(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
浸潤リンパ球を含む病巣組織をNOGマウスに移植する工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体を産生するプラズマ細胞の増殖方法。
【請求項２】
以下の（a）〜（c）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体を産生する細胞を生産する方法：
（a）浸潤リンパ球を含む病巣組織をNOGマウスに移植する工程
（b）移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程
（c）移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程
【請求項３】
さらに次の工程を含む、請求項2記載の生産方法。
（d）回収された病巣組織からプラズマ細胞を切り出し、該プラズマ細胞をパートナー細胞と融合する工程。
【請求項４】
以下の（a）〜（d）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部をコードする核酸の生産方法。
（a）浸潤リンパ球を含む病巣組織をNOGマウスに移植する工程
（b）移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程
（c）移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程
（d）回収した病巣組織より抗体をコードした核酸を取得する工程
【請求項５】
（d）の工程において、病巣組織よりプラズマ細胞を切り出した後に該プラズマ細胞から抗体をコードする核酸を回収することを特徴とする請求項4記載の生産方法。
【請求項６】
さらに次の工程を含む、請求項4または5記載の生産方法。
（e）抗体をコードした核酸を鋳型として、抗体可変領域を増幅し得るオリゴヌクレオチドを用いて、抗体可変領域をコードする核酸を増幅する工程。
【請求項７】
請求項2または3により生産された抗体産生細胞から抗体を単離する、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部の生産方法。
【請求項８】
以下の（a）〜（c）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部の生産方法。
（a）請求項4〜6のいずれかに記載の生産方法により得られた核酸又は該核酸をキメラ化、ヒト化した核酸を発現ベクターに導入する工程
（b）前記核酸を担持したベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
（c）形質転換体を培養し、抗体を産生させる工程
【請求項９】
さらに次の工程を含む、請求項8記載の生産方法。
（d）得られた抗体を病巣組織に接触させ、該病巣組織と結合する抗体を産生する形質転換体を選択する工程
【請求項１０】
移植した病巣組織に含まれる異常細胞が、癌細胞、過形成を構成する細胞、またはウイルス感染した細胞である、請求項2〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
癌が固形癌又は血液癌である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
固形癌が前立腺癌、胃癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌または膵臓癌である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
過形成が良性前立腺肥大である、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
抗体またはその一部が、IgG、IgM、Fab、F(ab')2、FvまたはシングルチェインFVである、請求項4〜9のいずれかに記載の生産方法。
【請求項１５】
産生された抗体又はその一部が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはその一部である請求項8又は9に記載の生産方法。
【請求項１６】
以下の工程を含む、病巣組織に対する治療用組成物の製造方法。
（a）リンパ球が浸潤している病巣組織をNOGマウスに移植する工程
（b）移植部位におけるリンパ球の増殖を検出する工程
（c）移植部位よりリンパ球を含む細胞を回収する工程
【請求項１７】
（d）回収されたリンパ球を含む細胞をインビトロで培養し、リンパ球をさらに増殖させる工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
リンパ球がプラズマ細胞を含む、請求項16又は17記載の方法。
【請求項１９】
病巣組織が癌もしくは過形成を構成する細胞、またはウイルス感染した細胞である、請求項16〜18のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体産生細胞の取得に関する。また、この抗体産生細胞から抗体および該抗体をコードする核酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌組織や病巣組織へのリンパ球の浸潤は古くから臨床上良く知られた現象である（非特許文献1、2、3、4、5）。さらに、多くの実験的および臨床的なデータは、浸潤したリンパ球が、癌細胞や病巣組織を攻撃することを示している（非特許文献6、7、 8）。【０００３】
癌の細胞性免疫の主役は、細胞傷害性T 細胞（CTL）とNK細胞であり（非特許文献９、10、11、12）、また液性免疫の主役はプラズマ細胞の産生する抗体である（非特許文献13、14、15）。癌患者の血清中には癌抗原を認識する抗体が存在することは示されており、患者抗体を用いて新規癌抗原の分離がなされている（非特許文献16、17）。さらに、癌組織に浸潤するプラズマ細胞の産生する抗体の幾つかは、癌細胞に結合することが証明されている（非特許文献18、19、20）。また、ハーセプチンやリツキサンのように癌で強く発現する抗原を認識する抗体が治療薬として開発され、癌特異抗原を認識する抗体の有用性が示されている（非特許文献21、22）。【０００４】
癌組織に浸潤するプラズマ細胞を分離し、その細胞から特異的な抗体産生を継続的に行う試みはなされているが、今のところうまく行っていない。その理由として、癌組織から腫瘍特異的なプラズマ細胞（Bリンパ球）を分離することが困難であり十分な数を確保できないこと、また分離がある程度うまく行ったとしても、抗体産生細胞を不死化させるためのEBVを用いた方法やハイブリドーマを用いた方法では抗体産生が安定しないことが挙げられる。【０００５】
一方で、クローン化された抗体産生細胞と同様の抗原結合活性を持つ抗体を作り出すための組み換えDNA技術、すなわち抗体遺伝子のクローニングと組み換え抗体蛋白質の調製法が確立されつつある（非特許文献23、24）。抗体遺伝子の可変領域をコードする遺伝子をクローニングすることにより、Fv, scFv, Fab, IgGあるいはIgMなどの抗体遺伝子を作ることが可能である（非特許文献25、26、27）。最も小さい組み換え抗体分子であるscFvは、重鎖可変領域、軽鎖可変領域をリンカーで連結した構造を持つ。【０００６】
クローン化されたB細胞は、単一の抗体遺伝子を発現している。したがってこの細胞から重鎖と軽鎖の可変領域をクローニングすることは容易である。しかしながら、末梢血に存在するB細胞や癌組織に浸潤するB細胞は、多様な抗体を産生する細胞集団(ポリクローン)であり（非特許文献28、29）、この集団から癌に特異的な遺伝子をクローニングすることは、大変困難である。
【非特許文献１】Hurliamnn et al. (1985) Int J Cancer 35:753
【非特許文献２】Whiteside et al. (1986) Cancer Immunol Immunother 23:169
【非特許文献３】Wolf et al. (1986) Otolaryngol Head Neck Surg 95:142
【非特許文献４】Husby et al (1976) J Clin Invest 57:1471
【非特許文献５】Vose et al. (1979) Int J Cancer 24:579
【非特許文献６】Rosenberg et al. (1988) New England J Med 319:1676
【非特許文献７】Van Pel et al. (1995) Immunol Reviews 145:229
【非特許文献８】Kreider et al. (1984) Cancer Metastasis Rev 3:53
【非特許文献９】Nobholz and MacDonald (1983) Annu Rev Immunol 1:273
【非特許文献１０】Gerundolo et al. (1987) Eur J Immunol 17:173
【非特許文献１１】Hanna et al. Nat Immun Cell Growth Regul. 1983-1984;3(1):22-33.
【非特許文献１２】Brittenden et al. (1996) Cancer 77:1226
【非特許文献１３】Roitt et al. (1969) Lancet 2:367
【非特許文献１４】Borsos (1971) Progress in Immunology: p841. New York, Academic Press
【非特許文献１５】Kodera and Bean (1975) Int J Cancer 16:579
【非特許文献１６】Yao-Tseng Chen et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:1914
【非特許文献１７】Ugur Sahin et al. (1997) Cancer 9:709
【非特許文献１８】Williams et al. (1996) Jour Immunol 156:1908
【非特許文献１９】Imahayashi et al. (2000) Cancer Invest 18:530
【非特許文献２０】Yasuda et al. (2002) Cancer Res 62:1751
【非特許文献２１】Green et al. (2000) Cancer Treat Rev 26:269
【非特許文献２２】Maloney et al. (1997) Blood 90:2188
【非特許文献２３】Marks et al. (1991) J Mol Biol 222:581
【非特許文献２４】Larrick et al. (1992) Immunol reviews 130:69
【非特許文献２５】Skerra et al. (1988) Science 240:1038-1041
【非特許文献２６】Bird et al. (1988) Science 242:423-426
【非特許文献２７】Better et al. (1988) Science 240:1041-1043
【非特許文献２８】Kotlan et al. (1999) Immunol Lett 65:143
【非特許文献２９】Hansen et al. (2001) Pro Natl Acad Sci USA 98:12659
【非特許文献３０】Blood, 100: 3175-3182, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、病巣組織を形成する異常細胞（ウイルス感染細胞、癌細胞、良性の過形成を構成する異常細胞など）に浸潤している抗体産生細胞の取得を容易にすることを目的とする。本発明は、病巣組織に浸潤している抗体産生細胞から抗体およびそれをコードした核酸を生産する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、病巣組織に浸潤している抗体産生細胞に基づき生産された抗体およびそれをコードした核酸を提供する。さらには、本発明は、病巣組織に浸潤している抗体産生細胞、該細胞に基づき得られた抗体およびそれをコードした核酸を用いて、病巣組織に対する治療用または診断用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者らは鋭意研究を行った結果、T cell, B cell, NK cellを持たず、かつ、低IFN産生能を示す高度免疫不全マウスであるNOD／SCID／γcnull  マウス(非特許文献３０、以下、このマウスを本願では「NOGマウス」と称する)に、浸潤リンパ球を含む癌組織を移植すると、予想外に浸潤リンパ球の分化・増殖が促され、癌組織を認識する抗体を産生するプラズマ細胞の数が飛躍的に高まり、該細胞を容易に分離できることを見出し、かかる知見に基づき本発明を完成した。具体的には、本発明は以下の通りである。
＜１＞  プラズマ細胞を含む組織、プラズマ細胞を含む血液、または組織若しくは血液から回収されたプラズマ細胞を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程を含む、プラズマ細胞の増殖方法。
＜２＞  組織が浸潤リンパ球を含む病巣組織である、上記＜１＞記載の増殖方法。
＜３＞  以下の（ａ）〜（ｃ）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体を産生する細胞を生産する方法。
