(57)【要約】疾患の原因遺伝子の変異に個別に対応した機能性抗体を、抗体工学技術を駆使して作製し、疾患に対する治療を可能とすることを見出した。具体的には、遺伝子変異により天然のリガンドに対する反応性がほとんど失われたレセプター（例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）反応性の著しく低下した変異トロンボポイエチン受容体）に対して、アゴニスト活性を持つリガンドを作用させることにより、正常レベルに近いシグナルを伝達し得る作用を有するリガンド、特に低分子化抗体の作製に成功した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異受容体に対して、アゴニスト活性を有するリガンド。
【請求項２】
リガンドが抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のリガンド。
【請求項３】
変異受容体に対して、天然リガンドより高いアゴニスト活性を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のリガンド。
【請求項４】
変異受容体が、アミノ酸配列の変異に起因する受容体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のリガンド。
【請求項５】
変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のリガンド。
【請求項６】
変異受容体が疾患の原因となっている受容体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のリガンド。
【請求項７】
変異受容体が、トロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド。
【請求項８】
抗体が低分子化抗体である、請求項２に記載のリガンド。
【請求項９】
低分子化抗体がダイアボディである、請求項８に記載のリガンド。
【請求項１０】
リガンドを結合させることにより変異受容体にシグナルを伝達する方法。
【請求項１１】
リガンドが抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
変異受容体が、アミノ酸変異に起因する受容体であることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
変異受容体が疾患の発症と関連している受容体であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
変異受容体が、トロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
変異受容体にリガンドを結合させることにより、変異受容体に起因する疾患を治療する方法。
【請求項１７】
リガンドが抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）変異受容体に被検物質を接触させる工程、
（ｂ）変異受容体におけるシグナルを検出する工程、
（ｃ）アゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程、
【請求項１９】
以下の工程を含む、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法。
（ａ）正常受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｂ）変異受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｃ）正常受容体と比較して、変異受容体において高いアゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程
【請求項２０】
以下の工程を含む、変異受容体と正常受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法
（ａ）正常受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｂ）変異受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｃ）正常受容体と変異受容体の両方にアゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程
【請求項２１】
リガンドが抗体である、請求項１８〜２０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質。
【請求項２３】
変異受容体に対するリガンドを含有する、変異受容体に起因する疾患の治療薬。
【請求項２４】
リガンドが請求項１〜９のいずれかに記載のリガンドである、請求項２３に記載の治療薬。
【請求項２５】
リガンドが抗体である、請求項２３に記載の治療薬。
【請求項２６】
変異受容体が、アミノ酸変異に起因する受容体であることを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２７】
変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２８】
変異受容体がトロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれかに記載の治療薬。
【請求項２９】
疾患が先天性無巨核球性血小板減少症である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンド、および該リガンドを有効成分として含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】  近年、遺伝子疾患の原因遺伝子が次々と明らかになり、その様々な治療法が研究され確立されつつある。その中で最も良く研究されているのは、主に酵素遺伝子の欠損を補う治療法である。β−グルコセレブロシダーゼが欠損したゴーシェ病患者に対する「セレザイム」（Ｇｅｎｚｙｍｅ）による酵素補充療法、ａｌｐｈａ−Ｌ−ｉｄｕｒｏｎｉｄａｓｅが欠損したムコ多糖症に対する「Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ」（Ｇｅｎｚｙｍｅ）による酵素補充療法等が有効である事が示されている。遺伝子を導入する試みとしては、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症患者に対するＡＤＡ遺伝子の導入や、血友病Ｂ患者に対する血液凝固第ＩＸ因子遺伝子を導入する試み等がなされている。酵素欠損以外にも数多くの遺伝子疾患が知られており、サイトカインやそのレセプターの遺伝子疾患も知られている。糖尿病の約９割を占める２型糖尿病患者の一部では、インスリンレセプターの欠損や変異が報告されており、発病の原因と考えられている。また、血小板減少症の患者の中には、そのトロンボポイエチン受容体の欠損や変異が報告されており、ＴＰＯのシグナルが伝達されない事が病気の原因と考えられている。このような遺伝子疾患には未だ根本的な治療法は無く、その治療法の確立が望まれている。
Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ（ＣＡＭＴ；先天性無巨核球性血小板減少症）はまれな病気で、幼年期には血小板減少（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）、幼年時代後期には無形成性貧血（ｐａｎｃｙｔｏｐｅｎｉａ）を引き起こす疾患である。ＣＡＭＴ患者の血清中には、血小板造血因子であるＴＰＯは高濃度に存在しているが、血小板や造血前駆細胞のＴＰＯに対する反応性が失われている事が明らかにされている。それらの患者のトロンボポイエチン受容体（ｃ−ＭＰＬ）遺伝子を解析すると、ほとんどの場合、ポイントミューテーションが見出される。それらの変異によりフレームシフトや終止コドンが挿入され、全くトロンボポイエチン受容体の機能が失われた患者や、ヘテロやホモで細胞外ドメインにアミノ酸置換が導入されている患者がいる事が報告されている（非特許文献１参照）。現在、骨髄移植のみがこれらの患者の唯一の治療法である。
