(57)【要約】ｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質ならびにそれを利用した阻害剤、およびｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質を利用した相互作用の検出方法及びスクリーニング方法を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス（ＩＶＶ）の共翻訳スクリーニングおよびＣ末端ラベル化法を用いて、ｃ−Ｆｏｓをベイトとして、マウス脳のｃＤＮＡライブラリーから転写制御因子複合体解析を網羅的に行い、これまで知られていなかった蛋白質、又は蛋白質としては公知であったが、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成することは知られていなかった蛋白質などを解析する。
2004053121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項２】
配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１又は２記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列を含む請求項４記載の核酸。
【請求項６】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、請求項１〜２のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
【請求項７】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、請求項１〜２のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項９】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１０】
有効成分の蛋白質が配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項９記載の阻害剤。
【請求項１１】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項９記載の阻害剤。
（ａ）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１２】
核酸が配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む請求項１１記載の阻害剤。
【請求項１３】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１４】
蛋白質が配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
核酸が配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１７】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１８】
有効成分の蛋白質が配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項１７記載の阻害剤。
【請求項１９】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項１７記載の阻害剤。
（ａ）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項２０】
核酸が配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む請求項１９記載の阻害剤。
【請求項２１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項２２】
蛋白質が配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
核酸が配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項２５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項２６】
配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項２５記載の蛋白質。
【請求項２７】
請求項２５又は２６記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項２８】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項２９】
配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列を含む請求項２８記載の核酸。
【請求項３０】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
【請求項３１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項３３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項３４】
配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項３３記載の蛋白質。
【請求項３５】
請求項３３又は３４記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項３６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項３７】
配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列を含む請求項４記載の核酸。
【請求項３８】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
【請求項３９】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項４１】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項４２】
有効成分の蛋白質が配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項４１記載の阻害剤。
【請求項４３】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項４１記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項４４】
核酸が配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む請求項４３記載の阻害剤。
【請求項４５】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項４６】
蛋白質が配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
核酸が配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項４９】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項５０】
有効成分の蛋白質が配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項４９記載の阻害剤。
【請求項５１】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項４９記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項５２】
核酸が配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む請求項５１記載の阻害剤。
【請求項５３】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項５４】
蛋白質が配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
核酸が配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項５７】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項５８】
有効成分の蛋白質が配列番号８５又は８６のアミノ酸配列を含む請求項５７記載の阻害剤。
【請求項５９】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項５７記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項６０】
核酸が配列番号１４９又は１５０の塩基配列を含む請求項５９記載の阻害剤。
【請求項６１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項６２】
蛋白質が配列番号８５又は８６のアミノ酸配列を含む請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
核酸が配列番号１４９又は１５０の塩基配列を含む請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項６５】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項６６】
有効成分の蛋白質が配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む請求項６５記載の阻害剤。
【請求項６７】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項６５記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項６８】
核酸が配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む請求項６７記載の阻害剤。
【請求項６９】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７０】
蛋白質が配列番号８７〜８９のアミノ酸配列を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
核酸が配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
請求項６９〜７１のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項７３】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項７４】
有効成分の蛋白質が配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む請求項７３記載の阻害剤。
【請求項７５】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項７４記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７６】
核酸が配列番号１５４又は１５５の塩基配列を含む請求項７５記載の阻害剤。
【請求項７７】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項７８】
蛋白質が配列番号９０又は９１のアミノ酸配列を含む請求項６９記載の方法。
【請求項７９】
核酸が配列番号１５４又は１５５の塩基配列を含む請求項７０記載の方法。
【請求項８０】
請求項７７〜７９のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項８１】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項８２】
有効成分の蛋白質が配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含む請求項８１記載の阻害剤。
【請求項８３】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項８２記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８４】
核酸が配列番号１５６又は１５７の塩基配列を含む請求項８３記載の阻害剤。
【請求項８５】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８６】
蛋白質が配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含む請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
核酸が配列番号１５６又は１５７の塩基配列を含む請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
請求項８５〜８７のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項８９】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項９０】
有効成分の蛋白質が配列番号９４又は９５のアミノ酸配列を含む請求項８９記載の阻害剤。
【請求項９１】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項９０記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項９２】
核酸が配列番号１５８又は１５９の塩基配列を含む請求項８３記載の阻害剤。
【請求項９３】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項９４】
蛋白質が配列番号９４又は９５のアミノ酸配列を含む請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
核酸が配列番号１５８又は１５９の塩基配列を含む請求項９３記載の方法。
【請求項９６】
請求項９３〜９５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項９７】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項９８】
有効成分の蛋白質が配列番号９６又は９７のアミノ酸配列を含む請求項９７記載の阻害剤。
【請求項９９】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項９８記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１００】
核酸が配列番号１６０又は１６１の塩基配列を含む請求項９９記載の阻害剤。
【請求項１０１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１０２】
蛋白質が配列番号９６又は９７のアミノ酸配列を含む請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
核酸が配列番号１６０又は１６１の塩基配列を含む請求項１０１記載の方法。
【請求項１０４】
請求項１０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１０５】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１０６】
有効成分の蛋白質が配列番号９８又は９９のアミノ酸配列を含む請求項１０５記載の阻害剤。
【請求項１０７】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項９８記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１０８】
核酸が配列番号１６２又は１６３の塩基配列を含む請求項１０７記載の阻害剤。
【請求項１０９】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１１０】
蛋白質が配列番号９８又は９９のアミノ酸配列を含む請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
核酸が配列番号１６２又は１６３の塩基配列を含む請求項１０９記載の方法。
【請求項１１２】
請求項１０９〜１１１のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１１３】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１１４】
有効成分の蛋白質が配列番号１００又は１０１のアミノ酸配列を含む請求項１１３記載の阻害剤。
【請求項１１５】
蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である請求項１１４記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１１６】
核酸が配列番号１６４又は１６５の塩基配列を含む請求項１１５記載の阻害剤。
【請求項１１７】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１１８】
蛋白質が配列番号１００又は１０１のアミノ酸配列を含む請求項１１７記載の方法。
【請求項１１９】
核酸が配列番号１６４又は１６５の塩基配列を含む請求項１１７記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１１７〜１１９のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１２１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１０２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１２２】
請求項１０２記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項１２３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１６６の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１２４】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、請求項１２１に記載の蛋白質、又は請求項１２２〜１２３のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
【請求項１２５】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、請求項１２１に記載の蛋白質、又は請求項１２２〜１２３のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
【請求項１２６】
請求項１２５記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【請求項１２７】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
【請求項１２８】
請求項１２７記載の蛋白質をコードする核酸。
【請求項１２９】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１６７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
【請求項１３０】
ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、請求項１２７に記載の蛋白質、又は請求項１２８〜１２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
【請求項１３１】
ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、請求項１２７に記載の蛋白質、又は請求項１２８〜１２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
【請求項１３２】
請求項１３１記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質及びそれをコードする核酸ならびにそれらを利用した阻害剤、ならびに、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質を利用した相互作用の検出方法及びスクリーニング方法に関する。
現在、多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。ゲノムシーケンスの研究では、第２幕のポストシーケンスの研究として、解読したゲノム情報からその意味を解析する研究、すなわち、遺伝子や蛋白質の構造や機能解析（非特許文献１、非特許文献２）、および蛋白質間、核酸−蛋白質間相互作用解析などが期待されている（非特許文献３、非特許文献４）。
以上のような技術を駆使したポストゲノム機能解析によって、蛋白質間および蛋白質−核酸間などの相互作用ネットワーク解析から公知の蛋白質の新たな機能やこれまで知られていなかった新規の蛋白質などの重要な生体酵素の発見による医薬品の創製などが期待されている。
蛋白質間相互作用の検出方法として、これまで免疫沈降（非特許文献５）、ＧＳＴ融合蛋白質によるプルダウン・アッセイ（非特許文献６）、ＴＡＰ法（非特許文献７）、酵母ツーハイブリッド法（非特許文献８）などが知られている。一方、進化分子工学のツールとして誕生した「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表現型）の対応付け」を応用して、ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作用を網羅的に解析する方法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法（非特許文献９、非特許文献１０、特許文献１、特許文献２）、ＳＴＡＢＬＥ法（非特許文献１１）、ファージディスプレー法（非特許文献１２）、リボソーム・ディスプレイ法（非特許文献１３、特許文献３）、ｍＲＮＡ−ペプチドヒュージョン（ｍＲＮＡディスプレイ）法（非特許文献１４）などである。
さらに、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動法、蛍光偏光解消法、エバネッセント場イメージング法、蛍光相関分光法、蛍光イメージング法、固相酵素免疫検定法などが知られている。また、ピューロマイシン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中で蛋白質のＣ末端を修飾する方法（特許文献４、特許文献５）を先に提案している。これらの方法は、従来の化学修飾法や蛍光蛋白質融合法に比べて、蛋白質の機能を損ないにくい等の利点がある。
生命科学の領域ではヒトゲノムの配列解析が終了し、ゲノム研究は遺伝子の機能解析のポストゲノム時代に突入し、網羅的なゲノム機能解析による創薬などが期待されている。これまで単独で研究されていた遺伝子や蛋白質を網羅的に解析できる手法、たとえば、創薬のターゲット蛋白質である転写制御因子の種種のコファクターなどを一度に解析する手法などが所望されている。転写制御因子としては、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質がよく知られている。
