(57)【要約】担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が、下記一般式（１）で表される構造単位を全モノマー単位の１０％以上含有しているポリマーを有し、選択結合性物質は担体表面に生成したカルボキシル基との共有結合にて固定化されていることを特徴とする選択結合性物質固定化担体である。2004102194.tif 000018  （一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
2004102194.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質が固定化された担体であって、該担体の表面が低自家蛍光樹脂から成り、アルカリもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してカルボキシル基を生成し、そして選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
【請求項２】
担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が、下記一般式（１）で表される構造単位を含有しているポリマーを有し、アルカリもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してから選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体。
2004102194.tif 000017
（一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
【請求項３】
担体表面のポリマーをアルカリもしくは酸にて処理して、一般式（１）からなる構造単位の側鎖をカルボキシル基とし、このカルボキシル基と選択結合性物質の官能基とを結合することにより選択結合性物質が固定化されていることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項４】
担体表面のポリマーが一般式（１）の構造単位を全モノマー単位の１０％以上含有していることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項５】
選択結合性物質のアミノ基もしくは水酸基と、担体表面のカルボキシル基との共有結合より、担体に選択結合性物質が固定化されていることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項６】
選択結合性物質が核酸である請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項７】
一般式（１）の構造単位を有するポリマーがポリメチルメタクリレートであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項８】
担体表面が黒色であることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項９】
一般式（１）で表される構造単位を有するポリマーが、カーボンブラックを含有していることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１０】
担体が少なくとも支持体層と選択結合性物質固定化層を有しており、選択結合性物質固定化層表面が上記一般式（１）で表される構造単位を有するポリマーを有し、かつ選択結合性物質は、選択結合性物質固定化層の表面と結合していることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１１】
支持体層がガラスまたは金属であることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１２】
択結合性物質が固定化された担体であって、該担体には凹凸部が設けられており、選択結合性物質が凹凸部の複数の凸部の上面に固定化されていることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１３】
該凹凸部の凸部上面が実質的に平坦であり、選択結合性物質が固定化された凸部上面の高さが、略同一である請求の範囲第１２項に記載に記載の選択結合性物質固定化坦体。
【請求項１４】
該担体には平坦部が設けられていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１５】
選択性結合物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部の高さと、最も低い凸部の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１６】
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１７】
担体表面が黒色であることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１８】
一般式（１）で表される構造単位を有するポリマーが、カーボンブラックを含有していることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【請求項１９】
凸部の側面に導電性材料が設けられている請求の範囲第１２項に記載の選択結合性物質固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」）を固定化した担体に関する。
【背景技術】  各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じであり、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間のに基づく蛋白質や糖鎖検出・定量にも応用が可能ではある。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれるガラスの平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。
例えば、特表平１０−５０３８４１号公報（特許請求の範囲）には、核酸を基板上に固定化するための技術として、スライドガラス等の平坦な基板の上にポリ−Ｌ−リジン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開示されている。
また、例えば、特開２００１−１０８６８３号公報（特許請求の範囲および実施例）には、ＤＮＡチップに用いられる核酸プローブ（基板上に固定化された核酸）は、従来の数百〜数千塩基の長さのｃＤＮＡおよびその断片から、検出の際のエラーを下げることと、合成機で容易に合成できるという理由から、核酸プローブとしてオリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１０〜１００塩基までのものをいう）を用いる方法が開示されている。この際、オリゴＤＮＡとガラス基板とを共有結合にて、結合させている。
その他、ＤＮＡチップに用いるガラス以外の基板の材料としては、樹脂製の基板についていくつかの提案がある。例えば、特開２００１−３３７０８９号公報（第１７段落）には基板として、ポリメチルメタクリレートからなるポリマーについての記述がある。しかしながら、特開２００１−３３７０８９号公報には具体的なＤＮＡの固定化方法については何ら述べられていない。また、特開２００３−１３０８７４号公報（第１２段落）にも同様の記述があるが、具体的なＤＮＡの固定化方法については何ら記述されていない。特開２００２−７１６９３号公報（第７段落）にはアクリル繊維などのニトリル基を有する繊維をアルカリ処理によってカルボキシル基を有する繊維に誘導し、このカルボキシル基とＤＮＡなどを結合して固定化する方法が開示してある。しかし、アルカリ繊維はポリアクリロニトリルが主成分であるため、材料自体の自家蛍光が大きく基板としては不適であるとの問題点がある。さらに特開２００２−７１６９３号公報（第７段落）には、ポリメタクリレートをアクリル酸、メタクリル酸との共重合によってカルボキシル基を有する繊維に誘導し、このカルボキシル基とＤＮＡとを結合する方法が開示してあるが、この方法では、基板（担体）表面のカルボキシル基の量が少なく、固定できるＤＮＡの量が少なくなり、結果的にハイブリダイゼーションを示すシグナルが十分に得られないと言った問題点があった。
【発明の開示】
