(57)【要約】本発明の目的は、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドを提供することである。本発明によれば、式（Ｉ）：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＩｌｅなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ３はＧｌｕなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ４はＧｌｎなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ５はＳｅｒなどのアミノ酸残基を示し、Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７はＧｌｕまたはＡｌａなどのアミノ酸残基を示す）等で表されるオリゴペプチドが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７        （Ｉ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＶ）
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失している。）
【請求項２】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す、請求項１に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項３】
式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列から成る５から７アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである、請求項１又は２に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項４】
下記の式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む６から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＶ）
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示す。）
【請求項５】
Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項４に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項６】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９がＧｌｕのアミノ酸残基を示す、請求項４又は５に記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項７】
式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列から成る７から９アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである、請求項４から６の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項８】
Ｘ６が、末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、または末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示す、請求項１から７の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項９】
修飾基内においてカルボニル基が炭素数２から１０の炭化水素鎖に結合している、請求項１から８の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項１０】
修飾基内においてカルボニル基が炭素数３から７の炭化水素鎖に結合している、請求項１から９の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項１１】
修飾基が、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、またはＮ−κ−マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基である、請求項１から１０の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
【請求項１２】
以下の何れかのオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチド。
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
（式中、Ｘａａは、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸に由来する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す。）
【請求項１３】
請求項１から１２の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む医薬。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む毛成長促進剤。
【請求項１５】
下記の式（１）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
2004101610.tif 000029
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｃｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示す。）
【請求項１６】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す、請求項１５に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項１７】
Ｙが欠失している、請求項１５又は１６に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項１８】
Ｙが、１〜１２個のアミノ酸配列を示す、請求項１５又は１６に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項１９】
下記の式（２）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
2004101610.tif 000030
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｃｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示し、
Ｌは連結基を示す。）
【請求項２０】
Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項１９に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２１】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９がＧｌｕのアミノ酸残基を示す、請求項１９又は２０に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２２】
下記の式（３）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
2004101610.tif 000031
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｌｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示し、
Ｚは、Ｌｙｓと反応して結合できる基を示す。）
【請求項２３】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す、請求項２２に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２４】
Ｙが欠失している、請求項２２又は２３に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２５】
Ｙが、１〜１２個のアミノ酸配列を示す、請求項２２又は２３に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２６】
下記の式（４）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
2004101610.tif 000032
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｌｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示し、
Ｌは連結基を示し、
Ｚは、Ｌｙｓと反応して結合できる基を示す。）
【請求項２７】
Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である、請求項２６に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２８】
Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９がＧｌｕのアミノ酸残基を示す、請求項２６又は２７に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項２９】
連結基Ｌの炭素数が６から８である、請求項１５から２８の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項３０】
