(57)【要約】本発明は、従来型のオリゴヌクレオチドは両端が開放になっているために不安定であること、ホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾により分解酵素に対する安定性高めることも行われているがホスホロチオエートに起因する毒性が生じることなどの問題点を改善したオリゴヌクレオチドと医薬を提供する。詳しくは、ステイプル型オリゴヌクレオチドおよびそれを有効成分とする医薬。具体的には転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡであり、より具体的には炎症、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再潅流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化またはＰＴＣＡ後の再狭窄の予防・治療・改善剤であり、さらに具体的には関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病、慢性関節リウマチまたは変形性関節症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡の予防・治療・改善剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖オリゴヌクレオチドであって、５’端配列が中間部配列に逆向きの相補性を有し、３’端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない３〜１０の塩基配列からなるループ部を有するステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
一本鎖オリゴヌクレオチドが３０〜７０塩基長である、請求項１記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
一本鎖オリゴヌクレオチドが３４〜６４塩基長である、請求項１または２記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
一本鎖オリゴヌクレオチドが３８〜５８塩基長である、請求項１ないし３のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
一本鎖オリゴヌクレオチドが４２〜５４塩基長である、請求項１ないし４のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ループ部が、４〜６塩基長である請求項１ないし５のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
一本鎖オリゴヌクレオチドが４２〜５４塩基長であり、ループ部が４〜６塩基長である、請求項１ないし６のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＤＮＡ誘導体である、請求項１ないし７のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
リン酸基がホスホロチオエート化されていないことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
配列表の配列番号１ないし３、または下記構造式で表されるオリゴデオキシヌクレオチドから選ばれた１種である、請求項１ないし９のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
2005030960.tif 000011
式中、縦線は非結合部［５’端および３’端］を意味する。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のステイプル型オリゴヌクレオチドからなる医薬。
【請求項１２】
医薬が転写因子阻害剤、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡである請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
転写因子阻害剤が拮抗的阻害剤である、請求項１２記載の医薬。
【請求項１４】
転写因子が、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＧＡＴＡ−３、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥから選ばれた１種である、請求項１２または１３記載の医薬。
【請求項１５】
医薬が、炎症、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再潅流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化または経皮的冠動脈形成術（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ；ＰＴＣＡ）後の再狭窄の予防・治療・改善剤である、請求項１２ないし１４のいずれかに記載の医薬。
【請求項１６】
炎症が、関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１２ないし１５のいずれかに記載の医薬。
【請求項１７】
関節炎が、慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、請求項１６記載の医薬。
【請求項１８】
皮膚炎が、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡である、請求項１６記載の医薬。
【請求項１９】
請求項１ないし１０のいずれかに記載したステイプル型オリゴヌクレオチドを転写因子阻害剤、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡの製造のために用いる用途。
【請求項２０】
