(57)【要約】１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１  ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターが導入されたＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作出した。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討した。その結果、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。さらに、胸腺の腫大を伴うリンパ性白血病が発症した。この結果は、ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現により、Ｔ細胞系列の胸腺内分化がブロックされ、その後リンパ性白血病が発症することを示すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
非ヒト動物がげっ歯類である、請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
げっ歯類がマウスである、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
ＷＴ１タンパク質が１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型ＷＴ１タンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
白血病の症状を呈する請求項１〜５のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を請求項１〜６のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
【請求項１３】
ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤。
【請求項１４】
化合物がヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である、請求項１３に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、および該動物から樹立された細胞に関する。また、本発明は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となる遺伝子として単離された［特許文献１、非特許文献１、２］。この遺伝子はジンクフィンガー転写因子をコードし、組織発生、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスに重要な役割を果たす［非特許文献３］。ＷＴ１遺伝子が破壊されたマウスは泌尿生殖器系に欠陥があり、胎生１３．５日の時点で死亡することが示されており、これは心不全のためと考えられている［非特許文献４］。
野生型ＷＴ１遺伝子は、病型を問わないほぼすべての白血病［非特許文献５〜１０］、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）［非特許文献１１］および発作性夜間血色素尿症［非特許文献１２］において高発現される。ＭＤＳにおけるＷＴ１遺伝子の発現は、疾患が不応性貧血（ＲＡ）から芽球増加を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ）を経て移行期ＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ−ｔ）へと進行するに伴って増加する。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は、肺癌および乳癌［特許文献５、非特許文献１３〜２７］をはじめとする、さまざまな種類の固形腫瘍でも過剰発現されている。これらの所見から、本発明者らはＷＴ１遺伝子に発癌作用があると考えるに至った。
ＷＴ１遺伝子は当初、癌抑制遺伝子に分類されていた［非特許文献３］。しかし、ＷＴ１アンチセンスオリゴマーの投与によって白血病細胞および固形腫瘍細胞の増殖は阻害された［特許文献２、３、非特許文献２３、２８、２９］。また、ＷＴ１タンパク質が癌ワクチンとして利用しうることが判明している［特許文献４］。一方、野生型ＷＴ１遺伝子の構成的発現によって骨髄球系前駆細胞の分化は妨げられ、その代わりに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に対する細胞増殖が誘導された［非特許文献３０、３１］。これらの結果は、ＷＴ１遺伝子が癌抑制遺伝子としての作用ではなく、発癌作用を発揮することを強く示すものである。
赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系細胞株ＨＬ−６０はいずれも、その分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［非特許文献３２、３３］。ヒトのＣＤ３４＋骨髄球系または赤芽球系前駆細胞はＷＴ１を発現するが、ＣＤ３４−細胞は発現しなくなる［非特許文献１０、３４］。これらの結果から、ＷＴ１遺伝子が骨髄球系および赤芽球系の前駆細胞の分化に関与することが示唆されている。さらに、野生型ＷＴ１遺伝子は急性リンパ球性白血病の大半で発現されている。しかし、ＷＴ１遺伝子がリンパ球系前駆細胞の発生および分化に関与することを示す直接的な証拠は得られていない。
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
［特許文献１］特開平４−５０３０１４
［特許文献２］特開平９−１０４６２９
［特許文献３］特開平１１−３５４８４
［特許文献４］ＷＯ  ００／０６６０２
［特許文献５］ＷＯ  ９８／３９３５４
［非特許文献１］Ｃａｌｌ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９
［非特許文献２］Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４
［非特許文献３］Ｍｅｎｋｅ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１
［非特許文献４］Ｍｏｏｒｅ  ＡＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１９９９；１２６：１８４５
［非特許文献５］Ｍｉｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９２；６：４０５
［非特許文献６］Ｍｉｙａｇｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９３；７：９７０
［非特許文献７］Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８４：３０７１
［非特許文献８］Ｂｒｉｅｇｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９４；８：２１３８
［非特許文献９］Ｍｅｎｓｓｅｎ  ＨＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９５；９：１０６０
［非特許文献１０］Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５
［非特許文献１１］Ｔａｍａｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３
［非特許文献１２］Ｓｈｉｃｈｉｓｈｉｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００２；１００：２２
［非特許文献１３］Ｐａｒｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４：４１５
［非特許文献１４］Ｂｒｕｅｎｉｎｇ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；１１：３９３
［非特許文献１５］Ｖｉｅｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５７：５１５
［非特許文献１６］Ｗａｌｋｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４；５４：３１０１
［非特許文献１７］Ｒｏｄｅｃｋ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；５９：７８
［非特許文献１８］Ｌａｄａｎｙｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｗ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９４；５４：２８３７
