(57)【要約】本発明は、骨組織と軟骨組織が繋がっている構造を有する骨−軟骨組織の移植体；および、骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞並びに軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞が実質的に分離した状態で細胞を保持し得る足場材料に播種する工程を含む骨−軟骨組織の移植体の製造方法に関する。
2004052418.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨組織と軟骨組織が繋がっている構造を有する骨−軟骨組織の移植体。
【請求項２】
前記骨組織が細胞を保持し得る足場材料と該足場材料に保持された骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞を含み、前記軟骨組織が細胞を保持し得る足場材料と該足場材料に保持された軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を含む、請求項１に記載の移植体。
【請求項３】
足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、請求項１に記載の移植体。
【請求項４】
前記足場材料が、生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の化合物からなる構造体が形成されている請求項２に記載の移植体。
【請求項５】
内部構造マトリックス内の構造体が、多孔質構造体、あるいは、ゲルである、請求項４に記載の移植体。
【請求項６】
内部構造マトリックス内の構造体が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物、或いはこれらの誘導体からなる群から選ばれる１種または２種以上をさらに含む、請求項４に記載の移植体。
【請求項７】
骨組織の足場材料が多孔質セラミックスである、請求項２に記載の移植体。
【請求項８】
軟骨組織の足場材料がゲルである、請求項２に記載の移植体。
【請求項９】
骨形成性細胞および／または軟骨形成性細胞が、骨髄由来の幹細胞である、請求項２に記載の移植体。
【請求項１０】
骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞並びに軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞が実質的に分離した状態で細胞を保持し得る足場材料に播種する工程を含む骨−軟骨組織の移植体の製造方法。
【請求項１１】
足場材料が第１足場材料及び第２足場材料からなり、細胞を保持し得る第１足場材料に骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞を播種する工程、細胞を保持し得る第２足場材料に軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を播種する工程、骨形成性細胞を保持する第１足場材料と軟骨形成性細胞を保持する第２足場材料とを積層する工程を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
骨形成性細胞と軟骨形成性細胞を別々の培地で培養する工程をさらに包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記足場材料が、生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の生体吸収性材料からなる構造体が形成されている請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造体を構成する前記生体吸収性材料が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子及び無機化合物或いはこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記構造体が、天然高分子の構造体を形成してから、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種と複合化して製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記構造体が、天然高分子と細胞成長因子の構造体を形成してから、細胞分化制御因子、あるいは無機化合物と複合化して製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記構造体が、天然高分子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、細胞成長因子、あるいは無機化合物と複合化して製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記構造体が、天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、無機化合物と複合化して製造されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記構造体が、無機化合物の構造体が形成してから、天然高分子、細胞成長因子、あるいは細胞分化制御因子と複合化して製造されたものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の生体吸収性材料からなる構造体が形成されている骨組織形成用足場材料。
【請求項２２】
足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、請求項２１に記載の材料。
【請求項２３】
シート状物及び／又はブロック状物の積層体である、請求項２１に記載の材料。
【請求項２４】
内部構造マトリックス内の構造体が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物からなる群から選ばれる１種または２種以上を含む、請求項２１に記載の材料。
【請求項２５】
生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の化合物からなる構造体が形成されている骨−軟骨組織形成用足場材料。
【請求項２６】
骨組織形成部と軟骨組織形成部を有し、骨組織形成部と軟骨組織形成部の間に細胞の移動を制限する部分を有する請求項２５に記載の材料。
【請求項２７】
シート状物及び／又はブロック状物の積層体である、請求項２６に記載の材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、難治性変形性関節炎や事故による軟骨創傷などの骨・軟骨疾患を修復するために用いられる骨・軟骨組織の再生に関する。
【背景技術】  変形性関節症は整形外科分野において高頻度見られる疾患で、しばしば高度の機能障害をきたす。人工関節手術が外科的治療の主体を成すが、現在の金属や高分子ポリマーを材料とする人工関節部分は感染・磨耗・緩み・破損といった問題を有する。組織移植の場合では、ドナーの不足という問題に加え、ドナーが他人の場合、免疫応答に基づく拒絶反応という問題もある。このような種々の問題点の存在により、現在では、再生医工学的な手法による治療法は理想的であると考えられ、骨、軟骨組織の再生に関する研究が盛んに行われている。軟骨組織を移植する際、軟骨組織の固定化が損傷治癒に重要であり、そのために骨・軟骨組織を同時再生することが最も望ましい。
さらに、再生医工学的な手法により骨、軟骨組織を再生するためには、骨、軟骨細胞あるいは骨、軟骨細胞に分化し得る幹細胞が増殖するための足場として、また、形成している生体組織の支持体としての３次元的な多孔質性の担体材料が必要である。このような担体材料は多孔質性や生体親和性や生体吸収性などの条件が要求され、従来、ポリ乳酸（ＰＬＡ）やポリグリコール酸（ＰＧＡ）や乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）のような生体吸収性合成高分子、あるいはコラーゲンなどの天然高分子で調製した３次元的な多孔質性担体材料がよく用いられている（特開２００２−１４６０８６；特開２００２−１４６０８４；特開２００２−１４３２９１；特開２００２−１４３２９０）。
