(57)【要約】バイオチップ使用時にスポット内での濃度分布がつかず、にじみ等の欠陥が発生しない、各スポットで高いＳ／Ｎ比が得られように、検出ＤＮＡを高密度に、しかも高精度に固定できる、スタンプ法に好適なバイオチップ用基板の提供を目的とする。基材上に、シリカ粒子やアルミナ粒子などの無機粒子を含み、好ましくは平均細孔半径が１〜１００ｎｍで、細孔容積が０．１〜５ｃｍ３／ｇである、多孔質層を有することを特徴とするバイオチップ用基板。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、該基材上に設けられた無機粒子を含む多孔質層とを有することを特徴とするバイオチップ用基板。
【請求項２】
前記無機粒子がアルミナ粒子および／またはシリカ粒子である請求項１記載のバイオチップ用基板。
【請求項３】
前記無機粒子がベーマイト粒子である請求項２記載のバイオチップ用基板。
【請求項４】
前記多孔質層が平均細孔半径１〜１００ｎｍを有する請求項１、２または３記載のバイオチップ用基板。
【請求項５】
前記多孔質層が細孔容積が０．１〜５ｃｍ３／ｇである請求項１、２、３または４記載のバイオチップ用基板。
【請求項６】
前記多孔質層表面上にＤＮＡ断片を含む層を有する請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、数百〜一万種類以上の遺伝子に対応するＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖やタンパク質断片などの生体高分子オリゴマを微小量ずつ整列、固定化するバイオチップに好適な基板に関する。
【背景技術】  バイオチップの代表的なものとして、多種類のＤＮＡの断片（以下、検出ＤＮＡという）を数百〜数万の微小なスポットとして基板上に固定させた、ＤＮＡチップがある。ＤＮＡチップに人間や動物のＤＮＡで評価したいもの（以下、評価ＤＮＡという）を作用させる（ハイブリダイゼーション）ことにより一度に多数のＤＮＡの配列を検出評価し、個体間の配列の違いや、細胞状態の違いによる遺伝子発現量の差などを解析できる。なお、ＲＮＡ、糖鎖等についても同様であり、以下の説明では代表例としてＤＮＡについて説明する。
バイオチップの作成法は、基板上に検出ＤＮＡを固定させる方法により、フォトリソグラフィを利用した固相合成法と、あらかじめ用意した多種類の検出ＤＮＡを基材上に並べていくスタンプ（スタンピング）法とに大別される。固相合成法は、多種類の生体高分子オリゴマを高密度に合成、配列できる技術であるが、タンパク質のような高次構造には適用できない、低コスト化には不適である、とされている（特開２００２−１３１３２７号公報参照。）。
これに対してスタンプ法は、検出ＤＮＡの入った溶液を基板平面上の特定の位置に何らかの方法により接触させるもので、検出ＤＮＡの制約が少なく、低コスト化に好適とされている。スタンプ法の具体的な態様として、ピンを使用して植え付ける方法（特開２０００−１５７２７２号公報参照。）やインクジェットを使用して植え付ける方法（特開２００１−３２４５０５号公報参照。）が提案されている。
従来、バイオチップの基板としては、スライドガラスなどのガラスプレート上にニトロセルロースなどの多孔質ポリマを形成したものがある（米国特許第６３１９６７４号公報参照。）。アミノ基およびカルボキシル基を含有したポリリジンを使用し、該ポリリジンをガラス基板の表面にコーティングするものがある（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、アメリカ、１９９５年、第２７０巻、ｐ．４６７−４７０参照。）。アミノシランをガラス基板の表面にコーティングするものもある（ニュークレイック  アシッド  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、イギリス、１９９４年、第２２巻、ｐ．５４５６−５４６５参照。）。また予め人工的に末端にアミノ基などの官能基を持たせたＤＮＡ断片を、該官能基との共有結合により基材に固定化するものも知られている（特開２００３−１２１４３７号公報参照）。しかし、いずれも濃度分布がついたり、にじみが発生するなどの問題があり、各スポットで高いＳ／Ｎ比が得られるようなスタンプ法に好適なバイオチップ用基板については提案されていない。
【発明の開示】
本発明は、バイオチップ使用時にスポット内での濃度分布がつかず、にじみ等の欠陥が発生しない、各スポットで高いＳ／Ｎ比が得られように、検出ＤＮＡを高密度に、しかも高精度に固定できる、スタンプ法に好適なバイオチップ用基板の提供を目的とする。
本発明は、以下の要旨を有するものである
（１）基材と、該基材上に設けられた無機粒子を含む多孔質層を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
