(57)【要約】本発明により、植物の２−ＯＧ含量を増大させることにより、植物の窒素吸収および代謝活性を亢進し、窒素を減じた、すなわち通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下での生育および／または収量が改善された植物を作出する方法が提供される。特に、本発明によりＧＤＨ遺伝子またはＥＣＡＳＰＣ遺伝子を導入し、導入したＧＤＨ遺伝子またはＥＣＡＳＰＣ遺伝子を植物内で発現させて２−ＯＧ含量を増加させることにより、または、植物にプロリンを葉面散布し２−ＯＧ含量を増加させることにより、植物の窒素吸収および代謝活性を亢進し、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下での生育および／または収量が改善された植物を作出する方法が提供される。また、そのような植物を窒素制限下で栽培する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）含量を増大させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件で生育および／または収量が改善された植物を作出する方法。
【請求項２】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子を導入し、その遺伝子を植物体内で発現させ、その結果前記植物の２−ＯＧ含量を増加させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／また収量が改善された植物を作出する方法。
【請求項３】
プロリンを植物の葉面に散布し、その結果前記植物の２−ＯＧ含量を増加させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／また収量が改善された植物を作出する方法。
【請求項４】
ＥＣＡＳＰＣ遺伝子を導入し、その遺伝子を植物体内で発現させ、その結果前記植物の２−ＯＧ含量を増加させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／また収量が改善された植物を作出する方法。
【請求項５】
窒素を制限した栽培条件で栽培することを特徴とする、２−ＯＧ含量が増加した植物を栽培する方法。
【請求項６】
窒素を制限した栽培条件で栽培することを特徴とする、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子が導入され、その結果２−ＯＧ含量が増大した植物を栽培する方法。
【請求項７】
窒素を制限した栽培条件で栽培することを特徴とする、プロリンを葉面散布し、その結果２−ＯＧ含量が増大した植物を栽培する方法。
【請求項８】
窒素を制限した栽培条件で栽培することを特徴とする、ＥＣＡＳＰＣ遺伝子が導入され、その結果２−ＯＧ含量が増大した植物を栽培する方法。
【請求項９】
標準窒素施肥量の下限から下限の１／１０量の範囲の窒素量という栽培条件下においても標準窒素施肥量栽培条件と同等またはそれ以上の生育および／または収量が得られる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
窒素を制限した栽培条件が、標準窒素施肥量の下限から下限の１／１０量の範囲の窒素施肥量という条件下である、請求項６〜８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、窒素制限下における植物の生育及び収量を改善する方法に関する。
【背景技術】  近代的な集約農業で見られる窒素供給を目的とした大量の化成肥料の投下は、劇的な収量増加を実現した反面、過剰な硝酸態としての窒素の周辺環境への放出は、河川、湖沼の富栄養化による環境汚染、また、収穫物への硝酸の蓄積にともなう健康被害、さらに、土壌に残留する窒素に由来する温暖化ガスの発生といった環境側面からの問題を有する。また、窒素肥料の製造段階で大量の電力が必要とされる点も農業の環境負荷の遠因ともされる。すなわち、持続性の確保のためには、化成肥料、とりわけ、窒素肥料を減じた農法の実現が望まれてきた。
しかし、マメ科などの例外をのぞき、植物は空気中の窒素を固定することはできず、その窒素栄養は全面的に外部から与えられる硝酸、またはアンモニアに依存している。したがって、窒素は植物の生長にとっては、最大の制限因子であり、これからの農業は、現行収量の維持・増大に加え、上記の環境負荷を減少し持続性に配慮するという一見矛盾する課題を抱えていることになる。このような観点からの取り組み、すなわち、特に窒素源を減少させた条件下で充分な生育および収量を示す植物の開発および栽培に対する取り組みは、これまで不十分であった。例えば、近代的な集約農業に対して、環境に配慮した持続型のいわゆる有機農法も提唱されているが、そのような環境配慮型の有機農法では窒素肥料の施用は抑えられる反面、その収量性には問題が多かった。
植物の品種改良の観点から、このような課題の解決を目指した育種例、すなわち、窒素肥料の施肥を減少させた場合のような窒素制限下において充分な生育および／または収量が得られる植物の育種に成功した例はない。従って、植物の窒素利用効率を改変・向上せしめ、少ない窒素肥料投下で、収量が維持・向上した品種の育成、またはそのような植物品種を育成するための技術の開発が望まれてきた。
植物が無機窒素を有機体に同化する第一段階は、主にグルタミンを生成するためのグルタミン酸へのアンモニアの取込みであることが知られている。これはグルタミン合成酵素（ＧＳ）とグルタミン酸合成酵素（ＧＯＧＡＴ）に触媒され、両者の反応の総和として、１分子のアンモニアが１分子の２−ＯＧに同化され、１分子のグルタミン酸が生じる反応である。このＧＳ／ＧＯＧＡＴサイクルが、植物における窒素同化の主要な経路と考えられている（文献：Ｍｉｆｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌｅａ：１９７６，Ｐｈｙｔｏ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：８７３−８８５）。
一方、微生物では、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａや大腸菌を用いた研究より、２−ＯＧとグルタミンの量的バランスが、硝酸の取り込み、および同化に関与する酵素遺伝子の発現を調節していると報告されている（文献：Ｆｏｒｃｈａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔａｎｄｅａｕ−Ｍａｒｓａｃ，１９９５，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：２０３３−２０４０；Ｊｉａｎｇら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２７９５−１２８０１）。しかし、これらの調節に関与するとされるＰＩＩ蛋白質と相同性が高い遺伝子がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）より単離され、この遺伝子をタバコに導入し過剰発現させたところ、硝酸含量の増加は認められず、高等植物における窒素の蓄積は微生物と異なると考えられた（文献：Ｈｓｉｅｈら，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１３９６５−１３９７０）。一方、フェレドキシン依存型グルタミン酸合成酵素遺伝子をアンチセンス方向に導入し、グルタミン酸合成酵素の発現を低下させたタバコを用いて、硝酸還元酵素（以下ＮＲと略す）の発現について調査した結果、硝酸及びショ糖、２−ＯＧを与えるとＮＲの転写レベルが高くなり、グルタミンを与えるとＮＲの転写レベルが低くなることが報告されており（文献：Ｆｅｒｒａｒｉｏ−Ｍｅｒｙら，２００１，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：２６５−２７１）、この文献では高等植物においても、２−ＯＧとグルタミンの量がＮＲの調節に関与しているとされた。しかし、これらは、ＮＲにのみ関する知見であり、窒素制限下での植物の生育への２−ＯＧの影響については、言及されていない。また、２−ＯＧは比較的不安定な化合物であり、散布等の目的に使用することは実際的ではないと考えられている。
また、ＧＤＨ遺伝子を導入したトランスジェニック植物も作出されており、大腸菌由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（ｇｄｈＡ）を、除草剤ホスホノスリシン耐性付与を目的にタバコとトウモロコシに導入したところ、乾燥重量や全アミノ酸含量、水溶性ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ含量が有意に増加したことが報告されている（文献：Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔら，ＣＡ２１８０７８６，１９９６）。同様にＴｉａｎら（文献：ＣＮ００１０９７７９．２）は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子をタバコに導入し、遺伝子を導入していないタバコに比べて、生育が良好であったことを報告した。さらに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子をトマトに導入し、果実中の遊離アミノ酸含量が増加したこと（文献：ＫｉｓａｋａらＪＰ１１−３７６７１０）及び同遺伝子をバレイショに導入し、塊茎の重量及び塊茎数が増加したことが報告されている（Ｋｉｓａｋａら、ＪＰ２０００−４０４３２２）。しかし、いずれの報告においても、導入した遺伝子の機能については明確にされておらず、導入した遺伝子がどのように機能し、また、どのような効果からこれらの形質が生じたのか全く分かっていない。さらに、窒素制限下での植物の生長および／または収量の改善についても言及されていない。
一方、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を植物に導入した報告はこれまでに無い。
【発明の開示】
本発明は、植物の窒素吸収および代謝活性を亢進し、窒素を減じた、すなわち通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下での生育および／または収量が改善された植物を作出する方法、およびそのような植物を窒素制限下で栽培する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、植物細胞が窒素栄養状態を感知するためのシグナル分子が存在することを想定し、かつそのシグナル分子として２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）を考慮した。すなわち、２−ＯＧが植物細胞の窒素吸収、代謝を包括的に制御するシグナル分子であって、かかる物質の含量を人為的に増減させれば、植物細胞の窒素吸収、代謝を亢進した状態に保持できるものと考えた。また、そのような亢進した状態の植物は外部の窒素を活発に取り込むことができると考えられるため、窒素を制限した条件下でも、窒素栄養は充足され、生育、および収量の改善が見られると考えた。さらに、本発明者らは実際に、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨと略す）活性またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ＡＳＰＣと略す）活性を過剰に発現させることによって植物細胞の２−ＯＧ含量を増加させ、２−ＯＧ含量の増加した植物が窒素制限下において生育および／または収量が改善することを見いだし、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は植物の２−ＯＧ含量を増大させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物を作出する方法である。
