(57)【要約】本発明において、ＮＦκＢに対するデコイを使用することにより、ＮＦκＢにより活性化される転写を調節（抑制）し、移植片における新生内膜肥厚を抑制する方法を提供する。また、本発明は、ＮＦκＢのデコイを含有する血管移植片の内膜肥厚に対する保護剤に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管または血管移植片の一部における転写因子ＮＦκＢにより活性化される転写を調節する方法であって、該移植片を転写因子ＮＦκＢに対するデコイと接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
該血管または血管移植片の一部が静脈移植片である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該血管または血管移植片の一部をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＮＦκＢに対するデコイと接触させることを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
圧力介在（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）法によりＮＦκＢに対するデコイを血管または血管移植片に導入する、請求項１〜３いずれか一項記載の方法。
【請求項５】
転写因子ＮＦκＢに対するデコイとの接触によって、移植片における新生内膜肥厚を抑制する、請求項１〜４いずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ＮＦκＢのデコイを含有する血管移植片の内膜肥厚に対する保護剤。
【請求項７】
該血管移植片が静脈移植片である、請求項６記載の保護剤。
【請求項８】
圧力介在法により血管または血管移植片にＮＦκＢに対するデコイを導入するための、請求項６または７記載の保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、血管または血管移植片の一部における転写因子ＮＦκＢにより活性化される転写を調節する方法に関する。特に、静脈移植片におけるＮＦκＢにより活性化される転写をＮＦκＢに対するデコイを圧力介在（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）法により血管または血管移植片に導入することにより、移植片における新生内膜肥厚を抑制する方法に関する。また、本発明は、ＮＦκＢのデコイを含有する血管移植片の内膜肥厚に対する保護剤に関する。
【背景技術】  従来、虚血性疾患の治療法として冠状動脈の再建、膝下の膝窩動脈及び脛骨動脈の再建が行われている。これらの再建においては、主に自家内胸動脈や大伏在静脈が利用されることが多い。しかしながら、血管形成術、動脈バイパス術、器官の移植の後に、血管平滑筋細胞の増殖などにより血管が肥厚し、血管の閉塞がしばしば起こることが知られている。特に、冠動脈バイパス移植（ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｂｙｐａｓｓ  ｇｒａｆｔｉｎｇ；ＣＡＢＧ）の移植片として用いられる伏在静脈移植片（ｓａｐｈｅｎｏｕｓ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔ；ＳＶＧ）は、内胸動脈等の動脈移植片を用いた場合と比べると長期開存率が劣り、現在では、動脈導管が利用されることが多くなっていることが報告されている（Ｈａｍｂｙ  Ｒ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ６０：９０１−９（１９７９）；Ｖｉｒｍａｍｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｃｌｉｎ．１８：４１−５９（１９８８）；Ａｃｉｎａｐｕｒａ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒ．３（４）：３２１−５（１９８９）；Ｌｏｏｐ  Ｆ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１４：１−６（１９８６）；Ｌｙｔｌｅ  Ｂ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．８９：２４８−５８（１９８５）；Ｇｒｏｎｄｉｎ  Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７８（Ｓｕｐｐｌ  Ｉ）：Ｉ２４−Ｉ２９（１９８９））。このような静脈移植片病（ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＶＧＤ）が予防されれば、その優れた応用性のため静脈移植の役割は高まると考えられる。
