(57)【要約】分子標的治療薬のより有効な効果をもたらすことを目的とし、完全寛解率を上げ、完全寛解への期間の短縮化を達成し、免疫療法との相乗効果を達成するための手段を提供するものである。つまり、ＣＴＬ活性、ＮＫＴ活性、ＮＫ活性及び−ＶＥＧＦ等に着目する新免疫療法と分子標的治療薬特にチロシンキナーゼ阻害剤の併用による相乗効果の達成を課題とする。チロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤の併用がガン治療における優位な相乗効果を達成することを見出し本発明を完成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤が併用されることを特徴とするガンの治療剤。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が、以下の１）〜７）の少なくとも１の受容体に対する選択的標的作用を有する請求項１のガンの治療剤。
１）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、２）ＨＥＲ３、３）ＨＥＲ４、４）ｃ−ｋｉｔ、５）ＰＤＧＦＲ、６）ｂｃｒ−ａｂｌ、７）ＥＧＦＲ
【請求項３】
チロシンキナーゼ阻害剤が、選択的にＥＧＦＲ又はｃ−ｋｉｔ標的作用を有する請求項１のガンの治療剤。
【請求項４】
ＩＬ−１２産生誘導剤が、β１，３／１，６グルカン構造を有する物質である請求項１〜３の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項５】
ＩＬ−１２産生誘導剤が、β１，３／１，６グルカン構造を有する茸菌糸体由来成分又は酵母由来成分である請求項４のガンの治療剤。
【請求項６】
ガンの化学療法剤及び放射線治療との併用無しに処置される請求項１〜５の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項７】
ＮＫＴ細胞のＮＫＲ−Ｐ１に選択的に作用してＮＫＴ細胞の活性化をおこす物質と併用される請求項１〜６の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項８】
血管新生阻害能を有する物質と併用される請求項１〜７の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項９】
以下の１）又は２）のいずれか１をマーカーとしてチロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤の併用治療が行われる請求項１〜８の何れか一に記載のガンの治療剤。
１）  ＮＫＴＰ値の投与前値が５．０％以上の測定値を示す、
２）  Ｔｈ２値の投与前値が３％以上の測定値を示す
【請求項１０】
Ｔｈ１／Ｔｈ２比がイレッサ投与前値に比較して、投与数ヶ月後に増加の測定値を示すことを併用治療の継続のマーカーにする請求項１〜９の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項１１】
ＮＫＴＰ値の投与前値が、５．０％未満の測定値を示すことを特徴とする請求項１０に記載のガンの治療剤。
【請求項１２】
ＩＬ−１２、ＩＮＦγの測定値が、イレッサ投与前値に比較して投与数ヶ月後の値で低下していないことを併用治療の継続のマーカーにする請求項９に記載のガンの治療剤。
【請求項１３】
ガンの治療剤が肺（腺）ガン治療剤であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一に記載のガンの治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか一に記載のガン治療剤を用いたガンの治療方法。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号２００２−２７３７３８，２００２−２８１７８０，２００２−３５４５１５，２００３−１６１２３８，２００３−１６９１５３からの優先権を請求する。
【技術分野】  本発明は、癌治療の新たな領域を提供するものである。すなわち、新規な癌治療法として着目されるチロシンキナーゼ阻害剤と医学博士八木田旭邦が開発したＮＫ細胞の活性化能、ＮＫＴ細胞の活性化能、血管新生阻害能、ＩＬ−１２の産生誘導能及びＩＦＮγの産生誘導能の動態に着目した新免疫療法の併用による新規なガン治療剤の提供に関する。
【背景技術】  ガン（ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）（ｃａｎｃｅｒ）の予防または治療のために有用な物質の選別には、従来、ガン細胞へのその直接的作用が重要視されていた。免疫賦活剤がガン治療に有用であることは認められていたが、免疫賦活剤として得られた化合物はいずれもその抗ガン効果が微弱であり、免疫療法単独または化学療法との併用治療によってもガンの十分な治療効果は達成されていない。
本発明者の医学博士、八木田は、先にガン治療における画期的な手法として、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を生体内で誘発する物質の有用性に着目し、キノコ菌糸体加工物がその機能を有することを発見し、新免疫療法（Ｎｏｖｅｌ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ）（ＮＩＴＣ）ともいうべきガン治療法を確立した。従来ＩＬ−１２は、抗ガン効果があるものの生体内にＩＬ−１２自体を直接投与した場合には副作用を生じるために患者が治療に耐えられないという事実があり、それ自体を抗ガン剤として使用できなかった。しかし、八木田が報告したキノコ菌糸体加工物を含む製剤は、ガンの治療において著しい治癒・延命効果を達成した。つまり八木田は、ＩＬ−１２を生体内で誘発できる有効量のキノコ菌糸体加工物を投与することにより、ガンの治療目的を達成した｛（特許文献１）特開平１０−１３９６７０号公報｝。
ＩＬ−１２は、ＴＮＦα→ＩＦＮγ→ＩＬ−１２→ＣＴＬ活性というルートでキラーＴ細胞の活性化効果と増強効果をもつ。つまりＩＬ−１２の産生増強は、キラーＴ細胞の活性化と増強により抗ガン効果が期待される。
八木田は、ＩＬ−１２の産生増強の系とは別にＮＫＴ細胞の活性化が抗ガン効果に有用であることを報告している。谷口等は、ＮＫＴ細胞が有するＶα２４Ｖβ１１という特異的なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）が認識する特異的な糖脂質抗原を発見し、この抗原が、αガラクトシルセラミドであることを報告している。更に、αガラクトシルセラミドを投与した担ガンマウスでは、ＮＫＴ細胞が活性化され、ガンの消失はみられないものの転移が抑制されることを証明した。
ＮＫＴ細胞には、もう一つの受容体としてＮＫ細胞抗原受容体（ＮＫＲ−Ｐ１；ナチュラルキラー受容体Ｐ１）があることは報告されている｛（非特許文献１）特集ＮＫＴ細胞の基礎と臨床：最新医学５５巻４号２０００年８１８〜８２３ページ｝。
ＮＫＲ−Ｐ１もＮＫＴ細胞の活性化に関与し、この活性化が抗ガン効果がより優位であることを八木田は見出している｛（特許文献２）ＵＳ２００２−００１０１４９Ａ１｝。