また、本発明はＧＤＨ遺伝子またはＡＳＰＣ遺伝子を導入し、その遺伝子を植物体内で発現させ、その結果２−ＯＧ含量が増加したことを特徴とする、通常栽培条件より窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物、およびその種子である。また、本発明はＧＤＨ遺伝子またはＡＳＰＣ遺伝子を導入し、その遺伝子を植物体内で発現させ、その結果前記植物の２−ＯＧ含量を増加させることを特徴とする、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物を作出する方法でもある。
特に、本発明は、上記方法において、各植物に対して定められる標準窒素施肥量の下限から下限の１／１０量の窒素量の範囲で標準窒素施肥量栽培条件と同等またはそれ以上の生育および／または収量が得られる、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物を作出する方法である。
本発明は、窒素を制限した条件下で栽培することを特徴とする、上述の本発明の方法によって作出した植物を栽培する方法である。特に、本発明は、各植物に対して定められる標準窒素施肥量の下限から下限の１／１０量の窒素施肥量の範囲という条件で上述の本発明の方法によって作出した植物を栽培する方法でもある。
さらに、本発明はプロリンを葉面散布することを含む、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で植物の生育および／または収量を改善する方法である。
【図面の簡単な説明】  図１は、構築したプラスミッドベクターの模式図である。Ｎｏｓ−Ｐｒｏ：ノパリンシンターゼプロモーター；ＮＰＴＩＩ：ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ；Ｎｏｓ−Ｔｅｒ：ノパリンシンターゼターミネーター；３５Ｓ−Ｐｒｏ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ｍｔｄ−ＡＮ−ＧＤＨ：ミトコンドリアへのトランジェットペプチドを付加したアスペルギルス・ニデュランス由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＤＨ）；ＨＰＴ：ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ；Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｂ：ＢａｍＨＩ，Ｘ：ＸｂａＩ，Ｓｐ：ＳｐｅＩ，Ｅ：ＥｃｏＲＩ；ＬＢ：レフトボーダー，ＲＢ：ライトボーダー
図２は、形質転換バレイショのＰＣＲ分析の結果を表す。  Ａ：Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的プライマー使用、Ｂ：ＮＰＴＩＩ遺伝子特異的プライマー使用。レーン１：１００ｂｐマーカー、レーン２：非形質転換バレイショ、レーン３：形質転換バレイショＭｔｄ１、レーン４：形質転換バレイショＭｔｄ２、レーン５：形質転換バレイショＭｔｄ３、レーン６：形質転換バレイショＭｔｄ５、レーン７：形質転換バレイショＭｔｄ８。
図３は、形質転換シロイヌナズナのＰＣＲ分析の結果を表す。Ａ：Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的プライマー使用、Ｂ：ＮＰＴＩＩ遺伝子特異的プライマー使用。レーン１：１００ｂｐマーカー、レーン２：非形質転換シロイヌナズナ、レーン３：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ２、レーン４：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ３、レーン５：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ４。
図４は、形質転換バレイショのノーザン分析の結果を表す。Ａ：葉組織より抽出したＲＮＡ、Ｂ：塊茎より抽出したＲＮＡ。１０μｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したパターン（Ａ，Ｂそれぞれ下側のパターン）。Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子全長をプローブに用いた。レーン１：非形質転換バレイショ、レーン２：形質転換バレイショＭｔｄ１、レーン３：形質転換バレイショＭｔｄ２、レーン４：形質転換バレイショＭｔｄ３，レーン５：形質転換バレイショＭｔｄ５、レーン６：形質転換バレイショＭｔｄ８。
図５は、形質転換シロイヌナズナのノーザン分析の結果を表す。葉組織より抽出したＲＮＡを用いた。１０μｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色したパターン（下のパターン）。Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子全長をプローブに用いた。レーン１：非形質転換シロイヌナズナ、レーン２：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ２、レーン３：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ３、レーン４：形質転換シロイヌナズナＭｔｄ４。
図６Ａ−Ｃは、ＧＤＨ形質転換植物（シロイヌナズナ）の２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、尿素、硝酸含量を表したグラフ。縦軸は新鮮質量あたりのそれぞれのモル数（ｎｍｏｌ）を表す。Ｍｔｄ３−１０：形賀転換シロイヌナズナ（ｎｏ．３系統）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ：非形質転換シロイヌナズナ。（ｎ＝３）。
図６Ｄ−Ｆは、ＧＤＨ形質転換植物（バレイショ）の２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、尿素、硝酸含量を表したグラフ。縦軸は新鮮質量あたりのそれぞれのモル数（ｎｍｏｌ）を表す。Ｍｔｄ−８：形質転換バレイショ、Ｃｏｎｔｒｏｌ：非形質転換バレイショ。（ｎ＝３）。
図７は、任意濃度のＫＮＯ３を含むＰＮＳ培地で３週間培養したシロイヌナズナ葉組織の２−ＯＧ含量を表すグラフ。縦軸は生質量あたりのそれぞれのモル数（ｎｍｏｌ）を表す。Ｃ：非形質転換シロイヌナズナ、Ｍ：形質転換シロイヌナズナ（Ｍｔｄ３系統）。（ｎ＝３）。
図８は、任意濃度のＫＮＯ３を含むＰＮＳ培地で３週間培養したシロイヌナズナ葉組織の硝酸含量を表すグラフ。縦軸は生質量あたりのそれぞれのモル数（ｎｍｏｌ）を表す。Ｃ：非形質転換シロイヌナズナ、Ｍ：形質転換シロイヌナズナ（Ｍｔｄ３系統）。（ｎ＝３）。
図９は、高等植物グルタミン酸デヒドロゲナーゼアミノ酸配列のアラインメント結果。ＡｔＧＤＨ１：シロイヌナズナＧＤＨ１、ＡｔＧＤＨ２：シロイヌナズナＧＤＨ２、ＬｅＧＤＨ：トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）ＧＤＨ、ＮｔＧＤＨ：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＧＤＨ、ＺｍＧＤＨ：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＧＤＨ
図１０は、カビＧＤＨと植物（トマト）ＧＤＨアミノ酸配列のアラインメント結果。ＡａＧＤＨ：アスペルギルス・アワモリＧＤＨ、ＡＮＧＤＨ：アスペルギルス・ニジュランスＧＤＨ、ＬｅＧＤＨ：トマトＧＤＨ。
図１１は、展着剤、尿素及びプロリン水溶液をバレイショ葉組織に葉面散布し、散布１時間後及び５時間後の葉組織内の遊離プロリン含量を示したグラフである（ｎ＝６）。Ａ：散布１時間後、Ｂ：散布５時間後
図１２は、展着剤、尿素及びプロリン水溶液をバレイショ葉組織に葉面散布し、散布１時間後及び２４時間後の葉組織内の２−ＯＧ含量を示したグラフである（ｎ＝６）。Ａ：散布１時間後、Ｂ：散布２４時間後
図１３は、ＭｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナのゲノムＰＣＲ分析結果を示す。
ＥＣＡＳＰＣ特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ分析を行った。９４℃−１分，５５℃−１分，７２℃−２分で３０サイクルの反応を行った。１％アガロースゲルで電気泳動を行った後、エチジウムブロマイドで染色した。レーン１：１ｋｂｐマーカー、レーン２：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣプラスミッドＤＮＡ、レーン３：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ２−２、レーン４：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ６−２、レーン５：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ８−１、レーン６：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ９−１。
図１４は、ＭｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。シロイヌナズナの葉組織よりキアゲン社のＰｌａｎｔ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲはＴａＫａＲａのＲＮＡ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用し、ＥＣＡＳＰＣ特異的プライマーを用いて行った。９４℃−１分，５５℃−１分，７２℃−２分で３０サイクルの反応を行い、１％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。レーン１：１ｋｂｐマーカー、レーン２：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣプラスミッドＤＮＡ、レーン３：逆転写酵素反応を行っていないＲＮＡ、レーン４−５：非形質転換シロイヌナズナ、レーン６：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ２−２、レーン７：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ６−２、レーン８：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ８−１、レーン９：ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ形質転換シロイヌナズナ，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ９−１。
