(57)【要約】本発明では、脳・中枢神経系への効率よい送達の方法を提供すること、およびウイルスエンベロープを用いたより効率の高い送達方法を提供することを課題とした。生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、Ａ）生体分子；Ｂ）ウイルスエンベロープ；およびＣ）グリコサミノグリカン、を含む、システムが提供される。また、脳内に生体分子を送達する方法であって、Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；およびＢ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、を包含する、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、
Ａ）生体分子；
Ｂ）ウイルスエンベロープ；および
Ｃ）グリコサミノグリカン、
を含む、システム。
【請求項２】
前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、請求項３に記載のシステム。
【請求項７】
前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項３に記載のシステム。
【請求項８】
前記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記生体分子は、核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記生体分子は、ポリペプチドを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記生体分子は、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ．、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ．および肝細胞増殖因子ＨＧＦ．からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記生体分子は、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ．、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ．および肝細胞増殖因子ＨＧＦ．からなる群より選択されるポリペプチドである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ヘパリンと、前記生体分子および前記ウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ヘパリンと、前記生体分子および前記ウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記生体分子は、前記ウイルスエンベロープ中に含有される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
生体分子を細胞に導入するための方法であって、
Ａ）ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を該細胞に投与する工程；および
Ｂ）グリコサミノグリカンを該細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程と同時に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程の前に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記グリコサミノグリカンを投与する工程は、前記組成物を投与する工程の後に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用であって、該医薬は、
Ａ）生体分子；
Ｂ）ウイルスエンベロープ；および
Ｃ）グリコサミノグリカン、
を含む、使用。
【請求項２４】
脳内に生体分子を送達する方法であって、
Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
Ｂ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体分子は、核酸を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体分子は、前記生体分子は、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ．、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ．および肝細胞増殖因子ＨＧＦ．からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸は、ベクターによって送達される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに導入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子と同時に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の前に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の後に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４４】
前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４５】
前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４７】
前記生体分子は、頸動脈に投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
脳内に生体分子を送達するためのキットであって、
Ａ）生体分子；ならびに
Ｂ）該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、該方法は、
ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
ｂ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、キット。
【請求項４９】
前記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記生体分子は、核酸を含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５１】
前記生体分子は、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ．、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ．および肝細胞増殖因子ＨＧＦ．からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５２】
前記核酸は、ベクターによって送達される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５３】
さらにウイルスエンベロープを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５４】
前記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５６】
前記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５７】
前記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５８】
さらにグリコサミノグリカンを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５９】
前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、請求項５８に記載のキット。
【請求項６１】
前記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、請求項５８に記載のキット。
【請求項６２】
前記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、請求項５９に記載のキット。
【請求項６３】
前記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、請求項５９に記載のキット。
【請求項６４】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子と同時に投与される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６５】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の前に投与される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６６】
前記グリコサミノグリカンは、前記生体分子の投与の後に投与される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６７】
前記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される、請求項４８に記載のキット。
【請求項６８】
前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、請求項４８に記載のキット。
【請求項６９】
前記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、請求項４８に記載のキット。
【請求項７０】
前記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、請求項４８に記載のキット。
【請求項７１】
前記生体分子は、頸動脈に投与される、請求項４８に記載のキット。
【請求項７２】
脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用であって、該キットは、
Ａ）生体分子；ならびに
Ｂ）該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、該方法は、
ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
ｂ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体分子を直接投与することに関連する新規治療方法に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスエンベロープを用いた生体分子の投与に関する。本発明はまた、脳への効率よい生体分子の送達方法にも関する。
【背景技術】  遺伝子機能解析、遺伝子治療などのために、培養細胞、生体組織などに対して遺伝子を導入する目的で、多くのウイルス法および非ウイルス法が開発されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、９２６〜９３２、１９９３年およびＬｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１２９〜１１４４、１９９５年）。一般に細胞へ遺伝子を送達するためには、ウイルス法がより効果的である。しかしウイルスベクターは、親ウイルス由来の親遺伝子必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子の発現、免疫原性などのため問題を生じ得る。一方、非ウイルス法の一つであるリポソーム法は細胞傷害性および免疫原性はウイルス法より少ないが、生体組織内への遺伝子導入効率においてはウイルスベクターに比し劣る傾向にある。
ＨＶＪはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され（岡田、微研ジャーナル、１、１０３−１１０、１９５８年）、細胞膜融合活性（以下融合活性とする）の解明が進められると共に遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきたウイルスである。一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に生産されるとＣＴＬを誘導することが知られており（Ｃｏｌｅ  Ｇ．Ａ．らＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８、４３０１〜４３０９、１９９７年）、さらに宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。そこで遺伝子、タンパク質などを封入したリポソームと予め紫外線照射により不活性化しておいたＨＶＪとを融合することで融合粒子（ＨＶＪ−リポソーム）を作製する方法が考案され、これにより培養細胞、生体などへの非侵襲の遺伝子導入が可能となった（米国特許第５，６３１，２３７号、Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５、１９９６年および金田ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３、１９９９年）。しかしながら、リポソームとウイルスエンベロープという２つの異なるベシクルを調製する必要があり煩雑であること、また融合活性においても、リポソームとの融合により平均粒子径がＨＶＪの１．３倍に増大する融合粒子は、ＨＶＪのそれの１／１０以下に低下するなどの欠点を有していることが判明している。さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織、極めて低効率である組織なども存在した。
本発明者らは、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを培養細胞、生体などに導入するための種々の新規な不活性化ウイルスエンベロープベクターを提供している（ＷＯ０１／５７２０４）。即ち、ＨＶＪをはじめ種々のエンベロープウイルスのゲノムを不活性化したウイルスエンベロープ中に遺伝子などを封入することにより、培養細胞、生体組織などに対して簡便かつ高効率で遺伝子などを導入することが可能で、細胞に対する毒性が低いベクターが調製される。
本発明者らは、経済的に安価で、有効かつ一定品質を保証できる不活性化ウイルスエンベロープの工業的製法としてアルキル化剤で処理する方法を開発した。
ほとんどの疾患について何らかの解決策が見出されている現代において、脳の疾患および障害は、解決策がさほど見出されていない最後の領域といえ、その治療および予防に対する需要は年々増えるばかりである。脳疾患の中でも、大脳動脈のアテローム性動脈硬化症、モヤモヤ病などによって引き起こされる大脳閉塞疾患は、しばしば、脳の慢性的な灌流不足を引き起こす。このような状態は、大脳虚血事象を導くのみでなく痴呆を含む神経病理学変化もまた導く（Ｋａｌａｒｉａ  ＲＮ，Ｂｈａｔｔｉ  ＳＵ，Ｌｕｓｔ  ＷＤ，Ｐｅｒｒｙ  Ｇ．，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９３；６９５：１９０−３．；Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｔａｋｅｄａ  Ｍ，Ｔａｎｉｍｕｋａｉ  Ｓ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ．，Ｓｔｒｏｋｅ．１９９３；２４：２５９−６４；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２６５．；Ｋｕｒｕｍａｔａｎｉ  Ｔ，Ｋｕｄｏ  Ｔ，Ｉｋｕｒａ  Ｙ，Ｔａｋｅｄａ  Ｍ．，Ｓｔｒｏｋｅ．１９９８；２９：１０５８−６２．；およびＳｅｋｈｏｎ  ＬＨ，Ｍｏｒｇａｎ  ＭＫ，Ｓｐｅｎｃｅ  Ｉ，Ｗｅｂｅｒ  ＮＣ．，Ｓｔｒｏｋｅ．１９９４；２５：１０２２−７）が、灌流不足を改善するための有効な処置は、未だ確立されていない。
