(57)【要約】高効率で簡便にＰＮＰａｓｅを製造することができ、また医薬品原料としての核酸重合体の合成において問題となるエンドトキシンの混入を低減できる、ＰＮＰａｓｅの製造法を提供することである。ＰＮＰａｓｅ遺伝子とＴ７プロモーターとを連結する発現ベクターにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌等を形質転換したものを用いることなどにより、ＰＮＰａｓｅを製造する。また、ＰＮＰａｓｅの精製工程をより簡便にするために、タグ遺伝子を有する発現ベクターを利用したり、培養時間を長くする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の工程を含有するＰＮＰａｓｅの製造法。
（Ａ）発現制御シグナルであるＴ７プロモーターを有するプラスミドに原核生物由来のＰＮＰａｓｅ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築する工程；
（Ｂ）当該発現ベクターを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌又はその類縁菌を形質転換する工程；
（Ｃ）当該形質転換体にＰＮＰａｓｅ遺伝子を発現させることによって、ＰＮＰａｓｅを菌体内に蓄積させる工程；
（Ｄ）ＰＮＰａｓｅが蓄積された菌体を回収し、ＰＮＰａｓｅを抽出精製する工程。
【請求項２】
上記Ｃ）Ｄ）の工程が、各々下記Ｃ’）Ｄ’）の工程である、請求項１記載の製造法。
（Ｃ’）当該形質転換体にＰＮＰａｓｅ遺伝子を発現させることによって、ＰＮＰａｓｅを菌体内に蓄積させ、さらに菌体が壊れＰＮＰａｓｅが菌体外上清中に滲出するまで発現を続ける工程；
（Ｄ’）上清中に滲出したＰＮＰａｓｅを回収精製する工程。
【請求項３】
当該プラスミドが、製造されるＰＮＰａｓｅにタグを付与することができるタグ遺伝子を有するものである請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
タグ遺伝子が、Ｈｉｓタグ遺伝子、Ｔ７タグ遺伝子、Ｓタグ遺伝子、Ｎｕｓタグ遺伝子、ＧＳＴタグ遺伝子、ＤｓｂＡタグ遺伝子、ＤｓｂＣタグ遺伝子、ＣＢＤｃｅｘタグ遺伝子、ＣＢＤｃｅｎＡタグ遺伝子、ＣＢＤｃｌｏｓタグ遺伝子、Ｔｒｘタグ遺伝子、ＨＳＶタグ遺伝子、又は３×ＦＬＡＧタグ遺伝子である請求項３記載の製造法。
【請求項５】
原核生物が、大腸菌である請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
【請求項６】
大腸菌が、Ｋ１２株大腸菌、又はＯ１５７株大腸菌である請求項５記載の製造法。
【請求項７】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌が、ＢＬ２１［ＤＥ３］株大腸菌、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ株大腸菌、ＢＬＲ［ＤＥ３］株大腸菌、Ｒｏｓｅｔｔａ［ＤＥ３］株大腸菌、又はＢ８３４［ＤＥ３］株大腸菌である請求項１〜６記載の製造法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造法により製造されたＰＮＰａｓｅを用いて製造された合成核酸重合体。
【請求項９】
合成核酸重合体が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリウリジル酸、ポリアデニル酸、ポリグアニル酸、ポリ（５−ブロモシチジル酸）、ポリ（２−チオシチジル酸）、ポリ（７−デアザイノシン酸）、ポリ（２’−アジドイノシン酸）、ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）、ポリ（１−ビニルシチジル酸）、ポリ（シチジル酸、ウリジル酸）、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジル酸）、又はポリ（アデニル酸、ウリジル酸）である請求項８記載の合成核酸重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、合成核酸重合体を製造するために有用な酵素であるＰＮＰａｓｅ（ポリヌクレオチドホスホリラーゼ）の製造法に関するものである。
【背景技術】  ＰＮＰａｓｅは、１９５５年にＳ．Ｏｃｈｏａにより発見された酵素であり、リボヌクレオシド二リン酸の可逆的重合を触媒し、無機リンを放出する酵素である。この酵素は、細菌に広く分布しているが、動物には存在しない。
試験管内でこの酵素を作用させればリボヌクレオシド二リン酸の重合を行うことができるので、高分子量のホモポリマー、コポリマー、または配列の決まったオリゴマーを合成するのに有用である。
ＰＮＰａｓｅは、古典的には細菌から分離抽出して得ることができるが、組換えＤＮＡ手法により微生物内で大量に製造しうる方法も知られている（米国特許第４９１２４９６号）。特許文献１では酵素遺伝子の発現量を上昇させるために適当な発現制御シグナルを含むベクターにＰＮＰａｓｅ遺伝子（以下、「ｐｎｐ遺伝子」ともいう）を組み込み、形質転換した菌体内でＰＮＰａｓｅを大量に蓄積させた後、菌体破砕を行いＰＮＰａｓｅを抽出精製する方法が示されている。
