(57)【要約】本発明は、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）に対して中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体およびその利用を提供する。抗ＰＣＩ抗体の製造およびスクリーニングにより、活性化プロテインＣ（ａＰＣ）の生成および活性を阻害するＰＣＩの作用を阻害する抗ＰＣＩ抗体を単離することに成功した。本発明の抗体は、ＰＣＩのａＰＣ生成阻害作用および／またはａＰＣ不活性化作用を抑制することを通して、ａＰＣの活性を維持し、血液凝固系の活性化の抑制または抗炎症作用などのａＰＣの生理活性の効果を持続させるために使用することができる。また本発明は、血栓症および敗血症などのａＰＣによる治療における本発明の抗体の使用を提供する。ａＰＣ投与による治療において、本発明の抗体を投与することにより、治療効果を持続させることができる。本発明の抗体は、血栓症および敗血症などの治療および予防において利用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＣＩ抗体であって、（ａ）活性化プロテインＣ（ａＰＣ）活性に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、または（ｂ）トロンビン／トロンボモデュリン（Ｔｈｒ／ＴＭ）複合体による活性化プロテインＣ（ａＰＣ）生成に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、の少なくともいずれかを有する抗体。
【請求項２】
抗ＰＣＩ抗体であって、（ａ）活性化プロテインＣ（ａＰＣ）活性に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、および（ｂ）トロンビン／トロンボモデュリン（Ｔｈｒ／ＴＭ）複合体による活性化プロテインＣ（ａＰＣ）生成に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、の両方を有する抗体。
【請求項３】
ＰＣ１９Ｇ８、ＰＣ２３Ａ７、ＰＣ２３Ｄ８、ＰＣ３０Ｇ１、ＰＣ３１Ｅ２、ＰＣ３１Ｆ１、およびＰＣ３９Ｃ６からなる群より選択される抗体の可変領域を含む抗体と、抗体認識部位が競合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１または２に記載の抗体であって、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体。
（ａ）配列番号：４９、５０、および５１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号：５５、５６、および５７に記載のアミノ酸配列。
（ｃ）配列番号：５２、５３、５４およびに記載のアミノ酸配列。
（ｄ）配列番号：５８、５９、６０およびに記載のアミノ酸配列。
（ｅ）配列番号：２５、３１、および３６に記載のアミノ酸配列。
（ｆ）配列番号：４１、４５、および４８に記載のアミノ酸配列。
【請求項５】
抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およびダイアボディーからなる群より選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１または２に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項７】
さらにプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
疾患が血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、（ａ）プロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｂ）請求項１または２に記載の抗体、を投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、請求項１または２に記載の抗体を投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）請求項１または２に記載の抗体、および（ｂ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、またはその両方、を含むキット。
【請求項１４】
活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、および請求項１または２に記載の抗体、および（ｂ）（ｉ）治療有効量のプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｉｉ）該抗体、を併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の中和抗体に関する。
【背景技術】  静脈血栓症は、下肢関節置換術、あるいは開腹手術後に高頻度で発症する。現在その治療は主として低分子ヘパリンおよびワーファリンにより予防的に行われている。しかし低分子ヘパリンは連日の皮下投与が必要であり、ワーファリンは経口投与できるがタンパク結合率が非常に高いため他薬との相互作用が問題となっている。またいずれの薬物も出血傾向を呈する。
ＤＩＣ（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；播種性血管内凝固）は全身の血管内で血液凝固が進み、循環不全による臓器障害や、血液凝固因子の過剰な消費による出血症状を来す病態であり、白血病、固形腫瘍、感染症や産科疾患などが原因となる。その治療は抗凝固作用を期待して広くヘパリン（静脈内投与ないし皮下投与）が使用されているが、薬物そのものに出血助長作用があり、またアンチトロンビンＩＩＩ濃度低下により充分な作用が得られないなどの欠点がある。合成蛋白分解酵素阻害薬も処方されるが、有効性が必ずしも明確ではない。
敗血症では、感染した菌体成分が凝固反応を惹起し、ＤＩＣを発症することがある。しかし敗血症に対して有効な薬物は極めて少なく、これまでにａＰＣ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ；活性化プロテインＣ）が米国で認可されているのみである。
その他の血液凝固系が関与する病態、例えば冠動脈症候群、末梢循環不全等においても、ヘパリンや合成抗トロンビン薬などの抗凝固薬が処方されるが、連日投与が必要なため患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）は低い。したがって、作用が長時間（数週間）持続し出血傾向を呈さない抗血栓薬は、血栓症を予防しかつ患者のＱＯＬを向上させることができる。
血栓は血小板と血液凝固系が活性化することにより形成され、一般には動脈血栓には血小板が、静脈血栓には凝固系が主として働くと考えられている。血液凝固系が活性化され生成されたトロンビンは血栓網の主体となるフィブリンを生成するとともに、血管内皮上に存在するトロンボモデュリンと結合して性質が変化し、ＰＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）を活性化させる。活性化されたＰＣ（ａＰＣ）はｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓを補酵素として、Ｆａｃｔｏｒ  ＶａおよびＶＩＩＩａを不活化し凝固系の回転を抑制する方向に働く。さらにａＰＣはＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）やＴＡＦＩ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などの線溶阻害物質抑制作用も有するため、線溶系を促進する。したがってａＰＣは活性化した血液凝固系に対するネガテイブフィードバック機構として重要な働きをすると考えられており、実際、先天性ＰＣ欠乏症、あるいは（Ｆａｃｔｏｒ  Ｖａ変異による）ａＰＣ不応症は血栓症の発現因子の一つであることからもａＰＣの血栓症における役割の重要性が裏付けられる。さらに近年では、ａＰＣが血管内皮に作用し抗炎症作用を有することが示唆されており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１１１９９−１１２０３）、また敗血症モデルにおいて死亡率を改善し（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７；７９：９１８−９２５）、その作用は抗凝固作用だけでは説明できないことも報告されている（Ｂｌｏｏｄ  １９９１；７８：３６４−３６８）。これらのことは、ａＰＣが血栓症および敗血症の治療および予防に有効であることを示している。
しかしながらａＰＣそのものを薬物として用いる場合、血中半減期が２０〜３０分と非常に短いために静脈内持続投与あるいは長期にわたる連続投与が必要であり、医療経済学的に、また患者のＱＯＬからも不都合である。半減期が短い理由は、ａＰＣが生体内の不活化物質、すなわちＰＣＩやα１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ（ＡＡＴ）などにより非可逆的に不活化されることである。これらのうち生理的に重要な役割を果たしているのはＰＣＩと考えられており（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ２０００；１４：１３３−１４５）、実際、ａＰＣ／ＰＣＩ複合体の血中濃度は、急性冠症候群、ＤＩＣ、深部静脈血栓症などの病態で上昇していることが報告されている（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ２００１；１２：５０３−５１０；Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０００；６５：３５−４０；Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００１；８６：１４００−１４０８）。
ＰＣＩは、ａＰＣとアシル酵素複合体を形成することにより非可逆的に酵素活性を阻害する（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４；９５：１８７−１９５）。それのみならず、ａＰＣの生成酵素であるトロンビン／トロンボモデュリン（Ｔｈｒ／ＴＭ）複合体を阻害し、ａＰＣの生成を抑制する（Ｂｌｏｏｄ  １９９８；９１：１５４２−１５４７）。すなわち、ＰＣＩはａＰＣの生成および活性の両方を阻害することによってａＰＣの働きを抑制している。したがってＰＣＩの作用を阻害することにより、内因的に生成されるａＰＣ、あるいは外因的に投与されるａＰＣの作用を増強することができ、効果的な抗血液凝固作用を得ることができる。
【発明の開示】
本発明は、ａＰＣの生成および酵素活性を阻害するＰＣＩに対し、中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体およびその利用を提供することを課題とする。
ＰＣＩ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８：１６３−１６８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ２０００，１４：１３３−１４５）は血中に存在する可溶性蛋白であり、その半減期は２３時間である。そこでこの蛋白に対する中和抗体を作製し、十分量投与すれば、長時間持続する抗血液凝固薬となる。
前述したように、ＰＣＩは（１）Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成の阻害作用（すなわちＰＣの活性化阻害作用）、および（２）ａＰＣの活性阻害作用を有する。そこで本発明者らは、ｐＣＩに対するモノクローナル抗体を産生するハイリドーマを作製し、ＰＣＩの二つの作用それぞれについて阻害作用のスクリーニングを行なった。その結果、（１）、（２）それぞれについて阻害作用を有する抗体を単離することに成功し、その一部は両方の作用を阻害した。本発明の抗体は、ａＰＣの作用増強を通して血液凝固系の働きを抑制するため、血栓症の治療および予防のために極めて有用である。また本発明の抗体は、ａＰＣによる敗血症の治療等において、ａＰＣと併用して用いることにより、血中におけるａＰＣの不活化を抑制することによりａＰＣの作用を増強する薬剤として利用することができる。
すなわち本発明は、ａＰＣの生成および酵素活性を阻害するＰＣＩに対し、中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体およびその利用に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明、特に、同一の独立項（他の項に記載の発明に包含されない発明に関する項）を引用する項（従属項）に記載の発明の１つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明にも関する。各独立項に記載の発明には、その従属項の任意の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、以下の発明を含む。
〔１〕抗ＰＣＩ抗体であって、（ａ）活性化プロテインＣ（ａＰＣ）活性に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、または（ｂ）トロンビン／トロンボモデュリン（Ｔｈｒ／ＴＭ）複合体による活性化プロテインＣ（ａＰＣ）生成に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、の少なくともいずれかを有する抗体、
