(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面にカーボンナノチューブ層を有する細胞培養容器を製造する方法であって、
所定形状の容器を用意すること；
カーボンナノチューブを主成分とするカーボンナノチューブ材料が分散媒に５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で分散されたカーボンナノチューブ分散液を用意すること；および、
該容器の表面にカーボンナノチューブ層を形成すること、
ここで前記カーボンナノチューブ層の形成は、前記分散液を前記容器に付与する供給ステップと該付与された分散液を乾燥させる乾燥ステップとを二回以上交互に繰り返して行い、
前記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるカーボンナノチューブ材料が前記カーボンナノチューブ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．１μｇ以下となるように行う；
を包含する、細胞培養容器製造方法。
【請求項２】
前記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるカーボンナノチューブ材料が前記カーボンナノチューブ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．００５μｇ〜０．０５μｇとなるように行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記供給ステップと前記乾燥ステップとの繰り返しを２０回以上行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カーボンナノチューブ層の形成を相対湿度３０％以下の低湿度条件下で行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記供給ステップでは、凝集物が視認されないレベルの高度な分散状態にある前記分散液を前記容器に付与する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分散液に含まれるカーボンナノチューブは主として単層カーボンナノチューブである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法により製造された細胞培養容器。
【請求項８】
細胞増殖促進活性を有するカーボンナノチューブ層を製造する方法であって、
カーボンナノチューブを主成分とするカーボンナノチューブ材料が分散媒に５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で分散されたカーボンナノチューブ分散液を基材に付与する供給ステップと、該付与された分散液を乾燥させる乾燥ステップと、を二回以上交互に繰り返すことによりカーボンナノチューブ層を形成し、
ここで、前記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるカーボンナノチューブ材料が前記カーボンナノチューブ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．１μｇ以下となるように行う、カーボンナノチューブ層の製造方法。
【請求項９】
前記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるカーボンナノチューブ材料が前記カーボンナノチューブ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．００５μｇ〜０．０５μｇとなるように行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法により製造された、細胞増殖促進活性を有するカーボンナノチューブ層。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養の分野においてカーボンナノチューブを利用する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の接着性、伸展性等を向上させるための表面処理が施された細胞培養用容器が知られている。例えば、いわゆるカルボキシル基処理、コラーゲン処理、ポリリジン処理等の表面処理（典型的には、表面の親水性を向上させる処理）が施されたポリスチレンディッシュが市販されている。
一方、細胞培養の分野におけるカーボンナノチューブ（以下「ＣＮＴ」と表記する。）の利用に関する従来技術文献として特許文献１〜３が例示される。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１３０７５９号公報
【特許文献２】特開２００６−２２３２７３号公報
【特許文献３】特開２００７−  ３９６２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら従来の技術は、既存の容器（例えばポリスチレンディッシュ）の表面処理には適用することができないか、あるいは単純に適用しても十分な処理効果（例えば、細胞の増殖を促進する効果）が発揮され難いものであった。
【０００５】
