(57)【要約】コンドロイチンの基本骨格を合成するための酵素であって、グルクロン酸転移活性を有しており、且つＮ−アセチルガラクトサミン転移活性も有しているヒト由来の新規コンドロイチン合成酵素。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリペプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
【請求項２】
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基をＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体に対して転移する酵素活性又はＤ−グルクロン酸残基をＤ−グルクロン酸受容体に対して転移する酵素活性を有すると共に、配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列のうち１〜１５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は転移を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
【請求項３】
非還元末端にＤ−グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該Ｄ−グルクロン酸残基に対してＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、非還元末端にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を有するコンドロイチンの当該Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基に対してＤ−グルクロン酸供与体からＤ−グルクロン酸残基を転移する酵素活性を有することを特徴とする請求の範囲２記載のコンドロイチン合成酵素。
【請求項４】
請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素をコードする核酸。
【請求項５】
請求の範囲４記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
発現ベクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とする請求の範囲５記載の発現ベクター。
【請求項７】
請求の範囲５又は６記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項８】
請求の範囲７記載の形質転換体を生育させ、生育物にコンドロイチン合成酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を単離することを特徴とするコンドロイチン合成酵素の製造方法。
【請求項９】
請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体及びＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体に対して作用させて、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式（２）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
2003102193.tif 000026
式（１）及び（２）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
【請求項１０】
請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（３）で示される構造を有するＤ−グルクロン酸受容体及びＤ−グルクロン酸供与体に対して作用させて、Ｄ−グルクロン酸受容体にＤ−グルクロン酸残基を転移することを特徴とする、下記式（４）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
2003102193.tif 000027
式（３）及び（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
【請求項１１】
下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移して下記式（２）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
2003102193.tif 000028
式（１）及び（２）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
【請求項１２】
下記式（３）で示される構造を有するＤ−グルクロン酸受容体の非還元末端に存在するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基に対して、Ｄ−グルクロン酸残基を転移して下記式（４）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
2003102193.tif 000029
2003102193.tif 000030
式（３）及び（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
【請求項１３】
請求の範囲１〜３いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性調節剤。
【請求項１４】
請求の範囲１３記載の活性調節剤を有効成分として含む、請求の範囲１〜３のいずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の糖鎖骨格（基本骨格：コンドロイチン骨格とも記載する）を合成する酵素及びそれをコードするＤＮＡに関するものである。より詳細にはコンドロイチン骨格の非還元末端にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基が存在する際には当該Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基にＤ−グルクロン酸残基を転移し、非還元末端にＤ−グルクロン酸残基が存在する場合には当該Ｄ−グルクロン酸残基にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有する酵素及びそれをコードするＤＮＡに関する。
背景技術
以下本明細書中の糖及び糖残基の表記においては特に明記しない限り光学異性体はすべてＤ体を示すものとする。
コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンはＤ−グルクロン酸残基（以下単に「グルクロン酸」又は「ＧｌｃＵＡ」とも記載する）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（以下単に「Ｎ−アセチルガラクトサミン」又は「ＧａｌＮＡｃ」とも記載する）の二糖の繰り返し構造（すなわち、−［ＧｌｃＵＡ  β（１，３）−ＧａｌＮＡｃ  β（１，４）−］ｎ：ｎは２以上の整数を示す）を基本骨格とするグリコサミノグリカンの一種である。
従来グリコサミノグリカン、特にコンドロイチンやコンドロイチン硫酸は動物の軟骨、臓器等から抽出・精製されていた。しかし、近年は原料の不足からコンドロイチンやコンドロイチン硫酸に共通するコンドロイチン骨格を人工的に合成する手法が模索されている。特に、ヒト由来の酵素を用いる方法であれば、人工的に合成したコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混入していても、抗原抗体反応などの生体防御機構が強く作用することもないため好ましい。現時点においてこのようなコンドロイチン骨格を合成するための酵素、その中でも特にヒト由来であってＧｌｃＵＡ転移活性を有しており、且つＧａｌＮＡｃ転移活性も有している酵素は１種類しか得られていない（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３８７２１−３８７２６（２００１））。
コンドロイチン骨格の合成を行うためには酵素を数種類含むカクテル形式で行うことが好ましいと考えられている。各々の酵素の至適反応条件が異なることから反応系全体での反応条件を緩和することが可能となるからである。しかし、現時点において、ＧｌｃＵＡ転移活性及びＧａｌＮＡｃ転移活性の両者を有するヒト由来の酵素としては上述の酵素が知られているのみであり、条件の厳密なコントロールが困難であることからコンドロイチン骨格の合成の検討が不十分な状況だった。
そこで、コンドロイチン骨格を合成するための酵素であって、ＧｌｃＵＡ転移活性を有しており、且つＧａｌＮＡｃ転移活性も有しているヒト由来の新たな酵素が期待されていた。
発明の開示
