(57)【要約】本発明は、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有する新規なパエニバチルス属微生物、およびマルトースのみに作用し、マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解する新規なマルトースホスホリラーゼ、並びにトレハロースのみに作用し、トレハロース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解する新規なトレハロースホスホリラーゼ、並びにこれらの酵素の製造方法を提供する。  この酵素は、従来の方法に比較し酵素の取得が容易であり、培養時間も大幅に短縮することができ、かつ、高い温度安定性を有し、両者がほぼ同じ最適ｐＨ範囲を有している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物。
【請求項２】
微生物が、パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５）（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４２０）である、請求の範囲第１項記載のマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有する微生物。
【請求項３】
以下に示す理化学的性質を有するマルトースホスホリラーゼ。
（イ）作用：マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、トレハロース、シュークロース、ラクトース、セロビオースなどには作用しない。
（ハ）最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．５〜６．５である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜７．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２０〜６０℃である。分解反応の最適温度は４５〜５５℃であり、合成反応の最適温度は５０〜５５℃である。
（ホ）温度安定性：ｐＨ６．０、１５分間の加熱条件下では５０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。
（ヘ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約８９，０００〜９０，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量は約１９０，０００ダルトンであり、ホモ２量体から構成されている。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこの配列中の１個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲第３項記載のマルトースホスホリラーゼ。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列と５２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第３項記載のマルトースホスホリラーゼ。
【請求項６】
請求の範囲第３項記載のマルトースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群、
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、より選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第６項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項８】
請求の範囲第７項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項９】
以下に示す理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼ。
（イ）作用：トレハロース中のα−１，１−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：トレハロースに作用し、マルトース、シュークロース、ラクトース、セロビオースなどに作用しない。
（ハ）最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．８〜７．８である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜９．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２５〜７０℃である。分解反応の最適温度は５０〜６５℃であり、合成反応の最適温度は４５〜６０℃である。
（ホ）温度安定性：ｐＨ７．０、１５分間の加熱条件下では６０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。
（ヘ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約８９，０００〜９０，０００ダルトンであり、ゲル濾過法による分子量は約１９０，０００ダルトンであり、ホモ２量体から構成されている。
【請求項１０】
配列番号３で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、請求の範囲第９項記載のトレハロースホスホリラーゼ。
【請求項１１】
配列番号３で示されるアミノ酸配列と６３％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第９項記載のトレハロースホスホリラーゼ。
【請求項１２】
請求の範囲第９項記載のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記（ｄ）〜（ｆ）からなる群、
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｆ）配列表の配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
より選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求の範囲第１３項記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１５】
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、請求の範囲第３項若しくは第４項に記載のマルトースホスホリラーゼおよび／または請求の範囲第９項若しくは第１０項に記載のトレハロースホスホリラーゼの少なくとも一つを生成・蓄積させ、これを採取することを特徴とする、マルトースホスホリラーゼ若しくはトレハロースホスホリラーゼまたは両者の混合物の製造方法。
【請求項１６】
前記培養を、マルトースを含む炭素源の存在下で行い、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを生成・蓄積させることを特徴とする、請求の範囲第１５項に記載のマルトースホスホリラーゼ、またはマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの混合物の製造方法。
【請求項１７】
前記培養を、トレハロースを含む炭素源の存在下で行い、トレハロースホスホリラーゼを優先的に生成・蓄積させる、請求の範囲第１５項に記載のトレハロースホスホリラーゼ、またはマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの混合物の製造方法。
【請求項１８】
次のいずれかの方法から選ばれるマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼの粗酵素の製造方法；
（ｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体をそのままの採取する、
（ｉｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体からマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼ粗酵素を抽出する、または、
（ｉｉｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から菌体を分離し、培養上清液を採取する。
【請求項１９】
燐酸の存在下で、請求の範囲第３項または第４項に記載のマルトースホスホリラーゼ、および請求の範囲第９項または第１０項に記載のトレハロースホスホリラーゼを、マルトースに作用させることを特徴とするトレハロースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な微生物、新規な酵素及び新規な酵素の製造方法に関する。更に詳しくは、トレハロースを酵素的に生産する場合に必要なマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの生産能を有するパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新規微生物、この微生物から得られる新規なマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ、これらの酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、並びにこれら酵素の製造方法に関するものである。
【背景技術】  トレハロースは、医薬品、化粧品、食品などに広い用途が期待され、従来から工業生産するための多くの試みがなされてきた。これらの技術は大別して次の三つに分類することができる。その一つはトレハロースを菌体内に蓄積する性質を有する微生物から該物質を抽出精製する方法である（例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２巻，２０５９頁，１９５０年、ドイツ特許第２６６５８４号公報、特開平３−１３００８４号公報、特開平５−９１８９０号公報、特開平５−１８４３５３号公報および特開平５−２９２９８６号公報を参照）。この方法は、微生物の培養工程、分離工程、微生物からのトレハロースの抽出工程、抽出したトレハロースの精製結晶化工程から構成されており、トレハロースの製造工程が非常に複雑である。しかも、トレハロースの生産性が低いばかりでなく、多量の微生物抽出残査が廃棄物として発生するため、経済効率の良い方法とは言えなかった。
また、トレハロースを菌体外に生産する微生物として、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等の微生物を培養してトレハロースを生産させる発酵法が開発されている（例えば、特開平５−２１１８８２号公報参照）。しかしながら、この方法においてもトレハロースの培地中の蓄積率は約３％（ｗ／ｖ）と低いため、トレハロースを工業的に大量生産するためには大容量の発酵槽とそれに見合う規模の精製設備が必要であり経済的に問題がある。しかも、この方法においても精製したトレハロースを得るためには除菌操作が必要とされるばかりでなく、培養時に使用菌株が生産する夾雑物あるいは培地成分等の除去に煩雑な工程が必要である。
