(57)【要約】本発明は、ヒトＨＣＣに関与する蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子及び医薬用途を提供することを目的とする。  本発明は、新規な細胞周期調節活性を有する蛋白質（ＦＲＭ蛋白質）と、該蛋白質をコードする核酸分子を提供した。さらに、該細胞周期調節蛋白質の生物活性を変化（亢進または阻害）させることを含む、細胞周期調節方法、前記細胞周期調節蛋白質の生物活性を変化（亢進または阻害）する活性を有する物質を含んでなる医薬組成物、ならびに、肝疾患（特に肝がん）または腎疾患の治療剤または予防剤としての前記医薬組成物を提供した。
2004061102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞周期調節蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の細胞周期調節蛋白質又はその塩。
（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡによりコードされる蛋白質。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質の部分ペプチド又はその塩。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養して、請求項２に記載の蛋白質を生成せしめることを特徴とする、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質又はその塩の製造方法。
【請求項７】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質若しくは請求項３に記載の部分ペプチド又はそれらの塩に対する抗体。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体を用いて請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩を定量する方法。
【請求項９】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを含む、細胞周期調節方法。
【請求項１０】
Ｇ２〜Ｍ期の細胞において、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞ががん細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の細胞内における内在量を増加または減少させることにより、該蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを特徴とする、請求項９から１１のいずれか１に記載の方法。
【請求項１３】
抗がん剤の使用を組み合わせてなることを特徴とする、請求項９から１２のいずれか１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗がん剤の使用が、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の細胞内における内在量を増加または減少させる手段と同時であるか、あるいは、一定時間間隔をおいて該手段の前後である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗がん剤がタキソールまたはその塩である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドの発現を亢進または抑制することを含む、請求項９から１１のいずれか１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質をコードするポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により、前記蛋白質の生物活性を抑制することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ干渉に用いるＲＮＡ分子が、配列番号：４および配列番号：５に記載の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子、または配列番号：６および配列番号：７に記載の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質をコードするｍＲＮＡのＲＮＡ干渉を媒介する作用を有する、１９〜２５塩基長の二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子。
【請求項２０】
配列番号：４および配列番号：５に記載の塩基配列、または配列番号：６および配列番号：７に記載の塩基配列からなる、請求項１９に記載の二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子。
【請求項２１】
請求項９から１８のいずれか１に記載の方法の使用を含む、細胞死の誘導方法。
【請求項２２】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害する物質を含んでなる医薬組成物。
【請求項２３】
前記物質が、（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチド、（ｂ）請求項２に記載の蛋白質若しくはその塩、（ｃ）請求項３に記載の部分ペプチド若しくはその塩、または、（ｄ）請求項７に記載の抗体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
肝疾患または腎疾患の治療剤または予防剤である請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
肝疾患が肝がんである、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
肝疾患または腎疾患の治療・予防剤の製造のための、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩または請求項３記載の細胞周期調節蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩の使用。
【請求項２７】
請求項２２に記載の組成物の治療上有効量を患者に投与することを特徴とする、肝疾患または腎疾患の治療または予防方法。
【請求項２８】
請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質もしくは請求項３に記載の部分ペプチドまたはそれらのｍＲＮＡを検出または定量することを含む、肝疾患または腎疾患の診断方法。
【請求項２９】
細胞周期調節蛋白質をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩、または、請求項３に記載の部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３０】
（ａ）請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質を発現する細胞に被験試料を接触させ；
（ｂ）前記蛋白質の生物活性の変化を検出し測定するか、または、当該細胞の細胞死を測定することを含む、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項３１】
細胞周期調節蛋白質をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩、または、請求項３に記載の部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する物質のスクリーニング用キット。
【請求項３２】
請求項２９もしくは３０に記載の方法または請求項３１に記載のキットにより単離されうる、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なヒト細胞周期調節蛋白質、それをコードするポリヌクレオチド、その製造方法及び用途等に関する。
【背景技術】  肝細胞癌（ＨＣＣ）はヒトにおいて最も多い癌の一つであり、その発生がＢ型又はＣ型肝炎ウィルスの感染やそれに続く炎症、肝臓の再生などと深く関わることが知られており、ＨＣＣ発生の分子レベルのメカニズムには不明な点が多い。本願発明者らは既に、ラットＨＣＣと密接に関与し、肝臓及び腎臓で特異的に発現するラットＨＰ３３蛋白質を見出すとともに、この蛋白質がラットＨＣＣ細胞や肝臓の再生過程で過剰に発現していること、また細胞内で微小管の中心体付近に局在し、その局在が細胞周期により変動することなどについて報告している（ＷＯ９９／０００４９５、Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２，１３５３−１３６４（１９９９））。又、ＨＰ３３蛋白質はウシＮ−アシルトランスフェラーゼと相同性が高く、哺乳類のアシルトランスフェラーゼファミリーは肝再生や肝癌において発現レベルが変化するとの報告がなされているが、その分子レベルでのメカニズムは不明であった。また、ラットＨＰ３３や、ウシＮ−アシルトランスフェラーゼに対応するヒトホモログ蛋白質は、全く知られていなかった。