ＶＧＤにおいては、動脈循環に静脈移植片を適用することにより顕著な新脈管内膜肥厚による静脈移植片の狭窄が観察される。動脈循環における静脈移植片の組織学的変化はＣｏｘらにより調べられている。彼らは、マクロファージ及び好中球の浸潤を伴う線維内膜肥厚が１年以内に起こること、及び１年以上後にはアテローム性動脈硬化が主な病変を占めることを示した（Ｃｏｘ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｉｄｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．３４：４５−６８（１９９１））。そして、Ａｎｇｅｌｉｎｉらにより、中膜（ｍｅｄｉａｌ）及び脈管内膜の肥厚に形態学的に３つの工程が寄与していることが報告されている。第一の工程は、移植から一週間後くらいに起こる、中膜における急激な平滑筋細胞増殖である。次の段階は、移植後１〜４週間の間に起こる、中膜及び新脈管内膜の両方における平滑筋細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、肥厚、及び細胞外マトリックスの合成である。最後に、移植から４週間後に、よりゆっくりとした新脈管内膜における平滑筋細胞増殖という後期の段階に到る（Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０３：１０９３−１０３（１９９２））。
このような内膜肥厚病変の発生および進展の機序は完全に明らかにされているわけではないが、血管内皮への物理的傷害が引き金となり、血管平滑筋細胞の異常増殖が誘発されると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８０１（１９９３））。動脈性硬化性内膜肥厚や再狭窄は、血管の内皮傷害が最大の原因であると考えられている。特に静脈移植片の場合には、動脈循環への適用による張力及び剪断力の変化、並びに手術による血管壁の内皮が喪失し、機能障害を受けることにより、炎症性サイトカイン及び成長因子が活性化され、血管中膜層から中膜平滑筋細胞が分化、増殖、及び遊走して、内膜層で増殖を重ねることによって内膜肥厚が形成されると考えられている（Ｂｒｙａｎ  Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｇ．Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．９：６４１−９（１９９４）；Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．９９：４３３−９（１９９０）；Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５３：８７１−４（１９９２）；Ｗａｔｅｒｓ  Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．５６：３８５−６（１９９３）；Ｏ’Ｎｅｉｌ  Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０７：６９９−７０６（１９９４）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｌ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１５：１７６−１８６（１９９２）；Ｇａｌｔ  Ｓ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１７：５６３−７０（１９９３）；Ｓｏｙｏｍｂｏ  Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２７：１９６１−７（１９９３））。
遺伝子の発現は、遺伝子の転写調節領域に結合する転写調節因子により制御されている。転写調節因子の一つとして知られる蛋白質ＮＦκＢは、ｐ６５とｐ５０のサブユニットからなるヘテロ二量体である（Ｓｅｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４６：７０５−１６（１９８６））。ＮＦκＢは細胞が外から刺激を受けた場合の一次応答のスイッチとして機能すると考えられている。ＮＦκＢは細胞質中に発現された後、リン酸化により活性化され、核内へ移行しゲノムＤＮＡ上のκＢモチーフと呼ばれる約１０塩基からなる特異的塩基配列に結合して種々の遺伝子の転写を活性化する。ＮＦκＢの刺激で転写される遺伝子として、（１）インターロイキン１、２、３、６、８、１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、リンホトキシン−α、インターフェロン−α等のサイトカイン、（２）顆粒球コロニー刺激因子、単球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球・単球マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン２等の受容体、（３）補体因子Ｂ、Ｃ３、Ｃ４、α１酸糖蛋白質等のストレス蛋白質、（４）ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン等の白血球接着分子、（５）主要組織適合複合体クラスＩ及びＩＩ、Ｔ細胞受容体α及びβ、β２ミクログロブリン等の免疫調節分子等が知られている（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９：８０（１９９８））。
