(57)【要約】異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進する新規タンパク質を提供するとともに、該タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断方法及び診断用キット、並びに該タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とし、この目的を達成するために、異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進する新規タンパク質として、（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質を提供し、該タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを疾患の診断の指標とするとともに、該タンパク質をコードする遺伝子の発現レベル低減効果を疾患の予防・治療物質のスクリーニングの指標とする。
2004061103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質
【請求項２】
前記異常細胞又は異常組織が、肺癌細胞又は肺癌組織である請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む請求項３記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項１又は２記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項８】
被験動物から採取した検体における請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを指標として、前記被験動物が、前記遺伝子の発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを診断する工程を含む、前記疾患の診断方法。
【請求項９】
前記検体における請求項１記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて前記発現レベルを測定する工程を含む請求項８記載の診断方法。
【請求項１０】
前記検体における請求項１記載のタンパク質の存在量に基づいて前記発現レベルを測定する工程を含む請求項８記載の診断方法。
【請求項１１】
前記疾患が肺癌である請求項８〜１０のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１２】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断用キット。
【請求項１３】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断用キット。
【請求項１４】
前記疾患が肺癌である請求項１２又は１３記載の診断用キット。
【請求項１５】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが亢進している細胞又は組織における前記遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、前記遺伝子の発現亢進が関与する疾患に対する候補物質の予防・治療効果を判定する工程を含む、前記疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
前記疾患が肺癌である請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング用キット。
【請求項１８】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング用キット。
【請求項１９】
前記疾患が肺癌である請求項１７又は１８記載のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、上記タンパク質に対する抗体又はその断片、上記遺伝子の発現レベルを指標とした上記遺伝子の発現亢進が関与する疾患（特に肺癌）の診断方法及び診断用キット、並びに上記遺伝子の発現レベル低減効果を指標とした上記遺伝子の発現亢進が関与する疾患（特に肺癌）の予防・治療物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】  肺癌は世界的に増加傾向にあり、２０１５年には日本国内の新患者数は男性１１万人、女性３万７千人になると予想されている。日本における１９９９年の肺癌による年間死亡者数は約５万２千人であり、１９９３年からは肺癌は男性の癌死亡率の第１位となり、女性では胃癌に次いで第２位となっている。そして肺癌の治療開始から５年間生存している割合である５年生存率は２５〜３０％といわれており、肺癌の効果的な治療薬は社会的に求められている。
また、肺癌を簡便に、かつ感度よく診断する方法も広く現在求められている。特に現在、期待されている新しい診断法として遺伝子診断法が挙げられ、危険因子の高い群を発見することによる一次予防、肺癌の早期発見による二次予防、又は末梢血や骨髄、リンパ節における微小転移細胞の検出、そして悪性度の判定による予後診断などへの応用の試みがなされている（仁井谷久暢監修，肺癌診療ハンドブック第２版，２００１）。
近年、ＤＮＡチップ等を用いた遺伝子解析技術が開発され、包括的かつ網羅的な癌の遺伝子発現解析が実用可能となって来ている。ＤＮＡチップ解析法を用いて癌組織のｍＲＮＡの発現量変化を解析することにより、多段階要因による癌の悪性化、癌細胞の浸潤・転移などに関わる遺伝子群の網羅的な同定が行われている。さらに、同定された遺伝子群の個々の生理機能を解明することによって、新しい癌細胞の特性に関して新たな知見が複数得られるものと期待され、様々な癌種において発現が亢進又は減少する分子の同定が進められている。肺癌においても遺伝子発現解析解析が行われ、発現が亢進する遺伝子群、または減少する遺伝子群が同定されている（バタチャルジ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ）Ａ．等，「プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１３７９０−１３７９５；ナッハト（Ｎａｃｈｔ）Ｍ．等，「プロシーディングズ  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」，２００１年，第９８巻，ｐ．１５２０３−１５２０８；チェン（Ｃｈｅｎ）Ｊ．Ｊ．Ｗ．等，「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，２００１年，第６１巻，ｐ．５２２３−５２３０；ビアー（Ｂｅｅｒ）Ｄ．Ｇ．等，「ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」，２００２年，第８巻，ｐ．８１６−８２４）。網羅的な遺伝子発現解析の結果、肺癌の種類による発現パターンの違いや、転移性癌における特長的な遺伝子発現制御、さらには予後診断に有用な遺伝子群の同定が報告されている。しかしながら、肺癌に特異的に発現する分子は見出されておらず、臨床的に有効であると期待される肺癌特異的な標的分子及び診断において有用なマーカー分子は未だ同定されていない状況である。
【発明の開示】
本発明は、第一に、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを指標とした、上記遺伝子の発現亢進が関与する疾患（特に肺癌）の診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベル低減効果を指標とした、上記遺伝子の発現亢進が関与する疾患（特に肺癌）の予防・治療物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体又はその断片、診断方法及び診断用キット、並びにスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
（１）下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質
（２）前記異常細胞又は異常組織が、肺癌細胞又は肺癌組織である前記（１）記載のタンパク質。
