(57)【要約】本発明により、生産蛋白質である糖蛋白質の糖鎖構造を制御することが可能な細胞、すなわち、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞、該細胞を用いた糖蛋白質の製造方法、該製造方法で製造された糖蛋白質、ならびにその用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
【請求項２】
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム遺伝子の少なくとも第５エクソン領域を欠失した、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、請求項１〜４のいずれかｌ項に記載の細胞。
【請求項６】
レクチンに耐性である細胞が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンを含む培地で培養した場合に、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞よりも高い生存率を示すことを指標に選択した細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
糖蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
糖蛋白質が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を有さない糖蛋白質である請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
糖蛋白質が、抗体分子である請求項７または８に記載の細胞。
【請求項１０】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、糖蛋白質組成物を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
【請求項１３】
糖蛋白質が、抗体である請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞を用いて作製された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１５】
トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル及びウサギからなる群から選ばれる動物あるいは植物である、請求項１４に記載のトランスジェニック非ヒト動物、またはその子孫。
【請求項１６】
糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した請求項１４または１５に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１７】
糖蛋白質が抗体分子である、請求項１６記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１８】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求項１７に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物から導入した糖蛋白質組成物を含む組織あるいは体液を取得し、取得した組織あるいは体液から目的とする糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質を製造する方法。
【請求項２０】
請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫の糖蛋白質生産細胞を取得し、取得した糖蛋白質生産細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
【請求項２１】
糖蛋白質が抗体である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１１〜１３および１９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
【請求項２３】
請求項１３または２１に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞および該細胞を用いた抗体などの糖蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】  一般的に、医薬品としての適用を考えられている、抗体などの糖蛋白質は、遺伝子組換え技術を用いて作製される。すなわち、動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞などを宿主細胞として用いて抗体などの糖タンパク質が製造されている。糖蛋白質の糖鎖構造は、糖蛋白質を産生する宿主細胞によって異なる。そのため、現状では、必ずしも、最適な薬理活性を有するための糖鎖が糖蛋白質に付加されているとは限らない。
抗体について、花井らは、抗体のＮ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加が抗体の有するＡＤＣＣ活性を５０倍以上低下させることを報告している［ＷＯ００／６１７３９、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７８，３４６６，２００３］。これらの報告は、ヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体のエフェクター機能には糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たすこと、糖鎖の構造が変化すると、エフェクター機能と関連した薬理活性も変化することなどを示している。
糖蛋白質の糖鎖構造は、糖鎖遺伝子、すなわち、糖鎖を合成する糖転移酵素および糖鎖を分解する糖分解酵素をそれぞれコードする遺伝子、また、糖鎖への糖の供与体となる細胞内糖ヌクレオチドの生合成、ゴルジ体への輸送などの各機能を担った蛋白質をコードする遺伝子の発現により規定されている。これまでに、これらの糖鎖の修飾に関与する酵素または蛋白質をコードする遺伝子を宿主細胞へ導入したり変異を与えたりすることで、その宿主細胞が生産する糖蛋白質の糖鎖構造を制御できる可能性が示されている。
糖鎖の修飾に関与する酵素をコードする遺伝子（以下、「糖鎖の修飾に関与する酵素遺伝子」と称す）を生産細胞へ導入することによって、生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変することが試みられている。具体的には、１）ラットのβ−ガラクトシドα２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をＣＨＯ細胞に導入することにより、糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が可能であること［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６１，１３８４８，１９８９］、２）ヒトのβ−ガラクトシド２−αフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をマウスＬ細胞に導入することにより、糖鎖の非還元末端にフコース（以下、Ｆｕｃとも表記する）が付加されたＨ抗原（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−）の発現が可能であること［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２５２，１６６８，１９９１］、３）β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）をコードする遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を生産することにより、Ｎ−グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置するＮ−アセチルグルコサミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること［ＷＯ９９／５４３４２、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ），５，８１３（１９９５）］が報告されている。ＧｎＴＩＩＩをコードする遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させた場合には、親株で発現させた抗体と比べて１６倍高いＡＤＣＣ活性を示したが、ＧｎＴＩＩＩあるいはβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ（ＧｎＴＶ）の過剰発現はＣＨＯ細胞に対して毒性を示すと報告されている。
糖鎖の修飾に係わる蛋白質または酵素をコードする遺伝子の活性が変化した突然変異体は、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  ｌｅｃｔｉｎ）などのレクチンに耐性を示す株として取得されている［ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，１９８６］。このように糖鎖の修飾に係わる酵素または蛋白質をコードする遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として用いることにより、糖鎖構造が変化した糖蛋白質が生産される事例が報告されている。具体的な例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｉ（ＧｎＴＩ）の活性が欠損しているＣＨＯ細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する抗体を生産した報告を挙げることができる［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。また、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターまたはＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、糖鎖非還元末端側にシアル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体またはガラクトースの付加のない抗体を生産した例が報告されているが、これらはいずれも医薬品として適当な程度のエフェクター作用を向上させた抗体を発現させていない［ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６０，３３９３，１９９８］。このような中、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ  ｎｏｖｏ合成経路において、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの活性が低下した株を宿主細胞として用いることで、ＡＤＣＣ活性の高い抗体を生産できることが報告されている［ＷＯ００／６１７３９、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７８，３４６６，２００３、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２７７，２６７３３，２００２］。これら報告では、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を示す株、例えば、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＡＡＬ株、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）に耐性を示すＣＨＯ−ＬＣＡ株あるいはＬｅｃ１３株が宿主細胞として用いられている。また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの活性が低下した株としては、この他にも、マウス白血病由来の細胞株ＢＷ５１４７のＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａｌｅｃｔｉｎ）耐性変異株として樹立されたＰＬＲ１．３が知られている［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２５５，９９００，１９８０］。しかしながら、これらの株はいずれも完全な遺伝子欠損体ではないため、抗体が高いＡＤＣＣ活性を示す原因となってぃる糖鎖構造、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの付加を完全に抑制することが困難である。特に、ＰＬＲ１．３やＬｅｃ１３株などの変異株は、変異剤処理によりランダムに変異を導入することで取得されており、医薬品製造に用いる株として必ずしも適した性質を有しているとは言い難い。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼをコードする遺伝子を標的とし、遺伝子工学的な手法を用いて標的遺伝子のみを破壊したノックアウト動植物の作製に関する報告はなく、そのようなノックアウト個体を用いた糖蛋白質の生産に関する報告もない。
細胞により生産される糖蛋白質に付加された糖鎖構造を改変するために、宿主細胞の糖鎖の修飾に関与する酵素や蛋白質の活性を制御する試みがなされている。しかしながら、実際には糖鎖の修飾機構は多様かつ複雑であり、かつ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。
【発明の開示】
医薬開発上有用な抗体などの糖蛋白質を生産することが可能な宿主細胞の開発が求められている。従って、本発明は、生産蛋白質である糖蛋白質に修飾された糖鎖構造を制御することが可能な細胞、すなわち、高い薬理活性を保持した糖蛋白質を生産することが可能な細胞、該細胞を用いた糖蛋白質の製造方法、該製造方法で製造された糖蛋白質を提供する。
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞。
（２）  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた、上記（１）に記載の細胞。
（３）  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム遺伝子の少なくとも第５エクソン領域が欠失した、上記（１）または（２）に記載の細胞。
（４）  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素が、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼである、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞。
（５）  Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の細胞。
（６）  レクチンに耐性である細胞が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンを含む培地で培養した場合に、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞よりも高い生存率を示すことを指標に選択した細胞である、上記（５）に記載の細胞。
（７）  糖蛋白質をコードする遺伝子を含む上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞。
（８）  糖蛋白質が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を有さない糖蛋白質である上記（７）に記載の細胞。
（９）  糖蛋白質が、抗体分子である上記（７）または（８）に記載の細胞。
（１０）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、上記（９）に記載の細胞。
（１１）  上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の細胞を用いることを特徴とする、糖蛋白質組成物を製造する方法。
（１２）  上記（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取し、精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
（１３）  糖蛋白質が、抗体である上記（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）  上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の細胞を用いて作製された、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１５）  トランスジェニック非ヒト動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル及びウサギからなる群から選ばれる動物である、上記（１４）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１６）  糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した上記（１４）または（１５）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１７）  糖蛋白質が抗体分子である、上記（１６）記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１８）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、上記（１７）に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫。
（１９）  上記（１４）〜（１８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を飼育し、飼育した動物あるいは植物から導入した糖蛋白質組成物を含む組織あるいは体液を取得し、取得した組織あるいは体液から目的とする糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質を製造する方法。
（２０）  上記（１４）〜（１８）のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫の糖蛋白質を生産する細胞を取得し、取得した糖蛋白質を生産する細胞を培地に培養し、培養物中に糖蛋白質組成物を生成蓄積させ、該培養物から糖蛋白質組成物を採取精製する工程を含む、糖蛋白質組成物を製造する方法。
（２１）  糖蛋白質が抗体である、上記（１９）または（２０）に記載の方法。
（２２）  上記（１１）〜（１３）および（１９）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法を用いて製造される糖蛋白質組成物。
（２３）  上記（１３）または（２１）に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。
（２４）  上記（２２）または（２３）に記載の組成物を有効成分として含有する医薬。
本発明の、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞（以下、「本発明の細胞」と表記する）としては、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失するようにゲノム遺伝子が改変された細胞があげられる。
ここで、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失するようにゲノムが改変されたとは、該酵素の発現を欠失させるように該酵素をコードする遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、または該酵素の機能を欠失させるように該酵素をコードする遺伝子のアミノ酸配列に変異を導入することをいう。変異を導入するとは、ゲノム上の塩基配列を欠失、置換、挿入および／または付加させるといった塩基配列の改変を行うことをいう。このように改変されたゲノム遺伝子の発現または機能が完全に抑制されることをゲノム遺伝子がノックアウトされるという。ゲノム遺伝子がノックアウトされる具体的な例としては、標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから欠失させた例があげられる。具体的には、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子において、ＡＴＧ領域、触媒活性部位、プロモーター領域などに相当するゲノムの一部または全てを染色体上から欠失させること、またはこれらの対立遺伝子のすべてを欠失させることなどがあげられ、具体的には少なくとも第５エクソンのゲノム領域を染色体上から欠失させた細胞、または対立遺伝子のすべてを欠失させることなどがあげられる。
したがって、本発明の細胞としては、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の、ゲノム上の対立遺伝子のすべてがノックアウトされた細胞、該酵素のＡＴＧ領域、触媒活性部位、プロモーター領域などに相当するゲノムの一部または全てを染色体上から欠失させること、または対立遺伝子のすべてを欠失させた細胞、具体的には少なくとも第５エクソンのゲノム領域を染色体上から欠失させた細胞などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素とは、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する酵素活性を有する酵素をいう。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼなどがあげられる。
本発明において、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼとしては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）あるいは（ｆ）のＤＮＡがコードする蛋白質、または下記（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）、（ｎ）あるいは（ｏ）の蛋白質などがあげられる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｅ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｆ）配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｇ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｊ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｋ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｌ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｍ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｎ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
