(57)【要約】独自に開発した効率的なシグナル配列トラップ法を用い、マウス骨髄由来培養マスト細胞ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行なった結果、Ｉ型の膜蛋白質をコードし、細胞外ドメインに一つのイムノグロブリンドメインを有し、細胞内に抑制性シグナルを伝達するモチーフを有する遺伝子を同定することに成功した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
ＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質と結合する蛋白質をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡまたは請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、請求項３に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項３に記載の蛋白質に結合する抗体。
【請求項８】
配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項１０】
請求項３に記載の蛋白質とＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で請求項３に記載の蛋白質とＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合活性を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合活性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
【請求項１１】
抗アレルギー剤の製造方法であって、請求項７に記載の抗体または請求項９若しくは１０に記載の方法により得られた化合物と薬理学上許容される担体若しくは媒体とを混合することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、マスト細胞に由来する、新規な膜蛋白質およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関する。
【背景技術】  マスト細胞は、アトピー性皮膚炎、鼻炎、喘息などのアレルギー疾患において、抗原刺激によりヒスタミン等の炎症関連物質を放出するエフェクター細胞として働くことが知られている。現在、これらのアレルギー疾患の治療薬としては、抗ヒスタミン剤やステロイドなどのマスト細胞からの炎症関連物質の生成あるいは遊離を抑制する薬剤、あるいはその作用に拮抗する薬剤が使用されているが、より選択性の高い有効な薬剤の出現が望まれている。
これまでマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与する膜タンパクの候補として、ＦｃγＲＩＩＢ、ｇｐ４９Ｂ、ＳＩＲＰα等が知られているが、アレルギー疾患に関与する抗原刺激応答を制御するメカニズムの全体像は明らかにされていない。
【発明の開示】
本発明は、マスト細胞に由来し、マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与すると考えられる新規な膜タンパク質およびその遺伝子、並びにそれらの製造および用途を提供する。本膜タンパク質は、マスト細胞における抗原刺激応答あるいは生存・増殖シグナル伝達の制御メカニズムの解明に利用可能である。
本発明者等は、上記課題を解決するために、マスト細胞に関してよく特徴付けされたモデルであるマウス骨髄由来培養マスト細胞からｃＤＮＡライブラリを調製し、レトロウイルス媒介発現クローニングシステム（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，９１４６−９１５０）を用いて独自に開発した効率的なシグナル配列トラップ法（ＳＳＴ−ＲＥＸ法）（Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，４８７−４９０）を用い、シグナルペプチド（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、（１９８５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８４，９９−１０５）を有する分子のスクリーニングを行なった。ＳＳＴ−ＲＥＸ法では恒常的活性型サイトカインレセプターＭＰＬとの融合蛋白質を発現するライブラリーをスクリーニングすることによって、ＭＰＬを細胞表面に発現させることができる蛋白質をコードするｃＤＮＡを探索する。この方法では、ＭＰＬの細胞表面への発現による、ＩＬ−３依存性の細胞株への自律増殖能の賦与を指標とするため、簡便に目的のクローンを選別できる。
本発明者等は、２．０×１０６のクローンをスクリーニングした結果、Ｉ型の膜蛋白質をコードし、細胞外ドメインに一つのイムノグロブリンドメインを有し、細胞内に抑制性シグナルを伝達するモチーフを有する遺伝子を同定した。それをＭＣ−ＰＩＲ１と命名した（その後ＬＭＩＲ１と改名）。また、ＭＣ−ＰＩＲ１のイムノグロブリンドメインとアミノ酸レベルでおよそ９０％相同性を有する分子も同じ遺伝子ライブラリーから見出し、ＭＣ−ＰＩＲ２と命名した（その後ＬＭＩＲ２と改名）。
これらの遺伝子は、マスト細胞に特異的な発現分布を示した。また、ＭＣ−ＰＩＲ１は、架橋することによりリン酸化を受け、シグナル伝達経路の制御に関与するアダプタータンパクであるホスホチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２、およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素ＳＨＩＰとの結合性を示した。また、ＭＣ−ＰＩＲ２は、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγと会合した。従って、これらのタンパク質はマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与する膜タンパクであると考えられる。
ＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２はマウス由来の遺伝子であるが、これらの塩基配列を基に遺伝子検索を行った結果、これらと相同性を示すヒト遺伝子ＣＭＲＦ−３５Ｈ、ＩＲｐ６０、及びＣＭＲＦ−３５Ａの存在が明らかになった。これらのヒト遺伝子がマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与することは知られておらず、ＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２を利用して得られた知見は、これらのヒト遺伝子産物の新たな利用方法を提供する。
ＭＣ−ＰＩＲ１、ＭＣ−ＰＩＲ２、及びこれらのヒトホモログの天然リガンドは不明であるが、これらの遺伝子発現産物を利用すればその天然リガンドの発見が可能である。また、同様に天然リガンドの作用をミミックする化合物あるいは抗体のスクリーニングにも利用可能である。このスクリーニングの結果得られる化合物もしくは抗体は、肥満細胞の活性化シグナル伝達を阻害し、新規な作用メカニズムをもった抗アレルギー剤となる可能性が考えられる。
本発明は、マスト細胞に由来する膜タンパク質、その遺伝子、およびそれらと機能的に同等な分子、並びにそれらの製造および用途に関し、より具体的には、
（１）  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２）  ＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質と結合する蛋白質をコードする、（１）に記載のＤＮＡ、
