(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応による細菌菌体の凝集を光を照射して光学的に測定することを含む細菌の血清型を判別する方法であって、
(i)  細菌を加熱処理により不活化し、
(ii)  細菌の遠心分離-再浮遊操作を行うことなく、不活化した細菌菌体と血清型別用の抗血清又は抗体を水溶媒中で混ぜて、細菌菌体と抗血清又は抗体の反応開始時の凝集を光学的に測定し、
(iii)  さらに反応開始後の凝集を光学的に測定し、
(iv)  反応開始後の測定値と反応開始時の測定値の差を計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定することを含む、
対照試験を必要としない、細菌の血清型を判別する方法。
【請求項２】
細菌菌体と複数の細菌型別用の単味血清から構成される混合血清を混ぜ、凝集を光学的に測定し、凝集した場合に、該細菌菌体と前記混合血清を構成するそれぞれの単味血清を混ぜ、凝集を光学的に測定することを含む、請求項１記載の細菌の血清型を判別する方法。
【請求項３】
照射する光の波長が200〜900nmである請求項１又は２に記載の細菌の血清型を判別する方法。
【請求項４】
生化学検査用自動分析装置を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の細菌の血清型を判別する方法。
【請求項５】
細菌が病原大腸菌である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌の血清型を判別する方法。
【請求項６】
細菌が病原大腸菌であり、混合血清として以下の混合１〜９の血清型の抗原に反応する抗体を含む混合血清を用い、単味血清として混合１〜９の混合血清に含まれる各抗体を含む単味血清を用いる、請求項２記載の細菌の血清型を判別する方法：
混合１  Ｏ1、Ｏ26、Ｏ86a、Ｏ111、Ｏ119、Ｏ127a、Ｏ128；
混合２  Ｏ44、Ｏ55、Ｏ125、Ｏ126、Ｏ146、Ｏ166；
混合３  Ｏ18、Ｏ114、Ｏ142、Ｏ151、Ｏ157、Ｏ158；
混合４  Ｏ6、Ｏ27、Ｏ78、Ｏ148、Ｏ159、Ｏ168；
混合５  Ｏ20、Ｏ25、Ｏ63、Ｏ153、Ｏ167；
混合６  Ｏ8、Ｏ15、Ｏ115、Ｏ169；
混合７  Ｏ28ac、Ｏ112ac、Ｏ124、Ｏ136、Ｏ144；
混合８  Ｏ29、Ｏ143、Ｏ152、Ｏ164；及び
混合９  Ｏ74、Ｏ91、Ｏ103、Ｏ121、Ｏ145、Ｏ161、Ｏ165。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫凝集法による細菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒は、食品、添加物、器具、又は容器包装等に含まれた、又は付着した微生物、化学物質、自然毒等を摂取することによって起きる衛生上の危害（飲食に起因する危害）とされる。【０００３】
細菌が病因物質である食中毒の場合は、患者便、吐物、原因食品から病原体を分離し、分離菌について生化学的性状、血清型別を調べるとともに毒素産生性などの試験を実施し菌を特定している。【０００４】
最近の検査技術の進歩により、病因物質の判明率が向上し病原大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ菌、ブドウ球菌等の細菌による件数が圧倒的に多いことがわかってきており、食中毒対策のいっそうの強化を図る必要があるとされている。【０００５】
例えば、大腸菌は、人の腸管内正常細菌叢に含まれる腸内細菌科に属するグラム陰性桿菌で菌体抗原（Ｏ群：Ｏ１〜Ｏ173）及び鞭毛抗原（Ｈ型：Ｈ１〜Ｈ56）の組み合わせによって血清学的型（血清型）が決められる。【０００６】
大腸菌のうち下痢、急性胃腸炎又は大腸炎等の腸管感染症の原因菌となるものは病原大腸菌と呼ばれている。病原大腸菌は、その病原性機構の違いによって腸管病原性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌、腸管出血性大腸菌の４つに大きく分類されている。（財）日本公衆衛生協会：微生物検査必携  細菌・真菌検査  第３版によれば、病原大腸菌の確定には病原性の証明が必要であるが、それぞれの病原大腸菌は特定の血清型を示す場合が多いことから、診断用抗血清を使用して血清型別試験で血清型を判定することにより病原大腸菌の分類を同定する方法が用いられている。【０００７】
