(57)【要約】ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤を、インターロイキン−６の産生に起因する疾患、例えば血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、慢性関節リューマチ、及びインフルエンザウイルス感染症等の予防及び／又は治療用の医薬等として用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項２】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である請求項１に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項３】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患が、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項２に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載のインターロイキン−６産生抑制剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【請求項５】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、ラクトパーオキシダーゼの使用。
【請求項６】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患が、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項５に記載のラクトパーオキシダーゼの使用。
【請求項７】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防又は治療を必要とする対象者に、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤を投与することを特徴とする、前記疾患を予防又は治療する方法。
【請求項８】
インターロイキン−６の産生に起因する疾患が、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン−６産生抑制剤である。さらに詳しくは、本発明はインターロイキン−６の異常産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に効果を有するインターロイキン−６産生抑制剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なインターロイキン−６産生抑制剤である。
【背景技術】  炎症反応は種々の侵襲で引き起こされる組織損傷に対する一種の生体防御反応であるが、その特徴として発赤、腫脹、発熱、疼痛などの症状を伴う。炎症反応に関与する生体内活性物質には、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンなどの炎症性メディエーターや、白血球をはじめとした種々の細胞が産生するインターロイキン−１、インターロイキン−６、インターロイキン−８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのいわゆる炎症性サイトカインが挙げられる（例えば、狩野庄吾、宮坂信之、湊長博編、「臨床免疫学」、朝倉書店、１９９７年、ｐ．７３−７７）。
インターロイキン−６は、１８４個のアミノ酸からなる分子量２１〜２８ｋＤａのポリペプチド性のサイトカインである。インターロイキン−６は、リポポリサッカライド、インターロイキン−１、ＴＮＦなどの炎症の場でみられる種々の刺激物質によって血管内皮細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージなど幅広い種類の細胞から産生される。インターロイキン−６の生物学的作用としては、急性期炎症性タンパクの合成促進、Ｂ細胞からの抗体産生誘導、Ｔリンパ球の活性化などの重要な作用が報告されている。その一方で、インターロイキン−６の産生異常は種々の免疫異常症、炎症性疾患、リンパ系腫瘍の発症と深く関係していることが示唆されている（例えば、松村正實編、「分子細胞生物学辞典」、東京化学同人、１９９７年、ｐ．９０）。
これに対し、インターロイキン−６の作用を阻害するインターロイキン−６抗体や、インターロイキン−６レセプター抗体は、慢性関節リュウマチなどの自己免疫疾患、乾癬、心房内粘液腫、メサンギウム増殖性腎炎、キャッスルマン症候群、ＡＩＤＳ、多発性骨髄腫など、多様な炎症性疾患に対する有効性が期待されており（例えば、「臨床免疫学」、朝倉書店、１９９７年、ｐ．７３−７７）、すでにインターロイキン−６レセプターに対する抗体を有効成分とするインターロイキン−６の産生に起因する疾患の治療剤（例えば、特開平８−１６９８４６号公報）、及び培養哺乳類細胞から産生されるインターロイキン−６抑制組成物（例えば、特開平８−９９９９６号公報）が開示されている。また、カラゲナン投与で胸膜炎を誘導したラットに抗炎症薬のインドメタシンを投与すると、胸膜炎の炎症が有意に抑制され、腹腔滲出液中のインターロイキン−６が抑制されることが明らかにされている（例えば、「薬学雑誌」、第１２０巻、２０００年、ｐ．４５５−４６２）。
現在までに、乳中の蛋白質によるインターロイキン−６への関与については、ラクトフェリンによる、大腸菌尿路感染マウスの尿中インターロイキン−６濃度の抑制作用（例えば、インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、アメリカ、第６８巻、２０００年、ｐ．５８１６〜５８２３）、及び発酵乳またはその処理物を有効成分として含有するインターロイキン産生能を調節するための組成物（例えば、特開平５−９１２４号公報）がそれぞれ開示されている。
乳タンパク質の一種であるラクトパーオキシダーゼは、哺乳類の乳汁をはじめ、唾液、涙液、気道粘液等の分泌液にも含有される酸化還元酵素であり（例えば、アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・アンド・クリティカル・ケアー・メディスン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．）、アメリカ、第１６６巻、２００２年、ｐ．Ｓ５７〜Ｓ６１）、工業的には牛乳から大量スケールで精製される（例えば、特開平５−４１９８１号公報）。
ラクトパーオキシダーゼには、抗菌性、抗ウイルス活性、抗酸化活性、抗癌作用、免疫調節作用等の多様な生物機能が報告されている（例えば、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、アメリカ、第１１巻、２０００年、ｐ．９４−１０２；ライフ・サイエンシーズ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アメリカ、第４３巻、１９８８年、ｐ．７３９−７４５；ライフ・サイエンシーズ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アメリカ、第４７巻、１９９０年、ｐ．７０３−７０９；ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、イギリス、第６３巻、１９９６年、ｐ．２５７−２６７；ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、イギリス、第６４巻、１９９７年、ｐ．２８１−２８８；ベテリナリー・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、オランダ、第５６巻、１９９７年、ｐ．８５−９６）。また、ヘリコバクタピロリ感染の治療用医薬を製造するためのラクトパーオキシダーゼ、パーオキシドドナーおよびチオシアネートの使用（例えば、特表２０００−５０９３６７号公報）、養殖水生動物の配合飼料に添加される病原菌感染予防及び治療剤（例えば、特許第３１０３６１５号公報）、老化防止剤（特許第３１０３１６７号公報）、肝機能改善剤（例えば、特開２００１−２２６２８９号公報）、パーオキシダーゼの予防および治療への応用（例えば、特表平６−５０１４５３号公報）、角膜障害治療剤（例えば、特許第２８４０７９５号公報）等に関する技術が開示されている。更に、本出願人により、すでにパーオキシダーゼ、チオシアン酸、及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物（特開２００２−２３８５５４号公報）が開示されている。しかしながら、現在に至るまで炎症性サイトカインの一種であるインターロイキン−６産生に及ぼすラクトパーオキシダーゼの効果に関する既存の技術は一切報告されていなかった。
【発明の開示】
