(57)【要約】本発明は、単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入し、該細胞を分化増殖させることを特徴とする、生体外での骨・軟骨組織の作製方法、及び該方法によって作製される骨・軟骨代替用インプラントに関する。
2004074489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入し、該細胞を分化増殖させることを特徴とする、生体外での骨・軟骨組織の作製方法。
【請求項２】
骨・軟骨誘導性転写因子が、Ｃｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、及びＳｏｘ−９からなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
骨・軟骨誘導性転写因子がＣｂｆａ１である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子がアデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターを用いて導入される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞の分化増殖が、デキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の存在下で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞の分化増殖が、多孔性セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上を足場として行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、生体外での骨・軟骨組織の作製方法。
１）単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子をアデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトする工程。
２）上記細胞を、デキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の存在下で、多孔性セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上を足場として分化増殖させる工程。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって作製された骨・軟骨組織を含む、インプラント。
【請求項９】
単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入することにより、該細胞を骨・軟骨細胞に分化誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入することにより、骨・軟骨組織を作製する方法、及び該方法により作製された骨・軟骨組織を含むインプラントに関する。
【背景技術】  骨・軟骨組織再生のための組織工学的アプローチでは、通常、骨髄由来の間葉系幹細胞が用いられる。実際、間葉系幹細胞等を用いた組織再生は、臨床においても多くの成功例が報告されている。しかしながら、間葉系幹細胞は加齢に伴って急激に減少するため、高齢者における組織工学的アプローチでは幹細胞だけに頼ることは難しい。
骨・軟骨組織は、間葉系幹細胞より分化した骨芽細胞又は軟骨芽細胞が、それぞれ骨細胞又は軟骨細胞へと分化して形成される。最近、骨・軟骨形成の過程では、増殖因子やＢＭＰ等の細胞外制御因子に加えて、転写因子等の細胞内制御因子が関与していることがわかってきた。例えば、転写因子Ｃｂｆａ１は、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化誘導に必要不可欠であることが確認されている（文献１）。この他にも、脊髄における間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化に関与するＢａｐｘ１（文献２）、頭蓋骨の骨化に関与するＭｓｘ２（文献３）、軟骨骨膜や内膜の骨化に関与するＤｌｘ−５（文献４）、間葉系幹細胞から軟骨細胞や結合組織への分化誘導に関与するＳｃｌｅｒａｘｉｓ（文献５）、ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ等の軟骨分化に関わる遺伝子の発現調節を担うＳｏｘ−９（文献６）等、種々の骨・軟骨誘導性転写因子が報告されている。
一方、間葉系幹細胞は多分化能を有し、骨・軟骨組織のほか、脂肪細胞、筋肉、心筋、肝臓、神経等に分化する（文献７および８）。そのため、骨髄由来の間葉系細胞から神経細胞を作り出すなど、未分化の間葉系細胞を他の間葉系細胞に分化させる試みも行われている（文献９および１０）。しかし、これらはいずれもｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験段階にあり、様々な因子によって制御される細胞の分化増殖をコントロールし、生体外で所望の組織へと分化誘導することは難しい。
文献１：Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，ｐ７５５−７６４
文献２：Ｔｒｉｂｉｏｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，ｐ５６９９−５７１１
文献３：Ｓａｔｏｋａｔａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４，ｐ３９１−３９５
文献４：Ａｃａｍｐｏｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，ｐ３７９５−３８０９
文献５：Ｃｓｅｒｊｅｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，ｐ１０９９−１１１０
文献６：Ｎｇ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３，ｐ１０８−１２１
