(57)【要約】下記の酵素（Ａ）と（Ｂ）：（Ａ）ニッキング活性を有する酵素；（Ｂ）５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が認められないＤＮＡポリメラーゼＩ等；を用いた、下記の増幅工程を、液相中で反復して行うことにより、ＤＮＡを増幅する、ＤＮＡ増幅法である。増幅工程：増幅の対象となる二本鎖ＤＮＡに対して作用させて、（１）当該二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡと、（２）置き換えられた一本鎖ＤＮＡ同士により形成される二本鎖ＤＮＡ、を新たに形成させ、これらの二本鎖ＤＮＡを、新たな増幅対象ＤＮＡとして、前記の酵素（Ａ）と（Ｂ）によるＤＮＡ増幅反応を、連続して行う工程。この方法により、簡便に、かつ、効率的に、遺伝子ＤＮＡを増幅することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類の酵素（Ａ）と（Ｂ）：
（Ａ）二本鎖ＤＮＡに、ニックを入れることのできる活性を有する酵素；
（Ｂ）ニックが入った二本鎖ＤＮＡに対して、ニックが入っていない、いずれか一方のＤＮＡ鎖を鋳型として、ニックの位置から、ニックの入った側のＤＮＡ鎖に置き換えて、この鋳型ＤＮＡ鎖に対して相補的な塩基配列の新たなＤＮＡ鎖を形成して、この鋳型ＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡを形成する活性を有し、かつ、前記の新たなＤＮＡ鎖に置き換えられて一本鎖ＤＮＡとして存在する、ニックの入った側のＤＮＡ鎖の分解は行わない酵素；
を用いた、下記の増幅工程を、液相中で反復して行うことにより、ＤＮＡを増幅する、ＤＮＡ増幅法。
増幅工程：増幅の対象となる二本鎖ＤＮＡに対して作用させて、（１）当該二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡと、（２）置き換えられた一本鎖ＤＮＡ同士により形成される二本鎖ＤＮＡ、を新たに形成させ、これらの二本鎖ＤＮＡを、新たな増幅対象ＤＮＡとして、前記の酵素（Ａ）と（Ｂ）によるＤＮＡ増幅反応を、連続して行う工程。
【請求項２】
酵素（Ａ）が、エンドヌクレアーゼＶであり、かつ、マグネシウムイオンの存在下で、この酵素による反応を行う、請求項１記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項３】
マグネシウムイオン濃度が、１〜１０ｍＭである、請求項１または２記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項４】
酵素（Ｂ）が、ＤＮＡ鎖置換活性、および、鋳型ＤＮＡ鎖交換活性を有し、かつ、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が認められない、ＤＮＡポリメラーゼＩである、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項５】
酵素（Ａ）および／または（Ｂ）が、好熱菌または耐熱菌由来の酵素である、請求項１〜４のいずれかにＤＮＡ増幅法。
【請求項６】
酵素（Ａ）が、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、または、Ａｅｒｏｐｙｒｕｓ  ｐｅｒｎｉｘ由来のエンドヌクレアーゼＶである、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項７】
酵素（Ａ）が、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、または、ＢｓｔＳＥＩである、請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項８】
酵素（Ｂ）が、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、または、ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ増幅法。
【請求項９】
下記の酵素（Ａ）と（Ｂ）：
（Ａ）二本鎖ＤＮＡに、ニックを入れることのできる活性を有する酵素
（Ｂ）ニックが入った二本鎖ＤＮＡに対して、ニックが入っていない、いずれか一方のＤＮＡ鎖を鋳型として、ニックの位置から、ニックの入った側のＤＮＡ鎖に置き換えて、この鋳型ＤＮＡ鎖に対して相補的な塩基配列の新たなＤＮＡ鎖を形成して、この鋳型ＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡを形成する活性を有し、かつ、前記の新たなＤＮＡ鎖に置き換えられて一本鎖ＤＮＡとして存在する、ニックの入った側のＤＮＡ鎖の分解は行わない酵素
を、構成要素として含む、請求項１〜８のいずれかのＤＮＡ増幅法を行うための、ＤＮＡ増幅用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子、特に、ＤＮＡの増幅方法に関する発明である。
【背景技術】  遺伝子の解析には、質的に良好な状態のＤＮＡが必要であることは勿論であるが、それと同時に、解析に十分な量のＤＮＡを確保することも、大変重要である。例えば、（１）少量の細胞より、遺伝子ＤＮＡを増幅し、複数の遺伝子領域の変異等を解析する場合や、（２）培養が困難で、サンプル中に少量しか存在しない細菌の、多数のＤＮＡの解析を行う場合や、（３）少量の未知の塩基配列からなるＤＮＡの解析を行う場合等においては、サンプルとなるＤＮＡの全遺伝子領域を、均等に増幅する技術が必要となることが多い。
この技術は、全遺伝子増幅（ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＷＧＡ）と呼ばれ、現在までに、いくつかの手法が提供されている。
例えば、ＰＥＰ（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．８４７−５８５１，１９９２）、ＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）法（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ａｎｄ  Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．１４６７６−１４６７９，１９９６）、ＭＤＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｄｅａｎ，Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ５２６１−５２６６，２００２）等が知られている。
上記の従来技術のうち、
