(57)【要約】ＨＤＡＲＴは、ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能する。また、ＨＤＡＲＴは、核内レセプターの転写コアクチベーターとして機能するＳｋｉｐと直接結合し、核内レセプターの転写を抑制する。さらに、ＨＤＡＲＴは核内レセプターの転写コリプレッサーの１つであり、ＨＤＡＣと結合しＨＤＡＣのヒストン脱アセチル化により強力に転写を抑制し得る。一方、ＨＤＡＲＴのドミナントネガティブペプチドも得られ、このペプチドは完全長のＨＤＡＲＴたんぱく質とは逆に転写を活性化することをも確認した。特にこのペプチドによるレチノイン酸レセプターの転写活性化能はａｌｌ−ｔｒａｎｓ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）を上回る活性を有していた。【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写抑制因子をコードしたＤＮＡであって、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたＤＮＡ、または、
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
転写抑制因子をコードしたＤＮＡであって、
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたＤＮＡ、または
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡによりコードされた転写抑制因子。
【請求項４】
核内ホルモンレセプターに起因した転写を抑制し得る請求項３記載の転写抑制因子。
【請求項５】
転写を活性化し得るペプチドをコードしたＤＮＡであって、
（Ａ）配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしたＤＮＡ、または
（Ｂ）配列番号１における１から５３７塩基までの塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
転写を活性化し得るペプチドをコードしたＤＮＡであって、
（Ａ）配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしたＤＮＡ、または
（Ｂ）配列番号１における１から５３７塩基までの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５または６に記載のＤＮＡによりコードされた転写活性化ペプチド。
【請求項８】
請求項１、２、５または６のいずれかに記載のＤＮＡのうち、少なくとも１５ヌクレオチド長を有するＤＮＡ
【請求項９】
請求項１、２、５または６のいずれがに記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項１０】
請求項１、２、５または６のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項９に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項３に記載の因子または請求項７に記載のペプチドに結合し得る抗体。
【請求項１２】
請求項１、２、５または６のいずれかに記載のＤＮＡとハイブリダイズし、少なくとも１０ヌクレオチド長を有する、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかが固定された基板。
（Ａ）請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
（Ｂ）請求項３または４に記載の転写抑制因子、もしくは該因子の部分ペプチド
（Ｃ）請求項７に記載の転写活性化ペプチド、もしくは該ペプチドの部分ペプチド
（Ｄ）請求項１１に記載の抗体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は転写調節因子等に関し、特に、核内ホルモンレセプターに起因した転写を調節し得る因子、ペプチドに関する。
【背景技術】  ホルモンや脂溶性ビタミンなどは生物の恒常性の維持、エネルギー代謝、分化、成長などに重要な役割を果たしている。これらホルモン等のレセプターは核内に存在する転写調節因子であり、クロマチンＤＮＡの特定部位に結合して、遺伝子の転写反応を調節する。多くの場合、ホルモン等のリガンドがレセプターに結合していない場合には、転写が抑制され、レセプターにリガンドが結合するとクロマチン構造の変化などにより転写が活性化される。この核内レセプターから転写装置に至る経路にはコアクチベーターやコリプレッサーと呼ばれる多くの因子が複合体を形成して働いていることが報告されている。リガンドが結合していないレセプターにはヒストン脱アセチル化酵素を含むコリプレッサー複合体が結合して遺伝子発現を抑制し、一方、リガンドが結合することによりレセプターの構造が変化すると、コリプレッサー複合体が離れて代わりにヒストンアセチル化酵素を含むコアクチベーター複合体がリクルートされる。このようなコアクチベーターの一例としてはＳｋｉｐ（Ｓｋｉ相互作用タンパク質、Ｎ−ＣｏＡ６２とも称されている）があり、いくつかの核内レセプター（例えば、ビタミン３レセプター、レチノイン酸レセプター、エストロゲンレセプター、およびグルコマルチコイドレセプター）と直接結合して、これら核内レセプターが媒介する遺伝子発現を増強し得る（Ｂａｕｄｉｎｏ，Ｔ．Ａ．，Ｋｒａｉｃｈｅｌｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｊｅｆｃｏａｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｊｒ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｎ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍａｃ  Ｄｏｎａｌｄ，Ｐ．Ｎ．（１９９８）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（２６），１６４３４−４１、ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｐ．Ｎ．，Ｂａｕｄｉｎｏ，Ｔ．Ａ．，Ｔｏｋｕｍａｒｕ，Ｈ．，Ｄｏｗｄ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｃ．（２００１）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６６（３−５），１７１−６．）。
【発明の開示】
上述したように、核内レセプターを介した転写の制御メカニズムの概要は明らかにされつつあるが、そのメカニズムにどのような因子が関与するかの解明は残されている。そこで、本発明は、転写調節因子、特に核内レセプターの転写調節にも関与し得る新たな因子を提供することを目的とする。
本願発明者らは、ショウジョウバエのｃｒｎ（ｃｒｏｏｋｅｄ  ｎｅｃｋ）遺伝子のヒトホモログのクローニングおよびその機能解析の研究を通して、このヒトホモログが核内レセプターを介した転写調節に関与することを見出した。なお、このショウジョウバエｃｒｎ遺伝子自体は、胚形成の早期段階で最大の発現レベルになる遺伝子であり、この遺伝子の不活性化は、胚形成の欠陥をひき起こし、主に神経系の発達に影響を及ぼすことが報告されている（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｓｍｏｕｓｅ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５（６），１０８０−９１）。ｃｒｎタンパク質の１つの独特な特徴は、縦列に方向付けられたテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）の１６のコピーが存在することである。ＴＰＲは、さまざまなタンパク質で見出され、進化中に広まった同義性の３４アミノ酸反復モチーフである。ＴＰＲタンパク質が関与するプロセスとしては、細胞サイクル制御、転写抑制、ストレス応答、タンパク質キナーゼ抑制、およびタンパク質輸送が含まれる（Ｌａｍｂ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｕｇｅｎｄｒｅｉｃｈ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｐ．（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２０（７），２５７−９）。
上記ｃｒｎ遺伝子のヒトホモログには、コピー数において１５と異なるが上記ショウジョウバエｃｒｎ遺伝子と同様に多数のＴＰＲが存在する。本願発明者らがクローニングしたヒトｃｒｎ遺伝子は既に報告されている転写に関連した転写共役ＤＮＡ修復に関与するタンパク質（ＸＡＢ２）をコードした遺伝子（Ｙｏｓｈｉｍｉｃｈｉら、Ｊｏｕｎａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４９３１−３４９３７）と一致するものであるが、本願発明者らは、本遺伝子産物が転写抑制に関与することを新たに見出した。特に、本遺伝子産物は、ＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能することから、本明細書では「ＨＤＡＲＴ（ａＨＤＡＣａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｅｐｒｅｓｓｏｒＴＰＲ）」タンパク質と称する。また、本願発明者らは、ＨＤＡＲＴが、上述した核内レセプターの転写コアクチベーターとして機能するＳｋｉｐと直接結合し、核内レセプターの転写を抑制することも見出した。さらに、ＨＤＡＲＴが核内レセプターの転写コリプレッサーの１つであり、ＨＤＡＣと結合しＨＤＡＣのヒストン脱アセチル化により強力に転写を抑制し得ることも明らかにした。一方、ＨＤＡＲＴのドミナントネガティブペプチドも得られ、このペプチドは全長ＨＤＡＲＴとは逆に転写を活性化することをも確認した。すなわち、本願発明は、ＨＤＡＲＴの新たに解明した種々の機能に基づくものであり、具体的には、以下の通りである。
（１）本発明は転写抑制因子をコードしたＤＮＡであって、（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたＤＮＡ、または、（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。
（２）本発明は転写抑制因子をコードしたＤＮＡであって、（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたＤＮＡ、または（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
（３）本発明は上記（１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされた転写抑制因子である。
（４）本発明は核内ホルモンレセプターに起因した転写を抑制し得る上記（３）記載の転写抑制因子である。
（５）本発明は転写を活性化し得るペプチドをコードしたＤＮＡであって、
（Ａ）配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしたＤＮＡ、または（Ｂ）配列番号１における１から５３７塩基までの塩基配列からなるＤＮＡである。
（６）本発明は転写を活性化し得るペプチドをコードしたＤＮＡであって、（Ａ）配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしたＤＮＡ、または（Ｂ）配列番号１における１から５３７塩基までの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
（７）本発明は上記（５）または（６）記載のＤＮＡによりコードされた転写活性化ペプチドである。
（８）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のＤＮＡのうち、少なくとも１５ヌクレオチド長を有するＤＮＡである。
（９）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のＤＮＡが挿入されたベクターである。
（１０）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のＤＮＡまたは上記（９）に記載のベクターを保持する宿主細胞である。
（１１）本発明は上記（３）に記載の因子または上記（７）に記載のペプチドに結合し得る抗体である。
（１２）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のＤＮＡとハイブリダイズし、少なくとも１０ヌクレオチド長を有する、オリゴヌクレオチドプローブである。
（１３）本発明は以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかが固定された基板である。
（Ａ）上記（１２）に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
（Ｂ）上記（３）または（４）に記載の転写抑制因子、もしくは該因子の部分ペプチド
（Ｃ）上記（７）に記載の転写活性化ペプチド、もしくは該ベプチドの部分ペプチド
（Ｄ）上記（１１）に記載の抗体
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において予め用いる略語を説明する：ＨＡＴ（ヒストンアセチルトランスフェラーゼまたはヒストンアセチル化酵素）、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼまたはヒストン脱アセチル化酵素）、ＤＡＰＩ（４′，６−ジアミジノ２−フェニルインドール）、ＲＡＲ（レチノイン酸レセプター）、ＧＲ（グルココルチコイドレセプター）、ＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）、ＡＤ（活性化ドメイン）、ＡＴＲＡ（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ：全トランスレチノイン酸）。
本発明は、転写調節に関する因子に関する。この転写調節因子には、転写を抑制する因子と、活性化する因子が含まれる。まず、転写抑制因子について説明する。本発明の転写抑制因子を例示すればＨＤＡＲＴであり、ＨＤＡＲＴのアミノ酸配列は、配列番号２からなる。但し、本発明の転写抑制因子は配列番号２に記載のＨＤＡＲＴに限定されず、転写抑制活性を有する範囲で、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、さらには、ＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡ（配列番号１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされたタンパク質をも包含される。
上記ＨＤＡＲＴタンパク質は、ヒト細胞の核内で発現していることから、ヒト細胞核より得ることができる。この原料となるヒト細胞は、特に限定はないが、一例を挙げればＨＤＡＲＴを内在的に発現していることが明らかである２９３細胞を用いることができる。
また、アミノ酸置換等を有するＨＤＡＲＴ類似タンパク質の調製は、例えば、公知の技術であるファージライブラリースクリーニング技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｐｐ．２．１−２．１１７）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，ｐｐ．８．１−８．１２６）技術を利用して実施することができる。具体的には、ＨＤＡＲＴをコードしたＤＮＡ（配列番号１）またはその一部をプローブやプライマーとして、配列番号１とホモロジーを備えたＤＮＡを得て、このＤＮＡを基にタンパク質を生成することにより得ることができる。ここで得られるタンパク質は、通常、ＨＤＡＲＴとアミノ酸配列において高いホモロジーを有する。この高いホモロジーは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％以上（例えば、９８から９９％）の塩基配列の一致を意味する。
また、上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者であれば適宜選択することができる。一例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを実施することが挙げられる。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃程度で、より厳しい条件としては、０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃程度で、さらに厳しい条件では、０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃程度で実施することができる。これらＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、適宜改変することは可能である。
配列のホモロジーは、ＢＬＡＳＴｎ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴｘ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
配列番号２に記載の配列を人為的に改変する場合には、一般的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内であると考えられるが、転写抑制活性を維持し得る範囲内であれば上記改変割合を超えてアミノ酸配列を置換等してもよい。この人為的にアミノ酸配列を改変する手法は、例えば、公知の手法であるｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ作製方法、ＰＣＲ法、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓなどにより実行することができる。なお、ここで改変されたタンパク質が、ＨＤＡＲＴと同様に、転写抑制活性を有するか否かは、後述する実施例に記載されているような種々のレポーター解析法などを用いて転写抑制能を解析し決定することができる。
上記ＨＤＡＲＴまたはこれに類似したタンパク質は、上述した通り転写抑制活性を有するため、この機能を利用して所望の転写装置に組合せて所望の遣伝子の転写を抑制することができる。この転写装置は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写系のいずれでもよい。また、ＨＤＡＲＴの転写抑制能は自律的であることから、本発明の転写抑制因子は単独で用いて転写を抑制させ得る。但し、この場合、ＨＤＡＲＴはＤＮＡ結合能を有しないため、好ましくは、ＤＮＡ結合領域を融合させた融合タンパク質として用いることがよい。また、ＨＤＡＲＴはＨＤＡＣと結合能を有し、ＨＤＡＲＴはＨＤＡＣをリクルートしてヒストン脱アセチル化活性により強力に転写を抑制し得る。そのため、本発明の転写抑制因子は、ＨＤＡＣと共に用いて、あるいはＨＤＡＣを誘導することにより転写を抑制することもできる。なお、ＨＤＡＣにはタイプＩ（ＨＤＡＣ１，ＨＤＡＣ２，ＨＤＡＣ３）とタイプＩＩ（ＨＤＡＣ４，ＨＤＡＣ５，ＨＤＡＣ６，ＨＤＡＣ７，ＨＤＡＣ８）が存在することが知られている。本発明のＨＤＡＲＴはＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８等と結合するものと考えられることから、本発明においては、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８を好適に使用することができるが、これらのＨＤＡＣに特に限定されるものではなく、タイプＩまたはＩＩに属するいずれのＨＤＡＣを用いることが可能である。
また、ＨＤＡＲＴは核内レセプターの転写を抑制し得ることから、本発明の転写抑制因子により抑制し得る転写装置としては、好適には核内レセプターを介した転写装置を挙げることができる。この核内レセプターとしては、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプターを好適に挙げることができ、また、本発明の因子が転写抑制し得る範囲でレチノインＸレセプター、ビタミンＤレセプター、アンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプター、チロイドホルモンレセプターなどのホルモンや脂溶性ビタミンなどに対する核内レセプターなどを含めることができる。そのため、本発明の転写抑制因子は、このような核内レセプターからの転写の不調節、特に過剰に転写が促進されることが起因した疾患の治療に役立ち得る。特に、後述する実施例で示すように、ＨＤＡＲＴはレチノイン酸レセプターの転写を抑制し、さらには、このレチノン酸レセプターの転写により誘導する分化をも抑制することが明らかになっているため、レチノン酸レセプターの転写による分化亢進が起因した疾患の治療薬として本転写抑制因子を応用してもよい。
本発明は上記転写抑制因子をコードしたＤＮＡに関する。このＤＮＡとしては、例えば配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、上述した配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードしたＤＮＡ、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたＤＮＡ、および配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡなどが包含される。
上記ＤＮＡは、配列番号１に記載のＤＮＡまたはその一部をプローブまたはプライマーとして用い、例えば、ヒト細胞（一例を挙げれば、後述する実施例１に示したように、ヒト膵臓の小島細胞）のｃＤＮＡライブラリーなどからハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得ることができる。他の方法としては、ヒト細胞のｍＲＮＡを鋳型に用い、配列番号１に記載のＤＮＡの一部をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｒｄ  Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ８，ｐｐ．８．４６−８．５３）により得ることもできる。なお、ここでは、ヒト細胞を例に挙げたが、それ以外の哺乳動物細胞、真核細胞などを用いて調製してもよい。また、ＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、上述した通りである。
上記ＤＮＡをクローニングする方法以外にも、ＤＮＡ合成機により配列番号１に記載のＤＮＡとその相補鎖とをそれぞれ合成し、アニーリングさせて生成してもよい。
上記ＤＮＡは転写抑制因子をコードしていることから、この転写抑制因子を生産するツールとして、または細胞や個体内に導入して転写抑制因子を発現させるツールとして用いることができる。このような目的で用いる場合には、上記ＤＮＡを発現ベクターなどに組み込むことが好ましい。発現ベクターは、タンパク質生産に用いる翻訳系により、あるいは導入する細胞により適宜選択することができる。
上記ＤＮＡが組込まれたベクターを用いて転写抑制因子を生産するためには、先ず、上記ベクターを宿主細胞に導入し、この宿主細胞を培養する。これにより、宿主細胞内では上記転写抑制因子が生産される。ここでベクターを細胞に導入する手法は、用いる細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスベクターやファージを介した生物学的な手法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などの化学的な手法、ジーンガン、エレクトロポーレション法などの物理的な手法などを用いることができる。宿主細胞において生産されたタンパク質は、必要に応じて、精製（例えば、アフィニティー精製など）を行った上で使用することができる。
上記ＤＮＡが組み込まれた発現ベクターはまた、細胞内あるいは個体内の所望の転写を抑制する目的で用いることができる。すなわち、この発現ベクターを細胞または個体内に導入し上記転写抑制因子を発現させることにより、所望の転写系を抑制することができる。特に、ＨＤＡＲＴは自律的な転写抑制能を有するため、本発明の転写抑制因子は単独でも転写抑制活性を発揮し得る。但し、ＨＤＡＲＴ自身はＤＮＡ結合能を有しないため、好ましくは、本転写抑制因子は、所望の遺伝子の制御領域のＤＮＡに結合し得るＤＮＡ結合領域との融合タンパク質として発現させることがよい。これに、標的となる遺伝子の転写を抑制することが可能となる。また、本転写抑制因子はＨＤＡＣと結合能を有することから、本転写抑制因子を発現させることにより、ＨＤＡＣをリクルートさせて転写をさらに強く抑制し得る。