文献７：Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ＭＦ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：ｐ１４３−１４７
文献８：Ｚｕｋ  ＰＡ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｖｏｌ．７（２）ｐ２１１−２２８
文献９：Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ＹＤ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｖｏｌ．７（６）ｐ７２９−７４１
文献１０：Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｖｏｌ．７（１１）ｐ５８１−５８８
【発明の開示】
本発明は、脂肪細胞を細胞ソースとして用い、生体外で骨・軟骨組織を効率良く構築する方法、及び該方法を利用した骨・軟骨代替用インプラントを提供することを課題とする。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子を導入・発現させることにより、該細胞を効率よく骨・軟骨組織に分化誘導しうることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入し、該細胞を分化増殖させることを特徴とする、生体外での骨・軟骨組織の作製方法に関する。
本発明の方法で用いられる骨・軟骨誘導性転写因子としては、例えば、Ｃｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、及びＳｏｘ−９等を挙げることができるが、なかでもＣｂｆａ１が好ましい。
本発明の方法において、骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子の脂肪細胞への導入は、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターを用いて行うことが望ましい。
本発明の方法において、細胞の分化増殖は、デキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の存在下で行われることが望ましい。
さらに、細胞の分化増殖は、多孔性セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上を足場として行うことが望ましい。
好ましい実施形態としては、本発明の方法は以下の工程を含む。
１）単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子をアデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターを用いてトランスフェクトする工程。
２）上記細胞を、デキサメタゾン、免疫抑制剤、骨形成タンパク質、及び骨形成液性因子からなる群より選ばれる１種又は２種以上の存在下で、多孔性セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体からなる群より選ばれる１種又は２種以上を足場として分化増殖させる工程。
本発明はまた、本発明の方法によって作製された骨・軟骨組織を含む、インプラントを提供する。該インプラントは、足場材料である生体適合性材料を含んでいてもよく、また適当な薬剤等を含んでいても良い。
さらに、本発明は、単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入することにより、該細胞を骨・軟骨細胞に分化誘導する方法を提供する。
以下に、本発明の方法の特徴を挙げる。
１）間葉系幹細胞や骨芽細胞を利用した従来の骨・軟骨組織構築とは異なり、単離が容易で、かつ豊富な脂肪細胞を細胞ソースとする。また、脂肪細胞は細胞増殖能力が高く、例えば、骨芽細胞の場合には必要な細胞数の確保に初代培養細胞を単離してから約１週間かかるところを、脂肪細胞の場合は約２〜３日で十分量を得ることができる。
２）増殖因子のような細胞外制御因子を利用した骨・軟骨組織構築とは異なり、骨・軟骨誘導性転写因子を利用することにより、その下流にある複数の骨・軟骨形成たんぱく質の発現を誘導して、細胞を効果的に骨・軟骨組織に分化誘導する。ちなみに、細胞増殖因子の細胞への直接添加では、目的のサイトカインが１００％その組織に特異的に効果を及ぼすとは限らない。
３）アデノウィルスベクターやレトロウィルスベクター系を用いて、骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を細胞に導入することで、極めて高い導入効率が達成できる。ちなみに、リポフェクション法によるサイトカイン遺伝子の導入の場合、樹立細胞株ではある程度の成功をおさめているが、初代培養細胞に対しては、殆ど０に近い導入効率しか得られていない。
【図面の簡単な説明】  図１は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を比較したグラフである。図中、左から、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図２は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞におけるカルシウム量を比較したグラフである。図中、左から、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図３は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞における細胞数の変化を比較したグラフである。図中、上からＣｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図４は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞におけるアリザリンレッド染色の結果を比較した写真である。図中、上から非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図５は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞におけるオイルレッド染色の結果を比較した写真である。図中、上から非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図６は、非感染脂肪細胞とＣｂｆａ１導入脂肪細胞におけるＧＰＤＨ活性の結果を比較したグラフである。図中、左から、非感染脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）、非感染脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地）の結果を示す。