ガンの分子標的治療剤が新タイプの制癌剤として従来の細胞標的治療剤と対比してその意義が着目されている。そのなかでも特にシグナル伝達阻害作用を有する薬剤としてチロシンキナーゼ阻害剤は注目されている。ＺＤ１８３９（イレッサ：登録商標  アストラゼネカ）はＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位におけるＡＴＰとの競合作用を有し、チロシンキナーゼの自己リン酸化を抑制することでチロシンキナーゼ活性を抑制する。その結果、ＥＧＦＲのもつ増殖、浸潤、分化、転移に関連するシグナル伝達〔ＥＧＦＲの細胞外ドメインに上皮成長因子（ＥＧＦ）等のリガンドが結合することにより、細胞内ドメインにあるＥＧＦＲチロシンキナーゼが活性化し、ＥＧＦＲの自己リン酸化および種々の細胞内標的たんぱくのリン酸化を引き起こすことにより細胞表面から核への増殖シグナルが伝達され、癌細胞表面から核への増殖シグナルが伝達され、癌細胞の増殖、浸潤、転移、血管新生を起こす〕を遮断することにより抗癌作用を発現する。ＩＭＣ−Ｃ２２５（ＥＧＦＲ標的モノクローナル抗体）は細胞膜表面のＥＧＦＲレセプター部分を認識し、ＥＧＦＲの自己リン酸化を抑制することでチロシンキナーゼ活性を阻害する。ハーセプチンはＥＧＦＲと相同性をもつＨｅｒ２／Ｎｅｕに対するモノクローナル抗体であり、ＳＴＩ−５７１（グリベック）はＢＣＲ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性の阻害とｃ−ｋｉｔのチロシンキナーゼ活性の阻害能を有する｛（非特許文献２）血液・免疫・腫瘍  Ｖｏｌ．７  Ｎｏ．３  ２００２−７｝。
このような分子標的治療剤は新メカニズのガン治療薬として着目されるが、その効果はいまだ革命的とはいえない。たとえば、ＺＤ１８３９（イレッサ）はアストラゼネカ社が新規に開発した強力かつ選択的なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であり、ヒトでもその有用性が判明している。しかし非小細胞肺癌や前立腺癌などでの臨床成績はＰＲ（部分寛解）が１０〜２０数％で、ＣＲ（完全寛解）は全くないと言ってもよいが、あっても極くまれで完全寛解まで４ヶ月以上の期間がかかっていた。そこでＺＡ１８３９（イレッサ）と各種抗癌剤との併用療法が試みられているものの現時点では相加あるいは相乗効果は得られていない。
【発明の開示】
本発明は、上記のような分子標的治療薬のより有効な効果をもたらすことを目的とし、完全寛解率を上げ、完全寛解への期間の短縮化を達成し、免疫療法との相乗効果を達成するための手段を提供するものである。つまり、ＣＴＬ活性、ＮＫＴ活性、ＮＫ活性及び−ＶＥＧＦ等に着目する新免疫療法と分子標的治療薬特にチロシンキナーゼ阻害剤の併用による相乗効果の達成を課題とする。
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤の併用がガン治療における優位な相乗効果を達成することを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、
「１．チロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤が併用されることを特徴とするガンの治療剤。
２．チロシンキナーゼ阻害剤が、以下の１）〜７）の少なくとも１の受容体に対する選択的標的作用を有する前項１のガンの治療剤。
１）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、２）ＨＥＲ３、３）ＨＥＲ４、４）ｃ−ｋｉｔ、５）ＰＤＧＦＲ、６）ｂｃｒ−ａｂｌ、７）ＥＧＦＲ
３．チロシンキナーゼ阻害剤が、選択的ＥＧＦＲ又はｃ−ｋｉｔ標的作用を有する前項１のガンの治療剤。
４．ＩＬ−１２産生誘導剤が、β１，３／１，６グルカン構造を有する物質である前項１〜３の何れか一に記載のガンの治療剤。
５．ＩＬ−１２産生誘導剤が、β１，３／１，６グルカン構造を有する茸菌糸体由来成分又は酵母由来成分である前項４のガンの治療剤。
６．ガンの化学療法剤及び放射線治療との併用無しに処置される前項１〜５の何れか一に記載のガンの治療剤。
７．ＮＫＴ細胞のＮＫＲ−Ｐ１に選択的に作用してＮＫＴ細胞を活性化をおこす物質と併用される前項１〜６の何れか一に記載のガンの治療剤。
８．血管新生阻害能を有する物質と併用される前項１〜７の何れか一に記載のガンの治療剤。
９．以下の１）又は２）のいずれか１をマーカーとしてチロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤の併用治療が行われる前項１〜８の何れか一に記載のガンの治療剤。
１）  ＮＫＴＰ値の投与前値が５．０％以上の測定値を示す、
２）  Ｔｈ２値の投与前値が３％以上の測定値を示す
１０．Ｔｈ１／Ｔｈ２比がイレッサ投与前値に比較して投与数ヶ月後に増加の測定値を示すことを併用治療の継続のマーカーにする前項１〜９の何れか一に記載のガンの治療剤。
１１．ＮＫＴＰ値の投与前値が、５．０％未満の測定値を示すことを特徴とする前項１０に記載のガンの治療剤。
１２．ＩＬ−１２、ＩＮＦγの測定値が、イレッサ投与前値に比較して投与数ヶ月後の値で低下していないことを併用治療の継続のマーカーにする前項９に記載のガンの治療剤。
１３．ガンの治療剤が肺（腺）ガン治療剤であることを特徴とする前項１〜１２の何れか一に記載のガンの治療剤。
１４．前項１〜１３の何れか一に記載のガン治療剤を用いたガンの治療方法。」
からなる。
【図面の簡単な説明】（図１）患者のレントゲン図
（図２）患者のレントゲン図
（図３）破骨細胞分化の必須シグナルの図
（図４）肺（腺）癌の奏効例
（図５）大腸癌の奏効例
（図６）各種癌での奏効例
（図７）ロジスティック回帰係数分析による各マーカーの奏効に対する寄与度（肺腺ガン）
（図８）イレッサ投与患者におけるロジスティック回帰係数分析による各マーカーの奏効に対する寄与度（肺腺ガン）
（図９）イレッサ投与前における有効例（Ｂ群）と無効例（Ａ群）の比較
（図１０）ＮＫＴＰ＜５．０における有効例（Ｂ群）と無効例（Ａ群）の比較
（図１１）２つの閾値による有効・無効群
（図１２）イレッサと新免疫療法との作用時期の相違
（図１３）イレッサ投与前におけるＣ群及びＤ群の比較
（図１４）Ｃ群、Ｄ群におけるサイトカインの相違
（図１５）イレッサとＮＩＴＣとの抗腫瘍作用における相乗作用機序仮説
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳しく説明するが、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者により普通に理解される意味を持つ。
本発明者の医学博士八木田のガン新免疫療法（ＮＩＴＣ）とは４つの異なる作用機序を組み合わせることからなる治療手段である。
第一の作用機序は、血管新生阻害物質（ベターシャーク）を投与してガンへの血流を障害してガン縮小をはかる方法である。これは血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定することでその効果は判定が可能である。血管新生阻害作用はＶＥＧＦ値のマイナス（負）値（−ＶＥＧＦ）で評価できる。このＶＥＧＦ値の替わりにＦＧＦ、ＨＧＦなどのその他の血管増殖因子を用いることも血管新生阻害能を評価することが可能である。またＶＥＧＦの替わりに血管新生阻害因子の正数値でもその評価が可能である（例えばエンドスタチン値）。
第２の作用機序は、β１，３グルカン構造を担持する化合物を投与してＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）を誘導してＣＴＬを活性化する方法である。ＣＴＬ活性はＣＤ８（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能であるが、このＣＤ８（＋）パーフォリン値には細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）と免疫抑制性Ｔ細胞（ＳＴＣ；Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔｃｅｌｌ）とがあり、前者はガン細胞を障害し、後者の活性化は結果的にガンの増殖につながる。したがってその絶体値では評価はできない。しかし前者はＩＦＮγが１０ＩＵ／ｍｌ以上かもしくはＩＬ−１２値が７．８ｐｇ／ｍｌ以上であればＣＴＬであり、ＩＦＮγとＩＬ−１２が低値であればＳＴＣと判定される。そこでＣＴＬ活性は、ＩＦＮγ産生能力（ＩＦＮγ値）もしくはＩＬ−１２産生能力（ＩＬ−１２値）で評価が可能である。