（ａ）浸潤リンパ球を含む病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程
（ｂ）移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程
（ｃ）移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程
＜４＞さらに次の工程を含む、上記＜３＞記載の生産方法。
（ｄ）回収された病巣組織からプラズマ細胞を切り出し、該プラズマ細胞をパートナー細胞と融合する工程。
＜５＞以下の（ａ）〜（ｄ）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部をコードする核酸の生産方法。
（ａ）浸潤リンパ球を含む病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程
（ｂ）移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程
（ｃ）移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程
（ｄ）回収した病巣組織より抗体をコードした核酸を取得する工程
＜６＞（ｄ）の工程において、病巣組織よりプラズマ細胞を切り出した後に該プラズマ細胞から抗体をコードする核酸を回収することを特徴とする上記＜５＞記載の生産方法。
＜７＞さらに次の工程を含む、上記＜５＞または＜６＞記載の生産方法。
（ｅ）抗体をコードした核酸を鋳型として、抗体可変領域を増幅し得るオリゴヌクレオチドを用いて、抗体可変領域をコードする核酸を増幅する工程。
＜８＞上記＜３＞または＜４＞により生産された抗体産生細胞から抗体を単離する、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部の生産方法。
＜９＞以下の（ａ）〜（ｃ）工程を含む、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体またはその一部の生産方法。
（ａ）上記＜５＞〜＜７＞のいずれかに記載の生産方法により得られた核酸又は該核酸をキメラ化、ヒト化した核酸を発現ベクターに導入する工程
（ｂ）前記核酸を担持したベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
（ｃ）形質転換体を培養し、抗体を産生させる工程
＜１０＞さらに次の工程を含む、上記＜９＞記載の生産方法。
（ｄ）得られた抗体を病巣組織に接触させ、該病巣組織と結合する抗体を産生する形質転換体を選択する工程
＜１１＞移植した病巣組織に含まれる異常細胞が、癌細胞、過形成を構成する細胞、またはウイルス感染した細胞である、上記＜３＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
＜１２＞癌が固形癌又は血液癌である、上記＜１１＞記載の方法。
＜１３＞固形癌が前立腺癌、胃癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌または膵臓癌である、上記＜１２＞記載の方法。
＜１４＞過形成が良性前立腺肥大である、上記＜１１＞記載の方法。
＜１５＞抗体またはその一部が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')2、ＦｖまたはシングルチェインＦＶである、上記＜５＞〜＜１０＞のいずれかに記載の生産方法。
＜１６＞産生された抗体又はその一部が、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはその一部である上記＜９＞又は＜１０＞に記載の生産方法。
＜１７＞上記＜５＞〜＜７＞のいずれか記載の方法により生産された核酸。
＜１８＞上記＜１７＞記載の核酸を含む、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体をコードした核酸。
＜１９＞上記＜８＞〜＜１０＞のいずれか記載の方法により生産された抗体。
＜２０＞前立腺癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、肝臓癌細胞、大腸癌細胞または膵臓癌細胞に対する抗体である、上記＜１９＞記載の抗体。
＜２１＞前立腺癌細胞に対する抗体である、上記＜２０＞記載の抗体。
＜２２＞前立腺癌細胞株ＤＵ１４５の表面分子を認識する、上記＜２１＞記載の抗体。
＜２３＞ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')2、ＦｖまたはシングルチェインＦＶである、上記＜１９＞〜＜２２＞のいずれかに記載の抗体。
＜２４＞可変領域部分からなる、上記＜１９＞〜＜２２＞のいずれかに記載の抗体。
＜２５＞シングルチェインＦＶである、上記＜２３＞又は＜２４＞記載の抗体。
＜２６＞以下の工程を含む、病巣組織に対する治療用組成物の製造方法。
（ａ）リンパ球が浸潤している病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程
（ｂ）移植部位におけるリンパ球の増殖を検出する工程
（ｃ）移植部位よりリンパ球を含む細胞を回収する工程
＜２７＞（ｄ）回収されたリンパ球を含む細胞をインビトロで培養し、リンパ球をさらに増殖させる工程をさらに含む、上記＜２６＞記載の方法。
＜２８＞リンパ球がプラズマ細胞を含む、上記＜２６＞又は＜２７＞記載の方法。
＜２９＞病巣組織が癌もしくは過形成を構成する細胞、またはウイルス感染した細胞である、上記＜２６＞〜＜２８＞のいずれかに記載の方法。
＜３０＞上記＜２６＞〜＜２９＞のいずれかに記載の方法により製造された、病巣組織に対する治療用組成物。
＜３１＞プラズマ細胞を含む病巣組織、プラズマ細胞を含む血液、または、病巣組織もしくは血液から回収されたプラズマ細胞、を移植した高度免疫不全非ヒト動物から回収された血清中に含まれる、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体。
＜３２＞ポリクローナル抗体である上記＜３１＞記載の抗体。
＜３３＞上記＜１７＞若しくは＜１８＞記載の核酸、または上記＜１９＞〜＜２５＞、＜３１＞若しくは＜３２＞のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、病巣組織に対する治療用または診断用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、高度免疫不全動物にリンパ球が浸潤している病巣組織を移植することにより、移植組織片のようなポリクローナルな細胞集団中、異常細胞（癌細胞や、良性の過形成を構成する異常細胞など）を認識する抗体を産生するプラズマ細胞を選択的に増殖させることが可能となり、目的のプラズマ細胞の分離が容易になる。プラズマ細胞の分離を容易にすることにより、さらには、そのプラズマ細胞から病巣組織に特異的な抗原を認識する抗体の取得、抗体をコードした核酸の取得をも容易にまたは可能にする。また、本発明により取得されたプラズマ細胞、抗体またはこれをコードした核酸は病巣組織に対する新規な治療薬または診断薬として寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト乳癌組織を細切し同量をNOGマウスおよびSCIDマウスに移植し、9週目に解剖し、パラフィン切片を作製後、HE染色を施した結果を示す写真である。NOGマウスでは、プラズマ細胞の高度の集簇が観察される。また、白血球が腫瘍細胞間に浸潤している像が観察され、免疫系が活発に作用していることが考えられた。この組織像から癌特異的な免疫反応が存在することが強く示唆された。
【図２】ヒト乳癌組織を移植後、NOGマウスとSCIDマウスに移植し、ヒトのIgG抗体価の推移をモニターした結果を示すグラフである。NOGにおけるIgG抗体価は、SCIDの数十倍から百倍の高い値を示した。
【図３】ヒト前立腺癌および良性前立腺肥大の検体を移植後、NOGマウス移植し、ヒトのIgG抗体価とIgM抗体価の推移をモニターした結果を示すグラフである。40検体中図中の4検体を移植したケースにおいて、抗体価の上昇が見られた。この中の4例からRNAを抽出し、抗体遺伝子を増幅した。
【図４】ヒト乳癌の検体を移植後、NOGマウス移植し、ヒトのIgG抗体価とIgM抗体価の推移をモニターした結果を示すグラフである。10検体中図中の4検体において、抗体価の上昇が見られた。この中の4例からRNAを抽出し、抗体遺伝子を増幅した。
【図５】プラズマ細胞の集簇度とNOGマウス血清中のヒトIgG濃度を示したグラフである。集簇度(密度)の高さと抗体価は良く相関した。
【図６】NOGマウスとSCIDマウスにヒトIgGを投与し、その半減期を調べた結果を示すグラフである。NOGマウスにおける半減期は、約18日、SCIDマウスにおける半減期は21日でNOGマウスの方が若干短かった。このことから、NOGマウスにおけるヒト抗体の高さはクリアランスの遅さに起因するものではないことが示された。
【図７】良性前立腺肥大の検体を移植したNOGマウス血清中に含まれるヒト抗体が、前立腺癌細胞株DU145の表面抗原を認識するかFACSで調べた結果を示すグラフである。結果から分かるように、良性前立腺肥大を移植したNOGマウスの血清中のIgG抗体の中に癌細胞株を認識するものが存在した。
【図８】乳癌（Ductal carcinoma）の検体を移植したNOGマウスの血清中に存在するヒト抗体が、乳癌腫瘍株ZR-75-1の表面抗原を認識するかFACSで調べた結果を示すグラフである。結果から分かるように、乳癌を移植したNOGマウスの血清中のIgM抗体の中に癌細胞株を認識するものが存在した。
【図９】scFv提示したファージを前立腺癌細胞株DU145細胞への結合を指標に濃縮する過程をフローサイトメトリーで確認した際の結果を示すグラフである。濃縮選択回数を増やすにつれ、DU145細胞に結合するファージ量が増加した。
【図１０】5回または6回濃縮選択後のライブラリよりDU145細胞へ結合するクローンを単離した際、クローンのDU145細胞への結合をフローサイトメトリー法で確認した結果示すグラフである。
【図１１】ProteinA精製したscFv融合蛋白質のSDS-PAGE分離後の銀染色結果を示す写真である。
【図１２】組み換え融合蛋白質5-16scFv FcがDU145細胞に結合する様子をフローサイトメトリーで確認した結果を示すグラフである。
【図１３】胃癌組織を移植したNOGマウスの血清中に現れるヒト抗体を用いて、癌細胞株の染色を行い、フローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。PLR0631を移植したマウスの血清中のヒトIgM抗体は、ヒト胃癌細胞株AGSと濃度依存的に反応した（ａ） 。また、PLR0624を移植したマウスの血清は、ヒト胃癌細胞株SNU-1と反応した（ｂ）。
【図１４】マウス血清中のヒト抗体を用い、癌組織の組織染色を行った結果を示す写真である。ａ：PLR0659胃癌組織を移植したマウスの血清中IgMの大腸癌細胞株との反応性、ｂ：PLR胃癌組織を移植したマウスの結成中IgMの胃癌細胞株との反応性。矢印で示した箇所の癌細胞の細胞膜が染色されている。
【図１５】胃癌組織PLR0530を移植したマウスのヒト血清中のIgG（ａ）およびIgM（ｂ）による、癌細胞株AGSの染色をフローサイトメトリーで観察した結果のグラフである。50ug/mlと10ug/mlの抗体濃度で、ほぼ同様の染色性が見られた。
【図１６】濃縮選択後のライブラリよりAGS細胞に結合するクローンを単離した際、クローンとAGS細胞との結合をフローサイトメトリー法で確認した結果を示すグラフである。
【図１７】ProteinA精製したscFv融合蛋白質のSDS-PAGE分離後の銀染色結果を示す写真である。
【図１８】組換え融合蛋白質1-3scFv FcがAGS細胞に結合する様子をフローサイトメトリーで確認した結果のグラフである。
【図１９】キメラ抗体を用いた、癌組織の免疫組織染色を行った結果を示す写真である。癌組織として、胃癌患者から摘出された組織（aとc）、小腸の癌(duodenum)から摘出された組織（ｂ）、結腸(CRC)から摘出された組織（ｄ）を用いた。免疫染色の結果、キメラ抗体は胃癌細胞の細胞質、小腸の癌および結腸の癌の管腔側細胞膜と反応することが確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の第一の側面として、プラズマ細胞を含む組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程を含む、プラズマ細胞の増殖方法が提供される。【００１２】
ここでプラズマ細胞は、抗体を産生し得る細胞を意味し、この抗体のクラスは特に限定はない。したがって、本明細書において「プラズマ細胞」の語は、B細胞の分化の初期段階におけるμ鎖を抗原受容体として細胞表面に発現しているB細胞、転写のプロセスが変わり、膜型IgMの生産から分泌型IgMの産生に変化したB細胞、クラススイッチが終了しIgG, IgA, IgMを分泌する成熟したB細胞、さらには毎秒２０００分子のIgGを産生し得る分化の最終段階にあるB細胞をも含む意味で用いられる。また、ここで、プラズマ細胞の増殖とは、前記Ｂ細胞の増殖および分化のいずれの意味も含む。【００１３】