連結基Ｌ内においてカルボニル基が炭素数５から７の炭化水素鎖に結合している、請求項１５から２９の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項３１】
連結基Ｌが、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは５〜７の整数を示す）である、請求項１５から３０の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項３２】
連結基Ｌ中の−ＣＯがＸ１と結合し、連結基Ｌ中のＮＨ−が、Ｘ６に結合しているＣｙｓ残基又はＺで表される基と結合している、請求項３１に記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
【請求項３３】
以下の何れかの環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチド。
2004101610.tif 000033
【請求項３４】
請求項１５から３３の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む医薬。
【請求項３５】
請求項１５から３３の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む毛成長促進剤。
【請求項３６】
請求項１５から３３の何れかに記載の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩、並びにミノキシジルを有効成分として含む毛成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド、及び該オリゴペプチドを有効成分として含む医薬に関するものである。
【背景技術】  上皮組織の正常な形態形成は上皮組織の周りに存在する間充織細胞由来の因子による制御を受けていることが示唆されており、また、上皮組織の形態形成異常に起因する疾患の多くが間充織細胞の異常を原因としていることから、間充織細胞が上皮組織の形態形成を制御するメカニズムの解明に興味がもたれている。しかしながら、上皮組織の形態形成の制御に関与する物質群は複雑な系の中で時間的及び空間的な制御を受けて発現されており、それらの物質を単離して機能を解析することは極めて困難であること、また、上皮組織の形態形成を単純化したモデル実験系の構築も難しいことなどの理由から、この分野の研究には今日まで大きな進展が見られていない。上皮組織の形態形成に起因する疾患の発症機序の解明やそれらの疾患の治療方法の確立などのために、上皮組織における形態形成の制御メカニズムの解析が切望されていた。
このような状況下にあって、上皮組織の形態形成の制御に関与するエピモルフィン（ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｎ）が分離・精製された（欧州特許公開第０５６２１２３号（米国特許第５，７２６，２９８号））。この物質は２７７ないし２８９個のアミノ酸からなる蛋白質をコア・蛋白質とする生理活性物質であり、主として間充織細胞により生合成されていることが明らかにされた。また、エピモルフィンは、上皮細胞に作用して上皮組織の形態形成を促進する作用を有していること、並びにエピモルフィンが機能しない場合には正常な組織形成が行われないことも明らかにされた。
エピモルフィンの構造については、エピモルフィン分子が構造上大きく４個のフラグメントに分けられることが見いだされている（欧州特許公開第０６９８６６６号）。すなわち、エピモルフィンの全長を構成するポリペプチドは、Ｎ末端側より、コイルドコイル領域（１）、機能ドメイン（２）、コイルドコイル領域（３）、及びＣ末端の疎水性領域に分けることができる。これらのフラグメントのうち、機能ドメイン（ヒト・エピモルフィンではＮ末端より１０４番目から１８７番目のアミノ酸により特定される領域）については、この領域が細胞接着に関与しており、エピモルフィンの生理活性の発現に密接にかかわっていることが示唆されている（上掲欧州特許公開）。
エピモルフィンが正常な形態形成を促進する作用を有することから、この物質は、形態形成の異常に起因する疾患などの予防や治療のための医薬や、又は育毛剤などの医薬の有効成分として有用であることが期待される。しかしながら、哺乳類動物から得られた天然型エピモルフィンは生理食塩水などの水性媒体に難溶であり、医薬として実用に供することが困難であった。このため、天然型エピモルフィンの形態形成促進作用を実質的に保持しつつ、溶解性に優れたエピモルフィン誘導体を創製する試みがなされている。例えば、Ｃ末端部の疎水性領域を除去した改変体（フラグメント１２３）などが知られている（欧州特許公開第０５６２１２３号（米国特許第５，７２６，２９８号））。
エピモルフィンの部分構造を有するポリペプチドが上皮細胞に作用して上皮組織の形態形成を促進することが知られている（欧州特許公開第１００８６０３号）。このポリペプチドは生理食塩水などの水性媒体に溶解可能なポリペプチドであり、上記刊行物には、該ポリペプチドが毛成長促進作用を有することが教示されている。また、欧州特許公開第１２８８２２１号には、エピモルフィンの部分構造であるオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドが開示されている。
【発明の開示】
本発明の課題は、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドを提供することにある。本発明の別の課題は、精製効率の高い上記オリゴペプチドを提供することである。本発明のさらに別の課題は、上記のオリゴペプチドを有効成分として含む医薬を提供することにある。
本発明者は上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、エピモルフィンの部分構造であるオリゴペプチド中のＣｙｓ残基またはＬｙｓ残基をカルボニル基を含有する修飾基により修飾することにより得たオリゴペプチドが、優れた毛成長促進作用を有していることを見出した。さらに本発明者らは、エピモルフィンの部分構造であるオリゴペプチド中のアミノ酸配列中に連結基を導入して分子内に環構造を形成することによって得られるオリゴペプチドが、優れた精製効率を示すと同時に優れた毛成長促進作用を有していることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
すなわち本発明によれば、下記の式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドが提供される。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７        （Ｉ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＶ）
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失している。）
好ましくは、Ｘ１はＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３はＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４はＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５はＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６はカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７はＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、上記式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列から成る５から７アミノ酸残基から成るオリゴペプチドが提供される。
本発明の別の側面によれば、下記の式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む６から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドが提供される。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＶ）
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示す。）
好ましくは、Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方は、Ａｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。
さらに好ましくは、Ｘ１はＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３はＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４はＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５はＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６はカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７はＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８はＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９はＧｌｕのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、上記式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列から成る７から９アミノ酸残基から成るオリゴペプチドが提供される。
好ましくは、Ｘ６は、末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、または末端にカルボキシル基を有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、修飾基内においてカルボニル基は炭素数２から１０の炭化水素鎖に結合している。
