(57)【要約】本発明の課題は、多能性幹細胞から内胚葉系幹細胞を分化させ、単離調製することである。本発明では、多能性幹細胞から分化させた種々の内胚葉系幹細胞を、特別な細胞表面マーカー、オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンの発現様式を指標に選別することにより、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた内胚葉系幹細胞であって、オルガナイザー特異的マーカー陽性およびＥ−カドヘリン陽性である細胞。
【請求項２】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
オルガナイザー特異的マーカーがグースコイドである、請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
オルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されている、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項４記載の細胞。
【請求項６】
ａ）多能性幹細胞を培養し、
ｂ）オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンを発現している細胞を選別し分離する、
ことを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法。
【請求項７】
選別段階においてセルソーターを用いる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上の無血清培地中、アクチビンの存在下に多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
請求項１から５までのいずれか記載の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法。
【請求項１０】
コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上の無血清培地中、アクチビンの存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分化させる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項９または１０記載の調製方法により得られる内胚葉細胞。
【請求項１２】
多能性幹細胞から目的の中間幹細胞を調製する方法であって、
ａ）多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、
ｂ）該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
中間幹細胞が内胚葉系幹細胞である、請求項１２または１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、多能性幹細胞からインビトロにおいて分化した中間幹細胞の混合物から高度に精製された内胚葉系幹細胞、および目的の幹細胞を調製する方法に関する。
発明の背景
哺乳類では、原腸胚形成期にダイナミックな形態の変化と共に、内胚葉、中胚葉、外胚葉と呼ばれる３胚葉が形成される。内胚葉は将来、胃、腸管、肝臓、膵臓、大腸に分化する組織である。他の組織同様に重要な組織であり、したがって内胚葉を分離し増殖させるシステムの開発は、薬物の開発、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばインスリン産生細胞の開発、そして臨床的にも重要な課題である。
１部の内胚葉組織はマウスにおけるオルガナイザー領域から分化することが判明している。オルガナイザー（形成体）とは１９２４年、ＳｐｅｍａｎｎとＭａｎｇｏｌｄらによりその存在が報告された体軸形成の指導的役割を果たす細胞組織群の総称である。すなわち、１つの胚の原口背唇（ｄｏｒｓａｌ  ｂｌａｓｔｏｐｏｒａｌ  ｌｉｐ）を別の胚に移植すると移植場所に二次軸の形成が起こる。その後の研究によりオルガナイザーはゼブラフィッシュ、ニワトリなど種を超えて存在することが明らかとなった。マウスにおいては、原条（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｓｔｒｅａｋ）の先端部分に形成される特別な組織形態をもつ結節（Ｎｏｄｅ）がこの役割の１部を担うことが判明している（Ｃｅｌｌ，１９９９，Ｖｏｌ．１９６，ｐｐ．１９５−２０９）。Ｎｏｄｅ細胞は体軸形成に関わるだけでなく、将来軸索中内胚葉（ａｘｉａｌ  ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）と呼ばれる組織へと分化するが、ここからは主に中胚葉と内胚葉組織が分化増殖してくる。
マウスではオルガナイザー特異的な細胞は１個体あたりの細胞数が少ないことから、その取り扱いは困難であり、よってオルガナイザー関連細胞についての分化、増殖に関する分子生物学的メカニズムは不明な点が多い。そこで、限られた細胞数しか分離できないという問題点を解決するために、直接個体から分離することが困難な細胞を胚性幹細胞を用いて純化する研究を行った。