〔２〕抗ＰＣＩ抗体であって、（ａ）活性化プロテインＣ（ａＰＣ）活性に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、および（ｂ）トロンビン／トロンボモデュリン（Ｔｈｒ／ＴＭ）複合体による活性化プロテインＣ（ａＰＣ）生成に対するプロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の阻害作用を阻害する活性、の両方を有する抗体、
〔３〕ＰＣ１９Ｇ８、ＰＣ２３Ａ７、ＰＣ２３Ｄ８、ＰＣ３０Ｇ１、ＰＣ３１Ｅ２、ＰＣ３１Ｆ１、およびＰＣ３９Ｃ６からなる群より選択される抗体の可変領域を含む抗体と、抗体認識部位が競合する、
〔１〕または〔２〕に記載の抗体、
〔４〕〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の抗体であって、以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体、
（ａ）配列番号：４９、５０、および５１に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号：５５、５６、および５７に記載のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号：５２、５３、５４およびに記載のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号：５８、５９、６０およびに記載のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号：２５、３１、および３６に記載のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号：４１、４５、および４８に記載のアミノ酸配列、
〔５〕抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体断片、一本鎖抗体、およびダイアボディーからなる群より選択される、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の抗体、
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、
〔７〕さらにプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣを含む、〔６〕に記載の組成物、
〔８〕活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に用いられる医薬組成物である、〔６〕または〔７〕に記載の組成物、
〔９〕疾患が血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患である〔８〕に記載の組成物、
〔１０〕血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が、敗血症、播種性血管内凝固症候群、動脈血栓症、および静脈血栓症からなる群より選択される、〔９〕に記載の組成物、
〔１１〕活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、（ａ）プロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｂ）〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体、を投与する工程を含む方法、
〔１２〕活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患を予防または治療する方法であって、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体を投与する工程を含む方法、
〔１３〕活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体、および（ｂ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、またはその両方、を含むキット、
〔１４〕活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）プロテインＣ、活性化プロテインＣ、および〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の抗体、および（ｂ）（ｉ）治療有効量のプロテインＣおよび／または活性化プロテインＣ、並びに（ｉｉ）該抗体、を併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキット。
本発明は、ａＰＣの生成および／または酵素活性を阻害するＰＣＩに対し、中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体およびその利用を提供する。ＰＣＩは、（１）Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成（すなわちＰＣの活性化）に対する阻害作用、および（２）ａＰＣの活性阻害作用を有するが、本発明の抗体は、ＰＣＩが持つこの（１）または（２）の活性のいずれか、より好ましくは（１）および（２）の両方の活性を有意に阻害する働きを有している。これらの活性の阻害は、例えば実施例に記載した方法またはその他の方法により測定することができる。具体的には、ＰＣＩによるａＰＣの活性阻害作用は、ＰＣＩを抗ＰＣＩ抗体とインキュベートした後、これをａＰＣ溶液に加えてインキュベートし、ａＰＣの活性を測定する。ＰＣＩを加えなかった場合（ＰＣＩによる阻害なしの条件下のａＰＣ活性）および抗ＰＣＩ抗体を加えなかった場合（ＰＣＩにより阻害した場合のａＰＣ活性）のａＰＣ活性の値を基に、抗ＰＣＩ抗体がＰＣＩによるａＰＣ活性の阻害作用を阻害した割合が決定される。抗体とＰＣＩとのインキュベーションにより、抗体を加えなかった場合よりもａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害の程度が低下すれば、この抗体はＰＣＩが持つａＰＣの活性阻害作用を阻害する活性を有すると判断される。ａＰＣの活性としては抗血液凝固作用が挙げられ、例えば公知の方法によりＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を測定して定量することができる。あるいは発色基質ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・ＨＣｌ（Ｓ−２３６６）などの低分子化合物を用いてａＰＣ活性をアッセイすることも可能である（実施例参照）。
Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩによる阻害については、例えばＰＣＩ、抗ＰＣＩ抗体、トロンビン（Ｔｈｒ）、およびトロンボモデュリン（ＴＭ）をインキュベートし、その後、ＰＣを加えてａＰＣの生成反応を行う。その後、ａＰＣ活性を測定して生成したａＰＣ量を測定する。ＰＣＩを加えなかった場合（ＰＣＩによる阻害なしの条件下のａＰＣ生成）および抗ＰＣＩ抗体を加えなかった場合（ＰＣＩにより阻害した場合のａＰＣ生成）のａＰＣ活性の値を基に、ＰＣＩの「Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対する阻害作用」における抗ＰＣＩ抗体の阻害の割合が決定される。抗体の添加により、抗体を加えなかった場合よりもａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害の程度が低下すれば、この抗体はＰＣＩが持つ「Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対する阻害作用」を阻害する活性を有すると判断される。ａＰＣの活性は上記と同様に定量することができる。
また本発明は、ＰＣＩに対して中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体のスクリーニング方法であって、ｉ）抗ＰＣＩ抗体を結合させたまたはさせていないＰＣＩの、ａＰＣの活性阻害作用を測定する工程、およびｉｉ）該抗体を結合させていないＰＣＩに比べ、該抗体を結合させたＰＣＩの該阻害作用が抑制されるような抗体を選択する工程、を含む方法を提供する。また本発明は、ＰＣＩに対して中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体のスクリーニング方法であって、ｉ）抗ＰＣＩ抗体を結合させたまたはさせていないＰＣＩの、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対する阻害作用を測定する工程、およびｉｉ）該抗体を結合させていないＰＣＩに比べ、該抗体を結合させたＰＣＩの該阻害作用が抑制されるような抗体を選択する工程、を含む方法を提供する。また本発明は、これらのスクリーニング方法により得ることができる抗体を提供する。本発明の抗体は、血中におけるａＰＣの生成および／または活性の阻害を防止することにより、ａＰＣの生体内での生成量および／または寿命を延長させて活性を増強することが可能である。
本発明の抗ＰＣＩ抗体は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、またはそれらの抗体の変異体であってもよい。均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。
本発明における「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、天然において起こり得る少量で存在する変異体を除いては均一である抗体集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作用するものである。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む慣用なポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の抗原決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンにより汚染されていないハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体を、例えばハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））、または、組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）により製造してもよい。本発明において使用するモノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））。本発明におけるモノクローナル抗体には、特に、重鎖（Ｈ鎖）及び／または軽鎖（Ｌ鎖）の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、抗体変異体、並びに抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列バリアントを指す。例えば、抗体の可変領域を、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変することができる。このような改変は、部位特異的変異（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）参照）、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となった抗体のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。
具体的には、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）のウェブサイトを参照；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は当業者に周知の方法により作製することができる。例えば以下の方法により作製することができる。
動物の免疫に用いるＰＣＩとしては、組換えＤＮＡ法又は化学合成により調製したＰＣＩのアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドなどが挙げられる。ヒトおよびその他の哺乳動物のＰＣＩのアミノ酸配列は公知である（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：６１１−６１６）。哺乳動物のＰＣＩとしては、例えばマウス、ラット、またはウシなどのＰＣＩを用いることができるがこれらに制限されない（Ｚｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ−Ｍａｃｈｈａｒｔ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１８６，（１），６１−６６，１９９７；Ｗａｋｉｔａ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２９，２６３−２６８，（３），１９９８；Ｙｕａｓａ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３，（２），２６２−２６７，２０００）。組み換えＰＣＩ蛋白質は、例えば実施例に記載したようにして調製することができる。抗原としてはＰＣＩまたはその部分ペプチド自体を用いることもできるし、キャリアー蛋白質に結合させて免疫することもできる。キャリアー蛋白質を用いる場合は、例えば抗原であるＰＣＩをキャリアー蛋白質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全なアジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。抗原蛋白質の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１０〜１００μｇ（例えば２０〜６０μｇ）を用いることができる。
