(57)【要約】ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制することができる核酸増幅方法、それに用いる核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制することを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、それに用いる一塩基多型検出用試薬キットを提供することを目的とする。ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法は、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行うことを特徴とする。
2004027060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、
反応液中に、鋳型ＤＮＡに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーＤＮＡについてのみプライマー伸長反応が起こるＲｅｃＡタンパク質またはこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の核酸増幅方法であって、
前記反応液中に、ＡＴＰ−γＳを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、
鋳型ＤＮＡが阻止的または抑制的２次構造の区域を有する
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、
前記反応液中に、ＫＣｌを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、
前記反応液中に、Ｍｇ２＋を加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の核酸増幅方法であって、
前記反応液中に、複数セットのプライマーＤＮＡを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項８】
ＰＣＲにより核酸を増幅させるための核酸増幅用試薬キットであって、
ＤＮＡポリメラーゼと、
４種類のｄＮＴＰと、
緩衝液と、
サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質と、
を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キット。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸増幅用試薬キットであって、
ＡＴＰ−γＳを備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キット。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載の核酸増幅用試薬キットであって、
ＫＣｌを備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キット。
【請求項１１】
請求項８〜請求項１０のいずれか一項に記載の核酸増幅用試薬キットであって、
Ｍｇ２＋を備える
ことを特徴とする核酸増幅用試薬キット。
【請求項１２】
一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、
鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用い、
反応液に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、
所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出する
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記反応液中に、ＡＴＰ−γＳを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記反応液中に、ＫＣｌを加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
【請求項１５】
請求項１２〜請求項１４のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法であって、
前記反応液中に、Ｍｇ２＋を加えて、ＰＣＲを行う
ことを特徴とする一塩基多型検出方法。
【請求項１６】
一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットであって、
ＤＮＡポリメラーゼと、
４種類のｄＮＴＰと、
緩衝液と、
サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質と、
を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キット。
【請求項１７】
請求項１６に記載の一塩基多型検出用試薬キットであって、
ＡＴＰ−γＳを備える
ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キット。
【請求項１８】
請求項１６または請求項１７に記載の一塩基多型検出用試薬キットであって、
ＫＣｌを備える
ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キット。
【請求項１９】
請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の一塩基多型検出用試薬キットであって、
Ｍｇ２＋を備える
ことを特徴とする一塩基多型検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法、ＰＣＲにより核酸を増幅させるための核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲにより一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法、及び、ＰＣＲにより一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットに関するものである。
【背景技術】  従来より、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法が知られている。即ち、反応液中に、鋳型ＤＮＡ、プライマーＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ等を混合して、鋳型ＤＮＡのうち、２種類のプライマーＤＮＡによって挟まれた領域を特異的に増幅させ、特定の核酸を得るものである。
このような核酸増幅方法には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等のＲｅｃＡタンパク質を用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】  特許第３０１０７３８号公報（第１−４頁）
しかしながら、ＰＣＲ反応を行うと、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）だけでなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）も増幅される場合がある。さらに、このような場合において、ＰＣＲの条件を適宜変更しても、上記のような従来の方法では、なお副産物が増幅されることも少なくない。
本発明はかかる現状に鑑みてなされたものであって、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットを提供することを目的とする。
【発明の開示】
前記目的を達成するための解決手段は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
本発明によれば、反応液中に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、所望の核酸を増幅させる。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の収量を減少させることなく、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。より具体的には、本発明によれば、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。さらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが２塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。またさらには、ＰＣＲの条件を適宜変更することにより、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが１塩基の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることも可能である。
また、本発明の核酸増幅方法によれば、反応液中に加えるプライマーＤＮＡの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーＤＮＡの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法は、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、従来の核酸増幅方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本発明によれば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法では、反応液中に加えるＤＮＡポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
このように、本発明の核酸増幅方法では、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
ここで、上記の相同組み換えタンパク質は、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質（本明細書では、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質とも言う。）、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を改変したものであってＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質（Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ改変タンパク質）、の少なくともいずれかを含むものであれば、いかなるものを用いてもよい。Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ改変タンパク質としては、例えば、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質をコードする遺伝子から、部位特異的変位誘発等により作出された遺伝子の産物であって、１または数個のアミノ酸が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するものが挙げられる。また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質のタンパク質断片であって、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するもの（Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡフラグメント）などであってよい。
なお、上記の相同組み換えタンパク質は、プライマーＤＮＡ  １μｇあたり、０．１μｇ〜１００μｇの範囲で混合するのが好ましく、更には１μｇ〜１０μｇの範囲で混合するのが好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。
以下に、ＰＣＲ反応で用いられる種々の試薬について説明する。
鋳型ＤＮＡは、直鎖状で有れば、いかなるものを用いてもよい。即ち、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、また、それらの鎖長に上限は存在しない。従って、例えば、３０００Ｍｂｐといわれるヒトゲノムの全長を持つような巨大なＤＮＡであっても構わない。勿論、その由来は問われない。従って、ウィルスや微生物、動植物のゲノム由来のＤＮＡやそれらを改変したＤＮＡであっても、微生物等のもつプラスミド等やプラスミド等に異種のＤＮＡ断片を挿入したキメラＤＮＡ等であっても、あるいは、人工的に合成したオリゴヌクレオチドなどであっても構わない。また、鋳型ＤＮＡとしては、２本鎖ＤＮＡでも１本鎖ＤＮＡでも利用することができる。さらに、ＲＮＡを逆転写することで得られるｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして利用することもできる。
プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡのうち増幅すべき配列（領域）の両端に位置する相当数の配列と実質的に相補的であれば、いかなる塩基配列からなるものであってもよく、その由来も問われない。実質的に相補的な程度は、鋳型ＤＮＡに対する塩基のミスマッチが３塩基以内であるのが好ましく、さらには、塩基のミスマッチが２塩基以内、またさらには、塩基のミスマッチが１塩基以内、特に、１００％の相補性を有するのが好ましい。前述したように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、プライマーＤＮＡの相補性が低いと、所望の核酸が増幅されにくくなるからである。
なお、プライマーＤＮＡは、各々のプライマーＤＮＡあたり、最終濃度で０．０１μＭ〜１０μＭの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．１μＭ〜１μＭの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、プライマーＤＮＡの濃度を従来よりも低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおいてＤＮＡ鎖を変性させる際の高温に短時間加熱されても永久的には不活性化されず、しかも、高温における活性を有するものが好適である。例えば、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノサーマス・フェルビドゥス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓｆｅｒｖｉｄｕｓ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．フラブス（Ｔ．ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、Ｔ．ルバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）及びＴ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの高熱菌由来のＤＮＡポリメラーゼや、デスルフロコッカス・モビリス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓｍｏｂｉｌｉｓ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィルクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｌｃｕｍ）、スルホロブス・ソルファタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、Ｓ．アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）及びサーモプラスマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）などの高熱性古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。このうち、入手容易性等の理由から、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）や、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ．ｔｈ．ＤＮＡポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼを利用するのが好ましい。
なお、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合には、１００μｌあたり、０．０５ｕｎｉｔ〜５０ｕｎｉｔの範囲で混合するのが好ましく、さらには、０．５ｕｎｉｔ〜５ｕｎｉｔの範囲で混合するのが特に好ましい。このような範囲でＰＣＲを行えば、より効率よく特異的に、所望の核酸の増幅させることができるからである。また、ＤＮＡポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
さらに、上記のＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅工程前の活性を阻害するために、ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体を反応液に混合するようにしてもよい。この抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え法により製造された抗体、化学的または組換え法により製造された抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）が挙げられる。このうち、モノクローナル抗体を用いるのが特に好ましい。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに対する公知のモノクローナル抗体を用いれば、約２０℃〜４０℃の温度においてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害することができると共に、ＰＣＲの熱的サイクルにおける高温によって不活性化される。
また、ＰＣＲは、一般に、４種類のｄＮＴＰ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在化において行う。
さらに、ＰＣＲは、一般に、適当な緩衝剤を含む反応液中で行われる。効率よく核酸を増幅させるためである。緩衝液は、使用する相同組み換えタンパク質やＤＮＡポリメラーゼ等により、反応の最適条件を得るため適宜変更することできる。例えば、ｐＨを適当に調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を利用することができる。
また、ＰＣＲ反応液には、５％〜１０％のＤＭＳＯと１％〜２％のベタインを添加してもよい。鋳型ＤＮＡの二字構造により目的とする産物が増幅されにくい問題を最小限に留める効果を有するものである。このような変性剤に対し、大膓菌由来のＲｅｃＡタンパク質等は耐性を有しないが、サーマス・サーモフィルスに由来するＲｅｃＡタンパク質等は耐性を有するので、本発明において使用することが可能である。
また、ＰＣＲ反応液には、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来するＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質に対する抗体を加えてもよい。
また、他の解決手段は、ＰＣＲにより核酸を増幅させる核酸増幅方法であって、反応液中に、鋳型ＤＮＡに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーＤＮＡについてのみプライマー伸長反応が起こるＲｅｃＡタンパク質またはこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法である。
本発明によれば、反応液中に、鋳型ＤＮＡに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーＤＮＡについてのみプライマー伸長反応が起こるＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、所望の核酸を増幅させる。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、この核酸増幅方法によれば、反応液中に加えるプライマーＤＮＡの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーＤＮＡの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法は、上記のように特異性が高いため、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度条件を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、従来の核酸増幅方法では、アニーリング温度等、プライマー伸長反応の温度を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、本発明によれば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
