(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、
対物レンズの近点側の焦点位置および／または対物レンズの遠点側の焦点位置を求め、求めた焦点位置に基づいて前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することを特徴とする焦点位置決定方法。
【請求項２】
試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、
試料へ光を照射する光照射ステップと、
対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更ステップと、
前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を計測する焦点位置計測ステップと、
前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて、前記光照射ステップで光が照射された試料を撮像する試料撮像ステップと、
前記試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量算出ステップと、
前記焦点位置変更ステップ、前記焦点位置計測ステップ、前記試料撮像ステップおよび前記特徴量算出ステップを繰り返し実行する実行ステップと、
前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出する焦点位置選出ステップと、
前記焦点位置選出ステップで選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定ステップと、
を含むことを特徴とする焦点位置決定方法。
【請求項３】
前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置を選出し、
前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選出ステップで選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項２に記載の焦点位置決定方法。
【請求項４】
前記２つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする請求項３に記載の焦点位置決定方法。
【請求項５】
前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置を選出し、
前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選出ステップで選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項２に記載の焦点位置決定方法。
【請求項６】
前記１つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする請求項５に記載の焦点位置決定方法。
【請求項７】
前記焦点位置決定ステップで決定した焦点位置にて試料を撮像する決定位置試料撮像ステップと、
前記決定位置試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定位置特徴量算出ステップと、
前記焦点位置決定ステップで決定した焦点位置を変更する決定後焦点位置変更ステップと、
前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて試料を撮像する決定後試料撮像ステップと、
前記決定後試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定後特徴量算出ステップと、
前記決定位置特徴量算出ステップで算出した特徴量と前記決定後特徴量算出ステップで算出した特徴量とを比較する特徴量比較ステップと、
前記特徴量比較ステップで比較した結果、前記決定後特徴量算出ステップで算出した特徴量の方が大きかった場合には、前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定する焦点位置再決定ステップと、
をさらに含むことを特徴とする請求項２から６のいずれか１つに記載の焦点位置決定方法。
【請求項８】
前記試料は生体細胞または組織であることを特徴とする請求項２から７のいずれか１つに記載の焦点位置決定方法。
【請求項９】
試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定装置であって、
試料へ光を照射する光照射手段と、
対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更手段と、
対物レンズの焦点位置を計測する焦点位置計測手段と、
試料を撮像する試料撮像手段と、
前記試料撮像手段で撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量算出手段と、
前記焦点位置変更手段、前記焦点位置計測手段、前記試料撮像手段および前記特徴量算出手段を繰り返し実行させるよう、各々の手段を制御する制御手段と、
前記制御手段で前記各々の手段を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の焦点位置から、前記繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出する焦点位置選出手段と、
前記焦点位置選出手段で選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定手段と、
を備えたことを特徴とする焦点位置決定装置。
【請求項１０】
前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置を選出し、
前記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項９に記載の焦点位置決定装置。
【請求項１１】
前記２つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする請求項１０に記載の焦点位置決定装置。
【請求項１２】
前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置を選出し、
前記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項９に記載の焦点位置決定装置。
【請求項１３】
前記１つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする請求項１２に記載の焦点位置決定装置。
【請求項１４】
前記特徴量算出手段で予め個別に算出した２つの特徴量を比較する特徴量比較手段と、
前記特徴量比較手段で比較した結果に基づいて前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を再度決定する焦点位置再決定手段と、
をさらに備え、
前記焦点位置決定手段で決定した焦点位置にて前記試料撮像手段で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づいて前記特徴量算出手段で特徴量を算出し、
前記焦点位置決定手段で決定した焦点位置を前記焦点位置変更手段で変更し、変更した焦点位置にて前記試料撮像手段で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づいて前記特徴量算出手段で特徴量を算出し、
前記決定した焦点位置に対応する特徴量と前記変更した焦点位置に対応する特徴量とを前記特徴量比較手段で比較し、比較した結果、前記変更した焦点位置に対応する特徴量の方が大きかった場合には、前記焦点位置再決定手段で、前記変更した焦点位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定することを特徴とする請求項９から１３のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項１５】
前記試料は生体細胞または組織であることを特徴とする請求項９から１４のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項１６】
前記光照射手段を含む照明光学系の瞳位置に開口を配置したことを特徴とする請求項９から１５のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項１７】
前記開口を光軸に対して偏芯させて配置したことを特徴とする請求項１６に記載の焦点位置決定装置。
【請求項１８】
前記光照射手段を含む照明光学系に狭帯域通過フィルターを配置したことを特徴とする請求項９から１５のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項１９】
前記光照射手段は単色の可視光を発することを特徴とする請求項９から１８のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項２０】
試料へ励起光を照射する励起光照射手段をさらに備えたことを特徴とする請求項９から１９のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置。
【請求項２１】
試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、
対物レンズの位置を移動させながら試料を撮像すると共に対物レンズの焦点位置を計測し、撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差であるコントラストを算出し、算出したコントラストおよび計測した対物レンズの焦点位置に基づいて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することを特徴とする焦点位置決定方法。
【請求項２２】
前記コントラストは、画像を構成する各画素の画素値のうち最大値を含む複数の上位の画素値の平均値と、画像を構成する各画素の画素値のうち最小値を含む複数の下位の画素値の平均値との差であることを特徴とする請求項２１に記載の焦点位置決定方法。
【請求項２３】
算出したコントラストを他のものと比較してその極小値を１つ探索し、探索した極小値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項２１または２２に記載の焦点位置決定方法。
【請求項２４】
算出したコントラストを他のものと比較してその極大値を２つ探索し、探索した各極大値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置の中間を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする請求項２１から２３のいずれか１つに記載の焦点位置決定方法。
【請求項２５】
対物レンズの位置を、その移動量を段階的に減らしながら移動させることを特徴とする請求項２１から２４のいずれか１つに記載の焦点位置決定方法。
【請求項２６】
対物レンズの位置を、その移動量を前回の移動量の半分に減らしながら移動させることを特徴とする請求項２５に記載の焦点位置決定方法。
【請求項２７】
生物由来の被験試料の微弱光画像を、光学的結像手段を用いて描出する微弱光検出方法であって、
請求項１から８、請求項２１から２６のいずれか１つに記載の焦点位置決定方法を用いて対物レンズの焦点位置を決定し、
決定した焦点位置において前記被験試料の微弱光画像および／または明視野または暗視野画像を取得することを特徴とする微弱光検出方法。
【請求項２８】
生物由来の被験試料の微弱光画像を、光学的結像手段を用いて描出する微弱光検出装置であって、
請求項９から２０のいずれか１つに記載の焦点位置決定装置を用いて対物レンズの焦点位置を決定し、
決定した焦点位置において前記被験試料の微弱光画像および／または明視野または暗視野画像を取得することを特徴とする微弱光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法および焦点位置決定装置に関するものである。
本発明は、微弱光を発する生物由来の被験試料を、レンズを含む拡大結像光学手段を用いて観察、または測定する方法、及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
［Ｉ］今日、蛍光を利用した生物試料のイメージング手法は生命科学の研究にとって、大きな役割を担っている。特定のタンパク質をマーキングし発光を利用することにより、細胞内外で起こっている種々の生命現象を観察することが可能となり、また、種々の生命現象の動的な振る舞いなどをリアルタイムで知ることができる。特に最近では、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）などの蛍光タンパク質を用いることにより、細胞内の構造物のイメージングを安定に且つ容易に実現できるようになってきており、種々の生命現象の解明が着実に進みつつある。【０００３】
また、生物発光性タンパク質（具体的にはルシフェラーゼやエクオリンなど）を発現する発光関連遺伝子を細胞内の種々の機能解析に役立てる（具体的には発光関連遺伝子をタンパク質発現のレポーター分子として活用する）ことも、しばしば行なわれるようになってきた。そして、このような機能解析を行なう上で、細胞内の特定の部位にレンズのフォーカスを合わせて鮮明な画像を描出したり、細胞内に導入した特定の生物発光性タンパク質からの発光を効率良く受光したりすることは、非常に重要である。ところが、生物試料からの自家発光の光強度は一般に極めて微弱であるので、通常、生物試料からの発光を肉眼で直接確認できないことが多い。このような微弱な光を発する試料に対して光学素子（例えば検出系のレンズなど）を調整しても試料内の特定の部位にレンズのフォーカスを合わせることは、当然、肉眼では困難である。【０００４】
ここで、試料容器内の試料に光をフォーカスする方法についてはいろいろ開示されている。ただし、その何れも、試料からの光を肉眼で（目視で）確認できる場合における方法である。例えば、試料容器の底面位置を検出し、検出した位置情報を元にして試料容器内の試料に光をフォーカスする方法については特許文献１や特許文献２で開示されている。特許文献１では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ照射し、光の照射位置を上下に移動させながら試料容器の底面からの鏡面反射光の強度を順番に検出し、検出した光の強度に基づいて試料容器の底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスする。また、特許文献２では、対物レンズを通して光を試料容器の底面へ下から斜めに照射し、試料容器の底面からの鏡面反射光のＸＹ平面上でのずれ量を光検出器で検出し、検出したずれ量に基づいて試料容器の光軸上での底面位置を検出し、検出した位置情報を元に試料容器内の試料の位置を推定し、推定した位置に光をフォーカスする。これにより、試料容器内の試料に対物レンズの焦点位置を合わせることができる。【０００５】
また、細胞などの位相物体を明視野で観察する顕微鏡を用いて、対物レンズの位置を通常の合焦位置から前後にずらして固定してデフォーカスによる高いコントラストの観察画像を得て細胞を観察する方法が、特許文献３や特許文献４に開示されている。これにより、位相物体である細胞の観察画像を高いコントラストで得ることができる。【０００６】
［ＩＩ］今日、蛍光や発光（化学発光および生物発光）現象を利用した、生物由来の試料を解析する技術は、生命科学分野の研究に重要な役割を担っている。細胞内外で起こっている種々の生命現象を、特定のタンパク質をマーキングし、蛍光や発光を利用することで、実際に計測可能となり、これらの動的な振る舞いなどをリアルタイムで求めることができる。特に最近ではＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）などの蛍光タンパク質を用いることにより、細胞内の構造物を安定に且つ容易にイメージングできるようになってきており、蛍光画像による解析技術は生命現象の解明に着実に寄与しつつある。【０００７】
蛍光画像による生物由来の試料の解析においては、試料が小さ過ぎる場合に観察画像を光学的ないし電子的（デジタル的）に拡大してから画像解析する試みが行なわれている。このような例として、増殖した微生物に対して蛍光色素により蛍光染色した蛍光画像を拡大した拡大画像を用いて微生物の数を測定する装置が開示されている（特許文献５参照）。【０００８】
【特許文献１】特表２００２−５４１４３０号公報
【特許文献２】特表２００２−５４２４８０号公報
【特許文献３】特開２００４−３５４６５０号公報
【特許文献４】特開２００５−１７３２８８号公報
【特許文献５】特開２００５−１７２６８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［Ｉ］しかしながら、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点では試料からの発光が微弱あるいは未だ起こってないので、従来の技術では、試料を設置した時点では当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができず、ゆえに、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができなかった、という問題点があった。【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置を提供することを目的とする。【００１１】
［ＩＩ］しかしながら、一般に蛍光は輝度が高い反面、光量が一定せず変動したり徐々に消失する。また、励起光を照射するために、長期間の観察においては、励起光の繰返し照射による輝度の変動も生じ易いという問題が有り、精密な画像解析、とりわけ定量的な解析は困難である。また、生物からの自家発光は蛍光と異なり常に一定の光量で発光しているとされている。しかし、自家発光による光強度は極めて微弱であり、肉眼では直接観察できない場合が多いので、フォーカス位置を正確に合わせることが出来ないので、鮮明な画像を描出したり、特定の生物発光タンパク質からの発光を効率良く受光することは不可能であった。【００１２】
一方、上記の蛍光タンパク質の代わりに、生物発光タンパク質であるルシフェラーゼやエクオリンなどといった遺伝子をタンパク質発現のレポーター分子として活用し、細胞内の機能解析に役立てることも、しばしば行なわれるようになってきており、自家発光による画像解析の期待も非常に高いと推測する。
従って、本発明は、発光等により直接観察が出来ない試料に対しても正確にフォーカス位置を合せることができる微弱光検出方法および装置を提供することを目的とする。また、本発明は、とくに鮮明な発光画像を得ることが可能な方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［Ｉ］上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる焦点位置決定方法は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、対物レンズの近点側の焦点位置および／または対物レンズの遠点側の焦点位置を計測し、計測した焦点位置に基づいて前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、試料へ光を照射する光照射ステップと、対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更ステップと、前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を計測する焦点位置計測ステップと、前記焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて、前記光照射ステップで光が照射された試料を撮像する試料撮像ステップと、前記試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量算出ステップと、前記焦点位置変更ステップ、前記焦点位置計測ステップ、前記試料撮像ステップおよび前記特徴量算出ステップを繰り返し実行する実行ステップと、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出する焦点位置選出ステップと、前記焦点位置選出ステップで選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定ステップと、を含むことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選出ステップで選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００１６】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記２つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記焦点位置選出ステップでは、前記実行ステップを実行して蓄積した複数の焦点位置から、前記実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定ステップでは、前記焦点位置選出ステップで選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記１つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記焦点位置決定ステップで決定した焦点位置にて試料を撮像する決定位置試料撮像ステップと、前記決定位置試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定位置特徴量算出ステップと、前記焦点位置決定ステップで決定した焦点位置を変更する決定後焦点位置変更ステップと、前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置にて試料を撮像する決定後試料撮像ステップと、前記決定後試料撮像ステップで撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出する決定後特徴量算出ステップと、前記決定位置特徴量算出ステップで算出した特徴量と前記決定後特徴量算出ステップで算出した特徴量とを比較する特徴量比較ステップと、前記特徴量比較ステップで比較した結果、前記決定後特徴量算出ステップで算出した特徴量の方が大きかった場合には、前記決定後焦点位置変更ステップで変更した焦点位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定する焦点位置再決定ステップと、をさらに含むことを特徴とする。
【００２０】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記試料は生体細胞または組織であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明は焦点位置決定装置に関するものであり、本発明にかかる焦点位置決定装置は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定装置であって、試料へ光を照射する光照射手段と、対物レンズの焦点位置を変更する焦点位置変更手段と、対物レンズの焦点位置を計測する焦点位置計測手段と、試料を撮像する試料撮像手段と、前記試料撮像手段で撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出する特徴量算出手段と、前記焦点位置変更手段、前記焦点位置計測手段、前記試料撮像手段および前記特徴量算出手段を繰り返し実行させるよう、各々の手段を制御する制御手段と、前記制御手段で前記各々の手段を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の焦点位置から、前記繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出する焦点位置選出手段と、前記焦点位置選出手段で選出した焦点位置に基づいて、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２２】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００２３】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記２つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置および対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記焦点位置選出手段は、前記蓄積した複数の焦点位置から、前記蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置を選出し、前記焦点位置決定手段は、前記焦点位置選出手段で選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００２５】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記１つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置または対物レンズの遠点側の焦点位置であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記特徴量算出手段で予め個別に算出した２つの特徴量を比較する特徴量比較手段と、前記特徴量比較手段で比較した結果に基づいて前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を再度決定する焦点位置再決定手段とをさらに備え、前記焦点位置決定手段で決定した焦点位置にて前記試料撮像手段で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づいて前記特徴量算出手段で特徴量を算出し、前記焦点位置決定手段で決定した焦点位置を前記焦点位置変更手段で変更し、変更した焦点位置にて前記試料撮像手段で試料を撮像し、撮像した撮像画像に基づいて前記特徴量算出手段で特徴量を算出し、前記決定した焦点位置に対応する特徴量と前記変更した焦点位置に対応する特徴量とを前記特徴量比較手段で比較し、比較した結果、前記変更した焦点位置に対応する特徴量の方が大きかった場合には、前記焦点位置再決定手段で、前記変更した焦点位置を、前記観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定することを特徴とする。
