(57)【要約】本発明は、制御性Ｔ細胞の活性を制御するための組成物および制御方法を提供する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が認識する抗原または抗原をコードする発現ベクターを含む組成物および該組成物を哺乳動物に投与して哺乳動物の免疫応答を制御する方法に関するものであり、自己免疫疾患およびアレルギー疾患の予防や治療、移植における拒絶反応や移植片対宿主反応の抑制に有用な手段を提供するものである。さらに免疫抑制状態はインターフェロン・ガンマの投与、あるいはインターロイキン１２とインターロイキン１８の併用投与によって解除される。すなわち、こうしたサイトカインの作用とＳＥＲＥＸ抗原による感作とを適切に組み合わせることにより、制御性Ｔ細胞を人為的に操作することができ、自己免疫疾患、臓器移植に伴う反応、アレルギー反応および腫瘍免疫の制御等に適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原を含む組成物。
【請求項２】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原がＳＥＲＥＸ法により同定される分子である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原をコードする発現ベクターを含む組成物。
【請求項４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原がＳＥＲＥＸ法により同定される分子である請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ＳＥＲＥＸ法により同定される分子が自己抗原である、請求項２または４記載の組成物。
【請求項６】
ＳＥＲＥＸ法により同定される分子が、ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００５４９４，ＸＭ＿０２８９６６，ＸＭ＿１７２１６１，ＸＭ＿０５２８６２，ＸＭ＿０６２７５４，ＸＭ＿０９３３８８，ＮＭ＿０１６３０６，ＮＭ＿０１２３２８，ＮＭ＿００５８８０）、ガレクチン［Ｇａｌｅｃｔｉｎ］８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＨ００８８１５，ＡＦ１９３８０６，ＡＦ１９３８０５）、ポリＡ結合タンパク質［ＰｏｌｙＡｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ］（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＸＭ＿０６７８４４）、リガーゼ［Ｌｉｇａｓｅ］１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０００２３４）から選ばれた１種である請求項２、４および５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
遺伝子銃を用いて投与される、請求項３ないし６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
自己免疫疾患の予防及び／または治療のための請求項１ないし７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
アレルギー疾患の予防及び／または治療のための請求項１ないし８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
臓器または組織の移植において、拒絶反応及び／または移植片対宿主反応を抑制するための請求項１ないし９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を抑制する方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物を哺乳動物へ投与して哺乳動物において免疫応答を抑制し、さらにインターフェロン・ガンマを投与して該哺乳動物の免疫応答を回復せしめることを含む哺乳動物の免疫制御方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物を哺乳動物へ投与して哺乳動物において免疫応答を抑制し、さらにインターロイキン１２およびインターロイキン１８を投与して該哺乳動物の免疫応答を回復せしめることを含む哺乳動物の免疫制御方法。
【請求項１４】
薬理上有効な量の請求項１記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含む自己免疫疾患の予防及び／または治療する方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物を自己免疫疾患の予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途。
【請求項１６】
薬理上有効な量の請求項１記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含むアレルギー疾患の予防及び／または治療する方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物をアレルギー疾患の予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途。
【請求項１８】
薬理上有効な量の請求項１記載の組成物を哺乳動物へ投与することを含む、臓器または組織の移植において拒絶反応及び／または移植片対宿主反応を抑制する方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１０のいずれか１項記載の組成物を臓器または組織の移植において拒絶反応及び／または移植片対宿主反応を抑制する予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途。