本発明が解決しようとする課題は次のようなものである。まず、平坦なガラスの基板にオリゴＤＮＡを固定化した場合、以下のような問題点があった。すなわち、１）ハイブリダイゼーションを行った時、ガラスが親水的なので、プローブＤＮＡを固定したスポット以外の部分にも非特異的に検体ＤＮＡが吸着し易く、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光検出を行う際、この非特異的に吸着した検体をも検出し、ノイズが大きくなるという問題点と、２）ガラスが剛体のため、これに共有結合したオリゴＤＮＡの空間的な自由度が妨げられるという推定理由から、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション効率が低いので、シグナル強度が小さく、結果的にＳ／Ｎ比が十分でないといった問題があった。
本発明が解決しようとする課題は、樹脂製の基板に強固にかつ、ハイブリダイゼーション効率の良い状態でＤＮＡを固定化した担体を提供するものである。さらには、上記のようなＳ／Ｎの悪化を防ぎ、検出感度の高い選択結合性物質が固定化された担体を提供するものである。
すなわち本発明は、選択結合性物質が固定化された担体であって、該担体の表面が低自家蛍光樹脂から成り、アルカリもしくは酸でこのポリマーの表面を処理し、カルボキシル基を生成してから選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体である。
また本発明は、担体の表面に選択結合性物質を固定化した選択結合性物質固定化担体であって、担体表面が、下記一般式（１）で表される構造単位を含有しているポリマーを有し、アルカリもしくは酸でこのポリマーの表面を処理してから選択結合性物質を固定化したことを特徴とする選択結合性物質固定化担体である。
2004102194.tif 000003
（一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
本発明により、非特異的な検体の吸着が少なく、かつ、ハイブリダイゼーション効率が良好であり、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合物質が固定化された担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＰＭＭＡ表面に選択結合性物質を固定化する際の反応スキーム示すための図、
図２は、本発明の担体の模式図、
図３は、本発明の担体の断面模式図、
図４は、マイクロアレイ突き当て用治具の例を示す図、
図５は、担体凹凸部の断面図、
図６は、支持体層と選択結合性物質固定化層を有する担体の概念図、
図７は、ガラス表面に選択結合性物質を固定化する際の反応スキームを示すための図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の選択結合性物質の固定化担体について説明する。
本発明の選択結合性物質の固定化担体は、選択結合性物質を固定化するため、担体表面が低自家蛍光樹脂からなり、かつ、アルカリもしくは酸にて表面を処理し、カルボキシル基を生成することを特徴とする。ここで、低自家蛍光樹脂とは、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂを用いて、厚み１ｍｍの清浄な平板を、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、蛍光強度が１０００以下であるものを言う。これを満たさない樹脂は、検出の際のＳ／Ｎが悪化するので、好ましくない。このような樹脂としては、例えば下記一般式（１）で表されるポリマーを挙げることができる。
2004102194.tif 000004
また、本発明の選択結合性物質の固定化担体は、選択結合性物質を固定化するための担体表面が、下記一般式（１）で表される構造単位を含有しているポリマーを有する固体である。
2004102194.tif 000005
（一般式（１）のＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、アルキル基、アリール基もしくは水素原子を表す。）
前記ポリマーとしては、単独重合体あるいは共重合体が用いられる。前記ポリマーは、少なくとも一つのタイプのモノマーを原料に用いており、そのモノマーは、重合に関与し得る二重結合および重縮合に関与し得る官能基ならびに、ケトンもしくはカルボン酸またはそれらの誘導体の形態で存在する。また前記ポリマーは、一般式（１）の構造を有することがより好ましい。
なお、前記ポリマーが共重合体の場合、一般式（１）で表される構造単位を全モノマー単位の１０％以上含有していることが好ましい。一般式（１）で表される構造単位の含有量が１０％以上であると、後に説明するようなステップにて、表面に多くのカルボキシル基を生成でき、プローブ核酸を多く固定化できるので、結果的にＳ／Ｎ比がより向上する。
本発明において、ポリマーとは、数平均重合度が５０以上のものを言う。このポリマーの数平均重合度の好ましい範囲は、１００から１万である。特に好ましくは、２００以上、５０００以下である。なお、数平均重合度はＧＰＣ（ゲルパーメイションクロマトグラフ）を用い定法にてポリマーの分子量を測定することにより、容易に測定できる。
一般式（１）において、Ｒ１およびＲ２はアルキル基、アリール基または水素原子を表し、それぞれ同一であっても異なっていても良い。前記アルキル基は直鎖状であってもまたは枝別れしていても良く、好ましくは１から２０の炭素数を有する。前記アリール基は、好ましくは６から１８、さらに好ましくは６から１２の炭素数を有する。官能基ＸはＯ、ＮＲ３、またはＣＨ２の中から任意に選ばれる。Ｒ３は前記Ｒ１およびＲ２と同様に定義される官能基である。
前記各種のような官能基を含むポリマーで、好ましいものとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチルメタクリレート（ＰＥＭＡ）またはポリプロピルメタクリレートのポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）等がある。これらの中で最も好ましいものは、射出成形やホットエンボス法にて成形が容易であり、かつ、比較的ガラス転移温度が高い点からポリメチルメタクリレートである。さらに、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリル酸シクロヘキシルまたはポリメタクリル酸フェニル等も用いることができる。また、前記ポリマーの構成要素を組み合わせた、または前記ポリマーの構成要素に他の一種または複数種のポリマーの構成要素を加えた構造の、共重合体も用いることができる。前記他のポリマーとしては、ポリスチレン等がある。
共重合体の場合、各構成要素の比の範囲は、カルボニル基を含むモノマー、例えばメタクリル酸アルキルの割合は、１０モル％以上が好ましい。こうすることにより、表面に多くのカルボン酸を生成できプローブ核酸を多く固定化できるので、結果的にＳ／Ｎ比がより向上するからである。ポリマーの構造単位のうち、より好ましい該モノマーの割合は５０モル％以上である。
さらに本発明では、一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーを有する担体に選択結合性物質を固定化するため、これにアルカリもしくは酸で前処理を施すことが必要である。こうすることにより、担体表面にカルボキシル基を形成させることができる。担体表面にカルボキシル基を生成する手段としては、アルカリ、酸などで処理する方法を単独で用いるだけではなく、温中での超音波処理、酸素プラズマ、アルゴンプラズマ、放射線に担体を晒す方法などと組み合わせても良い。これらの方法の中でも、担体の損傷が少なく、また、容易に実施できるという点から温度を上げたアルカリ、もしくは酸に担体を漬け込んで表面にカルボキシル基を生成させることが好ましい。具体的な例としては、水酸化ナトリウムや硫酸の水溶液（好ましい濃度は、１Ｎ〜２０Ｎ）に担体を漬け込み、好ましくは３０℃から８０℃の温度にして、１時間から１００時間の間保持すればよい。
上記の方法にて、カルボキシル基が担体表面に生成したかどうかは、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）にて確認できる。具体的には、フッ素を含むラベル化試薬（例えばトリフルオロエタノール）を用いてカルボキシル基をフッ素でラベル化する。そして、ラベル化後の試料でのＣ１ｓ、Ｆ１ｓピーク面積強度に反応率を考慮して官能基量を推定することが可能である。さらに精度を上げるためには、トリフルオロエタノールで標識化された試料の表面のフッ素分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型二次イオン質量分析法）で観察することにより、カルボキシル基が担体表面に生成しているかどうかを確認すればよい。