近年、前臨床研究によって、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のような血管形成増殖因子が、動物脳虚血モデルにおいて側副血管の発達を刺激し得ることが示された（Ｈａｒｒｉｇａｎ  ＭＲ，Ｅｎｎｉｓ  ＳＲ，Ｍａｓａｄａ  Ｔ，Ｋｅｅｐ  ＲＦ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２００２；５０：５８９−９８；Ｌｙｏｎｓ  ＭＫ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＥ，Ｍｅｙｅｒ  ＦＢ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９１；５５８：３１５−２０．；およびＹｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００２；３９：１０２８−３４．）。これは、治療的新脈管形成として知られている。血管形成増殖因子の遺伝子移入を用いた治療新脈管形成の効力は、重篤の肢虚血または心筋梗塞を有するヒト患者において報告されている（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８；９７：１１１４−２３．；Ｌｏｓｏｒｄｏ  ＤＷ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９８；９８：２８００−４．；Ｓｙｍｅｓ  ＪＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．１９９９；６８：８３０−６；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ８３６−７．；およびＲｏｓｅｎｇａｒｔ  ＴＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９９９；１００：４６８−７４．）。従って、治療的新脈管形成に関する戦略は、安全かつ有効な遺伝子移入方法がヒトに対して開発され得る場合、大脳虚血に罹患する患者のための治療法として使用され得るといえる。この観点に鑑みると、現在の遺伝子移入技術は、理想的とはいえないかもしれない。中枢神経系（ＣＮＳ）への遺伝子移入は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｆａｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．１９９８；２４８：６１−４）、レトロウイルス（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００１；６５：２０８−１９）、アデノウイルス（Ｍｉｙａｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｍａｅｄａ  Ｙ，Ｃｏｌｌｉｎ  Ｃ，Ｓｉｈａｇ  ＲＫ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ．２０００；５１：１９５−２０２．）、および単純疱疹ウイルス  １（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＰＡ，Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｋ，Ｇａｇｅ  ＦＨ，Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９２；１２：９５−１０２．）を含む種々のウイルスベクターを用いて達成されている。これらのベクター系は、ヒト遺伝子治療に関して利点および不利益を有する。これらの方法は、ＣＮＳへのインビボ遺伝子移入には有効であるが、安全性および産生量のような多数の問題が、ヒト遺伝子治療に関して生じている。
これらの問題を克服するために、本発明者らは、新規の非ウイルスベクター系である、ＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ＝センダイウイルス）エンベロープベクターを上述のように開発し、利用している。このベクター系は、ウイルスエンベロープおよびリポソームを用いた第１世代のＨＶＪベースの遺伝子移入（ＨＶＪリポソーム方法）（Ｙａｍａｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６；２７１：Ｒ１２１２−２０；Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９８７；１７３：５６−６９．）に基づいて開発された。第１世代のＨＶＪベクターは、ラットおよび霊長類のＣＮＳへのトランスフェクションに対して大きな可能性を有するが（Ｙａｍａｄａ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．前出；Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３．）、複雑な手順および保存の困難さなどの理論上の不利益がある。新規の非ウイルスベクター系である、ＨＶＪ−エンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクターは、外来遺伝子を移入するためにＨＶＪのエンベロープのみを利用する。
【発明が解決しようとする課題】
これらの状況にかんがみ、当該分野において、インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープを用いた脳・中枢神経系（ＣＮＳ）への効率よい生体分子の送達（例えば、遺伝子導入）のための方法が所望されている。
また、ウイルスエンベロープを用いた生体分子の送達の効率は、まだまだ充分高いといえない。したがって、ウイルスエンベロープを用いた生体分子のより効率の高い送達のためのシステムおよび方法を開発することが当該分野において求められている。
そこで、本発明では、脳・中枢神経系への効率よい送達の方法を提供すること、およびウイルスエンベロープを用いたより効率の高い送達方法を提供することを課題とした。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】  本発明者らは、上記課題について、鋭意研究を重ねた結果、グリコサミノグリカンをウイルスエンベロープ系に添加することによって解決されることを見出した。
本発明者らはまた、脳または頸部の動脈をいったん閉じた後、ウイルスエンベロープ系を用いて生体分子を投与すると、効率よく脳にその生体分子が送達されることを見出し、上記課題を解決した。
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）  生体分子を細胞に導入するためのシステムであって、
１）生体分子；
２）ウイルスエンベロープ；および
３）グリコサミノグリカン、
を含む、システム。
（２）  上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目１に記載のシステム。
（３）  上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目１に記載のシステム。
（４）  上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、項目１に記載のシステム。
（５）  上記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、項目１に記載のシステム。
（６）  上記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、項目３に記載のシステム。
（７）  上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目３に記載のシステム。
（８）  上記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、項目１に記載のシステム。
（９）  上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目１に記載のシステム。
（１０）  上記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、項目１に記載のシステム。
（１１）  上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目１に記載のシステム。
（１２）  上記生体分子は、核酸を含む、項目１に記載のシステム。
（１３）  上記生体分子は、ポリペプチドを含む、項目１に記載のシステム。
（１４）  上記生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目１に記載のシステム。
（１５）  上記生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択されるポリペプチドである、項目１に記載のシステム。
（１６）  上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有される、項目１に記載のシステム。
（１７）  上記ヘパリンと、上記生体分子および上記ウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有される、項目１に記載のシステム。
（１８）  上記生体分子は、上記ウイルスエンベロープ中に含有される、項目１に記載のシステム。
（１９）  生体分子を細胞に導入するための方法であって、
１）ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を上記細胞に投与する工程；および
２）グリコサミノグリカンを上記細胞に投与する工程、
を包含する、方法。
（２０）  上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程と同時に行われる、項目１９に記載の方法。
（２１）  上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の前に行われる、項目１９に記載の方法。
（２２）  上記グリコサミノグリカンを投与する工程は、上記組成物を投与する工程の後に行われる、項目１９に記載の方法。
（２３）  生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用であって、上記医薬は、
１）生体分子；
２）ウイルスエンベロープ；および
３）グリコサミノグリカン、
を含む、使用。
（２４）  脳内に生体分子を送達する方法であって、
１）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
２）上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、方法。
（２５）  上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（２６）  上記生体分子は、核酸を含む、項目２４に記載の方法。
（２７）  上記生体分子は、上記生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目２４に記載の方法。
（２８）  上記核酸は、ベクターによって送達される、項目２６に記載の方法。
（２９）  上記生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される、項目２４に記載の方法。
（３０）  上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目２９に記載の方法。
（３１）  上記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、項目２９に記載の方法。
（３２）  上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目２９に記載の方法。
（３３）  上記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、項目２９に記載の方法。
（３４）  上記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに導入される、項目２４に記載の方法。
（３５）  上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目３４に記載の方法。
（３６）  上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、項目３４に記載の方法。
（３７）  上記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、項目３４に記載の方法。
（３８）  上記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、項目３５に記載の方法。
（３９）  上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目３５に記載の方法。
（４０）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目３４に記載の方法。
（４１）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目３４に記載の方法。
（４２）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目３４に記載の方法。
（４３）  上記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される、項目２４に記載の方法。
（４４）  上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目２４に記載の方法。
（４５）  上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目２４に記載の方法。
（４６）  上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目２４に記載の方法。
（４７）  上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目２４に記載の方法。
（４８）  脳内に生体分子を送達するためのキットであって、
１）生体分子；ならびに
２）上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
Ｂ）上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、キット。
