(57)【要約】アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとを含む分散物をゲル化した後で凍結乾燥することにより多孔質体とし、次いで多孔質体中のコラーゲンを架橋することによりアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造する方法、及びこの方法により得られたアパタイト／コラーゲン架橋多孔体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとを含む分散物を凍結乾燥することにより多孔質体とした後で、前記多孔質体中のコラーゲンを架橋することによりアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造する方法において、前記分散物をゲル化した後に凍結乾燥することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体は、コラーゲンを含有するリン酸又はその塩の水溶液と、カルシウム塩の水溶液又は懸濁液とを同時に滴下することにより製造することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記分散物中の前記アパタイト／コラーゲン複合体と前記コラーゲンとの配合比が質量基準で９７／３〜９３／７であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの配合比が質量基準で９／１〜６／４であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記分散物をゲル化するために、前記分散物を３５〜４３℃の温度に保持することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記分散物のｐＨを６．８〜７．６とした後で前記分散物をゲル化することを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記分散物のイオン強度を０．２〜０．８とした後で前記分散物をゲル化することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体が長さ１ｍｍ以下の繊維状であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン架橋多孔体中のアパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法において、前記アパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイトがハイドロキシアパタイトであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法により製造されたアパタイト／コラーゲン架橋多孔体。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はアパタイト／コラーゲン複合体を含み、人工骨材、細胞の足場材等に用いるアパタイト／コラーゲン架橋多孔体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】  アパタイトからなる人工骨は自家骨に対して優れた親和性を有するために、自家骨に直接結合することができる。そのため、近年アパタイトからなる人工骨の有用性が評価されるようになり、整形外科、脳神経外科、形成外科、口腔外科等を中心に臨床応用されている。しかしアパタイトのようなセラミックス系の人工骨の機械的特性及び生理的性質は、自家骨と全く同じ訳ではない。例えばアパタイトのみからなるいわゆるセラミックス系人工骨は、自家骨より硬くて脆い。また自家骨は吸収と再生という代謝を繰り返すのに対し、アパタイトからなる人工骨は生体内でほとんど溶解しないため、生体内に半永久的に残存する。このため残存した人工骨が、人工骨と自家骨との界面で自家骨を破壊し、骨折の原因となることが懸念される。
最近、アパタイト人工骨より自家骨の組成に近く、生体内で分解する人工骨についての研究が活発化し、種々の提案がなされている。例えば特表平１１−５１３５９０号は、ハイドロキシアパタイトにコラーゲン及び必要に応じてその他のバインダーが結合したネットワークを有するアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を開示している。このアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は生体分解性を有するので、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体内に自家骨が形成されるとともに、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体自身は体内に吸収される。そのため、このアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は脊椎固定、骨欠損の補填、骨折修復及び、周欠損移植等に利用できる。しかし、このアパタイト／コラーゲン架橋多孔体はコラーゲンとアパタイトとの単なる混合物からなるものであり、アパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿って配向した生体骨の構造を有していない。さらにこのアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は機械的強度が不十分である他、骨形成能に乏しいという問題もある。
発明の目的
従って本発明の目的は、生体骨と同じ機構で体内に吸収されるとともに高い骨形成能を有し、人工骨等に使用できるアパタイト／コラーゲン架橋多孔体、及びその製造方法を提供することである。
