(57)【要約】本発明の目的は、光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造するための新規な製造方法を提供することである。本発明によれば、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物を使用して、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することを含む、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物を使用して、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することを含む、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法。
【請求項２】
ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物の菌体またはその処理物、該微生物の培養液、または該微生物が産生するケトン基を水酸基に還元する活性を有する酵素と１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンとを接触させてケトン基の還元反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該微生物が、糸状菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該微生物が、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトミセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属およびディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
該微生物が、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリカム・アルミラリエ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｒｍｉｌｌａｒｉａｅ）、ガラクトミセス・ゲオトリカム（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ガラクトミセス・レッシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｅｓｓｉｉ）、およびエンドミセス・ゲオトリカム（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に立体選択的に還元して、光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６の何れかに記載の方法により１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造し、次いで、製造した１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを用いてプロスタグランジン誘導体を製造することを含む、プロスタグランジン誘導体の製造方法。
【請求項８】
１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することにより１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造するための、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、医薬品の原料として有用な光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法に関する。
【背景技術】  プロスタグランジン類は微量で種々の重要な薬理学的、生理学的作用を発揮することから多数の誘導体の合成がなされ、生物活性の検討がなされてきた。このようなプロスタグランジン誘導体の１つとしてオメガ鎖の１３−１４位に三重結合を有し、末端にシクロヘキシル基を有するプロスタグランジンＥ誘導体がある（特開平７−２３３１４４号公報など）。かかるプロスタグランジンは製造工程も多く、医薬品として開発するためには安価な原料の供給が必要である。
プロスタグランジン誘導体を製造する上での原料の１つとして１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールがある。この化合物の製造法としては、これまで有機化学合成または酵素学的合成の手段を用いた製造法が知られている（米国特許第４，６０８，３８８号公報、および特開平３−２５９０９４号公報）。
しかし、有機化学合成方法は高価な光学分割剤もしくは触媒等を使用する必要があることや生成物の光学純度が低いことなどの問題があり、酵素を用いた製造法（不飽和アルコールエステルを加水分解し、光学活性な不飽和アルコールを得る）についても化学収率、および光学純度の点でなお問題を有する。
一方、有機化合物合成に微生物反応を利用することがある。微生物変換による有機化合物合成の例としては、例えば、ノカルジア属とストレプトミセス属微生物を用いたビタミンＤの水酸化反応やキャンデイダ属微生物やゲオトリカム属の菌体パウダーを用いたケトン体から光学活性なアルコールを得る還元反応を挙げることができる（特開平６−２２５７７７号公報、特開平９−２３４０８８号公報、および特開平２−４６９号公報）。
しかし、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンでは変換反応が進むか否か不明であり、特に光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造法についてはこれまで報告がない。
【発明の開示】
本発明の目的は、光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造するための新規な製造方法を提供することである。本発明の別の目的は、本発明の方法により製造した１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを用いてプロスタグランジン誘導体を製造する方法を提供することである。
本発明者らは、上記目的を達成するべく鋭意研究を行った結果、特定の微生物等を利用することにより、光学純度の高い１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物を使用して、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することを含む、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法が提供される。
好ましくは、本発明の方法は、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物の菌体またはその処理物、該微生物の培養液、または該微生物が産生するケトン基を水酸基に還元する活性を有する酵素と１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンとを接触させてケトン基の還元反応を行うことを含む。
好ましくは、該微生物が、糸状菌である。さらに好ましくは、該微生物は、ゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトミセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属およびディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属からなる群より選ばれる１種以上の微生物である。特に好ましくは、該微生物は、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリカム・アルミラリエ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｒｍｉｌｌａｒｉａｅ）、ガラクトミセス・ゲオトリカム（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）、ガラクトミセス・レッシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｅｓｓｉｉ）、およびエンドミセス・ゲオトリカム（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）からなる群より選ばれる１種以上の微生物である。
