(57)【要約】本発明は、核酸を含むサンプルの局所的加熱に適しており、サンプル中の温度変化を高速に制御することが可能であると同時に、製造が容易であり、かつ安価な核酸増幅のための反応容器、反応装置、及び核酸増幅方法を提供することを目的とし、核酸増幅反応に用いられる反応容器であって、反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、発熱体は、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、サンプル又は、サンプル及びキャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されている、反応容器を提供する。
2004029241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応に用いられる反応容器であって、
前記反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、
前記サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、
前記発熱体は、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、前記サンプル又は、前記サンプル及び前記キャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されている、反応容器。
【請求項２】
前記キャビティに前記サンプルを注入又は排出するための開口部を有する、請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
前記開口部の数は、２以上である、請求項２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記発熱体は、金属薄膜である、請求項１に記載の反応容器。
【請求項５】
前記発熱体は、前記キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、前記サンプルを前記キャビティに導入したときに、前記発熱体と前記サンプルとが直接接する、請求項１に記載の反応容器。
【請求項６】
前記発熱体は、前記キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、前記サンプルを前記キャビティに導入したときに、前記発熱体が前記サンプルと直接接しないように高分子膜で被覆されている、請求項１に記載の反応容器。
【請求項７】
前記高分子膜は、フッ素化合物又はシリコン化合物である、請求項６に記載の反応容器。
【請求項８】
前記高分子膜の膜厚は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である、請求項７に記載の反応容器。
【請求項９】
前記キャビティの最大容量が、１μｌ以上、１ｍｌ以下である、請求項１に記載の容器。
【請求項１０】
前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の反応容器。
【請求項１１】
請求項１に記載の反応容器と、電磁誘導により前記発熱体を発熱させるための加熱コイルとを有する、核酸増幅装置。
【請求項１２】
さらに、前記加熱コイルに電流を流すための交流電源を有する、請求項１１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
さらに、前記サンプルの加熱および冷却のサイクルを連続して行えるように、前記交流電源のオン／オフを制御する制御部を有する、請求項１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
核酸検出装置であって、
核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、
電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、
前記キャビティの各々は、前記サンプルが当該キャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、
前記発熱体は前記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在する前記サンプルを選択的に加熱するように前記基体に配置されている、核酸検出装置。
【請求項１５】
核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法であって、
ａ）前記サンプル又は、前記サンプル及び前記サンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、
ｂ）前記サンプルを冷却する工程とを含み、
前記工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、電磁誘導加熱による核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置に関する。特に、本発明は、電磁誘導加熱によるポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置に関する。
【背景技術】  近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
このような遺伝子情報に関する技術において最も重要な手法の一つとして、核酸の増幅反応がある。その中でもポリメラーゼ連鎖反応法は、遺伝子のある特定の部分のみを大量に増幅する技術であり、分子生物学等の研究用途の他、医療微生物学、遺伝疾患の臨床診断、法医学等、広範な分野において利用されている。特に臨床の場における遺伝子診断技術では、より迅速に分析できる事が望まれており、ポリメラーゼ連鎖反応法においても高速化技術の開発が要望されている。
ポリメラーゼ連鎖反応法によって遺伝子の増幅を行うためには、二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、プライマーを結合させる工程（アニーリング）、ポリメラーゼによりＤＮＡを伸長する工程（伸長反応）の三段階の工程を１サイクルとして、この工程を３０から３５サイクル繰り返すことによって行う。これらの工程は条件によっても異なるが、通常それぞれ熱変性９４℃×１分間、アニーリング５０〜６０℃×１分間、伸長反応７２℃×１〜５分間の条件で行う（例えば、特開昭６２−０００２８１号公報参照）。
一般に、ＰＣＲ装置においてＰＣＲ反応の温度変化の１サイクルにかかる時間は、（１）加熱のためのアルミブロックおよびサンプルを容れるための反応容器等が目的の温度になるまでの時間、（２）サンプル溶液が均一に目的の温度になるまでの時間、ならびに（３）熱変性、アニーリング、および鎖伸長という反応自体にかかる時間の和になると考えられる。（１）の時間は、主に、アルミブロックまたは反応容器等の熱容量、大きさ等に依存し、（２）の時間は、主に、サンプル容量や容器の形状等に依存すると考えられる。上記のように、ポリメラーゼ連鎖反応では４０℃程度の幅の温度変化を３０回以上も繰り返す必要があるが、従来のポリメラーゼ連鎖反応を行う装置では、ポリプロピレン製のチューブ内にサンプルを供し、熱容量の大きいアルミブロックを用いて温度の上昇を行っていたため、加熱または冷却に時間がかかり、ポリメラーゼ連鎖反応を完了させるためには、数時間以上を費やす必要があった。
一方、このようなポリメラーゼ連鎖反応装置を小型化して、反応に要する時間を短縮しようとする試みもなされている。例えば、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）チップ上に集積された微小形成されたＰＣＲ反応器が報告されている（特開２０００−２０１６８１号公報）。この集積化ＰＣＲ−ＣＥ装置は、２つのガラス基板の間に化学エッチングにより作製されたキャビティと、キャビティ内のサンプルを加熱するためにキャビティの内面または外面に金属薄膜蒸着によって配された抵抗ヒーターとを備えている。このＰＣＲ−ＣＥ装置によれば、１／１０μｌ未満の反応容量で、ＰＣＲの熱サイクルを行う場合の加熱率は２０℃／秒、冷却率は２℃／秒であることが記載されている。このＰＣＲ−ＣＥ集積装置では、加熱−冷却の１サイクルには約６０秒の時間を要するが、これは、３０サイクルを行うのに約３０分かかることに相当する。
熱サイクルをさらに短縮した例として、サンプルを容れるためのチップ様のガラスマイクロチャンバーと、非接触型加熱のための赤外線放射源としてのタングステンランプと、冷却のためのソレノイドゲート圧縮空気源とを備えた、ＰＣＲ用微小成形デバイスが報告されている（オダ（Ｏｄａ）ら，「ＤＮＡの超高速ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための赤外線媒介熱サイクル（Ｉｎｆｒａｒｅｄ・Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）」，分析化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国）１９９８年１０月１５日，第７０巻，第２０号，ｐ．４３６１−４３６８）。このデバイスでは、赤外線放射源をガラスマイクロチャンバーから２ｃｍ程のところに離して配置してサンプルを加熱し、室温の圧縮空気を利用してサンプルを冷却することで、５μｌ程度の容量のサンプルについて加熱−冷却の１サイクルを１７秒程度で完了し得る。
さらに加熱−冷却のサイクルを短縮した例として、赤外線（ＩＲ）レーザーを用いて溶液を局所的に加熱することで、高速の熱サイクルを可能にしている微小デバイスが開発されている（スリアドネフ（Ｓｌｙａｄｎｅｖ）ら，「赤外線ダイオードレーザーを使用したマイクロチップ上での化学反応の光熱的温度制御（Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｄｉｏｄｅ  Ｌａｓｅｒ）」，分析化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），２００１年８月１５日，第７３巻，第１６号，ｐ．４０３７−４０４４）。このデバイスによれば、わずか５ｎｌの容量のサンプルを用いて、６７℃／秒の加熱率、５３℃／秒の冷却率が可能であり、これは従来の熱ブロックを使ったシステムの３０倍、および上記のような電熱型の微小成形デバイスの３〜６倍の速さに相当する。
【発明の開示】
上記の従来技術では、反応容量を数μｌ〜数ｎｌの程度まで減少させ、あるいはさらに加熱部を非接触型としたりすることで、装置の熱容量を減少させ、または装置の熱容量の影響を最小限にすることにより、ＰＣＲにおける加熱−冷却のサイクルを短縮させることに成功している。しかしながら、これらのデバイスにも依然として以下のような問題が残存する。
例えば、特開２０００−２０１６８１号公報のＰＣＲ−ＣＥチップの場合、サンプルの加熱のための抵抗ヒーターを金属薄膜蒸発によってＰＣＲ−ＣＥチップ上に堆積して使用しているが、金属薄膜の種類によっては、基板への付着が良くなかったり、熱サイクルを繰り返す間に酸化を受けて抵抗値が上昇し加熱が困難となったりというような問題が生じる。さらに、ヒーターをキャビティの内部に配置すると、９５℃に加熱したときにヒーター側壁のコーティングの劣化を引き起こし、電気的導通の損失を生じる。このような問題を解消するために、特開２０００−２０１６８１号公報では、金属皮膜として白金／チタンを使用し、さらにヒーターをチップの外部平坦面上に堆積させているが、チップの外部平坦面上に配置したことでキャビティ内での温度遅れを生じさせたことも記載されている。いずれにしても、明らかなことは、このような抵抗ヒーターの使用には多くの制限があり、デバイスの製造が容易ではないということである。特に、このような抵抗ヒーターを使用する場合、ヒーター間に電圧を印加して反応容器を加熱することを可能にするために導線が必要であり、そのための配線が容易ではなく、チップの設計が複雑になる。
また、上記オダら（１９９８）のようなタングステンランプを使用した例では、チップ全体が加熱されるため、例えば、上記特開２０００−２０１６８１号公報のようなＰＣＲ−ＣＥ集積型チップで、ＰＣＲ反応に使用するキャビティ部分のみを加熱するというような局所的加熱ができないという問題がある。
また、上記スリアドネフら（２００１）のようなＩＲレーザーを使用する例では、熱源として非常に大きな出力を可能にする装置が必要となり、設備面でのコストが膨大になる。
したがって、加熱−冷却のサイクルを加速しつつ、なお局所的加熱が可能であり、しかも製造が容易であり、かつ安価なＰＣＲデバイスに対する必要性が存在する。