【非特許文献１】Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｂａｌｌｍａｉｅｒ，Ｍａｎｕｅｌａ  Ｇｅｒｍｅｓｈａｕｓｅｎ，Ｈａｒａｌｄ  Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｋｌａｒａ  Ｃｈｅｒｋａｏｕｉ，Ｓａｂｉｎｅ  Ｌａｎｇ，Ａｎｎｉｋａ  Ｇａｕｄｉｇ，Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｋｒｕｋｅｍｅｉｅｒ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｅｉｌｅｒｓ，Ｇａｂｒｉｅｌｅ  Ｓｔｒａｕｓｚ，ａｎｄ  Ｋａｒｌ  Ｗｅｌｔｅ著、「ＢＬＯＯＤ」、１  ＪＡＮＵＡＲＹ  ２００１、ＶＯＬ９７、ＮＵＭ  １、Ｐ１３９
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行い、上記疾患の原因遺伝子の変異に個別に対応した機能性抗体を、抗体工学技術を駆使して作製し、上記疾患に対する治療を可能とすることを見出した。具体的には、遺伝子変異により天然のリガンドに対する反応性がほとんど失われたレセプター（例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）反応性の著しく低下した変異トロンボポイエチン受容体）に対してアゴニスト活性を持つ抗体を作用させることにより、正常レベルに近いシグナルを伝達し得る作用を有する低分子化抗体を作製することに成功した。
このような抗体やその改変体を用いることにより、遺伝子変異に起因する疾患の治療が可能と考えられた。また、それらを発現しうる遺伝子を用いた遺伝子治療による治療も可能である。
本発明の抗体等のアゴニスト活性を有するリガンドやそれをコードする遺伝子を用いることにより、治療の困難なＣＡＭＴ患者に治療を施す道が開かれた。
また、本発明による手法は、細胞膜上のレセプターをコードする遺伝子の変異に起因する他の様々な疾患に対しても応用可能であり、新しい治療法を提供することが可能である。
即ち本発明は、変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンドに関し、より具体的には、
〔１〕  変異受容体に対して、アゴニスト活性を有するリガンド、
〔２〕  リガンドが抗体であることを特徴とする、〔１〕に記載のリガンド、
〔３〕  変異受容体に対して、天然リガンドより高いアゴニスト活性を有することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載のリガンド、
〔４〕  変異受容体が、アミノ酸配列の変異に起因する受容体であることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のリガンド、
〔５〕  変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のリガンド、
〔６〕  変異受容体が疾患の原因となっている受容体であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のリガンド、
〔７〕  変異受容体が、トロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のリガンド、
〔８〕  抗体が低分子化抗体である、〔２〕に記載のリガンド、
〔９〕  低分子化抗体がダイアボディである、〔８〕に記載のリガンド、
〔１０〕  リガンドを結合させることにより変異受容体にシグナルを伝達する方法、
〔１１〕  リガンドが抗体であることを特徴とする、〔１０〕に記載の方法、
〔１２〕  変異受容体が、アミノ酸変異に起因する受容体であることを特徴とする、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕  変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法、
〔１４〕  変異受容体が疾患の発症と関連している受容体であることを特徴とする、〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１５〕  変異受容体が、トロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、〔１０〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕  変異受容体にリガンドを結合させることにより、変異受容体に起因する疾患を治療する方法、
〔１７〕  リガンドが抗体である、〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕  以下の工程を含む、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法、
（ａ）変異受容体に被検物質を接触させる工程、
（ｂ）変異受容体におけるシグナルを検出する工程、
（ｃ）アゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程、
〔１９〕  以下の工程を含む、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法、
（ａ）正常受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｂ）変異受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｃ）正常受容体と比較して、変異受容体において高いアゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程
〔２０〕  以下の工程を含む、変異受容体と正常受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法、
（ａ）正常受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｂ）変異受容体に対するアゴニスト活性を測定する工程、
（ｃ）正常受容体と変異受容体の両方にアゴニスト活性を有するリガンドを選択する工程
〔２１〕  リガンドが抗体である、〔１８〕〜〔２０〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔２２〕  〔１８〕〜〔２１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた物質、
〔２３〕  変異受容体に対するリガンドを含有する、変異受容体に起因する疾患の治療薬、
〔２４〕  リガンドが〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載のリガンドである、〔２３〕に記載の治療薬、
〔２５〕  リガンドが抗体である、〔２３〕に記載の治療薬、
〔２６〕  変異受容体が、アミノ酸変異に起因する受容体であることを特徴とする、〔２３〕〜〔２５〕のいずれかに記載の治療薬、
〔２７〕  変異受容体が、天然のリガンドに対する反応性が失われていることを特徴とする、〔２３〕〜〔２６〕のいずれかに記載の治療薬、
〔２８〕  変異受容体がトロンボポイエチン受容体の変異受容体であることを特徴とする、〔２３〕〜〔２７〕のいずれかに記載の治療薬、
〔２９〕  疾患が先天性無巨核球性血小板減少症である、〔２３〕〜〔２８〕のいずれかに記載の治療薬、
を提供するものである。
本発明は、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドを提供する。
本発明において変異受容体とは、通常、５０％未満の頻度で存在する受容体であり、好ましくは２０％未満の頻度で存在する受容体であり、さらに好ましくは１０％未満の頻度で存在する受容体であり、特に好ましくは１％未満の頻度で存在する受容体である。頻度は通常、任意に抽出された被験者において計算された頻度が用いられるが、国や地域、性別などにより頻度に偏りがある場合もあるので、例えば、日本、アメリカ、欧州などのように国や地域を限定して頻度を算出したり、性別を限定して頻度を算出するなどしてもよい。又、１つの受容体について変異が複数個所に存在する場合には、複数の個所を組み合わせて頻度を算出してもよいし、１つの変異個所に絞って頻度を算出してもよい。変異受容体の判断は上述のように頻度で行うことが好ましいが、例えば、シグナル伝達能力等で変異受容体の判断を行うことも可能である。具体的には、例えば、２つの異なる受容体が存在する場合、天然リガンドが結合した際にシグナル伝達が強い方を非変異受容体とし、シグナル伝達が弱い方を変異受容体としてもよい。