ここで、ｖ−ｆｏｓ遺伝子は、ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＪ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）のもつ癌遺伝子として単離された（非特許文献１５）。ｃ−ｆｏｓは、典型的な極初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ）として、多くの細胞種で増殖刺激に伴って検出される転写制御因子である。Ｆｏｓ関連抗原（Ｆｏｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ｆｒａ）からｆｒａ−１とｆｒａ−２がクローニングされ、またｃ−ｆｏｓと塩基配列に相同性のある遺伝子としてｆｏｓＢも見出された。これらはｃ−ｆｏｓとともにｆｏｓファミリー遺伝子を構成する。ｃ−ｆｏｓを高レベルで発現するキメラマウスとトランスジェニックマウスは、それぞれ軟骨腫や骨肉腫を形成することが知られている（非特許文献１６）。
これまでに、ｃ−ｆｏｓと相互作用する遺伝子として、ｊｕｎファミリー遺伝子であるｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、ｊｕｎＤなどいろいろな蛋白質が知られているが（非特許文献１７）、最近、ツーハイブリッド法によって、転写制御因子Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ＡＰ−１）がＳＷＩ／ＳＮＦのＢＡＦ６０ａと複合体を形成して、クロマチンのリモデリングを誘導することがわかった。また、ＡＰ−１は、脳神経系の蛋白質であるＮＦＡＴと結合してＩＬ２遺伝子の発現を制御することがわかった。前者は、腫瘍形成・癌化に関わり、後者は、自己免疫疾患やアルツハイマーに関わる全く異なる疾患を誘発する二つの蛋白質である。このように、転写制御因子のいろいろな複合体の網羅的解析は、創薬のターゲット蛋白質の新たな宝庫として大変興味深い。しかしながら、ツーハイブリッド法のような総当たり的な１：１分子解析手法では、大変な時間と労力がかかる。
【非特許文献１】  Ｓａｅｇｕｓａ  Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，６７５１（１９９９）
【非特許文献２】  Ｄａｌｔｏｎ  Ｒ，Ａｂｂｏｔｔ  Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，６７６３（１９９９）
【非特許文献３】  宮本悦子、柳川弘志（２０００）シリーズ・ポストシークエンスのゲノム科学３：プロテオミクス，ｐｐ．１３６−１４５
【非特許文献４】  宮本悦子、柳川弘志（２００１）蛋白質・核酸・酵素、４６（２），ｐｐ．１３８−１４７）
【非特許文献５】  Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，７０１−７０４
【非特許文献６】  Ｋａｅｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｃｅｌｌ  ６４，５２１−５３２
【非特許文献７】  Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｒｉｇａｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，１０３０（１９９９）
【非特許文献８】  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｓ，Ｓｏｎｇ  Ｏ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４０，２４５（１９８９）
【非特許文献９】  Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  ２５，３５（１９９７）
【非特許文献１０】  Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）
【特許文献１】  国際公開第ＷＯ９８／１６６３６号パンフレット
【特許文献２】  国際公開第ＷＯ０２／４６３９５号パンフレット
【非特許文献１１】  Ｄｏｉ  Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５７，２２７（１９９９）
【非特許文献１２】  Ｓｍｉｔｈ  Ｇ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１３１５（１９８５）
【非特許文献１３】  Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，９０２２−９０２６
【特許文献３】  国際公開第ＷＯ９５／１１９２２号パンフレット
【非特許文献１４】  Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７
【特許文献４】  米国特許第６，２２８，９９４号明細書
【特許文献５】  国際公開第ＷＯ０２／４８３４７号パンフレット
【非特許文献１５】  Ｃｕｒｒａｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｖｉｏｌ．，４４：６７４−６８２，１９８２
【非特許文献１６】  Ａｇａｍｅｍｕｎｏｎ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．：Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１１：４３６−４４１，１９９５
【非特許文献１７】  Ｙｕｒｉｉ  Ｃｈｉｎｅｎｏｖ１  ａｎｄ  Ｔｏｍ  Ｋ  Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０，２４３８−２４５２
【発明の開示】
本発明は、転写制御因子として良く知られているｃ−Ｆｏｓ蛋白質をターゲット蛋白として、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する複合体を提供することを課題とする。
本発明者らは、それに代わる１：多分子解析法である網羅的解析手法として、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法を土台とし、これまでに研究を重ねてきたピューロマイシンテクノロジーと命名した二つの技術、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス（ＩＶＶ）の共翻訳セレクション／スクリーニングおよびＣ末端ラベル化法（米国特許第６２２８９９４号、ＷＯ  ０２／４８３４７）を用いて、ｃ−Ｆｏｓをベイトとして、マウス脳のｃＤＮＡライブラリーから転写制御因子複合体解析を網羅的に行い、これまで知られていなかった蛋白質、あるいは蛋白質としては公知であったが、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成することは知られていなかった蛋白質などを解析することを試みた。ここで複合体を形成するとは、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と直接又は間接的な相互作用がある蛋白質である。
本発明の課題は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質ならびにそれを利用した阻害剤、およびｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質を利用した相互作用の検出方法及びスクリーニング方法を提供することである。
本発明者らは、共翻訳スクリーニングにより、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する新規蛋白質を見出すとともに、既知の蛋白質がｃ−Ｆｏｓと相互作用することを見出し、本発明を完成した。本発明は、以下のものを提供する。
１．  以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
２．  配列番号１〜１４のいずれかのアミノ酸配列を含む１記載の蛋白質。
３．  １又は２記載の蛋白質をコードする核酸。
４．  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
５．  配列番号２３〜３８のいずれかの塩基配列を含む４記載の核酸。
６．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、１〜２のいずれか１項に記載の蛋白質、又は３〜５のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
７．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、１〜２のいずれか１項に記載の蛋白質、又は３〜５のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
８．  ７記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
９．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１０．  有効成分の蛋白質が配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む９記載の阻害剤。
１１．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である９記載の阻害剤。
（ａ）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１２．  核酸が配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む１１記載の阻害剤。
１３．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１４．  蛋白質が配列番号１５〜１９のいずれかのアミノ酸配列を含む１３記載の方法。
１５．  核酸が配列番号３９〜４３のいずれかの塩基配列を含む１３記載の方法。
１６．  １３〜１５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
１７．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１８．  有効成分の蛋白質が配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む１７記載の阻害剤。
１９．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である１７記載の阻害剤。
（ａ）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
２０．  核酸が配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む１９記載の阻害剤。
２１．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
２２．  蛋白質が配列番号２０〜２２のいずれかのアミノ酸配列を含む２１記載の方法。
２３．  核酸が配列番号４４〜４６のいずれかの塩基配列を含む２１記載の方法。
２４．  ２１〜２３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
２５．  以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
２６．  配列番号４７〜５６のいずれかのアミノ酸配列を含む２５記載の蛋白質。
２７．  ２５又は２６記載の蛋白質をコードする核酸。
２８．  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
２９．  配列番号１０４〜１１８のいずれかの塩基配列を含む２８記載の核酸。
３０．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、２５〜２６のいずれか１項に記載の蛋白質、又は２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
３１．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、２５〜２６のいずれか１項に記載の蛋白質、又は２７〜２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
３２．  ３１記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
３３．  以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
３４．  配列番号５７〜７６のいずれかのアミノ酸配列を含む３３記載の蛋白質。
３５．  ３３又は３４記載の蛋白質をコードする核酸。
３６．  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
３７．  配列番号１１９〜１４０のいずれかの塩基配列を含む４記載の核酸。
３８．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、３３〜３４のいずれか１項に記載の蛋白質、又は３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
３９．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、３３〜３４のいずれか１項に記載の蛋白質、又は３５〜３７のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
４０．  ３９記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
４１．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
４２．  有効成分の蛋白質が配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む４１記載の阻害剤。
４３．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である４１記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
４４．  核酸が配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む４３記載の阻害剤。
４５．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
４６．  蛋白質が配列番号７７〜８１のいずれかのアミノ酸配列を含む４５記載の方法。
４７．  核酸が配列番号１４１〜１４５のいずれかの塩基配列を含む４５記載の方法。
４８．  ４５〜４７のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
４９．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
５０．  有効成分の蛋白質が配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む４９記載の阻害剤。
５１．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である４９記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
５２．  核酸が配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む５１記載の阻害剤。
５３．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
５４．  蛋白質が配列番号８２〜８４のいずれかのアミノ酸配列を含む５３記載の方法。
５５．  核酸が配列番号１４６〜１４８のいずれかの塩基配列を含む５３記載の方法。
５６．  ５３〜５５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
５７．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
５８．  有効成分の蛋白質が配列番号８５又は８６のアミノ酸配列を含む５７記載の阻害剤。
５９．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である５７記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
６０．  核酸が配列番号１４９又は１５０の塩基配列を含む５９記載の阻害剤。
６１．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１４９もしくは１５０の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
６２．  蛋白質が配列番号８５又は８６のアミノ酸配列を含む６１記載の方法。
６３．  核酸が配列番号１４９又は１５０の塩基配列を含む６１記載の方法。
６４．  ６１〜６３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
６５．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
６６．  有効成分の蛋白質が配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む６５記載の阻害剤。
６７．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である６５記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
６８．  核酸が配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む６７記載の阻害剤。
６９．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号８７〜８９のいずれかのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
７０．  蛋白質が配列番号８７〜８９のアミノ酸配列を含む６９記載の方法。
７１．  核酸が配列番号１５１〜１５３のいずれかの塩基配列を含む７０記載の方法。
７２．  ６９〜７１のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
７３．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
７４．  有効成分の蛋白質が配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む７３記載の阻害剤。
７５．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である７４記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
７６．  核酸が配列番号１５４又は１５５の塩基配列を含む７５記載の阻害剤。
７７．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９０もしくは９１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５４もしくは１５５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
７８．  蛋白質が配列番号９０又は９１のアミノ酸配列を含む６９記載の方法。
７９．  核酸が配列番号１５４又は１５５の塩基配列を含む７０記載の方法。
８０．  ７７〜７９のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
８１．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
８２．  有効成分の蛋白質が配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含む８１記載の阻害剤。
８３．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である８２記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
８４．  核酸が配列番号１５６又は１５７の塩基配列を含む８３記載の阻害剤。
８５．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９２もしくは９３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５６もしくは１５７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
８６．  蛋白質が配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含む８５記載の方法。
８７．  核酸が配列番号１５６又は１５７の塩基配列を含む８５記載の方法。
８８．  ８５〜８７のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
８９．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
９０．  有効成分の蛋白質が配列番号９４又は９５のアミノ酸配列を含む８９記載の阻害剤。
９１．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である９０記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
９２．  核酸が配列番号１５８又は１５９の塩基配列を含む８３記載の阻害剤。
９３．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９４もしくは９５のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１５８もしくは１５９の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
９４．  蛋白質が配列番号９４又は９５のアミノ酸配列を含む９３記載の方法。
９５．  核酸が配列番号１５８又は１５９の塩基配列を含む９３記載の方法。
９６．  ９３〜９５のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
９７．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
９８．  有効成分の蛋白質が配列番号９６又は９７のアミノ酸配列を含む９７記載の阻害剤。
９９．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である９８記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１００．  核酸が配列番号１６０又は１６１の塩基配列を含む９９記載の阻害剤。
１０１．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９６もしくは９７のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６０もしくは１６１の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１０２．  蛋白質が配列番号９６又は９７のアミノ酸配列を含む１０１記載の方法。
１０３．  核酸が配列番号１６０又は１６１の塩基配列を含む１０１記載の方法。
１０４．  １０１〜１０３のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
１０５．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１０６．  有効成分の蛋白質が配列番号９８又は９９のアミノ酸配列を含む１０５記載の阻害剤。
１０７．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である９８記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１０８．  核酸が配列番号１６２又は１６３の塩基配列を含む１０７記載の阻害剤。