本発明者らは、前記背景技術に鑑み、安全で副作用が少なく、日常的に長期服用が可能なインターロイキン−６産生抑制剤についてタンパク質等の食品素材を中心に鋭意探索を重ねた結果、乳タンパク質であるラクトパーオキシダーゼがインターロイキン−６産生抑制作用を有すること初めて見出した。その結果、ラクトパーオキシダーゼの使用により、インターロイキン−６の産生によって起因する種々の感染症や炎症性疾患の症状を緩和させることが可能であることが判明した。
前記課題を解決する本発明は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤である。
前記インターロイキン−６産生抑制剤の好ましい態様は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である。
また、本発明は、前記インターロイキン−６産生抑制剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物を提供する。
また、本発明は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、ラクトパーオキシダーゼの使用を提供する。
さらに、本発明は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防又は治療を必要とする対象者に、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤を投与することを特徴とする、前記疾患を予防又は治療する方法を提供する。
前記の各々の発明において、前記インターロイキン−６の産生に起因する疾患としては、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症等が挙げられる。
本発明は、安全性に優れ、安価で大量に生産することが可能であり、インターロイキン−６の産生を効果的に抑制する作用を有し、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に有効な薬剤を提供するものである。
本願発明と、前記背景技術に記載した事項のうち、本発明と関連性の高い技術は、以下に示すような相違点がある。すなわち、
（１）特開平８−１６９８４６号公報に記載されたインターロイキン−６産生に起因する疾患の治療剤の有効成分は、インターロイキン−６レセプターの抗体であって、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼとは異なる。
（２）特開平８−９９９９６号公報に記載されたインターロイキン−６抑制活性を有する組成物は、分子量１０ｋＤａ又は４４ｋＤａであって、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼの分子量８０ｋＤａとは異なり、同公報にはラクトパーオキシダーゼについて一切記載されていない。
（３）インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、アメリカ、第６８巻、２０００年、ｐ．５８１６〜５８２３には、ラクトフェリンによる大腸菌尿路感染マウスの尿中インターロイキン−６濃度の抑制作用が記載されているが、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼとは異なり、同文献にはラクトパーオキシダーゼについて一切記載されていない。
（４）特開平５−９１２４号公報には、発酵乳またはその処理物を有効成分として含有するインターロイキン−６産生能を抑制するための組成物が記載されており、該有効成分である発酵乳の原料としては獣乳が例示されているが、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼについては一切記載されていない。尚、発酵乳にインターロイキン−６産生能を抑制する効果を有していたとしても、それのみではラクトパーオキシダーゼにインターロイキン−６の産生抑制効果を導き出すことは困難であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】  次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明に使用するラクトパーオキシダーゼは、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から得ることができる。例えば、特開平５−４１９８１公報（発明の名称：生菌含有液状組成物）に開示された方法のように、乳等未加熱のホエーまたは脱脂乳から、常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って工業的に製造することが好ましく、更に、市販の天然物由来のラクトパーオキシダーゼ（例えばバイオポール社製等）、又は組換え型ラクトパーオキシダーゼ〔例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第２７１巻、２０００年、ｐ．８３１−８３６］によって発現・精製された組換え型ラクトパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ラクトパーオキシダーゼ〕（例えばバイオポール社製等）を使用することも可能である。
本発明に使用することのできるラクトパーオキシダーゼは、上述したようなラクトパーオキシダーゼの改変体も含む。改変体として具体的には、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｍ５８１５０又は配列番号１や、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＹ３２４８７６、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ０２７９７０等のアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からなる蛋白質を有する蛋白質を例示することができる。ここで、数個とは、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは２〜１０個である。また、改変体としては、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｍ５８１５０又は配列番号１や、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＹ３２４８７６、ＥＭＢＬ−Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＦ０２７９７０等のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上相同な配列を有する蛋白質も例示することができる。これらのラクトパーオキシダーゼ改変体については、インターロイキン−６の産生抑制作用が保持され、且つヒトに対する抗原性ができるだけ低くなるように改変されていることが好ましい。上記のようなラクトパーオキシダーゼ改変体は、野生型ラクトパーオキシダーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ法等により変異させた遺伝子を公知の発現系で発現させ、得られたタンパク質のインターロイキン−６産生抑制作用を測定することによって得ることができる。また、野生型ラクトパーオキシダーゼをコードする遺伝子が導入された微生物等を、紫外線照射等によって変異処理し、得られた微生物から、ラクトパーオキシダーゼ改変体を精製し、そのインターロイキン−６産生抑制作用を測定することによっても得ることができる。ただし、本発明において「改変体」とは、必ずしも野生型を改変することによって作製されたものである必要はなく、天然に存在するような変異体であってもよい。尚、本発明において、ラクトパーオキシダーゼを飲食品や飼料に添加して使用する場合は、可能な限り、アミノ酸が置換、欠失若しくは付加等されていない野生型のラクトパーオキシダーゼを使用することが好ましい。
ラクトパーオキシダーゼは、インターロイキン−６の産生を抑制する作用を有しているので、インターロイキン−６産生抑制剤（以下、「本発明の抑制剤」という場合がある。）の有効成分として使用することができる。ここで、「有効成分」とは、インターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分を意味し、ラクトパーオキシダーゼが本発明の抑制剤の主成分である必要はなく、また、本発明の抑制剤にはラクトパーオキシダーゼ以外にインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分が含まれていてもよい。例えば、本発明の阻害剤にはラクトパーオキシダーゼ以外にインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分や、乳中の他の有用な蛋白質であるカゼインやα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が含まれていてもよい。