第三及び第四の作用機序であるα１，３グルカン構造を担持する化合物の投与によって活性化されるｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞はＮＫ細胞とＮＫＴ細胞である。このＮＫとＮＫＴ細胞とはＮＫＲ−Ｐ１（ＮＫ細胞受容体ＣＤ１６１（＋））を共有しており、前者はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）の表面マーカーでＮＫ細胞数は測定可能であり、その活性化はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン産生能力で判定が可能である。一方後者のＮＫＴ細胞はＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）でその細胞数は測定が可能となり、そのパーフォリン産生能力（ＮＫＴＰと記す）でＮＫＴ細胞の活性化は測定可能である。
したがってガン治療における新免疫療法（ＮＩＴＣ）であっても一般的な免疫療法であっても、以下の測定項目でそれぞれのｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞もしくは血管新生阻害作用を評価することが可能である。具体的には、ＣＴＬ活性はＩＦＮγあるいはＩＬ−１２の産生誘導能力で評価が可能である。ＮＫ細胞の活性化はＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）もしくはＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン値でも評価可能である。ＮＫＴ細胞の活性化はＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）もしくはＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン値（ＮＫＴＰ値）でも評価が可能である。
本発明は、上記の新免疫療法にチロシンキナーゼ阻害剤を併用することによる臨床における結果を検討することにより行われた。本発明者は、新免疫療法（ＮＩＴＣ）として、ガン患者にα１，３グルカン構造を担持する化合物、β１，３グルカン構造を担持する化合物と血管新生阻害作用物質（サメ軟骨）を併用し、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ他の各種サイトカインを測定した。なお、ＣＤ８（＋）パーフォリン産生は、ＩＦＮγ及びＩＬ−１２の産生とは強い正の相関性が存在し、この結果、ＣＤ８（＋）パーフォリン産生の測定はＣＴＬ活性ルートの評価に意義を見出している。
この意義によりＣＤ８（＋）パーフォリン産生能の測定は、有用なＣＴＬ活性化剤（つまりＩＬ−１２産生誘発剤）のスクリーニング方法に適用可能であり、このスクリーニング方法を利用すればＣＴＬ活性化能（ＩＬ−１２産生誘発能）を担持する新規β１，３グルカンの特定が可能である。本発明で使用する、ＩＬ−１２産生誘導剤は特に限定せず、広く使用可能である。例えば、β１，３グルカン構造を持つ茸菌糸体組成物製剤（例えばＩＬＸ商品名：東西医薬研究所、ＩＬＹ商品名：セイシン企業、ＡＨＣＣ：アミノアップ）、或はβ１，３グルカン構造を持つ各種酵母（海洋性酵母、パン酵母、ＮＢＧＴＭ）が利用できる。また、新規なＩＬ−１２産生誘導剤は、ＣＤ８パーフォリン産生能の測定を組み合わせることで当業者は容易にＩＬ−１２産生誘導剤（ＣＴＬ活性化剤）を特定可能である。ＣＴＬ活性化剤は、本発明で使用するＩＬ−１２産生誘導剤と同義である。
本発明では、このＩＬ−１２産生誘導剤とチロシンキナーゼ阻害剤の併用が必須である。具体例では、ＺＤ１８３９（イレッサ商品名）又はＳＴＩ５７１（グリベック商品名）を使ったが、各種チロシンキナーゼ阻害剤が有効に利用できる。それらは標的分子として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＥＧＦＲ等が例示される。最も効果的な分子はＥＧＦＲ又はｃ−ｋｉｔである。
チロシンキナーゼ阻害剤の投与量は、各分子標的化合物の推奨投与量に従うが、１０〜５００ｍｇ／日の経口投与がおこなわれる。
ＩＬ−１２産生誘導剤とチロシンキナーゼ阻害剤の併用は、特に限定はされないが、治療初期からでもどちらを先行させていても良い。具体例では、ＮＩＴＣ療法特にＩＬ−１２産生誘導剤を一定期間投与後に、チロシンキナーゼ阻害剤を併用し、劇的な臨床効果を確認した。
本発明では、ＩＬ−１２産生誘導剤に加えて、ＮＫ活性化剤又はＮＫＴ活性剤の併用が可能である。ニゲロオリゴ糖、フコイダン等のα１，３グルカン構造を持つ化合物の組成物製剤がＮＫ活性化剤又はＮＫＴ活性剤として有用である。α１，３グルカン構造を持つ化合物は種々知られており、この既知構造とＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）、ＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン産生能ＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）、ＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）パーフォリン産生能の測定を組み合わせれば当業者は容易にＮＫ活性化剤又はＮＫＴ活性化剤を特定可能である。なお、ＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）はＮＫＴ細胞の受容体ＮＫＲ−Ｐ１に作用することを意味する。
α１，３グルカン構造の糖類物質としては、例えば、ニゲロオリゴ糖（ＴＳＯ）、フコイダン、硫酸オリゴ糖等が挙げられる。
ニゲロオリゴ糖は、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類である。代表的なものとしては、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトース等が挙げられる。
また、市販されているニゲロオリゴ糖としては、ニゲロオリゴ糖液糖（販売者・武田食品工業株式会社）が挙げられるが、これが含有する主なニゲロオリゴ糖は（１）  ニゲロース  α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，３）−Ｄ−Ｇｌｃ  （２）  ニゲロシルグルコース  α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，４）−Ｄ−Ｇｌｃ  （３）  ニゲロシルマルトース  α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１，４）−Ｄ−Ｇｌｃ（なお、Ｇｌｃはグルコース、ｐはピラノースの略号である）である。