初回免疫前および２回目以降の免疫から３〜７日後に動物から採血し、血清を抗体力価について分析する。また、免疫応答を増幅するため、ミョウバン等の凝集剤が好ましくは用いられる。選択された哺乳動物抗体は通常、抗原に対して十分に強い結合親和性を有する。抗体の親和性は、飽和結合、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、及び競合分析（例えば、放射性免疫分析）により決定することができる。
ポリクローナル抗体のスクリーニング法としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｙ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｉｔ，（１９８８））に記載されるような慣用の交差結合分析を行うことができる。また、代わりに、例えば、エピトープマッピング（Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５））を行ってもよい。ポリペプチドまたは抗体の効力の測定方法として好ましいのは、抗体結合親和性の定量化を用いた方法であるが、その他の態様では、それに加えて、または結合親和性測定に代えて、抗体の１若しくはそれ以上の生物学的特性を評価する方法を含む。このような分析法は特に、抗体の治療的な有効性を示すので有用である。通常、必ずしもではないが、このような分析において改善された特性を示す抗体はまた、結合親和性も増幅されている。
モノクローナル抗体の調製におけるハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８１，７３，３−４６）等に準じて行うことができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えばＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）、Ｐ３Ｕ１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９７９；１５０：５８０；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７８；８１：１）等が好適に使用される。また、ヒトミエローマ、及び、マウス−ヒトｈｅｔｅｒｏｍｙｃｌｏｍａセルラインも、ヒトモノクローナ抗体の産生に用いることができる（Ｋｏｚｂａｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。抗体産生細胞は、例えば最終の免疫日から２〜３日後に犠牲死させた動物から採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。具体的には、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：２０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００（Ｄａ）のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより、抗体、または抗体断片を単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１））、及びＭａｒｋｓら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、各々、ファージライブラリーを用いたマウス及びヒト抗体の単離について記載している。また、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体のチェーンシャッフリングによる製造（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））、そして、巨大なファージライブラリーを構築するための方法としてのコンビナトリアル感染、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））などが知られている。これらの技術も、モノクローナル抗体の単離のために従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用し得る。
本発明の抗ＰＣＩ中和抗体は、好適には以下のスクリーニングにより選択することができる。
・１次スクリーニング
抗体の結合特異性を、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）、ＨＴＲＦ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、または蛍光免疫法等（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）により測定し、ＰＣＩへ結合するものを選択する。
・２次スクリーニング
ａＰＣ／ＰＣＩアッセイおよび／またはＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイを行い、ＰＣＩに対する阻害の度合いが相対的に強い抗体を選択する。ａＰＣ／ＰＣＩアッセイとは、上記した、ＰＣＩが持つａＰＣの活性阻害作用のアッセイであり、Ｔｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイとは、上記した、ＰＣＩが持つＴｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成（ＰＣの活性化）に対する阻害作用のアッセイである。これらのＰＣＩの作用に対する阻害の程度を測定し、その阻害の程度が相対的に高い抗体を選択する。例えば、ハイブリドーマなどの抗体産生細胞から得られた抗体を用いてアッセイしているならば、目的の活性を有する抗体を産生する抗体産生細胞を同定し、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により生育させる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）。培養培地としては、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＩＭ−１６４０培地を用いることができる。スクリーニングを繰り返して、より強い抗ＰＣＩ中和抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、ハイブリドーマのクローニングを行うことが可能である。本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマに関する。
ハイブリドーマ培養上清（１／５（ｖｏｌ／ｖｏｌ））を用いた上記ａＰＣ／ＰＣＩアッセイにおいては、ＰＣＩ非添加の場合の値を１００、ハイブリドーマ培養上清の代わりにハイブリドーマ培養のための培養液（例えばＨＡＴ培地）を用いた場合を０としたＰＣＩ阻害活性の相対値で、好ましくは４５以上、より好ましくは４８以上、より好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは７０以上、より好ましくは８０以上、より好ましくは９０以上の阻害活性を示すものが選択される。本発明は、このａＰＣ／ＰＣＩアッセイにおいて、培養上清（１／５（ｖｏｌ／ｖｏｌ））中のＰＣＩ活性阻害の相対値が好ましくは４５以上、より好ましくは４８以上、より好ましくは５０以上、より好ましくは６０以上、より好ましくは７０以上、より好ましくは８０以上、より好ましくは９０以上であるハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマ培養上清のａＰＣ／ＰＣＩアッセイは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。
ハイブリドーマ培養上清からは、常法により抗体を精製することができる。本発明の抗体は、抗体非添加の場合の値を１００％、ＰＣＩ非添加の場合を０％としたａＰＣ／ＰＣＩアッセイにおいて、５０％阻害濃度が好ましくは１００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは８０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは６０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは４０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２．５μｇ／ｍｌ以下である。あるいは本発明の抗体は、このａＰＣ／ＰＣＩアッセイにおいて、抗体濃度２５μｇ／ｍｌにおけるＰＣＩ阻害の相対値が、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上である。精製抗体のａＰＣ／ＰＣＩアッセイは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。５０％阻害濃度を決定するには、抗体濃度を変えてアッセイを行い、グラフを作成して５０％阻害に相当する抗体濃度を求めればよい。
また本発明の抗体は、好ましくはＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩに対する阻害活性を有している。本発明の抗体は、抗体非添加の場合の値を１００％、ＰＣＩ非添加の場合を０％としたＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおいて、５０％阻害濃度が好ましくは２００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは８０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２５μｇ／ｍｌ以下である。あるいは本発明の抗体は、このＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおいて、抗体濃度２５μｇ／ｍｌにおけるＰＣＩ阻害の相対値が、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上である。精製抗体のＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイは、例えば実施例に記載の方法に従って実施する。５０％阻害濃度を決定するには、抗体濃度を変えてアッセイを行い、グラフを作成して５０％阻害に相当する抗体濃度を求めればよい。
本発明の抗体は、ＰＣ／ＰＣＩアッセイにおけるＰＣＩ阻害活性、またはＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおけるＰＣＩ阻害活性のどちらかを有していればよいが、より好ましくは、ａＰＣ／ＰＣＩアッセイにおけるＰＣＩ阻害活性、およびＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおけるＰＣＩ阻害活性の両者を有している。すなわち本発明の抗体としては、上記のａＰＣ／ＰＣＩアッセイおよびＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおける５０％阻害濃度が、それぞれ好ましくは１００および２００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは８０および１５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは６０および１００μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５０および８０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは４０および５０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２５および３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１５および２５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２．５および２５μｇ／ｍｌ以下である抗体が含まれる。
本発明の抗体は、一般に、ＰＣＩとの結合力が強いものほど好ましいと考えられる。本発明の抗体は、ＰＣＩと相互作用における解離定数（ＫＤ）が、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは２０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは３ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、より好ましくは０．８ｎＭ以下、より好ましくは０．６ｎＭ以下、より好ましくは０．４ｎＭ以下、より好ましくは０．２ｎＭ以下である。解離定数や、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、最大結合量（Ｒｍａｘ）などの結合速度論的パラメーターは、例えばＢＩＡＣＯＲＥなどの表面プラズモン共鳴分析等により決定することができる。
