(57)【要約】本発明は、発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有するキメラマウス及び該キメラマウスから採取されるマウス胚性幹細胞由来の細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子を含むゲノムＤＮＡを有するマウス胚性幹細胞が導入されたマウス胚を発生させたキメラマウス。
【請求項２】
発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子が、生物学的活性を喪失したブラディオンタンパク質をコードするように遺伝子改変されていることを特徴とする、請求項１記載のキメラマウス。
【請求項３】
発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子が、そのコード領域全体を欠失するように遺伝子改変されていることを特徴とする、請求項１記載のキメラマウス。
【請求項４】
マウス胚性幹細胞がＰＪ１−５株由来であり、マウス胚がＣ５７ＢＬ／６系マウス由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラマウス。
【請求項５】
マウス胚が８細胞期胚、桑実胚及び胚盤胞からなる群より選択されるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラマウス。
【請求項６】
形態異常を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラマウス。
【請求項７】
形態異常が、頭蓋骨形成不良、視力障害、及び全身の発育不良からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６記載のキメラマウス。
【請求項８】
キメラ率が９０％以上９８％未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラマウス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のキメラマウスから採取される、マウス胚性幹細胞由来の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子改変により発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有するキメラマウスに関する。
【背景技術】  ２１世紀における分子医療革命は、ポストゲノム計画として、疾病の遺伝子・物質基盤を捉えて、個人特性に合わせた制御モニターシステムを構築していくことを目指している。具体的には、“Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ”の概念に基づいて、遺伝子病・癌・神経退行性疾患などの社会生活を脅かす疾患群のリスクグループの検出（診断及び遺伝子モニタリング）、さらにはリスク遺伝子の発見、並びに治療（例えば薬剤、遺伝子治療）に対する感受性検索など、個人の遺伝タイプに合った医療対応体制を確立するというものである。ここで、癌のみならず多くの疾病は、ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｅｆｆｅｃｔによるものであり、かつ、環境要因が大きく左右することから、何をコントロールしたら疾病にならないということは断言できない。しかしながら、疾病になってしまったものをコントロールする、いわゆる制御技術開発を通じて疾病制御対策をこうじることは可能なのである。
この概念に基づき、現在特に細胞の癌化・不死化制御技術開発が、脳神経系の分裂抑制物質解析等を通じて研究されることも多い。このような研究を通じて、様々な細胞増殖・分裂・癌化に関わる分子基盤が明らかにされてきた。そのような研究の結果として、既に、産業技術総合研究所（旧工業技術院）から、脳神経細胞の発生・分化後の長期生存に関わる細胞寿命制御因子であるヒトブラディオンタンパク質に関する発明の特許出願がなされている（特開２０００−１３９４７０号公報、特開２００１−１６１３８４号公報、米国特許第０９／４４０，９３６号）。これらの研究から、ブラディオンタンパク質は、成人脳神経系細胞、あるいは大腸癌・前立腺癌細胞、皮膚癌で特異的に発現することが判明しており、したがってこのブラディオンは、細胞変異等の早期診断のターゲットとしてはもちろんのこと、特異的阻害剤及び遺伝子治療のターゲットとして必要な諸条件を満たすことが明らかになった（上記特許群；Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１）２８６，５４７−５５３を参照のこと）。
【発明の開示】
ターゲットとなりうる情報伝達物質を発見しても、それを利用して本来の目的である疾病制御もしくは遺伝子機能制御技術の開発へと発展させるためには、培養細胞レベルの解析だけでは不十分であり、さらに生物個体モデルでの解析を行う必要がある。そのためには、適切な生物個体モデル動物を確立することが必要になってくる。この目的に対しては、現在のところ、特定の遺伝子に対する各種ノックアウトマウスを含む遺伝子改変動物が作製され、用いられている。
しかしながら、特定の遺伝子を発生時から発現抑制させる場合、発生過程においてその影響が形態形成及び生体機能にどのように及ぶがという点については、実質的に予測することは困難であるのが現状である。
