(57)【要約】所望の機能的性質を有する核酸を、迅速かつ簡便に単離するための方法およびキットを提供する。具体的には、（Ａ）核酸を第１の宿主細胞中に導入し、一過的に発現させる工程；（Ｂ）該核酸が導入された宿主細胞から、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞を選択する工程；（Ｃ）該選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程；および（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程を包含する方法、ならびにその方法を実行するために使用されるキットを提供する。
2004046353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の機能的性質を有する核酸を単離する方法であって、以下：
（Ａ）核酸を第１の宿主細胞中に導入し、一過的に発現させる工程；
（Ｂ）該核酸が導入された宿主細胞から、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞を選択する工程；
（Ｃ）該選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程；および
（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程；
を包含する方法。
【請求項２】
少なくとも２種類の前記核酸を前記第１の宿主細胞中に導入する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸の前記第１の宿主細胞中への導入方法が、以下：
ウイルスエンベロープを用いる導入法、リポソームを用いる導入法、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法、リン酸カルシウムを用いる導入法、およびエレクトロポーレーション法からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸が外来遺伝子およびプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスがＨＶＪである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターがウイルスエンベロープベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターがウイルスエンベロープから調製されたタンパク質とリポソームとを含むベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスエンベロープから調製されたタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記（Ｃ）選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程が、
（ｉ）前記選択された細胞から核酸を抽出し、
（ｉｉ）該抽出された核酸を、第２の宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を得、
（ｉｉｉ）該形質転換細胞を純化し、そして
（ｉｖ）該純化された形質転換細胞から、核酸を調製すること、
によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の宿主細胞が細菌または真菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸が前記細菌中または真菌中で自立複製するために必要な配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属の細菌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程が、
（ｉ）前記純化した核酸を、第３の宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を得ること、
（ｉｉ）該形質転換細胞の性質を、形質転換をしていない該第３の宿主細胞の性質と比較すること、
（ｉｉｉ）該比較の結果から、該形質転換細胞が所望の機能的性質を有するか否かを決定すること、
によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程がさらに、（ｉｖ）該選択された細胞から、所望の機能的性質を有する核酸を調製することを包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３の宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第３の宿主細胞がヒト細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記第３の宿主細胞が、前記第１の宿主細胞と同種由来である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記所望の機能的性質が、以下：
血管新生を誘発する遺伝子をコードすること、癌抑制遺伝子をコードすること、骨形成増強遺伝子をコードすること、アポトーシス誘発遺伝子をコードすること、サイトカイン分泌遺伝子をコードすること、神経細胞樹状突起誘導遺伝子をコードすること、動脈硬化抑制遺伝子をコードすること、糖尿病抑制遺伝子をコードすること、自己免疫疾患抑制遺伝子をコードすること、アルツハイマー病抑制遺伝子をコードすること、パーキンソン病抑制遺伝子をコードすること、神経細胞保護遺伝子をコードすること、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
所望の機能的性質を有する核酸を単離するためのキットであって、以下：
（Ａ）第１の宿主細胞中に導入して形質転換するための核酸導入用ベクター；および
（Ｂ）該形質転換された第１の宿主細胞から選択された細胞から、純化した核酸を調製するために使用される第２の宿主細胞
を含む、キット。
【請求項２７】
前記核酸導入用ベクターが、ウイルスエンベロープ、リポソーム、またはウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記第１の宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
前記第１の宿主細胞がヒト細胞である、請求項２６に記載のキット。
【請求項３０】
前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来である、請求項２６に記載のキット。
【請求項３１】
前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、請求項２６に記載のキット。
【請求項３２】
前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、請求項２６に記載のキット。
【請求項３３】
前記ウイルスがＨＶＪである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３４】
前記ベクターがウイルスエンベロープベクターである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３５】
前記ベクターがウイルスエンベロープから調製されたタンパク質とリポソームとを含むベクターである、請求項２６に記載のキット。
【請求項３６】
前記ウイルスエンベロープから調製されたタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記第２の宿主細胞が細菌または真菌である、請求項２６に記載のキット。
【請求項３８】
前記第１の宿主細胞に導入される核酸を調製するための核酸をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項３９】
さらに、前記純化した核酸が所望の機能的性質を有するか否かを決定するために使用される試薬をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項４０】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属の細菌である、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａである、請求項３７に記載のキット。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法によって単離された核酸。
【請求項４４】
所望の機能的性質を有する核酸を単離するための、ウイルスエンベロープの使用。
【請求項４５】
所望の機能的性質を有する核酸を単離するための、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、所望の機能的性質を有する核酸の単離方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】  発現クローニング法は、目的の遺伝子が発現して示す機能を指標として遺伝子をクローニングする方法である。この方法は、遺伝子の塩基配列や遺伝子産物のアミノ酸配列などの情報が全く不要であり、発現量の少ない遺伝子、および／または機能的情報のみが利用可な遺伝子のクローニングにその威力を発揮する方法である。
哺乳動物遺伝子産物の中には、哺乳動物細胞内の他の因子（例えば、タンパク質）と相互作用するタンパク質が多いことから、哺乳動物細胞の遺伝子を発現クローニングする場合、その遺伝子が由来する哺乳動物細胞を用いることが好ましい。
従来法により、哺乳動物細胞を用いて発現クローニングをする場合、たとえ所望の機能的性質を有する核酸を含む哺乳動物細胞を単離した場合でも、単離された哺乳動物細胞は、原核生物や真菌の場合と異なり、通常１つの細胞が、複数種類の核酸を同時にその細胞内に取り込んでいる。そのため、単離された細胞中に存在する複数種類の核酸から所望の機能的性質を有する核酸を純化する必要がある。
ところが、従来法を用いる場合、その単離された細胞から所望の機能的性質を有する核酸を純化するためには、多大な労力が必要である。なぜなら、哺乳動物細胞を用いる発現スクリーニングでは、外来遺伝子を安定に保持するために、ベクター系として公知のレトロウイルスおよびアデノウイルスが使用されるが、これらのウイルスベクター系は、複数種類のベクター遺伝子を宿主細胞の染色体に組込むため、導入された核酸の純化および同定のためには、純化工程を複数回繰り返すことが必須であるからである。代表的な純化工程としては、以下：
１）核酸配列のＰＣＲによる増幅、
２）増幅したＰＣＲ断片の導入による、宿主細胞のトランスフェクション、
３）所望の形質によるトランスフェクションした細胞の選択
という一連の工程を通常１０〜２０回程度繰り返さないと、純粋なクローンを得ることができない。
核酸の混合物をクローニング・純化する方法としては、大腸菌のような微生物を用いる方法が周知である。導入された複数種類の核酸を含む第１の宿主細胞を単離した後、その導入された複数種類の核酸から、大腸菌などの第２の宿主細胞を用いて特定の核酸を純化することも理論的には可能である。そのような純化の方法としては、例えば、染色体に組み込まれた核酸をＰＣＲなどによって増幅し、その後、第２の宿主細胞中で自立複製するベクターに連結し、その連結産物を第２の宿主細胞に導入する必要が挙げられる。しかし、この連結工程は非常に効率が悪いため、連結する核酸の種類が多くなるに従って、目的の核酸の純化に失敗する可能性が高まる。そのため、レトロウイルスおよびアデノウイルスなどを用いる従来法においては、発現クローニングなどにおいて、特定の核酸を純化するために大腸菌などの第２の宿主細胞を使用することはなかった。
哺乳動物細胞に外来の核酸を導入する手段としては、レトロウイルスのようなウイルスを用いる方法以外に、カルシウム沈殿法のような従来法もまた周知である。しかし、カルシウム沈殿法のような従来法を用いて一過性発現を行う場合は、レトロウイルスまたはアデノウイルスのような系を用いる場合と異なり、導入法自体の煩雑性、導入時における核酸の分解、および導入された外来遺伝子を含む核酸断片の細胞内での不安定性のため、カルシウム沈殿法のような一過性の発現系は、クローンを得る手段としては不適切であると考えられていた。
結局、従来法においては、一旦候補核酸を単離したとしても、その候補は、通常複数の異なるクローンを含むクローンの集団であるため、そのクローンの集団からクローンを純化して単離することが必要であるが、その純化には、多数回のスクリーニングのような多大な労力を必要とし、このことが、実際の単離・クローニングの障害となっていた。
従って、本発明は、新規の簡便かつ迅速な核酸の単離方法（例えば、スクリーニング方法）、およびその方法を実行するためのキットを提供することを課題とする。
発  明  の  要  旨
