(57)【要約】この発明は、上記の事情に鑑みて成されたものであり、その目的は、レシピエントへの組織移植後の拒絶反応を抑制できる薬剤及び治療方法を提供することにある。この目的を達成するため、この薬剤は、哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するための薬剤であって、前記移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御するのに有効な量の成分を含有するものであることを特徴とする。
2004054618.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するための薬剤であって、前記移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御するのに有効な量の成分を含有することを特徴とする薬剤。
【請求項２】
請求項１記載の薬剤において、
前記製剤は、哺乳動物に移植後の膵島のグラフト障害を防止するための糖尿病治療用薬剤であることを特徴とする薬剤。
【請求項３】
請求項１記載の薬剤において、
前記成分は、前記移植後にナチュラルキラーＴ細胞から分泌されるインターフェロン−γの作用を制御するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体であることを特徴とする薬剤。
【請求項４】
請求項３記載の薬剤において、
前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体であることを特徴とする薬剤。
【請求項５】
哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するための薬剤の開発方法であって、
前記薬剤は前記移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御する成分を含むものであり、
前記哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するのに有効な前記成分の投与量、形態及び方法を決定する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、
前記組織は膵島であり、
前記工程は、
（ａ）前記膵島を哺乳動物内に移植する工程と、
（ｂ）移植後の膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体を前記有効成分として含む薬剤を用意する工程と、
（ｃ）前記薬剤を所定の周期で前記哺乳動物に投与してモニターする工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５記載の方法において、
前記成分は、前記移植後にナチュラルキラーＴ細胞から分泌されるインターフェロン−γの作用を制御するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、
前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体であることを特徴とする方法。
【請求項９】
哺乳動物に移植された膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な方法であって、
（ａ）組織を哺乳動物内に移植する工程と、
（ｂ）移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御するのに有効な量の成分を含有する薬剤を用意する工程と、
（ｃ）前記哺乳動物に治療上有効な量の前記薬剤を投与する工程とを含む方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、
この方法は糖尿病の治療方法であり、
前記薬剤は、移植後の膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体を有効成分として含む薬剤であることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、
前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、
前記薬剤の１回目の投与は、移植直後であることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０記載の方法において、
前記薬剤の投与は、経口投与、腹腔内投与又は静脈内投与であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この発明は、レシピエントへの組織移植後の拒絶反応を抑制できる薬剤及び治療方法に関し、さらに詳しくは、糖尿病の治療において、膵島移植後に発生するグラフト障害を抑制できる薬剤及び治療方法に関するものである。
