(57)【要約】ＦＢＰを抑制するか否かを分析する工程、及び、ＦＢＰ−２を抑制するか否かを分析する工程を含む、スクリーニング方法を開示する。また、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物を開示する。更に、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を投与することからなる、増殖性疾患治療方法を開示する。前記スクリーニング方法は、増殖性疾患治療薬として有用な物質を得るためのスクリーニング系として有用である。前記増殖性疾患治療用医薬組成物及び増殖性疾患治療方法は、新たな作用機序に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＢＰを抑制するか否かを分析する工程、及び、ＦＢＰ−２を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
抑制が発現抑制である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
増殖性疾患が癌である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１に記載の分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。
【請求項６】
ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。
【請求項７】
ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を投与することを含む、増殖性疾患治療方法。
【請求項８】
ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質の、増殖性疾患治療用医薬組成物製造のための使用。
【請求項９】
ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２のＤＮＡ塩基配列のＡＡに続く１９〜２１塩基からなる、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的な塩基配列に基づいて設計されるｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
（１）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１３で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ；
（２）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１４で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ；あるいは
（３）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１５で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載のｓｉＲＮＡを有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、増殖性疾患治療薬のスクリーニング法に関する。
【背景技術】  癌をはじめとする増殖性疾患は、細胞外刺激に対する伝達機構、細胞の基礎的代謝機構、細胞周期進行に直接的に関わる機構、又はアポトーシスなどの細胞死に直接関わる機構を標的としてその治療が試みられてきた。しかし、毒性などの種々の理由から、未だ完治につながる分子標的型治療法は確立していない。
遺伝子発現異常に基づく細胞死調節の脱制御は、増殖性疾患の原因と考えられるが、増殖性疾患の理想的な治療標的分子に関しては同定されていない。遺伝子転写を司る転写因子は一般には二本鎖ＤＮＡを標的とするが、ＫＨ（ｈｎＲＮＰ  Ｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインを有する或るクラスのＤＮＡ結合性タンパク質は、特異的な一本鎖ＤＮＡに結合し、遺伝子転写を活性化することが知られている（非特許文献１）。そのクラスに属するＦＢＰ（ＦＵＳＥ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、細胞増殖及び細胞分化に関わるｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子のプロモーター配列の１５００塩基対上流に位置するフューズ（ＦＵＳＥ，ｆａｒ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の逆向き一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質として単離・同定された（非特許文献２）。アンチセンスを用いてＦＢＰの発現抑制を行なうと、細胞増殖抑制はおきるが、細胞死は誘導されないこと（非特許文献３）、ＦＢＰはフューズに結合する以外に、ＤＮＡへリカーゼ活性を有するＴＦＩＩＨ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＩＨ）と結合しうること（非特許文献４）、ＦＢＰの発現抑制が腫瘍細胞成長を阻むこと（特許文献１〜３）、分化によりＦＢＰのｍＲＮＡは減少すること（非特許文献２）が知られている。また、ＫＨドメインを含む構造的特徴及びアミノ酸配列に関して、ＦＢＰとの類似性が高いタンパク質として、ＦＢＰ−２及びＦＢＰ−３が知られており、分化誘導によりＦＢＰの発現が止まるが、ＦＢＰ−２の発現抑制は不完全であり、ＦＢＰ−３は分化誘導による発現抑制されない（非特許文献５）。しかし、これら３種のＦＢＰタンパク質の本質的な細胞内機能は不明であり、細胞死調節への関与は知られていない。
（非特許文献１）  「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，（アメリカ），１９９６年，第９５巻，ｐ．５８３０−５８３５
（非特許文献２）  「ジーンズ・アンド・ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」，（アメリカ），１９９４年，第８巻，ｐ．４６５−４８０
（非特許文献３）  「ザ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」，（ドイツ），２０００年，第１９巻，ｐ．１０３４−１０４４
（非特許文献４）  「モレキュラー・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ）」，（アメリカ），２０００年，第５巻，ｐ．３３１−３４１
（非特許文献５）  「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（アメリカ），１９９６年，第２７１巻，ｐ．３１６７９−３１６８７
（特許文献１）  国際公開ＷＯ９４１９４６５号パンフレット
（特許文献２）  米国特許第ＵＳ  ５７３４０１６号明細書
（特許文献３）  米国特許第ＵＳ  ５５８０７６０号明細書
【発明の開示】
本発明の課題は、癌をはじめとする増殖性疾患の治療薬を得るための新たな標的分子を見出し、増殖性疾患治療薬として有用な物質を得るための新たなスクリーニング系及び新たな作用機序に基づく増殖性疾患治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明者は、鋭意研究を行なった結果、癌細胞において、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、及びＦＢＰ−３の内、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、若しくはＦＢＰ−３の単独発現抑制、又はＦＢＰ及びＦＢＰ−３、若しくはＦＢＰ−２及びＦＢＰ−３の同時発現抑制を行なっても細胞死が誘導されないが、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の同時発現抑制を行なうと細胞死が誘導されることを見出した。増殖性疾患では病巣における異常な細胞増殖を抑制することが治療標的と考えられる為、前記知見に基づき、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を選択することにより新たな増殖性疾患治療薬スクリーニング、並びにＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質を投与することにより新たな増殖性疾患治療が可能になることを明らかにし、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
