(57)【要約】本発明は、配列番号１若しくは２に示す塩基配列のうち少なくとも２１２０〜２１３０番目の塩基配列、又は配列番号１若しくは２に示す塩基配列のうち少なくとも１〜２２０１番目、９６９〜２２０１番目、１１４２〜２２０１番目、１６９９〜２２０１番目、１８８０〜２２０１番目、２００２〜２２０１番目、２０９４〜２２０１番目若しくは２１１８〜２２０１番目の領域の塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター、及び前記プロモーターの活性を阻害又は促進することを特徴とする、転写活性調節方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２に示す塩基配列のうち少なくとも２１２０〜２１３０番目の塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
【請求項２】
配列番号１又は２に示す塩基配列のうち少なくとも１〜２２０１番目、９６９〜２２０１番目、１１４２〜２２０１番目、１６９９〜２２０１番目、１８８０〜２２０１番目、２００２〜２２０１番目、２０９４〜２２０１番目及び２１１８〜２２０１番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
【請求項３】
配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１〜３０４３番目、９６９〜３０４３番目、１１４２〜３０４３番目、１６９９〜３０４３番目、１８８０〜３０４３番目、２００２〜３０４３番目、２０９４〜３０４３番目及び２１１８〜３０４３番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
【請求項４】
配列番号２に示す塩基配列のうち少なくとも１〜３０９２番目、９６９〜３０９２番目、１１４２〜３０９２番目、１６９９〜３０９２番目、１８８６〜３０９２番目、２００２〜３０９２番目、２０９４〜３０９２番目及び２１１８〜３０９２番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のプロモーター。
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロモーターの塩基配列の一部の領域に欠失、置換若しくは挿入が生じ、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター
（ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロモーターの塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロモーター、発現の目的遺伝子及びターミネーターを含む遺伝子発現カセット。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子発現カセットを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロモーターの活性を阻害又は促進することを特徴とする、転写活性調節方法。
【請求項１０】
プロモーターの活性の阻害又は促進が、転写因子の結合活性を阻害又は促進するものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
転写因子の結合部位がＥｔｓ結合部位である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
転写因子が、ＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβ、ＧＡＢＰαとＧＡＢＰβとの複合体、Ｅｔｓ１、Ｐｅａ３、Ｔｅｌ及びＦｌｉ−１からなる群から選ばれるいずれかのものである請求項１０又は１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターに関する。
【背景技術】  シノビオリン（Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）は、関節リウマチ患者の滑膜細胞ライブラリーから、抗滑膜細胞抗体を用いた免疫スクリーニングによりクローニングされたタンパク質である。
シノビオリンは、ＲＩＮＧフィンガードメインを有するユビキチンリガーゼ（Ｅ３）であり、小胞体における品質管理を担う機能を有する。そして、シノビオリン（シノビオリン遺伝子）のアミノ酸配列（塩基配列）は、酵母Ｈｒｄ１と高い相同性を有し、酵母Ｈｒｄ１のヒトホモログとしてクローニングしたヒトｈｒｄ１と同じ分子であることが判明した（Ｋａｎｅｋｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．Ｄｅｃ  ４；５３２（１−２）：１４７−５２，２００２）。
上記小胞体の品質管理を担うために、現在までに以下の３つの機構が知られている。１つは、ＰＥＲＫ（小胞体係留蛋白質）による機構である。この機構は、翻訳開始因子であるｅｌｆをリン酸化することにより、翻訳を抑制し、ＥＲストレス（後述）を軽減するというものである。２つ目は、ＡＴＦ６、ＩＲＥ−１等のＥＲストレスを感知する小胞体膜タンパクによるＡＴＦ６、ＸＢＰ１の転写因子を介した転写調節機構である。この機構によれば、ＡＴＦ６、ＸＢＰ１は、Ｂｉｐ等のシャペロン分子の転写を誘導し、不良タンパク質の再折りたたみ反応を促進する。この反応は、ＵＰＲ（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）と呼ばれている。３つ目は、不良タンパク質を分解し、ＥＲストレスを軽減させるＥＲＡＤ（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）である（Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｊｕｎ；３（６）：４１１−２１，２００２）。このＥＲＡＤについて詳述すると以下の通りである。
すなわち、タンパク質は、細胞質で合成された後、正しい立体構造を形成して所定の場所に運ばれて初めて機能することができる。適切な高次構造がとれなかった不良又は損傷タンパク質は、細胞のもつ品質管理機能によりチェックを受けて、再生又は分解されて、細胞機能の恒常性を保つ。
小胞体内腔における生合成途中のタンパク質は不安定であるため、種々の物理化学的ストレス（例えば虚血、低酸素、熱ショック、アミノ酸飢餓、遺伝子変異等）に曝される。このようなストレスを小胞体ストレス（ＥＲストレス）と呼び、小胞体内に異常な折りたたみ構造を持つタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の出現頻度を上昇させる。立体構造に異常を来たした不良タンパク質は小胞体を出てゴルジ体に輸送されないため、そのままでは小胞体内に不良タンパク質が蓄積されてしまう。そこで、これらのＥＲストレスに対して、細胞はＵＰＲ及びＥＲＡＤと呼ばれる小胞体特異的なストレス応答機構によって、不良タンパク質を分解し、そのような不良タンパク質が蓄積することによる小胞体のストレスを防ぐのである。シノビオリンは、この３つ目の機構であるＥＲＡＤに関与し、ＥＲストレスにより誘導される（Ｋａｎｅｋｏ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．Ｄｅｃ  ４；５３２（１−２）：１４７−５２，２００２）。
