(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＳｈＫペプチド類縁体、又はその生理的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体と、医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３】
患者において、多発性硬化症の症状の再発を予防する又は軽減するための医薬の調製におけるＳｈＫペプチド類縁体の使用であって、前記ＳｈＫペプチド類縁体が請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体から選択される、前記使用。
【請求項４】
患者における、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病及び狼瘡からなる群から選択される自己免疫疾患を治療するための医薬の調製におけるＳｈＫペプチド類縁体の使用であって、前記ＳｈＫペプチド類縁体が請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体から選択される、前記使用。
【請求項５】
配列番号９１４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体。
【請求項６】
配列番号９１５のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体。
【請求項７】
配列番号９１６のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体。
【請求項８】
配列番号９１７のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のＳｈＫペプチド類縁体。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか１項に記載のＳｈＫペプチド類縁体をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
細胞が真核細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
細胞が哺乳動物細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細胞がＣＨＯ細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
細胞が原核細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
細胞がＥ．コリ細胞である請求項１１に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年４月２２日に出願された米国仮特許出願６０／６７２，３４２号の利益を主張する２００６年４月１７日に出願された米国非仮特許出願（出願番号未定）の利益を主張し、両出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願は、２００６年４月１７日に作製されたＡ−１００６．ＳＴ２５．ｔｘｔというファイル名によって特定され、ファイルサイズが７４４ＫＢであるコンパクトディスク上に含有される全ての主題を、参照により組み込む。
【０００３】
本願を通じて、様々な公報が括弧内に引用される。本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、これらの公報の開示内容全体が、参照により、本願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
１．発明の分野
本発明は、生物化学の分野に関し、具体的には、治療用ペプチド及び抱合体に関する。
【０００５】
２．関連技術分野の考察
イオンチャンネルは、膜を横切って、小さな無機イオンの交換を可能とする分子の多様な群である。全ての細胞は、機能のためにイオンチャンネルを必要とするが、神経系及び心臓中に存在する興奮性細胞などの興奮性細胞については、特にこのことが当てはまる。イオンチャンネルにより調整された電気信号は、考える脳、拍動する心臓及び収縮する筋肉を調節する。イオンチャンネルは、細胞容積を制御する役割を果たし、多様なシグナル伝達プロセスを調節する。
【０００６】
イオンチャンネルファミリーには、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＣａ２＋陽イオン並びにＣｌ−陰イオンチャンネルが含まれる。総称すると、イオンチャンネルは、リガンド開口型又は電圧開口型の何れかとして区別される。リガンド開口型チャンネルには、細胞外及び細胞内リガンド開口型チャンネルの両方が含まれる。細胞外リガンド開口型チャンネルには、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）受容体、グリシン及びγ酪酸受容体（ＧＡＢＡ）並びにカイニン酸、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）及びＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡ）受容体を含むグルタミン酸活性化チャンネルが含まれる（Ｈａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｏｕｚｏｕｎｉｓ（２００２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。細胞内リガンド開口型チャンネルには、環状ヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）、Ｃａ２＋及びＧタンパク質によって活性化されるものが含まれる。（Ｈａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｏｕｚｏｕｎｉｓ（２００２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。電圧開口型イオンチャンネルは、ナトリウム、カリウム、カルシウム及び塩化物イオンチャンネルを含む無機イオン種に対するそれらの選択性によって分類される。（Ｈａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｏｕｚｏｕｎｉｓ（２００２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。
【０００７】
電圧開口型イオンチャンネルの分類に対する統一された命名法が、最近発表された。（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７３−４；Ｇｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５，５８３−６；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７９−８１；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７５−８；Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５８７−９；Ｃｌａｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５５：５９１−６；Ｃｈａｎｄｙ（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：２６；Ｇｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３６５−８；Ｅｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：５３３−５）。
【０００８】
Ｋ＋チャンネルが、これまでに記載されているイオンチャンネルの最も大きく且つ最も性質決定が行われたファミリーを構成する。カリウムチャンネルは、６回膜貫通（６ＴＭ）Ｋ＋チャンネル、２ＴＭ−２ＴＭ／漏洩Ｋ＋チャンネル及び２ＴＭ／Ｋｉｒ内向き整流性チャンネルという３つの一般的な群に、細分される。（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６６，１３１−１５９）。これらの３つの群は、配列の類似性に基づいたファミリーへと、さらに細分される。（Ｋｖ１−６、Ｋｖ８−９）、ＥＡＧ、ＫＱＴ及びＳｌｏ（ＢＫＣａ）を含む電圧開口型Ｋ＋チャンネルは、６ＴＭ群のファミリーメンバーである。２ＴＭ−２ＴＭ群はＴＷＩＫ、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ、ＴＲＡＡＫ及びＴＨＩＫを含むのに対して、２ＴＭ／Ｋｉｒ群はＫｉｒ１−７からなる。イオンチャンネルのさらなる２つのクラスには、内向き整流性カリウム（ＩＲＫ）及びＡＴＰ開口型プリン作動性（Ｐ２Ｘ）チャンネルが含まれる。（Ｈａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｏｕｚｏｕｎｉｓ（２００２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４）。
【０００９】
様々な生物によって産生されるトキシンペプチドは、イオンチャンネルを標的とするように進化してきた。ヘビ、サソリ、クモ、ハチ、カタツムリ及びイソギンチャクは、イオンチャンネル及び受容体を強力且つ選択的に標的とする小さな生物活性トキシンペプチド又は「トキシン」の豊富な源としての役割を果たすことができる毒を産生する生物の数例である。多くの事例では、これらのトキシンペプチドは、チャンネルの孔に結合し、イオン伝導経路を物理的に遮断することによって、イオンチャンネルの強力なアンタゴニスト又は阻害剤として進化してきた。他の幾つかの事例では、タランチュラのトキシンペプチドの幾つかのように、ペプチドは、孔の外側領域（例えば、電圧センサードメイン）に結合することによってチャンネル機能を拮抗することが見出されている。
【００１０】
トキシンペプチドは、通常、約２０アミノ酸長と約８０アミノ酸長との間であり、２〜５個のジスルフィド結合を含有し、極めてコンパクトな構造を形成する（例えば、図１０参照）。（例えば、サソリ、イソギンチャク及びイモ貝から）トキシンペプチドが単離され、イオンチャンネルに対するそれらの影響が特徴付けられている。このようなペプチドは、効力及び安定性の重大な問題に対処するために特にきわめて適している構造的骨格の相対的に少数から進化してきたように見受けられる。サソリ及びイモガイのトキシンペプチドの多くは、例えば、１０〜４０個のアミノ酸及び最大５個のジスルフィド結合を含有し、しばしばタンパク分解を受けない極めてコンパクトで、固定された構造（ミクロタンパク質）を形成する。コノトキシン及びサソリトキシンペプチドは、それらのジスルフィド結合及びペプチドの折り畳みに基づいて、多数のスーパーファミリーに分類することが可能である。これらの多くの溶液構造がＮＭＲ分光法によって決定されており、それらのコンパクトな構造を示し、それらのファミリー折り畳みの保存を確認している。（例えば、Ｔｕｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９）；Ｊａｒａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ＯＳＫ１  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６（６）：１２２３−３２（１９９７）；ｄｅｌ  Ｒｉｏ−Ｐｏｒｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，；ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｎ１２，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｙｐｉｃａｌ  ｂｅｔａ−ｔｏｘｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｕｔ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１（１２）：２５０４−１６（２００４）；Ｐｒｏｃｈｎｉｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｅｐｉｎ，ａ  ｎｅｗ  Ｋ＋−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ＫＴｘ１５  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６））。
【００１１】
保存されたジスルフィド構造は、トキシンファミリーのそれぞれの薬理学的活性も反映し得る。（Ｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１  ：２３０５−１９，Ｔａｂｌｅ  １；Ａｄａｍｓ（１９９９），Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｒｅｓ．４６：２１９−３４）。例えば、α−コノトキシンは、明瞭に確定された４システイン／２ジスルフィドループ構造を有し（Ｌｏｕｇｈｎａｎ，２００４）、ニコチン性アセチルコリン受容体を阻害する。これに対して、ω−コノトキシンは、６システイン／３ジスルフィドループコンセンサス構造を有し（Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０００）、カルシウムチャンネルを遮断する。トキシンの構造的サブセットは、電圧開口型又はカルシウム活性型カリウムチャンネルを阻害するように進化してきた。図９は、ミツバチからカタツムリ及びサソリからヘビに至る、様々な有毒動物によって共有される保存されたジスルフィド構造の限られた数が、イオンチャンネルを標的とすることを示している。図７Ａ−Ｂは、α−サソリトキシンファミリーの並列を示しており、及び広範なカリウムチャンネルを標的とするトキシンを得るために保存された構造的骨格が使用されていることを図示している。
【００１２】