本発明は、生物個体モデル動物及び遺伝育種用動物として有用な、新規ノックアウトキメラマウスを提供することを目的とする。
そこで、本発明者らはまず、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、遺伝子工学的手法により発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を少なくとも１つ有するマウス胚性幹細胞を作製することに成功した。この胚性幹細胞を導入することによりキメラマウスを作製したところ、該キメラマウスは脳神経系全般の発育不全、並びに全身の発育不良、頭蓋骨形成不良、及び視力障害などの形態異常を示すことが判明し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子を含むゲノムＤＮＡを有するマウス胚性幹細胞が導入されたマウス胚を発生させたキメラマウス。
そのような発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子は、生物学的活性が低下しているブラディオンタンパク質、又は生物学的活性を喪失したブラディオンタンパク質をコードするように遺伝子改変されているものであり得る。さらに、発現が抑制されている内在性ブラディオン遺伝子は、そのコード領域全体を欠失するように遺伝子改変されているものであり得る。
（２）マウス胚性幹細胞がＰＪ１−５株由来であり、マウス胚がＣ５７ＢＬ／６系マウス由来である、上記（１）のキメラマウス。
（３）マウス胚が８細胞期胚、桑実胚及び胚盤胞からなる群より選択されるものである、上記（１）又は（２）のキメラマウス。
（４）形態異常を示す、上記（１）〜（３）のキメラマウス。
この形態異常としては、頭蓋骨形成不良、視力障害、及び全身の発育不良が挙げられる。
（５）キメラ率が９０％以上９８％未満である、上記（１）〜（４）のキメラマウス。
（６）上記（１）〜（５）のキメラマウスから採取される、マウス胚性幹細胞由来の細胞。
以下、本発明を詳細に説明する。
ブラディオン遺伝子は脳神経細胞の長期生存に関わる遺伝子であることが報告されている。さらに、例えば該遺伝子はヒトでは成人脳等に特異的に発現が認められ、ヒト胎児では発現が認められないことから、ブラディオン遺伝子の発生過程における機能は未知であった。この点に関して、本発明で初めて、内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたキメラマウスが上記のような脳神経系の発育不全及び形態異常を示すことが明らかになったものである。この知見に基づき、本発明のキメラマウスは、上記のような脳神経系の発育不全及び形態異常が生ずる分子的機構を解明し、さらにはそのような脳神経系の発育不全及び形態異常と関連する障害及び疾患の治療又は制御方法を開発する上で、好適な生物個体モデル動物として提供され得ることが判明した。
したがって本発明は、発生時から発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を少なくとも１つ有するマウス胚性幹細胞を導入し作製したキメラマウスが、生物個体モデル動物及び遺伝育種用動物として有用であることを見出し、完成されたものである。
本発明は、少なくとも１つの内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたゲノムＤＮＡを有するマウス胚性幹細胞を作製し、その胚性幹細胞をマウス初期胚に導入して発生させることにより作製した、ブラディオン遺伝子発現抑制キメラマウスに関するものである。本発明のキメラマウスは、発生時よりブラディオン遺伝子を発現抑制させることにより、脳神経系の発育不全及び各種形態異常を生じていることを特徴とする。
１．ブラディオン遺伝子
ブラディオンは、ヒト成人の脳などに特異的に存在することが知られている脳神経細胞の長期生存に関わるタンパク質である。このタンパク質は、細胞分裂及び増殖制御に関わる物質（セプチンファミリー）と類似した構造を有するものであり、また同時に細胞寿命の決定因子（プログラム細胞死を引き起こす）の構造を有するものでもある。既に予備実験などにより、その機能解明が進んでおり、ブラディオンは、癌細胞に特異的発現を示すセプチンファミリーとよばれる細胞分裂制御因子であること、細胞分裂の最終の時点でＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケード、細胞増殖装置のモーターポンプとしての役割を果たすことも示されている。ヒトにおいて、ブラディオンタンパク質は、同じブラディオン遺伝子によってコードされる２種類の転写翻訳産物、すなわちα型とβ型とが存在することが知られている。またブラディオンタンパク質のヒトにおける組織特異的発現は、大腸癌組織及び皮膚癌組織においても認められている（Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ  ａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２８６，５４７−５５３（２００１））。さらに、マウスにおいては、ブラディオンタンパク質β型の相同体が存在することが報告されている（特開２０００−１３９４７０号公報）。
本発明は、このような知見から、発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有するキメラマウスを作製することができれば、脳神経細胞に関連する障害・疾患、及び細胞の癌化に関するモデル動物として有用であろうという着想に基づいて完成されたものである。
