(57)【要約】細胞や組織に大きなダメージを与えることなく、遺伝子導入の効率を高めることができる、遺伝子導入促進剤及びそれを含む遺伝子導入用組成物が開示されている。遺伝子導入促進剤は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質から成る。
2004075924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質から成る遺伝子導入促進剤。
【請求項２】
物質がカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンのキレート化剤である請求項１記載の遺伝子導入促進剤。
【請求項３】
前記キレート化剤がＥＤＴＡ又はその塩である請求項２記載の遺伝子導入促進剤。
【請求項４】
遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターと、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の遺伝子導入促進剤とを媒体中に含む、遺伝子導入用組成物。
【請求項５】
前記組成物が低張液である請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物中の前記遺伝子導入促進剤の濃度が１〜３０ｍＭである請求項４又は５記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中の前記遺伝子導入促進剤の濃度が２〜２０ｍＭである請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、５０ｍＭないし１６０ｍＭのカリウムイオンを含む請求項４〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、５０ｍＭないし１６０ｍＭのカリウムイオン、１０ｍＭないし１２０ｍＭのナトリウムイオン、１０ｍＭないし８０ｍＭのリン酸イオン及び９０ｍＭないし１６０ｍＭの塩素イオンを含む請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
筋肉内注射用である請求項４ないし９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターを細胞内に導入することにより前記外来遺伝子を細胞内に導入する遺伝子導入を、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の遺伝子導入促進剤の存在下で行なうことにより遺伝子導入を促進する方法。
【請求項１２】
請求項４ないし９のいずれか１項に記載の組成物を動物細胞に投与することを含む、遺伝子導入方法。
【請求項１３】
前記組成物を筋肉内注射により投与する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の物質の、遺伝子導入促進剤の製造のための使用。
【請求項１５】
請求項４ないし１０のいずれか１項に記載の組成物の、遺伝子導入用組成物の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子導入促進剤及びそれを含む遺伝子導入用組成物に関する。
【背景技術】  遺伝子治療の１つの方法として、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターを生体に投与する方法が知られている。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ（ＢＢＲＣ），２３３：５２７−５３１（１９９７）及びＮａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６：８６７−８７０（１９９８））には、インターロイキン−５（ＩＬ−５）遺伝子を含む組換えベクターを筋肉に注射し、かつ、この際の遺伝子導入の効率を高めるために遺伝子導入時に電気パルスを与える（エレクトロポレーション）ことによりＩＬ−５遺伝子を生体に導入する方法が記載され、また、ＰＮＡＳ，９６：６４１７−６４２２（１９９９）には同様な方法でエリスロポエチン遺伝子を導入する方法が記載されている。
また、生体外で細胞に外来遺伝子を導入し、遺伝子導入した細胞を生体に移植することにより遺伝子治療を行う方法も知られている。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３：２４３−２５５（１９９７）には、線維芽細胞にプロインシュリン遺伝子を導入し、得られた遺伝子導入線維芽細胞を皮下に移植することにより、プロインシュリン遺伝子を導入する方法が記載されている。
また、更には外来遺伝子を導入する事で、直接にその導入成分が生体に作用する事を目指すのではなく、生体内での免疫応答状況を誘起し、ワクチン化を目指す試みとして、ＤＮＡワクチンも種々議論されている。例えば、Ｖｏｘ  Ｓｏｎｇｕｉｎｉｓ  ８０：１２−１８（２００１）には、感染症や癌への応用の期待を込めた例示が総説として紹介されている。Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：２８２６−２８２９（１９９９）にもＤＮＡワクチンが記載されている。