ヒトＨＣＣにおいて特異的に発現または増加している蛋白質やその蛋白質をコードする遺伝子を同定し、その蛋白質の機能を解明することができれば、癌発生の機構解明と癌治療用の医薬品の開発に非常に有用であると期待することができる。一方で、近年、ｃＤＮＡの断片であるＥＳＴが数多くデータベースに登録されており、他の哺乳類等における配列情報をもとにヒトホモログ蛋白質をコードするＤＮＡ配列が探索されているが、このように相同性のみに基づいて探索した遺伝子は偽遺伝子である可能性が高いことも示唆されており、それが実際にヒトホモログ蛋白質をコードするかどうかを確認し、機能を解明するのはそれだけでは困難である。
【発明の開示】
本発明者らは上記事情に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ラットＨＰ３３蛋白質のアミノ酸配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮデータベース検索により、塩基配列の相同性が６３％であるヒトの遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０１３０９３）を見出し、これを「ＦＲＭ」と名付けるとともに、ＰＣＲによりＦＲＭのＤＮＡ断片を増幅し、当該断片を使用してヒト肝臓のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、いくつかのクローンを得るに至った。そして、これらのクローンを用いて配列を解析した結果、配列番号：１に記載されたｃＤＮＡの全塩基配列を得た。これにより、ラットＨＰ３３とヒトＦＲＭのｃＤＮＡはどちらも８８８ｂｐのヌクレオチドからなり、２９５のアミノ酸をコードすること、両ＤＮＡが有意に高い相同性を有していることを確認した（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ６３％、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ７４％）。さらに、ノーザンブロット法によりヒトの各臓器におけるＦＲＭ  ｍＲＮＡの発現解析を行ったところ、ヒトＦＲＭ遺伝子がラットＨＰ３３遺伝子と同様に肝臓及び腎臓のみで転写されていることを確認し、又、ヒトＦＲＭ蛋白質を特異的に認識する抗体を用いた免疫組織学的手法により、ヒトＦＲＭ蛋白質がラットＨＰ３３蛋白質と同様にＨＣＣ細胞において過剰発現していることを見出し、これらの共通点から、ヒトＦＲＭ蛋白質がラットＨＰ３３蛋白質のヒトホモログ蛋白質であることを確認した。本発明者らは以上の知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）細胞周期調節蛋白質をコードする、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ、（ｄ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；（２）下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の細胞周期調節蛋白質又はその塩：（ａ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡによりコードされる蛋白質；（３）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質の部分ペプチド又はその塩；（４）前記（１）に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター；（５）前記（４）に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。（６）前記（５）に記載の形質転換体を培養して、前記（２）に記載の蛋白質を生成せしめることを特徴とする、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質又はその塩の製造方法；（７）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質若しくは前記（３）に記載の部分ペプチド又はそれらの塩に対する抗体；（８）前記（７）に記載の抗体を用いて前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩を定量する方法；（９）前記（２に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを含む、細胞周期調節方法；（１０）Ｇ２〜Ｍ期の細胞において、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを特徴とする、前記（９）に記載の方法；（１１）細胞ががん細胞である、前記（９）または（１０）に記載の方法；（１２）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の細胞内における内在量を増加または減少させることにより、該蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害することを特徴とする、前記（９）から（１１）のいずれか１に記載の方法；（１３）抗がん剤の使用を組み合わせてなることを特徴とする、前記（９）から（１２）のいずれか１に記載の方法；（１４）前記抗がん剤の使用が、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の細胞内における内在量を増加または減少させる手段と同時であるか、あるいは、一定時間間隔をおいて該手段の前後である、前記（１３）に記載の方法；（１５）前記抗がん剤がタキソールまたはその塩である、前記（１３）または（１４）に記載の方法；（１６）前記（２）に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドの発現を亢進または抑制することを含む、前記（９）から（１１）のいずれか１に記載の方法；（１７）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質をコードするポリヌクレオチドを標的とするＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）により、前記蛋白質の生物活性を抑制することを含���、前記（１２）に記載の方法；（１８）ＲＮＡ干渉に用いるＲＮＡ分子が、配列番号：４および配列番号：５に記載の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子、または配列番号：６および配列番号：７に記載の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子に記載の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子である、前記（１７）に記載の方法；（１９）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質をコードするｍＲＮＡのＲＮＡ干渉を媒介する作用を有する、１９〜２５塩基長の二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子；（２０）配列番号：４および配列番号：５に記載の塩基配列、または配列番号：６および配列番号：７に記載の塩基配列からなる、前記（１９）に記載の二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子；（２１）前記（９）から（１８）のいずれか１に記載の方法の使用を含む、細胞死の誘導方法；（２２）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質またはその塩の生物活性を亢進または阻害する物質を含んでなる医薬組成物；（２３）前記物質が、（ａ）前記（１）に記載のポリヌクレオチド、（ｂ）前記（２）に記載の蛋白質若しくはその塩、（ｃ）前記（３）に記載の部分ペプチド若しくはその塩、または、（ｄ）前記（７）に記載の抗体である、前記（２２）に記載の組成物；（２４）肝疾患または腎疾患の治療剤または予防剤である前記（２２）に記載の組成物；（２５）肝疾患が肝がんである、前記（２４）記載の組成物；（２６）肝疾患または腎疾患の治療・予防剤の製造のための、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩または前記（３）記載の細胞周期調節蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩の使用；（２７）前記（２２）に記載の組成物の治療上有効量を患者に投与することを特徴とする、肝疾患または腎疾患の治療または予防方法；（２８）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質もしくは前記（３）に記載の部分ペプチドまたはそれらのｍＲＮＡを検出または定量することを含む、肝疾患または腎疾患の診断方法；（２９）細胞周期調節蛋白質をコードする前記（１）に記載のポリヌクレオチド、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩、または、請求項３に記載の部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法；（３０）（ａ）前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質を発現する細胞に被験試料を接触させ、（ｂ）前記蛋白質の生物活性の変化を検出し測定するか、または、当該細胞の細胞死を測定することを含む、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法；（３１）細胞周期調節蛋白質をコードする前記（１）に記載のポリヌクレオチド、前記（２）に記載の細胞周期調節蛋白質もしくはその塩、または、前記（３）に記載の部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する物質のスクリーニング用キット；（３２）前記（２９）もしくは（３０）に記載の方法または前記（３１）に記載のキットにより単離されうる、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩、に関するものである。