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＥＳ細胞）とは、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化する。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生３．５日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持しつつ、増殖を維持できる。マウス胚性幹細胞は、発生３．５日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、インビボで再びすべての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分化させることが可能になっている（例えば、西川伸一ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８，１２５号、ｐｐ．１７４７−１７５７、仲野徹ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４、２６５号、ｐｐ．１０９８−１１０１、江良択実ら、Ｂｌｏｏｄ，２０００，９５号，ｐｐ．８７０−８７８）。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。
胚性幹細胞を強制的にインビトロで分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグループの研究で明らかとなった。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階にある幹細胞（中間幹細胞）を経て完全な成熟細胞に至ると考えられているが、その分化過程には未だ不明な点が多い。
そして、現在までにこの胚性幹細胞から純度の高い内胚葉細胞を直接分離した報告はなく、その開発は急務である。
【発明の開示】
本発明者らは、胚性幹細胞のインビトロ分化システムを用い、内胚葉細胞の同定、純化と分化能の解析を行った。残念ながら、現在まで内胚葉特異的な細胞表面マーカーは発見されていない。そこで、上記オルガナイザーに特異的に発現する遺伝子の１つであるグースコイド（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｇｓｃ）遺伝子にマーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子をノックイン（Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）した胚性幹細胞を作製し、内胚葉細胞の同定、純化を試みた。その結果、胚性幹細胞から分化させた内胚葉系幹細胞が、オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンを発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
即ち、本発明は、
（１）  多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた内胚葉系幹細胞であって、オルガナイザー特異的マーカー陽性およびＥ−カドヘリン陽性である細胞；好ましくは、
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、オルガナイザー特異的マーカーがグースコイドである、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、および／またはオルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されている細胞；
（２）  ａ）多能性幹細胞を培養し、ｂ）オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンを発現している細胞を選別し分離することを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法；  好ましくは選別段階においてセルソーターを用いる方法、さらに好ましくは、コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上の無血清培地中、アクチビンの存在下に多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる方法；
（３）  本発明の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法；好ましくはコラーゲンＩＶでコートした培養プレート上の無血清培地中、アクチビンの存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分化させる方法；さらに好ましくは、アクチビンとともｂＦＧＦ（塩基性フィブロブラスト成長因子）の存在下に内胚葉系幹細胞を培養することにより、内胚葉系幹細胞を内胚葉細胞に分化させる方法；より好ましくは、アクチビンとしてアクチビンＡを用いる方法；およびこれらの調製方法により得られる内胚葉細胞；ならびに
（４）  多能性幹細胞から目的の幹細胞を調製する方法であって、ａ）多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、ｂ）該標識タンパク質の標識を指標に目的の幹細胞を選別し分離することを特徴とする方法；  好ましくは、多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質である方法、に関する。
【図面の簡単な説明】  図１Ａ  グースコイド遺伝子のノックイン胚性幹細胞を組立てるスキームである。
図１Ｂ  ＧＳＣ遺伝子をプローブに用いた、相同組換え胚性幹細胞のサザーンブロッティング分析の結果を示す。
図２  分化誘導によるＧＦＰ陽性細胞の出現を示す細胞選別、およびＧＦＰ陽性細胞でのみグースコイドが発現していることを示すＲＴ−ＰＣＲの結果である。
図３  細胞選別して得られたＧＦＰ陽性細胞における遺伝子発現パターンを示す。
図４  アクチビンＡを添加した無血清培地によるＧｓｃ−ＧＦＰ陽性細胞の分化誘導の結果を示す。
図５  アクチビンＡの濃度依存的にＧＦＰ陽性細胞の割合が増加する結果を示す。
図６  ＧＦＰ陽性細胞の分化誘導に与えるＢＭＰ−４とｂＦＧＦの影響を示す。
図７  ＧＦＰ陽性細胞のＥ−カドヘリンの発現パターンを示す。
図８Ａ  ＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陽性細胞からの上皮様細胞の分化およびその細胞形態を示す。
