(57)【要約】被検試料中の蛍光分子を検出する方法であって、以下のステップ：（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、及び（ｂ）前記測定された蛍光強度を比較するステップを含むことを特徴とする前記方法。
2004090517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の蛍光分子を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、及び
（ｂ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
被検試料中の測定対象物質を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、及び
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項３】
被検試料中の測定対象物質のタイプを判別する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
（ｄ）前記比較された強度比を用いて前記測定対象物質のタイプを判別するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項４】
前記複数種類の蛍光分子が、固有の蛍光寿命として０．０１以上〜１．０ｎｓ未満を持つグループ、１．０以上〜２．０ｎｓ未満を持つグループ、２．０以上〜３．０ｎｓ未満を持つグループ、３．０以上〜４．０ｎｓ未満を持つグループ、４．０以上〜５．０ｎｓ未満を持つグループ、５．０以上〜６．０ｎｓ未満を持つグループ及び６．０以上〜７．０ｎｓ以下を持つグループからなる群から選択される異なる３つ以上のグループの各グループに属する蛍光分子を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
蛍光寿命が互いに１．０ｎｓ以上異なる蛍光分子を３つ以上含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
蛍光寿命が互いに１．１倍以上異なる蛍光分子を３つ以上含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
蛍光寿命が３０ｎｓ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
蛍光分子の少なくとも１種が既知の濃度を有するものである請求項１記載の方法。
【請求項９】
測定対象物質の少なくとも１種が既知の濃度を有するものである請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
測定対象物質がプローブ又はターゲットである請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
プローブ又はターゲットが核酸である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
被検試料中の蛍光分子の解析方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000011
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｂ）前記関数を用いて蛍光強度を計算するステップ、
を含むことを特徴とする解析方法。
【請求項１３】
測定対象物質の解析方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000012
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｃ）前記関数を用いて蛍光強度を計算するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１４】
蛍光強度の計算が、係数Ａｉと蛍光寿命τｉとの積を計算するものである請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子の判別方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で被検試料中の遺伝子を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000013
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｃ）前記関数を用いて蛍光強度を計算することによって、当該蛍光分子の蛍光強度を検出するステップ、及び
（ｄ）前記蛍光強度を指標として遺伝子のタイプを判別するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
蛍光強度の計算が、係数Ａｉと蛍光寿命τｉとの積を計算するものである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種の蛍光分子の蛍光寿命が既知のものである請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子を含む、測定対象物質の検出用試薬又はキット。
