(57)【要約】同一の発光基質で異なる色を発光する少なくとも２つの発光タンパク遺伝子のいずれかを哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んでなる遺伝子構築物、及び当該遺伝子構築物を導入して得た哺乳類細胞をを用い、発光タンパクの発現量を評価することにより、各発光タンパクに結合された各プロモータの転写活性をマルチに測定するシステム等に関する。
2004099421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞安定発現化された鉄道虫由来赤色及び緑色発光タンパク、並びにイリオモテボタル由来の緑色及び橙色発光タンパクからなる群から選ばれる少なくとも１種の発光タンパクをコードするＤＮＡであって、該ＤＮＡは、ａ）哺乳類細胞の余分な転写因子の結合配列がなく、哺乳類用のコドンユーセージを有することを特徴とするＤＮＡ．
【請求項２】
哺乳類がヒトであり、配列番号７、１０、１１及び１６からなる群から選ばれる少なくとも１種のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
鉄道虫またはイリオモテボタル由来発光タンパクをコードするＤＮＡの哺乳類における発現を可能にする方法であって、
ａ）余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変更する工程
ｂ）ｃＤＮＡの配列において、昆虫のコドンユーセージを哺乳類用に変更する工程、さらに任意に
ｃ）使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃＤＮＡを変更する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項４】
発光タンパクのアミノ酸配列を変更しないことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
最大発光波長が６３０ｎｍである発光タンパクであって、以下のいずれかで表されるポリペプチド：
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｉｉ）配列番号４の配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、付加、欠失してなるポリペプチド
【請求項６】
哺乳類細胞で発現されてなる請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子を哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んでなる遺伝子構築物。
【請求項８】
最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子とともに最大発光波長が４６０〜５２０ｎｍの１または２以上の発光タンパク遺伝子を組み込んでなる、３以上の発光タンパク遺伝子を哺乳類細胞で安定発現可能である請求項７に記載の遺伝子構築物。
【請求項９】
前記発光タンパク遺伝子が、哺乳類細胞で安定発現化された鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクおよびイリオモテボタル由来の緑色、橙色発光タンパクからなる群から選ばれる少なくとも１種の発光タンパクをコードする遺伝子である請求項７に記載の遺伝子構築物。
【請求項１０】
翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを含む請求項７に記載の遺伝子構築物。
【請求項１１】
発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子と、必要に応じて発光波長が測定条件に実質的に依存しない他の発光波長の光を発光する発光タンパク遺伝子を各々別個のプロモータの制御下に組み込んでなり、２種以上の発光タンパクによる各発光を分別して測定可能である遺伝子構築物。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物または請求項８に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
【請求項１４】
発光波長が測定条件に実質的に依存しない相互に分別可能な光を発光する２以上の発光タンパク遺伝子を別個のプロモータの制御下に哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んだ哺乳類細胞。
【請求項１５】
２以上の前記発光タンパクは、最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、１つの発光基質で発光可能である請求項１３または１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項１６】
鉄道虫由来赤色発光タンパク遺伝子を含み、さらに鉄道虫由来緑色発光タンパク遺伝子、イリオモテボタル由来の緑色発光タンパク遺伝子及び橙色発光タンパク遺伝子並びに青色発光タンパク遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも２種を各々別個のプロモータの制御下に含む請求項１５に記載の哺乳類細胞。
【請求項１７】
発光波長が測定条件に実質的に依存しない相互に分別可能な光を発光する３以上の発光タンパク遺伝子を別個のプロモータの制御下に哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んでなる請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項１８】
別個のプロモータの制御下にある３以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にあり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項１９】
別個のプロモータの制御下にある３以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にあり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２０】
別個のプロモータの制御下にある４以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にあり、第３の発光タンパク質が外的因子を受容するタンパクのプロモータであり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２１】
別個のプロモータの制御下にある４以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にあり、第３の発光タンパク質が外的因子を受容するタンパクのプロモータであり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２２】
別個のプロモータの制御下にある２個の前記発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２３】
別個のプロモータの制御下にある２個の前記発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞。
【請求項２４】
請求項１８〜２１のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記発光タンパク量を定量する工程、少なくとも１つの発光タンパクに連結された少なくとも１つの評価対象プロモータに対する該候補化合物の影響を評価する工程を包含する薬物のスクリーニング方法。
【請求項２５】
請求項１３〜２３のいずれかの哺乳類細胞の培養環境を変化させて、発光波長が測定条件に依存しない相互に分別可能な光を発光する２以上の発光タンパクの発現量を評価することにより、培養環境変化の前後における各発光タンパクに結合された各プロモータの転写活性をマルチに測定するシステム。
【請求項２６】
２以上の発光タンパクの発現量を同時に測定する請求項２３に記載のシステム。
【請求項２７】
３以上の発光タンパクの発現量を測定可能である請求項２３に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、生体細胞内の遺伝子転写活性を、発光色の異なる発光タンパクを用いてマルチに検出するための遺伝子構築物、該構築物を含む発現ベクター、該構築物または発現ベクターを含む形質転換された哺乳類細胞、該哺乳類細胞を使用する薬物のスクリーニング方法および各プロモータの転写活性をマルチに測定するシステムに関する。
また、本発明は、生体細胞内の遺伝子転写活性を、赤色、橙色、緑色または青色発光タンパクを用いて検出するシステムで用いられる遺伝子およびポリペプチドに関する。
【背景技術】  生命科学の分野では、細胞内で起きる遺伝子の転写活性を測定することが一般的に行われ、該測定は、細胞に与える外来因子の影響の評価、細胞内情報伝達の伝播、或いは個々のタンパク群の発現解析等に用いられている。これまで、遺伝子転写活性の測定はウェスタンブロット法等で直接測定するか、或は発光タンパクをレポータ遺伝子として間接的に測定する方法があり、特にホタル発光タンパク遺伝子を用いて発光量から転写活性を定量化することが一般化している。また、蛍光蛋白質は細胞内で発現とほぼ同時期に、補因子を必要とせず、蛍光活性を持つ。蛍光蛋白質は、細胞内で蛍光活性を指標として蛋白質の局在等に関するモニター蛋白質として利用されているが、定量化は難しく遺伝子発現レポータ遺伝子としては活用されにくい。