（３）前記（１）又は（２）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（４）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（３）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）前記（ｃ）に示すＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）前記（３）又は（４）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（６）前記（５）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（７）前記（１）又は（２）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（８）被験動物から採取した検体における前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを指標として、前記被験動物が、前記遺伝子の発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを診断する工程を含む、前記疾患の診断方法。
（９）前記検体における前記（１）記載のタンパク質をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて前記発現レベルを測定する工程を含む前記（８）記載の診断方法。
（１０）前記検体における前記（１）記載のタンパク質の存在量に基づいて前記発現レベルを測定する工程を含む前記（８）記載の診断方法。
（１１）前記疾患が肺癌である前記（８）〜（１０）のいずれかに記載の診断方法。
（１２）前記（１）記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断用キット。
（１３）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断用キット。
（１４）前記疾患が肺癌である前記（１２）又は（１３）記載の診断用キット。
（１５）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルが亢進している細胞又は組織における前記遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、前記遺伝子の発現亢進が関与する疾患に対する候補物質の予防・治療効果を判定する工程を含む、前記疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法。
（１６）前記疾患が肺癌である前記（１５）記載のスクリーニング方法。
（１７）前記（１）記載のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング用キット。
（１８）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含む、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング用キット。
（１９）前記疾患が肺癌である前記（１７）又は（１８）記載のスクリーニング用キット。
【図面の簡単な説明】  図１は、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応するｍＲＮＡの、ヒト肺腺癌組織及びヒト正常肺組織における発現量を示す図である。
図２は、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応するｍＲＮＡのヒト正常組織における発現量を示す図である。
図３は、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）により得られたＤＮＡ断片の電気泳動結果を示す図である。
図４は、遺伝子＃１５の塩基配列とＬＯＣ１３９３２０の塩基配列とのアライメント結果を示す図である。
図５は、遺伝子＃１５の塩基配列とＬＯＣ１３９３２０の塩基配列とのアライメント結果を示す図（図４の続き）である。
図６は、肺腺癌組織における遺伝子＃１５及びＬＯＣ１３９３２０の発現の有無を示す図である。
図７は、肺腺癌組織（１２例）及び正常肺組織（４例）における遺伝子＃１５の発現の有無を示す図である。
図８は、肺腺癌組織からマイクロダイゼクション法を用いて単離した癌細胞における遺伝子＃１５の発現の有無を示す図である。
図９は、活性型又は不活型の単核球又はリンパ球、及びヒト正常組織における遺伝子＃１５の発現の有無を示す図である。
図１０は、ヒト胃癌、肝細胞癌及び大腸癌における遺伝子＃１５の発現の有無を示す図である。
図１１は、遺伝子＃１５にコードされるタンパク質のアミノ酸配列とヒトＸＫタンパク質のアミノ酸配列とのアライメント結果を示す図である。
図１２は、遺伝子＃１５にコードされるタンパク質のアミノ酸配列と線虫Ｃｅｄ８タンパク質のアミノ酸配列とのアライメント結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という。）
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進するタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という。）
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、異常細胞又は異常組織（異常器官を含む）で特異的に発現亢進するタンパク質である。ここで、「異常細胞又は異常組織で特異的に発現亢進する」とは、正常細胞又は正常組織では発現亢進せず、異常細胞又は異常組織でのみ発現亢進することを意味する。また、「異常細胞又は異常組織」とは、何らかの疾患と関連して何らかの異常状態を呈する細胞又は組織を意味し、その種類は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）が発現亢進する限り特に限定されるものではないが、例えば、肺癌細胞、肺癌組織等が挙げられ、肺癌としては、例えば、肺腺癌、肺扁平上皮癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌等が挙げられる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現亢進は胃癌、肝細胞癌、大腸癌等の癌に由来する細胞又は組織では観察されないことから、タンパク質（ａ）又は（ｂ）は癌の中でも特に肺癌において発現亢進すると考えられる。また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）は肺癌の中でも特に肺腺癌細胞又は肺腺癌組織において発現亢進すると考えられる。
タンパク質（ａ）は、アミノ酸レベルにおいて、ヒトＸＫ蛋白（Ｋｅｌｌ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ遺伝子）及び線虫のＣＥＤ８蛋白とそれぞれ４４．７％及び１９．４％の相同性を示す（図１１及び１２参照）。ヒトＸＫ蛋白、線虫のＣＥＤ８蛋白は共に細胞膜等に発現し、トランスポーターとして機能していると予測されている。ヒトＸＫ蛋白は赤血球においてＫｅｌｌ抗原蛋白前駆体又はその一部を輸送する機能をもつと考えられ、ヒトＸＫ蛋白の変異によりＸＫ蛋白の機能障害が生じ、Ｋｅｌｌ抗原が赤血球表面から消失することで赤血球の形態異常を誘発し、最終的に有棘赤血球増加症を引き起こすと考えられている（Ｈｏ．Ｍ．，ら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７７，８６９−８８０，１９９４）。さらに、Ｍｃｌｅｏｄ症候群では赤血球異常以外にも筋肉障害、神経障害も見られることにより、神経や筋肉においてもＸＫ蛋白は神経伝達物質等の輸送に関与していると推察されている（Ｄａｎｅｋ，Ａら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，Ｖｏｌ．２８，７２０−７２２，１９９０、Ｄａｎｅｋ，Ａら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ，Ｖｏｌ．５０，７５５−７６４，２００１）。一方、線虫のＣＥＤ８蛋白はＸＫ蛋白と同様に１０回膜貫通領域を持ち、トランスポーター構造をとると予測され、細胞膜に局在することが示唆されている。さらに、線虫の肺発生初期にＣＥＤ８の機能を欠損するとプログラム細胞死の起こる時期が遅れることから、アポトーシスの制御因子の一つと考えられており、線虫のアポトーシス調節として働くＣＥＤ９蛋白と同時に、又はその下流でＣＥＤ８蛋白が機能することで細胞死に関与すると示唆されている（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ．Ｇ．Ｍ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５，４２３−４３３，２０００）。これらＸＫ蛋白及びＣＥＤ８の構造及び機能に基づき、本発明のタンパク質の構造及び機能を予測すると、本発明のタンパク質は、複数回の膜貫通領域を持つトランスポーターとして働くことが予想され、また、肺腺癌の癌化において需要な物質の輸送又は癌細胞の増殖や生命維持に必須な物質の輸送を行うことで、肺腺癌の発生・進展に関与する可能性や、ＣＥＤ８蛋白と同様にアポトーシス制御に関わる可能性が考えられる。