［非特許文献１９］Ａｍｉｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９５；１４６：３４４
［非特許文献２０］Ｌａｎｇｅｒａｋ  ＡＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９５；１２：８７
［非特許文献２１］Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ  ＧＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７；９４：８１３２
［非特許文献２２］Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１９９８；７８：１８２
［非特許文献２３］Ｏｊｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；９０：１９４
［非特許文献２４］Ｈａｒａｄａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．１９９９；３：３５７
［非特許文献２５］Ｍｅｎｓｓｅｎ  ＨＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０００；１２６：２２６
［非特許文献２６］Ｍｉｙｏｓｈｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；８：１１６７
［非特許文献２７］Ｏｊｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；１００：３０４
［非特許文献２８］Ｙａｍａｇａｍｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９６；８７：２８７８
［非特許文献２９］Ａｌｇａｒ  ＥＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９６；１２：１００５
［非特許文献３０］Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９
［非特許文献３１］Ｔｓｕｂｏｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９
［非特許文献３２］Ｐｈｅｌａｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７
［非特許文献３３］Ｓｅｋｉｙａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６
［非特許文献３４］Ｈｏｓｅｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００２；１１６：４０９
【発明の開示】
本発明は、ＷＴ１タンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにすることを目的とする。さらに本発明は、得られた知見を基に、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。より具体的には、本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、ＷＴ１タンパク質の機能を生体レベルにおいて明らかにするため、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１  ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターが導入されたＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作出した。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。その結果、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。さらに、胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。その結果、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−であるＤＮ１、＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった。
さらに、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した。
以上の結果は、ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現により、Ｔ細胞系列の胸腺内分化がブロックされ、その後リンパ性白血病が発症することを示すものである。従って、ＷＴ１遺伝子がＴ細胞系列の発生および分化に関与することが初めて判明した。
即ち、本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法に関し、以下の〔１〕〜〔１４〕を提供するものである。
〔１〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物。
〔２〕ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物。
〔３〕非ヒト動物がげっ歯類である、〔１〕または〔２〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔４〕げっ歯類がマウスである、〔３〕に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔５〕ＷＴ１タンパク質が１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型ＷＴ１タンパク質である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔６〕白血病の症状を呈する〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する工程
（ｃ）該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する工程
〔９〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物を〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する工程
〔１０〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる工程
（ｂ）該ＷＴ１タンパク質の活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１１〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１２〕以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる工程
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｄ）被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する工程
〔１３〕ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤。
〔１４〕化合物がヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体である、〔１３〕に記載の薬剤。
本発明は、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物の態様として、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡの導入により、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されている、または、Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができる、トランスジェニック非ヒト動物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は白血病のモデル動物としての用途を有する。本発明は、このような本発明のトランスジェニック非ヒト動物の用途もまた提供する。本発明における白血病の種類は、特に制限はないが、例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。
ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ（Ｎａｋａｇａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９）は、小児腎腫瘍であるウィルムス腫瘍の原因となるＤＮＡとして単離された［Ｃａｌｌ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９９０；６０：５０９、Ｇｅｓｓｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３：７７４、特開平４−５０３０１４］。ＷＴ１タンパク質は、ジンクフィンガー転写因子であり、組織発生、細胞の増殖および分化、ならびにアポトーシスに重要な役割を果たす［Ｍｅｎｋｅ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９９８；１８１：１５１］。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡは２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じることが判明している［Ｈｅｒｗｉｔｔ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明におけるＷＴ１タンパク質のスプライス形態としては、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型であることが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明において、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制が誘導されているトランスジェニック非ヒト動物」とは、Ｔ細胞系列の分化または発生が抑制されている状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。また、「Ｔ細胞系列の分化または発生の抑制を誘導することができるトランスジェニック非ヒト動物」とは、ＷＴ１タンパク質の発現を誘導することにより、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制しうる状態のトランスジェニック非ヒト動物を意味する。
本発明における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
トランスジェニック動物の作製方法は公知である。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：７３８０−７３８４（１９８０）に記載の方法により、トランスジェニック動物を得ることができる。具体的には、ＷＴ１をコードするＤＮＡを動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスを作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞などが挙げられる。より詳細には、後述の実施例に記載の方法により、トランスジェニック動物の作製を行うことができる。当業者においては、上記の方法を適宜改変して、所望の遺伝子の発現が改変されたトランスジェニック動物を作製することが可能である。
上記の「ＷＴ１をコードするＤＮＡ」は、該ＤＮＡを導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクト（発現ベクター）とするのが一般的である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記ＷＴ１をコードするＤＮＡと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。
本発明に利用することができるプロモーターとしては、動物細胞で発現可能なプロモーターであれば特に制限されないが、リンパ球で選択的に遺伝子発現が可能なプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターとしてはｌｃｋプロモーターが知られている。ｌｃｋプロモーターを有する遺伝子コンストラクトを使用することで、リンパ球に選択的にＷＴ１タンパク質が発現したトランスジェニック動物を作出することが可能である。本発明に利用することができるその他のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーターを挙げることができる。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）２７７，１０８）に従って、上記コンストラクトを作製することができる。
また、本発明に使用可能なベクターとしては、導入遺伝子を動物の生体内で広範囲に発現誘導でき得るものであればよく、当業者において周知の発現ベクターを利用することができる。例えば、ｌｃｋ−ｈＧＨベクターなどを挙げることができる。
適当な制限酵素によって前記ベクターから切り出した組み換え遺伝子コンストラクトは、十分に精製されトランスジェニック動物の作製に用いられる。通常、トランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作製される。コンストラクトを導入する細胞としては、通常、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常８細胞期以前のものが利用される。上記コンストラクトの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることによりトランスジェニック動物を作製することも可能である。
上記コンストラクトを導入する細胞は、トランスジェニック動物の作製が可能なあらゆる非ヒト動物に由来する細胞であることができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。マウスの場合、例えば、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。マウス受精卵では、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での培養の後、導入に成功したと思われる細胞が代理母の卵管に移植され、トランスジェニックキメラ動物が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
生まれたトランスジェニックキメラ動物は、ＷＴ１をコードするＤＮＡが組み込まれていることを確認した上で、Ｆ１動物の誕生のために正常な動物と交配させる。一般にコンストラクトとして導入した外来ＤＮＡは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な表現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、ＷＴ１をコードするＤＮＡが正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたＰＣＲや特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって確認することができる。
この交配の結果誕生するＦ１動物の中で、体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を有するもの（ヘテロザイゴート）は、生殖細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を伝えることができるトランスジェニック動物である。Ｆ１動物の中から体細胞に外来遺伝子（ＷＴ１をコードするＤＮＡ）を保持するものを選び、これらを両親とすることによって、Ｆ２動物であるホモザイゴートを得ることができる。
本発明のＷＴ１トランスジェニック動物は、ＷＴ１の発現が改変されたものであれば、上記のトランスジェニック動物のいずれの世代の動物であってもよい。例えば、ＷＴ１の外来ＤＮＡをヘテロで保持するトランスジェニック動物であっても、この外来性のＷＴ１が発現しているものであれば、本発明のＷＴ１トランスジェニック動物として利用可能である。
また、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物から樹立された細胞を提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）に従って細胞株を樹立することが可能である。
また、本発明は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法によって単離されるＴ細胞系列の分化または発生を促進する化合物は、免疫賦活剤、抗癌剤、感染症治療剤として利用でき、Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制する化合物は、免疫抑制剤、急性及び慢性リンパ性白血病の治療薬として利用することができる。
