(57)【要約】本発明の課題は、システイン残基をランダムにアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合をランダムに有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質を特定する方法であって、（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；及び（ｃ）工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程を含む上記スクリーニング方法等によって解決される。
2005012902.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程；
を含む上記スクリーニング方法。
【請求項２】
工程（ｃ）に続いて、さらに、（ｄ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、さらにそのＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供することによって、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記請求項１に記載の方法。
【請求項３】
システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程；
を含む上記スクリーニング方法。
【請求項４】
工程（ｄ）に続いて、さらに、（ｅ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）におけるＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供することによって、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）において、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３’末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結した構造である前記請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）において、前記ｍＲＮＡが、２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするＤＮＡから転写されることによって調製される、前記請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）において用いられる翻訳系が無細胞翻訳系である、前記請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質と前記標的物質とが相互作用しているか否かの判定が、アフィニティーカラムクロマトグラフィー法又はアフィニティービーズ法によって両者が結合しているか否かを判断することによって行われる、前記請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程をさらに含む、前記請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡの変異がＥｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによって行われる、前記請求項２、または４〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記の各工程を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡが、８〜５００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍＲＮＡが、１０〜２００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍＲＮＡが、２〜１０個のシステイン残基を有するタンパク質をコードするものである、前記請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡが、隣接するシステイン残基がそれぞれ２〜２０個離れて存在するようにアミノ酸配列中に分散しているタンパク質をコードするものである、前記請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡが、最もＮ末端側に位置するシステイン残基と最もＣ末端側に位置するシステイン残基が５〜５０個離れているタンパク質をコードするものである、前記請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、前記請求項５〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記スペーサーは固相結合部位を有し、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、その固相結合部位を介して固相に結合されている、前記請求項５〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、前記請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記スペーサーの固相結合部位が切断可能な部位を有するものであり、固相上でタンパク質をフォールディングさせた後に、前記切断可能部位を切断する工程を含む、前記請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記スペーサーがＤＮＡスペーサーであり、前記切断可能部位が制限酵素認識部位である、前記請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記請求項１〜２１のいずれかの方法によって得られるタンパク質であって、８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
【請求項２３】
８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ランダムな架橋を利用した有用なタンパク質のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法によって得られるタンパク質などに関する。
【背景技術】  タンパク質の構造解析から有用な機能を持つタンパク質をデザインするという発想に基づくタンパク質工学は、長年の努力にも関わらず目立った成果を挙げることが困難であった。そこで、進化の原理を応用した分子デザインの方法である「進化分子工学」（Ｅｉｇｅｎ，Ｅ．＆  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｗ．，Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，５６，９６７−９７８参照）の概念が１９８４年にＥｉｇｅｎらによって提案された。これは様々な変異体集団（ライブラリー）、つまり様々な構造をもつ分子集団から、目的の機能をもった分子を選択する技術の開発を意味する。１９９０年代に入り「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（試験管内進化法）」と呼ばれる一連の研究により具体的な成果が現れ、取得された機能分子もＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチドと多岐にわたっている。
核酸（ＲＮＡとＤＮＡ）のスクリーニング法としては、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２（１９９０）参照）やＳＥＬＥＸ法（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．＆  Ｇｏｌｄ，Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０（１９９０）参照）、また、ペプチド、タンパク質のスクリーニング法としては、ファージディスプレイ法（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．，＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０（１９９０）参照）、基板上に様々な配列のペプチドを光マスク法と光反応を用いて固相合成していくフォトリソグラフィー法（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７−７７３（１９９１）参照）、また、無細胞翻訳系を用いたものとしてリボソームディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９０２２−９０２６参照）が知られている。
また、ピューロマイシンの特異的性質を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）；Ｔａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０８，３０９（２００１）等参照）を用いてペプチドやタンパク質をスクリーニングする方法も開発されている（ＷＯ０１／０１６６００号公報参照）。
ペプチドやタンパク質のスクリーニング法では、大量に効率的にスクリーニングする上で、また、様々なタンパク質が合成できる点において無細胞翻訳系を用いるリボソームディスプレイ法やＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法が優れている。一方、タンパク合成はいわゆる液相中で行われるため、タンパク質が機能を発現するために必須なフォールディングが必ずしも容易ではない。例えば、タンパク質にシステインを多く含むペプチドやタンパク質は分子間でＳ−Ｓ結合を形成し、個々のタンパク質がフォールディングできない問題がある。
一方、タンパク質の機能は、専らその立体構造に依存する。すなわち、タンパク質がフォールドすることによって、ある部位が特定の構造を有し、その部位が受容体、酵素などと結合し、その受容体又は酵素を活性化又は不活性化することによって何らかの生理的機能を発現する。タンパク質の立体構造の解析は、現在盛んに行われているが、立体構造の解析は簡単なものではない。例えば、解析の対象となるタンパク質をＮＭＲあるいはＸ線回折によって解析できる程度までに大量に調製することは困難である。また、Ｘ線回折に供するためには、タンパク質を結晶化することが必須であるが、この結晶化も容易ではないからである。
【発明の開示】
このように、現在では、多くの労力が生体内で発現するタンパク質の立体構造解析とその機能解析に注がれている。しかしながら、上述のように、立体構造解析は困難であるから、人工合成によって得られる種々の立体構造を有するタンパク質から特定の機能を有するタンパク質を効率良く、かつ容易にスクリーニングできる手法が確立されることが望ましい。
また、タンパク質のスクリーニングあるいはタンパク質の機能解析において、タンパク質のフォールディングは極めて重要であるが上述のように合成途中で分子間の相互作用が生じるために困難である。タンパク質を確実にフォールディングさせた後にスクリーニングや機能解析をする手法を確立することが望ましい。また、そのようにして取得されたタンパク質の構造を改変してより高い活性を有するタンパク質を設計する手法が確立されることが望ましい。
上記の事情に鑑み本発明者らは、人工合成によって得られる種々の立体構造を有するタンパク質から特定の機能を有するタンパク質を効率良く、かつ容易にスクリーニングできる方法の提供を課題とする。
本発明者らは、システイン残基をランダムにアミノ酸配列中に導入することによって、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）をランダムに有するタンパク質群（ランダムライブラリー）を合成し、その機能を解析することにより、有用タンパク質をスクリーニング可能な方法の開発を行った。
まず本発明者らは、システイン残基を有するタンパク質をコードする核酸分子（ｍＲＮＡ）と、該ｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質との連結部としての役割を担うピューロマイシンとの連結体が、固相に固定された構造からなる「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体」の作製を行った。次いで、該連結体を翻訳系へ供することにより、該ｍＲＮＡの翻訳産物であるタンパク質がさらに連結されたランダムライブラリーを作製した。上記方法においては、固定化されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体を翻訳系と接触させることにより、固相上においてタンパク質を効率的に合成させることが可能である。合成されたタンパク質は、ピューロマイシンを介して固相に固定される。
さらに本発明者らは、上記固定化ランダムライブラリーを、逆転写反応系へ供することにより、該ライブラリーにおけるｍＲＮＡの逆転写産物である相補的ＤＮＡが連結されたランダムライブラリーを構築した。通常、ＲＮＡに比べてＤＮＡはより安定であることから、タンパク質相互作用解析等の機能解析において、被検分子と接触させる際に、上記ライブラリーは非常に有用である。
次いで本発明者らは、上記ライブラリーをペプチド酸化反応へ供することにより、該ライブラリーのタンパク質について、１以上のＳ−Ｓ結合を形成させ、タンパク質をフォールディングさせることに成功した。これにより、立体構造を形成し実際に機能を発現するタンパク質を、効率的にスクリーニングすることが可能となった。
続いて、フォールディングされたランダムライブラリーを、標的分子と接触させ、各ライブラリーに含まれるタンパク質の機能（例えば、標的分子との結合活性等）を解析し、所望の機能を有するタンパク質を選択することにより、有用タンパク質のスクリーニングを行うことができる。
