(57)【要約】本発明は、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を採取する。得られたＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質、またはこれらの物質の組成物は抗結核薬の医薬品として有用であると期待される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式［Ｉ］
2004065413.tif 000011
で表される化合物であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質。
【請求項２】
１．  下記式［ＩＩ］
2004065413.tif 000012
で表される化合物であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質。
【請求項３】
特に下記式［Ｉ］
2004065413.tif 000013
で表されるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び特に、下記式［ＩＩ］
2004065413.tif 000014
で表されるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなるＫ０１−Ｂ０１７１物質の組成物。
【請求項４】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を採取することを特徴とするＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の製造法。
【請求項５】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を採取することを特徴とするＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の製造法。
【請求項６】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を採取することを特徴とするＫ０１−Ｂ０１７１物質の組成物の製造法。
【請求項７】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）である請求の範囲４に記載の製造法。
【請求項８】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）である請求の範囲５に記載の製造法。
【請求項９】
ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）である請求の範囲６に記載の製造法。
【請求項１０】
医薬として使用するための請求の範囲１記載の化合物。
【請求項１１】
医薬として使用するための請求の範囲２記載の化合物。
【請求項１２】
医薬として使用するための請求の範囲３記載の組成物。
【請求項１３】
抗結核薬として使用するための請求の範囲１０に記載の化合物。
【請求項１４】
抗結核薬として使用するための請求の範囲１１に記載の化合物。
【請求項１５】
抗結核薬として使用するための請求の範囲１２に記載の化合物。
【請求項１６】
抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲１３記載の化合物の使用。
【請求項１７】
抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲１４記載の化合物の使用。
【請求項１８】
抗結核薬のための医薬の製造における請求の範囲１５記載の組成物の使用。
【請求項１９】
ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−Ｂ０１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）である微生物。
【請求項２０】
上記の微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）の変異株である請求の範囲１３に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】    本発明は、抗結核菌活性を有する新規Ｋ０１−Ｂ０１７１物質およびその製造法に関し、該Ｋ０１−Ｂ０１７１物質はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなる抗結核薬として予防、治療に有用な物質に関するものである。
【背景技術】    結核菌には全人類のおよそ１／３が感染していると推定され、年間３００万人が結核症により死亡していることが報告されている。発展途上国はもちろんのこと、近年、先進国においても学校、医療機関、老人関連施設での集団感染およびエイズ患者の日和見感染症の原因菌として同定さるなど、人類を脅かす重大な問題と再認識されている。現在、抗結核薬として、イソニアジド、リファンピシン、カナマイシンやエタンブトールなどが使用されているが、耐性菌や副作用たとえばアレルギーや腎・肝障害などの問題から、異なる骨格あるいは異なる作用機構の新しい抗結核薬の開発が強く望まれている（Ａ．Ｍａｕｒｅｅｎ  Ｒｏｕｈｉ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、５月１７日号、ｐｐ．５２−６９、１９９９年）。
【発明の開示】
かかる実情において、抗結核薬としてアレルギーや腎・肝障害などの問題を解決し得る作用機構を有する物質が見出せれば、新しい医薬品として人類への福音をもたらすことが期待される。
本発明はこのような期待を満足し得る結核菌に対して有効な抗結核薬を見出した新規Ｋ０１−Ｂ０１７１物質およびその製造法を提供するものである。