【００２７】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記試料は生体細胞または組織であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記光照射手段を含む照明光学系の瞳位置に開口を配置したことを特徴とする。
【００２９】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記開口を光軸に対して偏芯させて配置したことを特徴とする。
【００３０】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記光照射手段を含む照明光学系に狭帯域通過フィルターを配置したことを特徴とする。
【００３１】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、前記光照射手段は単色の可視光を発することを特徴とする。
【００３２】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置は、上記の発明において、試料へ励起光を照射する励起光照射手段をさらに備えたことを特徴とする。
【００３３】
また、本発明は焦点位置決定方法に関するものであり、本発明にかかる焦点位置決定方法は、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する焦点位置決定方法であって、対物レンズの位置を移動させながら試料を撮像すると共に対物レンズの焦点位置を計測し、撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差であるコントラストを算出し、算出したコントラストおよび計測した対物レンズの焦点位置に基づいて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することを特徴とする。
【００３４】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、前記コントラストは、画像を構成する各画素の画素値のうち最大値を含む複数の上位の画素値の平均値と、画像を構成する各画素の画素値のうち最小値を含む複数の下位の画素値の平均値との差であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、算出したコントラストを他のものと比較してその極小値を１つ探索し、探索した極小値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００３６】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、算出したコントラストを他のものと比較してその極大値を２つ探索し、探索した各極大値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置の中間を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定することを特徴とする。
【００３７】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、対物レンズの位置を、その移動量を段階的に減らしながら移動させることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法は、上記の発明において、対物レンズの位置を、その移動量を前回の移動量の半分に減らしながら移動させることを特徴とする。
【００３９】
［ＩＩ］本発明者は、以上の見地に初めて立ち、種々のイメージング技術を開発し鋭意検討して来た（特願２００５−２６７５３１号参照）。この検討によれば、対物レンズの開口数（ＮＡ）および投影倍率（β）で表される（ＮＡ÷β）の２乗の値が０．０１以上の光学系で撮像することによって、単一の細胞から発生する発光だけで画像化できることが証明された。驚くべきことに、この撮像条件は、従来、画像化が困難であったあらゆる生物由来の試料にも適用できる可能性が有り、短い時間（例えば２０分以内）で生物発光のような肉眼（および顕微鏡下）では直接観察出来ないような微弱な発光成分による細胞画像を撮像できる。さらに、発明者が追究した光学的条件によれば、撮像装置の対物レンズを開口数（ＮＡ）／投影倍率（β）の２乗で表される光学的条件が０．０７１以上である場合に、１〜５分以内という短時間で画像化でき、画像解析も可能な細胞画像を提供できること突き止めた。【００４０】
ここにおいて、まず、発明者は低倍率の対物レンズで被験試料全体の画像を取得し、視野内の所望の発光部位を確認していたが、この場合、所望の発光部位は観察視野内の一部分であることが多く、微小な領域に留まっているためにその解析や機能を確認することが困難ということが分かった。そこで、観察視野内の所望の部位を拡大して観察しようとしたところ、単に、対物レンズの倍率を上げただけでは生物発光タンパク質などの微弱な発光画像を取得しようとする場合、視野が暗くなり、発光像を容易に確認できない場合が有るという技術課題も発見した。【００４１】
そこで、本発明の微弱光検出装置は、生物由来の被験試料の画像を光学的結像手段を用いて描出する装置であって、前記被験試料の画像を光学的結像手段を用いて描出する画像生成工程と、前記画像生成工程で取得した当該画像から、所望の領域を抽出する画像抽出工程と、前記画像抽出工程で取得した当該領域を拡大する画像拡大工程と、を含むことを特徴とする。この装置は、前記被験試料の一部である、所望の領域の拡大画像を前記被験試料の明視野、または暗視野画像に重ねて表示する画像表示工程、または当該画像を記録する画像記録工程を含むのが好ましい。【００４２】
また、本発明の微弱光検出方法は、生物由来の被験試料の画像を描出し、当該画像から所望の領域を抽出し、当該領域を拡大して表示、または記録することを特徴とする。この方法は、さらに、前記被験試料の一部である、所望の領域の拡大画像を前記被験試料の明視野、または暗視野画像に重ねて表示、または記録する工程を有するのが好ましい。また、この方法において、前記画像拡大工程は、光学的な画像拡大工程、あるいは電気的な処理による画像拡大工程であるのが好ましい。【００４３】
本発明によれば、所望の発光部位の画像を特定し、その部分を拡大して表示する方法及び装置が提供される。ここで、レンズを含む拡大結像光学手段を用いて微弱光を発する被験試料の観察を行なう際に（或いは被験試料を観察し、画像として取得する際に）、描出された画像に基づいて、発光部位を含む所望の部位の画像を拡大し、表示する（或いは描出された画像内の所望の領域の画像要素を指定し、指定した画像要素を任意倍率で拡大し、画像表示する）ことが重要な構成要素となる。【００４４】
一方、移行塩基配列、及び発光関連遺伝子に加えて、さらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合した融合遺伝子を細胞に導入し、当該細胞の蛍光画像を得て、得られた蛍光画像に基づいて、細胞内の所定の部位に生物発光性タンパク質が局在するか否かを判定することも判明した（特願２００５−１０４３４１号参照）。このように蛍光物質による発光を利用して細胞内の発光タンパク質による発光位置のマーキングを行なうことは有効な方法であるが、蛍光物質による蛍光を利用した、細胞内の発光位置の特定が行なわれても、通常、その部位は細胞内の微小な部分であり、観察視野内のごく一部分に過ぎないために、これを撮像しているＣＣＤカメラの撮像素子のうち、受光に与る素子も、一部であり、得られる画像の解像度も不十分となる場合があり得る。すなわち、ボケた画像しか、得られないことになる。【００４５】
そこで、蛍光物質による蛍光を利用した場合にも、細胞内の発光タンパク質による発光位置を認識した後に、この位置でマーキングを行ない、この位置を細胞内の発光タンパク質による発光位置とし、次に、この部位についてディジタルズーム、あるいは光学ズームを行なって、所望部位の拡大画像を得ることとする（或いは、細胞内に導入された発光関連遺伝子による微弱発光を観察する微弱光測定装置において、微弱発光する生物発光タンパク質を含む細胞内の発光部分をその近傍に標識された蛍光物質が発する蛍光により同定し、これにより同定された発光部分の像を拡大し、拡大画像として生成させることとする）ことが出来る。
【発明の効果】
【００４６】
［Ｉ］本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）および／または対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置）を計測し、計測した焦点位置に基づいて試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定するので、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料内の発光部位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に対物レンズの焦点を合わせることができるという効果を奏する。【００４７】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、（１）試料へ光を照射し、（２）対物レンズの焦点位置を変更し、（３）変更した焦点位置を計測し、（４）変更した焦点位置にて、光が照射された試料を撮像し、（５）撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量を算出し、（６）（２）〜（５）を繰り返し実行し、（７）実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出し、（８）選出した焦点位置に基づいて、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定するので、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料内の発光部位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に対物レンズの焦点を合わせることができるという効果を奏する。【００４８】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、前記の（７）では、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置を選出し、前記の（８）では、選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置（略中央位置）を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができるという効果を奏する。【００４９】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、２つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）および対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置）であるので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易かつ簡便に決定することができるという効果を奏する。【００５０】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、前記の（７）では、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置を選出し、前記の（８）では、選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置をさらに容易に決定することができるという効果を奏する。【００５１】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、１つの焦点位置は、対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）または対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置）であるので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置をさらに容易かつ簡便に決定することができるという効果を奏する。【００５２】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、（９）前記の（８）で決定した焦点位置にて試料を撮像し、（１０）撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、（１１）前記の（８）で決定した焦点位置を変更し、（１２）変更した焦点位置にて試料を撮像し、（１３）撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、（１４）（１０）で算出した特徴量と（１３）で算出した特徴量とを比較し、（１５）比較した結果、（１３）で算出した特徴量の方が大きかった場合には、（１１）で変更した焦点位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定するので、試料を設置した時点だけでなく、試料の発光観察を開始してからも、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し続けることができ、その結果、対物レンズの焦点位置を常に当該観察対象部位に合わせることができるという効果を奏する。【００５３】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置によれば、試料は生体細胞または組織であるので、微弱光を発するものを試料として用いることができるという効果を奏する。【００５４】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、光照射手段（光源）を含む照明光学系の瞳位置に開口を配置したので、透過光と回折光との位相差を大きくすることができ、その結果、撮像画像のコントラストを高くすることができるという効果を奏する。【００５５】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、開口を光軸に対して偏芯させて配置したので、透過光と回折光との位相差をさらに大きくすることができ、その結果、撮像画像のコントラストをより高くすることができるという効果を奏する。【００５６】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、光照射手段（光源）を含む照明光学系に狭帯域通過フィルターを配置したので、光源から発せられた光を、波長帯域バンド幅の極めて狭い単色光とすることができ、その結果、撮像画像のコントラストを高くすることができるという効果を奏する。【００５７】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、光照射手段（光源）は単色の可視光を発するので、光源から発せられた光を試料に照射したときに、波長分散がほとんど無くなり、シャープな回折光を得ることができ、その結果、撮像画像のコントラストを高くすることができるという効果を奏する。【００５８】
また、本発明にかかる焦点位置決定装置によれば、試料へ励起光を照射する励起光照射手段（励起用光源）をさらに備えたので、試料の蛍光観察と発光観察とを同時に行うことができるという効果を奏する。【００５９】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、対物レンズの位置を移動させながら試料（具体的には、発光する物質を含む生物試料など）を撮像すると共に対物レンズの焦点位置を計測し、撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差であるコントラストを算出し、算出したコントラストおよび計測した対物レンズの焦点位置に基づいて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定するので、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、試料内の発光部位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に対物レンズの焦点を合わせることができるという効果を奏する。【００６０】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、コントラストは、画像を構成する各画素の画素値のうち最大値を含む複数の上位の画素値の平均値と、画像を構成する各画素の画素値のうち最小値を含む複数の下位の画素値の平均値との差であるので、撮像した画像に擬似信号（例えば反射光や散乱光などのノイズ光によるものなど）が入り込んでいても、当該画像から信頼性の高いコントラストを算出することができるという効果を奏する。【００６１】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、算出したコントラストを他のものと比較してその極小値を１つ探索し、探索した極小値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができるという効果を奏する。【００６２】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、算出したコントラストを他のものと比較してその極大値を２つ探索し、探索した各極大値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置の中間を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定するので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができるという効果を奏する。【００６３】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、対物レンズの位置を、その移動量を段階的に減らしながら移動させるので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を迅速に決定することができるという効果を奏する。【００６４】
また、本発明にかかる焦点位置決定方法によれば、対物レンズの位置を、その移動量を前回の移動量の半分に減らしながら移動させるので、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を迅速に決定することができるという効果を奏する。【００６５】
［ＩＩ］本発明によれば、低倍率の対物レンズで被験試料全体の画像を取得し、視野内の所望の発光部位を確認し、その部位のみのズームアップを行なうので、所望の発光部分に特化し、拡大された観察画像を得ることができる。なお、対物レンズの焦点位置決定方法、または焦点位置決定装置を用いて、対物レンズの焦点位置決定を行ない、被験試料の画像をデジタルズーム、または光学ズームを行なうことにより、焦点位置決定と画像描出、画像拡大を連続的に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、物点、光学系の入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示す図である。
【図２】図２は、対物レンズを移動させながらＣＣＤカメラで細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの各画素の出力信号の変化の仕方の一例、および当該変化の仕方に対応させて模式的に書いたシャーレの位置および細胞の位置を示す図である。
【図３】図３は、図２の位置αで細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布、および図２の位置βで細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布を示す図である。
【図４】図４は、２つの照明画像を撮像した時の対物レンズの光軸上での焦点位置および発光画像を撮像した時の対物レンズの光軸上での焦点位置に関する測定結果を示す図である。
【図５】図５は、対物レンズの焦点位置がシャーレの外側底面の位置に合った時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。
【図６】図６は、近点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示す図である。
【図７】図７は、図６の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。
【図８】図８は、中心点で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示す図である。
【図９】図９は、図８の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。
【図１０】図１０は、遠点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像と発光画像とを示す図である。
【図１１】図１１は、図１０の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。
【図１２】図１２は、第１実施形態の焦点位置決定装置１の基本構成を示す図である。
【図１３】図１３は、第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成の具体的一例を示す図である。
【図１４】図１４は、試料ステージ１７付近に配設された各部の構成の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、開口ユニット２４の構成および対物レンズ３０の瞳における開口の投影像の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、開口ユニット２４の別の構成および対物レンズ３０の瞳における開口の投影像の一例を示す図である。
【図１７】図１７は、第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成の別の具体的一例を示す図である。
【図１８】図１８は、第１実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、第１実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置再決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図２０】図２０は、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の具体的一例を示す図である。
【図２１】図２１は、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の別の具体的一例を示す図である。
【図２２】図２２は、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の別の具体的一例を示す図である。
【図２３】図２３は、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の照明画像および蛍光画像を示す図である。
【図２４】図２４は、プラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の照明画像および発光画像を示す図である。
【図２５】図２５は、選定した番号１のＨｅＬａ細胞からの発光強度の時間変化を示す図である。
【図２６】図２６は、対物レンズと試料との位置関係の一例を示す図である。
【図２７】図２７は、対物レンズの位置と画像のコントラストとの関係の一例を示す図である。
【図２８】図２８は、第３実施形態の焦点位置決定装置１'の構成を示すブロック図である。
【図２９】図２９は、第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図３０】図３０は、第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図３１】図３１は、画像を構成する各画素の受光強度の一例を示す図である。
【図３２】図３２は、画像を構成する各画素の受光強度の２次元分布の一例を示す図である。
【図３３】図３３は、画像を構成する各画素の受光強度の２次元分布の一例を示す図である。
【図３４】図３４は、第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図３５】図３５は、第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。
【図３６】図３６は、本発明の第１の実施形態に係わる光学系の構成を示した図である。
【図３７】図３７は、本発明の第１の実施形態に係わる試料容器近傍意の構成を示した図である。
【図３８】図３８は、本発明の第１の実施形態に係わるデジタルズームの動作を示したフローチャートである。
【図３９】図３９は、本発明の第１の実施形態に係わるデジタルズームの構成を示したブロック図である。
【図４０】図４０は、本発明の第１の実施形態に係わるデジタルズームの操作パネルの構成を示した図である。
【図４１】図４１は、本発明の第２の実施形態に係わる光学系の構成を示した図である。
【図４２】図４２は、本発明の第２の実施形態の変形例に係わる装置構成を示した図である。
【図４３】図４３は、本発明の第２の実施形態に係わるズーム動作を示したフローチャートである。
【符号の説明】
【００６７】
１  焦点位置決定装置
１０  試料（生体細胞）
１０ａ  観察対象部位
２０  光照射部（光源）
３０  対物レンズ
４０  焦点位置変更部（対物レンズｚ軸移動機構）
５０  焦点位置計測部
６０  試料撮像部（ＣＣＤカメラ）
７０  情報処理装置（パーソナルコンピュータ）
７０ａ  制御部
７０ａ１  特徴量算出部
７０ａ２  焦点位置選出部
７０ａ３  焦点位置決定部
７０ａ４  特徴量比較部
７０ａ５  焦点位置再決定部
７０ｂ  記憶部
７０ｂ１  撮像画像データベース
７０ｂ２  焦点位置管理ファイル
