(57)【要約】篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼを提供する。イネの篩管液に存在するタンパク質を分析し、植物のグルタチオンＳトランスフェラーゼと高い相同性を有するタンパク質を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の遺伝子によりコードされる篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質。
【請求項３】
請求の範囲１に記載の遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項４】
前記遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する、請求の範囲３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
請求の範囲３に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
請求の範囲４に記載の組換えベクターを有し、かつ薬剤に対する抵抗性を有する植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼに関する。
【背景技術】  高等植物の篩部は、代謝物質およびシグナルの長距離輸送経路である。篩部の主要な構成要素は篩管であり、篩管は篩部要素と呼ばれる細胞が連なったものである。篩部要素は大部分の細胞小器官（例えば、核、液胞、ゴルジ体など）とリボソームを分化の際に欠失したものである（Ｃｒｏｎｓｈａｗ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２：４６５−４８４，１９８１）。このように核等を欠く篩部要素は、タンパク質合成能を欠いていると考えられる（Ｏｐａｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１：３２３−４７，２０００）。しかしながら、篩管の生理学的機能を維持するためにはタンパク質が必要である。そのため原形質経路を介して篩部要素へ隣接の伴細胞からタンパク質が供給されると考えられている。実際、ウリ科植物、コムギ、ヒマおよびイネ植物の篩管内容物である篩管液では、１００種以上のタンパク質が検出されている（Ｅｓｃｈｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｅｙｓｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｓ．ｖｏｌ．１：Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，１．Ｐｈｌｏｅｍ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，ｅｄｓ．Ｍ．Ｈ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｍｉｌｂｕｒｎ，ｐｐ．１０１−１３６，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９７５；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：１４３３−１４４１，１９９２；Ｓａｋｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １９１：２０７−２１３，１９９３；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４，９２７−９３３，１９９３）。
カボチャでは、篩管液中に高濃度のＰタンパク質が含まれており、Ｐタンパク質の中でもＰＰ１およびＰＰ２が分析されている（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１２，４９−６１，１９９７；Ｂｏｓｔｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６，８８７−８９７，１９９４）。またカボチャにおいて、ウイルスの移行タンパク質に対する抗体と結合する篩管液タンパク質ＣｍＰＰ１６が細胞間のｍＲＮＡ輸送能力を有することが示されている（Ｘｏｃｏｎｏｓｔｌｅ−Ｃａｚａｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：９４−９８，１９９９）。さらにヒマでは、篩管液中にハウスキーピングタンパク質であるユビキチンおよび分子シャペロンが検出されている（Ｓｃｈｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １９６，２０５−２１０，１９９５）。このことにより、篩部要素におけるタンパク質の代謝回転およびフォールディングの存在が示唆される。またイネ植物およびヒマの篩管液において、チオレドキシンｈおよびグルタレドキシンがそれぞれ検出されている（Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １９５，４５６−４６３，１９９５；Ｓｚｅｄｅｒｋｅｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２０２，３４９−３５６，１９９７）。これら２種の篩管液タンパク質は、チオール酸化還元タンパク質であり、Ｓ−Ｓ結合の還元を行うことで、酸化傷害を受けたタンパク質を修復すると考えられている（Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  １９５，４５６−４６３，１９９５；Ｓｚｅｄｅｒｋｅｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２０２，３４９−３５６，１９９７）。またイネ植物の篩管液においてタンパク質リン酸化の酵素活性が検出されている。このことにより篩管におけるカルシウムシグナル伝達カスケードの存在が示唆される（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４，９２７−９３３，１９９３）。しかしながらこのように同定された篩部タンパク質は全体のほんの一部にすぎず、大部分の可溶型タンパク質が未だ同定も、分析されてもいない。
一方、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」という）は、種々の疎水性求電子化合物へのトリペプチドグルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ；ＧＳＨ）の抱合を触媒する。植物ＧＳＴは、アミノ酸配列およびイントロン／エキソン構造に基づき３つのグループ（Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）に分類されている（Ｄｒｏｏｇ，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．１６：９５−１０７，１９９７）。これら植物ＧＳＴの機能に関しては、主に除草剤を解毒化する能力に焦点が当てられている（Ｍａｒｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７，１２７−１５８，１９９６）。具体的には、植物ＧＳＴは除草剤にＧＳＨを抱合させ、除草剤をより親水性で毒性の低い形態に変化させる。なおこの形態の除草剤は液胞に隔離される。さらにストレス（例えば乾燥、損傷、活性酸素、病原体攻撃および生体異物の適用）によって、植物ＧＳＴが誘導されることが報告されている（Ｋｉｙｏｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３３５：１８９−１９２，１９９３；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１３：３４１−３４３，１９９４；Ｂａｒｔｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６，５７９−５８６，１９９３；Ｄｕｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．