また、本発明の抗体は、好ましくは血液によるａＰＣの不活性化を抑制する活性を有している。本発明の抗体は、血液によるａＰＣの不活性化を、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは２５％以上、より好ましくは３０％以上抑制する抗体である。このような抑制レベルは不活性化抑制率（％）と定義され、血液により不活性化した場合のａＰＣの活性と同レベルのａＰＣ活性を０％、しない場合のａＰＣ活性と同レベルのａＰＣ活性を１００％とした相対値で表される。
不活性化抑制率は適宜抗体の用量を変えながら至適条件で測定すればよく、具体的には、以下の手順で決定することができる。１０μｇ／ｍＬのａＰＣ（ＳＩＧＭＡ、＃Ｐ−２２００）溶液１０μＬと４０μＬの抗体溶液（ハイブリドーマのスクリーニングであれば、例えばハイブリドーマ培養上清）あるいはコントロールとして抗体を含まない溶液（例えばミエローマ細胞の培養上清またはＨＡＴ培地など）を混合し、室温で一定時間（例えば６０分）インキュベートする。この混合液に血漿（例えばヒト標準血漿）を５０μＬ添加し、さらに室温で一定時間（例えば６０分）インキュベートする。ＡＰＴＴ試薬（例えばＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＡＡ−２００Ａ）５０μＬを添加する。血漿とインキュベーションを行わないａＰＣの血液凝固時間は、ＡＰＴＴ試薬添加直前に血漿に加えて測定する。例えば３７℃で３分間インキュベートした後、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２（例えばＤＡＤＥ  ＢＥＨＲＩＮＧ、ＧＭＺ−３１０）５０μＬを添加し、凝固までの時間を測定する。血液凝固時間は、血液凝固自動測定装置（例えばＡｍｅｌｕｎｇ、ＫＣ−１０Ａ）などにより測定することができる。
血漿とインキュベートしなかったａＰＣを加えた場合の凝固時間（ａ）を１００％、コントロールとして抗体を含まない溶液（例えば上記のようにミエローマ細胞の培養上清またはＨＡＴ培地など）とインキュベート後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（ｂ）を０％とし、該ハイブリドーマ培養上清などの抗体溶液とインキュベート後に血漿とインキュベートしたａＰＣを加えた場合の凝固時間（ｃ）から、ハイブリドーマ培養上清などの抗体溶液の凝固時間延長に対する作用を求める（不活性化抑制率（％）＝｛（ｃ−ｂ）／（ａ−ｂ）｝×１００）。この値が大きいほど、ａＰＣ不活性化に対する抑制作用が強いと判断される。Ｓ−２３６６等の基質化合物を用いてａＰＣ活性を測定する場合でも、上記と同様に抗体とインキュベートせずに血漿で不活性化させたａＰＣ、および血漿とインキュベートしないａＰＣを比較に用いてａＰＣ活性を測定し、不活性化抑制率（％）を算出することができる。
本発明の抗体は、例えばａＰＣまたはＴｈｒｏｍｂｉｎとの相互作用または選択性に関与するＰＣＩ部位に結合する抗体であってよい。ＰＣＩがＴｈｒｏｍｂｉｎおよびａＰＣと反応する部位は、シグナルペプチドが切断された後のヒトＰＣＩにおけるＡｒｇ３５４−Ｓｅｒ３５５（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：６１１−６１６）である。また、ＰＣＩのＴｈｒｏｍｂｉｎへの選択性に関与する部位はＰｈｅ３５３、ＰＣＩのａＰＣへの選択性に関与する部位はＴｈｒ３５２である（Ｃｏｏｐｅｒ、Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５，３４：１２９９１−１２９９７；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｆ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２４６，２９−３３，１９９５）。本発明の抗体は、例えばＰＣＩ中のこれらのいずれかのアミノ酸あるいはその近傍（例えば１０アミノ酸以内の部位）に結合する抗体が含まれる。このような抗体を作製するには、目的のＰＣＩ部分を含むオリゴペプチドを合成し、それを抗原として動物に免疫して抗体を産生させればよい。
また、ＰＣＩの作用の一つであるａＰＣの活性阻害はＨｅｐａｒｉｎ依存的であり、ＰＣＩのＡｒｇ２７８、Ａｒｇ３６２、およびＬｙｓ２７６残基が、Ｈｅｐａｒｉｎを介したＰＣＩ−ａＰＣの相互作用に関与している（Ｌｅｉ  Ｓｈｅｎ，ｅｌ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，８２，７２−７９，１９９９）。従って、これらのアミノ酸またはその近傍に結合する抗体は、ＰＣＩのａＰＣ阻害を抑制する抗体の候補となる。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を敢得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水又は血清を採取する。腹水形成を促進するために、例えばプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）などを予め腹腔内投与することができる。
本発明で使用される抗体は、プロテインＡ−セファロース、プロテインＧ−セファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫黄塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
また、本発明では、上記の方法にしたがって得られた抗体の遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞としては、このような抗体遺伝子で形質転換された細胞、およびハイブリドーマが含まれる。
本発明の抗体として特に好適なのは、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体（ＰＣ１９Ｇ８，ＰＣ２３Ａ７，ＰＣ２３Ｄ８，ＰＣ３０Ｇ１，ＰＣ３１Ｅ２，ＰＣ３１Ｆ１，またはＰＣ３９Ｃ６）の可変領域を含む抗体と抗体結合部位が重複する（または同一の）抗体である。このような抗体を、本発明においては、該モノクローナル抗体（ＰＣ１９Ｇ８，ＰＣ２３Ａ７，ＰＣ２３Ｄ８，ＰＣ３０Ｇ１，ＰＣ３１Ｅ２，ＰＣ３１Ｆ１，またはＰＣ３９Ｃ６）のＰＣＩ結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体と呼ぶ。２つの抗体が抗原蛋白質の同じ部位に結合するかどうかは、例えば競合実験により決定することができる。具体的には、第一の抗ＰＣＩ抗体とＰＣＩとの結合が、第二の抗ＰＣＩ抗体によって競合阻害を受けるとき、第一の抗体と第二の抗体は同じ抗原部位に結合していると判断される。例えば、ＰＣ１９Ｇ８，ＰＣ２３Ａ７，ＰＣ２３Ｄ８，ＰＣ３０Ｇ１，ＰＣ３１Ｅ２，ＰＣ３１Ｆ１，またはＰＣ３９Ｃ６の抗体、あるいは、配列番号：８、９、１０、１１、１２、１３、または１４に記載のアミノ酸配列を含むＨ鎖可変領域に対して、それぞれ配列番号：１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１に記載のアミノ酸配列を含むＬ鎖可変領域を組み合わせた抗体のいずれかと、抗体結合部位が競合する抗体は、本発明の抗体に含まれる。あるいは、上記のモノクローナル抗体のエピトープを、ＰＣＩの部分ペプチドなどを用いた公知のエピトープマッピング法により解析し、同定されたエピトープを含むペプチドを抗原に用いて、これに結合する抗体を調製することにより、上記モノクローナル抗体のＰＣＩ結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体を得ることもできる。このような抗体は、ａＰＣ生成および／またはａＰＣ活性に対して実施例で単離した抗体と同様の阻害作用を発揮することが期待される。このように、実施例で単離した抗体のＰＣＩ結合部位と実質的に同じ部位に結合する抗体であって、ａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体および／またはＴｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体は本発明に含まれる。
また本発明の抗体には、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体（ＰＣ１９Ｇ８，ＰＣ２３Ａ７，ＰＣ２３Ｄ８，ＰＣ３０Ｇ１，ＰＣ３１Ｅ２，ＰＣ３１Ｆ１，またはＰＣ３９Ｃ６）の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を含む抗体が含まれる。機能的に同等とは、実施例において単離されたいずれかのモノクローナル抗体のＣＤＲｓのアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を有し、ＰＣＩに結合してその機能を阻害する作用を有することを言う。ＣＤＲとは抗体の可変領域（Ｖ領域とも言う）に存在する抗原への結合の特異性を決定している領域であり、Ｈ鎖とＬ鎖にそれぞれ３箇所ずつ存在し、それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と命名されている。ＣＤＲを挟むようにフレームワークと呼ばれるアミノ酸配列の保存性の高い４つの領域が介在する。ＣＤＲは他の抗体に移植することが可能であり、所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより組み換え抗体を作製することができる。また抗原に対する結合性を維持しながら１または数個のＣＤＲのアミノ酸を改変することが可能である。例えば、ＣＤＲ中の１または数個のアミノ酸を、置換、欠失、および／または付加することができる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ａｍｐ；Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内であり、好ましくは３５％以内であり、さらに好ましくは３０％以内（例えば、２５％以内）である。アミノ酸配列の同一性は本明細書に記載したようにして決定すればよい。
本発明に含まれる抗体を例示すれば、例えばＤ（Ｔ／Ｙ）（Ｆ／Ｙ）（Ｍ／Ｉ）Ｈ（配列番号：４９）、ＲＩＤ（Ｙ／Ｌ）（Ｖ／Ｅ）（Ｎ／Ｋ）（Ｇ／Ｖ）Ｎ（Ｔ／Ｉ）（Ｋ／Ｉ）ＹＤＰ（Ｋ／Ｎ）ＦＱ（Ｇ／Ｄ）（配列番号：５０）、およびＧＧＹＤＶ（Ｒ／Ｐ）（Ｅ／Ｓ）ＦＡＹ（配列番号：５１）（スラッシュで区切られたアミノ酸は、それらのいずれかのアミノ酸であることを表す）のアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。これらのＣＤＲを、所望のＨ鎖可変領域のフレームワークの間のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する位置に挿入すれば、本発明のＰＣＩ中和抗体を作製することができる。このような抗体のＨ鎖ＣＤＲとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＣＤＲ１としてはＤＴＦＭＨ（配列番号：２２）またはＤＹＹＩＨ（配列番号：２３）、ＣＤＲ２としてはＲＩＤＹＶＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号：２６）、ＲＩＤＬＶＮＶＮＴＫＹＤＰＮＦＱＤ（配列番号：２７）、またはＲＩＤＬＥＫＧＮＩＩＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号：２８）、ＣＤＲ３としてはＧＧＹＤＶＲＥＦＡＹ（配列番号：３２）、またはＧＧＹＤＶＰＳＦＡＹ（配列番号：３３）が用いられる。また、上記の各ＣＤＲのアミノ酸は、適宜置換などにより改変してもよい。例えば、各ＣＤＲのアミノ酸を保存的に置換することは本発明の範疇に含まれる。より具体的には、各ＣＤＲは、モノクローナル抗体ＰＣ２３Ｄ８，ＰＣ１９Ｇ８，ＰＣ２３Ａ７，またはＰＣ３９Ｃ６のＨ鎖のＣＤＲ１，２，および３の組み合わせを用いることができる（図５参照）。これらの抗体は、上記クローンと同等のＰＣＩ中和活性を有することが期待される。