また、この核酸増幅方法では、反応液中に加えるＤＮＡポリメラーゼの添加量を低く抑えても、従来の方法に比して、十分な量の核酸を増幅させることができる。
このように、本発明の核酸増幅方法では、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記反応液中に、ＡＴＰ−γＳを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ＡＴＰ−γＳも加えて、ＰＣＲを行う。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。なお、ＡＴＰ−γＳを加えた場合と同様に、ＡＴＰを加えても、ＰＣＲの特異性が増すと推測される。しかし、ＡＴＰは、上記の相同組み換えタンパク質によりＡＤＰに分解され、ＡＤＰは、上記の相同組み換えタンパク質がプライマーＤＮＡ等に結合するのを阻害する。このため、ＡＴＰを加えても、ＰＣＲの特異性が上がりにくい。従って、本発明のように、ＡＤＰに分解されないＡＴＰ−γＳを反応液に加えるのが良い。
なお、ＰＣＲ反応液を調製する際には、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を反応液に加えた状態で、ｄＮＴＰを加える前に、ＡＴＰ−γＳを加えるのが好ましい。このようにすることで、より効率よく所望の核酸を特異的に増幅することができる。その理由としては、先にｄＮＴＰを加えると、ｄＮＴＰがＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が結合し、後から加えたＡＴＰ−γＳがＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質に結合しにくくなるためであると考えられる。
ここで、ＡＴＰ−γＳの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、０．１ｍＭ〜１ｍＭとするのが良い。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、鋳型ＤＮＡが阻止的または抑制的２次構造の区域を有することを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、鋳型ＤＮＡが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する。即ち、鋳型ＤＮＡは、一般的なＰＣＲを行った場合に、核酸の増幅が阻止または抑制される２次構造をなす区域を有する。従って、従来のＰＣＲでは、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難であった。
これに対し、本発明では、前述の相同組換えタンパク質を混合してＰＣＲを行うので、鋳型ＤＮＡにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型ＤＮＡに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記反応液中に、ＫＣｌを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、反応液中にＫＣｌを加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
ここで、ＫＣｌの濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、１ｍＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは、１０ｍＭ〜１００ｍＭとするのが良い。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記反応液中に、Ｍｇ２＋を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、反応液中にＭｇ２＋を加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。Ｍｇ２＋を加えることで、上述した相同組み換えタンパク質のＤＮＡに対する親和性が向上するためであると考えられる。
ここで、Ｍｇ２＋の濃度は、目的に応じて適宜変更すればよいが、通常、０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、３ｍＭ〜１０ｍＭとするのが良い。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅方法であって、前記反応液中に、複数セットのプライマーＤＮＡを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする核酸増幅方法とすると良い。
本発明によれば、反応液中に複数セットのプライマーＤＮＡを加えて、ＰＣＲを行う。
従来の核酸増幅方法では、プライマーＤＮＡの濃度をある程度高くしないと所望の核酸を増幅することが難しかったため、複数セットのプライマーＤＮＡを加えることが困難であった。
これに対し、本発明では、上述した相同組み換えタンパク質を加えることにより、各プライマーＤＮＡの濃度を低くしても、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。従って、複数セットのプライマーＤＮＡを混合することができ、しかも、このようにしてＰＣＲを行っても、副産物の増幅を抑えつつ、各プライマーセットに対応した所望の核酸だけをより特異的に増幅させることができる。
また、他の解決手段は、ＰＣＲにより核酸を増幅させるための核酸増幅用試薬キットであって、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質と、を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キットである。
本発明の核酸増幅用試薬キットは、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質とを備える。
このようなキットを利用すれば、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲを行うことができる。しかも、上記の相同組み換えタンパク質により、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。従って、本キットを利用すれば、所望の核酸をより特異的に増幅させることができる。
なお、本発明に記載されているＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質は、前述したものと同様である。
ここで、本発明の核酸増幅用試薬キットは、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質とを備えていればよい。従って、これらのものが各々別個の容器等に分けられていても、あるいは、これらのうち２以上のものが予め混合されていてもよい。以下に述べるＡＴＰ−γＳ、ＫＣｌ、Ｍｇ２＋についても同様である。
さらに、上記の核酸増幅用試薬キットであって、ＡＴＰ−γＳを備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キットとするのが好ましい。
このようなキットを利用して、さらにＡＴＰ−γを加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅用試薬キットであって、ＫＣｌを備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キットとすると良い。
このようなキットを利用して、ＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
さらに、上記のいずれかに記載の核酸増幅用試薬キットであって、Ｍｇ２＋を備えることを特徴とする核酸増幅用試薬キットとすると良い。
このようなキットを利用して、ＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、他の解決手段は、一塩基多型を検出するための一塩基多型検出方法であって、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用い、反応液に、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行い、所望の核酸の増幅により一塩基多型を検出することを特徴とする一塩基多型検出方法である。
本発明によれば、プライマーＤＮＡの１つには、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いる。そして、反応液中に、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同組み換えタンパク質を混合して、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、上記の一塩基多型検出方法であって、前記反応液中に、ＡＴＰ−γＳを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とするのが好ましい。
本発明によれば、反応液中に、前述の相同組換えタンパク質を混合した上、さらに、ＡＴＰ−γＳも加えて、ＰＣＲを行う。このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記反応液中に、ＫＣｌを加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出方法であって、前記反応液中に、Ｍｇ２＋を加えて、ＰＣＲを行うことを特徴とする一塩基多型検出方法とすると良い。
このようにＰＣＲを行えば、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができるため、一塩基多型をより確実に検出することが可能となる。
また、他の解決手段は、一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットであって、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質及びこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質と、を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キットである。
本発明の一塩基多型検出用試薬キットは、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質とを備える。
このようなキットを利用すれば、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型ＤＮＡと、この鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡ含むプライマーＤＮＡを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲを行うことができる。そして、このようにＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能となる。
よって、本発明の一塩基多型検出用試薬キットを用いれば、容易に一塩基多型を検出することができる。
なお、本発明に記載されているＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質は、前述したものと同様である。
ここで、本発明の一塩基多型検出用試薬キットは、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質とを備えていればよい。従って、これらのものが各々別個の容器等に分けられていても、あるいは、これらのうち２以上のものが予め混合されていてもよい。以下に述べるＡＴＰ−γＳ、ＫＣｌ、Ｍｇ２＋についても同様である。
さらに、上記の一塩基多型検出用試薬キットであって、ＡＴＰ−γＳを備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キットとするのが好ましい。
このようなキットを利用して、さらにＡＴＰ−γを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに精度良く一塩基多型を検出することができる。
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出用試薬キットであって、ＫＣｌを備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キットとすると良い。
このようなキットを利用してＰＣＲ反応を行えば、さらに精度良く一塩基多型を検出することができる。
さらに、上記のいずれかに記載の一塩基多型検出用試薬キットであって、Ｍｇ２＋を備えることを特徴とする一塩基多型検出用試薬キットとすると良い。
このようなキットを利用してＰＣＲ反応を行えば、さらに精度良く一塩基多型を検出することができる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、実施例１に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２図は、実施例１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーＤＮＡの濃度を０．０６μＭにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はプライマーＤＮＡの濃度を０．２０μＭにしてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第３図は、実施例２に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４図は、実施例２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第５図は、実施例３に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第６図は、実施例３に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第７図は、実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はプライマーＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーＤＮＡを用いてプライマーＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第８図は、実施例３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は別のプライマーＤＮＡを用いてプライマーＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は別のプライマーＤＮＡを用いてプライマーＤＮＡの濃度を変えてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第９図は、実施例４に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第１０図は、実施例４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第１１図は、実施例５に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第１２図は、実施例５に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第１３図は、実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度６０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度５５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第１４図は、実施例５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はアニーリング温度５０℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はアニーリング温度４５℃でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第１５図は、実施例６に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第１６図は、実施例６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はオリゴヌクレオチド３７〜４４のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はオリゴヌクレオチド５４〜５８のいずれかを用いてＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第１７図は、実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は最初からプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１サイクル後にプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第１８図は、実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は３サイクル後にプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は６サイクル後にプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第１９図は、実施例７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は１０サイクル後にプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は１５サイクル後にプライマーＤＮＡを添加してＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第２０図は、実施例８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）は初期温度７０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）は初期温度８０℃の下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第２１図は、実施例９に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２２図は、実施例９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はＡＴＰ−γＳの非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はＡＴＰ−γＳの存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第２３図は、実施例１０に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２４図は、実施例１０に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２５図は、実施例１０に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（Ａ）はＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の非存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｂ）はＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真であり、（Ｃ）はＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質の存在下でＰＣＲ反応を行った場合を示す写真である。
