(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質が、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡについてのスプライシングを制御する機能を有し、その作用がＨＩＶ−１を複製・増殖過程へと導くものであることを明らかにしたことに基づく。本発明は、Ｖｐｒタンパク質を阻害、またはその発現を抑制することを特徴とするＨＩＶ−１の増殖を抑制するための医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、Ｖｐｒタンパク質を阻害することを特徴とするＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングするための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質が、宿主細胞内におけるＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの生成において、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の生成を増加させ、および／または、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の生成を減少させる活性を阻害する物質を有効成分とする、ＨＩＶ−１の増殖を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
ＡＩＤＳの発症および／またはＡＩＤＳウイルスの増殖を抑制するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）（ｉ）野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様なｍＲＮＡ発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター、および、（ｉｉ）Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを細胞に遺伝子導入する；
（２）遺伝子導入した細胞を、候補物質の存在下で２４時間ないし７２時間、好ましくは４８時間ないし７２時間培養する；
（３）（２）の細胞よりＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を増幅する；および、
（４）増幅したＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロールの値に近づいた場合には、その候補物質は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
ことを含む、上記方法。
【請求項４】
ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）（ｉ）野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様なｍＲＮＡ発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター、および、（ｉｉ）Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを細胞に遺伝子導入する；
（２）遺伝子導入した細胞を、候補物質の存在下で２４時間ないし７２時間、好ましくは４８時間ないし７２時間培養する；
（３）（２）の細胞よりＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を増幅する；
（４）増幅した各フォームのＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を、それぞれゲル電気泳動に供して、各フォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片を分離して検出する；および、
（５）各ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の検出により判明するＨＩＶ−１の各フォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡの発現パターンが、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロールのｍＲＮＡ発現パターンに近づいた場合には、その候補物質はＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
ことを含む、上記方法。
【請求項５】
ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を特異的に増幅するための配列番号６および配列番号８の配列を有するプライマー対。
【請求項６】
ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を特異的に増幅するための配列番号６および配列番号９の配列を有するプライマー対。
【請求項７】
ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を特異的に増幅するための配列番号６および配列番号１０の配列を有するプライマー対。
【請求項８】
ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類を増幅するための配列番号６および配列番号７の配列を有するプライマー対。
【請求項９】
ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
ＨＩＶ−１の増殖を抑制するための、請求項９に記載のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項１１】
ＡＩＤＳの発症を抑制するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の発現を抑制するためのアンチセンス核酸。
【請求項１３】
ＨＩＶ−１の増殖を抑制するための、請求項１２に記載のアンチセンス核酸を含む医薬組成物。
【請求項１４】
ＡＩＤＳの発症を抑制するための、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（１）の工程が、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示すＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターを細胞に遺伝子導入する；または、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノム、および前記変異ＨＩＶ−１ゲノムとは異なる発現カセットに組み込まれたＶｐｒタンパク質をコードする遺伝子、を含むベクターを細胞に遺伝子導入する；工程である、請求項３または４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｖｐｒタンパク質の機能に基づく、抗ＨＩＶ−１薬のスクリーニング方法、およびＨＩＶ−１感染を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（エイズ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の感染によって引き起こされる高度の免疫不全による日和見感染等を特徴とする伝染性致死性疾患である。ＨＩＶ−１は発見されてから２０年たった現在も未だ蔓延し続けており、現状ではその感染により１０年後にアフリカの人口が半減するであろうと予測されている。【０００３】
ＨＩＶ−１の粒子構造は１００ｎｍの球形で、中心に遺伝子本体であるＲＮＡとウイルス複製に働く酵素、逆転写酵素、インテグレース、およびプロテエースが含まれている。これまでに、これらの酵素を標的にした阻害剤が抗ＨＩＶ薬として開発されてきた。現在では、逆転写酵素阻害剤２種類とプロテエース阻害剤１種類を組み合わせた多剤併用療法（ＨＡＡＲＴ）により、体内のウイルス量を劇的に減らすことが可能となった。しかし、ＨＩＶ−１は、それが有する逆転写酵素が変異修復能を持たないことによって、その遺伝子に変異が生じやすいという性質を有しているため、薬剤耐性ウイルスの出現が問題となっている。この問題を克服するための新たなるエイズの治療法の緊急な開発が強く望まれている。【０００４】
