(57)【要約】本発明の目的は、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）と相互作用するタンパク質を見出し、グランザイムＢによる当該タンパク質の分解により引き起こされる疾患の防止手段および／または治療手段を提供することである。本発明によれば、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）をグランザイムＢの基質として用いる方法；グランザイムＢとゴルジン−１６０との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢによるゴルジン−１６０の分解の阻害剤をスクリーニングする方法；グランザイムＢとゴルジン−１６０との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢによるゴルジン−１６０の分解の阻害剤を含む各種の薬剤；並びにグランザイムＢとゴルジン−１６０との相互作用および／またはグランザイムＢによるゴルジン−１６０の分解を阻害する工程を含む各種疾患の防止および／または治療方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）をグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）の基質として用いる方法。
【請求項２】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）とを接触させる工程を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）を分解する方法。
【請求項３】
被験物質の存在下においてグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）とを接触させる工程を含む、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項４】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）および／またはそれをコードする遺伝子とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）および／またはそれをコードする遺伝子を含む、試薬キット。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により得られるグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤。
【請求項６】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、アポトーシス阻害剤。
【請求項７】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、移植片拒絶反応阻害剤。
【請求項８】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患の防止および／または治療のための医薬。
【請求項９】
ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患が、移植片対宿主病、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、アポトーシスを阻害する方法。
【請求項１１】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、移植片拒絶反応を阻害する方法。
【請求項１２】
グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患を防止および／または治療する方法。
【請求項１３】
ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患が、移植片対宿主病、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）をグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）の基質として用いる方法、並びにＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらにまた本発明は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤を含む各種の薬剤、並びにＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解を阻害する工程を含む各種疾患の防止および／または治療方法に関する。
【背景技術】  細胞障害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＣＴＬ）やナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ；ＮＫ）細胞等の免疫系の細胞障害性細胞は、移植片拒絶、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、各種自己免疫性疾患、各種アレルギー性疾患等の成因および／または増悪に関与していると考えられている（Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｂａｒｒｙ他、″ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ａｌｌ  ｒｏａｄｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ．″ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４０１−４０９（２００２）；Ｐｅｒｅ  Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，″Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．″Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３：６６３−６６９（２００１））。
これらの細胞の細胞障害機構は大きく２種類が知られており、その１つがグランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅｓ）ファミリーと呼ばれる複数のセリンプロテイナーゼおよびパーフォリンに依存した系である。ヒトの細胞障害性細胞の細胞質内顆粒では４種類の普遍的なグランザイムが知られているが、その中でもＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは存在量も多く、パーフォリンとの組合わせで標的細胞にアポトーシスを効率よく誘導することが示されている（Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｂａｒｒｙ他、″ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ａｌｌ  ｒｏａｄｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ．″ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４０１−４０９（２００２））。また、移植片拒絶反応、移植片対宿主病や自己免疫疾患の病態形成においては、標的組織に浸潤した免疫系の細胞障害性細胞のＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂやパーフォリンの産生が高まっていることが報告されている（Ｊｕｒｇｅｎ  Ｓｔｒｅｈｌａｕ他、″Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｓ  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．″ｉｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：６９５−７００（１９９７）、他多数）。