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進する限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜１００個、好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜１０個である。このとき、タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常１５％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは７０％以上の相同性を有する。
配列番号２記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進する限り特に限定されるものではない。例えば、配列番号２記載のアミノ酸配列において、９番目のアミノ酸Ｇｌｕがアミノ酸Ｇｌｙに、１０番目のアミノ酸Ａｒｇがアミノ酸Ｇｌｙに、１３番目のアミノ酸Ｔｈｒがアミノ酸Ａｌａに、２５番目のアミノ酸Ａｓｎがアミノ酸Ａｓｐに、２６番目のアミノ酸Ｖａｌがアミノ酸Ａｌａに、２９番目のアミノ酸Ｖａｌがアミノ酸Ａｓｐに、７６番目のアミノ酸Ｇｌｕがアミノ酸Ｇｌｙに、８３番目のアミノ酸Ｔｈｒがアミノ酸Ａｌａに、９０番目のアミノ酸Ｓｅｒがアミノ酸Ｐｒｏに、１１１番目のアミノ酸Ｌｅｕがアミノ酸Ｐｒｏに、１１２番目のアミノ酸Ｓｅｒがアミノ酸Ｐｒｏに、１１６番目のアミノ酸Ｈｉｓがアミノ酸Ａｒｇに、１２８番目のアミノ酸Ｇｌｕがアミノ酸Ｌｙｓに、１４５番目のアミノ酸Ｐｒｏがアミノ酸Ｓｅｒに、１８４番目のアミノ酸Ｍｅｔがアミノ酸Ｔｈｒに、２００番目のアミノ酸Ｇｌｎがアミノ酸Ａｒｇに、２２７番目のアミノ酸Ｔｙｒがアミノ酸Ｃｙｓに、２４１番目のアミノ酸Ｔｙｒがアミノ酸Ｃｙｓに、２５９番目のアミノ酸Ｔｒｐがアミノ酸Ａｒｇに、２９６番目のアミノ酸Ｇｌｕがアミノ酸Ｇｌｙに、３０８番目のアミノ酸Ｍｅｔがアミノ酸Ｔｈｒに、３３１番目のアミノ酸Ｌｅｕがアミノ酸Ｓｅｒに、３５４番目のアミノ酸Ａｓｐがアミノ酸Ｇｌｙに、３６９番目のアミノ酸Ａｒｇがアミノ酸Ｌｙｓに、３８６番目のアミノ酸Ｌｙｓがアミノ酸Ｇｌｕに、４００番目のアミノ酸Ｌｅｕがアミノ酸Ｐｈｅに、４０５番目のアミノ酸Ｌｅｕがアミノ酸Ｐｒｏに、４２２番目のアミノ酸Ａｒｇがアミノ酸Ｃｙｓに、４２３番目のアミノ酸Ｓｅｒがアミノ酸Ｐｒｏに置換され得る。タンパク質（ｂ）には、上記置換箇所のうち１箇所が置換されたタンパク質、及び任意の２箇所以上が置換されたタンパク質のいずれもが含まれる。
タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む）が挙げられる。
タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、ヒトを含む哺乳動物の肺癌細胞又は肺癌組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、ヒトを含む哺乳動物の肺癌細胞又は肺癌組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等を使用できる。
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておくことが好ましい。
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等を使用できる。
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１記載の塩基配列に基づいて設計できる。
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするオープンリーディングフレームとその３’末端に位置する終止コドンとを含む。また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５’末端及び／又は３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列は、タンパク質（ａ）をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１０３〜１０５番目の塩基配列に位置し、終止コドンは、１４８９〜１４９１番目の塩基配列に位置する。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子の塩基配列は、タンパク質（ａ）をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列に限定されるものではない。
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。具体的には、配列番号１記載の塩基配列のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列において、１２６番目の塩基ａが塩基ｇに、１２８番目の塩基ａが塩基ｇに、１３０番目の塩基ａが塩基ｇに、１３９番目の塩基ａが塩基ｇに、１７５番目の塩基ａが塩基ｇに、１７９番目の塩基ｔが塩基ｃに、１８８番目の塩基ｔが塩基ａに、２１６番目の塩基ｔが塩基ｃに、３２９番目の塩基ａが塩基ｇに、３４８番目の塩基ｃが塩基ｔに、３４９番目の塩基ａが塩基ｇに、３７０番目の塩基ｔが塩基ｃに、４１４番目の塩基ｔが塩基ｃに、４３４番目の塩基ｔが塩基ｃに、４３６番目の塩基ｔが塩基ｃに、４４９番目の塩基ａが塩基ｇに、４８４番目の塩基ｇが塩基ａに、５３５番目の塩基ｃが塩基ｔに、６５３番目の塩基ｔが塩基ｃに、７０１番目の塩基ａが塩基ｇに、７８２番目の塩基ａが塩基ｇに、８２４番目の塩基ａが塩基ｇに、８７７番目の塩基ｔが塩基ｃに、９４８番目の塩基ｔが塩基ｃに、９８９番目の塩基ａが塩基ｇに、１０２５番目の塩基ｔが塩基ｃに、１０９４番目の塩基ｔが塩基ｃに、１１６３番目の塩基ａが塩基ｇに、１２０８番目の塩基ｇが塩基ａに、１２５８番目の塩基ａが塩基ｇに、１３００番目の塩基ｃが塩基ｔに、１３０２番目の塩基ｃが塩基ｔに、１３１６番目の塩基ｔが塩基ｃに、１３６６番目の塩基ｃが塩基ｔに、１３６９番目の塩基ｔが塩基ｃに、１４５５番目の塩基ａが塩基ｇに置換された塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子には、上記置換箇所のうち１箇所が置換された遺伝子、及び任意の２箇所以上が置換された遺伝子のいずれもが含まれる。
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、タンパク質（ａ）をコードする遺伝子に、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得られる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されている遺伝子については、その塩基配列に従って化学合成することにより得ることができる。