本発明の変異受容体としては、例えば、アミノ酸変異に起因する受容体（アミノ酸配列が変異している受容体）が好ましいが、本発明はそれらに限定されず、立体構造、糖鎖構造、受容体が多量体として存在する場合にはそれぞれの位置関係・角度など、天然リガンドに対する反応性に影響を与えるものであればどのような変異でもよい。アミノ酸配列の変異には、アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加などがある。本発明の受容体は、天然のリガンドに対する反応性が失われていることが好ましい。
本発明においてリガンドとは、機能タンパク質に特異的に結合する物質のことをいい、低分子化合物、タンパク質、ペプチドなど、その種類は限定されない。本発明において好ましい機能タンパク質は受容体である。本発明において好ましいリガンドは、アゴニスト活性を有するリガンドである。また本発明は、本発明のリガンドを結合させることにより変異受容体にシグナルを伝達させる方法を提供する。本方法に用いられるリガンドは、天然リガンド以外の非天然リガンドであることが好ましい。
本発明は、天然リガンドに対する反応性が非変異受容体と異なっている変異受容体を対象とすることが好ましい。天然リガンドに対する反応性が非変異受容体と異なっている変異受容体とは、同一の天然リガンドを同一の条件下で変異受容体と非変異受容体に結合させた場合に、アゴニスト活性の強さやシグナル伝達の強さ等が非変異受容体とは異なっている変異受容体のことをいう。通常、変異受容体では、非変異受容体よりアゴニスト活性やシグナル伝達が弱くなっている（天然リガンドに対する反応性が失われている）。
受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、ＴＮＦ受容体ファミリー、Ｇ蛋白質共役型受容体ファミリー、ＧＰＩアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては多数の文献が存在し、例えば、Ｃｏｏｋｅ  ＢＡ．，Ｋｉｎｇ  ＲＪＢ．，Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｏｌｅｎ  ＨＪ．ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１８Ｂ  ″Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｐａｒｔ  ＩＩ″ｐｐ．１−４６（１９８８）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｐａｔｔｈｙ  Ｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：１３−１４．、Ｕｌｌｒｉｃｈ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：２０３−２１２．、Ｍａｓｓａｇｕｌ  Ｊ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，６９：１０６７−１０７０．、Ｍｉｙａｊｉｍａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０：２９５−３３１．、Ｔａｇａ  Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，７：３３８７−３３９６．、Ｆａｎｔｌ  ＷＩ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２：４５３−４８１．、Ｓｍｉｔｈ  ＣＡ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ，７６：９５９−９６２．、Ｆｌｏｗｅｒ  ＤＲ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２２：２０７−２３４．、宮坂昌之監修，細胞工学別冊ハンドブックシリーズ「接着因子ハンドブック」（１９９４）（秀潤社，東京，日本）等が挙げられる。上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）受容体、ヒト又はマウストロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、ヒト又はマウスＦｌｔ−３リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、ヒト又はマウスインターフェロン（ＩＦＮ）−α、β受容体、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（ＧＨ）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（ＩＬ）−１０受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）受容体等を例示することができる（ｈＥＰＯＲ：Ｓｉｍｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６，３１−３５．；ｍＥＰＯＲ：Ｄ′Ａｎｄｒｅａ，ＡＤ．Ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５７，２７７−２８５．；ｈＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７，８７０２−８７０６．；ｍＧ−ＣＳＦＲ：Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１，３４１−３５０．；ｈＴＰＯＲ：Ｖｉｇｏｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）８９，５６４０−５６４４．；ｍＴＰＯＲ：Ｓｋｏｄａ，ＲＣ．Ｅｔ  ａｌ．（１９９３）１２，２６４５−２６５３．；ｈＩｎｓＲ：Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３，７５６−７６１．；ｈＦｌｔ−３：Ｓｍａｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，４５９−４６３．；ｈＰＤＧＦＲ：Ｇｒｏｎｗａｌｄ，ＲＧＫ．Ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，３４３５−３４３９．；ｈＩＦＮα／βＲ：Ｕｚｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０，２２５−２３４．及びＮｏｖｉｃｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，３９１−４００．）。
本発明の変異受容体の一つの態様としては、疾患の発症と関連している受容体を挙げることができる。変異受容体が疾患の発症と関連するとは、天然のリガンドに対する反応性が失われることが一因となり、疾患の発症が誘発されることをいう。本発明においては、変異受容体は疾患の発症の一因を担っていればよく、変異受容体が疾患の発症の全ての原因である必要はない。現在までに変異受容体と疾患の発症の関連については多くの報告があるが、既に報告されている関連以外にも、変異受容体が疾患の発症と関連するか否かは統計的解析方法（例えば、相関解析など）により確認することも可能である。相関解析はケースコントロール研究とも言われ、当業者によく知られた解析方法である（例えば、西村泰治：多型の統計学的用法、最新医学４６：９０９−９２３，（１９９１）、Ｏｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｅｃｓ  ８，２１６５−２１７０（１９９０）、Ｏｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４，１４０６−１４１０（１９９９）、Ｏｚａｗａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５３，２６３−２６８（１９９９）など）。例えば、患者と健常者で変異受容体の頻度を測定し、患者において有意に変異受容体の頻度が上昇しているか否かを調べることにより、変異受容体と疾患の間の相関を調べることができる。通常、頻度の違いは、χ検定で検討され、χはχ２＝Σ（観察値−期待値）２／期待値で得られる。得られたχ２からｐ値を得ることができる。変異受容体と疾患が相関しているか否かはｐ値から判定することができ、例えば、ｐ＜０．０５の場合、変異受容体と疾患が相関していると判定することができる。