図７は、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞を含む多孔体をラット背中に皮下移植した結果を示す写真である。写真右がＣｂｆａ１導入脂肪細胞を含む多孔体の移植結果、左が非感染脂肪細胞を含む多孔体の移植結果である。それぞれ上（ＨＥ）がヘマトキシリンエオジン染色、下（ＴＲＡＰ）がＴＲＡＰ染色の結果である。また、＊印は脂肪組織、矢印（青）は骨形成部位、矢印（赤）は破骨細胞を示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００３−４０２５２号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】１．骨・軟骨組織の作製
本発明は、単離された脂肪細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入し、該細胞を骨・軟骨組織へと誘導し、生体外で骨・軟骨組織を効率良く作製する方法に関する。
１．１  脂肪細胞
本発明で用いられる細胞は、生体から単離された、分化多様性・増殖能力を有する脂肪細胞であり、脂肪前駆細胞を含むものとする。生体、特に脂肪組織から単離された脂肪細胞中には、体性幹細胞を含むｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ−ｃｅｌｌが多く存在し、本発明で用いられる脂肪細胞には、そのような体性幹細胞が含まれていてもよい。前記細胞は、市販のものを用いても、常法に従って調製してもよい。脂肪細胞の由来組織は特に限定されず、種々の組織に由来する脂肪細胞を用いることができる。特に皮下脂肪組織は脂肪細胞の豊富な供給源であり、脂肪吸引等により容易に集めることができる。また、本発明で用いられる脂肪細胞は、成熟細胞であっても未分化細胞であってもよいが、初代培養細胞を用いることが好ましい。該初代培養細胞は、継代して用いてもよいが、継代数は１回以下であることが好ましい。
１．２  転写因子
本発明に用いられる骨・軟骨誘導性転写因子は、未分化の細胞を骨及び／又は軟骨に分化誘導する、骨・軟骨誘導性の転写因子であり、例えばＣｂｆａ１、Ｄｌｘ−５、Ｂａｐｘ１、Ｍｓｘ２、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ、Ｓｏｘ−９が挙げられる。Ｃｂｆａ１は１９９３年京都大学の小川らによってクローニングされ、大阪大学の小守らにより間葉系幹細胞から骨芽細胞に分化誘導するのに必要不可欠であることが確認された転写因子である（Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９，７５５−７６４）。このＣｂｆａ１には２つのアイソフォーム、ｔｉｌ−１とｐｅｂｐ２αＡが存在する。Ｄｌｘ−５は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ（Ｄ１１）遺伝子の相同遺伝子で、軟骨骨膜や内膜の骨化に関わる転写因子である（Ａｃａｍｐｏｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，３７９５−３８０９）。Ｂａｐｘ１は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｂａｇｐｉｐｅ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ遺伝子の相同遺伝子で、特に脊髄での間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化に関わっており、Ｃｂｆａ１遺伝子の調節遺伝子の１つと考えられている（Ｔｒｉｂｉｏｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２６，５６９９−５７１１）。Ｍｓｘ２は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ（Ｍｓｈ）遺伝子の相同遺伝子で頭蓋骨の骨化に関わっており、Ｃｂｆａ１遺伝子の調節遺伝子の１つと考えられている（Ｓａｔｏｋａｔａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２４，３９１−３９５）。Ｓｃｌｅｒａｘｉｓは、間葉系幹細胞から軟骨細胞や結合組織への分化誘導に関わる転写因子である（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１，１０９９−１１１０）。Ｓｏｘ−９は、軟骨で発現しており、ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ等の軟骨分化に関わる遺伝子の発現調節をしている（Ｎｇ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８３，１０８−１２１）。
本発明において、前記骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子は、常法に従い公知の配列を基に調製することができる。例えば、骨芽細胞からＲＮＡを抽出し、常法に従ってクローニングすることにより目的とする転写因子のｃＤＮＡを調製することができる。
１．３  転写因子遺伝子の導入