【背景技術】  近年、欧米に於いて糖尿病の治療手段として膵ランゲルハンス氏島（膵島）移植の臨床応用が開始された。インスリン投与による治療ではなくインスリン産生細胞を移植しようとする試みである。臨床膵島移植の実際の手技は局所麻酔下、超音波ガイド下経皮経肝的に門脈を穿刺しカテーテルを留置、同部よりドナー膵島を肝内に移植する。膵島グラフトは門脈末端に生着、インスリンを分泌し血糖値を調節する。膵島移植が成功した場合糖尿病レシピエントは正常血糖となりインスリン治療が不要となる。しかしながら現在までに臨床膵島移植の成功例は限定され、しかも一人のレシピエントに対し２−３人の膵臓より単離された膵島が移植されているのが現状である。すなわち、移植直後膵島機能障害が発現し、グラフト生着率が低下、一人から一人への移植では十分ではなく２−３人のドナーから一人への移植が行われている。一説には移植グラフトの２０−３０％のみしか生着しないといわれている。この機能障害の詳細は未解明で臨床膵島移植の成績向上にとっては極めて重要な課題となっている。この問題が解決しグラフト生着率を改善する方法が見出されれば一人のドナーから一人のレシピエントへ、更には一人から二人以上への膵島移植が実現する可能性がある。
この発明は、上記の事情に鑑みて成されたものであり、その目的は、レシピエントへの組織移植後の拒絶反応を抑制できる薬剤及び治療方法を提供することにある。
さらに詳しくは、糖尿病の治療において、膵島移植後に発生するグラフト障害の原因を明らかにし、それを抑制できる薬剤及び治療方法を提供することにある。
【発明の開示】
上記課題を解決するべく、本発明の発明者らは膵島移植後のグラフト障害にナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が重要な役割を演じているのではないかとの仮説を立て、ＮＫＴ細胞欠損マウスを膵島移植のレシピエントに使用し実験を進めた。その結果、ＮＫＴ細胞が移植後の膵島グラフト障害に必須の役割を演じていることを見出した。さらにその効果はインターフェロン−γを介して発現していることが明らかとなった。
本発明の第１の主要な観点によれば、哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するための薬剤であって、前記移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御するのに有効な量の成分を含有することを特徴とする薬剤が提供される。
この発明の一実施形態によれば、前記製剤は、哺乳動物に移植後の膵島のグラフト障害を防止するための糖尿病治療用薬剤である。
この発明の別の一実施形態によれば、前記成分は、前記移植後にナチュラルキラーＴ細胞から分泌されるインターフェロン−γの作用を制御するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体である。前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体であることが好ましい。
また、この発明の第２の側面によれば、哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するための薬剤の開発方法であって、前記薬剤は前記移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御する成分を含むものであり、前記哺乳動物に移植された組織の移植拒絶を阻害するのに有効な前記成分の投与量、形態及び方法を決定する工程を含むことを特徴とする方法が提供される。
この発明の一の実施形態によれば、前記組織は膵島であり、前記工程は、（ａ）前記膵島を哺乳動物内に移植する工程と、（ｂ）移植後の膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体を前記有効成分として含む薬剤を用意する工程と、（ｃ）前記薬剤を所定の周期で前記哺乳動物に投与してモニターする工程とを含む。
この発明の別の一の実施形態によれば、前記成分は、前記移植後にナチュラルキラーＴ細胞から分泌されるインターフェロン−γの作用を制御するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体である。前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体であることが好ましい。
この発明の第３の主要な観点によれば、哺乳動物に移植された膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な方法であって、（ａ）組織を哺乳動物内に移植する工程と、（ｂ）移植後の哺乳動物内でのナチュラルキラーＴ細胞の作用を制御するのに有効な量の成分を含有する薬剤を用意する工程と、（ｃ）前記哺乳動物に治療上有効な量の前記薬剤を投与する工程とを含む方法が提供される。
この発明の一実施形態によれば、この方法は糖尿病の治療方法であり、前記薬剤は、移植後の膵島のグラフト障害を阻害するのに有効な量の抗インターフェロン−γ抗体を有効成分として含む薬剤である。また、前記哺乳動物がヒトの場合、前記抗インターフェロン−γ抗体はヒトリコンビナント抗体である。前記薬剤の１回目の投与は、移植直後であることが好ましい。前記薬剤の投与は、経口投与、腹腔内投与又は静脈内投与であることが望ましい。
この発明のその他の側面、特徴及び効果は、以下に説明する本発明の実施形態及び添付図面から当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】  図１は、単離膵島の移植を受けたストレプトゾトシン糖尿病マウスの血糖値の推移（本発明による治療なし）を示すものであり、図１ａは２００個の膵島を肝内に移植した場合、図１ｂは４００個の膵島を肝内に移植した場合の例である。
