤が提供される。上記した二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを用いて、Ｄ８遺伝子の転写および／または翻訳を抑制してアポトーシスを抑制することにより、アポトーシスの促進が病態に関与している疾患（例えば、アルツハイマー病などの神経変性疾患）を治療することができる。例えば、上記した二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞への取り込みを助けるために使用される、細胞膜との親和性の高い適当な担体（例えばリポソームやコレステロール等）と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてアポトーシスを抑制することにより、上記疾患を治療することができる。有効成分である二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
（１０）本発明のアポトーシス誘導タンパク質を利用したアポトーシスの制御
本明細書中の（７）アポトーシス誘導タンパク質に対する抗体、（８）オリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び（９）ＲＮＡｉによるアポトーシス抑制、に記載した通り、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害することにより、アポトーシスを抑制することが可能である。このように本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害することによりアポトーシスを抑制する方法は全て本発明の範囲内のものである。
アポトーシスを抑制する方法の具体例としては、アポトーシスの促進を伴う疾病の治療の他、アポトーシスによる細胞死を抑制する方法を挙げることができ、例えば、以下の（ａ）有用タンパク質の生産、及び（ｂ）移植細胞・移植臓器に記載の利用例などが挙げられる。
（ａ）有用タンパク質の生産
抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）やウイルスベクター産生細胞株などの有用タンパク質を生産する細胞株は、長期間培養している間に生産されるタンパク質の細胞障害性により細胞死を引き起こす場合がある。また、これらの細胞株では培養液中の血清を取り除くことでタンパク質の生産をより効率的に行うことが可能であるが、血清非存在下では細胞死を誘導してしまうという問題がある。このような細胞死の多くはアポトーシスによるものであることが知られている。従って、本発明の手法によりアポトーシスを抑制することにより、有用タンパク質の生産効率を上昇させることが可能になる。
（ｂ）移植細胞・移植臓器
パーキンソン病の治療の際、死亡胎児の神経細胞やドーパミン生産細胞を患者の脳内に移植する手法が用いられている。また輸血や骨髄移植、遺伝子治療におけるｅｘ  ｖｉｖｏ法など自家若しくは他者の細胞を患者に導入する細胞移植療法も行われている。移植細胞は、一般的にアポトーシスなどによる細胞死を起こし、長期維持が困難である。従って、本発明の手法によりアポトーシスを抑制することにより、臓器移植や細胞移植療法において効果をあげることができる。
さらに、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害する物質を含むアポトーシス抑制剤も本発明の範囲内である。本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を阻害する物質の具体例としては、本明細書中上記（７）に記載の抗体、（８）に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び（９）に記載の二本鎖ＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
さらに上記とは反対に、本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大することによってアポトーシスを促進する方法も本発明の範囲内であり、同様に本発明のアポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大する物質を含むアポトーシス促進剤も本発明の範囲内である。
アポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能を増大する方法としては、本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入する方法、該遺伝子のプロモーター領域に作用してその発現を増大する因子またはそれをコードする遺伝子を細胞に導入する方法などが挙げられる。
また、アポトーシスの抑制または促進の有無並びにその程度は、本明細書中上記した顕微鏡観察、ＴＵＮＥＬ法、ＤＮＡラダー検出法、ＤＮＡの断片化率の定量、細胞のサイズ分布測定などの手法により検出することができる。
（１１）アポトーシス調節物質のスクリーニング方法
本発明により同定されたアポトーシス誘導タンパク質（Ｄ８）の発現および／又は機能の変化を指標とすることにより、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングすることができる。スクリーニングの一例としては、本発明のアポトーシス誘導タンパク質をコードする遺伝子を有する細胞をＴＧＦ−βと一緒に、被験物質の存在下および非存在下において培養し、被験物質の有無に応じた当該アポトーシス誘導タンパク質の発現および／又は機能の変化を指標として、アポトーシスを抑制又は促進する物質をスクリーニングすることができる。