（３）  （１）に記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質、
（４）  （１）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
（５）  （１）に記載のＤＮＡまたは（４）に記載のベクターを保持する宿主細胞、
（６）  （５）に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から発現させた蛋白質を回収する工程を含む、（３）に記載の蛋白質の製造方法、
（７）  （３）に記載の蛋白質に結合する抗体、
（８）  配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
（９）  （３）に記載の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該蛋白質に被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質と被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する工程、
を含む方法、
（１０）  （３）に記載の蛋白質とＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で（３）に記載の蛋白質とＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質からなる群より選択される蛋白質とを接触させる工程、
（ｂ）これら蛋白質の結合活性を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合活性を低下させる化合物を選択する工程、
を含む方法。
（１１）  抗アレルギー剤の製造方法であって、（７）に記載の抗体または（９）若しくは（１０）に記載の方法により得られた化合物と薬理学上許容される担体若しくは媒体とを混合することを含む方法、
を提供するものである。
本発明は、マスト細胞に由来し、マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与すると考えられる新規な膜タンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明者等は、マウス骨髄由来培養マスト細胞から調製したｃＤＮＡライブラリを、最近確立された新規シグナル配列トラップ法（ＳＳＴ−ＲＥＸ法）によって検索することにより、Ｉ型の膜蛋白質をコードし、細胞外ドメインに一つのイムノグロブリンドメインを有し、細胞内に抑制性シグナルを伝達するモチーフを有する２つの遺伝子を同定した。ＭＣ−ＰＩＲ１と命名した遺伝子の塩基配列を配列番号：１に、該遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、ＭＣ−ＰＩＲ１のイムノグロブリンドメインとアミノ酸レベルでおよそ９０％相同性を有する、ＭＣ−ＰＩＲ２と命名した遺伝子の塩基配列を配列番号：３に、該遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。これらの遺伝子は、マスト細胞に特異的な発現分布を示した。また、ＭＣ−ＰＩＲ１は、抗原刺激によりリン酸化を受け、シグナル伝達経路の制御に関与するアダプタータンパクであるホスホチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２、およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素ＳＨＩＰとの結合性を示した。また、ＭＣ−ＰＩＲ２は、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγと会合した。これらのタンパク質はマスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与する膜タンパクであると考えられ、例えば、肥満細胞の活性化シグナル伝達を阻害する新規な作用メカニズムをもった抗アレルギー剤の開発などへの利用が期待される。
本発明は、また、ＭＣ−ＰＩＲ１、ＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）と機能的に同等な蛋白質を包含する。このような蛋白質には、例えば、これら蛋白質の変異体、マウス以外の生物のホモログ等が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる蛋白質がＭＣ−ＰＩＲ１、ＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と同様の生物学的あるいは生化学的活性を有することを指す。このような活性としては、例えば、抗原刺激によりリン酸化を受け、シグナル伝達経路の制御に関与するアダプタータンパクであるホスホチロシン脱リン酸化酵素ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２、およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素ＳＨＩＰと結合する活性や、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＦｃＲγと結合する活性を例示することができる。
ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質（配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば、５アミノ酸以内）であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、これら蛋白質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、これら蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質（配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードするＤＮＡと他のペプチド又は蛋白質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定されない。
本発明の蛋白質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡを本発明の蛋白質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合蛋白質を調製することができる。
また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１と３）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と機能的に同等な蛋白質を単離することも通常行いうることである。
本発明には、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質をコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードし、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含まれる。このような蛋白質としては、例えば、マウスおよび他の哺乳動物のホモログ（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ウシなどがコードする蛋白質）が挙げられる。
ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ハイブリダイゼーションにかえて、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１と３）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、通常、これら蛋白質（配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明の蛋白質にはＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と機能的に同等であり、かつ該蛋白質のアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上（９６％以上，９７％以上，９８％以上，９９％以上）の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明の蛋白質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた蛋白質が、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例えば、本発明の蛋白質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明の蛋白質はこのような蛋白質も包含する。
本発明の蛋白質は、当業者に公知の方法により、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明の蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然の蛋白質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明の蛋白質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明の蛋白質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体の作製、本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明の蛋白質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明の蛋白質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明の蛋白質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明の蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質により治療可能な疾患の遺伝子治療、あるいは遺伝子診断などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明の蛋白質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明の蛋白質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明の蛋白質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明の蛋白質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１または３）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明の蛋白質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明の蛋白質を発現する細胞、組織、臓器（例えば、マスト細胞や本実施例におけるＲＴ−ＰＣＲにより発現が認められた組織）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５′−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５′−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において１４８位の塩基ａから１１０１位の塩基ｇまでの塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において１位の塩基ａから６８４位の塩基ｇまでの塩基配列からなるＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１または３に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションにおける条件は当業者であれば適宜選択することができるが、具体的には上記した条件を用いることができる。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡを得ることができる。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡである。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明の蛋白質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明の蛋白質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０  Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明の蛋白質コードする遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の蛋白質の製造や発現のための産生系として使用することができる。蛋白質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより蛋白質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内で蛋白質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的の蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の蛋白質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする蛋白質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明の蛋白質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば蛋白質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された蛋白質も包含する。
なお、蛋白質を精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