疾患の発症との関連が知られている変異受容体については多くの報告があるが、具体的な例としては、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）受容体の変異受容体、インシュリン受容体の変異受容体、エリスロポエチン受容体の変異受容体、成長ホルモン受容体の変異受容体、コモンγチェーン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１の共通レセプター）の変異受容体、アンドロゲン受容体の変異受容体（Ｇｌｕｔａｍｉｎ  Ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ（２００１），２６１−２６７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ）、ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ（ＰＯＭＣ）、ｍｅｒａｌｏｃｏｒｔｉｎ受容体の変異受容体（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２００１），８６（４），１４４２−１４４６）、Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ受容体の変異受容体（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ（２０００），１５（５），４１０−４１７）、ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ受容体の変異受容体（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９９８），９（４），１３３−１４０）、ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ受容体の変異受容体（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），１（１０），４６０−４６４）などを挙げることができる。本発明において特に好ましい変異受容体はトロンボポイエチン受容体の変異受容体である。
本発明において、天然リガンドとは、生体内に存在しているリガンドのことをいい、好ましくは非変異受容体のシグナル伝達に最も影響を与えているリガンドである。本発明における天然リガンドには通常、抗体は含まれない。
アゴニスト活性とは、受容体にリガンドが結合することにより、細胞内にシグナルが伝達され、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、蛋白質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。
本発明において、生理的活性の変化を測定する為に用いる検出指標は、量的および／又は質的な変化が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系（ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ａｓｓａｙ）の指標、細胞系（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ）の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの量的および／又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、ＤＮＡ、ＲＮＡの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、形態の変化、特性の変化等を用いることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋やｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内蛋白質量等を用いることができる。また、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。本発明においては、変異受容体の細胞外領域と他のタンパク質の細胞内領域を含むキメラ受容体を用いることも可能である。例えば、Ｇ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ＥＧＦ受容体、トロンボポイエチン受容体の細胞内領域を用い、これらの受容体の刺激によって誘導される細胞増殖活性を検出指標とすることができる。また、細胞増殖活性を検出指標として測定する場合、検出感度を上げることを目的として、リガンドの非存在下では死滅する細胞株が好ましく、特に、継代が容易である点でサイトカイン依存性細胞株が好ましい。例えば、ＩＬ−２依存性細胞株であるＣＴＬＬ−２細胞や、ＩＬ−３依存性細胞株である３２Ｄ細胞、ＦＤＣ−Ｐ１細胞、Ｂａ／Ｆ３細胞を用いることができる。これらの細胞株は、ＩＬ−２あるいはＩＬ−３等の増殖に必要なサイトカインを培養液から除去することで、培養開始２日目か３日目には細胞が死滅する特徴を有する。マウスＧ−ＣＳＦ受容体細胞内領域を有するキメラ受容体を発現させたＦＤＣ−Ｐ１細胞やＢａ／Ｆ３細胞を用いることが好ましい。
本発明のアゴニスト活性を有するリガンドは、変異受容体に対してアゴニスト活性を有していれば特に限定されず、変異受容体と非変異受容体の両方にアゴニスト活性を有していてもよいし、変異受容体のみにアゴニスト活性を有していてもよい。変異受容体と非変異受容体の両方に対してアゴニスト活性を有する場合には、非変異受容体に対してより高いアゴニスト活性を有していてもよいし、変異受容体に対してより高いアゴニスト活性を有していてもよい。又、非変異受容体と変異受容体に対して、同程度のアゴニスト活性を有していてもよい。しかしながら、変異受容体に起因する疾患の治療が主目的である場合には、非変異受容体と比較して、変異受容体において高いアゴニスト活性を有するリガンドを用いることが好ましい。
本発明の抗体は、アゴニスト活性を有する限り特に制限はなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原としては特に限定されないが、例えば、目的の受容体の全長タンパク質や、部分ペプチド（例えば、細胞外領域）などを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８１，７３，３−４６．）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。本発明の抗体の認識する分子上のエピトープは特定のものに限定されず、分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよいが、通常、細胞外領域に存在するエピトープを認識する。本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考にすることができる。抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅ���ｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
また、抗体は抗原に結合することができれば、低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。本発明において低分子化抗体とは、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでいることが好ましく、特に好ましいのはＶＨとＶＬの両方を含む断片である。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（シングルチェインＦｖ）などを挙げることができるが、好ましくはｓｃＦｖ（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３、Ｐｌｉｃｋｔｈｕｎ「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｖｏｌ．１１３，Ｒｅｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５，（１９９４））である。このような抗体断片を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。本発明における低分子化抗体は、全長抗体よりも分子量が小さくなることが好ましいが、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーなどの多量体を形成すること等もあり、全長抗体よりも分子量が大きくなることもある。