しかしながら、上記の生体吸収性合成高分子からなるものは、機械強度に優れているものの、疎水性であり、またその大きい隙間、割れ目のため、大部分の細胞は隙間を通過してしまい、その上に載らず、骨、軟骨細胞あるいは骨、軟骨細胞に分化し得る幹細胞を播種することが極めて困難である。このため、有効な細胞の播種率が得られず、これら細胞を大量に支持担体に集積することができないため、骨、軟骨組織の再生効率が低い問題点があった。一方、生体由来の天然高分子の多孔質性材料である例えばコラーゲンスポンジは、親水性で、細胞との相互作用が非常に優れており、細胞の播種の容易なものであるが、機械強度が低く、また柔らかくて捩れやすいので、臨床では取り扱いにくいという問題点を包含していた。
また、骨・軟骨組織のような階層構造を有する組織を同時再生するための多孔質性担体材料はまだ開発されていない。
本発明は、従来技術のこのような問題点を解決することを課題とするものである。具体的には、良好な生体親和性を有し、骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞、あるいは軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞の播種が容易で、播種効率が良好であり、そのためこれら細胞を大量に支持体（足場）に集積することが可能であって、骨組織、軟骨組織の再生効率が良好であるとともに、機械的強度も高く、臨床においても取扱い易い、骨形成性細胞、あるいは骨−軟骨形成性細胞の支持体を提供することにある。
さらに、本発明は、このような支持体材料に骨形成性細胞及び軟骨形成性細胞をこれらが実質的に分離された状態で積層し、骨組織と軟骨組織が繋がっている構造を有する骨・軟骨組織を同時再生するための生体内移植体を提供しようとするものである。
【図面の簡単な説明】  図１：本発明に係る代表的なシート状の生体吸収性合成高分子、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子と細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質足場材料の模式図を示す。図１中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体；
（ｂ）シート状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体；及び
（ｃ）シート状の生体吸収性合成高分子と別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、またはそれらの誘導体）からなる多孔質体との複合多孔質構造体。
図２：本発明に係る代表的なシート状の生体吸収性合成高分子、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）と無機化合物からなる多孔質足場材料の模式図。図２中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体；
（ｂ）シート状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体；
（ｃ）シート状の生体吸収性合成高分子と別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体との多孔質複合多孔質構造体；及び
（ｄ）多孔質体の外表面に無機化合物からなる被覆層を有する、シート状の生体吸収性合成高分子と、別の生体吸収性材料（天然高分子と細胞成長因子、細胞分化誘導因子またはその誘導体）の層及び無機化合物の層を有する多孔質体の複合多孔質構造体。
図３：本発明に係る代表的なブロック状の生体吸収性合成高分子、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質足場材料の模式図。図３中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体；
（ｂ）ブロック状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体；及び
（ｃ）ブロック状の生体吸収性合成高分子と別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体との多孔質複合多孔質構造体。
図４：本発明に係る代表的なブロック状の生体吸収性合成高分子、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）と無機化合物からなる多孔質足場材料の模式図。図４中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体；
（ｂ）ブロック状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体；
（ｃ）ブロック状の生体吸収性合成高分子と別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体との多孔質複合多孔質構造体；及び
（ｄ）ブロック状の生体吸収性合成高分子と、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）の層と無機化合物の層を有する多孔質体との多孔質体の複合多孔質構造体。
図５：本発明に係る代表的なシート状の生体吸収性合成高分子、別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなるゲル状足場材料の模式図。図５中：
（ａ）シート状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体；
（ｂ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなるゲル；及び
（ｃ）シート状の生体吸収性合成高分子と別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）のゲルからなる多孔質体との複合構造体。
図６：骨−軟骨組織の再生用移植体の模式図。図６中：
（ａ）第２足場材料と軟骨形成性細胞からなる軟骨組織；及び
（ｂ）第１足場材料と骨形成性細胞からなる骨組織。
図７．生体吸収性合成高分子と生体吸収性天然高分子との複合メッシュの電顕写真。
図８．生体吸収性合成高分子と生体吸収性天然高分子と無機化合物との複合メッシュの電顕写真。
図９．再生したイヌ関節の骨・軟骨組織の外観写真。
図１０．積層されたシート状足場材料の縦方向模式断面図。図１０中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体、あるいはゲル；及び
（ｂ）シート状、あるいはブロック状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体
図１１．（ａ）および（ｂ）は、本発明に係る代表的なシート状複合体材料の模式断面図。図１１中：
（ａ）別の生体吸収性材料（生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはそれらの誘導体）からなる多孔質体、あるいはゲル；及び
（ｂ）シート状、あるいはブロック状の生体吸収性合成高分子の多孔質構造体
図１２：ヒト足関節の骨・軟骨組織を再生した写真。図１２中：
（ａ）  手術前の患者の足関節のＭＲ画像（距骨内側に骨軟骨障害がみられる：矢印）；
（ｂ）  手術前の患者の足関節のＣＴ画像（距骨内側に骨軟骨障害がみられる：矢印）；
（ｃ）  幹細胞をゲル化した外観図；及び
（ｄ）  幹細胞−骨構造体（矢印）移植後のレントゲン写真。
【発明の開示】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、以下の移植体及びその製造法に関する。
項１．  骨組織と軟骨組織が繋がっている構造を有する骨−軟骨組織の移植体。
項２．  前記骨組織が細胞を保持し得る足場材料と該足場材料に保持された骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞を含み、前記軟骨組織が細胞を保持し得る足場材料と該足場材料に保持された軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を含む、項１に記載の移植体。
