(57)【要約】基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤が開示されている。一分子内に、ホスホリルコリン基と、光反応性基を複数含むポリマーを用いることにより、該ポリマーは、光反応性基を介して基体及び固定化すべき物質に結合し、これによって、固定化すべき物質は該ポリマーを介して基体上に共有結合され、さらに、ホスホリルコリン基により非特異吸着が有効に防止される。また、基体上に所望の物質を固定化するために用いられる物質固定化剤であって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子から成る物質固定化剤も提供された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成る、物質固定化剤。
【請求項２】
下記一般式［Ｉ］で表される構造を有する単位と、下記一般式［ＩＩ］で示される構造を有する単位を含む、請求項１記載の物質固定化剤。
2004088319.tif 000020
（ただし、一般式［Ｉ］及び［ＩＩ］中、Ｘ及びＹは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、Ｒ１は光反応性基を有する原子団を表し、一般式［Ｉ］及び［ＩＩ］で表される単位は、それぞれ２個以上であり、かつ、一般式［Ｉ］で表される単位の数は、一般式［ＩＩ］で表される単位の数よりも大きい）。
【請求項３】
前記光反応性基がアジド基である請求項１又は２記載の物質固定化剤。
【請求項４】
一般式［Ｉ］で表される単位の数と一般式［ＩＩ］で表される単位の数の比が１００：２〜１００：５０である請求項２又は３記載の物質固定化剤。
【請求項５】
前記ポリマーの分子量が、１，０００〜１，０００，０００である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項６】
Ｘ及びＹがビニル系モノマー由来である請求項２ないし５のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項７】
前記物質固定化剤が、下記一般式［ＩＩＩ］で表される請求項３ないし６のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
2004088319.tif 000021
（ただし、式中、Ｘ’及びＹ’は、互いに独立して、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）を表し、Ｒ２は単結合、炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フェニレン基（ただし、１〜３個の炭素数１〜４のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい）、ｎ及びｍは、互いに独立して２以上の整数であり、かつ、ｎはｍよりも大きく、Ｘ’を含む単位とＹ’を含む単位はランダムな順序で結合している）を表す請求項５記載の物質固定化剤。
【請求項８】
Ｘ’を含む単位が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ−（２−メタクリルアミド）エチルホスホリルコリン、４−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は４−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する請求項７記載の物質固定化剤。
【請求項９】
前記一般式［Ｉ］で示される単位が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する請求項８記載の物質固定化剤。
【請求項１０】
下記式［ＩＶ］で表される請求項９記載の物質固定化剤。
2004088319.tif 000022
（ただし、ｎ’は５０ないし２００の整数、ｍ’は５ないし４０の整数を表し、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフェニル基含有単位はランダムな順序で結合している）。
【請求項１１】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項１２】
基体に固定化すべき物質と、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。
【請求項１３】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記光を選択照射することにより、物質を固定化する領域をパターニングすることを含む請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２ないし１４のいずれか１項に記載の方法により前記物質が固定化された基体。
【請求項１６】
前記水溶性ポリマーが、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子から成る請求項１記載の物質固定化剤。
【請求項１７】
前記ノニオン性水溶性高分子が、ポリアルキレングリコール、ポリビニル系高分子又は天然高分子である請求項１６記載の物質固定化剤。
【請求項１８】
前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールであり、ポリビニル系高分子がポリ（（メタ）アクリルアミド−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体又はポリ（グリシジル（メタ）アクリレート−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体である請求項１７記載の物質固定化剤。
【請求項１９】
前記ノニオン性水溶性高分子が、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド−光反応性アクリル酸アミド）共重合体又はポリ（グリシジルメタクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体である請求項１８記載の物質固定化剤。
【請求項２０】
前記光反応性基がフェニルアジド基である請求項１６ないし１９のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項２１】
前記ノニオン性水溶性高分子の分子量が５００ないし５００万である請求項１６ないし２０のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項２２】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項１６ないし２１のいずれか１項に記載の物質固定化剤。
