(57)【要約】本発明は、強力な細胞死誘導作用を有するタンパク質、すなわちＧＦＰをＮ末端に融合した改変型Ｂａｘタンパク質のＮ末端側にさらに癌細胞へのホーミング作用を有するホーミングシグナルペプチドを融合させた融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする遺伝子、および該融合タンパク質を含む癌細胞増殖抑制剤を提供する。本発明は、癌細胞に特異的に作用する細胞死誘導遺伝子を含む融合遺伝子であって、癌細胞に特異的なホーミングシグナルペプチド配列をコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子およびヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘをコードする遺伝子をこの順番で融合させた融合遺伝子および該融合遺伝子がコードする融合タンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用する細胞死誘導遺伝子を含む融合遺伝子であって、血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的なホーミングシグナルペプチド配列をコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子およびヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘをコードする遺伝子をこの順番で融合させた融合遺伝子。
【請求項２】
ホーミングシグナルペプチド配列が、以下の（ａ）〜（ｏ）のペプチド配列からなる群から選択される請求項１記載の融合遺伝子。
（ａ）ＲＧＤペプチド配列、
（ｂ）ＮＧＲペプチド配列、
（ｃ）配列番号７に示されるペプチド配列、
（ｄ）配列番号８に示されるペプチド配列、
（ｅ）配列番号９に示されるペプチド配列、
（ｆ）配列番号１０に示されるペプチド配列、
（ｇ）配列番号１１に示されるペプチド配列、
（ｈ）配列番号１２に示されるペプチド配列、
（ｉ）配列番号１３に示されるペプチド配列、
（ｊ）配列番号１４に示されるペプチド配列、
（ｋ）配列番号１５に示されるペプチド配列、
（ｌ）配列番号１６に示されるペプチド配列、
（ｍ）ＬＤＶからなるペプチド配列、
（ｎ）配列番号１７に示されるペプチド配列、および
（ｏ）配列番号１８に示されるペプチド配列
【請求項３】
ホーミングシグナルペプチド配列が、血管新生している内皮細胞へのホーミングシグナルペプチド配列であるＲＧＤまたはＮＧＲである、請求項２記載の融合遺伝子。
【請求項４】
ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘがヒトＢＡＸのアミノ酸配列第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなる、請求項１から３のいずれか１項に記載の融合遺伝子。
【請求項５】
融合遺伝子が以下の（ｐ）または（ｑ）のＤＮＡからなる請求項１から３のいずれか１項に記載の融合遺伝子。
（ｐ）配列番号３または５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
（ｑ）（ｐ）のＤＮＡの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の融合遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが無細胞系で融合遺伝子を発現し得る請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の融合遺伝子がコードする融合タンパク質を製造する方法。
【請求項９】
血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用する細胞死誘導タンパク質を含む融合タンパク質であって、血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的なホーミングシグナルペプチド配列、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質をこの順番で融合させた融合タンパク質。
【請求項１０】
ホーミングシグナルペプチド配列が、以下の（ａ）〜（ｏ）のペプチド配列からなる群から選択される請求項９記載の融合タンパク質。
（ａ）ＲＧＤペプチド配列、
（ｂ）ＮＧＲペプチド配列、
（ｃ）配列番号７に示されるペプチド配列、
（ｄ）配列番号８に示されるペプチド配列、
（ｅ）配列番号９に示されるペプチド配列、
（ｆ）配列番号１０に示されるペプチド配列、
（ｇ）配列番号１１に示されるペプチド配列、
（ｈ）配列番号１２に示されるペプチド配列、
（ｉ）配列番号１３に示されるペプチド配列、
（ｊ）配列番号１４に示されるペプチド配列、
（ｋ）配列番号１５に示されるペプチド配列、
（ｌ）配列番号１６に示されるペプチド配列、
（ｍ）ＬＤＶからなるペプチド配列、
（ｎ）配列番号１７に示されるペプチド配列、および
（ｏ）配列番号１８に示されるペプチド配列
【請求項１１】
ホーミングシグナルペプチド配列が、血管新生している内皮細胞へのホーミングシグナルペプチド配列であるＲＧＤまたはＮＧＲである、請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘがヒトＢＡＸのアミノ酸配列第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなる、請求項１０または１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
以下の（ｒ）若しくは（ｓ）に示す請求項１０から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
（ｒ）  配列番号４または６で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質
（ｓ）  （ｑ）の融合タンパク質アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む癌細胞増殖抑制剤。
【請求項１５】
請求項１４記載の癌細胞増殖抑制剤であって、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質との融合により、ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質の細胞死誘導作用が、単独のヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質の細胞死誘導作用に比べ増強されている癌細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、強力な細胞死誘導作用を有するタンパク質、すなわちＧＦＰをＮ末端に融合した改変型Ｂａｘタンパク質のＮ末端側にさらに血管新生している内皮細胞の表面受容体へのホーミング作用を有するホーミングシグナルペプチドを融合させた融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする遺伝子、および該融合タンパク質を含む癌細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】  アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、Ｂａｘ遺伝子は強力なアポトーシス誘導遺伝子として知られている。一方、アポトーシスを抑制する癌遺伝子として、Ｂｃｌ−２遺伝子が知られており、Ｂｃｌ−２タンパク質に相同性を示す多数のＢｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質が知られている（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等）。
アポトーシスあるいは広く細胞死を誘導する遺伝子の癌細胞への導入は抗癌治療の有望な方法であるが、近年Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等のＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質が癌細胞において発現し、Ｂａｘタンパク質の細胞死誘導に対して拮抗作用を示すことが報告されている。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質はＢａｘタンパク質のＢＨ３と呼ばれる領域を介してＢａｘタンパク質と結合し、拮抗作用を示す。本発明者は、ＢＨ３領域を含むＮ末端を欠損させた第１１２位から１９２位のアミノ酸からなるＮ端側欠失Ｂａｘ（ΔＮＢａｘ）について検討し、ΔＮＢａｘが細胞死誘導遺伝子Ｂａｘの細胞死誘導領域であることを報告した（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８  Ｆｅｂ  １３；２４３（２）：６０９−６１６）。ΔＮＢａｘをプロモーターの下流に連結し、細胞中で発現させると細胞死を誘導し、またＢｃｌ−ＸＬと強発現させた場合でも細胞死誘導活性が阻害されることはなかった。このΔＮＢａｘをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよびΔＮＢａｘペプチドを癌細胞増殖抑制に用い得ることについても報告されている（特開２００２−３５５０３４号公報）。
一方、抗癌剤等の薬剤を細胞に特異的に導入するためのホーミングシグナルペプチドが現在種々研究されている。例えば、ＮＧＲ、ＲＧＤと命名されたペプチドは血管新生している内皮細胞に選択的に作用することが知られており（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９  Ｓｅｐ；５（９）：１０３２−１０３８）、癌組織中の血管新生している内皮細胞の表面受容体への特異的ホーミングシグナルペプチドとして使用できる可能性がある。
