(57)【要約】一般式（１）：2004066994.tif 000023（式中、Ｒ１からＲ９は、明細書中に定義されるとおりである。）で表される化合物又はその薬学的に許容しうる塩を有効成分とする抗癌剤。
2004066994.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
2004066994.tif 000019
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を表し、或いは、ＣＲ１Ｒ２は、Ｃ＝Ｏを表し；
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基又はアシルアミノ基を表し；
Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシ基、チオール基、アルキルチオ基、置換されていてもよいアリールチオ基、アルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基、アルキルアミノカルボニル基、置換されていてもよいアリールアミノカルボニル基、アルキルアミノスルホニル基、置換されていてもよいアリールアミノスルホニル基、アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基又は置換されていてもよいアリールスルホニルアミノ基を表し；
Ｒ６は、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基又は下記一般式（２）
2004066994.tif 000020
で表される構造を表し；
Ｒ７は、Ｏ、ＮＨ又はＮＲ１３を表し；
Ｒ１０は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を表し；
Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基を表し；
Ｒ１３は、アルキル基、シクロアルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す）
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
【請求項２】
Ｒ７が酸素原子である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項３】
Ｒ５がメトキシ基である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項４】
Ｒ９がアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項５】
Ｒ９がｎ−プロピル基である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項６】
Ｒ６が、下記一般式（２）
2004066994.tif 000021
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、前記に定義されるとおりである）
で表される基である請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項７】
下記一般式（３）
2004066994.tif 000022
で表される請求項１に記載の抗癌剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の化合物の有効量を投与することを特徴とする癌の治療方法。
【請求項９】
癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、絨毛癌、多発性骨髄腫、軟部腫瘍、小細胞肺ガン、慢性骨髄性白血病、甲状腺髄様癌、骨肉腫、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺ガン、大腸癌、胃癌、胆道癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌からなる群より選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、小細胞肺ガンからなる群より選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌が多剤耐性（ＭＤＲ）の癌である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、抗癌剤並びに癌の治療方法に関する。
【背景技術】  従来から、植物より抽出した物質に、抗癌作用や発癌予防作用を有するものがあることが知られており、植物の抽出物から得られる成分に関して、多くの研究が行われてきた。例えば、Ｓｔ．Ｊｏｈｎ’ｓ  ｗｏｒｔという植物から得られる物質が抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２，２１，１２４２−１２５０）。また、キャロフィラム属から得られる物質の中に、癌予防に有効な物質があること（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，２００２，６５（３），２６７−２７２）、細胞障害性を有する物質があること（Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，５８，５７１−５７５）、エイズに対する抑制効果を有する物質があること（Ｃｌａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，８，３４７５−３４７８）が報告されている。これらの文献で報告されている物質の構造は様々で、機能又は作用との関連は明確になっていない。
一方、化学合成の分野においても、抗癌剤として有用な様々な薬剤の開発が行われてきた。これまでにも、高い細胞増殖抑制作用を示す抗癌剤などが種々開発されている。しかし、これらの中には、正常細胞にも毒性を示すものがあり、患者への実際の投与に十分な適性を有していないものも少なくなかった。また、癌においては、発症メカニズムとｐ５３との関連が指摘され、ｐ５３を誘導することにより効果を発揮する抗癌剤が多く開発されてきたが、望まれている程度の効果を有さないか、又は望まれている程度には異なるタイプの癌に幅広い効果を示さないものが少なくなかった。更に、相乗的な作用や副作用の軽減を目的として、複数の抗癌剤を併用する多剤療法も行われているが、Ｐ糖蛋白（Ｐｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が誘導されて、細胞が多剤耐性（ＭＤＲ）を獲得することが多く、そのような患者に、抗癌剤を投与しても、癌細胞内の薬物濃度が低下し、有効な効果が得られないといった問題が生じていた。
