(57)【要約】本発明は、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵、単為発生胚、単為発生哺乳動物の作出方法を提供することを目的とする。本発明は、（１）除核したＧＶ期卵に、ｎｇ卵子を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、精子形成退程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子を欠損する卵子を用いることを特徴とする、核移植卵、単為発生胚、単為発生哺乳動物の作出方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、原始卵胞卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法。
【請求項２】
原始卵胞卵（ｎｇ卵子）は、新生仔の卵母細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
別のＭＩＩ期卵は、排卵卵子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
インプリント遺伝子は、Ｈ１９、Ｇｔｌ２およびＲａｓ−ｇｒｆ１からなる群より選ばれる少なくとも一種の遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
インプリント遺伝子を欠損する卵子は、遺伝子欠損哺乳動物由来である請求項１または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法で得られた第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で得られた単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、核移植卵の作出方法に関する。さらに詳しくは、雌ゲノムのみから構成される核移植卵の作出方法に関する。また本発明は、核移植卵から単為発生胚を作出する方法に関する。さらに本発明は、該単為発生胚から単為発生哺乳動物を作出する方法に関する。
【背景技術】  哺乳動物では、精子と卵子の受精により個体発生が行われ、決して卵子のみでは個体発生を完了することはない。これは、精子と卵子のゲノムの機能が決定的に異なっていることを意味する。この機能差は生殖細胞が形成される過程で後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾の結果、同一遺伝子の発現が精子に由来するものと、卵子に由来するものとで全く異なる遺伝子群（インプリント遺伝子）が存在するためであると考えられている。事実、新生仔の卵母細胞はこの遺伝子修飾を受けておらず、あたかも精子由来の遺伝子発現パターンを示す遺伝子が多数存在する。
このようなインプリント遺伝子の発現パターンを解析するため、本発明者は、マウスの新生仔卵母細胞由来のゲノムと成熟雌由来の卵子ゲノムから核移植卵を作出する方法を提案した（非特許文献１参照）。かかる方法は、（１）除核した卵核胞期（ＧＶ期）卵に、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程からなる。かかる第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する。
本来、新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）は、卵子成長過程の後期（マウスでは卵子の直径がおよそ６０μｍ）になるまでは減数分裂を再開することがなく、第１減数分裂前期のディプロテン期で細胞周期を停止している。本発明者は、この細胞周期を停止している新生仔卵母細胞（ｎｇ卵子）を、十分に成長した卵母細胞の細胞質へ導入すると、減数分裂を再開することを見出し、上記方法を提案した。
導入されたｎｇ卵子由来の遺伝子は、卵子成長期に後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾を受けておらず、第２核移植卵はインプリント遺伝子の発現制御を解析する上で、有用な材料となることが期待される。かかる第２核移植卵からの単為発生胚は、形態的には受精卵由来の胎仔と比べ遜色のない妊娠１３．５日目の胎仔まで発生することを確認したが、その後の成長は確認できなかった。
【非特許文献１】河野友宏著、「卵子形成過程におけるゲノム刷込みと胚発生」、蛋白質  核酸  酵素Ｖｏｌ．４３  Ｎｏ．４（１９９８），ｐ２６７−２７４
【発明の開示】
そこで本発明は、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体までの発育能を有する核移植卵の作出方法、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法を提供することを目的とする。
