(57)【要約】本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物はレチノイドを含有する。レチノイドは、樹状細胞が浸潤能を発揮するために必要なＭＭＰ−９の産生を増大し、それにより、樹状細胞の浸潤能を活性化する。従って、免疫賦活化作用を有し、動物の感染症、癌の予防・治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノイドを含有する、樹状細胞浸潤能活性化組成物。
【請求項２】
レチノイドが、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の樹状細胞浸潤能活性化組成物。
【請求項３】
哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、樹状細胞の浸潤能を活性化する方法。
【請求項４】
レチノイドが、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項３に記載の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法。
【請求項５】
哺乳動物に対して、請求項１又は２に記載の樹状細胞浸潤能活性化組成物を投与することを特徴とする、樹状細胞の浸潤能を活性化する方法。
【請求項６】
レチノイドを含有する、免疫賦活剤。
【請求項７】
レチノイド及び樹状細胞を含有する、免疫賦活剤。
【請求項８】
レチノイドが、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項６又は７に記載の免疫賦活剤。
【請求項９】
哺乳動物細胞に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法。
【請求項１０】
哺乳動物に対して、請求項６〜８のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法。
【請求項１１】
レチノイドが、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸からなる群より選択される、請求項１０に記載の哺乳動物の免疫を賦活化する方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の樹状細胞浸潤能活性化組成物、又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を、投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、樹状細胞の浸潤能を活性化するための組成物、免疫賦活剤等に関する。
【背景技術】  これまでの腫瘍免疫療法では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）等を投与する免疫賦活療法や、患者の末梢リンパ球から誘導されたリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）や腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を輸注する養子免疫療法、抗腫瘍抗原モノクローナル抗体を用いたミサイル療法等、種々の免疫療法が試みられている。
また、癌に対する遺伝子治療も盛んに行われており、特に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のサイトカイン遺伝子を導入した癌細胞を移植して、癌に対する免疫を誘導し、癌を治療する細胞ワクチン療法が注目されている。一方、樹状細胞は代表的な抗原提示細胞として知られている。樹状細胞は造血幹細胞由来の樹枝状形態をとる細胞集団であり、生体内に広く分布している。ヘルパーＴ細胞の活性化は、樹状細胞による抗原提示に依存しており、樹状細胞は、末梢血液中の抗原をとらえ、リンパ節に移動し、最終的にリンパ節で成熟すると考えられている。
一般に、未成熟樹状細胞は、抗原となる異物を取り込み、その抗原を消化する能力が高いが、抗原提示能は低い。これに対し、成熟樹状細胞は、抗原の取り込み能が低いが、抗原提示能が高いということが知られている。生体内においては、未成熟樹状細胞が異物を取り込み、細胞内においてその異物を消化し、その刺激によって分化した成熟樹状細胞は、消化した異物の一部を細胞外に提示して、リンパ球に特定の抗原情報を伝えると考えられている。
生体内において、樹状細胞は骨髄の造血幹細胞から誘導されることが知られている。樹状細胞の前駆細胞及び未成熟樹状細胞は、血液及びリンパ球中に存在しており、成熟樹状細胞は脾臓及びリンパ節に存在している。末梢組織の単核が顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）で刺激されると、未成熟樹状細胞へ分化することが知られており、更に未成熟樹状細胞を腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）で刺激すると成熟樹状細胞へと分化することが知られている。
異物が生体内に侵入した場合、樹状細胞が異物を貧食し、抗原をＴ細胞に提示する機能を有しており、抗原を提示されたＴ細胞が抗原を貧食する。このような機能を発揮するために、樹状細胞は、生体内に異物が侵入した時に、末梢組織から所属リンパ節まで移動し、異物が侵入したことを提示している。
一般に、癌患者の癌細胞中の酸素濃度は正常細胞に比較して２０％程度に低下していることが知られている。このような低酸素状態で分化した樹状細胞は、細胞外マトリックスタンパク質を溶解するマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の産生が低下している。生体内においては、樹状細胞が末梢組織を移動する時や、血管やリンパ管を通り抜ける時にも、このマトリックスメタロプロテイナーゼ−９が必要であることが知られている。