ＨＩＶ−１はレトロウイルスの一員で、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖなどの構造遺伝子、調節遺伝子に加え、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕなどのアクセサリー遺伝子を有することを特徴とし、レトロウイルスの中では最も複雑な構造と機能を有している。ＨＩＶ−１においては、９ｋｂからなる１本のゲノムより３０種類以上の多様なウイルスｍＲＮＡが合成される。この多様性はスプライシングパターンの違いにより引き起こされることが示されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐ．６３６５−６３７８，１９９３）。この多彩なスプライシングパターンがウイルスのタンパク質の発現を制御しており、ウイルスの生活環に大きな役割を果たしていると考えられている。【０００５】
ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質は、ウイルス粒子中に多量に含まれるアクセサリータンパク質で、９６アミノ酸からなり、約１５ｋＤａの小さなタンパク質で、現在までに３つのα−ヘリックスドメイン、ロイシンジッパー様ドメイン、およびＣ末端のアルギニンリッチ領域などの様々な構造が確認されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６３：ｐ．３１３−３２２，１９９９）。このタンパク質は、単独で細胞に導入した場合、細胞周期のＧ２期停止、アポトーシス、核膜局在、核移行、及び転写活性化などを示し、多機能なタンパク質であることが明らかとなっている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７６：ｐ．１６−２６，２０００）。特に、Ｇ２で停止させた細胞はＨＩＶの複製効率が最も上昇することが解明されたことから、宿主細胞の細胞周期をＧ２期で停止させる機能を有するＶｐｒタンパク質は、エイズ発症の鍵を握っているものとして注目されている（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：６５−７１，１９９８）。【０００６】
また、Ｖｐｒタンパク質はＨＩＶ−１  ＬＴＲからの転写活性を上昇させることが知られているが、ウイルスｍＲＮＡの合成にどのような影響を与えるのかは不明である。【０００７】
さらに、本発明者らグループはＶｐｒタンパク質と結合する細胞内因子をＹｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法によって単離・同定した結果、ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １４５（ＳＡＰ１４５）がＶｐｒタンパク質と結合することを見いだした（第５０回日本ウイルス学会学術集会・総会、プログラム・抄録集、ｐ．１０８、２００２年１０月１６〜１８日開催）。そして、Ｖｐｒタンパク質とＳＡＰ１４５は細胞内においても相互作用しており、核内で部分的に共局在していることを明らかにした。また、ＳＡＰ１４５はスプライソソーム中のＵ２ｓｎＲＮＰに含まれるスプライシングファクター３ｂの構成分子であった。このことから、本発明者らのグループは、Ｖｐｒタンパク質がスプライシングに関与していると推測し、Ｖｐｒタンパク質によるα−ｇｌｏｂｉｎ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングへの影響を解析した。α−ｇｌｏｂｉｎ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、３つのエキソンとそれに夾まれた２つのイントロンを有するもので、スプライシングへの影響を解析するためのモデルとして選択した。その結果、Ｖｐｒタンパク質には、α−ｇｌｏｂｉｎ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのイントロン１のスプライシングを阻害する活性があることが明らかとなった（第５０回日本ウイルス学会学術集会・総会、プログラム・抄録集、ｐ．１０８、２００２年１０月１６〜１８日開催）。一方で、イントロン２のスプライシングは阻害されておらず、Ｖｐｒタンパク質によるスプライシング阻害には配列特異性がある可能性が示唆された。しかしながら、Ｖｐｒタンパク質によるスプライシング阻害という作用が、ＨＩＶ−１の複製および増殖とどのような関係を有するのかは未だ明らかとなっていない。
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３６５−６３７８，１９９３
【非特許文献２】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６３：３１３−３２２，１９９９
【非特許文献３】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７６：３２３−３２２，２０００
【非特許文献４】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：６５−７１，１９９８
【非特許文献５】第５０回日本ウイルス学会学術集会・総会、プログラム・抄録集、ｐ．１０８、２００２年１０月１６〜１８日開催
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２９，４６４−４７８，２００１
【非特許文献７】Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９（２）：２８４−２９１，  １９８６
【非特許文献８】Ｎｉｓｈｉｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３２（２）：５５０−５５４，１９９７
【非特許文献９】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２：４９１−５３２，１９９８
【非特許文献１０】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３６５−６３７８，１９９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制するための医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制するための物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質がスプライシングを制御する性質を有することを明らかにした。さらに、Ｖｐｒタンパク質は、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡについてのスプライシングにも影響を与えていることを明らかにした。ＨＩＶ−１ゲノムから生じるｐｒｅ−ｍＲＮＡは、９ｋｂフォーム、４ｋｂフォーム、および２ｋｂフォーム（１．８ｋｂフォームと呼ばれることもあるが、本明細書においては２ｋｂフォームと記載する）に大きく分けられる。９ｋｂフォームｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ（配列番号１）がスプライシングを受けていないことを特徴とする。４ｋｂフォームｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ（配列番号１）が１回スプライシングを受けていることを特徴とする。２ｋｂフォームｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡ（配列番号１）が２回以上スプライシングを受けていることを特徴とする。これら、９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｐｒｅ−ｍＲＮＡは、総計３０種類以上の成熟ｍＲＮＡとなってＨＩＶ−１のタンパク質の発現に使用される。したがって、たとえば、２ｋｂフォームのｐｒｅ−ｍＲＮＡからは複数の成熟ｍＲＮＡが得られるが、本明細書においては、２ｋｂフォームのｐｒｅ−ｍＲＮＡに由来する成熟ｍＲＮＡ群を、単に「２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群」と表記する。同様に、９ｋｂフォームのｐｒｅ−ｍＲＮＡに由来するの成熟ｍＲＮＡ群を「９ｋｂフォームのｍＲＮＡ群」と表記し、および、４ｋｂフォームのｐｒｅ−ｍＲＮＡに由来する成熟ｍＲＮＡを「４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群」と表記する。【００１０】
