(57)【要約】検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）を抗体に結合させ、次いで、抗体に結合したＴＲＡＣＰ  ５ｂを、ＴＲＡＣＰ  ５ｂの基質である２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩と酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを特異的に正確に免疫測定することができる。
2004077059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）を免疫測定する方法であって、
検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを抗体に結合させ、次いで、抗体に結合したＴＲＡＣＰ  ５ｂを、ＴＲＡＣＰ  ５ｂの基質である一般式（１）
2004077059.tif 000006
（ただし、式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒまたはＩを示す）
で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩と酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定する方法。
【請求項２】
酵素反応の際、ｐＨが６．３より大きくかつ６．８以下である請求項１の免疫測定方法。
【請求項３】
酵素反応の際、ｐＨが６．３５〜６．７５である請求項１または２の免疫測定方法。
【請求項４】
酵素活性の測定をレート法により実施する請求項１から３のいずれかの免疫測定方法。
【請求項５】
ＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定するためのキットであって、
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体、および
ｉｉｉ）一般式（１）
2004077059.tif 000007
（ただし、式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩを示す）
で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩であるＴＲＡＣＰ  ５ｂの基質
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、骨吸収マーカーとしての破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の免疫測定方法およびそれに用いるキットに関する。本発明によれば、特異的な破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定が可能であり、骨吸収のマーカーとして骨疾患の医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。
【背景技術】  血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ：Ｔａｒｔｒａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている（骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビュー社，１９９５）。一方、血清中の酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より０〜５の６つのバンドに分けられ、その中で５番目が酒石酸抵抗性であり、Ｂａｎｄ  ５酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ  ５：Ｔａｒｔｒａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５）と呼ばれている。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い５ａと、ほとんどシアル酸結合のない５ｂに分けられる。そして、５ａは破骨細胞以外からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、５ｂのみが骨吸収に伴い変動するため、５ｂが破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている。またＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１４９７．２００１）でもＴＲＡＣＰ  ５ｂを破骨細胞由来のＡＣＰとし、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと略記することを勧めている。よって本発明においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となるＡＣＰを意味するものはＴＲＡＣＰ  ５ｂとして、本明細書においては以降破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂは同義としてすべてＴＲＡＣＰ  ５ｂと表記する。
破骨細胞の活性を表す酸性ホスファターゼの指標としてＴＲＡＣＰ活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さ及び測定時間の点で問題を有している。
一般的に活性測定法によるＴＲＡＣＰ  ５ｂの測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールやフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸が前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、残存した酸性ホスファターゼ活性を基質で測定することにより、ＴＲＡＣＰ活性をＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性とみなして求めている。しかしながら、検体中に存在する破骨細胞由来以外の赤血球由来や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼも測定してしまうため、特異性の点で問題を有する。
このような方法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りのＴＲＡＣＰ活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を用いて測定する方法が知られている（日大医誌．４９：９０４−９１１．１９９０；およびＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：４５８−４６２．１９８７）。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できるが、血小板由来酸性ホスファターゼの影響は除くことは出来ない。さらにより特異的な活性測定法として、本発明者らは、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用したＴＲＡＣＰ  ５ｂ測定法を報告した（特開平１０−３７１９８号公報）。しかしながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、ＴＲＡＣＰ  ５ａの影響を除くことができず、またＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点で問題がある。さらに上記フッ素を利用した方法にＴＲＡＣＰ  ５ａの阻害物質を組み合わせて用いることにより、よりＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性を測定する方法が報告されている（特開２００１−２３１５９５号公報）。しかしながら、フッ素のみを用いる方法はより特異的ではあるものの、やはり差し引きで破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性を求めているため同様に、精度の点で問題を残している。
