(57)【要約】試料（１１２）は、試料導入路（１１４）に導入され、隔壁（１１８）に設けられた微細流路を介して泳動レーン（１２０）に導かれる。泳動レーン（１２０）には、電極（１１６ａ）及び電極（１１６ｂ）が対向配置されている。これらの電極により構成される電界の方向に対して側方から試料（１１２）が導入されるようになっている。試料（１１２）には、等電点電解質が含まれているため、電界の影響を受けて泳動レーン（１２０）内にｐＨ勾配が形成される。このため、隔壁（１１８）の微細流路から導入された試料は、図示したように、泳動レーン（１２０）内において、各成分の等電点に応じてバンドに収束する。収束されたバンドの成分は、速やかに泳動レーン（１２０）内に取り込まれる。
2004051252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、前記等電点分離領域に試料を導入する試料導入部とを備える分離装置であって、
前記試料導入部を介し、前記電界印加方向の側方から試料が導入されるように構成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の分離装置において、前記試料導入部は；試料の導入される流路と、前記流路および前記等電点分離領域の間に介在する隔壁と、
を含み、前記隔壁に、前記流路および前記等電点分離領域に連通する複数の導入流路が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項３】
請求の範囲１または２に記載の分離装置において、前記等電点分離領域が矩形形状を有し、前記矩形形状の対向する一対の辺に沿って前記一対の電極を備え、残る辺のうち一方の辺に沿って前記試料導入部を設けたことを特徴とする分離装置。
【請求項４】
請求の範囲１乃至３いずれかに記載の分離装置において、前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部を備えることを特徴とする分離装置。
【請求項５】
請求の範囲４に記載の分離装置において、前記試料回収部は、前記試料導入部と対向して配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の分離装置において、前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含むことを特徴とする分離装置。
【請求項７】
請求の範囲６に記載の分離装置において、複数の前記回収レーンの回収口は、前記等電点分離領域に沿って一列に密に配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項８】
請求の範囲６または７に記載の分離装置において、複数の前記回収レーンを区画する壁部は、前記等電点分離領域の延在する平面内において前記等電点分離領域に向けて尖鋭に突出した断面形状または曲面が突出した形状を有することを特徴とする分離装置。
【請求項９】
請求の範囲１乃至８いずれかに記載の分離装置において、前記等電点分離領域の所定箇所に光を照射する光照射部と、光を照射した箇所における吸光または発光を検出する光検出部と、前記吸光または発光に基づいて前記試料に含まれる成分の分析を実行する分析部と、をさらに備えることを特徴とする分離装置。
【請求項１０】
請求の範囲１乃至９いずれかに記載の分離装置において、前記等電点分離領域に隣接して、分子量による成分分離を行う分子量分離部をさらに備え、等電点分離と分子量分離とを連続的に実行するように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項１１】
生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、前記分離手段は、請求の範囲１乃至１０いずれかに記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、等電点等により試料の分離を行う分離装置およびそれを用いた質量分析システムに関するものである。
【背景技術】  ポストゲノム時代の一翼を担う研究手法としてプロテオミクスが注目を集めている。プロテオミクス研究では最終的に質量分析法等によりタンパク質等の同定を行うが、その前段階において、質量分析等を可能にするための試料分離および前処理が行われる。こうした試料分離の手法として、従来、２次元電気泳動が広く利用されてきた。２次元電気泳動は、ペプチド、タンパク質等の両性電解質をその等電点で分離した後、さらに分子量により分離するものである。
しかしながら、この分離方法は、通常、一昼夜を要するほど時間がかかる上、試料の回収率が低く、質量分析等に供する試料が比較的少量しか得られず、この点について改良が望まれていた。
一方、近年では、試料の前処理・反応・分離・検出などの化学操作をマイクロチップ上で行うマイクロ化学分析（μ−ＴＡＳ）が急速に発展しつつある。マイクロチップを利用する分離・分析手法によれば、使用する試料が微量で済み、環境負荷も小さく高感度な分析が可能となる。分離に要する時間を大幅に短縮することも可能となる。
特許文献１には、基板上に溝やリザーバを設けた構成のマイクロチップによりキャピラリ電気泳動を実現する装置が記載されている。
特許文献１  特開２００２−２０７０３１号公報
また、特許文献２には、ペプチド、タンパク質等をその等電点で分離し分析するマイクロチップ型の電気泳動装置が記載されている。
特許文献２  特開２０００−５５８７９号公報
以下、特許文献２記載の装置について図１を参照して説明する。この装置では、ガラス基板内部に分離流路１４と試料導入流路１６が交差して形成されたマイクロチップ１８が設けられている。マイクロチップ１８の一表面には、分離流路１４の両端及び試料導入流路１６の両端に対応する位置に、分離流路１４又は試料導入流路１６に達する穴がそれぞれ形成されている。分離流路１４の両端及び試料導入流路１６の両端に泳動電圧を印加する泳動電源装置２０が設けられている。