項３．  足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、項１に記載の移植体。
項４．  前記足場材料が、生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の化合物からなる構造体が形成されている項２に記載の移植体。
項５．  内部構造マトリックス内の構造体が、多孔質構造体、あるいは、ゲルである、項４に記載の移植体。
項６．  内部構造マトリックス内の構造体が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物、或いはこれらの誘導体からなる群から選ばれる１種または２種以上をさらに含む、項４に記載の移植体。
項７．  骨組織の足場材料が多孔質セラミックスである、項２に記載の移植体。
項８．  軟骨組織の足場材料がゲルである、項２に記載の移植体。
項９．  骨形成性細胞および／または軟骨形成性細胞が、骨髄由来の幹細胞である、項２に記載の移植体。
項１０．  骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞並びに軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞が実質的に分離した状態で細胞を保持し得る足場材料に播種する工程を含む骨−軟骨組織の移植体の製造方法。
項１１．  足場材料が第１足場材料及び第２足場材料からなり、細胞を保持し得る第１足場材料に骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の骨形成性細胞を播種する工程、細胞を保持し得る第２足場材料に軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の軟骨形成性細胞を播種する工程、骨形成性細胞を保持する第１足場材料と軟骨形成性細胞を保持する第２足場材料とを積層する工程を含む項１０に記載の方法。
項１２．  骨形成性細胞と軟骨形成性細胞を別々の培地で培養する工程をさらに包含する項１０に記載の方法。
項１３．  足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、項１０に記載の方法。
項１４．  前記足場材料が、生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の生体吸収性材料からなる構造体が形成されている項１０に記載の方法。
項１５．  前記構造体を構成する前記生体吸収性材料が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子及び無機化合物或いはこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む、項１４に記載の方法。
項１６．  前記構造体が、天然高分子の構造体を形成してから、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種と複合化して製造されたものである、項１５に記載の方法。
項１７．  前記構造体が、天然高分子と細胞成長因子の構造体を形成してから、細胞分化制御因子、あるいは無機化合物と複合化して製造されたものである、項１５に記載の方法。
項１８．  前記構造体が、天然高分子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、細胞成長因子、あるいは無機化合物と複合化して製造されたものである、項１５に記載の方法。
項１９．  前記構造体が、天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、無機化合物と複合化して製造されたものである、項１５に記載の方法。
項２０．  前記構造体が、無機化合物の構造体が形成してから、天然高分子、細胞成長因子、あるいは細胞分化制御因子と複合化して製造されたものである、項１４に記載の方法。
項２１．  生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の生体吸収性材料からなる構造体が形成されている骨組織形成用足場材料。
項２２．  足場材料がシート状物、あるいは、ブロック状物である、項２１に記載の材料。
項２３．  シート状物及び／又はブロック状物の積層体である、項２１に記載の材料。
項２４．  内部構造マトリックス内の構造体が、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物からなる群から選ばれる１種または２種以上を含む、項２１に記載の材料。
項２５．  生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に、さらに別の化合物からなる構造体が形成されている骨−軟骨組織形成用足場材料。
項２６．  骨組織形成部と軟骨組織形成部を有し、骨組織形成部と軟骨組織形成部の間に細胞の移動を制限する部分を有する項２５に記載の材料。
項２７．  シート状物及び／又はブロック状物の積層体である、項２６に記載の材料。
以下、本発明をさらに詳述する。
本発明の移植体は、骨組織と軟骨組織が繋がっている構造を有し、骨−軟骨組織が一体となったものであり、その好ましい実施態様では、軟骨組織が骨組識で支えられたものである。軟骨組織のみでは移植が困難であるが、骨組織と一体となることで、移植をより容易に行うことができる。
移植体の骨組織とは、全体が骨から構成されていてもよく、骨になり得る組織は広く包含される。例えば細胞を保持し得る足場材料、好ましくは生体吸収性材料からなる足場材料（足場）に骨形成性細胞を播種した組織、骨形成性細胞を保持した足場材料を培養液の存在下に培養して部分的に骨が形成された組織は該骨組織に包含される。骨組織の足場材料として、生体吸収性材料の他に、ハイドロキシアパタイトなどのセラミック材料を使用することもできる。
同様に、移植体の軟骨組織とは、全体が軟骨から構成されていてもよく、軟骨になり得る組織は広く包含される。例えば細胞を保持し得る足場材料、好ましくは生体吸収性材料からなる足場材料（足場）に軟骨形成性細胞を播種した組織、軟骨形成性細胞を保持した足場材料を培養液の存在下に培養して部分的に軟骨が形成された組織は該軟骨組織に包含される。軟骨組織の足場材料として、コラーゲンゲルなどのゲルを使用することができる。
骨組織と軟骨組織が繋がっている構造とは、骨組織が軟骨組織を支えることができる状態で結合している構造を意味する。例えば、骨組織と軟骨組織は相互に分離するものがなく直接繋がっているか、或いは、骨組織と軟骨組織の間に生体吸収性材料を介して繋がっているが、骨及び軟骨を再生した際には該生体吸収性材料は生体に吸収されている構造が包含される。
骨組織と軟骨組織が繋がっている構造としては、例えば骨組織と軟骨組織が層状に結合した階層構造を有するもの、骨組織上に１または複数の独立した軟骨組織が塊状に存在する構造が挙げられる。さらに骨組織にスポンジ状またはゲル状の軟骨組織を載置し、本発明の移植片としてもよい。
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、本発明の骨−軟骨組織の移植片は、骨−軟骨組織を、例えば脛骨などの他の骨組織から採取した骨膜、或いはその代用物で覆うのが好ましい。
本発明において、骨形成性細胞としては、骨を形成可能な細胞が全て包含され、例えば骨細胞、骨芽細胞、骨芽細胞に分化・誘導可能な骨髄細胞、間葉系幹細胞、体性幹細胞が例示される。生体骨から骨細胞系を得る場合、骨芽細胞のみからなるものが好ましいが、骨芽細胞の骨形成機能が破骨細胞の骨吸収機能を上回っている限り、破骨細胞が含まれていてもよい。また、骨形成性細胞として、全ての細胞が骨形成可能な細胞であるのが最も好ましいが、骨形性能を有する細胞を有する限り、骨形性能が弱いか骨形性能を有しない細胞が混在してもよい。骨形成性細胞としては、骨芽細胞が好ましい。骨形成性細胞として骨髄細胞、間葉系幹細胞などの幹細胞を使用して足場材料に播種した場合、骨形成性細胞を骨組織において骨芽細胞に分化誘導するのが好ましい。分化誘導培地として、分化誘導に適した任意の培地を使用でき、特に限定されないが、例えば、１０％ウシ胎児血清あるいは１０〜１５％ヒト血清、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地を使用することができる。このような分化誘導培地を使用して骨細胞に分化し得る幹細胞を培養し、分化させて行うことができる。