タンパクの遺伝子発現の定量的且つ時間的な動態変化解析を行うことが重要ではあるが、従来のレポータ技術では一つの遺伝子転写活性を解析することが中心である。しかし、最近、ホタル発光タンパク遺伝子にＡ転写活性領域を、同時にウミシイタケ発光タンパク遺伝子にＢ転写活性領域を挿入、細胞内に２つの遺伝子構築物を導入することで２つの転写活性を測定するシステム（デュアルアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ社）が市販されている。しかし、この方法は、別々の発光基質をそれぞれ加えることで、転写活性を測定するシステムであり、同時に２つの活性が測定できず、また、測定できる転写活性は２つである。さらに、ホタルルシフェラーゼを使用しているため、ｐＨにより波長が変化し、正確な測定が難しい。
細胞内では複数の情報が行き交っており、複数の転写活性を、定量的に測定する技術の構築が必須である。例えば、ヒト体内時計では、２４時間のリズムを発信するＰｅｒ遺伝子は、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ遺伝子産物によって制御される。そのため、体内時計を正確に評価するためには複数、少なくとも３種類の転写活性測定が必須である。これまで、個々の遺伝子転写活性の測定がホタル発光タンパクレポータ遺伝子で行われているが、一つの遺伝子転写動態しか観察しておらず、体内時計関連遺伝子発現の相互関係は不明なままである。
がん化は、がん遺伝子（オンコジーン）の活性化に伴って引き起こされる細胞の異常増殖、或いは腫瘍抑制遺伝子の不活性化に伴って起きる制御から開放された細胞の異常増殖によって進行する。そのため、がん化因子やがん化の細胞内情報伝達を評価するためには、がん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子及び細胞分裂マーカー遺伝子の遺伝子転写活性を測定することが望ましい。しかしながら、従来法では一つの遺伝子転写動態しか観察できず、３種類の遺伝子転写活性を評価できないため、がん化における３つの相互関係は充分に理解されていない。
遺伝子の転写は、遺伝子産物上流のプロモータ領域といわれる遺伝子配列上に存在する特定の配列に、遺伝子の発現を抑制、或いは促進しようとする物質が結合することによって引き起こされる。Ｅ−ボックスやｃＡＭＰ結合部位などが、その代表例である。遺伝子転写活性は、プロモータ領域のある長さをレポータ遺伝子上流に挿入して測定する。さらに、そこで有効と考えられた特定配列を合成、レポータ遺伝子上流に挿入し、特定配列の効果を検証する。特定配列の転写制御効果を検証するには、同時にオリジナルのプロモータ領域の転写活性とその効果を標準化できる転写活性を併せて評価する必要がある。しかしながら、従来法では一つの遺伝子転写動態しか観察しておらず、転写活性制御特定配列を充分に評価できない。
発光タンパク類は細胞内の遺伝子転写活性を直接観察する手段として有効であり、遺伝子発現検出モニター蛋白質として利用されている。発光タンパクは多種多彩であるが、その多様性に着目した転写活性測定用レポータ遺伝子はない。発光色の異なる発光タンパク遺伝子をレポータ遺伝子として、異なる転写活性領域を哺乳類細胞に挿入すれば複数の転写活性を測定できる。鉄道虫由来の赤色発光タンパクは最も発光波長が長く、ホタルやヒカリコメツキ由来発光タンパクに比べて識別が容易で、また、赤色であることから細胞透過性も高い。しかしながら、例えば鉄道虫由来の赤および緑発光タンパクの発現は現在成功しているのは大腸菌であり（ＵＳ２００２／０１１９５４２−Ａ１）、ヒトを含む哺乳類細胞でシステムとして成功した例はない。
また、鉄道虫発光タンパク遺伝子の構造を改変することで哺乳類細胞において発現させることが可能にした例もある（ＷＯ２００３／０１６８３９）。
発光タンパクとして、イリオモテボタル由来の発光タンパク質も知られている。
イリオモテボタル由来緑色発光タンパクの発現は現在成功しているのは大腸菌であり（Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．Ｓｕｍｉｙａ，Ｍ．Ｖｉｖｉａｎｉ，ＶＲ．ａｎｄ  Ｏｈｂａ  Ｎ．；Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｌｕｍｉｎｏｕｓ  ｂｅｅｔｌｅ  Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｏｈｂａ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｔ．Ｙｏｋｏｓｕｋａ  Ｃｉｔｙ  Ｍｕｓ．．４７，３１−３８，２０００）、この配列をもとにイリオモテボタル由来橙色発光タンパクが作られ、これも大腸菌での発現には成功した（Ｖｉｖｉａｎｉ，ＶＲ．，Ｕｃｈｉｄａ，Ａ．，Ｓｕｅｎａｇａ，Ｎ．，Ｒｙｕｆｕｋｕ  Ｍ．ａｎｄ  Ｏｈｍｉｙａ  Ｙ．：Ｔｈｒ−２２６  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｅｅｔｌｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８０，１２８６−１２９１，２００１）。さらに、発光タンパクとして渦鞭毛藻やウミシイタケ由来の青色発光タンパクも知られている。
本発明は、細胞内の複数の転写活性を、同時、或いは同時期に測定、定量化できるレポータ遺伝子の構築及び最適化、さらに本レポータ遺伝子群を用いたマルチ遺伝子転写活性測定システムを開発し、生命科学での細胞機能解析、更には病態の治療，検査及び新薬開発に利用することを目的とする。
また、本発明は、哺乳類細胞・動物において鉄道虫赤色または緑色発光タンパク遺伝子をより安定に転写され、安定に翻訳される遺伝子構築体を作成することを目的とする。
さらに、本発明は、哺乳類細胞・動物においてイリオモテボタル橙色または緑色発光タンパク遺伝子をより安定に転写され、安定に翻訳される遺伝子構築体を作成することを目的とする。
これにより、安定に哺乳類細胞・動物での遺伝子転写活性の変化を測定、可視化できる。
【図面の簡単な説明】  図１は、マルチ遺伝子転写活性の測定概略と従来法との違いを示す。
図２は、哺乳類細胞発現用ベクターの構造とＨｅｌａ細胞における発光活性を示す。
図３は、哺乳類培養細胞で生産された鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクの発光スペクトルを示す。
図４は、哺乳類培養細胞で生産された鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクの細胞内寿命を示す。
図５は、哺乳類細胞で生産された赤、緑色発光タンパクの同時発光スペクトルと色識別に用いたフィルターの特性（光の透過率）を示す。
図６は、赤、緑色発光タンパクの発光反応曲線と発光活性測定時間を示す。
図７は、赤、緑色発光タンパクの存在比と発光活性（図５のフィルターを用いた場合）を示す。
図８は、マルチ転写活性測定の実際・赤、緑色発光タンパクの光より同時に２つの転写活性を測定、青色発光タンパクの光によって標準遺伝子の転写活性を測定、２つの転写活性を標準化した結果を示す。
図９は、哺乳類細胞で生産された赤、緑、青色発光タンパクの同時発光スペクトルと色識別に用いたフィルターの特性（光の透過率）を示す。
図１０は、赤、緑色発光タンパクの示す転写活性は連続的に２つの転写活性をモニターした結果を示す。
図１１は、一次スクリーニングで多検体を網羅的に解析する例を示す。
図１２は、二次スクリーニングで個別事象を評価する例を示す。
図１３は、本発明の鉄道虫赤色発光タンパク遺伝子変異体（配列番号７）と鉄道虫野生型赤色発光タンパク遺伝子（配列番号３）とのＤＮＡ配列の相同性を示す。
図１４は、最大発光波長６３０ｎｍの本発明の鉄道虫赤色発光タンパク遺伝子変異体（配列番号７）と最大発光波長６２２ｎｍのＷＯ２００３／０１６８３９（配列番号６）の鉄道虫赤色発光タンパク遺伝子変異体とのＤＮＡ配列の相同性を示す。
図１５は、野生型、変異体鉄道虫赤色発光タンパクの発光活性の違いを示す。
図１６は、哺乳類細胞（マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞（太線））導入作成した、変異体（配列番号７）と昆虫カイコ細胞（細線）で作成した鉄道虫野生型（配列番号３）の発光スペクトルを示す。
図１７は、イリオモテボタル緑色発光タンパク遺伝子の変異型（配列番号１０）と野生型（配列番号８）とのＤＮＡ配列の相同性を示す。
図１８は、イリオモテボタル緑色発光タンパク野生型、変異体及びイリオモテボタル橙色発光タンパク野生型、変異体の発光活性の違いを示す。
図１９は、ホタルルシフェリン１つの基質で３つの遺伝子発現を検出する方法の概略を示す。本実施形態の方法は、３つの転写活性を赤、橙、緑色で伝え、それぞれを光の色識別することで測定する。
図２０は、哺乳類細胞で発現したイリオモテボタル緑、橙、鉄道虫赤色発光タンパク混合物の発光スペクトルと設定された分割フィルターの透過曲線である。
図２１は、２色発光タンパク（（Ａ）緑−赤、（Ｂ）緑−橙、（Ｃ）橙−赤色発光タンパクの組み合わせ）存在比と発光活性（図２２に示したフィルターを用いた場合）を示す。
図２２は、３色発光タンパク（（Ａ）赤色発光タンパクを１として緑−橙色発光タンパク、（Ｂ）橙色発光タンパクを１として緑−赤色発光タンパク、（Ｃ）緑色発光タンパクを１として橙−赤色発光タンパク）の存在比と発光活性（図２０に示したフィルターを用いた場合）を示す。
【発明の開示】
本発明者は，上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果，発光タンパクを基盤に、発光色の異なる（赤、緑、橙、青色など）或いは発光基質が多様であることに着目して、２つ以上、好ましくは３つ以上、さらに好ましくは４つ以上の発光タンパク（赤、橙、緑、青を含む）由来の光を分別して定量化できるレポータ遺伝子構築物を作成した。各発光タンパク由来の発光量は、各プロモータの転写活性、すなわち各プロモータが本来連結された遺伝子活性に対応するので、本発明により、２つ以上、好ましくは３つ以上さらに好ましくは４つ以上の遺伝子活性を、好ましくは同時、或いは同時期に測定することができる。また、発光波長が測定条件（ｐＨなど）によって変化しないため、正確な測定が可能である。例えば、本発明の１つの好ましい実施形態では、鉄道虫由来赤、緑色発光タンパク、イリオモテボタル由来緑、橙色などのレポータ遺伝子構築物を作成、また、ウミシイタケ、ウミボタル、発光性渦鞭毛藻、ヒカリコメツキ、エクオリン等の発光タンパクレポータ遺伝子を同時に用いることで、簡便且つ定量性良く、複数の遺伝子転写活性を測定するシステムを作成した。
