(57)【要約】本発明は、構造解析に適したＳＥＡ様ドメインを形成するタンパク質を取得し、その構造情報を解析し、創薬などに利用することを目的とする。具体的には、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩、配列番号２に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が１２０〜１３９であるタンパク質又はそれらの塩、それらの製造方法、それらをコードするポリヌクレオチド、それらのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩。
【請求項２】
配列番号２に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が１２０〜１３９であるタンパク質又はそれらの塩。
【請求項３】
配列番号１又は２に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、請求項１又は２に記載のタンパク質のいずれかと実質的に同一の機能を有するタンパク質又はそれらの塩。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３又は４に記載された塩基配列を含有する請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有する発現系。
【請求項７】
請求項４又は請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項４又は請求項５に記載のポリヌクレオチドにより形質転換させた形質転換体。
【請求項９】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質及び／又はそれらの塩に対する抗体。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗体を含む医薬。
【請求項１１】
請求項８に記載された形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
【請求項１２】
無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質又はそれらの塩と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の抗体を用いた請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の定量方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の定量方法を用いた、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれら塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程と、を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
【請求項１７】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で検索する工程とを含む請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩及び／又は請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載の立体構造情報のうちアミノ酸番号８〜１２６番目のアミノ酸残基からなるタンパク質の立体構造情報である請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、ＡＳＮ１５、ＡＳＮ１７、ＰＨＥ１８、ＴＨＲ１９、ＬＥＵ６７、ＡＲＧ７０、ＳＥＲ７１、ＶＡＬ７２、ＳＥＲ７３、ＡＳＮ７４、ＨＩＳ７８、ＧＬＹ８０、ＡＳＰ８２、ＡＳＰ１１９、ＳＥＲ１２２、ＡＳＰ１２６、ＳＥＲ１２７のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる請求項１７に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１７乃至請求項１９のいずれか一項に記載されたスクリーニング方法によって特定された、活性部位と相互作用する化合物を候補物質として用意し、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質又はそれらの塩と候補物質とが相互作用するかどうかを確認する工程とを含む請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩及び／又は請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造のうちアミノ酸番号８〜１２６番目のアミノ酸残基のタンパク質の立体構造情報に関する情報を用いて、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
【請求項２２】
請求項１３、請求項１５、請求項１７乃至請求項２０のうちいずれか一項に記載の方法により得られることを特徴とする細胞増殖活性を阻害する化合物。
【請求項２３】
有効成分として、以下の化合物群ｉ）から選択される少なくとも１つの化合物を含んでなる細胞増殖活性阻害剤。
ｉ）；下記（ａ）〜（ｅ）の化合物又はその塩
（ａ）下記構造式（Ｉ）で表されるＮ−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）−７−トリフルオロメチル−５，６−ジヒドロ−７ａ，８，１１−トリアザシクロペンタ［ｂ］フェナントレン−９−カルボキサミド
2004031384.tif 001440
（ｂ）下記構造式（ＩＩ）で表される１−［３−［４−（１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］チエピン−１０−イル）ピペラジン−１−イル］プロピル］−１，３−ジヒドロベンズイミダゾール−２−オン
2004031384.tif 001441
（ｃ）下記構造式（ＩＩＩ）で表される２−（３，４−ジメチルフェニル）−２−オキソエチル２−（３，５−ジオキソ−４−アザ−ジベンゾ［８，９：１０，１１］トリシクロ［５，２，２，０２，６］ウンデカン−４−イル）アセテート
2004031384.tif 001442
（ｄ）下記構造式（ＩＶ）で表される２−［４−エチル−５−（４−メチルフェニルアミノ）メチル−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル］スルファニル−１−（フェノチアジン−１０−イル）−１−エタノン
2004031384.tif 001443
（ｅ）下記構造式（Ｖ）で表される１−（８−クロロ−３−フルオロ−１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］チエピン−１０−イル）−４−［２−（１，３−ジオキソラン−２−イル）エチル］ピペラジン
2004031384.tif 001444
【請求項２４】
卵巣ガン細胞由来のがん細胞の増殖活性を阻害する、請求項２３に記載の細胞増殖活性阻害剤。
【請求項２５】
細胞増殖活性を阻害する化合物を含有する医薬組成物の製造方法であって、請求項１３、請求項１５、請求項１７乃至請求項２０のうちいずれか一項に記載の方法により得られた化合物を製薬的に許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ドメインを形成するマウス由来のタンパク質、それを含有するポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いた活性化合物のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】  近年、ヒトゲノム計画に代表されるさまざまなモデル生物のゲノム塩基配列が次々に解読されている。これらのゲノム配列情報から抽出される遺伝子について、個々の遺伝子にコードされたドメインタンパク質の立体構造を体系的に明らかにし、構造と機能の関係を明確にしようとする“構造ゲノム科学”が、新たな研究分野として急速に立ち上がり、世界各国で大規模なプロジェクトが進行している。
この構造ゲノム科学において、解析対象となるタンパク質数は１０万種類に及ぶとも見られており、その全立体構造の決定を目標とするのは現在の技術レベルでは未だ現実的ではない。
そこで、まず対象タンパク質を妥当な数に絞り、「代表的な構造」を選ぶことが必要である。網羅的な立体構造解析は、例えばａ）対象とするタンパク質のセットとして比較的小さいものに特定する、ｂ）超好熱性古細菌、高度好熱菌、マイコプラズマ等のゲノムサイズの小さい生物種を特定する、或いはｃ）シグナル伝達や遺伝子発現に関与するタンパク質、疾病関連遺伝子産物タンパク質等、生命現象を特定する等、様々な視点から解析対象を選定したプロジェクトが開始されている。
このような研究の流れにおいては、最初のステップとして、約１万種類とも推測されているファミリー（アミノ酸配列が約３０〜３５％の相同性を有するものをファミリーとして分類）のすべてについて代表的な立体構造を１つ以上決定することを１つの目標としている。ある代表的な立体構造（基本構造）があれば、同じファミリーに属する他のタンパク質の構造も、ホモロジーに基づくモデリングにより類推することが可能となる。このような研究の流れにおいては、最初のステップとして、約１万種類とも推測されているドメインファミリー（アミノ酸配列が約３０〜３５％の相同性を有するものをファミリーとして分類）のすべてについて代表的な立体構造を１つ以上決定することを１つの目標としている。ある代表的な立体構造（ドメイン）があれば、同じドメインファミリーに属する他のドメインの構造も、ホモロジーに基づくモデリングにより類推することが可能となる。
このプロジェクトの中で、機能ドメインの三次元構造のタイプ、又はトポロジー（基本構造：フォールド）に注目し、タンパク質の基本構造単位で機能との相関を解明しようとする研究が注目されている。
複数のドメインを有するタンパク質の場合、機能ドメインがパーツとして組み合わさってできているため、あるドメインがさまざまなタンパク質のなかに違ったドメインとの組み合わせで現れることがしばしば見られる。また、一次配列上のホモロジーが検出されなくても同じドメインをもつことはめずらしくない。従って、ドメインの数はタンパク質のファミリーの数よりもかなり少ないはずであり、それぞれのドメインが分子機能と関連付けられると期待される。このドメインの数は、約１万〜２万種類と予測されており、このオーダーの解析対象であれば、全対象タンパク質の立体構造を決定することも十分可能になる。
このようにして得られるタンパク質の立体構造と機能に関する情報は、生体機能の解明に新たな知見を与え、医薬品等の開発（例えば、ラショナルドラックデザインやバーチャルスクリーニングによる開発）を飛躍的に発展させるものであり、産業界においても非常に有益である。
一方、ＳＥＡドメインはウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、アグリン、肺ガンのマーカータンパク質であるムチン（ＭＵＣ１）等にみられ、タンパク質に近接する糖鎖成分の結合促進または調節に関与していると考えられる。
ＳＥＡはＯ−グリコシル化に関与する細胞外ドメインであり（例えば、Ｂｏｒｋ  Ｐ．ａｎｄ  Ｐａｔｔｈｙ  Ｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．１４２１−１４２５，（１９９５）参照）、共通の特徴はこれを有するタンパク質がほとんどグリコシル化されているという点である。さらに、よく解析されているタンパク質は、分子量を大きく左右するヘパラン硫酸などのＯ−グリコシド結合型糖鎖を含有している。