【請求項２３】
基体に固定化すべき物質と、請求項１６ないし２２のいずれか１項に記載の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法。
【請求項２４】
基体に固定化する物質が、ポリペプチド、多糖類、核酸、脂質並びに細胞及びその構成要素から成る群から選ばれる請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項１６ないし２４のいずれか１項に記載の方法により前記物質が固定化された基体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ポリペプチド、核酸、脂質等の所望の物質を基体上に固定化するための物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に関する。
【背景技術】  従来より、抗体又は抗原をプレート上に固定化した、免疫測定のためのイムノプレートや、核酸をチップ上に固定化したＤＮＡチップ等が広く用いられている。従来、基体上にタンパク質や核酸を固定化する方法の１つとして、物理吸着が広く用いられている。すなわち、例えばポリスチレンのような疎水性の基体と、基体上に固定化すべきタンパク質や核酸の水溶液とを接触させて放置することにより、物理吸着によってタンパク質や核酸が基体上に固定化される。
しかしながら、物理吸着を用いる方法では、基体と固定化物質との結合が弱く、物質を固定化した基体の安定性が不十分であるという問題がある。また、目的のタンパク質や核酸で被覆されなかった領域への非特異吸着を防止するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、スキムミルク等のタンパク質（タンパク質を固定化する場合）や、サケ精子ＤＮＡ等のＤＮＡ（ＤＮＡを固定化する場合）でブロッキングすることが行われているが、ブロッキングによる非特異吸着の防止効果も必ずしも満足できるものではない。
また、基体上の官能基と、固定化すべきタンパク質や核酸の官能基とを共有結合させることにより基体上にタンパク質や核酸を固定化することも行われている。しかしながら、この方法では、用いる官能基が物質の活性部位の中又はその近傍にある場合には、固定化により物質の活性が失われてしまう。また、適当な官能基が存在しない場合には、この方法により固定化することができない。また、物理吸着の場合と同様、ブロッキングにより非特異吸着が防止されているが、その防止効果は必ずしも満足できるものではない。
以上の従来技術を記載した文献として次のものを挙げることができる。
特開平１１−３３７５５１号公報
特開２００１−３３７０８９号公報
一方、光反応性基を利用して物質を基板に固定化することも知られている（Ｙ．Ｉｔｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｎｏｇａｗａ，″Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈｏｔｏ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  ａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ，″Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２４、３０２１−３０２６（２００３））。しかしながら、この方法では、非特異吸着を防止するための配慮は特にされてはいない。
【発明の開示】
従って、本発明の目的は、基体上に種々の固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、分子全体として電気的に中性な水溶性のポリマーを物質固定化剤に利用することにより、非特異吸着を有効に防止できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、基体上に所望の物質を固定化するために用いられる水溶性のポリマーであって、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前記水溶性ポリマーが分子全体として電気的に中性なポリマーから成る、物質固定化剤を提供する。
また、本発明は、基体に固定化すべき物質と、上記本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布し、光照射することを含む、基体上への物質の固定化方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法により前記物質が固定化された基体を提供する。
本願発明により、基体上に固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体が提供された。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  上記の通り、本発明の物質固定化剤は、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有し、かつ、前分子全体として電気的に中性なポリマーから成る。ここで、「分子全体として電気的に中性」とは、中性付近のｐＨ（ｐＨ６〜８）の水溶液中で電離してイオンになる基を有さないか、又は有していても陽イオンになるものと陰イオンになるものを有していて、その電荷の合計が実質的に０になることを意味する。ここで「実質的に」とは、電荷の合計が０になるか、又は０にはならないとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に小さいことを意味する。
本発明の物質固定化剤は、水溶性であり、水に対する溶解度（水１００ｇに溶解するグラム数）は、好ましくは５以上である。
水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式［Ｉ］で表される構造を有する単位と、下記一般式［ＩＩ］で示される構造を有する単位を含むポリマーを挙げることができる。
2004088319.tif 000002
（ただし、一般式［Ｉ］及び［ＩＩ］中、Ｘ及びＹは、互いに独立して、重合した状態の重合性原子団を表し、Ｒ１は光反応性基を有する原子団を表し、一般式［Ｉ］及び［ＩＩ］で表される単位は、それぞれ２個以上であり、かつ、一般式［Ｉ］で表される単位の数は、一般式［ＩＩ］で表される単位の数よりも大きい）。
（上記一般式［Ｉ］で表される構造を有する単位を以下、便宜的に「単位［Ｉ］」と言うことがある。また、上記一般式［ＩＩ］で示される構造を有する単位を、以下、便宜的に「単位［ＩＩ］」と言うことがある。）
を挙げることができる。