（４９）  上記生体分子は、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項目４８に記載のキット。
（５０）  上記生体分子は、核酸を含む、項目４８に記載のキット。
（５１）  上記生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である、項目４８に記載のキット。
（５２）  上記核酸は、ベクターによって送達される、項目４８に記載のキット。
（５３）  さらにウイルスエンベロープを含む、項目４８に記載のキット。
（５４）  上記ウイルスエンベロープは、不活性化されている、項目５３に記載のキット。
（５５）  上記ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである、項目５３に記載のキット。
（５６）  上記ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルスのエンベロープである、項目５３に記載のキット。
（５７）  上記ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである、項目５３に記載のキット。
（５８）  さらにグリコサミノグリカンを含む、項目４８に記載のキット。
（５９）  上記グリコサミノグリカンは、ヘパリンである、項目５８に記載のキット。
（６０）  上記グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、項目５８に記載のキット。
（６１）  上記グリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる、項目５８に記載のキット。
（６２）  上記ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである、項目５９に記載のキット。
（６３）  上記ヘパリンの硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である、項目５９に記載のキット。
（６４）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に投与される、項目５８に記載のキット。
（６５）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の前に投与される、項目５８に記載のキット。
（６６）  上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子の投与の後に投与される、項目５８に記載のキット。
（６７）  上記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される、項目４８に記載のキット。
（６８）  上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である、項目４８に記載のキット。
（６９）  上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である、項目４８に記載のキット。
（７０）  上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される、項目４８に記載のキット。
（７１）  上記生体分子は、頸動脈に投与される、項目４８に記載のキット。
（７２）  脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用であって、上記キットは、
１）生体分子；ならびに
２）上記生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、上記方法は、
Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および
Ｂ）上記頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、上記生体分子を脳内に導入する工程、
を包含する、指示書、
を備える、使用。
本発明の作用および効果は、本明細書の記載から当業者に明らかであることが理解される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いてＶｅｎｕｓ遺伝子でトランスフェクトした、培養ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞の代表例。Ｖｅｎｕｓの走査型共焦点レーザー顕微鏡の画像（ａ，ｄ，ｇ）、ＭＡＰ２の免疫蛍光染色の画像（ｂ）、ＮｅｕＮの免疫蛍光染色の画像（ｄ）、ＧＦＡＰの免疫蛍光染色の画像（ｈ）、および混合した画像（ｃ，ｆ，ｉ）。Ｖｅｎｕｓを発現する細胞のほとんどは、ＭＡＰ２またはＮｅｕＮについて免疫ポジティブであった（ａ〜ｆ）。これらの実験は、少なくとも５回繰り返した。
図２は、定位注射を用いたＥＧＦＰプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。走査型共焦点レーザー顕微鏡の蛍光画像。視床への定位注射（ａ，ｂ）は、その注射部位における限定された発現を示した。側脳室への定位注射（ｃ，ｄ）は、脈絡叢および脳室上衣細胞における発現を示す（ｅ，ｆ）。ＣＰ：脈絡叢、ＬＶ：側脳室、Ｓｔｒ：線条、ＥＰ：脳室上衣細胞層。これらの実験は、少なくとも３回繰り返した。
図３は、大槽を介した注射によるＶｅｎｕｓプラスミドの脳へのインビボ遺伝子移入。ＯＢ：嗅球、ＦＣ：前頭皮質、Ｍ：髄膜。これらの実験は、少なくとも３回繰り返した。
図４は、中大脳動脈の一過性閉塞後の、頸動脈を介したＶｅｎｕｓ遺伝子移入に起因する蛍光。６０分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の、３日後の冠状縫合切断。Ｖｅｎｕｓ遺伝子を有するＨＶＪ−Ｅベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。遺伝子発現は、梗塞病変においてのみ観察され、一方、蛍光は対側半球の中に検出され得なかった。これらの実験は、少なくとも３回繰り返した。
図５は、中大脳動脈の一過性閉塞後の頸動脈への遺伝子移入後の、損傷半球および対側半球の中のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ活性を、６０分間の左中大脳動脈の一過性閉塞の１日後に測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクターを、再灌流の間に左頸動脈に注入した。各群についてｎ＝５。
図６は、ルシフェラーゼ活性に対するヘパリンの影響。ルシフェラーゼ活性を、大槽を介したｐＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子のトランスフェクトの１日後に測定した。ヘパリンを、０、１０、５０、または１００Ｕ／ｍｌの濃度でベクターに添加した。＊＊０、１０および１００Ｕ／ｍｌに対してＰ＜０．０５。各群についてｎ＝３。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において好ましくは、使用されるウイルスは、オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスまたはセンダイウイルスであり得る。本明細書においてより好ましくは、使用されるウイルスは、センダイウイルスである。
本明細書において「センダイウイルス」または「ＨＶＪ」（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）とは、互換的に用いられ、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属する、細胞融合作用を有するウイルスをいう。Ｍ．Ｋｕｒｏｙａら（１９５３）がセンダイウイルスとして報告した。ゲノムは，約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。センダイウイルスのウイルス粒子にはエンベロープがあり、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す。センダイウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼを有する。熱に不安定で，ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、溶血性も示す。発育鶏卵および／または各種動物の腎臓由来培養細胞の細胞質中で増殖する。センダイウイルスは、株細胞に感染させた場合は持続感染を起こしやすい。種々の細胞を融合する能力をもつことから、細胞のヘテロカリオン形成、雑種細胞の作製などの細胞融合に広く利用されている。
本明細書において「（ウイルス）エンベロープ」とは、センダイウイルスなどの特定のウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造をいう。エンベロープは、通常、細胞から出芽によって成熟するウイルスにみられる。エンベロープは、概してウイルス遺伝子によりコードされたスパイクタンパク質からなる小突起構造物と宿主由来の脂質とからなる。したがって、「（ウイルス）エンベロープベクター」は、エンベロープをベクター（運び屋）として利用する際の名称であり、本明細書では、場合に応じて（ウイルス）エンベロープと互換可能に使用され得る。
本明細書において「グリコサミノグリカン」とは、ヘキソサミンを主成分とする多糖をいう。そのようなグリコサミノグリカンとしては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、およびそれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、ヘキソサミンとは、ヘキソースの水酸基がアミノ基に置きかわった化合物をいう。グリコサミノグリカンは上述のような分類が通常されているが、明確な分類が難しい場合もあり、例えば一部にコンドロイチン硫酸構造、一部にデルマタン硫酸構造をもったものなども報告されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｇｒｏｕｐ  Ａ）によっても合成分泌されるヒアルロン酸を除けば、ほぼすべてのグリコサミノグリカンは動物細胞（主に結合組織系の細胞）によってつくられるプロテオグリカンの側鎖成分であり、コア蛋白質部分を酵素分解するか、あるいは蛋白質中のセリンまたはスレオニンに結合しているエステル型の場合は，アルカリ処理で蛋白質とグリコサミノグリカン側鎖の結合を切断することによって得られる。グリコサミノグリカンの陰イオン性で高分子の構造は多数の水分子を含ませるのに有用である。本明細書では、グリコサミノグリカンは、グルコサミノグリカンおよびガラクトサミノグリカンの両方を含む。ガラクトサミノグリカンとは、ガラクトサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例示として、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などが挙げられる。グルコサミノグリカンは、グルコサミンを含むグリコサミノグリカンであり、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸などが挙げられる。
本明細書において「ヘパリン」とは、基本的にＤ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸とからなる（例えば、交互に重合した）グリコサミノグリカンをいう。硫酸はほとんどすべてのグルコサミンの２，６位のアミノ基のほか、その６位の水酸基、ウロン酸の２位にも結合している。動物のマスト細胞が合成し、硫酸基、カルボキシル基が多く存在することから、負電荷をもつ高分子電解質である。血液凝固抑制作用を有する。
本明細書において「硫酸化」とは、硫酸基がある置換基（例えば、アミノ基、水酸基など）に置き換わることをいう。硫酸化の程度は、その分子の電荷の程度を決定する重要な因子であり、細胞膜表面の郷土に変化を与えることにより、本発明のウイルスエンベロープの送達効率にも影響を与え得ると考えられる。したがって、好ましくは、硫酸化の程度として、薬学的に許容可能であるものが使用される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。したがって、コンビナトリアルケミストリなどで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（たとえば、低分子リガンドなど）もまた生体への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。好ましくは、生体分子は、核酸またはタンパク質を含む。別の好ましい実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の好ましい実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ウイルス、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が転写因子である場合、転写活性を調節する活性を包含する。ある因子がウイルスである場合、その生物学的活性は、そのウイルスが持つ感染活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、「不活性化」され得る。
本明細書において「不活性化」とは、ウイルス（例えば、センダイウイルス）について言及されるとき、ゲノムが不活性化されることをいう。不活性化されたウイルスは、複製欠損である。不活性化は、本明細書において記載される方法（例えば、アルキル化など）によって達成される。そのような不活性化の方法としては、例えば、（ａ）ウイルス（例えば、ＨＶＪ）をアルキル化剤で処理して不活性化する工程、（ｂ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスの濃縮液を得る工程、並びに（ｃ）ウイルスまたは不活性化されたウイルスをカラムクロマトグラフィー次いで限外濾過により精製する工程を含む方法、ならびにこれらの工程の順序を入れ替えた方法などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「アルキル化」とは、有機化合物の水素原子をアルキル基で置換する作用を有すことをいい、「アルキル化剤」（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とは、アルキル基を与える化合物をいう。アルキル化剤としては、例えば、ハロゲン化アルキル，硫酸ジアルキル、スルホン酸アルキル、アルキル亜鉛などの有機金属化合物が挙げられる。好ましいアルキル化剤としては、β−プロピオラクトン、ブチロラクトン、ヨウ化メチル、ヨウ化エチル、ヨウ化プロピル、臭化メチル、臭化エチル、臭化プロピル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドは、当該分野において周知である。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴをデフォルトパラメータを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
本明細書において「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