また、本発明のＤＮＡにコードされた転写抑制因子は核内レセプターの転写を効果的に抑制し得ることから、これら核内レセプターの転写亢進に起因した疾患の治療用組成物として、本ＤＮＡが組み込まれたベクターを応用してもよい。こうした治療目的のベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられる。
本発明は転写調節因子のうち、上記とは反対に転写を活性化し得るペプチドにも関する。ＨＤＡＲＴは全長であれば、転写抑制因子として機能するが、ＨＤＡＲＴのドミナントネガティブペプチドは、逆に転写活性化因子として機能する。このドミナントネガティブペプチドを例示すると、Ｎ末端の４つのＴＰＲ（以下、「Ｎ４ＴＰＲ」と省略する）をコードしているペプチド、すなわち、配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列からペプチドを挙げることができるが、これに限定されず転写活性化能を有する範囲で、配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドを含めることができる。
上記ドミナントネガティブペプチドの調製は、配列番号１のうち１から５３７までの塩基配列からなるＤＮＡを基にペプチドを合成することにより調整することができる。また、このペプチドとアミノ酸配列において置換等を有するペプチドの合成は、上記配列番号１のうち１から５３７までの塩基配列に変異（置換、欠失、挿入および／または付加）を加えコドンを変えたＤＮＡを基にペプチド合成することにより調製することができる。
上記ペプチドは、転写活性化能を有するため、所望の転写系の転写を促進させるために用いることができる。特に、実施例に示した通り、ＨＤＡＲＴのＮ４ＴＰＲは核内レセプターの転写を活性化することから、これら核内レセプターの転写を促進させるために用いることができる。この核内レセプターとして、好適には、Ｓｋｉｐが作用する核内レセプター、例えば、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプター、ビタミンＤレセプター、エストロゲンレセプターを挙げることができる。また、本発明のペプチドが転写活性化し得る範囲でレチノインＸレセプター、アンドロゲンレセプター、チロイドホルモンレセプターなどのホルモンや脂溶性ビタミンなどに対する核内レセプターなどを含めてもよい。
上記Ｎ４ＴＰＲによるレチノイン酸レセプターの転写活性化能は、ＡＴＲＡによる転写活性化能よりも高いことが後述する実施例で示されている。そのため、現在、ＡＴＲＡによるレチノイン酸レセプターの転写活性化による白血病などの悪性腫瘍の分化誘導療法が行われている。さらに、ビタミンＡやＡＴＲＡを含むその誘導体は、白血病以外にも肝細胞癌（Ｏｋｕｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ７，２０４−１８）、卵巣癌（Ｚｈａｎｇ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １８５（１），１−２０）、甲状腺癌（Ｓｃｈｍｕｔｚｌｅｒ  Ｃ．ａｎｄ  Ｋｏｈｒｌｅ  Ｊ．（２０００）Ｔｈｙｒｏｉｄ  １０（５），３９３−４０６）、皮膚癌（Ｎｉｌｅｓ  Ｒ．Ｍ．（２０００）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １６（１１−１２），１０８４−９）、膵癌（Ｒｉｅｃｋｅｎ  Ｅ．Ｏ．ａｎｄ  Ｒｏｓｅｗｉｃｚ  Ｓ．（１９９９）１０  Ｓｕｐｐｌ  ４，１９７−２００）等で治療に使用され始めており、このＡＴＲＡに代えて又はＡＴＲＡと組合せて、本ペプチドを用いることができる。
本発明は、上記転写活性化能を有するペプチドをコードしたＤＮＡに関する。このＤＮＡとしては、具体的には、配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしたＤＮＡ、一例としては、配列番号１から５３７塩基までの塩基配列からのＤＮＡを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、転写活性化能を有する範囲で、配列番号２における１から１７９位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしたＤＮＡ、または配列番号１における１から５３７塩基までの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含めることができる。
上記転写活性化ペプチドをコードしたＤＮＡは、上述した転写抑制因子をコードしたＤＮＡを得た後、例えば、Ｃ末端側を欠失させることに調製することができる。または、ＤＮＡ合成機により合成し調製してもよい。
上記ＤＮＡは、上記転写活性化ペプチドを生産するため、または、細胞または個体内に導入して上記転写活性化ペプチドを発現させる目的で用いることができる。ペプチドを生産する目的で上記ＤＮＡを用いる場合には、発現ベクターに組み込むことが望ましい。この場合の発現ベクターは、ペプチドを生産するための転写・翻訳系によって適宜選択することができる。この転写・翻訳系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでもよい。Ｉｎ  ｖｉｖｏ系の場合には、上記ＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを細胞に導入し、細胞を培養することにより、細胞内で上記転写活性化ペプチドが生産される。細胞への導入方法などについては上述と同様である。
上記ＤＮＡを細胞または個体内に導入して上記転写活性化ペプチドを発現させる目的で用いる場合には、上記ＤＮＡを直接、細胞内等に導入し一時的に発現または染色体に挿入させて安定的に発現させてもよく、また、発現ベクターに組み込んで細胞等に導入してもよい。
上述した通り、転写活性化ペプチドは、ＡＴＲＡのように悪性腫瘍の分化誘導療法に応用し得るため、転写活性化ペプチドを直接用いる代わりに、本ＤＮＡを患者に注入等し上記転写活性化ペプチドを発現させて、上記治療方法に利用してもよい。このような目的で使用するためには、上記ＤＮＡを所望の組織または細胞に該ＤＮＡを運搬するためのベクターに組み込み使用することが好ましい。こうした治療目的のベクターとしては、上述したレトロウイルスベクター等のウイルスベクターを用いることができる。
以上の通り、本発明の転写抑制因子をコードしたＤＮＡは、Ｎ末端側をコードしたＤＮＡに短くすることにより上記転写活性化ペプチドをコードしたＤＮＡに改変し得る。これ以外にも、上記転写抑制因子をコードしたＤＮＡまたは転写活性化ペプチドをコードしたＤＮＡはさらに短い一部フラグメントとしても、ハイブリダイゼーション用プローブ、ＰＣＲプライマーまたはリボザイム誘導体として利用することができる。これら目的で上記ＤＮＡの一部を用いる場合には、プローブ等としての特異性を保持できる長さ、例えば、１５ヌクレオチド長を有していることが好ましい。本発明は、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載のＤＮＡ等）とハイブリダイズし、少なくとも１０ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。例えば、こうしたポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものが挙げられる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションにおいて、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。上記プローブ、プライマーは、転写抑制因子等をコードしたＤＮＡのクローニング等に利用することができる。
本発明はまた、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドに結合し得る抗体に関する。本発明の抗体は、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドと特異的に結合し得るものであれは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを必要に応じてフロイントアジュバント等と混合し、周知の方法によりウサギ、ヤギ、モルモットなどの非ヒト動物を免疫し、抗体価が上昇したことを確認した上で免疫動物の末梢血から血清を回収することにより調製することができる。一方、モノクローナル抗体はまた、上記転写抑制因子もしくは転写活性化ペプチドまたはその部分ペプチドを用い、周知の方法によりマウスなどの動物を免疫し、抗体価が上昇した免疫動物の脾臓またはリンパ節を採取し、これら組織中の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマから産生される抗体を培養上清から回収することにより得ることができる。
これら抗体は、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドをアフィニティー精製する際等に利用することができる他、種々の細胞内における転写抑制因子の発現量を免疫学的に解析するなどの目的で、または転写抑制因子を阻害する目的で利用してもよい。
また本発明は、本発明の上記オリゴヌクレオチドが固定された基板を提供する。該基板をバイオチップとすることにより、例えば、被検生物（細胞）における本発明のＤＮＡの発現状態を解析することが可能である。
好ましい態様においては、まず、被検生物（細胞）から本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号１に記載のＤＮＡ、またはその部分ＤＮＡ領域）を増幅する。次いで、該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を用意する。次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出することにより、本発明のＤＮＡの発現状態を解析することができる。
このような方法としては、ＤＮＡアレイ法が例示できる。被検生物（細胞）からのＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該ＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、細胞から抽出した染色体ＤＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えば本発明のＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって本発明のＤＮＡを調製することも可能である。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味し、通常、チップとも呼ばれる。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のＤＮＡを検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、配列番号１に記載のＤＮＡと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
本発明においては、次いで、ＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本発明においては、次いで、該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、必要に応じて、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。上記方法としては、例えば、ＤＮＡアレイ法（ＳＮＰ遺伝子変異の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８−１３５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２２：１６４−１６７）等が挙げられ、当業者においては、公知の文献等を参照して、適宜、実施することができる。
また本発明は、本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の部分断片が固定された基板を提供する。該基板をバイオチップとすることにより、例えば、本発明のタンパク質と結合する分子の探索、またはＨＤＡＣ阻害化合物のスクリーニング等を行うことが可能である。
一般的に、タンパク質を基板へ固定させたものを、プロテインチップと呼ぶ。その原理はＤＮＡチップと同様、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用する蛋白質や核酸などを検出する。
本発明のＨＤＡＲＴタンパク質は、種々のＨＤＡＣタンパク質と結合することから、ＨＤＡＣ阻害化合物のスクリーニングに応用することができる。より具体的には、本発明のＨＤＡＲＴタンパク質を固相表面に固定することにより、一つの面に種々のＨＤＡＣを結合させることができる。この固相表面に種々の化合物を結合させ、ＨＤＡＣ活性を計測することにより、ＨＤＡＣ阻害化合物をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニングによって取得されるＨＤＡＣ阻害化合物の例としては、癌の分化誘導療法で薬剤として用いられるトリコスタチンＡを示すことができる。
また、本発明の抗体が固定された基板をバイオチップとすることも可能である。高純度で分離精製された抗体をチップ表面に固定化することにより高密度化が可能である。
本発明の好ましい態様においては、基板上にサンプルをスポットした後、スポット表面に対して親和性を示さないタンパク質やその他の夾雑物を洗浄することにより、溶出させることができる。その後の検出の工程は、当業者においては、基板の種類等を考慮し、適宜、公知の方法で、上記親和性の有無（強弱）を検出することができる。一例を示せば、洗浄後の上記基板へ、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）を添加し、乾燥後、質量分析計（ＴＯＦ−ＭＳ）装置にかけることにより、スポット表面に結合していたタンパク質の分子量スペクトルを測定することができる。
また、任意のＤＮＡ、もしくはペプチドの基板への固定は、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＤＡＲＴはＴＰＲ（Ｔｅｔｒａ  ｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）タンパク質であり、その構成および類縁の遺伝子との関係を示す。ＨＤＡＲＴ一次構造の概略的構成を示し、ＴＰＲ、酸性領域、Ｓｋｉｐ相互作用領域およびＣＲＮ相同性領域を示している。
図２は、ヒトＨＤＡＲＴとヒトＣＲＮとの間のＣＲＮ相同性領域の比較を示す図である。
図３は、ＨＤＡＲＴ／ＣＲＮタンパク質間の系統樹を示す図である。この系統樹は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣプログラムを用いて構築した（ソフトウェア開発）。
図４は、外来または内在ＨＤＡＲＴと外来Ｓｋｉｐと相互作用を免疫沈降解析により同定した結果を示す写真である。
（Ａ）外来ＨＤＡＲＴと外来Ｓｋｉｐとの相互作用を解析した結果を示す。レーン１はＧＦＰ−ＨＤＡＲＴのみ、レーン４はＦｌａｇ−Ｓｋｉｐのみ、またはレーン２，３はその両方を２９３細胞内で発現させた。レーン５は、何もベクターを導入していないコントロールの細胞である。また、レーン１、２、４および５は、抗−Ｆｌａｇ抗体により、レーン３は対照マウスＩｇＧにより免疫沈降させたサンプルである。上部２つのパネルは、発現された各タンパク質の発現を示し、下部２つのパネルは免疫沈降物を示している。なお、それぞれ上段は抗ＧＦＰ抗体、下段は抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした結果を示す。
（Ｂ）内在ＨＤＡＲＴと外来Ｓｋｉｐとの相互作用を解析した結果を示す。内在にＨＤＡＲＴを保持する２９３細胞にＦｌａｇ−Ｓｋｉｐ（レーン１）またはＦｌａｇ−ルシフェラーゼ（レーン２）を導入後、細胞抽出液を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降させた。何もベクターを導入していないコントロール実験も並行させた（レーン３）。細胞内でのＨＤＡＲＴタンパク質の発現状況（上部パネル）、免疫沈降したＦｌａｇ（中央パネル）、またはＨＤＡＲＴ（下部パネル）をパネル左「ＷＢ」として示す抗体を用いた免疫ブロッティングにより同定した。
図５は、Ｓｋｉｐ、ＨＤＡＲＴ両タンパク質上の相互作用領域の同定結果を示す。
（Ａ）Ｓｋｉｐ上のＨＤＡＲＴ結合領域部位のマッピング。プラス（＋）は、酵母ツーハイブリッドシステムにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性に基づき、相互作用が検出されたことを示す。プラスの数は、その相互作用の相対的強度を表わす。ＮＨＲ結合：核ホルモン受容体結合ドメイン、ＴＡ；トランス活性化ドメイン。
（Ｂ）ＨＤＡＲＴ上のＳｋｉｐ結合領域のマッピング。記号は上述と同様である。
図６は、核内ホルモン（レチノイン酸またはグルココルチコイド）による転写活性化をＨＤＡＲＴが抑制することを示すグラフである。
（Ａ）ＨＤＡＲＴによるレチノイン酸で活性化された転写の濃度依存的抑圧結果を示す。リガンドの不在下で空ベクター（１．０μｇ）を導入した際のＣＡＴ活性を基準として、補正されたＣＡＴ活性を表わした。３回の反復実験平均および、エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。
（Ｂ）ＨＤＡＲＴによるグルココルチコイド活性化を受けた転写の濃度依存的に抑圧結果を示す。
図７は、ＨＤＡＲＴの細胞内局在を示す写真である。
（Ａ）内因性ＨＤＡＲＴタンパク質の局在化。左側パネルは抗ＨＤＡＲＴ抗体（上段）または免疫前血清（下段）を用いた免疫蛍光染色結果を、右側パネルは左側パネルと対応した視野におけるＤＡＰＩ染色結果を示す。
（Ｂ）生存細胞中のＨＤＡＲＴの局在化。Ｈｅｌａ細胞にＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクター（左上）またはＧＦＰ発現ベクター（左下）を導入後のＧＦＰによる蛍光発光を観察した結果、およびＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２染料を用い核を視覚化した結果（右上）を示す。
図８は、ＨＤＡＲＴの自律的なプロモータ抑制活性を示す。
（Ａ）Ｇａｌ４リポーター（ルシフェラーゼ）プラスミドを保持するＮＩＨ３Ｔ３細胞に異なる量のＧａｌ４  ＤＢＤ−ＨＤＡＲＴ発現プラスミド（０、０．１、０．３、０．５μｇ）を導入した際のプロモータ抑制活性を検討した結果を示す。空ベクターのみ導入した際のルシフェラーゼ活性を基準（１００％）として、補正済みルシフェラーゼ値を表した。３回の反復実験結果の平均で示し、エラーバーはＳ．Ｄ．を示す。
（Ｂ）Ｕ−２０Ｓ細胞を用いた結果を示す。
図９は、ＨＤＡＲＴとＨＤＡＣとの直接的な相互作用を示す写真である。
（Ａ）ＨＤＡＲＴとＨＤＡＣとの相互作用。２９３細胞にＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターとＦｌａｇ−ＨＤＡＣｓ発現ベクター（（レーン１；ＨＤＡＣ１、レーン３；ＨＤＡＣ３、レーン４；ＨＤＡＣ４、レーン５；ＨＤＡＣ６）とをコトランスフェクションした後、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降および表示された抗体（抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＧＦＰ抗体）により免疫ブロッティングを行った結果を示す（それぞれ中央パネル、下部パネル）。なお、レーン２はＧＦＰ−ＨＤＡＲＴのみが導入されたサンプルである。また、上部パネルは免疫沈降前のサンプルを用いてＧＦＰ−ＨＤＡＲＴタンパク質の発現を確認した結果を示す。
（Ｂ）ＨＤＡＲＴとＨＤＡＣ３との直接的相互作用を示す結果である。
図１０は、ＨＤＡＲＴの抑制は２種のＨＤＡＣ阻害物質（トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム）によりそれぞれＨＤＡＲＴの抑制が阻害されたことを示す（Ｃ、Ｄ）。
図１１は、ＨＤＡＲＴのＮ末端における４つのＴＰＲ（Ｎ４ＴＰＲ）のドミナントネガティブ効果を示す図および写真である。
（Ａ）Ｎ４ＴＰＲによる内因性ＨＤＡＲＴとＳｋｉｐと相互作用の阻害。Ｆｌａｇ−ＳｋｉｐとＧＦＰ（レーン１）またはＧＦＰ−Ｎ４ＴＰＲ（レーン２）とがトランスフェクションされた２９３細胞の細胞抽出液を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降させ、この沈降産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した結果を示す。下方の３つのパネルは、それぞれ免疫沈降されたＳｋｉｐ（上段）、内因性ＨＤＡＲＴ（中央）およびＮ４ＴＰＲ（下段）を示す。免疫沈降前のＨＤＡＲＴタンパク質の発現は最上の一つのパネルに示されている。
（Ｂ）レチノイン酸レセプターに起因した転写をＮ４ＴＰＲによって活性化することを示すグラフである。
（Ｃ）グルココルチコイドに起因した転写をＮ４ＴＰＲによって活性化することを示すグラフである。
図１２は、ＭＭ−１−１９−Ｐ細胞内でのレチノイン酸による分化誘発をＨＤＡＲＴが阻害することを示す図および写真である。ＨＤＡＲＴ発現ベクターまたは空ベクターを導入したＭＭ−１−１９−Ｐ細胞をＡＴＲＡ（２μＭ）存在下、非存在下での分化誘発を解析した。形質移入された細胞を同定するため、上記ベクターとともにＧＦＰベクターをコトランスフェクションした。ＧＦＰによる緑色螢光発光を標準的顕微鏡写真により撮影した写真（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、および位相差顕微鏡下で撮影した写真（Ｅ、Ｆ）を示す。
（Ａ）ＡＴＲＡ（−）かつ空ベクター導入サンプル、（Ｂ）ＡＴＲＡ（＋）かつ空ベクター導入サンプル、（Ｃ）ＡＴＲＡ（−）かつＨＤＡＲＴ発現ベクター、（Ｄ）ＡＴＲＡ（＋）かつＨＤＡＲＴ発現ベクター、（Ｅ）（Ｃ）と同一視野の位相差写真、（Ｆ）（Ｄ）と同一視野の位相差写真。パネルＦにおいて、黒色矢印ヘッドは未分化ＧＦＰ陽性細胞を表わし、白色矢印ヘッドは分化された細胞を表わす。（Ｇ）グラフは、ＧＦＰ陽性細胞中形態学的に分化した細胞の百万率を示す。４つの独立した実験からの結果は、平均およびＳ．Ｄ．（エラーバー）として提示されている（ＭｏｃｋおよびＡＴＲＡ（＋）でのＨＤＡＲＴの間でＰ＜１％，スチューデントのｔテスト）。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ヒトＨＤＡＲＴのクローニング
ＢＬＡＳＴデータベースを用いてショウジョウバエｃｒｎ遺伝子のヒトホモログを検索したところ、膵臓の小島ｍＲＮＡ由来ヒトＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）クローン＃５２９３０が上記ｃｒｎ遺伝子と高い相同性を有することが示された。このクローンｗ５２９３０の完全な配列を定法に従い決定した。また更に５’−ＲＡＣＥ法（５’−ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）により、本遺伝子は、そのｃＤＮＡの完全長が２６６０塩基からなり、一つの長い読み枠を備えていることを同定した。なお、ここで同定したタンパク質は、後述するようにＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能することから、「ＨＤＡＲＴ（ａＨＤＡＣａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｅｐｒｅｓｓｏｒＴＰＲ）」タンパク質と称する。ＨＤＡＲＴは８５５アミノ酸をコードした高度に保存されたＴＰＲタンパク質である（図１）。ＤＮＡ配列から推定されるＨＤＡＲＴタンパク質は、ヒトＣＲＮタンパク質と明らかに類似していることが示されている。特に、ＨＤＡＲＴタンパク質の２６２残基から７７９残基の領域は、ＨＤＡＲＴとヒトＣＲＮタンパク質とで高度に保存されている（図１、２）。数種の種族間でのこのタンパク質の遺伝解析ではこれらは遺伝子ファミリーを形成していることを示した（図３）。
［実施例２］ＨＤＡＲＴと転写コアクチベーターＳｋｉｐとの直接的な相互作用
ＨＤＡＲＴ上に存在するいくつかのＴＰＲ領域に着目し、これらＴＰＲを介してＨＤＡＲＴと相互作用し得るタンパク質が存在するかを解析することとした。
