(57)【要約】本発明により哺乳動物のＰＳＤ画分に存在する蛋白質をコードするｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子が提供される。ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質は、シナプスに局在し、骨格蛋白質ＰＳＤ−９５と結合する。また、抗ｍＰｒｉｃｋｌｅ抗体を用いてｍＰｒｉｃｋｌｅを生体内より沈澱させるとＮＭＤＡ受容体も一緒に沈澱されることから、ＮＭＤＡ受容体を標的としたドラッグデリバリーシステムにおいてｍＰｒｉｃｋｌｅを利用することができる。ＮＭＤＡ受容体は学習及び記憶と密接に関連し、精神疾患との関係も指摘されていることから、将来的には、ｍＰｒｉｃｋｌｅを利用したボケ、痴呆等の学習・記憶に関連した神経変性疾患の診断・治療も可能と考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ蛋白質をコードする（１）〜（４）の核酸配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（２）配列番号：２の核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（４）上記（２）の配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドまたは請求項２記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドを翻訳する工程を含む、該ポリヌクレオチドによりコードされる哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ蛋白質を製造する方法。
【請求項５】
請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの断片であり、少なくとも８アミノ酸残基を有するポリペプチド断片。
【請求項６】
請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または請求項５記載のポリペプチド断片に対する抗体。
【請求項７】
請求項５記載のポリペプチド断片をコードするヌクレオチド鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、シナプス後膜肥厚（ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＰＳＤ）に発現している哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｉｃｋｌｅ；ｍＰｒｉｃｋｌｅ）蛋白質をコードする新規遺伝子に関する。さらに、本発明は該遺伝子を用いたポリペプチドの製造方法、該ポリペプチドの断片、並びに該ポリペプチドに対する抗体に関する。
【背景技術】  神経シナプスとは非対称形の神経細胞間の接着部位を指す。神経シナプスは神経伝達の中心でもあり、神経活動に依存してその接着を活発に変化させ、シナプス前膜及び後膜における神経伝達の効率を調節している。シナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）は、細胞骨格蛋白質が興奮性シナプスのシナプス後膜を裏打ちする特殊化した領域であり、ＰＳＤ−９５等の骨格分子（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、神経伝達物質受容体、イオンチャンネルが数多く存在し、神経細胞の形態変化、神経可塑性等の神経系の機能に深く関与していると考えられている（Ｙ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｙａｍａｕｃｈｉ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６３５４；Ｓ．Ｓｔａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２７２：１３４６７；Ｓｉｅｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３４９４−８；Ｗａｌｃｈ  ａｎｄ  Ｋｕｒｕｃ（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５９：６６７−８）。特に、膜蛋白質のニューロン内での局在及びクラスター化は、ニューロンの発達及びシナプス形成にとって重要である。従って、このような膜蛋白質と相互作用する蛋白質は、膜蛋白質の細胞における空間的配置、シナプスの活性制御、神経伝達物質受容体機能の調節等に影響することが考えられる。
【発明の開示】
Ｐｒｉｃｋｌｅはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｐｌａｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙに関与する蛋白質であり、羽に生える毛の向きを制御していることが知られている（以下、ショウジョウバエのＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質をＤ−Ｐｒｉｃｋｌｅと呼ぶ）（Ｇｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）″Ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｃｋｌｅ  ＬＩＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｐｌａｎａｒ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｉｍａｇｉｎａｌ  ｄｉｓｃｅ．″，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２３１５−２７）。Ｄ−Ｐｒｉｃｋｌｅはｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）と結合し、Ｄｓｈの局在を変化させることでｆｉｚｚｌｅｄ（ｆｚ）からのシグナル伝達を阻害すると考えられている。また、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ）のシグナリングは、ｐｌａｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙのシグナリングと関連しているが、哺乳動物のＤｓｈもショウジョウバエの場合と同様にＪＮＫシグナリングを活性化させる。これらの事実から、哺乳動物でもＤｓｈとＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質が相互作用することで、シナプスの極性形成やＪＮＫシグナリングに関与している可能性がある。しかしながら、このショウジョウバエのＰｒｉｃｋｌｅ（以下、Ｄ−Ｐｒｉｃｋｌｅと言う）に対応する、高等動物におけるホモログは単離されていない。そこで、本発明の目的は、ショウジョウバエのＰｒｉｃｋｌｅの高等動物におけるホモログを同定し、提供することである。
ＭＳ７３３は、本発明者らによりラット大脳からＰＳＤ分画に濃縮している蛋白質として同定された。本発明において、その一次構造を決定し、機能解析を行った。その結果、ＭＳ７３３は８４７アミノ酸からなるＮ末端に３つのＬＩＭドメインを有し、１つのＰＥＴドメインを有する蛋白質であることが判明した。さらにデータベースサーチの結果から、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｐｒｉｃｋｌｅ蛋白質と高い相同性を示すことが判明した。そこで、本発明のＭＳ７３３蛋白質を哺乳動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ）ｐｒｉｃｋｌｅ（ｍＰｒｉｃｋｌｅ）と命名した。以下、特に配列番号：１記載のアミノ酸配列を有するラット由来の蛋白質をＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅと呼ぶ。本発明において作成したｍＰｒｉｃｋｌｅに対する抗体を用いた解析により、ｍＰｒｉｃｋｌｅが生化学的にＰＳＤ分画に濃縮し、細胞骨格に強く結合していることが明らかとなった。さらに、ラット海馬初代神経細胞を用いた解析からは、ｍＰｒｉｃｋｌｅの局在が、シナプトフィジン、ＰＳＤ−９５、ＧＡＤ等と一致した。これらの結果から、ｍＰｒｉｃｋｌｅは新規のシナプス蛋白質であることが判明した。
さらに研究を進めたところ、ｍＰｒｉｃｋｌｅに対する抗体を用いて生体内のｍＰｒｉｃｋｌｅを沈澱させると神経伝達物質であるＮＭＤＡ受容体と一緒に沈澱することがわかった。ＮＭＤＡ受容体は、学習及び記憶に関与しており、精神疾患等において重要な役割を果たしていることが知られている（Ｊ．Ｚ．Ｔｓｉｅｎ（１９９９）″Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．″，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：６３−９）。また、ｍＰｒｉｃｋｌｅはＰＳＤ蛋白質であるＰＳＤ−９５と結合することが、本発明者らにより明らかにされた。ＰＳＤ−９５は、シナプスの成熟、学習、及び記憶の細胞レベルにおけるモデルとして考えられている長期増強（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ＬＴＰ）の発現において重要な役割を果たしていることが明らかにされている（ＥＩ−Ｈｕｓｓｅｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）″ＰＳＤ−９５  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．″，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１３６４−８；Ｍｉｇａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）″Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ−９５  ｐｒｏｔｅｉｎ″，Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：４３３−９）。従って、本発明のｍＰｒｉｃｋｌｅをドラッグデリバリーの標的とすることにより、記憶と密接に関与するＰＳＤ−９５及びＮＭＤＡレセプター等を間接的なターゲットとすることができると考えられる。
より具体的には、本発明は
［１］哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ蛋白質をコードする（１）〜（４）の核酸配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド、
（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（２）配列番号：２の核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（３）配列番号：１のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列
（４）上記（２）の配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列
［２］［１］記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
［３］［１］記載のポリヌクレオチドまたは［２］記載のベクターを含む宿主細胞、
［４］［１］記載のポリヌクレオチドを翻訳する工程を含む、該ポリヌクレオチドによりコードされる哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ蛋白質を製造する方法、
［５］［１］記載のポリヌクレオチドによリコードされるポリペプチドの断片であり、少なくとも８アミノ酸残基を有するポリペプチド断片、
［６］［１］記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または［５］記載のポリペプチド断片に対する抗体、並びに
［７］［５］記載のポリペプチド断片をコードするヌクレオチド鎖、