このようにカルボキシル基を担体の表面に生成すれば、これを足がかりに、担体側をビオチンもしくはアビチン修飾し、選択結合性物質をアビチンもしくはビオチン修飾して、アビチン・ビオチン相互作用にて選択結合性物質を担体に固定化する方法や、担体側をエチレンジアミン等のリンカーと反応させて、さらにこのリンカーと選択結合性物質を反応させ固定化することも考えられる。しかし、これらの方法では、２段階の反応を行うため、反応収率の関係から、担体に固定化できる選択結合性物質が少なくなりがちである。従って、担体のカルボキシル基と選択結合性物質との官能基とを直接反応させ、選択結合性物質を固定化することが好ましい。すなわち、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基や水酸基とを共有結合により固定化することが好ましい。一般的には、これらの結合の反応を助長するため、ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナートなどの様々な縮合剤が用いられている。これらの中でも、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、毒性が少ないことや、反応系からの除去が比較的容易なことから、選択結合性物質と担体表面のカルボキシル基との縮合反応にはもっとも有効な縮合剤の１つである。その他、有望な縮合剤としては４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチル−モルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）がある。これらＥＤＣなどの縮合剤は、選択結合性物質の溶液と混ぜて使用しても良いし、カルボキシル基が表面に生成された担体を予めＥＤＣの溶液に浸漬しておき、表面のカルボキシル基を活性化しておいても良い。
このような縮合剤を用い、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質のアミノ基とを反応させた場合は、アミド結合により担体表面と選択結合性物質が固定化されることになり、担体表面のカルボキシル基と選択結合性物質の水酸基とを反応させた場合は、エステル結合により担体表面と選択結合性物質とが固定化されることになる。選択結合性物質を含む試料を担体に作用させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。なお、選択結合性物質を固定化するためのスキームを図１に示す。（図１中の１はＰＭＭＡ基板を示し、２は選択結合性物質（ＤＮＡ）を示す。）
前述した方法により、ポリマー表面に選択結合性物質を固定化することにより、スポット部分以外は、電荷がマイナスのカルボキシル基が存在しているので、検体（代表的なＤＮＡ）の非特異的な吸着を抑え、さらに、共有結合で強固に、かつ、高密度に選択結合性物質を固定化でき、さらに、ガラスに比べ、固定化された選択結合性物質の空間的な自由度が高いという推定理由のために、検体とのハイブリダイゼーション効率が高い担体を得ることができる。空間的な自由度が高い利点は、特に固定化されている選択結合性物質がオリゴＤＮＡと呼ばれる塩基長が１０塩基から１００塩基のＤＮＡとターゲットの場合に、検体とのハイブリダイゼーション効率が非常に向上するという優れた特性を与える。
ところで、一般式（１）で示されるような構造単位を含むポリマーで担体を作製する場合、ガラス、セラミック、金属などに比較し、射出成形方法やホットエンボス法などを用いることにより、微細な形状を設けた担体をより簡単に大量生産することが可能である。そこで、選択結合性物質が固定化される担体の形状について述べる。本発明の選択結合性物質が固定化される担体には凹凸部があり、凸部上面に選択性適合物質が固定化されていることが好ましい。このような構造を取ることにより、検出の際、後述のように非特異的に吸着した検体を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。そして、凹凸部の複数の凸部の高さに関しては、凸部の上面の高さが略同一であるであることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検体とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が１００μｍより小さいことをいう。さらに本発明の担体には、平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図２、図３に示す。１１が平坦部であり、かつ、１２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。そして、該凹凸部の凸部分の上面が実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、５０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さが略同一である。ここで、平坦部と凹凸部との高さが略同一とは、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの低下具合が問題とならない高さをいう。具体的に高さの差が略同一とは、凹凸部凸部上面の高さと、平坦部の高さとの差が１００μｍより小さいことをいう。
すなわち、一般にマイクロアレイは、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とを反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。この集光された光をマイクロアレイの表面に照射して、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、この条件のまま、対物レンズもしくは、マイクロアレイ自体を走査することによりマイクロアレイから発生する蛍光を読み込むような仕組みとなっている。
このような、スキャナーを用いて本発明の凸部上面に選択結合性物質を固定化した担体をスキャンすると、凹凸部の凹部に非特異的に吸着した検体ＤＮＡの蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果を発揮する。この理由は、凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部ではレーザー光がデフォーカスされるからである。逆に言えば、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。なぜなら、凸部上面の高さにこれ以上のばらつきがあると、スキャナーの焦点深度の関係で正確な蛍光強度を測定できないことが起こりうるからである。
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部の内、最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であれば良いが、３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
なお、選択結合性物質が固定化された複数の凸部とは、データとして必要な選択結合性物質（例えば核酸）が固定化された部分をいうのであって、ただ単にダミーの選択結合性物質を固定化した部分は除く。
また、一般にスキャナーの焦点を調整する方法は、以下の通りである。すなわち、スキャナーがマイクロアレイの表面に励起光の焦点を合わせる際には、マイクロアレイの隅で励起光の焦点を合わせるか、図４に示すように、治具にマイクロアレイを突き当て、レーザー光の焦点をマイクロアレイ表面に合わせる。そして、その条件のまま、マイクロアレイ全体をスキャンする。（図４中の１３はマイクロアレイ、１４は対物レンズ、１５は励起光、１６はマイクロアレイを治具に突き当てるためのバネを示す。）したがって、本発明の担体には、特に凹凸部と平坦部が設けられていることが好ましい。具体例を図２、図３に示す。１１が平坦部であり、かつ、１２で示される凹凸部の凸部上面に選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。さらに、凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。このようにしておけば、選択結合性物質が固定化された担体をスキャンする場合は、いったん平坦部の上面で励起光の焦点を合わせたり、平坦部を治具に突き当てることが可能である。すなわち、スキャナーの焦点合わせが容易になる。このようにして、平坦部で励起光の焦点を合わせるので、選択結合性物質が固定化された凸部の上面は、平坦であり、かつ、凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍ以下であることが好ましい。