このＨＤＡＲＴと結合するタンパク質の単離のために、酵母ツーハイブリットシステムを用いた。具体的には、酵母ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッド解析キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。ｐＡＳ−１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内でＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインと読み枠を合わせるようにＨＤＡＲＴのＯＲＦ全長を挿入した。このｂａｉｔ  ｐｌａｓｍｉｄは、ＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）がサブクローニングされたｐＡＣＴ２  ｐｒｅｙ  ｐｌａｓｍｉｄと共に、サッカロマイセルセルビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｙ１９０に形質転換した。両プラスミドが導入されたクローンのスクリーニングは、キットに添付されたプロトコルに従って実施した。このようにして、約１×１０７をクローンした結果、数個のクローンを単離した。これらクローンを解析した結果、一つはＳｋｉｐと一致していた。
哺乳動物細胞内でのＨＤＡＲＴとＳｋｉｐとの相互作用を免疫沈降解析により確認した。この確認のために、先ず、Ｆｌａｇ−Ｓｋｉｐ融合タンパク質を発現するＦｌａｇ−Ｓｋｉｐ発現ベクターおよびＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ融合タンパク質を発現するＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターと（図４Ａ）をＨＥＫ２９３細胞にＥｆｆｅｃｔｅｎｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてトランスフェクションした。なお、対照実験として、Ｆｌａｇ−Ｓｋｉｐ発現ベクターのみ、ＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターのみを同細胞に、同条件でトランスフェクションを行った。
トランスフェクションの２４時間後、氷上で３０分間、１０μｌのプロテアーゼ阻害物質カクテル（Ｓｉｇｍａ＃ｐ８３４０）１００μｌを含有するＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で細胞溶解することによって、細胞抽出物（１ｍｇ）を調製した。この抽出物をタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズ４０μｌとともに３０分間４℃でインキュベートすることによって、予備的に清澄化した。次に、清澄した上清抽出物を１時間抗Ｆｌａｇ抗体または陰性対照のマウスＩｇＧ抗体（２μｇ）と共にインキュベートし、その後、４０μｌのタンパク質Ａ／Ｇセファロースビーズを用いて３０分間沈降させた。免疫沈降物を４回Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質をＳＤＳローディングバッファ中でＡ／Ｇセファロースビーズから溶出させ、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した。展開後、メンブレンに転写し、メンブレンを定法に従い免疫ブロットを実施した。この免疫ブロット用の抗体としては、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）および抗ＧＦＰモノクローナル抗体クローン１Ｅ４（ＭＢＬ）を用いた。
上記免疫沈降解析の結果を図４Ａに示す。図において上部２つのパネルは、各タンパク質の発現結果を示し、下部２つのパネルは免疫沈降物を示している。図４Ａに示されている通り、上記両複合タンパク質が発現している場合のみ、抗Ｆｌａｇ抗体によりＧＦＰ−ＨＤＡＲＴタンパク質がＦｌａｇ−Ｓｋｉｐ融合タンパク質と共に免疫沈降した（レーン２）。ＦＬＡＧ−Ｓｋｉｐが発現していない条件では、抗ＦＬＡＧ抗体によりＧＦＰ−ＨＤＡＲＴの沈殿はみられず（レーン１）、また、陰性対照の抗体を用いた場合も同様に沈殿は観察されなかった（レーン３）。この結果は、ＨＤＡＲＴとＳｋｉｐとがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて特異的に相互作用することを示唆している。
さらに、内在ＨＤＡＲＴと外来から導入したＳｋｉｐとの相互作用を解析した。２９３細胞（ＨＤＡＲＴが高発現している細胞）にＦｌａｇ−Ｓｋｉｐ発現ベクター、またはＦｌａｇ−ルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクションし、上述と同様の方法でトランスフェクションから２４時間後に細胞抽出液を調整した。この細胞抽出液を抗Ｆｌａｇ抗体とインキュベートし免疫沈降を行った。免疫複合体または免疫沈降前の細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、メンブレンに転写した。この同一のメンブレンを抗ＨＤＡＲＴ抗体または抗Ｆｌａｇ抗体とを用いて免疫ブロッティングを実施した。その結果を図４Ｂに示す。なお、図４Ｂにおいて、上部パネルは細胞抽出液を抗ＨＤＡＲＴ抗体で免疫ブロットした結果を、中央パネルは抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降後に抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした結果を、下部パネルは抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降後に抗ＨＤＡＲＴ抗体で免疫ブロットした結果を示す。
図４Ｂに示されているように、Ｆｌａｇ−Ｓｋｉｐが発現している条件においてのみ、抗Ｆｌａｇ抗体でＨＤＡＲＴが共沈殿し（図４Ｂ、レーン１）、Ｆｌａｇ−Ｌｕｃタンパク質が発現している条件（レーン２）および何もトランスフェクションされていない親の２９３クローンでは（レーン３）、ＨＤＡＲＴの共沈殿は見られなかった。
［実施例３］ＨＤＡＲＴとＳｋｉｐとの結合領域
ＨＤＡＲＴとの相互作用に関与するＳｋｉｐ上の領域をマッピングするために、Ｓｋｉｐ（Ｎ−末端領域（コドン１−２２０）、核内ホルモン結合領域（ＮＨＲ  ｂｉｎｄｎｇ、コドン２２１−３８８）、トランスアクティベーション領域（ＴＡ、コドン４３８−５３６））上の様々な領域を欠失させた欠失変異シリーズを作成し、上記実施例２に記載したＧａｌ４  ＤＢＤ−ＨＤＡＲＴを用いた酵母ツーハイブリッド解析によりＨＤＡＲＴと変異Ｓｋｉｐとの相互作用を解析した。解析結果を図５Ａに示す。図５Ａの右に示された「＋」記号はβ−ガラクトシダーゼ活性のフィルターリフト解析により相互作用が検出されたことを示し、「＋」数はその相互作用の相対的強度を示す。
「−」記号は相互作用が検出されなかったことを示す。
図５Ａに示すように、二つの異なる領域がＨＤＡＲＴとの相互作用に関与することを発見した。これら領域は、一つが９７−１１９残基内であり、もう一つは２２０−４３７残基内であった。Ｓｋｉｐのトランスアクティベーション領域はＨＤＡＲＴとの結合活性には、ほとんど関与しないことが示された。同様のアプローチをＨＤＡＲＴ上でのＳｋｉｐとの相互作用に関与する領域を解析するために実施した。すなわち、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ＨＤＡＲＴのさまざまな欠失突然変異体を作製し、これをＧａｌ４ＡＤ−Ｓｋｉｐと作用させた際のガラクトシダーゼ活性を解析した。この解析結果を図５Ｂに示す。４つのＴＰＲを含むＮ末端領域（１−１７９残基）はＳｋｉｐとの相互作用に必要十分であることが示された（図５Ｂ）。したがって、ＨＤＡＲＴはＮ末端の４つのＴＰＲ領域を介してＳｋｉｐと直接相互作用する。
［実施例４］ＨＤＡＲＴによる核内レセプターに起因した遣伝子の転写抑制
上記実施例においてＨＤＡＲＴがＳｋｉｐと相互作用し得ることが示されたことから、次に、核内レセプターに起因した転写経路に対するＨＤＡＲＴの機能的な役割を解析した。先ず、レチノイン酸レセプターによる転写制御に対するＨＤＡＲＴの作用を解析した。この目的のため、ＣＡＴ解析をレチノイドレスポンスエレメント（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の下流にチミジンキナーゼ最小プロモータ（ｐＴＲＥｐａｌ−ｔａｔａ）とＣＡＴ遺伝子を組み込んだＲＡＲ（ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）レポータープラスミドを用いて、ＣＡＴ解析を行った。
具体的には、ＨｅｐＧ２細胞にＲＡＲレポータープラスミドと同時に、ＨＤＡＲＴを定常的に発現するｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴをＥｆｆｅｃｔｅｎｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）によりトランスフェクションした。なお、ｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ発現ベクターの導入量を変えて０、０．５、１．０μｇとし、各々のトランスフェクションのＤＮＡ量を同一にするためにｐｃＤＮＡの空のベクターで１μｇになるように調整した。トランスフェクション後、ＡＴＲＡ（１０−８Ｍ）の存在下または非存在下で生育させ、その際のＣＡＴ活性を測定した。測定結果（図６）は、ＡＴＲＡ不存在下での空ベクター１．０μｇを導入したＣＡＴ活性を基準にして補正した値を表わした。また、３回の実験結果の平均およびエラーバーにより標準偏差を示す。
図６Ａに示すように、ＣＡＴ活性は空のベクター（ｐｃＤＮＡ）が導入された細胞ではＡＴＲＡにより５倍上昇した。しかしながら、このＡＴＲＡで誘導されたＣＡＴ活性はＨＤＡＲＴにより濃度依存的に抑制された。
さらにグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）による転写制御に対するＨＤＡＲＴの作用はＧＲ陽性Ｈｅｌａ細胞内でＧＲレポータープラスミドを用いて解析した。グルココルチコイド応答性ブロモータの転写活性化は、ＨｅＬａ細胞および１０−８Ｍのデキサメタゾンを代りに使用した点を除いて上記レチノイン酸レセプターに対する実験と同様に行った。測定結果の表示も上記と同様に行った。
ＨＤＡＲＴの共発現は、ＲＡＲ（レチノイン酸レセプター）起因トランスアクティベーションで観察された抑制と同程度で、グルココルチコイドに応答したレポーター遺伝子の活性化を抑制した（図６Ｂ）。これらの結果は、ＨＤＡＲＴが核内レセプターによって活性化された転写を選択的に抑制することを示している。
［実施例５］細胞核内におけるＨＤＡＲＴの局在
ＨＤＡＲＴが転写制御に直接関与することが示されたため、ＨＤＡＲＴは細胞の核内に局在することが予想される。そのため、ＨＤＡＲＴ組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体を作製し、これを免疫蛍光実験によりＨＤＡＲＴの細胞内の局在を解析することとした。
ポリクローナル抗体の作製は、先ず、大腸菌中でＨｉｓ−ＨＤＡＲＴ（アミノ酸残基２９６−４３１）の融合タンパク質として産生させ、Ｈｉｓと親和性があるＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。次に、このＨｉｓ−ＨＤＡＲＴタンパク質をウサギに免疫し、得られた抗ＨＤＡＲＴ抗血清を、ＰｒｏｔＯｎキット１（ＭＰＳ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。ここで精製されたウサギ抗ＨＤＡＲＴ抗体を、内在的にＨＤＡＲＴを保持するＨｅｌａ細胞とインキュベートし、その後、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）融合抗ウサギ抗体とインキュベートして、免疫螢光染色を行った。なお、コントロール実験として、ウサギ抗ＨＤＡＲＴ抗体に代えて免疫前のウサギ血清を用いて同様の操作を実行した。また、核の所在を明確にするために、ＤＡＰＩ染色も行った。
図７Ａに示されているように、抗ＨＤＡＲＴ抗体を用いた免疫蛍光染色像は、ＤＡＰＩ染色像と一致した。一方、免疫前血清では、核は染色されなかった。これら結果より、ＨＤＡＲＴはＨｅｌａ細胞の核内に優勢的に局在していることが示された（図７）。
また、生存している細胞でのＨＤＡＲＴの局在を解析した。Ｈｅｌａ細胞にＧＦＰまたはＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターをトランスフェクションし、２４時間後にＧＦＰによる蛍光発光を検出した。また、ＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ細胞については、核を視覚化するためにＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２染料を用いてインキュベーションを行った。
図７Ｂに示すように、ＧＦＰ−ＨＤＡＲＴベクターをトランスフェクションした細胞では、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２染料（右上パネル）で視覚化された核がＧＦＰにより蛍光発光していることが確認された（左上パネル）。特に、ＧＦＰ−ＨＤＡＲＴは、既に報告されているＳｋｉｐ分子の核スペックルパターン（１７）と部分的に類似のパターンを示した。類似の結果はＨＴ１０８０細胞および２９３細胞においても観察された（図示せず）。
［実施例６］ＨＤＡＲＴによる自律的な抑制機能
ＨＤＡＲＴがより直接的な抑制に関与すると仮定した場合、自律的な抑制機能を持つであろうことが予想された。この予想を確認するために、ＨＤＡＲＴをＤＮＡに接続させるために完全長のＨＤＡＲＴ  ｃＤＮＡをＧａｌ４  ＤＮＡ結合領域（ＧＡＬ４ＤＢＤ：ＧＡＬ４ＤＮＡとの結合領域のみを持ち、転写制御領域を持たない領域）に融合させ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞内でＧＡＬ４プロモータからの転写を調節し得るかを解析した。
具体的には、Ｇａｌ４レポータープラスミド（ｐＧａｌ４−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）が予め導入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、ＨＤＡＲＴ全長タンパク質とＧａｌ４  ＤＢＤとの融合タンパク質を発現するＧａｌ４  ＤＢＤ−ＨＤＡＲＴプラスミドを導入量を変えて（０、０．１、０．３、０．５μｇ）トランスフェクションした。なお、トランスフェクションに用いるトータルＤＮＡ量を揃えるために、各々のトランスフェクションにおいてＧａｌ４  ＤＢＤの空のベクターを用いて発現ベクターの量を０．５μｇに調整した。トランスフェクション２４時間後に、プロモータからのレポーター遺伝子の発現活性（ルシフェラーゼ活性）を解析した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、空のベクターのみ導入した際のルシフェラーゼ活性を基準（１００％）として補正した値で表した（図８）。なお、解析結果は３回の実験結果の平均で示し、また、標準偏差をエラーバーにより示した（図８Ａ）。また、Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＨＤＡＲＴ（導入量０または０．５μｇ）を用いて別の細胞Ｕ−２０Ｓ細胞においても同様の解析を行った（図８Ｂ）。
ＨＤＡＲＴはＮＩＨ−３Ｔ３細胞内におけるプロモータ活性を濃度依存的に著しく抑制し、最も高い濃度（０．５μｇ）ではルシフェラーゼの発現を８０％低下させた（図８Ａ）。類似の結果はＵ−２０Ｓ細胞でも観察された（図８Ｂ）。これら結果より、ＨＤＡＲＴそれ自身で自律的な転写抑制作用を有していることが示された。
また、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域をもたないＨＤＡＲＴの場合には、ルシフェラーゼの発現抑制は全く示されなかった（図示せず）。このことは、ＨＤＡＲＴそれ自身ではプロモータ領域のＤＮＡへの結合活性を有していないと考えられる。
［実施例７］ＨＤＡＲＴに起因した抑制メカニズム
急性の転写調節は、ＨＡＴ（ヒストンアセチル化酵素）による活性化およびＨＤＡＣ（ヒストン脱アセチル化酵素）による抑制が関与するメカニズムを介したコアヒストンのアセチル化の状態により制御されていることが報告されている。ＨＤＡＲＴが起因する遺伝子抑制のメカニズムを明らかにするために、このＨＤＡＲＴの機能がＨＤＡＣとの複合体形成を介して発揮されるか否かをＦｌａｇ−ＨＤＡＣ発現ベクターを用いた免疫沈降解析により調べた。
異なるタイプのＨＤＡＣ（１，３，４または６）を発現し得るＦｌａｇ−ＨＤＡＣｓ発現ベクターとＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターとを実施例２と同様に２９３細胞にコトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後に細胞抽出液を調整した。各細胞抽出液を抗Ｆｌａｇ抗体とインキュベートして免疫沈降を行った。免疫沈降産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分離したパターンをメンブレンに転写後、抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。参照として、各細胞におけるＧＦＰ−ＨＤＡＲＴタンパク質の発現を確認するために、免疫沈降前の各試料を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫ブロッティングを実行した。なお、図９Ａにおいて、上部パネルに免疫沈降前のＧＦＰ−ＨＤＡＲＴタンパク質の発現結果を示し、中央パネルは免疫沈降産物を抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロッティングした結果を示し、さらに、下部パネルは免疫沈降産物を抗ＧＦＰ抗体で免疫ブロッティングした結果を示す。また、ＨＤＡＣの種類は図左から次の通り：レーン１；ＨＤＡＣ１、レーン３；ＨＤＡＣ３、レーン４；ＨＤＡＣ４、レーン５；ＨＤＡＣ６である。なお、レーン２はＧＦＰ−ＨＤＡＲＴのみを発現させたサンプルである。
図９Ａに示すように、Ｆｌａｇ−ＨＤＡＣ発現ベクターとＧＦＰ−ＨＤＡＲＴ発現ベクターとがコトランスフェクションされた２９３細胞由来の抽出液では、抗ＦＬＡＧ抗体によってＧＦＰ−ＨＤＡＲＴが免疫沈降したことが確認された（下部パネル、左よりレーン１，３，４，５）。しかし、ＦＬＡＧ−ＨＤＡＣ非存在下（Ｆｌａｇ−ＨＤＡＣ発現ベクターが導入されていない株）では、抗ＦＬＡＧ抗体を添加してもＧＦＰ−ＨＤＡＲＴの沈降は見られなかった（下部パネル、レーン２）。従って、抗ＦＬＡＧ抗体によるＧＦＰ−ＨＤＡＲＴの沈殿は、Ｆｌａｇ−ＨＤＡＣとＧＦＰ−ＨＤＡＲＴとの特異的な相互作用によることが示された。また、ＨＤＡＲＴはタイプＩ（ＨＤＡＣ１および３）とタイプＩＩ（ＨＤＡＣ４および６）の両タイプのＨＤＡＣと相互作用することも示された。
さらに、ＨＤＡＲＴとＨＤＡＣ３との直接的な相互作用をＧＳＴプルダウン解析により調べた。ＧＳＴプルダウン解析は基本的に既知の方法に従って実施した（Ｔｚａｍａｒｉａｓ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．（１９９５）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９（７），８２１−３１．）。ＴＮＴ（登録商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、３５Ｓ−メチオニン存在下でＨＤＡＣ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行った。ＧＳＴタンパク質またはＧＳＴ−ＨＤＡＲＴ融合タンパク質は、それぞれ大腸菌内で発現させ、ＧＳＴ結合緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＬｉＣｌ、０．５％  ＮＰ４０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中、グルタチオンセファロースを用いて精製した。ＧＳＴ結合緩衝液１ｍｌ中ＧＳＴ−ＨＤＡＲＴ融合タンパク質または対照ＧＳＴタンパク質（約１μｇ）と３５Ｓ−放射線標識ｉｖ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物（１０μｌ）とを含有した結合反応液を調製した。この反応液を振とうしながら４℃、１時間インキュベートした後、セファロース−ＧＳＴタンパク質複合体をＧＳＴ結合緩衝液で５回洗浄した。ＧＳＴタンパク質に結合したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有サンプル緩衝液中で沸とうさせることにより溶出させ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ＧＳＴ融合タンパク質が同等に泳動されていることをクーマシーブリリアントブルー染色により確認し、さらにオートラジオグラフィにより３５Ｓ−放射線標識されたＨＤＡＣを検出した。
図９Ｂに示されているように、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳されたＨＤＡＣ３は、単なるＧＳＴタンパク質とは結合せずプルダウンさせることができなかったが、ＧＳＴ−ＨＤＡＲＴ融合タンパク質を用いることによりプルダウンされることが示された（図９Ｂ）。また図には示されていないがＨＤＡＣ１でもまた同様の結果が示された。このことから、このＨＤＡＲＴとＨＤＡＣとの相互作用は直接的であることが示唆された。
さらにＨＤＡＲＴの転写抑制作用に対するＨＤＡＣの脱アセチル化活性への影響を解析するために、ＨＤＡＣを特異的に阻害するトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）存在下で、実施例４と同様にＣＡＴレポーター解析を行った（図１０ＣおよびＤ）。但し、本実施例では、一定量のｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ発現ベクター（１μｇ）を用い（図１０中「ＨＤＡＲＴ＋」）、またリガンド（ＡＴＲＡまたはデキサメタゾン）と共に１００ｎＭ  ＴＳＡまたは１ｍＡ酪酸ナトリウムを添加した。
図１０Ｃ、Ｄに示すように、リガンドのみでは対応するプロモータからのリポーター遣伝子の発現は上昇し、そこにＨＤＡＲＴを発現させると、発現活性が抑制された。さらにトリコスタチンＡが添加されると、ＨＤＡＲＴによる発現抑制が完全に中和された。同一の結果がもう一つのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、酪酸ナトリウム（Ｂｕｔｙ）を添加した場合にも観察された。これら結果は、ＨＤＡＲＴによる転写抑制が脱アセチル化酵素活性を介して発揮していることを裏付けている。
［実施例８］ＨＤＡＲＴ−Ｓｋｉｐ相互作用によるリガンド非結合型レセプター（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の能動抑制
ＲＡＲおよびＴＲは、ｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｂａｎｉａｈｍａｄ，Ａ．，Ｋｏｈｎｅ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｅｎｋａｗｉｔｚ，Ｒ．（１９９２）Ｅｍｂｏ  Ｊ  １１（３），１０１５−２３）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｆｏｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｏｙ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．（１９９３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７（７Ｂ），１４００−１０．）においてリガンド非存在下で遺伝子活性化を抑制する。このことから、これを能動抑制（ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）と称している。また、Ｓｋｉｐはリガンド非依存的にＮＨＲと相互作用する（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｐ．Ｎ．，Ｂａｕｄｉｎｏ，Ｔ．Ａ．，Ｔｏｋｕｍａｒｕ，Ｈ．，Ｄｏｗｄ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，Ｃ．（２００１）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６６（３−５），１７１−６．）。そのため、これら抑制効果およびＳｋｉｐとの生理的な関与により、ＨＤＡＲＴ−Ｓｋｉｐ複合体がリガンド非結合型レセプター上に存在する可能性、また、この相互作用がレセプターの能動抑制に関与する可能性が示唆された。これら可能性を明らかにするために、ＨＤＡＲＴのドミナントネガティブ株を過剰発現させ、その際のＲＡＲに起因した転写に対する影響を調べた。実施例２に示した通りＨＤＡＲＴにおけるＮ末端の４つのＴＰＲ（Ｎ４ＴＰＲ）はＳｋｉｐ結合領域であるため、この領域の発現が内在ＨＤＡＲＴとＳｋｉｐとの相互作用を阻止することでＨＤＡＲＴの天然の機能を阻害してドミナントネガティブとして機能することが予想されたため、本実施例ではＮ４ＴＰＲをドミナントネガティブ候補として用いた。