本発明において、骨・軟骨誘導性転写因子遺伝子の標的細胞への導入は、動物細胞のトランスフェクションに通常用いられる方法、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、アデノウィルスやレトロウィルス、バキュロウィルス等をベクターとして用いる方法等を利用することができる。なかでも、導入効率が高いアデノウィルス又はレトロウィルスベクターが好ましく、特に、非増殖性細胞にも極めて強力に生体内での遺伝子発現を起こせるという点でアデノウィルスベクターが最も好ましい。
前記アデノウィルス又はレトロウィルスベクターは、周知の方法に基づいて調製することができる。例えばアデノウィルスベクターの調製は、Ｍｉｙａｋｅらの方法（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１３２０−１３２４，（１９９３））に基づいて行えばよいが、市販のキット、例えばＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）等を用いることもできる。このキットはＰ１ファージのＣｒｅリコンビナーゼとその認識配列であるｌｏｘＰを用いた新たな発現制御系（Ｋａｎｅｇａｅ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，１９９５  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３８１６）による組換えアデノウィルスベクター作製キットで、転写因子遺伝子を組み込んだ組換えアデノウィルスベクターを簡便に作製することができる。なお、アデノウィルス感染のｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、２００以上、好ましくは４００〜６００、より好ましくは５００前後である。
１．４  細胞の分化増殖（細胞培養）
細胞の分化増殖に用いられる培地としては、ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等、公知の培地を使用する脂肪細胞の特性に合わせて適宜選んで用いることができる。また、該培地には、ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）等の抗生物質等を添加しても良い。さらに骨形成を促進させるため、培地には、細胞の分化促進作用を有する、デキサメタゾン、ＦＫ−５０６やシクロスポリン等の免疫抑制剤、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びＢＭＰ−９等の骨形成タンパク質（ＢＭＰ：Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＧＦβ等の骨形成液性因子から選ばれる１種又は２種以上を、グリセリンリン酸、アスコルビン酸リン酸等のリン酸原とともに、添加することが好ましい。
細胞の培養は、３〜１０％ＣＯ２、３０〜４０℃、特に５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行うことが望ましい。培養期間は、特に限定されないが、少なくとも３〜７日、好ましくは４、５日である。
１．５  足場材料
骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子をトランスフェクトした細胞から完全な三次元構造を構築するためには、適当な足場を用いて分化増殖させることが必要である。足場材料は、足場上で構築された骨・軟骨組織をそのまま、生体に適用してもよいように、生体適合性材料を用いることが好ましい。そのような材料としては、例えばハイドロキシアパタイトやβ−ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）、α−ＴＣＰ等の多孔性セラミックス、コラーゲン、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、ならびにこれらの複合体（例えば、ポリ乳酸／ポリグリコール酸樹脂／コラーゲン複合体等）、あるいは吸収性合成ポリマー等が挙げられる。これらの足場材料は１種類であってもよいし、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。特に、多孔性のセラミックスは力学的強度が高いという点で、組織再生の足場として好ましい。
また前記生体適合性材料は、細胞の均一な播種が可能となるよう、多孔性であることが好ましい。なお、本明細書中において「多孔（性）」とは、気孔率が４０％以上を意味するものとする。また、孔の大きさは特に限定されないが、骨再生が起きやすいという点では直径２００μｍ〜５００μｍが好ましい。
前記生体適合性材料は構築された骨・軟骨組織の利用目的に応じて、最適なものを選ぶことができる。たとえば、後述するインプラントとして用いる場合、強度を必要とする移植箇所（あるいは手術法）への適用ではハイドロキシアパタイトが好ましく、強度を必要としない移植箇所（あるいは手術法）への適用では生体吸収性のβ−ＴＣＰ等が好ましい。
前記生体適合性材料の形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状もまた、構築された骨・軟骨組織の利用目的に応じて適宜選択すればよい。
細胞は前記足場材料に、該細胞を播種して、前述の培地を用いて通常の方法により培養すればよい。細胞の播種は、足場材料に単に播種するだけでもよく、あるいは、緩衝液、生理食塩水、注射用溶媒、あるいはコラーゲン溶液等の液体とともに混合して播種してもよい。また、材料によって、細胞が孔の中にスムーズに入らない場合は、引圧または加圧条件下で播種してもよい。
播種する細胞の数（播種密度）は細胞の形態を維持して組織再生をより効率よく行わせるため、用いる細胞の種類の特性や足場材料に応じて適宜調整することが望ましい。
２．  インプラント
本発明の方法によって作製された骨・軟骨組織は、足場材料とともに、あるいは足場材料とは別個に、生体内に埋入あるいは注入することで、骨・軟骨代替用インプラントとして利用できる。すなわち、本発明は生体外で構築された骨・軟骨組織を含むインプラントを提供する。
本発明のインプラントにおいて、骨・軟骨組織は足場材料と別個に移植してもよいが、足場材料とともに移植されることが好ましい。該足場材料は、インプラントの目的や適用部位により、前記した足場材料の中から適宜最適なものを選べばよい。たとえば、強度を必要とする移植箇所（あるいは手術法）については、ハイドロキシアパタイトが好ましく、強度を必要としない移植箇所（あるいは手術法）については、生体吸収性のβ−ＴＣＰ等が好ましい。