そこで本発明は、ＣＮＴを利用した表面処理が施された容器であって細胞の培養に適した容器（細胞培養容器）を製造する方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、上記表面処理が施された細胞培養容器を提供することである。さらに他の目的は、上記容器その他の基材の表面処理（表面改質）に利用可能な、細胞の培養に適した（典型的には、細胞増殖促進活性を有する）ＣＮＴ薄膜とその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によると、表面にＣＮＴ層を有する細胞培養容器を製造する方法が提供される。その方法は、所定形状の容器を用意することを含む。また、ＣＮＴを主成分とするＣＮＴ材料が分散媒に凡そ５０ｍｇ／Ｌ以下（好ましくは凡そ２０ｍｇ／Ｌ以下）の濃度で分散されたＣＮＴ分散液を用意することを含む。また、上記容器の表面にＣＮＴ層を形成することを含む。
ここで、前記ＣＮＴ層の形成は、前記分散液を前記容器に付与する供給ステップと、該付与された分散液を乾燥させる乾燥ステップとを、二回以上交互に繰り返して行われる。
また、上記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるカーボンナノチューブ材料が前記カーボンナノチューブ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．１μｇ以下となるように行う。上記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるＣＮＴ材料が上記ＣＮＴ層の形成面積１ｃｍ２当たり０．０５μｇ以下、例えば、０．００５μｇ〜０．０５μｇとなるように行うことが好ましい。
【０００７】
このように低濃度のＣＮＴ分散液を用いることにより、表面状態のよい（例えば、ＣＮＴが平面方向によく配向した、すなわち高度に平坦な）ＣＮＴ層が形成され得る。かかる表面状態は細胞の培養（典型的には増殖）に適している。したがって、上記方法により形成されたＣＮＴ層（ひいては該ＣＮＴ層が表面に形成された細胞培養容器）によると、良好な細胞増殖促進活性が実現され得る。
【０００８】
また、ＣＮＴ材料を低濃度のＣＮＴ分散液として該分散液を一度に少量のみ付与することにより、より表面状態のよいＣＮＴ薄層を形成することができる。上記供給ステップと乾燥ステップとを繰り返すことにより、上記薄層を積層して所望する厚さのＣＮＴ層を形成することができる。これにより、形成されるＣＮＴ層の全体厚さに拘らず、より表面状態のよい（すなわち、より細胞の培養に適した）ＣＮＴ層を形成することができる。
【０００９】
ここに開示される方法の好ましい一態様では、前記供給ステップと前記乾燥ステップとの繰り返しを凡そ２０回以上行う。すなわち、一回の供給ステップとそれに続く乾燥ステップにより形成されるＣＮＴ薄層を凡そ２０層以上積層してＣＮＴ層を形成する。かかる態様によると、本発明の構成を採用することによる効果が特によく発揮され得る。
【００１０】
前記ＣＮＴ層の形成は、相対湿度が凡そ３０％以下の低湿度条件下で行うことが好ましい。このことによって、より細胞の培養に適したＣＮＴ層が形成され得る。
【００１１】
上記ＣＮＴ分散液は、典型的には全体として薄い灰色の外観を呈する。この分散液に含まれるＣＮＴ材料が高度な分散状態にあるときは、目視による観察される分散液の色は一様である（例えば、粒状、斑点状等の凝集物が認められない）。ここに開示される方法の好ましい一態様では、前記供給ステップにおいて、かかる高分散状態（換言すれば、凝集物が視認されないレベルの高度な分散状態）にある前記分散液を前記容器に付与する。このことによって、より細胞の培養に適したＣＮＴ層が形成され得る。
【００１２】
前記分散液に含まれるＣＮＴは主として単層ＣＮＴであることが好ましい。かかる分散液を用いることによって、より細胞の培養に適したＣＮＴ層が形成され得る。
【００１３】
本発明によると、また、ここに開示されるいずれかの方法により製造された細胞培養容器が提供される。かかる細胞培養容器は、該容器内（典型的にはＣＮＴ層上）に培地（典型的には培養液）を配置してそこで各種の細胞（組織片であり得る。）を培養する用途に好ましく使用され得る。特に、低血清培地（無血清培地を包含する意味である。）において細胞を培養する用途に好適である。したがって本発明は、他の側面として、ここに開示されるいずれかの細胞培養容器（ここに開示されるいずれかの方法により製造された細胞培養容器であり得る。）を用いて細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法を提供する。
【００１４】
本発明によると、また、細胞増殖促進活性を有するＣＮＴ層（典型的には薄膜状）を製造する方法が提供される。その製造方法では、ＣＮＴを主成分とするＣＮＴ材料が分散媒に凡そ５０ｍｇ／Ｌ以下（より好ましくは凡そ２０ｍｇ／Ｌ以下）の濃度で分散されたＣＮＴ分散液を基材に付与する供給ステップと、該付与された分散液を乾燥させる乾燥ステップと、を二回以上交互に繰り返してＣＮＴ層を形成する。このように低濃度のＣＮＴ分散液を用いることにより、上述のように表面状態がよく細胞増殖活性を有するＣＮＴ層が形成され得る。前記供給ステップは、一回の該供給ステップにより付与される分散液に含まれるＣＮＴ材料が、前記ＣＮＴ層の形成面積１ｃｍ２当たり凡そ０．１μｇ以下（より好ましくは、一回当たり凡そ０．０５μｇ／ｃｍ２以下、例えば、０．００５μｇ〜０．０５μｇ）となるように行うことが好ましい。これにより、形成されるＣＮＴ層の全体厚さに拘らず、より表面状態のよい（より高い細胞増殖活性を実現し得る）ＣＮＴ層を形成することができる。
【００１５】