【請求項１９】
被検試料中の蛍光分子を検出する装置であって、以下の手段：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定する手段、及び
（ｂ）前記測定された蛍光強度を比較する手段、
を含むことを特徴とする前記装置。
【請求項２０】
被検試料中の測定対象物質の定量装置であって、以下の手段：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識する手段、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定する手段、及び
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較する手段、
を含むことを特徴とする前記装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、試料中に存在する特定の蛍光分子の定量用試薬、定量方法、定量装置及びその解析方法に関する。
【背景技術】  被検試料中に存在する蛍光を標識した物質の濃度や混合比の測定は、近年主に蛍光分子の蛍光強度を計測することによって行われてきている。すなわち、濃度既知の蛍光分子（以下「参照蛍光分子」という）を被検試料中に入れ、検出の対象となる蛍光分子と参照蛍光分子との蛍光強度を比較することにより、濃度や混合比が未知の蛍光分子を定量することができる。こうした蛍光強度を利用する方法を適用すると、蛍光分子をプローブやターゲットとなる分子に標識し、その強度を比較することにより、ターゲットとなる遺伝子の発現量や一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）のタイプを判別することが可能であるため、ＤＮＡマイクロアレイ、タックマン法、インベーダー法として工業的に応用され、現在広く使われている。例えば、特表平８−５１０５６２号公報には、２種類の蛍光分子を用い、その蛍光強度を比較することによって、ＰＣＲによって増幅された核酸の量をモニターする検出方法が開示されている。
一方、蛍光分子に固有の蛍光寿命は、蛍光分子の周囲の環境や化学反応の度合いにあまり影響を受けないと考えられていたことから、これまで利用されることが少なかったが、近年可視光領域において高出力のレーザーやレーザーダイオードが開発され、また電子回路の処理速度が高速化し測定精度が向上したことから、バイオ分野にも積極的に使われるようになってきた。例えば、特開平６−６６８０２号公報には、光ルミネセンスエネルギーの移転がみかけの蛍光寿命に現れることを利用して、免疫反応の反応生成物の存在量を定量する発明が紹介されている。また、特表２００２−５４２４５３号公報には「生物学的系についての蛍光分析法」が示されており、供与体と受容体との間に起こる蛍光共鳴エネルギー転移によって蛍光の調節寿命および相寿命が変化することにより、受容体の内部成長度をモニターすることができる測定方法が記載されている。
【発明の開示】
現在普及している被検試料、特に核酸の定量あるいは同定は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などによって増幅された試料を、蛍光分子で標識し、その蛍光強度を検出することによって実施されている。しかしながら、被検試料の増幅や同定には、長い作業時間と高コストの試薬を必要とすることから、簡便で、低コストの検出方法が求められている。
本発明は、蛍光分子の検出方法、検出用試薬、定量装置及び解析方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、蛍光分子の蛍光寿命に着目し、蛍光強度の減衰を時間依存的に測定することにより、簡便かつ低コストで検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）被検試料中の蛍光分子を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、及び
（ｂ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
（２）被検試料中の測定対象物質を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、及び
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
（３）被検試料中の測定対象物質のタイプを判別する方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定するステップ、
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較するステップ、
（ｄ）前記比較された強度比を用いて前記測定対象物質のタイプを判別するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