従って、低酸素状態下で分化した樹状細胞は末梢組織からリンパ節に移動することができず、上述したような抗原提示能を発揮することができなくなる。このため、癌細胞内では樹状細胞の抗原提示能が発揮されないため、Ｔ細胞が癌細胞を死滅することができない。
従って、本発明の目的は、癌細胞等の酸素濃度の低い状態で産生された樹状細胞がリンパ節まで移動することを可能にする、すなわち樹状細胞浸潤能を活性化する組成物を提供することにある。また、本発明の目的は、免疫賦活剤を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、レチノイドが樹状細胞の浸潤能を活性化することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、レチノイドを含有する、樹状細胞浸潤能活性化組成物を提供するものである。
また、本発明は、哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、樹状細胞の浸潤能を活性化する方法を提供するものである。
また、本発明は、哺乳動物に対して、上記樹状細胞浸潤能活性化組成物を投与することを特徴とする、樹状細胞の浸潤能を活性化する方法を提供するものである。
また、本発明は、レチノイドを含有する、免疫賦活剤を提供するものである。
また、本発明は、レチノイド及び樹状細胞を含有する、免疫賦活剤を提供するものである。
また、本発明は哺乳動物細胞に対して、レチノイドを投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法を提供するものである。
また、本発明は哺乳動物に対して、上記免疫賦活剤を投与することを特徴とする、哺乳動物の免疫を賦活化する方法を提供するものである。
また、本発明は上記樹状細胞浸潤能活性化組成物、又は上記免疫賦活剤を、投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防・治療方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】  図１はフローサイトメーターによる表面抗原解析の結果を示す図である。
図２は、リアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
図３は、ウェスタンブロット解析の結果である。
図４は、ゼラチンザイモグラフィー法の結果である。
図５は、ゼラチンザイモグラフィー法の結果である。
図６は、リアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
図７は未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能の活性を測定した結果を示すグラフである。
図８は、ＴＩＭＰ−１タンパク質による樹状細胞の浸潤能活性の変化を調べた結果を示すグラフである。
図９は、分化誘導後、細胞中のＭＭＰ−９のｍＲＮＡ濃度を測定した結果を示すグラフである。
図１０は、低酸素下で分化した樹状細胞の浸潤能活性を測定した結果である
【発明を実施するための最良の形態】  以下、先ず本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物について説明する。
本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物はレチノイドを含有する。本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物に用いられるレチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおよび脂肪酸レチニルエステル、ならびにデヒドロレチノール、デヒドロレチノール、脂肪酸デヒドロレチニルエステル等が挙げられる。
上記レチノイン酸としては、以下のレチノイン酸の異性体、すなわち全トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、１１−シスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、３，４−デヒドロ−レチノイン酸等が挙げられる。
また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノール、１３−シスレチノール、１１−シスレチノール、９−シスレチノール、３，４−デヒドロ−レチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸が好適である。
本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物中のレチノイドの含有量は、必要な患者に投与した際に、樹状細胞浸潤能を活性化するための量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物の投与量は、レチノイドの量として、約２０ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２程度である。なお、投与量は、投与方法、賦形剤の量、他の薬剤を併用する場合には変えることが好ましい。
本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物は、皮下、腹膜腔内、筋肉内、静脈等の非経口的に投与することができる。非経口投与製剤の形態の例として、例えば等張塩溶液中に、５％程度の濃度のグルコース又は他の公知の医薬的に使用可能な賦形剤と、活性剤を含む水溶液が挙げられる。シクロデキストリン等の可溶化剤や当業者に公知の他の可溶剤を賦形剤として添加してもよい。
次に、本発明の免疫賦活剤について説明する。
本発明の免疫賦活剤は、レチノイドを含有する。本発明の免疫賦活剤に用いられるレチノイドとしては、上述した樹状細胞浸潤能活性化組成物に用いられるものが使用可能である。