４，１４−１８，１９９１；Ｗｉｅｇａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７，２３５−２４３，１９８６）。これらのストレス誘導性ＧＳＴは反応性分子にＧＳＨを抱合させることで、反応性分子を解毒化する。従って、上記のチオレドキシンｈおよびグルタレドキシンとともに、ストレス誘導性ＧＳＴは酸化傷害から細胞を防御すると考えられている（Ｍａｒｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７，１２７−１５８，１９９６）。しかし、正常な植物におけるＧＳＴの研究は、上記の除草剤解毒能力、アントシアニンの液胞への隔離（Ｍａｒｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，３９７−４００，１９９５；Ａｌｆｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，１１３５−１１４９，１９９８）およびオーキシン結合活性（Ｂｉｌａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｕｒｍ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９，２５３−２６０，１９９５）に関することに限られている。また正常な植物組織におけるＧＳＴの分布も、十分に分析されていない。
イネ篩管液中には、高濃度（約４ｍＭ）の還元型ＧＳＨが検出されている（Ｋｕｚｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．４６，２６５−２７０，２０００）。しかしながら、イネ篩管液において、ＧＳＴは同定されていなかった。
【発明の開示】
本発明は、イネの篩管に存在するタンパク質を同定、分析することにより、例えば篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼを提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、篩管液に存在するタンパク質を分析し、植物のグルタチオンＳトランスフェラーゼと高い相同性を有するタンパク質を同定することで、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
また本発明は、前記遺伝子によりコードされる篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質である。
また本発明は、前記遺伝子を有する組換えベクター、又は前記遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する前記組換えベクターである。
また本発明は、前記遺伝子を有する組換えベクターを有する形質転換体である。
また本発明は、前記遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する前記組換えベクターを有し、かつ薬剤に対する抵抗性を有する植物体である。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列における少なくとも１以上のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質（以下、「篩管局在性ＧＳＴタンパク質」という）をコードする遺伝子である。配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は、２種のイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）ＥＳＴクローン、Ｓ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５：配列番号２）およびＲ２０８７（登録番号Ｄ２４５１７：配列番号３）、ならびにイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）ＢＡＣクローン、ＯＳＪＮＢｂ００１５Ｉ１１（登録番号ＡＣ０５１６３３−２２）に登録されている。該遺伝子によってコードされるタンパク質（以下「ＲＰＰ３１」という）は植物のＩ型ＧＳＴと高い類似性を有する。ＲＰＰ３１はＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇトリプレットを有する。該トリプレットは植物のＩ型ＧＳＴのＧＳＨ結合部位（Ｇ−部位）において高度に保存されている（Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７８，１９９−２０５，１９９７；ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４，１１０５−１１２０，２０００）。さらに上記ＢＡＣクローン（ＯＳＪＮＢｂ００１５Ｉ１１（登録番号ＡＣ０５１６３３−２２））のＤＮＡ配列分析の結果から、ＲＰＰ３１をコードする遺伝子は３つのエキソンと２つのイントロンを含む。この遺伝子構造は植物のＩ型ＧＳＴと一致する。以上からＲＰＰ３１は、植物のＩ型ＧＳＴであると特定できる。
ここで「篩管局在性」とは、植物の伴細胞で発現されたタンパク質が隣接する篩部要素に輸送され、少なくとも篩管（篩部要素）に存在することを意味する。従って、ＲＰＰ３１は、伴細胞に限らず篩部要素に局在する。これはイネの葉鞘基部の横断面切片における免疫組織染色実験から確認できる。なお、ＲＰＰ３１の篩管局在性は葉の成長段階にかかわらず確認できる。
篩部要素は篩管を構成する細胞であり、大部分の細胞小器官（例えば、核、液胞、ゴルジ体など）とリボソームを分化の際に欠失したものである（Ｃｒｏｎｓｈａｗ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３２：４６５−４８４，１９８１）。このように核等を欠く篩部要素は、タンパク質合成能を欠いていると考えられる（Ｏｐａｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１，３２３−４７，２０００）。そのため原形質経路を介して隣接の伴細胞から篩部要素へタンパク質が供給されると考えられている。従って伴細胞からタンパク質合成能を欠く篩部要素内に、ＲＰＰ３１が効率的に輸送されると考えられる。ＲＰＰ３１は篩管が存在する器官に存在する。篩管が存在する器官としては、植物の葉および茎、特に葉が挙げられる。なお、植物の各器官についてウエスタンブロッティング分析を行うことにより、ＲＰＰ３１が存在する器官を特定できる。例えば、ウエスタンブロッティング分析の結果、根の抽出液からＲＰＰ３１は検出されない。このことは根の篩管には、ＲＰＰ３１が存在しないかまたはきわめて微量で検出限界以下であることを示唆する。
（ｂ）に記載のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は数個（例えば１〜１０個、１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、且つＧＳＴ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。なお「ＧＳＴ活性」とは、種々の疎水性求電子化合物にＧＳＨを抱合させる活性を意味する。ＧＳＴ活性の測定方法としては、例えば一般的なＧＳＴ基質であるＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いる方法が挙げられる。この方法を用いると、ＧＳＴ活性の結果としてＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合体が得られる。ＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合体は、３４０ｎｍに吸光のピークを持つ。従って３４０ｎｍの吸光度の増加をＧＳＴ活性として測定が行われる。
一旦本発明に係る遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたクローンを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る遺伝子を得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明に係る遺伝子の変異型であって、変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。
