(57)【要約】組換えアデノウイルスベクターの作製に有効に用いられる新規コスミドベクター等を提供すること。具体的には、以下の（１）〜（３）：（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を含有する、という特徴を有するコスミドベクター、該コスミドベクターを利用した組換えアデノウイルスベクターの作製方法、前記コスミドベクターを成分として含有する組換えアデノウイルスベクター作製用試薬等を提供する。
2004094643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクター；
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を含有する。
【請求項２】
アデノウイルスゲノム以外に、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域を含有することを特徴とする、請求項１記載のコスミドベクター。
【請求項３】
薬剤耐性遺伝子および複製オリジンが、アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列とスペーサー配列との間に位置することを特徴とする、請求項２記載のコスミドベクター。
【請求項４】
アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列の外側から右端逆方向反復配列に向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域をこの順序で含有することを特徴とする、請求項３記載のコスミドベクター。
【請求項５】
アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列としてＴＴＣＧＡＡを含有する、請求項１〜４いずれか記載のコスミドベクター。
【請求項６】
ＴＴＣＧＡＡを認識する制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、請求項５記載のコスミドベクター。
【請求項７】
Ｅ１遺伝子領域欠失部位に外来遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列を有する、請求項１〜６いずれか記載のコスミドベクター。
【請求項８】
制限酵素がＳｗａＩである請求項７記載のコスミドベクター。
【請求項９】
Ｅ１遺伝子領域欠失部位にさらにＣＡＧプロモーターまたはＥＦ−１αプロモーターを含有する、請求項７または８記載のコスミドベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載のコスミドベクターを制限酵素で消化し、該コスミドベクターで細胞を形質転換することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項１１】
制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、請求項１０記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜９いずれか記載のコスミドベクターを成分として含有する、組換えアデノウイルスベクター作製用試薬。
【請求項１３】
以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクター；
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を複数含有する。
【請求項１４】
アデノウイルスゲノムの両側において、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴ、から選択される少なくとも二種類の制限酵素認識配列を含有する、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを少なくとも含有する、請求項１４記載のベクター。
【請求項１６】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを少なくとも含有する、請求項１４記載のベクター。
【請求項１７】
アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を二種類含有する、請求項１３記載のベクター。
【請求項１８】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴ、から選択される二種類の制限酵素認識配列を含有する、請求項１７記載のベクター。
【請求項１９】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを含有する、請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを含有する、請求項１８記載のベクター。
【請求項２１】
アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を三種類含有する、請求項１３記裁のベクター。
【請求項２２】
（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴの三種類の制限酵素認識配列を含有する、請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
Ｅ１遺伝子領域欠失部位に外来遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列を有する、請求項１３〜２２いずれか記載のベクター。
【請求項２４】
制限酵素がＳｗａＩである請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
Ｅ１遺伝子領域欠失部位にさらにＣＡＧプロモーターまたはＥＦ−１αプロモーターを含有する、請求項２３または２４記載のベクター。
【請求項２６】
ベクターがコスミドベクターである、請求項１３〜２５いずれか記載のベクター。
【請求項２７】
請求項１３〜２６いずれか記載のベクターを制限酵素で消化し、該ベクターで細胞を形質転換することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項２８】
制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、請求項２７記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項２９】
制限酵素がＰａｃＩである、請求項２７記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項３０】
制限酵素がＣｌａＩまたはＢｓｐＤＩである、請求項２７記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法。
【請求項３１】
請求項１３〜２６いずれか記載のベクターを成分として含有する、組換えアデノウイルスベクター作製用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規コスミドベクターに関する。さらに詳しくは、本発明は、組換えアデノウイルスベクターの作製に有効に用いられる新規コスミドベクターに関する。
【背景技術】  組換えアデノウイルスは遺伝子治療のみならず基礎分野での遺伝子機能解析などにも有用性が認められることから、広く利用され始めている。第一世代アデノウイルスベクターの作製法としては、ウイルスゲノム全長を二つのプラスミドに分けてクローン化し、片方のプラスミドのＥ１遺伝子欠失部位に目的遺伝子の発現単位を組み込み、ゲノム配列が一部重複するもう一方のプラスミドとの相同組換えにより組換えアデノウイルスベクターを得るＧｒａｈａｍらの作製法（Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８８０２−８８０６（１９９４））、最近キット化された目的遺伝子の発現単位をクローン化された全長ウイルスゲノムに組み込むクローン化ゲノム導入法（特開平１１−３３２５６０号公報、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：６００３−６０２０（１９８３）、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０：２０１３−２０１７（１９９９）および水口裕之ら、実験医学、２０：１７９９−１８０４（２００２））、そして我々の開発した末端蛋白付きウイルスゲノムを用いるＣＯＳ−ＴＰＣ法（特開平８−３０８５８５号公報およびＭｉｙａｋｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１３２０−１３２４（１９９６））が知られている。
クローン化ゲノム導入法の原理は約２０年前から知られており、作製法は簡便であるもののウイルス生成効率が劣るため実用的な方法とは考えられていなかった。我々の開発したＣＯＳ−ＴＰＣ法は、ウイルスゲノムのほぼ全長をクローン化したコスミドベクターとＥｃｏＴ２２  Ｉなどの制限酵素で切断した末端蛋白付きウイルスゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ）との相同組換えの原理に基づいており、高効率に目的組換えウイルスを得ることができる。そのため、細胞への影響を有することが想定される目的遺伝子を発現するベクターの作製例も多数報告されており、非常に有用であると考えられてきた。しかし、生成効率がやや低くとも目的の組換えアデノウイルスベクターが作製できる場合にまで、煩雑なＣＯＳ−ＴＰＣ法を用いる必要性は無い。この観点から簡便なクローン化ゲノム導入法が見直されている。しかしながらこれまでＣＯＳ−ＴＰＣ法に用いてきたコスミドベクターは、アデノウイルスゲノムの両端に欠失部分が存在するため、ウイルスゲノム部分を切り出し直鎖化して細胞を形質転換してもウイルスの生成は不可能である。そのため、より作製法の応用範囲を広げるために、ＣＯＳ−ＴＰＣ法、完全長クローン化ゲノム導入法の両方に応用可能であり（図１参照）、かつ簡便で実用性の高いコスミドベクターの作製が望まれている状況にあった。
【発明の開示】
本発明の目的は、組換えアデノウイルスベクターの作製に有効に用いられる新規コスミドベクターを提供することにある。すなわち本発明の目的は、ＣＯＳ−ＴＰＣ法、完全長クローン化ゲノム導入法の両方に応用可能であり、かつ簡便で実用性の高いコスミドベクターを提供することにある。
さらに本発明の目的は、アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を複数含有することにより、より効率的な組換えアデノウイルスベクターを作製することの可能なコスミドベクターまたはプラスミドベクターを提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＯＳ−ＴＰＣ法に用いられているコスミドベクターに存在していたアデノウイルスゲノム両端の欠失部分を完全長に修復し、さらにその外側にアデノウイルスゲノムを消化しない制限酵素の認識配列（ＴＴＣＧＡＡなど）を導入した新規なコスミドベクターが、従来知られているコスミドベクターに比して種々の利点を有し、組換えアデノウイルスベクターの作製において極めて有効に使用出来ることを明らかにした。さらに本発明者らは、前記制限酵素認識配列は１つだけでなく複数導入できることを初めて明らかにした。
本発明は、かかる知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、
１）  以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクター；
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を含有する、
２）  アデノウイルスゲノム以外に、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域を含有することを特徴とする、前記１）記載のコスミドベクター、
３）  薬剤耐性遺伝子および複製オリジンが、アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列とスペーサー配列との間に位置することを特徴とする、前記２）記載のコスミドベクター、
４）  アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列の外側から右端逆方向反復配列に向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域をこの順序で含有することを特徴とする、前記３）記載のコスミドベクター、
５）  アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列としてＴＴＣＧＡＡを含有する、前記１）〜４）いずれか記載のコスミドベクター、