本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌から新たに分離されたＫ０１−Ｂ０１７１菌株の培養物中に抗真菌活性を有する物質が産生されることを見いだした。次いで、該培養物中から抗真菌活性を示す活性物質を分離精製した結果、後記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で示される化学構造を有する物質を見いだした。このような化学構造を有する物質は従来まったく知られていないことから、各々本物質をＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質およびＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質と称することにし、その総称をＫ０１−Ｂ０１７１物質と称することにした。
本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものであって、下記式［Ｉ］
2004065413.tif 000002
で表される化合物であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を提供するものである。
本発明はまた、下記式［ＩＩ］
2004065413.tif 000003
で表される化合物であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を提供するものである。
本発明は更に、特に下記式［Ｉ］
2004065413.tif 000004
で表されるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び特に下記式［ＩＩ］
2004065413.tif 000005
で表されるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなるＫ０１−Ｂ０１７１物質の組成物を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を採取するＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を採取するＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｋ０１−Ｂ０１７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｋ０１−Ｂ０１７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス属に属し、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質を生産する能力を有する微生物が、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｋ０１−Ｂ０１７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）であるＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及び／又はＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなる組成物の製造法を提供するものである。
本発明は更に、ロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．Ｋ０１−Ｂ０１７１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）である微生物を提供するものである。
本発明は更に、抗結核薬として使用するためのＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及びＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質、またはＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質とＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質からなる組成物を提供するものである。
前記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表される本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質およびＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質またはこれら物質からなる組成物を生産する能力を有する微生物（以下「Ｋ０１−Ｂ０１７１物質生産菌」と称する）は、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）に属するが、例えば本発明者らが新たに分離したロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−Ｂ０１７１菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。
本発明のロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−Ｂ０１７１菌株の菌学的性状を示すと、以下のとおりである。
（Ｉ）形態的性質
本菌株は、シュークロース・硝酸塩寒天培地、グルコース・アスパラギン寒天培地、グリセロール・アスパラギン寒天培地、チロシン寒天培地、オートミール寒天培地、イースト・麦芽エキス寒天培地、栄養寒天培地、グルコース・硝酸塩寒天培地、グリセロール・リンゴ酸カルシウム寒天培地及びグルコース・ペプトン寒天培地上では良好に生育し、スターチ・無機塩寒天培地及びペプトン・イースト・鉄寒天培地上では中程度に生育し、気菌糸は着生しない。顕微鏡下の観察では、細胞は短桿菌から凝球菌状となり、その大きさは約１．１〜１．４×０．７〜０．８μｍである。