従って、本発明は、新規の簡便かつ迅速な核酸の単離方法、およびその方法を実行するためのキットを提供する。本発明の方法およびキットを用いることによって、例えば、スクリーニング、特に哺乳動物細胞を用いる発現スクリーニングを、迅速かつ簡便に行うことができる。従来、哺乳動物細胞を用いる発現スクリーニングにおいては、候補核酸の純化に多大な労力と時間が必要であったが、本発明を用いることで、必要な労力および時間を大幅に軽減することができる。従って、本発明の効果は、格別なものということができる。
本発明は、以下を提供する。
１．所望の機能的性質を有する核酸を単離する方法であって、以下：
（Ａ）核酸を第１の宿主細胞中に導入し、一過的に発現させる工程；
（Ｂ）該核酸が導入された宿主細胞から、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞を選択する工程；
（Ｃ）該選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程；および
（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程；
を包含する方法。
２．少なくとも２種類の前記核酸を前記第１の宿主細胞中に導入する、項目１に記載の方法。
３．前記核酸の前記第１の宿主細胞中への導入方法が、以下：
ウイルスエンベロープを用いる導入法、リポソームを用いる導入法、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法、リン酸カルシウムを用いる導入法、およびエレクトロポーレーション法からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
４．前記核酸が外来遺伝子およびプロモーターを含む、項目１に記載の方法。
５．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、項目１に記載の方法。
６．前記宿主細胞がヒト細胞である、項目１に記載の方法。
７．前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来である、項目１に記載の方法。
８．前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、項目１に記載の方法。
９．前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、項目８に記載の方法。
１０．前記ウイルスがＨＶＪである、項目９に記載の方法。
１１．前記ベクターがウイルスエンベロープベクターである、項目１に記載の方法。
１２．前記ベクターがウイルスエンベロープから調製されたタンパク質とリポソームとを含むベクターである、項目１に記載の方法。
１３．前記ウイルスエンベロープから調製されたタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、項目１２に記載の方法。
１４．前記（Ｃ）選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程が、
（ｉ）前記選択された細胞から核酸を抽出し、
（ｉｉ）該抽出された核酸を、第２の宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を得、
（ｉｉｉ）該形質転換細胞を純化し、そして
（ｉｖ）該純化された形質転換細胞から、核酸を調製すること、
によって行われる、項目１に記載の方法。
１５．前記第２の宿主細胞が細菌または真菌である、項目１４に記載の方法。
１６．前記核酸が前記細菌中または真菌中で自立複製するために必要な配列を含む、項目１５に記載の方法。
１７．前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属の細菌である、項目１５に記載の方法。
１８．前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目１７に記載の方法。
１９．前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａである、項目１５に記載の方法。
２０．前記（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程が、
（ｉ）前記純化した核酸を、第３の宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を得ること、
（ｉｉ）該形質転換細胞の性質を、形質転換をしていない該第３の宿主細胞の性質と比較すること、
（ｉｉｉ）該比較の結果から、該形質転換細胞が所望の機能的性質を有するか否かを決定すること、
によって行われる、項目１に記載の方法。
２１．前記（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程がさらに、（ｉｖ）該選択された細胞から、所望の機能的性質を有する核酸を調製することを包含する、項目２０に記載の方法。
２２．前記第３の宿主細胞が哺乳動物細胞である、項目２０に記載の方法。
２３．前記第３の宿主細胞がヒト細胞である、項目２０に記載の方法。
２４．前記第３の宿主細胞が、前記第１の宿主細胞と同種由来である、項目２０に記載の方法。
２５．前記所望の機能的性質が、以下：
血管新生を誘発する遺伝子をコードすること、癌抑制遺伝子をコードすること、骨形成増強遺伝子をコードすること、アポトーシス誘発遺伝子をコードすること、サイトカイン分泌遺伝子をコードすること、神経細胞樹状突起誘導遺伝子をコードすること、動脈硬化抑制遺伝子をコードすること、糖尿病抑制遺伝子をコードすること、自己免疫疾患抑制遺伝子をコードすること、アルツハイマー病抑制遺伝子をコードすること、パーキンソン病抑制遺伝子をコードすること、神経細胞保護遺伝子をコードすること、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
２６．所望の機能的性質を有する核酸を単離するためのキットであって、以下：
（Ａ）第１の宿主細胞中に導入して形質転換するための核酸導入用ベクター；および
（Ｂ）該形質転換された第１の宿主細胞から選択された細胞から、純化した核酸を調製するために使用される第２の宿主細胞
を含む、キット。
２７．前記核酸導入用ベクターが、ウイルスエンベロープ、リポソーム、またはウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームである、項目２６に記載のキット。
２８．前記第１の宿主細胞が哺乳動物細胞である、項目２６に記載のキット。
２９．前記第１の宿主細胞がヒト細胞である、項目２６に記載のキット。
３０．前記ウイルスエンベロープが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来である、項目２６に記載のキット。
３１．前記ウイルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、項目２６に記載のキット。
３２．前記ウイルスがパラミクソウイルス科に属するウイルス由来である、項目２６に記載のキット。
３３．前記ウイルスがＨＶＪである、項目２６に記載のキット。
３４．前記ベクターがウイルスエンベロープベクターである、項目２６に記載のキット。
３５．前記ベクターがウイルスエンベロープから調製されたタンパク質とリポソームとを含むベクターである、項目２６に記載のキット。
３６．前記ウイルスエンベロープから調製されたタンパク質が、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択されるタンパク質である、項目３５に記載のキット。
３７．前記第２の宿主細胞が細菌または真菌である、項目２６に記載のキット。
３８．前記第１の宿主細胞に導入される核酸を調製するための核酸をさらに含む、項目２６に記載のキット。
３９．さらに、前記純化した核酸が所望の機能的性質を有するか否かを決定するために使用される試薬をさらに含む、項目２６に記載のキット。
４０．前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属の細菌である、項目３７に記載のキット。
４１．前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、項目４０に記載の方法。
４２．前記真菌が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａである、項目３７に記載のキット。
４３．項目１に記載の方法によって単離された核酸。
４４．所望の機能的性質を有する核酸を単離するための、ウイルスエンベロープの使用。
４５．所望の機能的性質を有する核酸を単離するための、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームの使用。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＨＶＪ−Ｅを用いたゲノムスクリーニングの流れを示した図である。
図２は、ゲノムライブラリー遺伝子導入後のＨＡＥＣの細胞増殖アッセイ結果を示した図である。
図３は、ヒト心臓ｐｃＤＮＡライブラリー・スクリーニングにおける各ｗｅｌｌの細胞増殖状況を、コンピューターによりグラフ化した図である。
図４は、クローン化された遺伝子の制限酵素処理によるインサートを確認した図である。
図５は、２回目の細胞増殖アッセイを示した図である。
図６は、各ウェルを４０倍に拡大した顕微鏡写真である。
図７の左欄は、血管新生定量ソフトウェアを使用して得られた、管腔形成した細胞の面積を比較したグラフである。
図７の右欄は、管腔形成した細胞の長さを比較したグラフである。
図８の左欄は、管腔形成した細胞のジョイント数を比較したグラフである。
図８の右欄は、管腔形成した細胞のパス数を比較したグラフである。
図９は、ｃ−ｆｏｓ遺伝子ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性に及ぼす影響を比較したグラフである。
発  明  の  詳  細  な  説  明
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌｅ」、「ｌａ」など、スペイン語における「ｕｎ」、「ｕｎａ」、「ｅｌ」、「ｌａ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語の定義）
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。
本明細書において、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互換的に用いられ、一連のアミノ酸からなる高分子（重合体）をいう。アミノ酸は、炭素原子にカルボキシル基およびアミノ基を有する有機分子をいう。本明細書において好ましくは、アミノ酸は、天然に存在する２０種類のアミノ酸であるがこれらに限定されない。
本明細書において、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、特に言及する場合を除き互換的に用いられ、一連のヌクレオチドからなる高分子（重合体）をいう。ヌクレオチドとは、リボースの５’部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。塩基部分としては、ピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド（ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド）がある。ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。
この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。
そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の因子としての使用に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書では塩基配列の類似性、同一性の比較および相同性の算出は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。
「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２、４または６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。記載の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
本明細書中において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