これらのことから、従来とは異なるメカニズムを有し、多剤耐性癌細胞にも有効であって、しかも安全域の大きい、新たな抗癌剤の開発が期待されていた。
本発明は、従来と異なるメカニズムを有し、多剤耐性癌細胞にも有効で、しかも安全域の大きい抗癌剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、癌の治療方法を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓより得られた１５の化合物の構造を示す。
図２は、図１に示した１５の化合物について、ＢＶ１７３細胞の増殖抑制作用を、濃度０μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ及び３０μＭにおいて調べた結果を示す。
図３は、化合物７（ＧＵＴ−７０）の細胞増殖抑制作用を、５種類の白血病細胞株（ＢＶ１７３、ＳＥＭ、ＮＡＬＭ６、ＨＬ６０及びＫ５６２）について測定した結果を示す。また（◆）は０μＭ、（■）は０．５μＭ、（□）は１．０μＭ、（◇）は５．０μＭ、（×）は１０μＭの濃度での測定結果をそれぞれ示す。
図４は、化合物７によるアポトーシスを形態学的に観察した結果を示す。図４Ａは化合物７で処理する前、図４Ｂは化合物７で処理後の観察結果をそれぞれ示す。
図５は、ＴＵＮＥＬアッセイにより、細胞周期とアポトーシスの関係を測定した結果を示す。図５ＡはＧＵＴ−７０無処理時、図５ＢはＧＵＴ−７０  ５μＭ、２４時間処理時のアポトーシス誘導に関する結果をそれぞれ示す。
図６は、化合物７で処理した白血病細胞株ＮＡＬＭ６細胞とＢＶ１７３細胞における、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰｌ、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５３及びｐ５７の時間的変化を調べた結果を示す。
図７Ａは、Ｐ糖蛋白高発現細胞Ｋ５６２／Ｄ１−９とＰ糖蛋白が発現していない親株Ｋ５６２細胞に対するダウノルビシン（ＤＮＲ）の耐性を比較した結果を示す。図７Ｂは、Ｐ糖蛋白高発現細胞Ｋ５６２／Ｄ１−９とＰ糖蛋白が高発現していない親株Ｋ５６２細胞に対する化合物７の耐性を比較した結果を示す。
図８は、正常造血前駆細胞ＣＦＵ−ＧＭとＢＦＵ−Ｅを用いて、正常細胞に対する化合物７の毒性を調べた結果を示す。
図９は、ヒト小細胞肺ガンに対する化合物７（ＧＵＴ−７０）の効果を調べた結果を示す。
【発明の開示】
本発明者は、前記課題を解決することを主な目的として、鋭意検討を重ねた。その結果、特定の構造を有する化合物が、顕著なガン細胞の増殖抑制作用を奏すること、多剤耐性癌細胞に対しても有効であること、また安全域が大きいことも見出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の抗癌剤及び癌の治療方法に関するものである。
１．下記一般式（１）
2004066994.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を表し、或いは、ＣＲ１Ｒ２は、Ｃ＝Ｏを表し；
Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基又はアシルアミノ基を表し；
Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、ヒドロキシ基、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシ基、チオール基、アルキルチオ基、置換されていてもよいアリールチオ基、アルキルスルホニル基、置換されていてもよいアリールスルホニル基、アルキルアミノカルボニル基、置換されていてもよいアリールアミノカルボニル基、アルキルアミノスルホニル基、置換されていてもよいアリールアミノスルホニル基、アルコキシカルボニル基、置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基又は置換されていてもよいアリールスルホニルアミノ基を表し；
Ｒ６は、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、アルコキシ基、アシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基又は下記一般式（２）
2004066994.tif 000004
で表される構造を表し；
Ｒ７は、Ｏ、ＮＨ又はＮＲ１３を表し；
Ｒ１０は、水素原子、アルキル基、シクロアルキル基又は置換されていてもよいアリール基を表し；
Ｒ１１、Ｒ１２は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基を表し；
Ｒ１３は、アルキル基、シクロアルキル基または置換されていてもよいアリール基を表す）
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗癌剤。
２．Ｒ７が酸素原子である項１に記載の抗癌剤。
３．Ｒ５がメトキシ基である項１に記載の抗癌剤。
４．Ｒ９がアルキル基又は置換されていてもよいアリール基である項１に記載の抗癌剤。
５．Ｒ９がｎ−プロピル基である項１に記載の抗癌剤。
６．Ｒ６が、下記一般式（２）
2004066994.tif 000005
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、前記に定義されるとおりである）
で表される基である項１に記載の抗癌剤。
７．下記一般式（３）
2004066994.tif 000006
で表される項１に記載の抗癌剤。
８．項１〜７のいずれかに記載の化合物の有効量を投与することを特徴とする癌の治療方法。
９．癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、絨毛癌、多発性骨髄腫、軟部腫瘍、小細胞肺ガン、慢性骨髄性白血病、甲状腺髄様癌、骨肉腫、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺ガン、大腸癌、胃癌、胆道癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌からなる群より選択される項８に記載の方法。
１０．癌が、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、小細胞肺ガンからなる群より選択される項９に記載の方法。
１１．癌が多剤耐性（ＭＤＲ）の癌である項８に記載の方法。
本発明は、好ましくは一般式（３）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤、並びに該化合物を癌患者に投与する癌の治療方法に係るものである。