また、免疫賦活剤中のレチノイドの含有量、投与量、投与形態等についても、上述した樹状細胞浸潤能活性化組成物と同様である。
本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質であるＭＭＰ−９の産生を促進することにより、樹状細胞の浸潤能を活性化する作用を有する。樹状細胞の浸潤能が活性化され、樹状細胞がリンパ節までの移動が活性化され免疫賦活作用を発揮する。このような作用を有するため、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、哺乳動物（例えば、マウス、ネコ、イヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等）に対して用いられる。各種白血病、悪性リンパ腫、膵癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。
本発明の免疫賦活剤は、更に樹状細胞を含有していてもよい。
樹状細胞は、樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を培養することによって得ることができる。樹状細胞の前駆細胞である単核細胞の原料としては、例えば末梢血、骨髄液、臍帯血等が使用可能である。本発明の免疫賦活剤に用いられる樹状細胞は、成熟樹状細胞であっても未成熟樹状細胞であってもよい。例えば、単核細胞をＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４及びＴＮＦ−αで刺激して培養することにより、成熟細胞へと分化誘導することができる。
本発明の免疫賦活剤に用いられる樹状細胞は、上記単核細胞を、分化誘導剤の存在下で培養することにより得ることができる。樹状細胞の原料として、例えば末梢血の単核細胞を用いる。樹状細胞の前駆細胞である単核細胞を、採血等により採取し、採取した血液より分離精製することができる。単核細胞を赤血球から分離する方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法が用いられる。
例えば、末梢血単核細胞をフィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｌ）密度勾配又は溶出を利用する方法が一般的に用いられる。また、その他に血液細胞を、成人の赤血球を選択的に溶解する溶液、例えばアンモニウムクロライド−カリウム、アンモニウムオキサレート等に懸濁し、分離することができる。
樹状細胞の分化誘導の培養には、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地（ＩＭＤＭ）等、適当な市販されている培地を用いることができる。培地中には血清を加えてもよく、例えば、５−２０％程度の牛血清、牛胎児血清、もしくはヒト血清などが使用しうる。無血清で培養してもよいが、必要に応じ牛アルブミン（ＢＳＡ）、ヒトアルブミン（ＨＳＡ）などを添加してもよい。また、培地には、必要に応じ適当な抗生物質、抗体、ピルビン酸（０．１〜５ｍＭ程度）、グルタミン（０．５〜５ｍＭ程度）、２−メルカプトエタノール（１０〜１００μＭ程度）を含んでいてもよい。これらの培地に分化誘導剤を添加し、約３７℃、約５％炭酸ガス雰囲気下で５日〜２１日程度培養する。培養日数は７日〜１４日程度が好ましい。培養温度（３４〜３８℃）、ガスの混合比（炭酸ガス２〜１０％、さらには窒素ガス、もしくは酸素ガスを適宜混合しうる。）は、適切な条件を設定し行うことができる。
樹状細胞の前駆細胞を含む細胞群から樹状細胞へ分化誘導するには、適切な誘導剤を使用する必要がある。誘導剤としては、サイトカイン類を用いることができる。サイトカインとして、適当なものを使用すれば良いが、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ステムセルファクター（ＳＣＦ）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、ＴＮＦ−α、Ｆｌｔ３−Ｌｉｇａｎｄ等が使用可能である。上記サイトカインの濃度は、培地中、好ましくは１〜１０００ｎｇ／ｍｌ程度である。
培養に用いられるサイトカインは、マウスなどの異種動物由来の因子も使用可能であるが、ヒト由来の因子を用いることが好ましい。
本発明の免疫賦活剤に用いる樹状細胞は、ヒト体内に接種して用いられるものであるため、細胞増殖性をなくしておくとより安全である。単核細胞は、分化誘導することにより増殖能が低下することが知られているが、より安全に利用するために加熱処理、放射線処理又はマイトマイシンＣで処理しておくことが好ましい。
例えば、Ｘ線照射をする場合、Ｘ線照射器の管球の下に樹状細胞を含む容器を置き、総放射線量１０００〜３３００Ｒａｄ程度で照射することが好ましい。マイトマイシンＣで処理する場合、例えば、樹状細胞を１〜３×１０７細胞／ｍｌの密度で懸濁して細胞浮遊液を得、この細胞浮遊液１ｍｌ当たりマイトマイシンＣを２５〜５０μｇの比で添加して、３７℃の温度で３０〜６０分程度保温する。また、加熱処理方法は、例えば樹状細胞を１×１０７細胞／ｍｌ程度に懸濁して細胞浮遊液を得、この細胞浮遊液を５０〜６５℃の温度で２０分程度加熱処理を行う。
上述した、本発明の、樹状細胞を含有する免疫賦活剤は、レチノールによって樹状細胞の浸潤能が活性化され、免疫賦活作用が発揮される。従って、上記免疫賦活剤は哺乳動物（例えば、マウス、ネコ、イヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等）の各種白血病、悪性リンパ腫、膵癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等に対して用いられる。樹状細胞を含有する免疫賦活剤の投与量は、患者の年齢、体重、性別、癌の種類及び癌の進行度、症状等によって異なり、一概には決定できないが、例えば投与は週に一度、患者一人あたり、樹状細胞が１×１０７細胞となるような量を、１０週間にわたって投与する方法が挙げられる。