（ｏ）配列番号６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質
また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡとしては、配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡなどがあげられる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば配列番号１、２または３で表される塩基配列を有するＤＮＡなどのＤＮＡまたはその一部の断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡがあげられる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、配列番号１、２または３で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明において、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質とは、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる蛋白質をいう。欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、本発明において、配列番号４、５または６で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ活性を有する蛋白質とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号４、５または６に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上である蛋白質であることをいう。
本発明の細胞を取得する方法としては、目的とするゲノムの改変を行うことができれば、いずれの手法でも用いることができるが、遺伝子工学的な手法が望ましい。その具体的な手法としては、
（ａ）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
（ｂ）ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素についての突然変異を導入する手法などがあげられる。
また、本発明の細胞は、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する方法を用いることにより、選択することができる。
レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞をいう。有効濃度とは、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞（以下、親株とも称す）が正常に生育できない濃度以上であり、好ましくは、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生育できない濃度と同濃度、より好ましくは２〜５倍、さらに好ましくは１０倍、最も好ましくは２０倍以上の濃度をいう。
本発明において、生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよいが、通常１０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などがあげられる。
本発明の細胞としては、糖蛋白質を発現できる細胞であればいかなる細胞でもよいが、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などがあげられ、これらの細胞の具体的な例としては、後述の３．に記載の細胞があげられる。動物細胞の具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳＯ細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、抗体を生産するハイブリドーマ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞、植物細胞などがあげられる。好ましくは、抗体などの製造に用いられる、上述のミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞、ヒト化抗体あるいはヒト抗体を製造するための宿主細胞、ヒト抗体を生産するヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、ならびにヒト化抗体およびヒト抗体を生産するトランスジェニック植物を製造するために用いる植物細胞などがあげられる。
また、本発明の細胞としては、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する糖蛋白質組成物、例えば抗体組成物より、抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物を生産する能力を有する細胞に関する。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞とは、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子をノックアウトさせるための手法を施す前の細胞をいう。ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞としては、特に限定はないが、例えば、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のＮＳＯ細胞としては、バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），１０，１６９（１９９２）、バイオテクノロジー・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．），７３，２６１，（２００１）等の文献に記載されているＮＳＯ細胞があげられる。また、理化学研究所細胞開発銀行に登録されているＮＳＯ細胞株（ＲＣＢ０２１３）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞としては、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１２６，３１７，（１９８１）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２７６，２６９，（１９７８）、ヒューマン・アンチィボディズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ），３，１２９，（１９９２）等の文献に記載されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１．１）などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のチャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞としては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，ＩＩ（ｐ８８３−９００）等の文献に記載されているＣＨＯ細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＣＨＯ−Ｋ１株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７８１）や、市販のＣＨＯ−Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  Ｃａｔ＃１１６１９）、あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞としては、Ｙ３／Ａｇｌ．２．３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３１）から樹立された株化細胞が包含される。その具体的な例としては、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９３，５７６（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ，１（１９８１）等の文献に記載されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞があげられる。また、ＡＴＣＣに登録されているＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）あるいはこれら株を様々な無血清培地に馴化させた亜株などもあげられる。
本発明の細胞は、糖蛋白質の糖鎖構造に関与する酵素のうち、フコースの修飾に関する酵素が失活している。したがって、本発明の細胞に糖蛋白質をコードする遺伝子を導入した細胞では、生産された糖蛋白質がフコース付加を受けず、その結果、高い生理活性を有する糖蛋白質組成物を製造することができる。
高い生理活性を有する糖蛋白質組成物とは、受容体との親和性が向上した糖蛋白質組成物、血中の半減期が向上した糖蛋白質組成物、血中投与後の組織分布が変化した糖蛋白質組成物、薬理活性発現に必要な蛋白質との相互作用が向上する糖蛋白質組成物などをいう。
したがって、本発明で生産された糖蛋白質としては、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞で生産した場合、生産された蛋白質の糖鎖構造にフコースの結合を有する糖蛋白質組成物であればいかなる糖蛋白質組成物も含有される。その具体的な例としては、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩＩ、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤｎａｓｅＩ，ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼなどがあげられる。
糖蛋白質に結合する糖鎖は、蛋白質部分との結合様式により、アスパラギンと結合する糖鎖（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）とセリン、スレオニンなどと結合する糖鎖（Ｏ−グリコシド結合糖鎖）の２種類に大別される。これらを総称してグリコシド結合糖鎖という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］、いずれの場合も以下の構造式（Ｉ）に示す共通のコア構造を包含する。
構造式（Ｉ）
2005035741.tif 000002
構造式（Ｉ）において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端が還元末端、反対側が非還元末端という。
Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型糖鎖、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型（以下、複合型とも称す）糖鎖、コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型糖鎖などがあげられる。
Ｏ−グリコシド結合糖鎖としては、Ｎ−アセチルガラクトサミンの還元末端がセリンまたはスレオニンの水酸基とα結合し、更にガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、あるいはシアル酸が結合した糖鎖、キシロースがセリンの水酸基とβ結合した糖鎖、ガラクトースがハイドロキシリジンの水酸基とβ結合した糖鎖などがあげられる。
キシロースがセリンの水酸基とβ結合した糖鎖は、通常、当該キシロースの４位に複数の糖が結合し、結合した糖の先に２糖からなる直鎖状の多糖が結合している。このような糖鎖構造を有する物質としては軟骨プロテオグリカン等があげられる。ガラクトースがハイドロキシリジンの水酸基とβ結合した糖鎖構造を有する物質としては、コラーゲン等があげられる。
糖蛋白質組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖またはＯ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質分子からなる組成物をいう。糖蛋白質に結合する糖鎖は多数存在し、その糖鎖構造は多様性であるために、糖蛋白質の糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明の細胞を用いて製造される糖蛋白質組成物は、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造が結合された糖蛋白質分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造が結合された糖蛋白質分子から構成されていてもよい。
本発明の細胞により生産される糖蛋白質組成物としては、好ましくは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルガラクトサミンへのフコースの結合を有さない糖鎖、およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端へのフコースの結合を有さない糖鎖を有する糖蛋白質組成物があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルガラクトサミンへのフコースの結合を有さない糖鎖、およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端へのフコースの結合を有さない糖鎖を有する糖蛋白質組成物としては、糖蛋白質組成物中に含まれるアミノ酸領域に結合する全グリコシド結合糖鎖のうち、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端にフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％である糖蛋白質組成物があげられる。
フコースが結合していない糖鎖を有する糖蛋白質組成物としては、後述の６に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。
また、本発明において、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いて製造された糖蛋白質組成物も、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する糖蛋白質分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する糖蛋白質分子から構成されていてもよい。そのような糖蛋白質組成物として、好ましくは、糖蛋白質組成物中に含まれるアミノ酸領域に結合する全グリコシド結合糖鎖が、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端にフコースが結合していない糖鎖を有する糖蛋白質組成物があげられる。
ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫（以下、親個体と称す）では、フコース修飾された糖蛋白質組成物が製造される。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫は、本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞を用いて作製することができる。
本発明により生産された糖蛋白質組成物において、糖鎖が結合するアミノ酸領域に結合する全グリコシド結合糖鎖のうち、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端にフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞または親個体が生産する糖蛋白質組成物よりも高い場合、本発明により生産された糖蛋白質組成物は、該細胞または親個体が生産する糖蛋白質組成物より高い生理活性を有する。
グリコシド結合糖鎖を結合する糖蛋白質分子からなる組成物中に含まれる、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖およびＯ−グリコシド結合糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミン非還元末端にフコースが結合していない糖鎖の割合は、糖蛋白質分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］により分析し、決定することができる。
フコースを有さない糖鎖構造を有することにより、その生理活性が大幅に上昇する糖蛋白質のより具体的な例としては、例えば、抗体組成物があげられる。
抗体組成物とは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物をいう。
抗体は、重鎖、軽鎖の２種類のポリペプチド鎖がそれぞれ２分子ずつ会合した４量体である。重鎖のＮ末端側の約４分の１と軽鎖のＮ末端側の約２分の１（それぞれ１００余アミノ酸）は可変領域と呼ばれ、多様性に富み、抗原との結合に直接関与する。可変領域以外の部分の大半は定常領域と呼ばれる。抗体分子は定常領域の相同性によりＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの各クラスに分類される。
またＩｇＧクラスは定常領域の相同性により、さらにＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のサブクラスに分類される。
重鎖はＮ末端側よりＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の４つのイムノグロブリンドメインに分かれ、ＣＨ１とＣＨ２の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域があり、ＣＨ１とＣＨ２とが区切られる。ヒンジ領域以降のＣＨ２とＣＨ３からなる構造単位はＦｃ領域と呼ばれ、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合している。また、この領域は、Ｆｃレセプター、補体などが結合する領域である（免疫学イラストレイテッド原書第５版、２０００年２月１０日発行、南江堂版、抗体工学入門、１９９４年１月２５日初版、地人書館）。
抗体分子のＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が１カ所ずつ結合する領域を有しているので、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。抗体分子に結合するＮ−グルコシド結合糖鎖は様々な構造を有しているが、いずれの糖鎖構造も前記構造式（Ｉ）で示されるコア構造を包含する。抗体に結合する２本のＮ−グルコシド結合糖鎖には多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、本発明の細胞を用いて製造される抗体組成物としては、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。
本発明の細胞で生産される抗体組成物としては、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物があげられる。
本発明の細胞は、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞が生産する抗体組成物より、抗体依存性細胞傷害活性が高い抗体組成物を生産することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖としては、該フコースの１位がＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にα結合していないＮ−グリコシド結合複合型糖鎖があげられる。
また、本発明において、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫を用いて製造された抗体組成物も、本発明の効果が得られる範囲であれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。そのような抗体組成物として、好ましくは、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物があげられる。
抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物としては、抗体組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が１００％である抗体組成物があげられる。
フコースが結合していない糖鎖を有する抗体組成物としては、後述の６に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物、またはその子孫は、本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物細胞を用いて作製することができる。
本発明により生産された得られる抗体組成物において、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、ゲノム遺伝子がノックアウトされる以前の細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも高い場合、本発明により得られる抗体組成物は、該細胞または親個体が生産する抗体分子からなる抗体組成物より高いＡＤＣＣ活性を有する。
ＡＤＣＣ活性とは、生体内で、腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、抗体Ｆｃ領域とエフェクター細胞表面上に存在するＦｃレセプターとの結合を介してエフェクター細胞を活性化し、腫瘍細胞等を傷害する活性をいう［モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｐｔｅｒ  ２．１（１９９５）］。エフェクター細胞としては、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、活性化されたマクロファージ等があげられる。
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合は、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができる。また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］により分析し、決定することができる。