本明細書において「単離（された）」とは、ある物質または核酸の状態についていい、その物質または核酸が天然に存在する状態とは別の状態にあることをいい、その物質または核酸が天然に存在するときに付随する少なくとも１つの物質または核酸が伴わない状態をいう。本明細書において、核酸を「濃縮」するとは、ある特定の核酸の存在頻度を天然に存在する頻度より高くすることをいう。従って、好ましい状態では、純化された核酸または核酸組成物は、ある特定の核酸のみを含む。
本明細書において物質を「精製する」とは、その物質の存在頻度が高い状態にすることであって、実質的にその物質以外の物質が、その物質の機能に影響を与えない程度で存在させることをいう。従って、好ましい状態では、純化された物質または物質を含む組成物は、ある特定の物質のみを含む。
本明細書において「純化（された）」および「クローニング（された）」とは、互換可能に用いられる。「純化（された）」および「クローニング（された）」とは、ある物質または核酸の状態についていい、その核酸の存在頻度を高い状態にすることであって、好ましくは、その物質または核酸が、他の種類の物質または核酸が実質的に伴わない状態をいう。本明細書において「純化」および「クローニング」に関する文脈において使用される場合、他の種類の物質または核酸が「実質的に伴わない状態」とは、それら他の種類の物質または核酸が全く存在しない状態か、または存在するとしても、目的の物質または核酸に対して、何ら影響を与えない状態をいう。従って、より好ましい状態では、純化された核酸または核酸組成物は、ある特定の核酸のみを含む。
本明細書において物質を「精製する」とは、その物質の存在頻度が高い状態にすることであって、実質的にその物質以外の物質が、その物質の機能に影響を与えない程度で存在させることをいう。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、「ウイルスエンベロープベクター」および「リポソームベクター」が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクター、またはウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。
本発明において、ウイルスエンベロープまたはウイルスエンベロープ由来タンパク質の調製のために使用されるウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、パラミクソウイルス科に属するウイルスが、より好ましくは、ＨＶＪ（センダイウイルス）が、用いられる。
ウイルスエンベロープ由来タンパク質としては、例えば、ＨＶＪのＦタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質およびＭタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リポソームベクター」とは、リポソーム中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。リポソームベクターの調製のために使用される脂質としては、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノラミン）およびホスファチジルコリンなどの中性リン脂質、コレステロール、ホスファチジルセリンおよびホスファチジン酸などの負電荷リン脂質、ならびにＤＣ−コレステロール（ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール）およびＤＯＴＡＰ（ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン）などの正電荷脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」とは、脂質二重膜の一種である。例えば、レシチンのようなリン脂質を５０％（重量比）以上の水に、そのリン脂質固有のゲル−液晶相転移温度以上で懸濁すると脂質二重層からなる、内部に水相を有する閉鎖小胞が形成される。この小胞をリポソームという。二分子膜が何枚もタマネギ状に重なった多重膜リポソーム（ＭＬＶ）と、膜が１枚のリポソームに大別される。後者はまた、ホスファチジルコリンのようなリン脂質のサスペンション（懸濁液）を、ミキサーで激しく攪拌して分散した後、超音波処理を行なうことによっても調製することが可能である。
膜が１枚のリポソームはさらに、その粒子径によって小さな単膜リポソーム（ＳＵＶ）と大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）とに分類される。ＭＬＶは、脂質薄膜に水を加えて機械的振動を与えることにより調製される。ＳＵＶは、ＭＬＶを超音波するか、または脂質と界面活性剤の混合溶液から界面活性剤を透析などで除去するなどによって調製される。また、これ以外にも、（１）ＳＵＶの凍結融解を繰り返して、ＬＵＶを調製する方法、（２）酸性リン脂質でできたＳＵＶをＣａ２＋の存在下で融合させ、そしてこのＣａ２＋をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で除去することにより調製する方法、（３）脂質のエーテル溶液と水のエマルジョンからエーテルを留去しながら、相の転換を行ってＬＵＶなどを調製する方法（逆相蒸発法リポソーム；ＲＥＶ）が周知である。
本明細書において使用する場合、「界面活性剤」と「表面活性剤」とは、互換可能に使用される。界面活性剤とは、水に対して強い表面活性を示し、溶液内において臨界ミセル濃度以上でミセルのような会合体を形成する物質をいう。界面活性剤は、分子内に親水性の部分と疎水性（親油性）の部分とをあわせもち、その親水親油バランスによって、水−油の２相界面に強く吸着されて、界面の自由エネルギー（界面張力）をいちじるしく低下させる作用を示す。疎水基は代表的にはアルキル基などの長鎖炭化水素基であるが、親水基にはイオン性解離基や、ヒドロキシ基などの非イオン性極性基があり得る。カルボキシ基、スルホ基、硫酸水素基−ＯＳＯ−ＯＨを持つものは、水中で解離して陰イオンとなるので、陰イオン界面活性剤（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）とよばれる。代表的には、脂肪酸せっけん、アルキルベンゼンスルホン酸塩などが挙げられるがこれらに限定されない。これに対し第４級アンモニウム基をもつものは解離して陽イオンとなるので、陽イオン界面活性剤（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）とよばれる。長鎖アルキルアミノ酸のように、同一分子中に陽イオン性と陰イオン性の解離基をあわせもつものもあり、両性界面活性剤（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）とよばれる。また非イオン性の極性基をもつものは非イオン界面括性剤（ｎｏｎｉｏｎｉｃ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）とよばれ、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルなどが代表的である。
本明細書において使用する場合、「脂質」とは、（１）分子中に長鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖を持ち、かつ（２）生体内に存在するか、または生体に由来する分子である限り、任意の脂質が含まれる。好ましい脂質は、リポソームを形成し得るリン脂質であり、より好ましい脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用する場合、「脂肪酸」とは、天然の脂質の加水分解によって得られる脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸をいう。代表的な脂肪酸としては、アラキドン酸、パルミチン酸、オレイン酸およびステアリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、ウイルスエンベロープベクター内に含まれるウイルス以外の起源の核酸、またはリポソームベクター内に含まれる核酸をいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
本明細書において、「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。例えば、本明細書において「ＨＶＪのエンベロープ」と「センダイウイルスのエンベロープ」とは同一の意味を示す語句として用いられる。
本明細書において「センダイウイルス」とは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス属に属し、細胞融合作用をもつウイルスをいう。ウイルス粒子は、エンベロープをもち、直径１５０〜３００ｎｍの多形性を示す．ゲノムは、約１５５００塩基長のマイナス鎖ＲＮＡである。ＲＮＡポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集し、また溶血性を示す。
本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１  ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４、２０９〜２１３、１９６１）。
本発明で用いられる「候補核酸」は、純化を目的とする核酸であれば、どのようなものであってもよい。本発明において、候補核酸の集団は、哺乳動物細胞などの第１の宿主細胞を用いて、細胞内に含まれる形態で、または細胞から単離された形態で得られる。そのようにして得られた候補核酸の集団は、第２の宿主細胞を用いて、純化される。
宿主細胞として使用される動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５などが例示される。
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
第２の宿主細胞としては、候補核酸を「遺伝子導入」することができる細胞であれば特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、原核細胞、真菌細胞など）を用いることができる。
原核細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。
真菌細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａなどに属する酵母菌株、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａに属する真菌を挙げることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどを挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、真菌にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
植物細胞としては、ポテト、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、ダイズ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、ライムギ、アルファルファ、アマなどの植物細胞などを挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）などが例示される。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞などを用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）など、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ４などが例示される。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが、ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
本明細書において「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、プロモーター、ターミネーターおよび、選択マーカーを含み得る。発現プラスミドのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細菌細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明において、発現プラスミドは、候補核酸を、第１の宿主細胞および／または第２の宿主細胞において発現する。従って、発現プラスミドは、候補核酸、およびその候補核酸と作動可能に連結された調節エレメント（例えば、プロモーターなど）を含む。