本明細書において「スクリーニング」とは、遺伝子ライブラリーのようなライブラリーに対して所望の活性または機能を有するメンバーを選択することまたはそのようなアッセイをいう。そのようなスクリーニングの方法は、当該分野において公知である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。本明細書において、遺伝子の発現の「調節」には、遺伝子発現の増強、減少、誘導、消失、遅延化、早期化などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において処置の対象とされる遺伝子としては、例えば、酵素、ホルモン、リンホカイン、受容体、成長因子、調節タンパク質、免疫系に影響を与えるポリペプチド、免疫調節因子、抗体などをコードする遺伝子が挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、これらの遺伝子は、例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターロイキン２、腫瘍壊死因子、神経成長因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、因子ＶＩＩＩ：Ｃ、カルシトニン、チミジンキナーゼ、インターフェロン、顆粒球マクロファージ（ＧＭＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などをコードする遺伝子があげられるがそれらに限定されない。これら遺伝子は、本発明の医薬において、核酸形態またはポリペプチドの形態で存在し得る。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））を含み得る。
「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））などが例示される。
「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、哺乳動物由来のターミネーターのほかに、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、動物）の部位（例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、動物）の特定の段階（例えば、発作時など）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
本明細書において医薬として利用され得るワクチンとしては、例えば、癌、後天性免疫不全症候群、麻疹、単純疱疹などためのワクチンが挙げられるがそれらに限定されない。これらワクチンは、本発明の医薬において、核酸形態またはペプチドの形態で存在し得る。
本発明は、上記のエンベロープを単独で、または安定化化合物、希釈剤、担体、または別の成分または薬剤のような他の薬剤と組み合わせて含む薬学的組成物および医薬を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチン形態、遺伝子治療に適した形態であり得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、エンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
本発明の薬学的組成物および医薬は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない）中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。本発明のある実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。
本発明の薬学的組成物および医薬の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（例えば、頸動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
本明細書において「頭部」とは、頭蓋骨とその内容および関連構造からなる身体の部位をいう。本明細書において「頭部」は脳を包含する。
本明細書において「頸部」とは、脊椎動物の体で，頭部と上肢の間に見られる領域をいう。本明細書において、頭部・頸部または頭頸部という場合は、首より上の部分をさすことがある。
本明細書において「一過的」とは、ある処置を講じたときに、その処置が一時的に続くことをいう。したがって、処置を中止した後には、その処置の効果がなくなるか減弱する。
本明細書において「動脈」とは、血液を心臓から体各部に送り出す血管をいう。したがって、「脳動脈」は、脳に存在する動脈をいう。
本明細書において動脈または血管を「閉鎖する」とは、血流がその処置をしない場合に比べて顕著に減ずるかまたは停止するような処置を講じることをいう。好ましくは、閉鎖する際には出血を生じさせないことが好ましい。動脈または血管を閉鎖する手段としては、バルーンカテーテル、クリッピングなどが使用されるがそれらに限定されない。
本明細書において生体分子をある空間（例えば、細胞内）に「導入する」とは、その生体分子が別の空間からその空間に移動されることをいう。そのような導入には、どのような手段を用いてもよく、能動的であっても受動的であってもよい。
本明細書において「システム」とは、多くの構成要素からなる物をいい、医薬、農薬、組成物（例えば、薬学的組成物）、ワクチン、キットなどの概念を包含する。
本発明では、導入にはウイルスエンベロープが使用されるが、ウイルスエンベロープに加えて、本発明の組成物および医薬は、賦形剤または薬学的に使用できる製剤を調製するために、エンベロープのプロセシングを促進する他の化合物を含む、適切な、薬学的に受容可能なキャリアーを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。
本明細書において経口投与のための薬学的組成物は、投与に適した投与形において当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
経口使用のための薬学的組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望ならば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物をプロセシングすることを介して得られ得る。適切な賦形剤は炭水化物またはタンパク質充填剤であり、以下を含むが、それらに限定されない：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質。所望ならば、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤が添加され得る。
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素が錠剤または糖衣剤に添加され得る。
経口で使用され得る薬学的組成物は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルを含む。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、エンベロープは、安定化剤とともにまたはともなわずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁され得る。
非経口投与用の薬学的製剤は活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の薬学的組成物は水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中に処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。所望により、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
本発明の薬学的組成物は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明のエンベロープが意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
いずれの化合物についても、治療的有効用量は、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、最初に見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減するエンベロープの量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、エンベロープの投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用するエンベロープの種類等により適宜選択される。
ヒトに本発明のエンベロープベクターを利用して生体分子を投与する場合、１被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当のエンベロープベクターが投与され得る。投与されるエンベロープ中に含まれる外来遺伝子の量は、１被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇであり得る。
本明細書において「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいう。１ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４，２０９−２１３、１９６１）。上記の量は、例えば、１日１回から数回投与することができる。
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
本発明の組成物および医薬はまた、生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物および医薬は、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。
本発明はまた、ワクチン形態でも提供され得る。ワクチンとは、ある種の疾患（例えば、伝染病、感染症など）の予防（または治療）のため使用される抗原の諸形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ）をいう。感染、伝播、流行などの諸形式にしたがい、生きた弱毒病原体（生ワクチンｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）、不活化病原体（またはその一部）、病原体代謝物（毒素、毒素の不活化物すなわちトキソイドなど）、ＤＮＡワクチンなどが使用される．ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）により生物（ヒト・家畜・媒介動物）の体内に能動的につくられる免疫（体液性免疫、細胞性免疫、または両者）が病原体の感染、伝播、流行などを阻止する。
本発明に係るワクチンの剤形は特に問わず、また、その製造も当該分野で用いられている自体公知の方法に従ってよい。また、本発明に係るワクチンは、種々のアジュバントを含む乳濁液としてもよい。アジュバントは、含まない形態を投与した場合よりも、少ない量のワクチンを用いて、少ない投与量で、持続する高レベルの免疫性を持続させるのを助けるものである。アジュバントの例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、アジュバント６５（落下生油、マンナイドモノオレエートおよびアルミニウムモノステアレートを含む）、および水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはミョウバンのごとき鉱物ゲルがある。ヒトおよび食用動物のためのワクチンには、アジュバント６５を用いるのが好ましい。また、商業的動物用ワクチンには、鉱物ゲルを用いるのが好ましい。
本発明に係るワクチンには、上記アジュバントの他に例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を含有させてもよい。
本発明に係るワクチンの投与経路は、特に限定されないが、非経口的に投与することが好ましい。非経口投与としては、例えば、頸動脈内、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、筋肉内または腹腔内の投与が挙げられる。好ましくは、頸動脈内投与で本発明のワクチンが投与され得る。
本発明に係るワクチンの１回の投与量は、投与の目的により、また感染が初感染か再感染かにより、さらに患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。再感染により惹起される病気の治療を目的とする場合、本発明に係るワクチンの投与量は、体重１ｋｇあたり約０．０１ｎｇ〜１０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１ｎｇ〜１ｍｇ程度であり得る。
本発明に係るワクチンの投与回数は、上記のような種々の条件により異なるので、一概には言えないが、日単位から週単位の間隔で繰り返して投与するのが好ましい。中でも、約２〜４週間程度の間隔で、数回、好ましくは約１〜２回程度投与するのが好ましい。疾患症候学または抗体価を用いる基本的な検査により疾患の状態をモニターしながら投与回数（投与時間）を決定するのがより好ましい。
本明細書において、病因因子（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ロタウイルスなど）または細菌）を処置または予防するための組成物（例えば、ワクチン）が提供される。そのような組成物は、例えば、その病因因子の遺伝子またはタンパク質を少なくとも１つ含む。含まれる外来遺伝子は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において、「エピトープ」とは、構造の明らかな抗原決定基をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。エピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。
本明細書において「中和抗体」とは、酵素、毒素、細菌またはウイルスなど抗原の生物学的活性を中和する、中和反応に関与する抗体をいう。中和抗体は。ウイルスが結合すると活性が失われる。中和反応とは、抗原が中和抗体と結合すると、それらの活性が消失あるいは低下する反応をいう。ワクチンを投与すると、中和抗体ができ、その中和抗体の働きにより、病因を駆逐する働きが達成される。
本明細書において「遺伝子治療」または「遺伝子療法」とは、遺伝子の傷害（または欠陥）に起因する疾患を、患者に健全な核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することにより、または改変された核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入することにより治療しようとする方法をいう。遺伝子治療には、裸で核酸を注入する工程を利用する方法もあるが、何らかのベクターを利用することが多く、本発明では、ウイルスエンベロープをそのようなベクターとして使用し得る。