（４）上記（１）〜（３）記載の方法において、複数種類の蛍光分子は、例えば固有の蛍光寿命として０．０１以上〜１．０ｎｓ未満を持つグループ、１．０以上〜２．０ｎｓ未満を持つグループ、２．０以上〜３．０ｎｓ未満を持つグループ、３．０以上〜４．０ｎｓ未満を持つグループ、４．０以上〜５．０ｎｓ未満を持つグループ、５．０以上〜６．０ｎｓ未満を持つグループ、６．０以上〜７．０ｎｓ以下を持つグループからなる群から選択される異なる３つ以上のグループの各グループに属するものを使用することができる。また、蛍光分子の蛍光寿命は、互いに１．０ｎｓ以上異なるか、あるいは互いに１．１倍以上異なるものであり、これらの蛍光分子を３つ以上含んでいることが好ましい。これらの蛍光分子の蛍光寿命は、例えば３０ｎｓ以下である。また、蛍光分子の少なくとも１種、又は測定対象物質の少なくとも１種は、既知の濃度を有するものを使用することができる。測定対象物質としては、プローブ又はターゲット（例えば核酸）などを例示することができる。
（５）被検試料中の蛍光分子の解析方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000003
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｂ）前記関数を用いて蛍光強度を計算するステップ、
を含むことを特徴とする解析方法。
（６）被検試料中の測定対象物質の解析方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000004
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｃ）前記関数を用いて蛍光強度を計算するステップ、
を含むことを特徴とする解析方法。
上記（５）、（６）記載の解析方法において、蛍光強度は、係数Ａｉと蛍光寿命τｉとの積を計算することにより算出される。
（７）遺伝子の判別方法であって、以下のステップ：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で被検試料中の遺伝子を標識するステップ、
（ｂ）前記標識した蛍光分子の蛍光強度を時間依存的に測定し、次式Ｉ：
2004090517.tif 000005
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
で示される蛍光寿命関数を作成するステップ、
（ｃ）前記関数を用いて蛍光強度を計算することによって、当該蛍光分子の蛍光強度を検出するステップ、及び
（ｄ）前記蛍光強度を指標として遺伝子のタイプを判別するステップ、
を含むことを特徴とする前記方法。
また、蛍光強度は、係数Ａｉと蛍光寿命τｉとの積を計算することにより算出される。
上記解析方法及び判別方法において、少なくとも１種の蛍光分子の蛍光寿命が既知のものを使用することが好ましい。
（８）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子を含む、測定対象物質の検出用試薬又はキット。
（９）被検試料中の蛍光分子を検出する装置であって、以下の手段：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定する手段、及び
（ｂ）前記測定された蛍光強度を比較する手段、
を含むことを特徴とする前記装置。
（１０）被検試料中の測定対象物質の定量装置であって、以下の手段：
（ａ）固有の蛍光寿命を有する複数種類の蛍光分子で測定対象物質を標識する手段、
（ｂ）前記標識した蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定する手段、及び
（ｃ）前記測定された蛍光強度を比較する手段、
を含むことを特徴とする前記装置。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明で利用する単一光子計数法の測定原理及び測定装置を表す。
【符号の説明】
１：被検試料、  ２：パルス光源、  ３：パルス光、  ４：蛍光、  ５：光電子増倍管、  ６：アンプ、  ７：定フラクションデスクリミネータ、  ８：時間−電圧変換器、  ９：マルチチャンネルアナライザ、  １０：パーソナルコンピュータ、  １１：励起側波長フィルター、  １２：蛍光側波長フィルター。
図２は、本発明における２種類の蛍光分子の関係を説明するためのスペクトルを示す。Ｆ１ａｂとＦ１ｅｍはそれぞれ蛍光分子Ｆ１の規格化された吸収スペクトルと蛍光スペクトル、Ｆ２ａｂとＦ２ｅｍはそれぞれ蛍光分子Ｆ２の規格化された吸収スペクトルと蛍光スペクトルを示す。
図３は、波長と蛍光強度との関係を示す模式図である。
図４は、蛍光強度を時間軸に沿ってプロットした模式図である。
図５は、強度と時間との関係の蛍光減衰曲線を示す図である。
図６は、本発明における蛍光分子に由来する蛍光の蛍光減衰曲線の典型例を示す。（ａ）は表１のＩＤ３、（ｂ）はＩＤ６の場合にそれぞれ該当する。
図７は、本発明をＳＮＰのタイピングに応用した場合に得られる蛍光減衰曲線を表す。
図８は、蛍光寿命の蛍光減衰曲線から得られる蛍光強度の比が直線的に変化することを示す図である。
図９は、サンプルＣにおける蛍光の減衰曲線を表す。
図１０は、実施例４における４種類の蛍光分子の蛍光スペクトルを示す。