病原大腸菌の血清型別にはＯ群及びＨ型の抗血清が用いられる。Ｏ群抗血清は、大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫原として健康ウサギ、又は健康ブタに免疫して得た血清から類縁反応を吸収除去して調製された抗血清が使用される。また、Ｈ型抗血清は、大腸菌鞭毛を免疫原として健康ウサギに免疫して得た血清から類縁反応を吸収除去して調製された抗血清が使用される。【０００８】
これらの病原大腸菌免疫血清は、スライド凝集法（Ｏ群：50種類）、試験管凝集法（Ｈ型：22種類）用検査試薬として販売（デンカ生研株式会社）されている。また、ラテックス粒子を用いた凝集法による大腸菌の検出方法についても報告されている（特許文献１および２を参照）。【０００９】
例えば、病原大腸菌Ｏ群血清型別スライド凝集法は以下のように行う。【００１０】
患者材料から分離され大腸菌と同定された菌体を生理食塩液に懸濁浮遊し121℃、15分間又は100℃、60分間加熱した後、遠心分離し、上清を捨て、沈殿した菌を生理食塩液に懸濁浮遊し検体とする。検体とＯ群抗血清をスライドグラスや専用の平板上で混ぜ合わせ、同時に菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ合わせたものを対照として、対比して凝集の有無を目視により観察して陰性、陽性を判定する。【００１１】
このように、スライド凝集法は、検体と多くの種類のＯ群抗血清とを一つ一つ試験操作を行わなければならず、また、同時に菌体と生理食塩液を混ぜ合わせたものを対照として同様に操作を行わなければならず、操作が煩雑で多数検体を同時に検査するには多くの人手と時間を要するという問題を有している。【００１２】
また、実際に検体として得られる大腸菌は必ずしも単一の抗血清に反応するものだけではなく、複数の抗血清に対して凝集する場合もある。その場合は比較的遅れて出現する凝集や微弱な凝集を陰性と判定したり、定量凝集反応法による凝集価比較で判定するが、それには手間と習熟を要した。
【非特許文献１】（財）日本公衆衛生協会：微生物検査必携  細菌・真菌検査  第３版
【特許文献１】特開2002-119297号公報
【特許文献２】特開2003-284588号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、対照試験操作を必要とせず、簡便で迅速、正確且つ判定しやすい免疫凝集法による細菌の検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従来法においては、患者便、吐物、原因食品から病原体を分離し、分離菌について生化学的性状、血清型別を調べるとともに毒素産生性などの試験を実施し菌を特定していた。生化学的性状や毒素産生性等の試験は時間もコストもかかっていた。また、血清型別は、分離した菌体と血清型別用の抗血清（抗体液）をスライドグラスなどの平板上で混ぜ合わせ、同時に対照試験として菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ合わせたものとを対比して凝集の有無を目視により観察して陰性、陽性を判定する方法であるが、対照試験が必ず必要であり、多数検体を検査するには多くの人手と時間を要するという問題を有している。【００１５】
抗ベロ毒素抗体感作ラテックス粒子と大腸菌の凝集反応をラテックス凝集全自動測定器で測定するアイディア自体はあったが（特開2003-284588公報）、この方法では細菌の血清型を判別することは不可能である。また、細菌の血清型を判別するための方法として、各血清型別の抗体を準備し、それら抗体を感作したラテックス粒子を用い、大腸菌との凝集反応をラテックス凝集全自動測定器で測定する方法も考えられる。しかし、血清型は細菌の種類にもよるが、例えば大腸菌ではＯ群に173血清型、Ｈ群に56血清型存在し、全ての型に対して感作ラテックスを準備するのは多くの手間を必要とする。【００１６】
従来の血清型別用の抗血清を用いる方法においては、患者材料から分離された菌体を凝集素として用いていた。しかし、病原細菌は種々の形をしており、大きさもまちまちで、菌体を生理食塩液に浮遊させたとき菌体同士の自己凝集も起こり易い性質があるため、対照試験の菌体と生理食塩液を平板上で混ぜ合わせた場合においてさえ凝集が観察される。そのため、陰性、陽性の判定には格段の注意が要求されていた。【００１７】
このような背景のもとで、より簡便、迅速な測定方法が求められていた。【００１８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、菌体と抗体が抗原抗体反応することにより生ずる凝集（免疫凝集）反応を光学的な変化量として捉えることにより、従来から実施されているスライド凝集法では絶対に必要であった対照試験を省き、より簡便・迅速に多数検体を検査することができることを見出し、本発明法を完成させた。【００１９】
