(57)【要約】インスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニングに有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された細胞を開示する。前記ポリペプチドは骨格筋に発現する蛋白質であり、同蛋白質を過剰に発現させると細胞への糖取り込みが阻害される。前記ポリペプチドを用いたインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＣＡＰと結合するポリペプチド、あるいは配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかもＣＡＰと結合するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＣＡＰに結合する蛋白質であるポリペプチド
【請求項３】
配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求の範囲４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求の範囲５に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＣＡＰとの結合の変化を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＣＡＰとの結合阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項８】
結合阻害剤がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である請求の範囲７に記載のスクリーニングする方法。
【請求項９】
請求の範囲１乃至請求の範囲３に記載のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び
該ポリペプチドの発現量の変化を測定する工程を含むことを特徴とするインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求の範囲７乃至請求の範囲９に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングによって得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ｃ−ＣｂＩ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＡＰ）に結合する新規なポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び該ベクターを含有する形質転換細胞に関する。
【背景技術】  インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産・分泌に障害をもつ１型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくい２型の２つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、１型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、２型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の取り込み・消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。２型糖尿病は遺伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの２型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の９５％を占めている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性の改善により糖代謝を促進する２型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が高まっている。
現在１型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方２型患者に処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤（ＳＵ剤）や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内へのブドウ糖の取り込みと細胞内におけるブドウ糖利用の促進である。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲγ）のアゴニストとして作用することが示されている（非特許文献１）。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献２−３）。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用なので、インスリン抵抗性改善のために、ＰＰＡＲγにかわるより有用な創薬標的分子が求められている。
インスリン作用のシグナルは細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へ伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の２経路が存在する。（非特許文献４）。第一経路においては、活性化されたインスリン受容体からＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２、ＰＩ３キナーゼ、ＰＤＫ１を介してＡｋｔ１（ＰＫＢα）あるいはＡｋｔ２（ＰＫＢβ）、またはＰＫＣλあるいはＰＫＣζへ順次シグナルが伝達され、結果として細胞内に存在するグルコーストランスポーターＧＬＵＴ４を細胞膜上へ移行させることにより、細胞外からの糖の取り込みを促進する。（非特許文献５）。一方、第二経路ではインスリン受容体からｃ−ＣｂＩ及びＣＡＰを介してＣｒＫ  ＩＩ、Ｃ３Ｇ、及びＴＣ１０へ順次シグナルが伝達され、結果ＧＬＵＴ４による糖の取り込みを促進する（非特許文献６）。しかし、これらインスリンシグナル伝達経路の詳細についてはいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
ＣＡＰはインスリンシグナル第二経路に存在するアダプタータンパク質で、インスリン感受性組織である肝臓、骨格筋、腎臓や心臓で強く発現している（非特許文献７）。またＣＡＰの発現はＰＰＡＲγのアゴニストであるチアゾリジン誘導体によって亢進することが知られている（非特許文献８）。ＣＡＰはそのＣ末端側にあるＳＨ３ドメインを介してｃ−ＣｂＩと結合する。このＣＡＰ／ｃ−ＣｂＩ複合体はインスリンシグナルに応答してＣｒｋＩＩ−Ｃ３Ｇ複合体を介してＴＣ１０を活性化し、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４の細胞膜への移行を促進する。ｃ−ＣｂＩとの結合ドメインであるＳＨ３を欠損させたＣＡＰ（ＣＡＰ  ΔＳＨ３）は、ＰＩ３キナーゼ活性には影響は与えないが、細胞の糖取り込みを阻害することが報告されている（非特許文献９）。これらの事実から、ＣＡＰはｃ−ＣｂＩとの結合に依存して細胞内への糖取り込みに働くシグナル仲介因子であり、その機能阻害はインスリンシグナル伝達の部分的な遮断によりインスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病様態を引き起こすと考えられている。
【特許文献１】国際公開第０１／７５０６７号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／０１１９９１９号明細書
【特許文献３】国際公開第００／５８４７３号パンフレット
【非特許文献１】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｉ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１２９５３−１２９５６
【非特許文献２】「ダイアビーティーズ  フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」，（米国），１９９９年，第１０巻，ｐ．８１１−８１８
【非特許文献３】「ダイアビーティーズ  フロンティア（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ）」，（米国），１９９９年，第１０巻，ｐ．８１９−８２４
【非特許文献４】「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」（米国）、２０００年、第１０６巻、第２号、ｐ．１６５−１６９
【非特許文献５】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、１９９９年、第２７４巻、第４号、ｐ．１８６５−１８６８
【非特許文献６】「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、（英国）、２００１年、第４１０巻、第６８３１号、ｐ．９４４−９４８
【非特許文献７】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（米国）、１９９８年、第１８巻、第２号、ｐ．８７２−８７９
【非特許文献８】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２０００年、第２７５巻、第１３号、ｐ．９１３１−９１３５
【非特許文献９】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２００１年、第２７６巻、第９号、ｐ．６０６５−６０６８
