(57)【要約】ＨＢＶの薬物抵抗性を簡便に識別する方法を提供する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、ＨＢＶの薬剤抵抗性を識別する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、ＨＢＶの薬剤抵抗性を識別する方法。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の薬剤抵抗性がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤への抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
コアプロモーター領域の核酸配列が配列番号１に記載された配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＨＢＶコアプロモーター領域の核酸配列内の、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に示された核酸配列に相当する部分配列の少なくとも１の部分における遺伝子変異を確認することからなる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
配列番号１の７番目の核酸Ｃ、２８番目の核酸Ｔ、３３番目の核酸Ａ、５７番目の核酸Ａ、７３番目の核酸Ｔ、１０６番目の核酸Ａ、１０７番目の核酸Ｔ、２００番目の核酸Ａ、２５０番目の核酸Ｇ、または２５３番目の核酸Ｇのいずれか１つもしくはそれ以上の核酸が変化している遺伝子変異を確認する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列番号１に記載された７番目の核酸ＣがＴに、２８番目の核酸ＴがＣに、３３番目の核酸ＡがＧに、５７番目の核酸ＡがＧもしくはＣに、７３番目の核酸ＴがＧに、１０６番目の核酸ＡがＴもしくはＣもしくはＧに、１０７番目の核酸ＴがＣもしくはＧに、２００番目の核酸ＡがＴもしくはＣに、２５０番目の核酸ＧがＡに、または２５３番目の核酸ＧがＡに変化したいずれか１つもしくはそれ以上の遺伝子変異を確認する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１に記載された７番目の核酸Ｃ、２８番目の核酸Ｔ、３３番目の核酸Ａ、５７番目の核酸Ａ、７３番目の核酸Ｔ、１０６番目の核酸Ａ、１０７番目の核酸Ｔ、２００番目の核酸Ａ、２５０番目の核酸Ｇ、または２５３番目の核酸Ｇのいずれか一つもしくはそれ以上の核酸に遺伝子変異を有するＨＢＶ遺伝子型を同定する方法。
【請求項９】
配列番号１に記載された７番目の核酸ＣがＴに、２８番目の核酸ＴがＣに、３３番目の核酸ＡがＧに、５７番目の核酸ＡがＧもしくはＣに、７３番目の核酸ＴがＧに、１０６番目の核酸ＡがＴもしくはＣもしくはＧに、１０７番目の核酸ＴがＣもしくはＧに、２００番目の核酸ＡがＴもしくはＣに、２５０番目の核酸ＧがＡに、または２５３番目の核酸ＧがＡに変化したいずれか一つもしくはそれ以上の遺伝子変異を有するＨＢＶ遺伝子型を同定する方法。
【請求項１０】
遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定をＨＢＶの塩基配列を決定することで行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子変異の確認または遺伝子型の同定をプローブまたはプライマーを用いた方法で行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜７のいずれかに記載の核酸配列またはその一部からなる核酸を用いたＨＢＶ治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、例えばラミブジンなどのＢ型慢性肝炎治療薬に対するＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の抵抗性を、ＨＢＶコアプロモーター領域における遺伝子型を確認することで識別する方法に関する。
【背景技術】  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の感染者は、世界でおよそ３億人に達すると見積もられている。ＨＢＶの感染は急性および慢性の肝炎（Ｂ型肝炎）を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌の原因となる。
Ｂ型肝炎の診断には、肝組織像に加え、ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＢｃＡｂ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢｅＡｂ、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ−ＤＮＡ量などの血清マーカーが用いられる。このうち、抗ウイルス剤の治療効果の判定には血中ＨＢＶ−ＤＮＡ量が重視されている。すなわち、ＨＢＶ−ＤＮＡ量がいちじるしく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。