８０  励起光照射部（励起用光源）
１'  焦点位置決定装置
１０'  試料（生体細胞）
１０'ａ  観察対象部位
２０'  光照射部（光源）
３０'  対物レンズ
４０'  対物レンズ移動部
５０'  対物レンズ位置計測部
６０'  試料撮像部（ＣＣＤカメラ）
７０'  情報処理装置（パーソナルコンピュータ）
７０'ａ  制御部
７０'ａ１  コントラスト算出部
７０'ａ２  焦点位置決定部
７０'ｂ  記憶部
７０'ｂ１  画像等ファイル
７０'ｂ２  決定位置管理ファイル
Ａ１      照明光学系
Ａ３      試料ステージ
Ａ２      光源
Ａ４      被験試料
Ａ５      観察光学系
Ａ８      ＣＣＤカメラ
Ａ９      対物レンズＺ軸駆動機構
Ａ１５      対物レンズ
Ａ１９      結像面
Ａ２１      試料容器
Ａ２２      水槽
Ａ２７      ヒートプレート
Ａ３０      フタ付き密閉容器
Ａ３４      デジタルズーム回路
Ａ３５      ＣＰＵ
Ａ３７      ＴＶモニタ
Ａ３８      記録再生制御回路
Ａ４０      操作パネル
Ａ５１      コリメートレンズ
Ａ５３      切り替式ダイクロイックミラー
Ａ５４      遮光ボックス
Ａ６１      励起光源
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
［Ｉ］以下に、本発明にかかる焦点位置決定方法および焦点位置決定装置の実施の形態（第１実施形態、第２実施形態および第３実施形態）を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。【００６９】
［第１実施形態］
［１．本発明の基本原理］
まず、本発明の基本原理について図を参照して詳細に説明する。本発明は、基準となる対物レンズの焦点位置を決定し、決定した焦点位置を基準として対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）および／または対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置）を計測し、計測した焦点位置に基づいて試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し、決定した焦点位置に対物レンズの焦点位置を合わせる（移動する）。【００７０】
具体的には、本発明は、（１）試料へ光を照射し、（２）例えば試料の位置および／または対物レンズの位置を光軸方向に移動および／または対物レンズの焦点距離を変更（この場合は可変焦点レンズを採用する。）することで、対物レンズの焦点位置を例えば一定量だけ変更し、（３）変更した焦点位置を計測し、（４）変更した焦点位置にて、光が照射された試料を、ＣＣＤカメラを用いて撮像し、（５）撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量（例えば、撮像画像のコントラスト、撮像画像の輝度の積分値、撮像画像の輝度分布から得られる統計量、撮像画像における所定の閾値を超えた輝度を有する画素数と全画素数との比など）を算出し、（６）（２）〜（５）を繰り返し実行し、（７）実行して蓄積した複数の焦点位置（対物レンズの焦点位置を表す光軸上の座標値）から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置（具体的には対物レンズの近点側の焦点位置および／または対物レンズの遠点側の焦点位置）を選出し、（８）選出した焦点位置に基づいて、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定し、（９）例えば試料の位置および／または対物レンズの位置を光軸方向に移動および／または対物レンズの焦点距離を変更（この場合は可変焦点レンズを採用する。）することで、決定した焦点位置に対物レンズの焦点位置を合わせる（移動する）。【００７１】
ここで、本発明は、前記の（７）において、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、２つの焦点位置（具体的には対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）および対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置））を選出し、前記の（８）において、選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央位置（略中央位置）を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。【００７２】
また、本発明は、前記の（７）において、実行して蓄積した複数の焦点位置から、実行して蓄積した複数の特徴量に基づいて、１つの焦点位置（具体的には対物レンズの近点側の焦点位置（略焦点位置）または対物レンズの遠点側の焦点位置（略焦点位置））を選出し、前記の（８）において、選出した１つの焦点位置および予め定めた距離に基づいて、当該焦点位置から当該距離だけ離れた位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。【００７３】
また、本発明は、（１０）前記の（８）で決定した焦点位置にて、試料の発光画像をＣＣＤカメラを用いて撮像し、（１１）撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、（１２）前記の（８）で決定した焦点位置を変更し、（１３）変更した焦点位置にて試料の発光画像をＣＣＤカメラを用いて撮像し、（１４）撮像した撮像画像に基づいて特徴量を算出し、（１５）（１１）で算出した特徴量と（１４）で算出した特徴量とを比較し、（１６）比較した結果、前記の（１４）で算出した特徴量の方が大きかった場合には、（１２）で変更した焦点位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として再度決定してもよい。【００７４】
また、本発明は、前記の（１）で用いる光源を含む照明光学系の瞳位置に開口を例えば光軸に対して偏芯させて配置してもよく、また、前記の（１）で用いる光源を含む照明光学系に狭帯域通過フィルターを配置してもよい。また、本発明は、前記の（１）で用いる光源として、単色の可視光を発するものを用いてもよい。また、本発明は、試料として、生体細胞や組織などを用いてもよい。【００７５】
ここで、試料として生体細胞を用いた場合を一例として、生体細胞の位相分布に比例したコントラストを撮像画像（照明光による画像）に発生させる原理について、図１を参照して説明する。図１は、物点、光学系の入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示す図である。【００７６】
合焦位置に生体細胞（物体）を配置してから物体へ光を照射すると、図１に示すように、物点から出た光は実線で示したように球面状に広がって入射瞳に入射し、入射瞳に入射した光は射出瞳から射出し、射出瞳から射出した光は実線で示したように球面状の収束光となって結像面に集光することで、最終的に物体の像が形成される。なお、像が形成されるまでの過程で、光学系を通過する各光線の間に光路差（位相差）は生じず、像にボケは現れない。次に、物点を点線に示す位置に移動してから物体へ光を照射すると、図１に示すように、物点から出た光は点線で示したように球面状に広がって入射瞳に入射し、入射瞳に入射した光は射出瞳から射出し、射出瞳から射出した光は点線で示したように球面状の収束光となって移動後の結像面に集光することで、最終的に物体の像が形成される。以上より、移動後の結像面位置を観察点として物体を観察すれば光学系を通過する各光線の間に光路差（位相差）は生じないが、当初の結像面位置を観察点として物体を観察すると各光線の間に光路差（位相差）が生ずる。【００７７】
また、生体細胞は、通常、光学的に位相物体として取り扱うことができる。生体細胞は、通常、ほぼ同じような形状となっている。ゆえに、例えばシャーレ内に分布している培養生体細胞へ照明光を入射すると、生体細胞が回折格子のような役割を演じて、生体細胞の形状に依存して特有の方向に照射光が回折し、回折光が観察される。すなわち、シャーレ内の細胞へ特定の方向から照明光を入射すると、細胞に因り入射光に回折が起こり、入射光の方向に０次回折光（透過光）が発生し、更に透過光に対し特定の角度の方向に１次回折光が発生する。【００７８】
以上より、生体細胞を光学系の合焦位置からずらした位置に配置して光学系を透過する各光線の間に位相差を生じさせることができる。また、観察光学系の合焦位置から前後に外れた位置で生体細胞を観察することにより、生体細胞を透過した光と生体細胞で回折した光との間に、合焦位置からのずれ量（デフォーカス量）に応じた位相差を生じさせることができる。具体的には、対物レンズの焦点位置が通常の観察における合焦位置とされている位置に合うように対物レンズを光軸に沿って移動させ、当該移動させた位置から対物レンズをさらに微小量だけ移動させることで、観察光学系の透過する各光線の間に、移動量に比例した位相差を生じさせることができる。なお、この位相差は、対物レンズの最大ＮＡを通過する光線で最大となる。また、この時、偏射照明により、回折光の一部は対物レンズのＮＡ外に回折されて、観察光学系を透過しなくなるので、屈折光の場合と同様、レリーフ感のあるコントラストの像を形成することができる。【００７９】
つまり、これらの現象を利用して、生体細胞の鮮明な、照明光による画像（照明画像）を得ることができ、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡と同じような観察を行うことができる。また、結果として、生じた位相差量が位相差観察法で用いている位相膜と等価な機能を果たし、生体細胞の位相分布に比例したコントラストを観察画像に与えることができ、無色透明な生体細胞を高いコントラストで観察することができるようになる。【００８０】
なお、より高いコントラストで生体細胞を観察する場合、観察光学系の倍率を低くすれば、観察光学系を通過する回折光の角度が制限されるので、観察画像のコントラストを高くすることができる。【００８１】
また、生体細胞などの位相物体を観察する場合、位相物体の位相分布に比例したコントラストは、位相物体の位相量および透過光と回折光との間に与える位相差量に比例する。また、透過光と回折光との間の角度は位相物体の形状に依存して変わる。さらに、透過光と回折光との間の角度が変わると、同じデフォーカス量でも２つの光束の間に発生する位相差量が異なってくる。そこで、顕微鏡の照明光学系の瞳位置で開口を照明光学系の光軸に対して偏芯させて配置することにより、物体に対し特定の角度で照射する照明光を生成することができる。そして、開口を偏芯させている分、物体への入射光の方向に透過する透過光より角度を持たせた回折光を、光学系の入射瞳に入射させることができるので、透過光と回折光との位相差をさらに大きくすることができる。換言すると、開口を照明光学系の光軸から偏芯させて配置することにより、透過光より回折光にさらに角度を持たせることができるので、透過光と回折光との位相差をより大きくすることができる（特開２００４−３５４６５０号公報参照）。つまり、これらの方法で透過光と回折光との位相差を大きくすれば、観察画像のコントラストをより高くすることができる。【００８２】
また、デフォーカスによって生じる各光線間の位相差については、物体が観察光学系の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合とで、その符号が変わる。ゆえに、デフォーカスにより、物体の高コントラスト画像を光軸上の２箇所で得ることができる。また、画像のコントラストについては、培養細胞等の位相物体を観察光学系の合焦位置から近点側にずらして観察した画像と遠点側にずらして観察した画像とで、当該位相物体の位相分布に相当して反転する。また、シャーレの底面に付着したゴミ等からの光を吸収する物体は位相物体ではなくなるので、デフォーカスによって当該物体に位相差を与えても画像のコントラストに変化は生じない。従って、デフォーカスによって、位相物体とそうでない物体との区別を明確に行なうことができる。そこで、近点側にずらして撮像した画像および遠点側にずらして撮像した画像に対して画像間演算を行うことにより、デフォーカスによって与えられる位相差に影響されない画像成分を分離することができる。特に、２つの画像の各画素間で差演算を行なうことにより、物体の位相分布に相当する画像成分のコントラストを２倍にすることができるので、ゴミや異物、照明ムラなどの位相情報をもたない画像成分を無くすことができる。つまり、これらの方法で観察画像のコントラストをより高くすることができる。【００８３】
つぎに、対物レンズを移動させながらＣＣＤカメラで生体細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの各画素からの出力信号（各画素が捉えた光の光強度に対応したディジタル信号）の変化の仕方の一例、および当該出力信号の変化の仕方に基づく生体細胞内の特定の部位（観察対象部位）に合うような対物レンズの焦点位置の決定の仕方の一例について、図２や図３を参照して説明する。試料容器（シャーレ）に入れられた培養液に生体細胞を浸した状態で、生体細胞へ照明光を照射し、対物レンズを光軸（ｚ軸）に沿ってシャーレの下側から上側へ移動させながらＣＣＤカメラで生体細胞を撮像すると、ＣＣＤカメラの全画素からの出力信号（光強度、光検出信号）の積分値と対物レンズの焦点位置（ｚ軸上の座標）との関係は、図２の（Ａ）のようになる。また、シャーレの位置および生体細胞の位置を図２の（Ａ）と対応させて模式的に書くと、図２の（Ｂ）のようになる。【００８４】
具体的には、対物レンズを光軸に沿って上側へ移動させていくと、ＣＣＤカメラの全画素からの光強度の積分値は、まず、照射光が強く反射する試料容器の外側底面の位置で極大且つ最大となる。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、ＣＣＤカメラの全画素からの光強度の積分値は序々に低下し、試料容器の内側底面の位置で再び極大となる。なお、試料容器の内側底面の位置での積分値は、試料容器の内側底面とそれに接する培養液との屈折率差が試料容器の外側底面と空気の接触面との屈折率差に比べて小さいので、試料容器の外側底面の位置での積分値に比べて小さい。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、ＣＣＤカメラの全画素からの光強度の積分値は急激に低下し、図２の（Ａ）で示す位置αで再び極大となる。当該位置αが、デフォーカスに因る高いコントラストの撮像画像が得られるｚ軸上の位置である。また、当該位置αでは、生体細胞のほぼ下側の淵の部分（下側辺縁部）に対物レンズの焦点が合っている。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、ＣＣＤカメラの全画素からの光強度の積分値は低下し、図２の（Ａ）で示す位置βで極小となる。当該位置βでは、生体細胞のほぼ中央の位置に対物レンズの焦点が合っている。そして、対物レンズを光軸に沿って更に上側へ移動させていくと、ＣＣＤカメラの全画素からの光強度の積分値は増加し、図２の（Ａ）で示す位置γで再び極大となる。当該位置γも、デフォーカスに因る高いコントラストの撮像画像が得られるｚ軸上の位置である。当該位置γでは、生体細胞のほぼ上側の淵の部分（上側辺縁部）に対物レンズの焦点が合っている。【００８５】
つまり、図２の（Ａ）で示す位置αから位置γまでの領域（位置βを含む）では、生体細胞の内部に対物レンズの焦点が合っているので、当該位置αおよび当該位置γに基づいて生体細胞内の特定の部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができる。また、位置βを生体細胞内の所定の部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。【００８６】
ここで、図２の（Ａ）で示す位置αで生体細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの各画素からの出力信号（各画素がとらえた光の光強度に対応したディジタル信号）および図２の（Ａ）で示す位置βで生体細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの各画素からの出力信号から、予め定めた閾値を越えた出力信号のみを有効な出力信号としてそれぞれ選択し、選択したそれぞれの出力信号の強度分布を求めた（図３参照）。図３は、図２の（Ａ）で示す位置αで生体細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布（図３の（Ａ））、および図２の（Ａ）で示す位置βで生体細胞を撮像した時のＣＣＤカメラの特定の画素列に含まれる各画素の光強度の分布（細胞の内部の中央付近での出力信号の強度分布：図３の（Ｂ））を示す図である。なお、図３において点線は閾値を示す。図３に示す強度分布を統計処理することで、高いコントラストの画像が得られる対物レンズの焦点位置を決定することができる。さらに、図３で示す閾値より高い閾値を超えた光強度の画素の数の計算、および計算した画素の数の全画素数に対する割合（計算した画素数÷全画素数）の算出を、対物レンズの焦点位置を光軸上で動かしながら実行し、この割合が最も高かった時の対物レンズの焦点位置を最も高いコントラストの画像が得られる対物レンズの焦点位置として決定してもよい。【００８７】
つぎに、高いコントラストの２つの画像（照明画像）を撮像した時の対物レンズの焦点位置に基づいて決定した対物レンズの焦点位置が、生体細胞内の中心部位（例えば発光する部位）にどの程度合っているかを、細胞の発光画像を実際に撮像して確認した。なお、ここで用いた生体細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖｅｃｔｏｒ：プロメガ社）を、１ｍＭのルシフェリンを添加して導入したＨｅＬａ細胞である。なお、発光画像は、当該ＨｅＬａ細胞を室温で１分間露出してから撮像したものである。【００８８】
まず、対物レンズを光軸に沿って移動させながらＨｅＬａ細胞を照明光源で照明しながら撮像し、対物レンズの遠点側で撮像した、コントラストの最も高い撮像画像（照明画像）と、対物レンズの近点側で撮像した、コントラストの最も高い撮像画像（照明画像）とを選出した。一方、対物レンズを光軸に沿って移動させながら照明を行わずにＨｅＬａ細胞を撮像し、コントラストの最も高い撮像画像（発光画像）を選出した。そして、選出した２つの照明画像を撮像した時の対物レンズ（２０倍、４０倍）の光軸上での焦点位置と、選出した発光画像を撮像した時の対物レンズ（２０倍、４０倍）の光軸上での焦点位置とを計測した。計測結果を図４に示す。なお、計測した焦点位置は、図５に示すように、対物レンズの焦点位置が試料容器（シャーレ）の外側底面の位置に合った時の対物レンズの光軸上での位置（基準位置）からの距離と同じである。【００８９】
図４に示すように、選出した発光画像（図８の（Ｂ））を撮像した時の対物レンズの焦点位置（図４で示す「中心点」の欄に記載の１０．５０７、１０．５０６：図９で示す“Ｚｂ”）は、遠点側に対応する照明画像（図１０の（Ａ））を撮像した時の対物レンズの焦点位置（図４で示す「遠点側」の欄に記載の１０．５１２、１０．５９０：図１１で示す“Ｚａ”）および近点側に対応する照明画像（図６の（Ａ））を撮像した時の対物レンズの焦点位置（図４で示す「近点側」の欄に記載の１０．５００、１０．５０３：図７で示す“Ｚｃ”）の略中央であった。これにより、選出した２つの照明画像（図６の（Ａ）および図１０の（Ａ））を撮像した時の対物レンズの焦点位置（図７で示す“Ｚｃ”および図１１で示す“Ｚａ”）に基づいて決定した対物レンズの焦点位置が、細胞内の略中央部位（例えば発光する部位）に合っていることが確認できた。つまり、上述した計算により、細胞内の略中央部位（例えば発光する部位）に対物レンズの焦点位置をあわせることができた。なお、図６は、近点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像（Ａ）と発光画像（Ｂ）とを示す図である。図７は、図６の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。図８は、中心点で撮像した最も高いコントラストの照明画像（Ａ）と発光画像（Ｂ）とを示す図である。図９は、図８の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。図１０は、遠点側で撮像した最も高いコントラストの照明画像（Ａ）と発光画像（Ｂ）とを示す図である。図１１は、図１０の画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を模式的に示す図である。【００９０】
これにて、本発明の基本原理の説明を終了する。【００９１】
［２．装置構成］
つぎに、本発明にかかる第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成について、図１２から図１７を参照して詳細に説明する。まず、第１実施形態の焦点位置決定装置１の基本構成について、図１２を参照して説明する。図１２は、第１実施形態の焦点位置決定装置１の基本構成を示す図である。焦点位置決定装置１は、発光観察を行う際、生体細胞や組織などの試料１０を設置した時点で、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定する。焦点位置決定装置１は、図１２に示すように、光照射部２０と、対物レンズ３０と、焦点位置変更部４０と、焦点位置計測部５０と、試料撮像部６０と、情報処理装置７０と、で構成されている。【００９２】
光照射部（光源）２０は試料１０へ光を照射する。光照射部２０は、可視光領域の波長の光（可視光）を発するインコヒーレント光源であり、具体的にはハロゲンランプ、ＬＥＤ、タングステンランプ、水銀ランプなどである。なお、光照射部２０としてレーザーなどのコヒーレント光源を用いてもよい。ただし、この場合、コヒーレント光源から発せられる光（レーザー光など）は、拡散板などを用いてインコヒーレントな光に変えてから試料１０へ照射される。また、光照射部２０として赤外光を発する光源を用いてもよい。この場合、赤外光による焦点決定は照明を行わない状態を維持したままで行えるので、自家蛍光による画像ノイズの発生を防止することができると共に可視光よりも鮮明な物体情報を得ることができる。つまり、赤外光による焦点決定には当該焦点決定を精密に行えるという利点がある。また、検出しようとする微弱光と波長が一部重複する光又は当該微弱光と波長が同一の光であっても、当該微弱光に対して有意に強い光強度で且つ短時間（例えば０．５秒以内）に検出可能な光であれば、焦点決定用の照射光として用いてもよい。【００９３】
対物レンズ３０は試料１０の像を形成するためのものである。なお、対物レンズ３０として可変焦点レンズを用いてもよい。【００９４】
焦点位置変更部４０は、具体的には試料１０の位置および／または対物レンズ３０の位置を光軸方向に移動および／または対物レンズ３０の焦点距離を変更することで、対物レンズ３０の焦点位置を変更する。【００９５】
焦点位置計測部５０は、焦点位置変更部４０と接続され、例えば試料１０の光軸上での位置、対物レンズ３０の光軸上での位置、対物レンズ３０の焦点距離のうち少なくとも１つに基づいて、対物レンズ３０の焦点位置を計測する。【００９６】
試料撮像部６０は試料１０を撮像する。試料撮像部６０は、具体的には撮像素子を有する高感度のＣＣＤカメラである。【００９７】
情報処理装置７０は、具体的には市販のパーソナルコンピュータであり、焦点位置変更部４０、焦点位置計測部５０および試料撮像部６０と接続されている。情報処理装置７０は、制御部７０ａと記憶部７０ｂとを備えている。制御部７０ａは、当該制御部７０ａを統括的に制御するＣＰＵ等であり、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラムおよび所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行するための情報処理を行う。【００９８】
制御部７０ａは、焦点位置変更部４０、焦点位置計測部５０、試料撮像部６０、後述する特徴量算出部７０ａ１を繰り返し実行するよう、これら各部を制御したり、当該制御部７０ａが備える各部を制御したりする。また、キーボードやマウスなどの入力装置やＴＶモニタなどの出力装置が当該情報処理装置７０と接続されている場合には、制御部７０ａは、入力装置で入力された情報を取得したり、出力装置へ情報を出力したりする。制御部７０ａは、特徴量算出部７０ａ１と、焦点位置選出部７０ａ２と、焦点位置決定部７０ａ３と、特徴量比較部７０ａ４と、焦点位置再決定部７０ａ５と、で構成されている。特徴量算出部７０ａ１は、試料撮像部６０で撮像した撮像画像に基づいて撮像画像を特徴付ける特徴量（例えば、撮像画像のコントラスト、撮像画像の輝度の積分値、撮像画像の輝度分布から得られる統計量、撮像画像における所定の閾値を超えた輝度を有する画素数と全画素数との比など）を算出する。焦点位置選出部７０ａ２は、制御部７０ａで各部（具体的には、焦点位置変更部４０、焦点位置計測部５０、試料撮像部６０、特徴量算出部７０ａ１）を繰り返し実行させたことにより蓄積した複数の焦点位置（焦点位置計測部５０で計測した焦点位置）から、繰り返し実行させたことにより蓄積した特徴量に基づいて、少なくとも１つの焦点位置を選出する。焦点位置決定部７０ａ３は、焦点位置選出部７０ａ２で選出した焦点位置に基づいて、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置を決定する。特徴量比較部７０ａ４は、特徴量算出部７０ａ１で予め個別に算出した２つの特徴量の大小を比較する。焦点位置再決定部７０ａ５は、特徴量比較部７０ａ４で比較した結果に基づいて試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置を再度決定する。【００９９】
記憶部７０ｂは、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。記憶部７０ｂは、図示の如く、撮像画像データベース７０ｂ１と焦点位置管理ファイル７０ｂ２とを格納する。撮像画像データベース７０ｂ１は、撮像画像を一意に識別するための画像識別情報と、撮像画像と、当該撮像画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置と、当該撮像画像の特徴量と、を相互に関連付けて格納する。焦点位置管理ファイル７０ｂ２は、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置（具体的には焦点位置決定部７０ａ３で決定した焦点位置や焦点位置再決定部７０ａ５で再度決定した焦点位置）を格納する。ここで、撮像画像には、照明画像、発光画像、蛍光画像が含まれる。【０１００】