６）  ＴＴＣＧＡＡを認識する制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、前記５）記載のコスミドベクター、
７）  Ｅ１遺伝子領域欠失部位に外来遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列を有する、前記１）〜６）いずれか記載のコスミドベクター、
８）  制限酵素がＳｗａＩである前記７記載のコスミドベクター、
９）  Ｅ１遺伝子領域欠失部位にさらにＣＡＧプロモーターまたはＥＦ−１αプロモーターを含有する、前記７）または８）記載のコスミドベクター、
１０）  前記１）〜９）いずれか記載のコスミドベクターを制限酵素で消化し、該コスミドベクターで細胞を形質転換することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法、
１１）  制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、前記１０）記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法、
１２）  前記１）〜９）いずれか記載のコスミドベクターを成分として含有する、組換えアデノウイルスベクター作製用試薬、
１３）  以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクター；
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を複数含有する、
１４）  アデノウイルスゲノムの両側において、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴ、から選択される少なくとも二種類の制限酵素認識配列を含有する、前記１３）記載のベクター、
１５）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを少なくとも含有する、前記１４）記載のベクター、
１６）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを少なくとも含有する、前記１４）記載のベクター、
１７）  アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を二種類含有する、前記１３）記載のベクター、
１８）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴ、から選択される二種類の制限酵素認識配列を含有する、前記１７）記載のベクター、
１９）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを含有する、前記１８）記載のベクター、
２０）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを含有する、前記１８）記載のベクター、
２１）  アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を三種類含有する、前記１３）記載のベクター、
２２）  （ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴの三種類の制限酵素認識配列を含有する、前記２１）記載のベクター、
２３）  Ｅ１遺伝子領域欠失部位に外来遺伝子を挿入するための制限酵素認識配列を有する、前記１３）〜２２）いずれか記載のベクター、
２４）  制限酵素がＳｗａＩである前記２３）記載のベクター、
２５）  Ｅ１遺伝子領域欠失部位にさらにＣＡＧプロモーターまたはＥＦ−１αプロモーターを含有する、前記２３）または２４）記載のベクター、
２６）  ベクターがコスミドベクターである、前記１３）〜２５）いずれか記載のベクター、
２７）  アデノウイルスゲノム以外に、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域を含有することを特徴とする、前記２６）記載のコスミドベクター、
２８）  薬剤耐性遺伝子および複製オリジンが、アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列とスペーサー配列との間に位置することを特徴とする、前記２７）記載のコスミドベクター、
２９）  アデノウイルスゲノムの左端逆方向反復配列の外側から右端逆方向反復配列に向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域をこの順序で含有することを特徴とする、前記２８）記載のコスミドベクター、
３０）  前記１３）〜２９）いずれか記載のベクターを制限酵素で消化し、該ベクターで細胞を形質転換することを特徴とする組換えアデノウイルスベクターの作製方法、
３１）  制限酵素がＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉである、前記３０）記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法、
３２）  制限酵素がＰａｃＩである、前記３０）記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法、
３３）  制限酵素がＣｌａＩまたはＢｓｐＤＩである、前記３０）記載の組換えアデノウイルスベクターの作製方法、ならびに
３４）  前記１３）〜２９）いずれか記載のベクターを成分として含有する、組換えアデノウイルスベクター作製用試薬、に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のコスミドベクターを用いた組換えアデノウイルス作製法の概念図である。図中、ＤＮＡ−ＴＰＣは末端タンパク質が付いた状態のアデノウイルスゲノムＤＮＡを、Ａｄ５はヒトアデノウイルス５型ゲノムを、Ａｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは大腸菌複製オリジンを、ＣＯＳはＣＯＳ領域を示す。また、ＤＮＡ−ＴＰＣに記載された太い矢印は制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ認識部位の位置を示す。
Ａに示したＣＯＳ−ＴＰＣ法では、制限酵素消化していないコスミドベクターと制限酵素消化したＤＮＡ−ＴＰＣとで細胞を形質転換し組換えアデノウイルスを作製する。
Ｂに示したクローン化ゲノム導入法では、コスミドベクターを制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉで消化後、細胞を形質転換し組換えアデノウイルスを作製する。
図２は、本発明に用いたコスミドベクターの構造の概念図である。図中、ＣＡＧはＣＡＧプロモーターを、ＧｐＡはβ−グロビンポリＡ付加配列を示す。
図３は、本発明のコスミドベクターの構築法を示す模式図である。図中、Ψはアデノウイルスパッケージングシグナルを、ＩＴＲは逆方向反復配列を示す。
また、プラスミドやコスミド名の前の（Ａ）から（Ｋ）の識別記号は、図３から図５で共通である。
図４は、図３の続きであり、本発明のコスミドベクターの構築法を示す模式図である。
図５は、図４の続きであり、本発明のコスミドベクターの構築法を示す模式図である。
図６は、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（両端欠失型）、ｐＡｘｃｗｉｔ（両端完全型）およびｐＡｘＣＡｗｔｉｔ（両端完全型）の構造を示す模式図である。
図７は、コスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔで形質転換した細胞から生じた組換えアデノウイルスの構造を確認した実験結果である。形質転換５日ないし６日後にＲｅｄＥタンパク質の発現が確認されたクローン（早期発現）から５クローンを、形質転換８日から１０日後にＲｅｄＥタンパク質の発現が確認されたクローン（後期発現）から４クローンを選び、ウイルスゲノムＤＮＡをＳｍａＩまたはＣｌａＩ消化し解析した。
上左図はＳｍａＩ消化、上右図はＣｌａ消化したＤＮＡのアガロース電気泳動の結果である。図中、ゲル上の数字はクローン番号を示す。下図は、生じた組換えアデノウイルスゲノム上での各制限酵素認識部位の位置ならびに制限酵素消化断片のサイズを模式的に示したものである。矢印の上の数値が、ゲノム左端を１番とした場合の各制限酵素部位の塩基番号、線下の数値が制限酵素消化断片のサイズ（ｋｂ）を示す。
図８は、アデノウイルスゲノム両端に複数の制限酵素認識部位を有する本発明のコスミドベクターの構築法を示す模式図である。
図９は、図８の続きであり、アデノウイルスゲノム両端に複数の制限酵素認識部位を有する本発明のコスミドベクターの構築法を示す模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明について詳細に説明する。
なお、本明細書ではアデノウイルスゲノムでの遺伝子の位置を示すため、マップ単位（ｍａｐ  ｕｎｉｔｓ、以後ｍ．ｕ．と略す、１ｍ．ｕ．は約３６０塩基対）を使用することがあるが、その値はアデノウイルス５型を基準にしたものを用いている。当該アデノウイルスのゲノム構造は周知であり、例えばヒトアデノウイルス２型ゲノムの全塩基配列はジーンバンク（アクセス番号Ｊ０１９４９）に、またヒトアデノウイルス５型ゲノムの全塩基配列はジーンバンク（アクセス番号Ｍ７３２６０）に登録されている。よって特に断りがない限り、アデノウイルスにコードされる遺伝子の位置はアデノウイルス５型を例として示すが、本明細書におけるアデノウイルスはこれに限定されるものではない。
（Ｉ）本発明の第一の態様
本発明は、以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクターを提供する：
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を含有する。
ここで前記（１）におけるアデノウイルスゲノムとは、アデノウイルス科に属するウイルスが有する直鎖状二本鎖ＤＮＡのことを言う。具体的には、ヒトアデノウイルス２型ゲノム（ジーンバンク  アクセス番号Ｊ０１９４９）、ヒトアデノウイルス５型ゲノム（ジーンバンク  アクセス番号Ｍ７３２６０）などが挙げられる。当該アデノウイルスゲノムは、以下に示すように完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含有することを要するが、それ以外の領域については、組換えアデノウイルスベクターとしての機能を有することを限度として、当業者の常識の範囲で適宜塩基配列の置換、欠失および／または挿入が施されていても良い。
またアデノウイルス逆方向反復配列（以下、逆方向反復配列のことをＩＴＲと略する）とは、アデノウイルスゲノムの両末端に存在し、互いに逆向きになった反復配列のことで、その塩基数はアデノウイルスの血清型により異なるが、ヒトアデノウイルス５型においては１０３塩基、２型では１０２塩基である。
よって「完全な塩基配列のアデノウイルスＩＴＲを含むアデノウイルスゲノム」とは、それぞれの血清型のアデノウイルスに本来存在するＩＴＲ部分の塩基配列を完全に含むアデノウイルスゲノムを意味する。
前記（２）においてアデノウイルスＥ１遺伝子領域とは、１．３−４．６ｍ．ｕ．に位置するＥ１Ａ遺伝子領域と４．６−１１．２ｍ．ｕ．に位置するＥ１Ｂ遺伝子領域の総称である。Ｅ１遺伝子領域には、アデノウイルスの複製ならびに遺伝子発現に必須のタンパク質がコードされている。
アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失しているとは、Ｅ１遺伝子領域の全部もしくは一部の塩基配列が存在しないことであり、Ｅ１遺伝子領域にコードされるタンパク質が産生されない、あるいは産生されても機能しないような欠失であれば、欠失する範囲に特に制限はない。Ｅ１遺伝子領域の欠失の例として、１．３−９．３ｍ．ｕ．の欠失（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  Ｂ．Ｃ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．１２，１８５−１９９．（１９９３）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．）が挙げられる。
前記（３）においてアデノウイルスゲノムの両側とは、プラスミドベクターやコスミドベクターにクローニングされたアデノウイルスゲノムを挟む位置のことを言う。具体的には、左端ＩＴＲ側においてはアデノウイルスパッケージングシグナルとは逆側の位置、右端ＩＴＲ側においてはＥ４遺伝子プロモーターとは逆側の位置のことである。