現在癌の治療は主に抗がん剤を投与する化学療法、放射線を患部に照射する放射線療法、抗癌細胞抗体を投与する免疫療法および遺伝子治療によっている。しかし、化学療法や放射線療法は各種の副作用が問題となっている。また、免疫療法は長期間の経過を要し、さらに遺伝子療法では遺伝子の患者に対する作用等安全性の面で開発に多大な労力を要する。このため分子量の大きな癌細胞に直接作用するタンパク質を標的部位に直接作用する癌治療法が望まれていたが、従来は癌細胞の増殖を強く抑制し、なおかつ癌細胞に特異的に作用するタンパク質であって、癌治療に確実に用い得るものはなかった。ΔＮＢａｘを特異的に癌組織中の血管新生している内皮細胞の表面受容体に作用させることができれば、従来の方法の有する欠点を解消し、より効率的な癌細胞増殖抑制剤として利用されることが期待されていた。しかし、従来このような検討はされていなかった。また、ΔＮＢａｘはそのままでもアポトーシス誘導活性を有するが、より強力なアポトーシス誘導活性をもつΔＮＢａｘが望まれていた。
【発明の開示】
本願発明は、改変型ＢａｘであるΔＮＢａｘのアポトーシス誘導作用を増大させ、さらに血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用させることを目的とする。具体的には、ΔＮＢａｘに血管新生している内皮細胞の表面受容体特異的なホーミングシグナルペプチドおよびグリーン蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＰ）をホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰ、ΔＮＢａｘの順で融合させた融合タンパク質およびそれをコードする遺伝子、ならびにそれらを含む抗癌剤を提供することを目的とする。
本発明者はΔＮＢａｘの作用の検討を行うために、ΔＮＢａｘのＮ末端側にΔＮＢａｘの細胞内の局在の視覚化を容易にすべくＧＦＰを融合した融合タンパク質を作製し、株化細胞に導入し細胞死誘導作用を調べた。その結果、驚くべきことにＧＦＰと融合したΔＮＢａｘの細胞死誘導作用が促進されていることを見出した。さらに、本発明者はＧＦＰと融合しアポトーシス誘導作用が促進されたΔＮＢａｘを癌組織中の血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用させる方法について鋭意検討を行った結果、ＮＧＲ、ＲＧＤ等のホーミングシグナルペプチドをＧＦＰのＮ末端側に融合させることにより、アポトーシス誘導作用が促進されたΔＮＢａｘを血管新生している内皮細胞の表面受容体で特異的に作用させることができることを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用する細胞死誘導遺伝子を含む融合遺伝子であって、血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的なホーミングシグナルペプチド配列をコードする遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子およびヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘをコードする遺伝子をこの順番で融合させた融合遺伝子、
［２］  ホーミングシグナルペプチド配列が、以下の（ａ）〜（ｏ）のペプチド配列からなる群から選択される［１］の融合遺伝子、
（ａ）ＲＧＤペプチド配列、
（ｂ）ＮＧＲペプチド配列、
（ｃ）配列番号７に示されるペプチド配列、
（ｄ）配列番号８に示されるペプチド配列、
（ｅ）配列番号９に示されるペプチド配列、
（ｆ）配列番号１０に示されるペプチド配列、
（ｇ）配列番号１１に示されるペプチド配列、
（ｈ）配列番号１２に示されるペプチド配列、
（ｉ）配列番号１３に示されるペプチド配列、
（ｊ）配列番号１４に示されるペプチド配列、
（ｋ）配列番号１５に示されるペプチド配列、
（ｌ）配列番号１６に示されるペプチド配列、
（ｍ）ＬＤＶからなるペプチド配列、
（ｎ）配列番号１７に示されるペプチド配列、および
（ｏ）配列番号１８に示されるペプチド配列
［３］  ホーミングシグナルペプチド配列が、血管新生している内皮細胞へのホーミングシグナルペプチド配列であるＲＧＤまたはＮＧＲである、［２］の融合遺伝子、
［４］  ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘがヒトＢＡＸのアミノ酸配列第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなる、［１］から［３］のいずれかの融合遺伝子、
［５］  融合遺伝子が以下の（ｐ）または（ｑ）のＤＮＡからなる［１］から［３］のいずれかの融合遺伝子、
（ｐ）配列番号３または５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
（ｑ）（ｐ）のＤＮＡの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［６］  ［１］から［５］のいずれかの融合遺伝子を含む発現ベクター、
［７］  発現ベクターが無細胞系で融合遺伝子を発現し得る［６］の発現ベクター、
［８］  ［７］の発現ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることを含む、［１］から［５］のいずれかの融合遺伝子がコードする融合タンパク質を製造する方法、
［９］  血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に作用する細胞死誘導タンパク質を含む融合タンパク質であって、血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的なホーミングシグナルペプチド配列、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質をこの順番で融合させた融合タンパク質、
［１０］  ホーミングシグナルペプチド配列が、以下の（ａ）〜（ｏ）のペプチド配列からなる群から選択される［９］の融合タンパク質。
（ａ）ＲＧＤペプチド配列、
（ｂ）ＮＧＲペプチド配列、
（ｃ）配列番号７に示されるペプチド配列、
（ｄ）配列番号８に示されるペプチド配列、
（ｅ）配列番号９に示されるペプチド配列、
（ｆ）配列番号１０に示されるペプチド配列、
（ｇ）配列番号１１に示されるペプチド配列、
（ｈ）配列番号１２に示されるペプチド配列、
（ｉ）配列番号１３に示されるペプチド配列、
（ｊ）配列番号１４に示されるペプチド配列、
（ｋ）配列番号１５に示されるペプチド配列、
（ｌ）配列番号１６に示されるペプチド配列、
（ｍ）ＬＤＶからなるペプチド配列、
（ｎ）配列番号１７に示されるペプチド配列、および
（ｏ）配列番号１８に示されるペプチド配列
［１１］  ホーミングシグナルペプチド配列が、血管新生している内皮細胞へのホーミングシグナルペプチド配列であるＲＧＤまたはＮＧＲである、［１０］の融合タンパク質、
［１２］  ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘがヒトＢＡＸのアミノ酸配列第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなる、［１０］または［１１］の融合タンパク質、
［１３］  以下の（ｒ）若しくは（ｓ）に示す［１０］から［１２］のいずれかの融合タンパク質、および
（ｒ）  配列番号４または６で表されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質
（ｓ）  （ｒ）の融合タンパク質アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質
［１４］  ［１０］から［１３］のいずれかの融合タンパク質を含む癌細胞増殖抑制剤、ならびに
［１５］  ［１４］の癌細胞増殖抑制剤であって、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質との融合により、ヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質の細胞死誘導作用が、単独のヒトＢａｘのＢＨ３領域を含むＮ末端配列を除去したΔＮＢａｘタンパク質の細胞死誘導作用に比べ増強されている癌細胞増殖抑制剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０８１３３７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＧＦＰ−ΔＮＢａｘとΔＮＢａｘの細胞死誘導活性の比較の結果を示す図である。
図２は、ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの細胞への取込みを示す写真である。
図３は、ＰＩ陽性像を示す写真である。
図４は、担癌マウスを用いたＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本願発明は細胞死誘導遺伝子ヒトＢａｘの細胞死誘導領域部分を含む融合遺伝子およびその遺伝子がコードするタンパク質であり、該融合遺伝子はホーミングシグナルペプチドをコードする遺伝子およびＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードする遺伝子を含み、５’側からホーミングシグナルペプチドをコードする遺伝子、ＧＦＰをコードする遺伝子およびＢａｘの細胞死誘導領域部分の順番で連結されている。
Ｂａｘの細胞死誘導領域部分は、ＢａｘのＢＨ１領域、ＢＨ２領域およびＢＨ３領域のうち、Ｂａｘタンパク質の細胞死誘導作用に対して拮抗的に作用するＢｌｃ−２ファミリーのタンパク質が相互作用するＢＨ３領域を除いた部分である。ＢＨ３領域はＢａｘのＮ端側のアミノ酸配列の第５９位から７３位または７７位をコア領域としており、Ｂａｘの細胞死誘導領域部分を含む改変型ＢａｘはＢａｘ遺伝子の５’端側のＢａｘタンパク質のＮ端側のアミノ酸配列の少なくとも第５９位から７３位または７７位に相当するヌクレオチドを欠失させたもの（ΔＮＢａｘ）である。このようなＢａｘの細胞死誘導領域部分を含む改変型Ｂａｘとして、Ｂａｘ遺伝子がコードする１９２アミノ酸からなるＢａｘタンパク質の第１１２位のアミノ酸から第１９２位のアミノ酸をコードする２４３塩基からなるポリヌクレオチドが好ましい。ヒトＢａｘ遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ヒトＢａｘタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。この配列情報からヒトＢａｘ  ｃＤＮＡを通常の遺伝子工学的技法により合成し、制限酵素等を用いてΔＮＢａｘ遺伝子を得ることができる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８  Ｆｅｂ  １３；２４３（２）：６０９−６１６に記載の方法により取得できる。