［１］ＦＢＰを抑制するか否かを分析する工程、及び、ＦＢＰ−２を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法；
［２］抑制が発現抑制である、［１］に記載のスクリーニング方法；
［３］増殖性疾患が癌である、［１］又は［２］に記載のスクリーニング方法；
［４］［１］に記載の分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法；
［５］［１］に記載のスクリーニング方法で得ることができる物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物；
［６］ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又はＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物；
［７］ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を投与することを含む、増殖性疾患治療方法；
［８］ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質の、増殖性疾患治療用医薬組成物製造のための使用；
［９］ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２のＤＮＡ塩基配列のＡＡに続く１９〜２１塩基からなる、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的な塩基配列に基づいて設計されるｓｉＲＮＡ；
［１０］（１）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１３で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ；
（２）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１４で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ；あるいは
（３）二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１５で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列からなるｓｉＲＮＡ；並びに［１１］［９］又は［１０］に記載のｓｉＲＮＡを有効成分とする、増殖性疾患治療用医薬組成物
に関する。
「増殖性疾患」とは、病巣における細胞の異常増殖に基づく疾患であり、例えば、種々組織に病巣を有する癌、関節部位に病巣を有するリウマチ、腎臓メサンギウム細胞の病巣を有する腎疾患、前立腺間質に病巣を有する前立腺肥大症、あるいは、血管に病巣を有する動脈硬化などが挙げられる。
本発明の「増殖性疾患治療用医薬組成物」若しくは「増殖性疾患治療方法」としては、「癌治療用医薬組成物」若しくは「癌治療方法」が好ましい。「ＦＢＰを抑制する物質」又は「ＦＢＰ−２を抑制する物質」としては、それぞれ、「ＦＢＰの発現を抑制する物質」又は「ＦＢＰ−２の発現を抑制する物質」が好ましい。また、「増殖性疾患治療用医薬組成物」としては、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物が好ましいが、ＦＢＰを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とを併用することもでき、ＦＢＰを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と併用用のＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物、及び、ＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と併用用のＦＢＰを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物も本発明に含まれる。
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、小分子量干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を意味する。ｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ；ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現抑制を誘導する（Ｆｉｒｅ，Ａ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６−８１１，１９９８）。
また、本発明のｓｉＲＮＡとしては、
配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ；
配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ；又は
配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ
がより好ましい。
本明細書において、「ＦＢＰ」は、細胞増殖及び細胞分化に関わるｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子のプロモーター配列の１５００塩基対上流に位置するフューズ（ＦＵＳＥ，ｆａｒ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の逆向き一本鎖ＤＮＡに結合するタンパク質として単離・同定された（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８，４６５−４８０，１９９４）公知のヒトタンパク質である。また、「ＦＢＰ−２」及び「ＦＢＰ−３」は、アミノ酸配列に関して、前記ＦＢＰとの類似性が高い公知のヒトタンパク質（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３１６７９−３１６８７，１９９６）である。
【図面の簡単な説明】  図１は、各種ｓｉＲＮＡを導入したＰＣ３癌細胞株における、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、及びＦＢＰ−３の発現抑制の結果を示す、図面に代わる写真である。
（ａ）は導入後２４時間、（ｂ）は導入後４８時間、（ｃ）は導入後７２時間後の結果を示す。また、記号「Ａｃｔ」は、アクチンを意味する。
図２は、各種ｓｉＲＮＡを導入したＰＣ３癌細胞株における、生細胞数の変化を示すグラフである。縦軸は細胞数を、横軸は導入後時間（時間）を示す。
図３は、各種ｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａＳ３癌細胞株における、生細胞数の変化を示すグラフである。縦軸は細胞数を、横軸は導入後時間（時間）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】１．本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、ＦＢＰを抑制するか否かを分析（すなわち、検出又は測定）する工程、及び、ＦＢＰ−２を抑制するか否かを分析する工程を含む、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法である。ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の「抑制」には、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の「発現抑制」及び「機能抑制」の両方が含まれるが、「発現抑制」がより好ましい。
（１）ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の発現を抑制するか否かを分析する方法