ここで、アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列は、当該アデノウイルスゲノム中に存在しない制限酵素認識配列であれば如何なる配列であっても良い。望ましくは６塩基認識の制限酵素の認識配列が挙げられ、具体的には制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩおよびＢｓｔＢ  Ｉの認識配列であるＴＴＣＧＡＡを挙げることができる。すなわち本発明の好ましい態様として、本発明は、アデノウイルスゲノムの両側にＴＴＣＧＡＡを含有するコスミドベクターを提供する。
本発明のコスミドベクターは、アデノウイルスゲノムの両側において、前記制限酵素認識配列を１種類のみ有していても、複数（複数種類）含有していても良い。複数有する場合については後に詳しく述べる。
前記本発明のコスミドベクターにおけるアデノウイルスゲノム部分は、Ｅ１遺伝子領域以外の遺伝子がさらに欠失していても良いし、また塩基配列の一部に置換や挿入があっても良い。Ｅ１遺伝子領域以外の遺伝子の欠失の例として、Ｅ３遺伝子領域、ｐＩＸ遺伝子、Ｅ４遺伝子領域、若しくはＥ２Ａ遺伝子などの欠失が挙げられる。ここで欠失とは、前記いずれかの遺伝子（領域）において全部もしくは一部の塩基配列が存在しないことであり、当該遺伝子（領域）にコードされるタンパク質が産生されない、あるいは産生されても機能しないような欠失であれば、欠失する範囲に特に制限はない。
また、ｃＤＮＡやプロモーターなどの外来遺伝子が挿入できるように、アデノウイルスゲノム中に存在しない制限酵素認識配列がＥ１遺伝子領域欠失部位に存在することが好ましい。当該制限酵素認識配列としては、平滑末端を生じさせる制限酵素認識配列であることが好ましく、具体的にはＳｗａ  Ｉ認識配列（ＡＴＴＴＡＡＴ）が挙げられる。平滑末端を生じさせる制限酵素により認識される配列が好ましいのは、一つには外来遺伝子を含むインサート断片を当該コスミドベクターに組み込む際、インサート断片を平滑末端化するだけで直接組み込めるため、シャトルプラスミドを用いる必要が無いからである。もう一つには、当該コスミドベクターとインサート断片とをライゲーションした後に当該制限酵素（ＳｗａＩ等）で消化することにより、インサート断片が挿入されていないコスミドクローンが除かれるため、インサートが挿入された所望のコスミドクローンが効率的に得られるからである。
前記Ｅ１遺伝子領域欠失部位は、さらに、外来遺伝子を発現させるプロモーターを含有していても良い。ここでプロモーターとは、所望の外来遺伝子の転写を行うために必要な塩基配列のことを言い、哺乳動物の細胞で機能するプロモーターであれば、動物ウイルス由来プロモーターや哺乳動物細胞由来プロモーター、または両者のハイブリッドプロモーターなど、特に制限なく用いることができる。プロモーターの例として、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモータなどが挙げられるが、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ  Ｈ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００．（１９９１））やＥＦ−１αプロモーター（Ｋｉｍ  Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９１，２１７−２２３．（１９９０））、ならびにＣＭＶプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４５，１０１−１０５．（１９８６））など特に高発現とされているプロモーターを用いるのが好ましい。
前記本発明のコスミドベクターはアデノウイルスゲノム以外に、少なくとも、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、およびＣＯＳ領域を含有する。ここで薬剤耐性遺伝子とは、大腸菌に対して毒性を有する薬剤に対して耐性を賦与する遺伝子を言い、その例としてアンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。また複製オリジンとは、大腸菌におけるプラスミドの複製起点のことを言う。
スペーサー配列とは、それ自体は機能を有さないが、コスミドベクター全体のサイズを調節するための塩基配列を言う。その目的は、スペーサー配列を挿入しコスミドベクター全体のサイズを一定以上の大きさにすることにより、コスミドベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのパッケージング効率を上げるためである。当該スペーサー配列としては、具体的にはプラスミドｐＢＲ３２２由来の約２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｓａｉｔｏ  Ｉ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，８６６４−８６６８．（１９８６））が挙げられ、当該スペーサー配列が３個タンデムに並んでいるものを用いることが好ましい。
ＣＯＳ領域とは、バクテリオファージλの粘着末端が連結した塩基配列のことを言う。なお、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、およびＣＯＳ領域に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ等の基本書に明確に定義されているので、それらを参照されたい。
前記本発明のコスミドベクターにおいて、薬剤耐性遺伝子および複製オリジンは、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲとスペーサー配列との間に位置することが望ましい。すなわち、薬剤耐性遺伝子および複製オリジンが、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲとスペーサー配列との間に位置することにより、本発明のコスミドベクターに所望の外来遺伝子を挿入した後、外来遺伝子の挿入部位はコスミドベクターと全く同じ塩基配列を保持したまま、アデノウイルスゲノムの大部分及び、スペーサー領域ならびにＣＯＳ領域を除いたプラスミドを容易に作製することができる（アデノ落とし）。
なお、この操作を簡便に行うため、Ｅ１遺伝子領域の左側（ＩＴＲ／パッケージングシグナル側）から薬剤耐性遺伝子ならびに複製オリジンまでの間には存在しない制限酵素認識部位を、Ｅ１遺伝子領域の外来遺伝子挿入部位の右側（ＩＶａ２遺伝子側）に付加しておくことが望ましい。そのような制限酵素の例として、前述したｐＢＲ３２２由来のスペーサー配列内にも認識配列が存在するＳａｌＩやＮｒｕＩが挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子および複製オリジンは、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲの外側から右端ＩＴＲに向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジンの順序で含有されていても良いし、また複製オリジン、薬剤耐性遺伝子の順序で含有されていても良い。従って薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列およびＣＯＳ領域が、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲの外側から右端ＩＴＲに向けてどのような順序で含有されるかについては、以下の▲１▼〜▲４▼が例示される：
▲１▼薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、ＣＯＳ領域。
▲２▼複製オリジン、薬剤耐性遺伝子、スペーサー配列、ＣＯＳ領域。
▲３▼薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、ＣＯＳ領域、スペーサー配列。
▲４▼複製オリジン、薬剤耐性遺伝子、ＣＯＳ領域、スペーサー配列。
このうち特に、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列およびＣＯＳ領域をこの順序で含有するコスミドベクターが好ましい。
次に、前記本発明のコスミドベクターの作製法を以下に例示する。
前記本発明のコスミドベクターは、アデノウイルスゲノムの大部分がクローニングされたコスミドベクターから作製できる。その例を以下に示す。コスミドベクターｐＡｘｃｗ（特開平８−３０８５８５号公報、１５頁、ｐＡｄｅｘｌｃｗはｐＡｘｃｗと同一である）は、Ｅ１およびＥ３遺伝子領域以外のヒトアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むが、左端から３３ｂｐと右端から１９８ｂｐを欠失したベクターである（図３の（Ａ））。まず、コスミドベクターｐＡｘｃｗをＳａｌＩ消化後自己ライゲーションすることにより、アデノウイルスゲノムの大部分を除き、Ｅ１遺伝子領域欠失部位から左側（ＩＴＲ／パッケージングシグナル側）約４３０ｂｐを含むプラスミド（ｐｘｃｗｓ、図３（Ｂ））を作製する。プラスミドｐｘｃｗｓで欠失しているアデノウイルスゲノム左端部分は、ゲノム左端から３３ｂｐのみであるので、欠失部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡを合成し、欠失部位に挿入することで修復され、左端が完全なゲノム配列を持つプラスミドを作ることができる。なお、その際合成ＤＮＡのアデノウイルスゲノム左端に隣接して所望の制限酵素に認識配列を付加しておくことにより、アデノウイルスゲノム内には認識部位が存在しない制限酵素の認識配列をゲノム左端の挿入することができる。このようにして作製したプラスミドｐｙｃｔｃｗｓ（図３（Ｄ））は完全長の左端ＩＴＲおよびＩＴＲに隣接してＣｓｐ４５Ｉ部位を持つプラスミドである。ｐｙｃｔｃｗｓのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ間を、コスミドベクターｐＡｘｃｗのＥｃｏＲＩ−ＳｗａＩ間と置換することにより、ゲノム左端が完全長に修復されたコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔｈ（図４（Ｅ））が得られる。
ゲノム右端からの１９８ｂｐの欠失の修復は、左端と同様に欠失部位の塩基配列を複数のオリゴＤＮＡに分けて合成し、ゲノム右端部分を一旦クローニングしたプラスミドにこれらを合成ＤＮＡを挿入することでも実施可能である。しかし、本明細書では、左端ＩＴＲと右端ＩＴＲの塩基配列は同一であることを利用して右端の欠失部位の修復を行う方法について説明する。まず、アデノウイルス５型ゲノムの７６マップ単位のＥｃｏＲＩ部位からゲノム右端付近までを含むプラスミドｐｄｌｘ（Ｓａｉｔｏ  Ｉ．ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，７１１−７１９．（１９８５））のゲノム右端から約１ｋｂを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をサブクローニングする（プラスミドｐＵＡＦ９７Ｒ、（図４（Ｆ））。このプラスミドｐＵＡＦ９７ＲのＨｈａＩ−ＢａｍＨＩ間を、プラスミドｐｙｔｃｗｓのＨｈａＩ−ＢａｍＨＩ間（８３ｂｐ）と置換することにより、完全長の右端を有するプラスミドｐＵＡＦ９７Ｒｃｔ（図４（Ｇ））が得られる。最後に、コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔｈのゲノム右側部分をプラスミドｐＵＡＦ９７Ｒｃｔのゲノム右側部分とを順次入れ替えることにより、両端とも完全長に修復されたコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ（図５（Ｋ））を作製することができる。
前記本発明のコスミドベクターは、従来知られているコスミドベクターに比して、以下の（１）〜（５）に示すように種々の利点・特徴を有し、組換えアデノウイルスベクターの作製において極めて有効に使用することができる。
（１）本発明のコスミドベクターは、完全長クローン化ゲノム導入法、ＣＯＳ−ＴＰＣ法のいずれの方法においても高い効率でアデノウイルスベクターを作製することが出来る（図１）。特に、クローン化ゲノム導入法は従来よりウイルス生成効率が低いことが問題点として指摘されていたが、本発明のコスミドベクターを用いることにより充分なウイルス生成効率を確保することができる。
具体的なアデノウイルスベクターの作製ステップとしては、まず、外来遺伝子（目的遺伝子）を挿入した本発明のコスミドベクターを用いてクローン化ゲノム導入法により組換えアデノウイルスを作製する（図１（Ｂ））。ベクターに搭載した外来遺伝子の発現が宿主細胞に毒性を示すなどの理由により、この方法で目的アデノウイルスが得られにくい場合や、ウイルスゲノムを切り出すための制限酵素部位が外来遺伝子内に存在する場合は、そのまま従来のＣＯＳ−ＴＰＣ法（特開平８−３０８５８５号公報）のコスミドカセット（コスミドベクター）として用いて組換えアデノウイルスを取得することができる（図１（Ａ））。このように本発明のコスミドベクターを用いることにより、如何なる外来遺伝子に対しても効率良く組換えアデノウイルスを作製することが出来る。