（１）ＰＥＰ法は、ＰＣＲ法を応用した方法であり、ランダムな塩基配列の１５塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドの混合物をプライマーとして用いるＤＮＡ増幅法である。すなわち、ＰＥＰ法は、このプライマーを、例えば、適切な条件下で増幅対象とするヒト遺伝子ＤＮＡ等と共存させ、塩基配列が一致する遺伝子ＤＮＡの塩基配列位置にプライマーをアニールさせた後、３０〜４０℃程度の温度で、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーからＤＮＡ伸長反応（ＤＮＡ合成反応）を行い、まず、遺伝子ＤＮＡ全体を増幅させ、さらに、この増幅反応により得られた増幅産物を対象として、配列特異的プライマーを用いた通常のＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子ＤＮＡを増幅する方法である。
（２）ＰＯＰ−ＰＣＲ法は、オリゴヌクレオチドの５’側と３’側に、特定の塩基配列を有し、中央に、６塩基程度の長さのランダムな塩基配列のプライマーを用いて行う、ＤＮＡ増幅法である。すなわち、ＰＯＰ−ＰＣＲ法では、ＰＣＲ法により、対象のＤＮＡの増幅を行うが、はじめのＰＣＲサイクルは、低温で、長時間のＤＮＡ伸長反応を行い、ＰＣＲサイクルを重ねるに従い、ＤＮＡ伸長反応の温度を上げ、しかも、伸長反応時間を短くして、ＤＮＡ伸長反応を行う方法である。
上述した、（１）ＰＥＰ法も、（２）ＰＯＰ−ＰＣＲ法も、非特異的なＤＮＡの増幅が起こること、遺伝子ＤＮＡが均一に増幅されないこと、また、増幅されたＤＮＡのほとんどが１Ｋｂ以下であり、以降の遺伝子解析に適さないことがあるといわれている。
（３）ＭＤＡ法は、ランダムな６塩基配列程度のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＤＮＡ増幅法である。すなわち、ＭＤＡ法は、枯草菌のバクテリオファージである、優れたＤＮＡ鎖置換活性（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有することが知られているφ２９ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼを、熱変性させた増幅対象のＤＮＡと上記のランダムプライマーとを、３０℃程度でアニールさせた複合体に作用させ、ＤＮＡ鎖の伸長反応を同温度において行い（φ２９ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼの至適温度である）、ＤＮＡの増幅を行う方法である。
このＭＤＡ法においては、増幅温度を比較的低く設定する必要があり、所望のＤＮＡ増幅を行うために、１８時間程度の長時間を要するという問題が認められる。
そこで、本発明が解決すべき課題は、これらの従来技術の問題点を鑑み、さらに、簡便に、かつ、効率的に、遺伝子ＤＮＡを増幅する手段を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者は、この課題の解決に向けて、鋭意検討を重ねた。その結果、エンドヌクレアーゼのうち、二本鎖ＤＮＡに、ニックを入れることのできる活性が認められ得るものを利用することにより、所望する遺伝子ＤＮＡの増幅を行うことができることに想到した。すなわち、本発明者は、二本鎖ＤＮＡに、ニックを入れることのできる活性を有する酵素と、ＤＮＡの修復にかかわるＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて用いることにより、非常に、簡便、かつ、効率的な、全遺伝子増幅手段を提供することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、２種類の酵素（Ａ）と（Ｂ）：
（Ａ）二本鎖ＤＮＡに、ニックを入れることのできる活性（以下、この活性を、ニッキング活性ともいう）を有する酵素；
（Ｂ）ニックが入った二本鎖ＤＮＡに対して、ニックが入っていない、いずれか一方のＤＮＡ鎖を鋳型として、ニックの位置から、ニックの入った側のＤＮＡ鎖に置き換えて、この鋳型ＤＮＡ鎖に対して相補的な塩基配列の新たなＤＮＡ鎖を形成して、この鋳型ＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡを形成する活性を有し、かつ、前記の新たなＤＮＡ鎖に置き換えられて一本鎖ＤＮＡとして存在する、ニックの入った側のＤＮＡ鎖の分解は行わない酵素；
を用いた、下記の増幅工程を、液相中で反復して行うことにより、ＤＮＡを増幅する、ＤＮＡ増幅法（以下、本ＤＮＡ増幅法ともいう）を提供する発明である。
増幅工程：増幅の対象となる二本鎖ＤＮＡに対して作用させて、（１）当該二本鎖ＤＮＡのいずれか一方のＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡと、（２）置き換えられた一本鎖ＤＮＡ同士により形成される二本鎖ＤＮＡ、を新たに形成させ、これらの二本鎖ＤＮＡを、新たな増幅対象ＤＮＡとして、前記の酵素（Ａ）と（Ｂ）によるＤＮＡ増幅反応を、連続して行う工程。
【図面の簡単な説明】  第１図は、本ＤＮＡ増幅法による、ＤＮＡ増幅過程を示した概略図である。
第２図は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶの部分精製物についての電気泳動像を示す写真である。
第３図は、得られたエンドヌクレアーゼＶのランダムニッキング活性について検討した結果を示す、アガロースゲル電気泳動像を示す写真である。
第４図は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子ＤＮＡの、本ＤＮＡ増幅法による増幅反応物を示す、アガロースゲル電気泳動像を示す写真である。
第５図は、ＨｅＬａ細胞の遺伝子ＤＮＡの、本ＤＮＡ増幅法による増幅反応産物の量の経時的な変化を示した図面である。
第６図は、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた、本ＤＮＡ増幅法による増幅反応産物を示す、アガロースゲル電気泳動像を示す写真である。
第７図は、特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを用いた、本ＤＮＡ増幅法による増幅反応産物を示す、アガロースゲル電気泳動像を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の態様を説明する。
本ＤＮＡ増幅法は、ニッキング活性を有する酵素（Ａ）と、上記のポリメラーゼ活性を有する酵素（Ｂ）を用いるＤＮＡ増幅法である。
１．酵素（Ａ）について
上述のように、酵素（Ａ）は、ニッキング活性を有する酵素であるが、このニッキング活性には、二本鎖ＤＮＡの任意の位置にニックを入れることができる活性と、二本鎖ＤＮＡの特定の位置にニックを入れることのできる活性の、双方が含まれる。
（１）  酵素（Ａ）としては、まず、二本鎖ＤＮＡの任意の位置に、ニックを入れることができる活性（以下、この活性をランダムニッキング活性ともいう）を有する、エンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｖを挙げることができる。
エンドヌクレアーゼＶは、生体内において、ＤＮＡの修復に関わっている酵素であると考えられている。