ＦＢＰをコードするｍＲＮＡ及びＦＢＰ−２をコードするｍＲＮＡ、又は、ＦＢＰタンパク質の発現及びＦＢＰ−２タンパク質の発現を抑制するか否かを分析することにより、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニングが可能である。具体的には、細胞におけるＦＢＰ及びＦＢＰ−２の発現量の変化を分析することによってスクリーニングすることができる。
ＦＢＰをコードするｍＲＮＡ及びＦＢＰ−２をコードするｍＲＮＡ、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２タンパク質が、特定の細胞において産生されるか否かを決定するために、多様な核酸技術及び免疫学的技術を使用することができる。
例えば、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を発現する任意のヒト細胞、若しくは、ＦＢＰを発現する任意のヒト細胞及びＦＢＰ−２を発現する任意のヒト細胞を用い、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を分析することにより、前記試験物質がＦＢＰのｍＲＮＡ及びＦＢＰ−２のｍＲＮＡ、又は、タンパク質の発現を減少若しくは抑制するか否かを分析することができる。すなわち、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２発現を減少若しくは抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在するＦＢＰのｍＲＮＡ及びＦＢＰ−２のｍＲＮＡ、並びに、タンパク質の量を減少させるので、公知の分析方法、例えば、ノーザンブロット又はＥＬＩＳＡ法［例えば、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２を認識する抗体をプレート等の固相に吸着させた後、そこに試験物質を含むサンプルを加え、次いで、先の抗体とは抗原エピトープが異なるＦＢＰ及びＦＢＰ−２を認識する抗体、又は、ＦＢＰを認識する抗体及びＦＢＰ−２を認識する抗体を加えて、後者の抗体の固相への結合度合いを分析する（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１１８，７４２−７６６，１９８６）］等で同定することができる。ＦＢＰの発現抑制及びＦＢＰ−２の発現抑制は、同時に分析することもできるし、順次分析することもできる。より具体的には、実施例２に記載した方法で、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の発現抑制を分析することができる。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２を発現する細胞（好ましくはヒト細胞）を、試験物質の存在下若しくは非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞におけるＦＢＰのｍＲＮＡ及びＦＢＰ−２のｍＲＮＡ、又は、タンパク質の量が、試験物質非存在下で培養した前記細胞と比較して減少したか否かを分析する工程を含む。
別の方法としては、プロモーター活性の阻害は下流の遺伝子の転写の抑制を生じる一般的事象に基づき、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の各プロモーター領域を、それぞれ、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）上流に連結した作動可能なベクター、あるいは、ＦＢＰのプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクター及びＦＢＰ−２のプロモーター領域をレポーター遣伝子に連結した作動可能なベクターを作製し、外因的に導入した宿主細胞を利用し、試験物質の存在下若しくは非存在下におけるレポーター活性（例えば、ルシフェラーゼ活性）を分析することにより、前記試験物質がレポーター遺伝子の発現を減少又は抑制するか否かを分析することができる。ＦＢＰの発現抑制及びＦＢＰ−２の発現抑制は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の各プロモーター領域をレポーター遺伝子上流に連結した作動可能なベクター、あるいは、ＦＢＰのプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクター及びＦＢＰ−２のプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクターを導入した宿主細胞を用い、同時に分析することもできるし、ＦＢＰのプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクターを導入した宿主細胞、及び、ＦＢＰ−２のプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結した作動可能なベクターを導入した宿主細胞を用いて分析することもできる。
前記ベクターとしては、例えば、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２の各プロモーター領域（例えば、ＦＢＰのプロモーター領域としては、ゲノム登録番号ＡＣ０１１５３９の塩基配列における、開始コドンＡＴＧの上流域を用いることができ、ＦＢＰ−２のプロモーター領域としては、ゲノム登録番号ＡＣ１０３５９１の塩基配列における、開始コドンＡＴＧの上流域を用いることができる）をレポーター遺伝子上流に連結した組み換えＤＮＡであって、しかも、一過的な複製、あるいは、宿主染色体への挿入を可能とするベクターを用いることができる。こうして外因的に得られた宿主細胞を試験物質の存在下又は非存在下で培養した後、細胞の抽出物を調製し、次いで、抽出物を分析することにより、前記試験物質がＦＢＰ及びＦＢＰ−２のプロモーター活性を減少又は抑制するか否かを決定することができる。ＦＢＰ及びＦＢＰ−２のプロモーター活性を減少又は抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在するレポーター活性の量を減少させるので、それを指標として同定することができる。
発明のスクリーニング方法は、例えば、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２の各プロモーター領域の下流にレポーター遺伝子を連結したベクターで形質転換した細胞を、試験物質の存在下又は非存在下で培養する工程、並びに、試験物質存在下で培養した前記細胞におけるレポーター活性が、試験物質非存在下で培養した前記細胞と比較して減少したか否かを分析する工程を含む。
（２）ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の機能を抑制するか否かを分析する方法
ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の機能を発揮するためには、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２が結合分子と相互作用をする必要がある。そこで、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２と結合分子との相互作用を阻害することを指標に、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の機能を抑制する物質を同定することができる。本発明には、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２と結合分子との会合を減少又は抑制する物質を同定することによる、増殖性疾患治療薬として有用な物質のスクリーニング方法が含まれる。
具体的には、試験物質の存在下又は非存在下で、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２と結合分子との会合が許容される条件下での混合後、前記試験物質がＦＢＰ及びＦＢＰ−２と結合分子との会合を減少又は抑制するか否かを分析することにより、分析することができる。ＦＢＰ及びＦＢＰ−２と結合分子との会合を減少又は抑制する試験物質は、前記試験物質を含むサンプルに存在する会合の量を減少させるので、それを指標として同定することができる。