非特許文献１に記載の第２核移植卵の作出方法に使用するｎｇ卵子の遺伝子は、卵子成長期に後天的に刷り込まれる化学的なＤＮＡ修飾を受けておらず、精子由来の遺伝子に近いものではあるが、精子由来の遺伝子とは相違する。
本発明者は、卵子由来の半数ゲノム２セットを有する第２核移植卵のゲノム遺伝子を、より精子と卵子の生殖におけるゲノム遺伝子に近づけるべく鋭意検討した結果、卵子由来の半数ゲノムの一方として、精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子を欠損させた遺伝子を用いることを見出し、本発明に到達した。
すなわち哺乳動物では、父方および母方から由来している相同染色体上に、同じ遺伝子あるいはその対立遺伝子が同一順列で配列されており、両親のアレルから同等に遺伝子発現が行われ個体の形質発現に携わっている。
しかし、一部の遺伝子には父方発現するものと母方発現するものがある。例えば、Ｈ１９遺伝子は、胚成長因子であるＩＧＦ２（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＩ）遺伝子の発現調節をする遺伝子であり母方で発現し父方では発現しない。これはＨ１９遺伝子は精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけ、父方での発現を抑制されるからである。このような遺伝子をインプリント遺伝子と呼ぶ。
一方、ＩＧＦ２遺伝子は父方で発現し、母方では発現しない。これはＩＧＦ２遺伝子とＨ１９遺伝子がＨ１９遺伝子の下流に存在するエンハンサー（遺伝子発現増強配列）を共有しているためである。このエンハンサーは、通常Ｈ１９遺伝子に対して優位に機能するが、Ｈ１９遺伝子が精子形成過程で後天的遺伝子修飾を受けるとＨ１９遺伝子に対して機能することができなくなり、ＩＧＦ２遺伝子に対して機能するようになる。その結果、Ｈ１９遺伝子は父方での発現が抑制され、ＩＧＦ２遺伝子は父方で発現するといった相互関係が成り立つ。
すなわち、通常の精子と卵子による生殖においては、母方でＨ１９遺伝子が発現し、父方でＩＧＦ２遺伝子が発現することにより、正常な胚成形が行われている。本発明のように卵子同士の単為生殖を行い、双方の遺伝子が母方由来では、母方で発現するＨ１９遺伝子のみが発現され、父方で発現するＩＧＦ２遺伝子が発現されないことが予想される。
しかし、本発明者は、卵子同士の単為生殖において、卵子由来のＨ１９遺伝子の一方を欠損させておくと、本来父方で発現するＩＧＦ２遺伝子が卵子由来（母方）の遺伝子から発現し正常な胚形成および哺乳動物の形成がなされることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
（１）除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、原始卵胞卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養しＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させ第１核移植卵とする工程、
（２）該第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程、
からなる、ｎｇ卵子由来の半数体ゲノムセットおよびｆｇ卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子として、精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法である。
本発明は、該第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。
本発明は、該単為発生胚を雌哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。
本発明によれば、哺乳動物の卵子由来の半数ゲノムを２セット有する核移植卵であって、成体までの発育能を有する核移植卵の作出方法が提供される。また本発明によれば、該核移植卵からの単為発生胚の作出方法、該単為発生胚からの単為発生哺乳動物の作出方法が提供される。
特に、本発明によれば、成体までの発育能を有する核移植卵、単為発生胚を提供することができ、妊娠１３．５日目程度の胎仔までしか発生することの出来ない従来法に比べその技術的意義は大きい。
本発明者は、本発明の内容を本願の優先権の基礎とする日本出願後に発表した（Ｔｏｍｏｈｉｒｏ  Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．４２８，Ｎｏ．６９８５，ｐｐ．８６０−８６４，２２  Ａｐｒｉｌ  ２００４）。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の核移植卵を作出する方法の概略を示した図である。
図１中の符号ａ〜ｉは以下のとおりである。
ａ：新生児由来ｎｇ卵子
ｂ：成熟雌由来ｆｇ卵子
ｃ：核移植
ｄ：体外成熟培養
ｅ：成熟した核置換卵子
ｆ：排卵卵子
ｇ：ＭＩＩ期分裂装置の移植
ｈ：卵子の人為的活性化
ｉ：再構築されたｎｇ／ｆｇ単為発生胚