通常、エンドヌクレアーゼＶは、ＤＮＡ上のデオキシアデニン（ｄＡ）の、脱アミノ化によって生じる、デオキシイノシン（ｄＩ）を認識し、その一本鎖ＤＮＡにおけるその１塩基後ろに、切断（ニック：ｎｉｃｋ）を入れ、３’ＯＨ末端と５’Ｐ末端を生じさせることが、Ｋｏｗ，Ｙ．Ｗグループの、大腸菌を用いた研究により、明らかにされている（Ｙａｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，１６２６０−１６２６８）。さらに、後の研究により、エンドヌクレアーゼＶには、デオキシウリジン（ｄＵ）や、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ部位、さらには、フラップ（ｆｌａｐ）についても、これを認識してニックを入れる活性が認められることが突き止められた。
耐熱菌や好熱菌（以下、耐熱菌等ともいう）においても、エンドヌクレアーゼＶが存在することが突き止められている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａについて：Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０，８７３８−８７４８）。この耐熱菌等に由来するエンドヌクレアーゼＶは、大腸菌由来のエンドヌクレアーゼＶと同様に、マグネシウムイオンの存在下で、ｄＩ、ｄＵ、ミスマッチ部位等において、ニックを入れる活性が認められ、さらに、前述したランダムニッキング活性を有し、かつ、一本鎖ＤＮＡに対しては、ＤＮＡヌクレアーゼ活性が、殆ど認められないことが明らかにされている（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０，７３８−８７４８）。
本ＤＮＡ増幅法に用いられ得る、エンドヌクレアーゼＶの由来は、特に限定されず、大腸菌、枯草菌、酵母等、各種の生物由来のものを用いることができるが、耐熱菌等由来のエンドヌクレアーゼＶを用い、高温（５０〜６５℃程度）で、本ＤＮＡ増幅法を行うことは、エンドヌクレアーゼＶの酵素活性の半減期が長く、好適である。
このような耐熱菌等由来のエンドヌクレアーゼＶの供給源となる耐熱菌等は、特に限定されないが、例えば、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．４６１，ｐｐ１６９−１７７，２０００）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｐｈｉｌｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＬ４４５０６４）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＪ２４８２８７）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＣ  ００２７５４）、Ａｅｒｏｐｙｒｕｓ  ｐｅｒｎｉｘ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＰ００００５９）、等を挙げることができる。
各種の生物からの、エンドヌクレアーゼＶの分離・精製方法は、特に限定されず、既存の分離・精製方法に準じて行うことができる。
例えば、既に、エンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列が特定されている場合には、そのＤＮＡを増幅するためのＰＣＲプライマーを用いて、対象生物のＤＮＡにおいて、ＰＣＲ法等のＤＮＡの増幅方法を行い、そのＤＮＡ増幅産物を適当な発現ベクターに組み込んだ後、宿主細胞（大腸菌株等）に導入し、この形質転換株において、エンドヌクレアーゼＶ遺伝子を発現させて産生させることにより、エンドヌクレアーゼＶの分離を行うことができる。そして、この粗酵素に対して、通常公知の方法、すなわち、例えば、タンパク質沈澱剤による処理、限外濾過、ゲル濾過、高速液体クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、特異抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィー、透析法等の、常法による精製を行うことにより、本ＤＮＡ増幅法に用いるのに好適な程度に精製されたエンドヌクレアーゼＶを得ることができる。
また、エンドヌクレアーゼＶの供給源とすべき生物の、エンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列が特定されていない場合には、例えば、エンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列が特定されている、好適には複数の近縁生物種由来のエンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列の比較を行い、エンドヌクレアーゼＶ遺伝子ＤＮＡの特徴的な塩基配列（好適には、種に特異的であり、かつ、種の相違にかかわらず保存されている塩基配列）を選んで、これを基にしたＤＮＡ増幅用プライマーを調製する。そして、このＤＮＡ増幅用プライマーを用いた、対象生物のＤＮＡを鋳型とした、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅方法により得られるＤＮＡ増幅産物をプローブとして用い、常法により調製した対象生物のＤＮＡライブラリーから、対象となるエンドヌクレアーゼＶをクローニングすることができる。また、クローニングした対象生物のエンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列は、常法を用いて決定することができる。
この決定された遺伝子ＤＮＡの塩基配列を基にして、上記の既知の遺伝子ＤＮＡを用いたエンドヌクレアーゼＶの製造方法に従い、未だ、エンドヌクレアーゼＶの遺伝子ＤＮＡの塩基配列が特定されていない生物の、エンドヌクレアーゼＶを得ることができる。
（２）  本ＤＮＡ増幅法においては、酵素（Ａ）として、上述したランダムニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼＶのようなエンドヌクレアーゼのみならず、二本鎖ＤＮＡの特定の位置にニックを入れることができる活性（以下、この活性を、特定ニッキング活性ともいう）を有するエンドヌクレアーゼを用いることもできる。
本ＤＮＡ増幅法において用いることのできる特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼは、特に限定されない。
すなわち、例えば、認識する塩基配列とＤＮＡ切断を行う部位が離れているタイプのエンドヌクレアーゼである、ＩＩｓ型制限酵素のうち、特定ニッキング活性を有するものを、本発明において用いることができる。この種の特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼの中でも、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅａｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られるエンドヌクレアーゼ（Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ）を、好適なエンドヌクレアーゼとして挙げることができる。
