(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有する、生物学的活性を有する形態のペプチドのグルタミンが糖鎖で修飾されている、糖ペプチドを提供する。さらに本発明は、以下の工程：Ａ）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程；およびＢ）該グルタミンに糖鎖を導入する工程、を包含する機能的糖ペプチドを調製する方法を提供する。これによって、生物学的活性を有意に増強または調節することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有する、生物学的活性を有する形態のペプチドのグルタミンが、糖鎖で修飾されている、糖ペプチド。
【請求項２】
前記グルタミンは、野生型形態におけるグルタミン以外のアミノ酸残基が置換されたものである、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項３】
前記糖鎖は、スペーサーを介してグルタミンに結合される、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項４】
前記スペーサーは、−ＣＨ２−Ｒ−であって、該Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である、請求項３に記載の糖ペプチド。
【請求項５】
前記スペーサーは、Ｃ１−Ｃ１０ポリメチレンを含む、請求項３に記載の糖ペプチド。
【請求項６】
前記グルタミンは、前記Ｃ末端または前記Ｎ末端から５アミノ酸以内に存在する、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項７】
前記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、ＦｕＣα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）からなる群より選択される、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項８】
前記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項９】
前記糖ペプチドは、インスリンである、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項１０】
前記糖ペプチドは、インスリンであり、前記グルタミンは、該インスリンのＢ鎖のＣ末端から１１残基以内および／またはＮ末端から９アミノ酸以内に存在する、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項１１】
前記糖ペプチドはインスリンであり、前記アミノ酸残基は該インスリンのＢ鎖のＮ末端を含み、該Ｂ鎖のＮ末端はシアリルラクトースで置換される、請求項１に記載の糖ペプチド。
【請求項１２】
以下の工程：
Ａ）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程；および
Ｂ）該グルタミンに糖鎖を導入する工程、
を包含する、機能的糖ペプチドを調製する方法。
【請求項１３】
前記目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドにおいて、少なくとも１つのグルタミン以外のアミノ酸残基をグルタミンに置換することにより提供される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、
Ｃ）アミノ基を含む糖鎖を調製する工程を包含する、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程Ｃ）は、アミノ基と水酸基とスペーサーとを含む化合物を糖鎖に結合させることによって達成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グルタミンへの糖鎖の導入は、０．１ｍＭ以下のタンパク質濃度、ＧＳＨの非存在下、５ｍＭ以上のカルシウム濃度、および還元剤の除去処置後からなる群より選択される少なくとも１つの条件を含む条件下での、トランスグルタミナーゼによる糖鎖付加反応によって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖ペプチドは、インスリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖ペプチドは、インスリンであり、前記グルタミンは、該インスリンのＢ鎖のＣ末端から１１残基以内および／またはＮ末端から９アミノ酸以内に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖ペプチドはインスリンであり、前記アミノ酸残基は該インスリンのＢ鎖のＮ末端を含み、該Ｂ鎖のＮ末端はシアリルラクトースで置換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
糖鎖を伸長する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１２に記載の方法によって調製された、糖ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、糖ペプチドおよび糖タンパク質（特記しない限り、本明細書において、これらを総称して「糖ペプチド」と呼ぶ）およびそれを簡便に製造するための方法に関する。
【背景技術】  ペプチドおよびタンパク質は、生理活性物質の典型例としてこれまでに研究が進められている。生物（特に、真核生物）は、遺伝子の転写および翻訳という機構を通じてペプチドおよびタンパク質を生産した後に、翻訳後修飾することが多く、多くのペプチドおよびタンパク質は、翻訳後修飾により機能を発揮し、調節（例えば、増強または低減）される。翻訳後修飾としては、例えば、アミノ酸レベル（すなわち、シグナルペプチド切断など）のもののほか、例えば、糖鎖、脂質などの他の生体分子による修飾が挙げられる。この中で、糖鎖による修飾は代表的なものであり、真核生物において非常に多くのペプチドおよびタンパク質は、糖鎖を有するといわれている。
このような糖鎖修飾を模倣して、近年、機能を調節した人工的に複合ペプチドを生産する試みがなされている（特開２０００−３００２８７、特開２００１−２７８８９９、ＷＯ９６／０６１８１およびＷＯ９６／１００８９）。
しかし、どのように糖鎖を導入すればよいかが解明された例はなく、その種類、位置などに関する特定方法の解明が待たれている。
【発明の開示】
本発明は、生物学的活性などの機能を増強するのに有用である、ペプチドに外的に糖鎖を導入する機構を提供することを課題とする。
本発明者らは鋭意検討した結果、生物学的活性を有する形態のペプチドにおいて、該ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基に存在するかまたは導入されたグルタミンを適切な条件および適切な糖鎖で糖鎖修飾することにより生物学的活性を有意に増強または調節することが可能であることが判明したことによって、上記課題を解決した。
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有する、生物学的活性を有する形態のペプチドのグルタミンが、糖鎖で修飾されている、糖ペプチド。
（２）上記アミノ酸残基は、グルタミン残基に置換しても上記ペプチドの生物学的活性に実質的に影響を与えない、項目１に記載の糖ペプチド。
（３）上記ペプチドは、トランスグルタミナーゼの酵素活性が発揮される少なくとも１つの条件において水溶性である、
項目１〜２のいずれかに記載の糖ペプチド。
（４）上記グルタミンに置換される残基は、上記ペプチドの表面上に存在する、項目１〜３のいずれかに記載の糖ペプチド。
（５）上記グルタミンは、野生型形態におけるグルタミン以外のアミノ酸残基が置換されたものである、項目１〜４のいずれかに記載の糖ペプチド。
（６）上記糖ペプチドの機能を有する形態は、野生型形態である、項目１〜５のいずれかに記載の糖ペプチド。
（７）上記グルタミンに置換される残基は、プロテアーゼ消化を受けやすい部位にある、項目１〜６のいずれかに記載の糖ペプチド。
（８）上記糖鎖は、スペーサーを介してグルタミンに結合される、項目１〜７のいずれかに記載の糖ペプチド。
（９）上記スペーサーは、−ＣＨ２−Ｒ−であって、該Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素が１つ脱離して生ずる基である、項目８に記載の糖ペプチド。
（１０）上記スペーサーは、Ｃ１−Ｃ１０ポリメチレンを含む、項目８に記載の糖ペプチド。
（１１）上記スペーサーは、Ｃ１−Ｃ６ポリメチレンを含む、項目８に記載の糖ペプチド。
（１２）上記スペーサーは、Ｃ６−Ｃ１０ポリメチレンを含む、項目８に記載の糖ペプチド。
（１３）上記グルタミンは、上記Ｃ末端または上記Ｎ末端から５アミノ酸以内に存在する、項目１〜１３のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１４）上記グルタミンは、上記Ｃ末端または上記Ｎ末端に存在する、項目１〜１３のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１５）上記グルタミンは、Ｎ末端に存在する、項目１〜１３のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１６）上記糖鎖は、シアル酸を含む、項目１〜１５のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１７）上記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）からなる群より選択される、項目１〜１６のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１８）上記糖鎖は、少なくとも３糖の大きさを有する、項目１〜１７のいずれかに記載の糖ペプチド。
（１９）上記糖鎖は、分枝状または直鎖状である、項目１〜１８のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２０）上記糖ペプチドは、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、レセプター、およびシグナル伝達因子からなる群より選択される、項目１〜１９のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２１）上記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される、項目１〜２０のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２２）上記糖ペプチドは、インスリンである、項目１〜２１のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２３）上記糖ペプチドは、インスリンであり、上記グルタミンは、該インスリンのＢ鎖のＣ末端から１１残基以内および／またはＮ末端から９アミノ酸以内に存在する、項目１〜２２のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２４）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記糖鎖はシアリルラクトースである、項目１〜２３のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２５）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記糖鎖は該インスリンのＢ鎖においてグルタミンに置換されたＮ末端に結合する、項目１〜２４のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２６）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記アミノ酸残基は該インスリンのＢ鎖のＮ末端を含み、該Ｂ鎖のＮ末端はシアリルラクトースで置換される、項目１〜２５のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２７）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記糖鎖は３糖以上の大きさである、項目１〜２６のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２８）１以上のアミノ酸残基の置換、付加および／もしくは欠失、ならびに／または糖鎖および脂質からなる群より選択される少なくとも１つの生体分子をさらに含む、項目１〜２７のいずれかに記載の糖ペプチド。
（２９）以下の工程：
Ａ）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程；および
Ｂ）該グルタミンに糖鎖を導入する工程、
を包含する、機能的糖ペプチドを調製する方法。
（３０）上記目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドにおいて、少なくとも１つのグルタミン以外のアミノ酸残基をグルタミンに置換することにより提供される、項目２９に記載の方法。
（３１）上記目的とするペプチドのアミノ酸配列において、グルタミンに変化させても該目的とするペプチドの生物学的活性を喪失しない残基を同定する工程をさらに包含し、
上記少なくとも１つのアミノ酸残基は、該同定された残基である、項目３０に記載の方法。
（３２）上記目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドである、項目２９〜３１のいずれかに記載の方法。
（３３）上記グルタミンへの糖鎖の導入は、トランスグルタミナーゼを利用し、上記糖鎖はアミノ基を含む、項目２９〜３２のいずれかに記載の方法。
（３４）上記目的とするペプチドは、トランスグルタミナーゼの酵素活性が発揮される少なくとも１つの条件において水溶性である、項目２９〜３３のいずれかに記載の方法。
（３５）上記同定工程は、上記糖ペプチドの表面上のアミノ酸残基を同定することを包含する、項目２９〜３４のいずれかに記載の方法。
（３６）上記目的とするペプチドは、上記目的とするペプチドの野生型形態においてプロテアーゼ消化を受けやすい部位を同定し、該部位にグルタミンが存在しない場合、該プロテアーゼ消化を受けやすい部位をグルタミンに置換することによって提供される、項目２９〜３５のいずれかに記載の方法。
（３７）さらに、
Ｃ）アミノ基を含む糖鎖を調製する工程を包含する、
項目３３に記載の方法。
（３８）上記工程Ｃ）は、アミノ基と水酸基とスペーサーとを含む化合物を糖鎖に結合させることによって達成される、項目３７に記載の方法。
（３９）上記工程Ｃ）は、上記化合物を保護した後にグリコシデーション反応を行い、その後脱保護することによって達成される、項目３８に記載の方法。
（４０）上記糖鎖はさらにスペーサーを含む、項目２９〜３９のいずれかに記載の方法。
（４１）上記スペーサーは、−ＣＨ２−Ｒ−であって、該Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である、項目４０に記載の方法。
（４２）上記スペーサーは、Ｃ１−Ｃ１０ポリメチレンを含む、項目４０に記載の方法。（４３）上記スペーサーは、Ｃ１−Ｃ６ポリメチレンを含む、項目４０に記載の方法。
（４４）上記スペーサーは、Ｃ６−Ｃ１０ポリメチレンを含む、項目４０に記載の方法。
（４５）上記グルタミンは、上記Ｃ末端または上記Ｎ末端から５アミノ酸以内に存在する、項目２９〜４４のいずれかに記載の方法。
（４６）上記グルタミンは、上記Ｃ末端または上記Ｎ末端に存在する、項目２９〜４５のいずれかに記載の方法。
（４７）上記グルタミンは、Ｎ末端に存在する、項目２９〜４６のいずれかに記載の方法。
（４８）上記糖鎖は、シアル酸を含む、項目２９〜４７のいずれかに記載の方法。
（４９）上記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）からなる群より選択される、項目２９〜４８のいずれかに記載の方法。
（５０）上記糖鎖は、少なくとも３糖の大きさを有する、項目２９〜４９のいずれかに記載の方法。
（５１）上記トランスグルタミナーゼによる糖鎖付加反応は、０．１ｍＭ以下のタンパク質濃度、ＧＳＨの非存在下、５ｍＭ以上のカルシウム濃度、および還元剤の除去処置後からなる群より選択される少なくとも１つの条件を含む条件下で行われる、項目３３に記載の方法。
（５２）上記糖ペプチドは、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、レセプターおよびシグナル伝達因子からなる群より選択される、項目２９〜５１のいずれかに記載の方法。
（５３）上記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される、項目２９〜５２のいずれかに記載の方法。
（５４）上記糖ペプチドは、インスリンである、項目２９〜５３のいずれかに記載の方法。
（５５）上記糖ペプチドは、インスリンであり、上記グルタミンは、該インスリンのＢ鎖のＣ末端から１１残基以内および／またはＮ末端から９アミノ酸以内に存在する、項目２９〜５４のいずれかに記載の方法。
（５６）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記糖鎖はシアリルラクトースである、項目２９〜５５のいずれかに記載の方法。
（５７）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記糖鎖は該インスリンのＢ鎖においてグルタミンに置換されたＮ末端に結合する、項目２９〜５６のいずれかに記載の方法。
（５８）上記糖ペプチドはインスリンであり、上記アミノ酸残基は該インスリンのＢ鎖のＮ末端を含み、該Ｂ鎖のＮ末端はシアリルラクトースで置換される、項目２９〜５７のいずれかに記載の方法。
（５９）糖鎖を伸長する工程をさらに包含する、項目２９〜５８のいずれかに記載の方法。
（６０）上記糖鎖伸長は、β１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素，β１，４−ガラクトース転移酵素，β１，３−ガラクトース転移酵素，β１，６−ガラクトース転移酵素、α２，６−シアル酸転移酵素、α１，４−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２−フコース転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、α１，４−フコース転移酵素、α１，６−フコース転移酵素、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４−マンノース転移酵素、α１，２−マンノース転移酵素、α１，３−マンノース転移酵素、α１，４−マンノース転移酵素、α１，６−マンノース転移酵素、α１，２−グルコース転移酵素、α１，３−グルコース転移酵素、α２，３−シアル酸転移酵素、α２，８−シアル酸転移酵素、α１，６−グルコサミン転移酵素、α１，６−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３−グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される酵素を利用する、項目５９に記載の方法。
（６１）１以上のアミノ酸残基の置換、付加および／もしくは欠失、ならびに／または糖鎖および脂質からなる群より選択される少なくとも１つの生体分子を導入する工程をさらに包含する、項目２９〜６０のいずれかに記載の方法。
（６２）糖鎖が導入された上記機能的糖ペプチドを精製する工程をさらに包含する、項目２９〜６１のいずれかに記載の方法。
（６３）上記置換されたアミノ酸配列を有するペプチドは、合成により生産される、項目２９〜６２のいずれかに記載の方法。
（６４）上記置換されたアミノ酸配列を有するペプチドは、遺伝子工学的に生産される、項目２９〜６３のいずれかに記載の方法。
（６５）所望の生物学的活性が亢進されているかどうかを判定する工程をさらに包含する、項目２９〜６４のいずれかに記載の方法。
（６６）項目２９〜６５のいずれかに記載の方法によって調製された、糖ペプチド。
（６７）項目１〜２８または６６に記載の糖ペプチドを含む、医薬組成物。
（６８）項目１〜２８または６６に記載の糖ペプチドを含む、食品組成物。
（６９）項目１〜２８または６６に記載の糖ペプチドを含む、化粧品組成物。
（７０）項目１〜２８または６６に記載の糖ペプチドを含む、高分子材料組成物。
（７１）項目１〜２８または６６に記載の糖ペプチドを含む、農薬組成物。
（７２）グルタミンのアミノ酸側鎖である−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２が、
2004101619.tif 000002
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、およびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）である、項目１〜２８のいずれかに記載の糖ペプチド。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
（７３）上記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される、項目７２に記載の糖ペプチド。
（７４）上記糖ペプチドは、インスリンである、項目７２に記載の糖ペプチド。
（７５）上記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）からなる群より選択される、項目７２〜７４のいずれかに記載の糖ペプチド。
（７６）インスリンのＮ末端のフェニルアラニンがグルタミンに変換されたペプチドのＮ末端またはＮ末端から４番目のグルタミンのアミノ酸側鎖が、以下の式：
2004101619.tif 000003
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、およびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）
で表される側鎖である、インスリン。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
（７７）以下の式：
2004101619.tif 000004
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）で表される化合物と、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含むペプチドと、をトランスグルタミナーゼの存在下で反応させることを特徴とする、糖ペプチドの製造方法。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
（７８）上記スペーサーは、式：
2004101619.tif 000005
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）
で表される基である項目８に記載の糖ペプチド。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の直鎖状糖鎖を付加したインスリンモデル図を示す。
図２ＡおよびＢは、野生型インスリン［Ｉｎｓ．（ＷＴ）］と改変型インスリン［Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｉｎｓ（Ｂ−Ｔ３０Ｑ）］とをマウスに投与したときの血糖値の変化を示す。
