(57)【要約】競合物質より目的物質に親和性がある第一抗体と、目的物質より競合物質に親和性がある第二抗体の２種類の抗体を用い、これらの２種類の抗体に検体を作用させることにより、まず検体中の競合物質が第二抗体に先に結合し、そのため検体中で競合物質に対する目的物質の比が大きくなることにより、目的物質が第一抗体に結合しやすくなり、その結果、目的物質の反応性が第一抗体を単独で用いるより大きくなるため、検体中に含まれる競合物質の影響を除去して正確に検体中の目的物質を測定できる。
2004059320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の目的物質を２種類の抗体を用いて測定する免疫測定法であって、
（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が、第一抗体の目的物質への親和性より大きい、第一抗体および第二抗体の２種類の抗体を用い、
担体に吸着している第一抗体と、第二抗体とに、検体中の目的物質および競合物質を結合させ、
次いで、結合した目的物質のレベルを測定することにより、該検体中の目的物質を測定する免疫測定法。
【請求項２】
さらに、第二抗体の目的物質への親和性が、第一抗体の競合物質への親和性より大きい請求項１記載の免疫測定法。
【請求項３】
目的物質が活性型酵素であり、かつ結合した目的物質のレベルを測定することが該活性型酵素の酵素活性を測定する請求項１または２記載の免疫測定法。
【請求項４】
競合物質が該酵素活性のない物質である請求項３記載の免疫測定法。
【請求項５】
競合物質が酵素分解産物である請求項３または４記載の免疫測定法。
【請求項６】
活性型酵素が酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）である請求項３から５のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項７】
担体が不溶性固相支持体である請求項１から６のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項８】
第一抗体を吸着させる担体が固相支持体であり、かつ第二抗体が溶液中に分散している担体に吸着しているか、または溶解している請求項１から７のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項９】
検体中の目的物質を２種類の抗体を用いて免疫測定するためのキットであって、
（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が第一抗体の目的物質への親和性より大きい、第一抗体および第二抗体の２種類の抗体を含むキット。
【請求項１０】
第一抗体と第二抗体が担体に吸着されている請求項９記載のキット。
【請求項１１】
第一抗体が固相支持体に吸着されており、かつ第二抗体が溶液中に分散可能な担体に吸着されているか、または溶解している請求項９または１０に記載のキット。
【請求項１２】
分子量約５５８０Ｄａ、５７９５Ｄａ、６８６０Ｄａまたは７０７５Ｄａの酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）のフラグメントからなる骨疾患診断用マーカー分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、検体中の目的物質を２種類の特徴ある抗体を用いて正確に測定することができる免疫測定法およびそれに用いるキットに関する。更に詳細には、競合物質より目的物質に親和性がある第一抗体と、目的物質より競合物質に親和性がある第二抗体の２種類の抗体を用い、これらの２種類の抗体に検体を作用させることにより、まず検体中の競合物質が第二抗体に先に結合し、そのため検体中で競合物質に対する目的物質の比が大きくなることにより、目的物質が第一抗体に結合しやすくなり、その結果、目的物質の反応性が第一抗体を単独で用いるより大きくなるため、正確に目的物質を測定できる免疫測定法およびそれに用いるキットに関する。
【背景技術】  測定目的物を含む検体中には様々な様態の物質が存在するが、あるものでは測定目的物質とそれと競合する物質が同時に存在することがある。例えば血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ：Ｔａｒｔｒａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている物質である（骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビュー社，１９９５）が、血清中においては酵素活性を持つ酵素の他に酵素分解産物であるフラグメントが同時に存在することがわかっている（Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３３７−１３４５，２０００；およびＣｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４７：７４−８０．２００１）。
ところで、血清中酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より０〜５の６つのバンドに分けられ、その中で５番目が酒石酸抵抗性であり、Ｂａｎｄ  ５酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ  ５：Ｔａｒｔｒａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５）と呼ばれている。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い５ａと、ほとんどシアル酸結合のない５ｂに分けられる。そして、５ａは血小板やその他からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、５ｂのみが骨吸収に伴い変動するため、５ｂが破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている。またＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１４９７．２００１）でも破骨細胞由来のＡＣＰを、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと略記することを勧めている。よって本明細書においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となるＡＣＰを意味するものはＴＲＡＣＰ  ５ｂとして、また破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）は同義としてすべてＴＲＡＣＰ  ５ｂと表記する。