すなわち本発明の方法は、菌体（抗原）と抗体を反応させた際に任意の波長の光を照射し、抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体の凝集によって起こる吸光度変化を測定することにより、菌体（抗原）と抗体との反応性を測定する免疫凝集測定方法である。【００２０】
より具体的には本発明の方法は、菌体（抗原）を生理食塩液又は、緩衝液中に一定濃度に懸濁させた後、抗体を例えばプラスチックやガラス製のセル内で混合し反応させると、特異的な抗原抗体反応が起こった場合は抗原抗体複合体が生じ菌体は凝集するのでセル外部より200〜900nmの波長から選ばれる適当な波長の光を照射し、その吸光度変化を測定することにより、セル中の菌体（抗原）と抗体との反応性を測定する免疫凝集測定方法である。【００２１】
また、本発明の方法は、菌体（菌体抗原）を生理食塩液又は、緩衝液中に一定濃度に懸濁させた後にセル外部より200〜900nmの波長から選ばれる任意の波長の光を照射して吸光度を測定し、その後に菌体と抗血清を例えばプラスチックやガラス製のセル内で混合した後、反応させると、特異的な抗原抗体反応が起こった場合は抗原抗体複合体が生じ菌体は凝集するのでセル外部より200〜900nmの波長から選ばれる適当な波長の光を照射し、その吸光度変化を測定することにより、セル中の菌体（抗原）と抗体との反応性を測定する免疫凝集測定方法である。【００２２】
すなわち、スライド凝集法では必要であった対照試験が省け、簡便・迅速に多数の検体を検査することができる免疫凝集測定方法を提供する。【００２３】
本発明の態様は、以下の通りである。【００２４】
[１]  細菌の菌体とそれに対する抗体を水溶媒中で混ぜて抗原抗体反応による菌体の凝集を光を照射して光学的に測定することを含む免疫凝集測定法。【００２５】
[２]  細菌菌体と抗体の反応開始時の凝集を光学的に測定し、さらに反応開始後の凝集を光学的に測定し、反応開始後の測定値と反応開始時の測定値の差を計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定する、対照試験を必要としない、[１]の免疫凝集測定法。【００２６】
[３]  細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応による複数の凝集を光学的に測定し、得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定する[１]の免疫凝集測定法。【００２７】
[４]  照射する光の波長が200〜900nmである[１]〜[３]のいずれかの方法。【００２８】
[５]  生化学検査用自動分析装置を用いる[１]〜[４]のいずれかの方法。【００２９】
[６]  細菌が病原大腸菌である[１]〜[５]のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００３０】
従来法においては、凝集の程度を目視により判断しており、測定に習熟を要しており、必ずしも正確に測定できなかった。本発明により、対照試験の操作が必要なく、従来法よりも簡便、迅速、正確且つ判定しやすい検査を可能とする免疫凝集測定方法が確立された。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-348033号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】病原大腸菌Ｏ１を希釈して用いた場合の病原大腸菌Ｏ１と各混合血清（混合１〜９）の反応を示す図である。
【図２】病原大腸菌Ｏ１を希釈して用いた場合の病原大腸菌Ｏ１と単味抗血清の反応を示す図である。
【図３】病原大腸菌Ｏ１を希釈せずに用いた場合の病原大腸菌Ｏ1と混合血清の反応を示す図である。
【図４】病原大腸菌Ｏ１を希釈せずに用いた場合の病原大腸菌Ｏ１と単味血清の反応を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の方法において用いられる抗血清（抗体）は、検査しようとする菌体（抗原）と抗原抗体反応する抗体（以下、「特異抗体」と呼ぶ）を含むものである。ここで、特異抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体は公知の方法で作製することができる。例えば、ポリクローナル抗体はウサギ、ブタ、ヤギ等を免疫することにより作製し得る。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975）等の公知の方法により作製し得る。この際、検査しようとする菌体をそのまま免疫原として用いてもよいし、菌体に特異的な抗原を精製し免疫原として用いてもよい。【００３４】