図１１は、サンプルＣを励起した際の蛍光スペクトルを示す。
図１２は、サンプルＥにおける蛍光の減衰曲線を表す。
図１３は、実施例５における５種類の蛍光分子の蛍光スペクトルを示す。
図１４は、サンプルＥを励起した際の蛍光スペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、蛍光分子から発せられる蛍光強度が時間の経過により減衰する点に着目し、当該蛍光強度の減衰を時間依存的に測定することを考えた。そして、異なる蛍光寿命を持つ蛍光分子を含有する被検試料の蛍光強度の蛍光減衰曲線（試料から発せられる蛍光強度の時間依存性）を単一光子計数法（「蛍光測定」木下一彦・御橋廣眞編、学会出版センター）により測定した。
本発明において、「蛍光寿命」とは、パルス励起光による蛍光強度ＩＯが１／ｅ（ｅは自然対数の底を表す。）となるまでの時間を意味し、蛍光分子が固有に有する値である。例えば５−カルボキシナフトフルオレセインは０．６５ナノ秒（ｎｓｅｃ）、フルオレセインは４．０４ｎｓｅｃである。
単一光子計数法は、光の最低単位である光子を１個１個検出する方法であるため、あらゆる光検出法の中で最も感度が高く、一般的に用いられる蛍光強度や吸光度に比較し、極微量の試料の蛍光寿命を、濃度に依存することなく安定的に測定するのに適している。例えば、図１に示すように、セル、チューブ、マイクロプレート等に入れた被検試料１（被検試料１中に測定対象物質が含まれている）にパルス光源２からパルス光３を照射し、被検試料１から発せられる蛍光４を光電子増倍管（ＰＭＴ：ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）５で検出する。光源２の波長及び光電子増倍管５で検出する光の波長は、フィルターまたは分光器により選択する。パルス光源２からの信号をスタート信号とし、光電子増倍管５からの信号をストップ信号としてアンプ６、定フラクションデスクリミネータ（ＣＦＤ：ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒ）７を経由して時間−電圧変換器（ＴＡＣ：Ｔｉｍｅ  ｔｏ  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）８に入力すると、光電子増倍管５で検出されるタイミングによって、ＴＡＣ８の出力信号に差が出るため、これをマルチチャンネルアナライザ（ＭＣＡ：Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）９に取り込むことにより、蛍光寿命を測定することが可能である。出力信号は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）１０のハードディスク等に保存される。
本発明においては、異なる固有の蛍光寿命を持つ複数種類（ここでは２種類）の蛍光分子Ｆ１（蛍光寿命τ１）とＦ２（蛍光寿命τ２）を用いて蛍光分子Ｆ２の濃度を測定する場合について説明する。
測定対象物質を蛍光分子等で標識し、その蛍光強度を測定すると、波長と蛍光強度との関係を曲線として得ることができる。まず、蛍光分子Ｆ１とＦ２の吸収バンド（吸収スペクトル）を測定する。測定結果は、図２に示す曲線として得られる（Ｆ１ａｂ，Ｆ２ａｂ）。ここで、蛍光分子Ｆ１とＦ２の吸収バンド（吸収スペクトル）は、利用する光源の波長と重なっていることが望ましい。但し、光源の波長より長波長領域に吸収バンドが存在しても、励起光の一部が蛍光分子に吸収されればＦ１及びＦ２が蛍光を発することが可能である（図２）。
実際の測定でレーザー光源を利用する場合には、蛍光分子Ｆ１とＦ２の入った試薬を励起波長λｅｘで励起し、励起側波長フィルター１１（図１）として、減光フィルター（ＮＤフィルター）を用いて励起光の強さを調整する。一方、蛍光側波長フィルター１２（図１）として、励起光が検出されないようロングパスフィルターを使用する。ただし、ロングパスフィルターの代わりに、特定の波長領域を選択するためのバンドパスフィルターや、ロングパスフィルターとショートパスフィルターを併用して使用してももちろん構わない（図１）。
蛍光寿命τ１と蛍光寿命τ２が異なる場合に、被検試料中の測定対象物質の蛍光減衰曲線を測定する場合について説明する。
蛍光分子Ｆ１で測定対象物質を標識したときの蛍光強度の曲線が図３左側に示すように、また、蛍光分子Ｆ２で標識したときの蛍光強度の曲線が図３右側に示すように得られるものとする。そして、蛍光強度は時刻ｔ１から一定時間（ｔ２，ｔ３）の経過とともに（すなわち時間依存的に）減衰し（図３）、蛍光寿命τに至る。本発明においては、時間軸を新たに設定し、蛍光減衰曲線を得ることを試みた。すなわち、図３に示す座標に新たに時間軸を設けると、それぞれの時間において各蛍光強度の曲線を連続的に表示することができる（図４）。蛍光強度のカウントとして便宜的に各曲線の頂点を結ぶと、図４に示す曲線Ｓ１が得られる（図４は、簡略のためＦ１についての曲線Ｓ１のみを表示する）。