好ましくは、本発明の方法においては、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に立体選択的に還元して、光学活性な１−ジクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造する。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造し、次いで、製造した１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを用いてプロスタグランジン誘導体を製造することを含む、プロスタグランジン誘導体の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することにより１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造するための、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＩＦＯ４５９７株を用いて反応して得られた各光学活性なシクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）を示す。
図２は、ＩＦＯ４５９７株を用いて反応して得られた各光学活性なシクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明による１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの製造方法は、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物を使用して、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することを特徴とする。
本発明に使用される微生物は、所望の還元活性を有するものであれば特に限定されないが、好ましくは糸状菌であり、さらに好ましくはゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ）属、ガラクトミセス（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ）属またはディポダスカス（Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ）属である。最も好ましくは、ゲオトリカム・キャンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）ＩＦＯ４５９７、ＩＦＯ４５９９、ＩＦＯ４６０１、ＩＦＯ５７６７、ＩＦＯ９５４０、ＩＦＯ３１８１０、ＪＣＭ１７４７、ＪＣＭ５２２２、ＪＣＭ６２５９、ＪＣＭ６２６３、ゲオトリカム・アルミラリエ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ａｒｍｉｌｌａｒｉａｅ）ＪＣＭ２４５４、ガラクトミセス・ゲオトリカム（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）ＪＣＭ１９４５、ガラクトミセス・レッシイ（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｅｓｓｉｉ）ＪＣＭ１９４４、エンドミセス・ゲオトリカム（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）ＩＦＯ９５４１、ＩＦＯ９５４２である。これらはいずれも理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）または財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）の保存株であり、容易に第三者が入手することができる。
また、これらの微生物の有する還元酵素の遺伝子を導入した微生物であって、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に立体選択的に還元する微生物を用いることもできる。
あるいはまた、スポロボロマイセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属酵母由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子（特開平０８−１０３２６９号公報）やキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母由来のカルボニルレダクターゼ遺伝子（米国特許第６，２１８，１５６号公報）を導入した細胞を用いることもできる。
また、微生物の菌体または胞子を例えば紫外線照射処理やＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏ−Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，１−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）処理等をすることによって変異させ、より好ましい微生物を取得して得ることもできる。
本発明における反応に必要な微生物の菌体を得るためには、好気条件下で菌株の培養を培地中で行う。培地は主として液体培地を用い、炭素源としてグルコース、マルトース、デキストロース、スターチ、オートミール、アラビノース、キシロース、シュクロース、を単独または混合して用いる。窒素源としては、ペプトン、カゼイン、ポリペプトン、大豆ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカー、マルトエキス、綿実粕、グルテンミールおよび大豆粉などを単独または混合して用いる。以上に換えて、市販の混合培地（栄研製ＧＰ培地など）を用いてもよい。その他、本菌株の生育を助け光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの生産を促進する有機物および無機物を必要により添加することができる。
培養方法としては、振とう培養、通気攪拌培養などの好気的条件下、ｐＨ５〜８、２２〜３０℃で１〜５日間培養することが好ましい。
本発明においては、上記した培養により得られた微生物の菌体またはその処理物、該微生物の培養液、または該微生物が産生するケトン基を水酸基に還元する活性を有する酵素を使用することによって、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの（Ｓ）体または（Ｒ）体すなわち光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造する反応を行う。
反応に用いる菌体は、生菌体のままで使用してもよく、菌体処理物、例えば、菌体破砕物、凍結乾燥などの処理を施した処理物を使用してもよい。また、上記微生物の培養液を使用することもでき、さらにまた上記微生物が産生するケトン基を水酸基に還元する活性を有する酵素を使用することもできる。上記酵素は、慣用の方法を適宜組み合わせて精製することにより得ることができる。上記した微生物菌体やその菌体が産生する酵素は、光架橋性樹脂プレポリマー、たとえばＥＮＴ３４００（商品名；関西ペイント（株）製）などや、ウレタン・プレポリマー、たとえばＰＵ−９（商品名；東洋ゴム製）などやκ−カラギナンなどの多糖類に固定化してから反応に用いることもできる。反応系における菌体濃度は、目的化合物の光学純度および反応速度が低下しない範囲で適宜選択できる。
上記の通り、本発明においては、培養により得られた微生物の菌体そのものを使用する以外に、例えば、培養中の菌体を含む培養液に基質を添加するか、培養終了後、遠心分離または濾過により分離した菌体を破砕処理してその産生する酵素を抽出しこれに基質を添加して反応することもできる。また、反応液中にα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等のシクロデキストリン類や、アンバーライトＸＡＤ−７（商品名；オルガノ（株）製）等の吸着剤等の有機物、あるいはツイーン８０等の界面活性剤や塩化マグネシウムなどの無機塩を、反応を促進させる目的で添加することができる。
本発明において用いられる反応溶液は、前記培地を用いて培養した培養液であるか、あるいはトリス酢酸、トリス塩酸、コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸カリウム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン酸、カリウムおよびナトリムなどのリン酸塩、カコジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾール−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの緩衝液を単独または混合したものである。その他、溶液には目的の光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの生産を促進させる有機物、界面活性剤および無機塩を必要により添加することができる。