従来ＮＦκＢの転写活性を阻害する物質としては、ＮＦκＢ結合性蛋白質（ＥＰ第５８４２３８号公報）が知られており、また、非ステロイド系薬物であるアスピリン及びサリチル酸ナトリウムは高濃度でＮＦκＢの活性を阻害する（Ｋｏｐｐ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：９５６（１９９４））。さらに、ステロイド系薬物デキサメサゾンは、細胞質内でＮＦκＢと結合し、ＮＦκＢを不活性複合体の形態に維持する制御サブユニットＩκＢの産生を誘導することによりＮＦκＢの活性化を阻害すると報告されている（Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ  Ｒ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２８３（１９９５）；Ａｕｐｈａｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２８６（１９９５））。
一方、特異的な転写因子による遺伝子の転写の活性化を特異的に妨げる方法の一つとして、シスエレメントデコイ（ｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｃｏｙ）を用いた方法がＷＯ９５／１１６８７号明細書に開示されている。シスエレメントデコイ、特異的転写因子に対して結合性を有する二本鎖ＤＮＡ分子である。細胞に対して多量のシスエレメントデコイを供給することにより、転写因子はゲノム上の標的配列ではなく該シスエレメントデコイに対して結合することとなり、該転写因子による遺伝子の転写活性化が妨害される。また、本発明者らによりＮＦκＢに対するデコイを用いることにより、転写調節因子ＮＦκＢに起因する様々な疾患、例えば、虚血性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、ガンの転移浸潤、悪液質等の疾患を治療及び予防できることが示されている（ＷＯ９６／３５４３０号明細書）。
【特許文献１】  特表平８−５０２６５３号公報
【発明の開示】
血管内膜肥厚を放置すると、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、大動脈瘤、下肢閉塞性動脈硬化症等が誘発される可能性があり、臨床上大きな問題となる。内膜肥厚や再狭窄を防ぐために全身薬物療法、例えば、抗血小板剤、血液凝固阻止薬、コルチコステロイド、及びカルシウムチャンネル遮断剤等についての検討が従来より成されている。また、内膜細胞の欠如、及び、血小板の活性化は新脈管内膜形成と密接に関っている（Ｌｕｓｃｈｅｒ  Ｔ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．８：９６３−７４（１９９３））。新脈管内膜肥厚はｅＮＯＳ遺伝子（Ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙｅｎ  Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１３７−４１（１９９５））、または抗ＰＤＧＦ（ｆｅｒｎｓ  Ｇ．Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１２９−３２（１９９１））、若しくは抗ｂＦＧＦ抗体（Ｏｌｓｏｎ  Ｎ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：１０１７−２３（１９９２））の導入により抑制されることが知られている。また、その他の新生内膜肥厚を抑制する手法として、ラットの傷害血管に対しＥ２ＦデコイをＨＶＪ−リポソーム法により導入した例（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：５８５５−９（１９９５））、ウサギの頚静脈にｓｄｉ−１（ｐ２１）遺伝子をＨＶＪ−リポソーム法により導入し、頚動脈に自家移植した例（Ｂａｉ  ＨＺ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６６（３）：８１４−９  Ｓｅｐ；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ８１９−２０（１９９８））、ラットの傷害血管に対しＮＦκＢデコイをＨＶＪ−リポソーム法により導入した例（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（２１）Ｎｏｖ：１６３５−４２（２００１））、及びヒトの静脈グラフトにＥ２Ｆデコイを圧力介在（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）法により導入した例（Ｍａｎｎ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５４：１４９３−８（１９９９））が知られている。