好ましくは、修飾基内においてカルボニル基は炭素数３から７の炭化水素鎖に結合している。
好ましくは、修飾基は、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、またはＮ−κ−マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基である。
好ましくは、以下の何れかのオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000002
（式中、Ｘａａは、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸に由来する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す。）
本発明の別の側面によれば、上記した何れかに記載のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、医薬並びに毛成長促進剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の医薬または毛成長促進剤の製造のための上記のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩の使用；及び毛の成長促進方法であって、上記のオリゴペプチドまたはその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、下記の式（１）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000003
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｃｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示す。）
好ましくは、Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、Ｙは欠失しているか、又は１〜１２個のアミノ酸配列を示す。
好ましくは、下記の式（２）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000004
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｃｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示し、
Ｌは連結基を示す。）
好ましくは、Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方はＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。
好ましくは、Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９がＧｌｕのアミノ酸残基を示す。
本発明の別の側面によれば、下記の式（３）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000005
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｌｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示し、
Ｚは、Ｌｙｓと反応して結合できる基を示す。）
好ましくは、Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、そしてＸ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、Ｙは欠失しているか、又は１〜１２個のアミノ酸配列を示す。
好ましくは、下記の式（４）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000006
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｌｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示し、
Ｌは連結基を示し、
Ｚは、Ｌｙｓと反応して結合できる基を示す。）
好ましくは、Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方はＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である。
好ましくは、Ｘ１がＳｅｒアミノ酸残基を示し、Ｘ２がＩｌｅのアミノ酸残基を示し、Ｘ３がＧｌｕのアミノ酸残基を示し、Ｘ４がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、Ｘ５がＳｅｒのアミノ酸残基を示し、Ｘ６がＣｙｓのアミノ酸残基を示し、Ｘ７がＧｌｕまたはＡｌａのアミノ酸残基を示し、Ｘ８がＧｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９がＧｌｕのアミノ酸残基を示す。
好ましくは、連結基Ｌの炭素数は６から８である。
好ましくは、連結基Ｌ内においてカルボニル基が炭素数５から７の炭化水素鎖に結合している。
好ましくは、連結基Ｌは、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは５〜７の整数を示す）である。
好ましくは、連結基Ｌ中の−ＣＯがＸ１と結合し、連結基Ｌ中のＮＨ−が、Ｘ６に結合しているＣｙｓ残基又はＺで表される基と結合している。
特に好ましくは、以下の何れかの環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが提供される。
2004101610.tif 000007
本発明のさらに別の側面によれば、上記した何れかの環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を有効成分として含む、医薬並びに毛成長促進剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した何れかの環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩、並びにミノキシジルを有効成分として含む毛成長促進剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の医薬または毛成長促進剤の製造のための上記環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩の使用；及び毛の成長促進方法であって、上記環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。
図２は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。
図３は、合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を示す。
図４は、各種のオリゴペプチドの毛成長促進作用を評価した結果を示す。
図５は、各種のオリゴペプチドの毛成長促進作用を評価した結果を示す。
図６は、化合物（１１）のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
図７は、化合物（１２）のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
図８は、化合物（１３）のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
図９は、化合物（１４）のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
図１０は、本発明の環状オリゴペプチドの毛成長促進作用を示す。
図１１は、本発明の環状オリゴペプチドの毛成長促進作用を示す。
図１２は、本発明の環状オリゴペプチドとミノキシジルとを併用した場合の毛成長促進作用を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の第一の態様のオリゴペプチドは、下記の式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチドである。
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７        （Ｉ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７        （ＩＶ）
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＣｙｓまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失している。）
本発明の第二の態様のオリゴペプチドは、下記の式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む６から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ６−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ６−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＩＩ）
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ６−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９        （ＸＩＶ）
（式中、Ｘ１からＸ７は上記と同様のアミノ酸残基を示し、Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そしてＸ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示す。）