検体中にはＡＣＰとして、ＴＲＡＣＰ  ５ｂ以外に赤血球由来や血小板由来酸性ホスファターゼが存在する。すなわち、検体の採取により溶血が生じたとき、赤血球由来酸性ホスファターゼは検体中に含まれてくるし、検体として血清を用いる場合、血清製造時の血液凝固過程で血小板が破壊されて血小板由来酸性ホスファターゼが検体中に含まれてくる。そのため、従来のＴＲＡＣＰ活性測定法は、破骨細胞特異的ＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性を測定しているとは言えない。この測定法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りのＴＲＡＣＰ活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を用いて測定する方法が知られている（日大医誌．４９：９０４−９１１．１９９０；およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：４５８−４６２．１９８７）。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できるが、血小板由来酸性ホスファターゼの影響は除くことは出来ない。さらにより特異的な活性測定法として、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用したＴＲＡＣＰ  ５ｂ測定法がある（特開平１０−３７１９８号公報）。しかしながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、ＴＲＡＣＰ  ５ａの影響を除くことができず、またＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点でさらなる改良が求められている。
免疫的測定法では、Ｍａｒｉｕｓ  ＥやＳａｒｉ  Ｌらのポリクローナル抗体を用いる測定方法（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．７１：４４２−４５１．１９９０；およびＣｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４６：１７５１−１７５４．２０００）およびＪｕｓｓｉ  Ｍ．ＨａｌｌｅｅｎやＨｅａｔｈｅｒ  Ｂｕｌｌらのモノクローナル抗体を用いる方法（Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１３：６８３−６８７．１９９８；Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．７０：１４３−１４９．１９９９；Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１４：４６４−４６９．１９９９；Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４５：２１５０−２１５７．１９９９；およびＣｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４６：１７５１−１７５４．２０００）では、Ｂａｎｄ  ５全体を測定してしまうため、ＴＲＡＣＰ  ５ａの影響を無視できない。また、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを特異的に測定しているとしているＨａｌｌｅｅｎらの方法は、より破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性に特異的であるが、健常者検体と骨吸収が亢進している患者検体での差が小さく、骨吸収マーカーとして感度は十分とは言えない。これらはこれまで作製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する特異性が低いことがひとつの原因であったと思われる。また、ＴＲＡＣＰは血清中に酵素活性を持たないフラグメントを活性酵素の１０倍量も大量に含むとの報告があることからも、このフラグメントが血清中で活性型酵素と競合しているため、これまでは反応系に問題があるため特異性が低かったとも考えられるのである。
このような場合でも、これまでは酵素活性を持つ完全な物質：活性型酵素（Ｉｎｔａｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ）と酵素分解産物（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に共通な抗原を利用して免疫測定法などによって定量を行ってきた。しかしこの結果モノクローナル抗体のようにエピトープが限定された場合、測定できる分解フラグメントとできないフラグメントが現れたりするため、同一の目的物を測っても各キットによって相関性がなくなるなどの問題があると考えられる。また、先に例を挙げたＴＲＡＣＰはフラグメント量が臨床的に骨吸収を反映しないという報告もあり（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１３３７−１３４５，２０００；およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：７４−８０，２００１）、酵素活性体だけを測定することが求められる良い例と考えられる。このような場合フラグメントを取り除き、酵素量だけを測定する必要があるが、一般的に活性測定法によるＴＲＡＣＰの測定は、この活性のないフラグメントが酵素と競合するため測定が正確に行われなかったと考えられる。また、これまでは明確な蛋白質フラグメント分離を行うためのフラグメント特異的抗体が存在せず、手段自体が存在しなかった。
【発明の開示】
本明細書で説明するＴＲＡＣＰはその精密測定が臨床的に有意な意義を持つと言われながら長く不可能であった。その理由には２つが考えられる。１点目は破骨細胞の活性を表すＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する特異性の高い抗体がなかったことである。２点目は血清中にＴＲＡＣＰ酵素分解蛋白質フラグメントが活性酵素以上に大量に存在することである。
よって本発明ではＴＲＡＣＰ活性酵素に結合定数値の高い第一抗体と、酵素とはほとんど反応せず不活性分解酵素と結合する第二抗体を開発し、同一反応系中で利用することによって、分解物の影響を回避して酵素活性量のみを正確に測定しようとするものである。
本発明はかかる問題に鑑み、まず測定対象目的物質と反応性の高い第一抗体と、不活性フラグメントなど競合する物質と強く反応する第二抗体を組み合わせて使用することで反応系中の競合物質の影響を除き、活性酵素等の目的物質を特異的に精密測定する免疫測定法を提供する。
しかして、本発明は、検体中の目的物質を２種類の抗体を用いて測定する免疫測定法であって、
（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が第一抗体の目的物質への親和性より大きい、第一抗体および第二抗体の２種類の抗体を用い、
担体に吸着している第一抗体と、第二抗体とに、検体中の目的物質および競合物質を結合させ、
次いで、結合した目的物質のレベルを測定することにより、該検体中の目的物質を測定する免疫測定法である。
更に本発明は、検体中の目的物質を２種類の抗体を用いて免疫測定するためのキットであって、
（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が第一抗体の目的物質への親和性より大きい、第一抗体および第二抗体の２種類の抗体を含むキットである。
【図面の簡単な説明】  図１はサイファージェン社のプロテインチップシステムを用いた解析結果の簡易図面を示す。（１）、（２）からＴｒｋ４９が小児血清中に特異的に反応するフラグメントを４種類持っている事がわかった。一方Ｔｒｋ６２では（３）、（４）から特異的に反応するフラグメントは全くなかった。
図２では骨粗鬆症患者におけるホルモン治療療法前後の血清を測定している。治療前に認められる２つのピークは治療後には消失している。このことからもこれらのフラグメントが骨吸収特異的である事が考えられる。
図３は、同一濃度の抗体Ｔｒｋ４９とＴｒｋ６２を利用したＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｔｒｋ４９は弱い反応性しか示さなかった。しかしＴｒｋ４９とＴｒｋ６２を同時に利用したプレートではＴｒｋ６２を単独で使用した場合よりも反応性が向上している。