図２は、２００個の単離膵島の移植を受けたＳＴＺ糖尿病マウスの血糖値の推移を示すものである。図２ａは比較例として示した図１ａのグラフを示した。図２ｂは２００個の単離膵島の移植を受けたＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ欠損マウスの血糖値の推移を示した。図２ｃは２００個の単離膵島の移植を受けたＳＴＺ糖尿病野生型マウスに抗インターフェロン−γ抗体を投与した場合の血糖値の推移を示すもの、図２ｄは対照抗体（ｒａｔＩｇＧ１ｋ）を投与した場合の血糖値の推移を示した。
図３は、単離膵島の移植を受けたＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスの血糖値の推移を示すものであり、図３ａ及び図３ｂは比較例として示したもので、それぞれ図２ａ及び図２ｂと同じグラフ、図３ｃは膵島肝内移植と同時に野生型マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移入した場合、図３ｄは、ＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移入した場合、図３ｅは、インターフェロン−γ欠損マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移入した場合の例である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、この発明の実施の形態につき図面を参照して説明する。
この発明は、膵島移植後のグラフト障害におけるＮＫＴ細胞の役割の検証をヒトと解剖学的構造上及び生理学上類似する哺乳類モデルで検証することにより、前記グラフト障害の抑制におけるＮＫＴ細胞を制御する薬剤の適用性を見出したものである。
インスリン依存糖尿病の成因は血糖降下ホルモンであるインスリン産生細胞（膵島β細胞）が免疫学的機序により選択的に破壊されることによるもので、その結果発症後に高血糖となり、さまざまな障害を招来することが知られている。従来までの治療法は不足するインスリン製剤を投与（注射）し、高血糖を是正しようとするものであった。しかし、インスリンによる治療では厳密な血糖管理は困難で時に結果的に過剰投与になり、生命に危険な低血糖となることがある。また、糖尿病では発症後に糖尿病血管合併症（網膜症、腎症、神経症など）が進展し、従来の治療法（インスリン注射を含め）ではその進展を阻止できず、治療上重要な課題になっている。生理的には主として膵島β細胞による調節機構により血糖は制御されるが、インスリン依存糖尿病ではその欠落により血糖値の乱高下を招き、上記臨床症状の原因となる。
本発明に関係する膵島移植はインスリン依存糖尿病の治療としてインスリン投与ではなく、血糖制御機能を有するインスリン産生細胞を移植するもので、移稙が成功すると低血糖発作が消失し、インスリン注射が不要になり、血管合併症の改善が期待できる治療法である。１９９０年に臨床応用が開始され、一定程度の成果が得られている。現在の最も重要な課題は一人の移植を成功させるために２−３人分のドナー膵臓を必要とすることである。すなわち一人のドナー膵臓より単離した膵島の移植のみでは成功が得られていない。言い換えれば如何に少ないドナー膵島で移植を成功させられかということになる。この問題の解決法を見出せば、一人のドナーより一人、更には二人以上へのレシピエントへの膵島移植が実施できるようになり、画期的な発明となる。
本発明者らは膵島移植のこの問題の解決策として移植後膵島グラフト障害に着目、そのメカニズムを明らかにし、本発明の制御法を見出した。本発明のポイントはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が（肝臓内）移植後膵島グラフト障害の主因であるという知見であり、そのことをＮＫＴ細胞欠損マウスを用いた実験で明らかにした。今回のデータはマウスで得られているが、ヒトＮＫＴ細胞の性状はインターフェロン分泌能を含めマウスと同様であることが判明しており、膵島グラフト障害に対する抗インターフェロン−γの効果も同様であると考えられる。マウスでは抗マウス抗体、ヒトではヒトリコンビナント抗体を使用するのが妥当である。
下記の実施例によれば、糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスへの膵島移植ではレシピエントの移植後血糖値は正常になるが糖尿病の野生型マウスへの移植では血糖は是正されない。ＮＫＴ細胞欠損マウスへの膵島移植時に野生型またはＮＫＴ細胞欠損マウスの肝臓単核球を肝臓内に移入すると後者でのみ移植後高血糖は是正された。またインターフェロン−γ欠損マウスの肝単画球の移入ではＮＫＴ細胞欠損マウスと同様の結果が得られた。野生型肝単核球はＮＫＴ細胞を豊富に含有する。これらの知見はＮＫＴ細胞がグラフト障害に必須の役割を担っていることを示している。更にＮＫＴ細胞は活性化されるとインターフェロン−γを分泌することが知られているが、ＮＫＴ細胞による膵島グラフト障害はＮＫＴ細胞より分泌されるインターフェロン−γを介した作用であることが判明した。この知見は抗インターフェロン−γ抗体の投与により移植後膵島グラフト障害が制御できることを示した下記の実施形態のデータから明らかである。
すなわち、本発明の主題は、移植後膵島グラフト障害を抑制するために、移植後にＮＫＴ細胞を制御するものであり、本実施形態では、ＮＫＴ細胞から分泌されたインターフェロン−γの作用を制御するために抗インターフェロン−γ抗体を含む薬剤を投与している。しかし、インターフェロン−γに限定されるものではなく、ＮＫＴ細胞を介して作用を発現するものはすべて対象になると考えられる。