遺伝子治療では，組織特異的に外来遺伝子を発現導入する効率的な技術方法が未だ確立されていない。そこで導入しやすい部位にまず外来遺伝子を導入発現させて、その産物がうまく体内に分泌移動していく方法論・ターゲット分子を探索する方策が模索されてきた。そこでは血球系細胞に導入して効率良く導入された細胞のみを外部で選択して生体に導入する方法もあるが、直接遺伝子のみを導入する方が薬剤選択等の問題を抱え込まない点からより強い期待を抱かせている。いずれの方法でも、上記の通り、導入しようとする外来遺伝子を含む組換えベクターを細胞に導入する必要があるが、その際の遺伝子導入効率が低いという問題がある。この問題を解決すべく、上記のようにエレクトロポレーションの手法を採用する方法も知られているが、エレクトロポレーションでは、細胞に電気パルスを与えるので、組織のダメージが大きいという問題がある。
【発明の開示】
従って、本発明の目的は、細胞や組織に大きなダメージを与えることなく、遺伝子導入の効率を高めることができる、遺伝子導入促進剤及びそれを含む遺伝子導入用組成物を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質が遺伝子導入効率を高める効果を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質から成る遺伝子導入促進剤を提供する。また、本発明は、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターと、上記本発明の遺伝子導入促進剤とを媒体中に含む、遺伝子導入用組成物を提供する。さらに本発明は、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターを細胞内に導入することにより前記外来遺伝子を細胞内に導入する遺伝子導入を、上記本発明の遺伝子導入促進剤の存在下で行なうことにより遺伝子導入を促進する方法を提供する。さらに本発明は、上記本発明の遺伝子導入用組成物を動物細胞に投与することを含む、遺伝子導入方法を提供する。さらに、本発明は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質の物質の、遺伝子導入促進剤の製造のための使用を提供する。さらに、本発明は、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターと、上記本発明の遺伝子導入促進剤とを媒体中に含む組成物の、遺伝子導入用組成物の製造のための使用を提供する。
本発明により、細胞や組織に大きなダメージを与えることなく、遺伝子導入の効率を高めることができる、新規な遺伝子導入促進剤及びそれを含む遺伝子導入用組成物が提供された。本発明の遺伝子導入促進剤の存在下に遺伝子導入を行うことにより、細胞や組織に大きなダメージを与えることなく細胞への遺伝子導入効率を向上させることができるので、本発明は、遺伝子治療の効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の実施例１において行った遺伝子導入において、用いたＥＤＴＡの濃度と、導入されたＥＧＦＰ遺伝子を発現する骨格筋線維数との関係を示す図である。
図２は、本発明の実施例１において行った遺伝子導入において、ＥＤＴＡと等モル量のカルシウムイオン又はマグネシウムイオンを添加した場合の、導入されたＥＧＦＰ遺伝子を発現する骨格筋線維数を示す図である。
図３は、本発明の実施例１において行った遺伝子導入において、用いたＥＤＴＡの濃度及びＰＢＳの有無と、導入されたＥＧＦＰ遺伝子を発現する骨格筋線維数との関係を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の遺伝子導入促進剤は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質、すなわち、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのいずれか一方又は両方を捕捉する物質から成る。このような物質としては、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンのキレート化剤が好ましい。このようなキレート化剤の例として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（０，０’−ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ＭＷ＝３８０．３５）、ＣｙＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸一水和物、ＭＷ＝３６４．３５）、ＤＴＰＡ−ＯＨ（１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ＭＷ＝３２２．２７）、ＥＤＤＰ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジプロピオン酸二塩酸塩、ＭＷ＝２７７．１５）及びＨＤＴＡ（１，６−ヘキサメチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、ＭＷ＝３４８．