本発明は、以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）  配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリペプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
（２）  Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基をＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体に対して転移する酵素活性又はＤ−グルクロン酸残基をＤ−グルクロン酸受容体に対して転移する酵素活性を有すると共に、配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列のうち１〜１５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は転移を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とするコンドロイチン合成酵素。
（３）  非還元末端にＤ−グルクロン酸残基を有するコンドロイチンの当該Ｄ−グルクロン酸残基に対してＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体からＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移する酵素活性を有すると共に、非還元末端にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を有するコンドロイチンの当該Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基に対してＤ−グルクロン酸供与体からＤ−グルクロン酸残基を転移する酵素活性を有することを特徴とする（２）記載のコンドロイチン合成酵素。
（４）  （１）〜（３）いずれか記載のコンドロイチン合成酵素をコードする核酸。
（５）  （４）記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
（６）  発現ベクターが真核細胞中において発現可能であることを特徴とする（５）記載の発現ベクター。
（７）  （５）又は（６）記載の発現ベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
（８）  （７）記載の形質転換体を生育させ、生育物にコンドロイチン合成酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記コンドロイチン合成酵素を単離することを特徴とするコンドロイチン合成酵素の製造方法。
（９）  （１）〜（３）いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体及びＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン供与体に対して作用させて、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移することを特徴とする、下記式（２）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
2003102193.tif 000002
式（１）及び（２）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
（１０）  （１）〜（３）いずれか記載のコンドロイチン合成酵素を下記式（３）で示される構造を有するＤ−グルクロン酸受容体及びＤ−グルクロン酸供与体に対して作用させて、Ｄ−グルクロン酸受容体にＤ−グルクロン酸残基を転移することを特徴とする、下記式（４）で示される構造を有する糖鎖の合成方法。
2003102193.tif 000003
式（３）及び（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
（１１）  下記式（１）で示される構造を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン受容体の非還元末端に存在するＤ−グルクロン酸残基に対して、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を転移して下記式（２）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、（１）〜（３）いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
2003102193.tif 000004
式（１）及び（２）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
（１２）  下記式（３）で示される構造を有するＤ−グルクロン酸受容体の非還元末端に存在するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基に対して、Ｄ−グルクロン酸残基を転移して下記式（４）で示される構造を有する糖鎖を合成するための、（１）〜（３）いずれか記載のコンドロイチン合成酵素の使用。
2003102193.tif 000005
式（３）及び（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
（１３）  （１）〜（３）いずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性調節剤。
（１４）  （１３）の活性調節剤を有効成分として含む、（１）〜（３）のいずれか一項記載のコンドロイチン合成酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤。
発明を実施するための最良の形態
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、公知のコンドロイチン合成酵素と類似の酵素活性を有する別の酵素が存在することを発見した。そして当該酵素のＤＮＡを取得して酵素を調製することにより本発明を完成させた。
以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。
（１）本発明酵素
本発明酵素は配列番号２記載のアミノ酸配列又は配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はそれに糖鎖が結合した糖鎖結合ポリペプチドからなることを特徴とするコンドロイチン合成酵素である。
本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端に存在する糖残基に対して、ＧａｌＮＡｃを転移する活性及びＧｌｃＵＡを転移する活性（ＧａｌＮＡｃを転移する活性を「ＧａｌＮＡｃ転移活性」、ＧｌｃＵＡを転移する活性を「ＧｌｃＵＡ転移活性」と記載する）を有する。すなわち、本発明酵素は、コンドロイチン骨格の非還元末端にＧｌｃＵＡ残基が存在する場合には当該ＧｌｃＵＡ残基に対してＧａｌＮＡｃ転移活性を示し、非還元末端にＧａｌＮＡｃ残基が存在する場合には当該ＧａｌＮＡｃ残基に対してＧｌｃＵＡ転移活性を示す。この様な酵素が最もコンドロイチン骨格の合成において利用価値が高いからである。
したがって、本発明酵素はコンドロイチン骨格の非還元末端にＧｌｃＵＡ残基が存在するＧａｌＮＡｃ受容体と、非還元末端にＧａｌＮＡｃ残基が存在するＧｌｃＵＡ受容体との両者を糖残基受容体とすることが好ましい。
本発明酵素のＧａｌＮＡｃ受容体は例えば下記式（１）で示す構造を含む。
2003102193.tif 000006
式（１）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し、「−」はグリコシド結合を示す。ＧａｌＮＡｃ受容体において、上記ｎは２以上であることが好ましく、更に４以上であることが好ましい。このような範囲であると、より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。
このような式（１）の構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体としては、例えばコンドロイチン若しくはコンドロイチン硫酸又はこれらを切断して得られる低分子化コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸が例示されるが、これに限定はされない。
式（１）で示される構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体に対して本発明酵素はＧａｌＮＡｃ供与体からＧａｌＮＡｃ残基を転移する。本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成に有用であるため、ＧａｌＮＡｃ残基はβ１，４グリコシド結合で非還元末端のＧｌｃＵＡ残基に転移されることが好ましい。