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ３８３０８）は、高効率にかつ特異的にＴ７プロモーター下流の遺伝子の転写を促進する（米国特許第４９１２４９６号・米国特許第５６９３４８９号・米国特許第５８６９３２０号）。
【発明の開示】
本発明は、従来から知られている方法よりも高効率で簡便にＰＮＰａｓｅを製造することができ、また医薬品原料としての核酸重合体の合成において問題となるエンドトキシンの混入を低減できる、ＰＮＰａｓｅの製造法を主として提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討した結果、ｐｎｐ遺伝子とＴ７プロモーターとを連結する発現ベクターにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌等を形質転換したものを用いることなどにより、上記課題を解決することができ、本発明を完成した。
本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
（１）少なくとも次の工程を含有するＰＮＰａｓｅの製造法。
Ａ．発現制御シグナルであるＴ７プロモーターを有するプラスミドに原核生物由来のＰＮＰａｓｅ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築する工程；
Ｂ．当該ベクターを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌又はその類縁菌を形質転換する工程；
Ｃ．当該形質転換体にＰＮＰａｓｅ遺伝子を発現させることによって、ＰＮＰａｓｅを菌体内に蓄積させる工程；
Ｄ．ＰＮＰａｓｅが蓄積された菌体を回収し、ＰＮＰａｓｅを抽出精製する工程。
または、
（２）少なくとも次の工程を含有するＰＮＰａｓｅの製造法。
Ａ．発現制御シグナルであるＴ７プロモーターを有するプラスミドに原核生物由来のＰＮＰａｓｅ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築する工程；
Ｂ．当該ベクターを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌又はその類縁菌を形質転換する工程；
Ｃ’．当該形質転換体にＰＮＰａｓｅ遺伝子を発現させることによって、ＰＮＰａｓｅを菌体内に蓄積させ、さらに菌体が壊れＰＮＰａｓｅが菌体外上清中に滲出するまで発現を続ける工程；
Ｄ’．上清中に滲出したＰＮＰａｓｅを回収精製する工程。
この中、上記（２）の製造法が好ましい。
ｐｎｐ遺伝子の起源は特に制限されず、例えば、大腸菌（例、Ｋ１２株、Ｏ１５７株）やその類縁菌（例、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を挙げることができる。本発明においては、特に大腸菌（特に、Ｋ１２株）由来のｐｎｐ遺伝子が好ましい。
発現制御シグナルであるＴ７プロモーターを有するプラスミドとしては、Ｔ７プロモーターを有するプラスミドであれば特に制限されないが、菌体内で複製可能であり、特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高い当該プラスミドベクターを用いるのが好ましい。具体例としては、ｐＥＴ系プラスミド（ノバゲン社製）、ｐＲＳＥＴ−Ａ、ｐ−ＲＳＥＴ−Ｂ、ｐＲＳＥＴ−Ｃ（インヴィトロゲン社製）を挙げることができる。
また、当該プラスミドについては、本発明に係るＰＮＰａｓｅ（以下、当該酵素ともいう）にいわゆるタグを付与することができる、タグ遺伝子を有するものが好ましい。このようなタグ遺伝子としては、例えば、Ｈｉｓタグ遺伝子、Ｔ７タグ遺伝子、Ｓタグ遺伝子、Ｎｕｓタグ遺伝子、ＧＳＴタグ遺伝子、ＤｓｂＡタグ遺伝子、ＤｓｂＣタグ遺伝子、ＣＢＤｃｅｘタグ遺伝子、ＣＢＤｃｅｎＡタグ遺伝子、ＣＢＤｃｌｏｓタグ遺伝子、Ｔｒｘタグ遺伝子、ＨＳＶタグ遺伝子、３×ＦＬＡＧタグ遺伝子を挙げることができる。特にＨｉｓタグ遺伝子が適当である。
宿主としての大腸菌又はその類縁菌としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するものであれば特に制限されないが、組換えＤＮＡ実験で使用されるものが好ましい。具体例としては、ＢＬ２１［ＤＥ３］大腸菌、ＢＬ２１［ＤＥ３］ｐＬｙｓＳ株大腸菌、ＢＬＲ［ＤＥ３］株大腸菌、Ｒｏｓｅｔｔａ［ＤＥ３］株大腸菌、Ｂ８３４［ＤＥ３］株大腸菌を挙げることができる。
本発明によって製造された当該酵素を用いれば、核酸ホモポリマー、核酸コポリマー、オリゴ核酸など種々の核酸重合体を合成することができる。合成しうる核酸重合体の具体例としては、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリウリジル酸、ポリアデニル酸、ポリグアニル酸、ポリ（５−ブロモシチジル酸）、ポリ（２−チオシチジル酸）、ポリ（７−デアザイノシン酸）、ポリ（２’−アジドイノシン酸）、ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）、ポリ（１−ビニルシチジル酸）、ポリ（シチジル酸、ウリジル酸）、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジル酸）、ポリ（アデニル酸、ウリジル酸）を挙げることができる。
