(57)【要約】糖尿病の治療、予防等への応用手段を提供すること。Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体等に基づく、糖尿病治療又は予防剤のスクリーニング方法及びそのキット、糖尿病に対する医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質の存在下、下記（１）〜（５）：
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の動態を測定又は検出して、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物を得ることを特徴とする、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を阻害する化合物又はその塩である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該Ｒｅｖ−ｅｒｂが、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡαである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
（Ｉ）該因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ａ）Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
ＩＩ）該（１）の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と
を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
（Ａ）内在的にＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞における該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、該核内受容体の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
（Ａ’）内在的にＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（Ｂ’）前記ステップ（Ａ’）で得られた細胞における該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子の発現の変動を検出し、それにより、該核内因子の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
（ａ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
（ａ’）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ’）前記ステップ（ａ’）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ’）前記ステップ（ｂ’）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
請求項５記載の方法に用いるためのキットであり、かつ下記（１）〜（５）：
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有してなる、該因子に結合する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１２】
請求項６記載の方法に用いるためのキットであり、
Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、及び
ＩＩ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物
を含有してなる、該因子の機能を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
請求項７又は８記載の方法に用いるためのキットであり、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１４】
請求項７又は８記載の方法に用いるためのキットであり、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
を内在的に発現している細胞を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
請求項９又は１０記載の方法のためのキットであり、
Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーター、又はＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物
を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
【請求項１６】
Ｉ）（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、若しくは
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩、あるいは
ＩＩ）（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を阻害する化合物又はその塩
を有効成分として含有してなる、糖尿病の治療又は予防に用いる医薬組成物。
【請求項１７】
該化合物が、ｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡを発現するベクターである、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該ｓｉＲＮＡが、配列番号：５４〜５７のいずれかに示される塩基配列に対応する核酸である、請求項１７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糖尿病の治療、予防等のための手段に関する。より詳しくは、本発明は、糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に用いるキット、医薬組成物等に関する。
【背景技術】  糖尿病は、多飲、多尿、体重減少等の症状、慢性の高血糖を主徴とし、一般的に、網膜症、腎症、末端神経障害等の合併症を伴う疾患である。前記糖尿病は、病因により、原発性糖尿病〔インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、インスリン非依存性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）〕、二次性糖尿病〔膵臓性糖尿病、膵外性／内分泌性糖尿病、薬剤誘発性糖尿病〕等に分類されている。さらに、前記糖尿病は、心筋梗塞、脳梗塞等の動脈硬化性疾患の因子となることが知られている。
従来、糖尿病の治療方法として、例えば、食事療法、運動療法等による生活改善をはじめ、インスリン遺伝子、インスリンレセプター遺伝子、ミトコンドリアＤＮＡ等における遺伝子異常に関連する糖代謝の制御；α−グルコシダーゼ等の糖吸収に関連する因子の機能の制御等を標的とする治療方法等が行なわれている。
しかしながら、上述の糖尿病の治療方法を適用しても、所望の効果が得られない症例もある。
一方、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体は、オーファン核内受容体の１つである〔ミヤジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｎ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ），第５７巻，３１−３９頁（１９８９）（図１に記載）、ラザー（Ｌａｚａｒ  ＭＡ．）ら、ディーエヌエー  セル  バイオロジー（ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．），第９巻，７７−８３頁（１９９０）（図１に記載）、及びアデルマント（Ａｄｅｌｍａｎｔ  Ｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９３巻，３５５３−３５５８頁（１９９６）（図１に記載）〕。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のうち、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαは、肥満の治療用途の標的となる核ホルモン受容体であることが知られており、かかる治療用途の標的としてのＲｅｖ−ｅｒｂＡαの核ホルモン受容体機能のモジュレーターを同定するためのイン・ビトロアッセイが報告されている〔国際公開第９９／２７３６５号パンフレット（表１）を参照のこと〕。
さらに、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリーは、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ遺伝子の転写の負のレギュレーターであること、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαを欠損させたマウスにおいては、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩの上昇及び血清トリグリセリドの上昇が見られること等が見出されており、前記アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩに関連する脂質代謝異常の治療に有用な物質のスクリーニングに用いられている〔国際公開第９９／６７６３７号パンフレット（第３頁下から１４〜１６行、第２４頁第１５行〜第２６頁第１２行、図１）〕。
また、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂを活性化するリガンドをスクリーニングする方法が報告されている〔国際公開第００／１７３３４号パンフレット（請求項３）を参照のこと〕。
【発明の開示】
本発明の１つの側面は、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病に対する治療剤又は予防剤をスクリーニングすること；該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に対する作用機序に基づく治療剤又は予防剤をスクリーニングすること；及び前記治療剤又は予防剤の候補化合物を薬理評価すること、簡便、かつ迅速に、糖尿病治療剤又は予防剤をスクリーニングすることの少なくとも１つを行ないうる、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法を提供することに関する。
さらに、本発明の他の側面は、前記スクリーニング方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうこと、高い信頼性で行なうことの少なくとも１つを達成しうる、スクリーニング用キットを提供することにある。
また、本発明のさらなる他の側面は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に対する作用機序に基づく作用、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予防作用を発揮する医薬組成物を提供することに関する。
さらに、本発明の別の側面は、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病を、簡便に診断すること、迅速に診断することの少なくとも１つを行ないうる、糖尿病の診断方法を提供することに関する。
また、本発明の他の側面は、前記診断方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうことの少なくとも１つを達成しうる診断用キットを提供することに関する。
さらに、本発明の他の側面は、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病に罹患している個体由来の試料を、簡便に検出すること、迅速に検出することの少なくとも１つを達成しうる、糖尿病に罹患している個体由来の試料の検出方法を提供することに関する。
また、本発明の他の側面は、前記検出方法を、簡便に行なうこと、迅速に行なうこと、高処理量で行なうことの少なくとも１つを達成しうる検出用キットを提供することに関する。
さらに、本発明の他の側面は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に対する作用機序に基づく作用、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病の治療等への応用に有用な、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現抑制方法を提供することに関する。
即ち、本発明は、
〔１〕  被検物質の存在下、下記（１）〜（５）：
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の動態を測定又は検出して、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物を得ることを特徴とする、糖尿病治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、
〔２〕  該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩である、前記〔１〕記載の方法、
〔３〕  該糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物が、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を阻害する化合物又はその塩である、前記〔１〕記載の方法、
〔４〕  該Ｒｅｖ−ｅｒｂが、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡαである、前記〔１〕記載の方法、
〔５〕  （Ｉ）該因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔６〕  （ａ）Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
ＩＩ）該（１）の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物と
を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔７〕  （Ａ）内在的にＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞における該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、該核内受容体の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔８〕  （Ａ’）内在的にＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、及び
（Ｂ’）前記ステップ（Ａ’）で得られた細胞における該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子の発現の変動を検出し、それにより、該核内因子の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔９〕  （ａ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔１０〕  （ａ’）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ’）前記ステップ（ａ’）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ’）前記ステップ（ｂ’）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む、前記〔１〕記載の方法、
〔１１〕  前記〔５〕記載の方法に用いるためのキットであり、かつ下記（１）〜（５）：
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有してなる、該因子に結合する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔１２〕  前記〔６〕記載の方法に用いるためのキットであり、
Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、及び
ＩＩ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物
を含有してなる、該因子の機能を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔１３〕  前記〔７〕又は〔８〕記載の方法に用いるためのキットであり、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子に対する抗体又はその断片を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔１４〕  前記〔７〕又は〔８〕記載の方法に用いるためのキットであり、
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、又は
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
を内在的に発現している細胞を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット。
〔１５〕  前記〔９〕又は〔１０〕記載の方法のためのキットであり、
Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーター、又はＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物
を含有してなる、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット、
〔１６〕  Ｉ）（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、若しくは
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子
の発現を抑制する化合物又はその塩、あるいは
ＩＩ）（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を阻害する化合物又はその塩
を有効成分として含有してなる、糖尿病の治療又は予防に用いる医薬組成物、
〔１７〕  該化合物が、ｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡを発現するベクターである、前記〔１６〕記載の医薬組成物、
〔１８〕  該ｓｉＲＮＡが、配列番号：５４〜５７のいずれかに示される塩基配列に対応する核酸である、前記〔１７〕記載の医薬組成物、
〔１９〕  被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検対象の個体が、糖尿病に罹患している疑いがあることの指標となる、糖尿病の診断方法、