【発明の詳細な説明】
発明が属する技術分野
本発明は生体内において免疫能の制御に関わる制御性Ｔ細胞の活性を制御する方法、特にその制御活性を有する組成物に関する。
【背景技術】  ヒトは外来の異物を排除する生体防御機構が備わっていると同時に自己に対する寛容が成立しており、こうした免疫応答の誘起や制御はＢリンパ球、Ｔリンパ球、抗体および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の間の相互作用により行われる。まず、外来抗原はＡＰＣによるプロセシングを受け、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子に結合され、ヘルパーＴ細胞に提示される。ヘルパーＴ細胞によりＭＨＣに結合した外来抗原が認識されることにより、Ｔ細胞の活性化が起こり、サイトカインが分泌され、抗原で刺激されたＢ細胞が抗体産生細胞へと分化するのを助けると共に、キラーＴ細胞の分化も促す。分泌された抗体および活性化されたキラーＴ細胞により抗原を提示する細胞が排除され、外来抗原を排除する細胞性・体液性の反応が進行する。すなわち、Ｔ細胞が中心的な役割を果たして、標的となる抗原を認識し免疫応答が動員される。例えば、抗腫瘍免疫応答においても、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が極めて重要な役割を果たしていることが古くから知られている。（Ｌ．Ｇｒｏｓｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：３２６−３３３（１９４３）；Ｌ．Ｏｌｄ    ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１：８０−１０６（１９６２）；Ｒ．Ｊ．Ｎｏｒｔｈ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：８９−１５５（１９８４）；Ｐ．Ｄ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５（１９９１）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８））。
ＣＤ８＋ＣＴＬ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ）は、生体内においても試験管内においても直接的に腫瘍細胞を破壊する能力を持つ主要なエフェクター細胞であるが、ＭＨＣクラスＩに提示された抗原ペプチドの特異性に関して厳格であるのに対し、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の場合は抗原特異性の制約が緩く、固有性の免疫応答を示すエフェクター細胞であると考えられている（Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：６６１−６６８（２０００）；Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ  ＆  Ｄ．Ｉ  Ｇｏｄｆｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：４５９−４６０；Ｍ．Ｊ．Ｓｍｙｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：１６５−１７１（２００２）；Ｔ．Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ，ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５６９０−５６９３（１９９８））。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は直接には腫瘍細胞を破壊しないが、抗腫瘍免疫応答を複数の機構を通して制御する基本的な役割を担っているとされており（Ｋ．Ｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２３５７−２３６８（１９９８）；Ｆ．Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２（１９９８）；Ｄ．Ｍ．Ｐａｒｄｏｌｌ  ＆  Ｓ．Ｌ．Ｔｏｐｌｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−５９４（１９９８）；Ｒ．Ｆ．Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２６９−２７６（２００１））、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示された腫瘍抗原ペプチドを認識したＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用によるＣＴＬの活性化と増殖とを増幅する。これに対し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は抗腫瘍免疫応答や種々の自己免疫病の進展を抑制するのに有効であることが示されてきた（Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｖａｃｈ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４２３−４４９（２０００）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ  ＆  Ｍ．Ｋ．Ｌｅｖｉｎｇｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６７６−６８３（２０００）；Ｊ．Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：５２１１−５２１８（１９９９）；Ｓ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：１８−３２（２００１））。しかしながら、Ｔｒｅｇが認識する自己抗原ペプチドはどんなものであり、抗原認識や機能におけるヘルパーＴ細胞との違いや関係は何であるかについては明らかにされていない（Ｓ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２８３−２８４（２００１）；Ｋ．Ｊ．Ｍａｌｏｙ  ＆  Ｆ．Ｐｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：８１６−８２２（２００１）；Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８９−４００（２００２））。
ＣＴＬの定量的および定性的な増幅において、ヘルパーＴ細胞、ＣＴＬおよびＡＰＣ間の連続的な細胞間相互作用では、抗腫瘍免疫応答に関係するヘルパーＴ細胞が広い範囲の多様な抗原を認識する可能性が示唆されていた（Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８（１９９８）；Ｓ．Ｒ．Ｍ．Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８−４８０（１９９８）；Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０−４８３（１９９８）；Ｚ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：５４１−５５０（２０００））が、本発明者らは、ＣＴＬ認識抗原とともにＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）抗原を投与することにより、極めて強力なＣＴＬ活性の増強、そして強力な腫瘍拒絶能を誘導することを見出した（Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４５７１−１４５７６（２００１）；ＷＯ  ０３／０００８９４  Ａ１）。その結果、ＣＤ４＋ヘルパー抗原、好ましくはＳＥＲＥＸ法により見つけられた分子、および、ＣＤ８＋ＣＴＬにより認識される抗原、好ましくは腫瘍抗原をコードする発現ベクターを含む組成物をポリヌクレオチドワクチンとして用いるという、腫瘍特異免疫を発現させるためのワクチンに関する発明に至った（ＷＯ  ０３／０００８９４  Ａ１）。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ制御性細胞は機能的に成熟した状態で常時正常胸腺において産生されているが、通常はアナジーの状態にあり、Ｔ細胞リセプター（ＴＣＲ）刺激が入ると他のＴ細胞の活性化・増殖を強く抑制し、その際構成的に発現するＣＴＬＡ−４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ４）分子やＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ）分子を介した刺激伝達が抑制能発現に必要であることが明らかにされてきた（Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：３０３−３１０（２０００）；Ｓ．Ｒｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：２９５−３０２（２０００）；Ｊ．Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１３５−１４２（２００２））。ＴｒｅｇはＭＨＣクラスＩＩに結合した自己抗原を認識する多くの特異性を持つ細胞から成り立っていると考えられているが、未だ抗原は同定されておらず、またＴｒｅｇの抑制能増強の機構については全く不明であった。
【発明の開示】
マウスやヒトなどの正常個体においては、外来の異物に対する生体防御機構としての免疫システムが備わっており、自己を攻撃することはない。この自己に対する寛容は、自己反応性免疫細胞の排除、自己反応性免疫細胞の不活化およびＴｒｅｇによる免疫抑制の３つの機構によるものと考えられている。そして、自己に対する寛容が破綻すると自己免疫疾患を発症する一方で、この自己寛容性が癌細胞の増殖を許している。また、臓器や組織の移植にあっては、外来抗原の排除機構が移植を困難なものとしている。こうした免疫システムにおいてＴｒｅｇが免疫制御に大きな役割を果たしていることが明らかになってきた現在にあって、免疫異常による疾患、特に自己免疫疾患や移植拒絶反応、移植片対宿主反応、アレルギー疾患などに対して、Ｔｒｅｇの活性を制御する方法および薬剤の開発が強く望まれる。
本発明者は腫瘍抗原をコードする発現ベクターとＳＥＲＥＸ抗原をコードする発現ベクターとを担癌マウスに投与してその抗腫瘍効果を検討する際に、ＳＥＲＥＸ抗原をコードする発現ベクターのみを投与すると、むしろ腫瘍組織の成長と転移の促進が観察されたことから本発明に到達した。
本発明はＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原を含む組成物を提供する。  また、上記組成物を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を抑制する方法を提供する。  さらに薬理上有効な量の上記組成物を哺乳動物へ投与することを含む自己免疫疾患の予防及び／または治療する方法を提供する。  または上記組成物を自己免疫疾患の予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途を提供する。