なお、本発明に係る遺伝子に変異を導入する方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法が挙げられる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
本発明に係る篩管局在性ＧＳＴタンパク質は、本発明に係る遺伝子によりコードされるタンパク質である。例えば、本発明に係る遺伝子を大腸菌等に由来するベクターに組込み、次に得られた組換えベクターで大腸菌を形質転換する。その後、大腸菌内で合成されたタンパク質を抽出することで、本発明に係るタンパク質を得ることができる。
さらに本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子を有する組換えベクターである。適当なベクターに本発明に係る遺伝子を挿入することにより、本発明に係る組換えベクターを得ることができる。本発明に係る遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入することなどによって複製可能となるＤＮＡ断片であってもよい。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ３０ｂなどのｐＥＴ系、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２５などのｐＢＲ系、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９などのｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３などのＹＥｐ系、ＹＣｐ５０などのＹＣｐ系等）などが挙げられる。またファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルス、またはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明に係る遺伝子を挿入するには、まず適当な制限酵素で本発明に係る遺伝子のｃＤＮＡを切断し、次いで適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が用いられる。またベクターと本発明に係る遺伝子のｃＤＮＡのそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、ＰＣＲなどを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ法または酵母などを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ法によって両者を連結する方法であってもよい。
また本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する組換えベクターである。ここで「伴細胞特異的プロモーター」とは、植物の伴細胞で特異的にプロモーター活性を示すプロモーターを意味する。例えば、伴細胞特異的プロモーターとしては、イネのチオレドキシンｈプロモーター（Ｉｓｈｉｗａｔａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｎｔ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ−ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．８０９−８１０，１９９７）が挙げられるが、これに限定されない。なお本発明に係る遺伝子の上流への伴細胞特異的プロモーターの挿入は、該プロモーターが活性を示し、且つ該プロモーターの活性によって本発明に係る遺伝子が発現するような部位に挿入される。ベクターへの伴細胞特異的プロモーターの挿入方法は、ベクターに本発明に係る遺伝子を導入する方法と同様であってよい。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを有する形質転換体である。本発明に係る形質転換体は、本発明に係る組換えベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明に係る遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
本発明において形質転換の対象となる「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部等）又は植物培養細胞のいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、イネ科、アブラナ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
イネ科：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）
本発明に係る組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に導入することができる。
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧５００〜１６００Ｖ、２５〜１０００μＦ、２０〜３０ｍｓｅｃの条件で処理し、本発明に係る組換えベクターを宿主に導入する。
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物全体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、またはプロトプラストを調製して使用してもよい。次いで遺伝子導入装置（例えばＢｉｏ−Ｒａｄ社のＰＤＳ−１０００／Ｈｅ等）を用いて、調製した試料を処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１８００ｐｓｉ程度の圧力、５〜６ｃｍ程度の距離で行う。
アグロバクテリウムのＴｉプラスミド又はＲｉプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、本発明に係る遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。またアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にＴｉプラスミド又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ＤＮＡ）と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。従って、Ｔｉ又はＲｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に植物ゲノム中に組み込みたいＤＮＡを挿入する。次いでアグロバクテリウム属の細菌を植物宿主に感染させると、植物ゲノム中に該ＤＮＡを組込むことができる。
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能である。また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、本発明に係る遺伝子を植物に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に本発明に係る遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、本発明に係る遺伝子を植物宿主に導入することができる。
本発明に係る組換えベクターは、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９等の昆虫細胞などに導入することもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明に係る組換えベクターは該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、転写終結配列および本発明に係る遺伝子により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
