(57)【要約】感染性夾雑ウイルス混入の可能性を低減させた安全性、安定性に優れたアルブミン製剤を商業的規模で効率的に製造する。血清アルブミン含有溶液を、好適には１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜で除去する工程、とりわけウイルス不活性化を目的とする加熱処理に先立って当該濾過工程を実施することからなる。さらに好ましい態様として、当該濾過工程に先立ち陰イオン交換体及び／プレフィルターにより処理することからなる前処理を付す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス除去膜濾過工程が組み込まれたアルブミン製剤の製造方法。
【請求項２】
アルブミン含有溶液を液状加熱処理工程以前にウイルス除去膜濾過工程に付すことを特徴とする請求項１記載のアルブミン製剤の製造方法。
【請求項３】
前記ウイルス除去膜濾過工程に使用されるウイルス除去膜が除去サイズ１０〜２０ｎｍの孔径を有するものである、請求項１または請求項２のいずれかに記載のアルブミン製剤の製造方法。
【請求項４】
アルブミン含有溶液をウイルス除去膜濾過工程に付す前に陰イオン交換体及び／またはプレフィルターにより処理することを含む、請求項１ないし３のいずれかに記載のアルブミン製剤の製造方法。
【請求項５】
当該処理に使用されるプレフィルターが除去サイズ３５〜２００ｎｍの孔径を有するものである、請求項４記載のアルブミン製剤の製造方法。
【請求項６】
アルブミン含有水溶液のウイルス除去膜を用いた濾過工程に先立ち実施される、当該アルブミン含有水溶液を陰イオン交換体及び／またはプレフィルターにより処理することからなるウイルス除去膜工程前処理方法。
【請求項７】
当該処理に使用されるプレフィルターが除去サイズ３５〜２００ｎｍの孔径を有するものである、請求項６記載のウイルス除去膜工程前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、医療用医薬品の分野に関する。詳細には、血漿分画製剤の一種である血清アルブミン製剤の製造方法に関する。さらに詳細には、製造工程中にウイルス除去膜濾過工程が組み込まれた血清アルブミン製剤の製造方法に関し、当該製造方法を採用することにより、感染性ウイルスの夾雑の可能性を低減する安全性に優れた製剤を効率的に製造することを可能とする。
【背景技術】  血清アルブミンは分子量６．６万Ｄａの蛋白質で、５８５個のアミノ酸からなる楕円状の分子である。血清アルブミンは全蛋白質中の約６割を占める血漿中に最も多く含まれる蛋白質であって、生体内では肝臓で合成される。そして、血液中で血漿膠質浸透圧の維持、毒物の中和や酸塩基平衡の維持に関与しており、また多くの薬物や化合物と非特異的に結合し、それらを運搬する役割を担う。
上記アルブミンを製剤化したアルブミン製剤は、火傷、ネフローゼ症候群等によるアルブミン喪失およびアルブミン合成能低下による低アルブミン血症、出血性ショックなどの治療に用いられている。アルブミン製剤（加熱人血漿蛋白を含む）は、蛋白質濃度が４．４〜２５％（うち、アルブミン含量が８０％以上もしくは９６％以上）という高濃度の蛋白質製剤である。また、製剤１本あたりの容量も２０〜２５０ｍＬと大量であり、その製造においては大量かつ大容量の蛋白質を処理することが求められる。
ところで、蛋白、特に生体由来の蛋白、より具体的には血液由来の蛋白は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などの種々のウイルスに汚染されている可能性は否定できない。従って、これらを原料とした薬剤の製造に際しては、ウイルスを十分に除去または不活化する工程を組み込むことが必須である。