本発明においては、例えば、ある標的分子に対して少しでも結合活性を有するタンパク質を取得できた場合、そのタンパク質のアミノ酸配列をランダムあるいは計画的に改変して、より活性の強いタンパク質を取得することが可能である。即ち、改変されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、前述の「固定化ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体」を作製し、次いで、上述の方法を適宜、複数回繰り返すことにより、標的分子との結合活性が増強されたタンパク質を取得することができる。
本発明者らは、本発明の上記方法が、実際に実施し得ることを実証するために、標的分子としてＣｙ３を選択し、該Ｃｙ３と結合活性を有する機能タンパク質のスクリーニングを行った。
その結果、実際にＣｙ３と結合活性を有する複数のタンパク質を取得することに成功した。即ち、本発明の方法は実際に実施し得る有用な方法であることが明確に示された。
本発明は、人工合成によって得られる種々の立体構造を有するタンパク質から特定の機能を有するタンパク質を効率良く、かつ容易にスクリーニングできる方法に関し、より具体的には、次に示すような、有用なタンパク質のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法によって得られるタンパク質等を提供する。
（１）  システイン残基をランダムにアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合をランダムに有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程；
を含む上記スクリーニング方法。
（２）  前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３′末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結したものである前記（１）に記載の方法。
（３）  工程（ａ）において、前記ｍＲＮＡが、２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするＤＮＡから転写されることによって調製される、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）  工程（ｂ）において用いられる翻訳系が無細胞翻訳系である、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  工程（ｃ）において、前記タンパク質と前記標的物質とが相互作用しているか否かの判定が、アフィニティーカラムクロマトグラフィー法又はアフィニティービーズ法によって両者が結合しているか否かを判断することによって行われる、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  工程（ｃ）において相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程をさらに含む、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  工程（ｃ）に続いて、さらに、（ｄ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、さらにそのＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供することによって、標的物質との相互作用力を強化したタンパク質を取得する、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  前記ＤＮＡの変異がＥｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲによって行われる、前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力を強化したタンパク質を取得する、前記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  前記ｍＲＮＡが、８〜５００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  前記ｍＲＮＡが、１０〜２００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記ｍＲＮＡが、４〜１０個のシステイン残基を有するタンパク質をコードするものである、前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）  前記ｍＲＮＡが、隣接するシステイン残基がそれぞれ２〜２０個離れて存在するようにアミノ酸配列中に分散しているタンパク質をコードするものである、前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）  前記ｍＲＮＡが、最もＮ末端側に位置するシステイン残基と最もＣ末端側に位置するシステイン残基が１０〜５０個離れているタンパク質をコードするものである、前記（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、前記（１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）  前記スペーサーは固相結合部位を有し、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、その固相結合部位を介して固相に結合されている、前記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）  前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、前記（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）  前記スペーサーの固相結合部位は切断可能部位を有しており、工程（ｂ）において固相上でタンパク質を確実にフォールディングさせた後に、その切断可能部位を切断してｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を固相から切り離し、そして切り離されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を工程（ｃ）に供する、前記（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９）  前記スペーサーがＤＮＡスペーサーであり、前記切断可能部位が制限酵素認識部位である、前記（１８）に記載の方法。
（２０）  前記（１）〜（１９）のいずれかの方法によって得られるタンパク質であって、８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
（２１）  ８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
また本発明は、より好ましくは、以下の有用なタンパク質のスクリーニング方法、および該スクリーニング方法によって得られるタンパク質等に関する。
〔１〕  システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程；
を含む上記スクリーニング方法。
〔２〕  工程（ｃ）に続いて、さらに、（ｄ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、さらにそのＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供することによって、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕  システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程；
を含む上記スクリーニング方法。
〔４〕  工程（ｄ）に続いて、さらに、（ｅ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）におけるＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供することによって、標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕  工程（ａ）において、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、ｍＲＮＡの３′末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結した構造である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  工程（ａ）において、前記ｍＲＮＡが、２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするＤＮＡから転写されることによって調製される、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕  工程（ｂ）において用いられる翻訳系が無細胞翻訳系である、前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕  前記タンパク質と前記標的物質とが相互作用しているか否かの判定が、アフィニティーカラムクロマトグラフィー法又はアフィニティービーズ法によって両者が結合しているか否かを判断することによって行われる、前記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕  相互作用していると判断されたタンパク質及び／又は標的物質を同定する工程をさらに含む、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕  前記ＤＮＡの変異がＥｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ、等の変異導入法によって行われる、前記〔２〕、または〔４〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕  前記の各工程を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力が強化されたタンパク質を取得する、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕  前記ｍＲＮＡが、８〜５００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕  前記ｍＲＮＡが、１０〜２００個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものである、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕  前記ｍＲＮＡが、２〜１０個のシステイン残基を有するタンパク質をコードするものである、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕  前記ｍＲＮＡが、隣接するシステイン残碁がそれぞれ２〜２０個離れて存在するようにアミノ酸配列中に分散しているタンパク質をコードするものである、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕  前記ｍＲＮＡが、最もＮ末端側に位置するシステイン残基と最もＣ末端側に位置するシステイン残基が５〜５０個離れているタンパク質をコードするものである、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕  前記スペーサーが、ポリヌクレオチド、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、ペプチド核酸又はこれらの組合せを主骨格として含むものである、前記〔５〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕  前記スペーサーは固相結合部位を有し、前記ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体が、その固相結合部位を介して固相に結合されている、前記〔５〕〜〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕  前記固相が、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板、ガラス容器、プラスチック容器及びメンブレンから選択される、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕  前記スペーサーの固相結合部位が切断可能な部位を有するものであり、固相上でタンパク質をフォールディングさせた後に、前記切断可能部位を切断する工程を含む、前記〔１８〕又は〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕  前記スペーサーがＤＮＡスペーサーであり、前記切断可能部位が制限酵素認識部位である、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕  前記〔１〕〜〔２１〕のいずれかの方法によって得られるタンパク質であって、８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
〔２３〕  ８〜５００のアミノ酸残基を有し、ジスルフィド結合をするためのシステイン残基を２〜１０個含み、かつ酸化還元により標的物質との結合定数が変化する合成タンパク質。
以下、本発明をその実施態様に基づいて詳細に説明する。
本発明は、システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合をランダムに有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質を特定する方法に関する。
本発明の好ましい態様においては、下記工程（ａ）〜（ｃ）を有する、システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質を特定する方法に関する。