プラズマ細胞を含む組織は、生体内の免疫システムにより異物として認識され得る物質、新生物を含む生物あるいは生体物質の変性体が混在している細胞や組織、例えば、癌や過形成を構成している組織やウイルス感染した細胞などを挙げることができる。こうした癌やウイルス感染した細胞などは生体内で病巣部位を形成し得ることから、患者の病巣部位の組織片そのものを「プラズマ細胞を含む組織」として用いることができる。例えば、次のような病巣は、「プラズマ細胞を含む組織」として望ましい。【００１４】
固形癌の病巣
血液癌の病巣
過形成の病巣
動脈硬化の病巣
炎症性疾患の病巣
代謝性疾患の病巣
感染性病原体によって形成された病巣
自己免疫疾患の病巣【００１５】
なかでも、固形癌の病巣及び過形成の病巣が、上記組織として望ましい。固形癌の病巣としては、前立腺癌、胃癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌、膵臓癌などの病巣が挙げられる。過形成の病巣としては、良性の過形成を構成する病巣、なかでも、良性前立腺肥大を構成する病巣が望ましい。これらの組織は、外科的な切除により採取し得る。たとえば、検査のためのバイオプシーによって採取された癌組織を本発明における病巣組織として用いることができる。また、外科的治療である摘出術によって患者から摘出された組織も、病巣組織として有用である。【００１６】
また、炎症性疾患には、二次性のものも含まれる。代謝性疾患としては、アミロイドのプラークを形成する、アルツハイマーなどが例示される。【００１７】
また感染性病原体としては、例として、HCV（ヒトC型肝炎ウイルス）、HBV（ヒトB型肝炎ウイルス）、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらウイルス等の感染性病原体に侵された組織または細胞はバイオプシーによって、または血液から採取し得る。【００１８】
また、患者由来の病巣部位に限らず、実験動物などに人為的に形成させた病巣部位を「プラズマ細胞を含む組織」として用いてもよい。ここで実験動物などに人為的に形成させた病巣部位は、動物に人為的に異種の細胞や組織を移植することにより、あるいは人為的に導入した外来遺伝子が全身的または組織などの特定の部位で発現することにより形成されたもの等を挙げることできる。また、実験動物などにウイルス感染させることにより病巣組織を形成させることもできる。【００１９】
上記「プラズマ細胞を含む組織」は増殖させる出発細胞としてのリンパ球やプラズマ細胞を採取する際の最も典型的な試料として挙げているが、出発細胞としてのリンパ球やプラズマ細胞は、病巣などの組織に浸潤している場合だけでなく、血液中に存在している状態、またはこうした組織や血液から分離された状態のリンパ球やプラズマ細胞を用いてもよい。なお、以下の本明細書において、プラズマ細胞を増殖させる出発細胞となる試料として、「プラズマ細胞を含む（または浸潤している）組織」や「リンパ球を含む（または浸潤している）組織」という語を用いるが、この語には、プラズマ細胞等を含む血液、あるいは組織や血液から分離されたプラズマ細胞等そのものも包含される。したがって、以下の高度免疫不全非ヒト動物への移植では、プラズマ細胞等を含む組織、血液またはこれら組織もしくは血液から分離されたプラズマ細胞等のいずれを用いてもよい。「高度免疫不全非ヒト動物」は、移植組織や細胞を拒絶せず、移植組織中からプラズマ細胞を増殖させ得る活性を有する動物を指し、例えば、T cell, B cell, NK cellを持たず、かつ低IFN産生能を示す非ヒト動物、具体的にはNOGマウスが挙げられる。本願ではマウスの例を示すが、マウス以外にも、例えば、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットなども非ヒト動物として挙げられる。なお、以下、本明細書において、「高度免疫不全非ヒト動物」を、便宜的に単に「高度免疫不全動物」と称することもある。【００２０】
高度免疫不全非ヒト動物への移植は、プラズマ細胞を増殖させ得る移植箇所であれば特に限定はないが、移植操作およびその後の採取に便利な皮下に行うことができる。ここで移植されたプラズマ細胞は、特別に何らかの選択圧を必要とせずに、移植部位において優位に増殖する。このプラズマ増殖度（または集簇度）が、高度免疫不全動物の血清中の抗体価（移植組織由来の抗体の抗体価）とよく相関することを本発明者らは見出している。そのため、高度免疫不全動物の移植部位においてプラズマ細胞が増殖したかどうかは、動物から採取した血清におけるその抗体価の測定を行うことにより確認することができる。測定する抗体は、プラズマ細胞の増殖と相関が認められる限り種類を問わないが、好ましくはIgM、IgGである。抗体価の測定は、当業者に周知の方法によって可能である。例えば、IgMまたはIgGを一元免疫拡散法（single radial immunodiffusion: SRID）,免疫比濁法（turbidimetric immunoassay:TIA）,レーザーネフェロメトリー（laser nephelometry）,ラテックス凝集法（latex agglutination:LA）,RIA, EIA, ELISA法等の周知方法の中から選択して測定することができる。市販の測定キットを使用すれば、簡便な測定が可能である。【００２１】
上記本発明によれば、高度免疫不全動物の移植箇所で抗体産生細胞の数が増大されることから、従来難しかった抗体産生細胞の分離を容易にし、さらには後述する病巣組織に対する抗体の作製等を容易にすることができる。【００２２】
本発明の第二の側面として、抗体産生細胞の生産方法が提供される。上述したように本発明者らは、NOGマウスのような高度免疫不全動物に病巣組織を移植した際に病巣組織に浸潤しているプラズマ細胞を有利に増殖させ得ることを見出している。したがって、高度免疫不全動物をプラズマ細胞生産手段として利用することにより、従来では微量にしか得られなかったプラズマ細胞を増幅して回収することが可能となる。すなわち、本実施形態の抗体産生細胞の生産方法は、(a)浸潤リンパ球を含む病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程と、(b)移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程と、(c)移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程とが含まれる。【００２３】
ここで、移植工程およびプラズマ細胞の増殖を検出する工程は、上述したプラズマ細胞の増殖方法と同様に実施することができる。増殖させたプラズマ細胞の回収は、移植部位からプラズマ細胞が増殖した移植組織そのものを回収することにより行ってもよく、また、プラズマ細胞を選択的に回収することにより行ってもよい。このプラズマ細胞を選択して回収する手段として、マイクロダイセクションを挙げることができる。マイクロダイセクションは、組織切片から特定の細胞を切り取るための技術である。たとえば、凍結組織切片からLaser Microdissection (LMD)システムを使って、目的の細胞を単離することができる。紫外線レーザーによって組織切片を切り取ることができるシステムが既に市販されている。このシステムを利用すれば、顕微鏡観察下でコンピューターを使って画像中で切り取る領域を指定することにより、組織切片から任意の領域を切り取ることができる。【００２４】
このとき、標本を顕微鏡で観察し、プラズマ細胞が密集している部分を選択すれば、多くのプラズマ細胞を単離することができる。単一のプラズマ細胞を切り出せば、限定されたプラズマ細胞を容易に取得できる。【００２５】
上記高度免疫不全動物の移植部位から回収されたプラズマ細胞は、患者等から採取された病巣組織中のプラズマ細胞に比べ増加している。プラズマ細胞数の増加は、後述する実施例に示すとおり、病巣組織に対する抗体価の上昇を伴う。このように回収されたプラズマ細胞は病巣組織に対する抗体をより活発に産生していることから、このプラズマ細胞は抗体またはその遺伝子を得るための材料として、またはプラズマ細胞そのものを病巣組織の治療用組成物として有効に利用することができる。なお、回収されたプラズマ細胞を抗体生産手段等として活用する場合には、マウスミエローマ細胞やヒトミエローマ細胞などのパートナー細胞と融合させ、抗体産生細胞として細胞株を樹立することも望ましい。【００２６】
本発明の第三の側面として、抗体またはその一部をコードした核酸の生産方法が提供される。上述したように、リンパ球は浸潤している病巣組織を高度免疫不全動物に移植することにより、移植部位でプラズマ細胞が有利に増殖し得る。こうした移植部位で増殖したプラズマ細胞は、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体産生能を有することから、移植部位から回収されたプラズマ細胞は異常細胞に対する抗体またはその一部をコードする核酸の好適なクローニングソースとなる。要するに、本発明の抗体をコードした核酸の生産方法は、(a)浸潤リンパ球を含む病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程、(b)移植部位におけるプラズマ細胞の増殖を検出する工程、(c)移植部位からプラズマ細胞を含む病巣組織を回収する工程、(d)回収した病巣組織より抗体をコードした核酸を回収する工程が含まれる。【００２７】
浸潤リンパ球を含む病巣組織の高度免疫不全非ヒト動物への移植および移植部位におけるプラズマ細胞増殖の検出は、上述した増殖方法等と同様である。また、移植部位からのプラズマ細胞の回収は上記プラズマ細胞の生産方法と同様に、移植部位からプラズマ細胞が増殖した病巣組織そのものを回収することにより行ってもよく、また、マイクロダイセクションなどによりプラズマ細胞を選択して回収して行ってもよい。
【００２８】
回収した病巣組織または選択回収されたプラズマ細胞から抗体またはその一部をコードした核酸を取得する方法としては、プラズマ細胞もしくはその転写産物から染色体を単離し、そこから、抗体遺伝子またはその一部を取得してもよいが、プラズマ細胞から得られる抗体遺伝子は微量であることから、抗体遺伝子またはその一部を増幅して得ることが便利である。遺伝子の増幅方法は、公知である。たとえば、PCR法は抗体遺伝子の増幅方法として好ましい。以下に、PCR法を利用した抗体遺伝子の単離方法について説明する。【００２９】
まず単離されたプラズマ細胞（B細胞）からmRNAを抽出する。抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。mRNAの抽出やcDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。本発明においては、少数のプラズマ細胞に由来するmRNAが利用される。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後に精製される。あるいは一定量のRNAを抽出できる場合には、抗体産生細胞のRNAのみでも効率よく抽出することができる。たとえば１０以上、あるいは３０以上、好ましくは５０以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
【００３０】
得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文(J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597)やWebサイト(http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk)の開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列となる。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してPCR法を行う。【００３１】
具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１〜γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。その一例として、配列番号５５のプライマーを挙げることができる。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマー、例えば、本願実施例２に示すプライマー等を用いることができる。【００３２】
なお、上記プライマーとプラズマ細胞から回収したｍRNAを用いてRT-PCRにより、ｃDNAの単離を介さず、直接、抗体遺伝子またはその一部を増幅することもできる。【００３３】
重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖を組み合せて、抗体またはその一部を再構成することができる。【００３４】
上述したように本発明では「抗体またはその一部」をコードする核酸が生産される。核酸は抗体の全長をコードしていてもよいし、あるいは抗体の一部をコードしていてもよい。抗体は、好ましくはIｇG、IgMである。抗体の一部断片としては、好ましくは、抗体の相補鎖決定領域(complementarity determination region;CDR)を備えた可変領域を含む、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖなどを挙げることができる。【００３５】