このＮ．ＢｓｔＮＢＩは、二本鎖ＤＮＡの塩基配列ＧＡＧＴＣを認識し、その４塩基下流にニックを入れる活性を有するエンドヌクレアーゼである（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３８１，ｐｐ．１１２３−１１２５，２０００）。
また、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩと同一の塩基配列を認識して、ニックを入れる活性を有するエンドヌクレアーゼである、ＢｓｔＳＥＩ（Ａｂｄｕｒａｓｈｉｔｏｖ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ１２６１−１２６７，１９９６）も、本ＤＮＡ増幅法に用いる特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼとして好適なものの一つである。
特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼの、細菌等からの分離、精製方法は、特に限定されず、二本鎖ＤＮＡに対するニッキング活性を指標として、通常、用いられている方法（上記のランダムニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼの分離、精製に準ずる）を行うことができる。
本ＤＮＡ増幅法では、酵素（Ａ）が、ニッキング活性を発揮することが要件であるから、本ＤＮＡ増幅法は、これを満足する条件において行うことが必要である。この条件としては、例えば、酵素（Ａ）を用いる際の、マグネシウムイオンの存在を挙げることができる。
このマグネシウムイオンのイオン濃度は、通常、好適には、１〜１０ｍＭである。また、マグネシウムイオンの基となる物質は、特に限定されず、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。
２．酵素（Ｂ）について
酵素（Ｂ）としては、代表的には、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性が認められないＤＮＡポリメラーゼＩが挙げられる。
このようなＤＮＡポリメラーゼＩは、鋳型ＤＮＡに基づくＤＮＡポリメラーゼ活性と、３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を有している。
さらに、本ＤＮＡ増幅法に用いられる酵素（Ｂ）には、ＤＮＡ鎖置換活性（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が備わっていることが好適である。このＤＮＡ鎖置換活性とは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の進行上に、鋳型ＤＮＡ鎖に結合したＤＮＡ鎖が存在すると、この既存のＤＮＡ鎖を、新たに合成されたＤＮＡ鎖に置き換える活性である（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，２５１，２１６８−２１７４）。
さらにまた、酵素（Ｂ）には、鋳型ＤＮＡ交換活性（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）が備わっていることが好適である。
この鋳型ＤＮＡ交換活性とは、鋳型ＤＮＡと同じ配列か、あるいは、よく似た配列のＤＮＡ鎖が存在すると、そのＤＮＡ鎖を、今までの鋳型に代えて鋳型ＤＮＡとして、ＤＮＡ合成を行う活性である（Ｏｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ２０４９−２０５７，１９９５、Ｇｕｉｅｙｓｅｅ，Ａ−Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．９１９３−９１９９，１９９５）。
酵素（Ｂ）において、ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えて、上述したＤＮＡ鎖置換活性と鋳型ＤＮＡ交換活性が備わっていることにより、本ＤＮＡ増幅法において、ＤＮＡの増幅と増幅産物の分子量を大きくすることが可能であり、全遺伝子の増幅を行う上で、極めて重要な要素である。
上記のような活性を保持するＤＮＡポリメラーゼＩは、すでに公知で、市販品もあり、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩから得られる、いわゆるクレノウ酵素が挙げられる。
本ＤＮＡ増幅法において用いる酵素（Ｂ）として、さらに好適な酵素は、例えば、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）（Ｍｉｌｌａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．３９２−３９６，１９９８）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．１９６５−１９７５，１９９３）、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．６３，ｐｐ４５０４−４５１０，１９９７）、ＢｃａＢＥＳＴＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐａｒｇｏ，Ｃ．Ａ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ２４７−２５６，１９９６）、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６４，ｐｐ．８９３５−８９４０，１９８９）等を挙げることができる。
さらに、酵素（Ｂ）の製造方法は、通常公知の製造方法に従って行うことができる。すなわち、上記の酵素（Ａ）の製造方法に準じた製造方法で、ＤＮＡポリメラーゼＩの酵素由来生物からの抽出・精製を行い。これに、例えば、適当なポロテアーゼ処理を行い、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を失わせることで、所望する酵素（Ｂ）の製造を行うことができる。また、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を担っている遺伝子領域を予め除いた、ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子を用いて、この遺伝子ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを保持した宿主に、直接酵素（Ｂ）を生成させ、これの抽出・精製を行うことにより、酵素（Ｂ）の製造を行うことができる。
３．本ＤＮＡ増幅法の態様