２９３細胞にＦｌａｇ−ＳｋｉｐおよびＧＦＰまたはＧＦＰでタグ付けされたＮ４ＴＰＲをトランスフェクションした。トランスフエクション２４時間後に細胞抽出物を調製し、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。また、免疫沈降前の内在性ＨＤＡＲＴの発現を確認するために、免疫沈降前の細胞抽出液も同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。分離後のパターンをメンブレンに転写した。そして、Ｆｌａｇ−Ｓｋｉｐの発現については抗ＦＬＡＧ抗体を用い、ＧＦＰおよびＧＦＰ−Ｎ４ＴＰＲの発現については抗ＧＦＰ抗体を用い、さらに、内在ＨＤＡＲＴの発現については抗ＨＤＡＲＴ抗体を用いて、それぞれ検出した（図１１Ａ）。なお、図１１Ａにおいて、下方の３つのパネルは、それぞれ免疫沈降されたＳｋｉｐ（下部上）、内因性ＨＤＡＲＴ（下部中央）およびＮ４ＴＰＲ（下部下）を示し、上部の一枚のパネルには、免疫沈降前の内因性ＨＤＡＲＴタンパク質の発現を示す。
図１１Ａに示されているように、Ｎ４ＴＰＲの発現は、Ｎ４ＴＰＲを発現していない対照（ＧＦＰのみ、レーン１）に比べてＳｋｉｐと共沈殿したＨＤＡＲＴの量を減少させた（下部中央パネル、レーン２）。一方、Ｎ４ＴＰＲの過剰発現は、Ｎ４ＴＰＲとＳｋｉｐとの相互作用が増加し、共沈殿したＳｋｉｐの量を著しく上昇させた（レーン２、ｌｏｗｅｒ  ｂｏｔｔｏｍ  ｐａｎｅｌ）。コントロールのタンパク質（ＧＦＰ）の発現はＨＤＡＲＴとＳｋｉｐとの相互作用に対して影響はなかった（レーン１）。この結果は、Ｎ４ＴＰＲがＨＤＡＲＴに代わってＳｋｉｐと相互作用するドミナントネガティブタンパク質として作用することを示している。
次に、Ｎ４ＴＰＲの過剰発現がＲＡＲまたはグルココルチコイド応答性プロモータからの転写に与える影響を調べた。なお、ここでは、ＧＦＰ−Ｎ４ＴＰＲ発現ベクター（０、０．３、０．５μｇ）を用いた点を除いて、上記実施例４に記載したレポーター解析と同様の方法により検討した。
結果は図１１Ｂ、Ｃに示した通り、リガンド非存在下でＮ４ＴＰＲを制限して発現させることにより（導入量０．３μｇ）、ＲＡＲおよびグルココルチコイド応答性プロモータからの転写活性をリガンド存在下で誘導した転写活性の程度（グレーカラム）まで増加させた。Ｎ４ＴＰＲの最も高い発現レベルでは（導入量住０．５μｇ）、リガンド非存在下で転写活性を強く増加（〜約２０倍）させた。これらの結果はＨＤＡＲＴがＲＡＲやグルココルチコイドレセプターなど核内ホルモンレセプターの能動抑制にとって必要であることを示唆している。
［実施例９］レチノイン酸誘導による黄紋筋筋腫由来細胞株（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の筋組織への分化をＨＤＡＲＴの過剰発現により阻害
ＡＴＲＡ（Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）は、腫瘍細胞分化の重要な誘導剤であることが知られている（２０−２２）。ヒト黄紋筋筋腫由来細胞株ＭＭ−１−１９−Ｐは主に小さな多角形の細胞から構成され、最終的にレチノイン酸を備えた筋管様の巨大細胞に分化する。核内ホルモンレセプターに起因した反応におけるＨＤＡＲＴの生理学的な役割を明らかにするために、ＡＴＲＡによるＭＭ−１−１９−Ｐの筋組織の分化に対してＨＤＡＲＴ発現が与える影響を解析した。
１００ｍＭのペトリ皿上にＭＭ−１−１９−Ｐ細胞を植えつけ、この細胞に０．４μｇのｐＧＦＰベクターと２μｇのｐｃＤＮＡ３（空ベクター）またはｐｃＤＮＡ３−ＨＤＡＲＴ（ＨＤＡＲＴ発現ベクター）とをコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、培地をＡＴＲＡ含有（２μＭ）または非含有の新鮮な培地と交換した。４８時間の誘導後、細胞が筋管様の巨大細胞を示す細長い紡錘細胞へと変化した時点で、形態学的に分化したものとして細胞を評価した。すべての実験を４回反復し、ＧＦＰについて陽性と評価済みの細胞の数をカウントした。結果を図１２に示す。なお、図１２において、ＧＦＰの緑色螢光の標準的顕微鏡写真をパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに、位相差顕微鏡写真をパネルＥ、Ｆに示す。また、（Ａ）はＡＴＲＡ非処理かつ空ベクター導入細胞、（Ｂ）ＡＴＲＡ処理かつ空ベクター導入細胞、（Ｃ）ＡＴＲＡ非処理かつＨＤＡＲＴ発現ベクター導入細胞、（Ｄ）ＡＴＲＡ処理かつＨＤＡＲＴ発現ベクター導入細胞、（Ｅ）上記（Ｃ）と同一条件の細胞、（Ｆ）上記（Ｄ）と同一条件の細胞を示す。また、パネルＦでは、黒色矢印は、未分化ＧＦＰ陽性細胞を表わし、白色矢印は分化された細胞を指す。（Ｇ）グラフは、ＧＦＰ陽性細胞中の形態学的に分化された細胞の百分率を４回の独立した実験結果の平均で示し、また標準偏差はエラーバーで示されている（空ベクターかつＡＴＲＡ（＋）とＨＤＡＲＴ発現ベクターとの間でＰ＜１％，スチューデントのｔテスト）。
各実験において、ＧＦＰ陽性細胞数は３０〜７０であった。空ベクターを導入しＡＴＲＡ処理した細胞では、ＧＦＰ陽性の細胞数はＡＴＲＡの細胞毒性効果のため３０％未満であったが、一方、ＨＤＡＲＴ発現ベクターを導入した細胞では、ＡＴＲＡ処理群、非処理群とでＧＦＰ陽性の細胞数は同じであった。
空のベクターが導入された細胞の多くは、ＡＴＲＡ処理によって、筋管様の巨大細胞の出現で示されるように筋組織に分化した（図１２Ｂ、図１２Ｇ）。また、空のベクターが導入された細胞では、ＡＴＲＡ処理による表現型の変化の程度はＧＦＰ陽性および陰性の細胞の双方で同一であった。しかしながら、ＨＤＡＲＴが導入された細胞では、ＧＦＰ陽性細胞はＡＴＲＡ処理を行っても表現型の変化はほとんどないが（図１２Ｄ中黒色矢印、図１２Ｇ）、一方のＧＦＰ陰性細胞では特徴的な筋管様巨大細胞が観察された（図１２Ｆ中白色矢印）。この結果は、ＨＤＡＲＴの発現がレチノイン酸による分化を抑制することを示している。そして、この結果はレポーター解析においてＨＤＡＲＴがＲＡＲによる転写活性化を抑制した結果と一致する。これらの結果はＨＤＡＲＴが少なくともレチノイン酸レセプターにおける生理学的な転写のコリプレッサーであることを示している。
【産業上の利用の可能性】
上述した通り、本発明の転写抑制因子は、自律的に転写を抑制し、特に、核内レセプターの転写を抑制するため、所望の転写系に作用させ、該転写系の転写を抑制する目的で用いることができる。また、本発明の転写抑制因子はＨＤＡＣと結合能を有し、このＨＤＡＣのヒストン脱アセチル化活性を介して転写抑制能を発揮し得る。したがって、本発明の転写抑制因子を用いてＨＤＡＣをリクルートさせ、ＨＤＡＣの作用によって転写抑制を行うこともできる。本発明の転写抑制因子のこのような作用は、例えば核内レセプターの転写亢進が起因している疾患に応用し得るものであり、こうした疾患の治療薬として本転写抑制因子が有益となる。
また、上記転写抑制因子のドミナントネガティブペプチドは、転写活性化因子として機能する。したがって、このドミナントネガティブペプチドは、転写を促進させるために用いることができる。このドミナントネガティブペプチドもまた、核内レセプターの転写に作用し、その転写を逆に促進させる。そのため、核内レセプターの転写促進物質として本ペプチドが有益となる。特に、ＨＤＡＲＴのＮ末端側の４つのＴＰＲ（Ｎ４ＴＰＲ）は、ＡＴＲＡに比してレチノイン酸レセプターの転写活性化能が高いため、現在ＡＴＲＡが用いられている疾患治療（例えば、悪性腫瘍の分化誘導療法など）において、ＡＴＲＡに代えてまたはＡＴＲＡと共に本ペプチドを治療薬として応用し得る。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は転写調節因子等に関し、特に、核内ホルモンレセプターに起因した転写を調節し得る因子、ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンや脂溶性ビタミンなどは生物の恒常性の維持、エネルギー代謝、分化、成長などに重要な役割を果たしている。これらホルモン等のレセプターは核内に存在する転写調節因子であり、クロマチンDNAの特定部位に結合して、遺伝子の転写反応を調節する。
【０００３】
多くの場合、ホルモン等のリガンドがレセプターに結合していない場合には、転写が抑制され、レセプターにリガンドが結合するとクロマチン構造の変化などにより転写が活性化される。この核内レセプターから転写装置に至る経路にはコアクチベーターやコリプレッサーと呼ばれる多くの因子が複合体を形成して働いていることが報告されている。
【０００４】
リガンドが結合していないレセプターにはヒストン脱アセチル化酵素を含むコリプレッサー複合体が結合して遺伝子発現を抑制し、一方、リガンドが結合することによりレセプターの構造が変化すると、コリプレッサー複合体が離れて代わりにヒストンアセチル化酵素を含むコアクチベーター複合体がリクルートされる。
【０００５】
このようなコアクチベーターの一例としてはSkip（Ski相互作用タンパク質、N-CoA62とも称されている）があり、いくつかの核内レセプター（例えば、ビタミン３レセプター、レチノイン酸レセプター、エストロゲンレセプター、およびグルココルチコイドレセプター）と直接結合して、これら核内レセプターが媒介する遺伝子発現を増強し得る（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】
Baudino, T. A., Kraichely, D. M., Jefcoat, S. C., Jr., Winchester, S. K., Partridge, N. C., and MacDonald, P. N. (1998) J Biol Chem 273(26), 16434-41、MacDonald, P. N., Baudino, T. A., Tokumaru, H., Dowd, D. R., and Zhang, C. (2001) Steroids 66(3-5), 171-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、核内レセプターを介した転写の制御メカニズムの概要は明らかにされつつあるが、そのメカニズムにどのような因子が関与するかの解明は残されている。そこで、本発明は、転写調節因子、特に核内レセプターの転写調節にも関与し得る新たな因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、ショウジョウバエのcrn（crooked neck）遺伝子のヒトホモログのクローニングおよびその機能解析の研究を通して、このヒトホモログが核内レセプターを介した転写調節に関与することを見出した。
【０００８】
なお、このショウジョウバエcrn遺伝子自体は、胚形成の早期段階で最大の発現レベルになる遺伝子であり、この遺伝子の不活性化は、胚形成の欠陥をひき起こし、主に神経系の発達に影響を及ぼすことが報告されている（Zhang, K., Smouse, D., and Perrimon, N. (1991) Genes Dev 5(6), 1080-91）。
【０００９】
crnタンパク質の１つの独特な特徴は、縦列に方向付けられたテトラトリコペプチド反復（TPR）の１６のコピーが存在することである。TPRは、さまざまなタンパク質で見出され、進化中に広まった同義性の３４アミノ酸反復モチーフである。TPRタンパク質が関与するプロセスとしては、細胞サイクル制御、転写抑制、ストレス応答、タンパク質キナーゼ抑制、およびタンパク質輸送が含まれる（Lamb, J. R., Tugendreich, S., and Hieter, P. (1995) Trends Biochem Sci 20(7), 257-9）。
【００１０】
上記crn遺伝子のヒトホモログには、コピー数において１５と異なるが上記ショウジョウバエcrn遺伝子と同様に多数のTPRが存在する。本願発明者らがクローニングしたヒトcrn遺伝子は既に報告されている転写に関連した転写共役DNA修復に関与するタンパク質（XAB2）をコードした遺伝子（Yoshimichiら、Jounal. Biol. Chem. 275:34931-34937）と一致するものであるが、本願発明者らは、本遺伝子産物が転写抑制に関与することを新たに見出した。特に、本遺伝子産物は、HDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能することから、本明細書では「HDART（a HDAC associated repressor TPR）」タンパク質と称する。
【００１１】
また、本願発明者らは、HDARTが、上述した核内レセプターの転写コアクチベーターとして機能するSkipと直接結合し、核内レセプターの転写を抑制することも見出した。さらに、HDARTが核内レセプターの転写コリプレッサーの１つであり、HDACと結合しHDACのヒストン脱アセチル化により強力に転写を抑制し得ることも明らかにした。一方、HDARTのドミナントネガティブペプチドも得られ、このペプチドは全長HDARTとは逆に転写を活性化することをも確認した。
【００１２】
すなわち、本願発明は、HDARTの新たに解明した種々の機能に基づくものであり、具体的には、以下の通りである。
（１）本発明は転写抑制因子をコードしたDNAであって、（A）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA、または、（B）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAである。
（２）本発明は転写抑制因子をコードしたDNAであって、（A）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA、または（B）配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。
（３）本発明は上記（１）または（２）に記載のDNAによりコードされた転写抑制因子である。
（４）本発明は核内ホルモンレセプターに起因した転写を抑制し得る上記（３）記載の転写抑制因子である。
（５）本発明は転写を活性化し得るペプチドをコードしたDNAであって、（A）配列番号２における１から179位のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしたDNA、または（B）配列番号１における１から537塩基までの塩基配列からなるDNAである。
（６）本発明は転写を活性化し得るペプチドをコードしたDNAであって、（A）配列番号２における１から179位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしたDNA、または（B）  配列番号１における１から537塩基までの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAである。
（７）本発明は上記（５）または（６）記載のDNAによりコードされた転写活性化ペプチドである。
（８）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のDNAのうち、少なくとも１５ヌクレオチド長を有するDNAである。
（９）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のDNA が挿入されたベクターである。
（１０）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のDNAまたは上記（９）に記載のベクターを保持する宿主細胞である。
（１１）本発明は上記（３）に記載の因子または上記（７）に記載のペプチドに結合し得る抗体である。
（１２）本発明は上記（１）、（２）、（５）または（６）のいずれかに記載のDNAとハイブリダイズし、少なくとも10ヌクレオチド長を有する、オリゴヌクレオチドプローブである。
（１３）本発明は以下の（A）〜（D）のいずれかが固定された基板である。
（A）上記（１２）に記載のオリゴヌクレオチドプローブ
（B）上記（３）または（４）に記載の転写抑制因子、もしくは該因子の部分ペプチド
（C）上記（７）に記載の転写活性化ペプチド、もしくは該ペプチドの部分ペプチド
（D）上記（１１）に記載の抗体
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において予め用いる略語を説明する：HAT（ヒストンアセチルトランスフェラーゼまたはヒストンアセチル化酵素）、HDAC（ヒストンデアセチラーゼまたはヒストン脱アセチル化酵素）、DAPI（４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、RAR（レチノイン酸レセプター）、GR（グルココルチコイドレセプター）、DBD（DNA結合ドメイン）、AD（活性化ドメイン）、ATRA（all-trans Retinoic Acid:全トランスレチノイン酸）。
【００１４】
本発明は、転写調節に関する因子に関する。この転写調節因子には、転写を抑制する因子と、活性化する因子が含まれる。まず、転写抑制因子について説明する。本発明の転写抑制因子を例示すればHDARTであり、HDARTのアミノ酸配列は、配列番号２からなる。但し、本発明の転写抑制因子は配列番号２に記載のHDARTに限定されず、転写抑制活性を有する範囲で、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、さらには、HDARTをコードしたDNA（配列番号１）とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされたタンパク質をも包含される。
【００１５】
上記HDARTタンパク質は、ヒト細胞の核内で発現していることから、ヒト細胞核より得ることができる。この原料となるヒト細胞は、特に限定はないが、一例を挙げればHDARTを内在的に発現していることが明らかである293細胞を用いることができる。
【００１６】
また、アミノ酸置換等を有するHDART類似タンパク質の調製は、例えば、公知の技術であるファージライブラリースクリーニング技術（Molecular Cloning 3rd Ed, Chapter 2, pp. 2.1-2.117）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR：Molecular Cloning 3rd Ed, Chapter 8, pp. 8.1-8.126）技術を利用して実施することができる。具体的には、HDARTをコードしたDNA（配列番号１）またはその一部をプローブやプライマーとして、配列番号１とホモロジーを備えたDNAを得て、このDNAを基にタンパク質を生成することにより得ることができる。ここで得られるタンパク質は、通常、HDARTとアミノ酸配列において高いホモロジーを有する。この高いホモロジーは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の塩基配列の一致を意味する。
【００１７】
また、上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当業者であれば適宜選択することができる。一例としては、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを実施することが挙げられる。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、1xSSC、0.1% SDS、37℃程度で、より厳しい条件としては、0.5xSSC、0.1% SDS、42℃程度で、さらに厳しい条件では、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃程度で実施することができる。これらSSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、適宜改変することは可能である。
【００１８】
配列のホモロジーは、BLASTn（核酸レベル）やBLASTx（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic. Acids. Res.25:3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００１９】
配列番号２に記載の配列を人為的に改変する場合には、一般的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ましくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の1％以内であると考えられるが、転写抑制活性を維持し得る範囲内であれば上記改変割合を超えてアミノ酸配列を置換等してもよい。この人為的にアミノ酸配列を改変する手法は、例えば、公知の手法であるdeletion-mutant  作製方法、PCR法、site-directed mutagenesisなどにより実行することができる。なお、ここで改変されたタンパク質が、HDARTと同様に、転写抑制活性を有するか否かは、後述する実施例に記載されているような種々のレポーター解析法などを用いて転写抑制能を解析し決定することができる。
【００２０】
上記HDARTまたはこれに類似したタンパク質は、上述した通り転写抑制活性を有するため、この機能を利用して所望の転写装置に組合せて所望の遺伝子の転写を抑制することができる。この転写装置は、in vitro転写系、in vivo転写系のいずれでもよい。また、HDARTの転写抑制能は自律的であることから、本発明の転写抑制因子は単独で用いて転写を抑制させ得る。但し、この場合、HDARTはDNA結合能を有しないため、好ましくは、DNA結合領域を融合させた融合タンパク質として用いることがよい。また、HDARTはHDACと結合能を有し、HDARTはHDACをリクルートしてヒストン脱アセチル化活性により強力に転写を抑制し得る。そのため、本発明の転写抑制因子は、HDACと共に用いて、あるいはHDACを誘導することにより転写を抑制することもできる。なお、HDACにはタイプI(HDAC1, HDAC2, HDAC3)とタイプII(HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8)が存在することが知られている。本発明のHDARTはHDAC2、HDAC5、HDAC7、HDAC8等と結合するものと考えられることから、本発明においては、HDAC2、HDAC5、HDAC7、HDAC8を好適に使用することができるが、これらのHDACに特に限定されるものではなく、タイプIまたはIIに属するいずれのHDACを用いることが可能である。
【００２１】
また、HDARTは核内レセプターの転写を抑制し得ることから、本発明の転写抑制因子により抑制し得る転写装置としては、好適には核内レセプターを介した転写装置を挙げることができる。この核内レセプターとしては、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプターを好適に挙げることができ、また、本発明の因子が転写抑制し得る範囲でレチノインXレセプター、ビタミンDレセプター、アンドロゲンレセプター、エストロゲンレセプター、チロイドホルモンレセプターなどのホルモンや脂溶性ビタミンなどに対する核内レセプターなどを含めることができる。そのため、本発明の転写抑制因子は、このような核内レセプターからの転写の不調節、特に過剰に転写が促進されることが起因した疾患の治療に役立ち得る。特に、後述する実施例で示すように、HDARTはレチノイン酸レセプターの転写を抑制し、さらには、このレチノン酸レセプターの転写により誘導する分化をも抑制することが明らかになっているため、レチノン酸レセプターの転写による分化亢進が起因した疾患の治療薬として本転写抑制因子を応用してもよい。
【００２２】