本発明の方法により測定することができる細菌（抗原）は何ら限定されるものではなく、それに対応する抗体を作製することができるあらゆる細菌が本発明の方法により測定可能である。例えば、腸管感染症の原因菌となる病原大腸菌、急性胃腸炎を起こす腸炎ビブリオのような病原体等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。【００３５】
また、検体（菌体の懸濁液）は、患者の下痢便、患者の吐物、飲食物から分離培養した菌体（菌体抗原）を生理食塩液又は緩衝液中に一定濃度に懸濁させた状態で用いられる。【００３６】
この際、菌体抗原は生菌の状態で使用することができる。また、菌体抗原と特異抗体との抗原抗体反応をより効率よく反応させる目的、またはバイオハザードの安全性の面から菌体を不活化する目的で、菌体を加熱、ホルマリン・アルコール等の薬剤、及び酵素などにより予め処理してもよい。【００３７】
この菌体を含む抗原液を光学的に測定可能な範囲に濃度を調節して特異抗体を加えた後、これをセル内に例えば５〜100μL取り、緩衝液50〜500μLと混合し、セル外部より200〜900nmの波長から選ばれる任意の波長の光を照射して吸光度及び吸光度変化を測定する。この方法により、抗原抗体反応が開始する前の抗原抗体反応に基づかない自己凝集の影響を予め把握することが出来る。任意の波長とは、菌体（抗原）の抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体の凝集反応を捉えることができる最適な波長であれば、いずれの波長でも構わない。また、単一の波長で測定してもよいし、主波長と副波長の２波長で測定して、主波長と副波長の差を測定してもよい。【００３８】
従来のスライド凝集法においては、経時的に非特異的に自己凝集する傾向があるため、血清の代わりに緩衝液等を添加した対照試験を設ける必要があった。しかしながら、本発明の方法は、自己凝集の程度を抗原抗体反応に先立って確認するので対照試験を設ける必要がない。また、菌体抗原と抗体の抗原抗体反応に基づく凝集の程度を光学的に測定し比較するため、対照試験を設ける必要がない。【００３９】
また、従来のスライド凝集法においては、実際に検体として得られる大腸菌は必ずしも単一の抗血清に反応するものだけではなく、複数の抗血清に対して凝集する場合もある。その場合は比較的遅れて出現する凝集や微弱な凝集を陰性と判定したり、定量凝集反応法による凝集価比較で判定するが、それには手間と習熟を要した。しかしながら、本発明の方法は、細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応の凝集を光学的に測定し、得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定するため、対照試験を設ける必要がない。ここで言う、細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応の凝集を光学的に測定するとは、検体中の細菌菌体を複数の抗血清に反応させてその凝集を光学的に測定することである。従来のスライド凝集法においても複数の抗血清と反応させてその凝集を観察していたが、それは対照試験との比較観察を必要とし、また、目視によってのみ行っていただけであり、抗血清間の反応の違いを厳密に観察することは無かった。従来の方法は手技操作と目視による観察で行われるため、同時に行える試験数も限られていた。従って、抗血清間の反応の違いを観察することは実質的に不可能であった。本発明の方法では、自動分析装置を用いて検体中の細菌菌体を複数の抗血清に反応させてその凝集を光学的に測定し、その測定結果を比較することで対照試験を設けなくてもどの抗血清に対して陽性反応を示したかを判定することができる。得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定するとは、得られた複数の測定値の最大値を求める計算や、得られた複数の測定値の差を求め有意差のあるグループに分けるための計算を含み、その計算に基づいて凝集の程度を判定することを言う。判定の方法として例えば、最大値となったものは陽性と判定する方法、測定値が有意差のあるグループに分けられた場合はその測定値の大きいグループを陽性と判定する方法、測定値が有意差のあるグループに分けられた場合においてその測定値の大きいグループの員数が多い場合は判定を保留する方法、測定値が有意差のあるグループに分けられない場合は全て陰性とする方法などがある。これらの判定方法は試料と免疫血清の特性を考慮し、適宜選択して適用することが可能である。【００４０】