本発明は、また、本発明の蛋白質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明の蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来の蛋白質が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。ヒト由来の蛋白質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用される蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明の蛋白質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、蛋白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよい。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明の蛋白質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明の蛋白質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明の蛋白質の精製、検出に用いられる他、本発明の蛋白質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明の蛋白質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて蛋白質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明の蛋白質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明の蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。蛋白質として蛋白質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の蛋白質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該蛋白質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明の蛋白質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明の蛋白質の検出又は測定方法は、蛋白質を特異的に検出又は測定することができるため、蛋白質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ＭＣ−ＰＩＲ１蛋白質やＭＣ−ＰＩＲ２蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このような核酸には、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、該ＤＮＡの発現を検出するためのプローブやプライマー、本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードするＤＮＡ等）が含まれる。また、このような核酸は、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
プライマーとして用いる場合、３′側の領域は相補的とし、５′側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１または３の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１または３の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１または３に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明の蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋白質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明の蛋白質の発現を抑制することにより、結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明の蛋白質の発現を阻害し、従って本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明の蛋白質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の蛋白質は、これに結合する化合物のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋白質と、該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触せしめ、そして本発明の蛋白質に結合する活性を有する化合物を選択する、ことからなる本発明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法において使用される。
スクリーニングに用いられる本発明の蛋白質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態として、膜画分として被検試料に接触させることができる。
本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ  Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ  Ｉｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら  Ｇｅｎｅ  ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ  ＬＴＲ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ  α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ａｒｕｆｆｏ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｌａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ  ＴＫ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ  ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明の蛋白質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質を発現させることができる。用いるエピトープー抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合蛋白質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などとの融合蛋白質を発現することができるベクターが市販されている。
融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス糖蛋白質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ１０蛋白質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学１３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明の蛋白質、それと結合能を有する蛋白質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明の蛋白質に対する抗体は、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明の蛋白質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合蛋白質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降された蛋白質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることで蛋白質の分子量により結合していた蛋白質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明の蛋白質に結合した蛋白質は、クマシー染色や銀染色といった蛋白質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内の蛋白質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。