図８Ｂ  ＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）陽性細胞からの上皮様細胞における細胞系列特異的な遺伝子の発現を示す。
【発明を実施するための最良の形態】（１）本発明は、多能性幹細胞からインビトロにおいて分化させた内胚葉系幹細胞であって、オルガナイザー特異的マーカー陽性およびＥ−カドヘリン陽性である細胞を提供する。
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも１つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ：ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＡＰＳ細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものを使用する。
本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚性幹細胞を使用してもよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。
本明細書において、「内胚葉系幹細胞」は、内胚葉系の組織に属する細胞に分化する中間幹細胞であって、中胚葉および外胚葉系の組織に属する細胞には分化しない細胞を意味する。母体内のマウスの発生では、発生６．５日から７．５日にかけて起こる原腸胚形成の際、胞胚を形成する上皮組織の一定領域から離脱した予定中胚葉細胞が胚の内部に入り込み、予定外胚葉と予定内胚葉の間を移動して予定中胚葉を形成する。これら予定外胚葉、予定内胚葉および予定中胚葉を構成する細胞がそれぞれ、外胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞および中胚葉系幹細胞である。
本明細書において、「中間幹細胞」は、多能性幹細胞の分化が進んだ細胞であって、外胚葉、中胚葉または内胚葉系幹細胞のいずれか１つ、あるいはこれらの混合物を意味する。従って、中間幹細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉細胞のいずれか１つに分化する能力を有する細胞と表すことができる。
細胞移植治療のためには、試験管内（インビトロ）において胚性幹細胞を分化させ、特定の胚葉系に分化する中間幹細胞を出現させ、さらにそれを精製して１種類の中間幹細胞を調製することが求められる。細胞移植治療に利用される細胞材料として、中間幹細胞は成熟細胞よりも以下の点において利用価値が高い。
１．ほとんどの組織の成熟細胞の増殖能は低いが、中間幹細胞のインビトロでの増殖能ははるかに高い。即ち、適切な条件さえ整えば、インビトロで強制的に増幅させることが可能となる。
２．１種類の中間幹細胞が多種類の成熟細胞に分化するので、治療効果を比較した場合、少ない細胞でより高い成果をあげることが可能である。
本明細書において、「オルガナイザー特異的マーカー」とはオルガナイザーに特異的に発現しているタンパク質を意味し、マウスの場合、グースコイド（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｇｓｃ）、ＨＮＦ−３β、およびＬｉｍ１を包含する。グースコイド遺伝子はホメオボックスドメインをもつ転写因子であり、オルガナイザーに発現する遺伝子の中でもオルガナイザーに特異的に発現することが判明している（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｌｅｗｉｓ  Ｗｏｌｐｅｒｔ  ＯＸＦＯＲＤ  Ｐｒｅｓｓ，２００２，ｐ１０５）。本発明に使用するオルガナイザー特異的マーカーは１つであっても、２以上であってもよい。
オルガナイザー特異的マーカーであるＨＮＦ−３βはＡｎｇ，Ｓ．−Ｌ．ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．（１９９４），Ｃｅｌｌ  ７８，５６１−５７４、およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｃｅｌｌ  ７８，５７５−５８８）等に、Ｌｉｍ１はＳｈａｗｌｏｔ，Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４，４２５−４３０にそれぞれ記載されている。
Ｅ−カドヘリンは、細胞間の接着を担う膜貫通型の膜タンパク質であり（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９７：１３，１１９−１４６）、Ｅ−Ｃａｄを欠損したマウスは、極めて早い時期の胎生致死であることが知られている。
この態様では、オルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質が融合されているか、あるいはマーカー遺伝子が標識タンパク質遺伝子で置き換えられている（ジーンノックアウト法）細胞が好ましい。標識タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、あるいは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）にて利用可能なあらゆるタンパク質、例えばｄｓＲＥＤを利用できる。融合は当業者に周知の遺伝子工学的手法、例えば相同組換え、遺伝子導入により行うことができる。
本明細書において、ある分子について「陽性（＋）」とは、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性（−）」とは、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、ＦＡＣＳ等により判定できる。
本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養および／または分化させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。