本発明は、組成物および医薬を含むキット形態でも提供される。このキットは、本発明の組成物および医薬；ならびにこの組成物および医薬を投与する指針を与える指示書を備える。ここで、上記指示書は、組成物および医薬の適切な投与方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法において使用される組成物および医薬の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明の組成物および医薬は、宿主に導入されるべき物質または医薬成分を含む。そのような物質または医薬成分は、生体高分子であり得る。好ましくは、生体高分子は、核酸、ポリペプチド、糖、脂質、およびそれらの複合体からなる群より選択される。好ましくは、医薬成分は、導入される宿主において発現されるポリペプチドをコードする核酸であり得る。
本発明の組成物および医薬は、１つ以上のさらなる医薬成分を含み得る。そのような成分としては、例えば、さらなる医薬成分として、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない成分がその薬学的組成物に含有され得る：
中枢神経系用薬（例えば、全身麻酔剤、催眠鎮静剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、総合感冒剤、その他の中枢神経系用薬など）；
末梢神経用剤（例えば、局所麻酔剤、骨格筋弛緩剤、自律神経剤、鎮けい剤など）；
感覚器官用薬（例えば、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤など）；
循環器官用薬（例えば、、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、血管拡張剤、高脂血症用剤、その他の循環器官用薬など）；
呼吸器官用薬（例えば、呼吸促進剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、含嗽剤など）；
消化器官用薬（例えば、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍用剤、健胃消化剤、制酸剤、下剤、浣腸剤、利胆剤、その他の消化器官用薬など）；
ホルモン剤（例えば、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺、副甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞ホルモン剤、黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、その他のホルモン剤など）；
泌尿生殖器官および肛門用薬（例えば、泌尿器官用剤、生殖器官用剤、子宮収縮剤、痔疾用剤、他の泌尿生殖器管、肛門用薬など）；
外皮用薬（例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用剤、鎮痛剤、鎮痒剤、収斂剤、消炎剤、寄生性皮膚疾患用剤、皮膚軟化剤、毛髪用剤、その他の外皮用剤など）；
歯科口腔用剤；
その他の個々の器官系用薬；
ビタミン剤（例えば、ビタミンＡ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤、混合ビタミン剤、その他のビタミン剤など）；
滋養強壮薬（例えば、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤、乳幼児用剤、その他の滋養強壮剤など）；
血液および体液用薬（例えば、血液代用剤、止血剤、血液凝固阻止剤、その他の血液．体液用剤など）；
人工透析用薬（例えば、人工腎臓透析用剤、腹膜透析用剤など）；
その他の代謝性医薬品（例えば、臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、他に分類されない代謝性薬など）；
細胞賦活用剤（例えば、クロロフィル製剤、色素製剤、その他の細胞賦活用剤など）；
腫瘍用薬（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤、その他の腫瘍用剤など）；
放射性医薬品；
アレルギー用薬（例えば、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、非特異性免疫原製剤、その他のアレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、生薬、漢方製剤、その他の生薬漢方処方に基づく製剤など）；
抗生物質製剤（例えば、グラム陽性菌に作用する、グラム陰性菌に作用する、グラム陽・陰性菌に作用、グラム陽性菌マイコプラズマ作用、グラム陽性陰性．リケッチアに作用、抗酸菌に作用するもの、カビに作用するもの、その他の抗生物質製剤など）；
化学療法剤（例えば、サルファ剤、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウィルス剤、その他の化学療法剤など）；
生物学的製剤（例えば、ワクチン類、毒素．トキソイド類、抗毒素．抗レプトスピラ血清、血液製剤類、生物学的試験用製剤類、その他の生物学的製剤、抗原虫剤、駆虫剤など）；
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら  （１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
ウイルス（例えば、ＨＶＪ）はニワトリの受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織への持続感染系（培養液中にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたものおよびこれらの変異株のすべてが本発明で使用可能である。また、他の方法で入手可能なウイルス（例えば、ＨＶＪ）も使用することが可能である。組換え型ＨＶＪ（Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７８、２８１３〜２８３０、１９９７年またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ  Ｙ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８、９７０〜９７３、２０００年）なども使用可能である。ＨＶＪとして何れのものでも良いが、Ｚ株（例えば、寄託番号ＡＴＣＣ  ＶＡ  ２３８８またはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）またはＣａｎｔｅＩＩ株（例えば、Ｍ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、５６、１７５〜１８４、１９８１年に記載されたものまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＳＰＡＦＡＳから販売されているものが使用できる）がより望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】  １つの局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するためのシステムを提供する。このシステムは、１）生体分子；２）ウイルスエンベロープ；および３）グリコサミノグリカン、を含む。生体分子をウイルスエンベロープを利用して細胞に導入することを改善するために、本発明ではグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）が効果があることが明らかになった。理論に束縛されないが、グリコサミノグリカンを添加することにより細胞の強度が変化する（弱くなる）という効果があり、そのために生体分子の細胞への導入が促進されるものと考えられる。したがって、使用される分子としては、どのようなグリコサミノグリカンでもよいが、好ましくは、グルコサミン残基を有するグルコサミノグリカンが使用され、より好ましくは、ヘパリンが使用され得る。理論に束縛されないが、グルコサミノグリカンは、残基としてグルコサミンを有し、血液脳関門の通過を容易にするという効果を有すると考えられることからより好ましいと考えられる。ヘパリンの中でも、高分子量（例えば、１０，０００ｋＤａ以上、より好ましくは１１，０００ｋＤａ以上、さらに好ましくは１２，０００ｋＤａ以上）のヘパリンが好ましく、より好ましくは、平均分子量が１２，０００ｋＤａ〜１５，０００ｋＤａのものが使用される。しかし、それよりも低い分子量のものでも使用され得る。硫酸化の程度も効率に影響与えるようである。したがって、好ましいヘパリンとしては、硫酸化の程度が薬学的に許容可能なのものが使用される。また、上述のように、ヘパリン以外の分子も使用可能である。そのような分子としては、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸ならびにそれらの混合物および重合物などが挙げられるがそれらに限定されない。理論に束縛されないが、これらの分子は、硫酸分子を有しており、生体内での送達を容易にする働きがあると考えられるからである。そのようなグリコサミノグリカンは、本発明のシステム中で、通常少なくとも１Ｕ／ｍｌ含まれる。好ましくは、グリコサミノグリカンは、少なくとも５Ｕ／ｍｌ、より好ましくは１０Ｕ／ｍｌ、さらに好ましくは、５０Ｕ／ｍｌ、もっとも好ましくは１００Ｕ／ｍｌ本発明のシステム中に含まれ得る。
１つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化は、紫外線照射による不活性化、アルキル化によるものなどが挙げられるがそれらに限定されない。
１つの実施形態において、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープであり得る。好ましくはそのウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス（例えば、ＨＶＪ、インフルエンザウイルス）のエンベロープであり、より好ましくは、ＨＶＪのエンベロープであり得る。
本発明のシステムによって導入される生体分子は、上述のようなものであればどのような分子でもよいが、通常、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択されるものであり得る。好ましくは、そのような生体分子は、核酸またはポリペプチドを含む。ある実施形態では、そのような生体分子は核酸を含む。別の実施形態では、そのような生体分子は、ポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
別の実施形態において、本発明により導入される生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）からなる群より選択されるポリペプチドである。
好ましい実施形態において、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、同じ組成物中に含有されていてもよい。その場合の組成物中の均一性は問われない。
別の好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）と、生体分子およびウイルスエンベロープとは、異なる組成物中に含有されていてもよい。この場合、２種類の組成物は、投与は同時であってもよく、異なる時間であってもよい。ここで、生体分子は、好ましくは、ウイルスエンベロープ中に含有される。生体分子が効率よく送達されるからである。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための方法を提供する。この方法は、１）ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を該細胞に投与する工程；および２）グリコサミノグリカンを該細胞に投与する工程、を包含する。生体分子（例えば、核酸またはポリペプチド）、ウイルスエンベロープ（例えば、ＨＶＪのエンベロープ）およびグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
ここで、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）を投与する工程は、ウイルスエンベロープおよび生体分子を含む組成物を投与する工程と同時に行われても、前に行われても、後に行われてもよい。好ましくは、組成物とグリコサミノグリカンとは、同時または少し前に投与される。組成物とグリコサミノグリカンとは、より好ましくは同時に投与される。同時に投与する場合は、グリコサミノグリカンは組成物中に含まれていても含まれていなくてもよい。
別の局面において、本発明は、生体分子を細胞に導入するための医薬を製造するための、グリコサミノグリカンの使用を提供する。この使用において、本発明の医薬は、１）生体分子；２）ウイルスエンベロープ；および３）グリコサミノグリカン、を含む。生体分子（例えば、核酸またはポリペプチド）、ウイルスエンベロープ（例えば、ＨＶＪのエンベロープ）およびグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）について好ましい実施形態は、本明細書において上述したとおりである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達する方法を提供する。この方法は、１）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；および２）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。ここで、一過的に動脈を閉鎖することによって、生体分子が脳内に効率よく（例えば、２倍以上）導入されたことは、予想外の効果である。なぜなら、血液脳関門（ＢＢＢ）が存在することにより、血管と脳とは明確に区別されているため、生体分子の脳内への導入が行かないと考えられていたからである。一過的に閉鎖する方法は、バルーンカテーテル、クリッピング、生理的には脳梗塞などが挙げられる。バルーンカテーテル、クリッピングが好ましい。一過的とは、ここでは、生体分子を投与するのに十分な時間（例えば、少なくとも１分、少なくとも５分など）であるが、好ましくは、１〜１２０分間であり得る。
１つの実施形態において、生体分子は、本明細書において上述のものであればどのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましい実施形態では、その生体分子は、核酸を含む。
好ましい実施形態において、この生体分子は、前記生体分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＨＩＦ−１、Ｄｅｌ−１などの血管新生因子、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス因子、ＢＤＮＦなどの脳保護因子およびＭｎ−ＳＯＤなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
好ましい実施形態では、導入される核酸は、ベクターによって送達される。そのようなベクターは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサーなどの転写調節配列などを含み得る。好ましくは、ベクターは、発現ベクターであり得る。ベクターの構築は当該分野において周知である。
１つの実施形態において、生体分子は、ウイルスエンベロープとともに導入される。好ましくは、本発明において使用されるウイルスエンベロープは、不活性化されている。不活性化することによって、望ましくない毒性などを軽減することができる。不活性化は、どのような方法であってもよいが、ＵＶ照射、アルキル化剤の使用などが挙げられるがそれらに限定されない。