そして、Ｆ１及びＦ２についてそれぞれ曲線Ｓ１、Ｓ２を求め、これを対数プロットすると、図５のパネル（ａ）に示す結果が得られる。この対数プロットを蛍光減衰曲線とする。図５のパネル（ａ）は、複数の測定対象を独立して測定したときの蛍光減衰曲線を同一のグラフに表したものである。複数の測定対象を同一の測定系において測定した場合は、蛍光減衰曲線は、図５のパネル（ｂ）に示す曲線となる。このようにして得られる蛍光減衰曲線を指標として、蛍光分子がどの程度存在するのか、その濃度を測定することができる。測定対象物質に蛍光分子を結合させて、測定対象物質を蛍光分子で標識した場合は、その測定対象物質の濃度が測定される。
一般には、異なる固有の蛍光寿命を有するｉ種類の蛍光分子を用いて蛍光減衰曲線を求める場合の蛍光寿命関数ｆ（ｔ）は、次式Ｉで表される。
2004090517.tif 000006
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
上記の蛍光寿命関数ｆ（ｔ）は、必要により、測定時のバックグラウンド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を加えた式ＩＩ（下記）で求めることができる。
2004090517.tif 000007
（式中、Ａｉは係数、ｔは時刻、τｉは蛍光寿命を表す。）
被検試料に含まれる蛍光分子の蛍光寿命とその強度は、測定された蛍光減衰曲線をデコンボリューションすることによって求められる。なお、デコンボリューションは、当業者において明らかである。その結果得られる係数Ａと蛍光寿命τの値から、各蛍光分子の蛍光強度の割合が（Ａｉ×τｉ）（ここでｉ＝１，２，３，・・・）に比例するため、その混合比を、（Ａ１×τ１）：（Ａ２×τ２）：（Ａ３×τ３）：・・・・・・という方法で見積ることが可能である。そして被検試料に含まれる蛍光分子のうちの一つを参照蛍光分子とすれば、蛍光強度を比較することによって、濃度が未知の他の蛍光分子の濃度を求めることができる。
上記２種類の異なる蛍光寿命τ１と蛍光寿命τ２を有する蛍光分子を用いた場合において、被検試料の蛍光減衰曲線を測定すると、後述の実施例に示すように図６のようなデータが観察される。そして、装置の応答関数ｇ（ｔ）と蛍光分子の持つ本質的な蛍光寿命関数ｆ（ｔ）との畳み込み積分である蛍光強度の減衰をデコンボリューションすることにより、係数Ａと被検試料に含まれる蛍光分子の蛍光寿命とを求める。その結果得られる係数Ａと蛍光寿命τの値から、その混合比は、（Ａ１×τ１）：（Ａ２×τ２）により算出される。そして被検試料に含まれる蛍光分子のうちの一つを参照蛍光分子とすれば、蛍光強度を比較することによって、濃度が未知の他の蛍光分子の濃度を求めることができる。
本発明によれば、これまで蛍光スペクトルの重なりが大きいために同じ溶液中で同時に使用できなかった標識用の複数の蛍光分子でも、それぞれの蛍光寿命が少なくとも１．１倍以上、好ましくは１．１〜１０倍、より好ましくは１．１〜５倍、さらに好ましくは３〜５倍異なれば、その蛍光スペクトルに関係なく利用できることになり、検出を多重化（マルチプレックス）し、ハイスループットで測定する際にこれまでにないメリットを得ることができる。具体的な蛍光寿命の違いは、例えば１．１０倍、１．３２倍、１．４５倍、１．７９倍、１．９２倍、１．９５倍、２．１４倍、２．７７倍、２．８３倍、３．４３倍、５．３１倍、５．４０倍、５．９２倍、６．２２倍、７．８３倍又は９．４９倍の違いが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。したがって、これまで蛍光強度を比較することによって解析していた多くのアプリケーションに対し、本発明で示されているような蛍光分子の組合せを適用し、生産性を向上することが可能である。このことは具体的には、蛍光側波長フィルターとしてバンドパスフィルターを使用すると、蛍光強度の時間依存性だけでなく、波長依存性も利用することができ、検出しようとする対象物質に対して同時に標識できるプローブの数を飛躍的に増大させることが可能になり、アッセイの高効率化とコスト削減を実現することができることを意味する。τ１とτ２との蛍光寿命の差（寿命比）は、上記の通り１．１倍以上であり、好ましくは１．１〜１０倍、より好ましくは１．１〜５倍、さらに好ましくは３〜５倍であるが、５倍以上であっても、１０倍以上であってもよい。さらに、このような蛍光寿命を有する蛍光分子は、２つ以上、好ましくは３個以上１３個以下を同時に用いることができるが、同時に使用する蛍光分子は４個以上９個以下、さらに好ましくは５個以上７個以下であることが、定量・定性分析を安定的に行う上では望ましい。
例えば、複数の蛍光分子が、固有の蛍光寿命として０．０１以上〜１．０ｎｓ未満を持つグループ、１．０以上〜２．０ｎｓ未満を持つグループ、２．０以上〜３．０ｎｓ未満を持つグループ、３．０以上〜４．０ｎｓ未満を持つグループ、４．０以上〜５．０ｎｓ未満を持つグループ、５．０以上〜６．０ｎｓ未満を持つグループ、６．０以上〜７．０ｎｓ未満を持つグループからなる群のうち、異なる３つ以上のグループに属する蛍光分子であってもよい。蛍光分子の蛍光寿命は、３０ｎｓ以下であることが望ましい。あるいは、複数の蛍光分子の蛍光寿命の違いが互いに１．０ｎｓ以上異なる３個以上１３個以下、好ましくは４個以上９個以下、さらに好ましくは５個以上７個以下の蛍光分子を用いることもできる。