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、ラクトパーオキシダーゼの他に、ラクトパーオキシダーゼの部分ペプチド、又はラクトパーオキシダーゼの加水分解混合物（ペプチド混合物）を含有していてもよい。また、インターロイキン−６産生抑制作用を有するラクトパーオキシダーゼの部分ペプチド、又はラクトパーオキシダーゼの加水分解混合物（ペプチド混合物）を有効成分として含有していてもよい。
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、生体内において産生される炎症性サイトカインの一種であるインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する。したがって、本発明の抑制剤は、医薬、例えばインターロイキン−６の産生抑制を介して血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症などの各種の感染症や炎症性疾患の症状緩和作用を有する医薬等として用いることができる。しかし、本発明の抑制剤は、インターロイキン−６の異常産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療の使用に限定されるものではない。
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、その有効成分が乳タンパク質等の食品素材に含まれるものであるので、ヒトに対する安全性が高く、飲食品に含有させた組成物として日常的に経口摂取することによってインターロイキン−６の産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療に効果が発揮される特徴を持つ。
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の形態は特に限定されるものではなく、例えば、医薬組成物、飲食品組成物、及び飼料組成物等が挙げられる。すなわち、本発明の抑制剤の一つの態様は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有する、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である。また、本発明の他の態様は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、ラクトパーオキシダーゼの使用である。好ましい態様においては、本発明の抑制剤は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防又は治療を必要とする対象者に、前記疾患を予防又は治療するために投与される。また、他の態様においては、本発明の抑制剤は、飲食品組成物原料又は飼料組成物原料に添加され、飲食品組成物又は飼料組成物を構成する。
前記インターロイキン−６の産生に起因する疾患としては、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症などの各種の感染症や炎症性疾患等が挙げられる。
本発明の抑制剤は、ラクトパーオキシダーゼそれ自体であってもよいし、ラクトパーオキシダーゼ以外の成分を含有していてもよい。ラクトパーオキシダーゼ以外の成分は、摂取の形態に応じて適宜選択できる。例えば、ラクトパーオキシダーゼ粉末やラクトパーオキシダーゼ水溶液（シロップ等）等を本発明のインターロイキン−６産生抑制剤として配合して各種飲食品を調製してもよい。
医薬組成物は、例えば、ラクトパーオキシダーゼを、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造でき、製剤化したラクトパーオキシダーゼは、インターロイキン−６の産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療剤として使用できる。製剤化する場合、製剤中のラクトパーオキシダーゼの含有量は、通常０．００１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１５質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられ、結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられ、安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられ、注射剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられ、医薬組成物の投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
また、本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、投与量は、成人１日当たり通常１０ｍｇ〜１０ｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。また、投与期間としては、７日間以上が好ましい。
本発明のラクトパーオキシダーゼを配合した飲食品組成物の形態としては、例えば、ラクトパーオキシダーゼ粉末やラクトパーオキシダーゼ水溶液（シロップ等）等を本発明のインターロイキン−６産生抑制剤として配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられる。
飲食品組成物の形状としては、タブレット状のサプリメントを例示することができる。これによって、一日当りの食事量及び摂取カロリーを他の食品の摂取量を加味した上でコントロールする必要が無く、また、有効成分の摂取量を正確に把握できる。
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、インターロイキン−６の産生に起因する疾患、例えば血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症等の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここで、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
本発明において、ラクトパーオキシダーゼによるインターロイキン−６産生抑制作用を評価するために、ヒトおよび哺乳動物において、インフルエンザウイルスの感染によってインターロイキン−６の産生が誘導されるという報告〔ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、アメリカ、第６４巻、２００１年、ｐ．２６２−２６８、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、アメリカ、第１０３巻、２００１年、ｐ．２２８３−２２８８〕に基づき、インフルエンザ感染モデルマウスによるインターロイキン−６の産生誘導に対するラクトパーオキシダーゼの効果〔インターロイキン−６産生抑制作用、炎症細胞数抑制作用、肺コンソリデーション（肺炎症の重症度）抑制効果〕として検討した。詳細は、後記する試験例の方法に従った。
次に試験例を示して本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、ウイルス感染に伴う炎症によって産生されたインターロイキン−６、炎症細胞数、及び肺コンソリデーションの重症度に対するラクトパーオキシダーゼによる効果を調べるために行った。
（１）試料の調製
ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）を、１２．５質量％の濃度になるように精製水に溶解して試験試料を調製した。対照試料には精製水を使用した。
（２）試験方法
ａ）試料の投与
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）合計１２匹を、糞食防止ネットを設置したケージに入れ、標準固形飼料（日本クレア社製）と飲水で一週間馴化飼育した。次に、前記マウスを６匹ずつ２群に分け、その１群に対照試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与して対照群とした。残りの１群には試験試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与して試験群とした。これらの経口投与は、ウイルス感染の１日前から開始し、投与開始から７日間、一日一回ずつ連日投与した。ウイルス感染日（試料投与開始後２日目）に、すべてのマウスに対して、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株６６０ＰＦＵ（ＰＦＵ：プラーク形成単位）を含むリン酸緩衝液１０μｌを麻酔下で経鼻的に接種した。感染６日後（試料投与終了日）にマウスを解剖し、以下に示す各種測定サンプルを回収した。
ｂ）測定サンプルの回収