一方、本発明者は、シノビオリンの発現増加が、ＥＲＡＤを亢進させることにより、ＥＲストレスによるアポトーシスの感受性を低下させ、その発現低下によりアポトーシスの感受性が増加することを証明した。
また、リウマチ滑膜細胞において、正常滑膜に比較しその発現が増加していることも確認している。そこで、関節炎におけるシノビオリンの意義を確かめるため、ヘテロノックアウトマウスにＣＩＡ（ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ；コラーゲン誘導関節炎。ウシＩＩ型コラーゲンを皮内注射し、免疫させ、産生された抗体にて関節炎を発症させるマウスモデル）を誘導した。その結果、シノビオリンの発現を半分にすることでＥＲストレスに対するアポトーシス感受性が野生型マウスに比べ減少し、ＣＩＡに抵抗性をもつことを証明した。このことから、その発現の要求性には、細胞、組織特異性があることが考えられた。
以上の知見より、シノビオリンの量の調節機構は、細胞のＥＲストレスに対するアポトーシス感受性を担っていることから、その機構の解明は大変重要である。
【発明の開示】
本発明は、シノビオリン遺伝子のプロモーターを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、シノビオリンのプロモーター領域を切断して種々の長さを有する断片についてプロモーター活性を調べた結果、そのコア領域を特定し、転写因子との相互作用を解明することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１又は２に示す塩基配列のうち少なくとも２１２０〜２１３０番目の塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
（２）配列番号１又は２に示す塩基配列のうち少なくとも１〜２２０１番目、９６９〜２２０１番目、１１４２〜２２０１番目、１６９９〜２２０１番目、１８８０〜２２０１番目、２００２〜２２０１番目、２０９４〜２２０１番目及び２１１８〜２２０１番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
（３）配列番号１に示す塩基配列のうち少なくとも１〜３０４３番目、９６９〜３０４３番目、１１４２〜３０４３番目、１６９９〜３０４３番目、１８８０〜３０４３番目、２００２〜３０４３番目、２０９４〜３０４３番目及び２１１８〜３０４３番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
（４）配列番号２に示す塩基配列のうち少なくとも１〜３０９２番目、９６９〜３０９２番目、１１４２〜３０９２番目、１６９９〜３０９２番目、１８８０〜３０９２番目、２００２〜３０９２番目、２０９４〜３０９２番目及び２１１８〜３０９２番目の領域の塩基配列からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のプロモーター。
（ａ）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプロモーターの塩基配列の一部の領域に欠失、置換若しくは挿入が生じ、かつプロモーター活性を有する塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター
（ｂ）上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のプロモーターの塩基配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有する塩基配列を含む、シノビオリン遺伝子のプロモーター
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のプロモーター、発現の目的遺伝子及びターミネーターを含む遺伝子発現カセット。
（７）上記（６）記載の遺伝子発現カセットを含む組換え発現ベクター。
（８）上記（７）記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体。
（９）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のプロモーターの活性を阻害又は促進することを特徴とする、転写活性調節方法。
上記プロモーターの活性の阻害又は促進は、転写因子の結合活性を阻害又は促進するものである。また、転写因子の結合部位としてはＥｔｓ結合部位が挙げられる。転写因子としては、例えばＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβ、ＧＡＢＰαとＧＡＢＰβとの複合体、Ｅｔｓ１、Ｐｅａ３、Ｔｅｌ及びＦｌｉ−１からなる群から選ばれるいずれかのものを例示することができる。
【図面の簡単な説明】  図１ａは、切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す。
図１ｂは、切断型シノビオリンプロモーターの活性を示す。
図１ｃは、シノビオリンプロモーターのＥｔｓ結合部位及びコア領域を示す。
図１ｄは、プロモーターに変異を導入したときの転写活性を示す。
図２ａは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２ｂは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２ｃは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図２ｄは、ゲルシフトアッセイを行なった結果を示す写真である。
図３ａは、シノビオリンプロモーターの転写活性を示す。
図３ｂは、シノビオリンプロモーターの転写活性を示す。
図３ｃは、ＲＮＡｉを利用してノックアウトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるシノビオリンプロモーターの転写活性を示す。
図４ａは、３ｋと１ｋのシノビオリンプロモーターにＬａｃＺを結合したプラスミドの構築図である。
図４ｂは、マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図４ｃは、マウス胚におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図５は、ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンプロモーターの発現を示す写真である。
図６ａは、ＲＮＡｉを利用してシノビオリンをノックダウンしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるアポトーシスを示す写真及びウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図６ｂは、デコイＯＤＮを利用してシノビオリンをノックダウンしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるアポトーシスを示す写真及びウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
図７ａは、シノビオリンが過剰発現された細胞を示す写真である。
図７ｂは、ＥＢＳデコイＯＤＮｓによるシノビオリンの発現抑制を示す写真である。