本発明において好ましい低分子化抗体は、抗体のＶＨを２つ以上及びＶＬを２つ以上含み、これら各可変領域を直接あるいはリンカー等を介して間接的に結合した抗体である。結合は、共有結合でも非共有結合でもよく、また、共有結合と非共有結合の両方でよい。さらに好ましい低分子化抗体は、ＶＨとＶＬが非共有結合により結合して形成されるＶＨ−ＶＬ対を２つ以上含んでいる抗体である。この場合、低分子化抗体中の一方のＶＨ−ＶＬ対と他方のＶＨ−ＶＬ対との間の距離が、全長抗体における距離よりも短くなる抗体が好ましい。
本発明において特に好ましい低分子化抗体はダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）又はｓｃ（Ｆｖ）２である。ダイアボディは、可変領域と可変領域をリンカー等で結合したフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ等）（以下、ダイアボディを構成するフラグメント）を２つ結合させて二量体化させたものであり、通常、２つのＶＬと２つのＶＨを含む（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，８８−９８，（１９９１）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９，２９９−３０５，（１９９６）、Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１２１７−１２２６，（１９９４）、Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１２（７），５９７−６０４，（１９９９）、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９０，６４４４−６４４８，（１９９３）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，１３０１−１３１２，（１９９６））。ダイアボディを構成するフラグメント間の結合は非共有結合でも、共有結合でよいが、好ましくは非共有結合である。
また、ダイアボディを構成するフラグメント同士をリンカーなどで結合して、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｉａｂｏｄｙ）とすることも可能である。その際、ダイアボディを構成するフラグメント同士を２０アミノ酸程度の長いリンカーを用いて結合すると、同一鎖上に存在するダイアボディを構成するフラグメント同士で非共有結合が可能となり、二量体を形成する。
ダイアボディを構成するフラグメントは、ＶＬとＶＨを結合したもの、ＶＬとＶＬを結合したもの、ＶＨとＶＨを結合したもの等を挙げることができるが、好ましくはＶＨとＶＬを結合したものである。ダイアボディを構成するフラグメント中において、可変領域と可変領域を結合するリンカーは特に制限されないが、同一フラグメント中の可変領域の間で非共有結合がおこらない程度に短いリンカーを用いることが好ましい。そのようなリンカーの長さは当業者が適宜決定することができるが、通常２〜１４アミノ酸、好ましくは３〜９アミノ酸、特に好ましくは４〜６アミノ酸である。この場合、同一フラグメント上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため、同一鎖上のＶＬとＶＨの間で非共有結合がおこらず、単鎖Ｖ領域フラグメントが形成されない為、他のフラグメントとの非共有結合による二量体を形成する。さらに、ダイアボディ作製と同じ原理で、ダイアボディを構成するフラグメントを３つ以上結合させて、トリマー、テトラマーなどの多量体化させた抗体を作製することも可能である。
また、本発明におけるｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨ及び２つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９；２３１：１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高いアゴニスト活性を示す。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、ｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。
また２つのＶＨ及び２つのＶＬが、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点としてＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＬ（［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
２つのＶＨと２つのＶＬの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、配置も挙げることができる。
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（３），２９９−３０５，１９９６参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは３〜５０アミノ酸、更に好ましくは５〜３０アミノ酸、特に好ましくは１２〜１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。
例えば、ペプチドリンカーの場合：
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ
Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ
（Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ・Ｇｌｙ）ｎ
［ｎは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
よって本発明において特に好ましいｓｃ（Ｆｖ）２の態様としては、例えば、以下のｓｃ（Ｆｖ）２を挙げることができる。
［ＶＨ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＬ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＨ］ペプチドリンカー（１５アミノ酸）［ＶＬ］
合成化学物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
４つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、３つのリンカーが必要となるが、全て同じリンカーを用いてもよいし、異なるリンカーを用いてもよい。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディ又はｓｃ（Ｆｖ）２である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
全長抗体を低分子化することにより、非常に高いアゴニスト活性を有する抗体を作製することが可能である。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はある分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がある分子を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。この場合、ある分子を発現している細胞に直接細胞障害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に障害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能である。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