【発明の開示】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとを含有する分散物を凍結乾燥することによりアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造する場合に、凍結乾燥に先立って分散物をゲル化させると、得られるアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は均一な組織とともに高強度を有することを発見し、本発明に想到した。
すなわち本発明のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法は、アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとを含む分散物を凍結乾燥することにより多孔質体とした後で、前記多孔質体中のコラーゲンを架橋するもので、分散物をゲル化した後に凍結乾燥することを特徴とする。
分散物中の前記アパタイト／コラーゲン複合体と前記コラーゲンとの配合比は質量基準で９７／３〜９３／７であるのが好ましい。またアパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの配合比は質量基準で９／１〜６／４であるのが好ましい。
分散物をゲル化させる方法としては、分散物の温度を３５〜４３℃に保持するのが好ましく、またゲル化処理に先立って、分散物のｐＨを６．８〜７．６とし、イオン強度を０．２〜０．８とするのが好ましい。
アパタイト／コラーゲン複合体は長さ０．０１〜１ｍｍの繊維状であるのが好ましい。またアパタイト／コラーゲン複合体は、アパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した構造を有するのが好ましい。さらにアパタイト／コラーゲン架橋多孔体も、アパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した構造を有するのが好ましい。
本発明のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は上記方法のいずれかにより製造される。
発明を実施する最良の態様
［１］アパタイト／コラーゲン複合体の製造
本発明のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造方法は、アパタイト／コラーゲン複合体と、バインダーとなるコラーゲンとを出発物質とする。アパタイト／コラーゲン複合体は、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンが自己組織化的に配向し、生体骨と同様の構造を有するのが好ましい。ここで「自己組織化」とは、コラーゲン繊維に沿って、アパタイト構造を有する水酸化リン酸カルシウム（ハイドロキシアパタイト）が生体骨特有の配向をしていること、すなわちハイドロキシアパタイトのＣ軸がコラーゲン繊維に沿うように配向していることを意味する。
（１）原料
アパタイト／コラーゲン複合体は、コラーゲン、リン酸塩、及びカルシウム塩を原料として製造する。コラーゲンは特に限定されず、動物等から抽出したものを使用できる。なお由来する動物の種、組織部位、年齢等は特に限定されない。一般的には哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）や鳥類（例えばニワトリ等）の皮膚、骨、軟骨、腱、臓器等から得られるコラーゲンを使用できる。また魚類（例えばタラ、ヒラメ、カレイ、サケ、マス、マグロ、サバ、タイ、イワシ、サメ等）の皮、骨、軟骨、ひれ、うろこ、臓器等から得られるコラーゲン様蛋白を使用してもよい。なおコラーゲンの抽出方法は特に限定されず、一般的な抽出方法を使用することができる。また動物組織からの抽出ではなく、遺伝子組み替え技術によって得られたコラーゲンを使用してもよい。
リン酸又はその塩（以下単に「リン酸（塩）」という）としては、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。またカルシウム塩としては、例えば炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。リン酸塩及びカルシウム塩はそれぞれ均一な水溶液又は懸濁液の状態で添加するのが好ましい。
使用するアパタイト原料（リン酸（塩）及びカルシウム塩）とコラーゲンとの質量比により、生成するアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を制御できる。このため使用するアパタイト原料とコラーゲンとの質量比は、目的とするアパタイト／コラーゲン複合体の組成比により適宜決定する。本発明の製造方法に使用するアパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの比率は９／１〜６／４とするのが好ましく、例えば８／２とする。
（２）溶液の調製
まずリン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液又は懸濁液を調製する。リン酸（塩）水溶液及びカルシウム塩水溶液又は懸濁液の濃度は、リン酸（塩）とカルシウム塩とが所望の配合比にあれば特に限定されないが、後述する滴下操作の都合上、リン酸（塩）水溶液の濃度を１５〜２４０ｍＭ、例えば１２０ｍＭ程度とし、カルシウム塩水溶液又は懸濁液の濃度を５０〜８００ｍＭ、例えば４００ｍＭ程度とすれば良い。コラーゲンは一般的にはリン酸水溶液の状態で、前述のリン酸（塩）水溶液に加える。コラーゲンのリン酸水溶液としては、コラーゲンの濃度が０．１〜１質量％、例えば約０．８５質量％、リン酸の濃度が１〜４０質量％、例えば２０ｍＭ程度のものを使用する。
（３）アパタイト／コラーゲン複合体の製造
添加すべきカルシウム塩水溶液又は懸濁液の量とほぼ同量の水を予め反応容器に入れ、４０℃程度に加熱しておく。そこに、コラーゲンを含有するリン酸（塩）水溶液と、カルシウム塩水溶液又は懸濁液とを同時に滴下する。滴下条件を制御することにより、合成するアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長を制御できる。滴下速度は１〜６０ｍｌ／分、例えば３０ｍｌ／分程度とするのが好ましい。また攪拌速度は１〜４００ｒｐｍ、例えば２００ｒｐｍ程度とするのが好ましい。