別の実施形態において、ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープであり得る。好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス（例えば、ＨＶＪ、インフルエンザウイルス）のエンベロープである。もっとも好ましくは、使用されるウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである。
好ましい実施形態において、生体分子の脳への導入は、前記生体分子は、グリコサミノグリカンとともに行われ得る。ここで、グリコサミノグリカンは、どのような分子であってもよいが、好ましくは、ヘパリンである。グリコサミノグリカンであれば、どのような分子でも使用することができるが、好ましくは、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａである、より好ましくは、少なくとも１１，０００ｋＤａであり、さらに好ましくは、少なくとも１２，０００ｋＤａであり得る。好ましい実施形態において、ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである。
ある実施形態において、使用されるグリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ組成物中に含まれる。
ここで、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能であることが好ましい。
ある実施形態において、上記グリコサミノグリカンは、生体分子と同時に投与されても、その前に投与されても、その後に投与されてもよい。好ましくは、グリコサミノグリカンと生体分子は同時に投与される。
好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される。
１つの実施形態において、脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
１つの実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与される。
好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与される。頸動脈が好ましいのは、脳実質臓器へ広範囲に血流を供給するからである。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを提供する。このキットは、１）生体分子；ならびに２）この生体分子を投与する方法を指示する指示書を備える。ここで、この方法は、Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；およびＢ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する。一過的に閉鎖する方法は上述したとおりである。
キットに含まれる生体分子は、どのような分子でもよいが、好ましくは、核酸、ポリペプチド、脂質、糖、およびそれらの複合分子からなる群より選択される。好ましくは、この生体分子は、核酸を含む。
ここで含まれる生体分子として好ましいものは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＨＩＦ−１、Ｄｅｌ−１などの血管新生因子、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス因子、ＢＤＮＦなどの脳保護因子およびＭｎ−ＳＯＤなどの抗酸化因子からなる群より選択される遺伝子をコードする核酸である。
キットに含まれる核酸は、ベクターによって送達される。ここで使用されるベクターは、その核酸を発現することができるものであればどのようなものでもよい。好ましくは、哺乳動物（好ましくはヒト）において効率よく発現される、ベクターである。
好ましい実施形態では、本発明のこのキットは、さらにウイルスエンベロープを含む。
ここで、上記ウイルスエンベロープは、不活性化されていることが好ましい。それにより副作用が回避されるからである。
好ましくは、ウイルスエンベロープは、ＲＮＡウイルスのエンベロープである。
より好ましくは、ウイルスエンベロープは、パラミクソウイルス属のウイルス（例えば、ＨＶＪ、インフルエンザウイルスなど）のエンベロープである。
もっとも好ましくは、ウイルスエンベロープは、ＨＶＪのエンベロープである。
本発明のキットはさらに、グリコサミノグリカンを含んでいてもよい。
ここで、好ましくは、グリコサミノグリカンは、ヘパリンであるがそれに限定されない。
１つの実施形態において、グリコサミノグリカンの分子量は、少なくとも１０，０００ｋＤａであり、より好ましくは、少なくとも１１，０００ｋＤａであり、より好ましくは少なくとも１２，０００ｋＤａである。より好ましくは、ヘパリンの分子量は、１２，０００〜１５，０００ｋＤａである
１つの実施形態において、本発明のキットに含まれるグリコサミノグリカンは、少なくとも５０Ｕ／ｍｌ含まれる。
好ましい実施形態では、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）の硫酸化の程度は、薬学的に許容可能である。
好ましい実施形態では、上記グリコサミノグリカンは、上記生体分子と同時に、前に、または後に投与され得る。より好ましくは、生体分子とグリコサミノグリカンは同時に投与される。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記頭部または頸部の動脈は、１分間〜１２０分間閉鎖される。好ましい実施形態において、上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈または頸動脈である。上記脳および頸部の動脈は、中大脳動脈である。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈、視床、脳室内または髄腔内に投与されるが、これらに限定されない。
本発明のキットにおける好ましい実施形態において、上記生体分子は、頸動脈に投与されることが好ましい。
別の局面において、本発明は、脳内に生体分子を送達するためのキットを製造するための生体分子の使用を提供する。ここで、このキットは、１）生体分子；ならびに２）該生体分子を投与する方法を指示する指示書であって、この方法は、Ａ）頭部または頸部の動脈を一過的に閉鎖する工程；およびＢ）該頭部または頸部の動脈が閉鎖されている間に、該生体分子を脳内に導入する工程、を包含する、指示書、を備える。
このように、本発明において、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープ（例えば、ＨＶＪ−Ｅベクター）を用いたＣＮＳへの遺伝子移入の可能性を研究した。以下の実施例に示されるように、Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子（ＶｅｎｕｓまたはＥＧＦＰ）は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、５０Ｕ／ｍｌ  ヘパリンの添加によって顕著に増強された（Ｐ＜０．０５）。
結論として、ＨＶＪ−Ｅベクターは、いずれもの明らかな毒性も伴わずに、遺伝子をＣＮＳにトランスフェクトする高い効力を有する。ＨＶＪ−Ｅベクターは、種々の遺伝子の役割を研究するためおよび脳血管疾患を処置するために有用であり得る。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】  （実施例１：ＨＶＪを用いた方法）
（材料および方法）
（ＨＶＪ−エンベロープベクター）
１０，０００赤血球凝集素単位のＵＶ不活性化ＨＶＪ（Ｚ株）を、２００μｇプラスミドＤＮＡおよび０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘと混合し、平衡塩溶液（ＢＳＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を用いて洗浄し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．５）を用いて、大脳内注射のために１０μｌに、髄腔内注入または動脈内注入のために１００μｌに、および培養細胞のために４００μｌに調整した。インビトロ研究のために、硫酸プロタミン（Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）を、ベクターを用いた処理前に培養プレートへ１０μｇ／ウェルで添加し、トランスフェクション効率を増強した。ヘパリン（Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｊａｐａｎ）、低分子量のヘパリン（Ｆｒａｇｍｉｎ（登録商標），Ｋｉｓｓｅｉ，Ｊａｐａｎ）、またはアルガトロバン（Ｓｌｏｎｎｏｎ（登録商標），Ｄａｉｉｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）との同時注射の場合、これらをリン酸緩衝化生理食塩水と混合し、ベクターに添加した。
（プラスミドＤＮＡ）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼーＧＬ３（ｐｃＬｕｃ−ＧＬ３：７．４ｋｂ）を、ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）由来のルシフェラーゼ遺伝子を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位およびＢａｍ  ＨＩ部位でｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングすることによって構築した。プラスミドを、ＱＩＡＧＥＮプラスミド単離キット（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。ｐＣＭＶ−ＬａｃＺ（９．２ｋｂ）は、ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ  フラグメントをｐｃＤＮＡ３に挿入することによって構築した。Ｖｅｎｕｓ／ｐＣＳ２１９は、Ｄｒ．Ｎａｇａｉ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｂｒａｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＲＩＫＥＮ，Ｊａｐａｎ）から好意により寄贈された。
（Ｖｅｎｕｓに起因する蛍光の測定）
Ｖｅｎｕｓの発現を、蛍光顕微鏡の下、注射の９６時間後に試験した。より正確な画像を、共焦点レーザー顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて得た。
（ルシフェラーゼ活性のアッセイ）
ルシフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトされたラットを、トランスフェクトの２４時間後に麻酔下で屠殺した。器官（脳、肺、脾臓、肝臓）を、回収し、そして個別にＦＡＬＣＯＮ  ５０ｍｌ  チューブ中に置いた。ルシフェラーゼ活性のアッセイを、以前に記載されたように実施した（Ｂｒｅｗｅｒ  ＧＪ，Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉ  ＪＲ，Ｅｖｅｇｅ  ＥＫ，Ｐｒｉｃｅ  ＰＪ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．１９９３；３５：５６７−７６．）。ルシフェラーゼレベルを、組織抽出物のタンパク質濃度を測定することによって標準化した（Ｂｒｅｗｅｒ  ＧＪ，Ｔｏｒｒｉｃｅｌｌｉ  ＪＲ，Ｅｖｅｇｅ  ＥＫ，Ｐｒｉｃｅ  ＰＪ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．１９９３；３５：５６７−７６．）。ルシフェラーゼ単位を、組織タンパク質１グラムあたりの相対光単位（ＲＬＵ）として表した。
（インビトロ遺伝子移入）
ラット胚大脳皮質ニューロンを、妊娠１９日の妊娠Ｗｉｓｔａｒラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ，Ａｔｓｕｇｉ，Ｊａｐａｎ）から得て、培養した（Ｂｅｌａｙｅｖ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ．１９９６；２７：１６１６−２２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １６２３ＦＦ０９。簡単に言うと、大脳皮質を切断し、そして個々の細胞を、パパインを用いた処理によって単離し、Ｌ−１５  Ｌｅｖｏｖｉｔｚ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）培地に粉砕した。細胞を、ポリ−Ｄ−リジンでコートされた２４ウェルプラスチック培養ディッシュ上にＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）／Ｂ−２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、３７℃、９５％大気−５％  ＣＯ２の加湿雰囲気中でプレートに播いた。培地を、第１日目および第４日目に交換した。第７日目のＭＡＰ２に対する免疫ポジティブ細胞の割合は、９２．９％であった。トランスフェクション前、培地を、新鮮な５００μｌ  ＤＭＥＭ／ウェルに交換した。Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクター（２５０  ＨＡＵ）を、各ウェルに添加し、３７℃で１０分間放置した。トランスフェクション後、培地を、新鮮なＤＭＥＭ／Ｂ−２７に交換し、そしてこのディッシュを３７℃でインキュベートした。Ｖｅｎｕｓの発現を、走査型共焦点レーザー顕微鏡画像を用いてトランスフェクションの２日後に観察した。トランスフェクション効率を、（Ｖｅｎｕｓを発現する細胞の数／ＮｅｕＮ−免疫反応細胞の数）×１００（％）として計算した。この効率の平均をとるために、５ヶ所の視野を無作為に選択し、そして細胞数を計数した。
（免疫組織化学研究）
インビトロで培養された細胞を、４％  パラホルムアルデヒドを用いて３７℃で１５分間固定し、そして０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて１０分間処理した。この細胞を、２％  ヤギ血清、ウシ血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ）、およびグリシン（５０ｍＭ）を含むＰＢＳを用いてブロックした。それから、この細胞を、ＮｅｕＮに対するモノクローナル抗体（１：１０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、マウスモノクローナル抗体ＭＡＰ２（１：１０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）またはＧＦＡＰ（１：１０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、一晩４℃でインキュベートした。ＰＢＳを用いた洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を、二次抗体として適用し、そしてこのディッシュを、１時間室温でインキュベートした。画像を、共焦点レーザー顕微鏡（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。