ＨＩＶ−１の生活環において、感染初期段階においては、ウイルス由来のタンパク質は２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群から発現するが、感染後期段階となると４ｋｂフォームや９ｋｂフォームのｍＲＮＡ群からもタンパク質が発現するようになる。４ｋｂフォームや９ｋｂフォームのｍＲＮＡ群にコードされるタンパク質には、ＨＩＶ−１粒子を構成する構造タンパク質が含まれており、これらの発現はウイルス複製および増殖につながる（図１参照）。本発明者らは、Ｖｐｒタンパク質の存在下においては、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の量が増加し、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の量が減少することを見いだし（図２参照）、これはＶｐｒタンパク質によって４ｋｂフォームｍＲＮＡから２ｋｂフォームｍＲＮＡへのスプライシングが阻害された結果であると結論づけた。このようなＶｐｒタンパク質の作用はＨＩＶ−１増殖へと導くものであるので、本発明者らはＶｐｒタンパク質が有するスプライシング阻害活性を阻害することでＨＩＶ−１の増殖を抑制できると結論し、本発明を完成した。
スクリーニング方法
本発明は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）（ｉ）野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター、および、（ｉｉ）Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを細胞に遺伝子導入する；
（２）遺伝子導入した細胞を、候補物質の存在下で２４時間ないし７２時間、好ましくは４８時間ないし７２時間培養する（この時間は使用する細胞や培養条件によって当業者が適宜試験して決定してよい）；
（３）（２）の細胞よりＲＮＡを抽出して、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を増幅する；および、
（４）増幅したＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（上記の変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター、および、Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子を含まないコントロールベクターを遺伝子導入した細胞に由来するもの）の値に近づいた場合には、その候補物質は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
ことを含む方法を提供する。  野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターを使用する。Ｖｐｒタンパク質を発現しないような変異は、（ａ）ｖｐｒ遺伝子にコードされるタンパク質の発現が起こらないようにすることを目的とする、ｖｐｒ遺伝子の開始コドンに導入する変異やプロモータに導入する変異、および、（ｂ）生じた変異Ｖｐｒタンパク質がＶｐｒタンパク質の活性を失うようにすることを目的とする、ｖｐｒ遺伝子自体に導入する変異を含む。望ましくは、Ｖｐｒタンパク質を発現しないような変異は、ｖｐｒ遺伝子の開始コドンに導入する変異である。【００１１】
望ましい態様において、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターは、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｍ１９９２１）において、ｖｐｒ遺伝子の開始コドン（配列番号２における塩基番号５５５９−５５６１）に変異を導入してＶｐｒタンパク質を発現しないようにした変異型ＨＩＶ−１ゲノム  ｃＤＮＡを含むベクターである。さらに望ましくは、上記の変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターは、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｍ１９９２１）において、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇ−Ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２において塩基番号１５１１−４５５１）を欠失し、かつ、ｖｐｒ遺伝子の開始コドン（配列番号２において塩基番号５５５９−５５６１）に変異を導入してＶｐｒタンパク質を発現しないようにした変異型ＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡを含むベクターである。ここで、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇ−Ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２において塩基番号１５１１−４５５１）を欠失させるのは、通常の実験施設においてもウイルス遺伝子を安全に扱えるようにするためにウイルスの感染能および増幅能を失わせるためであり、この変異型のＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡは、野生型ＨＩＶ−１遺伝子とほぼ同様なｍＲＮＡの発現パターンを示すことが報告されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２９，４６４−４７８，２００１）。【００１２】
上記の通り、本発明のスクリーニング方法では、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつＶｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターは、例えば以下のようにして調製することができる。本明細書において、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示すとは、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様に転写およびスプライシング反応が起こり、そして野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様なＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの発現パターンを示すことを意味する。ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｍ１９９２１）において、ｖｐｒ遺伝子の開始コドン（配列番号２において塩基番号５５５９−５５６１）に変異を導入してＶｐｒタンパク質を発現しないようにした変異型ＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡ（配列番号３）を、制限酵素ＰｆｌＭＩおよびＥｃｏＲＩで処理し、処理した変異型ＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡを、同じく制限酵素ＰｆｌＭＩおよびＥｃｏＲＩで処理したプラスミドに挿入することで調製する。【００１３】
または、例えば、上記のｖｐｒ遺伝子の開始コドンに変異を導入した遺伝子を含むプラスミドを制限酵素ＢａｌＩおよびＳｐｅＩで処理し、ｇａｇ−ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２において、塩基番号１５１１−４５５１）を欠失させた断片を平滑末端処理した後、セルフライゲーションさせて調製したものを用いることができる。【００１４】