本発明において、ΔＮＢａｘ遺伝子は好適には配列番号１で表される塩基配列の第３３４位〜第５７６位の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｂａｘタンパク質の第１１２位〜１９２位のアミノ酸配列に相当）からなる遺伝子であるが、該ＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００ｍＭ、好ましくは７００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは６５℃での条件をいう。また配列番号１で表される塩基配列の第３３４位〜第５７６位の塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しており細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。さらに、配列番号１で表される塩基配列の第３３４位〜第５７６位の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１または複数の塩基が欠失、置換、付加され、かつ細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。ここで、細胞死誘導作用とは、細胞に細胞死を起こさせる作用をいい、アポトーシスとネクローシスがある。例えば、細胞死の一形態であるアポトーシスにより細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝縮という特徴的な形態が現れる。Ｂａｘはもともとアポトーシス誘導（促進）タンパク質として発見されたが、Ｂａｘは細胞によってはネクローシスも引き起こすことが報告されている（Ｓｈｉｎｏｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１８：５７０３（１９９９））。本明細書において細胞死という場合、アポトーシスとネクローシスの両方が含まれている。タンパク質が細胞死誘導作用を有するか否かは、本願明細書の実施例４の方法に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することができる。
ＧＦＰは、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のｇｆｐ  １０遺伝子によりコードされるＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｅａ由来のものを用いることができる（（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．ら（１９９２），”Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｇｅｎｅ  １１１：２２９−２３３））。また、ＧＦＰ遺伝子は市販のものも用いることができ、例えば市販のベクターｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（特表２０００−５０３５３６号公報）に含まれるＧＦＰをコードする遺伝子を用いることもできる。配列番号３の第４０位から７５３位の塩基配列（配列番号５では、第２８位から第７４１位）がＧＦＰをコードする遺伝子の配列を示す。また、種々の改変型ＧＦＰが知られており、これらの改変型ＧＦＰを本発明のＧＦＰとして用いることもできる。このような改変型ＧＦＰとしてＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰＵＶ、ＧＦＰｍｕｔ３．１、ＢＦＰ２（すべてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社から入手可能）、Ｖｅｎｕｓ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００２  Ｖｏｌ．２０−１，８７−９０）、Ｓ６５Ｔが挙げられる。また、ＧＦＰの蛍光色の変異体である、ＥＢＦＰ（Ｂｌｕｅ）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）、ＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（すべてＣＬＯＮＴＥＣＨ社から入手可能）も本発明のＧＦＰとして使用できる。これらの改変型ＧＦＰは例えば、『実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座３  ＧＦＰとバイオイメージング』  宮脇敦史  編、２０００年１０月２５日第１版第１刷発行、羊土社  に詳細に記載されており、この記載を参照して入手することができる。さらに、ΔＮＢａｘと融合させた場合にΔＮＢａｘの細胞死誘導作用をより促進するように改変されたＧＦＰまたはその誘導体タンパク質も本発明のＧＦＰに含まれる。
ホーミングシグナルペプチドとは、特定の細胞の表面に発現している受容体（ホーミングシグナルペプチドのリガンド）と結合するペプチドをいい、体内に投与した場合に体液中を循環しそのホーミングシグナルペプチドが特異的に結合し得る受容体を表面に担持している標的細胞に到達し結合する。ホーミングシグナルペプチドのＣ末端側に薬剤となりうるタンパク質等と結合させた場合、ホーミングシグナルペプチドは該タンパク質を標的細胞に到達させ該タンパク質がその細胞内部に取り込まれる。本願発明では血管新生している内皮細胞の表面受容体に特異的に結合することにより血管新生している内皮細胞に特異的に結合するペプチドを用いる。ホーミングシグナルペプチドとして、血管新生している内皮細胞のホーミングシグナルペプチド受容体に特異的結合するＮＧＲおよびＲＧＤ（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９  Ｓｅｐ；５（９）：１０３２−１０３８）を用いることができ、ＮＧＲおよびＲＧＤの塩基配列は、それぞれ配列番号３の第４位から第３３位および配列番号５の第７位から第２１位の塩基配列で示される。ＮＧＲはＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｎ（ＣＤ１３）に結合し（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６０：７２２−７２７）、ＲＧＤはインテグリンのαｖβ３およびαｖβ５に結合する（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：２６５−２７０）ことが知られている。ホーミングシグナルペプチドとしてＮＧＲまたはＲＧＤを用いた場合、ホーミングシグナルは血管新生している内皮細胞にホーミングするので、ホーミングシグナルペプチドと融合した細胞死誘導タンパク質が癌組織中の血管新生している内皮細胞の表面受容体に結合し該内皮細胞に取り込まれ癌組織中の血管新生している細胞の細胞死を引き起こす。癌組織中において癌細胞は血管新生している内皮細胞から生存・増殖に必要な養分を受け取っているので、これらの内皮細胞が細胞死を起こすことにより癌細胞は養分補給を受けられなくなり、癌細胞も死滅する。従って、ホーミングシグナルペプチドと融合した細胞死誘導タンパク質は、最終的に癌細胞を殺す効果がある。また、癌細胞によっては、癌細胞に脱分化した後に血管新生している内皮細胞が有している受容体を発現すると、この場合はホーミングシグナルペプチドが直接癌細胞に結合し、細胞死誘導タンパク質が癌細胞に取り込まれ癌細胞の細胞死を引き起こす。例えば、上述のＮＧＲはカポシ肉腫由来のＫＳ１７６７癌細胞に結合することが報告されている（Ｅｌｌｅｒｂｙ，Ｈ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．５：１０３２（１９９９））ので、ＮＧＲを融合した本発明の融合タンパク質は直接癌細胞の細胞死を引き起こすことができる。但し、ホーミングシグナルペプチドはこれらのペプチドに限定されず、特定組織または器官の細胞に特異的に結合し得る種々のペプチドを、該組織または器官の癌組織へのホーミングのために用いることができ、以下のものが例示できる。
（１）臓器特異的ホーミングシグナルペプチド（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．＆  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９９６  ｖｏｌ．３８０，ｐｐ．３６４−３６６．））
（ａ）  ＣＬＳＳＲＬＤＡＣ（配列番号７）、ＣＮＳＲＬＨＬＲＣ（配列番号８）、ＣＥＮＷＷＧＤＶＣ（配列番号９）、ＷＲＣＶＬＲＥＧＰＡＧＧＣＡＷＦＮＲＨＲＬ（配列番号１０）の４個は脳を標的にする。
（ｂ）  ＣＬＰＶＡＳＣ（配列番号１１）、ＣＧＡＲＥＭＣ（配列番号１２）の２個は腎臓を標的にする。
（２）（関節の）滑膜を標的にするホーミングシグナルペプチド（Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ，（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００２  ｖｏｌ．４６，ｐｐ．２１０９−２１２０．））
2004085653.tif 000002
（３）ｔｕｍｏｒ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓを標的にするホーミングシグナルペプチド（Ｌａａｋｋｏｎｅｎ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００２  ｖｏｌ．８，ｐｐ．７５１−７５５））
2004085653.tif 000003
（４）血管新生している血管内皮細胞を標的にするホーミングシグナルペプチド（Ａｓａｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ  ２００２  ｖｏｌ．５２０，ｐｐ．１６７−１７０．））