タンパク質（ａ）及び（ｂ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１等の大腸菌や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ  １１４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ２０７−２１等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を使用できる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ４等が挙げられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ  Ｆ１２培地、Ｈａｍ  Ｆ１２Ｋ培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる形質転換体の培養は、通常２７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等が挙げられる。
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
こうして得られるタンパク質（ａ）又は（ｂ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片である。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体」には、ウサギやマウス等の免疫動物にタンパク質（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を免疫して得られる抗血清、ヒト抗体、遺伝子組換えによって得られるヒト型化抗体も含まれる。また、「抗体の断片」には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が含まれる。
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）を免疫用抗原として利用することより作製できる。免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）遺伝子組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を使用できる。
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常５０〜５００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは４日〜３週間間隔で、合計２〜８回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終免疫日から３〜１０日後に、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：１〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングできる。
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
モノクローナル抗体をヒトに投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体又はヒト型化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体又はヒト型化抗体は、例えば、免疫動物としてヒト抗体遺伝子を導入したマウス等を用いてハイブリドーマを作製することにより、また、ファージ上に抗体を提示したライブラリーを用いることにより取得できる。具体的には、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて目的のタンパク質に対するヒト抗体を取得できる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９６−３３７３５及びＷＯ９６−３４０９６参照）。また、複数の異なるヒトｓｃＦｖをファージ上に提示させた抗体ライブラリーから、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物に結合する抗体を提示しているファージを選り分けることで、目的のタンパク質に結合するｓｃＦｖを選択できる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４，１９９３）。
本発明の診断方法は、被験動物から採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを指標して、被験動物が、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを診断する工程を含む。タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、正常細胞又は正常組織では発現亢進せず、異常細胞又は異常組織でのみ発現亢進しているので、当該遺伝子の発現レベルを、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断の指標とすることができる。
被験動物は特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。また、被験動物から採取する検体は特に限定されず、例えば、診断対象となる組織又は器官の細胞の他、血液、血清等を利用できる。診断対象となる組織又は器官は特に限定されるものではなく、例えば、脳、脳下垂体、脊髄、唾液腺、胸腺、甲状腺、肺、乳房、皮膚、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、胃、小腸、大腸、直腸、膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨髄、末梢単核球等が挙げられる。
「タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベル」には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子のｍＲＮＡへの転写レベル及びタンパク質（ａ）又は（ｂ）への翻訳レベルが含まれる。したがって、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルは、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量に基づいて測定できる。
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用できる。
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用でき、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用できる。
「タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１８〜３０塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは２００〜８００塩基である。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸の塩基配列に基づいて設計できる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加でき、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加できる。
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験動物から採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするｍＲＮＡの存在量を測定できる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用できる。
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ）反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定できる。
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ）二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ）蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定できる。