本ＤＮＡ増幅法は、増幅対象となる二本鎖ＤＮＡと、上記の酵素（Ａ）および（Ｂ）を、対象となる二本鎖ＤＮＡに対して作用させて、（１）前記のいずれか一方のＤＮＡ鎖と新たなＤＮＡ鎖との二本鎖ＤＮＡと、（２）置き換えられた一本鎖ＤＮＡ同士により形成される二本鎖ＤＮＡに対して、前記の酵素（Ａ）と（Ｂ）による反応を、連続的に行うことにより、対象となるＤＮＡを増幅する、ＤＮＡ増幅法である。
すなわち、第１図（本ＤＮＡ増幅法の概略を示す）（１）の、増幅対象となる二本鎖ＤＮＡ１０に対して、まず、酵素（Ａ）が作用して、任意の位置に、ニック（１１１，１１２，１１３）を入れる〔第１図（２）〕。上述したように、このニックが入る過程において、マグネシウムイオンが必要である。
なお、二本鎖ＤＮＡ１０は、二本鎖ＤＮＡであれば、特に対象は限定されず、線状ＤＮＡであっても、環状ＤＮＡであってもよいが、原核生物または真核生物の遺伝子ＤＮＡ等の、大きな分子量を有する二本鎖ＤＮＡが好適である。
次いで、これらのニックを、酵素（Ｂ）（１２１，１２２，１２３）が認識し、ニックの３’ＯＨから、ＤＮＡ鎖の合成を、３’方向に進め〔第１図（３）〕、この際、合成の進行上に存在するＤＮＡ鎖（１３１，１３２，１３３）は、酵素（Ｂ）のＤＮＡ鎖置換活性（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）により、新たな合成鎖（１４１，１４２，１４３）に置換され〔第１図（４）〕、合成の進行上に存在したＤＮＡ鎖（１３１，１３２，１３３）は、置換が進むにつれて、一本鎖ＤＮＡとして伸長し〔第１図（５）〕、ニックが存在する場所で、これらの一本鎖ＤＮＡは、相補鎖から離れる。
第１図に示したように、二本鎖ＤＮＡ１０の両側から、ＤＮＡ鎖の置換が行われながら、ＤＮＡの合成反応が進行する。そして、新たな合成鎖同士が交叉する時点で、酵素（Ｂ）の、鋳型ＤＮＡ交換活性（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）により、鋳型ＤＮＡを、合成進行上にあるＤＮＡ鎖に換える、鋳型ＤＮＡ交換が起こり〔例えば、酵素（Ｂ）１２１は、鋳型をＤＮＡ鎖１３３から、新たな合成鎖１４３に換えて、合成鎖１４１の合成を継続し、酵素（Ｂ）１２３は、鋳型をＤＮＡ鎖１３１から、新たな合成鎖１４１に換えて、合成鎖１４３の合成を継続する：第１図（４）〕、新たな合成鎖の合成が継続し、新たな二本鎖ＤＮＡが形成される〔例えば、新たな合成鎖１４１と１４３からなる二本鎖ＤＮＡ：第１図（５）〕。
そして、新たに合成された二本鎖ＤＮＡに対して、酵素（Ａ）による、ランダムニッキングが行われ、上と同様の行程により、さらに、新たな二本鎖ＤＮＡが合成される。
一方、ＤＮＡ鎖の置換により生じた一本鎖ＤＮＡ（第１図における、一本鎖ＤＮＡ１３１，１３２，１３３が該当する）は、同一の液相反応系において、相補的塩基配列を有する、他の一本鎖ＤＮＡとアニールする。このように、アニールしたＤＮＡの５’末端が突出している場合は、酵素（Ｂ）により、３’末端からＤＮＡ合成が進行し、その領域も二本鎖ＤＮＡとなる。そして、このようにして形成される二本鎖ＤＮＡにも、酵素（Ａ）が作用して、ランダムニッキングを行い、上と同様の行程により、ここでもさらに、新たな二本鎖ＤＮＡが合成される。
以上述べたように、酵素（Ａ）によるランダムニッキングと、酵素（Ｂ）によるＤＮＡ置き換え合成の連続的な繰り返しにより、所望する全ＤＮＡ増幅が効率的に行われる。
上述の一連の行程は、酵素（Ａ）が、ランダムニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼである場合の実施態様を示したものであるが、他の態様として、特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用いても、対象とするＤＮＡの増幅を行うことができる。この場合には、ニックが入るＤＮＡ上の位置が特定の塩基配列であるため、当該塩基配列が複数箇所存在することが必要となる。このため、特に、この特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼを酵素（Ａ）として用いる、本ＤＮＡ増幅法の態様においては、増幅対象となるＤＮＡは、原核生物や真核生物の遺伝子ＤＮＡ等、大きな分子量を有し、しかも、用いるエンドヌクレアーゼが認識する塩基配列が数多く存在する二本鎖ＤＮＡが好適である。
このＤＮＡの増幅反応は、液相反応であり、反応液中には、増幅対象となる二本鎖ＤＮＡと、酵素（Ａ）と酵素（Ｂ）は、必須である。ここで酵素（Ａ）と酵素（Ｂ）の反応液中における量比は、特に限定されないが、酵素（Ａ）によるランダムニッキングの進行と、酵素（Ｂ）によるＤＮＡ合成の開始、および、進行が、バランス良く行われるように設定することが好適である。
反応温度は、用いる酵素（Ａ）と（Ｂ）の至適温度に応じて設定される。すなわち、酵素（Ａ）と（Ｂ）が、大腸菌等の、哺乳動物の体温（３７℃程度）で生育する生物由来の場合には、反応温度も、３７℃程度とすることが好適であり、耐熱菌等のように、高温（５０〜１００℃位）で生育する生物由来の場合には、対象となる耐熱性菌等の生育環境と同程度の高温とすることが、一般的には好適である。また、酵素（Ａ）と（Ｂ）の至適温度は、同じ位の温度のものを組み合わせて選択することが好適である。例えば、酵素（Ａ）が耐熱菌等由来である場合には、酵素（Ｂ）も耐熱菌由来であることが好適である。
また、反応ｐＨも、用いる酵素（Ａ）と（Ｂ）の至適ｐＨに応じて設定される。すなわち、酵素（Ａ）と（Ｂ）の至適ｐＨも、一致させることが好適である。
本ＤＮＡ増幅反応を行う上で、他に反応液中に添加する要素として、例えば、ＤＮＡ合成に十分な量のｄＮＴＰｓ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）、ＮａＣｌ等の塩類、酵素（Ａ）がニッキングを行うことができる量のマグネシウムイオン供給物質が挙げられ、これらを、増幅反応を行う上で好適な緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中に共存させることにより、本ＤＮＡ増幅反応を行うことができる。
このように、ＤＮＡ増幅反応を終了後、ＤＮＡ増幅産物を、既知のＰＣＲ増幅反応産物の精製法に準じた精製法で、精製を行うことにより、本ＤＮＡ増幅法による遺伝子増幅産物を、遺伝子解析等の試料として用いることが可能となる。
なお、本ＤＮＡ増幅法を行う際に留意すべき点の一つとして、副反応が挙げられる。
すなわち、ＤＮＡポリメラーゼＩ等によるＤＮＡ合成反応は、ある特定条件下では、鋳型となるＤＮＡとプライマーを反応液に加えることなしに、ＤＮＡ合成が行われる可能性が報告されている（Ｏｇａｔａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｍｏｒｉｎｏ，Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．３９９９−４００４，２０００、Ｏｇａｔａ，Ｎ．ａｎｄ  Ｍｉｕｒａ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３９，ｐｐ．１３９９３−１４００１，２０００）。このような偶発的なＤＮＡ合成反応は、本ＤＮＡ増幅法においては、副反応であり、これを、可能な限り抑止することが好適である。