本発明を実施するための操作自体は、全て公知の方法により行うことができる。
Ｉ．工程Ａ〜Ｄについて
工程Ａ：
例えば、大腸菌の染色体ＤＮＡから常法によりｐｎｐ遺伝子をクローニングすることができる。具体例として、コロニーハイブリダイゼーション法によるクローニングを挙げることができる。
次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、ｐｎｐ遺伝子の開始コドンにＮｄｅＩ切断点を導入し、また終止コドン下流にＥｃｏＲＩ切断点を導入し、常法によりこのＮｄｅＩ切断点から、ｐｎｐ遺伝子を含んだＥｃｏＲＩ切断点までのＤＮＡ断片を得ることができる。
このＤＮＡ断片を、予めＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、５’末端を脱リン酸化した、Ｔ７プロモーターを有するプラスミドと常法により混合し結合反応を行うことにより、目的とする発現ベクターを構築することができる。
工程Ｂ：
上記により得られた発現ベクターを用いて、常法によりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌又はその類縁菌を形質転換することができる。形質転換された大腸菌等は、常法により凍結保存することができる。
形質転換法としては、常法により行うことができ特に限定されない。具体的には、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などの方法を挙げることができる。
工程Ｃ、Ｃ’：
当該形質転換体は、増殖可能な培地中で常法により培養増殖することができる。培養増殖に際しては、３７℃で例えば一晩、前培養することが好ましい。そして、本培養を開始して適当な濁度まで到達した後（例えば、６００ｎｍでの濁度が０．４〜１．０）、適当な発現誘導剤を適当量添加してｐｎｐ遺伝子を発現させ、当該酵素を菌体内に誘導することができる。当該誘導剤添加後、例えば７〜９時間培養を行えば、菌体内への当該酵素の蓄積が通常最大になるが、さらに例えば２４時間培養を続ければ、通常、菌体が自己消化し当該酵素を培養上清に滲出させることができる。当該酵素を培養上清に滲出させる方が、菌体破壊過程と抽出過程がないためそれだけ純度の高い当該酵素を得ることができ、またエンドトキシンの混入を低減することができる。
上記発現誘導剤としては、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧという）、ラクトースを挙げることができる。
形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法により行うことができる。当該培地としては、例えば、２×ＹＴ培地、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地など通常の大腸菌培養に用いられる培地を用いることができる。培養は、例えば２０〜４０℃の培養温度で必要により通気、攪拌しながら行うことができる。また、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じて、アンピシリン、カナマイシンなど）を適当量培養液に加えて培養することもできる。その際、培養後期の発泡によるオーバーフローを防ぐために、適当な消泡剤（例えば、アデカノールＬＧ−１０９（旭電化工業社製）、ＡｎｔｉｆｏａｍＡＦ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ナカライテスク社製））を適当量添加することもできる。
工程Ｄ、Ｄ’：
培養・誘導を終えた菌体を回収し、当該酵素を抽出・精製する方法としては、常法により行うことができる。
まず、菌体内に当該酵素が蓄積されている場合には、適当な緩衝液中に菌体を懸濁させ、超音波処理、フレンチプレス処理などの方法により物理的に菌体を破壊し、菌体残渣を除去して当該酵素を得ることができる。精製が必要な場合には、硫酸アンモニウムによる塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理、限外濾過などで当該酵素を精製することができる。
長時間の培養・誘導により、当該酵素が培養上清に滲出している場合には、上記のような菌体破壊の工程を省略することができる。
タグ付きで発現した当該酵素の場合には、常法により更に容易に回収精製を行うことができる。例えば、回収した上清を、付与されたタグに適したカラムで処理することにより精製することができる。
本発明方法により製造された当該酵素は、医薬品として使用可能なエンドトキシンフリーの核酸重合体を合成するためにエンドトキシン除去カラムで処理することもできる。なお、長時間の培養・誘導により、培養上清に滲出させて当該酵素を製造した場合には、菌体の破壊という工程が不要であるため、エンドトキシンの混入をそれだけ防ぐことができる。