図４は、抗体Ｔｒｋ６２をプレートに吸着させ、抗体Ｔｒｋ６２、Ｔｒｋ４９のいずれかをラテックス粒子に吸着させてＥＬＩＳＡを行った結果を示す。プレートと競合するＴｒｋ６２抗体感作ラテックス試薬では添加ラテックス試薬濃度が高くなるにつれて発色が弱くなっている。しかしＴｒｋ４９感作ラテックス試薬では０．１％〜０．１５％実験区では逆に酵素の発色値が強くなった。よってＴｒｋ４９抗体感作ラテックス試薬はプレートに吸着されたＴｒｋ６２と併用することで効果をあげられることがわかった。
発明を実施するための形態
本発明の免疫測定法では、検体中の測定対象物である目的物質を測定するために第一抗体と第二抗体の２種類の抗体を用いる。第一抗体と第二抗体とは、（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が第一抗体の目的物質への親和性より大きいものである。ここで競合物質とは、測定対象物である目的物質と類似の抗原性を有し、目的物質に対する抗体を作成した場合に目的物質と競合してその抗体と結合する性質を有する物質を指す。例えば、目的物質が蛋白質や酵素である場合には、その競合物質としては、それら蛋白質や酵素の断片フラグメント、それらを構成するアミノ酸配列においてアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した変異体、それらにリン酸エステル基が付加したり糖鎖部分が変化した修飾体などが挙げられる。
本発明では、測定対象である目的物質の代表的なものとして活性型酵素が挙げられ、目的物質が活性型酵素の場合の競合物質としては、該酵素活性のない物質、例えば酵素が分解された産物、即ち、酵素分解産物が代表的なものとして挙げられる。
本発明における第一抗体および第二抗体は、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。
本発明で用いる第一抗体および第二抗体は、例えば、測定対象である目的物質を抗原として動物に免疫し、その脾臓細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作成し、それらのハイブリドーマが産生する各種のモノクローナル抗体から、第一抗体と第二抗体の２種類の抗体として、（ｉ）第一抗体が目的物質と競合物質に親和性があり、（ｉｉ）第一抗体が競合物質より目的物質に親和性があり、（ｉｉｉ）第二抗体が目的物質より競合物質に親和性があり、かつ（ｉｖ）第二抗体の競合物質への親和性が第一抗体の目的物質への親和性より大きい、２種類のモノクローナル抗体を選択することにより、作成することができる。本発明においては、第二抗体は目的物質と競合物質とのいずれにも親和性のある抗体であっても構わない。目的物質と競合物質に対して上記した４つの条件を満たす２種類のモノクローナル抗体を得るためには、例えば、各種モノクローナル抗体の目的物質および競合物質に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法などによって測定し、その測定結果から上記４つの条件を満たす２種類のモノクローナル抗体を選択すればよい。あるいは、目的物質と競合物質に対するモノクローナル抗体の結合定数を公知の方法（蛋白質・酵素基礎実験法．南江堂）に従って測定し、その結果から２種類のモノクローナル抗体を選択することもでき、また、モノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマトカラムを作成し、それらに吸着する目的物質と競合物質を検定することによっても２種類のモノクローナル抗体を選択することができる。
第一抗体と第二抗体の２種類の抗体が、抗血清あるいはポリクローナル抗体の場合には、例えば、測定対象である目的物質で、アジュバントを変えたり免疫条件を変えたりして各種条件下に動物を免疫し、得られる抗血清あるいはポリクローナル抗体について、上記したモノクローナル抗体と同様の方法で目的物質や競合物質との結合性を測定し、上記４つの条件を満たす２種類の抗体を選択すればよい。
本発明で用いる２種類の抗体の代表例として、破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ  ５ｂ測定に用いることができる２種類のモノクローナル抗体を挙げることができる。本発明により得られたＴＲＡＣＰ  ５ｂについての２種類のモノクローナル抗体は、これまで報告されてきたモノクローナル抗体よりも更にＴＲＡＣＰ  ５ｂと反応性が高くフラグメントとほとんど反応しない第一のモノクローナル抗体と、不活性酵素フラグメントと反応し活性酵素とほとんど反応しない第二のモノクローナル抗体である。これら２種類の抗体を利用して、ＴＲＡＣＰ  ５ｂ不活性フラグメントとその他の血中アイソザイム（赤血球、血小板、好中球、マクロファージ）の影響を殆ど受けない破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ  ５ｂ特異的免疫測定法が可能となった。
以下に、これらのモノクローナル抗体を例として、本発明で用いる２種類の抗体について更に詳細に説明する。
上記モノクローナル抗体はヒト破骨細胞由来精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫原として使用することにより得ることができる。以下に説明する方法では正常破骨細胞による抗原により免疫を行ったが、これに限らず破骨細胞腫瘍などのＴＲＡＣＰ  ５ｂも抗原として用いることができる。
上記モノクローナル抗体は精製ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫原として動物を免疫し、その抗ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによってえられるハイブリドーマによって産生される。
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち上述のようにして得たヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂをフロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等既に公知のものを用いてともに混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞を融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットにより得ることができる。
上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。またセンダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
融合した細胞からヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地及びＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択するのである。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体が含まれている場合には、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂをプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等、２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ特異的抗体のスクリーニングができることになる。つまりヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂプレートで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで陰性のクローンを選択するのである。