あるいは、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２に結合することを指標に、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の機能を抑制する物質を同定することができる。具体的には、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２タンパク質を捕獲プローブとして使用し、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の結合分子を同定する。ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の結合分子は、本発明で見出したＦＢＰ及びＦＢＰ−２による細胞死調節を媒介する、生体分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の補因子）である。詳細には、周知の方法である酵母ツーハイブリッド系（Ｎａｔｕｒｅ，３４０，２４５−２４７，１９８９）、あるいは、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２を発現する任意のヒト細胞の抽出物若しくは画分と混合し、生化学的手法により、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の結合分子を回収し、分析することができる。
前記項目（１）のＦＢＰ及びＦＢＰ−２の発現を抑制するか否かを分析する方法、又は、前記項目（２）のＦＢＰ及びＦＢＰ−２の機能を抑制するか否かを分析する方法を用いる本発明のスクリーニング方法でスクリーニングすることのできる試験物質は、特に限定されるものではないが、例えば、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によって得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレイ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることができる。更には、本発明のスクリーニング方法により選択された化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることができる。
２．細胞死誘導の確認
本発明のスクリーニング方法によれば、「ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質」を得ることができる。「ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質」を単独で、あるいは、「ＦＢＰを抑制する物質」及び「ＦＢＰ−２を抑制する物質」を併用すると、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２が同時に発現抑制され、細胞死が誘導される。
本明細書において、細胞死の誘導は、所定の細胞集団において、細胞の数が減少することを意味する。また、細胞死の誘導効果は、例えば、実施例３に記載の方法で確認することができる。好ましくは、所定の細胞集団における細胞の減少は、この集団における細胞のうちの少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも約５０％である。
３．本発明の増殖性疾患治療用医薬組成物、及びその製造法
前項目１．に記載の方法による分析工程、及び製剤化工程を含む、増殖性疾患治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物の有効成分は、ＦＢＰを抑制する物質及びＦＢＰ−２を抑制する物質、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質である限り、特に限定されるものではない。これらは、例えば、本発明のスクリーニング方法と同様の工程で、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を抑制する物質を選択することにより得ることができる。
本発明の医薬組成物の有効成分として、例えば、ｓｉＲＮＡを用いることができる。ｓｉＲＮＡは、二重鎖のＲＮＡ部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡを介して起こる（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，４８５−４９０，２００１）。その２１〜２３塩基のｓｉＲＮＡ間には、効果に差はあるもののいずれもＲＮＡｉ効果を示す。また、３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸（リボ核酸又はデオキシリボ核酸）であるが、２塩基が好ましく、標的に相補した塩基が好ましいが、相補していないものでも充分なＲＮＡｉ効果が認められる（ＥＭＢＯ．Ｊ．，２０，６８７７−７８８８，２００１；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００，２００１）。また、オーバーハングがないｓｉＲＮＡもＲＮＡｉ効果を示す。
なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
ｓｉＲＮＡの３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（チミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる、本発明のｓｉＲＮＡには、
ＦＢＰの発現を特異的に抑制することのできるｓｉＲＮＡ（以下、ＦＢＰ特異的ｓｉＲＮＡと称する）；
ＦＢＰ−２の発現を特異的に抑制することのできるｓｉＲＮＡ（以下、ＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡと称する）；並びに
ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方の発現を特異的に抑制することのできるｓｉＲＮＡ（以下、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡと称する）
が含まれる。
ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡは、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的なＤＮＡ塩基配列（好ましくは２１塩基〜２３塩基からなる塩基配列）に基づいて設計され、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２の発現を特異的に抑制することのできるｓｉＲＮＡである限り、特に限定されるものではなく、常法（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，１１８２０−１１８２１，１９９８；及びＭｅｔｈｏｄｓ，２３，２０６−２１７，２００１）により製造することができる。より具体的には、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的なＤＮＡ塩基配列は、例えば、以下の手順により選択することができる。すなわち、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２の開始コドンから５０塩基以上下流の最初のＡＡを見つける（転写因子の結合部位を避けるため）。ＡＡに続く１９〜２１の塩基配列を記録し、ＡＡを含む２１〜２３塩基のＧＣコンテントを計算し、５０％前後であることを確認する。ＧＣコンテントが３０％以下や７０％以上である場合、あるいは、５０％前後であっても複数の候補が必要な場合には、更に下流のＡＡを選択し、同様にしてＧＣコンテントを計算する。得られた塩基配列候補について、データベース検索を実施し、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的であることを確認する。
なお、ＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２に特異的であるか否かは、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０，１９９０）サーチでＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２とは完全に一致するが、他には完全に一致する配列が存在しないことにより確認することができる。