ＮＦκＢは、好中球及びマクロファージ化学走性因子、接着分子、並びに細胞周期を調節する遺伝子の発現にも関与しているようである。静脈移植病の機構においては、術後一週間目に好中球及びマクロファージの移動に続いて迅速に平滑筋細胞の増殖が中膜で起こり、静脈移植から１〜４週目の間に中膜及び新脈管内膜の両方で細胞外マトリックスが合成される。従って、最低術後４週間の間に中膜におけるＮＦκＢの活性化を抑制することにより、ＣＡＢＧで用いられる伏在静脈移植片おける過剰な新脈管内膜肥厚形成及び続いての促進されたアテローム性動脈硬化を予防できるかも知れないと考えた。そこで、ＣＡＢＧ後のＶＧＤの減弱を目的として、発明者らは実際のＣＡＢＧを模倣する実験用ＣＡＢＧモデルをイヌを用いて作成し、圧力介在トランスフェクション法（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を改変し、ＮＦκＢデコイのＶＧＤに対する効果をイヌＣＡＢＧモデルの静脈移植壁中にＮＦκＢを改変圧力介在術中トランスフェクションする方法により調べた。
その結果、従来ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、または代替的な非冠動脈バイパスモデルで研究されていたＮＦκＢデコイのＶＧＤ予防効果が大動物モデルにおいて証明された。この結果により、ＮＦκＢデコイのトランスフェクションにより中膜平滑筋細胞の分化及び増殖が抑制されるだけでなく、新脈管内膜中の細胞外マトリックスの過剰な産生も抑制されることが組織病理学的方法により証明された。そして、ＮＦκＢデコイを導入した群における新脈管内膜形成は、スクランブルデコイを導入した群のそれと比べて有意に抑制されていた。従って、ＮＦκＢの活性化により静脈移植片中の中膜平滑筋細胞の分化及び増殖が引き起こされること、並びに、ＮＦκＢデコイのトランスフェクションにより新脈管内膜形成が効果的に減弱されることが示唆された。
本発明者らにより、ＮＦκＢデコイの静脈移植片壁へのトランスフェクションの新脈管内膜形成、中膜平滑筋細胞の分化及び増殖における４週間にわたる予防効果が証明され、ＣＡＢＧ後の静脈移植片における新脈管内膜肥厚を減弱するためにＮＦκＢデコイを臨床的に適用できる可能性が示唆された。従って、本発明により以下の方法及び保護剤が提供された。
（１）血管または血管移植片の一部における転写因子ＮＦκＢにより活性化される転写を調節する方法であって、該移植片を転写因子ＮＦκＢに対するデコイと接触させる工程を含む方法。
（２）該血管または血管移植片の一部が静脈移植片である、（１）記載の方法。
（３）該血管または血管移植片の一部をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＮＦκＢに対するデコイと接触させることを含む、（１）または（２）記載の方法。
（４）圧力介在（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）法によりＮＦκＢに対するデコイを血管または血管移植片に導入する、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）転写因子ＮＦκＢに対するデコイとの接触によって、移植片における新生内膜肥厚を抑制する、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）ＮＦκＢのデコイを含有する血管移植片の内膜肥厚に対する保護剤。
（７）該血管移植片が静脈移植片である、（６）記載の保護剤。
（８）圧力介在法により血管または血管移植片にＮＦκＢに対するデコイを導入するための、（６）または（７）記載の保護剤。
本発明で使用するＮＦκＢのデコイとしては、染色体上に存在するＮＦκＢの核酸結合部位と特異的に拮抗する作用を有する化合物で特に限定されない。例えば、核酸及びその類似体がそのような化合物として挙げられる。オリゴヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また天然に存在する核酸のみならず、核酸修飾体や擬核酸を含んでいてもよい。さらに、このようなオリゴヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖でも良く、線状でも環状であっても良い。このようなＮＦκＢのデコイは、ＮＦκＢにより認識される結合部位（内因性配列）に配列または構造のいずれかが似ているものである。即ち、このようなデコイのヌクレオチド配列は、ＮＦκＢにより認識され結合するのに十分に相同的な配列を含むものである。