（２）本発明のコスミドベクターをクローン化ゲノム導入法で用いる場合は、親ウイルスＤＮＡを必要としないため廉価で入手することが出来る。また従来法（ＣＯＳ−ＴＰＣ法）における相同組換えのステップを要さないため、生成した組換えウイルスはほぼ１００％目的のウイルスであり、目的ウイルスクローンの選別の手間をほとんどかけることなく目的遺伝子を持つウイルスベクターを簡便に作製することができる。
（３）本発明のコスミドベクターが、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲの外側から右端ＩＴＲに向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列およびＣＯＳ領域をこの順序で含有する場合、本発明のコスミドベクターに所望の外来遺伝子を挿入した後、外来遺伝子の挿入部位はコスミドベクターと全く同じ塩基配列を保持したまま、アデノウイルスゲノムの大部分及び、スペーサー領域ならびにＣＯＳ領域を除いたプラスミドを容易に作製することができる（アデノ落とし）という利点を有する。アデノ落としをしたプラスミドを用いることにより、外来遺伝子とベクターとのジャンクション部分を容易にシークエンスすることができる。さらには、アデノ落としをしたプラスミドで細胞を形質転換することにより、挿入した遺伝子の発現を確認することができる。
（４）本発明のコスミドベクターにおけるＥ１遺伝子欠失部位に、平滑末端を生じさせる制限酵素（例えばＳｗａ  Ｉ）の認識配列を有する場合、外来遺伝子を含むインサート断片を当該コスミドベクターに組み込む際、シャトルプラスミドを用いる必要が無く、インサート断片を平滑末端化するだけで直接組み込めるという利点を有する。また、当該コスミドベクターとインサート断片とをライゲーションした後にＳｗａＩで消化することにより、インサート断片が挿入されていないコスミドクローンが除かれるため、インサートが挿入された所望のコスミドクローンが高い頻度で得られるという利点も有する。
（５）本発明のコスミドベクターは、アデノウイルスゲノム両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を含有する。当該制限酵素がＣｓｐ４５Ｉである場合（すなわち制限酵素認識配列がＴＴＣＧＡＡである場合）、細胞を形質転換する前に当該コスミドベクターを制限酵素消化する際に、完全消化が容易であるという利点を有する。通常、本発明のコスミドベクターを制限酵素消化する際、コスミドＤＮＡ３０μｇを１００単位の制限酵素で消化する。Ｃｓｐ４５ＩはＴＯＹＯＢＯ社から市販されているが、１包装当たり２５００単位の酵素が含まれているので、本発明のコスミドベクターを１包装で２５回消化することができる。一方、従来のクローン化ゲノム法のプラスミドやコスミドベクターで用いられている制限酵素ＰａｃＩ（認識配列ＴＴＡＡＴＴＡＡ）も同じくＴＯＹＯＢＯ社から市販されているが、１包装当たり５０単位しか酵素が含まれておらず、本発明のコスミドベクターを消化するのに２包装が必要である。従って、Ｃｓｐ４５ＩとＰａｃＩとでは、同量のコスミドベクターを消化するのに必要な制限酵素の包装量に５０倍もの差がある。さらに本発明者らの経験では、１包装当たりに含まれる単位数が少ない制限酵素は、１包装当たりに含まれる単位数が多い制限酵素に較べると、同じ単位数を用いて基質ＤＮＡを消化をしても、完全消化が困難であるという傾向があることを見出している。従って、Ｃｓｐ４５Ｉを用いることにより、ＰａｃＩを用いるよりも必要な制限酵素量がさらに少なくて済み、かつ完全消化が容易であるという利点を有する。
本発明はまた、前記本発明のコスミドベクターを用いた組換えアデノウイルスベクターの作製方法を提供する。本発明の組換えアデノウイルスベクターの作製方法は、以下の工程（１）及び（２）を含有する；
（１）本発明のコスミドベクターを制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）工程で制限酵素消化したコスミドベクターで細胞を形質転換する工程。
工程（１）において用いる制限酵素は、アデノウイルスゲノム内には認識配列が存在せず、アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列を消化することの可能な制限酵素である。好ましくはＴＴＣＧＡＡを認識する制限酵素であるＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉが挙げられる。
工程（２）において用いる細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子を発現し、アデノウイルスを増殖させることに適した細胞であれば特に制限はない。そのような細胞の例として、ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）が挙げられる。
次に本発明の組換えアデノウイルスベクターの作製方法を以下に記載する。
まず、本発明のコスミドベクターを用いて、２９３細胞などの細胞を形質転換する。細胞を形質転換する方法に特に制限は無く、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ法、エレクトロポレーション法など既存の方法を用いることができる。形質転換した細胞を培養することにより、組換えアデノウイルスベクターが生成するが、生成したウイルスはクローニングすることが望ましい。クローニングの方法に特に制限は無く、生成したウイルスの増殖により出現したプラークを単離する方法や、形質転換した細胞をあらかじめ、限界希釈して９６穴プレート等にまき替える方法がある。生成したウイルスは、そのほとんどが目的のウイルスクローンであるので、任意のクローンを選び目的ウイルスとして用いることもできるが、ウイルスゲノムの制限酵素消化解析を行い、目的ウイルスの構造をしていることを確認したクローンを用いる方が望ましい。
本発明のコスミドベクターはまた、従来のＣＯＳ−ＴＰＣ法のコスミドカセット（コスミドベクター）として、組換えアデノウイルスベクターの作製に用いることができる。この場合、前記工程（１）のコスミドベクターを制限酵素で消化する工程は不要である。
本発明はまた、本発明のコスミドベクターを成分として含有する、組換えアデノウイルスベクター作製用試薬を提供する。本発明の試薬は、水または適当な緩衝液にコスミドベクターを溶解した形で提供される。当該緩衝液は、ＤＮＡを溶解、保持するのに適した緩衝液であれば特に制限は無いが、ＴＥバッファーを用いることが望ましい。
また前記試薬においては、本発明のコスミドベクターを環状のまま提供しても良いし、あらかじめＳｗａＩなどの制限酵素で消化したコスミドベクターとして提供しても良い。
本発明の試薬は、組換えアデノウイルス作製用のキットの一成分とすることができる。当該キット中の他の成分としては、組換えアデノウイルスを作製するために必須となる種々の試薬を挙げることができる。具体的には、制限酵素、制限酵素反応用バッファー、ＤＮＡリガーゼ、リガーゼ反応用バッファー、制限酵素消化済み末端タンパク質付きアデノウイルスゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ）等を挙げることができる。前記制限酵素としては、▲１▼アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列を消化する制限酵素（例えばＣｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉ）、および／または▲２▼Ｅ１遺伝子欠失部位に存在する制限酵素認識配列を消化する制限酵素（例えばＳｗａ  Ｉ）を挙げることができる。制限酵素消化済みＤＮＡ−ＴＰＣの例として、アデノウイルスＡｄ５−ｄｌＸ（Ｍｉｙａｋｅ  Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））のゲノムＤＮＡをＥｃｏＥ２２Ｉ消化したＤＮＡ−ＴＰＣや、組換えアデノウイルスＡｘＣＡｗｔ（Ｋａｎｅｇａｅ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２３，３８１６−３８２１（１９９５））のゲノムＤＮＡをＥｃｏＥ２２Ｉ及びＣｌａＩ消化したＤＮＡ−ＴＰＣ等が挙げられる。
（ＩＩ）本発明の第二の態様
前記本発明のコスミドベクターにおいて、ウイルスゲノムを切り出すための制限酵素認識配列が外来遺伝子内に存在する場合の解決手段の一つとして、従来のＣＯＳ−ＴＰＣ法のコスミドベクターとして用いれば良いことを既に説明したが、他の解決手段として、本発明者らは、ウイルスゲノムを切り出す制限酵素認識配列を複数有するコスミドベクターが有効に用いられることを明らかにした。すなわち従来は、アデノウイルスゲノムの両端に一種類の制限酵素認識配列のみを有するベクターしか知られておらず、またそれが常識となっていたところ、本発明者らは複数の制限酵素認識配列を導入できることを初めて見出した。このような複数の制限酵素認識配列の導入は、原理上コスミドベクターだけでなくプラスミドベクターにも応用することができる。
従って本発明は、以下の（１）〜（３）の特徴を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターを提供するものである：
（１）完全な塩基配列のアデノウイルス逆方向反復配列を含むアデノウイルスゲノムを含有する、
（２）アデノウイルスＥ１遺伝子領域を欠失している、
（３）アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を複数含有する。
ここで前記（１）〜（３）の各構成要素については前記本発明の第一の態様において述べたとおりであるため、ここでは前記（３）における「制限酵素認識配列を複数含有する」点についてのみ詳しく説明する。
アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列は、一つの制限酵素認識配列について左側、右側のいずれにも存在することを前提として、二種類以上何種類存在していても良い。
具体的な制限酵素認識配列としては、アデノウイルスゲノム中に存在しない制限酵素認識配列であれば如何なる配列であっても良いが、一例として、アデノウイルスゲノムの両側において、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  Ｉ、ＢｓｔＢ  Ｉにより認識される（以下単に制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されると略する場合がある）ＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩにより認識される（以下単に制限酵素ＣｌａＩにより認識されると略する場合がある）ＡＴＣＧＡＴ、から選択される少なくとも二種類の制限酵素認識配列を含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターが挙げられる。
好ましくは、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを少なくとも含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターや、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを少なくとも含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターが挙げられる。
前述のようにアデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列は、二種類以上何種類存在していても良いが、具体的には二種類の制限酵素認識配列を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクター、三種類の制限酵素認識配列を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクター、四種類の制限酵素認識配列を有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターが例示される。
アデノウイルスゲノムの両側において、該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を二種類含有する場合、その具体例としては、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴ、から選択される二種類の制限酵素認識配列を含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。