ｓｉＲＮＡを設計するためのＤＮＡ塩基配列が得られると、その配列に基づいてｓｉＲＮＡを設計することができる。例えば、二重鎖ＲＮＡ部分が、得られたＤＮＡ塩基配列をそのままＲＮＡ配列に変換したＲＮＡ塩基配列からなる、ｓｉＲＮＡを設計することができる。なお、本明細書において、ＤＮＡ塩基配列をＲＮＡ塩基配列に変換するとは、ＤＮＡ塩基配列におけるｄＴをＵに変換し、それ以外の塩基、すなわち、ｄＡ、ｄＧ、及びｄＣを、それぞれ、Ａ、Ｇ、及びＣに変換することを意味する。
ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡの設計に用いるＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的な塩基配列としては、例えば、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２のＤＮＡ塩基配列のＡＡ（好ましくは開始コドンから５０塩基以上下流のＡＡ）に続く１９〜２１塩基からなる、特異的な塩基配列（ＧＣコンテントが好ましくは４０〜６０％、より好ましくは４５〜５５％）を挙げることができる。
ＦＢＰ特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号１又は配列番号１６〜１９で表される各塩基配列を挙げることができる。
ＦＢＰ−２特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号２又は配列番号２０〜２５で表される各塩基配列を挙げることができる。
ＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的な塩基配列としては、例えば、配列番号４で表される塩基配列を挙げることができる。
配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明のＦＢＰ特異的ｓｉＲＮＡとしては、例えば、二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１３で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列（すなわち、配列番号１３で表される塩基配列における第１番目〜第２０番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号１３で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基からなる配列）からなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
配列番号２で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明のＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡとしては、例えば、二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１４で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列（すなわち、配列番号１４で表される塩基配列における第１番目〜第２０番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号１４で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基からなる配列）からなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
配列番号４で表される塩基配列に基づいて設計される、本発明のＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡとしては、例えば、二重鎖ＲＮＡ部分が、配列番号１５で表される塩基配列、又はそのセンス鎖の３’末端が１若しくは２塩基欠失した塩基配列（すなわち、配列番号１５で表される塩基配列における第１番目〜第２０番目の塩基からなる配列、若しくは配列番号１５で表される塩基配列における第１番目〜第１９番目の塩基からなる配列）からなるｓｉＲＮＡを挙げることができる。
これらの本発明のＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡには、例えば、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基の任意の核酸［例えば、リボ核酸（Ｕ、Ａ、Ｇ、若しくはＣ等）又はデオキシリボ核酸（ｄＴ、ｄＡ、ｄＧ、若しくはｄＣ等）］が付加されたオーバーハングを有するｓｉＲＮＡ、並びにオーバーハングを有しないｓｉＲＮＡが含まれる。なお、センス鎖及びアンチセンス鎖（オーバーハングを有する場合には、それを含む）は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。
前記オーバーハングとしては、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングが好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、それぞれ独立して、１又は２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングがより好ましく、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端に、２塩基のＵ又はｄＴが付加されたオーバーハングが特に好ましい。
本発明のＦＢＰ特異的ｓｉＲＮＡとしては、配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡが特に好ましい。配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡにおいては、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分が二重鎖を形成し、第２２番目及び第２３番目のｄＴが３’側オーバーハングを形成する。
本発明のＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡとしては、配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡが特に好ましい。配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡにおいては、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分が二重鎖を形成し、第２２番目及び第２３番目のｄＴが３’側オーバーハングを形成する。
本発明のＦＢＰ及びＦＢＰ−２特異的ｓｉＲＮＡとしては、配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡが特に好ましい。配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。このセンス鎖とこのアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡにおいては、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分が二重鎖を形成し、第２２番目及び第２３番目のｄＴが３’側オーバーハングを形成する。
本発明の医薬組成物の有効成分としては、ｓｉＲＮＡの他にも、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を用いることができる。