検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を用いて、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、組織免疫染色法等を利用できる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のタンパク質（ａ）又は（ｂ）を捕捉した後、捕捉されたタンパク質（ａ）又は（ｂ）を、固相担体に固定化した抗体とはタンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量できる。
また、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在量の測定は、検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性を測定することによって行うこともできる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性は、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しないタンパク質（例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ）をコードする遺伝子の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
本発明の診断方法においては、被験動物から採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルが、健常動物から採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルよりも亢進しているときに、被験動物が、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に罹患していると診断できる。
被験動物と健常動物との間で、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを比較する際には、検体として同一種類の細胞又は組織（器官を含む）を使用する。また、被験動物と健常動物との間で、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを比較する際には、複数の健常動物（健常動物群）におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを定量し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験動物におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。このとき、被験動物の検体における遺伝子の発現レベルが正常範囲以上であるときに、被験動物が疾患に罹患していると診断できる。
本発明の診断方法は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患について広く利用でき、診断可能な疾患の種類は特に限定されるものではない。ここで、「遺伝子の発現亢進が関与する」には、遺伝子が発現亢進した結果、疾患が発症する場合、及び疾患が発症した結果、遺伝子が発現亢進する場合の両者が含まれる。
本発明の診断方法により診断可能な疾患としては、例えば、肺癌が挙げられ、肺癌としては、例えば、肺腺癌、肺扁平上皮癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌等が挙げられる。本発明の診断方法は、これらの肺癌のうち特に肺腺癌の診断に有用である。また、大腸癌、胃癌等からの転移性の肺癌組織と原発性肺癌組織の遺伝子発現プロファイルが異なる傾向を示すこと（Ａｒｉｎｄａｍ  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９８，１３７９０−１３７９５，２００１）から、本発明の診断方法は、原発性肺癌の診断に特に有用である。肺癌の診断の際には、通常、検体として被験動物から採取した肺細胞、肺組織、血液、血清等を使用するが、肺癌細胞が転移した組織や器官においてタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現亢進が生じている場合もあるので、肺以外の組織や器官を使用することによっても肺癌の診断を行うことができる。但し、肺以外の組織や器官を使用する場合には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現亢進が、肺以外の組織や器官の独自の異常によるものか、肺癌細胞の転移によるものか、区別できないので、被験動物が罹患している可能性がある疾患に肺癌が含まれるか否かを診断できるに留まる。
本発明の診断用キットは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を含む。これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは抗体又はその断片は、被験動物から採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として本発明の診断用キットに含まれ、本発明の診断用キットを利用すれば、被験動物が、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを診断できる。
本発明の診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
本発明の診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
また、本発明の診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
本発明のスクリーニング方法は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルが亢進している細胞又は組織（器官を含む）におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に対する候補物質の予防・治療効果を判定する工程を含む。本発明のスクリーニング方法においては、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベル低減効果を有する物質を選択することにより、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質をスクリーニングできる。
本発明のスクリーニング方法は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニングに広くに利用でき、対象となる疾患の種類は特に限定されるものではない。本発明のスクリーニング方法の対象となる疾患としては、例えば、肺癌が挙げられ、肺癌としては、例えば、肺腺癌、肺扁平上皮癌、大細胞肺癌、小細胞肺癌等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、これらの肺癌のうち特に肺腺癌に対する予防・治療効果を有する物質のスクリーニングに有用である。
本発明のスクリーニング方法において、「タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベル低減効果」には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の転写・翻訳、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の活性発現等のいずれのステップに対する効果も含まれる。
本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれにおいても行うことができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルが亢進しているモデル動物に候補物質を投与した後、モデル動物から検体（候補物質の投与前に、当該遺伝子の発現レベルが亢進していた細胞又は組織（器官を含む））を採取し、当該検体における当該遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を投与した後の当該遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に対する候補物質の予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて当該疾患の予防・治療物質をスクリーニングできる。