以下に本発明のスクリーニング方法の態様を例示するが、本発明のスクリーニング方法は、これらに限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まず、ＷＴ１タンパク質に被検化合物を接触させる。本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
第一の態様においては、次いで、該ＷＴ１タンパク質と被検化合物との結合を検出する。次いで、該ＷＴ１タンパク質と結合する被検化合物を選択する。この方法によって、単離された化合物は、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する可能性があり、後述する他のスクリーニング方法の被検化合物として使用することができる。
ＷＴ１タンパク質を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＫｉｍらＧｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＷＴ１タンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＷＴ１タンパク質を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＷＴ１タンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＷＴ１タンパク質、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＷＴ１タンパク質に対する抗体は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＷＴ１タンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＷＴ１タンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＷＴ１タンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
また、ＷＴ１タンパク質を用いて、該ＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドを単離する方法としては、例えば、Ｓｋｏｌｎｉｋらの方法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたポリペプチドを固定し、精製して標識したＷＴ１タンパク質と上記フィルターとを反応させ、ＷＴ１タンパク質と結合したポリペプチドを発現するプラークを標識により検出すればよい。ＷＴ１タンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、ＷＴ１タンパク質又はＷＴ１タンパク質に融合したポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＷＴ１タンパク質またはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＷＴ１タンパク質に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
ＷＴ１タンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＷＴ１タンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＷＴ１タンパク質と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検化合物を適用する。この場合の被検化合物としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検化合物を適用した後、カラムを洗浄し、ＷＴ１タンパク質に結合したポリペプチドを調製することができる。
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、ポリペプチドに限らず、ＷＴ１タンパク質に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＷＴ１タンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＷＴ１タンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＷＴ１タンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。
また、本発明におけるスクリーニング方法の第二の態様としては、まず、被検化合物を本発明のトランスジェニック非ヒト動物に投与する。本発明のトランスジェニック非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、また注射等により行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明のトランスジェニック非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。
本発明におけるスクリーニング方法の別の態様としては、次いで、該トランスジェニック非ヒト動物のＴ細胞系列の分化または発生を測定する。トランスジェニック非ヒト動物からのＴ細胞系列の調製や調製したＴ細胞系列の分化または発生の測定は、実施例に記載の方法のように、当業者に周知の方法によって行うことができる。
第二の態様としては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｔ細胞系列の分化または発生を促進または抑制する化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第三の態様としては、まず、被検化合物をＷＴ１タンパク質に接触させる。第三の態様に用いられるＷＴ１タンパク質の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞としては、内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞、または外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を発現している細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＷＴ１タンパク質を有する細胞は、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＷＴ１タンパク質が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
また、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
また、本発明において「接触」は、ＷＴ１タンパク質の状態に応じて行う。例えば、ＷＴ１タンパク質が精製された状態であれば、精製標品に被検化合物を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＷＴ１タンパク質が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＷＴ１タンパク質が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
第三の態様では、次いで、上記ＷＴ１タンパク質の活性を測定する。ＷＴ１タンパク質の活性としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；１９：１６４１−１６４８）などの転写抑制活性、および、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ  ＬＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ  ＮＷ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）などの転写活性が挙げられる。
第三の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＷＴ１タンパク質の活性を上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第四の態様としては、まず、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ここで、「機能的に結合した」とは、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＷＴ１遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡもまた含まれる。
第四の態様においては、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
また、ＷＴ１遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