一方、これら発酵法の種々の問題点を解決する方法として酵素法が開発されている。即ち、微生物由来のマルトースホスホリラーゼ（ｍａｌｔｏｓｅ：ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と藻類由来のトレハロースホスホリラーゼ（α，α−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ：ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をリン酸存在下でマルトースに作用させてトレハロースを生産する方法（例えば、特許第１５１３５１７号公報、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４９巻，２１１３頁，１９８５年を参照）、および細菌由来のシュークローズホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ：ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と担子菌由来のトレハロースホスホリラーゼ（α，α−ｔｒｅｈａｌｏｓｅ：ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をリン酸存在下で蔗糖に作用させてトレハロースを得る方法（例えば、平成６年度日本農芸化学会大会講演要旨集  ３Ｒａ１４を参照）とが報告されている。これらの方法によればマルトースあるいは蔗糖から６０〜７０％の高い収率でトレハロースが生成することができる。また、原料として精製された高純度の糖質を使用することから、酵素反応により得られるトレハロースの精製も容易であり、他の方法に比較して工業的に有利な方法であると考えられている。しかしながら、これらの方法においても使用される酵素、特に、トレハロースホスホリラーゼの供給源がユーグレナやマイタケなどのように藻類や担子菌という非常に限られたものであり、安定して酵素を生産するためには経済的な問題ばかりでなく技術的にも困難な点があった。しかも、得られるトレハロースホスホリラーゼやこれに組み合わせて用いられるシュークローズホスホリラーゼやマルトースホスホリラーゼはそれぞれの酵素の至適ｐＨ領域が大きく異なっており、また、温度に対する安定性も非常に低く、トレハロースの生成反応は２５〜３７℃程度の低温下でしか行えなかった。このことは、２種類の酵素を組み合わせて使用する際のｐＨ管理が非常に困難であるばかりでなく、反応温度が低いため解放型の反応槽を用いて行われる酵素反応時に雑菌汚染が起こることを示唆しており、これによる副次的な反応を防止するために厳密な衛生管理を必要とする等の問題点を有している。さらには、これら公知の酵素を組み合わせて用いる場合、これらの酵素の有する基質濃度依存性の為に高濃度の原料が使用出来なかった。この為、これらの方法も経済的に効率の良い方法とは言えなかった。
更に澱粉分解物を基質として、トレハロースを得る方法が報告されている。この方法によれば、澱粉分解物に末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させるマルトオリゴシルトレハロース生成酵素と、この非還元性糖質から特異的にトレハロースを遊離するトレハロース遊離酵素を作用させ、澱粉から８０％の高い収率でトレハロースが生成する（例えば、特開平７−１４３８７６号公報、欧州特許出願６２８６３０Ａ２号明細書、日本農芸化学会講演要旨集、ｐ３１（１９９５）参照）。しかしながら、本方法では澱粉を基質としているため、当該酵素を固定化して基質を通液することが困難であり、リアクターなどの更なる製造の簡略化及び効率化が困難であった。更に、トレハロースを結晶化した後に得られる分蜜液の再糖化プロセスの構築も困難であった。
以上のことから、その製造および精製が容易で、かつ高い熱安定性を有し、基質濃度依存性が無い新たなマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを見出すことができれば、容易に且つ大量に入手できるマルトースを原料として高収率でしかも容易に且つ効率よくトレハロースを製造することが期待できる。
そこで、本発明の第一の目的は、上記のような従来の技術の種々の問題点を解決し、これらの種々の要求を満足する新規な酵素であるマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを高い生産効率で生成し得る新規微生物を提供することにある。本発明の第二の目的は、製造および精製が容易で、高い熱安定性を有し、基質濃度依存性が無い新たなマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを提供することにある。さらに本発明の第三の目的は、上記微生物を用いて、上記の２種類の酵素を容易に且つ高い収率で得ることができるマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼの製造方法を提供することにある。
【発明の開示】
本発明者らは、工業的生産に使用するためのマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼが具備すべき、上述の諸性質を有する酵素を生産する能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した。その結果、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物が上記要件を備えた両酵素を著量生産することを見出し、本発明を完成せしめたものである。
即ち、本発明は、以下に記載した内容をその要旨とする発明である。
（１）本発明は、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を提供するものであり、具体的には、例えば、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４２０のパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５）を提供するものである。
（２）また、本発明は、以下に示す理化学的性質を有するマルトースホスホリラーゼを提供するものである。
（イ）作用：マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、トレハロース、シュークロース、ラクトース、セロビオースなどには作用しない。
（ハ）作用ｐＨの範囲、最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：作用ｐＨの範囲は４．５〜９．５である。分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．５〜６．５である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜７．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２０〜６０℃である。４５〜５５℃近傍に分解反応の最適温度を有し、合成反応の最適温度は５０〜５５℃である。
（ホ）温度安定性：ｐＨ６．０、１５分間の加熱条件下では５０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。
（ヘ）阻害剤：銅、水銀、Ｎ−ブロモサクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸（各々１ｍＭ）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（１％）で阻害される。
（ト）等電点：ｐＨ４．８〜５．０の範囲にある。
（チ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約８９，０００〜９０，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量は約１９０，０００ダルトンであり、ホモ２量体から構成されている。
（３）また、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこの配列中の１個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、前記（２）に記載のマルトースホスホリラーゼを提供するものである。
（４）また、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と５２％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記（２）に記載のマルトースホスホリラーゼを提供するものである。
（５）また、本発明は、前記（２）に記載のマルトースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群、
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｃ）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
より選ばれたポリヌクレオチドのいずれかを提供するものである。
（６）また、本発明は、前記（５）に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターおよび該組換えベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
（７）更に、本発明は、以下に示す理化学的性質を有するトレハロースホスホリラーゼを提供するものである。
（イ）作用：トレハロース中のα−１，１−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：トレハロースに作用し、マルトース、シュークロース，ラクトース、セロビオースなどに作用しない。
（ハ）作用ｐＨの範囲、最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：作用ｐＨの範囲は４．５〜９．５である。分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．８〜７．８である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜９．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２５〜７０℃である。５０〜６５℃近傍に分解反応の最適温度を有し、合成反応の最適温度は４５〜６０℃である。
（ホ）温度に対する安定性：ｐＨ７．０、１５分間の加熱条件下では６０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。
（ヘ）阻害剤：銅、水銀、Ｎ−ブロモサクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸で阻害される。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（１％）で阻害されない。
（ト）等電点：ｐＨ４．８〜５．２の範囲にある。
（チ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約８９０００〜９００００ダルトンであり、ゲル濾過法による分子量は約１９０，０００ダルトンであり、ホモ２量体から構成されている。
（８）また、本発明は、配列番号３で示されるアミノ酸配列またはこの配列中の１個もしくは複数アミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する、前記（７）に記載のトレハロースホスホリラーゼを提供するものである。
（９）また、本発明は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と６３％以上、更には７５％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、前記（７）に記載のトレハロースホスホリラーゼを提供するものである。
（１０）また、本発明は、前記（７）に記載のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、下記（ｄ）〜（ｆ）からなる群、
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ｆ）配列表の配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
から選ばれるポリヌクレオチドのいずれかを提供するものである。
（１１）また、本発明は、前記（１０）記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクターおよび該組換えベクターにより形質転換された微生物を提供するものである。