〔２０〕  発現レベルが、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を指標として測定される、前記〔１９〕記載の方法、
〔２１〕  発現レベルが、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子産物の量を指標として測定される、前記〔２０〕記載の方法、
〔２２〕  配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた配列を検出しうる核酸を含有してなる、前記〔１９〕又は〔２０〕記載の方法を行なうための診断用キット、
〔２３〕  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体に対する抗体又はその断片を含有してなる、前記〔１９〕又は〔２１〕記載の方法を行なうための診断用キット、
〔２４〕  被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法、
〔２５〕  発現レベルが、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を指標として測定される、前記〔２４〕記載の方法、
〔２６〕  発現レベルが、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体遺伝子産物の量を指標として測定される、前記〔２４〕記載の方法、
〔２７〕  配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた配列を検出しうる核酸を含有してなる、前記〔２４〕又は〔２５〕記載の方法を行なうための検出用キット、並びに
〔２８〕  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体に対する抗体又はその断片を含有してなる、前記〔２４〕又は〔２６〕記載の方法を行なうための検出用キット、
に関する。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ピオグリタゾン投与群、食餌制限群及び食餌制限＋運動負荷群それぞれのＺｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ骨格筋におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現解析結果を示す図である。
第２図は、ピオグリタゾン投与群、食餌制限群及び食餌制限＋運動負荷群それぞれのＺｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ脂肪組織におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現解析結果を示す図である。
第３図は、ヒト組織におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現解析結果を示す図である。
第４図は、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα強制発現細胞のウェスタンブロットの結果を示す図である。
第５図は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα強制発現細胞でのグルコース取り込み能の解析結果を示す図である。
第６図は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα結合配列を用いた場合のレポーター遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
第７図は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαプロモーターを用いた場合のレポーター遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
第８図は、ｓｉＲＮＡ発現細胞におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡαの発現量を調べた結果を示す図である。
第９図は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα発現抑制細胞でのグルコース取り込み能の解析結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、インスリン抵抗性モデルラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ）に対して、食餌制限を適用すること、又は食餌制限と運動負荷との組み合わせを適用することにより、該ラットにおけるインスリン抵抗性を改善させた場合、改善前よりも、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現が、減少し、さらに、培養細胞において該Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαを強制発現させることにより、グルコース取り込み能が低下するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
以下に、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαポリヌクレオチドの調製、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαポリペプチドの調製、組換えベクター、形質転換体、該組換えベクター又は形質転換体の製造方法、抗体、該ポリペプチドの定量方法又は免疫学的検出方法、ｍＲＮＡの定量方法、ｍＲＮＡの翻訳抑制方法、結合物質、結合物質スクリーニング方法、転写制御活性調節物質、転写制御活性調節物質スクリーニング方法、発現調節物質、発現調節物質スクリーニング方法、スクリーニング用キット、糖尿病の検出方法、遺伝子検出用キット、医薬組成物等について説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞での組換えタンパク質の生産技術、発現タンパク質の分離精製法、分析法及び免疫学的手法が採用される。
本発明の糖尿病の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法は、かかる本発明者らの知見に基づくものであり、具体的には、被検物質の存在下、下記（１）〜（５）：
（１）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、
（２）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント、
（３）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子、
（４）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーター、及び
（５）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーター
からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の動態を測定又は検出することを１つの特徴とする。
本発明のスクリーニング方法によれば、前記（１）〜（５）の少なくとも１つの因子の動態を指標として、被検物質による該因子を介した糖尿病に対する作用を評価することにより、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物のスクリーニングを行なう。
したがって、本発明のスクリーニング方法によれば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体〔前記（１）等〕又はそれに関連する因子〔前記（２）〜（５）等〕の機能に関連して発症する糖尿病に有効な糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法によれば、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲ）を活性化させることにより、インスリン抵抗性改善を図るチアゾリジンジオン化合物とは異なる作用機序に基づく糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングできる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、前記機能に対する作用機序に基づく治療剤又は予防剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
さらに、本発明のかかるスクリーニング方法によれば、前記作用機序に基づく糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物を、簡便、かつ迅速にスクリーニングすることができる。
なお、本発明のスクリーニング方法は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療剤又は予防剤の候補化合物の薬理評価に用いることができる。
前記被検物質としては、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体、核酸又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。また、核酸の誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾核酸、塩基を改変することにより得られたバリアント核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。なお、本明細書において、前記核酸又はその誘導体には、リボザイム、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスＤＮＡ等）、ＲＮＡｉを誘発しうるｓｉＲＮＡ等も含まれる。
前記「因子の機能」としては、甲状腺／ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー〔例えば、甲状腺ホルモン（Ｔ３）受容体等〕、高密度リポタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、既日リズム制御因子（例えば、Ｂｍａｌ１等）及びＲｅｖ−ｅｒｂＡα自体それぞれの遺伝子の転写抑制及びタンパク質Ｃ−ＩＩＩの発現抑制等が挙げられる。
前記機能は、例えば、甲状腺／ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー〔例えば、甲状腺ホルモン（Ｔ３）受容体等〕、高密度リポタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、既日リズム制御因子（例えば、Ｂｍａｌ１等）及びＲｅｖ−ｅｒｂＡαそれぞれのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量をＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、ウエスタンブロッティング、イムノアッセイ等の測定法により測定することにより調べられうる。また、前記機能は、Ｒｅｖ−ｅｒｂとＲｅｖ−ｅｒｂ応答性エレメントとの結合活性や転写制御活性を測定すること等によっても調べられうる。
本明細書において、「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体」とは、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリーに属する核内受容体を意味する。かかる「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体」としては、甲状腺／ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー〔例えば、甲状腺ホルモン（Ｔ３）受容体等〕、高密度リプタンパク質代謝タンパク質〔例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等〕、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、既日リズム制御因子（例えば、Ｂｍａｌ１等）及びＲｅｖ−ｅｒｂＡα自体それぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質Ｃ−ＩＩＩの発現制御の機能を有するものであればよく、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂ、ＲＯＲ等が挙げられる。より具体的には、前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体」としては、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡβ、ＲＯＲα、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ等が挙げられる。なお、前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体」は、天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、前記機能を有するバリアントであってもよい。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαは、骨格筋、褐色脂肪、肝臓、心臓、脳、腎臓において発現が見られ、骨格筋＞褐色脂肪＞肝臓、心臓、脳、腎臓の発現パターンを示すという特徴を有する。また、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαは、例えば、ヒト由来のＲｅｖ−ｅｒｂＡαの場合、トランスアクチベーションに関与するドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、二量体形成に関与するドメイン、転写抑制に関与するドメイン、ホルモン（リガンド）結合ドメイン等を有する核内受容体の構造的特徴がある。
前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメント」としては、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の結合する核酸配列を有するエレメントであればよく、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂ応答性エレメント〔ＷＡＷＮＴＡＧＧＴＣＡ（Ｗ＝Ａ又はＴ）、配列番号：１４〕等が挙げられる。
前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」とは、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のパートナーであり、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とヘテロ多量体を構成しうる核内因子をいう。前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体と協調して、甲状腺／ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー〔例えば、甲状腺ホルモン（Ｔ３）受容体等〕、高密度リプタンパク質代謝タンパク質（例えば、アポタンパク質Ａ−Ｉ、アポタンパク質Ａ−ＩＩ等）、トリグリセリド関連タンパク質（例えば、アポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ、リポプロテインリパーゼ等）、既日リズム制御因子（例えば、Ｂｍａｌ１等）及びＲｅｖ−ｅｒｂＡα自体それぞれの遺伝子の転写制御及びタンパク質Ｃ−ＩＩＩの発現制御の機能を有するものであればよい。ここで、前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」は、天然由来のアミノ酸配列を有する因子であってもよく、前記機能を有するバリアントであってもよい。前記「Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子」としては、具体的には、特に限定されないが、例えば、Ｎ−ＣｏＲ／ＲＩＰ１３、ＳＵＮ−ＣｏＲ、Ｓｉｎ３、ＳＭＲＴ、ＲＩＰ１４０等が挙げられる。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーターとしては、例えば、配列番号：６０に示される塩基配列を有する核酸等が挙げられる。
なお、本発明においては、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーターは、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能を発揮する塩基配列を有するものであればよい。
したがって、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーターは、例えば、
−  前記配列番号：６０に示される塩基配列中のプロモーター機能の発現とは無関係である領域において、少なくとも１塩基の変異を有する配列を有し、かつＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能を発揮する核酸；
−  前記配列番号：６０に示される塩基配列において、プロモーター機能の発現とは無関係である領域の配列とそれに対応する配列との配列同一性が、少なくとも６０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上であり、かつＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能を発揮する核酸
等が挙げられる。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能は、例えば、
−  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸（野生型）におけるプロモーター部分を、評価対象の核酸と置換し、
−  得られた核酸を、適切な宿主〔例えば、ラット由来細胞株Ｌ６（骨格筋由来筋芽細胞）、マウス由来細胞株３Ｔ３Ｌ１（脂肪細胞）、マウス由来細胞株Ｃ２Ｃ１２（筋芽細胞）等〕に導入し、
−  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又は対応するｍＲＮＡを検出する
ことにより、該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又は対応するｍＲＮＡが、発現すること、好ましくは、野生型の場合と同程度若しくはそれ以上の程度で発現することを、該評価対象の核酸が、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能としての機能を発揮することの指標として評価されうる。
Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターとしては、前記（３）の核内因子のプロモーターが挙げられ、具体的には、例えば、ＲＩＰ１４０のプロモーター（配列番号：６１）等が挙げられる。
なお、本発明においては、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターは、該核内因子におけるプロモーターとしての機能を発揮する塩基配列を有するものであればよい。