次に、本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法について説明する。
本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法は、哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする。本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法において用いられるレチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおよび脂肪酸レチニルエステル、ならびにデヒドロレチノール、デヒドロレチノール、脂肪酸デヒドロレチニルエステル等が挙げられる。
上記レチノイン酸としては、以下のレチノイン酸の異性体、すなわち全トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、１１−シスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、３，４−デヒドロ−レチノイン酸等が挙げられる。
また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノール、１３−シスレチノール、１１−シスレチノール、９−シスレチノール、３，４−デヒドロ−レチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸が好適である。
本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法に用いられるレチノイドとしては、上述した本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物を用いることができる。
本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法が適用される哺乳動物としては、例えばマウス、ネコ、イヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト等が挙げられる。本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法において用いられるレチノイドの量としては、必要な患者に投与した際に、樹状細胞浸潤能を活性化するための量であると定義される。患者に投与すべき投与量は、一般に、患者の体表面積、体重、病状等に基づいて決定される。本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物の投与量は、レチノイドの量として、約２０ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２程度である。なお、投与量は、投与方法、賦形剤の量、他の薬剤を併用する場合には変えることが好ましい。投与方法としては、皮下、腹膜腔内、筋肉内、静脈等の非経口的な投与が好ましい。
本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法によれば、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質であるＭＭＰ−９の産生が促進され、樹状細胞の浸潤能が活性化され、樹状細胞のリンパ節への移動が活性化されることにより、免疫賦活作用を発揮する。従って、本発明の樹状細胞の浸潤能を活性化する方法は、上記哺乳動物に対して用いることができ、各種白血病、悪性リンパ腫、膵癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物を投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防・治療方法が提供される。
次に、本発明の免疫を賦活化する方法について説明する。
本発明の免疫を賦活化するする方法は、哺乳動物に対して、レチノイドを投与することを特徴とする。本発明の免疫を賦活化する方法において用いられるレチノイドとしては、例えばレチノイン酸、レチナール、レチノールおよび脂肪酸レチニルエステル、ならびにデヒドロレチノール、デヒドロレチノール、脂肪酸デヒドロレチニルエステル等が挙げられる。
上記レチノイン酸としては、以下のレチノイン酸の異性体、すなわち全トランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、１１−シスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、３，４−デヒドロ−レチノイン酸等が挙げられる。
また、レチノールとしては、以下のレチノールの異性体、すなわち全トランスレチノール、１３−シスレチノール、１１−シスレチノール、９−シスレチノール、３，４−デヒドロ−レチノール等が挙げられる。広く市販されているため、全トランスレチノール、１３−シスレチノール、全トランスレチノイン酸及び１３−シスレチノイン酸が好適である。
本発明の免疫を賦活化する方法に用いられるレチノイドとしては、上述した本発明の免疫賦活剤を用いることができる。
本発明の免疫を賦活化する方法が適用される哺乳動物としては、上述した、本発明の樹状細胞浸潤能活性化方法が適用される哺乳動物が挙げられる。また、使用されるレチノイドの量、投与方法などについても、上述した、樹状細胞浸潤能活性化方法と同様である。