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）（以下、「ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体（群）」ともいう）を得る工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ＰＭ連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）（以下、「ｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）」ともいう）を調製する工程；及び
（ｃ）工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程。
ここで、「システイン残基をアミノ酸配列中に導入する」とは、好ましくは、あるアミノ酸配列（天然タンパク質由来又は合成配列）に部位無作為的（ランダム）にシステイン残基を導入することをいう。但し本発明においては、アミノ酸配列中に導入されるシステイン残基は、必ずしもランダムに導入される場合に限定されず、例えば、ある規則性に基づいて、または計画的にシステイン残基が配置されるように導入される場合も含まれる。また、「ジスルフィド結合を有するタンパク質」とは、好ましくは、そのタンパク質が部位無作為的（ランダム）にジスルフィド結合を有することをいうが、上記のように必ずしも、ランダムにジスルフィド結合を有することに限定されない。
以下、各工程の詳細について説明する。
１．工程（ａ）：ｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）の調製
（ｍＲＮＡの配列設計）
工程（ａ）において用いられるｍＲＮＡは、取得上および取り扱い上の便宜から、人工的に調製されるものが好ましいが、自然界に存在するものを排除するものではない。ここで用いられるｍＲＮＡは、少なくとも１以上のジスルフィド結合を有するタンパク質を合成するために、少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードしている。このｍＲＮＡは、好ましくは、２〜１０個、より好ましくは４〜１０個のシステイン残基を有するタンパク質をコードする。本明細書中、「タンパク質」という用語はペプチドを含むものと解される。なお、翻訳によって合成されるタンパク質中のシステイン残基が、ジスルフィド結合を形成するためには、好ましくは、少なくとも２個以上のシステイン残基が、それぞれ、２アミノ酸残基以上、より好ましくは３アミノ酸残基以上離れていることが望まれる。また、システイン残基は、アミノ酸配列中にある程度分散していることが好ましく、Ｎ末端側あるいはＣ末端側に偏在しているものよりは、そうでない配列のほうが好ましい。また、最もＮ末端側に位置するシステイン残基と最もＣ末端側に位置するシステイン残基が、好ましくは５〜５０個、より好ましくは１０〜５０個離れているタンパク質をコードするｍＲＮＡであることが望ましい。
本発明において用いられるｍＲＮＡとしては、特にこれに限定されないが、好ましくは、１０〜２００、より好ましくは１０〜１００、さらに好ましくは１５〜５０、さらに好ましくは２０〜４０個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。あまりに長いものは調製が困難であるし、あまりに短いものは合成されるタンパク質が適当な立体構造をとりにくいからである。
尚、アミノ酸の種類は必ずしも２０種類全てを含む必要はない。
本発明で用いられるｍＲＮＡは、上記のような条件を考慮して、適宜設計される。なお、上記のような条件を満たす配列は、人為的にも容易に設計できるし、簡単なコンピュータープログラムによっても容易に設計することができる。本発明においては、これらに限定されるものではないが、例えば、アミノ酸残基を３０個有し、システインを６個有するタンパク質をターゲットとした場合は、例えば、下記のアミノ酸配列（式中、Ｓ１〜Ｓ６はシステイン残基を示し、Ａ１〜Ａ３０はシステイン残基以外のアミノ酸残基（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン又はヒスチジン）を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡが用いられる。
（１）Ａ１−Ａ２−Ｓ１−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ｓ２−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ｓ３−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ｓ４−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ｓ５−Ａ２０−Ａ２１−Ａ２２−Ｓ６−Ａ２４−Ａ２５−Ａ２６−Ａ２７−Ａ２８−Ａ２９−Ａ３０；
（２）Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｓ１−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ｓ２−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ｓ３−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ｓ４−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ｓ５−Ａ２１−Ａ２２−Ａ２３−Ｓ６−Ａ２５−Ａ２６−Ａ２７−Ａ２８−Ａ２９−Ａ３０；
（３）Ａ１−Ｓ１−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ｓ２−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ｓ３−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ｓ４−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ｓ５−Ａ２３−Ａ２４−Ａ２５−Ａ２６−Ｓ６−Ａ２８−Ａ２９−Ａ３０；
（４）Ａ１−Ｓ１−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ｓ２−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ｓ３−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ｓ４−Ａ２１−Ａ２２−Ａ２３−Ａ２４−Ｓ５−Ａ２６−Ａ２７−Ａ２８−Ｓ６−Ａ３０；
（５）Ａ１−Ａ２−Ｓ１−Ａ４−Ａ５−Ｓ２−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ｓ３−Ａ１５−Ｓ４−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ａ２２−Ａ２３−Ａ２４−Ｓ５−Ａ２６−Ａ２７−Ｓ６−Ａ２９−Ａ３０；
（６）Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ｓ１−Ａ７−Ａ８−Ｓ２−Ａ１０−Ａ１１−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ｓ３−Ａ１７−Ｓ４−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ｓ５−Ａ２３−Ａ２４−Ａ２５−Ｓ６−Ａ２７−Ｓ６−Ａ２９−Ａ３０；
（７）Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｓ１−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１−Ｓ２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ｓ３−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ｓ４−Ａ２３−Ａ２４−Ａ２５−Ｓ５−Ａ２７−Ａ２８−Ｓ６−Ａ３０；
（８）Ａ１−Ｓ１−Ａ３−Ｓ２−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ｓ３−Ａ１１−Ａ１２−Ｓ４−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ａ２２−Ａ２３−Ｓ５−Ａ２５−Ａ２６−Ａ２７−Ｓ６−Ａ２９−Ａ３０；
（９）Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ｓ１−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ｓ２−Ａ１２−Ａ１３−Ｓ３−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ａ１８−Ａ１９−Ａ２０−Ｓ４−Ａ２２−Ａ２３−Ａ２４−Ａ２５−Ａ２６−Ｓ５−Ａ２８−Ｓ６−Ａ３０；又は
（１０）Ａ１−Ｓ１−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ｓ２−Ａ８−Ｓ３−Ａ１０−Ｓ４−Ａ１２−Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５−Ａ１６−Ａ１７−Ｓ５−Ａ１９−Ａ２０−Ａ２１−Ａ２２−Ａ２３−Ａ２４−Ｓ６−Ａ２６−Ａ２７−Ａ２８−Ａ２９−Ａ３０。
なお、既に公知のアミノ酸配列あるいは核酸配列から、上記条件を満たす配列を検索し、これに基づいて所望の核酸配列を設計することもできる。このような公知のアミノ酸配列又は核酸配列情報は、公知のデータベース、例えば、ＰＤＢ（プロテインデータバンク）、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＥＢＩ）、ＤＤＢＪ（国立遺伝学研究所）等から入手可能である。
また、タンパク質の立体構造の形成には、ジスルフィド結合以外にも、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力などの種々の要素が関与している。また、α−ヘリックス、β−シート、ジンクフィンガー、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス、ヘリックスループヘリックス等を形成するアミノ酸配列も当業者には公知である。したがって、必要に応じてこれらの要素も考慮し、公知のコンピューター・アシステッド・モレキュラー・デザインの手法を用いて、より適切な配列を設計することもできる。例えば、βシート構造を３つほど有すると、それらのβシート構造間で水素結合を形成することが知られており、このような情報は、システイン残基によるＳ−Ｓ結合以外の立体構造形成のための情報として有用である。そのような配列設計のための有用な情報として下記文献が参考となる。
（１）Ｎｉｅｌｓｅｎ，ＫＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０００；１３：５５−７０
（２）Ｎｏｒｔｏｎ，ＲＳ，＆  Ｐａｌｌａｇｈｙ，Ｔｏｘｉｃｏｎ，１９９８；３６：１５７３−１５８３．
（３）Ｋｉｍ  ＪＩＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；２５０：６５９−６７１
（４）Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＤＰ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１；１０：５３８−５５０．
（５）Ｍｉｌｅｓ，ＬＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２；２７７：４３０３３−４３０４０．
（ｍＲＮＡの調製）
本発明で用いられるｍＲＮＡは、上記のようにしてそれがコードすべきアミノ酸配列を設計すれば、後は公知の核酸合成手法に基づいて合成することができる（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，１９９５）。また、このようなｍＲＮＡは、上記のようにして設計したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを合成し、そのＤＮＡを転写反応に供することによって容易に調製することができる（Ｋｒｕｐｐ  Ｇ  ＆  Ｓｏｌｌ  Ｄ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８７，２１２，２７１−２７５．）。
また、本発明の好ましい態様によれば、上記の設計方法に基づき、ＤＮＡ合成機によって、所望のタンパク質群をコードするＤＮＡライブラリーを作成し、このＤＮＡライブラリーから転写されるｍＲＮＡを用いることができる。
（ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物）
上記のようにして得られるｍＲＮＡを、通常、ｍＲＮＡの３′末端にスペーサーを介してピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物を連結して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を調製する。ここで、ピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物は、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系に投入してタンパク質を合成する際に、ｍＲＮＡと翻訳されたタンパク質とを連結するヒンジあるいは連結部の役割をする。すなわち、ｍＲＮＡにスペーサーを介してピューロマイシンを結合したものと翻訳系を接触させると、そのｍＲＮＡがピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質と結合したＩｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓビリオンが生成することが知られている（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５（１９９７）参照）。ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）は、その３′末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似している、下記式（Ｉ）：