血液由来の製剤、即ち血液製剤に夾雑する可能性を否定できないウイルスを不活化する方法としては、加熱処理法が汎用されている。その他、特殊な溶媒と洗浄剤を用いるソルベントディタージェント法（ＳＤ法）等もウイルス不活化の方法として採用され得る（特開昭６０−０５１１１６を参照）。また、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーによってもウイルスの除去が可能である（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．，８１，１９９−２０９（１９９３）を参照）。しかし、これらいずれの方法も一長一短があり、単独の方法での各種ウイルスの完全不活化、完全除去は期し難く、従って複数の方法を組み合せて用いることが有効であると考えられている。
本願発明の対象となるアルブミン製剤は、液状加熱（６０℃、１０時間）及びアルコール分画によるウイルス不活化／除去が施されており、そのウイルスに対する安全性は５０年来の臨床使用により実証されている。しかしながら、さらなる安全性の観点から、これらの工程を経ても不活化／除去されないウイルス等の病原体、または発見されていない未知のウイルス等病原体への対策として、ウイルス除去膜濾過導入によるウイルス等病原体の除去が検討されているが、未だ実際の商業規模での製造工程においてアルブミン製剤に導入された例はない。
【発明の開示】
（発明が解決しようとする技術的課題）
ウイルス除去膜濾過は、除去膜の孔径よりも大きなサイズを有するウイルス等病原体を製造工程で製剤から排除しようとするものである。しかしながら、蛋白質溶液からの膜によるウイルス等病原体除去における大きな問題は、膜が目詰まりを起こして、濾過が困難になるか、不能になる点である。
ウイルス除去膜の孔径はメーカーや規格毎に異なり、１０〜７０ｎｍの大きさを有する。一方、濾過において除去膜の孔を通液させたい蛋白質の分子量は１０〜数１０００ｋＤａであるが、分子の大きさとしてはウイルス除去膜の孔径と同レベルにある。ウイルス除去膜の孔径は小さければ小さい程より小さいウイルスまで捕捉除去できるため期待される効果は大であるが、通過させる蛋白質の大きさ次第では、蛋白質とウイルスとの分離は不可能となる。従って、蛋白質溶液のウイルス除去膜濾過においては、通過させたい蛋白質の大きさを考慮して、使用する除去膜の孔径を選択する必要がある。また、適切な孔径の除去膜を選定したとしても、その目的とする蛋白質溶液中に存在する微量の凝集体や夾雑蛋白質は、除去膜の孔を通過できず孔を塞いでしまい、目詰まり、ひいては濾過の障害を引き起こす。特に、小孔径（１０〜２０ｎｍ）のウイルス除去膜での濾過においては、孔を通過できる蛋白質の大きさは小さく、濾過液中に含まれる蛋白質の種類と量次第では、この目詰まり防止が課題となる。
加えて、他の血漿蛋白製剤に比べてアルブミン製剤の製造工程では、処理すべき蛋白質量が膨大であることから、ウイルス除去膜濾過を導入する場合には、製造工程中のどの工程段階で濾過するか、いかなる組成、性状のアルブミン含有水溶液を濾過するかがウイルス除去膜導入のポイントとして考慮されなければならない。また、ウイルス除去膜の使用数量、濾過面積及びそれに要するコストの問題も導入のポイントとして挙げられる。つまり、ウイルス除去膜濾過工程導入にあたっては、高価なウイルス除去膜の使用数量をできるだけ少なく抑えることができる条件を見出すことが、工業的な応用には必須である。
（その解決方法）
本願発明は、感染性ウイルスの夾雑の可能性を低減する安全性に優れる製剤を効率的に製造することを目的とし、薬液中のウイルス等病原体の除去を目的として使用されているウイルス除去膜による濾過を、これまで試みられることのなかった商業的実生産規模でのアルブミン製剤の製造工程に適応するに際し、良好な濾過特性を見出し、完成したものである。
これまで、アルブミン製剤においてウイルス除去膜濾過の良好な濾過条件が示されていないことから、本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルブミン含有水溶液をウイルス除去膜で濾過する場合、目詰まりの原因となる、ウイルス除去膜の孔径以上の大きさの夾雑蛋白質をウイルス除去膜濾過前に除去叉は低減化することで、良好な濾過が可能であることを見出した。