（１２）更に、本発明は、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、前記（２）若しくは（３）に記載のマルトースホスホリラーゼ、および／または前記（７）若しくは（８）に記載のトレハロースホスホリラーゼの少なくとも一つを生成・蓄積させ、これを採取することを特徴とする、マルトースホスホリラーゼ若しくはトレハロースホスホリラーゼまたは両者の混合物の製造方法を提供するものである。
（１３）また、本発明は、前記培養を、マルトースを含む炭素源の存在下で行い、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを生成・蓄積させることを特徴とする、前記（１２）に記載のマルトースホスホリラーゼまたはマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの混合物の製造方法を提供するものである。
（１４）また、本発明は、前記培養を、トレハロースを含む炭素源の存在下で行い、トレハロースホスホリラーゼを優先的に生成・蓄積させる、前記（１２）に記載のトレハロースホスホリラーゼまたはマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの混合物の製造方法を提供するものである。
（１５）また、本発明は、次の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれかの方法から選ばれるマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼの粗酵素の製造方法である。
（ｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体をそのままの採取する、
（ｉｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養液から分離した菌体からマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼ粗酵素を抽出する、または、（ｉｉｉ）マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ生産能を有するパエニバチルス属微生物を培養し、得られた培養後の培養液から菌体を分離し、培養上清液を採取する。
（１６）更に、本発明は、燐酸の存在下で、前記（２）または（３）に記載のマルトースホスホリラーゼ、および前記（７）または（８）に記載のトレハロースホスホリラーゼをマルトースに作用させることを特徴とするトレハロースの製造方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の酵素を生産する微生物であるパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５の分類学的位置を示す図である。
図２は、本発明のマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分析の結果を示す図である。
図３は、本発明のマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの分解反応（白丸）と合成反応（黒丸）の最適ｐＨと作用ｐＨ範囲を示す図である。
図４は、本発明のマルトースホスホリラーゼ（白丸）とトレハロースホスホリラーゼ（黒丸）の酵素活性とｐＨの関係を示す図である。
図５は、本発明のマルトースホスホリラーゼ（Ａ）とトレハロースホスホリラーゼ（Ｂ）の分解反応（白丸）と合成反応（黒丸）の酵素活性と作用温度の関係を示す図である。
図６は、本発明のマルトースホスホリラーゼ（白丸）とトレハロースホスホリラーゼ（黒丸）の耐熱性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明者らは、工業的生産に使用可能なことを目的として、その製造と精製が容易で、作用温度が比較的高く、高い熱安定性を有し、かつ基質濃度依存性のないマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを生産する能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索し、その結果、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する新規微生物が上記要件を備えた二つの酵素を著量生産することを見出した。
即ち、本発明の新規菌株は、本発明者等により、海洋研究開発機構が保有する深海探査潜水艇「深海２０００」を用いて、相模湾初島南東沖、水深１１７４ｍの海底泥から新たに単離されたものである。
このような本発明のパエニバチルスに属する新規な微生物の一例として、パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５）が挙げられる。以下にパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５の菌学的諸性質を以下に示す。
＜形態的性質＞
細胞の形態：桿菌
細胞の大きさ：（０．７〜０．９ｘ２．０〜４．０μｍ）
運動性：有り
鞭毛：有り（極鞭毛）
胞子形成：有り
＜生育状態＞
コロニーの形態：不規則で周辺はやや波状である。光沢がありクリーム色
（無均一）をしている。
生育温度：１５〜４５℃で生育する。５０℃で生育しない。
食塩濃度：５％の食塩で生育する。７％以上の食塩で生育しない。
嫌気での生育性：生育しない。
＜生理学的性質＞
グラム染色性：陰性
Ｏ−Ｆテスト（グルコース）：陰性。グルコースから酸とガスを生成しない。
カタラーゼテスト：陽性。
オキシダーゼテスト：陽性。
ゼラチン分解能：陰性。
カゼイン分解能：陽性。
デンプン分解能：陽性。
馬尿酸塩分解能；陰性
ＯＮＰＧテスト：陽性。
ウレアーゼ産生：陽性。
オルニチンデカルボキシラーゼ産生：陰性。
リシンデカルボキシラーゼ産生：陰性。
硫化水素生産：陰性。
インドール生産：陰性。
硝酸塩還元能：陰性。
硫化水素産生：陰性。
アセトイン産生（ＶＰテスト）：陰性。
資化性：グリセロール、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、ガラクトース、グルコース、フラクトース、マンノース、マンニトール、アルブチン、エスクリン、サリシン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラクトース、メリビオース、トレハロース、シュークロース、セロビオース、マルトース、ラフィノース、デンプン、グリコーゲンの資化性が有る。
また、この本発明菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列をＣＬＵＳＴＡＬ  Ｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １．８１）を用いて分類学的位置を解析した。解析した結果をｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ法に基づき記載した系統樹を図１に示す。この結果から、本発明菌は、分類的にはパエニバチルス  グルカノリティクス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｕｃａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）に近い位置にあるが、明らかに系統樹において異なった分岐に存在する。従って、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属の新種であると判断した。そして、これをパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５）と命名し、平成１５年（２００３年）６月２７日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−８４２０として国際寄託した。
本発明の新菌株は次のようにしてスクリーニングした。まず、採取した海底泥を生理食塩水に懸濁し、該懸濁液１滴を以下の組成の寒天培地に塗沫した。使用した寒天平板培地は、寒天２％（ｗ／ｖ）、トレハロースまたはマルトース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・七水塩０．０２％を含有し、ｐＨは７である。かくして、寒天平板培地を３７℃にて好気的に培養し、平板上に現れた各コロニーを得、各々のコロニーを上記の寒天培地に用いたものと同一の組成の液体培地中（ｐＨ７）で３７℃にて２４〜７２時間、１８０ｒｐｍで振盪培養した。次いで、各培養液を１２，０００×ｇにて１０分間、４℃で遠心分離し菌体と上澄液に分離した。かくして得られた菌体を少量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、後述する方法で活性を測定した。その結果、上記の菌学的諸特性を有する菌株を分離することができた。
このようにして見出された本発明の新規な微生物であるパエニバチルス属に属する微生物は、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを生産する新規な菌である。
この本発明の新規な微生物から本発明の酵素である前記のマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを得るには、例えばこの微生物を常法に従って適当な培地に接種して培養し、次いで培養物中から回収すればよい。培養条件は、微生物自体の生育温度の観点から２５〜４２℃の温度範囲が好ましく、８〜７０時間好気的に培養することが好ましい。
本発明の酵素を得るための微生物の培養に用いる培地は、以下に示すものに特に制限されるものではなく、微生物が生育でき、本発明の酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。
培地は、その炭素源としては、この微生物が資化しうる物であればよく、例えば、グルコース、フラクトース、マンノース、トレハロース、シュクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができるが、トレハロースやマルトースおよびこれらを含有する糖質を用いることが好ましい。炭素源としてトレハロースもしくは該物質を含有する糖質を用いると、本発明の微生物はトレハロースホスホリラーゼを優先的に生産する。また、マルトースもしくは該物質を含有する糖質を炭素源として用いると、本発明の微生物はマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを同時に生産する。さらに、炭素源としてトレハロースとマルトースの両者又はこれらの物質を含有する糖質を用いると、トレハロースホスホリラーゼとマルトースホスホリラーゼとを同時に生産させることができ、トレハロースとマルトースの量を制御することによって、トレハロースホスホリラーゼとマルトースホスホリラーゼの生成割合をコントロールすることもできる。
窒素源としては、各種有機および無機の窒素化合物、さらに培地は各種の無機塩を含むことができる。窒素源としては、例えば、コーンスチープリカー、大豆粕、あるいは各種ペプトン類等の有機窒素源、そして硫安、硝安、燐安、尿素等の無機窒素源などの一般に微生物の培養に用いられている化合物が使用可能である。尿素や有機窒素源が炭素源にもなることはいうまでもない。
また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用いられる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いられる。