図７ｃは、シノビオリンを過剰発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＢＳデコイＯＤＮｓ処理によるアポトーシスを示す写真である。
図７ｄは、シノビオリンを過剰発現したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＥＢＳデコイＯＤＮｓ処理によるアポトーシスを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
１．概要
本発明者は、シノビオリンを中心としたリウマチ病態解析を現在行なっている。最近、シノビオリンノックアウトマウスを用いた解析において、ＥＲストレスによるアポトーシス誘導の域値にＥＲＡＤの機能を担うシノビオリンの量が関与していることを見出した。
そこで、アポトーシス誘導の感受性を決定するシノビオリンの量を調節する転写機構を解明するためにプロモーター解析を行った。
現在、シノビオリンの誘導的遺伝子発現を担う機構として、ＥＲストレスを感知しリン酸化されたＩＲＥ−１を介しスプライシングされたＸＢＰ−１による転写制御が考えられている。この制御機構は以下の通りである。すなわち、ＥＲに不良タンパク質が蓄積すると、ＥＲに局在する膜タンパク質であるＩＲＥ−１は二量体化し、分子間自己リン酸化が起こる。その結果、ＩＲＥ−１内のエンドヌクレアーゼ様ドメインが活性化してＸＢＰ−１の未成熟ｍＲＮＡをスプライシングし、成熟型ＸＢＰ−１を作製する。このＸＢＰ−１がＥＲ分子シャペロン遺伝子などの転写を促すと考えられる。
しかし、構成的遺伝子発現に関しての報告はない。そこで、まず、はじめに、マウス細胞株及びマウス胚を用いてその構成的遺伝子発現を担う部位を決定した。
その結果、シノビオリンの構成的発現を担うＥＢＳを同定し、そのエレメントがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてシノビオリンの発現に必須であることを証明した。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、そのＥＢＳを介しＥｔｓファミリーの一つＧＡＢＰα／β複合体がその転写制御に関与していることを示した。
シノビオリンの発現は、ヘテロノックアウト（ＬａｃＺ  ｋｎｏｃｋ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ）の発現解析、ノーザン、ウエスタンによる解析によればユビキタスである。つまり、多くの細胞においてシノビオリンの発現が必要とされていることが考えられる。このことは、シノビオリン  ノックアウトマウスが全身性のアポトーシス亢進にて胎生致死であることからも推察される。但し、その発現には強弱があり、特に分泌能力の高い細胞（膵臓、精巣、神経細胞）においてその発現が強い。このことは、一部の細胞においては、シノビオリンの発現が非常に高く要求されていると考えられる。
シノビオリンの量を規定する転写制御を解明するため、本発明においてプロモーター解析を行った。転写制御機構には、（ｉ）基本転写複合体を含む構成的遺伝子発現と、（ｉｉ）ある刺激に対する誘導的遺伝子発現とがある。現在まで、ＥＲストレスに対しシノビオリンが誘導されることは報告されているが、その構成的遺伝子発現に関しての報告はない。そこで、本発明者は、構成的遺伝子発現を担うエレメントの検索を行った。
シノビオリンのプロモーターにはＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列が存在しない。このようなプロモーター構成の場合、ＳＰ１やＥｔｓファミリー等の転写因子がその転写誘導において重要である（Ｒｕｄｇｅ，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．Ｍａｒ  １０；２７４（１）：４５−５５．２００２）。
Ｅｔｓファミリーは、酵母からヒトまで保存されたＥｔｓと呼ばれるドメインをもつ転写因子である。このドメインは、３０種類以上のファミリーを形成し、その多くが分化・増殖・アポトーシスを担う分子の転写活性を担っている（Ｄ．Ｋ．Ｗａｔｏｓｏｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｔｈ，；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．ｒｅｖｉｅｗ  ｉｓｓｕｅ．Ｄｅｃ  １８；１９（５５）；２０００）。
そのＥｔｓファミリーの中でもＧＡＢＰαと呼ばれる転写因子は、ターゲット遺伝子の転写制御においていくつかの特徴をもっている。まず、ＧＡＢＰαは、ＥｔｓドメインによるＤＮＡ結合能をもつが、転写活性化能を持たない。これに対し、ＧＡＢＰαのコファクターとして働くＧＡＢＰβはＤＮＡ結合能をもたず、ＧＡＢＰαと２量体を形成することにより転写活性を誘導し、ヘテロ４量体を形成することによりさらに高い転写活性化能を発揮する（Ｙｕ  Ｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｎｏｖ  １４；２７２（４６）：２９０６０−７．１９９７）。また、ＧＡＢＰαは、ＴＡＴＡボックスを持たない遺伝子や、複数の転写開始点をもつ遺伝子の発現においてイニシエーターとして働くことができる（Ｙｕ  Ｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｎｏｖ  １４；２７２（４６）：２９０６０−７．１９９７；Ｋａｍｕｒａ  Ｔ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ａｐｒ  ２５；２７２（１７）：１１３６１−８．１９９７）。さらに、ＧＡＢＰαはその発現がユビキタスであるにも関わらず、他の部位に結合するパートナーの転写因子と相乗的に働くことにより、細胞特異的な分化・増殖に関与する遺伝子の発現を担う（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  Ｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｊｕｎ  １；１７（１１）：３０７８−９０．１９９８）。
以上のことから、本発明者はシノビオリンの構成的遺伝子発現を担うエレメントを決定し、さらにそのエレメントによるＮＩＨ３Ｔ３細胞における意義について検討した。
２．プロモーター
プロモーター領域を得るには、シノビオリン遺伝子又はマウスやヒトゲノム配列等から、制限酵素を用いて切り出すことが可能である。しかしながら、一般的に都合の良い制限酵素部位が適切な位置に存在するとは限らない。そこで、予め制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することにより得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーター領域を化学合成することも可能である。
（１）プロモーター配列
配列番号１にマウスシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を、配列番号２にヒトシノビオリン遺伝子の全長プロモーター配列を例示するが、本質的に転写活性を有する配列であればこれらの配列に限定されるものではなく、全長プロモーターを切断することが可能であり、一部の領域に欠失、挿入、置換、付加などによってその塩基配列を変異させることも可能である。但し、本発明においては、コア領域（Ｅｔｓ結合部位を含む）に変異を導入するとプロモーター活性の低下を来たすことが多いため、コア領域への変異の導入は、プロモーター活性を抑制する場合に行なうことが好ましい。