また、ＷＴ１遺伝子からコードされるＷＴ１タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＷＴ１タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＷＴ１タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＷＴ１タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
第四の態様においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
本発明におけるスクリーニング方法の第五の態様としては、まず、ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。ＷＴ１タンパク質が結合するプロモーター領域としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−α鎖遺伝子（Ｇａｓｈｌｅｒ  ＡＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２；８９：１０９８４−１０９８８）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）−１遺伝子（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１２７１−２１２７５）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）−ＩＩ遺伝子（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＩＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２；２５７：６７４−６７８）、ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）遺伝子（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９：５８２８−５８３２）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子（Ｅｎｇｌｅｒｔ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５；１４：４６６２−４６７５）、ＲＡＲ−α遺伝子（Ｇｏｏｄｙｅｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９５；１０：１１２５−１１２９）、ｃ−ｍｙｂ遺伝子（ＭｃＣａｎｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：２３７８５−２３７８９）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５；５５：５３８６−５３８９）、オルニチン脱炭酸酵素遺伝子（Ｌｉ  ＲＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９９；２４７：２５７−２６６）、Ｎ−ｍｙｃ遺伝子（Ｚｈａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９９；１９：１６４１−１６４８）、プロテイン４６結合網膜芽細胞腫抑制因子（ＲｂＡｐ４６）遺伝子（Ｇｕａｎ  ＬＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：２７０４７−２７０５０）、Ｄａｘ−１遺伝子（Ｋｉｍ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：２２８９−２２９９）、ｂｃｌ−２遺伝子（Ｍａｙｏ  ＮＷ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９；１８：３９９０−４００３）のプロモーター領域などを使用することができる。
第五の態様においては、次いで、上記細胞または該細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを上昇または減少させる化合物を選択する。
また、本発明は、ＷＴ１タンパク質の発現または活性を制御する化合物を有効成分として含有する、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御するための薬剤を提供する。Ｔ細胞系列の分化または発生を抑制するための薬剤としては、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する薬剤、本発明のスクリーニング方法によって単離される化合物等が例示できる。
上記ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、特開平９−１０４６２９や特開平１１−３５４８４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド等を使用することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＷＴ１タンパク質ＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＷＴ１タンパク質の産生細胞に作用して、該ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＷＴ１タンパク質の発現を抑制することにより、結果的にＷＴ１タンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明の化合物をヒトや他の動物のための薬剤として使用する場合には、本発明の化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、胸腺の全細胞数を示したグラフである。６週齢または１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）の全胸腺細胞数を測定した。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
図２は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスにおけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ胸腺細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）胸腺細胞を抗ＣＤ４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ８−ＰＥ抗体、抗ＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体、抗ＣＤ３−ＰＥ抗体、抗Ｂ２２０ビオチン、抗Ｇｒ−１ビオチン、抗ＣＤ１１ｂビオチンおよびストレプトアビジン−ＰＥで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲートはＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞（ＤＮ  Ｔ担当胸腺細胞）に対して設定し、数値は胸腺細胞全体に占めるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−細胞の比率を指す。ＴｇはＷＴ１−トランスジェニックマウス、ＬＭは正常同腹仔を示す。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢および１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３−Ｂ２２０−Ｇｒ−１−ＣＤ１１ｂ−胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス６〜７匹から得た結果の平均である。エラーバーは標準偏差を表す。
図３は、ＷＴ１トランスジェニックマウスのＤＮ胸腺細胞におけるＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットの増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスのゲート処理後のＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関して分析した。（Ｂ）および（Ｃ）１２週齢の＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒ）および正常同腹仔（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）におけるＨＳＡ＋ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７匹から得た結果の平均である。