３５）ならびにこれらの塩（好ましくは、ナトリウムやカリウムのようなアルカリ金属塩、複数のカルボキシル基の一部が塩になっているものを包含する）を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらのうち、ＥＤＴＡは細胞や組織へのダメージが軽微であり、医薬品として既に認可されているものでもあるので最も好ましい。なお、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉する物質として、キレート化剤は好ましいが、必ずしもキレート化剤に限定されるものではなく、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを捕捉できる物質であれば他の物質でもよい。
本発明の遺伝子導入促進剤は、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターと共に組織又は細胞に投与される。したがって、本発明はまた、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができる組換えベクターと、上記本発明の遺伝子導入促進剤とを媒体中に含む、遺伝子導入用組成物をも提供する。この遺伝子導入用組成物中の、上記遺伝子導入促進剤の濃度は、特に限定されないが、１〜３０ｍＭが好ましく、２〜２０ｍＭがさらに好ましく、３〜１０ｍＭがさらに好ましい。
遺伝子導入用組成物の媒体としては、水系媒体が好ましく、さらに水系緩衝液又は水が好ましい。組成物の浸透圧が細胞中の浸透圧よりも大きくなると組織及び細胞のダメージが発生し、遺伝子導入効率が低下するので、組成物は等張又は低張であることが好ましく、特に、下記実施例に具体的に示されるように、低張の場合に遺伝子導入効率が高くなるので、組成物は低張液であることが最も好ましい。低張液は、媒体として純水を用いるか又は生理緩衝液よりも緩衝剤及び塩の濃度を低下させた緩衝液を用いることにより容易に調製することができる。
また、媒体として、細胞内液のイオンバランスを有する緩衝液を用いると、等張液であっても細胞のダメージが特に小さく、また、遺伝子導入促進効果も高くなり、再現性も高まることが見出された。このような好ましい緩衝液では、カリウムイオン濃度が重要であり、緩衝液中のカリウムイオン濃度は、５０ｍＭないし１６０ｍＭ、好ましくは８０ｍＭないし１３０ｍＭである。特に、５０ｍＭないし１６０ｍＭ、好ましくは８０ｍＭないし１３０ｍＭのカリウムイオン、１０ｍＭないし１２０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭないし７０ｍＭのナトリウムイオン、１０ｍＭないし８０ｍＭ、好ましくは１５ｍＭないし３０ｍＭのリン酸イオン及び９０ｍＭないし１６０ｍＭ、好ましくは１１０ｍＭないし１４０ｍＭの塩素イオンを含む、カリウムリッチなリン酸緩衝液が好ましい。なお、このようなカリウムリッチな緩衝液は、等張液としても用いることができるし、上記の緩衝液を水で希釈して低張液として用いることもできる。水で希釈する場合、希釈倍率は１０倍以下が好ましい。また、浸透圧調節剤として用いられることがあるグルコースやショ糖のような単糖類や少糖類は、組成物を筋肉注射する場合、本発明の遺伝子導入促進効果を低減させるので用いないことが好ましい。
遺伝子導入用組成物中に含まれる組換えベクターは、遺伝子導入すべき所望の外来遺伝子を含み、遺伝子導入される動物の細胞中で前記外来遺伝子を発現することができるものであれば何ら限定されるものではなく、従来から遺伝子治療に用いられている、遺伝子発現用の発現ベクターに、導入すべき所望の外来遺伝子を挿入したものを用いることができる。遺伝子治療用の発現ベクターは、通常、大腸菌中での複製を可能にする複製開始点、ウイルス由来のプロモーター或いは標的組織での目的遺伝子発現に適したプロモーター、該プロモーターの下流に位置し、種々の制限酵素部位を含むマルチクローニングサイト、該マルチクローニングサイトの下流に位置するウイルス由来のターミネーター及び薬剤耐性、栄養要求性又は温度感受性等の選択マーカーを具備する。ベクターが細胞に導入されたか否かの調査を容易にするために、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子やルシフェラーゼ遺伝子を組み込み、これらの遺伝子を所望の外来遺伝子と共に発現させて、グリーン蛍光タンパク質やルシフェラーゼを産生させ、遺伝子導入細胞を容易に検出できるようにしているものもある。発現ベクターは、プラスミドベクターでも、レトロウイルスやアデノウイルスのようなウイルスベクターでもよいが、安全性の面からプラスミドベクターの方が好ましい。遺伝子治療に用いられる発現ベクター自体はこの分野において周知であり、種々のものが市販されており、市販のベクターをそのまま利用することができる。遺伝子導入用組成物中の組換えベクターの濃度は、特に限定されず、適宜選択されるが、通常、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ程度が好ましい。