（２）本発明は別の態様として、ａ）多能性幹細胞を培養し、ｂ）オルガナイザー特異的マーカーおよびＥ−カドヘリンを発現している細胞を選別し分離することを特徴とする、内胚葉系幹細胞の調製方法を提供する。
上記の調製方法では、好ましくはオルガナイザー特異的マーカーに標識タンパク質を融合させておくか、あるいはマーカー遺伝子を標識タンパク質遺伝子で置き換えておく（ジーンノックアウト法）。この場合、標識タンパク質の標識を指標としてセルソーター、好ましくは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により目的の細胞を選別する。
ＦＡＣＳは、通常、フローサイトメーター、レーザー発生装置、光学系、データ処理装置および細胞分取装置を備えている。ＦＡＣＳの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。ＦＡＣＳにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射し、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。ＦＡＣＳの装置はＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ等から市販されており、製造者の指示に従って当業者が操作することが可能である。
Ｅ−カドヘリン陽性は、抗Ｅ−Ｃａｄ抗体を使用して判定する。また、その分子発現に基づいて細胞を選別するためには、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用できる。
本発明で使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、ＦＡＣＳで使用する場合、モノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、実施例に記載の方法を参照して当業者が作成することができるが、市販のものを使用してもよい。抗Ｅ−カドヘリンモノクローナル抗体は宝酒造から市販されており（品番Ｍ１０８）、あるいは当業者に周知の手法により容易に調製できる。
Ｅ−カドヘリン陽性は、Ｅ−カドヘリンの細胞内ｍＲＮＡの存在を指標にして選別することも可能である。
胚性幹細胞の培養には、細胞の維持または分化の目的に適する組成の培地を使用する。胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、ＬＩＦ、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、組成の一例を挙げると、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦである。また、胚性幹細胞分化用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、ＬＩＦを含有しない。組成の一例を挙げると、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンである。各培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、各成分に代えて、同等の機能を有する代替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
本発明による胚性幹細胞の培養方法における具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）、Ｈｏｇａｎ，Ｇ．ら編：マウス胚の操作：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９９４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９８７）などの記載を参酌して適宜に決定することができる。
本発明のある実施態様では、胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させる段階が含まれる。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、典型的には、コラーゲンＩＶでコートした培養容器内、アクチビンの存在下に、ＬＩＦ不含の無血清培地を使用して胚性幹細胞を培養する。ここに使用するアクチビンはＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子ベーター）ファミリーに属する大きさ２４ｋＤのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、２個のベーターサブユニットがＳＳ結合を介して２量体を構成している（Ｌｉｎｇ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７９−７８２；Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，７７６−７７９）、本発明においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのいずれでも、またヒト、マウス等いずれの動物由来のものをも使用でき、これらはＲ＆Ｄから市販されている。このなかで、アクチビンＡが好適に用いられる。使用する多能性幹細胞の由来する動物種と同じ由来のアクチビンを用いるのが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒトアクチビンＡを用いるのが好ましい。アクチビンの濃度は１０ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌが最も好ましい。それよりも低濃度でも誘導は起こるが、陽性細胞の割合が低い。