（正常ラットにおけるインビボ遺伝子移入）
雄性のＷｉｓｔａｒラット（２７０〜３００ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）を、本発明に使用した。全ての手順は、Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのガイドラインに従って、実施した。ラットを、ケタミン（Ｓａｎｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて麻酔し、頭蓋をあらわにしながら定位フレーム（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に配置した。特別設計したテフロンコネクタ（ＦＥＰチューブ、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を備えるステンレス鋼のカニューレ（３０ゲージ；Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を、視床（ブレグマの後方３．８ｍｍ、中線の側方２．４ｍｍ、および頭蓋表面下５．０ｍｍ）または側脳室（ブレグマの後方０．４８ｍｍ、中線の側方０．８ｍｍｍ、および頭蓋表面下３．８ｍｍ）に導入した。ＶｅｎｕｓまたはＥＧＦＰ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクターを、１．０μｌ／分の速度で注射した。注入後、この注入カニューレを取り出した。痙攣または四肢の異常な動きのような行動変化はいずれの動物においても観察されなかった。
クモ膜下腔への注入のために、各動物の頭部を、腹臥位に固定し、そして環椎後頭膜を、後頭大脳中線の切開によって露出させた。ステンレスカニューレ（２７ゲージ；Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を、大槽（クモ膜下腔）に導入した。ルシフェラーゼまたはＶｅｎｕｓ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクター（１００μｌ）を、１００μｌのＣＳＦを除去した後に５０μｌ／分の速度で注入した。次いで、この動物を、頭部を下にして３０分間置いた。総頸動脈に注入するために、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、手術顕微鏡（Ｋｏｎａｎ，Ｊａｐａｎ）下での正中切開を介して単離した。左総頸動脈および内頸動脈を一時的に連結させ、そしてＰＥ−５０カテーテル（Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、左外頸動脈を切り落とすことによって左総頸動脈に導入した。ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクター（１００μｌ）を、２５μｌ／分の速度で注射した。注射後、カニューレを取り出し、そして総頸動脈への血流を、結紮を放すことによって回復させた。各手順において、ＥＧＦＰまたはＶｅｎｕｓは、トランスフェクションの４日後に観察され、そしてルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの１日後に測定した。脾臓、肺、および肝臓中のルシフェラーゼ活性をまた、髄腔内注射の１日後に測定した。全てのラットは、投与後に体重減少も活性の損失も示さなかった。ベクター投与後の組織学的変化を明確にするために、冠状縫合切断のＨＥ染色を、脳室内注射および髄腔内注射の３日後に実施した。この冠状縫合切断を、ブレグマから＋１．０ｍｍ、−３．３０ｍｍ、−５．３０ｍｍ、−１１．３０ｍｍ、および−１４．６０ｍｍで作製した。
（一過性の中大脳動脈閉塞後のインビボ遺伝子移入）
中大脳動脈閉塞モデルを作製するために、左中大脳動脈を、以前に記載されたように（Ｂｅｌａｙｅｖ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ  ２７，１６１６−１６２２（１９９６））、ポリ−Ｌ−リジンコートされた４−０ナイロンをＭＣＡの起点に配置することによって、閉塞させた。簡単に言うと、動物を顔面マスクを用いてハロタン（７０％  Ｎ２Ｏおよび３０％  Ｏ２の混合物中に１〜３．５％）で麻酔した。直腸温度を、フィードバック調節された加熱パッドを用いた手術手段の間、終始３７±１℃に維持した。手術顕微鏡の下、左総頸動脈、左外頸動脈、および左内頸動脈を、正中切開を介して単離した。６０分後、総頸動脈および内頸動脈を、一過性に連結し、そして４−０ナイロンを取り出し、そして動脈を１０分間、再灌流させた。それから、総頸動脈および内頸動脈を、再び一過性に連結させ、そしてＰＥ−５０カテーテルを、上記のように外頸動脈から総頸動脈に配置し、そしてベクターを、連結を放した後に２０μｌ／分の速度で注射した。注射後、ＰＥ−５０カテーテルを取り出し、そして外頸動脈を６−０ナイロンと連結させた。ルシフェラーゼまたはＥＧＦＰの発現は、注入の１日後または３日後に観察された。
（結果）
（培養ラット大脳皮質細胞へのトランスフェクション）
ＣＮＳに遺伝子を移入する有効な方法を開発するために、本発明者らは、最初にレポーター遺伝子（Ｖｅｎｕｓ遺伝子）を培養ラット大脳皮質細胞（Ｅ１９）にトランスフェクトした。なぜなら、このＶｅｎｕｓレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法として報告されているからである。アクセプターとしてのＶｅｎｕｓの使用は、脳薄片における確実な蛍光シグナルの初期検出を可能にすることが、報告される（Ｎａｇａｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：８７−９０．）。トランスフェクションの２日後、培養ラット大脳皮質細胞は、培養細胞中に容易に検出可能な蛍光を示した（図１ａ、１ｄ、１ｇ）。免疫組織化学染色を用いると、細胞は、ＭＡＰ２（微小管結合蛋白２；ニューロンマーカー）、ＮｅｕＮ（ニューロン核抗原；ニューロンマーカー）、またはＧＦＡＰ（グリア原線維酸性タンパク質；グリアおよび神経膠星状細胞マーカー）について免疫ポジティブであった（図１ｃ、１ｆ、および１ｉ）。ニューロン細胞へのトランスフェクション効率は、Ｖｅｎｕｓポジティブ細胞数／ＮｅｕＮポジティブ細胞数から計算した場合、２６．７±６．４％であったが、コントロールベクターでトランスフェクトされた細胞においてポジティブ細胞は検出され得なかった。細胞死は、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いたトランスフェクト後に観察されなかった。
（脳へのインビボ遺伝子移入）
次に、本発明者らは、Ｖｅｎｕｓ遺伝子の脳へのトランスフェクションを試験した。最初に、本発明者らは、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクターを、視床下部または側脳室に注射した。ＥＧＦＰ遺伝子の視床への定位注射の使用は、注射部位における限定された発現を示した（図２ａ）。側脳室への定位注射によって、蛍光は、脈絡叢および脳室上衣細胞において検出され得た（図２ｂ、ｃ）。予期せぬことに、ポジティブ細胞は、ニューロン中で検出されなかった。対照的に、蛍光のポジティブ染色は、コントロールベクターでトランスフェクトされた脳またはトランスフェクトされていない脳において検出され得なかった。従って、本発明者らは、クモ膜下腔への注射を用いた。本実験において、本発明者らは、ＥＧＦＰの代わりにＶｅｎｕｓを使用した。なぜなら、Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子の使用は、容易に検出されるトランスフェクション方法であるからである。大槽を介した脳脊髄液への注射によって、髄膜においては広汎性のＶｅｎｕｓ発現であるが、脈絡叢においてもニューロンにおいてもそうではない発現が明らかになった（図３ａ、３ｂ）。重要なことに、脳室内注射または髄腔内注射の３日後における冠状縫合切断のＨＥ染色が、炎症性の変化を示さなかった。
（一過性中大脳動脈閉塞後のＣＮＳへの遺伝子移入）
臨床設定にある大脳虚血疾患の処置を考慮すると、定位フレームを用いた側脳室への注射よりも、クモ膜下腔への注入を用いるほうが最良のようである。大脳虚血におけるＨＶＪ−Ｅベクターを用いた遺伝子治療の可能性をさらに探索するために、本発明者らは、最終的に、頸動脈を介したＣＮＳへの遺伝子移入を試験した。しかし、頸動脈への動脈内注入は、注射の３日後および７日後において脳および微小血管内皮細胞に導入遺伝子の発現をほとんど生成しなかった。この問題を克服するために、本発明者らは、大脳虚血後の遺伝子移入が、ＣＮＳへの異なるトランスフェクション効率を示すかもしれないと仮説をたてた。なぜなら、大脳虚血は、血液脳関門に変化を引き起こすからである（Ｂｅｌａｙｅｖ  Ｌ，Ｂｕｓｔｏ  Ｒ，Ｚｈａｏ  Ｗ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＭＤ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９６；７３９：８８−９６．；Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｔ，Ｔｉｎｇ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ，Ｋｌａｔｚｏ  Ｉ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９８５；６８：１２２−９．；およびＮｅｕｍａｎｎ−Ｈａｅｆｅｌｉｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２０００；３１：１９６５−７２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １９７２−３．）。従って、本発明者らは、Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクターを、６０分間の一過性中大脳動脈閉塞後に頸動脈に注入した。興味深いことに、Ｖｅｎｕｓに起因する蛍光が、一過性閉塞の３日後に梗塞した大脳皮質において検出され得た（図４）。ＣＮＳへのトランスフェクションの可能性を、ルシフェラーゼ遺伝子を用いた実験によって確認した。注射の２４時間後のルシフェラーゼ活性は、対側半球においてよりも梗塞した半球においてはるかに高かった（図５、Ｐ＜０．０５）。対照的に、ルシフェラーゼ活性は、脾臓、肺、および肝臓において検出され得なかった。
最後に、本発明者らは、ヘパリンの同時投与がトランスフェクション効率を増加するか否かをさらに調査した。ルシフェラーゼ遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅベクターを作製した後、ヘパリンを１０、５０、または１００Ｕ／ｍｌの濃度でこのベクターに添加した。ＨＶＪ−Ｅベクターを、大槽を介してＣＳＦに注射した。図６に示されるように、ルシフェラーゼ活性は、５０Ｕ／ｍｌ  ヘパリンの添加によって顕著に増強された（Ｐ＜０．０５）。ヘパリンを用いたトランスフェクション効率における増加の機構を明らかにするために、本発明者らは、１、５、１０、５０、１００、もしくは２００Ｕ／ｍｌの濃度の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、または０．１もしくは０．２ｍｇ／ｍｌの濃度のアルガトロバンの影響を試験した。低分子量ヘパリンもアルガトロバンも両方とも、ルシフェラーゼ活性に影響を与えなかった。
（考察）
以前、本発明者らは、ラットおよび霊長類のＣＮＳへのトランスフェクションに関するＨＶＪ−リポソーム方法の効力を報告している（Ｙａｍａｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９６；２７１：Ｒ１２１２−２０．；Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３．；およびＨａｙａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：１１６７−７３．）。ＨＶＪ−リポソーム方法は、種々の細胞および組織へのトランスフェクションのために、リポソームの組み合わせおよびＨＶＪエンベロープ（Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｓａｅｋｉ  Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ．１９９９；５：２９８−３０３．）由来のタンパク質の融合活性を利用する。しかし、ＨＶＪ−リポソーム小胞を作製することは非常に長期にわたり、そして複雑な手順である。さらに、長期保存は、不可能であり得る。これらの問題は、ヒト遺伝子治療のためのＨＶＪ−リポソーム複合体の用法に影響を及ぼし得る。これらの問題を克服するために、本発明者らは、最近、第２世代のＨＶＪベクター、いわゆるＨＶＪ−Ｅベクターを開発した。ＨＶＪ−Ｅベクターを産生するために、ウイルスゲノムを完全に破壊した後、導入遺伝子をＨＶＪのエンベロープに挿入した。ＨＶＪ−リポソームベクターと比較した場合のＨＶＪ−Ｅベクターの利点は、以下である：１）ＨＶＪ−Ｅベクターは、作製が容易である、２）産生には、ほとんど時間をとらない（９０分未満）、そして、３）ＨＶＪ−Ｅベクターは、長期間（少なくとも６ヶ月）保存可能である。本発明において、本発明者らは、インビボおよびインビトロの両方で、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いたＣＮＳへの遺伝子移入の可能性を示す。インビトロ研究において、レポーター遺伝子は、細胞死を誘導することなくニューロン（ＭＡＰ２ポジティブ細胞またはＮｅｕＮポジティブ細胞）および大グリア細胞（ＧＦＡＰポジティブ細胞）において好首尾に発現された。非ウイルスベクターを用いると、有糸分裂細胞は良好にトランスフェクトされるが、非有糸分裂細胞（例えば、休止（Ｇ０）ニューロン）は、ほとんどトランスフェクトされない（Ｂｅｒｒｙ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００１；３：３３８−４９．）。しかし、本発明において、レポーター遺伝子を、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いて非有糸分裂ニューロンに良好にトランスフェクトした。有効なトランスフェクションは、ニューロンの表面上に豊富にあるシアル酸に対するウイルスレポーターの存在に起因して、達成され得る。