さらに、アルブミン製造工程中でウイルス不活化を目的とした加熱安定剤存在下での６０℃、１０時間以上の液状加熱処理工程に先立ち、アルブミン含有水溶液のウイルス除去膜濾過を実施することで優れた濾過特性が得られることを見出した。
（従来技術より有効な効果）
本願発明のウイルス除去膜による濾過において、加熱処理工程以前のアルブミン含有溶液は、優れた濾過特性を示す点が明らかになった。また、好適な態様として示される、陰イオン交換体及び／またはプレ濾過での前処理により、溶液の化学的条件を操作せずに、濾過面積あたりの濾過量の増加という効果が得られることも確認できた。つまり、少ない濾過面積で大量のアルブミン溶液を濾過できることにより、アルブミン製剤製造へのウイルス除去膜濾過の導入に関して、工業スケールでの適用を可能とする。
本願発明の製造方法によれば、これまでのアルコール分画と加熱処理でのウイルス除去／不活化に加えて、ウイルス除去膜濾過という新しい機序での除去方法が可能となり、本願発明により得られたアルブミン製剤は、より安全性に優れた製剤として提供される。
本願発明は、これまで、アルブミン製剤においてウイルス除去膜濾過の良好な濾過条件が示されていないことから、アルブミン製剤の製造工程へのウイルス除去膜濾過導入に道を拓くものといえる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本願発明によってもたらされるアルブミン製剤の製造方法に組み込まれたウイルス除去膜を用いた濾過工程における濾過特性を示す。
図２は、本願発明によってもたらされるアルブミン製剤の製造方法に組み込まれたウイルス除去膜を用いた濾過工程における、各種前処理を施した場合の濾過特性（濾過量の効果）を示す。
図３は、本願発明によってもたらされるアルブミン製剤の製造方法に組み込まれたウイルス除去膜を用いた濾過工程における、タイプ別のプレ濾過の濾過流量効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  アルブミン溶液中には、ハプトグロビン、トランスフェリンやヘモペキシン等の他の蛋白質、並びにアルブミン自身の凝集体が夾雑蛋白質として含まれているうえに、アルブミン製剤の製造工程において液状加熱処理工程中、加熱安定剤は存在するものの熱による蛋白質の変性は避けられず、加熱後の工程液には微量の凝集体の形成が認められる。加えて、アルブミン自身が安定剤として添加されるＮ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムと相互作用し、その三次構造が変化していることが考えられる。これらが目詰まりの原因となると思われるが、この加熱処理工程によってアルブミンがウイルス除去膜濾過を困難にしているという報告はこれまでなされていない。
さらに好適な態様として、ウイルス除去膜濾過を行う前に、アルブミン溶液に対して陰イオン交換体処理及び／またはプレ濾過（除去サイズ３５〜２００ｎｍ）による前処理を実施し、夾雑蛋白質を除去叉は低減化することで、ウイルス除去膜濾過時の目詰まりを抑制することができ、大きな流速低下を伴わないアルブミン溶液の小孔径ウイルス除去膜（１０〜２０ｎｍ）での濾過をも可能とし、これによりウイルス除去膜の使用数量も削減され、アルブミン製剤製造での好適な工業的適用をもたらす。
本願発明に係る製剤の主成分であるアルブミンの由来には、特段の制約はなく具体的には哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ウサギ等に由来するもの、また、遺伝子組換え技術に基づく培養細胞に由来するもの等が挙げられ、特にヒト由来のものは実用的なものであり、例えば、コーン氏の冷アルコール分画によって得られた第Ｖ画分は好適な原材料として例示される。