アポトーシス誘導タンパク質のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、本明細書中の上記（８）に記載したノザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ等の常法により行うことができ、またタンパク質レベルでの発現量の測定は、本明細書中上記（７）記載の抗体を用いたウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、アポトーシス誘導タンパク質の機能の変化の分析は、アポトーシス誘導が抑制または促進の有無または程度を測定することにより分析することができる。アポトーシス誘導の上記測定については、本明細書中上記した顕微鏡観察、ＴＵＮＥＬ法、ＤＮＡラダー検出法、ＤＮＡの断片化率の定量、細胞のサイズ分布測定等により行なうことができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、癌、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、多発性硬化症等など）、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、癌細胞の悪性化は、癌細胞におけるアポトーシスの過程が阻害され、本来死滅するべき細胞が増殖し続けることによって引き起こされると考えられている（Ｈａｒｒｉｓ，Ｃ．Ｃ．，（１９９６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ．，８８，１４４２−１４４５）。また、自己免疫疾患は、本来、発生過程でアポトーシスによって除去されるはずの自己の抗原に対して反応する免疫細胞が、アポトーシス制御の異常により除去されなくなったことが原因で発症する（Ｒｉｅｕｘ−Ｌａｕｃａｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８，１３４７−１３４９）。神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０−１７１３）。
従って、上記した本発明のアポトーシス抑制物質は、特に神経変性疾患の治療剤として有効であると考えられる。また、アポトーシス促進物質は、特に各種の癌の治療やリウマチなどの自己免疫疾患の治療剤として有効であると考えられる。
上記の本発明によるアポトーシス抑制物質及びアポトーシス促進物質を有効成分として含むアポトーシスが関与する疾患の治療薬は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００３−３２０３６号の明細書に開示した内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１：ＴＧＦ−β標的遺伝子のスクリーニング
２×１０６のＡ５４９細胞に１０ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ培地（０．０２％ＦＢＳ）を加え、２４時間後、１ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ）を加え１時間放置した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製にはＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉（ＪＲＳ）を使用した。その後、ＴＧＦ−β１を１時間処理したＡ５４９細胞のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから作成したｃＤＮＡから、ＴＧＦ−β１を処理していないＡ５４９細胞のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから作成したｃＤＮＡを差し引くことによりサブトラクションを行った。サブトラクションはＣＬＯＮＴＥＣＨ  ＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のプロトコールに従って行った。サブトラクションにより得られたライブラリーをＰＣＲし、マイクロアレイを作成した。マイクロアレイには、プローブとして、ＴＧＦ−β１を１時間処理したＡ５４９細胞から回収したＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＣｙ５でラベルしたｃＤＮＡとＴＧＦ−β１を処理していないＡ５４９細胞から回収したＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをＣｙ３でラベルしたｃＤＮＡを使用し、１つのマイクロアレイに対して両プローブをハイブリダイゼーションすることで発現の変化する遺伝子を解析した。その結果、ＴＧＦ−β１により発現量に有意な差を示す新規遺伝子として、Ｄ８を同定した。