凸部の上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍより大きいと、以下のような問題点が生じることがある。すなわち、励起光の焦点は平坦部の上面で調整されているので、凸部の上面の高さが異なると、凸部上面での励起光の焦点がぼやけてしまい、最悪の場合、選択結合性物質と検体が反応したことによる蛍光が全く検出されないことが起こりうる。同様なことは、凸部上面と高さが同じ平坦部が設けられていない場合でも起こりうる。
また、凸部の上面が平坦でない場合、凸部上面での励起光の焦点の大きさにばらつきが起き、結果的に１つの凸部上面内で検出された蛍光の強さにむらが発生する。こうなると、後の解析が困難となる。本願の場合は、上記のような問題は起きず、良好なシグナル（蛍光）を得ることが可能である。
なお、凸部の上面の高さと平坦部分の高さの差は、５０μｍ以下であればよいが、３０μｍ以下であることがより好ましく、凸部の上面の高さと平坦部分の高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。
また本発明では、平面状の担体に選択結合性物質を点着するのではなく、凹凸部分の凸部上面にのみ選択結合性物質を固定化している。したがって、凸部上面以外の部分に非特異的に検体試料が吸着しても、凸部上面以外の部分では、励起光の焦点がぼやけてるため、望まざる非特異的な吸着をした検体試料からの蛍光を検出することがない。このため、ノイズが小さくなり、結果的にＳ／Ｎが良くなるという効果を発揮する。
このような形状の担体を作製するためには、射出成型法を用いることが生産性を鑑みると好ましい。上記のような形状の担体を射出成型法により作製するためには、型が必要となが、この型の作製方法としては、ＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスで型を作製すれば、成形後の担体の離型が容易な型が作製可能であるので好ましい。
また、凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。このようにすることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
凸部の上面の面積は、特に限定される物ではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、４ｍｍ２以下、１０μｍ２以上が好ましい。
凹凸部における凸部の高さとしては、０．０１ｍｍ以上、１ｍｍ以下が好ましい。凸部の高さがこれより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがある。また、凸部の高さが１ｍｍ以上であると、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合がある。
また、少なくとも凸部の側面に導電性材料が設けられていることが好ましい。こうすると、例えば、対抗電極を設け、対抗電極とこの導電性材料の間に電流、電圧を印加することにより核酸の場合であるとハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。導電性材料がコートされる好ましい領域としては、凹部の全部、凸部の側面全部である。その例を図５に示す。（図５中の２１は凸部上面、２２は導電性膜、２３は絶縁膜を示す。）印加する電圧の範囲としては、電流が流れる場合は、０．０１Ｖ以上、２Ｖ以下の範囲が好ましい。特に好ましい範囲は、０．１Ｖ以上、１．５Ｖ以下である。これより、大きい電圧を印加すると水が電気分解をおこし、表面の選択結合性物質に悪影響を及ぼす場合がある。導電性材料の材質としては特に限定されないが、炭素、マグネシウム、アルミ、シリコン、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、錫、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、銀、ハフニウム、タンタル、タングステン、白金、金、ステンレスやこれらの混合物や導電性ポリマーが挙げられる。この中でも、白金、金、チタンが特に好ましく用いられる。これらの導電性材料の膜の作製方法としては、蒸着、スパッタ、ＣＶＤ、メッキなどが挙げられる。
上記のように凸部に導電性材料をコートした場合は、凸部の上面以外はさらに絶縁材料の層を設けることが好ましい。絶縁材料の層があると、電流を流した場合凸部の上面にのみ被検体を引き寄せることが可能である。絶縁材料の材料としては、金属の酸化物（例えば、Ａｌ−Ｏ、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＶＯ、ＳｎＯ、Ｃｒ−Ｏ、Ｚｎ−Ｏ、ＧｅＯ２、Ｔａ２Ｏ５、ＺｒＯ２、Ｎｂ−Ｏ、Ｙ２Ｏ３など）、窒化物（Ａｌ−Ｎ、Ｓｉ３Ｎ４、ＴｉＮ、Ｔａ−Ｎ、Ｇｅ−Ｎ、Ｚｒ−Ｎ、ＮｂＮなど）、硫化物（ＺｎＳ、ＰｂＳ、ＳｎＳ、ＣｕＳ）、絶縁性のポリマーが挙げられる。
上述の方法により得られた選択結合性物質固定化担体は、選択結合性物質を固定した後、適当な処理をすることができる。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理などを行うことにより、固定された選択結合性物質を変性させることもできる。
また、選択結合性物質固定化担体は、蛍光標識化された検体と担体に固定化された選択結合性物質とをハイブリダイゼーション反応させ、スキャナーと呼ばれる装置で蛍光を読みとることが一般的である。スキャナーは励起光であるレーザー光を対物レンズで絞り込み、レーザー光を集光する。しかし、担体表面から自家蛍光が生じる場合、その発光がノイズとなり検出精度の低下に繋がることがある。これを防ぐため一般式（１）の構造単位を有するポリマーに黒色を呈し、またレーザー照射により発光を生じない物質を含有させて表面を黒色にすることにより、担体自身からの自家蛍光を低減させることができるので好ましい。このような担体を用いることにより、検出の際、担体からの自家蛍光を低減できるのでよりノイズが小さく、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合性物質物質が固定化された担体を提供することができる。
ここで、担体が黒色とは、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）範囲において、担体の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、担体の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることをいう。
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。なお、ここでいう分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２  条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率をいう。
黒色にする手段としては、担体に黒色物質を含有させることにより達成しうるが、この黒色物質の好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、ＣｏおよびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラックを好ましく含有させることができ、ポリマーに一様に分散しやすいことから特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。