ここで重要なのは、各種ガン細胞において、タンパク質に付加する糖鎖の分子量が大きくなり、癌特異性を有する事実が良く知られている事である。例えば、ＳＥＡドメインを有するＭＵＣ１は、肺ガン、脳腫瘍やアデノカルシノーマで発現が増強し、糖鎖が嵩高くなっていることが報告されている（例えば、Ｃｒｏｃｅ  Ｍｖ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７（４）ｐｐ．２８４−２９１，（２００１）参照）。このタンパク質は、糖鎖の影響で接着性が高いことから、癌の転移や悪性化に重要な意味を持つと考えられており、このタンパク質への特異抗原による癌の免疫療法も試みられている（例えば、Ｈｅｕｋａｍｐ  ＬＣ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｖｏｌ．２５（１）ｐｐ．４５−５６（２００２）参照）。
しかしながら、タンパク質の立体構造解析には、多くの時間と労力、費用を要するのが実情である。網羅的且つ体系的な構造解析を目指す構造ゲノム科学研究においては、構造解析のハイスループット化を図ることが重要な課題である。
タンパク質の立体構造解析には主にＮＭＲ法およびＸ線結晶構造解析法が使用されている。タンパク質をＮＭＲを用いて立体構造解析を行うためには、サンプルの分子量は約２００００以下（アミノ酸残基で約２００個以下）であることが好ましい。Ｘ線解析によって立体構造解析を行う場合にも、結晶作成のためにタンパク質の性状に制限がある。構造解析に適したタンパク質を得るためにタンパク質をランダムに分割すると、切断する部位がβシートやαヘリックス構造をとるアミノ酸配列中にあると、多くのタンパク質は生理的に意味のある構造が変形したり、ひも状になり構造を取らなかったり、あるいは凝集することになる。このように本来生体内でとる構造を有しないタンパク質の立体構造を解析しても意味がない。したがって、立体構造の解析に意味のあるドメインを形成するタンパク質を取得することが望まれる。
構造解析に適した、ドメインを有するタンパク質（以下、「ドメインを形成するタンパク質」という）を発現させるためには、ドメイン境界の位置に関する情報が必要である。一般に、このドメイン境界はアミノ酸配列の相同性などを手がかりにして予測される。このようにして予測されたドメイン領域のアミノ酸配列に基づいてタンパク質の発現を行っても実際に構造をとる（フォールドする）ドメインを形成するタンパク質が得られる確率は非常に低く、ドメイン発現が構造解析のボトルネックの１つとなっている。
本発明の対象であるＳＥＡ様ドメインを形成するタンパク質についても、これまでは取得されておらず、またその構造情報も未知であり、これらを創薬などに利用することはできなかった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、下記のようなタンパク質、その製造方法、それをコードするポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法などを提供する。
（１）配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質又はその塩。
（２）配列番号２に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が１２０〜１３９であるタンパク質又はそれらの塩。
（３）配列番号１又は２に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（１）又は（２）に記載のタンパク質のいずれかと実質的に同一の機能を有するタンパク質又はそれらの塩。
（４）（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
（５）配列番号３又は４に記載された塩基配列を含有する（４）に記載のポリヌクレオチド。
（６）（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチドを含有する発現系。
（７）（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（８）（４）又は（５）に記載のポリヌクレオチドにより形質転換させた形質転換体。
（９）（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質及び／又はそれらの塩に対する抗体。
（１０）（９）に記載の抗体を含む医薬。
（１１）（８）に記載された形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
（１２）無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の製造方法。
（１３）（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質又はそれらの塩と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
（１４）（９）に記載の抗体を用いた（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩の定量方法。
（１５）（１４）に記載の定量方法を用いた、（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質またはそれら塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
（１６）（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程と、を含む、（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
（１７）（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で検索する工程とを含む（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩及び／又は（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
（１８）前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載の立体構造情報のうちアミノ酸番号８〜１２６番目のアミノ酸残基からなるタンパク質の立体構造情報である（１７）に記載のスクリーニング方法。
（１９）立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、ＡＳＮ１５、ＡＳＮ１７、ＰＨＥ１８、ＴＨＲ１９、ＬＥＵ６７、ＡＲＧ７０、ＳＥＲ７１、ＶＡＬ７２、ＳＥＲ７３、ＡＳＮ７４、ＨＩＳ７８、ＧＬＹ８０、ＡＳＰ８２、ＡＳＰ１１９、ＳＥＲ１２２、ＡＳＰ１２６、ＳＥＲ１２７のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる（１７）に記載のスクリーニング方法。
（２０）（１７）〜（１９）のいずれか一項に記載されたスクリーニング方法によって特定された、活性部位と相互作用する化合物を候補物質として用意し、（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質又はそれらの塩と候補物質とが相互作用するかどうかを確認する工程とを含む（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質又はそれらの塩及び／又は（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
（２１）立体構造座標表１〜２０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造のうちアミノ酸番号８〜１２６番目のアミノ酸残基のタンパク質の立体構造情報に関する情報を用いて、（１）〜（３）のいずれか一項に記載されたタンパク質のアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
（２２）上記（１３）、（１５）、（１７）〜（２０）のうちいずれか一項に記載の方法により得られることを特徴とする細胞増殖活性を阻害する化合物。
（２３）有効成分として、以下の化合物群ｉ）から選択される少なくとも１つの化合物を含んでなる細胞増殖活性阻害剤。
ｉ）；下記（ａ）〜（ｅ）の化合物又はその塩
（ａ）下記構造式（Ｉ）で表されるＮ−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イルメチル）−７−トリフルオロメチル−５，６−ジヒドロ−７ａ，８，１１−トリアザシクロペンタ［ｂ］フェナントレン−９−カルボキサミド
2004031384.tif 000002
（ｂ）下記構造式（ＩＩ）で表される１−［３−［４−（１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］チエピン−１０−イル）ピペラジン−１−イル］プロピル］−１，３−ジヒドロベンズイミダゾール−２−オン
2004031384.tif 000003
（ｃ）下記構造式（ＩＩＩ）で表される２−（３，４−ジメチルフェニル）−２−オキソエチル２−（３，５−ジオキソ−４−アザ−ジベンゾ［８，９：１０，１１］トリシクロ［５，２，２，０２，６］ウンデカン−４−イル）アセテート
2004031384.tif 000004
（ｄ）下記構造式（ＩＶ）で表される２−［４−エチル−５−（４−メチルフェニルアミノ）メチル−４Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−イル］スルファニル−１−（フェノチアジン−１０−イル）−１−エタノン
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（ｅ）下記構造式（Ｖ）で表される１−（８−クロロ−３−フルオロ−１０，１１−ジヒドロ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］チエピン−１０−イル）−４−［２−（１，３−ジオキソラン−２−イル）エチル］ピペラジン
2004031384.tif 000006
（２４）卵巣ガン細胞由来のがん細胞の増殖活性を阻害する、（２３）に記載の細胞増殖活性阻害剤。
（２５）細胞増殖活性を阻害する化合物を含有する医薬組成物の製造方法であって、上記（１３）、（１５）、（１７）〜（２０）のうちいずれか一項に記載の方法により得られた化合物を製薬的に許容される担体と混合する工程を含むことを特徴とする医薬組成物の製造方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＳＤＳゲルによるタンパク質の発現を示す図面に変る写真である。図１中のＡはマウス由来のＳＥＡ様ドメイン１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基番号１３３番目から２５１番目のアミノ酸配列を有するタンパク質、Ｂはアミノ酸残基番号１２３番目から２６１番目のアミノ酸配列を有するタンパク質の発現をそれぞれＳＤＳゲルで見たものである。
図２は、比較例においえるタンパク質の発現を示す図面に変るＳＤＳゲル写真である。図中、奇数レーンはトータル量を、偶数レーンは上清をそれぞれ表し、第１及び第２レーンはマウス由来の１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基番号１１３番目から２８１番目、第３及び第４レーンは同タンパク質のアミノ酸残基番号１３３番目から２８１番目、第５及び第６レーンは同タンパク質のアミノ酸残基番号１４３番目から２５１番目、、第７及び第８レーンは同タンパク質のアミノ酸残基番号１４３番目から２６１番目、第９及び第１０レーンは同タンパク質のアミノ酸残基番号１４３番目から２７１番目のアミノ酸配列をそれぞれ有するポリペプチドの結果を表す。