また、同時に抗マウスイムノグロブリン抗体をマイクロタイタープレートにまき、ここに融合細胞培養上清を加えて反応させ、更に精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂを加えて活性酵素を結合させて免疫複合体を作製し、この結合酵素活性をｐＮＰＰのような発色基質を利用して測定することもできる。
本発明の第一のモノクローナル抗体としては、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを特異的に認識するモノクローナル抗体のうち、特に活性型ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂと反応し、かつ赤血球、血小板、好中球、前立腺由来の酸性ホスファターゼ及びポテトＡＣＰと交差反応しないもので、更に不活性フラグメントとの反応性が低いものが含まれる。たとえば本発明者が樹立したハイブリドーマＴｒｋ６２が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また、第二のモノクローナル抗体としては、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ不活性フラグメントを特異的に認識するモノクローナル抗体のうち、特に活性ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂとほとんど反応せず、かつ赤血球、血小板、好中球、前立腺由来の酸性ホスファターゼ及びポテトＡＣＰと交差反応しないものが含まれる。たとえば本発明者が樹立したハイブリドーマＴｒｋ４９が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
また特に本発明に使用する第一抗体としては活性酵素を特異的に結合するために不活性ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメントよりも活性ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂに親和性が高い抗体が好ましく、特に好ましくは第二抗体の活性ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ結合定数よりも高い結合定数を持つものがあげられる。また第二抗体としては第一抗体の活性ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ結合定数よりも高い不活性型フラグメント結合定数を持つものがふさわしい。第一抗体としてはたとえば本発明者が確立したハイブリドーマＴｒｋ６２が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。また第二抗体としては本発明者が確立したハイブリドーマＴｒｋ４９が産生するモノクローナル抗体が挙げられる。上記ハイブリドーマＴｒｋ４９およびＴｒｋ６２は、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）にそれぞれ、平成１４年１１月２７日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭＢＰ−８２４９として、また平成１４年２月１４日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８９０として寄託されている。
上記ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
上記の上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常法を用いることができる。たとえば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
上記方法によって精製された本発明によるモノクローナル抗体によって血清検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを精密測定することができる。以下に本発明の免疫測定法について説明する。
本発明の免疫測定法は、例えば、以下のようにして行える。まず、第一抗体及び第二抗体をプレート等の不溶性固相支持体に吸着させておき、それ以外は、通常のＥＬＩＳＡ法と同様の操作で実施できる。まず、２種抗体が吸着しているその支持体に、測定すべき検体を加える。この場合、結合定数の違いから、検体中の競合物質は、主に、支持体に吸着している第二抗体と抗原抗体反応し、次いで、検体中の目的物質は、主に、支持体に吸着している第一抗体と有利に抗原抗体反応する。次いで、その固相支持体を、場合により洗浄した後、固相に結合した目的物質のレベルを測定することにより、検体中の目的物質を測定することができる。このとき、目的物質がＴＲＡＣＰ５ｂのような活性型酵素の場合、ｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸）のような対応する基質溶液をその固相支持体に加えて酵素反応させ、固相に結合した目的物質のレベルを測定することにより、検体中の目的物質を精密に測定できる。
また、本発明においては、第一抗体を吸着させる担体が不溶性固相支持体であり、第二抗体は、ラテックス等の溶液中で分散できる担体に吸着させるか、溶解させてもよく、その場合は、例えば、以下のようにして目的物質を測定できる。まず、第二抗体をラテックス等の溶液に分散しうる担体に感作させておくか溶解させておき、一方、第一抗体を固相支持体に吸着させておく。次いで、その固相支持体に、その第二抗体を含む溶液と測定すべき検体とを加えることにより、検体中の競合物質を主に第二抗体と抗原抗体反応させ、また、目的物質を主に第一抗体と抗原抗体反応させる。次いで、その固相支持体を、場合により洗浄した後、固相に結合した目的物質のレベルを測定することにより、検体中の目的物質を測定することができる。このとき、目的物質がＴＲＡＣＰ５ｂのような活性型酵素の場合、ｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸）のような対応する基質溶液をその固相支持体に加え、固相に結合した目的物質を測定することにより、検体中の目的物質を正確に測定できる。
以上に説明した通り、通常、第一抗体を吸着させる担体は、不溶性固相支持体である。第二抗体は、不溶性固相支持体に吸着させておくか、ラテックス等の溶液中に分散させておくか、溶解させておいて使用される。
不溶性固相支持体とは、ＥＬＩＳＡ法等の固相免疫測定法に用いるものであれば限定されない。例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどが挙げられる。これらのそれ自体公知である固相に直接、または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して本発明によるモノクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であることが多い。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体にヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定する検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し発色基質を加え反応させる。基質には既知のｐＮＰＰなどを用いることができる。