2004085653.tif 000004
（５）細胞の表面に存在するインテグリン（インテグリンは総称で、複数の種類がある）に結合するペプチド（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１９９４，ｖｏｌ．２４５，ｐｐ．３４６−３６９．））
ＫＱＡＧＤＶ（配列番号１６）、ＬＤＶ、ＫＲＬＤＧＳ（配列番号１７）、ＤＧＥＡ（配列番号１８）の４個が知られている。
また、癌抗原に結合する抗癌抗原抗体、または該癌抗原に結合し得るその抗体の断片も本発明においてホーミングシグナルペプチドと同様の作用を有するものとして用いることができる。
Ｂａｘの細胞死誘導領域を含む部分、ＧＦＰおよびホーミングシグナルペプチドは、Ｎ末端側からホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰおよびＢａｘの細胞死誘導領域を含む部分の順番で融合させる。これは、ホーミングシグナルペプチドは、そのＣ末端側に存在するタンパク質を標的細胞に導入させることができるからであり、またＢａｘはそのＣ末端部分に膜融合部位があるからである。ΔＮＢａｘは単独でも細胞死誘導作用を有しているが、ΔＮＢａｘのＮ末端側にＧＦＰを融合させることによりΔＮＢａｘの細胞死誘導作用が促進される。本発明においてＧＦＰとΔＮＢａｘの融合タンパク質の促進された細胞死誘導作用とは、ΔＮＢａｘ単独で示す細胞死誘導作用よりも強い細胞死誘導作用をいう。ＧＦＰとΔＮＢａｘの融合タンパク質の細胞死誘導作用が促進されているかどうかは、ΔＮＢａｘタンパク質単独およびＧＦＰとΔＮＢａｘタンパク質の融合タンパク質の両方を用いて本明細書の実施例１の（２）に記載の方法により両者の細胞死誘導作用を比較すればよい。例えば適当な宿主細胞集団にＧＦＰ遺伝子とΔＮＢａｘ遺伝子の融合遺伝子を含む適当なベクターおよびΔＮＢａｘ遺伝子のみを含む該ベクターをそれぞれ導入し、ＧＦＰとΔＮＢａｘの融合タンパク質および単独のΔＮＢａｘタンパク質を発現させた場合の生細胞率により細胞死誘導作用を測定した場合、ＧＦＰとΔＮＢａｘの融合タンパク質の細胞死誘導作用は、ΔＮＢａｘ単独での細胞死誘導作用よりも有意に強く、好ましくは１．５倍以上強く（ΔＮＢａｘ単独での生細胞率がＧＦＰとΔＮＢａｘの融合タンパク質の生細胞率の１．５倍以上）、さらに好ましくは２倍以上強く、特に好ましくは３倍以上強い。
ホーミングシグナルペプチドをコードする遺伝子、ＧＦＰをコードする遺伝子およびＢａｘの細胞死誘導領域部分をコードする遺伝子の融合は、通常の遺伝子組換えの手法により行うことができる。この際、適当な制限部位を導入して行うことができる。上述のようにホーミングシグナルペプチドをコードする遺伝子、ＧＦＰをコードする遺伝子およびＢａｘの細胞死誘導領域部分をコードする遺伝子の順で融合させる。この際、融合する遺伝子の間にストップコドンが現れないようにする。融合する遺伝子の間の距離は限定されず、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。ホーミングシグナルペプチドの活性および増大された細胞死誘導作用を有する融合タンパク質が翻訳されるためには、３つの遺伝子のオープンリーディングフレームを合わせるようにする。ホーミングシグナルペプチドとしてＲＧＤ、ΔＮＢａｘとしてヒトＢａｘタンパク質のアミノ酸配列の第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなるΔＮＢａｘを用いた場合の融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に、ホーミングシグナルペプチドとしてＮＧＲ、ΔＮＢａｘとしてヒトＢａｘのタンパク質のアミノ酸配列の第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなるΔＮＢａｘを用いた場合の融合タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。該ＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、ΔＮＢａｘ単独よりも促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が５００〜１０００ｍＭ、好ましくは７００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは６５℃での条件をいう。また配列番号３または５で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しておりコードする融合タンパク質が血管新生している内皮細胞に結合し、ΔＮＢａｘ単独よりも促進された細胞死誘導作用を有するＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。さらに、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１または複数の塩基が欠失、置換、付加され、かつ血管新生している内皮細胞に結合し、ΔＮＢａｘ単独よりも促進された細胞死誘導作用を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
ホーミングシグナルペプチドとしてＲＧＤおよびＮＧＲ以外のものを用いた場合も、融合遺伝子全体として上述のように一部の塩基が欠失、置換、付加された配列を有する融合遺伝子も、用いたホーミングシグナルペプチドがその標的細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有する限り、本発明の融合遺伝子に含まれる。
このようにして作製した融合遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、発現させ、目的の融合タンパク質を回収、精製することができる。但し、この際発現ベクターを宿主細胞に導入してタンパク質を発現させようとする場合、ΔＮＢａｘの細胞死誘導作用で、宿主細胞が死に易くなるので、無細胞系（セルフリーシステム）で発現させるのが望ましい。ここで無細胞系での発現とは、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることをいう（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，（１９８８）”Ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，１１６２；Ｋｉｍ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）”Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９，８８１−８８６）。市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ）やＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞系発現システムに適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、ｐＥＸＰ１やｐＥＸＰ２が挙げられる。
また、本発明の融合遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に組込んで発現させる細胞を用いる発現システムで本発明の融合遺伝子を発現させ、本発明の融合タンパク質を発現させる場合は、融合遺伝子が常に発現していては、細胞死誘導タンパク質の作用により宿主細胞が細胞死を起こして増殖できなくなってしまう。そのため、宿主細胞を充分増殖させてから、発現融合タンパク質が細胞壊死を引き起こすまでの間に融合遺伝子を発現させる為に、発現誘導システムを有する宿主細胞を用いる必要がある。発現誘導システムを有する宿主細胞を用いることにより、融合遺伝子を有する宿主細胞を充分増殖させた後に発現を誘導すれば、宿主細胞に細胞死が起こる前に充分な量の融合タンパク質を得ることができる。遺伝子を誘導的に発現し得るベクターとは、特定の処理を施すことにより組込まれた外来遺伝子の発現が誘導されるベクターをいう。例えば、特定の調節物質または温度条件で発現を誘導または抑制し得るプロモーターをベクターに組込むことにより誘導型発現ベクターを構築することが可能である。このようなプロモーターとして宿主細胞の培養培地中に誘導物質である薬剤を導入することにより特異的に誘導するプロモーターがある。例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で発現が誘導される。また、Ｔ７プロモーター系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ（Ｔ７  ＤＮＡ１）がｌａｃプロモーターの下流に連結されている場合においても、発現誘導物質としてＩＰＴＧが用いられる。さらに、ｔｒｐプロモーターは３β−インドリルアクリル酸で発現が誘導される。発現誘導は、発現誘導物質の添加のみならず、培養温度を変化させることによって行ってもよい。λｃＩｔｓリプレッサーおよびλＰＬ−プロモーターを含有する発現ベクターを有する組換え体を使用する場合、培養を、例えば約１５〜３６℃、好ましくは約３０〜３６℃で行い、λｃＩｔｓリプレッサーの不活化による発現誘導を、例えば約３７〜４２℃で行うのが好ましい。Ｔ７プロモータの系においても、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ（Ｔ７  ＤＮＡ１）がλＰＬプロモーターの下流に連結されている場合には、培養の温度を上昇させることにより、生成するＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロモーターを作動させる。