に関する。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質を遺伝子工学的に発現させる際に使用することができる。ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質は、本発明においてシナプスに局在することが確認され、シナプスのマーカーとして使用することができる。即ち、本発明のｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質をコードするポリヌクレオチド、またはその一部の特異的断片を使用して、ｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子の発現を検出することによりシナプスを検出することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、シナプス検出試薬として用いることもできる。また、骨格蛋白質として知られるＰＳＤ−９５と結合することが示され、ＰＳＤ−９５の精製に利用することもできる。さらに、ｍＰｒｉｃｋｌｅに対する抗体を用いてｍＰｒｉｃｋｌｅを生体内より沈澱させるとＮＭＤＡ受容体も一緒に沈澱されることから、ＮＭＤＡ受容体を標的としたドラッグデリバリーシステムにおいてｍＰｒｉｃｋｌｅを利用することができる。ＮＭＤＡ受容体は、学習及び記憶と密接に関連し、精神疾患との関係も指摘されていることから、将来的には、ｍＰｒｉｃｋｌｅを利用したボケ、痴呆等の学習・記憶に関連した疾患の診断も可能と考えられる。本発明のポリヌクレオチドは、ｍＰｒｉｃｋｌｅをコードする、配列番号：２の核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列を含むものである。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。また、天然以外の塩基、例えば、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−０−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−０−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−０−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルリオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステル、ウリジン−５オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−０−メチル−５−メチルウリジン、２’−０−メチルウリジン、ワイブトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン等を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質をコードする、配列番号：１記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列を含む。このようなアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号：２に記載された核酸配列に加えて、遺伝子暗号の縮重により配列番号：２記載の配列とは異なる核酸配列を含むものである。本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリペプチドを発現させるのに用いる場合、使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：４３−７４）。
本発明のポリヌクレオチドは、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質、またはその抗原性断片をコードする、配列番号：１のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配列、または該核酸配列に相補的な配列を含む。１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドにおいても、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−５００；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６４０９−１３）。
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、蛋白質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸（Ａｌａ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ）、非荷電性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｙｒ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，．Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ）、中性アミノ酸（Ａｌａ，Ａｓｎ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｇｌｙ）、分枝アミノ酸（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｖａｌ）、ヒドロキシアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、含硫アミノ酸（Ｃｙｓ，Ｍｅｔ）、芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、複素環式アミノ酸（Ｈｉｓ，Ｔｒｐ）、イミノ酸（Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ）等に分類することができる。中でも、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間、Ｓｅｒ及びＴｈｒの間、Ａｓｐ及びＧｌｕの間、Ａｓｎ及びＧｌｎの間、Ｌｙｓ及びＡｒｇの間、Ｐｈｅ及びＴｙｒの間の置換は、蛋白質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸がｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質の抗原性を有していれば良い。
このような配列番号：１のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ８．１−８．５）、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２：２７１−５、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−９２、Ｋｒａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−６７、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５：２７６３−６等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質、またはその抗原性断片をコードする、配列番号：２の核酸配列または該核酸配列に相補的な配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、を含むポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドとしては、アイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、及びアレリック変異体が考えられ、本発明のポリヌクレオチドに含まれる。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：２を含む核酸配列からなるポリヌクレオチド、またはその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの作成方法については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
より具体的に、ｃＤＮＡライブラリーの作製においては、まず、本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−９）等の公知の手法により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を用いてｍＲＮＡを精製する。ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のような、直接ｍＲＮＡを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）のようなｃＤＮＡ合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、ｃＤＮＡはＰＣＲを利用した５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２９１９−３２）により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いｃＤＮＡライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｓｕｇａｎｏ（１９９４）Ｇｅｎｅ  １３８：１７１−４；Ｓｕｚｕｋｉ（１９９７）Ｇｅｎｅ  ２００：１４９−５６）等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたｃＤＮＡは、適当なベクター中に組み込む。
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の実施例において得られたラットＰｒｉｃｋｌｅのアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、『ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号：２を含む核酸配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％（例えば、９５％以上、さらには９９％）の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−８；Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはＢＬＡＳＴＸ、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ，ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．等を参照することができる。本発明の哺乳動物Ｐｒｉｃｋｌｅ遺伝子がコードする蛋白質とＤ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸レベルでの相同性は、約２３％であった。
その他、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４）により、ｍＰｒｉｃｋｌｅのアイソフォームやアレリック変異体等、ｍＰｒｉｃｋｌｅと類似した構造及び機能を有する遺伝子を、配列番号：２に記載の核酸配列を基にプライマーを設計し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の動物のｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）等により行うことができる。また、適当なＤＮＡシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
＜ヌクレオチド鎖＞
さらに、本発明により、本発明のポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも１５塩基からなるヌクレオチド鎖が提供される。ここで「相補的な配列」とは、ヌクレオチド配列中の少なくとも１５個の連続した塩基が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９７％または９９％）が対になっているものも含む。対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のＡに対しＴ（ＲＮＡの場合はＵ）、ＴまたはＵに対しＡ、Ｃに対しＧ、そしてＧに対対しＣが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして相同性は、上述のハイブリダイズするポリヌクレオチドの場合と同様の方法で決定することができる。
このような本発明のヌクレオチド鎖は、本発明のポリヌクレオチドを検出または単離するためのプローブ、増幅するためのプライマーとして利用することができる。通常、プライマーとして使用する場合には１５〜１００、好ましくは１５〜３５個の塩基より構成されていることが望ましく、プライマーとして使用する場合には、少なくとも１５、好ましくは３０個の塩基より構成されていることが望ましい。プライマーの場合には、３’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的な配列に、５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。本発明のヌクレオチド鎖は、本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができる。さらに、これらのプローブまたはプライマーを用いて、細胞内における本発明のポリヌクレオチドの変異を検出することができる。このような変異は、場合により本発明のポリペプチドの活性、または発現の異常を引き起こすものであることから、疾病の診断等に有用と考えられる。