図３Ａ〜Ｃは、野生型インスリン［Ｉｎｓ．（ＷＴ）］と本発明の糖鎖付加型インスリン［Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｓｉａ−Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］とをマウスに投与したときの血糖値の変化を示す。
図４Ａ〜Ｃは、本発明の分枝状（二本鎖型（ＤＩ）、三本鎖型（ＴＲＩ）および四本鎖型（ＴＥＴＲＡ））糖鎖の構造を示す。
図５は、本発明の二本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム１を示す。
図６は、本発明の二本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム２を示す。
図７は、本発明の三本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム３を示す。
図８は、本発明の三本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム４を示す。
図９は、本発明の三本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム５を示す。
図１０は、本発明の四本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム６を示す。
図１１は、本発明の四本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム７を示す。
図１２は、本発明の四本鎖型分枝状糖鎖の合成におけるスキーム８を示す。
図１３は、本発明におけるインスリン［Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］への分枝状（二本鎖型（ＤＩ）、三本鎖型（ＴＲＩ）および四本鎖型（ＴＥＴＲＡ））糖鎖の付加反応の模式図を示す。
図１４Ａ〜Ｃは、本発明における分枝状糖鎖付加したインスリンの模式図を示す。
図１５は、野生型インスリン［Ｉｎｓ（ＷＴ）］と本発明の糖鎖付加型インスリン［Ｓｉａ２，６−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｓｉａ２，３−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｓｉａ２，６−ＴＲＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］とをマウスに投与したときの血糖値の変化を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（用語）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。
本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、少なくとも１つの水酸基および少なくとも１つのアルデヒド基またはケトン基を含む、ポリヒドロキシアルデヒドまたはポリヒドロキシケトンならびにその誘導体をいう。通常単糖は、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表されるがそれらに限定されず、グルコース、フコース（デオキシヘキソース）、Ｎ−アセチルグルコサミンなども含まれる。ここで、上の式において、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース、後者をケトースという。
本明細書において特に言及するときは、「単糖の誘導体」は、置換されていない単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質をいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。本明細書では、単糖という場合は、上記誘導体も包含する。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の範囲内にある。
本明細書において「糖ペプチド」および「糖タンパク質」は、互換可能に使用され、少なくとも１つの糖鎖を含むペプチドおよびタンパク質をいう。通常、糖タンパク質は、高等生物において機能を発揮するために必要な糖鎖を有している。糖鎖とペプチドまたはタンパク質との間は直接結合されていてもよく、スペーサー（例えば、ポリメチレン基などの任意の二価の基）を介して間接的に結合されていてもよい。そのような糖タンパク質としては、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。
インスリンなどのペプチドは周知のものを使用することができる。例示としてインスリンとしては、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。インスリンにはＡ鎖、Ｂ鎖のＮ末端のアミノ基、およびリジン残基の側鎖アミノ基が存在する。種により、リジン残基の違いが存在することが知られているが、どのようなものでも使用することができる。
また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。単位糖同士の結合は、その位置によって、α１，２−、α１，３−、α１，４−、α１，６−、β１，２−などがあり、それらの表示は結合する単位糖における炭素の位置を併記すること、および通常その結合に関するアノマー（α、β）を記載する。糖鎖の結合に関する情報は複雑であり、ポリペプチド、ポリヌクレオチドのように簡素化することが困難であるが、例えば、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，１２７−１３７（２００２）では、リニアコードで糖鎖を表すことを提唱している。本明細書では、通常、Ｄ型またはＬ型の別、アノマー型（例えば、αまたはβ型）、結合（例えば、１，４など）、糖の種類（例えば、グルコース、本明細書ではしばしば３文字表記する）およびピラノース型、フラノース型などを利用して糖鎖を表記するが、当該分野において慣用される他の表現様式もまた使用され得る。本発明の通常の表記様式に従えば、例えば、−（１）−β−Ｄ−Ｘｙｌｐ−（１，４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐは、１つ目のＸｙｌ（キシロース）がピラノース型であり、β型をしており、Ｄ型のものであって、キシロースが他の分子と１位で結合していることを示し、２つ目のＧａｌ（ガラクトース）がピラノース型であり、β型をしており、Ｄ型のものであって、ガラクトースがキシロースと１，４結合していることを示す。
本明細書において「スペーサー」とは、２つの分子の間に連結して存在する物質であり、間隔をあけるためまたは直接結合し得ない２つの分子を間接的に結合させるために利用される。そのようなスペーサーとしては、例えば、Ｃ１−１０ポリメチレン、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、このスペーサーは、Ｃ１−１０ポリメチレンを含む。別の実施形態では、スペーサーは、Ｃ１−６ポリメチレンを含む。他の好ましい実施形態では、スペーサーは、Ｃ６−Ｃ１０ポリメチレンを含むがそれらに限定されない。さらに他の好ましい実施形態では、スペーサーは、式：
2004101619.tif 000006
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）
で表される基が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「相互作用」とは、２つの物体について言及するとき、その２つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、相互作用は、共有結合である。本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が２つの原子に共有されて形成する化学結合をいう。スペーサーは、対象とする２つの分子と共有結合されていることが好ましい。
本明細書において、生物学的活性に「実質的に影響を与えない」とは、目的とする生物学的活性が保持されていることを意味する。従って、もとの生物学的活性（例えば、インスリンであれば血糖値低下作用など）の少なくとも約１０％、好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、さらに好ましくは約８０％、もっとも好ましくは約１００％保持されていることが好ましくあり得る。別の実施形態では、そのような生物学的活性は、上昇していてもよく、上昇されていることが有利であり得る。生物学的活性が複数ある場合、少なくとも１つの生物学的活性が保持されていることで十分であり得る。
本明細書において「水溶性」とは、水に対するある物質の溶解性を示す。通常、水溶性は、１００ｇの水に対して溶解する溶質の量で示される。
本明細書において糖ペプチドの「表面」とは、ある糖ペプチドが水溶液中に存在する場合、水分子と相互作用し得る部分をいう。そのような表面に該当する位置は、当該分野において周知のＸ線結晶構造解析などによって同定することができる。
本明細書においてペプチドおよびタンパク質（例えば、インスリン）などの「野生型」（本明細書においてＷＴともいう）とは、天然に存在するペプチドおよびタンパク質などのうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。通常、ある種において最初に同定されるインスリンは野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。そのような野生型インスリンは、ヒトインスリンであれば、図１に示す配列（Ａ鎖およびＢ鎖は、それぞれ配列番号１および３（核酸配列）、配列番号２および４（アミノ酸配列））を有する。
本明細書において「トランスグルタミナーゼ」（時に、ＴＧａｓｅと略す）とは、タンパク質およびペブチド鎖の中のグルタミン（Ｇｌｎ）残基におけるγ−カルボキシアミド基と、リジン（Ｌｙｓ）残基におけるε−アミノ基またはアルキルアミンとの間のアシル転位反応を触媒する酵素をいう。トランスグルタミナーゼは、動物（種々の組織、血球および血漿）および微生物などに広く分布する。従って、トランスグルタミナーゼは、種々の分子形態をとっているが、その分子形態は多岐にわたる。トランスグルタミナーゼは、生体内においてペプチド鎖間または内のε−（γ−グルタミル）リジン−イソペプチド結合による架橋形成反応を触媒する。トランスグルタミナーゼはＧｌｎ残基に対する基質特異性が極めて高いことから、アルキルアミンなどの分子を用いることにより、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基のみを改変することができる。トランスグルタミナーゼは、フィブリン分子架橋、表皮細胞の角質化、精液凝固および創傷組織の治癒などに関与するといわれている。
トランスグルタミナーゼの存在下、グルタミン含有ポリペプチドにアミノアルキルグリコシドを作用させることにより、ペプチドのグルタミン残基にアミノアルキルなどのスペーサーを介して糖鎖が容易に導入される。糖鎖のドナーとして用いられるアミノアルキルグリコシドなどは、導入れるべき糖鎖に対応する糖と、アグリコンであるアミノアルキルなどの部分とからなり、アミノアルカノールなどの基質と糖とを常法にしたがって反応させれば容易に得られる。糖としては、本明細書において他の場所にも記すように、グルコース、マンノース等の単糖類、ラクトース、マルトース、ショ糖類のオリゴ糖およびデンプン等の多糖類が含まれる。アミノアルカノールとしては、２−アミノエタノール、３−アミノプロパノール、４−アミノ−ｎ−ブタノール等が含まれる。
本明細書において「転移酵素」とは、基転移反応を触媒する酵素をいう。本明細書において使用される代表的な転移酵素としては、糖転移酵素があり、糖転移酵素は、糖の転移を触媒する。例示的な糖転移酵素としては、例えば、β１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素，β１，４−ガラクトース転移酵素，β１，３−ガラクトース転移酵素，β１，６−ガラクトース転移酵素、α２，６−シアル酸転移酵素、α１，４−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２−フコース転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、α１，４−フコース転移酵素、α１，６−フコース転移酵素、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４−マンノース転移酵素、α１，２−マンノース転移酵素、ｄ１，３−マンノース転移酵素、α１，４−マンノース転移酵素、α１，６−マンノース転移酵素、α１，２−グルコース転移酵素、α１，３−グルコース転移酵素、α２，３−シアル酸転移酵素、α２，８−シアル酸転移酵素、α１，６−グルコサミン転移酵素、α１，６−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３−グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「残基」は、当該分野において通常の意味で用いられ、重合体における単位物質の分子の根幹部をいう。従って、糖鎖または糖ペプチドにおいて、キシロース残基という場合、キシロースから糖またはペプチドとの結合に必要な部分（例えば、水素原子）を除いた部分をいう。ただし、特に区別を必要としない場合は、糖残基またはアミノ酸残基は、通常の糖またはアミノ酸と互換可能に使用され得る。
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本発明の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。このようなポリペプチド形態の本発明の遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。本発明の遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。このようなポリヌクレオチド形態の本発明の遺伝子または遺伝子産物は、本発明の診断、予防、治療または予後のための組成物として有用である。
本明細書では「核酸分子」もまた、核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、本発明の遺伝子には、そのスプライス変異体もまた包含され得る。
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、インスリンなどの遺伝子というときは、通常、本発明の遺伝子の構造遺伝子ならびにそのプロモーターなどの転写および／または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、構造遺伝子のほか、転写および／または翻訳などの調節配列もまた、神経再生、神経疾患の診断、治療、予防、予後などに有用であることが理解される。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と類似性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのインスリンなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのインスリンなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。
本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「生物学的活性」および「生理活性」は、本明細書において互換的に使用され、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、２つの因子が相互作用する（例えば、インスリンが肝臓などにおけるインスリンレセプターに作用する）場合、その生物学的活性は、その二分子との間の結合およびそれによって生じる生物学的変化、例えば、一つの分子を抗体を用いて沈降させたときに他の分子も共沈するとき、２分子は結合していると考えられる。したがって、そのような共沈を見ることが一つの判断手法として挙げられる。また、神経突起の伸展を指標にしてある分子と他の分子とが機能的に関連していると関連付けることができる。具体的には、インスリンの血糖低下作用を確認することなどを包含する。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
本明細書において「生理活性物質」は、上述のような生物学的活性を有する任意の物質をいう。そのような物質としては、例えば、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、レセプター、シグナル伝達因子などが挙げられるがそれに限定されない。
本明細書において「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が、挙げられる。このような活性は、競合阻害のようなアッセイによって測定され得る。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少を意味する。
本発明では、野生型のペプチドをコードする核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるペプチドも使用され得ることが理解される。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」ポリヌクレオチドとは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
インスリンなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１などの核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。好ましいインスリンなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；  ７％  ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１などに示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において、「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるインスリンなどの生理活性物質には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
インスリンなどの生理活性物質における、特定の相互作用を担うドメインはまた、当該分野において周知のＸ線結晶構造解析の手法（例えば、ＢＷ７ｂビームライン（ＤＥＳＹ／ＥＭＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＸ線解析、ＭａｒＲｅｓｅａｃｈイメージングプレート検出器を用いたデータ測定、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＬＡＥＰＡＣＫなどのプログラムを用いたデータ処理）、およびコンピュータモデリングの手法（例えば、ＣＮＳプログラム、ＸＰＬＯ２Ｄプログラム、プログラムＯ、ＰＲＯＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＩＦなどを用いた精密化など）を用いて同定することができる。したがって、任意の生理活性物質は、上述の方法を用いて同定された相互作用ドメインまたはそれ以外の領域において改変を導入することによって本発明の目的の改変を導入することができる。そのような改変は、好ましくは、野生型におけるアミノ酸を他のアミノ酸（例えば、グルタミンなど）に置換することを包含する。例えば、配列番号２および４に示されるヒト由来のインスリンの場合、Ｂ鎖の１位フェニルアラニンのグルタミンへの置換が挙げられる。本発明のインスリンは、プロテアーゼとの相互作用ドメインにあるアミノ酸残基を改変することによって、酵素活性が高まり、副反応である加水分解活性が減少した。特に、酵素活性の上昇および加水分解活性の低下が同じドメインの改変、より好ましくは同じ残基の改変（例えば、アミノ酸置換）により達成されたことは、従来の技術では予想不可能であったことであり、本発明はその意味でも顕著な効果を奏するといえる。
（遺伝子、タンパク質分子、核酸分子などの改変）
あるタンパク質分子（例えば、インスリンなど）において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本明細書において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、±２以内のもの同士、好ましくは±１以内のもの同士、より好ましくは±０．５以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、１または数個の置換、付加および／または欠失、あるいは１つ以上の置換、付加および／または欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子およびβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、短縮化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、ホスホリル化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレオチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。
本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリペプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ  ＥＳ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（遺伝子工学）
本発明において用いられるインスリンなどならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよぴ組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明において用いられ得る原核細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。
本発明において用いられ得る動物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが例示される。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現することによって、組換え哺乳動物発現ベクターでは、特定の細胞型において核酸の発現を優先的に指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３，５３７−５４６））、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１，２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３，２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８，７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３，７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２６４，１６６）が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。