（２）前記無機粒子がアルミナ粒子および／またはシリカ粒子である上記（１）記載のバイオチップ用基板。
（３）前記無機粒子がベーマイト粒子である上記（２）記載のバイオチップ用基板。
（４）前記多孔質層が平均細孔半径が１〜１００ｎｍである上記（１）、（２）または（３）記載のバイオチップ用基板。
（５）前記多孔質層が細孔容積０．１〜５ｃｍ３／ｇを有する上記（１）〜（４）のいずれか記載のバイオチップ用基板。
（６）前記多孔質層表面上にＤＮＡ断片を含む層を有する上記（１）〜（５）のいずれか記載のバイオチップ。
【図面の簡単な説明】  図１の（ａ）は、ベーマイト基板上の点着スポットの蛍光例（２次元表示）であり、図１の（ｂ）は、比較用基板上の点着スポットの蛍光例（２次元表示）である。
図２は、ベーマイト基板上の点着スポットの蛍光例（３次元表示）である。
図３は、比較用基板上の点着スポットの蛍光例（３次元表示）である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のバイオチップ用基板（以下、本基板という）は、基材上に無機粒子を含む多孔質層を形成したことを特徴とする。本発明において、基材としては特に制限されないが、ガラス、合成石英ガラス、セラミックス、金属、プラスチックスなどのプレートやフィルムが挙げられる。検出ＤＮＡには、通常、蛍光物質が標識としてついているが、光を照射させたときに前記蛍光物質以外からの蛍光（以下、蛍光バックグランドという）が少ないものほど検出感度が高くなり、基材は、その点からは、ガラス、合成石英ガラス、セラミックス、または金属が好ましい。
本基板において、多孔質層を形成する無機粒子としては、アルミナ粒子、シリカ粒子、ジルコニア粒子、ムライト粒子などの酸化物粒子、炭化ケイ素粒子、窒化ケイ素粒子などの非酸化物粒子、シリコン粒子などの金属粒子が挙げられる。
本基板において、無機粒子としては酸化物粒子、なかでもアルミナ粒子および／またはシリカ粒子であると検出ＤＮＡの固定が強固となるため好ましい。詳細な理由は不明であるが、アルミナ粒子、シリカ粒子は、表面が帯電状態であり、標識として蛍光物質がついた検出ＤＮＡが帯電している場合、静電的な結合により固定が強固になるものと推測される。検出ＤＮＡは、アニオン性に帯電しているものが多いことから無機粒子がアルミナ粒子であるとさらに好ましい。
アルミナ粒子としては、ベーマイト（アルミナ水和物）粒子であると検出ＤＮＡの固定が強固であるので特に好ましい。本明細書において、ベーマイトとはＡｌ２Ｏ３・ｎＨ２Ｏ（ｎ＝１〜１．５）として表されるものをいう。ベーマイトは、ベーマイトゾルの形態で使用されると好ましい。これらのアルミナ水和物は、塗工液中で、一次粒子直径（以下、粒子直径を粒径と略す）が５〜１５ｎｍのものが好ましい。塗工液中で凝集している場合、二次凝集粒径が１００〜３００ｎｍであると好ましい。
なお、無機粒子としては、シリカアルミナ複合粒子でもよい。シリカアルミナ複合粒子は、コロイド粒子としてシリカとアルミナとを含む凝集粒子が水性媒体中に分散したゾルとして使用されると好ましい。ここで、アルミナの単体からなる粒子だけでなく、コアがシリカで表面がアルミナであるようなシリカ−アルミナ複合粒子でもよい。
本基板において、多孔質層には無機粒子以外にバインダーなどを含んでいてもよい。バインダーとしては、一般にデンプンまたはその変成物、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはその変成物、スチレンブタジエンゴム（ＳＢＲ）ラテックス、アクリルニトリルブタジエン（ＮＢＲ）ラテックス、ゼラチン、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミドなどの水溶性重合体、アルコール可溶性の重合体若しくはこれらの重合体の混合物などを使用できる。これらのうち、ＰＶＡを採用するとベーマイトの好ましい物性を実質的に阻害することなく、充分な機械的強度が得られるため好ましい。結合材の添加量としては、無機粒子１００質量部に対して、好ましくは、１〜３０質量部、特には、３〜１５質量部含まれるのが好ましい。本基板において、多孔質層の細孔容積が０．１〜５ｃｍ３／ｇであると好ましく、０．３〜２ｃｍ３／ｇであるとより好ましく、０．５〜１．５ｃｍ３／ｇであるとさらに好ましく、０．７〜１．２ｃｍ３／ｇであると特に好ましい。
本基板において、多孔質層としては平均細孔半径が１〜１００ｎｍであると好ましく、平均細孔半径が３〜２５ｎｍであるとＤＮＡ断片の吸収性などの点でより好ましい。さらには、その細孔半径が実質的に１〜１００ｎｍにあり、１００ｎｍを超える細孔半径が実質的に存在しないことが好ましい。本明細書において、細孔特性は窒素吸脱着法により測定するものとする。