また、本発明のヌクレオチド鎖には、本発明のポリヌクレオチドの細胞内における発現をｍＲＮＡまたはＤＮＡに対して結合することにより抑制するアンチセンス核酸、及び、ｍＲＮＡを特異的に開裂することにより阻止するリボザイムが含まれる。
アンチセンスによる標的遺伝子の発現抑制作用の機構としては、（１）３重鎖形成による転写開始阻害、（２）ＲＮＡポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部位とのハイブリッド形成による転写抑制、（３）合成中のＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、（４）イントロン−エキソン接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（５）スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（６）ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による、ｍＲＮＡの細胞質への移行抑制、（７）キャッピング部位またはポリＡ付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、（８）翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、（９）リボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、（１０）ｍＲＮＡ翻訳領域またはポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長抑制、並びに（１１）核酸と蛋白質の相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制が挙げられる（平島及び井上『新生化学実験講座２  核酸ＩＶ  遺伝子の複製と発現』日本生化学会編、東京化学同人、ｐｐ．３１９−３４７（１９９３））。
本発明のヌクレオチド鎖に含まれるアンチセンス核酸は、上述の（１）〜（１１）のどの機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよく、即ち、発現を阻害する目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配列を含むものであってもよい。アンチセンス核酸をコードするＤＮＡは、その発現を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。アンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要はなく、効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。このようなアンチセンス核酸としは、少なくとも１５ｂｐ以上、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上であり通常３０００ｂｐ以内、好ましくは２０００ｂｐ以内、より好ましくは１０００ｂｐ以内の鎖長を有し、標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である。このようなアンチセンス核酸は、本発明のポリヌクレオチドを基に、ホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−２１）等により調製することができる。
リボザイムとは、ＲＮＡを構成成分とする触媒の総称であり、大きくラージリボザイム（ｌａｒｇｅ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）及びスモールリボザイム（ｓｍａｌｌ  ｌｉｂｏｚｙｍｅ）に分類される。ラージリボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断し、反応後に５’−リン酸と３’−ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。ラージリボザイムは、さらに（１）グアノシンによる５’−スプライス部位でのトランスエステル化反応を行うグループＩイントロンＲＮＡ、（２）自己スプライシングをラリアット構造を経る二段階反応で行うグループＩＩイントロンＲＮＡ、及び（３）加水分解反応によるｔＲＮＡ前駆体を５’側で切断するリボヌクレアーゼＰのＲＮＡ成分に分類される。それに対して、スモールリボザイムは、比較的小さな構造単位（４０ｂｐ程度）であり、ＲＮＡを切断して、５’−ヒドロキシル基と２’−３’環状リン酸を生じさせる。スモールリボザイムには、ハンマーヘッド型（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）、ヘアピン型（Ｂｕｚａｙａｎ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４９；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物３０：１１２）等のリボザイムが含まれる。リボザイムは、改変及び合成が容易になため多様な改良方法が公知であり、例えば、リボザイムの基質結合部を標的部位の近くのＲＮＡ配列と相補的となるように設計することにより、標的ＲＮＡ中の塩基配列ＵＣ、ＵＵまたはＵＡを認識して切断するハンマーヘッド型リボザイムを作ることができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２８：２２５；小泉誠及び大塚栄子（１９９０）蛋白質核酸酵素３５：２１９１；Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７０５９）。ヘアピン型のリボザイムについても、公知の方法に従って設計、製造が可能である（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：６７５１；菊地洋（１９９２）化学と生物３０：１１２）。
本発明のヌクレオチド鎖に含まれるアンチセンス核酸及びリボザイムは、細胞内における遺伝子の発現を制御するために、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルス由来のベクター、リポソーム等を利用した非ウイルスベクター、またはｎａｋｅｄ  ＤＮＡとしてｅｘ  ｖｉｖｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法により遺伝子治療に用いることもできる。
本発明のヌクレオチド鎖の塩基配列の確認は、上述のポリヌクレオチドと同様の方法により行うことができる。
＜ベクター＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞内に保持したり、該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを発現させたりするのに有用である。本ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、クローニング用ベクター、発現ベクター等の種々のベクターが含まれる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７））。好ましい態様においては、ベクターを導入した宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドが発現されるように制御配列下に結合する。ここで「制御配列」とは、宿主細胞が原核生物であればプロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含み、真核生物の場合は、プロモーター及びターミネーターであり、場合によってトランスアクチベーター、転写因子、転写物を安定化するポリＡシグナル、スプライシング及びポリアデニル化シグナル等が含まれる。このような制御配列は、それに連結されたポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての構成成分を含むものである。また、本発明のベクターは、好ましくは選択可能なマーカーを含む。さらに、細胞内で発現されたポリペプチドを小胞体内腔、グラム陰性菌を宿主とする場合ペリプラズム内、または細胞外へと移行させるために必要とされるシグナルペプチドを目的のポリペプチドに付加するようにして発現ベクターへ組み込むこともできる。さらに、必要に応じリンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）の挿入を行ってもよい。
本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは、目的とする宿主細胞内で発現ベクター中にコードされるポリペプチドを発現させることができる構築物を指す。クローニングベクター、バイナリーベクター、インテグレイティングベクター等が本発明の発現ベクターに含まれる。発現の過程には、発現ベクター中のコード配列の翻訳可能なｍＲＮＡへの転写、及びｍＲＮＡから本発明のポリペプチドへの翻訳、さらに場合によっては発現されたポリペプチドの小胞体内腔、ペリプラズムまたは細胞外への分泌が含まれる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるポリペプチドの発現を可能にするベクターとしては、ｐＢＥＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を例示することができる。また、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞宿主における発現を可能にするプロモーターとしてはＰＬ、ａｒａＢ（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−３）、ｌａｃＺ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−６；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６：２４２２−７）、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃとｔｒｐの融合）等のプロモーターが挙げられる。また、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来ターミネーターが、利用可能である。さらに、大腸菌用のベクターは、好ましくはベクターを宿主内で増幅するための「ｏｒｉ」、及び形質転換された宿主を選抜するためのマーカー遺伝子を持つ。アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、及びクロラムフェニコール等の薬剤により宿主の判別を行うことを可能にする薬剤耐性遺伝子の使用が好ましい。特に、ポリペプチドをペリプラズムへ分泌させることを目的とする場合、ｐｅＩＢシグナル配列（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９）を使用することができる。例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＧＦＰ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；この場合の宿主はＴ７ポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）等のベクターを挙げることができる。また、特にサブクローニングまたは切出し用のベクターとしては、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７等を例示できる。