この副反応は、反応液組成中の試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩにおいて混在している、極微量の短いＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドが原因となって起こるものと考えられる。
よって、本ＤＮＡ増幅法を行うに際しては、酵素（Ａ）も酵素（Ｂ）も、夾雑物としてのＤＮＡ等の混入が排除されている精製品を用いることが好適である。
４．ＤＮＡ増幅用キット
本発明は、上述した本ＤＮＡ増幅法を行うためのキットをも提供する発明である。
すなわち、本発明は、上記の（Ａ）と（Ｂ）を、構成要素として含む、本ＤＮＡ増幅法を行うための、ＤＮＡ増幅用キット（以下、本ＤＮＡ増幅用キットともいう）を提供する発明である。
本ＤＮＡ増幅用キットは、必須の要素として、酵素（Ａ）と酵素（Ｂ）を含有するが、その他、ｄＮＴＰ、反応液の基となる緩衝液を調製するための成分、マグネシウムイオンの供給物質等を、必要に応じて、構成要素として含めることができる。さらに具体的には、後述する実施例において、本ＤＮＡ増幅法を行うために用いているものを、本ＤＮＡ増幅用キットの構成要素として例示することができる。
本ＤＮＡ増幅用キットを用いることにより、上述した本ＤＮＡ増幅法を効率的に行うことができる。
【実施例】  以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本実施例により、本発明が限定されるものではない。
１．エンドヌクレアーゼＶのクローニングと部分精製
（１）クローニング
下記の配列番号１，２で表される、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶ遺伝子全長のクローニング用プライマーの合成を、常法に従い行った。
2004046383.tif 000002
および
2004046383.tif 000003
これらの各々１μＭと、鋳型ＤＮＡとして、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ（ＡＴＣＣ４３５８９Ｄ）の遺伝子ＤＮＡ０．１μｇを用いて、ＴｂｒＥＸＴ  ＤＮＡポリメラーゼ用ＰＣＲキット（第１化学薬品）で、熱サイクル（９４℃１分、６２℃１分、７２℃１分）を４０サイクル繰り返した。その結果、約７００塩基対の単一バンドのＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物の塩基配列を確認したところ、公表されているＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ａ００１８２３）の塩基配列と同一であった。
次いで、このようにして得られたＰＣＲ産物を常法に従って精製し、Ｇａｔｅｗａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ用ベクター、ｐＤＯＮＲ２０にキットマニュアルに従って導入した（ライフテクノロジー社）。
次に、大腸菌で、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶ遺伝子を発現させるために、遺伝子発現用ベクターｐＤＥＳＴ１４に、上記キットマニュアルに従ってエンドヌクレアーゼＶ遺伝子を組み込み、これを用いて、発現用大腸菌ＢＬ２１  Ｓ１株の形質転換を行った。
得られたクローンを、Ｌ培地の組成から、ＮａＣｌを除き、ｐＨ７．５にＮａＯＨで調整した培地で、３７℃で培養し、中期対数増殖期に、０．３Ｍ  ＮａＣｌになるように５Ｍ  ＮａＣｌを加え、さらに３時間の培養を行い、エンドヌクレアーゼＶの発現誘導を行なった。発現誘導を行った菌体を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄して、マイナス７０℃で保存した。
（２）部分精製
下記のエンドヌクレアーゼＶの部分精製の行程は、処理温度を記載している処理以外の行程は０〜４℃で行った。
保存した菌体を、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１０％  ｓｕｃｒｏｓｅ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ  ２ＭＥ（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））で洗浄した後、菌湿重量約３ｇを、２０ｍｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。これにプロテアーゼの作用を抑えるためにＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロッシュ社）を加えた。これにリゾチームを終濃度１ｍｇ／ｍｌを加え０．５〜１．０時間の反応を行なった。次に、終濃度０．１％になるように、５％  Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅを加え、１０〜３０分間処理し、溶菌した。溶菌液を、２００００×ｇで遠心し、上精を得た。この上精に、ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加え２０ｍｌとし、さらに、０．６ｍｌの１０％ｐｏｌｙｍｉｎ  Ｐ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）（シグマ社）を加え、核酸および酸性蛋白質を沈澱させ、遠心により除去した。この遠心上精に、５．４ｇの硫酸アンモニウムを加えて溶解し、硫酸アンモニウム沈澱蛋白質を遠心により集め、沈澱した蛋白質に、４ｍｌのｓｔｏｒａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ），５０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（Ｗ／Ｖ））を加え、蛋白質を溶解した。次いで、この蛋白質溶解物を透析チューブに入れ、５００ｍｌのｓｔｏｒａｇｅ  ｂｕｆｆｅｒにおいて、１８時間の透析を２回行なった。透析を行った蛋白質液に対して、７０℃２０分の熱処理を行ない、エンドヌクレアーゼＶ以外の蛋白質を熱変性させ、１５０００×ｇの遠心により、熱変性蛋白質を除去し、得られた上精を、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶの部分精製品とした。
なお、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶの精製については、Ｈｕａｎｇ，Ｈ．ら（Ｈｕａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４０，ｐｐ．８７３８−８７４８，２００１）が報告している。