本明細書において使用される場合、動物細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト結腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス・ミエローマ細胞としては、ｐｓ２０、ＮＳＯなど、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０など、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）など、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１など、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト結腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−５Ｙ、マウス神経芽細胞腫Ｎｅｕｒｏ２Ａなどが例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法などが例示される。
本明細書において、レトロウイルスの感染方法は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  前出（特にＵｎｉｔｓ  ９．９−９．１４）などに記載されるように、当該分野において周知であり、例えば、トリプシナイズして胚性幹細胞を単一細胞懸濁物（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）にした後、ウイルス産生細胞（ｖｉｒｕｓ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）（パッケージング細胞株＝ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）の培養上清と一緒に１〜２時間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）することにより、十分量の感染細胞を得ることができる。
本明細書において使用されるゲノムまたは遺伝子座などを除去する方法において用いられる、Ｃｒｅ酵素の一過的発現、染色体上でのＤＮＡマッピングなどは、細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ「ＦＩＳＨ実験プロトコール  ヒト・ゲノム解析から染色体・遺伝子診断まで」松原謙一、吉川  寛  監修  秀潤社（東京）などに記載されるように、当該分野において周知である。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法  ・  中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「下流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの３’末端に向かう位置を示す。
本明細書において「塩基対の」および「Ｗａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本明細書では同義に用いられ、二重らせん状のＤＮＡにおいて見られるものと同様に、アデニン残基が２つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、３つの水素結合によってシトシン残基とグアニン残基とが結合するという配列の正体に基づいて互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照）。
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
（ポリペプチドの製造方法）
本発明のポリペプチド（例えば、インスリンまたはその改変体もしくはフラグメントなど）をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリペプチドを採取することにより、本発明に係るポリペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド（例えば、インスリンなど）が本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリペプチドを回収後、そのポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。このような融合タンパク質では、発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製に続いて、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素およびこれらの同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７，３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ，Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
さらに、本発明のポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。本発明のポリペプチドの生理活性は、公知の測定法に準じて測定することができる。
本発明において有用な可溶性ポリペプチドの産生もまた、当該分野で公知の種々の方法によって達成され得る。例えば、ポリペプチドは、エキソペプチダーゼ、エドマン分解またはその両方と組み合わせて特定のエンドペプチダーゼを使用することによるタンパク質分解によって、インタクトな膜貫通ｐ７５ポリペプチド分子から誘導され得る。このインタクトなｐ７５ポリペプチド分子は、従来の方法を使用して、その天然の供給源から精製され得る。あるいは、インタクトなｐ７５ポリペプチドは、ｃＤＮＡ、発現ベクターおよび組換え遺伝子発現のための周知技術を利用する組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。
好ましくは、本発明において有用な可溶性ポリペプチドは、直接的に産生され、従って、出発材料としてのｐ７５ポリペプチド全体の必要性を排除する。これは、従来の化学合成技術によって達成され得るか、または周知の組換えＤＮＡ技術（ここで、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列のみが形質転換された宿主で発現される）によって達成され得る。例えば、所望の可溶性ｐ７５ポリペプチドをコードする遺伝子は、オリゴヌクレオチド合成機を使用する化学的手段によって合成され得る。このようなオリゴヌクレオチドは、所望の可溶性ｐ７５ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。所望のペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼフラグメントの単離によってか、またはｃＤＮＡからの特定の領域のＰＣＲ合成によって、全長ＤＮＡ配列から誘導され得る。
（改変体ポリペプチドの作製方法）
本発明のポリペプチド（例えば、インスリンなど）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加（融合を含む）は、周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。
（有機化学）
本明細書において使用されるスペーサーは、二価の化学基であって、１級アミンを形成することができるものであれば、どのようなものであってもよい。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「ポリメチレン」とは、−（ＣＨ２）−が１または複数連結した化学基をいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル（ＣＨ２＝ＣＨ−）、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ９アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルキニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「ハロゲン」とは、周期表７Ｂ族に属するフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などの元素の１価の基をいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「ヒドロキシ」とは、−ＯＨで表される基をいう。「置換されたヒドロキシ」とは、ヒドロキシのＨが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「チオール」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基（メルカプト基）であり、−ＳＨで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプトのＨが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「シアノ」とは、−ＣＮで表される基をいう。「ニトロ」とは、−ＮＯ２で表される基をいう。「アミノ」とは、−ＮＨ２で表される基をいう。「置換されたアミノ」とは、アミノのＨが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨで表される基をいう。「置換されたカルボキシ」とは、カルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「チオカルボキシ」とは、カルボキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基をいい、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＨまたは−ＣＳＳＨで表され得る。「置換されたチオカルボキシ」とは、チオカルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アシル」とは、カルボン酸からＯＨを除いてできる１価の基をいう。アシル基の代表例としては、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ−）などが挙げられる。「置換されたアシル」とは、アシルの水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（アシル基）で置換した基であり、好ましくは、−ＣＯＮＨ２で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換されたものをいう。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「カルボニル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である−（Ｃ＝Ｏ）−を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル」は、下記において選択される置換基で置換されているカルボニル基を意味する。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「チオカルボニル」とは、カルボニルにおける酸素原子を硫黄原子に置換した基であり、特性基−（Ｃ＝Ｓ）−を含む。チオカルボニルには、チオケトンおよびチオアルデヒドが含まれる。「置換されたチオカルボニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたチオカルボニルを意味する。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「スルホニル」とは、特性基である−ＳＯ２−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたスルホニルを意味する。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「スルフィニル」とは、特性基である−ＳＯ−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルフィニル」とは、下記において選択される置換基で置換されているスルフィニルを意味する。
本明細書において「炭素環基」とは、炭素元素のみで環の骨格を形成する化学基をいう。そのような飽和または不飽和の炭素環基としては、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルカジエニル基等、アリール基等が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において単独でもしくは他の用語と組み合わせて用いられる「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。
本明細書中、「複素環基」とは、環系を構成する原子として酸素、硫黄、窒素の少なくとも１個のヘテロ原子を含有する複素環基を意味し、好ましくは芳香族複素環基であり、例えば、芳香族単環式複素環基、２環性または３環性の芳香族縮合複素環基等が挙げられる。その単環式複素環基の具体例としては、例えば、フリル、チエニル、ピロニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、フラザニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリル等が挙げられる。また、その２環性または３環性の芳香族縮合複素環基の具体例としては、例えば、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾ〔ｂ〕チエニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、１，２−ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、１Ｈ−ベンゾトリアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、ナフチリジニル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、α−カルボリニル、β−カルボリニル、γ−カルボリニル、アクリジニル、フェノキサジニル、フェノチアジニル、フェナジニル、フェノキサチイニル、チアントレニル、フェナトリジニル、フェナトロリニル、インドリジニル、ピロロ〔１，２−ｂ〕ピリダジニル、ピラゾロ〔１，５−ａ〕ピリジル、イミダゾ〔１，２−ａ〕ピリジル、イミダゾ〔１，５−ａ〕ピリジル、イミダゾ〔１，２−ｂ〕ピリダジニル、イミダゾ〔１，２−ａ〕ピリミジニル、１，２，４−トリアゾロ〔４，３−ａ〕ピリジル、１，２，４−トリアゾロ〔４，３−ａ〕ピリダジニル等が挙げられる。
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。
本明細書において、Ｃ１、Ｃ２、、Ｃｎは、炭素数を表す。従って、Ｃ１は炭素数１個の置換基を表すために使用される。
本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあって、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。
本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物（未反応減量、副生成物、溶媒など）を、当該分野で慣用される方法（例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法（例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど）を組み合わせて処理して単離し得る。
（医薬・化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。
固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。
固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。
固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、中枢神経、脳など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。
さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。非経口投与の場合、０．０１ｍｇ〜１ｇであり、好ましくは、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇなどであり得る。
本明細書中、「投与する」とは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、因子などまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生物の細胞または組織に化合物を取り込むことを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の静脈ラインを通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
異常な状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞の群に化合物を投与することによって予防または処置され得る。次いで、化合物を投与することの生物機能に対する効果が、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはヤギ、より好ましくは、サル（ｍｏｎｋｅｙまたはａｐｅ）、および最も好ましくは、ヒトである。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果またはインスリンなどに関連する疾患（例えば、神経疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、インスリンなどに関連する疾患（例えば、神経疾患）の再発により再開することができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。
（農薬）
本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。
本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤（ピラゾレートなど）、殺虫・殺ダニ剤（ダイアジノンなど）、殺菌剤（プロベナゾールなど）、植物成長調整剤（例、パクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、ベノミルなど）、共力剤（例、ピペロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色１号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。
（保健・食品）
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。
本発明は上記のように、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで、生体分子の検査が必要なものに全て適応可能である。本発明においては特に、食料の安全目的のための（たとえば、ＢＳＥ検査）使用も企図される。
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
１つの局面において、本発明は、グルタミンが糖鎖で修飾された糖ペプチドを提供する。この糖ペプチドでは、生物学的活性を有する形態のペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有することが特徴であり、そのグルタミンが糖鎖で修飾されている。ここで、修飾は、直接的または間接的な結合を意味する。糖鎖で修飾されるグルタミンは、ペプチドに含まれる少なくとも１つのグルタミンであればよく、好ましくは、複数（例えば、２つ、３つ）、あるいは、存在するグルタミンのすべてが糖鎖で修飾されていてもよい。結合は、通常共有結合であるが、それに限定されず、糖鎖が、結合したペプチドと同一の存在物（ｅｎｔｉｔｙ）を構成することができる限り、他の相互作用（例えば、疎水結合、水素結合など）を介していてもよい。１つの実施形態では、このグルタミンは、そのペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸以内に存在することが有利であり得る。
本発明の糖ペプチドにおいて、ペプチド部分は、当該分野に周知の技術を用いて合成または遺伝子工学的に製造することができ、そのような合成および遺伝子工学的製造の方法は、本明細書において他の場所に詳述されている。また、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有するようなペプチド（例えば、ペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸以内に存在するもの）の製造もまた、当該分野において周知の合成および／または遺伝子工学の技術を用いて製造することができる。このような場合、野生型のペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを有しない場合、その範囲内にグルタミンを有するようにアミノ酸配列を改変することができる。そのような改変方法もまた、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載されている。グルタミンの導入位置は、どのような位置でもよいが、例えば、ペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸、好ましくは５アミノ酸以内であり得るがそれに限定されない。
本発明の糖ペプチドにおいて、上記される生物学的活性は、通常、野生型のペプチドが有する活性を包含する。例えば、インスリンであれば、血糖低下作用を含む。
修飾に使用される糖鎖は、どのような糖鎖でもよい。したがって、修飾に使用される糖鎖の大きさは任意のものでよく、たとえば、単糖、二糖、三糖、四糖またはそれ以上の数の糖が連なった糖鎖などであってもよい。修飾される糖鎖の形状もまたどのようなものであってもよく、例えば、直鎖、分岐、環状のものなどが挙げられるがそれに限定されない。また、糖鎖を構成する単糖もまたどのようなものでもよく、単糖は誘導体であってもよく、誘導体でなくてもよい。そのような構成単糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸、２−デオキシ−Ｄ−リボースなどが挙げられるがそれらに限定されない。