また、担体の形状としてガラス、金属などの熱変形をし難い材料からなる支持体層の上に、一般式（１）で表される構造単位を少なくとも１つ有するポリマーからなる選択結合性物質固定化層を設けると、熱や外力による担体の形状変化を防げることから好ましい。その他支持体層としては、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミドなどの比較的高温に耐えられる樹脂などを用いても良い。この概念図を図６に示す。（２は選択結合性物質（ＤＮＡ）、３は支持体層（ガラス）、４は選択結合性物質固定化層（ＰＭＭＡ）を示す。）支持体層としては、ガラスや、鉄、クロム、ニッケル、チタン、ステンレスなどの金属が好ましい。また、この支持体層と選択結合性物質固定化層との密着性を良くするため、支持体層の表面を、アルゴン、酸素、窒素ガスでのプラズマ処理やシランカップリング剤での処理を施すことが好ましい。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。支持体層の上に選択結合性物質固定化層を設ける手段としては、ポリマーを有機溶媒に溶解し、スピンコートやディッピングなどの公知の手段を用いることができる。より簡単には、支持体層に接着剤で貼り付けることもできる。
ここで、「選択結合性物質」とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。核酸は、ＤＮＡやＲＮＡでもＰＮＡでもよい。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。また、タンパク質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。糖類としては、多糖類が好ましく、種々の抗原を挙げることができる。また、タンパク質や糖類以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。本発明に用いる選択結合性物質は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。「選択結合性物質」として、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが１０塩基から１００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能であり、また、核酸末端のアミノ基修飾が容易であるため、担体表面への固定化が容易となることから好ましい。さらに、２０塩基未満ではハイブリダイゼーションの安定性が低いという観点から２０〜１００塩基がより好ましい。ハイブリダイゼーションの安定性を保持するため、特に好ましくは４０〜１００塩基の範囲である。
本発明の担体を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオチド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。
固定化物質と被検物質を相互作用させる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。
【実施例】  本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１
透明なポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１ｍｍ、平均分子量１５万、すなわち数平均重合度１５００）をエタノールと純水で十分に洗浄した後、１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このアルカリ処理を施した板と、アルカリ処理を施していない板とを試料とし、フッ素を含むラベル化試薬（トリフルオロエタノール）を用いて気相状態で試料表面のカルボキシル基をラベル化した。そして、単色化されたＡｌ  Ｋα１，２線（１４８６．６ｅＶ）を用い、Ｘ線径１ｍｍ、光電子脱出角９０°の条件にて、ＸＰＳ測定を行い、Ｃ１ｓ、Ｆ１ｓピーク面積強度に反応率を考慮してカルボキシル基を推定した。その結果、カルボキシル基量は、アルカリ未処理の試料の場合０．００１３（全炭素量中のカルボキシル基炭素の割合）、アルカリ処理を行った試料の場合０．００１５であり、表面のカルボキシル基量が多くなっていることが認められた。
また、上記２つのトリフルオロエタノールによって表面のカルボキシル基をラベル化した試料表面のフッ素量と分布をＴＯＦ−ＳＩＭＳ（飛行時間型２次イオン質量分析）によって測定したところ、以下の結果が得られた。すなわち２つの試料で比較すると、水酸化ナトリウム処理品では未処理品よりも１９Ｆ−や６９ＣＦ３−が強く、水酸化ナトリウム処理品では未処理品よりもカルボキシル基が多いことが認められた。具体的には、未処理品では、Ｆ−に相当する質量数１９のイオンのカウント数は８０００であったが、水酸化ナトリウム処理品では２５０００であった。また、ＣＦ３−に対応する質量数６９のイオンのカウント数は、未処理品では１２００であったが、水酸化ナトリウム処理品では、７０００であった。さらに、ＴＯＦ−ＳＩＭＳにより両試料表面のフッ素の分布を２次元的に測定したところ、水酸化ナトリウム処理品では１９Ｆ−のイオン像に局在した分布がみられた（３０μｍ〜４０μｍφの円形や、３０μｍ〜４０μｍ幅の筋状にイオン強度の弱い領域がみられた）。上の結果から、アルカリ処理を行ったサンプルでは、表面のカルボキシル基が局在した分布を持っていることが推察される。一方、未処理品においては、１９Ｆ−のイオン像に特に局在した分布は認められなかった。一方、メトキシ基によるものと思われる３１ＣＨ３Ｏ−のイオン像には２つの試料ともに局在した分布は特に認められなかった。
【実施例１】（ＤＮＡ固定化担体の作製）
透明なポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）板（（株）クラレ製；コモグラス押し出し板、厚さ１ｍｍ、平均分子量１５万、すなわち数平均重合度１５００）を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、板表面のＰＭＭＡの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーのゲイン設定を７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、この板（アルカリ処理無し）の自家蛍光強度は６５０であった。
（プローブＤＮＡの固定化）
配列番号１（７０塩基、５’末端アミノ化）、配列番号２（６０塩基、５’末端アミノ化）、配列番号３（４０塩基、５’末端アミノ化）、配列番号４（２０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。これら配列番号１から４のＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。
これらのＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１１にメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をおよそ２００ｎｌ取り出して、これを基板に点着した。すなわち、４種類のプローブをＰＭＭＡ基板の上にそれぞれ１箇所点着した。次いで、基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。この反応スキームを図１に示す。
（検体ＤＮＡの調整）
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化基板とハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号８のＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調整方法を以下に示す。