フコイダンは、狭義ではフコースの２乃至６分子に硫酸１分子が結合した硫酸化フコース含有多糖類であり、これにキシロースあるいはウロン酸を含有したフコイダン様多糖体を食品レベルで「フコイダン」と称している。フコイダンは、例えばコンブを破砕し、チップ化し、水溶液成分を抽出した後、抽出残渣を遠心分離により除去し、ヨードや塩化ナトリウム等の低分子物質を限外ろ過により除去して凍結乾燥化して製剤化される。
フコイダンとしては、褐藻類由来フコイダン、例えばガゴメコンブ由来のフコイダン、およびオキナワモズク由来フコイダン等が例示される。ガゴメコンブ等の褐藻類コンブ科由来のフコイダンには少なくとも３種類のフコイダン、Ｆ−フコイダン（α−Ｌ−フコースのポリマー）、Ｕ−フコイダン（β−Ｄ−グルクロン酸とα−Ｄ−マンノースを主鎖とし、側鎖にα−Ｌ−フコースをもつ）、Ｇ−フコイダン（β−Ｄ−ガラクトースを主鎖とし、側鎖にα−Ｌ−フコースをもつ）、が存在しており、いずれのフコイダンもフコースが硫酸化されている。
硫酸オリゴ糖としては、例えば株式会社白子製のスサビノリ（Ｐｏｒｙｐｈｙｒａ  Ｙｅｚａｅｎｓｉｓ）由来の抽出物があげられる。該抽出物の主成分はα１，３結合のガラクタン硫酸のオリゴ糖とα１，３結合およびβ１，４結合よりなるガラクタン硫酸のオリゴ糖である。
本発明のチロシンキナーゼ阻害剤とＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）との併用、更にはＮＫ活性化剤、ＮＫＴ活性化剤、新生血管阻害剤との併用は、その適用法を選別することで肺ガン（肺扁平上皮ガン、肺腺ガン、小細胞肺ガン）、胸腺腫、甲状腺ガン、前立腺ガン、腎ガン、膀胱ガン、結腸ガン、直腸ガン、食道ガン、盲腸ガン、尿管ガン、乳ガン、子宮頸ガン、脳ガン、舌ガン、咽頭ガン、鼻腔ガン、喉頭ガン、胃ガン、肝ガン、胆管ガン、精巣ガン、卵巣ガン、子宮体ガン、転移性骨ガン、悪性黒色腫、骨肉腫、悪性リンパ腫、形質細胞腫、脂肪肉腫等の治療に有効である。
本発明に係るチロシンキナーゼ阻害剤とＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）の併用、更にはＮＫ活性化剤、ＮＫＴ活性化剤、新生血管阻害剤との併用は、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる処方にて用いられる。すなわち、その活性化を誘導または増強し、さらに活性化を維持できる投与量、ならびに投与期間を選択して用いられる。具体的には、その投与量は、ＮＫ活性化剤又はＮＫＴ活性化剤であるα−１，３グルカン構造を持つ化合物は１ｇ〜４０ｇ／日程度、好ましくは５ｇ〜２０ｇ／日程度で、ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）であるβ−１，３グルカン構造を持つ化合物は１ｇ〜１０ｇ／日程度、好ましくは３ｇ〜６ｇ／日程度である。また、投与期間は一般的には１０日間〜２４ヶ月間、投与頻度は隔日又は１〜３回／日で、好ましくは連日投与である。当該ＣＴＬ活性化剤（ＩＬ−１２産生誘導剤、ＩＮＦγ産生誘導剤）、ＮＫ活性化剤、ＮＫＴ活性化剤は、好適には経口摂取される。無論、投与量を減少させ、これらを非経口に耐え得る品質に調製することで、非経口摂取（静脈内または筋肉内投与などを含む）も可能である。
抗ガン（化学療法）剤、放射線、あるいはステロイド併用療法を、本発明の併用に加えて行う場合には、２種類の免疫系のうち、ＴＮＦα→ＩＦＮγ→ＩＬ−１２→キラーＴ細胞の系統が著しく障害される。そのためこれらは本発明では用いないことが好ましい。但し抗ガン剤を投与するとき、上記の免疫系を障害しない投与法である低濃度化学療法すなわち５ＦＵ、ＵＦＴ、ミフロール、フルツロン、ＣＤＤＰ（５μｇ〜１０μｇ）の低濃度やタキソテールあるいはタキソール、アドリアマイシン、マイトマイシン、ＣＰＴ−１１などの低濃度抗ガン剤の投与法等を適用することは有用である。また同様に放射線療法において低容量照射の適用、ステロイド療法においても低濃度投与等を選択する必要がある。
細胞および各サイトカインの測定方法を以下に例示する。
（ＮＫＴ細胞の測定）（ＮＫ細胞の測定）（ＣＤ８の測定）
ＮＫＲ−Ｐ１を有するＮＫＴ細胞の測定は、ＮＫＴ細胞の細胞表面に特異的に存在する細胞表面抗原（ＣＤ３およびＣＤ１６１）の測定により行うことができる。具体的には、末梢血中のリンパ球について、ＣＤ３が陽性でかつＣＤ１６１が陽性（ＣＤ３＋ＣＤ１６１＋）の細胞を検定する。つまり、ＮＫＴ細胞の細胞表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ１６１を、モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーを使用するＴｗｏ  Ｃｏｌｏｒ検査により測定する。ここでＮＫＴ細胞が活性化されているとは、リンパ球の中でＣＤ３＋ＣＤ１６１＋ＮＫＴ細胞の割合が１０％以上、より好ましくは１６％以上であることをいう。ＮＫＴ細胞活性化能とは、ＮＫＴ細胞の割合を１０％以上、より好ましくは１６％以上に増加せしめる機能、またはある物質を投与する前のＮＫＴ細胞の割合より更に増強せしめる機能を意味する。
同様に（ＣＤ３−ＣＤ１６１＋）とはＣＤ３が陰性でかつＣＤ１６１が陽性の細胞を検定することである。この方法はＮＫ細胞の測定に有用である。
さらにＣＤ８＋とはＣＤ８が陽性の細胞を検定することである。この方法はＣＴＬ活性の測定に有用である。
実施例ではガン患者の血液を用いて、血中細胞について細胞表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ１６１、ＣＤ８について陽性・陰性で区別し、各細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いたＴｗｏ  Ｃｏｌｏｒ検査により常法通り測定した。このときＣＤ３、ＣＤ１６１、ＣＤ８に対するモノクローナル抗体は、それぞれコールター社製製又はベクトンディッキンソン社製ものを使用した。
（パーフォリン産生細胞の測定）
末梢血中のリンパ球について、細胞表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ１６１、ＣＤ８のうち２者とパーフォリンについてフローサイトメトリーを用いたＴｈｒｅｅ  Ｃｏｌｏｒ検査により常法通り測定する。具体的には、採取した血液に固定液を加えて細胞を固定し、膜透過液を添加後抗パーフォリン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を添加して反応させ、さらにＰＲＥ−Ｃｙ５標識二次抗体（ＤＡＫＯ社製）を添加して反応させ、ついで抗ＣＤ３−ＰＥ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ６６０４６２７）抗体および抗ＣＤ１６１−ＦＩＴＣ（Ｂ−Ｄ）抗体を添加して反応させ、その後フローサイトメトリーで測定する。図・表中での略語はＰＥＲと表示した。
（サイトカインを測定するための試料の調製）
まず、血液より単核球画分を分離調製する。ヘパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で２倍に希釈して混和した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｃｏｎｒａｙ液（比重１．０７７）上に重層し、４００Ｇで２０分間遠沈後、単核球画分を採取する。洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、細胞数を１×１０６個となるように調製する。得られた細胞浮遊液２００μｌにフィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＤＩＦＣＯ社製）を２０μｇ／ｍｌの濃度となるように加え、９６穴マイクロプレートにて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養し、該培養した細胞溶液中のサイトカインを測定する試料とする。