１つの好ましい実施形態において、グルタミンが挿入されるアミノ酸残基は、グルタミン以外の残基であって、そのグルタミン以外の残基がグルタミンに置換されても生物学的活性を有する形態のペプチドの生物学的活性に実質的に影響を与えないことが有利である。ここで、「実質的に影響を与えない」とは、期待される生物学的活性（例えば、インスリンなどのホルモンであれば、血糖低下作用などの対応するホルモン作用であり、酵素であれば、対応する酵素（触媒）活性であり、サイトカインであれば、対応するサイトカイン作用である等）が改変後に使用される状況においても有用である程度に保持されていることをいう。従って、通常「実質的に影響を与えない」とは、改変前の生物学的活性を少なくとも保持していることをいうが、状況に応じて、改変前の生物学的活性が低減または上昇していてもよい。低減または上昇の程度は、所望により変更することができ、例えば、１０％の上昇または低下、２０％の上昇または低下などが挙げられるがそれに限定されない。あるいは、ある特定の生物学的活性に関しては、消失していてもよい。これは、２つ以上の生物学的活性をある分子が有する場合に、その１つ以上の生物学的活性が所望されないかまたは消失が所望されるときに好ましい形態である。このような実質的に影響を与えない置換は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、その具体的手法は、本明細書において上記され、実施例において例示されるがそれに限定されない。また、生物学的活性に実質的に影響を与えないか否かは、当該分野において周知の技術を用いて判定することができる。そのような方法は、対象となるペプチドに応じて当業者が適宜選択することができる。そのような生物学的活性の測定は、例えば、酵素学ハンドブック（丸尾文治、田宮信雄監修）に記載される酵素活性の測定法などを用いることができるがそれに限定されない。あるいは、抗体に対しては、特異的な抗原との任意の抗原抗体反応に基づくアッセイ（たとえば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなど）を用いることができる。ワクチンに対しても同様の活性測定が可能である。ホルモンの生物学的活性は、例えば、ホルモンの特異的なレセプターへの結合活性を測定することによって判定することができる。サイトカインもまた、特異的なレセプターへの結合活性を測定することによって判定することができる。レセプターに対しては、その特異的なリガンドを用いることができる。シグナル伝達因子の測定もまた、特定のシグナル伝達系を測定するアッセイを用いることができる。
１つの実施形態において、使用される生物学的活性を有する形態のペプチドは、トランスグルタミナーゼの酵素活性が発揮される少なくとも１つの条件において水溶性であることが好ましい。そのような条件は、使用されるトランスグルタミナーゼおよび基質などによって変動するが、当業者は、そのような条件を適宜設定することができる。例示的な条件としては、例えば、ｐＨ４〜ｐＨ９、塩濃度０ｍＭ〜１Ｍ、０℃〜４２℃の温度などが挙げられるがそれらに限定されない。使用される緩衝塩もまた、任意のものが使用され得る。そのような緩衝塩としては、用いられる緩衝液としてはｐＨ４〜ｐＨ９のものであればいずれの種類の緩衝液でもよく、例えば、Ｈｅｐｅｓ緩衝液、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、リン酸緩衝液（ｐＨ６．４〜７．４）等が挙げられる。また、動物由来のトランスグルタミナーゼはカルシウム依存性のタンパク質であることが多いことから、酵素活性を発現させるために、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を反応系に添加するのが好ましく、その添加量は通常０．１〜１００ミリモル濃度が好ましい。なお、微生物由来のトランスグルタミナーゼはカルシウム依存性ではないため、カルシウム塩の添加は必要でない。トランスグルタミナーゼとしては、ストレプトベルティシリウム属（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ  ｓ−８１１２）等の微生物の産生するもの、モルモット、ヒト等の動物由来のもの、さらに魚類由来のものなどいずれも用い得る。また汎用食品の増貼剤として市販もされており、本発明ではかかる市販のトランスグルタミナーゼでも用いられる。
より好ましくは、そのような条件は、「穏和な条件」であり得る。そのような穏和な条件とは、分子内ジスルフィド結合が切れない条件、立体構造に変化を与えない条件などが挙げられるがそれらに限定されない。このような穏和な条件を決定する条件としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質濃度、基質濃度、カルシウムイオン濃度、ｐＨ、温度、共存する塩の種類および濃度、ＧＳＨの存否、還元剤の存否などが挙げられるがそれらに限定されない。必要に応じて、これらの因子は複数考慮してもよい。そのような条件の具体的な例としては、例えば、インスリン（０．１ｍＭ）、Ｌａｃ．ＡｍｉｎｏＨｅｘ（０．９ｍＭ）、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、トランスグルタミナーゼ（３．５Ｕ／ｍｌ）；３７℃および３０分間反応などが挙げられるがそれに限定されない。ＧＳＨを加えると、野生型のインスリンでトランスグルタミナーゼの反応が進むが、そのような添加はペプチドの生物学的活性に悪影響があることから、好ましくない。他の穏和な条件の具体例としては、例えば、ペプチドまたはタンパク質（例えば、リジン残基を含むタンパク質（例えば、インスリン））の濃度を０．２ｍＭ以下（好ましくは、０．１ｍＭ以下）にすること、カルシウム濃度を２ｍＭ以上（好ましくは、５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ）とすること、ＧＳＨを加えた場合に３７℃での反応を短く（例えば、３時間以下、好ましくは１時間以下）すること、市販のトランスグルタミナーゼを使用する場合、還元剤の影響がない程度の量または緩衝液交換を行い還元剤を減少させて用いることなどが挙げられるがそれに限定されない。
本発明の方法において使用されるトランスグルタミナーゼは、どのような由来のものであってもよく、動物由来のもの（種々の組織、血漿成分由来など）または微生物由来のもの、あるいは人工的に作製したものであってもよい。
トランスグルタミナーゼを用いて糖鎖を導入した場合、反応生成物は、遠心分離法、クロマトグラフィー（例えば、逆相系ＨＰＬＣ、レクチンカラムによるアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過等）の当該分野において周知の方法により反応混合物から単離精製することができる。あるいは、得られた糖鎖結合型インスリンは、複数種の混合物として単離することができる。また、複数の異なる糖鎖または他の置換基で改変されたものを含んでいてもよい。
反応生成物の分粧は、高速液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴スペクトル、質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦマススペクトル分析など）などの各種分光分析法により行なうことができる。
好ましい実施形態において、本発明において生物学的活性を有する形態のペプチドにおいてグルタミンに置換されるアミノ酸残基は、そのペプチドの表面に存在するものであることが好ましい。表面上にあるアミノ酸残基をグルタミンに変化させ、糖鎖を結合させることによって、従来達成できなかった外的な攻撃からペプチド分子を保護することができる。そのうな表面上にあるアミノ酸残基の同定は、当該分野において周知の結晶構造分析によって行うことができる。ペプチドの空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。表面上に存在する部分を同定する方法には、エピトープを同定する方法が含まれる。所定のタンパク質におけるそのようなエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。
別の実施形態において、グルタミンは、生物学的活性を有するペプチドの野生型形態に存在していてもよいし、野生型において存在していない場合、グルタミンを置換または付加してもよい。あるいは、このような付加または置換型のペプチドの生産は、合成または遺伝子工学的に行うことができる。そのような生産方法は、本明細書において上述し、実施例において例示されるように当業者に周知なぎ術を用いて実施することができる。グルタミンが置換または付加される位置は、プロテアーゼ消化を受けやすい部位にあることが好ましい。プロテアーゼ消化を受けやすい部分をグルタミンとし、糖鎖で「マスク」することによって、プロテアーゼ消化を受けにくくすることができるからである。そのようなプロテアーゼ消化を受けやすい部位であるかどうかは、ペプチドを任意のプロテアーゼとインキュベートして消化した部分ペプチドの配列を決定することによって判定することができる。
本発明の好ましい実施形態において、糖鎖は、スペーサーを介してグルタミンに結合される。スペーサーは、アミノ基を付与することによって、トランスグルタミナーゼの基質となり得るものであることが好ましい。そのようなスペーサーとしては、例えば、−ＣＨ２−Ｒ−（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素が１つ脱離して生ずる基である）が挙げられるがそれに限定されない。好ましいスペーサーの例としては、Ｃ１−Ｃ１０ポリメチレン基（好ましくは、Ｃ１−Ｃ６ポリメチレン、Ｃ６−１０ポリメチレンなど）などが挙げられるがそれに限定されない。他の好ましい実施形態では、スペーサーは、式：
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（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）
で表される基が挙げられるがそれらに限定されない。
糖鎖が導入されるグルタミン残基の個数は少なくとも１つであり、２つ以上、３つ以上のグルタミン残基に糖鎖が導入されていてもかまわない。また、複数のグルタミン残基に糖鎖が導入される場合、導入される糖鎖は同一であっても異なっていてもよい。あるいは、１つのグルタミン残基に糖鎖が導入される場合であっても、導入される糖鎖は均一であっても混合物であってもよい。
糖鎖が導入されるグルタミン残基の位置は、例えばペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸以内にあることが有利であり得るがそれに限定されず、活性を維持または保持することができる限り、どのような位置であってもよい。より好ましくは、グルタミン残基は、ペプチドのＣ末端またはＮ末端から５アミノ酸以内に存在することが有利であり。さらに好ましくは、グルタミン残基は、ペプチドのＣ末端またはＮ末端に存在することがさらに有利である。好ましい実施形態では、糖鎖で修飾されるグルタミン残基は、ペプチドのＮ末端に存在することが有利であり得る。
本発明において使用される糖鎖としては、任意のものが使用され得る。好ましくは、使用される糖鎖は、ラクトースまたはシアル酸を含むことが有利である。より好ましくは、使用される糖鎖は、シアル酸を含むことがさらに有利である。特に、シアル酸を含む糖鎖を導入することによって、予想外に、糖ペプチドの代表例であるインスリンの活性を上昇させることができた。
従って、本発明において使用される糖鎖の例示としては、例えば、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）など、これらを含む３糖、４糖、５糖、６糖、またはｎ糖（ここで、ｎは７以上の任意の整数）などが挙げられるがそれらに限定されない。これらの例示される糖鎖は、直鎖状であっても分枝状であっても樹状であってもよい。糖鎖が分枝状である場合、その糖鎖の形態が、二本鎖型、三本鎖型または四本鎖型であることが好ましい。
導入される糖鎖の大きさもまた、どのようなものであってもよい。好ましくは、使用される糖鎖は、少なくとも２糖の大きさであり、より好ましくは少なくとも３糖の大きさである。このような糖鎖は、直鎖であっても、分岐していてもよく、あるいは環化されていてもよい。
本発明の糖ペプチドは、生物学的活性を有する限りどのようなものであってもよく、例示としては、例えば、酵素、抗体、ワクチン、血清タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、細胞接着分子、レセプター、およびシグナル伝達因子などが挙げられる。
酵素としては、例えば、（１）酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ），（２）転移酵素（トランスフェラーゼ）（３）加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、（４）脱離酵素（リアーゼ）（特定の基の脱離、二重結合への付加を触媒する）、（５）異性化酵素（イソメラーゼ）、（６）合成酵素（リガーゼ）（ＡＴＰなどヌクレオシド三リン酸の高エネルギー結合の水解を伴った新しい分子間の結合の生成を触媒する）などが挙げられるがそれらに限定されない。
血清タンパク質としては、アルブミン、グロブリンなどが挙げられる。
抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。
サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。細胞接着分子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
レセプターとしては、例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターなどが挙げられる。
シグナル伝達因子としては、例えば、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５などの系が挙げられるがそれらに限定されない。
本発明において有用な糖ペプチドの代表例としては、例えば、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンなどが挙げられるがそれらに限定されない。
特に有用であるのは、インスリンである。インスリンの特にＢ鎖のＮ末端に糖鎖を導入することで活性があがることは知られておらず、インスリンの糖鎖による活性上昇として初めての例であるといってもよい。
従って、好ましい実施形態では、本発明の糖ペプチドは、インスリンであり、ここで、少なくとも１つのグルタミン残基が、インスリンのＢ鎖のＣ末端から１１残基以内および／またはＮ末端から９アミノ酸以内に存在する。このような改変によりインスリンの活性が上昇したことが判明した。
あるいは、別の好ましい実施形態において、本発明の糖ペプチドは、インスリンであり、糖鎖はシアリルラクトースを含むことが有利である。このような改変によりインスリンの活性が上昇したことが判明した。
本発明の好ましい実施形態では、糖ペプチドはインスリンであり、糖鎖はインスリンのＢ鎖においてグルタミンに置換されたＮ末端に結合することが有利であり得る。このような置換による生物学的活性の維持および糖鎖による活性上昇は本発明のひとつの顕著な効果である。
本発明のさらに好ましい実施形態において、糖ペプチドはインスリンであり、グルタミンを含むアミノ酸残基はインスリンのＢ鎖のＮ末端を含み、Ｂ鎖のＮ末端はシアリルラクトースで置換される。このような置換によって生物学的活性が維持または上昇することが判明した。
別の実施形態において、本発明の糖ペプチドは、１または数個のアミノ酸残基の置換、付加および／もしくは欠失、ならびに／または糖鎖および脂質からなる群より選択される少なくとも１つの生体分子をさらに含むことが有利であり得る。このような糖ペプチドのさらなる改変は、所望の機能を付与または消失または調節したい場合に、行うことができる。そのような改変を行うことは、当業者により実施され得る。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、上記項目（１）におけるグルタミンのアミノ酸側鎖である−（ＣＨ２）２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２が、
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（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）である糖ペプチドを提供する。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
さらに好ましい実施形態において、上記糖ペプチドは、インスリン、エリスロポエチン、イムネース、Ｇ−ＣＳＦ、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、アドレナリン、副腎皮質刺激ホルモン、βエンドルフィンおよびネオエンドルフィンからなる群より選択される。最も好ましくは、上記糖ペプチドは、インスリンである。
なおさらに好ましい実施形態において、上記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｆｕｃα１，２−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ、およびＳｉａα２，８−Ｓｉａα２，６−（Ｆｕｃα１，２−）Ｌａｃ（式中、Ｌａｃはラクトース、ＬａｃＮＡｃは２−アセチルアミノラクトース、Ｓｉａはシアル酸、Ｆｕｃはフコースを表す）からなる群より選択される。
なお最も好ましい実施形態において、上記糖鎖は、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃ、Ｓｉａα２，３−Ｌａｃ、Ｓｉａα２，３−ＬａｃＮＡｃからなる群より選択される。
別の好ましい実施形態において、本発明は、インスリンのＮ末端のフェニルアラニンがグルタミンに変換されたペプチドのＮ末端またはＮ末端から４番目のグルタミンのアミノ酸側鎖が、以下の式：
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（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖ、およびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）
で表される側鎖であるインスリンを提供する。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
別の局面において、本発明は機能的糖ペプチドを調製する方法を提供する。このような方法は、Ａ）少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含む、目的とするペプチドを提供する工程；およびＢ）該グルタミンに糖鎖を導入する工程、を包含する。ここで、目的とするペプチドは、野生型形態のペプチドにおいて、少なくとも１つのグルタミン以外のアミノ酸残基をグルタミンに置換することにより提供されてもよく、あるいは、そのような位置にグルタミンを有する野生型形態のペプチドを直接提供してもよい。このようなグルタミン残基は、上記ペプチドのＣ末端またはＮ末端から１２アミノ酸以内に存在してもよいがそれに限定されない。
好ましい実施形態では、本発明の方法では、目的とするペプチドのアミノ酸配列において、グルタミンに変化させても目的とするペプチドの生物学的活性を喪失しない残基を同定する工程をさらに包含する。このような工程を有することによって、本発明において、着実に機能的糖ペプチドを生産することができる。ここで、グルタミンが置換される少なくとも１つのアミノ酸残基は、このような方法によって同定された残基であるが、このような残基以外の残基が改変されていてもよい。このような同定工程は、例えば、糖ペプチドの表面上のアミノ酸残基を同定することを包含してもよい。目的とするペプチドは、目的とするペプチドの野生型形態においてプロテアーゼ消化を受けやすい部位を同定し、その部位にグルタミンが存在しない場合、プロテアーゼ消化を受けやすい部位をグルタミンに置換することによって提供され得る。
改変されるペプチドは、野生型ペプチドであっても、合成された人工改変ペプチドであってもよい。
グルタミンへの糖鎖の導入は、通常、トランスグルタミナーゼを利用し、前記糖鎖はアミノ基を含むが、それに限定されない。トランスグルタミナーゼは、グルタミンに特異性が高いことから、グルタミン残基のみに糖鎖を導入するために有利に用いられる。アミノ基と糖鎖とは直接結合されていてもよいが、スペーサーを介して結合されていてもよい。
好ましい実施形態において、本発明の機能的糖ペプチド生産法では、糖鎖をさらに伸長する工程をさらに包含してもよい。伸長工程を有することによって、原理的には、無限に糖鎖を付加することができる。また、トランスグルタミナーゼを用いる場合に、限界となる導入される糖鎖の大きさの限度を事実上なくすことにもなる。
そのような糖鎖伸長は、β１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素，β１，４−ガラクトース転移酵素，β１，３−ガラクトース転移酵素，β１，６−ガラクトース転移酵素、α２，６−シアル酸転移酵素、α１，４−ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２−フコース転移酵素、α１，３−フコース転移酵素、α１，４−フコース転移酵素、α１，６−フコース転移酵素、α１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４−マンノース転移酵素、α１，２−マンノース転移酵素、α１，３−マンノース転移酵素、α１，４−マンノース転移酵素、α１，６−マンノース転移酵素、α１，２−グルコース転移酵素、α１，３−グルコース転移酵素、α２，３−シアル酸転移酵素、α２，８−シアル酸転移酵素、α１，６−グルコサミン転移酵素、α１，６−キシロース転移酵素、βキシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３−グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される酵素を利用してもよいが、それに限定されない。糖鎖伸長に使用する酵素は、それぞれの適切な条件下で用いることが好ましい。
さらなる実施形態において、本発明は、１または数個のアミノ酸残基の置換、付加および／もしくは欠失、ならびに／または糖鎖および脂質からなる群より選択される少なくとも１つの生体分子を導入する工程をさらに包含する。このような付加工程は、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。
さらなる実施形態では、本発明の機能的糖ペプチド生産法は、糖鎖が導入された機能的糖ペプチドを精製する工程をさらに包含する。そのような精製法は、本明細書において上述したように、どのようなものを用いてもよい。
１つの好ましい実施形態において、本発明は、以下の式：
2004101619.tif 000010
（式中、ｍ、ｎ、ｐ、ｓ、ｔ、ｕ、ｖおよびｗはそれぞれ独立して１〜１０の整数を表す）で表される化合物と、少なくとも１つのアミノ酸残基にグルタミンを含むペプチドと、をトランスグルタミナーゼの存在下で反応させることを特徴とする、糖ペプチドの製造方法を提供する。
糖鎖とメチレンとの結合様式は、糖の１位水酸基由来の酸素原子とメチレンの炭素原子が結合した「Ｏ−Ｃ」結合である。