つぎに、第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成の具体的一例について、図１３を参照して説明する。なお、上述した説明と重複するものについては、その説明を省略する場合がある。図１３は、第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成の具体的一例を示す図である。図１３に示す焦点位置決定装置１は、倒立型顕微鏡をベースとする構成であり、図１２に示す焦点位置決定装置１と同様、微弱光を発する生体細胞の発光観察を行うために用いるものである。図１３に示す焦点位置決定装置１は、上述した各部（光照射部２０、対物レンズ３０、焦点位置変更部４０、焦点位置計測部５０、試料撮像部６０、情報処理装置７０）に加えて、さらに、照明光学系、観察光学系、接眼レンズ４３などを備えて構成されている。以下、当該焦点位置決定装置１を構成する各部を詳細に説明する。【０１０１】
試料１０は、試料容器１１に入れた培養液に浸されている。【０１０２】
試料容器１１は、具体的にはシャーレであり、少なくともその底面が光学的に透明なもの（通常の対物レンズで対応できるようなもの）である。なお、当該底面は、具体的には顕微鏡用のカバーガラスと同じ素材で厚さが０．１７ｍｍのものである。ここで、試料容器１１として、シャーレの他、スライドガラス、マイクロプレートなどを用いてもよい。また、試料容器１１に対して、図１４に示すように、フタ１８を配設してもよい。再び図１３に戻り、試料容器１１は、ノズル１３を通して供給された純水が張られた水槽１２内に配置されている。なお、当該純水は、試料容器１１内の湿度を保つことを目的として水槽１２内に入れられている。【０１０３】
水槽１２には、ガスボンベ１４から排出された混合ガス（二酸化炭素（ＣＯ2）を５％、酸素（Ｏ2）を９５％含むガス）が、ガス供給チューブ１５を通して、図示の如く水槽１２の上方から、５０ｍＬ／ｍｉｎの流速で供給されている。なお、水槽１２の形状は、図１４に示すような、試料容器１１全体を覆い隠す形状でもよい。この場合、水槽１２の上部には着脱可能なフタ１９が配設される。再び図１３に戻り、水槽１２はヒートプレート１６の上に配置されている。【０１０４】
ヒートプレート１６は環境温度の設定を行うものであり試料ステージ１７の上に配置されている。なお、ヒートプレート１６は、当該ヒートプレート１６と接続された温度コントローラー（図示せず）の制御により、環境温度の設定を０．５℃間隔で行うことができる。【０１０５】
試料ステージ１７は、試料１０などを設置するための板状のものであり、図示の如く光軸（ｚ軸）に直交するように配設されている。試料ステージ１７は、互いに直交する向き（９０°方向）で当該ステージの所定の位置に取り付けられた２個のステッピング・モーター（図示せず）の駆動力に因り、当該ステージが配設された位置から光軸（ｚ軸）に直交する方向（例えばｘ方向やｙ方向）に移動可能である。なお、各ステッピング・モーターは、当該各モーターと接続された試料ステージコントローラー（図示せず）で制御される。また、試料ステージコントローラーは、情報処理装置７０と接続されており、情報処理装置７０からの指令に基づいて各ステッピング・モーターを適宜駆動し、試料ステージ１７を移動する。【０１０６】
照明光学系は、光源２０から発せられた照明光を試料１０へ導くためのものであり、コレクターレンズ２１と、照明光の光軸を偏向する偏向ミラー２２と、光源２０の像を投影するコンデンサーレンズ２３と、で構成されている。【０１０７】
ここで、コンデンサーレンズ２３の瞳位置には、図１５の（Ａ）に示す開口ユニット２４が着脱自在に配設されている。図１５は、開口ユニット２４の構成および対物レンズ３０の瞳における開口の投影像の一例を示す図である。開口ユニット２４は、部分輪帯の開口２４ａと遮光性を有する遮光板２４ｂとで構成されている。開口２４ａは、瞳の中心に対して偏芯した状態になるように光軸に対して配設され、自在に横ずれを起こすことができる構成となっている。開口２４ａの開口径は、当該開口２４ａの投影像が図１５の（Ｂ）に示すように対物レンズ３０の瞳の外周部分にほぼ内接するように決める。開口２４ａの幅（図１５の（Ａ）に示す“Ｒｏ−Ｒｉ”）は、共役関係にある対物レンズ３０の瞳半径の３分の１以下であることが望ましい。これにより、観察する生体細胞の種類によって対物レンズ３０の移動量を適宜設定することで、最良のコントラストの像を得ることができる。【０１０８】
なお、開口ユニット２４は、図１６の（Ａ）に示すように、矩形の開口２４ａを備えたものでもよい。図１６は、開口ユニット２４の別の構成および対物レンズ３０の瞳における開口の投影像の一例を示す図である。当該矩形の開口２４ａは、瞳の中心位置から所定の距離だけ離れた位置に、瞳の中心に対して偏芯した状態で配設されている。当該矩形の開口２４ａを備えた開口ユニット２４を用いて試料１０を偏射照明することで、対物レンズ３０の瞳に開口２４ａの像を投影させる。また、矩形の開口２４ａは瞳の中心に対して同心円状に配設されてないので、例えば観察する生体細胞が細長い場合において高いコントラストの像を得ることができる。ここで、偏射照明光は、立体的な大きさをもった生体細胞に入射され、透過光、屈折光および回折光に分離されて生体細胞から射出される。生体細胞内において、球や楕円体に近い形状の輪郭である部分からは屈折光が多くなり、扁平な部分からは透過光と回折光が多くなる。細胞内の、球や楕円体に近い形状である部分で屈折した屈折光の一部は、対物レンズ３０のＮＡより大きくなるので、対物レンズ３０には取り込まれない。【０１０９】
また、図１７に示すように、偏向ミラー２２の下側に、光源２０を準単色とするための干渉フィルター２５を配設してもよい。これにより、光源２０から発せられた照明光は偏向ミラー２２で進行方向が偏向され、偏向された照明光は、干渉フィルター２５を通ることで波長帯域バンド幅の極めて狭い単色光となって、コンデンサーレンズ２３へ向かう。なお、干渉フィルターに限らず、狭帯域バンドパス・フィルターを用いてもよい。【０１１０】
再び図１３に戻り、観察光学系は、試料１０の像を形成するためのものであり、試料ステージ１７の下方に倒立に配置されている。観察光学系は、対物レンズ３０以外に、対物レンズ３０で形成された像（試料１０の像）を結像面に結像させるリレーレンズ３１と、対物レンズ３０からの光を偏向する偏向ミラー３２と、リレーレンズ３１と共に対物レンズ３０で形成された像（試料１０の像）を結像面に結像させるリレーレンズ３３と、で構成されている。【０１１１】
焦点位置変更部４０は、具体的には、ラックピニオン機構（図示せず）で対物レンズ３０を光軸方向（ｚ軸方向）に移動（駆動）させる対物レンズｚ軸移動（駆動）機構である。ラックピニオン機構に含まれるノブは、コンピュータ制御されたステッピング・モーター（図示せず）で回転させる。なお、対物レンズｚ軸移動機構は、ラックピニオン機構の他、フリクションローラー機構で対物レンズ３０を光軸方向に移動させてもよい。また、焦点位置変更部４０は、対物レンズ３０を光軸に沿って移動させる構成の他、試料ステージ１７を光軸に沿って移動させる構成でもよい。対物レンズｚ軸移動機構には、図示の如く、対物レンズヒーター４１が備えられている。【０１１２】
対物レンズヒーター４１は、図示の如く、対物レンズ３０に接触して対物レンズ３０の周囲に取り付けられている。対物レンズヒーター４１は、当該対物レンズヒーター４１と接続された温度調節装置（図示せず）により制御されている。対物レンズヒーター４１は、対物レンズ３０の外側から対物レンズ３０の温度設定を０．５℃間隔で行うことで、対物レンズ３０の温度を一定に保っている。【０１１３】
接眼レンズ４３は、試料１０の像を拡大するものであり、観察者に試料１０の像を目視で観察させるためのものである。【０１１４】
切替ミラー４４は、図示の如く、接眼レンズ４３とリレーレンズ３３との間に配設されている。これにより、接眼レンズ４３による試料１０の目視での観察と、試料撮像部６０による試料１０の観察とを、任意に切り替えることができる。なお、切替ミラー４４として、機械的に２つの光路を切り替える形式のものの他、ハーフミラーを用いて２つの光路を分離する形式のものを用いてもよい。【０１１５】
赤外線カットフィルター４５は、図示の如く試料撮像部６０の受光面の上方に着脱自在に配設され、背景光となる赤外線を遮断する。換言すると、赤外線カットフィルター４５は、背景光となる赤外線が試料撮像部６０に入射するのを必要に応じて防ぐ。【０１１６】
試料撮像部６０は、具体的には、その受光面に撮像素子６０ａを有するＣＣＤカメラである。当該撮像素子６０ａの画素数は１３６０×１０２４である。当該ＣＣＤカメラには、試料１０から発せられた微弱光を検出することができるよう、できるだけ高感度のものを用いる。ここで、ＣＣＤカメラとして、カラーの明視野像を撮像するために、３板式カラーカメラを用いてもよい。また、試料撮像部６０は、ＣＣＤカメラに限定することなく、例えばＣＭＯＳイメージセンサーやＳＩＴカメラなどを用いてもよい。試料撮像部６０は、情報処理装置７０（当該情報処理装置７０と接続されたＴＶモニタ）と信号ケーブルを介して接続されている。試料撮像部６０の底部には、ＣＣＤカメラから発する暗電流を抑えるために、冷却装置６１が配設されている。【０１１７】
冷却装置６１は、ペルチェ素子から成るものであり、試料撮像部６０の温度を０℃程度に冷却して保温する。【０１１８】
情報処理装置７０は、入出力装置（ＴＶモニタ、キーボード、マウスなど）をさらに備えている。情報処理装置７０は、試料撮像部６０で撮像した撮像画像をＴＶモニタに描出する。【０１１９】
以上、図１３に示す焦点位置決定装置１では、まず、光照射部２０から発せられた光はコレクターレンズ２１で平行光にされ、この平行光がコンデンサーレンズ２３の瞳位置に投影される。そして、光照射部２０から発せられた光の像は、コンデンサーレンズ２３によりケーラー照明として試料１０を照明する。つぎに、試料１０を照明した光は、試料１０を透過して、対物レンズ３０に入射する。つぎに、対物レンズ３０に入射した光（測定光）は、対物レンズ３０、リレーレンズ３１およびリレーレンズ３２により結像面に試料１０の像を形成する。そして、結像面に形成された試料１０の像は、接眼レンズ４３にそのまま入射すると共に、切替ミラー４４によりＣＣＤカメラ６０の撮像素子６０ａ上に結像する。【０１２０】
これにて、第１実施形態の焦点位置決定装置１の構成の説明を終了する。【０１２１】
［３．焦点位置決定装置１の処理］
つぎに、第１実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置決定処理について図１８を参照して説明する。図１８は、第１実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置決定処理の一例を示すフローチャートである。なお、ここでは、生体細胞の発光観察を図１３に示す焦点位置決定装置１を用いて行う場合における焦点位置決定処理について説明する。【０１２２】
観察者が、試料１０である生体細胞を入れた試料容器１１を試料ステージ１７上に設置し、焦点位置決定装置１および光源２０を起動させると、焦点位置決定装置１は以下の処理を行う。【０１２３】
まず、焦点位置決定装置１は、光源２０から発せられた照明光を、生体細胞へ照射する（ステップＳＡ−１）。【０１２４】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより焦点位置変更部４０である対物レンズｚ軸移動機構を動作させ、対物レンズｚ軸移動機構により対物レンズ３０を初期位置から光軸に沿って一定量だけ移動させることで、対物レンズ３０の焦点位置を変更する（ステップＳＡ−２）。【０１２５】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより焦点位置計測部５０を動作させ、焦点位置計測部５０により対物レンズ３０の焦点位置を計測する（ステップＳＡ−３）。【０１２６】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより試料撮像部６０であるＣＣＤカメラを動作させ、ＣＣＤカメラにより生体細胞を撮像する（ステップＳＡ−４）。【０１２７】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより特徴量算出部７０ａ１を動作させ、特徴量算出部７０ａ１により、ステップＳＡ−４で撮像した撮像画像に基づいて当該撮像画像のコントラストを算出する（ステップＳＡ−５）。【０１２８】
ここで、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより、ステップＳＡ−３で計測した焦点位置、ステップＳＡ−４で撮像した撮像画像およびステップＳＡ−５で算出したコントラストを、相互に関連付けて、記憶部７０ｂの撮像画像データベース７０ｂ１に格納する。【０１２９】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより、ステップＳＡ−２からステップＳＡ−５を、ステップＳＡ−２で変更した対物レンズ３０の焦点位置が光軸上の予め定められた位置を越えるまで、繰り返し実行する（ステップＳＡ−６）。【０１３０】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより、焦点位置選出部７０ａ２を動作させ、焦点位置選出部７０ａ２により、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数のコントラストのうち極大となる２つのコントラストを選出し、選出したコントラストと対応付けられて撮像画像データベース７０ｂ１に格納されている焦点位置を取得する（ステップＳＡ−７）。換言すると、焦点位置決定装置１は、焦点位置選出部７０ａ２により、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の焦点位置から、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の特徴量に基づいて、対物レンズ３０の近点側の焦点位置（略焦点位置）および対物レンズ３０の遠点側の焦点位置（略焦点位置）を選出する。【０１３１】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより、焦点位置決定部７０ａ３を動作させ、焦点位置決定部７０ａ３により、ステップＳＡ−７で選出した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央の位置（略中央の位置）を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定する（ステップＳＡ−８）。【０１３２】
つぎに、焦点位置決定装置１は、情報処理装置７０の制御部７０ａにより、対物レンズｚ軸移動機構を動作させ、対物レンズｚ軸移動機構により、ステップＳＡ−８で決定した中央の位置（略中央の位置）に対物レンズ３０の焦点位置が合うように、対物レンズ３０の位置を調整する（ステップＳＡ−９）。【０１３３】
以上、説明したように、第１実施形態の焦点位置決定装置１は、光源２０により生体細胞へ照射光を照射する。そして、焦点位置決定装置１は、対物レンズｚ軸移動機構により対物レンズ３０を光軸に沿って一定量ずつ繰り返し移動させながら、移動させる度に、焦点位置計測部５０により対物レンズ３０の焦点位置を計測し、ＣＣＤカメラにより生体細胞を照明して撮像し、特徴量算出部７０ａ１により、撮像した撮像画像のコントラストを算出する。そして、焦点位置決定装置１は、焦点位置選出部７０ａ２により、対物レンズ３０を繰り返し移動させたことで蓄積した複数のコントラストのうち極大となるコントラストを２つ選出し、選出したコントラストに対応する撮像画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置を、対物レンズ３０を繰り返し移動させたことで蓄積した複数の焦点位置から取得する。そして、焦点位置決定装置１は、焦点位置決定部７０ａ３により、取得した２つの焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央の位置（略中央の位置）を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定し、対物レンズｚ軸移動機構により、対物レンズ３０を移動させて、対物レンズ３０の焦点位置を、決定した焦点位置に合わせる。これにより、生体細胞内の特定の部位を観察対象部位１０ａとして当該観察対象部位１０ａの発光観察を行う場合、生体細胞を設置した時点で、当該観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズ３０の焦点位置を当該観察対象部位１０ａに合わせることができる。具体的には、焦点位置決定装置１によれば、微弱光を発する生体細胞をレンズを含む拡大結像光学手段を用いて観察したり、当該生体細胞からの発光を測定したり、例えば、生体細胞内からの生物発光タンパク質による微弱発光を観察したりする顕微鏡において、生体細胞からの発光を確認しなくても、生体細胞内の発光している部位（生物発光タンパク質が局在する部位）に対物レンズの焦点を自動的に合わせることができる。ゆえに、レンズを含む拡大結像光学手段を用いて微弱光を発する試料の観察を行う際に、対物レンズの焦点位置を、試料内の目的とする部位に、手動で行う場合と比べて迅速に且つ精度よく設定することができる。また、焦点位置決定装置１では、対物レンズの焦点位置を決定において試料の照明画像を用いているが、当該照明画像は明るくしかもコントラストが高いので、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を、目視で行う場合と比べて容易且つ迅速に決定することができる。また、焦点位置決定装置１では、コントラストが高い、試料１０の照明画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置が、試料１０のほぼ上下辺縁部に対応しているので、その中央位置（略中央位置）を、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定すればよい。これにより、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を容易且つ簡便に決定することができる。【０１３４】
ここで、生物（生体細胞など）による発光現象を測定する場合、試料を設置した時点では、生物からの発光は、その強度が極めて微弱であるため、高性能のＣＣＤカメラでもほとんど検出することができない。すなわち、通常の顕微鏡観察のように生物内の観察対象部位（細胞など）を確認しながら対物レンズの焦点を合わせることができない。つまり、生物を設置した時点では、通常、生物の内部構造を観察することができない。また、蛍光や発光（化学発光または生物発光）を観察する顕微鏡においては、細胞内の発光タンパク質が局在する部位（微弱発光する部位）を細胞間で同時に観察する際、細胞などの位相物体の照明画像に基づいて検出した対物レンズの焦点位置では、細胞内に局在する発光タンパク質の発光部分に合わず、観察画像がぼけてしまう。また、蛍光観察においては、蛍光励起光により蛍光を発している位相物体について蛍光強度が最も大きい位置を焦点位置として決定している。ただし、この決定方法の場合、励起光に因る光毒性が強いため、生きた細胞など生物活性を有する試料に対して繰り返し焦点位置を決定するのは望ましくないので、焦点位置の決定回数をできるだけ少なくする必要がある。しかし、長期間の蛍光観察においては、焦点位置の決定回数を少なくすると、観察画像の鮮明度が不安定になる可能性がある。そこで、焦点位置決定装置１では、照明光による画像観察として、ハロゲンランプなどの光源２０から発せられる光を生物に照射し、顕微鏡により生物の照明画像を取得し、取得した照明画像に基づいて対物レンズ３０の焦点位置を決定する。つまり、生体細胞を照明下で撮像し、生体細胞の内部の位置を推定する。これにより、生物を設置した時点で生物の内部構造を観察することができる。また、細胞内の発光タンパク質が局在する部位（微弱発光する部位）を細胞間で同時に観察する際、細胞内に局在する発光タンパク質の発光部分に対物レンズの焦点を合わせることができる。また、蛍光で対物レンズの焦点位置を決定しないので、長期間の蛍光観察を行うことができる。【０１３５】
なお、焦点位置決定装置１は、ステップＳＡ−７において、焦点位置選出部７０ａ２により、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の焦点位置から、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の特徴量に基づいて、対物レンズ３０の近点側の焦点位置（対物レンズ３０の近点側においてコントラストの高い撮像画像が得られた時の対物レンズ３０の焦点位置）を選出し、ステップＳＡ−８において、焦点位置決定部７０ａ３により、選出した対物レンズ３０の近点側の焦点位置から予め測定した生体細胞の厚みの半分の距離だけ光軸の上方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定してもよい。換言すると、焦点位置決定装置１は、照明下での観察による近点側の高コントラストの画像が得られた時の対物レンズ３０の焦点位置を選出し、選出した焦点位置から細胞の厚さの半分程度の距離だけ光軸の上方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定してもよい。また、焦点位置決定装置１は、ステップＳＡ−７において、焦点位置選出部７０ａ２により、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の焦点位置から、撮像画像データベース７０ｂ１に格納された複数の特徴量に基づいて、対物レンズ３０の遠点側の焦点位置（対物レンズ３０の遠点側においてコントラストの高い撮像画像が得られた時の対物レンズ３０の焦点位置）を選出し、ステップＳＡ−８において、焦点位置決定部７０ａ３により、選出した対物レンズ３０の遠点側の焦点位置から予め測定した生体細胞の厚みの半分の距離だけ光軸の下方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定してもよい。換言すると、焦点位置決定装置１は、照明下での観察による遠点側の高コントラストの画像が得られた時の対物レンズ３０の焦点位置を選出し、選出した焦点位置から細胞の厚さの半分程度の距離だけ光軸の下方に離れた位置を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定してもよい。これにより、対物レンズ３０や試料１０を動かして、近点側と遠点側のデフォーカス位置を選出する場合に比べて、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置を容易且つ簡便に決定することができる。【０１３６】
ここで、焦点位置決定装置１は、以下の工程１から工程６を実行することで、試料容器１１に配置された生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定してもよい。
（工程１）光源２０の電源を入れ、光源２０のシャッターを開閉して試料容器１１の上方から照明光を照射する。
（工程２）試料容器１１の底面（外側底面または内側底面）に合うような対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚｄ”に対応）を決定する。具体的には、対物レンズｚ軸移動機構により、対物レンズ３０を光軸に沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動させる度に、ＣＣＤカメラにより生体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部７０ａ１により、撮像した撮像画像の全画素からの光強度の積分値（ＣＣＤカメラからの出力信号の強度）を算出し、制御部７０ａにより、算出した積分値が極大値であるか否かを確認し、極大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像した時に対物レンズ３０の焦点が試料容器１１の底面に合っていると見做して、当該撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚｄ”に対応）を焦点位置計測部５０で計測する。つまり、対物レンズ３０を光軸に沿って動かしながら、試料容器１１の底面からの反射光の極大値を照明画像で決定する。
（工程３）対物レンズ３０の近点側において、コントラストの高い撮像画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚｃ”に対応）を決定する。具体的には、対物レンズｚ軸移動機構により、対物レンズ３０を、（工程２）で移動させた位置からさらに光軸に沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動させる度に、ＣＣＤカメラにより生体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部７０ａ１により、撮像した撮像画像のコントラストを算出し、制御部７０ａにより、算出したコントラストが極大値であるか否かを確認し、極大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像した時に対物レンズ３０の焦点が生体細胞のほぼ下端面に合っていると見做して、当該撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚｃ”に対応）を焦点位置計測部５０で計測する。
（工程４）対物レンズ３０の遠点側において、コントラストの高い撮像画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚａ”に対応）を決定する。具体的には、対物レンズｚ軸移動機構により対物レンズ３０を（工程３）で移動させた位置からさらに光軸に沿って一定量ずつ移動させながら、一定量移動させる度に、ＣＣＤカメラにより生体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部７０ａ１により、撮像した撮像画像のコントラストを算出し、制御部７０ａにより、算出したコントラストが極大値であるか否かを確認し、極大値であると確認された場合には、当該極大値の元となった撮像画像を撮像した時に対物レンズ３０の焦点が生体細胞のほぼ上端面に合っていると見做して、当該撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置（図１４の“Ｚａ”に対応）を焦点位置計測部５０で計測する。