遺伝子の変異の導入は、通常の部位特異的変異誘発法を採用することができ、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ：タカラバイオ）等を用いて行なうことができる
本発明のプロモーターにおいて、その機能の中核を担うコア領域は、配列番号１又は２に示す塩基配列のうち、転写開始点（配列番号１又は２に示す塩基配列の第２２０１番のｔ）を起点としてその上流側（５’側）に向かって第７１番目（−７１）から第８１番目（−８１）までの領域、すなわち、配列番号１又は２に示す塩基配列のうち第２１２０〜２１３０番目の領域である。
従って、配列番号１又は２に示す全長配列において、上記コア領域を含む限り、その長さに限定されるものではない。例えば、後述の表１及び表２（実施例１参照）に示されている全長又は切断型配列であって上記コア領域を含むものも、本発明のプロモーターに含まれる。また、配列番号１又は２に示すプロモーター配列又はこれらの切断型プロモーター配列のうち、上記コア領域を含む配列に対して相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シノビオリンのプロモーター活性を有するものも、本発明のプロモーターに含まれる。
なお、本発明においては、プロモーター領域の位置を指定する場合、配列番号１又は２に記載の塩基番号を基準として特定する場合と、転写開始点を基準として特定する場合がある。転写開始点を基準とする場合は、配列番号１又は２に示す塩基配列の第２２０１番目のチミジン（ｔ）を転写開始点（ＴＳ）とする。そして、ＴＳを起点として、上流（５’側）方向は負の符号（−）をつけて特定し、下流（３’側）方向は正の符号（＋）をつけて特定する。但し、５’方向は、ＴＳの１塩基上流（５’側）の塩基を−１とし、３’方向は、ＴＳの塩基を＋１として特定する。例えば、配列番号１に示す塩基配列の第１番目のグアニン（ｇ）は、ＴＳからみて−２２０１の位置にあり、配列番号１に示す塩基配列の第３０４３番目のグアニン（ｇ）は、ＴＳからみて＋８４３の位置にあるということになる。
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションにおいて洗浄時の塩濃度が１００〜５００ｍＭ、好ましくは１５０〜３００ｍＭであり、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の条件を意味する。また、「プロモーター活性」とは、本発明のプロモーター領域に転写因子が結合し、転写を起こさせる活性を意味する。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」するＤＮＡ断片には、上記ストリンジェンシー条件下において、その一部の領域の塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異が生じていてもハイブリダイズし得るものを含む。プロモーターは、種々の長さの切断型を生じるため、ハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有する限り上記欠失、置換、挿入、付加等の変異の数は特に限定されるものではないが、例えば１個又は数個（１個〜１０個程度、好ましくは１個〜５個程度）の塩基に上記変異を生じたものを例示することができる。
（２）組換えベクターの構築
本発明の組換えベクターは、本発明のプロモーター、発現の目的遺伝子、ターミネーターを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。これを「遺伝子発現カセット」という。遺伝子発現カセットに使用されるベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔ系等の大腸菌プラスミドベクター、あるいはｐｃＤＮＡ３系の哺乳細胞発現用プラスミドベクターやアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを例示することができる。発現の目的遺伝子は、シノビオリン遺伝子に限らず、異種構造遺伝子（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα等の各種サイトカイン遺伝子、酵素遺伝子、増殖因子遺伝子、ケモカイン遺伝子等）であってもよい。発現ベクターの構成成分をベクターに挿入することは、慣用の技術により当業者が容易に実施することができる。さらに、上記ベクターには、選択マーカー遺伝子などを含めることも可能である。選択マーカー遺伝子としては、Ｇ−４１８等の抗生物質耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子等が挙げられる。
本発明において使用し得るターミネーターは特に限定されるものではなく、例えばｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌ等が挙げられる。
（３）形質転換体
宿主へのプラスミドの導入は、宿主の形質転換に用いられている一般的な方法を採用することが可能である。すなわち、当業者に周知のプロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、及びそれらの変法を適用すればよい。宿主は特に限定されるものではなく、例えば大腸菌等の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられる。
３．プロモーターの機能解析
（１）転写活性の解析
プロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、ＣＡＴアッセイ等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている（例えばｐｒｏｍｅｇａ  ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）。
例えばルシフェラーゼアッセイの場合は、目的遺伝子の転写開始点の上流にレポーターとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結する。また、アッセイの対象となる細胞間の導入効率を補正するために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子をレポーターとしてプロモーターの下流につないだベクターを細胞に同時に導入してもよい。細胞への導入は、例えばリン酸カルシウム法等を採用することができる。ベクターを導入した細胞は所定時間培養した後に回収し、凍結−融解等によって細胞を破壊した後、一定量の細胞抽出液を用いてルシフェラーゼ及びβガラクトシダーゼ活性を測定する。
（２）ＥＭＳＡ