さらに、本発明者は，ａ）余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えること、ｂ）ｃＤＮＡの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変え、さらにｃ）使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃＤＮＡを変えることで、本来哺乳類細胞中でほとんど或いは全く発現しない発光タンパクにおいて、哺乳類細胞中での転写が容易に行えることを見出した。
本発明は、以下のポリペプチド、遺伝子、遺伝子構築物、哺乳類細胞、該哺乳類細胞を使用する薬物のスクリーニング方法および各プロモータの転写活性をマルチに測定するシステムを提供するものである。
１．哺乳類細胞安定発現化された鉄道虫由来赤色及び緑色発光タンパク、並びにイリオモテボタル由来の緑色及び橙色発光タンパクからなる群から選ばれる少なくとも１種の発光タンパクをコードするＤＮＡであって、該ＤＮＡは、ａ）哺乳類細胞の余分な転写因子の結合配列がなく、哺乳類用のコドンユーセージを有することを特徴とするＤＮＡ．
２．哺乳類がヒトであり、配列番号７、１０、１１及び１６からなる群から選ばれる少なくとも１種のヌクレオチド配列を有することを特徴とする項１に記載のＤＮＡ。
３．鉄道虫またはイリオモテボタル由来発光タンパクをコードするＤＮＡの哺乳類における発現を可能にする方法であって、
ａ）余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変更する工程
ｂ）ｃＤＮＡの配列において、昆虫のコドンユーセージを哺乳類用に変更する工程、さらに任意に
ｃ）使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃＤＮＡを変更する工程
を有することを特徴とする方法。
４．発光タンパクのアミノ酸配列を変更しないことを特徴とする項３に記載の方法。
５．最大発光波長が６３０ｎｍである発光タンパクであって、以下のいずれかで表されるポリペプチド：
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド
（ｉｉ）配列番号４の配列において、１または複数個のアミノ酸が置換、付加、欠失してなるポリペプチド
６．哺乳類細胞で発現されてなる項５に記載のポリペプチド。
７．最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子を哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んでなる遺伝子構築物。
８．最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子とともに最大発光波長が４６０〜５２０ｎｍの１または２以上の発光タンパク遺伝子を組み込んでなる、３以上の発光タンパク遺伝子を哺乳類細胞で安定発現可能である項７に記載の遺伝子構築物。
９．前記発光タンパク遺伝子が、哺乳類細胞で安定発現化された鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクおよびイリオモテボタル由来の緑色、橙色発光タンパクからなる群から選ばれる少なくとも１種の発光タンパクをコードする遺伝子である項７に記載の遺伝子構築物。
１０．翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを含む項７に記載の遺伝子構築物。
１１．発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する１または２以上の発光タンパク遺伝子と、必要に応じて発光波長が測定条件に実質的に依存しない他の発光波長の光を発光する発光タンパク遺伝子を各々別個のプロモータの制御下に組み込んでなり、２種以上の発光タンパクによる各発光を分別して測定可能である遺伝子構築物。
１２．項７〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む発現ベクター。
１３．項７〜１１のいずれかに記載の遺伝子構築物または項８に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳類細胞。
１４．発光波長が測定条件に実質的に依存しない相互に分別可能な光を発光する２以上の発光タンパク遺伝子を別個のプロモータの制御下に哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んだ哺乳類細胞。
１５．２以上の前記発光タンパクは、最大発光波長が５３５〜６３５ｎｍであって、１つの発光基質で発光可能である項１３または１４に記載の哺乳類細胞。
１６．鉄道虫由来赤色発光タンパク遺伝子を含み、さらに鉄道虫由来緑色発光タンパク遺伝子、イリオモテボタル由来の緑色発光タンパク遺伝子及び橙色発光タンパク遺伝子並びに青色発光タンパク遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも２種を各々別個のプロモータの制御下に含む項１５に記載の哺乳類細胞。
１７．発光波長が測定条件に実質的に依存しない相互に分別可能な光を発光する３以上の発光タンパク遺伝子を別個のプロモータの制御下に哺乳類細胞で安定発現可能なように組み込んでなる項１４に記載の哺乳類細胞。
１８．別個のプロモータの制御下にある３以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にあり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
１９．別個のプロモータの制御下にある３以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にあり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
２０．別個のプロモータの制御下にある４以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にあり、第３の発光タンパク質が外的因子を受容するタンパクのプロモータであり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
２１．別個のプロモータの制御下にある４以上の発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にあり、第３の発光タンパク質が外的因子を受容するタンパクのプロモータであり、残りの１以上の発光タンパク遺伝子が評価対象のプロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
２２．別個のプロモータの制御下にある２個の前記発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
２３．別個のプロモータの制御下にある２個の前記発光タンパク遺伝子を有し、第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にある項１４に記載の哺乳類細胞。
２４．項１８〜２１のいずれかに記載の哺乳類細胞の培養液中に薬物候補化合物を存在させて該哺乳類細胞を培養する工程、該候補化合物の存在下及び非存在下で前記発光タンパク量を定量する工程、少なくとも１つの発光タンパクに連結された少なくとも１つの評価対象プロモータに対する該候補化合物の影響を評価する工程を包含する薬物のスクリーニング方法。
２５．項１３〜２３のいずれかの哺乳類細胞の培養環境を変化させて、発光波長が測定条件に依存しない相互に分別可能な光を発光する２以上の発光タンパクの発現量を評価することにより、培養環境変化の前後における各発光タンパクに結合された各プロモータの転写活性をマルチに測定するシステム。
２６．２以上の発光タンパクの発現量を同時に測定する項２３に記載のシステム。
２７．３以上の発光タンパクの発現量を測定可能である項２３に記載のシステム。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の発光タンパクは、２つ以上の発光タンパク由来の発光量を測定し、それらの相対比率を算出することが重要であるので、２つ以上の発光タンパクについて発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に実質的に依存しない光を発光することが必要である。
本明細書において、「発光波長が測定条件に実質的に依存しない」とは、ｐＨ、温度、濃度などが変化しても、最大発光波長の変動が３ｎｍ以下、好ましくは２ｎｍ以下、さらに好ましくは１ｎｍ以下、特に好ましくは０．５ｎｍ以下である。最大発光波長の変化量がこの範囲内であれば、複数の発光タンパク質の発現量をフィルター等で分離して定量する場合、相互の発光タンパク質の比率がほとんど変化しないため好ましい。
本明細書において、「相互に分別可能な光を発光する２以上の発光タンパク」とは、例えばフィルター（カラーフィルター、バンドパスフィルターなど）を用いて相互の光の発光量の比率を測定可能であることを意味する。例えば、鉄道虫由来の赤色、緑色発光タンパク、イリオモテボタル由来の橙色、緑色発光タンパクなどは、フィルターを使用することにより、緑色同士を除き、相互の光の発光量の比率を測定可能である。相互の光の発光量の比率を測定可能であるためには、フィルターの性能や各発光スペクトルのピーク形状にもよるが、最大発光波長が通常２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上、特に好ましくは５０ｎｍ以上離れているのが好ましい。