好ましい態様としては、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡを含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターが挙げられる。この場合、二つの制限酵素認識配列の配置に特に制限はなく、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）の配置が例示される：
（Ａ）ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｂ）Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−アデノウイルスゲノム−ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｃ）ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｄ）Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−ベクター配列の順に配置。
このうち特に、ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列の順に配置していることが望ましい。ウイルスゲノムを切り出す制限酵素部位がこのようなＣｓｐ４５Ｉ認識配列とＰａｃＩ認識配列の二つの場合、本発明のコスミドベクターに外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識配列としてはＳｗａＩ認識配列及びＣｌａＩ認識配列を用いることができる。
また、二種類の制限酵素認識配列を含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターの好ましい別の態様としては、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴを含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターが挙げられる。この場合も二つの制限酵素配列の配置に特に制限はなく、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）の配置が例示される：
（Ａ）ＣｌａＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＣｌａＩ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｂ）Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＣｌａＩ認識配列−アデノウイルスゲノム−ＣｌａＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｃ）ＣｌａＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−ＣｌａＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ベクター配列の順に配置、
（Ｄ）Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＣｌａＩ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＣｌａＩ認識配列−ベクター配列の順に配置。
このうち特に、ＣｌａＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＣｌａＩ認識配列の順に配置していることが望ましい。ウイルスゲノムを切り出す制限酵素認識配列がこのようなＣｓｐ４５Ｉ認識配列とＣｌａＩ認識配列の二つの場合、本発明のコスミドベクターに外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識配列としてはＳｗａＩ認識配列及びＰａｃＩ認識配列を用いることができる。
アデノウイルスゲノムの両側において、該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を三種類含有する場合、その具体例としては、（ａ）制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉにより認識されるＴＴＣＧＡＡ、（ｂ）制限酵素ＰａｃＩにより認識されるＴＴＡＡＴＴＡＡ、および（ｃ）制限酵素ＣｌａＩにより認識されるＡＴＣＧＡＴの三種類の制限酵素認識配列を含有するコスミドベクターまたはプラスミドベクターを挙げることができる。三種類の制限酵素認識配列の配置に特に制限はなく、前記二種類の制限酵素認識配列の場合と同様にどのような組み合わせ（３６通り）をとることも可能であるが、その例としてはＣｌａＩ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列−ＰａｃＩ認識配列−ＣｌａＩ認識配列−ベクター配列の順に配置されたコスミドベクターが挙げられる。この場合、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識配列としてＳｗａＩ認識配列を用いることができる。
ウイルスゲノムを切り出すための制限酵素認識配列を複数有する本発明のコスミドベクターにおいて、アデノウイルスゲノムに最も近い制限酵素認識配列だけでなく、ウイルスゲノム端から約二十塩基離れた位置に存在する制限酵素認識配列でコスミドベクターを切断しても、目的の組換えアデノウイルスベクターが十分に得られることは、実施例７より明らかである。
なお実施例７は、アデノウイルスゲノム端から離れた位置に存在する制限酵素認識配列でコスミドを切断してもアデノウイルスベクターが得られることを示すためのモデル系であるので、ウイルスゲノムを切り出すための制限酵素認識配列として、ＳｗａＩ認識配列、ＣｌａＩ認識配列、ＰａｃＩ認識配列、およびＣｓｐ４５Ｉ認識配列を有している。すなわちこれは、４種類の制限酵素認識配列が存在している場合であっても、アデノウイルスゲノムの両側から最も離れた位置に存在する制限酵素認識配列で切断して所望のアデノウイルスベクターが得られることを示すものであるが、実際の外来遺伝子挿入用コスミドベクターにおいては、ウイルスゲノムを切り出すための制限酵素認識配列からはＳｗａＩ認識配列を除き、外来遺伝子のクローニングのため、Ｅ１遺伝子欠失部位にＳｗａＩ認識配列を挿入しておくのが望ましい。
前述のように、アデノウイルスゲノムを切り出す制限酵素認識配列を複数有するベクターは、コスミドベクターに限定される必要はなく、プラスミドベクターにも応用可能である。すなわち、アデノウイルスゲノム全長をクローン化したプラスミドベクターやコスミドベクターを制限酵素で消化し、ウイルスゲノムを切り出した後に細胞を形質転換し、アデノウイルスを作製する原理に基づく方法（クローン化ゲノム導入法）全般に応用することができる。
例えば、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）が販売している当該方法に基づいた組換えアデノウイルス作製用プラスミドベクター（Ａｄｅｎｏ−Ｘ  ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、ウイルスゲノムの切り出しにＰａｃＩ認識配列が用いられているが、ベクターに挿入した外来遺伝子内にＰａｃＩ認識配列が存在する場合は、ＰａｃＩの部分消化を行うよう指示されている。しかし、一般に制限酵素の部分消化は条件設定が難しく、完全消化に較べると、部分消化で目的の箇所だけが切れたＤＮＡが生成する割合は極めて低い。従って、上記アデノウイルス作製用プラスミドベクターをＰａｃＩで部分消化しても、外来遺伝子内のＰａｃＩ認識配列では切断されずアデノウイルスゲノム両端のＰａｃＩ認識配列が切断されたＤＮＡの存在割合は非常に低いので、当該ＤＮＡで細胞を形質転換しても目的の組換えアデノウイルスベクターが得られる可能性は極めて低い。
このような場合、ＰａｃＩ認識配列だけでなく、アデノイルスゲノムを切り出すための第二、第三の制限酵素認識配列が存在する本発明のプラスミドベクターを用いれば、効率の悪い部分消化を行う必要がなく、この第二または第三の制限酵素認識配列で切断すれば良いので、効率的にアデノウイルスベクターの作製を行うことができる。そのような制限酵素認識配列は、アデノウイルスゲノム部分に認識配列が存在しない制限酵素認識配列であれば特に制限はなく、その例については前記したとおりである。好ましくはＰａｃＩ認識配列（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）、Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列（ＴＴＣＧＡＡ）およびＣｌａＩ認識配列（ＡＴＣＧＡＴ）のうち、少なくとも２つの制限酵素認識配列を有するプラスミドベクターが挙げられる。
以上に述べたような、アデノウイルスゲノムの両側に該アデノウイルスゲノム中には存在しない制限酵素認識配列を複数含有する本発明のベクター（コスミドベクター、プラスミドベクター）に関しても、前記本発明の第一の態様において述べたとおり、ｃＤＮＡやプロモーターなどの外来遺伝子が挿入できるように、アデノウイルスゲノム中に存在しない制限酵素認識配列がＥ１遺伝子領域欠失部位に存在することが好ましい。当該制限酵素認識配列としては、平滑末端を生じさせる制限酵素認識配列であることが好ましく、具体的にはＳｗａ  Ｉ認識配列（ＡＴＴＴＡＡＴ）が挙げられる。
前記Ｅ１遺伝子領域欠失部位は、さらに、外来遺伝子を発現させるプロモーターを含有していても良い。ここでプロモーターとは、所望の外来遺伝子の転写を行うために必要な塩基配列のことを言い、哺乳動物の細胞で機能するプロモーターであれば、動物ウイルス由来プロモーターや哺乳動物細胞由来プロモーター、または両者のハイブリッドプロモーターなど、特に制限なく用いることができる。プロモーターの例として、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモータなどが挙げられるが、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ  Ｈ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００．（１９９１））やＥＦ−１αプロモーター（Ｋｉｍ  Ｄ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．９１，２１７−２２３．（１９９０））、ならびにＣＭＶプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ．ａｌ．Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４５，１０１−１０５．（１９８６））など特に高発現とされているプロモーターを用いるのが好ましい。
本発明の第二態様のベクターがコスミドベクターの場合、アデノウイルスゲノム以外に、少なくとも、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、およびＣＯＳ領域を含有する。また、スペーサー配列も含有するのがより望ましい。これら各構成要素については前記本発明の第一の態様において述べたとおりである。
当該コスミドベクターにおいて、薬剤耐性遺伝子および複製オリジンは、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲとスペーサー配列との間に位置することが望ましい。すなわち、薬剤耐性遺伝子および複製オリジンが、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲとスペーサー配列との間に位置することにより、本発明のコスミドベクターに所望の外来遺伝子を挿入した後、外来遺伝子の挿入部位はコスミドベクターと全く同じ塩基配列を保持したまま、アデノウイルスゲノムの大部分及び、スペーサー領域ならびにＣＯＳ領域を除いたプラスミドを容易に作製することができる（アデノ落とし）。
なお、この操作を簡便に行うため、Ｅ１遺伝子領域の左側（ＩＴＲ／パッケージングシグナル側）から薬剤耐性遺伝子ならびに複製オリジンまでの間には存在しない制限酵素認識部位を、Ｅ１遺伝子領域の外来遺伝子挿入部位の右側（ＩＶａ２遺伝子側）に付加しておくことが望ましい。そのような制限酵素の例として、前述したｐＢＲ３２２由来のスペーサー配列内にも認識配列が存在するＳａｌＩやＮｒｕＩが挙げられる。