更に好ましくは、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、絨毛癌、多発性骨髄腫、軟部腫瘍、小細胞肺ガン、慢性骨髄性白血病、甲状腺髄様癌、骨肉腫、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺ガン、大腸癌、胃癌、胆道癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌からなる群より選択される疾患を治療するための、一般式（３）で表される化合物を有効成分として含有する抗癌剤に係るものである。
また、本発明は、好ましくは、一般式（３）で表される化合物の抗癌有効量を投与することを特徴とする癌の治療方法に係るものである。
更に好ましくは、一般式（３）で表される化合物の抗癌有効量を投与することを特徴とする、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、絨毛癌、多発性骨髄腫、軟部腫瘍、小細胞肺ガン、慢性骨髄性白血病、甲状腺髄様癌、骨肉腫、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺ガン、大腸癌、胃癌、胆道癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌からなる群より選択される疾患の治療方法に係るものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
抗癌化合物の構造
本発明の抗癌剤の有効成分は、下記一般式（１）で表される構造を有する。
一般式（１）
2004066994.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ９は、前記に定義されるとおりである。）
Ｒ１〜Ｒ１３において、アルキル基は、置換又は非置換の直鎖状或いは分岐状のものを含み、炭素数は通常は１〜１８、好ましくは１〜８、更に好ましくは１〜３であり、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルが挙げられる。
シクロアルキル基は、置換又は非置換のものを含み、炭素数も特に限定されないが、通常は３〜１０、好ましくは３〜７である。シクロアルキル基の具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。
アリール基としては、「アリール基」とは、５又は６員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３−ジヒドロ−１，４−ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
置換基を有するアリール基の置換基の数は１〜３個、好ましくは１または２個であり、該置換基としては、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、シアノ、ニトロ、フッ素、塩素、臭素、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、カルボキシル、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ＣＯＮＨ２，アセチルが例示される。置換アリール基の例示としては、フェニル、２−、３−若しくは４−フルオロフェニル、２−、３−若しくは４−クロロフェニル、２−、３−若しくは４−ブロモフェニル、２，４−ジフルオロフェニル、２，３−、２，４−、３，４−、３，５−若しくは２，６−ジクロロフェニル、３−クロロ−４−フルオロフェニル、４−イソプロピルフェニル、２，６−ジメチルフェニル、２−、３−若しくは４−トリフルオロメチルフェニル、４−メトキシフェニル、４−トリフルオロメトキシフェニル、２−、３−若しくは４−ジメチルアミノフェニル、２−、３−若しくは４−ニトロフェニル、４−スルファモイルフェニルが例示される。
アルコキシ基としては、−ＯＲ’（Ｒ’は前記アルキル基である）で表される基が挙げられ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシが例示される。
アシル基としては、−ＣＯＲ’’（Ｒ’’は前記アルキル基または前記置換されていてもよいアリール基である）で表される基が挙げられ、例えば、アセチル、プロピオニル、ベンゾイルが例示される。
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
アシルアミノ基としては、−ＮＨＣＯＲ’’（Ｒ’’は前記アルキル基または前記置換されていてもよいアリール基である）で表される基が挙げられ、例えば、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ、ブチリルアミノ、ベンゾイルアミノが挙げられる。
アルコキシカルボニル基としては、−ＣＯＯＲ’（Ｒ’は前記アルキル基である）で表される基が挙げられ、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｎ−プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルが例示される。
置換されていてもよいアリールオキシ基としては、−Ｏ−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルオキシ、ナフチルオキシが挙げられる。
アルキルチオ基としては、−Ｓ−（アルキル基）で表される基が挙げられ、例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオが挙げられる。
置換されていてもよいアリールチオ基としては、−Ｓ−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルチオ、ナフチルチオが挙げられる。
モノアルキルアミノ基としては、前記アルキルでモノ置換されたアミノ基、例えばメチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ｎ−プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、ｎ−ブチルアミノカルボニル、イソブチルアミノカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルアミノカルボニル、ｎ−ペンチルアミノカルボニル、イソペンチルアミノカルボニル、ヘキシルアミノカルボニルが挙げられる。
ジアルキルアミノ基としては、前記アルキルでジ置換されたアミノ基、例えばジメチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、ジｎ−プロピルアミノカルボニル、ジイソプロピルアミノカルボニル、ジｎ−ブチルアミノカルボニル、ジイソブチルアミノカルボニル、ジｔｅｒｔ−ブチルアミノカルボニル、ジｎ−ペンチルアミノカルボニル、ジイソペンチルアミノカルボニル、ジヘキシルアミノカルボニルが挙げられる。