請求項１ないし１０のいずれかに記載したステイプル型オリゴヌクレオチドの薬理学上有効量を患者に投与することにより、転写因子阻害剤、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡが有効な疾患を予防・治療・改善する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なステイプル型オリゴヌクレオチド、およびそれを有効成分とする医薬に関する。
【背景技術】  従来オリゴヌクレオチドは、転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどとして広く利用されてきた。
これらの中でも、例えば転写因子阻害剤として具体的には、遺伝子発現を調整する転写因子の活性を特異的に阻害する分子おとり（デコイオリゴヌクレオチド、以下デコイ）型核酸を挙げることができる。
ここで転写とは、生体内の遺伝情報が発現する際、ＤＮＡを鋳型にしてメッセンジャーＲＮＡを合成する過程を指し、転写によって作られたメッセンジャーＲＮＡの情報をもとにタンパク質が合成される。この転写を調整する因子を転写調節因子と呼んでいる。
具体的には、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＧＡＴＡ−３、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、Ｅｔｓ、ＣＲＥなど５４種類が知られている。
アンチセンスとして具体的には、目的の遺伝子と対合する配列を持ち、その遺伝子の発現を抑止する医薬を挙げることができる。
ｓｉＲＮＡとして具体的には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によって、標的遺伝子の発現阻害する医薬を挙げることができる。
またこれらのオリゴヌクレオチドは、構造上、二本鎖を構成していることが特徴である。
本発明の背景となる先行文献は、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３  Ｓｅｐ  ５；３０８（４）：６８９−９７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  Ｄｅｃ；９（２４）：１６８２−９２およびＣｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００２  Ｊｕｎ  ２８；９０（１２）：１３２５−３２  である。
【発明の開示】
本発明において解決しようとする問題点は、従来型のオリゴヌクレオチドは両端が開放（ｏｐｅｎ）になっているために不安定であること、またホスホロチオエート化（Ｓ化）修飾によりエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）等の分解酵素に対する安定性を高めることも行われているが、ホスホロチオエートに起因する毒性が生じることである。
本発明は、具体的には下記の物質および医薬である。
（１）一本鎖オリゴヌクレオチドであって、５’端配列が中間部配列に逆向きの相補性を有し、３’端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない３〜１０の塩基配列からなるループ部を有するステイプル型オリゴヌクレオチド。
（２）一本鎖オリゴヌクレオチドが３０〜７０塩基長である、（１）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（３）一本鎖オリゴヌクレオチドが３４〜６４塩基長である、（１）ないし（２）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（４）一本鎖オリゴヌクレオチドが３８〜５８塩基長である、（１）ないし（３）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（５）一本鎖オリゴヌクレオチドが４２〜５４塩基長である、（１）ないし（４）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（６）ループ部が、４〜６塩基長である（１）ないし（５）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（７）一本鎖オリゴヌクレオチドが４２〜５４塩基長であり、ループ部が４〜６塩基長である、（１）ないし（６）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（８）オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＤＮＡ誘導体である、（１）ないし（７）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（９）リン酸基がホスホロチオエート化されていないことを特徴とする、（１）ないし（８）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（１０）配列表の配列番号１ないし３で表されるオリゴデオキシヌクレオチドから選ばれた１種である、（１）ないし（９）記載のステイプル型オリゴヌクレオチド。
（１１）（１）ないし（１０）記載のステイプル型オリゴヌクレオチドからなる医薬。
（１２）医薬が転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである（１１）記載の医薬。
（１３）転写因子阻害剤が拮抗的阻害剤である、（１２）記載の医薬。
（１４）転写因子が、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＧＡＴＡ−３、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥから選ばれた１種である、（１２）または（１３）記載の医薬。