免疫凝集測定は、検体（菌体の懸濁液）、緩衝液、抗血清をセル内で混ぜ、抗原抗体反応による凝集を光学的に測定することにより行うことができる。例えば、検体５〜100μL、緩衝液50〜500μLおよび免疫血清を５〜100μL混合すればよい。光学的な測定は、例えば、プラスチックやガラス製のセル内で抗血清と検体を混合すると、検出しようとする菌体抗原物質を持つ菌体は、特異抗体と抗原抗体反応により凝集するので、このときセル外部より200〜900nmの波長から選ばれる適当な波長の光を照射して吸光度変化を測定し、凝集の程度を測定することにより菌の血清型別を行うことができる。凝集反応は、生理食塩液、任意のpHの適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の溶液中で行わせればよい。この際、特異抗体と菌体との非特異的結合を抑制するために、TritonX-100、Tween20、Tween80等の適当な界面活性剤を添加してもよい。【００４１】
吸光度変化は、例えば、抗原抗体反応開始から600秒間の吸光度の変化を測定することにより測定することができる。もっとも、測定時間はこれに限定されるものではなく、反応開始後から任意の時間における吸光度及び吸光度の変化を求めることにより測定することができる。また、検体に対して生理食塩水や緩衝液をセル内で混ぜ、吸光度を測定し、自己凝集の有無を確認することで、誤って陽性と判定しないための指標として用いることができる。【００４２】
時間単位で得られた測定値は例えばレート分析法やエンド分析法など、その目的や測定値によって好みの分析方法で分析して、抗原抗体反応を判定することが出来る。【００４３】
陽性、陰性の判定方法としては、吸光度の値に対して一定の閾値を設け、一定時間後の吸光度測定値がその閾値より上か下かで判定する方法や、１つの検体に対して複数の免疫血清に対する反応を見る場合はこれら試験工程を同期して行い、各試験より得られる吸光度の測定値の差を求め、予め設定した値以上に乖離したことをもって判定する方法などが挙げられる。後者の方法においては、測定値乖離をもって試験終了とすることができるため試験時間を短縮、短時間で判定することができる。【００４４】
これらの測定工程を連続して行う機器としては、医療関係の検査施設で生化学検査に広く使用されている生化学検査用自動分析装置が好ましく用いることができる。例えば、東芝社のTBA-120FR及びTBA-200FR 分析装置等、三菱化学社のLPIA-S500ラテックス凝集全自動測定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システムズ社のCOBAS FARA装置及びCOBAS MIRA装置、及び日立製作所の日立7070分析装置等を用いて行うことができる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。【００４６】
[実施例１]
病原大腸菌Ｏ群免疫血清を用い試験を行った。【００４７】
免疫血清の調製
免疫血清は、デンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」のＯ群血清（１号セット）と同じ構成となるよう準備した（表１）。
【表１】
0005142725.tif 000002
【００４８】
混合血清９種、および単味血清50種を作成した。【００４９】
混合血清１から９は、その右に列記される血清型の抗原に反応する抗体を含み、単味血清はそれぞれの血清型の抗原に反応する抗体を含む。検体試料と混合血清を反応させ凝集反応を生じた場合、当該検体試料中に当該混合血清の構成単味血清いずれかと反応する抗原が含まれていると推定することができる。また、検体試料と単味血清を反応させ凝集反応を生じた場合、当該検体試料中に当該単味血清と反応する抗原が含まれていると推定することができる。【００５０】
病原大腸菌Ｏ群免疫血清を以下の手順で調製した。【００５１】
混合血清および単味血清いずれも大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫原とした。【００５２】
混合血清は当該混合血清を構成する血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ブタに免疫して得た血清を56℃30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。【００５３】
単味血清は当該単味血清の血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ウサギに免疫して得た血清を56℃30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。【００５４】
従来の病原大腸菌免疫血清「生研」による大腸菌の血清学的型別の判定方法はスライド凝集法であり、その操作方法の詳細は添付文書に記載があるが、概略は以下の通りである。【００５５】