そこで本発明は上記の問題点に鑑み、サンプル中のＤＮＡを高速に増幅することが可能であると同時に、サンプルの局所的加熱に適しており、製造が容易であり、かつ安価な核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置を提供することを目的とする。さらに、本発明は、診断目的で使用するためのカード型ＰＣＲ反応装置またはカード型診断デバイスを提供することを目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明は、核酸増幅反応に用いられる反応容器を提供し、この反応容器は、反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、上記発熱体が、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、サンプル又は、サンプル及びキャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されていることを特徴とする。
好ましくは、本発明の反応容器は、キャビティにサンプルを注入又は排出するための開口部を有する。必要に応じて、その開口部の数は、２以上であり得る。
好ましくは、発熱体は、金属薄膜である。
好ましくは、発熱体は、キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、サンプルをキャビティに導入したときに、発熱体とサンプルとが直接接する。
好ましくは、発熱体は、キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、サンプルをキャビティに導入したときに、発熱体がサンプルと直接接しないように高分子膜で被覆されている。好ましくは、その高分子膜は、フッ素化合物又はシリコン化合物である。さらに好ましくは、その高分子膜の膜厚は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。
好ましくは、キャビティの最大容量は、１μｌ以上、１ｍｌ以下である。
好ましくは、上記の核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
本発明は、別の局面において、核酸増幅装置を提供し、この核酸増幅装置は、上記の反応容器と、電磁誘導により発熱体を発熱させるための加熱コイルとを有することを特徴とする。
好ましくは、本発明の核酸増幅装置はさらに、加熱コイルに電流を流すための交流電源を有する。
好ましくは、本発明の核酸増幅装置はさらに、サンプルの加熱および冷却のサイクルを連続して行えるように、交流電源のオン／オフを制御する制御部を有することを特徴とする。
本発明はさらに別の局面において、核酸検出装置を提供する。この核酸検出装置は、核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、キャビティの各々は、サンプルがキャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、発熱体は上記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在するサンプルを選択的に加熱するように基体に配置されていることを特徴とする。
本発明はさらに別の局面において、核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法を提供する。この方法は、ａ）サンプル又は、サンプル及びサンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、ｂ）上記サンプルを冷却する工程とを含み、工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする。
本発明によれば、サンプル中のＤＮＡを高速に増幅することが可能な核酸の増幅反応並びにそれに用いる反応容器及び反応装置を提供することができる。さらに、核酸を高速に増幅して検出することができる核酸検出装置が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明の一実施の形態に係る反応容器の構造を示す分解斜視図である。
図２は、同反応容器を基板側から見た斜視図である。
図３は、同反応容器の一変形例の構造を示す斜視図である。
図４は、同反応容器の他の変形例の構造を示す分解斜視図である。
図５は、同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す断面図である。
図６は、同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す上面図（ａ）および長手方向断面図（ｂ）である。
図７は、同実施の形態に係る反応装置を示す概略図である。
図８は、本発明の一実施例及び比較例の反応容器を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った際の増幅産物の結果を示す電気泳動写真である。
図９は、本発明の一実施例及び比較例の反応容器を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った際の増幅産物の結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の一実施の形態に係る、核酸増幅反応に用いられる反応容器は、反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、上記発熱体が、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、サンプル又は、サンプル及びキャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されていることを特徴とする。
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸増幅装置は、上記本発明の反応容器と、電磁誘導により発熱体を発熱させるための加熱コイルとを備えることを特徴とする。
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸検出装置は、核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、キャビティの各々は、サンプルがキャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、発熱体は上記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在するサンプルを選択的に加熱するように基体に配置されていることを特徴とする。
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法は、ａ）サンプル又は、サンプル及びサンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、ｂ）上記サンプルを冷却する工程とを含み、工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする。
以上のようにすると、電磁誘導により加熱したい部分のみを直接発熱させることができるので、極めて速やかに温度が上昇する。また、電磁誘導により発熱し得る材料を含む部分以外の反応容器は加熱されていないので、反応容器の熱容量で極めて速やかに温度が下降する。よって、アルミブロック等からなる従来の反応容器を用いた核酸の増幅反応と比較し、短時間で核酸の増幅を行うことができる。
以下、本発明の実施の形態について図面を用いてさらに詳細に説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係る反応容器の構造を示す分解斜視図である。
図１に示すように、本発明による核酸増幅反応容器では、少ないサンプル量であっても精度良く調整できるように、また温度の上昇・下降が速やかに行われるように、基板１上にキャビティ２を形成して作製され得る。
本発明による核酸増幅反応容器に用いられる基板１は、サンプル液と反応しなければどのような材料でもよく、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック等を使用することができる。さらに、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などの樹脂も使用され得る。基板１上に形成されるキャビティ２の形成方法は、基板１がシリコン等の半導体であれば、ＲＩＥ等のドライエッチングや強アルカリ性のエッチング液等を用いたウェットエッチングを用いることができ、ガラスであれば、フッ酸等を用いたウェットエッチングを用いることができる。中でも、基板１としてシリコン等の半導体を用いれば、半導体分野において公知である微細加工技術を利用し、微小なキャビティを精度良く加工することができるので好ましい。また、基板１がポリスチレンなどの樹脂の場合には、成型、削りだし、インプリンティングなどの技術によりキャビティ２を形成し得る。また、シート状の材料に切削などで作製した貫通孔を形成し、基板と張り合わせることによってもキャビティ２を形成することが可能である。
こうして形成したキャビティ２は、反応中にサンプルが流出しないよう適当な材質を用いた蓋板３で封止される。蓋板３の材質は、基板１の材質と同様のものを用いることができるが、基板１と完全に接着もしくは密着し、キャビティ２内部のサンプルを封止することが好ましい。例えば、基板１がシリコン、蓋板３がガラスの場合、陽極接合、直接接合等の技術を用いて封止することができる。その他、基板１及び蓋板３が双方ともガラスの場合は、フッ酸接合の技術を用いた接着等により封止することも可能である。また、基板１および基板３が上記のような樹脂の場合には、接着剤、熱融着などにより封止することが可能である。
蓋板３にはキャビティ２内部にサンプルを注入するためのサンプル注入孔４が設けられている。サンプル注入孔４は少なくとも１つあれば良いが、２つ以上設けておくと、サンプルの注入時に用いたもの以外のサンプル注入孔４がキャビティ２内部の空気の逃げ道として機能し、サンプルを速やかに注入することができるので好ましい。サンプル注入孔４は、サンプルを注入した後は耐熱性テープなどを用いて封止され、核酸の増幅反応中にサンプルがサンプル注入孔４から漏出または気化することを防ぐ効果を有する。
キャビティの容量は、目的に応じて異なり得るが、一般的には、数ｎｌ〜数ｍｌまでの範囲であり得る。例えば、キャビティの最大容量は、約１ｎｌ〜約１０ｎｌ、約１０ｎｌ〜約１００ｎｌ、約１００ｎｌ〜約１μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、約１０μｌ〜約１００μｌ、約１００μｌ〜約１ｍｌ、または約１ｍｌ〜約１０ｍｌの範囲であり得る。通常、キャビティの容量は、数μｌから数ｍｌのオーダーまでが好適であり得る。キャビティの形状は、円形に限らず、三角形、四角形などの多角形状であり得る。
図２に、本発明の同実施の形態に係る反応容器を基板側から見た斜視図を示す。基板１の裏面（蓋板３と面している面と反対側の面）上全面に、電磁誘導により発熱し得る材料を含む発熱部５が設けられている。
発熱部５に含まれる電磁誘導により発熱し得る材料としては、ステンレス、鉄、ニッケル、銀、銅、またはアルミニウムが挙げられる。これらの金属を単体として用いても、組み合わせて用いてもよい。または、上記の金属を含む合金やクラッド材を用いてもよい。
発熱部５は、薄板、ホイル等の形態のものを基板１上に貼付してもよく、また基板１上にスパッタ、蒸着等の方法で製膜することにより形成してもよい。
図３〜６に、本発明の同実施の形態に係る反応容器の変形例の構造を示す。図３は同反応容器の一変形例の構造を示す斜視図、図４は同反応容器の他の変形例の構造を示す分解斜視図、図５は同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す断面図である。図６は、キャビティを複数個有する本発明の反応容器の変形例の上面図（ａ）および長手方向断面図（ｂ）である。
一変形例では、図３に示すように、発熱部５は基板１の裏面上であって、キャビティ２を基板１の裏面に投影した位置の実質的に全部に設けられている。
他の変形例では、図４に示すように、発熱部５はキャビティ２内であって、実質的にキャビティ２の底面全面に設けられている。この場合、基板１と蓋板３との接着を妨げない位置に発熱部５が形成されていることが好ましい。また、発熱部５の少なくともサンプルと接触する部分が、サンプルと反応しない材料により構成されることが好ましい。このような材料としては、例えば、フッ素化合物を含む薄膜、もしくはシリコン化合物を含む疎水性の薄膜などの高分子膜が挙げられる。薄膜としては、サンプルと反応せず、９５℃程度の温度上昇に耐え得るものであれば、特にこれらに限定されない。また、薄膜の膜厚は、熱が拡散してしまう可能性を最小にする観点から、薄ければ薄いほどよく、好ましくは約１０ｎｍ〜約１０μｍ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約１μｍ、最も好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍである。約１０ｎｍ以上であることが好ましい理由は、これよりも膜厚が小さいと、発熱体とサンプルとが反応する可能性があるからである。
