(57)【要約】  Ｆｌｔ３の機能を調節する手段を提供すること。ヒトＦｌｔ３の機能を抑制するための組成物、該組成物を用いたアポトーシス誘発方法、該方法のためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物。
【請求項２】
下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物。
【請求項３】
１５〜２５塩基の鎖長を有する核酸を含有してなる、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応するＲＮＡ配列を含有してなる、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項５】
配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選択された核酸を含有してなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物。
【請求項７】
下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内でＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物。
【請求項８】
該核酸が、標的領域の１５〜２５塩基の塩基配列を有する、請求項６又は７記載の組成物。
【請求項９】
配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応し、かつ該塩基配列に対応するＲＮＡを発現しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、請求項６又は７記載の組成物。
【請求項１０】
該核酸が、配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有してなる、請求項６〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有するベクターを含有してなる、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
該プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群より選択されたプロモーターである、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選択されたベクターを基本骨格として含有してなる、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物により、ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、アポトーシス誘発方法。
【請求項１５】
キナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時に或いはいずれか一方の使用後に他方を使用し、ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物を含有してなる、請求項１４又は１５記載の方法を行なうためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＦｌｔ３の機能を抑制するための組成物、該組成物を用いたアポトーシス誘発方法、該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病の遺伝子治療は、長年にわたって研究されている（例えば、非特許文献１又は２参照）。そして、現実に臨床研究も開始されている（例えば、非特許文献３又は４参照）。さらに、アンチセンス技術やリボザイム技術を用いたＲＮＡベースの治療技術も開発されつつある（例えば、非特許文献５参照）。【０００３】
一方、１９９８年に報告された線虫におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的なｍＲＮＡ分解が生じることによる遺伝子発現の抑制現象として注目されている（例えば、非特許文献６参照）。前記ＲＮＡ干渉は、長鎖２本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩタイプの活性によりｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡに分解され、続いて、該ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるリボ核酸タンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡにＡＴＰ依存的に結合し、標的ＲＮＡを分解するというメカニズムにより起こると考えられている（例えば、非特許文献７〜１２参照）。その後、哺乳動物細胞でもＲＮＡ干渉を応用して遺伝子発現を抑制することが可能であることが報告されており（例えば、非特許文献１３又は１４参照）、白血病に特有なＢＣＲ−ＡＢＬやＡＭＬ１−ＭＴＧ８といったキメラｍＲＮＡの発現を抑制するＲＮＡ干渉剤が報告されている（例えば、非特許文献１５又は１６参照）。【０００４】
一方、白血病細胞では、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病、ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病、ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ＣＭＬ（慢性骨髄性白血病、ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｕｅｋｅｍｉａ）等の７０〜１００％で正常骨髄細胞に比べ１０００〜１００００倍というＦｌｔ３の高発現が観察されることが報告されている（例えば、非特許文献１７参照）。さらに、Ｆｌｔ３の膜貫通部直下をコードする膜近傍領域に縦列重複変異（Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異、ＩＴＤ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が発見され、ＡＭＬの２０〜３０％、ＡＰＬ（急性前骨髄球性白血病、ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、現在のＦＡＢ分類においてはＡＭＬ：Ｍ３と称する）の２０％、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群、ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の５％に検出され、病態や予後不良の独立した因子である可能性が示唆されている（例えば、特許文献１又は非特許文献１８〜２１参照）。Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異が存在する場合はリガンド非依存性のキナーゼ活性化がおこっている。かかるＦｌｔ３のキナーゼ活性を阻害する低分子化合物として、例えば、ＣＥＰ−７０１（例えば、非特許文献２２参照）、ＳＵ１１２４８（例えば、非特許文献２３参照）、ＳＵ５４１６（例えば、非特許文献２４参照）、ＡＧ１２９５（例えば、非特許文献２５参照）等が研究されているが、医薬品として有効な化合物は未だ得られていないのが現状である。
【特許文献１】国際公開第００／１１４７０号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｏｌｔ  Ｊ．  Ｔ．、他２名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８巻、第２号、９６３〜９７３頁（１９８８年）
【非特許文献２】Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ  Ｔ．、Ｒｅａｄ  Ｍ．  Ｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第３巻、第８号、１１６〜１２４頁（２００１年）
【非特許文献３】Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ  Ｓ．、他６名、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第９巻、第１５号、２２４３〜２２５１頁（１９９８年）
【非特許文献４】Ｗｉｅｒｄａ  Ｗ．  Ｇ．、Ｋｉｐｐｓ  Ｔ．  Ｊ．、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第２７巻、第５号、５０２〜５１１頁（２０００年）
【非特許文献５】Ｇｅｗｉｒｔｚ  Ａ．  Ｍ．、他２名、Ｂｌｏｏｄ、第９２巻、第３号、７１２〜７３６頁（１９９８年）
【非特許文献６】Ｆｉｒｅ  Ａ．、他５名、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、第８０６〜８１１頁（１９９８年）
【非特許文献７】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．、他３名、Ｎａｔｕｒｅ、第４０９巻、第６８１８号、３６３〜３６６頁（２００１年）
【非特許文献８】Ｔｕｓｃｈｌｔ．、他４名、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１３巻、第２４号、３１９１〜３１９７頁（１９９９年）
【非特許文献９】Ｚａｍｏｒｅ  Ｐ．  Ｄ．、他３名、Ｃｅｌｌ、第１０１巻、第１号、２５〜３３頁（２０００年）
【非特許文献１０】Ｎｙｋａｎｅｎ  Ａ．、他２名、Ｃｅｌｌ、第１０７巻、第３号、３０９〜３２１頁（２００１年）
【非特許文献１１】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．  Ｍ．、他２名、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１５巻、第２号、１８８〜２００頁（２００１年）
【非特許文献１２】Ｌｉｐａｒｄｉ  Ｃ．、他２名、Ｃｅｌｌ、第１０７巻、第３号、２９７〜３０７頁（２００１年）
【非特許文献１３】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  Ｓ．  Ｍ．、他５名、Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、第６８３６号、第４９４〜４９８頁（２００１年）
【非特許文献１４】Ｃａｐｌｅｎ  Ｎ．  Ｊ．、他４名、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９８巻、第１７号、９７４２〜９７４７頁（２００１年）
【非特許文献１５】Ｗｉｌｄａ  Ｍ．、他３名、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第２１巻、３７号、５７１６〜５７２４頁（２００２年）
【非特許文献１６】Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ  Ｏ．、他７名、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、第８号、３１５７〜３１６３頁（２００３年）
【非特許文献１７】Ｄｒｅｘｌｅｒ  Ｈ．  Ｇ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１０巻、第４号、５８８〜５９９頁（１９９６年）
【非特許文献１８】Ｎａｋａｏ  Ｍ．、他８名、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１０巻、第２１号、１９１１〜１９１８頁（１９９６年）
【非特許文献１９】Ｙｏｋｏｔａ  Ｓ．、他１０名、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１１巻、第１０号、１６０５〜１６０９頁（１９９７年）
【非特許文献２０】Ｋｉｙｏｉ  Ｈ．、他１９名、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、第１１巻、９号、１４４７〜１４５２頁（１９９７年）
【非特許文献２１】Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  Ｄ．  Ｇ．、Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｊ．  Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ、第１００巻、第５号、１５３２〜１５４２頁（２００２年）
【非特許文献２２】Ｌｅｖｉｓ  Ｍ．、他９名、Ｂｌｏｏｄ、第９９巻、第１１号、３８８５〜３８９１頁（２００２年）
【非特許文献２３】Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ  Ａ．  Ｍ．、他１４名、Ｂｌｏｏｄ、第１０１巻、第９号、３５９７〜３６０５頁（２００３年）
【非特許文献２４】Ｇｉｌｅｓ  Ｆ．  Ｊ．、他１６名、Ｂｌｏｏｄ、第１０２巻、第３号、７９５〜８０１頁（２００３年）