一方、免疫測定法によるＴＲＡＣＰ  ５ｂの測定方法として、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫測定法も知られている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．７１：４４２−４５１．１９９０；Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１３：６８３−６８７．１９９８；Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．７０：１４３−１４９．１９９９；Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．１４：４６４−４６９．１９９９；Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４５：２１５０−２１５７．１９９９；およびＣｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４６：１７５１−１７５４．２０００）。これらの方法は、Ｂａｎｄ  ５全体を測定してしまうため、ＴＲＡＣＰ  ５ａの影響を無視できない。さらに、ＴＲＡＣＰ  ５ｂをより特異的に測定する免疫測定法（特表２００２−５１００５０号公報）が報告されている。この方法では、５ａと５ｂの至適ｐＨの差を利用して活性測定で測定値を算出しているため、よりＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性に特異的な測定法であるとしている。しかし、用いる抗体は、５ｂに特異性があるものではないため、５ｂへの特異性が必らずしも十分とはいえず、骨吸収マーカーとして使用するには、さらなる改良が求められている。
【発明の開示】
本発明は、かかる問題に鑑み、骨吸収マーカーとしてのＴＲＡＣＰ  ５ｂを感度よく特異的に測定する方法及びそれに使用するキットを提供することを目的とする。
本発明は、検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）を免疫測定する方法であって、
検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを抗体に結合させ、次いで、抗体に結合したＴＲＡＣＰ  ５ｂを、ＴＲＡＣＰ  ５ｂの基質である一般式（１）
2004077059.tif 000003
（ただし、式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒまたはＩを示す）
で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩と酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定する方法である。
また、本発明は、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定するためのキットであって、
ｉ）固相支持体、
ｉｉ）ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体、および
ｉｉｉ）一般式（１）
2004077059.tif 000004
（ただし、式中、Ｘは、Ｃｌ、Ｆ、ＢｒまたはＩを示す）
で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩であるＴＲＡＣＰ  ５ｂの基質
を含むキットである。
【図面の簡単な説明】  図１は、酵素基質として２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸（ＣＮＰＰ）を用いてＴＲＡＣＰ  ５ｂおよびＴＲＡＣＰ  ５ａの酵素活性を測定した時の至適ｐＨを示すグラフである。
図２は、ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体を固定化したプレートに検体（標準液又は血清）作用させ、その後、酵素基質として２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸を用いてレート法により酵素活性を測定したグラフである。
発明の実施するための形態
本発明で対象となる検体は、ヒトの血液、血清、血漿などが挙げられるが、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを含む可能性のある検体であれば、特に限定しない。
本発明においては、抗体は、固相支持体に結合していることが好ましい。また、抗体は、ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体であればモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれもが使用可能であるが、特異性の面からモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体としては、従来既知のＴＲＡＣＰ  ５ｂに対するモノクローナル抗体が使用可能である。
本発明に使用する抗体として、ヒト破骨細胞から精製されたＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫原としてＴＲＡＣＰ  ５ｂのモノクローナル抗体を製造することができる。モノクローナル抗体は、例えば精製ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と、骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
融合した細胞からヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地およびＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体が含まれている場合には、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂをプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等の２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、ヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。コントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂ特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒトＴＲＡＣＰ  ５ｂプレートで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで陰性のクローンを選択できる。
このようにして選択されたＴＲＡＣＰ  ５ｂに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては、ハイブリドーマＴｒＫ２７、ＴｒＫ４９およびＴｒＫ６２を例示することができる。ハイブリドーマＴｒＫ２７、ＴｒＫ４９およびＴｒＫ６２は、〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に、それぞれ、平成１４年２月１４日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭＢＰ−７８８９として、平成１４年１１月２７日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４９として、平成１４年２月１４日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭＢＰ−７８９０として寄託されている。
ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、例えばマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物にハイブリドーマを腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
本発明に用いるモノクローナル抗体は、ＴＲＡＣＰ  ５ｂばかりでなくＴＲＡＣＰ  ５ａとも反応するモノクローナル抗体でも構わない。また、本発明では、ポリクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体は、例えば、ヒト破骨細胞から精製されたＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫原として、ラット、マウスなどの動物に免疫し、その動物から抗血清を調製することよって得られる。
本発明においては、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを上記した抗体に結合させ、結合したＴＲＡＣＰ  ５ｂに対して、酵素基質として一般式（１）で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩を酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定する。
本発明に用いる２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸としては、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸、２−フッ化−４−ニトロフェニルリン酸、２−ブロモ−４−ニトロフェニルリン酸を例示できる。２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸の塩としては、アンモニウム塩、イミダゾリウム塩、シクロヘキシルアンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トリスヒドロキシアンモニウム塩が例示できる。
本発明に用いる上記基質は、そのＫｍが、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）に比べ、ＴＲＡＣＰ  ５ｂでは小さく、ＴＲＡＣＰ  ５ａでは大きいため、ＴＲＡＣＰ５ｂを測定する際に用いると、感度、特異性の面から極めて有利である。
本発明で、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂとその基質である２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩とを酵素反応させるとき、反応時のｐＨは、６．３より大きく６．８以下が好ましく、６．３５〜６．７５がさらに好ましく、６．３８〜６．７０が特に好ましい。ｐＨが小さすぎるとＴＲＡＣＰ  ５ａの酵素反応がしやすくなるため、（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ反応性）／（ＴＲＡＣＰ  ５ａ反応性）が小さくなり、ＴＲＡＣＰ  ５ｂ特異性に問題が起こりやすくなる。また、ｐＨが大きすぎるとＴＲＡＣＰ  ５ｂ自体の酵素反応がおきにくく測定感度が低下しやすい。
本発明では、具体的には、例えばエンドポイント法を用いて、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを、以下のようにして測定できる。まず、固相支持体に吸着している抗体に測定すべき検体を加え、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂと抗体とを抗原抗体反応させてＴＲＡＣＰ  ５ｂを抗体に結合させる。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系に酵素基質として２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合しているＴＲＡＣＰ  ５ｂと基質とを、好ましくはｐＨが６．３より大きく６．８以下で反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成した２−ハロ−４−ニトロフェノールを、通常３９０ｎｍ〜４５０ｎｍ、好ましくは４００〜４３０ｎｍの波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、ＴＲＡＣＰ  ５ｂ酵素活性を反映するので、その値から、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定できる。
本発明においては、酵素活性を測定する際、従来のｐ−ニトロフェニルリン酸を用いる方法と異なり、２−ハロ−４−ニトロフェノールは反応時のｐＨで発色するので、レートアッセイすることもできる。レートアッセイするときは、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと基質との反応性を、一定時間、通常、１分間あたりの平均吸光度変化量として求めることにより、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定することができる。その結果、測定時間が短くなりより好ましい。
本発明では、上記した測定法から明らかな通り、抗体は固相支持体に結合させて用いるのが好ましく、固相支持体としては、通常、ＥＬＩＳＡ法等の固相免疫測定法に用いる固相支持体が用いられるが、特に限定されない。例えば、固相支持体の材料として、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、ビーズ等が挙げられる。
固相支持体に吸着している抗体を調製するには、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して固相支持体にＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体を結合させる。感作抗体量は、１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であることが多い。
本発明を実施するときは、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体、およびｉｉｉ）一般式（１）で表される２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩である基質を含むキットを用いて行える。
このキットにおいては、ｉ）固相支持体、ｉｉ）ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対する抗体に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
エンドポイント法でこのキットを使用するときは、酵素反応停止液を含むことが好ましい。酵素反応停止液としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ水溶液を使用できる。
さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
以下、本発明を参考例および実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれら参考例および実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１
ＴＲＡＣＰ  ５ｂに対するモノクローナル抗体の製造