第２６図は、実施例１１に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２７図は、実施例１１に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第２８図は、実施例１２に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第２９図は、実施例１２に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第３０図は、実施例１３に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第３１図は、実施例１３に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第３２図は、実施例１４に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第３３図は、実施例１４に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第３４図は、実施例１５に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第３５図は、実施例１５に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第３６図は、実施例１６に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第３７図は、実施例１６に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第３８図は、実施例１７に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第３９図は、実施例１７に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４０図は、実施例１７に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第４１図は、実施例１８に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４２図は、実施例１８に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
第４３図は、実施例１９に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４４図は、実施例１９に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４５図は、実施例１９に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４６図は、実施例１９に関し、鋳型ＤＮＡと各プライマーＤＮＡとの関係について示す説明図である。
第４７図は、実施例１９に関し、ＰＣＲ反応物についての電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施例を、図を参照しつつ説明する。
【実施例１】  第１図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用意した。また、プライマーＤＮＡとして１６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１〜１６）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−８５２Ｐ６  ｆｒｏｍ  ７ｐ１１．２−ｐ２１，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００６４５４）を参考にして設計した。なお、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮナンバーは、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋのアクセスナンバーを示している（以下同様）。各プライマーＤＮＡは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。また、各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒの塩基配列からなる。なお、各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡの塩基配列に基づいて公知の手法により合成すればよい。
2004027060.tif 000003
2004027060.tif 000004
また、相同組み換えタンパク質としてサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＲｅｃＡタンパク質を用意し、ＤＮＡポリメラーゼとしてサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ））を用意した。また、４種類のｄＮＴＰ、即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを用意し、緩衝剤としてｐＨを調整したトリス系の緩衝液に、塩化カリウムや塩化マグネシウムを加えた緩衝液を用意した。
なお、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同組換えタンパク質とは、核酸増幅用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲを行うことができるからである。
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、１０μｌのＰＣＲ反応液中に、０．０６μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、４０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡと、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  Ｔａｑと、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．２μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第２図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８を加えたものである。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９とオリゴヌクレオチド１０を加えたものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１１とオリゴヌクレオチド１２を加えたものである。
レーン７は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１３とオリゴヌクレオチド１４を加えたものである。
レーン８は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１５とオリゴヌクレオチド１６を加えたものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．２０μＭ（最終濃度）に増やして、レーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、所望の核酸の増幅がほとんど検出されないものもあった（レーン１５，１６等）。この理由としては、鋳型ＤＮＡのうち増幅されるべき領域が、阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
また、第２図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマーＤＮＡの濃度を増加させ、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２４でも、所望のＤＮＡの増幅が検出された。しかし、レーン１〜レーン８の結果に比べると、副産物が若干検出されたものも多い。
一方、プライマーＤＮＡの濃度を増加させ、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３２では、対応するレーン９〜レーン１６の結果に比べ、副産物がさらに多量に検出された。
これらのことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型ＤＮＡに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型ＤＮＡに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、反応液中に加えるプライマーＤＮＡの濃度（０．０６μＭ）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーＤＮＡの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【実施例２】  次いで、第２の実施例について説明する。なお、上記実施例１と同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１７〜２８）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−１６Ｐ１０  ｆｒｏｍ  ７，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ０９３７３４  ＡＣ０１１７８６）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。なお、各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000005
次に、上記実施例１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第４図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１７とオリゴヌクレオチド１８を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１９とオリゴヌクレオチド２０を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド２１とオリゴヌクレオチド２２を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド２３とオリゴヌクレオチド２４を加えたものである。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド２５とオリゴヌクレオチド２６を加えたものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド２７とオリゴヌクレオチド２８を加えたものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第４図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、多くのレーンでは、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、副産物が検出されたレーンでも、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーンに比べれば、副産物の生成が大幅に抑制された。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーＤＮＡの濃度（０．０６μＭ）を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーＤＮＡの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【実施例３】  次いで、第３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第５図及び第６図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして８種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２９〜３６）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡのｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ  ｇｅｎｅについて設計した。具体的には、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０は、Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１０１３Ａ２２  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２０  Ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ＨＮＦ４Ａ（ｈｅｐａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ４，ａｌｐｈａ）ｇｅｎｅ，ｐａｒｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｍｉｌａｒｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ  ＲＰＬ３７Ａ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ３７ａ）ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ，ｐａｒｔｓ  ｏｆ  ２ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅｓ，ＥＳＴｓ，ＳＴＳｓ  ａｎｄ  ＧＳＳｓ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＬ１３２７７２）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ３ｑ  ＢＡＣ  ＲＰ１１−５２９Ｆ４（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｈｕｍａｎ  ＢＡＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ）ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ０８０００７）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｅｔａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ（ＨＢＢ＠）ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮＮＧ＿０００００７）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６は、Ｈｏｍｏ  ｓｐａｉｅｎｓ  ＨＰＦＨ６０Ｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｘ８１４４５  Ｘ９１８３５）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000006
次に、プライマーＤＮＡの濃度以外は上記実施例１等と同じ条件で反応液を作成した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃３  ３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。その後、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第７図及び第８図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド２９と０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３０を加えたものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．０１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、オリゴヌクレオチド２９とオリゴヌクレオチド３０の濃度をそれぞれ０．００３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマーＤＮＡとして、０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３１と０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３２を加えたものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．０１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、オリゴヌクレオチド３１とオリゴヌクレオチド３２の濃度をそれぞれ０．００３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマーＤＮＡとして、０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３３と０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３４を加えたものである。
レーン２２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度をそれぞれ０．０３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．０１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、オリゴヌクレオチド３３とオリゴヌクレオチド３４の濃度を０．００３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン２１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマーＤＮＡとして、０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３５と０．３μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチド３６を加えたものである。
レーン３２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．０１μＭ（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、オリゴヌクレオチド３５とオリゴヌクレオチド３６の濃度をそれぞれ０．００３μＭ（最終濃度）に減らして、レーン３１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第７図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１，３，５，７，９のうち、レーン９を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。特に、プライマーＤＮＡの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン９では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーＤＮＡの濃度が同じであれば、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク賀を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２，４，６，８，１０のうち、レーン１０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１０では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
第７図（Ｂ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１１，１３，１５，１７，１９のうち、レーン１９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーＤＮＡの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン１９では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーＤＮＡの濃度が同じであれば、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１２，１４，１６，１８，２０のうち、レーン２０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２０では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
第８図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１，２３，２５，２７，２９のうち、レーン２９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーＤＮＡの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン２９では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーＤＮＡの濃度が同じであれば、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２２，２４，２６，２８，３０のうち、レーン２２，２４，２６では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン２８，３０では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