本発明は上記転写抑制因子をコードしたDNAに関する。このDNAとしては、例えば配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、上述した配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードしたDNA、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA、および配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAなどが包含される。
【００２３】
上記DNAは、配列番号１に記載のDNAまたはその一部をプローブまたはプライマーとして用い、例えば、ヒト細胞（一例を挙げれば、後述する実施例１に示したように、ヒト膵臓の小島細胞）のcDNAライブラリーなどからハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得ることができる。他の方法としては、ヒト細胞のmRNAを鋳型に用い、配列番号１に記載のDNAの一部をプライマーとしてRT-PCR（Molecular Cloning 3rd Ed, Chapter 8, Protocol 8, pp. 8.46-8.53）により得ることもできる。なお、ここでは、ヒト細胞を例に挙げたが、それ以外の哺乳動物細胞、真核細胞などを用いて調製してもよい。また、DNAを単離するためのハイブリダイゼーション条件は、上述した通りである。
【００２４】
上記DNAをクローニングする方法以外にも、DNA合成機により配列番号１に記載のDNAとその相補鎖とをそれぞれ合成し、アニーリングさせて生成してもよい。
【００２５】
上記DNAは転写抑制因子をコードしていることから、この転写抑制因子を生産するツールとして、または細胞や個体内に導入して転写抑制因子を発現させるツールとして用いることができる。このような目的で用いる場合には、上記DNAを発現ベクターなどに組み込むことが好ましい。発現ベクターは、タンパク質生産に用いる翻訳系により、あるいは導入する細胞により適宜選択することができる。
【００２６】
上記DNAが組込まれたベクターを用いて転写抑制因子を生産するためには、先ず、上記ベクターを宿主細胞に導入し、この宿主細胞を培養する。これにより、宿主細胞内では上記転写抑制因子が生産される。ここでベクターを細胞に導入する手法は、用いる細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスベクターやファージを介した生物学的な手法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などの化学的な手法、ジーンガン、エレクトロポレーション法などの物理的な手法などを用いることができる。宿主細胞において生産されたタンパク質は、必要に応じて、精製（例えば、アフィニティー精製など）を行った上で使用することができる。
【００２７】
上記DNAが組み込まれた発現ベクターはまた、細胞内あるいは個体内の所望の転写を抑制する目的で用いることができる。すなわち、この発現ベクターを細胞または個体内に導入し上記転写抑制因子を発現させることにより、所望の転写系を抑制することができる。特に、HDARTは自律的な転写抑制能を有するため、本発明の転写抑制因子は単独でも転写抑制活性を発揮し得る。但し、HDART自身はDNA結合能を有しないため、好ましくは、本転写抑制因子は、所望の遺伝子の制御領域のDNAに結合し得るDNA結合領域との融合タンパク質として発現させることがよい。これに、標的となる遺伝子の転写を抑制することが可能となる。また、本転写抑制因子はHDACと結合能を有することから、本転写抑制因子を発現させることにより、HDACをリクルートさせて転写をさらに強く抑制し得る。
【００２８】
また、本発明のDNAにコードされた転写抑制因子は核内レセプターの転写を効果的に抑制し得ることから、これら核内レセプターの転写亢進に起因した疾患の治療用組成物として、本DNAが組み込まれたベクターを応用してもよい。こうした治療目的のベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、EBウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクターなどのウイルスベクターなどが挙げられる。
【００２９】
本発明は転写調節因子のうち、上記とは反対に転写を活性化し得るペプチドにも関する。HDARTは全長であれば、転写抑制因子として機能するが、HDARTのドミナントネガティブペプチドは、逆に転写活性化因子として機能する。このドミナントネガティブペプチドを例示すると、N末端の４つのTPR（以下、「N4TPR」と省略する）をコードしているペプチド、すなわち、配列番号２における1から179位のアミノ酸配列からペプチドを挙げることができるが、これに限定されず転写活性化能を有する範囲で、配列番号２における１から179位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドを含めることができる。
【００３０】
上記ドミナントネガティブペプチドの調製は、配列番号１のうち１から537までの塩基配列からなるDNAを基にペプチドを合成することに行うことができる。また、このペプチドとアミノ酸配列において置換等を有するペプチドの合成は、上記配列番号１のうち１から537までの塩基配列に変異（置換、欠失、挿入および／または付加）を加えコドンを変えたDNAを基にペプチド合成することにより調製することができる。
【００３１】
上記ペプチドは、転写活性化能を有するため、所望の転写系の転写を促進させるために用いることができる。特に、実施例に示した通り、HDARTのN4TPRは核内レセプターの転写を活性化することから、これら核内レセプターの転写を促進させるために用いることができる。この核内レセプターとして、好適には、Skipが作用する核内レセプター、例えば、レチノイン酸レセプター、グルココルチコイドレセプター、ビタミンDレセプター、エストロゲンレセプターを挙げることができる。また、本発明のペプチドが転写活性化し得る範囲でレチノインXレセプター、アンドロゲンレセプター、チロイドホルモンレセプターなどのホルモンや脂溶性ビタミンなどに対する核内レセプターなどを含めてもよい。
【００３２】
上記N4TPRによるレチノイン酸レセプターの転写活性化能は、ATRAによる転写活性化能よりも高いことが後述する実施例で示されている。そのため、現在、ATRAによるレチノイン酸レセプターの転写活性化による白血病などの悪性腫瘍の分化誘導療法が行われている。さらに、ビタミンAやATRAを含むその誘導体は、白血病以外にも肝細胞癌(Okuno, M. et al., (2002) Front Biosci 7, 204-18)、卵巣癌(Zhang D. et al., (2000) J Cell Physiol 185(1), 1-20)、甲状腺癌(Schmutzler C. and Kohrle J. (2000) Thyroid 10(5), 393-406)、皮膚癌(Niles R. M. (2000) Nutrition 16(11-12), 1084-9)、膵癌(Riecken E. O. and Rosewicz S. (1999) 10 Suppl 4, 197-200)等で治療に使用され始めており、このATRAに代えて又はATRAと組合せて、本ペプチドを用いることができる。
【００３３】
本発明は、上記転写活性化能を有するペプチドをコードしたDNAに関する。このDNAとしては、具体的には、配列番号２における１から179位のアミノ酸配列からなるペプチドをコードしたDNA、一例としては、配列番号１から537塩基までの塩基配列からのDNAを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、転写活性化能を有する範囲で、配列番号２における１から179位のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するペプチドをコードしたDNA、または配列番号１における１から537塩基までの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを含めることができる。
【００３４】
上記転写活性化ペプチドをコードしたDNAは、上述した転写抑制因子をコードしたDNAを得た後、例えば、C末端側を欠失させることに調製することができる。または、DNA合成機により合成し調製してもよい。
【００３５】
上記DNAは、上記転写活性化ペプチドを生産するため、または、細胞または個体内に導入して上記転写活性化ペプチドを発現させる目的で用いることができる。ペプチドを生産する目的で上記DNAを用いる場合には、発現ベクターに組み込むことが望ましい。この場合の発現ベクターは、ペプチドを生産するための転写・翻訳系によって適宜選択することができる。この転写・翻訳系は、in vitro、in vivoのいずれでもよい。In vivo系の場合には、上記DNAが組み込まれた発現ベクターを細胞に導入し、細胞を培養することにより、細胞内で上記転写活性化ペプチドが生産される。細胞への導入方法などについては上述と同様である。
【００３６】
上記DNAを細胞または個体内に導入して上記転写活性化ペプチドを発現させる目的で用いる場合には、上記DNAを直接、細胞内等に導入し一時的に発現または染色体に挿入させて安定的に発現させてもよく、また、発現ベクターに組み込んで細胞等に導入してもよい。
【００３７】
上述した通り、転写活性化ペプチドは、ATRAのように悪性腫瘍の分化誘導療法に応用し得るため、転写活性化ペプチドを直接用いる代わりに、本DNAを患者に注入等し上記転写活性化ペプチドを発現させて、上記治療方法に利用してもよい。このような目的で使用するためには、上記DNAを所望の組織または細胞に該DNAを運搬するためのベクターに組み込み使用することが好ましい。こうした治療目的のベクターとしては、上述したレトロウイルスベクター等のウイルスベクターを用いることができる。
【００３８】
以上の通り、本発明の転写抑制因子をコードしたDNAは、N末端側をコードしたDNAに短くすることにより上記転写活性化ペプチドをコードしたDNAに改変し得る。これ以外にも、上記転写抑制因子をコードしたDNAまたは転写活性化ペプチドをコードしたDNAはさらに短い一部フラグメントとしても、ハイブリダイゼーション用プローブ、PCRプライマーまたはリボザイム誘導体として利用することができる。これら目的で上記DNAの一部を用いる場合には、プローブ等としての特異性を保持できる長さ、例えば、15ヌクレオチド長を有していることが好ましい。本発明は、本発明のDNA（例えば、配列番号１に記載のDNA等）とハイブリダイズし、少なくとも10ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。例えば、こうしたポリヌクレオチドとしては、配列番号１に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズするものが挙げられる。ここで、「特異的にハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションにおいて、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。上記プローブ、プライマーは、転写抑制因子等をコードしたDNAのクローニング等に利用することができる。
【００３９】
本発明はまた、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドに結合し得る抗体に関する。本発明の抗体は、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドと特異的に結合し得るものであれは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体は、本発明のタンパク質またはその部分ペプチドを必要に応じてフロイントアジュバント等と混合し、周知の方法によりウサギ、ヤギ、モルモットなどの非ヒト動物を免疫し、抗体価が上昇したことを確認した上で免疫動物の末梢血から血清を回収することにより調製することができる。一方、モノクローナル抗体はまた、上記転写抑制因子もしくは転写活性化ペプチドまたはその部分ペプチドを用い、周知の方法によりマウスなどの動物を免疫し、抗体価が上昇した免疫動物の脾臓またはリンパ節を採取し、これら組織中の抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させハイブリドーマを調製する。ハイブリドーマから産生される抗体を培養上清から回収することにより得ることができる。
【００４０】
これら抗体は、上記転写抑制因子または転写活性化ペプチドをアフィニティー精製する際等に利用することができる他、種々の細胞内における転写抑制因子の発現量を免疫学的に解析するなどの目的で、または転写抑制因子を阻害する目的で利用してもよい。
【００４１】
また本発明は、本発明の上記オリゴヌクレオチドが固定された基板を提供する。該基板をバイオチップとすることにより、例えば、被検生物（細胞）における本発明のDNAの発現状態を解析することが可能である。
【００４２】
好ましい態様においては、まず、被検生物（細胞）から本発明のDNA（例えば、配列番号１に記載のDNA、またはその部分DNA領域）を増幅する。次いで、該DNAとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を用意する。次いで、該DNAと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたDNAを検出することにより、本発明のDNAの発現状態を解析することができる。
【００４３】
このような方法としては、DNAアレイ法が例示できる。被検生物（細胞）からのDNA試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該DNA試料の調製の好ましい態様においては、細胞から抽出した染色体DNAを基に調製することができる。染色体DNAから本方法のDNA試料を調製するには、例えば本発明のDNAにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体DNAを鋳型としたPCR等によって本発明のDNAを調製することも可能である。調製したDNA試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００４４】
本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味し、通常、チップとも呼ばれる。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
【００４５】
一般にDNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのDNAは非透過性(non- porous)の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用することができる。
【００４６】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社開発によるオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ(in situ)で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット(Rosetta Inpharmatics社)技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００４７】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のDNAを検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、配列番号１に記載のDNAと特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、本発明のDNAに対し、完全に相補的である必要はない。
【００４８】
本発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常10〜100ベースであり、好ましくは10〜50ベースであり、さらに好ましくは15〜25ベースである。
【００４９】
本発明においては、次いで、DNA試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、DNA試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００５０】
本発明においては、次いで、該DNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、DNAアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したDNAをプローブといい、一方溶液中のラベルしたDNAをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。本方法においては、必要に応じて、検出したハイブリダイズの強度を対照と比較する。上記方法としては、例えば、DNAアレイ法（SNP遺伝子変異の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135、Nature Genetics(1999)22:164-167）等が挙げられ、当業者においては、公知の文献等を参照して、適宜、実施することができる。
【００５１】
また、本発明は、本発明のタンパク質もしくは該タンパク質の部分断片が固定された基板を提供する。該基板をバイオチップとすることにより、例えば、本発明のタンパク質と結合する分子の探索、またはHDAC阻害化合物のスクリーニング等を行うことが可能である。
【００５２】
一般的に、タンパク質を基板へ固定させたものを、プロテインチップと呼ぶ。その原理はDNAチップと同様、スライドガラスや膜の上にタンパク質を高密度に固定し、それらと相互作用する蛋白質や核酸などを検出する。
【００５３】
本発明のHDARTタンパク質は、種々のHDACタンパク質と結合することから、HDAC阻害化合物のスクリーニングに応用することができる。より具体的には、本発明のHDARTタンパク質を固相表面に固定することにより、一つの面に種々のHDACを結合させることができる。この固相表面に種々の化合物を結合させ、HDAC活性を計測することにより、HDAC阻害化合物をスクリーニングすることができる。
【００５４】
上記スクリーニングによって取得されるHDAC阻害化合物の例としては、癌の分化誘導療法で薬剤として用いられるトリコスタチンAを示すことができる。また、本発明の抗体が固定された基板をバイオチップとすることも可能である。高純度で分離精製された抗体をチップ表面に固定化することにより高密度化が可能である。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、基板上にサンプルをスポットした後、スポット表面に対して親和性を示さないタンパク質やその他の夾雑物を洗浄することにより、溶出させることができる。その後の検出の工程は、当業者においては、基板の種類等を考慮し、適宜、公知の方法で、上記親和性の有無（強弱）を検出することができる。一例を示せば、洗浄後の上記基板へ、エネルギー吸収分子(EAM)を添加し、乾燥後、質量分析計(TOF-MS)装置にかけることにより、スポット表面に結合していたタンパク質の分子量スペクトルを測定することができる。また、任意のDNA、もしくはペプチドの基板への固定は、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することができる。
【実施例１】
【００５６】
＜ヒトHDARTのクローニング＞
BLASTデータベースを用いてショウジョウバエcrn遺伝子のヒトホモログを検索したところ、膵臓の小島mRNA由来ヒトEST(expressed sequence tag)クローン#52930が上記crn遺伝子と高い相同性を有することが示された。このクローン#52930の完全な配列を定法に従い決定した。また更に5'-RACE法（5'-rapid amplification of cDNA ends strategy）により、本遺伝子は、そのcDNAの完全長が2660塩基からなり、一つの長い読み枠を備えていることを同定した。なお、ここで同定したタンパク質は、後述するようにHDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）に結合しリプレッサーとして機能することから、「HDART（a HDAC associated repressor TPR）」タンパク質と称する。HDARTは855アミノ酸をコードした高度に保存されたTPRタンパク質である（図１）。DNA配列から推定されるHDARTタンパク質は、ヒトCRNタンパク質と明らかに類似していることが示されている。特に、HDARTタンパク質の２６２残基から７７９残基の領域は、HDARTとヒトCRNタンパク質とで高度に保存されている（図１、２）。数種の種族間でのこのタンパク質の遺伝解析ではこれらは遺伝子ファミリーを形成していることを示した（図３）。
【実施例２】
【００５７】
＜HDARTと転写コアクチベーターSkipとの直接的な相互作用＞
HDART上に存在するいくつかのTPR領域に着目し、これらTPRを介してHDARTと相互作用し得るタンパク質が存在するかを解析することとした。
【００５８】
このHDARTと結合するタンパク質の単離のために、酵母ツーハイブリットシステムを用いた。具体的には、酵母MATCHMAKERツーハイブリッド解析キット（Clontech）を用いて実施した。pAS-1ベクター（Clontech）内でGal4 DNA結合ドメインと読み枠を合わせるようにHDARTのORF全長を挿入した。このbait plasmidは、HeLa cDNAライブラリー（Clontech）がサブクローニングされたpACT2 prey plasmidと共に、サッカロマイセスセルビジエ（Saccharomyces cerevisiae）Y190に形質転換した。両プラスミドが導入されたクローンのスクリーニングは、キットに添付されたプロトコルに従って実施した。このようにして、約1×10７をクローンした結果、数個のクローンを単離した。これらクローンを解析した結果、一つはSkipと一致していた。
【００５９】
哺乳動物細胞内でのHDARTとSkipとの相互作用を免疫沈降解析により確認した。この確認のために、先ず、Flag-Skip融合タンパク質を発現するFlag-Skip発現ベクターおよびGFP-HDART融合タンパク質を発現するGFP-HDART発現ベクターと（図４A）をHEK293細胞にEffecteneキット（QIAGEN）を用いてトランスフェクションした。なお、対照実験として、Flag-Skip発現ベクターのみ、GFP-HDART発現ベクターのみを同細胞に、同条件でトランスフェクションを行った。
【００６０】
トランスフェクションの２４時間後、氷上で３０分間、１０μlのプロテアーゼ阻害物質カクテル（Sigma ＃ｐ８３４０）１００μlを含有するNonidetP−40緩衝液（５０mM トリスHCl（ｐＨ７.６）、１５０mM NaCl、５mM EDTA、０.５％ Nonidet P-40、１mM PMSF）中で細胞溶解することによって、細胞抽出物（１mg）を調製した。この抽出物をタンパク質Ａ/Ｇセファロースビーズ４０μlとともに３０分間４℃でインキュベートすることによって、予備的に清澄化した。次に、清澄した上清抽出物を１時間抗Flag抗体または陰性対照のマウスIgG抗体（２μg）と共にインキュベートし、その後、４０μlのタンパク質Ａ/Ｇセファロースビーズを用いて３０分間沈降させた。免疫沈降物を４回Nonidet P-40緩衝液で洗浄した。結合したタンパク質をSDSローディングバッファ中でＡ/Ｇセファロースビーズから溶出させ、溶出液をSDS−PAGEで展開した。展開後、メンブレンに転写し、メンブレンを定法に従い免疫ブロットを実施した。この免疫ブロット用の抗体としては、抗Flag抗体Ｍ２（Sigma）および抗GFPモノクローナル抗体クローン１Ｅ４（MBL）を用いた。
【００６１】
上記免疫沈降解析の結果を図４Aに示す。図において上部２つのパネルは、各タンパク質の発現結果を示し、下部２つのパネルは免疫沈降物を示している。
【００６２】
図４Aに示されている通り、上記両複合タンパク質が発現している場合のみ、抗Flag抗体によりGFP-HDARTタンパク質がFlag-Skip融合タンパク質と共に免疫沈降した（レーン２）。Flag-Skipが発現していない条件では、抗Flag抗体によりGFP-HDARTの沈殿はみられず（レーン１）、また、陰性対照の抗体を用いた場合も同様に沈殿は観察されなかった（レーン３）。この結果は、HDARTとSkipとがin vivoにおいて特異的に相互作用することを示唆している。