ａ〜ｅは、本発明の第１核移植工程に対応する。ｆ〜ｉは、本発明の第２核移植工程に対応する。
図２は、本発明より得られた単為発生マウスとその産子の写真である。
【発明を実施するための最良の形態】（第１核移植工程）
除核した卵核胞期卵（ＧＶ期卵）に、原始卵胞卵（ｎｇ卵子）を導入した後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる工程である。
ＧＶ期卵は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により得られる体内成長卵子や、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を用いることが出来る。かかる体内成長卵子は、過排卵処理、あるいは無処理により得られる雌哺乳動物の卵巣からＰＢＳ溶液等を用いて注射針等で卵胞を切り裂いたり、注射針等で卵胞から吸引することにより採取することができる。卵丘細胞が付着しているＧＶ期卵はガラスピペットなどによるピペッティングや、トリプシン・ＥＤＴＡ等の酵素処理によって卵丘細胞を除去することが好ましい。
ＧＶ期卵は、透明帯の切断および除核を行いレシピエント卵とする。透明帯は、顕微鏡で観察しながらガラスナイフなどで切断することができる。除核は、除核ピペットを透明帯の切断部から挿入し、少量の細胞質とともに除去して行うことができる。
ｎｇ卵子は、胎生期の卵母細胞または新生仔の卵母細胞であることが好ましいが、成熟した哺乳動物の卵巣から採取することもできる。
導入は、細胞融合により行うことが好ましい。レシピエント卵の囲卵腔内にｎｇ卵子をセンダイウイルス（ＨＶＪ）とともに注入し融合させることが好ましい。
その後、体外成熟培養し、ＭＩＩ期（第２減数分裂中期）まで移行させる。体外成熟培養は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したαＭＥＭ培地等により、炭酸ガス培養器中で培養することができる。またウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を５％添加したＭ１６培地を用いることができる。体外成熟培養により、卵は核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出を行いＭＩＩ期に達した第１核移植卵を得ることができる。
哺乳動物としては、マウス、豚、牛、ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト動物が好ましい。
（第２核移植工程）
第１核移植卵からＭＩＩ期染色体を取り出し、別のＭＩＩ期卵（ｆｇ卵子）に導入し第２核移植卵とする工程である。
ｆｇ卵子は、雌成熟哺乳動物からの排卵卵子であることが好ましい。かかる排卵卵子は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンやヒト絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により排卵卵子を得ることが出来る。一方、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を卵丘細胞に覆われた状態で体外成熟培養しＭＩＩ期に達した卵をｆｇ卵子として用いることも出来る。ｆｇ卵子は透明帯の一部を切断しておくことが好ましい。
導入は以下の方法で行うことができる。第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペットでＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引する。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部から挿入してＭＩＩ染色体を注入することができる。これらの操作はＭ２培地等の核移植用培地中で行うことが好ましい。その後、Ｍ２培地中で所定の時間、培養して融合させ第２核移植卵を得ることができる。第２核移植卵は、ｎｇ卵子由来の半数ゲノムセットとｆｇ卵子由来の半数ゲノムセットを有する。
（インプリント遺伝子）
本発明においては、ｎｇ卵子またはｆｇ卵子は、精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子を欠損する卵子である。インプリント遺伝子およびその発現調節領域を欠損する卵子であることが好ましい。
インプリント遺伝子として、Ｈ１９遺伝子（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，３４−３９，１９９５）、Ｉｇｆ２遺伝子（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７５，３４−３９，１９９５）、Ｄｌｋ１遺伝子（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４，１９９７−２００２，２０００）、Ｇｔｌ２遺伝子（ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ３／ｇｅｎｅ−ｔｒａｐ  ｌｏｃｕｓ  ２，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４，１９９７−２００２，２０００）、Ｒａｓ−ｇｒｆ１遺伝子を挙げることができる。