また、アクチビンとともｂＦＧＦ（塩基性フィブロブラスト成長因子）の存在下に多能性幹細胞を培養すれば、より好適に内胚葉系幹細胞へと分化させることができる。ｂＦＧＦはＲ＆Ｄから入手できる。ｂＦＧＦの濃度は１０ｎｇ／ｍｌ以上が好ましく、１０ｎｇ／ｍｌが最も好ましい。
このような条件で胚性幹細胞を培養すると、マウスの胚性幹細胞では、通常４−６日目に本発明による精製に適する内胚葉系幹細胞の数が最適となる。あるいは、従来から行われている胚体形成法（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によっても、胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させることができる。また、効率は低いが、コラーゲンＩＶをゼラチンやフィブロネクチン等に代えても胚性幹細胞を内胚葉系幹細胞に分化させることができる（例えば、Ｗｉｌｅｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１，２５９−２６７，１９９１参照）。
（３）本発明は別の態様として、本発明の内胚葉系幹細胞を分化させ、目的の内胚葉細胞を調製する方法、およびこの調製方法により得られる内胚葉細胞を提供する。
この分化方法は上記と同様の手法により行えばよい。
本発明の内胚葉系幹細胞から分化して得られる内胚葉細胞は、将来、胃、十二指腸、腸管、肝臓、膵臓、大腸に分化する細胞であり、それは、薬物の開発、ホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばインスリン産生細胞としての利用、あるいは臨床的な利用があり得る。
（４）本発明は別の態様として、多能性幹細胞から目的の中間幹細胞を調製する方法を提供する。この態様における目的の中間幹細胞は外胚葉、中胚葉または内胚葉細胞のいずれか１つに分化する能力を有する。この方法は、ａ）多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにする。所定のマーカー遺伝子としては外胚葉、中胚葉、内胚葉系幹細胞のいずれか１つに特異的に発現するマーカー、例えば外胚葉系幹細胞であれば特異的マーカー遺伝子ＳＯＸ１を、中胚葉系幹細胞であれば特異的マーカー遺伝子ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１を、内胚葉系幹細胞であれば特異的マーカー遺伝子ＧＡＴＡ４またはＳＯＸ１７を用いることができる。標的タンパク質の遺伝子導入は通常、相同組換えが用いられ、他にプロモーターをつないだＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ法を用いることができる。
次いで、該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離する。ここでは、多能性幹細胞が胚性幹細胞であり、標識タンパク質が緑色蛍光タンパク質である方法が好ましい。
この態様における方法は、多能性幹細胞から中間幹細胞の前駆細胞（外胚葉、中胚葉または内胚葉系幹細胞のいずれか２つに分化できる段階の細胞）を調製する方法にも応用可能である。即ち、本発明は、多能性幹細胞から中間幹細胞の前駆細胞を調製する方法であって、ａ）多能性幹細胞のゲノム中、所定のマーカー遺伝子の発現系に適合するように標識タンパク質の遺伝子を導入し、それにより所定のマーカー遺伝子の代わりに、またはそれとともに該標識タンパク質が発現されるようにし、ｂ）該標識タンパク質の標識を指標に目的の中間幹細胞を選別し分離することを特徴とする方法をも包含する。
以下の実施例は、本発明の１態様を示すと共に、本発明の方法によって調製した内胚葉系幹細胞が成熟細胞への分化能を有することを証明するものである。
【実施例】参考例１  胚性幹細胞の維持
ａ．材料
胚性幹細胞の維持には、表１の試薬および器具を使用した。
2004104184.tif 000002
2004104184.tif 000003
胚性幹細胞の維持用培地の組成は、８９％  Ｇ−ＭＥＭ、１％  ＦＢＳ、１０％  ＫＳＲ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡおよび１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦであった。
胚性幹細胞としては、マウス１２９系統由来のＥＢ５細胞（Ｎｉｗａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９８，１２；２０４８−２０６０）を使用した。
ｂ．操作
６ｃｍディッシュをゼラチンでコートした。このディッシュに２ｘ１０５のＥＢ５胚性幹細胞を播種した。翌日、１度培地を交換した。２日目でコンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離し、再び２ｘ１０５の濃度で、ゼラチンコートされたディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。
参考例２  胚性幹細胞の無血清培地での分化誘導
ａ．材料
胚性幹細胞の分化誘導には、表２の材料を使用した。
2004104184.tif 000004
2004104184.tif 000005
ｂ．  胚性幹細胞の分化用培地
ＳＦ−０３粉末に１リットルの蒸留水を加え、付属のＮａＨＣＯ３  ２．２ｇを加えて撹拌した。次に、二酸化炭素ガスを培地の色がオレンジ色になるまで加えた。ＢＳＡを濃度が０．１％、２ＭＥが１０−４Ｍになるように加え、３０分以上撹拌した。最後にろ過滅菌した。
ｃ．分化誘導操作
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆１０ｃｍディッシュに１ｘ１０５のＥＢ５胚性幹細胞を播種した。３−６日目に細胞分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を分離し、その後の実験に使用した。