本発明の酵素を得るための微生物の培養に適した培地としては、具体的には、例えば、トレハロースホスホリラーゼを優先的に生産したい場合には、トレハロース０．５〜３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５〜２％、リン酸アンモニウム０．１５％、尿素０．１〜０．２％、食塩０．５〜１．５％、リン酸二カリウム０．０５〜０．３％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１〜０．０５％および炭酸カルシウム０．１〜０．３％を含むｐＨ７．０〜７．５の液体培地を用いることが適当である。また、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを同時に生産する場合には、マルトース０．５〜３％（ｗ／ｖ）、ポリペプトンＳ（日本製薬製）１〜３％、リン酸アンモニウム０．１〜０．３％、尿素０．０５〜０．３％、食塩０．５〜１．５％、リン酸二カリウム０．０５〜０．２５％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０１〜０．０５％および炭酸カルシウム０．１〜０．３％を含む液体培地を用いることができる。これらの培地濃度は限定されるものでは無く、炭素源や窒素源などの種類や濃度によって適当に変更できる。マルトースを炭素源として用いるとマルトースホスホリラーゼばかりでなく、トレハロースホスホリラーゼもある程度の量が生産される。従って、トレハロース生産用の粗酵素（マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとの混合物）を生産するためには、マルトースを炭素源として用いる方が経済的である。
培養は、通常、温度２０乃至４５℃、好ましくは２５乃至４２℃、ｐＨ５乃至９、好ましくは６乃至８から選ばれる条件で好気的に行われる。培養時間は微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは８時間乃至７０時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
このようにして、本発明の微生物を培養した後、生成した本発明の酵素であるマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを回収する。生成する酵素の大部分は菌体内に蓄積され、一部分は菌体外に蓄積される。そこで、菌体内あるいは菌体外に生成蓄積されたマルトースホスホリラーゼおよび／またはトレハロースホスホリラーゼを採取する。
本発明の酵素の回収法は、一般の酵素の採取の手段に準じて行うことができる。以下に示す方法に特に限定はされないが、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法等の菌体破砕法で得られた菌体破砕物、あるいは培養物を遠心分離、ろ過等の操作によって菌体と培養上清に分離することで得られた培養上清を、粗酵素液として用いることができる。
この粗酵素液は、そのままで使用することもできるが、必要に応じて、例えば塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の公知の方法を組み合わせて、更に分離精製したものも使用することができる。
また、本発明の酵素を得るための別の方法としては、上記の本発明の菌株から本発明の酵素をコードする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養する方法が挙げられる。具体的には、本発明の酵素のアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列を上記菌株より取得し、次いでこのヌクレオチド配列を適当なベクターに組込み、更に、このベクターにより大腸菌や枯草菌等の宿主を形質転換し、これを培養して本発明の酵素を産生させ、培養物より本発明の酵素を採取すればよい。
以下に具体的な遺伝子工学技術を用いた本発明の酵素の製造方法について説明する。本発明の両酵素、即ちマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼは、それぞれ配列表の配列番号１と３で示されるアミノ酸配列、または、それぞれこれらの配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであるから、これらに対応したヌクレオチド配列を使用することが必要である。
本発明の酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例としては、マルトースホスホリラーゼの場合には、具体的に下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列表の配列番号２に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
また、本発明の酵素のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の例として、トレハロースホスホリラーゼの場合には、具体的に下記（ｄ）〜（ｆ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列中の１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、逆位、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列表の配列番号４に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
本発明の酵素を生産する組換え微生物の作製は、公知の手段を組み合わせることにより行うことができる。すなわち、例えば、上記パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５から本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列の取得やその増幅、ベクターへのヌクレオチド配列の挿入、当該遺伝子による宿主の形質転換等は、この分野の成書に記載された方法を適宜利用することにより行われる。このうち、組換え微生物の製法の一例としては、特に限定はされないが、次に示す方法を用いることができる。即ち、パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５から、ショットガンクローニング、あるいは特定のプライマーを用いたＰＣＲ増幅等によって、該当する２つの酵素遺伝子を取得する。これらの遺伝子を、ＥＫ系の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等に代表されるグラム陰性菌、あるいはＢＳ系の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等に代表されるグラム陽性菌に導入して、組換え体を取得する。形質転換にはプラスミド等の核外遺伝子をベクターにして利用、あるいは宿主菌本来有しているＤＮＡ取り込み能力等を利用するする方法も用いることができる。
以上に述べたように、本発明のパエニバチルス属微生物または本発明の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物を培養し、その培養物から回収することによって、本発明の酵素を得ることができる。
本発明の酵素である前述のマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼは、既に述べたように、これらの培養菌体内又は菌体外の培養上清中に蓄積するので、常法により単離して取得することができる。まず、菌体内の酵素は、菌体ごと粗酵素として用いることができる。さらに、菌体から酵素を抽出することで粗酵素を回収することもできる。また、菌体外の培養上清中にも酵素は含まれており、菌体を分離した残りの培養液を粗酵素含有液として利用することもできる。さらに、これらの粗酵素は、エタノール、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈澱法、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の通常の方法を用いて精製することができる。さらに、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼとの分離は、例えば、両酵素の等電点の違いを利用して陰イオン交換クロマトグラフィーなどによって可能である。
このようにして得られる本発明の酵素は、後述の実施例において詳細に説明するように、既に述べたような理化学的性質を有する新規な酵素であるマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼである。
これらの酵素の活性の測定は、本発明のパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５がマルトースやトレハロースを加水分解するα−グルコシダーゼ（マルターゼ）、グルコアミラーゼ、トレハラーゼ等を生産しないので、加リン酸分解反応の場合の活性の測定には、それぞれマルトースあるいはトレハロースを基質とし、リン酸塩存在下で酵素反応させて生成するグルコースをグルコースオキシダーゼ法で測定するという簡便法を使うことができる。また、合成反応の場合には、β−Ｄ−グルコース１−リン酸とグルコースの混合液を基質とし、酵素反応により生成する無機リン酸を常法により測定することによって求めることができる。
以下に、本発明の酵素の活性測定法について説明する。
（ｉ）分解反応の場合：５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させた２０ｍＭのマルトースまたはトレハロース溶液０．５ｍＬに、酵素液０．０１ｍＬを添加し、５０℃で１５分間反応させた後、沸騰水浴中で３分間加熱して酵素反応を止める。氷水中で冷却した後、生成したグルコースをグルコースオキシダーゼ法（和光純薬工業（株）製、グルコースＣ−ＩＩテスト・ワコー）で測定する。ここで、この測定条件下で１分間に１μｍｏｌｅのグルコースを生成する酵素量を１単位の酵素活性と定義した。
（ｉｉ）合成反応の場合：７０ｍＭのヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた２７ｍＭのβ−Ｄ−グルコース１−リン酸Ｎａ塩と同濃度のグルコースとの混合溶液０．１５ｍＬに、０．０５ｍＬの酵素液を添加し、５０℃で１５分間反応させた後、沸騰水浴中で２分間加熱して酵素活性を止める。氷水中で冷却後、生成した無機リン酸を和光純薬工業（株）製ピーテストワコーを用いて測定する。ここで、この測定条件下で１分間に１μｍｏｌｅの無機リン酸を生成する酵素量を１単位の酵素活性と定義した。
以上のように、本発明の新規な酵素であるマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼは、新規な微生物である本発明のパエニバチルス属微生物（例えば、パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５））または本発明の酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだ組換え微生物を培養し、その培養生産物を回収することによって、容易に製造することができる。そして、この二つの本発明の酵素は、それぞれマルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合およびトレハロース中のα−１，１−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成するという特徴を有する。従って、リン酸の存在下に、マルトースにこれらの二つの酵素を組み合わせて作用させることによって、極めて効率よくトレハロースを生産することができる。しかも、これらの二つの酵素の作用ｐＨ範囲が４．５〜９．５と広く、かつ二つの酵素の最適ｐＨ範囲が重複しているため酵素反応において非常に取り扱いやすく、また、作用温度範囲が２０〜６０℃と比較的高い温度での使用が可能であるため、高い温度での酵素反応が可能となり、従来の方法に見られたような雑菌汚染の恐れがなくトレハロースを生産することができる。そして、原料としてマルトースという容易にかつ大量に入手することができ、さらに精製した高純度のものも使用することができるため、酵素反応後の生成物中への不純物の混入が少なく、従って生成物の精製が容易で、かつ極めて効率よくトレハロースを生産することができるという利点も有する。