図３は、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基番号１３３番目から２５１番目のアミノ酸配列を有するタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣスペクトルを示すグラフである。
図４は、１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基番号１２３番目から２６１番目のアミノ酸配列を有するタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣスペクトルを示すグラフである。
図５は、本発明のドメインタンパク質のリボン図である。
図６は、細胞増殖の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】（本発明のタンパク質）
本発明のタンパク質は、立体構造をもったドメインを形成するタンパク質である。本発明は、より具体的には、配列番号１で表されるＳＥＡ様ドメインタンパク質（１１１０００８Ｉ１４タンパク質の１３３−２５１番目のアミノ酸配列）に関する。なお、１１１０００８Ｉ１４タンパク質とは、ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ００３５７７．１、即ち理化学研究所・ゲノム科学総合研究センターのホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／，ＦＡＮＴＯＭ  ＤＢ  ｃｌｏｎｅ  ＩＤ．１１１０００８Ｉ１４のタンパク質を意味する。
（ＳＥＡ（Ｓｅａ  ｕｒｃｈｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ、Ａｇｒｉｎ）ドメイン）
ＳＥＡドメインは、先に説明したとおり、ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、アグリン、肺ガンのマーカータンパク質であるムチン（ＭＵＣ１）等にみられ、タンパク質に近接する糖鎖成分の結合促進または調節に関与していると考えられる。
ＳＥＡはＯ−グリコシル化に関与する細胞外ドメインであり（例えばＢｏｒｋ  Ｐ．，Ｐａｔｔｈｙ  Ｌ．によるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．４．１４２１−１４２５頁，（１９９５）等参照。）、共通の特徴はこれを有するタンパク質がほとんどグリコシル化されているという点である。さらに、よく解析されているタンパク質は、分子量を大きく左右するヘパラン硫酸などのＯ−グリコシド結合型糖鎖を含有している。
ここで重要なのは、各種ガン細胞において、タンパク質に付加する糖鎖が嵩高くなり、癌特異性を有する事実が良く知られている事である。例えば、ＳＥＡドメインを有するＭＵＣ１は、肺ガン、脳腫瘍やアデノカルシノーマで発現が増強し、糖鎖が嵩高くなっていることが報告されている（Ｃｒｏｃｅ  ＭＶらによる  Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．７（４）２８４−２９１頁（２００１））。このタンパク質は、糖鎖の影響で接着性が高いことから、癌の転移や悪性化に重要な意味を持つと考えられており、このタンパク質への特異抗原による癌の免疫療法も試みられている（Ｈｅｕｋａｍｐ  ＬＣらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｖｏｌ．２５（１）４５−５６頁（２００２））。
これらの癌特異的な糖鎖変化は、糖鎖付加を調節しているＳＥＡドメインの機能に依存していると考えることができる。したがって、本発明のＳＥＡ様ドメインの立体構造を明らかにし、その構造情報を用いることにより、糖鎖付加活性を抑制する活性を持つ化合物の設計・開発等を効果的に行い、これによって癌の転移、悪性化を抑制する薬剤を開発することが可能となる。
また、本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質のいずれかと実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩も提供する。
なお、「本発明のタンパク質と実質的に同一の機能を有する」とは、本発明のタンパク質が有する分子機能などと同種の分子機能などを有することを意味する。ここで、そのような分子機能としては、相互作用分子に対する結合活性、糖鎖修飾機能等が挙げられる。
（タンパク質の配列）
本発明のタンパク質の配列は以下のようにして決定される。
即ち、ｉ）公知のタンパク質配列情報に基づき、対象とする機能を有するドメイン領域を推定した後、ｉｉ）その推定ドメイン領域のアミノ酸配列を基本パターンとするドメイン候補配列パターンを用意し、ｉｉｉ）各配列パターン毎にタンパク質発現を行い、得られたドメインを形成するタンパク質の構造安定性評価により、良好な結果を示すものを目的タンパク質とする。
従って、本発明のタンパク質は、全長タンパク質中のある一部分（ＳＥＡ様ドメインとして機能する部分）を断片化してドメインを形成するタンパク質として発現させた時に、安定な構造を有するものを経験的に選別したものであり、ドメイン領域予測の段階では数１００のオーダーで存在するドメイン候補が、種々の要因により絞り込まれて実際は１０〜数１０のオーダーまで厳選される。このように選別されたタンパク質は、立体構造安定性に優れているので、立体構造解析に用いることにより、高精度で且つ信頼性に優れた構造解析を行うことができる。
（ドメイン領域の推定）
全長タンパク質中のドメイン領域を推定する手法としては、特に限定されるものではなく、例えばバイオインフォーマティクスなどの情報科学的な手法や計算科学的な手法（特願２００１−３０９４３４号明細書参照）、デリーテッド（ｄｅｌｅｔｅｄ）ＤＮＡライブラリとＧＦＰの組み合わせ（特願２００１−０６２７０３号明細書参照）、プロテアーゼによる限定分解などの実験的な手法等、いずれも利用可能である。より精度の高い手法を用いることにより、ドメイン候補群から目的ドメインを選び出す作業効率が向上する。
（ドメイン候補配列パターンの作製）
上記ドメイン候補配列パターンは、例えば、上述のように推定されたドメイン領域を基準にしてドメイン境界の位置をＮ末側又はＣ末側に伸ばしたり縮めたりすることにより作製される。
例えば、推定ドメイン領域のＮ末端側のドメイン境界におけるアミノ酸残基の位置より、Ｎ末端方向に例えば１又は数十残基分伸長させた、又はＣ末端方向に例えば１又は数十残基分短縮させた数種類の境界を新たに設け、それらの境界をＮ末端とするドメイン候補配列パターンが用意される。なお、伸長、短縮するアミノ酸残基の数は、Ｎ末端方向、及びＣ末端方向に例えば１〜２００残基が挙げられ、好ましくは１〜１００残基であり、より好ましくは１〜５０残基である。
同様に、推定ドメイン領域のＣ末端側のドメイン境界においても１又は数種類のドメイン境界を選定し、各境界をＣ末端とするドメイン候補配列パターンが上記Ｎ末端と同様にして作製されることが好ましい。
（ドメイン境界の伸縮）
上記推定ドメイン領域のドメイン境界を伸縮させる方法としては、例えば上記ドメイン候補配列パターンに対応したｃＤＮＡを作成できるＰＣＲプライマーを個々に合成して、ＰＣＲにより作成する方法が挙げられ、特に特願２００１−２０１３５６号明細書に示される２段階ＰＣＲ法が好適である。
（ドメイン候補配列パターンからの目的ドメイン情報の抽出）
このようなドメイン候補配列パターンから実際に安定な立体構造を有する目的ドメインタンパク質を選び出すためには、まず上述のようにして作製されたドメイン候補配列パターンのｃＤＮＡを用いて、それぞれタンパク合成を行う。
このドメイン候補配列パターンの発現系としては、特に限定されず、公知の発現系をいずれも使用可能である。
次に、得られたタンパク質が実際に安定な立体構造をとっているかどうかを判定し、立体構造を有することが確認できたものを本発明のタンパク質として採用する。
このタンパク質の立体構造の安定性の指標としては，例えば合成されたドメインタンパク質が可溶性タンパク質としてＳＤＳゲル電気泳動等により検出され、且つ適当な分子量相当な均一なバンドとして検出されるかという生化学的指標や、Ｃ末端側に融合させたＧＦＰの蛍光強度，ＮＭＲスペクトル，ＣＤスペクトルなどの分光学的手法等が挙げられる。
従来のタンパク質の配列決定の過程では、例えば（１）上記タンパク質合成で、目的とするドメインタンパク質が発現しない、又は（２）発現はしたものの、凝集を起こしたり、溶解度が低い等の問題があった。本発明者等はこのような問題点を克服し本発明を完成させるに至った。
（安定な立体構造を有することの確認）
上記ＮＭＲスペクトルにおいてドメインを形成するタンパク質のフォールディングの判定を以下に示す。
１Ｄスペクトルにおいて、ドメインを形成するタンパク質がフォールドしていない場合は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどのメチル基プロトンに由来するシグナルが０．８ｐｐｍ付近に観測される。しかしフォールドしている場合は、メチル基プロトンの環境が変化し、シグナルが高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）にシフトする。
また、１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣスペクトルにおける判定は、クロスピーク収束度合いとシグナル強度の均一性の評価を目視により行うことが挙げられる。即ち、クロスピークが密集する場合は、立体構造を形成していない状態とし、逆に分散する場合は、安定な立体構造を形成している状態として、立体構造安定性の評価を行う。
（発現系）
本発明のタンパク質は、本発明の発現系を含む一般的な宿主細胞などから公知の手段を用いて製造することができる。このような発現系としては、本発明のポリヌクレオチドを含む発現系や、その発現系を含み公知の手段により製造された宿主細胞、遺伝子組換え技術を用いて本発明のタンパク質を製造し得る発現系、本発明のタンパク質を製造し得る無細胞タンパク質合成系などが挙げられる。
（ベクター）
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子配列を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子配列を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子配列を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれる。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
大腸菌としては、例えばエッシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ６９，２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７５，１９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，１６３−１６８）等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
（抗体）
本発明のタンパク質を抗原として用いて、その抗原に対する抗体を調製することができる。
［本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製］
前記の抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて１００〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなどの非ヒト哺乳動物）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、好ましくは１〜１０回、より好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
［タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製］
上記抗原を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
免疫は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり５０μｇである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、好ましくは１〜１０回、より好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
［細胞融合］
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１５：１〜２５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在のもとで、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
［ハイブリドーマの選別及びクローニング］
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、好ましくは限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
［モノクローナル抗体の採取］
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、好ましくは、ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地又はＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
（本発明のタンパク質の製造）
本発明のタンパク質は、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、好ましくは、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、好ましくは、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
（無細胞タンパク質合成系を用いるドメインタンパク質の製造方法）
本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するドメインを形成するタンパク質、及び配列番号２に記載されたアミノ酸配列のＮ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損し、更にＣ末端から０個〜１０個のアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基数が１２０〜１３９であるタンパク質の製造方法も提供する。
無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。「無細胞タンパク質合成系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、及びＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む。無細胞タンパク質合成系は、系を容易に改変することができるため、目的のタンパク質に適した発現系を構築しやすいという利点がある。なお、無細胞タンパク質合成系の詳細については、特許公開２０００−１７５６９５号公報などに記載されている。
［細胞抽出液］
粗細胞抽出液は、細菌（例えば大腸菌等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であってもよい（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
粗細胞抽出液は、リボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含むことが好ましい。粗抽出液の調製は、例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載の方法を使用できる。具体的には、フレンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら，上掲）やグラスビーズを用いた破砕によって行うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌ＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ株から既知の方法、例えばＰｒａｔｔら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。細胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網状赤血球由来のものが使用される。
［透析装置］
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えばＤｉｓｐｏ  Ｄｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）が挙げられる。
また、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を例示できる。
［透析内液］
無細胞タンパク質合成系における透析内液（すなわち、タンパク質合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含んでもよい。
その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。一方、透析外液（すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ，塩類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
［緩衝液］
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌（回転攪拌など）し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することができる。温度および攪拌速度などの反応条件は、タンパク質の種類に応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃であるが、高度好熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。
また、振とう速度もしくは攪拌速度は、低速、例えば１００〜２００ｒｐｍとすることができる。目的のタンパク質が生成する様子を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
上記無細胞タンパク質合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが好ましい。また、透析膜の分子量限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場合には、タンパク質の生産量をさらに高めることができる。
［タンパク質の精製］
生成タンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法は、タンパク質の性質に応じて従来公知のものを単独にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げることができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。生成タンパク質の同定および定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法としては、本発明のタンパク質またはその塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む前記タンパク質と相互作用を有する化合物のスクリーニング方法が挙げられる。ここで、「相互作用を有する」とは、化合物とタンパク質が結合して、そのタンパク質の分子機能及び／又は生理活性を抑制または増強することなどをいう。このスクリーニング方法においては、そのタンパク質と候補物質を接触させて、そのタンパク質の分子機能及び／又は生理活性が変化するか否かを測定する。
［ＮＭＲを用いた相互作用物質探索］
相互作用物質探索にＮＭＲを用いる場合、候補物質の添加前後でのタンパク質のシグナル変化の有無により、相互作用の有無を判定することができる。即ち、相互作用物質候補がタンパク質と相互作用する場合には，タンパク質の相互作用物質相互作用部位近傍に由来するＮＭＲシグナルの化学シフト値，線幅，個数等に変化が起きることが期待されるので、その変化を検出することで相互作用の有無を判定できる。
特に、１５Ｎで標識したタンパク質は調製が比較的容易であり，そこから得られる１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルは，分解能や感度が比較的高く，添加した相互作用物質由来のＮＭＲシグナルの影響を受けにくいため，その有用性は高い。
（定量方法）
本発明のタンパク質は、例えば本発明の抗体を用いることによっても定量することができる。抗体を用いたタンパク質の定量方法としては、例えば、サンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法、ネフメトリー法などが挙げられる。また、放射性同位体や酵素、蛍光物質などの標識物質を用いて検出することもできる。
（定量方法を用いたスクリーニング方法）
本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合するため、本発明の抗体を用いることで、本発明のタンパク質と相互作用する化合物のスクリーングなどに用いることができる。この際のスクリーニング方法としては、公知のスクリーニング方法を用いることができる。
なお、本発明の抗体を用いた、本発明のタンパク質の定量方法によれば、本発明のタンパク質が関与する疾患の予防・診断を行うことができる。
（立体構造解析）
タンパク質の立体構造は、ＮＭＲによる構造解析、Ｘ線構造解析などによって解析することができる。
（ＮＭＲ）
ＮＭＲに用いる試料としては、特に限定されるわけではないが、好ましくは、タンパク質中の１２Ｃ、または１４Ｎを１３Ｃ、１５Ｎ核で安定同位体標識した試料を用いる（多核多次元ＮＭＲ測定）。タンパク質を安定同位体標識する技術は慣用技術であり、例えば、Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．＆  Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，ｐ．１３９０−１３９９，１９９１等の文献に記載されている。特に、主鎖１５Ｎ均一安定同位体標識したタンパク質試料を用いた解析が容易であり好ましい。また、タンパク質の主鎖の骨格を、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈのうち少なくとも２種類以上の同位体標識したものを使用してもよい（特表２００１−５１４２３９号公報）。
ＮＭＲ測定として、好ましくは、ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトルの観測等による１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数の測定を行う。「ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトル」とは、準位相、反位相の２つのＨＳＱＣスペクトルを同時に観測し、両者のスペクトルの足しあわせをすることにより、シグナルのオーバーラップを防いで、効果的に１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数を読みとるための測定法である。