本発明の免疫を賦活化する方法によれば、樹状細胞の浸潤に必要なタンパク質であるＭＭＰ−９の産生が促進され、樹状細胞の浸潤能が活性化され、樹状細胞のリンパ節への移動が活性化されることにより、免疫賦活作用を発揮する。従って、本発明の免疫を賦活化する方法は、上記哺乳動物に対して用いることができ、各種白血病、悪性リンパ腫、膵癌、肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、骨肉腫、悪性黒色腫、悪性繊毛上皮、筋肉腫、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、食道癌、頸頭部腫瘍、脳腫瘍等の各種の癌、及び各種ウイルス、細菌等による感染症等の治療及び予防に対して用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明の免疫賦活剤を投与又は使用することを特徴とする、動物の感染症、癌の予防・治療方法が提供される。
【実施例】  以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例１】  健常者由来の末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール−パック密度交配遠心分離により分離した。末梢単核細胞を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に、２×１０６細胞／ｍｌになるように分散させ、３７℃で１時間インキュベートすることにより付着性細胞を得た。非付着性細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地で５回洗浄して除去した。付着性細胞を、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、５０μＭ  ２−ＭＥ、１％非必須アミノ酸及び２ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ培地中で、低酸素状態（１％酸素濃度、以下本明細書において、低酸素状態とは、１％酸素濃度状態をいう）及び正常酸素状態（２０％酸素濃度、以下本明細書において、正常酸素状態とは、２０％酸素濃度状態をいう）で、毎日、培地を半分交換しながら３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で６日間培養した。６日目に、細胞を集め、２つのグループに分けた。１つ目のグループはＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地で１日培養し、未成熟樹状細胞として用いた。２つ目のグループはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で１日処理し、成熟樹状細胞として用いた。
【実施例２】  実施例１で得られた樹状細胞の表面抗原の検出をフローサイトメーターを用いて行った。抗原の検出は未成熟細胞及び成熟細胞について行った。測定する細胞（５×１０５個）を、ＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＤ１４、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲに対する、ＦＩＴＣ結合マウスモノクローナル抗体、及びヒトＣＤ１ａ及びＣＤ８６に対するマウスモノクローナル抗体と４℃で３０分インキュベートした。用いたモノクローナル抗体はＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社から購入した。次いで、細胞を生理食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で２回洗浄して過剰のモノクローナル抗体を除去した。次いで、フルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）山羊抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と４５分間インキュベートし、フローサイトメーターを用いて解析を行った。結果を図１に示す。図１はフローサイトメーターによる表面抗原解析の結果を示す図であり、図１においてｉｍＤＣｓは未成熟樹状細胞を示し、ｍＤＣｓは成熟樹状細胞を示す。
図１に示すように、単球細胞のマーカーであるＣＤ１４は未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に発現されていなかった。樹状細胞マーカーであるＣＤ８３は、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に発現していた。共刺激性分子、ＣＤ８０及びＣＤ８６は、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に発現していた。ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＡＢＣ及びＣＤ１ａは、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞に発現していた。これらの結果は、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦの存在下で正常酸素状態及び低酸素状態で分化した細胞は未成熟樹状細胞（ｉｍＤＣｓ）であると判断され、正常酸素状態及び低酸素状態で分化したＬＰＳで処理された細胞は成熟樹状細胞（ｍＤＣｓ）であると判断される。