したがって、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターは、例えば、
−  前記配列番号：６１に示される塩基配列中のプロモーター機能の発現とは無関係である領域において、少なくとも１塩基の変異を有する配列を有し、かつ当該核内因子におけるプロモーターとしての機能を発揮する核酸；
−  前記配列番号：６１に示される塩基配列において、プロモーター機能の発現とは無関係である領域の配列とそれに対応する配列との配列同一性が、少なくとも６０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上であり、かつ当該核内因子におけるプロモーターとしての機能を発揮する核酸
等が挙げられる。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターとしての機能は、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体におけるプロモーターとしての機能の評価と同様に、例えば、
−  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子をコードする核酸（野生型）におけるプロモーター部分を、評価対象の核酸と置換し、
−  得られた核酸を、前記と同様の適切な宿主に導入し、
−  Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子又は対応するｍＲＮＡを検出する
ことにより、該核内因子又は対応するｍＲＮＡが、発現すること、好ましくは、野生型の場合と同程度若しくはそれ以上の程度で発現することを、該評価対象の核酸が、該核内因子におけるプロモーターとしての機能としての機能を発揮することの指標として評価されうる。
本発明においては、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能を阻害若しくは発現を抑制する観点から、前記因子のなかでは、好ましくは、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子が望ましい。具体的には、ヒトの糖尿病に対してより有効な治療剤又は予防剤の候補化合物を得る観点及びインスリン抵抗性を改善する観点から、前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核受容体、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂのなかでは、好ましくは、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡαであり、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のなかでは、好ましくは、ヒトＮ−ＣｏＲ、ヒトＳｕｎ−ＣｏＲであることが望ましい。
前記ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡαは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アクセッション番号：Ｘ７２６３１に、その塩基配列（配列番号：１）及びアミノ酸配列（配列番号：２）が開示されている。
本発明のスクリーニング方法において、測定又は検出対象の「因子の動態」は、前記（１）〜（５）の因子全てによる協調的な動態であってもよく、前記（１）〜（５）の因子から任意に選ばれた２種の因子の組み合わせによる協調的な動態であってもよく、前記（１）〜（５）の因子それぞれ単独による動態であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、測定又は検出対象の「因子の動態」としては、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現、具体的には、該発現レベルの変動；該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とそのリガンドとの結合の有無；該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体と該核内受容体が特異的に結合する核酸との結合の有無；Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体のプロモーターの機能の発現の有無等が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法としては、測定又は検出対象の「因子の動態」に応じて、大きく４つの実施態様がある。
本発明のスクリーニング方法の第１の実施態様としては、（Ｉ）前記因子と、被検物質とを接触させるステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）の後、該因子と被検物質との結合を検出し、それにより、該因子と結合する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップを含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記因子への結合を介して当該因子の機能に作用する物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、直接的に前記因子に結合してその機能を調節するという特徴的な性質を有する。したがって、選択された候補化合物は、前記因子に直接的かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
前記ステップ（Ｉ）において、前記因子と被検物質との接触は、該因子の本来の機能を妨げない溶液中において、前記因子と被検物質とを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。
前記「因子の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。
また、ステップ（Ｉ）における反応条件としては、特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜９．０、より好ましくは、ｐＨ７．５〜８．５、さらに好ましくは、ｐＨ８．０で、１０℃から５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは、２５℃〜３７℃、さらに好ましくは、２５℃、１分〜１時間、好ましくは、３分〜３０分、より好ましくは５分〜２０分、さらに好ましくは、１０分維持すること、又は０℃〜２０℃、好ましくは、２℃〜１０℃、より好ましくは、３℃〜８℃、さらに好ましくは、４℃で、２０分〜２４時間、好ましくは、３０分〜１２時間、より好ましくは、４０分〜２時間、さらに好ましくは、１時間維持すること等が挙げられる。より具体的には、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、８０ｍＭ  ＫＣｌ、５％  グリセロール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｄＩｄＣ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０％  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ中、前記条件下に維持することが挙げられる。
ついで、ステップ（ＩＩ）において、前記ステップ（Ｉ）で得られた産物について、前記因子と被検物質との結合の有無を調べる。
前記因子と被検物質との結合の検出は、例えば、表面プラズモン解析、被検物質を保持した担体へのバインディングアッセイ等により行なわれうる。
表面プラズモン解析により、前記因子と、被検物質との間の結合を測定する場合、例えば、下記ステップ：
−  前記因子を固定化したセンサーチップと、被検物質を含有した溶液を一定の流速で送液するステップ、及び
−  適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）〕により、光学的変動又は質量の変動として、前記因子と、被検物質との相互作用を検出するステップ；
を含む方法を行なうことにより、該結合を測定することができる。なお、表面プラズモン解析を用いた測定方法においては、前記因子と、被検物質との間の結合は、例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液による被検物質の導入により変動した場合、当該被検物質が、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択されうる。
本発明のスクリーニング方法の第２の実施態様としては、（ａ）Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物と、
ＩＩ）前記（Ｉ）の核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物とを、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の増加をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ、
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記（１）の核内受容体と該核内受容体に対する応答性エレメントとの相互作用による該応答性エレメントの下流のレポーター遺伝子の発現の有無を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、前記（１）の核内受容体に対する阻害能、特に、前記（１）の核内受容体の転写抑制能に対する阻害能を有するという特徴的な性質を有し、前記（１）の核内受容体の転写制御能、あるいはＤＮＡ結合活性に対する阻害能が細胞レベルで機能するという優れた効果を発揮する。
なお、本明細書において、「動作可能」とは、プロモーターの機能、該プロモーター制御下での下流遺伝子若しくは各種因子の機能発現等を包含する概念を意図する。
前記ステップ（ａ）に用いられるＩ）の核酸構築物は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、プロモーターと、レポーター遺伝子とを含む構築物である。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントとは、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体が結合することにより作用する塩基配列からなる核酸をいい、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸中に局在するＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体自身による標的配列からなる核酸、前記標的配列からなる核酸のアンチセンス鎖にストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる核酸の塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子；前記標的配列からなる核酸の塩基配列と少なくとも６０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列同一性を有し、かつＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に結合及び／又は応答しうる配列からなる核酸分子等も含まれる。
前記Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントとしては、具体的には、配列番号：１４、１５、１６等が挙げられる。
前記プロモーターとしては、核酸構築物を導入するために用いられる細胞により適宜選択されうるが、宿主中で発現できるものであればいかなるものでもよい。プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の大腸菌やファージに由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等が挙げられる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたＰｔｒｐｘ２プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター、等が挙げられる。前記プロモーターは、前記応答性エレメントの下流及び支配下に動作可能に連結される。
前記レポーター遺伝子としては、その産物の発現が検出可能である遺伝子であればよく、核酸構築物を導入するために用いられる細胞により適宜選択されうるが、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、Ｂｉｏｔｉｎ遺伝子、蛍光タンパク質等が挙げられる。前記レポーター遺伝子は、前記プロモーターの下流及び支配下に動作可能に連結される。なお、前記プロモーターは、前記レポーター遺伝子本来のプロモーターであってもよい。
前記Ｉ）の核酸構築物は、慣用の細胞導入用担体、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、金属微粒子等に担持させてもよい。前記ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）；特開平３−２２９７９号公報〕、ｐＡＧＥ１０３〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）〕、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）等が挙げられる。
前記ＩＩ）の発現用核酸構築物は、前記（１）の核内受容体をコードする核酸を含有する。
前記（１）の核内受容体をコードする核酸としては、具体的には、例えば、
ｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする核酸、
ｉｉ）前記ｉ）の核酸のアンチセンス鎖に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
ｉｉｉ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列において、少なくとも１塩基の変異を有し、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上の配列同一性を有し、かつコードされたポリペプチドが、特定のクロマチン配列に結合し、標的遺伝子の転写開始効率を正負に調節する機能を発揮するものである核酸、
等が挙げられる。ここで、前記機能は、前述の機能の評価方法により評価されうる。
前記Ｉ）の核酸構築物と、前記ＩＩ）の発現用核酸構築物とは、好ましくは、細胞内で互いに共存できるもの（和合性を有するもの）であることが望ましい。
前記Ｉ）の核酸構築物はＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の応答性エレメントを慣用のレポータープラスミドのクローニング部位に挿入することにより構築されうる。レポータープラスミドとしては前記レポーター遺伝子の発現、及び検出ができるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとして、ｐＧＬ３、ｐＲＬ、ｐＣＡＴ３（プロメガ社製）、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＣＦＰ、ｐＥＹＦＰ、ｐＤｓＲｅｄ、ｐＳＥＡＰ、ｐβｇａｌ（クロンテック社製）、ＰＧＶ−ＣＳ，ＰＧＶ−Ｂ、ＰＧＶ−Ｐ、ＰＧＶ−Ｃ２、ＰＧＶ−Ｐ２、ＰＧＶ−Ｂ２（東洋インキ社製）等が挙げられる。
前記ＩＩ）の発現核酸構築物は、前記（１）の核内受容体をコードする核酸を発現可能な慣用の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター等におけるクローニング部位に挿入することにより構築されうる。前記（１）の核内受容体をコードする核酸の発現に適した発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで適切な宿主細胞、例えば、動物細胞で発現できるベクターであればいずれでもよく、そのようなベクターとしては、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６、ｐＨＢ６（ロシュダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオテク社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（ニューイングランドバイオラボ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）；特開平３−２２９７９号公報〕、ｐＡＧＥ１０３〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１（５），１３０７−１３１０（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８（３０），２２７８２−２２７８７（１９９３）〕、ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平５−３３６９６３号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）等が挙げられる。発現ベクターは、構成的プロモーター又は誘導可能なプロモーター、ポリＡ付加シグナル、複製開始起点、抗生物質耐性遺伝子等が含まれていることが望ましい。
前記プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればよく、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主に用いる宿主細胞としては、動物細胞、具体的には、ヒト由来細胞株のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９号公報）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来細胞株のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、ラット由来細胞株Ｌ６（骨格筋由来筋芽細胞）、マウス由来細胞株３Ｔ３Ｌ１（脂肪細胞）、マウス由来細胞株Ｃ２Ｃ１２（筋芽細胞）、サル由来細胞株のＣＯＳ−１〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０〕及びＣＯＳ−７〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１〕、ハムスター由来細胞株のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来細胞株のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。
本明細書に用いられる「ストリンジェントな条件」とは、高ストリンジェンシーな条件、例えば、１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳの条件等をいう。ここで、ストリンジェンシーを向上させるため、より低イオン強度、例えば、０．５×ＳＳＣ、好ましくは、０．２×ＳＳＣ、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、例えば、用いられる核酸のＴｍ値により異なるが、５０℃以上、好ましくは、６０℃以上、より好ましくは、６５℃以上等の条件下で洗浄等を行なってもよい。