配列番号５と配列番号６のＤＮＡを合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号７：２２６４塩基）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号５および配列番号６のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号５の溶液を２μｌ、配列番号６の溶液を２μｌ、テンプレート（配列番号７）を０．２μｌを加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号８（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液にに２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号８（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量体積％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとはＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたもの。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物２２．１ｇを純水にとかし、５ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量体積％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量体積％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用の溶液とした。
（ハイブリダイゼーション）
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した基板に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、先に用意したプローブ核酸が固定化されている担体にハイブリダイゼーション用の溶液を１０μｌ滴下し、その上にカバーガラスをかぶせた。また、カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。これを、プラスチック容器の中に入れ、６５℃、湿度１００％の条件で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
（測定）
ハイブリダイゼーションの有無を検出するために、ハイブリダイゼーション後の基板上の蛍光を蛍光顕微鏡（オリンパス光学）により観察した。全てのプローブ部分でハイブリダイゼーションを示す蛍光発光が観察された。また塩基数が４０、６０、７０と増加するにつれてスポット上の蛍光とバックグラウンドの差が大きくなった。すなわち、プローブの塩基数が長くなるに従い、Ｓ／Ｎ比が向上した。
次いで、定量的な議論を行うために、ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の担体をセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーのゲインを５００にした状態で測定を行った。その結果を表１に示す。ここで、蛍光強度とはスポット内の蛍光強度の平均値であり、ノイズとはスポット周り（ＤＮＡが点着されていない部分）の蛍光強度の平均値とした。
比較例１
実施例１のような基板がＰＭＭＡではなく、ガラスの場合の実験を行った。
スライドガラスを１０Ｎ  ＮａＯＨ水溶液に１時間浸漬したあと、純水で十分に洗浄した。ついで、ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量体積％の割合で純水に溶解した後、上記のスライドガラスを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにして、ガラスの表面にアミノ基を導入した。
ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた。１Ｍの５０ｍｌのホウ酸ナトリウム（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）に上記コハク酸溶液に加えた。この混合液に上記のガラス基板を２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラス基板の表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラス表面にカルボキシル基を導入した。これをＤＮＡ固定化用基板として用いた。さらに、塩基配列１から４のＤＮＡを実施例１と同様の手順で上記ガラス基板に固定化した。この反応スキームを図７に示す（図７中、２は選択結合性物質（ＤＮＡ）、５はガラス基板を示す）。そして、実施例１と同様の手順でハイブリダイゼーションを行った。これを、実施例１と同様の条件で蛍光顕微鏡にて観察した。
蛍光顕微鏡にて観察したところ、ガラス基板においてもプローブ部分が４０塩基以上の時に発光が観察された。しかし基板がＰＭＭＡの場合と比較して比較例の３つのガラス基板では蛍光強度は明らかに微弱であることが観察された。さらに定量的な議論を行うためにこれらの基板における発光強度をスキャナーにより測定した。その結果を実施例１と併せて表１に示す。表１の結果からガラス基板では蛍光が微弱であり、かつノイズも大きくＳ／Ｎ比が劣っていることがわかる。
また、その他の市販のアミノ基が導入されたスライドガラスを用い、上記と同様なスキームでＤＮＡの固定化、ハイブリダイゼーションまで行った。用いたスライドガラスは、ＤＮＡマイクロアレイ用コートスライド硝子  高密度アミノ基導入タイプ（松浪硝子工業（株）製；製品番号ＳＤ０００１１）とＭＡＳコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製；製品番号Ｓ０８１１１０）を用いた。同様に測定した結果、これらのスライドガラスを用いても、基板をＰＭＭＡとした場合よりもＳ／Ｎ比が劣っていた。その結果を表１に示す。
2004102194.tif 000006
比較例２
（スライドガラスの調整）
比較例１と同様に、３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いてスライドガラスの表面にアミノ基を導入した。そして、比較例１と同様に無水コハク酸を用いて、スライドガラスの表面に、カルボキシル基を導入したあと、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下で乾燥した。乾燥後の、末端にカルボキシル基が導入されたガラス基板を、ＥＤＣ（９５５ｍｇ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５７５ｍｇ）のアセトニトリル（５０ｍｌ）溶液に２時間浸し、アセトニトリルで洗浄し、１時間減圧下に乾燥し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがエステル結合にて表面に導入されているガラス基板を得た。
（ＤＮＡの固定化）
実施例１と同様の５’末端がアミノされたＤＮＡを用い、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．３）に分散してなる水性液（ＤＮＡの濃度は０．０２７ｎｍｏｌ／μｌ）２００ｎｌを、上記で得たガラス基板に点着した。直ちに、固定化後のガラス基板を２５℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このガラス基板を０．１重量体積％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄した。次いで、上記の洗浄後のガラス基板を０．１Ｍグリシン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸積した後、蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定されたガラス基板を得た。
（検出）
実施例１のハイブリダイゼーション実験と同様の手順、および検体ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行った。結果を表２に示す。実施例１の基板がＰＭＭＡの場合と比較してＳ／Ｎ比は十分でないことがわかる。
2004102194.tif 000007
【実施例２】（ＤＮＡ固定化担体の作製）
平均分子量が１５万のＰＭＭＡ中に３重量％の割合でカーボンブラックを混合して、キャスト法により、厚さ１ｍｍの黒色基板を作製した。この黒色ＰＭＭＡ基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、この板（アルカリ処理無し）の自家蛍光強度は２５０であった。実施例１と同様のプローブＤＮＡを４種類用い、同様な操作手順で、黒色化したＤＮＡ固定化担体を作製した。
別途同様な基板を作製して、この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
（検体ＤＮＡの調整およびハイブリダイゼーション）
実施例１と同様の検体ＤＮＡ調整法およびハイブリダイゼーション法により行った。
（測定）