第８図（Ｂ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３１，３３，３５，３７，３９のうち、レーン３９を除くレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。特に、プライマーＤＮＡの濃度が低くなるほど、副産物の生成は抑制される傾向にあった。また、レーン３９では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、プライマーＤＮＡの濃度が同じであれば、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものに比べ、所望の核酸の増幅量が多くなる傾向にあった。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３２，３４，３６，３８，４０のうち、レーン４０を除くレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン４０では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これらのことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、反応液中に加えるプライマーＤＮＡの濃度を低く抑えても、十分な量の核酸を増幅させることができ、しかも、プライマーＤＮＡの濃度を低くすることにより、副産物の増幅を抑えつつ、所望の核酸だけをより特異的に増幅させることが可能となる。
【実施例４】  次いで、第４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第９図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを用意し、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１１４２Ｊ１９  ｆｒｏｍ  ７ｑ３５−ｑ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００４９７５）を参考にして設計した。
プライマーＤＮＡのうち、オリゴヌクレオチド３７，３８は、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒまたは２１ｍｅｒの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド３９は、鋳型ＤＮＡと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４０は、鋳型ＤＮＡに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。また、オリゴヌクレオチド４１は、鋳型ＤＮＡに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド３７と同様である。
2004027060.tif 000007
次に、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．３μＭ（最終濃度）とし、それ以外は上記実施例３と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１０図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン５は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳ（ロッシュ）をさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第１０図の結果から明らかなように、ＡＴＰ−γＳを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、レーン１〜レーン３では、所望のＤＮＡ（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。一方、レーン４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン５とレーン６では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ＡＴＰ−γＳの非存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ＡＴＰ−γＳの存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ＡＴＰ−γＳを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同組換えタンパク質とを核酸増幅用試薬キットとして用意する場合には、さらに、ＡＴＰ−γＳも、そのキットに加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるからである。
また、上記実施例４の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、ＡＴＰ−γＳを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼと、４種類のｄＮＴＰと、緩衝液と、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質とは、一塩基多型検出用試薬キットとして用意しておくのが便利である。このようなキットを利用すれば、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類のｄＮＴＰ、緩衝液、及び、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等の相同的組換えタンパク質を反応液に加え、さらに、目的に応じた鋳型ＤＮＡとプライマーＤＮＡを用意して反応液に加えるだけで、容易にＰＣＲにより一塩基多型を検出することができるからである。
そしてさらに、上記キットには、ＡＴＰ−γＳも加えるのが好ましい。上記の実施例４で明らかなように、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行えば、さらに特異的に所望の核酸を増幅させることができるため、より確実に一塩基多型を検出することが可能となるからである。
【実施例５】  次いで、第５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第１１図及び第１２図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド４２〜５３）を用意した。具体的には、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１１４２Ｊ１９  ｆｒｏｍ７ｑ３５−ｑ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＱＮ  ＡＣ００４９７５）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−８５２Ｐ６  ｆｒｏｍ  ７ｐ１１．２−ｐ２１，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００６４５４）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅＲＰ５−９１２Ｉ１３  ｆｒｏｍ  ７，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００８０６０）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−１６Ｐ１０  ｆｒｏｍ  ７，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ０９３７３４  ＡＣ０１１７８６）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−８５２Ｐ６  ｆｒｏｍ  ７ｐ１１．２−ｐ２１，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００６４５４）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な１８ｍｅｒ〜２２ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000008
次に、上記実施例４と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースグルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１３図及び第１４図に示す。
なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件１とする。アニーリング温度は６０℃である。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４２とオリゴヌクレオチド４３を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４４とオリゴヌクレオチド４５を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４６とオリゴヌクレオチド４７を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４８とオリゴヌクレオチド４９を加えたものである。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５０とオリゴヌクレオチド５１を加えたものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５２とオリゴヌクレオチド５３を加えたものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件２とする。アニーリング温度は５５℃である。
レーン１３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件２の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５〜レーン３６は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、５０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件３とする。アニーリング温度は５０℃である。
レーン２５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、上記温度条件３の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７〜レーン４８は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、４５℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件４とする。アニーリング温度は４５℃である。
レーン３７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、上記温度条件４の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第１３図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が６０℃の場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型ＤＮＡの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
また、第１３図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５５℃の場合でも、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１８では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１９〜レーン２４のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も若干検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型ＤＮＡの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
第１４図（Ａ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が５０℃の場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５〜レーン３０のうち、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、一部のレーンでは、所望の核酸の増幅のみならず副産物も検出された。但し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン３１〜レーン３６のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型ＤＮＡの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
また、第１４図（Ｂ）の結果から明らかなように、アニーリング温度が４５℃の場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７〜レーン４２では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物も検出された。但し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったものと比べると、副産物の増幅量は少なかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４３〜レーン４８のうち、一部のレーンでは、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。また、一部のレーンでは、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。これは、鋳型ＤＮＡの増幅領域に阻止的または抑制的２次構造を有するためと考えられる。
これらのことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型ＤＮＡに阻止的または抑制的２次構造を有する場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。相同組み換えタンパク質が、鋳型ＤＮＡに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためと考えられる。
また、ＰＣＲの特異性が高いため、プライマー伸長反応の温度条件（アニーリング温度）を変えても、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、プライマー伸長反応の温度（アニーリング温度）を低く設定すると、目的とする核酸だけでなく、副産物も多量に増幅されることとなるが、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、目的とする核酸をより特異的に増幅させることが可能となる。
【実施例６】  次いで、第６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを用意し、プライマーＤＮＡとして、上記実施例４と同様な５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド３７〜４１）（第９図参照）と、第１５図に示すように５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５４〜５８）を用意した。
第１５図に示すように、後者の５種類のプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）を参考にして設計した。これらのプライマーＤＮＡのうち、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５は、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２２ｍｅｒの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５６は、鋳型ＤＮＡと１塩基だけ異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５７は、鋳型ＤＮＡに対し３塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。また、オリゴヌクレオチド５８は、鋳型ＤＮＡに対し５塩基について異なる塩基配列からなり、それ以外の部分はオリゴヌクレオチド５４と同様である。
2004027060.tif 000009
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１６図に示す。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン９は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５４とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１８は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５６とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン１９は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５７とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２０は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５８とオリゴヌクレオチド５５を加えたものである。
レーン２１は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン１７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン１８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン１９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、かつ、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外はレーン２０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第１６図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加え、かつ、ＡＴＰ−γＳを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、所望のＤＮＡ（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン５及びレーン６に比べ、レーン７では所望の核酸の増幅が少なく、さらに、レーン８では所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加え、かつ、ＡＴＰ−γＳも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２について見ると、レーン９〜レーン１１では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン１２では、核酸の増幅が検出できなかった。また、レーン９及びレーン１０に比べ、レーン１１では、所望の核酸の増幅が少なかった。さらに、このレーン１１は、上記レーン７と比べても、所望の核酸の増幅が少なかった。
他方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、所望のＤＮＡの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
また、第１６図（Ｂ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加え、かつ、ＡＴＰ−γＳを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０について見ると、レーン１７〜レーン１９では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１７及びレーン１８に比べ、レーン１９では、所望の核酸の増幅が少なかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加え、かつ、ＡＴＰ−γＳも加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４について見ると、レーン２１では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、レーン２２〜レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