本発明者らは、ヒトＦＲＭ蛋白質およびラットＨＰ３３蛋白質を用いて鋭意研究を重ねた結果、当該蛋白質について以下の事を見出した。
まず、臓器特異的な発現及びＨＣＣにおける過剰発現のメカニズムを探索するため、ＦＲＭ蛋白質のゲノムＤＮＡ配列を解析したところ、そのプロモーター領域にいくつかの転写因子結合領域の候補を見出した。そこで、それぞれの候補領域を欠損させたレポータープラスミドを作成してヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２に導入した結果、ＦＲＭ蛋白質の発現にはＳｐ１結合領域及び転写因子としてＳｐ１が必要であることが明らかになった。
続いて、ＦＩＳＨ法による解析の後、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｒｖｅｒを用いて検索した結果、ＦＲＭ遺伝子が１１番染色体の１１ｑ１３．２領域に位置することを確認した。
ＨＣＣ細胞においてＳｐ１が過剰発現することは既に報告されており（Ｙａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ（２００１）１５（９）：１５０７−１５１６、Ｘｕ，Ｘ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００１）９８（２６）：１５０８９−９４）、また、１１番染色体の１１ｑ１３．２領域は、各種癌疾患、特にＨＣＣと乳癌において増幅されることが知られる（Ｇｅｒｇｅｌｙ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０００）９７（２６）：１４３５２−７、Ｒａｆｆ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）１２（５）：２２２−５）。これらの事実から、ＨＣＣにおけるＦＲＭ蛋白質の過剰発現は、２つの異なる機構、即ち転写制御と遺伝子増幅に由来することが明らかとなり、ＦＲＭ蛋白質の過剰発現とＨＣＣの相関性が示された。このような特異的な発現の機構は、ラットＨＰ３３蛋白質やウシＮ−アシルトランスフェラーゼについては解明されていなかった。
また、正常ラット由来のＲＬ−３４細胞株を用いて、ラットＨＰ３３過剰発現株及び発現抑制株を作成し、チューブリン、ＤＮＡ及びＨＰ３３蛋白質を染色して観察したところ、アンチセンス法によりＨＰ３３蛋白質の発現を抑制したものについてはＦＲＭ蛋白質だけでなく、チューブリンも消失していることが確認された。
次に、ＨＰ３３アンチセンス発現プラスミドの導入によりＨＰ３３蛋白質の発現を抑制したラット由来肝臓癌細胞株と、通常のラット由来肝臓癌細胞株とをそれぞれラットに移植したところ、ＨＰ３３の発現が抑制された個体においては、発現抑制されていない個体に比較して、腫瘍の増殖が有意に抑制されることを確認した。
続いて、ＦＡＣＳ法によって、ＨＰ３３過剰発現株及びＲＬ−３４細胞株におけるタキソール（Ｔａｘｏｌ）感受性を比較したところ、ＲＬ−３４細胞株においては効果が見られない程度の微量のタキソールを添加しても、ＨＰ３３過剰発現株においてはＧ１期の細胞がＧ２／Ｍ期に移行することが確認された。このことから、ＨＰ３３の過剰発現とタキソールの共作用は、当該細胞の死を進行させるということができる。
さらに、ＦＲＭ蛋白質発現抑制株及びＦＲＭ蛋白質過剰発現株での細胞分裂時のＤＮＡと微小管の様子を蛍光顕徴鏡で観察したところ、ＦＲＭ蛋白質発現抑制株の細胞において、他の細胞における確率よりも有意に高い確率で微小管の形成異常がおこることを確認した。
ヒト肝癌細胞株において、ｓｉＲＮＡ法（ＲＮＡ干渉）により該細胞内のヒトＦＲＭ蛋白質の発現を抑制したところ、前記細胞にアポトーシスが誘導されることを示した。
【図面の簡単な説明】  図１は、ノーザンブロット法によるＦＲＭｍＲＮＡの発現解析の結果を示す。
図２は、抗ラットＨＰ３３抗体及びヒトＦＲＭ蛋白質の交差反応の実験結果を示す。
図３は、抗ラットＨＰ３３抗体を用いて、ＨＣＣ細胞におけるＦＲＭ蛋白質の発現を解析した免疫組織化学検査の結果を示す。
図４は、５’末端を欠損した種々のプロモーター／ルシフェラーゼ・レポーター系を示す模式図である。
図５は、ＨｅｐＧ２細胞及び、Ｈｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較を示す。
図６は、Ｓｐ１を過剰発現させた場合とさせなかった場合の、ＨｅｐＧ２細胞とＨｅｌａ細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較を示す。
図７は、ＦＲＭ遺伝子の染色体上の局在を確認したＦＩＳＨ法による解析の結果を示す。
図８は、ラットＨＰ３３過剰発現株及び発現抑制株においてＦＲＭ蛋白質、チューブリン及びＤＮＡを染色した結果を示す。
図９は、ラット由来肝臓癌細胞株においてＨＰ３３遺伝子の発現を抑制した場合としなかった場合の、腫瘍重量の変化を示す。
図１０は、ＦＲＭ過剰発現株におけるタキソール感受性検査の結果を示す。
図１１は、ＦＲＭ発現抑制株における細胞分裂時の微小管形成異常の様子を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本願明細書において記載する記号、用語等の意義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
本発明にかかる単離されたＦＲＭのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、ＦＲＭ蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に、それぞれ示す。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする塩基配列を含む限りいかなるポリヌクレオチドであってもよく、例えばＤＮＡであっても、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであっても、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖には、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが含まれる。一本鎖の場合はセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。又、その配列が本発明に含まれる限り、細胞や組織に由来するものも、合成されたものや増幅されたものも本発明に含まれる。
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチドも含む。当該「蛋白質」は、ＦＲＭ蛋白質と同質の生物学的活性を有する蛋白質を意味する。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載のＤＮＡに変異を導入することにより得られる。かかる「変異を導入する方法」としては、例えば部位特異的変異導入法を用いることができる。この方法によれば、まず変異させたい遺伝子をＭ１３ファージ等のベクターの一部に組み込んで一本鎖環状のファージＤＮＡを得て、これに変異を導入するよう一部の塩基を変更して設計されたオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせたのち、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡリガーゼで修復して一部ミスマッチの状態になった二本鎖環状ＤＮＡとする。これを大腸菌等に感染させて培養すると、二本鎖の組換え体Ｍ１３の複製の際、変異株と非変異株が分離してそれぞれ一本鎖となって個々のファージ粒子に入る。そこで変異が導入された方の鎖のみ選ぶことで、特定の部位に所望の変異を有する配列を得ることができる。この他、適当な制限酵素を用いて付着末端を生じさせ、そのままＤＮＡリガーゼで連結して数塩基の欠失を起こさせる方法、エラーが起こりやすい条件下でＰＣＲにより増幅することで一定の領域にランダムな変異を入れる方法、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法など公知の方法、又はそれに準じた方法を用いて変異を導入することができる。また、人為的に変異を導入したポリヌクレオチドだけでなく、細胞内で自然に誘発された変異を有するポリヌクレオチドも、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードする限り、本発明に含まれる。