（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）とデー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー、１６巻、８１３頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を次表に示す。色調は標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果は下記のとおりである。
2004065413.tif 000006
2004065413.tif 000007
2004065413.tif 000008
（ＩＩＩ）生理学的諸性質
（１）メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天                                    陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天                      陰性
（ハ）トリプトン・イースト液                          陰性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃）                陰性
（２）硝酸塩の還元                                        疑陽性
（３）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）（単純ゼラチン培地）  陰性
（４）スターチの加水分解                                  陰性
（５）脱脂乳の凝固（２７℃）                              陰性
（６）脱脂乳のペプトン化（２７℃）                        陰性
（７）生育温度範囲                                        ６〜３７℃
（８）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する  ：Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラクトース、
Ｌ−ラムノース、ｍｙｏ−イノシトール、シュークロース
利用しない：Ｌ−アラビソース、ラフィノース、メリビオース、Ｄ−キ
シロース
（９）セルロースの分解                                    陰性
（ＩＶ）細胞の化学組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はメソ型で、全菌体糖にはガラクトースとアラビノースを含む。細胞壁ムラミン酸はグリコリル型である。主要メナキノンは、ＭＫ−８（Ｈ２）である。ミコール酸を含む。
（Ｖ）１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子解析
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のうち約１３００塩基（Ｎｏ．１３１〜Ｎｏ．１３５０）の配列を決定し、ＤＮＡデータベースに登録され公開されているロドコッカス属に属する菌株およびその他の放射菌のデータを用い近隣結合法（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．＆  Ｎｅｉ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４巻、４０６〜４２５、１９８７年）による系統解析の結果、本菌株はロドコッカス属に分類することが妥当である。
（ＶＩ）結論
以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はメソ型、全菌体糖にはガラクトースとアラビノースを含む。細胞壁ムラミン酸はグリコリル型で、主要メナキノンはＭＫ−８（Ｈ２）である。ミコール酸を含有する。細胞は短桿菌から擬球菌状となり、その大きさは約１．１〜１．４×０．７〜０．８μｍである。コロニーはオレンジから褐色の色調を呈し、メラニン色素は産生しないが、ペプトン・イースト・鉄寒天培地上で黄色の可溶性色素をわずかに産生する。
これらの結果および１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の解析結果から、本菌株はロドコッカス属に属する１菌種であると同定した。本菌株はロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−Ｂ０１７１として、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）［ＡＩＳＴ  Ｔｓｕｋｕｂａ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ６，１−１，Ｈｉｇａｓｈｉ  １−Ｃｈｏｍｅ  Ｔｓｕｋｕｂａ−ｓｈｉ，Ｉｂａｒａｋｉ−ｋｅｎ  ３０５−８５６６  Ｊａｐａｎ］に所在する独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に平成１５年（２００３）１月６日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７が付与された。