又、本発明においては、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。
本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
前記のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法により精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
抗体の抗原結合活性（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
また本発明は、変異受容体に対してアゴニスト活性を有するリガンドのスクリーニング方法を提供する。本方法においては、まず、変異受容体に被検物質（被検化合物）を接触させる。変異受容体への被検物質の「接触」は、通常、変異受容体を発現する細胞の培養液もしくは抽出液に被検物質を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検物質がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
本方法においては次いで変異受容体におけるシグナルを検出する。シグナルの検出には、上記した方法を用いることができる。
本方法においては次いで、被検物質を接触させない場合（対照）と比較して、アゴニスト活性を有するリガンドを選択する。このようにして選択されたリガンドは、受容体の欠損あるいは変異に関連する疾患の治療または予防のための治療薬となることが期待される。
本発明のスクリーニング方法の別の態様としては、まず正常受容体に対し、被検物質を接触させ、アゴニスト活性を測定する。次いで、変異受容体に対し、同じく被検物質を接触させ、アゴニスト活性を測定する。そして、正常受容体に接触させた場合と比較して、変異受容体に接触させた場合において高いアゴニスト活性を有するリガンドを選択する。
さらに本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、まず、正常受容体に対し、被検物質を接触させ、アゴニスト活性を測定する。次いで、変異受容体に対し、同じく被検物質を接触させ、アゴニスト活性を測定する。そして、正常受容体と変異受容体の両方の場合にアゴニスト活性を有するリガンドを選択する。
上記方法におけるアゴニスト活性の測定は、上述の方法によって行うことができる。
本発明の上記スクリーニング方法によって取得される物質（化合物）もまた、本発明に含まれる。
本発明のリガンド（例えば、抗体）はアゴニスト活性を有することから、該リガンドが作用する受容体の欠損や変異による反応性低下に起因する疾病に対して、有効な治療薬となることが期待される。即ち本発明は、本発明の上記リガンドを含有する、変異受容体に起因する疾患の治療薬を提供する。上記の代表的な疾患として、例えば、血小板減少症や、２型糖尿病、Ｌａｒｏｎ症候群を挙げることができる。
本発明における疾患としては、先天性無巨核球性血小板減少症（Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ；ＣＡＭＴ）を好適に示すことができる。
本発明のリガンド、または本発明のスクリーニング方法によって取得される物質（化合物）を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌベクターの構成を示す図である。
図２は、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＧ３０５Ｃベクターの構成を示す図である。
図３は、ｐＢＡＣｓｕｒｆｌ−ｈＭＰＬ−ＦＬＡＧベクターの構成を示す図である。
図４は、ｐＣＯＳ２−ＨＡ−Ｂａ／Ｆ３の各ダイアボディとｈＴＰＯに対するアゴニスト活性を示す図である。縦軸は、Ｏ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図５は、ｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３の各ダイアボディとｈＴＰＯに対するアゴニスト活性を示す図である。縦軸は、Ｏ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図６は、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３の各ダイアボディとｈＴＰＯに対するアゴニスト活性を示す図である。縦軸は、Ｏ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図７は、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ７６９Ｔベクターの構成を示す図である。
図８は、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ８２３Ａベクターの構成を示す図である。
図９は、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子構築を表す図である。
図１０は、ｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２ベクターの構成を示す図である。
図１１は、ｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＴＡ１３６  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図１２は、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＴＡ１３６  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図１３は、ｈＭＰＬ（Ｃ７６９Ｔ）−Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＴＡ１３６  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
図１４は、ｈＭＰＬ（Ｃ８２３Ａ）−Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＴＡ１３６  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２のアゴニスト活性を示す図である。縦軸はＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍを示し、横軸は濃度を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹立
ＣＡＭＴ患者に見られるトロンボポイエチン受容体遺伝子変異のうちＧ３０５Ｃ（Ｒ１０２Ｐ）変異を持つ患者が複数報告されている。そこで、以下の方法でＧ３０５Ｃ（Ｒ１０２Ｐ）変異を持つトロンボポイエチン受容体遺伝子の発現ベクターを構築し、Ｂａ／Ｆ３細胞に導入した。正常なトロンボポイエチン受容体遺伝子（配列番号：１）および該遺伝子の開始コドンから３０５番目の塩基をＧからＣに置換した遺伝子（配列番号：３）を作製した。これらのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、動物細胞発現用ベクターｐＣＯＳ２−ＨａのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩサイトに導入し、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌ（図１）、およびｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＧ３０５Ｃ（図２）を作製した。
ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌ、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＧ３０５Ｃ、およびネガティブコントロールとしてｐＣＯＳ２−ＨａをｐｖｕＩ処理後、それぞれ２０μｇをＢａ／Ｆ３細胞に以下の条件でトランスフェクトした。ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ．Ｃｕｖｅｔｔｅ  ０．４ｃｍ、０．３３ｋＶ、９５０μＦの条件で遺伝子導入した後、培地をＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌ  ｒｍＩＬ３（Ｐｅｐｒｏ  ｔｅｃｈ）、５００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンにかえて細胞を選抜した。その結果、それぞれのベクターからｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｐＣＯＳ２−ＨＡ−Ｂａ／Ｆ３細胞株が得られた。
〔実施例２〕トロンボポイエチン受容体細胞外ドメインタンパクの調製
抗トロンボポイエチン受容体抗体作製用抗原調製のため、ヒトトロンボポイエチン受容体の細胞外ドメインを昆虫細胞Ｓｆ９で分泌生産する系を以下のように構築した。ヒトトロンボポイエチン受容体の細胞外ドメイン（Ｇｌｎ２６−Ｔｒｐ４９１）の下流にＦＬＡＧタグを付加した遺伝子を作製し、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＰｓｔＩ−ＳｍａＩサイトに挿入し、ｐＢＡＣｓｕｒｆ１−ｈＭＰＬ−ＦＬＡＧ（図３）を作成した。その結果、バキュロウイルスのｇｐ６４タンパクの分泌シグナル配列を用いてトロンボポイエチン受容体の細胞外ドメインを分泌しうる遺伝子が構築された（配列番号：５）。Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、キット添付のプロトコールに従い、４μｇの本ベクターをＳｆ９細胞にトランスフェクトした。培養３日後に培養上清を回収し、プラークアッセイで組換えウイルスを単離した。ウイルスストックを作成後、Ｓｆ９細胞に感染させ、その培養上清を回収した。得られた培養上清はＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア）に吸着させた後、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで溶出し、Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）に吸着させた。１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ３．５）で溶出後、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）により中和し、ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０によりゲルろ過クロマトを行い精製した（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液）。
〔実施例３〕抗トロンボポイエチン受容体抗体ダイアボディの作製
精製されたＴＰＯＲ細胞外ドメインタンパク質を初回免疫１００μｇ、２回目以降５０μｇずつ計７回ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに免疫し、定法に従いＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）細胞とのハイブリドーマを作製した。精製タンパクを用いたＥＬＩＳＡアッセイで抗トロンボポイエチン受容体抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択した（ＶＢ０８Ｂ、ＶＢ４５Ｂ、ＶＢ０３３、ＶＢ１４０、ＶＢ１５７）。
一方、ｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスに１．０ｘ１０７細胞ずつ１週間から５ヶ月の間隔で腹腔内投与し、計１１回免疫後、同様にハイブリドーマを作製し、抗トロンボポイエチン受容体抗体を産生するハイブリドーマを選択した（ＴＡ１３６）。
得られた各ハイブリドーマ細胞から抗体ｃＤＮＡの可変領域をＨ鎖、Ｌ鎖それぞれクローニングし塩基配列を決定した。決定した塩基配列に基づきＣ末端にＦＬＡＧタグの付いたダイアボディ遺伝子（ＶＢ０８Ｂ  ｄｂ、ＶＢ４５Ｂ  ｄｂ、ＶＢ０３３  ｄｂ、ＶＢ１４０  ｄｂ、ＶＢ１５７  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｄｂ）を設計し、動物細胞発現用ベクターｐＣＸＮＤ３に導入した（ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ０８Ｂ  ｄｂ、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ４５Ｂ  ｄｂ、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ０３３  ｄｂ、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ１４０  ｄｂ、ｐＣＸＮＤ３−ＶＢ１５７  ｄｂ、ｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｄｂ）。作製された各ベクターをＣＯＳ７細胞に導入し、その培養上清を培養３日目に回収した。得られた培養上清中のダイアボディ濃度はＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ（ファルマシア）で定量した。
〔実施例４〕Ｂａ／Ｆ３細胞株のダイアボディ依存性アッセイ
ｐＣＯＳ２−ＨＡ−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ＿Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞のそれぞれを、２．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に希釈し、６０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。ｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ、終濃度２５μｇ／ｍｌになるようにＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩで調整）とｄｉａｂｏｄｙ／ＣＯＳ７  ｓｕｐ（ＶＢ０８Ｂ  ｄｂ、ＶＢ４５Ｂ  ｄｂ、ＶＢ０３３  ｄｂ、ＶＢ１４０  ｄｂ、ＶＢ１５７  ｄｂ、ＴＡ１３６  ｄｂ、それぞれｘ１，ｘ３，ｘ９，ｘ２７，ｘ８１，ｘ２４３にＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩで調整）を４０μｌ／ｗｅｌｌで分注して２４時間培養した後、１０μｌ／ｗｅｌｌでＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライ）を加え、２時間培養後にＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍ測定した。その結果、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞ではｈＴＰＯや他のアゴニスト抗体に対する反応性が著しく低下していた。しかし、正常なレセプターを発現するｈＭＰＬ＿Ｂａ／Ｆ３細胞に対するアゴニスト活性の弱いＴＡ１３６  ｄｂ（配列番号：７）は、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞に対して強いアゴニスト活性を示した（図４〜６）。
なお、配列番号：８のアミノ酸番号４９〜５４が重鎖ＣＤＲ１に、６９〜８４が重鎖ＣＤＲ２に、１１７〜１２３が重鎖ＣＤＲ３に、１６３〜１７４が軽鎖ＣＤＲ１に、１９０〜１９６が軽鎖ＣＤＲ２に、２２９〜２３７が軽鎖ＣＤＲ３に相当する。
〔実施例５〕Ｂａ／Ｆ３細胞株の樹立（２）