本願発明のアルブミン製剤の製造方法は、上記アルブミンを含有する水溶液をウイルス除去膜に濾過し、夾雑の可能性あるウイルスを除去する工程を含むものであればすべてを包含するが、ウイルス不活化を目的とする加熱処理以前に本願の濾過工程を実施することにより、好ましい濾過特性をもたらすことができる。
ここで用いられるウイルス除去膜としては、１０〜２０ｎｍの孔径を有するウイルス除去膜が好ましい。この要件を満たすウイルス除去膜であれば特段の制約はないが、例えば、プラノバ１５Ｎ（旭化成）、ウルチポアＶＦ−ＤＶ２０（ポール）、バイアソルブＮＦＰ（ミリポア）等の製品名で市販されている除去膜は好適な例として挙げられる。
さらに、目詰まりの原因となる夾雑蛋白質を、陰イオン交換体での荷電に基づく分離除去及び／またはプレフィルター（除去サイズ３５〜２００ｎｍ）でのサイズに基づく分離除去によって前処理した上で、ウイルス除去膜濾過を行うことよりその効果を高めることができる。
本願発明では、好適な態様として、ウイルス除去膜を用いた濾過工程に先立って実施される前処理工程を行っており、陰イオン交換体による前処理またはプレ濾過による前処理並びにこれらを組み合わせることよりなる。各々の前処理単独によっても相応の効果は得られるが、組み合わせることでその効果は増長される。各前処理の具体的な態様は、以下のとおりである。
（１）陰イオン交換体による前処理の方法
ｐＨ、電気伝導度及び蛋白質濃度を調整したアルブミン含有水溶液を、適切な緩衝液で平衡化された陰イオン交換体に展開し、当該溶液中に含まれる夾雑蛋白質をこれに吸着させることにより除去する。使用する陰イオン交換体は、陰イオン交換基を有する不溶性担体であれば使用でき、具体的には、ＤＥＡＥ−セファロース（アマシャム・ファルマシア）、Ｑ−セファロース（アマシャム・ファルマシア）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、ＱＡＥ−トヨパール（東ソー）等が例示される。好ましくは、Ｑ−セファロースやＱＡＥ−トヨパールの強陰イオン交換体が挙げられる。
（２）プレ濾過による前処理の方法
ｐＨ及び蛋白質濃度を調整したアルブミン含有水溶液を、プレフィルター（除去サイズ３５〜２００ｎｍ）に通液し、目詰まりの原因と考えられる３５〜２００ｎｍ以上の大きさの蛋白質粒子をこれに捕捉させることにより除去する。使用するプレフィルターとしては、カートリッジ型フィルター（ザルトリウス社、ザルトポア２、０．１μｍ）、中空糸フィルター（旭化成、マイクローザ、０．１μｍ）、多孔膜中空糸（旭化成、プラノバ、３５ｎｍ）等が例示される。好ましくは、ザルトポア２やプラノバ３５ｎｍが挙げられる。
本発明に従い、アルブミン製剤は例えば以下のようにして調製することができる。
（１）アルブミン含有水溶液の調製
コーン氏のアルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペーストに、注射用水（日局）をペースト重量の２倍以上加え撹拌溶解し、限外濾過法により脱アルコールしたアルブミン画分を、ｐＨ４〜５（好ましくは４．４〜４．６）、ＥＣ５ｍＳ／ｃｍ以下（好ましくは１．５ｍＳ／ｃｍ以下）、蛋白濃度５〜１５ｗ／ｖ％（好ましくは８〜１２ｗ／ｖ％）に調整する。
（２）イオン交換体による前処理の方法
ｐＨ４〜５（好ましくは４．４〜４．６）、ＥＣ５ｍＳ／ｃｍ以下（好ましくは１．５ｍＳ／ｃｍ以下）の酢酸バッファーで平衡化した陰イオン交換体（例えば、ＤＥＡＥ−セファロース（アマシャム・ファルマシア）、Ｑ−セファロース（アマシャム・ファルマシア）、ＤＥＡＥ−トヨパール（東ソー）、ＱＡＥ−トヨパール（東ソー））に、前記（１）で調製されたアルブミン含有水溶液を展開し、素通り画分を回収する。
（３）フィルターによる前処理の方法
蛋白濃度５〜１５ｗ／ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ／ｖ％）、ｐＨ６〜７．５（好ましくは６．６〜７．２）に調整された前記（２）の前処理をしたアルブミン含有水溶液を、３５〜２００ｎｍのサイズ排除が可能なフィルターを用いて濾過し、回収する。