他方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６について見ると、所望のＤＮＡの増幅のみならず副産物も多量に増幅された。
これらのことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
具体的には、ＡＴＰ−γＳの非存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが３塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を反応液に加えることにより、所望の核酸をより特異的に増幅することができる。
一方、ＡＴＰ−γＳの存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチが１塩基以内の場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ＡＴＰ−γＳを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、ＡＴＰ−γＳは、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えたときには、ＰＣＲの特異性を向上させることができるが、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の非存在下、即ち、ＡＴＰ−γＳだけでは、ＰＣＲの特異性を向上させることができないと言える。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
さらに、ＡＴＰ−γＳを加えた場合には、より特異的に核酸を増幅することができるため、所望の核酸の増幅により、より確実に一塩基多型を検出することが可能となる。
【実施例７】  次いで、第７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして上記実施例４で用いたオリゴヌクレオチドの一部（オリゴヌクレオチド３８〜４０）を用意した（第９図参照）。
次に、上記実施例４等と同様な条件でＰＣＲ反応を行い、核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第１７図〜第１９図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｅＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２５は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２６は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２７は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２８は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２９は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３０は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３１は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３２は、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３３は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３４は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３５は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３６は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３７は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３８は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３９は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４０は、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４１は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４２は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４３は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４４は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４５は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４６は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４７は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４８は、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にはじめてプライマーＤＮＡを加え、その後さらにプライマー伸長反応を３０サイクルを行ったものであり、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第１７図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のＤＮＡ（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン４では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
同様に、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン６では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン７では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン８では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
また、第１７図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１サイクル終了後にプライマーＤＮＡを加えた場合であっても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１０では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１１では、核酸の増幅が僅かに検出された。また、レーン１２では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多最に増幅された。
同様に、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１３では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１４では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１５では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン１６では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
また、第１８図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の３サイクル終了後にプライマーＤＮＡを加えた場合であっても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１８では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン１９では、所望の核酸の増幅が僅かに検出できた。また、レーン２０では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２２では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も僅かに見られた。また、レーン２３では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。また、レーン２４では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
また、第１８図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の６サイクル終了後にプライマーＤＮＡを加えた場合であっても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２５では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン２６では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン２７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン２８では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２９では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３０では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３１では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３２では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
また、第１９図（Ａ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１０サイクル終了後にプライマーＤＮＡを加えた場合であっても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３３では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３４では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン３５では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン３６では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン３７では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン３８では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も見られた。また、レーン３９では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４０では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
また、第１９図（Ｂ）の結果から明らかなように、プライマー伸長反応の１５サイクル終了後にプライマーＤＮＡを加えた場合であっても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４１では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４２では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４３では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４４では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
一方、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン４５では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン４６では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物の増幅も若干見られた。また、レーン４７では、所望の核酸の増幅が見られたが、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン４８では、所望のＤＮＡの増幅は見られたが、副産物も多量に増幅された。
まず、第１７図（Ａ）の結果より、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
なお、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質はＰＣＲサイクル中にかかる熱によって変性しやすい。このため、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質の効果が減少しやすいと考えられる。また、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質が変性した（１本鎖の）鋳型ＤＮＡに結合した状態で熱変性を起こすと、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質が鋳型ＤＮＡから離れなくなる。その結果、ＰＣＲ反応を阻害することになる。なお、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質を加えた場合も、これと同様な現象でＰＣＲ反応が阻害されると考えられる。
他方、Ｔ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、所望の核酸は増幅されない。
次に、第１７図（Ｂ）、第１８図及び第１９図の結果より、プライマー伸長反応を繰り返した後にプライマーＤＮＡを加えても、即ち、プライマーＤＮＡを加える前に反応液が繰り返し高温状態に置かれても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行ったときに、ＰＣＲの特異性が劣ることがない。従って、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質は、高温においても不活性化せず安定であると考えられる。
【実施例８】  次いで、第８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを用意し、プライマーＤＮＡとして上記実施例４と同様に５種類のオリゴヌクレオチド３７〜４１を用意した（第９図参照）。
次に、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．３μＭし、それ以外は上記実施例１と同様にしてＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、このＰＣＲの温度条件、即ち、１サイクル（７０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）を温度条件５とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は７０℃である。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２０図に示す。
レーン５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３７とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド３９とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン７は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４０とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン８は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド４１とオリゴヌクレオチド３８を加えたものである。
レーン１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３〜レーン２４は、ＰＣＲの温度条件を、１サイクル（８０℃，１０分間、９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）とした。これを温度条件６とする。１サイクル目の最初の温度（初期温度）は８０℃である。
レーン１３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、上記温度条件６の下で、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２０図（Ａ）の結果から明らかなように、初期温度が７０℃の場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８のうち、レーン５〜レーン７では、所望のＤＮＡ（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン８では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２のうち、レーン９〜レーン１１では、所望のＤＮＡの増幅が見られたが、副産物も若干検出された。また、レーン１２では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望のＤＮＡの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
なお、初期温度が７０℃の場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行った場合には、初期温度をかけない場合に比べ、副産物が多く検出された。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質は、７０℃で不活性化しやすいと考えれる。
一方、初期温度７０℃をかけ、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行っても、初期温度をかけない場合と同様に、副産物はほとんど検出されなかった。従って、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質は、７０℃でも不活性化しにくいと考えれる。
第２０図（Ｂ）の結果から明らかなように、初期温度が８０℃の場合、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１７〜レーン２０のうち、レーン１７〜レーン１９では、所望のＤＮＡの増幅が見られたが、副産物が若干検出された。また、レーン２０では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン２１〜レーン２４のうち、レーン２１〜レーン２３では、所望のＤＮＡの増幅が見られたが、副産物も検出された。この副産物の量は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えた場合に比べて多かった。また、レーン２４では、核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
他方、ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１３〜レーン１６では、所望のＤＮＡの増幅が見られたが、それ以外に副産物も多量に検出された。
まず、第２０図（Ａ）の結果より、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
次に、第２０図（Ｂ）の結果より、初期温度を８０℃に上げると、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性が若干低下する。従って、初期温度を８０℃に上げることにより、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の一部が不活性化するものと考えられる。
【実施例９】  次いで、第９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２１図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド５９〜６３）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）を参考にして設計した。
プライマーＤＮＡのうち、オリゴヌクレオチド６０とオリゴヌクレオチド６１は、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２２ｍｅｒの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド５９は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６２は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６３は、オリゴヌクレオチド６１のうち一の塩基をＣからＴに変えたものである。