２種類以上のＮＭＲ法により化学シフト帰属が行われる。例えば、２次元ＮＭＲとしては２Ｄ、ＤＯＱ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ等、多次元ＮＭＲとしては、ＨＮＣＯ、ＨＣＡＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＣＡ（ＣＯ）Ｎ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＨＢ、ＣＢＣＡＮＨ、Ｈ（ＣＡ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＡＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＡＣＯＮ、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ等が公知技術として知られている。ＮＭＲの一般的手法は周知であり、例えば、「タンパク質のＮＭＲ」（共立出版、１９９６、荒田洋治）；「日本生化学会編  基礎生化学実験法第３巻  タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」第１８章ＮＭＲによる立体構造解析（東京化学同人、２００１年２月）；伊藤隆ら、日本農薬学会誌２１，ｐ．４５０−４５９、１９９６；田中俊之、化学と工業  第４９巻  第２号  ｐ．１５５−１５８、１９９６等に詳述されている。
立体構造解析にＮＭＲを用いる場合，タンパク質の各プロトン間の核オーバーハウザー効果の大きさから各プロトン間の距離を見積もり，その距離情報に基づき立体構造を決定する方法が一般的である．化学シフト値，スカラーカップリング値，残余双極子カップリング値，水素結合等の情報を加えて立体構造を精密化することも可能である．
ＮＭＲデータから構造解析を行うためのプログラムとしては、周知のものがいずれも使用可能であり、好ましくは、化学シフト帰属のためのものとして、例えばＮＭＲ  Ｐｉｐｅ、ＰＩＰＰ、Ｃａｐｐ、Ｆｅｌｉｘ、ＮＭＲ  Ｖｉｅｗ、ＸＥＡＳＹ等、また立体構造計算ソフトとしては、例えばＸ−ＰＬＯＲ、ＣＮＳ、ＤＹＡＮＡ，ＤＹＮＡＭＯ等が挙げられる。
（Ｘ線結晶構造解析）
立体構造解析にＸ線結晶構造解析を用いる場合，結晶化させたタンパク質のＸ線回折像に基づき電子密度図を計算し，立体構造を決定する．すなわち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像をもとに、該蛋白質の３次元構造を明らかにしていくものである（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＲＹＳＴＡＬ  ＬＯＧＲＡＰＨＹ，１−５６５頁，（１９７６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
（立体構造情報に基づくスクリーニング方法）
次に、本発明は、前記タンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で検索する工程とを含む、前記タンパク質またはその塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法をも提供する。
（インシリコスクリーニング）
分子の３次元構造に基づく薬物設計については、医薬品の開発・第７巻「分子設計」（廣川書店）をはじめとして数多くの総説がある。具体的には、第一にＦｌｅｘｉＤｏｃｋ、ＦｌｅｘＸ等のフレキシブルリガンドバインディングシミュレーションソフトウエアを用いて、Ｏｒａｃｌｅ等のリレーショナルデータベースに格納された低分子（分子量１０００以下）化合物のライブラリ（たとえば約１５００００種）をコンピュータでスクリーニングする。このライブラリ内の化学物質はＣＯＮＣＯＲＤ等のプログラムで３次元構造を指定し、活性部位にはめ込める物質を選択することができる。選ばれた物質の中からＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩやＭＯＥ等のシミュレーションプログラムを用いて肉眼により更によく活性部位にあてはまる化合物を絞り込む。
一連の過程で利用されるコンピューターソフトウエアとしては、例えばＦｌｅｘｉＤｏｃｋ、Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．ＦｌｅｘＸ、Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．ＣＯＮＣＯＲＤ、Ｔｒｉｐｏｓ  Ｉｎｃ．Ｏｒａｃｌｅ、Ｏｒａｃｌｅ  Ｃｏｒｐ．Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ等の市販のものがいずれも使用可能である。
他の方法は、未知の物質を含めた候補化合物のコンピュータによる設計である。この方法には、メチル、エチル等の化学基を活性部位に並べて適合するものを探す方法と、原子を活性部位にコンピュータプログラムを用いて並べていく方法とが知られている。
（ウェットスクリーニング）
本発明のタンパク質と相互作用する候補化合物の有力候補を選択するために、インシリコスクリーニングにより得られた候補化合物と本発明のタンパク質と接触させ、本発明のタンパク質の分子機能又は生理活性を測定する。更に、候補化合物と本発明のタンパク質の立体構造データをもとに候補化合物を修飾し、より望ましい構造とする。
そして、絞り込まれた化合物を合成し、実際に前記タンパク質と作用させ、スクリーニングする。前記タンパク質の活性を変化させた化合物を、更に動物実験によってインビトロでの活性や、体内動態、あるいは毒性等に関する試験を行う。
（相互作用する物質を含む医薬）
本発明のタンパク質と相互作用を有する物質は、そのタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。そのような医薬は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
（配列の説明）
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
【配列表フリーテキスト】［配列番号１］マウス由来１１１０００８Ｉ１４タンパク質の１３３番目から２５１番目までのアミノ酸配列を示す。
［配列番号２］マウス由来１１１０００８Ｉ１４タンパク質の１２３番目から２６１番目までのアミノ酸配列を示す。
［配列番号３］配列番号１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を示す。
［配列番号４］配列番号２のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を示す
［配列番号５］配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端にリンカー配列が付加したアミノ酸配列を示す。
［配列番号６］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を合成する際に、発現ベクター構築過程における第一次ＰＣＲに使用した５’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号７］配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を合成する際に、発現ベクター構築過程における第一次ＰＣＲに使用した５’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号８］配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を合成する際の上記第一次ＰＣＲに使用した３’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号９］配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンバク質を合成する際の上記第一次ＰＣＲに使用した３’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号１０］上記発現ベクター構築過程における第二次ＰＣＲに使用した５’プライマー２の塩基配列を示す。
［配列番号１１］上記第二次ＰＣＲに使用した３’プライマー２の塩基配列を示す。
［配列番号１２］上記第二次ＰＣＲに使用したユニバーサルプライマーＵ２の塩基配列を示す。
【実施例】  以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
Ｉ．ドメイン領域の推定
ドメイン領域の推定は以下の手順で行った。
まず、問い合わせ配列が、タンパク質データベースＳＣＯＰ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５５）に含まれる配列と相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＳＣＯＰ法＞
次に、問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰＦＡＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．５）に含まれる配列プロファイルと相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＨＭＭＥＲを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＰＦＡＭ法＞
問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰｒｏＤｏｍ（２０００年１月にＷｅｂより取得したバージョン）に含まれるコンセンサス配列のいずれかに対して相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＰｒｏＤｏｍ法＞
また、問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合、その相同性領域をグループとしてまとめ、ドメインとして予測した。＜ＮＲ法＞
更に、問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、相同性が検出された頻度を計算した。頻度の高い部分を山、低い部分を谷として表示し、谷となっている部分でドメイン境界となるように、一つの山をドメインとして予測した。＜ＰＡＳＳ法＞
これら５種類のいずれの方法を用いてもドメインとして検出されなかった領域（残余領域）をドメインとして予測した。＜Ｎｏ  Ｈｉｔ法＞
上記６種類のドメイン予測法について、ヒット領域が重なっている場合の優先順位は、ＳＣＯＰ法を最優先として、以下に続くＰＦＡＭ法，ＰｒｏＤｏｍ法，ＮＲ法，ＰＡＳＳ法，Ｎｏ  Ｈｉｔ法の順序とし、ヒット領域が重なっているものの、ドメイン境界のずれが３０残基以上あり、かつ低い優先度での定義のほうがＮ末側あるいはＣ末側により長く存在している場合は、その差分の配列を別途ドメインとして予測した。＜差分ドメイン境界設定法＞
この時、上述のいずれかの方法で推定されたドメイン領域のうち、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）を１箇所以上有するものや、全長３０残基に未満のものは、除外した。
このような手順に従い、本実施例において用いた１１１０００８Ｉ１４タンパク質についてドメイン予測を行ったところ、アミノ酸残基位置が１３３番目から２６１番目である領域をＰＦＡＭ法によりドメイン領域と推定した。尚、本領域は、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）をもたず、全長も３０残基以上であるため、最終的なバイオインフォーマティクスによるドメイン推定の結果とした。