また、本発明の抗体としては、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスはＩｇＧが好ましい。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｅｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨ  ｒ  Ｐ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８，１９９９）、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８，２０００）などがあげられる。
自己免疫疾患（具体的な例としては、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１，２０００）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６，１９９９）などがあげられる。
抗体分子としては、抗体のＦｃ領域を含む分子であればいかなる分子も包含される。具体的には、抗体、抗体の断片、Ｆｃ領域を含む融合蛋白質などがあげられる。
抗体としては、外来抗原刺激の結果、免疫反応によって生体内に生産される蛋白質で、抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよいが、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体のほか、遺伝子組換え技術により作製された抗体、すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体などがあげられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などをあげることができる。
ハイブリドーマは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＮＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーならびにヒト抗体生産トランスジェニック動物あるいはヒト抗体生産トランスジェニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を生産するリンパ球を取得し培養、該リンパ球を培養物中より該抗体を精製することにより得ることができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体生産トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することができる。また、動物の受精卵にヒト抗体遺伝子を導入し、該受精卵を発生させることにヒト抗体生産トランスジェニック動物を作製することもできる。ヒト抗体生産トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。
トランスジェニック非ヒト動物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル又はウサギ等があげられる。
また、本発明において、抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、抗体のクラスがＩｇＧのヒト抗体が好ましい。
抗体の断片は、上記抗体の少なくともＦｃ領域の一部を含んだ断片をいう。Ｆｃ領域とは、抗体のＨ鎖のＣ末端側の領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を意味し、天然型およびその変異型を包含する。少なくともＦｃ領域の一部とは、好ましくはＣＨ２領域を含む断片、より好ましくはＣＨ２領域内に存在する１番目のアスパラギン酸を含む領域をいう。ＩｇＧクラスのＦｃ領域は、カバット（Ｋａｂａｔ）らのＥＵ  Ｉｎｄｅｘ［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），５ｔｈＥｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］のナンバリングで２２６番目のシステインからＣ末端、あるいは２３０番目のプロリンからＣ末端までをいう。抗体の断片としては、具体的には、Ｈ鎖の単量体、Ｈ鎖の２量体などがあげられる。
Ｆｃ領域を有する融合蛋白質としては、抗体のＦｃ領域を含んだ抗体あるいは抗体の断片と、酵素、サイトカインなどの蛋白質とを融合させた物質（以下、Ｆｃ融合蛋白質と称す）であればいかなるものでもよい。
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、以下に述べる手法により作製することができる。
（１）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法
本発明の細胞は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子を標的とし、遺伝子破壊の方法を用いることにより作製することができる。ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼなどがあげられる。
遺伝子破壊の方法としては、標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる方法であればいかなる方法も包含される。その例としては、相同組換え法、ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＲＤＯ）法、レトロウイルスを用いた方法、トランスポゾンを用いた方法等があげられる。以下これらを具体的に説明する。
（ａ）相同組換え法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を標的とし、染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）（以下、「マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル」と略す）、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）（以下、「ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製」と略す）等に記載の染色体工学の手法を用い、例えば以下のように行うことができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のｃＤＮＡを取得する。
取得したｃＤＮＡの塩基配列に基づき、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノムＤＮＡを調製する。
該ゲノムＤＮＡの塩基配列にも基づき、改変する標的遺伝子（例えば、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の構造遺伝子、あるいはプロモーター遺伝子）を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の細胞があげられる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを取得する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ｃＤＮＡの調製方法
各種宿主細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。
調製した全ＲＮＡ又はｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の既知アミノ酸配列、例えばヒトのアミノ酸配列に基づいて、デジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法にて、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子断片を取得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードするｃＤＮＡを取得することができる。
各種宿主細胞のｍＲＮＡは、市販のもの（例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いてもよいし、以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。各種宿主細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５４，３（１９８７）］、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム（ＡＧＰＣ）法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１６２，１５６（１９８７）；実験医学、９，１９３７（１９９１）］などがあげられる。
また、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡとしてｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。
さらに、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）などのキットを用いることによりｍＲＮＡを調製することができる。
次に、調製した各種宿主細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．（１９８９）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ｐｃＤ２［モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］およびｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等をあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための宿主微生物としては、微生物であればいずれでも用いることができるが、好ましくは大腸菌が用いられる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社、ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ６００［ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
このｃＤＮＡライブラリーを、そのまま以降の解析に用いてもよいが、不完全長ｃＤＮＡの割合を下げ、なるべく完全長ｃＤＮＡを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴキャップ法［ジーン（Ｇｅｎｅ），１３８，１７１（１９９４）；ジーン（Ｇｅｎｅ），２００，１４９（１９９７）：蛋白質核酸酵素，４１，６０３（１９９６）；実験医学，１１，２４９１（１９９３）；ｃＤＮＡクローニング（羊土社）（１９９６）；遺伝子ライブラリーの作製法（羊土社）（１９９４）］を用いて調製したｃＤＮＡライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のアミノ酸配列に基づいて、該アミノ酸配列をコードすることが予測される塩基配列の５’端および３’端の塩基配列に特異的なデジェネレイティブプライマーを作製し、作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］を用いてＤＮＡの増幅を行うことにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片がＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードするＤＮＡであることは、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、確認することができる。
該遺伝子断片をＤＮＡプローブとして、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリー対してコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第２版）を行うことにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のＤＮＡを取得することができる。
また、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、各種宿主細胞に含まれるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてスクリーニングを行うことにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のＤＮＡを取得することもできる。
取得したＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードするＤＮＡの塩基配列を末端から、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したｃＤＮＡの塩基配列をもとに、ＢＬＡＳＴ等の相同性検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪなどの塩基配列データベースを検索することにより、データベース中の遺伝子の中でＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードしている遺伝子を決定することもできる。
上記の方法で得られるＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードしている遺伝子の塩基配列としては、例えば、配列番号１、２または３に記載の塩基配列があげられる。
決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２等のＤＮＡ合成機で化学合成することにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のｃＤＮＡを取得することもできる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシーＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、以下に記載の方法があげられる。
ゲノムＤＮＡの調製方法
ゲノムＤＮＡを調製する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒＴＭＫｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）などを用いることにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノムＤＮＡを単離することもできる。
上記の方法で得られるＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノムＤＮＡの塩基配列として、例えば配列番号７、８、９ならびに１０に記載の塩基配列があげられる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、後述の３．に記載の各種細胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（羊土社）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
また、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標として、相同組換え体を取得することもできる。具体的な方法としては、例えば、以下に記載の形質転換体を選択する方法があげられる。
形質転換体を選択する方法
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞を選択する方法としては、文献［新生化学実験講座３−糖質Ｉ，糖タンパク質（東京化学同人）日本生化学会編（１９８８）］、文献［細胞工学，別冊，実験プロトコールシリーズ，グライコバイオロジー実験プロトコール，糖タンパク質・糖脂質・プロテオグリカン（秀潤社製）谷口直之・鈴木明美・古川清・菅原一幸監修（１９９６）］、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。生化学的な方法としては、例えば、酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。遺伝子工学的な方法としては、例えば、酵素遺伝子のｍＲＮＡ量を測定するノーザン解析やＲＴ−ＰＣＲ法等があげられる。
また、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた結果、生じる形質の変化を指標に細胞を選択する方法としては、例えば、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法や、細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法などがあげられる。生産抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、後述の６．に記載の方法があげられる。細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法を挙げることができる。その具体的な例としては、ソマティク・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．），１２，５１，（１９８６）等に記載のレクチンを用いた方法があげられる。
レクチンとしては、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいずれのレクチンでも用いることができるが、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等が好ましい。
具体的には、数十μｇ／ｍｌ〜数ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度の上述のレクチンを含む培地にで１日〜２週間、好ましくは３日〜１週間培養し、生存している細胞を継代培養あるいはコロニーをピックアップし別の培養器に移し、さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、本発明の抗体生産細胞を選択することができる。
（ｂ）ＲＤＯ方法による本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を標的とし、ＲＤＯ法を用い、例えば、以下のように作製することができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを調製する。
調製したｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定したＤＮＡの配列に基づき、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする部分、非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのＲＤＯのコンストラクトを設計し合成する。
合成したＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、すなわちＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、本発明の細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞へのＲＤＯの導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のｃＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の「ゲノムＤＮＡの調製方法」などがあげられる。
ＤＮＡの塩基配列は、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
ＲＤＯは、常法またはＤＮＡ合成機を用いることにより調製することができる。
ＲＤＯを宿主細胞に導入し、標的とした酵素、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。
また、上記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」を用いることもできる。
ＲＤＯのコンストラクトは、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２７３，１３８６，（１９９６）；ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），４，２８５，（１９９８）；ヘパトロジー（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２５，１４６２，（１９９７）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ），５，１９６０，（１９９９）；ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．），７５，８２９，（１９９７）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７７４，（１９９９）；プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），９６，８７６８，（１９９９）；ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．），２７，１３２３，（１９９９）；インベスティゲーション・オブ・ダーマトロジー（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｍａｔｏｌ．），１１１，１１７２，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１６，１３４３，（１９９８）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，４３，（２０００）；ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．），１８，５５５，（２０００）等の記載に従って設計することができる。
（ｃ）トランスポゾンを用いた方法による、本発明の細胞の作製
本発明の細胞は、ネイチャー・ジェネティク（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２５，３５，（２０００）等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性、あるいは生産抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、本発明の細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させることで突然変異を誘発させるシステムであり、通常、トランスポゾンに挿まれた外来遺伝子を、突然変異を誘発させるベクターとして用い、この遺伝子を染色体上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞の中に導入する。