（ＩＬ−１２の測定）
ＩＬ−１２量の測定は自体公知の臨床、生化学的検査を利用できるが、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社やＭＢＬ社より入手することのできる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定キットが使用される。ここではＲ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社の測定キットを用いた。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に測定用希釈液Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ１Ｆを５０μｌ、標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または前記サイトカイン測定用試料の調製法で調製した試料を２００μｌずつ分注した後、室温にて静置して２時間反応させた。その後、西洋わさびパーオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ）標識抗ＩＬ−１２抗体を２００μｌずつ分注し２時間室温で静置した。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、２０分間室温静置後、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。５５０ｎｍを対照として４５０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＬ−１２量は、ｐｇ／ｍｌとして表される。ここでＩＬ−１２産生誘発能とは、末梢血単核球画分が刺激により産生するＩＬ−１２量を、７．８ｐｇ／ｍｌ以上に増強せしめる機能、またはある物質を投与する前のＩＬ−１２産生量より増強せしめる機能を意味する。
（ＩＦＮγの測定）
ＩＦＮγの測定は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．社のＩＦＮγ  ＥＡＳＩＡキットを用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で測定した。実際には９６穴マイクロプレートの各穴に標準液（ｓｔａｎｄａｒｄ）または上記調製した試料を２倍希釈したものを５０μｌずつ分注し、ＨＲＰ標識抗ＩＦＮ−γ抗体を５０μｌずつ分注し更に振盪しながら２時間室温で反応させた。各穴の反応液を除去し３回洗浄後、発色基質溶液を２００μｌずつ分注し、振盪しながら１５分間室温で反応させ、酵素反応停止溶液を５０μｌずつ分注した。６３０ｎｍを対照として４５０ｎｍおよび４９０ｎｍにおける各穴の吸光度をＥｍａｘ（和光純薬株式会社製）にて測定した。ＩＦＮγ量は、ＩＵ／ｍｌとして表される。
（血管新生阻害能の測定）
（血管内皮細胞増殖因子／ＶＥＧＦと塩基性繊維芽細胞増殖因子／ｂＦＧＦ及び血管新生阻害因子エンドスタチン／ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎの測定）
市販キットの各酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ  ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ＡＣＣＵＣＹＴＥ  Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ，ＡＣＣＵＣＹＴＥ  Ｈｕｍａｎ  ｂＦＧＦ，ＡＣＣＵＣＹＴＥ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ：ＣＹＴＩＭＭＵＮＥ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）で血清中濃度を測定した。
（Ｔｈ２の測定）
Ｔｈ２とは、細胞表面抗原ＣＤ４を有するヘルパーＴ細胞（１００％）の中で、ＩＮＦγ陰性かつＩＬ−４陽性細胞の割合値を示すものである。
癌患者血液をブレフェルジンＡ（Ｂｒｅｆｅｒｄｉｎ  Ａ：ＢＦＡ）存在下でホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３  Ａｃｅｔａｔｅ：ＰＭＡ）及びイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）を加え、３７℃で４時間刺激した。ＰＭＡ，イオノマイシンで血液中の細胞を刺激してサイトカインを産出させ、ＢＦＡで細胞内タンパク質の細胞外への輸送を阻害した。このようにして調製された活性化検体にＣＤ４−ＰＣ５（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加えて細胞表面のＣＤ４を染色した。次に、ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で溶血及び固定処理をした後、更にＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞膜透過処理を行なった。その後、ＩＦＮ−γ  ＦＩＴＣ／ＩＬ−４  ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞内サイトカインを染色し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で測定し、解析を行った。
｛Ｔｈ１／Ｔｈ２（細胞）比の測定｝
Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞比は、フローサイトメトリーによるヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞系統Ｔｈｒｅｅ  ｃｏｌｏｒ解析検査によって常法により検定した。Ｔｈ１／Ｔｈ２とは、細胞表面抗原ＣＤ４を有するヘルパーＴ細胞のなかでＩＦＮγを産生する細胞（Ｔｈ１）とＩＬ−４を産生する細胞（Ｔｈ２）の比率を表すもので、ＣＤ４×ＩＦＮγ／ＩＬ−４と記す。
まず癌患者血液を、ホルボール１２−ミリステート−１３−アセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３  Ａｃｅｔａｔｅ）とイオノマイシン（Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）により３７℃で４時間処理し、血液中の細胞を刺激してサイトカインを産生させた。次いでブレフェルジンＡ（Ｂｒｅｆｅｒｄｉｎ  Ａ）を加えて産生反応を停止させ、抗ＣＤ４抗体であるＣＤ４−ＰＣ５（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて細胞表面マーカーであるＣＤ４を染色し、細胞を固定後、ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（日本ベクトンディッキンソン社）を用いて溶血処理した。その後ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（日本ベクトンディッキンソン社）により細胞膜透過処理を行い、更に抗ＩＦＮγ抗体／抗ＩＬ−４抗体（ＦＡＳＴＩＭＭＵＮＥ  ＩＦＮγ  ＦＩＴＣ／ＩＬ−４  ＰＥ，日本ベクトンディッキンソン社）で細胞内のサイトカインを染色して、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で測定および解析を行った。