本発明で使用されるＫ０１−Ｂ０１７１物質生産菌としては、前述のロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｋ０１−Ｂ０１７１菌株が好ましい例として挙げられるが、菌は一般的性状として菌学上の性状は極めて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射または変異誘導体、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート等を用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工変異株は勿論、自然変異株も含め、ロドコッカス属に属し、前記の式［Ｉ］および［ＩＩ］で表されるＫ０１−Ｂ０１７１物質またはその物質の組成物を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
本発明のＫ０１−Ｂ０１７１物質を製造するにあたっては、先ずロドコッカス属に属するＫ０１−Ｂ０１７１物質生産菌を培地に培養することにより行われる。本発明のＫ０１−Ｂ０１７１物質生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。炭素源としては、グルコース、フラクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デキストリン、澱粉などの糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。
窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン・スチープ・リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニウム塩類、硝酸塩類などが単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩などの重金属塩類やビタミン類、その他Ｋ０１−Ｂ０１７１物質の生産に好適なものが添加される。
培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン油、界面活性剤などの消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記の栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい、少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。
培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生育遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。
培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込みなど既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は、滅菌したものを使用する。培養温度は、本Ｋ０１−Ｂ０１７１物質生産菌が本Ｋ０１−Ｂ０１７１物質を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は６〜３７℃、好ましくは１７℃前後で培養するのがよい。培養ｐＨは、通常は７〜８、好ましくは７前後で培養するのがよい。培養時間は、培養条件によっても異なるが、通常は４日程度である。
このようにして得られた培養物に蓄積されるＫ０１−Ｂ０１７１物質は、通常は培養菌体中に存在する。培養菌体から目的とするＫ０１−Ｂ０１７１物質を採取するには、通常の微生物の培養物から代謝産物を採取するに用いられる手段を単独あるいは任意の順序に組み合わせて、または反復して用いられる。
本Ｋ０１−Ｂ０１７１物質を分離、採取するには菌体抽出液から採取すればよい。例えば菌体よりアセトン、エタノールあるいはメタノールなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後クロロホルムや酢酸エチルなどの有機溶剤などで抽出する。抽出液を濃縮した後シリカゲルカラムクロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー等によって本Ｋ０１−Ｂ０１７１物質を単離することができる。
次に、本発明のＫ０１−Ｂ０１７１物質の理化学的性状について説明する。
１．Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質
（１）性状  ：淡黄色粉末
（２）融点  ：２４０℃（分解）
（３）分子式：Ｃ９４Ｈ１４３Ｎ２７Ｏ２５
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］
計算値２０５１．０８２６、実測値２０５１．０７６４
（４）分子量：２０５０
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］２０５１を観測
（５）紫外部吸収スペクトル：５０％メタノール水中で測定した紫外部吸収スペクトルは第１図に示すとおりであり、λｍａｘ２０３（ε＝２２５，２００）、２２０（ε＝８３，２００）、２８２（ε＝１１，９００）ｎｍに特徴的な吸収極大を示す。
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第２図に示すとおりであり、λｍａｘ１６４３ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す。
（７）比旋光度：［α］Ｄ２６−１９．６°（ｃ＝０．５、５０％メタノール水）
（８）溶剤に対する溶解性：水、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノールに可溶。アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶。
（９）塩基性、酸性、中性の区別：弱塩基性物質