本発明によると、さらに、ここに開示されるいずれかの方法により製造された、細胞増殖促進活性を有するＣＮＴ層が提供される。かかるＣＮＴ層は、該層上に培地（典型的には培養液）を配置してそこで各種の細胞（組織片であり得る。）を培養する用途に好ましく使用され得る。特に、低血清培地において細胞を培養する用途に好適である。したがって本発明は、他の側面として、ここに開示されるいずれかのＣＮＴ層（ここに開示されるいずれかの方法により製造されたＣＮＴ層であり得る。）上で細胞を培養することを特徴とする、細胞培養方法を提供する。また本発明は、さらに他の側面として、ここに開示されるいずれかの細胞培養方法を適用して細胞培養物（細胞集合塊や組織化した培養物を包含し、特定の形状に限定されない。）を製造する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄は、当該分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
【００１７】
ここに開示される技術においてＣＮＴ層の形成に使用するＣＮＴ分散液は、各種方法により得られたＣＮＴ材料を用いて調製されたものであり得る。すなわち、ＣＮＴ分散液の調製に使用するＣＮＴ材料としては、アーク放電法、レーザ蒸発法、化学気相成長法（すなわちＣＶＤ法）等の各種方法により製造されたＣＮＴを含むＣＮＴ材料を適宜選択して用いることができる。上記ＣＮＴ材料に含まれるＣＮＴは、単層ＣＮＴ、多層ＣＮＴおよびこれらを任意の割合で含む混合物のいずれであってもよい。該ＣＮＴ材料は、ＣＮＴ以外に、チューブを形成しないアモルファスカーボン等の炭素成分（不純物炭素）や触媒金属等を含んでもよい。このようなＣＮＴ材料として、上述のような各種方法（例えばアーク放電法）により得られた炭素質の生成物をそのまま使用してもよく、あるいは、該生成物に任意の後処理（例えば、アモルファスカーボンの除去、触媒金属の除去等の精製処理）を施したものを使用してもよい。上記ＣＮＴ材料を構成するＣＮＴの長さは、典型的には少なくとも凡そ１μｍ以上であり、好ましくは凡そ５μｍ以上（典型的には凡そ５μｍ〜数十μｍ）である。この長さが凡そ１０μｍ以上（典型的には凡そ１０μｍ〜数十μｍ）であってもよい。
【００１８】
かかるＣＮＴ材料を分散させる分散媒としては、室温程度の温度域（例えば２３℃）において液状を呈する各種の媒体を使用することができる。水、有機溶媒またはこれらの混合溶媒を主成分とする分散媒が好ましい。上記有機溶媒としては、常温域で液状を示す一般的な有機溶媒から選択される一種または二種以上の有機溶媒を用いることができる。上記液状媒体を構成する溶媒の種類および組成は、目的および態様等に応じて適宜選択することができる。水または水を主成分とする混合溶媒は、上記分散媒を構成する溶媒として好ましく選択され得る一典型例である。他の好適例として、炭素数１〜４程度の低級アルコール（例えばエタノール）が挙げられる。上記分散媒は、溶媒の他に、必要に応じて各種の添加剤を副成分として含有することができる。そのような添加剤としては、界面活性剤、酸化防止剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等が例示される。
【００１９】
ここに開示される技術において使用するＣＮＴ分散液としては、該分散液の不揮発分（ＣＮＴ層形成成分）に占めるＣＮＴ材料の割合が凡そ９０ｗｔ％以上（より好ましくは凡そ９５ｗｔ％以上、例えば凡そ９８ｗｔ％以上）のものを好ましく使用し得る。例えば、ポリマー成分（一般に分散物（ここではＣＮＴ材料）を結着させる目的で用いられる有機バインダ等）を実質的に含まない組成であり得る。かかる組成のＣＮＴ分散液を用いることにより、ＣＮＴ材料を高割合で含むＣＮＴ層を形成することができる。かかるＣＮＴ層によると、特に良好な細胞増殖促進効果が実現され得る。
【００２０】
ここに開示される技術では、上記分散媒中に上記ＣＮＴ材料を低濃度で（例えば凡そ１００ｍｇ／Ｌ以下の濃度で）分散させたＣＮＴ分散液を使用する。典型的には、該分散媒中に上記ＣＮＴ材料を凡そ５０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で含むＣＮＴ分散液を使用する。上記ＣＮＴ材料の濃度が凡そ２０ｍｇ／Ｌ以下（より好ましくは凡そ１５ｍｇ／Ｌ以下、例えば凡そ１０ｍｇ／Ｌ程度）であるＣＮＴ分散液の使用が好ましい。かかる低濃度のＣＮＴ分散液を用いることにより、より細胞の培養に適した（例えば、細胞の増殖をよりよく促進する）ＣＮＴ層が形成され得る。使用するＣＮＴ材料の濃度が高すぎると、得られるＣＮＴ層において細胞の増殖を促進する効果が発揮されないか、あるいは該効果の程度が少なくなりがちである。ＣＮＴ分散液における好ましいＣＮＴ材料濃度の下限は特に限定されないが、該濃度が低くなるにつれて所望の厚さのＣＮＴ層を形成するために要する供給ステップおよび乾燥ステップ（以下、「供給・乾燥ステップ」ともいう。）の繰り返し数は多くなることから、生産効率等を考慮して、通常はＣＮＴ材料の濃度が凡そ０．１ｍｇ／Ｌ以上（例えば凡そ１ｍｇ／Ｌ以上）のＣＮＴ分散液を用いることが適当である。
【００２１】