なお、本発明においては、Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であることが好ましい。Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方が、Ａｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である場合は、Ｘ７及びＸ９がともにＡｓｐのアミノ酸残基である場合に生じることがあるアスパラギン酸に起因するβ転移（スクシイミド）が起こることがなく合成収率が向上するためである。Ｘ７がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であればより好ましい。Ｘ７のＡｓｐがβ転移を生じることが多いためである。
上記のアミノ酸配列（Ｉ）から（ＩＶ）並びに（ＸＩ）から（ＸＩＶ）は、欧州特許公開第１００８６０３号に開示されたポリペプチド（ＩＩ）のＣ−末端から１１個のアミノ酸残基において、Ｎ−末端から１個のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）およびＣ−末端から２個のアミノ酸残基（Ａｓｐ−Ｇｌｕ）を除いたアミノ酸配列、または該アミノ酸配列においてさらにシステイン残基（Ｃｙｓ）の位置を変更したアミノ酸配列であって、当該Ｃｙｓ残基を、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基に置き換えたアミノ酸配列をベースにして、さらに１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列である。上記アミノ酸配列（Ｉ）〜（ＩＶ）並びに（ＸＩ）から（ＸＩＶ）を含むオリゴペプチドは、下記の実施例に具体的に示すように優れた毛成長促進作用を有している。
アミノ酸配列（Ｉ）から（ＩＶ）並びに（ＸＩ）から（ＸＩＶ）において、Ｘ６は、カルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基、またはカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示す。
本発明の好ましい態様によれば、修飾基は、末端にカルボキシル基を有する修飾基である。また、本発明のさらに好ましい態様によれば、修飾基内においてカルボニル基は炭素数２から１０の炭化水素鎖、さらに好ましくは炭素数３から７の炭化水素鎖に結合している。
本発明においてＸ６がカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す場合の修飾基の具体例としては、好ましくは、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸に由来する修飾基、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸に由来する修飾基、またはＮ−κ−マレイミドウンデカン酸に由来する修飾基などを挙げることができる。このような修飾基は、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸またはＮ−κ−マレイミドウンデカン酸などの試薬とオリゴペプチドとを反応させることにより、オリゴペプチド中のシステイン残基のスルフヒドリル基と上記試薬とを反応させ、これによりオリゴペプチド中のシステイン残基に導入することができる。
また本発明においてＸ６がカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＬｙｓのアミノ酸残基を示す場合の修飾基の具体例としては、上記したＸ６がカルボニル基を含有する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す場合と同様である。
本発明のオリゴペプチドは、式（Ｉ）から（ＩＶ）又は（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである。例えば、アミノ酸残基の数の下限値は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の何れでもよく、上限値は１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００の何れでもよい。アミノ酸残基の数は好ましくは５から４０、より好ましくは６から３０、さらに好ましくは７から２０、さらに好ましくは７から１５、さらに好ましくは７から１２であり、特に好ましくは７から１０の範囲内である。アミノ酸残基の数は、オリゴペプチドが生理食塩水又は水などの水性媒体に可溶であり、生物学的活性を有するように選択することが望ましい。
本発明の第三の態様によるオリゴペプチドは、下記の式（１）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドである。
2004101610.tif 000008
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｃｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示す。）
上記オリゴペプチドの好ましい具体例としては、下記の式（２）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが挙げられる。
2004101610.tif 000009
（式中、Ｘ１〜Ｘ７およびＬは、式（１）と同義であり、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示す。）
本発明の第四の態様のオリゴペプチドは、下記の式（３）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドである。
2004101610.tif 000010
（式中、Ｘ１は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ２は、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、またはＭｅｔのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失しており、
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、またはＡｓｐのアミノ酸残基を示し、
Ｘ４は、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはＨｉｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔのアミノ酸残基を示し、
Ｘ６は、Ｌｙｓのアミノ酸残基を示し、
Ｘ７は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示すか、あるいは欠失し、
Ｙは、欠失しているか、１〜９０個のアミノ酸配列を示し、
Ｌは連結基を示し、
Ｚは、Ｌｙｓと反応して結合できる基を示す。）
上記オリゴペプチドの好ましい具体例としては、下記の式（４）から成るアミノ酸配列を有し、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドが挙げられる。
2004101610.tif 000011
（式中、Ｘ１〜Ｘ７、ＬおよびＺは、式（３）と同義であり、
Ｘ８は、Ｇｌｎのアミノ酸残基を示し、そして
Ｘ９は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＬｅｕのアミノ酸残基を示す。）
なお、本発明においては、Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であることが好ましい。Ｘ７及びＸ９の少なくとも片方が、Ａｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基である場合は、Ｘ７及びＸ９がともにＡｓｐのアミノ酸残基である場合に生じることがあるアスパラギン酸に起因するβ転移（スクシイミド）が起こることがなく合成収率が向上するためである。Ｘ７がＡｓｐのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であればより好ましい。Ｘ７のＡｓｐがβ転移を生じることが多いためである。
上記のアミノ酸配列は、欧州特許公開第１００８６０３号に開示されたポリペプチド（ＩＩ）のＣ−末端から１１個のアミノ酸残基において、Ｎ−末端から１個のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）およびＣ−末端から２個のアミノ酸残基（Ａｓｐ−Ｇｌｕ）を除いたアミノ酸配列をベースにしたアミノ酸配列である。
上記した本発明の環状オリゴペプチドは、下記の実施例で具体的に示す通り、３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸で処理し、乾燥した後においても優れた毛成長促進作用を発揮できる。３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸での処理は、逆相クロマトグラフィーによる精製時にオリゴペプチドが供される条件でもあることから、本発明の環状オリゴペプチドは逆相クロマトグラフィーを使用して精製することができ、これにより精製効率を高めることができる。
アミノ酸配列（１）から（４）において、Ｘ６はＣｙｓまたはＬｙｓのアミノ酸残基を示し、特に好ましくは、Ｘ６はＣｙｓのアミノ酸残基を示す。
本発明の環状オリゴペプチドにおいては、Ｘ１とＸ６とが、−Ｌ−Ｃｙｓ−（式中、ＬはＸ１と結合している連結基を示し、ＣｙｓはＸ６と結合しているＣｙｓ残基を示す）または−Ｌ−Ｚ（式中、ＬはＸ１と結合している連結基を示し、ＺはＬｙｓと反応して結合できる基を示す）を介して結合して分子内環構造を形成していることを特徴とする。Ｚで表されるＬｙｓと反応して結合できる基の具体例としては、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル基、イミドエステル基、ヒドロキシメチルフォスフィン基などが挙げられる。