2004027060.tif 000010
次に、上記実施形態４と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２２図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド５９とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６１とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６２とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６３とオリゴヌクレオチド６０を加えたものである。
レーン５は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳをさらに加えて、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２２図の結果から明らかなように、ＡＴＰ−γＳを加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、すべてのレーンについて、所望のＤＮＡ（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。
一方、ＡＴＰ−γＳを加えてＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８について見ると、レーン６では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン５とレーン７とレーン８では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ＡＴＰ−γＳの存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ＡＴＰ−γＳを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【実施例１０】  次いで、第１０の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
第２３図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６４〜６８）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１１４２Ｊ１９  ｆｒｏｍ  ７ｑ３５−ｑ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００４９７５）を参考にして設計した。
プライマーＤＮＡのうち、オリゴヌクレオチド６５とオリゴヌクレオチド６８は、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒまたは２１ｍｅｒの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６４は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６６は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＣに変えたものであり、オリゴヌクレオチド６７は、オリゴヌクレオチド６８のうち３’末端から３塩基目の一の塩基をＴからＧに変えたものである。
2004027060.tif 000011
またさらに、第２４図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６９〜７３）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）を参考にして設計した。
これらのプライマーＤＮＡのうち、オリゴヌクレオチド７０とオリゴヌクレオチド７１は、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２２ｍｅｒの塩基配列からなる。一方、オリゴヌクレオチド６９は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＡに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７２は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＧに変えたものであり、オリゴヌクレオチド７３は、オリゴヌクレオチド７１のうち３’末端から４塩基目の一の塩基をＣからＴに変えたものである。
2004027060.tif 000012
次に、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（タカラバイオ）の代わりにＥｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用い、さらに１ｍＭ（最終濃度）のＡＴＰ−γＳを加えて、それ以外は上記実施形態４等と同様な条件でＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。なお、このＥｘ  Ｔａｑは、通常（従来）のＰＣＲの条件下では、プライマーＤＮＡの３’末端の塩基配列を認識しないことが知られているものである。そして、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１等と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２５図に示す。
レーン９は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６４とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１０は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６６とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６７とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６８とオリゴヌクレオチド６５を加えたものである。
レーン１３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド６９とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７１とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１５は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７２とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１６は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７３とオリゴヌクレオチド７０を加えたものである。
レーン１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずに、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２５図（Ｂ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを加えた場合には、まず、レーン９〜レーン１２について見ると、レーン１２では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン９〜レーン１１では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。なお、写真に映っているのは、バックグラウンドであると考えられる。また、レーン１３〜レーン１６について見ると、レーン１４では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。これに対し、レーン１３とレーン１５とレーン１６では、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これらに対し、第２５図（Ａ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えない場合には、レーン１〜レーン４についてもレーン５〜レーン８についても、プライマーＤＮＡに対応するＤＮＡの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
また、第２５図（Ｃ）の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えた場合には、レーン１７〜レーン２０についてもレーン２１〜レーン２４についても、プライマーＤＮＡに対応するＤＮＡの増幅が検出され、また、副産物も検出された。
これらのことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
そしてさらに、ＡＴＰ−γＳの存在下では、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡが１００％相補的である場合にのみ、特異的に核酸を増幅させるようにすることができる。従って、ＡＴＰ−γＳを反応液に加えることにより、所望の核酸をさらに特異的に増幅することができる。
また、上記の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【実施例１１】  次いで、第１１の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２６図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして６種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド７４〜７９）を用意した。オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５は、Ｈｕｍａｎ  Ｓ１００  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ，ｅｘｏｎ  １（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｍ５９４８６  Ｊ０５６００）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｌｕｅ  ｃｏｎｅ  ｏｐｓｉｎ  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｌ３２８３５）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｅｔａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ（ＨＢＢ＠）  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＧ＿０００００７）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０〜２５ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000013
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ−ＨＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，５３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１μｌについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第２７図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７４とオリゴヌクレオチド７５を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７６とオリゴヌクレオチド７７を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド７８とオリゴヌクレオチド７９を加えたものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２７図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン３では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン４〜レーン６では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン９では、所望の核酸の他、レーン４〜レーン６ほどではないが、副産物も検出された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【実施例１２】  次いで、第１２の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第２８図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８０〜８４）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）及びＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＤ−２１６６Ｊ９，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ０１０４１２）を参考にして設計した。フォワード側のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド８０〜８３）は、任意のプライマー設計の可能性を示すため、それぞれ位置をずらして設計してある。一方、リバース側のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド８４）は、共通のものである。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２２ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000014
次に、上記実施例１１のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１１と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第２９図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８０とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８１とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８２とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８３とオリゴヌクレオチド８４を加えたものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに同量の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＡタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第２９図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４では、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）の増幅はほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８では、所望の核酸のみならず副産物も多量に検出された。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２では、所望の核酸の他、レーン５〜レーン８ほどではないが、副産物も検出された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
一方、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲを行った場合には、これを加えない場合よりは、ＰＣＲの特異性が向上するものの、副産物が若干生成されることにより、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加える場合ほどＰＣＲの特異性は向上しない。
【実施例１３】  次いで、第１３の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３０図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとしてオリゴヌクレオチド８５とオリゴヌクレオチド８６を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡのｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｐｙ  ｇｅｎｅについて設計した。具体的には、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１１４２Ｊ１９  ｆｒｏｍ  ７ｑ３５−ｑ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００４９７５）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０〜２１ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000015
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々１．０μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ−ＨＳ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９０℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第３１図に示す。
レーン１は、上記のように、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ１．０μＭ（最終濃度）として、ＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．３μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．１μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．０３μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．０１μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．００３μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．００１μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、プライマーＤＮＡの濃度をそれぞれ０．０００３μＭ（最終濃度）に減らして、それ以外はレーン１と同様なＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第３１図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン８のうち、レーン７，８を除くレーンでは、所望の核酸（正しい特異的なＰＣＲ産物）の増幅が検出された一方、副産物（非特異的なＰＣＲ産物）はほとんど検出されなかった。また、レーン７及びレーン８では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１６のうち、レーン９〜レーン１２では、所望の核酸のみならず副産物も検出された。また、レーン１３及びレーン１４では、所望の核酸の増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。また、レーン１５及びレーン１６では、プライマーＤＮＡの濃度が低すぎるためか、核酸の増幅がほとんど検出できなかった。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