ＮＦκＢにより認識される内因性の配列としてはＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号：１）が挙げられる。本発明のデコイ配列としては、ストリンジェントな条件下で該内因性配列と結合する配列を挙げることができる。このようなデコイ配列は、好ましくは内因性配列と５０％以上同一であり、より好ましくは７０％以上同一であり、さらに好ましくは９０％以上同一である。さらに、このような化合物には上記配列の変異体が含まれる。ここで、変異体とは、上記配列の一部が欠失、置換、付加または／及び挿入により変異しているものであり、ＮＦκＢが結合する核酸結合部位と特異的に拮抗する核酸を意味する。一方、蛋白質により認識される核酸配列の構造特性は、核酸デコイの折り畳み、ループ構造、よじれ、十字型、ヘリックス構造等により模倣することができ、必要に応じ架橋剤等の非核酸成分により構造を安定化することも可能である。
より具体的には、本発明のＮＦκＢのデコイとしては内因性結合配列ＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号：１）またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチド（例えば、実施例で用いた５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号：２））等を挙げることができる。特定のヌクレオチド配列を認識する核酸結合蛋白質の結合親和性は、結合部位に近接する核酸領域の配列により増強されることが知られている。従って、必要に応じＮＦκＢの結合を促進するような配列を、上述の内因性配列、または内因性配列の類似体に対して配置することも可能である。ＮＦκＢのデコイとしては、上記配列を１つまたは数個含む２本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明のＮＦκＢのデコイとして機能するオリゴヌクレオチドには、生体内における分解を抑制するためにリン酸ジエステル結合部の酸素原子をイオウ原子に置換したチオリン酸ジエステル結合を含むオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、及び、リン酸ジエステル結合を電荷のないメチルホスフェートで置換したオリゴヌクレオチド等が包含される。
本発明で用いられるＮＦκＢデコイの製造は、通常のオリゴヌクレオチド化合物の製造で利用される化学的合成法または生化学的な合成法に従い行うことができる。例えば、核酸からなるＮＦκＢの製造は、遺伝子工学的な手法により、例えばＤＮＡ合成装置を用いて達成され得る。また、必要に応じ合成したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該核酸を増幅することもできるし、適当なクローニングベクターに該ＤＮＡを挿入して増幅してもよい。さらに、得られた核酸を制限酵素等により切断したり、ＤＮＡリガーゼ等を用いて結合したりすることにより、所望の核酸を得ることもできる。細胞内で安定なオリゴヌクレオチドとするために核酸の塩基、糖、リン酸部分を化学修飾（アルキル化、アシル化等）することもできる。
本発明のＮＦκＢデコイを含有する保護剤は、ＮＦκＢデコイを単独で含有することも可能であるが、必要に応じ、少なくとも１種類以上の添加剤及び／または助剤を含む形態とすることもできる。ここで、添加剤や助剤としては、例えば脂質、カチオン性脂質、ポリマー、核酸アプタマー、ペプチド及び蛋白質のような核酸の細胞中への移行を増大させたり、特定の細胞へ特異的に組成物が運搬されるようにしたり、細胞内における核酸の分解を抑制したり、細胞内における核酸の核への移行を促進したり、保存時に核酸を安定化したりすることができる化合物が挙げられる。
本発明のＮＦκＢに対するデコイを含有する保護剤は、患部の細胞または組織に取り込まれるような形態であればその形態は特に制限されず、単独または適当な担体と混合して局所投与、非経口投与、外用または経口投与され得る。例えば、溶剤、懸濁剤、シロップ剤、リポソーム製剤（Ｓｚｏｋａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉ，．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６０１：５５９（１９８０）［逆相蒸発法］；Ｄｅａｍｅｒ  Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３０８：２５０（１９７８）［エーテル注入法］；Ｂｒｕｎｎｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５５：３２２（１９７６）［界面活性剤法］）、乳剤等の液体の形態、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤等の固形であってもよい。このような製剤形態においては、必要に応じ、種々の担体、助剤、安定化剤、潤滑剤等の添加剤を加えることができる。本発明のＮＦκＢに対するデコイを含有する保護剤は、好ましくは圧力介在トランスフェクション法により患者に投与される。ＮＦκＢに対するデコイは、例えば、生理食塩水溶液中へ浸漬させ、圧力介在トランスフェクション法において１０〜５００ｍｇ、５〜３０分の条件で患者の血管または血管移植片へ導入することができる。