本発明で使用される好ましい発光タンパクは、鉄道虫由来の緑〜赤（その変異体を含む、最大発光波長：５３５〜６３５ｎｍ、例えば５４０〜６３０ｎｍ）の発光タンパク、ヒカリコメツキムシのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５３０〜６００ｎｍ）の発光タンパク、イリオモテホタルのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５５０〜５９０ｎｍ）の発光タンパクなどが挙げられる。例えば鉄道虫の場合、赤色最大発光波長６２２ｎｍと緑色最大発光波長５４５ｎｍの発光タンパクが知られているが（ＵＳ２００２／０１１９５４２−Ａ１）、この２種以外にも５４０〜６３５ｎｍの間の光を発光する多数の発光タンパクが存在していることを本発明者は確認しており、これらの発光タンパクは、全て使用可能である。例えば、鉄道虫由来の最大発光波長６２２ｎｍ（昆虫または大腸菌で発現）の赤色発光タンパクは、哺乳類細胞中で発現すると最大発光波長が６３０ｎｍにシフトすることを本発明者は確認した。この最大発光波長６３０ｎｍの鉄道虫由来の赤色発光タンパクは、本発明者により初めて発見された。
複数の発光タンパクを用いる場合、発光された各々の光をフィルター等を用いて分別して測定するためには、最大発光波長が２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上、特に５０ｎｍ以上離れているのが望ましい。この程度の最大発光波長の分離があれば、例えば各最大波長間のフィルターを使用し、フィルターの前後での各発光の透過率を測定して換算することで、各発光の発光量を同時に定量することができる。
例えば、図２０の各発光タンパクの最大発光波長は、赤（６３０ｎｍ）、橙（５８０ｎｍ）、緑（５５０ｎｍ）であり、これらは十分に分けることができる。
特に、最大発光波長がある程度離れている複数の発光タンパクを有する鉄道虫、イリオモテボタルなどに由来する発光タンパクを使用する場合、１つの発光基質（例えば鉄道虫、イリオモテボタル、ヒカリコメツキムシ由来の発光タンパクではホタルルシフェリンを使用できる）を使用して、共発現させた複数の発光タンパクに由来する発光量の同時定量が可能であり、各プロモータの発現量の比を正確に測定することができる。また、発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に依存しない光を発光する発光タンパクとして、青色に発光するウミシイタケ・ルシフェラーゼ、渦鞭毛藻の各種ルシフェラーゼ（全配列或いはドメイン１，ドメイン２，ドメイン３などの発光ドメインを含む；特開２００２−３３５９６１；Ｌｉ  Ｌ．，Ｈｏｎｇ  Ｒ．，Ｈａｓｔｉｎｇ  ＪＷ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４，８９５４）、ウミボタル・ルシフェラーゼをさらに組み合わせて使用することができる。鉄道虫、イリオモテボタル、ヒカリコメツキムシ由来の発光タンパクを使用すると、ホタルルシフェリンを使用できるので、バックグラウンドを低くすることが可能である。また、渦鞭毛藻のルシフェラーゼとルシフェリンの組み合わせについても、バックグラウンドが低く好ましい。
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、鉄道虫、イリオモテボタルの発光タンパクを使うことで１種類のルシフェリンでも少なくとも３つのプロモータの発現量の定量が可能である（例えば鉄道虫の赤色発光タンパクと、イリオモテボタルの橙色及び緑色発光タンパク）（ＶＲ．Ｖｉｖｉａｎｉ，Ａ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．Ｓｕｅｎａｇａ，Ｍ．Ｒｙｕｆｕｋｕ  ＆  Ｙ．Ｏｈｍｉｙａ：Ｔｈｒ−２２６  ｉｓ  ａ  ｋｅｙ−ｒｅｓｉｄｕｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｅｅｔｌｅ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉ．２８０，１２８６−１２９１）。また、青色ルシフェラーゼ（ウミシイタケ、渦鞭毛藻またはウミボタルの各ルシフェラーゼ）を合わせて４種以上は可能である。上手なフィルター設定により５４０−６３５ｎｍ（緑から赤色）、好ましくは５４０−６３０ｎｍの中で複数の発現解析は可能であり、さらに基質の違う青色の発光タンパクにより１種類を加えることができる。よって、発光タンパクの同時測定としては、同じルシフェリンで３つ以上、違うルシフェリンも用いて４つ以上の同時定量が可能である。
従来、哺乳類細胞で発現可能な発光タンパクとして、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼが知られていた。しかしながら、ホタルルシフェラーゼは細胞破砕液のｐＨによって発光する光の色が緑〜黄色に変化するため、２種以上の発光タンパクの発現量を比較する場合、正確性に欠ける欠点があった。ウミシイタケ・ルシフェラーゼに由来する青色の発光は、発光波長が測定条件に実質的に依存しない光を発光する点で望ましいが、ホタルルシフェラーゼと組み合わせた測定系では、ホタルルシフェリンを用いた定量とウミシイタケルシフェリンを用いた定量の両方を別個に実施する必要があるため、簡便性、正確性に欠ける欠点があった。
本発明者は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ以外の発光タンパクとして鉄道虫発光タンパクに着目してこれを哺乳類細胞で発現させることを試みたが、通常の発現系では、鉄道虫発光タンパクを哺乳類細胞で発現させることはできなかった。これが、現在まで、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ以外の発光タンパクが哺乳類細胞、特にヒト細胞で発現されてこなかった理由であると考えられる。
本発明者のこれまでの知見によると、本発明の好ましい１つの実施形態において、鉄道虫発光タンパク、イリオモテボタル発光タンパク、ヒカリコメツキ発光タンパクを実用化する上で重要なのは、鉄道虫発光タンパク遺伝子、イリオモテボタル発光タンパク遺伝子、ヒカリコメツキ発光タンパク遺伝子が安定に転写されて、安定に翻訳されることである。本発明の実施例で行った手法では、転写されたｍＲＮＡを安定化して翻訳回数を増やせば実用化が可能となることを証明した。つまりこの場合、グロブリンイントロンを挿入することでｍＲＮＡの寿命を延ばし、そして、コザック配列を挿入し翻訳回数を増やすことで、鉄道虫発光タンパク遺伝子の発現を哺乳類細胞で発現させることが初めて可能になった。
本発明の好ましい他の実施形態の更なる手法としては、例えばｍＲＮＡのコピー数を増やすことであるので、例えばｃＤＮＡの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えること、さらに使用上、制限酵素部位が多いことで応用が限定されることからそのｃＤＮＡを変えることが挙げられる。このような手法も、鉄道虫発光タンパク、イリオモテボタル発光タンパクの哺乳類細胞内での発現に有効であった。特にコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えることは有効である。
ｃＤＮＡの配列の変更は、以下の点を１）〜４）の順に考慮して行うことができる：
１）発光タンパクのアミノ酸配列はできるだけ変更しないのがよい（好ましくは全く変更しない）；
２）次に、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変更する；
３）さらに、ｃＤＮＡの配列において、昆虫のコドンユーセージを哺乳類用に変更する；
４）必要に応じてさらに、制限酵素部位をなくすようにｃＤＮＡ配列を変更する。
上記は、鉄道虫由来の発光タンパク、イリオモテボタル発光タンパクの発現について記載したが、ヒカリコメツキムシなどの他の生物由来の発光タンパクについても同様に当てはまると考えられる。
本明細書において、「発光タンパク」は、ルシフェラーゼなど、ルシフェリン光化学反応を触媒する発光酵素群を包含し、発光タンパクにはエクオリンのようなものも含まれる。また、ルシフェリンの構造を変化させることにより発光作用を有するような、触媒作用（ルシフェリンを酸化して発光物質に変換する作用）の弱いタンパク質も、発光波長が測定条件（例えばｐＨ）に実質的に依存しない限り本発明の発光タンパクに含まれ得る。
発光タンパクとしては、同一の発光基質で発光する２以上の発光タンパクの組み合わせが望ましい。測定条件により発光波長が実質的に変化せず、且つ、同一の発光基質で発光する好ましい発光タンパクとしては、鉄道虫由来の赤色発光タンパクおよび鉄道虫由来の緑色発光タンパク、或いは５４０〜６３５ｎｍ程度、好ましくは５４０〜６３０ｎｍ程度の範囲の発光波長を有する鉄道虫由来の他の発光タンパク、さらにはイリオモテボタル由来の緑色発光タンパクおよびイリオモテボタル由来の橙色発光タンパクが好ましく例示され、これ以外にも、ヒカリコメツキムシ由来の（５３０〜６００ｎｍ程度）発光タンパク、が例示される。特に、鉄道虫由来の赤色／緑色発光タンパク、イリオモテボタル由来の橙色／緑色発光タンパクは、発光タンパク量が同一であれば発光強度も同程度であるので、プロモータの転写活性をマルチに定量するのに好都合である。
本発明において、哺乳類としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌが挙げられ、好ましくはヒトである。
少なくとも２つの発光タンパク遺伝子は、同一の発光基質で異なる色を発光し、細胞内寿命が同程度であるのがよく、この点でも鉄道虫由来の赤色／緑色発光タンパク、イリオモテボタル由来の橙色／緑色発光タンパクは好ましく、特に鉄道虫由来の赤色発光タンパク、イリオモテボタル由来の橙色／緑色発光タンパクは好ましい。