前記薬剤耐性遺伝子および複製オリジンは、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲの外側から右端ＩＴＲに向け、薬剤耐性遺伝子、複製オリジンの順序で含有されていても良いし、また複製オリジン、薬剤耐性遺伝子の順序で含有されていても良い。従って薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列およびＣＯＳ領域が、アデノウイルスゲノムの左端ＩＴＲの外側から右端ＩＴＲに向けてどのような順序で含有されるかについては、以下の▲１▼〜▲４▼が例示される：
▲１▼薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列、ＣＯＳ領域。
▲２▼複製オリジン、薬剤耐性遺伝子、スペーサー配列、ＣＯＳ領域。
▲３▼薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、ＣＯＳ領域、スペーサー配列。
▲４▼複製オリジン、薬剤耐性遺伝子、ＣＯＳ領域、スペーサー配列。
このうち特に、薬剤耐性遺伝子、複製オリジン、スペーサー配列およびＣＯＳ領域をこの順序で含有するコスミドベクターが好ましい。
以上のような本発明の第二態様のコスミドベクターを用いることにより、組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。これに関しても前記本発明の第一の態様において述べたとおりであり、具体的には、以下の工程（１）及び（２）を含有する；
（１）本発明のコスミドベクターを制限酵素で消化する工程、
（２）前記（１）工程で制限酵素消化したコスミドベクターで細胞を形質転換する工程。
工程（１）において用いる制限酵素は、アデノウイルスゲノム内には認識配列が存在せず、アデノウイルスゲノムの両側に存在する制限酵素認識配列を消化することの可能な制限酵素である。例えばアデノウイルスゲノムの両側に存在するＴＴＣＧＡＡで消化する場合は制限酵素Ｃｓｐ４５  Ｉ、ＢｓｐＴ１０４  ＩまたはＢｓｔＢ  Ｉを用い、ＴＴＡＡＴＴＡＡで消化する場合はＰａｃＩを用い、ＡＴＣＧＡＴで消化する場合はＣｌａＩまたはＢｓｐＤＩを用いる。
工程（２）において用いる細胞は、アデノウイルスＥ１遺伝子を発現し、アデノウイルスを増殖させることに適した細胞であれば特に制限はない。そのような細胞の例として、ヒト胎児腎臓由来細胞株２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）が挙げられる。
以上のようなコスミドベクターおよび細胞を用いた組換えアデノウイルスベクターの作製方法についても前記本発明の第一の態様において述べたとおりである。また、ベクターがプラスミドベクターである場合も、前記コスミドベクターと同様にして組換えアデノウイルスベクターを作製することができる。
これらコスミドベクターおよびプラスミドベクターに関しても組換えアデノウイルスベクター作製用の試薬の成分とすることができる。具体的な態様については前記本発明の第一の態様において述べたとおりである。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞等を取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら編、第２版（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」に記載の方法に準じて行った。
【実施例１】−アデノウイルスゲノム両端を完全長にしたコスミドベクターの作製−
▲１▼ｐＡｘｃｗ（特開平８−３０８５８５号公報１５頁のｐＡｄｅｘｌｃｗはｐＡｘｃｗと同一である）は、ヒトアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むが、Ｅ１およびＥ３遺伝子領域ならびにアデノウイルスゲノムの左端から３３ｂｐと右端から１９８ｂｐを欠失した（両端欠失型）コスミドベクターである（図２Ａ及び図３（Ａ）参照）。ｐＡｘｃｗをＳａｌＩ消化後、自己ライゲーションし、アデノウイルスゲノム左端から約０．４ｋｂの部分以外のアデノウイルスゲノムを除いたプラスミドｐｘｃｗｓ（３．１ｋｂ、図３（Ｂ））を作製した。
▲２▼完全長の左端ＩＴＲを含むプラスミドを作製するため、以下の操作を行った。
（ａ）プラスミドｐｘｃｗｓをＢａｍＨＩ及びＢｓｒＧＩ消化し、ｏｒｉを含む約２．９ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
（ｂ）プラスミドｐｘｃｗｓをＨａｅＩＩＩ及びＢｓｒＧＩ消化し、ＩＴＲを含む１６２ｂｐのＤＮＡ断片（ｂ）を得た。
（ｃ）アデノウイルス５型ゲノム左端部分を含み、かつアニーリングした時に、片方の末端がＢａｍＨＩ消化断片と結合可能で、他方が平滑末端になるように設計した以下の２つのオリゴＤＮＡを合成し、その５’末端をリン酸化後アニーリングしたＤＮＡ断片を得た。
2004094643.tif 000003
（大文字はアデノウイルスゲノム部分の塩基配列を表す）
（ａ）（ｂ）（ｃ）の三断片をライゲーションし、完全長の左端ＩＴＲを含むプラスミドｐｙｔｃｗ（３．１ｋｂ、図３（Ｃ））を作製した。
▲３▼プラスミドｐｙｔｃｗにＣｓｐ４５Ｉ部位を導入するため、以下の操作を行った。プラスミドｐｙｔｃｗをＥｃｏＴ２２Ｉで消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で３’突出末端を平滑化した。このＤＮＡ断片と、Ｃｓｐ４５Ｉ認識配列を含みかつ５’末端をリン酸化した合成リンカー（５’−ＴＧＴＴＣＧＡＡＣＡ−３’）をライゲーションし、リンカーが一つのみ挿入されたプラスミドｐｙｃｔｃｗｓ（３．１ｋｂ、図３（Ｄ））を得た。
▲４▼プラスミドｐｙｃｔｃｗｓをＳｗａＩ及びＥｃｏＲＩ消化し、完全長左端ＩＴＲ及びパッケージングシグナルを含む４８２ｂｐのＤＮＡ断片（ａ）を調製した。一方、コスミドベクターｐＡｘｃｗをＥｃｏＲＩ消化し、ｏｒｉ及びＣＯＳ領域を含む約１８ｋｂのＤＮＡ断片（ｂ）を調製した。また、ｐＡｘｃｗをＳｗａＩ及びＥｃｏＲＩ消化し、ＣＯＳ領域を含まない側の約２４ｋｂのＤＮＡ断片（ｃ）を調製した。（ａ）（ｂ）（ｃ）の三断片をライゲーションし、コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔｈ（４２．５ｋｂ、図４（Ｅ））を得た。ｐＡｘｃｗｉｔｈは、ゲノム右端側はＩＴＲを含む１９８ｂｐを欠失しているものの、左端ＩＴＲは完全長であるコスミドベクターである。
▲５▼プラスミドｐｄｌｘは、アデノウイルス５型ゲノムの７６マップ単位のＥｃｏＲＩ部位からゲノム右端付近までを含むプラスミドである（Ｓａｉｔｏ  Ｉ．ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５４，７１１−７１９．（１９８５））。ｐｄｌｘをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ消化し、アデノウイルスゲノム右端側を含む約１ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイト内のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＵＡＦ９７Ｒ（３．７ｋｂ、図４（Ｆ））を得た。
▲６▼プラスミドｐＵＡＦ９７ＲをＢａｍＨＩ及びＡｏｒ５１ＨＩ消化し、ｏｒｉを含む約３．３ｋｂのＤＮＡ断片（ａ）を調製した。また、ｐＵＡＦ９７ＲをＡｏｒ５１ＨＩ及びＨｈａＩ消化し、ｏｒｉを含まない３７５ｂｐのＤＮＡ断片（ｂ）を調製した。一方、▲２▼で作製したプラスミドｐｙｃｔｃｗｓをＢａｍＨＩ及びＨｈａＩ消化し、ＩＴＲの一部を含む８３ｂｐのＤＮＡ断片（ｃ）を調製した。（ａ）（ｂ）（ｃ）の三断片をライゲーションし、プラスミドｐＵＡＦ９７Ｒｃｔ（３．７ｋｂ、図４（Ｇ））を得た。
▲７▼プラスミドｐＵＡＦ９７ＲｃｔをのＢｓｔＥＩＩ−ＢａｍＨＩ部位間の７１３ｂｐの領域を、プラスミドｐｄｌｘのＢｓｔＥＩＩ−ＢａｍＨＩ部位間と入れ替え、プラスミドｐｄｌｘｃｔ（９．０ｋｂ、図５（Ｈ））を作製した。ｐｄｌｘｃｔは完全長右端ＩＴＲを有するプラスミドである。
▲８▼コスミドベクターｐＡｘ４ｗ（図５（Ｉ））は、アデノウイルスＥ４遺伝子の上流と右端ＩＴＲとの間に外来遺伝子の挿入部位を有するベクターである（Ｍｉｙａｋｅ  Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））。ｐＡｘ４ｗをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化し、ｏｒｉ及びＣＯＳ領域を含む約１１ｋｂのＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐｄｌｘｃｔをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化し、ｏｒｉを含まない６．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。両断片をライゲーションし、プラスミドｐｃｄｌｘｃｔ（１８．１ｋｂ、図５（Ｊ））を得た。
▲９▼コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔｈ（▲４▼で作製）をＥｃｏＲＩ消化し、左端ＩＴＲを含む約２４．６ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をプラスミドｐｃｄｌｘｃｔのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ（４２．６ｋｂ、図５（Ｋ））を作製した。ｐＡｘｃｗｉｔは、左端ＩＴＲおよび右端ＩＴＲとも完全長であるコスミドベクターである。
【実施例２】−発現単位を挿入したコスミドベクターの作製−
（１）サンゴ由来赤色蛍光タンパク質の発現単位を挿入したコスミドベクターの作製
コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（図６（Ａ））は、ｐＡｘｃｗと同じアデノウイルスゲノム構造を有し（両端欠失型）、かつＥ１遺伝子欠失部位にＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ  Ｈ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００．（１９９１）および日本特許第２８２４４３４号）が左向き（Ｅ１遺伝子の転写方向の逆向き）に挿入されたベクターである（Ｋａｎｅｇａｅ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２３，３８１６−３８２１（１９９５））。ｐＡｘＣＡｗｔには、ＣＡＧプロモーターとポリＡ付加配列との間に外来遺伝子を挿入するためＳｗａＩ部位が存在する。
サンゴ由来赤色蛍光タンパク質（ＲｅｄＥ）をコードする遺伝子は、市販プラスミドｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（クローンテック社）より調製した。ｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−ＥｘｐｒｅｓｓをＮｏｔＩ及びＡｏｒ５１ＨＩ消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で両端を平滑化し、ＲｅｄＥ遺伝子を含む７１３ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ部位に挿入し、ＲｅｄＥ発現単位が挿入されたコスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥ（４５．５ｋｂ、両端欠失型、図２Ａ参照）を作製した。
次いで、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥをＳａｌＩ及びＰｍｅＩ消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化し、ＲｅｄＥ発現単位を含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、実施例１で作製したコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔｈのＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔｈ（４５．５ｋｂ、左端完全型、図２Ｂ参照）を作製した。同様に、ＲｅｄＥ発現単位を含むＤＮＡ断片をコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔのＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ（４５．５ｋｂ、両端完全型、図２Ｃ参照）を作製した。
（２）クラゲ由来緑色蛍光タンパク質の発現単位を挿入したコスミドベクターの作製