野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつＶｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターを導入した細胞においては、ｖｐｒ遺伝子の開始コドンに変異を有していても、このベクターから発現するｍＲＮＡのパターンは野生型ＨＩＶ−１遺伝子とほぼ同様である。【００１５】
Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子（配列番号５）を含む発現ベクターは、ＨＩＶ−１分離株ＮＬ４３２感染性分子クローン（Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９（２）：２８４−２９１，  １９８６）のｖｐｒ遺伝子をＰＣＲ法により増幅後、Ｆｌａｇ−ｔａｇを付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩサイトに挿入されたもの（Ｆｖｐｒ／ｐＳＫ＋ＩＩ）を鋳型として、哺乳類細胞用発現プラスミドｐＭＥ−１８Ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトにサブクローニングされたもの（Ｆｖｐｒ／ｐＭＥ１８Ｎｅｏ）（Ｎｉｓｈｉｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３２（２）：５５０−５５４，１９９７）を調製して用いることができる。【００１６】
別の態様において本発明は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示すＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターを細胞に遺伝子導入する；
（２）遺伝子導入した細胞を、候補物質の存在下で２４時間ないし７２時間、好ましくは４８時間ないし７２時間培養する（この時間は使用する細胞や培養条件によって当業者が適宜試験して決定してよい）；
（３）（２）の細胞よりＲＮＡを抽出して、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を増幅する；および、
（４）増幅したＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターを遺伝子導入した細胞に由来するもの）の値に近づいた場合には、その候補物質は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
ことを含む方法を提供する。【００１７】
望ましい態様において野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示すＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターは、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｍ１９９２１）を含むベクターである。さらに望ましくは、上記の変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクターは、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｍ１９９２１）において、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇ−Ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２において塩基番号１５１１−４５５１）を欠失した変異型ＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡを含むベクターである。【００１８】
さらなる態様において本発明は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（１）野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノム、および、前記変異ＨＩＶ−１ゲノムとは異なる発現カセットに組み込まれたＶｐｒタンパク質をコードする遺伝子、を含むベクターを細胞に遺伝子導入する；
（２）遺伝子導入した細胞を、候補物質の存在下で２４時間ないし７２時間、好ましくは４８時間ないし７２時間培養する（この時間は使用する細胞や培養条件によって当業者が適宜試験して決定してよい）；
（３）（２）の細胞よりＲＮＡを抽出して、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を増幅する；および、
（４）増幅したＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター；または、野生型ＨＩＶ−１遺伝子と同様な発現パターンを示し、かつ、Ｖｐｒタンパク質を発現しないように変異させた変異ＨＩＶ−１ゲノム、および、前記変異ＨＩＶ−１ゲノムとは異なる発現カセットに組み込まれたｖｐｒ遺伝子であって、Ｖｐｒタンパク質を発現しないＤＮＡを含むベクター；を遺伝子導入した細胞に由来するもの）の値に近づいた場合には、その候補物質は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
ことを含む方法を提供する。【００１９】
遺伝子導入する細胞は、哺乳類の細胞であれば特に限定されないが、望ましくは、ヒト由来の細胞である。ヒト由来の細胞で好ましいのはヒト由来の培養細胞、更に好ましくはＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、などである。培養は細胞系によって異なり、当業者に周知の方法で行うことができるが、より詳細な条件については適宜当業者が決定してもよい。【００２０】
遺伝子導入は、当業者に周知の常法で行ってもよく、特別な制限はないが、リポフェクション法、またはエレクトロポレーション法などにより行うことができる。また、トランスフェクション後の培養時間は２４時間ないし７２時間であるが、この時間は使用する細胞や培養条件によって当業者が適宜試験して決定してよい。例えば、少なくとも２４時間以上、望ましくは４８時間、または７２時間である。【００２１】
細胞からＲＮＡを抽出するには、ＡＧＰＣ法（acid guanidium-phenol-chloroform method）などの常法により行えばよく、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの市販のＲＮＡ抽出用試薬を用いて行ってもよい。【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲは、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類、ならびに９ｋｂ、４ｋｂおよび２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群を特異的に増幅するプライマーを用いて行う。ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＫＯＤ＋（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、９４℃２分の加熱の後、９４℃６０秒−６０℃６０秒−７２℃６０秒のサイクルを適宜繰り返す条件で行うことができる。そして、増幅した各フォームのｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片は、例えば、ＦＬＡ−２０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いる方法により定量する。定量方法は、半定量的方法であってもよい。このＤＮＡ断片の量は、各フォームのｍＲＮＡ群の量を反映する。【００２３】
ここで、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類に対応するＤＮＡ断片の量を測定して、実験系とコントロール系とで比較するのは、他の９ｋｂ、４ｋｂおよび２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群の生成量が比較可能であるかどうかを確認するためである。ｍＲＮＡ（全種類）生成量が実験系とコントロール系とで同じであれば、他の各フォームのｍＲＮＡの生成量の差を直接比較することができるからである。たとえば、図２においては、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群（４Ｋで示した）の生成量の比は１．５であるが、ｍＲＮＡの全種類（ＬＴＲで示した）の生成量の比は１．０であるので、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ量の増加はｍＲＮＡ全体の生成量が増加したことによるものではなく、スプライシングの制御によって生じたものであると結論することができる。【００２４】