標的細胞内に入ったＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは、プロカスパーゼ−３（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３）（および幾つかの他のプロカスパーゼ）、Ｂｉｄ、ＩＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ））等を切断して、カスパーゼ経路の活性化、ミトコンドリアからのチトクロムＣの遊離とそれに基づくカスパーゼ活性化の増幅、ＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮａｓｅ（ｃａｓｐａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＤＮａｓｅ））の活性化によるＤＮＡの切断等によりアポトーシスを誘導することが示されている（Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｂａｒｒｙ他、″ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ａｌｌ  ｒｏａｄｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ．″ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４０１−４０９（２００２）；及びＰｅｒｅ  Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，″Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．″Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３：６６３−６６９（２００１））。しかしながら、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢはＰＰＡＲＰ（ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ｐｏｌｙ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ））、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの触媒サブユニット（ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ））、ＮｕＭＡ（核有糸分裂器官タンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）  ）、フィラミン（ｆｉｌａｍｉｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、核ラミンズ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌａｍｉｎｓ）等をも基質とすることが見い出されているが、これらの切断、分解の生物学的意義は未だ明らかではない（Ｍｉｃｈｅｌｅ  Ｂａｒｒｙ他、″ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ：ａｌｌ  ｒｏａｄｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｅａｔｈ．″ｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２：４０１−４０９（２００２））。
一方、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０はゴルジ体の膜に局在するタンパク質で、その役割は未解明であるが、Ｎ末側の数十アミノ酸部分が切断、遊離されることによってアポトーシスにおけるゴルジ体の分解が進むことが報告されている（Ｍａｒｉｅ  Ｍａｎｃｉｎｉ他、″Ｃａｓｐａｓｅ−２  ｉｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｇｏｌｇｉ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｇｏｌｇｉｎ−１６０  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．″Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．１４９：６０３−６１２（２０００））。
【発明の開示】
本発明は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用するタンパク質を見出し、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂによる当該タンパク質の分解により引き起こされる疾患の防止手段および／または治療手段を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、先ず、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用する蛋白質の候補の一つとして、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０をインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）解析により予測した。続いて、本発明者らは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験により、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０が相互作用することを確認した。すなわち、該相互作用の結果としてＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによってＧｏｌｇｉｎ−１６０が分解されることを実証した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち、本発明によれば、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）をグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）の基質として用いる方法が提供される。
さらに本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）とを接触させる工程を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）を分解する方法が提供される。
また本発明によれば、被験物質の存在下においてグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）とを接触させる工程を含む、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤をスクリーニングする方法が提供される。
さらに本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）および／またはそれをコードする遺伝子とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）および／またはそれをコードする遺伝子を含む、試薬キットが提供される。
また本発明によれば、上記した本発明によるスクリーニングする方法により得られるグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤が提供される。
さらに本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、アポトーシス阻害剤が提供される。
また本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、移植片拒絶反応阻害剤が提供される。
さらに本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用の阻害剤および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解の阻害剤を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患の防止および／または治療のための医薬が提供される。
上記医薬において好ましくは、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患が、移植片対宿主病、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である。
また本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、アポトーシスを阻害する方法が提供される。
さらに本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、移植片拒絶反応を阻害する方法が提供される。
また本発明によれば、グランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）とゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）との相互作用および／またはグランザイムＢ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）によるゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解を阻害する工程を含む、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患を防止および／または治療する方法が提供される。
上記方法において、好ましくは、ゴルジン−１６０（Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）の分解に起因する疾患が、移植片対宿主病、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（図１ではＧＺＭＢと記す）とＧｏｌｇｉｎ−１６０（図１ではＧＯＬＧＡ３と記す）とのローカルアライメントの結果を示す。なお、図１に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２〜７に示す。