実施例１と同じ条件で、スキャナーにより蛍光測定を行った。表３にスキャナーにより観察した結果を示す。実施例１と同様に塩基数が増加するにつれ蛍光強度が増加した。また、実施例１の結果と比較してバックグラウンドが減少した。このことより、基板を黒色にするとノイズが低減し、より、Ｓ／Ｎ比の向上が確認された。
2004102194.tif 000008
【実施例３】  ３−アミノプロピルトリエトキシシランが表面に導入されたスライドガラスを比較例１の手順で作製した。これに、クロロホルムに溶解したＰＭＭＡをスピンコートして、１００℃で１５分間、１１５℃で１時間保持して、支持体層（ガラス）／選択結合性物質固定化層（ＰＭＭＡ）から成る担体を作製した。なお、スピンコートされたＰＭＭＡの厚さは、およそ２０μｍであった。
次いで、この担体を１０ＮのＮａＯＨに１０時間浸漬し、ＰＭＭＡの表面にカルボキシル基を生成した。実施例１と同様に、プローブＤＮＡの固定化、検体ＤＮＡ調整、ハイブリダイゼーション、蛍光強度の測定を行った。そのところ、実施例１と同様な結果が得られた。なお、実施例１では、若干基板が反っていたが、本実施例の担体には、反りが見られなかった。
また、実施例２で用いた、カーボンブラックが分散したＰＭＭＡを同様にスピンコートしても、実施例２と同様な蛍光強度とノイズが得られ、この場合も担体の反りは見られなかった。
【実施例４】  ＰＭＭＡ表面のカルボキシル基生成の際、１０ＮのＮａＯＨ水溶液を用いる代わりに、１０Ｎの硫酸を用いた以外は、実施例１と同様の実験を行った。その結果、実施例１と同様の結果が得られた。
【実施例５】  スチレンとＭＭＡ（メタクリル酸メチル）との共重合体ポリマーを作製した。作製したポリマー組成は、ＭＭＡが１０ｍｏｌ％、スチレンが９０ｍｏｌ％であった。この共重合体の具体的な作製方法は、ＭＭＡとスチレンとを１：９（モル比）の割合で脱水トルエンに溶解した後、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチルニトリル）をＭＭＡとスチレンを合わせたモル数の１／１０００の割合で加え、窒素雰囲気下で６０℃で１時間、６５℃で３時間、９０℃で２０時間保持した。そして、エタノール沈殿、濾過により精製した。
精製したポリマーの組成はＮＭＲ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）にて確認した。また、このポリマーの分子量をＧＰＣで測定して、数平均重合度を算出したところ、１１００であった。
ついで、精製したポリマーをキャスト法にて、厚さ１ｍｍ程度の板状とした。固定化するＤＮＡを配列番号２のみとした以外は、実施例１と同様な実験を行った。そして、実施例１と同じ条件で、スキャナーにより蛍光測定を行った。その結果、蛍光強度は５２００、ノイズは１５０であり、ＭＭＡの含有量が１０％であっても、比較例１、比較例２と比べ、Ｓ／Ｎ比が向上できた。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件でアルカリ処理を未実施の平板を測定したとき、この板の自家蛍光強度は７５０であった。
比較例３
ポリスチレンのホモポリマーを作製し、これをキャスト法にて厚さ１ｍｍ程度の板状とした。この板を用いて、実施例１と同様に実験を行ったが、プローブＤＮＡと検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを示す蛍光は全く観察されなかった。
【実施例６】  （ＤＮＡ固定化担体の作製）
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するＰＭＭＡ製の基板を得た。なお、この実施例で用いたＰＭＭＡの平均分子量は１５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、担体からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
基板の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部分を除き表面は平坦であった。基板の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、最上部の直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。なお、凸部の最低部（凸部の根本）の直径は０．２３ｍｍと、凸部にテーパーを付け、射出成形後の基板の離型が容易となるようにした。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、さらには、凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところそれぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
上記のＰＭＭＡ基板を１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に６５℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成した。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、本実施例で用いたカーボンブラック入りのＰＭＭＡの平板を、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件で測定したとき、この板の自家蛍光強度は２５０であった。
（プローブＤＮＡの固定化）
そして、配列番号２（６０塩基、５’末端アミノ化）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡは５’末端がアミノ化されている。このＤＮＡを、純水に０．２７ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。基板に点着する際は、ＰＢＳ（ｐＨ５．５）でプローブの終濃度を０．０２７ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をガラス製のキャピラリーに取り、顕微鏡下でこのプローブＤＮＡをＰＭＭＡ基板の凸部上の４箇所に点着した。次いで、この基板を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、その後純水で洗浄した。
（検体ＤＮＡの調整）
実施例１と同様に行った。
（ハイブリダイゼーション）
前述の（検体ＤＮＡの調整）で調整したＤＮＡ溶液を１０μｌ取りだし、これに３０μｌの、１重量体積％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．１重量体積％ＳＤＳ、０．０１重量体積％サケ精子ＤＮＡの溶液を加え、トータルで４０μｌとした（すなわち、実施例１や２と比較すると、検体の濃度は１／４であるが、トータルの検体量は実施例１と同じとなる）。そして、これを前述したＤＮＡが固定化された担体の凹凸部分に滴下して、注意深くカバーガラスをかぶせた。そして、カバーガラスの周りをペーパボンドでシーリングして、ハイブリダイゼーション溶液が乾かないようにした。すなわち、検体ＤＮＡの分子量を実施例１や比較例１と同じにした。これをプラスチック容器に入れて、湿度１００％、温度６５℃の状態で１０時間インキュベートした。インキュベート後、カバーガラスを剥離して、洗浄・乾燥した。
（測定）
実施例１と同じ条件にて、スキャナーにより蛍光測定を行った。その結果を表４に示す。
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これから、蛍光強度については実施例２とほぼ同一であるが、ノイズについては実施例２よりもさらに低下した。
【実施例７】  次いで、凸部の高さがばらついた場合について実験を行った。実施例６で用いたＰＭＭＡの射出成形品の凸部をラッピングペーパーで削り、凸部上面の高さに差を設けた。すなわち、他の凸部上面（基準となる凸部）よりも、３０μｍ低い凸部（４箇所）がある担体（担体ア）、他の凸部上面よりも、５０μｍ低い凸部（４箇所）がある担体（担体イ）をそれぞれ作製した。なお、これら担体の低い部分以外の凸部（基準となる凸部）上面の高さと、平坦部分の高さの差は３μｍ以下であった。実施例６と同様に、点着するプローブＤＮＡの調整を行った。ついで、基準となる凸部上面に４箇所、低い凸部上面に４箇所にプローブＤＮＡ溶液の点着を実施例６と同様に行った。さらに、ハイブリダイゼーション用のＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を実施例６と同様に行い、測定も実施例６と同様に行った。基準となる凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平均値、高さが低い凸部上面の蛍光強度の平均値とその周りのノイズの平均値を表５に示す。