アルキルスルホニル基としては、−ＳＯ２−（アルキル基）で表される基が挙げられ、例えばメチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルが挙げられる。
置換されていてもよいアリールスルホニル基としては、−ＳＯ２−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルスルホニル、ナフチルスルホニルが挙げられる。
アルキルアミノカルボニル基としては、前記アルキルでモノ置換またはジ置換されたアミノカルボニル基が挙げられ、前記アルキルでモノ置換されたアミノ基としては、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ｎ−プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、ｎ−ブチルアミノカルボニル、イソブチルアミノカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルアミノカルボニル、ｎ−ペンチルアミノカルボニル、イソペンチルアミノカルボニル、ヘキシルアミノカルボニルが挙げられ、前記アルキルでジ置換されたアミノカルボニル基としては、ジメチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、ジｎ−プロピルアミノカルボニル、ジイソプロピルアミノカルボニル、ジｎ−ブチルアミノカルボニル、ジイソブチルアミノカルボニル、ジｔｅｒｔ−ブチルアミノカルボニル、ジｎ−ペンチルアミノカルボニル、ジイソペンチルアミノカルボニル、ジヘキシルアミノカルボニルが挙げられる。
置換されていてもよいアリールアミノカルボニル基としては、−ＣＯＮＨ−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルアミノカルボニル、ナフチルアミノカルボニルが挙げられる。
アルキルアミノスルホニル基としては、前記アルキルでモノ置換またはジ置換されたアミノスルホニル基が挙げられ、前記アルキルでモノ置換されたアミノ基としては、メチルアミノスルホニル、エチルアミノスルホニル、ｎ−プロピルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、ｎ−ブチルアミノスルホニル、イソブチルアミノスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルアミノスルホニル、ｎ−ペンチルアミノスルホニル、イソペンチルアミノスルホニル、ヘキシルアミノスルホニルが挙げられ、前記アルキルでジ置換されたアミノスルホニル基としては、ジメチルアミノスルホニル、ジエチルアミノスルホニル、ジｎ−プロピルアミノスルホニル、ジイソプロピルアミノスルホニル、ジｎ−ブチルアミノスルホニル、ジイソブチルアミノスルホニル、ジｔｅｒｔ−ブチルアミノスルホニル、ジｎ−ペンチルアミノスルホニル、ジイソペンチルアミノスルホニル、ジヘキシルアミノスルホニルが挙げられる。
置換されていてもよいアリールアミノスルホニル基としては、−ＳＯ２ＮＨ−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルアミノスルホニル、ナフチルアミノスルホニルが挙げられる。
置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基としては、−ＣＯＯ−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニルが挙げられる。
アルキルスルホニルアミノ基としては、−ＮＨＳＯ２−（アルキル基）で表される基が挙げられ、例えばメチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ、ｎ−プロピルスルホニルアミノ、イソプロピルスルホニルアミノ、ｎ−ブチルスルホニルアミノ、イソブチルスルホニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルアミノ、ｎ−ペンチルスルホニルアミノ、イソペンチルスルホニルアミノ、ヘキシルスルホニルアミノが挙げられ、
置換されていてもよいアリールスルホニルアミノ基としては、−ＮＨＳＯ２−（置換されていてもよいアリール基）で表される基が挙げられ、例えばフェニルスルホニルアミノ、ナフチルスルホニルアミノが挙げられる。
本発明の一般式（１）で表される化合物に関し、Ｒ７は酸素原子（Ｏ）が好ましい。
Ｒ５はメトキシ基（−ＯＣＨ３）が好ましい。
Ｒ９はアルキル基又はアリール基が好ましく、特にｎ−プロピル基が好ましい。
また、Ｒ６は、一般式（２）
2004066994.tif 000008
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、前記に定義されるとおりである）
で表される基が好ましい。
本発明においては、一般式（３）
2004066994.tif 000009
で表される化合物（５−メトキシ−２，２−ジメチル−６−（２−メチル−１−オキソ−２−ブテニル）−１０−プロピル−２Ｈ，８Ｈ−ベンゾ［１，２−ｂ；３，４−ｂ’］ジピラン−８−オン（５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−６−（２−ｍｅｔｈｔｌ−１−ｏｘｏ−２−ｂｕｔｅｎｙｌ）−１０−ｐｒｏｐｙｌ−２Ｈ，８Ｈ−ｂｅｎｚｏ［１，２−ｂ；３，４−ｂ’］ｄｉｐｙｒａｎ−８−ｏｎｅ））が抗癌剤として好ましい。
この一般式（３）の化合物は、特に優れた癌細胞増殖抑制作用を有する。
本発明の一般式（１）で表される化合物の薬学的に許容される塩は、Ｒ３〜Ｒ６、Ｒ８，Ｒ９のいずれかがカルボキシル基（ＣＯＯＨ）あるいはアミノ基、モノ−またはジ−アルキルアミノ基を有する場合、薬学的に許容される塩を調製できる。薬学的に許容されるカルボキシル基の塩としては、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩）が例示され、薬学的に許容されるアミノ基、モノ−またはジ−アルキルアミノ基の塩としては、硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの無機酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩が挙げられる。このような薬学的に許容される塩は、本発明の化合物とアルカリ金属の炭酸塩または炭酸水素塩、アルカリ金属水酸化物、あるいは、無機酸または有機酸を作用させることにより得ることができる。
一般式（１）の化合物の製造方法
上記化合物は、種々の方法で適宜調製することができ、化学的に合成してもよく、また、適当な植物から抽出などにより分離してもよい。