【００６３】
さらに、内在HDARTと外来から導入したSkipとの相互作用を解析した。293細胞（HDARTが高発現している細胞）にFlag−Skip発現ベクター、またはFlag−ルシフェラーゼ発現ベクターをトランスフェクションし、上述と同様の方法でトランスフェクションから２４時間後に細胞抽出液を調製した。この細胞抽出液を抗Flag抗体とインキュベートし免疫沈降を行った。免疫複合体または免疫沈降前の細胞抽出液をSDS-PAGEで展開し、メンブレンに転写した。この同一のメンブレンを、抗HDART抗体または抗Flag抗体を用いて免疫ブロッティングを実施した。その結果を図４Bに示す。なお、図４Bにおいて、上部パネルは細胞抽出液を抗HDART抗体で免疫ブロットした結果を、中央パネルは抗Flag抗体を用いて免疫沈降後に抗Flag抗体で免疫ブロットした結果を、下部パネルは抗Flag抗体を用いて免疫沈降後に抗HDART抗体で免疫ブロットした結果を示す。
【００６４】
図４Bに示されているように、Flag-Skipが発現している条件においてのみ、抗Flag抗体でHDARTが共沈殿し（図４B、レーン１）、Flag-Lucタンパク質が発現している条件（レーン２）および何もトランスフェクションされていない親の293クローンでは（レーン３）、HDARTの共沈殿は見られなかった。
【実施例３】
【００６５】
＜HDARTとSkipとの結合領域＞
HDARTとの相互作用に関与するSkip上の領域をマッピングするために、Skip（N-末端領域（コドン1-220）、核内ホルモン結合領域（NHR bindng、コドン221-388）、トランスアクティベーション領域（TA、コドン438-536））上の様々な領域を欠失させた欠失変異シリーズを作成し、上記実施例２に記載したGal4 DBD−HDARTを用いた酵母ツーハイブリッド解析によりHDARTと変異Skipとの相互作用を解析した。解析結果を図５Aに示す。図５Aの右に示された「＋」記号はβ−ガラクトシダーゼ活性のフィルターリフト解析により相互作用が検出されたことを示し、「＋」数はその相互作用の相対的強度を示す。「−」記号は相互作用が検出されなかったことを示す。
【００６６】
図５Aに示すように、二つの異なる領域がHDARTとの相互作用に関与することを発見した。これら領域は、一つが97-119残基内であり、もう一つは220-437残基内であった。Skipのトランスアクティベーション領域はHDARTとの結合活性には、ほとんど関与しないことが示された。同様のアプローチをHDART上でのSkipとの相互作用に関与する領域を解析するために実施した。すなわち、Gal4 DBD-HDARTのさまざまな欠失突然変異体を作製し、これをGal4AD−Skipと作用させた際のガラクトシダーゼ活性を解析した。この解析結果を図５Bに示す。４つのTPRを含むN末端領域（1-179残基）はSkipとの相互作用に必要十分であることが示された（図５B）。したがって、HDARTはN末端の４つのTPR領域を介してSkipと直接相互作用する。
【実施例４】
【００６７】
＜HDARTによる核内レセプターに起因した遺伝子の転写抑制＞
上記実施例においてHDARTがSkipと相互作用し得ることが示されたことから、次に、核内レセプターに起因した転写経路に対するHDARTの機能的な役割を解析した。先ず、レチノイン酸レセプターによる転写制御に対するHDARTの作用を解析した。この目的のため、CAT解析をレチノイドレスポンスエレメント（retinoid response element）の下流にチミジンキナーゼ最小プロモータ（pTREpal-tata）とCAT遺伝子を組み込んだRAR（retionicacid receptor）レポータープラスミドを用いて、CAT解析を行った。
【００６８】
具体的には、HepG2細胞にRARレポータープラスミドと同時に、HDARTを定常的に発現するpcDNA3-HDARTをEffecteneキット（QIAGEN）によりトランスフェクションした。なお、pcDNA3-HDART発現ベクターの導入量を変えて０、０.５、１.０μgとし、各々のトランスフェクションのDNA量を同一にするためにpcDNAの空のベクターで１μgになるように調製した。トランスフェクション後、ATRA（１０−８Ｍ）の存在下または非存在下で生育させ、その際のCAT活性を測定した。測定結果（図６）は、ATRA不存在下での空ベクター１.０μgを導入したCAT活性を基準にして補正した値を表わした。また、３回の実験結果の平均およびエラーバーにより標準偏差を示す。
【００６９】
図６Aに示すように、CAT活性は空のベクター（pcDNA）が導入された細胞ではATRAにより５倍上昇した。しかしながら、このATRAで誘導されたCAT活性はHDARTにより濃度依存的に抑制された。
【００７０】
さらにグルココルチコイドレセプター（GR）による転写制御に対するHDARTの作用はGR陽性Hela細胞内でGRレポータープラスミドを用いて解析した。グルココルチコイド応答性プロモータの転写活性化は、HeLa細胞および１０−８Ｍのデキサメタゾンを代りに使用した点を除いて上記レチノイン酸レセプターに対する実験と同様に行った。測定結果の表示も上記と同様に行った。
【００７１】
HDARTの共発現は、RAR（レチノイン酸レセプター）起因トランスアクティベーションで観察された抑制と同程度で、グルココルチコイドに応答したレポーター遺伝子の活性化を抑制した（図６B）。これらの結果は、HDARTが核内レセプターによって活性化された転写を選択的に抑制することを示している。
【実施例５】
【００７２】
＜細胞核内におけるHDARTの局在＞
HDARTが転写制御に直接関与することが示されたため、HDARTは細胞の核内に局在することが予想される。そのため、HDART組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体を作製し、これを免疫蛍光実験によりHDARTの細胞内の局在を解析することとした。
【００７３】
ポリクローナル抗体の作製は、先ず、大腸菌中でHis-HDART（アミノ酸残基296-431）の融合タンパク質として産生させ、Hisと親和性があるNi-NTA樹脂（QIAGEN）で精製した。次に、このHis−HDARTタンパク質をウサギに免疫し、得られた抗HDART抗血清を、ProtOnキット１（MPS）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。ここで精製されたウサギ抗HDART抗体を、内在的にHDARTを保持するHela細胞とインキュベートし、その後、PE（Phycoerythrin）融合抗ウサギ抗体とインキュベートして、免疫螢光染色を行った。なお、コントロール実験として、ウサギ抗HDART抗体に代えて免疫前のウサギ血清を用いて同様の操作を実行した。また、核の所在を明確にするために、DAPI染色も行った。
【００７４】
図７Aに示されているように、抗HDART抗体を用いた免疫蛍光染色像は、DAPI染色像と一致した。一方、免疫前血清では、核は染色されなかった。これら結果より、HDARTはHela細胞の核内に優勢的に局在していることが示された（図７）。
【００７５】
また、生存している細胞でのHDARTの局在を解析した。Hela細胞にGFPまたはGFP-HDART発現ベクターをトランスフェクションし、２４時間後にGFPによる蛍光発光を検出した。また、GFP−HDART細胞については、核を視覚化するためにHoechest33342染料を用いてインキュベーションを行った。
【００７６】
図７Bに示すように、GFP-HDARTベクターをトランスフェクションした細胞では、Hoechest33342染料（右上パネル）で視覚化された核がGFPにより蛍光発光していることが確認された（左上パネル）。特に、GFP-HDARTは、既に報告されているSkip分子の核スペックルパターン（１７）と部分的に類似のパターンを示した。類似の結果はHT1080細胞および293細胞においても観察された（図示せず）。
【実施例６】
【００７７】
＜HDARTによる自律的な抑制機能＞
HDARTがより直接的な抑制に関与すると仮定した場合、自律的な抑制機能を持つであろうことが予想された。この予想を確認するために、HDARTをDNAに接続させるために完全長のHDART cDNAをGal4 DNA結合領域（GAL4DBD：GAL4DNAとの結合領域のみを持ち、転写制御領域を持たない領域）に融合させ、NIH3T3細胞内でGAL4プロモータからの転写を調節し得るかを解析した。
【００７８】
具体的には、Gal4レポータープラスミド（pGal4−Luciferase）が予め導入されたNIH3T3細胞に、HDART全長タンパク質とGal4 DBDとの融合タンパク質を発現するGal4 DBD-HDARTプラスミドを、導入量を変えて（０、０.１、０.３、０.５μg）トランスフェクションした。なお、トランスフェクションに用いるトータルDNA量を揃えるために、各々のトランスフェクションにおいてGal4 DBDの空のベクターを用いて発現ベクターの量を０.５μgに調製した。トランスフェクション24時間後に、プロモータからのレポーター遺伝子の発現活性（ルシフェラーゼ活性）を解析した。各サンプルのルシフェラーゼ活性は、空のベクターのみ導入した際のルシフェラーゼ活性を基準（100％）として補正した値で表した（図８）。なお、解析結果は３回の実験結果の平均で示し、また、標準偏差をエラーバーにより示した（図８A）。また、Gal4 DBD-HDART（導入量０または０.５μg）を用いて別の細胞U-2OS細胞においても同様の解析を行った（図８B）。
【００７９】
HDARTはNIH-3T3細胞内におけるプロモータ活性を濃度依存的に著しく抑制し、最も高い濃度（0.5μg）ではルシフェラーゼの発現を80％低下させた（図８A）。類似の結果はU-2OS細胞でも観察された（図８B）。これら結果より、HDARTそれ自身で自律的な転写抑制作用を有していることが示された。
【００８０】
また、Gal4 DNA結合領域をもたないHDARTの場合には、ルシフェラーゼの発現抑制は全く示されなかった（図示せず）。このことは、HDARTそれ自身ではプロモータ領域のDNAへの結合活性を有していないと考えられる。
【実施例７】
【００８１】
＜HDARTに起因した抑制メカニズム＞
急性の転写調節は、HAT（ヒストンアセチル化酵素）による活性化およびHDAC（ヒストン脱アセチル化酵素）による抑制が関与するメカニズムを介したコアヒストンのアセチル化の状態により制御されていることが報告されている。HDARTが起因する遺伝子抑制のメカニズムを明らかにするために、このHDARTの機能がHDACとの複合体形成を介して発揮されるか否かをFlag-HDAC発現ベクターを用いた免疫沈降解析により調べた。
【００８２】
異なるタイプのHDAC（１，３，４または６）を発現し得るFlag-HDACs発現ベクターとGFP-HDART発現ベクターとを実施例２と同様に293細胞にコトランスフェクションし、トランスフェクション２４時間後に細胞抽出液を調製した。各細胞抽出液を抗Flag抗体とインキュベートして免疫沈降を行った。免疫沈降産物をSDS-PAGEにより分離し、分離したパターンをメンブレンに転写後、抗Flag抗体または抗GFP抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。参照として、各細胞におけるGFP-HDARTタンパク質の発現を確認するために、免疫沈降前の各試料を同様にSDS-PAGEで展開し、抗GFP抗体を用いた免疫ブロッティングを実行した。
【００８３】
なお、図９Aにおいて、上部パネルに免疫沈降前のGFP-HDARTタンパク質の発現結果を示し、中央パネルは免疫沈降産物を抗Flag抗体で免疫ブロッティングした結果を示し、さらに、下部パネルは免疫沈降産物を抗GFP抗体で免疫ブロッティングした結果を示す。また、HDACの種類は図左から次の通り：レーン１；HDAC1、レーン３；HDAC3、レーン４；HDAC4、レーン５；HDAC6である。なお、レーン２はGFP−HDARTのみを発現させたサンプルである。
【００８４】
図９Aに示すように、Flag-HDAC発現ベクターとGFP-HDART発現ベクターとがコトランスフェクションされた293細胞由来の抽出液では、抗Flag抗体によってGFP-HDARTが免疫沈降したことが確認された（下部パネル、左よりレーン１，３，４，５）。しかし、Flag-HDAC非存在下（Flag-HDAC発現ベクターが導入されていない株）では、抗Flag抗体を添加してもGFP-HDARTの沈降は見られなかった（下部パネル、レーン２）。従って、抗flag抗体によるGFP-HDARTの沈殿は、Flag-HDACとGFP-HDARTとの特異的な相互作用によることが示された。また、HDARTはタイプI（HDAC1および３）とタイプII(HDAC4および6)の両タイプのHDACと相互作用することも示された。
【００８５】
さらに、HDARTとHDAC3との直接的な相互作用をGSTプルダウン解析により調べた。GSTプルダウン解析は基本的に既知の方法に従って実施した（Tzamarias, D., and Struhl, K. (1995) Genes Dev 9(7), 821-31.）。TNT（登録商標） in vitro転写・翻訳システム（Promega）を用い、３５Ｓ−メチオニン存在下でHDAC3のin vitro翻訳を行った。GSTタンパク質またはGST−HDART融合タンパク質は、それぞれ大腸菌内で発現させ、GST結合緩衝液（50mMトリス−HCl、200mM LiCl、0.5％ NP40、5mM EDTA、1mM PMSF）中、グルタチオンセファロースを用いて精製した。GST結合緩衝液１ml中GST−HDART融合タンパク質または対照GSTタンパク質（約１μg）と３５Ｓ−放射線標識in vitro翻訳産物（10μl）とを含有した結合反応液を調製した。この反応液を振とうしながら４℃、１時間インキュベートした後、セファロース-GSTタンパク質複合体をGST結合緩衝液で５回洗浄した。GSTタンパク質に結合したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有サンプル緩衝液中で沸とうさせることにより溶出させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。GST融合タンパク質が同等に泳動されていることをクーマシーブリリアントブルー染色により確認し、さらにオートラジオグラフィにより３５S−放射線標識されたHDACを検出した。
【００８６】
図９Bに示されているように、In vitro で翻訳されたHDAC3は、単なるGSTタンパク質とは結合せずプルダウンさせることができなかったが、GST−HDART融合タンパク質を用いることによりプルダウンされることが示された（図９B）。また図には示されていないがHDAC1でもまた同様の結果が示された。このことから、このHDARTとHDACとの相互作用は直接的であることが示唆された。
【００８７】
さらにHDARTの転写抑制作用に対するHDACの脱アセチル化活性への影響を解析するために、HDACを特異的に阻害するトリコスタチンA（TSA）存在下で、実施例４と同様にCATレポーター解析を行った（図１０CおよびD）。但し、本実施例では、一定量のpcDNA3−HDART発現ベクター（１μg）を用い（図１０中「HDART＋」）、またリガンド（ATRAまたはデキサメタゾン）と共に100nM TSAまたは1mA酪酸ナトリウムを添加した。
【００８８】
図１０C、Dに示すように、リガンドのみでは対応するプロモータからのリポーター遺伝子の発現は上昇し、そこにHDARTを発現させると、発現活性が抑制された。さらにトリコスタチンAが添加されると、HDARTによる発現抑制が完全に中和された。同一の結果がもう一つのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、酪酸ナトリウム（Buty）を添加した場合にも観察された。これら結果は、HDARTによる転写抑制が脱アセチル化酵素活性を介して発揮していることを裏付けている。
【実施例８】
【００８９】
＜HDART-Skip相互作用によるリガンド非結合型レセプター（unliganded receptor）の能動抑制＞
RARおよびTRは、in vivo（Baniahmad, A., Kohne, A. C., and Renkawitz, R. (1992) Embo J 11(3), 1015-23）およびin vitro（Fondell, J. D., Roy, A. L., and Roeder, R. G. (1993) Genes Dev 7(7B), 1400-10.）においてリガンド非存在下で遺伝子活性化を抑制する。このことから、これを能動抑制（active repression）と称している。また、Skipはリガンド非依存的にNHRと相互作用する（MacDonald, P. N., Baudino, T. A., Tokumaru, H., Dowd, D. R., and Zhang, C. (2001) Steroids 66(3-5), 171-6.）。そのため、これら抑制効果およびSkipとの生理的な関与により、HDART-Skip複合体がリガンド非結合型レセプター上に存在する可能性、また、この相互作用がレセプターの能動抑制に関与する可能性が示唆された。これらの可能性を明らかにするために、HDARTのドミナントネガティブ株を過剰発現させ、その際のRARに起因した転写に対する影響を調べた。実施例２に示した通りHDARTにおけるN末端の４つのTPR（N4TPR）はSkip結合領域であるため、この領域の発現が内在HDARTとSkipとの相互作用を阻止することでHDARTの天然の機能を阻害してドミナントネガティブとして機能することが予想されたため、本実施例ではN4TPRをドミナントネガティブ候補として用いた。
【００９０】
293細胞にFlag−SkipおよびGFPまたはGFPでタグ付けされたN4TPRをトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に細胞抽出物を調製し、抗Flag抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をSDS-PAGE上で分離した。また、免疫沈降前の内在性HDARTの発現を確認するために、免疫沈降前の細胞抽出液も同様にSDS-PAGEで分離した。分離後のパターンをメンブレンに転写した。そして、Flag-Skipの発現については抗Flag抗体を用い、GFPおよびGFP-N4TPRの発現については抗GFP抗体を用い、さらに、内在HDARTの発現については抗HDART抗体を用いて、それぞれ検出した（図１１A）。なお、図１１Aにおいて、下方の３つのパネルは、それぞれ免疫沈降されたSkip（下部上）、内因性HDART（下部中央）およびN4TPR（下部下）を示し、上部の一枚のパネルには、免疫沈降前の内因性HDARTタンパク質の発現を示す。
【００９１】
図１１Aに示されているように、N4TPRの発現は、N4TPRを発現していない対照（GFPのみ、レーン１）に比べてSkipと共沈殿したHDARTの量を減少させた（下部中央パネル、レーン２）。一方、N4TPRの過剰発現は、N4TPRとSkipとの相互作用が増加し、共沈殿したSkipの量を著しく上昇させた（レーン２、lower bottom panel）。コントロールのタンパク質（GFP）の発現はHDARTとSkipとの相互作用に対して影響はなかった（レーン１）。この結果は、N4TPRがHDARTに代わってSkipと相互作用するドミナントネガティブタンパク質として作用することを示している。
【００９２】
次に、N4TPRの過剰発現がRARまたはグルココルチコイド応答性プロモータからの転写に与える影響を調べた。なお、ここでは、GFP−N4TPR発現ベクター（０、０.３、０.５μg）を用いた点を除いて、上記実施例４に記載したレポーター解析と同様の方法により検討した。
【００９３】
結果は図１１B、Cに示した通り、リガンド非存在下でN4TPRを制限して発現させることにより（導入量0.3μg）、RARおよびグルココルチコイド応答性プロモータからの転写活性をリガンド存在下で誘導した転写活性の程度（グレーカラム）まで増加させた。N4TPRの最も高い発現レベルでは（導入量0.5μg）、リガンド非存在下で転写活性を強く増加（〜約20倍）させた。これらの結果はHDARTがRARやグルココルチコイドレセプターなど核内ホルモンレセプターの能動抑制にとって必要であることを示唆している。
【実施例９】
【００９４】
＜レチノイン酸誘導による黄紋筋筋腫由来細胞株（rhabdomyosarcoma cell line）の筋組織への分化をHDARTの過剰発現により阻害＞
ATRA（All-trans retinoic acid）は、腫瘍細胞分化の重要な誘導剤であることが知られている（20−22）。ヒト黄紋筋筋腫由来細胞株MM-1-19-Pは主に小さな多角形の細胞から構成され、最終的にレチノイン酸を備えた筋管様の巨大細胞に分化する。核内ホルモンレセプターに起因した反応におけるHDARTの生理学的な役割を明らかにするために、ATRAによるMM-1-19-Pの筋組織の分化に対してHDART発現が与える影響を解析した。
【００９５】
100mMのペトリ皿上にMM-1-19-P細胞を植えつけ、この細胞に0.4μgのpGFPベクターと２μgのpcDNA3（空ベクター）またはpcDNA3-HDART（HDART発現ベクター）とをコトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後に、培地をATRA含有（２μＭ）または非含有の新鮮な培地と交換した。４８時間の誘導後、細胞が筋管様の巨大細胞を示す細長い紡錘細胞へと変化した時点で、形態学的に分化したものとして細胞を評価した。すべての実験を４回反復し、GFPについて陽性と評価済みの細胞の数をカウントした。結果を図１２に示す。なお、図１２において、GFPの緑色螢光の標準的顕微鏡写真をパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに、位相差顕微鏡写真をパネルＥ、Ｆに示す。また、（Ａ）はATRA非処理かつ空ベクター導入細胞、（Ｂ）ATRA処理かつ空ベクター導入細胞、（Ｃ）ATRA非処理かつHDART発現ベクター導入細胞、（Ｄ）ATRA処理かつHDART発現ベクター導入細胞、（Ｅ）上記（Ｃ）と同一条件の細胞、（Ｆ）上記（Ｄ）と同一条件の細胞を示す。また、パネルＦでは、黒色矢印は、未分化GFP陽性細胞を表わし、白色矢印は分化された細胞を指す。（Ｇ）グラフは、GFP陽性細胞中の形態学的に分化された細胞の百分率を４回の独立した実験結果の平均で示し、また標準偏差はエラーバーで示されている（空ベクターかつATRA（＋）とHDART発現ベクターとの間でＰ＜１％，スチューデントのｔテスト）。
【００９６】
各実験において、GFP陽性細胞数は３０〜７０であった。空ベクターを導入しATRA処理した細胞では、GFP陽性の細胞数はATRAの細胞毒性効果のため３０％未満であったが、一方、HDART発現ベクターを導入した細胞では、ATRA処理群、非処理群とでGFP陽性の細胞数は同じであった。
【００９７】
空のベクターが導入された細胞の多くは、ATRA処理によって、筋管様の巨大細胞の出現で示されるように筋組織に分化した（図１２B、図１２G）。また、空のベクターが導入された細胞では、ATRA処理による表現型の変化の程度はGFP陽性および陰性の細胞の双方で同一であった。しかしながら、HDARTが導入された細胞では、GFP陽性細胞はATRA処理を行っても表現型の変化はほとんどないが（図１２D中黒色矢印、図１２G）、一方のGFP陰性細胞では特徴的な筋管様巨大細胞が観察された（図１２F中白色矢印）。この結果は、HDARTの発現がレチノイン酸による分化を抑制することを示している。そして、この結果はレポーター解析においてHDARTがRARによる転写活性化を抑制した結果と一致する。これらの結果はHDARTが少なくともレチノイン酸レセプターにおける生理学的な転写のコリプレッサーであることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
上述した通り、本発明の転写抑制因子は、自律的に転写を抑制し、特に、核内レセプターの転写を抑制するため、所望の転写系に作用させ、該転写系の転写を抑制する目的で用いることができる。また、本発明の転写抑制因子はHDACと結合能を有し、このHDACのヒストン脱アセチル化活性を介して転写抑制能を発揮し得る。したがって、本発明の転写抑制因子を用いてHDACをリクルートさせ、HDACの作用によって転写抑制を行うこともできる。本発明の転写抑制因子のこのような作用は、例えば核内レセプターの転写亢進が起因している疾患に応用し得るものであり、こうした疾患の治療薬として本転写抑制因子が有益となる。
【００９９】