本発明のインプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、インプラントの目的に応じて適宜選択すればよい。
本発明のインプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、ホルモン、サイトカイン、骨形成因子（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子、骨形成タンパク質、Ｓｔ、Ｍｇ、Ｃａ及びＣＯ３等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、薬剤等を挙げることができる。
また、構築された骨・軟骨組織は、インプラントに通常用いられる他の生体適合性材料、例えば、ＳＵＳ３１６Ｌ、バイタリウム及びＴｉ−６Ａｌ−４Ｖ等の金属材料、超高分子量ポリエチレン、ＭＭＡ骨セメント、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレンテレフタレート及びポリプロピレン等の高分子材料、ハイドロキシアパタイト、β−ＴＣＰ、α−ＴＣＰ及びバイオガラス等のセラミックス材料等に複合化して用いてもよい。
３．本発明の利用
本発明の方法を再生医療に応用すれば、自己の脂肪細胞を利用した骨・軟骨組織の再生が可能になる。すなわち、患者から採取した脂肪細胞又は脂肪前駆細胞に骨・軟骨誘導性転写因子の遺伝子を導入する。次いで該細胞を、適当な足場材料上で分化増殖させ、骨・軟骨組織を構築してから、足場材料とともに、あるいは足場材料とは別個に患者の骨・軟骨欠損部に適用する。あるいは、該細胞を播種した足場材料を、患者の骨・軟骨欠損部に適用し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織構築を試みてもよい。
本発明で用いられる脂肪細胞は極めて容易、かつ安全にヒトから採取できるので、骨髄由来の幹細胞や、ＥＳ細胞を用いた再生医療の守備範囲を大きく広げ、最も本技術を必要とする高齢者への適用が可能になることが期待される。
【実施例】  以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ラット脂肪細胞の骨芽細胞への分化誘導試験
１．  試験方法
１）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒの作製
Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）は、マウスの骨から抽出したＲＮＡを元にｃＤＮＡを合成し、これを鋳型に以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得た。
2004074489.tif 000003
このＣｂｆａ１  ｃＤＮＡをさらにＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングして大量調製した後、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＶでＣｂｆａ１  ｃＤＮＡを切り出し、平滑末端化した。切り出したＣｂｆａ１  ｃＤＮＡは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ  ｋｉｔ（宝酒造，６１５１）を用いてコスミドベクターｐＡｘＣＡＬＮＬｗに挿入し、Ｋｉｔの説明書に従って組換えアデノウィルスを作製した。作製したウィルスの力価は、約１０１１ＰＦＵ／ｍｌの価を示し、感染効率は非常に高いことが確認された。
２）脂肪細胞の調製
初代培養脂肪細胞は８週齢のＦｉｓｃｈｅｒ  ｒａｔ（オス）の腹部皮下脂肪から採取した。皮下脂肪は生理食塩水で洗浄後、細断し、０．０７５％コラゲナーゼで３７℃３０分間処理して細胞を分散させた。細胞は１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｆ−９４２３）添加ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ−５７９６）で中和した後、遠心し、その沈殿物を１６０ｍＭ塩化アンモニウム水溶液で１０分間処理した。これを遠心して得られた上清を１００μｍのナイロンメッシュでろ過し、１０％  ＦＢＳ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，１５２４０−０６２）添加ＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで培養した。
３）脂肪細胞へのＣｂｆａ１遺伝子導入
約４０万個の細胞をφ３．５ｃｍのｄｉｓｈに継代培養後、前項で作製したＣｂｆａ１及びＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子の組換えアデノウィルスをｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）＝５００で感染させ、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞を作製した。
４）培地の調製
脂肪細胞の培養は、上述の培地にＡｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとして２５０ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ−８８９３）、０．５ｍＭ  １−ｍｅｔｙｌ−３−ｉｓｏｂｕｔｙｌｘａｎｔｈｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｉ−７０１８）、１０μｇ／ｍｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｉ−５５００）を、あるいはＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとして５ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｄ−８８９３）、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ，Ｇ−９８９１）、５０μｇ／ｍｌ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｗａｋｏ，０１３−１２０６１）を添加した２種類の培地を調製して行った。