フッ素化合物を含む薄膜としては、フッ化炭素を利用することができる。フッ化炭素の薄膜は、ステンレス板をフッ素化炭素ガス雰囲気中に設置し、プラズマを発生させ、ステンレス板にプラズマ処理を行うことにより、形成することができる。また、フッ素系シランカップリング材を用いても、フッ素化合物を含む薄膜を形成することができる。
一方、シリコン化合物を含む薄膜は、シリコナイズ処理によって形成し得る。シリコナイズ液としては、例えば、ＳＩＧＭＡＣＯＴＥ（登録商標）（シグマ製）を用いることができる。デシケータ内にステンレス板とシリコナイズ液とを入れ、デシケータ内を真空に吸引することにより、シリコナイズ液が気化し、シリコン化合物の蒸気が、ステンレス板に付着して疎水性の薄膜を形成することができる。また、ステンレス板表面に直接シリコナイズ液を注入し、蒸留水で洗い流すことによっても、薄膜を形成することができる。
さらに他の変形例では、図５に示すように、発熱部５は基板１内部に埋め込まれた形で形成されている。図５のような構成の作成法の一例としては、基板１として高分子フィルムを接着することにより形成することが可能である。ここで高分子フィルムとしては、前述の樹脂材料を用いたものが利用できるが、このうち、ＰＥＴフィルムが安価であり入手が容易であるため、最も利用しやすい。
図５において、発熱部５とキャビティ２との間の距離（すなわち高分子フィルムの厚み）は、加熱効率を考えると、短いほど良い。具体的には、この距離の上限は、１ｍｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下が望ましい。また、この距離の下限としては、実用的な高分子フィルムの強度の限界等から１μｍ以上、より望ましくは５μｍ以上がよい。
これらの変形例では、キャビティ２の近傍のみに発熱部５が設けられているため、基板１の熱容量の影響を受けにくくなり、より速やかにサンプル温度の上昇・下降を行うことができる。また、本発明の発熱部５は、上記のように、薄板、ホイル等の形態のものを基板１上に貼付したり、または基板１上にスパッタ、蒸着、メッキ等の方法で製膜したりするのみで形成し得る。したがって、配線やヒーター端子の設置の必要がないため、例えば、抵抗ヒーターを用いる場合に比べて、反応容器の作製が容易であるという利点がある。また、発熱部５の性質上、位置や形状、大きさなども目的に応じて容易に変化させることができる。サンプルの加熱効率を高くするためには、発熱部５はキャビティに対する投影面積ができるだけ大きくなるような形状がよい。
なお、基板が、電磁誘導により発熱し得る材料を含んでいてもよい。このようにすると、別途発熱部を設ける必要がなく、簡易な構成とすることができる。この場合、上記と同様、基板の少なくともサンプルと接触する部分が、サンプルと反応しない材料により構成されることが好ましい。
図６は、上記本発明の応用例として、チャネル６ａ〜ｃで互いに流体連絡可能に連結され直線的に配置された複数のキャビティ（キャビティ２ａ〜ｄ）からなるカード（またはチップ）型ＰＣＲデバイスの代表的な実施形態を示す。図６のデバイスにおいて、キャビティ２ａは、細胞を破壊してゲノムＤＮＡを抽出するために使用される。キャビティ２ｂは、その抽出されたゲノムＤＮＡを精製するために使用され、キャビティ２ｃは、精製されたＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅するために使用される。キャビティ２ｄは、増幅したＤＮＡを検出するために使用される。
この実施形態において、サンプルは、血液、唾液、毛根などであり得る。本発明のカード型デバイスは、病院等における診断用に主として使用され得る。サンプル中の細胞からのゲノムＤＮＡの抽出、精製、ＰＣＲによる増幅、および検出が一連の工程によって迅速に行われ得るため、特に「ポイントオブケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ）」用途に特に有用であり得る。使用する試薬によるが、それぞれのキャビティには必要な試薬が予め入れられていても良いし、あるいは使用直前に入れるようにしてもよい。ＤＮＡの抽出→精製→ＰＣＲという各工程は、まとめて１つのキャビティ内で行ってもよい。
キャビティ２ａでのゲノムＤＮＡの抽出、およびキャビティ２ｂでのゲノムＤＮＡの精製は、適切な試薬等を用いて行い得る。例えば、白血球などの細胞を壊す試薬やプロテイナーゼなどの酵素試薬等を用いる。代表的なＤＮＡの抽出・精製法として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１巻（第３版）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１．３１−１．３８，２００１）の中の「Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ」に示されているような手法があるが、この手法では、遠心分離による操作が必要とされる。一方、近年、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（Ｒ）（株式会社  島津製作所製）のような、試薬を加えるだけでＤＮＡの抽出・精製を行い得る技術も開発されており、このような技術を使用すれば、容器（またはキャビティ）の構造によらず、ＤＮＡの抽出および精製を行い得る。また、ＤＮＡの抽出および精製は、２つの別々のキャビティで行う代わりに、同一キャビティ内で行うことが可能である。例えば、図６のキャビティ２ａおよび２ｂを併せて１つのキャビティ２ａｂ（不図示）とし、全体として３つのキャビティ（抽出・精製、増幅および検出）からなるカード型デバイスとすることも可能である。
ＰＣＲ反応用のキャビティ２ｃの下部には、金属などの電磁誘導により発熱し得る材料を埋め込んだ発熱部５が配置されており、これにより、キャビティ２ｃのみを局所的に加熱することができる。ＰＣＲ反応には、温度の上下が必要であるが、その上下サイクルが検出用キャビティ２ｄの酵素等に影響がないように発熱部５を配置することが重要である。
キャビティ２ｄでのＤＮＡの検出には、光学的方法や電気泳動等の方法が使用され得る。例えば、ＤＮＡの増幅と共に生成されるピロリン酸の濃度を測定する方法は、洗浄、分離などの操作を伴わず、本発明における検出部として有用である。例えば、特表２００１−５０６８６４号公報に開示されるように、ピロリン酸をＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に変換し、ＡＴＰを基質としてルシフェラーゼの作用によるルシフェリン発光を検出する光学的方法や、ピロホスファターゼ、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナザーゼ）、ジアホラーゼ等を用いて電気化学的に検出する方法などを用いることができる。光学方法の場合は、カード型デバイスにおけるキャビティ２ｄ上の基板１もしくは基板３のいずれかもしくは両方は、検出すべき光の波長に対して透過性の材料を用い、電気化学的方法の場合は、キャビティ２ｄ内に金、白金、炭素、必要であれば銀／塩化銀などの電極を設ける。
キャビティ間のサンプルの移動は、電気浸透流、ポンプ、遠心力などを利用して行い得る。例えば、正負それぞれの電極を設けて電気浸透流を利用して流体を移動させる方法（Ｂａｒｋｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．；（Ａｒｔｉｃｌｅ）；２０００；７２（２４）；５９２５−５９２９）、サンプル注入孔４にチューブ状の配管ポンプを設けてポンプによる圧力もしくは吸引力を利用する方法（Ｈｉｓａｍｏｔｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．：（Ａｒｔｉｃｌｅ）；２００１；７３（２２）；５５５１−５５５６）、または回転する部材（例えば、ＣＤドライブなど）の上に基板を設置し、流路を遠心力の働く方向に合わせることによって、遠心力を利用してサンプル溶液を移動させる方法（Ｄｕｆｆｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．；（Ａｒｔｉｃｌｅ）；１９９９；７１（２０）；４６６９−４６７８）等が利用され得る。
なお、図６では、一種類のＤＮＡサンプルのみ解析する構成となっているが、さらに多くのチャネルおよびキャビティのセットを設けてチップ上で複数のＤＮＡを解析するようにしてもよい。また、サンプル注入孔の数、キャビティの数、キャビティやチャネルの配置のパターンなどは上記実施形態のものに限らないことはもちろんである。
図６に示す本発明のカード型デバイスの大きさは、特に限定されないが、取り扱いの容易さを考慮すれば、スライドガラス程度の大きさから、クレジットカードの大きさ（名刺サイズ）程度までが好適であり得る。各キャビティの容量は、目的に応じて異なり得るが、一般的には、数ｎｌ〜数ｍｌまでの範囲であり得る。例えば、キャビティの最大容量は、約１ｎｌ〜約１０ｎｌ、約１０ｎｌ〜約１００ｎｌ、約１００ｎｌ〜約１μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、約１０μｌ〜約１００μｌ、約１００μｌ〜約１ｍｌ、または約１ｍｌ〜約１０ｍｌの範囲であり得る。しかしながら、診断用に病院等で通常使用される量を考慮すれば、キャビティの容量は、数μｌから数ｍｌのオーダーまでが好適であり得る。キャビティの形状は、円形に限らず、三角形、四角形などの多角形状であり得る。
図７に、本発明の同実施の形態に係る反応装置の概略図を示す。本実施の形態の反応装置は、図１に示す反応容器と、電磁誘導により発熱部を加熱するための加熱コイル６と、加熱コイルに電流を流すための電源部である交流電源７と、交流電源７を制御する制御部８およびタイマ９とを備えている。電磁誘導加熱は、交流電源７を用いて加熱コイル６に高周波電流を流すことにより発生する磁力線が、発熱部に渦電流を生じさせることにより発生する。この渦電流は、発熱部の電気抵抗により損失を発生し、この損失がジュール熱となって発熱部自体が発熱する。発熱部の発熱量と関係のある発熱部の吸収電力Ｐは、以下の式によって表される。
Ｐ＝ＫＲｓ（ＮＩ）２
但し、ここで、Ｐは発熱部の吸収電力（Ｗ）、Ｎは加熱コイルの巻き数、Ｒｓは発熱部の表皮抵抗（Ω）、Ｉは加熱コイルの電流（Ａ）、Ｋは定数である。また、発熱部の表皮抵抗Ｒｓは、
Ｒｓ＝ρ／δ
で表される。ここで、ρは発熱部の抵抗率（Ωｃｍ）、δは電流の表皮浸透深さ（ｍ）である。
通常、加熱コイルに流す高周波電流の周波数は２０〜２５ｋＨｚ程度であるので、発熱部における発熱量を大きくするためには、発熱部に含まれる、電磁誘導により発熱し得る材料は、抵抗率が大きくかつ２０〜２５ｋＨｚにおける浸透深さが小さいものが好ましい。このような好ましい材料としては、ステンレス、鉄、ニッケル、銀等が挙げられる。また、これらの材料のいずれかを含む合金、クラッド材等も好ましい。
また近年、２０ｋＨｚ程度のスイッチング方式で、加熱コイル電流周波数を約６０ｋＨｚにする３倍共振インバーターの開発や、低損失微細線集合撚りコイルによる表皮効果の低減が実現され、アルミニウム、銅、金、黄銅などの非磁性材料も好ましく使用することが可能である。
このように、例えば、抵抗コイルを使用する場合に材質の選択に制限があることに比べると、本発明は、発熱部の材料の選択に比較的自由度がある点で有利である。例えば、本発明の場合、発熱部の材料として、ＳＵＳ等の熱に強い材料を選択できるという利点がある。
反応容器を加熱コイル６上に設置し、加熱コイル６に高周波電流を流すことによって、電磁誘導加熱により発熱部がその電流量に伴って発熱し、キャビティ２内のサンプルの温度が上昇する。逆に、高周波電流を停止すると発熱部の発熱は終了し、キャビティ２内のサンプルの温度が下降する。このような高周波電流のオン／オフの制御は、制御部８が、反応容器上またはキャビティ内に設置された温度プローブ（不図示）で計測される温度およびタイマ９で計測される時間に基づいて行う。このように電磁誘導を用いると、発熱部を設ける位置を調整することにより、加熱したい部分のみを直接発熱させることができるので、極めて速やかにサンプルの温度が上昇する。また、加熱される部分が発熱部に限定され、反応容器の発熱部以外の部分は加熱されないので、電磁誘導による加熱を停止すると、反応容器の熱容量で極めて速やかに温度が下降する。よって、アルミブロック等からなる従来の反応容器を用いた核酸の増幅反応と比較し、短時間で核酸の増幅を行うことができる。さらに、反応容器の形状及び発熱部の位置・形状も自由に選択することができる。また、本発明の場合、交流電流を使用するため熱効率も非常に高く、劣化等が起こりにくいという利点がある。
【実施例】
【実施例１】  以下、図１及び図２に示す本発明の一実施の形態に係る反応容器を用いて、核酸の増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を行った実施例について説明する。
基板１として厚さ５００μｍのシリコン単結晶板を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応用の反応容器を作製した。