（ＴＮＦαの測定方法）
１．単核球の分離調製と培養
ヘパリン加末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で２倍に希釈して混和した後、Ｃｏｎｒａｙ−ｆｉｃｏｌｌ液（比重１．０７７）上に重層し、１８００ｒｐｍで２０分間遠沈後、単核球画分を採取した。洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、リンパ球数を１×１０６個／ｍｌとなるように調製した。得られた細胞浮遊液２００μｌにフィトヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：３０μｇ／ｍｌ）（ＤＩＦＣＯ社製）を２０μｌ加え、９６穴マイクロプレートにて５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。培養後は、測定まで凍結保存した。
２．ＥＬＩＳＡによる測定
あらかじめ抗ヒトＴＮＦαが固相化されている抗体プレートに標準液又は被検検体を加えて反応させた。次に、プレートを洗浄し、ＰＯＤ標識抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体（酵素標識抗体）を加え反応させた。再度プレートを洗浄後、基質を加えて酵素反応を行い、活性を波長４９２ｎｍにおける吸光度として読み取った。
なお、臨床検査に用いた各マーカーは何れも市販品を用い、各推奨の方法により測定値を示した。表示される略字は各一般的な表示方法によった。
患者の効果判定は、次のＣＲ（完全寛解）、ＰＲ（部分寛解）、ＬＮＣ（長期不変）、ＳＮＣ（短期不変）、ＰＤ（病状進行）の５段階判定を行った。また、各癌種での奏効率とは、各癌種の全症例中のＣＲ、ＰＲ、ＬＮＣ、ＳＮＣ、ＰＤの割合を示す（例、症例数７の結腸癌における、ＰＲ７１．４％とは７症例中の内５症例がＰＲを表す）。
【実施例】  以下に、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
新免疫療法（ＮＩＴＣ）として進行末期癌症例に対し治療を行ってきた。２００２年４月末現在３４９０例中３５．３％のＣＲ、ＰＲの奏効例を得ている。このＮＩＴＣはβ−１，３グルカンの投与で内因性ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２を誘導してＣＴＬ（キラーＴ細胞）を活性化し、かつα−１，３グルカンの投与でＮＫおよびＮＫＴ細胞の活性化をはかると共にベターシャークの経口投与で血管新生阻害をはかるＢＲＭ療法である。患者には、ＩＬ−１２産生誘発剤、さめ軟骨（セイシン企業）、及びα１，３構造をもつ糖類等を、各推奨処方により投与された。また、ＩＬ−１２産生誘導剤として、ＩＬＸ（東西医薬）、ＩＬＹ（セイシン企業）、クレスチン（三共）、イミュトール（ＮＢＧ）等を患者の症状により、単独又は併用して投与がなされ、略同一の結果を得た。
【実施例１】症例１
今回、末期肺腺癌（両肺粟粒性肺転移）で頚椎、胸椎および股関節の骨転移かつ脳転移も認められた症例（ＮＩＴＣＰＤ例）にイレッサ２５０ｍｇ／日の経口投与を追加したところ１ヶ月半で癌性胸水と原発性肺癌が完全に消失かつ右股関節・頚椎・胸椎の骨転移も治癒し、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ−１２も基準値を超えて活性化され、各種腫瘍マーカーも正常化しＣＲと判定された。（図−１）（表−１）
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症例２
前立腺癌で多発骨転移の症例でホルモン抵抗性、抗癌剤抵抗性、免疫療法抵抗性の末期癌症例にＺＡ１８３９（イレッサ）２５０ｍｇ／日をＮＩＴＣに併用追加投与したが１ヶ月で多発骨転移も完全寛解しＰＳＡの値も１７０ｍｇ／ｍｌから４．０ｎｇ／ｍｌと正常化した。（ＣＲ判定）（表−２）
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症例３
右肺腺癌で両肺に粟粒性肺転移と多発肋骨転移が認められ、呼吸困難と激しい背部痛が出現していた症例に２００２年８月３日よりイレッサ１錠２５０ｍｇ／日をＮＩＴＣに併用連日投与した。
８月３１日の投与後約１ヶ月で右肺原発巣は半減し粟粒性肺転移もほとんど消失し、多発肋骨転移も消失した。ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びＩＬ−１２産生誘導も増加し、腫瘍マーカーのＣＥＡが治療前２５６ｎｇ／ｍｌから１７２ｎｇ／ｍｌと、またＳＬＸ−１が４８０Ｕ／ｍｌから１４０Ｕ／ｍｌと半減以下となった。（ＰＲ判定）（図−２）（表−３）
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ＮＩＴＣと抗癌剤、放射線との併用は、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２の産生誘導を阻害するが、ＮＩＴＣとイレッサの併用はＩＦＮγ、ＩＬ−１２の産生を抑制せずかえって増加させる傾向が認められた。Ｔｈ１サイトカインの産生は骨転移を改善するために重要であり、破骨細胞分化増殖に対しＴＲＡＦ６を阻害することで阻害作用が認められている。またイレッサはＴＲＡＦ６の下流のｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡのシグナル伝達を阻害することで破骨細胞の分化増殖を阻害することが可能である。（図−３）
イレッサは、ｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡの発現を抑制してＥＧＦＲのチロシンキナーゼシグナル伝達系を抑制すると共に破骨細胞の分化を阻害する。また、新免疫療法（ＮＩＴＣ）によりＩＦＮγやＩＬ−１２等のＴｈ１サイトカインを増量することで破骨細胞の分化をｃ−ｆｏｓより上流で阻害し、イレッサとＮＩＴＣとは相加あるいは相乗的に骨転移を改善することが可能となる。骨転移に関してはＮＩＴＣによりＴｈ１サイトカインの産生増強により破骨細胞の分化におけるＴＲＡＦ６の産生を抑制し、さらにイレッサによるＴＲＡＦ６の下流にあるｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡの発現を抑制して２重システムで骨転移を阻害する。従って、骨転移に対してもＮＩＴＣとイレッサは相加あるいは相乗的に作用し症例１、症例２および症例３の骨転移を改善したものと考えられる。
イレッサは癌細胞に直接的あるいは間接的に抗腫瘍性を作用するのに対し、ＮＩＴＣはβ−１，３グルカン投与でＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）を産生増強し、ＣＴＬのみならずＮＫやＮＫＴ細胞も活性化する。一方、α−１，３グルカン投与でＮＫとＮＫＴ細胞を活性し、ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を活性化する。また、ＮＩＴＣはＡＤＣＣ活性化も促進することが分っている。すなわち、イレッサの分子標的治療と免疫療法とは相互に補いながら癌の治療効果を亢める作用が認められた。