ＩＩ．核酸重合体の合成方法
リボヌクレオシド二リン酸に、本発明方法で得られた当該酵素を常法により作用させることにより、核酸重合体を合成することができる。タグが付与されている当該酵素は、そのまま用いることができるが、常法によりタグを外して用いることもできる。
【図面の簡単な説明】第１図は、Ｈｉｓタグを付与したＰＮＰａｓｅ（Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅ）発現プラスミドｐＥＴ２８ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅのプラスミドマップを示す。
第２図は、Ｈｉｓタグを付与しないＰＮＰａｓｅ（ｎａｔｉｖｅ−ＰＮＰａｓｅ）発現プラスミドｐＥＴ３０ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・ｎａｔｉｖｅ−ＰＮＰａｓｅのプラスミドマップを示す。
第３図は、Ｈｉｓタグを付与したＰＮＰａｓｅの活性を示す。縦軸はＰＮＰａｓｅの活性（Ｕ／Ｌ培養液）を、横軸は発現誘導後の培養時間（時間）を、それぞれ示す。また、黒いカラムは菌体破砕液中のＰＮＰａｓｅ活性を、白いカラムは培養上清中のＰＮＰａｓｅ活性を示す。
第４図は、Ｈｉｓタグを付与していないＰＮＰａｓｅの活性を示す。縦軸はＰＮＰａｓｅの活性（Ｕ／Ｌ培養液）を、横軸は発現誘導後の培養時間（時間）を、それぞれ示す。また、黒いカラムは菌体破砕液中のＰＮＰａｓｅ活性を、白いカラムは培養上清中のＰＮＰａｓｅ活性を示す。
第５図は、ポリイノシン酸の合成反応収率と平均鎖長を示す。左縦軸は合成反応収率（％）を、右縦軸は平均鎖長（塩基数）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。−●−は合成反応収率の推移を、−−−○−−−は平均鎖長の推移をそれぞれ表す。
第６図は、ポリシチジル酸の合成反応収率と平均鎖長を示す。左縦軸は合成反応収率（％）を、右縦軸は平均鎖長（塩基数）を、横軸は時間（時間）をそれぞれ表す。−●−は合成反応収率の推移を、−−−○−−−は平均鎖長の推移をそれぞれ表す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例、試験例により本発明を更に詳述する。但し、本発明が下記実施例に限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】（１）ｐｎｐ遺伝子を組み込んだ発現ベクターの構築
大腸菌Ｃ６００Ｋ株の染色体ＤＮＡからコロニーハイブリダイゼーション法によりｐｎｐ遺伝子をクローニングし、ＰＣＲ法により、ｐｎｐ遺伝子の開始コドンにＮｄｅＩ切断点を導入し、また終止コドン下流にＥｃｏＲＩ切断点を導入し、常法によりこのＮｄｅＩ切断点から、ｐｎｐ遺伝子を含んだＥｃｏＲＩ切断点までのＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片を、予めＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、５’末端を脱リン酸化した発現ベクタープラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｈｉｓタグ遺伝子を含む。ノバゲン社製）と混合し結合反応を行い、タグ遺伝子を有する発現ベクターを構築した。
この発現ベクターは、約２４００塩基対のＤＮＡ断片が挿入されたｐＥＴ２８ａＤＮＡで構成され、このプラスミドをｐＥＴ２８ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅと命名した（図１参照）。ベクター由来の一部分を含めて、ｐｎｐ遺伝子の全ＤＮＡ配列を解読した結果、ベクター由来部分はノバゲン社が発表している配列と一致し、ｐｎｐ遺伝子部分は公的遺伝子データベースＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ０００９１３に記載されている大腸菌Ｋ１２株のｐｎｐ遺伝子相当部分のＤＮＡ配列と完全に一致した。
また、ｐＥＴ２８ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅ  ＤＮＡをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、約２４００塩基対のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片を抽出した。次にこのＤＮＡ断片を、予めＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、５’末端を脱リン酸化した発現ベクタープラスミドｐＥＴ３０ａ（タグ遺伝子を含まない。ノバゲン社製）と混合し結合反応を行い、タグ遺伝子を有しない発現ベクターを構築した。
この発現ベクターは、約２４００塩基対のＤＮＡ断片が挿入されたｐＥＴ３０ａＤＮＡで構成され、このプラスミドをｐＥＴ３０ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・ｎａｔｉｖｅ−ＰＮＰａｓｅと命名した（図２参照）。