参考例３  ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅによるＧＦＰ陽性細胞あるいはＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陽性細胞の選別
ａ．試薬の調製
表３の試薬を使用した。
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脱イオン水９００ｍｌに対して１００ｍｌの１０ｘハンクス緩衝液と１０ｇのＢＳＡ（終濃度１％）を加えてよく撹拌した。ＢＳＡが溶解した後、０．２μｍフィルターを用いて滅菌した。得られた溶液を以下、ＢＳＡハンクス緩衝液と称する。
ｂ．操作
分化３−６日目の分化誘導した胚性幹細胞を細胞分離緩衝液を用いてばらばらに分離した後、１度１％ＢＳＡハンクス緩衝液で洗浄した。次に、１０６あたり１ｍｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、ＧＦＰ陽性細胞を細胞選別にて回収する。また、Ｅ−カドヘリンに対する抗体染色を行う場合には、マウス血清を１０６あたり１０μｌ加え、氷上にて２０分インキュベートしてブロッキングを行った。次に、ビオチン標識したＥ−カドヘリンの抗体を加え、氷上にて２０分インキュベートした。２０分後、１度１％ＢＳＡハンクス緩衝液で洗浄した。ストレプトアビジン−アロピコシアニン（Ａｌｌｏｐｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＡＰＣ）を含む５００μｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に再溶解し、氷上にて２０分インキュベートした。最後に、２回１％ＢＳＡハンクス緩衝液で洗浄し、１０６あたり１ｍｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。なお、標識色素がＰＥ（フィコエリスリン）でも同様の結果であった。
ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。ノズルの振動の頻度は２６０００程度、レベルは３Ｖ、ｄｒｏｐ  ｄｅｌａｙは約１２−１４で行った。
参考例４  グースコイド陽性細胞の維持・分化
グースコイド（Ｇｓｃ）陽性細胞の維持・分化には、表４の試薬および器具を使用した。
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ｂ．操作
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆１０ｃｍディッシュに、細胞選別したＧＦＰ陽性細胞を播種した。
ｃ．Ｇｓｃ陽性細胞  維持・分化培地
維持・分化用培地の組成は、９０％  αＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンであった。
【実施例１】グースコイド−ＧＦＰノックイン胚性幹細胞の樹立
常法（例えば、Ｇｕ  Ｈ，Ｚｏｕ  ＹＲ，Ｒａｊｅｗｓｋｙ  Ｋ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７３，１１５５−１１６４）に従い、マウスグースコイド遺伝子の開始コドンＡＴＧに合わせて緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ））遺伝子を挿入した組立て物を作成し、胚性幹細胞に導入して相同組換えクローンを得た（図１Ａ）。
目的のクローンであることは、ＧＳＣ（グースコイド）遺伝子をプローブに用いたサザーンブロッティング分析により選別した。相同組換えが起こっていない正常細胞ではＨｉｎｄＩＩＩ消化により６．５ｋｂ長の断片が出現するのに対し、相同組換えクローンでは６．５および５．５ｋｂ長の２種類の断片が出現する（図１Ｂ）。さらに、ＮＥＯ遺伝子が完全に除かれているかを確認するため、ＮＥＯプローブでサザンブロッティングを行い、シグナルの消失を認めた（図１Ｂ右）。
上記操作を行った胚性幹細胞を、コラーゲンＩＶ被覆培養プレートにＬＩＦなしで、血清を加えた分化用培地とともに加え、３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養すると、４日目に約３％のＧＦＰ陽性細胞を認めた。この細胞をＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いて細胞選別し、ＲＴ−ＰＣＲ法にてグースコイド遺伝子の発現を調べた。その結果、ＧＦＰ陽性細胞でのみグースコイドの発現が見られた（図２）。これにより、ＧＦＰの発現がグースコイドの発現と一致していることが確認された。
次いで、このＧＦＰ陽性細胞が他のＮｏｄｅ（結節）細胞特異的遺伝子を発現しているかを同様にＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した（図３）。興味深いことにこの細胞はＮｏｄｅ細胞特異的遺伝子のみならず内胚葉特異的マーカー遺伝子（ＧＡＴＡ４、Ｓｏｘ１７）も特異的に発現していた。この遺伝子発現のパターンはＮｏｄｅ細胞とその子孫細胞のパターンに類似している。これにより、この細胞群がいわゆる中内胚葉の細胞を含んでいることが判明した。
【実施例２】ＧＳＣ陽性細胞の純化条件の確立