さらに、薬理上有効な量の上記組成物を哺乳動物へ投与することを含むアレルギー疾患の予防及び／または治療する方法または上記組成物をアレルギー疾患の予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途を提供する。
また、薬理上有効な量の上記組成物を哺乳動物へ投与することを含む、臓器または組織の移植において拒絶反応及び／または移植片対宿主反応を抑制する方法または上記組成物を臓器または組織の移植において拒絶反応及び／または移植片対宿主反応を抑制する予防剤及び／または治療剤を製造することに用いる用途を提供する。
より詳細には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（制御性Ｔ細胞）をＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃＤＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法により見つけられた分子（ＳＥＲＥＸ抗原）で感作して制御性Ｔ細胞の活性を増強し、逆に活性化された制御性Ｔ細胞の活性をインターフェロン・ガンマの使用あるいはインターロイキン１２とインターロイキン１８との共用により減弱させることによる、制御性Ｔ細胞の活性の制御方法である。特に、制御性Ｔ細胞の活性を増強する組成物として、ＳＥＲＥＸ抗原をコードする発現ベクターを含むポリヌクレオチドが挙げられ、ポリヌクレオチド単独で、あるいは担体粒子等の上に固定されて細胞内に投与されるものである。
本発明の目的は、制御性Ｔ細胞を人為的に抗原によって感作してその免疫抑制活性を増強することにより、移植における拒絶反応および移植片対宿主反応の抑制、自己免疫疾患の抑制およびアレルギー反応の抑制を実現することであり、これらの疾患あるいは病態を有する患者に対する有効な治療法を提供することにある。
本発明は、免疫を抑制するための方法に関するものであり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞により認識される抗原をコードする発現ベクターを投与することにより、免疫反応を抑制することが出来るという発見に基づくものである。従って、本発明はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞により認識される抗原またはそれをコードする発現ベクターを含む組成物に関する。より詳細には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞により認識される抗原は好ましくはＳＥＲＥＸ法により見つけられた分子であり、また抗原はヘテロ抗原であってもよいし自己抗原であってもよいが、自己抗原がより好ましい。ＳＥＲＥＸ法は、近年Ｍ．Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−１９１８（１９９７））により開発された方法であり、ヒト血清を用いてヒト腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリーの検索を行うものであり、インターネットには、ＳＥＲＥＸ法により同定された遺伝子がＳＥＲＥＸデータベースとして１８００種を超えて登録されている（ｗｗｗ．ｌｉｃｒ．ｏｒｇ／ＳＥＲＥＸ．ｈｔｍｌ）。これらに限定されるわけではないが、例えば熱ショックタンパク質であるＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００５４９４，ＸＭ＿０２８９６６，ＸＭ＿１７２１６１，ＸＭ＿０５２８６２，ＸＭ＿０６２７５４，ＸＭ＿０９３３８８，ＮＭ＿０１６３０６，ＮＭ＿０１２３２８，ＮＭ＿００５８８０）、ガレクチン［Ｇａｌｅｃｔｉｎ］８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＡＨ００８８１５，ＡＦ１９３８０６，ＡＦ１９３８０５）、ポリＡ結合タンパク質［ＰｏｌｙＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ］（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＸＭ＿０６７８４４）、リガーゼ［Ｌｉｇａｓｅ］１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＭ＿０００２３４）等を挙げることができる。本明細書中の「ＳＥＲＥＸ同定分子」とは、ＳＥＲＥＸ法により同定されたこれらの分子を意味する。
本発明において抗原をコードするポリヌクレオチドは、本発明の方法により宿主動物に投与することにより所望の免疫応答を生じさせ得る限り、特に限定されるものではなく、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本発明の抗原をコードするポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが所望の免疫応答を宿主において生じさせることができる限り、そのヌクレオチド配列が配列部位特異的変異誘発法等の公知の手法により（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５参照）人工的に１以上のアミノ酸配列を欠失・置換・挿入・付加されたものでもよい。また、所望の免疫応答を宿主動物において生じさせ得る限り、自然界に存在する変異体は、公知のハイブリダイゼーション技術（ａｄｉｔ．Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．３−６．４参照）および遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（ｅｄｉｔ．Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ６．１−６．４参照）を利用して単離することもできる。