５）アルカリフォスファターゼ活性の測定
骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性を測定した。感染３日後〜２週間後のＣｂｆａ１導入脂肪細胞は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で洗浄後、スクレイパーで集め、５００μｌの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に懸濁して超音波破砕した。破砕後６，０００ｇで５分間遠心して上清を回収した。酵素活性は、０．０５６Ｍ２−ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ（ｐＨ９．９），１０ｍＭ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２に各上清５μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、すぐにマイクロプレートリーダーで吸収波長４０５ｎｍの吸光度を測定して求めた。検量線はρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを用いて作製した。比較としてアデノウィルスを感染させていない非感染脂肪細胞についても同様にアルカリフォスファターゼ活性を測定した。
６）カルシウム量の測定
感染１〜３週間後のＣｂｆａ１導入脂肪細胞を１０％ホルマリン緩衝液で固定し、一昼夜０．６Ｍ  ＨＣｌで脱灰した。脱灰液を希釈しＣａｌｃｉｕｍ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓｉｇｍａ，５８７，３６０−１１）を用い、説明書に従ってカルシウム量を測定した。比較としてアデノウィルスを感染させていない非感染脂肪細胞についても同様にカルシウム量を測定した。
７）細胞数の計測
感染３日〜２週間後のＣｂｆａ１導入脂肪細胞を１％  ｇｌｕｔａｌａｌｄｅｈｙｄｅ  ｉｎ  ＰＢＳで５分間固定した後、蒸留水で２回洗い、０．１％  ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔで３０分間室温で染色した。蒸留水で３回洗浄して余分な染料を除いた後、１０％  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で脱色した。この脱色液を希釈し吸収波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。検量線は細胞を適当な濃度で播種し（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）、上述の染色法とトリプシン処理して剥がした細胞をカウントすることにより作製した。
８）アリザリンレッド染色
骨芽細胞が分泌するミネラル成分による石灰化の様子をアリザリンレッド染色により観察した。感染１〜３週間後のＣｂｆａ１導入脂肪細胞を１０％ホルマリン緩衝液で５分間固定し、蒸留水で軽く洗浄後、１％アリザリンレッド水溶液を加えて２分間インキュベートした。その後蒸留水で何度も洗浄し、結果をスキャナーで取り込んだ。比較としてアデノウィルスを感染させていない非感染脂肪細胞についても同様にアリザリンレッド染色を行った。
９）オイルレッド染色
感染１〜３週間後のＣｂｆａ１導入脂肪細胞を３．７％ホルマリン緩衝液で５分間固定し、蒸留水で軽く洗浄後、０．５％オイルレッド／イソプロピルアルコール染色液を加えて３０分間インキュベートした。その後蒸留水で何度も洗浄し、結果をスキャナーで取り込んだ。比較としてアデノウィルスを感染させていない非感染脂肪細胞についても同様にオイルレッド染色を行った。
１０）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）活性の測定
アルカリフォスファターゼ活性測定用サンプルと同様の方法で測定用サンプルを調製し、ＧＰＤＨ活性測定キット（ＷＡＫＯ３０９−０６１４１、ＷＡＫＯ製）を用いてＧＰＤＨ活性を測定した。各サンプルより５μｌをキットに添付された酵素抽出液で１０倍希釈し（５０μｌ）、これに１００μｌの反応溶液を加えてマイクロプレートリーダーで吸収波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定した。ＧＰＤＨ活性ユニットは、１分間あたりの吸光度の変化量より求めた。
２．  試験結果
１）アルカリフォスファターゼ活性
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、アルカリフォスファターゼ活性（ＡＬＰ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した（図１）。その結果、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞では、骨芽細胞の分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性が顕著に誘導されていることが確認された。Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔによっても、アルカリフォスファターゼ活性は誘導されたが、Ｃｂｆａ１導入に比較すると、その活性は非常に低い値であった。
２）カルシウム量
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、感染後１、２、３週間後のカルシウム量を測定した（図２）。その結果、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞では、顕著にカルシウムの分泌が誘導されていることが確認された。