また、上記転写抑制因子のドミナントネガティブペプチドは、転写活性化因子として機能する。したがって、このドミナントネガティブペプチドは、転写を促進させるために用いることができる。このドミナントネガティブペプチドもまた、核内レセプターの転写に作用し、その転写を逆に促進させる。そのため、核内レセプターの転写促進物質として本ペプチドが有益となる。特に、HDARTのN末端側の４つのTPR（N4TPR）は、ATRAに比してレチノイン酸レセプターの転写活性化能が高いため、現在ATRAが用いられている疾患治療（例えば、悪性腫瘍の分化誘導療法など）において、ATRAに代えてまたはATRAと共に本ペプチドを治療薬として応用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】
図１は、HDARTはTPR（Tetra trico peptide repeat）タンパク質であり、その構成および類縁の遺伝子との関係を示す。HDART一次構造の概略的構成を示し、TPR、酸性領域、Skip相互作用領域およびCRN相同性領域を示している。
【図２】
図２は、ヒトHDARTとヒトCRNとの間のCRN相同性領域の比較を示す図である。
【図３】
図３は、HDART／CRNタンパク質間の系統樹を示す図である。この系統樹は、GENETYX-MACプログラムを用いて構築した（ソフトウェア開発）。
【図４】
図４は、外来または内在HDARTと外来Ｓkipと相互作用を免疫沈降解析により同定した結果を示す写真である。
（Ａ）外来HDARTと外来Skipとの相互作用を解析した結果を示す。レーン１はGFP−HDARTのみ、レーン４はFlag−Skipのみ、またはレーン２，３はその両方を293細胞内で発現させた。レーン５は、何もベクターを導入していないコントロールの細胞である。また、レーン１、２、４および５は、抗−Flag抗体により、レーン３は対照マウスIgGにより免疫沈降させたサンプルである。上部２つのパネルは、発現された各タンパク質の発現を示し、下部２つのパネルは免疫沈降物を示している。なお、それぞれ上段は抗GFP抗体、下段は抗Flag抗体で免疫ブロットした結果を示す。
（Ｂ）内在HDARTと外来Skipとの相互作用を解析した結果を示す。内在にHDARTを保持する293細胞にFlag−Skip（レーン１）またはFlag−ルシフェラーゼ（レーン２）を導入後、細胞抽出液を抗Flag抗体で免疫沈降させた。何もベクターを導入していないコントロール実験も並行させた（レーン３）。細胞内でのHDARTタンパク質の発現状況（上部パネル）、免疫沈降したFlag（中央パネル）、またはHDART（下部パネル）をパネル左「WB」として示す抗体を用いた免疫ブロッティングにより同定した。
【図５】
図５は、Skip、HDART両タンパク質上の相互作用領域の同定結果を示す。
（Ａ）Skip上のHDART結合領域部位のマッピング。プラス（＋）は、酵母ツーハイブリッドシステムにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性に基づき、相互作用が検出されたことを示す。プラスの数は、その相互作用の相対的強度を表わす。NHR結合：核ホルモン受容体結合ドメイン、TA；トランス活性化ドメイン。
（Ｂ）HDART上のSkip結合領域のマッピング。記号は上述と同様である。
【図６】
図６は、核内ホルモン（レチノイン酸またはグルココルチコイド）による転写活性化をHDARTが抑制することを示すグラフである。
（Ａ）HDARTによるレチノイン酸で活性化された転写の濃度依存的抑圧結果を示す。リガンドの不在下で空ベクター（１.０μg）を導入した際のCAT活性を基準として、補正されたCAT活性を表わした。３回の反復実験平均および、エラーバーはS.D.を示す。
（Ｂ）HDARTによるグルココルチコイド活性化を受けた転写の濃度依存的に抑圧結果を示す。
【図７】
図７は、HDARTの細胞内局在を示す写真である。
（Ａ）内因性HDARTタンパク質の局在化。左側パネルは抗HDART抗体（上段）または免疫前血清（下段）を用いた免疫蛍光染色結果を、右側パネルは左側パネルと対応した視野におけるDAPI染色結果を示す。
（Ｂ）生存細胞中のHDARTの局在化。Hela細胞にGFP−HDART発現ベクター（左上）またはGFP発現ベクター（左下）を導入後のGFPによる蛍光発光を観察した結果、およびHoechst３３３４２染料を用いて核を視覚化した結果（右上）を示す。
【図８】
図８は、HDARTの自律的なプロモータ抑制活性を示す。
（Ａ）Gal4リポーター（ルシフェラーゼ）プラスミドを保持するNIH3T3細胞に異なる量のGal4 DBD-HDART発現プラスミド（０、０.１、０.３、０.５μg）を導入した際のプロモータ抑制活性を検討した結果を示す。空ベクターのみ導入した際のルシフェラーゼ活性を基準（100％）として、補正済みルシフェラーゼ値を表した。３回の反復実験結果の平均で示し、エラーバーはS.D.を示す。
（Ｂ）U-20S細胞を用いた結果を示す。
【図９】
図９は、HDARTとHDACとの直接的な相互作用を示す写真である。
（Ａ）HDARTとHDACとの相互作用。293細胞にGFP-HDART発現ベクターとFlag-HDACs発現ベクター（（レーン１；HDAC1、レーン３；HDAC3、レーン４；HDAC4、レーン５；HDAC6）とをコトランスフェクションした後、抗Flag抗体で免疫沈降および表示された抗体（抗Flag抗体または抗GFP抗体）により免疫ブロッティングを行った結果を示す（それぞれ中央パネル、下部パネル）。なお、レーン２はGFP−HDARTのみが導入されたサンプルである。また、上部パネルは免疫沈降前のサンプルを用いてGFP-HDARTタンパク質の発現を確認した結果を示す。
（Ｂ）HDARTとHDAC3との直接的相互作用を示す結果である。
【図１０】
図１０は、HDARTの抑制は2種のHDAC阻害物質（トリコスタチンA、酪酸ナトリウム）によりそれぞれHDARTの抑制が阻害されたことを示す（Ｃ、Ｄ）。
【図１１】
図１１は、HDARTのＮ末端における４つのTPR（N4TPR）のドミナントネガティブ効果を示す図および写真である。
（Ａ）N4TPRによる内因性HDARTとSkipと相互作用の阻害。Flag−SkipとGFP（レーン１）またはGFP-N4TPR（レーン２）とがトランスフェクションされた293細胞の細胞抽出液を抗Flag抗体で免疫沈降させ、この沈降産物をSDS―PAGEで分離した結果を示す。下方の３つのパネルは、それぞれ免疫沈降されたSkip（上段）、内因性HDART（中央）およびN4TPR（下段）を示す。免疫沈降前のHDARTタンパク質の発現は最上の一つのパネルに示されている。
（Ｂ）レチノイン酸レセプターに起因した転写をN4TPRによって活性化することを示すグラフである。
（C）グルココルチコイドに起因した転写をN4TPRによって活性化することを示すグラフである。
【図１２】
図１２は、MM-1-19-P細胞内でのレチノイン酸による分化誘発をHDARTが阻害することを示す図および写真である。HDART発現ベクターまたは空ベクターを導入したMM-1-19-P細胞をATRA（2μM）存在下、非存在下での分化誘発を解析した。形質移入された細胞を同定するため、上記ベクターとともにGFPベクターをコトランスフェクションした。GFPによる緑色螢光発光を標準的顕微鏡写真により撮影した写真（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、および位相差顕微鏡下で撮影した写真（Ｅ、Ｆ）を示す。
（Ａ）ATRA（−）かつ空ベクター導入サンプル、（Ｂ）ATRA（+）かつ空ベクター導入サンプル、（Ｃ）ATRA（−）かつHDART発現ベクター、（Ｄ）ATRA（＋）かつHDART発現ベクター、（Ｅ）（Ｃ）と同一視野の位相差写真、（Ｆ）（Ｄ）と同一視野の位相差写真。パネルＦにおいて、黒色矢印ヘッドは未分化GFP陽性細胞を表わし、白色矢印ヘッドは分化された細胞を表わす。（Ｇ）グラフは、GFP陽性細胞中形態学的に分化した細胞の百万率を示す。４つの独立した実験からの結果は、平均およびS.D.（エラーバー）として提示されている（ＭockおよびATRA（＋）でのHDARTの間でＰ＜１％，スチューデントのｔテスト）。
【配列表】
SEQUENCE LISTING 
<110> MIZUTANI, Shuki
YAMADA, Takayuki
<120> Transcription regulating factors
<130> SEN-A0122P
<140>
<141>
<150> JP 2002-217233
<151> 2002-07-25
<160> 2
<210> 1
<211> 2684
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220> 
<221> CDS
<222> (37)..(2601)
<400> 1
agcgcgcgac tctcctgtac ctgggcatcc agaaaa atg gtg gtg atg gcg cga   54    
Met Val Val Met Ala Arg
1               5    
ctt tcg cgg ccc gag cgg ccg gac ctt gtc ttc gag gaa gag gac ctc   102   
Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val Phe Glu Glu Glu Asp Leu
10                  15                  20        
ccc tat gag gag gaa atc atg cgg aac caa ttc tct gtc aaa tgc tgg   150   
Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln Phe Ser Val Lys Cys Trp
25                  30                  35            
ctt cgc tac atc gag ttc aaa cag ggc gcc ccg aag ccc agg ctc aat   198   
Leu Arg Tyr Ile Glu Phe Lys Gln Gly Ala Pro Lys Pro Arg Leu Asn
40                  45                  50                
cag cta tac gag cgg gca ctc aag ctg ctg ccc tgc agc tac aaa ctc   246   
Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu Pro Cys Ser Tyr Lys Leu
55                  60                  65                  70
tgg tac cga tac ctg aag gcg cgt cgg gca cag gtg aag cat cgc tgt   294   
Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala Gln Val Lys His Arg Cys
75                  80                  85    
gtg acc gac cct gcc tat gaa gat gtc aac aac tgt cat gag agg gcc   342   
Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn Asn Cys His Glu Arg Ala
90                  95                 100        
ttt gtg ttc atg cac aag atg cct cgt ctg tgg cta gat tac tgc cag   390   
Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu Trp Leu Asp Tyr Cys Gln
105                 110                 115            
ttc ctc atg gac cag ggg cgc gtc aca cac acc cgc cgc acc ttc gac   438   
Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His Thr Arg Arg Thr Phe Asp
120                 125                 130                
cgt gcc ctc cgg gca ctg ccc atc acg cag cac tct cga att tgg ccc   486   
Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln His Ser Arg Ile Trp Pro
135                 140                 145                 150
ctg tat ctg cgc ttc ctg cgc tca cac cca ctg cct gag aca gct gtg   534   
Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro Leu Pro Glu Thr Ala Val
155                 160                 165    
cga ggc tat cgg cgc ttc ctc aag ctg agt cct gag agt gca gag gag   582   
Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser Pro Glu Ser Ala Glu Glu
170                 175                 180        
tac att gag tac ctc aag tca agt gac cgg ctg gat gag gcc gcc cag   630   
Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg Leu Asp Glu Ala Ala Gln
185                 190                 195            
cgc ctg gcc acc gtg gtg aac gac gag cgt ttc gtg tct aag gcc ggc   678   
Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg Phe Val Ser Lys Ala Gly
200                 205                 210                
aag tcc aac tac cag ctg tgg cac gag ctg tgc gac ctc atc tcc cag   726   
Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu Cys Asp Leu Ile Ser Gln
215                 220                 225                 230
aat ccg gac aag gta cag tcc ctc aat gtg gac gcc atc atc cgc ggg   774   
Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val Asp Ala Ile Ile Arg Gly
235                 240                 245    
ggc ctc acc cgc ttc acc gac cag ctg ggc aag ctc tgg tgt tct ctc   822   
Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly Lys Leu Trp Cys Ser Leu
250                 255                 260        
gcc gac tac tac atc cgc agc ggc cat ttc gag aag gct cgg gac gtg   870   
Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe Glu Lys Ala Arg Asp Val
265                 270                 275            
tac gag gag gcc atc cgg aca gtg atg acc gtg cgg gac ttc aca cag   918   
Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr Val Arg Asp Phe Thr Gln
280                 285                 290                
gtg ttt gac agc tac gcc cag ttc gag gag agc atg atc gct gca aag   966   
Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu Ser Met Ile Ala Ala Lys
295                 300                 305                 310
atg gag acc gcc tcg gag ctg ggg cgc gag gag gag gat gat gtg gac   1014  
Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu Glu Glu Asp Asp Val Asp
315                 320                 325    
ctg gag ctg cgc ctg gcc cgc ttc gag cag ctc atc agc cgg cgg ccc   1062  
Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln Leu Ile Ser Arg Arg Pro
330                 335                 340        
ctg ctc ctc aac agc gtc ttg ctg cgc caa aac cca cac cac gtg cac   1110  
Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln Asn Pro His His Val His
345                 350                 355            
gag tgg cac aag cgt gtc gcc ctg cac cag ggc cgc ccc cgg gag atc   1158  
Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln Gly Arg Pro Arg Glu Ile
360                 365                 370                
atc aac acc tac aca gag gct gtg cag acg gtg gac ccc ttc aag gcc   1206  
Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr Val Asp Pro Phe Lys Ala
375                 380                 385                 390
aca ggc aag ccc cac act ctg tgg gtg gcg ttt gcc aag ttt tat gag   1254  
Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala Phe Ala Lys Phe Tyr Glu
395                 400                 405    
gac aac gga cag ctg gac gat gcc cgt gtc atc ctg gag aag gcc acc   1302  
Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val Ile Leu Glu Lys Ala Thr
410                 415                 420        
aag gtg aac ttc aag cag gtg gat gac ctg gca agc gtg tgg tgt cag   1350  
Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu Ala Ser Val Trp Cys Gln
425                 430                 435            
tgc gga gag ctg gag ctc cga cac gag aac tac gat gag gcc ttg cgg   1398  
Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn Tyr Asp Glu Ala Leu Arg
440                 445                 450                
ctg ctg cga aag gcc acg gcg ctg cct gcc cgc cgg gcc gag tac ttt   1446  
Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala Arg Arg Ala Glu Tyr Phe
455                 460                 465                 470
gat ggt tca gag ccc gtg cag aac cgc gtg tac aag tca ctg aag gtc   1494  
Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val Tyr Lys Ser Leu LysVal
475                 480                 485    
tgg tcc atg ctc gcc gac ctg gag gag agc ctc ggc acc ttc cag tcc   1542  
Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser Leu Gly Thr Phe Gln Ser
490                 495                 500        
acc aag gcc gtg tac gac cgc atc ctg gac ctg cgt atc gca aca ccc   1590  
Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp Leu Arg Ile Ala Thr Pro
505                 510                 515            
cag atc gtc atc aac tat gcc atg ttc ctg gag gag cac aag tac ttc   1638  
Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu Glu Glu His Lys Tyr Phe
520                 525                 530                
gag gag agc ttc aag gcg tac gag cgc ggc atc tcg ctg ttc aag tgg   1686  
Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly Ile Ser Leu Phe Lys Trp
535                 540                 545                 550
ccc aac gtg tcc gac atc tgg agc acc tac ctg acc aaa ttc att gcc   1734  
Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr Leu Thr Lys Phe Ile Ala