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このように、凸部の高さにばらつき（５０μｍ以下）があっても、比較例と比べると十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
【実施例８】  さらに、凸部上面と平坦部の差がある場合について検討した。実施例６で用いたＰＭＭＡの射出成形品の平坦部をラッピングペーパーで削り、平坦部上面と凸部上面の高さの差が３０μｍ（担体ウ）、５０μｍ（担体エ）の２種類の担体を作製した。すなわち、担体ウは凸部の高さが平坦部の高さより３０μｍ高いことになる。実施例６と同様に、点着するプローブＤＮＡの調整、凸部上面へのプローブＤＮＡ溶液の点着、ハイブリダイゼーション用ＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーションの操作を行い、実施例６と同様に測定を行った。なお、上面にＤＮＡ溶液をスポットした凸部はそれぞれの基板について４カ所である。そして、ＤＮＡを点着したスポット（４カ所）の蛍光強度と、その周りのノイズ（４カ所）の平均値を求めた。その結果を表６に示す。
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このように、平坦部上面と凸部上面との高さに差（５０μｍ以下）があっても、比較例と比較するれば十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
【実施例９】  ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、ポリフェニルメタクリレートの平板をキャスト法で作製し、これを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に５０℃で１０時間浸漬した。次いで、純水、０．１Ｎ  ＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。このようにして、板表面のポリマーの側鎖を加水分解して、カルボキシル基を生成した。
プローブＤＮＡの固定化（ただし固定化したプローブＤＮＡは６０塩基長のみである）、検体ＤＮＡの調整、ハイブリダイゼーション、測定を実施例１と同様に行った。その結果を表７に示す。
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このように、比較例と比べると十分に大きなＳ／Ｎが得られていることがわかる。
【実施例１０】  （ＤＮＡ固定化担体の作製）
実施例６と同様の基板を作製した。ついで、この基板上にスパッタ法によりＮｉ−Ｃｒ（組成はＮｉ８Ｃｒ２）を５０ｎｍ作製した。別途、クロロホルム１０ｍＬ中に上記基板（Ｎｉ−Ｃｒ膜は設けていない）を粉砕したものを１ｇの割合で溶かした溶液を用意した。そして、これをスピンコート法により塗布して、Ｎｉ−Ｃｒ膜上に黒色のＰＭＭＡ膜からなる絶縁層を作製した。ついで、研磨機により、凸部上面の絶縁層、Ｎｉ−Ｃｒ膜を除去した後、６５℃の１０ＮのＮａＯＨ溶液に浸漬したあと、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄した。そして、プローブＤＮＡの固定化、検体ＤＮＡの調整は、実施例６と同様に行った。
（ハイブリダイゼーション）
カバーガラスにクロムを５ｎｍ、金を１００ｎｍ蒸着した。これに金線をはんだで付けた。一方、先に用意した核酸が固定化されている担体の凹凸部分に、ハイブリダイゼーション用の溶液を５０μｌ加え、カバーガラスの金の面が担体の凹凸部分に向くようにして、上記のカバーガラスをかぶせた。この時、担体の金とカバーガラスの金が電気的にショートしないように、高さ０．２ｍｍのスペーサーを間に入れた。カバーガラスの周りをペーパーボンドでシールし、ハイブリダイゼーションの溶液が乾燥しないようにした。
ついで、担体のＮｉ−Ｃｒ膜と電源の陽極が電気的に導通するように、金線および市販の銀ペーストを用いて接続し、カバーガラスの金（金線）を電源の陰極につないだ。これを６５℃のオーブンに入れ１５分間インキュベートした。そして、電源から１Ｖの電圧を５分間印加した後、オーブンから取りだし、カバーガラスを剥離後に洗浄、乾燥した。
その結果、実施例６と同様な結果が得られた。このように、ハイブリダイゼーション時間が短くとも、凸部の側面に電極を設けて電界を印可することによりハイブリダイゼーションの時間を短くできる。
比較例４
ポリアクリロニトリルを主成分とする１ｍｍ厚の板（三井化学（株）製  ゼクロン）を７５ｍｍ×２５ｍｍの大きさに切断した。これを１０ＮのＮａＯＨに浸漬し、７０℃で１２時間放置した。これを洗浄後、実施例１と同様にプローブＤＮＡの固定化（プローブＤＮＡの塩基長は６０塩基）、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションとを行った。実施例１と同様に測定した結果、自家蛍光が大きく、検体とプローブとのハイブリダイゼーションの有無を検出することが不可能であった。これは、板自体が黄色みを帯びているいるため、自家蛍光が非常に大きいためである。なお、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件でアルカリ処理前の平板を測定したとき、この板の自家蛍光強度は３００００と非常に大きかった。
比較例５
メチルメタクリレート（ＭＭＡ）９９重量部とメタクリル酸１重量部とを共重合した。これを精製した後、溶媒にとかし、ディッピング法によりＰＭＭＡからなる板の上に、このポリマーからなる膜を作製した。アルカリに浸漬することを省いたこと以外は、実施例１と同様にこの膜上でのプローブＤＮＡ（６０塩基長）の固定化、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションとを行い、実施例１と同様に測定を行った。その結果、シグナルは６０００、ノイズは３００であった。
【実施例１１】  メチルメタクリレート（ＭＭＡ）９９重量部とメタクリル酸１重量部とを共重合した。これを精製した後、溶媒にとかし、ディッピング法によりＰＭＭＡの板の上に、この共重合ポリマーからなる膜を作製した。これを５０℃で１０時間アルカリに浸漬した以外は、実施例１と同様にこの膜上でのプローブＤＮＡ（６０塩基長）の固定化、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションとを行い、実施例１と同様に測定を行った。その結果、シグナルは１５０００、ノイズは１５０であった。比較例５より本実施例が優れている理由は、アルカリ処理を行うことにより、担体表面のカルボキシル基量が増えたためであると推定される。なお、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）９９重量部とメタクリル酸１重量部とを共重合したポリマーからなる１ｍｍ厚の板をキャスト法により作製し、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂを用いて、励起波長５３２ｎｍ、フォトマルチプライヤーの設定ゲインを７００、レーザーパワーを３３％の条件でアルカリ処理を未実施の平板を測定したとき、この板の自家蛍光強度は８５０であった。
比較例６
実施例１のアルカリ処理（水酸化ナトリウムに浸漬すること）を省いた以外は、同様な実験を行った。そのところ、ハイブリダイゼーションを示す蛍光は観察されなかった。これは、アルカリ処理品や酸での表面処理を行わないと、カルボキシル基が十分に生成されず、結果的に固定化されるプローブＤＮＡが非常に少ないことが原因であると考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明により、非特異的な検体の吸着が少なく、かつ、ハイブリダイゼーション効率が良好であり、結果的にＳ／Ｎ比が良好な選択結合物質が固定化された担体を提供することができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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