本発明のＮＦκＢに対するデコイと接触させる血管または血管移植片としては、内胸動脈、大伏在静脈を含む種々の血管が挙げられる。特に、静脈由来の移植片においては、本発明のＮＦκＢデコイを含有する保護剤の効果が大きいことが予測され、静脈由来の移植片は本発明の対象血管移植片として特に好ましい。
本発明のＮＦκＢデコイを主成分とする製剤は、血管または血管移植片における内膜肥厚を阻止するのに十分な量のＮＦκＢデコイを含有する。ＮＦκＢデコイの投与量は、患者の年齢、病状、及び体重等の条件、使用するデコイの種類、並びに投与形態等により変化するが、当業者であればそれらの条件を勘案し、適当な量を選択することができる。圧力介在トランスフェクション法により本発明のＮＦκＢを含有する保護剤を投与する場合、一般に、１０〜５００μｍｏｌ／ｌの濃度で生理食塩水溶液などへ浸漬させて、投与することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、圧力介在トランスフェクションの方法を模式的に示す図である。
図２は、下行大動脈と左前下行冠動脈の間に伏在静脈移植片を挿入したイヌＣＡＢＧモデルを示す写真である。
図３は、組織病理学的研究の結果を示す写真である。３−１−ａ及びｂは、ＦＩＴＣ−ＯＤＮｓの圧力介在トランスフェクションの効率をＦＩＴＣ標識ＯＤＮｓを用いて組織化学的に評価した結果を示す。３−２−ａ及びｂは、新脈管内膜肥厚をヘマトキシリンエオシン染色により評価した結果を示す。３−３−ａ及びｂは、中膜平滑筋細胞の増殖をα−アクチン染色により評価した結果を示す。３−４−ａ及びｂは、新脈管内膜中の細胞外マトリックス余剰産生をＭａｓｓｏｎ三色染色により評価した結果を示す。
図４は、中膜領域に対する新脈管内膜領域の割合を示す図である。
図５は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）指数（％）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】１）デコイの調製
実験には以下の配列の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用いた。
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手術の日まで、これらのデコイは−２０℃で保存し、トランスフェクションするまで４℃に置いた。トランスフェクションのために、室温下で０．９％生理食塩水注射溶液で４０μｍｏｌ／Ｌの濃度に調製した。
２）圧力介在トランスフェクションの条件検討
圧力介在トランスフェクションについてはＭａｎｎらにより詳細なデータが報告されている（Ｍａｎｎ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４１１−６（１９９９））。予備的に、種々のトランスフェクション圧力及び時間におけるトランスフェクション効率を調べた。この予備的な実験で示されたトランスフェクション効率は、２００ｍｍＨｇの圧力下、２０分という条件でもＭａｎｎらにより示された３００ｍｍＨｇ圧力下、１０分という条件と比べて大差はなかった（データ示さず）。むしろ、肢動脈バイパス移植手術における圧力介在トランスフェクションを３００ｍｍＨｇ圧力下、１０分の条件で行った場合、静脈移植片の新脈管内膜形成はＮＦκＢデコイをトランスフェクトした群でも非常に顕著であり、スクランブルデコイをトランスフェクトした群では６検体のうち３検体が完全に閉塞された。そのため、３００ｍｍＨｇ圧力下１０分という条件は、少なくとも冠動脈バイパス移植の静脈移植片へのデコイのトランスフェクションには最適なものではないと考えられた。そこで、以下の実験においては２００ｍｍＨｇ圧力下２０分という条件でトランスフェクションを行った。
３）イヌＣＡＢＧモデル