光照射手段２６は光源２２および分光器２４により構成され、分離流路１４の所定の範囲に光を照射する。光照射手段２６とは反対側に、分離流路１４からの光をそれぞれの位置で検出する受光素子が配置されている。この受光素子は分離流路１４に沿って並べられたアレイ型光検出器２８により構成されている。アレイ型光検出器２８は、検出信号を増幅する増幅回路３０及びアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換器３２を介して、ＣＰＵ３４に接続されている。ＣＰＵ３４は、前記検出信号に基づいて試料成分同定のためのデータ解析を実行する。容器３６には、マーカサンプルや試料、ポリバッファがそれぞれ貯蔵されており、これらはニードル３８により分離流路１４や試料導入流路１６の一端に注入されるようになっている。
こうしたマイクロチップによる分離手法を用いることにより、微量試料による高感度な分析が可能となる。しかしながら、これらのマイクロチップはその流路サイズが小さいことから、比較的少量の物質の分離しかできず、また、分離部において検出・回収される試料の量が少ないという課題を有していた。くわえて、上記手法はその性質上、バッチ形式の分離プロセスとなり、試料を連続的に導入する方法を採用することが困難であるという課題を有していた。
【発明の開示】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであって、その目的とするところは、比較的大量の試料を効率よく分離できる分離装置を提供することにある。また本発明の別の目的は、分離成分の拡散を抑制し、少量の物質でも検出、回収を可能とする分離装置を提供することにある。
本発明によれば、ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、前記等電点分離領域に試料を導入する試料導入部とを備える分離装置であって、前記試料導入部を介し、前記電界印加方向の側方から試料が導入されるように構成されていることを特徴とする分離装置が提供される。
この装置においては、分離対象となる試料が、導入流路を介し電界印可方向の側方から導入される。この点、試料導入口から排出口に至る流路方向に泳動電界が付与される従来の電気泳動装置と異なる。本発明によれば、上記のように試料が導入されるため、試料の連続導入が可能となる。この結果、等電点分離により分離された成分を比較的多量に得ることができる。また、分離成分の拡散が抑制されるため、少量の物質でも検出、回収が可能となる。
本発明の分離装置において、前記試料導入部は、試料の導入される流路と、前記流路および前記等電点分離領域の間に介在する隔壁と、を含み、前記隔壁に、前記流路および前記等電点分離領域に連通する複数の導入流路が形成されている構成とすることができる。
この装置においては、流路から直接等電点分離領域に試料が導入される構造となっているため、試料を連続的に導入しながら等電点分離を連続的に行うことが可能となる。これにより、効率の良い等電点分離操作を実現することができる。従来の等電位点分離装置は連続的に試料を導入することができなかったため、検出感度、回収効率に一定の限界があった。これに対し本発明は、試料を連続的に分離できることから、こうした課題を有効に解決することができる。
本発明の分離装置において、前記等電点分離領域が矩形形状を有し、前記矩形形状の対向する一対の辺に沿って前記一対の電極を備え、残る辺のうち一方の辺に沿って前記試料導入部を設けた構成とすることができる。
本発明の分離装置において、前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部を備える構成とすることができる。試料回収部は前記試料導入部に対向配置された構成とすることができる。また、前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含む構成としてもよい。また、複数の前記回収レーンの回収口は、前記等電点分離領域に沿って一列に密に配置されている構成とすることができる。こうした構成を採用することにより、分離した試料を効率良く回収することができる。
本発明の分離装置において、複数の前記回収レーンを区画する壁部は、前記等電点分離領域の延在方向の断面が、前記等電点分離領域に向けて尖鋭な形状または曲面が突出した形状を有する構成とすることができる。
本発明によれば、前記等電点分離領域の所定箇所に光を照射する光照射部と、光を照射した箇所における吸光または発光を検出する光検出部と、前記吸光または発光に基づいて前記試料に含まれる成分の分析を実行する分析部と、をさらに備えることを特徴とする分離装置が提供される。この分離装置によれば、等電点分離された試料を感度良く分析することができる。
さらに本発明によれば、前記等電点分離領域に隣接して、分子量による成分分離を行う分子量分離部をさらに備え、等電点分離と分子量分離を連続的に実行するように構成されたことを特徴とする分離装置が提供される。
さらに本発明によれば、生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、を備え、前記分離手段は、上述のマイクロチップを含むことを特徴とする質量分析システムが提供される。
この質量分析システムによれば、質量分析用に適した試料を効率よく調整できる。
以上説明したように本発明によれば、マイクロチップ上で比較的大量の試料を分離でき、少量の物質でも検出、回収を可能とする分離装置を実現することができる。
【図面の簡単な説明】上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
図１は、従来の電気泳動装置の構成を示す図である。
図２は、実施の形態に係る等電点分離装置の構成を示す図である。
図３は、実施の形態に係る等電点分離装置の構成を示す図である。