2005012902.tif 000003
に示される化合物で、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する。本明細書中、「ピューロマイシン様化合物」とは、その３′末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似し、翻訳系でタンパク質の合成が行われた際に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物をいう。
ピューロマイシン様化合物としては、３′−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３′−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、例えば、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。また、３′−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して形成されるアミド結合で連結した３′−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３′−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＡＡＮＳ−アミノ酸）、たとえば、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。なお、上記ピューロマイシン以外に好ましく用いられるピューロマイシン様化合物は、リボシチジルピューロマイシン（ｒＣｐＰｕｒ）、デオキシジルピューロマイシン（ｄＣｐＰｕｒ）、デオキシウリジルピューロマイシン（ｄＵｐＰｕｒ）などであり、下記にその化学構造式を示す。
2005012902.tif 000004
2005012902.tif 000005
（スペーサー）
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体においては、ｍＲＮＡとピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物（以下、単に「ピューロマイシン」と称する）は、スペーサーを介して連結される。また、この連結体は、好ましくは、このスペーサーに設けられた固相結合部位を介して固相に固定化される。スペーサーは、主として、ピューロマイシンをリボソームのＡサイトと呼ばれる部位に効率良く取り込ませるために用いられる。従って、スペーサーとしては、そのような性質を有する限り特に限定されないが、柔軟性があり、親水性で、側鎖の少ない単純な構造を有する骨格を有するものが好ましい。具体的には、ここで用いられるスペーサーとして、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ含む）、ポリエチレンなどのポリアルキレン、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリスチレン等の直鎖状物質又はこれらの組合せを主骨格として含むものが好ましく用いられる。上記直鎖上物質を組み合わせて用いる際は、適宜、それらを適当な連結基（−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎ−［ｎは例えば１〜１０、好ましくは１〜３］、−Ｓ−、−ＳＯ−など）で化学的に連結することができる。
ｍＲＮＡとスペーサーとの連結は、公知の手法を用いて直接的又は間接的に、化学的又は物理的に行うことができる。例えば、ＤＮＡをスペーサーとして用いる場合は、ｍＲＮＡの３′末端にそのＤＮＡスペーサーの末端と相補的な配列を設けておくことにより、両者を連結することができる。また、スペーサーとピューロマイシンを連結する場合は、通常、公知の化学的手法によって連結される。
なお、タンパク質を合成した後に、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離す必要がある場合は、スペーサー中に切断可能部位を設けると好ましい。ＤＮＡをスペーサーの一部に用いた場合は、そのような切断可能部位として、ＤＮＡ鎖中に制限酵素認識部位を設けることができる。このような制限酵素認識部位をもつスペーサーを用いた場合は、タンパク質合成後など所望の時に、制限酵素（例えば、Ａｌｕ  Ｉ、ＢａｍＨ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｐｖｕ  ＩＩなど）を投入することによって、ｍＲＮＡ−ＰＭ−タンパク質の複合体を固相から切り離すことができる。制限酵素認識部位とその部位を切断する酵素の組合せは公知である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ２０００・０１  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ等参照）。
なお、本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体には、必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、スペーサー又はピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。
（固相）
ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体が固定される固相は特に限定されず、その連結体が使用される目的に応じて適宜選択される。本発明で用いられる固相としては、生体分子を固定する担体となるものを用いることができ、例えば、スチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、セファロースビーズ、磁性体ビーズ等のビーズ；ガラス基板、シリコン（石英）基板、プラスチック基板、金属基板（例えば、金箔基板）等の基板；ガラス容器、プラスチック容器等の容器；ニトロセルロース、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）等の材料からなるメンブレンなどが挙げられる。
本発明のｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する場合は、ｍＲＮＡが翻訳系と接触する際に、その翻訳の障害とならないように固定すればよく、その固定化手段は特に限定されない。通常は、ｍＲＮＡとＰＭを連結するスペーサーに固相結合部位を設け、その固相結合部位を、固相に結合させた「固相結合部位認識部位」を介して、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を固相に固定する。固相結合部位は、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を所望の固相に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、このような固相結合部位として、特定のポリペプチドに特異的に結合する分子（例えば、リガンド、抗体など）が用いられ、この場合は、固相表面には固相結合部位認識部位として、その分子と結合する特定のポリペプチドを結合させておく。固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せの例としては、例えば、アビジン及びストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオールなどの、各種受容体タンパク質／そのリガンドなどが挙げられる。これらの中で、固相結合部位／固相結合部位認識部位の組合せとしては、アビジン及びストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、抗体／抗原分子（エピトープ）などが好ましく、特にストレプトアビジン／ビオチンの組合せが最も好ましい。
上記タンパク質の固相表面への結合は、公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法としては、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４−ジイソシアネート、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基などを利用する方法を挙げることができる（Ｐ．Ｍ．Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．Ｒｏｙｅｒ，Ａ  Ｎｅｗ  Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４（１９７９）等参照）。
なお、上記組合せは、固相結合部位と固相結合部位認識部位とを逆転させて用いることもできる。上記の固定化手段は、２つの相互に親和性を有する物質を利用した固定化方法であるが、固相がスチレンビーズ、スチレン基板などのプラスチック材料であれば、必要に応じて、公知の手法を用いてスペーサーの一部を直接それらの固相に共有結合させることもできる（Ｑｉａｇｅｎ社、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ等参照）。なお、本発明においては、固定手段については上記の方法に限定されることなく、当業者に公知である如何なる固定手段をも利用することができる。
２．工程（ｂ）：ｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）の調製
工程（ｂ）では、ｍＲＮＡ−ＰＭ連結体を翻訳系と接触させることによって、タンパク質の合成を行い、ｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）を調製する。ここで用いることができる翻訳系としては、無細胞翻訳系又は生細胞などが挙げられる。無細胞翻訳系としては、原核又は真核生物の抽出物により構成される無細胞翻訳系、例えば大腸菌、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽抽出物などが使用できる（Ｌａｍｆｒｏｍ  Ｈ，Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ  Ｍ．Ａｍｂｉｇｕｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  Ｕ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６７  ２７（１）：１−６等参照）。生細胞翻訳系としては、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞などが使用できる。本発明においては、取り扱いの容易さから、無細胞系を使用することが好ましい。
さらに必要に応じて、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を形成させるために、得られたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）を酸化還元処理に供する。例えば、得られたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）をジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤の存在下、０〜３５℃で、０．５〜３時間反応させて還元する。次に、このように処理されたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）をｏ−ヨードソ安息香酸等の酸化剤の存在下、適当なバッファー（例えばｐＨ．７の５０ｍＭリン酸バッファー）中、０〜３５℃で、５分〜１時間反応させる。必要に応じて各処理後、適当な洗浄用バッファー（例えば、Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．８．０，ＮａＣｌ  １００ｍＭ））で洗浄する。
なお、本発明の好ましい態様によれば、前記スペーサーの固相結合部位は切断可能部位を有しており、工程（ｂ）においては、固相上でタンパク質を確実にフォールディングさせた後に、その切断可能部位を切断してｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を固相から切り離し、そして切り離されたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を工程（ｃ）に供するようにする。このような操作をすることにより、タンパク質を確実にフォールディングさせた後にスクリーニングや機能解析をすることができる。
本発明においてタンパク質のフォールディングは、好ましくは、該タンパク質中に含まれるシステイン残基中のＳＨ基を酸化し、ジスルフィド結合を形成させることによって、実施することができる。このようにして形成されるタンパク質は、安定な立体構造を呈する。通常、タンパク質の機能は、その立体構造に依存することから、本発明の方法においては、立体構造に依存する機能タンパク質を、効率的にスクリーニングすることが可能である。
本発明の好ましい態様においては、固相に結合された状態のタンパク質についてフォールディングされることが好ましい。固相に結合された本発明の連結体を酸化反応に供することにより、効率的にＳ−Ｓ結合を形成させることができる。
３．工程（ｃ）：タンパク質と標的物質との相互作用の測定
上記工程（ｃ）においては、工程（ｂ）において調製されたｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させる。ここで用いられる「標的物質」とは、本発明において合成されるタンパク質と相互作用するか否か調べるための物質を意味し、具体的にはタンパク質、核酸、糖鎖、低分子化合物などが挙げられる。