（４）本願発明の処理：ウイルス除去膜への通液
プラノバ１５Ｎ（旭化成）に、蛋白濃度５〜１５ｗ／ｖ％（好ましくは６〜１０ｗ／ｖ％）、ｐＨ６〜７．５（好ましくは６．６〜７．２）に調整されたアルブミン含有水溶液を通液し、回収する。
（５）バルク調製
（４）で得られた回収液を、蛋白濃度を５〜３０ｗ／ｖ％（通常５または２０〜２５ｗ／ｖ％）になるように調整する。この際、蛋白の濃縮が必要な場合には限外濾過法を用いた。蛋白１ｇ当り、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムをそれぞれ０．０８ｍｍｏｌとなるように加え、溶液ｐＨを６．９±０．５とし、これを孔径０．２２μｍ以下の濾過膜を用いて除菌濾過して最終バルクとする。
（６）加熱処理及び小分け分注
最終バルクを６０．０±０．５℃で１０時間以上加熱したものを、所定量ずつバイアルに無菌的に分注して、密栓する。
以下に、調製例及び実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
調製例
（アルブミン製剤の調製）
（１）アルブミン含有水溶液の調製
コーン氏のアルコール分画によって得られた第Ｖ画分ペーストに、注射用水（日局）をペースト重量の２倍以上加え撹拌溶解し、限外濾過法により脱アルコールしたアルブミン画分を、ｐＨ４．５４、ＥＣ１．５ｍＳ／ｃｍ以下、蛋白濃度１２ｗ／ｖ％に調整した。
（２）イオン交換体による前処理の方法
ｐＨ４．５１、ＥＣ５ｍＳ／ｃｍ以下の酢酸バッファーで平衡化した陰イオン交換体（Ｑ−セファロース（アマシャム・ファルマシア））に、前記（１）で調製されたアルブミン含有水溶液を展開し、素通り画分を回収した。
（３）フィルターによる前処理の方法
蛋白濃度８ｗ／ｖ％、ｐＨ６．９８に調整された前記（２）の前処理をしたアルブミン含有水溶液を、１００ｎｍのサイズ排除が可能なフィルターを用いて濾過し、回収した。
（４）本願発明の処理：ウイルス除去膜への通液
プラノバ１５Ｎ（旭化成）に、蛋白濃度８ｗ／ｖ％、ｐＨ６．９８に調整されたアルブミン含有水溶液を通液し、回収した。
（５）バルク調製
（４）で得られた回収液を、蛋白濃度を２５ｗ／ｖ％になるように調整した。
この際、蛋白の濃縮が必要な場合には限外濾過法を用いた。蛋白１ｇ当り、Ｎ−アセチルトリプトファンナトリウム及びカプリル酸ナトリウムをそれぞれ０．０８ｍｍｏｌとなるように加え、溶液ｐＨを６．９±０．５とし、これを孔径０．２２μｍ以下の濾過膜を用いて除菌濾過して最終バルクとした。
（６）加熱処理及び小分け分注
最終バルクを６０．０±０．５℃で１０時間以上加熱したものを、所定量ずつバイアルに無菌的に分注して、密栓した。
【実施例１】（本願発明の好適な濾過特性の確認）
アルブミン製剤製造工程での本願発明による効果を確認するために、各工程の段階のアルブミン含有水溶液を用いて下記のように比較した。ｉ）調製例（１）→（３）の工程を実施して得られる加熱処理前のアルブミン含有水溶液を蛋白質濃度８％、ｐＨ４〜９に調整し、ウイルス除去膜に定圧濾過する場合と、ｉｉ）比較例として調製例（１）→（３）の工程で得られる加熱処理前のアルブミン含有水溶液を濃縮して最終バルク調整工程を実施し蛋白質濃度８％、ｐＨ７に再調整して、ウイルス除去膜に定圧濾過する場合、及びｉｉｉ）調製例（１）→（３）の工程で得られる加熱処理前のアルブミン含有水溶液を濃縮して最終バルク調整工程さらに加熱処理工程を実施し、蛋白質濃度８％、ｐＨ７に調整して、ウイルス除去膜に定圧濾過する場合の３例で濾過特性を比較した。
結果を図１に示す。図１から明らかなように加熱処理後のアルブミン溶液の濾過に比べ、本願発明による加熱処理前のアルブミン溶液において優れた濾過特性があることが判明した。特に、加熱処理後のアルブミン溶液に比べて、加熱処理前のアルブミン溶液は、約５０倍以上のアルブミンの濾過が可能であることが判明した。
【実施例２】（本願発明前処理の効果の確認）