発現を抑制させる対象となる内在性ブラディオン遺伝子は、マウスゲノムＤＮＡ中に内在するブラディオン遺伝子の対立遺伝子の片方または両方である。本明細書において、「発現抑制」又は「発現を抑制」させた遺伝子とは、該遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性が天然形態よりも低下するように遺伝的に改変された遺伝子を意味する。さらに、「発現抑制」又は「発現を抑制」させた遺伝子とは、該遺伝子にコードされるタンパク質が生物学的活性を喪失するように遺伝的に改変された遺伝子をも意味する。さらにまた、「発現抑制」又は「発現を抑制」させた遺伝子とは、該遺伝子にコードされるタンパク質が産生されないように遺伝的に改変された遺伝子をも意味する。内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたゲノムＤＮＡとは、構造的には、該遺伝子の全体を欠失しているゲノムＤＮＡでもよいし、該遺伝子の一部を欠失しているゲノムＤＮＡでもよい。あるいは、該遺伝子の内部に外来性のＤＮＡ断片が挿入されているゲノムＤＮＡでもよい。
本発明では、以下の工程にしたがって、ブラディオン遺伝子を発現抑制させたゲノムＤＮＡを有するマウス胚性幹細胞を作製することができる。
特定の遺伝子を発現抑制させるためには、公知のジーンターゲティング法が広く用いられている。公知のジーンターゲティング法は、ターゲティングベクターを導入して相同組換えを起こさせることにより、所望の遺伝子に特定の変異を導入する方法である。このようなジーンターゲティング法の詳細については、すでに様々な文献に記載されており、以下の２〜５の工程はそれらの文献に従って行うことができる（相澤慎一：ジーンターゲティング−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，バイオマニュアルシリーズ８，羊土社（１９９５）；Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，Ｆ．，Ｌａｃｙ，Ｅ．：Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．：Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）等を参照されたい）。
２．ターゲティングベクターの作製
本発明において、マウス胚性幹細胞のゲノムＤＮＡ中のブラディオン遺伝子を発現抑制させるために用いるターゲティングベクターとしては、例えば以下の通りにして構築することができる。
まず、マウスブラディオン遺伝子において変異を導入する領域に対し５’側に位置する領域、及び３’側に位置する領域を相同領域として選択し、その領域に相当するＤＮＡ断片を調製する。そのために、例えば、マウスゲノムライブラリーからのマウスブラディオンｃＤＮＡによるスクリーニングによって、マウスブラディオン遺伝子を含むプラスミドクローンを取得する。次に、プラスミドクローンの制限酵素地図を作製し、サブクローニングを行い、該遺伝子の構造を決定する。そして、所望の相同組換え体を得る上で好適に相同組換えを起こさせ得る領域を選択することにより、上記相同領域に相同なＤＮＡ断片を設計することができる。この際、組換え頻度を向上させるためにはマウスゲノムライブラリーと使用するＥＳ細胞とが同じ系統に由来するものであることが好ましいが、別の系統に由来するものであってもよい。特にブラディオン遺伝子全体を欠失させる場合には、ブラディオン遺伝子よりも上流（５’側）及び下流（３’側）の領域を相同領域として選択することが好ましい。ブラディオン遺伝子の一部のエキソンを含む領域を欠失させる場合には、ブラディオン遺伝子中の目的領域の両側に位置するエキソンを相同領域として選択することが好ましい。ブラディオン遺伝子中に外来遺伝子を挿入する場合には、エキソン中に存在する挿入部位の両側の領域を相同領域として選択することが好ましい。これらの領域に相当するＤＮＡ断片は、前記マウスブラディオン遺伝子を含むプラスミドクローンから、目的の領域を制限酵素によりそれぞれ切り出したＤＮＡ断片として調製することができる。あるいはこれらのＤＮＡ断片は、目的とする領域をＰＣＲ法により増幅した増幅断片であってもよいし、化学合成により合成したものであってもよい。
次いで、これらのＤＮＡ断片をセレクション用マーカー遺伝子と連結させる。限定するものではないが、通常は、上記５’側ＤＮＡ断片、ポジティブセレクション用マーカー遺伝子、上記３’側ＤＮＡ断片、ネガティブセレクション用マーカー遺伝子の順に連結させる。ネガティブセレクション用マーカー遺伝子は、場合により使用しなくてもよく、また場合により上記以外のＤＮＡ断片又は他の化合物等を付加してもよい。変異を導入する部位に組み込まれるポジティブセレクション用マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ遺伝子）、ピューロマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシンＢ耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、ポジティブセレクション用マーカーとして好適に用いられるならばどのようなものを用いてもよい。