Ｄ８全長のＤＮＡ塩基配列は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを使用し、ＥＳＴクローンのＤＮＡ塩基配列を連結することによって予想した。Ｄ８全長は、予想されたＤ８全長のＤＮＡ塩基配列から、Ｄ８ＦＷプライマー：５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣ−３’（配列番号３）とＤ８ＲＶプライマー：５’−ＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＡＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号４）を作成し、ｈｕｍａｎ  ｔｅｓｔｉｓ  ｌｉｂｒａｒｙを鋳型としたＰＣＲにより回収し、ＤＮＡ塩基配列を確認した。Ｄ８は全長１７１０塩基（配列番号１）、５６９アミノ酸（配列番号２）からなり、Ｎ末端側にはＲＮＡ結合モチーフであるＫＨドメインが２つ、Ｃ末端側にはユビキチンライゲースＥ３として機能するＲｉｎｇ−ｆｉｎｇｅｒドメイン、中央には機能は未知であるがＳｅｒｉｎｅ  ｒｉｃｈな領域が存在する（図１）。
Ｄ８ファミリーの構造を図１および図２に示す。ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴを使用した検索により、線虫およびショウジョウバエにＤ８ホモログが存在していることから、Ｄ８は線虫からヒトまで進化上保存されている重要な遺伝子であると考えられる。また、Ｄ８と相同性が高くドメイン構造も保存されているＤ８関連タンパク質がヒトでは３種類存在し、Ｄ８ファミリーを構成している。
Ｄ８ファミリーの２つのＫＨドメインとＲｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒドメインのアライメントを図３に示す。ＫＨドメインＲｉｎｇ  ｆｉｎｇｅｒドメインともに非常に保存されていることから、Ｄ８ファミリーは、同じ機能をしていると考えられる。
実施例２：ＴＧＦ−βによるＤ８の発現誘導
（１）２×１０６のＡ５４９細胞に１０ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ培地（０．０２％ＦＢＳ）を加え、２４時間後、１ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄ）を加え１時間放置した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収にはＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの調製にはＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈ｓｕｐｅｒ〉（ＪＲＳ）を使用した。ノーザンハイブリダイゼーションには、ＴＧＦ−β１を１時間処理したＡ５４９細胞と未処理のＡ５４９細胞から回収したＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  ２μｇを使用し、Ｄ８のＯＲＦをプローブとした。Ｇ３ＰＤＨはローディングコントロールとして、ＰＡＩ−１はＴＧＦ−β１応答のポジティブコントロールとして使用した。結果を図４の上段に示す。この結果から分かるように、ＴＧＦ−β１によってＤ８の発現が誘導されることが示された。
（２）上記（１）の方法と同様の方法でＤＵ１４５細胞とＨｅｐ３Ｂ細胞から、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。ｃＤＮＡは１μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡからＡｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を使用し合成した。ＰＣＲはＧ３ＰＤＨが２５サイクル、Ｄ８が３０サイクル行った。結果を図４の下段に示す。この結果から分かるように、ＤＵ１４５細胞とＨｅｐ３Ｂ細胞においてもＴＧＦ−β１によってＤ８の発現が誘導されることが示された。
実施例３：ＴＧＦ−βによるＤ８プロモーターの活性化
（１）Ｄ８のレポーターコンストラクション
Ｄ８のＯＲＦより上流のＤＮＡ断片の下流にルシフェラーゼ遺伝子を導入したレポーターを作成した。Ｄ８のプロモーター領域が含まれると予想されるヒトゲノムＤＮＡ断片の回収は、ＢＡＣクローンＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １５，ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−５９７Ｋ２３を鋳型としてＰＣＲで回収した。回収したＤＮＡ断片をｐＧＬ３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏ  Ｉ−Ｎｃｏ  Ｉサイトに挿入した（図５の左図）。
（２）Ｄ８のレポーターコンストラクションに対するＴＧＦ−β１の効果
Ｄ８のレポーターコンストラクションを１×１０５のＨｅｐ３Ｂ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入した。コントロールにはｐＧＬ３  ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ、ポジティブコントロールには３ＴＰＬｕｘ、インターナルコントロールにはｐＲＬＴＫを使用した。遺伝子導入には、レポーターを０．１μｇ、発現ベクターを０．１μｇ、インターナルコントロールを０．００１μｇ使用した。レポーターを導入して１８時間後、１０ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ）を加え、２４時間放置した。ルシフェラーゼの測定はＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。結果を図５の右図に示す。この結果から分かるように、存在するプロモーターの長さが減るに従ってルシフェラーゼ活性は減少したことから、ＴＧＦ−β１はＤ８プロモーターに作用してこれを活性化していることが示唆される。