特異的イオンチャンネルの強力且つ選択的な遮断のために、トキシンペプチドは、イオンチャンネルの薬理学を調べるためのツールとして、長年にわたって使用されてきた。心臓、筋肉及び脳内に存在するような興奮性細胞及び組織以外では、イオンチャンネルは、免疫細胞などの非興奮性細胞に対しても重要である。従って、Ｋｖ１．３及びＩＫＣａ１などのカリウムチャンネルは、リンパ球内のカルシウムシグナル伝達経路を間接的に調節するので、とりわけ、これらのチャンネルの阻害による様々な免疫疾患の治療について、トキシンペプチドの潜在的な治療的有用性が検討されてきた［例えば、Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ，米国特許第６，０７７，６８０号；Ｌｅｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ，米国特許第６，６８９，７４９号；Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｃｈａｎｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｔｙｐｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＯＳＫ１  ，ａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５：９５−１０４（２００５）；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｔｏｘｉｎ  １  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒｉｍｍｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：３５４−６２（２００６）；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ，ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ＷＯ  ２００６／００２８５０  Ａ２；Ｂ．Ｓ．Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ？，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２：４０１−４２２（２００１）；Ｒａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ  Ｙｉｅｌｄｓ  ａｎ  Ａｎａｌｏｇ  Ｔｈａｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｖｅｒ  Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２０１−１２０８（２０００）；Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｕｒｏｔｏｘｉｎ：Ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｃａ２＋−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４０９−４１８（２００３）；Ｃｈ���ｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５：２８０−２８９（２００４）；Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｇａｒｃｉａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｖｅｎｏｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：７９０−８０２（２００３）］。
【００１３】
免疫疾患を治療するために、Ｔ細胞中のＫｖ１．３及びＩＫＣａ１カリウムチャンネル及び主要なカルシウム流入チャンネルの小分子阻害剤であるＣＲＡＣも開発されているが［Ａ．Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８，１２５４；Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＴＩＰＳ  ２５，２８０；Ｈ．Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２０４０；Ｃ．Ｚｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１２４２７］、これらの標的の幾つかに対して選択性を有する小分子を得ることは困難である。
【００１４】
リンパ球におけるカルシウム動員は、炎症性応答の活性化において不可欠な経路であることが知られている［Ｍ．Ｗ．Ｗｉｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２９９］。他の細胞に比べて、Ｔ細胞は、細胞内カルシウム及びイオンチャンネルの増加したレベル（何れも、直接的及び間接的にこのプロセスを調節する。）に対して特有の感受性を示す。イノシトール三リン酸（ＩＰ３）は、カルシウムシグナル伝達経路を活性化する天然のセカンドメッセンジャーである。ＩＰ３は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のリガンド誘導性活性化後に産生され、その細胞内受容体（チャンネル）に結合すると、細胞内カルシウム貯蔵の放出を引き起こす。小胞体は、１つの中心的なカルシウム貯蔵を提供する。筋肉小胞体−小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）の阻害剤であるタプシンガルギンも、細胞内貯蔵の放出及びリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達経路の活性化を引き起こす。従って、タプシガルギンは、Ｔ細胞におけるカルシウムシグナル伝達経路の特異的な刺激として使用することが可能である。Ｔ細胞中の細胞内カルシウム貯蔵の放出は細胞表面上のカルシウムチャンネルの活性化を引き起こすことが知られており、これは細胞外からのカルシウムの流入を引き起こす。Ｔ細胞上のこの細胞内容量依存性カルシウムチャンネル（ＳＯＣＣ；ｓｔｏｒｅ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）は、「ＣＲＡＣ」（カルシウム放出活性化チャンネル（ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ））と称され、このチャンネルを通じたカルシウムの持続的流入は、完全なＴ細胞の活性化にとって不可欠であることが知られている［Ｓ．Ｆｅｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２，６５１  ａｎｄ  Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＰＮＡＳ  １０１，８９６９］。長年にわたって、Ｔ細胞内への継続的なカルシウム流入を維持するためには、細胞膜は、カリウムイオンの流出を通じた過分極した状態を保たなければならないと理解されてきた。Ｔ細胞では、電圧開口型カリウムチャンネルＫｖ１．３及びカルシウム活性化カリウムＩＫＣａ１によって、カリウム流出が達成される［Ｋ．Ｇ．Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＴＩＰＳ  ２５，２８０］。これらのカリウムチャンネルは、従って、ＣＲＡＣを通じたカルシウムの持続的流入を可能とする必要なカリウム流出を可能とすることによって、カルシウムシグナル伝達経路を間接的に調節する。細胞内カルシウムの持続的な増加は、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の活性化をもたらす経路を含む、Ｔ細胞中の様々な経路を活性化する［Ｑｕｉｎｔａｎａ−Ａ（２００５）  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．−Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５０，１］。これらの現象は、細胞サイズ及び膜の構成の変化、細胞表面エフェクター分子の活性化、サイトカイン産生及び増殖など、様々なＴ細胞応答をもたらす。幾つかのカルシウム感知分子は、カルシウムシグナルを伝達し、細胞応答を協調させる。カルモジュリンはカルシウムを結合する１つの分子であるが、他の多くが同定されている（Ｍ．Ｊ．Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，５１７）。カルシウム−カルモジュリン依存性ホスファターゼであるカルシニューリンは、細胞内カルシウムが持続的に増加されると活性化され、細胞質ＮＦＡＴを脱リン酸化する。脱リン酸化されたＮＦＡＴは、素早く、核に移動し、Ｔ細胞活性化のための重要な転写因子として広く受け入れられている（Ｆ．Ｍａｃｉａｎ（２００５）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４７２  ａｎｄ  Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＰＮＡＳ  １０１，８９６９）。シクロスポリンＡ（Ｎｅｏｒａｌ，Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ）及びＦＫ５０６（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）などのカルシニューリンの阻害剤は、固形臓器移植後に拒絶をもたらすものなど、重度免疫疾患の治療のための主な支柱のような存在である（Ｉ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３７，１７１３  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｊ．Ｋｕｙｐｅｒｓ（２００５）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １８，１４０）。臓器移植、重度関節リウマチ（Ｄ．Ｅ．Ｙｏｃｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ３９，１５６）及び重度乾癬（Ｊ．Ｋｏｏ（１９９８）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９，８８）の治療について、ネオーラルが承認を受けている。前臨床及び臨床データも提供されており、カルシニューリン阻害剤は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ；Ｂａｕｍｇａｒｔ  ＤＣ（２００６）  Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍａｒ  ３０；Ｅｐｕｂ出版前）、多発性硬化症（Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９０）  ２７，５９１）及び喘息（Ｓ．Ｒｏｈａｔａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，１２１１）の治療において有用であり得ることを示唆している。狼瘡は、ヘルパーＴ細胞の活性化を遮断する因子が有用であり得る別の疾患である。Ｔ細胞中のＮＦＡＴを制御する上でのカルシニューリンの重要性に関わらず、カルシニューリンは、他の組織（例えば、腎臓）中にも発現されており、シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６は、毒性を基礎とする機序のために、狭い安全域を有する。腎毒性及び高血圧が、シクロスポリン及びＦＫ５０６の有望性を限定してきた共通の副作用である。毒性に関する懸念のために、カルシニューリン阻害剤は、重度免疫疾患のみを治療するために多く使用されている（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ−Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５４，４７２）。Ｋｖ１．３阻害剤は、免疫疾患の治療のための、より安全なカルシニューリン阻害剤代替物である。これは、Ｋｖ１．３はＴ細胞中のカルシウムシグナル伝達経路を調節するが、カルシニューリン阻害剤とは異なる機序を通じて調節するようにも作用するからであり、Ｋｖ１．３の発現及び機能に関する証拠は、様々な非リンパ系細胞及び組織中でも機能するカルシニューリンに比べて、Ｋｖ１．３が、Ｔ細胞生物学において、より限定された役割を有することを示している。
【００１５】
免疫細胞中でのカルシウム動員は、炎症の重要な媒介物質であるサイトカインインターロイキン２（ＩＬ−２）及びインターフェロンγ（ＩＦＮｇ）の産生も活性化する。ＩＬ−２は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び分化から、Ｂ細胞による増殖及び抗体分泌の増強、ＮＫ細胞の活性化に至るまで、様々な生物学的応答を誘導する［Ｓ．Ｌ．Ｇａｆｆｅｎ  ＆  Ｋ．Ｄ．Ｌｉｕ（２００４）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２８，１０９］。ＩＬ−２の分泌は、Ｔ細胞活性化後、基迅速に起こり、Ｔ細胞がこのサイトカインの主要な源となっている。活性化後すぐに、高親和性ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）がＴ細胞上で上方制御され、ＩＬ−２に応答して増殖する能力をＴ細胞に付与する。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及び専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は全て、活性化時にＩＦＮｇを分泌することが可能である。Ｔ細胞は、養子免疫応答を媒介する上で、ＩＦＮｇ産生の主要な源であるのに対して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＡＰＣは、感染に対する宿主防御に際する重要な源である可能性がある［Ｋ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７５，１６３］。当初、マクロファージ活性化因子と称されたＩＦＮｇは、単球、マクロファージ及び樹状細胞による抗原加工及び提示を上方制御する。ＩＦＮｇは、増殖及び分化、ＮＫ細胞活性の増強及びＢ細胞免疫グロブリン産生の制御及びクラスのスイッチングなど、多くの細胞種において、多様な生物活性を媒介する［Ｕ．Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，７４９］。
【００１６】
ＣＤ４０Ｌは、カルシウム動員後に、活性化されたＴ細胞上に発現される別のサイトカインであり、及びＢ細胞上のその受容体への結合時に、Ｂ細胞の胚中心の形成、Ｂ細胞の分化及び抗体イソタイプのスイッチングを可能とする重大な補助を与える。ＣＤ４０Ｌによって媒介される、Ｂ細胞上のＣＤ４０の活性化は、免疫グロブリン（Ｉｇ）産生Ｂ細胞の深い分化とクローン性増殖を誘導することが可能である［Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，３０７］。ＣＤ４０受容体は樹状細胞上にも見出すことが可能であり、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達は、樹状細胞活性化及び分化も媒介することが可能である。Ｂ細胞及び樹状細胞の抗原提示能は、ＣＤ４０Ｌ結合によって促進され、養子免疫における本サイトカインの幅広い役割をさらに示している。Ｂ細胞生物学へのＣＤ４０シグナル伝達の不可欠な役割に鑑み、組織中への抗体複合体の沈着、炎症及び臓器の損傷を特徴とする疾患である全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）の治療における有用性について、前臨床及び臨床研究でＣＤ４０Ｌに対する中和抗体が調査されている［Ｊ．Ｙａｚｄａｎｙ  ａｎｄ  Ｊ  Ｄａｖｉｓ（２００４）  Ｌｕｐｕｓ  １３，３７７］。
【００１７】
トキシンペプチドの産生は、有毒生物における複雑なプロセスであり、合成においては、さらに複雑なプロセスである。トキシンペプチドの保存されたジスルフィド構造及び効率的な酸化的再折り畳みの必要性のため、トキシンペプチドは合成に対する困難な課題となっている。トキシンペプチドは、イオンチャンネルの高度に選択的な薬理学的阻害剤として、長年にわたって使用されてきたが、トキシンペプチドの合成の高い費用及び再折り畳み並びにインビボでのそれらの短い半減期は、これらのペプチドを治療法として実行する妨げとなってきた。トキシンペプチドそのものを与える努力より、さらにずっと大きな努力が、イオンチャンネルの治療的アンタゴニストとして小分子阻害剤を同定するために費やされてきた。１つの例外は、難治性疼痛の治療に対する、小ωコノトキシンＭＶＩＩＡペプチド（ジコノチド（ジコノチドＴＭの最近の承認である。しかしながら、ジコノチドＴＭの合成及び再折り畳み製造方法は、コストが高く、インビボでの半減期が極めて短い（約４時間）小ペプチド産物をもたらすに過ぎない。
【００１８】