上記の通り、抗体の可変領域をコードする核酸は、本発明の抗体断片として好ましい。可変領域をコードする核酸を取得することができれば、定常領域をコードする核酸と連結することによって、完全なイムノグロブリン分子を再構成することができる。抗体の定常領域は、同じクラスの抗体であればほぼ同じ構造を有している。つまり定常領域の構造は抗原結合活性には影響しない。したがって、可変領域の構造を明らかにすることができれば、既に取得されている定常領域との接合によって、その抗体と同様の活性を有する抗体を再構成することができる。【００３６】
また、本発明の抗体またはその一部をコードした核酸は、人為的に構造を改変した遺伝子組換え型抗体を含む。例えば、重鎖と軽鎖の可変領域をリンカーで接続したシングルチェインＦＶ（scFv）が含まれる。scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1988, 85, 5879-5883.)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域の例は、これに限定されるものではないが本願実施例に示されている。【００３７】
V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えば12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。実施例３にscFvの調製例を示すように、scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができる。【００３８】
また、ヒト以外の哺乳動物等で取得された抗体遺伝子の場合には、ヒトの定常領域遺伝子と置換し非ヒト動物−ヒトキメラ（Chimeric）化した抗体遺伝子や、あるいはヒト以外の哺乳動物の可変領域を構成するCDRをヒト可変領域に移植して構成されるヒト化抗体遺伝子も本発明の抗体遺伝子に含まれる。また、本発明における抗体をコードした核酸は、その塩基配列が維持されていれば、PNA等の人工的な構造を含むこともできる。【００３９】
本発明の第四の側面として、病巣組織に含まれる異常細胞に対する抗体を作製する方法が提供される。【００４０】
ポリクローナル抗体であればプラズマ細胞を含む病巣組織、プラズマ細胞を含む血液、または病巣組織もしくは血液から回収されたプラズマ細胞が移植された高度免疫不全動物から血液を採取し、血清を分離することにより簡便に調製することができる。この点は、後述する実施例でも示されている通り、高度免疫不全動物に病巣組織を移植後、動物より血液を採取したところ、病巣組織中に含まれる異常細胞に対する抗体が高度免疫不全動物の血液中に検出されている。このことから、病巣組織に含まれる異常細胞に対するポリクローナル抗体の調製方法としては、病巣組織が移植された高度免疫不全動物の血清を分離することにより実施し得る。
【００４１】
別の抗体作製方法としては上述した病巣組織を基に生産されたプラズマ細胞またはプラズマ細胞とパートナー細胞との融合株から抗体を調製する方法がある。パートナー細胞は、マウスミエローマ細胞やヒトミエローマ細胞などを挙げることができる。クローニングされたプラズマ細胞にパートナー細胞を融合させることより、モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株を調製することができる。こうしたプラズマ細胞とパートナー細胞との融合株から、目的である癌等の病巣組織中の異常細胞に対する抗体の単離精製は、例えば、癌等の異常細胞またはその表面分子に対する結合活性を利用して、アフィニティークロマトグラフィーなどにより実施することができる。さらに別の抗体作製方法としては、上記抗体またはその一部をコードする遺伝子を基に人工的に生産させる方法がある。この方法は、具体的には、上述した抗体またはその一部をコードした核酸又は該核酸をキメラ化、ヒト化した核酸を発現ベクターに導入する工程、前記核酸を担持したベクターで宿主細胞を形質転換する工程、形質転換体を培養し抗体を産生させる工程とが含まれる。【００４２】
ここで用いることができる発現ベクターは、遺伝情報の転写及び翻訳を制御するプロモーター、ターミネーター等のユニットを含む必要がある。例えば、大腸菌等のエシェリシア属の微生物を宿主細胞とする場合、プラスミドベクターとしてpBR、pUC系プラスミドを利用することができlac、trp、tac、trc、λファージPL、PR等に由来するプロモーターが利用可能である。また、ターミネーターとしてはtrpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のものを用いることができる。【００４３】
枯草菌等のバチルス属の微生物を宿主とする場合については、pUB110系、pC194系等のプラスミドが知られており、場合により遺伝子を染色体にインテグレートすることもできる。プロモーター・ターミネーターとしてapr、npr、amy等由来のものが利用できる。【００４４】
その他、原核細胞としてはシュードモナス属(例えば、Pseudomonas putida, P.cepacia等；pKT240等のベクター)、ブレビバクテリウム属(例えば、Brevibacterium lactofermentum；pAJ43等)、コリネバクテリウム属(例えば、Corynebacterium glutamicum等；pCS11、pCB101等)、ストレプトコッカス属(pHV1301、pGK1等)、ラクトバチルス属(pAMβ1等)、ロドコッカス属(Rhodococcus rhodochrous等より単離されたプラスミド(J.Gen.Microbiol. 138: 1003 (1992))等)、ストレプトマイセス属(例えば、Streptomyces lividans, S.virginiae等；pIJ486、pKC1064、pUWL-KS等)、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレビシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属(Salmonella typhimurium等)、セラチア属(Serratia marcescans)、シゲレラ属に属する微生物が挙げられる。【００４５】
真核微生物の発現系としては、Saccharomyces cerevisiaeを宿主とし、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系のプラスミドを用いた系が知られている。また、ADH、GAPDH、PHO、GAL、PGK、ENO等のプロモーター・ターミネーターが利用可能である。その他、クライベロマイセス属(例えば、Kluyveromyces lactis等;2μm系、pKD1系、pGKI1系、KARS系等のプラスミド)、シゾサッカロマイセス属(例えば、Schizosaccharomyces pombe等；pAUR224等)、チゴサッカロマイセス属(例えば、Zygosaccharomyces rouxii等；pSB3、及び、S.cerevisiae由来PH05プロモーター等)、ハンゼヌラ属(例えば、Hansenula polymorpha等)、ピキア属(例えば、Pichia pastoris等)、カンディダ属(例えば、Candida maltosa, Candida tropicalis, Candida utilis, Candida albicans等)、アスペルギルス属(例えば、Aspergillus oryzae, Aspergillus niger等)、及びトリコデルマ属(例えば、Trichoderma reesei等)等を本発明の発現ベクター系において用いることができる。【００４６】
その他、植物細胞を宿主として用いることもできる。例えば、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、ダイズ、ペチュニア、及びタバコ等由来の植物細胞を宿主とすることができる。特に良く知られた系としてNicotina tabacum由来の細胞を用いたものが知られており、これをカルス培養すればよい。植物を形質転換する際には、例えば、pMON530等の発現ベクターを用い、該ベクターをAgrobacterium tumefaciens等の細菌に導入する。この細菌をタバコ(例えば、Nicotina tabacum)に感染させると、所望のポリペプチドをタバコの葉等から得ることができる。【００４７】
カイコ(Bombyx mori)、カ(Aede aegypti, Aedes albopictus)、ショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)等の昆虫細胞を宿主として用いることも可能である。例えば、カイコを用いる場合、抗体をコードするDNAをバキュロウイルスベクター等に挿入し、該ウイルスをカイコに感染させることによりカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる(Nature 315: 592-594 (1985))。【００４８】
動物細胞を宿主として用いる場合には、例えば、pME18S(Med.immunol. 20: 27-32 (1990))、pEF-BOS(Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990))、pCDM8(Nature 329: 840-842 (1987)、pRSVneo、pSV2-neo、 pcDNAI/Amp(Invitrogen)、pcDNAI、pAMoERC3Sc、pCDM8(Nature 329: 840 (1987))、pAGE107(Cytotechnology 3: 133 (1990))、pREP4(Invitrogen)、pAGE103(J.Biochem. 101: 1307 (1987))、pAMoA、pAS3-3、pCAGGS(Gene 108: 193-200 (1991))、pBK-CMV、pcDNA3.1(Invirtogen)、pZeoSV(Stratagene)等が発現ベクターとして挙げられる。【００４９】
プロモーターとしては、サイトメガロウイルスのIE遺伝子のプロモーター及びエンハンサー、SV40の初期プロモーター、RSV、HIV及びMMLV等のレトロウイルスのLTR、メタロチオネインβ-アクチン、伸長因子1、HSP等の動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。その他、上述のようにウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、HIV等のDNA及びRNAウイルスが挙げられる。【００５０】
宿主細胞としては動物細胞では、マウス・ミエローマ細胞(例えば、SP2/0、NSO等)、ラット・ミエローマ細胞(例えば、YB2/0等)、マウス・ハイブリドーマ細胞、Nmalwa細胞(KJM-1細胞等も含む)、ヒト胎児腎臓細胞(293細胞等)、ヒト白血病細胞(BALL-1等)、CHO細胞、COS細胞(COS-1、COS-7等)、ハムスター胎児腎臓細胞(BHK等)、マウスセルトリ細胞(TM4等)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76等)、HBT637細胞、HeLa細胞、ウサギ腎臓細胞(MDCK等)、ヒト肝臓細胞(HepG2等)、マウス乳癌細胞(MMT060562細胞)、TRI細胞、MRC細胞、FS3細胞等がある。【００５１】
発現ベクターの導入方法としては、宿主及びベクターの種類に依存するが、細胞に抗体をコードするDNAを導入できる方法であれば、いずれも用いることができる。原核細胞へベクターを導入する方法としては、カルシウムイオンを用いる方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69: 2110 (1972))、プロトプラスト法(特開昭63-24829号公報)、エレクトポーレーション法(Gene 17: 107 (1982); Molecular&General Genetics 168: 111 (1979))等がある。酵母への導入方法としては、エレクトポレーション法(Methods in Enzymology, 194: 182 (1990))、スフェロプラスト法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 4889 (1984))、酢酸リチウム法(J.Bacteriol. 153: 163 (1983))等がある。植物細胞についてはAgrobacterium法(Gene 23: 315 (1983); WO89/05859等)や、超音波処理による方法(WO91/00358)等が知られている。動物細胞へベクターを導入する方法としてはエレクトポレーション(Cytotechnology 3:133 (1990))、リン酸カルシウム法(特開平2-227075号公報)、リポフェクション法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413 (1987); Virology 52: 456 (1973))、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法等が挙げられる。【００５２】
上述のようにして取得された形質転換体は、例えば、以下の方法で培養することができる。【００５３】