さらに、宿主細胞として細胞死誘導タンパク質に耐性を有する細胞を用いてもよい。例えば、ΔＮＢａｘに耐性の大腸菌等の耐性菌を用いればよい。このような細胞は、細胞をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の化学的変異原または紫外線等の物理的変異原により変異を起こさせ、細胞死誘導タンパク質に耐性を有する細胞をスクリーニングすることにより入手することができる。例えば、大腸菌に本発明の融合遺伝子を組込み、該組換え大腸菌に人為的に遺伝子変異を起こさせた後に培養した場合、増殖する大腸菌はΔＮＢａｘに対する耐性を有する大腸菌である。また、大腸菌に人為的に遺伝子変異を起こさせた後に、ΔＮＢａｘを作用させたときに増殖する大腸菌はΔＮＢａｘに対する耐性を有する大腸菌である。遺伝子に突然変異を起こさせる化学的変異原および物理的変異原ならびに変異原の利用法および用量は当業者に公知であるし、耐性を有する細胞をスクリーニングする方法も当業者ならば適宜設計することができる。
本発明の融合遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入して融合タンパク質を発現させる場合は以下のようにして行う。
ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ−１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。前述のように組込んだ遺伝子を誘導的に発現させる場合は、プロモーターとして発現誘導し得るものを用いる。
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することができ、例えば細菌性のものではｐＥＦ１、ｐＰＲＯＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ３ｂ、ｐＥＴ３ｃ、ｐＥＴ−１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、真核性のものではｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等がある。
複製開始点として、大腸菌ベクターに対して、例えばＣｏｌｉＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母ベクターに対して、例えば２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、哺乳類細胞用ベクターに対して、例えばＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス由来のものを用いることができる。また、プロモーターとしてアデノウイルス又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、酵母用としてのＡＤＨ、ＰＨＯ５、ＧＰＤ、ＰＧＫ、ＡＯＸ１プロモーター、蚕細胞用としての核多角体病ウイルス由来プロモーター等を用いることができる。
選択マーカーとして、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等を、哺乳類細胞には、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いることができる。前述のように組込んだ遺伝子を誘導的に発現させる場合は、プロモーターとしてプロモーター下流の遺伝子の発現を誘導し得るものを用いる。
ＤＮＡのベクターへの導入は、任意の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にＤＮＡを挿入することができる。本発明の融合遺伝子を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に前記融合遺伝子がコードするタンパク質を発現、産生させることができる。
宿主細胞としては、ＨＢ１０１、ＤＨ５、ＴＧ１、ＪＭ１０９、ＸＬ１−ｂｌｕｅ、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等の大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、アスペルギルス属菌株等の真菌細胞、パン酵母、メタノール資化性酵母等の酵母細胞、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７等の哺乳類細胞等が挙げられる。前述のように本発明の細胞死誘導融合タンパク質が含む細胞死誘導タンパク質に対する耐性細胞を用いてもよい。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション等の公知の方法で行うことができる。
得られたリコンビナント融合タンパク質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がＧＳＴ等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているタンパク質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列、いわゆるヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有するタンパク質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる、またＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた場合、ＧＳＴはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。
このようにして得られた発現産物はＮ末端からホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰおよびΔＮＢａｘが連結した融合タンパク質である。ホーミングシグナルペプチドとしてＲＧＤ、ΔＮＢａｘとしてヒトＢａｘタンパク質のアミノ酸配列の第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなるΔＮＢａｘを用いた場合の融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に、ホーミングシグナルペプチドとしてＮＧＲ、ΔＮＢａｘとしてヒトＢａｘタンパク質のアミノ酸配列の第１１２位から１９２位のアミノ酸配列からなるΔＮＢａｘを用いた場合の融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
本発明の融合タンパク質は、血管新生している内皮細胞に結合し、ΔＮＢａｘ単独よりも促進された細胞死誘導作用を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号４または６で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号４または６で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号４または６で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１又は数個（例えば１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。この場合のアミノ酸の欠失、置換、付加は融合タンパク質のホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰ、ΔＮＢａｘタンパク質のいずれの部分に生じてもよい。
上記アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有しているものも含まれる。
ホーミングシグナルペプチドとしてＲＧＤおよびＮＧＲ以外のものを用いた場合も、融合タンパク質全体として上述のように一部のアミノ酸が欠失、置換、付加された配列を有する融合タンパク質も、用いたホーミングシグナルペプチドがその標的細胞に結合し、促進された細胞死誘導作用を有する限り、本発明の融合タンパク質に含まれる。
本発明は、上記融合タンパク質を有効成分として含む癌細胞増殖抑制剤組成物も含む。該組成物は、種々の形態で投与することができる。このような投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬などによる非経口投与を挙げることができる。また、本発明の癌細胞増殖抑制剤を癌部に直接投与してもよい。この癌細胞増殖抑制剤は、公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射剤は、融合タンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。その投与量は、症状、年齢、体重および投与経路に依存するであろうから、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定すべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける試験またはｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデル試験系から導かれる。例えば、担癌マウスにおいて、本発明の融合タンパク質を０．２〜０．４ｃｍ３の腫瘍に、２回直接投与した場合、５００ｎｇ／μｌの融合タンパク質を５０μｌ投与することにより、マウスの腫瘍体積が減少する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕  ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの作製
（１）  ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの作製
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子（ＤＮＡ断片Ａ）とΔＮＢａｘの遺伝子（ＤＮＡ断片Ｂ）を２段階ＰＣＲ法で結合させた。
ｐＧｒｅｅｎｌａｎｔｅｒｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を鋳型にして５’側プライマーＰｒｉｍｅｒ  １と３’側プライマーＰｒｉｍｅｒ  ２でＤＮＡ断片Ａを増幅した。Ｐｒｉｍｅｒ  １の３’側半分はＧＦＰ遺伝子の開始コドンからのセンスの塩基配列を含み、プライマーの５’端に制限酵素ＣｌａＩの切断部位（ＡＴＣＧＡＴ）を持っている。Ｐｒｉｍｅｒ  ２の５’側半分はΔＮＢａｘの遺伝子５’側のアンチセンスの配列（Ａｌａ１１２からＳｅｒ１１８）を含み、Ｐｒｉｍｅｒ  ３と相補的な塩基配列である。また、その３’側半分はＧＦＰ遺伝子の終止コドンを除く３’端のアンチセンスの塩基配列である。