反応溶液のｐＨは８．９〜９．１に保つのが好ましい。カルシウムイオン及び／又はリン酸イオンの濃度が上記範囲を超えると、複合体の自己組織化が妨げられる。以上の滴下条件により、アパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の原料として好適な１ｍｍ以下となる。またアパタイト／コラーゲン複合体は、自己組織化したものとなる。
滴下終了後、スラリー状となった水とアパタイト／コラーゲン複合体との混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥は、−１０℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。
［２］アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の製造
（１）アパタイト／コラーゲン複合体を含む分散物の調製
アパタイト／コラーゲン複合体に水、リン酸水溶液等の液体を加えて撹拌し、ペースト状の分散物を調製する。液体の添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体１００体積％に対して、８０〜９９体積％とするのが好ましく、９０〜９７体積％とするのがより好ましい。製造するアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の気孔率Ｐは分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体と液体との体積比に依存し、下記式（１）：
Ｐ＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）・・・（１），
（ただし、Ａは分散物中のアパタイト／コラーゲン複合体の体積、Ｂは分散物中の液体の体積を示す。）により表される。このため加える液体の量を制御することによりアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の気孔率Ｐを制御することができる。液体を加えた後で分散物を撹拌することにより、繊維状のアパタイト／コラーゲン複合体が切断され繊維の長さの分布幅が大きくなるため、製造するアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の強度が向上する。
複合体の分散物にバインダーとなるコラーゲンを加え、さらに撹拌する。コラーゲンの添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体１００質量％に対して、１〜１０質量％とするのが好ましく、３〜６質量％とするのがより好ましい。複合体の場合と同様に、コラーゲンはリン酸水溶液の状態で加えるのが好ましい。コラーゲンのリン酸水溶液の濃度等は特に限定されないが、実用的にはコラーゲンの濃度は約０．８５質量％、リン酸の濃度は２０ｍＭ程度である。
（２）分散物のゲル化
コラーゲンのリン酸（塩）水溶液の添加により、分散物は酸性となるので、ｐＨが７程度となるまで水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を加える。分散物のｐＨは６．８〜７．６とするのが好ましく、７．０〜７．４とするのがより好ましい。分散物のｐＨを６．８〜７．６とすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンが、後述するゲル化処理時にゼラチンに変性するのを防止することができる。
分散物にリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）の１０倍程度の濃縮液を加えて撹拌し、イオン強度を０．２〜０．８に調整する。より好ましいイオン強度は、ＰＢＳと同程度のイオン強度（０．８程度）である。分散物のイオン強度を大きくすることにより、バインダーとして加えたコラーゲンの繊維化を促進することができる。
分散物を成形型に入れた後、３５〜４３℃の温度に保持することにより分散物をゲル化させる。保持温度は３５〜４０℃とするのがより好ましい。分散物を十分にゲル化させるため、保持する時間は０．５〜３．５時間とするのが好ましく、１〜３時間とするのがより好ましい。分散物の温度を３５〜４３℃に保持することにより、バインダーとして加えたコラーゲンが繊維化し、分散物がゲル状となる。分散物がゲル化することにより、アパタイト／コラーゲン複合体が分散物中で沈降するのを防ぐことができるため、均一な多孔質体を製造することが可能となる。
ゲル化処理を施した分散物はゼリー状となる。
（３）凍結乾燥
ゲル化処理後の分散物を凍結する。凍結温度は−８０〜−１０℃とするのが好ましく、−８０〜−２０℃とするのがより好ましい。凍結速度により、多孔質体の気孔径及び気孔形状を制御することができる。例えば凍結速度が大きいと、生成する多孔質体の気孔径は小さくなる傾向がある。
次いで分散物を凍結乾燥して多孔質体とする。凍結乾燥は複合体の場合と同様に、−１０℃以下に凍結した状態で真空引きし、急速に乾燥させることにより行う。凍結乾燥は分散物が十分に乾燥するまで行えばよく時間は特に制限されないが、一般的には２４〜７２時間程度である。
（４）コラーゲンの架橋
コラーゲンの架橋はγ線、紫外線、電子線、熱脱水等を用いた物理的架橋、架橋剤や縮合剤を用いた化学的架橋等いずれの方法を用いてもよい。化学的架橋の場合、架橋剤の溶液に凍結乾燥した多孔質体を浸すことにより、多孔質体中のコラーゲンを架橋する。
架橋剤としては、例えばグルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド系架橋剤、ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミド系架橋剤、エチレングリコールジエチルエーテル等のエポキシ系架橋剤、トランスグルタミナーゼ等が挙げられる。これらの架橋剤のうち、架橋度の制御の容易さや、得られるアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の生体適合性の観点から、グルタールアルデヒドが特に好ましい。