形質転換体が原核生物や真核微生物である場合は、培地は該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等の生育に必要な物質を含有し、形質転換体の効率的な培養を可能にするものであれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。培養は好気的条件、嫌気的条件のいずれで行ってもよく、生育温度、培地のpH、生育時間等の条件は、用いる形質転換体の種類に応じ適宜当業者により決定され得るものである。また、誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターについては、必要に応じてインデューサーを培地に添加すればよい。例えばlacプロモーターを有するベクターは、IPTGの添加によって発現が誘導される。あるいはtrpプロモーターであれば、IAAがインデューサーとして用いられる。【００５４】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、培地としてはTNM-FH培地(Pharmingen)、Sf-900 II SFM培地(Life Technologies)、ExCell400及びExCell405(JRH Biosciences)、Grace's Insect Medium(Nature 195: 788 (1962))等を用いることができ、必要に応じゲンタマイシン等の抗生物質を添加してもよい。【００５５】
形質転換体が動物細胞である場合には、一般に使用されているRPMI1640培地(The Journal of American Medical Association 199: 519 (1967))、EagleのMEM培地(Science 122: 501 (1952))、DMEM培地(Virology 8: 396 (1959))、199培地(Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950))、または、これらの培地にBSA等を添加した培地を使用することができる。培養は通常の条件、例えば、pH6〜8、30〜40℃、5％CO2存在下で行うことができる。この際、必要に応じカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００５６】
このようにして得られた本発明の抗体は、宿主細胞内、または、シグナル配列を用いて細胞外に分泌させた場合には培地等から単離し、実質的に純粋なポリペプチドとして精製することもできる。本発明の抗体は、一般的にポリペプチドの分離や精製に使用される方法を適宜選択し、必要に応じて組み合せることによって、分離あるいは精製することができる。このような手法としては、クロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈澱、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、再結晶等を示すことができる。クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)；Antibodies: A Laboratoy Course Manual, Harlow and David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988))。これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。また、抗原への結合性を利用して精製することも可能である。【００５７】
また、本発明の方法により得られた抗体は、その抗体の一部断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖若しくはL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv)などをコードした核酸から上記発現ベクター及び宿主を介して発現させてもよく(例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol., 1994, 152, 2968-2976.、 Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology, 1989, 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Lamoyi, E., Methods in Enzymology, 1989, 121, 663-669.、Bird, R. E. et al., TIBTECH, 1991, 9, 132-137.参照)、また、抗体全長を発現させた後に、その抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し、抗体断片を生成させることによって得てもよい。【００５８】
抗体修飾物としては、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。また抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質、あるいは標識物質などを結合することも可能である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。【００５９】
さらに、本発明における抗体は二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体は抗原分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位が抗原を認識し、他方の抗原結合部位が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞障害性物質を認識してもよい。この場合、抗原を発現している細胞に直接細胞障害性物質を作用させ癌細胞に特異的に障害を与え、癌細胞の増殖を抑制することが可能である。二重特異性抗体は2種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。【００６０】
本発明の抗体を製造するための発現系を構築するための手順および宿主に適合した組換えベクターの構築は遺伝子工学の分野において慣用の技術を用いて行うことができる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labolatories (1989)等参照)。宿主細胞としては、細菌等の原核生物、並びに、酵母、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞等の真核細胞等、本発明の軽鎖又は軽鎖を含む抗体を発現できる細胞であればいずれも用いることができる。特に、グリコシル化の点から考えると哺乳動物細胞が好ましい。【００６１】
上記の通り生産された抗体等が、病巣中の異常細胞またはその表面分子に対する結合活性を指標として目的の抗体であるか確認することができる。具体的には、上記方法によって得られた抗体を癌細胞に接触させ、前記癌細胞と抗体と結合するか否かを解析する。ここで、癌細胞と結合する抗体は、本発明において目的とされる抗体であると確認される。【００６２】
上記において、抗体と癌細胞との結合を検出する方法は特に限定はなく、任意の方法を用いることができる。例えば、癌の固定標本に対して被験抗体を反応させ、次に抗体を認識する標識抗体を反応させる。洗浄後に固定標本上の標識抗体が検出されたときには、当該被験抗体の癌への結合を証明できる。標識には、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダーゼ等の酵素活性蛋白質、あるいはFITC等の蛍光物質を利用することができる。また、フローサイトメトリー法も上記結合を検出する方法として好適な方法の一つである。あるいは、表面プラズモン共鳴（SPR)を利用した方法、例えば市販のBIACOREシステムを利用すれば、標識することなく抗体と癌細胞との結合を検出することもできる。抗体の結合活性を評価するための癌組織としては、プラズマ細胞（B細胞）を取得した病巣を構成する癌組織そのものであっても良いし、あるいは異なる個体から採取された同じ臓器の癌組織や癌由来の細胞株を用いることもできる。更に、異なる臓器に由来する癌組織、癌由来の細胞株、特定の表面抗原を備えた癌細胞株などを利用することによって、異なる種類の癌に特異的にまたは共通して反応する抗体をスクリーニングすることもできる。
【００６３】
上記において抗体の癌組織に対する反応性が、正常組織との反応性と比較して、有意に高いとき、その抗体は癌に特異的に結合する抗体であると言う。本発明の抗体の反応性を比較するには、一般に、同種の組織が用いられる。すなわち、癌組織と当該癌組織が由来する臓器の正常組織との間で、抗体の反応性が比較される。癌組織に対する反応性が確認できる条件下で、正常組織に対する結合活性が検出できないとき、この抗体は、癌組織に対して特異的な反応性を有すると言うことができる。【００６４】
結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法を用いることもできる。上記のように抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリーとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。実施例に記載するように、重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)とすることができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入すれば、scFvをファージ表面に発現するライブラリーを得ることができる。このファージを目的とする抗原と接触させて、該ライブラリーの中から抗原に結合したファージを回収すれば、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAを回収することができる。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、目的とする結合活性を有するscFvを濃縮することもできる。ファージライブラリーの調製については、例えば、Barabas, III, C.F. et al.: “phage display a laboratory manual", cold spring harbor laboratory press, 2001を参考とすることができる。また、ファージライブラリーの調製は市販のファージライブラリー構築用のシステムを用いることができ、例えば実施例にあるように、pCANTABファージミドベクターやM13KO7ヘルパーベクター等を用いて行うことができる。【００６５】
上記本発明の抗体は、病巣組織の診断および治療に有用となる。診断に本発明の抗体を用いる場合には、追跡可能な標識、例えば、酵素標識、放射標識、蛍光標識等を付けた抗体分子として利用することができる。このような標識で修飾された抗体を被検者に投与して抗体の局在から癌の存在を検出してもよい。また、本発明の抗体をプレート、ビーズなどの固相に固定して、診断用のキットなどを構成することもできる。また、治療に本発明の抗体を用いる場合については後述する。【００６６】
本発明の第五の側面として、病巣組織に対する治療用組成物の製造方法が提供される。上述した本発明の方法により高度免疫不全動物において増殖・活性化されたプラズマ細胞は、病巣組織中に異常物質に対する抗体を産生することから、この細胞そのものを病巣組織に対する治療用組成物として利用することができる。そのため、上述した本発明のプラズマ細胞の生産方法は病巣組織に対する治療用組成物の製造方法としても応用し得る。すなわち、本発明の病巣組織に対する治療用組成物の製造方法には、（ａ）リンパ球が浸潤している病巣組織を高度免疫不全非ヒト動物に移植する工程、（ｂ）移植部位におけるリンパ球の増殖を検出する工程、（ｃ）移植部位よりリンパ球を含む細胞を回収する工程が含まれる。【００６７】
治療用組成物の製造における「リンパ球が浸潤している病巣組織」としては、上述したプラズマ細胞の増殖方法や生産方法と同様であり、要するに、生体内の免疫システムにより異物として認識され得る物質、新生物を含む生物あるいは生体物質の変性体が混在している細胞や組織、例えば、癌や過形成を構成している組織やウイルス感染した細胞などを挙げることができる。こうした細胞や組織は治療の対象となる患者個体から採取したものに限らず、他の患者から採取した細胞・組織、あるいは他の動物から採取されたものを用いてもよい。
【００６８】
リンパ球が浸潤している細胞・組織は上述したプラズマ細胞の増殖方法や生産方法と同様に高度免疫不全動物に移植され、リンパ球の増殖が検出された後に回収される。ここで回収されたリンパ球が増殖している移植細胞は、そのまま治療用組成物として利用してもよく、また、マイクロダイセクションなどにより抗体を産生するプラズマ細胞やリンパ球など選択・分離した後に治療用組成物として利用してもよい。さらには、リンパ球が浸潤している細胞等が移植された高度免疫不全動物から採取された血液からプラズマ細胞等を選択・分離した後に治療用組成物として利用してもよい。【００６９】
回収された移植細胞または分離されたリンパ球等は、さらにインビトロで培養し、増殖させることが可能である。【００７０】