１０９．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号９８もしくは９９のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６２もしくは１６３の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１１０．  蛋白質が配列番号９８又は９９のアミノ酸配列を含む１０９記載の方法。
１１１．  核酸が配列番号１６２又は１６３の塩基配列を含む１０９記載の方法。
１１２．  １０９〜１１１のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
１１３．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
（ａ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１１４．  有効成分の蛋白質が配列番号１００又は１０１のアミノ酸配列を含む１１３記載の阻害剤。
１１５．  蛋白質が以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸から翻訳された蛋白質である１１４記載の阻害剤。
（ａ）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１１６．  核酸が配列番号１６４又は１６５の塩基配列を含む１１５記載の阻害剤。
１１７．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、以下の（ａ）もしくは（ｂ）の蛋白質、又は以下の（ａ’）もしくは（ｂ’）の核酸から翻訳された蛋白質である前記方法。
（ａ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１００もしくは１０１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
（ａ’）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列を含む核酸。
（ｂ’）配列番号１６４もしくは１６５の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１１８．  蛋白質が配列番号１００又は１０１のアミノ酸配列を含む１１７記載の方法。
１１９．  核酸が配列番号１６４又は１６５の塩基配列を含む１１７記載の方法。
１２０．  １１７〜１１９のいずれか１項に記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
１２１．  以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１０２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１２２．  １０２記載の蛋白質をコードする核酸。
１２３．  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１６６の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６６の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１２４．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、１２１に記載の蛋白質、又は１２２〜１２３のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
１２５．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、１２１に記載の蛋白質、又は１２２〜１２３のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
１２６．  １２５記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
１２７．  以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ）配列番号１０３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質。
１２８．  １２７記載の蛋白質をコードする核酸。
１２９．  以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１６７の塩基配列を含む核酸。
（ｂ）配列番号１６７の塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸。
１３０．  ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質と、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用の阻害剤であって、１２７に記載の蛋白質、又は１２８〜１２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳された蛋白質を有効成分とする前記阻害剤。
１３１．  ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出方法であって、ベイトが、１２７に記載の蛋白質、又は１２８〜１２９のいずれか１項に記載の核酸から翻訳する工程を含む蛋白質である前記方法。
１３２．  １３１記載の方法によりベイトとプレイとの間の相互作用を検出する工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイのスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】  図１Ａ及び図１Ｂは、本発明の蛋白質のアミノ酸配列と遺伝子配列などの情報をまとめて示す。ＤＮＡ配列番号の括弧内の数字は、それがコードするアミノ酸配列の番号を示す。枝番のあるものは、同じアミノ酸配列をコードするが、塩基配列が異なることを示す。図１Ａの配列番号１〜２２；実施例１。図１Ａの配列番号４７〜７６及び図１Ｂの配列番号７７〜１０３；実施例２。
図２は、本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の検出方法であるＩＶＶランダムライブラリーによる共翻訳スクリーニング法の概略を示す。マウス脳のＩＶＶランダムライブラリーとベイトとしてｃ−Ｆｏｓを用いて、無細胞共翻訳スクリーニングを行い、スクリーニング後のライブラリーをＲＴ−ＰＣＲで増幅して再びベイトと共に無細胞共翻訳スクリーニングすることを３回繰り返すことにより本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列を検出した。
図３は、本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の検出に用いたＩＶＶのランダムプライミングライブラリーとその製法の概略を示す。ＲＮＡライブラリーを鋳型として、９塩基からなるランダム配列と特定配列（ｔａｇ２配列）を含むランダムプライマーを用いてランダムプライミング法により逆転写でｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーを合成する（Ｉ）。ＲＮａｓｅＨによりｃＤＮＡとＲＮＡの二本鎖からＲＮＡのみを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼＩによるｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、さらに、ＤＮＡリガーゼによりＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間にあるニックを修正して二本鎖（ｄｓＤＮＡ）ライブラリーを合成する（ＩＩ）。合成された二本鎖ｃＤＮＡはＤＮＡポリメラーゼＩにより合成された側のみ５’末端にリン酸基を持つのでこれを利用し、特定配列（５’ＵＴＲ＝プロモーター＋エンハンサー）を持つアダプターをＤＮＡリガーゼを用いて結合し、ライゲーテッドｄｓＤＮＡライブラリーを合成する（ＩＩＩ）。アダプターとランダムプライマーの特定配列を利用してＰＣＲを行い、５’側にプロモーターとエンハンサーの配列、３’側にＡ  ｔａｉｌをもつ対応付け分子のｃＤＮＡライブラリー（ＩＶＶ  ｃＤＮＡライブラリー）を作成する（ＩＶ）。次にＩＶＶ  ｃＤＮＡライブラリーを転写してＩＶＶ  ＲＮＡライブラリーとし（Ｖ）、ＩＶＶとするためのスペーサーをライゲーションし（ＶＩ）、さらに、無細胞翻訳系などで翻訳すれば、対応付け分子のライブラリーとなる（ＶＩＩ）。
図４は、本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の相互作用の検証結果１（電気泳動写真）を示す。
Ａ：  配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），２２（Ｓｃｈｉｐ１）のアミノ酸配列を有する蛋白質をＣ末端ラベル化法により小麦の無細胞翻訳系で確認。レーン１−４；ｃ−Ｊｕｎ蛋白質、配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），配列番号１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），配列番号２２（Ｓｃｈｉｐ１）の蛋白質。
Ｂ：  配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），２２（Ｓｃｈｉｐ１）のアミノ酸配列を有するＩＶＶを小麦の無細胞翻訳系で確認。レーン１、２；ｍＲＮＡ、ＩＶＶ。Ｉ−ＩＶ；ｃ−Ｊｕｎ、配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），配列番号１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），配列番号２２（Ｓｃｈｉｐ１）。
Ｃ：  配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），２２（Ｓｃｈｉｐ１）のアミノ酸配列を有するＩＶＶによるプルーダウンでの相互作用確認。レーン１−３；ＩＶＶ、上澄、ビーズ。ａ，ｂ；ベイトｃ−Ｆｏｓなし、あり。Ｉ−ＩＶ；ｃ−Ｊｕｎ、配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），配列番号１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），配列番号２２（Ｓｃｈｉｐ１）。
図５は、本発明の蛋白質および遺伝子とその塩基配列の相互作用の検証結果２（電気泳動写真）を示す。
Ａ：  配列番号１０５，１３９，１４２，１４８，１５０，１５２，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５，１６６，１６７の核酸配列をもとにして、配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２），７８（Ｏｐｔｎ）、８４（Ｓｎａｐｃ５），８６（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），８８（ＦＬＪ３２０００），９１（Ｒｉｔ２），９３（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ），９５（Ａｐｏｅ），９７（ｂｅｔａＡＰＰ），９９（Ｈｓｐ４０），１０１（Ｆｉｐ−ｃ１０），１０２（Ｆｉｐ−ｃ４），１０３（Ｆｉｐ−ｃ１８）の蛋白質（図１Ａ及び１Ｂ）が無細胞翻訳系で発現することをＣ末端ラベル化法により小麦の無細胞翻訳系で確認。レーン１−１４；配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２），７８（Ｏｐｔｎ）、８４（Ｓｎａｐｃ５），８６（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），８８（ＦＬＪ３２０００），９１（Ｒｉｔ２），９３（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ），９５（Ａｐｏｅ），９７（ｂｅｔａＡＰＰ），９９（Ｈｓｐ４０），１０１（Ｆｉｐ−ｃ１０），１０２（Ｆｉｐ−ｃ４），１０３（Ｆｉｐ−ｃ１８）の蛋白質。
Ｂ：  得られた蛋白質とｃ−Ｆｏｓとの相互作用の検証実験として、配列番号１０５，１３９の核酸配列をもとにして、配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２）の蛋白質のアミノ酸配列を有するＣ末端ラベル化蛋白質を用いてプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）でｃ−Ｆｏｓとの直接的な相互作用を確認。レーン１；配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），レーン２；７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２）ａ，ｂ：ベイトｃ−Ｆｏｓあり、なし（レーン１，２；翻訳産物、溶出画分）。
図６は、本発明の遺伝子の濃縮率と間接的な相互作用の検証の結果を示す。４種類の配列番号７８（Ｏｐｔｎ）、８４（Ｓｎａｐｃ５），８６（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），８８（ＦＬＪ３２０００）の蛋白質の濃縮を確認するために、配列番号１４２，１４８，１５０，１５２の核酸配列をもとにしてリアルタイムＰＣＲを行った。
図７は、本発明の蛋白質や核酸配列を用いたＩＶＶの物質や蛋白質との相互作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの概略を示す。本発明の蛋白質や核酸配列を用いた、一次スクリーニングで物質や蛋白質と相互作用を検出し、さらに、相互作用の詳細をＦＣＣＳやマイクロアレイなどの二次スクリーニングで解析することが可能である。また、本発明の蛋白質や核酸配列は、ＩＶＶ又はＣ末端ラベル化蛋白質として、単独でＦＣＣＳやマイクロアレイなどにより物質や蛋白質との相互作用解析に利用することも可能である。また、本発明の蛋白質や核酸配列のＩＶＶを用いた進化分子工学に応用し、一次スクリーニングにより機能性蛋白質の創出に利用することも可能であり、その際に、一次スクリーニングと二次スクリーニングを組み合わせて、創出した機能性蛋白質の相互作用の詳細を解析することも可能である。
図８は、翻訳テンプレート（Ａ）ならびにその構成要素であるコード分子（Ｂ）及びスペーサー分子（Ｃ）の構成を示す。翻訳テンプレートは、コード分子由来のコード部とスペーサー分子由来のスペーサー部からなる。Ｆ１及びＦ２は蛍光色素を示す。
図９は、Ｃ末端修飾された蛋白質（Ｃ末端ラベル化蛋白質）（Ａ）、本発明の翻訳テンプレート（Ｂ）、及び、修飾剤（Ｃ）の構成を示す。
図１０は、無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
Ａ：  ベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
Ｂ：  ベイトの共存下、プレイが無細胞翻訳系で翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。
図１１は、複合ベイトを用いた場合の無細胞共翻訳による複合体の形成の概略を示す。
複合ベイトを構成する一部のベイトとプレイが無細胞翻訳系で共に翻訳され相互作用し、無細胞翻訳系において複合体を形成する。プレイは、単数（Ｉ）であっても複数（ＩＩ）であっても構わないし、また、無細胞翻訳系での翻訳で得られるポリペプチドそのものであっても、対応付け分子（結合体）であっても構わない。また、複合ベイトは、図に示した無細胞翻訳系で翻訳されたポリペプチドとＤＮＡベイトの組合せに限られず、無細胞翻訳系で翻訳された複数又は単独のポリペプチドと、無細胞翻訳系で共存する複数又は単独のベイト（たとえば、ＤＮＡベイトなど）の組み合わせが挙げられる。
図１２は、無細胞共翻訳による複合体のスクリーニング方法の概略を示す。
図１０及び１１で示したような無細胞共翻訳による複合体形成の工程（１）、その複合体のプレイをスクリーニングする工程（２）、及び、プレイの解析の工程（３）により、無細胞共翻訳とスクリーニングをトータルにｉｎ  ｖｉｔｒｏで実現することができる。プレイが対応付け分子でかつ複数であれば、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによってプレイをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡを再構成することにより再度（１）の工程からスクリーニングを繰り返すことができる。また、得られたプレイを解析後、ベイトとして（１）の工程からスクリーニングを新たに繰り返すことができる。
【発明を実施するための最良の形態】＜１＞本発明の蛋白質
本明細書においては、説明の便宜のため、ｃ−Ｆｏｓと相互作用することが見出された蛋白質を、新規蛋白質も含めて、本発明の蛋白質と呼ぶ。
本発明の蛋白質の第１の群（図１Ａの配列番号１〜１４）は、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能もそのアミノ酸配列も新規の蛋白質（Ｆｏｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ；Ｆｉｐ−ｃｘ）である。この蛋白質は、既存のゲノム配列ＷＧＳ  ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｇ  ＭｍＸ（ＮＷ＿０４２６３７）に含まれるＭＡＧＥ／ｎｅｃｄｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎのＭＡＧＥ−ｎｅｃｄｉｎ／ｔｒｏｐｈｉｎｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ遺伝子（ＡＢ０３２４７７）が（＋１）フレームシフトした核酸配列（２７５−８２９ｂｐ）およびアミノ酸配列（１８４ａａ）と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質（Ｙｕｒｉｉ  Ｃｈｉｎｅｎｏｖ１  ａｎｄ  Ｔｏｍ  Ｋ  Ｋｅｒｐｐｏｌａ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０，２４３８−２４５２）のいずれでもない。また、ＭＡＧＥ−ｎｅｃｄｉｎ／ｔｒｏｐｈｉｎｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓは、ＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）として発見されたＸ染色体に存在する癌・腫瘍関係の遺伝子であることが知られている（Ｓａｋｕｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２７６，４９３７８−４９３８９）が、本蛋白質Ｆｉｐ−ｃｘは、ＭＡＧＥ−ｎｅｃｄｉｎ／ｔｒｏｐｈｉｎｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓの遺伝子配列から＋１フレームがずれたものであり、ＭＡＧＥ−ｎｅｃｄｉｎ／ｔｒｏｐｈｉｎｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ遺伝子についてのフレームシフトは知られていないので、本蛋白質Ｆｉｐ−ｃｘはアミノ酸配列もｃ−Ｆｏｓとの相互作用の機能についても新規の蛋白質である。本蛋白質Ｆｉｐ−ｃｘのアミノ酸配列はロイシンジッパーを含み、直接ｃ−Ｆｏｓと相互作用を形成することが確認された（図２）。
本発明の蛋白質の第２の群（図１Ａの配列番号１５〜１９）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｄｅｌｔａ（Ｅｅｆ１ｄ，ＴＥＦ−１；ＮＭ＿０２３２４０）遺伝子の遺伝子配列およびアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。本蛋白質Ｅｅｆ１ｄが、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能については、今回初めて検出された。Ｅｅｆ１ｄは、翻訳伸長を調節する蛋白質として知られているが、最近、癌・腫瘍関係の遺伝子でもあることが示され、翻訳因子Ｅｅｆ１ｄと腫瘍形質転換との関係性として、Ｆｏｓの発現量が増加するとＥｅｆ１ｄの発現量も増加することが報告されている（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，６１３１−６１３６）。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第３の群（図１Ａの配列番号２０〜２２）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のｓｃｈｗａｎｎｏｍｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１（Ｓｃｈｉｐ１；ＮＭ＿０１３９２８）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｓｃｈｉｐ１は、癌・腫瘍関係の遺伝子であることが知られている（Ｇｏｕｔｈｅｂｒｏｚｅ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０，１６９９−１７１２）が、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能については、今回初めて検出された。本蛋白質は、ＡＰ−１の上流の制御遺伝子でありかつＡＰ−１活性を阻害するｓｈｗａｎｎｏｍｉｎと結合する。また、本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第４の群（図１Ａの配列番号４７〜５６）は、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能もそのアミノ酸配列も新規の蛋白質（Ｆｏｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ．１；Ｆｉｐ−ｃｘ．１）である。この蛋白質は、ＭａｇｅファミリーのＭａｇｅ−ｄ３遺伝子（ＮＭ＿０１９５４８）の（＋１）フレームシフト遺伝子である。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第５の群（図１Ａの配列番号５７〜７６）は、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能もそのアミノ酸配列も新規の蛋白質（Ｆｏｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｘ．２；Ｆｉｐ−ｃｘ．２）である。この蛋白質は、ＭａｇｅファミリーのＭａｇｐｈｉｎｉｎ遺伝子（ＡＢ０３２４７７）の（＋１）フレームシフト遺伝子である。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第６の群（図１Ｂの配列番号７７〜８１）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＯｐｔｉｎｅｕｒｉｎ（Ｏｐｔｎ；ＮＭ＿１８１８４８）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｏｐｔｎは、Ａｄｕｌｔ−Ｏｎｓｅｔ  ＰｒｉｍａｒｙＯｐｅｎ−Ａｎｇｌｅ  Ｇｌａｕｃｏｍａという視覚障害の原因遺伝子と言われている（Ｔａｙｅｂｅｈ  Ｒｅｚａｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，１０７７−１０７９）。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第７の群（図１Ｂの配列番号８２〜８４）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＳｎａｐｃ５（Ｓｎｐａｐ１９；ＸＭ＿２８４５０３．