本明細書に用いられる「変異」とは、塩基の置換、欠失、付加及び挿入をいう。かかる変異は、天然に存在するバリエーションであってもよく、慣用の部位特異的変異方法等により人為的に導入された変異であってもよい。
本明細書に用いられる「配列同一性」とは、比較対象の少なくとも２つの配列について、適切に整列化させ、それぞれの配列に存在する同一の残基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の残基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより算出されうる値をいう。かかる配列同一性は、具体的には、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において、一般に利用可能であるＢＬＡＳＴアルゴリズム等により算出されうる。本明細書における配列同一性とは、より具体的には、前記ＢＬＡＳＴアルゴリズムにおいて、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）５、Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）２、ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）−３、ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）１０及びＷ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）１１を満たす条件により算出された値をいう。
ステップ（ａ）においては、前記Ｉ）の核酸構築物と、前記ＩＩ）の発現用核酸構築物とを適切な細胞に導入する。
前記細胞としては、発現ベクターに対応する適当な細胞又は組織を用いることが可能であればよく、動物細胞等が挙げられる。宿主に用いる動物細胞としては、例えば、ラット由来細胞株のＬ６〔骨格筋由来筋芽細胞〕、ヒト由来細胞株のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、マウス由来細胞株のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞）及び３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞、ＡＴＣＣ  ＣＬ−１７３）、サル由来細胞株のＣＯＳ−１〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０〕及びＣＯＳ−７〔アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１〕、ハムスター由来細胞株のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来細胞株のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等が挙げられる。
前記細胞への核酸構築物及び発現核酸構築物の導入は、慣用の遺伝子導入法により行なわれうる。例えば、宿主が動物細胞である場合、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（２），１３３−１４０（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）；Ｖｉｌｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）〕、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、ウイルスを利用した方法等により行なわれうる。
前記核酸構築物及び発現核酸構築物が導入された細胞は、当該分野において周知慣用の常法により培養すればよい。前記培養は、用いられた細胞に適した培地を用いて行うことができ、培養に使用される培地としては液体培地が適当である。具体的には、ＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＹＴ培地、ＢＥＭ培地等が用いられる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際の培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＩＭ培地等にウシ胎児血清（ＦＣＳ）を適量添加したもの等が用いられる。培地には、必要により発現ベクターのプロモーターの転写活性を高めるために、転写活性を促進する物質を含んでいてもよい。転写活性を促進する物質としては、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等が挙げられる。
培地には、形質転換体が生育するのに必要な栄養素、例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン類、ホルモン類、血清、好ましくは、ＦＣＳ、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が含有されており、その様な培地であればどのような組成の培地でも用いることができ、市販されている培地も用いることができる。
培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件で行なうことができる。培養温度、培養時間及び培養液のｐＨは、各種宿主に適した範囲に設定される。例えば、培養は、通常１５〜４０℃、５時間〜７日間、ｐＨ３．０〜９．０、５％  ＣＯ２存在下等の条件で行なわれうる。ｐＨの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行なれうる。また、必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして、誘導性のプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを保持した発現ベクターで形質転換した宿主を培養する場合、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
なお、第２の実施態様のスクリーニング方法においては、前記核酸構築物と発現核酸構築物とが導入された安定な細胞系を用いる場合、ステップ（ａ）は、省略してもよい。
ついで、ステップ（ｂ）において、前記ステップ（ａ）で得られた細胞と、被検物質とを接触させる。
ステップ（ｂ）は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、前記ステップ（ａ）で得られた細胞を培養すること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に細胞をさらすこと、細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。
その後、ステップ（ｃ）において、ステップ（ｂ）で得られた細胞における前記レポーター遺伝子の発現の有無又は発現の変動を測定する。なお、対照として、前記Ｉ）の核酸構築物と前記ＩＩ）の発現用核酸構築物とを保持した細胞であり、かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、被検物質にさらされていない細胞、あるいは細胞抽出液等が用いられうる。
レポーター遺伝子の発現は、用いられたレポーター遺伝子に応じて、その産物の発現を調べることにより測定される。例えば、前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等の酵素遺伝子である場合、酵素活性を調べればよい。また、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素標識により検出するＥＬＩＳＡ法や化学発光法、ルミノールやＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の蛍光標識を検出するＦＩＴＣ法、１２５Ｉ等の放射性同位体標識を検出するＲＩＡ法、ラテックスに結合したラテックス凝集法、ウェスタンブロット法及び免疫組織染色等も例示される。
ここで、対照の細胞において、レポーター遺伝子の発現が見られない場合は、被検物質と接触させた細胞におけるレポーター遺伝子の発現の存在が、該被検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。また、対照の細胞において、レポーター遺伝子の発現が見られる場合は、対照の細胞に比べて、被検物質と接触させた細胞において、レポーター遺伝子の発現レベルが増加した場合、当該被検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。
本発明のスクリーニング方法の第３の実施態様としては、被検物質と、前記（１）又は（３）の因子が内在的に発現している細胞とを接触させ、前記（１）又は（３）の因子の発現の変動をタンパク質レベル又は核酸レベルで検出し、それにより、前記（１）又は（３）の因子の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択する方法が挙げられる。
前記（１）の核内受容体の発現の変動を指標とする場合のスクリーニング方法としては、
（Ａ）内在的に前記（１）の核内受容体を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）で得られた細胞における前記（１）の核内受容体の発現の変動を測定し、それにより、前記（１）の核内受容体の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップを含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記（１）の核内受容体の発現の変動を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、細胞レベルにおいて前記（１）の核内受容体の発現を転写レベルで抑制するという特徴的な性質を有し、核内受容体の機能を阻害することなく前記（１）の核内受容体の発現を特異的に抑制することができるという優れた効果を発揮する。
前記（３）の核内因子の発現の変動を指標とする場合のスクリーニング方法としては、
（Ａ’）内在的に前記（３）の核内因子を発現している細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（Ｂ’）前記ステップ（Ａ’）で得られた細胞における前記（３）の核内因子の発現の変動を検出し、それにより、該核内因子の発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法が挙げられる。かかる方法によれば、前記（３）の核内因子の発現の変動を指標として、候補化合物を選択する。したがって、選択された候補化合物は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリーの転写複合体を構成するいずれかの因子に作用するという優れた効果を発揮する。
前記ステップ（Ａ）及び（Ａ’）のそれぞれに用いられる細胞としては、前記実施態様２の場合と同様の細胞が挙げられる。
前記ステップ（Ａ）及び（Ａ’）のそれぞれにおいて、細胞と被検物質の接触は、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、内在的に前記（１）又は（３）の因子を発現している細胞を培養すること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に細胞をさらすこと、細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。
なお、対照として、前記（１）又は（３）の因子を内在的に発現している細胞であり、かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞を用いること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に細胞をさらすこと、細胞抽出液を被検物質にさらすこと等を用いうる。
前記ステップ（Ｂ）及び（Ｂ’）のそれぞれにおいて、ステップ（Ａ）及び（Ａ’）のそれぞれで得られた細胞における前記（１）及び（３）の因子それぞれの発現の変動は、タンパク質レベルでは、例えば、前記ステップ（Ａ）及び（Ａ’）のそれぞれで得られた細胞における前記（１）及び（３）の因子それぞれの発現レベルと、対照の細胞における前記（１）及び（３）の因子それぞれの発現レベルとを、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；前記（１）の核内受容体に対する抗体又はその断片又はその断片及び前記（３）の核内因子に対する抗体又はその断片のそれぞれを用いたウェスタンブロット解析；前記抗体又はその断片を用いたイムノアッセイ等により測定し、比較することにより評価されうる。また、前記（１）及び（３）の因子の発現の変動は、核酸レベルでは、例えば、被検物質との接触後の細胞から、核酸を抽出し、得られた核酸を、例えば、前記（１）及び（３）の因子をコードした各核酸を検出しうる核酸、すなわち、前記（１）及び（３）の因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸を用いたハイブリダイゼーション；前記（１）及び（３）の因子をコードした各核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、比較することにより評価されうる。
ここで、対照の細胞に比べて、被検物質と接触させた細胞において、前記（１）及び（３）それぞれの因子の発現レベルが減少した場合、当該被検物質が糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物であることの指標となる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、因子の動態を測定又は検出するための抗体としては、前記（１）又は（３）の因子に対する抗体、その断片等が挙げられる。前記抗体の作製方法は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｅｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法により、前記（１）又は（３）の因子の全部又は一部を用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。前記抗体は、前記（１）又は（３）の因子に特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体は、例えば、前記（１）又は（３）の因子中における特定の部分断片に特異的に結合しうる抗体であってもよい。また、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。さらに、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等を使用することもできる。かかる抗体又はその断片は、慣用の酵素（例えば、ペルオキシダーゼ等）、蛍光色素、放射性物質、アビジン若しくはビオチン等で標識されていてもよい。
Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαを認識するポリクローナル抗体の作製は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαのポリペプチドの全長、その部分ペプチド若しくは該部分ペプチドを含むポリペプチドを抗原として哺乳動物に投与することにより抗体を作製することができる。抗原とは、前記ポリペプチド又は部分ペプチドをそのまま用いてもよく、担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシガイのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）やウシチログロブリン（ＢＴＧ）等に結合したものを用いてもよい。また、抗原による免疫反応を高めるために、例えば、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）及び不完全アジュバント（ＩＦＡ）を投与してもよい。免疫に用いられる哺乳動物としてはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター等を用いることができる。
ポリクローナル抗体は、例えば、レーンらの方法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）〕等に従って作製することができる。
哺乳動物に抗原を１回目の投与後、１〜２週間毎に３〜１０回投与することで免疫された哺乳動物を得て、それらの哺乳動物から血清を採取し、精製することで作製できる。
前記抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。該抗原の投与量は１回当たり動物１匹に対し、５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、適当な担体に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、遺伝子工学的手法やペプチド合成機で合成することができる。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔「酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）」医学書院刊（１９７６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）〕等に記載の方法で確認することができる。
免疫された哺乳動物から採血し、抗体価を測定する。十分な抗体価が得られるまでに免疫された時点で採血し、血清を調製することによりポリクローナル抗体を得ることができる。ポリクローナル抗体の分離、精製方法としては、遠心分離、硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）〕又はＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡカラム、Ｇ−カラムあるいはゲル濾過カラム等の各種クロマトグラフィーを単独又は組み合わせることで行うことができる。
Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体を認識するモノクローナル抗体は、例えば、十分な抗体価が得られた免疫哺乳動物から、脾臓又はリンパ節を採取し、それらから得られた抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得、得られたハイブリドーマを用いて慣用の方法により目的の抗体を生産させることにより得られうる。
具体的には、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、その部分ペプチド若しくはその部分ペプチドを含むポリペプチドを抗原として投与して、十分な抗体価を示したラットに、前記抗原を最終投与する。その後、３〜７日目に、ラットから、脾臓を摘出する。得られた脾臓を、ＭＥＭ培地（例えば、日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離する。得られた沈殿分画中の脾細胞をＴｒｉｓ−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して、赤血球を除去する。その後、得られた脾細胞を、ＭＥＭ培地で３回洗浄する。得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