タンパク質としては、特に制限はなく、タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。またアミノ酸配列、及びその機能が既知のタンパク質でも、未知のタンパク質でもよい。これらは、合成されたペプチド鎖、生体より精製されたタンパク質、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、精製したタンパク質等でも標的分子として用いることができる。合成されたペプチド鎖はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質であってもよい。これらのうち好ましくはアミノ酸配列が既知の精製されたタンパク質か、あるいはｃＤＮＡライブラリー等から適当な方法を用いて翻訳、精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、特に制限されることはなく、ＤＮＡあるいはＲＮＡも用いることができる。また、塩基配列あるいは機能が既知の核酸でも、未知の核酸でもよい。好ましくは、タンパク質に結合能力を有する核酸としての機能、及び塩基配列が既知のものか、あるいはゲノムライブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができる。
糖鎖としては、特に制限はなく、その糖配列あるいは機能が、既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。好ましくは、既に分離解析され、糖配列あるいは機能が既知の糖鎖が用いられる。
低分子化合物としては、特に制限されず、機能が未知のものでも、あるいはタンパク質に結合する能力が既に知られているものでも用いることができる。
なお、これら標的物質とタンパク質との「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間の共有結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合、及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。共有結合としては、配位結合、双極子結合を含有する。また静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。相互作用の具体例としては、抗原と抗体間の結合及び解離、タンパク質レセプターとリガンドの間の結合及び解離、接着分子と相手方分子の間の結合及び解離、酵素と基質の間の結合及び解離、核酸とそれに結合するタンパク質の間の結合及び解離、情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、糖タンパク質とタンパク質との間の結合及び解離、あるいは糖鎖とタンパク質との間の結合及び解離が挙げられる。したがって、相互作用力は、２つの物質の結合の程度（結合定数）及び／または解離の程度（解離定数）を測定することによって判断することができる。（ＬｅＴｉｌｌｙ  Ｖ．＆  Ｒｏｙｅｒ  ＣＡ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３，３２，７７５３−７７５８）。なお、本明細書中、「酸化還元により標的物質との結合定数が変化する」とは、通常、数値が１桁以上（例えば、１０９が１０８）変化することをいう。
ここで用いられる標的物質は、必要に応じて標識物質により標識して用いることができる。必要に応じて標識物質を結合させることによって標識することができる。そのような標識物質は、蛍光性物質、放射性標識物質などから適宜選択される。蛍光物質としては、フリーの官能基（例えば活性エステルに変換可能なカルボキシル基、ホスホアミダイドに変換可能な水酸基、あるいはアミノ基など）を持ち、標的物質に連結可能な種々の蛍光色素を用いることができる。適当な標識物質としては、例えばフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネートもしくはＣｙ３等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。これらの標識物質は、標的物質と固定化タンパク質との間の相互作用に基づいて発生される信号の変化の測定又は解析方法に適したものが適宜用いられる。上記標識物質の標的物質への結合は、公知の手法に基づいて行うことができる。
工程（ｃ）において、該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを測定する。該タンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））、エバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５））、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２（１９９５））、蛍光偏光解消法（Ｐｅｒｒａｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．，１，３９０−４０１（１９２６））、及び蛍光相関分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＣＳ）：Ｅｉｇｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，５７４０−５７４７（１９９４））等が挙げられる。
また、両分子間の相互作用は、単純に、両分子が結合するか否かを判定することによって行うことができ、両分子の特異的親和性を利用した方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）によってそのような結合実験を行うことができる。具体的には、セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のような不溶性担体上（例えばビーズ、フィルター、メンブレン等の担体）に標的物質を常法により固定化（物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化）し、該不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、該カラム（例えば、円柱状カラム）に、試料を通して溶出させることにより、該試料中に含まれる、標的物質に結合するｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体を分離することができる。またこのような操作を行なうことによって、標的物質に結合しなかったタンパク質を本スクリーニングプロセスから排除することができ、必要なタンパク質のみを選別することができる。あるいは、両分子の特異的親和性を利用した方法としてアフィニティービーズ法によって結合実験を行うことができる（文献，Ｏｇａｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；７４：４７０２−４７０８）。具体的にはストレプトアビジンを表面に結合させた磁性体ビーズまたは標的分子をアミノ基などを介して表面に固定した磁性体ビーズを用いる。ビオチン化した標的分子に結合するｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体はストレプトアビジンビーズと接触させた後、磁石でストレプトアビジン磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。また、標的分子を表面に固定した磁性体ビーズとｍＲＮＡ−ＰＭ−ＰＲＴ連結体とを接触させた後に磁石で磁性体ビーズを回収することによって分離することができる。他にも、ビーズが磁性体でなく、アガロースビーズ等の場合は、磁石の代わりに遠心機を用いてビーズのみ沈殿させて回収することで分離することが可能である。
本発明の方法においては、必要に応じて、さらに、工程（ｃ）において相互作用していると判断されたタンパク質−標的物質結合体中の、タンパク質及び／又は標的物質を同定する。タンパク質の同定は、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできるし、該タンパク質に結合しているｍＲＮＡからＤＮＡを逆転写し、得られたＤＮＡの塩基配列を解析することによって行うこともできる。標的物質の同定は、ＮＭＲ、ＩＲ、各種質量分析などによって行うことができる。
４．工程（ｄ）：改変されたタンパク質の調製
本発明においては、好ましくは、工程（ｃ）に続いて、さらに、（ｄ）前記標的物質と相互作用をするタンパク質を含むｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、さらにそのＤＮＡに変異を導入することによって改変された配列を有するｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを工程（ａ）に供し、次いで上述のように工程（ｂ）及び（ｃ）の処理を行うことによって、標的物質との相互作用力を強化したタンパク質を取得することができる。ここで、前記ＤＮＡの変異は、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法（Ｇｒａｍ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２，８９，３５７６−８０．）、ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ法（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９４，３７０，３８９−３９１）等の公知の方法によって行うことができる。本発明においては、ＤＮＡにランダムに低確率で変異を導入することができる、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法が好ましい。なお、Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ法のキットは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社からＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＴ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈは商標）として市販されている。このような方法を利用すると、上記工程（ａ）〜（ｃ）において、ある標的物質に対して少しでも相互作用するタンパク質を取得できた場合に、そのタンパク質のアミノ酸配列をランダムに改変して、より活性の強いタンパク質を取得することができる。したがって、上記工程（ａ）〜（ｄ）を複数回繰り返すことによって標的物質との相互作用力をより強化したタンパク質を取得することができる。
また、このような工程を複数回（例えば、２〜１０回、好ましくは４〜８回）繰り返すことによって、ある特定の標的物質と相互作用するタンパク質が複数取得できた場合は、それら複数タンパク質のアミノ酸配列のコンセンサス配列情報等に基づいて新たなアミノ酸配列を有するタンパク質を設計し、これを前記工程（ａ）に供することによって、さらに高い活性を有するタンパク質を取得することが可能となる。
このようにして得られたタンパク質は、公知の有機合成手法に基づいて有機合成することができる（泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）等参照）。なお、このようなスクリーニング方法によって得られるタンパク質は、標的物質の生理的機能を調整する、生理活性物質として、種々の医薬用途に用いることができる。
また上記工程（ｃ）においては、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と標的物質とを接触させるが、本発明においては、該ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製した後、該連結体（群）を標的物質と接触させてもよい。
通常、ＤＮＡ分子はＲＮＡ分子より安定であることが知られている。また、ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ分子と比べてアルカリに強いため、例えば、架橋反応に供する場合、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体は、より化学反応を行い易い利点を有する。
また、本発明においては、本発明の上記工程によって調製されるＤＮＡ／ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−連結体（群）を、一旦保存した後に、適宜、保存された該連結体を標的分子との接触に供することも可能である。通常、ＤＮＡ分子は、凍結、融解を繰り返しても安定であるが、ＲＮＡ分子は、凍結、融解を繰り返すことにより通常、分解され易いことが知られている。さらに、ＲＮＡ分子はＤＮＡ分子と比べて非特異的な相互作用の影響が大きいことが知られており、従って、本発明において、標的分子との接触に供する連結体は、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）であることが好ましい。
即ち、本発明の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、システイン残基をアミノ酸配列中に導入することによってジスルフィド結合を有するタンパク質を合成し、そのタンパク質の機能を解析することによって有用タンパク質をスクリーニングする方法に関する。
（ａ）少なくとも２以上のシステイン残基を含むタンパク質をコードするｍＲＮＡを１以上調製し、得られたｍＲＮＡのそれぞれをピューロマイシン又はピューロマイシン様化合物と連結してｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）を得る工程
（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン連結体（群）と、翻訳系とを接触させてタンパク質を合成し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）を調製する工程
（ｃ）工程（ｂ）で得られたｍＲＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）のｍＲＮＡから逆転写によりＤＮＡを調製し、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体を調製する工程
（ｄ）工程（ｃ）において調製されたＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）と１以上の標的物質とを接触させ、ＤＮＡ−ピューロマイシン−タンパク質連結体（群）中のいずれかのタンパク質と該標的物質とが相互作用しているか否かを判定する工程