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、哺乳動物の部位におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、哺乳動物の発達段階に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
哺乳動物細胞での発現のための強力なプロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスのＥ１Ａプロモーター、ヒト  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ヒト延長因子−１（ＥＦ−１）プロモーター、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ最小熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ）のプロモーター、ヒト  メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒト  ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ヒト  アクチンプロモーター）、および人工のプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター（ＳＶ４０初期プロモーターとＨＴＬＶのＬＴＲプロモーターの融合）、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥエンハンサーとニワトリ  アクチンプロモーターのハイブリッド）のような融合プロモーター）が周知であることから、これら周知のプロモーターまたはその改変体を用いることによって、組換え発現の発現量を容易に上昇させることができる。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ  ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本明細書において、「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。哺乳動物細胞において使用する場合、代表的なエンハンサーとしては、ＳＶ４０のエンハンサーが挙げられるが、これに限定されない。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において、「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において「生物学的活性」は、「機能的性質」と互換可能に用いられる。本明細書において、「生物学的活性」および「機能的性質」とは、ある因子（例えば、核酸）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が増殖因子をコードする遺伝子である場合、その機能的性質は、その増殖因子を宿主細胞内で発現させ、好ましくは、その発現によって細胞の増殖を促進することを包含する。例えば、ある因子が酵素をコードする遺伝子である場合、その機能的性質は、その酵素活性を宿主細胞内で発現させ、好ましくは、その酵素活性が検出可能になることを包含する。別の例では、ある因子がリガンドをコードする遺伝子である場合、そのリガンドが対応するレセプターへ結合するリガンドの発現させ、好ましくは、そのリガンドの発現によって、そのリガンドに対応するレセプターを有する細胞を変化させることを包含する。
本明細書において、第２の宿主細胞に核酸を導入することが必要である場合、核酸の導入方法としては、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換などが挙げられる（例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「発現プラスミド」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させた後に、そのポリヌクレオチド配列に含まれる遺伝子を発現することができる核酸をいう。そのような発現プラスミドとしては、発現するべきポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
本明細書において宿主細胞に導入された核酸発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
本明細書において、宿主細胞に導入された核酸発現の「検出」または「定量」は、固相（例えば、基板、支持体、アレイ、チップ、またはマイクロチップ）を用いて行うこともまた可能である。
本明細書において使用される用語「基板」および「支持体」は、本明細書において、同じ意味で使用され、本発明のアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。ナイロン膜が好ましい。ナイロン膜を用いた場合は、簡便な解析システムを用いて結果を分析することができるからである。しかし、高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」とは、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、「ＤＮＡチップ」とは、基板と、ＤＮＡとを含み、その基板にはＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ断片）が少なくとも１つ配置されている。本明細書において、「プロテインチップ」とは、基板と、タンパク質とを含み、その基板にはタンパク質（例えば、ポリペプチドまたはオリゴペプチド）が少なくとも１つ配置されている。「ＤＮＡチップ」および「プロテインチップ」は、本明細書では、「マイクロチップ」または単に「チップ」に含まれる。「マイクロアレイ」とは、そのようなチップ上に１以上の生体分子（例えば、ｃＤＮＡ断片のようなオリゴヌクレオチド、またはペプチド）が整列されて配置されたものをいう。
本発明において使用される生体分子（たとえば、ＤＮＡのようなオリゴヌクレオチド、またはペプチド）は、生体から採取されたものを利用し得るほか、当業者に公知の方法によって化学的に合成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどにより市販されるＤＮＡ合成機もしくはペプチド合成機の何れかを用いて、自動化学合成により調製され得る。自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物および方法は、例えば、米国特許第４，４１５，７３２号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）；米国特許第４，５００，７０７号およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）；米国特許第４，６６８，７７７号，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）に開示される。
基板には、任意の数の生体分子（例えば、ＤＮＡまたはペプチド）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得る。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子（例えば、ＤＮＡまたはペプチド）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書では、生体分子は、好ましくは、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
宿主細胞に導入された核酸によって、宿主細胞が変化する場合、その変化の程度を測定することによって、宿主細胞に導入された核酸発現の「検出」または「定量」をすることが可能である。そのような宿主細胞の変化の例としては、細胞内の特定の酵素の酵素活性の変化、細胞増殖速度の変化などが挙げられるが、これらに限定されない。
「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。本明細書において「発現量」とは、発現される重量、または発現される重量と相関関係にある吸光度などの数値を単位とする絶対値であっても、コントロールまたは比較対照との比で表される相対値であってもよい。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
好ましい実施形態の説明
本発明において、候補核酸から所望の機能的性質を有する核酸を単離する方法は、以下の工程によって実施することができる：
（Ａ）核酸を第１の宿主細胞中に導入し、一過的に発現させる工程；
（Ｂ）該核酸が導入された宿主細胞から、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞を選択する工程；
（Ｃ）該選択された細胞から、純化した核酸を調製する工程；および
（Ｄ）所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択する工程。
上記の方法において、候補核酸は、任意の生体由来であり得、そして、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレオチドアナログであり得る。候補核酸は、１種類であっても、複数種類であってもよい。
上記方法において、第１の宿主細胞は、特に限定されることはないが、好ましくは、動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。候補核酸の第１の宿主細胞への導入には、種々の公知の方法を用いることができる。代表的な方法としては、ウイルスエンベロープを用いる導入法、リポソームを用いる導入法、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法、リン酸カルシウムを用いる導入法、およびエレクトロポーレーション法が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスエンベロープを用いる導入法、またはウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法を用いる場合、そのウイルスエンベロープを調製するために使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来であり得る。好ましくは、ウイルスは、パラミクソウイルス科のウイルス、特にＨＶＪである。
ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いて、第１の宿主細胞に候補核酸を導入する方法もまた、利用可能である。この方法において使用されるタンパク質としては、Ｆタンパク質、ＨＮタンパク質、ＮＰタンパク質、Ｍタンパク質またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
これら第１の宿主細胞に候補核酸を導入する方法は、第２の宿主核酸、および第３の宿主核酸に適用可能である。
さらに、第１の宿主細胞に候補核酸を導入した後、その第１の宿主細胞を変異誘発し、宿主細胞に導入された核酸の多様性を増加することも可能である。細胞の変異誘発法は、周知であり、エチジウムブロマイド、およびニトロソグアニジンのような化学物質を用いる方法、ならびにＵＶ照射、Ｘ線照射、放射線照射のように物理的方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、変異誘発によって多様性を増加させた後、その変異体から所望の機能的性質を有する候補核酸を選択することも可能である。
候補核酸を第１の宿主細胞内で発現させる場合、その候補核酸は、プロモーターなどの調節エレメントと作動可能に連結され得る。この発現は、一過的発現であっても、安定的発現であってもよい。
第１の宿主細胞内での候補核酸の発現は、一過的発現を生じれば、十分である。しかし、宿主細胞は、候補核酸を一過的に発現させた後に、その候補核酸を安定に発現させたとしても、なお本発明の範囲内である。
次に、核酸が導入された宿主細胞から、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞が選択される。所望の機能としては、例えば、血管新生を誘発する遺伝子をコードすること、癌抑制遺伝子をコードすること、骨形成増強遺伝子をコードすること、アポトーシス誘発遺伝子をコードすること、サイトカイン分泌遺伝子をコードすること、神経細胞樹状突起誘導遺伝子をコードすること、動脈硬化抑制遺伝子をコードすること、糖尿病抑制遺伝子をコードすること、自己免疫疾患抑制遺伝子をコードすること、アルツハイマー病抑制遺伝子をコードすること、パーキンソン病抑制遺伝子をコードすること、神経細胞保護遺伝子をコードすること、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