上記のＨ鎖ＣＤＲを含む抗体にはく適宜抗体Ｌ鎖の可変領域を組み合わせて用いることができる。Ｌ鎖ＣＤＲとしては、例えばＳＡ（Ｔ／Ｓ）ＳＳ（Ｌ／Ｖ）（Ｉ／Ｓ）ＹＭＨ（配列番号：５５）、ＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡ（配列番号：５６）、およびＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号：５７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。また、これらのＬ鎖ＣＤＲｓは、上記のＨ鎖とは独立に用いてもよい。これらのＣＤＲは、所望のＬ鎖可変領域のフレームワークの間のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する位置に挿入される。このような抗体のＬ鎖ＣＤＲとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＣＤＲ１としてはＳＡＴＳＳＬＩＹＭＨ（配列番号：３７）またはＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号：３８）、ＣＤＲ２としてはＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡ（配列番号：４２）、ＣＤＲ３としてはＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号：４６）が用いられるが、これらに制限されない。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：４９、５０、および５１に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：４９、５０、および５１の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：４９の３個以内、配列番号：５０の８個以内、および配列番号：５１の５個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：４９、５０、および５１とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：４９の２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：５０の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内である。また好ましくは配列番号：５１の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：５５、５６、および５７に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：５５、５６、および５７の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：５５の５個以内、配列番号：５６の５個以内、および配列番号：５７の４個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：５５、５６、および５７とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：５５の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：５６の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：５７の３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、上記のＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
また本発明の抗体としては、ＲＹＷＭＳ（配列番号：５２）、ＥＩＮＰＤＳＳＴＩ（Ｎ／Ｔ）ＹＴ（Ｐ／Ｓ）ＳＬＫＤ（配列番号：５３）、および（Ｆ／Ｌ）ＦＹＹＧＴＰＤＹ（配列番号：５４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。このような抗体のＨ鎖ＣＤＲとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＣＤＲ１としてはＲＹＷＭＳ（配列番号：２４）、ＣＤＲ２としてはＥＩＮＰＤＳＳＴＩＮＹＴＰＳＬＫＤ（配列番号：２９）またはＥＩＮＰＤＳＳＴＩＴＹＴＳＳＬＫＤ（配列番号：３０）、ＣＤＲ３としてはＦＦＹＹＧＴＰＤＹ（配列番号：３４）またはＬＦＹＹＧＴＰＤＹ（配列番号：３５）が挙げられる。具体的には、モノクローナル抗体ＰＣ３０Ｇ１またはＰＣ３１Ｆ１のＨ鎖のＣＤＲ１，２，および３の組み合わせを用いることができる。これらの抗体は、ＰＣ３０Ｇ１またはＰＣ３１Ｆ１と同等のＰＣＩ中和活性を有することが期待される。この場合はＬ鎖ＣＤＲｓとして、例えばＫＡＳＱＤＶＩ（Ｖ／Ｋ）ＡＶＡ（配列番号：５８）、Ｓ（Ａ／Ｔ）ＳＹＲＹＴＧＶＰＤ（配列番号：５９）、およびＨＹＳＳＰＰＷＴ（配列番号：６０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。また、これらのＬ鎖ＣＤＲｓは、上記のＨ鎖とは独立に用いてもよい。Ｌ鎖ＣＤＲとして好ましいアミノ酸配列をより具体的に例示すれば、ＣＤＲ１としてはＫＡＳＱＤＶＩＶＡＶＡ（配列番号：３９）またはＫＡＳＱＤＶＩＫＡＶＡ（配列番号：４０）、ＣＤＲ２としてはＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＤ（配列番号：４３）またはＳＴＳＹＲＹＴＧＶＰＤ（配列番号：４４）、ＣＤＲ３としてはＨＹＳＳＰＰＷＴ（配列番号：４７）が用いられるが、これらの配列には制限されない。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：５２、５３、および５４に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：５２、５３、および５４の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：５２の３個以内、配列番号：５３の８個以内、および配列番号：５４の５個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：５２、５３、および５４とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：５２の２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：５３の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内である。また好ましくは配列番号：５４の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：５８、５９、および６０に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：５８、５９、および６０の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：５８の５個以内、配列番号：５９の５個以内、および配列番号：６０の４個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：５８、５９、および６０とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：５８の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：５９の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：６０の３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、上記のＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
また本発明の抗体としては、ＴＹＰＩＥ（配列番号：２５）、ＫＦＨＰＤＮＤＤＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号：３１）、およびＧＨＤＹＤＹＧＭＤＹ（配列番号：３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する抗体が挙げられる。上記と同様に、それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に相当する。これらの抗体は、ＰＣ３１Ｅ２と同等のＰＣＩ中和活性を有することが期待される。この場合はＬ鎖ＣＤＲとして、例えばＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：４１）、ＧＡＳＮＬＥＳＧＴＰＡ（配列番号：４５）、およびＳＮＥＤＰＰＴ（配列番号：４８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを組み合わせることが好ましい。それぞれのアミノ酸配列は、抗体Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。
具体的には、本発明の抗体には、以下のＨ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：２５、３１、および３６に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：２５、３１、および３６の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：２５の３個以内、配列番号：３１の８個以内、および配列番号：３６の５個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：２５、３１、および３６とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：２５の２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：３１の７個以内、さらに好ましくは６個以内、さらに好ましくは５個以内、さらに好ましくは４個以内、さらに好ましくは３個以内である。また好ましくは配列番号：３６の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。
また本発明の抗体には、以下のＬ鎖相補性決定領域を有する抗体であって、Ｔｈｒ／ＴＭ複合体によるａＰＣ生成に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性および／またはａＰＣ活性に対するＰＣＩの阻害作用を阻害する活性を有する抗体が含まれる。
（ａ）配列番号：４１、４５、および４８に記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｂ）配列番号：４１、４５、および４８の任意のアミノ酸を保存的置換した配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）配列番号：４１の５個以内、配列番号：４５の５個以内、および配列番号：４８の４個以内のアミノ酸が、置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｄ）配列番号：４１、４５、および４８とそれぞれ７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる相補性決定領域。
（ｃ）におけるアミノ酸の改変数は、好ましくは配列番号：４１の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：４５の４個以内、さらに好ましくは３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また好ましくは配列番号：４８の３個以内、さらに好ましくは２個以内、さらに好ましくは１個である。また（ｄ）における同一性は、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。特に、上記のＨ鎖相補性決定領域とＬ鎖相補性決定領域の両方を有する抗体は、本発明の抗体として好適である。
ＣＤＲのアミノ酸配列を改変するには、例えばアミノ酸配列を改変したＣＤＲを含む可変領域をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、これらを基にＰＣＲにより可変領域をコードする核酸を生成させる。これを適当な発現ベクターに組み込んで発現させることにより、所望のＣＤＲを有する抗体を得ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの合成時に塩基を混合させて、ＣＤＲの特定の位置に様々なアミノ酸を有する抗体をコードするＤＮＡライブラリーを作製する。このライブラリーから、ＰＣＩに結合しその機能を抑制する抗体をコードするクローンを選択することによって、本発明の抗体を得ることができる。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、該核酸を含むベクター、および該核酸または該ベクターを含む宿主細胞に関する。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター等の公知の所望のベクターであってよい。宿主細胞は、バクテリア、酵母、昆虫、植物細胞、および哺乳動物細胞などが含まれる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体などが挙げられ、例えばヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体が挙げられる。このような抗体は、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体などの非ヒト抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域に置き換えたものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照）。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入させたＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなアミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識・結合能力をより正確に至適化するために行われる。例えば必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の一部または全てのレパートリーを有するトランスジェニック（Ｔｇ）動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）；Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７，ＷＯ  ９２／０３９１８，ＷＯ  ９４／０２６０２，ＷＯ  ９４／２５５８５，ＷＯ  ９６／３４０９６，ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。このようなＴｇ動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物およびＴｇ動物の作製、およびこれらの動物同士の掛け合わせにより作り出す。免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、Ｊ領域またはＣ領域（例えばＣμ領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロブリン軽鎖（例えばκ鎖）の機能的不活性化には、例えば、Ｊ領域若しくはＣ領域の一部、またはＪ領域及びＣ領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、該宿主は例えば所望の真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞である。