３）細胞数の変化
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、細胞数の変化を比較した（図３）。その結果、Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞では、非感染細胞に比較して高い細胞増殖能が確認された。また非感染脂肪細胞は、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した細胞の方がＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した細胞よりもやや高い細胞増殖能を示した。
４）石灰化の観察（アリザリンレッド染色）
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、感染後１、２、３週間後のアリザリンレッド染色の結果を比較した（図４）。その結果、Ｃｂｆａ１導入細胞では非感染細胞に比べて石灰化が顕著に進行していることが確認された。
５）中性脂肪染色の観察（オイルレッド染色）
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、感染後１、２、３週間後のオイルレッド染色の結果を比較した（図５）。その結果、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ非感染細胞では中性脂肪の顆粒が顕著に存在することが確認された。一方、Ｃｂｆａ１導入細胞では石灰化している部位（ｂｏｎｅ  ｎｏｄｕｌｅ）が認められた。
６）  グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）活性の比較
Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地、又はＯｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染脂肪細胞、Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養したＣｂｆａ１導入脂肪細胞における、ＧＰＤＨ活性を比較した（図６）。Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加培地で培養した非感染細胞でのみ、脂肪代謝系の酵素であり、脂肪細胞マーカーでもあるＧＰＤＨ活性が認められた。
以上の結果より、Ｃｂｆａ１のｃＤＮＡはアデノウィルスベクターにより極めて効率良く脂肪細胞に導入されることが確認され、これにより脂肪細胞は効率よく骨芽細胞に分化することが確認された。
また、この培養系は多孔性セラミックス等の適当な足場材料を用いることで、生体外での効率よい骨・軟骨組織作製手段を提供しうる。例えば、市販のβ−ＴＣＰ（リン酸三カルシウム）多孔性ブロック（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製，平均ポアサイズ＝直径２００μｍ，５ｍｍｘ５ｍｍｘ５ｍｍ）等を足場として、前述のＣｂｆａ１導入脂肪細胞を培養する。次いで、構築された骨・軟骨組織を、足場材料とともに動物の骨・軟骨欠損部に埋入し、適用部位における骨形成を組織染色（ヘマトキシリン／エオジン染色等）等により確認すれば、その骨・軟骨代替用インプラントとしての効果を確認することができる。
実施例２：ラット皮下移植実験
Ｆｉｓｃｈｅｒ  ラットより皮下脂肪組織を採取し、実施例１で使用したｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，５０μｇ／ｍｌ  ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ培地中で培養後、実施例１で作製したｃｂｆａ１導入用組換えアデノウィルス（Ａｄｖ−ｃｂｆａ１）をＭＯＩ＝５００で感染させた。この細胞を２００万個／ｍｌに調整後、減圧下（１００ｍＨｇ）でＯＰＬＡ多孔性ブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、平均ポアサイズ１００−２００μｍ、直径４．２−５．２ｍｍ、高さ３．９−４．５ｍｍ）に播種した。多孔体ブロックは前述の培地中で再度１〜２日間培養した後、Ｆｉｓｃｈｅｒラットの背中に皮下移植した。コントロールとして、非感染細胞を同様に播種して培養した多孔体をラットの背中に皮下移植した。
移植８週後に多孔体を取り出し、ヘマトキシリンエオジン染色、およびＴＲＡＰ染色を行った。その結果、Ａｄｖ−ｃｂｆａ１感染細胞（Ｃｂｆａ１導入脂肪細胞）では旺盛な骨形成が観察されたが、非感染脂肪細胞では観察されなかった（図７）。図中、＊印は脂肪細胞、矢印（青）は骨形成部位、矢印（赤）は破骨細胞を示す。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば、脂肪細胞を高効率で骨・軟骨組織に分化誘導することができる。該方法は、容易かつ豊富に得られる脂肪細胞を材料として、生体外での効率的な骨・軟骨組織構築を可能にするため、新たなインプラントや再生医療への応用が期待される。
【配列表フリーテキスト】配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
【配列表】
2004074489.tif 000004
2004074489.tif 000005
2004074489.tif 000006
【図１】
2004074489.tif 000007
【図２】
2004074489.tif 000008
【図３】
2004074489.tif 000009
【図４】
2004074489.tif 000010
【図５】
2004074489.tif 000011
【図６】
2004074489.tif 000012
【図７】
2004074489.tif 000013
【国際調査報告】
2004074489.tif 000014
2004074489.tif 000015
2004074489.tif 000016
2004074489.tif 000017
2004074489.tif 000018
2004074489.tif 000019