試料投与終了後のマウスを、麻酔下で眼窩静脈から採血し、血清サンプルを回収した。また、解剖気道に注射針を差し込み、１ｍｌの血清無添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を注射器で注入した後、同じ注射器内に液を回収した。同様の注入と回収をさらに２回繰り返し、計３回分の気管支肺胞洗浄液を回収した。回収した気管支肺胞洗浄液を１０００回転で遠心し、細胞画分と上清に分離した。細胞画分は炎症細胞サンプルとし、上清は気管支肺胞洗浄液上清サンプルとした。また、解剖したマウスから肺を回収し、肺コンソリデーションサンプルとした。
ｃ）インターロイキン−６濃度の測定
前記血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液サンプル中のインターロイキン−６の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、一群６匹の測定値を平均化した。
ｄ）炎症細胞数の測定
前記炎症細胞サンプルについて細胞数測定装置（日本光電社製）を使用して炎症細胞数を測定し、一群６匹の測定値を平均化した。
ｅ）肺コンソリデーションの重症度のスコア化
ウイルス感染による炎症の指標であるコンソリデーションの重症度は、ギンズバーグらの方法〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、アメリカ、第９５巻、１９５２年、第１３５〜１４５ページ〕に従って、０（コンソリデーションなし）から１０（重篤なコンソリデーション）にスコア化し、一群６匹の測定値を平均化した。
（３）試験結果
本試験の結果を表１、表２、表３に示す。表１は、血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液上清サンプル中のインターロイキン−６濃度の測定結果を示す。表２は、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数の測定結果を示す。表３は肺コンソリデーションスコアを示す。
その結果、表１から明らかなとおり、ウイルス感染マウスにラクトパーオキシダーゼを投与することにより、血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液上清サンプル中のインターロイキン−６濃度は有意に減少することが判明した。
また、表２から明らかなとおり、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数はラクトパーオキシダーゼを投与することにより減少したことから、ラクトパーオキシダーゼによる炎症性細胞の滲出を抑制する効果も確認された。
さらに、表３から明らかなとおり、肺コンソリデーションスコアは対照群では５．０であったのに対し、ラクトパーオキシダーゼを投与した試験群では１．８に低下し、ラクトパーオキシダーゼによる肺の炎症抑制効果も確認された。
従って、ラクトパーオキシダーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏでインターロイキン−６の産生を効果的に抑制する作用を有し、その効果に伴って炎症性細胞の滲出を抑制する作用、及び肺の炎症症状を改善する効果が発揮されることが明らかとなった。
尚、気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量について、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、イギリス、第７１巻、１９９０年、ｐ．２１４９−２１５５〕によって測定したところ、対照群と試験群の間でウイルス量の差は認められなかったことから、ラクトパーオキシダーゼは生体内において直接インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を持たないことが確認された。
2004073733.tif 000002
2004073733.tif 000003
2004073733.tif 000004
【実施例】  次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  次の組成のインターロイキン−６産生抑制効果を有する注射剤を常法により製造した。
ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）                ２．０（％）
アクチノマイシンＤ（シグマ社製）                          ０．００５
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                            ０．９
マンニトール（関東化学社製）                              １．０
注射用蒸留水（大塚製薬社製）                            ９６．０９５
【実施例２】  乳糖（メグレ社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びラクトパーオキシダーゼ６００ｇを５０メッシュのふるい（ヤマト科学社製）により篩い分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（セセレ・ペディーニ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Ｏｐ．Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．６  Ｂｏｄｙ、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、インターロイキン−６産生抑制効果を有するカプセル剤７０００個を得た。
【実施例３】  ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、および少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、およびラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、インターロイキン−６産生抑制剤であるラクトパーオキシダーゼを含有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【実施例４】  ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、インターロイキン−６産生抑制剤であるラクトパーオキシダーゼを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【産業上の利用の可能性】
以上詳記したとおり、本発明はラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤とその利用に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）インターロイキン−６の産生を効果的に抑制することが可能である。
（２）インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に効果を有する。
（３）乳等の原料から安価で大量に製造することができる。
（４）ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することが可能である。
（５）インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防用又は治療用であることを表示した飲食品組成物又は飼料組成物を提供することができる。
【配列表】
2004073733.tif 000005
2004073733.tif 000006
2004073733.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月5日(2004.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項２】  インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である請求項１に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項３】  インターロイキン−６の産生に起因する疾患が、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項２に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項４】  請求項１〜請求項３のいずれかに記載のインターロイキン−６産生抑制剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項２】
