(57)【要約】ヒト及びマウスのアディポネクチン受容体を単離・同定し、アディポネクチン結合能を有する新規タンパク質を提供するとともに、該タンパク質を利用したアディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とし、この目的を達成するために、アディポネクチン結合能を有する新規タンパク質として、（ａ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質を利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質
【請求項２】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む請求項２記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
【請求項７】
試験物質と請求項１記載のタンパク質とを接触させる工程を含む、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質、請求項２若しくは３記載の遺伝子、請求項４記載の組換えベクター又は請求項５記載の形質転換体を含む、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アディポネクチン結合能を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片に関する。さらに、本発明は、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットに関する。
【背景技術】  肥満は、脂肪組織量の増加として定義され、糖尿病、高脂血症、冠動脈性心疾患等の心臓血管疾患及び代謝疾患の高リスクと関連する（Ｒｅａｖｅｎ，Ｇ．Ｍ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ３８，３−１３．（１９９５）；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ  ８７，３７７−３８９．（１９９６））。肥満及び２型糖尿病の顕著な特徴であるグルコース及び脂質の代謝異常は、筋肉、肝臓等のインスリン標的組織における脂質蓄積量の増加の原因となり、インスリン抵抗性を引き起こす（Ｒｕｄｅｒｍａｎ，Ｎ．Ｂ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６，Ｅ１−Ｅ１８．（１９９９）；Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，１７１−１７６．（２０００））。脂肪組織は、エネルギー要求の変化に応答してトリグリセリド（ＴＧ）を蓄積するとともに遊離脂肪酸（ＦＦＡ）／グリセロールを放出する部位としての役割を果たす（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｂ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｆｌｉｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｃｅｌｌ  ８７，３７７−３８９．（１９９６））。また、脂肪組織は、ＦＦＡ（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６，１７１−１７６．（２０００））、アディプシン（Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９２１０−９２１３．（１９９２））、レプチン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，６３２−６３４．（２０００））、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｉ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２，８００−８０３．（１９９６））、レジスチン（Ｓｔｅｐｐａｎ，Ｃ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，３０７−３１２．（２００１））、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）（Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｇ．Ｓ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２４５，６２１−６２５．（１９９９））等の「アディポカイン（ａｄｉｐｏｋｉｎｅｓ）」（Ｍａｔｓｕｚａｗａ，Ｙ．ら，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９２，１４６−１５４．（１９９９））と呼ばれる多数の生物活性物質を分泌する重要な内分泌器官として、様々なエネルギーホメオスタシスの調節に関与する。
アディポネクチン又はＡｃｒｐ３０（Ｈｕ，Ｅ．，Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１０６９７−１０７０３．（１９９６）等）は、アディポサイト由来のホルモンであり、様々な生物学的機能を有している。肥満、２型糖尿病、冠動脈性心疾患は、アディポネクチンの血漿レベルの減少に関連しており、アディポネクチンはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗アテローム発生性を示すことが報告されている（Ｏｕｃｈｉ，Ｎ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３，１０５７−１０６３．（２００１）；Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ９６，１７２３−１７３２．（２０００））。また、Ａｃｒｐ３０の循環レベルの急増は、肝臓におけるグルコース産生を低下させることが報告されている（Ｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４７−９５３．（２００１）；Ｃｏｍｂｓ，Ｔ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，１８７５−１８８１．（２００１））。また、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｃｒｐ３０は、筋肉における脂肪酸酸化を亢進させ、マウスにおける体重減少を引き起こすことが報告されている（Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，２００５−２０１０．（２００１））。また、脂肪組織萎縮性マウス又は肥満マウスにおけるインスリン抵抗性が、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチン（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｇＡｄ）で処理することにより、筋肉における脂肪酸酸化の亢進を介して改善したこと、及び全長アディポネクチンで処理することにより程度はｇＡｄよりも低いが改善したことが報告されている（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４１−９４６．（２００１））。
さらに最近になって、骨格筋において、アディポネクチンがＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）を急性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化及びグルコース取り込みが亢進されることが報告されているとともに（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））、アディポネクチンがＰＰＡＲαを慢性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化が亢進されるが筋肉における組織ＴＧ含量は減少すること、そしてこれらの効果は全長アディポネクチンよりもｇＡｄの方が大きいことが報告されている（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２））。また、興味深いことに、肝臓においては、全長アディポネクチンのみがＡＭＰＫを急性的に活性化し、その結果、糖新生に関連する分子を減少させるとともに脂肪酸酸化を亢進させる一方、全長アディポネクチンのみがＡＭＰＫを慢性的に活性化し、その結果、脂肪酸酸化を亢進させるとともに肝臓における組織ＴＧ量を減少させる。そして、これらの変化はいずれもｉｎ  ｖｉｖｏにおけるインスリン感受性を増加させる（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２）；Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２））
これらのアディポネクチンの作用は、細胞表面の受容体によって媒介されると考えられるが、アディポネクチン受容体は未だ同定されておらず、骨格筋及び肝臓におけるアディポネクチン受容体が構造的及び機能的に異なるか否かも未だ不明である。なお、本発明者がアディポネクチン受容体をコードする遺伝子を同定した後、ホモロジー検索を行ったところ、ホモロジーを有する遺伝子として酵母ＹＯＬ００２ｃが発見された（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７，１９６０９−１９６１７．（２００２））。ＹＯＬ００２ｃは、脂肪酸酸化等の脂質の代謝経路において重要な役割を果たす７回膜貫通型タンパク質をコードする（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７，１９６０９−１９６１７．（２００２））。
【発明の開示】
本発明は、第一に、アディポネクチン結合能を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び上記タンパク質に対する抗体又はその断片を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、以下のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、抗体、並びにアディポネクチン受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質。
（ａ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質
（２）前記（１）記載のタンパク質をコードする遺伝子。
（３）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを含む前記（２）記載の遺伝子。
（ｃ）配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（４）前記（２）又は（３）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（５）前記（４）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（６）前記（１）記載のタンパク質に反応し得る抗体又はその断片。
（７）試験物質と前記（１）記載のタンパク質とを接触させる工程を含む、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法。
（８）前記（１）記載のタンパク質、前記（２）若しくは（３）記載の遺伝子、前記（４）記載の組換えベクター又は前記（５）記載の形質転換体を含む、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キット。
【図面の簡単な説明】  図１（ａ）は、アディポネクチンのＣ２Ｃ１２筋細胞への結合を示す図、図１（ｂ）は、アディポネクチンの肝細胞への結合を示す図、図１（ｃ）〜（ｅ）は、ＦＡＣＳ解析の結果を示す図、図１（ｆ）は、ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の転写物の構造を示す模式図、図１（ｇ）は、マウスの様々な組織に関するノーザンブロット解析の結果を示す図、図１（ｈ）は、ヒトの様々な組織に関するノーザンブロット解析の結果を示す図である。
図２（ａ）は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の構造を示す模式図、図２（ｂ）は、エピトープタグＦＬＡＧを有するＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫染色した結果を示す図、図２（ｃ）は、エピトープタグをＮ末端又はＣ末端に導入たＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２の細胞内局在を示す図、図２（ｄ）は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の予測構造モデルを示す図である。
図３（ａ）は、ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ（ｇＡｄ）の結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す図、図３（ｂ）は、当該２９３Ｔ細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏ（Ａｄ）の結合等温線を示す図、図３（ｃ）は、エピトープタグＦＬＡＧ又はＨＡを有するＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降した後、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体で免疫染色した結果を示す図、図３（ｄ）は、マウスＡｄｉｐｏＲ１発現細胞又はＢＬＴ１発現細胞にｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ、全長Ａｄｉｐｏ、ＬＴＢ４又はＡＴＰをチャレンジしたときの［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図、図３（ｅ）は、ホルスコリンで処理した又は処理しないＨＥＫ−２９３細胞にｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを蓄積させた結果を示す図、図３（ｆ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞をｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長ＡｄｉｐｏとインキュベートしたときのＰＰＡＲαリガンド活性を示す図である。
図４（ａ）は、マウスＡｄｉｐｏＲ１  ｍＲＮＡ量を示す図、図４（ｂ）はマウスＡｄｉｐｏＲ２  ｍＲＮＡ量を示す図、図４（ｃ）及び（ｄ）は、マウスＡｄｉｐｏＲ１又はマウスＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞に結合した［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ（ｇＡｄ）又は全長Ａｄｉｐｏ（Ａｄ）の結合等温線を示す図、図４（ｅ）は、マウスＡｄｉｐｏＲ１又はマウスＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞にＬａｃＺ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫを含有するアデノウイルスを感染させ、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏで７時間処理したときのＣ２Ｃ１２筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性を示す図、図４（ｆ）は上記Ｃ２Ｃ１２筋細胞内のｉｎ  ｖｉｔｒｏ脂肪酸酸化を示す図である。