また、この選択は、好ましくは、候補核酸の発現によって変化する宿主細胞の形質に基づいて行われる。例えば、候補核酸から、増殖因子をコードする遺伝子を単離する場合、その所望の機能的性質は、特定の細胞または任意の細胞の増殖の促進である。
本発明の方法は、目的とする機能的性質が認識可能である限り、任意の機能的性質に対して適用可能である。本発明において意図される機能的性質としては、細胞増殖の促進もしくは抑制、細胞の分化もしくは脱分化、マーカータンパク質の発現もしくは発現の抑制、マーカーｍＲＮＡの発現もしくは発現の抑制、膜電位の変化、脱分極、アポトーシス、癌化、増殖の停止、形態の変化、大きさの変化などが挙げられるが、これらに限定されない。
次に、所望の機能的性質を有する核酸を含有するとして選択された細胞から、純化した核酸を調製する方法としては、第２の宿主細胞を用いても、用いなくてもよい。第２の宿主細胞を用いる場合、限定されることはないが、例えば、以下の工程：
（ｉ）前記選択された細胞から核酸を抽出し、
（ｉｉ）該抽出された核酸を、第２の宿主細胞に導入することによって形質転換細胞を得、
（ｉｉｉ）該形質転換細胞を純化し、そして
（ｉｖ）該純化された形質転換細胞から、核酸を調製すること、
によって行われる。
上記方法において、第１の宿主細胞からの核酸を抽出する方法としては、種々の周知の方法、および市販のキットを用いることができる。第２の宿主細胞への核酸導入法は、その第２の宿主細胞の種類に依存して、種々の周知の方法を使用することができる。例えば、細菌を第２の宿主細胞として使用する場合、限定されることはないが、カルシウム法などによってコンピテント細胞を調製し、熱ショックを与えて核酸を細菌宿主細胞に導入することができる。また、エレクトロポーレーションを用いることも可能である。真菌にＤＮＡを導入する方法としては、限定されることはないが、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法が利用可能である。植物細胞を宿主細胞とする場合は、限定されることはないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法が公知である。動物細胞を宿主細胞として用いる場合、限定されることはないが、ウイルスエンベロープを用いる導入法、リポソームを用いる導入法、ウイルスエンベロープの少なくとも１つのタンパク質を含むリポソームを用いる導入法、リン酸カルシウムを用いる導入法、およびエレクトロポーレーション法が利用可能である。
第２の宿主細胞を用いる場合、好ましくは、その第２の宿主細胞は、１細胞あたり１種類の候補核酸のみが、その細胞内に導入される。従って、候補核酸の集団を入手した場合、その集団を第２の宿主細胞に導入し、そして核酸が導入された宿主細胞を純化することによって、候補核酸を純化することができる。
純化した核酸を調製した時点で、その純化した核酸が複数種類ある場合は、その純化した核酸から、所望の機能的性質を有する純化した核酸を選択することができる。その選択は、純化した核酸を発現させ、その機能を確認し、確認された機能が所望の機能であるか否かを決定することによってなされ得る。あるいは、その選択は、純化した核酸の構造の一部または全部を決定することによってもなされ得る。
本発明の方法を実施するためのキットもまた本発明において提供される。
（１．ウイルスエンベロープベクターの調製）
ウイルスエンベロープベクターとして種々の方法が公知である。例えば、本発明者らは、ウイルスおよび非ウイルスベクターを組み合わせることにより、ハイブリッド遺伝子移入ベクターを開発し、日本血球凝集性ウイルス（ＨＶＪ；センダイウイルス）由来の融合形成性エンベロープを持つ融合形成性ウイルスリポソームを構築した（Ｋａｎｅｄａ、Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅｓ，１４：５５３−５７２（１９９８）；Ｋａｎｅｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，５：２９８−３０３（１９９９））。この送達システムでは、ＤＮＡ充填リポソームを、ＵＶ不活性化ＨＶＪと融合させ、融合形成性ウイルスーリポソームであるＨＶＪリポソーム（直径４００〜５００ｎｍ）を形成する。融合媒介送達の利点は、ＤＮＡをトランスフェクトすることが、受容体細胞におけるエンドソーム分解およびリソソーム分解から保護されることである。１００ｋｂまでのＤＮＡがＨＶＪリポソーム中に取り込まれ、そして哺乳動物細胞に送達される。ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび薬物もまた、インビトロおよび生体内で細胞中に効率的に導入される。ＨＶＪ−リポソームは、生体内で有意な細胞損傷を誘導することは示されなかった。
繰り返したトランスフェクションが、ＨＶＪの低い免疫原性のため生体内で成功している（Ｈｉｒａｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４５９−４６４（１９９８））。このベクターシステムは改良され、そしてより効率的な遺伝子送達のためにアニオンタイプおよびカチオンタイプＨＶＪ−リポソームが開発された（Ｓａｅｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８：１９６５−１９７２（１９９７））。このＨＶＪ−リポソームシステムを用いて多くの遺伝子治療戦略が成功した（Ｄｚａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１１４２１−１１４２５（１９９６）；Ｋａｎｅｄａら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，５：２９８−３０３（１９９９））。また、ＨＶＪ由来の合成ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）を構築するためにいくつかの試みがなされている（Ｗｕら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔ．，１９０：７３−７６（１９９５）；Ｒａｍａｎｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４０４：１６４−１６８（１９９７）；Ｒａｍａｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１１８８６−１１８９０（１９９８））
ベクターの調製のためにウイルスを不活化する必要がある場合、種々の公知の方法を使用する事ができる。代表的な不活化法としては、ＵＶの照射、アルキル化剤での処理、β−プロピオラクトンでの処理、界面活性剤での処理、酵素処理によるエンベロープの部分的分解が挙げられるが、これらに限定されない。
上記に列挙したウイルスエンベロープベクターを改良した調製方法もまた公知である。その代表的な例を以下に示す。以下に説明するウイルスエンベロープベクターの調製方法は、例示であって、本発明は以下の調製方法によって調製されたベクターに限定されない。
（１．１．ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製）
ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む遺伝子導入ベクターとしては、ＨＶＪ（センダイウイルス）のＦ融合タンパク質およびＨＮ融合タンパク質を再構成したリポソームからなる、遺伝子導入ベクターであって、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能な量のＨＶＪゲノムＲＮＡを含まない、遺伝子導入ベクターが挙げられる。
そのような遺伝子導入ベクターの調製に用いられるＦ融合タンパク質およびＨＮ融合タンパク質は、天然のＨＶＪ由来のタンパク質であっても、組換え発現したタンパク質であってもよい。組換え産生される融合タンパク質は、インビトロでプロテアーゼによってプロセシングされるか、または哺乳動物細胞宿主内において、内在性プロテアーゼによってプロセシングされる。
ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む遺伝子導入ベクターは、例えば、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ＵＶ照射をしていないＨＶＪウイルスから、融合タンパク質を単離する工程、
・融合タンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・所望の核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームをする工程。
上記方法において使用される界面活性剤は、特定の界面活性剤に限定されないが、好ましくは、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳまたはＮＰ−４０、あるいはこれらの混合物である。
上記方法において使用される脂質は、特定の脂質に限定されず、（１）分子中に長鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖を持ち、かつ（２）生体内に存在するか、または生体に由来する分子であればよい。好ましい脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール、スフィンゴミエリン、およびホスファチジン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
リポソームの調製法は周知であり、例えば、以下の方法を使用することも可能である：
（Ａ）第１の試験管内にリン脂質薄膜をあらかじめ作っておく。この試験管に、５５℃の水を飽和させた窒素ガスを導入し、十分に水和させる。水和が完了すると、薄膜は透明になる；
（Ｂ）第２の試験管の緩衝液を静かに試験管Ａに加え、窒素ガスを導入後、密封し（例えば、パラフィルムによる）、３７℃の恒温槽（一定の温度で実験を行うための装置です）中で約２時間放置する；
（Ｃ）静かに振り動かすことにより巨大リポソームを調製する。リポソームが生成すると液が薄く濁る。これを用いて、次の測定を行う。
（Ｄ）試料を一滴スライドグラス上に採り、蛍光顕微鏡（１０００倍）によりその形態を確認する。
ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターを作製するために必要とされるタンパク質の調製方法は周知である。
例えば、天然のＨＶＪを供給源としてＨＶＪのエンベロープタンパク質を精製するか、または組換え発現したＨＶＪのエンベロープタンパク質を精製することができる。周知のタンパク質の精製方法としては、例えば、硫安沈殿法、等電点電気泳動、およびカラムによる精製法が挙げられるが、これらに限定されない。カラムによるタンパク質の精製を行う場合、所望のタンパク質の性質および夾雑物の性質に応じて、種々のカラムを選択する。タンパク質精製のためのカラムとしては、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、アフィニティーカラムが挙げられるが、これらに限定されない。
あるいは、ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む遺伝子導入ベクターは、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ＨＶＪのＦタンパク質およびＨＮタンパク質を組換え発現する工程、
・Ｆタンパク質をプロテアーゼでプロセシングする工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を単離する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームをする工程。
また、ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む遺伝子導入ベクターは、以下の工程を包含する方法によっても調製される：
・Ｆタンパク質をプロセシングするプロテアーゼを発現する宿主細胞内において、Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を組換え発現する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を単離する工程、
・Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調製する工程、
・所望の核酸を充填したリポソームを調製する工程、および
・再構成粒子および該リポソームを融合する工程。
（１．２．ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製）
ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製法としては、例えば、以下の工程を包含する方法が挙げられる：
１）ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