本発明の遺伝子導入用組成物は、従来の遺伝子導入用組成物と同様に用いることができる。すなわち、これを筋肉注射及び皮下注射等により、生体に直接投与することができる。この場合、投与量は、特に限定されず、治療の目的や、導入効率等により適宜選択されるが、通常、生体の体重１ｋｇ当り１０μｌ〜１００μｌ程度である。また、本発明の遺伝子導入用組成物は、線維芽細胞やリンパ球に生体外で遺伝子導入する場合にも用いることができる。体外に取り出して遺伝導入するときに細胞に傷害を与えると、生体再移入したときに生着率が低下すると考えられるが、本発明の遺伝子導入促進剤を用いると細胞傷害性が少ないため、生着率が向上する。この場合の組成物の使用量も特に限定されず、適宜選択される。
本発明の遺伝子導入用組成物を生体に投与することにより、又は本発明の遺伝子導入用組成物を作用させて遺伝子導入した細胞を生体に移植することにより、生体に所望の外来遺伝子を導入することができる。所望の外来遺伝子としては、何ら限定されるものではなく、従来から知られているＩＬ−５、エリスロポエチン、プロインシュリン等の他、例えば、生物学製剤の置き換え（血友病Ａ対する第ＶＩＩＩ因子遺伝子、血友病Ｂに対する第ＩＸ因子遺伝子等）、
ＤＮＡワクチン（マラリア、結核、スギ花粉、種痘、ＨＢＶなどのウイルス感染等）等、体外遺伝子治療（体外に取り出した細胞に対して遺伝子導入して生体内に戻す治療、ＡＤＡ欠損症などの遺伝子治療等）、
動物に対するＤＮＡワクチン、例えば、
（猫）猫ＡＩＤＳ、ヘルペス、
（牛）牛白血病、牛下痢症候群ウイルス、
（馬）馬ヘルペス、
（豚）豚コレラ、
（犬）狂犬病、ジステンパー、パルボ、伝染性肝炎、など、
を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１    ＩＣＲマウスの前頸骨筋で増強型グリーン蛍光タンパク質を発現させた場合
増強型グリーン蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ：以下ＥＧＦＰと記載する）の発現プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ａｃｃｓｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ５５７６３、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より市販）を用い、骨格筋での遺伝子導入効率をＥＧＦＰ発現陽性筋線維数として蛍光顕微鏡下に観察した（この実施例ではＥＧＦＰ遺伝子が外来遺伝子）。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を大腸菌（ＸＬ−１Ｂｌｕｅコンピテント細胞）に導入し、カナマイシン含有ＬＢ寒天プレートに播種して３７℃で約１２時間培養した。このプレートより、単一の大腸菌のコロニーを選択し、この大腸菌をカナマイシン含有Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ培養液にて約２０時間振盪培養した。増殖した大腸菌よりアルカリ溶解法にてプラスミドを抽出し、２回のＣｓＣｌ２平均密度勾配遠心法により調製した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１は、終濃度４ｍｇ／ｍｌ以上の濃度になるようにＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ＝８．０）に溶解し遺伝子導入用試料とした。
遺伝子導入実験の骨格筋として、１）皮膚の直下にあり微小な皮膚切開により直視下に観察できること、２）骨格筋の収縮・弛緩による変位が少ないこと、３）筋肉注射が容易な厚みがあるなどの条件から、下肢外側前面にある前頸骨筋を選択した。筋肉注射用の試料の体積は、２０μｌで、遺伝子導入効率を改善するためにエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａと記載する）の５倍濃度溶液（ｐＨ＝８．０）を終濃度１，３，１０、３０ｍＭとなるように加えた。試料の組成は以下の通りである。
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１                        １０μｌ（４０μｇ、終濃度２ｍｇ／ｍｌ）
５倍濃度ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ＝８．０）  ４μｌ
４倍濃度リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）      ５μｌ
純水                                      １μｌ
筋肉注射用試料は、滅菌された１．５ｍｌチューブに入れ氷冷した。使用する直前に室温にもどし、２９ゲージ注射針の付いたインシュリン自己注射用シリンジ（２９Ｇ  ０．５ｍｌ  ｍｙｊｅｃｔｏｒ  ＳＳ−０５Ｍ２９１３、テルモ）に気泡が入らないように移し筋肉注射を施行した。