図５（ａ）は、ｓｉＲＮＡ又はｍｏｃｋをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞内のマウスＡｄｉｐｏＲ１  ｍＲＮＡの量を示す図、図５（ｂ）は、上記Ｃ２Ｃ１２筋細胞内のマウスＡｄｉｐｏＲ２  ｍＲＮＡの量を示す図、図５（ｃ）は、非標識ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの濃度を増加させることによって、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に結合する［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏを置換した競合ラジオリガンド結合アッセイの結果を示す図、図５（ｄ）は、非標識全長Ａｄｉｐｏの濃度を増加させることによって、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に結合する［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏを置換した競合ラジオリガンド結合アッセイの結果を示す図、図５（ｅ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合等温線を示す図、図５（ｆ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏの結合等温線を示す図、図５（ｇ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞をｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ、全長Ａｄｉｐｏ又はＷｙ−１４，６４３と７時間インキュベートしたときのＰＰＡＲαリガンド活性を示す図、図５（ｈ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞をｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ、全長Ａｄｉｐｏ又はＷｙ−１４，６４３と７時間インキュベートしたときのｉｎ  ｖｉｔｒｏ脂肪酸酸化を示す図、図５（ｉ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞をｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ、全長Ａｄｉｐｏ又はインスリンと７時間インキュベートしたときのグルコース取り込みを示す図である。
図６（ａ）は、ｇＡｄの肝細胞への特異的結合を示す図、図６（ｂ）は、Ａｄの肝細胞への特異的結合を示す図、図６（ｃ）は、ＨＡＥＣにおけるヒトＡｄｉｐｏＲ１  ｍＲＮＡの発現レベルを示す図、図６（ｄ）は、ＨＡＥＣにおけるヒトＡｄｉｐｏＲ２  ｍＲＮＡの発現レベルを示す図、図６（ｅ）は、ｇＡｄのＨＡＥＣへの特異的結合を示す図、図６（ｆ）は、ＡｄのＨＡＥＣへの特異的結合を示す図である。
図７（ａ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す図、図７（ｂ）は、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す図、図７（ｃ）は、図７（ａ）に示す結果に基づきスキャッチャードプロット解析を行った結果を示す図、図７（ｄ）は、図７（ｂ）に示す結果に基づきスキャッチャードプロット解析を行った結果を示す図である。
図８（ａ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｂ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＣＣ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｃ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｄ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｅ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていない肝細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｆ）は、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていない肝細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＣＣ抗体とを反応させた結果を示す図、図８（ｇ）は、優性阻害型ＡＭＰキナーゼ（ＤＮ−ＡＭＰＫ）又はｐ３８  ＭＡＰＫ特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０の存在下におけるＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２筋細胞の脂肪酸酸化を示す図、図８（ｈ）は、優性阻害型ＡＭＰキナーゼ（ＤＮ−ＡＭＰＫ）又はｐ３８  ＭＡＰＫ特異的阻害剤ＳＢ２０３５８０の存在下におけるＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２筋細胞のグルコース取り込みを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明のタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下「タンパク質（ａ）」という。）
（ｂ）配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質（以下「タンパク質（ｂ）」という。）
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、アディポネクチン結合能を有するタンパク質である。「アディポネクチン結合能」とは、アディポネクチンと結合する能力、好ましくはアディポネクチンと特異的に結合する能力（すなわちアディポネクチン受容体が有するアディポネクチン結合能）を意味する。「アディポネクチン結合能」には、全長アディポネクチン又はｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンのいずれに対する結合能も含まれる。アディポネクチン結合能を有するタンパク質には、全長アディポネクチンにのみ結合し得るタンパク質、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンにのみ結合し得るタンパク質、全長アディポネクチン及びｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンの両者に結合し得るタンパク質、全長アディポネクチン及びｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンのいずれか一方に優先的に結合し得るタンパク質等が含まれる。
なお、「ｇｌｏｂｕｌａｒドメイン」とは、アディポネクチンのＣ末端側に約１００アミノ酸強の長さで存在する糸状体類似の構造ドメインである。補体のＣｌｑ等にもｇｌｏｂｕｌａｒドメインとホモロジーの高いドメインが存在する。アディポネクチンのｇｌｏｂｕｌａｒドメインは機能的には骨格筋等に強く作用して、脂肪酸を燃焼させ、脂肪が蓄積するのを抑制する作用を有しており、全長のアディポネクチンより数十分の一の低い濃度で同程度の強い活性を示す。
タンパク質（ａ）のうち、配列番号２又は４に記載のタンパク質はヒト由来のアディポネクチン受容体であり、配列番号６又は８に記載のタンパク質はマウス由来のアディポネクチン受容体である。また、配列番号２及び６記載のタンパク質は同一種類のアディポネクチン受容体（ＡｄｉｐｏＲ１）であり、配列番号４及び８記載のタンパク質は、ＡｄｉｐｏＲ１とは異なる種類のアディポネクチン受容体（ＡｄｉｐｏＲ２）である。ＡｄｉｐｏＲ１は、全長アディポネクチンよりもｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンに対して比較的選択性を有する受容体であると考えられ、ＡｄｉｐｏＲ２は、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンよりも全長アディポネクチンに対して比較的選択性を有する受容体であると考えられる。
ＡｄｉｐｏＲ１について、ヒト（配列番号２）及びマウス（配列番号６）間のアミノ酸レベルでの相同性は９６．８％である。ＡｄｉｐｏＲ２について、ヒト（配列番号４）及びマウス（配列番号８）間のアミノ酸レベルでの相同性は９５．２％である。ＡｄｉｐｏＲ１とＡｄｉｐｏＲ２の構造は類似しており、マウスにおけるＡｄｉｐｏＲ１（配列番号６）及びＡｄｉｐｏＲ２（配列番号８）の相同性は６６．７％である。
生体において、ＡｄｉｐｏＲ１はほとんどの組織で発現しており、特に骨格筋で高度に発現している一方、ＡｄｉｐｏＲ２は肝臓で高度に発現している。また、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、ホモ又はヘテロマルチマーを形成していると考えられる。また、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２はともに、全長アディポネクチン及びｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンと結合し、これらのアディポネクチンによるＰＰＡＲα（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）リガンド活性及び脂肪酸酸化の亢進を媒介する。例えば、ＡｄｉｐｏＲ１は、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンによる筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性、脂肪酸酸化及びグルコース取り込みの増加を媒介すると考えられる。また、ＡｄｉｐｏＲ２は、全長アディポネクチンによる肝細胞及び筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性及び脂肪酸酸化の増加を一部媒介すると考えられる。
ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２はいずれも７個の膜貫通ドメインを有すると考えられる。配列番号２記載のアミノ酸配列（ヒトＡｄｉｐｏＲ１）のうち、１３６〜１５８番目、１７２〜１９４番目、２０７〜２２８番目、２３４〜２５５番目、２６７〜２８９番目、２９９〜３２１番目、３３６〜３５８番目のアミノ酸配列が膜貫通ドメインに相当すると考えられる。また、配列番号４記載のアミノ酸配列（ヒトＡｄｉｐｏＲ２）のうち、６０〜８２番目、９６〜１１８番目、１３０〜１５２番目、１５８〜１７９番目、１９２〜２１４番目、２２２〜２４４番目、２６０〜２８２番目のアミノ酸配列が膜貫通ドメインに相当すると考えられる。また、配列番号６記載のアミノ酸配列（マウスＡｄｉｐｏＲ１）のうち、１３６〜１５８番目、１７２〜１９４番目、２０７〜２２８番目、２３４〜２５５番目、２６７〜２８９番目、２９９〜３２１番目、３３６〜３５８番目のアミノ酸配列が膜貫通ドメインに相当すると考えられる。また、配列番号８記載のアミノ酸配列（マウスＡｄｉｐｏＲ２）のうち、７２〜９４番目、１０８〜１３０番目、１４２〜１６４番目、１７０〜１９１番目、２０４〜２２６番目、２３４〜２５６番目、２７２〜２９４番目のアミノ酸配列が膜貫通ドメインに相当すると考えられる。
配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の個数は、アディポネクチン結合能が保持され得る限り特に限定されるものではなく、その個数は１又は複数個、好ましくは１又は数個であり、その具体的な範囲は通常１〜１００個、好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜１０個である。このとき、タンパク質（ｂ）のアミノ酸配列は、タンパク質（ａ）のアミノ酸配列と通常６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有する。
配列番号２、４、６又は８に記載のアミノ酸配列において欠失、置換又は付加されるアミノ酸の位置は、アディポネクチン結合能が保持され得る限り特に限定されるものではない。
タンパク質（ｂ）には、タンパク質（ａ）に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質の他、欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質や、それに対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質も含まれる。欠失、置換、付加等の変異が導入された状態で天然に存在するタンパク質としては、例えば、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット等）由来のタンパク質（これらの哺乳動物において多型によって生じ得るタンパク質を含む）が挙げられる。
タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、糖鎖が付加されたタンパク質及び糖鎖が付加されていないタンパク質のいずれもが含まれる。タンパク質に付加される糖鎖の種類、位置等は、タンパク質の製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、糖鎖が付加されたタンパク質には、いずれの宿主細胞を用いて得られるタンパク質も含まれる。また、タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、その医薬的に許容される塩も含まれる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、ヒト、マウス等の哺乳動物の骨格筋、肝臓、心臓、マクロファージ、血管、脳、腎臓、肺、胎盤、脾臓、精巣、末梢血液、胸腺、腸管等の組織から抽出したｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列に基づいて合成したプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングすることにより得られる。以下、ｃＤＮＡライブラリーの作製、及び目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニングの各工程について説明する。
〔ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ｃＤＮＡライブラリーを作製する際には、例えば、ヒト、マウス等の哺乳動物の骨格筋、肝臓、心臓、マクロファージ、血管、脳、腎臓、肺、胎盤、脾臓、精巣、末梢血液、胸腺、腸管等の組織から全ＲＮＡを得た後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法、バッチ法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。この際、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。このようにして得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーが得られる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターは、宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター等を使用できる。宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等を使用できる。
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞に、組換えベクターを加える方法等により行うことができる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は、テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておく。
ｃＤＮＡライブラリーの作製にあたっては、市販のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）等を使用できる。