本発明において用いられる、置換されたアミノ酸配列を有するペプチドは、合成により生産されてもよく、遺伝子工学的に生産されてもよい。従って、本発明の機能的糖ペプチド生産法は、このような合成工程および／または遺伝子工学的な産生工程を包含し得る。
好ましい実施形態では、本発明の機能的糖ペプチドの生産法は、所望の生物学的活性が亢進されているかどうかを判定する工程をさらに包含する。そのような活性判定は、当該分野において周知のアッセイ方法を用いて行うことができる。
別の局面において、本発明は、本発明の機能的糖ペプチドの生産法によって生産された糖ペプチドに関する。
別の局面において、本発明は、本発明の糖ペプチドを含む、医薬組成物、食品組成物、化粧品組成物、高分子材料組成物、農薬組成物などに関する。このような組成物の処方は、本明細書において上述したとおりであり、当業者によって容易に調製され得る。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】  以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定させるものではない。
（実施例１：直鎖状糖鎖を付加したインスリンの製造およびその機能）
１．１  インスリンの改変および製造
本実施例では、機能的糖ペプチドの代表例として、インスリンを用いて、本発明の効果を実証した。
インスリンにおいて、糖鎖を付加したい箇所のアミノ酸をグルタミン残基に変異させるかまたは野生型のものを、調製した。その調製法を以下に簡便に示す。
まず、配列番号２（Ａ鎖野生型）および４（Ｂ鎖野生型）に基づいて、以下の配列のものを遺伝子工学的に生産した。
野生型：（配列番号２および４）
Ｂ−Ｆ１Ｑ（配列番号６）
Ｂ−Ｔ３０Ｑ（配列番号８）
Ａ−Ｇ１Ｑ（配列番号１０）
Ａ−Ｎ２１Ｑ（配列番号１２）。
上記インスリンは、Ｎ末端にＨｉｓタグを付けたプロインスリン遺伝子に各プライマーを用いて変異を導入した。各々の改変に用いたプライマーは以下のとおりである。
2004101619.tif 000011
それぞれの改変体を発現ベクターｐＱＥ３１（ＱＩＡＧＥＮ、オランダ）に組み込み、大腸菌Ｍ１５株に形質転換した。
ヒトインスリンの１次構造は、Ａ鎖が２１個のアミノ酸（配列番号２）からなり、Ｂ鎖は３０個のアミノ酸（配列番号４）からなり、２箇所のジスルフィド結合によって両方の鎖が連結されている。
上記形質転換体を、ベクター製造業者が提唱するプロトコルに従って発現させ、精製を行い、Ｈｉｓ−プロインスリンを封入体として得た。
このペプチドを以下の実験に用いた。なお、ペプチドが正しい配列であるかどうかの決定は、ペプチド配列決定機を用いて確認した。
１．２  プロインスリンの巻き戻し
大腸菌から得られた封入体のＨｉｓタグ付きプロインスリン（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ  Ｉｎｓｕｌｉｎ、配列番号１９および２０）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素、１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ３，１０ｍＭ  Ｎａ２Ｓ４Ｏ６中で室温３時間で反応させ、インスリンのシステイン残基をスルホン化した後、５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０５）で緩衝液交換を行い、タンパク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌに合わせ、そこにメルカプトエタノールを１．５モル／システインモルとなるように加え、４℃で１終夜攪拌し、タンパク質を巻き戻した。
１．３  インスリンの精製
巻き戻されたＨｉｓ−プロインスリンは、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０でタンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌとなるように溶かし、トリプシン、カルボキシペプチダーゼＢをそれぞれ最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃、３０分間反応させ、Ｈｉｓタグ、プロインスリンのＣ鎖を同時除去することによりインスリン標品を得た。精製は、上記反応液をＣ４逆相液体高速クロマトグラフィーカラム（Ｖｙｄａｃ）を通すことで精製した。
１．４  直鎖状糖鎖の調製
トランスグルタミナーゼによって転移されるためには、アミノ基を有することが必要であることから、導入を目的とした糖鎖にアミノ基およびスペーサー（Ｃ６基など）を導入した。導入は、以下のとおりである。
全水酸基をベンゾイル保護したラクトースにＣＨ２Ｃｌ３、ＨＢｒ存在下で０℃で反応させ、１位水酸基をＢｒ化した。これにＺ化したアミノヘキサノール（ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＯＣＨ２−Ｃ６Ｈ１０）を、ＡｇＯＴｆ／ＣＨ２Ｃｌ２中でグリコシデーション反応を行って結合させ、ＭｅＯＮａ／ＭｅＯＨ、ＴＨＦ中でベンゾイル保護を取り除き、次いでＰｄ−Ｃ／ＭｅＯＨ中でＺ保護を取り除き、スペーサーを有するラクトース（６−アミノヘキシルラクトース、Ｌａｃ．Ａｍｉｎｏｈｅｘ．）を得た。
アミノヘキシルラクトースが調製されたか否かは、ＮＭＲなどで確認した。
１．５  インスリンへの直鎖状糖鎖付加
反応は、野生型インスリン（ＷＴ）の場合、インスリン（０．１ｍＭ）、Ｌａｃ．ＡｍｉｎｏＨｅｘ（０．９ｍＭ）、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＧＳＨ（１０ｍＭ）、トランスグルタミナーゼ（３．５Ｕ／ｍｌ）；３７℃および３０分間行った。
また、改変型インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ、Ｂ−Ｔ３０Ｑ、Ａ−Ｇ１Ｑ）の場合、インスリン（０．１ｍＭ）、Ｌａｃ．ＡｍｉｎｏＨｅｘ（０．９ｍＭ）、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、トランスグルタミナーゼ（３．５Ｕ／ｍｌ）；３７℃および３０分間反応を行った。
トランスグルタミナーゼは、オリエンタル酵母工業（株）（東京、日本）から入手した。反応液は、Ｃ４逆相液体高速クロマトグラフィーカラム（Ｖｙｄａｃ）に通し、糖鎖付加型インスリン（Ｌａｃ−Ｉｎｓ．）を得た。
反応が進行したかどうかは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳで確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳでの確認は、条件（波長（λ）：３３７ｎｍ；マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）；サンプル濃度：１０〜５０ｐｍｏｌ／μｌ）を条件として用いた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳの測定結果より、野生型、Ａ−Ｎ２１Ｑは、糖鎖がほとんど結合しないことが判明し、それ以外のインスリンにはある程度糖鎖が入ることが明らかになった。
１．６  糖鎖伸長
次に糖鎖の伸長を行った。本実施例では、ラクトースにシアル酸を付加した。
反応溶液の組成は、Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（０．１５ｍＭ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（０．８ｍＭ）、ＢＳＡ（０．２％）、ＭｎＣｌ２（１．６ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ５４（０．２％）、ＣＩＡＰ（０．０２Ｕ／μｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）、α２，６−シアル酸転移酵素を含んだ。反応は、３７℃および１終夜行った。
インスリンの改変体についても同様の反応を行った。反応液は、Ｃ４逆相液体高速クロマトグラフィーカラム（Ｖｙｄａｃ）に通し、シアルリルラクトース付加型インスリン（Ｓｉａ−Ｌａｃ−Ｉｎｓ．）を得た。
１．７  マウスへの投与時の変化
６〜８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃ１）を、１８〜２０時間絶食させ、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  ２００ｍｇ／ｋｇ（体重）を腹腔内投与し、血糖値４００ｍｇ／ｄｌ以上のものを糖尿病マウスとして、インスリンの活性測定に使用した。
インスリンの投与は皮下注射によって行い、血糖値の測定は、尾静脈より採取した血液をダイアセンサー（ＡＲＫＲＡＹ）によって測定した。
本実施例では、ＷＴ（野生型）、Ｂ−Ｆ１Ｑ、Ｂ−Ｔ３０ＱおよびＡ−Ｇ１Ｑ（３改変体）を投与したときの血糖値変化を調べた。まず、種々の位置における糖鎖付加のインスリン（１Ｕ）をマウスに投与したときの血糖値の変化を図２ＡおよびＢに示す。横軸は、各インスリン投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値を示す。この結果、２つ（インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）および（Ｂ−Ｔ３０Ｑ））は、インスリン活性を維持していることが判明した。残りのインスリン（Ａ−Ｇ１Ｑ）、ならびに（Ｂ−Ｆ１Ｑ、Ｂ−Ｔ３０ＱおよびＡ−Ｇ１Ｑ）の組み合わせでも活性は保持されていた。
次に、種々の糖鎖を付加した各インスリン（１Ｕ）をマウスに投与したときの血糖値の変化を示す。
投与サンプルはインスリン（ＷＴ）、インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）およびＳｉａ−Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）の４種類とした。
図３Ａ〜Ｃにその結果を示す。結果から明らかなように、改変型インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）は、上述の実施例とほぼ同様の結果が得られ、コントロールとほぼ差がないことが確認された。また、Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）は、コントロールと比較して若干強い血糖値抑制効果を示すことが確認された。また、Ｓｉａ−Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）は、血糖値がコントロールに比べ、長時間低い位置を維持していた。従って、コントロールに比べ、活性が長時間維持されていたことが明らかになった。
このように、３糖またはそれ以上へのサイズ変化またはシアル酸の付加により、活性が上昇したことがわかった。
１．８  ＣＤ曲線
次に、インスリン（ＷＴ）、インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）およびＳｉａ−Ｌａｃ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）のＣＤ（円偏光二色性）を調べた。その検査方法は以下のとおりである。
各インスリンは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かし、紫外線波長２８０ｎｍの吸収によってサンプル濃度を決定した。ＣＤスペクトルの測定範囲は、２００〜３００ｍμ（ｎｍ）で行った。
ＣＤスペクトルの測定結果より、インスリンに改変を施したことまたは糖鎖の付加では、インスリンの構造は実質的に変化していなかったことが確認された。
（実施例２：分枝状糖鎖を付加したインスリンの製造およびその機能）
２．１  二本鎖型糖鎖の調製
２．１．１  化合物（４）の合成
Ｎε−Ｚ−Ｌ−リジン（２．００ｇ，７．１３ｍｍｏｌ）のメタノール（８０ｍＬ）溶液に、無水コハク酸（２．１４ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）を加え、１２時間、４０°Ｃで撹拌した。反応後、混合物を減圧濃縮し、ＤＥＡＥ−ｓｅｐｈａｃｅｌ（溶出溶媒：０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム）を用いたクロマトグラフィーにより精製し、化合物（４）（２．５４ｇ，８６％）を得た（図５のスキーム１）。
［α］Ｄ＋２０．４°（ｃ０．２６４，ＭｅＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４８−７．３９（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１０（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．１２（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５５−２．４６（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ），１．７７（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．６６（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．４８（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３４（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ１８Ｈ２２Ｎ２Ｏ７・（ＮＨ４）２についての分析計算値：Ｃ，５２．１６；Ｈ，７．３０；Ｎ，１３．５２．実測値：Ｃ，５２．６４；Ｈ，７．０９；Ｎ，１３．０３。
２．１．２  化合物（５）の合成
化合物（４）（３００ｍｇ，０．７２４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液に、ピリジン（１４０μＬ，１．７４ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（３１８μＬ，１．８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、０．１ＮＨＣｌ水溶液、水、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、水で連続的に洗浄した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン−酢酸エチル（１：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（５）（４４０ｍｇ，７７％）を得た（図５のスキーム１）。
［α］Ｄ−７．８°（ｃ０．１５５，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３６−７．２６（ｍ，５Ｈ，芳香族），７．０４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ（α）），５．２０（ｂｒｔ，１Ｈ，ＮＨ（ε）），５．０８（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），４．２０（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），３．０１（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．６６（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），１．９５（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５２（ｍ，４Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ，γ））；Ｃ３０Ｆ１０Ｈ２２Ｎ２Ｏ７についての分析計算値：Ｃ，５０．５７；Ｈ，３．１１；Ｎ，３．９３．実測値：Ｃ，５０．８４；Ｈ，３．４５；Ｎ，４．０８。
２．１．３  化合物（６）の合成
３−アミノプロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１９５ｍｇ，０．４２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液に、化合物（５）（１００ｍｇ，０．１４０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（７３．２μＬ，０．４２０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１７時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（８：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（６）（１３６ｍｇ，８４％）を得た（図５のスキーム１）。
［α］Ｄ−１１．０°（ｃ０．１９７，ＤＭＦ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．９２（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ（α）），７．８９（ｔ，２Ｈ，ＮＨ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ），７．７５（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ），７．３８−７．２８（ｍ，５Ｈ，芳香族），７．１９（ｔ，１Ｈ，ＮＨ（ε）），５．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ２，３１０．０Ｈｚ，Ｈ−３），４．９９（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．８２（ｔ，２Ｈ，Ｊ３，４１０．５Ｈｚ，Ｈ−４），４．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．４Ｈｚ，Ｈ−１），４．１８（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ５，６ａ４．７ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．１０（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），４．００（ｄｔ，２Ｈ，Ｈ−６ｂ），３．８２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５），３．７５−３．６８（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−２），３．４３（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．０７（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．０２（ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．９５（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．３８−２．２８（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．０１，２．０１，１．９６，１．９０，１．７７，１．７６（全て２４Ｈ，Ａｃ×８），１．６６−１．５５（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ２−×２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．４６（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．３６（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ））１．２７（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））１．２０（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−γ）；Ｃ５２Ｈ７６Ｎ６Ｏ２３・３Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，５１．７３；Ｈ，６．８５；Ｎ，６．９６．実測値：Ｃ，５１．７６；Ｈ，６．６５；Ｎ，６．８９。
２．１．４  化合物（７）の合成
化合物（６）（４０ｍｇ，３４．７μｍｏｌ）のメタノール−水（３．０ｍＬ，２：１）混合溶液に、トリエチルアミン（２３２μＬ，１．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）で精製し、凍結乾燥により化合物（７）（２８．０ｍｇ，９０％）を得た（図５のスキーム１）。
［α］Ｄ−２８．０°（ｃ０．３１４，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４５−７．３５（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．０３（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．４８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．１５（ｂｒ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．９２（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ５，６ａ４．２ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１３．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．８８（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７５（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ５，６ｂ３．７Ｈｚ，Ｈ−５），３．７０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ２，３１０．１Ｈｚ，Ｈ−２），３．５９（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．５６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３），３．４５（ｍ，４Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−６ｂ），３．３０−３．１５（ｍ，４Ｈ，ＮＨＣＨ２），２．９５（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５５（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．５０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），１．９３（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８３−１．７３（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ２−×２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．６７（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．４８（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ））１．３３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７７．４，１７７．１×２，１７６．８，１６１．０，１３９．２，１３１．４×２，１３１．０，１３０．２×２，１０３．６×２，７８．５×２，７６．５×２，７２．６×２，７０．４，７０．３，６９．４，６３．４×２，５８．２×２，５６．７，４２．７，３８．９，３８．８，３３．６，３３．５，３３．３，３１．０×３，２４．８×３；Ｃ４０Ｈ６４Ｎ６Ｏ１７・５Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，４８．４８；Ｈ，７．５２；Ｎ，８．４７．実測値：Ｃ，４８．２６；Ｈ，７．１４；Ｎ，６．８９。