本発明のスクリーニング方法において、増幅したＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびＶｐｒタンパク質を発現しないコントロールベクターを遺伝子導入した細胞に由来するもの）の値に近づくとは、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較して４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が減少することをいい、望ましくは４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が減少し、かつ、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片の量が増加することをいう。このような場合は、当該候補物質はＶｐｒタンパク質によるスプライシング阻害活性を阻害しているので、この物質はＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する。【００２５】
本発明のスクリーニング方法において、候補物質は、化学物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸などの生体物質であってもよい。化学物質は、公知の化合物を用いてもよく、または、当業者に既知のコンビナトリアルケミストリーの手法により合成した化合物ライブラリーを用いてもよい。生体物質は、天然由来の配列を有するものを用いてもよく、または、人工的な配列のものを用いてもよい。【００２６】
また、候補物質は、数段階の希釈列で試験することにより、Ｖｐｒタンパク質によるスプライシング阻害活性の阻害能力を更に詳細に評価することができる。【００２７】
ＨＩＶ−１の２ｋｂフォームおよび４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群には、選択的スプライシングを受けることによって生じる３０種類以上の異なるｍＲＮＡが含まれる（図３参照）。本発明者らは、それぞれのフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡの発現量についても詳細に検討したところ、Ｖｐｒタンパク質の存在下においては、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡのうちｅｎｖ  ｍＲＮＡが増加し、および、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡのうちｔａｔ  ｍＲＮＡの量が減少することを見いだした（図４および５参照）。このことは、Ｖｐｒタンパク質はＨＩＶ−１  ｍＲＮＡにおける選択的スプライシングをも選択的に阻害することにより制御することで、ＨＩＶ−１の遺伝子の中でも構造遺伝子の発現を上昇させていることを示している。【００２８】
したがって、別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、前記（４）の工程に代えて、以下の工程：
（４’）増幅した各フォームのＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を、それぞれゲル電気泳動（例えば、アクリルアミドゲル電気泳動）に供して、各フォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片を分離して検出する；および、
（５’）各ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の検出により判明するＨＩＶ−１の各フォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡの発現パターンが、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（上記の変異ＨＩＶ−１ゲノムを含むベクター、および、Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子を含まないコントロールベクターを遺伝子導入した細胞に由来するもの）の発現パターンに近づいた場合には、その候補物質はＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する；
によって候補物質を評価してもよい。【００２９】
この場合に、本発明のスクリーニング方法において、各ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の検出により判明するＨＩＶ−１の各フォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡの発現パターンが、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較してコントロール（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびＶｐｒタンパク質を発現しないコントロールベクターを遺伝子導入した細胞に由来するもの）の値に近づくとは、候補物質の存在によって、候補物質の非存在下と比較して４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群についてｅｎｖ  ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の量が減少した場合をいい、望ましくは、４ｋｂフォームのｍＲＮＡについてｅｎｖ  ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の量が減少し、かつ、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群についてｔａｔ  ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ断片の量が増加した場合をいう。このような場合は、当該候補物質はＶｐｒタンパク質によるスプライシング制御を阻害しているので、この物質はＨＩＶ−１の増殖を抑制する物質であると判断する。
プライマー
本発明は、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類、ならびに９ｋｂ、４ｋｂおよび２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群を特異的に増幅するプライマーを提供する。プライマーはいずれも、ＨＩＶ−１ゲノムに対応する連続した１５−３０塩基のＤＮＡで構成される。【００３０】
具体的には、フォーワードプライマーとしては配列番号６の塩基配列を有するプライマーを用い、リバースプライマーとしては、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類を増幅するものとして配列番号７の塩基配列を有するプライマーを、９ｋｂフォームｍＲＮＡ群に特異的なものとして配列番号８の塩基配列を有するプライマーを、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群に特異的なものとして配列番号９の塩基配列を有するプライマーを、２ｋｂフォームｍＲＮＡ群に特異的なものとして配列番号１０の塩基配列を有するプライマーをそれぞれ用いればよい（図６参照）。したがって、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類を増幅するためには配列番号６および配列番号７で示されるプライマー対、９ｋｂフォームｍＲＮＡ群を特異的に増幅するためには配列番号６および配列番号８で示されるプライマー対、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群を特異的に増幅するためには配列番号６および配列番号９で示されるプライマー対、２ｋｂフォームｍＲＮＡ群を特異的に増幅するためには配列番号６および配列番号１０で示されるプライマー対をそれぞれ用いればよい。【００３１】