〔目的のＤＮＡを含むクローンのスクリーニング〕
ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを含むクローンをスクリーニングする際には、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、ＰＣＲ増幅断片を得る。ＰＣＲ増幅断片は、適当なプラスミドベクターを用いてサブクローニングしてもよい。ＰＣＲに使用するプライマーセットは特に限定されるものではなく、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列に基づいて設計できる。
ｃＤＮＡライブラリーに対して、ＰＣＲ増幅断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、目的のＤＮＡが得られる。プローブとしては、ＰＣＲ増幅断片をアイソトープ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ等で標識したものを使用できる。目的のＤＮＡを含むクローンは、抗体を用いたイムノスクリーニング等の発現スクリーニングによっても得られる。
取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのまま、又は適当な制限酵素等で切断した後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、マキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いて決定できる。塩基配列解析の際には、通常、３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）等の塩基配列分析装置が用いられる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするオープンリーディングフレームとその３’末端に位置する終止コドンとを含む。また、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子は、オープンリーディングフレームの５’末端及び／又は３’末端に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。ここで、配列番号１記載の塩基配列のうち１〜１１２５番目の塩基配列は、配列番号２記載のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号１記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１〜３番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１１２６〜１１２８番目の塩基配列に位置する。また、配列番号３記載の塩基配列のうち１〜８９７番目の塩基配列は、配列番号４記載のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号３記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１〜３番目の塩基配列に位置し、終止コドンは８９８〜９００番目の塩基配列に位置する。また、配列番号５記載の塩基配列のうち１〜１１２５番目の塩基配列は、配列番号６記載のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号５記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１〜３番目の塩基配列に位置し、終止コドンは１１２６〜１１２８番目の塩基配列に位置する。また、配列番号７記載の塩基配列のうち１〜９３３番目の塩基配列は、配列番号８記載のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり、配列番号７記載の塩基配列のうち、翻訳開始コドンは１〜３番目の塩基配列に位置し、終止コドンは９３４〜９３６番目の塩基配列に位置する。
タンパク質（ａ）をコードする遺伝子の塩基配列は、タンパク質（ａ）をコードする限り特に限定されるものではなく、オープンリーディングフレームの塩基配列は、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列に限定されるものではない。タンパク質（ａ）をコードする遺伝子は、その塩基配列に従って化学合成により得ることもできる。ＤＮＡの化学合成は、市販のＤＮＡ合成機、例えば、チオホスファイト法を利用したＤＮＡ合成機（島津製作所社製）、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機（パーキン・エルマー社製）を用いて行うことができる。
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアディポネクチン結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子が挙げられる。
「ストリンジェントな条件」としては、例えば、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件、好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件が挙げられる。
配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの具体例としては、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
タンパク質（ｂ）をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１、３、５又は７に記載の塩基配列からなるＤＮＡに、部位特異的変異誘発法等の公知の方法を用いて人為的に変異を導入することにより得られる。変異の導入は、例えば、変異導入用キット、例えば、Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて行うことができる。また、塩基配列が既に決定されているＤＮＡについては化学合成によっても得られる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、例えば、以下の工程に従って、それぞれのタンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
〔組換えベクター及び形質転換体の作製〕
組換えベクターを作製する際には、目的とするタンパク質のコード領域を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、目的とするタンパク質のコード領域の塩基配列を、宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。
このＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより組換えベクターを作製し、該組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することにより、目的とするタンパク質を生産し得る形質転換体が得られる。上記ＤＮＡ断片は、その機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を含有できる。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０）が挙げられ、ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）が挙げられ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスが挙げられる。
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。また、動物個体、植物個体、カイコ虫体等を使用してもよい。
細菌を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用できる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１等の大腸菌や、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ  １１４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ２０７−２１等の枯草菌を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、大腸菌等の細菌中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。また、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも使用できる。
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
酵母を宿主細胞とする場合、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を使用できる。
酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用できる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等を宿主細胞として使用できる。この場合のプロモーターは、動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用できる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を使用できる。
昆虫細胞を宿主とする場合には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿主細胞として使用できる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ  ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ４等が挙げられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用できる。
〔形質転換体の培養〕
目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を使用できる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物等を使用できる。無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用できる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体の培養は、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は通常２５〜３７℃、培養時間は通常１２〜４８時間であり、培養期間中はｐＨを６〜８に保持する。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。また、培養の際、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｈａｍ  Ｆ１２培地、Ｈａｍ  Ｆ１２Ｋ培地又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用できる。形質転換体の培養は、通常５％ＣＯ２存在下、３７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてカナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）等を使用できる形質転換体の培養は、通常２７℃で３〜１０日間行う。また、培養の際、必要に応じてゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするタンパク質は、分泌タンパク質又は融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン等が挙げられる。
〔タンパク質の単離・精製〕
形質転換体の培養物より目的とするタンパク質を採取することにより、目的とするタンパク質が得られる。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。
目的とするタンパク質が形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出する。目的とするタンパク質が形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養上清をそのまま使用するか、遠心分離等により培養上清から細胞又は菌体を除去する。
こうして得られるタンパク質（ａ）又は（ｂ）は、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法等により精製できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）は、そのアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造できる。この際、市販のペプチド合成機を使用できる。
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に反応し得る抗体又はその断片である。ここで、「抗体」には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体」には全てのクラスのモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。また、「抗体」には、ウサギやマウス等の免疫動物にタンパク質（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を免疫して得られる抗血清、ヒト抗体、遺伝子組換えによって得られるヒト型化抗体も含まれる。また、「抗体の断片」には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が含まれる。
本発明の抗体又はその断片は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）を免疫用抗原として利用することより作製できる。免疫用抗原としては、例えば、（ｉ）タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織の破砕物又はその精製物、（ｉｉ）遺伝子組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子を大腸菌、昆虫細胞又は動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を使用できる。
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用できる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常５０〜５００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは４日〜３週間間隔で、合計２〜８回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終免疫日から３〜１０日後に、タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用できる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：１〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングできる。
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用できる。