細菌への本発明に係る組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母への本発明に係る組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞などが用いられる。動物細胞への本発明に係る組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への本発明に係る組換えベクターの導入方法としては、昆虫細胞にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
一方、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって、本発明に係る遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認を行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして１本のバンドとして増幅産物を検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法を採用してもよい。
本発明に係る植物体は、本発明に係る遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する組換えベクターを有し、かつ薬剤に対する抵抗性を有するものである。ここで「植物体」とは、本発明に係る遺伝子の上流にさらに伴細胞特異的プロモーターを有する組換えベクターによって形質転換された植物全体を意味する。上記組換えベクターを植物細胞等に導入し、得られた形質転換植物細胞から形質転換植物体に再生させることによって、本発明に係る植物体を得ることができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、ＬＳ培地、ＭＳ培地等が挙げられる。なお組換えベクターの植物細胞等への導入は、上記と同様の方法によって行うことができる。
本発明に係る植物体では、伴細胞において、本発明に係る遺伝子によりコードされる篩管局在性ＧＳＴタンパク質が特異的に発現する。さらに発現した該タンパク質は、篩部要素に輸送される。一方、下記の実施例に示すように、本発明に係る篩管局在性ＧＳＴタンパク質はＧＳＴ活性を示す。またイネの篩管液中には、ＧＳＨが検出されている（Ｋｕｚｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．４６，２６５−２７０，２０００）。従って、本発明に係る植物体では、伴細胞で特異的に発現し、次いで篩部要素に輸送された本発明に係る篩管局在性ＧＳＴタンパク質が、篩管を通過する薬剤にＧＳＨを抱合させ、薬剤を解毒化し得る。このように本発明に係る植物体は薬剤に対して抵抗性を有することができる。本発明に係る植物体が抵抗性を示し得る薬剤としては、プレチラクロール等のクロルアセトアミド系薬剤が挙げられるが限定されない。
ＲＰＰ３１はその他のＩ型ＧＳＴと高い類似性を示す。しかしＲＰＰ３１は、既知のＩ型ＧＳＴに存在しない領域（およそアミノ酸配列第１２６位〜第１７７位の領域）を含んでいる。
この配列の機能的意義は、現在のところ明らかではない。しかしながら伴細胞で発現した該タンパク質が篩部要素へと輸送されるためのシグナル配列として該配列が機能すると考えられる。
従って、以下のことが考えられる。伴細胞特異的プロモーターの下流に本発明に係る遺伝子および外来遺伝子を有する組換えベクターを植物細胞等に導入する。この場合、本発明に係る遺伝子と外来遺伝子は、融合タンパク質をコードするように連結される。次いで得られた形質転換細胞から形質転換植物体に再生させる。
該植物体では、伴細胞特異的プロモーターによって、本発明に係る遺伝子と外来遺伝子とによってコードされる融合タンパク質が伴細胞で特異的に発現する。次いで上記シグナル配列により、該融合タンパク質が篩部要素に輸送される。このように融合タンパク質として外来タンパク質を篩管に局在化させることができる。外来遺伝子としては、いかなるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であっても良いが、植物由来の殺虫性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。例えば外来遺伝子として殺虫性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を有する上記組換えベクターをイネ植物細胞に導入する。このようにして、種子では発現しないが篩管内だけで殺虫性ペプチドまたはタンパク質を発現する吸汁昆虫抵抗性遺伝子組換えイネを作製することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、イネ篩管液に由来するタンパク質の２次元電気泳動パターンを示す。
図２は、推定されるＲＰＰ３１のアミノ酸配列とその他の植物のＩ型ＧＳＴのアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
図３Ａは、大腸菌で産生させた組換え体ＲＰＰ３１を電気泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＣＢＢ染色を示す。
図３Ｂは、大腸菌で産生させた組換え体ＲＰＰ３１のＧＳＴ活性を示す。
図３Ｃは、イネ篩管液のＧＳＴ活性を示す。
図４Ａは、イネの篩管液および葉抽出液のウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
図４Ｂは、イネの葉抽出液および根抽出液のウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
図５Ａは、免疫組織染色した葉鞘基部の横断面切片の全体写真である。
図５Ｂは、図５ＡのＢの箇所に対応する拡大写真である。
図５Ｃは、図５ＡのＣの箇所に対応する拡大写真である。
図５Ｄは、図５ＡのＤの箇所に対応する拡大写真である。
図５Ｅは、図５ＡのＥの箇所に対応する拡大写真である。
図５Ｆは、図５ＡのＦの箇所に対応する拡大写真である。
図５Ｇは、陰性対照として免疫吸収抗体を用いて染色した大維管束領域の写真である。
図６は、プレチラクロールおよび／またはフェンクロリムで処理したイネに由来する葉抽出液および根抽出液におけるＲＰＰ３１のウエスタンブロッティング分析の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
研究用試薬の入手元
以下の実施例で用いた試薬において、本明細書中に記載していないものについては、和光純薬（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の製品を用いた。
実施例１．篩管局在性ＧＳＴの同定
（１）  イネ植物からの篩管液の回収
Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４，９２７−９３３，１９９３に記載のように、温度制御温室（３０／２５℃、昼／夜）において水栽培条件下で、イネ植物（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｃｖ．Ｋａｎｔｏｕ）を成長させた。次にトビイロウンカの口針切断末端法（Ｋａｗａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１，１３１９−１３２７，１９８０）によって、４〜５週間成長させた植物の葉鞘からイネ篩管液を回収した。なお篩管液を回収する全ての手順は、室内光条件（２０μｍｏｌ  ｓ−１  ｍ−２）下で２５℃および相対湿度６０％の室内で行われた。回収した篩管液は分析まで−２０℃で保存した。ＧＳＴ活性アッセイに用いる篩管液は４℃で保存した。
（２）  ＲＰＰ３１のＮ末端アミノ酸配列分析