第二抗体を吸着する溶液中に分散できる担体とは、ラテックス粒子、磁性粒子、脂質粒子等を例示できる。更に化学合成ポリマー、天然ポリマー、例えば、デキストランなどに第二抗体を結合させて溶液中に分散させたおいたものも使用できる。この場合、ＥＬＩＳＡ法の緩衝液試薬中に競合物質を結合する第二抗体を添加することによって固相プレート上の目的物質の測定を有利にすることができる。不溶化担体に第二抗体を結合させて固相プレートに吸着した第一抗体と競合させ、目的物質測定を有利にすることができる。また化学合成もしくは天然ポリマー、例えばデキストランなどに第二抗体を結合させて緩衝液試薬中に添加することで目的物質の測定を有利にすることができる。
本発明の免疫測定法を行うためのキットは、上記した第一抗体と第二抗体との２種類の抗体を含むものであり、これらは、必要に応じて、上記したように、不溶性固相支持体あるいはラテックス等の溶液中で分散できる担体に吸着されていてもよい。また更に必要に応じて、抗体に結合した目的物質を測定するための試薬を含んでいてもよい。
本発明では、上記したハイブリドーマＴｒｋ４９およびＴｒｋ６２から産生されるモノクローナル抗体Ｔｒｋ４９およびＴｒｋ６２を用いて、後の実施例１で詳述するように、プロテインチップテクノロジーにより、各種血清中のＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメントを実際に調べた結果、骨吸収が活発な小児血清あるいは骨粗鬆症患者血清中に、分子量約５５８０Ｄａ、５７９５Ｄａ、６８６０Ｄａまたは７０７５ＤａのＴＲＡＣＰ  ５ｂのフラグメントが見出されることが明らかになった。従って、これらのＴＲＡＣＰ  ５ｂのフラグメントが、骨疾患、例えば骨吸収が活発な骨疾患の診断用マーカー分子となり得ることが判明した。従って、患者からの血清、血漿、血液などの検体中にこれらのマーカー分子が存在するか否かを検出すことにより、あるいはこれらのマーカー分子の量を測定することにより、骨疾患を診断することができる。
マーカー分子の存否の検出あるいはその量の測定は、現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、質量分析法、免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、ガスクロマトグラフィー法などが挙げられる。質量分析法としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）により行う方法が挙げられる。レーザーイオン化飛行時間型質量分析計としては、表面増強レーザー脱離イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）、マトリックス支援レーザーイオン化（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法）などを例示できる。例えば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法を用いる場合、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発されたプロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を使用することができる。この機械はＳＥＬＤＩ（ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーである。その詳細はＷＯ  ０１／２５７９１  Ａ２号公報、特開２００１−２８１２２２号公報等に詳しい。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ法の場合、通常、検体を、前処理した後、チップに吸着させて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ質量計に付す。検体が血清の場合、アルブミンの吸着剤を用いるか、イオン交換チップでアルブミンが電荷をもたなくなるまでバッファーで洗浄してアルブミンを系から除去することが好ましい。これらの方法に用いられるプロテインチップとしては、上記したマーカー分子を吸着できるチップであれば特に限定しない。例えば、疎水性やイオン交換などの蛋白質に親和性を持つ官能基が修飾されているチップ（ケミカルチップともいう）、目的の蛋白質に対する抗体を固定化したチップ（バイオケミカルチップ）等を例示できる。
その他の質量分析法としては、例えばＥＳＩ法（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）による質量分析法が挙げられる。ＥＳＩ法の場合は、プロテアーゼ処理等の前処理した検体を、高速液体クロマトグラフィー等の分離手段と直結した質量分析計に付するのが好ましいことが多い。免疫測定法としては、マーカー分子に対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を作成し、従来知られている蛋白質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
これらの方法以外にも、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などが挙げられる。これらの方法も既に当業者に周知であり、それらの周知の方法をそのまま採用することにより、測定することができる。
以下に好ましい実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら限定されるものではない。
【実施例１】（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
抗ヒトＴＲＡＣＰモノクローナル抗体作成のための抗原として、ヒト破骨細胞由来のＴＲＡＣＰ  ５ｂを準備した。以下に精製法を述べる。
インフォームド・コンセントを行った後、外科的手術により摘出されることになったヒト大腿骨骨頭部１３０ｇを液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．３Ｍ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０２％  ＮａＮ３，１ｕｎｉｔ／ｍｌアプロチニンｐＨ７．５）２００ｍＬ中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。４℃一晩攪拌後、１０，０００ｒｐｍ，２０分遠心分離し、その上清を１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．２に透析後ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（φ４０ｍｍ×４０ｃｍ）（ＳＩＧＭＡ）にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（０−０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性は、基質パラニトロフェニルリン酸を用い測定し、活性の高い部分をプールした。それを濃縮後、０．７Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２に透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（φ１６ｍｍ×６０ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にアプライし、同様に溶出したフラクションの酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性部分をプールした。それを２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２で２倍に希釈し、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４の直線濃度勾配（０．３５Ｍ−１Ｍ  ＮａＣｌ）塩濃度勾配をかけ溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ高活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製破骨細胞由来酸性ホスファターゼを０．４ｍｇ得た。