モノクローナル抗体をヒトに投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体又はヒト型化抗体を使用することが好ましい。ヒト抗体又はヒト型化抗体は、例えば、免疫動物としてヒト抗体遺伝子を導入したマウス等を用いてハイブリドーマを作製することにより、また、ファージ上に抗体を提示したライブラリーを用いることにより取得できる。具体的には、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いて目的のタンパク質に対するヒト抗体を取得できる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９６−３３７３５及びＷＯ９６−３４０９６参照）。また、複数の異なるヒトｓｃＦｖをファージ上に提示させた抗体ライブラリーから、抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物に結合する抗体を提示しているファージを選り分けることで、目的のタンパク質に結合するｓｃＦｖを選択できる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ．等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２，７２５−７３４，１９９３）。
本発明のスクリーニング方法は、試験物質とタンパク質（ａ）又は（ｂ）とを接触させる工程を含む。本発明のスクリーニング方法によれば、試験物質とタンパク質（ａ）又は（ｂ）とを接触させ、試験物質がタンパク質（ａ）又は（ｂ）に結合するか否かを判別することにより、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングできる。スクリーニングされた物質は、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用を実際に有するか否かを判別する工程にさらに供することが好ましい。
試験物質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、高分子化合物、低分子化合物、細胞培養物、組織抽出物等が挙げられる。
スクリーニングの際には、タンパク質（ａ）又は（ｂ）として、例えば、（ｉ）タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞若しくは組織又はそれらの処理物（ｉｉ）ＤＮＡ組換え技術を用いて、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ）化学合成したペプチド等を使用できる。タンパク質（ａ）又は（ｂ）を発現している細胞又は組織は、タンパク質（ａ）又は（ｂ）を内因性タンパク質として発現している細胞又は組織（例えば、筋細胞、骨格筋、心臓、マクロファージ、血管、脳、腎臓、肺、胎盤、脾臓、精巣、末梢血液、胸腺、腸管等）であってもよいし、外因性タンパク質として発現している細胞又は組織（例えば、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードするＤＮＡを導入した大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）であってもよい。また、細胞又は組織の処理物は、細胞又は組織に、破砕、抽出、精製等の処理を施したものであり、細胞又は組織の処理物としては、例えば、細胞又は組織の細胞膜画分が挙げられる。
試験物質がアディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用を有するか否かは、例えば、タンパク質（ａ）又は（ｄ）に対する試験物質の結合量、試験物質とタンパク質（ａ）又は（ｂ）との結合により生じる細胞応答の有無又は程度に基づいて判別できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する試験物質の結合量は、例えば、標識した試験物質、試験物質に対する標識抗体等を使用して測定できる。標識としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ等の放射性同位体元素、蛍光色素等を使用できる。放射性同位体元素の放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定でき、蛍光色素の蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定できる。
試験物質とタンパク質（ａ）又は（ｂ）との結合により生じる細胞応答としては、例えば、ＰＰＡＲαリガンド活性の亢進又は抑制、脂肪酸酸化の亢進又は抑制、グルコース取り込みの亢進又は抑制、細胞内ｐＨの上昇又は低下、ＡＭＰキナーぜ活性の増加又は低下、ＡＭＰキナーゼのリン酸化の増加又は低下、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性の増加又は低下、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼのリン酸化の増加又は低下、糖新生の促進又は抑制、脱共役蛋白の増加又は低下等が挙げられる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）に対する試験物質の結合量の測定、及び細胞応答の有無又は程度の測定にあたっては、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の存在下及び不存在下における測定値を比較することが好ましい。
脂肪細胞は主要なインスリン感受性ホルモンとしてアディポネクチンを分泌し、脂肪細胞肥大はアディポネクチン分泌低下を惹起し、アディポネクチン分泌低下はインスリン抵抗性を惹起する。そして、インスリン抵抗性は、糖尿病、高脂血症、高血圧を惹起する。また、アディポネクチン分泌低下は動脈硬化を促進させる。したがって、アディポネクチン受容体に対するアゴニスト又はアンタゴニストとしてスクリーニングされた物質は、例えば、インスリン抵抗性改善薬、糖尿病予防・治療薬、高脂血症予防・治療薬、高血圧予防・治療薬、動脈硬化予防・治療薬、肥満予防・治療薬、抗炎症薬、骨粗鬆症予防・治療薬、抗癌剤等として使用できる。
これらの薬剤はスクリーニングされた物質のみから構成してもよいが、通常は、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化する。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等）が挙げられ、投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、懸濁剤等が挙げられる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、体重、性別等により異なり、スクリーニングされた物質の種類に応じて適宜調節できる。
タンパク質（ａ）又は（ｂ）、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター又は該組換えベクターを含む形質転換体は、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キットの構成要素として利用できる。これらは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）の供給源としてスクリーニング用キットに含まれる。
スクリーニング用キットは、タンパク質（ａ）又は（ｂ）、タンパク質（ａ）又は（ｂ）をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター又は該組換えベクターを含む形質転換体を含む限り、いかなる形態であってもよく、各種試薬（例えば、緩衝液等）、測定機械器具、標識化合物、モデル動物、細胞株、細胞培養用培地等を含むことができる。
【実施例】  以下、実施例に関する本文及び図において、アディポネクチンを「Ａｄｉｐｏ」と、ｇｌｏｂｕｌａｒドメインのみからなるアディポネクチンを「ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ」又は「ｇＡｄ」と、全長アディポネクチンを「全長Ａｄｉｐｏ」又は「Ａｄ」という場合がある。また、アディポネクチン受容体を「ＡｄｉｐｏＲ」と、ヒト由来アディポネクチン受容体を「ｈＡｄｉｐｏＲ」と、マウス由来アディポネクチン受容体を「ｍＡｄｉｐｏＲ」という場合がある。また、「ＡｄｉｐｏＲ１」及び「ＡｄｉｐｏＲ２」はアミノ酸配列が異なるアディポネクチン受容体を表す。
１．実験方法
（１）レトロウイルスの作製及び感染
レトロウイルス含有上清を作製するために、リポフェクタミンＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、１０７個のＰｌａｔ−Ｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ細胞（Ｍｏｒｉｔａ，Ｓ．ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７，１０６３−１０６６（２０００））に、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１０μｇを一過性にトランスフェクトした。２４時間インキュベーションした後、上清（１０ｍＬ）を回収した。Ｂａ／Ｆ３細胞に、ポリブレン（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍＬを添加した１／２０倍希釈上清（推定ｍ．ｏ．ｉ＝０．３）を感染させた。６時間後、培養液を交換し、Ｂａ／Ｆ３細胞を６日間培養して増殖させた後、冷凍保存又は細胞選別を行った。
（２）ＦＡＣＳ解析及びｃＤＮＡの配列決定
ＦＡＣＳ解析は、Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎらの方法（Ｓｔｏｅｃｋｌｉｎ，Ｇ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，４７０９−４７１８．（２０００））に従って行った。細胞選別のために、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリーをトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞１×１０７個からＦＡＣＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞を濃縮した。細胞を回収し、増殖させた後、１１日後にＦＡＣＳ解析に供した。選別された細胞をさらに増殖してＦＡＣＳ解析に供した。選別された細胞に組み込まれたｃＤＮＡの配列決定を行うために、レトロウイルスベクターに対する上流及び下流のプライマーを用いて、選別された細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅断片の配列決定を行った。
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用いて、９４℃で１分間、５６℃で２分間、７２℃で３分間のサイクルを３５サイクル行った。レトロウイルスベクターに対するプライマー（ｐＬＩＢプライマー）は以下のとおりである。
2004061108.tif 000002
ＰＣＲ産物は、プライマーを除去した後、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅにより塩基配列を決定した。
（３）ノーザンブロット解析
ヒトの様々な組織（脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、末梢血白血球）のノーザンブロットフィルターＩ及びＩＩをＣｌｏｎｅｔｅｃｈより購入した。これらのフィルターを、４×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．２％ＳＤＳ、２００ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中、４２℃で２４時間、［３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したｃＤＮＡプローブ（ヒトＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ、マウスＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ、ヒト又はマウスＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡをそれぞれＰｓｔＩ／ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩを処理して得られた断片）とハイブリダイズさせた。０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件でフィルターを洗浄した後、オートラジオグラフィーに供した。同様のノーザンブロット解析をマウスの様々な組織（脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、脾臓、精巣）についても行った。
（４）哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現及び性状決定
ＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ又はＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡをｐＣＸＮ２（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ，Ｓ．ら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５，１８５１−１８５６（１９９８））のＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ部位にライゲートすることにより、ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２発現ベクターを構築した。ＨＥＫ−２９３Ｔ（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ：ヒト胎児腎臓細胞）、ＨＡＥＣ（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：正常ヒト大動脈内皮細胞）及びＣ２Ｃ１２筋細胞（マウス筋細胞株）をＤＭＥＭ中で培養した。培養液には、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有させた。ＤＮＡトランスフェクションは、いずれの細胞についても、リポフェクタミンＰＬＵＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いたリポフェクションによって行った。
（５）Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）
Ｋａｒｐｉｃｈｅｖらの方法（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１９６０９−１９６１７（２００２））に従い、二組のｓｉＲＮＡを化学合成し、アニーリングさせ、リポフェクタミンＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、コンフルエントから２日後にウマ血清含有ＤＭＥＭで４〜７日間培養して筋管細胞に分化させたＣ２Ｃ１２筋細胞にトランスフェクトした。肝細胞又はＨＡＥＣについても同様にｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後、細胞を溶解した。
無関係なコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ）の塩基配列は次のとおりである。
2004061108.tif 000003
マウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のコーディング領域に対応するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｍＡｄｉｐｏＲ１）の塩基配列は次のとおりである。
2004061108.tif 000004
マウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のコーディング領域に対応するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｍＡｄｉｐｏＲ２）の塩基配列は次のとおりである。
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ヒトＡｄｉｐｏＲ１遺伝子のコーディング領域に対応するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｈＡｄｉｐｏＲ１）の塩基配列は次のとおりである。
2004061108.tif 000006
ヒトＡｄｉｐｏＲ２遺伝子のコーディング領域に対応するｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ｈＡｄｉｐｏＲ２）の塩基配列は次のとおりである。
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（６）ＰＰＡＲα（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）リガンド活性の測定
大腸菌を用いて発現させたマウスｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏを、Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））に従って精製した。Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））に従って、分化したＣ２Ｃ１２筋細胞又は単離した肝細胞を所定濃度のアディポネクチンで処理した。ＰＰＡＲαリガンド活性は、Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２））に従って、（ＵＡＳ）×４−ｔｋ−ＬＵＣリポータープラスミド、ＧＡＬ４−ｒａｔＰＰＡＲα  リガンド結合ドメイン発現プラスミド、及びβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（内部コントロール）を用いて定量した。
（７）脂質及びグルコース代謝
Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４１−９４６．（２００１））に従って、細胞溶解物を用いて［１−１４Ｃ］パルミチン酸からの［１４Ｃ］ＣＯ２産生を測定した。また、Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））に従って、グルコース取り込みを測定した。
（８）優性阻害型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）を用いた研究
α２  ＡＭＰＫ（４５番目のリジン残基がアルギニン残基に置換された変異を含む）をコードするｃＤＮＡをＤＮ−α２ＡＭＰＫとして用いた（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））。Ｃ２Ｃ１２筋細胞に、コントロールＭｏｃｋベクター又はＤＮ−α２ＡＭＰＫを含有する等しい力価のアデノウイルスを感染させた。Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））に従って、分化の誘導の５日後に、細胞を所定濃度のアディポネクチンで処理して、ＰＰＡＲαリガンド活性及び脂肪酸酸化を測定した。
（９）結合アッセイ
合成ヒト又はマウスＡｄｉｐｏのＴｙｒを、Ｎａ１２５Ｉ（２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の存在下、ＩＯＤＯ−ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）により１２５Ｉで標識した。組換えｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長ＡｄｉｐｏをＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化した。細胞を９６ｗｅｌｌプレート上に４．１×１０４個／ｗｅｌｌの密度で播き、一晩培養した後、培養液を除去し、細胞を３７℃で一晩、所定濃度の［１２５Ｉ］Ａｄｉｐｏ及び非標識競合物質を含有する結合アッセイ用緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水／０．１％ウシ血清アルブミン）とインキュベートした。その後、Ｙａｍａｕｃｈｉらの方法（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２）；Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４（１９９７））に従って、細胞を氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ／０．１％ＳＤＳで溶解し、細胞に結合した放射活性をγカウンターで測定した。
（１０）蛍光顕微鏡による解析
ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２の細胞内局在を、２９３Ｔ細胞を用いて、共焦点蛍光顕微鏡により評価した。細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した後、５倍希釈した透過緩衝液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて透過させて又は透過させずに、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２；３０μｇ／ｍＬ）と２２℃で１時間インキュベートした。次いで、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ  ４８８を結合させた二次抗体１０μｇ／ｍＬとともにインキュベートした。次いで、ニコン顕微鏡及びクリプトン／アルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を備えたレーザスキャンニング顕微鏡システムを用いて共焦点イメージングを行った。
（１１）ＡｄｉｐｏＲ１遺伝子及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の転写物のリアルタイムＰＣＲによる定量的解析
Ｈｅｉｄらの方法（Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６，９８６−９９４（１９９６））に従って、ヒトＡｄｉｐｏＲ１遺伝子、ヒトＡｄｉｐｏＲ２遺伝子、マウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子及びマウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子に関する４種類の転写物の定量をリアルタイムＰＣＲによって行った。それぞれの転写物に関するプライマー及びプローブは以下のとおりである。ＰＣＲ産物は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて連続的に測定した。それぞれの転写物の相対量をアクチンの転写物量に対して標準化した。
［マウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子］
2004061108.tif 000008
［マウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子］
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［ヒトＡｄｉｐｏＲ１遺伝子］
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［ヒトＡｄｉｐｏＲ２遺伝子］
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（１２）細胞内カルシウム濃度、ｃＡＭＰ量及びｃＧＭＰ量の測定
細胞内Ｃａ２＋濃度は、Ｙｏｋｏｍｉｚｏらの方法（Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４（１９９７））に従って測定した。すなわち、細胞に、Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  ＢＳＡ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４），１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ，１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２，１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース，０．３７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，０．４９ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％［ｗｔ／ｖｏｌ］脂肪酸不含ＢＳＡ；Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ）に溶解した１０μＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（Ｄｏｊｉｎ）を３７℃で２時間接触させた。細胞を２回洗浄し、Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  ＢＳＡ緩衝液に１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。０．５ｍＬの細胞懸濁液をＣＡＦ−１００  ｓｙｓｔｅｍ（Ｊａｓｃｏ）にアプライし、５μＬのリガンドのエタノール溶液（ＬＴＢ４用）又はＰＢＳ溶液（Ａｄｉｐｏ用）を加えた。３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの励起光によって発せられる５００ｎｍの蛍光の割合に基づいて細胞内Ｃａ２＋濃度を測定した。
また、ｃＡＭＰ量及びｃＧＭＰ量は、Ｙｏｋｏｍｉｚｏらの方法（Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４（１９９７））に従い、アッセイキット（ｃＡＭＰ：Ｂｉｏｔｒａｋ  ｃＡＭＰ  ＥＩＡシステム，ｃＧＭＰ：Ｂｉｏｔｒａｋ  ｃＧＭＰ  ＥＩＡシステム）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコルに基づき測定した。
（１３）ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の構造予測
Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｌｅのハイドロパシーインデックスを用いて、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２タンパク質のハイドロパシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｐｌｏｔ）を行った。また、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の構造モデルをＳＯＳＵＩによって予測し、ＰＲＩＮＴＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＰＲＩＮＴＳ／）によってコンセンサス配列を解析した。さらに、リン酸化部位をＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ．によって解析した。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１／Ｒ２がその他のクラスのＧＰＣＲとホモロジーを有するか否かをｈｔｔｐ：／／ｃｂｒｇ．ｉｎｆ．ｅｔｈｚ．ｃｈ／Ｓｅｒｖｅｒ／ＡｌｌＡｌｌ．ｈｔｍｌに記載の方法により解析した。
（１４）ＡＭＰキナーゼ（ＡＭＰＫ）、ＡＣＣ、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８  ＭＡＰＫ）及びＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）のリン酸化及びリン酸化量の測定
ＡＭＰＫ、ＡＣＣ（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＭＡＰＫ（Ｂａｒｇｅｒ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４４４９５−４４５０１（２００１）；Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８，９７１−９８２（２００１）；Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，３８２０−３８２５（２００１））のリン酸化及びリン酸化量を、抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体、抗リン酸化ＡＣＣ抗体、抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体又は抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を利用したウェスタンブロッティング法により測定した。この際、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした又はしていないＣ２Ｃ１２細胞又は肝細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、各細胞の溶解物と各抗体とを反応させた。
２．結果
（１）ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の発現クローニング
筋肉において、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏは全長Ａｄｉｐｏよりもインスリン抵抗性を改善させ、ＰＰＡＲα及び脂肪酸酸化を活性化させる（Ｆｒｕｅｂｉｓ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．９８，２００５−２０１０（２００１）；Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９４１−９４６（２００１）；Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２））。さらに、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏは全長ＡｄｉｐｏよりもＣ２Ｃ１２筋細胞に強く結合するとともに、肝細胞及び肝臓の膜よりも骨格筋の膜に強く結合する（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２））（図１ａ，ｂ参照）。図１ａは、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長ＡｄｉｐｏとＣ２Ｃ１２筋細胞との結合、図１ｂはｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏと肝細胞との結合を示す。細胞は、図示する濃度のビオチン化ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏとともにインキュベートし、細胞表面に結合したビオチン化ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長ＡｄｉｐｏはＥＬＩＳＡにより定量した。図中のそれぞれのバーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝３−５）を示し、「※」はＰ＜０．０５、「※※」はＰ＜０．０１を示す。
そこで、ヒト骨格筋のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを組み込んだレトロウイルスをＢａ／Ｆ３細胞に感染させて作製したライブラリーから、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する結合能を有するタンパク質をスクリーニングすることにより、ＡｄｉｐｏＲ１のｃＤＮＡの単離を試みた。