【実施例３】  実施例１で得られた未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を、低酸素状態及び正常酸素状態で分化し、それぞれの細胞中のＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲ法により調べた。なお、低酸素状態及び正常酸素状態での分化は、それぞれ１％酸素濃度、２０％酸素濃度において、培養チャンバーを用いて７日間行った。リアルタイムＰＣＲは以下のように行った。細胞は、３名のドナー由来の未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を用いた。培養して得られた細胞（１×１０６細胞）からトリゾル試薬（ＴＲＩＺＯＬ  ｒｅａｇｅｎｔ、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）を用いて全ＲＮＡを分離した。７５ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、２μＭ  ランダムプライマー、及び１０００ＵのＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ転写試薬を含む５０μｌの反応混合物中で各ＲＮＡ試料（２μｇ）をｃＤＮＡに変換した。各ｃＤＮＡ（１０ｎｇ）をＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて３組増幅し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで配列を決定した。ＰＣＲ反応は、５０℃で２分、９５℃で１５分インキュベートし、次いで９５℃での１５サイクルの変性、６０℃での３０サイクルのアニーリング、及び７２℃での１分間の伸長を行った。プライマーとして配列番号１及び配列番号２に示すものを用いた。
結果を図２に示す。図２は、リアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。図２において、ｉｍＤＣｓは未成熟樹状細胞を示し、ｍＤＣｓは成熟樹状細胞を示し、Ｎは正常酸素状態、Ｈは低酸素状態を示す。図２に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟樹状細胞及び成熟細胞は、低酸素状態で分化したものよりも２〜５倍高いレベルでＭＭＰ−９のｍＲＮＡを発現した。
【実施例４】  実施例１で得られた未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を、５×１０５細胞／ｍｌになるように、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、３７℃の温度で低酸素状態及び正常酸素状態で２４時間培養を行った。培地を遠心分離して上清を集め、−７０℃に保存した。ＭＭＰ−９タンパク質の生産量を定量するため、同量のタンパク質濃度の樹状細胞の培養上清を７．５ｗ／ｖのポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の培地を、ポジティブコントロールとして用いた（β−アクチンを生産する）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上にセミドライ法によりブロッティングした。通常のブロッキング及び洗浄を行った後、その膜を濃度１μｇ／ｍｌのヒトＭＭＰ−９に対する一次抗体を用いて、室温で１時間インキュベートした。用いた一次抗体は、ヒトＭＭＰ−９に対して生じるマウスポリクローナルＩｇＧであり、二次抗体は１：２０００の希釈率でホースラディッシュ・ペルオキシダーゼにより標識されたウサギａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）である。細胞内のＭＭＰ−９プロテインを検出するために、１５μｇのタンパク質を含むそれぞれの細胞溶解物をロードし、ウェスタンブロット解析を行った。膜はペルオキシダーゼで標識されたヤギ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを用いてインキュベートし、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、東京、日本）を用いて現像した。
結果を図３に示す。図３は、ウェスタンブロット解析の結果であり、図３に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞は、低酸素状態下で分化したものよりも、高いレベルでＭＭＰ−９タンパク質を産生していた。
【実施例５】  実施例４で培養した、未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞いついて、ゼラチンザイモグラフィー法を実施した。その方法を以下に説明する。
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びゼラチンを含有するポリアクリルアミドゲル中での電気泳動法によって検定した。簡単に説明すると、同じタンパク質含有物を含む細胞培養の上澄から分離した培養上清を３倍のバッファーと混合して、１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを１００ｍｌの再生バッファー（２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  脱イオン水溶液）中で攪拌しながらインキュベートした。次に、そのゲルを１００ｍｌのｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔバッファー（０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＣａｃｌ２、０．０５％のＮａＮ３）中で、３７℃で一晩インキュベートした。ゲルは、０．５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０  ４０％メタノール／１０％酢酸溶液で、室温で１時間染色した。続いて４時間、時々脱色液（４０％メタノール／１０％酢酸  脱イオン水溶液）を換えながら脱色を行った。蛋白質分解活性のバンドは、紺青色のバックグラウンドに対してクリアバンドとして明らかに見られた。ポジティブコントロールとして、ヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０の培地を用いた。