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡも包含する。配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号：１に記載の塩基配列がコードする蛋白質を含む融合蛋白質をコードするＤＮＡが挙げられる。このようなＤＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡと、融合させる蛋白質をコードするＤＮＡとを、フレームが一致するように連結することで得ることができる。例えば、配列番号：１に記載の塩基配列のいずれかの末端に７つのＨｉｓｔｉｄｉｎｅをコードするポリヌクレオチドを連結して発現させれば、Ｈｉｓタグを有するＦＲＭ蛋白質を得ることができるので、ＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）カラムに吸着し、０〜４００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で溶出することができる。
本発明にかかるポリヌクレオチドには、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。前記ストリンジェントな条件は適宜選択することができるが、好ましくは、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃といった条件とすることができる。ストリンジェンシーはＳＳＣの濃度及び温度などでコントロールすることができ、高ストリンジェントな条件を選択すれば、より高い相補性を有するポリヌクレオチドを得ることができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドはＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
本発明にかかるＦＲＭ蛋白質は、ラットＨＰ３３蛋白質のヒトホモログ蛋白質であり、そのアミノ酸配列がＦＲＭ蛋白質に含まれる限り、生体に由来する蛋白質も合成された蛋白質も本発明に含まれる。ＦＲＭ蛋白質は、例えばヒトの肝細胞や腎細胞のホモジネートから通常の蛋白質精製の方法によって精製して得ることができ、後述のように本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを適当な宿主に導入することで得ることもできる。又、自体公知の無細胞系蛋白質合成方法によっても製造することができる。
本願明細書における蛋白質のアミノ酸配列は通常のペプチド表記に従い、左端がＮ末端、右端がＣ末端である。本発明の蛋白質のＣ末端は通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）化されているものも本発明に含まれる。ここで、エステルのＲとしては、例えば１〜１０個好ましくは１〜６個の炭素数のアルキル基であることができ、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、飽和していても１つ以上の二重結合を含有してもよく、１つ以上の官能基を有していてもよい。また、Ｎ末端がホルミル基、アセチル基などのアシル基で保護されているものや、ピログルタミン酸化されているものも本発明に含まれる。Ｎ末端及びＣ末端以外のアミノ酸の側鎖上の置換基がアミド化、エステル化されているもの、ホルミル基やアセチル基などで保護されているもの、又、糖鎖が結合した糖蛋白質などの複合蛋白質も本発明に含まれる。
本発明にかかるＦＲＭ蛋白質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質に加え、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失、置換及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質も含む。該蛋白質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに変異を導入することにより製造することができる。具体的には、例えば上述の部位特異的変異導入法を用いて配列番号：１に記載の塩基配列の特定の部位に所望の変異を導入し、このＤＮＡを挿入したベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、目的の蛋白質を発現させることができる。
本発明にかかる「配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡによりコードされる蛋白質」とは、例えば配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと別の蛋白質をコードするＤＮＡが連結されたＤＮＡがコードする蛋白質全体を意味する。このような蛋白質には、ＦＲＭ蛋白質を含む融合蛋白質が含まれ、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡが挿入された発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養し、発現した蛋白質を回収することにより得られる。融合させる蛋白質は特に限定されないが、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などが精製のために好ましく、またＨｉｓタグのようなオリゴペプチドであってもよい。ＧＦＰ等の蛍光蛋白質との融合蛋白質は検出の際有用である。
本発明における「塩」は、薬理学的に許容される塩である限りにおいて特に種類は限定されず、例えば塩酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩などの無機酸との塩、あるいは酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
本発明はまた、ＦＲＭ蛋白質の部分ペプチドを含むが、該「部分ペプチド」としては例えば、ＦＲＭ蛋白質がその生理的リガンドと結合する部位に相当するペプチドが挙げられる。このような部分ペプチドを用いれば、ＦＲＭ蛋白質がそのリガンドと結合するのを拮抗的に阻害することが可能であり、またＦＲＭ蛋白質の結合部位に結合しうる化合物のスクリーニングにも用いることができる。ＦＲＭ蛋白質の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法で得ることもできるし、公知の固相または液相ペプチド合成法により合成することもでき、またＦＲＭ蛋白質を適当なペプチダーゼや臭化シアンなどで切断することによっても得ることができる。
本発明にかかる組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクターを意味し、宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることができるものであれば制限はなく、プラスミド、ファージ、コスミドのいずれであってもよい。プラスミドとしては、大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌由来、枯草菌などのグラム陽性菌由来、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ由来、酵母由来のものなどがあり、宿主に適合するよう選択される。また薬剤耐性遺伝子や栄養要求性を有する遺伝子などを選択マーカーとして適宜挿入しておくことにより、プラスミドの安定性や有用性を向上させることができる。ファージとしては、例えば大腸菌を宿主とする場合に良く用いられるλファージ系やＭ１３ファージ系などが挙げられ、溶菌ファージであるか溶原ファージであるかを問わない。動物細胞を宿主とする場合は、ベクターとしてＳＶ４０、パピローマウィルス、ワクシニアウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルスなどのウィルスＤＮＡを用いたものが使用される。又、選択された宿主においてＦＲＭ蛋白質が効率よく発現するよう、宿主に適したプロモーター配列、エンハンサー配列、シャインダルガーノ配列、シグナル配列、ポリＡシグナルなどを適宜選択し、ベクターに挿入することができる。
本発明にかかる形質転換体は、本発明の組換えベクターで形質転換させた形質転換体も含む。本発明の形質転換体は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターに適した宿主を選択し、この宿主に前記ベクターを導入することにより得られる。宿主としては、例えば大腸菌や緑膿菌などのグラム陰性菌、枯草菌などのグラム陽性菌、放線菌、酵母、糸状菌、動植物培養細胞、昆虫培養細胞などが挙げられる。動物細胞の場合は健常動物由来の細胞（例えばラット由来ＲＬ−３４）であっても、疾患を有する動物由来（例えば肝臓癌ラット由来ＦＡＡ−ＨＴＣ１）であってもよい。また、動物細胞を宿主とする方法には、動物の受精卵に遺伝子を導入することにより、その遺伝子を先天的にもったトランスジェニック動物を得て、その動物が産生する蛋白質を得る方法も含まれる。その他、ショウジョウバエにＰエレメントという転移因子を用いて遺伝子を導入する方法、バキュロウィルスをカイコに感染させ、カイコが産生した蛋白質を体液から得る方法も含まれる。
ベクターの導入方法としては、宿主が大腸菌である場合には塩化カルシウム法、枯草菌を宿主とする場合にはコンピテントセル法や酢酸リチウム法、枯草菌、放線菌、酵母などにはプロトプラスト法、動植物細胞、酵母、細菌などに広く用いられる方法としてリン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ−デキストランやポリブレンなどのポリマーと複合体を形成させる方法などから適宜選択することができる。又、カチオン性脂質のリポソームと複合体を形成させるリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いることもできる。