なお、タンパク量はＡ２８０により確認し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＴＩＦＣＯ）を行い銀染色の結果、分子量３５，０００付近でシングルバンドであることにより確認した。単一バンドになった酵素は精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂとして免疫抗原とした。
（２）免疫
精製ヒト破骨細胞由来酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）を２５０μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈し、２５μｇ（１００μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）１００μｌと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ  ６週齢雌マウス（日本クレアー）にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量のＴＲＡＣＰ  ５ｂ（２５μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド（ＷＡＫＯ）と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫としてＴＲＡＣＰ  ５ｂ  ２５μｇ／ｍｌを５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後にＴＲＡＣＰ  ５ｂにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）（ＭＥＲＫ）を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。その融合比率は脾臓細胞数８×１０７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、４：１であった。融合細胞は１０％  ＦＣＳ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）α−ＭＥＭ（ＩＲＶＩＮＥ）ＨＡＴ（コスモバイオ）培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート（住友ベークライト）に分注して３７℃、５％  ＣＯ２条件にて培養した。
（４）スクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製したＴＲＡＣＰ  ５ｂを５０ｍＭクエン酸緩衝液中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル（Ｎｕｎｃ）に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｎａｋａｌａｉ）クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チェックした。
（５）抗体の確認
ＥＬＩＳＡによって精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂとの反応性を確認すると、クローンＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２ではアフィニティーに差があったが、プレートと感度よく反応した。その結果、クローンＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２をＴＲＡＣＰ  ５ｂを認識したものとして選択したのである。得られた抗体をモノクローナル抗体タイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて検定した結果、以下の表１のような結果であった。
2004059320.tif 000003
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（５）で得られたハイブリドーマＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２  １×１０７細胞個をプリスタン（アルドリッチ）０．５ｍｌ投与後２週間のＢａｌｂ／ｃマウス（日本クレアー）、１０週齢、雌性に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。上記（４）のスクリーニングで行ったＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、プロテインＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。するとＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２ともに非還元では分子量約１５０，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約５０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製された抗体はＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２ともにマウス１匹あたり約１５ｍｇまたはそれ以上であって工業的利用を行うには十分量であった。
（７）特異性検定
モノクローナル抗体Ｔｒｋ４９、Ｔｒｋ６２の特異性を調べるためにさまざまなアイソフォーム（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ、赤血球、血小板、ＰＡＰ（ＳＩＧＭＡ）、ポテトＡＣＰ（ＳＩＧＭＡ社））を用いて下記の実験を行った。測定方法は簡単には以下のとおりである。
固相プレート（Ｎｕｎｃ）上にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを利用して精製したモノクローナル抗体を２μｇ／ｗｅｌｌになるように分注し、４℃で２日間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）洗浄液にて３回洗浄した後、１．５％ＢＳＡ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）を２００μＬ加ええて４℃で一晩ブロッキングした。このようにして作製したプレートを先の洗浄液で１回洗浄して、各種アイソフォームの酵素活性を全て１０ＩＵ／Ｌにあわせ、その１００μｌを抗体結合プレート上に加えた。室温で２時間反応させ、反応終了後、前出の洗浄液にて３回洗浄して１００μｌの酸性ホスファターゼ基質を加えて、３７℃、１時間反応させて抗体が捕らえた酵素が基質を発色させることから検体中酵素量の定量を行った。測定は反応停止液５０μｌを加えた後に測光波長４０５ｎｍで行った。