イレッサによる治療では、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害により癌細胞の縮小（ＰＲ）（約２０％）と増殖の停止（ＮＣ）（約５０％）の成績である。ＮＩＴＣを併用することでβ−１，３グルカンでＴｈ１サイトカイン→ＣＴＬ活性を促し、α−１，３グルカンでＮＫおよびＮＫＴ細胞を活性化することによりそれぞれのｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を増殖、活性化することが可能である。これらの活性化ＣＴＬ、ＮＫおよびＮＫＴ細胞がイレッサで発育、増殖の減速あるいは停止状態におちいった腫瘍細胞を攻撃しやすくなることによるものと考えられる。従って人類がこれまで治療不能と考えられた粟粒性肺転移や骨転移など難治性悪性腫瘍も治療可能となる。
【実施例２】症例４  ７３歳  男性
２０００年８月１０日に小腸平滑筋肉腫で小腸切除し、２００１年１２月２７日に肝転移で肝動脈塞栓術を施行し経度に縮小をみた。その後、２００２年７月肝転移が増大し、腹膜転移も出現した。そのため、２００２年７月２２日より、ＮＩＴＣ治療を開始した。２００２年８月２０日より、グリベック４００ｍｇ／日の投与も開始した。８月２０日時点での、Ｔｈ１サイトカインの活性化は起こっており、各ＴＮＦα（２５７０ｐｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（１７．５ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（４９．８ｐｇ／ｍｌ）であった。ＮＫ活性も強い値〔ＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）：３０．６％〕を示した。しかし、ＮＫＴ細胞活性はみとめられなかった〔ＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）ｐｅｒｆｏｒｉｎ（＋）：２９．９％〕。腫瘍マーカーはＧＡＴは２２．９ｕ／ｍｌ（正常値１３．６以下）、ＢＦＰ：９３ｎｇ／ｍｌ（正常値７５以下）、ＩＣＴＰ：５．２ｎｇ／ｍｌ（正常値４．５以下）と高値を示した。約１ヶ月間、ＮＩＴＣとグリベックの併用療法を続け、２００２年９月１８日に測定した各免疫マーカーの値は前回よりも増強していた。各ＴＮＦα（４３２２ｐｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（３４．８ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（９８．３ｐｇ／ｍｌ）、ＮＫ活性〔ＣＤ３（−）ＣＤ１６１（＋）：３５．４％〕、ＮＫＴ細胞活性〔ＣＤ３（＋）ＣＤ１６１（＋）ｐｅｒｆｏｒｉｎ（＋）：３２．４％〕。腫瘍マーカーはＧＡＴは１８．３ｕ／ｍｌ（正常値１３．６以下）、ＢＦＰ：７９ｎｇ／ｍｌ（正常値７５以下）、ＩＣＴＰ：４．８ｎｇ／ｍｌ（正常値４．５以下）であった。そして、驚いたことに、同時に行った超音波検査で肝転移は５０％以上縮小し、異常を示した腫瘍マーカーも全て改善していた。
症例５  ６２歳  女性  子宮筋肉腫
２０００年１月２６日に子宮筋肉腫で子宮全摘出と両側付属器官の切除を受けた。しかし、腹腔内残存腫瘍が認められた。２０００年２月から５月まで、パラプラチン、エンドキサン、テラルビシンの抗癌剤投与を受けたがＰＤと判定された。２００１年１１月１５日に左腹部腹壁に手拳大の腫瘍が出現し、２００２年１月２３日再切除を施行した。その後、２００２年２月から４月までイホマイドの抗癌剤投与したが２００２年４月に右腹壁に６ｘ５ｃｍ大の子宮筋肉腫の再々転移が認められた。２００２年８月１０日に超音波検査で右腹壁に１０３ｘ８８ｘ８１ｍｍと左腹壁に２９ｘ３０ｘ２７ｍｍの肉腫の増大が認められた。
２００２年８月１０日より、グリベック４００ｍｇ／日とＮＩＴＣの併用療法を行った。２００２年９月１７日の超音波検査で右腹壁の腫瘍５８ｘ４０ｘ３９ｍｍと左腹壁の腫瘍１５ｘ１４ｘ１３ｍｍと半減していた。また、Ｔｈ１サイトカインの産生能力の増強が確認された（ＴＮＦα（４１０６ｐｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（３３．５ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（８０．６ｐｇ／ｍｌ）。
症例４、症例５はいずれも末期肉腫である。これらの症例では、ＮＩＴＣ単独ではＰＤであったが、クリベック併用で約１ヶ月の極めて短い期間でいづれも著名な改善（ＰＲ）を得た。これまでのグリベックの投与報告例では４ヶ月から６ヶ月の投与で２０％前後の奏効例しか報告されていない。しかし、本臨床例では、極めて短期間に処方例全てでＰＲを達成した。このことは、ＮＩＴＣ療法特にＩＬ−１２の産生誘発療法とグリベックの併用療法は、上記イレッサのＮＩＴＣ療法特にＩＬ−１２の産生誘発療法との併用療法と同様に、対癌治療に対して相乗効果が発揮されたものと推定された。かくして、本発明により、チロシンキナーゼ阻害剤とＴｈ１サイトカイン産生増強剤の併用には、対抗癌効果に相乗効果のあることを確認した。なお、抗癌剤とＮＩＴＣの併用療法ではＴｈ１サイトカイン値の著名な抑制が認められたが、本発明のチロシンキナーゼ阻害剤とＮＩＴＣの併用療法ではいずれも免疫能力を上昇させ、そして抗腫瘍作用においても相乗的に作用することが確認された。
【実施例３】  ＮＩＴＣとイレッサとの併用治療における、癌の免疫治療の実施例１、２の症例１〜５症例を含む５５症例での治療結果を総括した。５５症例の癌の進行度は、初期段階から進行末期段階であり、癌種類は肺癌、大腸癌、肛門癌、腎癌、舌癌、乳癌、胃癌、前立腺癌、食道癌、膵癌、咽頭癌、耳下腺癌、膀胱癌、子宮頚癌、卵巣癌である。また、各症例のＮＩＴＣとイレッサとの併用治療期間は、約２〜４ヶ月間である。また、各症例での、患者には、実施例１と同様に、ＩＬ−１２産生誘導剤、さめ軟骨（セイシン企業）、及びα１，３構造をもつ糖類（ＮＫ、ＮＫＴ活性化剤）が、各推奨処方により投与された。また、イレッサは、各推奨処方に従い、例えば、症例１のように、２５０ｍｇ／日の量を経口投与した。
各癌種での奏効率の検討
肺（腺）癌は１５例中ＰＲ症例が１２例の８０％に奏効例が認められた。残り３例はＮＣ症例であった。肺（腺）癌症例では４例が粟粒性肺転移症例である。すなわち肺（腺）癌のなかでも粟粒性肺転移は最も予後が不良で呼吸困難を合併し、従来の治療法では全くといってよいほどに改善することは不可能であった。このような粟粒性肺転移症例はイレッサ単独では改善することはあり得ないと考えられる。また肺（腺）癌のイレッサ単独治療例はこれまで奏効例の割合は２０％前後と報告されているが、今回のＮＩＴＣとイレッサとの併用は１５例中１２例である８０％がＰＲ例という驚くべき改善率を示した（図４）。
大腸癌は直腸癌と結腸癌とに分類される。一般に直腸癌は結腸癌に比較し、予後不良と考えられている。ＮＩＴＣとイレッサとの併用治療による効果は、直腸癌は４例でいずれもＰＲと判定され奏効率１００％であった。一方、結腸癌は７例でＰＲが５例（７１．４％）、ＮＣが１例（１４．３％）、そしてＰＤが１例（１４．３％）であった。従って大腸癌としてはＰＲが９例（８１．８％）という驚くべき改善率を示した（図５）。
ＮＩＴＣとイレッサとの併用治療による効果において、肺（腺）、大腸癌以外の癌種で、ＰＲ症例が認められた悪性腫瘍は、肛門癌２例中１例の５０％、腎癌２例中２例の１００％、舌癌は１例中１例の１００％、卵巣癌が４例中２例の５０％であり、胃癌が３例中１例の３３．３％、乳癌は６例中１例の１６．７％であった。また、前立腺癌は２例中２例がＮＣであり、腫瘍マーカーのＰＳＡは低下しなかったが骨転移の疼痛は著明に改善した。食道癌は３例中２例の６６．７％がＮＣ、膵癌、喉頭癌、耳下腺癌の各１例はＮＣで進行が停止していた。膀胱癌と子宮頸癌ではいずれもＰＤ症例のみであった。