【非特許文献２５】Ｌｅｖｉｓ  Ｍ．、他４名、Ｂｌｏｏｄ、第９８巻、第３号、８８５〜８８７頁（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の１つの側面は、Ｆｌｔ３の機能を抑制すること、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、Ｆｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること、Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制すること、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、Ｆｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること等の少なくとも１つを達成しうる、組成物を提供することにある。【０００６】
また、本発明の他の側面は、前記組成物による効果を発揮させること、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞において、前記組成物中のＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を発現させること、前記細胞において、Ｆｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること、Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制すること、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、Ｆｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること等の少なくとも１つを達成しうる、組成物を提供することにある。【０００７】
また、本発明のさらに他の側面は、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること等の少なくとも１つを達成しうる、アポトーシス誘発方法を提供することにある。【０００８】
さらに、本発明の別の側面は、前記アポトーシス誘発方法を効率よく行なうこと、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること等の少なくとも１つを達成しうる、前記方法のための組成物及びキットを提供することにある。なお、本発明の他の概念、目的等は、本明細書の記載からも明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、第１の側面では、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有した組成物に関する。【００１０】
本発明は、第２の側面では、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物に関する。本発明の組成物においては、好ましくは、１５〜２５塩基の鎖長を有する核酸であることが望ましい。特に限定されないが、例えば、配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応するＲＮＡ配列を含有するもの等が挙げられる。さらに、本発明の組成物としては、例えば、配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、及び配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸との組み合わせ、を含有するもの等が挙げられる。【００１１】
本発明は、第３の側面では、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。【００１２】
本発明は、第４の側面では、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内でＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物に関する。本発明の組成物中のベクターにおいて、プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等のプロモーターを含有していてもよい。また、該ベクターにおいては、特に限定されないが、例えば、前記プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター等であることが望ましい。さらに、該ベクターには、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選択されたベクターを基本骨格として好適に使用できる。【００１３】
本発明は、第５の側面では、本発明の組成物により、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、アポトーシス誘発方法に関する。本発明のアポトーシス誘発方法においては、キナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時にあるいはいずれか一方の使用後に他方を使用し、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発してもよい。【００１４】
本発明の第１〜第５の側面において、本発明の組成物は、前記アポトーシス誘発を効率よく行なうこと、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること等のための組成物でもある。【００１５】
本発明は、第６の側面では、本発明の組成物を含有したキットに関する。かかるキットは、前記アポトーシス誘発を効率よく行なうこと、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること等のためのキットとしても用いうる。【００１６】
すなわち、本発明の要旨は、
［１］  ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物、
［２］  下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物、
［３］  １５〜２５塩基の鎖長を有する核酸を含有してなる、前記［１］又は［２］記載の組成物、
［４］  配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応するＲＮＡ配列を含有してなる、前記［１］又は［２］記載の組成物、
［５］  配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選択された核酸を含有してなる、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物、
［６］  ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物、
［７］  下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内でＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物、
［８］  該核酸が、標的領域の１５〜２５塩基の塩基配列を有する、前記［６］又は［７］記載の組成物、
［９］  配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応し、かつ該塩基配列に対応するＲＮＡを発現しうる核酸を保持したベクターを含有してなる、前記［６］又は［７］記載の組成物、
［１０］  該核酸が、配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有してなる、前記［６］〜［９］のいずれか１項に記載の組成物、
［１１］  プロモーターとして、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有するベクターを含有してなる、前記［６］〜［１０］のいずれか１項に記載の組成物、
［１２］  該プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター及びＣＭＶプロモーターからなる群より選択されたプロモーターである、前記［１１］記載の組成物、
［１３］  アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから選択されたベクターを基本骨格として含有してなる、前記［６］〜［１２］のいずれか１項に記載の組成物、
［１４］  前記［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組成物により、ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、アポトーシス誘発方法、
［１５］  キナーゼを阻害する薬剤をさらに用いて、同時にあるいはいずれか一方の使用後に他方を使用し、ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該ＦＬＴ３高発現細胞及び／又はＦＬＴ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、前記［１４］記載の方法、並びに
［１６］  前記［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組成物を含有してなる、前記［１４］又は［１５］記載の方法を行なうためのキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、従来のアンチセンス技術やリボザイム技術とは異なる、Ｆｌｔ３の機能の抑制に使用できる組成物が提供される。本発明により、前記組成物として化学合成された核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）ならびにその誘導体を含有する組成物、又は当該核酸を細胞内で発現するように構築されたベクターを含有する組成物が提供される。また、本発明の組成物を利用したＦｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する細胞で選択的に又は優先的にＦｌｔ３の機能を抑制する方法、例えば、アポトーシス誘発方法、該方法のためのキットが提供される。本発明の組成物によれば、Ｆｌｔ３の機能をダウンレギュレーションし、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること、あるいはＦｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の組成物によれば、前記Ｆｌｔ３の機能を抑制する効果を発揮させ、前記細胞において、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を発現させ、前記細胞において、例えば、ＲＮＡ干渉を生じさせ、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制すること、Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制することあるいはＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のアポトーシス誘発方法によれば、前記細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のキットによれば、前記アポトーシス誘発方法を効率よく行なうことができ、前記細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させることができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｓｉＲＮＡ及びキナーゼ阻害剤の併用による、細胞増殖活性の変化に関する図である。
【図２】ｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いた細胞増殖抑制に関する図である。
【図３】ｓｉＲＮＡ単独もしくはｓｉＲＮＡカクテルの使用による、細胞増殖活性の変化に関する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、Ｆｌｔ３（ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３）の機能をダウンレギュレートすることでＦｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を優先的に抑制し、アポトーシスを誘発することができるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。白血病の予後不良の要因であるＦｌｔ３の高発現やＩＴＤ変異を有する患者の治療は、骨髄移植法に頼っており、白血病の約２５％つまり全世界で年間数万人のＦｌｔ３異常を有する患者を救命できない状態にあるのが現状であり、したがって、本発明により、Ｆｌｔ３遺伝子の高発現及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異遺伝子の発現を阻害すること、あるいはＦｌｔ３タンパク質の発現を制御することにより、白血病細胞の増殖シグナル伝達の大元を阻害することになり、白血病細胞の増殖を阻害することが期待される。【００２０】