ネオマイシン耐性遺伝子は、プラスミドクローンとして市販されている（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社等）。このようなターゲティングベクターを用いることにより変異導入部位に組み込まれるネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブセレクション用マーカー遺伝子は、その前後にｌｏｘＰ配列を挿入しておけば、ポジティブセレクション後に制限酵素Ｃｒｅを用いてゲノムＤＮＡ中から除去することも可能である。また、胚性幹細胞に導入する際にベクターを直鎖状化するために、ユニークな制限酵素部位を相同領域の外側に組み込んでおくことが好ましい。また、相同組換え体を相同領域の外側のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングする場合には、組換え遺伝子検出用の制限酵素切断部位を組み込んでおくことが好ましい。これらのＤＮＡ断片の連結は、当業者に公知の通常の方法に従って行うことができる。またこれらのＤＮＡ断片の連結は、例えばプラスミドベクター（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋等）又はファージベクター上等で行うと都合がよい。
上記のようにして設計・構築されたターゲティングベクターは、通常の分子生物学的手法により、例えば大腸菌の形質転換及び培養によるクローニングによって、増幅して使用することができる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい）。
３．内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させるマウス胚性幹細胞とそれを導入するマウス胚の選択
キメラマウスを作製する上では、胚性幹細胞株とそれを導入する胚（特に初期胚）のマウス系統との好適な組み合わせを選択する必要がある。この組み合わせによってキメラ形成率（キメラ率）が変化することから、好適なキメラ率を達成できる組み合わせを選択するべきである。また作製したキメラマウスを、その後、野生型マウス等と交配させてヘテロ接合体、ホモ接合体を作製するために用いることを意図する場合には、導入した胚性幹細胞がキメラマウスの生殖細胞系列に寄与するものであることが必要である。このため、本発明で用いる胚性幹細胞と初期胚のマウス系統との組み合わせは、相同組換え前の胚性幹細胞を初期胚に導入した場合、胚性幹細胞が生殖細胞系列に寄与することが確認されるものであることが好ましい。また、作製したキメラマウスの胚性幹細胞の寄与率（キメラ率）を容易に確認するためには、適切な遺伝的マーカーを利用できるような胚性幹細胞と初期胚のマウス系統との組み合わせを用いるのがよい。このような遺伝的マーカーとしては、体毛色が好適である。体毛色を用いれば、マウスの外観から、容易にキメラ率を判定することができる。
本発明のキメラマウス作製に用いることができる、胚性幹細胞株とそれを導入する初期胚のマウス系統との好適な組み合わせとしては、例えば、１２９系胚性幹細胞株（例えばＰＪ１−５株）とＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス初期胚、Ｄ３系胚性幹細胞株とＣ５７ＢＬ／６系マウス初期胚等が挙げられる。キメラマウス作製において好適に使用可能な胚性幹細胞および初期胚のマウス系統については、例えば「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」（Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ著、野田哲夫訳、メディカル・サイエンス・インターナショナル社；特に１０１頁表１および１０３頁）や「実験医学別冊  バイオマニュアルシリーズ８  ジーンターゲッティング」（相沢慎一著、羊土社（１９９５）；特に第２章ＩＶ  ＥＳ細胞の培養  ３１頁の表１、および３３頁表２Ａ）等の一般的な実験マニュアル書にも記載されている。但し、目的とするキメラマウスを作製可能であれば、これらの組み合わせに限定されるものではない。
４．発現抑制させた内在性ブラディオン遺伝子を有するマウス胚性幹細胞の作製
マウス胚性幹細胞中に、「２．ターゲティングベクターの作製」で調製したターゲティングベクターを導入する方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いる方法等、当業者に公知の任意の方法を用いることができる。
ターゲティングベクターを導入する方法としては、このうちエレクトロポレーション法が広く用いられており、その方法は以下のようにして行うことができる。
まずマウス胚性幹細胞としては、飼育細胞（フィーダー細胞）上で培養し、その後トリプシン処理により培養皿から剥離させた細胞浮遊液を用いる。細胞浮遊液は所定の濃度に調製しておくことが好ましい。上記の通り調製したターゲティングベクターは、相同領域の外側に組み込むように設定したユニークな制限酵素切断部位を利用して直鎖状化する。これを上記の細胞浮遊液と混合し、エレクトロポレーターによりパルスを加える。パルス印加後の胚性幹細胞は、培養液中で３６〜４８時間程度培養する。その後該培養液にポジティブセレクション用添加薬剤を添加して、ポジティブセレクションを行う。ターゲティングベクター構築に用いたポジティブセレクションマーカー用遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である場合には、ポジティブセレクション用添加薬剤としてＧ４１８を用いることができる。