（工程５）（工程３）で決定した焦点位置（図１４の“Ｚｃ”に対応）および（工程４）で決定した焦点位置（図１４の“Ｚａ”に対応）の略中央の位置（例えば、図１４の“Ｚｂ（（Ｚｃ＋Ｚａ）÷２）”に対応）を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定する。
（工程６）（工程５）で決定した中央の位置に対物レンズ３０の焦点位置が合うように、対物レンズ３０を移動する。【０１３７】
なお、工程４および工程５において、対物レンズ３０を一定量移動させる度にＣＣＤカメラで生体細胞を照明下で撮像すると共に当該撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置を計測し、対物レンズ３０を移動させながら撮像してきた複数の撮像画像のコントラスト（複数の撮像画像の各画素からの出力信号の総和）を算出し、算出した各コントラスト（各総和）を比較して極大のコントラスト（総和）を選出し、選出したコントラスト（総和）に対応する撮像画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置を、対物レンズ３０を移動させながら計測してきた複数の対物レンズ３０の焦点位置の中から選択することで、図１４の“Ｚｃ”または“Ｚａ”に対応する対物レンズ３０の焦点位置を決定してもよい。また、焦点位置決定装置１は、ＣＣＤカメラの代わりにフォトダイオードを配設してもよい。この場合、工程４および工程５において、対物レンズ３０を一定量移動させる度に、フォトダイオードの出力電流を増幅して電圧信号に変換すると共に対物レンズ３０の焦点位置を計測し、対物レンズ３０を移動させながら変換してきた複数の電圧信号の強度を比較して極大の電圧信号の強度を選出し、選出した電圧信号の強度に対応する対物レンズ３０の焦点位置を、対物レンズ３０を移動させながら計測してきた複数の対物レンズ３０の焦点位置の中から選択することで、図１４の“Ｚｃ”または“Ｚａ”に対応する対物レンズ３０の焦点位置を決定してもよい。また、焦点位置決定装置１において、対物レンズ３０や試料１０を移動させる量（移動量）は、ＣＣＤカメラで撮像した像にボケが生じない範囲であることが望ましい。具体的には、当該移動量は、光源２０で発せられる光の波長を対物レンズ３０のＮＡの二乗で割った値（λ÷ＮＡ2：λは波長、ＮＡは開口数）以下であることが望ましい。【０１３８】
また、焦点位置決定装置１において、光源２０として単色性の高い光源（レーザーなど）を用いてもよい。ここで、光源の単色性が高いと、照明光を位相物体に照射したときに、波長分散がほとんど無くなるので、シャープな回折光が得られる。従って、近点側の撮像画像、遠点側の撮像画像のいずれにおいても、そのコントラストが、白色光源を用いたときと比べて、非常に高くなる。これにより、コントラストが極大となる撮像画像を撮像した時の対物レンズの焦点位置を容易に選出することができる。【０１３９】
また、焦点位置決定装置１において、観察者（オペレーター）が、対物レンズｚ軸移動機構のノブを手動で回しながら接眼レンズ４３を介して、生体細胞の像のコントラストが高くなる２箇所の対物レンズの位置を目視で決定し、焦点位置計測部５０により、当該決定した時の対物レンズの焦点位置を計測し、焦点位置決定部７０ａ３により、計測した２つの焦点位置の中央位置（略中央位置）を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。【０１４０】
また、焦点位置決定装置１によれば、対物レンズ３０の位置を通常の観察の合焦位置から試料１０に対して微小量だけ前後に移動させることにより、位相差用の対物レンズを使用しなくても位相差観察法と同様なコントラストの像を得ることができる。また、焦点位置決定装置１によれば、対物レンズ３０とコンデンサーレンズ２３との瞳収差を考慮する必要がないので、低倍率の対物レンズを使用することができる。つまり、焦点位置決定装置１によれば、位相差観察法では使えない、１倍や２倍の倍率の対物レンズを使用しても、培養細胞のような位相物体を観察することができ、従来の観察法では実現できなかった広い範囲での観察が可能になる。また、焦点位置決定装置１によれば、偏射照明により、位相分布に陰影を付けたレリーフ感のある、高いコントラストの像を得ることができる。また、焦点位置決定装置１によれば、切替ミラー４４により、目視による観察とＴＶモニタによる観察とを切り替えて行うことができる。また、切替ミラー４４としてハーフミラーを用いることで、目視による観察とＴＶモニタによる観察とを同時に行うことができる。また、焦点位置決定装置１によれば、開口を取り外すことで、通常の顕微鏡として試料の観察を行うことができる。また、焦点位置決定装置１によれば、対物レンズ３０の焦点位置の決定を２段階に分けて実施することにより、高倍率の対物レンズを用いた場合でも焦点位置の決定を行うことができる。また、焦点位置決定装置１によれば、励起光を使用しないので、蛍光を発する生物学的試料に対して繰り返し焦点位置決定処理を実行しても、光毒性の影響が殆どないという利点がある。換言すると、生きた細胞に対して連続的・経時的に観察を行う場合において、焦点位置決定処理を繰り返し行うことで鮮明な撮像画像を撮像し続けることができる。また、焦点位置決定装置１によれば、赤外光を用いて焦点位置決定処理を行う場合において、可視光での照明を行わない状態を維持したまま、対物レンズの焦点位置を合わせることと試料の暗視野画像を撮像することの両方を行うことができるので、自家発光により撮像画像にノイズが生じることを効果的に防止することができる。【０１４１】
また、焦点位置決定装置１は、試料１０から発せられる発光の強度がＣＣＤカメラで検出できる程度になった場合には、試料１０を設置した時点で決定した、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置を再度決定し直してもよい（焦点位置再決定処理）。ここで、高倍率（例えば４０倍以上）の対物レンズ３０で試料１０からの発光を観察する場合には、対物レンズ３０の倍率が高くなればなるほど、焦点深度が極めて浅くなっていくので、対物レンズ３０の焦点位置が精確に試料１０内の観察対象部位１０ａに合ってないと試料１０の像がぼやける。上述した焦点位置決定処理で決定した焦点位置は試料１０のほぼ中心に合っているが、さらに高精度で試料１０からの発光を取得する場合には、より精度よく試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定する必要がある。そこで、焦点位置再決定処理を実行することにより、試料１０を設置した時点だけでなく、試料１０の発光観察を開始してからも、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置を決定し続けることができ、その結果、対物レンズの焦点位置を常に当該観察対象部位１０ａに合わせることができる。ここで、焦点位置決定装置１が行う焦点位置再決定処理について、図１９を参照して説明する。図１９は、第１実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置再決定処理の一例を示すフローチャートである。【０１４２】
まず、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａによりＣＣＤカメラを動作させ、ＣＣＤカメラにより、焦点位置決定部７０ａ３で決定した焦点位置（上述した図１８におけるステップＳＡ−８で決定した、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置）にて、試料１０を照明を行わずに撮像する（ステップＳＢ−１）。【０１４３】
つぎに、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａにより特徴量算出部７０ａ１を動作させ、特徴量算出部７０ａ１により、ステップＳＢ−１で撮像した撮像画像（発光画像）に基づいて特徴量（例えば発光画像の各画素からの発光強度、発光画像の発光強度分布から得られる統計量、発光画像のコントラストなど）を算出する（ステップＳＢ−２）。【０１４４】
つぎに、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａにより対物レンズｚ軸移動機構を動作させ、対物レンズｚ軸移動機構により、対物レンズ３０を光軸に沿って一定量だけ移動することで、焦点位置決定部７０ａ３で決定した焦点位置を変更する（ステップＳＢ−３）。なお、焦点位置の変更は、対物レンズ３０の移動の他、試料ステージ１７の移動で行ってもよい。【０１４５】
つぎに、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａによりＣＣＤカメラを動作させ、ＣＣＤカメラにより、ステップＳＢ−３で変更した焦点位置にて試料１０を照明を行わずに撮像する（ステップＳＢ−４）。【０１４６】
つぎに、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａにより特徴量算出部７０ａ１を動作させ、特徴量算出部７０ａ１により、ステップＳＢ−４で撮像した撮像画像（発光画像）に基づいて特徴量（例えば発光画像の各画素からの発光強度、発光画像の発光強度分布から得られる統計量、発光画像のコントラストなど）を算出する（ステップＳＢ−５）。【０１４７】
つぎに、焦点位置決定装置１は、制御部７０ａにより特徴量比較部７０ａ４を動作させ、特徴量比較部７０ａ４により、ステップＳＢ−２で算出した特徴量とステップＳＢ−５で算出した特徴量とを比較する（ステップＳＢ−６）。なお、特徴量の比較においては、試料１０の種類や特性に因りコントラストで比較した方が適当である場合と発光強度分布から得られる統計量で比較した方が適当である場合とがあるが、最終的にはＳ／Ｎ（シグナル・ノイズ比）で比較する。【０１４８】
つぎに、焦点位置決定装置１は、ステップＳＢ−６での比較結果がステップＳＢ−５で算出した特徴量の方が大きかった場合（ステップＳＢ−７：Ｙｅｓ）には、制御部７０ａにより焦点位置決定部７０ａ５を動作させ、焦点位置決定部７０ａ５により、ステップＳＢ−３で変更した焦点位置を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズの焦点位置として決定する（ステップＳＢ−８）。【０１４９】
一方、焦点位置決定装置１は、ステップＳＢ−６での比較結果がステップＳＢ−５で算出した特徴量の方が大きくなかった場合（ステップＳＢ−７：Ｎｏ）には、制御部７０ａにより、ステップＳＢ−３の実行回数が所定回数に達したか否か（ステップＳＢ−３での対物レンズ３０の移動量が所定量に達したか否か）を確認し、所定回数に達した場合（ステップＳＢ−９：Ｙｅｓ）には、制御部７０ａにより対物レンズｚ軸移動機構を動作させ、対物レンズｚ軸移動機構により、ステップＳＢ−３で変更した対物レンズ３０の焦点位置を、焦点位置決定部７０ａ３で当初決定した焦点位置（上述した図１８におけるステップＳＡ−８で決定した、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置）に戻す（ステップＳＢ−１０）。また、焦点位置決定装置１は、所定回数に達してない場合（ステップＳＢ−９：Ｎｏ）には、制御部７０ａにより、ステップＳＢ−３の処理に戻る。【０１５０】
以上、第１実施形態の焦点位置決定装置１の説明を終了する。【０１５１】
［第２実施形態］
つぎに、本発明にかかる第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成について、図２０から図２２を参照して詳細に説明する。なお、上述した第１実施形態の説明と重複する説明を省略する場合がある。【０１５２】
図２０は、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の具体的一例を示す図である。図２０に示す焦点位置決定装置１は、倒立型顕微鏡をベースとする構成であり、微弱光を発する生体細胞の発光観察と蛍光観察とを同時に行うために用いるものである。焦点位置決定装置１は、蛍光観察と発光観察とを同時に行う際、生体細胞や組織などの試料１０を設置した時点で、試料１０内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定する。焦点位置決定装置１は、図２０に示すように、励起光照射部（励起用光源）８０、コリメートレンズ８１、偏向ミラー８２およびダイクロイックミラー８３からなる励起用光学系をさらに備えて構成されている。【０１５３】
なお、図２０に示す焦点位置決定装置１において、試料１０が空気中に存在する（試料１０が培養液などの液体に浸されてない）場合には、対物レンズ３０として開口数（ＮＡ）が０．９程度のものを用い、試料１０が液体に浸されている場合には、対物レンズ４０として開口数が１．０以上のものを用いる。また、試料１０は、蛍光色素（蛍光物質）であるローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＲｈＧ）で予め染色されている。ここで、蛍光物質として、ローダミン・グリーンの他、例えばＴＭＲ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、５−Ｔａｍｒａ（５−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＴＯＴＯ１、Ａｃｒｉｄｉｎｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄなどを用いてもよい。【０１５４】
励起光照射部８０は、可視光領域の波長のレーザー光を発するガスレーザー（例えばアルゴン・レーザー、ヘリウムネオン・レーザー（Ｈｅ・Ｎｅレーザー）など）であり、具体的には、波長４８８ｎｍで出力１０ｍＷのアルゴン・レーザーである。ここで、試料１０を蛍光物質であるＴＭＲで染色した場合には、当該ＴＭＲを励起するために、励起光照射部８０として波長５１４．５ｎｍのアルゴン・レーザーを用いる。また、試料１０を蛍光物質である５−Ｔａｍｒａで染色した場合には、当該５−Ｔａｍｒａを励起するために、励起光照射部８０として波長５４３．５ｎｍのＨｅ・Ｎｅレーザーを用いる。【０１５５】
コリメートレンズ８１は、励起光照射部８０から発せられたレーザー光を、ビーム幅を有する円形の平行光束に変換する。【０１５６】
偏向ミラー８２は、コリメートレンズ８１で平行光束に変換されたレーザー光の光軸を偏向する。【０１５７】
ダイクロイックミラー８３は、具体的には切替式ダイクロイックミラーであり、偏向ミラー８２で偏向されたレーザー光を対物レンズ３０へ入射させる。なお、切替式ダイクロイックミラーは、励起用光源８０の発振波長の光を反射し、蛍光信号および発光信号のスペクトルを透過するスペクトル特性を持っている。ここで、ダイクロイックミラー８３は、ホルダー（図示せず）に収められており、レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に配設されている。なお、励起光照射部８０から発するレーザー光の波長を変更する必要がなければ、ダイクロイックミラー８３として、切替式のものでなく、通常のダイクロイックミラーを用いてもよい。【０１５８】
以上、図２０に示す焦点位置決定装置１では、試料１０から発せられた蛍光および発光は、対物レンズ３０を通って、ダイクロイックミラー８３に到達する。そして、ダイクロイックミラー８３に到達した蛍光および発光は、ダイクロイックミラー８３を透過し、リレーレンズ３１およびリレーレンズ３３を通って、切替ミラー４４で反射し、ＣＣＤカメラ６０の受光面にある撮像素子６０ａで焦点を結ぶ。なお、切替ミラー４４を光路から取り外した場合、試料１０から発せられた蛍光および発光は、接眼レンズ４３に到達する。これにより、観察者が試料１０の像を直接観察することができる。【０１５９】
つぎに、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の別の具体的一例について、図２１を参照して詳細に説明する。図２１は、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の別の具体的一例を示す図である。【０１６０】
図２１に示すように、焦点位置決定装置１の本体（光学系部分）は本体架台１０６に固定されている。なお、本体架台１０６は上下方向に移動できるような構成である。本体架台１０６は支柱１０５に取り付けられている。支柱１０５は底板１００の上に固定されている。焦点位置決定装置１の観察光学系やＣＣＤカメラ６０などは鏡筒に収められている。鏡筒は、鏡筒上部１０７および当該鏡筒上部１０７と連結された鏡筒下部１０８で構成されている。鏡筒上部１０７は本体架台１０６に固定されている。鏡筒下部１０８はベース架台１０４の上に固定されている。鏡筒は上下方向に移動可能に取り付けられている。ベース架台１０４は底板１００の上に固定されている。焦点位置決定装置１の本体は遮光性を有する遮光箱１０１で覆われている。遮光箱１０１は底板１００に固定されている。遮光箱１０１の上面には遮光蓋１０２が取り付けられている。遮光蓋１０２は、その一端が遮光箱１０１と蝶番１０３で連結されており、開閉できるように取り付けられている。【０１６１】
試料１０を入れた試料容器１１は、試料ステージ１７上に配設されている。ここで、図２２に示すように、試料容器１１を水槽１２に入れて試料ステージ１７上に配設してもよい。【０１６２】
再び図２１に戻り、光照射部２０には例えばハロゲンランプ、メタルハライドランプなどを用い、光照射部２０から発せられた光は光ファイバー２６を通して試料ステージ１７上の試料１０を含む試料容器１１に照射される。【０１６３】
観察光学系において、偏向ミラー３２は用いず、対物レンズ３０で形成された像（試料１０の像）を結像させるリレーレンズ３４が鏡筒下部１０８に図示の如く配設されている。【０１６４】
ここで、図２１に示す焦点位置決定装置１は、図２２に示すように、焦点位置変更部４０として、対物レンズｚ軸移動機構ではなく、試料ステージ１７をｚ軸に沿って移動させるステージｚ軸移動機構を備えてもよい。ここで、図２２には、本体架台１０６にステージｚ軸移動機構を備えたＺ軸移動ステージが設置されている。当該Ｚ軸移動ステージは、ＸＹ方向に移動可能なＸＹ試料ステージの下方に、当該ＸＹ試料ステージを支える形で取り付けられている。当該Ｚ軸移動ステージの上方には、試料容器１１が配置されており、試料容器１１はＺ軸移動ステージの上下移動と共に上下に移動する。Ｚ軸移動ステージはラックピニオン機構により上下運動する。なお、ラックピニオン機構の動作は、ラックピニオン機構のノブ（図示しない）をステッピング・モーターにより回転駆動することにより実施される。そして、ステッピング・モーターの駆動はコンピュータにより制御される。これにより、対物レンズ３０を上下移動させた場合と同様の操作ができる。ここで、Ｚ軸移動ステージの上下移動は手動により行ってもよい。また、ラックピニオン機構の動作は、当該ラックピニオン機構のノブ（図示しない）を回転して行なってもよい。【０１６５】
再び図２１に戻り、ＣＣＤカメラ６０は、その受光面の中心が光軸にほぼ合うように、配設されている。試料（生体細胞）１０から発せられた蛍光および発光は、ダイクロイックミラー８３を透過し、リレーレンズ３４を通ってＣＣＤカメラ６０の受光面に集光する。ここで、赤外光を取り出す場合には、ＣＣＤカメラ６０の前面に取り付けられた赤外線カットフィルター４５を、焦点位置決定装置１を起動させる前に取り外す。ＣＣＤカメラ６０は、ＣＣＤカメラ６０からの出力信号を処理する情報処理装置７０とケーブルを介して接続されている。【０１６６】
情報処理装置７０は、ＣＣＤカメラの出力信号から発光画像を描出してそれを解析したり、発光強度の時間変化を測定したり、出力信号を解析したりする。また、情報処理装置７０は、対物レンズ３０の焦点位置が試料１０内の観察対象部位１０ａに合った後、試料１０からの蛍光および発光を受光するために、制御部７０ａによりＣＣＤカメラを動作させる。【０１６７】
励起光照射部８０は、波長４８８ｎｍで出力１０ｍＷのアルゴン・レーザーであり、図示の如く、遮光箱１０１の外に配設されている。なお、遮光箱１０１には光ファイバーを通すレーザー入射口８４が設けられている。励起光照射部８０から発せられたレーザー光はコリメートレンズ８１を通過して光ファイバー内を伝播し、伝播したレーザー光はダイクロイックミラー８３に到達する。ダイクロイックミラー８３に到達したレーザー光はダイクロイックミラー８３で反射されて対物レンズ３０に下方から入射し、入射したレーザー光は集光して試料１０に照射される。ダイクロイックミラー８３は、ホルダー８５に収められており、レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に配設されている。【０１６８】
以上、図２１に示す焦点位置決定装置１では、試料１０から発せられた蛍光および発光は、対物レンズ３０を通って、ダイクロイックミラー８３に到達する。そして、ダイクロイックミラー８３に到達した蛍光および発光は、ダイクロイックミラー８３を透過し、リレーレンズ３４を通って、ＣＣＤカメラの受光面にある撮像素子６０ａで焦点を結ぶ。【０１６９】
これにて、第２実施形態の焦点位置決定装置１の構成の説明を終了する。【０１７０】
つぎに、第２実施形態の焦点位置決定装置１が行う焦点位置決定処理および焦点位置再決定処理については、上述した第１実施形態の説明と同様であるため、その説明を省略する。【０１７１】
以上、説明したように、第２実施形態の焦点位置決定装置１は、励起用光学系をさらに備えている。第２実施形態の焦点位置決定装置１は、光源２０により生体細胞へ照射光を照射する。そして、焦点位置決定装置１は、対物レンズｚ軸移動機構により対物レンズ３０を光軸に沿って一定量ずつ繰り返し移動させながら、移動させる度に、焦点位置計測部５０により対物レンズ３０の焦点位置を計測し、ＣＣＤカメラにより生体細胞を照明下で撮像し、特徴量算出部７０ａ１により、撮像した撮像画像のコントラストを算出する。そして、焦点位置決定装置１は、焦点位置選出部７０ａ２により、対物レンズ３０を繰り返し移動させたことで蓄積した複数のコントラストのうち極大となるコントラストを２つ選出し、選出したコントラストに対応する撮像画像を撮像した時の対物レンズ３０の焦点位置を、対物レンズ３０を繰り返し移動させたことで蓄積した複数の焦点位置から取得する。そして、焦点位置決定装置１は、焦点位置決定部７０ａ３により、取得した焦点位置に基づいて、当該２つの焦点位置の中央の位置（略中央の位置）を、生体細胞内の観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置として決定し、対物レンズｚ軸移動機構により、対物レンズ３０を移動させて、対物レンズ３０の焦点位置を、決定した焦点位置に合わせる。これにより、生体細胞内の特定の部位を観察対象部位１０ａとして当該観察対象部位１０ａの蛍光観察と発光観察とを同時に行う場合、生体細胞を設置した時点で、当該観察対象部位１０ａに合うような対物レンズ３０の焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズ３０の焦点位置を当該観察対象部位１０ａに合わせることができる。【０１７２】
ここで、第２実施形態の焦点位置決定装置１を用いて生体細胞の発光画像と蛍光画像とを同時に観察しながら、生体細胞内のＡＴＰ量の測定を行う手法について、その幾つかを以下に説明する。ルシフェラーゼの発光反応（発光の強度）はＡＴＰ量に依存するので、ルシフェラーゼの発光反応を利用してＡＴＰを定量することは以前から行われている。そして、バイオ、臨床検査、食品衛生などの分野では、ルシフェラーゼを用いた細胞内のＡＴＰ量の測定が行なわれている。なお、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）は細胞内のエネルギーの供給源であり、生命現象に深く関わっている物質である。一方、ホタルのルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｏ2、Ｍｇ2+の存在下で、Ｄ‐ルシフェリンを発光基質として、オキシルシフェリン、ＣＯ2、ＡＭＰ、ピロリン酸を生成する反応を触媒し、当該反応により発光する。【０１７３】
生体細胞内のＡＴＰ量の測定は、通常、以下の（１Ａ）〜（１Ｃ）の工程で行われる（Ｈ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ａ．Ｅ．Ｐｏｕｌｉ，  Ｅ．Ｋ．Ａｉｎｓｃｏｗ，  Ｌ．Ｓ．Ｊｏｕａｖｉｌｌｅ，  Ｒ．Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｇ．Ａ．Ｒｕｔｔｅｒ，  “Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｓｕｂ−ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｓｌｅｔ  β−ｃｅｌｌｓ．”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．２７４，  ｐｐ．１３２８１−１３２９１，  １９９９）。
（１Ａ）細胞または細菌を溶解してＡＴＰを抽出する。
（１Ｂ）その抽出液をルシフェリンおよびルシフェラーゼを含む反応液に添加する。
（１Ｃ）抽出液が添加された反応液から生じる発光量を測定することで、細胞内のＡＴＰを定量する。【０１７４】
また、細胞内のＡＴＰ量の測定は、通常、以下の（２Ａ）〜（２Ｃ）の工程で行われる。
（２Ａ）ルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入して発現させる。
（２Ｂ）細胞を含む培養液中にルシフェリンを添加する。
（２Ｃ）ルシフェリンが加えられた培養液から生じる発光量を検出し、細胞内のＡＴＰを定量する。【０１７５】
さらに、生きた細胞内の所定の部位（具体的にはミトコンドリア）におけるＡＴＰ量の経時的測定は、以下の（３Ａ）および（３Ｂ）の工程で行われる（Ｈ．Ｊ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ａ．Ｅ．Ｐｏｕｌｉ，  Ｅ．Ｋ．Ａｉｎｓｃｏｗ，  Ｌ．Ｓ．Ｊｏｕａｖｉｌｌｅ，  Ｒ．Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｇ．Ａ．Ｒｕｔｔｅｒ，  “Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｓｕｂ−ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｓｌｅｔ  β−ｃｅｌｌｓ．”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．２７４，  ｐｐ．１３２８１−１３２９１，  １９９９）。