【非特許文献１０】「モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（米国）、２００２年、第２２巻、第１１号、ｐ．３５９９−３６０９
【発明の開示】
本発明者らは、上述の知見からＣＡＰの働きを増強させることができれば、インスリン抵抗性を改善できると考えた。そしてこの目的は、アダプター蛋白質であるＣＡＰに結合してその作用を制御している細胞内因子を同定し、その作用を調節することにより達成できると考えた。そこで本発明者らはＣＡＰに結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。その結果、インスリン応答組織である骨格筋に発現している蛋白質ＣＡＰＢＰ１（ＣＡＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）をコードする新規な塩基配列のヒト由来ｃＤＮＡのクローニングに成功した。さらに同蛋白質のマウスオルソログは糖尿病モデルマウスの筋肉組織において正常個体より発現量が顕著に増加していること、脂肪細胞において同蛋白質を過剰に発現させると細胞への糖取り込みが阻害されること、及び同蛋白質がグリコーゲン合成酵素を不活性化するリン酸化酵素ＧＳＫ３蛋白質と相互作用することから同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出した。これらの結果、本発明者らはインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
［１］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、ＣＡＰと結合するポリペプチド、あるいは配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかもＣＡＰと結合するポリペプチド、
［２］配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＣＡＰに結合する蛋白質であるポリペプチド、
［３］［２］又は［４］で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
［４］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
［６］［５］に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、
［７］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとＣＡＰとの結合の変化を測定する工程、及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程、
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとＣＡＰとの結合阻害剤をスクリーニングする方法、
［８］結合阻害剤がインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬である［７］に記載のスクリーニングする方法、
［９］［１］乃至［３］に記載のポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、及び該ポリペプチドの発現量の変化を測定する工程を含むことを特徴とするインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、
［１０］［７］乃至［９］に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングによって得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
本発明のポリヌクレオチドと相同性を有する塩基配列が特許文献１〜特許文献３に開示されている。特許文献１及び特許文献３には本発明のポリヌクレオチドと相同性を有する配列を含む１１３７塩基又は１５１５塩基の配列と同時に多数の塩基配列が開示され、それら全体に対して診断やスクリーニングに使用できると記載されているが、個々に対する具体的な用途については記載されていない。特許文献２には多数の塩基配列が開示され、その中に本発明のポリヌクレオチドと相同性を有する配列を含む３２２０４塩基の配列が開示され、多数の疾患、特には消化器疾患に関与することが記載されているがその実験的裏づけはない。配列データベースＧｅｎＢａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔのアクセッション番号ＡＦ５１４９９２に本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドと相同性を有する配列が収載されているが、その具体的用途については記載されていない。更に特許文献３には本発明のポリペプチドと相同性を有する配列が開示されているが、上記ポリヌクレオチドと同様に多数の配列に対して診断やスクリーニングに使用できると記載されているが、個々の具体的な用途については全く記載されていない。なお、本願優先日後に公開されたＷＯ０３／０２３００２号パンフレットには本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性を有する配列を含む多数の配列が開示され、それらが関与する疾患として糖尿病を含む多数の疾患名が列挙されている。しかしながらこれらの配列を現実に取得したとの具体的記載はなく実験的な用途の裏づけは全くない。従って、本発明者らが本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の増加が糖尿病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとＣＡＰとの結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らが初めて見出した方法である。
【図面の簡単な説明】図１は、糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ及びｄｂ／ｄｂと正常マウスにおける筋肉組織でのＣＡＰＢＰ１発現量の比較を示す図である。縦軸はマウス筋肉における相対発現量を示している。バーＡはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、バーＢはＫＫＡｙ／Ｔａマウス、バーＣはＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｍ＋／ｍ＋マウス、バーＤはＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｄｂ／ｄｂマウスをサンプルとした結果を示す。
図２は、ＣＡＰＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞における糖取り込み能の阻害を示す図である。図の縦軸は２−デオキシ−グルコースの取り込み量（ｃｐｍ）を、横軸はインスリン濃度を示している。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
ＣＡＰに結合する性質を有し、糖尿病態において発現量が増加する本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、糖尿病の診断に有用である。また、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は糖尿病治療剤のスクリーニングに有用である。本発明のポリヌクレオチドを検出できるＰＣＲ用プライマーを利用することにより、糖尿病の診断が可能である。
＜本発明のポリペプチド＞
本発明のポリペプチドには、
（１）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列を含み、しかもＣＡＰに結合するポリペプチド、あるいは、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列において、１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、しかもＣＡＰに結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）；及び
（３）配列番号２または４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＣＡＰに結合する蛋白質であるポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）；
が含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、ＣＡＰに結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号２または４で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
なお、本明細書における前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３，２３７−２４４，１９９８；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，４６７３−４６８０，１９９４）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓとして
Ｋ  ｔｕｐｌｅ  １
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ  ３
Ｗｉｎｄｏｗ  ５
Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  Ｓａｖｅｄ  ５
また、本発明のポリペプチドは、他の脊椎動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタ、ニワトリなど）由来のものも包含する。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、その機能的等価改変体、または、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。また、いずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号２または４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号１または３に記載の塩基配列である。なお、本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする限り、あらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変、作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記本発明のポリペプチドをコードする全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６８）１５０，１７８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うＤＮＡを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりＤＮＡ分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造及び取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形貿転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト骨格筋を挙げることができる。ヒト骨格筋からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマーまたはオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｂ）第２製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ｃ）第３製造法、ｄ）第４製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロッティング解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの方法を挙げることが出来る。ＲＴ−ＰＣＲによって本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する場合に用いられるプライマーは、該ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できるものである限り特に制限は無く、本発明のポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することが出来る。本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを検出するための特異プライマー及び特異プローブとして利用できる。
＜本発明の発現ベクター及び細胞＞
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年］等に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることに利用できる。
具体的には特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドの下流に上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーＲＮＡレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のＣＡＰが豊富に存在する脂肪由来細胞、あるいは筋由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例２に記載のように所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリポフェクトアミン試薬を用いてＣＯＳ−１細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。例えば上記ＣＯＳ−１細胞であれば牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えたものを使用できる。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出し、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。あるいは所望により、該蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号２または４に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を１個ずづ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
＜本発明のスクリーニング方法＞
本発明のポリペプチドを使用し、本発明のポリペプチドとＣＡＰとの相互作用を利用して、ＣＡＰとｃ−ＣｂＩの結合の変化を指標とすることからなる糖代謝改善作用を有する物質のスクリーニング方法を構築できる。
本発明のポリペプチドの一つであるＣＡＰＢＰ１は、ＣＡＰと結合すること、糖尿病モデルマウスでマウスオルソログの発現が亢進していること、及びＣＡＰＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが阻害されることから、本発明のポリペプチドはＣＡＰとの結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニング方法の一つの実施態様としては、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞を用い、これを試験物質と共存させ、試験用細胞において試験物質によるＣＡＰとｃ−ＣｂＩとの結合の量的あるいは質的変化を指標とすることからなる糖代謝改善作用を有する物質のスクリーニング方法が挙げられる。
本発明のスクリーニング法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，４（１）：４１，１９９９）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物（ペプチドを含む）を化学的又は生物学的に修飾した化合物（ペプチドを含む）を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
１）本発明のポリペプチドとＣＡＰとの結合を利用したスクリーニング方法
本発明のポリペプチドはＣＡＰとの結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることから、本発明のポリペプチドとＣＡＰとの結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部又は全長域、あるいはＧＳＴやＦｌａｇ、ＨＩＳなどのタグを融合させた本発明のポリペプチドの一部又は全長域を発現させた試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗ＣＡＰ抗体を用いた免疫沈降によりＣＡＰ蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたＣＡＰおよびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のポリペプチドの量を測定することにより、本発明のポリペプチドとＣＡＰの結合を阻害する試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、本発明のポリペプチドあるいはその部分配列をもとに作製した本発明のポリペプチドに対する抗体（例えば抗ＣＡＰＢＰ１抗体）、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。また上述と同様に本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、ＧＳＴなどのタグをつけて精製したＣＡＰ蛋白質を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏのプルダウン法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもＣＡＰと本発明のポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。あるいはここで本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液を用いずに、本発明のポリペプチドの発現プラスミド（例えば実施例１（５）で作製したＣＡＰＢＰ１発現プラスミド）から直接本発明のポリペプチドである蛋白質（例えばＣＡＰＢＰ１蛋白質）をＴＮＴキット（プロメガ社）等を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にＣＡＰと本発明のポリペプチド（例えばＣＡＰＢＰ１）の結合を阻害する試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。またタグを融合させて発現させた本発明のポリペプチドおよびＣＡＰを同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のＥＬＩＳＡ法に従ってもＣＡＰと本発明のポリペプチドの結合を阻害する試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム（クロンテック社）を利用して、ベイトにＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域と融合させたＣＡＰを、プレイ側にＶＰ１６の転写促進領域を融合させた本発明のポリペプチドを配置することにより、既存のＣＡＴあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりＣＡＰと本発明のポリペプチドの結合を阻害する試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