本基板において、多孔質層の膜厚は適宜選択されるが、乾燥後の厚さとして、１〜１００μｍであると好ましい。無機粒子がベーマイト粒子の場合、膜厚が１０〜３０μｍであると好ましく、膜厚が１２〜２５μｍであるとさらに好ましい。無機粒子がシリカ粒子の場合、膜厚が１５〜６０μｍであると好ましく、膜厚が２０〜４５μｍであるとさらに好ましい。
前記多孔質層の形成法としては、特に制限されないが、塗工法などが挙げられる。例えば、無機粒子に結合材等を加えてスラリー状とし、ロールコーター、エアナイフコーター、ブレードコーター、ロッドコーター、バーコーター、コンマコーター、グラビアコーター、ダイコーター、カーテンコーター、スプレーコーター、スライドダイコーターなどを用いて塗布し、乾燥する方法を採用できる。塗工法においては、無機粒子を含む塗工液を調製し、塗工機器を使用して塗工液を塗工後、乾燥して多孔質層とする。塗工量としては、１〜１００ｇ／ｍ２であると好ましい。
本基板に検出ＤＮＡを固定させる方法としては、特に制限されないが、インクジェット法が好適な方法として挙げられる。
以下に本発明の実施例と比較例を示す。
［例１（実施例）］
容量２Ｌのガラス製反応器（セパラブルフラスコ、撹拌羽根・温度計付き）に水９００ｇ（５０モル）とイソプロピルアルコール７５１ｇ（１２．５モル）を仕込み、マントルヒーターにより液温を７５℃に加熱した。撹拌しながらアルミニウムイソプロポキシド２０４．２５ｇ（１モル）を添加し、液温を７５〜７８℃に保持しながら１２０時間加水分解した。そのあとイソプロピルアルコールを留去しながら９５℃に昇温し、酢酸６ｇ（０．１モル）を添加して４８時間９５〜９７℃に保持して解膠した。さらにこの液を４００ｇになるまで濃縮し、白色のベーマイトゾルを得た。得られたゾル液の固形分は、１５質量％（以下、％と略す）であった。
得られたベーマイトゾルにポリビニルアルコール（ケン化度９９．８％、重合度４０００）をベーマイト固形分に対して１０質量％加え、７６ｍｍ×２６ｍｍ×厚さ１ｍｍのスライドガラス（松浪硝子社製、材質：ソーダライムガラス）上にバーコーターを用いて塗布し、７０℃で乾燥してバイオチップ用基板を得た。乾燥後の多孔質層（塗工層）の厚さは１６μｍであった。
蛍光標識分子（Ｃｙ３、Ｃｙ５）を結合させたＤＮＡ断片（７５量体）を、蒸留水で希釈しＤＮＡ濃度が０．１〜１μｇ／μＬである希釈液を作成した。直径０．５ｍｍのステンレスピンの先端を該希釈液に付け、上記で作成したバイオチップ用基板上に、およそ０．５〜１．５ｎＬずつ点着した。この点着したスポットを静置乾燥させて評価サンプルとした。
［例２（比較例）］
例１において、ベーマイトを含む多孔質を形成したスライドガラスの代わりにポリ−Ｌ−リジンコートしたスライドガラスを用いた以外は例１と同様にした。
［評価および評価結果］
例１、例２で得られた評価サンプルを使用して、蛍光特性を評価した。評価用サンプルの点着面を、蛍光測定装置を用いて、励起光５３２ｎｍおよび６３５ｎｍに対してそれぞれ５７５ｎｍおよび６７０ｎｍの蛍光を観察した。結果を図１から図３に示す。
図１は点着スポットからの蛍光を２次元で表したものであり、図中（ａ）は例１の評価サンプルの点着スポット（概ね楕円形状）からの蛍光を、（ｂ）は例２の評価サンプルの点着スポットからの蛍光をそれぞれ示す。白い程蛍光強度が強く、黒い程蛍光強度が弱い。（ａ）の方が（ｂ）に比べて点着スポット全体から強度の強い蛍光が発生していることがわかる。図２は図１（ａ）を立体的に表したものであり、図３は図１（ｂ）を立体的に表したものである。
すなわちポリ−Ｌ−リジンコート済みのスライドガラス（以下、比較用基板という）上の点着スポットの蛍光特性（図１（ｂ）、図３）では、点着スポット内の蛍光にムラが見られ蛍光強度も弱い。一方、本発明のベーマイトを含む多孔質を形成したスライドガラス（以下、ベーマイト基板という）上の点着スポットの蛍光特性（図１（ａ）、図２）では、点着スポット内の蛍光のムラがほとんどなく、蛍光強度も強い。また、図示していないが、点着スポット間の蛍光特性を比較したところ、ベーマイト基板上の点着スポット間の蛍光特性の差はほとんど観察されなかったが、比較用基板上の点着スポット間の蛍光特性、特に蛍光強度、に差が認められた。
【産業上の利用可能性】  蛍光ラベルを施した評価ＤＮＡを作用させた場合に、本基板を使用することにより、検出ＤＮＡを高密度、高精度に強固に固定できる。すなわち、ハイブリダイゼーション作用が高効率・効果的にでき検出感度が向上する。特に、本基板の多孔質層がベーマイトを含むものであると、マイナスに荷電した化学物質やタンパク質の定着に優れるためインクジェット法によるスタンピングに好適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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