１）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｓｎａｐｃ５は、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩによって転写されるｓｎＲＮＡのプロモーターであるＰＳＥに結合し、転写を制御するＳＮＡＰ複合体のサブユニットの一つである（Ｈｅｎｐｙ，Ｒ．Ｗ．；Ｍｉｔｔａｌ，Ｖ．；Ｍａ，Ｂ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｒ．；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２６６４−２６７２，１９９８．ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ：９７３２２６５）。本蛋白質のアミノ酸配列はロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第８の群（図１Ｂの配列番号８５〜８６）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＣ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ（ＢＣ０２６４８３）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋは、蛋白質のフレームは予想されているが、その機能は未知である遺伝子である。アノテーションは、転写制御因子となっている。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第９の群（図１Ｂの配列番号８７〜８９）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＦＬＪ３２００（ＸＭ＿３４２８９６．１）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。ＦＬＪ３２００は、蛋白質のフレームは予想されているが、その機能は未知である遺伝子である。Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ類似の配列を有する蛋白質である。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第１０の群（図１Ｂの配列番号９０〜９１）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＲｉｔ２（ＮＭ＿００９０６５．２）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｒｉｔ２は、Ｒａｓ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎでＲａｓファミリーの蛋白質であるが、Ｒａｓ蛋白質の膜の足場として知られている典型的なＣ末端に存在するＣＡＡＸボックスを持っていない。Ｒａｓは、Ａｐｐ遺伝子のプロモーターを活性化することが知られている（Ｒｕｉｚ−Ｌｅｏｎ，Ｙ．ａｎｄ  Ｐａｓｃｕａｌ，Ａ．，（２００１）２，２７８−２８５）。さらに、ＲａｓはＲｈｏとともにＡｐｐ蛋白質の分泌過程の制御に関わっていることが報告されている（Ｍａｉｌｌｅｔ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，６３３−６３９）。Ｒｈｏファミリーは、小さなＧＴＰ結合蛋白質で、細胞骨格、転写、発生、形質転換などに関わり、Ｒｈｏ遺伝子がＡＰ１の活性を促し、Ｔ細胞の活性化に関わる転写因子を制御している可能性が報告されている（ＪＩＮ−ＨＯＮＧＣＨＡＮＧ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｉｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９８）１８，４９８６−４９９３）。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１１の群（図１Ｂの配列番号９２〜９３）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ（ＡＦ５４０９１２．１）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。登録されているｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ遺伝子は全長クローンされていない。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含む。
本発明の蛋白質の第１２の群（図１Ｂの配列番号９４〜９５）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ（Ａｐｏｅ；Ｎ＿００９６９６．２）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ａｐｏｅは、アルツハイマーのリスクファクター遺伝子として知られており、ＡＰＰと相互作用する（Ｄａｖｉｄ  Ｍ．Ｈｏｌｔｚｍａｎ、ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）９７，２８９２−９７）。Ａｐｏｅ遺伝子はＡＰ１サイトを持ち、ＡＰ１の下流遺伝子である。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１３の群（図１Ｂの配列番号９６〜９７）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ（Ａ４）ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ａｐｐ；ＢＣ００５４９９．１）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ａｐｐは、アルツハイマーのリスクファクター遺伝子として知られており、Ａｐｏｅと相互作用する（Ｄａｖｉｄ  Ｍ．Ｈｏｌｔｚｍａｎ、ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）９７，２８９２−９７）。Ａｐｐ遺伝子は、Ａｐｏｅ遺伝子と同様に、ＡＰ１サイトを持ち、ＡＰ１の下流遺伝子である。実際、記憶の形成時の一連の反応の最初のカスケードは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの発現であり、続いて記憶形成の初期に、Ａｐｐ／Ａｐｏｅが発現することが報告されている（Ｓｔｅｖｅｎ  Ｐ．Ｒ．Ｒｏｓｅ，Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ＆  Ｍｅｍｏｒｙ（２０００）７，１−１７）。さらに、Ａｐｐは翻訳時に、Ａｐｏｅのシャペロン機能によって、共翻訳により折り畳まれること（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ）が最近報告された（Ｓｉｌｋｅ  Ｈａｂ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１３８９２−１３８９７（１９９８））。このことは、ＩＶＶの共翻訳時に、Ａｐｐ／Ａｐｏｅ複合体を形成したものが、さらにベイトＦｏｓと複合体を形成し検出されてきた例と云える。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１４の群（図１Ｂの配列番号９８〜９９）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＤｎａｊａ２（ＨＳＰ４０；ＢＣ００３４２０）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｄｎａｊａ２は、ヒートショック蛋白質であり、ヒートショックを与えた際にＦｏｓ、Ｊｕｎとともに発現量が増加することが知られている（Ｋａｔｏ  Ｎ、ｅｔ．ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）９７，６４４−６４９）。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１５の群（図１Ｂの配列番号１００〜１０１）は、ｃ−Ｆｏｓと相互作用する機能が新規の蛋白質である。この蛋白質は、既存のＦｉｐ−ｃ１０（ＫＩＡＡ１２０９；ＸＭ＿１３６９１１）遺伝子配列かつアミノ酸配列と相同性を有していることを特徴とする蛋白質であり、これまで、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成することが知られていた蛋白質のいずれでもない。Ｆｉｐ−ｃ１０は、蛋白質のフレームは予想されているが、その機能は未知である遺伝子である。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１６の群（図１Ｂの配列番号１０２）は、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能もそのアミノ酸配列も新規の蛋白質（Ｆｏｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ４．１；Ｆｉｐ−ｃ４）である。この蛋白質は、ゲノム配列のこれまで全く蛋白質のフレームが予想されていない領域にコードされている。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
本発明の蛋白質の第１７の群（図１Ｂの配列番号１０３）は、ｃ−Ｆｏｓと複合体を形成する機能もそのアミノ酸配列も新規の蛋白質（Ｆｏｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １８；Ｆｉｐ−ｃ１８）である。この蛋白質は、ゲノム配列のこれまで全く蛋白質のフレームが予想されていない領域にコードされている。本蛋白質のアミノ酸配列は、ロイシンジッパーを含まない。
以下、本発明の蛋白質についてさらに説明する。
本発明の蛋白質のうち、配列番号１〜２２及び４７〜１０３のいずれかのアミノ酸配列を有する蛋白質は、後述の実施例に記載したように、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用すること、すなわち、複合体を形成することが判明した蛋白質である。蛋白質には一般に同一の機能を有する変異体の存在が予測される。また、蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号１〜２２及び４７〜１０３のいずれかに示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質も本発明の蛋白質に包含される。また、配列番号１〜２２及び４７〜１０３のいずれかに示すアミノ酸配列に対して、１５％以上の相同性を有し、かつｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質も包含される。このようなアミノ酸の変化した蛋白質としては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質に関しては、配列番号２〜１４のアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号１５のアミノ酸配列を有する蛋白質に関しては、配列番号１６〜１９のアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号２０のアミノ酸配列を有する蛋白質に関しては、配列番号２１〜２２のアミノ酸配列を有する蛋白質がそれぞれ挙げられる。
蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を改変し、塩基配列が改変されたＤＮＡを発現させることによって行うことができる。このような改変された蛋白質のうち、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用するものが本発明の蛋白質に含まれる。ｃ−Ｆｏｓ蛋白質との相互作用は、公知の相互作用の測定法により測定することでき、例として、後記実施例に記載されたような複合体の形成を検出する方法が挙げられる。
本発明の蛋白質は、他の蛋白質と融合させることにより、融合蛋白質とされてもよい。
本発明の核酸は、本発明の蛋白質をコードする核酸である。核酸は通常にはＲＮＡ又はＤＮＡである。本発明の核酸としては、配列番号２３〜４０及び１０４〜１６７のいずれかの塩基配列を有する核酸が挙げられる。この核酸は後述の実施例において、塩基配列が決定された核酸である。遺伝子には、同一の産物をコードするが塩基配列の異なる遺伝子や、同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子の存在が予測される。また、塩基配列の改変により、同一の産物や同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子を得ることができる。従って、本発明の核酸には、配列番号２３〜４０及び１０４〜１６７のいずれかの塩基配列に類似する塩基配列を有し、かつｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードする核酸も包含される。類似の塩基配列を有する核酸としては、配列番号２３〜４０及び１０４〜１６７のいずれかの塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸、又は、配列番号２３〜４０及び１０４〜１６７のいずれかの塩基配列と相同性が１６％以上の塩基配列を有する核酸が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば４２℃でＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシェ・ダイアグノスティックス株式会社）におけるハイブリダイゼーション、次いで６０℃で１５分０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄である。塩基配列の相同性は、比較する配列間でアラインメントを行い一致した塩基数を算出し、比較対象となる配列の鎖長に対する一致した塩基数の割合である。また、アミノ酸配列の相同性は、比較する配列間でアラインメントを行い一致したアミノ酸数を算出し、比較対象となる配列の鎖長に対する一致したアミノ酸数の割合である。
ＤＮＡがｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質をコードすることは、そのＤＮＡから蛋白質を発現させ、発現した蛋白質がｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用することを上述の方法により確認することにより容易に確認できる。
本発明の核酸は、明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることができる。例えば、化学合成法により合成してもよいし、適宜設定されたプライマーを用いて、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と相互作用する蛋白質を発現している細胞や組織から調製されたｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により得ても良い。
＜２＞本発明の蛋白質等の用途
本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能（ここではｃ−Ｆｏｓと結合できる機能）を利用して、遺伝子治療などによりｃ−Ｆｏｓの転写機能や遺伝子複製機能などをブロックする阻害剤として応用することができる。その根拠は、本発明の蛋白質の遺伝子は、スクリーニングを複数回繰り返すことにより競争過程を経て検出されてきていることに起因する。この方法で検出された遺伝子群は、ある個数分布を描き、競争力が強い遺伝子ほど多く検出されることになる。このことは、この方法で検出されるクローン数が多いほど競争力が強く、ブロック剤・阻害剤として有効に働くことを示している。
本発明の蛋白質とそれをコードする遺伝子および配列の用途として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの応用としては、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能を利用して、たとえば、無細胞蛋白質合成系を利用した進化分子工学又は、ゲノム機能解析へ応用できる。この場合に、対応付け分子の共翻訳スクリーニング／セレクションを用いた解析は非常に有効である。なぜなら、共翻訳スクリーニング／セレクション法によって、ベイト蛋白質と直接又は間接的に相互作用のある蛋白質を網羅的に検出することが可能となったからである。さらに、ＩＶＶ間又はＩＶＶとＣ末端ラベル化蛋白質との相互作用の解析などにおいて、「標的分子（ベイト蛋白質）」としても利用出来る。さらに、一般的な相互作用の解析の方法としては、例えば、マイクロアレイ、蛍光相関分光法（ＦＣＳ／ＦＣＣＳ）、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法などが挙げられる。無細胞蛋白質合成系の具体例としては、小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液等が挙げられる。これらの無細胞蛋白質合成系の中に、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列の翻訳テンプレートを加え、Ｃ末端ラベル化の場合は、同時に１〜１００μＭの修飾剤を加え、２５〜３７℃で１〜数時間保温することによってＣ末端修飾蛋白質が合成される。対応付けの場合は、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列の対応付け分子のテンプレートを加えて、２５〜３７℃で１〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。
また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの応用としては、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能を利用して、たとえば、無細胞蛋白質合成系で合成された、分離用修飾及び検出用標識された蛋白質（両修飾蛋白質）は、そのまま次の精製プロセス又は検出プロセス、又は直接細胞への導入に供することができる。細胞発現系の具体例としては、大腸菌、枯草菌、好熱菌、酵母等の細菌から、昆虫細胞、哺乳類等の培養細胞、さらに線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。これらの細胞の中に、上記Ｃ末端ラベル化又は対応付けされた両修飾蛋白質を直接導入し、目的の蛋白質をブロックすることができる。又は、上記本発明の蛋白質の遺伝子や核酸配列を導入し、アンチセンス配列やＲＮＡｉ配列として遺伝子や核酸配列をそのまま利用して目的の核酸配列の発現をブロックすることも可能であるし、細胞内で発現させて蛋白質や対応付け分子として相互作用のある蛋白質をブロックすることにも利用できる。蛋白質として利用する場合は、Ｃ末端ラベル化法では、同時に１〜１００μＭのＣ末端ラベル化修飾剤を電気穿孔法、マイクロインジェクション法等により細胞の中に導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって修飾蛋白質が合成される。対応付けの場合は、上記本発明の蛋白質の遺伝子や核酸配列をもつ対応付け分子のテンプレートを導入し、細胞の至適生育温度で数時間保温することによって対応付け分子が合成される。合成された両修飾蛋白質は、細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセス又は検出プロセスに供することができる。また、そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。
以下、本発明の蛋白質等の用途についてさらに説明する。
本発明検出方法は、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイトとして本発明の蛋白質を用いるものである。
好ましくは、ベイト及びプレイに特定の様式で分離用修飾及び検出用標識を行い、そして、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを主な特徴とするものである。本明細書においては、無細胞翻訳系においてベイトの存在下で、プレイを翻訳により生成させることによりベイトとプレイとを接触させることを「無細胞共翻訳」ともいう。
本明細書において、ベイト及びプレイの用語は、物質間の相互作用の解析の技術分野で通常に用いられる意味を有する。すなわち、既知の物質である蛋白質や核酸などをベイト（おとり）と呼び、それと相互作用する物質である蛋白質や核酸などをプレイ（獲物）と呼ぶ。本発明では、プレイは蛋白質であることが好ましい。
ここで、ベイトとしては、本発明の蛋白質、又は、本発明の蛋白質を含む限り、あらゆる蛋白質（ペプチドを含む）、核酸、抗体、ホルモンなどのリガンド、金属などの任意のものから構成される複合体が挙げられ、天然のものでも人工のもののいずれでも構わない。ベイトとしての分子量の制限などは特にない。たとえば蛋白質であれば、機能ドメイン又は機能ドメインを含む完全長蛋白質などが挙げられる。プレイライブラリーを用いる場合は、完全長蛋白質とすることでより網羅的検出が可能となる。
また、プレイとしては、好ましくは、蛋白質が用いられる。プレイとしての分子量の制限などは特にない。
本発明検出方法は、好ましくは、上述のように、ベイトとプレイとの間の相互作用の検出において、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明検出方法の好ましい構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとプレイとを接触させ、接触により形成された複合体を検出することを含む、ベイトとプレイとの間の相互作用の通常の検出方法と同様でよい。
ベイト及びプレイの分離用修飾及び検出用標識は、複合体の検出に適合したものが適宜選択されるが、無細胞共翻訳において、ベイトとプレイとが共に検出用標識で標識されたり、分離用修飾を受けたりしないように行われる必要がある。そのため、プレイは、検出用標識として使用できる蛋白質との融合蛋白質とされるか、又は、対応付け分子とされ、それに応じて、ベイトは分離用修飾を有するものとされる。
プレイが融合蛋白質とされる場合には、ベイトは分離用修飾を有するようにする。ベイトが蛋白質である場合には、ベイトは、分離用修飾として使用できる蛋白質との融合蛋白質として、無細胞翻訳系において、ベイトを含む融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳が行われることにより無細胞翻訳系に存在させることが好ましい。
ベイトが蛋白質の場合の分離用修飾の例としては、蛋白質として、ＧＳＴ蛋白質やＴＡＰ法などに用いられているＣＢＰ（カルモジュリンビーズとの親和性により分離可能）やプロテインＡ（ＩｇＧ−プロテインＡ親和性により分離可能）、親和性タグとして、各種の抗体タグなどとの融合蛋白質とすることが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。プレイの検出用修飾としては、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光蛋白質との融合蛋白質とすることが挙げられる。
上記の融合蛋白質をコードするｍＲＮＡの調製及びこのｍＲＮＡの無細胞翻訳系での翻訳は通常の方法に従って行うことができる。ｍＲＮＡは、無細胞転写翻訳系において、ＤＮＡの転写により生成するものであってもよい。
プレイが対応付け分子とされる場合には、ベイトには任意の分離用修飾を施すことができる。ベイトが蛋白質である場合には、上述の分離用修飾の例が挙げられる他、ベイトが核酸やドラッグなどの場合の分離用修飾の例としては、ストレプトアビジンやアビジンと相互作用のあるビオチンなどを利用することが挙げられる。ベイト自体が分離用修飾として使用できる性質を有する場合には、ベイトをそのまま、分離用修飾を有するベイトとして使用できる。