ＮＩＴＣとイレッサとの併用治療による効果において、肺（腺）癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、腎癌、舌癌、卵巣癌、胃癌、肛門癌、乳癌の有効例ではＴｈ１サイトカインのＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ−１２が高値を示す傾向が認められた。また、ＶＥＧＦも抑制している傾向が認められた。一方、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞においては有効例と無効例とで差は認められなかった。従ってイレッサ（商品名）と免疫療法の併用治療はＴｈ１サイトカインのなかでもＩＦＮγとＩＬ−１２とを上昇させ得ることがこのような著効例を見出しているものと考えられる（図６）。
現在、イレッサ（商品名）と抗癌剤との併用ではその効果が認められていないが、本発明に係るＮＩＴＣ（特にＩＬ−１２産生誘導剤）とイレッサとの併用治療では、各癌種での治療効果を確認できた。特に、肺（腺）癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、腎癌、舌癌、卵巣癌、胃癌、肛門癌、乳癌種に対してのＮＩＴＣ（特にＩＬ−１２産生誘導剤）とイレッサ（商品名）との併用治療は有効である。
以上より、ガン患者に本発明に係るＮＩＴＣ（特にＩＬ−１２産生誘導剤）とイレッサＲとの併用治療を施すことは、有効なガンの治療方法となる。
【実施例４】  免疫療法（ＮＩＴＣ）の単独症例の４６例（ＣＲ：１例、ＰＲ：１３例、ＬＮＣ：２例、ＳＮＣ：２２例、ＰＤ：８例）および免疫療法（ＮＩＴＣ）とイレッサ（２５０ｍｇ／日／経口）追加併用例の２７例（ＣＲ：２例、ＰＲ：２０例、ＮＣ：５例、ＰＤ：０例）の合計７３例において、イレッサ投与の寄与度と各免疫学的因子のそれぞれにおける寄与度（率）を検討した。結果は、ロジスティック回帰係数によって図７に示した。
肺腺癌の治療において全体で検討すると、第一はイレッサを投与するか否かが最も重要である。第二が、ＩＬ−１２の産生能力とＮＫＴ細胞でのパーフォリン産生細胞（ＮＫＴＰと記載）がほぼ同率で重要である。ついでＩＦＮγ、ＴＮＦαの産生能力の順で意義があった。
免疫療法（ＮＩＴＣ）とイレッサ投与症例の２６例における、免疫学的各ファクターの寄与率を検討した。結果は、ロジスティック回帰係数によって図８に示した。その結果、イレッサ投与前ではＮＫＴＰ細胞（ＮＫＴ細胞でＰｅｒｆｏｒｉｎ陽性細胞）が最も重要な意義を示した。イレッサ投与前における患者の免疫能力の差違で本療法での有効群と無効群での識別が可能か否かを判定することは肺腺癌患者の治療方針決定にとって重要なことと考えられた。
そこで、まずイレッサ投与前のＮＫＴＰ細胞の割合（総リンパ球中のＮＫＴＰ細胞の割合）を確認し、結果を図９に示した。ＮＫＴＰ細胞数（割合）を５．０％でカットオフ値とした場合、９２．９％が有効と判定された。しかし、ＮＫＴＰが５．０％以下でもなお５７．１％は有効例であり、判定から落ちこぼれている。この５．０％未満となった症例については、さらにＴｈ１／Ｔｈ２比で有効例を判定できることが判明した。すなわち、図８から明らかであるように、イレッサ投与前後の変化量としてＴｈ１／Ｔｈ２比が非常に高値を示しているので、この指標を用いてＮＫＴＰが５．０％未満の症例を解析した。図１０に示されたように、Ｔｈ１／Ｔｈ２比がイレッサ投与後に増加した場合に８８．９％の割合で有効例を判定できることがわかった。Ｔｈ１／Ｔｈ２比がイレッサ投与後に減少すると１００％無効例となった。
以上の結果をまとめると、ＮＫＴＰ値が５．０％以上であればイレッサとＮＩＴＣ併用で有効性が高く、ＮＫＴＰ値が５．０％未満の値でも、Ｔｈ１／Ｔｈ２比がイレッサ投与後に増加していれば有効性が期待できる可能性が高いことが示唆された。かくして本実施例の分析結果から、ＮＩＴＣとイレッサ併用投与症例において、ＮＫＴＰ値のイレッサ投与前値が５．０％以上、もしくはイレッサ投与後のＴｈ１／Ｔｈ２比が増加していれば、ＮＩＴＣとイレッサ併用投与による有効例が有意に高いと判定される（ｐ＜０．００１）（図１１）ことが判明した。
【実施例５】  実施例４の臨床例によって、免疫療法（ＮＩＴＣ）とイレッサとの併用療法のさらなる有用性を分析した。分析結果は図１２に示した如く、イレッサ投与１ヶ月以降に、腫瘍の増殖が抑制されるＢタイプとイレッサ投与の効果がないＡタイプに分かれることが判明した。さらに、症状が良くなったＢタイプでも、さらに６ヶ月以内に、再燃・再発するＣタイプと再燃しないＤタイプに分かれることが判明した。それぞれの分岐点でどちらのタイプ（Ａ又はＢタイプ、Ｃ又はＤタイプ）にいくかを予測することが出来れば有効なガン免疫治療の指標となる。また、イレッサ投与後、数週間から５ヶ月、好ましくは１ヶ月から３ヶ月に患者の免疫学的各ファクターを測定することによって、その後の免疫療法（ＮＩＴＣ）とイレッサの併用療法を継続することが有効な治療となるかを予測することが出来れば有効なガン免疫治療の指標となる。そのために、タイプの予測因子を明らかにするために宿主の免疫学的特徴（腫瘍マーカー）を検討した。
その結果、Ａタイプ又はＢタイプになるかは、イレッサ投与前のＮＫＴＰ値が５．０％以上であればＢタイプとなり、たとえＮＫＴＰ値が５．０％未満でもイレッサ投与後のＴｈ１／Ｔｈ２比が増加していればＢタイプの方向に向かうことが判明した（図８〜１１）。また、ＮＫＴＰ値が５．０％未満で、Ｔｈ１／Ｔｈ２比が減少していればＡタイプとなり、イレッサは効果を発揮しないことが判明した。
一方、Ｃタイプ又はＤタイプになるかは、図１３に示した結果によりＴｈ２値の割合が３％を超えればＤタイプに向かい、３％未満の場合には再燃・再発するＣタイプになることが判明した。ただし、Ｄタイプに向かう場合にはイレッサ投与後のＩＬ−１２、ＩＮＦγの値がイレッサ投与後でも低下していないことが重要であると判明した（図１４）。
以上の分析結果をもとに、イレッサとＮＩＴＣとの抗腫瘍作用の相違を図１５のシェーマに示した。
癌細胞の増殖が著明な場合は抗原も提示されていない。癌細胞は増殖が激しい細胞ほどＥＧＦＲが多いはずである。このＥＧＦＲのシグナル伝達系のチロシンキナーゼ阻害作用でイレッサが細胞内でシグナルをブロックする。このことによって癌細胞の核がアポトーシスにおちいり、核の障害が起こり癌細胞の表面にＦＡＳ抗原や癌抗原のＣｌａｓｓＩまたはＣｌａｓｓＩＩ抗原が表出する。その結果ＣＴＬ細胞（キラーＴ細胞）やＮＫ細胞が抗原認識し免疫細胞が癌細胞をターゲットとして攻撃しアポトーシス小体となった癌細胞を貧食することになる。
従って図１５に示した如くイレッサとＮＩＴＣの併用療法では、まずイレッサが癌細胞での増殖を促すＥＧＦＲのシグナル伝達をブロックする。その後、免疫細胞が活性化して癌を攻撃するという時間差があると考えられる。
イレッサが作用するか否かはＮＫＴパーフォリン活性とＴｈ１サイトカインが重要である。また、腫瘍が一時縮小し、その効果が続くか否かはＩＦＮγとＩＬ−１２の産生が投与後も持続することが重要である。またその際にＴｈ２系の免疫系が必要となるものと推定される。
【産業上の利用可能性】  以上の実施例によれば、チロシンキナーゼ阻害剤とＩＬ−１２産生誘導剤（Ｔｈ１サイトカイン産生増強）の併用はガンの治療において相乗効果あることが見出され、ガン治療における画期的な成果を達成した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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