このような蛍光寿命の測定に用いることが可能な蛍光分子として、例えば以下の色素等が挙げられる：
Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ，Ｄａｐｏｘｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ，７−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ，ＰｙＭＰＯ，５−ｃａｒｂｏｘｙｎａｐｈｔｈｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，Ｄａｂｃｙｌ  ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ，Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ，ＮＢＤ−Ｘ，ＤＣＣＨ，ＨＥＸ，ＪＯＥ，ＲＯＸ，Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ（米国インビトロジェン社製），Ｃｙ２，Ｃｙ３，Ｃｙ３Ｂ，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５，Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製），ＦＩＴＣ。
これらの蛍光分子は、本発明において測定対象物質を測定するためのキット又は試薬として使用される。キットには、上記蛍光分子のほか、緩衝液、使用説明書、部品などを含めてもよい。
以上の例では、異なる蛍光寿命を持つ蛍光分子が入った溶液中に存在する特定の蛍光分子の濃度を測定する方法を示したが、本発明の測定方法は、標識されたプローブまたはターゲット（例えば核酸、タンパク質、ペプチド、リガンド、レセプター、ドナー、ホルモン、糖鎖）の濃度同定や蛍光を発する微量物質の同定・検出に適用できる。また、種類の異なる測定物質（例えば遺伝子）の判別をすることも可能である。
そうした例として、ＤＮＡマイクロアレイ、タックマン法、インベーダー法等で使用されている蛍光分子を、本発明で示されているような蛍光寿命の異なる複数の蛍光分子で置き換えることによって、マルチプレックス化し、ハイスループットで遺伝子等の測定対象物質を解析することが可能になる。図７には本発明をＳＮＰのタイピングに応用した場合に得られる蛍光寿命の蛍光減衰曲線を表す。
上記図６では、蛍光分子を４０８ｎｍで励起しているが、用いる複数の蛍光分子の吸収スペクトルに即した波長、例えば６３５ｎｍで励起してもよい。また、４０８ｎｍ、６３５ｎｍなどの複数の波長で励起させることで、広範囲の吸収スペクトルを有するさまざまな蛍光分子を同時に用いることが可能となるため、さらに検出をマルチプレックス化できる。
上記例では、光源としてレーザーダイオード（ＬＤ）やレーザーを使用する場合について説明したが、それ以外にフラッシュランプや発光ダイオード（ＬＥＤ）を使ってももちろん構わない。
なお、本発明においては、パルス周波数、パルス強度、パルス径は、測定対象によって適宜選択することができる。例えば、パルス周波数は１ｋＨｚ〜１ＧＨｚであり、パルス強度は数μＷ〜数百Ｗである。また、パルス径は数十μｍ〜数十ｍｍである。
さらに、本発明は、上述のように蛍光分子のそれぞれの蛍光強度を時間依存的に測定する手段、及び蛍光強度を比較することで濃度を測定する手段を含む測定装置を提供する。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１：異なる蛍光寿命を有する蛍光分子の定量測定
本実施例では、０．６５ｎｓ（τ１）の蛍光寿命を持つ５−ｃａｒｂｏｘｙｎａｐｈｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（以下「ＣＮＦ」という）をＦ１とし、４．０４ｎｓ（τ２）の蛍光寿命を持つフルオレセインをＦ２とし、前者を参照蛍光分子として両蛍光分子を含む被検試料の蛍光減衰曲線を図１の測定原理を使って測定し、蛍光強度の比を観察した。ＣＮＦの吸収スペクトルと蛍光スペクトルのピーク波長は、それぞれ５９１ｎｍと６４９ｎｍである。また、フルオレセインの吸収スペクトルと蛍光スペクトルのピーク波長は、それぞれ４９４ｎｍと５１９ｎｍである。
操作として蛍光分子ＣＮＦおよびフルオレセインが表１の割合で含まれるバッファー（組成：ｐＨ＝７．６，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）溶液を調製し、その蛍光減衰曲線を測定した（図６）。被検試料を波長４０８ｎｍのＬＤ光源で励起し、４３０ｎｍのロングパスフィルターを使って、測定したところ、表１に示す結果が得られた。ここでは、ＣＮＦとフルオレセインそれぞれの単体が入った溶液からそれぞれに固有の蛍光寿命を求め、予め求めた蛍光寿命を利用して、フィッティング関数の係数Ｂｉ（ここでｉ＝１，２）を計算した。