上記の行程を経て、部分精製したエンドヌクレアーゼＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥの図を示す（第２図）。レーンＭは分子量マーカーで上より分子量は、それぞれ、９７４００、６６０００、４５０００、３１０００、２１０００と１４５００である。レーン１およびレーン２は、それぞれ別のクローン株から部分精製したｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａエンドヌクレアーゼＶに対応するレーンであり、共に分子量は２９０００であった。
これにより、Ｔｈｅｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶの部分精製品が得られたことが確認された。
２．エンドヌクレアーゼＶのニッキング活性の確認
共有結合により閉環している２本鎖の環状プラスミドＤＮＡは、ニックが入ると、開環状ＤＮＡとなり、さらに閉環状プラスミドＤＮＡの２本鎖とも同一位置に、ニックが入ると直線状ＤＮＡとなる。これらの、閉環状、開環状、直線状ＤＮＡは同じ分子量にかかわらず、それぞれ、アガロース電気泳動における泳動位置が異なることが知られている。
この性質を利用して、上記の行程により得られた、エンドヌクレアーゼＶの部分精製品のＤＮＡニッキング活性を検討した。
すなわち、プラスミドＤＮＡとして、ｐＴ７ｂｌｕｅ由来の約４ＫｂのプラスミドＤＮＡを約１μｇと、上記１において得た、Ｔｈｅｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶのうち、約１００ｎｇを、ニッキング活性測定用反応液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）２０μｌ中で、反応させた。
第３図はこの反応による結果物を、１．２％アガロースゲルに載せ、電気泳動を行なって、得られた泳動像である。
レーンＭは、分子量マーカーに対応するレーンであり（λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断したもの）、レーン１は、エンドヌクレアーゼＶを入れないコントロールに対応するレーンであり、上から開環状プラスミドＤＮＡ、直線状プラスミドＤＮＡ、および、閉環状プラスミドＤＮＡのバンドが存在していた。
レーン２は、反応温度を０℃として、６０分間反応させた結果を示すレーンであり、各々のバンドの濃度はコントロールと同じであった。レーン３は、反応温度を６５℃として、６０分間反応させた結果を示すレーンである。
第３図において、レーン１のコントロールに認められる閉環状プラスミドＤＮＡの存在を示すバンド（最も下のバンド）は、レーン３では消失しており、レーン３では開環状プラスミドＤＮＡを示す一番上のバンドが濃くなっていることが認められた。直線状プラスミドＤＮＡの存在を示す真中のバンドはレーン１、レーン３ともに同じ様な濃度を示した。
この結果により、上記１で得られたエンドヌクレアーゼＶは、６５℃で、ＤＮＡにランダムにニックを入れる活性が存在することが明らかになった。
３．ＤＮＡの増幅
（１）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子ＤＮＡの増幅
耐熱菌であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子ＤＮＡを、常法により分離して、これを、１）上記１で得られたＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶを０．５μｌ（１μｇ／μｌ）、２）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを１μｌ（ＮＥＢ社、８ｕｎｉｔｓ／μｌ），１００μＭ  ｄＮＴＰｓ（１ｍＭ）をＭＭバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ１８．０），２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ））に混合し、全量が１００μｌとなるように反応液を調整した。ＤＮＡ増幅反応は、このようにして調整した反応液を、６０℃で１４時間反応させることにより行った。
反応終了後、各反応液１０μｌを用い、１％アガロースゲルで電気泳動を行った。その泳動像を第４図に示す。
第４図において、レーンＭは、分子量マーカーに対応するレーンであり、λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断産物を示している。レーン１は、エンドヌクレアーゼを加えていないコントロールに対応するレーン、レーン２は、標的ＤＮＡを加えていないコントロールに対応するレーンである。また、レーン３は、ＤＮＡを０．３ｎｇ、レーン４は、ＤＮＡを３．０ｎｇ、レーン５は、ＤＮＡを３０．０ｎｇ、レーン６は、ＤＮＡ３００ｎｇをそれぞれ加えた系に対応するレーンである。
エンドヌクレアーゼを加えていないレーン１、および、ＤＮＡを加えていないレーン２では、ＤＮＡの増幅は認められなかった。それに対して、ＤＮＡを加えたレーン３，４，５および６では、すべてのレーンにおいて、ＤＮＡが増幅しており、増幅されたＤＮＡは、おおよそ、３〜０．５Ｋｂの分子量であった。
次いで、キアゲンＰＣＲ産物精製キット（キアゲン社）を用いて、第４図の各レーンに泳動された増幅産物を精製し、ＯＤ２６０ｎｍを測定し、ＤＮＡ量を求めた。その結果を、第１表に示す。
2004046383.tif 000004
増幅したＤＮＡ量は、最初に加えた鋳型ＤＮＡ量が異なるにもかかわらず、ほぼ一定の４〜９μｇ／１００μｌ反応液となった。
このＤＮＡ増幅量の一定化の原因としては、例えば、ｄＮＴＰｓが４時間のＤＮＡ合成により消費され、ＤＮＡ合成が停止した、等の律速要素が考えられるが、生物反応においては通常認められる現象でもあり、この実施例におけるＤＮＡ増幅反応の時間は、４時間程度が効率的であると考えられる。
また、この精製した増幅産物が、標的ＤＮＡであるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの遺伝子ＤＮＡの増幅産物であるか否かが問題になる。これを確かめるために、特定の遺伝子に着目して、その増幅量を限界希釈ＰＣＲ法（Ｓｙｋｅｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４４４−４４９，１９９２）を行った。
すなわち、まず、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子ＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｄ２８８７８）の、１０８８〜１１７８番目まで、および、１２３１〜１２６０番目までの塩基配列からなる２種のプライマーを設計し、これらのプライマーを、常法により、合成した。一方、既知濃度のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子ＤＮＡの１０倍の希釈段階と、増幅産物の１０倍稀釈段階とを行った。