さらに、本発明で使用する発光波長が測定条件（例えばｐＨ）により変化しない少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの発光タンパク及びこの標準化のための他の発光タンパクの各々異なる発光色は、フィルターで分離可能であることが、各発光色の簡単な装置での定量のために好ましい。例えば鉄道虫由来の赤色／緑色発光タンパクは図５に示されるように、フィルターを用いて容易に分離できるので好ましい。さらに、鉄道虫由来の赤色／緑色発光タンパクとウミシイタケ由来或いは渦鞭毛藻由来発光タンパク（最大発光波長４７４〜４８０ｎｍ）の組み合わせは、例えば図１０に示されるように２つのフィルターを使用することにより容易に分離できるので特に好ましい。さらに、鉄道虫由来赤色、イリオモテボタル緑色／橙色発光タンパク遺伝子は、２つのフィルターを使用して相互に分離することができる（図１９）
上記のように鉄道虫由来の発光タンパクは、大腸菌では発現することが知られているが、哺乳類細胞、特にヒト細胞での発現系は知られていない。実際、ヒト細胞で鉄道虫由来の発光タンパク（赤、緑）の発現を試みると、図２および実施例１に示すように哺乳類細胞では代表的な発現プロモータであるＳＶ４０やＣＭＶプロモータを単独に用いても発現を誘導することができない。また、イリオモテボタルの場合にも、公知の配列自体では発現レベルが低すぎて実用的ではないが、本発明の変異体は野生型のルシフェラーゼと比較して４４倍（緑色）及び５７倍（橙色）の発現レベルを有し、十分に実用性を有する。本発明の好ましい実施形態では、発光スペクトルの中からフィルター等を用いて、特定の色の発光タンパクの発現量を評価するため、野生型の発現量では充分に活用できない。
鉄道虫由来の発光タンパク（赤、緑）遺伝子配列は、ＵＳ２００２／０１１９５４２−Ａ１に開示され、ＵＳ２００２／０１１９５４２−Ａ１の赤色発光タンパク遺伝子（誤りを有する）を配列番号５に示す。鉄道虫由来の発光タンパクの正しい塩基配列を配列番号１（緑色発光タンパク遺伝子）と配列番号３（赤色発光タンパク遺伝子）に示し、正しいアミノ酸配列を配列番号２（緑色発光タンパク）および配列番号４（赤色発光タンパク）に示す。
本発明の発光タンパク遺伝子としては、野生型又は変異型発光タンパク遺伝子をそのまま使用することもでき、該発光タンパク遺伝子とストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得るＤＮＡ、該発光タンパクの１又は複数のアミノ酸が置換、付加、欠失または挿入され、且つ発光タンパク活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを該発光タンパク遺伝子として使用することが可能である。
１つの好ましい実施形態において、本発明者は様々な発現系を検討することにより、発光タンパクの哺乳類細胞での安定発現のためには、翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを遺伝子構築物に導入することが重要であることを見出した。翻訳を効率化するエレメントとしては、ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏ）などが例示され、ｍＲＮＡの安定化エレメントとしては、β−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｔｒｏｎ  ＩＩなどが例示される。発光タンパクを哺乳類細胞中で安定に発現するためには、特に、（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤／緑色発光タンパク）の部分構造が好ましい。また、ｃＤＮＡの配列を、昆虫のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を哺乳類用に変えること、さらには、余分な転写因子が結合しないように、ｃＤＮＡの配列を変えることも発光タンパクの哺乳類細胞での安定発現のために好ましいことを確認した。
一つの好ましい実施形態において、本発明の遺伝子構築物には発光タンパク遺伝子、該遺伝子の上流側にプロモータ、翻訳を効率化するエレメント及び／又はｍＲＮＡの安定化エレメントを含み、さらにエンハンサ、ＩＲＥＳ、ＳＶ４０ｐＡ、薬剤耐性遺伝子（Ｎｅｏｒなど）を含み得る。
本発明の好ましい遺伝子構築物の例を以下に示す。
（１）（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）
（２）（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏ遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）
本発明の遺伝子構築物は、そのままで哺乳類細胞に導入してもよいが、ベクター（例えばプラスミドやウイルスベクターを含む）に組み込んで哺乳類細胞に導入するのが好ましい。遺伝子構築物に複数の発光タンパクを発現可能に組み込んだ場合には、１つの遺伝子構築物または発現ベクターを哺乳類細胞に導入すればよいが、１つの遺伝子構築物に１つの発光タンパクを組み込んだ場合には、複数の遺伝子構築物または発現ベクターを同時にまたは逐次的に哺乳類細胞に常法に従って導入すればよい。
本発明のシステムにより同時測定が望ましい遺伝子の組み合わせとしては、
・時計遺伝子（Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、ＢＭＡＬ遺伝子など）
・癌遺伝子（がん遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、細胞分裂マーカー遺伝子など）
・病気（病態対応遺伝子、生死感受アポトーシス遺伝子、ホルモン遺伝子など）
・定常発現遺伝子（アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子、サル由来ＳＶ４０ウイルス遺伝子など）
などが例示される。
本発明は、以下のような応用が可能である。
（１）一次スクリーニング：多検体を網羅的に解析することを想定して、同時に３つ以上の情報を得ることは重要である。当然、複数の組み合わせが考えられる。創薬を考えた場合、その薬の効果はプラスの面を評価するだけでなく、マイナスの毒性も評価する必要がある。さらに、２つの遺伝子転写レベルの変化は細胞自体の状況を反映することから、細胞の状況を現す一定発現プロモータをコントロールにするのが好ましい。よって、創薬スクリーニングでは、以下のような組み合わせが例示される。
なお、表１、表２において、赤色／青色／緑色発光タンパクは単なる例示であり、橙色発光タンパクを含めた他の発光タンパクあるいは組み合わせを使用できることは言うまでもない。特に、鉄道虫とイリオモテボタルの赤色／橙色／緑色発光タンパクの組み合わせは、ホタルルシフェリンで同時測定が可能であるので特に好ましい。
また、各色の発光タンパクを任意に選択することができる。
2004099421.tif 000003
この場合、毒性評価と定常発現は薬剤評価対象プロモータのコントロールとなることから、一つのベクターで構築することも有用（必須ではない）であり、このベクターを入れた細胞自体がスクリーニング用の基本細胞となる。
2004099421.tif 000004
この場合、偽プロモータと定常発現プロモータはスクリーニング対象プロモータのコントロールとなることから、一つのベクターで構築することも有用（必須ではない）であり、このベクターを入れた細胞自体がスクリーニング用の基本細胞となる。
赤／橙／緑の組み合わせは表１、表２であらわされるスクリーニングを一つの基質を用いて達成することが可能である。つまり青色発光タンパクを橙色発光タンパクで代用するのである。この場合、一つの基質で測定が行うことが出来、より簡便な方法となる。また、青色発光タンパクを測定するためには細胞を破砕する必要があるが、ホタルルシフェリンは濃度勾配的に生きた細胞中に浸透し発光するので、生きた細胞のまま３つの発光を測定することが出来る。よって、細胞を破砕することなくスクリーニングが出来る特徴がある。
一方、赤／橙／緑／青の組み合わせは、例えば環境ホルモンの評価など、外的な因子も同時に評価できるという利点があり、外的な因子の及ぼす細胞内の複数の遺伝子転写活性の変化を測定できる。例えば、外的な因子を直接捕捉する受容体の発現をモニターすることが挙げられる。
2004099421.tif 000005
この場合、外的因子を受容するタンパク、それによって直接影響を受けるタンパク、さらには細胞自体の安全性を評価でき、これらを定常発現プロモータのタンパクのコントロールで標準化できることで、外的な因子が細胞に与える情報を正確に評価することができることから一つのベクターで構築することも有用（必須ではない）であり、このベクターを入れた細胞自体がスクリーニング用の基本細胞となる。
一次スクリーニングの例を図１１に示す。
（２）二次スクリーニング：絞られた薬剤効果、或いはプロモータ情報の評価を想定、３つ以上の情報を得ることは重要である。創薬などでは、薬剤の効果が複数想定される場合も多い、まずは細胞状態の変化を表す遺伝子、薬剤の一過的な影響（例えば毒性、ショック応答など）を知ること、そして、実際の効果を知ることも重要である。例えば表３，表４に示されるような時計関連薬剤効果の評価システムを例示できる。
2004099421.tif 000006
2004099421.tif 000007
特に上記のように、一つの基質で生きた細胞のまま３つの発光を測定することが出来る。よって、細胞を破砕することなく時計軸に従って薬剤の効果を評価出来る特徴がある。
また、同じ細胞に対して、一連の操作を行うことで、複数の操作の組み合わせ（履歴）に対する薬剤の効果を評価出来る。
二次スクリーニングの例を図１２に示す。