（１０）プロトン核磁気共鳴スペクトル：日本国、Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータ（重水中）での測定は第３図に示すとおりであり、その水素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
０．６４（３Ｈ）、０．６６（３Ｈ）、０．６８（８Ｈ）、０．７２（３Ｈ）、０．７４（３Ｈ）、０．７９（３Ｈ）、０．８１（３Ｈ）、０．９０（３Ｈ）、０．９３（３Ｈ）、１．０５（１Ｈ）、１．１５（３Ｈ）、１．３５（１Ｈ）、１．３５（２Ｈ）、１．４０（１Ｈ）、１．４２（１Ｈ）、１．５８（１Ｈ）、１．６０（２Ｈ）、１．６５（１Ｈ）、１．６６（１Ｈ）、１．６７（２Ｈ）、１．７２（１Ｈ）、１．７５（２Ｈ）、１．７６（１Ｈ）、１．８０（２Ｈ）、１．８０（２Ｈ）、１．８４（１Ｈ）、２．００（１Ｈ）、２．０３（２Ｈ）、２．０４（１Ｈ）、２．１０（１Ｈ）、２．１８（１Ｈ）、２．３０（１Ｈ）、２．３８（２Ｈ）、２．６０（１Ｈ）、２．７０（１Ｈ）、２．８３（１Ｈ）、２．８６（１Ｈ）、２．９８（２Ｈ）、３．１４（１Ｈ）、３．１６（１Ｈ）、３．１７（２Ｈ）、３．３０（１Ｈ）、３．３５（１Ｈ）、３．６２（１Ｈ）、３．６２（１Ｈ）、３．７０（１Ｈ）、３．７３（１Ｈ）、３．７４（１Ｈ）、３．７８（１Ｈ）、３．８０（１Ｈ）、３．８４（１Ｈ）、３．９２（１Ｈ）、３．９４（１Ｈ）、４．１０（１Ｈ）、４．１５（１Ｈ）、４．２８（１Ｈ）、４．３８（１Ｈ）、４．４３（１Ｈ）、４．４５（１Ｈ）、４．４７（１Ｈ）、４．５３（１Ｈ）、４．６９（１Ｈ）、４．７０（１Ｈ）、４．７３（１Ｈ）、４．８９（１Ｈ）、４．９４（１Ｈ）、４．９７（１Ｈ）、５．１５（１Ｈ）、５．２９（１Ｈ）、６．７０（１Ｈ）、６．７２（２Ｈ）、７．００（２Ｈ）、７．１２（１Ｈ）、７．２２（１Ｈ）、７．２７（１Ｈ）、７．４８（１Ｈ）、７．６７（１Ｈ）、８．６０（１Ｈ）。但し、（  ）内は水素原子数を示す。
（１１）カーボン核磁気共鳴スペクトル：日本国、Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータ（重水中）での測定は第４図に示すとおりであり、その炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
１３．２０、１７．００、２０．１０、２０．６０、２０．８０、２１．００、２１．３０、２１．７０、２３．７０、２４．６０、２４．７０、２７．１０、２７．４０、２７．６０、２７．８０、２７．８０、２８．６０、２９．３０、２９．７０、３０．６０、３１．８０、３２．１０、３２．６０、３２．９０、３４．００、３４．３０、３４．４０、３４．８０、３８．３０、３８．８０、４０．１０、４２．１０、４３．４０、４４．９０、４５．３０、４７．１０、５０．６０、５３．４０、５３．７０、５３．８０、５４．８０、５５．００、５６．２０、５７．２０、５７．４０、５８．３０、５８．６０、６１．２０、６１．３０、６１．９０、６２．００、６２．４０、６３．７０、６５．９０、６８．８０、１１１．２０、１１４．９０、１１８．４０、１１９．３０、１２１．３０、１２２．３０、１２５．００、１２７．７０、１２９．６０、１３１．４０、１３２．００、１３３．６０、１３６．５０、１３９．３０、１５７．６０、１５９．７０、１７２．１０、１７４．２０、１７４．３０、１７４．７６、１７４．７７、１７４．８０、１７４．８５、１７４．９０、１７５．１０、１７５．２０、１７５．３２、１７５．３３、１７５．８０、１７５．９３、１７６．５４、１７６．７５、１７６．９０、１７７．００、１７７．７０、１７８．８０、１８０．５０。
以上のように、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質は下記の式［Ｉ］で表される化学構造であることが決定された。
2004065413.tif 000009
２．Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質
（１）性状  ：淡黄色粉末
（２）融点  ：２４０℃（分解）
（３）分子式：Ｃ１０１Ｈ１５３Ｎ２９Ｏ２７
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）［Ｍ＋Ｈ］
計算値２２０５．１５６８、実測値２２０５．１５０４
（４）分子量：２２０４
ＦＡＢ−ＭＳ（ｍ／ｚ）で［Ｍ＋Ｈ］２２０５を観測
（５）紫外部吸収スペクトル：５０％メタノール水中で測定した紫外部吸収スペクトルは第５図に示すとおりであり、λｍａｘ２０３（ε＝１８２，７００）、２２０（ε＝６６，８００）、２８４（ε＝９，８００）ｎｍに特徴的な吸収極大を示す。
（６）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは第６図に示すとおりであり、λｍａｘ１６５０ｃｍ−１に特徴的な吸収極大を示す。
（７）比旋光度：［α］Ｄ２６−２９．６°（ｃ＝０．５、５０％メタノール）
（８）溶剤に対する溶解性：水、ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノールに可溶。アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、アセトンに不溶。
（９）塩基性、酸性、中性の区別：弱塩基性物質。
（１０）プロトン核磁気共鳴スペクトル：日本国、Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製４００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトルメータ［重水−重メタノール（３：２）中］での測定は第７図に示すとおりであり、その水素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