（１５）医薬が、炎症、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再潅流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化または経皮的冠動脈形成術（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ；ＰＴＣＡ）後の再狭窄の予防・治療・改善剤である、（１２）ないし（１４）記載の医薬。
（１６）炎症が、関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、（１２）ないし（１５）記載の医薬。
（１７）関節炎が、慢性関節リウマチまたは変形性関節症である、（１６）記載の医薬。
（１８）皮膚炎が、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍または褥瘡である、（１６）記載の医薬。
（１９）（１）ないし（１０）のいずれかに記載したステイプル型オリゴヌクレオチドを転写因子阻害剤、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡの製造のために用いる用途。
（２０）（１）ないし（１０）のいずれかに記載したステイプル型オリゴヌクレオチドの薬理学上有効量を患者に投与することにより、転写因子阻害剤、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡが有効な疾患を予防・治療・改善する方法。
本発明におけるステイプル型オリゴヌクレオチドは一本鎖であって、５’端配列が中間部配列に逆向きの相補性を有し、３’端配列も中間部配列に逆向きの相補性を有し、中間部の両端に分子内で相補的な結合を形成しない３〜１０の塩基配列からなるループ部を有するステイプル型構造（押圧後のホッチキス針の形状）を有しており、具体的には例えば、下記化学式のような構造を有する。
2005030960.tif 000002
式中、縦線は非結合部［５’端および３’端］を意味する。
またその鎖長は限定されないが、通常は３０〜７０塩基長であり、好ましくは３４〜６４塩基長であり、より好ましくは３８〜５８塩基長であり、さらに好ましくは４２〜５４塩基長である。
次にループ部は３〜１０塩基長であり、好ましくは４〜６塩基長である。
さらに５’端および３’端の折り返し部配列（５’端または３’端からループ部までの相補性を有する配列）の鎖長も限定されないが、通常は４〜２０塩基長であり、好ましくは６〜１８塩基長であり、より好ましくは８〜１６塩基長である。
なお５’端および３’端の折り返し部配列の鎖長は、同一（対称形）であっても異なって（非対称形）いてもよい。
さらに本発明におけるオリゴヌクレオチドは限定されず、ＤＮＡ、ＤＮＡ誘導体、ＲＮＡあるいはＲＮＡ誘導体であってもよいが、ＤＮＡまたはＤＮＡ誘導体がより好ましい。
本発明におけるステイプル型オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列表の配列番号１ないし３で表されるオリゴデオキシヌクレオチドを挙げることができる。
なお本発明にかかるステイプル型オリゴヌクレオチドは、常法に従い、ＤＮＡ合成機などで目的とする一本鎖配列を合成した後、溶媒中で加温することによって得ることができる。
また本発明におけるホスホロチオエートとは、リン酸基中の酸素原子が一部または全部、硫黄原子で置換された構造を意味する。
本発明におけるステイプル型オリゴヌクレオチドの医薬用途は限定されないが、具体的には、例えば転写因子阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等であり、より具体的には、例えば炎症、自己免疫疾患、中枢性疾患、虚血性疾患の再潅流障害、臓器移植又は臓器の手術後の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄等の予防・治療・改善剤である。
ここで炎症としてさらに具体的には、例えば関節炎、皮膚炎、腎炎、肝炎、腎不全、膀胱炎、前立腺炎、尿道炎、潰瘍性大腸炎、クローン病等を挙げることができる。
次に関節炎としてさらに具体的には、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）等を挙げることができる。
続いて皮膚炎としてさらに具体的には、例えばアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬、皮膚潰瘍、褥瘡等を挙げることができる。
本発明におけるステイプル型オリゴヌクレオチドの投与量あるいは投与経路も、疾患の種類・程度、症状、患者の年齢、性別、合併症、併用薬等によって異なり限定されないが、通常１回あたり１０μｇ〜１０ｇを、好ましくは１００μｇ〜５ｇを、より好ましくは１ｍｇ〜１ｇを、経皮、皮下、関節内、筋肉内、静脈内または経口投与する。
なお本発明とは別に、例えばＷＯ０３／０９１４３２号公報等に開示された環状デコイ（リボン型デコイ）もあるが、本発明にかかるステイプル型は開環部を有しており、構造的に全く異なる。
本発明の実施により、従来型オリゴヌクレオチドが有する不安定性が改善され、投与量低減が可能となり、また安全性も向上させることができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＬＰＳ刺激２４時間後の、培養上清中のＩＬ−１β量を示した図である。
図２は、ＬＰＳ刺激２４時間後の、滑膜上清中のＩＬ−１β量を示した図である。
図３は、ステイプル型デコイの安定性を示した電気泳動図である。
【実施例】  以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
［実施例１］
ステイプル型オリゴヌクレオチドの抗炎症効果の検討
Ａ．サイトカインの定量
１．滑膜組織の処理
（１）手術時に採取した関節リウマチ患者の滑膜組織をホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）した後、１００ｍｇずつ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播いた。（無血清培地［ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ］５００μｌ／ｗｅｌｌ）