プラスミドｐｘＣＡＥＧＦＰは、ＣＡＧプロモーターの下流にクラゲ由来緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が連結されたベクターである（Ｎａｋａｎｏ  Ｍ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２９，ｅ４０（２００１））。ｐｘＣＡＥＧＦＰをＳａｌＩ及びＰｍｅＩ消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑化し、ＧＦＰ発現単位を含む約３．１ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、コスミドベクターｐＡｘｃｗ（両端欠失型）のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰ（４５．６ｋｂ）を作製した。同様に、ＧＦＰ発現単位を含むＤＮＡ断片をコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ（両端完全型）のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔ（４５．６ｋｂ）を作製した。
（３）ＣＡＧプロモーター下流に任意の遺伝子を挿入するためのコスミドベクターの作製
コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（両端欠失型、図６（Ａ））をＢｓｒＧＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ消化し、ＣＡＧプロモーターを含む約５．１ｋｂのＤＮＡ断片（ａ）を得た。一方、コスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ（両端完全型、図６（Ｂ））をＢｓｒＧＩ及びＳｒｆＩ消化し、ｏｒｉ及びＣＯＳ領域を含む約１８ｋｂのＤＮＡ断片（ｂ）を得た。また、ｐＡｘｃｗｉｔをＢｓｔＺ１７Ｉ及びＳｒｆＩ消化し、ｏｒｉを含まない約２２ｋｂのＤＮＡ断片（ｃ）を得た。（ａ）（ｂ）（ｃ）の三断片をライゲーションし、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔｉｔ（４５．０ｋｂ、図６（Ｃ））を作製した。ｐＡｘＣＡｗｔｉｔは、アデノウイルスゲノム両端部分以外は、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ（両端欠失型）と同じ構造であり、ＣＡＧプロモーターとポリＡ付加配列との間のＳｗａＩ部位またはＣｌａＩ部位に外来遺伝子を挿入することができるコスミドベクターである。
【実施例３】−アデノウイルスゲノムの大部分を除いたプラスミドの作製及び挿入遺伝子の発現確認−
（１）アデノウイルスゲノムの大部分を除いたプラスミドの作製
実施例２で作製したコスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ及びｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔには、ＣＡＧプロモーターの上流すぐの所とスペーサー領域内に制限酵素ＳａｌＩ部位ならびにＮｒｕＩ部位が存在するので、コスミドベクターをこれらの制限酵素で消化後自己ライゲーションすることにより、アデノウイルスゲノムの大部分を除いた（左端から約０．４ｋｂは存在する）プラスミドを作製することができる。
まず、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔをＳａｌＩ消化後、自己ライゲーションさせたＤＮＡで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アデノウイルスゲノムの大部分及びスペーサー領域を除いたプラスミドｐｘＣＡＲｅｄＥｉｔ（６．１ｋｂ）を作製した。
同様に、コスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔをＳａｌＩ消化後自己ライゲーションすることにより、プラスミドｐｘＣＡＧＦＰｉｔ（６．２ｋｂ）を作製した。
（２）赤色蛍光タンパク質の発現確認
コスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔにおいて、サンゴ由来赤色蛍光タンパク質（ＲｅｄＥ）の発現単位が正確に組み込まれていることを確認するため、（１）で作製したプラスミドｐｘＣＡＲｅｄＥｉｔで細胞を形質転換し、ＲｅｄＥの発現確認を行った。
まず、血清を含まないダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）１ｍｌに、プラスミドｐｘＣＡＲｅｄＥｉｔ３μｇとＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）９μｌを加え、よく混合後室温で１５分放置した。次いで、コラーゲンコート６穴プレートでほぼコンフルエントに培養した２９３細胞の培地を除き、上記プラスミド／試薬の混合物全量を加え、３７℃で１時間培養後、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地２ｍｌを加え、１６時間培養後培地交換を行い、さらに培養した。形質転換の２日後、蛍光顕微鏡で赤色の蛍光を観察（励起波長５５８ｎｍ／放射波長５８３ｎｍ）したところ、多数の細胞で赤色の蛍光が認められたことより、コスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔはＲｅｄＥ発現単位が正確に組み込まれていることを確認した。
【実施例４】−コスミドベクター単独での形質転換による組換えアデノウイルスベクターの作製−
実施例２で作製したコスミドベクターｐＡｘＣＡＲｅｄＥ（両端欠失型）、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔｈ（左端完全型）、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ（両端完全型）、ｐＡｘＣＡＧＦＰ（両端欠失型）、ｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔ（両端完全型）を大量に調製し、おのおの３０μｇを制限酵素Ｃｓｐ４５Ｉ（ＴＯＹＯＢＯ）で３７℃、２時間消化した。反応液の一部をアガロース電気泳動し、ＤＮＡが完全に消化されたことを確認後、反応液をフェノール／クロロホルム抽出し、次いでクロロホルム抽出を２回行った後、エタノール沈殿した。エタノール沈殿後のＤＮＡをＴＥバッファー６０μｌに溶解し、その１μｌをアガロース電気泳動し、１．５ｋｂのバンドの濃さを濃度既知のＤＮＡのバンドと比較することによりＤＮＡ濃度を算定し、形質転換に用いた。
まず、血清を含まないダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）２ｍｌに、Ｃｓｐ４５Ｉ消化したコスミドＤＮＡ１０μｇとＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）トランスフェクション試薬３０μｌを加え、よく混合後室温で１５分放置した。なお、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔについては、Ｃｓｐ４５Ｉ消化せず、環状のままのコスミドも形質転換に用いた。６ｃｍシャーレにほぼコンフルエントになった２９３細胞から培地を除き、上記プラスミド／試薬の混合物全量を加え、３７℃で１時間培養後、５％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭ培地（以後単に培地と呼ぶ）３ｍｌを加え、さらに培養を続けた。１６時間後、培地交換を行い、シャーレから細胞を剥がし培地１１ｍｌに縣濁した。これとは別に、形質転換していない２９３細胞（６ｃｍシャーレ）を用意し、細胞を剥がし培地１０ｍｌに縣濁した。形質転換した細胞１１ｍｌのうち１．１ｍｌを形質転換していない細胞９ｍｌと混合し、コラーゲンコートされた９６穴プレート１枚に１００μｌ／ウェルずつ分注した（１０倍希釈プレート）。形質転換した残りの細胞も、同様に９６穴プレート１枚に１００μｌ／ウェルずつ分注した（１倍希釈プレート）。各々のプレートは５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養し、５日後および１０日後に培地５０μｌを添加した。
形質転換３日目以降、連日、細胞変性の有無を観察すると共に、ＲｅｄＥの発現単位を搭載したコスミドベクター（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥ、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔｈ、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ）で形質転換した細胞は、赤色の蛍光を発するＲｅｄＥタンパク質が発現しているかどうか蛍光顕微鏡で観察した（励起波長５５８ｎｍ／放射波長５８３ｎｍ）。ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔで形質転換した細胞では、ＲｅｄＥタンパク質の発現が確認された。ただし、その時期はクローンにより異なり、形質転換５日ないし６日後の比較的早い時期から発現が認められたクローンと、形質転換８日から１０日後の比較的遅い時期に初めて発現が認められたクローンが存在した。そこで、前者から５クローン、後者から４クローンを任意に選び、それぞれ細胞変性が完全に起きてから、細胞縣濁液を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心チューブに回収し、密閉型超音波破砕機で破砕後（２００Ｗ、３０秒ｘ３回）、マイクロ遠心機で遠心し（５，０００ｒｐｍ、５分）、その上清をウイルス液として回収した。
一方、コラーゲンコートした２４穴プレートにほぼコンフルエントとなった２９３細胞を用意し、約１００μを残して培地を除き、回収したウイルス液１０μｌを加え、３７℃で１時間、ウイルスを感染させた後、培地０．４ｍｌを加え、３７℃で培養した。細胞が完全に変性した３日から４日後に、細胞画分を回収し、１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを含むＴＮＥバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）４００μｌで細胞をよく縣濁後、１０％  ＳＤＳ  ４μｌを添加し、５０℃、２時間加温した。次いで、フェノール／クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を各々２回行った後、エターノール沈殿し、沈殿後のＤＮＡを２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡを含むＴＥバッファー５０μｌに溶解した。最後に、回収したＤＮＡを制限酵素ＳｍａＩまたはＣｌａＩで消化後、アガロース電気泳動を行い、目的の組換えアデノウイルスが出来ているかどうかを確認した（図７）。
図７の下段に制限酵素消化により生じるバンドのサイズを模式的に示したが、目的の組換えアデノウイルスが生成していると、ＣｌａＩ消化により、ウイルスゲノム左端を含む約０．４５ｋｂのバンドと発現単位由来の約１．７ｋｂ、０．７４ｋｂ、０．５７ｋｂのバンドが生じる。一方、ＳｍａＩ消化では、ウイルスゲノム右端を含む０．５８ｋｂのバンドが生じる。アガロースゲル電気泳動の写真に示したように、ＲｅｄＥタンパク質の発現が早期に認められた５クローンならびに比較的後期に認められた４クローンとも、ＣｌａＩ消化及びＳｍａＩ消化において、全て予想通りのバンドが生じたことより、本発明の両端完全型のコスミドベクターを用いることにより、ほぼ１００％の頻度で目的の組換えアデノウイルスが得られることが示された。
次に、両端欠失型（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥ）、左端完全型（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔｈ）、両端完全型（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ）のコスミドベクターにより得られた組換えアデノウイルスのクローン数を比較した。実験は２回行い、１回目は全てＣｓｐ４５Ｉで消化したコスミドＤＮＡを用いて形質転換を行った。両端欠失型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥ）及び左端完全型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔｈ）では組換えアデノウイルスは全く得られなかったが、両端完全型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ）では、コスミドＤＮＡ１０μｇ当たり３４０クローンと十分な数の組換えアデノウイルスが得られた（表１）。実験２では、両端完全型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ）をＣｓｐ４５Ｉ消化せず環状のまま形質転換する群も加えたが、Ｃｓｐ４５Ｉ消化しない場合は組換えアデノウイルスは全く得られなかったことより、両端完全型コスミドを制限酵素消化しアデノウイルスゲノム部分を直鎖状にしてから形質転換する必要があることが示された（表１）。