前記Ｆｌｔ３は、造血細胞の増殖因子であるＦＬ（Ｆｌｔ３リガンド）の受容体であり、ＫＩＴ（幹細胞因子受容体）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）を含むＴｙｐｅ  ＩＩＩ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＴＲＫ）ファミリーに属する膜結合型チロシンキナーゼ受容体のひとつである。前記Ｆｌｔ３は、５つの細胞外イムノグロブリン様ドメインと１つの膜貫通ドメインとそれに続く膜近傍ドメインとＴＫ１及びＴＫ２という２つのサブドメインからなる細胞内キナーゼドメインとから構成される。前記Ｆｌｔ３にＦＬが結合することにより、受容体の２量体化と受容体キナーゼの活性化がおこり、細胞内へのシグナル伝達が開始される。【００２１】
また、前記Ｆｌｔ３は、特に造血細胞の腫瘍化や増殖に関与する重要な分子と考えられる。Ｆｌｔ３遺伝子をノックアウトしたマウスは健康なマウスに成長するが、初期造血細胞の欠乏状態を示し、正常骨髄細胞ではＣＤ１１７を強発現しているＣＤ３４＋細胞に限定されて発現している。【００２２】
（１）本発明の組成物
本発明の１つの側面は、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有した組成物に関する。【００２３】
本発明の別の側面は、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有してなる、組成物に関する。【００２４】
本明細書において、「ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域」とは、例えば、健常人の当該Ｆｌｔ３遺伝子のエキソン１３〜１４の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物に含まれる核酸（すなわち、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸）の標的領域として好適である。また、当該「ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域」は、「ヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」を包含する。前記「ヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」とは、配列番号：２７の塩基配列で示されるヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列の領域に対応する領域をいい、例えば、特に限定されないが、前記配列番号：２７において、塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有する配列の領域も包含する。また、上記膜近傍領域を含むエキソン１４〜１５において、Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異を有する配列の領域も、本発明の組成物に含まれる「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸の標的領域」、すなわち、「ヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」に含まれる。なお、ヒト正常型Ｆｌｔ３のアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列については、例えば、ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００４１１９に開示された配列等が例示される。【００２５】
本明細書において、「ヒトＦｌｔ３のキナーゼ領域」とは、例えば、健常人の当該Ｆｌｔ３遺伝子のエキソン１５〜エキソン１９の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物に含まれる核酸（すなわち、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸）の標的領域として好適である。また、当該「ヒトＦｌｔ３のキナーゼ領域」は、「ヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」を包含する。前記「ヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」とは、配列番号：２８の塩基配列で示されるヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列の領域に対応する領域をいい、例えば、特に限定されないが、配列番号：２８において、塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有する配列の領域も包含する。【００２６】
本明細書において、「ヒトＦｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域」とは、例えば、健常人の当該Ｆｌｔ３遺伝子のエキソン１４〜エキソン１９の領域をいう。前記領域は、本発明の組成物に含まれる核酸（すなわち、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸）の標的領域として好適である。また、当該「ヒトＦｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域」は、「ヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」をも包含する。前記「ヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域」とは、配列番号：２９の塩基配列で示されるヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合領域のｃＤＮＡ塩基配列の領域に対応する領域をいい、例えば、特に限定されないが、配列番号：２９において、塩基の付加、置換、欠失、挿入等を有する配列の領域も包含する。【００２７】
本発明の組成物は、ヒトＦｌｔ３の機能を抑制するための核酸を含有するものであって、前記ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域、又は前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的領域とすることに１つの大きな特徴がある。なお、前記標的領域は、１種の領域であっても、複数種の領域であってもよい。従って、本発明の組成物は、上記領域の塩基配列から任意に後述の実施例にそって構築することができる。また、本発明の組成物によれば、該ＲＮＡ干渉剤が前記領域を標的としているものであるするものであるため、Ｆｌｔ３の機能を効果的にダウンレギュレーションすることができるという優れた効果を発揮する。【００２８】
本明細書において、「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる」とは、特に限定されないが、Ｆｌｔ３遺伝子の発現、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルの機能及び／又は発現あるいはＦｌｔ３タンパク質の発現を抑制しうることをいう。いいかえれば、例えば、かかる概念には、Ｆｌｔ３遺伝子の転写を抑制しうること、転写後のｍＲＮＡを不安定化しうること、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡからの翻訳を抑制しうること、あるいは翻訳後のアミノ酸配列の機能を抑制しうることも含まれる。また、別の側面では、「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる」とは、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を抑制すること、前記細胞の増殖を優先的に抑制すること、前記細胞のアポトーシスを誘発させること、前記細胞のＦｌｔ３由来増殖シグナルを抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３タンパク質発現量を抑制すること、前記細胞のＦｌｔ３遺伝子の発現量を抑制することであってもよい。上記「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる」核酸としては、特に限定されないが、ｓｉＲＮＡが例示される。【００２９】
従って、本発明の組成物によれば、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を優先的に抑制することができるという優れた効果を発揮する。さらに、別の側面では、本発明の組成物によれば、該組成物がヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域、又は前記（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１種の領域を標的としているものであるため、Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制することができる。【００３０】
本明細書において、「Ｆｌｔ３高発現細胞」とは、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡが高発現している細胞、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルが増大している細胞、Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している細胞等のいずれもが含まれる。また、前記「Ｆｌｔ３高発現癌化細胞」とは、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡが高発現している癌化細胞、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルが増大している癌化細胞、Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している癌化細胞等のいずれもが含まれる。さらに、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞とは、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡが高発現している白血病細胞、Ｆｌｔ３由来増殖シグナルが増大している白血病細胞、Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している白血病細胞等のいずれもが含まれる。【００３１】
さらに、「Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞」とは、Ｆｌｔ３の膜近傍領域のエキソン１４〜１５の領域において健常人にはない縦列重複変異を有する細胞、すなわち、当該変異由来のｍＲＮＡが高発現している細胞、当該変異に起因してＦｌｔ３由来増殖シグナルが増大している細胞、当該変異Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している細胞等のいずれもが含まれる。また、「Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞」とは、Ｆｌｔ３の膜近傍領域のエキソン１４〜１５の領域において健常人にはない縦列重複変異を有する癌化細胞、すなわち、当該変異由来のｍＲＮＡが高発現している癌化細胞、当該変異に起因してＦｌｔ３由来増殖シグナルが増大している癌化細胞、当該変異Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している癌化細胞等のいずれもが含まれる。さらに、「Ｆｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞」とは、Ｆｌｔ３の膜近傍領域のエキソン１４〜１５の領域において健常人にはない縦列重複変異を有する白血病細胞、すなわち、当該変異由来のｍＲＮＡが高発現している白血病細胞、当該変異に起因してＦｌｔ３由来増殖シグナルが増大している白血病細胞、当該変異Ｆｌｔ３タンパク質が高発現している白血病細胞等のいずれもが含まれる。【００３２】
前記「Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象」としては、例えば、造血器腫瘍、具体的には白血病、さらに具体的には急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄性白血病（ＡＰＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）等が挙げられる。【００３３】