（１）破骨細胞由来酸性ホスファターゼＴＲＡＣＰ  ５ｂの精製
インフォームド・コンセントを行った後、外科的手術により摘出されることになったヒト大腿骨骨頭部１３０ｇを液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プロテアーゼインヒビターを含む緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．３Ｍ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０２％  ＮａＮ３，１  ｕｎｉｔ／ｍｌ  アプロチニンｐＨ７．５）２００ｍＬ中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。４℃一晩攪拌後、１０，０００ｒｐｍ，２０分遠心分離し、その上清を１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．２に透析後ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（φ４０ｍｍ×４０ｃｍ）［シグマ社］にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（０−０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性は、基質２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸［日東紡社製］を用い測定し、活性の高い部分をプールした。それを濃縮後、０．７Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２に透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（φ１６ｍｍ×６０ｃｍ）［アマシャムファルマシア社］にアプライし、同様に溶出したフラクションの酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性部分をプールした。それを２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．２で２倍に希釈し、ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（５ｍＬ）［アマシャムファルマシア社］にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４の直線塩濃度勾配（０．３５Ｍ−１Ｍ  ＮａＣｌ）をかけ溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ高活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製破骨細胞由来酸性ホスファターゼを０．４ｍｇ得た。なお、タンパク量はＡ２８０により確認し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ＴＩＦＣＯ社］を行い銀染色の結果、分子量３５，０００付近でシングルバンドであることにより確認した。単一バンドになった酵素は精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂとして免疫抗原とした。
（２）免疫
精製ヒト破骨細胞由来酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ  ５ｂ）を２５０μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈し、２５μｇ（１００μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド［和光純薬工業社］１００μｌと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ  ６週齢雌マウス［日本クレアー社］にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量のＴＲＡＣＰ  ５ｂ（２５μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド［和光純薬工業社］と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫としてＴＲＡＣＰ  ５ｂは２５μｇ／ｍｌをそれぞれ５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後にＴＲＡＣＰ  ５ｂにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）［メルク社］を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。その融合比率は脾臓細胞数８×１０７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０７個で、４：１であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社］α−ＭＥＭ［ＩＲＶＩＮＥ社］ＨＡＴ［コスモバイオ社］培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート［住友ベークライト社］に分注して３７℃、５％ＣＯ２条件にて培養した。
（４）スクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリーニングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製したＴＲＡＣＰ  ５ｂを５０ｍＭクエン酸緩衝液中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴ウエル［Ｎｕｎｃ社］に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体［Ｚｙｍｅｄ社］を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ  Ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）［ナカライテスク社］クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チエックした。
（５）抗体の確認
ＥＬＩＳＡによって精製ＴＲＡＣＰ  ５ｂとの反応を確認し、ＴＲＡＣＰ  ５ｂと反応する抗体を産生するクローンとしてＴｒＫ２７を選抜した。このハイブリドーマＴｒＫ２７は、〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に、平成１４年２月１４日に受託番号ＩＰＯＤ  ＦＥＲＭＢＰ−７８８９として寄託されている。
このハイブリドーマが産生する抗体をモノクローナル抗体タイピングキット［アマシャムファルマシア社］にて検定した結果、クラスはＩｇＧ１、軽鎖はκであった。この抗体の特異性を以下の通り検討した。検体としてＴＲＡＣＰ  ５ｂ及びヒト血清よりＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラムにて溶出したＴＲＡＣＰ  ５ａ及び前立腺由来ＡＣＰ、血小板由来ＡＣＰ（血小板抽出液）、赤血球由来ＡＣＰ（赤血球抽出液）を用いてＥＬＩＳＡを行った。その結果、この抗体はＴＲＡＣＰ  ５ｂ及び５ａとは反応したが、その他のアイソフォームとは反応しなかった。
（６）モノクローナル抗体の作製および精製