図４は、実施の形態に係る等電点分離装置の構成を示す図である。
図５は、図４における試料導入口および試料回収口の詳細構造を示す図である。
図６は、実施の形態に係る分離装置の構成を示す図である。
図７は、実施の形態に係る分子量分離部の概略構成図である。
図８は、図６の装置における回収部から回収される成分を説明するための図である。
図９は、分子量分離部における電圧印加方法及びこれに対応する成分の分離の様子を示す図である。
図１０は、実施の形態で説明した分離装置を含むシステムの構成図である。
図１１は、実施の形態で説明した分離装置の構成図である。
図１２は、質量分析装置の構成を示す概略図である。
図１３は、本実施形態に係る質量分析システムのブロック図である。
図１４は、試料濃縮をマイクロチップ上で行う装置の主要部を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  第１の実施の形態
本実施形態は、タンパク質等の試料を等電点により分離するものである。図２は、この分離装置を含むシステムの概略構成図である。連続２次元電気泳動チップ１００は、連続等電点分離部１１０及び連続分子量分離部１０５により構成されている。連続２次元電気泳動チップ１００に注入された試料は、まず連続等電点分離部１１０に導入される。連続等電点分離部１１０において、導入された試料は、等電点に応じて複数のバンドに分離する。それぞれのバンドに分離された試料は、次に連続分子量分離部１０５に導入される。連続分子量分離部１０５は、連続等電点分離部１１０の泳動方向と垂直な方向に、アレイ状に複数形成されている。連続分子量分離部１０５に導入された試料は、その分子量に応じて分離される。分離された各成分は、それぞれ回収された後、所定の手順により、たとえば質量分析法用の試料に調製される。
図３は、等電点分離装置の構成の例を示す図である。試料１１２は、あらかじめ所定のバッファと混合しておく。このバッファとは、電界をかけるとｐＨ勾配を形成する溶液であり、たとえばアマーシャルバイオサイエンス社のＡｍｐｈｏｌｉｎｅやＰｈａｒｍａｌｙｔｅ等を含む溶液が例示される。この溶液が試料導入路１１４に導入され、隔壁１１８に設けられた微細流路（不図示）を介して泳動レーン１２０に導かれる。泳動レーン１２０には、電極１１６ａ及び電極１１６ｂが対向配置されている。これらの電極により構成される電界の方向に対して側方から試料１１２が導入されるようになっている。試料１１２には、等電点電解質が含まれているため、電界の影響を受けて泳動レーン１２０内にｐＨ勾配が形成される。このため、隔壁１１８の微細流路（不図示）から導入された試料は、図示したように、泳動レーン１２０内において、各成分の等電点に応じてバンドに収束する。収束されたバンドの成分は、速やかに回収部１２２内に取り込まれる。
本実施形態では、こうした分離装置がマイクロチップ上で実現されている。図４は、本実施形態に係る分離装置の構造を示す図である。この装置は、ヒーターやバッファ流路等を格納する中空構造の支持台１４７と、その支持台１４７上に配置される石英基板により構成され、この石英基板表面に溝状に分離部等が形成される。これらは、フォトリソグラフィー技術およびドライエッチング技術と用いて形成することができる。支持台１４７上に配置される板状部材の材料として、ここでは石英ガラス基板を用いたが、表面に酸化膜を有するシリコン基板やプラスチック基板等を用いることもできる。
図５は、図４における試料導入口および試料回収口の詳細構造を示す図である。
隔壁１１８に設けられた試料導入口は、図中右側の拡大図のような構造になっている。隔壁に設けられた試料導入口は、間隔Ｂで規則的に配列され、隔壁の幅はＡとなっている。一方、回収部１２２に設けられる試料回収口は、図中左側の拡大図に示されるように、泳動レーン１２０の延在する平面内において、泳動レーン１２０に向けて尖鋭に突出した断面形状となっている。回収レーンの幅はｄ１であるのに対し、回収口の幅はｂとなっている。このように開口部が泳動レーン１２０に向けて拡大した形状となっていることにより、回収効率が向上する。また、泳動レーン１２０に向けて尖鋭に突出した断面形状または曲面が突出した形状とすることにより、隣接する回収レーンへの試料の回収が円滑に行われる。こうすることにより、泳動レーン１２０から回収部１２２に向かう液体の流れが乱れず、各成分が回収されるべきレーンに取り込まれることにより分解能が向上する。なお、各部の開口幅等は任意に設計することができるが、たとえば以下のようなサイズとすることができる。
Ａ：０．１ｍｍ
Ｂ：１ｍｍ
ａ：０．５ｍｍ
ｂ：１ｍｍ
ｄ１：０．５ｍｍ
ｄ２：０．１ｍｍ
回収された試料は、他の分離装置、例えば分子量分離装置により更なる分離を行うことができる。また、試料回収後、他の分析方法による分析を行ってもよい。
以上説明した本実施形態の分離装置によれば、マイクロチップ上で比較的大量の試料を連続的に等電点分離することができる。この装置によれば、少量の物質でも検出、回収が可能となる。
回収した試料を濃縮するには、以下のように電界を利用した方法を用いることができる。図１４は、回収流路中の電極の配置を示す。図１４（ａ）に示すように、試料が通過できる程度の隙間が設けられた電極板３３４を、試料１１２の進行方向における間隔をＤとして複数配置することができる。このとき、各電極板３３４は、間隔Ｄが、流路１１２の幅Ｗより広く、より好ましくは流路１１２の幅の２倍以上となるように配置される。このようにすれば、電極３３４間の電気力線の影響で、各電極板３３４間に試料が入り込めないという現象を防ぐことができる。なお、電極板３３４に設ける隙間は、試料が充分通過できる程度の大きさに形成される。さらに、図１４（ｂ）に示すように、試料の電荷と反対の極性に帯電される電極３３４の間に、電極３３４の対向電極３３５を設けた構成とすることもできる。これにより、試料は対向電極３３５の両側にある電極３３４のいずれかに向かって進行するので、電極３３４への試料の付着量を増加することができる。