蛋白質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的の蛋白質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明の蛋白質を用いて、該蛋白質に結合する蛋白質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば、脂肪細胞や実施例におけるノザンブロッティングにより発現が認められた組織）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させた蛋白質を固定し、精製して標識した本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応させ、本発明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明の蛋白質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明の蛋白質又は本発明の蛋白質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ  Ｓ，ａｎｄ  Ｔｒｅｉｓｍａｎ  Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＰ−１，ａｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ，Ｃｅｌｌ  ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））を用いて行う方法が挙げられる。２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明の蛋白質またはその部分ペプチドをＳＲＦ  ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードする蛋白質を得ることができる。これにより本発明の蛋白質に結合する蛋白質またはその遺伝子を調製することが可能である。２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２−ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明の蛋白質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明の蛋白質に結合した蛋白質を調製することができる。
得られた蛋白質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明の蛋白質と被検化合物との間の相互作用を微量の蛋白質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明の蛋白質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ  ＦＸ；Ｃｈａｎｇ  Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ  ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ  ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ  ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ  ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ  ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ  ２６  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ  ＧＬ．，Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ  ＪＣ  Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ  ７  １９９６，３８４  ｐ１７−９）が当業者に公知である。
また、本発明者らにより、本発明の蛋白質が、ＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質と結合することが示された。従って、上記免疫沈降や２−ハイブリッドシステムなどを利用して、被検試料の存在下における、本発明の蛋白質と、ＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、ＳＨＩＰ蛋白質、ＤＡＰ１０蛋白質、ＤＡＰ１２蛋白質、またはＦｃＲγ蛋白質との結合能を検出し、これら結合能を低下させるような化合物を選択することにより、医薬品候補化合物をスクリーニングすることも可能である。すなわち、本発明は、また、被検試料の存在下で本発明の蛋白質とＳＨＰ−１蛋白質、ＳＨＰ−２蛋白質、またはＳＨＩＰ蛋白質からなる群より選択される蛋白質とを接触させ、これら蛋白質の結合活性を検出し、被検試料非存在下で検出した場合と比較して、これら蛋白質の結合活性を低下させる化合物を選択することを含む、スクリーニング方法をも提供するものである。
本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物は、本発明の蛋白質の活性を調節するための薬剤の候補となり、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常などに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御することにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。このような疾患としては、マスト細胞のシグナル伝達に関係する疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、鼻炎、喘息などのアレルギー疾患を例示することができる。本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明の蛋白質に結合する化合物に含まれる。
本発明の蛋白質、または本発明のスクリーニングにより単離しうる化合物をヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、蛋白質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の蛋白質の投与量は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約１００μｇから２０ｍｇであると考えられる。
本発明の蛋白質と結合する化合物や本発明の蛋白質の活性を調節する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＭＣ−ＰＩＲ１のｃＤＮＡ配列と翻訳されるアミノ酸配列を示す図である。ＤＮＡ配列の下線点線はＳＳＴ−ＲＥＸで回収されたＤＮＡ断片である。ポリＡシグナルを下線で示す。シグナル配列は小文字で示す。太い下線は膜貫通ドメインを示す。二重下線はＩＴＩＭ配列を示す。ＳＳ結合をするシステインをボックスで示す。アスパラギン結合糖鎖の結合配列をボックスで示す。
図２は、ＭＣ−ＰＩＲ２のオープンリーディングフレームを示す図である。シグナル配列は小文字で示す。太い下線は膜貫通ドメインを示す。ＩＴＡＭ配列を有する他の共役分子との結合に重要な膜貫通ドメイン中のリジンをボックスで示す。ＳＳ結合をするシステインをボックスで示す。アスパラギン結合糖鎖の結合配列をボックスで示す。