【発明を実施するための最良の形態】  前述したように、本発明者らは、植物細胞が窒素栄養状態を感知するためのシグナル分子の存在を想定した。すなわち、植物細胞の窒素吸収、代謝を包括的に制御するシグナル分子があって、かかる物質の含量を人為的に増減させれば、植物細胞の窒素吸収、代謝を亢進した状態に保持できるものと考えた。また、そのような亢進した状態の植物は外部の窒素を活発に取り込むことができると考えられるため、窒素を制限した条件下でも、窒素栄養は充足され、生育、および収量の改善が見られると考えた。さらに、本発明者らは、かかるシグナル分子として、２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）を想定した。
植物が無機窒素を有機体に同化する第一段階は、主にグルタミンを生成するためのグルタミン酸へのアンモニアの取込みであり、これはグルタミン合成酵素（ＧＳ）とグルタミン酸合成酵素（ＧＯＧＡＴ）に触媒され、このＧＳ／ＧＯＧＡＴサイクルが、植物における窒素同化の主要な経路と考えられていることも既に述べたとおりである。したがって、植物細胞において、窒素の同化の程度、あるいは、窒素の欠乏の程度は２−ＯＧの量に反映されると考えられる。
本発明者らは植物細胞の２−ＯＧ含量を増加させる一つの手段として、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）活性またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＰＣ）活性を過剰に発現させることを考案した。ＧＤＨはグルタミン酸を生成するため２−ＯＧへアンモニアを取り込ませる場合と、逆に２−ＯＧを生成するためにグルタミン酸からアンモニアを解離させる場合と可逆的な反応を触媒する。しかし、一般的にＧＤＨはアンモニアに対して高いＫｍ値を有するため、細胞内においては、２−ＯＧにアンモニアを取り込みグルタミン酸を生成する反応より、グルタミン酸を２−ＯＧとアンモニアに分解する方向にはたらくと考えられ、その反応の結果、２−ＯＧ含量の増加がおこることが期待された。一方、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼはオキサロ酢酸のアミノ基を転移する反応を触媒する酵素で、この反応の結果、アスパラギン酸と２−ＯＧが生成され、２−ＯＧ含量の増加が期待された。
本発明者らはＧＤＨ遺伝子またはＡＳＰＣ遺伝子を導入した形質転換植物を作出し、実際に２−ＯＧ含量が増加することを確認し、さらに、当該植物が通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下における生育、および収量が改善することを確認した。
本発明の一つの実施態様においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）遺伝子またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＰＣ）遺伝子を含む核酸構築物が植物に導入され、得られた形質転換植物においてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子が発現することにより２−ＯＧ含量が増加し、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物が得られる。
また、本発明の別の実施態様においては、内在性ＧＤＨ遺伝子または内在性ＡＳＰＣ遺伝子のコピー数および／または転写量を増加させることによってＧＤＨまたはＡＳＰＣの活性を増強させ、植物体中の２−ＯＧ含量が増大し、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物が得られる。転写量を増大させるためには、たとえば、転写活性因子を発現し得る遺伝子構築物を導入すること、および／またはエンハンサーのようなｃｉｓ作用エレメントを導入することができる。そのような転写活性因子およびｃｉｓ作用エレメントは当業者によく知られたものである。
本発明で利用するグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、特にその由来が限定されるものではないが、より好ましくはアスペルギルス属微生物に由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼが用いられる。さらに、好ましくは、アスペルギルス・ニデュランス、およびアスペルギルス・アワモリに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼが用いられる。さらに、上述したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有し、植物体内の生理条件下においてグルタミン酸から２−ＯＧとアンモニアを生成する反応を優先的に触媒する活性を有する限り、当該酵素タンパク質において１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有するグルタミン酸デヒドロゲナーゼも本発明において利用することができる。
また、本発明で用いられるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼも特にその由来が限定されるものではないが、好ましくは、エシェリシア・コリに由来するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼが用いられる。さらに、上述したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する限り、当該酵素タンパク質において１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加を有するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼも本発明において利用することができる。
また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの植物細胞の細胞内小器官に関する局在性についても、細胞質にかぎらず、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシゾームなどに局在させたものを用いることができる。したがって、これらの細胞内小器官に当該酵素タンパク質を移行させるためのシグナル、またはトランジット・ペプチドをそのＮ末端、またはＣ末端に付加したグルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子も本発明において利用することができる。
このようなグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはそのｃＤＮＡは公開された配列情報にもとづき、当業者であれば、比較的容易に調製することができる。たとえば、アスペルギルス・ニデュランスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子については、そのゲノム遺伝子のヌクレオチド配列がＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号Ｘ１６１２１にその配列が公開されている。そのヌクレオチド配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。その配列に基づきタンパク質をコードする部分を含むようにＤＮＡ断片が増幅するようなＰＣＲプライマーを合成し、アスペルギルス・ニデュランスの培養菌体より抽出したＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲをおこなえば、容易にグルタミン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡを得ることができる。アスペルギルス・ニデュランスのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号１７に示す。アスペルギルス・ニデュランスは、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからＡＴＣＣ１００７４、あるいはＡＴＣＣ１１２６７として入手可能である。また、アスペルギルス・アワモリのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子についても、そのゲノム配列はＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｙ１５７８４として公開されている。そのヌクレオチド配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に示す。また、アスペルギルス・アワモリのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号１８に示す。アスペルギルス・アワモリ自体もＡＴＣＣ１０５４８、あるいはＡＴＣＣ１１３５８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能である。これらの菌株および配列情報から上述した方法と同様にグルタミン酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡを取得することができる。
アスペルギルス・ニデュランスのＧＤＨとアスペルギルス・アワモリのＧＤＨの相同性はアミノ酸配列において約８４％である（図１０）。
その他、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・アワモリ、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のＧＤＨアミノ酸配列のアラインメント結果を図１０に、シロイヌナズナＧＤＨ１、シロイヌナズナＧＤＨ２、トマトＧＤＨ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ＧＤＨ、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＧＤＨのアミノ酸配列のアラインメント結果を図９に示した。