感染させたＢａ／Ｆ３細胞を回収し、ビオチン化したｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏとインキュベートした後、ストレプトアビジンを結合させたフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ：ＰＥ）（赤色蛍光プローブ）で染色し、蛍光活性化セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）に供した（図１ｃ参照）。ＦＡＣＳ解析の結果を図１ｃ，ｄ，ｅに示す。図１ｃは、感染後であるが、第一の選別前のＢａ／Ｆ３細胞を示し、図１ｄは、第三の選別前のＢａ／Ｆ３細胞を示し、図１ｅは、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を結合させたｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏとインキュベートした後であるが、第四の選別前のＢａ／Ｆ３細胞を示す。また、図１ｃ，ｄ，ｅにおいて、四角で囲まれた領域は、ＡｄｉｐｏＲ１陽性細胞を示し、四角内の細胞は選別された細胞を示す。
選別されたｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ結合能を有する細胞を第二ラウンド目の選別に供した。再選別されたｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ結合能を有する細胞（図１ｄ参照）を第三ラウンド目の選別に供し、再選別された細胞を直ちにＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（緑色蛍光プローブ）を結合させたｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏとインキュベートした。赤色から緑色に変化した細胞がｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する特異的結合部位を有する細胞であるから（図１ｅ参照）、そのように変化した細胞のみを選別し、さらなる分析のために培養により増殖させた。これらの細胞から抽出したゲノムＤＮＡを、ウイルスベクターに対するプライマーを用いたＰＣＲに供し、配列決定した。
なお、上記のように細胞を二色（赤色及び緑色）で染色したのは、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏがその粘着性によって非特異的に結合した細胞を除去するためである。
配列決定されたヒトＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、それにコードされるタンパク質（ヒトＡｄｉｐｏＲ１）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、Ｃ２Ｃ１２筋細胞から同様の方法によって取得したマウスＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示し、それにコードされるタンパク質（マウスＡｄｉｐｏＲ１）のアミノ酸配列を配列番号６に示す。ヒトＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ（配列番号１）及びマウスＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ（配列番号５）は、３７５個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが判明した（図１ｆ参照）。ヒトＡｄｉｐｏＲ１及びマウスＡｄｉｐｏＲ１のアミノ酸配列の相同性は９６．８％である（図１ｆ参照）。図１ｆは、データベース（ＮＩＨ−ＭＧＣ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ａｎｄ  ＮＣＢＩ  ｃｏｎｔｉｇ）におけるＡｄｉｐｏＲ１遺伝子及びＡｄｉｐｏＲ２遺伝子の転写物の模式的構造を示す。
これまでの知見（Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，１２８８−１２９５．（２００２）；Ｙａｍａｕｃｈｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２４６１−２４６８（２００２））から、ＡｄｉｐｏＲには、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏに対する結合親和性が異なる２種類のタイプ、すなわち、骨格筋で発現するｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに優先的に結合するタイプと、肝臓で発現する全長Ａｄｉｐｏにのみ結合するタイプとが存在すると考えられる。
ＡｄｉｐｏＲ１とホモロジーを有するタンパク質を調査したところ、ヒト及びマウスに関するデータベース（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｈｕｍａｎ／；Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｇｕｉｄｅ／ｍｏｕｓｅ／）（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５２０−５６２（２００２）；Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５６３−５７３（２００２））において、ＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡとは異なるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する遺伝子が発見された。そこで、このｃＤＮＡをＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）のｍＲＮＡからクローニングし、配列決定し、このｃＤＮＡにコードされているタンパク質をＡｄｉｐｏＲ２と名付けた。配列決定されたヒトＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示し、それにコードされるタンパク質（ヒトＡｄｉｐｏＲ２）のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、Ｃ２Ｃ１２筋細胞から同様の方法によって取得したマウスＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示し、それにコードされるタンパク質（マウスＡｄｉｐｏＲ２）のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
ヒトＡｄｉｐｏＲ２及びマウスＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の相同性は９５．２％である。また、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は構造的に高度に類似しており、マウスＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２のアミノ酸配列の相同性は６６．７％である。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴにおいて、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２と相同性が高い哺乳動物のタンパク質は存在しなかったが、興味深いことに、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２をコードするｃＤＮＡは、酵母ＹＯＬ００２ｃ（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１９６０９−１９６１７．（２００２））とホモロジーを有していた。ＹＯＬ００２ｃは、脂肪酸酸化等の脂質の代謝経路において重要な役割を果たす７回膜貫通型タンパク質をコードすると報告されている（Ｋａｒｐｉｃｈｅｖ，Ｉ．Ｖ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１９６０９−１９６１７（２００２））。種を問わず、７回膜貫通構造を有するＡｄｉｐｏＲ／ＹＯＬ００２ｃは、脂肪酸酸化等の脂肪代謝において重要な制御シグナルを媒介すると考えられる。
（２）ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の組織分布
マウスの様々な組織に関するノーザンブロット解析の結果を図１ｇに示し、ヒトの様々な組織に関するノーザンブロット解析の結果を図１ｈに示す。図１ｇ中、レーン１は脳、レーン２は心臓、レーン３は腎臓、レーン４は肝臓、レーン５は肺、レーン６は骨格筋、レーン７は脾臓、レーン８は精巣の結果を示し、図１ｈ中、レーン１は脳、レーン２は心臓、レーン３は骨格筋、レーン４は大腸、レーン５は胸腺、レーン６は脾臓、レーン７は腎臓、レーン８は肝臓、レーン９は小腸、レーン１０は胎盤、レーン１１は肺、レーン１２は末梢血白血球の結果を示す。
ヒト及びマウスの様々な組織に関するノーザンブロット解析によって、上記データベースにおいて予測されたｍＲＮＡのサイズを有する２．０ｋｂの一本の主要なバンドが同定され、ＡｄｉｐｏＲ１がほとんどの組織で発現しており、骨格筋において高度に発現していることが明らかになった。また、上記データベースにおいて予測されたｍＲＮＡのサイズを有する４．０ｋｂの一本の主要なバンドが同定され、ＡｄｉｐｏＲ２が肝臓において高度に発現していることが明らかになった。
（３）ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の細胞内局在
マウスＡｄｉｐｏＲ１の推定アミノ酸配列（配列番号６）から、マウスＡｄｉｐｏＲ１は３７５個のアミノ酸からなるタンパク質であり、その分子量は４２．４ｋＤａと予測される。また、マウスＡｄｉｐｏＲ２の推定アミノ酸配列（配列番号８）から、マウスＡｄｉｐｏＲ２は３１１個のアミノ酸からなるタンパク質であり、その分子量は３５．４ｋＤａと予想される（図２ａ参照）。図２ａは、ソフトウエアＰＲＩＮＴＳ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｍａｎ．ａｃ．ｕｋ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＰＲＩＮＴＳ／）によってＡｄｉｐｏＲの配列をスキャンした結果であり、図中、下線領域は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の７個の膜貫通ドメインを示し、太字の下線部は、Ｇタンパク質結合受容体のメンバーに特徴的な保存モチーフを示す。また、図２ａには、ＰＫＣリン酸化部位及びチロシンリン酸化部位も併せて示す。
ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の推定アミノ酸配列からＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、７個の膜貫通ドメインを有するタンパク質であると予測される（図２ａ参照）。ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２について、７個の膜貫通ドメインを有する公知の受容体（Ｗａｔｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５２０−５６２（２００２）；Ｏｋａｚａｋｉ，Ｙ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，５６３−５７３（２００２）；Ｗｅｓｓ，Ｊ．，ＦＡＳＥＢ．Ｊ．１１，３４６−３５４（１９９７））とのアライメントを行ったが、Ｇタンパク質結合受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＰＣＲ）ファミリーに属するメンバーとのアミノ酸配列の相同性は低かった。ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、Ｇタンパク質結合受容体ファミリーの特徴（例えば、保存アミノ酸、グリコシル化部位、Ｇタンパク質結合部位）（Ｗｅｓｓ，Ｊ．らＦＡＳＥＢ．Ｊ．１１，３４６−３５４（１９９７）；Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４（１９９７）；Ｓｃｈｅｅｒ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ．Ｊ．１５，３５６６−３５７８（１９９６））が欠落していた。Ｇタンパク質結合受容体ファミリーにおいて高度に保存されているアミノ酸のうち、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の第一及び第二細胞外ループにおいて高度に保存されている２個のＣｙｓ残基のうちの１つのみが存在していた。ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、ＴＭ７の末端に存在する高度に保存されたＡｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘａａ２−Ｔｙｒモチーフを欠落していた。また、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２のＴＭ３／細胞内ループ２トランジションに存在する高度に保存されたＡｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒモチーフ（Ｗｅｓｓ，Ｊ．らＦＡＳＥＢ．Ｊ．１１，３４６−３５４（１９９７）；Ｓｃｈｅｅｒ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ．Ｊ．１５，３５６６−３５７８（１９９６））も欠落していた。
エピトープタグＦＬＡＧで標識したヒト及びマウスのＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫染色した。ヒト及びマウスＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、予想された分子量を示した（図２ｂ参照）。
マウスＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２の細胞内局在及びトポロジーを調べるために、いずれかの末端にエピトープタグを有するＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２のｃＤＮＡをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞で発現させた（図２ｃ参照）。図２ｃ中、「ｉｎｔａｃｔ」は細胞を透過させなかった場合、「ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ」は細胞を透過させた場合を表す。
エピトープタブをＮ末端に導入した場合には、細胞を透過させたときのみ、細胞表面に存在するＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２を検出できた（図２ｃ参照）。これに対して、エピトープタグをＣ末端に導入した場合には、細胞表面に存在するＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２を検出できた（図２ｃ参照）。これらの結果は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２が７個の膜貫通ドメインを有する膜内在性タンパク質であり、そのＮ末端は膜内に存在し、そのＣ末端は膜外に存在することを示す（図２ｃ，ｄ参照）。これは、これまでに報告されている全てのＧタンパク質結合受容体（Ｗｅｓｓ，Ｊ．らＦＡＳＥＢ．Ｊ．１１，３４６−３５４（１９９７）；Ｙｏｋｏｍｉｚｏ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，６２０−６２４（１９９７）；Ｓｃｈｅｅｒ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ．Ｊ．１５，３５６６−３５７８（１９９６））と反対のトポロジーである。なお、図２ｄは、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の予測構造モデルである。