Ｌで表される連結基の具体例としては、炭素数が６から８の連結基が挙げられ、例えば、カルボニル基が炭素数５から７の炭化水素鎖に結合している連結基などが挙げられる。連結基Ｌの具体例としては、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは５〜７の整数を示す）が挙げられる。上記の連結基Ｌ中において、−ＣＯはＸ１と結合し、ＮＨ−は、Ｘ６に結合しているＣｙｓ残基またはＺと結合することができる。
本発明の環状オリゴペプチドは、式（１）又は（３）のアミノ酸配列を有する５から９８アミノ酸残基から成るオリゴペプチドである。アミノ酸残基の数は好ましくは５から２０、より好ましくは７から１５、さらに好ましくは７から１２であり、特に好ましくは７から１０の範囲内である。アミノ酸残基の数は、オリゴペプチドが生理食塩水又は水などの水性媒体に可溶であり、生物学的活性を有するように選択することが望ましい。
以下、上記した第一の態様から第四の態様までのオリゴペプチド（即ち、式（Ｉ）から（ＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド；式（ＸＩ）から（ＸＩＶ）の何れかのアミノ酸配列を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって、毛成長促進作用を有するオリゴペプチド；式（１）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド；及び、式（３）のアミノ酸配列から成り、毛成長促進作用を有する環状オリゴペプチド）を本発明のオリゴペプチドと称する。
本発明のオリゴペプチドにおけるアミノ酸残基の種類は特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基、又はそれらの誘導体の何れでもよい。即ち、即ち、アミノ酸としてはＬ−アミノ酸であってもよいし、Ｄ−アミノ酸であってもよいし、これらの混合物でもよい。また、アミノ酸の種類としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸の何れでもよいが、天然型アミノ酸であるα−アミノ酸が好ましい。
本明細書で言う非天然型アミノ酸とは、天然型蛋白質を構成する天然型アミノ酸２０種類（グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン）以外の全てのアミノ酸を意味し、具体的には、（１）天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型アミノ酸、（２）天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、（３）天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型アミノ酸、並びに（４）天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能などを変化させた非天然型アミノ酸などが挙げられる。
本発明のオリゴペプチドの別の態様は、上記のアミノ酸配列（Ｉ）から（ＩＶ）、（ＸＩ）から（ＸＩＶ）を含む５から１００アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって毛成長促進作用を有するオリゴペプチドの修飾オリゴペプチドであって、上記した本発明のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有する修飾オリゴペプチドである。
本発明のオリゴペプチドの別の態様は、上記のアミノ酸配列（１）から（４）の何れかを含む７から９８アミノ酸残基から成るオリゴペプチドであって毛成長促進作用を有するオリゴペプチドの修飾オリゴペプチドであって、上記した本発明のオリゴペプチドと同様の毛成長促進作用を有する修飾オリゴペプチドである。
本発明のオリゴペプチド又は修飾オリゴペプチドが、毛成長促進作用を有することは、本明細書の実施例に詳細かつ具体的に記載した試験方法によって、又は上記試験方法に適宜の改変や修飾を加えることにより、当業者が容易に確認可能である。このような方法の具体例としては、以下の方法が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
（１）Ｃ３ＨやＣ５７ＢＬ／６マウスは生後４５日から９５日前後まで約５０日間休止期が続くことが知られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が容易である。このマウスを使用し、被験物質の投与により、成長期への移行が促進されるか否か評価することにより、育毛活性を評価することが可能である。
（２）上皮性の新生毛包に存在する抗原（例えば、約２２０ｋＤａの抗原が挙げられる）を特異的に認識するモノクローナル抗体（例えば、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２１を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体）またはその断片を用いて育毛活性を評価することができる。より具体的には、生体由来の皮膚組織を被験物質の存在下で培養し、該皮膚組織片を回収し、上記のモノクローナル抗体またはその断片と反応させ、皮膚組織片と反応した該モノクローナル抗体またはその断片を検出または測定することにより、上皮性の新生毛包に存在する抗原の発現量を測定し、育毛活性を評価することができる。あるいは、皮膚を切断して被験物質の存在下で培養し、その培養物中の蛋白質と前記モノクローナル抗体を反応させた結果により、育毛活性を評価することができる。
本発明の修飾オリゴペプチドにおいて、「修飾」という用語は、化学的修飾及び生物学的修飾を含めて最も広義に解釈しなければならない。修飾の例としては、例えば、アルキル化、エステル化、ハロゲン化、又はアミノ化などの官能基導入、酸化、還元、付加、又は脱離などによる官能基変換、糖化合物（単糖、二糖、オリゴ糖、若しくは多糖）又は脂質化合物などの導入、リン酸化、あるいはビオチン化などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
好ましい修飾オリゴペプチドとしては、ビオチン化されたオリゴペプチドを挙げることができ、より好ましくは修飾オリゴペプチドとして、スペーサを介して又はスペーサーを介さずにビオチンがＮ−末端に結合したオリゴペプチドを挙げることができる。上記の修飾オリゴペプチドにおいて、ビオチンには所望の生理活性を損なわない限りにおいて適宜の化学的修飾が施されていてもよい。適宜の長さのスペーサーを介してビオチンをオリゴペプチドのＮ−末端に導入するためには、例えば、ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ又はＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（いずれもピアース社から入手できる）などを用いることができる。
上記した本発明の各種のオリゴペプチド（修飾オリゴペプチドも含む）は遊離形態であってもよいが、酸付加塩又は塩基付加塩として提供されてもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱酸塩；又は、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩；アンモニウム塩；メチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩などの有機アンモニウム塩を挙げることができる。グリシンなどのアミノ酸と塩を形成する場合もあり、また、分子内で対イオンを形成することもある。
さらに、これらのオリゴペプチド又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合がある。上記オリゴペプチドは複数の不斉炭素を有している。各不斉炭素の立体は特に限定されないが、アミノ酸残基はＬ−アミノ酸であることが望ましい。これらの不斉炭素に基づく光学活性体、ジアステレオ異性体などの立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
本発明のオリゴペプチドは、ペプチド合成に通常用いられる固相法および液相法などの化学的手法により合成することができる。ペプチド合成におけるアミノ基等の保護基および縮合反応の縮合剤については種々の成書があり、それらを参照することができる。固相法では市販の各種ペプチド合成装置を利用することができる。必要に応じて、官能基の保護及び脱保護を行うことにより効率的に合成を行うことができる。保護基の導入及び脱離方法については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（１９８１年）などを参照することができる。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修飾オリゴペプチドの製造方法は当業者に周知されており、いかなる方法を用いてもよい。
また、通常の遺伝子発現操作等の生物学的手法に従って、上記オリゴペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組み換えベクターを製造した後、該ベクターにより形質転換された微生物（形質転換体）を調製し、該形質転換体を培養した培養物から所望のオリゴペプチドを分離・精製することができる。もっとも、上記オリゴペプチドの製造方法はこれらの化学的方法及び生物学的方法に限定されることはない。また、化学的修飾又は生物学的修飾などを含めて修飾オリゴペプチドの製造方法は当業者に周知されており、いかなる方法を用いてもよい。
次に、本発明のオリゴペプチドが環状オリゴペプチドである場合の製造方法をより具体的に説明する。本発明の環状オリゴペプチドは、以下の（１）〜（３）の手順に従って合成することができる。
（１）先ず、連結基Ｌ（−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−）に相当する化合物であるＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは５〜７の整数を示す）を化学合成する。