大腸菌以外の細菌宿主用としては、バチルス属のものが挙げられ、ｐＵＢ１１０系、ｐｃ１９４系のベクターが例示される。より具体的に、枯草菌由来のｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０等を挙げることができる。その他、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ等のシュードモナス属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ等のブレビバクテリウム属（ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ  ３９：２８１（１９８５））等）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等のコリネバクテリウム属（ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６：１７５（１９８４））等）、ストレプトコッカス属（ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６：２３９（１９８５））、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５０：９４（１９８５））等）、ラクトバチルス属（ｐＡＭβ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｉｏｌ．１３７：６１４（１９７９））等）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ等のロドコッカス属（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：１００３（１９９２））、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｅ等のストレプトマイセス属（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８５）参照；ｐＩＪ４８６（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−７８（１９８６））、ｐＫＣ１０６４（Ｇｅｎｅ  １０３：９７−９（１９９１））、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Ｇｅｎｅ  １６５：１４９−５０（１９９５）））の細菌を宿主とするベクター系が開発されている。微生物を宿主として利用できるベクターについては、『微生物学基礎講座８  遺伝子工学』（共立出版）等の文献を参照することができる。ベクターを細菌宿主へ導入するための手法としては、塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｈｉｇａ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５８−６２；Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−８０）、エレクトポレーション法等を採用することができる。
また、真核細胞宿主での発現を可能にする調節要素は、酵母を宿主とする場合には、ＡＯＸ１及びＧＡＬ１プロモーターが例示される。酵母由来の発現ベクターとしては、Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１等が例示できる。酵母で利用可能なベクターに関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．４３：７５−１０２（１９９０）、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−８８（１９９２）等に詳述されている。より具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のサッカロマイセス属では、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、及びＹＩｐ系ベクターが利用可能である。特に、多コピーの遺伝子導入が可能であり、安定に遺伝子を保持できるインテグレーションベクター（ＥＰ５３７４５６等）が有用である。その他、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ等のクルイベロマイセス属では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来２μｍ系ベクター、ｐＫＤ１系ベクター（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５：３８２−９０（１９８１））、ｐＧＫ１１由来ベクター、クライベロマイセス自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系ベクター等、シゾサッカロマイセス属では、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：８０（１９８６）に記載のベクター、ｐＡＵＲ２２４（宝酒造）、チゴサッカロマイセスではｐＳＢ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４２６７（１９８５））由来ベクター、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等のピキア属ではＹｅａｓｔ  ７：４３１−４３（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３８５９（１９８７）等の文献記載のベクター、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ等のキャンディダ属では、特開平８−１７３１７０号公報記載のベクター、またＣ．ｍａｌｔｏｓａ由来のＡＲＳ（Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：１５８７（１９８７））を利用したベクター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス属では、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：２８３−７（１９８９）記載のベクター、トリコデルマ属では菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：５９６−６０３（１９８９））を利用したベクターが利用できる。
哺乳動物及びその他の動物細胞を宿主とする場合には、アデノウイルスｌａｔｅプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００）、ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙプロモーター（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３３６５−９）、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２１７−２３）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６）、ＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８）、ＳＶ４０  ｅａｒｌｙプロモーター（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｖｏｌ．３，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）ｐｐ．８３−１４１）、ＳＶ４０  ｌａｔｅプロモーター（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３８５−９４）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）−ＬＴＲプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６８４−７０４）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、及びグロビンイントロン等を使用することができる。さらに、ネオマイシン、Ｇ４１８等の薬剤による判別を可能とする薬剤耐性遺伝子がベクターに含まれていることが好ましい。そして、細胞内で遺伝子のコピー数の増加を計る場合には、例えば核酸合成経路を欠損したＣＨＯを宿主とし、その欠損を補うＤＨＦＲ遺伝子を有するｐＣＨＯＩ等のベクターを採用し、メトトレキセート（ＭＴＸ）によりコピー数を増幅させることができる。一方、遺伝子の一過性発現のためには、ＳＶ４０のＴ抗原遺伝子を染色体上に有するＣＯＳ細胞を宿主とし、ｐｃＤ等のＳＶ４０の複製起点、またはアデノウイルス、ウシパピーローマウイルス（ＢＰＶ）、ポリオーマウイルス等の複製開始点を持つベクターを使用することができる。さらに、遺伝子コピー数の増幅のための選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）等をコードする遺伝子を含んでもよい。適当なベクターとして、例えば、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０−２（１９８７））、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４（１９８１））、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２（１９９０））、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、��ＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３、ｐＭＥ１８Ｓ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−７２（１９８８））等が公知である。
特に動物の生体内において本発明のポリヌクレオチドを発現させるためには、ｐＡｄｅｘｌｃｗ等のアデノウイルスベクター、ｐＺＩＰｎｅｏ等のレトロウイルスベクターが挙げられる。ベクターはアデノウイルス法、エレクトポレーション（電気穿孔）法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１３３（１９９０））、カチオニックリポソーム法（カチオニックリポソームＤＯＴＡＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等）、正電荷ポリマーによる導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）法、パーティクルガンを用いる方法、リポソーム法、リポフェクション（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３（１９８７））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、レセプター介在遺伝子導入法、レトロウイルス法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス−リポソーム法（別冊実験医学『遺伝子治療の基礎技術』羊土社（１９９７）；別冊実験医学『遺伝子導入＆発現解析実験法』羊土社（１９９７）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：１４５８−６４（１９９４）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：１２１２−２０（１９９６）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０：１４４０−８（１９９３）；実験医学１２：１８２２−６（１９９４）；蛋白質核酸酵素４２：１８０６−１３（１９９７）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２（Ｓｕｐｐｌ．  ＩＩ）：４７９−８２（１９９５））、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法等により宿主に導入することができる。アデノウイルス及びレトロウイルス以外由来のウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、トガウイルス、パラミクソウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス等を元に作製されたベクターを利用することもできる。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法でもｉｎ  ｖｉｖｏ法で行ってもよい。
その他、昆虫発現システムも異種ポリペプチドを発現させる系として知られており、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ核ポリヘドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとし、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅ細胞中で外来遺伝子を発現させることができる。この際、目的とする外来遺伝子は、ウイルスの非必須領域にクローニングする。例えば、ポリヘドリンプロモーター制御下に連結してもよい。この場合、ポリヘドリン遺伝子は不活化され、コート蛋白質を欠く組換えウイルスが産生され、該ウイルスに感染したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅ等の細胞中で目的とするポリペプチドが発現される（Ｓｍｉｔｈ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３２２４−７）。その他、昆虫細胞由来の発現ベクターとして、Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｇｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８等も公知である。