（１）検体となる大腸菌を寒天培地で好気的条件下、37℃で一夜（18〜24時間）培養する。【００５６】
（２）マッチ棒の頭３〜５倍程度の菌体を掻き取り、３mLの生理食塩水に浮遊した後、１21℃、15分間、又は100℃、60分間加熱処理をする。【００５７】
（３）900×ｇ、20分間遠心分離し、上清を捨て、沈渣に0.5mLの生理食塩水を加え均一に浮遊して抗原液とする。【００５８】
（４）ガラス鉛筆でスライドグラスを数区画に分け、区画毎に各混合血清１〜９と対照として生理食塩水を滴下する。【００５９】
（５）抗原液の１白金耳を各混合血清30μL又は生理食塩水30μLとよく混和する。【００６０】
（６）スライドを前後に傾斜させながら凝集の有無を観察する。【００６１】
（７）混合血清で陽性と判定された場合、その混合血清を構成する単味血清を用いて（例えば混合血清１に陽性と判定された場合、Ｏ１、Ｏ26、Ｏ86a、Ｏ111、Ｏ119、Ｏ127a、Ｏ128の各単味血清を用いて）同様に試験する。【００６２】
実施例１においては生化学検査用自動分析装置を用いて、菌体と血清との凝集反応を光学的に測定し、反応開始後の測定値から、反応開始時の測定値の差を計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定できるか試験した。【００６３】
検体の調製
市販の病原性大腸菌免疫血清「生研」で血清型がＯ１と同定された病原大腸菌Ｏ１（混合１の血清のみと反応）をスライド凝集法と同様に検体を調製した。【００６４】
測定
生化学検査用自動分析装置日立7070（日立社製）を用いて次のように測定（自動分析法）を行った。検体50μLに対し生理食塩水80μLを加えその後に混合免疫血清120μLを加え、反応開始（混合免疫血清添加後）前（-60秒）から約650秒後における吸光度を時系列に波長750nmで測定する設定とした。結果を図１に示す。図１は、本発明法での検体（Ｏ１）と各種混合免疫血清との反応による吸光度変化を示し、比較した図である。【００６５】
図１に示すように、検体に生理食塩水加えてから抗血清を加えるまでの-60秒〜０秒の間においても吸光度を測定する。ここで吸光度が上昇する場合はサンプルの自己凝集が考えられるので、誤って陽性と判定しないための指標として用いることができる。本試験結果においては吸光度は上昇しておらず、自己凝集は起こしていないと考えられる。【００６６】
また、混合免疫血清添加後の０秒以降においては、混合血清を加えることで全体の液量が増えることから菌濃度が実質希釈され、一旦、吸光度が低下する。その後、病原大腸菌Ｏ１は混合１〜９の血清の中で混合１に対して著しい吸光度の上昇を示し、また他の血清に対しては殆ど吸光度の変化を示さないことから、菌体と血清の抗原抗体反応を光学的な変化量として捉えることができた。【００６７】
また、陰性の血清と対照である生理食塩水を比較した場合、生理食塩水の反応は陰性反応と同様に吸光度に変化がなく、陽性の血清と陰性の血清及び生理食塩水との間の測定値の差が明確であることから、対照試験として生理食塩水を特に必要としないことも明らかとなった。【００６８】
次に混合１に対して陽性であったことから混合１を構成する単味血清Ｏ１、Ｏ26、Ｏ86a、Ｏ111、Ｏ119、Ｏ127a、Ｏ128の各単味血清を用いて同様に試験した。結果を図２に示す。図２も図１と同様に検体に生理食塩水加えてから抗血清を加えるまでの-60秒〜０秒の間においては吸光度は上昇しておらず、自己凝集は起こしていないと考えられる。【００６９】
また、血清添加後の０秒以降においては、混合血清を加えることで全体の液量が増えることから菌濃度が実質希釈され、一旦、吸光度が低下した後、病原大腸菌Ｏ１は各単味血清の中でＯ１に対して著しい吸光度の上昇を示し、また他の血清に対しては殆ど吸光度の変化を示さないことから、菌体と血清の抗原抗体反応を光学的な変化量として捉えることにより大腸菌の血清学的型別の判定ができることが明らかとなった。【００７０】
また、陰性の血清と対照である生理食塩水を比較した場合、生理食塩水の反応は陰性反応と同様に吸光度に変化がなく、陽性の血清と陰性の血清及び生理食塩水との間の測定値の差が明確であることから、対照試験として生理食塩水を特に必要としないことも明らかとなった。【００７１】
[実施例２]
病原大腸菌Ｏ群免疫血清を用い試験を行った。【００７２】
本実施例においては生化学検査用自動分析装置を用いて、細菌菌体と複数の抗体による抗原抗体反応による複数の凝集を光学的に測定し、得られた複数の測定値を比較計算し、該計算値に基づいて凝集の程度を判定できるか試験を行った。【００７３】
免疫血清の調製