ＣＮＴ材料を分散媒に分散させる手法としては、ＣＮＴ材料と分散媒とを共存させた混合物を機械的に攪拌する攪拌処理（例えば、プロペラ状等の適当な形状の攪拌体を混合物中で回転させる態様の攪拌機を用いて行う攪拌処理）、該混合物に超音波振動を付与する超音波処理、該混合物を振盪する振盪処理等の一種または二種以上を適宜組み合わせることができる。かかる超音波処理に使用する超音波としては、例えば、周波数２０ｋＨｚ〜４０ｋＨｚ程度の超音波を好ましく採用することができる。かかる周波数の超音波振動を発生し得る超音波装置を用いて、例えば出力８０Ｗ〜２００Ｗ程度の条件で処理するとよい。出力が低すぎると処理効率が低下傾向となることがあり、出力が高すぎるとＣＮＴの損傷が生じやすくなることがある。使用する超音波装置の種類（超音波の発生方式、装置の構成等）は特に限定されず、目的および態様等に応じて適当なものを選択することができる。
【００２２】
ここに開示される技術においてＣＮＴ層を形成する基材（支持体）としては、細胞を培養するために用いられている従来公知の種々の基材を特に制限なく採用することができる。例えば、基材を構成する材質としては、ポリマー材料、ガラス（典型的にはシリカガラス）、シリコン、セラミックス、金属材料等が挙げられる。上記ポリマー材料の好適例としては、ポリスチレン、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン樹脂、ポリアセタール、ポリアミド、ポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、ポリイミド、フッ素系樹脂、およびこれらの誘導体等が挙げられる。また、このような合成樹脂製の基材のほか、例えば絹フィブロインフィルム製の基材等を用いてもよい。上記セラミックスの好適例としては、シリカ、アルミナ、アパタイト等が挙げられる。上記金属材料の好適例としては、金、銀、銅およびこれらの合金が挙げられる。基材の形状は特に限定されず、培養の目的（態様）および細胞培養物の用途に応じた種々の形状の基材を適宜選択して用いることができる。例えば、表面が平滑な板状または筒状の基材を好ましく使用することができる。上記基材の好適例として、一般に細胞培養の目的に使用される従来公知のディッシュ、フラスコ、チューブ、ウェルプレート等の各種容器が挙げられる。
【００２３】
ここに開示される技術では、かかる基材に上記ＣＮＴ分散液を付与する供給ステップと、その供給されたＣＮＴ分散液を乾燥させる乾燥ステップとを必要に応じて繰り返すことにより、該基材上にＣＮＴ層を形成する。最終的に形成されるＣＮＴ層の厚さは特に限定されない。通常は、１ｃｍ２当たり凡そ０．０１μｇ以上のＣＮＴ材料を含むＣＮＴ層とすることが好ましい。ＣＮＴ材料量が凡そ０．０２μｇ／ｃｍ２以上のＣＮＴ層によると、より良好な結果（典型的には、より高い細胞増殖活性）が実現され得る。ＣＮＴ層１ｃｍ２当たりに含まれるＣＮＴ材料量の上限は特に限定されないが、材料費や生産効率の観点から、通常は凡そ５０μｇ／ｃｍ２以下（例えば凡そ１０μｇ／ｃｍ２以下）とすることが適当である。
【００２４】
上記供給ステップは、一回の該供給ステップにより少量の（例えば凡そ０．５μｇ／ｃｍ２以下、典型的には凡そ０．２μｇ／ｃｍ２以下の）ＣＮＴ材料を付与するように行うことが適当であり、一回の該供給ステップにより付与されるＣＮＴ材料の量が凡そ０．１μｇ／ｃｍ２以下（より好ましくは一回当たり凡そ０．０５μｇ／ｃｍ２以下、例えば凡そ０．０３μｇ／ｃｍ２以下）となるように行うことが好ましい。上記好ましいＣＮＴ材料量の下限は特に限定されないが、該材料量が少なくなるにつれて所望の厚さのＣＮＴ層を形成するために要する供給・乾燥ステップの繰り返し数は多くなることから、生産効率等を考慮して、通常は一回の供給ステップにより供給されるＣＮＴ材料量を凡そ０．００１μｇ／ｃｍ２以上（例えば凡そ０．００５μｇ／ｃｍ２以上）とすることが適当である。例えば、一般的な直径６０ｍｍのディッシュを使用して該ディッシュの底面全体にＣＮＴ層を形成する場合には、一回の供給ステップにより上記ディッシュに付与されるＣＮＴ材料の量を例えば凡そ１０μｇ以下とすることができ、凡そ３μｇ以下とすることが好ましく、凡そ２μｇ以下（例えば凡そ１μｇ以下）とすることがより好ましい。一回の供給ステップにより上記ディッシュに付与されるＣＮＴ材料の下限は例えば凡そ０．０２μｇ以上とすることが好ましく、凡そ０．１μｇ以上とすることがより好ましい。
【００２５】
ここに開示される技術の好ましい一態様では、上記供給・乾燥ステップを少なくとも２回以上繰り返してＣＮＴ層を形成する。この繰り返し数が１０回以上（例えば２０回以上）であることがより好ましい。かかる態様によると、各供給・乾燥ステップにより形成されるＣＮＴ薄層が積層された構成のＣＮＴ層が得られる。かかる構成のＣＮＴ層は、例えば該ＣＮＴ層と同量のＣＮＴ材料を一度に（一回の供給ステップにより）付与して乾燥させることにより形成されたＣＮＴ層に比べて、より良好な表面状態を有する（したがって、より細胞増殖活性の高い）ものとなり得る。上記繰り返し数の上限は特に限定されないが、生産効率等の観点から、通常は凡そ１０００回以下（例えば凡そ５００回以下）とすることが適当である。
【００２６】
各供給ステップにおけるＣＮＴ材料の付与量は、例えば、製造しようとするＣＮＴ層１ｃｍ２に含まれるＣＮＴ材料量に基づいて、かかる分量のＣＮＴ材料が適当な回数の供給ステップに分割して付与されるように決定することができる。各供給ステップにより供給されるＣＮＴ材料の分量は同一であってもよく異なってもよい。例えば、ＣＮＴ層の形成に用いられるＣＮＴ材料のうち凡そ５０〜７０ｗｔ％を含むＣＮＴ分散液を用いて一度の供給・乾燥ステップによりＣＮＴ薄層（第１層）を形成した後、一回の供給ステップ当たりのＣＮＴ材料付与量を上述した好ましい範囲とした供給・乾燥ステップを少なくとも１回（典型的には２回以上、好ましくは１０回以上）繰り返すことによりＣＮＴ層の形成を完了してもよい。