本発明はまた、本発明の形質転換体を培養して、ＦＲＭ蛋白質又はその塩を生成せしめることを特徴とする、ＦＲＭ蛋白質又はその塩の製造方法も含む。形質転換体の培養は、宿主細胞の特性、発現する蛋白質の特性、プロモーターの特性などにより選択することができ、例えばＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社）等の公知の培地を使用することができる。また、例えば抗生物質耐性を有するプラスミドを用いた場合は、当該抗生物質を培地に添加することにより目的蛋白質の発現を調節することができ、又ラクトース依存性プラスミドを使用した場合はＩＰＴＧを培地に添加して発現を誘導することができる。
このようにして得た形質転換体を培養して発現させたＦＲＭ蛋白質は、通常の蛋白質の精製方法を用いて精製することができ、使用した発現系により、例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過法、塩析、浸透圧ショック法、超音波処理などを組み合わせて精製することができる。クロマトグラフィー法としては、例えば、水溶液中で行うイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。本発明はこれらの精製方法を用いて精製された蛋白質も含む。
また、発現させた蛋白質は、精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を用いて修飾を加えたり部分的にペプチドを除去したりすることもでき、これらの修飾された蛋白質も本発明に含まれる。蛋白質修飾酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、プロテインキナーゼやグルコシダーゼなどが挙げられる。尚、当業者は、発現した蛋白質が遊離した状態であれば塩に、塩として得られた場合に遊離した状態に容易に変えることができる。
本発明にかかる抗体は、ＦＲＭ蛋白質に特異的に結合するものであればよく、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。ヒト以外の哺乳動物を本蛋白質で免疫することによって得た抗体のほか、ヒト抗体や、遺伝子組換えにより得られた抗体も、本発明のＦＲＭ蛋白質に特異的に結合する限り本発明に含まれる。本発明にかかる抗体は、自体公知またはそれに準じた方法により製造することができるが、以下に代表的方法を例示する。ポリクローナル抗体は、ＦＲＭ蛋白質を用いて哺乳動物、好ましくはマウスやラット等のげっ歯目、ウサギ目、サルなどの霊長目の動物を免疫し、血清を得て、この血清をＦＲＭ蛋白質又は部分ペプチドを固定したアフィニティーカラムに通して精製することにより得ることができる。またモノクローナル抗体は、まず同様に哺乳動物を免疫し、この動物から得た抗体産生細胞と、増殖力の強いミエローマ細胞とを融合させ、個々の融合細胞を分離し、求める抗体の生産能を検定することによって抗原の一つのエピトープに特異的に反応する抗体分子を１種だけ生産する細胞を選択し、この細胞を培養することによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、このベクターを宿主に導入して産生させて遺伝子工学的方法で得ることもできる。ヒト抗体遺伝子を導入したトランスジェニック動物を免疫すれば、ヒト抗体を産生することもでき、マウスのモノクローナル抗体の抗原結合部位をコードするｃＤＮＡとヒトのＩｇＧ遺伝子の定常部をコードする遺伝子を連結してこれをＢリンパ球に導入すればキメラ抗体分子を生産させることも可能であり、これらの抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体は、ＦＲＭ蛋白質を特異的に認識して結合する限り、フラグメントや修飾された抗体であってもよい。抗体のフラグメントとしては例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃフラグメント、またはシングルチェインＦｖなどが挙げられ、修飾された抗体としては例えばポリエチレングリコールなどの化合物と結合された抗体などが挙げられる。本発明の抗体は、ＦＲＭ蛋白質の精製や検出、定量に用いることができるし、またＦＲＭ蛋白質の生物学的活性を亢進または抑制する作用を有する場合には、アゴニスト又はアンタゴニストとなりうる。
本発明は、本発明の抗体を用いて、ＦＲＭ蛋白質を定量する方法も含む。具体的には、本発明の抗体（フラグメントを含む）を適当な方法で標識し、この標識を検出及び／又は定量することにより、ＦＲＭ蛋白質を検出及び／又は定量することができる。標識の方法には、放射性同位体や安定同位体を用いる同位体による方法と、抗体分子の末端を蛍光性の基や紫外部や可視部に吸収を持つ置換基で標識する置換基による方法、酵素標識して酵素活性を測定する方法などがある。標識する抗体は、本発明の抗体であってもよいし、また本発明の抗体を抗原として認識する二次抗体であってもよい。
本発明にかかる「細胞周期調節方法」とは、細胞内にあるＦＲＭ蛋白質の生物活性を変化、即ち、亢進または阻害することにより、前記細胞の細胞周期を調節して細胞分裂を制御する方法を意味する。前記「生物活性を亢進または阻害する」とは、ＦＲＭ蛋白質に直接または間接的に作用することにより、ＦＲＭの生物活性を変化させることを意味し、例えば、（１）ＦＲＭ蛋白質をコードする遺伝子の発現を亢進または抑制することによってＦＲＭ蛋白質を過剰発現または発現抑制すること（例えば、該蛋白質をコードするポリヌクレオチドの転写制御により蛋白質発現を亢進または抑制する）；（２）ＦＲＭ蛋白質を添加する等により内在量を増加または減少させること；（３）ＦＲＭ蛋白質と直接または間接的に相互作用することによりＦＲＭの活性を亢進または阻害すること、等があげられる。かかる「亢進または阻害」するために有用な物質の具体例としては、例えばＦＲＭ蛋白質をコードするポリヌクレオチド、ＲＮＡ干渉作用を有する二本鎖ＲＮＡ、ＦＲＭ蛋白質またはその塩、ＦＲＭ部分ペプチドまたはその塩、ＦＲＭ蛋白質の抗体、ＦＲＭ蛋白質のアゴニスト・アンタゴニスト、その他ＦＲＭ蛋白質に親和性を有する物質等があげられる。例えば、前記「細胞周期調節方法」を用いることにより、用いられた細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導することができる。
本発明にかかる前記「細胞周期調節方法」は、好ましくは増殖中の細胞、即ち、細胞分裂過程にある細胞において有用で、Ｇ２期からＭ期のいずれかの段階にある細胞に最も有用である。対象となる細胞は正常細胞でもがん細胞・腫瘍細胞であってもよく、がん細胞に用いれば、抗がん作用・抗腫瘍作用が得られる。
前記ＲＮＡｉ（またはｓｉＲＮＡ）法に用いる二本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子は、ＦＲＭ蛋白質をコードする遺伝子を不活性化、即ち、該遺伝子の発現を抑制する作用を奏する限りにおいて得に限定されないが、好ましくは１９〜２５塩基長を有する二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子であり、より好ましくは１９〜２３塩基長、最も好ましくは２３塩基長を有する二本鎖ＲＮＡ分子または二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子である。例として以下の塩基配列を標的ＤＮＡとする二本鎖ＲＮＡ分子があげられ、かかるＲＮＡ分子は、二本鎖のうちの一方を以下のいずれかのＤＮＡ塩基配列をセンス鎖とし、他方はその相補鎖、即ち、該センス配列に対するアンチセンス鎖である。
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本発明者らは、ヒトＦＲＭ蛋白質及びラットＨＰ３３蛋白質は、肝臓および腎臓において特異的に発現すること、ＨＣＣにおいて過剰発現していること、癌細胞においてその発現を抑制すると腫瘍の増殖が抑制されること、細胞内において過剰発現させた上で、式
【化１】
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で表されるタキソール（Ｔａｘｏｌ（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；
（２Ｒ，５Ｒ，７Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ）−１０，２０−Ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙ）−２−ｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙ−１，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｏｘｏ−５，２０−ｅｐｏｘｙｔａｘ−１１−ｅｎ−１３−ｙｌ
（３Ｓ）−３−ｂｅｎｚｏｙｌａｍｉｎｏ−３−ｐｈｅｎｙｌ−Ｄ−ｌａｃｔａｔｅ））またはその塩を添加するとその細胞の死が誘導されること、アンチセンス法により細胞内での発現が抑制されるとその細胞のアポトーシスが誘導されること、アンチセンス法により細胞内での発現が抑制されるとその細胞で微小管形成の異常が発生する確率が高くなること等を見出した。