更に、本発明においては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子とは別個の、グルタミン酸から２−ＯＧを生成する種々の酵素をコードする遺伝子を利用して、植物の２−ＯＧ含量を増大させ、常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で生育および／または収量が改善された植物を得ることができる。そのような酵素には、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼやアラニンアミノトランスフェラーゼが含まれる。
例えば、エシェリシア・コリＫ−１２株のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子については、そのゲノムＤＮＡの塩基配列がＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３６２９として登録されている。その配列に基づき、タンパク質をコードする領域を含むＤＮＡ断片が増幅されるようなＰＣＲプライマーを合成し、そのプライマーを用いてエシェリシア・コリＫ−１２株から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行えば容易にアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を得ることができる。
また、本発明に従って、植物内の２−ＯＧ含量を高める方法として、プロリンの葉面散布によって、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で植物の生育および／または収量を改善することができる。葉面散布したプロリンは、葉組織内に吸収され、グルタミン酸へと代謝される。さらに、このグルタミン酸は、内在性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼによって、２−ＯＧに代謝されるため、組織内の２−ＯＧ含量を高めることができる。このようにプロリンを葉面散布することにより２−ＯＧ含量が増加した植物は、栽培期間中の施用窒素量を通常栽培条件より制限した条件下で生育および／または収量が改善される。
本発明において使用し得る核酸構築物は当業者によく知られた方法を使用して作成することができる。核酸構築物を単離し、その配列を決定する方法を含む分子生物学的手段については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのような文献を参照することができる。あるいは、本発明に使用しうる核酸構築物を作成するためにＰＣＲ法をはじめとする遺伝子増幅が必要になることもあるが、そのような手法については、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）などを参照することができる。
本発明に使用する核酸構築物は一般に、植物細胞で機能する適切なプロモーター、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターなどの適切なターミネーター、その他の発現に必要な、あるいは有利な配列、及び、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子、例えば、カナマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ハイグロマイシン耐性のような薬剤耐性遺伝子を含んでよい。
そのような構築物に使用しうるプロモーター５は構成的プロモーターであっても器官特異的または生育ステージ特異的であってもよく、使用する宿主、必要とする発現量、発現を特に意図する器官、または、生育ステージによって選択することができる。本発明の好ましい実施態様においては、器官、及び生育ステージに非特異的に発現する強力なプロモーターが使用され、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターがそのようなプロモーターの例として使用される。器官特異的プロモーターとしては、ファゼオリン遺伝子プロモーターやパタチン遺伝子プロモーターなどが使用される。本発明の最も好ましい実施態様においては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのような強力な構成的プロモーターで当該グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を駆動する構築物が使用される。
本発明において使用しうる遺伝子導入法は特に限定されず、植物細胞、あるいは植物体への遺伝子導入法として当業者に知られた方法を宿主に応じて選択することができる。例えば、本発明の実施態様の一つにおいては、アグロバクテリウムを用いた遺伝子導入法が利用される。このような形質転換系には、バイナリーベクターを使用することが望ましい。アグロバクテリウムを利用する場合は、形質転換に用いる核酸構築物は植物細胞に導入すべきＤＮＡ配列に隣接するＴ−ＤＮＡ領域をさらに含む。好ましい実施態様においては移入された配列は左右のＴ−ＤＮＡボーダー配列の間に挿入される。このようなＴ−ＤＮＡをベースとする形質転換ベクターの適切な設計及び構築は当業者によく知られたものである。また、そのような核酸構築物を有するアグロバクテリウムを植物に感染させるための条件も当業者によく知られたものである。そのような技術、及び条件については、例えば、秀潤社、細胞工学別冊「モデル植物の実験プロトコル  イネ・シロイヌナズナ編」（１９９６）を参照することができる。
本発明においては、他の遺伝子導入法を利用することもできる。使用しうる遺伝子導入方法の例としては、ポリエチレングリコールやカルシウムを用いたＤＮＡのプロトプラストへの導入法、エレクトロポーレーションによるプロトプラストの形質転換法、パーティクルガンによる導入法等を挙げることができる。
上述したような遺伝的操作をおこなう植物種は特に限定されないが、植物体そのものを利用して形質転換を行う場合以外は、形質転換が容易で植物体への再生系が確立している植物種が好ましい。本発明に適した植物は前述の特性を有するもののほか、農業の環境負荷の低減という観点から、大量栽培技術の確立した植物種がより好ましい。本発明を実施するため適した植物としては、例えば、アブラナ科植物全般のほか、トマト、バレイショ、トウモロコシ、コムギ、イネ、サトウキビ、ダイズ、ソルガムなどが挙げられる。また、大量の窒素を与えることが困難な植物として、樹木・果樹などもあり、ポプラ、ユーカリ、リンゴなども挙げることができる。これらの植物におけるＧＤＨまたはＡＳＰＣの活性および特性は本発明の一つの実施態様で使用するアスペルギルス・ニデュランス由来のＧＤＨ（配列番号１および２）またはエシェリシア・コリＫ−１２株由来ＡＳＰＣ（配列番号１９および２０）と同等である。従って、これらの植物についても、アスペルギルス・ニデュランス由来のＧＤＨ遺伝子（配列番号１）またはエシェリシア・コリＫ−１２株由来のＡＳＰＣ遺伝子（配列番号１９）を導入して２−ＯＧ含量を増大させることができる。また、同様にこれらのいずれかの植物由来のＧＤＨ遺伝子またはＡＳＰＣ遺伝子も本発明において使用することができる。上述したような遺伝的操作をおこなう器官、細胞は特に限定されず、使用する宿主、遺伝子導入法等に応じて選択することができる。例として、器官外植片、花粉、培養細胞、胚、植物体等を挙げることができるが、これらに限定されない。
次に上述したように操作された植物細胞等は、形質転換について選抜される。この選抜は、例えば、形質転換に使用した核酸構築物上に存在したマーカー遺伝子の発現に基づいておこなうことができる。例えば、マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である場合は、適当な濃度の抗生物質、または除草剤等を含む培地上で操作された植物細胞等を培養、または生育させることにより選択することができる。あるいは、マーカー遺伝子が、β−グルクロニダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などの場合はその活性についてスクリーニングすることにより形質転換体を選抜することができる。このようにして同定された形質転換体が植物体以外、例えば、プロトプラスト、カルス、外植片等である場合は植物体への再生がおこなわれる。この再生には使用する宿主植物について当業者に知られた方法を利用することができる。
このようにして得られた植物体は通常の方法、すなわち、非形質転換体と同様の条件で栽培してよく、本発明の核酸構築物を含む形質転換植物を同定するために、前述のマーカー遺伝子に基づく選抜に加えて、種々の分子生物学的手法を利用することができる。例えば、組換えＤＮＡ挿入断片の有無及びその構造を検出するためにはサザンハイブリダイゼーションやＰＣＲを利用することができる。導入した核酸構築物に由来するＲＮＡ転写産物を検出・測定するためには、ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲなどを利用することができる。
次に得られた形質転換体のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現については、当該グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのタンパク質量、ｍＲＮＡ量、あるいは酵素活性の測定により評価される。例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼタンパク質またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼタンパク質の量はウェスタンブロット等の方法により、ｍＲＮＡ量はノーザンブロット、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって評価することができる。また、植物抽出液中のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定は、Ａｍｅｚｉａｎｅらの方法に従えばよい（Ａｍｅｚｉａｎｅ  Ｒ．，Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｋ．，ａｎｄ  Ｌｉｇｈｔｆｏｏｄ  Ｄ．，Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｉｌ，２２１：４７−５７，２０００）。また、植物抽出液中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性はＣｈａｏらの方法に従えばよい（Ｃｈａｏ  ＹＰ，Ｌａｉ  ＺＩ，Ｃｈｅｎ  Ｐ，Ｃｈｅｎ  ＪＴ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１５：４５３−４５８，１９９９）