さらに、他の遺伝子（ＧＦＰ）を挿入したコスミドベクターを用いて検討を行った。両端欠失型コスミド（ｐＡｘＣＡＧＦＰ）または両端完全型コスミド（ｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔ）１０μｇを、前述したＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）トランスフェクション試薬またはＣｅｌｌＰｈｅｃｔトランスフェクションキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて２９３細胞を形質転換した。ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔの場合と同様の操作で、形質転換細胞を希釈して９６穴プレートにまき替え、生じた組換えアデノウイルスクローン数を計測した。結果を表１に示したが、両端欠失型コスミドで形質転換を行った場合には組換えアデノウイルスは全く得られず、両端完全型コスミドで形質転換した場合のみ、コスミドＤＮＡ１０μｇ当たり５０ないし８０クローンと十分な数の組換えアデノウイルスが得られた。さらに、このうち１０クローンを、ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔの場合と同様、ゲノムＤＮＡの制限酵素消化により、生じたクローンのアデノウイルスゲノム構造を解析した。データは省略するが、全てのクローンが目的の組換えアデノウイルスであることが確認できた。
以上の結果より、本発明の両端完全型コスミドベクターは、所望の遺伝子を搭載した組換えアデノウイルスベクターを効率良く作製できることが示された。
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【実施例５】−ＣＯＳ−ＴＰＣ法による組換えアデノウイルスベクターの作製−
両端完全型コスミドベクターが、末端タンパク質付きアデノウイルスゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ）とコスミドベクターとの相同組換え法（ＣＯＳ−ＴＰＣ法）にも適用できることを確認するため、以下の実験を行った。
ＤＮＡ−ＴＰＣは市販の組換えアデノウイルス作製キット（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ、タカラバイオ社、＃６１５０）に添付されているＤＮＡ−ＴＰＣを用いた。両端欠失型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥ）または両端完全型コスミド（ｐＡｘＣＡＲｅｄＥｉｔ）８μｇとキット添付の制限酵素処理済ＤＮＡ−ＴＰＣ  ５μｌとを、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）トランスフェクション試薬またはＣｅｌｌＰｈｅｃｔトランスフェクションキットを用いて、実施例４に示した方法で２９３細胞を形質転換し、翌日に細胞を９６穴プレートにまき替え、細胞変性が生じたウェル数より、生成した組換えアデノウイルス数を計算した。結果を表２に示す。両端完全型コスミドを用いた場合でも、従来の両端欠失型コスミドを用いた場合とほぼ同数の組換えアデノウイルスが得られたことより、本発明の両端完全型コスミドはＣＯＳ−ＴＰＣ法による組換えアデノウイルスベクター作製にも使用できることが確認された。
なお、ＣＯＳ−ＴＰＣを用いたにもかかわらず、生成した組換えアデノウイルス数はコスミド単独で形質転換した場合（表１）と差は無かった。本発明者らによるＣＯＳ−ＴＰＣ法のこれまでの実績では、コスミドＤＮＡ  １０μｇ当たり、約１０００クローンの組換えアデノウイルスが生成する（Ｍｉｙａｋｅ  Ｓ．ｅｔ．Ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，１３２０−１３２４．（１９９６））ので、原因は不明であるが、コスミド単独で形質転換した場合と差が無かったのは、今回のＣＯＳ−ＴＰＣ法での組換えアデノウイルス生成効率が低かったためと考えられる。
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【実施例６】−アデノウイルスゲノム両端に複数の制限酵素認識部位を付加したコスミドベクターの作製−
▲１▼実施例２で用いたＣＡＧプロモーター下流にＧＦＰ遺伝子が挿入されたプラスミドｐｘＣＡＥＧＦＰ（図８（Ｌ））をＡｓｅＩ及びＣｌａＩ消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で両端を平滑化し、ＧＦＰ遺伝子を含む７７３ｂｐのＤＮＡ断片を調製した。一方、プラスミドｐＣＡｗＧ（図８（Ｍ））は、ＣＡＧプロモーターを含むプラスミドｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０８，１９３−２００（１９９１））のクローン化部位であるＥｃｏＲＩ部位をＳｗａＩ部位に変えたプラスミドｐＣＡＧｗ（特開平８−８４５８９号公報１０頁）と同一のプラスミドである。前記７７３ｂｐのＤＮＡ断片をｐＣＡｗＧのＳｗａＩ部位に挿入し、ＧＦＰ遺伝子がプロモーターと同方向に挿入されたプラスミドｐＣＡＧＦＰｄｃ（５．６ｋｂ、図８（Ｎ））を得た。
▲２▼実施例１で作製したコスミドベクターｐＡｘｃｗｉｔ（図５（Ｋ）及び図８（Ｋ））のＳｗａＩ部位及びＣｌａＩ部位を欠失させ、かつＧＦＰ発現単位を挿入したコスミドベクターを作製するため、以下の操作を行った。プラスミドｐＣＡＧＦＰｄｃをＨｉｎｄＩＩＩ消化後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で末端を平滑化し、ＳａｌＩリンカー（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＣ）を結合し、次いでＳａｌＩ部位と同じ塩基配列を認識するＡｃｃＩで消化し、ＧＦＰ発現単位を含む約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。ＡｃｃＩ消化断片はＣｌａＩ消化断片と同じ突出末端を生じるので、両断片は結合可能である。そこで、ｐＡｘｃｗｉｔをＣｌａＩ消化し、先ほどの約３．０ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションし、ＧＦＰ発現単位が左向き（Ｅ１遺伝子の転写方向の逆向き）に挿入されたコスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐ（４５．６ｋｂ、図８（Ｏ））を得た。
▲３▼コスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐに３ヶ所存在するＣｓｐ４５Ｉ部位のうち、ＣＯＳ領域近傍のＣｓｐ４５Ｉ部位を欠失させるため、ｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐをＣｓｐ４５Ｉで部分消化し、次いでＫｌｅｎｏｗ酵素で末端を平滑化後、自己ライゲーションし、ＣＯＳ領域近傍のＣｓｐ４５Ｉ部位のみが欠失したコスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐ２ｂ（４５．６ｋｂ、図８（Ｐ））を得た。
▲４▼アデノウイルスゲノム両端のＣｓｐ４５Ｉ部位の外側に、さらにＳｗａＩ部位−ＣｌａＩ部位−ＰａｃＩ部位を有するコスミドベクターを作製するため、以下の操作を行った。
（１）ＳｗａＩ部位、ＣｌａＩ部位、ＰａｃＩ部位をこの順に含み、かつアニーリングした時に両端とも５’末端側が２塩基突出し、Ｃｓｐ４５Ｉ消化断片と結合できるように設計した以下の２つのオリゴＤＮＡを合成し、その５’末端をリン酸化後アニーリングし、合成ポリリンカーを調製した（図９）。
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このポリリンカーは両末端ともにＣｓｐ４５Ｉ消化断片と結合可能であるが、ＰａｃＩ部位側の末端がＣｓｐ４５Ｉ消化断片と結合した場合のみＣｓｐ４５Ｉ部位が再生する。
（２）コスミドベクターｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐ２ｂをＣｓｐ４５Ｉ消化し、アデノウイルスゲノムを含む約３４ｋｂのＤＮＡ断片とアデノウイルスゲノムを含まない約１１．４ｋｂのＤＮＡ断片とに切断し、両ＤＮＡ断片を混合したまま（１）で調製した合成ポリリンカーを大過剰（モル比１５０倍）加え、ライゲーションした。両ＤＮＡ断片の両端に複数コピー結合したポリリンカーを除くため、ライゲーション後のＤＮＡをＣｌａＩ消化後、電気泳動により両ＤＮＡ断片に結合していない短いＤＮＡを除いた。この操作により、両端がＣｌａＩ消化断片で、その内側にＳｗａＩ部位またはＰａｃＩ部位を有する約３４ｋｂまたは１１．４ｋｂのＤＮＡ断片が生じる。最後に両ＤＮＡ断片をライゲーションし、アデノウイルスゲノム部分、アンピシリン耐性遺伝子、大腸菌複製オリジン及びＣＯＳ領域はｐＡｘＣＡＧＦＰｉｔｄｃｐ２ｂと同じ位置関係に配置され、かつＳｗａＩ部位−ＣｌａＩ部位−ＰａｃＩ部位−Ｃｓｐ４５Ｉ部位−アデノウイルスゲノム−Ｃｓｐ４５Ｉ部位−ＰａｃＩ部位−ＣｌａＩ部位−ＳｗａＩ部位の順に制限酵素認識部位が配置されたコスミドベクターｐｓｂＡｘＧｂｓ（４５．７ｋｂ、図９（Ｑ））を得た。
【実施例７】−異なる制限酵素部位で消化したコスミドベクターを用いたアデノウイルスベクター生成効率の比較−
実施例６で作製したコスミドベクターｐｓｂＡｘＧｂｓを制限酵素Ｃｓｐ４５ＩまたはＣｌａＩあるいはＳｗａＩ消化し、各々１０μｇのＤＮＡを用い、実施例４に示した方法で２９３細胞を形質転換後（ＴｒａｎｓＦａｓｔ使用）、細胞を９６穴プレートにまき替えた。１７日後に、組換えアデノウイルスの生成による細胞変性を伴い、かつＧＦＰを発現している細胞の割合が７５％以上のウェルを数え、生成したウイルスクローン数とした。
実験は２回行い、１回目はＣｓｐ４５ＩまたはＳｗａＩで消化したコスミドを用い、２回目はＣｓｐ４５Ｉ、ＣｌａＩ、ＳｗａＩで消化したコスミドを用いて形質転換を行った。
結果を表３に示す。２回の実験とも、Ｃｓｐ４５Ｉ消化したコスミドを用いた場合に較べ、ＳｗａＩ消化したコスミドを用いた場合に生成したウイルス数は明らかに少なく、またＣｌａＩ消化したコスミドを用いた場合に生成したウイルス数は両者の中間の値であった（実験２）。
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この結果から、アデノウイルスゲノム末端から３塩基外側の切断部位（Ｃｓｐ４５Ｉ）より遠い、２１塩基外側の切断部位（ＳｗａＩ）でコスミドを切断した場合でも、ウイルスの生成効率はやや減少するものの、Ｃｓｐ４５Ｉの場合の約３分の１以内にとどまっているので、アデノウイルスゲノム末端外側に複数のウイルスゲノム切り出し部位を持つコスミドベクターは有用であることが明らかとなった。また、コスミドベクターをアデノウイルスゲノム末端により近い部位で切断した方が、組換えアデノウイルス生成効率が高い可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】  本発明により、組換えアデノウイルスベクターの作製に有効に用いられる新規コスミドベクターなどが提供される。本発明の新規コスミドベクターは、ＣＯＳ−ＴＰＣ法、完全長クローン化ゲノム導入法の両方に応用可能であり、かつ簡便で実用性の高いコスミドベクターであることから、組換えアデノウイルスベクターの作製において有効に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：１に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号：２に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号：３に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号：４に記載の塩基配列は合成オリゴヌクレオチドである。
【配列表】
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2004094643.tif 000009
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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