結果としてＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２はＴｒＡＣＰ  ５ｂとしか反応せず、他アイソフォームとの交差性を示さないことから非常に特異性の高いモノクローナル抗体であることがわかった。
（８）ＳＥＬＤＩ法を利用したフラグメント確認
近年、ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）と飛行型質量分析計を組み合わせたプロテインチップテクノロジーが米国Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社により開発され、新規腫瘍マーカーの検出などへ臨床応用が始まっている。本発明者らは本テクノロジーを応用し、樹立したハイブリドーマＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２が産生するモノクローナル抗体を利用して血清中ＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメントを実際にとらえることを試みた。
１）ＰＳ２０チップによる実験
はじめに本発明者らはＰＳ２０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）を用いて抗体Ｔｒｋ４９、Ｔｒｋ６２と反応する血清中のＴＲＡＣＰ  ５ｂ、またはそのフラグメントを検索した。ＰＳ２０チップは抗体結合チップのことであり、初めに金属上に結合させた抗体と検体中の反応物質を抗体に結合させ、レーザーによって抗体から解離した抗体反応物が真空中を飛行することから、その量と分子量を決定するという特徴を持っている。以下にプロテインチップアレイ実験操作法を簡単に述べる。はじめに合成培地Ｓ−ｃｌｏｎｅ（三光純薬）に馴化させたハイブリドーマＴｒｋ４９、Ｔｒｋ６２を培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｉａ）によってそれぞれの抗体を精製した。この抗体濃度を５００μｇ／ｍＬにあわせてその２μＬをＰＳ２０チップにアプライし、室温にて１時間反応させた後５μＬのブロッキングバッファー（１ＭエタノールアミンＰＢＳ  ｐＨ８．０）（ＷＡＫＯ）を加え室温１０分間反応させた。ブロッキング後８ｍＬの洗浄バッファー（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  １００  ＰＢＳ）にて室温、５分間洗浄した。これを２回繰り返しＰＢＳで軽くすすいだ。反応スポットの周りを軽く拭いて３μＬの健常人ボランティア血清、１２歳以下の小児血清、骨粗鬆症患者ホルモン補充治療前、骨粗鬆症患者ホルモン補充治療後の４検体を別々にアプライし、４℃で一晩反応させた。反応終了後、キムワイプ（十條キンバリー）にてサンプルを吸収し、８ｍＬの洗浄バッファー（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  １００  ＰＢＳ）にて室温、５分間洗浄した。これを２回繰り返してＰＢＳで軽くすすぎ、キムワイプ（十條キンバリー）にて水滴を拭き取り０．５μＬの飽和シナピン酸（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）／５０％アセトニトリル（Ｗａｋｏ）／０．５％ＴＦＡ（Ｗａｋｏ）溶液を２回添加した。作製したプロテインチップアレイは、プロテイン・バイオロジー・システムＩＩ・マス・スペクトロメーター（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）によって読み取った。
２）ＰＳ２０チップによる実験結果
図１、図２に測定データを示す。このデータフォーマットでは、ＰＳ２０プロテインチップから脱着されたサンプルのタンパク質の分子量を横軸に、その分子量で検出器に到達した分析物の量を反映するピークを縦軸で表すことができる。この時の縦軸の単位はＡｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｕｎｉｔｓ（ＡＵ）とする。本実験では小児血清及び骨粗鬆症患者ホルモン補充治療前血清が骨吸収の活発な血清である。結果としてＴｒｋ４９抗体の実験区にのみ骨吸収の活発な上記２つの実験区で５７９５Ｄａ付近、６８６０Ｄａ付近のピークが認められた（図１の（２）、図２の（５））。このピークは骨吸収の緩やかな成人血清では認められない（図１の（１）、（３））。ピークの大きかった小児血清では更に５５８０、７０７５（図１の（２））Ｄａ付近のピークも確認できる。骨粗鬆症患者の５７９５Ｄａ付近、６８６０Ｄａ付近のピークはホルモン補充療法で治療後に消えている（図２の（６））。なお、ピークの分子量標記で付近としているのは、この実験では、通常、２０以内の測定誤差があるときがあるからである。また、Ｔｒｋ６２抗体を用いた実験区では骨吸収の活発な血清からは、特異的なフラグメントを認めなかった（図１の（３）、（４））。結果として発明者はこれまで知られていなかった全く新規のＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメント数種類を発見することに成功した。実際にはサイファジェン社ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＡＳによって約５７９５Ｄａ付近、５５８０Ｄａ付近、６８６０Ｄａ付近、７０７５Ｄａ付近に検出される蛋白質またはその分解物である。これらのフラグメントは全く新規の物質であり、骨吸収や病態を反映するマーカーである。このフラグメント結合量は各抗体の結合定数とよく相関していた。特に注目すべきはＴｒｋ６２の反応性である。Ｔｒｋ６２はＴｒｋ４９によって結合するフラグメントとは殆ど反応せず、活性酵素に対する特異性が高いことが証明された。逆にＴｒｋ４９はフラグメントと非常によく反応していた。これらの事実より本発明の２種類のモノクローナル抗体、Ｔｒｋ４９及びＴｒｋ６２は、それぞれ、フラグメント、酵素、に対して特異性が高く、そのため、本発明において、それら２つの抗体を用いた酵素免疫測定法により、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを特異的、高感度に測定できると考えられる。
（９）モノクローナル抗体結合定数の測定
抗原に対する結合定数を求めるため下記の実験を行った。方法は（蛋白質・酵素基礎実験法．南江堂）に従って行った。２種類の抗原溶液（Ａ）精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂ及び（Ｂ）Ｔｒｋ４９アフィニティカラム精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメント（少なくとも分子量約５５８０Ｄａ、５７９５Ｄａ、６８６０Ｄａおよび７０７５ＤａのＴＲＡＣＰ  ５ｂのフラグメントを含むＴＲＡＣＰ  ５ｂのフラグメントの混合物）を５μｇ／ｍＬ  ２０ｍＭクエン酸緩衝液となるように調製し、５０μＬづつ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に感作させた。４℃、一晩静置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭトリス緩衝液２００μＬでプレートを３回洗浄し、ブロッキング剤（１．５％ＢＳＡ  １０％サッカロースを含む２０ｍＭトリス緩衝液）を１００μＬづつ加えて４℃一晩静置した。再び０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭトリス緩衝液２００μＬでプレートを３回洗浄し、１２段階に希釈した抗体溶液（０、０．１、０．１５、０．２０、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．７５、１．０μｇ／ｍＬ）を２０μＬづつ加えて条件（ｉ）３７℃、（ｉｉ）４℃でそれぞれ２時間反応させた。１次反応後０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭトリス緩衝液２００μＬでプレートを３回洗浄し、１／１０００希釈標識２次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識抗体：Ｚｙｍｅｄ）５０μＬを加えて３７℃で２時間反応させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭトリス緩衝液２００μＬでプレートを３回洗浄した後に３ｍｇ／ｍＬ  ＯＰＤ溶液１００μＬを加えて発色させ、０．１Ｎ硫酸溶液１００μＬで停止後４９２ｎｍにて比色した。