このようして、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の発現または発現の増強が確認された形質転換植物は、さらに２−ＯＧ含量について評価される。２−ＯＧ含量は例えば、形質転換植物体全体またはその一部を破砕し、その抽出液を調製し、例えば、酵素法で定量することができる。植物抽出液の調製、および、２−ＯＧの定量については、例えば、Ｕｓｕｄａの方法にしたがえばよい（Ｕｓｕｄａ  Ｈ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，７８：８５９−８６４，１９８５）。
２−ＯＧ含量の増加については、通常の栽培条件、および、通常の栽培条件に比較して窒素が制限された条件において、その地上部（例えば、葉部、茎部、あるいはその両方、あるいは花器、果実の一部）、あるいは地下部（例えば、根、塊茎）における２−ＯＧ含量が、遺伝子導入の元株とした系統より、１．２倍以上増大した場合にその含量が増加したと判定する。
このようにして、２−ＯＧ含量の増加が確認された形質転換植物については、栽培期間中、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件下で栽培し、その生育、あるいは収量を評価することができる。ここでいう、通常栽培条件よりも窒素を制限した栽培条件とは、それぞれの植物の栽培の際に通常使用される標準窒素量、即ち、標準的な窒素施肥量よりも少ない窒素量、例えば、７０％以下、好ましくは５０％以下の量、を与える条件をいう。特に、本発明の方法によれば、標準窒素量の下限から下限の１／１０量程度に減少した範囲の量の窒素を与える栽培条件においても標準窒素量を与える栽培条件と同等以上の生育および／または収量が達成される。例えば、農作物については、個々の農作物について、標準の窒素施肥量が定められている。例えば、バレイショでは、１０ａあたり窒素施肥量は標準で７ｋｇ（ＪＲＴ日本イモ類研究会ホームページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｒｔ．ｇｒ．ｊｐ／ｍｉｎｉ／ｐｍ＿ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；吉田稔著、まるごと楽しむジャガイモ百科、農文協、１９８８）、とされており、また、イネでは、１０ａあたり５〜１５ｋｇ（日向康吉、羽柴輝良編、植物生産農学実験マニュアル、ソフトサイエンス社、１９９５；奈良県農業技術センターホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｒａｎｏｕｇｉ．ｊｐ／ｓｅｈｉ−ｋｉｊｙｕｎ／ｓｅｈｉｋｉｊｙｕｎ−ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）とされている。また、シロイヌナズナなどの実験植物では、５ｍＭ以上の硝酸塩を含む培地が生育に適する標準培地とされる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ  Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｌｉｎａｓ  Ｊ．ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８）。このような標準窒素施肥量または標準培地中の窒素量は当業者にはよく知られたものである。
形質転換植物は、通常栽培条件より窒素を制限した条件下、すなわち、上述したように、窒素を標準的な窒素施肥量の下限から下限の１／１０量程度に減少した範囲の量で栽培され、その生育および／または収量が評価される。生育は、地上部、または植物体全体の草丈、葉数、生重量、または、乾燥重量を測定することにより評価することができる。本明細書において生育の改善とは、このような植物体の部位、または全体に関するパラメーター（例えば、草丈、葉数、生重量、または、乾燥重量）の少なくとも１つが、同時期に標準的な窒素施肥量の下で栽培を開始した対照植物に対して、１．２倍以上上回っている状態と定義される。また、収量はその植物の収穫部位、例えば、バレイショならば塊茎、イネならば子実の総数、単位当たりの重量、または、得られる収穫部位の全体の重量を指標として評価することができる。したがって、本明細書において収量の改善（または増加）とは、このような収穫部位において、対照となる同時期に標準的な窒素施肥量の下で栽培を開始した植物区に比べて１．２倍以上増加したことと定義する。
このようにして、施用窒素量を、通常栽培条件より制限した条件下での生育、および収量が対照となる非形質転換体より改善された形質転換植物が同定されたならば、その形質が遺伝的に安定に保持されるか否かが調べられる。このためには、通常の条件に従い植物体を育成・栽培・採種し、後代における形質、その分離を解析すればよい。後代における導入核酸構築物の有無、その位置、その発現等は初代（Ｔ１世代）形質転換体と同様に解析することができる。
通常栽培条件より施用窒素量を制限した条件下での生育、および収量が改善された形質転換植物、すなわち、窒素制限下での成育抑制が解除された形質転換植物は、導入したゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列に関してヘミ接合の場合もホモ接合の場合もあり得るが、必要に応じて交配すること等により、後代においてヘミ接合体もホモ接合体も導くことができる。ゲノムに組み込まれた核酸構築物由来の配列は後代においてメンデリズムに従い分離する。従って、形質の安定性の観点から子孫植物及び種子を取得するためには、ホモ接合植物を使用することが望ましい。
また、形質転換体は多くの場合、遺伝子座としては、１ヶ所に外来遺伝子が挿入されるが、複数の遺伝子座に挿入された多コピー形質転換体であることも珍しくはない。導入遺伝子の安定性等の理由で、本発明においては単一コピー形質転換体がより好ましい。例えば、Ｔ２（第２世代）でのカナマイシン抵抗性の分離比を調べることにより、導入遺伝子が１遺伝子座であるもの、すなわち単一コピー形質転換体を選択することができる。Ｔ１がヘミ接合体であって、導入遺伝子が１遺伝子座である場合は、メンデルの法則にしたがい、Ｔ２では、カナマイシン抵抗性と感受性が３：１に分離する。また、導入遺伝子が多コピー存在する場合は、抵抗性形質転換体の出現頻度が高くなる。従って、得られたＴ２種子を再びカナマイシンを含む培地に播種し、３：１の分離比を示す系統を選択し、導入遺伝子が１遺伝子座に存在すると考えられる形質転換体を選抜することによって、単一コピー形質転換体を得ることができる。
そのようにして得られた形質転換植物は天然に存在する同種の植物と同様の栽培条件に従って栽培することができ、施用窒素量を、通常栽培条件より制限した条件下で栽培され、非形質転換植物と同等、あるいはそれを上回る収穫物を提供することができる。また、このようにして作製された形質転換植物からその種子を得ることもできる。種子は同種の非形質転換植物と同様な方法によって容易に得ることができる。必要であれば、得られた種子の保存、殺菌、害虫駆除等も当業者によく知られた通常の方法によっておこなうことが出来る。
このように、遺伝子導入によって植物の２−ＯＧ含量を増加させることができるが、このような方法に加えて、アミノ酸の一種であるプロリンを葉面散布することによっても植物の２−ＯＧ含量を増加させることができる。具体的には、２０ｍｇ／ｌ〜５００ｍｇ／ｌの範囲のプロリン水溶液を適当な展着剤と共に植物の葉面にスプレー等で散布すればよい。このようにプロリンの葉面散布を受けた植物は上述の方法と同様に２−ＯＧ含量を評価することができる。また、窒素制限条件における生育効果についても上述したのと同様な条件および方法で評価することが出来る。
本発明は、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ遺伝子、またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の過剰発現について操作された植物の作成および収量調査、成分分析に関する以下の実施例、または、プロリンの葉面散布を受けた植物の収量調査、成分分析に関する以下の実施例により具体的かつ詳細に例示される。
【実施例】［実施例１］．アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子の単離とＴｉプラスミドベクターの構築
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子（Ａｎ−ＧＤＨ）の単離
Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓをポテトデキストロース寒天培地にまき、一晩３０℃で培養し、更に得れらたコロニーをデキストロース液体培地で２日間培養した。増殖した菌よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを調整した。
ＲＮＡはＰｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いてｍＲＮＡを精製した後、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを作成した。作成したＦｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートに用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃−３分；９４℃−４５秒、５９℃−３０秒、７２℃−９０秒、３５サイクル；７２℃−１０分とし、パーキンエルマー社のＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用いて行った。用いたプライマーは、５‘−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号５）と５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ−３’（配列番号６）である。その結果、約１．４ｋｂｐのバンドが認められ、予測される遺伝子のサイズと一致した。得られたＰＣＲ産物は、ＴＡ−Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングした。得られたクローンはシークエンサー（ＡＢＩ社３７７Ａ）を用いて塩基配列を決定した。既知のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ由来ＮＡＤＰ依存型ＧＤＨ遺伝子と一致し、これをＡｎ−ＧＤＨとした（配列番号１７）。
（２）Ｔｉ−プラスミドベクターの構築