また、高度免疫不全動物を用いて活性化されたプラズマ細胞などのリンパ球そのものではなく、プラズマ細胞から産生された抗体、抗体をコードした核酸を用いて、癌やウイルス感染による病巣組織に対する治療用組成物を製造してもよい。ここで使用する抗体や抗体をコードした核酸は上述した本発明における抗体の生産方法、抗体をコードした核酸の生産方法により生産されたものを用いることができる。抗体を治療用の組成物に用いる場合には、癌細胞やウイルス感染細胞などの異常物質に対する抗体の直接の攻撃作用だけではなく、抗体に抗癌剤や抗ウイルス剤を結合させ癌細胞やウイルス感染細胞などに抗癌剤や抗ウイルス剤を運搬する手段として抗体を用いてもよい。また、抗体をコードした核酸もまた、同様に、そのまま又は発現ベクターに担持させて、ヒト患者に投与し、生体内で発現した抗体により病巣組織中に異常物質を攻撃させてもよく、また、本発明の抗体をコードした核酸は、抗癌作用または抗ウイルス作用を有する他のポリペプチドをコードした核酸と融合させ、抗癌作用や抗ウイルス作用を有するポリペプチドを異常細胞に運搬させる目的で用いてもよい。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００７２】
[実施例１]  NOGマウスにおける特異的なプラズマ細胞の集簇と抗体価上昇
NOGマウスを用いて癌細胞株を樹立する目的で、組織提供の同意の得られた癌患者から手術で取り除かれた腫瘍組織をNOGマウスの皮下に移植を行った。対照としてSCIDマウスを用いて同様の移植を行った。具体的には、ヒト乳癌組織を細切し同量をNOGマウスおよびSCIDマウスの皮下に移植した。【００７３】
NOGマウスは、B cell およびNK cellを持つnudeマウスやNK cellを有するSCIDマウス(Nature 301: 527-530, 1983)に比べ移植効率が上がると想定して移植を実施したが、移植効率は予想に反して低かった（データ示さず）。【００７４】
その理由を調べる目的で、上記の通り、NOGマウスおよびSCIDマウスに癌組織を移植し、９週間経過後にマウスを解剖して移植片を回収した。移植片をOCT compoundに包埋し、凍結ブロックを作製し、deep freezerに保存した。移植片の一部は、PFA固定後、Amex法によりパラフィンに包埋し、薄切後、HE染色を施し、病理観察を行った。【００７５】
その結果、驚くべきことが判明した。即ち、病理組織解析においてNOGマウスの癌組織にはSCIDマウスに比較して著しく高度にプラズマ細胞が集簇し、その産生する抗体が癌組織を攻撃していると考えられる病理像が観察された（図１）。移植前の病理像と比較すると、さらに高いプラズマ細胞の濃縮がNOGマウスで起こっていることが確認された（データ提示せず）。【００７６】
癌細胞は、宿主の免疫系からエスケープするために様々な戦略を採っている。最も一般的な方法は、発現するHLA抗原を少なくして、癌抗原が免疫担当細胞に提示されることを防いでいる（Moller et al. (1992) Cancer Surv 13:101）。また、癌細胞が分泌するTGF-βがIL-12に拮抗し、腫瘍免疫の活性化を防いでいることも報告されている(Mouri (2002) Acta Med Pkayama 56:309 )。その他、indoleamine 2,3-dioxygenaseやFas ligandの分泌により生体の免疫反応を抑制している(Zheng et al. (2003) Gast Cancer 9:1415; 文献34/Uyttenhove et al. Nat Med 9:1269)。本発明者は、高度免疫不全非ヒト動物に移植された腫瘍組織では免疫系を抑制する機構が減弱し、リンパ球の活性化が起こる可能性を考えた。腫瘍免疫には、細胞傷性T cellおよびNK cellによる細胞性免疫系と抗体を中心とした液性免疫系があるが、移植腫瘍組織では、特に液性免疫系が活性化していることが病理観察より見出された。【００７７】
次に、NOGマウスの血清中に含まれるヒト由来の抗体価を測定した。具体的には、ヒト乳癌組織をNOGマウスと対照のSCIDマウスに移植し、その後、毎週各マウスの眼窩採血を行い、血清を分離して抗体価のモニターを行った。その結果、NOGにおけるIgG抗体価は、SCIDの数十倍から百倍の高い値を示した。NOGマウスのなかで、高いものでは10mg/mlという抗体価を示すものがあることが確認された（図２）。【００７８】
移植片に於けるプラズマ細胞の集簇度とNOG血清中のヒト抗体の抗体価との関係を調べた。プラズマ細胞の集簇度は病理学的な観察に基づいて評価し、次の基準で分類した。
グレード１：全組織片中に少数の形質細胞が認められる
グレード２：全組織片中にいくつかの形質細胞の集簇巣が認められる
グレード３：複数の視野にわたって形質細胞の集簇巣が認められる
【００７９】
抗体価は上述したように、マウスの眼窩採血を行い、血清を分離して測定した。その結果、移植片に於けるプラズマ細胞の集簇度とNOG血清中のヒト抗体の抗体価との間に高い相関が見られた（図５）。【００８０】
NOGマウスにおける高い抗体価がNOGマウスにおけるクリアランスの影響によるかを検討した。NOGマウスとSCIDマウスにヒトIgGを投与し、その半減期を調べた。NOGマウスにおける半減期は、約18日、SCIDマウスにおける半減期は21日でNOGマウスの方が若干短かった（図６）。このことから、NOGマウスにおけるヒト抗体の高さはクリアランスの遅さに起因するものではないことが示された。【００８１】
[実施例２]  乳癌移植片におけるプラズマ細胞の濃縮と分離および抗体遺伝子の増幅と配列の確認
新鮮なヒト乳癌組織を適当な大きさに切断後、NOGマウスとSCIDマウスの皮下に外套針を用いて移植した。移植後、毎週NOGマウスの眼窩採血を行い、血清を分離して抗体価のモニターを行った。抗体価は移植後すぐに上昇を初め、移植後5週目で最大値を取り、その後ゆっくりと減少する傾向が示された(図４)。【００８２】
抗体価が最大に成ったことを確認し、マウス（＃1385、#1386、#1403、#1405）の解剖を行った。解剖後、移植片をOCT compoundに包埋し、凍結ブロックを作製し、deep freezerに保存した。移植片の一部は、PFA固定後、Amex法によりパラフィンに包埋し、薄切後HE染色を施し、病理観察を行った。OCT compoundに包埋した凍結切片は、薄切し直接RNAを抽出する方法と、薄切後LMDでプラズマ細胞を切り出し、RNAを抽出する方法を行った。【００８３】
上記において直接切片から抽出したトータルRNAおよび、LMDでプラズマ細胞を切り出した後に抽出したトータルRNAのいずれについても、RNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて精製した。これら精製トータルRNAを基に、Sensiscript Reverse Transcriptase (QIAGEN)を用いて製造者の指示に従いcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、ヒト抗体可変領域をクローニングするプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーの設計は、J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597およびMedical Research Council (MRC)のWEBサイト"V BASE" (http//www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php?mene=901)を参考にデザインした。VHおよびJHの頭文字で始まるプライマーは重鎖可変領域をクローニングするプライマーに相当し、VKとJK、VLとJLの頭文字で始まるプライマーはそれぞれ軽鎖κ鎖、軽鎖λ鎖を増幅するためのプライマーに相当する。【００８４】
VH1a     5'-CAGGT(GT)CAGCTGGTGCAGTCTGG-3'  （配列番号：1）
VH1b     5'-CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGG-3'  （配列番号：2）
VH1c     5'-(GC)AGGTCCAGCTGGTACAGTCTGG-3'  （配列番号：3）
VH1d     5'-CA(AG)ATGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'  （配列番号：4）
VH2a     5'-CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGGT-3'  （配列番号：5）
VH2b     5'-CAGGTCACCTTGA(AG)GGAGTCTGGT-3'  （配列番号：6）
VH3a     5'-GA(AG)GTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'  （配列番号：７）
VH3b     5'-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'  （配列番号：8）
VH3c     5'-GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3'  （配列番号：9）
VH4a     5'-CAG(CG)TGCAGCTGCAGGAGTCGGGC-3'  （配列番号：10）
VH4b     5'-CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGC-3'  （配列番号：11）
VH5a     5'-GA(AG)GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGA-3'  （配列番号：12）
VH6a     5'-CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGT-3'  （配列番号：13）
VH7a     5'-CAGGT(CG)CAGCTGGTGCAATCTGG-3'  （配列番号：14）
JH1245   5'-TGAGGAGACGGTGACCAGGGT(GT)CC-3'  （配列番号：15）
JH3      5'-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3'  （配列番号：16）
JH6      5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3'  （配列番号：17）
VK1a     5'-(AG)ACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3'  （配列番号：18）
VK1b     5'-G(AC)CATCCAGTTGACCCAGTCTCCA-3'  （配列番号：19）
VK1c     5'-GCCATCC(AG)GATGACCCAGTCTCCA-3'  （配列番号：20）
VK1d     5'-GTCATCTGGATGACCCAGTCTCCA-3'  （配列番号：21）
VK2a     5'-GATATTGTGATGACCCAGACTCCA-3'  （配列番号：22）
VK2b     5'-GAT(AG)TTGTGATGACTCAGTCTCCA-3'  （配列番号：23）
VK3a     5'-GAAATTGTGTTGAC(AG)CAGTCTCCA-3'  （配列番号：24）
VK3b     5'-GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCA-3'  （配列番号：25）
VK3c     5'-GAAATTGTAATGACACAGTCTCCA-3'  （配列番号：26）
VK4a     5'-GACATCGTGATGACCCAGTCTCCA-3'  （配列番号：27）
VK5a     5'-GAAACGACACTCACGCAGTCTCCA-3'  （配列番号：28）
VK6a     5'-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCA-3'  （配列番号：29）
VK6b     5'-GATGTTGTGATGACACAGTCTCCA-3'  （配列番号：30）
JK1      5'-ACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'  （配列番号：31）
JK24     5'-ACGTTTGATCTCCA(CG)CTTGGTCCC-3'  （配列番号：32）
JK3      5'-ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3'  （配列番号：33）
JK5      5'-ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'  （配列番号：34）
VL1a     5'-CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCC-3'  （配列番号：35）
VL1b     5'-CAGTCTGTG(CT)TGACGCAGCCGCCC-3'  （配列番号：36）
VL2      5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(CG)-3'  （配列番号：37）