（２）次に、Ｃｙｓ−Ｌ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（Ｘ６がＣｙｓの場合）で表されるオリゴペプチドまたはＺ−Ｌ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（Ｘ６がＬｙｓの場合）を上記したような通常のペプチド合成法により合成する。例えば、市販のペプチド自動合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のペプチド自動合成機４３０Ａモデルなど）を使用して、プログラムに従ってＣ端より逐次ＢＯＣ法によりペプチド鎖を延長して目的の保護ペプチド樹脂の合成を行なうことができる。
（３）最後に、Ｘ６がＣｙｓの場合は、Ｎ末端のＣｙｓ残基とＸ６で表されるＣｙｓとを共有結合により結合させる。この共有結合の形成は常法により行なうことができる。具体的には、遊離チオール基を有するオリゴペプチドを酢酸溶液中でのヨウ素酸化により環化反応を行なうことにより、上記共有結合を形成することができる。
また、Ｘ６がＬｙｓの場合は、Ｎ末端のＺ残基とＸ６で表されるＬｙｓとを共有結合により結合させる。この共有結合の形成は常法により行なうことができる。
本発明のオリゴペプチドは、医薬の有効成分として有用である。本明細書における医薬という用語は、ヒトを含む哺乳類の病気の予防又は治療のほか、医薬部外品や化粧品として分類される場合がある毛成長促進剤などを含めて最も広義に用いる。
本発明の医薬の投与対象、薬効、並びに本発明の医薬による治療の対象疾患の具体例を以下に列挙する。
（１）本発明のオリゴペプチドは、血管再生作用、再生促進作用、心臓血管再生作用、血管内皮細胞誘導作用などを示し、慢性閉塞性動脈硬化症、バージャー病、重症狭心症、動脈硬化症などの治療及び予防に有用である（Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １９９６  Ｊａｎ  １０，２２２（１）：１８９−９８）
（２）本発明のオリゴペプチドは、膵臓上皮の形態形成に関与し、糖尿病などの治療および予防に有用である（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１，Ｍａｒ  ５；１５２（５）：９１１−２２）。
（３）本発明のオリゴペプチドは、肝臓の形成（再生）に関与し、肝代謝障害の治療および予防に有用である（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９８  Ｓｅｐ  １８；２５０（２）：４８６−９０）。
（４）本発明のオリゴペプチドは、骨や歯の形成に関与し、歯周病、骨折、骨腫瘍、骨欠損、骨粗しょう症の治療および予防に有用である（Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ  １９９５  Ｆｅｂ；４０（２）：１６１−４）。
（５）本発明のオリゴペプチドは、肺分岐の形態形成や肺線維症に関与し、肺疾患の治療および予防に有用である（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９７  Ｍａｙ  １９；２３４（２）：５２２−５；及びＡｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；２３（２）：１６８−７４）。
（６）本発明のオリゴペプチドは、腸ひだの形成に関与し、腸疾患の治療および予防に有用である（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９８  Ｊｕｌ；２７５（１  Ｐｔ１）：Ｇ１１４−２４）。
（７）本発明のオリゴペプチドは、筋肉の構造の維持に関与し、例えば、筋ジストロフィー症の治療および予防に有用である（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９８  Ｄｅｃ；３０（１２）：９０３−８）。
（８）本発明のオリゴペプチドは、胆嚢上皮の形成に関与し、胆嚢疾患の治療および予防に有用である（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ２０００  Ｍａｙ；３００（２）：３３１−４４）
（９）本発明のオリゴペプチドは、乳上皮の形態形成に関与し、乳疾患の治療および予防に有用である（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１  Ｍａｙ  １４；１５３（４）：７８５−９４）
これらの中でも最も好ましくは、毛成長促進剤として使用することができる。
本明細書において用いられる「毛成長促進剤」という用語は、育毛促進、発毛促進、及び脱毛予防などを含めて最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
また、本発明の環状オリゴペプチド又はその修飾オリゴペプチドあるいは生理学的に許容されるそれらの塩を毛成長促進剤として使用する場合、ミノキシジルと組み合わせて使用することもできる。
本発明の医薬としては、上記のオリゴペプチド又は生理学的に許容されるその塩から選ばれる１又は２種以上の物質をそのまま用いてもよいが、通常は、製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて上記物質の１又は２種以上を有効成分として含む医薬組成物を製造して投与することが好ましい。上記のオリゴペプチドの１種又は２種以上を有効成分として含む毛成長促進剤は、クリーム剤、噴霧剤、塗布用の溶液剤、又は貼付剤などとして外用剤として適用できるが、注射剤として患部に直接投与してもよく、毛成長促進剤としての使用目的に好適な形態の製剤として提供することが可能である。
例えば、シャンプーやリンスに有効成分である上記のオリゴペプチドを配合してもよく、上記のオリゴペプチドをリポソームなどに封入して製剤を調製してもよい。このような形態の組成物も本発明の医薬に包含される。皮膚のケラチン層を通して有効成分であるオリゴペプチドを効率的に経皮吸収させるために、適宜の界面活性剤や脂溶性物質などをクリーム剤などに配合することも好適である。
哺乳動物への局所投与のためには、本発明の組成物は、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、スティック剤、スプレー剤、軟膏、ペースト剤などを含む（但し、これらに限定されない）多様な剤形として提供することができる。これらの剤形は、溶液、乳濁液、ゲル、固体及びリポソームなどを含む多様な調合形態を含む。
溶液として調剤した本発明の組成物の局所投与に有用な組成としては、一般的には、薬学的に許容可能な水性又は有機溶媒が挙げられる。「薬学的に許容可能な有機溶媒」とは、本発明のオリゴペプチドを分散または溶解することができ、許容可能な安全性（例えば、刺激性及び感受性など）を有する溶媒のことを言う。好適な有機溶媒の具体例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（２００〜６００）、ポリプロピレングリコール（４２５〜２０２５）、グリセロール、１，２，４−ブタントリオール、ソルビトールエステル、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、ブタンジオール、及びそれらの混合物などが挙げられる。
局所用組成物をエアロゾルとして調剤し、スプレーオンとして皮膚に投与する場合、推進剤を溶液組成物に添加する。推進剤の具体例としては、塩素化、フッ素化または塩フッ素化した低分子量の炭化水素が挙げられるが、これに限定されるものではない。
局所用組成物は、緩和剤を含む溶液として調剤してもよい。緩和剤とは、乾燥の防止または緩和、並びに皮膚の保護のために使用される物質を言う。多様な好適な緩和剤が公知であり、本発明において使用することができる。
本発明のオリゴペプチドを含む組成物から調剤することができる別の剤形としては、クリーム剤及びローション剤がある。
本発明のオリゴペプチドを含む組成物から調剤することができる別の剤形としては、軟膏がある。軟膏は、動物又は植物の油あるいは半固体炭化水素（油性）の基剤を含むことができる。軟膏はまた、水を吸収して乳濁物を形成する吸収軟膏基剤を含むことができる。軟膏は水溶性でもよい。
別の剤形は、乳濁剤である。乳化剤は、非イオン性、アニオン性又はカチオン性の何れでもよく、乳化剤の例としては、例えば、米国特許第３，７５５，５６０号及び４，４２１，７６９号に記載されている。
ローション剤及びクリーム剤は、乳濁剤及び溶液として調剤することができる。水中油型及び油中水型のローション剤及びクリーム剤等の局所調製物のための単一乳濁剤は周知である。水中油中水型などの多相乳濁組成物も公知であり、例えば、米国特許第４，２５４，１０５号に記載されている。３重乳濁剤も本発明の局所投与のためには有用であり、シリコン中水中油型の液体乳濁物などが挙げられ、例えば、米国特許第４，９６０，７６４号に記載されている。
局所組成物に有用な他の乳濁剤は、マイクロエマルジョン系である。例えば、約９〜約１５％のスクアレン、約２５〜約４０％のシリコン油、約８〜約２０％の脂肪アルコール、約１５〜約３０％のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸（商品名ＴＷＥＥＮＳで市販）または他の非イオン性剤、及び約７〜約２０％の水を含む系が挙げられる。
本発明のオリゴペプチドを含む組成物にはリポソーム製剤も有用である。リポソーム組成物は、本発明のオリゴペプチドを含む組成物を、ジパルミトイルホスファチジルコリン等のリン脂質、コレステロール及び水と定法に従って混合することによって調製できる。リポソーム形成用の好適な組成物の表皮脂質をリン脂質の代わりに使用してもよい。リポソーム調製物を上記局所調剤の一つ（例えば、ゲル剤又は水中油型乳濁剤）に取り込んで、リポソーム製剤とすることができる。局所投与されるイポソームの他の組成及び薬学的用途については、例えば、Ｍｅｚｅｉ（１９８５）Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ３４５−３５８に記載されている。
上記の毛成長促進剤の投与量は使用目的、製剤形態、有効成分の種類などに応じて適宜選択可能であるが、例えば、本明細書の実施例に具体的に示した投与量を参考にして選択することが可能である。例えば、例えば、成人一日当たり有効成分の投与量としては、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日程度の範囲内である。