（ｉ）化学的合成方法
化学的に合成する方法としては、適宜公知の方法を用いることができる。
例えば、以下のような方法が挙げられる。
下記一般式（４）
2004066994.tif 000010
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物、又は、下記一般式（５）
2004066994.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、前記に定義されるとおりである。Ｚは水素原子またはＲ１３（Ｒ１３は前記定義されるとおりである）を示す。）
で表される化合物と、下記一般式（６）
2004066994.tif 000012
（式中、Ｒ８及びＲ９は、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物とを、濃硫酸を用いて加熱反応させて、
それぞれ、下記一般式（７）
2004066994.tif 000013
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ８及びＲ９は、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物、又は、下記一般式（８）
2004066994.tif 000014
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ８、Ｒ９及びＺは、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物を得る。
次いで、一般式（７）又は（８）で表される化合物に、例えば、下記一般式（９）
2004066994.tif 000015
で表される化合物を、フリーデル・クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）触媒を用いて反応させることによって、下記一般式（１）
2004066994.tif 000016
（式中、Ｒ１〜Ｒ９は、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物を得る。
Ｒ６が一般式（２）で表される構造の化合物は、一般式（９）で表される化合物として、下記一般式（１０）
2004066994.tif 000017
（式中、Ｒ１０〜Ｒ１２は、前記に定義されるとおりである）
で表される化合物を、フリーデル・クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）触媒を用いてアシル化反応させて得ることができる。
フリーデル・クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ）触媒としては、例えば、ＡｌＣｌ３、ＢＦ３、ＺｎＣｌ２、ＳｎＣｌ４などが挙げられる。
一般式（４）〜（１０）で表される化合物は、いずれも、汎用の方法により得ることができ、市販品がある場合には、それをそのまま用いればよい。
斯くして得られる本発明の化合物は、通常、溶解、抽出、分液、傾斜、濾過、濃縮、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、蒸留、昇華、結晶化などの方法を単独又は組み合わせて、適宜精製を行う。
上記と同様の方法において、所望の置換基を有する中間物を用い、又は適当な官能基を適宜導入することによって、各種化合物を得ることができる。
例えば、一般式（４）において、Ｒ１、Ｒ２がメチル基、Ｒ３、Ｒ４が水素、Ｒ５が−ＯＣＨ３基である化合物を用い、一般式（６）において、Ｒ８が水素、Ｒ９が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３基である化合物を用い、一般式（１０）において、Ｒ１０が水素、Ｒ１１、Ｒ１２がメチル基である化合物を用いる場合には、
下記一般式（３）
2004066994.tif 000018
で表される化合物を得ることができる。
（ｉｉ）植物からの抽出方法
本願発明の医薬組成物の有効成分となる化合物は、適当な植物から抽出して得ることもできる。植物としては、オトギリ草科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）の植物が例示できる。オトギリ草科の植物では、キャロフィラム（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ）属のもの、例えば、Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＣａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｉｎｏｐｈｙｌｌｕｍなどが好適であり、特に、Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓが好適に用いられる。
植物から該化合物を抽出して得る方法は、適宜公知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、植物の樹皮などを粉砕し、有機溶媒で抽出する方法などを用いることができる。
具体的には、次のように行うことができる。Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ又はＣａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｉｎｏｐｈｙｌｌｕｍの乾燥した樹皮の粉砕物に、適当な有機溶媒、例えば、アセトン、ヘキサン、メタノール、エタノール等の低級アルコールなどを適宜組み合わせて用いて、室温で抽出した後、低圧下溶媒を蒸発する。更にクロマトグラフィーやろ過、抽出など、適宜分離精製を行って、所望の化合物を得る。
例えば、一般式（３）の化合物は、Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）の植物抽出物を分離精製して得ることができる。
医薬組成物（医薬製剤）の製法
一般式（１）の化合物またはその塩は、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤；シロップ剤、注射剤などの液状製剤、貼付剤、軟膏剤、硬膏剤などの経皮吸収剤、吸入剤、坐剤として、適宜製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、経口または非経口投与され、上記化合物を１種単独で用いてもよく、又は２種以上を併用して用いてもよい。
薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用されている各種有機あるいは無機担体物質を用いることができる。具体的には、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。
滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。
緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
対象疾患
本発明の抗癌剤は、各種の癌の治療に適用することができる。
癌の種類は、特に限定されないが、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、悪性リンパ腫、絨毛癌、多発性骨髄腫、軟部腫瘍、小細胞肺ガン、慢性骨髄性白血病、甲状腺髄様癌、骨肉腫、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺ガン、大腸癌、胃癌、胆道癌、脳腫瘍、悪性黒色腫、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌が挙げられる。
本発明の抗癌剤は、特に、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、小細胞肺ガン、に有効である。中でも急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、小細胞肺ガンに好適に用いられる。
本発明の抗癌剤の投与条件及び投与方法は、疾患の種類や患者の状態又は適用部位などに応じて、適宜設定することができる。
具体的には、投与量は、動物の種類や大きさ（または体重）、症状等に応じて適宜調節する。ヒト又はヒト以外の動物に投与する場合には、約０．１−１００ｍｇ／ｋｇ（体重）程度、好ましくは約１．０−１０ｍｇ／ｋｇ（体重）程度、更に好ましくは約１．０−３．０ｍｇ／ｋｇ（体重）程度の量で投与する。また投与方法も、最適の治療効果が得られるように適宜調節でき、例えば、毎日数回に分けて投与でき、治療中に危険な状態が生じた場合には、その状態に応じて投与量や投与回数を適宜減らすこともできる。
本願発明の抗癌剤は、所望の効果を得るために、単独で投与することもでき、また他の抗癌剤、化学療法剤、抗炎症剤または免疫療法剤などと適宜組み合わせて用いることもできる。
本発明の抗癌剤と組み合わせて用いる他の抗癌剤としては、例えば、代謝拮抗剤、アルキル化薬、白金系抗癌剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗癌性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ヒト化抗体が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例、試験例等を挙げて、本発明をより一層具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
化合物の調製
ブラジルで採取されたキャロフィラム  ブラジリエンシス（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）を用いて、次のような手順で複数の化合物を得た。まず、Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ乾燥樹皮（６３０ｇ）を粉砕した後、アセトン（３Ｌ）を用いて３回冷浸抽出を行った。得られたアセトン抽出液を減圧下濃縮し、残渣をアセトン抽出物（１９．２６ｇ）とした。このアセトン抽出物について、溶出液としてヘキサン−アセトンを用いて、Ｓｉゲルカラムクロマトグラフィーを行ったところ、８５：１５溶出部より、化合物７（ＧＵＴ−７０）（１３７．８ｍｇ）が得られた。溶出液として、ヘキサン−アセトン、アセトン、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、及びメタノールを用いて、同様の処理を行った結果、化合物７を含む１５種類の化合物が得られた。得られた１５の化合物の構造を図１に示す。
なお、化合物７（ＧＵＴ−７０）は、Ｐａｌｍｅｒ，Ｃ．Ｊ．；Ｊｏｓｅｐｈｓ，Ｊ．Ｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，５３６３−５３６６，ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｔｈｅｒｅｉｎに基づいて同定した。また、他の化合物の構造についても、公知文献に基づいて同定した。
細胞の調製
ヒト白血病細胞ＢＶ１７３、ＳＵＰＢ１５、ＮＡＬＭ６、ＨＬ６０及びＳＥＭをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。また、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ−１、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、Ｎ４２７、Ｎ６９、ＬＵＴ−１３Ｏ、Ｈ８２、ＮＣＩ３４５、ＬＵＴ１３４Ｂを実験に使用した。ヒト白血病細胞株ＢＶ１７３、ＳＵＰＢ１５、ＮＡＬＭ６、ＨＬ６０及びＳＥＭ、並びにヒト小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ−１、ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、Ｎ４２７、Ｎ６９、ＬＵＴ−１３Ｏ、Ｈ８２、ＮＣＩ３４５、ＬＵＴ１３４Ｂは、非働化した１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中、３７℃、５％ＣＯ２の湿気中培養下で維持した。ＳＥＭは、非働化した１０％ＦＣＳを添加したＩｓｃｏｖｅ培養液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で培養した。Ｐ糖蛋白高発現多剤耐性（ＭＤＲ）Ｋ５６２／Ｄ１−９細胞を非働化した１０％ＦＣＳと０．１μＭダウノルビシン（ＤＮＲ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液で維持した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖活性の測定
細胞増殖は、トリパンブルー染色排除方法（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用した細胞数のカウントとＳＦ試薬（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を用いた改変ＭＴＴアッセイ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＴＴ  ａｓｓａｙ）を使用して決定した。白血病細胞は、平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）で１００μｌ媒体中１ウェルあたり２×１０４細胞として培養し、種々の濃度の化合物とともに７２時間培養した。Ｐ糖蛋白高発現細胞におけるＧＵＴ−７０（化合物７）の効果を調べるために、Ｋ５６２／Ｄ１−９細胞を、ＧＵＴ−７０又はＤＮＲについて種々の濃度で７２時間、同様の条件で培養した。それぞれ６つのデータの平均値を使用した。ＭＴＴアッセイと細胞数の間には直線関係が見られた。