実施例１にて示されるように、血清添加培地ではＧＦＰ陽性細胞が２−３％と出現はするもののその割合は低い。まず血清ありの状態でアクチビンＡ、ＢＭＰ−４（骨形成タンパク質−４）、ＢＭＰ−２、ＬｉＣｌ等の添加で変化が見られるか比較検討した。しかし、アクチビンＡで多少の効果が見られたのみであり、大きな効果は観察できなかった。そこでＧＳＣ−ＧＦＰ陽性細胞を出現させる培養条件の検討を無血清培地を使い、同様のアクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２、ＬｉＣｌ等で比較検討した。詳細には、ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆ディッシュにグースコイドノックイン胚性幹細胞をＬＩＦなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときアクチビンＡを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で０日目から添加しておいた。２日目から６日目までのＧＦＰの発現をＦａｃｓを用いて解析した。その結果、アクチビンＡを加えた場合、６日目に９７％の細胞にＧＦＰの発現が誘導された（図４）。一方、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２、ＬｉＣｌでは誘導されなかった。さらに、アクチビンＡを０、０．３、１、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で０日目から添加しておく実験を同様に行い、４日目でＧＦＰの発現をＦａｃｓを用いて解析した。これにより、アクチビンＡの濃度依存的にＧＦＰ陽性細胞の割合が増加することが判明した（図５）。このようにして得られた細胞の遺伝子発現は、血清添加時に得られたＧＦＰ陽性細胞と同じく、Ｎｏｄｅ細胞特異的遺伝子であるＨＮＦ−３β，Ｌｉｍ１、および内胚葉特異的遺伝子であるＧＡＴＡ−４，Ｓｏｘ１７を発現していた。
次に、ＧＦＰ陽性細胞の分化誘導に与えるＢＭＰ−４とｂＦＧＦ（塩基性フィブロブラスト成長因子）の影響を調べた。
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆ディッシュにグースコイドノックイン胚性幹細胞をＬＩＦなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときアクチビンＡを３ｎｇ／ｍｌと一定の濃度で、ＢＭＰ４とｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。ＢＭＰ４添加時では、Ｇｓｃ−ＧＦＰ陽性細胞の割合が減少し、抑制効果があるのに対し、ｂＦＧＦ添加時では、逆にアクチビンＡ単独添加時よりも増強された（図６）。このことから、ＧＦＰ陽性細胞の分化誘導はあらゆる成長因子で誘導されるわけではなく、アクチビンＡとｂＦＧＦがその能力をもつことが分かる（ｂＦＧＦは補助的であるが）。
【実施例３】ＧＦＰ陽性細胞から内胚葉細胞の分離と増殖
ＧＦＰ陽性細胞の分化能を解析するため、内胚葉と外胚葉に発現しているＥ−カドヘリンの発現パターンが胚性幹細胞の分化に伴ってどのように変化するか解析した。ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆ディッシュにグースコイドノックイン胚性幹細胞をＬＩＦなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときアクチビンＡを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で０日目から添加しておいた。４日目、５日目、６日目にＧＦＰの発現とＥ−カドヘリンの発現をＦａｃｓを用いて解析した。４日目ではＧＦＰ陽性細胞のほとんどＥ−カドヘリン陽性であった。分化が進むにつれ、ＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陰性細胞が出現し、その割合が増加した（図７）。この結果は、グースコイドが中内胚葉に発現することと考えあわせるとＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陽性の細胞は内胚葉系の細胞であることを示すと考えられた。
次いで、ＧＦＰ陽性の中でＥ−カドヘリン陽性と陰性の細胞からの上皮様細胞への分化を試みた。
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶ被覆ディッシュにグースコイドノックイン胚性幹細胞をＬＩＦなしで無血清の状態で分化誘導用培地を用いて分化誘導を開始した。このときアクチビンＡを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で０日目から添加しておいた。６日目にＧＦＰ陽性細胞Ｅ−カドヘリン陽性細胞とＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陰性細胞をそれぞれ、Ｅ−カドヘリンの抗体で染色し、ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅを用いて細胞選別により純化した。これらの細胞を血清入りの分化用培地で培養するとＥ−カドヘリン陽性分画からは上皮様の細胞のみが効率に出現してきたのに対し、Ｅ−カドヘリン陰性分画からは、このようなの上皮様の細胞の出現はほとんど観察できなかった（図８Ａ）。これは、ＧＦＰ陽性細胞Ｅ−カドヘリン陽性細胞のほうから優先的に上皮様細胞が出現してくることを意味する。
次に、この上皮様の細胞の細胞系列を調べるために、細胞系列特異的な遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法にて解析した。その結果、内胚葉特異的マーカーであるＨＮＦ３ｂ、Ｓｏｘ１７、ＧＡＴＡ４が発現しているものの、肝細胞や膵臓の細胞で発現する分子の発現は見られなかった（図８Ｂ）。細胞形態（図８Ａ）と、この遺伝子発現のパターンより、６日目のＧＦＰ陽性Ｅ−カドヘリン陽性から分化した上皮様の細胞は、内胚葉細胞であることが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明の内胚葉系幹細胞は内胚葉細胞に分化し、得られた内胚葉細胞は、将来、胃、十二指腸、腸管、肝臓、膵臓、大腸に分化する細胞である。この内胚葉細胞は薬物の開発に利用でき、あるいはホルモンや生理活性物質等の産生細胞、例えばインスリン産生細胞としての利用、または臨床的に利用することができる。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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