実施例４：コロニーフォーメーションアッセイ
２μｇのｐｃＤＮＡと２μｇのｐｃＤＮＡ−ＦｌａｇＤ８をそれぞれ１×１０６のＨｅｐ３Ｂ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入を行った。２４時間後、トリプシン処理により細胞を回収し、１０ｃｍ  ｄｉｓｈ３枚に希釈した。希釈して２４時間後、２００μｇ／ｍｌになるようにｇｅｎｅｔｉｃｉｎを加え１４日間放置したのち、クリスタルバイオレッドを使用して染色した。結果を図６の左図に示し、コロニー数を計測した結果を図６の右図に示す。この結果から分かるように、Ｄ８の遺伝子導入により細胞増殖が抑制された。
実施例５：ＴＧＦ−βによって誘導される細胞死（アポトーシス）に対するＤ８の効果
ＬａｃＺ発現ｐｌａｓｍｉｄとともにｐｃＤＮＡとｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧＤ８をそれぞれ１×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入を行った。遺伝子導入には、発現ベクターを０．０２５μｇ、ＬａｃＺ発現ｐｌａｓｍｉｄを０．０１２５μｇ使用した。遺伝子導入して１８時間後、ＤＭＥＭ培地（０％ＦＢＳ）に培地を交換し、５ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β１を加え２４時間培養した。ＴＧＦ−β１を処理して２４時間後、１％グルタルアルデヒドで固定し、Ｘ−ｇａｌ染色した。本研究ではｗｅｌｌ上の全ての青色に染色された細胞をカウントし、青色に染色された細胞を生存した細胞、空ベクターを導入した細胞の数をコントロールとした。
図７の結果から分かるように、ＴＧＦ−β１によって誘導される細胞死（アポトーシス）はＤ８の遺伝子導入によって促進されることが示された。
実施例６：ＴＧＦ−βによって誘導されるアポトーシスに対するＤ８の欠失変異体の効果
（１）Ｄ８の欠失変異体の構築
図８の左図に示す欠失変異体はＰＣＲを行い作成した。図８の左に示す欠失変異体の詳細は以下の通りである。
Ｄ８Ｎ１：  Ｄ８アミノ酸配列中の１３６番目から５６９番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｎ２：  Ｄ８アミノ酸配列中の２３０番目から５６９番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｎ３：  Ｄ８アミノ酸配列中の４０８番目から５６９番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｃ１：  Ｄ８アミノ酸配列中の１番目から５１０番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｃ２：  Ｄ８アミノ酸配列中の１番目から４９２番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｃ３：  Ｄ８アミノ酸配列中の１番目から３９２番目までのアミノ酸配列
Ｄ８Ｃ４：  Ｄ８アミノ酸配列中の１番目から１６４番目までのアミノ酸配列
（２）アポトーシスに対するＤ８欠失変異体の効果
ＬａｃＺ発現ｐｌａｓｍｉｄとともにそれぞれのＤ８欠失変異体を１×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入を行った。遺伝子導入には、発現ベクターを０．０５μｇ、ＬａｃＺ発現ｐｌａｓｍｉｄを０．１２５μｇ使用した。遺伝子導入して１８時間後、ＤＭＥＭ培地（０％ＦＢＳ）に培地を交換し、５ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β１を加え２４時間培養した。ＴＧＦ−β１を処理して２４時間後、１％グルタルアルデヒドで固定し、Ｘ−ｇａｌ染色した。生存細胞数を計測した結果を図８の右図に示す。この結果から分かるように、Ｄ８のＮ末端側に存在するＫＨドメイン（ＲＮＡ結合ドメイン）がＴＧＦ−β１により誘導されるアポトーシスを誘導するのに必須であるが、Ｃ末端側に存在するＲＩＮＧフィンガーはアポトーシスを誘導するのに必須ではないことが示唆された。
実施例７：ＴＧＦ−βによって誘導されるアポトーシスに対するＤ８のＲＮＡｉ効果
（１）Ｄ８のＲＮＡｉ効果によるＤ８の発現抑制
Ｄ８のＲＮＡｉを発現するｐｌａｓｍｉｄはＤ８の２１６番目から２３６番目のＤＮＡ塩基配列をもとに合成オリゴ（Ｄ８ｉＦ１とＤ８ｉＲ１）を作製した。アニーリングには、４８μｌのａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［１００ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  Ｍｇ  ａｃｅｔａｔｅ］に、１μｌのＤ８ｉＦ１（１００ｐｍｏｌ）と１μｌのＤ８ｉＲ１（１００ｐｍｏｌ）を加え、９５℃で４分、７０℃で１０分処理した後、室温で３０分放置し、行った。その後、アニーリングした合成オリゴをｐＳＨＡＧ  ｖｅｃｔｏｒのＢｓｅ  ＲＩ−Ｂａｍ  ＨＩサイトに挿入した（ｐＳＨＡＧ−Ｄ８ｉ）。