植物細胞を宿主とする場合には、例えばカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等を利用したベクターが使用可能である。植物細胞へのベクターの導入法としては、ＰＥＧ法、エレクトポーレション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等が公知である。
ベクターへのＤＮＡの挿入は、制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ５．６１−５．６３）。
＜宿主＞
本発明により、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主が提供される。本発明のポリペプチドの製造には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの産生系が考えられる。本発明の宿主には、古細菌、細菌、真菌類、植物、昆虫、魚類、両生類、ハ虫類、鳥類、哺乳類由来の原核及び真核細胞が含まれる。本発明の宿主は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に含むものである。該ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム上の天然に存在する位置になければよく、該ポリヌクレオチド自身のプロモーター支配下にあっても、ゲノム中に組み込まれていても、染色体外の構造として保持されていても良い。
細菌宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９，ＤＨ５α，ＨＢ１０１，ＸＬ１Ｂｌｕｅ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等、エシェリシア属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、セラチア属、バシルス属等に属するのグラム陽性及びグラム陰性細菌を例示することができる。
真核宿主には、酵母等の真菌類、高等植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来細胞）、昆虫（ドロソフィラＳ２、スポロドプテラＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５）、魚類、両生類（アフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：３５８−４０））、ハ虫類、鳥類、哺乳類（ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１０８：９４５（１９９５）；中でもＤＨＦＲ遺伝子欠損ｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０（１９８０））及びＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６０：１２７５（１９６８））が好適である）、ＣＯＳ、Ｈｅｌａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）、ミエローマ、Ｖｅｒｏ、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ  ＫＪＭ−１、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９号公報）、植物（ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ダイズ、トマト、コムギ、オオムギ、ライ麦、アルファルファ、亜麻等）等の細胞が含まれる。真菌類としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ属等の酵母に加えて、糸状菌のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ等の細胞を宿主とした発現系も公知である。
宿主細胞へのベクターの導入は、エレクトポレーション法（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−２６）、カチオニックリポソーム法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１−９．９）、微小ガラス管を使用した直接注入法、マイクロインジェクション法、リポフェクション（Ｄｅｒｉｊａｒｄ（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７：１０２５−３７；Ｌａｍｂ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：２２−３０；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：２３０−４）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５−５２）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：５７０７−１７；Ｓｕｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１６４２−３）、ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）等により行い得る。
＜ポリペプチド断片＞
本発明の「ポリペプチド断片」は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの断片のペプチド重合体である。配列番号：１記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部と同一であり、少なくとも８アミノ酸残基以上（例えば、８、１０、１２、または１５アミノ酸残基以上）からなるポリペプチド断片である。特に好ましい断片としては、アミノ末端、カルボキシル末端、膜貫通ドメインを欠失したポリペプチド断片を挙げることができる。αヘリックス及びαヘリックス形成領域、α両親媒性領域、βシート及びβシート形成領域、β両親媒性領域、基質結合領域、高抗原指数領域、コイル及びコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、ターン及びターン形成領域、並びに表面形成領域を含む断片が本発明のポリペプチド断片に含まれる。本発明のポリペプチド断片は、本発明のポリペプチドの抗原性さえ有すればどのような断片であってもよい。ポリペプチドの抗原決定部位は、蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性を解析する方法（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−２２）、二次構造を解析する方法（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ（１９７８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４７：２５１−７６）により推定し、さらにコンピュータープログラム（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−６（１９８５））、または短いペプチドを合成しその抗原性を確認するＰＥＰＳＣＡＮ法（特表昭６０−５００６８４号公報）等により確認することができる。
本発明のポリペプチド断片を構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、ＧＰＩアンカー形成、架橋、γ−カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、シスチンの形成、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、蛋白質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメ−ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ＡＤＰ−リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。さらに、本発明のポリペプチドにはシグナルペプチド部分がついた前駆体、シグナルペプチド部分を欠く成熟蛋白質、及びその他のペプチド配列により修飾された融合蛋白質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、サブスタンスＰ、多重ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ等）、プロテインＣ断片、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、免疫グロブリン定常領域、α−チューブリン断片、β−ガラクトシダーゼ、Ｂ−タグ、ｃ−ｍｙｃ断片、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｈｃｎｏｌ．６：１２０４−１０）、ｌｃｋタグ、ｐ１８  ＨＩＶ断片、ＨＳＶ−タグ（ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質）、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、Ｔ７−タグ（Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質）、ＶＳＶ−ＧＰ断片（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質）等の蛋白質の精製を容易にする配列（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のようなベクターを利用できる）、組換え技術により蛋白質を生産する際に安定性を付与する配列等を選択することができる。
本発明のポリペプチド断片は公知の遺伝子組換え技術により、また化学的な合成法により製造することができる。遺伝子組換え技術により本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片を製造する場合、製造される蛋白質は、選択する宿主の種類によってグリコシル化を受ける場合と受けない場合、さらに分子量、等電点等が異なる場合がある。通常、大腸菌等の原核細胞を宿主としてポリペプチドを発現させた場合、得られるポリペプチドは本来ポリペプチドが有していたＮ−末端にメチオニン残基が付加された形で産生される。このような宿主の違いにより、構造の異なるポリペプチドも本発明のポリペプチドに含まれる。
＜ポリペプチドの製造＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでポリペプチドまたはポリペプチド断片を製造する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスレーション（Ｄａｓｓｏ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３１２９−４４）等の方法に従って、細胞を含まない試験管内の系でポリペプチドを製造することができる。それに対して、細胞を用いてポリペプチドを製造する場合、まず、上述の中から適当な宿主細胞を選択し、目的とするＤＮＡによる形質転換を行う。続いて形質転換された細胞を培養することにより所望のポリペプチドを得ることができる。培養は、選択した細胞に適した公知の方法により行う。例えば、動物細胞を選択した場合には、ＤＭＥＭ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８：３９６（１９５９））、ＭＥＭ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２２：５０１（１９５２））、ＲＰＭＩ１６４０（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９：５１９（１９６７））、１９９（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３：１（１９５０））、ＩＭＤＭ等の培地を用い、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加し、ｐＨ約６〜８、３０〜４０℃において１５〜２００時間前後の培養を行うことができる。その他、必要に応じ途中で培地の交換を行ったり、通気及び攪拌を行ったりすることができる。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるポリペプチドの生産系を確立するためには、動物または植物へ目的とするＤＮＡを導入し、生体内においてポリペプチドを産生させる。ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等の哺乳動物、カイコ等の昆虫（Ｓｕｓｕｍｕ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：５９２−４）等の動物系が公知である（Ｌｕｂｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．４：１−５４）。また、哺乳動物系においてトランスジェニック動物を用いることもできる。