対応付け分子とは、表現型と遺伝子型と対応付ける分子を意味する。対応付け分子は、通常には、遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺伝子型分子と、表現形の発現に関与する蛋白質を含む表現型分子とが結合してなる分子である。この蛋白質としてプレイを用いることによりプレイを対応付け分子とすることができる。このような対応付け分子は、無細胞翻訳系において、プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うこと、又は、無細胞転写翻訳系において、プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより形成することができる。従って、この製造の際に、ベイトを存在させることにより、無細胞共翻訳を行うことができる。すなわち、下記（１）又は（２）により無細胞共翻訳を行うことができる。
（１）無細胞翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするｍＲＮＡの翻訳を、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合するように行うことにより、無細胞翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
（２）無細胞転写翻訳系において、前記ベイトの存在下で、前記プレイをコードするＤＮＡの転写及び翻訳を、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合するように行うことにより、無細胞転写翻訳系にプレイを生成させて、ベイトとプレイとを接触させる。
以下、上記（１）及び（２）の態様について説明する。
（１）の態様では、ｍＲＮＡが、その３’末端に結合したスペーサー領域と、スペーサー領域に結合した、ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドアクセプター領域とを有することにより、翻訳されたプレイが該ｍＲＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス方法が挙げられる。
ｍＲＮＡは、好ましくは、転写プロモーター及び翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域と、５’非翻訳領域の３’側に結合した、プレイをコードするＯＲＦ領域と、ＯＲＦ領域の３’側に結合した、ポリＡ配列を含む３’末端領域を含む核酸である。好ましくは、ポリＡ配列の５’側に、ＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）配列を含む発現増幅配列（例えば制限酵素ＸｈｏＩが認識する配列）が更に含まれる。５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。
ポリＡ配列は、少なくとも２残基以上のｄＡ及び／又はｒＡの混合又は単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは８残基以上のポリＡ連続鎖である。
翻訳効率に影響する要素としては、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなる５’ＵＴＲ、及び、ポリＡ配列を含む３’末端領域の組み合わせがある。３’末端領域のポリＡ配列の効果は通常には１０残基以下で発揮される。５’ＵＴＲの転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はない。好ましくはＳＰ６であり、特に、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用する場合はＳＰ６を用いることが特に好ましい。翻訳エンハンサーは好ましくはオメガ配列の一部であり、オメガ配列の一部としては、ＴＭＶのオメガ配列の一部（０２９；Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ  ０２／４８３４７の図３参照）を含んだものが好ましい。
また、翻訳効率に関し、３’末端領域においては、ＸｈｏＩ配列とポリＡ配列の組み合わせが好ましい。さらに、ＯＲＦ領域の下流部分、すなわちＸｈｏＩ配列の上流に親和性タグがついたものとポリＡ配列の組み合わせが好ましい。親和性タグ配列としては、抗原抗体反応など、蛋白質を検出できるいかなる手段を用いるための配列であればよく、制限はない。好ましくは、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列又はＨｉｓ−ｔａｇ配列である。ポリＡ配列効果としては、Ｆｌａｇ−ｔａｇ等の親和性タグにＸｈｏＩ配列がついたものとそこへさらにポリＡ配列がついたものの翻訳効率が上昇する。ここで、Ｈｉｓ−ｔａｇについては、ＸｈｏＩ配列のない構成でも十分な翻訳効率を示し、有効である。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、対応付け効率にも有効である。
５’ＵＴＲをＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）又はＨｉｓ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’ＵＴＲで約４９ｂｐ、３’末端領域で約３８ｂｐ又は約２６ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として組み込める長さである。このため、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、５’ＵＴＲと３’末端領域をもったコード領域を簡単に作成できる。コード領域において、翻訳はＯＲＦ領域を超えてされてもよい。すなわち、ＯＲＦ領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
ペプチドアクセプター領域は、ペプチドのＣ末端に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。
ペプチドアクセプター領域は、好ましくは、ピューロマイシンもしくはその誘導体、又は、ピューロマイシンもしくはその誘導体と１残基もしくは２残基のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。ここで、誘導体とは蛋白質翻訳系においてペプチドのＣ末端に結合できる誘導体を意味する。ピューロマイシン誘導体は、ピューロマイシン構造を完全に有しているものに限られず、ピューロマイシン構造の一部が欠落しているものも包含する。ピューロマイシン誘導体の具体例としては、ＰＡＮＳ−アミノ酸、ＡＡＮＳ−アミノ酸などが挙げられる。
ペプチドアクセプター領域は、ピューロマイシンのみの構成でもかまわないが、５’側に１残基以上のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ，Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
スペーサー領域は、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域である。スペーサー領域は、通常には、ＰＥＧ領域の他に、核酸の３’末端に結合できるドナー領域を含む。
核酸の３’末端に結合できるドナー領域は、通常、１以上のヌクレオチドからなる。ヌクレオチドの数は、通常には１〜１５、好ましくは１〜２である。ヌクレオチドはリボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。ドナー領域は修飾物質を有していてもよい。
ドナー領域の５’末端の配列は、プレイをコードするコード領域とのライゲーション効率を左右する。コード領域とスペーサー領域をライゲーションさせるためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。
ＰＥＧ領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。ここで、主成分とするとは、ＰＥＧ領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が２０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が４００以上であることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドの合計の数が１０ｂｐ以下、又は、ポリエチレングリコールの平均分子量が１０００以上であることを意味する。
ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、通常には、４００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜８，０００である。ここで、ポリエチレングリコールの分子量が約４００より低いと、このスペーサー領域を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、対応付け翻訳の後処理が必要となることがあるが（Ｌｉｕ，Ｒ．，Ｂａｒｒｉｃｋ，Ｅ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３１８，２６８−２９３）、分子量１０００以上、より好ましくは２０００以上のＰＥＧを用いると、対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができるため、翻訳の後処理が必要なくなる。また、ポリエチレングリコールの分子量が増えると、遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、特に分子量１０００以上で良好であり、分子量４００以下ではＤＮＡスペーサーと性質がそれほどかわらず不安定となることがある。
ポリエチレングリコールを主成分とするスペーサー領域を有することによって、対応付け分子がウサギ網状赤血球のみならず小麦胚芽の無細胞翻訳系でも形成可能となり、両翻訳系での遺伝子型分子の安定性が飛躍的に向上し、翻訳後の処理を施すことが不要となる。
（２）の態様では、ＤＮＡが、蛋白質とストレプトアビジン又はアビジンとの融合蛋白質をコードし、ＤＮＡがビオチンにより標識され、ＤＮＡ一分子がエマルジョンの一区画に含まれる状態で転写及び翻訳が行われることにより、翻訳されたプレイが該ＤＮＡと会合することが好ましい。このような対応付け分子を用いる相互作用の検出方法としては、ＳＴＡＢＬＥ法が挙げられる。
エマルジョンは、通常には、２種の界面活性剤及びミネラルオイルと、無細胞転写翻訳系の反応液を混合して形成されるＷ／Ｏ型のエマルジョンである。Ｗ／Ｏ型のエマルジョンを形成するには、通常には、界面活性剤のＨＬＢ（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）値が３．５〜６である必要がある。２種の界面活性剤を混合した場合のＨＬＢ値は、個々の界面活性剤のＨＬＢ値から簡単な計算式で求められる。例えば、Ｓｐａｎ８５（ＨＬＢ＝１．８及びＴｗｅｅｎ  ８０（ＨＬＢ＝１５．０）を、それぞれ４０．２μｌ及び９．８μｌの割合で混合することによりＨＬＢ＝４．４となる。界面活性剤とミネラルオイルの割合は、通常１：１８（容量比）である。また、反応液の割合はエマルジョン全体に対して１〜５０％（容量比）であり、通常は５％である。界面活性剤とミネラルオイルの混合物に、撹拌しながら、低温で、反応液をいくつかに分けて添加し、混合することによりエマルジョンを形成することができる。転写及び翻訳の反応は、エマルジョンの温度を上げることにより、開始させることができる。
プレイをコードするＤＮＡの調製及びこのＤＮＡの無細胞転写翻訳系での転写及び翻訳は通常の方法に従って行うことができる。
上述のように、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行うことにより、無細胞共翻訳により形成された複合体を特異的に検出することができる。
ベイトとプレイの無細胞共翻訳において、無細胞共翻訳を行う無細胞翻訳系（無細胞転写翻訳系を含む）については、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法では、対応付け分子の形成は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉではかなり不安定であるが、ウサギ網状赤血球の系（Ｎｅｍｏｔｏ  Ｎ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓａｔｏ  Ｅ，Ｙａｎａｇａｗａ  Ｈ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｒ．Ｗ，Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１２２９７）では安定であることが確認されており、さらに小麦胚芽の系（特開２００２−１７６９８７）ではより安定であることが確認されている。ＳＴＡＢＬＥ法では、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽の系などいずれでも構わない。
無細胞共翻訳における翻訳又は転写及び翻訳の条件は、用いる無細胞翻訳系に応じて適宜選択される。
無細胞翻訳系に添加するベイトとプレイのテンプレートは、無細胞翻訳系が転写も生じる無細胞転写翻訳系であれば、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらでも構わない。
以下、ベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるベイトとして、図８に示すように、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなることを特徴とする翻訳テンプレートを利用する。コード部は、蛋白質に翻訳される情報であり、どのような配列でも良いが、好ましくは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持つ、あるいは、コード部の３’末端領域にアクセプター（Ａ配列）を持ち、かつＡ配列の５’上流に翻訳増幅配列（Ｘ配列）を持つことを特徴とする。コード部のＡ配列として、短いポリＡ配列を含む。短いポリＡ配列とは、通常には２〜１０塩基のＡからなる配列である。Ｘ配列として、（Ｃ又はＧ）ＮＮ（Ｃ又はＧ）配列を有する配列、たとえば、ＸｈｏＩ配列を有することを特徴とする。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域、コード部と連結するためのドナー領域、および３’末端にＣＣＡ領域を持つ。ＰＥＧスペーサー部は、ドナー領域のみ、ＣＣＡ領域のみでもかまわないが、好ましくは、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域を含む構成をとる。ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量は、５００以上であることを特徴とする。また、ドナー領域及び／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの機能付与ユニット（Ｆ）を含むことを特徴とする。機能付与ユニット（Ｆ１及び／又はＦ２）が、該翻訳テンプレート及び／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これらのコード部や翻訳テンプレート、およびそのライブラリー、さらに、リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライブラリーに関するものである。
ベイトの翻訳テンプレート（図８のＡ）は、コード分子（図８のＢ）に由来するコード部とＰＥＧスペーサー分子（図８のＣ）に由来するＰＥＧスペーサー部からなる。本態様では、基本的にはコード部の配列によらず、コード部にＰＥＧスペーサー部を連結（ライゲーション）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。しかしながら、さらにコード部の構成やＰＥＧスペーサー部の種類によって、その翻訳効率をより向上させることが可能である。以下にその詳細を記載する。
本態様のコード部（図８のＢ）は、５’末端領域、ＯＲＦ領域、３’末端領域からなり、５’末端にＣａｐ構造があってもなくても良い。また、コード部の配列には特に制限はなく、あらゆるベクターやプラスミドに組み込まれたものとしての利用が考えられる。また、コード部の３’末端領域は、Ａ配列としてポリＡｘ８配列、あるいはＸ配列としてＸｈｏＩ配列や４塩基以上でＳＮＮＳ（ＳはＧ又はＣ）の配列を持つもの、およびＡ配列とＸ配列の組み合わせとしてのＸＡ配列がある。Ａ配列、Ｘ配列、又はＸＡ配列の上流に親和性タグ配列としてＦｌａｇ−ｔａｇ配列、からなる構成が考えられる。ここで、親和性タグ配列としてはＨＡ−ｔａｇやＩｇＧのプロテインＡ（ｚドメイン）などの抗原抗体反応を利用したものやＨｉｓ−ｔａｇなど、蛋白質を検出又は精製できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。ここで、翻訳効率に影響する範囲としては、ＸＡ配列の組み合わせが重要であり、Ｘ配列のなかで、最初の４塩基が重要であり、ＳＮＮＳの配列を持つものが好ましい。また、５’末端領域は、転写プロモーターと翻訳エンハンサーからなり、転写プロモーターはＴ７／Ｔ３又はＳＰ６などが利用でき、特に制限はないが、小麦の無細胞翻訳系では、翻訳のエンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、プロモーターとしては、ＳＰ６を用いることが好ましい。翻訳エンハンサーのオメガ配列の一部（０２９）は、ＴＭＶのオメガ配列の一部を含んだものである（Ｇａｌｌｉｅ  Ｄ．Ｒ．，Ｗａｌｂｏｔ  Ｖ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２０，４６３１−４６３８、および、ＷＯ  ０２／４８３４７の図３参照）。コード部のＯＲＦ領域については、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなるいかなる配列でもよい。遺伝子配列、エキソン配列、イントロン配列、ランダム配列、又は、いかなる自然界の配列、人為的配列が可能であり、配列の制限はない。
本態様のＰＥＧスペーサー分子（図８のＣ）は、ＣＣＡ領域、ＰＥＧ領域、ドナー領域からなる。最低限必要な構成は、ドナー領域である。翻訳効率に影響する範囲としては、ドナー領域のみならずＰＥＧ領域を持つものが好ましく、さらにアミノ酸との結合能力のないピューロマイシンを持つことが好ましい。ＰＥＧ領域のポリエチレングリコールの分子量の範囲は、４００〜３０，０００で、好ましくは１，０００〜１０，０００、より好ましくは２，０００〜６，０００である。また、ＣＣＡ領域にはピューロマイシンを含む構成と含まない構成が可能であり、ピューロマイシンについては、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、化学結合として３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形成されたアミド結合でつながった３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、例えばアミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、バリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、全アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−全アミノ酸が利用できる。また、ヌクレオシド又はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。その他、ヌクレオシド又はヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、アミノ酸又はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。本翻訳テンプレートでは、以上のピューロマイシン誘導体のアミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆる物質、およびピューロマイシンを欠いたＣＣＡ領域も考えられるが、リボソーム上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、より翻訳効率を高められる。その理由は定かではないが、蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボソームを刺激することでターンオーバーが促進される可能性がある。ＣＣＡ領域（ＣＣＡ）の５’側に１残基以上のＤＮＡ及び／又はＲＮＡからなる塩基配列を持つことが好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。配列としては、ｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣ−ピューロマイシンなど、より好ましくはｄＣｄＣ−ピューロマイシン，ｒＣｒＣ−ピューロマイシン，ｒＣｄＣ−ピューロマイシン，ｄＣｒＣ−ピューロマイシンなどの配列で、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端を模倣したＣＣＡ配列（Ｐｈｉｌｉｐｐｓ  Ｇ．Ｒ．（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ  ２２３，３７４−３７７）が適当である。本発明の一態様では、これらのピューロマイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本態様のＰＥＧスペーサー部は修飾物質（Ｆ１及び／又はＦ２）を有する構成が可能である。このことによって、翻訳テンプレートを回収、精製による再利用、又は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。少なくとも１残基のＤＮＡ及び／又はＲＮＡの塩基に修飾物質として、蛍光物質、ビオチン、又はＨｉｓ−ｔａｇなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。また、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計可能な長さである。これによって新たな効果が生み出された。すなわち、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、このコード部に、３’ＵＴＲの代わりとしてＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本態様のＰＥＧスペーサー分子とコード分子のライゲーションは、その方法については、一般的なＤＮＡリガーゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、特に限定されるものではない。ＲＮＡリガーゼを用いるライゲーションでは、コード部でライゲーション効率に影響を与える範囲としては３’末端領域のＡ配列が重要であり、少なくとも２残基以上のｄＡ及び／又はｒＡの混合又は単一のポリＡ連続鎖であり、好ましくは、３残基以上、より好ましくは６から８残基以上のポリＡ連続鎖である。ＰＥＧスペーサー部のドナー領域の５’末端のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列は、ライゲーション効率を左右する。コード部とＰＥＧスペーサー部を、ＲＮＡリガーゼでライゲーションするためには、少なくとも１残基以上を含むことが必要であり、ポリＡ配列をもつアクセプターに対しては、少なくとも１残基のｄＣ（デオキシシチジル酸）又は２残基のｄＣｄＣ（ジデオキシシチジル酸）が好ましい。塩基の種類としては、Ｃ＞（Ｕ又はＴ）＞Ｇ＞Ａの順で好ましい。さらに、ライゲーション反応時に、ＰＥＧ領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
次に、プレイとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートの例について説明する。