２．１．５  化合物（８）の合成
化合物（７）（３０．０ｍｇ，３３．３μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ガラクトース（４８．８ｍｇ，７９．９μｍｏｌ）を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０，０．５０ｍＬ，含１０ｍＭ塩化マンガン）に溶解し、その反応溶液にβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（１Ｕ）を加え、３７°Ｃで４８時間培養した。限外ろ過（４ｍＬ  Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（１０ｋＤａ  Ｍｗ  ｃｕｔ  ｏｆｆ））により、除タンパクした後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（溶出溶媒：０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム）、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）を用いて精製され、凍結乾燥後、化合物（８）（３４．０ｍｇ，８３％）を得た（図６のスキーム２）。
［α］Ｄ−２９．０°（ｃ０．１７２；Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．５０−７．４０（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１４（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ１，２７．２Ｈｚ，Ｈ−１），４．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ１，２７．９Ｈｚ，Ｈ−１’），４．１８（ｂｒｔ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．９１（ｂｒｄ，２Ｈ，Ｈ−６ａ），３．８６（ｄ，２Ｈ，Ｈ−４’），３．８３（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．７６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ５，６ｂ４．９ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６５（ｍ，１６Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−３’，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．６３−３．５５（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−２’），３．３６−３．２０（ｍ，４Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．１８（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５７（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．５４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．０６（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．８０−１．７５（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ２−×２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．７２（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β））１．５３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ））１．３７（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７７．３，１７７．０，１７６．７，１６４．４，１６１．０，１３９．２，１３１．４×２，１３０．９，１３０．２×２，１０５．５×２，１０３．６×２，８１．１×２，７７．９×２，７７．３×２，７５．１×２，７５．０×２，７３．５×２，７１．１×２，７０．３×２，７０．２×２，６９．３，６３．６×２，６２．７×２，５７．７×２，５６．６，４２．６，３８．８，３８．７，３３．５，３３．４，３３．２，３０．９×３，２４．８×３；Ｃ５２Ｈ８５Ｎ６Ｏ２７についてのＦＡＢ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｈ］＋，１２２５．５４６２。実測値：１２２５．５４４０。
２．１．６  化合物（１）の合成
化合物（８）（２０ｍｇ，１６．３２μｍｏｌ）のメタノール−水（７．０ｍＬ，５：２（ｖ／ｖ））混合溶液に、１０％パラジウム−活性炭（１０ｍｇ）および氷酢酸（２．８１μＬ，４８．９６μｍｏｌ）を加え、水素雰囲気下で６時間撹拌した。ろ過の後、減圧濃縮し、得られた残渣をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５、溶出溶媒：０．０１−０．１０Ｍ酢酸アンモニウム）、およびゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）により精製し、凍結乾燥の後、二本鎖型糖鎖として化合物（１）（１７．５ｍｇ，９２％）を得た（図６のスキーム２）。
［α］Ｄ−２８．２°（ｃ０．２９４，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ４．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２７．６Ｈｚ，Ｈ−１），４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２７．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ１，２７．７Ｈｚ，Ｈ−１’），４．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．９６（ｂｒｄ，２Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ１２．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ３，４３．５Ｈｚ，Ｈ−４’），３．９１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．８４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ５，６ｂ５．２ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．０Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６８（ｍ，１４Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．６７（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ２，３９．９Ｈｚ，Ｈ−３’），３．６１（ｂｒ，２Ｈ，ＯＣＨ２），３．５４（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ２，３１０．１Ｈｚ，Ｈ−２’），３．３０−３．１５（ｍ，４Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．００（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．５４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．０４（ｓ，６Ｈ，Ａｃ×２），１．９３（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯＨ），１．７６（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ２−×２），１．６９（ｍ，４Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β，δ））１．５５−１．３６（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ４４Ｈ７８Ｎ６Ｏ２５ＮａについてのＥＳＩ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋，１１１３．４９１４。実測値：１１１３．４９１０。
２．２  三本鎖型糖鎖の調製
２．２．１  化合物（９）の合成
化合物（８）（１．３０ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８０ｍＬ）溶液に、コハク酸アリル、コハク酸イミドエステル（１．２９ｍＬ，９．２８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２９ｍＬ，９．２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で８時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（４０：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（９）（１．９２ｇ，９８％）を得た（図７のスキーム３）。
［α］Ｄ＋８．７°（ｃ０．２８２，ＭｅＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３３（ｂｒｓ，５Ｈ，芳香族），６．７９（ｂｒｄ，１Ｈ，ＮＨ（α）），５．８５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−），５．２９−５．１１（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−，ＮＨ（ε）），５．０７（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．６０（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），４．５５（ｄ，２Ｈ，−ＣＨ２Ｏ），３．１８（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．５４（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），１．８８（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．７３（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５０（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３８（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ２１Ｈ２８Ｎ２Ｏ７についての分析計算値：Ｃ，５９．９９；Ｈ，６．７１；Ｎ，６．６６．実測値：Ｃ，５９．６０；Ｈ，６．８１；Ｎ，６．６８。
２．２．２  化合物（１０）の合成
化合物（９）（１．００ｇ，２．３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸（４１０ｍｇ，３．５７ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（５８９ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、０°Ｃで３０分間撹拌した。Ｌ−グルタミン酸ジアリルエステル（７６３ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液を加え、さらに１５時間室温で、撹拌した。反応後、ろ過により不溶物を取り除いた後、ろ液を酢酸エチルで希釈し、１ＮＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（４０：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１０）（１．２９ｇ，８６％）を得た（図７のスキーム３）。
［α］Ｄ−７．１°（ｃ０．２７２，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３６−７．２６（ｂｒ，６Ｈ，芳香族，ＮＨ（Ｇｌｕ）），６．７６（ｂｒｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），５．８８（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−×３），５．２９−５．１１（ｍ，７Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−×３，ＮＨ（Ｌｙｓ−ε）），５．０６（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．６０−４．４８（ｄ，８Ｈ，−ＣＨ２Ｏ×３，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），３．１７（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６７（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．４９（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．４２（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．２０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０１（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．８５（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．６６（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５０（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３９（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ３２Ｈ４３Ｎ３Ｏ１０・０．５Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，６０．１７；Ｈ，７．０５；Ｎ，６．５８．実測値：Ｃ，６０．５２；Ｈ，６．８９；Ｎ，６．８９。
２．２．３  化合物（１１）の合成
化合物（１０）（５００ｍｇ，０．７０４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１３８ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（１．２９ｍＬ，１１．９ｍｍｏｌ）を加えられ、窒素雰囲気下、１４時間撹拌した。反応後、減圧濃縮され、イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８，Ｈ＋−ｆｏｒｍ）、カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（１５：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１１）（３００ｍｇ，７４％）を得た（図７のスキーム３）。
［α］Ｄ−７．４°（ｃ０．２６２，ＭｅＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ７．３４−７．２５（ｂｒ，５Ｈ，芳香族），５．０５（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．１１（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．５１（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．４０（ｔ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．１９（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．９７（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．６６（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．４２（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ２３Ｈ３１Ｎ３Ｏ１０についての分析計算値：Ｃ，５４．２２；Ｈ，６．１３；Ｎ，８．２５．実測値：Ｃ，５３．９８；Ｈ，６．３５；Ｎ，８．１３。
２．２．４  化合物（１２）の合成
化合物（１１）（２７０ｍｇ，０．５３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液に、ピリジン（１４１μＬ，１．７５ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（３２１μＬ，１．８３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、０．１ＮＨＣｌ水溶液、水、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、水で連続的に洗浄した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン−酢酸エチル（１：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１２）（４２０ｍｇ，７９％）を得た（図７のスキーム３）。
［α］Ｄ−１０．６°（ｃ０．２５４，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．４９（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｇｌｕ）），７．３３−７．２６（ｂｒ，５Ｈ，芳香族），６．８６（ｄｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−α）），５．０６（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），５．０５（ｍ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−ε）），４．９６（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），４．５２（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．１６（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），３．１０−２．９０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．８４（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．６３（ｍ，２Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．４７（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．２２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．９２（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．７４（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５２（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．４１（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ４１Ｆ１５Ｈ２８Ｎ３Ｏ１０についての分析計算値：Ｃ，４８．８７；Ｈ，２．８０；Ｎ，４．１７．実測値：Ｃ，４９．１５；Ｈ，２．９６；Ｎ，４．０４。
２．２．５  化合物（１３）の合成
３−アミノプロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（２０７ｍｇ，０．４４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液に、化合物（１２）（１００ｍｇ，９９．２μｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１５６μＬ，０．８９３ｍｍｏｌ）を加えられ、室温で１７時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（７：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１３）（１４０ｍｇ，８５％）を得た（図８のスキーム４）。