架橋剤としてグルタールアルデヒドを用いる場合、グルタールアルデヒド溶液の濃度は０．００５〜０．０１５質量％とするのが好ましく、０．００５〜０．０１質量％とするのがより好ましい。アパタイト／コラーゲン架橋多孔体は脱水する必要があるが、ここでグルタールアルデヒド溶液の溶媒としてエタノール等のアルコールを使用すると、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の脱水をコラーゲンの架橋と同時に行うことができる。脱水を架橋と同時に行うことにより、アパタイト／コラーゲン複合体が収縮した状態で架橋反応が起こり、生成するアパタイト／コラーゲン架橋多孔体の弾性を向上させることができる。
架橋処理後、未反応のグルタールアルデヒドを除去するため２質量％程度のグリシン水溶液にアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を浸漬し、次いで水洗する。さらにエタノールに浸漬することによりアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を脱水した後、室温で乾燥させる。
［３］アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の物性及び用途
本発明のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を含んでおり、従来のアパタイトアパタイト／コラーゲン架橋多孔体より吸水性及び弾性が高い。また含水状態で弾力性を示し、優れた生体親和性及び骨伝導能を有する。
上述のような物性は、生体材料として好ましい。このため本発明のアパタイト／コラーゲン架橋多孔体はγ線、電子線、乾燥加熱等により滅菌処理すると、生体骨置換型骨再建材等として使用できる。具体的には人工骨、人工関節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材等として好適である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【実施例１】（Ａ）アパタイト／コラーゲン複合体の合成
１２０ｍＭのリン酸水溶液１６８ｍｌに、コラーゲンのリン酸水溶液（コラーゲン濃度：０．８５質量％、リン酸濃度：２０ｍＭ）を２３５ｇ加えて撹拌し、希釈コラーゲンリン酸水溶液を調製した。他方、４００ｍＭの水酸化カルシウム懸濁液を２００ｍｌ調製した。反応容器に２００ｍｌの純水を入れ、４０℃に加熱した。この反応容器に希釈コラーゲンリン酸水溶液と水酸化カルシウム懸濁液とをそれぞれ約３０ｍｌ／分の速度で同時に滴下し、得られた反応溶液を２００ｒｐｍで撹拌して、アパタイト／コラーゲン複合体繊維を含むスラリーを作製した。滴下中の反応溶液のｐＨは８．９〜９．１に保持した。生成したアパタイト／コラーゲン複合体の繊維長は概ね１ｍｍ以下であった。アパタイト／コラーゲン複合体を含むスラリーは凍結乾燥した。アパタイト／コラーゲン複合体中のアパタイト／コラーゲンの配合比は、質量基準で８／２であった。
（Ｂ）アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の作製
凍結乾燥したアパタイト／コラーゲン複合体１ｇに純水３．６ｍｌを加えて撹拌し、ペースト状の分散物とした。このペースト状分散物にコラーゲンのリン酸水溶液４ｇを加えて撹拌した後、１ＮのＮａＯＨ水溶液をｐＨがほぼ７になるまで加えた。アパタイト／コラーゲン複合体とコラーゲンとの配合比は質量基準で９７／３であった。次いで分散物のイオン強度が０．８となるまで、１０倍濃縮のＰＢＳを加えた。液体（純水＋希釈コラーゲンリン酸水溶液＋ＮａＯＨ水溶液＋ＰＢＳ）の添加量は、アパタイト／コラーゲン複合体の９５体積％であった。
得られた分散物を成形型に入れ、３７℃で２時間保持してゲル化させることにより、ゼリー状の成形体を得た。この成形体を−２０℃で凍結し、次いで凍結乾燥機を用いて乾燥させた。エタノール（濃度９９．５％）を溶媒とする０．０１質量％のグルタールアルデヒド溶液に乾燥した成形体を浸し、２５℃で１時間架橋処理することにより、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体を得た。このアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を水洗した後、２質量％のグリシン水溶液に浸して未反応のグルタールアルデヒドを除去し、再度水洗した。さらにエタノール（濃度９９．５％）に浸して脱水した後、室温で乾燥した。
得られたアパタイト／コラーゲン架橋多孔体から角柱状（５ｍｍ×５ｍｍ×１０ｍｍ）の試験片を切り出し、引張り速度を０．１ｍｍ／秒として破断強さを測定した。その結果、アパタイト／コラーゲン架橋多孔体の破断強さは約０．８Ｎであった。
【実施例２】  ゲル化処理温度を４０℃とした以外実施例１と同様にしてアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造し、破断強さを測定した。破断強さは約０．８Ｎであった。
比較例１
ゲル化処理を行わない以外実施例１と同様にしてアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造し、破断強さを測定した。破断強さは約０．４Ｎであった。
【産業上の利用可能性】  以上詳述したように、本発明の方法により、自己組織化したアパタイト／コラーゲン複合体を含むことにより優れた生体親和性及び骨伝導能を有し、破断強さ等の機械的強度が大きいアパタイト／コラーゲン架橋多孔体を製造することができる。このような特性を有するアパタイト／コラーゲン架橋多孔体は人工骨、人工関節等の生体材料として好適である。
【国際調査報告】
2004041320.tif 000002
2004041320.tif 000003
2004041320.tif 000004
2004041320.tif 000005