イネ篩管液３００μｌを１５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。次にＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３４，９２７−９３３，１９９３に記載のように、沈殿したタンパク質を２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）に課した。その後、ゲル上に分離したタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）メンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）上に電気ブロッティングした。次に、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０（ＣＢＢ）バッファー（０．０２５％（ｗ／ｖ）ＣＢＢ、１０％（ｖ／ｖ）酢酸および４０％（ｖ／ｖ）メタノール）を用いて、該ＰＶＤＦメンブレンを染色した。結果を図１に示す。図１中、矢印の部分が３１ｋＤａタンパク質である。
次にＰＶＤＦメンブレンから３１ｋＤａタンパク質のスポットを切り離した。その後、気相プロテインシークエンサー（４９２ＨＴ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて、該タンパク質のＮ末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、該タンパク質のＮ末端アミノ酸配列がＰＧＡＶＫＶＦＧＳＰ（配列番号４）であることが判明した。
さらに該Ｎ末端アミノ酸配列から予測される塩基配列について、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を用いて検索した。この検索により、該Ｎ末端アミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含むクローンとして、２種のイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）ＥＳＴクローン、Ｓ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５）およびＲ２０８７（登録番号Ｄ２４５１７）、ならびにイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ，ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ）のＢＡＣクローンＯＳＪＮＢｂ００１５Ｉ１１（登録番号ＡＣ０５１６３３−２２）が特定された。
（３）  ＥＳＴクローンのＤＮＡ配列分析
シークエンスアナライザー（ＡＢＩＰＲＩＳＭＴＭ３１０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）によって、上記ＥＳＴクローン、Ｓ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５）およびＲ２０８７（登録番号Ｄ２４５１７）、両方のＥＳＴクローンに対応する４種のプライマー、ならびにシークエンスキット、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて、各ＥＳＴクローンの全ヌクレオチド配列を決定した。なおＥＳＴクローンは、両方とも農業生物資源研究所（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ）から提供された。
両方のＥＳＴクローンに対応する４種のプライマーの配列は以下の通りであった。
2004024924.tif 000002
上記配列分析の結果、ＥＳＴクローン、Ｓ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５）およびＲ２０８７（登録番号Ｄ２４５１７）の塩基配列が、それぞれ配列番号２および配列番号３のように決定された。さらにこの分析により、両方のクローンが推定分子量３０．７ｋＤａ（これはＲＰＰ３１の分子量に対応する）の同一のタンパク質をコードする遺伝子を含むことが明らかとなった。またＢＡＣクローン、ＯＳＪＮＢｂ００１５Ｉ１１（登録番号ＡＣ０５１６３３−２２）のＤＮＡ配列により、ＲＰＰ３１をコードする遺伝子は３つのエキソンと２つのイントロンを含むことが示された。この遺伝子構造は植物のＩ型ＧＳＴと一致する。さらに全ゲノムショットガンのイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  Ｌ．ｓｓｐ．Ｉｎｄｉｃａ）コンティグにおけるデータベース（北京ゲノム研究所，ｈｔｔｐ：／／ｂｔｎ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｒｉｃｅ）を用いて、上記Ｎ末端アミノ酸配列から予測される塩基配列を検索した。検索により、イネゲノムは該Ｎ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子の１コピーを含んでいることが判明した。
（４）  相同性検索分析
アミノ酸レベルでのＲＰＰ３１と植物のＩ型ＧＳＴとの相同性検索分析（ＤＤＢＪ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った（図２）。なお多重配列アラインメントは、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を用いて行った。結果を図２に示す。
比較した植物のＩ型ＧＳＴは、以下のものである：トウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）由来のＺｍＧＳＴ１４およびＺｍＧＳＴ３（ＺｍＧＳＴ１４：登録番号ＡＦ２４４６７９，ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４，１１０５−１１２０，２０００、ＺｍＧＳＴ３：登録番号ＡＪ０１０２９５−１，Ｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６，４２５−４２８，１９８８）、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＡＣ０１２３２８（登録番号ＡＣ０１２３２８−１２）、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）由来のｐａｒＢ（登録番号Ｄ１０５２４−１，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，５６−５９，１９９２）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  Ｘ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のＡｎ９（登録番号Ｙ０７７２１−１，Ａｌｆｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，１１３５−１１４９，１９９８）、コムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＴａＧＳＴＡ１（登録番号Ｔ０６５０９，Ｄｕｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．４，１４−１８，１９９１）、ならびにイネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来のＲＧＳＴＩおよびＲＧＳＴＩＩ（ＧＳＴの部分配列）（登録番号ＡＪ００２３８０，ＡＪ００２３８１，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１０５，１０２−１０８，１９９９）。
図２中、白い枠中のアミノ酸配列は、プロテインシークエンサーによって検出されたＮ末端アミノ酸残基を示す。またＩＳＲＥＣ  ＢＯＸＳＨＡＤＥソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＃ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）によって、同一残基および類似残基にそれぞれ黒色および灰色の影をつけた。星印（＊）は、ＧＳＨ結合部位（Ｇ−部位）において保存されるアミノ酸を示す（ＭｃＧｏｎｉｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４，１１０５−１１２０，２０００）。またダッシュ（−）は、ギャップを示す。