そこで、このバイオインフォーマティクスの情報を基に、種々の検討を行った結果、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基位置が１３３番目から２５１番目である領域が実際にＳＥＡ様ドメインを構成する領域であることを見出した。
ＩＩ．コンストラクトの作成及びドメインタンパク質の合成
上記推定ドメイン領域におけるアミノ酸配列を基準にし、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸配列に対し、該推定ドメインのドメイン境界の位置をＮ末端およびＣ末端においてそれぞれ数残基ずつ伸ばしたり短縮したりしたコンストラクトを系統的に作成した。
即ち、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸酸残基番号１３３番を基準とし、このアミノ酸残基位置からドメイン境界を１０残基単位でずらし、１１３番，１２３番，１３３番，１４３番とした４通りのパターンと、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸酸残基番号２６１番を基準とし、このアミノ酸残基位置からドメイン境界を１０残基単位でずらし、２５１番，２６１番，２７１番，２８１番とした４通りのパターンとを用意し、これらの組み合わせで計１６通りの配列パターンを用意した。
そして、これら１６通りの配列パターンのコンストラクトを全て発現させ、その発現状態をＳＤＳゲル電気泳動にて評価した。
【実施例１】  本実施例では、上記コンストラクトのうち、立体構造解析に用いて好適な，ＳＥＡ様ドメインを構成する１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）について検討した結果を説明する。
＜発現ベクターの構築＞
（１）第１次ＰＣＲ
１１１０００８Ｉ１４タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ＤＤＢＪ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＫ００３５７７．１、即ち理化学研究所・ゲノム科学総合研究センターのホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／，ＦＡＮＴＯＭ  ＤＢ  ｃｌｏｎｅ  ＩＤ．１１１０００８Ｉ１４）がプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋にクローン化されたプラスミドを含む組換え大腸菌培養液を用い、５’プライマー１（配列番号６），３’プライマー１（配列番号８）を用いて，ＰＣＲを行った．ＰＣＲ反応液組成，およびプログラムを，それぞれ表１および表２に示した．
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（２）第２次ＰＣＲ
次に、上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有する５’プライマー２（配列番号１０）とＴ７ターミネーター配列を有する３’プライマー２（配列番号１１）、ユニバーサルプライマーＵ２（配列番号１２）とを用いて、第２次ＰＣＲを行った。プログラムは上記第１次ＰＣＲと同様であり、ＰＣＲ反応液組成は表３に示す通りとした。
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この結果、Ｔ７プロモータの制御下で、Ｈｉｓタグ配列と１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）との融合タンパク質を発現することのできる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を増幅できた。
（３）クローン化
上記第２次ＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片を，ＴＯＰＯ  ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）により，ベクターｐＰＣＲ２．１（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化することにより、発現ベクターＰ０１１１０９−１６を構築した。
＜透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応による１５Ｎ標識ＳＥＡ様ドメインの合成＞
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙら（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉ，７，２６７−２８７，１９７３）の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ株から調製した。
透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応は、反応液３ｍＬ、透析外液３０ｍＬのスケールで、３０℃で一晩行った。反応液組成および透析外液組成は、それぞれ表４および表５に示した。
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＜ＳＤＳゲル電気泳動による発現状態の判定＞
合成反応終了後、定法に従ってＳＤＳゲル電気泳動を行い、得られたタンパク質の発現状態を判定した。
その結果を図１Ａに示す。図１Ａから、１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）が発現していることが確認できた。この１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）のＳＥＡ様ドメインを形成する領域のアミノ酸配列は配列番号１に示される。
【実施例２】  実施例１における第１次ＰＣＲで用いた５’プライマー１及び３’プライマー１をそれぞれ配列番号７及び配列番号９に示す通りとし、その他は実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとしてタンパク質合成を行った。
そして、合成反応終了後、上述と同様にＳＤＳゲル電気泳動によるタンパク質発現状態の判定を行った。
その結果を図１Ｂに示す。図１Ｂから、１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１２３−２６１）が発現していることが確認できた。実施例２におけるＳＥＡ様ドメインを形成する領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される。
（比較例１〜５）
上述のようにして作成したコンストラクトのうち、１１１０００８Ｉ１４タンパク質のアミノ酸残基番号１１３番目から２８１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドａ（比較例１とする。）、アミノ酸残基番号１３３番目から２８１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドｂ（比較例２）、アミノ酸残基番号１４３番目から２５１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドＣ（比較例３）、アミノ酸残基番号１４３番目から２６１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドｄ（比較例４）、及びアミノ酸残基番号１４３番目から２７１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドｅ（比較例５）について、実施例１と同様にして発現ベクターを構築し、得られた直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を鋳型ＤＮＡとしてタンパク質合成を行った。この際、実施例１における第１次ＰＣＲで用いた各プライマーは、本比較例に適したものとして設計したＤＮＡ配列を有するものにそれぞれ代えた。
そして、得られた試料について、上述と同様にＳＤＳゲル電気泳動によるタンパク質発現状態の判定を行った。
その結果を図２に示す。図２から明らかなように、比較例１，２では各ポリペプチドａ，ｂのアミノ酸配列から求められる分子量ＭＷａ，ＭＷｂに対応する位置（それぞれ、ＭＷａ＝２３．１ｋＤａ，ＭＷｂ＝２０．９ｋＤａ）にバンドが殆ど現れていないことから、目的とするタンパク質が実際に発現していないことがわかった。
また、比較例３〜５では、各ポリペプチドｃ，ｄ，ｅのアミノ酸配列から求められる分子量ＭＷｃ，ＭＷｄ，ＭＷｅに対応する位置（それぞれ、ＭＷｃ＝１６．５ｋＤａ，ＭＷｄ＝１７．６ｋＤａ，ＭＷｅ＝１８．７ｋＤａ）の上清にはバンドが確認できないことから、可溶化するタンパク質が得られていないことが明らかとなった。
ＩＩＩ．構造安定性の評価
＜１５Ｎ標識ＳＥＡ様ドメインの精製＞
続いて、良好な発現状態であることが確認できた実施例１，２における目的タンパク質の精製を行った。
１５Ｎ標識タンパク質ドメインの精製には，ヒスチジンタグとニッケルの親和性を利用した．操作は４℃で行った．まず合成反応終了後，３ｍｌの反応液を４．２ｍｌの洗浄緩衝液［５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／３００ｍＭ塩化ナトリウム／１０ｍＭイミダゾール］で希釈，回収し，１９６０×ｇ，５分間遠心して沈殿を取り除いた．次に，得た上清を０．８ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社）に通して吸着させ，９．６ｍｌの洗浄緩衝液を通すことで夾雑物を除去した．最後に４ｍｌの溶出緩衝液［５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）／３００ｍＭ塩化ナトリウム／５００ｍＭイミダゾール］を通すことでサンプルを樹脂から遊離させた．以上の手順により，０．８８ｍｇの精製サンプルを得た．
＜構造安定性評価のための試料調製＞
精製サンプルをＮＭＲ測定に適した溶媒にするために，２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）／１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液に置換した．その後，サンプルを０．２５ｍｌ（サンプル濃度０．２８ｍＭ）まで濃縮した．以上の操作には限外ろ過装置（ビバスピン２；ザルトリウス社）を用いた．最後に０．０３ｍｌの重水を添加して，構造安定性評価のための試料とした．
＜ＮＭＲ測定による立体構造安定性の判定＞
ＮＭＲ測定用のサンプル管にはシゲミ社の対称型ミクロ試料管（５ｍｍプローブ用）を用いた．ＮＭＲ測定は，６００ＭＨｚのＮＭＲ装置（Ａｖａｎｃｅ６００；ブルカー社）で，温度２５℃のもとで行った．判定には，１Ｈの１次元スペクトル（以後１Ｄスペクトルと略記），および１Ｈ−１５Ｎ２次元ＨＳＱＣスペクトル（以後１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルと略記）を用いたその条件は表６のとおりであった．各実施例１，２の結果を図３，４にそれぞれ示す。
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ＮＭＲ測定の結果，図３，４に示すように、１Ｄスペクトルのメチル領域の高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）に，高磁場シフトしたシグナルが認められた。
また、１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルには，７ｐｐｍから９ｐｐｍにわたって分離したアミドプロトンのシグナルが認められた。