上記ホスホリルコリン含有ポリマーは、生体膜が種々の物質と接触するにもかかわらず、非特異吸着がほとんど起きないことに着目し、生体膜の構成成分であるホスホリルコリンを含む高分子を利用して、所望の物質を基体に固定化することにより非特異吸着を有効に防止できるのではないかという着想に基づいて発明されたものである。
単位［Ｉ］は、ホスホリルコリン基を含む単位であり、Ｘは重合した状態の重合性原子団を表す。Ｘとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位［Ｉ］としては、下記一般式［Ｖ］に示されるものが好ましい。
2004088319.tif 000003
（ただし、式中、Ｘ’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）を表す）。
このような単位の好ましい具体例として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ−（２−メタクリルアミド）エチルホスホリルコリン、４−メタクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−メタクリロイルオキシデシルシルホスホリルコリン、ω−メタクリロイルジオキシエチレンホスホリルコリン又は４−スチリルオキシブチルホスホリルコリンに由来する（すなわち、これらの単位を重合させた）単位を挙げることができる。これらの中でも２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する単位が特に好ましい。
−方、単位［ＩＩ］中の光反応性基の好ましい例としてアジド基（−Ｎ３）を挙げることができるがこれに限定されるものではない。また、一般式［ＩＩ］のＹとしては、ビニル系モノマー残基が好ましい。単位［ＩＩ］の好ましい例として、下記一般式［ＶＩ］で示されるものを挙げることができる。
2004088319.tif 000004
（ただし、Ｙ’は、ビニル部分が付加重合している状態のメタクリルオキシ基、メタクリルアミド基、アクリルオキシ基、アクリルアミド基、スチリルオキシ基又はスチリルアミド基を表し、Ｒ２は単結合、炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フェニレン基（ただし、１〜３個の炭素数１〜４のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい。）
単位［Ｉ］の数は単位［ＩＩ］の数よりも大きく、その比率は、特に限定されないが、１００：２〜１００：５０程度が好ましく、特に１００：５〜１００：２０程度が好ましい。このように、ポリマーは、ホスホリルコリン基を有する単位［Ｉ］から主として成ることにより、非特異吸着が効果的に防止される。また、水溶性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、通常、１，０００〜１，０００，０００程度であり、好ましくは、５，０００〜１００，０００程度である。
上記水溶性ポリマーは、単位［Ｉ］と単位［ＩＩ］のみから成るものが好ましいが、本発明の効果に悪影響を与えない範囲で他の重合性モノマー由来の単位を含んでいてもよい。このような他の単位の割合は、本発明の効果に悪影響を与えない範囲であれば特に限定されないが、通常、通常、ポリマー中の全単位中の３０モル％以下、好ましくは１０モル％以下である。
上記水溶性ポリマーの好ましい例として、下記一般式［ＩＩＩ］で表すものを挙げることができる。
2004088319.tif 000005
（ただし、式中、Ｘ’、Ｙ’、Ｒ１、Ｒ２は上記定義と同じ意味を表し、ｎ及びｍは、互いに独立して２以上の整数であり、かつ、ｎはｍよりも大きく、Ｘ’を含む単位とＹ’を含む単位はランダムな順序で結合している。）
上記一般式［ＩＩＩ］で示される化合物の中でも、特に下記式［ＩＶ］で示されるポリマーが好ましい。
2004088319.tif 000006
（ただし、ｎ’は５０ないし２００の整数、ｍ’は５ないし４０の整数を表し、ホスホリルコリン含有単位と、アジドフェニル基含有単位はランダムな順序で結合している）。
上記水溶性ポリマーは、上記した単位［Ｉ］及び単位［ＩＩ］を単に重合させることにより製造することができる。あるいは、側鎖（ホスホリルコリン基含有基及び光反応性基含有基）を含まない主鎖のポリマーを先に合成し、後から側鎖を結合してもよい。また、ホルホリルコリン基含有基を有する単位［Ｉ］と、光反応性基を有さない単位［ＩＩ］とを先ず重合し、後から光反応性基含有基を結合させてもよい。下記の実施例ではこの方法を採用している。なお、モノマーの重合や、側鎖の結合は、当業者の技術常識に従って容易に実施することができるし、下記の実施例にもその一例が具体的に記載されている。
また、本発明に用いられる水溶性ポリマーとしては、１分子中に少なくとも２個の光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子（ポリマー）を好ましい例として挙げることができる。ノニオン性水溶性高分子は、上記したホスホリルコリン含有ポリマーと同等の非特異吸着防止効果を有し、それでいてホスホリルコリン含有ポリマーよりも安価に製造又は入手可能であるという利点を有する。
ここで、「ノニオン性」とは、中性付近のｐＨ（ｐＨ６〜８）の水溶液中で電離してイオンになる基を実質的に有さないことを意味する。ここで「実質的に」とは、このような基を全く含まないか、又は含んでいるとしても本発明の効果に悪影響を与えない程度に微量（例えば、このような基の数が炭素数の１％以下）であることを意味する。
ノニオン性水溶性高分子の分子量は、特に限定されないが、通常、３５０〜５００万程度であり、好ましくは、５００〜数１０万程度である。