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の一実施態様に係るスクリーニング方法の概要を示す図である。
図２は、ｍＲＮＡへ、ピューロマイシン付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す図である。
図３は、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡの概略図を示す図である。Ｐはピューロマイシン、ＦはＦＩＴＣ、Ｂはビオチン、Ａ，Ｔ，Ｃ，ＧはＤＮＡ、ａ，ｕ，ｇ，ｃはＲＮＡのシーケンスを示している。四角枠で囲った部分は制限酵素ＰｖｕＩＩサイトを示す。ＲＮＡの３′末端とＤＮＡの５′末端は“Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲーションされるように合成した。
図４は、全長ＤＮＡライブラリーの配列構成を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実験例１
１．スペーサーＢｉｏＬｏｏｐ−Ｐｕｒｏ（以下“ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ”と略す）の合成
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５′−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）−３′、ＢＥＸ社より購入］１０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ  ＴＣＥＰを１μｌ加え（ｆｉｎａｌ  １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を除いた。なお、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの配列中、（Ｓ）は５′−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  ＣＰＧ、Ｓｐａｃｅｒ１８はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅａｒｃｈ社製のスペーサー（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する。
2005012902.tif 000006
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ［（５６ｍｅｒ）配列；５′−ＣＣＣＧＧ  ＴＧＣＡＧ ＣＴＧＴＴ  ＴＣＡＴＣ（Ｔ−Ｂ）ＣＧＧＡ  ＡＡＣＡＧ ＣＴＧＣＡ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧＣＣＧ  ＣＣＣＣＣ  ＣＧ（Ｔ）ＣＣＴ−３′（配列番号１、ＢＥＸ社より購入）、（Ｔ）：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、（Ｔ−Ｂ）：Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ（アンダーラインは制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す）］２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４−０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ  ＣＳＯＭＯＳＩＬ  ３７９１８−３１  １０  ｘ  ２５０ｍｍ  Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％  ３３ｍｉｎ）
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
２．抗体様ペプチドの鋳型ＤＮＡ作成
抗体様ペプチドの鋳型ＤＮＡは同一分子内に少なくとも２つ以上のＳ−Ｓ結合を形成させるために、一つのペプチド内に４つ以上のシステイン残基を含ませた。したがって鋳型ＤＮＡはシステインに対応するコドン（ＵＧＵ、ＵＧＣ）のうちどれかを４つ以上含む配列を作成した。
本実施例では、下記アミノ酸配列（配列番号２又は３）を有するタンパク質をコードする下記ＤＮＡライブラリ（配列番号４又は５、ただしこの配列は相補的な配列）をＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製：３４００）を用いて固相合成法によって合成した。
2005012902.tif 000007
2005012902.tif 000008
また、これを鋳型にしてＤＮＡプライマー（配列番号６：ＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ、及び配列番号７：ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ）を用いてＰＣＲ（条件：熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング６９℃１５秒、伸長反応７２℃４５秒、サイクル数３０回）を行い、エタノール沈殿により精製した後、Ｔ７プロモーター配列と非翻訳領域配列をもつＤＮＡ（以下、Ｔ７Ωと略す）（配列番号８：ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）をプライマーなしのＰＣＲ（条件：熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング６０℃１５秒、伸長反応７２℃５０秒、サイクル数３０回）を行い連結し、フェノール抽出、エタノール沈殿を行うことで精製した。これにより、５′側にＴ７、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３′末端にｘ６ヒスチジンタグの他にスペーサーＤＮＡの一部と相補なタグ配列（５′側−ＡＧＧＡＣＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡ（配列番号９）アンダーラインはスペーサー配列と相補な部分）を含む鋳型ＤＮＡが合成された。
３．転写
上記工程２で合成したＤＮＡを鋳型として、以下のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写をプロメガ社のプロトコルに従い行なった。ＤＮＡ８μｇに対し、ｍ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を最終濃度が３２０μＭになるように加え、３７℃で１時間反応させた。次にＤＮａｓｅ、フェノール・クロロフォルム処理した後、ＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製し定量した。
４．ｍＲＮＡとＰＭ付きスペーサーＤＮＡの結合
５′キャップ及び３′にタグ配列を持ったｍＲＮＡ  ３００ｐｍｏｌに、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを３００ｐｍｏｌ、１０  ｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）６μｌ、ＤＭＳＯ  ２．５μｌを加え、５５μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。熱湯上で８５℃から３５℃へ２０分かけてアニーリングし、１５ｕｎｉｔ  Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）、１００ｕｎｉｔ  Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ、２．５μｌ）を加え、２５℃４５分反応させた。サンプルをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，７４１０４）で処理した後、さらにＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒで精製した。
図２に、ｍＲＮＡへＰＭ付きスペーサーＤＮＡを共有結合させたものの概略図を示す。図２中、Ｐはピューロマイシン、Ｂはビオチン、ＡＴＣＧｕはＤＮＡ、ＲＮＡシーケンスを示している。大文字で示した部分は制限酵素ＰｖｕＩＩサイト（四角枠で囲った部分）を含むＤＮＡ部分、小文字で示した部分はｍＲＮＡで、３′末端側のＤＮＡと相補鎖を形成している部分がＴａｇ配列に結合している。ＲＮＡの３′末端とＤＮＡの５′末端は“Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ”と示した部分でライゲートされている。
５．ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体のビーズ上への結合
上記のように合成した、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を、直径２．３μｍ±０．３μｍのアビジンビーズ（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、ＴａＫａＲａ、９０８８）へ、添付のプロトコルに基づき以下のようにして結合させた。
６０μｌのアビジンビーズを２００μｌのｘ１  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）で２回、マグネットスタンドを用いてアビジンビーズを沈殿させ、上清を交換することで洗浄した。洗浄後、沈殿させたビーズへ、上記２−２で合成したＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を４８ｐｍｏｌ加え、１  ｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）を合計で１２０μｌになるように加え、１０分間室温で静置した。その後、上記のように、２００μｌの１  ｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）でビーズを洗浄することで、ビーズに結合しなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体を取り除いた。さらに、２０  ｘ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ）１０μｌ、ＤＥＰＣ処理水１９０μｌを加え、同様にビーズを洗浄した。
６．翻訳
上記のビーズをマグネットスタンド上で沈殿させ、無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）を３００μｌ加え、３０℃１５分翻訳反応を行った。その後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加えて３７℃で１．５時間放置した。サンプルは、約１時間毎に軽く攪拌した。上記のようにビーズを沈殿させ、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ａｍｂｉｏｎ社、２６９４）２０ｕｎｉｔを含んだ１  ｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌで２回ビーズを洗浄した。
７．逆転写
洗浄後、上記と同様にして沈殿させたビーズに対して、ＴａＫａＲａ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社添付のプロトコルに従い、８０μｌのスケールで逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ、２６４０Ａ）を用いて４２℃１０分間、逆転写反応を行った。その後に上記と同様にして、１  ｘ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（添付されたもの）２００μｌでビーズを洗浄した。
８．酸化還元処理
上記工程６及び７で翻訳されてビーズに固定化されたペプチドを１００ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を用いて室温、１時間反応させ還元したのち、Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．８．０，ＮａＣｌ  １００ｍＭ）２００μｌで２回ビーズを洗浄した。次にペプチドを酸化するためにｏ−ヨードソ安息香酸５０ｍＭを用いて室温で１０分、ｐＨ．７の５０ｍＭリン酸バッファー中で反応後、Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ．８．０，ＮａＣｌ  １００ｍＭ）２００μｌでビーズを２回洗浄した。
９．ビーズからＤＮＡ−タンパク質を回収
沈殿させたビーズに対して、添付のプロトコルに従い、４０μｌのスケールで２４ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）で３７℃１時間放置することで、ビーズ上のＤＮＡ−タンパク質をビーズから切り離す処理を行った。ここでは特に、ビーズとＤＮＡ−タンパク質の非特異的な吸着を避けるために、ＢＳＡを最終０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。その後、上記と同様にしてビーズを沈殿させ、上清を新しいサンプルチューブに移した。
１０．Ｈｉｓタグ精製
Ｑｉａｇｅｎ社のプロトコルに従い、サンプルを等量のＬｙｓｉｓバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４５０ｍＭ，ＮａＣｌ  ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％，ｐＨ８．０）に希釈し、２０μｌのＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｎｉ−ＮＴＡ  ＭａｇｎｅｔｉｃＡｇａｒｏｓｅＢｅａｄｓ、ＱＩＡＧＥＮ社、３６１１１）を加え、室温で４０分攪拌しながら放置した。上記と同様にしてマグネットスタンドでＮｉ−ＮＴＡビーズを沈殿させ、１００μｌのＷａｓｈバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４  ５０ｍＭ，ＮａＣｌ  ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％，ｐＨ８．０）で軽く洗浄した。ビーズを沈殿させた後、Ｅｌｕｔｅバッファー（ＮａＨ２ＰＯ４  ５０ｍＭ，ＮａＣｌ  ３００ｍＭ，ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ２５０ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％，ｐＨ８．０）を１５μｌ加え１分間室温で放置し、ＤＮＡ−タンパク質を溶出させた。