０．５９（３Ｈ）、０．６２（３Ｈ）、０．７０（３Ｈ）、０．７５（３Ｈ）、０．７６（３Ｈ）、０．８０（３Ｈ）、０．８２（３Ｈ）、０．９０（３Ｈ）、０．９４（３Ｈ）、１．０１（１Ｈ）、１．１５（３Ｈ）、１．３２（１Ｈ）、１．３３（２Ｈ）、１．４０（１Ｈ）、１．４３（１Ｈ）、１．５８（１Ｈ）、１．６０（２Ｈ）、１．６５（１Ｈ）、１．６６（１Ｈ）、１．６７（２Ｈ）、１．７４（１Ｈ）、１．７５（２Ｈ）、１．７６（１Ｈ）、１．８０（２Ｈ）、１．８０（２Ｈ）、１．８４（１Ｈ）、１．９９（１Ｈ）、２．０１（１Ｈ）、２．０２（２Ｈ）、２．０３（２Ｈ）、２．０４（１Ｈ）、２．１０（１Ｈ）、２．１８（１Ｈ）、２．３１（１Ｈ）、２．３２（１Ｈ）、２．３８（２Ｈ）、２．４８（１Ｈ）、２．４９（１Ｈ）、２．８４（１Ｈ）、２．８７（１Ｈ）、２．９９（２Ｈ）、３．０４（１Ｈ）、３．０８（１Ｈ）、３．１３（２Ｈ）、３．３１（１Ｈ）、３．３５（１Ｈ）、３．４８（１Ｈ）、３．５１（１Ｈ）、３．５４（１Ｈ）、３．６１（１Ｈ）、３．６８（１Ｈ）、３．７２（１Ｈ）、３．７６（１Ｈ）、３．７７（１Ｈ）、３．７８（１Ｈ）、３．７９（１Ｈ）、３．８１（１Ｈ）、３．９１（１Ｈ）、３．９４（１Ｈ）、３．９９（１Ｈ）、４．０７（１Ｈ）、４．１４（１Ｈ）、４．２１（１Ｈ）、４．２５（１Ｈ）、４．４３（１Ｈ）、４．４４（１Ｈ）、４．４９（１Ｈ）、４．５９（１Ｈ）、４．６４（１Ｈ）、４．６７（１Ｈ）、４．９２（１Ｈ）、４．９９（１Ｈ）、５．１４（１Ｈ）、５．２２（１Ｈ）、５．２５（１Ｈ）、５．３２（１Ｈ）、６．３５（１Ｈ）、６．７０（２Ｈ）、６．９９（２Ｈ）、７．０８（１Ｈ）、７．１８（１Ｈ）、７．４３（１Ｈ）、７．５５（１Ｈ）、７．６２（１Ｈ）、８．４２（１Ｈ）。但し、（  ）内は水素原子数を示す。
（１１）カーボン核磁気共鳴スペクトル：日本国、Ｖａｒｉａｎ  Ｊａｐａｎ社製１００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトロメータ［軽水−重メタノール（３：２）中］での測定は第８図に示すとおりであり、その炭素の化学シフト（ｐｐｍ）は下記に示すとおりである。
１１．１３、１４．９７、１７．８９、１８．７２、１８．８５、１９．０８、１９．３２、１９．７５、２１．６５、２２．４３、２２．４９、２２．９５、２３．１０、２５．０５、２５．１３、２５．２８、２５．７３、２６．０１、２６．６７、２６．９３、２７．４６、２８．３６、３０．２９、３０．３５、３１．０５、３１．１４、３１．８９、３２．２７、３２．４４、３２．９１、３６．０７、３６．６６、３８．０８、４０．３０、４１．０８、４２．５７、４３．３０、４３．４５、４５．２９、４７．４４、４８．０５、４９．５４、５１．４０、５１．５０、５１．７４、５２．７８、５４．２３、５５．１６、５５．９３、５６．３４、５８．９５、５９．４３、５９．９９、６０．２１、６１．３５、６１．７９、６２．８１、６３．９７、６７．２０、６８．３９、１０９．２１、１１２．６８、１１６．３５、１１８．８０、１１９．０５、１２０．１２、１２２．７２、１２５．３７、１２７．５７、１２９．０８、１３１．６０、１３４．７８、１３６．１５、１３７．３１、１５５．７０、１５７．７２、１６８．６１、１６９．５７、１７１．０７、１７１．８３、１７２．１５、１７２．３２、１７２．４０、１７２．５７、１７２．８３、１７２．９４、１７２．９９、１７３．１３、１７３．６７、１７３．８９、１７４．０２、１７４．３９、１７４．７１、１７４．７５、１７４．８０、１７５．０６、１７８．５６、１７９．５２、１８０．１５。
以上のように、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の各種理化学性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質は下記の式［ＩＩ］で表される化学構造であることが決定された。
2004065413.tif 000010
次に、本発明のＫ０１−Ｂ０１７１物質の生物学的性状について述べる。
Ｋ０１−Ｂ０１７１物質の抗結核菌活性は以下２種類の方法で測定した。
（１）ペーパーディスク法による抗結核菌活性の測定
結核菌としてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（北里大学北里生命研究所の保管株）を用い、ワックスマン寒天培地（Ｐｅｐｔｏｎｅ  ０．５％、Ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、Ｇｌｕｃｏｓｅ  １．０％、Ａｇａｒ  ０．８％）に０．３％で植菌した。活性はペーパーディスク法（厚手６ｍｍ、ＡＤＶＡＮＴＥＣＨ社製、日本国）により評価し、２７℃、２４時間培養後に阻止円を測定した。
その結果、本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質は１０μｇ／ディスクで１９ｍｍの阻止円を示した。また本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質は１０μｇ／ディスクで１８ｍｍの阻止円をそれぞれ示した。
（２）液体培養法による抗結核菌活性
ＭＩＣ測定は、微量液体希釈法の改変により行った。Ｗａｋｓｍａｎ  ｂｒｏｔｈ（Ｐｐｔｏｎｅ  ０．５％、Ｍｅａｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ２．０％）１０ｍＬを入れた大試験管にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（北里大学北里生命研究所の保管株）を一白金耳植菌し、ガラスビーズ（ｄ＝５ｍｍ）を５つ入れて２７℃、４８時間震盪培養し、種培養液を得た。