本発明のこれらの酵素は、それぞれ粗酵素又は精製酵素として利用することができる。さらに、両酵素の活性を有する菌体および該菌体を適当な担体に包括、吸着あるいは化学的に結合させた固定化菌体などをトレハロースの製造に使用することができる。さらには、本発明の両酵素は、夫々公知の方法で固定化させた固定化酵素として使用することもできる。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例１］：
菌体内及び菌体外マルトースホスホリラーゼの製造及び精製
パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＳＨ−５５）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４２０）を、マルトース１％（ｗ／ｖ）、ポリペプトンＳ（日本製薬製）２．５％、リン酸アンモニウム０．１５％、尿素０．１５％、食塩１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０２％および炭酸カルシウム０．２％を含むｐＨ７．０の液体培地に植菌した。次に、この液体培地を３７℃で２４時間好気的に培養した。得られた培養液を４℃で１２，０００×ｇにて１５分間遠心分離して菌体と上清液とに分けた。
ここで得られた菌体は、少量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁させた後、超音波破壊した。該破砕菌体懸濁液に硫安を加えて３０％飽和とし、４℃で一夜放置した。次いで、遠心分離をして沈澱物を除いて得られる上清液にさらに硫安を加えて７０％飽和とした。更に４℃で一夜放置して生成する沈澱物を遠心分離で集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解させた後、同緩衝液で充分に透析した。
次いで、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＤＥＡＥ−フラクトゲル（メルク社製）カラムに酵素を吸着させた。吸着酵素を上記の緩衝液に含まれる０Ｍから０．５Ｍの食塩の濃度勾配法で溶出させた後、ＵＦ膜（アミコン社製、ＹＭ−３０）で濃縮した。濃縮酵素を０．２Ｍ食塩含有の上述の緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラムでゲル濾過精製した。得られたマルトースホスホリラーゼ活性画分を集め、１．５Ｍ硫安を含む同上緩衝液で透析した後、１．５Ｍ硫安を含む同上緩衝液で平衡化したフェニル・トヨパール（東ソー社製）カラムに酵素を吸着させた。吸着酵素を同上緩衝液中で１．５Ｍから０Ｍの硫安の濃度勾配法で溶出させた後、得られたマルトースホスホリラーゼ活性画分を集め０．２Ｍ食塩を含む同上緩衝液で透析した。前述のＵＦ膜を用いて濃縮後、０．２Ｍ食塩を含む同上緩衝液で平衡化したスーパーデックス２００（ファルマシア社製）を用いて再度ゲル濾過クロマトグラフィーを行い、得られたマルトースホスホリラーゼ活性画分を前述の方法で濃縮した。
ここで、活性画分とは、ゲル濾過クロマトグラフィー等により分離して得た画分であって、マルトースまたはトレハロースを基質にして活性測定を行った場合に活性が認められた画分であり、それぞれマルトースホスホリラーゼ活性画分およびトレハロースホスホリラーゼ活性画分のことを意味する。即ち、マルトースまたはトレハロースに対する活性がみとめられるときは、ＤＥＡＥ−フラクトゲルカラムを用いた場合、食塩濃度０．３Ｍ付近にマルトースホスホリラーゼ活性画分があり、０．３５Ｍ付近にトレハロースホスホリラーゼ活性画分がある。
その結果、菌体内酵素として、ポリアクリルアミドゲルスラブ電気泳動法並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法において均一なマルトースホスホリラーゼ（活性収率約３０％）を得た。また、菌体外酵素についても培養上清を出発原料として、上記の方法と同様の方法で精製し、活性収率約２５％でマルトースホスホリラーゼの精製酵素を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により得られた精製酵素の分子量を測定したところ、分子量は８９，０００〜９０，０００ダルトン近傍にあり、後述の実施例３で決定した推定アミノ酸配列から計算された８７，７６２ダルトンとよく一致していた。精製酵素の分子量をセファクリルＳ−２００ゲル濾過法により測定したところ、その分子量は約２００，０００ダルトンであったので、本酵素はホモ２量体で構成されていると思われた。
［実施例２］：
菌体内および菌体外トレハロースホスホリラーゼの製造及び精製
パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５を、トレハロース１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス２％、リン酸アンモニウム０．１５％、尿素０．１５％、食塩１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩０．０２％および炭酸カルシウム０．２％を含むｐＨ７．０の液体培地に植菌した。この液体培地を実施例１と同様に培養し、後処理して菌体破砕液と上清液を得た。得られた菌体破砕液と上清液について、それぞれ実施例１と同様な方法で精製した。更に、菌体破砕液と上清液から得た上記の精製液を、それぞれポリアクリルアミドゲルスラブ電気泳動法ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法において精製し、均一な菌体内トレハロースホスホリラーゼおよび菌体外トレハロースホスホリラーゼを得た。それぞれの活性収率は３０％および３５％であった。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により両方の精製酵素の分子量を測定したところ、分子量はいずれも８９，０００〜９０，０００ダルトン近傍にあり、後述の実施例３で決定した推定アミノ酸配列から計算された値８７，１５１ダルトンとよく一致していた。精製酵素の分子量をセファクリルＳ−２００ゲル濾過法により測定したところ、分子量は約１９０，０００ダルトンであったので本酵素はホモ２量体で構成されていると思われた。
［実施例３］：
マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの遺伝子のクローニングとシーケンス
マルトースホスホリラーゼの遺伝子のクローニングは以下の方法で行った。実施例１で得られた精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を常法により決定したところ、ＭＫＱＹＬＫＬＤＥＷの配列を有していた。さらに精製酵素をプロテアーゼの一種であるＶ８（シグマ製）によりゲル内消化を行った。ゲル内消化は、精製酵素５μｇをＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルに供し、同時にＶ８プロテアーゼ溶液１μｇを精製酵素溶液に重層して泳動を行い、ゲル中で目的酵素を分解する方法で行った。得られた蛋白質断片の２種類のＮ末端アミノ酸配列を常法により決定した。その結果、断片１からＡｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、断片２からＧｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｒｇの配列を得ることができた。１種類のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列は１〜６種類存在する。そこで、断片１の１〜９番目のアミノ酸配列のおよび断片２の１〜９番目アミノ酸配列からＤＮＡ配列に基づく下記で表わされる混合プライマーおよびアンチセンス混合プライマーを調製した。
断片１のアミノ酸配列に基づくプライマー：
2005003343.tif 000002
断片２のアミノ酸配列に基づくアンチセンスプライマー：
2005003343.tif 000003
上記混合プライマーを用い、染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＥｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片の増幅を行った。反応条件は、９６℃で２分間加熱した後、９６℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返してから、最後に７２℃で１０分間保温した。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約０．８ｋｂ塩基対のＤＮＡ断片が検出された。反応液から増幅されたＤＮＡ断片をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いてクローニングし、塩基配列決定用プラスミドを調製した。このプラスミドをテンプレートとしてｄＲｏｄａｍｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、配列番号５に示されるヌクレオチド配列のうち４７７番目〜１３０４番目の塩基配列を決定した。
上記塩基配列を基に、５’−ＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＧ−３’で示されるプライマーＭＦ１、及び５’−ＡＴＧＧＣＧＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧ−３’で示されるプライマーＭＲ１を調製した。一方、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏｌで切断した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて１６℃で１時間ライゲーションを行い、このＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとしてＭＦ１及びＭＲ１を用い、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてインバースＰＣＲを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約７ｋｂ塩基対のＤＮＡ断片が検出された。反応液から増幅されたＤＮＡ断片を精製し、塩基配列決定用ＤＮＡを調製した。このＤＮＡ断片をテンプレートとしてｄＲｏｄａｍｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、配列番号１で示されるアミノ酸配列および配列番号２で示されるヌクレオチド配列によって表されるマルトースホフホリラーゼの遺伝子を取得した。
次に、トレハロースホスホリラーゼの遺伝子のクローニングは以下の方法で行った。実施例２で得られた精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を常法により決定したところ、Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕであった。ここから、下記のプライマー１で表される配列の混合プライマーを設計した。さらに、既知のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列から相同性の高い配列を検索しＧｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐのアミノ酸配列を見出した。ここから、下記のプライマー２で表される配列のアンチセンス混合プライマーを設計した。
2005003343.tif 000004
上記混合プライマーを用い、染色体ＤＮＡをテンプレートにして上記プライマー１及び２を用いてＥｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）によりＰＣＲを行い、ＤＮＡ断片の増幅を行った。反応条件は、９６℃で２分間加熱した後、９６℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを３０回繰り返してから、最後に７２℃で１０分間保温した。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約１．０ｋｂ塩基対のＤＮＡ断片が検出された。反応液から増幅されたＤＮＡ断片をＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いてクローニングし、塩基配列決定用プラスミドを調製した。このプラスミドをテンプレートとしてｄＲｏｄａｍｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、配列番号７に示されるヌクレオチド配列のうち１１１３番目〜２１６８番目の塩基配列を決定した。