本発明のプライマーは当業者に既知のホスホルアミダイト法などによる化学合成によって得ることができる。
医薬組成物
本発明は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質を阻害することにより、ＨＩＶ−１における、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の増加および２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群の減少を抑制する物質を有効成分とする医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、望ましくは本発明のスクリーニング方法により選択される物質を有効成分とする。本発明の医薬組成物は、望ましくはＨＩＶ−１の増殖を抑制するために用いられる。【００３２】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。【００３３】
本発明の医薬組成物は、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点滴剤などの液剤、または凍結乾燥製剤などであってもよい。液剤の場合、本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤を適当量含有していてもよい。凍結乾燥製剤は、本発明の液剤を凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。本発明の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な滅菌済の溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液を挙げることができる。【００３４】
本発明の医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトに対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経粘膜投与または経直腸投与することができ、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよい。これらの投与方法に適した剤型、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、坐剤等で投与される。【００３５】
本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましい。医師であれば、個々の患者に最適な投与量および投与間隔を決定することができる。
ｓｉＲＮＡ
本発明者らは、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質がＨＩＶ−１  ｍＲＮＡのスプライシング制御に関わって、ＨＩＶ−１の複製・増殖に重要な役割を果たしていることを突き止めた。そして、Ｖｐｒタンパク質の発現を抑制することで、ＨＩＶ−１の複製・増殖を抑制できるという考えに到達し、本発明を完成させた。【００３６】
したがって、本発明は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）に関する。ｓｉＲＮＡは、２１〜２３塩基の配列を有する二本鎖ＲＮＡであって、それぞれのＲＮＡの３’末端は２〜３塩基の突出端となっているものである。ｓｉＲＮＡが細胞内に導入されると、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるタンパク質複合体によって、当該ｓｉＲＮＡの相補鎖を有するＲＮＡが切断される（Ｓ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒら、“Ｎａｔｕｒｅ”、２００１年、４１１巻、ｐ．４９４−４９８）。したがって、ｖｐｒ遺伝子に対応するｓｉＲＮＡを細胞内に導入することによって、ｖｐｒ  ｍＲＮＡが切断されるため、Ｖｐｒタンパク質の発現が抑制（ノックダウン）される。ｖｐｒ遺伝子についてのｓｉＲＮＡによってＶｐｒタンパク質の発現を抑制することで、ＨＩＶ−１の複製・増殖を抑制することができる。【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡは、ｖｐｒ遺伝子（配列番号５）の内部の連続する２１〜２３塩基の配列を有する二本鎖ＲＮＡに加えて、それぞれのＲＮＡの３’末端は２〜３塩基の突出端となっているものである。本発明のｓｉＲＮＡは、ホスホルアミダイト法などにより化学合成で作成してもよい。【００３８】
また、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物に関する。本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制するために用いられる。【００３９】
本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ｓｉＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効な、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどのカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体などを含んでいてもよい。また、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、本発明の医薬組成物と同様に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよく、患者に適切に投与できるような形態であり、用量は医師により決定される。【００４０】
また、本発明のｓｉＲＮＡを含む医薬組成物は、本発明のｓｉＲＮＡの代わりに、標的細胞内で本発明のｓｉＲＮＡを発現するようなベクターを含んでいる医薬組成物をも意味する。このようなベクターは、標的細胞に導入すると、細胞内で本発明のｓｉＲＮＡを発現するので、本発明のｓｉＲＮＡを投与するのと同様の効果が得られる。
アンチセンス核酸
本発明は、ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の発現を抑制するためのアンチセンス核酸に関する。本発明のアンチセンス核酸は、ｖｐｒ遺伝子（配列番号５）の内部の連続する１５〜３０塩基の配列の相補鎖ＤＮＡで構成される。本発明のアンチセンス核酸は、ホスホルアミダイト法などにより化学合成で作成してもよい。【００４１】
また、本発明は、本発明のアンチセンス核酸を含む医薬組成物に関する。本発明のアンチセンス核酸を含む医薬組成物は、ＨＩＶ−１の増殖を抑制するために用いられる。【００４２】
本発明のアンチセンス核酸を含む医薬組成物は、アンチセンス核酸を細胞内に移行させるのに有効な、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどのカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体などを含んでいてもよい。また、本発明のアンチセンス核酸を含む医薬組成物は、本発明の医薬組成物と同様に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよく、患者に適切に投与できるような形態であり、用量は医師により決定される。
【発明の効果】
【００４３】
本発明は、新規な抗ＨＩＶ−１薬およびそのスクリーニング方法を提供することにより、薬剤耐性ウイルスの出現が問題となっているエイズ治療の分野に、新たな治療法およびその開発手段を提供する。本発明のスクリーニング方法および医薬組成物は、従来治療のターゲットとされてきたウイルスの感染過程でなく、感染後のウイルスの複製・増幅過程における全くの新規な機構をターゲットとしており、エイズ治療に多様性を持たせるという意味においても貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１の感染前期過程および感染後期過程におけるＨＩＶ−１の各フォームのｍＲＮＡ群の発現パターンの模式図である。