血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防及び／又は治療用の医薬である請求項１に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のインターロイキン−６産生抑制剤を含有し、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防効果又は治療効果を有するものであることを特徴とし、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品組成物又は飼料組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有することを特徴とするインターロイキン−６産生抑制剤である。さらに詳しくは、本発明はインターロイキン−６の異常産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に効果を有するインターロイキン−６産生抑制剤、並びに飲食品及び飼料等に利用することが可能なインターロイキン−６産生抑制剤である。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は種々の侵襲で引き起こされる組織損傷に対する一種の生体防御反応であるが、その特徴として発赤、腫脹、発熱、疼痛などの症状を伴う。炎症反応に関与する生体内活性物質には、ヒスタミン、セロトニン、プロスタグランジンなどの炎症性メディエーターや、白血球をはじめとした種々の細胞が産生するインターロイキン−１、インターロイ
キン−６、インターロイキン−８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのいわゆる炎症性サイトカインが挙げられる（例えば、狩野庄吾、宮坂信之、湊長博編、「臨床免疫学」、朝倉書店、１９９７年、ｐ．７３−７７）。
【０００３】
インターロイキン−６は、１８４個のアミノ酸からなる分子量２１〜２８ｋＤａのポリペプチド性のサイトカインである。インターロイキン−６は、リポポリサッカライド、インターロイキン−１、ＴＮＦなどの炎症の場でみられる種々の刺激物質によって血管内皮細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージなど幅広い種類の細胞から産生される。インターロイキン−６の生物学的作用としては、急性期炎症性タンパクの合成促進、Ｂ細胞からの抗体産生誘導、Ｔリンパ球の活性化などの重要な作用が報告されている。その一方で、インターロイキン−６の産生異常は種々の免疫異常症、炎症性疾患、リンパ系腫瘍の発症と深く関係していることが示唆されている（例えば、松村正實編、「分子細胞生物学辞典」、東京化学同人、１９９７年、ｐ．９０）。
【０００４】
これに対し、インターロイキン−６の作用を阻害するインターロイキン−６抗体や、インターロイキン−６レセプター抗体は、慢性関節リュウマチなどの自己免疫疾患、乾癬、心房内粘液腫、メサンギウム増殖性腎炎、キャッスルマン症候群、ＡＩＤＳ、多発性骨髄腫など、多様な炎症性疾患に対する有効性が期待されており（例えば、「臨床免疫学」、朝倉書店、１９９７年、ｐ．７３−７７）、すでにインターロイキン−６レセプターに対する抗体を有効成分とするインターロイキン−６の産生に起因する疾患の治療剤（例えば、特開平８−１６９８４６号公報）、及び培養哺乳類細胞から産生されるインターロイキン−６抑制組成物（例えば、特開平８−９９９９６号公報）が開示されている。また、カラゲナン投与で胸膜炎を誘導したラットに抗炎症薬のインドメタシンを投与すると、胸膜炎の炎症が有意に抑制され、腹腔滲出液中のインターロイキン−６が抑制されることが明らかにされている（例えば、「薬学雑誌」、第１２０巻、２０００年、ｐ．４５５−４６２）。
【０００５】
現在までに、乳中の蛋白質によるインターロイキン−６への関与については、ラクトフェリンによる、大腸菌尿路感染マウスの尿中インターロイキン−６濃度の抑制作用（例えば、インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）、アメリカ、第６８巻、２０００年、ｐ．５８１６〜５８２３）、及び発酵乳またはその処理物を有効成分として含有するインターロイキン産生能を調節するための組成物（例えば、特開平５−９１２４号公報）がそれぞれ開示されている。
【０００６】
乳タンパク質の一種であるラクトパーオキシダーゼは、哺乳類の乳汁をはじめ、唾液、涙液、気道粘液等の分泌液にも含有される酸化還元酵素であり（例えば、アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・アンド・クリティカル・ケアー・メディスン（American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine.）、アメリカ、第１６６巻、２００２年、ｐ．Ｓ５７〜Ｓ６１）、工業的には牛乳から大量スケールで精製される（例えば、特開平５−４１９８１号公報）。
【０００７】
ラクトパーオキシダーゼには、抗菌性、抗ウイルス活性、抗酸化活性、抗癌作用、免疫調節作用等の多様な生物機能が報告されている（例えば、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・バイオケミストリー（Journal of Nutritional Biochemistry）、アメリカ、第１１巻、２０００年、ｐ．９４−１０２；ライフ・サイエンシーズ（Life Sciences）、アメリカ、第４３巻、１９８８年、ｐ．７３９−７４５；ライフ・サイエンシーズ（Life Sciences）、アメリカ、第４７巻、１９９０年、ｐ．７０３−７０９；ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Journal of Dairy Research）、イギリス、第６３巻、１９９６年、ｐ．２５７−２６７；ジャーナル・オブ・デイリー・リサーチ（Journal of Dairy Research）、イギリス、第６４巻、１９９７年、ｐ．２８１−２８８；ベテリナリー
・イミュノロジー・アンド・イミュノパソロジー（Veterinary Immunology and Immunopathology）、オランダ、第５６巻、１９９７年、ｐ．８５−９６）。また、ヘリコバクタピロリ感染の治療用医薬を製造するためのラクトパーオキシダーゼ、パーオキシドドナーおよびチオシアネートの使用（例えば、特表２０００−５０９３６７号公報）、養殖水生動物の配合飼料に添加される病原菌感染予防及び治療剤（例えば、特許第３１０３６１５号公報）、老化防止剤（特許第３１０３１６７号公報）、肝機能改善剤（例えば、特開２００１−２２６２８９号公報）、パーオキシダーゼの予防および治療への応用（例えば、特表平６−５０１４５３号公報）、角膜障害治療剤（例えば、特許第２８４０７９５号公報）等に関する技術が開示されている。更に、本出願人により、すでにパーオキシダーゼ、チオシアン酸、及び過酸化水素を有効成分とするウレアーゼ不活性化組成物（特開２００２−２３８５５４号公報）が開示されている。しかしながら、現在に至るまで炎症性サイトカインの一種であるインターロイキン−６産生に及ぼすラクトパーオキシダーゼの効果に関する既存の技術は一切報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、前記背景技術に鑑み、安全で副作用が少なく、日常的に長期服用が可能なインターロイキン−６産生抑制剤についてタンパク質等の食品素材を中心に鋭意探索を重ねた結果、乳タンパク質であるラクトパーオキシダーゼがインターロイキン−６産生抑制作用を有すること初めて見出した。その結果、ラクトパーオキシダーゼの使用により、インターロイキン−６の産生によって起因する種々の感染症や炎症性疾患の症状を緩和させることが可能であることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決する本発明は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤である。
前記インターロイキン−６産生抑制剤の好ましい態様は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である。
【００１０】
また、本発明は、前記インターロイキン−６産生抑制剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、ラクトパーオキシダーゼの使用を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防又は治療を必要とする対象者に、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤を投与することを特徴とする、前記疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【００１３】