上記のように、２種以上、特に３種以上、あるいは４種以上のプロモータの発現量を、好ましくは同時に評価することで、１つのプロモータに対する作用を評価する場合に、活性、毒性等の標準化、或いは偽情報の標準化を行うことができる。
さらに、哺乳類において複数の遺伝子の発現が複雑に関連した現象を解明する場合にも、本発明のシステムは極めて有用である。
本発明の特に好ましい実施形態では、鉄道虫由来の赤色、緑色発光タンパク遺伝子、イリオモテボタル由来の緑色、橙色発光タンパク遺伝子及び青色発光タンパク遺伝子を用いて３つまたは４つの遺伝子転写活性を同時定量化するための方法・システムを提供する．本システムを使用することで、細胞内の複数の転写活性を同時に測定することができる。これらは病態の治療，検査及び新薬開発に利用が可能である．
この際、赤、緑、橙、青色に特化したフィルターを用いて、発光活性を測定することで、色識別が行われ、細胞内で行われる複数の転写を同時に測定でき、従来、１つの転写活性の変化情報では判断が容易でなかった細胞内の変化について、同時に多くの情報を引き出すことができ、各種病態の治療及び新薬開発への利用も可能となる。
本発明において、別個のプロモータの制御下にある２個の発光タンパク遺伝子を有し、
ｉ）第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が毒性評価プロモータの制御下にある哺乳類細胞；あるいは、
ｉｉ）第１の発光タンパク遺伝子が定常発現プロモータの制御下にあり、第２の発光タンパク遺伝子が偽プロモータの制御下にある請求項１４に記載の哺乳類細胞
は、これら哺乳類細胞に、１以上の発光タンパク遺伝子を評価対象のプロモータの制御下に組み込んだ遺伝子構築物をさらに導入して、薬物スクリーニング用の哺乳類細胞を製造するための中間体細胞として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】  鉄道虫由来緑、赤色発光タンパク遺伝子（配列番号１，３）は大腸菌では発現するが、哺乳類細胞では代表的な発現プロモータであるＳＶ４０やＣＭＶを単独に用いても発現を誘導することができない。そこで遺伝子発現を安定化させるコザック（ｋｏｚａｋ）配列、β−グロビンイントロンＩＩ（β−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｔｒｏｎ  ＩＩ）を挿入、さらにニワトリβアクチンプロモータやＣＭＶエンハンサの４つの因子を選択した構築物を赤、緑色発光タンパクに連結した遺伝子構造体を作成し、酵素活性を測定した（図２）。この際、ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ、およびＣＡＧプロモータ下流に発光タンパク遺伝子を挿入したものを比較とした。それぞれの遺伝子を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞にリポフェクタミンを用いて導入、２４時間後の細胞内の発光活性を測定した（図２）。発光活性の測定には基質として発光基質混合溶液（東洋ビーネット社製）を、発光測定装置はアトー（株）製ＡＢ−２０００を用いた。サンプルは細胞抽出液５０μＬにピッカジーン５０μＬを加えた。その結果、（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）を挿入したもので、最も高い活性が、下流に（ＳＶ４０ポリＡ配列）の変わりに（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏ遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列を）挿入したもので次いで高い活性が得られた。しかしながら、ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ単独では、ほとんど活性がなかった。但し（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏ遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）の活性に対して、（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏ遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）は約５００分の１に、（ＣＭＶプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）では約１０分の１の活性となった。このことから、鉄道虫由来、緑色発光タンパク遺伝子を哺乳類細胞内で安定に発現、遺伝子転写活性を測定するためには、直接的に転写活性には影響を与えない領域である酵素遺伝子上流に（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）を挿入することが好ましいことが明らかとなった。これはｋｏｚａｋ配列による翻訳の高効率化及びβ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｔｒｏｎ  ＩＩによるｍＲＮＡの安定化が大きいと考えられ、発光タンパク遺伝子を含む転写産物の効率化・安定化が実用化の鍵であることが明らかとなった。
【実施例２】  哺乳類細胞内で発現した鉄道虫由来、緑色発光タンパク遺伝子の発光スペクトル解析を行った。最も高い活性を示した（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）遺伝子を導入した細胞の抽出液１５μＬにピッカジーン１５μＬを加え、アトー（株）製微弱発光スペクトル測定装置を用いて発光スペクトルを測定した。図３は、それぞれを単独に発現させた場合の発光スペクトルであり、赤色発光タンパクでは最大発光波長６３０ｎｍのスペクトルが、緑色では最大発光波長５５０ｎｍのスペクトルが各々得られた。本スペクトルはｐＨや周りの溶液の影響を受けず、常に同じスペクトルを示した。
【実施例３】  哺乳類細胞内で発現した鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパク遺伝子の細胞内寿命を評価した。（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＩＲＥＳ）−（Ｎｅｏ遺伝子）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）遺伝子を導入した細胞を用いた。細胞内で発現した発光タンパクをリポフェクション法により培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に導入した細胞を用いた。遺伝子導入４８時間後、１００μＭの蛋白質生合成阻害剤シクロヘキシミドを含む培養液に置換し、３０分間培養後、経時的に細胞内の発光活性を測定した。発光活性の測定は実施例１と同様の方法で行った。その結果、赤色、緑色発光タンパク共に、同じような時間経過で活性減少が認められ、細胞内でのそれぞれの酵素の半減期は約３．５時間であった（図４）。
【実施例４】  鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパク遺伝子（（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列））を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３で共発現させた。共発現細胞を破砕し細胞抽出物の鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクの発光スペクトルを実施例２と同様な手法で測定した。図５は共発現細胞の発光スペクトルである。赤色、緑色発光タンパクが発光することで２つのピークが観察されるスペクトルとなった。これは２つの遺伝子転写活性を同時に測定した結果である。この発光活性を、フォトマルを用いたルミノメータで測定すれば、２つの鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパク遺伝子の発光活性の総計となる。そこで、緑色発光タンパクの発光活性だけを測定するため、赤色発光タンパクの光をカットすることにした。発光スペクトルから評価して、図５の点線で示す光波長カットフィルターを選択した。このフィルターを用いると、緑色発光タンパク活性の８％、赤発光タンパク活性の７６％が検出可能であり、換算することで赤色、緑色発光タンパクの発光量、存在量を評価することができる。
【実施例５】  赤色、緑色発光タンパクを個々に含む細胞抽出液５０μＬにピッカジーン５０μＬ添加し、ＡＴＴＯ（株）社製ディッシュ型ルミノメータＡＢ２５００を用いて１分間隔で発光活性を測定し、図６のような発光反応曲線を得た。反応開始後５分以内では活性は安定しないが、６分後では両方共に安定な発光活性を示した。そこで、赤色、緑色発光タンパク遺伝子を共発現させた細胞の発光活性の測定を行う際、この発光反応の安定化した時間帯で測定した。測定手順は、１）フィルター（Ｈｏｙａ社製カラーフィルターＲ−５４型）なしで発光量を測定する（赤色、緑色発光タンパクの発光活性）。２）実施例４で決定したフィルター（Ｈｏｙａ社製カラーフィルターＲ−５４型）をルミノメータに挿入、発光量を測定、緑色発光タンパクの発光活性とする。３）フィルター（Ｈｏｙａ社製カラーフィルターＲ−５４型）の透過率を換算することで赤色の発光活性を算出する。
【実施例６】  実施例５で決めた手順で存在比の異なる赤色、緑色発光タンパクを定量できるかをモデル実験で検証した。図７は赤色、緑色発光タンパクの存在比を変えたサンプルについて、１）全発光量の測定、２）緑色発光タンパクのみ測定、３）赤色、緑色発光タンパク量の定量、を行った。その結果、それぞれの存在比に対して直線関係で変化することが明らかとなった。これは、細胞内で異なる発現量を示した赤色、緑色発光タンパク量を、カラーフィルター（Ｈｏｙａ社製カラーフィルターＲ−５４型）を挿入したルミノメータで定量化できることを示している。