また、抗原蛋白質をコードする遺伝子が知られている場合に、その蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性／親水性領域を解析し（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１２２（１９８２））、二次構造を解析し（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６（１９７８））アミノ酸配列中の抗原性領域を推定すること（例えば、Ａｎａｌ／Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：５４０−５４６（１９８５）参照）、そして、推定されたアミノ酸配列のペプチドを合成しその抗原性をＰＥＰＳＣＡＮ法（Ｎａｔｕｒｅ  ３１４（１９８５）；特表昭６０−５００６８４号公報）等により」決定することは当業者が容易に行い得ることである。従って、前記方法に基づき決定されたエピトープ部分を含むペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを化学合成等の手法により製造して本発明の抗原の発現ベクターとして用いることもできる。
本発明において用いられる発現ベクターは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原遺伝子を組込んだ組換えベクターであり、抗原遺伝子を挿入するベクターとしてはプラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス、及び、当分野において従来用いられているその他のベクターを例示することができる。当業者であれば、例えば、ｅｄｉｔ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．）、及び、ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ等に記載された技術により、様々なプラスミド及びベクターを構築することが可能である。
ここで用いるプロモーター、ターミネーター等の宿主内における発現制御を行う因子は、当業者であれば宿主の種類及び目的に応じて公知の制御配列から適宜選択し、抗原遺伝子の上流及び／または下流に配置することが可能である。従って、抗原由来の制御配列を用いてもよいし、異種の制御配列を用いることも可能である。また必要であれば、抗生物質耐性マーカー等のマーカーを本発明の発現ベクターの中で用いることも可能である。多数の市販のベクターを利用することができるが、本発明において必須ではないポリヌクレオチド配列を除去することが好ましい。
本発明の組成物はｎａｋｅｄプラスミドとして使用でき、リポソーム内にパッケージングするか、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルス関連ベクター及びＨＶＪベクター等の各種ウイルスベクターとして形成するか（例えば、Ｋ．Ａｄｏｌｐｈ“ウイルスゲノム法”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ（担体）に被覆して用いることができる。これに限定されるわけではないが、好ましくは遺伝子銃等により生体内に導入される金粒子等の担体粒子上に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞により認識される抗原を発現させるベクターを付着させた形態のものである。ポリヌクレオチドで担体粒子をコートする技術は公知である（例えば、ＷＯ９３／１７７０６参照）。最終的にポリヌクレオチドは、生体への投与に適する生理的食塩水等の溶液中に調整することができる。その他、プラスミドの細胞内取り込みの助けとなるカルシウムイオン等の薬剤を併用することも可能である。その他、必要に応じトランスフェクションを容易にする医薬的に許容される薬剤を合わせて用いることができる。
本発明組成物は、いかなる方法により投与することもできるが、好ましくは、適当な非経口経路、例えば静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により投与される。これらの投与方法うち、加速粒子による遺伝子形質転換技術は、米国特許第４，９４５，０５０号、第５，２４０，８４２号等にも記載されており、その改良法に基づく装置も市販されている（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
本発明における宿主動物の種類も限定されないが、具体的には例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、猫、豚、ヒツジ、牛、馬、並びに、サル及びヒト等の霊長類を含む哺乳動物を挙げることができ、中でもヒトがより好ましい宿主動物である。
発明の詳細な説明
本発明において用いられる抗原あるいは発現ベクターの投与量は、疾患の種類、程度、性別、年齢、体重、投与経路等によって異なり限定されないが、通常は一回あたり０．００１μｇ〜１ｇ、好ましくは０．０１μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは０．１μｇ〜１００μｇを投与する。
以上のようにして実施された結果として実現される免疫抑制状態はインターフェロン・ガンマの投与、あるいはインターロイキン１２とインターロイキン１８の併用投与によって解除される。すなわち、こうしたサイトカインの作用とＳＥＲＥＸ抗原による感作とを適切に組み合わせることにより、制御性Ｔ細胞を人為的に操作することができ、自己免疫疾患、臓器移植に伴う反応、アレルギー反応および腫瘍免疫の制御等に適用することができる。