【図２】図２は、ＨｅＬａ細胞をｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびＶｐｒタンパク質発現ベクター、ならびに、ｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびコントロールベクターでトランスフェクションした後、４８時間目における各フォームのｍＲＮＡ群の生成量の比を示すグラフである。縦軸は、生成量の比＝｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋Ｖｐｒタンパク質発現ベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝／｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋コントロールベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝を示す。横軸について、ＬＴＲは全ｍＲＮＡを示し、９Ｋは９ｋｂフォームｍＲＮＡ群、４Ｋは４ｋｂフォームｍＲＮＡ群、および２Ｋは２ｋｂフォームｍＲＮＡ群をそれぞれ示す。
【図３】図３は、ＨＩＶ−１の２ｋｂフォームおよび４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡを示す図である。
【図４】図４は、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群をゲル電気泳動により分析した結果を示す写真、および、４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡそれぞれのＶｐｒタンパク質非存在下に対するＶｐｒタンパク質存在下における生成量の比を示すグラフである。写真において、レーン１はトランスフェクションしなかったもの、レーン２はｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびＶｐｒタンパク質発現ベクターでトランスフェクションしたもの、レーン３はｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびコントロールベクターでトランスフェクションしたもの、である。グラフにおいて、横軸は、生成量の比＝｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋Ｖｐｒタンパク質発現ベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝／｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋コントロールベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝を示す。
【図５】図５は、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群をゲル電気泳動により分析した結果を示す写真、および、２ｋｂフォームのｍＲＮＡ群を構成するｍＲＮＡそれぞれのＶｐｒタンパク質非存在下に対するＶｐｒタンパク質存在下における生成量の比を示すグラフである。写真において、レーン１はトランスフェクションしなかったもの、レーン２はｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびＶｐｒタンパク質発現ベクターでトランスフェクションしたもの、レーン３はｐΔＰＳＰΔｖｐｒおよびコントロールベクターでトランスフェクションしたもの、である。グラフにおいて、横軸は、生成量の比＝｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋Ｖｐｒタンパク質発現ベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝／｛（ｐΔＰＳＰΔｖｐｒ＋コントロールベクター）におけるｍＲＮＡ発現量｝を示す。
【図６】図６は、ｐΔＰＳＰΔｖｐｒより生じる、全ｍＲＮＡ、９ｋｂフォームｍＲＮＡ群、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群、２ｋｂフォームｍＲＮＡ群を増幅するためのプライマーについて、ゲノムにおいて対応する位置を示す図である。
【図７】図７は、感染後８日目のＨＩＶ−１感染細胞におけるＬＴＲ、９ｋｂフォーム、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒの各ｍＲＮＡについてＶｐｒタンパク質非存在下に対するＶｐｒタンパク質存在下における生成量の比を示すグラフである。グラフにおいて、縦軸は、ｍＲＮＡ発現量の比＝（ＮＬ４３２で感染させた細胞におけるｍＲＮＡ発現量）／（ＮＬ４３２Δｖｐｒで感染させた細胞におけるｍＲＮＡ発現量）を示す。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質がウイルスゲノムのスプライシングに及ぼす影響
ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｍ１９９２１）よりＧａｇ−Ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２における塩基番号１５１１−４５５１）を欠失させたｐΔＰＳＰを作成するために、制限酵素ＢａｌＩおよびＳｐｅＩで処理した。このｐΔＰＳＰは野生型遺伝子と同様な発現パターンを示すことが報告されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２９：４６４−４７８）。【００４６】
また、ＨＩＶ−１のｃＤＮＡ  ＮＬ４３２（配列番号２：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｍ１９９２１）を制限酵素ＮｄｅIおよびｓａｌＩで処理し、切り出した断片を平滑末端処理してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋に組み込んだ。このプラスミド中のｖｐｒ遺伝子の開始コドン（配列番号２における塩基番号５５５９−５５６１）ＡＴＧをＧＴＧに変異させた。変異させたプラスミドより制限酵素ＰｆｌＭＩおよびＥｃｏＲＩで断片を切り出し、同様に制限酵素ＰｆｌＭＩおよびＥｃｏＲＩで処理したＮ４３２に組み込むことで、ＮＬ４３２Δｖｐｒを作成した。次に、ＮＬ４３２Δｖｐｒを制限酵素ＢａｌＩおよびＳｐｅＩで処理し、ｇａｇ−ｐｏｌ領域の一部分（配列番号２における塩基番号１５１１−４５５１）を欠失させた断片を平滑末端処理した後、セルフライゲーションさせ変異ＨＩＶ−１ゲノムｃＤＮＡ（配列番号４）含むプラスミドｐΔＰＳＰΔｖｐｒとした。【００４７】
Ｖｐｒタンパク質をコードする遺伝子（配列番号５）を含む発現ベクターは、ＨＩＶ−１分離株ＮＬ４３２感染性分子クローン（Ａｄａｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５９（２）：２８４−２９１，１９８６）のｖｐｒ遺伝子をＰＣＲ法により増幅後、Ｆｌａｇ−ｔａｇを付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩサイトに挿入されたもの（Ｆｖｐｒ／ｐＳＫ＋ＩＩ）を鋳型として、哺乳類細胞用発現プラスミドｐＭＥ−１８ＮｅｏベクターのＸｈｏＩおよびＮｏｔＩサイトにサブクローニングされたもの（Ｆｖｐｒ／ｐＭＥ１８Ｎｅｏ）を調製して用いた。【００４８】
コントロールベクターとしては、上述のＶｐｒ発現ベクターのＶｐｒタンパク質の三番目のアミノ酸をコードする配列ＣＡＡを終止コドンＴＡＡに変異させたものを用いた。したがって、コントロールベクターからはＶｐｒタンパク質は発現しない。【００４９】