アンチセンスポリヌクレオチドを設計及び作製する方法は、周知であり（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１，１９８１）、まず、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチでＦＢＰ及び／又はＦＢＰ−２特異的な配列（例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列）を選択し、それに対するアンチセンスポリヌクレオチドを、本発明の医薬組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の医薬組成物は、非経口経路（例えば、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、又は頬内経路）を介して投与することができる。あるいは、または同時に、経口経路によって投与することもできる。投薬量は、レシピエントの年齢、健常度、及び体重、同時処置される種類（もしあれば）、処置の頻度、並びに所望される効果の性質に依存する。各成分の有効な量の至適な範囲の決定は、当業者の範囲内である。典型的な投薬量は０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重であり、好ましい投薬量は、０．１〜１０μｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましい投薬量は、０．１〜１μｇ／ｋｇ体重である。薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な適切なキャリアーを含むことができ、これには、作用の部位に到達するために薬学的に使用可能な、調製物への活性な化合物のプロセシングを容易にする賦形剤及び／又は補助剤を含む。
非経口投与のために適切な処方物は、水溶性形態の活性化合物（例えば、水溶性の塩）の水溶液を含む。更に、適切な油性の注入懸濁液としての活性化化合物の懸濁液が投与可能である。適切な親油性溶媒又はベヒクルは、脂肪油又は合成の脂肪酸エステルを含む。水溶性注入懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質を含むことができる。必要に応じて懸濁液は安定剤を含むことができる。リポソームも、細胞への送達のために、薬剤をカプセル化するために使用することができる。本発明に従う全身投与についての薬学的組成物は、腸投与、非経口投与、又は局所投与について処方することができる。実際、処方物の全ての３つのタイプは、有効成分の全身性投与を達成するために同時に使用することができる。
経口投与のための適切な処方物は、堅質又は軟質ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、又は吸入薬、及びそれらの制御された放出形態を含む。本発明の医薬組成物は、単独で、又は組み合わせで、あるいは、他の治療剤又は診断剤と組み合わせて使用することができる。特に好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、一般的に受容されている医療の実施に従って、これらの状態について典型的に処方される他の化合物（例えば、化学療法剤）とともに投与することができる。
本発明の医薬組成物は、ＦＢＰを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と、ＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とを組み合わせて、キットにすることもできる。
また、ＦＢＰを抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物と、ＦＢＰ−２を抑制する物質を有効成分とする増殖性疾患治療用医薬組成物とは、同時に、あるいは、時間差をおいて、投与することができる。
４．遺伝子治療
細胞増殖性疾患、例えば、癌の治療において、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２発現の調節因子をコードする遺伝子発現単位（例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列に対するアンチセンス分子又はｓｉＲＮＡ分子）を、処置される被験体に導入することにより、遺伝子治療をすることができる。このような調節因子は、細胞又は特定の標的細胞で、構成的に継続的に産生させることもできるし、あるいは、誘導性とすることもできる。
具体的には、前記アンチセンス分子、又はｓｉＲＮＡ分子（例えば、配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖と配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ）を作製するための方法は、当該分野において周知である（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１，１９８１）。
配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列に対するアンチセンス分子を含む組み換えＤＮＡを作製する方法は、当該分野において周知であり（″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等）、好ましい組み換えＤＮＡにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列は、発現制御配列及び／又はベクター配列に作動可能に連結することができる。前記ベクターは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列を含む組み換えＤＮＡの複製、あるいは、宿主染色体への挿入を少なくとも可能とし、遺伝子治療に用いることができる。
更に、本発明では、配列番号１、配列番号２、又は配列番号４で表される塩基配列に対するアンチセンスを含む組み換えＤＮＡを外因的に導入した宿主細胞を提供し、これも遺伝子治療に用いることができる。宿主細胞は、任意のヒト細胞に限る。本発明の組み換えＤＮＡでの適切な宿主細胞の形質転換は、周知の方法によって達成される。
【実施例】  以下、実施例により本発明を詳述するが，本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（例えば、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８９等の遺伝子操作実験マニュアル）や試薬等に添付の指示書に従った。
実施例１：ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又はＦＢＰ−３に特異的なｓｉＲＮＡの作製
ＦＢＰをコードする塩基配列の内、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するｓｉＲＮＡとして、配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ（ダーマコンリサーチ社）を使用した。配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴ（チミジン）が２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。
同様に、ＦＢＰ−２をコードする塩基配列の内、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するｓｉＲＮＡとして、配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡ（ダーマコンリサーチ社）を使用した。また、ＦＢＰ−３をコードする塩基配列の内、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するｓｉＲＮＡとして、配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、ＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ（ダーマコンリサーチ社）を使用した。配列番号６又は７で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号１０又は１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチの結果、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３で表される塩基配列は、それぞれ、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、及びＦＢＰ−３に特異的な配列であることが示された。