第２の実施の形態
本実施形態は、タンパク質等の試料を等電点により分離し、続いて分子量に応じて成分を分離する分離装置に関するものである。
図６は、本実施形態に係る分離装置の概略図である。平面図の右側の部分は、第１の実施の形態で説明したものと同様の構造の等電点分離部である。平面図の左側は、分子量に応じて成分を分離する分離部分である。泳動レーン１２０で等電点分離された成分は、混和部１３０を経由して分子量分離部１４０に導かれ、ここで分子量による分離がなされる。断面図についてみると、泳動レーン１２０及び混和部１３０は、支持台１４７上の石英基板表面に溝部として形成されている。混和部１３０形成箇所の石英基板の下面にはヒーター１３２が設けられており、回収された成分が効率よく混和されるようになっている。分子量分離部１４０は、高さ方向に電界が印加されるようになっており、この電界に応じて、分子量による分離がなされる。
以下、各部における操作の詳細について説明する。
泳動レーン１２０による等電点分離については、第１の実施の形態で既に説明したのでここでは説明を省略する。
混和部１３０は、泳動レーン１２０から回収された成分を、分子量泳動に適するように調整する役割を果たす。混和の目的は、以下の２点である。第１に、ｐＨの偏った溶液を分子量泳動用のバッファのｐＨ（ｐＨ８．０）付近に中和することである。第２に、界面活性剤と回収された成分を反応させ、回収成分の分子を伸展、荷電させることである。この目的のため、混和部では、各回収レーン毎に、ｐＨに合わせて中和に適切な量の界面活性剤を含むバッファが持続的に注入されることが重要である。
また、界面活性剤とタンパク質の結合を促進するために、ヒーターにより加熱することが重要である。ここでは混和部１３０の下面にヒーター１３２が設置されている。なお、界面活性剤としては、ＳＤＳ等が好適に用いられる。
ここで、混和部１３０の各流路に供給する中和用バッファのｐＨは、次のようにする。流路の本数をＮとし、ｐＨレンジを２〜１０とすると、１流路当たり、Δ＝８／ＮずつｐＨが異なる等電点分離済み試料が得られる。１番の流路がｐＨ２とすると、２番の流路は、ｐＨ＝２＋Δである。各流路のｐＨを中和するため、流路のｐＨが酸性の場合、アルカリ性の中和液を用い、流路のｐＨがアルカリ性の場合、酸性の中和液を用いる。中和液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファを用いることができる。この場合、アルカリ性とする場合はＴｒｉｓを多くし、酸性とする場合はＨＣｌを多くする。中和液は、当然のことながら等電点回収部と試料導入部の静水圧差を維持できるように選択される。すなわち、
試料導入部の静水圧Ｐ１
等電点回収部の静水圧Ｐ２
中和溶液の注入圧Ｐ３
とする時、
Ｐ１＝Ｐ３    （１）
Ｐ１＞Ｐ２    （２）
の３式を満たすように選ぶ。
ヒーターによる加温は、どの流路も同じ温度になるようにすればよい。ヒーターによる加温結果は、沸騰を避けられる最高の温度、例えば８０□とする。試料やバッファーは常に流れているので、気泡が形成されたり乾燥固着したりすることはない。
続いて分子量分離部１４０について説明する。分子量分離部１４０は、混和部１３０の流路の本数に応じその数だけ設けられる。これらは、幅約１ｍｍの板状の構造を有している。図７は、一個の分子量分離部の概略構造を示す図である。この分子量分離部は、絶縁性の高いプラスチック或いは石英ガラス等により形成される。こうした材料からなる基板にエッチングを施し、電極を設置し、蓋を設けることでこのような分子量分離部を形成することができる。泳動領域１４１は、高さ方向に仕切りのない一つの流路として形成されるのに対し、回収部１４５は高さ方向に区画された複数の流路からなる。それぞれの回収部１４５からは回収成分１５０が回収される。ここで回収部１４５は、図５に示したものと同様の構造を採用し、各成分が導入される部分において、尖鋭に突出した断面形状または曲面が突出した形状を有するものとする。泳動に用いられるバッファは、図中１４６で示されており、泳動領域１４１の側面全体から供給される。一方、試料は図中試料導入部１４８で示され、泳動領域１４１の右上角部から導入される。試料導入部１４８に導入された試料は、高さ方向の電界に応じて分子量により成分が分離する。
図６に戻り、バッファ及び混和液の供給方式について説明する。図６の右側面図は、混和液流路１３４及びバッファ流路１４２の導入口の配置パターンを示す。混和液流路１３４は、各レーン毎に一つ開口部が設けられている。一方、バッファ流路１４２は、支持台１４７の底面近傍に直線状の導入口を有する。混和液流路１３４は各回収レーン毎に供給され混和部１３０に導かれる。一方、バッファ流路１４２は、分子量分離部１４０の側面全体に連通しており、泳動領域１４１にバッファ（例えば１×ＴＢＥ、ｐＨ８．０）を供給する。
図８は、図６の回収部１４５により成分が回収される様子について説明する図である。回収される成分は、図示したように、等電点及び分子量の２つのパラメータにより分離される。分離目的の成分は、その等電位点および分子量に応じて特定の流路１５２に回収される。
図９は、分子量分離部１４０における電圧印加方法及びこれに対応する成分の分離の様子を示す図である。図示した構造は、図６の回収部１４５に対応する。ここでは、各回収レーン毎に異なる電圧が印加される点が重要となる。各回収レーンの端部が同じ電位になるようにすると、等電点電気泳動の電界が崩れ、分離効率が低下する。ここでは、等電点電気泳動で形成される電位勾配に沿った形で、各回収レーンの陰極側の電極を選択する。次いで陽極側の電位は、この陰極側電位に対し、分子量電気泳動に必要な電圧を負荷した電位を選択する。分子量電気泳動用の電圧は、約１０ｃｍの泳動レーンの場合、１０００ｖから３０００ｖ程度とするのがよい。
回収された成分は、回収部１４５に接続されたチューブ等（不図示）により所定の容器に導かれ回収される。