［α］Ｄ−１４．４°（ｃ０．３２３，ＤＭＦ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．１４（ｂｒｄ，１Ｈ，ＮＨ（α）），７．９６−７．８８（ｍ，４Ｈ，ＮＨ），７．７７（ｍ，２Ｈ，ＮＨ），７．５３（ｂｒｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．３８−７．２８（ｍ，５Ｈ，芳香族），７．２１（ｔ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−ε）），５．０７（ｔ，３Ｈ，Ｊ２，３１０．４ＨｚおよびＪ３，４９．７Ｈｚ，Ｈ−３），５．００（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．８２（ｔ，３Ｈ，Ｊ４，５９．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．５８（ｄ，３Ｈ，Ｊ１，２８．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．２１（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ５，６ａ７．２ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１１．８Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．０９（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），４．０１（ｂｒｄ，３Ｈ，Ｈ−６ｂ），３．８２（ｍ，３Ｈ，Ｈ−５），３．７７−３．６４（ｍ，６Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−２），３．４３（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．１５−２．９２（ｍ，８Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε））２．５０（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（λ）），２．３５（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．１０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０１，２．０１，１．９６，１．９１，１．７７，１．７７（全て３６Ｈ，Ａｃ×１２），１．７９（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．６６−１．５５（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−×２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．３９（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．２９（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ７４Ｈ１０９Ｎ９Ｏ３４・２Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，５２．１３；Ｈ，６．６８；Ｎ，７．３９．実測値：Ｃ，５１．９３；Ｈ，６．５４；Ｎ，７．００。
２．２．６  化合物（１４）の合成
化合物（１３）（５０ｍｇ，３０．０μｍｏｌ）のメタノール−水（６．０ｍＬ，２：１）混合溶液に、トリエチルアミン（１５０μＬ，１．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）で精製し、凍結乾燥により化合物（１４）（３８．７ｍｇ，ｑ．ｙ．）を得た（図８のスキーム４）。
［α］Ｄ−４０．８°（ｃ０．１５９，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４７−７．３９（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．５０（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．８Ｈｚ，Ｈ−１），４．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．３Ｈｚ，Ｈ−１），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２８．６Ｈｚ，Ｈ−１），４．２１（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），３．９２（ｂｒｄ，３Ｈ，Ｈ−６ａ），３．８８（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．７４（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ９．７ＨｚＪ５，６ｂ４．２Ｈｚ，Ｈ−５），３．６９（ｔ，３Ｈ，Ｊ２，３１０．２Ｈｚ，Ｈ−２），３．６０（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．５４（ｍ，３Ｈ，Ｈ−３），３．４４（ｍ，６Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−６ｂ），３．３０−３．１０（ｍ，８Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５４（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．２９（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．１０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０４（ｓ，９Ｈ，Ａｃ×３），１．９８（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．７４（ｂｒ，８Ｈ，−ＣＨ２−，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３７（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７８．２，１７７．８，１７７．４，１７７．３×２，，１７７．２，１７５．８，１７５．７，１６１．２，１３９．４，１３１．６×２，１３１．１，１３０．３×２，１０３．９×３，７８．７×３，７６．６×３，７２．７×３，７０．５×２，７０．３，６３．６×３，５８．４×３，５６．９，５６．１，４２．８，３９．１，３９．１，３９．０，３４．８，３３．６，３３．５，３３．２，３１．２×２，３１．１×３，２９．８，２５．０×３；Ｃ５６Ｈ９１Ｎ９Ｏ２５・３Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，５０．０３；Ｈ，７．２７；Ｎ，９．３７．実測値：Ｃ，４９．７３；Ｈ，６．８２；Ｎ，９．３８。
２．２．７  化合物（１５）の合成
化合物（１４）（２８ｍｇ，２１．７μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ガラクトース（４７．７ｍｇ，７８．１μｍｏｌ）を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０，０．５０ｍＬ，含１０ｍＭ塩化マンガン）に溶解し、その反応溶液にβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（１Ｕ）を加え、３７°Ｃで４８時間培養した。限外ろ過（４ｍＬ  Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（１０ｋＤａ  Ｍｗ  ｃｕｔ  ｏｆｆ））により、除タンパクした後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（溶出溶媒：０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム）、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）を用いて精製し、凍結乾燥後、化合物（１５）（３７．０ｍｇ，９６％）を得た（図９のスキーム５）。
［α］Ｄ−２７．０°（ｃ０．１６６，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４７−７．３９（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．５０（ｂｒｄ，３Ｈ，Ｊ１，２７．０Ｈｚ，Ｈ−１），４．４７（ｄ，３Ｈ，Ｊ１，２７．８Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），３．９８（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ１２．２ＨｚＪ５，６ａ２．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．９３（ｄ，３Ｈ，Ｊ３’，４’３．４Ｈｚ，Ｈ−４’），３．８９（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．８３（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ５，６ｂ４．９Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６８（ｍ，２１Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．６７（ｄｄ，３Ｈ，Ｈ−３’），３．５８（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．５５（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ２’，３’９．９Ｈｚ，Ｈ−２’），３．３０−３．１０（ｍ，８Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５５（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．２９（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．１０（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０３（ｓ，９Ｈ，Ａｃ×３），１．９５（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．７４（ｂｒ，８Ｈ，−ＣＨ２−，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３７（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７８．０，１７７．７，１７７．４，１７７．１×３，，１７５．７，１６１．１，１３９．４，１３１．５×２，１３１．１，１３０．３×２，１０５．７×３，１０３．８×３，８１．６×３，７８．１×３，７７．５×３，７５．４×３，７５．２×３，７３．８×３，７１．３×３，７０．６×２，７０．３，６９．５，６３．７×３，６３．０×３，５７．９×３，５６．８，５６．１，４２．９，３９．１，３９．１，３９．０，３４．８，３３．７，３３．６，３３．２，３１．２×３，２９．８，２５．０×３；Ｃ７４Ｈ１２１Ｎ９Ｏ４０ＮａについてのＦＡＢ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋，１７９８．７６０９。実測値：１７９８．７６００。
２．２．８  化合物（２）の合成
化合物（１５）（２０ｍｇ，１１．２６μｍｏｌ）のメタノール−水（７．０ｍＬ，５：２（ｖ／ｖ））混合溶液に、１０％パラジウム−活性炭（１０ｍｇ）および氷酢酸（１．９３μＬ，３３．７６μｍｏｌ）を加え、水素雰囲気下で６時間撹拌した。ろ過の後、減圧濃縮し、得られた残渣をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５、溶出溶媒：０．０１−０．１０Ｍ酢酸アンモニウム）、およびゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）により精製し、凍結乾燥の後、三本鎖型糖鎖として化合物（２）（１６．２ｍｇ，８４％）を得た（図９のスキーム５）。
［α］Ｄ−３０．０°（ｃ０．２８２，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ４．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ１，２７．３Ｈｚ，Ｈ−１），４．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２７．５Ｈｚ，Ｈ−１），４．４８（ｄ，３Ｈ，Ｊ１’，２’７．８Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）），３．９９（ｂｒｄ，３Ｈ，Ｈ−６ａ），３．９３（ｄ，３Ｈ，Ｊ３，４３．４Ｈｚ，Ｈ−４’），３．９１（ｍ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．８４（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ５，６ｂ５．２ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６５（ｍ，２４Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−３’，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．６０（ｂｒ，３Ｈ，ＯＣＨ２），３．５４（ｄｄ，３Ｈ，Ｊ２，３１０．１Ｈｚ，Ｈ−２’），３．３０−３．１２（ｍ，６Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．０１（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５７（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．３０（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．１２（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０４（３ｓ，９Ｈ，Ａｃ×３）２．０１（ｍ，１Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．９２（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯＨ），１．７６（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ２−×２），１．７１（ｍ，４Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β，δ）），１．４３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ６６Ｈ１１５Ｎ９Ｏ３８ＮａについてのＥＳＩ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋，１６６４．７２４１。実測値：１６６４．７２７９。
２．３  四本鎖型糖鎖の調製
２．３．１  化合物（１６）の合成
化合物（４）（３８０ｍｇ，０．９９９ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸（３５２ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（５２１ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．０ｍＬ）に溶解し、０°Ｃで３０分間撹拌した。Ｌ−グルタミン酸ジアリルエステル（５４５ｍｇ，２．４０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４．０ｍＬ）溶液を加え、さらに１８時間室温で、撹拌した。反応後、ろ過により不溶物を取り除いた後、ろ液を酢酸エチルで希釈し、１ＮＨＣｌ水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、減圧濃縮した。得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（４０：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１６）（７６０ｍｇ，９５％）を得た（図１０のスキーム６）。
［α］Ｄ−４．２°（ｃ０．２６２，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．３８（ｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｇｌｕ）），７．３６−７．２７（ｂｒ，５Ｈ，芳香族），７．０８（ｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−α）），６．８３（ｄ，１Ｈ，ＮＨ（Ｇｌｕ）），５．８８（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−×４），５．３９（ｔ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−ε）），５．３４−５．２１（ｍ，８Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ−×４，），５．０７（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．６２−４．５５（ｍ，１０Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２，−ＣＨ２Ｏ×４），４．４８（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．１７（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．５６（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２×２），２．４３（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）×２），２．２０（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．００（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．８３（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．６４（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５０（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３８（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ４０Ｈ５４Ｎ４Ｏ１３・０．５Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，５９．４７；Ｈ，６．８６；Ｎ，６．９３．実測値：Ｃ，５９．５０；Ｈ，６．８７；Ｎ，６．９９。
２．３．２  化合物（１７）の合成
化合物（１６）（４００ｍｇ，０．５０１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液に、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１３８ｍｇ，０．１１９ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルアニリン（１．０８ｍＬ，１０．２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１４時間撹拌した。反応後、減圧濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８，Ｈ＋−ｆｏｒｍ）、カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（１０：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１７）（２４０ｍｇ，７５％）を得た（図１０のスキーム６）。
［α］Ｄ−１６．１°（ｃ０．２８９，ＭｅＯＨ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ７．３８−７．２５（ｂｒ，５Ｈ，芳香族），５．０５（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．４３（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２），４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α）），３．１１（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６０−２．４９（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．４０（ｔ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）×２），２．１０（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．９４（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．８１（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．６５（ｍ１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５２（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．４０（ｍ２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ２８Ｈ３８Ｎ４Ｏ１３・０．５Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，５１．９３；Ｈ，６．０７；Ｎ，８．６５．実測値：Ｃ，５１．８１；Ｈ，６．０２；Ｎ，８．４１。
２．３．３  化合物（１８）の合成
化合物（１７）（４０ｍｇ，６２．６μｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、ピリジン（２３．２μＬ，０．２８８ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（５２．７μＬ，０．３００ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水、０．１ＮＨＣｌ水溶液、水、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、水で連続的に洗浄した。減圧濃縮後、得られたシロップをＤＭＦ（３．０ｍＬ）に溶解し、３−アミノプロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１７４ｍｇ，０．３７６ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１３１μＬ，０．７５２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム−メタノール（５：１，ｖ／ｖ））により精製し、化合物（１８）（８０ｍｇ，５９％）を得た（図１１のスキーム７）。