【００２７】
上記供給ステップにおいて基材（容器）にＣＮＴ分散液を付与する方法としては、例えば、該基材にＣＮＴ分散液を滴下する方法、スプレーコートによる方法等の、従来公知の各種塗布方法を適宜採用することができる。付与されたＣＮＴ分散液をＣＮＴ層の形成を意図する範囲に均一に広げるため、必要に応じて基材を傾けたり回転させたりしてもよい。例えば、一般的なスピンコートを好ましく適用することができる。
また、上記乾燥ステップは、自然乾燥（風乾）により行ってもよく、必要に応じて加熱、送風、減圧等の乾燥促進手段を適宜採用してもよい。通常は、付与されたＣＮＴ分散液を自然乾燥させる態様を好ましく採用することができる。
【００２８】
かかる供給・乾燥ステップによるＣＮＴ層の形成は、常温・常圧下で好ましく行うことができる。かかるＣＮＴ層の形成を相対湿度が凡そ４０％以下（好ましくは凡そ３０％以下、より好ましくは凡そ２０％以下）の環境下で行うことにより、より良好な結果（例えば、より高い細胞増殖促進活性）が実現され得る。ＣＮＴ層形成時における好ましい相対湿度の下限は特に限定されないが、生産コストや湿度管理の容易性等の観点から、通常は凡そ５％以上とすることが適当である。
【００２９】
ここに開示されるＣＮＴ層または該ＣＮＴ層を備えた細胞培養容器（ここに開示されるいずれかの方法により製造されたＣＮＴ層または細胞培養容器であり得る。）は、各種の細胞を培養する用途に好ましく使用され得る。例えば、上皮細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、肝細胞、神経細胞、がん細胞等の接着性細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や骨髄性幹細胞のような幹細胞その他の浮遊性細胞；のいずれの培養にも適用可能である。
【００３０】
培養に用いられる培地（典型的には培養液）としては、従来公知の種々の培地を特に制限なく用いることができる。例えば、種々の組成のイーグル培地、ＲＰＭＩ培地、ＨａＭ’ｓ培地、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ培地等を用いることができる。イーグル培地としては、ＢＭ培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等が挙げられる。このうち、哺乳動物細胞の培養においては例えばイーグル培地を好ましく採用し得る。
上記培地は、５〜１０％程度の血清を含む培地であってよく、あるいは血清濃度が５％未満の低血清培地（実質的に血清を含まない無血清培地であり得る。）であってもよい。ここに開示されるＣＮＴ層または該ＣＮＴ層を備えた細胞培養容器は、かかる低血清培地を用いた培養にも好ましく用いられて、優れた細胞増殖促進効果を発揮することができる。特に、血清濃度３％以下（典型的には０〜３％）、例えば血清濃度１％の条件、血清濃度２％の条件等で培養を行う用途に好適である。
【００３１】
このような培地を用いて細胞を培養する手法は特に限定されず、培養する細胞や目的とする細胞培養物に応じた培養方法、培養条件等を適宜選択する（例えば、培地の組成や濃度、培養温度、培養期間等を適宜決定する）ことができる。例えば、一般的な哺乳動物細胞の場合、培養温度としては室温から哺乳動物の体温程度の温度（すなわち２０〜４０℃程度、好適には３３〜３８℃程度）を、また培養期間としては半日〜１ヶ月程度（例えば１週間〜２週間）の期間を好ましく採用することができる。また、培地のｐＨ上昇を防止するために、培養雰囲気中のＣＯ２濃度をほぼ一定（例えば３〜１０％、特に５％程度）に保持して培養を行うことが好適である。
【００３２】
以下、本発明に関する具体的な実施例につき説明するが、本発明をかかる具体例に示すものに限定することを意図したものではない。
【００３３】
＜例１＞
［細胞培養容器の作製］
単体の鉄（１モル％）を含むグラファイトからなる一対のスティック状電極（陽極および陰極）を用意し、０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度の間隔をあけて反応容器内に対向配置した。上記反応容器内を水素ガス（Ｈ2）分圧１．３×１０4Ｐａ、アルゴンガス（Ａｒ）分圧１．３×１０4Ｐａ程度の雰囲気に調整した。そして、上記一対の電極間に接続された直流電源により２０〜４０Ｖ程度の電圧を印加し、該電源から３０〜７０Ａ程度の電流を供給して両電極間にアーク放電を発生させた。かかるアーク放電により陽極からカーボンを蒸発させ、単層ＣＮＴを含む蜘蛛の巣状の生成物を得た。該生成物に含まれる単層ＣＮＴの割合は７０モル％以上であった。
【００３４】
次いで、無水（９９．５％）エタノール１００ｍＬに上記生成物（ＣＮＴ材料、以下「ＳＷＮＴ材料」ともいう。）０．５ｍｇを投入し、３５ｋＨｚの超音波振動を３０分間付与する超音波分散処理を行った。これにより、上記ＳＷＮＴ材料を５ｍｇ／Ｌの濃度で含むＣＮＴ分散液（以下、「ＳＷＮＴ分散液」ともいう。）を調製した。このＳＷＮＴ分散液の外観は一様な薄い灰色を呈し、凝集物は視認されなかった。
【００３５】
上記超音波分散処理の後すぐに、上記ＳＷＮＴ分散液から５０μＬ（このなかには０．２５μｇのＳＷＮＴ材料が含まれる。）を分取し、これを直径６０ｍｍのポリスチレン製ペトリディッシュ（コーニング社製の無処理表面ディッシュ、以下「ＰＳディッシュ」という。）に滴下して該ディッシュの底面全体に行き渡らせた後、上記滴下されたＳＷＮＴ分散液を乾燥（ここでは風乾）させた。この第１回目の供給・乾燥ステップにより、ＰＳディッシュの底表面上にＣＮＴの薄層を形成した。