２）この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合する工程。
あるいは、ウイルスエンベロープ由来の遺伝子導入ベクターは、以下の工程を包含する方法によって調製される：
・ウイルスを不活性化する工程、
・不活性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および
・混合液を凍結融解する工程、
を包含する、方法が提供される。
本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；
・ウイルスを不活性化する工程、および
・不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、
を包含する、方法が提供される。
（１．３．リポソームベクター）
リポソームベクターは、リポフェクションに一般的に用いられる脂質から調製したリポソームを用いることができる。例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００のような脂質を用いることができる。
（細胞の選択）
本発明において、種々の細胞が、第１の宿主細胞として使用され得る。第１の宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、候補核酸が由来する種由来の細胞である。
また、本発明において、種々の細胞が、第２の宿主細胞として使用され得る。任意の種々の細胞を、第２の宿主細胞として用いることができる。第２の宿主細胞として好ましい細胞は、１細胞あたり、１種類の候補核酸を取り込む細胞である。そのような細胞としては、細菌細胞、および真菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明において、種々の細胞が、第３の宿主細胞として使用され得る。第３の宿主細胞は、好ましくは、第１の宿主細胞と同一であるか、または同様の遺伝子発現機構を有する細胞である。
以上、好ましい実施形態を例示して本発明を説明してきた。以下に、図面を参照しながら、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供されることに留意されるべきである。従って、本発明の範囲は、説明に用いた特定の実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】  （実施例１：ウイルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入した遺伝子導入ベクターの調製および使用）
（ウイルスの調製）
ＨＶＪ、Ｚ株を、先に記載のように（Ｋａｎｅｄａ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ｖｏｌ．３，ｐｐ．５０−５７（１９９４））差示的遠心分離により精製した。精製ＨＶＪを平衡化塩溶液（ＢＳＳ：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そしてウイルス力価を、５４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。５４０ｎｍにおける光学的密度は、１５，０００血球凝集単位（ＨＡＵ）に対応し、融合活性と相関する。
（ＨＶＪからのＦおよびＨＮ融合タンパク質の抽出）
エタノール中に溶解した、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を、それぞれ０．５％および２ｍＭの最終濃度で精製ＨＶＪ懸濁液の２０ｍｌ（１，７５０，０００  ＨＡＵ）に添加した。この混合物を、回転しながら、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、この懸濁液を、１００，０００ｇ、４℃で７５分間遠心分離し、不溶性タンパク質およびウイルスゲノムを除去した（Ｕｃｈｉｄａら、１９７９）。上清液を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して３日間透析し、緩衝液を毎日交換することにより、残存ＮＰ−４０およびＰＭＳＦを洗い流した。透析した溶液を、１００，０００ｇ、７５分間４℃で遠心分離し、不溶性物質を取り除いた。上清液を、先に記載した方法（Ｙｏｓｈｉｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：５３５５−５３６１（１９８１））に基づき０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のイオン交換カラムにアプライした。素通り画分および０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶出液を集めた。両画分を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、タンパク質成分を分析した。ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、そして各タンパク質の比率を、コンピューター化デンシトメトリー（ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ；Ａｐｐｌｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて評価した。
（組換え発現）
ＨＶＪの融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに組み込み、適切な宿主細胞において発現することによっても、調製され得る。Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質のアミノ酸配列は公知である。
種々の宿主細胞に使用され得る発現ベクターとしては、市販の各種のベクターを使用し得る。
融合タンパク質をコードする発現ベクターは、細胞に導入され得、当該分野において公知でありそして記載される任意の種々の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ、Ｖｏｌｓ  １  ｔｏ  ３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９４）、これらの各々は、本明細書において参考として援用される））によって、本発明の融合タンパク質を産生し得る。組換え発現ベクターを原核生物または真核生物細胞中に導入する方法として、例えば、エレクトロポーレーション法などの、形質転換またはトランスフェクション法が挙げられる。
組換えＦタンパク質を大腸菌で発現した場合、不活性なＦ０形態として発現された。大腸菌で発現された不活性なＦ０形態のタンパク質を活性なＦ１形態に変換するためには、０．０００４〜０．００１％トリプシンを用いる３７℃３０分間のトリプシン処理が必要とされた。
トリプシン処理された活性化Ｆ１タンパク質に対応するポリペプチドは、短縮された活性化Ｆ１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いて、大腸菌で発現され得る。短縮されたＦ１タンパク質は、少なくとも、１１７番目のフェニルアラニンから１４２番目のアラニンまでの２６アミノ酸残基を含む必要がある。短縮型タンパク質が封入体を形成する場合は、封入体をリフォールディングすることにより、活性型タンパク質を得ることが当業者にとって容易に可能である（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆ．ＫｅｌｌｅｙおよびＭａｒｊｏｒｉｅ  Ｅ．Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、（１９９０）ｖｏｌ．１２、１〜１９頁を参照のこと）。
ＨＶＪが複製し得る細胞（例えば、げっ歯類の気管上皮細胞；ニワトリ胚；サル腎臓の初代培養細胞；ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞）を宿主細胞として使用してＦタンパク質を発現させる場合、発現された全長Ｆタンパク質が宿主細胞の内在性プロテアーゼにより切断され、その結果として活性化されるため、活性型Ｆタンパク質を発現および単離することが可能である。あるいは、Ｔｒｉｐｔａｓｅ  ｃｌａｒａ（Ｋｉｄｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｓ  ９，２３５−２４４（１９９９））を、内在性の酵素として発現する宿主細胞（例えば、ラットの気管上皮細胞）、または組換え的に発現する宿主細胞もまた使用され得る。
これら発現ベクターの選択および構築方法、宿主細胞への導入方法、宿主細胞での発現方法、ならびに発現タンパク質の回収方法は、当業者にとって周知である。
（ＨＶＪからの融合タンパク質の精製）
融合タンパク質の精製のために、ＮＰ−４０処理したＨＶＪの溶解物を、超遠心によって明澄化した。上清のタンパク質を、さらなる精製の前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この上清は、ＨＶＪ由来の多くのタンパク質を合んでいた。次に、この上清を、イオン交換クロマトグラフィーにアプライした。５２ｋＤａおよび７２ｋＤａタンパク質が主に、素通り画分に溶出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度によって、これら２つのタンパク質を、それぞれＦ１およびＨＮであると同定した（Ｏｋａｄａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｄｕｚｇｎｅｓ（Ｅｄ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｖｏｌ．２２１，ｐｐ．１８−４１（１９９３））。５２ｋＤａタンパク質の下のかすかなバンドは、融合タンパク質（Ｆ１およびＨＮ）の分解産物であると考えられた。なぜなら、これらのタンパク質は、異なる実験間で再現性がなかったからである。タンパク質を、さらに０．２Ｍ  ＮａＣｌによって溶出した。しかし、融合タンパク質は、効率よくは得られなかった。そしてＨＶＪのＮＰタンパク質であると推測されるさらなる６０ｋＤａタンパク質が出現した。結果として、素通り画分のみを、さらなる実験の融合タンパク質の供給源として使用した。デンシトメトリーは、素通り画分のＦ１対ＨＮの濃度比が２．３：１であることを示した。このことは、ウイルスエンベロープ中の両タンパク質の比と一致した。以前の論文（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１４２：９５−１０１（１９８２））は、この比がＨＶＪの効率的な融合に必要であると報告している。
（遺伝子導入ベクターの調製）
３．５６ｍｇホスファチジルコリンおよび０．４４ｍｇコレステロールの脂質混合物を、クロロホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発させた（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０：１０−２０（１９７９））。乾燥脂質混合物を、０．８５％ＮＰ−４０を含む２．０ｍｌの上記素通り画分からのタンパク質溶液（１．６ｍｇ）中にボルテックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して透析し、ＮＰ−４０を除去した。透析は、毎日緩衝液を交換して６日間実施した。この透析された溶液を、０．３Ｍスクロースおよび１ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化したアガロースビーズ（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ−５０ｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）にアプライした。５４０ｎｍにおける光学的密度が１．５を超える画分を再構成融合粒子として集め、そして以下に記載のように１０ｍｇ脂質から調製された核酸充填リポソームと融合し、遺伝子導入ベクターを調製した。
（ヒトＨＥＫ２９３株由来のトランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現）
上記の方法で調製した遺伝子導入ベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒトＨＥＫ２９３株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。