図２は、インビトロプロテアーゼアッセイの結果を示す。
ＡはＴＲＸ−ｇｏｌｉｎ−１６０、Ｂはｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３、そしてＣはＴＲＸ−ＬＡＧ３を示す。
レーン１はＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの非存在下、レーン２はＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの存在下における実験結果を示す。矢印は完全長の各タンパク質を示す。
図３は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解を示す。ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧをＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ非存在下（レーン１）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ存在下（レーン２）に３７℃で２時間インキュベーション後、等容量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、５分間加熱してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたウエスタンブロットを実施した。矢印に相当するバンドを切り出し、Ｎ末端のアミノ酸配列分析に供した。
【発明を実施するための最良の形態】１．Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質としてのＧｏｌｇｉｎ−１６０
本発明では、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０とが相互作用することを予測した。具体的には、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有する蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂとの間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用すると予測した。予測の結果、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＬＱＥＶＫ、ＫＡＱＶＫおよびＡＶＱＰＬＲＬと相同性のあるオリゴペプチドＩＱＥＡＫ、ＶＡＱＶＲ、ＡＬＱＳＬＲＬが、アポトーシスの進行に関わるオルガネラであるゴルジ体膜上に存在する蛋白質であるＧｏｌｇｉｎ−１６０のアミノ酸配列中に存在することが分かった。上記の結果より、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０は、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用することが予測された。本明細書において、「相互作用」とは、結合する、基質と酵素の関係にあるなど、互いに作用し、または、影響を及ぼし合うことを言う。
なお、本明細書の以下の実施例１では、上記したｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析を行うことにより、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質の候補の一例としてＧｏｌｇｉｎ−１６０が同定された。しかし、上記のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によってＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質の候補として予測されるものを本発明で使用することもできる。
続いて、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０の相互作用の結果、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによりＧｏｌｇｉｎ−１６０が分解されることをｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で確認した。なお、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの確認実験は、本明細書の実施例２に記載の方法またはこれに準ずる方法により当業者であれば適宜実施することができる。
従って、本発明によれば、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質としてＧｏｌｇｉｎ−１６０を使用する方法が提供される。該方法の一例としては、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０とを相互作用させることによってＧｏｌｇｉｎ−１６０を分解することができる。本発明によれば、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの新規の基質としてＧｏｌｇｉｎ−１６０が初めて同定された。本発明によりＧｏｌｇｉｎ−１６０がＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質となり得ることが判明したことにより、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解により引き起こされる疾患の防止手段および／または治療手段を提供することが可能になる。
２．スクリーニング方法及び試薬キット
Ｇｏｌｇｉｎ−１６０がＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの基質であり、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの作用によりＧｏｌｇｉｎ−１６０が分解されることが判明したことにより、被験物質の存在下においてＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０とを接触させることによって、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤をスクリーニングすることが可能になった。
本発明において、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤をスクリーニングする方法とは、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤の同定方法である。これは、例えば、本明細書に記載するようなＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の検出方法を用いて、酵素としてＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂを使用し、基質としてＧｏｌｇｉｎ−１６０を使用することにより実施することが可能である。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質の種類は特に限定されず、任意の化合物を被験物質として使用することができる。被験物質は、個々の低分子化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは低分子化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよく、これらは全て本明細書で言う被験物質の範疇に属するものとする。医薬品としての用途を勘案した場合、被験物質としては、低分子化合物あるいは低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。
上記した被験物質の存在下においてＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０とを接触させることによってＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０とを相互作用させ、被験物質の存在により、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解が阻害されるかどうかを検出・測定することにより、目的物質をスクリーニングすることができる。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の検出および測定は、例えば、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０を含む適当な緩衝液（例えば、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４０，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴ）にＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂを添加し、３７℃でインキュベーションした後、反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、染色することによりＧｏｌｇｉｎ−１６０およびＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解産物を観察することができる。この反応系に被験物質を添加した場合としなかった場合で、生成したＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解産物の有無および／またはその量を比較することにより、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解に対する被験物質の阻害活性を評価することが可能である。なお、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の分解産物の有無および／またはその量の検出・測定は、当該分解産物に特異的な抗体などを用いる免疫学的方法により行うこともできるし、あるいはクロマトグラフィーなどの物理化学的方法により行うこともできる。