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ  ９２／０１０４７，ＷＯ  ９２／２０７９１，ＷＯ  ９３／０６２１３，ＷＯ  ９３／１１２３６，ＷＯ  ９３／１９１７２，ＷＯ  ９５／０１４３８，ＷＯ  ９５／１５３８８を参考に実施することができる。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏ，（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９，Ｓｆ２１，Ｔｎ５など、あるいはカイコなどの個体が挙げられる。植物細胞としては、ニコティアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、例えばニコティアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。
本発明の抗体のアイソタイプとしては制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等が挙げられるが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭである。また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含む断片のことである。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または重鎖および軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などが挙げられる。従来、抗体断片は天然の抗体のプロテアーゼによる消化により製造されてきたが、現在では、遺伝子工学的に組み換え抗体として発現させること方法も公知である（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９１，９，１３２−１３７参照）。
「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含むものである。この領域は１つの重鎖および軽鎖の可変領域が非共有結合により強く連結されたダイマーである（ＶＢ−ＶＬダイマー）。各可変領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用し、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。即ち、重鎖と軽鎖をあわせて６つのＣＤＲが抗体の抗原結合部位として機能している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位を含む場合よりは低い親和性ではあるものの、抗原を認識し、結合する能力を有していることが知られている。従って、本発明における抗体断片はＦｖ断片が好ましいが、これに限定されるものではなく、重鎖または軽鎖のＣＤＲが保存され抗原を認識し、結合する能力を有する抗体の断片を含むポリペプチドであってよい。
また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常領域および重鎖の定常領域（ＣＨ１）を含む。例えば抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と呼ばれる、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために「Ｆｃ」と呼ばれる断片が生じる。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域の１またはそれ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点でＦａｂ断片と異なるが、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片である点で構造的にＦａｂと同等である。本発明においては、プロテアーゼによる消化で生成した抗体断片と同一でなくても、パパイン消化により得られるものと同等な、１つの抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗原結合断片をＦａｂ様抗体と称する。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常領域の１またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を示すものである。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。抗体をペプシンで消化すると、２つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得るＦ（ａｂ’）２断片、及び、残りの別な断片（ｐＦｃ’と呼ばれる）が得られる。本発明において、ペプシン消化により得られるのも同等な、２つの抗原結合部位を有し抗原を交差結合し得る抗体断片をＦ（ａｂ’）２様抗体と称する。例えば、これらの抗体断片は組換技術により製造することも可能である。例えば、上述の抗体ファージライブラリーから抗体断片を単離することもできる。また、大腸菌等の宿主より直接Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を回収し、Ｆ（ａｂ’）２断片の形態に化学的結合させることもできる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２））。さらにまた別の方法としては、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接、組換宿主培養物から単離することもできる。
さらに、本発明で使用される抗体は多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。具体的には、結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ；Ｄｂ）は、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号等）。一般にダイアボディは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）が、互いに結合できない位に短い、例えば、５残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖Ｖ領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは２つの抗原結合部位を有することとなる。このとき２つの異なる抗原（ａ、ｂ）に対するＶＬとＶＨをＶＬａ−ＶＨｂとＶＬｂ−ＶＲａの組合わせで５残基程度のリンカーで結んだものを同時に発現させると二種特異性Ｄｂとして分泌される。本発明の抗体としては、このようなＤｂであってもよい。
一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏｌ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４））参照。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖または重鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、および軽鎖または軽鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
本発明は、本発明の抗体を含む、ＰＣＩの活性の阻害剤を提供する。また本発明は、本発明の抗体の、ＰＣＩの活性の阻害のための使用に関する。また本発明は、本発明の抗体とＰＣＩとを接触させる工程を含む、ＰＣＩの活性を阻害する方法に関する。本発明の抗体をＰＣＩと接触させることにより、ＰＣＩによるａＰＣ生成の阻害および／またはＰＣＩによるａＰＣ活性の阻害を抑制することができる。また本発明は、本発明の抗体を含む、ａＰＣの生成および／または活性の増強剤を提供する。また本発明は、本発明の抗体の、ａＰＣの生成および／または活性の増強のための使用に関する。本発明の抗体をＰＣＩと接触させる工程により、ＰＣＩの阻害を通して、内在性または外来のＰＣの活性化の低下および／またはａＰＣ活性の低下を抑制することが可能である。本発明の抗体を投与する場合、抗体は単独で投与することも可能であり、また、ＰＣおよび／またはａＰＣと併用することも可能である。
ａＰＣは血液凝固および炎症を抑制する作用が知られており、本発明のＰＣＩ中和抗体を投与する工程により、血液凝固または炎症を抑制するａＰＣの効果を高めることが可能となる。本発明は、本発明の抗体を投与する工程を含む、血液凝固または炎症を抑制する方法に関する。該方法においては、さらにＰＣおよび／またはａＰＣを投与する工程を含んでもよい。この場合、ＰＣおよび／またはａＰＣと本発明の抗体とを予め混合しておき、それを投与することができるし、別々に投与してもよい。本発明の抗体を有効成分として含有する医薬製剤を用いることにより、ａＰＣによる処置（例えば血栓症および敗血症等の予防および治療）におけるａＰＣの効果をより高めることが可能となる。なお本発明の抗体を「有効成分として含有する」とは、本発明の抗体を活性成分の少なくとも１つとして含むという意味であり、本発明の抗体の含有率を制限するものではない。本発明の抗体は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に有用であり、その中でも血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患の予防および／または治療に特に有効である。そのような疾患としては、具体的には例えば動脈血栓症、静脈血栓症、播種性血管内凝固（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）症候群、敗血症等が挙げられる。
また本発明は、（ａ）本発明の抗体、および（ｂ）ＰＣおよび／またはａＰＣを含むキットを提供する。このキットは、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用することができる。さらに本発明は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患の予防または治療に使用されるキットであって、（ａ）ＰＣ、ａＰＣ、および本発明の抗体からなる群から選択される少なくとも一つ、および（ｂ）治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと該抗体とを併用することの記載または該記載へのリンクを含む記録媒体、を含むキットを提供する。このような疾患としては、上記のように血液凝固反応の亢進および／または炎症反応の亢進によって惹起される疾患が挙げられ、具体的には動脈血栓症、静脈血栓症、ＤＩＣ、敗血症等が含まれる。本キットは、内因的ａＰＣあるいは生体外から投与したＰＣまたはａＰＣの体内における活性を相対的に上昇させるために有用であり、これにより上記疾患の予防および治療を行うことができる。記録媒体としては、紙およびプラスチックなどの印刷媒体、フレキシブルディスク（ＦＤ）、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）、半導体メモリ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体など所望の記録媒体が挙げられる。典型的には、キットに添付される指示書などが挙げられ、そこに治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと本発明の抗体とを併用することが記載されているものであってよい。リンクとは、直接には治療有効量のＰＣおよび／またはａＰＣと該抗体とを併用することは記載されていないが、印などによって該記載と関連付けられていることを言い、その印を通して該記載にたどり着ける場合である。例えば指示書には別紙またはＵＲＬなどを参照するように指示または示唆する記載があり、別紙またはＵＲＬに該記載がある場合などが含まれる。このようなリンクは、３回までの参照（リンクの深さが３以内）で該記載までたどり着けることが好ましく、より好ましくは２回の参照（リンクの深さが２）、より好ましくは１回の参照（リンクの深さが１）である。