本発明において、軟骨形成性細胞としては、軟骨を形成可能な細胞が全て包含され、例えば軟骨細胞、軟骨細胞に分化・誘導可能な骨髄細胞、間葉系幹細胞、体性幹細胞が例示される。
軟骨形成性細胞としては、軟骨細胞が好ましい。軟骨形成性細胞として骨髄細胞、間葉系幹細胞、体性幹細胞などの幹細胞を使用して足場材料に播種した場合、軟骨形成性細胞を軟骨組織において軟骨細胞に分化誘導する。分化誘導培地として、分化誘導に適した任意の培地を使用でき、特に限定されないが、例えば、上記足場材料に上記軟骨細胞に分化し得る幹細胞の播種用細胞液を含浸した後、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ−β３）、１００ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ培地（分化培地）を使用することができる。このような分化誘導培地を使用して軟骨細胞に分化し得る幹細胞を培養し、分化させて行うことができる。
本発明における生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の隙間、ポアの内に備えられるコラーゲン等の天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、無機化合物などの生体吸収性材料を含む構造体として、多孔質構造体、あるいはゲルが例示される。
本発明に用いられる生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体は、主として本発明の足場材料の機械的強度を増大させるために用いられ、メッシュ体は、織物、編物、織布又は不織布等からなるものでよい。また、多孔質体は、発泡剤を利用する発泡成形法、あるいは多孔質化剤除去法等周知の方法により得ることができる。この多孔質体の発泡成型法においては、高分子化合物に発泡剤を添加し発泡剤を発泡させた後、上記高分子を硬化させる。高分子溶液中に、水溶性の糖類あるいは塩類を添加し、硬化後、該水溶性物質を水で洗浄除去すればよい。骨形成性材料の足場材料としては、多孔質ハイドロキシアパタイトなどの多孔質セラミック材料を使用することができる。
メッシュの編目の大きさあるいは多孔質体の孔の大きさは大きくなればなるほど、機械的強度は低下するものの、メッシュ単位当たりの天然高分子多孔質構造体の細孔密度が高くなり、播種細胞はこの細孔に保持されるので、複合体における播種細胞数を増大でき、骨組織、軟骨組織の再生が効率的になる。
したがって、そのメッシュの編目の大きさあるいは多孔質体の孔の大きさは、移植される生体内の場所等に応じて、求められる機械強度あるいは弾力性、あるいは骨組織、軟骨組織の再生速度等を勘案して適宜定められる。メッシュの編目の大きさとしては、例えば０．１ｍｍ〜５ｃｍが挙げられる。
メッシュ体あるいは多孔質体を形成する生体吸収性合成高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体、ポリリンゴ酸、ポリ−ε−カプロラクトンなどのポリエステル或いはセルロース、ポリアルギン酸などの多糖類等を挙げることができる。本発明において好ましく使用される生体吸収性合成高分子はポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸とグリコール酸の共重合体である
本発明の構造体を構成する、生体吸収性合成高分子とは別の生体吸収性材料としては、天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物、或いはこれらの誘導体が例示される。
天然高分子は、自然に存在する、あるいは生体に由来するもので、生体親和性を示すものであれば、何れも使用できるが、コラーゲン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ゼラチン、フィブロネクチン、及びラミニンなどから選ばれた１種以上のもの、特にコラーゲンが好ましく使用される。コラーゲンにはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ型などのものがあるが、本発明においてはこれらの何れも使用でき、これらの誘導体を使用してもよい。
細胞成長因子と細胞分化制御因子は細胞の成長、分化を制御できるものであれば、何れも使用できるが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、デキサメタゾンなどから選ばれた１種以上のもの或いはこれらの誘導体があるが、本発明においてはこれらの何れも使用できる。
無機化合物は骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞の接着、成長、分化誘導を促進するものであれば、何れも使用できるが、ハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムなどから選ばれた１種以上或いはこれらの誘導体があるが、本発明においてはこれらの何れも使用できる。
生体吸収性合成高分子からなるメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内に形成される、さらに別の生体吸収性材料からなる構造体の細孔は、播種細胞の増殖及び組織再生の足場とするものであり、細孔は連続していることが好ましい。その大きさは１〜３００μｍ、好ましくは２０〜１００μｍ程度とするのがよい。
また、本発明においては、メッシュ状（シート状を含む）の足場材料の厚みは、生体複合材料の使用態様によって適宜定めればよいが、通常０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍである。その空隙率は、通常５０％以上である。ブロック状の足場材料の厚みは、通常３〜５０ｍｍ、好ましくは５〜２０ｍｍである。その空隙率は、通常５０％以上である。
本発明の１つの好ましい内部構造マトリックス内の構造体は多孔質構造体であり、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内、すなわちメッシュ体の編目あるいは多孔質体の孔内に、生体吸収性天然高分子またはその誘導体を含み、さらに細胞成長因子、細胞分化制御因子及び無機化合物またはその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む多孔質体をさらに形成したものである（図１、図２）。本発明の多孔質構造体を有する足場材料は種々の方法により製造することができるが、例えば、前記生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体と生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子、無機化合物またはそれらの誘導体などの生体吸収性材料からなる多孔質構造体とを架橋結合または吸着させることにより得ることができる。
なお、以下の方法において、多孔質構造体は、生体吸収性材料の少なくとも１種を含むものであるが、該材料は、生体吸収性天然高分子またはその誘導体を必須成分として含み、さらに細胞成長因子、細胞分化制御因子及び無機化合物またはその誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むものである。
例えば内部構造マトリックス内の構造体は、
天然高分子の構造体を形成してから、細胞成長因子、細胞分化制御因子および無機化合物からなる群から選ばれる少なくとも１種と含浸、浸漬、塗布などにより複合化してもよく、天然高分子と細胞成長因子の構造体を形成してから、細胞分化制御因子および／または無機化合物と含浸、浸漬、塗布などにより複合化してもよく、
天然高分子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、細胞成長因子および／または無機化合物と含浸、浸漬、塗布などにより複合化してもよく、