イオンチャンネルの阻害剤など（但し、これに限定されない。）の治療剤を製造するための費用効果が高いプロセスは、本発明によって提供される必要物であり、これは、ビヒクルに融合され、又はその他ビヒクルに共有結合されたトキシンを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許第６，０７７，６８０号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６８９，７４９号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６／００２８５０号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｈａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｏｕｚｏｕｎｉｓ（２００２），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１４：１２９−３４
【非特許文献２】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７３−４
【非特許文献３】Ｇｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５，５８３−６
【非特許文献４】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７９−８１
【非特許文献５】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５７５−８
【非特許文献６】Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５５：５８７−９
【非特許文献７】Ｃｌａｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５５：５９１−６
【非特許文献８】Ｃｈａｎｄｙ（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：２６
【非特許文献９】Ｇｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３６５−８
【非特許文献１０】Ｅｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｎｅｕｒｏｎ  ２５：５３３−５）
【非特許文献１１】Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６６，１３１−１５９
【非特許文献１２】Ｔｕｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１（１−２）：１３３−４１（１９９８）
【非特許文献１３】Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＳｈＫ  ｔｏｘｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（４４）：１４５４９−５８（１９９９）
【非特許文献１４】Ｊａｒａｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｏｘｉｎ  ＯＳＫ１  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６（６）：１２２３−３２（１９９７）
【非特許文献１５】ｄｅｌ  Ｒｉｏ−Ｐｏｒｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，；ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｎ１２，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｍｅｘｉｃａｎ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｙｐｉｃａｌ  ｂｅｔａ−ｔｏｘｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｕｔ  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１（１２）：２５０４−１６（２００４）
【非特許文献１６】Ｐｒｏｃｈｎｉｃｋａ−Ｃｈａｌｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｃｒｅｐｉｎ，ａ  ｎｅｗ  Ｋ＋−ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ＫＴｘ１５  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５（６）：１７９５−１８０４（２００６）
【非特許文献１７】Ｎｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１  ：２３０５−１９
【非特許文献１８】Ａｄａｍｓ（１９９９），Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｒｅｓ．４６：２１９−３４
【非特許文献１９】Ｌｏｕｇｈｎａｎ，２００４
【非特許文献２０】Ｎｉｅｌｓｅｎ，２０００
【非特許文献２１】Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｃｈａｎｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）
【非特許文献２２】Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｔｙｐｅｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＯＳＫ１  ，ａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ｖｅｎｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５：９５−１０４（２００５）
【非特許文献２３】Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ  ｔｏｘｉｎ  １  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｒｉｍｍｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６９：３５４−６２（２００６）
【非特許文献２４】Ｂ．Ｓ．Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ？，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２：４０１−４２２（２００１）
【非特許文献２５】Ｒａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈａｒｙｂｄｏｔｏｘｉｎ  Ｙｉｅｌｄｓ  ａｎ  Ａｎａｌｏｇ  Ｔｈａｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｖｅｒ  Ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  Ｋ＋  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２０１−１２０８（２０００）
【非特許文献２６】Ｃａｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｕｒｏｔｏｘｉｎ：Ａ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  Ｃａ２＋−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４０９−４１８（２００３）
【非特許文献２７】Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２５：２８０−２８９（２００４）
【非特許文献２８】Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｇａｒｃｉａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｖｅｎｏｍ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：７９０−８０２（２００３）
【非特許文献２９】Ａ．Ｓｃｈｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ｍｏｌｅｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６８，１２５４
【非特許文献３０】Ｈ．Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３２０４０
【非特許文献３１】Ｃ．Ｚｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，１２４２７
【非特許文献３２】Ｍ．Ｗ．Ｗｉｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，２９９
【非特許文献３３】Ｓ．Ｆｅｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２，６５１
【非特許文献３４】Ｎ．Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  ＰＮＡＳ  １０１，８９６９
【非特許文献３５】Ｑｕｉｎｔａｎａ−Ａ（２００５）  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．−Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４５０，１
【非特許文献３６】Ｍ．Ｊ．Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，５１７
【非特許文献３７】Ｆ．Ｍａｃｉａｎ（２００５）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，４７２
【非特許文献３８】Ｉ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３７，１７１３
【非特許文献３９】Ｄ．Ｒ．Ｊ．Ｋｕｙｐｅｒｓ（２００５）  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １８，１４０
【非特許文献４０】Ｄ．Ｅ．Ｙｏｃｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ３９，１５６
【非特許文献４１】Ｊ．Ｋｏｏ（１９９８）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９，８８
【非特許文献４２】Ｂａｕｍｇａｒｔ  ＤＣ（２００６）  Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｍａｒ  ３０；Ｅｐｕｂ出版前
【非特許文献４３】Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９０）  ２７，５９１
【非特許文献４４】Ｓ．Ｒｏｈａｔａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，１２１１
【非特許文献４５】Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ−Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．５４，４７２
【非特許文献４６】Ｓ．Ｌ．Ｇａｆｆｅｎ  ＆  Ｋ．Ｄ．Ｌｉｕ（２００４）  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２８，１０９
【非特許文献４７】Ｋ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７５，１６３
【非特許文献４８】Ｕ．Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，７４９
【非特許文献４９】Ｓ．Ｑｕｅｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２，３０７
【非特許文献５０】Ｊ．Ｙａｚｄａｎｙ  ａｎｄ  Ｊ  Ｄａｖｉｓ（２００４）  Ｌｕｐｕｓ  １３，３７７
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、式
（Ｘ１）ａ−（Ｆ１）ｄ−（Ｘ２）ｂ−（Ｆ２）ｅ−（Ｘ３）ｃ
の組成物及びその多量体に関する。
（式中：
Ｆ１及びＦ２は半減期延長部分であり、並びにｄ及びｅは、各々独立に、０又は１であり（但し、ｄ及びｅの少なくとも１つは１である。）；
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、各々独立に、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−であり、並びにｆ及びｇは、各々独立に、０又は１であり；
Ｐは、少なくとも２つのペプチド内ジスルフィド結合を含む、約８０アミノ酸残基長以下のトキシンペプチドであり；
Ｌは、場合によって存在するリンカーであり（ｆ＝１及び／又はｇ＝１の場合に存在する。）；並びに
ａ、ｂ及びｃは、各々独立に、０又は１である（但し、ａ、ｂ及びｃの少なくとも１つは、１である。）。）
従って、本発明は、慣用的に、ペプチドのＮ末端を左側に記載すると、式：
（ＩＩ）Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１（すなわち、ｂ、ｃ及びｅは、０に等しい。）；
（ＩＩＩ）Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐ（すなわち、ａ、ｃ及びｅは、０に等しい。）；
（ＩＶ）Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐ又は（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ（すなわち、ｃ及びｅは、０に等しい。）；
（Ｖ）Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ２（すなわち、ａ及びｃは、０に等しい。）；
（ＶＩ）Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ２−（Ｌ）ｆ−Ｐすなわち、ａは、０に等しい。）；
（ＶＩＩ）Ｆ１−Ｆ２−（Ｌ）ｆ−Ｐ（すなわち、ａ及びｂは、０に等しい。）；
（ＶＩＩＩ）Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−Ｆ２（すなわち、ｂ及びｃは、０に等しい。）；
（ＩＸ）Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−Ｆ２−（Ｌ）ｆ−Ｐすなわち、ｂは、０に等しい。）；
及びこれらの何れかのあらゆる多量体など、式１に対する変形を有する分子に関する。式ＩＩ−ＩＸのこのような分子の全てが、構造式Ｉの意味に属する。式Ｉの意味の範疇において、トキシンペプチド（Ｐ）が２以上存在する場合、トキシンペプチド（Ｐ）は、本発明の組成物中に存在する他の何れものトキシンペプチドと独立に同一又は別異であることができ、リンカー部分が存在する場合、リンカー部分（（Ｌ）ｆ及び／又は（Ｌ）ｇ）は、本発明の組成物中に存在し得る他の何れものリンカーと独立に同一又は別異であることができる。半減期延長部分へのトキシンペプチドの抱合は、トキシンペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端を介することが可能であり、又はその一次アミノ酸配列に対して中間であることが可能である（Ｆ１は、連結されるＦ２より、トキシンペプチドのＮ末端により近く連結されている。）。有用な半減期延長部分（Ｆ１又はＦ２）の例には、免疫グロブリンＦｃドメイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。本明細書に記載されているこれら及びその他の半減期延長部分は、個別に又は組み合わせて有用である。