本態様の共翻訳スクリーニングにおけるプレイとして、図９に示すように、翻訳テンプレートによってＣ末端修飾された蛋白質（＝対応付け分子）を利用する。翻訳テンプレートは、蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とＰＥＧスペーサー部からなる。コード部の３’末端にＡ配列を有し、Ａ配列は、短いポリＡ配列を含む。ＰＥＧスペーサー部は、ポリエチレングリコールを主成分としたＰＥＧ領域において、ポリエチレングリコールの分子量が４００以上であることを特徴とする、また、ドナー領域及び／又はＣＣＡ領域において、少なくとも１つの修飾物質（Ｆ１及び／又はＦ２）を含むことを特徴とする。また、ＣＣＡ領域は、該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、ペプチド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、代表的にはＣＣＡ領域にピューロマイシンを有する。また、修飾物質（Ｆ１及び／又はＦ２）が、該翻訳テンプレート及び／又は該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化又は蛍光ラベル化することを特徴とする。固定化物質としてビオチンなどが考えられ、蛍光性物質として、フルオレセイン，Ｃｙ５，又はローダミングリーン（ＲｈＧ）などが考えられる。これら、コード部および翻訳テンプレート、およびそのライブラリーが、リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質（＝対応付け分子）および蛋白質（＝対応付け分子）のライブラリーに関するものである。
プレイは、翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成された、翻訳テンプレートでＣ末端修飾された蛋白質（図９のＡ；対応付け分子）であり、翻訳テンプレート（図９のＢ）と、ＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図９のＣ）の構成に特徴を持つ。以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図９のＢ）のＰＥＧスペーサー部は、ピューロマイシンがアミノ酸と連結できることを特徴とする以外は上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様である。また、コード部も上記のベイトとして用いるのに好ましい翻訳テンプレートと同様であるが、特に、対応付けに適した構成としては、３’末端領域をＡ配列にすることが重要であり、トータル蛋白の対応付けの効率が著しく向上してフリー蛋白質の量が激減する。ここでも、コード部の５’末端領域をＳＰ６＋０２９とし、３’末端領域を、たとえば、Ｆｌａｇ＋ＸｈｏＩ＋Ａｎ（ｎ＝８）とすることで、各長さは、５’末端領域で約６０ｂｐ、３’末端領域で約４０ｂｐであり、ＰＣＲのプライマーにアダプター領域として設計できる長さである。これによって、あらゆるベクターやプラスミドやｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって、本態様の５’末端領域と３’末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、ＰＥＧスペーサー部をライゲーションすることで、対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られる。
本態様のＰＥＧによってＣ末端修飾された蛋白質（図９のＣ）は、蛋白質の相互作用検出などにおいて、コード部を利用しない場合、たとえば、ＦＣＣＳ測定、蛍光リーダー、プロテインチップなどに応用する場合は、ＲＮａｓｅ  Ａなどで意図的に切断してもよい。切断することによって、コード部の妨害による蛋白質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。また、単独の対応付け分子をプレートやビーズやスライドガラスに固定することも可能である。
無細胞共翻訳を、図１０を参照して説明する。図１０に示すように、ベイトの存在下でプレイがｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳される。図１０のＡ及びＢに示されるように、ベイトが蛋白質であって、無細胞翻訳系でプレイと同時に翻訳される場合と、ベイトが、核酸やホルモンなどであって、無細胞翻訳系に添加される場合がある。図１０に示すように、プレイは融合蛋白質又は対応付け分子とされる。
複合体は、ベイトと一つのプレイが結合して形成されること（Ｉ）の他に、ベイトに結合したプレイにさらに別のプレイが結合することにより形成されること（ＩＩ）もある。
本発明検出方法によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複合体の形成を行うことができるので、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間又は核酸−蛋白質間などの相互作用を検出できる。
ベイトが蛋白質である場合は、ベイトとしては、目的蛋白質との相互作用のための機能ドメインのみの蛋白質、機能ドメインを含む蛋白質、又は完全長蛋白質などが挙げられる。ここで、完全長蛋白質を用いることは、複数の機能ドメインを有することが一般に予測されるため、さらに網羅的にプレイを検出可能となることから、好ましい。完全長蛋白質は、単独で完全長の蛋白質でもよいし、完全長の蛋白質を再構成する複数のベイトの集まりでもよい。
ベイトは、図１１に示したように、複合体であってもよく、これを「複合ベイト」と呼ぶ。複合体にすることによって、より非特異的な吸着を減らすことができ、かつ完全長蛋白質と同様の効果として、より網羅的にプレイを検出することが可能となる。
以上のように、無細胞共翻訳で考えられる複合体としては、単独のベイトと単独のプレイの複合体、複合ベイトとプレイの複合体、ベイトと複数のプレイの複合体、及び、複合ベイトと複数のプレイの複合体が可能である。従って、本発明検出法により検出可能な相互作用は、ベイトとプレイとの間の直接の相互作用だけでなく、複合体を形成するための間接的な相互作用をも包含するものである。
本発明における無細胞共翻訳で最も重要なことは、蛋白質がネイティブな状態でフォールディングしており、翻訳されたての変性していない状態であり、相互作用するべきベイトとプレイ又はベイトとベイトやプレイとプレイが無細胞翻訳系に共存しており、速やかに相互作用できると言うことと考えられる。このことは、別々に翻訳して翻訳直後に混合して共存させるよりも、共に翻訳したものの方が優れた結果が得られたことにより支持される。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳された蛋白質がネイティブなフォールディング状態で、蛋白質又は核酸などと出会うことができるため、速やかに相互作用による複合体の形成が可能となったためと思われる。
従来の相互作用の検出法では、ベイトを大腸菌で大量に発現精製する必要があった。例えば、ＴＡＰ法などでベイトとプレイの相互作用を細胞で発現させる場合は、最低一ケ月の準備が必要であった。また、ＧＳＴ融合蛋白によるプルダウン法を採用しているｍＲＮＡディスプレイ法では、ベイトを大腸菌などで大量に発現させて精製するため、最低２〜３週間かかり、大腸菌で発現しないものはベイトに出来ないなどの問題があり、さらに、プレイと相互作用させるにはプレイの５０〜１００倍の量のベイトを添加する必要があった。無細胞共翻訳では、無細胞翻訳系において、ほぼ同量のｍＲＮＡ又はＤＮＡテンプレートを添加すればよいだけとなり、ベイトを細胞で発現させる必要は全くなくなり作業時間の大幅な短縮が行える。さらに、複合ベイトや完全長蛋白質によって、ベイトとプレイの相互作用をより強化し特異的なものとし、非特異的な結合の検出を回避することができる。また、複合ベイトによって、その第二のベイトと相互作用するより多くのプレイを網羅的に解析できる。
これまで、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで相互作用による複合体形成とスクリーニングを実現するシステムは存在しなかったが、以上の本発明検出法によって、ベイトも含めて完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳とスクリーニングを行って、蛋白質間又は蛋白質−核酸間の相互作用を非特異的な検出を回避しかつ網羅的に検出可能なシステムを構築できる。従って、本発明は、本発明検出方法を利用したスクリーニング方法も提供する。
本発明スクリーニング法は、ベイトとプレイが無細胞共翻訳を通して相互作用して複合体を形成し、複合体のスクリーニングによってベイトと相互作用するプレイを解析することを特長とする。従って、本発明スクリーニング方法は、本発明検出方法により、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程を含む他は、ベイトとプレイとの間の相互作用を検出する検出工程、及び、相互作用が検出されたプレイを選択する選択工程を含む、ベイトと相互作用するプレイの通常のスクリーニング方法と同様でよい。
本発明スクリーニング方法は、選択工程で選択されたプレイを調製する調製工程をさらに含み、調製されたプレイを、検出工程で使用されたベイトの代わりに又はそのベイトと共に用いて、検出工程、選択工程及び調製工程を繰り返すことが好ましい。この態様は、例えば、図１２に示すように、１）プレイ及びベイトが相互作用を形成する無細胞翻訳系における無細胞共翻訳の工程、２）ベイトと相互作用しているプレイを検出するスクリーニングの工程、３）プレイを分析及び解析する工程、及び４）３）で分析及び解析されたプレイを新たな次のベイトとし、１）から繰り返す工程から構成される。１）及び２）の工程が検出工程及び選択工程に相当し、３）の工程が調製工程に相当する。すなわち、検出工程のうちの、ベイトとプレイを接触させる工程が無細胞共翻訳の工程に相当し、検出工程のうちの複合体の検出及び選択工程がスクリーニングの工程に相当する。
本発明スクリーニング法では、選択工程で選択されたプレイを再度検出工程に付してもよい。
本発明スクリーニング法では、ベイトと複数のプレイの集団であるプレイ・ライブラリーとの無細胞共翻訳を行い、スクリーニングの工程において、２つ以上のプレイが検出されてもよい。
図１１に示すように、複合ベイトとプレイが共存し、相互作用によって複合ベイトとプレイの複合体を形成する場合がある。この無細胞共翻訳で、プレイ・ライブラリーの複数のプレイがベイトと共存し、相互作用によってベイトと複数のプレイの複合体を形成することによって、スクリーニングにおいて、一挙に網羅的な相互作用する複数のプレイを検出できる。また、ベイトが完全長蛋白質であることによって、完全長蛋白質は一般に相互作用の機能ドメインを複数含むので、より多くのプレイを網羅的に検出可能となる。
さらに、図１１に示すように、複合ベイトと相互作用する複数のプレイの複合体を形成することによって、複合ベイトと相互作用する複数のプレイを検出でき、また、第二のベイトがベイトとプレイの相互作用の補強剤となり、より特異的な相互作用が実現されることによって、網羅的検出における非特異的検出の回避が可能となる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法では、プレイは対応付け分子（ｆｕｓｉｏｎ）となる。プレイ・ライブラリーや複数のプレイを用いた場合の複合体の形成では、プレイは直接ベイトと相互作用する場合としない場合がある。
複合体のスクリーニングにより得られた複合体が対応付け分子である場合には、図１２に示すように、複合体を形成するプレイをＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲにより検出し、さらに、ＰＣＲ産物をプレイとして再スクリーニングする（プレイの再構築）、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングしてもよい。ここで、ＰＣＲ産物から再スクリーニングする、あるいは、ＰＣＲ産物から解析したプレイを新たな次のベイトとしてスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法など進化分子工学的手法においてのみ可能であり、プルダウン法、ＴＡＰ法など蛋白質を直接解析する方法ではできない。
対応付け分子を用いた場合には、スクリーニングの後、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって蛋白質プレイの遺伝子配列を知ることが出来る。図１０及び１１に示すように、ここでの蛋白質プレイとは、ベイトと相互作用しているプレイ又はそのプレイと相互作用しているプレイなどであり、ベイトと相互作用しているすべての複数のプレイが網羅的に解析できる。さらにプレイの再スクリーニングが必要な場合は、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲの産物であるＤＮＡテンプレートを転写し、同じサイクルを繰り返す。また、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲとそれに続くシークエンスによってプレイが定まった場合は、その蛋白質プレイはベイトとして使えるようになる。はじめのベイトに対して相互作用するプレイが複数個見つかれば、複合ベイトを形成することが出来るようになり、さらにより多くのプレイを検出することが出来るようになる。
無細胞共翻訳を用いると、プルダウン法やＴＡＰ法においても一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになるが、ＴＡＰ法では対応付け分子を形成していないので、プレイの解析において直接的に蛋白質を解析しなければならない。そこで、プルダウン法やＴＡＰ法をスクリーニングの方法としてｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法に応用すれば、対応付け分子を形成しているので、ＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲによって、相互作用するプレイの解析においてその遺伝子配列を簡単に検出することが出来る。さらに、無細胞共翻訳を用いると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法において、一貫してｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質間相互作用を検出できることになる。また、プレイの数が莫大な場合は、サイクルを回すことで再スクリーニングによりプレイを絞り込むことが可能である。また、解析されたプレイは、次の解析では、ベイトとして使うことができ、ベイトの数が増えれば、ベイトの複合化が進み、さらなるプレイが検出されることにつながる。このように、プレイをベイトとして次のサイクルで使用することは、対応付け分子を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法やＳＴＡＢＬＥ法などでのみ簡単に実現できる。しかしながら、ｍＲＮＡディスプレイなどの方法では、新しいベイトのＧＳＴ融合蛋白を大腸菌で大量合成と精製が必要であり、ベイトの用意に時間がかかり困難である。無細胞共翻訳によれば、その必要もなく簡単にサイクルを回すことが出来る。
無細胞共翻訳後の複合体のスクリーニングにおいて、無細胞共翻訳によって出来た複合体を壊すことなくプレイを網羅的にスクリーニングできることが好ましい。このために、親和性タグなどによってベイトに固定化の仕組みを持たせ、ベイトと相互作用するプレイを検出してもよい。その固定化の仕組みは、いかなるものでも構わない。たとえば、既存のＴＡＰ法などのように、ＩｇＧ−プロテインＡ親和性やカルモジュリンビーズを用いた２段階のスクリーニングを行う方法、又はプルダウン法のように、ストレプトアビジン又はアビジン−ビオチン親和性、ＧＳＴ−ｔａｇ、Ｆｌａｇ−ｔａｇ，Ｔ７−ｔａｇ，Ｈｉｓ−ｔａｇなどを利用した一段階又は二段階のスクリーニングを行う方法が挙げられる。
プレイ・ライブラリーとしては、ｃＤＮＡライブラリー（ランダムプライミング・ライブラリー、ｄＴプライミング・ライブラリー）、ランダム・ライブラリー、ペプチド・ライブラリー、ホルモン・ライブラリー、抗体・ライブラリー、リガンド・ライブラリー、医薬化合物ライブラリーなどが挙げられ、いかなるライブラリーでも構わない。たとえば、プレイ・ライブラリーとしてランダムプライミング・ｃＤＮＡライブラリーを用いた場合、このライブラリーには完全長プレイは望めないが、機能ドメインを含むプレイは期待できる。このようなライブラリーは、特に、複合ベイトや完全長蛋白質との組み合わせによるスクリーニングに用いると、プレイの網羅的検出に有効となる。
ランダムプライミングライブラリーの例としては、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の５’側に、転写プロモーターとしてＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６）と、翻訳エンハンサーとしてタバコモザイクウイルスのＴＭＶオメガ配列の一部（０２９）とを含んだ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域を持ち、かつＭＣＳの３’側に親和タグ配列として、抗原抗体反応によるアフィニティー分離分析用タグであるＦｌａｇ−ｔａｇ配列を、ＭＣＳに組み込まれた挿入配列から発現した蛋白質のＣ末端にＦｌａｇ−ｔａｇが付加されるように含む３’末端を持つベクターのＭＣＳに、ランダムプライミングで得られたｃＤＮＡが組み込まれたものが挙げられる。
上記の本発明検出方法は、ベイトとプレイとを接触させ複合体を形成させる工程を含んでいる。従って、この工程に準じて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとの複合体を形成させる方法が提供される。
本発明形成方法は、ベイトとベイトと相互作用する蛋白質であるプレイとの複合体の形成において、ベイトとして本発明の蛋白質を用いるものであり、好ましくは、さらに、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを主な特徴とするものである。従って、本発明形成方法の好ましい構成は、ベイト及びプレイに特定の様式で検出用標識及び分離用修飾を行い、そして、無細胞共翻訳を行うことを除いて、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させることを含む、ベイトとプレイとの複合体の通常の形成方法と同様でよい。ベイト及びプレイの特定の様式での検出用標識及び分離用修飾ならびに無細胞共翻訳については、本発明検出方法に関し説明した通りでよい。
本発明形成方法では、相互作用が既知のベイトとプレイとの間の複合体だけでなく、ベイトと、複数のプレイからなるプレイライブラリーとを接触させることにより、ベイトとそのベイトと相互作用するプレイとを接触させる工程を行うことによって、相互作用が未知の要素を含む複合体を形成することもできる。
その他の本発明の蛋白質の利用方法としては以下のものが挙げられる。
本発明の蛋白質を用いた、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる蛋白質と物質の相互作用解析方法。
本発明の蛋白質を用い、該蛋白質のＣ末端に結合したコード部の塩基配列の増幅により蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
本発明の蛋白質を用い、無細胞共翻訳法や無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを特徴とする蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
本発明の蛋白質を用い、蛋白質を蛍光ラベル化及び／又は固定化することを特徴とする、蛋白質と物質の相互作用解析方法。
本発明の蛋白質を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質又は物質の相互作用を解析する方法。
本発明の蛋白質を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共翻訳法を利用することを特徴とする蛋白質又は物質との相互作用を解析する方法。
本発明の蛋白質を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質又は物質との相互作用を解析する方法。
本発明の蛋白質をコードする核酸を用いた、上記の相互作用解析方法。
また、以下のものも挙げられる。
蛋白質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、該蛋白質を含む、修飾剤がＣ末端に結合したＣ末端修飾蛋白質を用いることを特徴とする方法。相互作用の解析は、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行うことができる。Ｃ末端修飾蛋白質を固定化してもよい。標的分子が固定されたアレイ上にＣ末端修飾蛋白質を添加し、該標的分子と特異的に結合した該Ｃ末端修飾蛋白質を検出してもよい。
本態様の解析方法においては、通常には、上記で得られた本発明修飾蛋白質と標的分子を、修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接触せしめ、該本発明修飾蛋白質又は該標的分子が発する信号において両分子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互作用を解析する。相互作用の解析は、例えば、蛍光相関分光法、蛍光イメージングアナライズ法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン共鳴法、又は、固相酵素免疫検定法により行われる。これらの方法の詳細については下記で説明する。
「標的分子」とは、本発明修飾蛋白質と相互作用する分子を意味し、具体的には蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられ、好ましくは、蛋白質又はＤＮＡである。
蛋白質としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、蛋白質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、およびその機能が既知の蛋白質でも、未知の蛋白質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製された蛋白質、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製した蛋白質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖蛋白質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製された蛋白質か、又はｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳および精製された蛋白質を用いることができる。