このようなノニオン性水溶性高分子の好ましい例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール；ビニルアルコール、メチルビニルエーテル、ビニルピロリドン、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、２−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、Ｎ−ビニルサクシンイミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−ｉｓｏ−プロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、アクリロイルピロリジン、アクリロイルピペリジン、スチレン、クロロメチルスチレン、ブロモメチルスチレン、酢酸ビニル、メチルメタクリレート、ブチルアクリレート、メチルシアノアクリレート、エチルシアノアクリレート、ｎ−プロピルシアノアクリレート、ｉｓｏ−プロピルシアノアクリレート、ｎ−ブチルシアノアクリレート、ｉｓｏ−ブチルシアノアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルシアノアクリレート、グリシジルメタクリレート、エチルビニルエーテル、ｎ−プロピルビニルエーテル、ｉｓｏ−プロピルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、ｉｓｏ−ブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルビニルエーテルなどのモノマー単位を単独か混合物を構成成分とするノニオン性のビニル系高分子；ゼラチン、カゼイン、コラーゲン、アラビアガム、キサンタンガム、トラガントガム、グアーガム、プルラン、ペクチン、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、キトサン、キチン誘導体、カラギーナン、澱粉類（カルボキシメチルデンプン、アルデヒドデンプン）、デキストリン、サイクロデキストリン等の天然高分子、メチルセルロース、ビスコース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような水溶性セルロース誘導体等の天然高分子を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、特に好ましいものはポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド（本明細書及び特許請求の範囲において、「（メタ）アクリル」は、「メタクリル」又は「アクリル」を意味する）及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート）であり、これらの中で特に好ましくは、ポリエチレングリコールである。
上記したノニオン性水溶性高分子は、１分子当り少なくとも２個の光反応性基を有する。ノニオン性水溶性高分子１分子当りの光反応性基の数は、２個以上であれば、特に限定されるものではないが、あまりに多すぎると、非特異吸着が増大する恐れがあるので、高分子を構成する炭素数（側鎖の炭素を含まない）の１０％以下が好ましく、さらに好ましくは５％以下である。光反応性基の好ましい例としてアジド基（−Ｎ３）を挙げることができるがこれに限定されるものではない。光反応性基の具体例としてフェニルアジド基、アセチル基、ベンゾイル基が挙げられるが、特に好ましくはフェニルアジド基である。アジド基等の光反応性基は、ノニオン性水溶性高分子に直接結合していてもよいが、任意のスペーサー構造を介してノニオン性水溶性高分子に結合されていてもよく、通常、後者の方が製造が容易であり好ましい。後者の場合、スペーサー構造は、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数１〜１０のアルキレン基（ただし１個又は２個のヒドロキシル基で置換されていてもよい）、フェニレン基（ただし、１〜３個の炭素数１〜４のアルキル基又はヒドロキシル基で置換されていてもよい）等を挙げることができる。
ノニオン性水溶性高分子への光反応性基の導入は、常法に基づき容易に行うことができる。例えば、官能基を有するノニオン性水溶性高分子と、該官能基と反応する官能基を有するアジド化合物を反応させて、ノニオン性水溶性高分子にアジド基を結合させることができる。好ましいノニオン性水溶性高分子であるポリエチレングリコールを用いる場合、両末端にアミノ基やカルボキシル基を有するポリエチレングリコールが市販されているので、このような市販の官能基含有ポリエチレングリコールの官能基に、アジド基含有化合物を反応させてポリエチレングリコールにアジド基を結合させることができる。下記実施例にも、複数のこのような方法が具体的に記載されている。あるいは、ノニオン性水溶性高分子が水溶性ビニル系高分子のように、モノマーの重合により形成されるものである場合には、水溶性ビニル系高分子の主な構成単位となるビニル系モノマーと、光反応性ビニル系モノマーとを共重合させることにより光反応性基を有するノニオン性水溶性高分子を製造することもできる。この方法により得られる光反応性水溶性ビニル系高分子の好ましい例として、ポリ（（メタ）アクリルアミド−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体及びポリ（グリシジル（メタ）アクリレート−光反応性（メタ）アクリル酸アミド）共重合体、ポリ（エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート−光反応性アクリル酸アミド）共重合体等を挙げることができ、これらを製造する方法は、下記実施例に具体的に記載されている。
本発明の物質固定化剤を用いて固定化される物質は、特に限定されないが、ポリペプチド（糖タンパク質及びリポタンパク質を包含する）、核酸、脂質並びに細胞（動物細胞、植物細胞、微生物細胞等）及びその構成要素（核、ミトコンドリア等の細胞内小器官、細胞膜や単位膜等の膜等を包含する）を例示することができる。本発明の物質固定化剤に光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。
基体としては、少なくともその表面が、上記光反応性基と結合し得る物質から成るものであれば特に限定されず、マイクロプレート等で広く用いられているポリスチレンをはじめ、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネートやポリプロピレン等の有機物から成るものを例示することができる。ガラス板にシランカップリング剤をコーティングしたもの等も用いることができる。また、基体の形態は何ら限定されるものではなく、マイクロアレイ用基板のような板状のものや、ビーズ状、繊維状のもの等を用いることができる。さらに、板に設けられた穴や溝、例えば、マイクロプレートのウェル等も用いることができる。本発明の物質固定化剤は、これらのうち、特にマイクロアレイ用に適している。
本発明の物質固定化剤を用いて、基体上に所望の物質を固定化することは、次のようにして行うことができる。先ず、基体に固定化すべき物質と、本発明の物質固定化剤とを含む水溶液又は水懸濁液を前記基体に塗布する。この場合、水溶液中の物質固定化剤の濃度（重量基準）は、特に限定されないが、通常、０．００５％〜１０％程度であり、好ましくは０．０４〜１％程度である。また、固定化すべき物質の濃度（重量基準）は、通常、用いる物質固定化剤の１０倍ないし２００倍程度であり、好ましくは２０倍ないし１００倍程度である。