ｉｎ  ｖｉｖｏのスクリーニング方法において利用されるモデル動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。また、候補物質を投与するモデル動物としては、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させたトランスジェニック動物を利用することもできる。このようなトランスジェニック動物は、例えば、（ｉ）タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子と卵とを混合してリン酸カルシウムで処理する方法、（ｉｉ）位相差顕微鏡下で前核期卵の核にタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、（ｉｉｉ）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等の公知の方法によって得ることができる。なお、トランスジェニック動物におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルの亢進には、当該遺伝子が外来遺伝子として導入されて強制発現している状態、宿主が固有に有する当該遺伝子の発現レベルが亢進している状態、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の分解が抑制された状態のいずれもが含まれる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルが亢進している細胞又は組織（器官を含む）に候補物質を接触させた後、当該細胞又は組織における当該遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を接触させた後の当該遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患に対する候補物質の予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて当該疾患の予防・治療物質をスクリーニングできる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法において利用される細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等由来の細胞株を利用できる。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法においては、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させた細胞を利用することもできる。このような細胞は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
本発明のスクリーニング用キットは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片を含む。これらのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは抗体又はその断片は、被験動物から採取した検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として本発明のスクリーニング用キットに含まれ、本発明のスクリーニング用キットを利用すれば、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質をスクリーニングできる。
本発明のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドあるいは上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、上記診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、候補物質、候補物質合成キット、モデル動物の飼育キット等を含むことができる。
以下の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、大腸菌等を用いた遺伝子操作は基本的にモレキュラー・クローニング（Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  １９８９）に記載されている方法に従って行った。
〔実施例１〕ヒト肺腺癌組織において特異的に発現する遺伝子の同定
肺腺癌に特異的に発現する遺伝子の同定を行うために、ヒト肺腺癌摘出組織におけるｍＲＮＡの発現解析をＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｇｅｎｅ  ＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−１３３Ａ，Ｂ  Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて実施した。
（１）ヒト肺腺癌組織及びヒト正常肺組織における遺伝子発現解析
まず、各種分化度・ステージを含む肺腺癌摘出組織（１２例）の腫瘍部位及び正常肺（１例）（表１参照）から、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて添付の方法に従い全ＲＮＡを調製した。続いて、肺腺癌及び正常肺におけるｍＲＮＡの発現を肺腺癌のＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。すなわち、腫瘍部位に関しては、１２例から調製した全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例の正常肺から調製した全ＲＮＡ  ５μｇを試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量を相対値として求めた。
その結果、図１に示すように、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応する肺腺癌のｍＲＮＡ発現量は、正常肺のｍＲＮＡ発現量の１２．６倍であった。
2004061103.tif 000003
（２）ヒト正常組織における発現解析
続いて、肺以外のヒト正常組織において、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応するｍＲＮＡ発現量をＧｅｎｅ  ｃｈｉｐを用い解析した。ヒト正常組織としては表１に示す各種臓器を用いた。ヒト臓器由来ＲＮＡ各１０ｎｇずつを試料とし、遺伝子発現解析は上記と同様に実施した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、それに対する相対値を求めた。
その結果、図２に示すように、いずれのヒト正常組織においてもヒト正常肺と同様に低い値を示した。したがって、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応するｍＲＮＡは、肺腺癌組織で特異的に発現が亢進していることが明らかとなった。
〔実施例２〕全長ｃＤＮＡの単離・解析
２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂの配列情報を基に、ＲＡＣＥ法（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）を用いて全長のｃＤＮＡを単離した。
２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのターゲット配列はヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡ２１３８１４）であるが、このヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡ２１３８１４）は一部塩基配列が未同定であることから、このヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡ２１３８１４）を含むＸ染色体の配列情報を基に、ｃＤＮＡ単離に用いるＰＣＲプライマーＧＳＰ１（配列番号３）、ＧＳＰ２（配列番号４）及びＧＳＰ３（配列番号５）をそれぞれ設計し、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてプローブのターゲット配列の５’側及び３’側のｃＤＮＡを増幅した。