ＨＢＶの遺伝子は約３，２００塩基対からなる環状不完全２本鎖ＤＮＡである。このＨＢＶの遺伝子の複製には、逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の４段階に分けられる。
▲１▼細胞の核内で内因性のＤＮＡポリメラーゼにより完全２本鎖環状ＤＮＡとなり、これが閉環して閉環２本鎖ＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ：ｃｃｃＤＮＡ、）となる段階。このｃｃｃＤＮＡは超らせん構造をとっている。
▲２▼ｃｃｃＤＮＡを鋳型として細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩによりｍＲＮＡが転写される段階。このうち最長の３．５ｋｂのものがｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ＲＮＡとして、逆転写の鋳型となる。このＲＮＡの５’および３’末端に”ε”シグナル（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）が存在し、このうち５’側のシグナルがｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ＲＮＡおよびウイルスポリメラーゼのコアの粒子内へのパッケージングに重要な作用をすると考えられている。
▲３▼コア粒子内でＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによリプライマーとしてオリゴヌクレオチドが合成され、ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ＲＮＡを鋳型として逆転写により（−）鎖ＤＮＡが合成される段階。
▲４▼ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ  ＲＮＡの５’末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、（−）鎖ＤＮＡを鋳型として（＋）鎖ＤＮＡが合成される段階。
これらの過程のいずれかを阻害することにより、ＨＢＶの遺伝子の複製は止められ、ウイルスの増殖が抑えられると考えられる。特に、ＨＢＶの複製には逆転写の過程があり、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もその増殖に逆転写の過程を有していることから、治療薬としてＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤のスクリーニングが行われてきた。
ラミブジンも、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初はＨＩＶ治療薬としての開発が行われたが、ＨＢＶに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、１９９２年からＢ型慢性肝炎の治療薬としての開発が始まった。
ラミブジンのＨＢＶに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド（シチジン）誘導体の抗ウイルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤のＨＢＶに対する増殖抑制機序の一つは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）阻害によりプレゲノムＲＮＡの逆転写を阻害することである。
もう一つの機序として、ウイルスＤＮＡ鎖に取り込まれ、その伸長を止めることも考えられている。また、免疫系への間接的な影響として、ラミブジン投与によりウイルスの減少が起こると、血流中のウイルス蛋白が減少し、ＨＢＶ抗原に対するＴ細胞の低反応性が回復することも報告されている（Ｂｏｎｉ  Ｃｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０２，９６８−９７５，１９９８）。
このような作用機序により、ＨＢＶ感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中ウイルス量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。ラミブジンがより効果的である症例を選択するためのウイルス側の遺伝子変化と治療効果の関係を論じた研究として、主にラミブジンのターゲットであるＤＮＡポリメラーゼのＢ及びＣドメインについてのものは数多く見られるが（Ｏｎｏ−Ｎｉｔａ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，９３９−９４５，１９９９）（Ａｌｌｅｎ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７，１６７０−１６７７，１９９８）、それ以外の領域について検討された報告は少ない。