本発明においては、前記菌体を含有する溶液中で振とう操作、通気攪拌培養操作等に付して好気条件下で行うことが適しており、ｐＨ５〜９、１８〜３７℃で１〜１０日間振とう攪拌するととが好ましい。また、必要により酸素気流下またはアルゴンや窒素などの不活性ガス気流下で反応することができる。基質は振とう攪拌開始時に適量添加することが好ましい。
また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合は基質を添加後、さらに上記と同条件下で反応を行う。
これらの反応により製造された光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを単離するには、合成反応液から２級アルコールを単離する一般的な方法に準じて行えばよい。例えば、反応終了後、反応液を酢酸エチル等の有機溶媒で抽出する。この有機溶媒層を分取し濃縮した後、順相シリカゲルカラム（キーゼルゲル６０Ｆ２５４またはローバーカラムＳｉ６０、メルク社製）または逆相シリカゲルカラム（ローバーカラム、リクロプレップＣ１８、メルク社製）を用いて精製することにより、目的の光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを単離することができる。また、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア製）等を用いた分配クロマトグラフィーやシリカゲルの薄層クロマトグラフィーおよびダイヤイオンＨＰ−２０（商品名；三菱化成工業社製）等によっても光学活性な１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを単離することができる。
上記の通り、１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンのケトン基を水酸基に還元することにより１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造するために、ケトン基を水酸基に還元する活性を有する微生物を使用することができる。上記した微生物の使用は、その態様を問わず、全て本発明の範囲内のものとする。
さらに本発明においては、上記の方法により製造した１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを用いてプロスタグランジン誘導体を製造することができる。１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを用いてプロスタグランジン誘導体を製造する方法は公知であり、例えば、Ｆ．Ｓａｔｏ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，５６，３２０５−３２０７、および特許第２９１７５５２号などに記載されている。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００２−３４４７０７号の明細書に開示した内容は全て、本明細書の開示の一部として本明細書中に引用するものとする。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【実施例１】  試験に供する菌株をそれぞれ５０ｍｌの三角フラスコに入れた５ｍｌのＧＰ培地（栄研化学製）に植菌し、１７時間３０℃で通気攪拌培養した。培養後、それぞれの三角フラスコに１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンを２０ｍｇ添加し、引き続き２４時間同じ条件で培養し、微生物変換を行った。
培養終了後、各培養液に酢酸エチル５ｍｌを加えて攪拌し溶媒抽出を行った。抽出後、各酢酸エチル画分を濃縮し、ＴＬＣ分析を行った。
ＴＬＣプレート；シリカゲルＳｉ６０（メルク製）
展開溶媒；ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：４
発色；アニスアルデヒド：濃硫酸：酢酸＝１：２：１００（ホットプレートにて１０５℃加熱処理する）
１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールのラセミ体のＲｆ値：０．３
ＴＬＣ分析の結果、ＴＬＣ上のＲｆ値が標準品のＲｆ値（０．３）と一致し、かつ同じ呈色（橙〜ピンク色）を示したスポットを検出し、還元化合物１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを得た。この１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの検出が顕著であった菌株を以下に挙げる。
2004048586.tif 000002
2004048586.tif 000003
【実施例２】  表３に示した各菌株（菌株番号は表１、２と同じ）を、それぞれ２００ｍｌの三角フラスコに入れた４０ｍｌのＧＰ培地（栄研化学製）に植菌し、１７時間３０℃で通気攪拌培養した。培養後、培養液を遠心分離して菌体を集め、それぞれリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）に４０ｍｌに各菌体を懸濁し別々に２００ｍｌ三角フラスコに入れた。この三角フラスコそれぞれに２００ｍｇの１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンを添加し、３０℃で通気攪拌しながら２４時間インキュベートして、微生物変換を行った。
反応終了後、各菌体懸濁液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて攪拌し溶媒抽出を行った。抽出後、各菌体反応物の酢酸エチル画分を濃縮し、シリカゲルカラム（ローバーカラムサイズＡ、シリカゲル６０、メルク製）に付した（溶出溶媒ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２０、２５０ｍｌ）。実施例１に記したＴＬＣ条件により還元化合物１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを検出させ、この画分を集め濃縮乾固した。
これらをｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝４：１の混合溶媒１．５ｍｌに溶解しキラルカラムを用いたＨＰＬＣ分析による光学純度測定を行った。
カラム：ダイセル化学工業製  キラルセルＯＤ  ４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ（２本直列に接続）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール＝９７／３
流速：  １．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：  ４０℃
波長：  ２２０ｎｍ
保持時間：
（−）−（１Ｓ）−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール：７．４９分
（＋）−（１Ｒ）−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オール：８．２５分
各菌株の菌体反応による１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールの光学純度（エナンチオ過剰率％ｅｅ）を表３に記す。なお、（−）−（１Ｓ）−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを（Ｓ）−体、（＋）−（１Ｒ）−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを（Ｒ）＋体で記した。
2004048586.tif 000004
また、ＩＦＯ４５９７株を用いて得られた化合物のＮＭＲの結果を図１、２に示す。単離した各光学活性なシクロヘキシル−２−プロピン−１−オールのＮＭＲは化学合成で得られた（−）−（１Ｓ）−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールのＮＭＲと完全に一致した。
【産業上の利用可能性】  本発明の方法により１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オンの１位カルボニル基炭素原子を立体選択的に直接還元し、光学純度の高い１−シクロヘキシル−２−プロピン−１−オールを製造することが可能になった。
【図１】
2004048586.tif 000005
【図２】
2004048586.tif 000006
【国際調査報告】
2004048586.tif 000007
2004048586.tif 000008
2004048586.tif 000009
2004048586.tif 000010