前記の各々の発明において、前記インターロイキン−６の産生に起因する疾患としては、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症等が挙げられる。すなわち、本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の好ましい態様は、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防及び／又は治療用の医薬である。また、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の好ましい態様は、前記インターロイキン−６産生抑制剤を含有し、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防効果又は治療効果を有するものであることを特徴とし、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関
節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防又は治療のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品組成物又は飼料組成物である。
【００１４】
本発明は、安全性に優れ、安価で大量に生産することが可能であり、インターロイキン−６の産生を効果的に抑制する作用を有し、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に有効な薬剤を提供するものである。
本願発明と、前記背景技術に記載した事項のうち、本発明と関連性の高い技術は、以下に示すような相違点がある。すなわち、
（１）特開平８−１６９８４６号公報に記載されたインターロイキン−６産生に起因する疾患の治療剤の有効成分は、インターロイキン−６レセプターの抗体であって、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼとは異なる。
【００１５】
（２）特開平８−９９９９６号公報に記載されたインターロイキン−６抑制活性を有する組成物は、分子量１０ｋＤａ又は４４ｋＤａであって、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼの分子量８０ｋＤａとは異なり、同公報にはラクトパーオキシダーゼについて一切記載されていない。
【００１６】
（３）インフェクション・アンド・イミュニティー（Infection and Immunity）、アメリカ、第６８巻、２０００年、ｐ．５８１６〜５８２３には、ラクトフェリンによる大腸菌尿路感染マウスの尿中インターロイキン−６濃度の抑制作用が記載されているが、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼとは異なり、同文献にはラクトパーオキシダーゼについて一切記載されていない。
【００１７】
（４）特開平５−９１２４号公報には、発酵乳またはその処理物を有効成分として含有するインターロイキン−６産生能を抑制するための組成物が記載されており、該有効成分である発酵乳の原料としては獣乳が例示されているが、本発明の有効成分であるラクトパーオキシダーゼについては一切記載されていない。尚、発酵乳にインターロイキン−６産生能を抑制する効果を有していたとしても、それのみではラクトパーオキシダーゼにインターロイキン−６の産生抑制効果を導き出すことは困難であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１９】
本発明に使用するラクトパーオキシダーゼは、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から得ることができる。例えば、特開平５−４１９８１公報（発明の名称：生菌含有液状組成物）に開示された方法のように、乳等未加熱のホエーまたは脱脂乳から、常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って工業的に製造することが好ましく、更に、市販の天然物由来のラクトパーオキシダーゼ（例えばバイオポール社製等）、又は組換え型ラクトパーオキシダーゼ〔例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Biochemical and Biophysical Research Communications）、第２７１巻、２０００年、ｐ．８３１−８３６］によって発現・精製された組換え型ラクトパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ラクトパーオキシダーゼ〕（例えばバイオポール社製等）を使用することも可能である。
【００２０】
本発明に使用することのできるラクトパーオキシダーゼは、上述したようなラクトパーオキシダーゼの改変体も含む。改変体として具体的には、EMBL-Accession No.：M58150又は配列番号１や、EMBL-Accession No.：AY324876、EMBL-Accession No.：AF027970等のアミノ酸配列において、一又は数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列からな
る蛋白質を有する蛋白質を例示することができる。ここで、数個とは、２〜５０個、好ましくは２〜２０個、特に好ましくは２〜１０個である。また、改変体としては、EMBL-Accession No.：M58150又は配列番号１や、EMBL-Accession No.：AY324876、EMBL-Accession
No.：AF027970等のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上相同な配列を有する蛋白質も例示することができる。これらのラクトパーオキシダーゼ改変体については、インターロイキン−６の産生抑制作用が保持され、且つヒトに対する抗原性ができるだけ低くなるように改変されていることが好ましい。上記のようなラクトパーオキシダーゼ改変体は、野生型ラクトパーオキシダーゼをコードする遺伝子をPCR法等により変異させた遺伝子を公知の発現系で発現させ、得られたタンパク質のインターロイキン−６産生抑制作用を測定することによって得ることができる。また、野生型ラクトパーオキシダーゼをコードする遺伝子が導入された微生物等を、紫外線照射等によって変異処理し、得られた微生物から、ラクトパーオキシダーゼ改変体を精製し、そのインターロイキン−６産生抑制作用を測定することによっても得ることができる。ただし、本発明において「改変体」とは、必ずしも野生型を改変することによって作製されたものである必要はなく、天然に存在するような変異体であってもよい。尚、本発明において、ラクトパーオキシダーゼを飲食品や飼料に添加して使用する場合は、可能な限り、アミノ酸が置換、欠失若しくは付加等されていない野生型のラクトパーオキシダーゼを使用することが好ましい。
【００２１】
ラクトパーオキシダーゼは、インターロイキン−６の産生を抑制する作用を有しているので、インターロイキン−６産生抑制剤（以下、「本発明の抑制剤」という場合がある。）の有効成分として使用することができる。ここで、「有効成分」とは、インターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分を意味し、ラクトパーオキシダーゼが本発明の抑制剤の主成分である必要はなく、また、本発明の抑制剤にはラクトパーオキシダーゼ以外にインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分が含まれていてもよい。例えば、本発明の阻害剤にはラクトパーオキシダーゼ以外にインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する成分や、乳中の他の有用な蛋白質であるカゼインやα−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン等が含まれていてもよい。
【００２２】
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、ラクトパーオキシダーゼの他に、ラクトパーオキシダーゼの部分ペプチド、又はラクトパーオキシダーゼの加水分解混合物（ペプチド混合物）を含有していてもよい。また、インターロイキン−６産生抑制作用を有するラクトパーオキシダーゼの部分ペプチド、又はラクトパーオキシダーゼの加水分解混合物（ペプチド混合物）を有効成分として含有していてもよい。
【００２３】
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、生体内において産生される炎症性サイトカインの一種であるインターロイキン−６の産生を抑制する作用を有する。したがって、本発明の抑制剤は、医薬、例えばインターロイキン−６の産生抑制を介して血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症などの各種の感染症や炎症性疾患の症状緩和作用を有する医薬等として用いることができる。しかし、本発明の抑制剤は、インターロイキン−６の異常産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療の使用に限定されるものではない。
【００２４】