次いで、上記で調製したＳＷＮＴ分散液（引き続き凝集物が視認されない高分散状態にある。）から新たに５０μＬを分取し、これを上記第１回目の供給・乾燥ステップにより形成されたＣＮＴ薄層（第１層）の上から滴下して乾燥させることにより（第２回目の供給・乾燥ステップ）、上記第１層の上にＣＮＴ薄層（第２層）を形成した。この手順を合計で４０回繰り返すことにより（直径６０ｍｍのディッシュに供給されたＳＷＮＴ材料の総量（すなわちＣＮＴ材料のコート量）＝１０μｇ）、ＰＳディッシュの底面にＣＮＴ層が形成された（換言すれば、ＣＮＴ材料がコーティングされた）細胞培養容器を作製した。以下、この容器を「ＳＷＮＴ１０ディッシュ」という。
【００３６】
このＳＷＮＴ１０ディッシュの表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察して得られた像を図６に示す。図示されるように、ＰＳディッシュの表面に単層ＣＮＴが、よく分散した状態で（バンドルがよく解れた状態で）付着している様子が確認された。
【００３７】
［培養試験］
上記で作製したＳＷＮＴ１０ディッシュを常法により紫外線滅菌処理した後、該ディッシュを用いて以下の培養試験を行った。すなわち、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉａ）培地にＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）１０ｗｔ％およびＰＳＮ（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｉｘｔｕｒｅ）１ｗｔ％を添加した培養液４ｍＬをＳＷＮＴ１０ディッシュに入れた。ここにＳａＯｓ−２（ヒト骨肉種由来の骨芽細胞様細胞）を１×１０４セル／ディッシュとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１週間培養した。
また、ＳＷＮＴ１０ディッシュの代わりに上記ＰＳディッシュ（すなわち、ＣＮＴ層を形成する表面処理を行っていない（未処理の）ＰＳディッシュ）およびコーニング社製の細胞培養用ＰＳディッシュ（以下「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュ」という。）を用いて同様にＳａＯｓ−２を培養した。上記Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュには、細胞培養のための表面処理（コロナ放電処理等の親水化処理）が施されている。
培養期間終了後、培養液を光学顕微鏡で観察することによりセル数をカウントし、その結果から培養面積１ｃｍ２当たりのセル数を算出した。
上記培養試験の結果を表１および図１に示す。ここで、図１の縦軸はセル数［ｃｍ−２］である。
【００３８】
【表１】
0005327936.tif 000002
【００３９】
表１および図１に示されるように、ＳＷＮＴ１０ディッシュを用いた培養によると、ＰＳディッシュおよびＣｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュのいずれにも勝る細胞数増加が観察された。より具体的には、ＳＷＮＴ１０ディッシュによると、ＰＳディッシュの約１．４倍、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュに対しても約１．２倍の細胞増殖促進効果が実現された。
【００４０】
なお、上記ＳＷＮＴ１０の作製においてＰＳディッシュの代わりにＣｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュを使用して（すなわち、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュに上記ＳＷＮＴ分散液５０μＬ／回を供給・乾燥するステップを４０回繰り返して）、該Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュに計１０μｇのＳＷＮＴ材料がコーティングされた細胞培養容器（以下「ＳＷＮＴ１０／ＣＰＳディッシュ」という。）を作製し、このＳＷＮＴ１０／ＣＰＳディッシュを用いて上記と同様にＳａＯｓ−２の培養試験を行った。その結果、未処理のＣｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュに比べてＳＷＮＴ１０／ＣＰＳディッシュでは細胞の増殖がさらに促進されること（すなわち、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュにおいてもＣＮＴ層の形成により細胞増殖促進効果が発揮されること）が確認された。
また、上記ＳＷＮＴ材料１ｍｇを無水（９９．５％）エタノール１００ｍＬに投入し、上記と同様の超音波分散処理を行って濃度１０ｍｇ／ＬのＳＷＮＴ分散液を調製し（凝集物は視認されなかった。）、このＳＷＮＴ分散液５０μＬを上記ＰＳディッシュに供給・乾燥するステップを２０回繰り返して（ＳＷＮＴ材料の総量＝１０μｇ）同様に細胞培養容器を作製した。この細胞培養容器を用いて上記と同様にＳａＯｓ−２の培養試験を行ったところ、濃度５ｍｇ／ＬのＳＷＮＴ分散液を用いて作製したＳＷＮＴ１０ディッシュと同様に細胞増殖促進効果が得られることが確認された。
【００４１】
＜例２＞