まず、表面が鏡面処理された厚みが５００μｍのシリコン単結晶板と厚みが４００μｍのガラスを用意し、シリコン単結晶板に六フッ化硫黄を用いたドライエッチングによって、６ｍｍφのキャビティ２を形成した。エッチング深さは、１７０μｍとした。
次に、蓋板３となるガラスに、サンドブラストによってサンプル注入孔４となる０．６ｍｍφの穴を２箇所開けた。
次に、シリコン単結晶板とガラスとを、酸性洗浄剤を用いて表面を洗浄し、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱することによって、接着剤を用いない直接接合によってシリコン単結晶板からなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着した。
最後に、８ｍｍ×６ｍｍのチップ状に切り出した後、裏面側すなわちシリコン単結晶板側のほぼ全面に、発熱部５として、サイズが８ｍｍ×１６ｍｍで厚さ１ｍｍのＳＵＳ４３０板を、高熱伝導接着シート（三菱ガス化学株式会社製セラジン）を用いて接着し、反応容器を作製した。また、比較例としては、０．５ｍｌポリプロピレンチューブを反応容器として用いた。
ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレートとしてλＤＮＡ（寳酒造製）（λＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｖ００６３６，Ｊ０２４５９，Ｍ１７２３３，Ｘ００９０６を参照）を用いた。プライマーとしてＴａＫａＲａ  ポリメラーゼ連鎖反応  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒｌ（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’）及びＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’）を用いて実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。
２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（Ｒ）０．２５μｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ３各２．２５μｌ、０．２５μｇ／μｌウシ血清アルブミン２μｌを加えた後、１０ｎｇ／μｌ  λＤＮＡ  ５μｌを加え蒸留水２９μｌを加えて総量を５０μｌとした。
上記で調製したサンプルを、本実施例の反応容器に５μｌ、比較例の反応容器に２０μｌそれぞれ注入し、本実施例の反応容器は耐熱性テープでサンプル注入孔４を封止した。比較例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９８℃１分、５５℃１分、７２℃２０秒で３０サイクル行った。トータルの反応時間は８０分であった。一方、本実施例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、反応容器を加熱コイル上に設置し、電磁誘導加熱によって、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃５秒で３０サイクル行った。温度は、熱電対を直接反応容器上に固定して測定し、加熱コイルに流す周波数２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御した。トータルの反応時間は５分であった。
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、１．５ｍｌ遠心チューブ内に容器を挿入し、１０ｋｒｐｍの回転数で１分間遠心処理を行うことにより、容器からサンプルの回収を行った。回収したサンプルは、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応により目的の５００ｂｐが増幅されているかどうかを確認した。電気泳動に使用したゲルは、３％アガロースを用いた。アガロースは日本ジーン社製ＡｇａｒｏｓｅＳを用いた。電気泳動用バッファーは、日本ジーン社製５０×ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を希釈して用いた。電気泳動条件は、１００Ｖ、３５〜４０分で行った
図８に、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を表す電気泳動写真を示す。図中、Ａはマーカー（分子量マーカー）、Ｂは比較例の反応容器を用いた場合、Ｃは本実施例の反応容器を用いた場合を示す。また、矢印で示した部分が目的の増幅産物である。
図８から、本実施例の反応容器を用いた場合も、比較例の反応容器を用いた場合と同様に目的のＤＮＡが増幅されたことがわかる。よって、本実施例の反応容器を用いることにより、比較例の反応容器を用いた場合と比較して１０分の１以下の反応時間で、良好な核酸の増幅反応を行うことができた。
なお、加熱温度と時間を変えて、比較例として、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分で３０サイクルを行った場合には、トータルの反応時間は９０分であった。一方、本発明の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応として、電磁誘導加熱によって、９４℃１秒、５５℃１秒、７２℃５秒で３０サイクル行った場合（周波数は２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御）、トータルの反応時間は１０分であった。この場合も、本発明の反応容器を用いるＰＣＲ反応により、目的のＤＮＡを、比較例の場合と比較して９分の１程度の反応時間で増幅し得た。
なお、本実施例では、シリコン単結晶板とガラスとを、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱し、直接接合によってシリコン単結晶板がらなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着したが、加熱するときの温度はガラスの材質によって変えれば良い。ナトリウム、カリウムなどを含むガラスであれば２５０℃で、これらを含まないガラスであれば４００℃程度まで上げる。また、ガラスの材質は石英ガラスのように不純物を含まないものでも可能である。この場合はさらに温度を５００℃以上に上げる。さらに、蓋板材料はシリコン単結晶板でも可能である。この場合はキャビティ２を形成したシリコン単結晶板とサンプル注入孔４を形成したシリコン単結晶板とを直接接合によって張り合わせる。張り合わせ時の温度は５００℃以上にすればよい。
【実施例２】  以下、実施例１と同様にして作成した反応容器を用いて、核酸の増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を行った実施例について説明する。比較例として、０．５ｍｌポリプロピレンチューブを反応容器として用いた。
ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレートとしてヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ溶液を用いた。ＤＮＡ溶液は、被験者の血液から、ＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）（寳酒造製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出して用意した。プライマーとしては、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ用コントロールプライマーβ−ｇｌｏｂｉｎ（ｈｕｍａｎ）Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（寳酒造製）のＧＨ２０（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー（５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ−３’）および、ＧＨ２１（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー（５’−ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ）を用いて実験を行った（４０８ｂｐ増幅用）。２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｚ−Ｔａｑ（Ｒ）０．５μｌ、１０×Ｚ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ３各２．２５μｌ、０．２５μｇ／μｌウシ血清アルブミン２μｌを加えた後、１０ｎｇ／μｌヒトゲノムＤＮＡ  ５μｌを加え蒸留水２９μｌを加えて総量を５０μｌとした。
上記で調製したサンプルを、本実施例の反応容器に５μｌ、比較例の反応容器に２０μｌそれぞれ注入し、本実施例の反応容器は、液状シール材エレップコートＬＳＳ−５２０（日東シンコー株式会社製）を用いてサンプル注入孔４を封止した。比較例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９８℃５秒、６６℃２秒で３０サイクル行った。トータルの反応時間は２０分であった。一方、本実施例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、反応容器を加熱コイル上に設置し、電磁誘導加熱によって、９８℃２秒、６６℃１秒で３０サイクル行った。温度は、熱電対を直接反応容器上に固定して測定し、加熱コイルに流す周波数２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御した。トータルの反応時間は５分であった。
さらに、ＰＣＲ反応の１サイクルにかかる時間に対する容器の形状、大きさ、熱容量等の影響を確認するために、従来のアルミブロック式のサーマルサイクラーを使用するＰＣＲ装置において、５μｌのサンプルを含んだ本実施例の反応容器をアルミブロック上に載せて、通常のポリプロピレンチューブを用いた場合と同様に、電磁誘導による加熱を利用せずに、ＰＣＲ反応を行った。９８℃２秒、６６℃１秒で３０サイクルを行い、トータルの反応時間は１８分であった。このように、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いた場合、本実施例の反応容器を用いたとしても、トータルの反応時間は通常のポリプロピレンチューブを用いたときと同定度の時間がかかった。したがって、アルミブロック式のサーマルサイクラーを使用した場合に１サイクルに要する時間を主として決定しているのは、容器の形状等よりもむしろアルミブロック自体の熱容量であることが確認された。
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、実施例１と同様にサンプルの回収を行った。回収したサンプルは、実施例１と同様にアガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応により目的の４０８ｂｐが増幅されているかどうかを確認した。
図９に、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を表す電気泳動写真を示す。図中、ＡおよびＡ’はマーカー（分子量マーカー）、Ｂは比較例の反応容器を用いてアルミブロック式のサーマルサイクラーでＰＣＲを行った場合、Ｃは本実施例の反応容器を用いて電磁誘導加熱によりＰＣＲを行った場合を示す。また、矢印で示した部分が目的の増幅産物である。
図９から、本実施例の反応容器を用いて電磁誘導加熱を利用した場合も、比較例の反応容器を用いてアルミブロック式のサーマルサイクラーを利用した場合と同様に目的のＤＮＡが増幅されたことがわかる。よって、本実施例の反応容器において電磁誘導による加熱を用いることにより、比較例の反応容器でアルミブロック式のサーマルサイクラーを用いた場合と比較して、反応時間を約４分の１に短縮すると同時に、匹敵する良好な核酸の増幅反応を行うことができた。
【産業上の利用可能性】  本発明に係る電磁誘導加熱を用いた核酸増幅反応に用いる反応容器、反応装置、核酸検出装置及び核酸増幅方法は、サンプルの局所的加熱に適しており、サンプル中の温度変化を高速に制御することが可能である。同時に、本発明に係る核酸増幅反応に用いる反応容器、反応装置および核酸検出装置は、製造が容易であり、かつ安価であるという効果を有し、ＰＣＲによる核酸増幅、各種酵素反応、およびそれらを組み合わせて用いるポイントオブケア用途の診断カードデバイスなどの用途に有用である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月7日(2004.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応に用いられる反応容器であって、