得られたハイブリドーマＴｒＫ２７  １×１０７細胞個をプリスタン［アルドリッチ社］０．５ｍｌ投与後２週間のＢａｌｂ／ｃマウス［日本クレアー社］、１０週齢、雌性に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行ったＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、プロテインＧカラム［アマシャムファルマシア社］により精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。その結果、非還元では分子量約１５０，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約５０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製された抗体はマウス１匹あたり約１５ｍｇであって工業的利用を行うには十分量であった。
（７）抗ＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体固定化プレートの作製
上記（６）により得られた抗体をＰＢＳ中に溶解し、１μｇ／２００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレート［Ｎｕｎｃ社］に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ溶液を２００μｌ分注して、更に４℃１晩静置し、抗ＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体固定化プレートを完成させた。
参考例２
Ｋｍの測定等による本発明で用いる基質と他の基質との比較
２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸（ＣＮＰＰ）に対するＴＲＡＣＰ  ５ｂ及び５ａの反応性の違いをみるため、それぞれの場合のＫｍを求めた。その結果、ＴＲＡＣＰ  ５ｂでは１．５ｍＭ（ｐＨ６．４）、５ａでは３．５ｍＭ（ｐＨ５．６）であった。５ｂに対するＫｍが５ａの２分の１以下であり、この基質がＴＲＡＣＰ  ５ａに比べ５ｂの測定に適した基質であることを示している。
一方、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４７（１），７４〜８０によると、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）に対するＴＲＡＣＰ  ５ｂ、５ａの反応でのＫｍは、それぞれ、７．０ｍＭ（ｐＨ５．８）、１．９ｍＭ（ｐＨ５．２）である。すなわち、本発明で用いるＣＮＰＰがＰＮＰＰに比べ、ＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定するのに、親和性、特異性の面から有利である。
【実施例１】種々のｐＨでのＴＲＡＣＰ  ５ｂまたは５ａの測定
ＣＮＰＰを含む基質緩衝液のｐＨを５．６から６．８まで変化させ、この基質におけるＴＲＡＣＰ  ５ｂ及び５ａの活性を求めた。基質緩衝液の組成は、ＣＮＰＰ  ５ｍＭ，ＭＥＳ  ０．１Ｍ，酒石酸ナトリウム４０ｍＭでｐＨを５．６から６．８まで０．２刻みに調製した。検体として用いたＴＲＡＣＰ  ５ａ、５ｂはヒト血清をＨｅｐａｒｉｎカラムにて分離し、ＴＲＡＣＰ  ５ａ、５ｂの各ピークを濃縮することにより調製した。なお、ＴＲＡＣＰ  ５ａはｐＨ５．６（ＴＲＡＣＰ  ５ａの至適）で吸光度０．８、ＴＲＡＣＰ  ５ｂはｐＨ６．４（ＴＲＡＣＰ  ５ｂの至適）で吸光度０．８になるような濃度の検体を用いた。測定方法は、抗ＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体Ｔｒｋ２７プレートを用い、ウエルに検体１００μＬを加え、室温で１時間振とう攪拌した。その後反応液を廃棄し、各ウエルを２００μＬの０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した。その後、基質緩衝液を１００μＬ加え、３０秒間振とう後、３７℃のインキュベーターで１時間反応後、０．２Ｎ  ＮａＯＨ  ５０μＬを加え酵素反応を停止させ、その４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。その結果を図１に示す。この条件下において、ＴＲＡＣＰ  ５ｂの至適ｐＨは約６．４であり、５ａは５．６であった。
【実施例２】ＰＮＰＰ（従来の基質）を用いた方法と本発明との比較
ＣＮＰＰを含む基質緩衝液のｐＨ６．２、６．４、６．６及び６．８での５ａ，５ｂの反応吸光度と、比較例としてＴＲＡＣＰ  ５ｂの測定に適しているとされるＰＮＰＰを基質とした緩衝液ｐＨ６．１を用いた結果とを比較した。特表２００２−５１００５０号公報記載の方法に従い、ＰＮＰＰ基質緩衝液の組成は、ＰＮＰＰ  ８ｍＭ，酢酸ナトリウム０．１Ｍ，酒石酸ナトリウム４０ｍＭ，ｐＨ６．１とした。ＴＲＡＣＰ  ５ｂの検体は、実施例１と同様なものを用いた。ＴＲＡＣＰ  ５ａの検体は、特表２００２−５１００５０号公報記載のデータに従い、比較例（ＰＮＰＰをｐＨ６．１で使用）のとき、ＴＲＡＣＰ  ５ａでの値が、ＴＲＡＣＰ  ５ｂでの値の１／１０になるように調製したものを用いた。測定操作は実施例１と同様にして吸光度を用い酵素活性の指標とした。その結果を表１に示す。結果から明らかなようにＣＮＰＰ  ｐＨ６．４，６．６での５ｂ／５ａ比がそれぞれ１７と１８であり、本発明の方法が、従来法（比較例）に比べ、ＴＲＡＣＰ  ５ｂの測定に適していることを示している。
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【実施例３】レート法によるＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性測定法
抗ＴＲＡＣＰ  ５ｂ抗体ＴｒＫ２７固定化プレートに検体（標準液又は血清）１００μＬを分注し、室温で１時間振とう攪拌する。その後反応液を廃棄し、各ウエルを２００μＬの０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄する。その後、基質（ＣＮＰＰ）緩衝液を１００μＬ加え、３０秒間振とう後、マイクロプレートリーダーにて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その後、３７℃のインキュベーターで６０分間加温したが、その間、１０分毎に４０５ｎｍの吸光度を測定した。一方、比較（エンドポイント法）として、６０分後に反応停止液として０．２Ｎ  ＮａＯＨ  ５０μＬを加えて、同様に４０５ｎｍの吸光度を測定した。図２に６０分までの反応タイムコースを示した。なおＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性値は下記の式より計算される。
Ｕ／Ｌ＝検体のΔＯＤ／ｍｉｎ／標準液のΔＯＤ／ｍｉｎ×標準液の表示値
ΔＯＤ／ｍｉｎは測定波長４０５ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化
レート法として１０分から２０分の１分間当りの吸光度変化を求め、活性を上式より算出した。その結果、血清検体１，２のＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性は４．１Ｕ／Ｌと９．１Ｕ／Ｌであり、この値は、エンドポイント法での６０分反応させた後、反応停止液を加えて測定した値の４．２Ｕ／Ｌと９．３Ｕ／Ｌとほとんど変らなかった。したがって、本発明では、停止液を用いず、レート法でしかも約２０分以内でもＴＲＡＣＰ  ５ｂ活性が測定可能な事を示している。
【産業上の利用の可能性】
以上に詳細に説明したように、本発明の免疫測定法においては、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ａの影響をほとんど受けることなく、検体中のＴＲＡＣＰ  ５ｂを感度良く特異的に測定することができる。従って、従来より、正確にＴＲＡＣＰ  ５ｂを測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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