次に、塗布した液を好ましくは乾燥した後、光を照射する。光は、用いる光反応性基がラジカルを生じさせることができる光であり、光反応性基としてアジド基を用いる場合には、紫外線が好ましい。照射する光線の線量は、特に限定されないが、通常、１ｃｍ２当たり１ｍＷ〜１００ｍＷ程度である。
光を照射することにより、ポリマー中の光反応性基がラジカルを生じ、ポリマーが基体及び固定化すべき物質の双方と共有結合する。その結果、固定化すべき物質がポリマーを介して基体に固定化される。光反応性基として用いられるアジド基は、光を照射することにより窒素分子が離脱すると共に窒素ラジカルが生じ、この窒素ラジカルは、アミノ基やカルボキシル基等の官能基のみならず、有機化合物を構成する炭素原子とも結合することが可能であるので、ほとんどの有機物を固定化することが可能である。なお、本発明の方法では、光反応性基により生じるラジカルを利用して結合反応を行うので、固定化すべき物質の特定の部位と結合するのではなく、ランダムな部位と結合する。従って、活性部位が結合に供されて活性を喪失する分子も当然出てくると考えられるが、活性部位に影響を与えない部位で結合する分子も当然存在するので、本発明の方法によれば、従来、適当な置換基が活性部位又はその近傍にあるために、共有結合で固定化することが困難であった物質であっても、全体として活性を喪失させることなく、共有結合により基体に固定化することができる。
光が照射されなかった部分では、光反応性基が基体及び物質に結合しないので、洗浄すればポリマーも物質も除去される。従って、フォトマスク等を介して選択露光を行うことにより、任意のパターンで物質を固定化することができる。従って、選択露光により、マイクロアレイ等の任意の種々の形状に物質を固定化することができるので、非常に有利である。
あるいは、本発明の物質固定化剤と、固定化すべき物質の混合物を基体上にマイクロスポッティングし、基体の全面を光照射してもよい。マイクロスポッティングは、液を基体上に非常に狭い領域に塗布する手法であり、ＤＮＡチップ等の作製に常用されており、そのための装置も市販されているので、市販の装置を用いて容易に行うことができる。あるいは、先ず、基体上に本発明の物質固定化剤を全面にコーティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合、固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。さらに、基体上に本発明の物質固定化剤をマイクロスポッティングし、その上に固定化すべき物質をマイクロスポッティングし、次いで基体の全面に光照射してもよい。この場合にも固定化すべき物質のスポットが、物質固定化剤の層（それぞれ分離したスポット）の上に形成され、物質固定化剤を介して基体に共有結合で固定化される物質の割合が高くなる。
本発明の方法は、抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原を固定化した免疫測定用プレートの作製、ＤＮＡやＲＮＡを基板上に固定化した核酸チップ、マイクロアレイ等の作製に好適に用いることができるがこれらに限定されるものではなく、例えば、細胞全体やその構成要素の固定化等にも適用することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１    物質固定化剤の製造（その１）
下記の合成スキームにより光反応性メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）ポリマーを合成した。
2004088319.tif 000007
２ｍＬのＰＭＡｃ水溶液（５ｗｔ％＝５０ｍｇ／ｍＬ）（ＰＭＡｃは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（９０％）とメタクリル酸（１０％）のランダム共重合体で上記反応式中の化合物１）に１２．４４ｍｇの４−アジドアニリンと、１７．４７ｍｇの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を混合し，最終的に純水で１００ｍＬにメスアップした。ｐＨ７で２４時間撹拌（冷蔵庫中４℃）し、反応終了後，透析カセット（ＰＩＥＲＣＥ社製）で、外液からアジドアニリンのＵＶ吸収がなくなるまで透析。最後に凍結乾燥し光反応性ＭＰＣポリマーを得た。
試験例１    光反応性ＭＰＣポリマーの非特異吸着性
実施例１で製造した光反応性ＭＰＣポリマーの非特異吸着性を、以下のようにＦＩＴＣ化タンパク質又は細胞と接触させることにより調査した。
（１）  ＭＰＣポリマーの基板上への結合
実施例１で製造した光反応性ＭＰＣポリマーを、純水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ポリスチレン基板（直径２ｃｍ）上に２５μｌ塗布して風乾した。次に、幅１００μｍのストライプパターンを有するフォトマスクを介して紫外線（波長２６０ｎｍ）を選択照射した（照射量１６ｍＷ／ｃｍ２）。次いで、水洗し、ポリスチレン基板上に光反応性ＭＰＣポリマーをストライプ状に固定化した。
（２）  ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）化タンパク質の吸着
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（シグマ社より市販）水溶液（濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ（シグマ社より市販）水溶液（濃度２ｍｇ／ｍｌ）又はＦＩＴＣ−フィブリノーゲン水溶液（濃度３．７ｍｇ／３７０μｌ）を、上記パターンが形成された基板上に５０μｌ載せ、３７℃で１０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、乾燥させ、蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、光反応性ＭＰＣポリマーが固定化されていない領域にのみ蛍光が見られ、極めて明瞭なストライプパターンが観察された。これにより、ＭＰＣポリマーがタンパク質を非特異吸着しないことが確認された。
なお、上記試験に用いたＦＩＴＣ−フィブリノーゲンは、次のようにして調製した。すなわち、フィブリノーゲン２０ｍｇにＦＩＴＣ−Ｉ  ０．１ｍｇを加えて５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）７ｍｌに溶解し、４℃で一夜反応させ、排除分子量３０００のフィルターで遠心濃縮した。脱塩のため、ＭｉｌｌｉＱ水（商品名）で３回遠心分離した。その後、凍結乾燥して３．７ｍｇのＦＩＴＣ−フィブリノーゲンを得た。
（３）  細胞の吸着