本発明の抗体は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の抗体はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明の抗体は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）、医薬的に許容される担体および／または添加物を供に含むものであってもよい。例えば界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸を含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｏｓｌｏ  Ｅｄ．（１９８０）等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）；米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３）；ＥＰ第１３３，９８８号）。
また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（Ａｄｏｌｐｈ『ウイルスゲノム法』，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（ＷＯ９３／１７７０６等）して投与することができる。しかしながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、添鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウイルス感染を利用して細胞に投与し、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＰＣＩ  ｃＤＮＡの塩基配列（タグなし）を示す図である。全長ＰＣＩ遺伝子の塩基配列を示した。動物細胞用発現ベクター（ｐＣＨＯＩ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入する目的で５’末端および３’末端にそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ認識配列（下線）を、さらに転写効率を上げるために開始コドンの手前にＫｏｚａｋ配列を付加してある。塩基配列を配列番号：４、アミノ酸配列を配列番号：５とした。
図２は、ＰＣＩ  ｃＤＮＡの塩基配列（ＦＬＡＧタグ付き）を示す図である。Ｆｌａｇタグ付きのＰＣＩ遺伝子の塩基配列を示した。動物細胞用発現ベクター（ｐＣＨＯ２−ＦＬＡＧ）のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に全長ＰＣＩをコードするｃＤＮＡを挿入することにより、全長ＰＣＩ遺伝子の３’側にＦｌａｇ配列（波線）を付加した。塩基配列を配列番号：６、アミノ酸配列を配列番号：７とした。
図３は、ＰＣＩ−ＦｌａｇおよびＰＣＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによる分析結果を示す写真である。（Ａ）ＰＣＩ−Ｆｌａｇ（レーン１および２）、または（Ｂ）タグなしのＰＣＩ（レーン３および４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブルー染色（レーン１および３）または抗ＰＣＩ抗体を用いたウェスタンブロッティング（レーン２および４）により検出した。
図４は、各抗ＰＣＩ抗体のａＰＣ／ＰＣＩおよびＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイにおける中和活性の比較を示す図である。白い円はａＰＣ／ＰＣＩアッセイ、黒い円はＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイの結果を表す。ＰＣＩ非添加時を１００％とし、ＰＣＩ添加で抗体非添加時を０％とした時の相対値で示した。
図５は、各抗ＰＣＩ中和抗体のＨ鎖のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１、２および３を囲みで示した。図中のアミノ酸配列は上から順に配列番号：８〜１４とした。
図６は、各抗ＰＣＩ中和抗体のＬ鎖のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ１、２および３を囲みで示した。図中のアミノ酸配列は上から順に配列番号：１５〜２１とした。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  ＰＣＩ発現ベクターの構築
１．１  ＰＣＩ遺伝子のクローニング
全長ＰＣＩ遺伝子のクローニングは以下のプライマーを用いたＰＣＲ法によって行った。
2004065418.tif 000002
Ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍａｒａｔｈｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型にして上記プライマーによりＰＣＲを行い、５’末端にＥｃｏＲＩ配列、３’末端にＢａｍＨＩ配列を持つ全ＯＲＦを含むヒトＰＣＩ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、動物細胞発現ベクターであるｐＣＨＯＩのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断部位に挿入した。ベクター中のＰＣＩ遺伝子について塩基配列を解析し、正しい配列を有したプラスミドを選別することでｐＣＨＯＩ−ＰＣＩベクター構築を完了した。（図１）
また、Ｆｌａｇタグ付きＰＣＩ（ＰＣＩ−Ｆｌａｇ）発現ベクターの構築は以下のとおり行った。ｐＣＨＯＩ−ＰＣＩベクターを鋳型にして、ＰＣＩ−ｕｐ及びＰＣＩ−ｌｏｗ２プライマーを用いてＰＣＲを行いＰＣＩ遺伝子の増幅を行った。
2004065418.tif 000003
このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、クローニングサイトの直後にＦｌａｇタグを持つ動物細胞発現ベクターｐＣＨＯＩＩ−ＦｌａｇのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ切断部位に挿入した。塩基配列を確認し、ｐＣＨＯＩＩ−ＰＣＩ−Ｆｌａｇの構築を完了した。（図２）
１．２  ＰＣＩおよびＰＣＩ−Ｆｌａｇ産生細胞株の樹立
ｐＣＨＯＩ−ＰＣＩ、ｐＣＨＯＩＩ−ＰＣＩ−ＦｌａｇをそれぞれＰｖｕＩで切断し、直鎖化を行った。このＤＮＡ３０μｇをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１株）にエレクトロポレーション法により導入した。その後、細胞を５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃１００９９−１４１）を添加したα（−）ＭＥＭ（核酸未含有）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃１２５６１−０５６）で培養し、ＰＣＩあるいはＰＣＩ−Ｆｌａｇ産生株の選抜を行った。この段階で得られた細胞株を、終濃度５０ｎＭとなるようにＭＴＸを加えた同培地で培養し、高産生細胞株を樹立した。ＰＣＩおよびＰＣＩ−Ｆｌａｇの発現は抗ＰＣＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＣＡＴ＃ＧＡＰＣＩ−ＩＧ）を用いて確認した。
［実施例２］  ＰＣＩ−Ｆｌａｇの精製
ＰＣＩ−Ｆｌａｇ高発現ＣＨＯ株を、ローラーボトル（１７００ｃｍ２）を用いて、５％ＦＢＳを添加したα（−）ＭＥＭ（核酸未含有）培地中で培養を行った。細胞がコンフルエントになるまで培養（３７℃、０．５ｒｐｍ）した後、培地除去およびＰＢＳによる洗浄を行い、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  ＣＡＴ＃１２０５２−０９８）を添加し７２時間培養した。得られた培養上清は、遠心分離により細胞破砕物を除去後、０．４５μｍフィルターによりろ過して以下の精製に用いた。培養上清を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０７１９−０１）に添加し、洗浄後、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液により溶出した。溶出画分をＮａＣｌ濃度が２００ｍＭとなるよう希釈し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＡｎｔｉ−Ｆｌａｇ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌカラム（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃Ａ−２２２０）に添加した。溶出は０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）により行い、溶出画分は１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて、直ちに中和した。次に、ＰＣＩ−Ｆｌａｇを含む画分を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに添加後、４００ｍＭのＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出を行うことにより溶媒置換を行った。さらにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３（Ａｍｉｃｏｎ）による限外ろ過濃縮を行い、ＰＣＩ−Ｆｌａｇを調製した。精製タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したのち、クマシー染色、およびＰＶＤＦ膜へ転写し、抗ＰＣＩ抗体によるウエスタン解析により確認した。（図３Ａ）
［実施例３］  ＰＣＩの精製
ＰＣＩ高発現ＣＨＯ株を、上記同様の方法にてローラーボトル（１７００ｃｍ２）を用い、培養上清を調製した。培養上清を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＣＭ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに添加し、洗浄後、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む同緩衝液により溶出した。次に、ＰＣＩを含む画分を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０４０７−０１）カラムに添加し、段階的にＮａＣｌ濃度（０ｍＭから１０００ｍＭ）を上昇させることにより溶出を行った。溶出画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−１０７１−０１）に添加し、分子量に従って分画した。溶媒には０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を用いた。これを２回繰り返し、ＰＣＩを精製した。精製タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離したのち、クマシー染色およびＰＶＤＦ膜へ転写し抗ＰＣＩ抗体によるウエスタン解析で確認した。（図３Ｂ）
［実施例４］  ＰＣＩに対する中和活性を持つ抗ＰＣＩ抗体の作製
４．１  免疫及びハイブリドーマの作製
ＰＣＩ−Ｆｌａｇを免疫抗原として、Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、１３週齢、日本チャールズリバー）５匹に定法に従い免疫を行った。初回免疫には抗原を１００μｇ／ｈｅａｄとなるように調製し、ＦＣＡ｛フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１）｝を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与し、２週間後に５０μｇ／ｈｅａｄとなるように調製したものをＦＩＡ｛フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０）｝でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降、２週間間隔で追加免疫を合計５回行い、最終免疫については５０μｇ／ｈｅａｄとなるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内または皮下に投与した。ＰＣＩを０．５μｇ／ｍｌ，１００μｌ／ｗｅｌｌでコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＰＣＩに対する血清中の抗体価が上昇しているのを確認後、Ｎｏ．２マウスは尾静脈内、Ｎｏ．４マウスは皮下に最終免疫を施し、定法に従い、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。それぞれマウス由来のハイブリドーマは９６穴培養プレート１６枚ずつ培養した。フュージョン翌日よりＨＡＴ培地｛１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０／１ｘ  ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ  ＣＡＴ＃  Ｈ−０２６２）／４％  ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ  ＣＡＴ＃  １０８８９４７）｝で選択を開始し、フュージョン後１０日目に培養上清を回収しＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡスクリーニングは前述の抗体価測定と同様にＰＣＩを０．５μｇ／ｍｌ，１００μｌ／ｗｅｌｌでコートしたイムノプレートを用いて行った。