また、ＨＢＶの遺伝子型の研究として、ＨＢｓ領域の配列を比較してＧｅｎｏｔｙｐｅ  Ａ−Ｄの遺伝子型を決定した例が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２，６８，５２２−５２８）。この報告は、この遺伝子型の違いにより、ＨＢＶに対するインターフェロンの治療効果が異なることを示している。さらに、コアプロモーター領域の遺伝子において、ＨＢＶ−ＤＮＡの１８９６番目の塩基ＧがＡに、１８９９番目の塩基ＧがＡに変異していることなども報告されている。しかしながら、これらの遺伝子の変化は、ウイルスの遺伝子型ではなく感染後の変異と考えられており、またＨＢＶの治療との関係は明らかになっていない（唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウイルス病学  基礎・臨床・予防  下巻  Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ型火炎ウイルス、１９９５年、５２−５７）。このようにコアプロモーター領域の遺伝子変異は報告されているが、この領域の変異がＨＢＶの遺伝子型であるという概念は報告されていない。
【非特許文献１】          Ｏｎｏ−Ｎｉｔａら．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２９，９３９−９４５，１９９９
【非特許文献２】          Ａｌｌｅｎ  ＭＩら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２７，１６７０−１６７７，１９９８
【非特許文献３】          Ｙｕｈら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，４０７３−４０８４，１９９２
【非特許文献４】          Ｈｏｎｉｇｗａｃｈｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３，９１９−９２４，１９８９
【非特許文献５】          Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｂｒｅｒａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８７，５０６９−５０７３，１９９０
【非特許文献６】          唐沢達信ら、日本臨床増刊号、分子肝炎ウイルス病学  基礎・臨床・予防  下巻  Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ型火炎ウイルス、１９９５年、５２−５７
【発明が解決しようとする課題】
ＨＢＶ肝炎の薬物的治療において、当該薬物の効果をＨＢＶとの関連において客観的に知ることは、治療方針や薬物の選択に対して有益な情報となる。本発明は、ＨＢＶ肝炎に対する治療方針や薬物の選択に対する有益な情報を、遺伝子工学的見地から入手する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、ＨＢＶ肝炎の治療を薬物的に行う際の効果がウイルス側の要因によって影響されることを仮定し、ウイルスの増殖過程に関係がある遺伝子型の違い、特にＨＢＶのコアプロモーター領域における塩基配列の多様性がＨＢＶに対する薬物の効果の違いに関与していることを新たに見出し、本発明を完成させたものである。
すなわち本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアプロモーター領域の核酸配列における遺伝子変異を確認することからなる、ＨＢＶの薬剤抵抗性を識別する方法である。
また本発明は、血中のＨＢＶ−ＤＮＡを単離精製し、ＰＣＲによりＨＢＶコアプロモーター領域を増幅し、塩基配列を決定することにより、薬剤治療効果を左右するコアプロモーター遺伝子の変異を同定する方法に関する。
本発明は、ラミブジンに代表されるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療効果を予測する一助として、ＨＢＶコアプロモーター核酸配列の変化（変異）を同定（検出）する方法にも関する。特に、ＨＢＶコアプロモーター核酸配列の変異を少なくとも１つ同定（検出）することにより、薬物投与後の血中ＨＢＶ量の低下を予測する一助ともなる。
さらに本発明は、ＨＢＶコアプロモーター核酸配列の特定の部分配列（例えば配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７に記載された配列）の少なくとも１つの変異を同定（検出）すること、好ましくは配列番号１に記載された７番目の核酸Ｃ、２８番目の核酸Ｔ、３３番目の核酸Ａ，５７番目の核酸Ａ、７３番目の核酸Ｔ、１０６番目の核酸Ａ、１０７番目の核酸Ｔ、２００番目の核酸Ａ、２５０番目の核酸Ｇ、または２５３番目の核酸Ｇのいずれか１つもしくはそれ以上の核酸が変化していることを同定（検出）することに関する。
本発明は、さらに好ましくは、配列番号１に記載された７番目の核酸ＣがＴ、または２８番目の核酸ＴがＣ、または３３番目の核酸ＡがＧ、または５７番目の核酸ＡがＧまたはＣ、または７３番目の核酸ＴがＧ、または１０６番目の核酸ＡがＴまたはＣまたはＧ、または１０７番目の核酸ＴがＣまたはＧ、２００番目の核酸ＡがＴまたはＣ、２５０番目の核酸ＧがＡ、２５３番目の核酸ＧがＡとなっているいずれか１つもしくはそれ以上の変異を同定（検出）することに関するものである。ＨＢＶの薬剤抵抗性、あるいは感受性の違いはＨＢＶの遺伝子型による種類の違いに起因すると考えられる。そのため本発明はＨＢＶのコアプロモーターに上述した変異のいずれかを有するＨＢＶの遺伝子型を提供する。この遺伝子型を利用する薬剤抵抗性の予測方法を提供する。また本発明はＨＢＶの遺伝子型を同定する方法も提供する。