上記のような添加薬剤を含有した培養液を毎日交換しながら胚性幹細胞の培養を継続し、７〜９日経過後、出現した薬剤耐性コロニーを採取する。
得られた薬剤耐性コロニーは、相同組換え体の候補と考えられる。そこでそれらのコロニーから抽出されるゲノムＤＮＡについて、サザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより所望の相同組換えを起こしたゲノムＤＮＡを有する胚性幹細胞株をスクリーニングする。
前記スクリーニングには、ターゲティングベクターの構築に用いた相同領域の外側に設定したプローブを利用したサザンハイブリダイゼーションを用いることができる。また前記スクリーニングには、ターゲティングベクターの構築に用いた相同領域の外側に設定したプライマーと、ｎｅｏ遺伝子内に設定したプライマーとを利用するＰＣＲを用いることもできる。
５．発現抑制されたブラディオン遺伝子を有するマウス胚性幹細胞を導入したキメラマウスの作製
次に、相同組換えにより所望の遺伝子変異を導入したマウス胚性幹細胞を、マウス初期胚に導入して、キメラマウスを作製する。このようなキメラマウスの作製方法としては、マウス初期胚として胚盤胞を利用してこれに胚性幹細胞を注入する方法（胚盤胞注入法）、マウス初期胚として８細胞期胚又は桑実胚を利用しこれと胚性幹細胞塊を接着させる方法（アグリゲーション法；Ａｎｄｒａ，Ｎら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８４２４−８４２８，１９９３、Ｓｔｅｐｈａｎ．Ａ．Ｗ．ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５８２−４５８５等を参照のこと）等の、当業者に公知の方法を用いることができる。
胚性幹細胞を導入したマウス初期胚は、偽妊娠マウスの子宮又は卵管内に胚移植し、キメラマウス個体へと発生させ、産出させる。この工程は当業者には公知であり、様々な文献及び実験プロトコールにしたがって実施することができる（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ら：「マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８、村松正實ら編：新遺伝子工学ハンドブック  第３版，羊土社（１９９９）、等を参照されたい）。
６．発現抑制されたブラディオン遺伝子を有するキメラマウスの特徴
上記のようにして作製され産出された本発明のキメラマウスは、その体細胞及び生殖細胞が、オリジナル系統由来のものと導入した胚性幹細胞由来のものとのキメラとなっている。このキメリズムの遺伝的マーカーとして、例えば、容易に観察することができる体毛色を用いることができる。この場合、キメラマウスを、初期胚の由来するオリジナル系統と異なる色の体毛を有するマウス系統に由来する胚性幹細胞を導入して作製すれば、その胚性幹細胞由来系統の毛色を示す体毛の割合から、胚性幹細胞の組織への寄与率（キメラ率）を算出することができる。このキメラ率は、例えば、外観から測定したそれぞれの体毛の面積に基づいて、胚性幹細胞の由来するマウス系統の体毛色の面積の割合を算出すればよい。
また、本発明のキメラマウスは、固有の性質として、脳神経系全般の発育不良を示す。さらに本発明のキメラマウスは、外観上、全身の発育不良、頭蓋骨形成不良及び／又は視力障害という顕著な形態異常を示す。本明細書において、全身の発育不良とは、正常マウスの同週齢の個体と比較して、体重及び体長が大幅に劣っている状態を意味する。また頭蓋骨形成不良とは、正常マウスの面長な頭蓋骨と比較して丸顔（ハムスター様）となる頭蓋骨を有しており、かつ正常マウスと比較すると眼球が顔面の大きさに比して大きいことを意味する。さらに視力障害とは、視神経の発育不良に起因するものであり、外観上はその視点が合っていない状態を意味する。
上記のように、脳神経系全般の発育不良、及び外観上顕著な形態異常を示すことから、本発明のキメラマウスは、先天的な脳神経系の発育不良と関連する障害及び疾患、並びに全身の発育不良、頭蓋骨形成不良、及び視神経系の発育不良に基づく視力障害と関連する障害及び疾患に関して、好適な生物個体モデル動物として用いることができる。さらに本発明のキメラマウスは、ブラディオンタンパク質が関与することが知られている、後天的な脳神経系の退行状態と関連する障害及び疾患、また細胞の癌化と関連する障害及び疾患、並びに細胞死と関連する障害及び疾患に関して、好適な生物個体モデル動物として用いることができる。これらの疾患及び障害に関する生物個体モデル動物としての本発明のキメラマウスは、ブラディオン遺伝子の詳細な機能の解明に有用であるだけでなく、脳神経系の形成・維持機構、細胞寿命制御機能の解明にも有用であり、さらには前記障害及び疾患の治療又は制御法の開発の上でも有用である。
また、本発明のキメラマウスが視神経の発育不良に基づく視力障害を示すことは、本発明のキメラマウスの大きな特徴である。本発明のキメラマウスにおいて、脳神経細胞で部位特異的・細胞特異的に働くことが報告されているブラディオン遺伝子を発現抑制させることにより、中枢神経系に先駆けて発生・分化が開始される視神経までが発生異常を引き起こすことが初めて明らかにされた。このことは、これまで解明されていない視神経発生異常の分子基盤を明らかにするための糸口となるものであり、さらに、発生段階における中枢神経系の分化以前の形態形成、及びそれに関連する障害及び疾患に関しても、本発明のキメラマウスを生物個体モデルとして用いることができる可能性を示すものである。