骨髄腫細胞としては、マウス又はラットから由来の株化細胞が挙げられる。かかる骨髄腫細胞としては、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１株（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４株（以下、ＳＰ−２と略す）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６、２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３株（以下、６５３と略す）〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（以下、Ｘ６３と略す）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等が挙げられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地（１５μｇ／ｍｌ  ８−アザグアニンを含む正常培地〔１．５ｍＭ  グルタミン、５×１０−５Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ジェンタマイシン及び１０％  ＦＣＳ（ＣＳＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）〕で継代し、細胞融合を行なう３〜４日前に正常培地で培養する。細胞融合には、そのようにして調製した細胞を２×１０７個以上用いる。
細胞融合は、既知の方法で行なわれ得、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）〕に従って行なわれうる。具体的には、前記抗体産生細胞と前記骨髄腫細胞とを、ＭＥＭ培地又はＰＢＳ（１リットル当たり；１．８３ｇ  リン酸二ナトリウム、０．２１ｇ  リン酸−カリウム、７．６５ｇ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄し、骨髄腫細胞の細胞数に対し抗体産生細胞５〜１０倍になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に対し抗体産生細胞１０８個当たり、ポリエチレングリコール溶液〔２ｇ  ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、２ｍｌ  ＭＥＭ培地、０．７ｍｌ  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）〕を０．２〜１ｍｌを３７℃で攪拌しながら添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。ＭＥＭ培地で全量を５０ｍｌになるように調製し、９００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、沈殿分画を得る。沈殿分画にＨＡＴ培地（正常培地、１０−４Ｍ  ヒポキサンチン、１．５×１０−５Ｍ  チミジン及び４×１０−７Ｍ  アミノプテリンを含む）１００ｍｌを添加し、ゆるやかにほぐし、懸濁する。
得られた懸濁液を９６穴培養用プレートの各穴に１００μｌ穴ずつ分注し、３７℃、５％  ＣＯ２存在下で７〜１４日間培養する。酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）〕等に記載の方法で、培養上清に産生された抗体のうち、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
前記ハイブリドーマによる抗体の生産は、慣用の方法により行なわれうる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、因子の動態を測定又は検出するための核酸としては、前記（１）又は（３）の各因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸等が挙げられる。前記（１）又は（３）の各因子をコードした各核酸に特異的に結合する核酸としては、例えば、前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（３）の核内因子をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（３）の核内因子をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた核酸、配列番号：４１〜５１からなる群より選ばれた核酸、それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。
前記（１）又は（３）の因子をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸及び前記（３）の核内因子をコードした核酸それぞれの５’末端に対応するプライマーと３’末端に対応するプライマーとからなるプライマー対；前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列及び前記（３）の核内因子をコードした核酸に特徴的な部分配列それぞれの５’末端に対応するプライマーと３’末端に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた配列を、核酸増幅を介して検出できるプライマー対等が挙げられる。なお、かかるプライマー対は、前記配列番号：１、３、４、６又は８の配列の全部又はその特徴的な部分配列を増幅可能なものであればよい。より具体的には、例えば、配列番号：１０、１２、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１１、１３、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。プライマー対の具体例としては、特に限定されないが、配列番号：１０と１１とのプライマー対、配列番号：１２と１３とのプライマー対、配列番号：１７と１８とのプライマー対、配列番号：１９と２０とのプライマー対、配列番号：２１と２２とのプライマー対、配列番号：２３と２４とのプライマー対、配列番号：２５と２６とのプライマー対、配列番号：２７と２８とのプライマー対、配列番号：２９と３０とのプライマー対、配列番号：３１と３２とのプライマー対、配列番号：３３と３４とのプライマー対、配列番号：３５と３６とのプライマー対、配列番号：３７と３８とのプライマー対、配列番号：３９と４０とのプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光色素による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。
本明細書において、「（核酸に）特徴的な部分配列」とは、例えば、データベースに登録された配列のうち、前記（１）又は（３）の因子を除くものの塩基配列には、見出されない部分配列をいい、例えば、データベースに登録された配列との配列同一性が、２０％以下、好ましくは、１０％以下、より好ましくは、５％以下、特に好ましくは０％である配列をいう。
本発明のスクリーニング方法の第４の実施態様としては、前記（４）のＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーター又は前記（５）のＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターの機能を阻害する被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択する方法が挙げられる。
かかる第４の実施態様の方法としては、
（ａ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法（方法１）；
（ａ’）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を、細胞に導入して発現させるステップ、
（ｂ’）前記ステップ（ａ’）で得られた細胞と被検物質とを接触させるステップ、並びに
（ｃ’）前記ステップ（ｂ’）で得られた細胞における該レポーター遺伝子の発現の有無を検出又は発現の変動を測定し、それにより、該レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす被検物質を、糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物として選択するステップ
を含む方法（方法２）
が挙げられる。
前記方法１によれば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターの機能の阻害、すなわち、レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターの機能の阻害を介して、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に作用するという性質を有する。したがって、選択された候補化合物は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体プロモーターに直接的かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
また、前記方法２によれば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターの機能の阻害、すなわち、レポーター遺伝子の発現の存在又は発現の減少をもたらす物質を選択することができるため、選択された候補化合物は、当該核内因子のプロモーターの機能の阻害を介して、該核内因子に作用するという性質を有する。したがって、選択された候補化合物は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターに直接的かつ特異的に作用させることができるという優れた効果を発揮する。
前記ステップ（ａ）又は（ａ’）に用いられる核酸構築物は、前記（４）又は（５）のプロモーターと、レポーター遺伝子とを含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結した構築物である。かかるレポーター遺伝子としては、上述のレポーター遺伝子と同様のものが挙げられる。
前記ステップ（ａ）及び（ａ’）に用いられる細胞としては、上述の宿主細胞と同様のものが用いられうる。
前記ステップ（ａ）及び（ａ’）において、細胞への前記核酸構築物の導入は、上述の慣用の遺伝子導入法により行なわれうる。なお、得られた細胞の培養には、前記実施態様２の方法に用いられる培地と同様の培地が用いられうる。
なお、第４の実施態様のスクリーニング方法においては、前記核酸構築物が導入された安定な細胞系を用いる場合、ステップ（ａ）及び（ａ’）は、省略してもよい。
ついで、ステップ（ｂ）及び（ｂ’）において、それぞれ、前記ステップ（ａ）及び（ａ’）で得られた細胞と、被検物質とを接触させる。
ステップ（ｂ）及び（ｂ’）は、それぞれ、例えば、被検物質を含有した培地を用いて、前記ステップ（ａ）及び（ａ’）で得られた細胞を培養すること、被検物質の入ったＰＢＳ等の緩衝液に細胞をさらすこと、細胞抽出液を被検物質にさらすこと等により行なわれうる。
その後、ステップ（ｃ）及び（ｃ’）において、それぞれ、ステップ（ｂ）及び（ｂ’）で得られた細胞における前記レポーター遺伝子の発現の有無又は発現の変動を測定する。なお、対照として、前記Ｉ）の核酸構築物を保持した細胞であり、かつ前記被検物質を含有しない培地を用いて培養された細胞、被検物質にさらされていない細胞、あるいは細胞抽出液等が用いられうる。
本発明のスクリーニング方法により得られる糖尿病治療剤又は予防剤の候補化合物としては、前記（１）又は（３）の因子の発現を抑制する化合物又はその塩；前記（１）〜（５）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子の機能を阻害する化合物又はその塩等が挙げられる。
前記化合物又はその塩としては、例えば、前記（１）〜（５）の因子の少なくとも１つに結合することにより、該因子の少なくとも１つの機能を阻害する化合物、例えば、低分子化合物、高分子化合物、該（１）又は（３）の因子に対する抗体、該（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸のアンチセンス鎖等の核酸、ペプチド；該（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸に対応してＲＮＡｉを誘発する核酸、具体的には、ｓｉＲＮＡ；該（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸に対応するリボザイム等が挙げられる。
なお、前記ｓｉＲＮＡの配列は、ＲＮＡｉに無関係な結合因子影響を減少させる観点から、調節タンパク質結合部位が多い５’及び３’の非翻訳領域と開始コドン周辺の領域を避けることが望ましい。前記ｓｉＲＮＡの配列は、特に限定されないが、例えば、
▲１▼  機能を阻害する標的となる配列の開始コドンから、好ましくは、５０〜１００ヌクレオチド以上下流、より好ましくは、少なくとも７５ヌクレオチド下流の領域を選択し、
▲２▼  選択された領域から、好ましくは、細胞死を引き起こさない程度の長さ、より好ましくはＡＡ−〔Ｎ１９（任意の１９ヌクレオチド残基）〕の配列又はＡＡ−〔Ｎ２１（任意の２１ヌクレオチド残基）〕の配列、さらに好ましくは、ＡＡＧ−〔Ｎ１８（任意の１８ヌクレオチド残基）〕の配列又はＡＡＣ−〔Ｎ１８（任意の１８ヌクレオチド残基）〕の配列を選択し、
▲３▼  選択された配列について、
−  ＧＣ含量が、好ましくは、３０％〜７０％、より好ましくは、４０％前後〜５０％前後、さらに好ましくは、５０％前後である
−  公知のデータベースを検索、例えば、ホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／から利用可能なＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴサーチにより、標的となる配列に対して特異的である
配列であることを確認する
ことによりデザインされうる。かかるデザインには、例えば、慣用のｓｉＲＮＡデザインツール〔例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製のｓｉＲＮＡデザインツール等〕を用いてもよい。デザインされた配列のｓｉＲＮＡについて、例えば、ＤＥＰＥＣ（ジエチルピロカルボン酸）処理水等中で保存されることが望ましい。
本発明においては、前記ｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号：５４又は５５に示される塩基配列を有する核酸に対応するｓｉＲＮＡ、配列番号：５６又は５７に示される塩基配列を有する核酸に対応するｓｉＲＮＡが挙げられる。
なお、本発明のスクリーニング方法において、被検物質として、ｓｉＲＮＡを用いる場合、デザインされたｓｉＲＮＡを、適切なアニーリング用緩衝液、例えば、組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌの緩衝液、組成：３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇの緩衝液、組成：１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡの緩衝液中、慣用のアニーリング条件下、例えば、９０〜９５℃で５分間インキュベーションし、徐々に２５℃前後まで温度を下げることにより、二本鎖ＲＮＡを形成させて用いられうる。
また、本発明のスクリーニング方法において、被検物質として、ｓｉＲＮＡを用いる場合、本発明のスクリーニング方法は、該ｓｉＲＮＡを慣用の手法により、前記実施態様２のステップ（ａ）で得られる細胞又は前記実施態様３のステップ（Ａ）で得られる細胞に導入すること等により行なわれうる。
また、ＲＮＡｉに際して用いられうるベクターとしては、特に限定されないが、例えば、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．１．０−Ｕ６〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．２．０−Ｕ６〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．３．０−Ｈ１〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．２．１−Ｕ６Ｈｙｇｒｏ〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．３．１−Ｈ１Ｈｙｇｒｏ〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ＩＭＧ−７００、ＩＭＧ−８００〔イムジェネックス（ＩＭＧＥＮＥＸ）社製〕、商品名：ｐＧＥ−１〔ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｈＵ６〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｍＵ６〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｓｉＲＮＡ−ｈＨｌｎｅｏ〔インビボジェン（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）社製〕、商品名：ｐｓｉＲＮＡ．ｈＨｌｚｅｏ〔インビボジェン（ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）社製〕等；アデノウイルスを用いた系として、商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ．ａｄｅｎｏｌ．０−ＣＭＶＳｙｓｔｅｍ〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ．Ａｄｅｎｏ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ〔イムジェネックス（ＩＭＧＥＮＥＸ）社製〕等；レトロウイルスを用いた系として、商品名：ＧＥＮＥＳＵＰＲＥＳＳＯＲ  ＲＥＴＲＯＶＩＲＡＬ  ＳＹＳＴＥＭ〔イムジェネックス（ＩＭＧＥＮＥＸ）社製〕等が挙げられる。
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｉＲＮＡを合成し、それを細胞に導入する方法も利用することができ、かかる方法には、特に限定されないが、例えば、商品名：ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｄｉｃｅｒ  ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、商品名：Ｓｉｌｅｎｃｅｒ．ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕、商品名：ＣＵＧＡＲ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ〔ニッポンジーン社製〕等が用いられうる。