この種培養液をＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｎｏ．０．５（ＯＤ６３０ｎｍにおける、１％ＢａＣｌ２溶液０．０５ｍＬ、１％Ｈ２ＳＯ４溶液９．９５ｍＬの混合液と同等の透過度）に調製し、１０倍希釈した（１０倍希釈培養菌液：１０７ＣＦＵ／ｍＬ）。Ｗａｋｓｍａｎ  ｂｒｏｔｈ  ９０μＬ／ｗｅｌｌを分注した９６穴マイクロプレートにあらかじめ調製しておいた薬剤希釈系列（３．９、７．８、１５．６、３１．３、６２．５、１２５、２５０、５００μｇ／ｍＬ）の各々を５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、更に１０倍希釈培養菌液を５μＬ／ｗｅｌｌずつ加えて混合し（最終接種菌量：５×１０４ＣＦＵ／ｗｅｌｌ）、３７℃、９６時間培養後、菌の生育の見られない濃度をもってＭＩＣとした。
その結果、本発明Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質はＭＩＣ３．１３μｇ／ｍＬ、また本発明Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質はＭＩＣ６．２５μｇ／ｍＬをそれぞれ示した。。
（３）細胞毒性試験
ＲＰＭＩ培地で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を１０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、アスピレーターで上清を除き、新たにＲＰＭＩ培地を加えて細胞数が５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように調製して細胞懸濁液とした。サンプルを添加した９６穴マイクロプレート中に細胞懸濁液２００μＬ加え、３７℃で２０時間培養した。培養後、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、アスピレーターで上清を除きＫｒｉｓｈａｎ’ｓ  ｒｅａｇｅｎｔ［５００ｍｇ  Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ（和光純薬社製、日本国）、１．５ｍＬ  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（シグマ社製、米国）、１０ｍｇ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ（シグマ社製、米国）、２５ｍｇ  Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（シグマ社製、米国）を５００ｍｌの滅菌水に溶解］を各ｗｅｌｌに２００μｌ加えた後アルミホイルで遮光し、振盪機で軽く振盪しながら室温で２時間放置してＤＮＡを染色した。染色後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、米国）を用いて測定を行った。
その結果、終濃度５０μＬ／ｍＬで細胞毒性を示さなかった。
以上に詳しく述べたように、本発明のＫ０１−Ｂ０１７１物質は、新しい骨格を有し、結核菌に対し有効な新しい抗結核薬として有用であると期待される。
【図面の簡単な説明】    第１図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の紫外部吸収スペクトル（５０％メタノール水中）を示したものである。
第２図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤法）を示したものである。
第３図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
第４図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（重水中）を示したものである。
第５図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の紫外部吸収スペクトル（５０％メタノール水中）を示したものである。
第６図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質の赤外部吸収スペクトル（臭化カリウム錠剤法）を示したものである。
第７図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル［重水−重メタノール（３：２）中］を示したものである。
第８図は本発明のＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル［軽水−重メタノール（３：１）中］を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】    次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものでない。
寒天斜面培地（Ｓｅｉｎｏ培地）で培養したロドコッカス  エスピー  Ｋ０１−Ｂ０１７１菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２６７）を、種培地［４９培地；Ｍａｎｎｉｔｏｌ  ３．０％、Ｇｌｕｃｏｓｅ  １．０％、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％、コハク酸アンモニウム０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、微量金属溶液（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＭｇＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０００１％）１ｍＬ／Ｌ］１００ｍＬを分注した５００ｍＬ容三角フラスコに一白金耳ずつ接種し、２７℃で３日間ロータリーシェイカー（２１０ｒｐｍ）で培養した。