本発明にかかる「細胞周期調節方法」は、各種抗癌剤との併用される方法であってもよい。前記抗癌剤として好適なのは、タキソールまたはその塩である。抗癌剤の使用は、ＦＲＭ蛋白質の生物活性を亢進または阻害する手段を用いるのと同時であってもよいし、一定時間間隔をおいて前記手段の前または後の使用であってもよい。ＦＲＭ蛋白質の細胞内濃度を変化させたり、ＦＲＭ蛋白質の生物活性を亢進または抑制する物質は、医薬の有効成分として有用である。ＦＲＭ蛋白質の細胞内の濃度が増加または減少するとアポトーシスが誘導されることから、ＦＲＭ蛋白質の生理学的作用を阻害する作用を有する抗体、化合物又はＦＲＭ蛋白質をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、アポトーシス抑制による疾患の予防及び／又は治療等に寄与することができる。より具体的には、ＦＲＭ蛋白質は肝臓及び腎臓で特異的に発現していることから、これらの臓器の細胞内におけるＦＲＭ蛋白質濃度を減少させることにより、当該細胞のアポトーシスを誘導することができる。アポトーシス抑制による疾患とは、例えば各種癌疾患や自己免疫疾患などが挙げられ、最も好適には肝細胞癌（肝がん）に有効であると期待することができる。その他、ＦＲＭ蛋白質を患者の細胞内に投与したり、ＦＲＭ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを患者に投与して発現させたり、対象となる細胞にＦＲＭ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを導入して発現させた後に、この細胞を患者の体内に移植したりして、当該細胞のアポトーシスを抑制することができ、アポトーシス亢進による疾患の予防及び／又は治療に有用であると期待することもできる。細胞のアポトーシスを抑制するためには、本発明にかかるＦＲＭ蛋白質の機能を亢進する抗体や化合物を当該細胞に投与することもできる。アポトーシス亢進による疾患とは、例えば、エイズや肝炎などのウィルス感染症や、アルツハイマー病などの神経変性疾患などが挙げられる。
本発明にかかる「医薬組成物」とは、細胞周期調節蛋白質（ＦＲＭ）またはその塩の生物活性を亢進または阻害する物質を含んでなる医薬組成物である。該物質は、ＦＲＭ蛋白質の生物活性を亢進または阻害する活性を有するものである限りにおいて得に限定されず、ＦＲＭ蛋白質をコードする遺伝子の発現を亢進または抑制する物質、ＦＲＭ内在量を増加させる物質、ＦＲＭ蛋白質の活性を亢進または阻害する作用を有する物質等が含まれる。これらの物質の具体例としては、例えばＦＲＭ蛋白質をコードするポリヌクレオチド、ＦＲＭ蛋白質またはその塩、ＦＲＭ部分ペプチドまたはその塩、ＦＲＭ蛋白質の抗体、ＦＲＭ蛋白質のアゴニスト・アンタゴニスト等があげられる。即ち、前記医薬組成物の有効成分物質は、ＦＲＭ蛋白質に直接または間接的に作用して、ＦＲＭの生物活性を変化させるものであればよい。
本発明にかかる医薬組成物の用途は特に限定されないが、とりわけ肝疾患または腎疾患の治療剤または予防剤として有用である。前記肝疾患と腎疾患の例は特に限定されず、医学的にこれらの疾患に分類される全ての疾患を含む。肝疾患として特に有効なのは肝がんである。
本発明にかかる医薬組成物を治療剤又は予防剤として使用する場合は、通常の手段に従って製剤化することができる。例えば、本発明の医薬組成物は薬理的に許容しうる担体と均一に混合して使用することができる。前期担体は、投与に望ましい製剤の形態に応じて、広い範囲の形態をとることができ、経口的に又は注射により投与しうる単位服用形態にあることが望ましい。懸濁剤及びシロップ剤のような経口液体調整物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油当の油類、アキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント・フレーバーなどのフレーバー類を使用することができる。散剤、丸剤、カプセル及び錠剤は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調整することができる。
又本発明のポリヌクレオチドを予防剤や治療剤として使用する場合には、本発明のポリヌクレオチドを単独で、またはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、公知の手段によって投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、単独で、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明にかかる「スクリーニング方法」とは、細胞周期調節蛋白質（ＦＲＭ）をコードするポリヌクレオチド、ＦＲＭもしくはその塩、または、ＦＲＭの部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を意味する。該スクリーニング方法としては、例えば、（ａ）ＦＲＭ蛋白質を発現する細胞に被験試料を接触させ；（ｂ）前記蛋白質の生物活性の変化を検出し測定するか、または、当該細胞の細胞死を測定することを含む、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法があげられる。スクリーニングに用いるＦＲＭ蛋白質は、ヒトの細胞から抽出されたものでもよく、遺伝子組換えにより得られたものでもよく、前記方法で得られた部分ペプチドであってもよい。
他のスクリーニング法の例として、ＦＲＭ蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニング方法として例えばウェスタンブロッティング法が挙げられる。被検試料としてある細胞の全蛋白質をＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を含む緩衝液で溶解抽出したのち、ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、分子量に従って分離展開する。次にゲル中に展開された蛋白質をニトロセルロース膜に電気転写する。そして標識したＦＲＭ蛋白質をこの膜に接触させ、この標識を検出することにより、ＦＲＭ蛋白質に結合する蛋白質のバンドを検出することができる。標識の方法としては、ラジオアイソトープを利用する方法、蛍光を利用する方法、ＦＲＭ蛋白質と標識となる蛋白質の融合蛋白質を利用する方法などがある。また、ＦＲＭ蛋白質自体を標識せず、本発明にかかる抗体を標識して、ニトロセルロース膜上の蛋白質に結合したＦＲＭ蛋白質を検出する方法も可能である。
本発明にかかるＦＲＭ蛋白質に結合する低分子化合物のスクリーニング方法としては、例えばＦＲＭ蛋白質をビオチンで標識し、ビオチンとアビジンの反応を利用してＦＲＭ蛋白質を基質上に固定し、これに低分子化合物を含む被検試料を接触させる。この方法の場合、ＦＲＭ蛋白質と低分子化合物の結合は、低分子化合物を予め標識しておくことで検出することも可能であり、例えば表面プラズモン共鳴を利用したシステムや質量分析計を利用して標識をせずに結合を検出することも可能である。
また、ＦＲＭ蛋白質をアフィニティーカラム内に固定し、被検試料をこのカラム内に通し、カラムに特異的に結合した化合物を精製することによっても、ＦＲＭ蛋白質に結合する化合物を得ることができる。
ＦＲＭ蛋白質に結合する活性、又はＦＲＭ蛋白質の生物学的活性を変化させる活性を有する化合物は、天然由来であっても、人工的に合成された化合物であってもよい。
本発明にかかるスクリーニング用キットとは、本発明にかかるスクリーニング方法の実施に用いるためのキットであり、即ち、細胞周期調節蛋白質（ＦＲＭ）をコードするポリヌクレオチド、ＦＲＭ蛋白質もしくはその塩、または、ＦＲＭ蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩を用いた、細胞周期調節活性を有する物質のスクリーニング用キットをいう。
本発明にかかるスクリーニング方法またはスクリーニング用キットにより単離される化合物またはその塩は、細胞周期調節活性を有する化合物またはその塩である。前記化合物またはその塩は、ＦＲＭ蛋白質の生物活性を亢進または抑制する活性を有する。
本発明はまた、細胞内におけるＦＲＭ蛋白質の量を調節することを含む各種癌疾患、自己免疫疾患、ウィルス感染症若しくは神経変性疾患の治療方法または予防方法を提供する。本発明者らは、既に述べたように、ラット肝臓癌細胞株を移植したラットにおいてアンチセンス法によりＨＰ３３蛋白質の発現を抑制したところ、腫瘍細胞の増殖が抑制されることを確認した。また、ＲＮＡｉ法により細胞内におけるＦＲＭ蛋白質の発現を抑制したところ、当該細胞のアポトーシスが誘導されることを見出した。さらに、細胞内でＨＰ３３蛋白質を過剰発現させ、同時にＴａｘｏｌを添加すると、当該細胞の死が誘導されることを確認した。以上より、細胞内におけるＦＲＭ蛋白質量を調節することにより、アポトーシス関連疾患、好ましくは癌疾患、さらに好ましくは肝臓癌の治療又は予防をすることができると期待される。細胞内におけるＦＲＭ蛋白質量の調節は、本発明にかかる医薬組成物の治療上有効量を患者に投与することによりおこなうことができる。