さらに、本発明のスクリーニング方法において、被検物質として、ｓｉＲＮＡを用いる場合、ｓｉＲＮＡの効果は、用いられたｓｉＲＮＡと同じ塩基組成を有するｓｉＲＮＡを陰性対照として用いればよい。
また、前記（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸に対応するリボザイムは、例えば、ｔＲＮＡ連結型リボザイムの場合
▲１▼  機能を阻害する標的となる配列中におけるリボザイムにより切断可能な配列を選択し、
▲２▼  選択された配列とその隣接の両側の６〜９ヌクレオチドとをリボザイムの認識配列として、該認識配列に相補的なリボザイムの配列を設計し、
▲３▼  設計された配列のＲＮＡが、例えば、ｔＲＮＡの構造を正しく形成すること、リボザイムの構造が比較的安定であること、標的となるｍＲＮＡにおけるステム構造の形成がないこと等を指標として、リボザイムと標的となる配列の評価を行なうこと
により、デザインされうる。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質として、リボザイムを用いる場合、前記デザインされたリボザイムを、発現に適したベクター、例えば、商品名：ｐｉＧＥＮＥｔＲＮＡ〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｈＵ６〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｍＵ６〔タカラバイオ社製〕等に組込み、得られたベクターを適切な宿主細胞に導入して、該宿主細胞内で増幅させることができる。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質として、リボザイムを用いる場合、本発明のスクリーニング方法は、該リボザイムを発現するためのベクター又はウイルスを慣用の手法により、前記実施態様２のステップ（ａ）で得られる細胞又は前記実施態様３のステップ（Ａ）で得られる細胞に導入すること等により行なわれうる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる前記（１）〜（５）の各因子、該（１）〜（５）の各因子をコードする各核酸、該核酸を保持した細胞等は、本発明のスクリーニング方法を行なうためのキットとしても提供される。したがって、このようなスクリーニング用キットも本発明に含まれる。
本発明のスクリーニング用キットとしては、具体的には、
前記（１）〜（５）からなる群より選ばれた少なくとも１つの因子を含有した、かつ該因子に結合する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；
Ｉ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体に対する応答性エレメントと、
プロモーターと、
レポーター遺伝子と
を含み、該応答性エレメントの下流及び支配下に、該プロモーターと該レポーター遺伝子とが動作可能に連結し、かつ該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物、及び
ＩＩ）Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸を含有した発現用核酸構築物
を含有した、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；
前記（１）又は（３）の因子に対する抗体又はその断片を含有した、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；
前記（１）又は（３）の因子をコードした核酸が導入された細胞を含有した、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット；
前記（４）又は（５）のプロモーターと、レポーター遺伝子とを含み、該プロモーターの下流及び支配下に、該レポーター遺伝子が動作可能に連結したものである核酸構築物を含有した、該因子の発現を調節する化合物又はその塩のスクリーニング用キット
等が挙げられる。
本発明のスクリーニング用キットは、検出用試薬、緩衝液、標準物質、標準曲線等をさらに含有してもよい。
本発明のスクリーニング用キットによれば、前記スクリーニング方法を、簡便に、かつ迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができるという優れた効果を発揮する。
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩は、前記（１）〜（５）の各因子の機能に対する作用機序に基づく作用、前記（１）〜（５）の各因子の機能に関連して発症する糖尿病に対する治療又は予防作用を発揮しうる。したがって、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、前記（１）〜（５）の各因子の機能に関連する疾患、特に糖尿病の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。
本発明の医薬組成物は、本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有することに１つの特徴がある。したがって、本発明の医薬組成物は、前記（１）〜（５）の各因子の機能に関連する疾患、該機能に関連して発症する疾患に対して、該因子の機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。また、本発明の医薬組成物によれば、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、前記（１）〜（５）の各因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症するＩＩ型糖尿病に対して、該機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の医薬組成物によれば、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（ＰＰＡＲ）を活性化させることに基づくチアゾリジンジオン化合物とは異なる作用機序によりインスリン抵抗性を改善することができるという優れた効果を発揮する。
本発明の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇであることが望ましい。
本発明の医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。
また、本発明の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、核酸又はその誘導体の場合、例えば、０．００００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の薬理評価は、例えば、インスリン抵抗性モデル動物、例えば、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔに、本発明の医薬組成物を投与し、非投与動物に比べ、投与動物において、インスリン抵抗性の改善が見られた場合を指標として評価する方法；グルコースクランプ試験法等により行なわれうる。
なお、本発明の医薬組成物には、前記（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸に対応してＲＮＡｉを誘発しうる核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡを発現するベクターを有効成分として含有した医薬組成物、該（１）〜（３）のいずれかの因子をコードする核酸に対応するリボザイムに対応するリボザイムを有効成分として含有した医薬組成物も含まれる。
前記ｓｉＲＮＡとしては、特に限定されないが、配列番号：５４又は５５に示される塩基配列を有する核酸に対応するｓｉＲＮＡ、配列番号：５６又は５７に示される塩基配列を有する核酸に対応するｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分が、ｓｉＲＮＡである場合、投与対象となる個体、好ましくは、筋肉、脂肪、肝臓等の組織から慣用の方法により全ＲＮＡを抽出し、標的となるｍＲＮＡが分解されることを指標として、薬理評価を行なうこともできる。
前記リボザイムとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列における塩基番号：６９１〜７０１内、５７８〜５９９内のいずれかを認識配列とするリボザイムが挙げられる。
本発明の医薬組成物の有効成分が、リボザイムである場合、認識配列の切断に基づく前記（１）〜（３）のいずれかの因子又はそれをコードする核酸の量の減少を指標として、薬理評価を行なうこともできる。
また、本発明によれば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸（センス核酸）のアンチセンス核酸を用いたＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現抑制方法も提供されうる。
かかるアンチセンス核酸を用いたＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現抑制方法においては、前記（１）をコードする核酸と相補的なＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡを、細胞内で発現させるか、あるいは導入することにより、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の遺伝子の発現を抑制する。
前記アンチセンス核酸は、標的とするＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の遺伝子より転写されるｍＲＮＡに相補的な配列を有するものであればよく、例えば、少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは、２５ヌクレオチド長以上、より好ましくは、２８ヌクレオチド長以上の核酸を化学的合成〔例えば、商品名：Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏアンチセンス［ジーンツールズ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ）社製］、商品名：ホスホロチオエートオリゴ［バイオグノスティック（ＢｉｏＧＮＯＳＴＩＣ）社製］等を参照のこと〕又は酵素的合成により作製されうる。
前記アンチセンス核酸は、標的とする癌組織へのデリバリーに適する性質、組織又は細胞に対する親和性を付与しうる種々の修飾を有していてもよい。
前記アンチセンス核酸は、例えば、個体の筋肉、脂肪組織等の組織への局所投与、非経口投与、経口投与等により個体に投与することができる。投与手段としては、金属粒子、リポソーム、例えば、内包型リポソーム、正電荷リポソーム、ＨＶＪ（センダイウイルス）−リポソーム等による導入法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。
また、前記アンチセンス核酸の投与量及び投与回数は、投与目的、個体の年齢、体重、状態等に応じて、発現抑制効果を発揮させるに十分な量となるように、適宜設定され得る。
なお、アンチセンス核酸は、使用目的、使用形態等に応じて、適宜、適切な溶液、例えば、アンチセンス核酸を安定に維持しうる緩衝液等に溶解させた形態で用いられうる。また、アンチセンス核酸は、薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤などを含有した剤として用いてもよい。
また、本発明によれば、前記リボザイムを用いたＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体の発現抑制方法も提供されうる。
前記リボザイムの投与手段等は、前記アンチセンス核酸の投与手段等と同様である。
個体、特に、組織や細胞への前記リボザイムの導入に適したベクターとしては、特に限定されないが、例えば、前記商品名：ｐｉＧＥＮＥｈＵ６〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｍＵ６〔タカラバイオ社製〕、商品名：ｐｉＧＥＮＥｔＲＮＡ〔タカラバイオ社製〕等が挙げられる。
前記発現抑制方法は、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体をコードする核酸に対応する、アンチセンス核酸、リボザイム等が用いられるため、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に対する作用機序に基づく作用、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病の治療等への応用に有用である。
本発明によれば、インスリン抵抗性モデルラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ）において、インスリン抵抗性を改善させた場合、改善前よりも、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現が、減少し、さらに、培養細胞において該Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαを強制発現させることにより、グルコース取り込み能が低下するという知見に基づき、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の診断方法が提供される。
本発明の糖尿病の診断方法は、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおけるＲｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体遺伝子、すなわち、前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルを測定することを１つの特徴とする。したがって、本発明の診断方法によれば、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病を、簡便に、迅速に、診断することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の診断方法によれば、高い信頼性で診断することを可能にする。
本発明の診断方法においては、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検対象の個体が、糖尿病に罹患している疑いがあることの指標となる。
前記個体としては、ヒト、マウス、ラット、サル等が挙げられる。
核酸含有被検試料は、例えば、個体の組織、細胞、血液等から慣用の手法により調製されうる。
前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルは、前記（１）の核内受容体の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量又は前記（１）の核内受容体の遺伝子産物の量を指標として測定されうる。
ｍＲＮＡ転写物の量を指標とする場合、被検対象の個体由来の核酸含有被検試料及び正常個体由来の核酸含有対照試料のそれぞれを、例えば、前記（１）の核内受容体をコードした核酸を検出しうる核酸、すなわち、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特異的に結合する核酸を用いたハイブリダイゼーション、あるいは前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はその一部のそれぞれを特異的に増幅しうるプライマー対を用いたＰＣＲ等に供し、ハイブリッドの形成若しくは量又は増幅産物の出現若しくは量を測定し、比較することにより評価されうる。
ハイブリダイゼーションに用いられる核酸としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の核酸又はそのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた核酸、配列番号：４１〜５１からなる群より選ばれた核酸、それらのアンチセンス鎖の核酸等が挙げられる。かかる核酸は、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されていてもよい。
ＰＣＲに用いられるプライマー対としては、前記（１）の核内受容体をコードした核酸の５’末端に対応するプライマーと３’末端に対応するプライマーとからなるプライマー対、前記（１）の核内受容体をコードした核酸に特徴的な部分配列の５’末端に対応するプライマーと３’末端に対応するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマー対は、使用時における操作性を考慮し、適切なＴｍ値、二次構造等に基づき、適宜選択されうる。具体的には、例えば、配列番号：１、３、４、６及び８からなる群より選ばれた配列を、核酸増幅を介して検出できるプライマー対等が挙げられる。より具体的には、例えば、配列番号：１０、１２、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７及び３９からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号：１１、１３、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８及び４０からなる群より選ばれた１種に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。かかるプライマーは、慣用の蛍光色素、放射性物質等で標識されたプライマーであってもよい。増幅産物の検出は、慣用のアガロースゲル電気泳動等において、臭化エチジウムや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。
遺伝子産物の量を指標とする場合、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料のそれぞれを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、前記（１）の核内受容体に対する抗体又はその断片を用いたウェスタンブロット解析；前記抗体又はその断片を用いたイムノアッセイ等に供し、遺伝子産物量を測定し、比較することにより評価されうる。
なお、前記診断方法により得られた結果は、媒体、電気通信回線等を介して、医者、受診者等に供給されうる。
また、本発明によれば、本発明の診断方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうために、前記プローブ及び／又はプライマー対を含有した診断用キット、又は前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を含有した診断用キットが提供される。
本発明の診断用キットには、検出用試薬、緩衝液、対照試料等をさらに含有してもよい。
さらに、本発明によれば、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料の検出又は選別方法も提供される。
本発明の検出又は選別方法によれば、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料を、簡便、迅速に、高い信頼性で検出することができる。