これらのシグナルの現れ方は，安定な立体構造を形成しているタンパク質に特徴的であることから，得られた各１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）（実施例１），１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１２３−２６１）（実施例２）は安定な立体構造を形成していると判定した。
このように、タンパク質全長からコンピュータによりタンパク質の構造・機能を有する構成要素（ドメイン）を予測して、予測した領域を中心にＮ端、Ｃ端へ伸ばしたり短縮したりしたコンストラクトを各種作成し、これらのタンパク質を発現させ、実際に取得したタンパク質の発現状態をＳＤＳゲル電気泳動で確認した。さらに構造を有するか否かはＨＳＱＣスペクトル等のＮＭＲ測定を行い個々のドメインについて確認した。したがって、本発明では、実際に構造をもつ（フォールドする）ドメインのタンパク質配列上の位置を正確に決定できたことが確認された。また、このような分子量の小さいタンパク質を用いることで、全長では難しいとされる立体構造解析を容易に且つ精度良く行うことができるようになった。
ＩＶ．ＮＭＲ法によるＳＥＡ様ドメインの立体構造決定
上述のようにして得られた安定な立体構造を有するＳＥＡ様ドメインについて、１３Ｃ１５Ｎ多核多次元ＮＭＲ法により立体構造解析を行った。
＜立体構造解析のための１３Ｃ１５Ｎ標品の調製＞
全ての炭素核および窒素核はそれぞれ安定同位体である炭素１３、窒素１５によりおよそ１００％置換された，配列番号５に記載のタンパク質を、上述の無細胞タンパク質合成系を用いて上記１５Ｎ標識体の作製と同様にして作成した。ここで、配列番号５に記載されたタンパク質は、配列番号１に記載のタンパク質のＮ末端及びＣ末端にクローニングのためのリンカーのアミノ酸配列がそれぞれ付加されてなるものであるが、これら架橋配列の付加は立体構造に影響を与えないものであり、従って配列番号５に記載されたタンパク質の立体構造を解析することにより実質的に配列番号１に記載のタンパク質の立体構造を解析したこととみなせる。
得られた高純度標品は、高速遠心機用の限外濾過膜付タンパク質濃縮器を用いて、およそ濃度１．５ｍｍｏｌ／ｌになるまで濃縮した。ＮＭＲ解析用標品緩衝液により１０倍に希釈したのち、同様の方法により、もとの濃度まで濃縮した。
この濃縮、希釈の操作を３回繰返し、標品精製用の緩衝液をＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換した。ただし、用いられたＮＭＲ解析用標品緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ｌ燐酸ナトリウム緩衝液  １００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム  １ｍｍｏｌ／ｌヂチオトレイトール  ０．０２％アジ化ナトリウムであり、ｐＨは６．０である。ＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換された標品の最終的な標品濃度およそ１．５ｍｍｏｌ／ｌである。
得られた標品は外径５ｍｍのＮＭＲ測定用試料管に入れた後、２５℃にて２時間保存することにより安定化させた。
＜２次元及び３次元ＮＭＲ測定＞
ＮＭＲ測定には、スイスＢｒｕｋｅｒ社製ＤＲＸ６００およびＤＲＸ８００を使用した。全ての測定において、温度は２５℃とした。
主鎖シグナル帰属を目的としたＮＭＲ測定として、２次元スペクトルとしては１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣを、また３次元スペクトルとしてはＨＮＣＯ，ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ，ＨＮＣＡＣＢ，ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ，Ｈ（ＣＣＣＯ）ＮＨ，Ｃ（ＣＣＣＯ）ＮＨ，１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹを測定した。
また、側鎖シグナル帰属を目的としたＮＭＲ測定として、２次元スペクトルとしては１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ，ＴＯＣＳＹ，ＮＯＥＳＹ，ＤＱＦ−ＣＯＳＹを、３次元スペクトルとしてはＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ，脂肪族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ，芳香族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹを測定した。
＜測定データの解析＞
測定データは米シリコングラフィックス社製ワークステーションＯｃｔａｎｅ２及びＯｒｉｇｉｎ３８００を用いてフーリエ変換計算を行い、それぞれ２次元および３次元スペクトルを得た。
得られたスペクトルデータに基づいて、アミノ酸残基における主鎖シグナルとしてα位およびβ位の炭素核、Ｃα、Ｃβ、カルボニル基の炭素核、Ｃ’、α位およびβ位の水素核、Ｈα、Ｈβ、アミド基の水素核、ＨＮ、アミド基の窒素核、Ｎを連鎖帰属法により帰属した。
今回の連鎖帰属法においては、まずＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ上で隣接残基のＣαおよびＣβシグナルの化学シフト値に一致するシグナルをＨＮＣＡＣＢ上で検索し、自身と隣接する残基とＣαおよびＣβシグナルの連続性を明らかにする。
この操作を繰返すことによりプロリン残基及び何らかの原因でシグナルが観測できない場合を除く全てのＣαおよびＣβシグナルを連続的に帰属できる。
同様の操作をおこなうことにより、ＨＮＣＯとＨＮ（ＣＡ）ＣＯによりＣ’シグナルについての帰属も得ることができる。更に、得られた主鎖帰属情報、及び側鎖帰属用に測定したスペクトルデータを用いてγ位以降γ、δ、ε、ζ、η位の炭素核、窒素核、水素核の帰属を行った。以上の操作によりほぼ全てのアミノ酸残基に対するシグナルの帰属データを得た。また、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ、脂肪族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ，芳香族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹスペクトル上において見出されたＮＯＥピーク群から距離制限データを得た。主鎖帰属の際に得られたＣα、Ｃβ、Ｃ’、Ｈα、Ｈβ、ＨＮ、Ｎシグナルの化学シフト値から、ポリペプチド主鎖二面角であるφ角、およびψ角を高精度で予測するソフトウエアＴＡＬＯＳを用いて、φ、ψ角データを得た。これらシグナルの完全帰属データ、距離制限データ、φ、ψ角データを元に、ＮＯＥの完全自動帰属、およびタンパク質立体構造計算用ソフトウエアであるＡＲＩＡ−ＣＮＳを用いて、ＮＯＥの帰属とドメイン構造の計算を行った。計算には２０７２個の１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥ、１４９３個の１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ  ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥを用いた。得られた立体構造に基づいて、供した距離制限が満たされていないＮＯＥ群を比較検討しながら最適化を行った。
これを繰り返すことで最終的に全ての角度制限と２２７７個の距離制限を用いて計算し、エネルギー的に安定した立体構造２０個を得た。これら構造において二次構造を形成するアミノ酸残基部分の収斂度は、主鎖の原子団に対して０．４５０Å、側鎖を含めた水素原子以外の全原子団に対しては０．９２０Åであった。
得られた立体構造座標を以下の立体構造座標１〜２０に示す。
以下の立体構造座標は、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて記載されているものである。１列目のＡＴＯＭはこの行が原子座標の行であることを示し、２列目はその原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４列目はアミノ酸残基等を、５列目は配列番号５に対応したアミノ酸の番号等を、６，７，８列目はその原子の座標（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）を、９列目はその原子の占有率（本発明においては全て１．００）を、１０列目はその原子の温度因子を示している。最終行は、この表の終わりの行であることを示している。また、最安定構造であった、立体構造座標表１に記載の立体構造のリボン図を図５に示す。
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Ｖ．インシリコスクリーニング
＜データベース最適化＞
低分子化合物データベースの対象データベースとしては、ＳＰＥＣＳ社から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。
１エントリーに複数分子を含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団として用いた。このデータベースには１５２３２３分子が含まれている。
次に、”Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ  Ｒｕｌｅ  ｏｆ  ５”に基づき、上記低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞り込み条件は以下の通りである。
１．分子量１００以上５００以下
２．計算ＬｏｇＰ値（ｏ／ｗ）５以下（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）
３．水素結合アクセプター原子数（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）１０以下
４．水素結合ドナー原子数（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）５以下
更に、ドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外した。
１．回転可能な単結合数が２１以上のもの
２．ラジカルを含むもの
３．Ｈ，Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｆ，Ｓ，Ｐ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ以外の元素を含むもの
絞り込み後の分子数は１０３７７３となった。
＜結合部位予測＞
本発明におけるＳＥＡ様ドメインのβシート面のＬｅｕ６７，Ａｒｇ７０，Ｖａｌ７２，Ｐｈｅ１２４及びＡｓｐ１２６で囲まれる領域には大きな親水性ポケットが形成されており、結合部位予測プログラムＰＡＳＳ，ＳＰＨＧＥＮ，及びＭＯＥのＡＳＦでもいずれも上位に提示されたことから、この領域を結合部位予測の対象とした。
＜スクリーニング＞
（１）一次スクリーニング
Ｄｏｃｋ４．０を用いて、結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリ全体に対してドッキングを行った。この時、Ｄｏｃｋのｅｎｅｒｇｙ  ｓｃｏｒｅに基づいて低分子化合物をランク付けした。
（２）二次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位９７５３分子とデータベース内に含まれるその類似化合物１７９分子について、ＡｕｔｏＤｏｃｋ３．０．５を用いて、詳細なドッキングを行った。
その後、ドッキングの際に使用したスフィアーから４Å以内にある化合物に絞り込み、更に計算が異状終了した分子を除去した。