トランスポゼースは、用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいかなるものも用いることができる。
外来遺伝子としては、細胞のＤＮＡに変異を誘起するものであればいかなる遺伝子も用いることができる。
細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、標的とするＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。具体的には、後述の３．に記載の宿主細胞があげられる。
細胞への遺伝子の導入には、後述の３．に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」があげられる。
（２）酵素についての突然変異を導入する手法
本発明の細胞は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子について突然変異を導入し、該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製することができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼなどがあげられる。
具体的には、１）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、２）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、３）突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、該細胞の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、親株の細胞のＤＮＡに点突然変異、欠失あるいはフレームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができる。具体的には、エチルニトロソウレア、ニトロソグアニジン、ベンゾピレン、アクリジン色素による処理、放射線の照射などがあげられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。突然変異誘発物質を細胞に作用させる方法としては、例えば、組織培養の技術  第三版（朝倉書店）日本組織培養学会編（ｌ９９６）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．），２４，３１４，（２０００）等に記載の方法を挙げることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、特別な突然変異誘発処理を施さないで、通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる突然変異体を挙げることができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、生産された抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法としては、例えば、上記１の（１）の（ａ）に記載の、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素活性の変化を指標とした「形質転換体を選択する方法」があげられる。
２．本発明の、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明の、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失するようにゲノム遺伝子が改変されたトランスジェニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫は、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子を標的として、１．に記載の手法を用いて作製した本発明の胚性幹細胞、受精卵細胞、または植物カルス細胞より、公知の方法を用い作製することができる。
ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素としては、具体的には、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼなどがあげられる。
具体的な方法について、以下に記す。
トランスジェニック非ヒト動物の場合、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の胚性幹細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失した本発明の胚性幹細胞を作製することができる。
具体例としては、染色体上のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法［例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等］により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあげられる。作製した胚性幹細胞（例えば、該変異クローン）を用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。このキメラ個体と正常個体を掛け合わせることにより、全身の細胞でＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型、ジーントラップ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等をあげることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（１９９５）等に記載のポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。具体的には、ｈｐｒｔ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ｈｐｒｔ遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導入後、胚性幹細胞をアミノプテリン、ヒポキサンチンおよびチミジンを含む培地で培養し、アミノプテリン耐性の株を選別することにより、ｈｐｒｔ遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。ネオマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、ベクターが導入された胚性幹細胞を、Ｇ４１８を含む培地で培養して、Ｇ４１８耐性の株を選別することにより、ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選択することができる。ＤＴ遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、相同組換え以外のランダムに染色体に挿入された組換え体は、ＤＴ遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、ＤＴの毒性により生育できない。そこで、ベクターが導入された胚性幹細胞を培養し、生育してきた株を選別することにより、ＤＴ遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。選択された細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）やＰＣＲ法［ピーシーアール・プロトコールズ（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］等があげられる。
集合キメラ法を用いて胚性幹細胞を受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。注入キメラ法を用いて胚性幹細胞を受精卵に取り込ませる場合には、一般に８細胞期から胚盤胞の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスヘ受精卵を移植する場合には、精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工的に移植および着床させる方法が好ましく、偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得られるが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（以下、ＬＨＲＨと略する）あるいはその類縁体を投与後、雄マウスと交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌マウスを得ることもできる。ＬＨＲＨの類縁体としては、例えば［３，５−Ｄｉｌ−Ｔｙｒ５］−ＬＨＲＨ、［Ｇｌｎ８］−ＬＨＲＨ、［Ｄ−Ａｌａ６］−ＬＨＲＨ，ｄｅｓ−Ｇｌｙ１０−［Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）６］−ＬＨＲＨｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ等があげられる。
また、目的とする非ヒト動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サル、ウサギ等の受精卵細胞に、１．に記載の手法を用いることにより、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失した本発明の受精卵細胞を作製することができる。
作製した受精卵細胞を、マニピューレーティング・マウス・エンブリオ第２版等に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させることで、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失したトランスジェニック非ヒト動物を作製することもできる。
トランスジェニック植物の場合、目的とする植物体カルス又は細胞に、１．に記載の手法を施すことでＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失した本発明のカルスを作製することができる。
作製したカルスを、公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じてオーキシン及びサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化させ、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の活性が欠失したトランスジェニック植物を作製することができる。
３．糖蛋白質組成物の製造方法
抗体組成物の製造を具体例として、本発明の細胞を用いた糖蛋白質組成物の製造方法を示す。
抗体組成物は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（以下、アンチボディズと略す）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３（以下、モノクローナルアンチボディズと略す）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６（以下、アンチボディエンジニアリングと略す）等に記載された方法を用い、例えば、以下のように抗体分子をコードする遺伝子を導入する宿主細胞中で発現させて取得することができる。
抗体分子のｃＤＮＡを調製する。
調製した抗体分子の全長ｃＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
該ＤＮＡ断片、または全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。
ｃＤＮＡは、上記１．の（１）の（ａ）に記載の「ｃＤＮＡの調製方法」に従い、ヒト又は非ヒト動物の組織又は細胞より、目的とする抗体分子に特異的なプローブプライマーを用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）］に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウィルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ミズクサ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他の蛋白質との融合蛋白質発現等を行うことができる。
糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞等により発現させた場合には、導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付加された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に抗体分子を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、抗体組成物を製造することができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパープルなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マン癌、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地邊［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。フェドバッチ培養、ホロファイバー培養などの培養法を用いて１日〜数ヶ月培養を行うこともできる。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、抗体分子をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、抗体組成物を生成蓄積させ、該培養物より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。
抗体組成物の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法などがあげられるが、使用する宿主細胞や、生産させる抗体分子の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
抗体組成物が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・ハイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体分子をコードするＤＮＡ、および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させることにより、目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体組成物を製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体組成物を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体組成物を採取することにより、該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体組成物を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体組成物を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体組成物を採取することにより、抗体組成物を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成物は、例えば抗体組成物が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
また、抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体組成物の不溶体を回収する。回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体組成物を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。
抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体組成物を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体組成物の精製標品を得ることができる。
このようにして取得される抗体組成物として、例えば、抗体、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合蛋白質などを挙げることができる。
以下に、抗体組成物の製造方法のより具体的な例として、ヒト化抗体およびＦｃ融合蛋白質の組成物の製造方法について記すが、他の抗体組成物等の糖蛋白質を上述の方法および当該方法に準じて取得することもできる。
Ａ．ヒト化抗体組成物の製造
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を生産するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ．ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲとヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲとを単に連結させただけのヒト型ＣＤＲ移植抗体は、その抗原結合活性が元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域では、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用しているアミノ酸残基、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基などを同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ），９，２６６（１９９１）］。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［プロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されていない。現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項３の（５）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項３の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（７）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、本項３の（５）及び（６）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項３の（５）及び（６）でヒト型ｃＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項３の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
（８）ヒト化抗体の安定的生産
本項３の（４）及び（７）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、１．に記載の細胞等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
Ｂ．Ｆｃ融合蛋白質の製造
（１）Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターの構築
Ｆｃ融合蛋白質発現用ベクターとは、ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＦｃ領域としては、ＣＨ２とＣＨ３領域を含む領域のほか、ヒンジ領域、ＣＨ１の一部が含まれるものも包含される。またＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも１つのアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入され、実質的にＦｃγ受容体への結合活性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。それら遺伝子とＦｃ領域を連結する方法としては、各遺伝子配列を鋳型として、ＰＣＲ法（レキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）を行うことがあげられる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐｓＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
（２）ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡの取得
ヒト抗体のＦｃ領域と融合させる蛋白質とをコードするＤＮＡは以下のようにして取得することができる。
目的のＦｃと融合させる蛋白質を発現している細胞や組織よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、目的の蛋白質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、塩基配列より全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、細胞や組織を摘出することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（モレキュラー・クローニング第２版）等があげられる。また、細胞や組織からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（モレキュラー・クローニング第２版；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、細胞や組織から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  ＥＸｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社裴）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ，ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからの目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法により目的の蛋白質をコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体のＦｃ領域と融合させる方法としては、ＰＣＲ法があげられる。例えば、目的の蛋白質の遺伝子配列の５’側と３’側に任意の合成オリゴＤＮＡ（プライマー）を設計し、該プライマーを用いてＰＣＲ法を行うことにより、ＰＣＲ産物を取得する。同様に、融合させるヒト抗体のＦｃ領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設計し、ＰＣＲ産物を得る。このとき、融合させる蛋白質のＰＣＲ産物の３’側とＦｃ領域のＰＣＲ産物の５’側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライマーを設計する。この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、その変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。得られた２種類のＰＣＲ断片を用いてさらにＰＣＲを行うことで、両遺伝子を連結する。もしくは、同一の制限酵素処理をした後にライゲーションすることでも連結することができる。