核酸としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、ＤＮＡ又はＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列又は機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、蛋白質に結合能力を有する核酸としての機能、および塩基配列が既知のものか、又はゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はなく、その糖配列又は機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列又は機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、本発明修飾蛋白質と相互作用する能力を有する限り、特に制限はない。機能が未知のものでも、又は蛋白質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子が本発明修飾蛋白質と行う「相互作用」とは、通常は、蛋白質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、および静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合および解離、蛋白質レセプターとリガンドの間の結合および解離、接着分子と相手方分子の間の結合および解離、酵素と基質の間の結合および解離、核酸とそれに結合する蛋白質の間の結合および解離、情報伝達系における蛋白質同士の間の結合と解離、糖蛋白質と蛋白質との間の結合および解離、又は糖鎖と蛋白質との間の結合および解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、態様に応じて修飾物質により修飾して用いることができる。修飾物質は、通常、蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えばカルボキシル基、水酸基、アミノ基など）を持ち、蛋白質、核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、例えばフルオレセイン系列、ローダミン系列、Ｃｙ３、Ｃｙ５、エオシン系列、ＮＢＤ系列などのいかなるものであってもよい。その他、色素など修飾可能な化合物であれば、その化合物の種類、大きさは問わない。
これらの修飾物質は、標的分子と本発明修飾蛋白質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。
上記修飾物質の標的分子への結合は、それ自体既知の適当な方法を用いて行うことができる。具体的には、例えば、標的分子が蛋白質の場合、ＷＯ  ０２／４８３４７に記載されたＣ末端を修飾する方法等を用いることができる。また標的分子が核酸の場合は、予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲを行う方法などによって簡便に修飾することができる。
また、本発明修飾蛋白質又は本発明に用いられる標的分子は態様に応じて、固相に結合させる（即ち、固定化する）場合があるが、固相に結合させる方法としては、修飾物質を介して結合させるものと、それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。
修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、通常には、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（以下、「リガンド」と称することがある。）であり、固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド（以下、「アダプター蛋白質」と称することがある）を結合させる。アダプター蛋白質には、結合蛋白質、受容体を構成する受容体蛋白質、抗体なども含まれる。
アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチンおよびイミノビオチン結合蛋白質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、Ｇ蛋白質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合蛋白質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合蛋白質／ＡＴＰ、又はエストラジオール受容体蛋白質／エストラジオールなどの各種受容体蛋白質／そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、アダプター蛋白質／リガンドの組み合わせとしては、アビジンおよびストレプトアビジンなどのビオチンおよびイミノビオチン結合蛋白質／ビオチン又はイミノビオチン、マルトース結合蛋白質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）、などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチン又はイミノビオチンの組み合わせが最も好ましい。これらの結合蛋白質は、それ自体既知のものであり、該蛋白質をコードするＤＮＡは既にクローニングされている。
アダプター蛋白質の固相表面への結合は、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基又はアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、通常蛋白質、核酸、糖鎖、低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、具体的には例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、アミノ基、活性エステルに変換可能なカルボキシル基、又はホスホアミダイドに変換可能な水酸基又はアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
固相は、通常、蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるものでよく、その材質および形状は特に限定されない。例えば、ガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレンやポリビニリデンフロライド膜、又はプラスチック製のマイクロプレート等を用いることができる。
「測定」とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。用いられる測定法としては、例えば、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動法、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光偏光解消法、蛍光イメージングアナライズ法、表面プラズモン共鳴法、固相酵素免疫検定法など、分子間相互作用を検出できるあらゆる系が利用可能である。
この測定法は、標的分子が固定されたアレイ上に本発明修飾蛋白質を添加し、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質を検出することを含む方法も含む。標的分子が固定されたアレイとは、標的分子がそれらの同定が可能な配置で固定化されている固相を意味する。該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質の検出の方法は、該標的分子と特異的に結合した本発明修飾蛋白質が検出される限り、特に限定されず、通常には、本発明修飾蛋白質を添加したアレイから、標的分子に結合しない本発明修飾蛋白質を洗浄により除去し、残った本発明修飾蛋白質を検出する方法が挙げられる。
以下、測定法の例について説明する。
（１）蛍光相関分光法
蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））は、共焦点レーザー顕微鏡等の下で、粒子の流動速度、又は拡散率、容積収縮等を測定する方法であり、本発明においては、本発明修飾蛋白質（Ｃ末端修飾蛋白質）と標的分子間の相互作用により元の修飾分子１分子の並進ブラウン運動の変化を測定することにより、相互作用する分子を測定することができる。
具体的には試料粒子が励起光により励起されて、試料液容積の一部において蛍光を放射し、この放射光を測定し光子割合を得る。この値は、特定の時間に観測されている空間容積中に存在する粒子の数と共に変化する。上述した種々のパラメターは自己相関関数を使用してこの信号の変動から算出され得る。このＦＣＳを行う為の装置もカールツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社等から市販されており、本方法においてもこれらの装置を用いて解析を行うことができる。
この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供することが必要である（液相法）。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾蛋白質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
しかし、２種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）は、１種類の蛍光色素を用いるＦＣＳでは困難であった同じくらいの分子量をもつ蛋白質間の相互作用も検出できる。２種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法が知られているが、ＦＲＥＴが生じるためには２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があり、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性がある。ＦＣＣＳ法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、そのような問題がない。一方、他の検出系である蛍光偏光解消法と比較すると、ＦＣＣＳ法は必要なサンプル量が少なく、検出時間が短く、ＨＴＳのための自動化が容易等の長所がある。さらにＦＣＣＳ法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的な情報が得られるので、表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用できる可能性がある。両者の違いは、表面プラズモン共鳴法では蛋白質が固定化された状態で相互作用を検出するのに対して、ＦＣＣＳ法ではより天然の状態に近い溶液中の相互作用を見ることができる点にある。ＦＣＣＳ法では、蛋白質の固定化が必要ないかわりに、蛋白質を蛍光色素で標識する必要があるが、本発明により、この課題を克服することが可能となった。
また、ＦＣＣＳ法では細胞内の環境に近い溶液状態で蛋白質・蛋白質相互作用や蛋白質・核酸相互作用を調べることができ、かつ解離定数（結合定数）を１回の測定で簡便に算出することができる。
本方法においてＣ末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販のＦＣＳ用装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記ＦＣＳ用測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾蛋白質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、あるいは特定のＣ末端修飾蛋白質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（２）蛍光イメージングアナライズ法
蛍光イメージングアナライズ法は、固定化された分子に、修飾分子を接触せしめ、両分子の相互作用により、固定化された分子上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化して用いる場合には修飾されているものと、されていないもののどちらも利用可能である。また、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。Ｃ末端修飾蛋白質は、修飾部を介して固定化されているものも、修飾部以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
Ｃ末端修飾蛋白質、又は標的分子を固定化するための基板（固相）としては、通常、蛋白質や核酸等を固定化するのに用いられるガラス板やニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、又はプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。また、表面が種々の官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基等）や種々のリガンド（ビオチン、イミノビオチン、ニッケル又はコバルト等の金属イオン、グルタチオン、糖類、ヌクレオチド類、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、カルモジュリン、受容体蛋白質等）が結合した上記基板等も用いることができる。
本方法において修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する修飾標的分子又はＣ末端修飾蛋白質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった標的分子又はＣ末端修飾蛋白質の修飾物質から発せられる蛍光信号、又は固定化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、市販のイメージングアナライザーを用いて測定又は解析することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記固相表面に、複数のＣ末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子を番地付けして固定化する方法、又は１種類のＣ末端修飾蛋白質又は修飾もしくは非修飾標的分子に固定化されていない複数種のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。複数種のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を接触させる場合には、固相にとどまった該分子を緩衝液の濃度の差等により解離させて取得し、これを既知の方法により分析することにより同定できる。
（３）蛍光共鳴エネルギー移動法
２種類の蛍光色素を用いる他の分子間相互作用検出法として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法がよく知られている。ＦＲＥＴとは、２種類の蛍光色素の一方（エネルギー供与体）の蛍光スペクトルと、もう一方（エネルギー受容体）の吸収スペクトルに重なりがあるとき、２つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、供与体からの発光が起こらないうちに、その励起エネルギーが受容体を励起してしまう確率が高くなる現象をいう。したがって、相互作用を検出したい２つの蛋白質を、それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、供与体を励起すれば、２つの蛋白質が相互作用しない場合は、蛍光色素間の距離が大きいためＦＲＥＴは起こらず、供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、２つの蛋白質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、ＦＲＥＴにより受容体の蛍光スペクトルが観察されるので、蛍光スペクトルの波長の違いから蛋白質間相互作用の有無を判別することができる。蛍光色素としては、供与体がフルオレセイン、受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。また最近では、蛍光緑色蛋白質（ＧＦＰ）の波長の異なる変異体の組み合わせにより、細胞の中でＦＲＥＴを観察し相互作用を検出する試みがなされている。この方法の欠点としては、ＦＲＥＴが生じるために２つの蛍光色素が４０〜５０Å以内に近接する必要があるため、蛋白質の大きさや蛍光色素の付いている位置によっては、相互作用していてもＦＲＥＴが観測されない危険性があるという点が挙げられる。
（４）エバネッセント場分子イメージング法
エバネッセント場分子イメージング法とは、Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５）等に記載されている方法で、ガラス等の透明体に固定化した分子に溶液として第２の分子を接触せしめ、これにエバネッセント場が発生する角度でレーザー光等の光源を照射し、発生したエバネッセント光を検出器によって測定又は解析する方法である。これらの操作は、それ自体既知のエバネッセント場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれか一方は上記した方法により固定化されていることが必要である。標的分子は固定化する場合は修飾の必要はないが、固定化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
Ｃ末端修飾蛋白質、又は標的分子を固定化するための基板としては、ガラス等の材質の基板が用いられ、好ましくは石英ガラスが用いられる。また、レーザー光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
本方法において固定化していないＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を固定化分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは固定化していないＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これを固相表面に滴下する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、エバネッセント場照明により励起された蛍光をＣＣＤカメラ等の検出器を用いて測定することにより、固定化された分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記基板に、複数のＣ末端修飾蛋白質又は修飾標的分子を番地付けして固定化する方法等が用いられる。
（５）蛍光偏光解消法
蛍光偏光法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））は、蛍光偏光で励起された蛍光分子が、励起状態の間、定常状態を保っている場合には同一の偏光平面で蛍光を放射するが、励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を行った場合に、放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する方法である。分子の運動はその大きさに影響を受け、蛍光分子が高分子である場合には、励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、放射光は偏光を保ったままになっているのに対して、低分子の蛍光分子の場合は、運動速度が速いために放射光の偏光が解消される。そこで、平面偏光で励起された蛍光分子から放射される蛍光の強度を、元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、両平面の蛍光強度の割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものである。この方法によれば、夾雑物があってもこれに影響されることなく、蛍光修飾された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。これは蛍光修飾された分子と標的分子が相互作用するときにのみ、偏光度の変化として測定されるからである。
この方法を行うための装置としては例えばＢＥＣＯＮ（Ｐａｎｙｅｒａ社製）等が市販されており、本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質又は標的分子のいずれも溶液として供する必要がある。標的分子は修飾の必要はない。また相互作用を調べようとするＣ末端修飾蛋白質より非常に分子量の小さい分子は、Ｃ末端修飾蛋白質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法においてＣ末端修飾蛋白質に標的分子を接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであってもよいが、好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ウェルに通常生化学的に用いられる緩衝液等に適当な濃度でＣ末端修飾蛋白質溶解した溶液を投入し、さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって行われる。
本方法において測定するＣ末端修飾蛋白質および標的分子との間の相互作用は、必ずしも抗原抗体反応ほど特異性は高くないことが考えられるため、最適の組み合わせを検出するためには、相互作用の程度を数値化することが有効である。相互作用の程度を示す指標としては、例えば一定濃度のＣ末端修飾蛋白質に対して、極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記蛍光偏光解消法測定装置の各測定用ウェルにそれぞれ異なる複数のＣ末端修飾蛋白質を投入し、これに特定の標的分子溶液を投入するか、又は特定のＣ末端修飾蛋白質を投入し、各ウェルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が用いられる。
（６）表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法とは、金属／液体界面で相互作用する分子によって表面プラズモンが励起され、これを反射光の強度変化で測定する方法である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））。この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、Ｃ末端修飾蛋白質は上記した方法により固定化されていることが必要であるが、標的分子の修飾は必要ない。
Ｃ末端修飾蛋白質を固定化するための基板としては、ガラスの等の透明基板上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。透明基板としては、通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるものであってもよく、レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガラス等からなるものであり、その厚さは０．１〜５ｍｍ程度のものが用いられる。また金属薄膜の膜厚は１００〜２０００Å程度が適当である。このような表面プラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。Ｃ末端修飾蛋白質の上記基板への固定化は前述した方法により行うことができる。
本方法において標的分子をＣ末端修飾蛋白質へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液に固定化されたＣ末端蛋白質を接触させる方法を用いることができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、例えばＢＩＡｃｏｒｅ２０００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ社製）によってもよい。両分子を接触せしめた後、それ自体既知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、それぞれの反射光の相対強度の時間的変化を測定することにより、固定化されたＣ末端修飾蛋白質と標的分子の相互作用が解析できる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記表面プラズモン共鳴装置に用いられる基板に、複数のＣ末端修飾蛋白質を番地付けして固定化するか、又は１種類の固定化されたＣ末端修飾蛋白質に複数種の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
（７）固相酵素免疫検定法
固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））は、固相上に固定化した抗原に対し、抗体を含む溶液を接触せしめ、両分子の相互作用（抗原抗体反応）により、固定化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分子（ＩｇＧ等）から発せられる蛍光、又は修飾分子を基質とする色素から発せられる信号を、市販の検出器（ＥＬＩＳＡリーダー）を用いて測定又は解析する方法である。