本発明は、遺伝子の変異を同定（検出）検出する方法が、核酸の配列を決定する方法であるものを含む。さらに、プローブまたはプライマーとして核酸を用いた核酸同士の２本鎖形成（ハイブリダイゼーション）を利用した方法であるものを含む。
さらに本発明は、上記のＨＢＶコアプロモーター領域の遺伝子変異を検出するための診断薬、診断キットを提供する。
また本発明は、ＨＢＶコアプロモーターの配列番号１またはその一部の遺伝子配列を有する核酸を用いた新たなＨＢＶ治療薬に関する。かかる核酸は囮（デコイ）核酸として、ＨＢＶコアプロモーターの野生株の遺伝子配列をターゲットとする蛋白質に特異的に結合し、本来のターゲットであるＨＢＶ自身のコアプロモーターへの該蛋白質の結合を拮抗的に妨げる効果を有する。従って、本発明のデコイ核酸を生体に投与することにより、ＨＢＶコアプロモーターからの転写を抑制し、ＨＢＶの増殖を阻害することが可能となる。
ＨＢＶのコアプロモーター領域は、報告により多少の差はあるが、基本的には転写開始部位の上流約２００ｂｐまでがコアプロモーター領域として同定されている（Ｙｕｈ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６６，４０７３−４０８４，１９９２；Ｈｏｎｉｇｗａｃｈｓ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３，９１９−９２４，１９８９；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｂｒｅｒａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８７，５０６９−５０７３，１９９０）。
本発明では、説明の便宜上、塩基配列の番号を、ＨＢＶの２本鎖ＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩ部位ＧＡＡＴＴＣの最初のＴを核酸番号１として表記する。この便宜的な番号を用いた場合に、本発明に言うＨＢＶコアプロモーター領域は、核酸番号１６３１からコア蛋白の開始アミノ酸までの核酸番号１９００として規定される。
この領域には、増殖に重要なエンハンサーＩＩ領域（ＥｎｈＩＩ）及びプレゲノムＲＮＡのコア粒子への包含に必要なエンカプシデーションシグナル（ε）領域が存在し、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼや肝細胞特異的な核内因子の結合部位となっているため、一度変異が生ずるとウイルスの増殖・複製に重要な変化が生じると考えられる。このε領域はＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼのプライミングおよび逆転写活性に必要である（Ｕｒｂａｎ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９８），７９，１１２１−２２３１）。また、エンハンサーＩＩ領域（ＥｎｈＩＩ）にはｆｏｏｔｐｒｎｔｉｎｇあるいはｍｅｔｈｙｌａｔｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅで同定されるｆｏｏｔｐｒｉｎｔＩＩまたはＢｏｘα、ｆｏｏｔｐｒｉｎｔＩ、Ｂｏｘβの調節エレメントが存在している。
本発明は、ポリメラーゼ等が結合する領域及び、ウイルス遺伝子複製の調節に重要な役目を果たしているエンハンサー領域に着目して、Ｂ型肝炎の治療薬、特にラミブジンの治療効果に影響を与えるコアプロモーターの遺伝子変異を同定するものである。
本発明によりＢ型慢性肝炎患者の治療前診断に有用なＨＢＶコアプロモーター遺伝子変異を検出することで、薬剤耐性株や肝炎再燃の少ないテイラーメード医療に貢献でき、また新たな診断薬を開発することができる。また、ラミブジン等の逆転写阻害剤で治療効果をあげにくいウイルスが同定できることから、こうした変異ウイルスの配列を用いることにより、かかるウイルスにも効果の高い新規抗ＨＢＶ薬の開発に役立てることができる。
本発明は、具体的には、コアプロモーター領域の核酸配列を確認してＨＢＶの遺伝子変異を同定することを含む方法である。この領域はウイルスの増殖に重要な部位であり、遺伝子配列の違いにより、ＨＢＶの治療に用いられる薬剤に対する感受性が異なるという関係を有することが、本発明者らの研究により演繹的に証明された。この研究過程において、コアプロモーター領域の中でも、６つの短い領域、さらにその中でもある特定の核酸配列の変化を確認することで、ＨＢＶの薬物抵抗性の違いを簡便に識別し得ることが見出いだされた。
以下、代表的なＨＢＶの治療薬であるラミブジンを例として本発明を説明するが、本発明はラミブジンの治療にのみ限定されるものではない。