上記塩基配列を基に、５’−ＡＣＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧ−３’で示されるプライマーＴＦ１、及び５’−ＴＣＡＧＡＴＡＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＴＧＧ−３’で示されるプライマーＴＲ１を調製した。一方、染色体ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏｌで切断した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてライゲーションを行い、このＤＮＡをテンプレートとし、プライマーとしてＴＦ１及びＴＲ１を用い、ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてインバースＰＣＲを行った。反応液をアガロースゲル電気泳動したところ、約６ｋｂ塩基対のＤＮＡ断片が検出された。反応液から増幅されたＤＮＡ断片を精製し、塩基配列決定用ＤＮＡを調製した。このＤＮＡ断片をテンプレートとしてｄＲｏｄａｍｉｎｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマー）を用いた蛍光ラベル反応を行い、ＤＮＡシークエンサー３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析し、配列番号３で示されるアミノ酸配列および配列番号４で示されるヌクレオチド配列によって表されるトレハロースホフホリラーゼの遺伝子を取得した。
配列番号１と配列番号３から推定される分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による）と等電点は、マルトースホスホリラーゼが８７，７６２ダルトンとｐＨ４．９８、トレハロースホスホリラーゼが８７，１５１ダルトンとｐＨ５．１３であった。
［実施例４］：
大腸菌の形質転換、形質転換体の培養および精製
実施例３で得た配列番号５のマルトースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドンである３４３塩基目からの５’−ＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧ−３’で表されるオリゴヌクレオチドの５’末端に制限酵素Ｘｈｏｌ切断部位を付けた５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧ−３’で表されるプライマーをＭＦ２、終止コドンである２６４９塩基目からのアンチセンス配列５’−ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧ−３’で表されるオリゴヌクレオチドの３’末端に制限酵素Ｋｐｎｌ切断部位を付けた５’−ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧ−３’で表されるをプライマーをＭＲ２とし、染色体ＤＮＡをテンプレートとしＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行い、マルトースホスホリラーゼを含む約２．３ｋ塩基対のＤＮＡ断片を取得した。反応条件は、９６℃で２分間加熱した後、９６℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを３０回繰り返してから、最後に７２℃で１０分間保温した。得られたＤＮＡ断片を精製した後、制限酵素Ｘｈｏｌ及びＫｐｎｌで切断した。これをプラスミドベクターｐＲＳＥＴＡ（インビトロジェン社）を制限酵素Ｘｈｏｌ及びＫｐｎｌで切断したもの５０ｎｇとＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、１６℃で２時間ライゲーションして、組換えプラスミドｐＲＳＭＰ１を創製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｆ−’ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＣａｍＲ））株へコンピテントセル法を用いて導入を行い、形質転換された大腸菌ＲＳＭＰ１を得た。
同様に、実施例３で得た配列番号７のトレハロースホスホリラーゼをコードするＤＮＡ配列の開始コドンである１１１３塩基目からの５’−ＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣ−３’で表されるオリゴヌクレオチドの５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位をつけた５’−ＣＧＣＧＧＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣ−３’で表されるプライマーをＴＦ２、終止コドンである３４１３塩基目からのアンチセンス配列５’−ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧ−３’で表されるオリゴヌクレオチドの３’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を付けた５’−ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ−３’で表されるをプライマーをＴＲ２とし、染色体ＤＮＡをテンプレートとしＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ）を用いＰＣＲを行い、トレハロースホスホリラーゼを含む約２．３ｋ塩基対のＤＮＡ断片を取得した。反応条件は、９６℃で２分間加熱した後、９６℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分のサイクルを３０回繰り返してから、最後に７２℃で１０分間保温した。得られたＤＮＡ断片を精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。これをプラスミドベクターｐＲＳＥＴＡ（インビトロジェン社）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断したもの５０ｎｇとＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて、１６℃で２時間ライゲーションして、組換えプラスミドｐＲＳＴＰ１を創製した。これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｆ−’ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＣａｍＲ））株へコンピテントセル法を用いて導入を行い、形質転換された大腸菌ＲＳＴＰ１を得た。
次に、形質転換大腸菌ＲＳＭＰ１及びＲＳＴＰ１をそれぞれ培養し、組換え酵素の調製を行った。
まず、得られた形質転換体のＲＳＭＰ１またはＲＳＴＰ１のシングルコロニーを、容量３００ｍＬの三角フラスコにＬＢ培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０、５％、塩化ナトリウム０、５％）にアンピシリン溶液を終濃度で５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール溶液を終濃度で３４μｇ／ｍＬになるように添加した溶液３０ｍＬに植菌し、３７Ｃ、１８０ｒｐｍで１６時間培養して、ＲＳＭＰ１またはＲＳＴＰ１の種培養液を調製した。
次いで、形質転換体の培養を以下のようにして行なった。即ち、形質転換体のＲＳＭＰ１またはＲＳＴＰ１のそれぞれについて、容量２Ｌの三角フラスコにＬＢ培地（バクトペプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％）０．５Ｌを入れて滅菌した後、アンピシリン溶液を終濃度で５０μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール溶液を終濃度で３４μｇ／ｍＬになるように添加し、ＲＳＭＰ１またはＲＳＴＰ１を用いた種培養液を１％になるようにそれぞれ接種して、温度３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００（６００ｎｍでの濁度）が０．５になるまで培養した。その後、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度で１ｍＭになるように添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、培養液を５０００ｘｇ、１０分間遠心分離を行い菌体を得た。得られた大腸菌を超音波破壊し、１２０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行った。得られた粗抽出液をアフィニテイーカラム（ＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ、クロンテック社製）で２度クロマトグラフィーを行い（洗浄、５ｍＭイミダゾール；溶出、１００ｍＭイミダゾール）、均一なまでに精製したマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）とトレハロースホスホリラーゼ（ＴＰ）を得た。両酵素のアフィニティーカラムによる精製の結果を表１に示す。
2005003343.tif 000005
表１に示すように、精製したマルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）とトレハロースホスホリラーゼ（ＴＰ）の比活性はそれぞれ約５０および４２単位／ｍｇであった。これら組換えマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法によって求めた分子量は、図２のＡおよびＢに示すように、夫々約９０，０００〜９２，０００ダルトン（計算値、９２，２３３ダルトン）（図２Ａ）と約８９，０００〜９１，０００ダルトン（計算値、９１，２８０ダルトン）であった（図２Ｂ）。これらは推定アミノ酸配列から計算された夫々の分子量９２，２３３ダルトンおよび９１，２８０ダルトンとよく一致していた。
［実施例５］：
枯草菌の形質転換、形質転換体の培養および精製
枯草菌での発現は以下の方法で行った。即ち、実施例３で得たマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼのＤＮＡ配列をそれぞれ枯草菌用発現ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラ社）にライゲーションし、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｂｔｉｌｉｓ  ＩＳＷ１２１４（ｌｅｕＡ８  ｍｅｔＢ５  ｈｓｒＭ１）に形質転換し、形質転換体ＢＳＭＰ１及びＢＳＴＰ１を得た。
また、実施例４と同様に、得られた形質転換体のＢＳＭＰ１またはＢＳＴＰ１のシングルコロニーを、試験管にＰＭ培地（ポリペプトンＳ４％、マルトース４％、酵母エキス０．１％、ＬＡＢ  ＬＥＭＣＯ  ＰＯＷＤＥＲ（Ｏｘｏｉｄ）０．２％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩化カルシウ０，０２％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬ）の５ｍＬに植菌し、３０Ｃ、１２０ｒｐｍで２４時間培養して、ＢＳＭＰ１またはＢＳＴＰ１の種培養液を調製した。