（３Ａ）ルシフェラーゼ遺伝子にミトコンドリア移行シグナル遺伝子を融合し、その融合した遺伝子を細胞に導入する。細胞に導入する融合遺伝子は、移行塩基配列および発光関連遺伝子に加えてさらに蛍光タンパク質を発現する蛍光関連遺伝子を融合したものである。
（３Ｂ）ルシフェラーゼが細胞内のミトコンドリアに局在しているということを前提とし、細胞からの発光量を経時的に測定することで、細胞内のミトコンドリアにおけるＡＴＰ量の時間変動を測定する。具体的には、当該融合遺伝子が導入された細胞の蛍光画像を撮り、得られた蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを判定する。判定結果が局在すると結論された場合、細胞からの発光量を検出する。これにより、当該細胞の所定の部位に発光たんぱく質が局在しているか否かを判定することができる。すなわち、融合遺伝子が導入された生きた細胞に対し発光タンパク質の局在を確認すると共に、当該細胞からの発光量を測定する。また、測定した発光量が所定の部位からのものであることを確認することができる。
なお、融合遺伝子が導入された生きた細胞が撮像視野の範囲内に複数個存在する場合、複数の細胞の蛍光画像および発光画像を撮り、その蛍光画像に基づいて所定の部位に発光タンパク質が局在するか否かを細胞ごとに判定し、撮像した蛍光画像および撮像した発光画像を重ね合わせることで、判定結果が局在すると判定された細胞の中から測定対象の細胞を選定し、選定した細胞からの発光量を測定する。これにより、複数の細胞の中から個々の細胞を識別し、単一の細胞内の所定の部位からの発光量を他と分離して測定することができる。また、蛍光画像および発光画像を同時に取得することで、測定対象の細胞における発光タンパク質の局在と、当該細胞から発せられる発光強度を同時に得ることができる。そのため、遺伝子の導入効率や細胞周期による個々の細胞の生理的な状態の違いの影響を排除した解析を行うことができる。ここで一例として、蛍光画像を撮像した後、発光タンパク質が所定の部位に局在しているか否かの判定を行ない、局在すると判定された場合、発光画像を撮像してもよい。さらに、蛍光画像および発光画像を撮像した後、局在の判定を行なってもよい。【０１７６】
以上、第２実施形態の焦点位置決定装置１の説明を終了する。【０１７７】
［第３実施形態］
つぎに、本発明にかかる第３実施形態の焦点位置検出装置１'の概要、その構成およびその処理について、図を参照して詳細に説明する。なお、上述した第１実施形態や第２実施形態の説明と重複するものを省略する場合がある。【０１７８】
まず、本発明の概要について詳細に説明する。本発明は、対物レンズの位置を移動させながら試料（具体的には、発光する物質を含む生物試料）を撮像すると共に対物レンズの焦点位置を計測し、撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差であるコントラストを算出し、算出したコントラストおよび計測した対物レンズの焦点位置に基づいて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する。具体的には、本発明は、位置ｚに対物レンズがあるときに試料を撮像した画像のコントラストと、位置ｚからΔｚだけ離れた位置に対物レンズを移動して試料を撮像したときの画像のコントラストとを比較することで、対物レンズの焦点位置を求める。つまり、本発明は、対物レンズの位置と画像のコントラストとの関係に着目して、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を求める。したがって、本発明では、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定するに先立って、対物レンズの位置と画像のコントラストとの関係を得る。これにより、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができる。また、これにより、試料内の発光部位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に対物レンズの焦点を合わせることができる。ところで、画像のコントラストは対物レンズの位置の変化に従ってスムーズに変化しないことがある。換言すると、画像のコントラストと対物レンズの位置との関係を表す曲線がスムーズなものにならず、コントラストの値にバラツキが出ることがある。そこで、このような場合には、本発明は、対物レンズの位置と画像のコントラストとを関連付けたデータに対し、画像のコントラストと対物レンズの位置との関係を表す曲線がスムーズになるようにスムージング処理を行ってから、スムージング処理後のデータを用いて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定してもよい。【０１７９】
なお、本発明は、コントラストを、画像を構成する各画素の画素値のうち最大値を含む複数の上位の画素値の平均値と、画像を構成する各画素の画素値のうち最小値を含む複数の下位の画素値の平均値との差としてもよい。これにより、撮像した画像に擬似信号（例えば反射光や散乱光などのノイズ光によるものなど）が入り込んでいても、当該画像から信頼性の高いコントラストを算出することができる。【０１８０】
また、本発明は、算出したコントラストを他のものと比較してその極小値を１つ探索し、探索した極小値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよく、算出したコントラストを他のものと比較してその極大値を２つ探索し、探索した各極大値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置の中間を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。これにより、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができる。ところで、細胞などの生物試料は位相物体であり、対象領域に屈折率差を持っている。そのため、このような位相物体を観察対象にした場合、図２６に示すように対物レンズをｚ軸方向に移動していくと、画像のコントラストは図２７に示すように変化し、結果として２つの極大値およびこの２つの間に挟まれた１つの極小値が得られる。そこで、本発明者は、このことに基づき、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置が、画像のコントラストが極小値となるときの対物レンズの焦点位置であること、さらには、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置が、画像のコントラストが極大値となるときの対物レンズの焦点位置２つのほぼ中間であること、を見い出した。【０１８１】
また、本発明は、対物レンズの位置を、その移動量を段階的に減らしながら移動させてもよい。具体的には、本発明は、対物レンズの位置を、その移動量を前回の移動量の半分に減らしながら移動させてもよい。これにより、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を迅速に決定することができる。【０１８２】
つぎに、本発明にかかる第３実施形態の焦点位置決定装置１'の構成について、図２８を参照して詳細に説明する。焦点位置決定装置１'は、光照射部２０'と、対物レンズ３０'と、対物レンズ移動部４０'と、対物レンズ位置計測部５０'と、試料撮像部６０'と、情報処理装置７０'と、で構成されている。【０１８３】
光照射部（光源）２０'は、発光する物質を含む生物試料のような試料１０'へ光を照射する。光照射部２０'は、可視光領域の波長の光（可視光）を発するインコヒーレント光源であり、具体的にはハロゲンランプ、ＬＥＤ、タングステンランプ、水銀ランプなどである。対物レンズ３０'は試料１０'の像を形成するためのものである。対物レンズ移動部４０'は、対物レンズ３０'の位置を光軸（ｚ軸）方向に移動する。対物レンズ位置計測部５０'は、焦点位置変更部４０'と接続され、対物レンズ３０'の光軸上での位置を計測する。【０１８４】
試料撮像部６０'は試料１０'を撮像する。試料撮像部６０'は、具体的には撮像素子を有する高感度のＣＣＤカメラである。【０１８５】
情報処理装置７０'は、具体的には市販のパーソナルコンピュータであり、対物レンズ移動部４０'、対物レンズ位置計測部５０'および試料撮像部６０'と接続されている。情報処理装置７０'は、制御部７０'ａと記憶部７０'ｂとを備えている。【０１８６】
制御部７０'ａは、当該制御部を統括的に制御するＣＰＵ等であり、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラムおよび所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行するための情報処理を行う。制御部７０'ａは、当該制御部が備える各部は勿論、対物レンズ移動部４０'や対物レンズ位置計測部５０'、試料撮像部６０'を制御する。また、キーボードやマウスなどの入力装置やＴＶモニタなどの出力装置が情報処理装置７０'と接続されている場合には、制御部７０'ａは、入力装置で入力された情報を取得したり、出力装置へ情報を出力したりする。制御部７０'ａは、コントラスト算出部７０'ａ１と、焦点位置決定部７０'ａ２とで構成されている。コントラスト算出部７０'ａ１は、試料撮像部６０'で撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差で定義されるコントラストを算出する。焦点位置決定部７０'ａ３は、コントラスト算出部７０'ａ１で算出したコントラストおよび対物レンズ位置計測部５０'で計測した対物レンズの位置に基づいて、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する。【０１８７】
記憶部７０'ｂは、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。記憶部７０'ｂは、図示の如く、画像等ファイル７０'ｂ１と決定位置管理ファイル７０'ｂ２とを備えている。画像等ファイル７０'ｂ１は、試料撮像部６０'で撮像した画像と、コントラスト算出部７０'ａ１で算出したコントラストと、対物レンズ位置計測部５０'で計測した対物レンズの位置とを相互に関連付けて格納する。具体的には、画像等ファイル７０'ｂ１は、画像を一意に識別するための画像識別情報と、画像と、コントラストと、画像を撮像した時の対物レンズの位置と、を相互に関連付けて格納する。決定位置管理ファイル７０'ｂ２は、試料１０'内の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置（具体的には焦点位置決定部７０'ａ２で決定した焦点位置）を格納する。【０１８８】
つぎに、第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理について、図２９、図３０、図３４、図３５などを参照して詳細に説明する。まず、図２９や図３０などを参照して第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の一例を説明し、続いて図３４や図３５などを参照して第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の別の一例を説明する。【０１８９】
観察者が、生体細胞などの試料１０'を所定の位置に設置し、焦点位置決定装置１'および光源２０'を起動させると、焦点位置決定装置１'は、図２９に示す以下の処理を行う。【０１９０】
まず、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、光源２０'から発せられた照明光が照射されている試料１０'を試料撮像部６０'で撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'の光軸（ｚ軸）上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を、予め設定した変数Ｚkへ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１）。【０１９１】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＣ−１で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、予め設定した変数Ｃkに代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−２）。なお、画像のコントラストは、画像を構成する各画素の受光強度Ｉi（図３１のＩ0，Ｉ1，Ｉ2，・・・，Ｉk，・・・，Ｉn）の分布を図３２に示すように２次元的に再生することで得られた受光強度の最大値Ｉmaxと受光強度の最小値Ｉminの差、つまり「Ｉmax−Ｉmin」で定義される。【０１９２】
ここで、測定データ（画像を構成する各画素の受光強度）には、擬似信号（例えば反射光や散乱光などのノイズ光に因るもの等）が入り込む可能性がある。そこで、算出したコントラストの値の信頼性を高めるために、コントラストを、受光強度の値Ｉmax・meanと受光強度の値Ｉmin・meanとの差、つまり「Ｉmax・mean−Ｉmin・mean」で定義してもよい。これにより、ノイズ光に因る測定誤差（受光強度の誤差）を低減することができる。なお、受光強度の値Ｉmax・meanは、一番大きな受光強度の値Ｉmaxを含む複数の上位の受光強度の値の平均値、すなわち受光強度の大きい順に第１番目の受光強度の値から第Ｎ番目の受光強度の値までの平均値であり、例えば図３３に示すように、一番大きな受光強度の値Ｉmax、二番目に大きな受光強度の値Ｉmax・2ndおよび三番目に大きな受光強度の値Ｉmax・3rdの平均値、つまり「（Ｉmax＋Ｉmax・2nd＋Ｉmax・3rd）／３」で定義してもよい。また、受光強度の値Ｉmin・meanは、一番小さな受光強度の値Ｉminを含む複数の下位の受光強度の値の平均値、すなわち受光強度の小さい順に第１番目の受光強度の値から第Ｎ番目の受光強度の値までの平均値であり、例えば図３３に示すように、一番小さな受光強度の値Ｉmin、二番目に小さな受光強度の値Ｉmin・2ndおよび三番目に小さな受光強度の値Ｉmin・3rdの平均値、つまり「（Ｉmin＋Ｉmin・2nd＋Ｉmin・3rd）／３」で定義してもよい。【０１９３】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を初期位置から光軸方向に一定量だけ移動させる（ステップＳＣ−３）。【０１９４】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料１０'を試料撮像部６０'で撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−４）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を、予め設定した変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−４）。【０１９５】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＣ−４で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、予め設定した変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−５）。【０１９６】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk＜Ｃk+1」であった場合（ステップＳＣ−６：Ｙｅｓ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、Ｃk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＣ−７）、ステップＳＣ−３へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk＜Ｃk+1」でない場合（ステップＳＣ−６：Ｎｏ）には、焦点位置決定部７０'ａ２で、Ｃkの値が最初のコントラストの極大値（第１極大値）であると判断し、Ｃkが得られたときの対物レンズの位置Ｚkの値を、予め設定した変数Ｚmax・1stへ格納する（ステップＳＣ−８）。【０１９７】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、Ｃk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入する（ステップＳＣ−９）。【０１９８】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸方向に一定量だけ移動させる（ステップＳＣ−１０）。【０１９９】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１１）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１１）。【０２００】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＣ−１１で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１２）。【０２０１】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk≦Ｃk+1」でない場合（ステップＳＣ−１３：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、Ｃk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＣ−１４）、ステップＳＣ−１０へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk≦Ｃk+1」であった場合（ステップＳＣ−１３：Ｙｅｓ）には、焦点位置決定部７０'ａ２で、Ｃkの値がコントラストの極小値であると判断すると共に、当該極小値に対応する対物レンズ３０'の位置が試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置であると決定し、Ｃkが得られたときの対物レンズの位置Ｚkの値を、予め設定した変数Ｚminへ格納する（ステップＳＣ−１５）。【０２０２】
そして、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で、対物レンズ３０'を変数Ｚminの値に対応する位置へ移動する（ステップＳＣ−１６）。
これにて、図２９に示す焦点位置決定処理の説明を終了する。【０２０３】
ここで、焦点位置決定装置１'は、ステップＳＣ−１５に引き続いて、図３０に示す焦点位置決定処理を実行してもよい。これにより、試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置の測定精度をさらに高めることができる。以下、図３０に示す焦点位置決定処理について説明する。なお、上述した説明と重複する説明を省略する場合がある。【０２０４】
ステップＳＣ−１５に引き続いて、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、Ｃk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入する（ステップＳＣ−１７）。【０２０５】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸方向に一定量だけ移動させる（ステップＳＣ−１８）。【０２０６】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１９）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−１９）。【０２０７】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＣ−１９で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＣ−２０）。【０２０８】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk≧Ｃk+1」でない場合（ステップＳＣ−２１：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、Ｃk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＣ−２２）、ステップＳＣ−１８へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk≧Ｃk+1」であった場合（ステップＳＣ−２１：Ｙｅｓ）には、焦点位置決定部７０'ａ２で、Ｃkの値が二番目のコントラストの極大値（第２極大値）であると判断すると共に、ステップＳＣ−８で得られた第１極大値に対応する対物レンズ３０'の位置と当該第２極大値に対応する対物レンズ３０'の位置の中間が試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置であると決定し、Ｃkが得られたときの対物レンズの位置Ｚkの値を、予め設定した変数Ｚmax・2ndへ格納する（ステップＳＣ−２３）。【０２０９】
そして、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で、対物レンズ３０'を「（Ｚmax・1st＋Ｚmax・2nd）／２」の値に対応する位置へ移動する（ステップＳＣ−２４）。
これにて、図３０に示す焦点位置決定処理の説明を終了する。【０２１０】
つぎに、図３４や図３５などを参照して第３実施形態の焦点位置決定装置１'が行う焦点位置決定処理の別の一例を説明する。なお、上述した説明と重複する説明を省略する場合がある。【０２１１】
焦点位置決定装置１'は、最初の段階では対物レンズ３０'の移動量を大きくし、その移動量を対物レンズ３０'の移動方向を変えながら次第に小さくして、最終的には画像のコントラストが極小値となる位置へ対物レンズ３０'の位置を収束させる。【０２１２】
具体的には、焦点位置決定装置１'は、以下の手順１〜１１を実行する。
手順１：対物レンズ３０'のスタート位置（初期位置）で、画像のコントラスト（Ｃ1）を取得する。
手順２：対物レンズ３０'を、予め設定したｚ軸の正（＋）方向に、上記の第２極大値に対応する対物レンズ３０'の位置を越える程度の位置まで大きく移動する。
手順３：手順２で移動した位置で、画像のコントラスト（Ｃk）を取得する。
手順４：対物レンズ３０'を、ｚ軸の正方向に、１ステップ（予め設定した１回あたりの移動量）移動する。
手順５：手順４で移動した位置で、画像のコントラスト（Ｃk+1）を取得する。
手順６：Ｃkの値とＣk+1の値との大小を比較する。
手順７：「Ｃk＞Ｃk+1」を満たす場合、対物レンズ３０'を、ｚ軸の負（−）方向に、上記の第１極大値に対応する対物レンズ３０'の位置付近まで大きく移動する。また、「Ｃk＜Ｃk+1」を満たす場合、対物レンズ３０'を、ｚ軸の負方向に、１ステップ移動する。
手順８：手順７で移動した位置で、画像のコントラスト（Ｃk+1）を取得する。
手順９：Ｃkの値とＣk+1の値との大小を比較する。
手順１０：「Ｃk＜Ｃk+1」を満たす場合、対物レンズ３０'を、ｚ軸の正方向に、上記の第２極大値に対応する対物レンズ３０'の位置付近まで大きく移動する。
手順１１：上記の手順を、対物レンズ３０'の移動量を小さくしながら繰り返すことで、画像のコントラストの極小値に対応する対物レンズ３０'の位置を求め、この位置を試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置として決定する。【０２１３】
なお、焦点位置決定装置１'は、上記に示した手順において、２回目以降の対物レンズ３０'の移動時の移動量を、先に行われた移動時の移動量の半分に設定し、移動先の位置でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、次の移動時の移動量を、直前の移動時の移動量の半分に設定し、このような移動および比較を繰り返してもよい。すなわち、対物レンズ３０'の移動量をコントラストの比較の度に半分に減らすことで、対物レンズ３０'の移動距離を減らし、最終的に、対物レンズ３０'の位置をコントラストが極小値になるときの対物レンズの位置に収束させてもよい。具体的には、焦点位置決定装置１'は、図３４および図３５に示す焦点位置決定処理を実行してもよい。これにより、試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置をより高速に決定することができる。【０２１４】
ここで、図３４および図３５に示す焦点位置決定処理について説明する。なお、上述した説明と重複する説明を省略する場合がある。観察者が、生体細胞などの試料１０'を所定の位置に設置し、焦点位置決定装置１'および光源２０'を起動させると、焦点位置決定装置１'は以下の処理を行う。【０２１５】