実施例１で調製した光反応性ＭＰＣポリマーを、上記と同様にポリスチレン基板上にパターンをつけて固定化し、水洗後、７０％エタノールを用いて滅菌し、滅菌水で洗浄した。得られた基板をそのままで、又は１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液若しくは１％フィブリノーゲン／ＰＢＳ溶液２５０μｌを基板に載せて３７℃で１０分間反応させ、水洗後、細胞の吸着試験に供した。用いた細胞は、Ｃｏｓ  ７細胞（理化学研究所  細胞バンクより市販）及びＲａｗ  ２４６細胞（理化学研究所  細胞バンク社より市販）であった。細胞を基板上に播き、１時間後及び４時間後に顕微鏡で観察した。
その結果、光反応性ＭＰＣポリマーを固定化した領域には、細胞がほとんど吸着されず、細胞がストライプ状に吸着された。とりわけ、光反応性ＭＰＣポリマー単独の場合及び光反応性ＭＰＣポリマーにフィブリノーゲンを塗布した基板で明瞭なストライプパターンが観察された。
実施例２    免疫測定
以下に記載する方法により、本発明の方法により作製した、コラーゲン固定化基板を用いて、コラーゲンを検出する免疫測定を行った。
方法
（ｉ）０．１％光反応性ＭＰＣポリマー（実施例１で製造したもの）水溶液と０．５％コラーゲン水溶液を１：１０で混合。
（ｉｉ）  ３５ｍｍポリスチレンディッシュに３μｌのＭＰＣ／コラーゲン水溶液をスポット。
（ｉｉｉ）乾燥後、ＵＶ照射（波長２６０ｎｍ、照射量１６ｍＷ／ｃｍ２、１０秒間）により固定化。
（ｉｖ）  ＰＢＳで３回洗浄。
（ｖ）一次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販）（５μｇ／ｍｌ）又は抗ヒトＣＤ３抗体（ファーミンジェン社より市販）（５μｇ／ｍｌ）をスポット上に１００μｌ添加、室温で４時間インキュベーション。
（ｖｉ）ＰＢＳで３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識二次抗体（抗ラビットＩｇＧあるいはマウスＩｇＧ抗体）（アマーシャム社より市販）（５０００倍希釈）１００μｌ添加、室温で１時間インキュベーション。
（ｖｉｉ）ＰＢＳで３回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。
（ｖｉｉｉ）  コントロールとしてＭＰＣポリマーのみをスポットしたもの、またタカラ社製Ｈｕｂｂｌｅスライドガラスにポリマー無しでコラーゲン溶液のみをスポットしたもので同様の操作を行った。さらに、コントロールとして、負電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）とコラーゲンの水溶液、又は正電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアリルアミン（ＰＡＡｍ）とコラーゲンの水溶液を同様にポリスチレン基板上にスポットしたものを用いて同様の操作を行った。
結果と考察
抗コラーゲン抗体による免疫染色後、蛍光顕微鏡によりＭＰＣポリマー／コラーゲンスポットに蛍光が観察され、抗ＣＤ３抗体では染色されず、コラーゲンが特異的に染色されることが確認された。コントロールとして行ったＭＰＣポリマーのみのスポットではほとんど蛍光は無く、負電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）とコラーゲンでも、蛍光はなかった。正電荷のみを有するアジドフェニル基導入ポリアリルアミン（ＰＡＡｍ）では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上のことから、ＭＰＣポリマーの非特異的吸着が少ない特性を実証することが出来た。コントロールとしてタカラ社製のＨｕｂｂｌｅスライドガラスへコラーゲンの固定化を行ったが、スポット上に蛍光は観察されなず、この場合にはコラーゲンは固定化できなかったと考えられる。以上よりＭＰＣポリマーを用いてタンパク質の共有固定化が可能となり、非特異的吸着を抑制し、有効であることが明らかになった。なお、結果を下記表１にまとめて示す。
2004088319.tif 000008
実施例３    物質固定化剤の製造（その２）
（１）  Ｎ−（４−アジドベンゾイロキシ）スクシンイミドの合成
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４−アジド安息香酸（東京化成（株）より市販）６００ｍｇとＮ−ヒドロキシスクシンイミド（和光純薬（株）より市販）４２０ｍｇを１，４−ジオキサン４０ｍｌに溶解し、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（和光純薬（株）より市販）７６０ｍｇを加えて室温で攪拌しながら反応を開始した。２４時間後、副生成物をろ紙でろ去し、ろ液は減圧下で溶媒を留去した。得られた生成物は、１，４−ジオキサンとジエチルエーテルを用いて２回再結晶して精製した。その結果、６７５ｍｇのＮ−（４−アジドベンゾイロキシ）スクシンイミドを得た（収率７０．６％）。
（２）  ポリエチレングリコールへのアジド基の導入
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１００ｍｇのポリ（エチレングリコール）ビス（３−アミノプロピル）末端（Ａｌｄｒｉｃｈ社より市販、平均分子量１５００、以下、便宜的に「ＰＥＧ−ＮＨ２」と言うことがある）と６８．６ｍｇの（１）で製造したＮ−（４−アジドベンジロキシ）スクシンイミドをジメチルホルムアミド（和光純薬（株）より市販）１０ｍｌに溶解し、ｐＨ６で４℃で２４時間攪拌した。反応終了後、エバポレータにより減圧下でＤＭＦを留去し、純水を入れ、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により、沈降させ上清を回収し、凍結乾燥により光反応性ＰＥＧ−ＮＨ２（ＮＨ２基は、アジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載する）を得た。
実施例４    物質固定化剤の製造（その３）
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１００ｍｇのポリ（エチレングリコール）ビス（カルボキシメチル）エーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社より市販、平均分子量６００、以下、便宜的に「ＰＥＧ−ＣＯＯＨ」と言うことがある））と１１３．３ｍｇの４−アジドアニリンと１２７ｍｇの水溶性カルボジイミドを純水１０ｍｌに溶解し、ｐＨ６で４℃で２４時間攪拌した。反応終了後、水酸化ナトリウムによりｐＨ１２にし、未反応物を沈殿させた。沈殿物を遠心分離により沈降させ、上清を回収し、分液ロートにてクロロホルムで脱塩した（ｐＨが中性になるまで繰り返した）。そして凍結乾燥により光反応性ＰＥＧ−ＣＯＯＨを得た（ＣＯＯＨ基は、アジド化合物との結合に消費されてもはや存在しないが便宜的にこのように記載する）。