ｐＥＦ１ＢＯＳ−Ｂａｘ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８  Ｆｅｂ  １３；２４３（２）：６０９−６１６）を鋳型にしてＰｒｉｍｅｒ  ３とＰｒｉｍｅｒ  ４の組み合わせでＤＮＡ断片Ｂを増幅した。５’側プライマーＰｒｉｍｅｒ  ３はΔＮＢａｘ遺伝子の５’端（Ｂａｘのアミノ酸残基Ａｌａ１１２からＳｅｒ１１８）のセンスの塩基配列である。３’側プライマーＰｒｉｍｅｒ  ４はΔＮＢａｘ遺伝子の終止コドンを含む３’端（Ｂａｘの３’端）のアンチセンスの配列で、プライマーの５’端には制限酵素ＸｂａＩの切断部位（ＴＣＴＡＧＡ）を持っている。
ＰＣＲ反応の詳細は以下のとおりである。
反応溶液（溶液量１００μｌ）：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ  ＫＣｌ  １．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．００１％  ｇｅｌａｔｉｎ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ  各０．２ｍＭ
ＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤ：２．５Ｕ
一対のプライマー：Ｐｒｉｍｅｒ  １とＰｒｉｍｅｒ  ２の組み合わせ、Ｐｒｉｍｅｒ  ３とＰｒｉｍｅｒ  ４の組み合わせ（各プライマー１μＭ）
鋳型ＤＮＡ：１００ｎｇ
反応条件１：９４℃／１０分；（９４℃／３０秒；５４℃／３０秒；７２℃／１分）  ｘ  １５サイクル；７２℃／３分
反応後、増幅された二つのＤＮＡ断片（Ａ，Ｂ）は５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。次いで、上記ＰＣＲ反応液（２５μｌ）にＤＮＡ断片Ａ，Ｂ（それぞれ５０ｎｇ）を混合しＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤを使ってそれぞれの相補鎖を合成した。合成条件は以下の反応条件２のとおりとした。
反応条件２：９４℃／１０分；（９４℃／３０秒；３６℃−４２℃／３０秒；７２℃／１分）  ｘ  ５サイクル；７２℃／３分
反応後、Ｐｒｉｍｅｒ  １とＰｒｉｍｅｒ  ４（最終濃度各１μＭ）とＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤ（２．５Ｕ）を含むＰＣＲ反応液７５μｌを加え、以下の反応条件３によりＰＣＲを実行した。
反応条件１：９４℃／１０分；（９４℃／３０秒；５４℃／３０秒；７２℃／１分）  ｘ  １２サイクル；７２℃／３分
９６０ｂｐのＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、制限酵素ＣｌａＩとＸｂａＩで切断した。ホ乳類細胞発現ベクターｐＥＦ−ＬＡＣＡＢのＣｌａＩとＸｂａＩ切断部位の間にクローニングし、ｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ／ＧＦＰ−ΔＮＢａｘを得た。
（２）  ＧＦＰ−ΔＮＢａｘとΔＮＢａｘの細胞死誘導活性の比較
ΔＮＢａｘとＧＦＰ−ΔＮＢａｘをホ乳類細胞で発現させるために、ベクターとしてｐＥＦ−ＬＡＣ（Ｅｄａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ．，Ｉｔｏｈ，Ｈ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ｐＥＦ−ＬＡＣ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｌａｌｐｈ  ａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｌａｃ  ｏｐｅｒａｔｏｒ．Ｇｅｎｅ（１９９７）１８７：２８９−２９４）を用いた。ΔＮＢａｘをコードする塩基配列（配列番号３の７５４位から９９９位）の５’端に開始コドンＡＴＧを付加したＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＬＡＣのＥＦ１αプロモーター下流のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ（ＸｂａＩ切断部位）に挿入し、ｐＥＦ−ＬＡＣ−ΔＮＢａｘを作製した。コントロールプラスミッドとしてはｐＥＦ−ＬＡＣを用いた。
同じように、ＧＦＰ−ΔＮＢａｘをコードする塩基配列（配列番号３の４０位から９９９位）を含むＤＮＡ断片をｐＥＦ−ＬＡＣのＥＦ１αプロモーター下流のｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ（ＣｌａＩ切断部位とＸｂａＩ切断部位の間）にクローニングし、ｐＥＦ−ＬＡＣ−ＧＦＰΔＮＢａｘを作製した。
細胞死誘導活性は以下に記した様にＪｕｒｋａｔ細胞に上記のプラスミッドＤＮＡを導入し、遺伝子導入された細胞の生存数をＦｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙで計数し、コントロールプラスミッド導入した細胞のそれと比較した。
ｐＥＦ−ＬＡＣ−ΔＮＢａｘ  ２μｇにＧＦＰの発現プラスミッドｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１μｇを加えて、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＪｕｒｋａｔ細胞にｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。方法はキットに添付されたマニュアルに従った。コントロールとしてｐＥＦ−ＬＡＣ（空ベクター）２μｇにｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ  １μｇを混合した溶液で同じようにｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。加えたｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎの量が少ないので、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎが導入された細胞にはｐＥＦ−ＬＡＣ−ΔＮＢａｘあるいはｐＥＦ−ＬＡＣも導入されている。ｐＥＦ−ＬＡＣ−ＧＦＰΔＮＢａｘについては２μｇを上記同様ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＪｕｒｋａｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。遺伝子導入された生細胞はＧＦＰによる緑色の蛍光を示す。
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした後、細胞は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５％  ＣＯ２／９５％  Ａｉｒ，３７℃（ＢＩＯ−ＬＡＢＯ  十慈フィールド（株））の中で２日間培養し、Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣＯＵＬＴＥＲ社  ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ  ＥＳＰ）で解析した。細胞をＦｏｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＦＳ）とＳｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＳＳ）で正常の大きさの細胞５０，０００個を選別し（ゲート）、その中でＧＦＰの緑色蛍光（Ｅｍ．４８８ｎｍ）を発する細胞数を計数した。
結果をコントロールｐＥＦ−ＬＡＣでの生細胞数を１００にして図１に示した。ＧＦＰΔＮＢａｘを遺伝子導入した生細胞数は、ΔＮＢａｘ遺伝子導入した生細胞数にくらべて顕著に少なく、ＧＦＰΔＮＢａｘの細胞死誘導活性が上昇していることが確認された。
〔実施例２〕  ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘとＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの作製
内皮細胞特異的ホーミングシグナル配列（ＲＧＤおよびＮＧＲ）をＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合遺伝子の５’端に結合するために大腸菌細胞発現ベクターｐＰＲＯＥＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。ベクターｐＥＦ−ＬＡＣＡＢには３個、ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合遺伝子のＧＦＰ遺伝子配列内（ｎｔ．１６６）に１個の制限酵素ＮｃｏＩ切断部位が存在する。ｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ／ＧＦＰ−ΔＮＢａｘをＮｃｏＩで４個のＤＮＡ断片に切断し、ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合遺伝子（全長９６０ｂｐ）の３’側７９４ｂｐ（ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ）を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をｐＰＲＯＥＸ１のＮｃｏＩ部位に順方向にクローニングし、ｐＰＲＯＥＸ１／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘを得た。制限酵素ＮｏｔＩの切断部位がｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ由来の配列（ＸｂａＩ部位の７塩基対下流）とクローニング断片３’端（３’端ＮｃｏＩ部位）の下流のベクターｐＰＲＯＥＸ１配列に存在する。ｐＰＲＯＥＸ１／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘをＮｏｔＩで切断し、３’端ＮｃｏＩ部位を含むｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ由来の配列を除いて、ｐＰＲＯＥＸ１／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩを得た。