【００２２】
本発明は、固有配列を有するＳｈＫ、ＯＳＫ１又はマウロトキシン（ＭＴＸ）ペプチドに比べてより大きなＫｖ１．３又はＩＫＣａ１アンタゴニスト活性及び／又は標的選択性を有する、１つ若しくはそれ以上のアミノ酸残基が固有配列から修飾された、抱合された又は抱合されていない、ＳｈＫ、ＯＳＫ１、ＣｈＴｘ又はマウロトキシンのトキシンペプチド類縁体を含む組成物にも関する。トキシンペプチド類縁体は、
表２に記載されている配列番号８８、８９、９２、１４８〜２００、５４８〜５６１、８８４〜９４９若しくは１２９５〜１３００；又は
表７に記載されている配列番号９８０〜１２７４、１３０３若しくは１３０８；又は
表１３に記載されている配列番号３３０〜３３７、３４１、１３０１、１３０２、１３０４〜１３０７、１３０９、１３１１、１３１２及び１３１５〜１３３６；又は
表１４に記載されている配列番号３６、５９、３４４−３４６若しくは１３６９〜１３９０の何れかから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
本発明は、以下の何れか：
表３に記されている配列番号２０１〜２２５；又は
表４に記されている配列番号２４２〜２４８若しくは２５０〜２６０；又は
表５に記されている配列番号２６１〜２７５；又は
表６に記されている配列番号２７６〜２９３；又は
表８に記されている配列番号２９９〜３１５；又は
表９に記されている配列番号３１６〜３１８；又は
表１０に記されている配列番号３１９；又は
表１１に記されている配列番号３２７若しくは３２８；又は
表１３に記されている配列番号３３０〜３３７、３４１、１３０１、１３０２、１３０４〜１３０７、１３０９、１３１１、１３１２又は１３１５〜１３３６；
表１４に記されている配列番号１３６９〜１３９０；又は
表１６に記されている配列番号３４８〜３５３；又は
表１９に記されている配列番号３５７〜３６２、３６４〜３６８、３７０、３７２〜３８５若しくは３８７〜３９８；又は
表２０に記されている配列番号３９９〜４０８；又は
表２２に記されている配列番号４１０〜４２１；又は
表２３に記されている配列番号４２２、４２４、４２６若しくは４２８；又は
表２４に記されている配列番号４３０〜４３７；又は
表２５に記されている配列番号４３８〜４４５；又は
表２６に記されている配列番号４４７、４４９、４５１、４５３、４５５若しくは４５７；又は
表２８に記されている配列番号４７０〜４８２若しくは４８４〜４９３；又は
表２９に記されている配列番号４９５〜５０６；又は
表３０に記されている配列番号５０７〜５１８；
から選択されるアミノ酸配列を含む他のトキシンペプチド類縁体にも関する。
【００２４】
本発明は、本発明の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
【００２５】
本発明の組成物は、慣用の合成法、組換えＤＮＡ技術又は本分野において周知の、他のあらゆるペプチド及び融合タンパク質調製方法によって調製することが可能である。非ペプチド部分を有する本発明の組成物は、適宜、慣用のペプチド化学反応の他に、慣用の有機化学反応によって合成することが可能である。
【００２６】
治療剤及び／又は予防剤としての主な用途が想定されている。トキシンペプチドを取り込む本発明の組成物は、抱合されていないペプチドと同等の、又はこれよりずっと大きな活性及び／又はイオンチャンネル標的選択性を有することが可能である。
【００２７】
従って、本発明は、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄（ｒｅｓｔｉｎｏｓｉｓ）、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病又は狼瘡などの自己免疫疾患と診断された患者に、前記疾患の少なくとも１つの症候が前記患者において緩和されるように、本発明の組成物（好ましくは、Ｋｖ１．３アンタゴニストペプチド又はＩＫＣａ１アンタゴニストペプチドを含む。）の治療的有効量を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法を含む。
【００２８】
さらに、本発明は、多発性硬化症の少なくとも１つの症候を以前に経験した患者に、多発性硬化症の少なくとも１つの症候の再発が予防され、又は多発性硬化症の少なくとも１つの症候が軽減されるように、本発明の組成物（好ましくは、Ｋｖ１．３アンタゴニストペプチド又はＩＫＣａ１アンタゴニストペプチドを含む。）の予防的有効量を投与することを含む、多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法に関する。
【００２９】
多くの場合、治療剤として想定されているが、本発明の組成物は、治療剤又は診断剤に対するスクリーニングにおいても有用であり得る。例えば、抗Ｆｃ被覆されたプレートを用いたアッセイにおいてＦｃペプチドを使用することが可能である。Ｆｃなどの半減期延長部分は、不溶性ペプチドを可溶性にし、次いで、多数のアッセイにおいて有用とすることが可能である。
【００３０】
本発明の多数のさらなる態様及び利点が、本発明の図面及び詳細な説明の検討において明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ａ：単一ジスルフィド結合した二量体
【図１Ｂ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ｂ：二重にジスルフィド結合した二量体
【図１Ｃ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ｃ：非共有結合二量体
【図１Ｄ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ｄ：単一ジスルフィド結合した二量体
【図１Ｅ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ｅ：二重にジスルフィド結合した二量体
【図１Ｆ】ＩｇＧ１抗体から派生し得る幾つかの典型的なＦｃ二量体の模式的構造を示す。図の「Ｆｃ」は、本明細書の「Ｆｃドメイン」の意味内のＦｃ変異体のいずれかを表す。「Ｘ１」及び「Ｘ２」は、後述に定義されるペプチド又はリンカーとペプチドとの組み合わせを表す。特異的二量体は、次のとおりである。  図１Ｆ：非共有結合二量体
【図２Ａ】薬理学的に活性のある毒素ペプチドの単一単位を示す本発明の組成物の幾つかの実施形態の模式的構造を示す。図２Ａは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。
【図２Ｂ】薬理学的に活性のある毒素ペプチドの単一単位を示す本発明の組成物の幾つかの実施形態の模式的構造を示す。図２Ｂは、リンカー−ペプチド部分が二量体の唯一の鎖のみを表す二量体を示す。
【図２Ｃ】薬理学的に活性のある毒素ペプチドの単一単位を示す本発明の組成物の幾つかの実施形態の模式的構造を示す。図２Ｃは、両鎖上にペプチド部分を有する二量体を示す。図２Ｃの二量体は、図２Ａに示される単一鎖をコードするＤＮＡコンストラクトの発現に際し、特定の宿主細胞において自然発生的に形成する。他の宿主細胞において、細胞は、二量体の形成に好ましい条件下に配置され得るか、又は二量体はインビトロで形成され得る。
【図３Ａ】哺乳類発現に最適化し、本発明で使用できるヒトＩｇＧ１  Ｆｃの典型的な核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。
【図３Ｂ】哺乳類発現に最適化し、本発明で使用できるヒトＩｇＧ１  Ｆｃの典型的な核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１及び２）を示す。
【図４Ａ】細菌発現に最適化し、本発明において使用できるヒトＩｇＧ１  Ｆｃの典型的な核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３及び４）を示す。
【図４Ｂ】細菌発現に最適化し、本発明において使用できるヒトＩｇＧ１  Ｆｃの典型的な核酸配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号３及び４）を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、哺乳類細胞、細菌又は酵母における発現に最適化したコドンを含有する核酸配列によってコード化できる成熟ＳｈＫペプチド（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＳｈＫペプチド（配列番号１０）内の６個のシステインによって形成される３つのジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を示す。
【図６Ａ】電位開口型カリウムチャネル阻害剤スチコダクチラヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）（ＳｈＫ）のイソギンチャク毒素ファミリーの他の密接に関連したメンバーとの配列比較を示す。スチコダクチラヘリアンサスの毒液から単離された３５個のアミノ酸の成熟ＳｈＫ毒素（受入番号Ｐ２９１８７）の配列を、イソギンチャクファミリーの他の密接に関連したメンバーと整列して示す。高度に保存された残基に陰影を付されている共通配列及び推定されるジスルフィド結合を示す。示されるＨｍＫペプチド毒素配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ受入番号０９７４３６）は、大イソギンチャク（Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ  ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ）（ラジアンサスマグニフィカ（Ｒａｄｉａｎｔｈｕｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）；センジュイソギンチャク（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ））由来の未熟な前駆体のものであり、推定シグナルペプチドに下線が付されている。成ＨｍＫペプチド毒素は、長さ３５アミノ酸であると推定され、及び４０ないし７４の残基に及ぶ。ＡｅＫは、アクティニアエクイン（Ａｃｔｉｎｉａ  ｅｑｕｉｎｅ）イソギンチャク（受入番号８１８９７）の毒液から単離された成ペプチド毒素である。ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ  Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ及びＢｕｎｏｄｏｓｏｍａ  ｑｒａｎｕｌｉｆｅｒａの毒液からそれぞれ単離される成ペプチド毒素ＡｓＫＳ（受入番号Ｑ９ＴＷＧ１）及びＢｇＫ（受入番号Ｐ２９１８６）の配列も示す。図６Ａは、イソギンチャクファミリーの毒素の他のメンバーＨｍＫ（配列番号６（成熟ペプチド）、（配列番号５４２、シグナル及び成熟ペプチド部分））、ＡｅＫ（配列番号７）、ＡｓＫｓ（配列番号８）及びＢｇＫ（配列番号９）に対するアミノ酸整列（配列番号１０）を示す。推定ジスルフィド結合を示し、保存された残基を強調する。（ＨｍＫ、配列番号５４３；ＳｈＫ、配列番号１０；ＡｅＫ、配列番号５４４；ＡｓＫＳ、配列番号５４５）。
【図６Ｂ】電位開口型カリウムチャネル阻害剤スチコダクチラヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）（ＳｈＫ）のイソギンチャク毒素ファミリーの他の密接に関連したメンバーとの配列比較を示す。スチコダクチラヘリアンサスの毒液から単離された３５個のアミノ酸の成熟ＳｈＫ毒素（受入番号Ｐ２９１８７）の配列を、イソギンチャクファミリーの他の密接に関連したメンバーと整列して示す。高度に保存された残基に陰影を付されている共通配列及び推定されるジスルフィド結合を示す。示されるＨｍＫペプチド毒素配列（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ受入番号０９７４３６）は、大イソギンチャク（Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ  ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ）（ラジアンサスマグニフィカ（Ｒａｄｉａｎｔｈｕｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）；センジュイソギンチャク（Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ））由来の未熟な前駆体のものであり、推定シグナルペプチドに下線が付されている。成ＨｍＫペプチド毒素は、長さ３５アミノ酸であると推定され、及び４０ないし７４の残基に及ぶ。ＡｅＫは、アクティニアエクイン（Ａｃｔｉｎｉａ  ｅｑｕｉｎｅ）イソギンチャク（受入番号８１８９７）の毒液から単離された成ペプチド毒素である。ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ  Ａｎｅｍｏｎｉａ  ｓｕｌｃａｔａ及びＢｕｎｏｄｏｓｏｍａ  ｑｒａｎｕｌｉｆｅｒａの毒液からそれぞれ単離される成ペプチド毒素ＡｓＫＳ（受入番号Ｑ９ＴＷＧ１）及びＢｇＫ（受入番号Ｐ２９１８６）の配列も示す。図６Ｂは、３個のジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５）を有するこのファミリーに関するジスルフィド結合マップを示す。
【図７Ａ】カリウムチャネル阻害剤のα−サソリ毒素のアミノ酸整列を示す。（ＢｍＫＫ１、配列番号１１；ＢｍＫＫ４、配列番号１２；ＰＢＴｘ１、配列番号１４；Ｔｃ３２、配列番号１３；ＢｍＫＫ６、配列番号１５；Ｐ０１、配列番号１６；Ｐｉ２、配列番号１７；Ｐｉ３、配列番号１８；Ｐｉ４、配列番号１９；ＭＴＸ、配列番号２０；Ｐｉ１、配列番号２１；ＨｓＴｘ１、配列番号６１；ＡｇＴｘ２、配列番号２３；ＫＴＸ１、配列番号２４；ＯＳＫ１、配列番号２５；ＢｍＫＴＸ、配列番号２２；ＨｇＴＸ１、配列番号２７；ＭｇＴｘ、配列番号２８；Ｃ１１Ｔｘ１、配列番号２９；ＮＴＸ、配列番号３０；Ｔｃ３０、配列番号３１；Ｔｓ−ＴＸ−Ｋａ、配列番号３２；ＰＢＴｘ３、配列番号３３；Ｌｇｈ１５−１、配列番号３４；Ｍａｒｔｅｎ  Ｔｘ、配列番号３７；ＣｈＴｘ、配列番号３６；ＣｈＴｘ−Ｌｑ２、配列番号４２；ＩｂＴｘ、配列番号３８；ＳｌｏＴｘ、配列番号３９；ＢｍＴｘ１；配列番号４３；ＢｕＴｘ、配列番号４１；ＡｍｍＴｘ３、配列番号４４；ＡａＴＸ１、配列番号４５；ＢｍＴＸ３、配列番号４６；Ｔｃ１、配列番号４８；ＯＳＫ２、配列番号４９；ＴｓＫ、配列番号５４；ＣｏＴｘ１、配列番号５５；ＣｏＴｘ２、配列番号８７１；ＢｍＰｏ５、配列番号６０；ＳｃｙＴｘ、配列番号５１；Ｐ０５、配列番号５２；タマピン（Ｔａｍａｐｉｎ）、配列番号５３：及びＴｍＴｘ、配列番号６９１。高度に保存された残基に影を付し、共通配列を列挙する。α−ＫＴｘのサブファミリーを列挙し、それらはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，  Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＴＩＰＳ２４：２２２−２２７に由来する。拮抗すると報告される幾つかのイオンチャネルのリストを列挙する（ＩＫ＝ＩＫＣａ、ＢＫ＝ＢＫＣａ、ＳＫ＝ＳＫＣａ、Ｋｖ＝電位開口型Ｋ＋チャネル）。この整列におけるほとんどのファミリーメンバーが成ペプチド生成物を表すが、幾つものメンバーは、未成熟であるか、前記ペプチドの改変された形態を表し、これらには、ＢｍＫＫ１、ＢｍＫＫ４、ＢｍＫＫ６、ＢｍＫＴＸ、Ｍａｒｔｅｎ  Ｔｘ、ＣｈＴｘ、ＣｈＴｘ−Ｌｑ２、ＢｍＴｘ１、ＡａＴｘ１、ＢｍＴＸ３、ＴｓＫ、ＣｏＴｘ１、ＢｍＰ０５が含まれる。