ＧａｌＮＡｃ供与体とは、ＧａｌＮＡｃ残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが最も好ましい。生体内でのコンドロイチン骨格の合成はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃがＧａｌＮＡｃ供与体として主に働いているからである。しかし、本発明酵素によるＧａｌＮＡｃ転移活性に関してＧａｌＮＡｃ残基を供給しうるＧａｌＮＡｃ供与体であれば特に限定はされない。
上記式（１）で示される構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体に対してＧａｌＮＡｃ残基を本発明酵素により転移すると、下記式（２）記載の構造を有する糖鎖が得られる。
2003102193.tif 000007
式（２）中、「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」、ｎ、ｍ、「−」は式（１）と同義である。
なお、ＧａｌＮＡｃ受容体は上記（１）で表される構造を有しており、更にその還元末端に更に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質もＧａｌＮＡｃ受容体とすることができ、そのようなＧａｌＮＡｃ受容体に対してＧａｌＮＡｃ残基を転移した場合には、上記（２）で表される構造を有しており、かつ更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などを有する化合物が得られる。
このような本発明酵素のＧａｌＮＡｃ転移活性は例えば本明細書実施例２（１）記載の方法の様に放射性同位元素でＧａｌＮＡｃ残基を標識しておく手法を用いることで容易に検出・測定することができる。
本発明酵素のＧｌｃＵＡ受容体は例えば下記式（３）で示す構造を含む。
2003102193.tif 000008
式（３）中、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し、「−」はグリコシド結合を示す。ＧｌｃＵＡ受容体において、上記ｎは２以上であることが好ましく、更に４以上であることが好ましい。このような範囲であると、より効率的にコンドロイチン骨格の伸長をさせることができるからである。
このような式（３）の構造を有するＧｌｃＵＡ受容体としては、例えばコンドロイチン又はコンドロイチン硫酸若しくはこれらを切断して得られる低分子化コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸が例示されるが、これに限定はされない。
式（３）で示される構造を有するＧｌｃＵＡ受容体に対して本発明酵素はＧｌｃＵＡ供与体基質からＧｌｃＵＡ残基を転移する。本発明酵素はコンドロイチン骨格の合成に有用であるため、ＧｌｃＵＡ残基はβ１，３グリコシド結合でＧａｌＮＡｃ残基に転移されることが好ましい。
ＧｌｃＵＡ供与体とは、ＧｌｃＵＡ残基を有する糖ヌクレオチドであることが好ましい。そのような物質としては例えばアデノシン二リン酸−Ｄ−グルクロン酸（ＡＤＰ−ＧｌｃＵＡ）、ウリジン二リン酸−Ｄ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ）、グアノシン二リン酸−Ｄ−グルクロン酸（ＧＤＰ−ＧｌｃＵＡ）、シチジン二リン酸−Ｄ−グルクロン酸（ＣＤＰ−ＧｌｃＵＡ）等が例示され、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡが最も好ましい。生体内でのコンドロイチン骨格の合成はＵＤＰ−ＧｌｃＵＡがＧｌｃＵＡ供与体として主に働いているからである。しかし、本発明酵素によるＧｌｃＵＡ転移活性に関してＧｌｃＵＡを供給しうるＧｌｃＵＡ供与体であれば特に限定はされない。
上記式（３）で示される構造を有するＧｌｃＵＡ受容体に対してＧｌｃＵＡ残基を本発明酵素により転移すると、下記式（４）記載の構造を有する糖鎖が得られる。
2003102193.tif 000009
式（４）中、「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」、ｎ、ｍ、「−」は式（３）と同義である。
なお、ＧｌｃＵＡ受容体は上記（３）で表される構造を有しており、更にその還元末端に更に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質もＧｌｃＵＡ受容体とすることができ、そのようなＧｌｃＵＡ受容体に対してＧｌｃＵＡ残基を転移した場合には、上記（４）で表される構造を有しており、かつ更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などを有する構造が得られる。
このような本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性は例えば本明細書実施例２（２）記載の方法の様に放射性同位元素でＧｌｃＵＡ残基を標識しておく手法を用いることで容易に測定することができる。
本発明酵素は配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。この様な範囲のアミノ酸配列を含むポリペプチドは上述したＧａｌＮＡｃ転移活性及びＧｌｃＵＡ転移活性の双方を有するからである（本明細書実施例２参照）。
一般に酵素は、それを構成するタンパク質に若干数のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加及び／又は転移（これらを総括して以下「アミノ酸変異」と記載する）を有していてもその活性が維持され、このようなアミノ酸変異を有する酵素はバリアントと呼ばれている。一般的に全アミノ酸数の２０％程度のアミノ酸変異であれば、活性中心に係る変異でない限りにおいて酵素活性は十分に維持される。従って、上述のＧａｌＮＡｃ転移活性及びＧｌｃＵＡ転移活性を有する限りにおいて、本発明酵素も上記配列番号２記載のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるアミノ酸配列に、若干数のアミノ酸変異を有していてもよい（酵素活性の有無は上述の様に本明細書実施例２に従って検定することが可能である）。なお、上記した「若干数」とは酵素を構成する全アミノ酸数の２０％以下（配列番号２のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるポリペプチドにおいては１５０個以下：すなわち相同性８０％以上）、好ましくは１５％以下（配列番号２のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるポリペプチドにおいては１１２個以下：すなわち相同性８５％以上）、最も好ましくは１０％以下（配列番号２のアミノ酸番号１３０〜８８２からなるポリペプチドにおいては７５個以下：すなわち相同性９０％以上）である。このようなアミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピュータソフトウェアを用いて容易に算出することができる。ＦＡＳＴＡのようなソフトウェアはインターネットによっても利用に供されている。
なお、配列番号２記載のアミノ酸配列の全配列からなるポリペプチドによって構成された酵素も、アミノ酸番号１３０〜８８２からなるポリペプチドに若干数の変異が起こって得られるポリペプチドによって構成されていると言うことができ、本発明酵素として好ましいポリペプチドの範囲内であると言える。
また、更にほ乳類由来のタンパク質には糖鎖が結合しているものも多く、本発明酵素は、ポリペプチドのみからなる酵素も、ポリペプチドに糖鎖が結合した酵素もいずれも包含する。
また本発明酵素は、下記の性質を有することが好ましい。
活性の増強：二価金属陽イオン（好ましくはマンガンイオン、コバルトイオン、カドミウムイオン）を反応系に存在させることにより活性が増強される。具体的には上記金属陽イオンのハロゲン化物（塩化物など）を反応液中に存在させればよい。
活性の阻害：１０ｍｍｏｌ／ｌ濃度のエチレンジアミン四酢酸を反応系に存在させることにより実質的に酵素活性を失う。
至適反応ｐＨ：ＧｌｃＵＡ転移酵素活性は２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液中でｐＨ５．５〜６．５（好ましくはｐＨ５．７〜６．０）、ＧａｌＮＡｃ転移酵素活性はＭＥＳ緩衝液中でｐＨ５．７〜６．７（好ましくはｐＨ６．０〜６．４）
また、本発明酵素の活性測定系を利用することで、かかる酵素の活性を促進したり阻害したりする働きを有する物質をスクリーニングして得ることができる。かかる物質は、本発明酵素の活性調節剤の有効成分として利用することが可能である。更に、この様な活性調節剤は、本発明酵素の活性の変化に起因する疾患の処置剤として利用することができる。
（２）本発明核酸
本発明核酸は本発明酵素をコードすることを特徴とする。