【実施例１４】  次いで、第１４の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３２図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８７〜９１）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＢＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＣＴＢ−１３５Ｃ１８  ｆｒｏｍ  ７ｑ１１．２−ｑ２２，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００５１６４）を参考にして設計した。一方のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド８７〜９０）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９０が鋳型ＤＮＡと１００％相補的である。他方のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド９１）は、共通のものであり、鋳型ＤＮＡと１００％相補的である。各プライマーＤＮＡは、２２ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000016
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．３μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  Ｔａｑ−ＨＳ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，１分間）、３０サイクル（９４℃，３０秒間、６０℃，３０秒間、６８℃，１分間）、１サイクル（６８℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガローヌゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第３３図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８７とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８８とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド８９とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９０とオリゴヌクレオチド９１を加えたものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第３３図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型ＤＮＡと１００％相補的なプライマーＤＮＡを用いたレーン４では、所望のＤＮＡの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーＤＮＡを用いたレーン１〜レーン３では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のＤＮＡの増幅が検出された。また、レーン５及びレーン６では、副産物も増幅された。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のＤＮＡの増幅が検出された。また、レーン９及びレーン１０では、副産物が増幅された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーＤＮＡの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型ＤＮＡとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、ＲｅｃＡタンパク質と同様にＤＮＡに結合するＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【実施例１５】  次いで、第１５の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３４図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして５種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９２〜９６）を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＣ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ５−１１４２Ｊ１９  ｆｒｏｍ  ７ｑ３５−ｑ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＣ００４９７５）を参考にして設計した。一方のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド９２〜９５）は、３’末端から３番目の塩基配列をそれぞれ異ならせてあり、オリゴヌクレオチド９３が鋳型ＤＮＡと１００％相補的である。他方のプライマーＤＮＡ（オリゴヌクレオチド９６）は、共通のものであり、鋳型ＤＮＡと１００％相補的である。各プライマーＤＮＡは、２０〜２１ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000017
次に、上記実施例１４のレーン１等と同様な条件でＰＣＲ反応を行った。そして、その反応液について１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、上記実施例１４と同様にして、その結果を写真に記録した。これを第３５図に示す。
レーン１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９２とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９３とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン３は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９４とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン４は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９５とオリゴヌクレオチド９６を加えたものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりに、同量のＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えて、それ以外はレーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第３５図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン４について見ると、鋳型ＤＮＡと１００％相補的なプライマーＤＮＡを用いたレーン２では、所望のＤＮＡの増幅が強く検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。一方、３’末端から３番目の塩基が異なるプライマーＤＮＡを用いたレーン１，３，４では、所望の核酸の増幅がほとんど検出されなかった。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン５〜レーン８については、いずれのレーンにおいても所望のＤＮＡの増幅が検出された。また、レーン７では、副産物も増幅された。
また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質の代わりにＴ．ｔｈ．のＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン９〜レーン１２についても、いずれのレーンにおいても所望のＤＮＡの増幅が検出された。また、レーン１１では、副産物が増幅された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。具体的には、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの塩基のミスマッチがない場合においてのみ、特異的に核酸を増幅させることが可能となる。一般に、プライマーＤＮＡの３’末端近傍の塩基（特に、３’末端から３塩基以内の塩基）が鋳型ＤＮＡとミスマッチしている場合には、核酸が増幅されやすい傾向にある。しかし、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸を特異的に増幅させることができる。
一方、ＲｅｃＡタンパク質と同様にＤＮＡに結合するＴ．ｔｈ．ＳＳＢタンパク質を加えてＰＣＲを行っても、ＰＣＲの特異性は特に向上しない。
また、本実施例の結果より、一塩基多型を検出することが可能である。即ち、プライマーＤＮＡの１つに、鋳型ＤＮＡのうち一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行えば、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全に相補的である場合に、所望の核酸を増幅させるようにすることができる。一方、鋳型ＤＮＡと一塩基多型をなす塩基を含む配列に対応したプライマーＤＮＡとが完全には相補的ではない場合、即ち、一塩基多型をなす塩基がプライマーＤＮＡと相補的でない場合に、所望の核酸が増幅しない、または、抑制されるようにすることができる。このため、ＰＣＲによる所望の核酸の増幅により、一塩基多型を検出することが可能である。
【実施例１６】  次いで、第１６の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３６図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとしてオリゴヌクレオチド９７とオリゴヌクレオチド９８を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １４  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＢＡＣ  Ｃ−２２４０Ｈ２３  ｏｆ  ｌｉｂｒａｒｙ  ＣａｌＴｅｃｈ−Ｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １４  ｏｆ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ），ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＬ３５６０１７）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000018
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．５μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ｎｇのヒトｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）と、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ−ＨＳ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１×ＥｘＴａｑ−ＨＳ専用  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３０サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μｌについて１％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第３７図に示す。
レーン１は、上記のように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えたものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第３７図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。なお、下方に見えるシグナルはバックグラウンドと考えられる。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン２では、所望のＤＮＡの増幅が検出されなかった。これは、鋳型ＤＮＡに阻止的または抑制的２次構造の区域があるためと考えられる。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、鋳型ＤＮＡに阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型ＤＮＡに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
【実施例１７】  次いで、第１７の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第３８図及び第３９図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして１２種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９９〜１１０）を用意した。オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００は、Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ１１−７６０Ｍ１  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １３，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＬ３５４８１５）及びＨｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ，ｅｘｏｎ  １（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ７２９５９  Ｕ７２９６０）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２は、Ｈｕｍａｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ４９７４２  Ｋ０２２８１）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｅｔａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ（ＨＢＢ＠）ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＧ＿０００００７）を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６は、Ｈｏｍｏ  ｓｐａｉｅｎｓ  ＨＰＦＨ６０Ｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｘ８１４４５  Ｘ９１８３５）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８は、Ｈｕｍａｎ  ｐ５３（ＴＰ５３）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ９４７８８）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０は、Ｈｕｍａｎ  ｐ５３（ＴＰ５３）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ９４７８８）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０〜２７ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000019
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．８μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．０ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ−ＨＳ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μｌについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第４０図に示す。
レーン７は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド９９とオリゴヌクレオチド１００を加えたものである。
レーン８は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１０１とオリゴヌクレオチド１０２を加えたものである。
レーン９は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１０３とオリゴヌクレオチド１０４を加えたものである。
レーン１０は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１０５とオリゴヌクレオチド１０６を加えたものである。
レーン１１は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１０７とオリゴヌクレオチド１０８を加えたものである。
レーン１２は、プライマーＤＮＡとして、オリゴヌクレオチド１０９とオリゴヌクレオチド１１０を加えたものである。
レーン１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１５は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１６は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１７は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１８は、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１９は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２０は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン８と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２１は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン９と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２２は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１０と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２３は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２４は、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えて、レーン１２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第４０図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン７〜レーン１２では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はそれほど検出されなかった。
また、１５ｍＭ  ＫＣｌを加えたレーン１３〜レーン１８では、レーン７〜レーン１２よりも副産物の増幅が抑制された。
またさらに、３０ｍＭ  ＫＣｌを加えたレーン１９〜レーン２４では、レーン１３〜レーン１８よりも、効果的に副産物の増幅が抑制された。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン６では、所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物も多く検出された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、所望の核酸の収量を減少させることなく、副産物の増幅を低く抑えることができる。即ち、上記の相同組み換えタンパク質が存在することにより、プライマーＤＮＡが鋳型ＤＮＡの非特異的な領域に結合してプライマー伸長反応を起こすことが抑制されるため、非特異的なＰＣＲ産物の増幅を抑制することができる。
特に、ＰＣＲ反応液にＫＣｌを加えることにより、ＰＣＲの特異性を向上させることができる。
【実施例１８】  次いで、第１８の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４１図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとしてオリゴヌクレオチド１１１とオリゴヌクレオチド１１２を用意した。これらのプライマーＤＮＡは、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｂｅｔａ  ｇｌｏｂｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ（ＨＢＢ＠）ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＧ＿０００００７）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２１〜２２ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000020