次に、得られた形質転換体ＢＳＭＰ１及びＢＳＴＰ１のそれぞれについて、ＰＭ培地（ポリペプトンＳ４％、マルトース４％、酵母エキス０．１％、ＬＡＢ  ＬＥＭＣＯ  ＰＯＷＤＥＲ（Ｏｘｏｉｄ）０．２％、リン酸二水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０２％、塩化カルシウム０，０２％、テトラサイクリン１５μｇ／ｍＬ）に上記の種培養液１％をそれぞれ接種し、３０℃、１２０ｒｐｍ、６４時間培養を行った。培養終了後、培養液を１００００×ｇ、１０分間遠心分離を行い、ＢＳＭＰ１及びＢＳＴＰ１の培養上清及び菌体を得た。菌体は超音波破壊し、１２０００ｘｇ、１５分間遠心分離を行い、粗抽出液を調製した。それぞれの活性を測定したこところ、マルトースホスホリラーゼでは、培養上清で０．２単位／ｍｇ、菌体で０．１単位／ｍｇであり、トレハロースホスホリラーゼでは、培養上清で０．４単位／ｍｇ、菌体で０．２単位／ｍｇであった。
［実施例６］：
マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの推定アミノ酸配列と他酵素のアミノ酸配列の相同性
実施例３で得たマルトースホスホリラーゼ遺伝子とトレハロースホスホリラーゼ遺伝子について、これらの遺伝子がコードしている夫々のアミノ酸配列のＦＡＳＴＡ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）を行った。本発明のマルトースホスホリラーゼは、バチルス  エスピー  ＲＫ−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＲＫ−１，ＡＢ００８４４６０）、エンテロコッカス  ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ，Ｅ２１７６９）、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、１Ｈ５４Ａ）、ラクトバチルス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｅ８６８３４）、ラクトバチルス  サンフラウンシセンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ，ＬＳＪＡ４３４０）、ネイセリア  メニンギティギス（Ｎｅｉｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ，Ｆ８１２０３）と全アミノ酸を通じてそれぞれ５１．４％、５１．４％、４８．３％、４８．９％、４５．１％、４８．４％しか一致しなかった。また、本発明のトレハロースホスホリラーゼは、バチルス  ステアロサーモフィラス  ＳＫ１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＳＫ−１，ＡＢ０７９６１０）、サーモアエロビウム  ブロッキ  ＡＴＣＣ３５０４７（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ  ＡＴＣＣ３５０４７，ＡＢ０７３９３０）と全アミノ酸を通じてそれぞれ６２．７％、４４．２％しか一致しなかった。
［実施例７］：
パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５の生産するマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの酵素化学的諸性質
パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５が生産する本発明の新規マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの一般的な酵素化学的特性に関し、実施例１、２、４および５と同様な方法で精製して得た精製酵素を用いて検討した。なお、予備実験の結果、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼのいずれについても、パエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５の菌体内および菌体外の両酵素と、これらの組換え酵素は共にほぼ同様な理化学的、酵素学的諸性質を有していたので、ここでは実施例４で得た大腸菌で発現させた組換え酵素についての諸性質を示す。
（イ）作用
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた１％（ｗ／ｖ）のマルトース及びトレハロース溶液に、マルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼを基質１ｇに対してそれぞれ５単位（分解反応活性）添加し、５０℃で５時間反応させた後、沸騰水浴中で３分間加熱して酵素を失活させた。得られた糖化液中の糖を高速液体クロマトグラフィー法で測定した結果、グルコース及びグルコース１−リン酸がそれぞれ検出された。また、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた１％（ｗ／ｖ）のグルコースおよびβ−Ｄ−グルコース１−リン酸Ｎａ塩もしくはα−Ｄ−グルコース１−リン酸Ｎａ塩との混合溶液を基質とし、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを基質１ｇに対してそれぞれ５単位添加し５０℃で５時間反応させた。上述のように処理して生成した糖組成を測定した結果、グルコースとβ−Ｄ−グルコース１−リン酸からはマルトースおよびトレハロースが検出され、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼによる合成反応が確認されたが、グルコースとα−Ｄ−グルコース１−リン酸からの二糖類の合成反応は検出されなかった。
生成糖の分析は以下の方法で行った。先ず、加熱失活させて得られる糖化液中の不溶物を０．４５μｍポアサイズのメンブレンフィルターで濾別した。得られた濾液を供試糖液とし、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＱ（ＡＱ−３０４、ＹＭＣ社製）カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー法で測定した。なお、移動相には水を用い、カラム温度を３０℃とし、検出には示差屈折計を用いた。
（ロ）基質特異性（分解反応）
（ｉ）マルトースホスホリラーゼの場合：
先に記載した酵素の活性測定法（分解反応）において、使用する基質をマルトースの代わりに、トレハロース、イソマルトース、ネオトレハロース、シュークロース、ラクトース、またはセロビオースを基質としてこれらの基質の分解活性を調べたが、これらの基質では酵素活性は全く認められなかった。
（ｉｉ）トレハロースホスホリラーゼの場合：
同様に酵素の活性測定法（分解反応）において、使用する基質をトレハロースの代わりに、マルトース、イソマルトース、ネオトレハロース、シュークロース、ラクトース、またはセロビオースを基質としてこれらの基質の分解活性を調べたが、これらに基質では酵素活性は全く認められなかった。
（ハ）作用ｐＨ範囲、最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
実施例４で得た精製酵素を用いて分解および合成反応の最適ｐＨを測定した。その結果を図３に示す。図３のＡに示したように、マルトースホスホリラーゼの分解反応（白丸）の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、作用ｐＨ範囲は４．５〜９．５であった。同じくマルトースホスホリラーゼの合成反応（黒丸）の最適ｐＨは５．５〜６．５であり、作用ｐＨ範囲は４．５〜９．５であった。
また、図３のＢに示すように、トレハロースホスホリラーゼの分解反応（白丸）では、最適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０であり、同じく合成反応（黒丸）はｐＨ５．８〜７．８が最適であった。作用ｐＨ範囲は、分解反応と合成反応の何れの場合も４．５〜９．５であった。
なお、分解反応の場合は５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）、リン酸−硼酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．５）とグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１２．０）に２５ｍＭリン酸カリウムを添加した溶液を用いた。合成反応の場合には、ＭＥＳ（ｐＨ５．５〜６．５）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５〜７．０）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０〜８．０）、トリス−塩酸（ｐＨ７．５〜９．０）の各緩衝液を用いた。
精製した両酵素を各緩衝液中で１０分間、５０℃で処理し、それらの残存酵素活性を分解反応で測定した。図４に示すように、マルトースホスホリラーゼ（白丸）はｐＨ５．５〜７．５の範囲で、また、トレハロースホスホリラーゼ（黒丸）はｐＨ５．５〜９．５まで安定であった。なお、ｐＨ調節は５０ｍＭのリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５〜８．０）、リン酸−硼酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．５）とグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０〜１２．０）の各緩衝液を用いた。
（ニ）作用温度範囲と最適温度
図５のＡに示すように、マルトースホスホリラーゼの分解反応の場合（白丸）は４５〜５５℃近傍に最適作用温度を有し（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、作用温度範囲は２０〜６０℃であり、合成反応の場合（黒丸）は５０〜５５℃近傍に最適作用温度を有し、作用温度範囲は２０〜６０℃であった。また、図５のＢに示すように、トレハロースホスホリラーゼの分解反応の場合（白丸）は５０〜６５℃近傍に最適作用温度を有し（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、作用温度範囲は２５〜７０℃であり、合成反応の場合（黒丸）は４５〜６０℃近傍に最適作用温度を有し、作用温度範囲は２５〜７０℃であった。
（ホ）温度安定性
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの耐熱性を、それぞれｐＨ６．０および７．０（５０ｍＭリン酸緩衝液中）の条件下で、種々の温度で１５分間処理してその残存活性を常法により求めることにより測定した。その結果を図６に示す。図６からわかるように、マルトースホスホリラーゼ（白丸）は５０℃まで極めて安定であり、７０℃で完全に失活した。また、トレハロースホスホリラーゼ（黒丸）は６０℃まで極めて安定であり、７０℃で完全に失活した。
（ヘ）阻害剤
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの分解活性を各種無機イオンと阻害剤存在下で測定した。その結果両酵素活性は、銅、水銀、Ｎ−ブロモサクシニイミド、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸（各々１ｍＭ）によって強く阻害された。マルトースホスホリラーゼはＳＤＳ（１％）で強く阻害されたが、トレハロースホスホリラーゼは阻害されなかった。
（ト）等電点
イソエレクトロフォーカシング法アイソゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｏ社製）により、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの等電点を測定した結果、マルトースホスホリラーゼはｐＨ４．８〜５．０（計算値、ｐＨ４．９８）、トレハロースホスホリラーゼはｐＨ４．８〜５．２（計算値、ｐＨ５．１３）であった。
（チ）ゲルろ過法による分子量