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、その有効成分が乳タンパク質等の食品素材に含まれるものであるので、ヒトに対する安全性が高く、飲食品に含有させた組成物として日常的に経口摂取することによってインターロイキン−６の産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療に効果が発揮される特徴を持つ。
【００２５】
本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の形態は特に限定されるものではなく、例え
ば、医薬組成物、飲食品組成物、及び飼料組成物等が挙げられる。すなわち、本発明の抑制剤の一つの態様は、ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有する、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬である。また、本発明の他の態様は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療用の医薬の製造における、ラクトパーオキシダーゼの使用である。好ましい態様においては、本発明の抑制剤は、インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防又は治療を必要とする対象者に、前記疾患を予防又は治療するために投与される。また、他の態様においては、本発明の抑制剤は、飲食品組成物原料又は飼料組成物原料に添加され、飲食品組成物又は飼料組成物を構成する。
【００２６】
前記インターロイキン−６の産生に起因する疾患としては、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症などの各種の感染症や炎症性疾患等が挙げられる。
本発明の抑制剤は、ラクトパーオキシダーゼそれ自体であってもよいし、ラクトパーオキシダーゼ以外の成分を含有していてもよい。ラクトパーオキシダーゼ以外の成分は、摂取の形態に応じて適宜選択できる。例えば、ラクトパーオキシダーゼ粉末やラクトパーオキシダーゼ水溶液（シロップ等）等を本発明のインターロイキン−６産生抑制剤として配合して各種飲食品を調製してもよい。
【００２７】
医薬組成物は、例えば、ラクトパーオキシダーゼを、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造でき、製剤化したラクトパーオキシダーゼは、インターロイキン−６の産生に起因する疾患に対する予防及び／又は治療剤として使用できる。製剤化する場合、製剤中のラクトパーオキシダーゼの含有量は、通常０．００１〜２０質量％、好ましくは０．１〜１５質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。
【００２８】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられ、結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マグロゴール等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸類塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられ、安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられ、矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられ、注射剤用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００２９】
医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げら
れ、医薬組成物の投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【００３０】
また、本発明のインターロイキン−６産生抑制剤は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、投与量は、成人１日当たり通常１０ｍｇ〜１０ｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。また、投与期間としては、７日間以上が好ましい。
【００３１】
本発明のラクトパーオキシダーゼを配合した飲食品組成物の形態としては、例えば、ラクトパーオキシダーゼ粉末やラクトパーオキシダーゼ水溶液（シロップ等）等を本発明のインターロイキン−６産生抑制剤として配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられる。
【００３２】
飲食品組成物の形状としては、タブレット状のサプリメントを例示することができる。これによって、一日当りの食事量及び摂取カロリーを他の食品の摂取量を加味した上でコントロールする必要が無く、また、有効成分の摂取量を正確に把握できる。
【００３３】
尚、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物は、以下に示す疾患の予防用又は治療用としての効能を表示した飲食品組成物又は飼料組成物とすることができる。すなわち、インターロイキン−６の産生に起因する疾患、例えば血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症等の予防用又は治療用であること、を表示することができる。
ここで、「表示」とは、前記効能を需要者に対して知らしめる行為を意味し、例えば、本発明の飲食品組成物又は飼料組成物の商品若しくは商品の包装・広告等に前記効能を付する行為、付したものを譲渡、引き渡し、展示等をする行為等があるが、特に特定保健用食品〔健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日、日本国厚生労働省令第８６号）の第１２条第１項第５号参照〕として表示する態様が好ましい。
【００３４】
本発明において、ラクトパーオキシダーゼによるインターロイキン−６産生抑制作用を評価するために、ヒトおよび哺乳動物において、インフルエンザウイルスの感染によってインターロイキン−６の産生が誘導されるという報告〔ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー（Journal of Medical Virology）、アメリカ、第６４巻、２００１年、ｐ．２６２−２６８、サーキュレーション（Circulation）、アメリカ、第１０３巻、２００１年、ｐ．２２８３−２２８８〕に基づき、インフルエンザ感染モデルマウスによるインターロイキン−６の産生誘導に対するラクトパーオキシダーゼの効果〔インターロイキン−６産生抑制作用、炎症細胞数抑制作用、肺コンソリデーション（肺炎症の重症度）抑制効果〕として検討した。詳細は、後記する試験例の方法に従った。
【００３５】
次に試験例を示して本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本試験は、ウイルス感染に伴う炎症によって産生されたインターロイキン−６、炎症細胞数、及び肺コンソリデーションの重症度に対するラクトパーオキシダーゼによる効果を調べるために行った。
【００３６】
（１）試料の調製
ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）を、１２．５質量％の濃度になるように精製水に溶解して試験試料を調製した。対照試料には精製水を使用した。
【００３７】
（２）試験方法
ａ）試料の投与
７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ雌性マウス（日本エス・エル・シー社から購入）合計１２匹を、糞食防止ネットを設置したケージに入れ、標準固形飼料（日本クレア社製）と飲水で一週間馴化飼育した。次に、前記マウスを６匹ずつ２群に分け、その１群に対照試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与して対照群とした。残りの１群には試験試料０．５ｍｌをゾンデで経口投与して試験群とした。これらの経口投与は、ウイルス感染の１日前から開始し、投与開始から７日間、一日一回ずつ連日投与した。ウイルス感染日（試料投与開始後２日目）に、すべてのマウスに対して、インフルエンザウイルスA/PR/8/34（H1N1）株６６０ＰＦＵ（ＰＦＵ：プラーク形成単位）を含むリン酸緩衝液１０μｌを麻酔下で経鼻的に接種した。感染６日後（試料投与終了日）にマウスを解剖し、以下に示す各種測定サンプルを回収した。
【００３８】
ｂ）測定サンプルの回収