例１で作製したＳＷＮＴ１０ディッシュと同様の手法により、但し上記ＳＷＮＴ分散液５０μＬを供給・乾燥するステップの繰り返し数を４回（ＳＷＮＴ材料の総量＝１μｇ）に変更して、ＰＳディッシュの底面にＣＮＴ層が形成された細胞培養容器を作製した。以下、この容器を「ＳＷＮＴ１ディッシュ」という。また、上記供給・乾燥ステップの繰り返し数を２００回（ＳＷＮＴ材料の総量＝５０μｇ）とした点以外は上記と同様にして細胞培養容器（ＳＷＮＴ５０ディッシュ）を作製した。
さらに、一回の供給ステップで供給するＳＷＭＴ分散液の量を１００μＬとして上記供給・乾燥ステップを２００回繰り返すことにより（ＳＷＮＴ材料の総量＝１００μｇ）細胞培養容器（ＳＷＮＴ１００ディッシュ）を作製した。
【００４２】
上記で作製したＳＷＮＴ１，５０，１００ディッシュ、例１で作製したＳＷＮＴ１０ディッシュおよび未処理のＰＳディッシュを用いて、培養期間を２週間とした点以外は例１と同様にしてＳａＯｓ−２の培養試験を行った。その結果を表２および図２に示す。ここで、図２の縦軸はセル数［ｃｍ−２］である。また、ＰＳディッシュを用いた場合の培養後セル数を基準として、他のディッシュの培養後セル数の比率（相対細胞増殖率）を算出した。その結果を表２に併せて示す。この相対細胞増殖率が１を超えれば細胞増殖促進効果があるといえる。
【００４３】
【表２】
0005327936.tif 000003
【００４４】
表２および図２に示されるように、ＳＷＮＴ分散液を用いてＣＮＴ層を形成する処理を行ったいずれのディッシュにおいても、未処理のＰＳディッシュに勝る細胞数増加が観察された。ＳＷＮＴ分散液の供給・乾燥ステップを２０回以上行ってなるディッシュ（ＳＷＮＴ１０，５０，１００ディッシュ）では特に高い細胞増殖促進効果（相対細胞増殖率３．５倍以上、より具体的には３．８〜５倍）が認められた。
【００４５】
＜例３＞
市販の多層ＣＮＴ（ＮａｎｏＬａｂ社製、純度８０％品）を燃焼酸化および塩酸処理により精製してなるＣＮＴ材料（以下「ＭＷＮＴ材料」ともいう。）１ｍｇを無水（９９．５％）エタノール１００ｍＬに投入し、３５ｋＨｚの超音波振動を３０分間付与する超音波分散処理を行ってＣＮＴ分散液（以下、「ＭＷＮＴ分散液」ともいう。）を調製した。ＳＷＮＴ分散液に代えて上記ＭＷＮＴ分散液（ＭＷＮＴ材料濃度１０ｍｇ／Ｌ）を使用し、その他の点については例１と同様にして細胞培養容器を作製した。すなわち、直径６ｃｍのＰＳディッシュに１回当たり５０μＬの上記ＭＷＮＴ分散液を供給・乾燥するステップを２回（ＭＷＮＴ材料の総量＝１μｇ）行うことにより、ＰＳディッシュの底面にＣＮＴ層が形成された細胞培養容器（以下、「ＭＷＮＴ１ディッシュ」という。）を作製した。また、上記ＭＷＮＴ分散液５０μＬを供給・乾燥するステップを２０回繰り返して（ＭＷＮＴ材料の総量＝１０μｇ）、同様に細胞培養容器（ＭＷＮＴ１０ディッシュ）を作製した。
【００４６】
上記ＭＷＮＴ材料２ｍｇを無水（９９．５％）エタノール１００ｍＬに投入し、上記と同様の超音波分散処理を行ってＭＷＮＴ分散液を調製した。この分散液５０μＬを上記ＰＳディッシュに供給・乾燥するステップを５０回繰り返して（ＭＷＮＴ材料の総量＝５０μｇ）、同様に細胞培養容器（ＭＷＮＴ５０ディッシュ）を作製した。
【００４７】
上記ＭＷＮＴ材料５ｍｇを無水（９９．５％）エタノール１００ｍＬに投入し、上記と同様の超音波分散処理を行ってＭＷＮＴ分散液を調製した。この分散液５０μＬを上記ＰＳディッシュに供給・乾燥するステップを４０回繰り返して（ＭＷＮＴ材料の総量＝１００μｇ）、同様に細胞培養容器（ＭＷＮＴ１００ディッシュ）を作製した。
なお、上記で用いたいずれのＭＷＮＴ分散液においても凝集物は視認されなかった。
【００４８】
上記で作製したＭＷＮＴ１，２０，５０，１００ディッシュおよび未処理のＰＳディッシュを用いて、例２と同様にＳａＯｓ−２の培養試験（２週間）を行い、同様に相対細胞増殖率を算出した。それらの結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
表３に示されるように、ＭＷＮＴ分散液を用いてＣＮＴ層を形成する処理を行ったいずれのディッシュにおいても、未処理のＰＳディッシュに勝る細胞数増加が観察された。ＭＷＮＴ分散液の供給・乾燥ステップを２０回以上行ってなるディッシュ（ＭＷＮＴ１０，５０，１００ディッシュ）では特に高い細胞増殖促進効果（相対細胞増殖率２倍以上、より具体的には２〜２．５倍）が認められた。なお、ＭＷＮＴとＳＷＮＴとの比較では、ＳＷＮＴ分散液を用いて処理されたディッシュのほうが更に高い効果を示した。
【００５１】
＜例４＞
上記で作製したＳＷＮＴ１０ディッシュおよびＰＳディッシュを用い、培養液としてＤＭＥＭ培地またはＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ）にＦＢＳ１０ｗｔ％およびＰＳＮ１ｗｔ％を添加した培養液を使用した点以外は例２と同様の培養条件で各種細胞を培養する培養試験を行った。培養に使用した細胞は次のとおりである。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（マウス頭蓋骨  骨芽細胞）、ＳＴ２（マウス骨髄  間葉系幹細胞）、ＲＰＣ−Ｃ２Ａ（ラット歯髄細胞株）、ＫＢ（口腔扁平上皮がん）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚部  類上皮がん）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児  上皮細胞）およびＮＩＨ−３Ｔ３（マウス胎児皮膚  繊維芽細胞）。各細胞を５０％〜７０％コンフルエントになるまで培養し、光学顕微鏡下でセル数をカウントした。それらの結果を、ＰＳディッシュを用いた場合の培養後セル数に対するＳＷＮＴ１０ディッシュを用いた場合の培養後セル数の比（相対細胞増殖率）として表４および図３に示す。ここで、図３の縦軸は相対細胞増殖率である。また、表４および図３には、例２におけるＳａＯｓ−２の相対細胞増殖率を併せて示している。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