陰イオン交換体処理及び／またはプレ濾過による効果を確認するために、調製例の（１）により得られるアルブミン含有水溶液を、本願発明による前処理の１）陰イオン交換体（Ｑ−セファロース（アマシャム・ファルマシア））処理のみ、２）プレ濾過（カートリッジ型フィルター（ザルトリウス社、ザルトポア２、０．１μｍ））処理のみ、及び３）陰イオン交換体（Ｑ−セファロース（アマシャム・ファルマシア））とプレ濾過（カートリッジ型フィルター（ザルトリウス社、ザルトポア２、０．１μｍ））を組み合せた前処理、並びに比較例として４）未処理のアルブミン溶液をそれぞれ蛋白濃度８％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．９８に調整し、ウイルス除去膜（旭化成、プラノバ、１５Ｎ）を用いて０．５ｋｇｆ／ｃｍ２の定圧濾過を実施した。結果、各濾過の流量を単位膜面積あたりのアルブミン通液容量で表した結果を図２に示す。
図２から明らかなように未処理のアルブミン溶液の濾過に比べ、本願発明による前処理を実施したアルブミン溶液の濾過量に増加効果があることが判明した。
特に、陰イオン交換体処理とプレ濾過処理を組み合せると、未処理のアルブミン溶液に比べて約２倍以上のアルブミンの濾過が可能であることが判明した。
【実施例３】（タイプ別プレフィルターの濾過流量効果の確認）
プレフィルターのタイプ毎の濾過流量の効果を比較確認するために調製例の▲２▼により得られるアルブミン含有水溶液を、本願発明によるプレ濾過処理として１）カートリッジ型フィルター（ザルトリウス社、ザルトポア２、０．１μｍ）、２）中空糸フィルター（旭化成、マイクローザ、０．１μｍ）、及び３）多孔膜中空糸（旭化成、プラノバ、３５ｎｍ）を前処理として実施したアルブミン溶液、並びに比較例として４）未処理（未プレ濾過）のアルブミン溶液を、それぞれ蛋白濃度８％となるように注射用水（日局）で調整し、１ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液でｐＨを６．９８に調整し、ウイルス除去膜（旭化成、プラノバ１５Ｎ）を用いて０．５ｋｇｆ／ｃｍ２の定圧濾過を実施した。結果、各濾過の流量を単位膜面積あたりのアルブミン通液重量で表した結果を図３に示す。図３から明らかなように陰イオン交換体といずれのタイプのプレフィルターを組み合せても濾過面積あたりの濾過量の増加という効果が得られることが判明した。特にカートリッジ型フィルター（ザルトリウス社、ザルトポア２、０．１μｍ）、多孔膜中空糸（旭化成、プラノバ、３５ｎｍ）で濾過流量の増加効果が大きいことが判明した。
【実施例４】（ウイルス除去効果の確認）
本願発明によるウイルス除去効果を確認するために、調製例（１）→（３）の工程を実施して得られるウイルス除去膜濾過を実施する前のアルブミン含有水溶液４９容量に対し、ｉ）仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）液１容量を加えた場合、ｉｉ）ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）液１容量を加えた場合、ｉｉｉ）マウス脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）液１容量を加えた場合、ｉｖ）ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）１容量を加えた場合のそれぞれ４種のウイルス混合溶液をウイルス除去膜（プラノバ１５Ｎ、旭化成）に濾過し、濾過前後でのウイルス感染価を測定して、ウイルス除去効果を確認した結果を表１に示す。表１から明らかなように、いずれのウイルスに対してもウイルス除去膜濾過による明らかな除去効果が判明した。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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