上記肺腺癌組織より調製した全ＲＮＡのうち３例分を混合した約４００ｎｇを基に、キット添付の方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成し、続いて、ＰＣＲプライマーＧＳＰ１（配列番号３）及びＧＳＰ２（配列番号４）を用いて５’側のｃＤＮＡを増幅した。すなわち、１．２５μＬの一本鎖ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、５ｐｍｏｌｅのＧＳＰ１（配列番号３）又はＧＳＰ２（配列番号４）をＰＣＲプライマーとして用い、キット添付の方法に従ってＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、初めに９４℃で５秒、続いて７２℃で３分のサイクルからなる反応を５サイクル行った後、引き続き９４℃で５秒、７０℃で１０秒、そして７２℃で３分のサイクルからなる反応を５サイクル行い、最後に９４℃で５秒、６８℃で１０秒、そして７２℃で３分からなる反応を２５サイクル行った。
上記のＰＣＲの結果、図３に示すように、約２０００ｂｐの主要なバンドと約２５００ｂｐのバンドが増幅された。なお、図３は、ＰＣＲ産物の電気泳動結果（１％アガロース電気泳動後にエチジウムブロマイド染色）であり、図３中、Ｍは分子量マーカー（１ｋｂｐ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製））を示す。このＰＣＲ反応による増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、常法により大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換した後、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製した。
初めに約２０００ｂｐのプラスミドＤＮＡの挿入遺伝子の塩基配列を解析した結果、数個の塩基が異なる遺伝子配列が得られたため、コンセンサスであったクローンを遺伝子＃１５と命名し、その全長塩基配列を配列番号１に示した。遺伝子＃１５のオープンリーディングフレームと考えられる塩基配列は、配列番号１のうち１０３〜１４８８番目の塩基配列であり、このオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。そして、数塩基が異なる各クローンと遺伝子＃１５とを比較することで判明した各クローンの変異箇所の一覧を表２に示す。また、約２５００ｂｐの増幅産物は、５’ＵＴＲがさらに遺伝子＃１５から上流に伸長した塩基配列を含み、コーディング領域を含まないものであった。その５’ＵＴＲ領域の塩基配列を配列番号１３に示す。なお、配列番号１３記載の塩基配列中、４７２番目までの塩基配列が５’ＵＴＲの塩基配列であり、４７３番目以降の塩基配列がコーディング領域の塩基配列（遺伝子＃１５のコーディング領域と同一の塩基配列）である。
2004061103.tif 000004
なお、表２中の「塩基の位置」は遺伝子＃１５（配列番号１）の開始コドンのＡを１番目としたときの番号である。また、下線を引いてあるアミノ酸は塩基配列の変化による種類の変化がないものである。
次に、プローブのターゲット配列に基に、３’側のｃＤＮＡの単離を上記と同様にＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行った。すなわち、肺腺癌患者由来組織３例より調製した全ＲＮＡを混合したものを基に、キット添付の方法に従って一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて、１．２５μＬの一本鎖ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、５ｐｍｏｌｅのＧＳＰ３（配列番号５）をＰＣＲプライマーとして用い、ｃＤＮＡの増幅を行った。なお、ＰＣＲは上記と同様の反応を行った。
ＰＣＲの結果、図３に示すように、約５００ｂｐのバンドの増幅が認められた。上記と同様にＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、塩基配列を決定した。配列番号１記載の塩基配列のうち、ＧＳＰ３配列以降の塩基配列がその領域を示す。
以上のＲＡＣＥ法により得られた全長ｃＤＮＡ配列を基に相同遺伝子の検索をＢｌａｓｔ法により行ったところ、ＬＯＣ１３９３２０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０６６６１９）が見出された。遺伝子＃１５の塩基配列とＬＯＣ１３９３２０の塩基配列とのアライメント結果を図４及び５に示す。図４及び５に示すように、今回単離・同定した遺伝子＃１５とＬＯＣ１３９３２０との間では塩基配列が完全に一致する領域が存在するものの、５’領域の配列及び中間領域の配列が異なっていた。ＬＯＣ１３９３２０は、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのターゲット配列と同様のＸ染色体（Ｘｑ２２．１）に存在し、かつ一部の塩基配列が完全に一致するものの、ヒトゲノム配列から予測された塩基配列である。
そこで、今回ｍＲＮＡ発現解析により肺腺癌での特異的な発現が認められたｍＲＮＡは、遺伝子＃１５又はＬＯＣ１３９３２０のいずれに由来するものであるかを明らかにするために、それぞれの５’末端と考えられる領域にＰＣＲプライマーを設計し、肺腺癌組織におけるｍＲＮＡの発現の有無をＰＣＲ法により検討した。すなわち、遺伝子＃１５の５’転写開始領域に対するＰＣＲプライマー（配列番号６）と、ＬＯＣ１３９３２０の５’転写開始領域に対するＰＣＲプライマー（配列番号７）、そして３’領域の共通のＰＣＲプライマー（配列番号８）を設計し、５’ＲＡＣＥ用の肺腺癌ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記と同条件のＰＣＲ反応を行った。その結果、図６に示すように、肺腺癌組織において、遺伝子＃１５に由来するＤＮＡ断片のみの増幅が認められた。
以上に示すように、肺腺癌組織において特異的に発現が亢進している新規遺伝子＃１５の同定に成功した。
〔実施例３〕遺伝子＃１５の遺伝子発現解析
遺伝子＃１５に由来するｍＲＮＡの発現確認を、ＲＴ−ＰＣＲ法及びＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｇｅｎｅ  ＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−１３３Ｂ  Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）による発現解析法により行った。
（１）肺腺癌組織における遺伝子＃１５の発現解析
肺腺癌組織（１２例）及び正常肺組織（４例）における遺伝子＃１５の発現比較を行った。配列番号１の１２１４〜１２３８番目の塩基配列をセンス方向のＰＣＲプライマー＃１５＿ＲＦ（配列番号９）とし、配列番号１の１４０２〜１３７８番目の塩基配列をアンチセンス方向のＰＣＲプライマー＃１５＿ＲＲ（配列番号１０）として設計した。肺腺癌組織（１２例）に関してはＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析時に調製した全ＲＮＡを使用し、正常肺組織（４例）（摘出肺から調製）に関しては上記と同様の方法により調製した全ＲＮＡを用いた。全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成したものをそれぞれ鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲ反応を行い、各組織におけるｍＲＮＡ発現量を比較した。