【図７Ｂ】カリウムチャネル阻害剤のα−サソリ毒素のアミノ酸整列を示す。（ＢｍＫＫ１、配列番号１１；ＢｍＫＫ４、配列番号１２；ＰＢＴｘ１、配列番号１４；Ｔｃ３２、配列番号１３；ＢｍＫＫ６、配列番号１５；Ｐ０１、配列番号１６；Ｐｉ２、配列番号１７；Ｐｉ３、配列番号１８；Ｐｉ４、配列番号１９；ＭＴＸ、配列番号２０；Ｐｉ１、配列番号２１；ＨｓＴｘ１、配列番号６１；ＡｇＴｘ２、配列番号２３；ＫＴＸ１、配列番号２４；ＯＳＫ１、配列番号２５；ＢｍＫＴＸ、配列番号２２；ＨｇＴＸ１、配列番号２７；ＭｇＴｘ、配列番号２８；Ｃ１１Ｔｘ１、配列番号２９；ＮＴＸ、配列番号３０；Ｔｃ３０、配列番号３１；Ｔｓ−ＴＸ−Ｋａ、配列番号３２；ＰＢＴｘ３、配列番号３３；Ｌｇｈ１５−１、配列番号３４；Ｍａｒｔｅｎ  Ｔｘ、配列番号３７；ＣｈＴｘ、配列番号３６；ＣｈＴｘ−Ｌｑ２、配列番号４２；ＩｂＴｘ、配列番号３８；ＳｌｏＴｘ、配列番号３９；ＢｍＴｘ１；配列番号４３；ＢｕＴｘ、配列番号４１；ＡｍｍＴｘ３、配列番号４４；ＡａＴＸ１、配列番号４５；ＢｍＴＸ３、配列番号４６；Ｔｃ１、配列番号４８；ＯＳＫ２、配列番号４９；ＴｓＫ、配列番号５４；ＣｏＴｘ１、配列番号５５；ＣｏＴｘ２、配列番号８７１；ＢｍＰｏ５、配列番号６０；ＳｃｙＴｘ、配列番号５１；Ｐ０５、配列番号５２；タマピン（Ｔａｍａｐｉｎ）、配列番号５３：及びＴｍＴｘ、配列番号６９１。高度に保存された残基に影を付し、共通配列を列挙する。α−ＫＴｘのサブファミリーを列挙し、それらはＲｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，  Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＴＩＰＳ２４：２２２−２２７に由来する。拮抗すると報告される幾つかのイオンチャネルのリストを列挙する（ＩＫ＝ＩＫＣａ、ＢＫ＝ＢＫＣａ、ＳＫ＝ＳＫＣａ、Ｋｖ＝電位開口型Ｋ＋チャネル）。この整列におけるほとんどのファミリーメンバーが成ペプチド生成物を表すが、幾つものメンバーは、未成熟であるか、前記ペプチドの改変された形態を表し、これらには、ＢｍＫＫ１、ＢｍＫＫ４、ＢｍＫＫ６、ＢｍＫＴＸ、Ｍａｒｔｅｎ  Ｔｘ、ＣｈＴｘ、ＣｈＴｘ−Ｌｑ２、ＢｍＴｘ１、ＡａＴｘ１、ＢｍＴＸ３、ＴｓＫ、ＣｏＴｘ１、ＢｍＰ０５が含まれる。
【図８】本発明におけるペプチボディへと変換された毒素ペプチドの整列を示す（Ａｐａｍｉｎ、配列番号６８；ＨａＴｘ１、配列番号４９４；ＰｒｏＴｘ１、配列番号５６；ＰａＴｘ２、配列番号５７；ＳｈＫ［２−３５］、配列番号９２；ＳｈＫ［１−３５］、配列番号５；ＨｍＫ、配列番号６；ＣｈＴｘ（Ｋ３２Ｅ）、配列番号５９；ＣｈＴｘ、配列番号３６；ＩｂＴｘ、配列番号３８；ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ、Ｋ２０Ｄ）、配列番号２９６；ＯＳＫ１、配列番号２５；ＡｇＴｘ２、配列番号２３；ＫＴＸ１、配列番号２４；ＭｇＴｘ、配列番号２８；ＮＴＸ、配列番号３０；ＭＴＸ、配列番号２０；Ｐｉ２、配列番号１７；ＨｓＴｘ１、配列番号６１；Ａｎｕｒｏｃｔｏｘｉｎ［ＡｎＴｘ］、配列番号６２；ＢｅＫｍ１、配列番号６３；ＳｃｙＴｘ、配列番号５１；ωＧＶＩＡ、配列番号６４；ωＭＶＩＩａ、配列番号６５；Ｐｔｕ１、配列番号６６；及びＣＴＸ、配列番号６７）。毒素の本来の源が、各々におけるシステインの数と同様、示されている。鍵となる標的のイオンチャネルが列挙される。整列は、それらの源及びイオンチャネル標的衝撃に基づいた毒素ペプチドのクラスター形成を示す。
【図９】毒素ファミリー内のジスルフィド配置を示す。各サブファミリーに関するジスルフィドの数及びジスルフィド結合の順序が示される。各ジスルフィド結合カテゴリー内に収まる毒素の部分的なリストを表す。
【図１０】毒素の溶液構造がコンパクトな構造を明示することを示す。  イソギンチャク（ＳｈＫ）、サソリ（ＭｇＴｘ、ＭＴＸ、ＨｓＴｘ１）、ウミイモガイ（ｍａｒｉｎｅ  ｃｏｎｅ  ｓｎａｉｌ）（ｗＧＶＩＡ）及びタランチュラ（ＨａＴｘ１）由来の天然毒素の溶液構造は、２８ないし３９アミノ酸のペプチドが全て、コンパクトな構造を形成することを示す。示される毒素は、３又は４個のジスルフィド結合を有し、図９に示される６個のサブファミリーのうちの４個内に収まる。イソギンチャク（ＳｈＫ）、サソリ（ＭｇＴｘ、ＭＴＸ、ＨｓＴｘ１）、ウミイモガイ（ｗＧＶＩＡ）及びタランチュラ（ＨａＴｘ１）由来の天然毒素の溶液構造は、ＭＭＤＢ  Ｅｎｔｒｅｚ３次元構造データベース［Ｊ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，４７４］及びビューワーを使用する、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）受入番号１ＲＯＯ（ｍｍｄｂｌｄ：５２４７）、１ＭＴＸ（ｍｍｄｂｌｄ：４０６４）、１ＴＸＭ（ｍｍｄｂｌｄ：６２０１）、１ＱＵＺ（ｍｍｄｂｌｄ：３６９０４）、１ＯＭＺ（ｍｍｄｂｌｄ：１８１６）及び１Ｄ１Ｈ（ｍｍｄｂｌｄ：１４３４４）に由来した。
【図１１Ａ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−ｐｅｐの残基５１３１ないし６６６０の核酸配列（配列番号６９及び配列番号１３５８）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７０、配列番号１３５９及び配列番号１３６０）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７１及び７２）は、Ｃ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＣ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１１Ｂ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−ｐｅｐの残基５１３１ないし６６６０の核酸配列（配列番号６９及び配列番号１３５８）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７０、配列番号１３５９及び配列番号１３６０）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７１及び７２）は、Ｃ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＣ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１１Ｃ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−ｐｅｐの残基５１３１ないし６６６０の核酸配列（配列番号６９及び配列番号１３５８）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７０、配列番号１３５９及び配列番号１３６０）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７１及び７２）は、Ｃ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＣ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１１Ｄ】ペプチド−リンカー配列で置換されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｔ；「ＣｍＲ」部位）を有するペプチボディ細菌発現ベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−ｐｅｐの環状図を示す。
【図１２Ａ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの残基５１３１ないし６３１９の核酸配列（配列番号７３及び配列番号１３６１）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７４、配列番号１３６２及び配列番号１３６３）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１２Ｂ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの残基５１３１ないし６３１９の核酸配列（配列番号７３及び配列番号１３６１）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７４、配列番号１３６２及び配列番号１３６３）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１２Ｃ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの残基５１３１ないし６３１９の核酸配列（配列番号７３及び配列番号１３６１）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号７４、配列番号１３６２及び配列番号１３６３）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１２Ｄ】ペプチド−リンカー配列で置換されたゼオシン抵抗（ｂｌｅ；「ＺｅｏＲ」）部位を有するペプチボディ細菌発現ベクターの環状図を示す。
【図１２Ｅ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの核酸配列（配列番号１３３９）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号１３４０、配列番号１３４１及び配列番号１３４２）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１２Ｆ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの核酸配列（配列番号１３３９）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号１３４０、配列番号１３４１及び配列番号１３４２）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１２Ｇ】ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃの核酸配列（配列番号１３３９）及びコード化されるアミノ酸配列（配列番号１３４０、配列番号１３４１及び配列番号１３４２）を示す。Ｆｃドメインの配列（配列番号７５及び７６）は、Ｎ末端の５個のグリシン残基を除外する。このベクターによって、ペプチド−リンカー部分がＦｃドメインのＮ末端にあるペプチボディの生成が可能となる。
【図１３Ａ】哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉの環状図である。
【図１３Ｂ】ヒトＩｇＧ１、１０個のアミノ酸のリンカー及びアクチビンＲＩＩｂ遺伝子を含有する哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−Ｆｃ−２ｘＧ４Ｓ−アクチビンＲＩＩｂの環状図である。
【図１３Ｃ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］コード化配列を含有するＣＨＯ発現ベクターｐＤＳＲａ２２の環状図である。
【図１４Ａ】前述の実施例１の「Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号７７及び７８）を示す。Ｌ１０リンカーアミノ酸配列（配列番号７９）に下線が付されている。
【図１４Ｂ】前述の実施例１の「Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号７７及び７８）を示す。Ｌ１０リンカーアミノ酸配列（配列番号７９）に下線が付されている。
【図１５Ａ】前述の実施例２の「Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８０及び８１）を示す。Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］（図１４）において使用されるのと同一のＬ１０リンカーアミノ酸配列（配列番号７９）に下線が付されている。
【図１５Ｂ】前述の実施例２の「Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８０及び８１）を示す。Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］（図１４）において使用されるのと同一のＬ１０リンカーアミノ酸配列（配列番号７９）に下線が付されている。
【図１６Ａ】前述の実施例２の「Ｆｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８２及び８３）を示す。Ｌ２５リンカーアミノ酸配列（配列番号８４）に下線が付されている。
【図１６Ｂ】前述の実施例２の「Ｆｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］」として同定される分子のヌクレオチド配列及びコード化されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号８２及び８３）を示す。Ｌ２５リンカーアミノ酸配列（配列番号８４）に下線が付されている。
【図１７】前述の実施例３２にも記載される還元的アミノ化によるＳｈＫペプチド（配列番号５及び配列番号１０）のＮ末端ＰＥＧ化に関するスキームを示す。
【図１８】前述の実施例３４にも記載されるアミド形成を介するＳｈＫペプチド（配列番号５及び配列番号１０）のＮ末端ＰＥＧ化に関するスキームを示す。
【図１９】前述の実施例３３にも記載される官能基選択的オキシム形成によるＳｈＫペプチド（配列番号５及び配列番号１０）のＮ末端ＰＥＧ化に関するスキームを示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、折りたたまれた「Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ」（ペプチド２）とも記載される折りたたまれたＳｈＫ［２−３５］の２１４ｎｍでの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、折りたたまれた「Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ」（ペプチド２）とも記載される折りたたまれたＳｈＫ［２−３５］のエレクトロスプレー質量分析を示す。
【図２１】Ｎ末端がＰＥＧ化した「Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ」とも呼ばれるＮ末端がＰＥＧ化されたＳｈｋ［２−３５］の２１４ｎｍでの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、「ＳｈＫ」とも呼ばれる、折りたたまれたＳｈＫ［１−３５］のエレクトロスプレー質量分析を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、「ＳｈＫ」とも呼ばれる、折りたたまれたＳｈＫ［１−３５］のエレクトロスプレー質量分析を示す。
【図２３】前述の実施例３１にも記載の還元的アミノ化によるＳｈＫ［２−３５］（「Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ」又は「ＳｈＫｄ１」とも呼ばれる配列番号９２及び配列番号５８）のＮ末端ＰＥＧ化に関するスキームを示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］で一過的に形質移入したＨＥＫ２９３細胞由来の培養上清のウェスタンブロットを示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２：１５μＬのＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ、レーン３：１０μＬのＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ、レーン４：５μＬのＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ、レーン５：分子量マーカー、レーン６：ブランク、レーン７：ＤＮＡを含有しない１５μＬの対照、レーン８：ＤＮＡを含有しない１０μＬの対照、レーン９：ＤＮＡを含有しない５μＬの対照、レーン１０：分子量マーカー。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］で安定して形質移入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のクローン由来の培養上清１５μＬによるウェスタンブロットを示す。レーン１ないし１５を次のとおり負荷した。ブランク、ＢＢ６、分子量マーカー、ＢＢ５、ＢＢ４、ＢＢ３、ＢＢ２、ＢＢ１、ブランク、ＢＤ６、ＢＤ５、分子量マーカー、ＢＤ４、ＢＤ３、ＢＤ２。