さらに免疫抑制状態の解除は、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２５抗体による処理によっても可能である。
従って本発明は、制御性Ｔ細胞の活性を制御する方法および組成物を提供するものである。
本発明では、ＳＥＲＥＸ抗原が制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を促進することが明らかにされたことにより、制御性Ｔ細胞の活性を制御する方法が初めて示された。
従来、自己免疫疾患やアレルギーの治療および移植拒絶や移植片対宿主反応を抑制する治療は様々な手法や薬剤が開発されているにもかかわらず有効性に限界があり、これらを超える有効性が求められている。
本発明は近年生体内における重要性がますます明らかにされつつあるＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の作用を制御する極めて有効な方法と組成物を提供するものであり、自己免疫疾患やアレルギー疾患の治療、臓器・組織移植に伴う療法に大きな進歩をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＳＥＲＥＸ抗原単独による免疫化が肺転移を促進することを示すグラフである。
図２は、ＳＥＲＥＸ抗原単独免疫化によって誘導された肺転移促進を担う細胞はＣＤ４＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞であり、ＣＤ８＋細胞ではないことを示すグラフである。
図３は、ＳＥＲＥＸ抗原単独免疫化マウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の移植により肺転移が促進されることを示すグラフである。
図４は、ＳＥＲＥＸ抗原の単独前処理は、ｍＥＲＫ２抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を抑制することを示すグラフである。
図中、９ｍ−ｐｕｌｓｅｄ  Ｐ１ＨＴＲはｍＥＲＫ２  ９ｍ抗原タンパクを、ｐ６３−７１（Ｔ）−ｐｕｌｓｅｄ  Ｐ１ＨＴＲは対照の抗原タンパクを意味する。
図５は、ｍＥＲＫ２または１４７ＨＥＲ２、及びＤｎａ  Ｊ−ｌｉｋｅ２を用いた免疫化による肺転移に対するｉｎ  ｖｉｖｏの予防・治療効果を示すグラフである。
図６、図７、図８および図９は実施例４におけるマウス背部の腫瘍径の測定結果を示す。
図６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＳＥＲＥＸ同定自己抗原ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２免疫によりＣ５７ＢＬ／６由来メラノーマＢ１６の拒絶が遷延し一部のマウスが腫瘍死したことを示す。
図７は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する他のＳＥＲＥＸ同定自己抗原免疫の場合もＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２免疫と同様にＣ５７ＢＬ／６由来メラノーマＢ１６の拒絶が遷延し一部のマウスが腫瘍死したことを示す。
図８は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２免疫によりＣ５７ＢＬ／６由来メラノーマＢ１６の拒絶の遷延は抗ＣＤ２５抗体投与により解除されたことを示す。
図９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２免疫によりＣ５７ＢＬ／６由来メラノーマＢ１６の拒絶の遷延は抗ＧＩＴＲ抗体投与により解除されたことを示す。
【実施例】  以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、該実施例は本発明をいかなる意味でも限定することを意図したものではない。
参考例  ＳＥＲＥＸ抗原と腫瘍抗原との同時感作による肺転移の阻止
ＢＡＬＢ／ｃ起源の３−メチルコラントレン誘導肉腫ＣＭＳ５ｍ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射の後、肺転移を起こし、動物を５〜６週間以内に死に至らしめる。そこで、総量０．１ｍｌの１×１０６ＣＭＳ５ｍ腫瘍細胞を側尾静脈よりＢＡＬＢ／ｃマウスへ投与し、肺転移についてのモデルとした。腫瘍抗原として変異キナーゼであるｍＥＲＫ２、ＳＥＲＥＸ抗原としてＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２を用いた。１）ｍＥＲＫ２をコードするプラスミド、２）ｍＥＲＫ２プラスミドおよびコントロールベクターをコードするプラスミドの混合物、３）ｍＥＲＫ２プラスミドおよびＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２プラスミドの混合物、により腫瘍投与の１４日前、７日前、腫瘍投与の日（同日）、または、腫瘍投与から５日後に隔週免疫化を開始した（Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４５７１−１４５７６（２００１）に記載の方法による）。腫瘍投与から２８日後にマウスを殺し、肺小瘤数を解剖顕微鏡で数えた。各グループについて５匹の動物を用い、結果はその平均±ＳＥＭとして表した。
腫瘍投与を始める１４日前にマウスをｍＥＲＫ２をコードするプラスミドで免疫化することにより肺転移を完全に予防することができた。この予防的な効果は、腫瘍投与の７日前に行った場合、または腫瘍投与後に行った場合には見られなかった（図５参照）。それに対して、ｍＥＲＫ２プラスミドおよびＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２プラスミドを組合わせての免疫化では、腫瘍投与から５日後までの免疫化でも転移が完全に予防された（図５参照）。転移の有無は組織病理学的試験により確認した。図中の数値は各グループについて５匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。