体重１８〜２０ｋｇの雑種のイヌ（ＮＲＢ；Ｎｉｈｏｎ  Ｎｏｓａｎ，Ｋａｎａｇａｗａ，ＪａｐａｎまたはＨＢＤ；Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を標準食で飼育したものを利用した。ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ体重，筋肉注射）で麻酔した後、気管内挿管を行った。１．５％セボフルランの吸入で通常麻酔下に維持し、伏在静脈移植片をイヌの左後肢から回収した。伏在静脈をおよそ１０ｃｍ露出するために肢の外側を前後軸方向に切断した。周囲の組織から静脈を”未接触技術（ｎｏ  ｔｏｕｃｈ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）”（Ｇｏｔｔｌｏｂ  Ｒ．，Ｍｉｎｅｒｃａ  Ｃｈｉｒ．３２：６９３−７００（１９７７））により切り離し、４−０シルク結紮糸を用いて全ての側枝を結紮した。その後、イヌから静脈を回収し、ヘパリン化０．９％塩溶液で膨張させずに洗浄した（Ａｎｇｅｌｉｎｉ  Ｇ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２１：９０２−７（１９８７））。その後、前静脈を同じ溶液中、室温で約６０分間置いた。左第４肋間を開胸し、スクランブルデコイ（ＳＤ群；ｎ＝５）またはＮＦκＢデコイ（ＮＤ群；ｎ＝５）溶液（４０μｍｏｌ／Ｌ）を静脈移植片壁へＭａｎｎらの方法（圧力介在トランスフェクション；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６４１１−６（１９９９））に従い、室温、２０００ｍｍＨｇの圧力で２０分間かけて静脈移植壁へ導入した（図１）。ヘパリン（１００ユニット／ｋｇ体重）を静脈注射した後、伏在静脈移植片を下行大動脈（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ  Ａｏ．）と左前下行冠動脈（ＬＡＤ）の間に、心肺バイパス及び心停止なし（心鼓動下）で挿入した。即ち、静脈移植片及び左前下行冠動脈の間の末端一側部吻合を心鼓動下、７−０Ｐｒｏｌｅｎｅ（Ｅｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を”Ｏｃｔｏｐｕｓ”（Ｍｅｄｏｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）スタビライザーを用いて行い、静脈移植片の他の末端を下行大動脈に６−０Ｐｒｏｌｅｎｅを用いて末端一側部の形で縫い付けた。ＬＡＤの隣接部は４−０Ｐｒｏｌｅｎｅで縫合した（図２）。
手術３日後に、イヌに抗生物質（ＣＥＺ，Ｆｕｊｉｓａｗａ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）を投与した。術後４週間後にイヌを屠殺し、移植片を丁寧に回収した。実験は、大阪大学医学部動物実験委員会により承認されたガイドラインに従って行った。全ての動物は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより作成された”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ”及び米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から発行された『動物実験に関する指針”Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ”』（ＮＩＨｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．８６−２３，改訂１９８５）に沿って取り扱った。移植片を解離し、０．９％生理食塩溶液で簡単に洗浄した。その後、移植片の真中部分を３つの部分、およそ５ｍｍの厚さに分けた。各部分を液体窒素に入れた凍結型中で、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）中に凍結した。
４）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）の圧力介在トランスフェクションによる分布
各移植片の新たに凍結した塊からの横断切片（厚さおよそ５μｍ）における、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）の圧力介在トランスフェクションによる分布を蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ＯＤＮｓ（ＦＩＴＣ−ＯＤＮｓ）を用いて組織化学的に評価した（図３−１−ａ，ｂ）。ＦＩＴＣ−ＯＤＮｓの圧力介在トランスフェクションによる分布を評価した後、同じ横断切片をヘマトキシリン  エオシン（ＨＥ）で染色した。その後、デコイのトランスフェクション効率を計算した。ＦＩＴＣ陽性の核の数と、ヘマトキシリン陽性の核の数をＮＩＨ  ｉｍａｇｅで×２００の倍率で数えた。デコイのトランスフェクション効率（全核数に対するＦＩＴＣ陽性核数の割合として定義される）の平均は７７±２０％であった。
５）新脈管内膜及び中膜領域の測定