さらに本発明のキメラマウスは、内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させた生殖細胞を有するため、交配により、ヘテロ接合体及びホモ接合体の作製に用いることができる。また、他の遺伝子変異を有するマウスとの交配により、遺伝子同士の相互作用を解析することも可能である。その際、本発明のキメラマウスが顕著な形態異常を示すという特徴を、遺伝子の機能及び相互作用の変化を容易に観察できるマーカーとして、有利に利用することができる。したがって、本発明のキメラマウスは、遺伝育種用動物として有用である。
なお、本発明のキメラマウスから採取した、内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させた細胞を含む器官、組織、細胞集団も、本発明に含まれるものとする。これらの生体材料は、発育不全等の形態異常を示しているものであり得る。これらの生体材料も、上述したような遺伝子機能の解析、並びに障害及び疾患の治療・制御方法の開発において用いることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ターゲティングベクター構築に用いたサブクローンの制限酵素切断地図、並びに該サブクローンに含まれるマウスブラディオン遺伝子断片、マウスゲノムＤＮＡに含まれるブラディオン遺伝子、及び該遺伝子の相同組換えにより得られた組換え遺伝子を、それぞれ対応させて示した図である。
図２は、ターゲティングベクターの構造図である。
図３は、本発明において胚性幹細胞株２８１を用いて得たキメラマウスの外観上の形態異常を示す写真である。図３Ａ〜図３Ｄのマウスは実施例３で作製したキメラマウスであり、図３Ａは識別番号５８１ｍのキメラ個体、図３Ｂは識別番号５８２ｍのキメラ個体、図３Ｃは識別番号５８４ｆのキメラ個体、図３Ｄは識別番号５８０ｍのキメラ個体を示している。
図４は、本発明において胚性幹細胞株３４４を用いて得たキメラマウスの外観上の形態異常を示す写真である。図４Ａ〜図４Ｄのマウスは実施例３で作製したキメラマウスであり、図４Ａは識別番号５８９ｍのキメラ個体、図４Ｂは識別番号５８７ｍのキメラ個体、図４Ｃは識別番号５８５ｆのキメラ個体、図４Ｄは識別番号５８８ｍのキメラ個体を示している。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］  ターゲティングベクターの作製
ブラディオン遺伝子をコードするマウスｃＤＮＡ（配列番号１）をプローブとして、マウス・ゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ；Ｂａｃｔｅｒｉｌａ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製）を常法によりスクリーニングし、ＢＡＣ９４Ｒ−Ｃクローンを得た。そのＢＡＣクローンを、制限酵素ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ベクターｐＺＥｒ０−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中へサブクローニングを行った。そのサブクローン・ライブラリーより、３つのサブクローン、Ａ１（１７．７ｋｂ）、Ｅ２（５．１ｋｂ）、Ｆ１１（１４．１ｋｂ）をそれぞれ組み込んだプラスミド・クローンを得た（図１）。それらのサブクローンを各種制限酵素により消化し、アガロースゲル電気泳動による解析を行って、制限酵素マップを作成した（図１）。その結果、この３種のサブクローンは、マウスゲノム上で、５’側からＦ１１  Ａ１、Ｅ２の順に配列していることが判明した（図１）。次に、これらのサブクローンにおけるマウスブラディオン遺伝子の局在を確認するために、Ｆ１１、Ａ１、Ｅ２の各サブクローンを各種制限酵素によりそれぞれ消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、サザンハイブリダイゼーション解析を行った。そのためのプローブとしては、マウスブラディオン遺伝子の５’側非翻訳領域（５’ＵＴＲ）相当配列（９７ＵＴＲＦ／９４Ｒ）（配列番号２）、読み枠内領域相当配列（２２３Ｆ／３５６Ｒ）（配列番号３）、及び３’側領域相当配列（７４９Ｆ／９１９Ｒ）（配列番号４）の３種のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により調製して用いた。なお、この３’側領域相当配列（７４９Ｆ／９１９Ｒ）は、マウスブラディオン遺伝子中の、ヒトブラディオンαのｍＤＮＡ配列（配列番号５）の３’側非翻訳領域（３’ＵＲＦ）に対応する領域に含まれている。この解析の結果、サブクローンＡ１は、５’側非翻訳領域相当配列（９７ＵＴＲＦ／９４Ｒ）、読み枠内領域相当配列（２２３Ｆ／３５６Ｒ）、及び３’側領域相当配列（７４９Ｆ／９１９Ｒ）の各プローブにより検出され、またサブクローンＥ２は、３’側領域相当配列（７４９Ｆ／９１９Ｒ）のプローブにより検出された。サブクローンＦ１１は、上記３つのプローブのいずれを用いても検出されなかった。すなわち、サブクローンＡ１にはマウスブラディオン遺伝子が、Ｅ２には該遺伝子の後半の一部が含まれるが、サブクローンＦ１１には該遺伝子は含まれないことが判明した。