前記反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、
前記サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、
前記発熱体は、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、前記サンプル又は、前記サンプル及び前記キャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されている、反応容器。
【請求項２】
前記キャビティに前記サンプルを注入又は排出するための開口部を有する、請求項１に記載の反応容器。
【請求項３】
前記開口部の数は、２以上である、請求項２に記載の反応容器。
【請求項４】
前記発熱体は、金属薄膜である、請求項１に記載の反応容器。
【請求項５】
前記発熱体は、前記キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、前記サンプルを前記キャビティに導入したときに、前記発熱体と前記サンプルとが直接接する、請求項１に記載の反応容器。
【請求項６】
前記発熱体は、前記キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、前記サンプルを前記キャビティに導入したときに、前記発熱体が前記サンプルと直接接しないように高分子膜で被覆されている、請求項１に記載の反応容器。
【請求項７】
前記高分子膜は、フッ素化合物又はシリコン化合物である、請求項６に記載の反応容器。
【請求項８】
前記高分子膜の膜厚は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である、請求項７に記載の反応容器。
【請求項９】
前記キャビティの最大容量が、１μｌ以上、１ｍｌ以下である、請求項１に記載の反応容器。
【請求項１０】
前記核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の反応容器。
【請求項１１】
請求項１に記載の反応容器と、電磁誘導により前記発熱体を発熱させるための加熱コイルとを有する、核酸増幅装置。
【請求項１２】
さらに、前記加熱コイルに電流を流すための交流電源を有する、請求項１１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
さらに、前記サンプルの加熱および冷却のサイクルを連続して行えるように、前記交流電源のオン／オフを制御する制御部を有する、請求項１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
核酸検出装置であって、
核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、
電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、
前記キャビティの各々は、前記サンプルが当該キャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、
前記発熱体は前記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在する前記サンプルを選択的に加熱するように前記基体に配置されている、核酸検出装置。
【請求項１５】
核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法であって、
ａ）前記サンプル又は、前記サンプル及び前記サンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、
ｂ）前記サンプルを冷却する工程とを含み、
前記工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電磁誘導加熱による核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置に関する。特に、本発明は、電磁誘導加熱によるポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
【０００３】
このような遺伝子情報に関する技術において最も重要な手法の一つとして、核酸の増幅反応がある。その中でもポリメラーゼ連鎖反応法は、遺伝子のある特定の部分のみを大量に増幅する技術であり、分子生物学等の研究用途の他、医療微生物学、遺伝疾患の臨床診断、法医学等、広範な分野において利用されている。特に臨床の場における遺伝子診断技術では、より迅速に分析できる事が望まれており、ポリメラーゼ連鎖反応法においても高速化技術の開発が要望されている。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応法によって遺伝子の増幅を行うためには、二本鎖のＤＮＡを一本鎖へと解離させる工程（熱変性）、プライマーを結合させる工程（アニーリング）、ポリメラーゼによりＤＮＡを伸長する工程（伸長反応）の三段階の工程を１サイクルとして、この工程を３０から３５サイクル繰り返すことによって行う。これらの工程は条件によっても異なるが、通常それぞれ熱変性９４℃×１分間、アニーリング５０〜６０℃×１分間、伸長反応７２℃×１〜５分間の条件で行う（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一般に、ＰＣＲ装置においてＰＣＲ反応の温度変化の１サイクルにかかる時間は、（１）加熱のためのアルミブロックおよびサンプルを容れるための反応容器等が目的の温度になるまでの時間、（２）サンプル溶液が均一に目的の温度になるまでの時間、ならびに（３）熱変性、アニーリング、および鎖伸長という反応自体にかかる時間の和になると考えられる。（１）の時間は、主に、アルミブロックまたは反応容器等の熱容量、大きさ等に依存し、（２）の時間は、主に、サンプル容量や容器の形状等に依存すると考えられる。上記のように、ポリメラーゼ連鎖反応では４０℃程度の幅の温度変化を３０回以上も繰り返す必要があるが、従来のポリメラーゼ連鎖反応を行う装置では、ポリプロピレン製のチューブ内にサンプルを供し、熱容量の大きいアルミブロックを用いて温度の上昇を行っていたため、加熱または冷却に時間がかかり、ポリメラーゼ連鎖反応を完了させるためには、数時間以上を費やす必要があった。
【０００６】
一方、このようなポリメラーゼ連鎖反応装置を小型化して、反応に要する時間を短縮しようとする試みもなされている。例えば、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）チップ上に集積された微小形成されたＰＣＲ反応器が報告されている（特許文献２）。この集積化ＰＣＲ−ＣＥ装置は、２つのガラス基板の間に化学エッチングにより作製されたキャビティと、キャビティ内のサンプルを加熱するためにキャビティの内面または外面に金属薄膜蒸着によって配された抵抗ヒーターとを備えている。このＰＣＲ−ＣＥ装置によれば、１／１０μｌ未満の反応容量で、ＰＣＲの熱サイクルを行う場合の加熱率は２０℃／秒、冷却率は２℃／秒であることが記載されている。このＰＣＲ−ＣＥ集積装置では、加熱−冷却の１サイクルには約６０秒の時間を要するが、これは、３０サイクルを行うのに約３０分かかることに相当する。
【０００７】
熱サイクルをさらに短縮した例として、サンプルを容れるためのチップ様のガラスマイクロチャンバーと、非接触型加熱のための赤外線放射源としてのタングステンランプと、冷却のためのソレノイドゲート圧縮空気源とを備えた、ＰＣＲ用微小成形デバイスが報告されている（非特許文献１）。このデバイスでは、赤外線放射源をガラスマイクロチャンバーから２ｃｍ程のところに離して配置してサンプルを加熱し、室温の圧縮空気を利用してサンプルを冷却することで、５μｌ程度の容量のサンプルについて加熱−冷却の１サイクルを１７秒程度で完了し得る。
【０００８】
さらに加熱−冷却のサイクルを短縮した例として、赤外線（ＩＲ）レーザーを用いて溶液を局所的に加熱することで、高速の熱サイクルを可能にしている微小デバイスが開発されている（非特許文献２）。このデバイスによれば、わずか５ｎｌの容量のサンプルを用いて、６７℃／秒の加熱率、５３℃／秒の冷却率が可能であり、これは従来の熱ブロックを使ったシステムの３０倍、および上記のような電熱型の微小成形デバイスの３〜６倍の速さに相当する。
【特許文献１】特開昭６２−０００２８１号公報
【特許文献２】特開２０００−２０１６８１号公報
【非特許文献１】アール．ピー．オダ（Ｒ．Ｐ．Ｏｄａ）、外９名、「ＤＮＡの超高速ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための赤外線媒介熱サイクル（Ｉｎｆｒａｒｅｄ-Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）」，分析化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国）１９９８年１０月１５日，第７０巻，第２０号，ｐ．４３６１−４３６８
【非特許文献２】マキシム  エヌ．スリアドネフ（Ｍａｘｉｍ  Ｎ．Ｓｌｙａｄｎｅｖ）、外３名、「赤外線ダイオードレーザーを使用したマイクロチップ上での化学反応の光熱的温度制御（Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  Ｕｓｉｎｇ  ａｎ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｄｉｏｄｅ  Ｌａｓｅｒ）」，分析化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），（米国），２００１年８月１５日，第７３巻，第１６号，ｐ．４０３７−４０４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記の従来技術では、反応容量を数μｌ〜数ｎｌの程度まで減少させ、あるいはさらに加熱部を非接触型としたりすることで、装置の熱容量を減少させ、または装置の熱容量の影響を最小限にすることにより、ＰＣＲにおける加熱−冷却のサイクルを短縮させることに成功している。しかしながら、これらのデバイスにも依然として以下のような問題が残存する。
【００１０】
例えば、特許文献２のＰＣＲ−ＣＥチップの場合、サンプルの加熱のための抵抗ヒーターを金属薄膜蒸発によってＰＣＲ−ＣＥチップ上に堆積して使用しているが、金属薄膜の種類によっては、基板への付着が良くなかったり、熱サイクルを繰り返す間に酸化を受けて抵抗値が上昇し加熱が困難となったりというような問題が生じる。さらに、ヒーターをキャビティの内部に配置すると、９５℃に加熱したときにヒーター側壁のコーティングの劣化を引き起こし、電気的導通の損失を生じる。このような問題を解消するために、特許文献２では、金属皮膜として白金／チタンを使用し、さらにヒーターをチップの外部平坦面上に堆積させているが、チップの外部平坦面上に配置したことでキャビティ内での温度遅れを生じさせたことも記載されている。いずれにしても、明らかなことは、このような抵抗ヒーターの使用には多くの制限があり、デバイスの製造が容易ではないということである。特に、このような抵抗ヒーターを使用する場合、ヒーター間に電圧を印加して反応容器を加熱することを可能にするために導線が必要であり、そのための配線が容易ではなく、チップの設計が複雑になる。
【００１１】
また、上記非特許文献１のようなタングステンランプを使用した例では、チップ全体が加熱されるため、例えば、上記特許文献２のようなＰＣＲ−ＣＥ集積型チップで、ＰＣＲ反応に使用するキャビティ部分のみを加熱するというような局所的加熱ができないという問題がある。
【００１２】
また、上記非特許文献２のようなＩＲレーザーを使用する例では、熱源として非常に大きな出力を可能にする装置が必要となり、設備面でのコストが膨大になる。
【００１３】
したがって、加熱−冷却のサイクルを加速しつつ、なお局所的加熱が可能であり、しかも製造が容易であり、かつ安価なＰＣＲデバイスに対する必要性が存在する。
【００１４】
そこで本発明は上記の問題点に鑑み、サンプル中のＤＮＡを高速に増幅することが可能であると同時に、サンプルの局所的加熱に適しており、製造が容易であり、かつ安価な核酸の増幅方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置を提供することを目的とする。さらに、本発明は、診断目的で使用するためのカード型ＰＣＲ反応装置またはカード型診断デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題を解決するために、本発明は、核酸増幅反応に用いられる反応容器を提供し、この反応容器は、反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、上記発熱体が、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、サンプル又は、サンプル及びキャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されていることを特徴とする。