（２）形質転換体の調製
上記プラスミドｐＥＴ２８ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅないしｐＥＴ３０ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・ｎａｔｉｖｅ−ＰＮＰａｓｅを用いて、大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株（ノバゲン社製）を常法により形質転換して、各々の形質転換体を調製した。
（３）当該酵素の産出
ｐＥＴ２８ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅを含む大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株の形質転換体ないしｐＥＴ３０ａ・Ｅ．ｃｏｌｉ・ｎａｔｉｖｅ−ＰＮＰａｓｅを含む大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株の形質転換体を、カナマイシンを添加した変法ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ培地（２４ｇ／Ｌ酵母エキス（ナカライテスク社製）、１２ｇ／Ｌトリプトン（ナカライテスク社製）、０．４％［ｖ／ｖ］グリセロール）中で３７℃、約１６時間往復振盪培養（ＭＲ−２００Ｌ振盪培養機、高崎科学社製）し、前培養した。
１０Ｌ容卓上型ジャーファーメンター（オリエンタル酵母社製、ＬＳ−１０）にＬＢ培地（ＬＢ  ＢＲＯＴＨ  ＢＡＳＥ、インビトロゲン社製、ｃａｔ  Ｎｏ．１２７８０−０５２）を仕込み、前培養液を植菌し（培養開始時点での６００ｎｍでの濁度は約０．２）、３７℃、１ｖｖｍ、５００ｒｐｍで通気培養を行った。６００ｎｍでの濁度が０．５〜０．７に達した時、ＩＰＴＧ（ナカライテスク社製）を０．４ｍＭとなるよう添加し、発現誘導を行うことにより２つの当該酵素をそれぞれ産出した。
なお、発現ベクターの脱落を阻止するため、カナマイシンを２５ｍｇ／Ｌとなるよう添加した。消泡剤としてアデカノールＬＧ−１０９（旭電化工業社製）を、培地７Ｌ当たり約０．２ｍＬ添加した。
（４）回収、抽出、精製
▲１▼まず、ＩＰＴＧ添加による発現誘導３時間後の培養液１１２Ｌ（７Ｌ培養×１６回）から集めた菌体より、Ｈｉｓタグを付与された当該酵素の精製を行った。
菌体を培養液量の約１／６０量の抽出用緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１０％グリセロール）に懸濁し、５０ｍｇ／Ｌとなるよう卵白リゾチームを加え、室温で３０分振盪した後、−８０℃で凍結した。３７℃で凍結菌体を急速に融解した後、アストラソン社製超音波細胞破砕機ＸＬ２０２０およびｃａｔ  Ｎｏ．２００の破砕ホーンを用いて、最大出力にて約５分間超音波破砕した。菌体破砕液を２０，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心し、上清を採取し、１．６Ｌの菌体粗抽出液を調製した。菌体粗抽出液をＮｉ＋親和性クロマトグラフ（φ２．６×２０、Ｈｉｓ  Ｂｉｎｄ  Ｆｌａｃｔｏｇｅｌ  Ｍ、ノバゲン社製）にかけ、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素を精製した。菌体粗抽出液を抽出用緩衝液Ａで平衡化したカラムに５ｍＬ／ｍｉｎにアプライした後、樹脂を１Ｌの抽出用緩衝液Ａで洗浄し、最後に１Ｌの０．５Ｍイミダゾールを含む抽出用緩衝液ＡでＨｉｓタグが付与された当該酵素をカラムから溶出した。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムおよびイミダゾールを除去する目的で、限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションを行った。当該酵素を含む１Ｌの溶出液を、限外濾過カートリッジ（ＰＲＥＰ／ＳＣＡＬＥ−ＴＦＦ、分画分子量：１０，０００、ミリポア社製）を用いて約６００ｍＬまで濃縮し、次に液量を一定に保つように緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５％グリセロール）を添加しながら限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した。次にこの酵素液をエンドトキシン除去カラム（Ｋｕｒｉｍｏｖｅｒ  ＩＩ、φ２．６×１０ｃｍ、栗田工業社製）にかけた。酵素液を１．７ｍＬ／ｍｉｎで活性化したＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラムに通し、通過画分を集めた。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムを除去する目的で、限外濾過カートリッジを用いたダイアフィルトレーションを行った。酵素液の液量を一定に保つように緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５％グリセロール）を添加しながら、限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した後、−２０℃で凍結保存した。精製の各工程で試料を採取し、当該酵素の活性測定とエンドトキシン量の測定を行った。