図３は、各種臓器におけるＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２のＰＣＲによる発現解析の結果を示す電気泳動写真である。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
図４は、各種細胞におけるＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２のＲＴ−ＰＣＲによる発現解析の結果を示す電気泳動写真である。コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。
図５は、ＭＣ−ＰＩＲ１及びＭＣ−ＰＩＲ２がマスト細胞表面に存在することを示すＦＡＣＳによる解析結果を示す図である。
図６は、キメラタンパク質の抗マウスＩｇＧ抗体の架橋によるチロシンリン酸化の結果を示す電気泳動写真である。
図７は、ホスホチロシン脱リン酸化酵素、ＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２およびホスホイノシチド脱リン酸化酵素、ＳＨＩＰとの会合についての結果を示す電気泳動写真である。
図８は、ＭＣ−ＰＩＲ２がＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、あるいはＦｃＲγと会合することを示す電気泳動写真である。
図９は、ＦｃεＲＩのシグナル伝達とＭＣ−ＰＩＲ１の抑制作用について示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ｃＤＮＡライブラリの構築およびスクリーニング
レトロウイルスベクターｐＭＸ−ＳＳＴ（Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，４８７−４９０）を用いて、ｃＤＮＡライブラリ構築および発現を行なった。
ファスト・トラック２．０ｍＲＮＡ単離キット（インビトロゲン社、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて、製造元のプロトコールに従って、抗原刺激をしたマウス骨髄由来マスト細胞からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出した。
スーパースクリプト・チョイス・システム（インビトロゲン社）を用いて、ｃＤＮＡをランダムヘキサマーによってポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成し、ＢｓｔＸＩアダプターを用いてｐＭＸ−ＳＳＴベクターのＢｓｔＸＩ部位に挿入した（インビトロゲン社）。ＳＳＴ−ＲＥＸライブラリーを構築するために、ライゲーションしたＤＮＡをＤＨ１０Ｂ細胞（エレクトロマックス、インビトロゲン社）で増幅して、キアゲン・プラスミドキット（キアゲン・インク、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて、ライブラリーＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡライブラリーの規模は２．０×１０６クローンであった。
ＳＳＴ−ＲＥＸライブラリーを提示する高力価レトロウイルスを、パッケージングした細胞株Ｐｌａｔ−Ｅ（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，１０６３−１０６６）を用いて産生し、記述のようにＢａ／Ｆ３細胞に感染させた。１日感染させた後、細胞を３回洗浄し、９６ウェルマルチタイタープレート（１０３個／ウェル）を用いてＩＬ−３の非存在下でクローンを選択した。
１２日後、ゲノムＤＮＡを因子非依存的Ｂａ／Ｆ３クローンから抽出し、ゲノムＰＣＲに供し、ベクタープライマーを用いて、組み入れられたｃＤＮＡを回収した（ＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＴＣＴＡ／配列番号：５、およびＣＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＧ／配列番号：６）。ジーンアンプＰＣＲシステム４８０（パーキン・エルマー、ノーウォーク、コネチカット州）およびＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ、京都、日本）を用いて、ＰＣＲを３０サイクル（９８℃で変性２０秒、６８℃でアニーリングおよび伸長２分）行った。得られたＰＣＲ断片を、Ｔａｑダイターミネーター・サイクルシークエンシングキット（アプライド・バイオシステムズ・インク、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてシークエンシングして、自動シークエンサー（３７７遺伝子アナライザー、アプライド・バイオシステムズ・インク）によって分析した。
なお、実験に用いた分化したマウス骨髄由来培養マスト細胞は、以下のようにして調製した。ＣＢＡ／ＪＮマウスの大腿骨から調製した骨髄細胞を、１０％ＦＣＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３を含むＲＰＭＩ１６４０中で５％ＣＯ２において３７℃で培養した。数日おきに５×１０５細胞の密度で継代培養し、４週間維持し、細胞を分化させた。マウスＩＬ−３依存的前Ｂ細胞株であるＢａ／Ｆ３を１０％ＦＣＳおよび１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄシステムズ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
マスト細胞の抗原による刺激は、以下のように行った（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３５１３−３５１９）。マスト細胞を０．５μｇ／ｍｌの抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体（シグマ）で一晩感作し、翌日に１００ｎｇ／ｍｌのＤＮＰ−ＢＳＡ（コスモバイオ社）で２時間刺激した。
［実施例２］  単離されたｃＤＮＡクローンの分析
ｃＤＮＡクローンの中でのシグナル配列を含み、一つのイムノグロブリンドメインをコードする遺伝子断片を単離した。
オリゴｄ−Ｔプライマーを用いたｃＤＮＡライブラリーを構築した。スーパースクリプト・チョイス・システム（インビトロゲン社）を用いて、ｃＤＮＡをオリゴｄ−Ｔプライマーによってポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成し、ＢｓｔＸＩアダプターを用いてｐＭＥ１８ＳベクターのＢｓｔＸＩ部位に挿入した（インビトロゲン社）。オリゴｄ−Ｔライブラリーを構築するために、ライゲーションしたＤＮＡをＤＨ１０Ｂ細胞に増幅して、プラスミド精製キット（キアゲン・インク、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてライブラリーＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡライブラリーの規模は１．５×１０８クローンであった。
ＲｅｃＡ（第一化学薬品（株）、東京、日本）を用いたハイブリダイゼーションにより全長ｃＤＮＡを単離した。先に単離したｃＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、ビオチン２１−ｄＵＴＰ（クローンテック社）を取り込ませたおよそ５００ｂｐのプローブを合成した。このプローブをＲｅｃＡ存在下にオリゴｄ−ＴｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションさせた。ストレプトアビジン−マグネチックビーズ（プロメガ社）で回収したＤＮＡをＤＨ１０Ｂ細胞で増幅して（エレクトロマックス、インビトロゲン社）大腸菌クローンを得た。得られた大腸菌クローンを大量培養し、キアゲン・プラスミドキット（キアゲン・インク）を用いてＤＮＡを調製した。Ｔａｑダイターミネーター・サイクルシークエンシングキット（アプライド・バイオシステムズ・インク、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いてシークエンシングして、自動シークエンサー（３７７遺伝子アナライザー、アプライド・バイオシステムズ・インク）によって分析した。