図２に示すように、ＲＰＰ３１は植物のＩ型ＧＳＴと高い類似性を示した。例えば、ＲＰＰ３１はＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇトリプレット（図２中、星印（＊）を付したアミノ酸残基）を有する。該トリプレットは植物のＩ型ＧＳＴのＧＳＨ結合部位（Ｇ−部位）において高度に保存されている。またＲＰＰ３１は、ＺｍＧＳＴ１４と最も高い類似性を有していた（ＦＡＳＴＡ検索によれば７０．５％のアミノ酸配列同一性）。これらのことから、ＲＰＰ３１は植物のＩ型ＧＳＴに分類されると考えられる。しかし、他のＩ型ＧＳＴと異なり、ＲＰＰ３１は既知のＩ型ＧＳＴに存在しない領域（およそアミノ酸配列第１２６位〜第１７７位の領域）を含んでいた。さらにＲＰＰ３１とその他の植物のＩ型ＧＳＴとのＮ末端アミノ酸配列を比較すると、ＲＰＰ３１はタンパク質のＮ末端にメチオニンを有していないことが明らかとなった。
実施例２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＴ酵素アッセイ
（１）  組換え体ＲＰＰ３１の合成
ＧＳＴ酵素アッセイに用いる組換え体ＲＰＰ３１を、大腸菌内で合成した。まず、イネＥＳＴクローンＳ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５：配列番号２）を鋳型とし、該クローンに対応するプライマーを用いたＰＣＲによって、ＲＰＰ３１  ｃＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ反応条件およびプライマー配列は以下の通りであった。
ＰＣＲ反応条件：９６℃で４５秒、６０℃で４５秒および７２℃で２分の３０サイクル、ならびに４℃で保存。
2004024924.tif 000003
次に、増幅したＲＰＰ３１  ｃＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩとで切断し、同一制限酵素で切断したプラスミドベクターｐＥＴ３０ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に挿入してサブクローニングした。得られたプラスミドは、以下「ｐＡＦ２７」と呼ぶ。
次に、大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にｐＡＦ２７を導入し、以下のようにＲＰＰ３１タンパク質を合成させた。まず、ＬＢ培地で２６．５℃にて一晩、ｐＡＦ２７を含む大腸菌を前培養した。次にこの前培養液１ｍｌをＬＢ培地５０ｍｌに加えて、２６．５℃でさらに２時間培養した。その後、最終濃度０．１Ｍとなるようにイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質合成を誘導し、さらに２６．５℃で４時間培養した。次に培養液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、大腸菌を回収した。得られた大腸菌に抽出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）および０．２Ｍ  ＮａＣｌ）０．５ｍｌを加え、超音波処理によって溶解した。次に１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで細胞破片を除去した。得られた上清を抽出液としてＧＳＴ活性アッセイに用いた。
（２）  ＩＰＴＧで誘導された組換え体ＲＰＰ３１発現の確認
ＩＰＴＧで処理された大腸菌において、組換え体ＲＰＰ３１が発現されているか否かを確認するために、ＳＤＳ電気泳動およびＣＢＢ染色を行った。ｐＡＦ２７を有する大腸菌に由来する、ＩＰＴＧ誘導前に抽出したタンパク質およびＩＰＴＧ誘導後に抽出したタンパク質をＳＤＳ電気泳動に供した。次にＣＢＢバッファー（０．０２５％（ｗ／ｖ）ＣＢＢ、１０％（ｖ／ｖ）酢酸および４０％（ｖ／ｖ）メタノール）を用いてゲルを染色した。結果を図３Ａに示す。図３Ａ中、レーン１は、ＩＰＴＧ誘導前に抽出したタンパク質、レーン２はＩＰＴＧ誘導後に抽出したタンパク質である。矢印は、ＲＰＰ３１タンパク質を示す。
図３Ａに示すように、ＩＰＴＧ誘導後にはＲＰＰ３１の発現が誘導されていることが確認できた。
（３）  組換え体ＲＰＰ３１のＧＳＴ活性アッセイ
ｐＡＦ２７を含有する大腸菌に由来する抽出液のＧＳＴ活性を、一般的ＧＳＴ基質であるＣＤＮＢ（１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて測定した。なおアッセイには、ｐＡＦ２７を含有する大腸菌に由来する抽出液およびｐＥＴ３０ｂを有する大腸菌（ベクター対照）に由来する抽出液を用いた。抽出液と水との混合物（１５０μｌ）および反応バッファー（１０ｍＭ  ＣＤＮＢ  ５０μｌ、１０ｍＭ  ＧＳＨ  ５０μｌ、および０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）２５０μｌ）からなる反応液０．５ｍｌで、酵素反応を５分間実施した。ＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合体は、３４０ｎｍに吸光のピークを持つ。従って次に３４０ｎｍの吸光度の増加をＧＳＴ活性として、測定を行った。ＧＳＴ活性測定法の詳細は、秀潤社「活性酸素実験プロトコール」（谷口直之監修）に従った。結果を図３ｂに示す。
ＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合体のモル吸光係数９６００をもとに、反応液中のタンパク質の酵素活性値を測定した。図３ｂのグラフは、４回の独立して繰り返した実験の平均と標準偏差を示す。ｐＥＴ３０ｂを有する大腸菌（ベクター対照）に由来する抽出液と比較してｐＡＦ２７を有する大腸菌に由来する抽出液において、ＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合活性、すなわちＧＳＴ活性が有意に増加していた（ｔ検定；ｐ＜０．００５）。このことは、組換え体ＲＰＰ３１がＧＳＴ活性を有することを示す。
（４）  イネ篩管液のＧＳＴ活性アッセイ
イネ篩管液自体がＣＤＮＢ−ＧＳＨ抱合活性を有するか否かを調べるために、イネ篩管液のＧＳＴ活性の測定を行った。限外ろ過用フィルターＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、４℃にてイネ篩管液６０μｌを約３μｌにまで濃縮した。上記と同様にＣＤＮＢを基質として用いて、３４０ｎｍの吸光度変化により濃縮篩管液のＧＳＴ活性を測定した。反応液（１０ｍＭ  ＣＤＮＢ  ０．５μｌ、１０ｍＭ  ＧＳＨ  ０．５μｌ、０．２Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）２．５μｌ、水０．５μｌおよび濃縮篩管液１μｌ）５μｌを用いて吸光度の測定を行うため、内径０．５ｍｍの微量セル（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｃｅｌｌ；Ｈｅｌｉｘ  Ｃｏ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。陰性対照には、篩管液の濃縮の際にフィルターを通過した低分子の画分（分子量＜３０００）および篩管液の組成に似せた合成篩管液（５ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＯＨ、１０ｍＭマレート、２０ｍＭアスパラギン酸、２０ｍＭグルタミン酸、２０ｍＭセリン、２０ｍＭトレオニン、１０ｍＭチロシン、１０ｍＭリシン、１０ｍＭフェニルアラニン、５ｍＭトリプトファンおよび２５０ｍＭスクロース）を用いた。測定は、独立した実験を２度行った。結果を図３Ｃに示す。
陰性対照である篩管液の低分子画分および合成篩管液の吸光度変化は、水を用いて測定したバックグラウンドと変わらなかった。一方、ＲＰＰ３１が存在する濃縮篩管液では、これらに比べ、大きな吸光度変化が検出された。このことは、イネ植物の篩管でＲＰＰ３１がＧＳＴ活性を有することを示唆する。