更に、得られた遺伝子に、ミトコンドリアへのトランジェットペプチドをコードする塩基配列を付加した。これは、トマト由来ＮＡＤ依存型ＧＤＨ遺伝子の５‘側の配列で、プライマー，５’−ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号７）と５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧ−３’（配列番号８）を用いてＰＣＲによって取得した。このようにして得られたＡｎ−ＧＤＨ遺伝子とミトコンドリアへのトランジェットペプチドをコードする塩基配列の連結は、４種のプライマー、５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＴＴＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号９），５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＴ  ＴＡＧ  ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  Ｔ−３’（配列番号１０），５’−ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  ＣＣＣ−３’（配列番号１１）及び５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＡＡ−３’（配列番号１２）を用いて行った。このようにして得られたミトコンドリアへのトランジェットペプチド配列を付加したＧＤＨ遺伝子をＭｔｄ−Ａｎ−ＧＤＨとした。このＭｔｄ−Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子は、アグロバクテリウムによる形質転換用のベクター、Ｔｉプラスミド，ｐＩＧ１２１−ＨｍのＧＵＳ領域と置換した（図１）。得られたＴｉ−プラスミッドはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ＥＨＡ１０１に導入し、シロイヌナズナとバレイショの形質転換に用いた。
［実施例２］．バレイショ形質転換体の作出
バレイショ（品種、メークイン）の形質転換は，Ｇｏｒｄｏｎら（文献：Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１９９３，１２：３２４−３２７）の方法に従って行った。無菌的に誘導したマイクロチューバーを切り、チューバーディスクを作成し、２ｍｇ／ｌゼアチンと０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を加えたＭＳ寒天培地上に植え、１６時間日長、２５℃で２４時間培養した。構築した遺伝子を含むアグロバクテリウムは５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＹＥＰ培地（１０ｇ／ｌバクトトリプトン，１０ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ，１ｇ／ｌグルコース）に接種し、２８℃で一晩振とう培養した。２４時間培養したチューバーディスクにアグロバクテリウム液を加え感染させた。１０分後、滅菌した濾紙を用いて、余分なアグロバクテリウム液を取り除き、先に用いたシャーレに移植し、同条件で、２４時間培養した。その後、チューバーディスクは、５０ｍｇ／ｌカナマイシン，３００ｍｇ／ｌセファタキシム塩酸塩，２ｍｇ／ｌゼアチン及び０．１ｍｇ／ｌインドール酢酸を含むＭＳ寒天培地に移植し、形質転換体の選抜を行った。再分化したシュートを再度前記選抜培地に移し、耐性の確認を行った。明らかにカナマイシン抵抗性が認められたシュートは、５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び３００ｍｇ／ｌセファタキシム塩酸塩を含むＭＳ寒天発根培地に移植し、根の分化を誘導した。発根した再分化植物は、最低３回茎頂部を切り取り、選抜発根培地に移植し、カナマイシン抵抗性の確認を行い、キメラ個体を排除した。このようにして得られた５個体は、土壌に馴化させ、塊茎を得た。
［実施例３］．シロイヌナズナの形質転換体の作出
シロイヌナズナへの遺伝子導入はＢｅｃｈｔｏｌｄら（文献：Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１１９４−１１９９，１９９３）の方法に従った。培養土にシロイヌナズナの種子をまき、１０日間１６時間日長、２４℃で栽培した幼植物を、ロックウール１個に１株ずつ移植し、更に２週間同条件で栽培した。植物が抽だいをはじめたら摘心し、更に１週間栽培を行った。アグロバクテリウムは５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＹＥＰ培地で、２８℃で２４時間振とう培養し、遠心（７，０００ｒｐｍ，１０分）によって集菌した。菌は浸潤用懸濁培地（１／２ＭＳ塩，１／２  Ｂ５ビタミン，５％ショ糖，０．５ｇ／ｌ  ＭＥＳ，０．０４４μＭ  ベンジルアミノプリン，ｐＨ５．７）に懸濁した。既に開花、結実している花器を除き、アグロバクテリウム懸濁液に漬け、デシケーターに入れ、１５分間減圧（４０ｍｍＨｇ）処理を行った。処理した植物は１ヶ月間栽培した後、種子を採集した。種子は、５０ｍｇ／ｌカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌセファタキシムを含むＭＳ寒天培地に播種し、選抜を行った。このようにして得られた形質転換体３株は、Ｔ３世代まで世代を更新し、カナマイシン抵抗性の分離が生じなくなった系統を解析に用いた。
［実施例４］．導入遺伝子の確認
カナマイシンに抵抗性を示した選抜個体、バレイショ５個体、シロイヌナズナ３個体及び非感染植物よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出はＨｏｎｄａら（文献：Ｈｏｎｄａ  ａｎｄ  Ｈｉｒａｉ，１９９０，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｂｒｅｅｄ  ４０：３３９−３４８）の方法に従った。抽出したＤＮＡを用いて、Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的プライマー、５‘−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号１３）と５’−ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＴＣ−３’（配列番号１４）及びベクター内のＮＰＴＩＩ遺伝子を増幅するためのプライマー、５’−ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＴＴＡ  ＧＡＧ−３’（配列番号１５）と５’−ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＧ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲ分析を行った。反応は、９４℃−３分；９４℃−４５秒、５５℃−３０秒、７２℃−９０秒、３５サイクル；７２℃−１０分とし、パーキンエルマー社のＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用いて行った。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、選抜した形質転換バレイショ（図２）及び形質転換シロイヌナズナ（図３）に、Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的なバンド（約１．５ｋｂｐ）とＮＰＴＩＩ遺伝子特異的なバンド（約１．１ｋｂｐ）が認められ、非感染植物には、これらのバンドが認められないことから、Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子を含むＴ−ＤＨＡ領域が、形質転換バレイショ及び形質転換シロイヌナズナに導入されていることが分かった。
［実施例５］．導入遺伝子の発現の確認（ノーザン分析）
Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された形質転換バレイショ及び形質転換シロイヌナズナを用いて、導入した遺伝子の発現を確認するために、ノーザン分析を行った。
形質転換バレイショの葉組織、塊茎及び形質転換シロイヌナズナの葉組織より、ＳＤＳ−フェノール法によってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、１８％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した。ナイロンメンブラン（ＨｙｂｏｎｄＮ＋）にブロッティングした後、ＵＶで固定し、ハイブリダイゼーションを行った。Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子全長をプローブに用いた。ノーザンブロット及びプローブの作成はロシュ・ダイアグノスティックス社のＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ  及びＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いた。
その結果、形質転換バレイショの葉組織及び塊茎において、Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的バンドが確認された（図４）。導入した遺伝子が、形質転換バレイショの葉組織及び塊茎において転写発現していることがわかった。一方、形質転換シロイヌナズナ葉組織においても、Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子特異的バンドが確認された（図５）。導入した遺伝子が形質転換シロイヌナズナの葉組織において転写発現していることが示唆された。非形質転換バレイショ及び非形質転換シロイヌナズナには、これらのＡｎ−ＧＤＨ特異的バンドは認められなかった。
［実施例６］．導入した遺伝子の発現（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性）
Ａｎ−ＧＤＨ遺伝子が導入されていることが確認された形質転換バレイショ及び形質転換シロイヌナズナを用いて、導入した遺伝子の発現を確認するために、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性の測定を行った。
活性の測定はＡｍｅｚｉａｎｅら（文献：Ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  Ｓｏｉｌ，２０００，２２１：４７−５７）の方法に従った。形質転換バレイショ（約０．２ｇ）及び形質転換シロイヌナズナの葉組織（約０．２ｇ）を液体窒素で凍結させ、乳鉢で破砕した後、重量の５倍量の抽出緩衝液｛２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），１４ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１０ｍＭ  Ｌ−システイン−ＨＣｌ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ｝を加えた。遠心チューブに移し、４℃、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心した後、上清を限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ウルトラフリー０．５フィルターユニット，バイオマックス−１０）し、更に、抽出緩衝液で３回洗浄した。