（４）２９３Ｔ細胞におけるＡｄｉｐｏＲの発現の効果
ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２を細胞表面上に過剰発現させた２９３Ｔ細胞を用いて、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏにより亢進される結合活性及び細胞内シグナルを調べた。２９３Ｔ細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２の発現は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両者の結合を亢進させた（図３ａ，ｂ参照）。図３ａは、ＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ（ｇＡｄ）の結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示し、図３ｂは、当該２９３Ｔ細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏ（Ａｄ）の結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示し、図中、□はＭｏｃｋ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１、●はマウスＡｄｉｐｏＲ２に関する結果を示す。
次に、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２がマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を形成するかどうかを調べた。エピトープタグＦＬＡＧを有するＡｄｉｐｏＲ１及びエピトープタグＨＡを有するＡｄｉｐｏＲ１をともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で発現させた場合には、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降において、エピトープタグＦＬＡＧを有するＡｄｉｐｏＲ１が検出された（図３ｃ参照）。図３ｃは、エピトープタグＦＬＡＧ又はＨＡを有するＡｄｉｐｏＲ１又はＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の細胞溶解物を、抗ＦＬＡＧ抗体（上側及び下側のパネル）を用いて免疫沈降（ＩＰ）した後、抗ＦＬＡＧ抗体（上側のパネル）又は抗ＨＡ抗体（下側のパネル）で免疫染色した結果であり、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２によるホモ−及びヘテロ−マルチマーの形成を示す。
さらに、エピトープタグＨＡを有するＡｄｉｐｏＲ１及びエピトープタグＦＬＡＧを有するＡｄｉｐｏＲ２をともにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中で発現させた場合には、抗ＨＡ抗体を用いた免疫沈降において、エピトープタグＦＬＡＧを有するＡｄｉｐｏＲ２が検出された（図３ｃ参照）。これらの結果は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２がホモ−及びヘテロ−マルチマーの両者を形成する可能性を示す。
ＧＰＣＲ又はＬＴＢ４受容体ＢＬＴ１を発現させた細胞では、ＬＴＢ４により細胞内カルシウムが増加し、ＡｄｉｐｏＲ１を発現する細胞の発現レベルと類似する発現レベルを示したが（データは示さず）、ＡｄｉｐｏＲ１を発現する細胞では、Ａｄｉｐｏによる細胞内カルシウムの変化は観察されなかった（図３ｄ参照）。図３ｄは、Ｆｕｒａ−２／ＡＭをロードしたマウスＡｄｉｐｏＲ１発現細胞又はＢＬＴ１発現細胞に、１０μｇ／ｍＬ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ（ｇＡｄ）、１０μｇ／ｍＬ  全長Ａｄｉｐｏ（Ａｄ）、１μＭ  ＬＴＢ４又は１００μＭ  ＡＴＰをチャレンジし、［Ｃａ２＋］ｉの変化を測定した結果である。
さらに、ＡｄｉｐｏＲ１を発現する細胞において、ＡｄｉｐｏＲ１はｃＡＭＰ及びｃＧＭＰレベルに対して全く影響しないか、ほとんど影響を与えなかった（図３ｅ参照）。図３ｅはホルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）で処理した又は処理しないＨＥＫ−２９３細胞にｃＡＭＰ又はｃＧＭＰを蓄積させた結果であり、図中、「ｇＡｄ０．０１」、「ｇＡｄ０．１」はそれぞれ０．０１、０．１μｇ／ｍＬのｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏを表し、「Ａｄ１」、「Ａｄ１０」はそれぞれ１、１０μｇ／ｍＬの全長Ａｄｉｐｏを表す。対照的に、ＡｄｉｐｏＲ１の発現は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏによる２９３Ｔ細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性の増加を増強した（図３ｆ参照）。図３ｆは、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を図示する濃度（μｇ／ｍＬ）のｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長ＡｄｉｐｏとインキュベートしたときのＰＰＡＲαリガンド活性を示し、図中、「ｇＡｄ０．１」、「ｇＡｄ０．５」、「ｇＡｄ２．５」はそれぞれ０．１、０．５、２．５μｇ／ｍＬのｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏを表し、「Ａｄ１」、「Ａｄ５」、「Ａｄ２５」はそれぞれ１、５、２５μｇ／ｍＬの全長Ａｄｉｐｏを表す。また、図中、各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝３−５）を表し、「※」はＰ＜０．０５を表し、「※※」はＰ＜０．０１を表す。
（５）Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＰＰＡＲα活性化及び脂肪酸酸化
Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１の発現（図４ａ参照）は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両方の結合を促進させ（図４ｃ，ｄ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＣ２Ｃ１２筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性（図４ｅ参照）及び脂肪酸酸化（図４ｆ参照）の増加と関連した。また、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＡｄｉｐｏＲ２の発現（図４ｂ参照）は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両方の結合を促進させ（図４ｃ，ｄ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＣ２Ｃ１２筋細胞内の脂肪酸酸化の亢進（図４ｆ）に関連した。図４ａはマウスＡｄｉｐｏＲ１  ｍＲＮＡ量を示し、図４ｂはマウスＡｄｉｐｏＲ２ｍＲＮＡ量を示し、図中、□はＭｏｃｋ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１、点線を引いた□はマウスＡｄｉｐｏＲ２に関する結果を示す。また、図４ｃ及びｄは、マウスＡｄｉｐｏＲ１又はマウスＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞に結合した［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ（ｇＡｄ）又は全長Ａｄｉｐｏ（Ａｄ）の結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示し、図中、□はＭｏｃｋ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１、●はマウスＡｄｉｐｏＲ２に関する結果を示す。また、図４ｅは、マウスＡｄｉｐｏＲ１又はマウスＡｄｉｐｏＲ２をトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞に、ＬａｃＺ又はＤＮ−α２ＡＭＰＫを含有するアデノウイルスを感染させ、図示する濃度（μｇ／ｍＬ）のｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏで７時間処理したときの、当該Ｃ２Ｃ１２筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性を示し、図中、□はＭｏｃｋ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１に関する結果を示す。また、図４ｆは、上記Ｃ２Ｃ１２筋細胞内のｉｎ  ｖｉｔｒｏ脂肪酸酸化を示し、図中、□はＭｏｃｋ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１、点線を引いた□はマウスＡｄｉｐｏＲ２に関する結果を示す。なお、各図中、各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝３−５）を表し、「※」はＰ＜０．０５を表し、「※※」はＰ＜０．０１を表す。
優性阻害型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ：ＤＮ）ＡＭＰキナーゼの発現は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏ誘導性であってＡｄｉｐｏＲ１発現依存的なＰＰＡＲαリガンド活性の亢進に影響を与えなかった。これらの結果は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２はともに、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの結合を媒介し、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＰＰＡＲαリガンド活性及び脂肪酸酸化を亢進させることを示す。
（６）筋細胞内のＡｄｉｐｏＲの結合及び作用に対するｓｉＲＮＡの影響
筋細胞において、内因性のＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２がＡｄｉｐｏの特異的結合及び代謝的作用を媒介しているか否かを調べるため、ｓｉＲＮＡを用いてＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の発現を抑制した（図５ａ，ｂ参照）。図５ａは、ｓｉＲＮＡ又はｍｏｃｋをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞内のマウスＡｄｉｐｏＲ１  ｍＲＮＡの量を示し、図５ｂは、当該Ｃ２Ｃ１２筋細胞内のマウスＡｄｉｐｏＲ２  ｍＲＮＡの量を示す。また、図５ａ，ｂ中、レーン１はｍｏｃｋ、レーン２は無関係なｓｉＲＮＡ、レーン３はマウスＡｄｉｐｏＲ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、レーン４はマウスＡｄｉｐｏＲ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果を示す。
Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、ｓｉＲＮＡによりＡｄｉｐｏＲ１の発現を抑制すると（図５ａ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合活性は全く観察されなくなり、全長Ａｄｉｐｏの結合活性は一部低下した（図５ｃ，ｄ参照）。図５ｃは、非標識ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの濃度を増加させることによって、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に結合する［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏを置換した競合ラジオリガンド結合アッセイの結果（ｎ＝４）であり、図５ｄは、非標識全長Ａｄｉｐｏの濃度を増加させることによって、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に結合する［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏを置換した競合ラジオリガンド結合アッセイの結果（ｎ＝４）である。
ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏで７時間処理すると、Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＰＰＡＲαリガンド活性が増加し（図５ｇ参照）、脂肪酸酸化が亢進し（図５ｈ参照）、グルコース取り込みが亢進した（図５ｉ参照）。図５ｇは、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞を、図示する濃度（μｇ／ｍＬ）のｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏ、あるいは１０−５Ｍ  Ｗｙ−１４，６４３（図中「Ｗｙ」と記載）と７時間インキュベートしたときのＰＰＡＲαリガンド活性を示す。図５ｈは、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞を、図示する濃度（μｇ／ｍＬ）のｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏ、あるいは１０−５Ｍ  Ｗｙ−１４，６４３（図中「Ｗｙ」と記載）と７時間インキュベートしたときのｉｎ  ｖｉｔｒｏ脂肪酸酸化を示す。図５ｉは、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞を、図示する濃度（μｇ／ｍＬ）のｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ又は全長Ａｄｉｐｏ、あるいは１０−７Ｍインスリン（図中「Ｉｎｓ」と記載）と７時間インキュベートしたときのグルコース取り込みを示す。図５ｇ〜ｉにおいて、「ｇＡｄ０．０１」、「ｇＡｄ０．０３」、「ｇＡｄ０．１」、「ｇＡｄ０．５」、「ｇＡｄ２．５」はそれぞれ０．０１、０．０３、０．１、０．５、２．５μｇ／ｍＬのｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏを表し、「Ａｄ０．１」、「Ａｄ０．３」、「Ａｄ１」、「Ａｄ５」、「Ａｄ２５」はそれぞれ０．１、０．３、１、５、２５μｇ／ｍＬの全長Ａｄｉｐｏを表す。図中、各バーは平均値±ｓ．ｅ．（ｎ＝３−５）を表し、「※」はＰ＜０．０５、「※※」はＰ＜０．０１を表す。また、図５ｇ〜ｉにおいて、□は無関係なｓｉＲＮＡ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１に対するｓｉＲＮＡ、点線を引いた□はマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡ、斜線を引いた□はマウスＡｄｉｐｏＲ１及びマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡを用いたときの結果を示す。
Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、ｓｉＲＮＡによりＡｄｉｐｏＲ１の発現を抑制すると（図５ａ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  ＡｄｉｐｏによるＰＰＡＲαリガンド活性（図５ｇ参照）、脂肪酸酸化（図５ｈ参照）及びグルコース取り込み（図５ｉ参照）の増加が減少した。これに対して、ＡｄｉｐｏＲ１の発現を抑制しても、全長Ａｄｉｐｏによるこれらの作用の有意な減少は観察されなかった。したがって、ＡｄｉｐｏＲ１は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏによる筋細胞内のＰＰＡＲαリガンド活性、脂肪酸酸化及びグルコース取り込みの増加を媒介していると考えられる。
内因性のＡｄｉｐｏＲ２が、筋細胞におけるＡｄｉｐｏの特異的結合及び代謝的作用を媒介しているか否かを調べるため、ｓｉＲＮＡを用いてＡｄｉｐｏＲ２の発現を抑制した（図５ｂ参照）。Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、ｓｉＲＮＡによってＡｄｉｐｏＲ２の発現を抑制すると（図５ｂ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの結合が一部減少した（図５ｅ，ｆ参照）。さらに、ＡｄｉｐｏＲ２の発現抑制によって、全長ＡｄｉｐｏによるＰＰＡＲαリガンド活性（図５ｇ参照）及び脂肪酸酸化（図５ｈ参照）の亢進が部分的に減少した。したがって、ＡｄｉｐｏＲ２は、全長Ａｄｉｐｏによる筋細胞内のＰＡＲαリガンド活性、脂肪酸酸化の亢進を部分的に媒介していると考えられる。図５ｅは、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示し、図５ｆは、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す。なお、図中、□は無関係なコントロールｓｉＲＮＡ、●はマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡ、▲はマウスＡｄｉｐｏＲ１及びマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果を示す。
ＡｄｉｐｏＲ１は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対して比較的選択性を有する受容体であり、ＡｄｉｐｏＲ２は全長Ａｄｉｐｏに対して比較的選択性を有する受容体であると考えられる。しかしながら、いずれのタイプのＡｄｉｐｏＲの機能的発現を抑制しても、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両者に対する有意な影響が観察される。これらの結果は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２は、ホモマルチマー及びヘテロマルチマーの両者を形成しているという結果（図３ｅ参照）によって説明され得る。
興味深いことに、Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の両者の発現をｓｉＲＮＡにより同時に抑制すると、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両者の結合がほとんど観察されなくなるとともに（図５ｅ，ｆ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＰＰＡＲαリガンド活性（図５ｇ参照）及び脂肪酸酸化（図５ｈ参照）の増加がほとんど観察されなくなった。
（７）肝細胞内の結合及び作用に対するｓｉＲＮＡの影響
肝細胞へのＡｄｉｐｏの結合を調べた。肝細胞は全長Ａｄｉｐｏに対して特異的な結合を示した（図６ｂ参照）。ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の発現によって、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの肝細胞への結合が促進した（図６ａ，ｂ参照）。逆に、肝細胞において、ｓｉＲＮＡによりＡｄｉｐｏＲ２の発現を抑制すると、全長Ａｄｉｐｏの結合が大きく減少した（図６ｂ参照）。これらの結果から、ＡｄｉｐｏＲ１は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対して比較的選択性を有する受容体であり、ＡｄｉｐｏＲ２は全長Ａｄｉｐｏに対して比較的選択性を有する受容体であると考えられる。
正常ヒト大動脈内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＡＥＣ）へのＡｄｉｐｏの結合を調べた。ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲ２の両者の発現をｓｉＲＮＡにより同時に抑制すると、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合は大幅に減少し（図６ｅ参照）、全長Ａｄｉｐｏの結合は一部減少した（図６ｆ参照）。この結果は、ＡｄｉｐｏＲ１及びＡｄｉｐｏＲが、ＨＡＥＣにおいてもＡｄｉｐｏに対する受容体であることを示す。
（８）スキャッチャードプロット解析
図５ｅ及びｆに関する実験を再度より詳細に行って得られた結果を図７ａ及びｂに示す。図７ａは図５ｅに対応する図であり、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示し、図７ｂは図５ｆに対応する図であり、二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞への［１２５Ｉ］全長Ａｄｉｐｏの結合等温線（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す。なお、図７ａ及びｂ中、□は無関係なコントロールｓｉＲＮＡ、■はマウスＡｄｉｐｏＲ１に対するｓｉＲＮＡ、●はマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡ、▲はマウスＡｄｉｐｏＲ１及びマウスＡｄｉｐｏＲ２に対するｓｉＲＮＡを用いた場合の結果を示す。
図７ａ及びｂに示す結果に基づきスキャッチャードプロット解析を行った結果をそれぞれ図７ｃ及びｄに示す。
無関係なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋細胞は、全長Ａｄｉｐｏよりもｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに強く結合した（図７ａ及びｂ参照）。
スキャッチャードプロット解析によって、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する２種類の結合部位、すなわち高アフィニティー結合部位（Ｋｄ値：約０．０６μｇ／ｍＬ，１．１４ｎＭ  ｇＡｄ三量体等量）と中アフィニティー結合部位（Ｋｄ値：約０．８０μｇ／ｍＬ，１４．４ｎＭ  ｇＡｄ三量体等量）が存在する一方（図７ｃ参照）、全長Ａｄｉｐｏに対する２種類の結合部位、すなわち中アフィニティー結合部位（Ｋｄ値：約６．７μｇ／ｍＬ，４９．１ｎＭ  Ａｄ六量体等量）と低アフィニティー結合部位（Ｋｄ値：約３２９．３μｇ／ｍＬ，２４１５ｎＭ  Ａｄ六量体等量）が存在することが明らかとなった（図７ｄ参照）。
ｓｉＲＮＡによりＡｄｉｐｏＲ１の発現を抑制すると、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合はかなり減少したが（図７ａ参照）、全長Ａｄｉｐｏの結合はわずかに減少しただけだった（図７ｂ参照）。ＡｄｉｐｏＲ１の発現を特異的に抑制すると、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する高アフィニティー結合部位の活性は失われるが、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する中アフィニティー結合部位の活性は影響されないことが、スキャッチャードプロット解析によって明らかとなった（図７ｃ参照）。さらに、ＡｄｉｐｏＲ１の発現を特異的に抑制すると、全長Ａｄｉｐｏに対する中アフィニティー結合部位の活性は部分的に減少するが、全長Ａｄｉｐｏに対する低アフィニティー結合部位の活性は失われることが、スキャッチャードプロット解析によって明らかとなった（図７ｄ参照）。
ＡｄｉｐｏＲ１とは対照的に、ｓｉＲＮＡによりＡｄｉｐｏＲ２の発現を抑制すると、全長Ａｄｉｐｏの結合はかなり減少したが（図７ｂ参照）、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏの結合はわずかに減少した（図７ａ参照）。ＡｄｉｐｏＲ２の発現を特異的に抑制すると、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する高アフィニティー結合部位の活性は部分的に減少するが、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏに対する中アフィニティー結合部位の活性が失われることが、スキャッチャードプロット解析によって明らかとなった（図７ｃ参照）。さらに、ＡｄｉｐｏＲ２の発現を特異的に抑制すると、全長Ａｄｉｐｏに対する中アフィニティー結合部位の活性は失われるが、全長Ａｄｉｐｏに対する低アフィニティー結合部位の活性は影響されないことが、スキャッチャードプロット解析によって明らかとなった（図７ｄ参照）。
（９）ＡＭＰＫ、ＡＣＣ、ｐ３８  ＭＡＰＫ及びＭＡＰＫのリン酸化及びリン酸化量
図８ａのパネルは、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした（図中「ＡｄｉｐｏＲ１」と記載）又はしていない（図中「Ｍｏｃｋ」と記載）Ｃ２Ｃ１２細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体とを反応させた結果を示し、図８ｂのパネルは、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＣＣ抗体とを反応させた結果を示し、図８ｃのパネルは、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体とを反応させた結果を示し、図８ｄのパネルは、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体とを反応させた結果を示す。図８ｅのパネルは、ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトした（図中「ＡｄｉｐｏＲ１」と記載）又はしていない（図中「Ｍｏｃｋ」と記載）肝細胞を０．１μｇ／ｍＬ  ｇＡｄ又は１μｇ／ｍＬとともに１０分間インキュベートした後、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体とを反応させた結果を示し、図８ｆのパネルは、当該細胞の溶解物と抗リン酸化ＡＣＣ抗体とを反応させた結果を示す。図８ａ〜ｆの各パネルの下側のグラフは、パネルの各位置におけるリン酸化量を示す。なお、図中、「ｐＡＭＰＫ」はリン酸化ＡＭＰＫ、「ｐＡＣＣ」はリン酸化ＡＣＣ、「ｐｐ３８  ＭＡＰＫ」はリン酸化ｐ３８  ＭＡＰＫ、「ｐｐ４４ＭＡＰＫ」はリン酸化ｐ４４ＭＡＰＫ、「ｐｐ４２  ＭＡＰＫ」はリン酸化ｐ４２  ＭＡＰＫを表す。
ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトしていないＣ２Ｃ１２筋細胞において、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長Ａｄｉｐｏの両者がＡＭＰＫ、ＡＣＣ及びｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化量を増加させたが、ＭＡＰＫ等の他のプロテインキナーゼのリン酸化量は増加させなかった（図８ａ〜ｄ参照）。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１の発現は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  ＡｄｉｐｏによるＡＭＰＫ、ＡＣＣ及びｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化の亢進に関連していた（図８ａ〜ｄ参照）。このことは、ＡｄｉｐｏＲ１がｇｌｏｂｕｌａｒ  ＡｄｉｐｏによるＡＭＰＫ及びｐ３８  ＭＡＰＫ活性化を媒介することを示唆する。
ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトしていない肝細胞において、全長ＡｄｉｐｏはＡＭＰＫ活性化及びＡＣＣリン酸化を亢進させたが、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏは亢進させなった（図８ｅ及びｆ参照）。肝細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１の発現は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＡＭＰＫ及びＡＣＣリン酸化の亢進に関連していた（図８ｅ及びｆ参照）。このことは、ＡｄｉｐｏＲ１がｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏ及び全長ＡｄｉｐｏによるＡＭＰＫ及びＡＣＣリン酸化を媒介することができることを示唆する。
ＡｄｉｐｏＲ１をトランスフェクトしていない（図８中「Ｍｏｃｋ」と記載）Ｃ２Ｃ１２筋細胞において、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏにより亢進される脂肪酸酸化及びグルコース取り込みは、優性阻害型（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ：ＤＮ）ＡＭＰＫ又はｐ３８  ＭＡＰＫ特異的阻害剤  ＳＢ２０３５８０（Ｂａｒｇｅｒ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４４４９５−４４５０１（２００１）；Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ，Ｐ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８，９７１−９８２（２００１）；Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｌ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９８，３８２０−３８２５（２００１））によって部分的に阻害された（図８ｇ及びｈ参照）。Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＡｄｉｐｏＲ１の発現（図８中「ｍＡｄｉｐｏＲ１」と記載）は、ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏによる脂肪酸酸化及びグルコース取り込みを亢進させたが、これもＤＮ−ＡＭＰＫ又はＳＢ２０３５８０によって部分的に阻害された（図８ｇ及びｈ参照）。したがって、ＡｄｉｐｏＲ１を介したｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏによる脂肪酸酸化及びグルコース取り込みの亢進は、Ｃ２Ｃ１２筋細胞におけるＡＭＰＫ及びｐ３８  ＭＡＰＫの両者の経路に関連していると考えられた。
以上の結果は、本実施例で取得されたＡｄｉｐｏＲ１  ｃＤＮＡ（配列番号１，５）及びＡｄｉｐｏＲ２  ｃＤＮＡ（配列番号３，７）が、それぞれ生物学的機能を有するＡｄｉｐｏＲ１（配列番号２，６）及びＡｄｉｐｏＲ２（配列番号４，８）をコードすることを示す。
【産業上の利用の可能性】
本発明によって、アディポネクチン結合能を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体及び上記タンパク質に対する抗体が提供される。また、本発明によって、上記タンパク質、遺伝子、組換えベクター又は形質転換体を利用した、アディポネクチン受容体に対するリガンド、アゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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