この結果から明らかなように、ＣＮＦとフルオレセインの蛍光寿命の比が６倍以上（６．２＜４．０４／０．６５＜６．３）あるため、ＣＮＦとフルオレセインに由来する蛍光寿命の成分を分離することは容易であり、ＣＮＦに対するフルオレセインの濃度を変えると、それに応じて、蛍光寿命の蛍光減衰曲線から得られる蛍光強度の比（表１中、「ｌｏｇ（τ２Ｂ２／τ１Ｂ１）」の値）が直線的に変化することが認められる（図８）。この結果を検量線として利用すると、濃度未知のフルオレセインが入った被検試料の蛍光減衰曲線を測定し、参照蛍光分子に対する濃度の割合を求めることによって溶液中のフルオレセインの濃度を特定することが可能である。図８から明らかなように、定量したいフルオレセインの濃度が約３桁変化しても直線性が維持できることから、フルオレセインの濃度が０．００１５〜０．５μＭの範囲から外れる場合でも、参照蛍光分子のＣＮＦの量を変えることによって、フルオレセインの濃度を特定することが可能である。また、濃度既知の２種類以上の参照蛍光分子を溶液中に混合することによって、フルオレセインの濃度検出範囲（ダイナミックレンジ）をさらに広げることも可能である。
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実施例２：異なる蛍光寿命を有する蛍光分子を利用したインベーダー法によるＳＮＰ（一塩基多型）のタイピング方法
実験操作として、初めに容量２００μＬのＰＣＲ用チューブにヒトのゲノムＤＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）を１０μＬ分注した。チューブを大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、ＣＮＦとフルオレセインが標識されたＦＲＥＴプローブの入ったＩｎｖａｄｅｒ法の試薬約２０μＬを分注した。チューブを密閉した後、９５℃で５分間ＤＮＡを変性し、６３℃の恒温槽中で４時間反応させ、反応終了後、被検試料を波長４０８ｎｍのＬＤ光源で励起し、４３０ｎｍのロングパスフィルターを使って、被検試料から発せられる蛍光の蛍光減衰曲線を図１の蛍光寿命測定の原理を使って測定し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）した。その結果、蛍光減衰曲線から得られる（ＣＮＦの蛍光強度）／（フルオレセインの蛍光強度）から換算した（ＣＮＦの濃度）／（フルオレセインの濃度）の値が、ホモ接合体の試料に対しては、６〜１２０、または０．０１〜０．１５となり、ヘテロ接合体の試料に対しては、０．２〜４になった。この結果から明らかなように、異なる蛍光寿命を有する蛍光分子をタイピングする対象となるＳＮＰのＦＲＥＴプローブに対して標識することにより、ホモ接合体とヘテロ接合体の違いを判別することが可能である。
実施例３：異なる蛍光寿命を有する蛍光分子を利用したタックマン法によるＳＮＰのタイピング方法
実験操作として、初めに容量２００μＬのＰＣＲ用チューブにゲノムＤＮＡ（４０ｎｇ／μＬ）を１０μＬ分注した。チューブを大気中に放置して溶媒を蒸発させた後、ＣＮＦとフルオレセインが標識されたＴａｑＭａｎ法の試薬約２０μＬを分注した。試薬を分注した後、サーマルサイクラーにて、９５℃で１０分間ＤＮＡを変性し、（９５℃で１分、６０℃で３分）というインキュベーションのサイクルを４０回行った。反応終了被検試料を波長４０８ｎｍのＬＤ光源で励起し、４３０ｎｍのロングパスフィルターを使って、被検試料から発せられる蛍光の蛍光減衰曲線を図１の蛍光寿命測定の原理を使って測定し、ＳＮＰの頻度を解析（タイピング）した。その結果、蛍光減衰曲線から得られる（ＣＮＦの蛍光強度）／（フルオレセインの蛍光強度）から換算した（ＣＮＦの濃度）／（フルオレセインの濃度）の値が、ホモ接合体の試料に対しては、５〜９５、または０．０１５〜０．２となり、ヘテロ接合体の試料に対しては、０．２３〜４．２になった。この結果から明らかなように、異なる蛍光寿命を有する蛍光分子をタイピングする対象となるＳＮＰのプローブに対して標識することにより、ホモ接合体とヘテロ接合体の違いを判別することが可能である。
実施例４：異なる蛍光寿命を有する複数の蛍光分子の定量測定
実験操作として、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＰｙＭＰＯ、ＣＮＦが表２に示す割合で含まれるバッファー（組成：ｐＨ＝７．６，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）溶液Ａ、Ｂ、Ｃを調製し、その蛍光減衰曲線を測定した。ここで、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＰｙＭＰＯ、ＣＮＦそれぞれの単体が入った溶液からそれぞれの蛍光分子に固有の蛍光寿命を求めたところ、それぞれ蛍光寿命として、３．４５ｎｓ、６．１７ｎｓ、１．８０ｎｓ、０．６５ｎｓを持つことが判明した。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＰｙＭＰＯ、ＣＮＦは、吸収スペクトルのピーク波長として、それぞれ４１０ｎｍ、４２５ｎｍ、４００ｎｍ、５９０ｎｍを有する。また、蛍光スペクトルのピーク波長として、それぞれ４５２ｎｍ、５２５ｎｍ、５６０ｎｍ、６５０ｎｍを有する。
例として、表２のサンプルＣを、分光器を用いて異なる２つの蛍光波長（５００ｎｍ、６５０ｎｍ）で測定した蛍光減衰曲線を図９に示す。分光器のバンド幅は８ｎｍであった。