ＮＦ−κＢデコイ、Ｓｃｒａｍｂｌｅデコイのトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）（ＨＶＪ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ法）
（２）ＨＶＪ１．１×１０４  ＨＡＵ／１．１ｍｌ  ＢＳＳ［Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６］の状態で９９ｍＪ／ｃｍ２でＵＶ処理した。
（３）１ｍｌずつ１．５ｍｌチューブに分注し、４℃，１５０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ遠心処理した。
（４）２００μｇのデコイにＢＳＳを添加し９２μｌとした。
（５）３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液８μｌを添加した。
（６）４℃，１５０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ遠心後上清除去した。
（７）ＢＳＳ  １ｍｌを加えて混合後１５０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ遠心分離した。
（８）上清除去後２００μｌのＰＢＳに懸濁した。
（９）１５μＭになるようにデコイ−ＨＶＪ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ混合体を滑膜組織に加えて３７℃のＣＯ２インキュベーターで３０分インキュベートした。
加えたデコイの配列
二重鎖ＮＦ−κＢデコイ
2005030960.tif 000003
Ｓｃｒａｍｂｌｅデコイ
2005030960.tif 000004
ステイプル型オリゴヌクレオチド（ｉ）
2005030960.tif 000005
リボン型オリゴヌクレオチド（ｉｉ）
2005030960.tif 000006
２．ＬＰＳ刺激
（１０）デコイ−ＨＶＪ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ混合体を除去し１０％ＦＢＳ入り培養液（ｍｅｄｉｕｍ）５００μｌを加えて０．０１μｇ／ｍｌとなるようにＬＰＳを添加した。
３．培養液、滑膜組織回収、ＩＬ−１β測定
（１１）２４時間後に培養液及び滑膜組織を回収。滑膜組織にＰＢＳ  ５００μｌを加えてホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）でホモジナイズ（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）した。
５０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心後上清を採取した。ＩＬ−１β測定まで−２０℃で保存した。
（１２）培養上清、滑膜上清をＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキット（ＥＮＤＯＧＥＮ社、カタログＮｏ．：ＥＨ２１Ｌ１Ｂ）で測定した。
４．結果
2005030960.tif 000007
2005030960.tif 000008
ＮＴ：未処置群
ＳＣ：ｓｃｒａｍｂｌｅデコイ投与群
ＮＦ：ＮＦκＢデコイ投与群
Ｒ１：ステイプル型オリゴヌクレオチド（ｌｉｇａｔｉｏｎ１か所）
Ｒ２：リボン型オリゴヌクレオチド（ｌｉｇａｔｉｏｎ２か所）
ステイプル型オリゴヌクレオチド作用群において培養上清、滑膜上清中のＩＬ−１βの産出を抑えていた。１ケ所ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）したステイプル型オリゴヌクレオチドの方が抑制効果は強かった。（二重鎖ＮＦκＢ作用群で今回の実験では抑制効果が弱かった。）
上記サイトカイン定量の全体の流れを下記に示す。
2005030960.tif 000009
［実施例２］
Ｂ．リボン型デコイの安定性試験（図３参照）
目的：関節液（原液）中でのデコイの耐性比較
配列、実験条件：
１）Ｓ化二重鎖デコイ
２）Ｓ化ステイプル型デコイ
３）非Ｓ化ステイプル型デコイ（Ｓ化なし）
４）一本鎖デコイ（ステイプル型オリゴヌクレオチドのｌｉｇａｔｉｏｎする前の段階）
５）断端Ｓ化一本鎖デコイ（ステイプル型オリゴヌクレオチドのｌｉｇａｔｉｏｎする前の段階、両断端のみＳ化したもの）
それぞれに関節液（原液）を０％，５０％または１００％加え、安定性を電気泳動にて比較した。
結果：関節液中で１）Ｓ化二重鎖デコイ、２）Ｓ化ステイプル型デコイと５）断端Ｓ化一本鎖デコイは安定、３）非Ｓ化ステイプル型デコイはほぼ安定、４）一本鎖デコイは分解されていた。
詳しくは、１）Ｓ化二重鎖デコイ、２）Ｓ化ステイプル型デコイは、共に１００％関節液中においても０％（無添加）と同様に安定であった。
また３）非Ｓ化ステイプル型デコイでは、関節液濃度依存的にデコイの安定性は減少したものの、１００％関節液中においても、十分に検出可能な安定なデコイが存在した。
一方、４）断端Ｓ化一本鎖デコイと５）一本鎖デコイは、１）〜３）と比較して関節液中での安定性は低かった。
しかし４）断端Ｓ化一本鎖デコイと５）一本鎖デコイを比較すると、４）断端Ｓ化一本鎖デコイでは１００％関節液中においても、安定なデコイがわずかに認められたが、５）一本鎖デコイでは５０％関節液中でも安定なデコイは認められなかった。
【配列表】
2005030960.tif 000010
【図１】
2005030960.tif 000012
【図２】
2005030960.tif 000013
【図３】
2005030960.tif 000014
【国際調査報告】
2005030960.tif 000015
2005030960.tif 000016
2005030960.tif 000017
2005030960.tif 000018
2005030960.tif 000019
2005030960.tif 000020
2005030960.tif 000021