天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子の構造体を形成してから、含浸、浸漬、塗布などにより無機化合物と複合化してもよい。なお、天然高分子と細胞成長因子の構造体は、天然高分子溶液の代わりに天然高分子と細胞成長因子の溶液を用いて同様に製造することができる。天然高分子と細胞分化制御因子の構造体、天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子の構造体も同様である。また、メッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックスが予め無機化合物と含浸、浸漬、塗布などにより複合化してから、前記構造体を形成してもよい。
この作製方法の好ましい方法の１つとしては、（１）１次構造体である生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体に２次構造体を構成する生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子或いはそれらの誘導体などの１種以上の溶液を付着、含浸せしめた後、続いて、（２）凍結乾燥し、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤で処理することにより架橋するものである。
上記工程（１）においては、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子或いはそれらの誘導体などは１種以上混ぜてから、含浸せしめるか、あるいはそれぞれ１種以上を混ぜて行われる。
上記工程（１）においては、前記１次構造体である生体吸収性合成高分子メッシュ体（多孔質構造体）を前記生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはこれらの誘導体の水溶液で処理する。処理方法としては種々のものがあるが、浸漬法や塗布法が好ましく採用される。
浸漬法は、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはこれらの誘導体の水溶液の濃度や粘度が低い場合に有効であり、具体的には、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子またはこれらの誘導体の低濃度水溶液に生体吸収性合成高分子メッシュ体を浸漬することにより行われる。
塗布法は、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子の水溶液の濃度や粘度が高く、浸漬法が適用できないときに有効であり、具体的には、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子の高濃度水溶液を生体吸収性合成高分子メッシュ体に塗布することにより行われる。
本発明で用いられる架橋剤としては、従来公知のものが何れも使用できる。好ましく使用される架橋剤は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドのようなアルデヒド類、特にグルタルアルデヒドである。
本発明の架橋化は、前記したように、上記の架橋剤をガス状にして用いるのが好ましい。
具体的には、上記天然高分子多孔質体を架橋するに際し、一定温度で一定濃度の架橋剤又はその水溶液で飽和した架橋剤蒸気の雰囲気下で一定時間架橋を行う。
架橋温度は、生体吸収性合成高分子メッシュ体が溶解せず、且つ架橋剤の蒸気が形成できる範囲内で選定すればよく、通常、２０℃〜５０℃に設定される。
架橋時間は、架橋剤の種類や架橋温度にもよるが、上記天然高分子多孔質体の親水性や生体吸収性を阻害せず、かつ生体移植時にこのものが溶解しないような架橋固定化が行われる範囲に設定するのが望ましい。
架橋時間が短くなると、架橋固定化が不十分となり、移植後生体内で天然高分子多孔質体が短時間で溶解する恐れがあり、また架橋時間が長いほど架橋化が進むが、架橋時間があまり長過ぎると、親水性が低くなり、骨形成性細胞、軟骨形成性細胞の足場材料に対する播種密度が低くなり、細胞の贈殖及び組織再生が効率よく行われないほか、生体吸収性も低下する等の問題点を生じるので好ましくない。好ましい架橋時間は１０分から１２時間程度である。
他の作製方法としては、（１）１次構造体としての生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体に２次構造体を構成する生体吸収性天然高分子またはその誘導体の１種以上の溶液を付着、含浸せしめた後、（２）凍結乾燥し、好ましくはガス状ないし液状の架橋剤で処理することにより架橋し、次いで、（３）カルボジイミドなどの水溶性架橋促進剤で処理し、細胞成長因子及び／又は細胞分化制御因子或いはそれらの誘導体と架橋反応するものである。
上記工程（１）においては、生体吸収性天然高分子またはその誘導体は１種以上混ぜてから、含浸せしめて行われる。含浸方法は上記に記載の方法と同様である。
上記工程（３）においては、２次構造体の生体吸収性天然高分子またはその誘導体の多孔質体をあらかじめカルボジイミドなどの水溶性架橋促進剤で処理した後、細胞成長因子、細胞分化制御因子のそれぞれ１種類以上の混合水溶液に含浸することにより行うのが好ましい。
本発明の第２の足場材料はゲル状の構造体であり、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内、すなわちメッシュ体の編目あるいは多孔質体の孔内に、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子及びそれらの誘導体からなるゲル構造体をさらに形成したものである。
この作製方法としては、（１）１次構造体の生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体に生体吸収性天然高分子、細胞成長因子、細胞分化制御因子などの１種類以上の溶液を付着、含浸せしめた後、続いて、（２）ゲル化することにより架橋するものである。
ゲルを構成する天然高分子としては、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンまたはアルギン酸及びこれらの材料の誘導体が挙げられる。
ゲル状構造体作製の具体例としては、低温で生体吸収性天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子などの１種類以上のもの、あるいはそれぞれ１種以上のものの混合溶液を１次構造体の多孔質体に導入してから、３７℃までに温度を上げてゲル化する方法、あるいは、低温で生体吸収性天然高分子と細胞成長因子と細胞分化制御因子などの１種以上の混合溶液をさらに、架橋剤と混ぜてから１次構造体の多孔質体に導入し、３７℃まで温度を上げてゲル化する方法が挙げられる。架橋剤としては、エポキシ化合物、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネートなどが挙げられる。
上記の図１に示されるメッシュ状の多孔質構造体の代わりに図３に示されるブロック状の多孔質構造体を用いることにより、上記と同様にして対応するブロック状の足場材料を得ることが可能である。
本発明の第３の足場材料は多孔質構造体であり、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内、すなわちメッシュ体の編目あるいは多孔質体の孔内に、生体吸収性天然高分子、細胞成長因子および細胞分化制御因子からなる群から選ばれる少なくとも１種と無機化合物からなる多孔質体をさらに形成したものである（図２）。
この作製方法としては、上記に記載の多孔質構造体の表面に無機化合物の微粒子を沈着、あるいはコーティングすることにより、行われる。無機化合物の微粒子を沈着、あるいはコーティングする方法は特開２００２−１４３２９１に記載されている。
上記の図２に示されるメッシュ状の多孔質構造体の代わりに図４に示されるブロック状の多孔質構造体を用いることにより、上記と同様にして対応するブロック状の足場材料を得ることが可能である。
本発明の複合材料の望ましい形状は、シート状の形状であり、このような形状の生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の内部構造マトリックス内、すなわちメッシュ体の編目あるいは多孔質体の孔内に、天然高分子の多孔質構造体を形成させる。このシート状物の全体の厚さは、通常０．１〜５ｍｍ、好ましくは０．１〜１ｍｍが好ましく、また、上記天然高分子多孔質構造体の厚さは適宜調製できるが、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体とほぼ同じ厚さに形成するのが好ましい。その多孔質構造体の空隙率は、通常８０％以上である。なお、本明細書においてシート状物というときは、メッシュ状物、フィルム状物ないし膜状物を包含する（図１，２，５）。