２）本発明のポリペプチドの発現量測定を利用したスクリーニング方法
インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法として、上述（１）の他に本発明のポリペプチドの発現量を測定することによるスクリーニング方法が挙げられる。糖尿病モデルマウスでＣＡＰＢＰ１のマウスオルソログの発現が亢進していること（実施例４）、およびＣＡＰＢＰ１を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが減弱していること（実施例６）から、内在性のＣＡＰＢＰ１の発現量を試験物質により減少させることが可能であれば、該試験物質はインスリン抵抗性を改善する作用を持つことが予想される。このような物質は具体的には以下の方法によって選択することができる。
まず試験物質で未処理又は処理した細胞から実施例４（１）に示した方法に従ってＲＮＡを調製することができる。該細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。このＲＮＡ調製液から公知の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これを本発明のポリヌクレオチドの配列を含むラベルした短鎖ＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット解析により、試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡの発現量の増減を検出できる。これにより本発明ポリペプチドの発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。あるいは本発明のポリヌクレオチドの配列を含む短鎖ＤＮＡプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法によっても試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するＲＮＡの発現量の増減を定量的に検出できる。リアルタイムＰＣＲはより具体的には実施例４の方法に従って実施できる。これにより本発明のポリペプチドの発現量を抑制する物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。本発明のポリヌクレオチドは本スクリーニング方法に利用することができる。
＜インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法＞
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び／又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び／又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、１又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、アルコール類（例えば、エタノール）、又はポリソルベート８０等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人（体重６０ｋｇとして）において、１日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇである。非経口投与の場合、注射剤の形では、１日につき０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇである。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
（実施例１）ＣＡＰＢＰ１遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
（１）ＣＡＰのクローニング
遺伝子データベースＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｕ５８８８３に記載されたマウスＣＡＰ（ｃ−ＣｂＩ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を参照して、ｍＣＡＰ−５ＨＳ，ｍＣＡＰ−１，ｍＣＡＰ−２，ｍＣＡＰ−３ＳＥと命名した以下の４つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして設計した（配列番号５−８）。ｍＣＡＰ−５ＨＳには制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイトを、またｍＣＡＰ−３ＳＥには制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを各プライマーの５’側に付加してある。
１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア社）の骨格筋から全ＲＮＡを調製して逆転写により１本鎖ｃＤＮＡを作成し、ＣＡＰ遺伝子クローニングのためのＰＣＲの鋳型として用いた。ここで全ＲＮＡはＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて説明書に従い調製した。調製した全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ（ニッポンジーン社）を用いて処理し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解した。全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、１μｇの全ＲＮＡを逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。
配列番号５と配列番号６のプライマーの組み合せによりＣＡＰのＮ末側半分をコードする遺伝子を、また配列番号７と配列番号８のプライマーの組合せによりＣＡＰのＣ末側半分をコードする遺伝子をそれぞれＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲは上述の１本鎖ｃＤＮＡを５μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）を０．５μｌ、プライマーを各５０ｐｍｏｌ用いて、全量５０μｌの反応系で行った。温度条件は９５℃で３分おいたのち、９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、７４℃で９０秒の３ステップからなる工程を４０サイクル繰り返し、最後に７４℃で７分反応させた。
次に増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化したプラスミドｐＺＥｒ０−２．１（インビトロジェン社）にサブクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片の塩基配列はシークエンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定し、報告されている塩基配列と一致することを確認した。
ＰＣＲで増幅されたＮ末側半分をコードする遺伝子断片の３’側とＣ末側半分をコードする遺伝子断片の５’側は、ＣＡＰ遺伝子に内在性にただひとつ存在する制限酵素ＳａｃＩサイトをどちらも有している。よってＮ末側半分をコードする遺伝子断片は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩを用いて、またＣ末側半分をコードする遺伝子断片は制限酵素ＳａｃＩとＥｃｏＲＩを用いてそれぞれサブクローニングされたプラスミドから切り出すことができ、それらを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社）に同時にライゲーションすることによりマウスＣＡＰ遺伝子の全長がクローニングできた。
（２）酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
マウスＣＡＰのｃＤＮＡを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターｐＤＢｔｒｐ（インビトロジェン社）に挿入するため、マウスＣＡＰ遺伝子配列のそれぞれ５’側及び３’側にｐＤＢｔｒｐベクターのマルチクローニングサイトの前後４０ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号９及び１０に示すプライマーを設計した。ＰＣＲは上述でクローニングしたマウスＣＡＰプラスミドを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回、繰り返した。その結果得られたＤＮＡ断片はマウスＣＡＰ遺伝子の全コード領域を有している。