実験には、静岡実験動物（ＳＬＣ）より購入したＩＣＲマウス（オス、６週齢）を飼育し、７週齢から８週齢で用いた。麻酔には、３０ｍｇ／ｋｇ体重に相当する希釈したソムノペンチル（ペントバルビタール）を腹腔内に投与した。下肢を７０％アルコールにて消毒し、前頸骨筋の筋腹に相当する部分の皮膚に約３ｍｍ程度の切開を加えた。インシュリン自己注射用シリンジの２９ゲージ針を筋の走行に対して直角に挿入しプラスミド溶液を静かに注入した。しばらく注射針を前頸骨筋に挿入したままにして漏れを防いだ。注入後、数分経過してから皮膚を縫合した。注入後、４日目に動物を頸椎脱臼法によって屠殺した。下肢の皮膚を剥離し、前頸骨筋を摘出した。速やかに前頸骨筋試料を筋線維の走行に対して垂直方向に４分割しＯＣＴコンパウンドに包埋した後、液体窒素にて十分冷却したイソペンタン中で急速凍結した。定法に従い、前頸骨筋サンプルの連続凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡Ｂ２−Ａフィルターを使用）を用いて、骨格筋内で発現しているＥＧＦＰに特異的な蛍光を観察した。
その結果、３ｍＭ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａをプラスミド試料に加えた場合、ＥＧＦＰを強く発現する骨格筋線維数がダルベッコ変法リン酸緩衝液（１ｘｄＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）を用いた場合に比較して１０倍以上に増加した（図１）。更に、ＥＤＴＡによる遺伝子導入効率の改善は、等モル量のカルシウムやマグネシウムイオンを加えることにより観察されなくなった（図２）。したがって、ＥＤＴＡによる２価陽イオンに対するキレート作用が遺伝子導入効率の改善に必要であると考えられた。
ＥＤＴＡに代えて、分子構造の異なるキレート物質であるＥＧＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ−ＯＨ、ＥＤＤＰ又はＨＤＴＡを用いて上記実験を行ったところ、これらのキレート化剤を用いた場合でもＥＤＴＡと同様な効果があることが確認された。もっとも、ＥＧＴＡなどを用いた場合は、骨格筋組織へのダメージが観察されたので、このような組織傷害性が全く観察されないＥＤＴＡが最も好ましい。
実施例２    ＩＣＲマウスの前頸骨筋でルシフェラーゼを発現させた場合
ｐＧＬ３ｂａｓｉｃプラスミド（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ４７２９５）より１．７ｋｂのルシフェラーゼ遺伝子断片（５３−１７４２）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌ消化により切り出した。この遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌで消化した発現ベクターｐＣＲ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。結合反応産物を用いて大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅを形質転換し、アンピシリン添加寒天培地にて選択した。３７℃で約１２時間培養し、培地上に形成されたアンピシリン耐性コロニーを複数１ｍｌのＬＢ液体培地に播種しプラスミドＤＮＡを定法に従い少量調製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａｌ消化後、アガロース電気泳動法により１．７ｋｂの遺伝子断片を含む組み換えプラスミドを選別し、さらにベクター特異的なプライマーＧＬｐｒｉｍｅｒ２（ｃｔｔｔａｔｇｔｔｔｔｔｇｇｃｇｔｃｔｔｃｃ）とルシフェラーゼプライマーｌｕｃＡ（ｔｃｇｔｃａｔｃｇｃｔｇａａｔａｃａｔｇ）によるＰＣＲ法によりルシフェラーゼ発現プラスミドｐＣＭＶｌｕｃを含むクローンを選択した。選択した大腸菌クローンをアンピシリン含有Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ培養液にて約２０時間振盪培養した。増殖した大腸菌よりアルカリ溶解法にてプラスミドを抽出し、２回のＣｓＣｌ２平均密度勾配遠心法により調製した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１は、終濃度４ｍｇ／ｍｌ以上の濃度になるようにＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ＝８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ＝８．０）に溶解し遺伝子導入用試料とした。
実施例１と同様に、静岡実験動物（ＳＬＣ）より購入したＩＣＲマウス下肢の前頸骨筋に対して遺伝子の導入を行った。ＥＤＴＡ−２Ｎａの５倍濃度溶液（ｐＨ＝８．０）を終濃度１０ｍＭとなるように加えた。試料の組成は以下の通りである。
ｐＣＭＶｌｕｃ                          １０μｌ（４０μｇ、終濃度２ｍｇ／ｍｌ）
５０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ＝８．０）４μｌ
純水                                      ６μｌ
筋肉注射用試料は、滅菌された１．５ｍｌチューブに入れ氷冷した。使用する直前に室温にもどし、２９ゲージ注射針の付いたインシュリン自己注射用シリンジ（２９Ｇ  ０．５ｍｌ  ｍｙｊｅｃｔｏｒ  ＳＳ−０５Ｍ２９１３、テルモ）に気泡が入らないように移し筋肉注射を施行した。