この段階希釈を行ったＤＮＡ液と上記の２種のプライマーを用いたＰＣＲ反応液の系列を作製し、ＰＣＲ法を同一条件で行い、これらにより得られる増幅産物に対してアガロースゲル電気泳動を行い、泳動後のそれぞれのバンドの濃度を比較することにより、本ＤＮＡ増幅法で増幅した産物中のＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子の増幅の程度を求めた。その結果、第４図のレーン３はおおよそ１０００倍、レーン４はおおよそ１００倍、そして、レーン５およびレーン６はおおよそ数十倍増幅したことが認められた。
このことから、本ＤＮＡ増幅法を用いることにより、確かに目的とするＤＮＡを増幅することができることが確かめられた。
（２）ＨｅＬａ細胞の遺伝子ＤＮＡの増幅
本ＤＮＡ増幅法によるＤＮＡの増幅の経時的挙動についての検討を、真核生物のＤＮＡであるＨｅＬａ細胞の遺伝子ＤＮＡを用いて行った。
ＨｅＬａ細胞の遺伝子ＤＮＡ３０ｎｇを、（１）の増幅反応液に入れ、６０℃で増幅反応を行った。反応開始から３０分ごとに、２７０分にわたって、本ＤＮＡ増幅法による増幅産物量を，前述のキアゲンＰＣＲ産物精製キットで反応液からＤＮＡを精製し、そのＯＤ２６０ｎｍを計測することにより算出した。
その結果を、第５図に示す。第５図の縦軸に、得られたＤＮＡ量（μｇ／１００μｌ）であり、横軸に時間（分）を示した。第５図により、本ＤＮＡ増幅法では、ＤＮＡ増幅産物は、経時的に増加して得られることが明らかとなった。また、真核生物由来遺伝子ＤＮＡでも、原核生物遺伝子ＤＮＡと同様に増幅可能であることも明らかになった。
（３）Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合の検討
上記（１）（２）のＤＮＡ増幅では、ＤＮＡポリメラーゼとして、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたが、他のＤＮＡポリメラーゼを用いた場合でも、本ＤＮＡ増幅法によるＤＮＡ増幅が可能であるか、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼについて検討した。
すなわち、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｔｉｍａのエンドヌクレアーゼＶを１μｌ（０．１μｇ／μｌ）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ（ＮＥＢ社、２ｕｎｉｔｓ／μｌ）、１００μＭ  ｄＮＴＰｓ（１ｍＭ）を、ＭＭバッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），２０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ））に混合し、これに増幅しようとするＤＮＡを加え、全量が１００μｌとなるように反応液を調整した。次いで、６５℃で３時間の増幅反応を行い、その増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示した図面が第６図である。
第６図のレーンＭは、分子量マーカーでλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断産物のレーンである。レーン１と２は、増幅反応液にＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子ＤＮＡを１５ｎｇ加えた系のレーンである。レーン３と４は、増幅反応液にＨｅＬａ細胞遺伝子ＤＮＡを３０ｎｇ加えた系のレーンである。
第６図に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼを、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼに換えても、本ＤＮＡ増幅法でＤＮＡの増幅が行えることが確かめられた。
（４）エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを用いた場合の検討
ランダムニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼＶの換わりに、特定ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼである、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用い、本ＤＮＡ増幅法でＤＮＡの増幅が可能であるか否かを検討した。
すなわち、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴおよび１００μＭ  ｄＮＴＰｓを含む反応液を用い、これに、１μｌのＮ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ社、１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）と１μｌのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社、８ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加え、さらに増幅の標的となるＤＮＡを加え、反応液全量を１００μｌとした。
増幅反応は６０℃で３時間行った。得られた増幅産物を、アガロースゲル電気泳動した結果を第７図に示す。
第７図において、レーンＭは、分子量マーカーでλＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断産物の系のレーンである。レーン１は、増幅標的となるＤＮＡを加えていないコントロールのレーンである。レーン２は、エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを加えていないコントロールのレーンである。レーン３は、ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子ＤＮＡを１５ｎｇ加えた系のレーンである。そして、レーン４は、同じくｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ遺伝子ＤＮＡを１５０ｎｇ加えた系のレーンである。
第７図に示されるように、ニッキング活性を有するエンドヌクレアーゼ、あるいは、増幅対象となるＤＮＡを加えない場合は、増幅産物は認められないが、レーン３，４のように、ＤＮＡとニックを入れるエンドヌクレアーゼが共に存在する場合は、ニッキング活性が、特定ニッキング活性であっても、増幅産物が得られることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明により、簡便に、かつ、効率的に、遺伝子ＤＮＡを増幅する全遺伝子増幅手段が提供される。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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