本発明において、シート状の足場材料中に形成されるコラーゲンスポンジ等の天然高分子の多孔質構造体は薄いことが好ましい。薄い多孔質構造体においては、播種用細胞液が多孔質体の細孔にもれなく含浸でき、結果として足場材料において保持される細胞の密度が高まり、骨及び軟骨組織の再生が速やかにかつ効率的に行われることになる。
骨形成性細胞ないし軟骨形成性細胞を播種した足場材料を１枚のシートで用いると薄い骨−軟骨組織の再生が可能であるが、図１０に示すように、これら細胞を播種した足場材料を積層して用いることもできる。この場合において再生される骨及び軟骨の厚みは、骨組織及び軟骨組織に使用されるシートの枚数により調節可能である。図１０のものは、積層されたシート状足場材料の各々において細胞の播種が行われているので、播種された細胞の密度は１枚のシート状足場材料と同様に高く、これを移植体として生体内に移植すれば、骨−軟骨組織の再生が良好に行われる。
骨組織と軟骨組織を積層する場合、骨組織と軟骨組織の厚みは、同じであっても異なっていてもよい（図６）。軟骨組織の厚みは、通常０．４〜７．０ｍｍ程度であり、骨組織の厚みは、０．４〜３０ｍｍ程度である。
本発明の移植体は、骨形成性細胞或いは軟骨形成性細胞を播種した後、培養することなく使用してもよいが、好ましくは２週間から２ヶ月程度培養後に移植体とするのが好ましい。
例えば、図１１（１）に示されるような、本発明のシート状の足場材料を製造するには、シート状の生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体を生体由来の天然高分子の水溶液中に位置させて凍結し、凍結乾燥する。これにより、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体が天然高分子多孔質構造体中にサンドイッチされているシート状の足場材料が形成される。
また、図１１（２）に示されるような、シート状の生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体を生体由来の天然高分子水溶液の上面或いは下面で凍結し、凍結乾燥すると、片面が生体吸収性合成高分子メッシュ体あるいは多孔質体で、他面が天然高分子多孔質構造体であるシート状足場材料が形成される。
なお、図１１（１）および（２）は、模式図であり、これらによれば、天然高分子多孔質構造体が生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の表面に形成されているように記載しているが、図１の模式図からも明らかなように、実際には、天然高分子多孔質構造体は、生体吸収性合成高分子のメッシュ体の編目あるいは多孔質体の孔内にも形成される。
本発明における軟骨形成性細胞ないし骨形成性細胞を保持する足場材料の他の好ましい実施形態においては、生体吸収性合成高分子のメッシュ体あるいは多孔質体の隙間、ポアの内にコラーゲン等の天然高分子、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インシュリン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、骨形成因子（ＢＭＰ）、デキサメタゾンなどの細胞成長因子と細胞分化制御因子、ハイドロキシアパタイト、三リン酸カルシウムなどの無機化合物からなる構造体をさらに形成した足場材料により構成される。
本発明において用いる軟骨細胞および軟骨細胞に分化し得る幹細胞は常法により生体組織から調製する。
軟骨細胞は、生体軟骨組織をコラーゲナーゼ、トリプシン、リバラーゼ、プロティナーゼ等の酵素処理により、細胞外マトリックスを分解処理し、次いで血清培地を添加し、遠心して、軟骨細胞を単離する。単離した軟骨細胞を培養フラスコに播き、１０％ウシ胎児血清，４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ血清培地）で培養する。十分な細胞数になるまで、２〜３回継代培養し、この継代培養した細胞をトリプシン処理により回収し、播種用細胞液とする。
また、軟骨細胞に分化し得る幹細胞は、直接遠心により単離か、あるいは骨髄抽出液をパーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）からなる密度勾配媒体を用いた密度勾配遠心法により遠心して単離する。これらの細胞を培養フラスコに播き、ＤＭＥＭ血清培地で十分な細胞数となるまで、２〜３回継代培養する。継代培養した細胞をトリプシン処理により回収し、播種用細胞液とする。
本発明の足場材料に、軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞を播種するには、上記足場材料を培養液で濡らしておき、この足場材料に上記播種用細胞液を含浸するか、あるいは上記足場材料に直接播種用細胞液を含浸することにより行う。或いは、軟骨形成性細胞を低温で生体吸収性天然高分子と細胞成長因子及び細胞分化制御因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶液を混ぜてから、１次構造体の多孔質体に導入し、３７℃まで温度を上げてゲル化する方法、あるいは、低温で生体吸収性天然高分子と細胞成長因子及び細胞分化制御因子からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶液をさらに、軟骨形成性細胞と架橋剤と混ぜてから、１次構造体の多孔質体に導入し、３７℃まで温度を上げてゲル化する方法が例示される。
上記播種用細胞液の細胞濃度は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが望ましく、足場材料の体積以上の容量の細胞液を播種することが望ましい。
本発明の軟骨組織を再生するため、軟骨細胞を利用する場合、上記足場材料に上記播種用細胞液を含浸した後、さらに、培養液を添加し、該複合体中の軟骨細胞をＤＭＥＭ血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータにおいて培養増殖させることにより、軟骨組織移植体を得る。
幹細胞の場合は、さらに軟骨細胞への分化工程が必要であり、上記足場材料に上記軟骨細胞に分化し得る幹細胞の播種用細胞液を含浸した後、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍＬトランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ−β３）、１００ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ培地（分化培地）で培養し、分化させて当該移植体を得る。
本発明において用いる骨細胞に分化し得る幹細胞は常法により生体組織から調製する。骨細胞に分化し得る幹細胞は、直接遠心により単離か、あるいは骨髄抽出液をパーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）からなる密度勾配媒体を用いた密度勾配遠心法により遠心して単離する。これらの細胞を培養フラスコに播き、ＤＭＥＭ血清培地で十分な細胞数となるまで、２〜３回継代培養する。継代培養した細胞をトリプシン処理により回収し、播種用細胞液とする。
骨細胞は、生体骨組織をコラーゲナーゼ等の酵素処理により、細胞外マトリックスを分解処理し、細胞を遊離させることにより得られる。また、培養容器の上に粉砕した骨片を培養し、骨片周辺から遊出した細胞から単離する。単離した骨細胞を１０％ウシ胎児血清、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を加えたＤＭＥＭ培地で培養する。
本発明において骨組織を再生するために、骨細胞と、骨細胞に分化し得る幹細胞はどちらを利用しても良いが、骨細胞に分化し得る幹細胞を利用することが望ましい。
本発明の足場材料に、骨形成性細胞を播種するには、上記足場材料を培養液で濡らしておき、この足場材料に上記播種用細胞液を含浸するか、あるいは上記足場材料に直接播種用細胞液を含浸することにより行う。