免疫血清は、デンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」のＯ群血清（１号セット）と同じ構成となるよう準備した。【００７４】
病原大腸菌Ｏ群免疫血清を以下の手順で調製した。【００７５】
混合血清および単味血清いずれも大腸菌血清型参照株のホルマリン死菌を免疫原とした。【００７６】
混合血清は当該混合血清を構成する血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ブタに免疫して得た血清を56℃30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。【００７７】
単味血清は当該単味血清の血清型のホルマリン死菌を免疫原として健康ウサギに免疫して得た血清を56℃30分間加熱処理した後、類縁凝集素を吸収除去し無菌ろ過した後、リン酸緩衝液で希釈し力価を調整した。【００７８】
検体の調製
実施例１と同様の方法にて行った。【００７９】
測定
生化学検査用自動分析装置日立7070（日立社製）を用いて次のように測定（自動分析法）を行った。検体50μLに対し混合免疫血清200μLを加え、反応開始（混合免疫血清添加後）直後（０秒）から約650秒後における吸光度を時系列に波長750nmで測定する設定とした。結果を図３に示す。図３は、本発明法での検体（Ｏ１）と各種混合免疫血清との反応による吸光度変化を示し、比較した図である。【００８０】
混合１の吸光度が他の混合免疫血清に比べて上昇しており、陽性と判定することができる。【００８１】
次に混合１に対して陽性であったことから混合１を構成する単味血清Ｏ１、Ｏ26、Ｏ86a、Ｏ111、Ｏ119、Ｏ127a、Ｏ128の各単味血清を用いて同様に試験した。結果を図４に示す。【００８２】
Ｏ１の吸光度が他の単味血清に比べて上昇しており、陽性と判定することができる。【００８３】
[実施例３]
次に本発明方法と従来技術であるスライド凝集法との特異性を比較した。【００８４】
免疫血清の調製
実施例１と同じ免疫血清を使用した。【００８５】
検体の調製
予め血清型が同定されている大腸菌50株を使用した。菌株の内訳は以下の通りである。【００８６】
混合１陽性７株  Ｏ1  Ｏ26  Ｏ86a  Ｏ111  Ｏ119  Ｏ127a  Ｏ128
混合２陽性６株  Ｏ44  Ｏ55  Ｏ125  Ｏ126  Ｏ146  Ｏ166
混合３陽性６株  Ｏ18  Ｏ114  Ｏ142  Ｏ151  Ｏ157  Ｏ158
混合４陽性６株  Ｏ6  Ｏ27  Ｏ78  Ｏ148  Ｏ159  Ｏ168
混合５陽性５株  Ｏ20  Ｏ25  Ｏ63  Ｏ153  Ｏ67
混合６陽性４株  Ｏ8  Ｏ15  Ｏ115  Ｏ169
混合７陽性５株  Ｏ28ac  Ｏ112ac  Ｏ124  Ｏ136  Ｏ144
混合８陽性４株  Ｏ29  Ｏ143  Ｏ152  Ｏ164
混合９陽性７株  Ｏ74  Ｏ91  Ｏ103  Ｏ121  Ｏ145  Ｏ161  Ｏ165
以上の菌株を実施例１と同じ方法で検体を調製した。【００８７】
測定
生化学検査用自動分析装置日立7070（日立社製）を用いて次のように測定（自動分析法）を行った。検体50μLに対し生理食塩水80μLを加えた後に混合免疫血清120μLを加え、反応開始（混合免疫血清添加後）直後（０秒）から約650秒後における吸光度を時系列に波長750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（０秒）における測定値をABS0とし、600秒後における測定値をABS600として、ABS600-ABS0=ΔABSの値が100mAbs以上の場合を陽性とし、100mAbs以下を陰性とした。【００８８】
比較試験（スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」混合１、２、３、４、５、６、７、８、９を添付文書の通りに使用して判定した。混合量は上述のスライド凝集法と同じである。【００８９】
比較試験の結果を表２〜表１０に示す。表中、従来法はスライド凝集法である。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００９０】
表２〜表１０に示されるように、本発明方法による成績は、比較した従来のスライド凝集法成績と完全に一致することが分かる。【００９１】
[実施例４]
次に本発明方法と従来技術であるスライド凝集法との判定能力を比較した。【００９２】
免疫血清の調製
実施例１と同じ免疫血清を使用した。【００９３】
検体の調製
大腸菌Ｏ103の変異株を実施例１と同じ方法で検体を調製した。この変異株は単味血清においてはＯ103と判定されるが、混合血清においては複数の混合血清と凝集反応を示す株である。【００９４】
測定