上記方法により連結された遺伝子配列を、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］あるいはＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７ＤＮＡシークエンサー（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＦｃ融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、目的のアミノ酸配列と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含むＦｃ融合蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
（３）Ｆｃ融合蛋白質の安定的生産
前記の（１）項に記載のＦｃ融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりＦｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのＦｃ融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、Ｆｃ融合蛋白質を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、前記１項に記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Ｆｃ融合蛋白質発現ベクターの導入後、Ｆｃ融合蛋白質を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にＦｃ融合蛋白質を生産蓄積させることができる。培養上清中のＦｃ融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系等を利用してＦｃ融合蛋白質の生産量を上昇させることができる。
Ｆｃ融合蛋白質は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムやプロテインＧカラムを用いて精製することができる（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ８、モノクローナル・アンティボディズ）。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したＦｃ融合蛋白質分子全体の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法（アンチボディズ，Ｃｈａｐｔｅｒ１２、モノクローナル・アンティボディズ）等で測定することができる。
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造することができる。
既に、抗体分子等の糖蛋白質を発現する能力を有している細胞の場合には、上記１．に記載の方法を用いて生産細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体や糖蛋白質を精製することにより、本発明の抗体組成物や糖蛋白質を製造することができる
４．糖蛋白質組成物の活性評価
精製された糖蛋白質組成物の蛋白量、糖蛋白質組成物と受容体との親和性、糖蛋白質組成物の血液中での半減期、体内へ糖蛋白質を投与した後の組織への分布、または薬理活性発現に必要な蛋白質と糖蛋白質組成物との相互作用の変化を測定する方法としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（１９９５）、日本生化学会編  新生化学実験講座１９動物実験法，東京化学同人（１９９１）、日本生化学会編新生化学実験講座８細胞内情報と細胞応答，東京化学同人（１９９０）、日本生化学会編新生化学実験講座９ホルモンペプチドホルモン，東京化学同人（１９９１）、実験生物学講座３アイソトープ実験法，丸善株式会社（１９８２）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５）、酵素免疫測定法第３版，医学書院（１９８７）、改訂版酵素抗体法，学際企画（１９８５）等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、精製された糖蛋白質組成物をラジオアイソトープなどの化合物で標識し、標識された糖蛋白質組成物の受容体あるいは相互作用をする蛋白質との結合活性を定量的に測定する方法があげられる。また、Ｂｉａｃｏｒｅ社のＢＩＡｃｏｒｅシリーズなどの各種装置を用いて、蛋白質と蛋白質との相互作用を測定することもできる（Ｊ．Ｉｍｍｎｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９（１９９１）、実験医学別冊バイオマニュアルＵＰシリーズタンパク質の分子間相互作用実験法，羊土社（１９９６））。
標識された糖蛋白質組成物を生体内に投与することで、血液中での半減期あるいは生体内へ投与後の糖蛋白質の組織への分布を観察することができる。標識体を検出するには、標識物質を検出する方法と検出の対象となる糖蛋白質組成物に特異的な抗体を用いた抗体抗原反応とを組み合わせた検出方法が好ましい。
５．抗体組成物の活性評価
精製された抗体組成物の量、抗体組成物と抗原との結合活性または抗体組成物のエフェクター機能などを測定する方法としては、モノクローナルアンチボディズ、あるいはアンチボディエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、抗体組成物がヒト化抗体の場合、抗体組成物と抗原との結合活性、抗体組成物の抗原陽性培養細胞株に対する結合活性などはＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。また、抗体組成物の抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。
また、抗体組成物のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
６．糖蛋白質組成物の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた糖蛋白質組成物の糖鎖構造は、通常の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。例えば、抗体組成物のＩｇＧ分子に結合している糖鎖はガラクトース、マンノース、フコースなどの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖、シアル酸などの酸性糖から構成されており、糖組成分析および二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
糖蛋白質組成物の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法があげられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｕｃ．Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
（２）糖鎖構造解析
糖蛋白質組成物の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、糖蛋白質をヒドラジン分解して糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
７．本発明の糖蛋白質組成物の利用
本発明の糖蛋白質組成物は、フコースが結合していない糖鎖構造を有しているため、例えば、糖蛋白質組成物に対する受容体との親和性が向上すること、糖蛋白質組成物の血中半減期が向上すること、糖蛋白質組成物を血中に投与した後の組織分布が改善されること、薬理活性に必要な蛋白質との相互作用が向上することなどの効果が期待できる。特に、本発明の抗体組成物は、高いエフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害活性を有する。
上述の生理活性の高い糖蛋白質組成物は、癌、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患、循環器疾患、またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防および治療において有用である。
癌、すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。通常の抗癌剤は癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする。例えば、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体は、殺細胞効果により癌細胞を傷害することにより癌を治療することができるため、通常の抗癌剤よりも治療薬として有効である。特に癌の治療薬において、現状では抗体医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われているが［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８０，１１９７，１９９８］、本発明で生産された抗体組成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、化学療法に対する依存度が低くなり、副作用の低減にもつながる。
炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギーなどの免疫疾患において、それら疾患における生体内反応は、免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起される。例えば、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、アレルギー反応を抑えることができる。
循環器疾患としては、動脈硬化などがあげられる。動脈硬化は、現在バルーンカテーテルによる治療を行うが、治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて抑えることより、循環器疾患を予防および治療することができる。
ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体を用いて抑えることにより、ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防および治療することができる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体、アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、またはウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体の具体例を以下に述べる。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、抗ＧＤ２抗体（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３，３３１，１９９３）、抗ＧＤ３抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０，１９９３）、抗ＧＭ２抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１５１１，１９９４）、抗ＨＥＲ２抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５，１９９２）、抗ＣＤ５２抗体（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８）、抗ＭＡＧＥ抗体（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３，２０００）、抗ＨＭ１．２４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７，１９９９）、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体（Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９，２０００）、抗ＦＧＦ８抗体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１，１９８９）抗塩基性繊維芽細胞増殖因子抗体、抗ＦＧＦ８受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５，１９９０）、抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、抗インスリン様増殖因子抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗インスリン様増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７，１９９５）、抗ＰＭＳＡ抗体（Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６，１９９８）、抗血管内皮細胞増殖因子抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，４５９３，１９９７）または抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８，２０００）、抗ＣＡ１２５抗体、抗１７−１Ａ抗体、抗インテグリンαｖβ３抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＥＧＦ受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＤ１０抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１１３，３７４，２０００）などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、抗インターロイキン６抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン６受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１，１９９４）、抗インターロイキン５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５，１９９２）、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２，１９９１）、抗インターロイキン４受容体抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２１７，４１，１９９８）、抗腫瘍壊死因子抗体（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３，１９９４）、抗腫瘍壊死因子受容体抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７，２０００）、抗ＣＣＲ４抗体（Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，１９９９）、抗ケモカイン抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）、抗ケモカイン受容体抗体（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３，１９９７）、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）、抗ＣＲＴＨ２抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２，１２７８，１９９９）、抗ＣＣＲ８抗体（ＷＯ９９／２５７３４）、抗ＣＣＲ３抗体（ＵＳ６２０７１５５）などがあげられる。
循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８，１９９４）、抗血小板由来増殖因子抗体（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９，１９９１）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００，１９９７）または抗血液凝固因子抗体（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８，２０００）などがあげられる。
自己免疫疾患（具体的な例としては、乾癬、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）に関連する抗原を認識する抗体としては、抗自己ＤＮＡ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，７２，６１，２０００）、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗インテグリンα４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１，４０３，２０００）などがあげられる。
ウイルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、抗ｇｐ１２０抗体（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５，２０００）、抗ＣＤ４抗体（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５，１９９８）、抗ＣＣＲ４抗体、抗ベロ毒素抗体（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６，１９９９）などがあげられる。
上記抗体は、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、理化学研究所細胞開発銀行、工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、あるいは大日本製薬株式会社、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、コスモバイオ社、フナコシ株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。
本発明の糖蛋白質組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造された医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経囗投与をあげることができ、抗体製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。または、ヒト化抗体を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該化合物そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該化合物および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等があげられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられる。
ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、抗腫瘍実験は、文献［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），３６，３７３（１９９３）；キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），５４，１５１１（１９９４）］等記載の方法に従って行うことができる。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】  第１図は、精製した２種類の抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を示した図である。縦軸に細胞傷害活性、横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。□がＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウト株ＣＨＯ  ＳＭ株より得られた形質転換株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株が生産するＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体、■が親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株ＣＨＯ／ＣＣＲ４株が生産するＣＨＯ／ＣＣＲ４抗体の活性を示す。
第２図は、無血清培地に馴化したＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株を用い無血清フェドバッチ培養を行った際の、生細胞密度（Ａ）、細胞生存率（Ｂ）、抗体濃度（Ｃ）の推移を示した図である。各グラフの横軸は、培養開始後の培養日数を示す。□がＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株、■がＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株の結果を示す。
第３図は、フコース非結合型糖鎖の割合が異なる１１種類の抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸にフコース非結合型糖鎖の割合をそれぞれ示す。○は各抗ＣＣＲ４キメラ抗体の結合活性、図中の実線は各抗ＣＣＲ４キメラ抗体の結合活性をもとに作成した検量線をそれぞれ示す。