【実施例７】  本システムの有効性を検証するため、２つの時計遺伝子の遺伝子転写活性を測定、同時に３つ目の遺伝子転写活性として定常的な遺伝子転写活性を示すプロモータを用いて、２つの時計遺伝子の転写活性を標準化した。具体的には、マウスＰｅｒ１プロモータ内のＥ−ｂｏｘ３，４，５を連結したエレメント（Ｅ５４）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）遺伝子、およびマウスＢＭＡＬ１のプロモータ内のＲＥＶ−ＥＲＶ／ＲＯＲエレメント１，２（ＲＯＲＥ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列）遺伝子、および標準化用青色発光タンパクベクター（ｐｈＲＬ−ＴＫ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ヒトＢＭＡＬ１、ヒトＣＬＯＣＫ、マウスＲＯＲ・４発現ベクターと供にＮＩＨ３Ｔ３細胞にコトランスフェクションした。２４時間後細胞を破砕し、スペクトロメータを用いて細胞内でのルシフェラーゼ発光波長の解析を行った。その結果、これら２種のルシフェラーゼに由来する発光波長の検出が認められ、またこれらは個々のルシフェラーゼを単独で発現させたものと同一の発光スペクトルを示した。そこで実施例６で決定した方法により赤および緑色ルシフェラーゼの発光活性を測定した。更にこの活性値を青色発光タンパクの活性値で標準化した各々の転写活性を図８に示す。個別の実験において、ＢＭＡＬ１及びＣＬＯＣＫタンパクが細胞内に発現するとＥ−ｂｏｘ３，４，５を連結したエレメント（Ｅ５４）プロモータは活性化、（ＲＯＲ・）プロモータは不活性化されるのに対して、マウスＲＯＲ・４が細胞内で発現すると（ＲＯＲ・）プロモータが大きく活性化することが知られている。本実験において同時に測定された赤、緑色発光タンパクの活性は（Ｅ５４）プロモータ及び（ＲＯＲ・）プロモータ活性は転写活性の違いを定量的に示している。
【実施例８】  鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパク遺伝子（（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列））および青色発光タンパクベクター（ｐｈＲＬ−ＴＫ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３で共発現させた。共発現細胞を破砕し細胞抽出物の鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパクおよびウミシイタケ由来青色発光タンパクの発光スペクトルを実施例２と同様な手法で測定した。図９は共発現細胞の発光スペクトルである。赤色、緑色、青色発光タンパクが発する３つのピークが観察され、スペクトル上のピークの高さはそれぞれのプロモータ活性の高さを反映している。発光色を識別可能なフィルターを持つ発光量計測測定装置によって赤色、緑色、青色の発光量を換算することによって、３つの遺伝子転写活性を評価できる。
【実施例９】  鉄道虫由来赤色、緑色発光タンパク遺伝子（（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）−（赤、緑色発光タンパク）−（ＳＶ４０ポリＡ配列））遺伝子を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３にリポフェクションにより導入し、１６時間培養後、１００ｎＭのデキサメタゾンを含む培養液に置換し２時間培養した。その後、１００μＭのホタルルシフェリンを含む培養液に交換し、ＡＴＴＯ（株）社製ディッシュ型ルミノメータＡＢ２５００で赤色、緑色発光タンパクの発光活性を連続的に測定した。図１０は転写活性を連続的に測定した結果であり、発光する色を識別する連続発光量計測測定装置を用いれば、２つの転写活性を連続的に測定することが可能である。
【実施例１０】  哺乳類細胞内での発現を安定化させるために鉄道虫赤色発光タンパクの配列を下記の点に気をつけて設計した。１）転写因子結合部位の３４箇所（４８個のＤＮＡ配列）を変更（表４）、２）コドン使用頻度を哺乳類により近くするために２７９個のＤＮＡ配列を変更（表５）、３）一般的な制限酵素部位１５箇所（４５個のＤＮＡ配列内４箇所は転写因子結合部位と同じ）を変更（表６）して配列番号７の配列を設計し、人工的に構築物（配列番号７）を作成した。本配列は天然型鉄道虫赤色発光タンパク遺伝子（配列番号３）との相同性は７７．５％、ＷＯ２００３／０１６８３９に記載の赤色発光タンパク変異体（配列番号６）との相同性は８２．８％である（図１３，図１４）。
2004099421.tif 000008
2004099421.tif 000009
2004099421.tif 000010
2004099421.tif 000011
【実施例１１】  野生型と変異型の発光タンパク遺伝子を３種のプロモータ配列（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＣＡＧ｛ＣＡＧ；（ＣＭＶエンハンサ）−（ニワトリβアクチンプロモータ）−（β−グロビンイントロンＩＩ）−（コザック配列）｝の下流に挿入したベクターを作成した（野生型；ＣＭＶ−Ｒｅｄ，ＣＡＧ−Ｒｅｄ、変異型；ＣＭＶ−ＲＥＤｍ，ＣＡＧ−ＲＥＤｍ）。この際、ペルオキシゾーム移行配列として知られるＣ末端のＳＫＬ配列を削除したものも作成した（野生型；ＳＶ４０−Ｒｅｄ（−ＳＫＬ）、変異型；ＳＶ４０−ＲＥＤｍ（−ＳＫＬ），ＣＡＧ−ＲＥＤｍ（−ＳＫＬ））。
それぞれの遺伝子を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞にリポフェクタミンを用いて導入、２４時間後の細胞内の発光活性を測定した（図１５）。発光活性の測定には基質として発光基質混合溶液（東洋ビーネット社製）を、発光測定装置はアトー（株）製ＡＢ−２０００を用いた。サンプルは細胞抽出液５０μＬにピッカジーン５０μＬを加えた。その結果、ＣＭＶ−Ｒｅｄ、ＳＶ４０−Ｒｅｄ（−ＳＫＬ）では１０００ＲＬＵ前後であるが、ＣＭＶ−ＲＥＤｍ、ＳＶ４０−ＲＥＤｍ（−ＳＫＬ）において２ｘ１０７−４ｘ１０７ＲＬＵの値を示した。また、図１５に示すように、ＣＡＧ−Ｒｅｄでも高い活性は認められていたが、変異体を用いることで２倍程度の活性上昇が認められた。ＳＫＬ配列は活性上昇に有効な方法と考えられていたが、数％の活性上昇に留まった。これらの結果、ＣＡＧおよびＲＥＤｍは哺乳類遺伝子発現解析用レポータ遺伝子として有用であることが明らかとなった。実施例１０の手法で鉄道虫発光タンパクの哺乳類細胞での安定発現化が可能であることから、同様な手順で鉄道虫緑色発光タンパクの遺伝子配列を改変した（配列番号１６）。改変配列は野生型に比べて１６箇所の転写因子結合部位を改変し、相同性が７６％となっている。
【実施例１２】  哺乳類細胞内で発現した鉄道虫由来、赤色発光タンパク遺伝子の発光スペクトル解析を行った。最も高い活性を示したＣＭＶ−ＲＥＤｍ遺伝子を導入した細胞（マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３、ラット由来Ｒａｔ−１、ヒト由来Ａ５４３細胞）の抽出液１５μＬにピッカジーン１５μＬを加え、アトー（株）製微弱発光スペクトル測定装置を用いて発光スペクトルを測定した。また、参考のためカイコ昆虫細胞に配列番号３に記載の遺伝子を導入した細胞の抽出液の発光スペクトルを測定した。図１６は、マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞（太線）及びカイコ昆虫細胞（細線）において発現させた場合の発光スペクトルであり、マウス由来ＮＩＨ３Ｔ３細胞では最大発光波長６３０ｎｍ、カイコ細胞由来では最大発光波長６２２ｎｍ前後のスペクトルが得られた。本スペクトルはｐＨや周りの溶液の影響を受けず、常に同じスペクトルを示した。また、ラット由来Ｒａｔ−１、ヒト由来Ａ５４３細胞でも最大発光波長６３０ｎｍのスペクトルであった。
【実施例１３】  哺乳類細胞内での発現を安定化させるために、野生型のイリオモテボタル緑色発光タンパク（遺伝子配列を配列番号８に、アミノ酸配列を配列番号１２に各々示す）および野生型のイリオモテボタル橙色発光タンパク（遺伝子配列を配列番号９に、アミノ酸配列を配列番号１３に各々示す）の配列を下記の点に気をつけて設計し、人工的に構築物を作成した。
１）転写因子結合部位の１５箇所（２０個のＤＮＡ配列）を変更（表７）、
２）コドン使用頻度を哺乳類により近くするために３２２個のＤＮＡ配列を変更（表８）、
３）一般的な制限酵素部位３０箇所（４９個のＤＮＡ配列内２箇所は転写因子結合部位と同じ）を変更（表９）。
表８，９中、ＲｏＬＷＴは野生型イリオモテボタル発光タンパクを示し、ＲｏＬｍは変異型イリオモテボタル発光タンパクを示す。
得られた変異型のイリオモテボタル緑色発光タンパクの遺伝子配列を配列番号１０に、アミノ酸配列を配列番号１４に各々示す。また、変異型のイリオモテボタル橙色発光タンパクの遺伝子配列を配列番号１１に、アミノ酸配列を配列番号１５に各々示す。
変異型のイリオモテボタル緑色発光タンパクの遺伝子配列（配列番号１０）と天然型のイリオモテボタル緑色発光タンパクの遺伝子配列（配列番号８）との相同性は７６．０％である（図１７）
2004099421.tif 000012
2004099421.tif 000013
2004099421.tif 000014