その結果を表１に示す。
2004058959.tif 000002
表１から明らかなように、１１２Ｌ培養菌体（誘導後３時間培養）から約２０万ユニットの当該酵素を得ることができた。また、１回目のダイアフィルトレーション後に多量に含まれていたエンドトキシンは、ＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラム処理によりほとんど除去され、最終産物にはＰＮＰａｓｅ  １ユニット当たり、９．３ＥＵのエンドトキシンが含まれるのみであった。
▲２▼次に、ＩＰＴＧ添加による発現誘導７時間後の培養液５６Ｌ（７Ｌ培養×８回）から集めた菌体より、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素の精製を行った。菌体を培養液量の約１／３０量の抽出用緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５％グリセロール）に懸濁し、５０ｍｇ／Ｌとなるよう卵白リゾチームを加え、室温で３０分間振盪した後、−８０℃で凍結した。３７℃で凍結菌体を急速に融解した後、アストラソン社製超音波細胞破砕機ＸＬ２０２０およびｃａｔ  Ｎｏ．２００の破砕ホーンを用いて、最大出力にて約５分間超音波破砕した。菌体破砕液を２０，０００×ｇ、４℃、６０分間遠心し、上清を採取し、１．５Ｌの菌体粗抽出液を調製した。菌体粗抽出液をＮｉ＋親和性クロマトグラフにかけ、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素を精製した。菌体粗抽出液を抽出用緩衝液Ｂで平衡化したカラムに５ｍＬ／ｍｉｎにアプライした後、樹脂を１Ｌの抽出用緩衝液Ｂで洗浄し、最後に１Ｌの０．５Ｍイミダゾールを含む抽出用緩衝液ＢでＨｉｓタグが付与されたタンパク質をカラムから溶出した。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムおよびイミダゾールを除去する目的で、限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションを行った。当該酵素を含む１Ｌの溶出液を、限外濾過カートリッジを用いて約６００ｍＬまで濃縮し、次に液量を一定に保つように緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化マグネシウム、５％グリセロール）を添加しながら限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した。次にこの酵素液をＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラムにかけた。活性化したＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラムに酵素液を１．７ｍＬ／ｍｉｎで処理し、通過画分を集めた。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムを除去する目的で、限外濾過カートリッジを用いたダイアフィルトレーションを行った。酵素液の液量を一定に保つように緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ塩化マグネシウム、５％グリセロール）を添加しながら、限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した後、−２０℃で凍結保存した。精製の各工程で試料を採取し、当該酵素の活性測定とエンドトキシン量の測定を行った。
その結果を表２に示す。
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表２から明らかなように、５６Ｌ培養菌体（誘導後７時間培養）から約１７万ユニットの当該酵素を得ることができた。これは、誘導後３時間培養１１２Ｌ菌体から精製した当該酵素量とほぼ同じであり、培養時間を延長することで当該酵素収量を増大させることを証明した結果となった。また、１回目のダイアフィルトレーション後に多量に含まれていたエンドトキシンは、ＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラム処理によりほとんど除去され、最終産物には当該酵素１ユニット当たり、１．０ＥＵのエンドトキシンが含まれるのみであった。この数値は、誘導後３時間培養１１２Ｌ菌体から精製した当該酵素に含まれるエンドトキシン量（９．３ＥＵ／Ｕ−ＰＮＰａｓｅ）を下回っていた。