第４図は、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養から採取したサンプルに含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した図である。縦軸に結合活性、横軸にサンプルを採取した培養開始後の日数をそれぞれ示す。□がＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプル、■がＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプルの活性を示す。
第５図は、プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩの構築を示した図である。
第６図は、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩの構築を示した図である。
第７図は、プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５ＱおよびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの構築を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例１】  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子が発現していない細胞株の取得
１．レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４株の取得
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０））を、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地［ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）］にて接着培養用フラスコ７５ｃｍ２（グライナー社製）中で培養し、コンフルエント直前まで増殖させた。５ｍＬのダルベッコＰＢＳ（以下、ＰＢＳと表記する）（インビトロジェン社製）にて細胞を洗浄後、ＰＢＳで希釈した０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）を１．５ｍＬ添加して３７℃にて５分間放置し、細胞を培養器底面から剥離させた。剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心分離操作により回収し、１×１０５細胞／ｍＬの密度になるようにＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地を添加して懸濁後、未添加又は０．１μｇ／ｍＬのアルキル化剤であるＭＮＮＧ（シグマ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベーター（ＴＡＢＡＩ製）内で３７℃にて３日間放置後、培養上清を除き、再び上述した操作と同様の操作で細胞を洗浄、剥離、回収し、ＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地に懸濁後、接着培養用９６穴プレート（旭テクノグラス社製）に１０００細胞／ウェルの密度で播種した。各ウェルには培地中終濃度で１ｍｇ／ｍＬのレンズマメレクチン（Ｌｅｎｓｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＬＣＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）を添加した。ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２週間培養後、出現したコロニーをレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株として取得した。
２．取得したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼｍＲＮＡの定量
本実施例の１項で取得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株における、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素であるＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼの発現量を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて以下の様に解析した。
（１）レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株からのＲＮＡ調製と一本鎖ｃＤＮＡ
親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、および本実施例の１項で取得した各レクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株それぞれ１×１０７細胞より、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってＲＮＡを調製した。続いて、ＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）を用い、添付の使用説明書に従って各ＲＮＡ５μｇより２０μＬの反応液中にて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたβ−アクチン遺伝子の発現量解析
本項の（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの品質を確かめる目的で、β−アクチンｃＤＮＡがＰＣＲ法によって増幅されるかを、以下の様に検討した。
本項の（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ０．５μＬを鋳型として含む２０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号１１と１２の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを１４サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μＬをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約８００ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。その結果、調製したいずれの細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡを用いても、同程度のβ−アクチンの発現を検出することができた。
（３）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現量解析
次に、本項（１）で収得したそれぞれのレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現量解析を行った。ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のｃＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅するために、配列番号１で示されるＣＨＯ細胞由来のＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのｃＤＮＡ配列より、配列番号１３で示される塩基配列を有する２６ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーと配列番号１４で示される塩基配列を有する２８ｍｅｒの合成ＤＮＡプライマーを作製した。続いて、本項（１）で作製した各細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡ０．５μＬを鋳型として含む２０μＬの反応液［１×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ’ｓ、０．５単位のＥＸ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、０．５μＭの配列番号１３と１４の合成ＤＮＡプライマー］を調製し、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー社製）を用いて、９４℃にて５分間加熱した後、９４℃にて１分間、６８℃にて２分間のサイクルを３０サイクル行なった。上記の該ＰＣＲ反応液１０μＬをアガロース電気泳動した後、サイバーグリーン（ＢＭＡ社製）を用いてＤＮＡ断片を染色し、予想される約４３０ｂｐのＤＮＡ断片量をＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＳＩ（モレキュラーダイナミクス社製）を用いて測定した。その結果、取得したレクチン耐性ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株の中に、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現が観察されない細胞株が存在することを確認した。このＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子の発現が観察されない株をＣＨＯ  ＳＭ株と名付けた。
なお、取得したＣＨＯ  ＳＭ株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、ＣＨＯ  ＳＭ株は、ＬＣＡが認識する糖鎖構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、すなわち、Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基の６位とフコースの１位がα結合で付加された糖鎖構造を認識する他のレクチンに対しても耐性を示した。具体的には、終濃度１ｍｇ／ｍＬのエンドウマメレクチン（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；以下、ＰＳＡと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地、あるいは終濃度１ｍｇ／ｍＬのヒイロチャワンタケレクチン（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ；以下、ＡＡＬと表記、Ｖｅｃｔｏｒ社製）が添加された培地でも耐性を有していた。
【実施例２】  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素の遺伝子が発現していない細胞株のゲノム解析
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞および実施例１で取得したＣＨＯ  ＳＭ株をＩＭＤＭ−ＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）培地を用いて接着細胞培養用Ｔ７５フラスコ（グライナー社製）でコンフルエントに到達する直前まで培養した後、公知の方法［ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３，２３０３，（１９７６）］に従ってゲノムＤＮＡを調製し、ＴＥ−Ｒｎａｓｅ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌ  Ｒｎａｓｅ  Ａ］３００μｌに一晩溶解した。
上記で調製したゲノムＤＮＡ１２μｇを、３種の異なる制限酵素、ＥｃｏＲＩ（宝酒造）、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）、ＢｇｌＩＩ（宝酒造）でそれぞれ消化し、エタノール沈殿法を用いてＤＮＡ断片を回収した後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）［１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ］２０μｌに溶解し、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、公知の方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７６，３６８３，（１９７９）］に従い、ナイロン膜へゲノムＤＮＡを転写した。転写終了後、ナイロン膜に対して８０℃で２時間の熱処理を行った。
次にナイロンメンブレンに転写されたゲノムＤＮＡの品質を確認する目的で、細胞株を問わずゲノム中に存在すると考えられるα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行った。ＦＵＴ８遺伝子を検出するためのプローブは以下のように調製した。まず、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１１に記載のマウスＦＵＴ８  ＣＤＮＡを含むプラスミドｍｆＦＵＴ８−ｐＣＲ２．１  １０μｇを５０μＬのＭ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）に溶解し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）で一晩消化した後、反応液をＨ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）に置換し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）でさらに一晩消化反応を行った。反応終了後、該反応液を２％アガロース電気泳動を行った後、ＦＵＴ８遺伝子エクソン２を含む１５６ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片２５ｎｇに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ  １．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて放射線標識した。
ハイブリダイゼーションを以下のように行った。まず、上記ナイロン膜をローラーボトルへ封入し、ハイブリダイゼーション液［４×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｌｄｔ’ｓ液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ］１５ｍＬを加えて６５℃で３時間のプレハイブリダイゼーションを行った。次に３２Ｐ標識したプローブＤＮＡを熱変性してボトルへ投入し、６５℃で一晩加温した。
ハイブリダイゼーション後、ナイロン膜を２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。上記の洗浄操作を２回繰り返した後、膜を０．２×ＳＳＣ−０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ  ５０ｍＬに浸漬し、６５℃で１５分間加温した。洗浄後、ナイロン膜をＸ線フィルムへ−８０℃で二晩暴露し現像した。現像後、ナイロン漠をストリッピング液［１％ＳＤＳ、０．ｌ×ＳＳＣ］中で煮沸することにより、プローブを剥離させ、再度異なるプローブでのハイブリダイゼーションを行った。
本法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４株およびＣＨＯ  ＳＭ株いずれのゲノムＤＮＡにおいても、ＦＵＴ８遺伝子エクソン２に特異的な断片が検出された。以上の結果よりナイロン膜上に転写されたＣＨＯ  ＳＭ株およびＣＨＯ／ＤＧ４４株由来のゲノムＤＮＡに分解等は見られず、等しい品質を有していた。
一方、ＧＭＤ遺伝子エクソン５に特異的なプローブを以下のように調製した。まず、公知であるヒトＧＭＤゲノムＤＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＴ＿０３４８８０）を基に、エクソン５に特異的に結合するプライマー（配列番号１５および配列番号１６）を設計した。該領域は配列番号２に記載のヒトＧＭＤ  ｃＤＮＡ配列の塩基番号３４６から塩基番号５３８に相当する。次に、ＷＯ０２／３１１４０の実施例１５に記載のプラスミドｐＡＧＥ２４９ＧＭＤを１０ｎｇ含む１００μＬの反応液［ＥｘＴａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰｓ、２．５μｍｏｌ／Ｌ上記遺伝子特異的プライマー（配列番号１５および配列番号１６）］を調製し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間の加熱の後、９４℃で１分間、５８℃で２分間、７２℃で３分間からなる反応を１サイクルとした３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を２％アガロース電気泳動に供し、約２００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。得られたＤＮＡ断片２５ｎｇに対し、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ１．７５ＭＢｑおよびＭｅｇａｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ，ｄＣＴＰ（アマシャムバイオサイエンス）を用いて放射線標識した。該プローブを上記で示したナイロン膜に対してハイブリダイゼーションを行った結果、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のゲノムＤＮＡではＧＭＤ遺伝子エクソン５の特異的断片が見出されたのに対し、ＣＨＯ  ＳＭ株由来のゲノムＤＮＡにおいてはＧＭＤ遺伝子エクソン５の特異的断片が全く検出されなかった。以上の結果からＣＨＯ  ＳＭ株はＧＭＤをコードするゲノム領域のうち、少なくともエクソン５を含む領域を欠損したＧＭＤノックアウト細胞であることが示された。
【実施例３】  ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト，６−デオキシ−ＧＤＰ−マンノースに変換する脱水反応を触媒する酵素のゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞株を用いた抗体の生産
１．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体生産細胞の作製
実施例１で得られた、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウト株ＣＨＯ  ＳＭ株および親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株に、ＷＯ０１／６４７５４に記載の抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ２１６０を導入し、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。
抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ２１６０の４μｇを１．６×１０６細胞へエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により導入後、１０ｍＬのＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）−ＨＴ（１）［ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を１０％、ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを１倍濃度で含むＩＭＤＭ培地］に懸濁し、９６ウェル培養用プレート（岩城硝子社製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、２４時間培養した後、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）（透析ＦＢＳを１０％で含むＩＭＤＭ培地）に培地を交換し、１〜２週間培養した。ＨＴ非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、増殖の認められたウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の発現量を本実施例の２項に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。
培養上清中に抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の生産が認められたウェルの形質転換株については、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、ＭＴＸを５０ｎＭ含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）の培地に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェルプレート（岩城硝子社製）に０．５ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。増殖が認められたウェルの形質転換株については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を２００ｎＭ、５００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＣＨＯ／ＣＣＲ４株、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウト株ＣＨＯ  ＳＭ株より得られた形質転換株をＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株と名付けた。なお、取得したＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株はＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４の株名で、平成１５年９月９日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４７３として寄託されている。
２．培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰＢＳで希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡを１％の濃度で含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、または培養上清から精製した抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度で含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム（和光純薬社製）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を１μＬ／ｍＬで添加した容液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