すなわち、本発明核酸は、それ又はそれに相補的な塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体内で発現させることで本発明酵素を生産させることができる核酸であれば特に限定はされない。また、本発明核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもかまわないが、安定性の面で極めて優れるためＤＮＡであることが好ましい。
本発明核酸の好ましい態様の一つとしては配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号３８８〜２６４９からなるＤＮＡ、及び配列番号１記載の全塩基配列からなるＤＮＡが例示される。
ところでタンパク質の生合成においては、遺伝暗号（トリプレット）とアミノ酸は必ずしも１対１とはなっておらず、同一のアミノ酸が異なるトリプレットに対応することがある（遺伝暗号の縮重）。従って上述のような遺伝暗号の縮重によって同一アミノ酸配列に対応する、例示した特定の塩基配列以外の他のトリプレットを含む核酸も、結果的に同一の本発明酵素を得るために利用可能であることは当業者であれば容易に理解されるところであり、本発明核酸に含まれることは言うまでもない。
また、配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号３８８〜２６４９からなるＤＮＡ又はそれに相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸は、例えば本発明核酸の生体内での発現状況などを検査するためのプローブとして使用することができ、試薬として極めて有用である。このようなプローブとしての核酸はあまりに分子量が大きいと取扱が困難となるため、５００ｂｐ〜１０ｋｂｐが例示され、より好ましくは６００ｂｐ〜９ｋｂｐ、最も好ましくは７００ｂｐ〜８ｋｂｐが例示される。
なお、ここでストリンジェントな条件下とは、一般にハイブリダイズを使用する手法（例えばノザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション）等で用いられる条件が挙げられ、好ましくは３７．５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での４２℃で条件が例示される。
（３）本発明発現ベクター
本発明発現ベクターは本発明核酸を含む発現ベクターである。
本発明発現ベクターは上記本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現しうるように遺伝子発現に関与する領域（プロモータ領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されている。従って本発明発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することで形質転換体が得られる。本発明発現ベクターの基本ベクター（本発明遺伝子を導入する前のベクター）は、発現ベクターを導入する宿主細胞との関係において適宜選択される。例えば宿主細胞として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞など）を使用する場合には、真核細胞用のベクターを基本ベクターとして選択し、原核細胞（大腸菌、枯草菌など）を宿主細胞として選択する場合には、原核細胞用のベクターを基本ベクターとして選択する。ところで本発明酵素はヒト由来の酵素であるため、本発明においては真核細胞を宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した本発明酵素が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、宿主細胞としては真核細胞、特にほ乳類細胞を選択することが好ましく、本発明発現ベクターの基本ベクターは真核細胞、特にほ乳類細胞用のベクターを選択することが好ましい。
なお、近年は遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させてその培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。本発明発現ベクターはそのような本発明酵素の単離・精製が容易となるように構築されていることが好ましい。特に本発明酵素を標識ペプチドとの融合タンパク質として発現するように構築した本発明発現ベクターを用いて遺伝子工学的に本発明酵素を調製すると単離・精製・検出が比較的容易となるため好ましい。
上記識別ペプチドの例としては、目的タンパク質を遺伝子組み換えによって調製する際に、該ペプチドと目的タンパク質とが結合した融合タンパク質として発現させることにより、形質転換体の生育物から目的タンパク質の分泌・分離・精製又は検出を容易にすることを可能とするペプチドである。このような識別ペプチドとしては、例えばシグナルペプチド（多くのタンパク質のＮ末端に存在し、細胞内の膜透過機構においてタンパク質の選別のために細胞内では機能している１５〜３０アミノ酸残基からなるペプチド：例えばＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、Ｄｓｂ等）、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分で分子量約４２，０００のタンパク質）、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ（ヒスチジン残基を６〜１０個並べて配した配列）、ｍｙｃタグ（ｃＭｙｃタンパク質由来の１３アミノ酸配列）、ＦＬＡＧペプチド（８アミノ酸残基からなる分析用マーカー）、Ｔ７タグ（ｇｅｎｅ１０タンパク質の最初の１１アミノ酸残基からなる）、Ｓタグ（膵臓ＲＮａｓｅＡ由来の１５アミノ酸残基からなる）、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ（大腸菌外膜タンパク質ｐｅｌＢの２２アミノ酸配列）、ＨＡタグ（ヘマグルチニン由来の１０アミノ酸残基からなる）、Ｔｒｘタグ（チオレドキシン配列）、ＣＢＰタグ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＢＤタグ（セルロース結合ドメイン）、ＣＢＲタグ（コラーゲン結合ドメイン）、β−ｌａｃ／ｂｌｕ（βラクタマーゼ）、β−ｇａｌ（βガラクトシダーゼ）、ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、ＨＰ−Ｔｈｉｏ（Ｈｉｓ−ｐａｔｃｈチオレドキシン）、ＨＳＰ（熱ショックペプチド）、Ｌｎγ（ラミニンγペプチド）、Ｆｎ（フィブロネクチン部分ペプチド）、ＧＦＰ（緑色蛍光ペプチド）、ＹＦＰ（黄色蛍光ペプチド）、ＣＦＰ（シアン蛍光ペプチド）、ＢＦＰ（青色蛍光ペプチド）、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光ペプチド）、ＭＢＰ（マルトース結合ペプチド）、ＬａｃＺ（ラクトースオペレーター）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、アビジン、プロテインＧ等のペプチドが挙げられ、何れの識別ペプチドであっても使用することが可能である。その中でも特にシグナルペプチド、プロテインキナーゼＡ、プロテインＡ、グルタチオンＳ転移酵素、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧペプチド、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ｐｅｌＢ又はＨＡタグが、遺伝子工学的手法による本発明物質の発現、精製がより容易となることから好ましく、特にＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として本発明酵素を得るのが、取扱面が極めて優れるため好ましい。
ほ乳類細胞で発現可能であって、かつ上述のＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として本発明酵素を得ることができる基本ベクターとしては例えばｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社）等が例示されるが、当業者であれば本発明酵素の発現に使用する宿主細胞、制限酵素、識別ペプチドなどから判断して適当な基本ベクターを選択することが可能である。
（４）本発明核酸、本発明発現ベクター、及び形質転換体の調製方法
本発明によって本発明核酸の塩基配列が開示されたため、当業者であれば目的とする本発明核酸や調製したい核酸の領域の両端の塩基配列を基に適宜プライマーを作成し、それを用いてＰＣＲ法などによって目的の領域を増幅して調製することが可能である。本発明核酸の好ましい態様である配列番号１の塩基番号３８８〜２６４９からなるＤＮＡの調製は以下のように行うことができる。