図４は、ＷＴ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ）と正常同腹仔（ＬＭ）との、６週齢と１年齢での胸腺を示した写真である。ＷＴ１トランスジェニックマウスの１年齢の胸腺は腫大し、急性リンパ性白血病が発症したことを示している。
図５は、ＷＴ１トランスジェニックマウスの脾臓におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加を示す図およびグラフである。（Ａ）１２週齢の＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞をＣＤ４およびＣＤ８の発現に関して分析した。数値は４群の各々に該当する細胞の比率を指す。（Ｂ）ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらにＴＣＲβの発現に関して分析した。（Ｃ）および（Ｄ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の割合の平均（Ｃ）および全細胞数（Ｄ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図６は、ＷＴ１−トランスジェニックマウスの脾臓において増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞を含むことを示すグラフである。ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を、抗ＣＤ４  Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＴＣＲβ−ＦＩＴＣおよび抗ＴＣＲγδ−ＰＥ抗体で染色した。（Ａ）１２週齢の＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞全体に占めるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ−細胞（ｄｏｔｔｅｄ  ｂａｒ）およびＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−ＴＣＲγδ＋細胞（ｓｏｌｉｄ  ｂａｒ）の比率を示している。（Ｂ）および（Ｃ）６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウス（ｃｌｏｓｅｄ  ｂａｒ）ならびに正常同腹仔（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）におけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδ＋細胞の割合の平均（Ｂ）および全細胞数（Ｃ）を示している。示した結果はマウス７〜８匹から得た結果の平均である。
図７は、ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞のＣＤ８分子はＣＤ８αβであることを示す図である。ＣＤ８＋ＴＣＲγδ細胞の比率が高い１２週齢の＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾細胞を、抗ＴＣＲγδ−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ８α−ＰＥ抗体または抗ＣＤ８β−ＰＥ抗体で二重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）ｌｃｋｐｒ−ＷＴ１の構築
この構築物は、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型［Ｎａｋａｇａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１５：１４８９］のマウスＷＴ１  ｃＤＮＡを含む１．５ｋｂのＳａｕ  ３ＡＩ断片（国立がんセンター研究所（日本）のＨ．Ｎａｋａｇａｍａ博士から寄贈）をｌｃｋ−ｈＧＨベクター［Ｃｈａｆｆｉｎ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９０；９：３８２１］中に挿入することによって作製した。
（２）トランスジェニックマウス
１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のＷＴ１  ｃＤＮＡを含むｌｃｋ−ｈＧＨベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの受精卵に微量注入した。続いて、注入後の卵を偽妊娠させた代理母に移植し［Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、２つの異なるトランスジェニックマウス（＃２１および＃３５）をファウンダーとして樹立した。これらの系統からの子孫を、ＰＣＲによる尾部ＤＮＡの分析によってＷＴ１導入遺伝子の存在に関してスクリーニングし、ＷＴ１導入遺伝子を有する雄の子孫をＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌と交配させた。トランスジェニックマウスの胸腺から単離したＷＴ１導入遺伝子の配列解析により、ＷＴ１導入遺伝子に変異がないことを確認した。
（３）逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を製造者のプロトコールに従って用いて、胸腺細胞から全ＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡへの変換にはオリゴｄＴプライマーおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を用い、総容積を３０μｌとした［Ｔａｍａｋｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１９９９；１３：３９３］。
ＷＴ１の発現レベルはＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって定量化した。ＰＣＲ反応は、５００ｎＭの各プライマーおよび１００ｎＭのプローブを最終容量５μｌとして含む、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて行った。ｃＤＮＡの増幅にはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ−７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、４０サイクル（変性は９５℃で１５秒間／アニーリングおよび伸長は５９℃で１分間）の増幅を行った。以下のプライマーおよびプローブを用いた。マウスＷＴ１、順方向プライマー：５’−ＡＴＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＣＡ−３’（配列番号：１）；逆方向プライマー：５’−ＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＧＣＧＡ−３’（配列番号：２）、プローブ：５−ＦＡＭ−ＡＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：３）。β−グルクロニダーゼ、順方向プライマー：５’−ＣＧＡＧＴＡＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号：４）；逆方向プライマー；５’−ＣＣＧＡＣＣＡＣＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣ−３’（配列番号：５）、プローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＧＣ−ＴＡＭＲＡ３’（配列番号：６）。ＲＴ−ＰＣＲに関するＲＮＡのローディング量および個々の試料に関するＲＮＡ分解の差異を標準化するために、ＷＴ１遺伝子の発現をβ−グルクロニダーゼ遺伝子の発現で割った値を相対的なＷＴ１発現レベルとして用い、マウスＷＴ１をトランスフェクトしたＣ１４９８細胞［Ｔｓｕｂｏｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；２０：１９５］におけるＷＴ１遺伝子の発現を１．０と定義した。
（４）フローサイトメトリー分析