▲３▼次に、ＩＰＴＧ添加による発現誘導２４時間後の培養液２８Ｌ（７Ｌ培養×４回）から集めた培養上清より、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素の精製を行った。培養上清を、１５０ｍＬ／ｍｉｎの速度で、予め２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で平衡化した陰イオン交換カラム（ＱＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＲＬ  ５５０Ｃ、φ１４０×７０ｍｍ）にかけた。カラムを５Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄した後、イオン交換樹脂に吸着した当該酵素を５Ｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出し粗酵素液を得た。粗酵素液をＮｉ＋親和性クロマトグラフにかけ、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素を精製した。粗酵素液を抽出用緩衝液Ｂで平衡化したカラムに５ｍＬ／ｍｉｎにアプライした後、樹脂を１Ｌの抽出用緩衝液Ｂ、および１Ｌの５０ｍＭイミダゾールを含む抽出用緩衝液Ｂで洗浄し、最後に０．５Ｌの０．５Ｍイミダゾールを含む抽出用緩衝液ＢでＨｉｓタグが付与された当該酵素をカラムから溶出した。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムおよびイミダゾールを除去する目的で、限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションを行った。当該酵素を含む１Ｌの溶出液を、限外濾過カートリッジ（ＰＲＥＰ／ＳＣＡＬＥ−ＴＦＦ、分画分子量：３０，０００、ミリポア社製）を用いて約５００ｍＬまで濃縮し、次に液量を一定に保つように緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム）を添加しながら限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した。次にこの酵素液をＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラムにかけた。活性化したＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラムに酵素液を１．７ｍＬ／ｍｉｎで処理し、通過画分を集めた。次に、ｐＨの変更、塩化ナトリウムを除去する目的で、限外濾過膜（ＰＲＥＰ／ＳＣＡＬＥ−ＴＦＦ、分画分子量：３０，０００、ミリポア社製）を用いたダイアフィルトレーションを行った。酵素液の液量を一定に保つように緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５ｍＭ塩化マグネシウム、５％グリセロール）を添加しながら、限外濾過を行った。濾液が７Ｌに達するまで限外濾過を続け、当該酵素溶液の緩衝液組成を変更した後、−２０℃で凍結保存した。精製の各工程で試料を採取し、当該酵素の活性測定とエンドトキシン量の測定を行った。
その結果を表３に示す。
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表３から明らかなように、２８Ｌ培養上清（誘導後２４時間培養）から約５万ユニットの当該酵素を得ることができた。本酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシーブルー染色によるタンパク質純度検定において、他のタンパク質の存在をほとんど認めなかった。また、１回目のダイアフィルトレーション後に多量に含まれていたエンドトキシンは、ＫｕｒｉｍｏｖｅｒＩＩカラム処理によりほとんど除去され、最終産物には当該酵素１ユニット当たり、１．２ＥＵのエンドトキシンが含まれるのみであった。この数値は、誘導後３時間培養１１２Ｌ菌体から精製した当該酵素に含まれるエンドトキシン量（９．３ＥＵ／Ｕ−ＰＮＰａｓｅ）を下回っていた。このことから、培養上清からの当該酵素精製は、菌体破砕というスケールアップが困難な過程を省略することができ、かつ純度の高い当該酵素を得る方法であると言うことができる。
試験例１  当該酵素の活性測定
発現誘導後（ＩＰＴＧ添加後）、０、１、２、３、５、７、９、２４時間に試料の採取を行い、当該酵素の活性を測定した。
その結果、図３および図４に示す通り、Ｈｉｓタグが付与された当該酵素およびタグが付与されていない当該酵素ともに、誘導後７〜９時間で菌体内への蓄積が最大となり、２４時間後には減少していた。誘導後２４時間では、誘導後７〜９時間で菌体内へ蓄積した量を上回る量の当該酵素が培養上清中に放出されていた（図３、図４参照）。
▲１▼当該酵素の活性測定用の試料調製
５００ｍＬの遠心管に４００ｍＬの培養液を採取し、５，０００×ｇ、室温、５分の遠心分離（日立工機社製  ＳＣＲ−２０ＢＡ）により菌体を回収した。上澄みは培養上清として保存した。菌体を３０ｍＬの５０ｍｇ／Ｌ卵白リゾチームを含む緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１０％［ｖ／ｖ］グリセロール、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ＨＣｌ）に懸濁し、室温で１５分間放置した後、−８０℃保存した。凍結／融解を２回繰り返し、大腸菌を穏和に破砕した後、アストラソン社製超音波細胞破砕機ＸＬ２０２０およびｃａｔ  Ｎｏ．２００の破砕ホーンを用いて、最大出力にて約３０秒間超音波破砕した。菌体破砕液を１０，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心し、上清を採取し、菌体粗抽出液を調製した。