公知のβ１，４ガラクトース転移酵素（β４Ｇａｌ−Ｔ）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ２９８０５がコードするアミノ酸配列）をクエリーとしてＢＬＡＳＴ検索を行ない本発明核酸の部分配列を得ることができる。そして例えばそれによって得られるＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００４２１９等）を基にゲノムデータベースからゲノム配列の検索を行うことができる。ゲノム配列の検索は例えばＧｅｎＳｃａｎ（米国スタンフォード大学）などを用いて行うことができる。この方法によって配列番号１記載の全塩基配列を得ることができる。このようにして得られた塩基配列からプライマーを調製して塩基番号３８８〜２６４９からなるＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの調製は例えばポリメラーゼチェインリアクション法（以下「ＰＣＲ法」と記載する）が好ましくは挙げられる。ＰＣＲ法においては、ベクターにあわせた適切な制限酵素領域を予めプライマーに含めておくことが、本発明核酸のベクターへの導入が容易とするため好ましい。この様なプライマーとしては例えば５’プライマーとしては配列番号３記載の塩基配列（ＨｉｎｄＩＩＩ領域を含んでいる）、３’プライマーとしては配列番号４記載の塩基配列（ＸｂａＩ領域を含んでいる）が例示される。
例えば上記ＧｅｎＳｃａｎでＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００４２１９のＥＳＴを基にして検索して得られるゲノムは、データベース上の情報からヒトの脳で発現していることが分かる。そこでＰＣＲ法の鋳型としては市販のヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（例えばＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ（クロンテック社製）等）などを用いることができる。
上記で例示したプライマーを用いてＰＣＲ法を行うと約２．３ｋｂの増幅産物として本発明核酸（ＤＮＡ）が生じる。この増幅産物の単離はアガロースゲル電気泳動法などの分子量によるＤＮＡの分離方法とゲルの切り出し、本発明核酸の抽出などを常法に従って行うことができる。
上記で例示したプライマーはＨｉｎｄＩＩＩ領域とＸｂａＩ領域とを含んでいるため、これらの制限酵素によって処理することで、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ領域を有するベクターへ常法により挿入することができる。例えば上記で例示した基本ベクターであるｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１にはＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ領域が含まれているため、この基本ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、本発明核酸を結合させることで本発明ベクターを得ることができる。
本発明ベクターの宿主細胞への導入は常法に従って行うことができる。基本ベクターとしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１を使用した場合にはｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１の宿主細胞として機能するＣＯＳ１細胞やＣＯＳ７細胞等のほ乳類由来の細胞にエレクトロポレーション法などの常法を用いて導入して形質転換体を得ることができる。
（５）本発明酵素調製法
本発明酵素調製法は、本発明組換体を生育させ、生育物に本発明酵素を産生又は蓄積させて該生育物から前記本発明酵素を単離することを特徴とする。
本発明酵素の調製は、形質転換体をそれが生育するのに適した条件下で生育させて、本発明核酸を発現させてその生育物から調製して行なうことができる。
ここで宿主細胞の生育とは、宿主細胞を培養することの他、宿主細胞を生体などに投与してその生体内で宿主細胞を生育させることも含む概念である。また、生育物とは、培養された宿主細胞、培養上清の他、宿主細胞を生体内で生育させた場合には、その生体の排泄物、分泌物なども含む概念である。
例えばＣＯＳ−７細胞を宿主細胞として選択した場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質転換体を培養し、その培養物（培養後の形質転換体及び培養上清）から本発明物質を精製することが可能である。本発明酵素の単離・精製の方法は、識別ペプチドによって適宜、適当な方法を常套的に選択することが可能である。特に上記ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１ベクターを用いた場合には本発明酵素はＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として得られるので、本発明物質は例えば抗ＦＬＡＧ抗体（例えばＭ１ど）を用いて、アフィニティー精製などの方法で本発明酵素を単離・精製することが可能である。抗ＦＬＡＧ抗体が結合した樹脂などを使用すると、宿主細胞の培養物（培養上清や宿主細胞の抽出物など）からタンパク質を容易に単離・精製することが可能であり、またその樹脂をそのまま緩衝液などに懸濁して酵素懸濁液として使用することも可能である。
（６）本発明合成法
（ａ）本発明合成法１
本発明合成法１は、本発明酵素を下記式（１）で示される構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体及びＧａｌＮＡｃ供与体に対して作用させて、ＧａｌＮＡｃ受容体にＧａｌＮＡｃ残基をＧａｌＮＡｃ供与体から転移することを特徴とする、下記式（２）で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。
2003102193.tif 000010
式（１）及び（２）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
本発明合成法１において、ＧａｌＮＡｃ受容体とは、ＧａｌＮＡｃ残基が転移される対象となる上記式（１）の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質もＧａｌＮＡｃ受容体とすることができる。
上記式（１）のＧａｌＮＡｃ受容体に対して本発明酵素を作用させてＧａｌＮＡｃ供与体からＧａｌＮＡｃ残基を転移すると、上記式（２）で示す構造を有する化合物が得られる。
コンドロイチン骨格は、ＧｌｃＵＡ残基とＧａｌＮＡｃ残基とがβ１，３グリコシド結合で結合した二糖がβ１，４グリコシド結合で結合した構造からなり、本発明合成方法１においてもそのような糖鎖にＧａｌＮＡｃ残基を結合できることが好ましい。すなわち上記式（１）の構造を有するＧａｌＮＡｃ受容体は下記式（１’）の構造を有することがより好ましい。
2003102193.tif 000011
式（１’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」及び「−」は上記式（１）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
式（１’）に本発明酵素でＧａｌＮＡｃ残基を転移させ、下記式（２’）の構造を含む産物が得られることが好ましい。ＧａｌＮＡｃ残基をβ１，４グリコシド結合でＧｌｃＵＡ残基に結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。
2003102193.tif 000012
式（２’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」及び「−」は上記式（２）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
本発明合成方法１においてＧａｌＮＡｃ残基はＧａｌＮＡｃ供与体からＧａｌＮＡｃ受容体に対してＧａｌＮＡｃ残基が転移される。本発明合成方法１に使用する本発明酵素は、前記ＧａｌＮＡｃ受容体に対し前記ＧａｌＮＡｃ供与体からＧａｌＮＡｃ残基をβ１，４グリコシド結合で転移するものであることが好ましい。コンドロイチン骨格へのＧａｌＮＡｃ残基の結合はβ１，４グリコシド結合でなされているからである。
本発明合成方法におけるＧａｌＮＡｃ供与体からＧａｌＮＡｃ受容体へのＧａｌＮＡｃ残基の転移反応は、本発明酵素の至適反応ｐＨ、至適反応温度の範囲内で行われることが好ましい。例えばｐＨは５．０〜９．０が好ましく、５．３〜８．０がより好ましく、５．７〜７．５であることが最も好ましい、６．０〜７．０であることが極めて好ましい。このような条件を保つために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましい。緩衝液としては酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ヒドロキシメチルアミノエタン−塩酸緩衝液（以下単に「Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液」とも記載する）、イミダゾール緩衝液及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましいｐＨ範囲（ｐＨ６．０〜７．０）全体において安定したｐＨを保つ作用が強いことからＭＥＳが最も好ましい。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましい範囲としては２０〜１００ｍｍｏｌ／ｌが例示される。