図１０には、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＰｙＭＰＯ、ＣＮＦのそれぞれ単体を４０８ｎｍで励起した場合の規格化した蛍光スペクトルを示す。また、図１１はサンプルＣを４０８ｎｍで励起した際の蛍光スペクトルを表す。図１１のように、４種類の蛍光分子が混合されると蛍光スペクトルを使って分離したり、定量することは非常に難しくなる。
一方、表２から明らかなように、４種類の蛍光分子の濃度比と、蛍光寿命の測定から得られた濃度比とは比例することから、４種類の蛍光分子が混合された溶液でも、各蛍光分子の蛍光寿命に１．０ｎｓ以上の差（あるいは１．１倍以上の差）があれば、減衰曲線を解析することにより正確に濃度比を求めることができる。
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実施例５：異なる蛍光寿命を有する複数の蛍光分子の定量測定とＳＮＰのタイピングへの応用
実験操作として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、ＣＮＦが表３に示す割合で含まれるバッファー（組成：ｐＨ＝７．６，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）溶液Ｄ、Ｅ、Ｆを調製し、その蛍光減衰曲線を測定した。ここで、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、ＣＮＦそれぞれの単体が入った溶液からそれぞれの蛍光分子に固有の蛍光寿命を求めたところ、それぞれ蛍光寿命として、３．５１ｎｓ、５．０９ｎｓ、１．８０ｎｓ、３．８５ｎｓ、０．６５ｎｓを持つことが判明した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、ＣＮＦは、吸収スペクトルのピーク波長として、それぞれ４０５ｎｍ、３６０ｎｍ、４００ｎｍ、５９０ｎｍ、５９０ｎｍを有する。また、蛍光スペクトルのピーク波長として、それぞれ４２５ｎｍ、４５５ｎｍ、５６０ｎｍ、６２０ｎｍ、６５０ｎｍを有する。
例として、表３のサンプルＥを、分光器を用いて異なる３つの蛍光波長（４５０ｎｍ、５２０ｎｍ、６５０ｎｍ）で測定した蛍光減衰曲線を図１２に示す。分光器のバンド幅は８ｎｍであった。
図１３には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、ＣＮＦのそれぞれの単体を４０８ｎｍで励起した場合の規格化した蛍光スペクトルを示す。また、図１４はサンプルＥを４０８ｎｍで励起した際の蛍光スペクトルを表す。図１４のように、５種類の蛍光分子が混合されると蛍光スペクトルを使って分離したり、定量することは非常に難しくなる。
一方、表３から明らかなように、５種類の蛍光分子の濃度と、蛍光寿命の測定から得られた濃度比は比例することから、５種類の蛍光分子が混合された溶液でも、各蛍光分子の蛍光寿命に１．０ｎｓ以上の差（あるいは１．１倍以上の差）があれば、減衰曲線を解析することにより正確に濃度比を求めることができる。
以上の例は、例えば、２箇所（２つの部位）のＳＮＰのタイピングを行う場合に応用できる。例えば、上記Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５とＭａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅをある特定部位のＳＮＰに対応させ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４及びＣＮＦを別のＳＮＰ部位に対応させ、ＰｙＭＰＯを濃度既知の参照蛍光分子として利用する。このようにすれば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５とＭａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅの蛍光強度比からＳＮＰ部位のタイプ分け（ホモかヘテロか）が可能になり、同様にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４及びＣＮＦの蛍光強度比から別のＳＮＰ部位のタイプ分けが可能になる。このように蛍光寿命が異なる複数の蛍光分子を利用することにより、ＳＮＰタイピングのマルチプレックス化が可能になり、コストと測定時間を大幅に削減することが可能である。
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【産業上の利用可能性】  本発明により、蛍光分子の定量方法、定量用試薬、定量装置及びその解析方法が提供される。本発明は、異なる蛍光寿命を持つ蛍光分子をプローブまたはターゲットとなる物質に標識し、低濃度の被検試料に対して高感度に検出することができるため、測定対象物質の検出又は定量用試薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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