実施例３．ウエスタンブロッティング分析
（１）  Ｈｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１の合成
ＲＰＰ３１に対する抗体を作製するために、抗原としてＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１を以下のように作製した。まずイネＥＳＴクローンＳ１３４１５（登録番号Ｄ４７７４５：配列番号２）を鋳型とし、該クローンに対応するプライマーを用いたＰＣＲによって、ＲＰＰ３１  ｃＤＮＡを増幅した。
ＰＣＲ反応条件およびプライマー配列は以下の通りであった。
ＰＣＲ反応条件：９６℃で４５秒、６０℃で４５秒および７２℃で２分の３０サイクル、ならびに４℃で保存。
2004024924.tif 000004
2004024924.tif 000005
次に制限酵素ＫｐｎＩとＮｃｏＩとを用いて増幅断片を処理した。その後、同一制限酵素で切断したプラスミドベクターｐＥＴ３０ｂのＨｉｓ−ｔａｇ配列の下流に、制限酵素で処理した断片を挿入し、サブクローニングした。次に実施例１のｐＡＦ２７において記載した同様の方法によって、Ｈｉｓ−ｔａｇ付き組換え体ＲＰＰ３１を含む大腸菌抽出液の上清を調製した。さらに製造元の使用説明書に従い、Ｈｉｓ−結合バッファーキット（Ｎｏｖａｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ニッケルカラムでＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１タンパク質を精製した。
（２）  ウサギ抗ＲＰＰ３１ポリクローナル抗体の作製および精製
抗原としてＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１タンパク質３．０ｍｇをウサギに免疫した。なお抗ＲＰＰ３１血清の作製は、サワディーテクノロジー社（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に依託した。次にＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  ＩｇＧ（プロテインＡ）精製キット（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて、免疫したウサギ血清中のＩｇＧを精製した。その後、Ｙａｍａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１４２７−１４３２，１９９２の方法に従って、抗ＲＰＰ３１  ＩｇＧのアフィニティー精製を以下のように行った。
Ｈｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１タンパク質１００μｇをＳＤＳ電気泳動に供し、ナイロンメンブレン上に転写した。次にＰｏｎｃｅａｕＳ染色液（０．１％（ｗ／ｖ）ＰｏｎｃｅａｕＳ（ＳＩＧＭＡ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含む１％（ｖ／ｖ）酢酸）で、該ナイロンメンブレンを染色した後、１％（ｖ／ｖ）酢酸および脱イオン水で洗浄し、ＲＰＰ３１のバンドを切り出した。該バンドを１００μＭ  ＮａＯＨで洗浄し、ＰｏｎｃｅａｕＳを完全に除去した。次に脱イオン水およびＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）で３回ずつ、該バンドを洗浄し、ＲＰＰ３１結合シートとした。５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）を含むＴＰＢＳ（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）（ＴＰＢＳ−ＭＩＬＫ）中で、該結合シートを４時間ブロッキングした。次に、ＩｇＧ溶液４５０μｌを含むＰＢＳ−ＢＳＡ（０．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３を含むＰＢＳ）９ｍｌ中に該結合シートを移し、一晩インキュベートすることで、Ｈｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１にＩｇＧを結合させた。その後、ＴＰＢＳ−ＭＩＬＫを用いて２０分を３回、ＰＢＳを用いて１０分を１回、該結合シートを洗浄した。さらに０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）５００μｌ中で、該結合シートを２分３０秒間洗浄し、ＩｇＧを溶出させた。即座に、溶出液に６．９％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）８５μｌを加えて中和した。さらにもう一度、該結合シートを用いてこの抗ＲＰＰ３１  ＩｇＧを含む溶出液を精製した。このようにして得られた溶出液をアフィニティー精製ＲＰＰ３１抗体として、下記のウエスタンブロッティング分析および免疫組織染色実験に用いた。また、結合シートとインキュベートした後の溶液は、さらに２回、結合シートとインキュベートして完全に抗ＲＰＰ３１  ＩｇＧを取り除いた。免疫吸収抗体としてこの溶液を、免疫組織染色実験の陰性対照に用いた。
（３）  イネ葉および根の可溶型タンパク質の抽出
イネの葉または根を液体窒素中で粉砕し、葉の場合は等重量、根の場合は半分量の抽出バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％β−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ｐ−ＡＰＭＳＦおよび２５μｇ／ｍｌロイペプチン）と混合した。それぞれ得られたホモジェネートを１３０００ｇ、４℃、３０分にて２回遠心分離し、可溶型タンパク質を含む抽出液を得た。なお葉抽出液、根抽出液、篩管液および大腸菌細胞抽出液の全タンパク質濃度の測定には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｃｏ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた。測定方法は、付属のプロトコールに従った。
（４）  ウエスタンブロッティング分析
ウエスタンブロッティング分析により、イネの葉抽出液および根抽出液および篩管液中のＲＰＰ３１の検出を行った。ここでは、陽性対照として大腸菌細胞由来のＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１を用いた。まず葉抽出液、根抽出液および篩管液をＳＤＳ電気泳動に課し、ＰＶＤＦメンブレン上に転写した。次に３％（ｗ／ｖ）ゼラチン（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＯ．，ＣＡ，ＵＳＡ）中で該ＰＶＤＦメンブレンをブロッキングした。その後、１次抗体としてアフィニティー精製抗ＲＰＰ３１抗体および２次抗体としてヤギ−抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｃｏ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、免疫ブロッティングを行った。なお検出用の基質としてジアミノベンジジンを用いた。結果を図４Ａ、Ｂに示す。
図４Ａにおいて、Ｍは分子量マーカー、ＰはＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１（陽性対照、５０ｎｇ）、レーン１は篩管液（タンパク質含量１．５μｇ）、レーン２は葉抽出液（タンパク質含量１．５μｇ）、レーン３は葉抽出液（タンパク質含量１５μｇ）を示す。
図４Ａに示されるように、イネ植物の篩管液および葉抽出液において、ＲＰＰ３１の分子量に対応する３１ｋＤａの主要なバンドが検出された。篩管液においては、さらに約３７ｋＤａ、３５ｋＤａおよび２８ｋＤａの位置にさらに３本の薄いバンドが検出された。植物ＧＳＴは２５〜２９ｋＤａの分子質量であるものが多いことから（Ｍａｒｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７，１２７−１５８，１９９６）、２８ｋＤａのバンドは別のＧＳＴである可能性が考えられた。さらに約３７ｋＤａおよび３５ｋＤａの２本のバンドは、ＧＳＴの分子量とは大きく外れることから、抗体が非特異的に検出したものと考えた。一方、等重量のタンパク質を泳動した葉抽出液のバンドより篩管液のＲＰＰ３１のバンドは濃かった。従って、篩管液中ではＲＰＰ３１の存在割合が高いと考えられる。