本発明の組成物に含まれる「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸」としては、特に限定されないが、ＲＮＡ干渉用のｓｉＲＮＡが例示され、当該ｓｉＲＮＡの場合、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１５〜２９塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜２５塩基対の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、２０〜２５塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列の全てが標的領域の塩基配列であってもよく、その一部が標的領域の塩基配列であってもよい。さらに、本発明の組成物には、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側に２〜４塩基突出した二本鎖ＲＮＡの形状のものさらに好ましくは３’末端側に２塩基突出した二本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。該に２〜４塩基としてはＴＴ配列〜ＴＴＴＴ配列が例示される。【００３４】
また、本発明の一態様として、健常人には見られないＦｌｔ３遺伝子の縦列重複変異の領域を標的とした核酸を含有する組成物であってもよい。当該「縦列重複変異」とは、Ｆｌｔ３遺伝子の膜近傍領域において、数十ヌクレオチドの塩基配列が縦列重複をおこす変異のことをいう。なお、前記縦列重複変異には、縦列重複の度合い、縦列重複する配列等について、各個体（症例）による多様性が生じている場合も含まれる。【００３５】
すなわち、当該縦列重複変異を標的とする場合、上記個々の症例の縦列重複変異領域を含む塩基配列に対応する核酸を用いることができる。特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡであってもよい。当該縦列重複変異領域を用いることにより、Ｆｌｔ３遺伝子の縦列重複変異を有する細胞のみをＲＮＡ干渉させることができ、その結果としてＦｌｔ３の機能を抑制することができる。【００３６】
本発明の組成物によれば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、該細胞にアポトーシスを誘発させることができる。【００３７】
以下、本発明の組成物に含まれる「Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸」の設計方法について、ＲＮＡ干渉用のｓｉＲＮＡを例として説明する。当該ｓｉＲＮＡの場合、（Ｉ）２次構造予測のステップ、及び（ＩＩ）ｓｉＲＮＡ配列選定のステップにより設計されうる。【００３８】
前記（Ｉ）２次構造予測は、抑制すべき遺伝子の２次構造をプログラム等によって予測することにより行なわれうる。ＲＮＡ干渉を効率よく生じさせる観点から、強い２次構造をとる箇所は避けることが好ましい。前記２次構造予測プログラムとしては、特に限定は無いが、ＭＦＯＬＤプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｍｆｏｌｄ−ｓｉｍｐｌｅ．ｈｔｍｌ）が使用できる。【００３９】
前記（ＩＩ）ｓｉＲＮＡ配列選定においては、標的とする領域の配列、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸の塩基配列に対応する領域の配列であればよく、特に限定されないが、例えば、プロモーター領域、構造遺伝子領域、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域及び開始コドン周辺領域の塩基配列のいずれもが好適に使用できる。例えば、標的とする領域の配列を選定する場合、Ｆｌｔ３をコードする核酸における配列の開始コドンから７５ヌクレオチド残基以上下流、より好ましくは、１６８７〜２３４７ヌクレオチド残基下流の領域において、２つの連続したアデニル酸残基、又は２つのアデニル酸残基と１つのグアニル酸残基とを、センス鎖とすることが望ましい。また、ｓｉＲＮＡ配列を作製する場合、２つの連続したアデニル酸残基以降の任意の１３〜２９ヌクレオチド残基とからなる配列、さらに好ましくは、１つのグアニル酸残基と任意の２０ヌクレオチド残基とからなる配列又は１つのシチジル酸残基と任意の２０ヌクレオチド残基とからなる配列であることが望ましい。センス鎖のＧＣ含量は、特に限定されないが、３０〜７０％、より好ましくは４０〜６０％とすることができる。非特異的作用を防ぐため、好ましくは、設計段階で塩基配列相同性検索を行ない、標的配列に特異的であること、すなわち、既知配列のデータベース中の配列に対する配列同一性が低く、標的配列に対して特異的である配列を確認することが望ましい。【００４０】
本発明の組成物に含有される核酸は、特に限定されないが、哺乳動物細胞において発現したＦｌｔ３の機能を抑制しうる配列の観点から、例えば、配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応するＲＮＡ配列を含有するものが好適である。さらに、本発明の組成物としては、配列番号：２及び３、５及び６、８及び９、３３及び３４、３６及び３７、又は３９及び４０記載の塩基配列の組み合わせからなる核酸を含有する組成物、すなわち、配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選択された少なくとも１種の核酸を含有した組成物が例示される。【００４１】
本発明の組成物に含まれる核酸は、好ましくは、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドによって構成されるものが望ましい。また、当該核酸は、特に限定されないが、Ｆｌｔ３の機能を抑制する作用を有するものであればよく、一本鎖核酸であってもよく、二本鎖核酸であってもよい。また、本発明の組成物に含まれる核酸は、特に限定されないが、２’−ＡＣＥ（２’−ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）又は２’−ＴＢＤＭＳ（２’−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙｌ）等の保護基を用いた化学合成法により合成することができる。【００４２】
化学合成法により合成された核酸は、特に限定は無いが、安定化や標識化のために、化学修飾基により修飾してもよい。本発明に使用できる修飾には特に限定は無いが、例えば、６−フルオレセイン付加、ビオチン付加、２’−Ｏ−メチル化、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）化、アミノ化等が挙げられる。当該修飾基は、ＲＮＡ干渉作用を阻害しない限り、５’末端、３’末端あるいは内部塩基のいずれに付加してもよい。【００４３】
本発明の組成物の別の側面としては、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。【００４４】
さらに本発明の別の側面としては、前記核酸、例えば、下記（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号：２７記載のヒト正常型Ｆｌｔ３の膜近傍領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
（ｂ）配列番号：２８記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のキナーゼ領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、及び
（ｃ）配列番号：２９記載のヒト正常型Ｆｌｔ３のＡＴＰ結合部位領域のｃＤＮＡ塩基配列に対応する領域、
からなる群より選択された領域を標的とし、かつ哺乳動物細胞内でＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物、具体的には、例えば、配列番号：１、４、７、３２、３５及び３８からなる群より選ばれた少なくとも１種の塩基配列に対応し、かつ該塩基配列に対応するＲＮＡを発現しうる核酸を保持したベクターを含有した組成物、さらに具体的には、例えば、配列番号：２の塩基配列を有する核酸と配列番号：３の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：５の塩基配列を有する核酸と配列番号：６の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：８の塩基配列を有する核酸と配列番号：９の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３３の塩基配列を有する核酸と配列番号：３４の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
配列番号：３６の塩基配列を有する核酸と配列番号：３７の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、及び
配列番号：３９の塩基配列を有する核酸と配列番号：４０の塩基配列を有する核酸とを組み合わせた核酸、
からなる群より選ばれた核酸を保持したベクターを含有した組成物に関する。【００４５】
本発明の組成物によれば、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域及びＡＴＰ結合部位領域からなる群より選択された少なくとも１種の領域、又は前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択された少なくとも1種の領域を標的とし、かつＦｌｔ３の機能を抑制する核酸を保持し発現させうるベクターを含有しているため、前記核酸による効果を発揮させ、前記細胞において、前記Ｆｌｔ３の機能を抑制する核酸を発現させ、前記細胞において、Ｆｌｔ３をコードする核酸の変異に基づく事象を抑制することができる。なお、標的領域は、１種の領域であってもよく、複数種の領域であってもよい。【００４６】
本発明の組成物に含まれるベクターは、哺乳動物細胞内でＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持・発現させるためのベクターであり、当該細胞内で効率良く発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、特に限定はないが、例えば、プラスミドベクターや、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐｉＧＥＮＥ  ｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣ  Ｈｙｇｒｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ａｍｂｉｏｎ社製）等が挙げられる。前記アデノウイルスベクターとしては、ＢＤ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ  Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等が挙げられる。【００４７】
本発明の組成物に含有されるベクターに用いるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーター等が挙げられる。また、組織特異的プロモーターを用いることにより、所望の部位、臓器等においてＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸の発現が可能となる点で有利である。特に限定は無いが、例えば、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ系プロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーター等が挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーター等が挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密に発現を制御することもできる。【００４８】
当該ベクターは、例えば前記Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を（Ｉ）２次構造予測のステップ、及び（ＩＩ）ｓｉＲＮＡ配列選定のステップで構築し、当該核酸を得、適切なベクターに保持・発現可能に組み込むことにより構築されうる。【００４９】
前記ベクターの構築は、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡ干渉の場合（Ａ）異なる２つのプロモーター制御下に、前記核酸に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置して、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプとして、（Ｂ）１つのプロモーター制御下に本発明のＲＮＡ干渉剤に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ逆方向に配置して、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがそれぞれループで連結されたステムループタイプ（又はヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプとして、あるいは、（Ｃ）ベクターのセンス鎖にて機能するプロモーター制御下に一方のＲＮＡをコードする核酸を、アンチセンス鎖にて機能するプロモーター制御化に該ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を配置して、それぞれ別個のプロモーター制御下でそれぞれのＲＮＡを転写する対向タイプとして、構築することにより行われうる。本発明のＲＮＡ干渉ベクターにおいては、特に限定されないが、好ましくは、反応条件、例えば、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセンス配列の種類等に応じ、タンデムタイプ、ステムループタイプ、対向タイプを使い分けることが望ましい。【００５０】