重要なことに、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いた遺伝子発現の分布は、ＣＮＳへのインビボ遺伝子移入のためのＨＶＪ−リポソームを用いた遺伝子発現の分布と異なった。髄腔内注射後、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現が、ＨＶＪ−リポソーム方法を用いた大脳実質において観察されたが（Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：７５９−６３．；およびＨａｙａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：１１６７−７３．）、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いると遺伝子発現は髄膜のみで検出された。その上、脳室内カチオン性リポソーム（ＨＶＪカチオン性リポソーム）媒介遺伝子移入は、大脳実質における発現を示したが（Ｚｏｕ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９９；６：９９４−１００５．）、一方、ＨＶＪ−Ｅベクター媒介遺伝子トランスフェクションは、脈絡叢および脳室上衣細胞においてのみ導入遺伝子発現を示した。ＨＶＪ−Ｅベクターの視床への直接注入がニューロンへのトランスフェクションを生じることを考慮すると、リポソームの存在は、軟髄膜または脳室上衣細胞を交差することに重要であるのかもしれない。本発明者らおよび他の者は、定位フレームを用いた側脳室への投与を用いるいくつか遺伝子移入方法の高いトランスフェクション効率を報告しているが（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００２；３９：１０２８−３４．；およびＹｕｋａｗａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００；７：９４２−９．）、その技術は、かなり侵襲性である。幸運にも、本発明者らは、導入遺伝子発現が、大槽への注射後に脳表面上で観察されたことを見出した。さらに、本発明は、ＣＮＳへの遺伝子移入が、一過性頸動脈閉塞後の再疎通の間にＨＶＪ−Ｅベクターの動脈内注射を介して可能であったことを明らかに示す。一過性中大脳動脈閉塞後の血液脳関門の破壊が論議の的となっているが（Ｂｅｌａｙｅｖ  Ｌ，Ｂｕｓｔｏ  Ｒ，Ｚｈａｏ  Ｗ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＭＤ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９６；７３９：８８−９６．；Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｔ，Ｔｉｎｇ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ，Ｋｌａｔｚｏ  Ｉ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９８５；６８：１２２−９．；およびＮｅｕｍａｎｎ−Ｈａｅｆｅｌｉｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ．２０００；３１：１９６５−７２；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  １９７２−３．）、Ｋｕｒｏｉｗａらは、一過性中大脳動脈閉塞の１時間後の血液脳関門の二相性の開放を実証し、この開放は、閉塞を放し、次いで５時間および７２時間の再灌流の１５分後に生じた（Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｔ，Ｔｉｎｇ  Ｐ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｈ，Ｋｌａｔｚｏ  Ｉ．，Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１９８５；６８：１２２−９．）。この制限された期間中のＨＶＪ−Ｅベクターの注入は、動脈内手段を介した大脳実質への治療遺伝子のトランスフェクションを可能にする。
ヘパリンの同時投与がＨＶＪ−Ｅベクターを用いたトランスフェクションの効率を増加したことは、注目すべきことである。これは、ＡＡＶベクターを用いたヘパリンとの同時注入がより高くそしてより同質の遺伝子発現を誘導したという報告（Ｍａｓｔａｋｏｖ  ＭＹ，Ｂａｅｒ  Ｋ，Ｋｏｔｉｎ  ＲＭ，Ｄｕｒｉｎｇ  ＭＪ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２；５：３７１−８０．２９．；およびＮｇｕｙｅｎ  ＪＢ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｎａｕｔｅ  Ｒ，Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｊ，Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ＫＳ．，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．２００１；１２：１９６１−４．）に類似する。ヘパリンがウイルス結合レセプターのひとつである、２，３−連結シアリックテオグリアシッド（ｓｉａｌｉｃ  ｔｅｏｇｌｙａｃｉｄ）に影響を与え、トランスフェクションの効率を高めたか、またはヘパリンがウイルス表面に結合して、細胞表面上のＨＳＰＧとの相互作用を制限し得ると推測された。この機構を明らかにするために、本発明者らは、ＬＭＷＨおよびアルガトロバンのような類似の物質の影響を試験した。しかし、これらの分子を用いてトランスフェクション効率の増加は観察されなかった。特に、従来のヘパリン（１２，０００〜１５，０００ｋＤａ）とＬＭＷＨ（５０００ｋＤａ）との間の差異は、分子の大きさおよび硫酸化の程度のみである（Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２；３１：２０８０−８．）。おそらく、これらの因子は、ＨＶＪ−Ｅベクターと標的細胞表面との間の相互作用に影響を及ぼし得る。
ここで、本発明は、いずれの明らかな毒性も伴わない、インビボおよびインビトロでの、ＣＮＳへのＨＶＪ−Ｅベクターを用いた高いトランスフェクション効率を示すが、遺伝子発現の部位は、種々の投与経路間で異なった。一過性動脈閉塞後の動脈内注射による好首尾な遺伝子トランスフェクションは、大脳虚血の処置のための有望な手段を提供する。さらに、本発明者らの知る限り、副作用の証拠はない。ＨＶＪは、ヒトに対して病原性ではなく（Ｏｋａｄａ  Ｙ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９３；２２１１，１８−４１．；およびＯｋａｄａ  Ｙ，Ｔａｄｏｋｏｒｏ  Ｊ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９６２；２６，１０８−１１８．）、そしてＨＶＪ融合活性を損失することなく適切な化学修飾によって完全に不活性化される。本発明において、髄腔内投与または脳室内投与は、動物の体重を減少させず、神経学的な欠損も引き起こさず、炎症性の変化も引き起こさなかった。さらに、髄腔内注射後にいずれの他の器官においても、ルシフェラーゼ活性は観察されなかった。従って、ＨＶＪ−Ｅベクターは、脳へのトランスフェクションに安全なようである。免疫原性に関して、５回のＨＶＪ−リポソーム方法によるプラスミドＤＮＡおよびアンチセンスＯＤＮの反復投与は、生物学的効果のいずれの損失もＨＶＪに対する抗体の産生も引き起こさなかった（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ，Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＧＨ，Ｋａｎｅｄａ  Ｙ，Ｏｇｉｈａｒａ  Ｔ，Ｄｚａｕ  ＶＪ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０００；２７３：６６６−６７４；およびＨｉｒａｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９９８；５：４５９−４６４．）。これらの理由から、ＨＶＪ−Ｅベクターは、脳血管疾患の処置のための適切な遺伝子移入方法であり得る。
（実施例２：他のウイルスベクターを用いた送達）
インフルエンザウイルスの調製：
オルトミクソウイルス科のインフルエンザウイルスを、原則的にＷＯ９６／０５２９４に記載されるように、孵化鶏卵から得、増殖させた。簡潔には以下のとおりである。受精卵の選択は注意深く行わなければならず、専用に確保された健全な農場より入手したものでなければならない。受精卵を３７．８℃の培養器に９〜１２日間入れ、尿嚢にインフルエンザウィルスを接種する前に、卵をろうそくの光に透かして胚の成長および胚の生存を確認した。
その後、最適条件でウィルスに感染させるために、温度および湿度を制御した培養インキュベータ中で２〜３日間卵を培養した。これらの条件はインフルエンザの株と使用したウィルス種に依存していた。５±３℃に急冷して培養を停止した。その後、感染した卵から多量のウィルス粒子を含む尿嚢液を取り出す。こうして得られたウィルスを含む尿嚢液を、迅速に精製して不純物（例えばオバルブミンを含むタンパク質、レシチン、バクテリア等）を除去するために、回収した材料を遠心分離して上澄液を取り、限外濾過で２０倍まで濃縮してからウィルスの精製を行った。
（アルキル化処理）
使用直前に、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４中に０．０１％  β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温に保ち素早く作業を行った。
上述のように得たインフルエンザウイルス濃縮液にβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間インキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり適量し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈澱を−２０℃で保存した。これを必要に応じて、このインフルエンザウイルスを限外濾過した。
上記サンプルを、５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた限外濾過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ほぼ１００％のインフルエンザウイルスエンベロープの回収率であり優れた結果が得られた。
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）ｂｕｆｆｅｒ、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ））でインフルエンザウイルスエンベロープを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
このようにしてインフルエンザウイルス含有漿尿液からの不活性化インフルエンザウイルスエンベロープを製造した。
インフルエンザウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、インフルエンザウイルスエンベロープを用いたＣＮＳへの遺伝子移入の可能性を実施例１に記載のように調べたところ、Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子（ＶｅｎｕｓまたはＥＧＦＰ）は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、５０Ｕ／ｍｌヘパリンの添加によって顕著に増強された。
このように、ＨＶＪ−Ｅベクターのみならず、他のウイルス由来のものでも脳動脈の一過性閉塞後での脳への遺伝子導入効率が顕著に上昇し、ヘパリンの添加がインフルエンザウイルスエンベロープの生体分子送達効率を上昇させることが見出された。
（実施例３：アデノ随伴ウイルスを用いた方法）
次に、アデノ随伴ウイルスを用いて、実施例１および２と同様の実験を行った。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。
アルキル化処理は、実施例２に記載されるように行った。
アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いた脳への送達について調べた。本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、アデノ随伴ウイルスエンベロープを用いたＣＮＳへの遺伝子移入の可能性を実施例１に記載のように調べたところ、Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を用ると、蛍光が、ラット大脳皮質ニューロンおよびグリア細胞において検出され得た。インビボにおいて、レポーター遺伝子（ＶｅｎｕｓまたはＥＧＦＰ）は、免疫学的な変化を誘導せずに、視床への直接注射によってか、脳室内注射によってか、または髄腔内注射によって、ラットの脳に好首尾にトランスフェクトされた。遺伝子発現は、総頸動脈を介した動脈内注入後に観察されなかったが、ベクターが中大脳動脈の一過性閉塞後に注射された場合、ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼ活性は、損傷した半球の中でのみ検出され得た。最後に、トランスフェクション効率を増加するために、ヘパリンの影響を試験した。ルシフェラーゼ活性は、５０Ｕ／ｍｌヘパリンの添加によって顕著に増強された。
（実施例４：ヘパラン硫酸）
実施例１〜３におけるヘパリンに代えて、ヘパラン硫酸（生化学工業（株）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎから購入可能）を用いてＨＶＪ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、ヘパラン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン一般で本発明の効果があることが実証される。
（実施例５：コンドロイチン硫酸）
実施例１〜３におけるヘパリンに代えて、コンドロイチン硫酸（生化学工業（株）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎから購入可能）を用いてＨＶＪ、インフルエンザウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを用いた場合に、同様な効果が見られるかどうか実証する。
実験の結果、コンドロイチン硫酸を用いた場合でも、脳への遺伝子導入効率が上昇することが確認される。従って、グルコサミノグリカン、ガラクトサミノグリカンを含め、グリコサミノグリカン一般で本発明の効果が実証される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】  インビトロおよびインビボの両方で、ウイルスエンベロープを用いた脳・中枢神経系（ＣＮＳ）への効率よい生体分子の送達（例えば、遺伝子導入）のための方法が提供された。また、ウイルスエンベロープを用いた生体分子のより効率の高い送達のためのシステムおよび方法が提供された。したがって、本発明は、生体分子を効率よく神経系へと投与する技術を提供し、その技術は、種々の薬剤の投与に応用され得るという産業上の利用可能性を提供する。
本発明は、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として本発明の組成物などを生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、事業目的の治験そのものとして有用であることから、産業上の利用可能性がある。また、本発明の治療方法を間接的または直接的に実施することが、医療業周辺の産業において利用する可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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