【図２５Ａ】図２５Ａは、Ｆｃ−Ｌ−ＳｍＩＩＩＡで一過的に形質移入した２９３Ｔ細胞由来の培養上清を含有する非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、Ｆｃ−Ｌ−ＳｍＩＩＩＡで一過的に形質移入した２９３Ｔ細胞由来の培養上清を含有する非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロットを示す。
【図２６Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈した、安定して形質移入したＣＨＯ細胞由来の１０μＬの精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］生成物のスペクトル走査を示す。
【図２６Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷した。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２６Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ及びｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］生成物２０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２６Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析するＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２７Ａ】安定して形質移入したＣＨＯ細胞から精製した最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷した。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２７Ｂ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ及びｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２７Ｃ】安定して形質移入したＣＨＯ細胞から精製したＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２７Ｄ】安定して形質移入したＣＨＯ細胞から精製したＦｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２７Ｅ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］生成物１０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２７Ｆ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２７Ｇ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］生成物１０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２７Ｈ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］生成物５０ｍｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２７Ｉ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２７Ｊ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈した生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２７Ｋ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２７Ｌ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２８Ａ】細菌細胞から精製及び再折りたたみされたＦｃ−Ｌ１０−ＫＴＸ１のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２８Ｂ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＫＴＸ１の４５μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２８Ｃ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＫＴＸ１生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２８Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＫＴＸ１の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２９Ａ】細菌細胞から精製及び再折りたたみされたＦｃ−Ｌ−ＡｇＴｘ２のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図２９Ｂ】細菌細胞から精製及び再折りたたみされたＦｃ−Ｌ１０−ＨａＴｘ１のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物、精製した材料のスペクトル走査。
【図２９Ｃ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用して、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＡｇＴｘ２生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２９Ｄ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＡｇＴｘ２生成物２０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２９Ｅ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＡｇＴｘ２の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図２９Ｆ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＨａＴｘ１生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図２９Ｇ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＨａＴｘ１生成物２０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図２９Ｈ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＨａＴｘ１の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図３０Ａ】ＣＨＯ細胞から精製されるＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］が、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じることを示す。
【図３０Ｂ】多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、１５±２ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図３０Ｃ】（「ＳｈＫ」単独とも呼ばれる）合成ＳｈＫ［１−３５］が、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じることを示す。
【図３０Ｄ】多様な濃度でのＳｈＫ［１−３５］遮断の時間経過を示す。ＳｈＫに関するＩＣ５０は、１２±１ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図３１Ａ】図３１Ａは、４９±５ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）のＩＣ５０で、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の縫う℃依存的遮断を生じる合成ペプチド類縁体ＳｈＫ［２−３５］を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、１１５±１８ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）のＩＣ５０でヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じる、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ペプチボディを示す。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、Ｆｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］ペプチボディが、１００ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）のＩＣ５０でヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じることを示す。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じる細菌細胞から精製されるＦｃ−Ｌ−ＫＴＸ１ペプチボディを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＫＴＸ１によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。
【図３３Ａ】免疫組織化学によって、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ヒトＫｖ１．３で安定して形質移入したＨＥＫ２９３細胞を染色する（図３３Ａ）のに対し、形質移入されていないＨＥＫ２９３細胞は、前期ペプチボディで染色されない（図３３Ｂ）ことを示す。
【図３３Ｂ】免疫組織化学によって、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ヒトＫｖ１．３で安定して形質移入したＨＥＫ２９３細胞を染色する（図３３Ａ）のに対し、形質移入されていないＨＥＫ２９３細胞は、前期ペプチボディで染色されない（図３３Ｂ）ことを示す。
【図３４Ａ】ヒトＫｖ１．３で安定して形質移入した固定したＨＥＫ２９３細胞を使用する酵素イムノアッセイの結果を示す。図３４Ａは、（本明細書で単純に「Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ」と呼ばれる）ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、反応において用量依存的な亢進を示すのに対し、ＣＨＯ−Ｆｃ対照（「Ｆｃ対照」）は示さないことを示す。
【図３４Ｂ】ヒトＫｖ１．３で安定して形質移入した固定したＨＥＫ２９３細胞を使用する酵素イムノアッセイの結果を示す。図３４Ｂは、（本明細書で「Ｆｃ−ＳｈＫ」と呼ばれる）Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、同様の条件を使用して形質移入されていないＨＥＫ２９３細胞からの反応を誘発しないことを示し、他のネガティブ対照も示す。
【図３５Ａ】ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ＰＭＡ及びαＣＤ３抗体で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２（図３５Ａ）及びＩＦＮγ（図３５Ｂ）の用量依存的阻害を示す。前記ペプチボディは、反応の完全な阻害を呈する新規の薬理学を示すのに対し、合成ＳｈＫ［１−３５］ペプチド単独は、部分的な阻害のみを示す。
【図３５Ｂ】ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ＰＭＡ及びαＣＤ３抗体で刺激されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２（図３５Ａ）及びＩＦＮγ（図３５Ｂ）の用量依存的阻害を示す。前記ペプチボディは、反応の完全な阻害を呈する新規の薬理学を示すのに対し、合成ＳｈＫ［１−３５］ペプチド単独は、部分的な阻害のみを示す。
【図３６Ａ】哺乳類由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体で刺激された２つの正常なドナー由来のヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖（３Ｈ−チミジン組み込み）を阻害することを示す。図３６Ａは、ドナー１の反応を示し、図３６Ｂは、ドナー２の反応を示す。抗ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩ）遮断抗体によるプレ温置は、ペプチボディに対する感度を変化させなかった。
【図３６Ｂ】哺乳類由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体で刺激された２つの正常なドナー由来のヒトＰＢＭＣにおけるＴ細胞増殖（３Ｈ−チミジン組み込み）を阻害することを示す。図３６Ａは、ドナー１の反応を示し、図３６Ｂは、ドナー２の反応を示す。抗ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩ）遮断抗体によるプレ温置は、ペプチボディに対する感度を変化させなかった。
【図３７Ａ】ＣＨＯ由来の精製したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、αＣＤ３及びαＣＤ２８抗体で刺激したヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２（図３７Ａ）及びＩＦＮγ（図３７Ｂ）の生成の用量依存的阻害を生じることを示す。
【図３７Ｂ】ＣＨＯ由来の精製したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、αＣＤ３及びαＣＤ２８抗体で刺激したヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２（図３７Ａ）及びＩＦＮγ（図３７Ｂ）の生成の用量依存的阻害を生じることを示す。
【図３８Ａ】図３８Ａは、ＰＥＧ化されたＳｈｋ［２−３５］合成ペプチドが、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じることを示し、多様な濃度でのカリウム電流遮断の時間経過が図３８Ｂに示される。
【図３８Ｂ】図３８Ａは、ＰＥＧ化されたＳｈｋ［２−３５］合成ペプチドが、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を生じることを示し、多様な濃度でのカリウム電流遮断の時間経過が図３８Ｂに示される。