ｐＣＭＶ−ルシフェラーゼ（７．４ｋｂ）を、ｐＧＥＭ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）からのルシフェラーゼ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）中に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位でクローニングすることにより構築した。約４０μｇのｐＣＭＶ−ルシフェラーゼを含む遺伝子導入ベクターを、先に記載のように構築し、そしてこの遺伝子導入ベクター（約１．５×１０１１粒子／ｍｌ、ＤＮＡ濃度は約４０μｇ／ｍｌ）の１／１０量（１００μｌ）を、ヒト２９３細胞株（ヒト胎児腎臓：ＨＥＫ）由来の２×１０５細胞とインキュベートした。ＨＶＪリポソームを用いて、また同量のルシフェラーゼＤＮＡを２×１０５ＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入２４時間後、細胞を回収し、そして他に記載のように（Ｓａｅｋｉら、Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８：１９６５−１９７２（１９９７））、ルシフェラーゼ活性アッセイを確認した。
（実施例２：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製および使用）
（遺伝子導入ベクターの調製およびその使用）
（１：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製）
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換えＨＶＪウイルスを様々な回数で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。
ＴＥ５００μｌに、７５０μｇのルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（ＳａｅｋｉおよびＫａｎｅｄａら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１、４７１〜４７９（２０００））と様々な濃度のＨＶＪウイルスを混合した。ＨＶＪウイルス濃度は、１０、２５、５０、１００ＨＡＵ／μｌに調製した。この溶液を１２分割し、それぞれをドライアイスによって４℃に保存して凍結させた後、融解することを最大３０回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、ＢＨＫ−２１細胞（２４ウェルディッシュ、４×１０４細胞／ディッシュ、０．５ｍｌ  ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて２０分間反応後、ＰＢＳにより洗浄し、新たに培養液を０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。
培地を除去し、１×Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５００μｌを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清２０μｌから、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＳｙｓｔｅｍとＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０１  Ｌｕｍｉｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液について３回行い、平均値を求めた。
この結果、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、３回の凍結融解に比べ２０回の凍結融解では１０倍以上のルシフェラーゼ発現が観察された。この結果から、この実施例に用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は好ましくは５回以上、さらに好ましくは１５〜２０回程度であることが確認された。
（２：凍結融解により調製されたＨＶＪエンベロープベクターの遺伝子導入効率）
上記１と同様の組換えＨＶＪウイルスを３０回凍結融解した後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。
その結果、例えばＸ軸が５００ＨＡＵの場合では、ウイルス濃度１０ＨＡＵ／μｌの溶液の添加量は５０μｌであり、１００ＨＡＵ／μｌの溶液は５μｌとなる。ウイルス濃度が１００ＨＡＵ／μｌの溶液は１０〜５０ＨＡＵ／μｌ濃度の場合に比較して遺伝子発現の効率が約５０％低下した。この結果から、この実施例の条件では、組換えウイルス濃度は１０〜５０ＨＡＵ／μｌの範囲とすることが好ましいことが確認された。
また、組換えＨＶＪウイルスを２９回凍結融解した後、３０回目の凍結を行い、その凍結状態で１週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この１週間冷凍保存した組換えＨＶＪウイルスも、３０回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。
（実施例３：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製および使用）
（１：ＨＶＪの増殖）
ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
本実施例において、ＨＶＪの増殖を以下のようにおこなった。
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ  Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ＮａＣｌを混合し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．１ｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。
（２：ＨＶＪの精製）
ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ、３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ、９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。
本実施例において、具体的には、以下の方法によってＨＶＪを精製した。
ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍｌを広口の駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５、１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。
このウイルス液０．１ｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ  ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ  ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。
手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。
具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。
漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられた。
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮した。
（３：ＨＶＪの不活性化）
ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。
（３．１：紫外線照射法）
ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ２を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。
（３．２：アルキル化剤による処理）
使用直前に、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ、１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。
（４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）
保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。
この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。
冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。
（５：ＨＶＪエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
（遺伝子導入方法）
１，０００ＨＡＵ分をエッペンドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）５μｌを加えた。ＢＨＫ−２１細胞（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加した。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中に１０分間放置した。
培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。
（実施例４：リポソームベクターの調製および使用）
（リポソームベクターの調製）
本発明のリポソームベクターを、２０〜２４μｇのｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡと、２４〜７２μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ  ２０００（リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ９２００８））試薬をそれぞれ１．２ｍｌの無血清培地に希釈し、速やかに混合し、２０分間常温でインキュベートすることにより、リポソームと核酸との複合体を形成する。
（リポソームベクターによるトランスフェクション）
宿主細胞を、適切な培地とともに、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、培養する。血清存在下でトランスフェクションする場合、複合体１２．５μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに直接添加し混合する。血清非存在下でトランスフェクションする場合は複合体を添加する前に血清を含んだ培地を除去し、血清を含まない培地に交換する。４〜１２時間ＣＯ２インキュベーターで培養後、培地交換を行う。所定の時間の培養後、アッセイを行う。
（実施例５：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーからの血管内皮増殖因子をコードする遺伝子の単離および解析）
本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する目的遺伝子を分離することが可能である。その分離方法の実施形態の１つを模式的に図１に示す。
実際に、本明細書の実施例３で調製した遺伝子導入ベクターを使用して、血管内皮増殖因子をコードする遺伝子を単離した。なお、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の実施例３で調製した遺伝子導入ベクターのみならず、任意の「ウイルスエンベロープベクター」および「リポソームベクター」が使用可能である。
ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社；ヒト心臓由来ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドｐＳＰＯＲＴに連結したプラスミド）をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１２Ｓに導入し、そのＥ．ｃｏｌｉから、プラスミドを調製した。プラスミド２００μｇを、１００００ＨＡＵのＨＶＪ−Ｅ遺伝子導入ベクター（本発明の実施例３で調製した遺伝子導入ベクター、３×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅ）に封入した。宿主細胞として、ヒト大動脈内皮細胞ＨＡＥＣ（三光純薬）約５０００細胞を、９６ウェルマクロタイタープレートの各ウェルに培地とともに添加して、一晩培養した細胞を用いた。宿主細胞を含んだ各ウェルに対して、上記ＨＶＪ−Ｅの１００分の１量を添加し、３７℃  ３０分間放置した後、培地交換をした。