４．２  スクリーニング
４．２．１  ＥＬＩＳＡ
ＰＣＩを用いたＥＬＩＳＡスクリーニングにより陽性ウェルを選択した。選択した陽性ウェルは２４ウェルプレートに拡大した後、限界希釈法（１陽性ウェルの細胞１００個を９６ウェルプレート１枚に播き込む）によりクローニングした。クローニングしたハイブリドーマを拡大培養し、培養上清から抗体の精製を行った。２９０個の陽性ウェルを選択し２４ウェルプレートに拡大した後、１次スクリーニングでＯＤ値の高かった方から１１１個を選び、限界希釈法によりクローニングを行った。限界希釈を行わなかった１７９個は培養上清を回収し、細胞の保存のみを行った。１１１個の限界希釈を行ったウェルから最終的に抗体を安定に産生する８１クローンを樹立した。
４．２．２  ａＰＣ／ＰＣＩアッセイ
ａＰＣ／ＰＣＩアッセイによるＰＣＩに対する中和活性の測定法は、反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１％  ＢＳＡ，５Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ）にハイブリドーマの培養上清または精製抗体、及び５μｇ／ｍｌ  ＰＣＩを添加して３７℃、３０分加温した。０．２５μｇ／ｍｌ  ａＰＣを添加してさらに３７℃、３０分加温した。０．４ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ａＰＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．）を添加し室温で２時間反応させた後、４０５ｎｍで比色した。（以上、表示濃度はすべて最終濃度）。単一クローン化したハイブリドーマの培養上清８１検体について、ａＰＣ／ＰＣＩアッセイを行い、ＰＣＩ活性が中和されることによりａＰＣ活性が回復されるクローンの選抜を行った。ＰＣＩに対する中和活性が強かったクローンから順番に１６クローンを選択し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムにて抗体の精製を行った。精製した抗体を用いて、ａＰＣ／ＰＣＩアッセイを行ったところ、１６クローン中８クローンに抗体の用量に依存した強い中和活性が確認された。これらのうち７クローンの用量依存曲線を図４に示した。
４．２．３  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｔｈｒ）／Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ（ＴＭ）／ＰＣＩアッセイ
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｔｈｒ）／Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ（ＴＭ）／ＰＣＩアッセイによるＰＣＩに対する中和活性の測定法は、反応液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．１％ＢＳＡ，５Ｕ／ｍｌ  Ｈｅｐａｒｉｎ）に精製抗体、５μｇ／ｍｌ  ＰＣＩ、２ｎＭ  Ｔｈｒ、１０ｎＭ  ＴＭを添加して３７℃、３０分加温した。０．７３μｇ／ｍｌ  ＰＣを添加してさらに３７℃、５０分加温した後、０．８７５μｇ／ｍｌ  ａｒｇａｔｈｒｏｂａｎを加えて反応を停止した。０．４ｍＭ  Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ  ａＰＣを添加し室温で２時間反応させた後、４０５ｎｍで比色した。（以上、表示濃度はすべて最終濃度）。
精製した抗体でａＰＣ／ＰＣＩアッセイにて中和活性が確認された７クローンについてＴｈｒ／ＴＭ／ＰＣＩアッセイを行った。その結果、７クローン中３クローン（ＰＣ３１Ｅ２、ＰＣ３１Ｆ１、およびＰＣ３０Ｇ１）について用量に依存した強い中和活性が確認された（図４）。
４．３  抗体精製
アイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂであった抗体は、それぞれハイブリドーマ培養上清を２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃  １７−０４０４−０１）に添加し、洗浄後、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出することにより精製した。溶出画分は１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９．０）で直ちに中和を行った。抗体を含む画分をプールした後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで一昼夜、透析を行い溶媒置換後、０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した。
４．４  抗ＰＣＩ抗体のアイソタイプ解析
抗ＰＣＩ抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。樹立した抗ＰＣＩ抗体８１クローンについてアイソタイプ解析をしたところ、ＩｇＧ１が７０クローン、ＩｇＧ２ａが６クローン、ＩｇＧ２ｂが４クローン、ＩｇＭが１クローンであった。
４．５  ＢＩＡＣＯＲＥによる抗ＰＣＩ抗体の速度論的解析
１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で２５μｇ／ｍｌに希釈したＰＣＩ−Ｆｌａｇを用いて、アミンカップリングキット（ＢＩＡＣＯＲＥ社、ＢＲ−１０００−５０）に記載された方法にて、センサーチップＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社、ＢＲ−１０００−１４）にアミンカップリングした。この操作にて約３０００ＲＵのＰＣＩ−Ｆｌａｇが、ＣＭ５チップ上に固定化された。このセンサーチップを用いてＢＩＡＣＯＲＥ２０００により以下の速度論的解析を行った。各抗ＰＣＩ抗体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＢＩＡＣＯＲＥ社、ＢＲ−１００１−８８）にて希釈して、１．２５、２．５、５、１０、２０μｇ／ｍｌになるように調製した。チップをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で平衡化後、流速２０μｌ／ｍｉｎにて各濃度の抗体４０μｌを添加した。抗体を添加中の２分間を結合相とし、その後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に切り換え、２分間を解離相とした。解離相終了後、４０μｌの１０ｍＭ塩酸、及び４０μｌの０．０５％ＳＤＳを連続して添加することにより、センサーチップを再生した。この操作により得られたセンサーグラムを重ね書きし、データ解析用ソフト（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ｖｅｒ．３．０）にて結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、解離定数（ＫＤ）、最大結合量（Ｒｍａｘ）を算出した。
精製抗体を用いたａＰＣ／ＰＣＩアッセイにてＰＣＩに対する強い中和活性の認められた８つのクローンについてＢＩＡＣＯＲＥによる速度論的解析を行った結果、解離定数が１０−９〜１０−１０Ｍで比較的高親和性の抗体が多く含まれていることが明らかとなった。表１に得られたクローンの抗ＰＣＩ抗体の性質をまとめた。
2004065418.tif 000004
［実施例５］  抗ＰＣＩ中和抗体のＨ鎖及びＬ鎖の解析
各抗体を産生するハイブリドーマ約１×１０７個の細胞よりＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ．Ｎｏ．７４９０４）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行った。ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１８１１−１）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡの合成を行った。ＰＣ１９Ｇ８、ＰＣ３０Ｇ１、ＰＣ３１Ｅ２、ＰＣ３１Ｆ１、ＰＣ３９Ｃ６はＩｇＧ１の定常領域特異的なプライマー、またＰＣ２３Ａ７、ＰＣ２３Ｄ８はＩｇＧ２ａの定常領域特異的なプライマーを用いてＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  Ｋｉｔにて５’−ＲＡＣＥによるＰＣＲを行い、Ｈ鎖及びＬ鎖の増幅を行った。増幅されたＨ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）を用いてクローニングし、塩基配列の決定を行った。
得られた塩基配列を解析した結果、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ図５及び６に示したようになった。ＰＣ１９Ｇ８、ＰＣ２３Ｄ８はアミノ酸配列が一致したことから、同一クローン由来の抗体であることが予測された。ただし、Ｉｓｏｔｙｐｅは、ＰＣ１９Ｇ８はＩｇＧ１でＰＣ２３Ｄ８はＩｇＧ２ａであったので、クラススイッチが起きたと考えられた。ＰＣ２３Ａ７及びＰＣ３９Ｃ６は上記２クローンの抗体に類似した配列を有しており、これら４クローンの抗体のエピトープが近傍にあることが予測された。一方、ＰＣ３０Ｇ１とＰＣ３１Ｆ１の配列は、前述の４クローンの抗体との類似性は低かったが、これら２クローンは類似の配列を有していたのでお互いのエピトープは近いことが予測された。ＰＣ３１Ｅ２の配列に関しては他の６クローンとは類似性が低いことが明らかとなった。ＰＣ１９Ｇ８、ＰＣ２３Ａ７、ＰＣ２３Ｄ８、ＰＣ３９Ｃ６はａＰＣ−ＰＣＩ系のみ、またＰＣ３０Ｇ１、ＰＣ３１Ｅ２、ＰＣ３１Ｆ１はａＰＣ−ＰＣＩ系及びＴｈｒ−ＴＭ−ＰＣＩ系の両方を抑制することから、配列上のグループ分けがＰＣＩに対する中和活性の様式にほぼ反映していることが推察された。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ＰＣＩに対し中和作用を有する抗ＰＣＩ抗体が提供された。本発明の抗体は、ａＰＣの生成および酵素活性を阻害するＰＣＩに対して、その活性を阻害するように働くことを通してａＰＣの活性を維持し、血液凝固系の活性化の抑制または抗炎症作用などのａＰＣの生理活性の効果を持続させる働きを有する。本発明の抗体は、活性化プロテインＣの活性の低下ないしは不足によって発症および／または進展する疾患または傷害の予防または治療に用いることができ、特に血栓症および敗血症などのａＰＣによる予防および治療において有用である。
【配列表】
2004065418.tif 000005
2004065418.tif 000006
2004065418.tif 000007
2004065418.tif 000008
2004065418.tif 000009
2004065418.tif 000010
2004065418.tif 000011
2004065418.tif 000012
2004065418.tif 000013
2004065418.tif 000014
2004065418.tif 000015
2004065418.tif 000016
2004065418.tif 000017
2004065418.tif 000018
2004065418.tif 000019
2004065418.tif 000020
2004065418.tif 000021
2004065418.tif 000022
2004065418.tif 000023
2004065418.tif 000024
2004065418.tif 000025
2004065418.tif 000026
2004065418.tif 000027
2004065418.tif 000028
2004065418.tif 000029
2004065418.tif 000030
2004065418.tif 000031
2004065418.tif 000032
2004065418.tif 000033
2004065418.tif 000034
2004065418.tif 000035
2004065418.tif 000036
2004065418.tif 000037
2004065418.tif 000038
2004065418.tif 000039
2004065418.tif 000040
2004065418.tif 000041
2004065418.tif 000042
2004065418.tif 000043
2004065418.tif 000044
【図１】
2004065418.tif 000045
【図２】
2004065418.tif 000046
【図３】
2004065418.tif 000047
【図４】
2004065418.tif 000048
【図５】
2004065418.tif 000049
【図６】
2004065418.tif 000050
【国際調査報告】
2004065418.tif 000051
2004065418.tif 000052
2004065418.tif 000053
2004065418.tif 000054
2004065418.tif 000055
2004065418.tif 000056
2004065418.tif 000057