まず、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、光源２０'から発せられた照明光が照射されている試料１０'を試料撮像部６０'で撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−１）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'の光軸（ｚ軸）上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を、予め設定した変数Ｚkへ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−１）。【０２１６】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＤ−１で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、予め設定した変数Ｃkに代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２）。【０２１７】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を初期位置から、光軸（ｚ軸）の正（＋）方向に、予め設定した移動ステップ数Ｎ（Ｎは、移動ステップ数を格納する変数である。）だけ移動させる（ステップＳＤ−３）。なお、光軸の正負の方向や１ステップあたりの移動量は予め設定しておく。【０２１８】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−４）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を、予め設定した変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−４）。【０２１９】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＤ−４で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、予め設定した変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−５）。【０２２０】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、移動ステップ数を格納する変数Ｎに、当該Ｎの値の半分（Ｎ／２）の値を代入する（ステップＳＤ−６）。【０２２１】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk＜Ｃk+1」であった場合（ステップＳＤ−７：Ｙｅｓ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の負（−）方向に、ステップＳＤ−６で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−８）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＤ−９）、ステップＳＤ−４へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk＜Ｃk+1」でない場合（ステップＳＤ−７：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の正（＋）方向に、ステップＳＤ−６で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−１０）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入する（ステップＳＤ−１１）。【０２２２】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−１２）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−１２）。【０２２３】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＤ−１２で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−１３）。【０２２４】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、変数Ｎに、当該Ｎの値の半分（Ｎ／２）の値を代入する（ステップＳＤ−１４）。【０２２５】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk＞Ｃk+1」であった場合（ステップＳＤ−１５：Ｙｅｓ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の負（−）方向に、ステップＳＤ−１４で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−１６）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＤ−１７）、ステップＳＤ−１２へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk＞Ｃk+1」でない場合（ステップＳＤ−１５：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の正（＋）方向に、ステップＳＤ−１４で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−１８）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入する（ステップＳＤ−１９）。【０２２６】
つぎに、図３５へ進み、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２０）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２０）。【０２２７】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＤ−２０で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２１）。【０２２８】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、変数Ｎに、当該Ｎの値の半分（Ｎ／２）の値を代入する（ステップＳＤ−２２）。【０２２９】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk＞Ｃk+1」でない場合（ステップＳＤ−２３：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の負（−）方向に、ステップＳＤ−２２で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−２４）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＤ−２５）、ステップＳＤ−２０へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk＞Ｃk+1」であった場合（ステップＳＤ−２３：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の正（＋）方向に、ステップＳＤ−２２で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−２６）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入する（ステップＳＤ−２７）。【０２３０】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで試料撮像部６０'を動作させ、試料撮像部６０'で試料１０'を撮像し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、撮像した試料の画像を画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２８）。また、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ位置計測部５０'を動作させ、対物レンズ位置計測部５０'で対物レンズ３０'のｚ軸上での位置を計測し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、計測した対物レンズ３０'の位置を変数Ｚk+1へ代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２８）。【０２３１】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでコントラスト算出部７０'ａ１を動作させ、コントラスト算出部７０'ａ１で、ステップＳＤ−２８で撮像した画像から当該画像のコントラストを算出し、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、算出したコントラストの値を、変数Ｃk+1に代入すると共に、画像等ファイル７０'ｂ１の所定の記憶領域に格納する（ステップＳＤ−２９）。【０２３２】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで、変数Ｎに、当該Ｎの値の半分（Ｎ／２）の値を代入する（ステップＳＤ−３０）。【０２３３】
つぎに、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで焦点位置決定部７０'ａ２を動作させ、焦点位置決定部７０'ａ２でＣkの値とＣk+1の値との大小を比較し、「Ｃk＝Ｃk+1」でない場合（ステップＳＤ−３１：Ｎｏ）には、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で対物レンズ３０'を光軸（ｚ軸）の負（−）方向に、ステップＳＤ−３０で更新された移動ステップ数Ｎだけ移動させ（ステップＳＤ−３２）、情報処理装置７０'の制御部７０'ａでＣk+1の値をＣkに代入すると共にＺk+1の値をＺkに代入して（ステップＳＤ−３３）、ステップＳＤ−２８へ戻る。また、焦点位置決定装置１'は、「Ｃk＝Ｃk+1」であった場合（ステップＳＤ−３１：Ｙｅｓ）には、焦点位置決定部７０'ａ２で、Ｃkの値がコントラストの極小値であると判断すると共に、当該極小値に対応する対物レンズ３０'の位置が試料１０'の観察対象部位１０'ａに合うような対物レンズ３０'の焦点位置であると決定し、Ｃkが得られたときの対物レンズの位置Ｚkの値を、予め設定した変数Ｚminへ格納する（ステップＳＤ−３４）。【０２３４】
そして、焦点位置決定装置１'は、情報処理装置７０'の制御部７０'ａで対物レンズ移動部４０'を動作させ、対物レンズ移動部４０'で、対物レンズ３０'を変数Ｚminの値に対応する位置へ移動する（ステップＳＤ−３５）。
これにて、図３４および図３５に示す焦点位置決定処理の説明を終了する。【０２３５】
以上、説明したように、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、対物レンズの位置を移動させながら試料を撮像すると共に対物レンズの焦点位置を計測し、撮像した画像に基づいて、画像を構成する各画素の画素値の最大値と最小値との差であるコントラストを算出し、算出したコントラストおよび計測した対物レンズの焦点位置に基づいて観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定する。これにより、試料内の特定の部位を観察対象部位として当該観察対象部位の発光観察を行う場合、試料を設置した時点で、当該観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を決定することができ、その結果、対物レンズの焦点位置を当該観察対象部位に合わせることができる。また、試料内の発光部位の発光観察を行う際、当該発光部位からの発光を確認しなくても、試料内の発光部位に対物レンズの焦点を合わせることができる。【０２３６】
なお、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、算出したコントラストを他のものと比較してその極小値を１つ探索し、探索した極小値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。具体的には、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、対物レンズをステップ毎にｚ軸方向に移動し、それぞれのステップで画像のコントラストを比較し、画像のコントラストが極小となるときの対物レンズのｚ軸位置を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。これにより、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができる。【０２３７】
また、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、算出したコントラストを他のものと比較してその極大値を２つ探索し、探索した各極大値の元となる画像を撮像したときの対物レンズの焦点位置の中間を、観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。具体的には、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、対物レンズをステップ毎にｚ軸方向に移動し、それぞれのステップで画像のコントラストを比較し、画像のコントラストが極大となるときの対物レンズのｚ軸位置を２箇所決定し、この２箇所の極大値に対応する対物レンズのｚ軸位置の中間位置を、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置として決定してもよい。これにより、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を容易に決定することができる。【０２３８】
また、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、対物レンズの位置を、その移動量を段階的に減らしながら移動させてもよい。具体的には、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、対物レンズのｚ軸方向の移動の幅を移動のステップ毎にほぼ半分にして、対物レンズを移動させてもよい。これにより、試料内の観察対象部位に合うような対物レンズの焦点位置を迅速に決定することができる。【０２３９】
また、第３実施形態の焦点位置決定装置１'は、コントラストを、画像を構成する各画素の画素値のうち最大値を含む複数の上位の画素値の平均値と、画像を構成する各画素の画素値のうち最小値を含む複数の下位の画素値の平均値との差として定義してもよい。これにより、撮像した画像に擬似信号（例えば反射光や散乱光などのノイズ光によるものなど）が入り込んでいても、当該画像から信頼性の高いコントラストを算出することができる。【０２４０】
［ＩＩ］以下に、本発明にかかる微弱光検出装置および微弱光検出方法の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。【０２４１】
［第１の実施の形態］
図３６から図３７を用いて、第１の実施の形態の構成について説明する。図３６は倒立型顕微鏡をベースとする微弱光検出装置の概略図である。微弱光検出装置は、光源Ａ２と、光源Ａ２から発せられた光を平行光とし、被験試料Ａ４へ導くための照明光学系Ａ１と、被験試料Ａ４の像を生成するための観察光学系Ａ５と、被験試料Ａ４の像を拡大して目視観察するための接眼レンズＡ６と、被験試料Ａ４の像を撮像するための撮像素子Ａ７を有するＣＣＤカメラＡ８とにより構成されている。またＣＣＤカメラＡ８には、テレビモニターを兼ねるコンピューターＡ１６が信号ケーブルＡ１００によって接続されている。【０２４２】
照明光学系Ａ１は、光源Ａ２側から順に、コレクターレンズＡ１０、照明光の光軸Ａ１１を偏向させるための偏向ミラーＡ１２、及びコンデンサレンズＡ１４により構成される。光源Ａ２はハロゲンランプ、ＬＥＤ光源、タングステンランプ、水銀ランプなどの可視域の波長のインコヒーレント光源を用いる。あるいはレーザーのようなコヒーレント光源の光を拡散板などを用いてインコヒーレントな光に変えて、光源として用いても良い。光源の波長は通常、可視光を用いるが、赤外光を用いても良い。【０２４３】
観察光学系Ａ５は、被験試料Ａ４側から順に、被験試料Ａ４の像を形成するための対物レンズＡ１５、第１のリレーレンズＡ１６、対物レンズＡ１５からの光を偏向するための偏向ミラーＡ１７、第１のリレーレンズＡ１６と共に対物レンズＡ１５の像（被験試料Ａ４の像）を結像面Ａ１９に結像させるための第２のリレーレンズＡ１８により構成される。また、第２のリレーレンズＡ１８と結像面Ａ１９との間には、被験試料Ａ４の像を接眼レンズＡ６による目視観察とＣＣＤカメラＡ８による観察が任意に切り替えることができるように、切替ミラーＡ２０が配置されている。なお、切替ミラーＡ２０は機械的な切り替えタイプ以外に、ハーフミラーを用いて２つの光路を分離するようにしても良い。【０２４４】
次に本発明による微弱光検出装置の構成について、図３７を用いて説明する。被験試料はシャーレなどの試料容器Ａ２１に、培養液と共に入れられる。試料容器Ａ２１の周囲には水槽Ａ２２が配置されており、この水槽Ａ２２内に純水がノズルＡ２３を通して供給される。この純水は試料容器内の湿度を保つために送られる。また水槽Ａ２２の上面にはガス供給チューブＡ２４を通してＣＯ2ガスが供給される。ＣＯ2ガスは測定装置本体の外部に置かれたガスボンベＡ２５から供給される。図３９参照。ガスボンベ内はＣＯ2５％、Ｏ2９５％の混合ガスで満たされている。ＣＯ2ガスはガスボンベＡ２５から試料容器Ａ２１が入ったフタ付き密閉容器Ａ３０内へ、ガス供給チューブＡ２４を通って、５０ｍＬ／ｍｉｎの流速で供給される。また、試料容器全体はヒートプレートＡ２７の上に乗っている。ヒートプレートＡ２７は温度コントローラー（図示しない）により環境温度の設定が０．５°ステップ間隔で行なわれている。試料容器Ａ２１の底面は顕微鏡用カバーガラスと同じ材質で、厚さ０．１７ｍｍになっており、通常の対物レンズが対応できるようになっている。試料容器Ａ２１の底面は光学的に透明になっている。なお、試料容器Ａ２１はシャーレに限ることなく、スライドガラス、マイクロプレートなどを用いても良い。【０２４５】
試料容器Ａ２１の上面には試料容器フタＡ２６が、試料容器Ａ２１の上面前面を覆って、かぶせられるように配置されている。試料容器フタＡ２６は光学的に透明なアクリル樹脂などの合成樹脂でできており、試料容器Ａ２１内の被験試料Ａ４内にゴミなどの異物が侵入することを防いでいる。また、試料容器Ａ２１内の被験試料Ａ４が蒸発することも防いでいる。水槽Ａ２２を含めた試料容器Ａ２１はフタ付き密閉容器Ａ３０内に収められている。フタ付き密閉容器Ａ３０は光学的に透明なアクリル樹脂などの合成樹脂でできており、上面には蝶番Ａ３２を介して、フタＡ３１が取り付けられている。フタＡ３１は蝶番Ａ３２により、手動で開閉することができる。【０２４６】
試料ステージＡ３には２個のステッピング・モーター（図示しない）がそれぞれ９０°方向に別々に取り付けられており、それぞれのステッピング・モーターは試料ステージコントローラーに接続されている。試料ステージコントローラーはコンピューターＡ１６に接続されており、コンピューターＡ１６からの指令により、２個のステッピング・モーターを駆動し、試料ステージＡ３をＸ方向、Ｙ方向に移動させる。試料ステージＡ３下方には対物レンズＡ１５が倒立に配置されており、対物レンズヒーターＡ２８が対物レンズＡ１５に接触して周囲に取り付けられている。対物レンズヒーターＡ２８は温度調整装置につながれており、０．５°ステップ間隔で温度コントロールが行なわれ、対物レンズを外側から一定温度に保持している。また、対物レンズヒーターの周囲には対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９が備えられており、対物レンズＡ１５をＺ軸（光軸方向）に沿って自動的に駆動する。対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９はラックピニオン機構（図示しない）で対物レンズを上下に移動させる。ラックピニオン機構のノブの回転動作はコンピューター制御されたステッピングモーター（図示しない）により行なう。なお、対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９はラックピニオン機構のほかに、フリクションローラー機構で行なっても良い。【０２４７】
受光器はＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラを用いる。図３９を用いて、受光部分の構成を説明する。ＣＣＤカメラＡ８の受光面にある撮像素子の画素数は１，３６０×１，０２４となっている。被験試料から発せられた光が微弱光のため、受光器としてのＣＣＤカメラＡ８はできる限り高感度のものを用いる。ＣＣＤカメラＡ８から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラＡ８の底部にはペルチエ素子から成る冷却装置Ａ２９が備え付けられており、ＣＣＤカメラＡ８の温度を０℃程度で冷却保温する。ＣＣＤカメラＡ８の受光面の上方に赤外線カットフィルターを配置し、背景光となる赤外線を遮断する。ＣＣＤカメラには信号ケーブルを通してＴＶモニターが接続されており、ＴＶモニター上に試料画像が描出される。ＣＣＤカメラは３板式カラーカメラとして、カラーの明視野像が得られるようにしても良い。【０２４８】
なお光検出器はＣＣＤカメラに限ることなく、例えばＣＭＯＳ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍｅｔａｌ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）イメージセンサーやＳＩＴ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ  Ｔａｒｇｅｔ）カメラなどを用いても良いのは勿論である。【０２４９】
生物発光タンパク質による発光現象を測定する場合、試料セッティング時には発光強度がまだ極めて微弱で、ほとんど光信号として、受光器で検出することができない。従って、細胞の内部構造は通常、観察できない。すなわち、通常の顕微鏡観察のように、試料内の観察対象である細胞を確認しながら対物レンズのフォーカスを合わせることができない。そこで明視野像観察として、ハロゲンランプなどの光源からの光を照明光学系を通して、被験試料に投光し、被験試料による顕微鏡の明視野像を得て、これに基づいて対物レンズのフォーカス位置を決定する。すなわち、明視野観察において、高いコントラスト像が得られる、対物レンズの光軸上の２箇所の略中心位置を対物レンズのフォーカス位置とする。これにより、生物発光タンパク質による発光強度が大きくなってきたときに、ＣＣＤカメラに合焦された鮮明な発光像が得られる。対物レンズの焦点位置決定方法は先の実施例で詳細に説明した。【０２５０】
次に、第１の実施の形態の光学系の作用について図３６に基づいて説明する。光源Ａ２はコレクタレンズＡ１０により平行光とされ、コンデンサーレンズＡ１４の瞳位置に投影される。この光源Ａ２の像は、コンデンサーレンズＡ１４によってケーラー照明として被験試料Ａ４を照明する。被験試料Ａ４を照明した光は、被験試料Ａ４を透過して対物レンズＡ１５に入射する。対物レンズＡ１５に入射した測定光は、対物レンズＡ１５と第１のリレーレンズＡ１６及び第２のリレーレンズＡ１８により結像面Ａ１９に被験試料Ａ４の像を形成する。ここでは倍率×２０の対物レンズを用いている。【０２５１】
結像面Ａ１９に形成された被験試料Ａ４の像は、接眼レンズＡ６にそのまま入射すると共に、切替ミラーＡ２０により、ＣＣＤカメラＡ８の撮像素子Ａ７上に結像する。ＣＣＤカメラＡ８の受光面の前方に赤外線カットフィルターＡ１３が設置され、これにより背景光となる赤外線を遮断する。なお、対物レンズを移動させるに限らず、試料ステージＡ３を光軸に沿って移動させても良いことは勿論である。【０２５２】
次にディジタルズーム機能について、図３９のブロック図に基づき、説明する。被験試料の画像はＣＣＤカメラＡ８の撮像素子Ａ７に入力され、ここでアナログの電気信号、すなわち画像信号に変換される。変換後の画像信号は信号処理回路Ａ３３に入力され、ここで増幅処理やフィルタリング処理、輪郭強調などの画像処理が施された後、ディジタルズーム回路Ａ３４に導かれる。画像信号はディジタルズーム回路Ａ３４によりＡ／Ｄ変換されてディジタル画像信号が生成されるとともに、このディジタル画像信号に対しＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）Ａ３５から与えられるディジタルズーム制御信号に応じてディジタルズーム処理が施される。そして、この処理後のディジタル画像信号は、表示制御回路Ａ３８を通ってＴＶモニタＡ３７に入力され、ＴＶモニタＡ３７の画面上に被験試料の拡大画像が表示される。【０２５３】
一方、ディジタルズーム回路から出力されるディジタル画像信号は、記録再生制御回路Ａ３８にも入力される。記録再生制御回路Ａ３８は入力されたディジタル画像信号を、ＣＰＵＡ３５から与えられる記録制御信号に基づいて、メモリスロット（図示しない）に収容されている着脱可能な記録媒体Ａ３９に記録する。記録媒体としてメモリカードが用いられる。また記録再生制御回路Ａ３８は、ＣＰＵＡ３５から与えられる再生制御信号に応答して、記録媒体Ａ３９に記録されているディジタル画像信号を読み出す。この読み出されたディジタル画像信号は、表示制御回路Ａ３８を介してＴＶモニタＡ３７に入力され、これによって、ＴＶモニタＡ３７の画面上に被験物体の画像が表示される。なお、画像の記録はメモリカードに限ることなく、例えばハードディスク、磁気ディスク、光磁気ディスクなどの記録媒体に記録しても良い。【０２５４】
また、ＣＰＵＡ３５には図４０に示すような操作パネルＡ４０がつながれている。操作パネルＡ４０には電源スイッチＡ４６が備えられており、操作パネルＡ４０の電源のオン・オフを行なう。操作パネルＡ４０による指示で、ＣＰＵＡ３５を介し、ディジタルズーム制御信号をディジタルズーム回路Ａ３４に供給する。このとき、ＣＰＵＡ３５から発せられるディジタルズーム制御信号は、矩形波の連続パルス信号となっている。そして操作パネルＡ４０には、録画ボタンＡ４２および再生ボタンＡ４３も組み込まれている。このうち録画ボタンＡ４２をＯＮすると、ＣＰＵＡ３５は録画モードに入り、録画制御信号を生成して記録再生制御回路Ａ３８に供給する。一方、再生ボタンＡ４３をＯＮすると、ＣＰＵＡ３５は再生モードに入り、上述した再生制御信号を生成して記録再生制御回路Ａ３８に供給する。このＣＰＵＡ３５の動作を制御するための制御プログラムは、メモリＡ４１に記憶されている。【０２５５】
これらボタンの押圧操作によって操作基板からＣＰＵＡ３５に、各ボタンに対応した指示信号を出力して、ズーム中心位置、ズーム倍率などの調節を行なう。なお、図４０においてはこれらシャッタボタンＡ４８、ズーム拡大ボタンＡ４３、ズーム縮小ボタンＡ４４、十字カーソルボタンＡ４５を例として示し、他の操作部材はその表記を省略する。【０２５６】