この結果から初めに条件（ｉ）で１ＭあたりのＡ４９２における抗体結合量を求める。例えばＴＲＡＣＰ  ５ｂプレートの抗体０．０５μｇではＡ４９２＝０．２５０であったので、抗体の分子量を１４．６万とすると次のように求められる。
2004059320.tif 000004
次に（１）で求めた値から条件（ｉｉ）の各抗体濃度における結合抗体濃度［ＰＬ］を求める。
2004059320.tif 000005
そして加えた抗体濃度から遊離抗体濃度［ＰＦ］を求める。
2004059320.tif 000006
結合抗体濃度に対して［ＰＬ］／［ＰＦ］をプロットしてその勾配（−ｎＫ）より結合定数（Ｋａ）を求める。
2004059320.tif 000007
上記方法より結果として２種類のモノクローナル抗体Ｔｒｋ４９、Ｔｒｋ６２の結合定数（Ｋａ）は下記の表２のとおりであった。
2004059320.tif 000008
これを反応系中で考えると反応の強さ、即ち親和性は以下のようになることがわかった。
Ｔｒｋ４９とフラグメントとの反応性＞Ｔｒｋ６２と酵素との反応性
＞Ｔｒｋ４９と酵素との反応性＞Ｔｒｋ６２とフラグメントとの反応性
よってモノクローナル抗体Ｔｒｋ４９はＴＲＡＣＰ  ５ｂ自体よりもＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメントと反応性が高く、その上Ｔｒｋ６２のＴＲＡＣＰ  ５ｂとの結合定数よりも反応性が高いため、はじめに反応系中で選択的にＴｒｋ４９とＴＲＡＣＰ  ５ｂフラグメントが結合し、競合フラグメントの減少した反応系中でＴｒｋ６２はより有利にＴＲＡＣＰ  ５ｂと反応することができることがわかった。この結果はプロテインチップ実験結果を裏付けるものである。
（１０）ＥＬＩＳＡによる測定実験
そこでＴｒｋ４９  １μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ、Ｔｒｋ４９  ２μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ、Ｔｒｋ６２  １μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ、Ｔｒｋ６２  ２μｇ／ｗｅｌｌ／１００μＬ、（Ｔｒｋ４９  １μｇ＋Ｔｒｋ６２  １μｇ）／ｗｅｌｌ／１００μＬの５種類のプレートを作製した。プレート作成法は上記（７）のモノクローナル抗体の特異性検定で作製したのと同様である。ただし感作抗体液を１００μＬに、ブロッキング溶液量を２００μＬに、サンプル量を１００μＬに変更して行った。また、１次反応は、プレートに吸着した抗体に、サンプルとしてＴＲＡＣＰ５ｂ高値プール血清（少なくとも分子量約５５８０Ｄａ、５７９５Ｄａ、６８６０Ｄａおよび７０７５ＤａのＴＲＡＣＰ  ５ｂのフラグメントを含む）を加え、室温にて、振とう条件下で１時間抗原抗体反応を行った。次いで、洗浄操作を行い、合成基質溶液１００μＬを添加し、３７℃で１時間、酵素反応をさせた。０．２ＮのＮａＯＨ溶液を加えて反応を停止させ比色定量し、酵素活性を求めた。結果を図３に示す。
結合定数から酵素に反応性が弱く、フラグメントと強い反応性を示すＴｒｋ４９は酵素との結合活性が弱く測定に必要な感度が得られなかった。一方結合定数より酵素に強い反応性を持つと考えられたＴｒｋ６２は良好な直線性を示した。更にＴｒｋ４９とＴｒｋ６２を混合したプレートではより直線性が長くなり感度も向上していた。抗体量を１μｇから２μｇに増量しても直線性、感度には殆ど向上しなかったことから反応に関与する抗体量は１μｇ／ｗｅｌｌでほぼ十分であったと考えられた。つまり結合定数実験の理論どおりＴｒｋ４９は反応系中でフラグメントをほぼ優先的に結合させ、次にＴｒｋ６２がＩｎｔａｃｔな酵素を結合させるため直線性、感度が改善されたと考えられるのである。
（１１）ラテックス試薬を利用したフラグメント吸収法
フラグメントをほぼ特異的に吸収することがわかったモノクローナル抗体Ｔｒｋ４９、またコントロールにＴｒｋ６２を使用して、２種類のモノクローナル抗体をラテックスに感作し、ラテックス試薬を作製した。ラテックス試薬作製は下記のように行った。
１％ラテックス懸濁液２ｍＬと、０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｔｒｋ４９及びＴｒｋ６２抗体溶液２ｍＬとを混合し、約１時間攪拌した。遠心後、沈殿を１％ＢＳＡ溶液に懸濁し、再度約１時間攪拌した。再び遠心後、沈殿をＰＢＳ溶液中に懸濁し、ラテックス試薬を得た。このラテックス試薬を０．１５％及び０．１％から１／２倍づつ希釈して合計８段階のラテックス試薬（０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５、０．００３１３、０．００１５６％）を作成した。以下ＥＬＩＳＡ法における手技について説明する。
はじめにこのラテックス試薬をＴｒｋ６２（２μｇ／ｗｅｌｌ）でまいたプレートに５０μＬづつ分注した。次にインフォームド・コンセントを行ったＴＲＡＣＰ  ５ｂ高値プール血清（８Ｕ／ｍＬ）を１００μＬづつ加えて、室温、振とうを行いながら１時間反応させた。反応後０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し合成基質溶液を加えた。３７℃、１時間インキュベートを行った後、反応停止液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ溶液）を５０μＬ添加して、４０５／４９０ｎｍで測定した。結果を図４に示す。Ｔｒｋ６２感作ラテックス試薬添加実験ではプレート上のモノクローナル抗体と競合してしまい、添加ラテックス試薬濃度依存的に酵素発色が低下していた。しかし、Ｔｒｋ４９では０．１〜０．１５％ラテックス試薬添加実験で有意に酵素発色値が上昇するなど、競合フラグメント吸収にプレートへの抗体同時感作に限らずこのようなラテックスなどの抗体吸着用担体を用いる吸収法も有効であることが示された。また、Ｔｒｋ４９をラテックッスに感作せず、溶液に溶解させたものを用いても有効であった。
【産業上の利用可能性】  以上に詳細に説明した通り、本発明の免疫測定法では、測定対象目的物質と反応性の高い第一抗体と、目的物質の不活性フラグメントなど競合する物質と強く反応する第二抗体を組み合わせて使用することで反応系中の競合物質の影響を除き、活性酵素等の目的物質を特異的に精密測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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