例えば、所望のポリペプチドをヤギの乳汁中に分泌させることを目的とする場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡをβカゼイン等の乳汁中に特異的分泌される蛋白質をコードするＤＮＡと結合し、目的ポリペプチドを融合蛋白質として発現させるようにする。次に、融合蛋白質をコードするＤＮＡをヤギの胚へ導入する。ＤＮＡを導入した胚を雌ヤギの子宮へ移植する。このヤギから生まれるトランスジェニックヤギ、またはその子孫は乳汁中に所望のポリペプチドを分泌する。必要に応じ、乳汁量を増やすため、ホルモンを投与することもできる（Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：６９９−７０２）。
タバコ等の植物を用いたトランスジェニック植物のポリペプチド産生系が公知である。まず、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡをｐＭＯＮ５３０等の植物発現に適したベクターに組み込み、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ等の細菌に導入する。ＤＮＡの導入された細菌をＮｉｃｏｔｉｎａ  ｔａｂａｃｕｍ等の植物に感染させ、植物を再生させることにより、所望のポリペプチドを得られたトランスジェニック植物の葉より単離することができる（Ｊｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１３１−８）。その他の方法としては、ＰＥＧを用いプロトプラストへＤＮＡを導入して植物体を再生する方法（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ａｎｄ  Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ  ｅｄ．（１９９５）６６−７４；インド型イネ品種に適する）、電気パルスによりプロトプラストへＤＮＡを導入して植物体を再生する方法（Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−７；日本型イネに適する）、パーティクルガン法で植物細胞に直接ＤＮＡを導入し植物体を再生する方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−６２）、アグロバクテリウムを介し細胞にＤＮＡを導入し植物体を再生する方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−８２）等が確立されている。植物を再生する方法については、Ｔｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１５０３−７を参照することができる。
トランスジェニック植物が一度得られた後は、さらに該植物の種子、果実、塊茎、塊根、株、切穂、カルス、プロトプラスト等を材料として同じように本発明のポリペプチドを産生する植物宿主を繁殖させることができる。
通常、遺伝子組換え技術により製造された本発明のポリペプチドは、まず、ポリペプチドが細胞外に分泌される場合には培地を、特にトランスジェニック生物の場合には体液等を、細胞内に産生される場合には細胞を溶解して溶解物を回収する。そして、蛋白質の精製方法として公知の塩析、蒸留、各種クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ゲル濾過、限外濾過、再結晶、酸抽出、透析、免疫沈降、溶媒沈澱、溶媒抽出、硫安またはエタノール沈澱等を適宜組合せることにより所望のポリペプチドを精製する。クロマトグラフィーとしては、アニオンまたはカチオン交換等のイオン交換、アフィニティー、逆相、吸着、ゲル濾過、疎水性、ヒドロキシアパタイト、ホスホセルロース、レクチンクロマトグラフィー等が公知である（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、天然由来のポリペプチドを精製して取得してもよい。例えば、後述の本発明のポリペプチドに対する抗体、を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより精製することもできる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  １６．１−１６．１９）。また、ＧＳＴとの融合蛋白質とした場合にはグルタチオンカラムを、ヒスチジンタグを付加した融合蛋白質とした場合にはニッケルカラムを用いた精製法も利用できる。本発明のポリペプチドを融合蛋白質として製造した場合には、必要に応じて精製後にトロンビンまたはファクターＸａ等を使用して不要な部分を切断することもできる。さらに、必要に応じキモトリプシン、グルコシダーゼ、トリプシン、プロテインキナーゼ、リシルエンドペプチダーゼ等の酵素を用い得られたポリペプチドを修飾することも可能である。
本発明のポリペプチド断片は、上述の合成及び遺伝子工学的な手法に加えて、ペプチダーゼのような適当な酵素を用いて本発明のポリペプチドを切断して製造することもできる。
＜抗体＞
本発明により、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド断片に対する抗体が提供される。本発明の抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ｌａ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）２６９−３１５）、ヒト化抗体、多特異性抗体（ＬｅＤｏｕｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５８−６２；Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．７８：１１８−３２；Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １０５：１７６−２６０；Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：９４４−９）、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。さらに、本発明の抗体は必要に応じ、ＰＥＧ等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、ＧＳＴ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）等との融合蛋白質として製造され得、二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、本発明のポリペプチド若しくはその断片のうち短いものは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合して免疫原として用いてもよい。また、本発明のポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全（または不完全）フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片を所望によりアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より血清を得る。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を４〜２１日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２−１１．１３）を参照することができる。
モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６）に準じて行うことができる。ここで、適当なミエローマ細胞として特に、融合細胞を薬剤により選択することを可能にする細胞を挙げられる。このようなミエローマを用いた場合、融合されたハイブリドーマは、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液（ＨＡＴ培養液）で培養して選択する。次に、作成されたハイブリドーマの中から、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７）Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）を参照することもできる。
ハイブリドーマは、その他、最初にＥＢウイルスに感染させたヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞（Ｕ２６６等）と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法（特開昭６３−１７６８８号公報）によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる（ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９３−０２２２７；ＷＯ９４／０２６０２；ＷＯ９４／２５５８５；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９６／３４０９６；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６等）。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ（１９９０）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤ．，ＵＫ参照）。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞（感作リンパ球等）からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び、ヒト抗体由来フレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−９；Ｐｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−６；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：９９−１２１（１９９１））。
本発明の抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９６８−７６；Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：６５２−６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）１２１：６６３−９；Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３２−７参照）。
本発明の多特異性抗体には、二特異性抗体（ＢｓＡｂ）、ダイアボディ（Ｄｂ）等が含まれる。多特異性抗体は、（１）異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法（Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｌｌ．７８：１１８−３２）、（２）異なるモノクローナル交代を分泌するハイブリドーマを融合する方法（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−９）、（３）異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子（４種のＤＮＡ）によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクションした後、二特異性の一価部分を単離する方法（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ（１９８６）Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０５：１７６−２６０；Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４３：９４４−９）等により作製することができる。一方、Ｄｂは遺伝子融合により構築され得る二価の２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−８；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１参照）。