細胞の分化や活性化は遺伝子発現によって制御されており、転写レベルの遺伝子発現の調節は特に重要な役割を担っている。転写因子の多くはＤＮＡの応答性配列（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に異なった様式で結合することが明らかになりつつある。この転写因子相互の複雑な関係を解析する方法の１つとして、ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ：ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）がある。ゲルシフトアッセイとは、放射又は非放射標識されたプローブＤＮＡ断片とＤＮＡ結合タンパク質とを混合し、低塩濃度の未変性ゲルで電気泳動を行ない、ＤＮＡをオートラジオグラフィー等で検出する方法である。タンパク質と結合したＤＮＡは、遊離ＤＮＡと比較してゲル中で遅れて移動するため、特異的バンドとして検出することができる。ＤＮＡ−タンパク質複合体に特異的抗体を作用させると、その移動度はさらに小さくなる（これをスーパーシフトという）。多くの転写因子は、この方法で同定することができる。
ところで、細胞において、分泌タンパク質、膜タンパクなどの小胞体を経て合成されるタンパク質の一部は、小胞体の中で不良タンパク質となっており、その不良タンパク質の分解のため、細胞に必要な機構であるＥＲＡＤを担う分子の発現が必要である。このことは、後述の実施例に示すように、シノビオリンのノックアウトが胎生致死であることから明らかである。すなわち、シノビオリンは細胞に必要最低限の発現が必要であると考えられる。この転写制御に必要な部位がＥＢＳ（Ｅｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）である。このＥＢＳ部位を介したシグナルの異常は、細胞機能の維持にとって抑制的に働く。これに対し、Ｅｔｓファミリーは種類や発現が多様であり、部位への結合能が他のパートナーと相乗的に働く。これらのことは、ＥＢＳ部位を介して種々のＥｔｓファミリーの転写制御機構を備わっていることを意味する。
従って、ＥＢＳ部位に結合するタンパク質の作用を促進又は阻害することにより、本発明のプロモーターの転写活性機能を調節することができる。
転写因子としては、ＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβ、ＧＡＢＰαとＧＡＢＰβとの複合体、Ｅｔｓ１、Ｐｅａ３、Ｔｅｌ、Ｆｌｉ−１などが挙げられる。
ＧＡＢＰαは、ＥｔｓドメインをもつＥｔｓファミリーの一つであり、４５４アミノ酸を有するタンパク質である。ＧＡＢＰαは、細胞においてユビキタスに発現する。Ｅｔｓドメインを介し、ＧＡＢＰβとヘテロ２量体を形成する。さらに、２つのＥｔｓ結合部位を使用し、ヘテロ４量体を形成することが知られている。
ＧＡＢＰβはＧＡＢＰαのコファクターであり、３８２アミノ酸を有する。Ｅｔｓファミリーではない。Ａｎｋｙｒｉｎリピート配列を介しＧＡＢＰαとヘテロ２量体を形成する。また、転写活性ドメインをもつ。
Ｅｔｓ１は、１９８３年に鶏に赤芽球症を起こすレトロウイルスＥ２６の癌原遺伝子として発見されたｖ−ｅｔｓのヒトホモログであり、４４１アミノ酸を有するタンパク質である。
Ｔｅｌは、４５２アミノ酸を有するタンパク質であり、Ｅｔｓファミリーの中でも、転写抑制に働くことが報告されている。臨床的には、ｔ（１２；２１）の染色体転座によりＡＭＬ１と癒合遺伝子を形成し、白血病を起こすことが知られている。
Ｆｌｉ−１は、ｔ（１１；２２）染色体転座によりＥＷＳと癒合遺伝子を形成し、ユーイング肉腫を起こすことが知られている。４５２アミノ酸を有する。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  シノビオリンプロモーターの作製
（１）プラスミド構築
マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６系）のゲノムより、シノビオリン遺伝子を含む５’から３’まで約７．５ｋｂｐのゲノムをＳｙＢ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。その後、シノビオリン遺伝子のプロモーター領域をＸｈｏＩとＮｃｏＩで処理し、約３ｋの断片を抜き出し、ＰＧＶ−Ｂ２（ＴＯＹＯ  ＩＮＫ  ＧＲＯＵＰ）の中に挿入した（ＳｙＧ−２．２ｋ）。この約３ｋの断片を全長プロモーターとした（配列番号１）。さらに、全長プロモーターの５’側から一部の領域を削除し、プロモーター領域を短くしたコンストラクトを作製した。作製したプロモーターをまとめると表１の通りである。
2005019456.tif 000002
なお、ヒトのシノビオリン遺伝子の切断型プロモーターも、マウスの場合と同様に作成することができる。この場合の切断部位の位置を表２に示す。
2005019456.tif 000003
次に上記マウス由来プロモーターの変異体を作製するため、オーバーラップ伸長による部位特異的変異誘発法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，３ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１年，ｃｈａｐｔｅｒ  １３）を用いてＳｙＧ−２．２ｋＧ−７６Ｔ／ＢＶ２を作製した。使用したＰｒｉｍｅｒを以下に示す。
2005019456.tif 000004
ＰＣＲは、反応液５０μｌ中、１ｐｍｏｌ  ＳｙＢ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、１００ｐｍｏｌプライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、５Ｕポリメラーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）及び５０ｍＭ  ＫＣｌを含む反応組成液を用いて、以下のＰＣＲ条件で行なった。
ＰＣＲ条件
第一段階：９４℃、１分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）ｘ２５回
第二段階：１サイクル目：９４℃、１分→５５℃、３０秒→２９分かけて３０℃に落とす→３０℃、１分→９分かけて７２℃に→７２℃、１分→（９４℃、３０秒→５５℃、３０秒→７２℃、１分）ｘ２５回
ＥＢＳｍ（Ｇ−７６Ｔ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１２５番目（ＴＳから上流に向かって７６番目（−７６））のＧをＴに変異させるためのプライマーであり、
ＡＭＬｍ（Ｇ−６８Ｔ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１３３番目（ＴＳから上流に向かって６８番目（−６８））のＧをＴに変異させるためのプライマーであり、
ＳＰ１ｍ（Ｇ−９２Ａ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１１１番目（ＴＳから上流に向かって９２番目（−９２））のＧをＡに変異させるためのプライマーであり、
ＳＰ１ｍ（Ｇ−９２Ａ，Ｃ−９１Ａ）は、配列番号１に示す塩基配列の第２１１２番目（ＴＳから−９１番目）のＣをＡに、かつ、配列番号１に示す塩基配列の第２１１１番目（ＴＳから−９２番目）のＧをＡに変異させるためのプライマーである。
〔実施例２〕  シノビオリンプロモーターの機能解析
シノビオリンの量の調節機構を解明するために、プロモーター解析を行った。なお、シノビオリンは、トランスジェニックマウス（ＬａｃＺ  ｋｎｏｃｋ  ｉｎ）の解析、並びにノーザン及びウエスタンの結果よりユビキタスに発現していることがわかっている。
はじめに、シノビオリン  プロモーターのクローニング後、翻訳開始点より２．２ｋを含む領域をルシフェラーゼベクターに結合させた。様々な細胞（下記）を用いて、上流側から削ったコンストラクションにてその転写活性を調べた。なお、細胞は、１０％不活化ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて培養した。