３．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の精製
本実施例の１項で得られた形質転換株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４株を用いて、それぞれが生産する抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体を以下の様にして精製した。
各々の形質転換株を、ＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地中で、１８２ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）にて５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて培養した。数日後、細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳにて細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）を３５ｍＬ注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法により取得した培養上清より、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＣＲヒト型キメラ抗体は、ＣＨＯ／ＣＣＲ４株より得られた抗体をＣＨＯ／ＤＧ４４抗体と、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株より得られた抗体をＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体とそれぞれ名付けた。
４．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のヒトＣＣＲ４抗原に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
本実施例の３項で精製したＣＨＯ／ＣＣＲ４抗体およびＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体の、ヒトＣＣＲ４抗原に対する結合活性を、以下の様にして測定した。
抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体が反応し得るヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドとして化合物１（配列番号１７）を選択した。ＥＬＩＳＡ法による活性測定に用いるため、以下の方法でＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライテスク社製）とのコンジュゲートを作製し、抗原として用いた。すなわち、１０ｍｇのＢＳＡを含むＰＢＳ溶液９００ｍＬに、１００ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ  ＳＭＣＣ［４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシリックアシッドＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル］（シグマ社製）−ＤＭＳＯ溶液をｖｏｒｔｅｘしながら滴下し、３０分間ゆっくりと攪拌した。２５ｍＬのＰＢＳで平衡化したＮＡＰ−１０カラムなどのゲルろ過カラムに反応液１ｍＬをアプライし、１．５ｍＬのＰＢＳで溶出させた溶出液をＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液とした（Ａ２８０測定からＢＳＡ濃度を算出）。次に、０．５ｍｇの化合物１に２５０ｍＬのＰＢＳを加え、次いで２５０ｍＬ  ＤＭＦを加えて完全に溶解させた後、前述のＢＳＡ−ＳＭＣＣ溶液（ＢＳＡ換算１．２５ｍｇ）をｖｏｒｔｅｘ下で添加して３時間ゆっくり攪拌した。反応液をＰＢＳに対して４℃、一晩透析し、最終濃度０．０５％となるようにアジ化ナトリウムを添加して、０．２２ｍｍフィルターでろ過した後、ＢＳＡ−化合物１溶液とした。
９６穴のＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、上述のように調製したコンジュゲートを０．０５μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、形質転換株の培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。
反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで６０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。本実施例の３項で取得したＣＨＯ／ＤＧ４４抗体とＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体は、ヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドに対して同等の結合活性を有することを確認した。
５．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体のＡＤＣＣ活性の測定
本実施例の３項で得られた２種類の抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品のＡＤＣＣ活性を、ＷＯ０１／６４７５４に記載のヒトＣＣＲ４を高発現させたマウス胸腺種細胞ＥＬ４細胞株であるＣＣＲ４／ＥＬ４細胞を標的細胞として、以下のようにして測定した。
（１）標的細胞溶液の調製
ＣＣＲ４／ＥＬ４細胞を遠心分離操作及び懸濁によりＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地（５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。
（２）ヒトエフェクター細胞溶液の調製
健常人末梢血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製）を用いて使用説明書に従い、遠心分離（８００ｇ、２０分間）して単核球層を分離した。ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２．５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は２５：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体を各最終濃度０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行い、上清のＬＤＨ活性を測定することにより求めた。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
2005035741.tif 000003
第１図に、ＣＨＯ／ＣＣＲ４抗体およびＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体のＣＣＲ４／ＥＬ４細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した。ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウト株ＣＨＯ  ＳＭ株より得られた形質転換株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株が生産するＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４抗体では、ＣＨＯ／ＣＣＲ４抗体と比較して、約１００倍程度のＡＤＣＣ活性の上昇が観察された。なお、本結果は、エフェクター細胞のドナーが異なっても同様であった。
６．抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体の単糖組成分析
本実施例の３項で得られた２種類の抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体精製標品の中性糖・アミノ糖組成分析を、以下の様にして行った。
抗体を遠心濃縮機で減圧下乾固した後、２．０−４．０ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸溶液を加えて１００℃、２−４時間酸加水分解を行い、タンパク質から中性糖・アミノ糖を遊離した。トリフルオロ酢酸溶液を遠心濃縮機で除去し、脱イオン水に再溶解してＤｉｏｎｅｘ社製糖分析装置（ＤＸ−５００）を用いて分析を行った。ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラ厶、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１ガードカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社製）を用い、溶離液として１０−２０ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液、洗浄液として５００ｍＭ水酸化ナトリウム−脱イオン水溶解液を使用して、以下の溶出プログラムで分析した。
2005035741.tif 000004
得られた中性糖・アミノ糖成分のピーク面積から、Ｎ−アセチルグルコサミン比を４とした場合の各成分（フコース、ガラクトース、マンノース）の組成比を算出した。
第２表に、その結果を示した。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株ＣＨＯ／ＣＣＲ４株が生産する抗体の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合は約１５％と見積もられた。一方、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウト株ＣＨＯ  ＳＭ株より得られた形質転換株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株が生産する抗体の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合は有意に高く、フコースが修飾された糖鎖構造は検出限界以下であったことから、ほぼ１００％と見積もられた。
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【実施例４】ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４を用いた無血清フェドバッチ培養
１．ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４の無血清培地への馴化
実施例３の１項で得られた形質転換株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４およびＣＨＯ／ＣＣＲ４の無血清培地への馴化を、以下の様にして行った。
各々の形質転換株を、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に２〜４×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁して接着細胞用７５ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に播種し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて静置培養した。コンフルエントとなった細胞を０．０５％トリプシン（インビトロジェン社製）溶液で剥離し、ＭＴＸを５００ｎＭの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地に懸濁した後、遠心により上清を除去した。得られた細胞を、ＭＴＸ−を５００ｎＭ、Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社製）を６ｍＭの濃度で含むＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）（以下、無血清培地と表記）に５×１０５細胞／ｍＬの密度で懸濁し、該細胞懸濁液１５ｍＬを１２５ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて浮遊旋回培養を行った。３〜４日間隔で継代を繰り返し、最終的には無血清培地で増殖可能な形質転換株を取得した。以下、無血清馴化したＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４株をＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ、無血清馴化したＣＨＯ／ＣＣＲ４株をＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦと表記する。
２．無血清培地に馴化したＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト株ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦを用いた無血清フェドバッチ培養
本実施例の１項で無血清培地に馴化したＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株を用いて、無血清フェドバッチ培養を以下の様にして行った。
フェドバッチ培養の基礎培地には、前項の無血清培地を改変した培地を用い、２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように追添加して使用した（以下、無血清フェドバッチ培養培地と表記）。フィード培地としては、通常の添加濃度よりも高濃度に調製したアミノ酸（Ｌ−アラニン０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン一塩酸０．５９３ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物０．１７７ｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸０．６４６ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸０．５３０ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン５．８４ｇ／Ｌ、グリシン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン一塩酸二水和物０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．７４２ｇ／Ｌ、Ｌ−リジン一塩酸１．０３１ｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン０．２１２ｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン０．４６６ｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン０．２８３ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン０．２９７ｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン０．６７１ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン０．１１３ｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物０．７３５ｇ／Ｌ、Ｌ−バリン０．６６４ｇ／Ｌ）、ビタミン（ｄ−ビオチン０．０９１８ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸カルシウム０．０２８３ｇ／Ｌ、塩化コリン０．０２８３ｇ／Ｌ、葉酸０．０２８３ｇ／Ｌ、ｍｙｏ−イノシトール０．０５０９ｇ／Ｌ、ナイアシンアミド０．０２８３ｇ／Ｌ、ピリドキサール塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、リボフラビン０．００２８３ｇ／Ｌ、チアミン塩酸０．０２８３ｇ／Ｌ、シアノコバラミン０．０９１８ｍｇ／Ｌ）、インシュリン０．３１４ｇ／Ｌから構成されたものを用いた。
ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株を、３×１０５細胞／ｍＬの密度で無血清フェドバッチ培養培地に懸濁し、該細胞懸濁液４０ｍＬを２５０ｍＬ三角フラスコ（コーニング社製）に播種した。培養容器の４倍量以上の５％ＣＯ２を通気してフラスコ内の空気を置換した後に密栓し、３５℃、９０〜１００ｒｐｍにて１３日間浮遊旋回培養を行った。培養開始後３日目、６日目、９日目、１１日目に、アミノ酸などの消費量を補う目的でフィード培地を３．３ｍＬ添加し、グルコース濃度を制御する目的で２０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を終濃度５０００ｍｇ／Ｌとなるように添加した。培養開始後０日目、３日目、６日目、９日目、１１日目、１３日目に培養液約２ｍＬを採取し、生細胞密度と細胞生存率をトリパンブルー染色により、各培養上清中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体濃度を実施例３の２項に記載のＥＬＩＳＡ法によりそれぞれ測定した。
結果を第２図Ａ〜Ｃに示した。培養開始後の各時点におけるＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株の生細胞密度（Ａ）、細胞生存率（Ｂ）および培養上清中の抗ＣＣＲ４キメラ抗体濃度（Ｃ）は、いずれもＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株とほぼ同等であり、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子のノックアウトによる細胞増殖性および抗体生産性への影響は認められなかった。
３．可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を指標とした、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖を有する抗ＣＣＲ４キメラ抗体の定量
本実施例の２項で採取したＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株の無血清フェドバッチ培養サンプルに含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を、ＷＯ０３／０８５１１９の実施例１１の３項に記載の可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（以下、ｓｈＦｃγＲＩＩＩａと表記）に対する結合活性を指標として、以下の様に測定した。
（１）還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合の異なる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の調製
ＷＯ０３／０８５１１９の実施例４の５項に記載の、ＹＢ２／０細胞由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ＫＭ２７６０−１、およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞由来のＫＭ３０６０を用い、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合が異なる標準品を調製した。ＫＭ２７６１−１とＫＭ３０６０、および両者を混合して調製した９サンプルを含む計１１サンプルの標準品について、実施例３の６項に記載の単糖組成分析により還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を測定したところ、ＫＭ２７６０−１は９０％、ＫＭ３０６０は１０％、調製した９サンプルの標準品はそれぞれ８２％、７４％、６６％、５８％、５０％、４２％、３４％、２６％、１８％であった。
（２）抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性の評価
ＷＯ０３／０８５１１９の実施例１１の３項に記載の方法に従って行った。まずヒトＣＣＲ４細胞外領域ペプチドコンジュゲートを、１．０μｇ／ｍＬの濃度で９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェル分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５．０μｇ／ｍＬに希釈した各抗ＣＣＲ４キメラ抗体サンプルを５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５．０μｇ／ｍＬに希釈したｓｈＦｃγＲＩＩＩａ溶液を５０μＬ／ウェル加え、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて０．１μｇ／ｍＬに調製したＨｉｓ−ｔａｇに対するＨＲＰ標識マウス抗体Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェル加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。
第３図に、本項（１）で調製した、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合が既知である各抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を示した。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合に比例してｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性は上昇した。
第４図に、本実施例の２項で採取した無血清フェドバッチ培養サンプルに含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体のｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性を、ＯＤ４１５実測値で示した。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプルは、いずれもｓｈＦｃγＲＩＩＩａに対する結合活性がほとんど認められなかった。一方、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプルは、培養期間を通じてｓｈＦｃγＲＩＩＩａへの強い結合活性を示した。