本発明の検出又は選別方法は、被検対象の個体由来の被検試料及び正常個体由来の対照試料それぞれにおける前記（１）の核内受容体の遺伝子の発現レベルを測定するステップを含み、ここで、被検試料における発現レベルが、対照試料における発現レベルよりも高くなる場合、該被検試料が、糖尿病に罹患している疑いがある個体由来の試料であることの指標となる。
本発明の検出又は選別方法においては、発現レベルは、前記（１）の核内受容体の遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量又は前記（１）の核内受容体の遺伝子産物の量を指標として測定されうる。
ｍＲＮＡ転写物の量又は遺伝子産物の量の測定は、前記プローブ及び／又はプライマー対、あるいは前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を用いることにより実施されうる。
また、本発明によれば、本発明の検出又は選別方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうために前記プローブ及び／又はプライマー対を含有した診断用キット、又は前記（１）の核内受容体に対する抗体若しくはその断片を含有した検出用キットが提供される。したがって、かかる検出用キットによれば、前記検出方法を、簡便、迅速に、高処理量で、高い信頼性で行なうことができる。
前記検出用キットには、検出に必要な各種試薬、例えば、標識物質、標識用試薬、適切な対照等を適宜含有してもよい。
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載された方法を用いた。
【実施例１】（１）ＤＮＡチップを用いた糖尿病ラットの遺伝子発現解析
インスリン抵抗性モデル動物について、▲１▼  インスリン抵抗性改善剤であるピオグリタゾンの投与〔ピオグリタゾン投与群〕、▲２▼  食餌制限〔食餌制限群〕、又は▲３▼  食餌制限と運動負荷との組み合わせ〔食餌制限＋運動負荷群〕による処理を行なった。
インスリン抵抗性モデル動物として、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ（塩野義製薬株式会社  油日ラボラトリーズＡＣ部門育成供給、１０齢）を用いた。対照として、Ｚｕｃｋｅｒ  ｌｅａｎ  ｒａｔ（塩野義製薬株式会社  油日ラボラトリーズＡＣ部門育成供給、１０齢）を用いた。飼育温度２４±１℃、湿度５５±５％、照明期間１２時間（８時から２０時）の飼育条件の下、自由に摂餌飼育した。
前記▲１▼のピオグリタゾン投与群については、ピオグリタゾン（武田薬品社製、商品名：アクトス）１０ｍｇ／ｋｇラット体重を、１日あたり、１回投与した。上記と同じの飼育条件の下、３週間、飼育した。
前記▲２▼の食餌制限群については、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔに、一日摂餌量の７０％相当量のみを摂餌させた。期間は５週間とした。上記と同じ条件の下、飼育した。
前記▲３▼の食餌制限＋運動負荷群については、食事制限に加えトレッドミルを用いて運動負荷を行なった。運動負荷条件は、１５ｍｌ／分×１５分のｗａｒｍｉｎｇ−ｕｐ、２０ｍｌ／分×６０分の運動、１５ｍｌ／分×１５分のｃｏｏｌ−ｄｏｗｎとした。期間は、５週間とした。
インスリン抵抗性の改善は、グルコースクランプ試験を行ない、グルコース注入量の増加をインスリン抵抗性が改善したことの指標として評価した。
（２）インスリン抵抗性改善により発現が変動する遺伝子の検索
▲１▼〜▲３▼の各処理群においてインスリン抵抗性が改善された個体及び対照群の個体のそれぞれの脳、骨格筋、肺、及び脂肪組織から、ＴＲＩＺＯＬ試薬（商品名、インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを調製し、全ＲＮＡ３００μｇを得た。得られた全ＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルにしたがってｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、インビトロジェン社製）を用いてクローニング用ｃＤＮＡ断片を調製した。
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  ２〜５μｇを用い、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８ｐｒｉｍｅｒとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  ＲＴとを用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成し、ついで、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼとＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈとを用いてセカンドストランドｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端をもつｃＤＮＡを生成した。その後、得られたｃＤＮＡに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＥｃｏＲＩ（ＮｏｔＩ）アダプターを５’及び３’両末端に付加した。アダプターを付加したｃＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、５’末端をリン酸化した。その後、ＳｉｚｅＳｅｐ  ４００  Ｓｐｕｎ  Ｃｏｌｍｎｓ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）で約４００ｂｐ以上のｃＤＮＡ断片を回収した。ベクタープラスミド  ｐＳｐｏｒｔ  １（商品名、インビトロジェン社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で処理し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’末端をリン酸化した後、該ベクタープラスミドに、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて得られたｃＤＮＡ断片を組み込んだ。得られた組換えプラスミドＤＮＡをエタノール沈殿後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）２０μｌに溶解し、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８）〕により、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ（商品名、インビトロジェン社製）に導入して、形質転換体を作製した。
形質転換体をＳ．Ｏ．Ｃ．培地（インビトロジェン社製）１ｍｌ中、３７℃で１時間培養し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。その結果、ｃＤＮＡライブラリーとして約１０００万個（挿入率９５％）のアンピシリン耐性を示す形質転換体を取得した。得られた形質転換体のコロニー約２００００個から、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡ断片を調製した。得られたｃＤＮＡ断片は、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｋｉｔ（ＭｅｇａＢＡＣＥ）（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルに従って、ＭｅｇａＢＡＣＥ  ５００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）によりｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した。ｃＤＮＡの配列情報を、ＣＨＩＰＳｐａｃｅ（商品名、日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いて解析することにより、重複のない約５０００種類のｃＤＮＡクローンを選択した。これらのクローンをＤＮＡチップ作製システムＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  Ｓｐｏｔｔｅｒ（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を用いて，Ｔｙｐｅ７スライドグラス（商品名、アマシャム  バイオサイエンス社製）にスポットしてＤＮＡチップを作製した。
このＤＮＡチップを用いて、糖尿病モデルＺｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ  ラット〔Ｊ．Ｈｅｒｅｄ，５２，２７５−２７８（１９６１）〕での遺伝子発現変動解析を実施した。３０％食餌制限と週５日間運動とを実施したＺｕｃｋｅｒ  Ｆａｔｔｙ  ラットから、骨格筋を摘出した。得られた骨格筋から、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、インビトロジェン社製）を用い、添付のマニュアルに従って全ＲＮＡを調製した。得られた全ＲＮＡを、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ＭｉｃｒｏｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、添付のマニュアルにしたがって、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し、このｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてプローブを作製した。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ  ０．５μｇをサンプルとし用い、Ｒａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒをアニールさせた後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  ＩＩ  ＲＴ（インビトロジェン社製）を用いてＣｙ−３  ｄＣＴＰ又はＣｙ−５  ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませｃＤＮＡを蛍光標識した。さらに、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて標識ｃＤＮＡを精製し、プローブとして用いた。プローブは、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｌｉｄｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（商品名、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いてＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーションは、Ｔｙｐｅ  ７スライドのプロトコールに従い、前処理の後にプローブと４８℃で１２時間行った。バッファーにはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｖｅｒ．２（商品名、アマシャムバイオサインス社製）を用いた。洗浄後、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  Ｓｃａｎｎｅｒ（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）により読み取りを行ない、解析コンピューターソフト〔商品名：Ａｒｒａｙ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）及び商品名：ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（シリコンジェネテックス社製）〕を用いてデータ解析を実施した。その結果、ラット骨格筋において、コントロールと比較して食餌制限と運動により発現量の減少が認められた遺伝子としてＲｅｖ−ｅｒｂＡαが見出された。
その結果、インスリン抵抗性糖尿病により、オーファン核内受容体であるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現が増加していることがわかった。さらに、▲２▼の食餌制限群及び▲３▼の食餌制限＋運動負荷群において、インスリン抵抗性改善処置により、改善前（対照群）に比べ、オーファン核内受容体であるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現が約１／１０に減少することがわかった。また、インスリン抵抗性改善薬物であるピオグリタゾンによっては、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現に変化は認められなかった。
以上の結果より、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現を指標として、糖尿病が診断できることが示唆される。
実施例２  糖尿病モデルラットにおけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα  ｍＲＮＡの発現
Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαは、骨格筋における発現量が多いことが知られている。したがって、前記▲１▼〜▲３▼の各処理群について、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔの骨格筋におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現プロファイルを調べた。
なお、ＲＴ−ＰＣＲには、配列番号：３７と３８とのプライマー対、配列番号：３９と４０とのプライマー対を用いた。対照として、対照群のｍＲＮＡ及び未処理の骨格筋由来のｍＲＮＡを用いた。具体的には、３０％食餌制限と週５日間運動を実施したラットの骨格筋、及び脂肪組織より、インビトロジェン社製のＴＲＩｚｏｌ試薬（商品名）を用いて、添付マニュアルに従い、全ＲＮＡを抽出し、５０μｇの全ＲＮＡを得た。このＲＮＡをキアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製の商品名：ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔにて添付マニュアルに従いＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、回収した。得られた全ＲＮＡ  ２μｇよりＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、インビトロジェン社製）を用いて添付マニュアルに従い、ｃＤＮＡを合成した。次に、ラットＲｅｖ−ｅｒｂＡα（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２５８０４）の配列をもとにプローブ検索ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商品名、ＡＢＩ社製）によりリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマーを選択した。プライマーは、キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社に合成を依頼した。このプライマーを用いて、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによるリアルタイム定量ＰＣＲを行ない、ｍＲＮＡ量を定量した。
反応試薬としては、キアジェン社の商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔを使用し、９５℃で１５分間反応した後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分の反応を４０サイクル行なって定量した。ＰＣＲ、及び蛍光測定は、ＡＢＩ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）を用いてにて行なった。その結果、糖尿病ラット骨格筋（第１図）、及び脂肪組織（第２図）において、食餌制限と運動によりインスリン抵抗性が改善されるとＲｅｖ−ｅｒｂＡαの発現が減少することが確認された。第１図、第２図のグラフは、Ｚｕｃｋｅｒ  Ｌｅａｎ  ラットにおける発現量を１とした相対量で示している。なお、リアルタイム定量ＰＣＲでは、増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一種類のみ増幅されていることを確認した。
その結果、第１図及び第２図に示すように、▲２▼の食餌制限群及び▲３▼の食餌制限＋運動負荷群において、インスリン抵抗性の改善により、改善前（対照群）に比べ、オーファン核内受容体であるＲｅｖ−ｅｒｂＡα遺伝子の発現が約１／１０に減少することがわかった。
以上の結果より、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現を指標として、糖尿病が診断できることが示唆される。
実施例３  ヒト正常組織におけるＲｅｖ−ｅｒｂＡα  ｍＲＮＡの発現
ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７２６３１）の配列をもとに、実施例２と同様の手法によりリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマーを設計し、合成した。このプライマーを用い、Ｈｕｍａｎ  ＭＴＣ  ＰａｎｅｌＩ（商品名、クローンテック社製）を鋳型としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによるリアルタイム定量ＰＣＲを行なった。反応試薬、及び反応条件は実施例２と同様とし、反応後、増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一種類のみ増幅されていることを確認した。その結果、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαのｍＲＮＡは、発現量の大きい順に骨格筋、膵臓、脳、心臓であることが観察された（第３図）。第３図のグラフは、ヒト脳での発現を１とした相対量で示している。
実施例４  ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現細胞株の樹立
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ７２６３１の塩基配列に基づき、Ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（商品名、クローンテック社製）より、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα  ＣＤＮＡ全長をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（商品名、インビトロジェン社）へクローニングした。