【図３９Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（1−３５）生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図３９Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図３９Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４０Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図４０Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図４０Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４０Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図４１Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬの製剤緩衝液中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図４１Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図４１Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１生成物１２３μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４１Ｄ】ＬＣＱイオントラップ質量分光光度計へと配向される溶出物の一部を使用してＶｙｄａｃ  Ｃ４カラムを使用する最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１試料約４μｇの液体クロマトグラフィー−質量スペクトル分析を示す。質量分析計の製造者によって提供されるＢｉｏｗｏｒｋｓソフトウェアを使用して、質量スペクトルをデコンボルートした。
【図４２Ａ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４０及び配列番号１０４１）を示す。
【図４２Ｂ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４０及び配列番号１０４１）を示す。
【図４３Ａ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４２及び配列番号１０４３）を示す。
【図４３Ｂ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４２及び配列番号１０４３）を示す。
【図４４Ａ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４４及び配列番号１０４５）を示す。
【図４４Ｂ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４４及び配列番号１０４５）を示す。
【図４５Ａ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４６及び配列番号１０４７）を示す。
【図４５Ｂ】Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（それぞれ配列番号１０４６及び配列番号１０４７）を示す。
【図４６】抗ヒトＦｃ抗体による（トリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの）ウェスタンブロットを示す。レーン１ないし６を次のとおり負荷した。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］１５μＬ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］１５μＬ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］１５μＬ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の１５μＬ、「ＤＮＡなし」の対照１５μＬ、分子量マーカー。
【図４７】抗ヒトＦｃ抗体による（トリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの）ウェスタンブロットを示す。レーン１ないし５を次のとおり負荷した。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の２μＬ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の５μＬ、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の１０μＬ、２０ｎｇのヒトＩｇＧ標準物質、分子量マーカー。
【図４８】抗ヒトＦｃ抗体による（トリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの）ウェスタンブロットを示す。レーン１ないし１３を次のとおり負荷した。２０ｎｇのヒトＩｇＧ標準物質、Ｄ１、Ｃ３、Ｃ２、Ｂ６、Ｂ５、Ｂ２、Ｂ１、Ａ６、Ａ５、Ａ４、Ａ３、Ａ２（レーン２ないし１３中に負荷したクローン培養上清）。
【図４９Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図４９Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図４９Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１生成物１４９μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図４９Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析したＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１の最終試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図５０Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図５０Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図５０Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図５０Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析した最終生成物Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）の試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図５１Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図５１Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図５１Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図５１Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析した最終生成物Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図５２Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図５２Ｂ】最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷する。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図５２Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される最終的なＦｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）生成物５０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図５２Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析した最終生成物Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【図５３Ａ】アジアサソリのオルトキルススクロビキュロサス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）毒液の３８残基毒素ペプチドである合成Ｏｓｋ１によるヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の阻害を示す。図５３Ａは、合成Ｏｓｋ１毒素ペプチドによってヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。図５３Ｂは、多様な濃度での合成Ｏｓｋ１毒素ペプチド遮断の時間経過を示す。合成Ｏｓｋ１毒素ペプチドに関するＩＣ５０は、３９±１２ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図５３Ｂ】アジアサソリのオルトキルススクロビキュロサス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）毒液の３８残基毒素ペプチドである合成Ｏｓｋ１によるヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の阻害を示す。図５３Ａは、合成Ｏｓｋ１毒素ペプチドによってヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。図５３Ｂは、多様な濃度での合成Ｏｓｋ１毒素ペプチド遮断の時間経過を示す。合成Ｏｓｋ１毒素ペプチドに関するＩＣ５０は、３９±１２ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図５４Ａ】抗体のＦｃ断片（ＯＳＫ１−ペプチボディ）に対する融合による合成ＯＳＫ１毒素ペプチドの改変が、ヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５４Ａは、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５４Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１遮断の時間経過を示す。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１に関するＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約５倍弱い１９８±３５ｐＭ（ｎ＝６個の細胞）であると概算した。
【図５４Ｂ】抗体のＦｃ断片（ＯＳＫ１−ペプチボディ）に対する融合による合成ＯＳＫ１毒素ペプチドの改変が、ヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５４Ａは、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５４Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１遮断の時間経過を示す。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１に関するＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約５倍弱い１９８±３５ｐＭ（ｎ＝６個の細胞）であると概算した。
【図５５Ａ】ＯＳＫ１−ペプチボディの単一アミノ酸残基置換がヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５５Ａは、（Ｎ末端から７番目の位置でのリジンからセリンへの）単一アミノ酸置換（［Ｋ７Ｓ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５５Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約１０倍弱い３７２±７１ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図５５Ｂ】ＯＳＫ１−ペプチボディの単一アミノ酸残基置換がヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５５Ａは、（Ｎ末端から７番目の位置でのリジンからセリンへの）単一アミノ酸置換（［Ｋ７Ｓ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５５Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約１０倍弱い３７２±７１ｐＭ（ｎ＝４個の細胞）であると概算した。
【図５６Ａ】ＯＳＫ１−ペプチボディの２つのアミノ酸残基置換がヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５６Ａは、（Ｎ末端からそれぞれ１６番目及び２０番目の位置でのグルタミン酸からリジンへの及びリジンからアスパラギン酸への）２つのアミノ酸置換（［Ｋ７Ｓ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６ＫＫ２０Ｄ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５６Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６ＫＫ２０Ｄ］による、カリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約６倍弱い２４８±６３ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）であると概算した。
【図５６Ｂ】ＯＳＫ１−ペプチボディの２つのアミノ酸残基置換がヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持したことを示す。図５６Ａは、（Ｎ末端からそれぞれ１６番目及び２０番目の位置でのグルタミン酸からリジンへの及びリジンからアスパラギン酸への）２つのアミノ酸置換（［Ｋ７Ｓ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６ＫＫ２０Ｄ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５６Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６ＫＫ２０Ｄ］による、カリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約６倍弱い２４８±６３ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）であると概算した。
【図５７Ａ】ＯＳＫ１−ペプチボディのアミノ酸残基三重置換が、ヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持するが、阻害の有効性は合成ＯＳＫ１毒素ペプチドと比較して有意に低下したことを示す。図５７Ａは、（Ｎ末端からそれぞれ７番目、１６番目及び２０番目の位置でのリジンからセリンへの、グルタミン酸からリジンへの及びリジンからアスパラギン酸への）三重のアミノ酸置換（［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５７Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約２１倍弱い８１２±８４ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）であると概算した。