また、本発明は、ＦＲＭ蛋白質若しくは部分ペプチド又はその塩をマーカーとして肝臓癌又は腎臓癌を診断する方法も提供する。上述のように、ＦＲＭ蛋白質はＨＣＣ細胞において過剰発現しているので、ある細胞ないおけるＦＲＭ蛋白質や、本発明のポリヌクレオチド、好ましくはＦＲＭ蛋白質をコードするｍＲＮＡを検出及び／又は定量し、過剰発現しているかどうかを確認することで、その細胞がＨＣＣに侵されているかどうかの診断をすることができる。ポリヌクレオチドの検出及び定量には公知の方法を使用することができ、例えば、ＦＲＭ蛋白質をコードするＤＮＡをプローブとした競合ハイブリダイゼーション法や、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）−ＰＣＲ法などの発現解析方法を用いることができる。ＦＲＭ蛋白質の検出及び定量も公知の方法を使用することができる。例えば本発明の抗体（フラグメントを含む。）を使用して、適当な標識を用いて検出又は定量する方法のほか、各種質量分析法を用いてＦＲＭ蛋白質と等しい質量の蛋白質量を計測し、これを健常者の平均値を比較する方法、電気泳動によりＦＲＭ蛋白質を検出する方法などを用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  ヒトＦＲＭｃＤＮＡの単離、及び配列解析
ＴＢＬＡＳＴＮデータベース検索により、ラットＨＰ３３蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相同性の高い（６３％）ヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ０１３０９３）を見出した。この遺伝子配列の断片をＰＣＲにより増幅し、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用い、いくつかのクローンを得た。これらのクローンの配列を解析した結果、ヒトｃＤＮＡが８８８ｂｐのヌクレオチドからなり、２９５のアミノ酸をコードすることが確認された。ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。ヒトＦＲＭ蛋白質の分子量は３４ｋＤと計算された。
［実施例２］  ノーザンブロット法による、ＦＲＭｍＲＮＡの発現解析
Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてヒトＦＲＭ蛋白質のｃＤＮＡを放射能ラベルし、プローブとした（１×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）。仕様書に従って、２ｕｇ／ｌａｎｅのポリ（Ａ）＋ＲＮＡがブロットされたＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に前記プローブをハイブリダイズさせ、オートラジオグラフィーにより検出した。結果を図１に示す。
［実施例３］  ＦＲＭ抗体を用いたＨＣＣ細胞におけるヒトＦＲＭ蛋白質の発現解析
３−１．ＦＲＭ及びＨＰ３３抗体の交差反応の確認
ｐＥＴ−３ａ発現ベクターに、Ｎ末端にＦｌａｇタグ及びＨｉｓｔｉｄｉｎｅタグを有するＨＰ３３及びＦＲＭのコード領域を挿入し、ＩＰＴＧ誘導により、ラットＨＰ３３及びヒトＦＲＭ蛋白質をＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を用いて過剰発現させた。Ｅ．Ｃｏｌｉの菌体を超音波処理のにより破壊し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）によって上清をアフィニティ精製した。得られた組換え蛋白質５０ｎｇを１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にヒトＦＲＭ蛋白質を固定して抗ラットＨＰ３３抗体をアフィニティー精製し、３０００倍に希釈した。蛋白質はＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）のプロトコルにしたがって検出した。結果を図２に示す。
３−２．ＨＣＣ細胞におけるＦＲＭ蛋白質の過剰発現の検出
ヒトＦＲＭ蛋白質の免疫組織化学検査は、ＨＣＣ組織片を用いて、ＳａｓａｋｉらによるＡｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＡＢＣ）法に従って、標準的な手法により行った。組織片はアフィニティー精製された抗ラットＨＰ３３抗体とインキュベーションした。結果を図３に示す。上段は健常者、下段がＨＣＣ患者から得た組織片である。
［実施例４］  ＦＲＭのゲノムＤＮＡ配列解析とプロモーターの研究、ＦＩＳＨ、及び臓器特異的発現とＨＣＣにおける過剰発現機構
４−１．ヒトＦＲＭのゲノムＤＮＡクローンの単離
４−２．プロモーター／レポーター・プラスミドの構築
ＦＲＭゲノムＰ１クローンをテンプレートとして、ＦＲＭ遺伝子の−２９３２の下流、＋１０２の上流部分のＤＮＡ断片（ｐＢＳ−２９３２）をＰＣＲにより作成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングした。−８２２から＋１０２までの配列を配列番号：３に示す。そして、このｐＢＳ−２９３２をテンプレートとして、５’末端を欠損した種々のプロモーター／ルシフェラーゼ・レポーター系（ｐＬｕｃ−２９３２からｐＬｕｃ＋１）を構築し、ルシフェラーゼ発現ベクターのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＳｍａｌ部位にサブクローニングした。プロモータの欠損の種類を図４に示す。図中、それぞれの数字は５’末端を表す。ｐＬｕｃ−２５５−Ｓｐ１はＡｐａｌ部位からＥｃｏＲＩ部位（Ｓｐ１様モチーフを含む）を欠損することにより作成した。全てのプラスミドは配列を確認した。
４−３．細胞培養、遺伝子導入、ルシフェラーゼ・アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞は１０％ＦＣＳ、１００ｕＭ  ＮＥＡＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ社）及び抗生物質を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で、ＨｅＬａ細胞とＲＬ３４細胞は、１０％ＦＣＳと抗生物質を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で、ＦＡＡ−ＨＴＣ１細胞は１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及び抗生物質とともにＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社）で培養した。ルシフェラーゼ・アッセイには、３０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅの培養細胞を２４穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ社）に用意し、３５０ｎｇ／ｗｅｌｌのｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ由来のレポーター遺伝子と、コントロールとして５ｎｇ／ｗｅｌｌのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた。Ｓｐ１を用いたルシフェラーゼ・アッセイに関しては、Ｓｐ１／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を５０ｎｇ／ｗｅｌｌ、同様にｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎさせた。遺伝子の導入にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。４８から６０時間後、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とＴＤ２０  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、コントロールのｐＲＬ−ＴＫ活性を基準として標準化した。結果を図５及び図６に表す。
４−４．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）
ヒトの血液からリンパ球を単離して解析した。Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ＢｉｏＮｉｃｋ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔを使用し、ｄＡＴＰ存在下でＰ１クローン由来のヒトＦＲＭ遺伝子断片をビオチン化してハイブリダイゼーションのプローブとした。ＦＩＳＨ法は、Ｈｅｎｇら（１９９２）の方法及びＨｅｎｇとＴｓｕｉ（１９９３）による方法に従った。染色体はＤＡＰＩにより染色された。結果を図７に示す。
［実施例５］  ＨＰ３３過剰発現株及び発現抑制株におけるチューブリンとＦＲＭ蛋白質の挙動
５−１．ＨＰ３３過剰発現株の作成
ラットＨＰ３３のｃＤＮＡを用いてラクトース依存性動物細胞発現用ＨＰ３３発現プラスミドを作成し、正常ラット由来のＲＬ−３４細胞株にリポフェクトアミンを用いて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後２日目に、４００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン、４００ｕｇ／ｍｌのジェネテシンが入った培地に取替え、培養を行った。その後ＨＰ３３を発現させるため５ｍＭ  ＩＰＴＧを添加してＨＰ３３の発現を行った。
５−２．ＨＰ３３の発現抑制株の作成