ＨＢＶの代表的な治療薬であるラミブジンによる治療は、血中ウイルス量を示すＨＢＶ−ＤＮＡ量及び肝細胞内のウイルス量を反映するマーカーであるＨＢｅ抗原量の高力価症例において、ウイルス量が減少しにくい例が多数存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。
しかし、ＨＢＶ−ＤＮＡ量やＨＢｅ抗原量の高力価症例においても、ラミブジンが奏効し、血中のＨＢＶ−ＤＮＡ量を速やかに減少させ、肝炎を鎮静化させる症例が存在する。
本発明者らは、ラミブジン治療を受けるＢ型慢性肝炎患者の治療前血清と治療開始６ヶ月後の血清を用いて、ＴＭＡ法にて血中ＨＢＶ−ＤＮＡ量を測定し、治療６ヶ月後のＨＢＶ−ＤＮＡ量が検出感度未満（５０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ未満）に低下した場合、ウイルス陰性群と判定し、それ以上である場合をウイルス陽性群とし、有意差検定により予後因子を検索した。
次に、六波羅ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６２，４７１−４７８，２０００）の方法により、採取した治療前の血清検体から市販の核酸抽出キットを用いてＨＢＶ−ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法を用いてＨＢＶコアプロモーター領域を増幅し、３％アガロースゲルにて電気泳動後、ゲルより陽性バンドを切出し、核酸を精製し、ダイレクトシークエンス法にて塩基配列を決定した。さらに、治療前のコアプロモーター領域の塩基配列と野生株との比較により、遺伝子変異を起こしている部位を選別し、治療６ヶ月後のウイルス陽性群と陰性群を指標に有意差検定を行い、ラミブジン治療効果を予測できる遺伝子変異部位を解析した。
その結果、従来報告されているＨＢｅ抗原陽性、ＨＢＶ−ＤＮＡ量が有意な予後マーカーとして抽出されてきたが、年齢・性別・既往歴・病型・血小板値・アルブミン値・ＡＬＴ値・ビリルビン値に有意差は見られなかった。しかしながら、コアプロモーター領域の遺伝子変異を解析したところ、３箇所において有意にラミブジン治療効果と関連する遺伝子変異が検出された。
また、そのＨＢＶコアプロモーター領域における遺伝子変異が、少なくとも一つでもある場合においては、６ヶ月後のウイルス陽性群と陰性群との間に有意差（Ｐ＜０．０００１）が認められ、この変異を確認することでラミブジンの治療効果を予測できることが証明された。この遺伝子変異を有するＨＢＶと有しないＨＢＶは異なる遺伝子型のＨＢＶと考えられる。この遺伝子型の違いはＨＢＶの増殖能等の生物学的な機能とも相関している可能性がある。
このように、本発明のＨＢＶコアプロモーター領域の変異は、ＨＢＶのＤＮＡポリメラーゼや肝細胞特異的な核内因子に係わるＨＢＶの増殖・複製の阻害効果に関係することが明らかとなり、この変異を同定することで、ラミブジン治療の奏効率の向上を促すことができる。したがって、ＨＢＶのコアプロモーター領域の遺伝子変異がラミブジン治療効果の予測マーカーとして用いることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の遺伝子の変異を同定検出する方法は、例えばＨＢＶのコアプロモーター領域の核酸配列を決定することによって行うことが可能である。核酸配列決定の方法は、基本的にはＭａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ法あるいはジデオシキ法の改良法が使用されている。これらの詳しい解説は「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＥＳＳ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）」あるいは「新生化学実験講座２核酸ＩＩ構造と性質ｐ５９−１００」に詳述されている。また各種のキットが多くのメーカーから発売されており、これらも利用可能である。
核酸配列を決定するためのＤＮＡは、ＰＣＲで本発明のコアプロモーター領域を増幅し、そのままダイレクトシークエンス法で核酸の配列を決定してもよい。また一度ＰＣＲ産物をベクターにクローニングしてから配列の決定を行っても構わない。あるいはポイントミューテーション（点突然変異）を見つけるシークエンス法を用いてもよい。
本発明の核酸配列の変異を検出する方法は、遺伝子配列を決定する以外にも、１塩基から数塩基の違いを検出する方法であればどのような方法でも使用することが可能である。例えばＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ＣＦＬＰ、ＲＦＬＰのような遺伝子変異の検出法が利用可能である。また１塩基変異のＳＮＰの検出に用いられているインベーダー法も利用可能である。さらに相補的な核酸が二本鎖を形成するハイブリダイゼーションの原理を利用した変異検出法もすべて利用可能である。これらの遺伝子、核酸の変異の検出法はプローブまたはプライマーを用いた方法あるいはそれらを組合せた方法がある。これらのプローブまたはプライマーは核酸に限らず標的の核酸とハイブリダイゼーションで結合可能なものが含まれる。
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】  ＜実施例１＞ラミブジン治療とウイルス陰性化に関与する予後因子の検索