【実施例１４】  野生型と変異型の発光タンパク遺伝子（イリオモテボタル由来の橙色および緑色）を３種のプロモータ配列ＳＶ４０の下流に挿入したベクターを作成した（野生型；ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｇｒｅｅｎ），ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｏｒａｎｇｅ）、変異型；ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｇｒｅｅｎ）ｍ，ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｏｒａｎｇｅ）ｍ）。それぞれの遺伝子を培養繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞にリポフェクタミンプラスを用いて導入、２４時間後の細胞内の発光活性を測定した。発光活性の測定には基質として発光基質混合溶液（東洋ビーネット社製）を、発光測定装置はベルトールド製ＬＢ９５０６を用いた。サンプルは細胞抽出液５０μＬにピッカジーン５０μＬを加えた。その結果、野生型ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｇｒｅｅｎ），ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｏｒａｎｇｅ）ではそれぞれ１Ｘ１０６、４Ｘ１０５ＲＬＵ前後であるが、ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｇｒｅｅｎ）ｍ、ＳＶ４０−ＲｏＬ（Ｏｒａｎｇｅ）ｍにおいて５ｘ１０８、８ｘ１０７ＲＬＵの値を示した。図１８において野生型と変異型を比較すると、野生型を１として場合と、緑色発光タンパクではおよそ活性値として約４４倍、橙色では約５７倍に増加した。これらの結果、変異体は哺乳類遺伝子発現解析用レポータ遺伝子として有用であることが明らかとなった。
【実施例１５】  哺乳類内の３つの遺伝子転写活性を同時に、且つ一つの発光基質で測定する方法の概略を図１９に示す。鉄道虫由来赤色、イリオモテボタル緑、橙色発光タンパク遺伝子上流にプロモータ配列を挿入した３つの遺伝子ベクターを培養細胞等に共発現させる。細胞処理後、一定時間経過した共発現細胞を破砕し細胞抽出物の鉄道虫由来赤色、イリオモテボタル緑、橙色発光タンパクの発光活性をカラーフィルターで分離することで３つの転写活性を測定する。そこで、哺乳類細胞内で個々に発現した鉄道虫由来赤色、イリオモテボタル緑色、橙色発光タンパクについて遺伝子を導入した細胞の抽出液１５μＬにピッカジーン１５μＬを加え、アトー（株）製微弱発光スペクトル測定装置を用いて発光スペクトルを測定した（図２０）。発光スペクトルを検討した結果、緑色と橙色発光を分割するためにＨｏｙａ社製カラーフィルターＯ−５４型を選択、また橙色と赤色発光を分割するためにＨｏｙａ社製カラーフィルターＲ−６０型を選択することで色分割が可能であることを確認した。測定手順は、１）フィルターなしで発光量を測定する（赤色、橙、緑色発光タンパクの発光活性）。２）カラーフィルターＯ−５４型で決定したフィルターをルミノメータに挿入、発光量を測定、緑色発光タンパクの発光活性とする。３）カラーフィルターＲ−６０型で決定したフィルターをルミノメータに挿入、発光量を測定、緑及び橙色発光タンパクの発光活性とする。４）フィルターの透過率を換算することで赤色の発光活性を算出、さらに３色の発光タンパクの活性を補正する。このように、赤色、緑、橙色発光タンパクの発光量、存在量を評価することができる。
【実施例１６】  実施例１５で決めた手順で存在比の異なる赤色、橙、緑色発光タンパクのうち２つの異なる組成の酵素を定量できるかをモデル実験で検証した。図２１（Ａ）は赤色、緑色発光タンパクについて、（Ｂ）は緑色、橙色発光タンパクについて、そして（Ｃ）は橙色、赤色発光タンパクについて、それぞれ存在比を変えたサンプルについて１）全発光量の測定、２）設定したフィルターを用いて測定、換算し、発光活性を求めた。その結果、それぞれの存在比に対して直線関係で変化することが明らかとなった。これは、細胞内で異なる発現量を示した赤色、橙色及び緑色発光タンパク量を、カラーフィルターを挿入したルミノメータで定量化できることを示唆している。
【実施例１７】  実施例１５で決めた手順で存在比の異なる赤色、橙、緑色発光タンパクのうち１つの発光色酵素量を一定として、２つの異なる組成の酵素を定量できるかをモデル実験で検証した。図２２（Ａ）は赤色発光タンパクを一定として、橙色、緑色発光タンパクについて、（Ｂ）は橙色発光タンパクを一定として、緑色、赤色発光タンパクについて、そして（Ｃ）は緑色発光タンパクを一定として、橙色、赤色発光タンパクについて、それぞれ存在比を変えたサンプルについて１）全発光量の測定、２）設定したフィルターを用いて測定、換算し、発光活性を求めた。その結果、それぞれの存在比に対して直線関係で変化することが明らかとなった。これは、細胞内で異なる発現量を示した赤色、橙色及び緑色発光タンパク量を、カラーフィルターを挿入したルミノメータで定量化できることを示唆している。よって、一つの基質であっても、３つの発光色をもつ発光タンパクの定量は可能であり、３つの遺伝子の転写活性量が測定できることが明らかとなった。
2004099421.tif 000015
緑色は薬剤の効果を感知する。よって、Ａ１カラムの薬剤は疾患に効果があるが、致死的に働く、Ａ２カラムの薬剤はＡ１に比べてほぼ同様な効果があり、且つＡ１に比べて安全であると評価できる。
2004099421.tif 000016
には、プロモーター配列ライブラリーから得られた未知機能のプロモーターの活性をレポートする、偽プロモーター配列を青色発光タンパクに挿入、非特異的な効果を評価する。プロモーターターゲットが定まらない薬剤のターゲット部位をスクリーニングする。よって、ある薬剤に対してＡ１カラムの選択プロモーターでは一見効果があるが、青色で判断すると非特異的な可能性がある、Ａ２カラムではＡ１と同様な効果があり、且つ青色で判断する限り非特異的ではない。
2004099421.tif 000017
くか、或いは何時投与することが重要であるかを評価できる。青色発光タンパクは人の体内時計の日周を現すプロモーターで最大値は昼間１２時に対応、緑色発光タンパクは薬剤の一過的な影響を、赤色発光タンパクは薬剤が最終的に働くプロモーター領域を想定する。青色の朝６時に薬剤を投与すると、そのショックで１時間後に薬剤に対する影響を示す緑色が一過的に立ち上がるが、その影響は数時間で消え、お昼ぐらいから薬剤の効果が緩やかに立ち上がることがわかる。この結果から、投与時間の設計、薬剤の影響と効果を適切なものにする創薬が可能となる。
【配列表】
2004099421.tif 000018
2004099421.tif 000019
2004099421.tif 000020
2004099421.tif 000021
2004099421.tif 000022
2004099421.tif 000023
2004099421.tif 000024
2004099421.tif 000025
2004099421.tif 000026
2004099421.tif 000027
2004099421.tif 000028
2004099421.tif 000029
2004099421.tif 000030
2004099421.tif 000031
2004099421.tif 000032
2004099421.tif 000033
2004099421.tif 000034
2004099421.tif 000035
2004099421.tif 000036
2004099421.tif 000037
2004099421.tif 000038
2004099421.tif 000039
2004099421.tif 000040
2004099421.tif 000041
2004099421.tif 000042
2004099421.tif 000043
2004099421.tif 000044
2004099421.tif 000045
2004099421.tif 000046
2004099421.tif 000047
2004099421.tif 000048
2004099421.tif 000049
2004099421.tif 000050
2004099421.tif 000051
2004099421.tif 000052
2004099421.tif 000053
2004099421.tif 000054
2004099421.tif 000055
2004099421.tif 000056
2004099421.tif 000057
2004099421.tif 000058
【図１】
2004099421.tif 000059
【図２】
2004099421.tif 000060
【図３】
2004099421.tif 000061
【図４】
2004099421.tif 000062
【図５】
2004099421.tif 000063
【図６】
2004099421.tif 000064
【図７】
2004099421.tif 000065
【図８】
2004099421.tif 000066
【図９】
2004099421.tif 000067
【図１０】
2004099421.tif 000068
【図１１】
2004099421.tif 000069
【図１２】
2004099421.tif 000070
【図１３】
2004099421.tif 000071
【図１４】
2004099421.tif 000072
【図１５】
2004099421.tif 000073
【図１６】
2004099421.tif 000074
【図１７】
2004099421.tif 000075
【図１８】
2004099421.tif 000076
【図１９】
2004099421.tif 000077
【図２０】
2004099421.tif 000078
【図２１】
2004099421.tif 000079
【図２２】
2004099421.tif 000080
【国際調査報告】
2004099421.tif 000081
2004099421.tif 000082
2004099421.tif 000083
2004099421.tif 000084
2004099421.tif 000085
2004099421.tif 000086
2004099421.tif 000087