実施例１  ＳＥＲＥＸ抗原単独感作による肺転移の促進
参考例と同様の肺転移モデルにおいて、腫瘍投与の５日後にＳＥＲＥＸ抗原をコードするプラスミドまたはコントロールベクターで免疫したマウスを腫瘍投与後２８日目に殺し、肺小瘤数を数えた。ＳＥＲＥＸ抗原として熱ショックタンパク質ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２、ＤＮＡリガーゼ１、ガレクチン８およびポリＡ結合タンパク質サイトプラスミックの４種類（いずれもマウスのタンパク質）各々のプラスミドで免疫した場合は小瘤数は１３０−１７０であり、こうした免疫をしない場合には小瘤数は３０−５０であった。これに対し、ＳＥＲＥＸ分析を繰り返しても検出されなかったマウス分子３種、グルコース制御タンパク質、分泌ネクシンおよびＴＣＰ−１ゼータ１サブユニット（Ｃｃｔｚ−１）含有シャペロンをコードするプラスミドで免疫した場合には、転移の促進は観察されなかった（図１ａ、１ｂ）。また、ヒトＳＥＲＥＸ抗原３種類（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＨＭＢＡ誘導タンパク質、ヒトレチノイン酸応答タンパク質およびＨ．ｓａｐｉｅｎｓ肝炎デルタ抗原反応タンパク質Ａ）やオブアルブミンなど異種のタンパク質をコードするプラスミドで免疫しても転移の促進は観察されなかった（図１ａ）。すなわち、自己抗原としてのＳＥＲＥＸ抗原による単独感作が転移を促進していることが示唆された。
そこで、この転移促進に関与している細胞表現型を解析した。マウスを抗ＣＤ４モノクローン抗体や抗ＣＤ２５モノクローン抗体で前処理しておくと、ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２感作による転移促進は全くなくなった（図２ａ、２ｂ）。抗ＣＤ２５モノクローン抗体による前処理のみの場合には、前処理もない場合に比べて転移小瘤はかなり減少した（図２ｂ）。また、抗ＣＤ８モノクローン抗体で前処理しＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２で感作した場合は転移の促進が抗体前処理のない場合と同程度に観察された（図２ｃ）。この結果から、転移の促進はＣＤ４＋またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が担っていることが示された。
実施例２  ＳＥＲＥＸ抗原で感作されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞は肺転移を促進する
実施例１で得られた結果を直接的に確認するために、ＳＥＲＥＸ抗原で感作されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を腫瘍接種マウスに移植して転移の促進の有無を調べた。すなわち、ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２抗原で免疫したマウスから腫瘍マウスにＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を移植した場合には肺転移を著しく促進したが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を移植した場合には肺転移の促進はほとんど観察されなかった。また、感作されていないＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を移植した場合は、移植していない場合に比して有意な転移促進が観察されたが、それは感作されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を移植した場合に比してずっと小さいものであった（図３）。
実施例３  ＳＥＲＥＸ抗原による前処理はＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を抑える
本発明者らは先に、腫瘍接種マウスに各々腫瘍抗原およびＳＥＲＥＸ抗原をコードするプラスミドを投与すると強力な抗腫瘍免疫応答を惹起できること、その際ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルパー機能が著しく増強され、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答増幅はＣＤ４＋Ｔ細胞に依存するものであることを報告した（Ｈ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４５７１−１４５７６（２００１）；ＷＯ  ０３／０００８９４  Ａ１）。