試料投与終了後のマウスを、麻酔下で眼窩静脈から採血し、血清サンプルを回収した。また、解剖気道に注射針を差し込み、１ｍｌの血清無添加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬社製）を注射器で注入した後、同じ注射器内に液を回収した。同様の注入と回収をさらに２回繰り返し、計３回分の気管支肺胞洗浄液を回収した。回収した気管支肺胞洗浄液を１０００回転で遠心し、細胞画分と上清に分離した。細胞画分は炎症細胞サンプルとし、上清は気管支肺胞洗浄液上清サンプルとした。また、解剖したマウスから肺を回収し、肺コンソリデーションサンプルとした。
【００３９】
ｃ）インターロイキン−６濃度の測定
前記血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液サンプル中のインターロイキン−６の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、一群６匹の測定値を平均化した。
【００４０】
ｄ）炎症細胞数の測定
前記炎症細胞サンプルについて細胞数測定装置（日本光電社製）を使用して炎症細胞数を測定し、一群６匹の測定値を平均化した。
【００４１】
ｅ）肺コンソリデーションの重症度のスコア化
ウイルス感染による炎症の指標であるコンソリデーションの重症度は、ギンズバーグらの方法〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、アメリカ、第９５巻、１９５２年、第１３５〜１４５ページ〕に従って、０（コンソリデーションなし）から１０（重篤なコンソリデーション）にスコア化し、一群６匹の測定値を平均化した。
【００４２】
（３）試験結果
本試験の結果を表１、表２、表３に示す。表１は、血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液上清サンプル中のインターロイキン−６濃度の測定結果を示す。表２は、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数の測定結果を示す。表３は肺コンソリデーションスコアを示す。
【００４３】
その結果、表１から明らかなとおり、ウイルス感染マウスにラクトパーオキシダーゼを投与することにより、血清サンプル及び気管支肺胞洗浄液上清サンプル中のインターロイキン−６濃度は有意に減少することが判明した。
【００４４】
また、表２から明らかなとおり、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数はラクトパーオキシダーゼを投与することにより減少したことから、ラクトパーオキシダーゼによる炎症性細胞の滲出を抑制する効果も確認された。
【００４５】
さらに、表３から明らかなとおり、肺コンソリデーションスコアは対照群では５．０であったのに対し、ラクトパーオキシダーゼを投与した試験群では１．８に低下し、ラクトパーオキシダーゼによる肺の炎症抑制効果も確認された。
【００４６】
従って、ラクトパーオキシダーゼは、in vivoでインターロイキン−６の産生を効果的に抑制する作用を有し、その効果に伴って炎症性細胞の滲出を抑制する作用、及び肺の炎症症状を改善する効果が発揮されることが明らかとなった。
【００４７】
尚、気管支肺胞洗浄液の上清中のウイルス量について、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー（Journal of General Virology）、イギリス、第７１巻、１９９０年、ｐ．２１４９−２１５５〕によって測定したところ、対照群と試験群の間でウイルス量の差は認められなかったことから、ラクトパーオキシダーゼは生体内において直接インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス効果を持たないことが確認された。
【００４８】
【表１】
2004073733.tif 000008
【００４９】
【表２】
2004073733.tif 000009
【００５０】
【表３】
2004073733.tif 000010
【実施例】
【００５１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
実施例１
次の組成のインターロイキン−６産生抑制効果を有する注射剤を常法により製造した。
【００５３】
ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）            ２．０（％）
アクチノマイシンＤ（シグマ社製）                      ０．００５
塩化ナトリウム（和光純薬社製）                        ０．９
マンニトール（関東化学社製）                          １．０
注射用蒸留水（大塚製薬社製）                        ９６．０９５
【００５４】
実施例２
乳糖（メグレ社製）６００ｇ、トウモロコシデンプン（日清製粉社製）４００ｇ、結晶セルロース（和光純薬工業社製）４００ｇ及びラクトパーオキシダーゼ６００ｇを５０メッシュのふるい（ヤマト科学社製）により篩い分けし、厚さ０．５ｍｍのポリエチレン製の袋にとり、転倒混合し、全自動カプセル充填機（セセレ・ペディーニ社製。プレス式）を用い、前記粉末をカプセル（日本エランコ社製。１号ゼラチンカプセル、Op. Yellow No.6 Body、空重量７５ｍｇ）に内容量２７５ｍｇで充填し、インターロイキン−６産生抑制効果を有するカプセル剤７０００個を得た。
【００５５】
実施例３
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、および少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、およびラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）６０ｇを添加し、均一に混合して、インターロイキン−６産生抑制剤であるラクトパーオキシダーゼを含有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【００５６】
実施例４
ラクトパーオキシダーゼ（バイオポール社製）１５０ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１００ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６３５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）８５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）２４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、インターロイキン−６産生抑制剤であるラクトパーオキシダーゼを含有するタブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上詳記したとおり、本発明はラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤とその利用に関するものであり、本発明により奏される効果は次のとおりである。
（１）インターロイキン−６の産生を効果的に抑制することが可能である。
（２）インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防及び／又は治療に効果を有する。
（３）乳等の原料から安価で大量に製造することができる。
（４）ヒトに対する安全性が高く、日常的に摂取することが可能である。
（５）インターロイキン−６の産生に起因する疾患の予防用又は治療用であることを表示した飲食品組成物又は飼料組成物を提供することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月8日(2005.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトパーオキシダーゼを有効成分として含有するインターロイキン−６産生抑制剤。
【請求項２】
血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防及び／又は治療用の医薬である請求項１に記載のインターロイキン−６産生抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記の各々の発明において、前記インターロイキン−６の産生に起因する疾患としては、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、及びインフルエンザウイルス感染症等が挙げられる。すなわち、本発明のインターロイキン−６産生抑制剤の好ましい態様は、血小板増多症、骨髄腫、キャッスルマン病、心臓粘液腫、糸球体腎炎、慢性関節リューマチ、敗血症、又はインフルエンザウイルス感染症の予防及び／又は治療用の医薬である。
【国際調査報告】
2004073733.tif 000011
2004073733.tif 000012
2004073733.tif 000013
2004073733.tif 000014
2004073733.tif 000015
2004073733.tif 000016