なお、前記ベクターにおいて、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸の塩基配列は、配列特異的抑制作用、例えばＲＮＡｉ干渉作用を示す配列であれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、以下の２つの条件：
−  転写開始点は、プリン残基〔グアニル酸残基（Ｇ）又はアデニル酸残基（Ａ）〕とすること、及び
−  アンチセンス鎖の３’末端に連続した４個のウラシル残基が付加されるため、転写開始点の前２塩基はＡＡとすること、
を満たすことが望ましい。また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、
−  ステムループタイプにすること、及び
−  短いポリ（Ａ）配列を付加すること
が望ましい。【００５１】
以下にＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターの作製方法について、ＲＮＡ干渉用のベクターの場合について説明する。【００５２】
すなわち、Ｆｌｔ３の場合、例えば膜近傍領域、ＡＴＰ結合領域及びキナーゼ活性領域について、前記のようにｓｉＲＮＡ配列を選択し、該ｓｉＲＮＡが転写されるようにベクターを構築する。一方、ｓｉＲＮＡ転写に用いる発現ベクター、すなわち、本発明の組成物は、転写によりｓｉＲＮＡを生じる配列をＰＣＲ法で作製し、Ｕ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（すなわち、Ｕ６プロモーター）の下流に挿入して、発現カセットを作製し、得られた発現カセットを適切なベクターの骨格に連結すること、あるいは、転写によりｓｉＲＮＡを生じるＤＮＡを化学合成し、制限酵素の認識配列のタグを付加し、得られた産物を、ベクターに挿入することにより得られうる。次に、得られたベクターを含む組成物を、エレクトロポレーション法やリポフェクション法によって、目的ｍＲＮＡ発現細胞にトランスフェクションすること、又は標的遺伝子を共トランスフェクションすることで、目的ｍＲＮＡの発現抑制をスクリーニングする。一方、細胞へのトランスフェクション効率を改善する観点からは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスベクターに発現カセットを挿入したベクターが本発明の組成物として利用できる。【００５３】
このように本発明の組成物は、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸又は当該核酸を保持したベクターを含有する組成物であり、さらに薬学的に許容される公知の担体と組み合わせて調製することができ、また、その使用目的に応じて製剤化することもできる。例えば、注射剤、点滴用剤のような医薬組成物としてもよい。さらに、前記有効成分の安定化や細胞への導入のための成分を含有する組成物も本発明の組成物に包含される。なお、医薬組成物としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び投与される患者の年齢、体重、症状に応じて適宜設定される。【００５４】
（２）本発明の組成物を用いたＦｌｔ３高発現細胞のアポトーシス誘発方法
本発明は、別の側面では、本発明の組成物を用いたＦｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発させる、アポトーシス誘発方法に関する。【００５５】
具体的には、本発明のアポトーシス誘発方法は、１つの実施態様では、本発明の組成物により、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることを特徴とする、アポトーシス誘発方法に関する。【００５６】
本発明のアポトーシス誘発方法は、本発明の組成物が用いられているため、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させることができる。【００５７】
また、本発明のアポトーシス誘発方法は、キナーゼを阻害する薬剤を用いる方法をさらに組み合わせてもよい。前記キナーゼを阻害する薬剤としては、好ましくは、チロシンキナーゼを阻害する薬剤、より好ましくは、Ｆｌｔ３キナーゼを阻害する薬剤が挙げられる。前記キナーゼを阻害する薬剤は、特に限定されないが、例えば、インドカルバゾール系誘導体ＣＥＰ−７０１（セファロン社製）、キナゾリン系化合物ＣＴ５３５１８（ミレニアム  ファーマシューティカル社製）、スタウロスポリン誘導体ＰＫＣ４１２（ＣＧＰ４１２５１、ノバルティス社製）、インドリノン系化合物ＳＵ１１２４８（スージェン社製）、メタノン誘導体Ｄ−６４４０６、Ｄ−６５４７６（ＡＳＴＡメディカ社製）、ＡＧ１２９５（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）等が挙げられる。【００５８】
すなわち、前記キナーゼを阻害する薬剤は、本発明の組成物との相乗効果により、Ｆｌｔ３キナーゼの発現を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発できるものであれば、いずれもが好適に使用できる。【００５９】
本発明のアポトーシス誘発方法によれば、具体的には、本発明の組成物を、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞に導入し、それにより該細胞の増殖を選択的に抑制するステップを行ない、それにより、該細胞のアポトーシスを誘発させることができる。【００６０】
Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、具体的にはＦｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、より具体的には  Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞への本発明の組成物の導入は、公知の遺伝子導入方法を用いることができる。特に限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、組織内注射、ハイドロダイナミクス法、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション法、金粒子を用いたボンバードメント法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル粒子を用いる方法、逆ミセル粒子を用いる方法、低密度リポタンパク質を用いる方法、トランスフェリンを用いる方法、アテロコラーゲンを用いる方法、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法、膜透過性ペプチドを用いる方法、膜融合性ペプチドを用いる方法等により行われうる。【００６１】
また、前記キナーゼを阻害する薬剤を用いる場合、同時にあるいはいずれか一方の使用後に他方を使用し、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、それにより、該Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスを誘発させることができる。【００６２】
Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖の抑制は、公知の遺伝子増幅方法、核酸ハイブリダイゼーション法、抗体を用いる方法等を用いて評価することができる。特に限定するものではないが、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫染色法等により行われうる。【００６３】
Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞のアポトーシスは、公知の方法を用いて評価することができる。特に限定するものではないが、例えば、当該細胞の形態変化の観察、該細胞中におけるＤＮＡ断片化の検出、乳酸脱水素酵素等の細胞外への漏出の検出、ＴＵＮＥＬ法、ＭＴＴ法、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等により行われうる。【００６４】
さらに、本発明のアポトーシス誘発方法は、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞を有する白血病患者の当該細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発させることができ、上記Ｆｌｔ３遺伝子が関与する白血病の治療方法としても利用できる。【００６５】
白血病の治療効果は、公知の方法を用いることができる。特に限定するものではないが、例えば、骨髄・末梢血中の白血球像の確認、白血球のＲＴ−ＰＣＲ法による確認、免疫染色による確認、ＥＬＩＳＡによる確認等により評価されうる。【００６６】
（３）前記アポトーシス誘発方法を行なうためのキット
本発明は、別の側面では、前記アポトーシス誘発方法を行なうためのキットに関する。【００６７】
本発明のキットによれば、本発明の組成物を含有しているため、前記アポトーシス誘発方法を効率よく行なうことができ、前記Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、例えば、Ｆｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、さらに例えば、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を優先的に抑制し、前記細胞のアポトーシスを誘発させることができる。【００６８】
本発明のキットには、本発明の組成物を安定化させる緩衝溶液をさらに含有してもよい。また、本発明のキットには、本発明の組成物を、公知の遺伝子導入方法、特に限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、組織内注射、ハイドロダイナミクス法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法等に使用される試薬をさらに含有していてもよい。【００６９】
また、本発明のキットには、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターから当該核酸を転写させるためのＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼをさらに含有していてもよい。【００７０】
本発明の組成物又はキットを用いることにより、Ｆｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発させることができる。【００７１】
Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞、具体的にはＦｌｔ３高発現癌化細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有癌化細胞、より具体的にはＦｌｔ３高発現白血病細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有白血病細胞への本発明の組成物の導入は、公知の遺伝子導入方法を用いることができる。特に限定するものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、組織内注射、ハイドロダイナミクス法、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション法、金粒子を用いたボンバードメント法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、ミセル粒子を用いる方法、逆ミセル粒子を用いる方法、低密度リポタンパク質を用いる方法、トランスフェリンを用いる方法、アテロコラーゲンを用いる方法、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる方法、膜透過性ペプチドを用いる方法、膜融合性ペプチドを用いる方法等により行われうる。【００７２】
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００７３】
（１）Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸の合成と選択