▲２▼当該酵素の活性測定
１．５ｍＬ容遠心チューブ（エッペンドルフ社製）に２０μＬの酵素液と８０μＬの当該酵素反応液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０、０．２５ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、６ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭアデノシン二リン酸三ナトリウム塩）を加えて穏やかに混合し、３７℃で１５分間保温した。０．９ｍＬの氷冷した４％過塩素酸ナトリウム水溶液を加えて反応を止めた後、氷上で１０分間放置した。４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間（トミー精工社製、ＭＲ−１５０）の遠心により、上清を分離した。次に、反応上清中に遊離した無機リン酸を定量するために、９６穴プレート（コーニング社製）に５０μＬの上清と５０μＬのＴａｓｓｋｙ−Ｓｈｏｒｒ試薬（０．５Ｍ硫酸、１０ｇ／Ｌモリブデン酸アンモニウム、５０ｇ／Ｌ硫酸第一鉄）を加えて３０秒間攪拌した後、室温で５分間放置した。６６０ｎｍの吸光度を測定し（Ｍｏｄｅｌ  ５５０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、当該酵素の活性を算出した。ここで定義する１Ｕとは、３７℃、ｐＨ９．０、１５分間の反応により１μｍｏｌｅの無機リン酸を遊離させる酵素量である。
実施例２  ポリイノシン酸の合成
１１２Ｌ培養菌体から精製した当該酵素を用いて、ポリイノシン酸（ＲＮＡホモポリマー）の合成を行った。予め、小スケールの合成反応を行い、反応収率が高く平均鎖長の長いポリマーが合成できる条件を決定した。ポリイノシン酸の合成は、総容量３５０ｍＬ、反応液組成（１００ｍＭ  ２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）−ＮａＯＨ  ｐＨ７．５、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、５０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｇ／Ｌイノシン二リン酸三ナトリウム塩（ヤマサ醤油社製）、１１．４３Ｕ／ｍＬ  Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅ）、３７℃で行った。経時的に試料を採取し、その一部を変性条件下（７Ｍ尿素存在下）でのゲル濾過ＨＰＬＣで分析し、平均鎖長と反応収率を計算した。
鎖長は、ｐＵＣ１１９（宝酒造社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮａｒＩおよびＮｓｐＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ  Ｌａｂ社製）による分解物を指標として決定した。
その結果を図５に示す。図５から明らかなように、３７℃、１１時間の反応により、反応収率約５０％で平均鎖長が約２２００塩基のポリイノシン酸が得られた。
実施例３  ポリシチジル酸の合成
同様にしてポリシチジル酸の合成を行った。総容量３５０ｍＬ、反応液組成（１００ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｐＨ９．０、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム、２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｇ／Ｌシチジン二リン酸三ナトリウム塩（ヤマサ醤油社製）、１１．４３Ｕ／ｍＬ  Ｈｉｓ−ＰＮＰａｓｅ）、３７℃で行った。経時的に試料を採取し、その一部を変性条件下でのゲル濾過ＨＰＬＣで分析し、平均鎖長と反応収率を計算した。
その結果を図６に示す。図６から明らかなように、３７℃、７時間の反応により、反応収率約６５％で平均鎖長が約２２００塩基のポリシチジル酸が得られた。
【産業上の利用可能性】  本発明ではタグを付けた当該酵素を発現させることにより精製が非常に簡便になり、また大腸菌の当該酵素生産量が２倍程度増加するという予想外の効果が得られた。また、培養法の工夫により、当該酵素が菌体内に蓄積せず培養上清中に放出されるようになり、菌体破砕による大量のエンドトキシンの混入を防ぐことができるなど、大量培養からでも迅速かつ簡便に当該酵素を精製できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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