したがって、Ｈ１９、Ｉｇｆ２、Ｄｌｋ１、Ｇｔｌ２、Ｒａｓ−ｇｒｆ１からなる群から選ばれる少なくとも一種の遺伝子を欠損する卵子を用いることが好ましい。Ｈ１９、Ｇｔｌ２およびＲａｓ−ｇｒｆ１からなる群より選ばれる少なくとも一種の遺伝子を欠損する卵子を用いることがさらに好ましい。Ｈ１９遺伝子、Ｇｔｌ２遺伝子のどちらか一方または双方を欠損する卵子を用いることが特に好ましい。
インプリント遺伝子を欠損する卵子は、遺伝子欠損哺乳動物から得ることができる。遺伝子欠損哺乳動物は、公知の標的遺伝子組換え法（ジーン・ターゲティング：例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５：８０３−８９０，１９９３）を用いることにより、例えばマウスの場合、以下のとおりに作成することができる。
先ず、単離したＨ１９遺伝子、Ｇｔｌ２遺伝子などのインプリント遺伝子の標的配列をネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ遺伝子）と置換し、またインプリント遺伝子の端部にヘルペスウイルスのサイミジンカイネース遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子）を付加してターゲティング・ベクターを作成する。このターゲティング・ベクターをマウスの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、細胞ゲノムＤＮＡのインプリント遺伝子がターゲティング・ベクター中の変異配列に相同組換えされた細胞を選択する。
このような遺伝子組換え細胞の選択は、Ｇ４１８を細胞培地に添加してＮｅｏｒ遺伝子を持たない非組換え細胞を除去し、さらにガンシクロビルを添加してＨＳＶ−ｔｋ遺伝子が残存するランダムな組換え細胞を除去することによって行うことができる。選択された遺伝子組換え細胞のインプリント遺伝子は、そのコード配列中にＮｅｏｒ遺伝子が挿入された変異配列であり、インプリント遺伝子を発現することはできない。
次いで、この遺伝子組換えされたＥＳ細胞をマウスの初期胚（胚盤胞）に注入し、この初期胚を雌マウスの体内で個体へと発生させ、キメラマウスを産出させる。そして、このキメラマウスと野生型マウスとを交配して子孫マウスを産出させ、これらの子孫マウスの中から、対立遺伝子の両方または片方に変異配列を有するマウス個体を選別することによって、遺伝子欠損マウスを得ることができる。
（単為発生胚の作出）
本発明は、上記第２核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。卵子の活性化は、ストロンチウムで行うことが好ましい。具体的には、１０ｍＭのＳｒＣｌ２を含むＭ１６培地で培養して活性化させることができる。また、電気パルスやエタノール等によっても卵子を活性化することが出来る。体外発生培養は、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の気相、３７〜３９℃の条件で行うことができる。
（単為発生哺乳動物の作出）
本発明は、上記単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。移植する哺乳動物としては、特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠初期にプロスタグランジンＦ２α等を用いて人工流産させ、同期化を行った哺乳動物を用いることが好ましい。哺乳動物としては、マウス、豚、牛ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物が好ましい。
【実施例】  以下、実施例により本発明を説明する。実施例では、哺乳動物としてマウスを用いた。
［実施例１］
（ｎｇ卵子の採取）
標的遺伝子組換え法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５：８０３−８９０，１９９３）によりＨ１９遺伝子およびその上流を合わせて１３Ｋｂを欠損したマウス（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７５：３４−３９，１９９５）の生後１日の新生仔の卵巣を採取した。採取した卵巣を０．０２％ＥＤＴＡ溶液中に移し３７℃で１０分間培養した。ついで、注射針にて卵巣を切り裂き解離してきた非成長期卵子を採取し、ドナー用ｎｇ卵子とした。
（ＧＶ期卵の採取）
成熟したマウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンを５〜７．５ＩＵ投与した後、卵巣中の発育した卵胞を２７ゲージ注射針にて裂き卵丘細胞に包まれたＧＶ期卵を採取した。卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、ＧＶ期卵をＭ２培地（２４０μＭ  ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）で３７℃にて２時間培養した。