１１．選択過程
上記工程１０で溶出したＤＮＡ−タンパク質は、ビオチン−セルロースゲル（ｓｉｇｍａ社）を充填したカラムに流し、溶出されたものを回収した。次にこれとＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｂｉｏｔｉｎ（５−（（Ｎ−（６−（ｂｉｏｔｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｈｅｘａｎｏｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｅｎｔｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅｉｄｙｌ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸バッファー、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で混合し、２５℃で１時間インキュベーションした。次にアビジンビーズ（ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ、ＴａＫａＲａ社）２０μｌを加え、室温で１０分静置した。ここでマグネットを使いビーズを集めて、バッファー交換した。Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで３回ビーズを洗浄した後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸バッファー、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＤＴＴ）を加えて１時間室温で静置した。マグネットでビーズを底に集めた後、上清を回収した。
１２．ＰＣＲによる選択分子のＤＮＡ増幅
上記工程１１で回収したＤＮＡ−タンパク質を２μｌ取り、最終的な体積が５０μｌになるように調整してＰＣＲ反応に供した。この際、プライマーはΩ−ＲＴ−Ｌ（５′−ＣＡＡＣＡ  ＡＣＡＴＴ  ＡＣＡＴＴ  ＴＴＡＣＡ  ＴＴＣＴＡ  ＣＡＡＣＴ  ＡＣＡＡＧ  ＣＣＡＣＣ−３′（配列番号１０））、Ｙｔａｇ−Ｒ（５′−ＴＴＴＣＣ  ＣＣＧＣＣ  ＣＣＣＣＧ  ＴＣＣＴ−３′（配列番号１１））を用い、ＴａｑポリメラーゼはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社）、反応条件は熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒：アニーリング６９℃１５秒：伸長反応７２℃４５秒のサイクルを３０回繰り返した。プライマーを除くためにプライマーリムーバー（Ｅｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて精製後、エタノール沈殿した。
１３．Ｔ７プロモーター領域連結のためのＰＣＲ
上記工程１２で得られたＤＮＡをＲＮＡ化するために、Ｔ７プロモーターを連結した。そのため、Ｔ７プロモーター配列と非翻訳領域配列をもつＤＮＡ（Ｔ７Ω）（配列番号５）を用いてプライマーなしのＰＣＲを行い連結し精製した。（上記工程２と同じ）
１４．選択サイクルの繰り返し
上記工程３で得たＤＮＡは再度、上記工程３に戻し、転写を行い、以下、工程４〜１３を３回繰り返した。
１５．シーケンス
上記工程１４までで、最終的にこのサイクルを４回ほど回して得られたＰＣＲ産物はプライマー（ＮｅｗＬｅｆｔ）を用いてシーケンスを行った。その際、最初のライブラリーと各サイクルで得られたＰＣＲ産物も同時にシーケンスを行い、ランダムな配列が特定の配列に収束することを確認した。そこで、ＰＣＲ産物をクローニングし、２０本のクローンを選びだし、再度、シーケンスを行った。シーケンス結果からホモロジー配列を抽出した。
１６．有機合成
上記工程１５で得られたＤＮＡのホモロジー配列に基づいてアミノ酸配列に直し、有機的にペプチドの固相合成法によってペプチドを合成、ペプチドを固相から切り離す前に脱保護の後に上記工程８の酸化還元処理を行ったのち、切り離し回収した。
１７．結合アッセイ
合成されたペプチドが実際にＦＩＴＣと結合能があるかどうかを調べるために蛍光偏光解消法を用いて解離定数を測定した。
なお、参考のため、図１に上記実施例のフローを示す概略図を示す。
実験例２  蛍光分子Ｃｙ３に対する結合ペプチドの取得
１．ＰＭ付きスペーサーＤＮＡの合成
ＰＭ付きスペーサーＤＮＡは実験例１の方法に従って合成した。概略図を図３に示す。
２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏウィルスの合成のためのライブラリー作成
５７ｂｐのランダムな領域を含むＤＮＡライブラリーは、（株）ファスマックに依託合成した３本の一本鎖ＤＮＡフラグメント（配列番号１２−１４）をつなぎ合わせて完全長を作成した（図４）。配列番号１２−１４で示すようにｆｒａｇｍｅｎｔ１と２、２と３が互いに２０〜３０ｍｅｒの相補な配列を持つ。これら３本の一本鎖ＤＮＡフラグメントを、最初にｆｒａｇｍｅｎｔ２と３、次に、ｆｒａｇｍｅｎｔ１の順で逐一伸長反応を行うことでつなぎ合わせて、全長のＤＮＡライブラリーを得た（配列番号１５）。伸長反応はＥｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて、熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング６９℃１５秒、伸長反応７２℃４５秒のサイクルを１８回繰り返すことで行った。完全長のＤＮＡは５′末端にＴ７プロモーター、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３′末端にヒスチジンタグ、転写したときにＰＭ付きスペーサーＤＮＡの一部と相補なタグ配列（図４中、“Ｙ−ｔａｇ”）を含む。配列番号１５で“ｘｙｚ”の１９回の繰り返しで示した１２４ｂｐ−１８０ｂｐのランダムな領域は、翻訳時に終止コドンの出現が少なくなるように、ｘはＴ１３％，Ｃ２０％，Ａ３５％，Ｇ３２％，ｙはＴ２４％，Ｃ２２％，Ａ３０％，Ｇ２４％、ｚはＴ３７％，Ｃ３７％，Ａ０％，Ｇ２６％（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９３  Ａｕｇ；２（８）：１２４９−５４）、になるように特殊ミックスした塩基を表す。配列表においては、“ｘｙｚ”は“ｎｎｎ”の繰り返しで示される。完全長のＤＮＡは変性アクリルアミドゲルから切り出し精製した後、定量しそのまま転写反応に使用した。
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2005012902.tif 000010
転写は、プロメガ社のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１３００）に付属するプロトコルに従いＤＮＡ  ２μｇ、４０μｌスケールで行った。合成の際、ｍ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１７１１）を加えた。３７℃で１時間放置した後、キット付属のＤＮａｓｅ（ＲＱ１  ＤＮａｓｅ）を２ｕｎｉｔ加え、さらに３７℃で１５分放置することでテンプレートのＤＮＡを分解した。フェノール・クロロフォルム処理を行った後、ＤＳ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製した。
３．ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの結合
転写した結果できたｍＲＮＡ  ４５０ｐｍｏｌに、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを４５０ｐｍｏｌ、１０  ｘ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）１２μｌを加え、１１２μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。８５℃から２５℃へ１０〜１５分かけてアニーリングし、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を２４ｕｎｉｔ、Ｔ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を８０ｕｎｉｔ加え、２５℃４０分反応させた。後に、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、７４１０４）で精製した。
４．翻訳（ｉｎ  ｖｉｔｒｏウィルスの合成）
ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体４００ｐｍｏｌを、無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）２．５ｍｌスケールで翻訳した。翻訳は３０℃１０分間行った。その後、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加えて３７℃で２時間放置することで、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体を得た。翻訳のスケールは、セレクションの最初のラウンドのために上記のように４００ｐｍｏｌ、２ｎｄラウンドのために５０ｐｍｏｌ、以降のラウンドのためには２０ｐｍｏｌへスケールダウンして行った。
５．逆転写
翻訳した産物４００ｐｍｏｌ分を、付属のＢｉｎｄｉｎｇバッファーであらかじめ洗浄した４００μｌのアビジンビーズ（ＴａＫａＲａ、９０８８、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ）に結合させ、付属のバッファーで洗浄した後、直ちに４００ｐｍｏｌに対して、逆転写用のバッファー４００μｌ（逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ、２６４０Ａ）を４０００ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰ  ０．５ｍＭ．ＲＮａｓｅインヒビター（Ａｍｂｉｏｎ、２６９４、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ）４００ｕｎｉｔを含む）に置換して、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ（配列番号１）の３′末端にある塩基“ＣＣＴ”からｍＲＮＡの５′末端へ逆転写反応を行った（１０分間、４２℃）。
６．ビーズからＤＮＡ−タンパク質を回収
アビジンビーズから、翻訳した産物４００ｐｍｏｌ分（ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体、および翻訳に使用されなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ）を回収するため、２２５ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）、０．０１％ＢＳＡを含む付属のバッファー３００μｌに置換し、１時間３７℃で放置した。
７．Ｈｉｓタグ精製
アビジンビーズを沈殿させた上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ、３６１１１、Ｎｉ−ＮＴＡ  ＭａｇｎｅｔｉｃＡｇａｒｏｓｅＢｅａｄｓ）１００μｌを使って、付属のプロトコルどおりに、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製を行い、翻訳に使用されなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ・複合体を取り除いた。Ｈｉｓ−ｔａｇ精製した産物は、６Ｍ尿素を含んだ６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、バンドをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（Ｂｉｏ  ＲＡＤ  ｃｏ．）でＦＩＴＣの蛍光を可視化することで純度の確認および定量を行い、以下のセレクションに使用した。
８．Ｃｙ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの作成
Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｑ１３１０８、Ｃｙ３  ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅ  ｔｏ  ｌａｂｅｌ  １．０ｍｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）１ｖｉａｌをＳｅｐｈａｒｏｓｅゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１７−０５６９−０１、ＥＡＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）２ｍｌへ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、室温で２〜６時間、攪拌させて結合させた。
９．選択過程
精製されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体は、３０分〜２時間シェーカーで攪拌した後、１日〜３日間４℃で放置することにより酸化させた。得られたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体は、１ｓｔラウンドでは２７  ｘ  １０１０、以降は３  ｘ  １０１０個程度で、これらほぼ全量をセレクションに使用した。セレクションは下記のように、ダミーカラム、Ｃｙ３カラムの順で各ラウンド１本ずつ使用して行った。