【００１６】
好ましくは、本発明の反応容器は、キャビティにサンプルを注入又は排出するための開口部を有する。必要に応じて、その開口部の数は、２以上であり得る。
【００１７】
好ましくは、発熱体は、金属薄膜である。
【００１８】
好ましくは、発熱体は、キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、サンプルをキャビティに導入したときに、発熱体とサンプルとが直接接する。
【００１９】
好ましくは、発熱体は、キャビティを規定する容器内壁の一部を構成し、サンプルをキャビティに導入したときに、発熱体がサンプルと直接接しないように高分子膜で被覆されている。好ましくは、その高分子膜は、フッ素化合物又はシリコン化合物である。さらに好ましくは、その高分子膜の膜厚は、１０ｎｍ以上、１０μｍ以下である。
【００２０】
好ましくは、キャビティの最大容量は、１μｌ以上、１ｍｌ以下である。
【００２１】
好ましくは、上記の核酸増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００２２】
本発明は、別の局面において、核酸増幅装置を提供し、この核酸増幅装置は、上記の反応容器と、電磁誘導により発熱体を発熱させるための加熱コイルとを有することを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、本発明の核酸増幅装置はさらに、加熱コイルに電流を流すための交流電源を有する。
【００２４】
好ましくは、本発明の核酸増幅装置はさらに、サンプルの加熱および冷却のサイクルを連続して行えるように、交流電源のオン／オフを制御する制御部を有することを特徴とする。
【００２５】
本発明はさらに別の局面において、核酸検出装置を提供する。この核酸検出装置は、核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、キャビティの各々は、サンプルがキャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、発熱体は上記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在するサンプルを選択的に加熱するように基体に配置されていることを特徴とする。
【００２６】
本発明はさらに別の局面において、核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法を提供する。この方法は、ａ）サンプル又は、サンプル及びサンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、ｂ）上記サンプルを冷却する工程とを含み、工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、サンプル中のＤＮＡを高速に増幅することが可能な核酸の増幅反応を起こさせる方法並びにそれに用いる反応容器及び反応装置を提供することができる。さらに、核酸を高速に増幅して検出することができる核酸検出装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２９】
本発明の一実施の形態に係る、核酸増幅反応に用いられる反応容器は、反応容器のキャビティから形成されるサンプル収容部と、サンプル収容部に収容された核酸を含むサンプルを加熱するための発熱体とを備え、上記発熱体が、電磁誘導により発熱する導電性部材から成り、かつ、サンプル又は、サンプル及びキャビティ周辺部を局部的に加熱する位置に配置されていることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸増幅装置は、上記本発明の反応容器と、電磁誘導により発熱体を発熱させるための加熱コイルとを備えることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸検出装置は、核酸を含むサンプルを保持することが可能な複数のキャビティが形成された基体と、電磁誘導により発熱する導電性部材から成る発熱体とを備え、キャビティの各々は、サンプルがキャビティ間を移動し得るように、チャネルにより互いに接続されており、発熱体は上記複数のキャビティの中から選択された特定のキャビティ内に存在するサンプルを選択的に加熱するように基体に配置されていることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明の一実施の形態に係る、核酸を含むサンプルを加熱および冷却して核酸増幅反応を起こさせる方法は、ａ）サンプル又は、サンプル及びサンプル周辺部を電磁誘導加熱により局部的に加熱する工程と、ｂ）上記サンプルを冷却する工程とを含み、工程ａ）およびｂ）を２回以上繰り返すことを特徴とする。
【００３３】
以上のようにすると、電磁誘導により加熱したい部分のみを直接発熱させることができるので、極めて速やかに温度が上昇する。また、電磁誘導により発熱し得る材料を含む部分以外の反応容器は加熱されていないので、反応容器の熱容量で極めて速やかに温度が下降する。よって、アルミブロック等からなる従来の反応容器を用いた核酸の増幅反応と比較し、短時間で核酸の増幅を行うことができる。
【００３４】
以下、本発明の実施の形態について図面を用いてさらに詳細に説明する。図１は、本発明の一実施の形態に係る反応容器の構造を示す分解斜視図である。
【００３５】
図１に示すように、本発明による核酸増幅反応容器では、少ないサンプル量であっても精度良く調整できるように、また温度の上昇・下降が速やかに行われるように、基板１上にキャビティ２を形成して作製され得る。
【００３６】
本発明による核酸増幅反応容器に用いられる基板１は、サンプル液と反応しなければどのような材料でもよく、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック等を使用することができる。さらに、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリ四フッ化エチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などの樹脂も使用され得る。基板１上に形成されるキャビティ２の形成方法は、基板１がシリコン等の半導体であれば、ＲＩＥ等のドライエッチングや強アルカリ性のエッチング液等を用いたウェットエッチングを用いることができ、ガラスであれば、フッ酸等を用いたウェットエッチングを用いることができる。中でも、基板１としてシリコン等の半導体を用いれば、半導体分野において公知である微細加工技術を利用し、微小なキャビティを精度良く加工することができるので好ましい。また、基板１がポリスチレンなどの樹脂の場合には、成型、削りだし、インプリンティングなどの技術によりキャビティ２を形成し得る。また、シート状の材料に切削などで作製した貫通孔を形成し、基板と張り合わせることによってもキャビティ２を形成することが可能である。
【００３７】
こうして形成したキャビティ２は、反応中にサンプルが流出しないよう適当な材質を用いた蓋板３で封止される。蓋板３の材質は、基板１の材質と同様のものを用いることができるが、基板１と完全に接着もしくは密着し、キャビティ２内部のサンプルを封止することが好ましい。例えば、基板１がシリコン、蓋板３がガラスの場合、陽極接合、直接接合等の技術を用いて封止することができる。その他、基板１及び蓋板３が双方ともガラスの場合は、フッ酸接合の技術を用いた接着等により封止することも可能である。また、基板１および蓋板３が上記のような樹脂の場合には、接着剤、熱融着などにより封止することが可能である。
【００３８】
蓋板３にはキャビティ２内部にサンプルを注入するためのサンプル注入孔４が設けられている。サンプル注入孔４は少なくとも１つあれば良いが、２つ以上設けておくと、サンプルの注入時に用いたもの以外のサンプル注入孔４がキャビティ２内部の空気の逃げ道として機能し、サンプルを速やかに注入することができるので好ましい。サンプル注入孔４は、サンプルを注入した後は耐熱性テープなどを用いて封止され、核酸の増幅反応中にサンプルがサンプル注入孔４から漏出または気化することを防ぐ効果を有する。
【００３９】
キャビティの容量は、目的に応じて異なり得るが、一般的には、数ｎｌ〜数ｍｌまでの範囲であり得る。例えば、キャビティの最大容量は、約１ｎｌ〜約１０ｎｌ、約１０ｎｌ〜約１００ｎｌ、約１００ｎｌ〜約１μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、約１０μｌ〜約１００μｌ、約１００μｌ〜約１ｍｌ、または約１ｍｌ〜約１０ｍｌの範囲であり得る。通常、キャビティの容量は、数μｌから数ｍｌのオーダーまでが好適であり得る。キャビティの形状は、円形に限らず、三角形、四角形などの多角形状であり得る。
【００４０】
図２に、本発明の同実施の形態に係る反応容器を基板側から見た斜視図を示す。基板１の裏面（蓋板３と面している面と反対側の面）上全面に、電磁誘導により発熱し得る材料を含む発熱部５が設けられている。
【００４１】
発熱部５に含まれる電磁誘導により発熱し得る材料としては、ステンレス、鉄、ニッケル、銀、銅、またはアルミニウムが挙げられる。これらの金属を単体として用いても、組み合わせて用いてもよい。または、上記の金属を含む合金やクラッド材を用いてもよい。
【００４２】
発熱部５は、薄板、ホイル等の形態のものを基板１上に貼付してもよく、また基板１上にスパッタ、蒸着等の方法で製膜することにより形成してもよい。
【００４３】
図３〜６に、本発明の同実施の形態に係る反応容器の変形例の構造を示す。図３は同反応容器の一変形例の構造を示す斜視図、図４は同反応容器の他の変形例の構造を示す分解斜視図、図５は同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す断面図である。図６は、キャビティを複数個有する本発明の反応容器の変形例の上面図（ａ）および長手方向断面図（ｂ）である。
【００４４】
一変形例では、図３に示すように、発熱部５は基板１の裏面上であって、キャビティ２を基板１の裏面に投影した位置の実質的に全部に設けられている。
【００４５】
他の変形例では、図４に示すように、発熱部５はキャビティ２内であって、実質的にキャビティ２の底面全面に設けられている。この場合、基板１と蓋板３との接着を妨げない位置に発熱部５が形成されていることが好ましい。また、発熱部５の少なくともサンプルと接触する部分が、サンプルと反応しない材料により構成されることが好ましい。このような材料としては、例えば、フッ素化合物を含む薄膜、もしくはシリコン化合物を含む疎水性の薄膜などの高分子膜が挙げられる。薄膜としては、サンプルと反応せず、９５℃程度の温度上昇に耐え得るものであれば、特にこれらに限定されない。また、薄膜の膜厚は、熱が拡散してしまう可能性を最小にする観点から、薄ければ薄いほどよく、好ましくは約１０ｎｍ〜約１０μｍ、より好ましくは約１０ｎｍ〜約１μｍ、最も好ましくは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍである。約１０ｎｍ以上であることが好ましい理由は、これよりも膜厚が小さいと、発熱体とサンプルとが反応する可能性があるからである。
【００４６】
フッ素化合物を含む薄膜としては、フッ化炭素を利用することができる。フッ化炭素の薄膜は、ステンレス板をフッ素化炭素ガス雰囲気中に設置し、プラズマを発生させ、ステンレス板にプラズマ処理を行うことにより、形成することができる。また、フッ素系シランカップリング材を用いても、フッ素化合物を含む薄膜を形成することができる。
【００４７】
一方、シリコン化合物を含む薄膜は、シリコナイズ処理によって形成し得る。シリコナイズ液としては、例えば、ＳＩＧＭＡＣＯＴＥ（登録商標）（シグマ製）を用いることができる。デシケータ内にステンレス板とシリコナイズ液とを入れ、デシケータ内を真空に吸引することにより、シリコナイズ液が気化し、シリコン化合物の蒸気が、ステンレス板に付着して疎水性の薄膜を形成することができる。また、ステンレス板表面に直接シリコナイズ液を注入し、蒸留水で洗い流すことによっても、薄膜を形成することができる。
【００４８】
さらに他の変形例では、図５に示すように、発熱部５は基板１内部に埋め込まれた形で形成されている。図５のような構成の作成法の一例としては、基板１として高分子フィルムを接着することにより形成することが可能である。ここで高分子フィルムとしては、前述の樹脂材料を用いたものが利用できるが、このうち、ＰＥＴフィルムが安価であり入手が容易であるため、最も利用しやすい。
【００４９】
図５において、発熱部５とキャビティ２との間の距離（すなわち高分子フィルムの厚み）は、加熱効率を考えると、短いほど良い。具体的には、この距離の上限は、１ｍｍ以下、より好ましくは２００μｍ以下が望ましい。また、この距離の下限としては、実用的な高分子フィルムの強度の限界等から１μｍ以上、より望ましくは５μｍ以上がよい。
【００５０】