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインＡ及びＧを用いて行う他、＜ポリペプチドの製造＞の項で詳細に記載した蛋白質精製技術によっても行い得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインＡを利用する場合、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等のプロテインＡカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等により決定することができる。
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等により測定することができる。ＥＬＩＳＡ法による測定の場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いで本発明のポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産性細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートのインキュベーションを行う。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体がアルカリフォスファターゼで標識されている場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の市販の系を使用することもできる。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド及びその断片の精製に使用することができる。また、ＮＭＤＡ受容体を標的としたドラッグデリバリーシステムにおいて利用することもできる。さらに、本発明においてｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質がシナプスに局在することが確認されたことから、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質をシナプスのマーカーとして、本発明の抗体を用いた検出を行うこともできる。従って、本発明の抗体は、必要に応じシナプス検出試薬として用いることができる。
＜ｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子の発現領域解析＞
本発明によりｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子の発現制御領域が提供される。本発明の発現制御領域は、本発明のポリヌクレオチドを利用してゲノムＤＮＡから公知の方法によってクローニングすることができる。例えば、Ｓ１マッピング法のような転写開始点の特定方法（細胞工学  別冊８  新細胞工学実験プロトコール，東京大学医科学研究所制癌研究部編，秀潤社（１９９３）ｐｐ．３６２−３７４）が公知であり、本発明において利用できる。一般に、遺伝子の発現制御領域は、遺伝子の５’末端の１５〜１００ｂｐ、好ましくは３０〜５０ｂｐをプローブＤＮＡとして利用して、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローニングすることができる（本発明においては、配列番号：２の塩基全部またはその１部）。このようにして得られるクローンは、１０ｋｂｐ以上の５’非翻訳領域を含むものであるので、次にエキソヌクレアーゼ等により処理し短縮化または断片化する。最後に、短縮された発現制御領域の候補を含む配列部分をレポーター遺伝子を利用して、その発現の有無、強さ、制御等について評価し、本発明のｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子の発現制御領域の活性維持のための最小必要単位を決定することができる。
遺伝子の発現制御領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ等のプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ．／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ．ｈｔｍｌ；Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９６  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ  ｅｄ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ，（１９９６））を用いて予測することもできる。さらに、発現制御領域の活性最小単位を予測するプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｃｉ．ｃｂｓ．ｕｍｎ．ｅｄｕ．／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｏｓｃａｎ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ．ｈｔｍ；Ｐｒｅｓｔｒｉｄｇｅ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：９２３−３２）も公知であり、本発明において用いることができる。
このようにして単離された、ｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子の発現制御領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏでシナプス後膜肥厚特異的に所望の蛋白質を産生するのに利用することもできる。
＜リガンドの同定＞
本発明により、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質に対するリガンドが提供される。ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質はＬＩＭドメイン及びＰＥＴドメインを有することから、天然において核酸と結合する機能を有すると考えられる。そして、骨格蛋白質として知られるＰＳＤ−９５と結合し、また、ＮＭＤＡ受容体とも関与していると予測された。従って、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質に対するアゴニストやアンタゴニスト等の機能を示す可能性があるリガンドは、学習や記憶に関与する神経細胞の形態変化、神経可塑性等の神経系の機能を制御するのに利用できる可能性がある。ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質に対するリガンドの同定においては、まず、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質と候補化合物とを接触させ、結合の有無を検定する。この際、ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質を担体に固定したり、細胞膜に埋めこまれた状態に発現させたりして用いることもできる。候補化合物としては特に制限はなく、遺伝子ライブラリーの発現産物、海洋生物由来の天然成分、各種細胞の抽出物、公知化合物及びペプチド、植物由来の天然成分、生体組織抽出物、微生物の培養上清、並びにファージディスプレイ法等によりランダムに製造されたペプチド群（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−１０（１９９１））等が含まれる。特に、海馬を界面活性剤により処理して得た抽出物等を候補化合物として使用すれば、生体内においてＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質と相互作用している物質を同定することが可能となる。さらに、結合の検出を容易にするために、候補化合物は標識しても良い。
【図面の簡単な説明】  図１は、可溶化前の分画、並びに可溶化後の上清及び沈澱に対してＮＭＤＡＲ、ＰＳＤ−９５、ｈｏｍｅｒ１ｂ／ｃ及びＭＡＰＫ抗体を用いてウェスタン・ブロットを行った結果を示す写真である。
図２は、本発明のＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸配列とＤ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸配列レベルでの比較を示す図である。
図３は、図２の続きを示す図である。
図４は、Ｐｒｉｃｋｌｅファミリー間でのドメイン構造を比較する模式図である。斜線部はＰＥＴドメインを、黒塗りの部分はＬＩＭドメインを、点の部分は質量分析により同定した領域を示す。Ｈｓ：ヒト、ＸＰ：アフリカツメガエル、Ｄ：ショウジョウバエ、Ｃｉ：カタユウレイボヤ。
図５は、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅのラットの各組織における組織分布を示す写真である。
図６は、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅのラット脳における細胞内分布を示す写真である。Ｈ：ホモジネート、ＳＰＭ：シナプス原形質膜、ＰＳＤ−Ｓ１：０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００可溶性ＳＰＭ、ＰＳＤ−Ｐ１：０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００不溶性ＳＰＭ、ＰＳＤ−Ｓ２：１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００可溶性ＳＰＭ、ＰＳＤ−Ｐ２：１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００不溶性ＳＰＭ。
図７は、各種界面活性剤によるＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅの可溶化を調べた結果を示す写真である。Ｐ：ペレット、Ｓ：上清、Ｔｒｉｔｏｎ：ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＤＯＣ：デオキシコール酸ナトリウム。
図８は、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅの各発生段階におけるラット大脳における発現を示す写真である。
図９は、ラット胎児海馬初代培養におけるＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅの局在を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明についてより詳細に検討するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。
［実施例１］  ＰＳＤ分画の調製方法
雌ラット（日本セスエルシー株式会社）の大脳よりＰＳＤ分画を、Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）″Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ．″Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．７：１８７−９７）に従って調製した。
［実施例２］  難溶性分子の濃縮・同定
ＰＳＤの骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）分子や膜蛋白質は、細胞骨格系の分子等と強く結合し、大きな複合体を形成しているために難溶性を示す。そこで、実施例１において得られたＰＳＤ画分に２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ  ３５５−２２ＣＰ）を加え、１９６，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し可溶性画分と不溶性画分に分離した。その後、可溶化処理前のＰＳＤ画分、並びに可溶化により得られた可溶性画分及び不溶性画分に対して、ＮＭＤＡ受容体、ＰＳＤ−９５、ｈｏｍｅｒ１ｂ／ｃ（樹状蛋白質；ＰＤＺ様結合ドメインを含有し、代謝型グルタミン酸誦様立位のＣ−末端に特異的に結合）、ＭＡＰ（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）キナーゼに対する抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ（Ｃ−２９）ＳＣ−１４６７；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐ４３５２０；Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ（Ｃ−１６）ＳＣ−８９２３；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅ１７１２０）を用いてウェスタン・ブロットを行った。その結果、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４不溶性画分に難溶性のＰＳＤ構成分子が濃縮していることが判明した（図１）。