新たに調製した胸腺細胞、脾細胞または末梢血単核細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁させた。細胞の染色は以前の記載の通りに行った［Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：１４０５］。直接染色に関しては、非特異的な結合を少なくするために細胞をまず抗マウスＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体モノクローン抗体（ｍＡｂ）とともに４℃で２０分間インキュベートし［Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：１０５］、続いて適切な濃度のｍＡｂを４℃で３０分間用いて３色または４色による細胞表面染色を行った。用いた抗体は以下の通りである：抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、抗マウスＣＤ４−ＰＥ、抗マウスＣＤ４  Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ８−ＰＥ、抗マウスＣＤ８−ＦＩＴＣ、抗マウスＣＤ８−ＡＰＣ、抗マウスＣＤ４４−Ｃｙ−ＣｈｒｏｍｅＴＭ、抗マウスＣＤ２５−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＦＩＴＣ、抗マウスＴＣＲβ−ＡＰＣ、抗マウスＴＣＲγδ−ＰＥ。抗マウスＨＳＡ−ＦＩＴＣ抗体を除き、抗体はすべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、０．５％ＦＣＳを含む１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた上で、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析した。
（５）統計分析
統計学的有意性はスチューデントのｔ検定によって分析した。
［実施例１］ＷＴ１トランスジェニックマウスの胸腺におけるＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブのＣＤ４４＋ＣＤ２５−（ＤＮ１）細胞の増加
ＷＴ１トランスジェニック（Ｔｇ）マウスおよび正常同腹仔の胸腺細胞におけるＷＴ１導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞はいずれもＷＴ１導入遺伝子を発現したが、正常同腹仔の胸腺細胞は発現しなかった（非提示データ）。ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の全胸腺細胞数を測定した結果、図１に示すとおり、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺細胞の絶対数は、正常同腹仔の胸腺細胞数よりも有意に少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の成長抑制が示された。ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺においてＴ細胞系列が正常に発生したか否かを検討するために、６週齢または１２週齢の＃２１および＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスならびに正常同腹仔の胸腺細胞を、ＦＡＣＳにより、ＨＳＡ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、Ｂ２２０、Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｂの発現に関して分析した。図２Ａ、Ｂに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より多かった。一方、図２Ｃに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の総数は、６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの２系統のいずれの胸腺においても正常同腹仔より少なく、ＷＴ１−Ｔｇマウスの全胸腺細胞数が減少したためと考えられる。胸腺細胞の４つのＤＮサブセット（ＤＮ１、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−；ＤＮ２、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋；ＤＮ３、ＣＤ４４−ＣＤ２５＋；ＤＮ４、ＣＤ４４−ＣＤ２５−）のうちどのサブセットが増加したかを明らかにするために、ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ胸腺細胞をＣＤ４４およびＣＤ２５の発現に関してＦＡＣＳ分析した。図３に示す通り、４つのＤＮサブセットのうちＣＤ４４＋ＣＤ２５−ＤＮ１の比率および全細胞数は、＃２１  ＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が同腹仔の場合よりも有意に多かったが（７４．２％対１８．７％）、ＤＮ２（１．５％対２４．８％）およびＤＮ３（２．０％対３７．３％）は有意に少なかった。＃３５  ＷＴ１−Ｔｇマウスでは、正常同腹仔との比較で４つのＤＮサブセットの割合に有意差は認められなかったが（非提示データ）、１２週齢のＷＴ１−ＴｇマウスではＤＮ胸腺細胞が有意に多かった。ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＤＮ胸腺細胞の増加とは対照的に、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスのいずれの系統ともに正常同腹仔よりも少なかった（非提示データ）。
胸腺細胞におけるＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現により、Ｔ細胞系列の分化が妨げられた。ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が正常同腹仔よりも有意に多く、一方、ＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットおよびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットはＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺の方が有意に少なかった。ＣＤ４−ＣＤ８−ＤＮ細胞の胸腺内分化は、ＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１からＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２およびＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３細胞を経てＣＤ４４−ＣＤ２５−のＤＮ４細胞へと進行することがよく知られているため［Ｇｏｄｆｒｅｙ  ＤＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；１５０：４２４４、Ｈｏｆｆｍａｎ  ＥＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．１９９６；１０：９４８、Ｖｏｌｌ  ＲＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０００；１３：６７７］、これらの結果から、ＷＴ１遺伝子のｌｃｋプロモーター駆動性発現によってＣＤ４４＋ＣＤ２５−のＤＮ１サブセットからＣＤ４４＋ＣＤ２５＋のＤＮ２サブセットへの分化がブロックされることが示された。ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＷＴ１遺伝子の発現がＤＮ胸腺細胞の分化をブロックしたという本発明者らの今回の結果は、胸腺細胞においてｌｃｋプロモーター活性があるという事実と一致する［Ｍａｒｔｈ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８５；４３：３９３、Ｗｉｌｄｉｎ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９１；１７３：３８３］。赤芽球系細胞または骨髄球系細胞ではＷＴ１発現と分化との間に明瞭な相関があることがよく知られている。赤芽球系白血病細胞株Ｋ５６２および骨髄球系白血病細胞株ＨＬ−６０はいずれも、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはレチノイン酸、およびレチノイン酸によって誘導した分化に伴ってＷＴ１を発現しなくなる［Ｐｈｅｌａｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆ．１９９４；５：６７７、Ｓｅｋｉｙａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：１８７６］。その反対に、ＷＴ１遺伝子の構成的発現により、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）に反応して起こる骨髄球系前駆細胞３２Ｄ  ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧおよびＣＦＵ−Ｍ）の分化が妨げられる［Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。しかし、構成的なＷＴ１発現によってリンパ球の分化が妨げられるか否かという問題は本実施例を行う前は不明なままであった。したがって、本発明者らの今回の発明により、Ｔ細胞系列の発生および分化に対するＷＴ１遺伝子の関与を初めて報告することができた。なお、本発明のＷＴ１−Ｔｇマウスでは、胸腺の腫大が起こり、急性リンパ性白血病が起こることが判明した（図４）。