使用した細胞
ＡＴＤＣ５：マウスｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞ＡＴ８０５由来の亜株。軟骨および色素細胞特異的。アルカリフォスファターゼ陽性。
ＨＥＫ２９３：ヒト胎児腎臓由来細胞
ＮＩＨ３Ｔ３：マウス胎仔由来線維芽細胞
トランスフェクションとレポーターアッセイは以下の通り行なった。
細胞を２×１０４／ｗｅｌｌにて２４ｗｅｌｌプレートに準備した。その２４時間後、ＦＵＧＥＮＥ６キットを使用し、キットのマニュアルに従ってトランスフェクションした（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｏｃｈｅ）。またトランスフェクション効率の補正のため、ＣＭＶ−β−ｇａｌを各５０ｎｇ使用し、さらに全ベクターのみを入れて全量を１５０ｎｇにそろえた。
トランスフェクション後３０時間でタンパク質を回収した。まず、培地を捨てた後、ＰＢＳで洗い、Ｐａｓｓｉｖｅ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μｌ用いて細胞溶解物を回収した。次にその細胞溶解物の２０μｌを９６ｗｅｌｌプレートに移した後、ルミノメーターにてルシフェラーゼ活性を測定した。さらに、β−ｇａｌ活性をプレートリーダーにて測定した後、β−ｇａｌ値でＬｕｃ値を割り補正した。なお、β−ｇａｌ染色は以下の通り行なった。β−ガラクトシダーゼはＸ−ｇａｌを用い、染色した（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；Ｓｉｇｍａ）。胚を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、Ｘ−ｇａｌ溶液に浸した後、３７℃で１２時間〜２４時間染色した。染色後、ＰＢＳで洗浄し、再度４％パラホルムアルデヒドで固定した。
その結果、プロモーター配列の−８４から−７３ｂｐの領域（１２塩基）を欠失させることによりその転写活性が１０から３０％に低下した（図１ａ、ｂ）。
上記欠失領域を含む−１１４から−１においては、マウスとヒトで９４％の相同性をもち、さらに１２塩基においては、１００％の相同性を認めた。コンピュータを用いたバイオインフォマティクス解析ソフト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｄｂ／ＴＦＳＥＡＲＣＨＪ．ｈｔｍｌ）にて解析を行った結果、その１２塩基にＥＢＳ（Ｅｔｓ結合部位）が存在することが判明した（図１ｃ）。
次に本発明者は、その領域を含む前後の領域における転写因子結合配列に変異を導入し、いくつかのＣｅｌｌ  ｌｉｎｅを用いその部位の転写に及ぼす影響について検討した。
図１ｄにみられるようにＥＢＳ（ＧＢＳともいう。図１ｄは「ＧＢＳ」と表示。）の点変異により、ほぼすべてのＣｅｌｌ  ｌｉｎｅにてその活性が約９から４０％程度に低下した。これらのことから、このＥＢＳは、シノビオリンの構成的発現を担う必須のエレメントであると考えられた。
〔実施例３〕  ＥＢＳ（−８５から−７０）につく転写因子の同定
Ｅｔｓファミリーは３０種類以上のファミリーを形成し、すべてＤＮＡ結合ドメインであるＥｔｓドメインを持っている。またその中心配列はＧＧＡＡであり、その配列への結合にはその配列に続く配列が重要であると考えられている。
まず、その１２塩基配列を含んだプローブを使用し、実際にその配列に転写因子が結合するかどうか検討した。この転写因子の結合試験は、ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行った。
ＥＭＳＡは以下の通り行った。
Ｐｒｏｂｅ
2005019456.tif 000005
ＥＭＳＡ用のプローブは、２５塩基配列のセンス鎖とアンチセンス鎖を９０℃で１０分アニーリングさせることにより作製した。
次に、Ｔ４ヌクレアーゼキナーゼ、バッファーおよびγ３２Ｐを混合し、混合液を室温で３０分反応させた。反応液をＭｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通し、採取されたカラムのフラクションを遠心にて分離し、標識したプローブを得た。放射活性は１μｌあたり３００００ｃｐｍ以上のものを使用した。
１０μｇのタンパク質、反応バッファーおよびプローブを混ぜ、室温で３０分反応させた。スーパーシフトの場合は、プローブと反応させる前に１時間４℃で反応させた。その反応液を非変性ゲルにて１００ｖ、５０ｍＡで３時間程度泳動させた。ゲルを乾燥させた後、Ｆｕｊｉｉ  ＢＡＳ２０００を用いオートラジオグラフィーにて解析した。
その結果、ＮＩＨ３Ｔ３の核抽出液を使用したゲルシフトにより、４つのバンド（図２ａのａ、ｂ、ｃ、ｄの位置のバンド）が形成されることが判明した。さらにｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ（標識していないプローブを用いた競合試験）により、そのすべてのバンドが消失し、１塩基変異を入れたプローブにおいてはその阻害が見られなかった（図２ａ）。
次に、プロモーター配列にどのＥｔｓファミリーが結合するかを検討するため、Ｅｔｓ１／Ｐｅａ３、Ｅｔｓプローブのｃｏｌｄ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎを行ったところ、ｅｔｓ１／ｐｅａ３のプローブで競合阻害され、その変異によりその阻害が消失した（図２ｂ、５と６番のレーン）。
このことは、プロモーター配列に結合する因子は、Ｅｔｓ１／Ｐｅａ３プローブ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社より購入）に結合する因子であるＥｔｓ１、Ｐｅａ３、ＧＡＢＰα等の転写因子である可能性が考えられた。さらにさまざまな抗体を使用して、スーパーシフト試験を行ったところ、ＧＡＢＰαとＴｅｌがスーパーシフトし、Ｆｌｉ−１は阻害効果を示した（図２ｂの５，６番のレーン、図２ｃの６，７，８と１０，１１，１２番のレーン）。また、ＧＡＢＰα、Ｆｌｉ−１、ｅｔｓ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物でゲルシフト試験を行ったところ、そのすべてにスーパーシフトが見られた。これらのことから、この配列には複数のＥｔｓファミリーが結合することが示された。
次に、スーパーシフトしたＧＡＢＰαによるＧＡＢＰβとの複合体形成について検討を行なった。それぞれｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物を用い、ゲルシフト試験を行ったところ、ＧＡＢＰαタンパク質にＧＡＢＰβタンパク質を加えたレーン７において、新たなバンドａ、ｂ（複合体）の形成が認められた（図２ｄ）。さらに、ＧＡＢＰα抗体を加えるとその複合体ａ、ｂが消失しスーパーシフトした（図２ｄ、レーン８、９）。またＧＡＢＰβ抗体を加えたところ、複合体ａの形成が阻害された（図２ｄ、レーン１０、１１）。
これらのことから、ＧＡＢＰα／βは、シノビオリン  プロモーターのＥＢＳにて複合体を形成することがわかった（図２ｄ）。
〔実施例４〕  ＮＩＨ３Ｔ３におけるＥｔｓファミリーによる転写制御およびＧＡＢＰαとＦｌｉ−１、Ｅｔｓ１のシノビオリン転写活性に対する効果