ウェスタンブロット分析
蛋白質試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上でエレクトロブロットした。膜を、５％ノンファット乾燥ミルクを含有するＴＢＳＴ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．８，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で飽和させ、ウサギポリクローナルｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰｌ、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５３抗体（１０００分の１に希釈）で一晩インキュベートした。次いでＴＢＳＴで完全に洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）と複合体化したロバ抗ウサギＩｇＧで１時間インキュベートした。検出は、増幅化学蛍光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。
アポトーシス誘導分析
未処理のＮＡＬＭ６及びＧＵＴ−７０で１２時間及び２４時間処理したＮＡＬＭ６細胞について、アポトーシス誘導を調べた。全体の形態を研究するためにＭａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色を用い、またアポトーシスを検出するためにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼアッセイ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴＵＮＥＬ）ａｓｓａｙ）を用いた。薬物処理した後、５×１０４細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．３）で洗浄し、同じバッファーで再懸濁した。細胞懸濁液のサイトスピン調製液を固定し、Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ染色液で染色した。細胞形態は光学顕微鏡で決定した。ＴＵＮＥＬアッセイはアポトーシス検出キット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて指示書に従って行った。簡単に説明すると、ＮＡＬＭ６細胞を、３．７％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中で氷上１０分間再懸濁し、ＰＢＳで濯いだ。次いで固定した細胞をｃｙｔｏｎｉｎ中３０分間、室温でインキュベートし、標識バッファーで洗浄した。細胞は、ラベリングミックス（ｄＮＴＰＭｉｘ、Ｍｎ２＋、ＴｄＴ、ＴｄＴラベリングバッファー）を２５μｌ用いて３７℃で１時間再懸濁し、停止バッファーで反応を停止した。次いで、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ）を含む溶液２５μｌを用いて暗室中室温で１０分間再懸濁した。細胞をＰＢＳで濯ぎ、２μｇ／ｍｌプロピジウムヨウ化物（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）で３０分間対比染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ．ＮＪ）で解析を行った。
正常造血前駆細胞に対するＧＵＴ−７０の毒性評価
正常造血前駆細胞のＧＵＴ−７０に対する感受性を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、Ｇ−ＳＣＦを含む標準メチルセルロース培養アッセイ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）によって調べた。正常造血前駆細胞は、インフォームドコンセントで同意を得た健常なボランティアからの骨髄細胞を使用した。ＧＵＴ−７０の濃度を０，２０又は５０μＭとして、該細胞（１×１０５）を、５％ＣＯ２の培養器内で、３７℃で１２日間、メチルセルロース中で培養した。ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅのコロニーの数は顕微鏡で数えた。各グループの試験に対し３つのティッシュを用い、その平均を求めた。
統計分析
統計は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔを使用した。０．０５より小さいＰ値は統計的に有意と見なし、ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｔｅｓｔｓから引き出した。
細胞増殖抑制評価
Ｃ．Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓからの１５の天然抽出物、すなわち６つのキサントン（Ｘａｎｔｈｏｎｅｓ）（１−６）及び９つの４−フェニルクマリン類（４−ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｓ）（これは、２つの三環型クマリン化合物（７，８）、６つの四環型クマリン（９−１４）及び１つのジメチルシクロプロピル（１５）を含む）が得られた。化合物８は、以前にＣａｌｏｐｈｙｌｌｏｌｉｄｅ（Ｓｐｉｎｏ）又はＯｂｌｏｎｇｕｌｉｄｅ（Ｄｈａｒｍａｒａｔａｎ）として同定されている化合物である。これらについてＭＴＴアッセイを用いて５つの白血病細胞の抗白血病活性を調べた。ＢＶ１７３細胞の増殖は三環形クマリン構造を含む４−フェニルクマリン化合物（化合物７（ＧＵＴ−７０）及び８）によって抑制された。この増殖抑制作用は、０μＭから３０μＭの範囲の濃度で濃度依存的であった。一方、他の１３の化合物は増殖抑制作用を示さなかった。
化合物７と化合物８のどちらもＢＶ１７３細胞の増殖抑制作用を示したが、プロピル基を有する化合物７（ＧＵＴ−７０）の方が、より顕著な作用を示した（図２）。また、化合物７と化合物８のＩＣ５０値（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）はそれぞれ３μＭと９μＭであった。更に、化合物７は、その他５種類の白血病細胞株（Ｋ５６２、ＨＬ６０、ＳＥＭ、ＮＡＬＭ６、ＳＵＰＢ１５）についても、濃度依存的及び時間依存的な細胞増殖抑制作用を示した（図３）。又ＧＵＴ−７０は、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ−１、ＳＢＣ−３、ＬＵＴ１３４Ｂ、Ｈ８２の増殖を着実に抑制した（ＩＣ５０値５μＭ〜８μＭ、図９）。