【実施例】  既に知られているように、ストレプトゾトシン糖尿病マウスの高血糖を正常化するには一定以上の膵島、例えば４００個の膵島移植が必要である。図１はこのことを示したグラフである。
ここでは、雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２２−２５ｇ）にストレプトゾトシン（ＳＴＺ、１８０ｍｇ／ｋｇ）を静注し糖尿病状態とした。その３−５日後、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２５−３０ｇ）の単離膵島を糖尿病マウスの経門脈的肝内に移植した。膵島はドナー膵臓よりコラゲナーゼ法により単離した。移植前後週３回無麻酔下に眼窩静脈叢より採血しグルコースアナライザー（ベックマン）にて非空腹時血糖を測定した。又移植後６０日目にレシピエントに糖負荷試験（腹腔内グルコース０．５ｇ／ｋｇ投与）を施行した。
ドナー膵島数が４００個の場合、図１に示すように、移植後にレシピエントの血糖値は１０日以内に全て（ｎ＝５）正常血糖（２００ｍｇ／ｄｌ以下）となった。
一方、ドナー膵島数が２００個の場合、全てのマウス（ｎ＝１０）は移植後６０日以上高血糖（４００ｍｇ／ｄｌ以上）で推移した。すなわち、ドナー膵島２００個の移植で生着する膵島グラフトでは高血糖を是正出来ないことが分かる。
これに対して、ＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスでは２００個のドナー膵島で移植後に血糖値は正常化する。図２ａ〜図２ｂはこの実験結果を示したものである。
ここでは、上記と同様の実験をＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｊα２８１−／−）をレシピエントに用いて行い、ＮＫＴ細胞の役割を検討した。２００個の膵島をＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスの肝内に移植した。これによれば、図２ｂに示すように、全てのレシピエント（ｎ＝５）は移植後７日以内に正常血糖となった。すなわち、ＮＫＴ細胞の非存在下では移植後の膵島生着率が有意に改善することが明らかになった。
なお、図２ａは、図１で示したストレプトゾトシン糖尿病野生型マウスの実験結果であり、本発明の実施例との比較のために提示したものである。
以上の知見はＮＫＴ細胞が肝内移植膵島グラフト非特異的障害に必須の役割を果たしていることを示している。
次に、抗インターフェロン−γ抗体投与により２００個の膵島でＳＴＺ糖尿病野生型マウスの血糖値は移植後正常化することを示す。
ＮＫＴ細胞は活性化すると大量のインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）を分泌する事が知られている。従って上記で示されたＮＫＴ細胞欠損マウスに於ける膵島グラフトの生着率改善効果にＩＮＦ−γが関与しているかどうかを明らかにするために抗ＩＮＦ−γ抗体を移植時にレシピエントに投与して同様の実験を行なった。ここでは、抗ＩＮＦ−γ抗体は、ｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ１６−７３１２）（ｃｌｏｎｅ  Ｒ４−６Ａ２）を使用した。
図２ｃに示すように、２００個の膵島を移植し抗ＩＮＦ−γ抗体（１００μｇ）を１日１回、計３回（ｄａｙ  ０、２、４）腹腔内投与した野生型ＳＴＺ糖尿病マウスの血糖値は４／５が移植後正常化した。また図２ｄに示すように、対照抗体（ｒａｔＩｇＧ１ｋ）を投与したマウス（ｎ＝４）ではドナー膵島２００個の移植では血糖値は移植後正常化せず高血糖で推移した。
図３ａ〜ｄは、別の実験例を示したものである。
まず、図３ａ及び図３ｂは、上記図２ａ及び図２ｂと同じ実験結果であり、比較のために示したものである。これより、すなわち、ＮＫＴ細胞の非存在下では移植後の膵島生着率が有意に改善することが明らかである。
図３ｃは、ＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｊα２８１−／−）に２００個の膵島を肝内に移植し、野生型マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移植時に肝内に移入した例である。細胞移入された糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウス（ｎ＝３）の血糖は移植後正常化せず高血糖で推移した。
また、図３ｄは、ＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスに２００個の膵島を肝内に移植し、ＳＴＺ糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移植時に肝内に移入した例、図３ｅはインターフェロン−γ欠損マウスの肝単核球（５ｘ１０６）を移植時に肝内に移入した例である。いずれも、細胞移入された糖尿病ＮＫＴ細胞欠損マウス（ｎ＝３）の血糖は移植後正常化した。
以上の知見はＮＫＴ細胞から分泌されるインターフェロン−γが肝内移植膵島グラフトに発現する非特異的障害に必須の役割を果たしていることを示している。
【図１】
2004054618.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2004054618.tif 000007
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