上記の解析に基づき、該遺伝子全体をノックアウトするためのターゲティングベクターを構築した。相同組換えに利用するマウスブラディオン遺伝子の外側の配列としては、サブクローンＦ１１の制限酵素ＸｂａＩによる切り出し断片（４．１ｋｂ）と、サブクローンＡ１の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによる切り出し断片（３．３ｋｂ）とを選択し、これらのＤＮＡ断片を制限酵素によって切り出して、通常法により調製した。また、ポジティブセレクションマーカーとして用いるネオマイシン耐性遺伝子を、プラスミド・クローンｐＧＴ−Ｎ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）からの制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩによる切り出し断片として同様に調製した。次いで、ベクター３８ｌｏｘＰに、Ｆ１１のＸｂａＩ断片、ｌｏｘＰ、ネオマイシン耐性遺伝子、ｌｏｘＰ、Ａ１のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片の順に連結して、ターゲティングベクターを構築した。
［実施例２］  ブラディオン遺伝子を完全欠失した対立遺伝子を有する胚性幹細胞の作製
（１）ターゲティングベクターの胚性幹細胞への導入及び相同組換え体の選択
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）ＰＪ１−５株を継代後、培養液中で３７℃、５％ＣＯ２で３６時間培養した。この胚性幹細胞を、１００ｍｍ培養皿当たり３ｍｌのトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１５０５０−０６５）を用いて処理することにより培養皿から剥がし、これをピペッティングして、単細胞として浮遊させた。これに１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を７ｍｌ加え、さらにピペッティングした。
次いで、飼育細胞（フィーダー細胞）だけを培養皿に付着させて胚性幹細胞と分けるために、前記細胞浮遊液を別の１００ｍｍ培養皿に播き、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に１５〜３０分間入れた。その後、上清を採取し、２〜５培養皿分を１本の５０ｍｌチューブにまとめ、２７０ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引除去し、ペレットを、細胞を剥がす前の培養皿１枚あたり１ｍｌの氷冷リン酸緩衝液に再懸濁して浮遊させた。溶液中の細胞数を数え、７×１０６細胞／ｍｌに濃度を調整した。
このようにして得た細胞浮遊液（７×１０６細胞／ｍｌ）０．８ｍｌと、制限酵素ＮｏｔＩで処理して直鎖状にしたベクターＤＮＡ４０μｇとを混合した後、エレクトロポレーション用キュベット（ＢｉｏＲａｄ社製、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６５−２０８８）に移した。これに、エレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ社製、ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ）で２４０Ｖ、５００μＦのパルスを加えた。次いでキュベットをキュベットホルダーから取り出し、氷上に２０分間静置した。その後、キュベット中の細胞浮遊液を、マウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む上記培養液１０〜２０ｍｌ中に移した。
次に、このＬＩＦ含有培養液中に懸濁した細胞浮遊液を、ゼラチンコーティングした培養皿に１枚あたり１０ｍｌずつ播いた。翌日、培養液を交換し（ＬＩＦを含んだ培養液を使用）、さらに２日後、ＬＩＦを含んだ培養液に、選択性薬剤である１５０〜２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を加えて培養した。培養液を毎日交換しながらコロニーの観察を続け、選択後８日頃から出現した薬剤耐性コロニーを複数個採取し、各々クローン化し、株化した。
（２）サザンハイブリダイゼーションによる相同組換え体の同定
上記のようにして得た薬剤耐性コロニー（Ｇ４１８による選択の約８日後に出現）を、サザンハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングし、ブラディオン遺伝子全体が欠失した相同組換え体を同定した。
そのためにまず、ブラディオン遺伝子全体が欠失した相同組換え体の候補である薬剤耐性コロニー由来の胚性幹細胞株２７９、２８１、３１３、３４４のそれぞれのゲノムＤＮＡ抽出用培養細胞から、通常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。そのゲノムＤＮＡについて、制限酵素ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで各々消化したサンプルを作製した。両サンプルはアガロース・ゲル電気泳動に供し、その後ナイロン・メンブレンにブロッティングした。