上記の結果から明らかなように、ブラジルで採取されたＣａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  Ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの茎より抽出された三環形クマリン構造を有する化合物が、白血病細胞及び小細胞肺癌細胞において、顕著な細胞増殖抑制作用を有することが明らかとなった。
化合物７及び８を含む三環形クマリン化合物（Ｉ）は濃度依存的に細胞の増殖を抑制した。一方、他の構造の１３の化合物は増殖を抑制しなかった。このうち、四環形クマリン化合物は、発癌予防作用を示すものも一部に報告されているが、増殖抑制作用は示さなかった。また化合物７の作用は、化合物８よりも顕著であることが分かった。
これらの知見は、三環形クマリン構造が増殖抑制作用に必須の構造であることを示すものであり、また側鎖のプロピル基が抗白血病作用を増加することを示すものである。プロピル基を側鎖に有する化合物７がより効果的な作用を示すのは、膜に対するより強い親和性を有するためと推測される。この側鎖の重要性について得られた知見は、三環系クマリンを含む４−フェニルクマリン化合物の作用の改善につながることが予測される。
アポトーシス誘導による細胞増殖抑制
次に化合物７（ＧＵＴ−７０）の白血病細胞増殖抑制作用とアポトーシスとの関連を調べた。ＮＡＬＭ−６細胞を化合物７の濃度を変えて２４時間さらし、アポトーシスの誘導を形態学的手法とフローサイトメトリーで測定した。５μＭの濃度の化合物７に２４時間さらした後、顕著な細胞のアポトーシスが形態学的に観察された（図４）。化合物７は顕著な数のＴＵＮＥＬ陽性（即ちアポトーシス）細胞を誘導し、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合を減少させた。プロピウムヨード２重染色を用いたＴＵＮＥＬアッセイにより、化合物７がＧ１期の細胞に蓄積され、アポトーシス細胞は主にＧ１／Ｓ期付近で現れた（図５）。
上記のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで５つの異なるヒト白血病細胞に対し増殖抑制作用を示した化合物７の作用について、幾つかの異なる方法を用いて、細胞のアポトーシスを評価した。その結果、化合物７で処理した白血病細胞は、ＤＮＡの開裂を引き起こし、アポトーシスを誘導すること、また、主にＧ１／Ｓ境界でアポトーシスを誘導していることが明らかとなった。
細胞周期関連蛋白に対する化合物７（ＧＵＴ−７０）の影響
ＮＡＬＭ６細胞とＢＶ１７３細胞において、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰｌ、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ５３及びｐ５７のタイムコースを調べた。化合物７は、ＮＡＬＭ６細胞において、癌抑制遺伝子産物ｐ５３及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターであるｐ２７及びｐ５７を誘導したが、ｐ２１は誘導しなかった。またＢＶ１７３細胞において、ｐ２７及びｐ５７を誘導したが、ｐ２１及びｐ５３は誘導しなかった（図６）。また、前述したように、化合物７は、野生型ｐ５３を欠損するヒト白血病細胞株ＨＬ６０にも増殖抑制作用を示した。これらのことから、化合物７は、ｐ５３非依存的であること、即ち、化合物７の細胞増殖抑制作用は、ｐ５３誘導を介したｐ２１の発現による作用でないことがわかった。
また、全ての細胞において、ｐ２７Ｋｉｐ１の発現が増加したが、一方、ｐ５３の発現が増加したのは、ＮＡＬＭ６のみであった。それゆえ、化合物７の処理後の主なシグナル伝達経路はｐ５３−ｐ２１経路ではなく、Ｇ１／Ｓ移行をブロックするｐ２７の経路であることがわかった。
Ｐ糖蛋白高発現細胞Ｋ５６２／Ｄ１−９に対する化合物７（ＧＵＴ−７０）の作用
抗癌剤として一般に用いられているダウノルビシン（ＤＮＲ）は、Ｐ糖蛋白が高発現している細胞であるＫ５６２／Ｄ１−９に対し、Ｐ糖蛋白が発現していない親株Ｋ５６２の約７５倍の耐性を示した。これに対し、化合物７の感受性は、Ｐ糖蛋白が高発現しているＫ５６２／Ｄ１−９に対しても、Ｐ糖蛋白が発現していない親株Ｋ５６２に比べて低下しなかった（図７）。
これらの知見は、化合物７（ＧＵＴ−７０）が、Ｐ糖蛋白関連ＭＤＲシステムに関与しないことを示すものである。化合物７（ＧＵＴ−７０）は、ＭＤＲの誘導を克服する好適な候補成分となるものと思われる。再発患者は、抗癌剤の排出ポンプとなるＰ糖蛋白を誘導するＭＤＲを有し、多剤耐性を示すことが多く、抗癌剤としての化合物７の臨床試験は、当初再発又は難治性の患者に適用されるものと考えられる。
正常造血前駆細胞に対する化合物７の安全性評価
正常造血前駆細胞を２０μＭと５０μＭの化合物７（ＧＵＴ−７０）で処理した結果、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの数は、それぞれコントロールの７５％±１０％、５％±２％であることが明らかになった。またＢＦＵ−Ｅコロニーの数は、それぞれコントロールの８０％±１０％、３％±１％であることが明らかになった（図８）。これらの結果から、濃度２０μＭまで、化合物７（ＧＵＴ−７０）の正常造血前駆細胞に対する増殖抑制作用が極めて低いことが明らかとなった。このことから、化合物７（ＧＵＴ−７０）は、安全域が大きい化合物であることがわかった。
上記の結果に示されるように、本願発明の医薬組成物は、顕著な癌増殖抑制作用を有し、癌治療、特に白血病及び小細胞肺癌の治療に対し、優れた効果を奏し得るものである。
本願発明の抗癌剤は、従来とは異なる作用メカニズムを有し、ｐ５３非依存的に癌細胞増殖を抑制する。従って、本願発明は、従来の抗癌剤などでは効果が期待できなかった癌などに対しても有効な効果が期待できる。また、異なるメカニズムを有する薬剤と併用することによって、より広範な種類の癌に対する治療や副作用の軽減などを行うことが可能となる。
更に、本願発明の医薬組成物は、Ｐ糖蛋白が誘導された多剤耐性癌細胞に対しても優れた効果を維持する。従って、他の抗癌剤が効かなくなった患者や多剤併用療法を必要とする患者に対しても有効に用いることができる。
しかも、本願発明は、安全域が大きく、臨床での使用に適している。
このように、本願発明は、癌治療において切望されている種々の要件を備えており、それらの疾患の治療に優れた手段を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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