Ｆｌｔ３配列のＡＴＰ結合部位領域、キナーゼ領域（ＴＫ領域）又は膜近傍領域を標的としたＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を含有する組成物の有効性を、ＨＬ−６０細胞〔Ｆｌｔ３ＷＴ（野生型）低発現細胞〕、ＥｏＬ−１細胞〔Ｆｌｔ３ＷＴ（野生型）高発現細胞〕及びＭＶ４−１１細胞〔Ｆｌｔ３／ＩＴＤ高発現細胞〕を用いて検討した。【００７４】
Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸として用いるｓｉＲＮＡは、以下に示す配列を設計し、タカラバイオ社に製造を委託した。【００７５】
ＡＴＰ結合部位領域の標的配列を配列番号：１に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡ１のセンス配列を配列番号：２に、アンチセンス配列を配列番号：３に示す。ＴＫ領域の標的配列を配列番号：４に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡ２のセンス配列を配列番号：５に、アンチセンス配列を配列番号：６に示す。膜近傍領域（Ｆｌｔ３／ＪＭＤ領域）の標的配列を配列番号：７に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡ３のセンス配列を配列番号：８に、アンチセンス配列を配列番号：９に示す。【００７６】
（２）各細胞への遺伝子導入
ＨＬ−６０細胞〔Ｆｌｔ３ＷＴ（野生型）低発現細胞；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０〕、ＥｏＬ−１細胞〔Ｆｌｔ３ＷＴ（野生型）高発現細胞；ＥＣＡＣＣ  ９４０４２２５２〕及びＭＶ４−１１細胞〔Ｆｌｔ３／ＩＴＤ高発現細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９５９１〕の各細胞を、１０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（タカラバイオ社製）で、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。【００７７】
次に、細胞（２×１０5細胞／ｍｌ）を、６ウェルプレート中で２４時間予め培養し、細胞を回収し、該細胞を１．５×１０5細胞／ｍｌとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、得られた懸濁液に、終濃度２００ｐｍｏｌとなるように合成ｓｉＲＮＡを添加した。Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ４μｌ／反応を用いて、商品名：Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎに添付のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコールに従ってトランスフェクションを行なった。なお、コントロールとして、ｓｉＲＮＡ無添加で同様に操作した。また、ｓｉＲＮＡによる非特異的影響を、ＢＣＲ／ＡＢＬキメラ  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを用いて評価した。【００７８】
ＢＣＲ／ＡＢＬキメラ  ｍＲＮＡの標的配列を配列番号：１０に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡ４のセンス配列を配列番号：１１に、アンチセンス配列を配列番号：１２に示す。【００７９】
（３）ＲＮＡ干渉の確認
標的遺伝子のＲＮＡ干渉の確認は、以下のように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量の変化を測定することによって行なった。【００８０】
Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、合成ｓｉＲＮＡを各細胞にトランスフェクションした。２４時間後、得られた細胞から、ＴＲＩｚｏｌTM試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、得られた産物を、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）により処理した。なお、トランスフェクション、全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩによる処理について、用いた試薬の製造者のプロトコールに従って行なった。【００８１】
得られたＲＮＡ  １００ｎｇを鋳型とし、配列番号：１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号：１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマー対（各２０ｐｍｏｌ）とし、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行なった。なお、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（タカラバイオ社製）に基づく蛍光の変動を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ社製）により測定した。配列番号：１５及び１６記載のプライマーを用いて同様にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定することにより、ＲＮＡ量を標準化した。【００８２】
ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒のインキュベーションの後、９５℃で１秒と６０℃で１０秒と７２℃で３０秒とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。【００８３】
各ｓｉＲＮＡによるＦｌｔ３  ｍＲＮＡ干渉の結果を以下の表１に示す。なお、表１において、合成ｓｉＲＮＡを添加せず、トランスフェクションの各操作のみを行なった細胞の相対ｍＲＮＡ発現量（Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）を１００％とし、合成ｓｉＲＮＡを用いることにより変化した相対ｍＲＮＡ発現量（Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）の抑制された割合（％）を算出し、表示した。【００８４】
【表１】
2005035004.tif 000002
【００８５】
表１に示されるように、ｓｉＲＮＡ１を用いた場合、ＩＴＤ変異を有する細胞におけるＦｌｔ３  ｍＲＮＡ発現を、ｓｉＲＮＡを用いない場合の６５％抑制し、ＩＴＤ変異がない（つまりＷＴ）の細胞の場合のＦｌｔ３  ｍＲＮＡ発現の抑制率と比べ、抑制相対値で１．６倍以上Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ発現を選択的に抑制することがわかる。【００８６】
一方、ｓｉＲＮＡ３を用いた場合、ＩＴＤ変異の有無にかかわらず、Ｆｌｔ３高発現細胞において、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ発現を、ｓｉＲＮＡを用いない場合の６５％抑制し、Ｆｌｔ３低発現細胞に比較し、抑制相対値で１．６倍以上Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ発現を選択的に抑制することが示された。【００８７】
なお、ｓｉＲＮＡ２を用いた場合、全ての細胞でＦｌｔ３  ｍＲＮＡ発現を抑制し、その効果は、ｓｉＲＮＡを用いない場合の５０％前後であった。以上のことから、本発明の組成物は、Ｆｌｔ３の機能を抑制することができることを確認した。【００８８】
一方、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡとは関係ないｓｉＲＮＡ４では、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ発現の抑制は起こらなかった。したがって、Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ発現の抑制において、配列特異性があることが確認された。
【実施例２】
【００８９】
本発明の組成物の細胞増殖及びアポトーシスへの影響について検討した。【００９０】
本発明の組成物（合成ｓｉＲＮＡ１〜３）は、上記実施例１―（１）と同様のものを用いた。【００９１】
２×１０4細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに入れた細胞をＲＰＭＩ培地（１０体積％  ＦＢＳ含有）で培養した。各種合成ｓｉＲＮＡ（各１０ｎＭ）でトランスフェクションし、２０時間後、細胞増殖活性を、商品名：Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ１試薬（商品名、タカラバイオ社製）を用いて測定した。コントロール（ｓｉＲＮＡ無添加でトランスフェクション処理した場合）の増殖能に比較しての相対増殖能（％）を求めた。なお、実験は、各々ｎ＝３で実施し、その平均値を求めた。【００９２】
また、全細胞中におけるアポトーシス細胞の比率を、アポトーシス検出ＥＬＩＳＡ試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、添付のプロトコールにしたがって測定した。なお、実験は、各々ｎ＝３で実施し、その平均値を求めた。アポトーシスの検出は、ｓｉＲＮＡを導入した後の細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄し、５×１０3細胞から細胞ライゼートを得、該細胞ライゼートのサイトプラズミック画分をビオチン化抗ヒストン抗体と反応させ、ペルオキシダーゼ標識抗ＤＮＡ抗体と反応させるサンドイッチＥＬＩＳＡを行なうことにより実施した。非結合抗体を洗浄後、ＡＢＴＳ発色試薬を添加し、４０５ｎｍの吸光度を測定し、コントロール（ｓｉＲＮＡ無添加でトランスフェクション処理した場合）に対するアポトーシスの相対頻度を％で表した。【００９３】
各種合成ｓｉＲＮＡによるＦｌｔ３  ｍＲＮＡ発現白血病細胞への増殖活性への影響の結果を表２に示す。【００９４】
【表２】
2005035004.tif 000003
【００９５】
表２に示されるように、ｓｉＲＮＡ１〜３を用いた場合、各々Ｆｌｔ３  ｍＲＮＡ高発現細胞の増殖を選択的に抑制することが確認できた。また、ｓｉＲＮＡ３を用いた場合、ＩＴＤ変異の有無に関係なく、ＩＣ５０（５０％阻止濃度）  １０ｎＭの濃度でＦｌｔ３  ｍＲＮＡ高発現細胞の増殖を抑制することが確認できた。【００９６】
さらに、ｓｉＲＮＡを導入することによって増殖が６０％以下に抑制された細胞では、４０％以上の細胞でアポトーシスが起こっていることが確認された。
【実施例３】
【００９７】
Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を発現させるためのカセットは、ＢａｍＨＩサイト、ｌｏｏｐサイト、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ）ターミネーターサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するように設計され、タカラバイオ社により製造された。【００９８】
ＡＴＰ結合部位領域に対するセンス配列を配列番号：１７に、アンチセンス配列を配列番号：１８に示す。また、対照として、上記ｓｉＲＮＡとＧＣ含量が同じであるカセットも作製した。センス配列を配列番号：１９に、アンチセンス配列を配列番号：２０に示す。【００９９】
Ｆｌｔ３／ＩＴＤ領域に対するセンス配列を配列番号：２１に、アンチセンス配列を配列番号：２２に示す。また、対照として、上記ｓｉＲＮＡとＧＣ含量が同じであるカセットも作製した。センス配列を配列番号：２３に、アンチセンス配列を配列番号：２４に示す。【０１００】
得られた合成ＤＮＡを、９０℃で３分間加熱した。その後、直ちに３７℃に冷却し、センス配列を有する核酸と対応するアンチセンス配列を有する核酸とを１時間インキュベーションし、アニ−リングすることでＦｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を発現させるためのカセットを作製した。【０１０１】
次に商品名：ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ２．１  ｓｉＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ  Ｕ６  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ、Ｈｙｇｒｏｍｙｓｉｎ選択用；Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、製造者のプロトコールにしたがって、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを構築した。すなわち、前記アニーリングさせた該カセットを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、上記ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒに連結させ、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターを得た。得られたベクターを用いて、大腸菌コンピテントセル（ＤＨ５α、又はＪＭ１０９）を形質転換し、３７℃で１晩、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ含有ＬＢ培地上で培養し、形質転換されたコロニーを選択し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミドを精製した。なお、精製されたプラスミドを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとを用いて消化し、挿入断片の存在を指標として陽性クローンを確認した。また、陽性クローンのＤＮＡについて、配列番号：２５に示される塩基配列及び配列番号：２６に示される塩基配列のそれぞれのシーケンシングプライマーを用いて解析し、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒプラスミドの挿入断片の塩基配列を確認した。