その後、生産培地［４９培地；Ｍｎｎｉｔｏｌ  ３．０％、Ｇｌｕｃｏｓｅ  １．０％、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１％、コハク酸アンモニウム  ０．５％、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．１％、微量金属溶液（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＭｇＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０００１％、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０００１％）１ｍＬ／Ｌ］２０Ｌを入れた３０Ｌ容ジャーファーメンターに植菌し、３７℃で４日間培養した。
経時的に培養液５０ｍＬを取り、ｐＨ：菌体量（１００００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離し、沈澱量を培養液１０ｍＬ分に換算してｍＬで表示）、抗Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ活性［上清１ｍＬをＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ（１ｍｇ、ウォーターズ社製、米国）にかけ、水１ｍＬ、２０％アセトニトリル３００μＬで洗浄後、４０％アセトニトリル３００μＬで溶出し、５０μＬ／８ｍｍ  ｄｉｓｋ）を測定した。
前記４日間培養した培養液（１６Ｌ）をシャープレス遠心機（国産精工社製、日本国）で遠心して上清と菌体に分け、上清をＤｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０カラム（φ７５×２２０ｍｍ、三菱化成社製、日本国）にかけ、水および２０％アセトン各３Ｌで洗浄後、活性成分を８０％アセトン３Ｌで溶出し、減圧下濃縮して凍結乾燥した。得られた粗物質５ｇのうち、２ｇを少量のメタノールに溶解してＯＤＳカラム（φ３５×２７０ｍｍ、センシュー科学社製、日本国）にかけ、水および２０％アセトニトリル各６００ｍＬで洗浄後、活性成分を４０％アセトニトリル６００ｍＬで溶出し、減圧下濃縮乾固して粗物質１５４ｍｇを得た。残りの３ｇについても活性成分を同様に溶出して減圧下濃縮乾固し、粗物質１９４ｍｇを得た。
得られた粗物質全３４８ｍｇを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填したセファデックス  ＬＨ−２０カラム（φ２．５×１１０ｃｍ、ファルマシア社製、スウェーデン国）にかけ、１ｍＬ／ｍｉｎ．の流速で１ｍＬずつ計１２０フラクションをメタノールで溶出し、活性成分を含むフラクションを濃縮乾固した。最終的な精製を分取ＨＰＬＣ（カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ、φ２０×２５０ｍｍ、資生堂、日本国）により行った。１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）−２２％アセトニトリルのアイソクラティックを移動相とし、８ｍＬ／ｍｉｎ．の流速において、ＵＶ２１０ｎｍの吸収をモニターした。４４分、５６分に活性を示すピークを観察し、このピークを分取して分取液を濃縮した。
１００倍濃縮液２ｍＬをＯＡＳＩＳ  ＨＬＢ（３ｍｇ、ウォーターズ社製、米国）に載せ、水３ｍＬで洗浄して、脱塩を行った後、活性成分を８０％アセトニトリル２ｍＬで溶出した。これを繰り返すことにより得られた溶出液を減圧下濃縮乾固し、凍結乾燥を行うことにより薄黄色粉末状の本発明Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質成分を収量３８．３ｍｇ、総収率１１．５％で、また本発明Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質成分を収量１１．２ｍｇ、総収率１１．５％でそれぞれ単離した。
産業上の利用分野
以上に説明したように、Ｋ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及びＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質又はこれら物質の組成物を生産する能力を有するロドコッカス属に属するＫ０１−Ｂ０１７１株を代表とする微生物を培地に培養して、その培養液中にＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質及びＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質又はこれら物質の組成物を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質およびＫ０１−Ｂ０１７１−Ｃ物質またはこれら物質の組成物を蓄積せしめ、該培養物からＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質およびＫ０１−Ｂ０１７１−Ｂ物質またはこれら物質の組成物を採取する。得られた物質または組成物は、抗結核菌活性を有することから結核の予防、治療に有効な医薬品として期待される。
【図１】
2004065413.tif 000015
【図２】
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【図３】
2004065413.tif 000017
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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