VL3a     5'-TCCTATG(AT)GCTGACTCAGCCACCC-3'  （配列番号：38）
VL3b     5'-TCCTATGAGCTGACACAGC(CT)ACCC-3'  （配列番号：39）
VL3c     5'-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCT-3'  （配列番号：40）
VL3d     5'-TCCTATGAGCTGATGCAGCCACCC-3'  （配列番号：41）
VL4a     5'-CAGCCTGTGCTGACTCAATCATCC-3'  （配列番号：42）
VL4b     5'-CAGCTTGTGCTGACTCAATCGCCC-3'  （配列番号：43）
VL4c     5'-CTGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCG-3'  （配列番号：44）
VL5a     5'-CAGCCTGTGCTGACTCAGCCA(CT)CT-3'  （配列番号：45）
VL5c     5'-CAGGCTGTGCTGACTCAGCCGGCT-3'  （配列番号：46）
VL6      5'-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC-3'  （配列番号：47）
VL7      5'-CAG(AG)CTGTGGTGACTCAGGAGCCC-3'  （配列番号：48）
VL8      5'-CAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCA-3'  （配列番号：49）
VL4_9    5'-C(AT)GCCTGTGCTGACTCAGCCACCT-3'  （配列番号：50）
VL10     5'-CAGGCAGGGCTGACTCAGCCACCC-3'  （配列番号：51）
JL1      5'-ACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3'  （配列番号：52）
JL23     5'-ACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'  （配列番号：53）
JL7      5'-ACCGAGGACGGTCAGCTGGGTGCC-3'  （配列番号：54）
IgGrev   5'-CGTCACCGGTTCGGGGAAGTAGTC-3'  （配列番号：55）
IgMrev   5'-GGGGAATTCTCACAGGAGACGAG-3'  （配列番号：56）
IgKrev   5'-GGCAGTTCCAGATTTCAACTGCT-3'  （配列番号：57）【００８５】
重鎖可変領域、κ鎖可変領域、λ鎖可変領域のクローニングを行う目的で、別々にそれぞれの遺伝子サブセットに対するプライマー混合液とTaq DNA polymerase Core Kit (QIAGEN)の組み合わせでPCR増幅を行った。γ鎖、μ鎖、κ鎖、λ鎖を増幅するためにそれぞれ５つのプライマー混合液をつくり、このプライマー混合液を用いて計20種類の反応液を調製した。混合液におけるプライマーの組み合せを表１に示した。4μLの鋳型cDNAを含む終濃度1x反応緩衝液、1xQ solution (QIAGEN)、0.4mM dNTP、0.4μMのforwardおよびreverse-wardプライマー、2U Taq DNAポリメラーゼを含む反応混合液20μLを調製した。反応混合液をアプライドバイオシステムズPE9700にセットし40サイクルの増幅反応を行った。増幅サイクルは、９４℃１０秒の変性のあと５０℃３０秒のアニーリング、７２℃３０秒の伸長反応からなる。【００８６】
【表１】
0005314242.tif 000002
重鎖可変領域（γ鎖およびμ鎖）、κ鎖可変領域の増幅産物に関して、更に入れ子のPCR増幅反応を行った。用いたプライマーの組み合わせを表2に示した。【００８７】
【表２】
0005314242.tif 000003
【００８８】
[実施例３] 前立腺癌移植片におけるプラズマ細胞の濃縮と分離および抗体遺伝子の増幅と配列の確認およびscFvの作製
実施例２に示した方法に基づき、前立腺癌もしくは前立腺肥大組織を移植した際に増殖、集簇の見られたプラズマ細胞が産生する抗体遺伝子の可変領域をPCR増幅した。PCRに用いたプライマーおよびPCRの条件も実施例２と同様である。【００８９】
PCR増幅された抗体重鎖可変領域DNA断片をpGEM-T Easyベクター (Promega)に挿入し、これを用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られた組換えプラスミドの挿入配列を塩基配列決定した。決定した塩基配列を配列番号：58、60、62、64、66に示した。これらの塩基配列の翻訳アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：59、61、63、65、67に示した。16クローン解析したうち、機能的なオープンリーディングフレームを持つ配列は８つで、そのうち独立の配列は5つであった。配列番号：64および配列番号：66に示した配列は、16クローン中でそれぞれ3および2回の頻度で見出された。配列バラエティが少数であることは特定の抗体を産生するプラズマ細胞がクローナルに増殖する何らかの選択圧がかかっていたことを示唆する。【００９０】
一本鎖抗体遺伝子作成のためのリンカー配列をMarksらの方法(J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597)に従って作成した。用いた鋳型DNA配列およびプライマーの塩基配列を以下に示した。PCR増幅によって合成されたリンカー断片をアガロースゲル電気泳動により確認し、切り出して精製した。【００９１】
鋳型DNA配列(template linker)
5'-GGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGTGGTGGTTCGGGTGGTGGTGGTTCGGGTGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3'  （配列番号：68）
プライマーの塩基配列
Reverse JH for linker
1 LJH1_2    5'-GCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGG-3'  （配列番号：69）
2 LJH3      5'-GGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGG-3'  （配列番号：70）
3 LJH4_5    5'-GAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGG-3'  （配列番号：71）
4 LJH6      5'-GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGG-3'  （配列番号：72）
Reverse VK for linker
5 LVK1      5'-GGAGACTGGGTCATCTGGATGTCCGATCCGCC-3'  （配列番号：73）
6 LVK2      5'-GGAGACTGAGTCATCACAACATCCGATCCGCC-3'  （配列番号：74）
7 LVK3      5'-GGAGACTGCGTCAACACAATTTCCGATCCGCC-3'  （配列番号：75）
8 LVK4      5'-GGAGACTGGGTCATCACGATGTCCGATCCGCC-3'  （配列番号：76）
9 LVK5      5'-GGAGACTGCGTGAGTGTCGTTTCCGATCCGCC-3'  （配列番号：77）
10 LVK6     5'-GGAGACTGAGTCAGCACAATTTCCGATCCGCC-3'  （配列番号：78）
Reverse VL for linker
11 LVL1     5'-GGCGGCTGCGTCAACACAGACTGCGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：79）
12 LVL2     5'-GCAGGCTGAGTCAGAGCAGACTGCGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：80）
13 LVL3a    5'-GGTGGCTGAGTCAGCACATAGGACGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：81）
14 LVL3b    5'-GGGTCCTGAGTCAGCTCAGAAGACGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：82）
15 LVL4     5'-GGCGGTTGAGTCAGTATAACGTGCGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：83）
16 LVL5     5'-GACGGCTGAGTCAGCACAGACTGCGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：84）
17 LVL6     5'-TGGGGCTGAGTCAGCATAAAATTCGATCCGCCACCGCCAGAG-3'  （配列番号：85）【００９２】
PCR増幅した重鎖可変領域、κ鎖可変領域もしくはλ鎖可変領域、リンカー配列を混ぜ、以下に示したプライマーセットを用いてPCRを行った。軽鎖がκ鎖の場合にはVHプライマーとJKプライマーの組み合わせ、軽鎖がλ鎖の場合にはVHプライマーとJLプライマーの組み合わせの反応液を調製した。Ex Taq DNA polymerase（TaKaRa）を用いて製造者の指示に従い反応液を調製した。94℃1分の変性の後、30サイクルの94℃15秒の変性および68℃ 1分の伸長反応を行うことにより、一本鎖抗体遺伝子ライブラリのアセンブリングおよび増幅反応を行った。
VH1BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3'  （配列番号：86）
VH2BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3'  （配列番号：87）
VH3BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3'  （配列番号：88）
VH4BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3'  （配列番号：89）
VH5BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC-3'  （配列番号：90）
VH6BACKSfi  5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3'  （配列番号：91）
JK1FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'  （配列番号：92）
JK2FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'  （配列番号：93）
JK3FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3'  （配列番号：94）
JK4FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3'  （配列番号：95）
JK5FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'  （配列番号：96）
JL1FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3'  （配列番号：97）
JL2_3FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'  （配列番号：98）
JL4_5FORNot  5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3'  （配列番号：99）【００９３】
増幅産物をアガロースゲル電気泳動により確認した後、相当する遺伝子断片を含むバンドを切り出して精製した。切り出した断片を制限酵素Sfi IとNotIで切断し、ファージミドベクターpCANTAB5E（Amersham Bioscience）へと挿入した。ファージミドに挿入された断片がコードするscFv蛋白質はM13ファージgeneIIIとの融合蛋白質として発現し、ヘルパーファージ感染下においてM13ファージ上へと提示される。scFvライブラリファージミドを用いて大腸菌TG1を形質転換し、得られた大腸菌ライブラリからランダムに選択したクローンの挿入塩基配列を解読した。本実施例において配列決定した一本鎖抗体scFvの塩基配列を配列番号：100、102、104、106、108、110に、その翻訳アミノ酸配列を配列番号：101、103、105、107、109、111に示した。【００９４】