活性の反応は、１００ｍＭ  Ｔｒｓｉ（ｐＨ８．５），２０ｍＭ  ２−オキソグルタル酸，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ，２００ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌを含む反応液に、先に抽出した素酵素液を加え、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少を測定した。抽出した素酵素液中のタンパク質濃度は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質として、ブラッドフォード法で測定した。
その結果、形質転換バレイショは非形質転換バレイショに比べて約２０−５０倍の高い活性が認められた（表１）。形質転換シロイヌナズナにおいても、非形質転換シロイヌナズナに比べて、約５−１２倍の高い活性が認められた（表２）。非形質転換体は殆んどＨＡＤＰ−ＧＤＨ活性が認められなかったことから、これらの活性は、導入したＡｎ−ＧＤＨ遺伝子の発現による活性であると考えられた。
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［実施例７］．ＧＤＨ遺伝子導入シロイヌナズナ及びバレイショの２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）、尿素、及び硝酸含量
形質転換バレイショ（Ｍｔｄ  ８）及び形質転換シロイヌナズナ（Ｍｔｄ  ３）の葉組織中の２−ＯＧ，尿素及び硝酸含量の測定を行った。バレイショはパワーソイル５００ｇとバーミキュライト５００ｇの混合土壌で１ヶ月間栽培した生育旺盛な植物体の葉組織を材料に用いた。シロイヌナズナはＰＮＳ培地（５ｍＭ  ＫＮＯ３を含む）で３週間生育させた植物の葉組織を用いた。注出はＡｇａｒｉｅら（文献：Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，１６２：２５７−２６５）の方法に従った。葉組織（約０．１ｇ）を、液体窒素を用いて破砕した後、２００μｌの３％  ＨＣＯ４を加えよく混合した。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を別のチューブに移した。残った沈殿に再度、２００μｌの３％  ＨＣＯ４を加え、よく混合した。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を先のチューブに移した。回収した上清に５０−７０μｌの５Ｍ  Ｋ２ＣＯ３を加え、液を中性化した。リトマス試験紙を用いて、液のｐＨが中性であることを確認した後、滅菌水で液量を６００μｌに調製し、測定用のサンプルとした。硝酸及び尿素の測定にはロシュ・ダイアグノスティックス社のＦ−ｋｉｔ、硝酸及び尿素／アンモニアをそれぞれ用いた。２−ＯＧ含量の測定は、Ａｍｅｚｉａｎｅら（文献：前掲）の方法を改変した。４７５μｌの反応液｛０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ，０．２Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ｝に抽出したサンプル２０μｌを加え、３４０ｎｍの吸光度を測定した後、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＤＨ）を５μｌ（１０ｕｎｉｔ）加え、３７℃で１０分間反応させた。再度３４０ｎｍの吸光度を測定し、酵素液を加えた後の吸光度値と酵素を加える前の吸光度値の差から、２−ＯＧ酸含量を算出した。
その結果、形質転換シロイヌナズナは非形質転換シロイヌナズナに比べて、２−ＯＧ含量が２．６倍、尿素含量が２倍、硝酸含量が１．２培に増加していた。一方、形質転換バレイショにおいても、非形質転換バレイショに比べて、２−ＯＧ含量が１．７倍、尿素含量が１．５倍、硝酸含量が１．３倍に増加していた（図６Ａ−Ｆ）。
さらに、シロイヌナズナを培養する際の、培地中の窒素濃度を１０，５，３，０．３，０．１ｍＭに調整した培地で３週間培養したシロイヌナズナの葉組織を用いて、２−ＯＧ含量と硝酸含量を測定した。その結果、形質転換シロイヌナズナの２−ＯＧ含量と非形質転換シロイヌナズナの２−ＯＧ含量の差異が、培地中の窒素含量が減少するのに従って、増加する事が分かった（図７）。この結果より、導入したＧＤＨは、グルタミン酸を分解し、２−ＯＧとアンモニアを合成する方向に機能していると考えられた。また、硝酸含量は、３ｍＭ以上の窒素を含む場合、形質転換シロイヌナズナと非形質転換シロイヌナズナ共に、ほぼ一定の蓄積量が保たれ、その条件において形質転換シロイヌナズナは非形質転換シロイヌナズナに比べて最大１．３倍の蓄積量の増加が認められた。０．３及び０．１ｍＭの窒素条件においても２．５−４．５倍の増加が認められた（図８）。この結果より、形質転換シロイヌナズナの葉組織中には、非形質転換シロイヌナズナよりも多くの硝酸が蓄積されていることが示され、このことは窒素の取り込み効率が向上していることを示唆した。
［実施例８］．ＧＤＨ遺伝子導入シロイヌナズナ及びバレイショの葉組織の窒素同化関連酵素の活性
形質転換バレイショ及び形質転換シロイヌナズナの葉組織（約０．１ｇ）中のＮＡＤＨ依存型グルタミン酸合成酵素（ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴ）、硝酸還元酵素（ＮＲ）及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）の酵素活性を測定した。バレイショはパワーソイル５００ｇとバーミキュライト５００ｇの混合土壌で１ヶ月間栽培した生育旺盛な植物体の葉組織を材料に用いた。シロイヌナズナはＰＮＳ培地（５ｍＭ  ＫＮＯ３を含む）で３週間生育させた植物の葉組織を用いた。素酵素液の抽出は、Ｇｒｏａｔら（文献：Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９８１，６７：１１９８−１２０３）の方法に従って行った。液体窒素を用いて葉組織を破砕した後、氷冷しておいた抽出バッファー｛１００ｍＭ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ｓｕｃｒｏｓｅ，２％（ｖ／ｖ）メルカプトエタノール，１５％エチレングリコール，０．１％  ＰＭＳＦ｝を５００μｌ加え、穏やかに混合した。１２，０００ｒｐｍ、０℃で２０分間遠心した後、上清をウルトラフリー（Ｂｉｏｍａｘ−１０Ｋ、ミリポア社）を用いて精製した。同じバッファーを用いて３回洗浄した後、１００μｌのバッファーに溶解し、酵素液とした。
ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴ活性の測定は、同様にＧｒｏａｔら（文献：前掲）の方法に従った。５００μｌの反応液｛１００ｍＭ  Ｋ−リン酸塩（ｐＨ８．２），１００μＭ  ＮＡＤＨ，２．５ｍＭ  ２−オキソグルタル酸，１０ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１ｍＭアミノオキシアセテート｝を調製した後、酵素液１０μｌを加え混合した。３４０ｎｍの吸光度を３分間測定し、ＮＡＤＨの消費に伴う吸光度値の減少を測定した。
ＮＲの活性はＦｅｒｒａｒｉｏ−Ｍｅｒｙら（文献：Ｐｌａｎｔａ，１９７，２０２：５１０−５２１）の方法に従った。４９０μｌの反応液｛５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８），１ｍＭ  ＮａＦ，１０ｍＭ  ＫＮＯ３，０．１７ｍＭ  ＮＡＤＨ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は５ｍＭ  ＥＤＴＡ｝を調製し、酵素液１０μｌをそれぞれに加え混合した。１６分後に１％スルファニルアミド（ｉｎ  ３Ｎ  ＨＣｌ）を５００μｌ加え、更に、２％  Ｎ−ナフチル−１−エチレン  ジアミン  ジクロロハイドレートを１０μｌ加えた。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。ＭｇＣｌ２を加えて反応した値からＥＤＴＡを加えて反応した際の値を引いた値をＮＲ活性とした。
ＧＳの活性もＦｅｒｒａｒｉｏ−Ｍｅｒｙら（文献：前掲）の方法に従った。４８０μｌの反応液｛８０ｍＭグルタミン酸，２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭトリシン，６ｍＭヒドロキシルアミン，８ｍＭ  ＡＴＰ｝に２０μｌの酵素液を加え、３０℃で１５分間反応した。５００μｌの０．３７Ｍ  ＦｅＣｌ３，０．２Ｍトリクロロ酢酸，０．６７Ｎ  ＨＣｌ液を加え、反応を停止させた後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
抽出した酵素液中のタンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパク質として、ブラッドフォード法で測定した。その結果、形質転換シロイヌナズナは非形質転換シロイヌナズナに比べて、ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴ活性，ＮＲ活性及びＧＳ活性がそれぞれ、１．３８倍、１．４０倍及び１．２５倍増加していた（表３）。一方、形質転換バレイショにおいても、非形質転換バレイショに比べて、ＮＡＤＨ−ＧＯＧＡＴ活性，ＮＲ活性及びＧＳ活性がそれぞれ、１．３３倍、１．３６倍及び１．０１倍増加していた（表４）。以上の結果より、形質転換シロイヌナズナ及び形質転換バレイショは、非形質転換体に比べて、窒素の吸収効率が向上したのみでなく、窒素代謝に関連する酵素が活性化され、窒素の代謝効率も向上していることが分かった。
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［実施例９］．形質転換バレイショの収量調査
形質転換バレイショを用いて、収量調査を行った。収量調査には形質転換バレイショ及び非形質転換バレイショ由来の種芋を用いた。窒素濃度を変えた条件で栽培した時の、生育及び塊茎重量、塊茎数等について調査した。標準条件として８．５リットル鉢に３ｋｇのパワーソイル（全窒素１．２ｋｇ）を加えた場合と低窒素条件として７号鉢に３００ｇのパワーソイル（全窒素０．１２ｋｇ）を加えた場合の２区を設け、土壌の不足分はバーミキュライト（養分無し）を補填した。播種後３ヶ月後に収穫し、地上部重、塊茎重、塊茎数について調査した。
その結果、窒素１．２ｇ区においては、形質転換バレイショは非形質転換バレイショに比べて、塊茎重量及び塊茎数がそれぞれ１．１２−１．１３倍及び１．０９−１．２３倍に増加した（表５）。窒素０．１２ｇ区（窒素制限条件）においては、形質転換バレイショは非形質転換バレイショに比べて、塊茎重量及び塊茎数がそれぞれ、１．２９−１．３５倍及び１．２４−１．５６倍に増加した（表６）。
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［実施例１０］．形質転換シロイヌナズナの生育調査