ここで、回収された成分を、回収部１４５に接続されたチューブ等（不図示）により試料濃縮装置に導く方式としてもよい。図１４（ａ）はこうした試料濃縮をマイクロチップ上で行う装置の主要部を示す図である。この装置では、試料を電極に付着させた後、電界の印可を中止または電位を反転させる等の操作を行い付着試料を回収するものである。電極３３４には試料の帯電電荷と反対の電位が付与される。電極３３４は、図中横方向に、試料が通過できる程度の隙間を設けて離間して形成され、この隙間から試料が流入する。各電極板３３３の間隔Ｄは、流路１１２の幅Ｗより広く、より好ましくは流路１１２の幅の２倍以上となるように配置される。このようにすれば、電極３３４間の電気力線の影響で、各電極板３３３間の間に試料が入り込めないという現象を防ぐことができる。ここで、図１４（ｂ）に示すように、試料の電荷と反対の極性に帯電される一対電極３３４の間に、対向電極３３５を設けた構成とすることもできる。これにより、試料は対向電極３３５の両側にある電極３３４のいずれかに向かって進行するので、電極３３４への試料の付着量を増加することができる。
こうして一定時間試料を流した後、電界の印可を中止または電位を反転させる等の操作を行い、付着試料を回収する。こうすることによって、目的の成分を高濃度で得ることが可能となる。
以上説明した構成により、等電点分離及び分子量分離を効率良く連続的に行うことができる。回収された成分は、質量分析などタンパク質の同定シークエンスに供することできる。
第３の実施の形態
第１及び第２の実施の形態では、２次元電気泳動装置をマイクロチップ上で実現する分離装置について説明した。即ち、等電点分離部と分子量分離部が一体化した分離装置の例を示した。これに対して本実施形態では、等電点分離部及びデータ分析部からなる分離装置の例を示す。図１１は、本実施形態に係る分離装置のブロック図である。光源９０１から出射した光は分光器９０２を介して等電点分離装置９０３の泳動レーンに照射される。照射された光の吸収又は発光を受光器９０４により受光する。この受光した光をデータ解析９０５により解析し、予め記憶された情報を参照して成分同定部９０６により成分同定が行われる。
第４の実施の形態
本実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）用の試料を提供する分離装置の例を示す。この装置によれば、タンパク質を分子量ごとに分画し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析に利用できる試料調製が実現される。以下、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析用の試料調製の手順について説明する。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定を行うためには、測定対象のタンパク質を、１０００Ｄａ程度まで低分子化する必要がある。このため、タンパク質試料を低分子化した後、マトリックス溶液と混合し、その後、乾燥して測定試料とする。
まず、測定対象のタンパク質が分子内ジスルフィド結合を有する場合、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元試薬を含むアセトニトリル等の溶媒中で還元反応を行う。こうすることにより、次の分解反応が効率よく進行する。なお、還元後、チオール基をアルキル化等により保護し、再び酸化するのを抑制することが好ましい。
次に、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素を用いて還元処理されたタンパク質分子の低分子化処理を行う。低分子化は燐酸バッファー等の緩衝液中で行われるため、反応後、脱塩および高分子画分すなわちトリプシンの除去を行う。
得られた試料に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳの基質と混合する。ここで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用のマトリックスは、測定対象物質に応じて適宜選択されるが、たとえば、シナピン酸、α−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、２，５−ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、２，５−ＤＨＢおよびＤＨＢｓ（５−メトキシサリチル酸）の混合物、ＨＡＢＡ（２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸）、３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシピコリン酸）、ジスラノール、ＴＨＡＰ（２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン）、ＩＡＡ（トランス−３−インドールアクリル酸）、ピコリン酸、ニコチン酸等を用いることができる。
その後、濃縮、乾燥を行う。乾燥後の試料は、乾燥装置ごとＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置にセットし、乾燥装置に備えられた電極を利用して電圧を印可し、たとえば３３７ｎｍの窒素レーザー光を照射し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析を行う。図１２は、質量分析装置の構成を示す概略図である。図１２において、試料台上に乾燥試料が設置される。そして、真空下で乾燥試料に波長３３７ｎｍの窒素ガスレーザーが照射される。すると、乾燥試料はマトリックスとともに蒸発する。試料台は電極となっており、電圧を印可することにより、気化した試料は真空中を飛行し、リフレクター検知器、リフレクター、およびリニアー検知器を含む検出部において検出される。