そこで、実施例２で確認した抗腫瘍免疫応答の抑制において、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫応答性が変化しているか否かを調べた。腫瘍抗原として変異キナーゼであるＥＲＫ２の９マーのペプチドｍＥＲＫ２  ９ｍを用いた。マウスをＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２で前免疫し、その上でｍＥＲＫ２  ９ｍをコードするプラスミド単独、あるいはこれとＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２をコードするプラスミドと併用で免疫して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりｍＥＲＫ２  ９ｍ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した。ｍＥＲＫ２  ９ｍ単独の場合は、ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２前処理がＣＤ８＋Ｔ細胞を変化させなかった（図４ａ）が、併用免疫の場合は、ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２前処理がない時に観察されたヘルパー活性の増強がＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２前処理により全く消滅してしまった（図４ｂ）。この結果から、ＳＥＲＥＸ抗原で免疫すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞のヘルパー活性が抑制されることが明らかになった。なお、α−ＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄテトラマーによる解析により、局所のナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の細胞数減少が認められた。
以上の実施例１、実施例２および実施例３により、マウス腫瘍転移モデルにおける抗腫瘍免疫応答を例として、ＳＥＲＥＸ抗原をコードするプラスミド単独による処理がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を活性化する結果としてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性を抑制し、免疫応答全体を抑制することが実験的に証明された。
実施例４  制御性Ｔ細胞活性制御による同種免疫応答の制御
本発明者は、担癌マウス血清を用いＳＥＲＥＸ法により担癌個体の免疫系が認識する変異のない野生型自己抗原（ＳＥＲＥＸ同定自己抗原）を同定してきた。ＳＥＲＥＸ同定自己抗原はＩｇＧに認識されることよりＣＤ４細胞に認識されると考えられる。これらＳＥＲＥＸ同定自己抗原と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）認識癌拒絶抗原をヘリオス型遺伝子銃（Ｈｅｌｉｏｓ社Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ登録商標）を用いて共免疫した場合、強いヘルパー効果を発揮する。
一方、ＳＥＲＥＸ同定自己抗原単独の免疫ではマウス肉腫肺転移モデルでは腫瘍の増悪を認め、免疫を抑制的に制御すると考えられた。
この機構はＳＥＲＥＸ同定自己抗原単独免疫では制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞を活性化しＮＫＴを減少させるためと考えられている。本実施例ではＳＥＲＥＸ同定自己抗原単独の免疫による免疫抑制効果が移植などの同種免疫応答にどのように関与するのかを検討するために、ＳＥＲＥＸ同定自己抗原単独の免疫を行ったマウスに対し、他系統のマウス由来の腫瘍を接種しその増殖に及ぼす影響を検討した。
（１）材料および方法
マウス：    ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを用いた。
プラスミド：ＳＥＲＥＸ同定自己抗原遺伝子（ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ２、Ｍｕｓ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １（Ｌｉｇａｓｅ  １）、Ｍｕｓ  ｐｏｌｙ（Ａ）ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  １（Ｐｏｌｙ  Ａ））をｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドに組み込み金粒子にコーティングした。
遺伝子導入（免疫）：ＳＥＲＥＸ同定自己抗原を単独でヘリオス型遺伝子銃によりマウス腹部皮内に２週間隔で免疫した。
腫瘍接種：  ＳＥＲＥＸ同定自己抗原単独２回目免疫の１週間後、ＢＡＬＢ／ｃマウスにはＣ５７ＢＬ／６由来メラノーマ細胞株Ｂ１６を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにはＢＡＬＢ／ｃ由来線維肉腫細胞株ＣＭＳ５ａをそれぞれ１ｘ１０６個を背部皮下に接種した。
腫瘍接種後、経時的にマウス背部の腫瘍径を測定した。（図６〜９参照）
抗体：      抗ＣＤ２５抗体はハイブリドーマＰＣ６１より硫安分画により濃縮し０．２５ｍｇ投与した。
抗ＧＩＴＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ１８）抗体はハイブリドーマＤＴＡ−１（京都大学・坂口志文教授より供与）腹水を８倍希釈して２００μｌ（２５μｌ）投与した。
抗ＣＤ４抗体はハイブリドーマＧＫ１．５腹水を８倍希釈して２００μｌ（２５μｌ）投与した。抗体投与はいずれの抗体も腫瘍接種直前に１回のみ行った。
（２）結果と考察
ＢＡＬＢ／ｃマウスではＳＥＲＥＸ同定自己抗原による免疫によりＣ５７ＢＬ／６マウス由来の腫瘍拒絶が遷延し、一部のマウスは腫瘍死した。
この現象は抗ＣＤ２５抗体の投与、抗ＧＩＴＲ抗体の投与によりキャンセルされたことよりＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が関与していると考えられた。
ＳＥＲＥＸ同定自己抗原の免疫により免疫応答が抑制的に制御された結果、同種免疫応答も低下しているものと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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