実施例５      物質固定化剤の製造（その４）
（１）  Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミドの合成
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４−アジドアニリン（Ａｌｄｒｉｃｈ社より市販）３４１．２ｍｇとＮ−アクリロキシスクシンイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ社より市販）１６９．１ｍｇをＤＭＦ１０ｍｌに溶解し、４℃で攪拌しながら反応を開始した。２４時間後、再結晶により精製した。その結果、Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミドを得た。
（２）    光反応性ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
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６３９．７ｍｇのアクリルアミド（和光純薬市販）と１６０ｍｇのＮ−アジドフェニルアクリル酸アミドをエタノール３０ｍｌに溶解し、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブリロニトリル（和光純薬より市販）を８２．１ｍｇ添加し、攪拌しながら６０℃で反応を開始した。５時間後、アセトンへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥により光反応性ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。
実施例６    物質固定化剤の製造（その５）
光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
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１．２８ｇのグリシジルメタクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ社より市販）と１６０ｍｇのＮ−アジドフェニルアクリル酸アミドをメタノール３０ｍｌに溶解し、重合開始剤として２，２’−アゾビスイソブリロニトリルを１６．４２ｍｇ添加し、攪拌しながら６０℃で反応を開始した。５時間後、ジエチルエーテルへの再沈殿により重合物を精製し、減圧乾燥により光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。水酸化ナトリウム（ｐＨ１２）による処理によりエポキシ基をグリセロール化させ、水溶性とした。
比較例１    光反応性ポリアクリル酸の製造
光反応性ポリアクリル酸は、次のように調整した。７２０ｍｇのポリアクリル酸（和光純薬社より市販、平均分子量１，０００，０００）と１７０．６ｍｇの４−アジドアニリンと１．９１７ｇの水溶性カルボジイミドを純水１００ｍｌに溶解し、ｐＨ７．０、４℃で２４時間攪拌した。反応終了後、外液からアジドアニリンのＵＶ吸収がなくなるまで透析を行った。最後に凍結乾燥し光反応性ポリアクリル酸ポリマーを得た。
比較例２    光反応性ポリアリルアミンの製造
比較例１の方法において、ポリアクリル酸をポリアクリルアミンに代えた同様な方法により光反応性ポリアクリルアミンを製造した。
実施例７    免疫測定
（１）  コラーゲン固定化基体の作製及びそれを用いた抗コラーゲン抗体の免疫測定
以下の手順により、実施例３ないし６、又は実施例１、比較例１若しくは比較例２で製造した物質固定化剤を用い、コラーゲンを固定化した基体（ポリスチレンディッシュ）を作製し、これを用いて抗コラーゲン抗体の免疫測定を行った。
（ｉ）上記作成した光反応性ＰＥＧ−ＮＨ２（実施例３）、光反応性ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（実施例４）、光反応性ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例５）又は光反応性ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例６）（０．１２５ｗｔ％）とコラーゲン（０．２５ｗｔ％）を１：１で混合。
（ｉｉ）３５ｍｍポリスチレンディッシュに０．５μｌのポリマー／コラーゲン水溶液をスポット。
（ｉｉｉ）乾燥後、ＵＶ照射（波長２６０ｎｍ、照射量４０ｍＷ／ｃｍ２、１０秒間）により固定化。
（ｉｖ）ＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄。
（ｖ）一次抗体として抗コラーゲン抗体（モノサン社より市販）１０倍希釈溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）又はマウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より市販）４０倍希釈溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）をスポット状に１００μｌ添加、室温で３時間インキュベーション。
（ｖｉ）ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で３回洗浄後、ＦＩＴＣ標識二次抗体（抗ラビットＩｇＧ抗体あるいはマウスＩｇＧ抗体）（アマシャム社より市販）２０倍希釈溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１００μｌ添加、室温で１時間インキュベーション。
（ｖｉｉ）ＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商品名））で３回洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察。
（ｖｉｉｉ）光反応性ＭＰＣポリマー（実施例１）、比較として光反応性ポリアクリル酸（比較例１）、光反応性ポリアリルアミン（比較例２）およびコントロールとして各例において物質固定化剤のみをスポットしたもので同様の操作を行った。
（２）  結果