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．２５μＭ（最終濃度）の２種類のオリゴヌクレオチドと、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．２５ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μｌについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第４２図に示す。
レーン１は、上記のように、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．２５ｕｎｉｔの加えてＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン２は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．６３ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン３は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．３１ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン４は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．１６ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン５は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．０８ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン６は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．０４ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン７は、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．０２ｕｎｉｔに減らして、それ以外はレーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン８は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン１と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン９は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン２と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１０は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン３と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１１は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン４と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１２は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン５と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１３は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン６と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
レーン１４は、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えないで、レーン７と同じＰＣＲ反応を行ったものである。
第４２図の結果から明らかなように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行ったレーン１〜レーン７のうち、レーン１〜レーン５において、所望のＤＮＡの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液にＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．０８ｕｎｉｔ以上に加えることにより、所望のＤＮＡが増幅された。
これに対し、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えずにＰＣＲ反応を行った場合には、レーン８〜レーン１４のうち、レーン８〜レーン１０のみに、所望のＤＮＡの増幅が検出された。即ち、ＰＣＲ反応液に  ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．３１ｕｎｉｔ以上に加えた場合にのみ、所望のＤＮＡが増幅された。
このことから、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応を行えば、ＤＮＡポリメラーゼの添加量を少なくしても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質がプライマーＤＮＡや鋳型ＤＮＡに結合し、プライマーＤＮＡと鋳型ＤＮＡとの結合を促進させるため、ＤＮＡポリメラーゼの添加量を少なくしても、ＰＣＲ反応が効率よく進行するものと考えられる。
【実施例１９】  次いで、第１９の実施例について説明する。なお、上記各実施例のいずれかと同様な部分の説明は、省略または簡略化する。
本実施例では、第４３図〜第４６図に示すように、鋳型ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、プライマーＤＮＡとして２０種類のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１１３〜１３２）を用意した。オリゴヌクレオチド１１３とオリゴヌクレオチド１１４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  １６ｐ１３．３ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ  １  ｏｆ  ８（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＥ００６４６２  ＡＥ００５１７５）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１５とオリゴヌクレオチド１１６は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＳＶＭＴ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｅｘｏｎ  １６  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＢ０４４４０１）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１１７とオリゴヌクレオチド１１８は、Ｈｏｍｏ  ｓｐａｉｅｎｓ  ＨＰＦＨ６０Ｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｘ８１４４５  Ｘ９１８３５）を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１１９とオリゴヌクレオチド１２０は、Ｈｕｍａｎ  ｐ５３（ＴＰ５３）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ９４７８８）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２１とオリゴヌクレオチド１２２は、Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ４−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ，ｅｘｏｎ  １（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ７２９５９  Ｕ７２９６０）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２３とオリゴヌクレオチド１２４は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ，ｚｅｔａ  １０４ｋＤａ（ＤＧＫＺ），ｍＲＮＡ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＭ＿００３６４６）を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１２５とオリゴヌクレオチド１２６は、Ｈｕｍａｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｕ４９７４２  Ｋ０２２８１）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２７とオリゴヌクレオチド１２８は、Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ＣＡＡＦ１（ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｍｎｉｏｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ  １），ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｄ８３６５７）を参考にして設計した。また、オリゴヌクレオチド１２９とオリゴヌクレオチド１３０は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＣＹＰ２１  ｇｅｎｅ，ｅｘｏｎｓ  １  ｔｈｒｏｕｇｈ  １０；  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ２１−ｈｙｄｐｏｘｙｌａｓｅ（ＣＹＰ２１）ｇｅｎｅ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｍ１２７９２  Ｍ２３２８０）を参考にして設計した。オリゴヌクレオチド１３１とオリゴヌクレオチド１３２は、Ｈｕｍａｎ  Ｓ１００  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｅｔａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅ，ｅｘｏｎ  １（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｍ５９４８６  Ｊ０５６００）を参考にして設計した。各プライマーＤＮＡは、鋳型ＤＮＡと１００％相補的な２０〜２６ｍｅｒの塩基配列からなる。
2004027060.tif 000021
2004027060.tif 000022
次に、ＰＣＲ反応により核酸を増幅させた。具体的には、５０μｌのＰＣＲ反応液中に、各々０．１μＭ（最終濃度）の２０種類のオリゴヌクレオチドと、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、１．２５ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と、０．２ｍＭのｄＮＴＰ混合液と、１．０μｇのＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を、１×ＥｘＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）に混合した。そして、ＰＣＲ反応を、１サイクル（９４℃，３０秒間）、３５サイクル（９４℃，１５秒間、５５℃，３０秒間、７２℃，１分間）、１サイクル（７２℃，７分間、４℃，１分間）で行った。
次に、反応液の１０μｌについて１．２％のアガロースゲルで電気泳動を行い、アガロースゲルをエチジウムブロミドの溶液に浸してゲル中のＤＮＡを染色し、その後、染色されたＤＮＡを写真に記録した。その結果を第４７図に示す。
第４７図の結果から明らかなように、各々のプライマーセットに対応した所望のＤＮＡの増幅が検出された一方、副産物はほとんど検出されなかった。
このことから、複数種類のプライマーＤＮＡを添加して同時にＰＣＲ反応を行っても、即ち、マルチプライマーＰＣＲを行っても、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えてＰＣＲ反応をさせれば、副産物の生成を抑制しつつ、所望の核酸を増幅させることができる。前述したように、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を加えることにより、プライマーＤＮＡの濃度を下げても所望の核酸が増幅できるため、このようなマルチプライマーＰＣＲを行っても、各々のプライマーセットに対応した所望のＤＮＡを増幅させることのできると考えられる。
以上において、本発明の実施の形態を実施例に即して説明したが、本発明は上記各実施例１〜１９に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で、適宜変更して適用できることは言うまでもない。
例えば、上記各実施例では、相同組換えタンパク質としてＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を使用したが、前述したように、それ以外のものを使用することも可能である。即ち、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を改変したものであってＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質（Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡ改変タンパク質）や、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質とＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡ改変タンパク質との混合物を用いてもよい。また、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡフラグメントを用いることもできる。
さらに、上記以外のＲｅｃＡタンパク質であっても、鋳型ＤＮＡに対する塩基のミスマッチが３塩基以内のプライマーＤＮＡについてのみプライマー伸長反応が起こるＲｅｃＡタンパク質を用いることができる。また、このようなＲｅｃＡタンパク質またはこのＲｅｃＡタンパク質を改変したタンパク質であってこのＲｅｃＡタンパク質と類似する機能を有するＲｅｃＡ改変タンパク質の少なくともいずれかを含む相同的組換えタンパク質を利用することもできる。
また、鋳型ＤＮＡが阻止的または抑制的二次構造の区域を有する場合には、一般的なＰＣＲを行ったとき、このような区域を有する所望の核酸を、効率よく特異的に増幅させることは困難である。
これに対し、本発明を適用すれば、鋳型ＤＮＡにこのような阻止的または抑制的２次構造の区域がある場合であっても、所望の核酸を効率よく特異的に増幅させることができる。その理由は、相同組み換えタンパク質が、鋳型ＤＮＡに結合することにより、阻止的または抑制的２次構造が解かれるためであると考えられる。
また、上記各実施例では、別途抽出し精製したＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を反応液に加えてＰＣＲを行っている。しかしながら、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等を発現可能なように形質転換した大腸菌等を用意し、これに熱処理を行ったものをＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等として利用することもできる。つまり、大腸菌等を熱処理して、耐熱性の高いＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等を残しつつ、他のタンパク質を失活させ、これをＰＣＲに利用する方法である。
特に、大腸菌のゲノムＤＮＡやプラスミドＤＮＡを鋳型ＤＮＡとする場合には、Ｔ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質等を発現する大腸菌等に熱処理を行うことで、鋳型ＤＮＡとＴ．ｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質を同時に得ることができるので、ＰＣＲを行うための作業効率を向上させることができる。
【産業上の利用可能性】  以上の説明から明らかなように本発明によれば、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅方法、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができる核酸増幅用試薬キット、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出する一塩基多型検出方法、及び、ＰＣＲ反応において副産物の増幅を抑制しつつ所望の核酸を増幅することができることを利用して一塩基多型を検出するための一塩基多型検出用試薬キットを提供することができる。
【配列表】
2004027060.tif 000023
2004027060.tif 000024
2004027060.tif 000025
2004027060.tif 000026
2004027060.tif 000027
2004027060.tif 000028
2004027060.tif 000029
2004027060.tif 000030
2004027060.tif 000031
2004027060.tif 000032
2004027060.tif 000033
2004027060.tif 000034
2004027060.tif 000035
2004027060.tif 000036
2004027060.tif 000037
2004027060.tif 000038
【図１】
2004027060.tif 000039
【図２】
2004027060.tif 000040
【図３】
2004027060.tif 000041
【図４】
2004027060.tif 000042
【図５】
2004027060.tif 000043
【図６】
2004027060.tif 000044
【図７】
2004027060.tif 000045
【図８】
2004027060.tif 000046
【図９】
2004027060.tif 000047
【図１０】
2004027060.tif 000048
【図１１】
2004027060.tif 000049
【図１２】
2004027060.tif 000050
【図１３】
2004027060.tif 000051
【図１４】
2004027060.tif 000052
【図１５】
2004027060.tif 000053
【図１６】
2004027060.tif 000054
【図１７】
2004027060.tif 000055
【図１８】
2004027060.tif 000056
【図１９】
2004027060.tif 000057
【図２０】
2004027060.tif 000058
【図２１】
2004027060.tif 000059
【図２２】
2004027060.tif 000060
【図２３】
2004027060.tif 000061
【図２４】
2004027060.tif 000062
【図２５】
2004027060.tif 000063
【図２６】
2004027060.tif 000064
【図２７】
2004027060.tif 000065
【図２８】
2004027060.tif 000066
【図２９】
2004027060.tif 000067
【図３０】
2004027060.tif 000068
【図３１】
2004027060.tif 000069
【図３２】
2004027060.tif 000070
【図３３】
2004027060.tif 000071
【図３４】
2004027060.tif 000072
【図３５】
2004027060.tif 000073
【図３６】
2004027060.tif 000074
【図３７】
2004027060.tif 000075
【図３８】
2004027060.tif 000076
【図３９】
2004027060.tif 000077
【図４０】
2004027060.tif 000078
【図４１】
2004027060.tif 000079
【図４２】
2004027060.tif 000080
【図４３】
2004027060.tif 000081
【図４４】
2004027060.tif 000082
【図４５】
2004027060.tif 000083
【図４６】
2004027060.tif 000084
【図４７】
2004027060.tif 000085
【国際調査報告】
2004027060.tif 000086
2004027060.tif 000087
2004027060.tif 000088