【実施例４】
【０１０２】
（１）Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとの組み合わせの検討
本発明の組成物（合成ｓｉＲＮＡ３）とＫｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとの組み合わせによる処理によるＭＶ４−１１（ＩＴＤ変異）細胞の増殖阻害活性について検討した。合成ｓｉＲＮＡ３は、上記実施例１−（１）と同様のものを用いた。Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして、ＩＴＤ変異細胞に対して特異性の高いＡＧ１２９５（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）を用いた。【０１０３】
（２）細胞へのトランスフェクション
上記実施例１−（２）と同様に、ＲＰＭＩ１６４０培地（タカラバイオ社製）に１０体積％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加して得られた培地（以下、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍと称す）、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間、ＭＶ４―１１細胞を培養した。ついで、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で懸濁したＭＶ４―１１細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）をＣｕｖｖｅｔ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製；間隙  ４ｍｍ）に移し、該Ｃｕｖｖｅｔに、ｓｉＲＮＡ３を終濃度１．２μＭとなるように添加した。次に、このＣｕｖｖｅｔを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商品名、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）にセットした後、電場強度  ６５０Ｖ／ｃｍ、２５ｍｓｅｃでＰｕｌｓｅした。次に、Ｃｕｖｖｅｔに懸濁した細胞液量の４倍量のｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ中に加えて懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように分注した。【０１０４】
なお、コントロールｓｉＲＮＡとして、Ｃ３ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎの変異体）の配列（センス配列：配列番号：３０、アンチセンス配列：配列番号：３１）を有するｓｉＲＮＡを用い、同様に操作して実施した。【０１０５】
（３）ＡＧ１２９５処理
４ｍＭ  ＡＧ１２９５（ＤＭＳＯにて溶解）を、前記ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍにて１０μＭ、６μＭ及び０μＭ（０．２５体積％  ＤＭＳＯ）に調製した各濃度のＡＧ１２９５を、上記（２）で用意した９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように添加し、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。培養開始後７２時間目、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１試薬（商品名、タカラバイオ社製）を用い、製造者のプロトコールに従って、細胞の増殖活性を測定した。なお、実験は各々ｎ＝６で実施し、その平均値を求めた。コントロールｓｉＲＮＡ／０μＭ  ＡＧ１２９５でトランスフェクションした場合の増殖能に比較した相対増殖率（％）を求めた。結果を図１に示す。【０１０６】
図１において、横軸はＡＧ１２９５濃度（μＭ）、縦軸は相対増殖率（％）を示す。黒棒はコントロールｓｉＲＮＡを、白棒はｓｉＲＮＡ３を用いた場合の結果を示す。【０１０７】
図１に示されるように、Ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ単独での処理により、ＭＶ４−１１（ＩＴＤ変異）細胞の増殖は、コントロールｓｉＲＮＡ／０μＭ  ＡＧ１２９５でトランスフェクションした場合と比べ、濃度依存的に、３．０μＭ  ＡＧ１２９５で５９．８％、５．０μＭ  ＡＧ１２９５で８４．３％抑制されることが確認できた。また、ｓｉＲＮＡ３単独で用いた場合、細胞の増殖は、コントロールｓｉＲＮＡ／０μＭ  ＡＧ１２９５でトランスフェクションした場合と比べ、８３．７％抑制されることが確認できた。【０１０８】
しかしながら、驚くべきことに、ｓｉＲＮＡ３とＡＧ１２９５とを併用すると、細胞の増殖は、コントロールｓｉＲＮＡ／０μＭ  ＡＧ１２９５でトランスフェクションした場合と比べ、３．０μＭ  ＡＧ１２９５で９４．５％、５．０μＭ  ＡＧ１２９５で９９．７％と非常に高く抑制することが確認できた。【０１０９】
このことにより、ｓｉＲＮＡ３単独の場合、あるいは当該組成物とＡＧ１２９５等のレセプター型Ｋｉｎａｓｅ阻害剤と併用した場合のいずれにおいても、非常に高い増殖抑制効果を得ることができることが確認できた。
【実施例５】
【０１１０】
（１）Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸を保持したベクターによる細胞増殖効果
予め５体積％  ＣＯ2、３７℃で培養しておいたＭＶ４−１１細胞（２×１０6細胞）をＣｕｖｖｅｔ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製；間隙  ４ｍｍ）に移し、該Ｃｕｖｖｅｔに、実施例３で構築したＦｌｔ３／ＩＴＤ領域を有するベクター  ３μｇ、又はコントロールとして、Ｆｌｔ３／ＩＴＤ領域とＧＣ含量が同じであるベクター  ３μｇを添加した。次にこのＣｕｖｖｅｔを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商品名、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）にセットした後、電場強度  ６５０Ｖ／ｃｍ、２５ｍｓｅｃでＰｕｌｓｅした。次にＣｕｖｖｅｔに懸濁した細胞液量の４倍量のｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ中に加えて懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル分注し、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で細胞を培養した。培養開始２４時間後、細胞の増殖活性を、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１試薬（タカラバイオ社製）を用いて、添付の製造者のプロトコールに従い測定した。なお、実験は各々ｎ＝６で実施し、その平均値を求めた。ＭＶ４−１１（ＩＴＤ変異高発現）細胞の増殖阻害活性をコントロールの増殖能に比較しての相対増殖率（％）を求めた。結果を図２に示す。【０１１１】
図２に示されるように、ＭＶ４−１１（ＩＴＤ変異高発現）細胞の増殖は、コントロールに比べ、７１．４％抑制されることが確認できた。従って、前記実施例１〜４における合成ｓｉＲＮＡと同様にＦｌｔ３／ＩＴＤ領域を標的とするｓｉＲＮＡにおいても、ＩＴＤ変異高発現であるＭＶ４−１１を効率よく増殖抑制する効果を得られることが確認できた。
【実施例６】
【０１１２】
（１）抗Ｆｌｔ３  ｓｉＲＮＡの合成と選択
Ｆｌｔ３配列のＡＴＰ結合部位領域、キナーゼ領域（ＴＫ領域）又は膜近傍領域を標的とした核酸としてのｓｉＲＮＡの有効性を、ＨＬ−６０細胞（Ｆｌｔ３ＷＴ低発現）、ＥｏＬ−１細胞（Ｆｌｔ３ＷＴ高発現）及びＭＶ４−１１細胞（Ｆｌｔ３／ＩＴＤ高発現）を用いて検討した。なお、本発明の組成物として用いるｓｉＲＮＡも、タカラバイオ社で製造した。
本実施例においては、３’突出構造を有さないｄｓＲＮＡについて検討した。【０１１３】
ＡＴＰ結合部位領域の標的配列を配列番号：３２に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡのセンス配列を配列番号：３３に、アンチセンス配列を配列番号：３４に示す。ＴＫ領域の標的配列を配列番号：３５に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡのセンス配列を配列番号：３６に、アンチセンス配列を配列番号：３７に示す。膜近傍領域（Ｆｌｔ３／ＪＭＤ領域）の標的配列を配列番号：３８に示す。この標的配列に対するｓｉＲＮＡのセンス配列を配列番号：３９に、アンチセンス配列を配列番号：４０に示す。【０１１４】
（２）各細胞への遺伝子導入
ＨＬ−６０細胞、ＥｏＬ−１細胞及びＭＶ４−１１細胞の各細胞は、１０重量％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（タカラバイオ社製）で、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間培養した。【０１１５】
該細胞を１．５×１０6細胞／ｍｌとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、得られた懸濁液をＣｕｖｖｅｔ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製；間隙  ４ｍｍ）に移し、該Ｃｕｖｖｅｔに合成したｓｉＲＮＡをそれぞれ終濃度１．２μＭとなるように添加した。【０１１６】
次に、このＣｕｖｖｅｔをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（商品名、ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）にセットした後、電場強度  ６５０Ｖ／ｃｍ、２５ｍｓｅｃでＰｕｌｓｅした。次に、Ｃｕｖｖｅｔに懸濁した細胞液量の４倍量のｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ中に加えて懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように分注した。【０１１７】
なお、コントロールｓｉＲＮＡとしてはＣ３ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎの変異体）の配列（センス配列：配列番号：３０、アンチセンス配列：配列番号：３１）を有するｓｉＲＮＡを用い、同様に操作して実施した。【０１１８】
（３）ＲＮＡ干渉の確認
標的遺伝子のＲＮＡ干渉の確認は、以下のように、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ量によって行なった。すなわち、合成ｓｉＲＮＡを各細胞にトランスフェクションした。１７時間後、前記細胞から、ＴＲＩｚｏｌTM試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。その後、得られた全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）により処理した。トランスフェクション、全ＲＮＡの抽出及びＤＮａｓｅＩによる処理について、各々、製造者のプロトコールに従って行なった。【０１１９】
得られたＲＮＡ  １００ｎｇを鋳型とし、配列番号：１３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号：１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマー対（各２０ｐｍｏｌ）とし、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（商品名、タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を行なった。なお、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（タカラバイオ社製）に基づく蛍光の変動を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ社製）により測定した。配列番号：１５及び１６記載のプライマーを用いて同様にＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定することにより、ＲＮＡ量を標準化した。【０１２０】
ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒のインキュベーションの後、９５℃で１秒と６０℃で１０秒と７２℃で３０秒とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。【０１２１】
その結果、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸において３’末端に突出しているＴＴ配列を含まない配列である核酸でもＩＴＤ変異を有する細胞で発現したＦｌｔ３  ｍＲＮＡを抑制し、ＩＴＤ変異がない（つまりＷＴ）の細胞と比較して選択的に抑制することが確認できた。
【実施例７】
【０１２２】
（１）合成ｓｉＲＮＡの細胞増殖への影響
本発明の組成物として合成ｓｉＲＮＡ１、２、３を含有するカクテル及びｓｉＲＮＡ３単独によるＭＶ４−１１（ＩＴＤ変異）細胞の増殖阻害活性について検討した。合成ｓｉＲＮＡ１、２及び３は上記実施例１−（１）と同様のものを用いた。【０１２３】
（２）細胞へのＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ＭＶ４―１１細胞の培地は上記実施例１−（２）と同様のものを用い、ＲＰＭＩ１６４０培地（タカラバイオ社製）に１０体積％  牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えた培地（以下、ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍと称す）、５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で２４時間培養した。次に合成ｓｉＲＮＡ３のトランスフェクションは、以下のように行った。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で懸濁したＭＶ４―１１細胞（２×１０6細胞／ｍｌ）をＣｕｖｖｅｔ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製；間隙  ４ｍｍ）に移し、これに合成したｓｉＲＮＡ１、２及び３を等量モル加えたｓｉＲＮＡカクテル及びｓｉＲＮＡ３単独をそれぞれ終濃度１．２μＭとなるように添加した。次にこのＣｕｖｖｅｔをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）にセットした後、電場強度  ６５０Ｖ／ｃｍ、２５ｍｓｅｃでＰｕｌｓｅした。次に、Ｃｕｖｖｅｔに懸濁した細胞液量の４倍量のｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ中に加えて懸濁し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルとなるように分注した。【０１２４】
なお、コントロールｓｉＲＮＡとしてはＣ３ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎの変異体）の配列（センス配列：配列表の配列番号３０、アンチセンス配列：配列表の配列番号３１）を有するｓｉＲＮＡを同様に操作して実施した。【０１２５】
（３）細胞増殖測定
上記（２）で用意した９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェル加え５体積％  ＣＯ2存在下、３７℃で培養した。培養開始後７２時間目に細胞の増殖活性をＰｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１試薬（タカラバイオ社製）でメーカーのプロトコールに従い測定した。なお、実験は各々ｎ＝６で実施し、その平均値を求めた。コントロールｓｉＲＮＡでＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎの増殖能に比較しての相対増殖率（％）を求めた。結果を図３に示す。【０１２６】
図３に示したように、ｓｉＲＮＡ３単独では４６．５％増殖抑制することが示されたが、ｓｉＲＮＡカクテルでは２３．０％と非常に高い増殖抑制することが示された。このことにより、ｓｉＲＮＡ３単独でも十分な増殖抑制効果を得ることでき、さらにｓｉＲＮＡを含有するカクテルで用いることにより非常に高い増殖抑制効果を得ることができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、ヒトＦｌｔ３の膜近傍領域、キナーゼ領域、あるいはＡＴＰ結合部位領域から選択された領域を標的とし、Ｆｌｔ３の機能を抑制しうる核酸あるいは該核酸を保持したベクターを含有してなる、組成物が提供される。当該組成物は、Ｆｌｔ３高発現細胞及び／又はＦｌｔ３／ＩＴＤ変異含有細胞の増殖を選択的に抑制し、アポトーシスを誘発させる方法に使用することができる。さらに、当該方法のためのキットが提供される。本発明の組成物は、白血病患者の治療剤として用いることができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号：１は、ＡＴＰ結合部位領域の部分ｃＤＮＡ配列である。【０１２９】
配列番号：２は、ＳＥＱ１−Ｓと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３０】
配列番号：３は、ＳＥＱ１−ＡＳと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３１】
配列番号：４は、ＴＫドメインの部分ｃＤＮＡ配列である。【０１３２】
配列番号：５は、ＳＥＱ２−Ｓと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３３】
配列番号：６は、ＳＥＱ２−ＡＳと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３４】
配列番号：７は、Ｆｌｔ３／ＩＴＤドメインの部分ｃＤＮＡ配列である。【０１３５】
配列番号：８は、ＳＥＱ３−Ｓと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３６】
配列番号：９は、ＳＥＱ３−ＡＳと称す。ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３７】
配列番号：１０は、ｂｃｒ／ａｂｌキメラドメインの部分ｃＤＮＡ配列である。【０１３８】
配列番号：１１において、ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１３９】
配列番号：１２において、ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１４０】
配列番号：１３は、Ｆｌｔ３をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーＦｌｔ１１Ｆである。【０１４１】
配列番号：１４は、Ｆｌｔ３をコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーＦｌｔ１２Ｒである。【０１４２】
配列番号：１５は、ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーＧ１である。【０１４３】
配列番号：１６は、ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーＧ２である。【０１４４】
配列番号：１７は、ＡＴＰ結合ドメインに対するｓｉＲＮＡを発現させるための発現カセットＦｌｔ３ＳＩ１Ｆである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、ヌクレオチド２６−３４の領域は、ループ部位、ヌクレオチド５４−５９の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位である。【０１４５】
配列番号：１８は、ＡＴＰ結合ドメインに対するｓｉＲＮＡを発現させるための発現カセットＦｌｔ３ＳＩ１Ｒである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ヌクレオチド１０−１５の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位、ヌクレオチド３５−４３の領域は、ループである。【０１４６】
配列番号：１９は、コントロール配列のための発現カセットＦｌｔ３ＣＯＮ１Ｆである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、ヌクレオチド２６−３４の領域は、ループ部位、ヌクレオチド５４−５９の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位である。【０１４７】
配列番号：２０は、コントロール配列の発現のための発現カセットＦｌｔ３ＣＯＮ１Ｒである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ヌクレオチド１０−１５の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位、ヌクレオチド３５−４３の領域は、ループ部位である【０１４８】
配列番号：２１は、Ｆｌｔ３／ＩＴＤドメインに対するｓｉＲＮＡの発現のための発現カセットＦｌｔ３ＳＩ３Ｆである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、ヌクレオチド２６−３４の領域は、ループ部位、ヌクレオチド５４−５９の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位である。【０１４９】
配列番号：２２は、Ｆｌｔ３／ＩＴＤドメインに対するｓｉＲＮＡの発現のための発現カセットＦｌｔ３ＳＩ３Ｒである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ヌクレオチド１０−１５の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位、ヌクレオチド３５−４３の領域は、ループ部位である。【０１５０】
配列番号：２３は、コントロール配列の発現のための発現カセットＦｌｔ３ＣＯＮ３Ｆである。ヌクレオチド１−５の領域は、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、ヌクレオチド２６−３４の領域は、ループ部位、ヌクレオチド５４−５９の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位である。【０１５１】
配列番号：２４は、コントロール配列の発現のための発現カセットＦｌｔ３ＣＯＮ３Ｒ  である。ヌクレオチド１−５の領域は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、ヌクレオチド１０−１５の領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター部位、ヌクレオチド３５−４３の領域は、ループ部位である。【０１５２】
配列番号：２５は、５’シーケンシングプライマーである。【０１５３】
配列番号：２６は、３’シーケンシングプライマーである。【０１５４】
配列番号：２７は、膜近傍部位ドメインである。【０１５５】
配列番号：２８は、チロシンキナーゼドメインである。【０１５６】
配列番号：２９は、ＡＴＰ結合ドメインである。【０１５７】
配列番号：３０において、ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１５８】
配列番号：３１において、ヌクレオチド２０及び２１は、デオキシリボヌクレオチド、他のヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。【０１５９】
配列番号：３２は、ＡＴＰ結合部位の部分ｃＤＮＡ配列である。【０１６０】
配列番号：３３は、ｓｉＲＮＡである。【０１６１】
配列番号：３４は、ｓｉＲＮＡである。【０１６２】
配列番号：３５は、ＴＫドメインの部分ｃＤＮＡ配列である。【０１６３】
配列番号：３６は、ｓｉＲＮＡである。【０１６４】
配列番号：３７は、ｓｉＲＮＡである。【０１６５】
配列番号：３８は、Ｆｌｔ３／ＩＴＤドメインの部分ｃＤＮＡ配列である。【０１６６】
配列番号：３９は、ｓｉＲＮＡである。【０１６７】
配列番号：４０は、ｓｉＲＮＡである。
【図１】
2005035004.tif 000004
【図２】
2005035004.tif 000005
【図３】
2005035004.tif 000006
【配列表】
2005035004000001.app
【国際調査報告】
2005035004.tif 000007
2005035004.tif 000008
2005035004.tif 000009
2005035004.tif 000010
2005035004.tif 000011
2005035004.tif 000012