さらに本発明によれば、試薬キットが提供される。該キットは、少なくとも、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂおよび／またはそれをコードする遺伝子とＧｏｌｇｉｎ−１６０および／またはそれをコードする遺伝子とを含む。即ち、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０はタンパク質（それぞれ酵素と基質）の形態で提供してもよいし、遺伝子の形態で提供してもよい。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０を遺伝子の形態で提供する場合、好ましくは、当該遺伝子は、適当な宿主内で発現できるような発現ベクターに組み込まれた組換え発現ベクターの形態で提供される。宿主とそれに適した発現ベクターの組み合わせは当業者に既知である。例えば、宿主としては、細菌、酵母、動物細胞または植物細胞などが挙げられ、それぞれに適した発現ベクターも各種のものが既知であり、当業者であれば適宜選択することができる。
また、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０の遺伝子には、検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、そのＮ末端側やＣ末端側に別の蛋白質、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片もしくはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を、あるいはＦＬＡＧ−ｔａｇもしくはＨｉｓ×６−ｔａｇ等のペプチドを、直接またはリンカーペプチド等を介して間接的に公知の遺伝子工学的方法を用いて付加することもできる。
また、本発明で用いるＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０は、天然に存在する野生型のタンパク質や遺伝子のみならず、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（酵素）によるＧｏｌｇｉｎ−１６０（基質）の分解という酵素反応が達成される限り、変異蛋白質、相同蛋白質、変異遺伝子または相同遺伝子などを用いてもよい。このような変異蛋白質や相同蛋白質は、一般的には、野生型のタンパク質のアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入等の変異を有するアミノ酸配列、あるいは、野生型のタンパク質のアミノ酸配列と一定以上（例えば、約７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有している。上記した変異蛋白質や相同蛋白質をコードする遺伝子の取得方法は公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法またはそれに準ずる方法により適宜実施することができる。
本発明のキットを用いることにより、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤を簡便にスクリーニングすることができる。
３．Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤、該阻害剤を用いた各種薬剤、並びに、該阻害を利用した疾患の防止または治療方法
上記２．に記載したスクリーニングにより得られるＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤も本発明の範囲内に含まれる。このような阻害剤は上記した被験物質の中から所望の阻害活性を示すものとして選択された物質である。
また、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解がアポトーシスの進行に関与していることから、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤はアポトーシス阻害剤として使用することができる。さらに、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解が移植片拒絶反応の進行に関与している可能性があることから、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤は、移植片拒絶反応阻害剤として使用することができる。上記と同様に、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤は、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の分解に起因する疾患の防止および／または治療のための医薬として使用することができる。Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の分解に起因する疾患の種類は特に限定されないが、例えば、移植片対宿主病、自己免疫疾患またはアレルギー疾患などが挙げられる。上記したアポトーシス阻害剤、移植片拒絶反応阻害剤および医薬のことを総称して、本明細書中以下においては、本発明の薬剤とも称する場合がある。
本発明に関わるＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤は、医薬品を開発する際に通常実施される試験を経た後、医薬品として提供することが可能である。
本発明の薬剤の投与形態は特に制限されず、経口的・非経口的に投与することができる。本発明の薬剤としては、有効成分である化合物をそのまま用いてもよいが、有効成分の化合物と薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で提供されることが好ましい。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、またはシロップ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、または貼付剤等を挙げることができる。
本発明の薬剤の投与量は特に限定されず、有効成分の薬効、治療または防止の目的、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能であるが、一般的には、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日／成人ヒト、である。
また、生体内または細胞内においてＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解を阻害することによって、アポトーシスを阻害すること、移植片拒絶反応を阻害すること、並びにＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解に起因する疾患を防止および／または治療することが可能であり、これらの方法も本発明の範囲内である。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解を阻害するための手段としては、本明細書中上記したＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０との相互作用の阻害剤および／またはＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の阻害剤を投与する方法のほか、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのアミノ酸配列の一部を改変し、プロテアーゼ活性を有しないものの基質であるＧｏｌｇｉｎ−１６０に対する親和性は上記Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのそれと等しいような変異体（ドミナントネガティブ変異体）を投与する方法などが挙げられる。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１：Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用するタンパク質のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの探索