上記播種用細胞液の細胞濃度は、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが望ましく、足場材料の体積以上の容量の細胞液を播種することが望ましい。
骨細胞に分化し得る幹細胞は、１０％ウシ胎児血清あるいは１０〜１５％ヒト血清、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地で培養し、分化させて骨組織の移植体を得ることができる。
さらに軟骨組織部分と骨組織部分を積層して、軟骨組織培養培地と骨組織培養培地をそれぞれ軟骨組織部分と骨組織部分に通すバイオリアクターを用いて培養し、骨−軟骨組織を再生する。
上記の軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞を播種し、積層した軟骨組織部分と上記の骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞を播種し、積層した骨組織部分をさらに重ねて、通常の生体吸収性の縫合系で縫って、あるいはテフロンなどのプラスチックのクリップで挟んで、軟骨組織部分と骨組織部分を接触する。これを通常のバイオリアクターの中に入れ、１０％ウシ胎児血清あるいは１０〜１５％ヒト血清、抗生物質、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータにおいて培養する。あるいは、軟骨組織部分と骨組織部分を重ねたものを軟骨組織培養用培地と骨組織培養培地をそれぞれ、軟骨組織部分と骨組織部分に提供するバイオリアクターで培養する。軟骨組織培養用培地は４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ−β３）と１００ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ培地で構成する。骨組織培養培地は１０％ウシ胎児血清あるいは１０〜１５％ヒト血清、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地で構成する。それぞれの培地の流速は調整が可能である。
本発明の移植体は、骨組織と軟骨組織が繋がったものであり、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞は、足場材料において、実質的に分離した状態で存在しているのが好ましい。「実質的に分離した状態」とは、骨組織と軟骨組織の界面付近では骨形成性細胞と軟骨形成性細胞が重なっている部分があってもよいが、その重なっている部分はできるだけ少ない方がよく、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞の重なりは骨−軟骨結合にほとんど或いは全く影響せず、軟骨が骨に支えられているものであればよい。例えば骨形成性細胞と軟骨形成性細胞を各々第１足場材料と第２足場材料に播種し、次いで得られた第１足場材料（骨組織）と第２足場材料（軟骨組織）を積層し、必要に応じてこれを培養したものは、「実質的に分離した状態」に該当する。或いは、１つの足場材料において、骨組織形成部と軟骨組織形成部を図５に示される生体吸収性シートのような骨形成性細胞と軟骨形成性細胞の移動が制限される部分を形成し、該足場材料に骨形成性細胞と軟骨形成性細胞を播種し、必要に応じて培養したものも「実質的に分離した状態」に該当する。培養の過程で足場構造は徐々に分解ないし吸収されるので、骨形成性細胞と軟骨形成性細胞は界面付近で混ざり得るが、この程度は実質的に分離した状態の範囲内である。また、骨形成性細胞には軟骨形成性細胞が少ない割合で混合することがあり得、軟骨形成性細胞には骨形成性細胞が少ない割合で混合することがあり得るが、このような場合も、骨及び軟骨が移植に適するように形成される範囲内であれば、「実質的に分離した状態」に該当する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
【実施例１】  機械強度が高い生体吸収性高分子である乳酸とグリコール酸との共重合体（ＰＬＧＡ）メッシュ体を０．３ｗｔ％のブタ腱由来ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン酸性水溶液に浸漬し、−８０℃で１２時間凍結した。次にこの凍結物を、真空減圧下（０．２Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、ＰＬＧＡメッシュ体とコラーゲンスポンジとのシート状の未架橋足場材料を製造した。
得られた未架橋複合生体材料を３７℃で、２５ｗｔ％のグルタルアルデヒド水溶液で飽和したグルタルアルデヒド蒸気で４時間架橋処理した後、リン酸緩衝液で１０回洗浄した。さらに、０．１Ｍグリシン水溶液に４時間浸漬し、リン酸緩衝液で１０回洗浄した後、蒸留水で３回洗浄し、−８０℃で１２時間凍結した。これを真空減圧下（０．２Ｔｏｒｒ）で２４時間凍結乾燥し、本発明で軟骨細胞あるいは軟骨細胞に分化し得る幹細胞、あるいは骨細胞あるいは骨細胞に分化し得る幹細胞を播種し、培養する足場材料の１種類である生体吸収性合成高分子と生体吸収性天然高分子の複合多孔質体、ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを得た。
この足場材料を金でコーティングし、それらの構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。１００倍拡大した写真を図７に示す。
【実施例２】  実施例１で得られたＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で緩衝した１００ｍＭの塩化カルシウム水溶液（２０ｍＬ）に浸漬し、３７℃の恒温槽で３時間インキュベートした。ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを塩化カルシウム水溶液から取り出し、６００ｒｐｍの速度で遠心処理した。遠心したＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液で緩衝した１００ｍＭのリン酸水素二ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）に浸漬し、３７℃の恒温槽で３時間インキュベートした。ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュをリン酸水素二ナトリウム水溶液から取り出し、６００ｒｐｍの速度で遠心した。遠心したＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを、再び上記の塩化カルシウム水溶液とリン酸水素二ナトリウム水溶液に交互浸漬し、６回までこの交互浸漬を繰り返した。
得られたＰＬＧＡ−コラーゲン−ハイドロキシアパタイト多孔質複合構造体を金でコーティングし、その構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。２００倍拡大した写真を図８に示す。
このＳＥＭ写真によれば、ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュの細孔表面にハイドロキシアパタイト微粒子が沈着している状態が観察される。また、繰り返した交互浸漬の回数の増加と共に、沈着したハイドロキシアパタイト微粒子の沈積量と粒径が大きくなっていることが分った。
実施例１で作成したＰＬＧＡメッシュ体とコラーゲンスポンジとのシート状多孔質構造体を酸化エチレンガスで滅菌した。
試験例１
（１）軟骨組織の形成
イヌ肘関節の軟骨から薄い軟骨片をメスで剃りおろし、細かく刻んだ後、０．２（ｗ／ｖ）％のコラーゲナーゼを含有するＤＭＥＭ培地中で３７℃で１２時間インキュベートした。そして、ポアサイズが７０μｍのナイロンフィルターで濾過した上澄みを１５００ｒｐｍで５分間遠心し、１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、イヌ肘の軟骨細胞を得た。得られた軟骨細胞を１０％ウシ胎児血清，抗生物質、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリンおよび５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２回継代培養した軟骨細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ細胞液を調製した。