使用した培地は、血清濃度を１％とした低栄養状態のもので、この状態下で、１週間培養を行う。この条件下では、ＨＥＡＣの増殖は確認されなかった。
２週間後、細胞増殖アッセイを行った。試薬として、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ミトコンドリアの酸化還元状態を試薬の色調の変化として捉えて、細胞増殖の指標とした。その結果を、図２に示す。
図２において、最も色の濃いウェルは、最も活発に細胞増殖が行われた細胞が存在するウェルである。そこで、マイクロタイタープレート全体をプレートリーダーで読み取り、その細胞増殖を、図３に示すように、コンピュータによりグラフ化した。このグラフから、最も増殖作用を示す２つのウェル内の細胞から、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いて、核酸を調製した。調製した核酸には、プラスミドＤＮＡが含まれるので、これをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α；宝酒造）に熱ショック法を用いて導入した。
このＥ．ｃｏｌｉをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させた。１つのウェルより調製したＤＮＡから、約２０〜２００個のコロニーを得ることができた。各コロニーからプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の遺伝子フラグメントの存在を確認した。その結果、調製したプラスミドのうち、約６０〜７０％のプラスミドが、挿入物を有するプラスミドであった（図４、白矢印は、挿入物のフラグメントを示す）。
次に、Ｑｉａｇｅｎ社のＥｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを精製し、その精製したプラスミドをＨＶＪ−Ｅに封入して、再度ＨＡＥＣ細胞に導入し、同様の細胞増殖実験を行った。この細胞増殖実験において、有意に高い細胞増殖を示したプラスミドが、血管内皮増殖因子をコードする核酸を含むことが予想される候補プラスミドである。今回の結果では、２つのクローン（ｐ３７４３、ｐ７７４２１）が、再現性良く、高いＨＥＡＣ増殖能を示した。そのうちの１つの結果を、図５に示す。
今回単離された遺伝子の産物は、ヒト大動脈内皮細胞ＨＡＥＣに対して、ＶＥＧＦやＨＧＦよりも高い増殖作用を有していた。一方、ヒト血管平滑筋細胞に対してはＶＥＧＦやＨＧＦと同様の活性であった。
（血管新生作用の検討）
上記、高いＨＡＥＣ増殖能を示した２つの遺伝子（ｐ３７４３、ｐ７７４２１）について、血管新生キット（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，ＫＺ−１０００，倉敷紡績株式会社）を用い、以下の方法に従い血管新生作用を評価した。対照として、ブランク、血管内皮細胞増殖因子−Ａタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ）、ｐＶＥＧＦプラスミド（血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含むプラスミド）、ｐＳＰＯＲＴ１（血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子を含まないプラスミド）を用いた。得られた各画像を、以下の方法に従い血管新生定量ソフトウェア（ＫＳＷ−５０００Ｕ，倉敷紡績株式会社）を用い定量化した。
２４ウエルプレート上でヒト臍帯静脈血管内皮細胞と、ヒト成人皮膚由来繊維芽細胞を共存培養している血管新生キット（倉敷紡績（株）製ＫＺ−１０００）を用いた。血管新生専用培地（倉敷紡績（株）ＫＺ−１４００）中へ、ＶＥＧＦ−Ｅ（ＮＺ−７）１０ｎｇ／ｍｌを添加した培地へ、さらに抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ中和抗体を０、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの各濃度となるように添加して培養した。
抗ヒトＶＥＧＦ−Ａ中和抗体としては、Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ、Ｈｕｍａｎ，Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏ（２６５０３．１１１）（Ｒ＆Ｄ社製カタログＮｏ．ＭＡＢ２９３）を用いた。培養は３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて行った。培地は、培養４日目、７日目および９日目に同じ添加物を含有するものと交換した。培養開始１１日目に培地を除き、管腔染色キット（ＣＤ３１抗体染色用：倉敷紡績（株）ＫＺ−１２２５）を用いて以下の手順に従い染色した。
ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）染色１次抗体（マウス抗ヒトＣＤ３１抗体）をブロッキング液（１％−ＢＳＡを含むダルベッコ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で４，０００倍希釈した。各ウエルにこの１次抗体溶液０．５ｍｌを添加し、６０分間３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、１ｍｌのブロッキング液で各ウエルを計３回洗浄した。
次いでブロッキング液で５００倍希釈した２次抗体溶液（ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体）０．５ｍｌを各ウエルに添加し、６０分間３７℃でインキュベートした後、１ｍｌの蒸留水で３回洗浄した。その間に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴの錠剤２錠を蒸留水２０ｍｌに溶解し、ポアサイズ０．２μｍのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液０．５ｍｌを各ウエルに添加し、管腔が深紫色になるまで（通常５〜１０分間）３７℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水１ｍｌで、各ウエルを３回洗浄した後洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウエルを観察した。
各ウエルを４０倍の顕微鏡で観察し、各ウエルの写真を撮影した。
また、１ｍｍのスケールを４０倍に拡大した写真を撮影し（図６）、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積（図７左欄）、長さ（図７右欄）、ジョイント（図８左欄）、およびパス（図８右欄）を測定した。管腔の分岐点の数を「ジョイント」、分岐点から出る管腔の数を「パス」として示した。
図６に示す観察結果および、図７および８に示す形成管腔のデータより、クローンｐ７７４２１は、ＶＥＧＦと同程度の血管新生作用を有し、そしてクローンｐ３７４３は、ＶＥＧＦよりも優れた血管新生作用を有することが実証された。
（ｃ−ｆｏｓルシフェラーゼアッセイ）
上記実験によって単離された遺伝子の産物が、ｃ−ｆｏｓ遺伝子のプロモーター活性に及ぼす影響を、ルシフェラーゼ遺伝子の上流にｃ−ｆｏｓ遺伝子プロモーターを組み込んだレポータープラスミドを用いるレポーターアッセイにより検討した。
具体的には、以下のとおりに行った：
内皮細胞を、６ウェルプレートに播種し、次に、ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いて、ｃ−ｆｏｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐ２ＦＴＬ）をトランスフェクションした。このｆｏｓ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、２コピーのｃ−ｆｏｓ  ５’−調節エンハンサーエレメント（−３５７〜−２７６）、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター（−２００〜＋７０）、およびルシフェラーゼ遺伝子からなる。必要に応じて、ｐ３７４３プラスミドと同時にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクションした細胞を無血清培地中で２４時間インキュベーションした。必要に応じて、休止状態の細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（幹細胞増殖因子）またはＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）で４時間処理した。ＰＢＳで洗浄し、５００μｌの細胞溶解緩衝液を添加し、室温で１５分間放置することにより、細胞を溶解した。細胞を溶解して得られた細胞抽出液の１０μｌを１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合して、ルミノメーターを用いて３０秒間、発光を測定し、ＲＬＵとして示した。ルシフェラーゼ活性の著明な上昇から、ｐ３７４３がｃ−ｆｏｓ遺伝子プロモーター活性を上昇させる、ことが示された。（図９）
以上の結果は、本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する遺伝子の単離を迅速かつ簡便に行うことができたことを実証する。
（実施例６：所望の機能的性質を有する変異核酸の単離方法）
本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する変異遺伝子を分離することが可能である。
本明細書の実施例３で調製した遺伝子導入ベクターを使用して、血管内皮増殖因子をコードする遺伝子を単離する。なお、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の実施例３で調製した遺伝子導入ベクターのみならず、任意の「ウイルスエンベロープベクター」および「リポソームベクター」が使用可能である。
出発物質として、特定の遺伝子を含む核酸を選択する。その核酸を、第１の宿主細胞内でプロモーターとして機能する配列に、作動可能に連結したプラスミドを作製する。そのプラスミドを、実施例３に従って、第１の宿主細胞に導入する。
核酸を導入した第１の宿主細胞に変異誘発をし、約５０００個の細胞を、９６ウェルマクロタイタープレートの各ウェルに培地とともに添加して、一晩培養する。培養後、各ウェル内の変異宿主細胞を、所望の機能について、スクリーニングする。所望の機能を示す細胞を取り出し、最も好ましい性質を示したウェル内の細胞から、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを用いて、核酸を調製する。調製される核酸には、プラスミドＤＮＡが含まれるので、これをコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α；宝酒造）に熱ショック法を用いて導入する。
このＥ．ｃｏｌｉをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させる。１つのウェルより調製したＤＮＡから、通常約２０〜２００個のコロニーを得ることができる。各コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の遺伝子フラグメントの存在を確認する。
次に、Ｑｉａｇｅｎ社のＥｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを用いて、プラスミドＤＮＡを精製し、その精製したプラスミドをＨＶＪ−Ｅに封入して、再度ＨＡＥＣ細胞に導入し、同様の機能的性質について試験する。この細胞増殖実験において、好ましい機能的性質を示したプラスミドが、所望の機能的性質を有する変異核酸を含むプラスミドであることが判明する。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】  所望の機能的性質を有する核酸を単離するための、新規な方法およびキットが提供される。これにより、従来よりも迅速かつ簡便に、所望の機能的性質を有する核酸を単離することができる。本発明は、特に、哺乳動物細胞を宿主細胞とする発現スクリーニングにおいて有効である。
本発明では対象細胞やアッセイ法の組み合わせを変えることにより様々な機能を持つ遺伝子が分離できる。具体的には、例えば癌抑制遺伝子、骨形成増強遺伝子、アポトーシス誘発遺伝子、サイトカイン分泌遺伝子、神経細胞樹状突起誘導遺伝子、動脈硬化抑制遺伝子、糖尿病抑制遺伝子、自己免疫疾患抑制遺伝子、アルツハイマー病抑制遺伝子、パーキンソン病抑制遺伝子、神経細胞保護遺伝子等を挙げることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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