慢性Ｂ型肝炎感染患者５３人（男性４０例、女性１３例、平均年齢４９．８±９．４歳、慢性肝炎３８例、肝硬変１５例）にラミブジンを１００ｍｇ／ｄａｙ経口連日投与し、投与前のデータおよび投与後のデータを解析した。ラミブジン投与６ヶ月の時点でＨＢＶ−ＤＮＡ量がＴＭＡ法にて感度未満（３．７ＬＧＥ／ｍＬ未満）に低下した時、ウイルス陰性化と判定した。
ウイルスが陰性化した人と陽性のままだった人について、年齢、性別、ＨＢｅＡｇ陽性率、治療前のＨＢＶ  ＤＮＡ量、既往歴、病型、血小板値、アルブミン、ＡＬＴ、ビリルビン値等について治療効果の予測因子となり得るかについて、Ｆｉｓｈｅｒの直接法、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定で有意差を検定した。
2004053162.tif 000002
2004053162.tif 000003
表１より、従来報告されているＨＢｅ抗原陽性、ＨＢＶ−ＤＮＡ量が有意な予後マーカーとして抽出されてきたが、年齢・性別・既往歴・病型・血小板値・アルブミン値・ＡＬＴ値・ビリルビン値に有意差は見られなかった。
＜実施例２＞  ＨＢＶコアプロモーター領域の塩基配列の決定
実施例１でラミブジン治療を行った５３例のうち、４３例の治療前患者血清５０μｌからウイルスＤＮＡをＤＮＡ抽出キット（スマイテスト、（株）ゲノムサイエンス研究所）でマニュアルに従って抽出した。
抽出ＤＮＡ２ｕｌ、０．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ  ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を反応液（２００μＭ  ｄＮＴＰ，５０ｍＭ  ＫＣＬ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ［ｐＨ８．３］，２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．００１％ｇｅｌａｔｉｎ）２５μｌに加え、ｉｓ２：５’−ＧＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＧＣＣ  ＣＡ（１６１１−１６３０）およびＣＢ４：５’−ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＡＧ（１９５４−１９３５）の各プライマー０．２５ｍＭで増幅した。
ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌはｐｒｅｈｅａｔの後、９４℃、３０秒、５５℃、１分のサイクルを４３サイクル繰り返した。サーマルサイクラーはＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）を用いた。ＰＣＲ陰性検体は、ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ｓｅｔにて１ｓｔ  ＰＣＲを行った後、２ｎｄ  ＰＣＲは３０サイクルとした。このＰＣＲで陰性だった検体は、ｏｕｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｓｅｔとして、ｅｓ２：５’−ＡＣＧ  ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＧ（１６０１−１６２０）、ＣＢ２：５’−ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＡＡ（１９７４−１９５５）を用い、１ｓｔ  ＰＣＲを行った後に、ｉｓ２とＣＢ４のプライマーで３０サイクルの２ｎｄ  ＰＣＲを行なった。
このＰＣＲ産物を３％アガロースゲルで電気泳動後、ゲルからバンドを切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ）で精製した。シークエンスはジデオキシ法である、Ｔａｑ  Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔで反応させ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。配列を決定した４３例の患者のコアプロモーター領域配列を第１−１図〜第１−３図に示す。
Ｈ５から２６２までの３１検体がラミブジン治療により、６ヵ月後に血中のＤＮＡ量が検出限界以下に減少した患者の配列である。Ａ１７からＡ５までの１１検体がＤＮＡが検出限界以下まで減少せず、ラミブジンの治療効果が少なかった患者の配列である。
各図の一番上の列は、元になる配列（野生型）の配列を示している。各図の上段３１検体と下段１２検体では配列に違いがあることがわかる。またその違いは一定の領域に集中していることが明らかである。ラミブジンの効果のある群（効果群）では、塩基番号で１６７１〜１６８２番目の領域（配列番号２）に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に１６７４番目（配列番号１の２８番目）の核酸ＴがＣに、１６７９番目（配列番号１の３３番目）のＡがＧに変化しているが、ラミブジンの効果のない群（非効果群）ではそのような変化は見られない。