上記のｐΔＰＳＰΔｖｐｒを、Ｖｐｒ発現ベクターまたはコントロールベクターと共に、トランスフェクション法によりＨｅＬａ細胞に導入した。具体的にはトランスフェクションは、リポフェクタミンＰｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造元のプロトコルに従って行った。トランスフェクションした細胞を３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。    培養開始後、２４時間、４８時間、７２時間の各時間において、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞からＲＮＡを抽出した。このＲＮＡを鋳型として、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いて、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。具体的には、ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造元のプロトコルに従って逆転写反応を行った。【００５０】
ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの９ｋｂ、４ｋｂ、および２ｋｂの各フォームのｍＲＮＡ群を特異的に増やすプライマーを設計して合成した。具体的には、フォーワードプライマーとしてはｏｄｐ０４５プライマー（配列番号６）を用い、リバースプライマーとしては、ＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの全種類を増幅するものとして７４４（Ｔｏｔａｌ）プライマー（配列番号７）、９ＫｂフォームｍＲＮＡ群特異的なものとしてＧａｇプライマー（配列番号８）、４ＫｂフォームｍＲＮＡ群特異的なものとしてＫＰＮＡプライマー（配列番号９）、および２ＫｂフォームｍＲＮＡ群特異的なものとしてＳＪ４．７Ａプライマー（配列番号１０）を用いた（図６参照）。【００５１】
上記のプライマーを用いて、上記の細胞から抽出したＲＮＡを鋳型に、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により各フォームのｍＲＮＡ群に対応するＤＮＡ断片を半定量的に増幅した。このＤＮＡ断片の量は、各フォームのｍＲＮＡ群の量を反映しているので、増幅されたＤＮＡ断片の量を観察することにより、Ｖｐｒタンパク質の有無によってそれぞれのフォームのｍＲＮＡ群の量が変化するかどうかについて観察した。【００５２】
トランスフェクション後、２４時間目に抽出したＲＮＡでは、Ｖｐｒタンパク質の有無に基づくＨＩＶ−１の各フォームのｍＲＮＡ群の量の変化は認められなかった。一方、４８時間目に抽出したＲＮＡでは、Ｖｐｒタンパク質が存在する場合、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群の増加および２ｋｂフォームｍＲＮＡ群の減少が観察された（図２参照）。【００５３】
通常、ＨＩＶ−１の感染の初期段階では、ＨＩＶ−１ゲノムＲＮＡは２回スプライシングを受けた２ｋｂ（１．８ｋｂ）フォームになり、核外へ移行し、細胞質においてこのＲＮＡから調節性遺伝子であるＲｅｖ、Ｔａｔ、Ｎｅｆが発現する。この時点では、フルゲノムＲＮＡである９ｋｂフォームおよび１回スプライシングを受けた４ｋｂフォームは、核外へ移行できず核内にとどまる。一方、Ｒｅｖの発現量が高まって感染後期になると、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ中のＲＲＥ（Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）配列にＲｅｖが結合し、４ｋｂフォームおよび９ｋｂフォームのＲＮＡが核外に輸送され、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌといったウイルス本体を構成するタンパク質も発現するようになる（図１参照：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５２：４９１−５３２，１９９８）。【００５４】
本実施例の結果は、Ｖｐｒタンパク質が２ｋｂフォームＲＮＡ群の生成を抑制しつつ、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群の生成を促進する働きを有することを示すものである。このことは、Ｖｐｒタンパク質によるウイルスゲノムのスプライシング阻害がＨＩＶ−１ウイルスの感染段階をウイルス複製・増殖の過程に導いていることを示唆している。【００５５】
また、本実施例の実験系の確立により、Ｖｐｒタンパク質のＨＩＶ−１  ｍＲＮＡのスプライシングに及ぼす影響を評価することが可能となったので、この実験系を抗ＨＩＶ薬のスクリーニングにおける評価に適用することができる。
実施例２：ＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の存在下でのウイルスゲノムのスプライシングパターンが受ける影響
ＨＩＶ−１の２ｋｂフォームおよび４ｋｂフォームのｍＲＮＡ群には、選択的スプライシングをうけることによって生じる３０種類以上の異なるｍＲＮＡが含まれる（図３参照）。この選択的スプライシングのパターンによって、Ｅｎｖ、調節遺伝子、およびアクセサリー遺伝子など、個々の遺伝子の発現を制御していることが明らかとなっている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３６５−６３７８，１９９３）。【００５６】
そこで、Ｖｐｒタンパク質の存在下および非存在下における各フォームのｍＲＮＡ群に含まれるｍＲＮＡ種を調べて、Ｖｐｒタンパク質が選択的スプライシングに及ぼす影響を観察した。【００５７】
実施例１と同様にして得た半定量ＲＴ−ＰＣＲ産物を、４％アクリルアミドゲルにて泳動後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．）により染色し、蛍光イメージアナライザー（ＦＬＡ−２０００：ＦＵＪＩＦＩＬＭ）により各バンドを定量した。【００５８】
観察の結果、４ｋｂフォームｍＲＮＡ群ではＶｐｒタンパク質の存在下、Ｅｎｖタンパク質をコードする遺伝子が、Ｖｐｒタンパク質の非存在下と比較して増加していることが示唆された（図４参照）。一方、２ｋｂフォームｍＲＮＡ群ではＶｐｒタンパク質の存在によりＴａｔタンパク質をコードしているｍＲＮＡがＶｐｒタンパク質の非存在下と比較して減少していることが観察された（図５参照）。
実施例３：ＨＩＶ−１感染細胞におけるＨＩＶ−１  Ｖｐｒタンパク質の存在下でのウイルスゲノムのスプライシングパターンが受ける影響
Ｍｏｌｔ４細胞にＨＩＶ−１  ＮＬ４３２（配列阿番号２：ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｍ１９９２１）またはＨＩＶ−１  ＮＬ４３２Δｖｐｒを感染させ、ＨＩＶ−１感染細胞を作製した。ＨＩＶ−１感染細胞を２、３、４、または８日間培養した後、細胞からトータルＲＮＡを抽出し、ＬＴＲ、９ｋｂフォーム、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、およびｖｐｒのそれぞれに特異的なプライマーでＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）により、製造者のプロトコルに従って定量した。【００５９】
実施例２の結果、すなわち、ｐΔＰＳＰΔｖｐｒとＶｐｒ発現ベクター、または、ｐΔＰＳＰΔｖｐｒとコントロールベクターをＨｅＬａ細胞に導入した際のＨＩＶ−１  ｍＲＮＡの発現パターンをアクリルアミドゲル電気泳動で測定した結果（図４および図５）と同様に、ＨＩＶ−１感染細胞を用いた場合においてもＶｐｒ存在下で、感染後８日目においてｅｎｖ  ｍＲＮＡおよびｒｅｖ  ｍＲＮＡの増加とｔａｔ  ｍＲＮＡの減少が観察された（図７）。また、感染後、２、３、および４日目に抽出したＲＮＡにおいても同様の傾向がみられた。このことから、ＨＩＶ−１感染細胞においても、Ｖｐｒタンパク質はｅｎｖ、ｒｅｖ、およびｔａｔのｍＲＮＡパターンに影響を及ぼすことが示唆された。
本実施例の結果は、Ｖｐｒタンパク質が選択的スプライシングにも影響を及ぼして、ＨＩＶ−１ウイルスのタンパク質発現パターンに関与していることを示唆している。【００６０】
また、本実施例の実験系の確立により、Ｖｐｒタンパク質のＨＩＶ−１  ｍＲＮＡのスプライシングに及ぼす影響を各ｍＲＮＡレベルで評価することが可能となったので、この実験系を抗ＨＩＶ薬のスクリーニングにおける評価に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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