ホーミングシグナルペプチドＲＧＤとＮＧＲをそれぞれΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘのＮ末端にＰＣＲ法で結合させた。Ｐｒｉｍｅｒ  ５はＮｃｏＩ切断部位に続きホーミングシグナルペプチドＲＧＤをコードする塩基配列とＧＦＰ遺伝子の５’端の塩基配列を含む。上記ＰＣＲ反応液（２５μｌ）にＰｒｉｍｅｒ  ５とｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ／ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ（それぞれ２０ｎｇ）を混合しＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤを使ってＰｒｉｍｅｒ  ５の相補鎖を合成した。合成条件は以下の反応条件３のとおりとした。
反応条件３：９４℃／１０分；（９４℃／３０秒；４４℃−５０℃／３０秒；７２℃／１分）  ｘ  ６サイクル
反応後、Ｐｒｉｍｅｒ  ６とＰｒｉｍｅｒ  ７（最終濃度各１μＭ）とＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤ（２．５Ｕ）を含むＰＣＲ反応液７５μｌを加え、以下の反応条件４によりＰＣＲを実行した。
反応条件４：９４℃／１０分；（９４℃／３０秒；５０℃／３０秒；７２℃／１分）  ｘ  １６サイクル
Ｐｒｉｍｅｒ  ６はＰｒｉｍｅｒ  ５の５’側半分の塩基配列を持ち、Ｐｒｉｍｅｒ  ７はＧＦＰ遺伝子ｎｔ．２００からｎｔ．２１７までのアンチセンスの塩基配列である。ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、制限酵素ＮｃｏＩで切断した。本断片をＮｃｏＩで切断したｐＰＲＯＥＸ１／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩにクローニングし、ｐＰＲＯＥＸ１／ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩを得た。本プラスミッドからホーミングシグナルペプチドＲＧＤをＮ末端に持つＧＦＰ−ΔＮＢａｘ（ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ）が産生される。ＤＮＡシークエンシングによって塩基配列を確認している。
Ｐｒｉｍｅｒ  ８はＮｃｏＩ切断部位に続きホーミングシグナルペプチドＮＧＲをコードする塩基配列とＧＦＰ遺伝子の５’端の塩基配列を含む。上記ＰＣＲ反応液（２５μｌ）にＰｒｉｍｅｒ  ８とｐＥＦ−ＬＡＣＡＢ／ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ（それぞれ２０ｎｇ）を混合しＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤを使ってＰｒｉｍｅｒ  ８の相補鎖を合成した。合成条件は反応条件３のとおりとした。反応後、Ｐｒｉｍｅｒ  ９とＰｒｉｍｅｒ  ７（最終濃度各１μＭ）とＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤ（２．５Ｕ）を含むＰＣＲ反応液７５μｌを加え、上記反応条件４によりＰＣＲを実行した。Ｐｒｉｍｅｒ  ９はＰｒｉｍｅｒ  ８の５’側半分の塩基配列である。ＰＣＲ産物を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、制限酵素ＮｃｏＩで切断した。本断片をＮｃｏＩで切断したｐＰＲＯＥＸ１／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩにクローニングし、ｐＰＲＯＥＸ１／ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩを得た。本プラスミッドからホーミングシグナルペプチドＮＧＲをＮ末端に持つＧＦＰ−ΔＢａｘ（ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＢａｘ）が産生される。ＤＮＡシークエンシングによって塩基配列を確認している。
〔実施例３〕  ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ遺伝子とＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ遺伝子のベクターｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅへの載せ替えとそれらの遺伝子産物の無細胞系タンパク質合成による産生
細胞系のタンパク質合成でＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘおよびＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘを産生させるためにプラスミッドベクターｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅ（Ｒｏｃｈｅ）にクローニングした。方法は実施例２と同じようにＧＦＰ遺伝子配列内のＮｃｏＩを利用して２段階に分けてクローニングした。
ｐＰＲＯＥＸ１／ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩをＮｃｏＩとＸｈｏＩで切断し、ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合遺伝子（全長９６０ｂｐ）の３’側７９４ｂｐ（ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ）を含む８２２ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を予めＮｃｏＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅへクローニングし、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅ／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘを得た。
実施例２と同じように、ｐＰＲＯＥＸ１／ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩとｐＰＲＯＥＸ１／ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ／ΔＮｏｔＩをそれぞれ鋳型にしてＰＣＲ法でＮＧＲ−ＧＦＰおよびＲＧＤ−ＧＦＰの２０６−ｂｐ  ＮｃｏＩ  ＤＮＡ断片を増幅した。ＤＮＡ断片を回収した後、ＮｃｏＩで処理したｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅ／ΔＮＧＦＰ−ΔＮＢａｘにクローニングし、ｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅ／ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘとｐＩＶＥＸ２．２ｂＮｄｅ／ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘを得た。これらのプラスミッドＤＮＡをＲｏｃｈｅ社のマニュアルに従ってＲＴＳ５００ＨＹキット（Ｒｏｃｈｅ）に加え、細胞系タンパク質合成装置ＲＴＳプロテオマスター（Ｒｏｃｈｅ）でＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘタンパク質とＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘタンパク質を合成した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動においてＰＡＧ  Ｍｉｎｉ（第一化学薬品）のゲルを使用し、２Ｄ銀染色試薬ＩＩ（第一化学薬品）を用いた銀染色法と常法のクマシーブリリアントブルー染色法によって合成されたタンパク質の確認とその定量（牛血清アルブミンをスタンダードとして使用）を行なった。
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【実施例４】（１）培養細胞の培養
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓな状態にある細胞としてＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞：三光純薬）、ｃｏｎｔｒｏｌとしてＨｅＬａ細胞を使用した。ｍｅｄｉｕｍとしてＨＵＶＥＣではＥＢＭ−２（三光純薬）とその添加因子キット（血清、抗生物質含む：三光純薬）を使用した。ＨｅＬａではＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に１０％ＦＢＳ（牛胎児血清；三光純薬）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加したものを使用した。
（２）蛋白の導入と細胞死活性の測定