この方法を用いて蛋白質−標的分子間相互作用の測定又は解析を行う場合、抗原となるＣ末端修飾蛋白質は上記した方法により固定化されていることが必要である。また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されていることが必要である。
抗原となるＣ末端修飾蛋白質を固定化するための基板としては、通常ＥＬＩＳＡに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。
本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法としては、両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであってもよいが、好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、これをマイクロプレートに注入する方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、好ましくは過剰に存在する固定化分子に結合していない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、固相上にとどまった修飾分子から発せられる蛍光を、市販のＥＬＩＳＡリーダー等を用いて測定又は解析することにより、固定化された抗原分子と相互作用する分子を同定することができる。
この方法において、同時に多数の解析を行う方法としては、例えば上記マイクロプレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固定化する方法が用いられる。
また、本発明の蛋白質は相互作用する分子の同定にも使用できる。
上記のそれぞれの方法により測定されＣ末端修飾蛋白質との間に相互作用が認められた標的分子は、該分子の一次構造が未知の場合、それ自体既知の適当な方法により、その一次構造を解析することができる。具体的には、相互作用を認められた標的分子が蛋白質の場合、アミノ酸分析装置等によりアミノ酸配列を解析し、一次構造を特定することができる。また、標的分子が核酸の場合には、塩基配列決定方法により、オートＤＮＡシーケンサーなどを用いれば塩基配列を決定することができる。
さらに、本発明の蛋白質は、蛋白質のライブラリーとの相互作用の解析にも使用できる。
本発明は、ベイトをｃ−Ｆｏｓ蛋白質として、プレイをマウス脳のｃＤＮＡライブラリーとして、ＩＶＶの共翻訳セレクション／スクリーニングを行い、その結果得たｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成しうる新規の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列、およびそれらの利用方法を提供する。また、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成しうることが知られていない既知の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列の利用方法を提供する。
本発明は、既知の遺伝子配列や核酸配列を探索するにとどまらず、予想されなかったフレームシフトによる新規のアミノ酸配列を持つ新規の蛋白質、ゲノム情報から核酸配列のみ公開されていた核酸配列を持つ新規の蛋白質、又は、全く新規の核酸配列を持つ新規の蛋白質、さらに、直接的な相互作用のみならず、予想されなかった間接的な相互作用による複合体を形成する蛋白質やそれら蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列、およびそれらの利用方法を提供することが可能である。
【実施例】  以下、本発明の蛋白質のアミノ酸配列とそれをコードする核酸の配列について具体的に記するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
【実施例１】  ベイトをｃ−Ｆｏｓ蛋白質として、プレイをマウス脳のｃＤＮＡライブラリーとして、ＩＶＶの共翻訳セレクション／スクリーニングを行い（図２）、その結果、ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成しうる新規の蛋白質をコードする遺伝子又は核酸配列を得た。
ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質の作成方法は以下の通りであった。ｐＣＭＶ−ＦｏｓＣＢＰｚｚベクター（配列番号１６８）から、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’ＳＰ６（０２９）Ｔ７−ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号１６９）と３’ＦｏｓＣＢＰｚｚ（配列番号１７０）、ＰＣＲプログラムＣＹＣＢ１（表１参照））によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸＴＭ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃，２ｈ）し、ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレートを準備した。共存させるベイトＤＮＡは、Ｆｏｓ／Ｊｕｎの結合配列を含むＤＮＡ−Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（配列番号１７１）をテンプレートとし、ＰＣＲ（プライマー５’ＤＮＡ（配列番号１７２）と３’ＤＮＡ（配列番号１７３）、ＰＣＲプログラムＶ−２（表１参照））によって準備した。
プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリーの作成方法は以下の通りであった。図３に従ってＩＶＶランダムライブラリーを作成した。ＲＮＡライブラリーとして、市販のマウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（組織抽出ＲＮＡライブラリーをｏｌｉｇｏ  ｄＴカラムで精製したもの；ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を購入した。アダプター設計は、対応付け分子の形成に適した５’ＵＴＲ配列（プロモーターＳＰ６＋エンハンサー０２９又は０’）をライブラリーに、ＩＶＶ形成に必要な配列として付加するための設計を行った。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーには、エンハンサー０２９をもつアダプターを使用した。エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖（配列番号１７４又は１７５）と副鎖（ｇａａｔｔｃｇｃ又はｇｇａａｔｔｃｇ）は、各々ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解して１００μＭとし、主鎖と副鎖をそれぞれ１０μｌずつ等モルで混合した。９０℃で２分間加熱し、７０℃で５分加熱し、６０℃のウオーターバスにセットしてバスのヒーターを切ってゆっくりと６０℃から室温まで下げた。５μｌづつに分注して−２０℃に保存した。次に、マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリーを一本鎖ＤＮＡに逆転写した（図３，Ｉ）。マウス脳（ｐｏｌｙＡ＋）ＲＮＡライブラリー（１．４ｐｍｏｌｅ／０．５μｇ）を０．５μｇ、３’ランダムプライマー（配列番号１７６）を２ｐｍｏｌとＤＥＰＣ水とを加えて１２．０μｌとし、７０℃で１０ｍｉｎ加熱し、氷上で１分間冷却した。これを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４５℃で１ｈ逆転写反応を行った。次に、逆転写反応で合成した一本鎖ＤＮＡを全量用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１６℃で２ｈ反応し、さらにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで１６℃で５ｍｉｎで末端を平滑化し、二本鎖ＤＮＡを合成した（図３，ＩＩ）。次に、この二本鎖ＤＮＡの５’末端がリン酸化されていることを利用して、先に準備したアダプターを用いてライゲーションした（図３，ＩＩＩ）。合成した二本鎖ＤＮＡライブラリーをエタノール沈殿し、４μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。これに、１００μＭの準備したアダプターを１．０μｌ添加し、５０μｌ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、１６℃でオーバーナイトで反応させ、精製（ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）した後５０μｌとした。次に、ＰＣＲ（ＥＸ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ；ＴａＫａＲａ）を行った（図３，ＩＶ）。５０μｌのライゲーションした二本鎖ＤＮＡライブラリーから２μｌをテンプレートとして、ＩＶＶに必要な特定配列（０２９）を持つ５’ＰＣＲプライマー（配列番号１７２）と３’ＰＣＲプライマー（配列番号１７３）を用いて、ＩＶＶｃＤＮＡライブラリーを作成した。ＰＣＲの条件は、全量１００μｌ、２２サイクル（９４���で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で９０秒を１サイクルとし、最後の伸長反応は、７２℃で１８０秒）とした。
これらベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質のｍＲＮＡテンプレート、プレイのマウス脳ｃＤＮＡライブラリー、そして共存させるベイトＤＮＡを小麦の無細胞翻訳系（Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて５０μｌで共翻訳（２６℃，６０ｍｉｎ）させた。５０μｌのサンプルに対し、ＩｇＧ結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ４０）５０μｌを添加し計１００μｌ（共翻訳サンプル）とした。その後、ＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ）をＩｇＧ結合バッファーで２回洗浄し、これに共翻訳サンプル（１００μｌ）を加え、４℃で２時間回転攪拌した。結合バッファーで３回、ＴＥＶ切断バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  Ｎａｃｌ，０．１％ＮＰ４０，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ）で１回洗浄し、ＩｇＧアガロースに結合したベイト／プレイ複合体をＴＥＶプロテアーゼ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で切断した（１６℃、２時間）。さらに、上清９０μｌを３００μｌカルモジュリン結合バッファーと０．３μｌ  １Ｍ  ＣａＣｌ２、さらに、５００μｌカルモジュリン結合バッファーで２回洗浄した５０μｌカルモジュリンビーズを加えて４℃で１時間回転攪拌した。遠心後、１０００μｌカルモジュリン結合バッファーで３回洗浄した。５０μｌカルモジュリン溶出バッファーを加えて、氷上で１〜２分放置し、遠心後、５０μｌを回収した。回収した溶液をテンプレートとして、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）、プライマー；配列番号１７７と１７８、プログラム；ＲＴ−ＱＨ３０’（表１参照））を行った。このスクリーニング／セレクション操作（図２）を３ラウンド繰り返した後のライブラリーをクローニングしてシーケンスすることで、配列番号１〜１４（Ｆｉｐ−ｃｘのアミノ酸配列）、配列番号１５〜１９（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１のアミノ酸配列）、配列番号２０〜２２（Ｓｃｈｉｐ１のアミノ酸配列）、それらに対応する各核酸配列が得られた（図１Ａの配列番号１〜２２）。この結果は、エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖として配列番号１７４を用いて作成したライブラリーおよび配列番号１７５を用いて作成したライブラリーのいずれでも同様であった。
どの蛋白質もＬｅｕジッパーを持ち、ｃ−Ｆｏｓと直接相互作用があることが今回初めて明らかとなった蛋白質である。
得られた蛋白質とｃ−Ｆｏｓとの相互作用の検証実験として、配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），２２（Ｓｃｈｉｐ１）の蛋白質（図１Ａ）が無細胞翻訳系で発現することを、配列番号２−１，１６−１、２２−１のＤＮＡ配列をもとにして、ＷＯ  ０２／４６３９５の実施例１の（２）コード分子の調製と（３）コード分子の翻訳にしたがって実験し、小麦無細胞翻訳系で各蛋白質が発現することをＣ末端ラベル化法で確認した（図４，Ａ）。また、ＷＯ  ０２／４６３９５の実施例１の（４）スペーサー分子とコード分子の連結と（５）対応付け分子の形成にしたがって、ＩＶＶの形成も確認した（図４，Ｂ）。さらに、ｃ−Ｆｏｓとの相互作用を確認するために、一段目のｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ（図２，ＩｇＧ＋ＴＥＶ）したものを８Ｍ  ｕｒｅａ／１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図４Ｃ）。その結果、配列番号２（Ｆｉｐ−ｃｘ），１６（Ｅｅｆ１ｄＴＥＦ−１），２２（Ｓｃｈｉｐ１）の蛋白質はｃ−Ｆｏｓと相互作用していることが確認できた。
また、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能（ここではｃ−Ｆｏｓと結合できる機能）を利用して、ｃ−Ｆｏｓの持つ機能としての転写や遺伝子複製などをブロックする阻害剤として応用することができる。その根拠は、ＩＶＶ法で検出された遺伝子は、スクリーニングを複数回繰り返すことにより競争過程を経て検出されてきていることに起因する。よって、ＩＶＶ法で検出された遺伝子群は、ある個数分布を描き、競争力が強い遺伝子ほど多く検出されることになる。このことは、クローン数が多いほど競争力が強く、ブロック剤・阻害剤として有効に働くことを示している。本実施例のＩＶＶセレクションでは、ベイトｃ−Ｆｏｓに対して、プレイとしてよく知られているｃ−Ｊｕｎが３コ（／７２コ）検出された。このように、セレクションで検出されるクローン数（図１Ａ）から、Ｆｉｐ−ｃｘ，Ｅｅｆ１，Ｓｃｈｉｐ１は既知の蛋白質に比較して非常に強い競争力を持ち、十分競争することができることを示しており、各蛋白質は、ｃ−Ｊｕｎと既知の蛋白質の相互作用による複合体の転写や遺伝子複製などの機能をブロックする阻害剤として応用することができる。
【実施例２】  実施例１と同様にして、ベイトｃ−Ｆｏｓとマウス脳ｃＤＮＡライブラリーからプレイＩＶＶライブラリーを準備し、スクリーニング／セレクション操作（図２）も同様に行った。ただし、ここでは、二段スクリーニング／セレクションのうち一段目のＩｇＧビーズによるセレクションを３回繰り返し、４回目のみ二段セレクションを行い、配列番号４７〜５６（Ｆｉｐ−ｃｘ．１のアミノ酸配列）、配列番号５７〜７６（Ｆｉｐ−ｃｘ．２のアミノ酸配列）、配列番号７７〜８１（Ｏｐｔｉｎのアミノ酸配列）、配列番号８２〜８４（Ｓｎａｐ１９のアミノ酸配列）、配列番号８５〜８６（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋのアミノ酸配列）、配列番号８７〜８９（ＦＬＪ３２０００のアミノ酸配列）、配列番号９０〜９１（Ｒｉｔ２のアミノ酸配列）、配列番号９２〜９３（ｃｙｔｏｃｒｏｍｅ  ｂのアミノ酸配列）、配列番号９４〜９５（Ａｐｏｅのアミノ酸配列）、配列番号９６〜９７（Ａｐｐのアミノ酸配列）、配列番号９８〜９９（Ｄｎａｊａ２のアミノ酸配列）、配列番号１００〜１０１（Ｆｉｐ−ｃ１０のアミノ酸配列）、配列番号１０２（Ｆｉｐ−ｃ４のアミノ酸配列）、配列番号１０３（Ｆｉｐ−ｃ１８のアミノ酸配列）、それらに対応する各核酸配列が得られた（図１Ａの配列番号４７〜７６及び図１Ｂの配列番号７７〜１０３）。この結果は、エンハンサー０２９用のアダプターの主鎖として配列番号１７４を用いて作成したライブラリーおよび配列番号１７５を用いて作成したライブラリーのいずれでも同様であった。
Ｆｉｐ−ｃｘ．１，Ｆｉｐ−ｃｘ．２，Ｏｐｔｉｎ，Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ，ＦＬＪ３２０００，ｃｙｔｏｃｒｏｍｅ  ｂ蛋白質はＬｅｕジッパーを持ち、Ｒｉｔ２，Ａｐｏｅ，Ａｐｐ，Ｄｎａｊａ２，Ｆｉｐ−ｃ１０，Ｆｉｐ−ｃ４，Ｆｉｐ−ｃ１８蛋白質はＬｅｕジッパーを持たず、いずれの蛋白質もｃ−Ｆｏｓと複合体形成することが今回初めて明らかとなった蛋白質である。
得られた蛋白質とｃ−Ｆｏｓとの相互作用の検証実験として、配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２），７８（Ｏｐｔｎ）、８４（Ｓｎａｐｃ５），８６（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），８８（ＦＬＪ３２０００），９１（Ｒｉｔ２），９３（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ），９５（Ａｐｏｅ），９７（ｂｅｔａＡＰＰ），９９（Ｈｓｐ４０），１０１（Ｆｉｐ−ｃ１０），１０２（Ｆｉｐ−ｃ４），１０３（Ｆｉｐ−ｃ１８）の蛋白質（図１）が無細胞翻訳系で発現することを、配列番号１０５，１３９，１４２，１４８，１５０，１５２，１５５，１５７，１５９，１６１，１６３，１６５、１６６，１６７の核酸配列をもとにして、ＷＯ  ０２／４６３９５の実施例１の（２）コード分子の調製と（３）コード分子の翻訳にしたがって実験し、小麦無細胞翻訳系で各蛋白質が発現することをＣ末端ラベル化法で確認した（図５，Ａ）。また、発現を確認したそれらのＣ末端ラベル化蛋白質のうち、データベースには登録されていない全く新規な蛋白質である配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２）をプレイ蛋白質として用いて、ベイトｃ−Ｆｏｓとの相互作用をｐｕｌｌ−ｄｏｗｎにより確認した。具体的には、プレイ蛋白質の作製方法は、ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＤｒｉｖｅベクター（配列番号１７９、ＱＩＡＧＥＮ社製）にクローニングされた配列を菌体から抽出し、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造）を用いて、ＰＣＲ（プライマー５’Ｆ３（配列番号１８０）と３’Ｒ３（配列番号１８１）、ＰＣＲプログラムＩＳＨＩ１５６２（表１参照）、１００μｌスケール）によってＤＮＡテンプレートを準備した。ＤＮＡテンプレートをＲｉｂｏＭＡＸＴＭ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写（３７℃、２時間、５０μｌスケール）を行い、プレイ蛋白質のｍＲＮＡテンプレートを準備した。
ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質の作製方法はセレクション／スクリーニングの際と同じである。
プレイテンプレートをＣ末端ラベル化法を用いた無細胞翻訳（１０μｌスケール）を１時間行い、Ｃ末端ラベル化された状態でプレイ蛋白質を作製した。同時にベイトｃ−ｆｏｓテンプレートは無細胞翻訳（５０μｌスケール）により１時間翻訳反応を行い、ベイト蛋白質を作製した。翻訳後、両者および結合バッファーを混合させ（プレイ：８μｌ、ベイト：１０μｌ、ＩｇＧ結合バッファー：８２μｌ）、ＩｇＧアガロースビーズ５０μｌに２時間インキュベートし、ビーズを洗浄後、ビーズに２０μｌのＳＤＳ含有の緩衝液を加え、５分間１００℃で煮沸し溶出させた。このサンプルを１７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ＦＩＴＣ蛍光色素を蛍光イメージャーにより観察した（図５，Ｂ）。なお、コントロールとして、ベイトｃ−Ｆｏｓ蛋白質を加えない反応も行った。
その結果、配列番号４８（Ｆｉｐ−ｃｘ．１），７５（Ｆｉｐ−ｃｘ．２）蛋白質はｃ−Ｆｏｓと直接相互作用していることが確認できた。
さらに、図６に示すように、配列番号１４２（Ｏｐｔｎ），１４８（Ｓｎａｐｃ５），１５０（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），１５２（ＦＬＪ３２０００）の核酸配列をもとにして、リアルタイムＰＣＲによりｃ−Ｆｏｓと直接および間接的に相互作用している遺伝子の濃縮を確認した。具体的なリアルタイムＰＣＲの方法は、４種の遺伝子（配列番号１４２（Ｏｐｔｎ），１４８（Ｓｎａｐｃ５），１５０（Ｃ１３００２０Ｍ０４Ｒｉｋ），１５２（ＦＬＪ３２０００）についてスクリーニングにより得られた配列の範囲内で増幅されるよう、プライマーを設計した（配列番号１８２〜１８９）。検量線作製用に、ポジティブコントロールのＤＮＡ断片をｐＤｒｉｖｅベクターに組み込まれた遺伝子をＰＣＲ（５’Ｍ１３＿Ｆプライマー（配列番号１９０）、３’Ｍ１３＿Ｒプライマー（配列番号１９１））を用い、表１のＰＣＲプログラムｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒを使用）により増幅し、１Ｅ０３、１Ｅ０５、１Ｅ０７、１Ｅ０９クローン／反応となるように調整した。測定は、スクリーニング前のライブラリーＤＮＡ、スクリーニングの各サイクルのライブラリーＤＮＡ、およびベイトｃ−Ｆｏｓを添加しなかったＭｏｃｋライブラリーＤＮＡをそれぞれ５ｎｇ／反応となるよう調整した。ＰＣＲ測定反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（共にロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて表１に示したプログラムにより、２０μｌのスケールで行った。
また、本発明による蛋白質や遺伝子又は核酸配列による新たな機能（ここではｃ−Ｆｏｓと結合できる機能）を利用して、ｃ−Ｆｏｓの持つ機能としての転写や遺伝子複製などをブロックする阻害剤として応用することができる。その根拠は、ＩＶＶ法で検出された遺伝子は、スクリーニングを複数回繰り返すことにより競争過程を経て検出されてきていることに起因する。よって、ＩＶＶ法で検出された遺伝子群は、ある個数分布を描き、競争力が強い遺伝子ほど多く検出されることになる。このことは、クローン数が多いほど競争力が強く、ブロック剤・阻害剤として有効に働くことを示している。本実施例のＩＶＶセレクションでは、ベイトｃ−Ｆｏｓに対して、プレイとしてよく知られているＪｕｎＤが３コ（／１４２コ）検出された。このように、セレクションで検出されるクローン数（図１Ａ及び１Ｂ）から、Ｆｉｐ−ｃｘ．１，Ｆｉｐ−ｃｘ．２，Ｏｐｔｎなどは既知の蛋白質に比較して非常に強い競争力を持ち、また、Ｓｎａｐ１９，ＦＬＪ３２０００などは、既知の蛋白質と十分競争することができることを示しており、各蛋白質は、ｃ−Ｊｕｎと既知の蛋白質の相互作用による複合体の転写や遺伝子複製などの機能をブロックする阻害剤として応用することができる。
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【産業上の利用の可能性】
ｃ−Ｆｏｓと相互作用する蛋白質が提供されたことにより、ｃ−Ｆｏｓとの直接的な相互作用のみならず、予想されなかった間接的な相互作用による複合体を形成する蛋白質及びそれら蛋白質をコードする核酸、ならびに、それらの利用方法を提供することが可能になる。
【配列表】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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