またラミブジンの治療効果を奏した群では、塩基番号で１７０１〜１７２１番目の領域（配列番号３）に、元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に１７０３番目（配列番号１の５７番目）の核酸ＡがＣまたはＧに、１７１９番目（配列番号１の７３番目）のＴがＧに変化しているが、ラミブジンの治療効果を奏さなかった非効果群ではそのような変化は見られない。
同様に、効果群では塩基番号で１７３６〜１７６１番目の領域（配列番号４）に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に１７５２番目（配列番号１の１０６番目）の核酸ＡがＴまたはＣまたはＧに、１７５３番目（配列番号１の１０７番目）のＴがＧまたはＣに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。
さらに、効果群では塩基番号で１７９９〜１８１７の領域（配列番号５）に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多く、１８０２番目、１８０３番目、１８０９番目、１８１０番目、１８１１番目、１８１２番目、１８１４番目に変化が見られるが、非効果群ではそのような変化は見られない。さらに効果群では１８４３−１８６０番目の領域（配列番号６）に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に１８４６番目（配列番号１の２００番目）の核酸ＡがＴまたはＣに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。効果群では１８９３−１９０２番目の領域（配列番号７）に元になる配列と異なる配列を持つ検体が多い。特に１８９６番目（配列番号１の２５０番目）の核酸ＧがＡに、１８９９番目（配列番号１の２５３番目）のＧがＡに変化しているが、非効果群ではそのような変化は見られない。
＜実施例３＞コアプロモーター領域の遺伝子変異による解析
（Ａ）遺伝子変異部位による統計的解析
さらに効果のあった患者９人および効果の無かった患者２検体のコアプロモーター領域を実施例１の方法に従って配列決定し、合計５３検体についてラミブジンの治療効果と核酸配列の変化（変異）関係を調べ、Ｆｉｓｈｅｒの直接法で有意差を検定した。表２に有意差のあった変異と、陽性群には見られず、陰性化群に見られた変異を示す。
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表２の陰性化群（ｎ＝４０）はラミブジン治療の効果のある群、陽性群（ｎ＝１３）はラミブジン治療の効果のない群である。このようにいくつかのポイントで有意差があることが示された。
尚、コアプロモーター変異（Ａ１７６２Ｔ，Ｇ１７６４Ａ）については、陰性化群、陽性群でそれぞれ８２．５％，８４．６％にみられ、有意差はなかった。
（Ｂ）コアプロモーター領域全体における変異の統計的解析
表２に示した核酸の変化が見られる検体と全く見られない検体で、ラミブジンの治療効果の予測ができるかについて、Ｆｉｓｈｅｒの直接法で有意差を検定した。
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いずれかの変化が見られる患者は５３人中３８人でそのうち３５人はラミブジン治療の効果が認められた。また一箇所も変化が見られなかった患者は１５人で、そのうち１０人は治療効果が見られなかった。このことはこのコアプロモーター領域の核酸配列の変化がラミブジン治療の効果に顕著な関連があることを示している。ラミブジンはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ阻害効果を有しており、それがＨＢＶの増殖抑制に関与していると考えられる。
本発明の効果
本発明によれば、ウイルス側の遺伝子変異を治療前または治療中に検出することにより、ラミブジンに代表されるＨＢＶ治療の効果を予測でき、治療成績を向上させる、または耐性株や肝炎再燃をおさえるなどの効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】第１−１図は、ラミブジン治療を行った患者のＨＢＶコアプロモーター領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段３１検体がラミブジン治療効果のある検体、下段１２検体が治療効果が無かった検体を表す。
第１−２図は、ラミブジン治療を行った患者のＨＢＶコアプロモーター領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段３１検体がラミブジン治療効果のある検体、下段１２検体が治療効果が無かった検体を表す。
第１−３図は、ラミブジン治療を行った患者のＨＢＶコアプロモーター領域の核酸配列を比較を示す。最上段が元になる配列、上段３１検体がラミブジン治療効果のある検体、下段１２検体が治療効果が無かった検体を表す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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