図１３（ａ）は本実施形態の乾燥装置を含む質量分析システムのブロック図である。このシステムは、試料１００１について、夾雑物をある程度除去する精製１００２、不要成分１００４を除去する分離１００３、分離した試料の前処理１００５、前処理後の試料の乾燥１００６、の各ステップを実行する手段を備えている。これらの各手段のうち一部または全部を一または二以上のマイクロチップ１００８上に搭載することができる。試料をマイクロチップ１００８上で連続的に処理することにより、微量の成分についても損出が少ない方法で効率よく確実に同定を行うことが可能となる。
このように、本実施形態の処理フローでは、試料を一枚のマイクロチップ１００８上で連続的に処理することにより、微量の成分についても損出が少ない方法で効率よく確実に同定を行うことが可能となる。なお、図１３（ｂ）に示すように、試料の精製１００２から乾燥１００６までに至るすべての前処理工程を一枚のマイクロチップ１００８上で行うようにしてもよい。
図１０は、こうした一連の処理工程を一または二以上のチップにより実現するシステム構成を示す。このシステムは、等電点分離部８０１および分子量分離部８０２からなる分離部８１０と、回収部８２１、反応部８２２、溶媒置換部８２３、脱塩部８２４および乾燥部８２５からなる前処理部８２０からなる。分離部８１０のみを一つのチップ上で実現してもよいし、分離部８１０および前処理部８２０を一つのチップ上で実現してもよい。こうしたシステムを用いることにより、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳをはじめとする質量分析に好適な試料を供することができる。
以上、本発明を実施形態に基づき説明した。これらの実施形態は例示であり、各構成要素や各製造工程の組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
2004051252.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月6日(2004.5.6)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、前記等電点分離領域に試料を導入する試料導入部と、前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部とを備える分離装置であって、
前記試料導入部を介し、前記電界印加方向の側方から試料が導入されるように構成されており、
前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含み、
複数の前記回収レーンを区画する壁部は、前記等電点分離領域の延在する平面内において前記等電点分離領域に向けて尖鋭に突出した断面形状または曲面が突出した形状を有することを特徴とする分離装置。
【請求項２】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記試料導入部は、試料の導入される流路と、前記流路および前記等電点分離領域の間に介在する隔壁と、を含み、
前記隔壁に、前記流路および前記等電点分離領域に連通する複数の導入流路が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項３】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記等電点分離領域が矩形形状を有し、前記矩形形状の対向する一対の辺に沿って前記一対の電極を備え、残る辺のうち一方の辺に沿って前記試料導入部を設けたことを特徴とする分離装置。
【請求項４】（削除）
【請求項５】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記試料回収部は、前記試料導入部と対向して配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項６】（削除）
【請求項７】請求の範囲１に記載の分離装置において、複数の前記回収レーンの回収口は、前記等電点分離領域に沿って一列に密に配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項８】（削除）
【請求項９】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記等電点分離領域の所定箇所に光を照射する光照射部と、光を照射した箇所における吸光または発光を検出する光検出部と、前記吸光または発光に基づいて前記試料に含まれる成分の分析を実行する分析部と、をさらに備えることを特徴とする分離装置。
【請求項１０】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記等電点分離領域に隣接して、分子量による成分分離を行う分子量分離部をさらに備え、等電点分離と分子量分離とを連続的に実行するように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項１１】（削除）
【請求項１２】請求の範囲１に記載の分離装置において、
前記試料回収部は、
試料の電荷と反対の極性に帯電される電極を有し、回収した試料を前記電極に付着させ、回収試料を濃縮する濃縮部
を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項１３】請求の範囲１２に記載の分離装置において、前記電極は、回収した試料の通る流路中に複数設けられることを特徴とする分離装置。
【請求項１４】請求の範囲１３に記載の分離装置において、前記濃縮部は、前記電極と反対の極性に帯電される対向電極を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項１５】ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、