各２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％  Ｇｅｌａｔｉｎ、各１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬの一本鎖ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌｅずつのセンスプライマー＃１５＿ＲＦ（配列番号９）、アンチセンスプライマー＃１５＿ＲＲ（配列番号１０）、０．２５μＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＦＧ  Ｐｌｕｔｈｅｒｏ，Ｒａｐｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９３  ２１：  ４８５０−４８５１．）を含むように調製した後、初めに９４℃で３分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３０回行なった。また、個々のＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号１１）及びアンチセンスプライマー（配列番号１２）を用いて上記と同様に解析を行った。ＰＣＲ法により増幅されたバンドは１．０％アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色にて確認を行った。
その結果、図７に示すように、４例の正常肺においてはＰＣＲによる増幅が認められなかったのに対し、肺腺癌組織においては解析した１２例中１０例で特異的なバンドの増幅が確認された。この結果から、遺伝子＃１５のｍＲＮＡは、肺腺癌組織において高頻度で発現亢進していることが確認された。
一方、肺癌などの癌組織では肺腺癌細胞以外にも浸潤リンパ球や結合組織などの組織も混在していることが知られており、いずれの細胞において遺伝子＃１５の発現が亢進しているかを明らかにする必要がある。そこで、初めに肺腺癌組織より癌細胞のみをマイクロダイゼクション法により単離し、上記と同様にＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子＃１５  ｍＲＮＡの発現を確認した。すなわち、ＬＭ２００（ＬＣＭ）（オリンパス社製）を用い機器添付の方法に従って、肺腺癌組織より肺癌細胞のマイクロダイゼクションを行い、単離した癌細胞より全ＲＮＡを調製し、さらに一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて、上記と同様にＰＣＲによる増幅を試みた。その結果、図８に示すようにマイクロダイゼクションした肺癌細胞においても遺伝子＃１５の特異的増幅バンドが検出された。
続いて、肺癌組織への浸潤リンパ球において遺伝子＃１５の発現が亢進しているかを明らかにするために、不活性型・活性型の各種免疫細胞より調製したｃＤＮＡを含むＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型ＤＮＡとして用い、上記と同様にＰＣＲを行った。肺癌組織においては浸潤免疫細胞の約２／３がリンパ球で、そのうちの８０％がＴリンパ球であり、残りがＢリンパ球である。また、残りの約１／３が浸潤したマクロファージと考えられ、わずかにＮＫ細胞と樹状細胞が存在すると報告されている（Ａｇａｐｉ  Ｋａｔａｋｉら、Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ  １４０，３２０−３２８，２００２）。その結果、図９に示すように、活性型、不活型いずれの単核球、リンパ球においても遺伝子＃１５の発現は認められなかった。以上の結果から、遺伝子＃１５は肺腺癌組織の肺腺癌細胞において特異的に発現亢進している可能性が示された。
（２）ヒト正常組織における遺伝子＃１５発現解析
ヒト正常組織における遺伝子＃１５の発現を上記と同様に定量的ＰＣＲ法により解析した。この際、ヒト正常組織より調製した一本鎖ｃＤＮＡとしてＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉ、ＩＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。なお、陽性対照には上記で作製した５’ＲＡＣＥ用一本鎖ｃＤＮＡを使用した。
その結果、図９に示すように、いずれのヒト正常組織において遺伝子＃１５の発現が認められなかった。この結果は、上記Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析における結果と一致していた。
（３）ヒト胃癌・肝細胞癌・大腸癌における遺伝子＃１５のｍＲＮＡ発現解析
進行型かつ分化型胃癌（腸型）（３例）、Ｃ型肝炎由来中分化型肝細胞癌（３例）、Ｃ型肝炎由来低分化型肝細胞癌（３例）、そして進行型大腸癌（３例）から、上記と同様に全ＲＮＡを調製し、等量を混合した後に、上記と同様にＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて遺伝子＃１５の発現解析を行った。
その結果、図１０に示すように、２３０３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂのプローブと反応するｍＲＮＡの発現は胃癌、肝細胞癌、大腸癌のいずれにおいても認められなかった。従って、遺伝子＃１５は肺腺癌において特異的に発現亢進していることが明らかとなった。
以上の結果より、今回同定した遺伝子＃１５は肺腺癌組織において特異的かつ高頻度に発現亢進していることが明らかになり、遺伝子＃１５の発現をＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析やＲＴ−ＰＣＲ法などの遺伝子発現解析法を用いることで肺癌、特に肺腺癌の診断に有用な遺伝子であることが示された。また、大腸癌・胃癌等からの転移により発生する転移性肺癌組織と原発性肺癌組織の遺伝子発現パターンが異なる傾向を示すことから（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ  Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，１３７９０−１３７９５，２００１）、この遺伝子＃１５は大腸癌、胃癌由来の転移性肺癌では発現亢進していない可能性が示唆され、この遺伝子を指標とした原発性肺癌の診断の可能性が考えられた。
【産業上の利用の可能性】
本発明によって、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体が提供される。また、本発明によって、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを指標とした、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患の診断方法及び診断用キットが提供される。さらに、本発明によって、異常細胞又は異常組織（特に肺癌細胞又は肺癌組織）で特異的に発現亢進するタンパク質をコードする遺伝子の発現レベル低減効果を指標とした、当該遺伝子の発現亢進が関与する疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。
【配列表】
2004061103.tif 000005
2004061103.tif 000006
2004061103.tif 000007
2004061103.tif 000008
2004061103.tif 000009
2004061103.tif 000010
2004061103.tif 000011
2004061103.tif 000012
2004061103.tif 000013
2004061103.tif 000014
2004061103.tif 000015
2004061103.tif 000016
2004061103.tif 000017
2004061103.tif 000018
【図１】
2004061103.tif 000019
【図２】
2004061103.tif 000020
【図３】
2004061103.tif 000021
【図４】
2004061103.tif 000022
【図５】
2004061103.tif 000023
【図６】
2004061103.tif 000024
【図７】
2004061103.tif 000025
【図８】
2004061103.tif 000026
【図９】
2004061103.tif 000027
【図１０】
2004061103.tif 000028
【図１１】
2004061103.tif 000029
【図１２】
2004061103.tif 000030
【国際調査報告】
2004061103.tif 000031
2004061103.tif 000032
2004061103.tif 000033
2004061103.tif 000034