これらの変形例では、キャビティ２の近傍のみに発熱部５が設けられているため、基板１の熱容量の影響を受けにくくなり、より速やかにサンプル温度の上昇・下降を行うことができる。また、本発明の発熱部５は、上記のように、薄板、ホイル等の形態のものを基板１上に貼付したり、または基板１上にスパッタ、蒸着、メッキ等の方法で製膜したりするのみで形成し得る。したがって、配線やヒーター端子の設置の必要がないため、例えば、抵抗ヒーターを用いる場合に比べて、反応容器の作製が容易であるという利点がある。また、発熱部５の性質上、位置や形状、大きさなども目的に応じて容易に変化させることができる。サンプルの加熱効率を高くするためには、発熱部５はキャビティに対する投影面積ができるだけ大きくなるような形状がよい。
【００５１】
なお、基板が、電磁誘導により発熱し得る材料を含んでいてもよい。このようにすると、別途発熱部を設ける必要がなく、簡易な構成とすることができる。この場合、上記と同様、基板の少なくともサンプルと接触する部分が、サンプルと反応しない材料により構成されることが好ましい。
【００５２】
図６は、上記本発明の応用例として、チャネル６ａ〜ｃで互いに流体連絡可能に連結され直線的に配置された複数のキャビティ（キャビティ２ａ〜ｄ）からなるカード（またはチップ）型ＰＣＲデバイスの代表的な実施形態を示す。図６のデバイスにおいて、キャビティ２ａは、細胞を破壊してゲノムＤＮＡを抽出するために使用される。キャビティ２ｂは、その抽出されたゲノムＤＮＡを精製するために使用され、キャビティ２ｃは、精製されたＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅するために使用される。キャビティ２ｄは、増幅したＤＮＡを検出するために使用される。
【００５３】
この実施形態において、サンプルは、血液、唾液、毛根などであり得る。本発明のカード型デバイスは、病院等における診断用に主として使用され得る。サンプル中の細胞からのゲノムＤＮＡの抽出、精製、ＰＣＲによる増幅、および検出が一連の工程によって迅速に行われ得るため、特に「ポイントオブケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ）」用途に特に有用であり得る。使用する試薬によるが、それぞれのキャビティには必要な試薬が予め入れられていても良いし、あるいは使用直前に入れるようにしてもよい。ＤＮＡの抽出→精製→ＰＣＲという各工程は、まとめて１つのキャビティ内で行ってもよい。
【００５４】
キャビティ２ａでのゲノムＤＮＡの抽出、およびキャビティ２ｂでのゲノムＤＮＡの精製は、適切な試薬等を用いて行い得る。例えば、白血球などの細胞を壊す試薬やプロテイナーゼなどの酵素試薬等を用いる。代表的なＤＮＡの抽出・精製法として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１巻（第３版）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １．３１−１．３８，  ２００１）の中の「Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ」に示されているような手法があるが、この手法では、遠心分離による操作が必要とされる。一方、近年、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（株式会社  島津製作所製）のような、試薬を加えるだけでＤＮＡの抽出・精製を行い得る技術も開発されており、このような技術を使用すれば、容器（またはキャビティ）の構造によらず、ＤＮＡの抽出および精製を行い得る。また、ＤＮＡの抽出および精製は、２つの別々のキャビティで行う代わりに、同一キャビティ内で行うことが可能である。例えば、図６のキャビティ２ａおよび２ｂを併せて１つのキャビティ２ａｂ（不図示）とし、全体として３つのキャビティ（抽出・精製、増幅および検出）からなるカード型デバイスとすることも可能である。
【００５５】
ＰＣＲ反応用のキャビティ２ｃの下部には、金属などの電磁誘導により発熱し得る材料を埋め込んだ発熱部５が配置されており、これにより、キャビティ２ｃのみを局所的に加熱することができる。ＰＣＲ反応には、温度の上下が必要であるが、その上下サイクルが検出用キャビティ２ｄの酵素等に影響がないように発熱部５を配置することが重要である。
【００５６】
キャビティ２ｄでのＤＮＡの検出には、光学的方法や電気泳動等の方法が使用され得る。例えば、ＤＮＡの増幅と共に生成されるピロリン酸の濃度を測定する方法は、洗浄、分離などの操作を伴わず、本発明における検出部として有用である。例えば、特表２００１−５０６８６４号公報に開示されるように、ピロリン酸をＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に変換し、ＡＴＰを基質としてルシフェラーゼの作用によるルシフェリン発光を検出する光学的方法や、ピロホスファターゼ、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナザーゼ）、ジアホラーゼ等を用いて電気化学的に検出する方法などを用いることができる。光学方法の場合は、カード型デバイスにおけるキャビティ２ｄ上の基板１もしくは基板３のいずれかもしくは両方は、検出すべき光の波長に対して透過性の材料を用い、電気化学的方法の場合は、キャビティ２ｄ内に金、白金、炭素、必要であれば銀／塩化銀などの電極を設ける。
【００５７】
キャビティ間のサンプルの移動は、電気浸透流、ポンプ、遠心力などを利用して行い得る。例えば、正負それぞれの電極を設けて電気浸透流を利用して流体を移動させる方法（Ｂａｒｋｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．；（Ａｒｔｉｃｌｅ）；２０００；７２（２４）；５９２５−５９２９）、サンプル注入孔４にチューブ状の配管ポンプを設けてポンプによる圧力もしくは吸引力を利用する方法（Ｈｉｓａｍｏｔｏら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．：（Ａｒｔｉｃｌｅ）；２００１；７３（２２）；５５５１−５５５６）、または回転する部材（例えば、ＣＤドライブなど）の上に基板を設置し、流路を遠心力の働く方向に合わせることによって、遠心力を利用してサンプル溶液を移動させる方法（Ｄｕｆｆｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．；（Ａｒｔｉｃｌｅ）；１９９９；７１（２０）；４６６９−４６７８）等が利用され得る。
【００５８】
なお、図６では、一種類のＤＮＡサンプルのみ解析する構成となっているが、さらに多くのチャネルおよびキャビティのセットを設けてチップ上で複数のＤＮＡを解析するようにしてもよい。また、サンプル注入孔の数、キャビティの数、キャビティやチャネルの配置のパターンなどは上記実施形態のものに限らないことはもちろんである。
【００５９】
図６に示す本発明のカード型デバイスの大きさは、特に限定されないが、取り扱いの容易さを考慮すれば、スライドガラス程度の大きさから、クレジットカードの大きさ（名刺サイズ）程度までが好適であり得る。各キャビティの容量は、目的に応じて異なり得るが、一般的には、数ｎｌ〜数ｍｌまでの範囲であり得る。例えば、キャビティの最大容量は、約１ｎｌ〜約１０ｎｌ、約１０ｎｌ〜約１００ｎｌ、約１００ｎｌ〜約１μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、約１０μｌ〜約１００μｌ、約１００μｌ〜約１ｍｌ、または約１ｍｌ〜約１０ｍｌの範囲であり得る。しかしながら、診断用に病院等で通常使用される量を考慮すれば、キャビティの容量は、数μｌから数ｍｌのオーダーまでが好適であり得る。キャビティの形状は、円形に限らず、三角形、四角形などの多角形状であり得る。
【００６０】
図７に、本発明の同実施の形態に係る反応装置の概略図を示す。本実施の形態の反応装置は、図１に示す反応容器と、電磁誘導により発熱部を加熱するための加熱コイル６と、加熱コイルに電流を流すための電源部である交流電源７と、交流電源７を制御する制御部８およびタイマ９とを備えている。電磁誘導加熱は、交流電源７を用いて加熱コイル６に高周波電流を流すことにより発生する磁力線が、発熱部に渦電流を生じさせることにより発生する。この渦電流は、発熱部の電気抵抗により損失を発生し、この損失がジュール熱となって発熱部自体が発熱する。発熱部の発熱量と関係のある発熱部の吸収電力Ｐは、以下の式によって表される。
【数１】
2004029241.tif 000013
【００６１】
但し、ここで、Ｐは発熱部の吸収電力（Ｗ）、Ｎは加熱コイルの巻き数、Ｒｓは発熱部の表皮抵抗（Ω）、Ｉは加熱コイルの電流（Ａ）、Ｋは定数である。また、発熱部の表皮抵抗Ｒｓは、
【数２】
2004029241.tif 000014
で表される。ここで、ρは発熱部の抵抗率（Ωｃｍ）、δは電流の表皮浸透深さ（ｍ）である。
【００６２】
通常、加熱コイルに流す高周波電流の周波数は２０〜２５ｋＨｚ程度であるので、発熱部における発熱量を大きくするためには、発熱部に含まれる、電磁誘導により発熱し得る材料は、抵抗率が大きくかつ２０〜２５ｋＨｚにおける浸透深さが小さいものが好ましい。このような好ましい材料としては、ステンレス、鉄、ニッケル、銀等が挙げられる。また、これらの材料のいずれかを含む合金、クラッド材等も好ましい。
【００６３】
また近年、２０ｋＨｚ程度のスイッチング方式で、加熱コイル電流周波数を約６０ｋＨｚにする３倍共振インバーターの開発や、低損失微細線集合撚りコイルによる表皮効果の低減が実現され、アルミニウム、銅、金、黄銅などの非磁性材料も好ましく使用することが可能である。
【００６４】
このように、例えば、抵抗コイルを使用する場合に材質の選択に制限があることに比べると、本発明は、発熱部の材料の選択に比較的自由度がある点で有利である。例えば、本発明の場合、発熱部の材料として、ＳＵＳ等の熱に強い材料を選択できるという利点がある。
【００６５】
反応容器を加熱コイル６上に設置し、加熱コイル６に高周波電流を流すことによって、電磁誘導加熱により発熱部がその電流量に伴って発熱し、キャビティ２内のサンプルの温度が上昇する。逆に、高周波電流を停止すると発熱部の発熱は終了し、キャビティ２内のサンプルの温度が下降する。このような高周波電流のオン／オフの制御は、制御部８が、反応容器上またはキャビティ内に設置された温度プローブ（不図示）で計測される温度およびタイマ９で計測される時間に基づいて行う。このように電磁誘導を用いると、発熱部を設ける位置を調整することにより、加熱したい部分のみを直接発熱させることができるので、極めて速やかにサンプルの温度が上昇する。また、加熱される部分が発熱部に限定され、反応容器の発熱部以外の部分は加熱されないので、電磁誘導による加熱を停止すると、反応容器の熱容量で極めて速やかに温度が下降する。よって、アルミブロック等からなる従来の反応容器を用いた核酸の増幅反応と比較し、短時間で核酸の増幅を行うことができる。さらに、反応容器の形状及び発熱部の位置・形状も自由に選択することができる。また、本発明の場合、交流電流を使用するため熱効率も非常に高く、劣化等が起こりにくいという利点がある。
【実施例１】
【００６６】
以下、図１及び図２に示す本発明の一実施の形態に係る反応容器を用いて、核酸の増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を行った実施例について説明する。
【００６７】
基板１として厚さ５００μｍのシリコン単結晶板を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応用の反応容器を作製した。
【００６８】
まず、表面が鏡面処理された厚みが５００μｍのシリコン単結晶板と厚みが４００μｍのガラスを用意し、シリコン単結晶板に六フッ化硫黄を用いたドライエッチングによって、６ｍｍφのキャビティ２を形成した。エッチング深さは、１７０μｍとした。
【００６９】
次に、蓋板３となるガラスに、サンドブラストによってサンプル注入孔４となる０．６ｍｍφの穴を２箇所開けた。
【００７０】
次に、シリコン単結晶板とガラスとを、酸性洗浄剤を用いて表面を洗浄し、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱することによって、接着剤を用いない直接接合によってシリコン単結晶板からなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着した。
【００７１】
最後に、８ｍｍ×１６ｍｍのチップ状に切り出した後、裏面側すなわちシリコン単結晶板側のほぼ全面に、発熱部５として、サイズが８ｍｍ×１６ｍｍで厚さ１ｍｍのＳＵＳ４３０板を、高熱伝導接着シート（三菱ガス化学株式会社製セラジン）を用いて接着し、反応容器を作製した。また、比較例としては、０．５ｍｌポリプロピレンチューブを反応容器として用いた。