合成オリゴヌクレオチド
Ｄ８ｉＦ１：
2004069869.tif 000002
Ｄ８ｉＲ１：
2004069869.tif 000003
ＥＧＦＰ−Ｄ８とｐＳＨＡＧ−Ｄ８ｉを１×１０６のＨｅｌａ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入を行った。遺伝子導入には、発現ベクターを１μｇ、ＲＮＡｉ発現ベクターを１μｇ使用した。遺伝子導入して２４時間後、溶解バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］で細胞を溶解し１μｇのａｎｔｉ−ＡＦＰ  ｍＡＢ  ３Ｅ６（ＱＵＡＮＴＵＭ）を加え、１時間放置した。その後、ｐｒｏｔｅｉｎ    Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ゲルとバッファーを１：１に懸濁したもの）を５０μｌ加えて１時間放置し、洗浄バッファー［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００］を使用して洗浄したものを免疫沈降のサンプルとした。免疫沈降物は１０％アクリルアミドゲルを使用して電気泳動し、１次抗体としてｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒｓ  Ａ．ｖ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣ）［１μｇ／ｍｌ］を、２次抗体としてＡｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｆｃ）ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［０．２μｇ／ｍｌ］を使用してＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。結果を図９の右図に示す。この結果から、Ｄ８のＲＮＡｉ効果によりＤ８の発現は抑制されていることが分かる。
（２）Ｄ８のＲＮＡｉ効果によるアポトーシスの抑制
ＬａｃＺ発現ｖｅｃｔｏｒとともにＤ８のＲＮＡｉを発現するｐＳＨＡＧ−Ｄ８ｉを１×１０４のＨｅｐ３Ｂ細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して遺伝子導入を行った。遺伝子導入には、ＲＮＡｉ発現ベクターを０．０５μｇ、ＬａｃＺ発現ｐｌａｓｍｉｄを０．０１２５μｇ使用した。遺伝子導入して１８時間後、ＤＭＥＭ培地（０％ＦＢＳ）に培地を交換し、５ｎｇ／ｍｌになるようにＴＧＦ−β１を加え２４時間培養した。ＴＧＦ−β１を処理して２４時間後、１％グルタルアルデヒドで固定し、Ｘ−ｇａｌ染色を行った。生存数を計測した結果を図９の左図に示す。Ｄ８のＲＮＡｉ効果により、ＴＧＦ−β１により誘導されるアポトーシスが抑制されることが示された。
実施例８：Ｄ８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ
ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎにより、３５ＳでラベルしたＤ８Ｎ３タンパク質を合成した。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１５  ｕｎｉｔｓ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｋｉｎａｓｅ、５μＭ  ＬＬｎＬ、３μＭ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ａｌｄｅｈｙｄｅ］に０．１μｇの３５ＳでラベルしたＤ８Ｎ３タンパク質と０．０２μｇのＥＩ（ＵＢＡ１）と０．０２μｇのＥ２（ＵｂｃＨＣのｗｉｌｄ  ｔｙｐｅまたはｄｏｎｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｙｐｅ）を加え３０℃で９０分間放置した。その後、アクリルアミドゲル［ＰＡＧ  Ｍｉｎｉ  ＤＡＩＩＣＨＩ  ２／１５（１３Ｗ）（第一化学）］を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図１０に示す。この結果から、Ｄ８は、ユビキチンリガーゼＥ３として機能することが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、新規なアポトーシス誘導遺伝子が同定された。本発明の遺伝子を利用することにより、本遺伝子の各組織での発現を検出したり、アポトーシス誘導タンパク質を遺伝子工学的に製造することができる。さらに、本発明の遺伝子を利用することにより、アポトーシス関連疾患の診断及びアポトーシス抑制剤または促進剤をスクリーニングすることができる。更に、本発明の遺伝子は、アポトーシス抑制を目的とする遺伝子治療やアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた疾患の予防法及び治療法の開発に極めて有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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