生化学検査用自動分析装置日立7070（日立社製）を用いて次のように測定（自動分析法）を行った。検体50μLに対し生理食塩水80μLを加えた後に混合免疫血清120μLを加え、反応開始（混合免疫血清添加後）直後（０秒）から約650秒後における吸光度を時系列に波長750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（０秒）における測定値をABS0とし、600秒後における測定値をABS600として、ABS600-ABS0=ΔABSの値を求めた。【００９５】
比較試験（スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」混合１、２、３、４、５、６、７、８、９を添付文書の通りに使用して判定した。【００９６】
本発明の方法による測定結果を表１１、比較試験（スライド凝集法）による結果を表１２に示す。表に示す値はΔABSの値である。単位はmAbsとした。
【表１１】
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【００９７】
表１１に示すように、本発明の方法において、混合４と混合９の測定値が高く、その中でも特に、混合９における測定値が他の血清と比較して測定値が高く、強陽性と判定された。
【表１２】
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【００９８】
表１２に示すように、従来法であるスライド凝集法でも、混合４と混合９が陽性と判断された。しかしながら、混合４と混合９のどちらがより強陽性なのか判定ができなかった。【００９９】
大腸菌Ｏ群の型別は50種類の単味血清を全て反応させるのは手間とコストが掛かることから、最初に複数の単味血清で構成されている混合血清で分類してから、単味血清で血清型を同定する。表２および表３に示されるように、従来のスライド凝集法では判定をその凝集像で判定することから、複数の混合血清と凝集を示した場合、複数の混合血清を構成する単味血清全てと反応させなければ血清型を同定できない。しかし、本発明の方法においては凝集を光学的に測定することから、その数値の大きさによって従来のスライド凝集法では判定が難しい検体も容易に判定することができる。【０１００】
[実施例５]
次に検体調製の際に加熱処理後の遠心-再浮遊操作の省略化について、本発明方法と従来技術であるスライド凝集法を比較した。【０１０１】
免疫血清の調製
実施例１と同じ免疫血清を使用した。【０１０２】
検体の調製
市販の病原性大腸菌免疫血清「生研」で血清型がＯ１と同定された、病原大腸菌Ｏ１（混合１の血清のみと反応）を寒天培地で好気的条件下、37℃で一夜培養した。次に得られた生菌を生理食塩水で浮遊した後、浮遊菌液を121℃、30分間加熱処理をし、そのまま検体として用いた。【０１０３】
測定
生化学検査用自動分析装置日立7070（日立社製）を用いて次のように測定（自動分析法）を行った。検体50μLに対し生理食塩水80μLを加えた後に混合免疫血清120μLを加え、反応開始（混合免疫血清添加後）直後（０秒）から約650秒後における吸光度を時系列に波長750nmで測定する設定とした。次に反応開始直後（０秒）における測定値をABS0とし、600秒後における測定値をABS600として、ABS600-ABS0=ΔABSの値を求めた。【０１０４】
比較試験（スライド凝集法）
検体は本発明方法と同じ検体を使用し、判定方法はデンカ生研社製の病原大腸菌免疫血清「生研」混合１、２、３、４、５、６、７、８、９を添付文書の通りに使用して判定した。【０１０５】
本発明による測定結果を表１３、比較試験（スライド凝集法）による結果を表１４に示す。表１３に示す値は、ΔABSの値である。単位はmAbsとした。
【表１３】
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【０１０６】
この結果、混合１の測定値が最も高いことから、混合１に対して陽性と判定された。
【表１４】
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【０１０７】
スライド凝集試験においては全て陰性と判定された。【０１０８】
表１３および表１４に示されるように、従来のスライド凝集法では検体処理の際に遠心−再浮遊操作が必要であるが、本発明方法では省略しても判定することができた。【０１０９】
本発明法は、凝集を光学的に測定し得るので、比較例に比べより簡便、正確且つ判定しやすいことから、優れた方法である。【０１１０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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