［α］Ｄ−１１．１°（ｃ０．２３０，ＤＭＦ）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．０８（ｂｒ，１Ｈ，ＮＨ），７．９８−７．８４（ｍ，３Ｈ，ＮＨ），７．９１（ｄ，３Ｈ，ＮＨ），７．７７（ｍ，１Ｈ，ＮＨ），７．７５（ｍ，２Ｈ，ＮＨ），７．５３（ｂｒｔ，１Ｈ，ＮＨ），７．３８−７．２８（ｍ，５Ｈ，芳香族），７．２０（ｂｒｔ，１Ｈ，ＮＨ（Ｌｙｓ−ε）），５．０７（ｔ，４Ｈ，Ｊ２，３９．９Ｈｚ，Ｈ−３），５．００（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．８２（ｔ，４Ｈ，Ｊ４，５９．８Ｈｚ，Ｈ−４），４．５８（ｄ，４Ｈ，Ｊ１，２８．４Ｈｚ，Ｈ−１），４．１９（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ５，６ａ４．４ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ａ），４．１２（ｍ，３Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２），４．００（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ５，６ｂ２．４Ｈｚ  Ｈ−６ｂ），３．８２（ｂｒ，４Ｈ，Ｈ−５），３．７１（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−２），３．４２（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．１２−２．９３（ｍ，１０Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε））２．５０（ｂｒ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．３９（ｍ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．１２−２．０１（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０１，１．９６，１．９０，１．７７，１．７６（全て４８Ｈ，Ａｃ×１６），１．６５−１．５５（ｍ，１０Ｈ，−ＣＨ２−×４，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．３９（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．２５（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ９６Ｈ１４２Ｎ１２Ｏ４５についての分析計算値：Ｃ，５２．７９；Ｈ，６．５５；Ｎ，７．６９．実測値：Ｃ，５２．４５．；Ｈ，６．５３；Ｎ，７．４４。
２．３．４  化合物（１９）の合成
化合物（１８）（６０ｍｇ，２７．５μｍｏｌ）のメタノール−水（６．０ｍＬ，２：１）混合溶液に、トリエチルアミン（９１．６μＬ，０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。減圧濃縮後、得られたシロップをゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）で精製し、凍結乾燥により化合物（１９）（４５ｍｇ，９７％）を得た（図１１のスキーム７）。
［α］Ｄ−４７．２°（ｃ０．１５８，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４７−７．３９（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．５１−４．４６（ｍ，４Ｈ，Ｈ−１），４．１９（ｍ，３Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２），３．９４−３．８６（ｂｒ，８Ｈ，Ｈ−６ａ，ＯＣＨ２），３．７４（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ６ａ，６ｂ１１．９ＨｚＪ５，６ｂ４．４Ｈｚ，Ｈ−５），３．６９（ｔ，４Ｈ，Ｊ１，２８．９ＨｚおよびＪ２，３１０．４Ｈｚ，Ｈ−２），３．６３−３．５０（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−３），３．４８−３．４０（ｍ，８Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−６ｂ），３．３２−３．１０（ｍ，１０Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６０（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．２９（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）×２），２．０８（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０４（ｓ，１２Ｈ，Ａｃ×４），１．９４（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．７５（ｂｒ，１０Ｈ，−ＣＨ２−，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３６（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７８．０，１７７．４，１７７．４，１７７．３×３，１７７．１，１７６．１，１７５．７，１６１．２，１３９．４，１３１．６×２，１３１．１，１３０．４×２，１０３．９×４，７８．７×４，７６．６×４，７２．７×４，７０．５×２，７０．４，７０．３，７０．２，６９．５，６３．６×４，５８．４×４，５６．８，５６．２，４２．８，４１．５，３９．１×２，３９．０，３９．０，３４．８×２，３３．２×２，３１．２×４，２５．０×４；Ｃ７２Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ３３・５Ｈ２Ｏについての分析計算値：Ｃ，４８．８６；Ｈ，７．２９；Ｎ，９．５０．実測値：Ｃ，４８．４２；Ｈ，６．９９；Ｎ，９．４７。
２．３．５  化合物（２０）の合成
化合物（１９）（２５ｍｇ，１４．９μｍｏｌ）およびＵＤＰ−ガラクトース（４３．６ｇ，７１．５μｍｏｌ）を５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０，０．５０ｍＬ，含１０ｍＭ塩化マンガン）に溶解し、その反応溶液にβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（１Ｕ）を加え、３７°Ｃで４８時間培養した。限外ろ過（４ｍＬ  Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（１０ｋＤａ  Ｍｗ  ｃｕｔ  ｏｆｆ））により、除タンパクした後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（溶出溶媒：０．０１Ｍ炭酸水素アンモニウム）、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）を用いて精製し、凍結乾燥後、化合物（２０）（２７．０ｍｇ，７８％）を得た（図１２のスキーム８）。
［α］Ｄ−３３．５°（ｃ０．１５４，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．４６−７．３９（ｍ，５Ｈ，芳香族），５．１２（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ２），４．５２（ｂｒ，４Ｈ，Ｈ−１），４．４７（ｄ，４Ｈ，Ｊ１，２７．９Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２１（ｍ，３Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２），３．９９（ｂｒｄ，４Ｈ，Ｈ−６ａ），３．９３（ｄ，４Ｈ，Ｊ３’，４’２．８Ｈｚ，Ｈ−４’），３．９５−３．８５（ｍ，８Ｈ，ＯＣＨ２，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６６（ｍ，３２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−３’，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．５９（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．５５（ｔ，３Ｈ，Ｊ２’，３’９．９Ｈｚ，Ｈ−２’），３．２９−３．１２（ｍ，１０Ｈ，ＮＨＣＨ２，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６０（ｂｒｓ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．２９（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）×２），２．１０（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０４（ｓ，１２Ｈ，Ａｃ×４），１．９５（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．７５（ｂｒ，１０Ｈ，−ＣＨ２−，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β）），１．５１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（δ）），１．３６（ｂｒ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ１７８．１，１７７．８，１７７．５×４，１７７．２×３，１７６．１，１７５．７，１６１．２，１３９．４，１３１．６×２，１３１．１，１３０．４×２，１０５．７×４，１０３．９×４，８１．４×４，７８．１×４，７７．６×４，７５．３×４，７５．２×４，７３．８×４，７１．３×４，７０．６×２，７０．４，７０．４，７０．３，６９．５，６３．８×４，６２．９×４，５７．９×４，５６．８，５６．１×２，４２．９，３９．１，３９．１，３９．０，３９．０，３４．８×２，３３．２×２，３１．２×４，２９．８，２５．０×４；Ｃ９６Ｈ１５８Ｎ１２Ｏ５３ＮａについてのＦＡＢ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋Ｎａ］＋，２３４９．９９３５；実測値：２３４９．９９７１。
２．３．６  化合物（３）の合成
化合物（２０）（１５ｍｇ，６．４４μｍｏｌ）のメタノール−水（７．０ｍＬ，５：２（ｖ／ｖ））混合溶液に、１０％パラジウム−活性炭（１０ｍｇ）および氷酢酸（１．１１μＬ，１９．３２μｍｏｌ）を加え、水素雰囲気下で６時間撹拌した。ろ過の後、減圧濃縮し、得られた残渣をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５、溶出溶媒：０．０１−０．１０Ｍ酢酸アンモニウム）、およびゲルろ過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５溶出溶媒：水）により精製し、凍結乾燥の後、四本鎖型糖鎖として化合物（３）（１２．０ｍｇ，８２％）を得た（図１２のスキーム８）。［α］Ｄ−３１．４°（ｃ０．２７５，Ｈ２Ｏ）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ４．５１（ｂｒ，４Ｈ，Ｈ−１），４．４８（ｄ，４Ｈ，Ｊ１，２７．８Ｈｚ，Ｈ−１’），４．２１（ｍ，３Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（α），Ｇｌｕ−ＣＨ２（α）×２），４．００（ｂｒｄ，４Ｈ，Ｈ−６ａ），３．９３（ｄ，４Ｈ，Ｊ３，４３．５Ｈｚ，Ｈ−４’），３．９１（ｍ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．８５（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ５，６ｂ５．１ＨｚおよびＪ６ａ，６ｂ１２．４Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８０−３．６５（ｍ，３２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈ−３’，Ｈ−５’，Ｈ−６’ａ，Ｈ−６’ｂ），３．６０（ｂｒ，４Ｈ，ＯＣＨ２），３．５３（ｄｄ，４Ｈ，Ｊ２，３１０．２Ｈｚ  Ｈ−２’），３．３０−３．１２（ｍ，８Ｈ，ＮＨＣＨ２），３．００（ｔ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（ε）），２．６２（ｂｒ，４Ｈ，ＣＯＣＨ２），２．３２（ｂｒ，４Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（γ）），２．１５（ｍ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），２．０５（ｓ，９Ｈ，Ａｃ×３）１．９８（ｂｒ，２Ｈ，Ｇｌｕ−ＣＨ２（β）），１．９２（ｓ，３Ｈ，ＡｃＯＨ），１．７６（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ２−×２），１．７０（ｍ，４Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（β，δ）），１．４６（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ２（γ））；Ｃ８８Ｈ１５２Ｎ１２Ｏ５１Ｎａ２についてのＥＳＩ−ＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋２Ｎａ］２＋，１１１９．４７３３。実測値：１１１９．４７２２。
２．４  インスリンへの分枝状糖鎖付加
変異体インスリンへの二本鎖型糖鎖（図１３のＤＩ；化合物（１）の遊離アミンに相当）の付加は、変異体インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）（０．１ｍＭ）、二本鎖型糖鎖（図１３のＤＩ）（０．９ｍＭ）、ＣａＣｌ２（５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、トランスグルタミナーゼ（Ｔｇａｓｅ：３．５Ｕ／ｍｌ）を用いて、３７℃で３０分間反応させることによって行った。
変異体インスリンへの三本鎖型糖鎖（図１３のＴＲＩ；化合物（２）の遊離アミンに相当）または四本鎖型糖鎖（図１３のＴＥＴＲＡ；化合物（３）の遊離アミンに相当）の付加は、上記と同様にして行った。
トランスグルタミナーゼは、オリエンタル酵母工業（株）（東京、日本）から入手した。反応液は、Ｃ４逆相液体高速クロマトグラフィーカラム（Ｖｙｄａｃ）に通し、糖付加型インスリン（ＤＩ−Ｉｎｓ．）を得た。
反応が進行したかどうかは、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳで確認した。
ＨＰＬＣの測定結果から、Ｔｇａｓｅ反応の結果、糖鎖付加前のインスリン［Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］のピークとは別個に、二本鎖型糖鎖付加インスリン［ＤＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、三本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＲＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、および四本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＥＴＲＡ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］のピークが出現していることが確認された。これより変異体インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）に、ある程度分枝状糖鎖が導入されたことがわかった。
一方、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳでの確認は、波長（λ）：３３７ｎｍ；マトリックス：２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）；サンプル濃度：１０〜５０ｐｍｏｌ／μｌを条件として行った。測定結果から、Ｔｇａｓｅ反応の結果、二本鎖型糖鎖付加インスリン［ＤＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、三本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＲＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、および四本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＥＴＲＡ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］のそれぞれのピークが、糖鎖付加前のインスリン［Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］の分子量５８００付近（Ｍ．Ｗ．＝５７８８．６、Ｅｘａｃｔ  ｍａｓｓ＝５７８４．６）から、高分子量側にシフトしていることが確認された。以上により、変異体インスリン（Ｂ−Ｆ１Ｑ）に、分枝状糖鎖が導入されたことがわかった。
２．５  糖鎖伸長
次に糖鎖の伸長を行った。本実施例では、二本鎖型糖鎖付加インスリン［ＤＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、三本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＲＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］、および四本鎖型糖鎖付加インスリン［ＴＥＴＲＡ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］にシアル酸を付加した。
二本鎖型糖鎖付加インスリンの糖鎖伸長反応における反応溶液の組成は、ＤＩ−Ｉｎｓ（Ｂ−Ｆ１Ｑ）（０．１５ｍＭ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（０．８ｍＭ）、ＢＳＡ（０．２％）、ＭｎＣｌ２（１．６ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ  ＣＦ５４（０．２％）、ＣＩＡＰ（０．０２Ｕ／μｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）、α２，６−シアル酸転移酵素を含んだ。反応は、３７℃および３０分間行った。三本鎖型糖鎖付加インスリンおよび四本鎖型糖鎖付加インスリンの糖鎖伸長反応についても、上記同様の組成を有する反応溶液を用いて行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ測定結果より、糖鎖付加インスリンへのシアル酸付加による高分子量側へのピークシフトが確認された。
２．６  マウスへの投与時の変化
６〜８週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃ１）を、１８〜２０時間絶食させ、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  ２００ｍｇ／ｋｇ（体重）を腹腔内投与し、血糖値４００ｍｇ／ｄｌ以上のものを糖尿病マウスとして、インスリンの活性測定に使用した。
インスリンの投与は皮下注射によって行い、血糖値の測定は、尾静脈より採取した血液をダイアセンサー（ＡＲＫＲＡＹ）によって測定した。
糖鎖伸長後の分枝状糖鎖付加インスリン３種類［Ｓｉａ２，３−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｓｉａ２，６−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、およびＳｉａ２，６−ＴＲＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］について、ノーマルインスリン（Ｉｎｓ．（ＷＴ））をコントロールとして、血糖値変化実験を行った（図１５）。横軸は、各インスリン投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値の変化を示す。この結果、Ｓｉａ２，３−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、Ｓｉａ２，６−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）、およびＳｉａ２，６−ＴＲＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）のいずれもコントロールとほぼ同様の血糖値変化パターンを示し、インスリン活性を増強していることが明らかとなった。
２．７  ＣＤ曲線
次に、糖鎖伸長後の分枝状糖鎖付加インスリン２種類［Ｓｉａ２，６−ＤＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）およびＳｉａ２，６−ＴＲＩ−Ｉｎｓ．（Ｂ−Ｆ１Ｑ）］について、ＣＤ（円偏光二色性）を調べた。コントロールとして、野生型インスリン（Ｉｎｓ．（ＷＴ））を用いた。その検査方法は以下のとおりである。
各インスリンは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かし、紫外線波長２８０ｎｍの吸収によってサンプル濃度を決定した。ＣＤスペクトルの測定範囲は、２００〜２５０ｍμ（ｎｍ）で行った。その結果、インスリンに改変を施したことまたは糖鎖の付加および伸長では、インスリンの構造には実質的に変化を及ぼさないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、機能が亢進された糖ペプチドが提供される。
（配列表の説明）
配列番号１：ヒトインスリンＡ鎖核酸配列
配列番号２：ヒトインスリンＡ鎖アミノ酸配列
配列番号３：ヒトインスリンＢ鎖核酸配列
配列番号４：ヒトインスリンＢ鎖アミノ酸配列
配列番号５−１２：改変体（奇数は核酸配列、偶数はアミノ酸配列）
配列番号１２−１８：プライマー
配列番号１９：Ｈｉｓ−プロインスリンの核酸配列
配列番号２０：Ｈｉｓ−プロインスリンのアミノ酸配列
配列番号２１：Ｂ−Ｆ１Ｑ、Ｂ−Ｔ３０Ｑ改変体核酸配列
配列番号２２：Ｂ−Ｆ１Ｑ、Ｂ−Ｔ３０Ｑ改変体アミノ酸配列
【配列表】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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