ランダムな重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせをもつscFv大腸菌ライブラリにヘルパーファージM13KO7を感染させ、scFv蛋白質をファージ上に提示したファージライブラリを作製した。1mlのファージ液に対し、0.2mlのファージ沈殿液（20% ポリエチレングリコール(平均分子量8000)、2.5M NaCl）を加えてよく混合し、氷上で30分間インキュベーションした。その後、遠心分離を行い、ファージを沈殿させた。この沈澱物を2%スキムミルク・PBS溶液に懸濁させ、室温1時間のブロッキング反応を行った。【００９５】
前立腺癌株DU145細胞の細胞表面に対する結合活性を指標にファージクローンの濃縮選択を行った。DU145細胞は、10%のウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI1640培地を用いて37℃、5% CO2下にて培養した。増殖状態にある付着DU145細胞をPBSで洗浄したのち、1mM EDTAを含むPBSを用いて細胞をディッシュより剥がした。細胞懸濁液を一度遠心した後、細胞数2 x 106/mlになるように2% FBS/PBSに再懸濁した。細胞懸濁液に等量のscFvファージライブラリ液を加え、4℃にて、振とうしながら2時間のインキュベーションを行った。細胞に結合したファージと、細胞に結合していないファージとを分離する目的で遠心分離を行い、沈澱した細胞を分取し、2% FBS/PBSに再懸濁した。この洗浄作業を合計5回繰り返した後、沈殿化した細胞に対数増殖期にある大腸菌TG1を加え、細胞に結合したファージを回収した。TG1を加えて37℃、1時間のインキュベーションを行った後、薬剤マーカーアンピシリンを含む培地プレートにTG1溶液を撒き、37℃で終夜培養を行い、コロニー形成させてクローン化を行った。【００９６】
細胞表面に対する結合活性を指標にファージクローンの濃縮選択を計6回行った。生細胞表面に対する結合選択を行ったscFvを提示したファージライブラリ液を用いてDU145細胞の染色を行い、フローサイトメトリ法により解析した。詳細には、DU145細胞とファージライブラリ液とを混合した後、二次抗体としてM13ファージコートタンパク質に対するマウス抗M13抗体（アマシャムバイオサイエンス）を反応させ、続いて三次抗体にヤギ抗マウスIgG抗体FITCラベル(ベクトン・ディクトン)と反応させて、免疫染色を行った。細胞の染色状態をFACSCalibur(ベクトン・ディクトン)で解析した（図９）。4回、5回と濃縮選択を経るにつれ、細胞に結合するファージ量が増加した。細胞結合ファージの割合が増加したライブラリより、結合ファージのクローン化を行い、5回、6回濃縮選択を行ったライブラリよりそれぞれ結合クローン、5-16、6-24をひとつずつ同定した(図１０)。同定されたクローンの塩基配列を配列番号：112, 114に、その翻訳アミノ酸配列を配列番号:113, 115に示した。【００９７】
配列番号１１３に相当するアミノ酸配列とマウスIgG2a ヒンジ領域よりC末端側の定常領域配列と融合させたキメラ蛋白質を動物細胞系で分泌発現させるベクターを構築した。N末端にヒト重鎖イムノグロブリンに由来する分泌シグナル配列が付加されるよう発現カセットをデザインした。このscFv融合蛋白質をコードする塩基配列を配列番号:116に、翻訳配列を配列番号:117に示した。発現ベクター（G418薬剤耐性遺伝子を有する）をCHO細胞にエレクトロポレーション法で導入し、安定発現株をサンドイッチELISA法にて選択した。ヤギ抗マウスIgG(Gamma)抗体（ザイメッド, 62-6600）を1000倍希釈して弱アルカリ条件にてコーティングし、洗浄後、BSAを含むブロッキング液でブロッキングした。培養上清を添加して、scFv融合蛋白質を捕捉させた後、この補足量をアルカリホスファターゼ修飾ウサギ抗マウスIgG2a抗体で検出した。蛋白質発現量の多い安定株を培養し、この培養上清から、HiTrap ProteinA（アマシャムバイオサイエンス）を用いた精製によりscFv融合蛋白質の調製を行った。精製したscFv融合蛋白質の解析をSDS-PAGE・銀染色により確認した(図１１)。精製したscFv融合蛋白質がDU145に結合することをフローサイトメトリ法により確認した(図１２)。
【００９８】
[実施例４] NOG血清による、フローサイトメトリー法解析
前立腺癌および良性前立腺肥大の検体をNOGマウスに移植し、移植後、定期的にマウスの眼窩採血を行い、血清を分離してヒト抗体価（IgG、IgM）の推移をモニターした。約40検体中4検体を移植した６匹のマウスで抗体価の上昇が見られた（図３）。これらの抗体を50ug/mlに希釈して、前立腺癌細胞株（DU145, PC3, LNCaP, 22Rv1）と反応させた。一定時間反応後、FITCラベルした抗ヒトIgG抗体もしくはIgM抗体を加え、再度反応を行った。反応後、フローサイトメトリー法により、細胞が染色されているか確認した。その結果、良性前立腺肥大を移植したNOGマウス#1321のヒトIgG抗体が、前立腺癌細胞株DU145の表面抗原を認識していた（図７）。【００９９】
同様に、乳癌検体を移植したNOGマウスのヒト抗体価の推移をモニターした。10検体中4検体を移植した５匹のマウスでヒト抗体価の上昇が見られた（図４）。これらの抗体を用いて、癌細胞株(MCF-7, MDA-MB-231, ZR-75-1, BT-474)を上記と同様の方法で免疫染色し、フローサイトメトリー法にて解析した。その結果、乳癌を移植したNOGマウス#1385、#1386、#1403の血清中のヒトIgM抗体の中に癌細胞株ZR-75-1を認識するものが存在した（図８）。【０１００】
[実施例５]ヒト胃癌を移植したNOGマウス血清に存在する抗腫瘍抗体のフローサイトメトリー法と免疫組織染色による検出
12例の胃癌患者より摘出した癌組織をNOGマウスに移植して前立腺と同様にヒト抗体価(IgG, IgM)をモニターした。ヒト抗体価が50μg/ml以上になったNOG血清は、4種の胃癌株(AGS, KATO III, SNU-1, SNU-5)を用いて癌細胞株を認識する抗体が含まれていないかフローサイトメトリー法による解析を行った。PLR0530を移植したマウスの血清中のIgGとIgMは、ヒト癌細胞株AGSと強く反応し(詳細は実施例６に記載）、PLR0631およびPLR0659を移植したマウスの血清中のIgMが同様にAGSと強く反応した。また、PLR0624を移植したマウスの血清中のIgMがSNU-1と強く反応した。PLR0624とPLR0631を移植したマウスの血清をさらに希釈し、IgM濃度を10μg/ml、2μg/ml、0.4μg/mlに調整しフローサイトメトリー法解析を行った結果を図１３ａおよび図１３ｂに示す。
次に当社で樹立した細胞株を用いて、NOGマウスの血清に含まれる抗体のなかに癌細胞の細胞膜を認識するものは無いか免疫組織染色による検討を行った。免疫組織染色は樹立細胞株で作ったTissue Arrayで行い、その作製方法は以下の様である。NOGマウスで３代以上継代した癌細胞株を摘出し、4％パラホルムアルデヒドで一夜固定後、0.01Mリン酸緩衝液で２時間洗浄し、AMeX法(参考文献Sato Y et al. (1986) Am J Pathol. 125(3):431-5.)によりパラフィン包埋した。このブロックから、1.5mmの直径の癌組織を切りだし、約2.5cmx3.0cmの新しいブロックに移植し、計36種類(6x6)の異なった癌組織を配列した。組織の内訳は、大腸癌21種、小腸の癌4種、胃癌4種、胆膵管膨大部由来の腺癌、乳癌、膀胱癌、脳腫瘍、子宮癌、肺癌、卵巣癌各1種である。このTissue Arrayを薄切し、脱パラフィン後Ventana HX Discovery System (Ventana Medical Systems, Inc., Arizona, USA)を用いて免疫組織染色を行った。すなわち、一次抗体としてNOGマウスの血清を希釈し、抗体濃度を1μg/ml、２μg/mlもしくは10μg/mlとし、薄切した組織に添加し、反応させた。さらに、2次抗体としてIgGはBiotin-SP-conjugated goat anti-human IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Labs)を、IgMはBiotin-SP-conjugated goat anti-human IgM antibody (Jackson ImmunoResearch Labs)を加え、その後DABで発色反応を行った。異なる11検体の胃癌を移植したマウス血清中のヒトIgGによるIHCでは、1検体で癌細胞の膜抗原と反応することが確認され、異なる７検体の胃癌を移植したマウス血清中のヒトIgMのうち５検体が癌細胞の膜抗原と反応することが確認された。陽性になった検体のうちPLR0659とPLR0530の結果を下表(表３と表４)に示した。表から分かるように、PLR0659を移植したマウスの血清中に含まれるIgM抗体は、胃癌細胞4種の全ての膜に結合しただけで無く、複数の大腸癌や小腸の癌の膜抗原との結合が確認された。一方IgGは癌細胞の膜抗原を認識せず、核内抗原を認識した。IgMも全例で、核内抗原との反応が見られた。増殖の過程で変性・壊死した一部の癌細胞から核内抗原が露出し、生体内で抗核抗体が産生されたと推察される。免疫組織染色で膜抗原の染色が見られたものの代表例を図１４ａおよび図１４ｂに示した。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
[実施例６]ファージパニングで選択されたキメラ抗体の癌細胞との反応性
胃癌組織PLR0530を移植したNOGマウス血清中のヒトIgGとIgMが胃癌細胞株AGSに強く反応したことから(図１５ａ,１５ｂ)、実施例2、実施例3に示した方法に基づき、胃癌組織を移植した際に増殖したプラズマ細胞が産生する抗体遺伝子可変領域より、scFv提示ファージライブラリを作製した。胃癌細胞株であるAGSに対して細胞表面に結合するファージクローンの濃縮選択を実施例3に示した方法により行った。濃縮操作後に結合ファージ量の高まりが見られたライブラリより、結合ファージのクローニングを行い、配列番号:118に相当するクローン1-3を単離した(図１６)。クローン1-3に相当する翻訳アミノ酸配列を配列番号:119に示した。このクローン配列に相当するscFvマウスIgG2a定常領域融合蛋白質発現ベクターを構築し、CHO細胞に導入、安定発現株を樹立した。scFv融合蛋白質をコードする塩基配列を配列番号:120に、翻訳配列を配列番号:121に示した。培養上清より精製(図１７)したscFv融合蛋白質がAGS細胞に結合することをフローサイトメトリ法により確認した(図１８)。【０１０４】
次に、このキメラ抗体を用いて、癌組織の免疫組織染色を行った。検体として、癌患者から提供された胃、結腸、小腸を用いた。それぞれの組織は、癌組織に加えて隣接する非腫瘍組織を含んでいる。免疫組織染色の結果、胃では、癌細胞の細胞質、過形成性胃型粘液細胞の細胞質、正常細胞胃型粘液細胞および胃腺細胞の細胞質が染色された(図１９)。また、結腸の癌細胞あるいは正常粘膜上皮細胞の管腔側細胞膜および細胞質、また小腸では、過形成性粘膜上皮細胞の管腔側細胞膜および細胞質が染色された(図１９)。このように、この方法を行うことで、癌細胞および癌組織に反応する抗体が得られることが明らかとなった。特異性の高い抗体を得るためには、この方法を繰り返し、幾つかの候補クローンを得る必要がある。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明により、癌組織などの病巣組織に浸潤しているプラズマ細胞を、抗体産生をするプラズマ細胞へと分化・増殖させ、高濃度に濃縮することができる。これにより、抗体産生細胞をin vitroでクローン化することなく、癌細胞や病巣組織を認識する抗体産生細胞を容易に分離・取得することができる。さらに、この細胞から、容易に抗体遺伝子の分離が可能である。癌などの疾病の診断や治療において、癌などの病巣組織を認識するヒト抗体遺伝子を容易に取得することができる方法を提供する本発明の意義は大きい。【０１０６】
抗体を利用した診断や治療において、抗体はヒトへ投与される。例えば、抗体を用いた癌診断において、追跡可能な標識を付けた抗体分子が投与され、抗体の局在により、癌の存在が示される。また治療においては、抗体の直接作用だけではなく、抗癌剤を結合した抗体が患者に投与される。ヒト抗体は、ヒトに投与したときに高い安全性が期待され、同種であることから血中濃度を長期にわたって安定に維持できることが期待される。【０１０７】
本発明により、多くの癌組織から、癌特異抗体の遺伝子を効率よく分離することができる。更に、免疫系を液性免疫優位に方向付けるメカニズムも解明できる可能性があり、抗体のみならず低分子の癌治療薬、自己免疫疾患治療薬、感染症治療薬、アレルギー疾患治療薬などの創製に役立つ可能性もある。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１７】
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【図１９】
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【配列表】
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