図４に示すように、正常酸素状態下で分化した未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞は、低酸素状態下で分化したものよりも高いレベルでＭＭＰ−９タンパク質を分泌した。ＭＭＰ−９の活性形態は、正常酸素状態で分化した樹状細胞にのみ検出された。次いで、正常酸素状態及び低酸素状態で分化した未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞から分泌されたＭＭＰ−９のタンパク質の分解活性を調べた。図５に示すように、ゼラチンザイモグラフィは、低酸素状態下で分化した樹状細胞よりも正常酸素状態で分化した樹状細胞の方がより高いレベルでｐｒｏ−ＭＭＰ−９を分泌したことを示している。ＭＭＰ−９タンパク質の活性形態は、正常酸素状態で分化した樹状細胞にのみ分泌された。これらの結果は、低酸素状態で分化した樹状細胞が正常酸素状態で分化した樹状細胞よりもタンパク質分解活性が低いことを示している。
【実施例６】  実施例１で得られた未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞を、低酸素状態及び正常酸素状態で分化し、それぞれの細胞中のＭＭＰ−９の特異的阻害剤である、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３の発現をリアルタイムＰＣＲ法により調べた。方法は実施例３と同様に行った。ＴＩＭＰ−１のプライマーとしては配列番号３及び配列番号４に示すものを、ＴＩＭＰ−２のプライマーとしては配列番号５及び配列番号６に示すものを、ＴＩＭＰ−３のプライマーとしては配列番号７及び配列番号８に示すものを用いた。
結果を図６に示す。図６は、リアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。図６に示すように、ＴＩＭＰ−１は低酸素状態で分化した樹状細胞において、正常酸素状態で分化した樹状細胞よりも高いレベルで発現した。ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３は、正常酸素状態及び低酸素状態の両方で培養された樹状細胞において同レベルで発現した。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ−９の特異的阻害剤であるから、この結果は、低酸素状態で分化した樹状細胞が正常酸素状態で分化した樹状細胞よりも低いタンパク質分解活性を有することを示す。
【実施例７】  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ法を用いて上室と下室をくぎるメンブレン上にマトリゲルを固相化し、洗浄後、上室に樹状細胞を入れ、下室には未成熟樹状細胞の場合にはリコンビナントヒトＲＡＮＴＥＳを１００ｎｇ／ｍｌ入れ、成熟樹状細胞の場合にはリコンビナントヒトＭＣＰ−３を１００ｎｇ／ｍｌ入れ、下室に移動してきた細胞数を計測し、樹状細胞の浸潤能の活性を測定した。
結果を図７に示す。図７は未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能の活性を測定した結果を示すグラフである。図７に示すように、未成熟樹状細胞及び成熟細胞は、いずれも正常酸素状態で分化した方が、低酸素状態で分化したものよりも高い浸潤能の活性を有していた。
【実施例８】  ＴＩＭＰ−１タンパク質による浸潤能活性の低下を調べるため、実施例７で行った系にＴＩＭＰ−１タンパク質を１０ｎｇ／ｍｌ加えて同様に試験を行った。
結果を図８に示す。図８は、ＴＩＭＰ−１タンパク質による樹状細胞の浸潤能活性の変化を調べた結果を示すグラフである。図８において、＋はＴＩＭＰ−１タンパク質を加えた場合の結果であり、−はＴＩＭＰ−１タンパク質を加えない場合の結果である。図８に示すように、正常酸素状態で分化した未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能活性は、ＴＩＭＰ−１タンパク質によって低下することがわかる。これに対し、低酸素状態で分化した未成熟樹状細胞及び成熟樹状細胞の浸潤能活性はＴＩＭＰ−１タンパク質によって変化しなかった。
【実施例９】  実施例１で得られた成熟樹状細胞を、全トランスレチノイン酸を培地に１μＭ濃度になるように添加し、３日間培養するか、全トランスレチノイン酸を培地に５μＭ濃度になるように添加して１日培養し、次いで全トランスレチノイン酸を培地に１μＭ濃度に添加して２日培養して、樹状細胞の分化を行った。分化誘導後、細胞中のＭＭＰ−９のｍＲＮＡ濃度を測定した。結果を図９に示す。図９に示すように、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡ濃度は、培地中に全トランスレチノイン酸を添加することにより上昇した。
【実施例１０】  実施例１で得られた成熟樹状細胞を、全トランスレチノイン酸を培地に１μＭ濃度になるように添加して培養を行い分化誘導を行った。次いで、実施例７と同様に操作を行い、樹状細胞の浸潤能の活性を測定した。結果を図１０に示す。図１０は、低酸素下で分化した樹状細胞の浸潤能活性を測定した結果である。図１０に示すように、樹状細胞の浸潤能は培地中に全トランスレチノイン酸を添加することにより向上した。
以上詳述した通り、レチノイドである全トランスレチノイン酸は、樹状細胞が浸潤能を発揮するために必要なＭＭＰ−９の産生を増大し、それにより樹状細胞の浸潤能を活性化することが見出された。この効果は、低酸素状態においても発揮され、酸素濃度が低下している癌細胞においても発揮される。従って、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物は免疫賦活化作用を発揮し、哺乳動物の免疫を賦活化するためにも用いられる。また、本発明の樹状細胞浸潤能活性化組成物及び免疫賦活剤は、動物の感染症、癌の予防・治療に用いることができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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