得られたｃＤＮＡは全長１７５２塩基対であり、９５７残基がオープンリーディングフレームであった。３’側は６４８残基であり、ポリＡ付加シグナルを有していた。翻訳されたアミノ酸配列は３１８残基であり、２７残基のシグナルシークエンス、１５６残基の細胞外ドメイン、２３残基の細胞膜貫通ドメイン、１１２残基の細胞内ドメインであった。また、細胞外ドメインはバリアブルタイプのイムノグロブリンドメインを一つ有していた。細胞内ドメインは４個のＩＴＩＭ様配列を有していた（図１）。この遺伝子をＭＣ−ＰＩＲ１と命名した。
このマウス由来の新規遺伝子に相同性を示す遺伝子として、ＣＭＲＦ−３５−Ｈ９（ＣＭＲＦ−３５Ｈ）（Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，８９１−８９９，１９９８、アクセションＮｏ．ＡＦ０２０３１４）およびＩＲｐ６０（Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，３１４８−３１５９，１９９９、アクセションＮｏ．ＡＪ２２４８６４）が存在する。しかしながら、ＣＭＲＦ−３５ＨおよびＩＲｐ６０がマスト細胞に発現することは知られていない。これらの遺伝子は、構造上の類似性からＭＣ−ＰＩＲ１のヒトホモログと考えられる。
ＭＣ−ＰＩＲ１の配列を元に、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ遺伝子データーバンクを調べたところＭＣ−ＰＩＲ１のイムノグロブリンドメインとおよそ９０％の相同性を有する遺伝子配列が得られた（アクセション＃ＢＣ００６８０１）。得られた配列情報を元にプライマーを作製した。マスト細胞から調製した全ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、同様の遺伝子産物の発現が認められた。更に、ＤＮＡ断片を回収して配列を調べた。
遺伝子データーバンクに登録されている配列とほぼ同じ遺伝子（アクセションＮｏ．ＢＣ００６８０１と２ヶ所の塩基が異なり、２個のアミノ酸置換が見られる）が得られ、ＭＣ−ＰＩＲ２と命名した（図２）。その後、ＭＣ−ＰＩＲ２はＤＩｇＲ１（Ｌｕｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８７，３５−４１，２００１；アクセションＮｏ．ＡＹ０４８６８５）と全く同じタンパク質をコードすることが明らかになった。また、このマウス由来の遺伝子に相同性を示すヒト遺伝子として、ＣＭＲＦ−３５Ａ（Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５７，４１５−４２３，２００１、アクセションＮｏ．ＢＣ０２２２７９）が存在する。しかしながら、ＤＩｇＲ１あるいはＣＭＲＦ−３５Ａがマスト細胞に発現することは知られておらず、その機能も不明である。
［実施例３］  ＭＣ−ＰＩＲ１及びＭＣ−ＰＩＲ２の発現分布
ＰＣＲ法により遺伝子発現パターンを解析した。マウスの各種臓器由来のｍＲＮＡが予めｃＤＮＡ化されたＤＮＡ（クロンテック社）を鋳型にして、ＰＣＲ法により遺伝子断片を増幅した。また、各種血球系細胞株から全ＲＮＡをトリゾール試薬（インビトロゲン社）を用いて抽出した。得られた全ＲＮＡをリバーストランスクリプターゼ（キアゲン社）を用いてｃＤＮＡ化したものを鋳型にして、ＰＣＲ法により遺伝子断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片を１％アガロース寒天により分離した。
ＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２の発現は両者とも脾臓および肝臓で多くの発現が見られた。両者とも特異的なＤＮＡ断片の増幅は、マウス骨髄由来培養マスト細胞（ＢＭＭＣ）で見られた。ＭＣ−ＰＩＲ１ではその他の細胞株、Ｂａ／Ｆ３、Ａ２０、ＥＬ４、ＣＴＬＬ−２、ＦＤＣ−Ｐ１、Ｌ−Ｇ、３２Ｄｃ１３、Ｊ７７４．１、Ｐ８１５では増幅は見られなかった。ＭＣ−ＰＩＲ２はＪ７７４．１、ＦＤＣ−Ｐ１でも発現が見られた（図３、図４）。以上の実験事実はＭＣ−ＰＩＲ１およびＭＣ−ＰＩＲ２はマスト細胞の機能調節に密接に関与していることを示唆している。
［実施例４］  マウス骨髄由来マスト細胞におけるＭＣ−ＰＩＲ１及びＭＣ−ＰＩＲ２の細胞表面における発現
実施例１で示した方法で調製したマスト細胞をＰＥ標識抗ＣＤ１１７モノクローナル抗体（ＢＤファーミンジェン）と反応後、抗ＭＣ−ＰＩＲ１マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズに委託して作製）あるいは抗ＭＣ−ＰＩＲ２ウサギポリクローナル抗体（シグマジェノシスに委託して作製）と反応させた。細胞を洗浄後、それぞれの細胞を、ＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＢＤファーミンジェン）あるいはＦＩＴＣ標識抗ウサギイムノグロブリン抗体（ＢＤファーミンジェン）と反応させた。細胞を洗浄後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトンデッキンソン）で解析した。
調製した細胞のおよそ９０％から９５％がＣＤ１１７陽性細胞であり、ほぼ全ての細胞がマスト細胞に誘導されていた。ＣＤ１１７陽性細胞の内、９０％の細胞がＭＣ−ＰＩＲ１陽性であり、２５％がＭＣ−ＰＩＲ２陽性であった（図５）。これらの結果は、ＭＣ−ＰＩＲ１及びＭＣ−ＰＩＲ２がマスト細胞表面上に存在することを示すものである。
［実施例５］  ＭＣ−ＰＩＲ１の細胞内ドメインの解析
ＦｃγＲＩＩＢとＭＣ−ＰＩＲ１のキメラ遺伝子を作製した。ＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインをコードする遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅した。同様にＭＣ−ＰＩＲ１の細胞内ドメインをコードする遺伝子断片をＰＣＲ法にて増幅した。両遺伝子断片を混合したものを鋳型にし、再度ＰＣＲ法にて遺伝断片を増幅しキメラ遺伝子を作製した。その後、キメラ遺伝子断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにて消化し、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏベクターに挿入し、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−Ｆｃ−ＰＩＲ１を作製した。
ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ−Ｆｃ−ＰＩＲ１を提示する高力価レトロウイルスを、パッケージング細胞株Ｐｌａｔ−Ｅを用いて産生し、記述のようにＦｃγＲＩＩＢ欠損細胞であるＩＩＡ１．６細胞（Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６，３４８−３５６）に感染させた。感染１日後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（クロンテック社）を培地に添加し、更に１週間培養してキメラ遺伝子発現細胞株を得た。