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ２，細胞傷害性Ｔリンパ球関連セリンエステラーゼ１（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  １））と相互作用する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従って予測した。すなわち、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂとの間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂと相互作用すると予測した。ここではローカルアライメントのスコアを、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の方法と同様に、２５．０以上とした。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢはＮＫ細胞や細胞毒性Ｔリンパ球から分泌される細胞毒性顆粒の一つであるセリンプロテアーゼであり、アポトーシスに関与する分子を基質とした反応を触媒することによってアポトーシスの進行に関与することが知られている。
予測の結果、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＬＱＥＶＫ、ＫＡＱＶＫおよびＡＶＱＰＬＲＬと相同性のあるオリゴペプチドＩＱＥＡＫ、ＶＡＱＶＲ、ＡＬＱＳＬＲＬが、オルガネラであるゴルジ体膜上に存在するアポトーシスの進行に関わる蛋白質Ｇｏｌｇｉｎ−１６０のアミノ酸配列中に存在することが分かった。図１に、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（図１ではＧＺＭＢと記す）とＧｏｌｇｉｎ−１６０（図１ではＧＯＬＧＡ３と記す）とのローカルアライメントの結果を示す。
実施例２：Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解の解析
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢによりＧｏｌｇｉｎ−１６０が分解されるかどうかについて実験的に確認するために、インビトロプロテアーゼアッセイを実施した。
＜材料＞
Ｇｏｌｇｉｎ−１６０発現プラスミドの構築
ヒトＧｏｌｇｉｎ−１６０ｃＤＮＡ（塩基配列を配列表の配列番号１に記載する）は、ヒト肺ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲにより取得し、ＰＣＲエラーと思われる塩基置換や挿入はＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて修正した。これを、Ｎ末端にチオレドキシン（ＴｈｉｏＲｅｄｏｘｉｎ）（ＴＲＸ）−ｔａｇを付加させる大腸菌用発現ベクター、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ組み込み、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０発現プラスミドを構築した。
ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の精製
Ｇｏｌｇｉｎ−１６０は、上記Ｇｏｌｇｉｎ−１６０発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）存在下で２５℃で一晩培養することにより、Ｎ末端ＴＲＸ融合タンパク質（以下、ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０）として発現させた。ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０は、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１％ＮＰ−４０，１％サルコシル，１ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム（ＰＢＳ中））を用いて可溶化し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ中）に対して透析後、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に吸着させた。次いで、イミダゾールでＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０を溶出させ、ＰＢＳに対して透析した後に濃縮し、使用した。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの入手
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ，Ｈｕｍａｎ，ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３６８０４２）を購入して使用した。
Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３の入手
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのインビトロプロテアーゼアッセイにおいて陽性対照として使用するｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３については、大腸菌で発現させたＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３（ＭＢＬ／ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１０８３Ｐ−５）を購入して使用した。
ＴＲＸ−ＬＡＧ３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）の調製
ＬＡＧ３（リンパ球活性化タンパク質３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３））のＮ末端にＴＲＸ−ｔａｇを付加したＴＲＸ−ＬＡＧ３をＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０と同様にして調製し、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂのインビトロプロテアーゼアッセイにおいて陰性対照として使用した。
＜方法＞インビトロプロテアーゼアッセイ
ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０、ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３、あるいはＴＲＸ−ＬＡＧ３（それぞれ、０．２μｇ）を含むｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４０，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴ）（Ｋａｍ  Ｃ．Ｍ．，Ｈｕｄｉｎｇ  Ｄ他、″Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．″Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４７７：３０７−３２３（２０００））１０μｌ中にＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（０．０５μｇ）を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、各反応液に等量の２ｘＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム，２０％（ｖ／ｖ）グリセロール，０．０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、２０％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール）を加えて５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、クーマシーブルー染色により各タンパク質およびその分解産物を観察した。
＜結果＞
図２Ａに示すようにＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによりＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０が分解された。なお、同条件下、陽性対照のｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３はＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂにより分解され（図２Ｂ）、ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０と同様のＮ末端ＴＲＸ融合タンパク質ＮＴＲＸ−ＬＡＧ３は分解されなかった（図２Ｃ）。