各移植片の新たに凍結した塊からの横断切片（厚さおよそ５μｍ）をＨＥで染色し、新脈管内膜及び中膜領域、並びに中膜に対する新脈管内膜の割合をこれらのＨＥ染色した横断切片を用い、コンピューターイメージ解析ソフト”ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ”により測定した。ＮＤ群の新脈管内膜肥厚はＳＤ群と比べて有意に抑制されていた（図３−２−ａ，ｂ）。術後４週間に測定した横断切片中の新脈管内膜及び中膜の平均領域を表１に示す。
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術後４週間に測定した横断切片の新脈管内膜及び中膜の平均領域を示す。ＮＤ群の平均新脈管内膜領域はＳＤ群のそれと比べて有意に抑制されていた（＊ｐ＜０．０５  対ＳＤ群）。
さらに、中膜領域に対する新脈管内膜領域の割合を図４に示す。ＮＤ群の中膜領域に対する新脈管領域の割合（新脈管内膜領域（ｍｍ２）／中膜領域（ｍｍ２）は０．６２±０．４３であり、ＳＤ群の１．４５±０．４５に比べて有意に勝っていた（＊ｐ＜０．０５）。全ての数値は平均±ＳＤとして表現される。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｎｏｎｐａｉｒｅｄ  Ｔテストを２つの群の比較に用いた。統計的有意差は、Ｐ＜０．０５とした。
６）免疫組織化学研究
６−１．中膜平滑筋細胞の増殖
中膜平滑筋細胞の増殖を平滑筋特異的α−アクチンに対するモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学的に評価した。凍結切片（厚さおよそ５μｍ）を新しく凍結した組織の塊から切出し、α−アクチン平滑筋特異的α−アクチンに対するモノクローナル抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ，Ｎｉｃｈｉｒｅｉ，Ｊａｐａｎ）、免疫組織化学染色は免疫ペルオキシダーゼアビジン−ビオチン複合体系において、塩化ニッケル顔料を用いてＢａｉらの方法（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１４：１８４６−５３（１９９４））を改変して行った。染色の結果は、コンピューターイメージ解析ソフド”ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ”で測定した。α−アクチン染色によりＮＦκＢデコイのトランスフェクションにより中膜平滑筋細胞増殖が抑制される傾向にあることが示された（図３−３−ａ，ｂ）。
６−２．中膜平滑筋細胞の分化及び増殖
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対するモノクローナル抗体（ＰＣ−１０，ＤＡＫＯ）を平滑筋細胞、並びに、分化及び増殖細胞の特異的マーカーとして用いる以外は、上記５−１におけるα−アクチン染色と同様の手順によるＰＣＮＡ染色を行った。中膜中のＰＣＮＡ陽性の核、及びヘマトキシリン陽性の核の数をＮＩＨ  ｉｍａｇｅにより×２００の倍率で数えた。細胞増殖の頻度はＰＣＮＡ指数で表現した。ＰＣＮＡ指数は、中膜中の全核数に対するＰＣＮＡ陽性の核数の割合として定義する。
中膜平滑筋細胞の分化及び増殖を、術後４週間の横断切片についてＰＣＮＡに対するモノクローナル抗体を用いて評価した。ＮＤ群のＰＣＮＡ指数は１３±４＊％であり、ＳＤ群の５６±２４％より低かった（＊ｐ＜０．０５  対ＳＤ群）（図５）。全ての数値は平均±ＳＤとして表現される。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｎｏｎｐａｉｒｅｄ  Ｔテストを２つの群の比較に用いた。統計的有意差は、Ｐ＜０．０５とした。
６−３．細胞外マトリックス染色
細胞外マトリックス染色としてマッソン三色染色を行った。Ｍａｓｓｏｎ三色染色では、ＮＤ群において新脈管内膜中の細胞外間トリックスの過剰な産生の抑制が観察された（図３−４−ａ，ｂ）。
【産業上の利用の可能性】
従来ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、または代替的な非冠動脈バイパスモデルで研究されていたＮＦκＢデコイのＶＧＤ予防効果が大動物モデルにおいて証明された。本発明により、ＮＦκＢデコイのトランスフェクションにより中膜平滑筋細胞の分化及び増殖が抑制されるだけでなく、新脈管内膜中の細胞外マトリックスの過剰な産生も抑制されることが組織病理学的方法により証明された。本発明により、ＮＦκＢデコイの静脈移植片壁へのトランスフェクションの新脈管内膜形成、中膜平滑筋細胞の分化及び増殖における予防効果が証明され、ＣＡＢＧ後の静脈移植片における新脈管内膜肥厚を減弱するためにＮＦκＢデコイを臨床的に適用できることが示された。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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