前記クローンの塩基配列を確認した後、ＢａｍＨＩとＸｂａＩとでｃＤＮＡ全長を切りだし、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−７．１ベクター（商品名、シグマ社製）のＢｇｌＩＩとＸｂａＩの制限酵素サイトへクローニングして、発現ベクターを得た。この発現ベクターをＬ６細胞に導入し、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαを安定的に発現する細胞を取得した。発現ベクターを導入した細胞におけるヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡαの発現は抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した（第４図）。全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（商品名、ミリポア社製）に転写した。このメンブランを５％スキムミルク、ＰＢＳ中で室温、１時間ブロッキング処理した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を加え、さらに１時間室温でインキュベートした。インキュベート後、メンブランを０．１％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ〔商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用いて発色させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ〔商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ社製〕に露光した。
実施例５  ヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現細胞株におけるグルコース取りこみ活性の測定
実施例４により得られたヒトＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現細胞株を用いてグルコース取りこみ活性の測定を行なった。ＣｙｔｏＳｔａｒ−Ｔ  ｐｌａｔｅ（商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ社製）に、細胞を２×１０４細胞／ウェルで捲いた後、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、一晩培養した。この細胞を３００μｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、８０μｌのＨＥＰＥＳ−Ｋｒｅｂｓバッファー〔組成：１１９ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７５ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，２．５４ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ・７Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．４）〕を添加した。続いて３μＭのインスリンを１０μｌ、及び２−ＤＥＯＸＹ−Ｄ−〔Ｕ−１４Ｃ〕Ｇｌｕｃｏｓｅ溶液（アマシャムバイオサイエンシーズ社製）を１０μｌ添加後、軽く混和して、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２０分間インキュベートした。インキュベート後、１００μＭのＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂを１０μｌ添加し、商品名：１４５０  ＭＩＣＲＯ  ＢＥＴＡ  ＴＲＩＬＵＸ（商品名、パーキンエルマー社製）で測定した。この結果、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα強制発現細胞では、コントロール細胞と比較してインスリン濃度非依存的にグルコース取りこみ能が低下していることが観察された。アッセイに使用したサンプルは、商品名：ＣｙＱＵＡＮＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ〔モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕により測定したＤＮＡ量で補正し、その結果を図に示した。
なお、細胞の培養については、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍと  １ｘＡｎｔｉ〔１００ｘＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（商品名）、インビトロジェン社製〕を加えたα−ＭＥＭを培地として使用し、７０−８０％コンフルエントに達した時点でトリプシンを使用して細胞を回収し、１／１０−１／２０希釈して、継代する条件で行なった。
その結果、第５図に示すように、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの強制発現により、グルコース取り込み能が低下することがわかった。したがって、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現の増加が、糖尿病の病態に関連することが示唆された。
【実施例６】  前記実施例の結果より、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現の阻害を指標として、糖尿病の治療又は予防に有効な候補化合物をスクリーニングできる可能性が示唆された。そこで、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαレポーターアッセイ系を構築した。
Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα結合配列〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，３５５３−３５５８（１９９６）〕を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：５２及び５３）をアニーリングさせた後、商品名：ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕のＢｇｌ  ＩＩ部位に挿入し、レポーター遺伝子とした。
このレポーター遺伝子を、前記実施例４で示したＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現ベクターと同時にＬ６細胞に導入し、レポーター遺伝子の転写活性を、ピッカジーンデュアルシーパンジーキット（東洋インキ製造株式会社製）を用いて測定した。測定結果を第６図に示す。
その結果、第６図に示されるように、Ｌ６細胞ではＲｅｖ−ｅｒｂＡαの強制発現によりレポーター遺伝子の転写活性が１／８に低下した。
したがって、上記のレポーター遺伝子の転写活性を指標にしてＲｅｖ−ｅｒｂＡα機能阻害剤をスクリーニングすることが可能である。
実施例７  Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα発現阻害剤のスクリーニング系
前記実施例２の結果より、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現の阻害を指標として、糖尿病の治療又は予防に有効な候補化合物をスクリーニングできる可能性が示唆された。そこで、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαプロモーターを利用したレポーターアッセイ系を構築した。Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡから、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，３５５３−３５５８（１９９６）で同定されたＲｅｖ−ｅｒｂＡαのプロモーター領域（約１．７ｋｂ）をＰＣＲクローニングした。使用したプライマーを配列番号：５８及び５９に示す。
得られた断片を商品名：ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕のＳｍａ  Ｉ部位に挿入し、レポーター遺伝子とした。
このレポーター遺伝子を前記実施例４で示したＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現ベクターと同時にＬ６細胞に導入し、レポーター活性を、商品名：ピッカジーンデュアルシーパンジーキット（東洋インキ製造株式会社製）にて測定した。
Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαは、自身のプロモーター領域に結合してその転写を抑制することが知られている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３，３５５３−３５５８（１９９６）〕。
そこで、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの転写抑制機能を有するデキサメサゾン〔Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１，３７９９−３８０６（２０００）〕を１０ｎＭの濃度で培地に添加した場合のレポーター遺伝子の転写活性も同時に測定した。測定結果を第７図に示す。
その結果、第７図に示されるように、Ｌ６細胞では、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの強制発現によりレポーター遺伝子の転写活性が１／５に低下した。またデキサメサゾンの添加では１／２にレポーター遺伝子の転写活性が低下した。したがって、このレポーター遺伝子の転写活性を指標にしてＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現阻害剤をスクリーニングすることが可能である。
実施例８  ＲＮＡｉによるＲｅｖ−ｅｒｂＡα発現抑制下でのグルコース取り込み能の測定
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１４５７７５の塩基配列に基づき、ラットＲｅｖ−ｅｒｂＡαの発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ領域を選択した。前記領域に相当する４種のオリゴヌクレオチド（配列番号：５４〜５７）を合成した。合成されたオリゴヌクレオチド（配列番号：５４と５５との対、配列番号：５６と５７との対）をアニーリングさせ、得られた二本鎖核酸を商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６  Ｈｙｇｒｏ  ｖｅｃｔｏｒ〔アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社製〕に挿入し、発現ベクターを得た。
得られた発現ベクターを、Ｌ６細胞に導入し、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαに対するｓｉＲＮＡを安定的に発現する細胞を取得した。
得られた細胞でのＲｅｖ−ｅｒｂＡαの発現量を実施例２と同様の方法により測定した。結果を第８図に示す。
その結果、第８図に示されるように、対照の細胞と比較して、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαのｍＲＮＡ量は、１／３に低下していた。
また、この細胞を用いて、実施例５と同様の方法にてグルコース取り込み量を測定した。結果を第９図に示す。
その結果、第９図に示されるように、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現を抑制するとインスリンによるグルコース取り込みの活性化がおよそ２倍に上昇していた。
したがって、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの発現の抑制が、糖尿病の病態改善に関連することが示唆された。
実施例９  Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα発現阻害剤のスクリーニング系
配列番号：６１に示されるＲＩＰ１４０のプロモーターの断片を商品名：ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕のＳｍａＩ部位に挿入し、プラスミドを得る。得られたプラスミドをＬ６細胞に導入し、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターの機能阻害を介したＲｅｖ−ｅｒｂＡα機能阻害剤のスクリーニング系として用いるための細胞を得る。得られた細胞を、被検物質を含む培地で一定時間培養し、レポーター活性を、商品名：ピッカジーンデュアルシーパンジーキット（東洋インキ製造株式会社製）にて測定する。
その結果、レポーター遺伝子の転写活性の減少を指標として、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体とＲＮＡポリメラーゼ複合体とを機能的に共役させうる核内因子のプロモーターの機能阻害を介したＲｅｖ−ｅｒｂＡα機能阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることが可能である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号：１０は、ラットＲｅｖ−ｅｒｂ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号：１１は、ラットＲｅｖ−ｅｒｂ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
配列番号：１２は、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂ増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号：１３は、ヒトＲｅｖ−ｅｒｂ増幅用リバースプライマーの配列を示す。
配列番号：１４は、Ｒｅｖ−ｅｒｂ応答性エレメントの配列を示す。
配列番号：１５は、Ｒｅｖ−ｅｒｂ応答性エレメントの配列を示す。
配列番号：１６は、Ｒｅｖ−ｅｒｂ応答性エレメントの配列を示す。
配列番号：１７は、ＰＣＲフォワードプライマー１の配列を示す。
配列番号：１８は、ＰＣＲリバースプライマー１の配列を示す。
配列番号：１９は、ＰＣＲフォワードプライマー２の配列を示す。
配列番号：２０は、ＰＣＲリバースプライマー２の配列を示す。
配列番号：２１は、ＰＣＲフォワードプライマー３の配列を示す。
配列番号：２２は、ＰＣＲリバースプライマー３の配列を示す。
配列番号：２３は、ＰＣＲフォワードプライマー４の配列を示す。
配列番号：２４は、ＰＣＲリバースプライマー４の配列を示す。
配列番号：２５は、ＰＣＲフォワードプライマー５の配列を示す。
配列番号：２６は、ＰＣＲリバースプライマー５の配列を示す。
配列番号：２７は、ＰＣＲフォワードプライマー６の配列を示す。
配列番号：２８は、ＰＣＲリバースプライマー６の配列を示す。
配列番号：２９は、ＰＣＲフォワードプライマー７の配列を示す。
配列番号：３０は、ＰＣＲリバースプライマー７の配列を示す。
配列番号：３１は、ＰＣＲフォワードプライマー８の配列を示す。
配列番号：３２は、ＰＣＲリバースプライマー８の配列を示す。
配列番号：３３は、ＰＣＲフォワードプライマー９の配列を示す。
配列番号：３４は、ＰＣＲリバースプライマー９の配列を示す。
配列番号：３５は、ＰＣＲフォワードプライマー１０の配列を示す。
配列番号：３６は、ＰＣＲリバースプライマー１０の配列を示す。
配列番号：３７は、ＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマー１の配列を示す。
配列番号：３８は、ＲＴ−ＰＣＲリバースプライマー１の配列を示す。
配列番号：３９は、ＲＴ−ＰＣＲフォワードプライマー２の配列を示す。
配列番号：４０は、ＲＴ−ＰＣＲリバースプライマー２の配列を示す。
配列番号：４１は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ領域）の配列を示す。
配列番号：４２は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＸｈｏＩ−ＳｍａＩ領域）の配列を示す。
配列番号：４３は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＥｃｏＲＩ−終止コドン領域）の配列を示す。
配列番号：４４は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（７８３位−ＥｃｏＲＩ領域）の配列を示す。
配列番号：４５は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（全長ＯＲＦ）の配列を示す。
配列番号：４６は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（５’非コード領域）の配列を示す。
配列番号：４７は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（開始コドン−ＥｃｏＲ  Ｉ領域）の配列を示す。
配列番号：４８は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉ領域）の配列を示す。
配列番号：４９は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＰＣＲ断片）の配列を示す。
配列番号：５０は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＰＣＲ断片）の配列を示す。
配列番号：５１は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの検出用プローブ（ＰＣＲ断片）の配列を示す。
配列番号：５２は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα結合配列（フォワード）の配列を示す。
配列番号：５３は、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡα結合配列（リバース）の配列を示す。
配列番号：５４は、ｓｉＲＮＡ標的領域を含有した配列（フォワード）を示す。
配列番号：５５は、ｓｉＲＮＡ標的領域を含有した配列（リバース）を示す。
配列番号：５６は、ｓｉＲＮＡ標的領域を含有した配列（フォワード）を示す。
配列番号：５７は、ｓｉＲＮＡ標的領域を含有した配列（リバース）を示す。
配列番号：５８は、プロモーター領域を増幅するためのフォワードプライマーの配列を示す。
配列番号：５９は、プロモーター領域を増幅するためのリバースプライマーの配列を示す。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、糖尿病、具体的には、ＩＩ型糖尿病、特に、Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に関連して発症する糖尿病に対して、該Ｒｅｖ−ｅｒｂファミリー核内受容体又はそれに関連する因子、例えば、Ｒｅｖ−ｅｒｂＡαの機能に対する作用機序に基づく治療又は予防効果を呈しうる治療剤又は予防剤の候補化合物、前記糖尿病に対する治療又は予防剤の薬理評価及び糖尿病の治療又は予防手段への応用が可能になる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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