制眼酵素ＳａｌＩ及びＮｃｏＩで切断して直鎖上にしたベクターｐＤＢｔｒｐ及び上記で得られたマウスＣＡＰのｃＤＮＡを含むＰＣＲ断片を同時にツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３（インビトロジェン社）へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した（Ｇｕｔｈｒｉｅ  Ｃ．ａｎｄ  Ｆｉｎｋ  Ｒ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、ｐＤＢｔｒｐのマルチクローニングサイトにマウスＣＡＰ  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（以下ｐＤＢ−ＣＡＰと略称する）が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース（生化学工業）で室温にて３０分処理した後、アルカリ法でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行い、ＣＡＰのｃＤＮＡが、ｐＤＢｔｒｐのＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
（３）酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のｐＤＢ−ＣＡＰにより形質転換したツーハイブリッド用酵母株ＭａＶ２０３を４００ｍｌのＹＰＤ液体培地（ＤＩＦＣＯ社）に懸濁し、波長５９０ナノメートルの吸光度が０．１から０．４になるまで３０℃で約６時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を１．０ｍｌの０．１Ｍリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞をヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社Ｍａｔｃｈ  Ｍａｋｅｒ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ）各２０μｇで形質転換し、同細胞をｐＤＢ−ＣＡＰ及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地（ＤＩＦＣＯ社）（２０％アガロース）上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたＧＡＬ４  ＤＮＡ  結合領域の融合蛋白質に、ＧＡＬ４転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子ＨＩＳ３が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにＨＩＳ３がコードする酵素の阻害剤である３ＡＴ（３−ＡＭＩＮＯ−１，２，４−ＴＲＩＡＺＯＬＥ；シグマ社）２０ｍＭを添加した固形最小倍地（２０％アガロース）上で３０℃で５日間培養した。同条件下でＣＡＰに結合する蛋白質を発現していることを示す３ＡＴ耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を２４時間ＹＰＤ固形培地上で成長させた後、ＨＩＳ３とは別のツーハイブリッド  システムの結合指示レポーターであるｌａｃＺ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素に付けて凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを０．４％のＸ−ＧＡＬ（シグマ社）溶液を浸した濾紙上にのせて３７℃で２４時間静置し、β−ガラクトシダーゼ青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、ＣＡＰに結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号１１で表される塩基配列（ＧＡＬ４  ＡＤ領域に結合する配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２９８９９  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐＡＣＴ２由来）をプライマーとし、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した結果、配列番号１に示す塩基配列を含む１クローンと配列番号１の第６４番目から９塩基挿入のある配列番号３に示す塩基配列を含む２クローンが含まれていることを確認した。
（４）ＣＡＰＢＰ１遺伝子の全長ｃＤＮＡのクローニング
前述（３）の結果、配列番号１又は３で表される塩基配列の全長を含む遺伝子断片を持ったプラスミド各１と配列番号１で表される塩基配列の第１６番目の塩基以降の配列を含むプラスミドがそれぞれｃＤＮＡライブラリから得られ、ＣＡＰに結合する因子の存在が示された。そこで配列番号１で示された塩基配列の第５２５番目から第５０４番目の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号１２で表される塩基配列のプライマーを合成（プロリゴ社）し、該プライマーと配列番号１１で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の骨格筋由来ｃＤＮＡライブラリー中からＰＣＲ法により全長ｃＤＮＡの増幅を試みた。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ；宝酒造社）を用い、９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）・５８℃（１．５分）・７２℃（４分）のサイクルを３５回繰り返し、そのＰＣＲ産物を鋳型にしてさらに同じ条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約６００塩基対のＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同ＤＮＡ断片を発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇシステム（インビトロジェン社）を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を、ベクター上のＴ７プロモーター領域に結合するプライマー（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ／インビトロジェン社；配列番号１３）とシーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。その結果、配列番号１または３に示すＤＮＡ配列を含むクローンであることを確認し、配列番号１または３よりさらに５’側上流に約２５０塩基対のＤＮＡ断片の付随が認められたが、配列番号２または４に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡのトリプレットに従うと配列番号１及び３の初めにあるＡＴＧ（開始コドン）より上流には別の開始コドンは認められず、ストップコドンのトリプレットが存在した。これにより配列番号１及び３に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をＣＡＰＢＰ１遺伝子と名付けた。
（５）ＣＡＰＢＰ１発現ベクターの作製
前述（４）で得られたＣＡＰＢＰ１遺伝子の全長配列を含むプラスミドから、配列番号１及び３に示す塩基配列情報に従い、正味ＣＡＰＢＰ１蛋白質をコードするＣＡＰＢＰ１  ｃＤＮＡを、配列番号１４、及び配列番号１２を用いてＰＣＲ法により増幅した。これら２種類のＤＮＡプライマーはそれぞれ配列番号１または３に示すＣＡＰＢＰ１遺伝子の５’側、３’側の一部と相同な塩基配列を有する。配列番号１２に示すプライマーはクローニング後３’にベクター由来のＶ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ（１９９１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１５５１−１５５７，１９９１）及びＨｉｓ６タグ（Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｐ（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２，１４０−１４９）がＣＡＰＢＰ１遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように、ＣＡＰＢＰ１のストップコドン配列が除かれるよう設計した。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ  ｐｙｒｏｂｅｓｔ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）・５８℃（３０秒）・７２℃（２分）のサイクルを４０回繰り返した。その結果得られた５２５塩基対および５３４塩基対のＣＡＰＢＰ１  ｃＤＮＡをそれぞれ含むＤＮＡ断片を、前述の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニングした。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を上述（４）と同様にして決定した結果、配列番号１および３に示すＤＮＡ配列の３’側のストップコドンを除いたＤＮＡがそれぞれ挿入されていることを確認した。以下これらの発現プラスミドのうち配列番号１の配列を含むものをｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）、配列番号３の配列を含むものをｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（＋３）と略記する。