なお、本発明の実施に当っては、分子生物学（遺伝子組み換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び免疫学の慣用技術を使用することができ、これらは当業者の知識の範囲内である。このような技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ，Ｍ．Ｗｅｉ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）等に記載されている。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されることはない。
実施例１：修飾オリゴペプチドの作製
下記のアミノ酸配列で表されるオリゴペプチドをＦｍｏｃを用いた固相法により合成した。
2004101610.tif 000012
次に、合成したオリゴペプチドと以下の修飾試薬とを、同試薬の使用説明書に従って反応させた。オリゴペプチドと修飾試薬との比率は、モル比で正確に１：１で反応を行った。
ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）：ピアス社製
ＫＭＵＡ（Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）：ピアス社製
ＢＭＰＡ（Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸）：ピアス社製
フェニルマレイミド：シグマ社製
合成したオリゴペプチド、並びに修飾試薬との反応産物を、液体クロマトグラフィーを用いて解析した結果を図１から図３に示す。液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである。
注入サンプル：２０μｌ
溶離条件ＴＦＡ、アセトニトリル２０→７５％
２１０ｎｍの吸収でペプチドの溶出位置を見る。
図１から３では、オリゴペプチドと修飾試薬（ＥＭＣＡ）とをモル比で正確に１：１の比率で反応させ、その前後の逆相液体クロマトグラムを示す。
図１の左図は配列番号１の合成オリゴペプチドの結果を示し、図１の右図は、そのシステイン残基をＥＭＣＡで修飾したオリゴペプチドの結果を示す。
図２の左図は配列番号２の合成オリゴペプチドの結果を示し、図２の右図は、そのシステイン残基をＥＭＣＡで修飾したオリゴペプチドの結果を示す。
図３の左図は配列番号３の合成オリゴペプチドの結果を示し、図３の右図は、そのシステイン残基をＥＭＣＡで修飾したオリゴペプチドの結果を示す。
実施例２：新生毛包に特異的なモノクローナル抗体の作製
Ｂ５７ＢＬマウスの成長期（４８から５０日目）の皮膚から毛を切り取り、８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴを含むＰＢＳ中で３７℃で一晩インキュベートし、タンパク質を抽出した。また、Ｂ５７ＢＬマウスのヒゲの毛包（毛球部に色素がついているもの；成長期）を実体顕微鏡で採取し、ＰＢＳ中にホモジナイズした。上記２種類の試料（タンパク質量として０．５ｍｇ）を混合し、等量のコンプリートアジュバンドと混合してミセルを作製した。
上記で得たミセル（０．２ｍｇ）をラット（Ｗｉｓｔｅｒ）の皮下（３箇所）に分けて投与して免疫した。初回免疫の１ヵ月後に上記と同様に追加免疫を行なった。さらに２週間後に上記と同様に２回目の追加免疫を行なった。２回目の追加免疫の３日後に、免疫ラットから脾臓を取り出し、メッシュにて血球成分を回収した。この血球成分の中には抗体産生細胞が含まれている。上記で回収した血球成分（全量）とマウスミエローマＰ３Ｕ１とをポリエチレングリコール１５００を用いて混合し、ダルベッコ／ハムＦ１２混合培地中に懸濁し、９６ウエルプレートに各ウエル１００μｌずつ播いた。翌日、等量（１００μｌ）のＨＡＴ培地（シグマ社）を各ウエルに添加した。２日後に各ウエルから１５０μｌずつを吸引廃棄し、１５０μｌの新培地を各ウエルに添加した。９６ウエルプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター内に静置した。
成長期のＢ５７ＢＬマウスのヒゲの毛包を８Ｍ尿素中に超音波粉砕機を用いて溶解した。この溶液にニトロセルロースメンブレンを５分間浸し、ＰＢＳで十分に洗浄したものをＢｉｏｒａｄドットブロッターに装着したものを用いて、上記の９６ウエルプレートの各ウエルから回収したハイブリドーマ上清を一次スクリーニングした。先ず、上記で作製したニトロセルロースメンブレンを５％スキムミルクを溶解したトリスバッファー（ＴＢＳＴ）でブロッキングした後、当該ニトロセルロースメンブレンを底とする各ウエルにハイブリドーマ上清１００μｌを添加した。１時間インキュベートした後、トリスバッファーで洗浄し、二次抗体であるホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ  ＴＢＳＴ）を添加した。発色基質であるＥＣＬ試薬（アマシャムファルマシア社製）を添加して、発色の有無により成長期のヒゲの毛包と反応する抗体（全部で５０種類）を選出した（一次スクリーニング）。
上記の一次スクリーニングで選出した抗体（５０種類）について、成長期ヒゲ毛包の凍結切片（１０μｍ）を用いて特異的に反応にするものを選出した（二次スクリーニング）。具体的には、スライドガラス上に成長期ヒゲ毛包の凍結切片を置き、一次スクリーニングで選出されたハイブリドーマ上清を添加し、二次抗体で発色させた。具体的には、クライオスダト（ブライト社）で作成した成長期ヒゲ毛包の凍結切片を−２０℃メタノールで処理し、ＴＢＳＴで１時間ブロッキングを行った後、ハイブリドーマ上清を１時間反応させた。トリスバッファーで洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ（ＴＢＳＴに１００μｇ／ｍｌで溶解したもの）を反応させた。トリスバッファーで洗浄後、カバーガラスをかけて、蛍光顕微鏡にて観察を行った。
二次スクリーニングの結果、全部で８種類の抗体を選出した。これらの抗体は表皮とは反応せず、毛包に特異的に反応するものであった。これら８種類の抗体を限界希釈法でクローニングした。
これら８種類の抗体について、成長期ヒゲ毛包又は休止期ヒゲ毛包をサンプルとしたウエスタンブロットで反応性を調べ、さらに毛包が形成されている１４日齢マウス胎児皮膚の切片試料を用いて反応性を調べた。その結果、成長期ヒゲ毛包及び形成途中毛包（新生毛包）と特異的に反応し、休止期ヒゲ毛包とは反応しないモノクローナル抗体としてｍＡｂ２７を取得した。モノクローナル抗体ｍＡｂ２７を産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７８として平成１３年１１月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託されており、平成１４年７月２２日付けで受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１２１として国際寄託に移管された。
実施例３：各種オリゴペプチドの毛成長促進作用の評価
実施例１で作成した各種のオリゴペプチドを用いて毛成長促進作用を評価した。使用したオリゴペプチドを以下に示す。
2004101610.tif 000013
上記式中、Ｘａａは、ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）、ＫＭＵＡ（Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸）、ＢＭＰＡ（Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸）またはフェニルマレイミドに由来する修飾基が結合しているシステイン（Ｃｙｓ）残基を示す。
2004101610.tif 000014
（上記式中、Ｘａａは、ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）に由来する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す。）
１２日目のＩＣＲマウス胎児の上アゴ皮膚組織を実体顕微鏡で採取し、左と右に分けて５頭分を回収した。回収した５頭分の皮膚を左（コントロール用）と右（被験オリゴペプチド用）を別々に５個ずつ一枚のヌクレポアメンブレン（孔径８μｍ、直径１３ｍｍ）の上に載せ、実体顕微鏡で観察して外側が上になるようにした。１％ＢＳＡを含むダルベッコＭＥＭ／ハムＦ１２培地５００μｌを２４ウエルディッシュの２ウエルに添加し、片方には被験オリゴペプチド溶液（溶媒はＰＢＳ）を最終濃度２０μＭとなるように添加し、他方には溶媒（ＰＢＳ）を対照として同量入れた。被験オリゴペプチドとしては、上記（１）で作製した未修飾オリゴペプチド及び修飾オリゴペプチドを使用した。
皮膚組織を載せたメンブレン１枚ずつを上記のウエル中の溶液に浮かべ、３７℃で６日間培養した。メンブレンから５個の組織片をＳＤＳサンプルバッファ（ＳＤＳ  ０．０２ｇ／ｍｌ、グリセロール  ０．２ｇ／ｍｌ、ｐＨ６．８）１００μｌ中に回収し、超音波粉砕器により溶解した。対照も同様に処理した。上記処理で得た溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド４〜２０％）にて電気泳動後（３５ｍＡ、１．５時間）、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、５％スキムミルクを含むトリス緩衝液（ＴＢＳＴ）中で１時間インキュベートした。実施例２で取得したｍＡｂ２７（ＴＢＳＴ中１０μｇ／ｍｌ）と１時間反応後、ＴＢＳにて十分に洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧ（アマシャム社）をＴＢＳＴで１／１０００に希釈したものを二次抗体として反応させ、十分に洗浄後、ＥＣＬキット（アマシャム社）を用いてｍＡｂ２７の反応の強さを調べた。
得られた結果を図４及び図５に示す。図４および図５におけるＡＨＦは、モノクローナル抗体ｍＡｂ２７が認識する抗原（具体的には、配列番号１１に示す１４３９アミノ酸残基からなるタンパク質）を示す。