表４および図３に示されるように、未処理のＰＳディッシュに比べてＳＷＮＴ１０ディッシュによると、いずれの細胞についても細胞増殖促進効果（相対細胞増殖率１．２〜５倍）が認められた。
【００５４】
＜例５＞
本例では、例１〜４で用いた培養液（ＦＢＳ１０ｗｔ％）に代えて、ＤＭＥＭ培地にＦＢＳ２ｗｔ％およびＰＳＮ１ｗｔ％を添加した低血清の培養液を用い、ここに５×１０４セル／ディッシュのＳａＯｓ−２を播種して培養試験を行った。細胞培養容器としては、上記で用いたＳＷＮＴ１０ディッシュ、ＳＷＮＴ１００ディッシュの他、ＰＳディッシュおよびＣｕｌｔｕｒｅ  ＰＳディッシュの他、高細胞接着性ＰＳディッシュ（コーニング社製、商品名「ＳｅｌｌＢｉｎｄ」）、コラーゲンコートＰＳディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製、表および図中では「Ｃｏｌｌａｇｅｎ」と表記する。）およびポリリジンコートＰＳディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製、表および図中では「Ｐｏｌｙ−Ｌｙｓ」と表記する。）を使用した。培養期間は２週間とし、その間、２日毎に培養液を交換した。その他の点については例２と同様にして培養を行い、培養後のセル数（伸展細胞数）を求めた。得られた結果を表５および図４に示す。ここで、図４の縦軸は伸展細胞数［ｃｍ−２］である。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
表５および図４に示されるように、かかる低血清条件（ＦＢＳ２ｗｔ％）での培養では市販の各種細胞培養用容器ではセル数が播種セル数を下回っていたのに対し、ＳＷＮＴ分散液を用いてＣＮＴ層を形成する処理を行ってなるディッシュ（ＳＷＮＴ１０ディッシュおよびＳＷＮＴ１００ディッシュ）ではいずれも細胞が良好に増殖していた。なかでもＳＷＮＴ１００ディッシュは該低血清条件下においても特に高い細胞増殖活性を示すことが確認された。
【００５７】
＜例６＞
本例では、例５よりもさらに低血清の培養液、すなわちＤＭＥＭ培地にＦＢＳ１ｗｔ％およびＰＳＮ１ｗｔ％を添加した培養液を用いた。その他の点については例５と同様にしてＳａＯｓ−２を２週間培養する培養試験を行い（すなわち、培養液は２日毎に交換）、培養後のセル数（伸展細胞数）を求めた。得られた結果を表６および図５に示す。ここで、図５の縦軸は伸展細胞数［ｃｍ−２］である。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
表６および図５に示されるように、かかる低血清条件（ＦＢＳ１ｗｔ％）での培養では市販の各種細胞培養用容器ではセル数が播種セル数を下回るか或いは細胞が死滅したのに対し、ＳＷＮＴ分散液を用いてＣＮＴ層を形成する処理を行ってなるディッシュ（ＳＷＮＴ１０ディッシュおよびＳＷＮＴ１００ディッシュ）ではいずれも細胞が良好に増殖していた。なかでもＳＷＮＴ１００ディッシュは該低血清条件下においても特に高い細胞増殖活性を示すことが確認された。
【００６０】
以上、本発明の好適な実施態様を詳細に説明したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した態様を様々に変形、変更したものが含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上に説明したとおり、ここに開示されるいずれかのＣＮＴ層または該ＣＮＴ層を有する細胞培養容器によると、各種の細胞を効率よく（例えば、該ＣＮＴ層を有しない容器に比べて高い細胞増殖率で）培養することができる。かかるＣＮＴ層または容器は、特に低血清培地での培養において優れた細胞増殖促進効果を発揮するものであり得る。一般に低血清培地での培養には、血清成分に由来する外乱を排除または低減できることからより一定した培養性能が得られる、より精確に培養条件を制御できる、より信頼性の高い細胞培養物が得られる、培養液からの精製および後続するプロセスが容易である、等の種々の利点がある。したがって、かかる低血清培地での培養においても優れた増殖促進効果を発揮し得る本発明のＣＮＴ層または細胞培養容器は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】例１に係る培養試験の結果を示すグラフである。
【図２】例２に係る培養試験の結果を示すグラフである。
【図３】例４に係る培養試験の結果を示すグラフである。
【図４】例５に係る培養試験の結果を示すグラフである。
【図５】例６に係る培養試験の結果を示すグラフである。
【図６】ＳＷＮＴ１０ディッシュ表面のＳＥＭ像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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