９６穴プレートにＨＵＶＥＣ（１．０ｘ１０３個／ｗｅｌｌ）、ＨｅＬａ（５．０ｘ１０２／ｗｅｌｌ）を播種した。１ｗｅｌｌあたりのｍｅｄｉｕｍ量は２００μｌとした。ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘをＲＴＳ５００ＨＹキット（Ｒｏｃｈｅ）にて作製した。合成反溶液２０μｌを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，４℃，１０分）した。上清を除去し、沈澱を２０μｌの溶解液（６Ｍ  ＵＲＥＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）で再溶解した。室温にて１０分静置後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，４℃，１０分）し、その上清をＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料として用いた。常法のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて、既知量の牛血清アルブミンを標準にしてクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色の度合いからＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの濃度を決定したところ、その濃度は１５０ｎｇ／μｌであった。細胞の培地より抜き取った１５０μｌに下記に示した量のＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料を加えて混合し、抜き取った細胞のｗｅｌｌに加え戻した。蛋白質添加後２４時間、４８時間において細胞障害を判定するためにＰＩ、ヘキスト３３３４２をｍｅｄｉｕｍ中で５μＭとなるように加えた。蛍光顕微鏡（ＬＥＩＣＡ  ＤＭＩＲＢ）にてＰＩ陽性細胞数、ヘキスト陽性細胞数を計数した。それぞれのｗｅｌｌについて重なり合わない６視野（１００倍視野）、合計約１０００個の細胞を計数した。
２種類の実験を行った。実験１では細胞としてＨＵＶＥＣ細胞のみを用いＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ（７５０ｎｇ）の代わりに溶媒である溶解液（６Ｍ  ＵＲＥＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）を同体積（５μｌ）加えたものをコントロールとした。４８時間後に評価した。実験２ではＨＵＶＥＣ細胞とＨｅＬａ細胞を用い、どちらの細胞にもＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ（２００ｎｇと６０ｎｇ）を加えた。２４時間後に評価した。結果を表１に示す。表１に示すように４８時間後の細胞死（ＰＩ陽性率）は、血管新生している内皮細胞のモデル細胞ＨＵＶＥＣにＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合蛋白質を添加した場合に、同体積の溶媒だけを加えたコントロールより高頻度であった。また、ＨＵＶＥＣ細胞にＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合蛋白質を添加した場合、血管新生しないＨｅＬａ細胞にＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合蛋白質を添加した場合よりも４〜十数倍２４時間後の細胞死の割合が高かった。
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注：”無添加”は、何も加えない、かつ何も処理しない培地のみでの使用した細胞のＰＩ陽性率である。
ＲＧＤ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ蛋白質とＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ蛋白質が細胞に導入されていることを確認するために、４穴プレート（ＳｏｎｉｃＳｅａｌ  Ｓｌｉｄｅ；ＬＡＢ−ＴＥＫ社）にＨＵＶＥＣは１ｘ１０５個／ｗｅｌｌ、ＨｅＬａは５ｘ１０４個／ｗｅｌｌを各々播種した。ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合蛋白質２００ｎｇを添加して、３時間後にそれぞれのｍｅｄｉｕｍを交換し、ＰＩ（５μＭ）を加えた。共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＬＵＯＶＩＥＷＦＶ３００  ＯＬＹＭＰＵＳ）を用いてＧＦＰとＰＩによる蛍光（対物レンズ１０倍）を観察した。図２に細胞中のＧＦＰの存在を示す図を示す。図に示すように細胞死をおこしているＨＵＶＥＣでは細胞中にＧＦＰの蛍光の存在が認められたが（死亡した細胞の核は赤色に見える）、ＨｅＬａ細胞では認められず、ホーミングシグナルペプチドであるＮＧＲにより融合タンパク質が血管新生を行っている内皮細胞のモデル細胞であるＨＵＶＥＣ細胞にのみ取り込まれていることが明らかになった。また、図３に細胞のＰＩ染色像を示す。左図はＨＵＶＥＣ細胞をＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合タンパク質で処理したもの、右図はＨｅＬａ細胞をＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合タンパク質で処理したものを示す。図に示すようにＨＵＶＥＣ細胞でより多くのＰＩ陽性細胞が認められた。図３の下には、ＨＵＶＥＣ細胞をＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ融合タンパク質で処理したものの一部分の拡大図を示すが、この拡大図中でＰＩで示される細胞（ＰＩ陽性細胞）が死亡した細胞であり、Ｈで示される細胞（ヘキスト陽性細胞）が生きている細胞である。
〔実施例５〕  担癌マウスを用いたＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの抗腫瘍作用
ＨｅＬａ細胞（１ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）をヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ  Ｓｌｃ（♀，８週齢）の皮下に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍の大きさ（体積）は麻酔下（ネンブタール）に精密ノギスで長径と短径を測定し、常法に従い（長径）×（短径）２÷２の計算式で求めた。ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘをＲＴＳＨＹ５００キット（Ｒｏｃｈｅ）で合成した。合成反応液１００μｌを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，４℃、１０分）した。上清を除去し、沈澱を１００μｌの溶解液（６Ｍ  ＵＲＥＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）で再溶解した。室
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ＮＢａｘ試料として用いた。常法のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法にて、既知量の牛血清アルブミンを標準にしてクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）による染色の度合いからＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘの濃度を決定したところ、その濃度は５００ｎｇ／μｌであった。ネンブタール麻酔下に腫瘍の大きさを測定した担癌マウスに、ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料５０μｌずつ２回腫瘍（０．２〜０．４ｃｍ３）に直接注入した（３匹）。コントロールとして溶解液（６Ｍ  ＵＲＥＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）だけを注入した（３匹）。１週間後に腫瘍の大きさを測定した（図４の１Ｗ；白丸、ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料投与；黒丸、コントロール）。さらに、それぞれ２匹については、ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料とコントロールとして溶解液（６Ｍ  ＵＲＥＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２）を１回目と同様に５０μｌずつ２回腫瘍に直接注入し、１週間後に腫瘍の大きさを測定した（図４の２Ｗ）。図には個々の腫瘍の体積（白丸、ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ試料投与；黒丸、コントロール）の増加率を１回目の注入前の腫瘍体積に対する百分率（％）で示し、その平均値（水平のバー）も示した。１回目の注入後１週間での測定（１Ｗ）では、垂直のバーで標準偏差を示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで統計処理を行なった結果、統計的有意差を得た。ＮＧＲ−ＧＦＰ−ΔＮＢａｘ投与（１回、および２回）で腫瘍体積の減少が認められた。
【産業上の利用可能性】  実施例４の結果が示すように、ホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰおよびΔＮＢａｘをこの順で融合させた融合タンパク質は、血管新生している細胞において特異的に強く細胞死を誘導した。このことは、融合タンパク質のホーミングシグナルペプチドの作用により融合タンパク質が血管新生している細胞に特異的に取り込まれ、ＧＦＰで細胞死誘導作用が増大したΔＮＢａｘの作用で、細胞死が誘導されたことを示す。また、実施例５の結果が示すように、担癌マウスにホーミングシグナルペプチド、ＧＦＰおよびΔＮＢａｘをこの順で融合させた融合タンパク質を投与すると、腫瘍体積の減少が認められた。この結果より、本発明の融合タンパク質が血管新生している癌細胞の死を特異的に強く誘導し得、癌細胞増殖抑制剤、すなわち抗癌剤として有用であることが判明した。
【配列表フリーテキスト】配列番号７〜１８：ホーミングシグナルペプチド
配列番号１９〜２７：プライマー
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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