セファクリルＳ−２００を用いるゲル濾過法によりマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの分子量を測定した。その結果、ゲル濾過法では両酵素の分子量はいずれも約１９０，０００ダルトンであったが、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気永動法ではマルトースホスホリラーゼは約８９，０００〜９０，０００ダルトン（計算値、９２，２３３ダルトン）、トレハロースホスホリラーゼは約８９，０００〜９０，０００ダルトン（計算値、９１，２８０ダルトン）であったことから、これらの酵素はそれぞれホモ２量体から構成されていることが予想された。両組換え酵素の分子量が野性型に較べて若干大きいのは、Ｎ末端にＨｉｓタグとスペーサー部分の２３アミノ酸配列が付加されている為に、分子量が野生型に比べて約３５００大きくなっている為である。
［実施例８］：
菌体内および菌体外トレハロースホスホリラーゼの製造
トレハロース１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）２％、リン酸アンモニウム０．２５％、尿素０．１５％、食塩１％、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム・七水塩０．０２％および炭酸カルシウム０．１５％を含むｐＨ７．５の液体培地１０Ｌ（リットル）に、予め同じ培地で一夜培養したパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５の種菌５００ｍＬを無菌的に添加し、３５℃、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ［通気量（Ｌ）／培地（Ｌ）／ｍｉｎ］の条件下で２４時間通気攪拌培養した。本培養液のトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した結果、培養液１ｍＬ当たり１．８単位であった。また同様にマルトースホスホリラーゼ活性も測定したが、活性は微量であった。次いで、この培養液を、１２，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、約７５ｇの菌体（湿潤量）および約１０Ｌ（リットル）の上清液を得た。この上清液をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）社製ＵＦ膜（ＹＭ−３０）で濃縮し、約５００ｍＬの菌体外濃縮粗酵素が得られた。上清液中の酵素活性を測定した結果、全活性（約１４×１０３単位）の約２５％の活性があった。菌体部分については１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で充分洗浄し、２４０ｍＬの同上緩衝液に懸濁させ、超音波菌体破砕機で菌体を破砕した。常法によりトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した結果、全活性の約７５％が菌体内に含まれていた。
従って、炭素源としてトレハロースを用いてパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５を培養することにより、トレハロースホスホリラーゼを優先的に生産することができ、その際酵素は菌体内に約７５％、菌対外に約２５％の割合で含まれることが分かった。
［実施例９］：
マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ含有菌体内および菌体外酵素の製造
実施例２で用いた培地成分中のトレハロースをマルトースに、酵母エキス２％をポリペプトンＦＣ（日本製薬（株）製）４．５％（ｗ／ｖ）にそれぞれ代え、その他は同様な条件と方法でパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５を培養した。この培養液のマルトースホスホリラーゼ活性とトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した結果、培養液１ｍＬ当たり０．８単位のマルトースホスホリラーゼ活性と０．５単位のトレハロースホスホリラーゼを生産していた。実施例８と同様に遠心分離して約５０ｇの菌体（湿潤量）および７Ｌ（リットル）の上清液を得た。得られた菌体および上清中のマルトースホスホリラーゼ活性を測定したところ、マルトースホスホリラーゼの全活性の約８０％が菌体内に、約２０％が菌体外（培養上清）に含まれていた。また、トレハロースホスホリラーゼの全活性の約８０％が菌体内に、約２０％が菌体外（培養上清）に含まれていた。実施例１と同様な方法で培養上清を濃縮し、約３３０ｍＬの濃縮酵素を得た。濃縮酵素中には約５５０単位のマルトースホスホリラーゼと５００単位のトレハロースホスホリラーゼが含まれていた。
従って、炭素源としてマルトースを用いてパエニバチルス  エスピー  ＳＨ−５５を培養することにより、マルトースホスホリラーゼを生産するが、同時に、トレハロースホスホリラーゼも生産することができ、その際いずれの酵素とも菌体内に約８０％、菌対外に約２０％の割合で含まれることが分かった。
［実施例１０］：
マルトースからのトレハロースの製造
１０ｍＬの１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解させた１０％、２０％、３０％、および４０％（Ｗ／Ｖ）の各マルトース溶液に本発明のトレハロースホスホリラーゼおよびマルトースホスホリラーゼを各々基質重量１ｇ当たり５単位（分解活性）添加し、５５℃で７０時間反応させた。反応終了後、反応液を１００℃で５分間加熱して酵素を失活させて得られる糖化液中のトレハロース含有量を測定した。その結果、前記４種類のマルトース溶液のそれぞれについて、基質重量に対してそれぞれ５８．２％、５８．１％、５８．６％、および５７．９％のトレハロースが生成していた。
なお、トレハロースの定量は以下の方法で行った。即ち、加熱失活させた糖化液に水を加え、約１％（Ｗ／Ｖ）とした後、該糖化液０．５ｍｌにグルコアミラーゼ（生化学工業製、ピュアグレード３０Ｕ／ｍｇ）を０．０１単位添加し、５０℃、ｐＨ５．０で１時間反応させて未反応のマルトースをグルコースに完全に分解させた。次いで１００℃の沸騰水浴中で５分間加熱してグルコアミラーゼを失活させた後、生成する不溶性蛋白質を０．４５μｍのメンブレンフィルターで除去して得られる濾液中のトレハロース含有量をＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ（ＡＱ−３０４、ＹＭＣ社製）カラムを用いる液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）で測定した。なお、測定は移動相に水を用い、カラム温度を３０℃として、検出には示差屈折計を用いた。
［実施例１１］：
マルトースシラップからのトレハロースの製造
１０ｍＬの５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解させた２０％（Ｗ／Ｖ）のハイマルトースシラップ（日本食品化工製、商品名ＭＣ−９５、糖組成：グルコース２．５％、マルトース９５．２％、マルトトリオース０．８％、マルトテトラオース１．５％）に、本発明のトレハロースホスホリラーゼおよびマルトースホスホリラーゼを基質重量１ｇ当たり各々５単位添加し、以下実施例１０と同様に反応させた。生成したトレハロースをＨＰＬＣ法で測定した結果、使用した基質重量に対して５４．３％のトレハロースが生成した。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、トレハロースを酵素的に製造する際に必要なマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを菌体内及び菌体外に生産し得る新規な微生物が提供される。本発明の微生物は細菌であるので、従来トレハロースホスホリラーゼの供給源として知られていた緑藻や担子菌に比較して、酵素の取得方法が非常に容易であるばかりでなく、培養時間も大幅に短縮することができ経済的である。さらに、本発明の微生物は、一種類の微生物のみを用いて、トレハロースの酵素的生産に必要な二種類の酵素を同時に生産し得るという点でも実用的に著しい利点を有する。また、本発明の２つの酵素は、トレハロースを酵素的に生産する際に要求される諸要件をいずれも満足するので、得られるトレハロースの有効利用を著しく容易にし、経済的にも大幅な改善を達成し得るものである。即ち、本発明のマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼは高い温度安定性を有し、高温での酵素反応が可能であるので反応中の雑菌汚染から免れることができる。さらには、両方の酵素がほぼ同じ最適ｐＨ範囲を有しているので反応中の煩雑なｐＨ管理が不要であるという利点も有する。更に、本発明の酵素を得るための別の方法として、上記菌株から本発明の酵素をコードする遺伝子を取り出した後、遺伝子工学技術を用いて組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養することによってトレハロースを酵素的に製造する際に必要なマルトースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの生産、両酵素のタンパク質工学的な改良が可能になった。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月6日(2005.5.6)
【手続補正００１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】以下に示す理化学的性質を有するパエニバチルス属微生物由来のマルトースホスホリラーゼ。
（イ）作用：マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：マルトースに作用し、トレハロース、シュークロース、ラクトース、セロビオースなどには作用しない。
（ハ）最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．５〜６．５である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜７．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２０〜６０℃である。分解反応の最適温度は４５〜５５℃であり、合成反応の最適温度は５０〜５５℃である。
（ホ）温度安定性：ｐＨ６．０、１５分間の加熱条件下では５０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。


【手続補正００２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】以下に示す理化学的性質を有するパエニバチルス属微生物由来のトレハロースホスホリラーゼ。
（イ）作用：トレハロース中のα−１，１−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース１−リン酸を生成する。
（ロ）基質特異性（分解反応）：トレハロースに作用し、マルトース、シュークロース、ラクトース、セロビオースなどに作用しない。
（ハ）最適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：分解反応の最適ｐＨは７．０〜８．０であり、合成反応の最適ｐＨは５．８〜７．８である。５０℃、１０分間の加熱条件下ではｐＨ５．５〜９．５の範囲内で安定である。
（ニ）作用温度の範囲と最適温度：作用温度範囲は２５〜７０℃である。分解反応の最適温度は５０〜６５℃であり、合成反応の最適温度は４５〜６０℃である。
（ホ）温度安定性：ｐＨ７．０、１５分間の加熱条件下では６０℃まで極めて安定である。また、７０℃で完全に失活する。
（ヘ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量は約８９，０００〜９０，０００ダルトンであり、ゲル濾過法による分子量は約１９０，０００ダルトンであり、ホモ２量体から構成されている。




【国際調査報告】
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