更に、ＦＢＰをコードする塩基配列と、ＦＢＰ−２をコードする塩基配列とが相同な部分の内、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡに対応するｓｉＲＮＡとして、配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖とからなる、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に対するｓｉＲＮＡを合成した。配列番号８で表される塩基配列からなるセンス鎖及び配列番号１２で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖は、それぞれ、第１番目〜第２１番目の塩基からなるＲＮＡ部分の３’側に、ｄＴが２つ付加されたＲＮＡ／ＤＮＡキメラポリヌクレオチドである。
ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴサーチの結果、配列番号４で表される塩基配列は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に特異的な配列であることが示された。
非特異的なｓｉＲＮＡの影響を検討する対照実験のために、哺乳類細胞に存在しない二本鎖ＲＮＡのコントロールｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  Ｄｕｐｌｅｘ；ダーマコンリサーチ社）を入手した。
実施例２：ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又はＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡの癌細胞株への導入によるＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又はＦＢＰ−３特異的な発現抑制
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手したヒト子宮頚部癌由来細胞株ＨｅＬａＳ３及びヒト前立腺癌由来細胞株ＰＣ３を用いた。各癌細胞株は、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ；ＪＲＨバイオサイエンス社）を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）に培養して維持した。
トランスフェクション実験は、以下の手順で実施した。
トランスフェクションの前日に、細胞培養用６穴プレート（イワキ）に、ＨｅＬａＳ３癌細胞株については、１穴当たり４００００細胞を、ＰＣ３癌細胞株については、１穴当たり２００００細胞を播いた。トランスフェクション当日に、血清無添加培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）で細胞を洗浄した後、ＨｅＬａＳ３癌細胞株の場合は、１％熱不活化胎児ウシ血清を添加したＯＰＴＩ−ＭＥＭ８００μＬを加え、ＰＣ３細胞株の場合は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ８００μＬを加えた。
実施例１で作製した各ｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（オリゴフェクタミン；インビトロジェン社）を用いて、添付指示書に従い、前記状態の２種の癌細胞株に導入した。導入したｓｉＲＮＡは、
ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ単独、
ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡ単独、
ＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ単独、
ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に特異的なｓｉＲＮＡ単独、
コントロールｓｉＲＮＡ単独、
ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合、
ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合、及びＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合であった。
導入から４時間経過後に、熱不活化胎児ウシ血清の最終濃度が１０％となるようにＤＭＥＭを加えた。トランスフェクションは、各サンプルに対して独立に４穴を用いて行なった。
前記各ｓｉＲＮＡを導入してから２４、４８、又は７２時間経過後に細胞を回収した。回収した細胞に、細胞溶解用溶液［５０ｍｍｏｉ／Ｌ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），０．２５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ，１０％グリセロール，１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ−ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ；シグマ社）］を加えて溶解し、エッペンドルフチューブ遠心機（トミー精工社）にて１５０００回転で１５分間遠心した後の上清を回収した。
各ｓｉＲＮＡの特異性及び効果を、各々のタンパク質レベルでの発現抑制で確認するために、各導入細胞ライゼートについて、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を認識するヤギ抗体ＦＢＰ（Ｎ−１５；サンタクルズ社）、若しくはＦＢＰ−３を認識するヤギ抗体ＦＢＰ３（１−２０；サンタクルズ社）、又は非特異的な効果の検討を行なうための、アクチンを認識するウサギ抗体（アンチアクチン；シグマ社）を用いたウエスタンブロッティングで確認した。
具体的には、前記各ライゼートをＳＤＳ／１０％アクリルアミドゲル（第一化学薬品社）で電気泳動（還元条件下）した後、ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ［ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）］膜（ミリポア社）に転写した。ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、及びＦＢＰ−３の分子量が近いため、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２検出用と、ＦＢＰ−３及びアクチン検出用の２セットを作成した。そして、ＦＢＰ−３及びアクチン検出用セットは、ブロッティング後、併行して流した分子量マーカをもとに、分子量４５ＫＤａ〜１１６ＫＤａの範囲でＰＶＤＦ膜を切り出してＦＢＰ−３の検出に使用し、分子量４５ＫＤａ以下の範囲でＰＶＤＦ膜を切り出してアクチンの検出に使用した。
転写後のＰＶＤＦ膜にブロッキング剤（ブロックエース；大日本製薬社）を添加してブロッキングした後、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２検出用ＰＶＤＦ膜をヤギ抗体ＦＢＰ（Ｎ−１５）と反応させ、次いで、西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗ヤギ抗体と反応させた。同様に、ＦＢＰ−３検出用ＰＶＤＦ膜をヤギ抗体ＦＢＰ３（１−２０）と反応させ、次いで、西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗ヤギ抗体と反応させた。また、アクチン検出用ＰＶＤＦ膜をウサギ抗体（アンチアクチン）と反応させ、次いで、西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（アマシャムファルマシア社）と反応させた。
反応後、市販のウエスタンブロッティング検出システム（ＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム；アマシャムファルマシア社）を用いて目的タンパク質の発現を確認した。
ＰＣ３癌細胞株に関する結果を図１に示す。図１において、
レーン１は、コントロールｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
レーン２は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
レーン３は、ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