次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュをＤＭＥＭ血清培地で濡らし、複合体（膜）の縁をゴムのリングで囲って、０．５ｍｌ／ｃｍ２細胞液を滴下した。インキュベータ中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、４時間静置して培養した。その後、ゴムのリングを取り外し、多量の培養液を入れて、培養を続けた。２４時間後、細胞を播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを転倒し、複合体（膜）の縁をゴムのリングで囲って、ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュの下面にも０．５ｍｌ／ｃｍ２細胞液を滴下し、軟骨細胞を播種した。インキュベータ中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、４時間静置して培養した。その後、ゴムのリングを取り外し、多量の培養液を入れて、培養を続けた。２４時間後、細胞を２回播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを積層し、テフロンのクリップで積層体の回りを挟んで、軟骨組織層を得た。
（２）骨組織の形成
イヌの大腿骨から採集した骨髄を１５００ｒｐｍで遠心することにより、細胞を単離し、ファルコンのＴ−７５培養フラスコ中で１０％ウシ胎児血清、抗生物質、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を加えたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２４時間後、培地を交換し、接着していない細胞を捨てて、フラスコの表面に接着した骨髄細胞に１０％ウシ胎児血清、抗生物質、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸を加えた新しいＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を続けた。培地は２日間ごと交換した。
２回継代培養した骨髄細胞を０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ骨髄細胞液を調製した。次に、酸化エチレンガスで滅菌した上記実施例２のＰＬＧＡ−コラーゲン−ハイドロキシアパタイト多孔質複合構造体をＤＭＥＭ血清培地で濡らし、複合体（膜）の縁をゴムのリングで囲って、０．５ｍｌ／ｃｍ２細胞液を滴下した。インキュベータ中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、４時間静置して培養した。その後、ゴムのリングを取り外し、多量の培養液を入れて、培養を続けた。２４時間後、細胞を播種したＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュを転倒し、複合体（膜）の縁をゴムのリングで囲って、ＰＬＧＡ−コラーゲン複合メッシュの下面にも０．５ｍｌ／ｃｍ２細胞液を滴下し、骨髄細胞を播種した。インキュベータ中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、４時間静置して培養した。その後、ゴムのリングを取り外し、１０％ウシ胎児血清あるいは１％ヒト血清、抗生物質、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地を大量に入れて、培養を続けた。２４時間後、細胞を２回播種したＰＬＧＡ−コラーゲン−ハイドロキシアパタイト多孔質複合構造体を積層し、テフロンのクリップで積層体の回りを挟んで、骨組織層を得た。
（３）骨−軟骨組織移植体の移植
上記の軟骨組織層と骨組織層をテフロンのクリップで挟んで、１０％ウシ胎児血清、抗生物質、１０００ｍｇ／Ｌグルコース、５８４ｍｇ／Ｌグルタミン、０．４ｍＭプロリン、５０ｍｇ／Ｌアスコルビン酸、１００ｎＭデキサメタゾン、１０ｍＭグリセロリン酸を加えたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータにおいて培養した。２週間培養した後、複合体をヌードマウスの背中の皮下に移植した。移植後８週の時点で検体を採収した。図９に示すように８週間後軟骨層表面光沢があり、色が乳白色であることが観察された。また、検体をＨＥ染色とｓａｆｒａｎｉｎ−０染色を行った結果、軟骨層に小窩内小円形細胞とＳａｆｒａｎｉｎ−０染色性細胞外マトリックスが認められた。さらに検体から抽出したｍ−ＲＮＡ試料中にタイプＩＩコラーゲンやアグリカンを発現するｍ−ＲＮＡが検出同定された。骨層から抽出したｍ−ＲＮＡ試料中にオステオカルシンを発現するｍ−ＲＮＡが検出同定された。これらのことにより、再生した組織が骨・軟骨組織であることを確認した。
【実施例３】  インフォームドコンセントを得て、距骨に骨−軟骨障害を有する患者の腸骨から第一回目の骨髄１０ｍＬを採集した。採集した骨髄を１５００ｒｐｍで遠心することにより、細胞を単離し、ファルコンのＴ−７５培養フラスコ中で１５％自己血清、抗生物質、αＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。２日後、培地を交換し、接着していない細胞を捨ててフラスコの表面に接着した骨髄細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養を続けた。培地は２日間ごと交換した。これにより、軟骨細胞あるいは骨細胞へ分化し得る幹細胞を多く含む接着性細胞集団が増殖する。
上記の培養細胞を２回継代培養して０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞液を調製した。この細胞液に多孔体のハイドロキシアパタイトセラミックを浸漬させたのち、１５％自己血清、抗生物質、αＭＥＭ培地に８２μｇ／ｍｌアスコルビン酸，１０ｍＭグリセロリン酸，１００ｎＭデキサメサゾン添加してさらに２週間培養をおこない、セラミック表面ならびに気孔内に骨芽細胞と骨基質すなわち骨形成を生じさせた。
第一回の骨髄採取から２週間後に第２回目の骨髄採取を第一回目と同様におこない、接着性細胞を増殖させた。この培養細胞を２回継代して０．０２５％トリプシン／０．０１％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（−）で剥離・採集し１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞液を調製した。この細胞液をコラーゲン水溶液と混合し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養し、コラーゲンと細胞溶液をゲル化させた。
以上の２回採取された骨髄から、骨形成を生じたセラミックを作製でき、さらに軟骨あるいは骨細胞へ分化し得る幹細胞がゲル状態に保持できた。そこで、患者の手術をおこなった。患者足関節を展開し、骨軟骨障害のある距骨を露出させた。この距骨表面内側に約１×２ｃｍの軟骨変性がみられた。この部分を軟骨と下層の骨を一体として摘出した。
上記のコラーゲンゲルを基盤とした軟骨細胞へ分化可能な幹細胞を、セラミック（多孔体のハイドロキシアパタイト）を基盤とした骨組織層に載せ、骨−軟骨組織の移植体を作製し、この摘出部分に充填した。さらに脛骨より採取した骨膜を覆って縫合した。
移植後の組織形成はレントゲン写真により観察した。術後のレントゲン観察によりセラミックと周囲の骨組織の一体化がみられた。また、足関節の疼痛は軽減し、足関節の安定性も獲得できた。以上より、骨、軟骨組織が形成していることが類推できた。
このように、幹細胞−骨構造体を作製することにより、セラミックを基盤とする上には幹細胞が骨形成を営み、セラミック表面と安定な結合を生じた。さらに関節面に接する部分には軟骨形成が生じ、骨軟骨の同時再生が可能であることを示した。
本発明によれば、軟骨組織を骨組織で支えることが可能であるので、軟骨組織の再生を効率よく行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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