［実施例２］ＷＴ１−ＴｇマウスにおけるＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の増加
ＷＴ１−Ｔｇマウスにおける末梢Ｔ細胞系列の変化を調べるために、１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスおよび正常同腹仔の脾細胞を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体および抗ＴＣＲβ抗体で三重染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。図５Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋細胞はＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓の方が正常同腹仔の場合よりも多かったため、以降の分析には脾細胞をＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して提示させた。図５Ｂに示す通り、ＷＴ１−Ｔｇマウスと正常同腹仔との間にはＣＤ８およびＴＣＲβの発現に関して明らかに異なる像が認められた。ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＷＴ１−Ｔｇマウスの方が正常同腹仔よりも有意に多かった。末梢血単核細胞に関する同じ分析でも上記のものと同じ結果が得られた（非提示データ）。図５Ｃ、Ｄに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞の比率および絶対数の増加は、＃２１系統および＃３５系統のいずれのＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓においても観察された。また、６週齢または１２週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの胸腺ではいずれの系統とも正常同腹仔に比べてＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞のわずかな増加が観察された（非提示データ）。
［実施例３］増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団はＴＣＲγδＴ細胞を含む
ＷＴ１−Ｔｇマウスの両系統の脾臓および末梢血で増加したＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団を、抗ＴＣＲδγ抗体を用いてさらに分析した。図６Ａに示す通り、ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の約４９％はＴＣＲδγＴ細胞であった。ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲβ−細胞集団の残りの５１％の細胞系列を明らかにすることはできなかった。図６Ｂ、Ｃに示す通り、ＴＣＲδγＴ細胞の比率および絶対数の増加は６週齢のＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓でも既に観察された。末梢血のＦＡＣＳ分析でも同様の結果が得られた（非提示データ）。
ＣＤ４−ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は、ＷＴ１−Ｔｇマウスの脾臓および末梢血において有意に増加した。この所見に関して考えられる説明は以下の通りである。すなわち、ＴＣＲγδＴ細胞はＣＤ４４−ＣＤ２５＋のＤＮ３サブセットから生じることが報告されている［Ｃａｐｏｎｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８；９５：１２５２２、Ｌｉｖａｋ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；１６２：２５７５、Ｓｈｏｒｔｍａｎ  Ｋ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１４：２９］。ＤＮ１段階からＤＮ２段階への分化経路がＷＴ１−Ｔｇマウスではブロックされており、ＴＣＲαβＴ細胞の生成に至る胸腺細胞の主な分化経路が制限されるため、ＤＮ３からＴＣＲγδＴ細胞への分化経路が進行しやすくなり、このためにＴＣＲγδＴ細胞が多く生じたと考えられる。また、これらの結果は、ＤＮ１胸腺細胞からＴＣＲγδＴ細胞に至る分化経路の存在を示唆する可能性もある。
ＷＴ１遺伝子は２つのスプライス部位で選択的スプライシングを受けるため、４つの異なるスプライス形態（１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋、１７ＡＡ−／ＫＴＳ−、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−、および、１７ＡＡ−／ＫＴＳ＋）が生じる［Ｈｅｒｗｉｔｔ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：８５８８、Ｄａｖｉｅｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。４つのスプライス形態のそれぞれの機能については現在も議論がある［Ｄａｖｉｅｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９；（Ｓｕｐｐｌ）５９：１７４７ｓ］。本発明者らの以前の研究では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ＋非スプライス型の構成的発現により、骨髄球系前駆細胞株３２Ｄ  ｃｌ３およびマウス正常骨髄球系前駆細胞の分化がいずれも妨げられることを示した［Ｉｎｏｕｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：２９６９、Ｔｓｕｂｏｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９９；２３：４９９］。本実施例では、１７ＡＡ＋／ＫＴＳ−スプライス型のｌｃｋプロモーター駆動性発現によって胸腺におけるＴ細胞系列の初期分化が阻げられることを初めて記載した。
［実施例４］ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来である
ＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞が、胸腺由来、あるいは胸腺外由来か否かを調べるため、抗ＣＤ８α抗体および抗ＣＤ８β抗体を用いたＦＡＣＳ分析を行った。図７に示す通り、多数のＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞がＣＤ８αβであった。この結果からＣＤ８＋ＴＣＲγδＴ細胞は胸腺由来であることがわかった。
【実施例５】  ４匹のＷＴ１−Ｔｇマウスから発生した白血病細胞にＷＴ１アンチセンスオリゴマーを投与したところ、増殖が抑制された。このことは、導入したＷＴ１遺伝子が発癌に関与していることを示している。また、４匹のＷＴ１−Ｔｇマウス由来の白血病細胞について、ＴＣＲのＶβレセプターを解析したところ、２匹からの細胞についてはオリゴクローナルであり、残り２匹からの細胞についてはモノクローナルであった。このことは、４匹のＷＴ１−Ｔｇマウスから発症した白血病細胞の形質が多様であることを示している。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ＷＴ１タンパク質をコードするＤＮＡが導入されたトランスジェニック非ヒト動物、該動物から樹立された細胞、Ｔ細胞系列の分化または発生を制御する化合物、並びに、該化合物のスクリーニング方法が提供される。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は急性リンパ性白血病を起こすことから、本非ヒト動物を用いることにより優れた白血病治療薬のスクリーニングを容易に行うことができるといった利点を有する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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