それぞれＥＢＳに結合する転写因子の細胞内でのシノビオリンの転写活性化能を評価するため、転写活性化アッセイを行った。
（１）ＯＤＮのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
２０ヌクレオチド長のオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）は化学合成により得た。デコイＯＤＮはセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製した。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、９６−ｗｅｌｌプレート（１×１０３個／ｗｅｌｌ）に移した。２４時間後、１ウェルあたり２０ｐｍｏｌのｄｅｃｏｙ（デコイ）ＯＤＮをウェルに入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてキットの説明書に従って３日間トランスフェクションを行った。デコイＯＤＮを有する細胞の増殖を決定するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、キットの説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。
（２）ＲＮＡｉのオリゴ作製と細胞抽出液の作製
２１ヌクレオチド長のＲＮＡは化学合成により得た。ｓｉＲＮＡはＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）のプロトコール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８．２００１）に従って作製した。対数増殖期の細胞をトリプシン処理し、９６−ｗｅｌｌプレート（１×１０３個／ｗｅｌｌ）に移した。２４時間後、１ウェルあたり２０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡをウェルに入れ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてキットの説明書に従って３日間トランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡ細胞の増殖を決定するために、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて、キットの説明書に従って細胞増殖アッセイを行った。
（３）結果
ＮＩＨ３Ｔ３において、Ｆｌｉ−１はシノビオリン転写活性を抑制し、ＧＡＢＰαはその転写活性を増加させる結果が得られた（図３ａ、ｂ）。また、ＧＡＢＰα、ＧＡＢＰβのＲＮＡｉにてノックアウトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞では、シノビオリンの転写も低下が認められた（図３ｃ）。これらのことからＮＩＨ３Ｔ３において、ＧＡＢＰα／β複合体がシノビオリンの発現を担っていることが考えられた。
さらに、そのＧＡＢＰα／β複合体がＥＢＳを介してシノビオリンの転写活性を担っていることを証明するため、ＥＢＳ（Ｇ−７６Ｔ）変異体およびＥＢＳ  ｗｉｌｄをもつプロモーター（−２００から＋８４３）を使用し転写活性アッセイを行った。
その結果、変異体が全く活性化されないにもかかわらず、野生型では約３倍の転写活性化がみられた。
（４）ウエスタンブロッティング
最後にＮＩＨ３Ｔ３を２００ｎＭのデコイで処理した後、シノビオリンの発現をウエスタンブロッティングにて評価した。
ウエスタンブロット解析は以下の通り行った。すなわち、細胞培養物を回収し、１％ＮＰ−４０，２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８，０．２５％ＳＤＳ，０．０５％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｈｔａｎｏｌ  ａｎｄ  ０．１％ｇｌｙｃｅｒｏｌを含む溶液中で溶解させた。透明な細胞溶解物のアリコートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、抗シノビオリンモノクローナル抗体を用いてイムノブロットを行った。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン及びＥＣＬ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により検出した。
その結果、ＥＢＳ野生型で処理したシノビオリンの発現は約半分に低下した。
これらのデータからＧＡＢＰα／βによりＥＢＳを介して、シノビオリンの転写が制御されていることが示された。
〔実施例５〕  マウス胚におけるシノビオリンの発現に必須の部位の同定
次に、マウスの胚においてｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥＢＳの効果を確認するため、シノビオリン  プロモーターにＬａｃＺを結合したプラスミドを過剰発現させたトランスジェニックマウスを作製した。Ｔｇは全長３ｋと１ｋのプロモーターとそれぞれ１塩基変異を入れたプロモーターを過剰発現させた４種類を作製した（図４ａ）。
トランスジェニック（Ｔｇ）マウス用のコンストラクションとＴｇマウスの作製は以下の通り行なった。
ＳｙＧ−２．２ｋ／ＢＶ２からＮｏｔＩとＮｃｏＩで約３ｋの断片を抜き出した後、ＳｙＴＢ／ｐｂｓへ挿入し、ＳｙＬ−２．２ｋｗｔ／ｐｂｓを作製した。さらに、ＳｙＬ−２．２ｋｍＧ−７６Ｔ／ｐｂｓ、ＳｙＬ−２００ｗｔ／ｐｂｓ及びＳｙＬ−２００ｍＧ−７６Ｔ／ｐｂｓを、それぞれＳｙＧより取り出した断片を用いて作製した。各構築物について、それぞれＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用し精製後、ＳｃａＩにて線状化したＤＮＡをＢＤＦマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮとＤＢＡ／２Ｎの交配による仔マウス）の受精卵の核内に直接マイクロインジェクションし、仮親の卵管に移植した。それぞれ、８から９母胎より誕生したマウスの尾からゲノムを抽出し、サザンブロット法にてＴｇマウスであることの確認を行った。
これらのＴｇマウスからシノビオリンの発現を検討するため、胚によるＸ−ｇａｌ染色を行った。そのＬａｃＺをノックインしたノックアウトマウスの胚におけるＬａｃＺの発現と今回作製した４つのＴｇマウスの発現を比較検討した。
シノビオリンの１１．５から１４．５ｄ．ｐ．ｃ（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｃｏｉｔｕｓ：胎齢）の胚を使用し、ＬａｃＺ染色を行った。３ｋと１ｋのプロモーターを導入したトランスジェニックマウスは、ヘテロノックアウトマウスとほぼ同じ部位に染色がみられた。驚いたことに、１塩基変異を導入した３ｋと１ｋのプロモーターを導入したトランスジェニックマウスは、そのどちらも発現部位がその系によりランダムになることが確認された（図４ｂ）。
転写活性化に必要な領域がなくなると、上記結果と同様の結果が得られることが報告されている（ｐａｘ５，ｃｏｌ１１ａ２等）。これらのことから、ＥＢＳは、シノビオリンの転写に必須の部位であることが判明した。