また、この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、更に好ましくはマンガンイオン、コバルトイオン、カドミウムイオン等、特にマンガンイオンが含まれていることが好ましい。このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても良い。塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物が例示される。また更に緩衝液にはアデノシン三リン酸（以下「ＡＴＰ」とも記載する）が含まれることが好ましい。
作用時の温度条件は２０〜４５℃が例示され、好ましくは２４〜４０℃、最も好ましくは３６〜３７℃が例示される。
本発明酵素は、上述の式（２）及び式（２’）記載の糖鎖の合成に使用することができ、式（２）又は式（２’）の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在するＧａｌＮＡｃ残基を転移するための使用は本発明使用となる。
（ｂ）本発明合成法２
本発明合成法２は、本発明酵素を下記式（３）で示される構造を有するＧｌｃＵＡ受容体及びＧｌｃＵＡ供与体に対して作用させて、ＧｌｃＵＡ受容体にＧｌｃＵＡ残基をＧｌｃＵＡ供与体から転移することを特徴とする、下記式（４）で示される構造を有する糖鎖の合成方法である。
2003102193.tif 000013
式（３）及び（４）中、「ＧａｌＮＡｃ」はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基を示し、「ＧｌｃＵＡ」はＤ−グルクロン酸残基を示し、ｎは１以上の整数を示し、ｍは１又は０を示し「−」はグリコシド結合を示す。
本発明合成法２において、ＧｌｃＵＡ受容体とは、ＧｌｃＵＡ残基が転移される対象となる上記式（３）の糖鎖を含むものであれば特に限定はされず、更にその還元末端に糖鎖、タンパク質、脂質、合成高分子化合物などが結合した構造を有する物質であっても良い。
上記式（３）のＧｌｃＵＡ受容体に対して本発明酵素を作用させてＧｃｌＵＡ供与体からＧｌｃＵＡ残基を転移すると、上記式（４）で示す構造を有する化合物が得られる。
コンドロイチン骨格は、ＧｌｃＵＡ残基とＧａｌＮＡｃ残基とがβ１，３グリコシド結合で結合した二糖がβ１，４グリコシド結合で結合した構造からなり、本発明合成方法１と同様に本発明合成方法２においてもそのような糖鎖にＧｌｃＵＡ残基を結合できることが好ましい。すなわち上記式（３）の構造を有するＧｌｃＵＡ受容体は下記式（３’）の構造を有することがより好ましい。
2003102193.tif 000014
式（３’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」及び「−」は上記式（３）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
式（３’）に本発明酵素でＧｌｃＵＡを転移させ、下記式（４’）の構造を含む産物が得られることが好ましい。ＧｌｃＵＡ残基をβ１，３グリコシド結合でＧａｌＮＡｃ残基に結合する活性がコンドロイチン骨格の合成には必要とされるからである。
2003102193.tif 000015
式（３’）、（４’）中の「ＧｌｃＵＡ」、「ＧａｌＮＡｃ」及び「−」は上記式（１）、（２）と同様である。βはβ結合を示し、数字は隣り合う糖残基との結合位置（グリコシド結合存在位置）を示す。
本発明合成方法２においてＧｌｃＵＡ残基はＧｌｃＵＡ供与体からＧｌｃＵＡ受容体に対してＧａｌＮＡｃが転移される。本発明合成方法２に使用する本発明酵素は、前記ＧｌｃＵＡ受容体に対し前記ＧｌｃＵＡ供与体からＧｌｃＵＡ残基をβ１，３グリコシド結合で転移する活性を有することが好ましい。コンドロイチン骨格へのＧｌｃＵＡ残基の結合はβ１，３グリコシド結合でなされているからである。
本発明合成方法におけるＧｌｃＵＡ供与体からＧｌｃＵＡ受容体へのＧｌｃＵＡ残基の転移反応は、本発明酵素の至適反応ｐＨ、至適反応温度の範囲内で行われることが好ましい。例えばｐＨは４．０〜８．０が好ましく、４．５〜７．０がより好ましく、５．０〜６．５であることが最も好ましい。このような条件を保つために、上記転移反応は緩衝液中で行われることが好ましい。緩衝液としては酢酸緩衝液、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、及びリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられ、いずれも使用することは可能である。しかし本発明合成方法において最も好ましいｐＨ範囲（ｐＨ５．０〜６．５）全体において安定したｐＨを保つ作用が強いことから酢酸緩衝液及びＭＥＳが好ましく、ＭＥＳが最も好ましい。ｐＨ５．０〜６．５が緩衝領域の中心域なので、ｐＨをより安定に保つことができるからである。緩衝液の緩衝剤の濃度は特に限定はされないが１０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましい範囲としては２０〜１００ｍｍｏｌ／ｌが例示される。
また、この緩衝液には酵素活性の促進のために二価の金属陽イオン、更に好ましくはマンガンイオン、コバルトイオン、カドミウムイオン等、特にマンガンイオンが含まれていることが好ましい。このような金属陽イオンは塩の形で緩衝液に添加しても良い。塩としては例えば塩化マンガンなどの上記金属陽イオンのハロゲン化物が例示される。
作用時の温度条件は２０〜４５℃が例示され、好ましくは２４〜４０℃、最も好ましくは３６〜３７℃が例示される。
本発明酵素は、上述の式（４）及び式（４’）記載の糖鎖の合成に使用することができ、式（４）又は式（４’）の構造を有する糖鎖の非還元末端に存在するＧｌｃＵＡ残基を転移するための使用は本発明使用となる。
実施例１
本発明酵素の調製
（１）ｃＤＮＡのクローニングと発現ベクターの構築
β１，４ガラクトース転移酵素（β４Ｇａｌ−Ｔ）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ２９８０５がコードするアミノ酸配列）をクエリーとして、ＢＬＡＳＴ検索を行った。その結果、ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０００４２１９）が見つかった。しかし、この配列は不完全であったため、ゲノムデータベースから、ＧｅｎＳｃａｎ（米国スタンフォード大学）によりＯＲＦを調べた。その結果、配列番号１記載の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号２）を発見した。配列番号１記載の塩基配列からなる遺伝子は、少なくともヒト脳で発現していることをＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型としたＲＴ−ＰＣＲ法によって確認した（ＰＣＲ用のプライマーとしては配列番号５及び配列番号６、並びに配列番号７及び配列番号８の５’プライマーと３’プライマーの組み合わせを使用した）。この遺伝子の膜貫通領域を含む領域（配列番号２のアミノ酸番号１〜１２９からなる領域）を除く可溶性領域をクローニングするため、配列番号３及び配列番号４の２種のプライマーを用いて常法に従ってＰＣＲを行った。使用した鋳型ｃＤＮＡはＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ（クロンテック社製）を使用した。増幅された約２．３ｋｂのバンドを常法に従ってＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、ほ乳類細胞用の発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１（シグマ社製）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位に常法に従って挿入して本発明ベクター（Ｋ３−ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１）を得た。得られたベクターの塩基配列を確認したところ、配列番号１記載の塩基配列の塩基番号３８８〜２６４９の塩基配列からなるＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。
（２）本発明酵素の調製