【００７２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレートとしてλＤＮＡ（寳酒造製）（λＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｖ００６３６，Ｊ０２４５９，Ｍ１７２３３，Ｘ００９０６を参照）を用いた。プライマーとしてＴａＫａＲａ  ポリメラーゼ連鎖反応  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１（５'−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３'）及びＰｒｉｍｅｒ３（５'−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３'）を用いて実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。
【００７３】
２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（登録商標）  ０．２５μｌ、１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物  ４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ３  各２．２５μｌ、０．２５μｇ／μｌ  ウシ血清アルブミン２μｌを加えた後、１０ｎｇ／μｌ  λＤＮＡ  ５μｌを加え蒸留水２９μｌを加えて総量を５０μｌとした。
【００７４】
上記で調製したサンプルを、本実施例の反応容器に５μｌ、比較例の反応容器に２０μｌそれぞれ注入し、本実施例の反応容器は耐熱性テープでサンプル注入孔４を封止した。比較例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９８℃１分、５５℃１分、７２℃２０秒で３０サイクル行った。トータルの反応時間は８０分であった。一方、本実施例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、反応容器を加熱コイル上に設置し、電磁誘導加熱によって、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃５秒で３０サイクル行った。温度は、熱電対を直接反応容器上に固定して測定し、加熱コイルに流す周波数２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御した。トータルの反応時間は５分であった。
【００７５】
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、１．５ｍｌ遠心チューブ内に容器を挿入し、１０ｋｒｐｍの回転数で１分間遠心処理を行うことにより、容器からサンプルの回収を行った。回収したサンプルは、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応により目的の５００ｂｐが増幅されているかどうかを確認した。電気泳動に使用したゲルは、３％アガロースを用いた。アガロースは日本ジーン社製ＡｇａｒｏｓｅＳを用いた。電気泳動用バッファーは、日本ジーン社製５０×ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ)を希釈して用いた。電気泳動条件は、１００Ｖ、３５〜４０分で行った。
【００７６】
図８に、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を表す電気泳動写真を示す。図中、Ａはマーカー（分子量マーカー）、Ｂは比較例の反応容器を用いた場合、Ｃは本実施例の反応容器を用いた場合を示す。また、矢印で示した部分が目的の増幅産物である。
【００７７】
図８から、本実施例の反応容器を用いた場合も、比較例の反応容器を用いた場合と同様に目的のＤＮＡが増幅されたことがわかる。よって、本実施例の反応容器を用いることにより、比較例の反応容器を用いた場合と比較して１０分の１以下の反応時間で、良好な核酸の増幅反応を行うことができた。
【００７８】
なお、加熱温度と時間を変えて、比較例として、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分で３０サイクルを行った場合には、トータルの反応時間は９０分であった。一方、本発明の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応として、電磁誘導加熱によって、９４℃１秒、５５℃１秒、７２℃５秒で３０サイクル行った場合（周波数は２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御）、トータルの反応時間は１０分であった。この場合も、本発明の反応容器を用いるＰＣＲ反応により、目的のＤＮＡを、比較例の場合と比較して９分の１程度の反応時間で増幅し得た。
【００７９】
なお、本実施例では、シリコン単結晶板とガラスとを、互いの間に空気が入らないように張り合わせた後、３００℃で３時間加熱し、直接接合によってシリコン単結晶板からなる基板１とガラスからなる蓋板３とを接着したが、加熱するときの温度はガラスの材質によって変えれば良い。ナトリウム、カリウムなどを含むガラスであれば２５０℃で、これらを含まないガラスであれば４００℃程度まで上げる。また、ガラスの材質は石英ガラスのように不純物を含まないものでも可能である。この場合はさらに温度を５００℃以上に上げる。さらに、蓋板材料はシリコン単結晶板でも可能である。この場合はキャビティ２を形成したシリコン単結晶板とサンプル注入孔４を形成したシリコン単結晶板とを直接接合によって張り合わせる。張り合わせ時の温度は５００℃以上にすればよい。
【実施例２】
【００８０】
以下、実施例１と同様にして作成した反応容器を用いて、核酸の増幅反応としてポリメラーゼ連鎖反応を行った実施例について説明する。比較例として、０．５ｍｌポリプロピレンチューブを反応容器として用いた。
【００８１】
ポリメラーゼ連鎖反応は、テンプレートとしてヒトの血液より抽出したゲノムＤＮＡ溶液を用いた。ＤＮＡ溶液は、被験者の血液から、Ｇｅｎとるくん（登録商標）（血液用）（寳酒造製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出して用意した。プライマーとしては、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ用コントロールプライマーβ-ｇｌｏｂｉｎ（ｈｕｍａｎ）ＰｒｉｍｅｒＳｅｔ（寳酒造製）のＧＨ２０（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー（５’−ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ−３’）および、ＧＨ２１（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー（５’−ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ）を用いて実験を行った（４０８ｂｐ増幅用）。２．５Ｕ／μｌ  ＴａＫａＲａ  Ｚ−Ｔａｑ（登録商標）  ０．５μｌ、１０×Ｚ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物  ４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ３  各２．２５μｌ、０．２５μｇ／μｌ  ウシ血清アルブミン２μｌを加えた後、１０ｎｇ／μｌ  ヒトゲノムＤＮＡ  ５μｌを加え蒸留水２９μｌを加えて総量を５０μｌとした。
【００８２】
上記で調製したサンプルを、本実施例の反応容器に５μｌ、比較例の反応容器に２０μｌそれぞれ注入し、本実施例の反応容器は、液状シール材エレップコートＬＳＳ−５２０（日東シンコー株式会社製）を用いてサンプル注入孔４を封止した。比較例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いて９８℃５秒、６６℃２秒で３０サイクル行った。トータルの反応時間は２０分であった。一方、本実施例の反応容器を用いたポリメラーゼ連鎖反応は、反応容器を加熱コイル上に設置し、電磁誘導加熱によって、９８℃２秒、６６℃１秒で３０サイクル行った。温度は、熱電対を直接反応容器上に固定して測定し、加熱コイルに流す周波数２０ｋＨｚの高周波電流のＯＮ／ＯＦＦによって制御した。トータルの反応時間は５分であった。
【００８３】
さらに、ＰＣＲ反応の１サイクルにかかる時間に対する容器の形状、大きさ、熱容量等の影響を確認するために、従来のアルミブロック式のサーマルサイクラーを使用するＰＣＲ装置において、５μｌのサンプルを含んだ本実施例の反応容器をアルミブロック上に載せて、通常のポリプロピレンチューブを用いた場合と同様に、電磁誘導による加熱を利用せずに、ＰＣＲ反応を行った。９８℃２秒、６６℃１秒で３０サイクルを行い、トータルの反応時間は１８分であった。このように、アルミブロック式のサーマルサイクラーを用いた場合、本実施例の反応容器を用いたとしても、トータルの反応時間は通常のポリプロピレンチューブを用いたときと同程度の時間がかかった。したがって、アルミブロック式のサーマルサイクラーを使用した場合に１サイクルに要する時間を主として決定しているのは、容器の形状等よりもむしろアルミブロック自体の熱容量であることが確認された。
【００８４】
ポリメラーゼ連鎖反応終了後、実施例１と同様にサンプルの回収を行った。回収したサンプルは、実施例１と同様にアガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応により目的の４０８ｂｐが増幅されているかどうかを確認した。
【００８５】
図９に、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を表す電気泳動写真を示す。図中、ＡおよびＡ’はマーカー（分子量マーカー）、Ｂは比較例の反応容器を用いてアルミブロック式のサーマルサイクラーでＰＣＲを行った場合、Ｃは本実施例の反応容器を用いて電磁誘導加熱によりＰＣＲを行った場合を示す。また、矢印で示した部分が目的の増幅産物である。
【００８６】
図９から、本実施例の反応容器を用いて電磁誘導加熱を利用した場合も、比較例の反応容器を用いてアルミブロック式のサーマルサイクラーを利用した場合と同様に目的のＤＮＡが増幅されたことがわかる。よって、本実施例の反応容器において電磁誘導による加熱を用いることにより、比較例の反応容器でアルミブロック式のサーマルサイクラーを用いた場合と比較して、反応時間を約４分の１に短縮すると同時に、匹敵する良好な核酸の増幅反応を行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明に係る電磁誘導加熱を用いた核酸増幅反応に用いる反応容器、反応装置、核酸検出装置及び核酸増幅方法は、サンプルの局所的加熱に適しており、サンプル中の温度変化を高速に制御することが可能である。同時に、本発明に係る核酸増幅反応に用いる反応容器、反応装置および核酸検出装置は、製造が容易であり、かつ安価であるという効果を有し、ＰＣＲによる核酸増幅、各種酵素反応、およびそれらを組み合わせて用いるポイントオブケア用途の診断カードデバイスなどの用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の一実施の形態に係る反応容器の構造を示す分解斜視図である。
【図２】同反応容器を基板側から見た斜視図である。
【図３】同反応容器の一変形例の構造を示す斜視図である。
【図４】同反応容器の他の変形例の構造を示す分解斜視図である。
【図５】同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す断面図である。
【図６】同反応容器のさらに他の変形例の構造を示す上面図（ａ）および長手方向断面図（ｂ）である。
【図７】同実施の形態に係る反応装置を示す概略図である。
【図８】本発明の一実施例及び比較例の反応容器を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った際の増幅産物の結果を示す電気泳動写真である。
【図９】本発明の一実施例及び比較例の反応容器を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った際の増幅産物の結果を示す電気泳動写真である。
【符号の説明】
【００８９】
１  基板
２  キャビティ
２ａ〜２ｄ  キャビティ
３  蓋板
４  サンプル注入孔
５  発熱部
６  加熱コイル
６ａ〜６ｃ  チャネル
７  交流電源
８  制御部
９  タイマ
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004029241.tif 000021
【図８】
2004029241.tif 000022
【図９】
2004029241.tif 000023
【国際調査報告】
2004029241.tif 000024
2004029241.tif 000025
2004029241.tif 000026
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