実施例３：Ｇｏｌｇｉｎ−１６０のＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂによる分解位置の同定
Ｇｏｌｇｉｎ−１６０のＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂによる分解位置を解析するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｓｓａｙを実施後の切断断片のＮ末端アミノ酸配列分析を実施した。
＜材料＞
Ｇｏｌｇｉｎ−１６０発現プラスミドの構築
実施例２で作製したＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の発現プラスミドを用い、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０  ｃＤＮＡのＣ末端にＦＬＡＧ配列を挿入したＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧ（ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧ）発現プラスミド（ｐＴＨＩＯ−ＨｉｓＡ／Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧ）を構築した。
ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧの精製
ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧは、上記の発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、ＬＢ培地で３７℃で一晩培養後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）存在下に、２５℃６時間の培養により発現させた。ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１％ＮＰ−４０，１％Ｓａｒｃｏｓｙｌ，１ｍｇ／ｍｌ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｉｎ  ＰＢＳ）を用いて可溶化し、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ｉｎ  ＰＢＳに対して透析後、ＰｒｏＢｏｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に吸着させた。ｉｍｉｄａｚｏｌｅで溶出、ＰＢＳに対して透析した後に濃縮し、使用した。
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂの入手
Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは、実施例２と同様に市販品を使用した。
＜方法＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏプロテアーゼ試験
ＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧ（０．６μｇ）を含むｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＮＰ−４０，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＤＴＴ）（Ｋａｍ  Ｃ．Ｍ．，Ｈｕｄｉｇ  Ｄ．ａｎｄ  Ｐｏｗｅｒｓ  Ｊ．Ｃ．，″Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．″ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４７７：３０７−３２３（２０００））５０μｌ中にＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ（０．１５μｇ）を添加し、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応液に等量の２×ＳＤＳサンプルバッファーを加えて５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＣＢＳ染色、および図３に示すように、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いたウエスタンブロットによりＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧおよびその分解産物を特定した。
Ｎ末端アミノ酸配列解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写したＴＲＸ−Ｇｏｌｇｉｎ−１６０−ＦＬＡＧの分解産物のうち最大分子量のバンドを切り出し、５０％メタノール／０．１％ＴＦＡ、１００％メタノールで処理後、乾燥し、Ｎ末端のアミノ酸配列分析を行った。プロテインシーケンサーはＰｒｏｃｉｓｅ  ｃＬＣ  ４９２ｃＬＣ型（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＴＨアナライザーは１４０Ｄ型（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、分析プログラムはＰｕｌｓｅｄ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｏｓｏｒｂ  ｃＬＣを使用した。
＜結果＞
Ｎ末端５アミノ酸の配列はＧｏｌｇｉｎ−１６０の９３番目〜９７番目に相当するＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列表の配列番号８）と同定された。したがって、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０は、９２番目のＡｓｐと９３番目のＡｌａの間でＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂによって切断されることが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明では、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢがＧｏｌｇｉｎ−１６０と相互作用すること、その相互作用においてＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによりＧｏｌｇｉｎ−１６０が分解されることを初めて見出した。Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂはパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）とともにＣＴＬやＮＫ細胞から分泌され、標的細胞にアポトーシスを誘導し、移植片拒絶、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、各種自己免疫性疾患、各種アレルギー性疾患等の成因および／または増悪に関与していると考えられている。一方、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０はゴルジ体の膜に局在するタンパク質で、Ｎ末側の数十アミノ酸部分が切断、遊離されることによってアポトーシスに於けるゴルジ体の分解が進むことが知られている。これらから、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  ＢとＧｏｌｇｉｎ−１６０の相互作用を阻害することにより、例えばＧｒａｎｚｙｍｅ  ＢによるＧｏｌｇｉｎ−１６０の分解を阻害することにより、Ｇｏｌｇｉｎ−１６０の分解に起因してアポトーシスが促進される疾患、具体的には、移植片拒絶、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、各種自己免疫性疾患、各種アレルギー性疾患等の防止および／または治療が可能になる。
【配列表】
2004113523.tif 000002
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2004113523.tif 000004
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【図１】
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【図２】
2004113523.tif 000009
【図３】
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【国際調査報告】
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2004113523.tif 000012
2004113523.tif 000013
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