この結果、最終的に９８７７分子についてドッキング構造を得た。
得られた化合物のうち、ΔＧ（結合自由エネルギー変化）＝−８．５５、Ｋｄ＝約１μＭ以下を化合物選定の基準とし、この基準値より高い結合性を有する化合物１０００個をリガンド候補とした。
ＶＩ．ファーマコフォア定義における重要な残基の探索
ターゲットであるＳＥＡ様ドメインの立体構造座標表１から、Ｄｏｃｋ付属のプログラムＳＰＨＧＥＮによりターゲット表面にスフィアと呼ばれる球状のプローブを生成し，このスフィアとの中心間距離が４．５Å以内のものを選択することにより、ファーマコフォア定義における重要なアミノ酸残基ＡＳＮ１５、ＡＳＮ１７、ＰＨＥ１８、ＴＨＲ１９、ＬＥＵ６７、ＡＲＧ７０、ＳＥＲ７１、ＶＡＬ７２、ＳＥＲ７３、ＡＳＮ７４、ＨＩＳ７８、ＧＬＹ８０、ＡＳＰ８２、ＡＳＰ１１９、ＳＥＲ１２２、ＡＳＰ１２６、ＳＥＲ１２７を求めた。
ＶＩＩ．細胞増殖活性試験
＜細胞培養＞
▲１▼  ＨｅＬａ細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＤ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとでＨｅＬａ細胞を培養した。
▲２▼  ２９３細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、０．１ｍＭのシグマ社製非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、１ｍＭのシグマ社製ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＤ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとで２９３細胞を培養した。
▲３▼  ＣＨＯ細胞
１０％のＩＣＮ社製細胞培養用ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ））、２ｍＭのシグマ社製Ｌ−グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、０．１ｍＭのシグマ社製非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、１ｍＭのシグマ社製ピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、及び１００μｇ／ｍｌのシグマ社製ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含むシグマ社製ダルベッコＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＤ）培地）を用い、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとでＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養した。
＜培養細胞への本発明のタンパク質の遺伝子導入＞
配列番号１に記載の１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）をコードするｃＤＮＡ（配列番号３）をＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡ断片を、インビトロジェン社の導入ベクター（ゲートウェイシステム）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩマルチクローニングサイトにサブクローニングし、ＬＲ反応により目的遺伝子を真核細胞用発現ベクターｐＤＥＳＴ２６（インビトロジェン社製）に移し換えた。続いて、６０ｍｍプレート上に１０５個／３５ｍｍディッシュの密度となるように各細胞を二次培養し、およそ２４時間インキュベートした。ついで、ＬｉｐｏＦｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）を用いて仕様通りにｐＤＥＳＴ２６を細胞へトランスフェクションした。
＜細胞増殖の測定＞
ＳＥＡ様ドメインによる細胞増殖への影響を調べるために、上述のように２９３細胞及びＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞に目的遺伝子をそれぞれ導入したものと、各細胞に目的遺伝子がクローニングされていない発現ベクターｐＤＥＳＴ２６を導入したもの（コントロール）について以下の対照実験を行った。
先ず、遺伝子導入から４８時間後、培地の１０％となるように生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を添加し、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとで３０分間の呈色反応を行い、４５０ｎｍ（参照波長は６００ｎｍ）の吸光度を測定した。測定は、それぞれ３回行い、その結果について平均値と標準偏差を求め、コントロールの測定結果を１００％としたときの相対値により示した。
この結果を図６に示す。図６から、２９３細胞及びＨｅＬａ細胞においては、本発明の１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）をコードするｃＤＮＡが導入された場合は、導入されていない場合（発現ベクターｐＤＥＳＴ２６のみ導入されたもの。図６中に「対照」と記する。）と比較して、生細胞の数が顕著に減少したのに対して、ＣＨＯ細胞では、ｃＤＮＡが導入された場合と導入されていない場合で有意な差が見られなかった。
これは、癌細胞由来のＨｅｌａ細胞や２９３細胞では、卵巣癌診断用マーカーとして知られているＣＡ１２５（ＭＵＣ１６、ＳＥＡ様ドメインを有する全長タンパク質）が発現しており、正常細胞由来のＣＨＯ細胞には内在性のＣＡ１２５が存在していないこと（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１６巻、１３０５〜１３１８ページ、２００３年参照。）に起因すると考えられる。
即ち、Ｈｅｌａ細胞と２９３細胞内に１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）が発現すると、該１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）と内在性のＣＡ１２５とが細胞増殖活性制御に関与するリガンドに対して競合するかたちで共存することとなり、リガンドとの結合活性がより高い本タンパク質の方が先に相互作用し、結果として全長タンパク質ＣＡ１２５のリガンドとの結合を阻害する。このため、全長タンパク質においては、細胞増殖におけるシグナル活性が抑制されるので、結果として細胞数の減少が見られたと推定できる。
これに対して、ＣＨＯ細胞には、内在性のＣＡ１２５が存在しておらず、１１１０００８Ｉ１４タンパク質（１３３−２５１）が発現しても、相互作用を受ける因子がないために、細胞増殖への影響が特に現れなかった。
このことから、全長タンパク質ＣＡ１２５の存在下において本発明のＳＥＡ様ドメインタンパク質を培養動物細胞内で発現させることにより、細胞は増殖抑制性の制御をうけると考えられる。
ＶＩＩＩ．細胞増殖測定によるリガンド候補化合物のＣＡ１２５との結合活性試験
ここでは、培養動物細胞として、内在性のＣＡ１２５が存在する２９３細胞とＣＡ１２５が発現していないＣＨＯ細胞を用い、ＣＡ１２５に含まれるＳＥＡ様ドメインの結合阻害実験を行った。
＜細胞培養＞
上述と同様の方法により、２９３細胞及びＣＨＯ細胞をそれぞれ培養した。
＜細胞増殖の測定＞
上述のインシリコスクリーニングで得られたリガンド候補化合物の中から、Ａｕｔｏ  Ｄｏｃｋによる結合自由エネルギー変化（ΔＧ）及び溶解度などを考慮して選択した複数のリガンド候補化合物を１〜１００μＭの濃度範囲でＤＭＳＯ−ｄ６に最終ＤＭＳＯ濃度が０．１％となるように溶解し、培養細胞に添加した。
上記リガンド候補化合物の添加後、培地の１０％となるように生細胞数測定試薬ＳＦ（ナカライテスク社製）を添加し、５％の二酸化炭素を含む３７℃の湿った環境のもとで３０分間の呈色反応を行い、４６０ｎｍ（参照波長は６００ｎｍ）の吸光度を測定した。測定は、それぞれ３回行い、その結果について平均値と標準偏差を求め、化合物無添加の場合の測定結果を１００％としたときの相対値により示した。
この結果、内在性のＣＡ１２５との相互作用により細胞増殖活性が制御された化合物を以下の表７に、また各化合物の細胞増殖試験の結果を表８にそれぞれ示す。
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表７に示すように、全長タンパク質ＣＡ１２５と相互作用する化合物は、６員環−７員環−６員環の構造を有する化合物が多く見られた。
また、表８の結果から、いずれの化合物においても、内在性のＣＡ１２５が存在する２９３細胞では、至適濃度条件下で細胞増殖抑制的な効果が得られたのに対して、ＣＡ１２５が存在しないＣＨＯ細胞では、細胞増殖について大きな影響が見られないことが明らかとなった。
このことから、本発明のタンパク質（即ちＳＥＡ様ドメイン）の結合ポケットに作用すると予想される上記化合物は、ＣＡ１２５タンパク質中のＳＥＡ様ドメインの相互作用部位に結合し、ＣＡ１２５の細胞増殖活性を阻害する機能を有すると考えられる。
【産業上の利用可能性】  以上のように、全長タンパク質ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）が細胞内に発現していると、細胞増殖が促進的に働くと推定することにより、本発明のＳＥＡ様ドメインとＣＡ１２５とが細胞内で共存した場合の現象が明解に説明することができる。即ち、両者が相互作用因子に対して競合するような状態に置かれると、よりシグナル活性の高いＳＥＡ様ドメインの方がリガンドと結合することにより、全長タンパク質の機能を阻害することにより細胞増殖を抑制すると考えられる。
また、このＳＥＡ様ドメインの立体構造情報に基づくインシリコスクリーニングにより選び出された上述の表７に示す化合物は、細胞増殖活性を阻害することがわかった。
従って、本発明によれば、卵巣癌診断用マーカーとして知られているＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）タンパク質の癌化におけるメカニズムを解明する上で、有効な研究試薬としてのタンパク質やその活性阻害剤を提供することが可能になる。
また、ＭＵＣ１タンパク質においては、抗体を用いた癌の治療方法が既に公表されていることから、本発明のタンパク質は、人体への投与による癌の転移や悪化を防止することが可能な新規癌治療薬としての応用が期待できる。
更に、本発明の化合物は、卵巣ガンの腫瘍マーカーであるＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）の結合阻害剤として動物細胞内で機能を発揮することが確認できたことから、本発明は新規な卵巣ガンの抗ガン剤を開発する上でも非常に重要である。
以上説明したように、本発明のタンパク質ドメインは生理的に意味のある構造を有し、タンパク質の分子機能を有していることから、このタンパク質ドメインはそのタンパク質と相互作用する生理活性物質のスクリーニングに用いることができる。また、本発明のタンパク質ドメインの立体構造解析を行うことにより、該ドメインに作用する化合物をコンピュータ上で探索・設計することが可能となる。
これらの結果により、本ドメインタンパク質及び／又は本ドメインタンパク質を含んだ天然のタンパク質と相互作用する化合物をスクリーニングすることができる。
したがって、本発明によるタンパク質ドメインを提供することで、タンパク質の構造−機能解析を基礎としたゲノム創薬を効果的に行うことができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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