前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、
前記等電点分離領域に対し、電界印加方向の側方から試料を導入する試料導入部と、
前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部と、
前記試料回収部により回収された試料を、分子量により成分分離する分子量分離部と、を備え、
前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含み、
前記分子量分離部は、各回収レーンにそれぞれ接続して設けられた複数の泳動領域を含む
ことを特徴とする分離装置。
【請求項１６】請求の範囲１５に記載の分離装置において、前記等電点分離領域と前記分子量分離部との間に、前記等電点分離領域から回収された試料を含む液体に中和液を添加して前記液体のｐＨを調整する混和部を備えることを特徴とする分離装置。
【請求項１７】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部は、前記回収レーン内に設けられていることを特徴とする分離装置。
【請求項１８】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部は、前記回収レーン毎に異なる中和液が添加されるように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項１９】請求の範囲１８に記載の分離装置において、前記混和部は、前記液体に対し、前記中和液にくわえ界面活性剤が添加されるように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項２０】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部にヒーターが設けられたことを特徴とする分離装置。
【請求項２１】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記等電点分離領域および前記回収レーンは、第一の平面内に設けられ、
前記複数の泳動領域は、第一の平面と直交する第二の平面内に設けられていることを特徴とする分離装置。
【請求項２２】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記泳動領域の前記回収レーン側端部とその反対側の端部との間に第一の電圧を印加するとともに、前記泳動領域において、前記第二の平面内にあって前記第一の電界と直交する方向に第二の電圧を印加する電圧印加部を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項２３】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記電圧印加部は、各泳動領域の回収レーン側端部がそれぞれ異なる電位となるように電圧を印加することを特徴とする分離装置。
【請求項２４】生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、前記分離手段は、請求の範囲１に記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。
【請求項２５】生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、前記分離手段は、請求の範囲１５に記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。




【手続補正書】
【提出日】平成16年8月16日(2004.8.16)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲
【請求項１】ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、前記等電点分離領域に試料を導入する試料導入部とを備える分離装置であって、
前記試料導入部を介し、前記電界印加方向の側方から試料が導入されるように構成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項２】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記試料導入部は；試料の導入される流路と、前記流路および前記等電点分離領域の間に介在する隔壁と、
を含み、前記隔壁に、前記流路および前記等電点分離領域に連通する複数の導入流路が形成されていることを特徴とする分離装置。
【請求項３】請求の範囲１または２に記載の分離装置において、前記等電点分離領域が矩形形状を有し、前記矩形形状の対向する一対の辺に沿って前記一対の電極を備え、残る辺のうち一方の辺に沿って前記試料導入部を設けたことを特徴とする分離装置。
【請求項４】請求の範囲１乃至３いずれかに記載の分離装置において、前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部を備えることを特徴とする分離装置。
【請求項５】請求の範囲４に記載の分離装置において、前記試料回収部は、前記試料導入部と対向して配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項６】請求項１乃至５いずれかに記載の分離装置において、前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含むことを特徴とする分離装置。
【請求項７】請求の範囲６に記載の分離装置において、複数の前記回収レーンの回収口は、前記等電点分離領域に沿って一列に密に配置されていることを特徴とする分離装置。