形質転換シロイヌナズナ（Ｍｔｄ  ３）を用いて成長量の調査を行った。ＰＮＳ培地（窒素源は硝酸態窒素のみ）のＫＮＯ３濃度を０．１，０．３，３，５ｍＭに改変し、ショ糖１％を加えた培地（テルモ８ｃｍシャーレ使用）に播種し、１シャーレ当り８株ずつ培養した。播種後３週間後に地上部重量を測定した。データは８株全体の地上部重で、１区３シャーレの平均及び誤差を示した。その結果、形質転換シロイヌナズナは、非形質転換シロイヌナズナに比べて、低窒素条件においても生育が良く、生重量で１．１〜１．１４倍の成長量を示した（表７）。
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［実施例１１］．プロリン水溶液のバレイショ植物への葉面散布
バレイショ（品種、メイクイーン）を用いて、プロリン液を葉面散布した際の、生育や収量に及ぼす効果について調査した。バレイショ塊茎を、パワーソイル（呉羽化学）１．５ｋｇを入れた７号鉢に播種した。パワーソイルに含まれる窒素肥料は表８の通りである。通常の栽培では、元肥として窒素肥料が５ｇ程度使用され、この栽培試験は低窒素条件で栽培を行ったことになる。
葉面散布は、展着剤区（アプローチＢＩ，花王）、尿素区（展着剤＋０．８７ｍＭ尿素）、プロリン区（展着剤＋１．７５ｍＭプロリン）の３区を設け、播種後１ヶ月目頃（開花直前）から、１週間毎に１株当り約２０ｍｌスプレーした。散布は合計６回（６週間）行い、播種後３ヶ月目に収穫を行った。
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［実施例１２］．プロリン葉面散布バレイショ葉組織の遊離プロリン含量と２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ）含量の測定
展着剤及び尿素、プロリンの各水溶液をバレイショの葉面に散布した後、経時的に遊離プロリン含量及び２−ＯＧ含量の測定を行った。葉面散布後、１，３，５，８時間目の植物の茎頂部より３枚目の葉組織をサンプリングし良く水洗いし試料とした。液体窒素を用いて破砕した後、生重量の５倍量の８０℃に加温した８０％エタノールを加え、さらに、８０℃で２０分間インキュベートした。１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を別のチューブに移した。再度、８０％エタノールを加え８０℃で２０分間インキュベートし、遠心し、上清を回収し、同様な抽出を合計３回行った。エタノール抽出物は凍結乾燥させた後、３００μｌ滅菌水及び２００μｌエチルエーテルを加え、よく混合した後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上層のエチルエーテル層を取り除いた後、水層を２００μｌ別のチューブに移し、再度凍結乾燥した。２００μｌの０．０２Ｎ塩酸に溶解した後、０．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。このようにして得られた抽出液を、日立高速アミノ酸分析装置（Ｌ８８００）を用いて分析した。同様な植物サンプルを用いて、２−ＯＧ含量の測定を行った。２−ＯＧの抽出及び含量の測定は、実施例７に記した方法と同様に行った。
その結果、葉面散布１時間後の葉組織中のプロリン含量に３区間で、有意な差異は認められなかったが、散布５時間後にはプロリン散布区の葉組織中の遊離プロリン含量が有意に増加した（図１１）。葉面散布したプロリンが葉組織内に取り込まれているものと考えられた。同様に、葉組織内の２−ＯＧ含量を測定した結果、葉面散布後１時間後の葉組織内の２−ＯＧ含量に３区間で、有意な差異は認められなかったが、散布２４時間後にはプロリン散布区の葉組織中の２−ＯＧ含量が有意に増加することが分かった（図１２）。葉面散布したプロリンは、葉組織内に取り込まれた後、２−ＯＧに代謝され、ＴＣＡサイクルに取り込まれるものと考えられた。
［実施例１３］．プロリン葉面散布バレイショの収量調査
播種後１ヶ月目のバレイショ植物に展着剤、尿素及びプロリン水溶液を１週間毎に６回葉面散布を行った。各区６鉢ずつ栽培を行い、茎数を１本に統一し、播種後から３ヶ月間栽培を行った。１鉢毎に塊茎を収穫し、１鉢当りの塊茎重量及び塊茎数を求めた。
その結果、塊茎重量において、展着剤区は１鉢当りの塊茎重量が１４５．８ｇ、尿素区が１４０．１ｇ、プロリン区が１５８．４ｇとなり、プロリン区は展着剤区に比べて、１．１倍に塊茎重量が増加した。一方、塊茎数においては、展着剤区が８．２個、尿素区が６．８個、プロリン区が８．２個となり、塊茎数に関しては、差異は認められなかった（表９）。以上の結果より、プロリンを葉面散布することによって、塊茎収量が増加することが分かった。
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［実施例１４］．大腸菌由来アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣＡＳＰＣ）遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナの作出
大腸菌で既に報告されているアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ＥＣＡＳＰＣ）の配列情報（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３６２９）を元に、ＥＣＡＳＰＣ遺伝子を単離した（ヌクレオチド配列：配列番号１９，アミノ酸配列：配列番号２０）。同遺伝子に、実施例１で述べたように、ミトコンドリアへのトランジェットペプチド配列を付加した（ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ）。この遺伝子を、植物形質転換用のＴｉ−プラスミッドベクター、ｐＢＩ１２１のＧＵＳ領域と置換した後、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ＥＨＡ１０５に形質転換した。このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いて、実施例３と同様な方法で、シロイヌナズナにｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子を導入した。カナマイシンを含む培地に播種し、耐性個体を選抜し（Ｔ１世代）、次世代でカナマイシン耐性の耐性と感受性が３対１に分離する系統を得た（Ｔ２世代）。さらに次世代で、すべての個体がカナマイシン耐性を示す系統（Ｔ３世代）を、４系統（ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ２−２，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ６−２，ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ８−１及びｍｔｄＥＣＡＳＰＣ９−１）選定した。得られた形質転換体における導入遺伝子の確認はゲノムＰＣＲ法により実施例４と同様に行った。また、導入した遺伝子の転写発現はＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。シロイヌナズナの葉組織よりキアゲン社のＰｌａｎｔ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ−Ｋｉｔを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲはＴａＫａＲａのＲＮＡ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用し、ＥＣＡＳＰＣ特異的プライマーを用いて行った。９４℃−１分，５５℃−１分，７２℃−２分で３０サイクルの反応を行い、１％アガロースゲルで電気泳動した後、エチジウムブロマイドで染色した。
その結果、カナマイシン耐性を示した形質転換シロイヌナズナには、ポジティブコントロールとして用いたｍｔｄＥＣＡＳＰＣプラスミッドＤＮＡをテンプレートに用いた場合と同じサイズのバンドが確認された（図１３）。これは、カナマイシン耐性を示した形質転換シロイヌナズナのゲノム内に、ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子が導入されていることを示唆する結果であった。一方、ＲＴ−ＰＣＲ分析においても、形質転換シロイヌナズナに、ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ特異的バンドが確認された（図１４）。このバンドは、非形質転換シロイヌナズナにバンドが認められず、また、逆転写反応を行っていないＲＮＡをテンプレートに用いた場合においてもバンドが認められないことから、ゲノムの混入は無いと考えられた。すなわち、これは、導入したｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子が形質転換シロイヌナズナ内で、転写されていることを示唆する結果であった。
［実施例１５］．ＥＣＡＳＰＣ遺伝子形質転換シロイヌナズナの窒素制限条件での生育調査
得られた形質転換体を用いて、実施例１０の要領で、生長量の調査を行った。窒素源が硝酸態窒素のみであるＰＮＳ培地を用いた。培地のＫＮＯ３の濃度を５ｍＭ及び１０ｍＭとし、各々１％ショ糖を加えた。無菌的に種子を播種し、１週間後に、生育が揃った株１０株を残した。さらに２週間後（播種から３週間後）に、１０株の地上部重量を測定した。２プレートの平均と誤差を表１０に示した。その結果、ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子導入シロイヌナズナは、遺伝子を導入していない非形質転換シロイヌナズナに比べて、地上部生重量の顕著な増加が認められ、窒素５ｍＭ区では、１．１８−１．２８倍、窒素１０ｍＭ区では、１．１２−１．３８倍の増加を示した。
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［実施例１６］．ＭｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子導入シロイヌナズナの２−ＯＧ含量の測定
実施例１４で選抜した４系統のｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子導入シロイヌナズナを用いて、２−ＯＧ含量の測定を行った。ＫＮＯ３を５ｍＭ、ショ糖を１％含むＰＮＳ培地に無菌的に種子を播種し、２４℃、１６時間日長で２週間生育させた植物の地上部を用いた。２−ＯＧの抽出及び含量の測定は、実施例７に記した方法と同様に行った。
その結果、ｍｔｄＥＣＡＳＰＣ遺伝子を導入した形質転換シロイヌナズナは、同遺伝子を導入していない非形質転換シロイヌナズナに比べて、地上部組織中の２−ＯＧ含量が、１．２７−１．９３倍に顕著に増加していることが分かった。これらの結果は、ＧＤＨ遺伝子を導入した形質転換植物に認められた結果と、非常に酷似するものであった。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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