第３表に、第３図の検量線より求めた、各培養サンプル中に含まれる抗ＣＣＲ４キメラ抗体の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を示した。なお、ＫＭ２７６０−１（９０％）の吸光度を超える値を示したサンプルについては９０％以上（＞９０％）と表記した。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプルでは、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合が１０〜１１％と低値であったのに対して、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来のサンプルでは、培養期間を通じて９０％以上の高い値を示した。
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（３）抗ＣＣＲ４キメラ抗体の単糖組成分析
無血清フェドバッチ培養１３日目に、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株およびＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株から約４０ｍＬの細胞懸濁液を回収し、実施例３の３項に記載の方法に従って抗ＣＣＲ４キメラ抗体を精製した後、実施例３の６項に記載の方法に従って抗ＣＣＲ４キメラ抗体の単糖組成分析を行った。
第４表に、各抗体の単糖組成比により計算される、全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖に占める、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖の割合を示した。ＣＨＯ／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来の抗ＣＣＲ４キメラ体は、フコースが結合していない糖鎖の割合が１５％であったのに対して、ＳＭ３Ｇ１／ＣＣＲ４−ＡＦ株由来の抗ＣＣＲ４キメラ抗体ではフコースのピークは検出限界以下であったことから、フコースが結合していない糖鎖の割合は１００％と見積もられた。
以上の結果より、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト株は、無血清フェドバッチ培養下においても、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合していない糖鎖を有する抗体を安定的に生産できることが確認された。
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実施例５．フコースが結合していない糖鎖を有するヒトアンチトロンビンＩＩＩおよび変異型ヒトアンチトロンビンＩＩＩの製造とその生物活性
実施例１で取得したＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト株であるＣＨＯ  ＳＭ株を用いて、ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（以下ＡＴＩＩＩと称す。）、および成熟型における１３５位Ｎ結合型糖鎖付加部位のＡｓｎをＧｌｎに置換した変異型ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（以下ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑと称す。）の安定生産細胞を、以下に示す方法で作製した。
１．プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩの作製
ヒトＡＴＩＩＩ遺伝子配列（ＵｎｉＧｅｎｅ：Ｈｓ．７５５９９、配列番号１８）より制限酵素サイト（ＢｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ）及びコザック配列を付加した二種類のＡＴＩＩＩ遺伝子特異的プライマー（配列番号１９および配列番号２０）を作製し、以下のＰＣＲを行なった。即ち、ヒト肝臓由来ｃＤＮＡをテンプレートとして含む２０μＬの反応液［ＰｙｒｏｂｅｓＲ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）、１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、０．５μｍｏｌ／Ｌ上記プライマー（配列番号１９および配列番号２０）］を調製し、９４℃で１分間加熱した後、９８℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとした３０サイクルの反応でＰＣＲを行なった。ＰＣＲ後、反応液を１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、約１４００ｂｐのＡＴＩＩＩ遺伝子のＤＮＡ断片を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。
得られた精製ＡＴＩＩＩＤＮＡ断片を１７μＬの水に溶解した後、該液に１０単位のＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行なった。続いてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）３μｇを１７．５μＬの水に溶解し、該液に１０単位のＥｃｏＲＩ、２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製後、３７℃で１６時間消化反応を行なった。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理及びエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μＬの水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩ、２μＬの１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製後、３７℃で１６時間消化反応を行なった。
上記で得られたＡＴＩＩＩＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１４００ｂｐ、３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いでＡＴＩＩＩＤＮＡ断片（ＥｃｏＲ  Ｉ−ＢａｍＨ  Ｉ）２０ｎｇ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）８０ｎｇ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を含む反応液２０μＬを調製し、１６℃でｌ６時間連結反応を行なった。得られたプラスミドＤＮＡを用い、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ法により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐＲ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）とＤＮＡシーケンサＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。その結果、第５図に示すＡＴＩＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩを得た。
２．発現ベクターｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩの作製
本実施例の１項で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ３μｇを１７μＬの水に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）、１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。
次に、実施例６の１項の（３）に記載のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３  ３μｇを１７．５μＬの水に溶解した。該液に１０単位のＥｃｏＲＩと２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μＬの水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩと２μＬの１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。
上記で得られたｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）およびｐＫＡＮＴＥＸ９３断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．４Ｋｂ、９ＫｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、精製ｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）５０ｎｇ、精製ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）断片３０ｎｇ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を含む反応液２０μＬを調製し、１６℃でｌ６時間連結反応を行なった。得られたプラスミドＤＮＡを用い、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ法により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐＲ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、第６図に示すｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩが得られた。
３．プラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの作製
まず、配列番号１８に示されたＡＴＩＩＩ遺伝子配列（ＵｎｉＧｅｎｅ：Ｈｓ．７５５９９）より、１６７番目のアミノ酸（成熟ＡＴＩＩＩ中では１３５位）がＡｓｎからＧｌｎへと置換された二種類のプライマー（配列番号２１および配列番号２２）を作製した。本実施例の１項で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩ、これらのプライマーおよびＱｕｉｃｋ  ＣｈａｎｇｅＲ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、ＡＴＩＩＩ遺伝子配列のアミノ酸置換を行なった。方法は添付マニュアルに従った。得られた形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐＲ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（ＱＩＡＧＥＮ社製）とＤＮＡシーケンサＡＢＩＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した。その結果、第７図に示す変異型ＡＴＩＩＩ遺伝子配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを得た。
４．発現ベクターｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑの作製
本実施例の３項で作製したｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ３μｇを１７μＬの水に溶解し、１０単位のＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）、１０単位のＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）、２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。
次に、実施例６の１項の（３）に記載のプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３  ３μｇを１７．５μＬの水に溶解した。該液に１０単位のＥｃｏＲＩと２μＬの１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。反応後、フェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、回収したプラスミドを１７．５μＬの水に溶解した。さらに該液に１０単位のＢａｍＨＩと２μＬの１０×Ｋ  ｂｕｆｆｅｒを加えて２０μＬの反応液を調製し、３７℃で１６時間消化反応を行った。
上記で得られたｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）およびｐＫＡＮＴＥＸ９３断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）を１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約１．４Ｋｂ、９ＫｂのＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、精製ｐＢＳ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）５０ｎｇ、精製ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ）断片３０ｎｇ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を含む反応液２０μＬを調製し、ｌ６℃で１６時間連結反応を行なった。得られたプラスミドＤＮＡを用い、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ法により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換した。形質転換株よりＱＩＡｐｒｅｐＲ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、第７図に示すｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑを得た。
５．ＣＨＯ  ＳＭ株へのＡＴＩＩＩおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ発現プラスミドの導入
実施例１にて作製したＣＨＯ  ＳＭ株に、本実施例の２項、４項で作製したプラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑをそれぞれ導入した。これらの遺伝子導入は公知のエレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］により以下の手順で行った。まず、プラスミドｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩまたはｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ  ３０μｇをＮＥＢｕｆｆｅｒ  ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）２０μＬと１００単位の制限酵素ＭｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を含む２００μＬの反応液とを調整し、３７℃で１６時間消化反応を行うことにより線状化した。反応後、該反応液に対しフェノール／クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿により精製を行い、線状化プラスミドを回収した。
次に、実施例１で取得したＣＨＯ  ＳＭ株をＫ−ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、２．７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．５ｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）に懸濁して８×１０７細胞／ｍＬとした。細胞懸濁液２００μＬ（１．６×１０６個）と上記の線状化プラスミド９μｇを混和した後、細胞−ＤＮＡ混和液の全量をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（電極間距離２ｍｍ）（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）へ移し、細胞融合装置Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてパルス電圧３５０Ｖ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。遺伝子導入を行ったのち、細胞懸濁液を１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）および５０μｇ／ｍＬジェンタマイシン（ナカライテスク社製）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）３０ｍＬに懸濁し、接着細胞培養９６ウェルプレート（グライナー社製）３枚へ１００μＬ／ウェルで播種した。培養は５％ＣＯ２、３７℃の条件下で行った。
６．５００ｎＭ  ＭＴＸ  耐性株の取得
前項で得たｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ導入細胞およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ導入細胞を６日間それぞれ培養した後、培養上清を除去し、１０％ウシ胎児透析血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび５０ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）（シグマ社製）を添加したＩＭＤＭ培地を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この培地交換作業を３〜４日毎に繰り返しながら９日間の培養を行った。次いで、１０％ウシ胎児透析血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび２００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を同様に３〜４日毎に繰り返しながら１８日間培養し、最終的に形成されたコロニーを２４ウェルプレート（シグマ社製）に植え替えた。さらに、１０％ウシ胎児透析血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地を用いた培地交換作業を３〜４日毎に繰り返し、適宜拡大しながら１９日間培養を行い、５００ｎＭ  ＭＴＸ耐性株を取得した。
７．ＡＴＩＩＩおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ高生産株の選別
前項で取得した複数の５００ｎＭ  ＭＴＸ耐性株より、各１．０×１０６細胞を５ｍＬの１０％ウシ胎児透析血清、５０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび５００ｎＭのＭＴＸを添加したＩＭＤＭ培地に懸濁し、Ｔ２５フラスコへ播種して培養を行った。培養３日後に培養上清を回収し、上清中に含まれるＡＴＩＩＩ、ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ量をＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＡＴＩＩＩ）ｋｉｔ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）を用いて測定した。方法は添付マニュアルに従い、検量線には医薬品のノイアート登録商標（三菱ウェルファーマ社製）を用いた。その結果、得られたＡＴＩＩＩ生産株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１  ＧＭＤＫＯおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ生産株であるｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６  ＧＭＤＫＯの培養上清中にそれぞれ５１３ｎｇ／ｍＬおよび４５．４ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＡＴＩＩＩおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑが発現していることを確認した。なお、ｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１  ＧＭＤＫＯ株およびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６  ＧＭＤＫＯ株はｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩ１  ＧＭＤＫＯおよびｐＫＡＮ−ＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑ６  ＧＭＤＫＯの株名で、平成１６年８月１０日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００８３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１００８４としてそれぞれ寄託されている。また、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ遺伝子ノックアウト細胞で生産したＡＴＩＩＩおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑは、それらの糖鎖構造にフコース修飾が見られず、通常のＣＨＯ細胞で作製されたＡＴＩＩＩおよびＡＴＩＩＩＮ１３５Ｑと比較して血中安定性が向上しており、ヘパリン結合活性などの薬理活性においても有意な活性差が認められることが確認された。
【産業上の利用可能性】  本発明により、薬理活性が高い糖蛋白質を生産することが可能な細胞、該細胞を用いた糖蛋白質の製造方法、該製造方法で製造された糖蛋白質、ならびにその用途を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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