【請求項８】請求の範囲６または７に記載の分離装置において、複数の前記回収レーンを区画する壁部は、前記等電点分離領域の延在する平面内において前記等電点分離領域に向けて尖鋭に突出した断面形状または曲面が突出した形状を有することを特徴とする分離装置。
【請求項９】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記等電点分離領域の所定箇所に光を照射する光照射部と、光を照射した箇所における吸光または発光を検出する光検出部と、前記吸光または発光に基づいて前記試料に含まれる成分の分析を実行する分析部と、をさらに備えることを特徴とする分離装置。
【請求項１０】請求の範囲１に記載の分離装置において、前記等電点分離領域に隣接して、分子量による成分分離を行う分子量分離部をさらに備え、等電点分離と分子量分離とを連続的に実行するように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項１１】削  除
【請求項１２】請求の範囲１に記載の分離装置において、
前記試料回収レーンは、
試料の電荷と反対の極性に帯電される電極を有し、回収した試料を前記電極に付着させ、回収試料を濃縮する濃縮部
を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項１３】請求の範囲１２に記載の分離装置において、前記電極は、回収した試料の通る流路中に複数設けられることを特徴とする分離装置。
【請求項１４】請求の範囲１３に記載の分離装置において、前記濃縮部は、前記電極と反対の極性に帯電される対向電極を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項１５】ｐＨ勾配の形成される等電点分離領域と、
前記等電点分離領域に電界を印加する一対の電極と、
前記等電点分離領域に対し、電界印加方向の側方から試料を導入する試料導入部と、
前記等電点分離領域に連通し、前記等電点分離領域に導入された試料を回収する試料回収部と、
前記試料回収部により回収された試料を、分子量により成分分離する分子量分離部と、を備え、
前記試料回収部は、前記等電点分離領域と連通する複数の回収レーンを含み、
前記分子量分離部は、各回収レーンにそれぞれ接続して設けられた複数の泳動領域を含む
ことを特徴とする分離装置。
【請求項１６】請求の範囲１５に記載の分離装置において、前記等電点分離領域と前記分子量分離部との間に、前記等電点分離領域から回収された試料を含む液体に中和液を添加して前記液体のｐＨを調整する混和部を備えることを特徴とする分離装置。
【請求項１７】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部は、前記回収レーン内に設けられていることを特徴とする分離装置。
【請求項１８】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部は、前記回収レーン毎に異なる中和液が添加されるように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項１９】請求の範囲１８に記載の分離装置において、前記混和部は、前記液体に対し、前記中和液にくわえ界面活性剤が添加されるように構成されたことを特徴とする分離装置。
【請求項２０】請求の範囲１６に記載の分離装置において、前記混和部にヒーターが設けられたことを特徴とする分離装置。
【請求項２１】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記等電点分離領域および前記回収レーンは、第一の平面内に設けられ、
前記複数の泳動領域は、第一の平面と直交する第二の平面内に設けられていることを特徴とする分離装置。
【請求項２２】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記泳動領域の前記回収レーン側端部とその反対側の端部との間に第一の電圧を印加するとともに、前記泳動領域において、前記第二の平面内にあって前記第一の電界と直交する方向に第二の電圧を印加する電圧印加部を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項２３】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記電圧印加部は、各泳動領域の回収レーン側端部がそれぞれ異なる電位となるように電圧を印加することを特徴とする分離装置。
【請求項２４】生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分析手段と、
を備え、前記分離手段は、請求の範囲１に記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。
【請求項２５】生体試料を分子サイズまたは性状に応じて分離する分離手段と、前記分離手段により分離された試料に対し、酵素消化処理を含む前処理を行う前処理手段と、前処理された試料を乾燥させる乾燥手段と、乾燥後の試料を質量分析する質量分折手段と、
を備え、前記分離手段は、請求の範囲１５に記載の分離装置を含むことを特徴とする質量分析システム。
【請求項２６】請求の範囲１５に記載の分離装置において、
前記泳動領域から所定の成分を回収する回収手段と、
前記回収部に接続して設けられた試料濃縮手段と、
を含むことを特徴とする分離装置。
【請求項２７】請求の範囲２６に記載の分離装置において、
前記試料濃縮手段は、試料の電荷と反対の極性に帯電される電極を有し、回収した試料を前記電極に付着させ、回収試料を濃縮することを特徴とする分離装置。




【国際調査報告】
2004051252.tif 000017
2004051252.tif 000018
2004051252.tif 000019
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