さらに、その発現とＧＡＢＰαの発現を１３．５ｄ．ｐ．ｃの胚を用いて比較したところ、ほぼ同様の部位に発現していることが判明した（図４ｃ）。以上の結果より、胚発生においても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果と同様、ＧＡＢＰαがＥＢＳを介してシノビオリンの発現を制御していることが示された。
〔実施例６〕  ＲＡ滑膜細胞におけるシノビオリンの発現
リウマチの滑膜細胞におけるＥＢＳを介したＧＡＢＰαの効果について検討を行ったところ、滑膜細胞の核抽出液を用いたゲルシフトにおいても、ＮＩＨ３Ｔ３の各抽出液のときと同様にＧＡＢＰαにてスーパーシフトが得られた。さらにそのＥＢＳのリウマチ滑膜細胞における意義、すなわちＧＡＢＰαによるＥＢＳを介した転写制御がシノビオリンの発現抑制につながり、最終的に滑膜細胞の増殖抑制となるかことを確認するため、ＥＢＳデコイによるシノビオリンの発現抑制について検討した。
その結果、約半分にその発現の低下が認められた（図５）。
以上の結果から、ＲＡ滑膜細胞においても、ＧＡＢＰα／βがシノビオリンの構成的遺伝子発現を担っていることが証明された。
〔実施例７〕  アネキシンＶによる染色とＦＡＣＳ解析
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトリプシン処理し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１×ａｎｎｅｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｙｂｒａｎｔ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度となるように調製した。１試験あたり、細胞懸濁液１００μｌを使用した。５μｇのＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよび１μｌのＰＩ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、室温で１５分間インキュベートした後、４００μｌの１×ａｎｎｅｘｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、ゆっくり撹拌した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により解析を行なった。
また、シノビオリンはＥＲストレスにより誘導されるアポトーシスに抵抗性を持つことから、シノビオリンの量とアポトーシスの関係を明らかにするために以下の実験を行なった。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を調製し、２４時間後にＧＦＰ又はＳｙｎｏｖｉｏｌｉｎのｓｉＲＮＡ（２５ｎＭ）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトし、８４時間インキュベートした。また、上記と同様にしてＥＢＳデコイＯＤＮを作製し、これをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。
その結果、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において、シノビオリンのＲＮＡｉによりシノビオリンの発現量を低下させたところ、アポトーシスが誘導された（図６ａ）。図６ａにおいて、上パネルはウエスタンブロッティングの結果を示し、下パネルはＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である（１００倍）。同様に、ＥＢＳデコイ核酸を用いてシノビオリンの転写阻害による影響をみたところ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてアポトーシスが誘導された（図６ｂ）。図６ｂにおいて、上パネルはウエスタンブロッティングの結果を示し、下パネルはＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である（１００倍）。
さらに、シノビオリンを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を作製し（図７ａ）、ＥＢＳデコイ核酸による影響を検討した。
Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎを過発現する安定細胞株の樹立については、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションの２４時間後、細胞を新鮮増殖培地で１０倍希釈して継代した。翌日、選択培地（Ｇ４１８を０．５μｇ／ｍｌ含有）を添加し、ＨＡ−Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ−ＨＡＨＡ／ｐｃＤＮＡ３発現ベクターを安定発現するクローンを得た。なお、対照として又はＨＡ−ｐｃＤＮＡ３空ベクターを使用した。各細胞株においてプラスミドからの発現を確認するため、ＨＡｔａｇに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
また、ＥＢＳデコイＯＤＮｓによるアポトーシス誘導については、次の通り実験を行った。
ＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）試薬によるＥＢＳのトランスフェクションを行って８４時間後に、細胞を回収してマイクロチューブに入れ、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣでラベルした。ＦＡＣＳ分析により、生細胞とアポトーシスを起こした細胞との分布状態を測定した。さらに、Ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ抗体を用いたウエスタンブロッティングも行った。なお、対照としてβ−アクチン抗体を使用し、安定発現の確認用としてＨＡ−抗体を使用した。
結果を図７に示す。シノビオリン過剰発現細胞ではＥＢＳデコイ核酸によるアポトーシスに抵抗性を持つ結果となった（図７ｂ、図７ｃ）。加えて、アネキシンＶを用いたＦＡＣＳによるアポトーシスの定量化を行なったところ、通常のＮＩＨ３Ｔ３細胞においては５１．１％がアポトーシスを起こしていたが、シノビオリン過剰発現細胞では、その割合が２９．８％であった（図７ｄ）。図７ｃは、１００倍の倍率によるＮＩＨ３Ｔ３細胞の顕微鏡写真である。
以上のことから、ＥＢＳを介して転写調節を抑制すると、シノビオリンの発現が抑制され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のアポトーシスが誘導されることが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明により、シノビオリンのプロモーターが提供される。本発明のプロモーターは、シノビオリンの発現を制御すること、また、シノビオリンが発現する部位に、有用遺伝子を発現させることにより、各種疾患（例えばリウマチ）の治療に用いることができる点で有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図５】
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【国際調査報告】
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