（実施例２）ＣＡＰＢＰ１蛋白質を発現する培養細胞の作成
（１）ＣＡＰＢＰ１発現細胞の作製
上述の実施例１（５）で作成した発現プラスミドｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）およびｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（＋３）をそれぞれＣＯＳ−１細胞に導入した。ＣＯＳ−１細胞は６ウェル培養プレート（ウェル直径３５ｍｍ）の培養皿に各ウェル２ｍｌの１０％牛胎児血清（シグマ社）を含む最少必須培地ＤＭＥＭ（ギブコ社）を加えて７０％コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６，１９７３、新井直子、遺伝子導入と発現／解析法１３−１５頁１９９４年）により、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）あるいはｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（＋３）（１．０μｇ／ウェル）を一過性にトランスフェクトした。４８時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略称する）で洗浄した後にウェルあたり０．１ｍｌの細胞溶解液（１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％トリトンＸ−１００）を添加して細胞を溶解した。
（２）ＣＡＰＢＰ１蛋白質の検出
上述＜実施例２＞（１）のＣＡＰＢＰ１発現細胞の溶解液１０μｌに１０μｌの２倍濃度ＳＤＳサンプルバッファー（１２５ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％ラウリル硫酸ナトリウム、２０％グリセリン、０．１４Ｍ  β−メルカプトエタノール、０．０２％ブロムフェノールブルー）を添加し、１００℃で２分間処理した後、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のＣＡＰＢＰ１蛋白質の検出を行った。一次抗体にはＣＡＰＢＰ１のＣ末端に融合させたＶ５エピトープを認識するモノクローナル抗体（インビトロジェン社）を用い、二次抗体にはラビットＩｇＧ−ＨＲＰ融合抗体（バイオラッド社）を用いた。４５アミノ酸からなるＣ末端側のタグを含む２２０あるいは２２３アミノ酸からなるＣＡＰＢＰ１−Ｖ３−Ｈｉｓ６融合蛋白質を示す約２４ｋＤａの蛋白質が発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）あるいはｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（＋３）の存在に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のＣＡＰＢＰ１遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとることが明らかになった。
（実施例３）ＣＡＰＢＰ１遺伝子の組織別発現分布解析
ＣＡＰＢＰ１蛋白質はＣＡＰと相互作用することから、該蛋白質はインスリンに応答する組織で発現し、インスリンシグナル第二経路に作用することが予想された。そこで上述の配列番号１２、及び配列番号１４に示すＣＡＰＢＰ１に相同な一対のプライマーを用いて、配列番号１あるいは３に示すＣＡＰＢＰ１遺伝子の全長ｃＤＮＡ断片を、各種組織由来ｃＤＮＡからＰＣＲ反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるＣＡＰＢＰ１の発現の有無を調べた。ヒト骨髄、脳、軟骨、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ球、乳腺、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、骨格筋、ＨｅＬａ細胞由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）各１μｇをテンプレートとしてＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（ｒ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；アプライドバイオシステム社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５８℃（３０秒）、７２℃（１．５分）のＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、ＨｅＬａ細胞、脳、リンパ球、乳腺由来の各ｃＤＮＡライブラリーからは所望するＣＡＰＢＰ１の部分断片を含むと思われる約５００塩基対のＤＮＡ断片が増幅された。これらのＤＮＡ断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の＜実施例１＞（４）に記した方法に従い配列番号１４に示すプライマーを用いて該ＤＮＡ断片の塩基配列をそれぞれ決定した結果、配列番号１あるいは３に示したＣＡＰＢＰ１と同一の配列を有することが確認された。このことから、配列番号１及び配列番号３で示される本発明ＣＡＰＢＰ１遺伝子の発現は、インスリンシグナルに応答する骨格筋を含む限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
（実施例４）正常及び糖尿病モデルマウスにおけるＣＡＰＢＰ１発現量の測定
上述の知見により本発明のＣＡＰＢＰ１蛋白質はＣＡＰと結合し、骨格筋などのインスリン応答組織で発現していることが判明した。ＣＡＰ蛋白質はインスリンシグナル第二経路に作用する因子であることから、本発明ＣＡＰＢＰ１の作動の様態がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで２種類の糖尿病モデルマウスＫＫＡｙ／Ｔａ（Ｉｗａｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐｏｎ．：１７，２３−３５，１９７０、Ｔａｋｅｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，７，２４２−２４６，１９７５）、およびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８４，４９１−４９５，１９９６、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，６３２−６３５，１９９６、Ｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，３２，６３６−６４３，１９８９）の骨格筋におけるＣＡＰＢＰ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現量を測定し、比較した。
遺伝子発現量は、本発明ＣＡＰＢＰ１遺伝子のマウスオルソログの発現量を測定し、同時に測定したグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇ３ＰＤＨ））遺伝子の発現量により補正した。測定系としてはＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍとＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いた。本測定系においてはＰＣＲで増幅された２本鎖ＤＮＡがとりこむＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ色素の蛍光量をリアルタイムに検出・定量することにより、目的とする遺伝子の発現量が決定される。
具体的には、以下の手順により測定した。
（１）全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡはＲＮＡ抽出用試薬（Ｉｓｏｇｅｎ；ニッポンジーン社）を用いて説明書に従い、１５週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＫＫＡｙ／Ｔａマウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｍ＋／ｍ＋マウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｄｂ／ｄｂマウス（いずれも日本クレア社）の骨格筋から調製した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスとＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｍ＋／ｍ＋マウスは健常マウス、ＫＫＡｙ／ＴａマウスとＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂｍ  ｄｂ／ｄｂマウスは２型糖尿病モデルマウスとして知られている。調製した全ＲＮＡはその後デオキシリボヌクレアーゼ（ニッポンジーン社）を用いて処理し、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−２０℃で保存した。
（２）１本鎖ｃＤＮＡの合成
全ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写は、０．２５μｇのＲＮＡを用い、逆転写反応用キット（ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ；クロンテック社）を用いて２０μｌの系で行った。逆転写後、滅菌水１８０μｌを加えて−２０℃で保存した。
（３）ＰＣＲプライマーの作製
ＣＡＰ１４０３，ＣＡＰ１４０４，Ｇ３ＰＤＨ  Ｆ，Ｇ３ＰＤＨ  Ｒと命名した以下の４つのオリゴヌクレオチド（配列番号１５−１８）を（４）の項で述べるＰＣＲのプライマーとして設計した。ＣＡＰＢＰ１遺伝子に対しては配列番号１５と配列番号１６の組合せ、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に対しては配列番号１７と配列番号１８の組み合わせで使用した。
（４）遺伝子発現量の測定
ＰＲＩＳＭＴＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍによるＰＣＲ増幅のリアルタイム測定は２５μｌの系で説明書に従って行った。各系において１本鎖ｃＤＮＡは５μｌ、２ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ試薬を１２．５μｌ、各プライマーは７．５ｐｍｏｌ使用した。なお検量線作成には、１本鎖ｃＤＮＡに代えて０．１μｇ／μｌのマウスゲノムＤＮＡ（クロンテック社）を適当に希釈したものを５μｌ用いた。ＰＣＲは、５０℃で１０分に続いて９５℃で１０分の後、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒の２ステップからなる工程を４５サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスＣＡＰＢＰ１遺伝子の発現量は、下記式に基づいてＧ３ＰＤＨ遺伝子の発現量で補正した。
［ＣＡＰＢＰ１補正発現量］＝［ＣＡＰＢＰ１遺伝子の発現量（生データ）］／［Ｇ３ＰＤＨ遺伝子の発現量（生データ）］
上述の結果、図１に示す通り、本発明ＣＡＰＢＰ１のマウスオルソログ遺伝子の発現は糖尿病モデルマウスの骨格筋において顕著に増加していることが判明した。従って本発明のＣＡＰＢＰ１は筋肉における機能亢進によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のＣＡＰＢＰ１の関与が大きいと結論づけられる。
また本実施例の結果より、ＣＡＰＢＰ１発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
（実施例５）ＣＡＰＢＰ１とＣＡＰの相互作用の検証
（１）ＣＡＰ遺伝子のリクローニング
上述実施例１でクローニングしたマウスＣＡＰの全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を鋳型として、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を付加するように設計した配列番号１９及び配列番号２０で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社）を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを４０回、さらに７４℃７分間の条件で、ＰＣＲを行なった。これにより生成した約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にクローニングした。得られたプラスミドを、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＰ−ＦＬＡＧと名付けた。ベクター上にクローニングしたＣＡＰ  ｃＤＮＡの配列は前述の配列番号１３に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
（２）ＧＳＴ融合ＣＡＰＢＰ１発現プラスミドの作製
ヒトＣＡＰＢＰ１のｃＤＮＡをＧＳＴ融合発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス社）に挿入するため、上記で得られたｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで酵素処理してＣＡＰＢＰ１のｃＤＮＡ断片を調製した。更に、両端にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ断片を形成するリンカーオリゴ（配列番号２１および２２）を用いて、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に組み換え、ｐＧＥＸ−ＣＡＰＢＰ１を得た。
（３）ＧＳＴ融合ＣＡＰＢＰ１タンパク質の精製
上述の（２）で得られたプラスミドｐＧＥＸ−ＣＡＰＢＰ１を大腸菌ＢＬ２１を用いて、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ法による形質転換を行い、２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（シグマ社）を添加し、更に３時間振盪培養してＧＳＴ融合ＣＡＰＢＰ１蛋白質（以下ＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１と略記する）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知の方法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）に従ってＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１をグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ；アマシャム・ファルマシア社）上に精製した。コントロールとしてｐＧＥＸ−６Ｐ−１で形質転換した大腸菌ＢＬ２１からＧＳＴ部分のみの蛋白質（以下ＧＳＴ蛋白質と略記する）を上述と同様に発現誘導して精製した。精製したこれらの蛋白質は、公知の方法に従ってＳＤＳゲル電気泳動法による分離と、クーマジーブリリアントブルー染色により期待される分子量の蛋白質（ＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１；５０ｋＤａ、ＧＳＴ蛋白質；２６ｋＤａ）が精製されていることを確認した。
（４）ＣＡＰ蛋白質とＣＡＰＢＰ１蛋白質との生化学的結合の確認
上述（３）で作製したＧＳＴ融合ＣＡＰＢＰ１蛋白質（ＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１）を用いて、ＣＡＰＢＰ１蛋白質とＣＡＰ蛋白質の直接の相互作用の有無をＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）によって確認した。
まず、（１）で作製したｐｃＤＮＡ−ＣＡＰ−ＦＬＡＧ  １５μｇをｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、１０ｃｍ−ｄｉｓｈに培養した２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。陰性コントロールとしてプラスミドなしで、同様の操作を行った。遺伝子導入４８時間後に、細胞を細胞溶解液（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０）１ｍＬに溶解した。この細胞溶解液各３００μｌと上述（３）でグルタチオンビーズ上に精製したＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１各３０μｇを混合し、４℃で１時間振盪した。その後遠心分離によりビーズ上のＧＳＴ蛋白質あるいはＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１に結合する蛋白質を共沈殿させた。これを上述の細胞溶解液ののＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに置換した緩衝液０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返したのち、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳゲル電気泳動法により分離し、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社）を用いたウエスタンブロット法により解析した。その結果、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＰ−ＦＬＡＧ導入細胞溶解液とＧＳＴ−ＣＡＰＢＰ１とを混合した場合にのみ、ＣＡＰ−ＦＬＡＧと思われるサイズのバンドが抗ＦＬＡＧ抗体により検出された。このことはＣＡＰＢＰ１にＣＡＰが結合し共沈殿されたことを示している。以上のように、本発明のＣＡＰＢＰ１は、ＣＡＰ蛋白質と相互作用することが明らかになった。従って本発明のＣＡＰＢＰ１は、ＣＡＰ蛋白質との相互作用を介してインスリン抵抗性の惹起に関与すると考えられる。
（実施例６）ＣＡＰＢＰ１高発現細胞における糖取り込み能の測定
（１）アデノウイルスベクターを利用したＣＡＰＢＰ１高発現ウイルスの作製
ヒトＣＡＰＢＰ１をコードする遺伝子断片を、ｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）ベクターより制限酵素ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩを用いて切り出し、さらに、ＦＬＡＧ配列をふくみ両端にＰｓｔＩ，ＮｏｔＩ切断片を形成するリンカーオリゴ（配列番号２３および配列番号２４）を用いて、アデノウイルスベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ（ジョンズホプキンス癌センターより入手）のマルチクローニングサイト（ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ）に挿入し、ＣＡＰＢＰ１／ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターを得た。