以上の説明から判るように、この第１実施の形態の微弱光測定装置は、取得された画像信号をディジタル処理することによって、ズーム倍率を調整可能なディジタルズーム機能を有している。ディジタルズーム機能によるズーム倍率Ｍは、最大で４．０倍であり、上述したディジタルズーム制御信号に従ってディジタルズーム回路Ａ３４を制御することで、Ｍ＝１．００〜４．００の範囲内で当該ズーム倍率Ｍを可変できる。なお、ディジタルズーム機能を担うディジタルズーム回路Ａ３４については、公知の技術を用いているので、ここでは説明を省略する。【０２５７】
前記デジタル信号処理部は、アナログ信号処理部（Ａ／Ｄ変換器）から入力された画像データに、必要に応じてガンマ補正などのデジタル処理を施すほか、ＣＰＵＡ３５からの制御信号に基づいて、ＣＣＤによって取り込まれた画像データ（ＣＰＵの全画素領域の画像データ）からデジタルズーム領域の画像データを取り込む画像取込手段として用いられる。すなわち、デジタル信号処理部にＣＰＵＡ３５からズーム倍率およびズーム中心位置を制御する制御信号が入力されることで、該ズーム中心位置を中心とした該ズーム倍率の画像データを切り出して１画面分の画像を生成し、この画像をデジタルズーム領域の画像として取り込むことができる。【０２５８】
特にデジタル信号処理部では、ズーム中心位置およびズーム倍率をオペレーターに視覚的に示すため、取り込んだデジタルズーム領域の画像を表示メモリに出力し、ＴＶモニタＡ３７に表示させることができる。これにより撮影者はズーム中心位置を把握できるほか、前記十字カーソルボタンＡ４５を押圧操作することで、ズーム中心位置を任意位置に移動でき、所望の位置でズーム中心位置を指定できる。また、ズーム拡大ボタンＡ４３、ズーム縮小ボタンＡ４４を押下操作することで、デジタルズーム領域を変化させて所望のズーム倍率に指定できる。【０２５９】
前記メモリカードＡ３９は画像データを記録保存する。図４０に示すように、モードスイッチＡ４７を撮像モードとし、シャッターボタンＡ４８の押下操作により、画像の記録指示入力があると、ＣＰＵＡ３５からデジタル信号処理部に制御信号が出力され、ＣＣＤから１コマ分の画像データが読み込まれ、デジタル信号処理部にてデジタル信号処理が施された後、この画像データがメモリＡ４１に書き込まれる。メモリＡ４１に書き込まれた画像データは圧縮回路によって圧縮処理されて、記録再生制御回路Ａ３８によってメモリカードＡ３９に記録され、保存される。【０２６０】
表示画像のズーミングはデジタルズームに限ることなく、光学ズームを用いて行なっても良い。光学ズームはズームレンズにより行なう。光学ズームは通常行なわれているように、ＣＣＤカメラと第２のリレーレンズの間の焦点距離をステッピングモーターによるモーター駆動で、光軸に沿って移動させて行なう。ズームレンズの構成は３変倍レンズ群、収差補正などを行なう補正レンズ群、およびフォーカス調整を行なうフォーカスレンズから成り、レンズの焦点距離を１０段階で手動、または自動で変化できるようになっている。ズームレンズの駆動はズームレンズの周囲に取り付けられたズームモーターの作動により行なわれる。ズームモーターは超音波モータなどが用いられており、ＣＰＵＡ３５から発せられる制御信号に基づいて、レンズを光軸に沿って移動させる。【０２６１】
［第２の実施の形態］
（蛍光と生物発光の同時測定）
デジタルズームと光学ズームを同時に行なうことができ、また、蛍光と生物発光の同時測定を行なうことができる微弱光検出装置の光学系の概略を図４１に示す。なお、光学系の構成や動作については、励起用光学系Ａ４９が追加されている以外は、基本的に図３６の第１の実施の形態で説明した内容と同じである。基本的な構成は倒立型光学顕微鏡をベースに用いている。そして照明用光源、試料ステージ、対物レンズ、コンピューターが付属する。光学系は光をシャーレなどの試料容器Ａ２１内の被験物体Ａ４に導く照明光学系Ａ１、そして、被験物体Ａ４から発せられた微弱光をＣＣＤカメラＡ８に導く観察光学系Ａ５より構成される。【０２６２】
励起用光学系Ａ４９は励起光源Ａ５０、コリメートレンズＡ５１、偏向ミラーＡ５２、切り替式ダイクロイックミラーＡ５３より構成される。励起光源は通常、アルゴンレーザー、ヘリウムネオン・レーザーなどの可視域のガスレーザーが用いられる。また、切り替式ダイクロイックミラーＡ５３は励起光源の発振波長の光を反射し、螢光、および発光信号のスペクトルを透過させるスペクトル特性を持っている。
本体外部には励起光源Ａ５０が備えられている。励起光源Ａ５０は波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷのアルゴン・レーザーである。レーザー光はコリメートレンズによりビーム幅を有する円形の平行光束に変換されて偏向ミラーＡ５２で反射され、観察光学系Ａ５に設置された切り替式ダイクロイックミラーＡ５３に入射する。観察光学系Ａ５に入射したレーザー光は、切り替式ダイクロイックミラーＡ５３により反射されて対物レンズＡ２８に下から入射し、試料容器Ａ２１内の被験試料Ａ４に集光して照射される。切り替式ダイクロイックミラーＡ５３はホルダー（図示しない）に収められており、励起レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に設置される。なお、励起光源Ａ５０の波長を変更する必要がなければ、切り替式ダイクロイックミラーＡ５３を用いず、通常のダイクロイックミラーを固定して観察光学系Ａ５の中に設置しても良い。【０２６３】
細胞画像を得るためにＮＡ（開口数）０．９程度の開口数の対物レンズを用いる（空気中の場合）。液浸された被験試料に対しては１．０以上の高ＮＡの対物レンズを用いる。被験試料Ａ４から発せられた蛍光信号、あるいは発光信号は再び対物レンズＡ１５を通って、装置本体の観察光学系Ａ５を通過し、切り替式ダイクロイックミラーＡ５３に達する。そして切り替式ダイクロイックミラーＡ５３を透過し、第１のリレーレンズＡ１６、第２のリレーレンズＡ１８を通って、切り替ミラーＡ２０で反射され、ＣＣＤカメラＡ８内の撮像素子Ａ７の受光面に焦点を結ぶ。
被験試料から発せられた蛍光信号、あるいは発光信号は切り替ミラーＡ２０を光路から取り外した場合は、結像面Ａ１９で結像した後、接眼レンズＡ６に到達し、画像を直接、観察者が観察することができる。【０２６４】
ＣＣＤカメラＡ８からの光信号は微弱光装置本体外部に置かれたコンピューターＡ１６に送られ、コンピューターＡ１６により、発光画像の描出、解析、また発光強度の時間測定、信号解析などが行なわれる。解析結果はコンピューターＡ１６のモニター画面上に表示される。すなわち、コンピューターＡ１６は試料画像を描出するのみでなく、発光強度の時間変化などの解析も行なう。
蛍光色素としてローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＲｈＧ）を用いる。螢光物質として、ローダミン・グリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＲｈＧ）以外に、例えばＴＭＲ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、５−Ｔａｍｒａ（５−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などを用いても良い。この場合、螢光物質ＴＭＲを励起するために、波長５１４．５ｎｍのアルゴンレーザー、螢光物質５−Ｔａｍｒａを励起するために波長５４３．５ｎｍのＨｅ・Ｎｅレーザーなどを励起レーザー光源として用いればよい。その他螢光色素としてＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＴＯＴＯ  １、Ａｃｒｉｄｉｎｅ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄなどを用いても良い。【０２６５】
図４２にデジタルズームと光学ズームを同時に行なうことができ、また、蛍光と生物発光の同時測定を行なうことができる微弱光検出装置の実施例を示す。測定装置本体はアルミニュウムなどの金属板の表面を黒色塗装し、ボックス型に組み合わせた構造の遮光ボックスＡ５４内に入れられ、底板Ａ５５に止め具Ａ５６で固定されている。遮光ボックスＡ５４は上面に遮光フタＡ５７が分離して取り付けられており、遮光フタＡ５７の一端は遮光ボックスＡ５４本体と蝶番Ａ５８で連結され、遮光フタＡ５７は扇状に手動、または自動で開閉できるようになっている。
照明用の光源として、例えばハロゲンランプ、あるいはメタルハライドランプなどのインコヒーレント光源を用いる。照明用の光源は光源ボックスＡ５９内に設置されている。光源ボックスＡ５９からは照明用光ファイバーＡ６０を通して試料ステージＡ３上の試料容器Ａ２１上面から照明光を導き、被験試料Ａ４全体を照明する。観察光学系では第１の実施例で用いた偏向ミラーは用いず、対物レンズＡ１５により集光した被験試料Ａ４から発せられた信号光を、レンズＡ６７を通してＣＣＤカメラＡ８で受光する。【０２６６】
微弱光測定装置本体外部にはレーザー光源Ａ６１が励起光源ボックスＡ６２内に固定されており、レーザー光源Ａ６１を出射したレーザー光は励起光源ボックスＡ６２内に取り付けられ、固定されたコリメーターレンズＡ６３により、ビーム直径が拡大された平行光となり、遮光ボックスＡ５４に配設されれた円形のレーザー入射口Ａ６４を通して、装置本体に入射する。レーザー光源Ａ６１として、波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷのアルゴン・レーザーを用いる。レーザー入射口Ａ６４を通して微弱光測定装置本体に入射したレーザー光は、切り替式ダイクロイックミラーＡ６５に到達し、切り替式ダイクロイックミラーＡ６５により反射されて、対物レンズＡ１５に下部から入射し、被験試料Ａ４に集光して照射される。切り替式ダイクロイックミラーＡ６５は励起光源の波長領域を含み、この波長領域より短い波長領域の光を反射し、励起光源の波長領域よりも長い波長領域の光を透過させる光学特性を持っている。切り替式ダイクロイックミラーＡ６５は鏡筒Ａ７０内でホルダーＡ７２に収められている。このホルダーＡ７２内に取り付けられた切り替式ダイクロイックミラーＡ６５は、励起レーザー光の発振波長に合わせて、交換可能に設置される。【０２６７】
鏡筒Ａ７０は鏡筒上部Ａ７８、鏡筒下部Ａ６６に分離しており、鏡筒上部Ａ７８、鏡筒下部Ａ６６は連結されている。鏡筒上部Ａ７８は支柱Ａ７３に鏡筒Ｚ軸駆動機構Ａ７６を介して保持されている。鏡筒上部Ａ７８は鏡筒Ｚ軸駆動機構Ａ７６の駆動動作により、光軸に沿って上下移動できるようになっている。なお、鏡筒Ｚ軸駆動機構Ａ７６はラックピニオン機構により光軸に沿って、鏡筒上部Ａ７８の位置を上下移動できるようになっている。【０２６８】
微弱光測定装置本体に取り付けられた鏡筒下部Ａ６６にはレンズＡ６７が配置されており、そのＺ軸上のフォーカス位置に受光面のほぼ中心が合うようにＣＣＤカメラＡ８が取り付けられている。レンズＡ６７はズームレンズになっている。ズームレンズの動作については第１の実施の形態で述べているので、説明を省略する。試料から発せられた光が微弱光のため、ＣＣＤカメラＡ８はできる限り高感度のものを用いる。ここで、ＣＣＤカメラＡ８の画素数は１，３６０×１，０２４となっている。ＣＣＤカメラＡ８から発する暗電流を抑えるために、ＣＣＤカメラＡ８の底部にはペルチエ素子から成る冷却装置Ａ２９が装着されており、ＣＣＤカメラＡ８の温度を０℃程度で冷却保温する。ＣＣＤカメラＡ８の受光面の上方に赤外線カットフィルターＡ６８を設置し、背景光となる赤外光を遮断する。ただし、赤外光を信号光として取り出す場合は、この赤外カットフィルターＡ６８を測定の前に鏡筒下部Ａ６６から取り外しておく。ＣＣＤカメラＡ８の出力部には信号ケーブルＡ６９を通して焦点検出部、続いて位置検出部、さらにコンピューターＡ１６が接続されており、コンピューターＡ１６に付属したＴＶモニターＡ７２上に試料画像が描出される。ＣＣＤカメラＡ８は３板式カラーカメラとして、カラーの明視野像が得られるようにしても良い。なお、本体架台は鏡筒Ａ７０をスライド上下させて、位置調整することができる。【０２６９】
試料容器Ａ２１はＸＹ試料ステージＡ３の上に止めピン（図示しない）で固定される。ＸＹ試料ステージはＸＹ平面に沿って、ラックピニオン機構により自在にＸＹ平面上の位置を移動できるようになっている。試料容器Ａ２１の下方に対物レンズＡ１５が設置されている。対物レンズＡ１５は対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９に取り付けられており、光軸（Ｚ軸）に沿って移動できる。対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９は導線Ａ６９によって、微弱光検出装置外部に設置された焦点検出部Ａ７０に接続し、焦点検出部Ａ７０から位置検出部Ａ７１に繋がれ、位置検出部Ａ７１の出力信号がコンピューターＡ１６に付属したＴＶモニタＡ７２に出力される。一方、導線Ａ６９は分岐され、ＣＣＤカメラＡ８の出力信号は信号処理部Ａ７４に導かれ、信号処理部Ａ７４の出力信号はコンピューターＡ１６に接続されている。【０２７０】
細胞から発せられた蛍光、あるいは発光信号は、対物レンズＡ１５、および切り替え式ダイクロイックミラーＡ６５を透過し、鏡筒下部Ａ６６に取り付けられたレンズＡ６７を通過して、ＣＣＤカメラＡ８の受光面に集光される。【０２７１】
微弱光測定装置本体はベース架台Ａ７５に固定されている。ベース架台Ａ７５は支柱Ａ７３に取り付けられており、ベース架台Ａ７５は上下移動できるようになっている。鏡筒下部Ａ６６はベース架台Ａ７５の上に止め具（図示しない）により固定されている。また支柱Ａ７３、ベース架台Ａ７５は底板Ａ５５の上に固定されている。【０２７２】
次に動作を説明する。ＣＣＤカメラＡ８から得られた、照明光源による被験試料の照明画像の信号を信号処理部Ａ７４に導き、各画素からの出力強度信号を統計処理して、光信号強度分布を得る。対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９と連動し、対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９を動作させて、対物レンズＡ１５を光軸に沿って適当量、移動させる。対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９は対物レンズ駆動装置Ａ７７に信号ケーブルを介して繋がれており、対物レンズ駆動装置Ａ７７による指令に基づいて、対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９が作動し、対物レンズＡ１５を自動的に上下動させることができる。【０２７３】
対物レンズＡ１５の移動ステップ毎にＣＣＤカメラＡ８からの光出力信号を信号処理部Ａ７４で信号解析し、高コントラスト画像が得られる対物レンズＡ１５の光軸上の位置を検出する。上下２箇所の高コントラスト画像が得られる対物レンズＡ１５の光軸上の位置を見つけ出し、信号処理部Ａ７４で計算を行なって、上下２箇所の略中央位置を被験試料Ａ４の発光位置とする。続いて、対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９を動作させて、この位置に対物レンズＡ１５を移動させる。これによって、対物レンズＡ１５のフォーカス位置が決定されたので、この位置で対物レンズＡ１５を固定し、被験試料Ａ４から発せられる蛍光信号、ならびに発光信号をＣＣＤカメラＡ８で受光する。対物レンズの焦点位置決定方法は先の実施例で詳細に説明した。【０２７４】
対物レンズＡ１５は交換可能に対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９に取り付けられている。対物レンズＡ１５の倍率を上げて被験試料Ａ４を撮像すると、得られた画像は暗くなる。細胞などの被験試料Ａ４は培養液中で動く。高倍率の対物レンズでこれを観察すると、視野が狭くなり、場合によっては被験試料Ａ４が動いて、視野からいなくなってしまうことがある。従って、まず、×１０、×２０といった低倍率の対物レンズで被験試料Ａ４を観察する。そして、被験試料Ａ４の所望の位置を確認してマウスやキーボードを用いて指定し、試料画像のズームアップを行なう。あるいは、発光画像における発光部分と、それ以外の部分の光強度について、スレショッドを決めて２値化し、発光部分の領域を求め、この領域についてズームアップを行なっても良い。【０２７５】
なお、信号処理部Ａ７４を省略し、信号処理部Ａ７４の機能をコンピューターＡ１６の機能に兼ねて用いても良い。【０２７６】
対物レンズＺ軸駆動機構Ａ９は導線Ａ６９によって、微弱光検出装置外部に設置された焦点検出部Ａ７０に接続し、焦点検出部Ａ７０から位置検出部Ａ７１に繋がれ、位置検出部Ａ７１の出力信号がＴＶモニタに出力される。【０２７７】
（測定手順）
１）ディジタルズームまたは光学ズームのいずれかを行なう場合の測定手順を以下に示す。
デジタルズームを行なう場合のフローチャートを図３８に示す。
１．被験試料（細胞）を培養液が入ったシャーレ（試料容器）に浸す。
２．光源による照明開始。
３．受光器の電源を入力し、被験試料（細胞）の画像を描出。焦点位置決定方法および装置を用いて、被験試料の焦点位置を決定し、対物レンズを焦点位置に移動する。
４．得られた画像のうち、所望の領域を指定。
５．光源による照明終了。
６．励起光源を入力。
７．被験試料（細胞）の蛍光画像を描出。
８．励起光源の電源を落とす。
９．被験試料（細胞）の発光画像を描出。
１０．ディジタルズームを行なう場合、所望の発光領域を指定。
１１．ディジタルズーム駆動。
１２．デジタルズームを行なって所望のズーム画像が得られた場合、対物レンズの焦点位置決定動作を行ない、対物レンズを被験試料の焦点位置に移動する。その後、これをＴＶモニタ上に表示、またはメモリカードに入力。デジタルズームを行なって所望のズームが得られなかった場合、発光領域の指定をやり直す、或いは焦点位置のずれ量をデジタル画像解析により算出して、ずれ量に応じた補正位置に対物レンズを移動して９．に戻る。
１３．終了。
ただし、蛍光画像の重ね合わせが不要な場合は、励起光源による細胞内の所望の部位に標識された蛍光物質の励起は行なわない。発光画像だけでも同様に対物レンズの焦点位置検出を行ない、対物レンズを焦点位置に移動し、デジタルズーム、あるいは光学ズーム、あるいはデジタルズームと光学ズームの両方を行うことができる。焦点位置決定方法および装置を用いて、被験試料の焦点位置を決定するタイミングは、得られた画像のうち、所望の領域を指定した後、すなわち４．の後に行なってもよい。また、必要に応じて、対物レンズの焦点位置決定動作は３．または１２．のうちいずれか１回でもよい。【０２７８】
２）ディジタルズームと光学ズームを同時に行なう場合の測定手順を以下に示す。
フローチャートを図４３に示す。
１．被験試料（細胞）を培養液が入ったシャーレ（試料容器）に浸す。
２．光源による照明開始。
３．受光器の電源を入力し、被験試料（細胞）の画像を描出。焦点位置決定方法および装置を用いて、被験試料の焦点位置を決定し、対物レンズを焦点位置に移動する。
４．得られた画像のうち、所望の領域を指定。
５．光源による照明終了。
６．励起光源を入力。
７．被験試料（細胞）の蛍光画像を描出。
８．励起光源の電源を落とす。
９．被験試料（細胞）の発光画像を描出。
１０．所望の発光領域を指定。
１１．デジタルズームを行なう場合、上述した測定手順１）の１０．〜１２.を行う。但し、この測定手順２）ではずれ量の算出を行わずに、デジタルズームで得た画像では所望の画像が得られないとオペレータが判断した場合には光学ズーム駆動（図４２のズームレンズＡ６７の移動）を行って発光画像を描出（表示）する。
１２．光学ズーム駆動。対物レンズの焦点位置決定動作を行ない、対物レンズを被験試料の焦点位置に移動する。
１３．終了。焦点位置決定方法および装置を用いて、被験試料の焦点位置を決定するタイミングは、得られた画像のうち、所望の領域を指定した後、すなわち４．の後に行なっても良い。また、必要に応じて、対物レンズの焦点位置決定動作は３．または１２．のうちいずれか１回でもよい。
ただし、蛍光画像の重ね合わせが不要な場合は、励起光源による細胞内の所望の部位に標識された蛍光物質の励起は行なわない。発光画像だけでも同様に対物レンズの焦点位置検出を行ない、対物レンズを焦点位置に移動し、デジタルズーム、あるいは光学ズーム、あるいはデジタルズームと光学ズームの両方を行うことができる。デジタルズーム、及び光学ズームを行なった後、さらに対物レンズの焦点位置決定動作を行なうことにより、試料内の所望の領域において、より鮮明な画像を得ることができる。【０２７９】
以上、本発明を実施の形態によって説明したが、上述した説明から導出されるあらゆる発明を包含しており、その均等物にも及ぶ。また、本発明は、上述した実施の形態に制限されず、種々の変更が可能であり、それらの設計物ないし製造物もしくは使用する方法を包含する。なお、第２の実施の形態では、デジタルズーム画像により発光量の計測を行うとともに、光学ズーム画像により観察用画像を得るような併用も可能である。このようなデジタル画像と光学画像を併用する場合には、タイムラプスによる連続的な発光量の計測を行いながら、別途、高倍率での鮮明な発光画像を描出することが可能である。
また、蛍光と異なり、生物発光のような極めて微弱な発光画像は、画像形成に必要な発光シグナルを所定時間露光する蓄積時間が被験試料の種類に応じて１０〜６０分と長い画像形成時間を必要とする。単に、光学ズームしようとして倍率を高くした場合に低倍率におけるよりも長い露光時間を必要とする。これにより、光学ズームにより微弱発光画像を取得するようにすると、低倍率の場合に対して高倍率の場合に２倍以上の露光時間が必要となり、画像形成だけで非常に長時間かかってしまう。一方、タイムラプスによる撮像を行う場合には、撮像間隔よりも長い露光時間では撮像出来ないので、なるべく短時間に拡大した微弱光画像を得る必要がある。撮像する被験試料の数が多いほど、デジタルズームにするのが好ましい。
なお、デジタルズーム画像は、光学ズーム画像と違って、既に取得済み画像をデジタルで拡大するだけで迅速に拡大画像が得られるので、低倍率の逐一の画像化モニタリング中に、いつでも所望の部位を指定して、その拡大画像を拡大する前の画像とともに並列表示できる。
【実施例】
【０２８０】
本実施例では、第２実施形態の焦点位置決定装置１でプラスミドベクターを導入した複数のＨｅＬａ細胞に対物レンズの焦点を合わせ、複数のＨｅＬａ細胞の中から対象とするＨｅＬａ細胞を選定し、選定したＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアからの発光量およびＡＴＰ量を経時的に測定した。まず、本実施例における実験を、以下の（手順１）〜（手順７）に従って行った。【０２８１】
（手順１）蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とミトコンドリア移行シグナルとルシフェラーゼとが繋がった融合遺伝子を作製する。
（手順２）融合遺伝子が入ったプラスミドベクターをＨｅＬａ細胞に導入する。
（手順３）焦点位置決定装置１により、ＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアに対物レンズの焦点位置を予め合わせて、ＣＣＤカメラでＨｅＬａ細胞を照明下と照明無しのそれぞれで撮像し、撮像した撮像画像（蛍光画像）に基づいてＧＦＰがミトコンドリアに局在しているか否かを判定することで、ルシフェラーゼがミトコンドリアに局在しているか否かを確認する（図２３参照）。図２３はプラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の照明画像および蛍光画像を示す図である。
（手順４）ＨｅＬａ細胞にヒスタミンを投与し、Ｃａ2+を介したミトコンドリアのＡＴＰ量の変動を引き起こす。
（手順５）ＣＣＤカメラでＨｅＬａ細胞を照明下と照明無しのそれぞれで撮像することで、ＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアからの発光を捉えた発光画像を経時的に取得する（図２４参照）。図２４はプラスミドベクターを導入したＨｅＬａ細胞の照明画像および発光画像を示す図である。
（手順６）撮像した照明画像、蛍光画像および発光画像を重ね合わせることで、対象とするＨｅＬａ細胞を選定する。
（手順７）選定したＨｅＬａ細胞内のミトコンドリアからの発光強度の時間変化を測定すると共に、ＡＴＰ量の時間変動をモニタする。【０２８２】
つぎに、実験結果について説明する。図２３に示すように、番号１のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していることが確認できた。また、番号２および番号４のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されていないことが確認できた。さらに、番号３のＨｅＬａ細胞においては、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入されているがミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していないことが確認できた。つまり、プラスミドベクターにより融合遺伝子が導入され且つミトコンドリアにルシフェラーゼが局在していることが確認できたＨｅＬａ細胞は番号１のＨｅＬａ細胞のみであったので、対象とするＨｅＬａ細胞は番号１のＨｅＬａ細胞に選定された。また、図２４に示すように、番号３のＨｅＬａ細胞からの発光強度が最も大きく、ついで番号１のＨｅＬａ細胞からの発光強度が大きく、ついで番号２および番号４のＨｅＬａ細胞からの発光強度は同等の大きさであることが確認できた。そして、図２５に示すように、番号１のＨｅＬａ細胞のミトコンドリアからの発光強度の経時変動をモニタすることができた。図２５は、選定した番号１のＨｅＬａ細胞からの発光強度の時間変化を示す図である。
【産業上の利用可能性】
【０２８３】
以上のように、本発明にかかる焦点位置決定方法、焦点位置決定装置、微弱光検出装置および微弱光検出方法は、生体細胞の発光観察、蛍光観察、蛍光・発光同時観察において、好適に実施することができる。また被験試料を設置した後、本実施例による対物レンズの焦点位置決定方法、または焦点位置決定装置を用いて、対物レンズの焦点位置を決定した後、被験試料の画像のデジタルズーム、または光学ズームを行なうことにより、画像拡大したときの画像が高コントラストで、しかも鮮明となり、画像を解析する上でも精度良く実施できるという利点がある。本発明の対物レンズの焦点位置決定方法、または焦点位置決定装置、さらにデジタルズーム、または光学ズームの方法、装置については、実施例で説明した生物発光タンパク質を含む生物試料に限らず、発光を伴わない通常の位相物体についても適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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