図４の結果から分かるように、左から１番目、２番目及び３番目のレーンのバンドはそれぞれ左から４番目及び５番目のレーンのバンドよりも濃かった。これらの結果は、オリゴペプチド中のシステイン残基にカルボニル基を含有する修飾基（ＥＭＣＡ、ＫＭＵＡ、またはＢＭＰＡ）が結合しているオリゴペプチドは強い発毛活性を有すること、特に、対応する未修飾のオリゴペプチドやカルボニル基を含有しない修飾基（フェニルマレイミド）が結合しているオリゴペプチドよりも強い発毛活性を有することを実証するものである。上記の中でもＥＭＣＡの活性が特に強かった。
また、図５の結果は、
2004101610.tif 000015
（上記式中、Ｘａａは、ＥＭＣＡ（Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸）に由来する修飾基が結合しているＣｙｓのアミノ酸残基を示す。）
で表されるオリゴペプチドが強い発毛活性を有することを実証している。上記の中でも配列番号８と９で表されるオリゴペプチドが特に強い発毛活性を示した。
実施例４：環状オリゴペプチドの作製
下記のアミノ酸配列で表される環状オリゴペプチドを化学合成した。また、化合物１１において−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−を−ＣＯＮＨ−に置換して化合物も合成した。
2004101610.tif 000016
合成は以下の手順で行なった。
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社のペプチド自動合成機（４３０ＡモデルＦｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用し、プログラムに従ってＣ端より逐次ＢＯＣ法によりペプチド鎖を延長し、目的の保護ペプチド樹脂の合成を行なった。出発アミノ酸樹脂担体は、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＰＡＭ（０．２５ｍｍｏｌ）を使用し、Ｃｙｓ（ＭｅＢｚｌ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｇｌｕ（ｃＨｘ）など通常のアミノ酸誘導体を使用した。
樹脂上へのペプチドの構築が終了した後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護基とペプチドの樹脂担体からの切り離しは、無水フッ化水素処理によって行なった。チオール基遊離の粗ペプチドは酢酸水溶液によって抽出した後、凍結乾燥粉末として得た。続いて、チオール基遊離の粗ペプチドを酢酸溶液中でのヨウ素酸化により環化反応を行い、上記に示した環状オリゴペプチドを合成した。得られた粗ペプチドを逆相高速クロマトグラフィー（島津製作所、分取装置  モデルＬＣ８Ａ）によりアセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸水の系を用いて分取精製を行なって目的とする環状オリゴペプチドを得た。得られた精製物を、分析用ＨＰＬＣ、質量分析ならびにアミノ酸分析により検定した。上記で合成した化合物の同定データを以下に示し、またＨＰＬＣの結果を図６〜図９に示す。
化合物（１１）
外観：白色凍結乾燥体
アミノ酸分析値：
加水分解条件：６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２時間
Ｓｅｒ（２）１．７８、Ｇｌｕ（４）４．００、Ａｌａ（１）０．９６
Ｉｌｅ（１）０．９８、ＮＨ３（２）２．０５、Ｃｙｓ（２）１．８６
ε−Ａｃｐ（１）１．０５
純度（ＨＰＬＣ）：９８．４％
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量１２０７．７（理論値１２０８．３）
化合物（１２）
外観：白色凍結乾燥体
アミノ酸分析値：
加水分解条件：６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２時間
Ｓｅｒ（２）１．８０、Ｇｌｕ（４）４．００、Ａｌａ（１）１．００
Ｉｌｅ（１）０．９９、ＮＨ３（２）２．０８、Ｃｙｓ（２）１．９１
８−Ａｏａ（１）Ｎ．Ｄ．（通常分析条件下、溶出されないため、定量できない）
純度（ＨＰＬＣ）：９７．８％
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量１２３５．８（理論値１２３６．４）
化合物（１３）
外観：白色凍結乾燥体
アミノ酸分析値：
加水分解条件：６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２時間
Ｓｅｒ（２）１．７９、Ｇｌｕ（２）２．０１、Ａｌａ（１）１．００
Ｉｌｅ（１）０．９７、ＮＨ３（１）１．２０、Ｃｙｓ（２）１．９４
ε−Ａｃｐ（１）１．０１
純度（ＨＰＬＣ）：９９．０％
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量９５０．５（理論値９５１．１）
化合物（１４）
外観：白色凍結乾燥体
アミノ酸分析値：
加水分解条件：６Ｎ  ＨＣｌ、１１０℃、２２時間
Ｓｅｒ（２）１．７９、Ｇｌｕ（２）２．００、Ｉｌｅ（１）０．９７
ＮＨ３（１）１．１８、Ｃｙｓ（２）１．９２、ε−Ａｃｐ（１）１．０１
純度（ＨＰＬＣ）：９７．９％
ＥＳＩ−ＭＳ：分子量８７９．６（理論値８８０．０）
実施例５：各種オリゴペプチドの毛成長促進作用の評価
実施例４で合成した環状オリゴペプチドを３０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸で処理し、乾燥した。この環状オリゴペプチドを０．００００２重量％となるようにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、この溶液に等容量の１００％エタノールを加えて０．００００１重量％の５０％エタノール・ＰＢＳ溶液を調製した。コントロール溶液としては、ＰＢＳを用いた。
Ｃ３ＨやＣ５７ＢＬ／６マウスは生後４５日から９５日前後まで約５０日間休止期が続くことが知られている。また、休止期ではピンク、成長期ではグレー又はクロと皮膚の色が変化するため、毛周期の判定が容易である。このマウスを使用し、本発明の環状オリゴペプチドの投与により、成長期への移行が促進されるか否か評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの７週齢（４８〜５０日齢、雌）を購入し、背中（約３×２．５ｃｍ２）を動物用電気バリカンで傷が付かないように注意深く刈毛し、皮膚の色から毛周期が休止期であることを確認した。上記で調製した環状オリゴペプチド溶液（０．００００１重量％）を０．２ｍｌずつ毎日１回、週５日間、実験開始後３８日まで各群１０匹ずつ塗布を行った。塗布は針の付いていない注射器を用いて行った。
評価は週２回マウスを観察し、毛を刈った面積に対する再生した面積の割合に応じてスコアを６段階に設定し、複数人（２人）が肉眼判定することにより行った。また、写真撮影も行った。発毛スコアは以下の要領で計算した。毛を刈った部分のうち、皮膚の色がグレー又はクロになった部分の割合により下記のようにスコアを付けた。０〜２０％：１、２０〜４０％：２、４０〜６０％：３、６０〜８０％：４、８０〜１００％：５。各群における上記スコアの合計を発毛スコアとした。判定者１人あたり発毛スコアの各群の最大値は５０であり、判定者を２人としたので発毛スコアの最大値は１００である。
環状オリゴペプチドを塗布した群では、コントロール群に比べて毛の再生が促進されていた。結果を図１０及び図１１に示す。これらの結果から、本発明の環状オリゴペプチドは毛成長促進作用を有することが実証された。
実施例６：本発明の環状オリゴペプチドとミノキシジルとの併用
製剤１：実施例４で製造した式（１３）の環状オリゴペプチド（０．００００１％）とミノキシジル（１％）との混合液
製剤２：ミノキシジル（１％）液（市販品であるリアップ（大正製薬株式会社）をそのまま使用）
製剤１と製剤２をそれぞれ実施例５と同様にして、毛包が休止期にあるＣ５７ＢＬ／６マウスの背中に投与して毛包の成長期への移行が促進されるかどうかを評価した。結果を図１２に示す。ミノキシジルのみを投与した場合と比較して、本発明の環状ペプチドとミノキシジルとを併用して投与した場合には、毛包の成長期への移行が飛躍的に促進された。両者の間で、ウィルコキソンの検定で棄却率５％未満のｐ値で有意差があった。
実施例７：細胞障害性の評価
実施例４で製造した式（１３）の環状オリゴペプチドの０．１重量％液、０．０１重量％液、０．００１重量％液、０．０００１重量％液、０．００００１重量％液、及び０．０００００１重量％液のそれぞれについて細胞障害性試験を行った。被験細胞としては皮膚由来細胞ＨＳＣ−５（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団の下部組織であるヒューマンサイエンス研究資源バンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｈｓｆ．ｏｒ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｂ．ｈｔｍｌ）から入手）を２４穴培養プレートに１００，０００細胞／ウエルで播種した。培地としては、１０％ＦＣＳを含むＩＳＣＯＶ変法ＤＭＥＭ培地を使用し、培養は２日間行った。培養終了後、生細胞の割合をカウントした。その結果、何れの場合も細胞は生存しており、細胞障害性は認められなかった。
【産業上の利用可能性】  本発明のオリゴペプチドは毛成長促進作用を有しており、毛成長促進剤などの医薬の有効成分として有用である。本発明では、修飾基を特定のものとすることにより、国際公開ＷＯ０１／０９４３８２号に記載のペプチドよりも毛成長促進作用が向上している。さらに、Ｘ７及びＸ９をＡｓｐ以外の別のアミノ酸に置換することで収率を向上させることができる。また、本発明の環状オリゴペプチドは、分子内に環構造を有し、有機溶媒に露出しても安定であるため、逆相クロマトグラフィーなどの厳しい条件下でも安定であり、特に精製効率が高いという利点を有している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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