Ｋ３−ＦＬＡＧ−ＣＭＶ１  １５μｇをＴｒａｎｓＦａｓｔ（プロメガ社製）を用い、プロトコールに従って、１００ｍｍ培養皿に７０％コンフルエントになるように培養したＣＯＳ７細胞に遺伝子を導入した。３日間培養した上清を回収し、０．２２μｍのフィルターで濾過後、その上清１０ｍｌにＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２−Ａｇａｒｏｓｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（シグマ社製）１００μｌを加え、４℃で一晩、転倒混和した。反応後、ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／２０％グリセロールで３回洗浄後、２７Ｇの注射針をつけたシリンジを用い余分な洗浄液を除いた。このゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４／２０％グリセロール／１０ｍｍｏｌ／ｌフェニルメチルスルホニルフルオライド／１μｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ／１μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎに５０％（ｖ／ｖ）となるように懸濁し、これを遠心分離した後に上清を取り除いて酵素吸着ゲル懸濁液とした。
実施例２
本発明酵素を用いたコンドロイチン骨格の伸長
（１）コンドロイチン／コンドロイチン硫酸奇数糖の調製
コンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）をウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を１０分間１００℃で保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラム（６０×１．６ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮＨ４ＨＣＯ３、流速：２ｍｌ／分）にかけ、溶出液を２２５ｎｍの吸光度でモニターしながら２ｍｌ毎に分画し、１０糖相当画分をプールした。画分をＰＤ１０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従ってカルバゾール硫酸法によりウロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を１ｍｍｏｌ／ｌとなるように蒸留水に溶解し、偶数オリゴ糖サンプルとした（コンドロイチン由来の１０糖を「ＣＨ１０」、コンドロイチン硫酸由来の１０糖を「ＣＳ１０」と記載する）。
１０ｎｍｏｌ／ｌのＭｎＣｌ２、１７１μｍｏｌ／ｌのＡＴＰナトリウム塩を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に酵素吸着ゲル懸濁液１０μｌ、被検物質（コンドロイチン（ＣＨＥＬ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳＥＬ）、ＣＨ１０又はＣＳ１０）を１ｎｍｏｌ、［３Ｈ］ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを０．０３６ｎｍｏｌ添加して全量を３０μｌとした。酵素反応は３７℃で１時間行い、その後反応液を１００℃で１分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
各々の反応液を孔径０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラム（３０×１．０ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、流速１．０ｍｌ／分）で分離し、溶出液を０．５ｍｌの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（第１図）。その結果、強いＧａｌＮＡｃ転移活性がＣＨＥＬ（１７〜１８画分）、ＣＨ１０（２３画分）及びＣＳ１０（２３画分）をＧａｌＮＡｃ受容体基質とした場合に観察され、ＣＳＥＬに対してはＧａｌＮＡｃ転移活性は観察されなかった（１６画分）。ＣＨ１０及びＣＳ１０から得られた反応生成物の２３画分は１１糖が溶出する分子量を示す画分だった。ＣＨ１０から得られた１１糖を「ＣＨ１１」、ＣＳ１０から得られた１１糖を「ＣＳ１１」と記載する。
ＣＳ１１の２１〜２５画分を回収してプールし、ＰＤ１０カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を３０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌに溶解し（ＣＳ１１Ａ）、他方をコンドロイチナーゼＡＣＩＩで消化した（１００ｍＵのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を１００μｌのＣＳ１１画分に溶解し、３７℃で１０時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：ＣＳ１１Ｂ）。
ＣＳ１１ＡとＣＳ１１Ｂとを孔径０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラム（３０×１０ｍｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、流速０．５ｍｌ／分）で分離し、溶出液を０．５ｍｌの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、ＣＳ１１Ｂにおいて単糖画分に放射能ピークがシフトした（第２図）。この結果から、本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の１０糖の非還元末端のＧｌｃＵＡ残基に対してＧａｌＮＡｃ残基をβ１，４結合で転移し、１１糖を調製することができることが明かとなった。
（２）コンドロイチン／コンドロイチン硫酸偶数糖の調製
コンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）をウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を１０分間１００℃で保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液を１０，０００×ｇで１０分間遠心処理し、上清を回収して更にウシ肝臓由来βグルクロニダーゼ（シグマ社製）で消化した。酵素反応は反応液を１０分間１００℃で保って停止させた。この反応液をＳｕｐｅｒｄｅｘ３０カラム（６０×１．６ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮＨ４ＨＣＯ３、流速：２ｍｌ／分）にかけ溶出液を２２５ｎｍの吸光度でモニターしながら、２ｍｌ毎に分画し、１１糖相当画分をプールした。各画分をＰＤ１０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従ってカルバゾール硫酸法によりウロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を１ｍｍｏｌ／ｌとなるように蒸留水に溶解し、奇数オリゴ糖サンプルとした（コンドロイチン由来の１１糖：「ＣＨ１１」、コンドロイチン硫酸由来の１１糖：「ＣＳ１１」）。
またコンドロイチン（サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式社製）をウシ肝臓由来βグルクロニダーゼ（シグマ社製）で消化してサンプルとした（各々「ＣＨＯＬ」及び「ＣＳＯＬ」と記載する）。
１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｎＣｌ２、５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）に酵素吸着ゲル懸濁液１０μｌ、被検物質（ＣＨＯＬ、ＣＳＯＬ、ＣＨ１１又はＣＳ１１）を１ｎｍｏｌ、［１４Ｃ］ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡを０．４３２ｎｍｏｌ添加して全量を３０μｌとした。酵素反応は３７℃で１時間行い、その後反応液を１００℃で１分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
各々の反応液を孔径０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラム（３０×１．０ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、流速０．５ｍｌ／分）で分離し、溶出液を０．５ｍｌの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（第３図）。その結果、強いＧｌｃＵＡ転移活性がＣＨＯＬ（１７〜１８画分）、ＣＨ１１（２３画分）及びＣＳ１１（２３画分）をＧｌｃＵＡ受容体基質とした場合に観察され、ＣＳＯＬに対してはＧｌｃＵＡ転移活性が観察されなかった（１６画分）。ＣＨ１１及びＣＳ１１から得られた反応生成物の２２〜２３画分は１２糖が溶出する分子量を示す画分だった。ＣＨ１１から得られた１２糖を「ＣＨ１２」、ＣＳ１１から得られた１２糖を「ＣＳ１２」と記載する。