555                 560                 565    
cgc tat ggg ggc cgc aag ctg gag cgg gca cgg gac ctg ttt gaa cag   1782  
Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala Arg Asp Leu Phe Glu Gln
570                 575                 580        
gct ctg gac ggc tgc ccc cca aaa tat gcc aag acc ttg tac ctg ctg   1830  
Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala Lys Thr Leu Tyr Leu Leu
585                 590                 595            
tac gca cag ctg gag gag gag tgg ggc ctg gcc cgg cat gcc atg gcc   1878  
Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu Ala Arg His Ala Met Ala
600                 605                 610                
gtg tac gag cgt gcc acc agg gcc gtg gag ccc gcc cag cag tat gac   1926  
Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu Pro Ala Gln Gln Tyr Asp
615                 620                 625                 630
atg ttc aac atc tac atc aag cgg gcg gcc gag atc tat ggg gtc acc   1974  
Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Val Thr
635                 640                 645    
cac acc cgc ggc atc tac cag aag gcc att gag gtg ctg tcg gac gag   2022  
His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile Glu Val Leu Ser Asp Glu
650                 655                 660        
cac gcg cgt gag atg tgc ctg cgg ttt gca gac atg gag tgc aag ctc   2070  
His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala Asp Met Glu Cys Lys Leu
665                 670                 675            
ggg gag att gac cgc gcc cgg gcc atc tac agc ttc tgc tcc cag atc   2118  
Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr Ser Phe Cys Ser Gln Ile
680                 685                 690                
tgt gac ccc cgg acg acc ggc gcg ttc tgg cag acg tgg aag gac ttt   2166  
Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp Gln Thr Trp Lys Asp Phe
695                 700                 705                 710
gag gtc cgg cat ggc aat gag gac acc atc aag gaa atg ctg cgt atc   2214  
Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile Lys Glu Met Leu Arg Ile
715                 720                 725    
cgg cgc agc gtg cag gcc acg tac aac acg cag gtc aac ttc atg gcc   2262  
Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr Gln Val Asn Phe Met Ala
730                 735                 740        
tcg cag atg ctc aag gtc tcg ggc agt gcc acg ggc acc gtg tct gac   2310  
Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Val Ser Asp
745                 750                 755            
ctg gcc cct ggg cag agt ggc atg gac gac atg aag ctg ctg gaa cag   2358  
Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp Met Lys Leu Leu Glu Gln
760                 765                 770                
cgg gca gag cag ctg gcg gct gag gcg gag cgt gac cag ccc ttg cgc   2406  
Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu Arg Asp Gln Pro Leu Arg
775                 780                 785                 790
gcc cag agc aag atc ctg ttc gtg agg agt gac gcc tcc cgg gag gag   2454  
Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser Asp Ala Ser Arg Glu Glu
795                 800                 805    
ctg gca gag ctg gca cag cag gtc aac ccc gag gag atc cag ctg ggc   2502  
Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro Glu Glu Ile Gln Leu Gly
810                 815                 820        
gag gac gag gac gag gac gag atg gac ctg gag ccc aac gag gtt cgg   2550  
Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu Glu Pro Asn Glu Val Arg
825                 830                 835            
ctg gag cag cag agc gtg cca gcc gca gtg ttt ggg agc ctg aag gaa   2598  
Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val Phe Gly Ser Leu Lys Glu
840                 845                 850                
gac tgacccgtcc ctcccccatc ccccctcccc accccctccc caatacagct        2651  
Asp                                                       
855                                                       
acgtttgtac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa                              2684  
<210> 2
<211> 855
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Val Val Met Ala Arg Leu Ser Arg Pro Glu Arg Pro Asp Leu Val  
1               5                  10                  15      
Phe Glu Glu Glu Asp Leu Pro Tyr Glu Glu Glu Ile Met Arg Asn Gln  
20                  25                  30          
Phe Ser Val Lys Cys Trp Leu Arg Tyr Ile Glu Phe LysGln Gly Ala  
35                  40                  45              
Pro Lys Pro Arg Leu Asn Gln Leu Tyr Glu Arg Ala Leu Lys Leu Leu  
50                  55                  60                  
Pro Cys Ser Tyr Lys Leu Trp Tyr Arg Tyr Leu Lys Ala Arg Arg Ala  
65                  70                  75                  80  
Gln Val Lys His Arg Cys Val Thr Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Val Asn  
85                  90                  95      
Asn Cys His Glu Arg Ala Phe Val Phe Met His Lys Met Pro Arg Leu  
100                 105                 110          
Trp Leu Asp Tyr Cys Gln Phe Leu Met Asp Gln Gly Arg Val Thr His  
115                 120                 125              
Thr Arg Arg Thr Phe Asp Arg Ala Leu Arg Ala Leu Pro Ile Thr Gln  
130                 135                 140                  
His Ser Arg Ile Trp Pro Leu Tyr Leu Arg Phe Leu Arg Ser His Pro  
145                 150                 155                 160  
Leu Pro Glu Thr Ala Val Arg Gly Tyr Arg Arg Phe Leu Lys Leu Ser  
165                 170                 175      
Pro Glu Ser Ala Glu Glu Tyr Ile Glu Tyr Leu Lys Ser Ser Asp Arg  
180                 185                 190          
Leu Asp Glu Ala Ala Gln Arg Leu Ala Thr Val Val Asn Asp Glu Arg  
195                 200                 205              
Phe Val Ser Lys Ala Gly Lys Ser Asn Tyr Gln Leu Trp His Glu Leu  
210                 215                 220                  
Cys Asp Leu Ile Ser Gln Asn Pro Asp Lys Val Gln Ser Leu Asn Val  
225                 230                 235                 240  
Asp Ala Ile Ile Arg Gly Gly Leu Thr Arg Phe Thr Asp Gln Leu Gly  
245                 250                 255      
Lys Leu Trp Cys Ser Leu Ala Asp Tyr Tyr Ile Arg Ser Gly His Phe  
260                 265                 270          
Glu Lys Ala Arg Asp Val Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Thr Val Met Thr  
275                 280                 285              
Val Arg Asp Phe Thr Gln Val Phe Asp Ser Tyr Ala Gln Phe Glu Glu  
290                 295                 300                  
Ser Met Ile Ala Ala Lys Met Glu Thr Ala Ser Glu Leu Gly Arg Glu  
305                 310                 315                 320  
Glu Glu Asp Asp Val Asp Leu Glu Leu Arg Leu Ala Arg Phe Glu Gln  
325                 330                 335      
Leu Ile Ser Arg Arg Pro Leu Leu Leu Asn Ser Val Leu Leu Arg Gln  
340                 345                 350          
Asn Pro His His Val His Glu Trp His Lys Arg Val Ala Leu His Gln  
355                 360                 365              
Gly Arg Pro Arg Glu Ile Ile Asn Thr Tyr Thr Glu Ala Val Gln Thr  
370                 375                 380                  
Val Asp Pro Phe Lys Ala Thr Gly Lys Pro His Thr Leu Trp Val Ala  
385                 390                 395                 400  
Phe Ala Lys Phe Tyr Glu Asp Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ala Arg Val  
405                 410                 415      
Ile Leu Glu Lys Ala Thr Lys Val Asn Phe Lys Gln Val Asp Asp Leu  
420                 425                 430          
Ala Ser Val Trp Cys Gln Cys Gly Glu Leu Glu Leu Arg His Glu Asn  
435                 440                 445              
Tyr Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Arg Lys Ala Thr Ala Leu Pro Ala  
450                 455                 460                  
Arg Arg Ala Glu Tyr Phe Asp Gly Ser Glu Pro Val Gln Asn Arg Val  
465                 470                 475                 480  
Tyr Lys Ser Leu Lys Val Trp Ser Met Leu Ala Asp Leu Glu Glu Ser  
485                 490                 495      
Leu Gly Thr Phe Gln Ser Thr Lys Ala Val Tyr Asp Arg Ile Leu Asp  
500                 505                 510          
Leu Arg Ile Ala Thr Pro Gln Ile Val Ile Asn Tyr Ala Met Phe Leu  
515                 520                 525              
Glu Glu His Lys Tyr Phe Glu Glu Ser Phe Lys Ala Tyr Glu Arg Gly  
530                 535                 540                  
Ile Ser Leu Phe Lys Trp Pro Asn Val Ser Asp Ile Trp Ser Thr Tyr  
545                 550                 555                 560  
Leu Thr Lys Phe Ile Ala Arg Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Glu Arg Ala  
565                 570                 575      
Arg Asp Leu Phe Glu Gln Ala Leu Asp Gly Cys Pro Pro Lys Tyr Ala  
580                 585                 590          
Lys Thr Leu Tyr Leu Leu Tyr Ala Gln Leu Glu Glu Glu Trp Gly Leu  
595                 600                 605              
Ala Arg His Ala Met Ala Val Tyr Glu Arg Ala Thr Arg Ala Val Glu  
610                 615                 620                  
Pro Ala Gln Gln Tyr Asp Met Phe Asn Ile Tyr Ile Lys Arg Ala Ala  
625                 630                 635                 640  
Glu Ile Tyr Gly Val Thr His Thr Arg Gly Ile Tyr Gln Lys Ala Ile  
645                 650                 655      
Glu Val Leu Ser Asp Glu His Ala Arg Glu Met Cys Leu Arg Phe Ala  
660                 665                 670          
Asp Met Glu Cys Lys Leu Gly Glu Ile Asp Arg Ala Arg Ala Ile Tyr  
675                 680                 685              
Ser Phe Cys Ser Gln Ile Cys Asp Pro Arg Thr Thr Gly Ala Phe Trp  
690                 695                 700                  
Gln Thr Trp Lys Asp Phe Glu Val Arg His Gly Asn Glu Asp Thr Ile  
705                 710                 715                 720  
Lys Glu Met Leu Arg Ile Arg Arg Ser Val Gln Ala Thr Tyr Asn Thr  
725                 730                 735      
Gln Val Asn Phe Met Ala Ser Gln Met Leu Lys Val Ser Gly Ser Ala  
740                 745                 750          
Thr Gly Thr Val Ser Asp Leu Ala Pro Gly Gln Ser Gly Met Asp Asp  
755                 760                 765              
Met Lys Leu Leu Glu Gln Arg Ala Glu Gln Leu Ala Ala Glu Ala Glu  
770                 775                 780                  
Arg Asp Gln Pro Leu Arg Ala Gln Ser Lys Ile Leu Phe Val Arg Ser  
785                 790                 795                 800  
Asp Ala Ser Arg Glu Glu Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gln Val Asn Pro  
805                 810                 815      
Glu Glu Ile Gln Leu Gly Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Met Asp Leu  
820                 825                 830          
Glu Pro Asn Glu Val Arg Leu Glu Gln Gln Ser Val Pro Ala Ala Val  
835                 840                 845              
Phe Gly Ser Leu Lys Glu Asp                                      
850                 855                                      
【国際調査報告】
2004031388.tif 000031
2004031388.tif 000032
2004031388.tif 000033
2004031388.tif 000034