レーン４は、ＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
レーン５は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
レーン６は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
レーン７は、ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
レーン８は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果である。また、（ａ）は導入後２４時間、（ｂ）は導入後４８時間、（ｃ）は導入後７２時間後の結果を示す。
図１に示すように、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ（配列番号５で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号９で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン２）、ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡ（配列番号６で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１０で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン３）、又はＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ（配列番号７で表される塩基配列からなるセンス鎖と、配列番号１１で表される塩基配列からなるアンチセンス鎖との組合せ；レーン４）は、それぞれ、特異的にＦＢＰ、ＦＢＰ−２、又はＦＢＰ−３の発現を抑制した。
また、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合（レーン５）、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合（レーン６）、又はＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合（レーン７）は、それぞれ、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２、ＦＢＰ及びＦＢＰ−３、又はＦＢＰ−２及びＦＢＰ−３の発現を抑制した。
更に、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に特異的なｓｉＲＮＡ（レーン８）は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の発現を抑制した。
これらのタンパク質の発現抑制は、４８時間後及び７２時間後に顕著に認められた。一方、コントロールｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  Ｄｕｐｌｅｘ；レーン１）の導入によっては、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、ＦＢＰ−３、及びアクチンの各タンパク質の発現は抑制されなかった。これらの結果より、前記各ｓｉＲＮＡの特異性と効果が確認された。
実施例３：ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の同時発現抑制による細胞死誘導
実施例２で行なったｓｉＲＮＡ導入実験において、導入から２４時間、４８時間、７２時間、及び９６時間経過後に、それぞれ、独立の３穴から細胞を回収し、トリパンブルー染色によって生細胞数を計測した。ｓｉＲＮＡ導入時の細胞数は、ＨｅＬａＳ３癌細胞株では８００００個、ＰＣ３癌細胞株では５００００個であった。
ＰＣ３癌細胞株に関する結果を図２に、ＨｅＬａＳ３癌細胞株に関する結果を図３に示す。図２及び図３において、
記号「Ｓ」は、コントロールｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
記号「Ｆ１」は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
記号「Ｆ２」は、ＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
記号「Ｆ３」は、ＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果であり；
記号「Ｆ１＋Ｆ２」は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
記号「Ｆ１＋Ｆ３」は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
記号「Ｆ２＋Ｆ３」は、ＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡ−２とＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡとの等量混合の場合の結果であり；
記号「Ｆ１Ｆ２」は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２の両方に特異的なｓｉＲＮＡ単独の場合の結果である。
ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、若しくはＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡ単独による、ＦＢＰ、ＦＢＰ−２、若しくはＦＢＰ−３単独の発現抑制、又はＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡの等量混合、若しくはＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−３特異的なｓｉＲＮＡの等量混合の導入による、ＦＢＰとＦＢＰ−３の同時発現抑制、若しくはＦＢＰ−２とＦＢＰ−３の同時発現抑制した細胞は、それぞれ、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞と同じく、経時的に細胞数を増加させた。
一方、ＦＢＰとＦＢＰ−２両者に対するｓｉＲＮＡ単独、又はＦＢＰ特異的なｓｉＲＮＡとＦＢＰ−２特異的なｓｉＲＮＡの等量混合を導入した細胞では、導入から４８時間経過後までは、他のｓｉＲＮＡを導入した細胞と同様に細胞数を増加させたが、導入から７２時間及び９６時間経過後では、細胞数を減少させた。細胞数が減少することは、細胞死が誘導されたことを意味する。実施例２で示したように、これらの導入細胞では、導入から４８時間経過後からＦＢＰとＦＢＰ−２の同時抑制が認められたことから、ＦＢＰとＦＢＰ−２の同時発現抑制が細胞死を誘導することが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明のスクリーニング方法によれば、増殖性疾患（例えば、癌）の治療薬として有用な物質を得ることができる。本発明のスクリーニング方法で得られた物質は、ＦＢＰ及びＦＢＰ−２を同時に発現抑制することにより細胞死を誘導するという全く新たな作用機序に基づく増殖性疾患治療剤として有用である。また、ＦＢＰを抑制する物質とＦＢＰ−２を抑制する物質を併用することによっても、細胞死を誘導するという作用機序に基づく増殖性疾患治療が可能となる。
また、本発明のｓｉＲＮＡは、本発明の増殖性疾患治療用医薬組成物の有効成分として有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号５〜８の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したｓｉＲＮＡのセンス鎖であり、第１番目〜第２１番目はＲＮＡであり、第２２番目〜第２３番目はＤＮＡである。
配列番号９〜１２の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であり、第１番目〜第２１番目はＲＮＡであり、第２２番目〜第２３番目はＤＮＡである。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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