ＣＳ１２の２１〜２５画分を回収してプールし、ＰＤ１０カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を３０ｍｍｏｌ／ｌの酢酸ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）１００μｌに溶解し（ＣＳ１２Ａ）、他方をコンドロイチナーゼＡＣＩＩで消化した（１００ｍＵのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（生化学工業株式会社製）を１００μｌのＣＳ１１画分に溶解し、３７℃で１０時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：ＣＳ１２Ｂ）。
ＣＳ１２ＡとＣＳ１２Ｂとを孔径０．２２μｍのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅカラム（３０×１．０ｃｍ：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：０．２ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、流速０．５ｍｌ／分）で分離し、溶出液を０．５ｍｌの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、ＣＳ１２Ｂにおいて二糖画分に放射能ピークがシフトした（第４図）。この結果から、本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の１１糖に対してＧｌｃＵＡをβ１，３結合で転移し、１２糖を調製することができることが明かとなった。
更に上記と同様の手法を用いてコンドロイチン硫酸の８糖と９糖を調製し、これらをＧｌｃＵＡ受容体及びＧａｌＮＡｃ受容体として用いたところ、同様に糖残基を転移する活性を有することが明かとなった。
実施例３
実施例２の本発明酵素のＧｌｃＵＡ及びＧａｌＮＡｃ転移作用を、緩衝液のｐＨを変化させて至適ｐＨを調べた。酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、何れの緩衝液も最終濃度５０ｍｍｏｌ／ｌで使用した。
その結果、ＧｌｃＵＡ転移活性の至適ｐＨは５．８（第５図）、ＧａｌＮＡｃ転移活性の至適ｐＨは６．２（第６図）であることが判明した。
実施例４
実施例２の本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性及びＧａｌＮＡｃ転移活性の測定条件において、反応系に１０ｍｍｏｌ／ｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加してＧｌｃＵＡ転移活性及びＧａｌＮＡｃ転移活性を調べたところ、酵素活性が完全に失われた（第７図）。従って、本発明酵素はその活性に二価陽イオンを必要とすることが明かとなった。
また、反応系にＭｎＣｌ２に代えてＣｏＣｌ２又はＣｄＣｌ２を１０ｍｍｏｌ／ｌで添加すると、高い酵素活性が得られることが明かとなった（第７図）。
更に、マンガンイオンの濃度による本発明酵素の活性への影響を調べるために、実施例２の反応条件でマンガンイオンの最終濃度を０〜５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内で変化させて同様にＧｌｃＵＡ転移活性及びＧａｌＮＡｃ転移活性を測定したところ、ＧｌｃＵＡ転移活性及びＧａｌＮＡｃ転移活性に対する至適マンガンイオン濃度は各々２０〜３０ｍｍｏｌ／ｌ、５〜１０ｍｍｏｌ／ｌであった（第８図）。
実施例５
本発明遺伝子のヒト組織発現パターンの解析
ヒト各種組織における本発明遺伝子の発現量を解析するために、リアルタイムＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いた。各種Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型にし、２種のプライマー（配列番号９及び配列番号１０）と３’末端にマイナーグルーヴバインダー（アプライドバイオシステムズ社製）が結合したプローブ（配列番号１１）を用いて増幅、定量を行った。標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を含むプラスミドｐＣＲ２．１（インビトロゲン社製）で希釈系列を作り、検量線を作成して使用した。また、ＲＴ−ＰＣＲはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（アプライドバイオシステムス社製）を使用した（第９図）。
その結果、本発明遺伝子は脳全体、大脳皮質、小腸、子宮、特に大脳皮質及び小腸で強く発現していることが明かとなった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年５月３１日および２００３年５月６日出願の日本特許出願（特願特願２００２−１６０８５５および特願２００３−１２８３４４）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
産業上の利用可能性
本発明により、コンドロイチンの基本骨格を合成するための酵素であって、グルクロン酸転移活性を有しており、且つＮ−アセチルガラクトサミン転移活性も有しているヒト由来の新規コンドロイチン合成酵素が提供される。
配列表フリーテキスト
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明酵素のＧａｌＮＡｃ転移活性による奇数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示すチャートである。白三角はコンドロイチン硫酸１０糖に対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示すチャートであり、黒三角はコンドロイチン１０糖に対するＧａｌＮＡｃ転移活性を示すチャートである。
第２図は、本発明酵素のＧａｌＮＡｃ転移活性により調製された１１糖とそのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼＡＣＩＩ未消化の１１糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼＡＣＩＩ消化後の消化産物のチャートを示す。
第３図は、本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性による偶数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するＧｌｃＵＡ転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するＧｌｃＵＡ転移活性を示すチャートである。白三角はコンドロイチン硫酸１１糖に対するＧｌｃＵＡ転移活性を示すチャートであり、黒三角はコンドロイチン１１糖に対するＧｌｃＵＡ転移活性を示すチャートである。
第４図は、本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性により調製された１２糖とそのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼＡＣＩＩ未消化の１２糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼＡＣＩＩ消化後の消化産物のチャートを示す。
第５図は、本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性の至適ｐＨを示す図である。白丸は酢酸緩衝液を示し、黒丸はＭＥＳ緩衝液を示し、白三角はイミダゾール緩衝液を示し、黒三角はＴｒｉｓ緩衝液を示す。
第６図は、本発明酵素のＧａｌＮＡｃ転移活性の至適ｐＨを示す図である。白丸は酢酸緩衝液を示し、黒丸はＭＥＳ緩衝液を示し、白三角はイミダゾール緩衝液を示し、黒三角はＴｒｉｓ緩衝液を示す。
第７図は、本発明酵素の活性に対する二価陽イオンの影響を示す図である。白いバーはＧｌｃＵＡ転移活性を示し、黒いバーはＧａｌＮＡｃ転移活性を示す。
第８図は、本発明酵素の活性に対するマンガンイオンの濃度による影響を示す図である。白丸は本発明酵素のＧｌｃＵＡ転移活性への影響を示し、黒丸は本発明酵素のＧａｌＮＡｃ転移活性への影響を示す。
第９図は、健常人各組織における本発明酵素の発現量の定量値を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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