下記表２に示すように、抗コラーゲン抗体による免疫染色後、ＰＥＧ−ＮＨ２（実施例３）／コラーゲンスポット及びＰＥＧ−ＣＯＯＨ（実施例４）／コラーゲンスポット、ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例５）／コラーゲンスポット、ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例６）／コラーゲンスポットで蛍光が観察され、抗ＩｇＧ抗体スポットでは蛍光は観察されなかった。これによりコラーゲンが特異的に染色されたことが確認できた。ＰＥＧ−ＮＨ２（実施例３）、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（実施例４）では蛍光強度もＭＰＣポリマー／コラーゲンスポット（実施例１）を抗コラーゲン抗体で染色した場合とほぼ同等であり、ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例５）、ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例６）では約１／２の蛍光強度を示した。それに対して、負電荷のみを有する光反応性ポリアクリル酸／コラーゲンスポット（比較例１）では、蛍光は無く、正電荷のみを有する光反応性ポリアリルアミン／コラーゲン（比較例２）では、抗体の種類によらず非特異的な染色が起こった。以上より光反応性ポリエチレングリコールはＭＰＣポリマーと同等にタンパク質を固定化することができ、また非特異的吸着を抑制することが明らかとなった。また、ポリ（アクリルアミド−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例５）、ポリ（グリシジルメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体（実施例６）においてもポリエチレングリコール（実施例３、４）よりはタンパク質の固定化量は低いが、固定化は可能であり、非特異的吸着も抑制することができる。
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実施例８    物質固定化剤の製造（その６）
１．  Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミドの合成
（反応式）
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４−アジドアニリン塩酸塩（Ａｉｄｒｉｃｈ社より市販）３００．０２ｍｇを９７ｍｌの純水に溶解し、その溶液に２ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨ水溶液を３ｍｌ加えた。次にアクリル酸クロリド（東京化成工業より市販）２００ｍｇをジクロロメタンで希釈し、１３ｍｌにしたものをゆっくりと攪拌しながら滴下し、滴下終了後、密栓し１時間強攪拌した。析出した固体をろ過により回収、ジクロロメタン相はクロロホルム８０ｍｌを加えて分液した。分液した有機層を乾燥させ、固体を回収した。その結果、Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミドを得た。
２．  光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体の合成
（反応式）
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３００ｍｌナス型フラスコにＮ−アジドフェニルアクリル酸アミド４９．９０ｍｇ、ＰＥＧ（重合度ｎ＝８）モノメタクリレート２２２５．２ｍｇを４３ｍｌの酢酸エチルに溶解させアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を６．３１ｍｇ入れて窒素で満たし密栓し、湯浴で６０℃、６時間攪拌した。加熱を止めてある程度溶媒を留去させた後ジエチルエーテルに移しソニケーターを３０分かけた。固体を回収し、減圧乾燥を２時間行った。その結果、光反応性ポリ（エチレングリコールモノメタクリレート−Ｎ−アジドフェニルアクリル酸アミド）共重合体を得た。
実施例９    アレルゲン固定化基体の作製及びそれを用いたアレルゲン抗体の免疫測定
スギ及びダニアレルゲン（生化学工業（株）より市販）を純水で０．２５ｗｔ％に調整し、実施例１又は実施例８で製造した光反応性ポリマー（０．１２５ｗｔ％）と１：１（Ｖ／Ｖ）で混合した。混合したアレルゲン／ポリマー溶液をポリスチレン基板上に０．５μｌスポットして風乾した。次に紫外線（波長２６０ｎｍ、照射量１５ｍＷ／ｃｍ２）を照射してポリスチレン基板上にアレルゲンを固定化した。
次いでＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、一次抗体としてアレルゲン抗体（生化学工業（株）より市販）をヒト血清で１００μｇ／ｍｌに調整したものをスポット上に１０μｌ添加し、室温で２時間反応させた。次にＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、ＨＲＰ標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社より市販）を１０％ＢＳＡ／ＰＢＳで１００倍に希釈したものをスポット上に１０μｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄後、化学発光試薬ＥＣＬ  ａｄｖａｎｃｅ（アマシャムバイオサイエンス社より市販）を１０μｌ添加し、ゲル撮影装置により３０秒間露光した画像を得た。得られた画像を解析ソフトにより数値化した。
以下の表３に数値化した発光強度を纏めて示す。
抗体濃度１００ｎｇ／ｍｌで最も高い発光強度を示したのは、ＰＥＧと、実施例８の共重合体であった。また、抗体濃度が０の時の発光強度が低いのも実施例８の共重合体であり、非特異的吸着が最も少ないことがわかった。
以上の結果より、アレルゲン固定化量が多く、非特異的吸着の少ない実施例８の共重合体がアレルゲンアレイに使用するマトリックスに最も適していることがわかった。
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【産業上の利用可能性】  本願発明は、基体上に固定化すべき物質を共有結合により固定化することができ、かつ、非特異吸着の防止効果に優れた、物質固定化剤、それを用いた物質固定化方法及びそれを用いた物質固定化基体に係る。本発明によれば、固定化すべき物質を、その種類に関係なく共有結合により固定化することができ、安定な固定化基板を得ることができる。また、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化すると、非特異吸着が効果的に防止される。さらに、本発明の物質固定化剤を用いて物質を固定化する場合、選択露光を行うことにより、固定化物質のパターニングも可能であり、容易にマイクロアレイ等の任意のパターンに物質を固定化することができる。従って、本願発明は、各種マイクロアレイの作製等に有用である。
【国際調査報告】
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