注入後、３日目に動物を頸椎脱臼法によって屠殺した。下肢の皮膚を剥離し、前頸骨筋を摘出し、凍結した。凍結した骨格筋を粉砕し、抽出バッファー１００ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ＝７．８、１ｍＭジチオスレイトール添加）を骨格筋質重量の２倍加え懸濁した。室温にて攪拌後、凍結融解を３回繰り返し、１５０００回転５分間の遠心分離後に上清を骨格筋抽出液として回収した。
タンパク質の定量には、ブラッドフォード法に基づくキット（ＢｉｏＲａｄ社製）を使用した。ルシフェラーゼ活性の検出には、プロメガ社製のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いた。あらかじめ、ガラスバイアル中に５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬を分注し、ルミノメーター（ＢＬＲ−３０１，アロカ社製）に入れ、攪拌しながら１０μｌの骨格筋抽出液を加えた。発光を１５秒間積算し、サンプル間の比較にはタンパク量で補正した値を用いた。
その結果、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を発現させた実施例１と同様に、３ｍＭから１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａをプラスミド試料に加えた場合にルシフェラーゼ活性が１０倍高くなった。ｄＰＢＳを加えない低張液を用いると、更に、ルシフェラーゼの発現量が３倍程度高くなることが分かった（図３）。
【実施例３】  媒体として、下記表１に示す組成を有する、細胞内液のイオンバランスを有する、カリウムリッチな緩衝液（以下、「Ｋ−ＰＢＳ」）又は下記の組成を有するｄＰＢＳを用いたことを除き、実施例１と同様な実験を行なった。なお、遺伝子導入用組成物中のＥＤＴＡ−２Ｎａ濃度は３ｍＭとした。
Ｋ−ＰＢＳの調製は具体的には次のように行なった。ＫＣｌ粉末を終濃度で１２０ｍＭとなるように秤量した。次に、０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４と０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を混和し、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を調製した。秤量したＫＣｌを適当量の蒸留水に溶解し、リン酸ナトリウム緩衝液を終濃度２５ｍＭになるように加えてから、正確に体積を合わせ、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液とした。
2004075924.tif 000003
その結果、蛍光顕微鏡を用いた観察により、ＥＧＦＰ発現筋線維数は、Ｋ−ＰＢＳを用いた場合の方がｄＰＢＳを用いた場合よりも明らかにＥＧＦＰ発現筋線維数が多く、媒体としてＫ−ＰＢＳを用いることにより遺伝子導入効率が高まることが確認された。
また、筋細胞の細胞膜の損傷（透過性亢進）を調べるために、上記遺伝子導入用組成物を投与した１時間後に０．１％エバンスブルー（色素）溶液１００μｌを尾静脈より注射した。色素投与１時間後に前頸骨筋を採取し、定法にしたがい凍結組織切片を作製した。筋線維に取り込まれた色素は、蛍光顕微鏡（Ｇフィルター）を用いて観察した。
その結果、エバンスブルーの取り込み（細胞膜の損傷の程度を表す）は、Ｋ−ＰＢＳを用いた場合の方が明らかに少なく、Ｋ−ＰＢＳを用いることにより細胞膜の損傷がさらに少なくなることがわかった。さらに、Ｋ−ＰＢＳとＰＢＳの２：１、１：１及び１：２混合物を媒体として用いて同様な実験を行なったところ、色素の取り込みは、Ｋ−ＰＢＳの濃度依存的に変化した。このことから、Ｋ−ＰＢＳを媒体として用いることにより、筋細胞膜の損傷をさらに少なくできることが明らかになった。なお、ＰＢＳを用いた場合でも、筋細胞膜の損傷は時間の経過と共に減少した。
【産業上の利用可能性】  本発明のにより、遺伝子導入促進剤は、細胞や組織に大きなダメージを与えることなく、遺伝子導入の効率を高めることができる。本発明の遺伝子導入促進剤の存在下に遺伝子導入を行うことにより、細胞や組織に大きなダメージを与えることなく細胞への遺伝子導入効率を向上させることができるので、本発明は、遺伝子治療の効率を高めることができ、遺伝子治療に有用な遺伝子導入用組成物を提供するものである。
【配列表】
2004075924.tif 000004
【図１】
2004075924.tif 000005
【図２】
2004075924.tif 000006
【図３】
2004075924.tif 000007
【国際調査報告】
2004075924.tif 000008
2004075924.tif 000009
2004075924.tif 000010
2004075924.tif 000011
2004075924.tif 000012
2004075924.tif 000013
2004075924.tif 000014
2004075924.tif 000015
2004075924.tif 000016
2004075924.tif 000017