テトラサイクリン依存性動物細胞発現用ＨＰ３３アンチセンス発現プラスミドを作成し、テトラサイクリン活性化因子ベクターとＧ４１８耐性遺伝子ベクターと共にリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＬ３４株に導入した。導入後２日目に４００ｕｇ／ｍｌのジェネテシン、１５ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンが入った培地に取替え、培養を行い、Ｇ４１８耐性の細胞株を分離した。ＨＰ３３の発現抑制はテトラサイクリンを含まない培地で培養することにより行った。
５−３．チューブリン、ＨＰ３３蛋白質、ＤＮＡの染色
ＲＬ−３４細胞をカバーグラス上で４％パラホルムアルデヒド、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２入りリン酸ナトリウム緩衝液にて８分間固定後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００にて５分間膜透過処理を行い、１％ＢＳＡにて１時間ブロッキング反応を行った。ブロッキング後、１％ＢＳＡにて２０００倍希釈した抗α−チューブリン抗体、２００倍希釈した抗ＨＰ３３抗体を用いて１時間反応を行い、その後１００倍希釈したＦＩＴＣ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧにて１時間染色を行った。最後に１ｕｇ／ｍｌのＤＡＰＩにてＤＮＡを染色し観察に供した。結果を図８に示す。
［実施例６］  ラット由来肝臓癌細胞株ＦＡＡ−ＨＴＣ１におけるＨＰ３３遺伝子の発現抑制と腫瘍増殖抑制効果
Ｗｉｓｔｅｒ  Ｒａｔにラット由来肝臓ガン細胞株ＦＡＡ−ＨＴＣ１（ＦＡＡ）、ＨＰ３３発現抑制株（α１、α１４）を１０６個経腹投与を行い、２ヵ月後の腫瘍増殖の様子を観察した。ＨＰ３３発現抑制株はテトラサイクリン依存性動物細胞発現用ＨＰ３３アンチセンス発現プラスミド（ｐＴｅｔ−ＨＰ３３）を作成し、親株であるＦＡＡ細胞株にリポフェクトアミンを用い遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、２日目に４００μｇ／ｍｌのジェネテシン１５ｕｇ／ｍｌのテトラサイクリンが入った培地に取替え、培養を行いＧ４１８耐性の細胞株を分離した。ＨＰ３３の発現抑制はテトラサイクリンを含まない培地で培養することにより行った。結果を図９に示す。グラフはラット体重における腫瘍重量の割合である（ｎ＝３）。ＦＲＭ蛋白質の発現を抑制したラットでは、腫瘍重量の増加がほとんど見られなかった。
［実施例７］  ＦＲＭ過剰発現株におけるＴａｘｏｌ感受性
培養フラスコ中のＲＬ−３４、ファーム過剰発現株（それぞれタキソール０  ｏｒ  ０．１ｕＭ含むＤＭＥＭ培地で２４時間培養）をトリプシン／ＥＤＴＡにて３７℃、３分処理し、血清を含むＤＭＥＭ培地で反応を停止、細胞浮遊液を得、その後、冷ＰＢＳ（ＦＡＣＳ用ＰＢＳ）にて３回洗浄し、最終的に３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。この懸濁液に７ｍｌの−２０℃エタノールを激しく攪拌しながら滴下し、細胞を固定した。固定した細胞は−２０℃で一晩固定し、その後、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅを含むＰＢＳ５００ｕｌに懸濁し、プロピディウムイオダイド（ＰＩ）を細胞浮遊液中に加え、室温にて１０分間反応させる。この溶液を、ＦＡＣＳ解析に用いた。結果を図１０に示す。図中、ピークが二つ見られるものについては、左のピークはＧ１期にある細胞、右のピークはＧ２／Ｍ期にある細胞を示す。過剰発現株にＴａｘｏｌを添加したものはＧ１期の細胞が極端に減少し、Ｇ２／Ｍ期の細胞が増大している。
［実施例８］  ＦＲＭ発現抑制株における細胞分裂時の微小管形成異常
ＲＬ−３４細胞株、ファーム過剰発現株、ファーム発現抑制株での細胞分裂時のＤＮＡ、微小管の様子を蛍光顕微鏡にて観察した。細胞をカバーグラス上で４％パラホルムアルデヒド、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２入り燐酸ナトリウム緩衝液にて８分間固定後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００にて５分間膜透過処理を行ない、１％ＢＳＡにて１時間ブロッキング反応を行なった。ブロッキング後、１％ＢＳＡにて２００倍希釈した抗微小管抗体を用いて１時間反応を行いその後２０倍希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、１時間染色を行った。最後に１μｇ／ｍｌの濃度のＤＡＰＩにてＤＮＡを染色し観察に供した。結果を図１１に示す。上段のパネルはファーム蛋白発現抑制株のＤＮＡ、微小管を示す。パネル内右下にはＲＬ−３４細胞の様子を示す。下段グラフはそれぞれの細胞をスライドグラス上にて培養し、微小管染色を行った後の微小管形成異常があった細胞の顕微鏡下にて計数し、全細胞数に対する異常細胞の割合を示す。
［実施例９］  ｓｉＲＮＡ法を用いたヒトＦＲＭの発現抑制によるアポトーシスの誘導
（１）ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２におけるＦＲＭ遺伝子発現抑制の影響
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を１ｘ１０４個の濃度にて６穴培養皿で培養を行った。培養２日目に２００ｎＭの濃度のＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラを培養中に添加し、遺伝子発現抑制を行った。用いたＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの配列として、以下に示す配列番号：４と配列番号：５とに記載の塩基配列からなる２本鎖、または配列番号：６と配列番号：７とに記載の塩基配列からなる２本鎖を用いた。また、対照群には、配列番号：３０と配列番号３１とに記載のランダムな塩基配列からなる２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラを用いた。
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上記オリゴヌクレオチドを培養中に添加後、２４ｈ，４８ｈ，７２ｈの細胞の様子を示す。
結果：ＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ添加群では経日的な細胞の減少が観察されるが、対象群では細胞の減少は観察されなかった。
（２）ＦＲＭ遺伝子発現抑制したヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２における細胞死の機序
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を１ｘ１０４個の濃度にて６穴培養皿で培養を行った。培養２日目に２００ｎＭの濃度のＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラを培養中に添加し、遺伝子発現抑制を行った。用いたＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラの配列は以下の配列を用いた。また、対照群にはランダムな塩基配列の２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラを用いた。
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上記オリゴヌクレオチドを培養中に添加後、４８ｈ，７２ｈで細胞を回収し、細胞より核を抽出し、ＤＮＡの断片化をアガロース電気泳動にて観察した。核の抽出にはＡｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮＡ−Ｌａｄｄｅｒ  ｋｉｔ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いた。
結果：ＦＲＭ遺伝子に相補的な２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ添加群ではＤＮＡの断片化が観察されるが、対象群ではＤＮＡの断片化は観察されなかった。この断片化はアポトーシスを起こした細胞に特徴的に見られるが、ＦＲＭ遺伝子の発現を抑制したヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２ではアポトーシスにより細胞が死んでいくことを示す。
【産業上の利用可能性】  本発明により新規なヒト細胞周期調節蛋白質（ＦＲＭ蛋白質）、それをコードする遺伝子、該蛋白質を用いる細胞周期調節方法を提供することができた。本発明にかかる細胞周期調節方法を用いることにより、細胞死を誘導することができ、細胞死に基づく各種疾患の治療・予防を行うことが可能である。ＦＲＭ蛋白質は、ヒトＨＣＣや細胞のアポトーシス等に密接に関与しており、ＦＲＭ蛋白質やＦＲＭ蛋白質を特異的に認識する抗体等を利用して癌発生の機構解明やアポトーシス関連疾患の医薬品の開発のためのスクリーニング等を容易に行うことができる。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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