以下、公知のプロトコール［“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＡｄＥａｓｙ  Ｓｙｓｔｅｍ”］（ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ．ｈｔｍ、“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ａｄｅａｓｙ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ２．ｈｔｍ”）］に従い、ＣＡＰＢＰ１を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶより調製した。
なおウイルス量は２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定し、下記の計算式で換算した。
［式］    １  Ａ２６０＝１．１×１０１２ウイルス粒子＝３．３×１０１１ｐｆｕ／ｍｌ
（２）脂肪細胞の分化とＣＡＰＢＰ１発現アデノウイルスの添加
３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いてＣＡＰＢＰ１の糖とりこみに対する効果を評価した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、コラーゲンコートした２４穴プレート（旭テクノグラス社）に１．６×１０５個／穴になるように分注した。翌日、１０μｇ／ｍｌインスリン、２５０ｎＭデキサメサゾン、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を加えたＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に培地を交換して３Ｔ３−Ｌ１細胞の分化を誘導した。その２日後、培地を０．４ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に戻した。その４日後、ＣＡＰＢＰ１を発現させるアデノウイルスを１穴あたり１．６×１０１０ｐｆｕの濃度で培地に添加した。コントロールとしてはｅＧＦＰのみを発現させるアデノウイルスを用いた。
（３）ＣＡＰＢＰ１高発現細胞における糖取り込み能の測定
アデノウイルス添加して３６時間後、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭに交換して３時間おいた。その後、糖取り込みに対する効果を評価した。まず培地を所定濃度のインスリンを含むＫＲＰ緩衝液（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，４．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．４）０．２５ｍｌに交換し、３７℃で２０分インキュベートした。次に１ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−グルコースを含むＫＲＰに１ｍｌあたり１５μｌの２−デオキシ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（アマシャムバイオサイエンス社）を加えたものを用意し、各穴に５０μｌずつ添加して３７℃で１０分インキュベートした。その後、氷冷リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で３回洗い、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて細胞を溶解し、２ｍｌのシンチレーター（Ａｑｕａｚｏｌ−２、パッカードバイオサイエンス社）と混合して、細胞内に取り込まれたグルコース量を液体シンチレーションアナライザー（トライカーブＢ２５００ＴＲ、パッカード社）を用いて測定した。図２に示すとおり、ＣＡＰＢＰ１の発現により、細胞内に取り込まれるグルコース量は有意に低下した。これにより本発明ＣＡＰＢＰ１は、その過剰発現により細胞への糖取り込みを妨げることによって糖尿病態の増悪因子として作用することがわかった。なお、図中の記号「＊」はＳｔｕｄｅｎ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにおける評価を示す。「＊」は、コントロール群に対する有意差がｐ＜０．０５であることを、「＊＊＊」は同有意差がｐ＜０．００１であることを意味している。
（実施例７）ＣＡＰＢＰ１とＧＳＫ−３αの相互作用の検出
上述の結果からＣＡＰＢＰ１はインスリンシグナル下流にあるＣＡＰに結合して細胞内への糖取り込みを阻害することが明らかとなった。ＣＡＰＢＰ１が細胞の糖代謝に関わるのであればＣＡＰ以外の糖代謝関連蛋白質にも作用することが予想される。そこで複数の糖代謝関連蛋白質とＣＡＰＢＰ１の相互作用を調べた結果、あらたに同蛋白質はグリコーゲン合成酵素をリン酸化して不活性化する作用を持つＧＳＫ−３α蛋白質と結合することを見い出した。
（１）ＧＳＫ−３α遺伝子のクローニング
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１９８８４にあるヒトＧＳＫ３αの配列情報に従って配列番号２５および配列番号２６に示すＤＮＡオリゴプライマー（プロリゴ社）を用いてヒト平滑筋ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社）から前述実施例１（４）に示したものと同一のＰＣＲ法およびクローニング法によりＧＳＫ３αの全長ｃＤＮＡを取得し、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ；インビトロジェン社）にクローニングした。このときＧＳＫ３αのＮ末端側にＦＬＡＧタグが挿入されるように設計した。この発現プラスミドをｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＧＳＫ３αと名付けた。
（２）ＣＡＰＢＰ１とＧＳＫ３αの生化学的結合の検出
上述実施例１（５）で作製したｐｃＤＮＡ−ＣＡＰＢＰ１（−）と前述のｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＧＳＫ３αをともに、上述実施例２（１）に示した方法に従ってＣＯＳ−１細胞にコトランスフェクトして４８時間培養した。細胞を回収した後、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ）を用いて公知の免疫沈降法（実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ７、羊土社、１９９４年９１頁  浜口道成）に従いＧＳＫ３αに結合する蛋白質を分離した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動および抗Ｖ５抗体（インビトロジェン社）を用いたウエスタンブロット法により、分離した蛋白質中に発現させたＣＡＰＢＰ１−Ｖ３−Ｈｉｓ６融合蛋白質が含まれるかを調べた結果、同蛋白質とＦＬＡＧ−ＧＳＫ３αとを同時に発現させた細胞の分画のみからＣＡＰＢＰ１−Ｖ３−Ｈｉｓ６融合蛋白質の２４ｋＤａのバンドが検出され、両蛋白質が結合することが明らかとなった。
ＧＳＫ−３はグリコーゲン合成酵素（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）をリン酸化して不活性化させ、細胞への糖取り込みを抑制する。またＧＳＫ−３αはインスリンシグナルによって活性化したＰＫＢによりリン酸化されその活性が抑制される。これらの事実から同蛋白質はインスリンシグナルに対して負の方向へ作用する分子であると考えられている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９３年  ２９４（３）：ｐ６２５−６２９）。このＧＳＫ３αと結合するという事実から本発明のＣＡＰＢＰ１はインスリンシグナルを負に制御することにより、糖尿病態の惹起に関わることがわかった。
【産業上の利用可能性】  ＣＡＰＢＰ１はインスリンシグナルに関わる新たな新規分子であり、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、インスリン抵抗性改善薬及び／又は糖尿病改善薬の同定、及びスクリーニングに用いることが出来る。また、糖尿病態において発現量が増加する本発明のポリヌクレオチドは糖尿病の診断に有用である。
【配列表フリーテキスト】  以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号５〜１０、１２〜１８、２３、２４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号１１の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターｐＡＣＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ２９８９９）の第５１８３番目（５’）〜第５１６２番目（３’）の塩基からなる配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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