キメラ遺伝子発現細胞株の細胞表面に発現しているＢ細胞受容体、およびキメラ遺伝子を抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメッド社）で架橋した細胞を経時的に採取し、細胞溶解緩衝液で溶解した。細胞溶解液に２．４Ｇモノクローナル抗体（ベクトンデッキンソン）および抗ラットＩｇＧ抗体−セファロースを添加し、免疫複合体を沈降させた。得られた沈降物をペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（第一化学薬品（株））で消化し、１０％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。
ポリアクリルアミド電気泳動で分離した免疫複合体をイモビロン−Ｐメンブラン（ミリポア社）に電気的に転写した。メンブランを１０％ＦＣＳを含む緩衝液でブロックした後、４Ｇ１０モノクローナル抗体（アップステートバイオテクノロジー社）続いてＨＲＰ結合抗マウスイムノグロブリン抗体（シグマ）とインキュベーションした。その後ケミルミネッセンス試薬（ファルマシア社）で検出した。
キメラ遺伝子発現細胞株を同様に架橋後、以下同様にメンブランを調製した。メンブランを抗ＳＨＰ−１抗体（サンタクルーズ社）、抗ＳＨＰ−２抗体（サンタクルーズ社）、あるいは抗ＳＨＩＰ抗体と反応させた。その後の検出は同様に行った。
キメラタンパク質は架橋後、０．５分でチロシンのリン酸化が検出された。また、キメラタンパク質を含む免疫複合体中にはＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、ＳＨＩＰが含まれていた。これらの会合はキメラタンパク質のチロシンのリン酸化に依存して生じていた（図６、図７）。
［実施例６］  ＭＣ−ＰＩＲ２とＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子との会合
Ｃ末端側にＨＡタグを付加したプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＭＣ−ＰＩＲ２を増幅した。得られた遺伝子断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩにて消化後、ｐＭＫＩＴベクターに挿入し、ｐＭＫＩＴ−ＭＣ−ＰＩＲ２−ＨＡを作製した。
ＩＴＡＭ配列を有するＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＦｃＲγの成熟型タンパク質をコードする遺伝子断片をＰＣＲ法により増幅した。得られた遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＭＫＩＴ−ＦＬＡＧベクターのＦＬＡＧタグ下流に挿入した。
ｐＭＫＩＴ−ＭＣ−ＰＩＲ２−ＨＡおよびｐＭＫＩＴモックベクター、あるいはＦＬＡＧ−ＤＡＰ用ベクター、あるいはＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２ベクター、あるいはＦＬＡＧ−ＦｃＲγベクターをＣＯＳ１細胞にトランスフェクションをした。２日後に細胞を回収し、細胞溶解緩衝液で溶解した。細胞溶解液に抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５、ロシュダイアグノスティックス）およびプロテインＡセファロースを添加し、免疫複合体を沈降させた。得られた沈降物を１５％ポリアクリルアミド電気泳動に供した。ポリアクリルアミド電気泳動で分離した免疫複合体をイモビロン−Ｐメンブラン（ミリポア社）に電気的に転写した。メンブランを１０％ＦＣＳを含む緩衝液でブロックした後、抗ＦＬＡＧ−Ｍ２モノクローナル抗体（シグマ）、続いてＨＲＰ結合抗マウスイムノグロブリン抗体（シグマ）とインキュベーションした。その後ケミルミネッセンス試薬（ファルマシア社）で検出した。
ＭＣ−ＰＩＲ２とｐＭＫＩＴモックベクターを導入した場合には抗ＦＬＡＧ抗体で検出されるバンドは見られなかった。ＭＣ−ＰＩＲ２とＦＬＡＧ−ＤＡＰ１０、あるいはＦＬＡＧ−ＤＡＰ１２、あるいはＦＬＡＧ−ＦｃＲγを導入した場合には、それぞれ抗ＦＬＡＧ抗体でバンドが検出された。従って、ＭＣ−ＰＩＲ２は、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０（Ｗｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，７３０−７３２）、ＤＡＰ１２（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，７０３−７０７）、あるいはＦｃＲγ（Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１３１３−１３２３）と会合することが示された（図８）。これらの結果は、ＭＣ−ＰＩＲ２が活性化シグナル伝達の制御に関与することを示す。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、マスト細胞に由来し、マスト細胞のシグナル伝達経路の制御に関与すると考えられる新規な膜タンパク質をコードする遺伝子が提供された。これらの遺伝子産物の発現特性及びシグナル伝達に関与するタンパク質への結合性から、これらは以下の作業仮説により、マスト細胞の抗原刺激後のシグナル伝達を抑制もしくは活性化すると考えられる。
即ち、マスト細胞がＩｇＥと抗原によりＦｃεＲＩが架橋をされると、細胞内でプロテインキナーゼ活性の上昇に引き続き、ホスファチジルイノシトールの代謝回転が亢進され、細胞内カルシウム濃度の上昇および脱顆粒が引き起こされる。また、ＰＩ３Ｋも活性化されることから細胞膜上ではＰＩＰ３の上昇を引き起こし、Ｂｔｋなどが活性化される（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，５１０８−５１１３）。一般に抑制性のシグナル伝達経路としてはＦｃγＲＩＩＢなどに見られる、ＳＨＩＰ依存性経路（Ｍｕｔａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，３６８，７０−７３）と、チロシン脱リン酸化酵素により伝達されるＳＨＰに依存する経路（Ｂｉｎｓｔａｄｔ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５，６２９−６３８）が知られているが、ＭＣ−ＰＩＲ１では両経路を同時に活性化できるため、ＦｃεＲＩからのシグナルをより強く抑制できると考えられる（図９）。
一方、ＭＣ−ＰＩＲ２はＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＦｃＲγと会合することから、ＳｒｃファミリーキナーゼあるいはＰＩ３キナーゼ等のリン酸化酵素を通じて活性化を引き起こすと考えられる（Ｗｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，７３０−７３２、Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，７０３−７０７、Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，１３１３−１３２３）。従って、例えばＭＣ−ＰＩＲ２とこれらのＩＴＡＭを有するシグナル伝達分子との会合を阻害すれば、活性化シグナル伝達を抑制することができるものと期待される。即ち、ＭＣ−ＰＩＲ２自身がマスト細胞の活性化シグナル伝達抑制物質の標的分子となる可能性が考えられる。
ＭＣ−ＰＩＲ１、ＭＣ−ＰＩＲ２、及びこれらのヒトホモログの遺伝子発現産物は天然リガンド、その作用をミミックする化合物、あるいは抗体のスクリーニングに利用可能である。これらの発現産物を利用したスクリーニングによって得られたリガンド、化合物もしくは抗体は、マスト細胞の活性化シグナル伝達を阻害し、新規な作用メカニズムをもった抗アレルギー剤となる可能性が考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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