最初に、ダミーカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルを空のカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、２７−３５６５−０１、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎｓ）にカラムのベッドボリューム約４００μｌ程度になるように充填したもの）へ、精製されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体をアプライし、フロースルー（アプライした量の１〜１．５倍）を回収した。カラムは、使用前に１０カラムボリューム以上のカラム用バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で平衡化した。
次に、カラム用バッファー１０カラムボリューム以上で平衡化したＣｙ３カラム（Ｃｙ３−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを空のカラムにカラムボリューム約３５０μｌ程度になるように充填したもの）へ、回収したダミーカラムのフロースルーを流速０．１−０．３ｍｌ／分でアプライすることで、Ｃｙ３カラムへ結合させた。カラム用バッファーで洗浄（１４ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ（ｃｖ）〜６３ｃｖ）した後、最終濃度５０ｍＭのＤＴＴ（Ｗａｋｏ、０４７−０８９７３、Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むカラム用バッファーでＣｙ３カラムに結合しているＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体を溶出した（流速０．１−０．３ｍｌ／分）。
溶出されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体は脱塩・濃縮の後、ＰＣＲで増幅し（プライマー；配列番号１６／５′−ＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣ−３′、配列番号１７／５′−ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴ−３′、熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング６９℃１５秒、伸長反応７２℃４５秒のサイクルを３０回繰返し）、精製したＰＣＲ産物にｆｒａｇｍｅｎｔ１をライゲーションすることで、再び全長のＤＮＡを得た。後に、転写、ＰＭ付きスペーサーとのライゲーション、翻訳、精製を行い、次のラウンドのセレクションに使用した。
１０．クローニング
上記のようなセレクションを１３回連続して行った後のＤＮＡを、ベクターｐＤｒｉｖｅ（ＱＩＡＧＥＮ、２３１２２２、ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）へライゲーション、ＱＩＡＧＥＮ  ＥＺ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌへトランスフォーメーション、ＬＢプレートで培養を行い、２５個のコロニーをランダムに選びＤＮＡのシーケンス解析を行った。シーケンス解析は（株）日立ハイテクノロジーズへ依頼した。２５個のクローンの解析結果全てについて、１１５ｂｐ〜１８０ｂｐをアミノ酸の一文字表記に変換して配列番号１８−４２へ示した。
２５個のクローンのうち、４４％のクローンにはＮ末端−ＳＣＧＭＬＣＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号４３）、１６％のクローンにはＮ末端−ＳＶＨＦＧＬＱＣＧＮＭＧＨＶＨＤＳＩＨ（配列番号４４）、４％のクローンにはＮ末端−ＴＬＶＧＳＧＮＰＮＶＧＳＶＩＨＬＨＣＨ（配列番号４５）が含まれていた。
１３ラウンド後に選択された配列を以下に示す。なお、配列中のアスタリスク（＊）は終止コドンに対応する部位を表す。：
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１１．Ｃｙ３との結合定数決定
標的分子が低分子でかつ蛍光をもつＣｙ３であるため、蛍光偏向解消法によってＫｄを求めた。ただし、上述したような無細胞翻訳系では十分な量のペプチドを回収することが困難なため、（１）大腸菌による発現精製、（２）ペプチド合成、で測定に十分な量（１０μｇ）を確保した後、蛍光偏向解消装置（ＢＥＡＣＯＮ２０００、Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）によって測定した。
（１）大腸菌による発現精製
上記スクリーニングで得られたコンセンサス配列“ＳＣＧＭＬＣＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号４３）”のＮ末端にＭＧＣを連結した“ＭＧＣＳＣＧＭＬＣＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号１８）”のＣ末端側にリンカーとして“ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４６）”を加えさらにタグ配列（ＸＸＸ）として、１）ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）Ｇｅｎｅと２）Ｈｉｓ−ｔａｇを連結した。
発現ベクターに組み込む遺伝子領域は、“ＭＧＣＳＣＧＭＬＣＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ−ＧＧＧＳＧＧＧＳ−ＸＸＸ”とした。ここでＸＸＸは、１）ＸＸＸ＝ＧＳＴ（配列番号４７）、２）ＸＸＸ＝Ｈｉｓ−ｔａｇ（配列番号４８）の２通りである。
１）ＧＳＴ融合タンパク質
ＧＳＴ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてペプチドの発現及び精製を行った。その際、発現ベクターｐＧＥＭ−１λＥｃｏＲ１／ＢＡＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にインサートするために、ＢａｍＨ１サイトとＸｈｏ１サイトを両端にもつ配列番号：４９および配列番号５０に示すＤＮＡ相補鎖を作成した。
上記の配列コードする２種類のＤＮＡをファスマック（株）で合成し、それぞれ１００ｐＭずつを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで溶かした後、９５℃５分間、２０分間でゆっくり室温まで冷まし、アニーリングさせハイブリダイゼーションを行った。その後、ＢａｍＨ１とＸｈｏ１で制限酵素処理した後に、同様にＢａｍＨ１とＸｈｏ１で処理し精製したｐＧＥＭ−１λＥｃｏＲ１／ＢＡＰをＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ）を用いて１時間反応させた。作成したプラスミドはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＧＳＴ融合タンパク質の発現と検出のプロトコールにしたがい、大腸菌に形質転換後、目的プラスミドをもつクローンを選択した。ここでクローンをシーケンスし確認を行った。次に通常のプロトコールに従い大腸菌を培養した。大腸菌はＳＤＳを含むバッファーを用いて５分間９５℃で煮た後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＣＢＢ染色で確認後、抗ＧＳＴヤギ抗体を用いてウェスタンブロッティング行い、ＧＳＴ融合タンパク質の発現を確認した。次にＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＢｕｌｋ  ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅに添付のプロトコールに従いタンパク質の精製を行った。１００ｍｌの培養液で大腸菌を培養後、培養液を８，０００×ｇ、１０分間遠心分離を行った。回収した菌体のペレットを開始バッファーに懸濁、氷冷下、超音波で処理した。不溶物除去のために１２，０００×ｇ、４℃、１０分間の遠心分離後、沈殿物を開始バッファーで懸濁した。上精および沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥして目的のタンパク質を確認した。次にＡｍｅｒｓｈｑｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＧＳＴｒａｐ  ＦＦのプロトコールに従い、Ｈｉｔｒａｐ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラムによりバッファー中のグルタチオンを除去した。ＧＳＴタグについては上述のプロトコールに従い切断、除去したものと切断せず精製したものを調製した。
２）Ｈｉｓ−ｔａｇ
Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてペプチドの発現・精製を行った。このシステム用の発現ベクターｐＱＥ−３０  Ｘａ（ＱＩＡＧＥＮ社）のマルチクローニングサイトには、Ｎ末端側にＢａｍＨ１、Ｃ末端側にはＨｉｎｄＩＩＩをもつ必要があるため、上述のコンセンサス配列の両端に制限酵素配列をもつ配列番号５１および５２に示すような配列をもつＤＮＡ相補鎖をファスマック（株）で合成した。
合成されたＤＮＡはそれぞれ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで１００ｐｍｏｌ溶かした後、９５℃５分間、２０分間でゆっくり室温までアニーリングしてハイブリダイゼーションさせた。その後、ＢａｍＨ１とＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理した後に、同様にＢａｍＨ１とＨｉｎｄＩＩＩで処理し精製したｐＱＥ−３０  ＸａをＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ社）を用いて１時間反応させた。作成したプラスミドはＱＩＡＧＥＮ社のプロトコール「Ｔｈｅ  ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ」に従い、▲１▼トランスフォーメーション  ▲２▼トランスフォーメーション体の選択  ▲３▼目的タンパク質の溶解度の決定  ▲４▼変性常態下での精製をおこなった。この場合もＦａｃｔｏｒ  ＸａによってＨｉｓ−ｔａｇを除去したものと除去していないものの両方を調整した。
（２）ペプチド合成
ペプチド合成は部位特異的にＳ−Ｓ結合架橋させる技術をもつペプチド研究所に以下の配列は同じであるがＳ−Ｓ架橋が異なる３種類のペプチド合成を依頼した。
（Ｃ１）（Ｃ２）（Ｃ３）はシステインのインデックスを表す。
ＭＧ（Ｃ１）Ｓ（Ｃ２）ＧＭＬ（Ｃ３）ＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号５３）、
ＭＧ（Ｃ１）Ｓ（Ｃ２）ＧＭＬ（Ｃ３）ＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号５４）：（Ｃ１）と（Ｃ３）がＳ−Ｓ架橋したもの、
ＭＧ（Ｃ１）Ｓ（Ｃ２）ＧＭＬ（Ｃ３）ＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号５５）：（Ｃ１）と（Ｃ２）がＳ−Ｓ架橋したもの、
ＭＧ（Ｃ１）Ｓ（Ｃ２）ＧＭＬ（Ｃ３）ＴＨＶＲＨＨＳＲＦＨＭＶＨ（配列番号５６）：（Ｃ２）と（Ｃ３）がＳ−Ｓ架橋したもの。
これらは、いずれも１ｍｇ以上の収量が得られた。
（３）ペプチド酸化処理
（１）で精製したタンパク質はｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸バッファーに溶解し、オーバーナイトした。あるいは、ｏ−ヨードソ安息香酸５０ｍＭを用いて室温で１０分、ｐＨ．７の５０ｍＭリン酸バッファー中で反応させた。
（４）蛍光偏向解消度測定
（２）のペプチド及び（３）の酸化処理したそれぞれのペプチドを最終濃度１μＭになるように５０ｍＭのリン酸バッファーに溶解した。次にそれぞれのペプチド溶液を２倍ごとに希釈した。つまり５００ｐＭ、２５０ｐＭ，１２５ｐＭ，６２．５ｐＭ、３１．２５ｐＭ、１６ｐＭ、８ｐＭ、４ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、０．２５ｐＭ、０．１２５ｐＭ、０．６ｐＭの各濃度になるようにし、いずれも１００μｌ以上用意した。これらの溶液に最終濃度１ｐＭになるようにＣｙ３を加えた。１０分ほど室温で静置したのち、ＢＥＡＣＯＮ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で偏向解消度を順次測定した。得られたデータは、グラフ解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭによって、Ｋｄを求めた。
測定の結果、各サンプルとも１μ〜１００μＭの間のＫｄ値をとり、十分に結合することがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明のスクリーニング方法によれば、種々の立体構造を構成する種々のタンパク質を設計し、そのタンパク質と標的物質との相互作用を容易に判定できる形態で調製し、それをスクリーニング工程に供することができるので、ある標的物質と相互作用するタンパク質を容易にスクリーニングすることができる。
また、本発明の別の態様によれば、ある標的物質と相互作用する有用タンパク質のアミノ酸配列をランダムに改変して、さらにその改変されたタンパク質の活性を測定することによって、有用タンパク質のアミノ酸配列の最適化を容易に行うことができるという利点がある。このようなスクリーニング方法によって得られるタンパク質は、標的物質の生理的機能を調整する、生理活性物質として、種々の医薬用途に用いることができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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