実施例１と同様ＣＡＭＴ患者に見られるトロンボポイエチン受容体遺伝子変異のうちＣ７６９Ｔ（Ｒ２５７Ｃ）、およびＣ８２３Ａ（Ｐ２７５Ｔ）変異を持つトロンボポイエチン受容体遺伝子の発現ベクターをそれぞれ構築し、Ｂａ／Ｆ３細胞に導入した。トロンボポイエチン受容体遺伝子（配列番号：１）の開始コドンから７６９番目の塩基をＣからＴに置換した遺伝子（配列番号：９）、および８２３番目の塩基をＣからＡに置換した遺伝子（配列番号：１１）を作製した。これらのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで切断し、動物細胞発現用ベクターｐＣＯＳ２−ＨａのＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩサイトに導入しｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ７６９Ｔ（図７）、およびｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ８２３Ａ（図８）を作製した。
ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ７６９Ｔ、ｐＣＯＳ２−ｈＭＰＬｆｕｌｌＣ８２３ＡをｐｖｕＩ処理後、それぞれ２０μｇをＢａ／Ｆ３細胞に以下の条件でトランスフェクトした。ＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い、１ｘ１０７Ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ  ０．４ｃｍ、０．３３ｋＶ、９５０μＦの条件で遺伝子導入した後、培地をＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌ  ｒｍＩＬ３（Ｐｅｐｒｏ  ｔｅｃｈ）、５００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンにかえて細胞を選抜した。その結果、それぞれのベクターからｈＭＰＬ（Ｃ７６９Ｔ）−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｃ８２３Ａ）−Ｂａ／Ｆ３細胞株が得られた。
〔実施例６〕抗トロンボポイエチン受容体抗体ｓｃ（ＦＶ）２の作製
前述のｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｄｂを用いて以下の手法によりＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２遺伝子を構築した（図９）。
プライマーＡ（ＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧ／配列番号：１５）とプライマーＢ（ＴＧＧＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＴＧＣＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧ／配列番号：１６）の組み合わせ、およびプライマーＣ（ＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣ／配列番号：１７）とプライマーＤ（ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧ／配列番号：１８）の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行い、それぞれの産物の混合物をテンプレートとし、プライマーＡとプライマーＤで再びＰＣＲを行った。得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＮｏｔＩで消化し、ｐＢａｃＰＡＫ９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）にクローニングし、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＴＡ１３６を作製した。
次に、ｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＴＡ１３６をテンプレートとし、プライマーＥ（ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＡＣ／配列番号：１９）とプライマーＦ（ＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣ／配列番号：２０）でＰＣＲを行い、約８００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）へクローニングした。
塩基配列の確認後、制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、得られた約８００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＢａｃＰＡＫ９−ｓｃＴＡ１３６のＰｖｕＩＩサイトに挿入し、ｐＢａｃＰＡＫ９−ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した。作製したベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し、約１６００ｂｐのＤＮＡ断片を発現ベクターｐＣＸＮＤ３にクローニングし、ｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２を作製した（配列番号：１３）（図１０）。
〔実施例７〕ＴＡ１３６  ｄｂおよびＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆ）２のＴＰＯ様アゴニスト活性の評価
ｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｄｂ、およびｐＣＸＮＤ３−ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２をＣＯＳ７細胞に導入し、それぞれの培養上清を培養３日目に回収した。得られた培養上清中のＤｉａｂｏｄｙ濃度はＭ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いたＢＩＡｃｏｒｅ（ファルマシア）で定量した。
ｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｇ３０５Ｃ）−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｃ７６９Ｔ）−Ｂａ／Ｆ３細胞、ｈＭＰＬ（Ｃ８２３Ａ）−Ｂａ／Ｆ３細胞のそれぞれを４．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に希釈し、６０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。ｈＴＰＯ（Ｒ＆Ｄ社）と上記ＣＯＳ７細胞培養上清を４０μｌ／ｗｅｌｌで分注して２４時間培養した後、１０μｌ／ｗｅｌｌでＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライ）を加え、２時間培養後にＯ．Ｄ．４５０／６５５ｎｍ測定した。
その結果、ＴＡ１３６  ｓｃ（Ｆｖ）２は、３種のトロンボポイエチン受容体変異株全てにおいてｈＴＰＯやＴＡ１３６  ｄｂよりもさらに強いアゴニスト活性を示した（図１２、図１３、図１４）。また、正常トロンボポイエチン受容体を発現するｈＭＰＬ−Ｂａ／Ｆ３細胞においては、ＴＡ１３６  ｄｂはｈＴＰＯよりも弱い活性しか示さなかったが、ｓｃ（Ｆｖ）２化する事により天然リガンドであるｈＴＰＯと同等のアゴニスト活性を示す事が判明した（図１１）。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、変異受容体に起因する疾患、例えば、ＣＡＭＴの患者に対する治療用リガンド（抗体）、抗体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該抗体の製造方法が提供された。さらに、該抗体をコードするポリヌクレオチドを用いた遺伝子治療の手段が提供された。また本発明の手法は、細胞膜上のタンパク質をコードする遺伝子の変異が原因の様々な遺伝子疾患に対する治療法を提供する。今後患者個人個人の遺伝子診断が広く行われる事が予測されており、個人個人の遺伝子型に適合した医薬品の開発が本発明の抗体工学技術を用いることにより可能となる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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