一方、図４Ｂにおいて、ＰはＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１（陽性対照、５０ｎｇ）、Ｍは分子量マーカー、レーン４は葉抽出液（タンパク質含量１０μｇ）、レーン５は根抽出液（タンパク質含量１０μｇ）を示す。
図４Ｂに示されるように、葉抽出液と同じタンパク質含量の根抽出液ではＲＰＰ３１が検出されなかった。このことは根におけるＲＰＰ３１の存在量が、検出限界以下であることを示唆する。
実施例４．免疫組織染色法によるＲＰＰ３１の局在の確認
イネ植物の葉鞘基部の横断面切片において、ＲＰＰ３１の細胞局在を調査した。まず５週間成長させたイネ植物の葉鞘基部約５ｍｍを切り取り、固定バッファー（１．８５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、４５％（ｖ／ｖ）エタノールおよび５％（ｖ／ｖ）酢酸）中で固定した。次に、組織をｔ−ブチルアルコールで脱水し、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋方法の詳細は、Ｋｏｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｈａｔａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３８：１０６−１１９，１９９３の方法に従った。次に、ミクロトーム（ＬＲ−８５，ＹＡＭＡＴＯ  ＫＯＨＫＩ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、該組織を１０μｍ厚の横断面切片にスライスし、スライドガラスに移した。その後、製造元の使用説明書に従い、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）および上記のアフィニティー精製ウサギ抗ＲＰＰ３１ポリクローナル抗体を用いて、組織切片表面上のＲＰＰ３１を可視化した。なお陰性対照における１次抗体として、上記の免疫吸収抗体を用いた。
免疫組織染色した葉鞘基部の横断面切片の全体写真を図５Ａに示す。スケールバーは、２００μｍである。切片の全体図は顕微鏡の一視野に入り切らないため、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウエアを用いて６つの視野に分けて撮影したものをつなぎ合わせた。最も内側に存在する未熟な葉は、Ｐ１と呼ばれている（Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ  ３５：２４〜２９，１９９５）。以下、外側に向かってＰ２、Ｐ３と葉に番号が付けられている。図５Ａに示されるように、ＲＰＰ３１のシグナルは、維管束の篩部にのみに検出され、葉肉細胞や表皮細胞では検出されなかった。
図５Ｂ〜Ｆは、図５Ａ中に示す各々の箇所に対応する拡大写真である。図中の各々の略語の意味は、以下の通りである。Ｘｙ；木部導管、ＣＣ：伴細胞、ＳＥ：篩部要素、Ｐｈ：篩部。また図５Ｂ〜Ｆにおいてスケールバーは、２５μｍである。
図５ＢおよびＣにそれぞれＰ３葉の大維管束および小維管束の拡大写真を示す。Ｐ３葉の大維管束および小維管束では、ＲＰＰ３１は篩部要素および伴細胞に局在するが、木部や維管束鞘細胞に局在していなかった。特に伴細胞と篩部要素の区別が明確なＰ３葉の大維管束では、篩部要素内においてシグナルが強く、伴細胞では弱かった（図５Ｂ）。このことは、ＲＰＰ３１が伴細胞から篩部要素へ輸送されていることを示唆する。
また図５ＤおよびＥにそれぞれＰ２葉の大維管束および小維管束の拡大写真を示す。Ｐ２葉においても、ＲＰＰ３１は篩部に局在するが、木部には局在していなかった。さらに図５Ｆは、Ｐ１葉の維管束の拡大写真を示す。同様にＰ１葉においても、ＲＰＰ３１は篩部に局在していた。
なお図５Ｇは、陰性対照として免疫吸収抗体を用いて染色した大維管束領域の写真である。
以上の結果より、イネ植物の葉の伴細胞および篩部要素にＲＰＰ３１が局在することが示された。
なおこの実験では、細胞全体でシグナルが見られる篩部要素と、シグナルが細胞膜付近では見られるが細胞中心部では見られない篩部要素が存在した。この理由として、細胞中心部にシグナルが見られない篩部要素では、細胞内容物が固定されずに流失してしまった可能性がある。また細胞全体でシグナルが見られる篩部要素では、篩板の近くで細胞が切り取られた等の理由で細胞内容物が残ったと考えられる。
実施例５．ＲＰＰ３１の薬剤に対する誘導性の調査
イネから単離された２種のＩ型ＧＳＴ遺伝子、ＲＧＳＴＩおよびＲＧＳＴＩＩの発現は、除草剤プレチラクロールおよび薬害軽減剤フェンクロリムにより誘導される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１０５，１０２−１０８，１９９９）。そこでプレチラクロールおよびフェンクロリムの処理によってＲＰＰ３１が誘導されるか否かを調査するために、上記の薬剤で処理した植物の葉および根の可溶型タンパク質を含む抽出液をウエスタンブロッティングによって分析した。
まず実施例１に記載のように、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ  ｃｖ．Ｋａｎｔｏｕ）を３〜４週間成長させた。次に２×１０−５Ｍプレチラクロール（Ｋａｎｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）もしくは２×１０−５Ｍフェンクロリム（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）またはそれら両方を含む水耕液５００ｍｌ中に５〜７葉期のイネ４本を移し、薬剤を含む水耕液にイネ根部を１日間浸した。その後、実施例３に記載のように、葉および根の可溶型タンパク質を抽出し、得られた葉および根の抽出液を用いてウエスタンブロッティング分析を行った。結果を図６に示す。
図６において、ＰはＨｉｓ−ｔａｇ付きＲＰＰ３１（陽性対照、５０ｎｇ）、Ｍは分子量マーカー、Ｃは未処理植物に由来する葉または根の抽出液（タンパク質含量１０μｇ）、＋Ｐはプレチラクロールで処理した植物に由来する葉または根の抽出液（タンパク質含量１０μｇ）、＋Ｆはフェンクロリムで処理した植物に由来する葉または根の抽出液（タンパク質含量１０μｇ）、＋Ｐ＋Ｆはプレチラクロールおよびフェンクロリムの両方で処理した植物に由来する葉または根の抽出液（タンパク質含量１０μｇ）を示す。
プレチラクロールもしくはフェンクロリムまたはその両方の処理した後で、葉の抽出液中のＲＰＰ３１量は変化しなかった。また根の抽出液においては、プレチラクロールまたは／およびフェンクロリムで処理した後でさえもＲＰＰ３１は検出されなかった。また１０日間プレチラクロールまたは／およびフェンクロリムで処理したイネにおいても、１日間処理と同様に葉抽出液においてはＲＰＰ３１量の変化が見られず、また根抽出液においてはいずれもＲＰＰ３１が検出されなかった（データは示していない）。これらの結果より、イネではプレチラクロールまたは／およびフェンクロリム処理によってＲＰＰ３１は誘導されないことが示された。
以上の実施例により、ＲＰＰ３１は根に局在しないが、葉の篩部要素と伴細胞に局在する。さらにプレチラクロールまたは／およびフェンクロリム処理によってＲＰＰ３１の発現は誘導されない。従って、ＲＰＰ３１は葉に恒常的に存在するＧＳＴであることが示された。
【産業上の利用の可能性】
本発明により篩管局在性グルタチオンＳトランスフェラーゼが提供される。従って本発明により、篩管におけるＧＳＴの機能的メカニズムの解明が前進すると考えられる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図６】
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【国際調査報告】
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