［実施例３］  ＴｒｉｔｏｎＸ−１１１４不溶性画分の分離及び同定
実施例２のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４不溶性画分をさらに７Ｍ尿素と２Ｍチオ尿素を含む溶液で可溶化し、ＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と１Ｄ−ＰＡＧＥで分離した後、銀染色及びウェスタン・ブロットを行った。ウェスタンブロットには、ＰＳＤ−９５抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐ４３５２０）、ＧｌｕＲ２／３抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３９７）、Ｈｏｍｅｒ１ｂ／ｃ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ（Ｃ−１６）ＳＣ−８９２３）、アクチン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ１５０１）、チューブリン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＭＡＢ３８０）、ＮＭＤＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ（Ｃ−２９）ＳＣ−１４６７）を用いた。その結果、溶出画分の１７から２４のフラクションにＰＳＤ−９５とＨｏｍｅｒ１ｂ／ｃが含まれていたので、この画分をまとめ、１０％アクリルアミドゲルを用いた１Ｄ−ＰＡＧＥで分離した。ＰＡＧＥゲルを１〜２ｍｍ幅で切出し、トリプシン消化を行った後、ＬＣＱ（ｃｌａｓｓｉｃ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ社，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して質量分析による同定を行った。１７−２４画分に含まれていた分子を表１に示す。
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［実施例４］  ＭＳ７３３のホモロジーサーチ
実施例３において同定された機能が未知のＥＳＴクローン（ＭＳ７３３）（ＩＭＡＧＥ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）をプローブとして、対応する全長配列をクローニングした。ＭＳ７３３全長配列についての塩基配列を決定し（配列番号：２）、データベースサーチ（ＧｅｎＢａｎｋ；ｂｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈ）を行った。
その結果、ＭＳ７３３は、Ｄ−Ｐｒｉｃｋｌｅと約２３％の相同性を示した。そこで、本ＭＳ７３３蛋白質をラットｐｒｉｃｋｌｅ（Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅ）と命名した。Ｄ−ＰｒｉｃｋｌｅとＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸配列レベルを比較した結果を図２に示す。また、Ｄ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸配列を配列番号：３、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。本発明のＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅは８４７アミノ酸残基からなり、Ｎ末端に１つのＰＥＴドメイン、及び３つのＬＩＭドメインを有している（図２及び３）。このような構造は、Ｐｒｉｃｋｌｅファミリー間で良く保存されていた（図３）。
［実施例５］  Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅの組織分布
ラットの各組織のホモジェネート（２０μｇ蛋白質）に対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、抗Ｐｒｉｃｋｌｅ抗体を用いたウエスタンブロットを行った。
まず、雌ラット（日本セスエルシー株式会社）をジエチルエーテルで麻酔し、ＰＢＳ緩衝液を用い環流を行った。その後、各臓器を取出し、約１０倍量のＰＢＳ緩衝液を加え、テフロン（登録商標）ホモジナイザーでホモジェナイズした。ホモジェネートを８００×ｇ、１０分間遠心し、上清を各組織のホモジェネートとして使用した。
次に、ｍＰｒｉｃｋｌｅのアミノ酸３６５−６１８残基の部分をＧＳＴ融合蛋白質として発現させ、ウサギ抗血清を作成し、アフィニティー精製を行い抗Ｐｒｉｃｋｌｅ抗体としてウエスタンブロットに用いた。詳細な抗体の作成手順は、Ｏｈｔｓｕｋａらの方法（Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）″Ｃａｓｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＲＩＭ１  ａｎｄ  ｍｕｎｃ  １３−１．″Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８：５７７−９０）に従って行った。その結果、脳において２本のバンドが認められた（図４）。長時間感光させた場合、骨格筋にもシグナルが認められた。このことから、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅは脳に強く発現していることが示唆された。
［実施例６］  Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅびラット脳における細胞内分布
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ分画（１０μｇ蛋白質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、抗Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ分画の調製は、Ｏｈｔｓｕｋａらの方法（Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）″Ｃａｓｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＲＩＭ１  ａｎｄ  ｍｕｎｃ  １３−１．″Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８：５７７−９０）に従って行った。その結果、Ｒ−ＰｒｉｃｋｌｅはＮＭＤＡ受容体と同様にＰＳＤ分画に強く濃縮していた（図５）。
［実施例７］  Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅの可溶化
次に、両性（１％ＣＨＡＰＳ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ））、非イオン性（１％ＮＰ４０（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ））、及びイオン性（１％ＳＤＳ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）、１％ＤＯＣ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ））の界面活性剤を用いてＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅの可溶化を行った。Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅの調製は、Ｏｈｔｓｕｋａらの方法（Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）″Ｃａｓｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＲＩＭ１  ａｎｄ  ｍｕｎｃ  １３−１．″Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８：５７７−９０）に従って行った。その結果、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅは、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００ではほとんど可溶化されなかったのに対し、ＤＯＣで一部可溶化され、ＳＤＳではほぼ完全に可溶化された（図６）。従って、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅはシナプス結合の細胞骨格に強く結合していることが示唆された。
［実施例８］  Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅの各発生段階における発現
Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅのラット胎児Ｅ１８から出生後Ｐ７０までの発生段階におけるラット大脳のホモジネートをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。
ラット（日本セスエルシー株式会社）からの大脳ホモジネートの調製は、実施例５記載の方法に従って行った。その後、抗Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅは、Ｐ１４で発現がピークに達することが判った（図７）。
［実施例９］  初代培養神経細胞におけるＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅの局在
抗Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅ抗体を用いて、ラット胎児海馬初代培養におけるＲ−Ｐｒｉｃｋｌｅの局在を検討した。培養２８日目の細胞を固定し、シナプス前膜のマーカーであるシナプトフィジン、ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅのマーカーであるＢａｓｓｏｏｎ、シナプス後膜のマーカーであるＰＳＤ−９５との共染色を行った（Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）″Ｃａｓｔ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｍａｔｒｉｘ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＲＩＭ１  ａｎｄ  ｍｕｎｃ  １３−１．″Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５８：５７７−９０）（図８）。Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅとこれらのマーカーの局在はほぼ一致し、特にＰＳＤ−９５とよく一致していたことから、Ｒ−Ｐｒｉｃｋｌｅは、シナプス後膜に局在することが示唆された。
【産業上の利用可能性】本発明により、従来ＭＳ７３３として知られていたＰＳＤ画分に存在する蛋白質をコードする遺伝子、ｍＰｒｉｃｋｌｅ遺伝子が提供された。ｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質は、本発明においてシナプスに局在することが確認され、シナプスのマーカーとして使用することができる。また、骨格蛋白質として知られるＰＳＤ−９５と結合することが示され、ＰＳＤ−９５の精製に利用することもできる。さらに、ｍＰｒｉｃｋｌｅに対する抗体を用いてｍＰｒｉｃｋｌｅを生体内より沈澱させるとＮＭＤＡ受容体も一緒に沈澱されることから、ＮＭＤＡ受容体を標的としたドラッグデリバリーシステムにおいてｍＰｒｉｃｋｌｅを利用することができる。さらに、ＮＭＤＡ受容体は、学習及び記憶と密接に関連し、精神疾患との関係も指摘されている。従って、ＮＭＤＡ受容体との関与が明らかにされたｍＰｒｉｃｋｌｅ蛋白質または遺伝子を用いシナプスにおけるその発現・機能を検討することは、記憶、学習、神経の発達段階を知る上でも、また、神経変性疾患の機序を研究する上でも重要と思われる。そして、将来的には、ｍＰｒｉｃｋｌｅを利用したボケ、痴呆等の学習・記憶に関連した疾患の診断や治療も可能と考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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