（除核）
倒立顕微鏡にマイクロマニピュレーター（成茂社製）を取り付け実施した。まず、ＧＶ期卵の透明帯をガラスナイフを用いて１５〜２０％切断した。ついで、ＧＶ期卵を核移植用Ｍ２培地（１０μｇ／ｍｌ  サイトカラシンＢ、１００ｎｇ／ｍｌ  コルセミド、２４０μＭ  ｄｂｃＡＭＰおよび５％ＦＢＳを添加）に移し、１５分間３７℃で培養した。顕微操作により除核ピペット（直径が２５μｍ）を透明帯の切断部から挿入し、ＧＶ期卵の核を少量の細胞質とともに除去しレシピエント卵とした。
（第１核移植工程）
次いで、ｎｇ卵子を移植用ピペット（直径が１５μｍ）に吸引したのち、センダイウイルス（ＨＶＪ：コスモバイオ）をピペットの先端に吸引した。ピペットをレシピエント卵の透明帯の切断部から挿入しレシピエント卵に押し付けながら注入した。得られた核移植卵を５％  ＦＣＳ添加αＭＥＭ培地に移し、炭酸ガス培養器中で３７℃にて１４時間、培養した。核移植卵は、核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第１極体の放出の各工程を経て、第２減数分裂中期（ＭＩＩ期）に達した第１核移植卵を得た。
（第２核移植工程）
雌成熟マウス（８〜１２週齢、Ｂ６Ｄ２Ｆ１、チャールズリバー／クレア）に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを４８時間間隔でそれぞれ５〜７．５  ＩＵ投与し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与１４時間後に卵管を採取した。卵管より卵丘細胞に包まれた排卵卵子の塊を採取した後、３００μｇ／ｍｌヒアルロニダーゼを含むＭ２培地中で卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、排卵卵子（ｆｇ卵子）を採取した。顕微操作により透明帯の一部を切断した。排卵卵子および第１核移植卵を核移植用Ｍ２培地（５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢを添加）に移した。上述の第１核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペット（直径２５μｍ）を挿入し、ＭＩＩ期染色体（分裂装置）を吸引した。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、ｆｇ卵子の透明帯切断部にピペットを挿入して、ＭＩＩ期染色体を注入した。Ｍ２培地中に移し、３７℃で３０分間培養して両者を融合させ第２核移植卵を得た。
下記表１に核移植卵の生産効率を示す。
2005011371.tif 000002
［実施例２］
（単為発生胚の作出）
得られた２１２個の第２核移植卵を、１０Ｍ塩化ストロンチウムを含むＭ１６培地にて３７℃で３時間培養し、人為的に卵子の活性化を誘起させた。その結果１８９個の卵子が活性化された。第２極体および前核がそれぞれ二つ形成されたもの１５８個をＭ１６培地にて３７℃で３日間体外培養した。その結果、１３１個の胚盤胞が作出された。
［実施例３］
（単為発生マウスの作出）
得られた１３１個の胚盤胞を偽妊娠２．５日目の雌マウス（定法にしたがい、精管結紮雄と交配させ膣栓を確認した日を偽妊娠０．５日とした雌マウス）の子宮に移植したところ、２匹の正常雌産子が誕生した。これらの遺伝子を解析した結果、Ｈ１９遺伝子（ｆｇ卵子由来）およびＮｅｏｒ遺伝子（ｎｇ卵子由来）を持つことから、第２核移植卵由来の産子であることが確認された。
このうち一匹は、遺伝子解析のため、蘇生を確認後、安楽死させた。他の１匹は、「かぐや」と命名され正常に成体に発育した。「かぐや」は、雄との交配により産子を分娩したことから正常な繁殖能力を持つことが確認された。「かぐや」が産子を無事分娩したところの写真を図２に示す。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、卵子由来の半数ゲノムを２セット有する成体の単為発生哺乳動物が作出できる。かかる哺乳動物は遺伝子の働きを解析する実験用動物として有用である。本発明によれば、作出される哺乳動物は全て雌なので、例えば、優秀な遺伝子を有し遺伝的に均一な乳牛を効率よく生産することが可能となる。また、優れた肉牛を作出する雌牛を効率よく生産することが可能となる。このように本発明は畜産業において利用が期待される。本発明により単為発生哺乳動物を作出する場合は非ヒト哺乳動物を主たる対象とするが、本発明は医療分野における移植用の臓器の生産にも応用することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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