サザンハイブリダイゼーションは、以下の手順で３回、プローブ毎に行った。まず、プレハイブリダイゼーション溶液を用いて、６５℃で３０分間のプレハイブリダイゼーションを行い、次いでハイブリダイゼーション溶液及び下記のプローブを１種づつ用いて、６５℃で一晩のハイブリダイゼーションを行った。その後、０．１×ＳＳＣ−０．１×ＳＤＳ溶液により６５℃で１５分間洗浄を行い、さらに同様の洗浄を再度行い、さらにメンブレンをイメージアナライザー（ＢＡＳ２０００）を用いてシグナルの解析を行った。
プローブとしては、ブラディオン遺伝子の上流のゲノム配列を認識する５’プローブ、ネオマイシン耐性遺伝子を認識するＮｅｏプローブ、ブラディオン遺伝子の下流のゲノム配列を認識する３’プローブをそれぞれ別々に用いた。５’プローブは、実施例１のサブクローンＦ１１のＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ切り出し断片として調製した０．９ｋｂのＤＮＡ断片であり、相同組換えが起こった遺伝子又は野生型遺伝子において、図１に示す通りブラディオン遺伝子の上流の配列を認識する。３’プローブは、実施例１のサブクローンＡ１のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ切り出し断片として調製した０．６ｋｂのＤＮＡ断片であり、相同組換えが起こった遺伝子又は野生型遺伝子において、図１に示す通りブラディオン遺伝子のすぐ下流の配列を認識する。Ｎｅｏプローブは、Ｆｉｎａｌ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社製）のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ切り出し断片として調製した１．８ｋｂのＤＮＡ断片であり、図１に示す通り、ターゲティングベクターとの相同組換えによりゲノムに組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）を認識する。これらのプローブは、ａｌｐｈａ−ＣＴＰ３２を用いてＲｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈｒａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）によりラベリングして用いた。
これらのプローブを用いて解析を行ったところ、ＢａｍＨＩで消化したサンプルでは、相同組換えの起こっている胚性幹細胞由来ＤＮＡサンプルでは５．７キロベースのシグナルが、相同組換えの起こっていない胚性幹細胞由来の野生型対立遺伝子のみを含むＤＮＡサンプルでは１７．７キロベースのシグナルが認められた。ＨｉｎｄＩＩＩで消化したサンプルでは、相同組換えの起こっている胚性幹細胞由来ＤＮＡサンプルでは１２．２キロベースのシグナルが、相同組換えの起こっていない胚性幹細胞由来の野生型対立遺伝子のみを含むＤＮＡサンプルでは１４．１キロベースのシグナルが検出された。
このようなサザンハイブリダイゼーションの結果より、内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制されたゲノムＤＮＡを有する胚性幹細胞株として２８１株及び３４４株が同定された。したがって、胚盤胞への胚性幹細胞の注入のために、胚性幹細胞株２８１及び３４４を選定した。
［実施例３］  ブラディオン遺伝子を欠失したゲノムを有するマウス胚性幹細胞を用いたキメラマウスの作製及び該キメラマウスの形態観察
胚性幹細胞株２８１及び３４４のそれぞれを、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの胚盤胞へマイクロインジェクション法により注入した。その後常法に従って、該胚盤胞を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植し、個体へと発生させた。
その結果、以下のキメラマウスが得られた。
▲１▼胚性幹細胞株２８１を用いて得たキメラマウス（２００１年５月６日誕生）
キメラ個体（識別番号５８０ｍ）・・・キメラ率９０％、雄
キメラ個体（識別番号５８１ｍ）・・・キメラ率９０％、雄
キメラ個体（識別番号５８２ｍ）・・・キメラ率９０％、雄
キメラ個体（識別番号５８３ｍ）・・・キメラ率９０％、雄
キメラ個体（識別番号５８４ｆ）・・・キメラ率９５％、雌
▲２▼胚性幹細胞株３４４を用いて得たキメラマウス（２００１年５月８日誕生）
キメラ個体（識別番号５８５ｆ）・・・キメラ率９０％、雌
キメラ個体（識別番号５８７ｍ）・・・キメラ率９８％、雄
キメラ個体（識別番号５８８ｍ）・・・キメラ率９８％、雄
キメラ個体（識別番号５８９ｍ）・・・キメラ率９０％、雄
図３及び４は、上記で得られたキメラマウスの外観を示す写真である。図３には、胚性幹細胞株２８１を用いて得たキメラマウスを示した。図４には、胚性幹細胞株３４４を用いて得たキメラマウスを示した。いずれのキメラマウスにおいても、全身の発育不良、ハムスター様の顔、比較的大きな眼球、及び視点の定まらない様子が観察される。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明により、脳神経系の発育不全及び各種形態異常を示す、発生時より内在性ブラディオン遺伝子を発現抑制させたキメラマウスが提供される。このキメラマウスは、脳神経系の異常に関連した生物個体モデル動物及び遺伝育種用動物として有用に利用できる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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