【図５７Ｂ】ＯＳＫ１−ペプチボディのアミノ酸残基三重置換が、ヒトＫｖ１．３チャネルに対する阻害活性を保持するが、阻害の有効性は合成ＯＳＫ１毒素ペプチドと比較して有意に低下したことを示す。図５７Ａは、（Ｎ末端からそれぞれ７番目、１６番目及び２０番目の位置でのリジンからセリンへの、グルタミン酸からリジンへの及びリジンからアスパラギン酸への）三重のアミノ酸置換（［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］）を有し、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片へ結合したＯＳＫ１−ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］）によって、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現させるＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断を示す。融合コンストラクトは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において安定して発現した。図５７Ｂは、多様な濃度でのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７ＳＥ１６ＫＫ２０Ｄ］によるカリウム電流遮断の時間経過を示す。ＩＣ５０は、合成ＯＳＫ１毒素ペプチドよりも約２１倍弱い８１２±８４ｐＭ（ｎ＝３個の細胞）であると概算した。
【図５８Ａ】血清の付与された割合での各標準物質に関する線形回帰式を含有するＳｈＫ（図５８Ａ）に関する標準曲線を示す。
【図５８Ｂ】血清の付与された割合での各標準物質に関する線形回帰式を含有する２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］（図５８Ｂ）に関する標準曲線を示す。
【図５９】静脈内注射後の２０Ｋ  ＰＥＧ  ＳｈＫ［１−３５］分子に関する、ラットにおける薬物動態学的特性を示す。
【図６０】Ｋｖ１．３阻害剤であるＳｈＫ対２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］の単一等モル量の静脈内注射を受容するラットの血清試料（５％）中のＫｖ１．３阻害活性を示す。
【図６１】養子移植ＥＡＥモデル実験デザイン（ｎ＝治療群あたり５匹のラット）を示す。１キログラムあたりのマイクログラム（ｍｇ／ｋｇ）における投与値は、ペプチド含有量に基づいている。
【図６２】ＰＥＧ−ＳｈＫによる治療が、養子移植ＥＡＥモデルにおけるラットの疾病を寛解したことを示す。臨床的評価：０＝徴候なし、０．５＝遠位跛行尾部、１．０＝跛行尾部、２．０＝軽度不全対麻痺、運動失調、３．０＝中等度不全対麻痺、３．５＝片後肢麻痺、４．０＝完全後肢麻痺、５．０＝完全後肢麻痺及び失禁、５．５＝四肢麻痺、６．０＝瀕死状態又は死亡であった。５．５ないし６のスコアに到達しているラットを安楽死させた。平均±平均値の標準誤差の値を示す（ｎ＝治療群あたり５匹のラット）
【図６３】ＰＥＧ−ＳｈＫによる治療が、養子移植ＥＡＥモデルにおける体重の低下を予防したことを示す。ラットは、（生存しているラットに関して）第−１、４、６及び８日に体重測定した。平均±平均の標準誤差の値を示す。
【図６４Ａ】ヒト全血におけるタプシガルジン誘発性ＩＬ−２生成が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］によって抑制されたことを示すカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡも前記反応を遮断する。ＢＫＣａチャネル阻害剤であるイベリオトキシン（ＩｂＴｘ）は、有意な活性を示さなかった。２つの個別のドナー由来の全血の反応を図６４Ａ及び図６４Ｂに示す。
【図６４Ｂ】ヒト全血におけるタプシガルジン誘発性ＩＬ−２生成が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］によって抑制されたことを示すカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡも前記反応を遮断する。ＢＫＣａチャネル阻害剤であるイベリオトキシン（ＩｂＴｘ）は、有意な活性を示さなかった。２つの個別のドナー由来の全血の反応を図６４Ａ及び図６４Ｂに示す。
【図６５Ａ】ヒト全血におけるタプシガルジン誘発性ＩＦＮ−ｇ生成が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］によって抑制されたことを示すカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡも前記反応を遮断する。ＢＫＣａチャネル阻害剤であるイベリオトキシン（ＩｂＴｘ）は、有意な活性を示さなかった。２つの個別のドナー由来の全血の反応を図６５Ａ及び図６５Ｂに示す。
【図６５Ｂ】ヒト全血におけるタプシガルジン誘発性ＩＦＮ−ｇ生成が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］によって抑制されたことを示すカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡも前記反応を遮断する。ＢＫＣａチャネル阻害剤であるイベリオトキシン（ＩｂＴｘ）は、有意な活性を示さなかった。２つの個別のドナー由来の全血の反応を図６５Ａ及び図６５Ｂに示す。
【図６６Ａ】ヒト全血におけるＴ細胞に関するＣＤ４０Ｌのタプシガルジン誘発性上方制御が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［1−３５］（Ｆｃ−ＳｈＫ）によって抑制されたことを示す。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）も前記反応を遮断する。図６６Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計の反応で見る実験の結果を示す。図６６Ｂは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ４５＋及びＣＤ４＋ＣＤ４５−Ｔ細胞で見た実験の結果を示す。図６６Ｂにおいて、ＢＫＣａチャネル阻害剤イベリオトキシン（ＩｂＴｘ）及びＫｖ１．１チャネル阻害剤デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）は、有意な活性を示さなかった。
【図６６Ｂ】ヒト全血におけるＴ細胞に関するＣＤ４０Ｌのタプシガルジン誘発性上方制御が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［1−３５］（Ｆｃ−ＳｈＫ）によって抑制されたことを示す。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）も前記反応を遮断する。図６６Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計の反応で見る実験の結果を示す。図６６Ｂは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ４５＋及びＣＤ４＋ＣＤ４５−Ｔ細胞で見た実験の結果を示す。図６６Ｂにおいて、ＢＫＣａチャネル阻害剤イベリオトキシン（ＩｂＴｘ）及びＫｖ１．１チャネル阻害剤デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）は、有意な活性を示さなかった。
【図６７Ａ】ヒト全血におけるＴ細胞に関するＩＬ−２Ｒのタプシガルジン誘発性上方制御が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［1−３５］（Ｆｃ−ＳｈＫ）によって抑制されたことを示す。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）も前記反応を遮断する。  図６７Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計の反応で見る実験の結果を示す。  図６７Ｂは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ４５−Ｔ細胞の合計で見る実験の結果を示す。図６７Ｂにおいて、ＢＫＣａチャネル阻害剤イベリオトキシン（ＩｂＴｘ）及びＫｖ１．１チャネル阻害剤デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）は、有意な活性を示さなかった。
【図６７Ｂ】ヒト全血におけるＴ細胞に関するＩＬ−２Ｒのタプシガルジン誘発性上方制御が、Ｋｖ１．３チャネル阻害剤であるＳｈＫ［１−３５］及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［1−３５］（Ｆｃ−ＳｈＫ）によって抑制されたことを示す。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）も前記反応を遮断する。  図６７Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の合計の反応で見る実験の結果を示す。  図６７Ｂは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ４５−Ｔ細胞の合計で見る実験の結果を示す。図６７Ｂにおいて、ＢＫＣａチャネル阻害剤イベリオトキシン（ＩｂＴｘ）及びＫｖ１．１チャネル阻害剤デンドロトキシン−Ｋ（ＤＴＸ−Ｋ）は、有意な活性を示さなかった。
【図６８Ａ】ＰＥＧ−Ｓｈｋ精製（図６８Ａ）に関するＳＰセファロースＨＰカラム上でのＰＥＧ−ペプチド精製の陽イオン交換クロマトグラムを示す。
【図６８Ｂ】ＰＥＧ−ＯＳＫ−１精製（図６８Ｂ）に関するＳＰセファロースＨＰカラム上でのＰＥＧ−ペプチド精製の陽イオン交換クロマトグラムを示す。
【図６９Ａ】ＰＥＧ−Ｓｈｋ純度９９％超（図６９Ａ）の純度を示すための、最終的なＰＥＧ−ペプチドプールに関するＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６９Ｂ】ＰＥＧ−Ｏｓｋ１純度９７％超（図６９Ｂ）の純度を示すための、最終的なＰＥＧ−ペプチドプールに関するＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７０】Ｆｃ  Ｎ末端ドメイン（アミノ酸残基１ないし１３９）、ＯｓＫ１（下線を付したアミノ酸残基１４２ないし１７９）及びＦｃ  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸残基１８２ないし２７０）の３つの結合したドメインを有する典型的なＦｃループ−Ｌ２−ＯｓＫ１−Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号９７６）を示す。
【図７１】Ｆｃ  Ｎ末端ドメイン（アミノ酸残基１ないし１３９）、ＳｈＫ（下線を付したアミノ酸残基１４２ないし１７９）及びＦｃ  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸残基１７９ないし２６７）の３つの結合したドメインを有する典型的なＦｃループ−Ｌ２−ＳｈＫ−Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号９７７）を示す。
【図７２】Ｆｃ  Ｎ末端ドメイン（アミノ酸残基１ないし１３９）、ＳｈＫ（下線を付したアミノ酸残基１４２ないし１７６）及びＦｃ  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸残基１８１ないし２６９）の３つの結合したドメインを有する典型的なＦｃループ−Ｌ２−ＳｈＫ−Ｌ４のアミノ酸配列（配列番号９７８）を示す。
【図７３】Ｆｃ  Ｎ末端ドメイン（アミノ酸残基１ないし１３９）、ＯｓＫ１（下線を付したアミノ酸残基１４４ないし１８１）及びＦｃ  Ｃ末端ドメイン（アミノ酸残基１８４ないし２７２）の３つの結合したドメインを有する典型的なＦｃループ−Ｌ４−ＯｓＫ１−Ｌ２のアミノ酸配列（配列番号９７９）を示す。
【図７４】２０Ｋ  ＰＥＧ化ＳｈＫ［１−３５］が、ＨＥＫ２９３／Ｋｖ１．３細胞に関するホールセルパッチクランプ電気生理学によって測定されるヒトＫｖ１．３の有力な遮断を提供したことを示す。データは、ピーク電流の遮断を表す。
【図７５Ａ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｂ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｃ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｄ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｅ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｆ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｇ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７５Ｈ】本発明の組成物の幾つかの他の典型的な実施形態の模式的構造を示す。「Ｘ２」及び「Ｘ３」は、本明細書に定義される毒素ペプチド又はリンカー−毒素ペプチドの組み合わせ（すなわち、−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−）を表す。本明細書に記載されているが、図７５には示されていないように、付加的なＸ１ドメイン及び１つ以上の付加的なＰＥＧ部分も他の実施形態に包含される。本明細書に示される特異的な実施形態は次のとおりである。  図７５Ｃ、図７５Ｄ、図７５Ｇ及び図７５Ｈは、単一鎖分子を示し、前記分子に関するＤＮＡコンストラクトも表し得る。  図７５Ａ、図７５Ｂ、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、（位置Ｆ２にある）二重にジスルフィド結合したＦｃ二量体を示し、図７５Ａ及び図７５Ｂは、位置Ｘ３における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示し、図７５Ｅ及び図７５Ｆは、位置Ｘ２における両鎖上の毒素ペプチド部分を有する二量体を示す。
【図７６Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用する、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したＳｈＫ［２−３５］−Ｆｃ生成物５０μＬのスペクトル走査を示す。
【図７６Ｂ】最終的なＳｈＫ［２−３５］−Ｆｃ生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２に次のとおり負荷した。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図７６Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なＳｈＫ［２−３５］−Ｆｃ生成物７０μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図７６Ｄ】Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱイオントラップ質量分光光度計のエレクトロスプレー源へ直接連結されるカラム溶出液を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＣＬを使用する逆相クロマトグラフィーを使用して、最終的なＳｈＫ［２−３５］−Ｆｃ試料のＬＣ−ＭＳ分析を示す。関連するスペクトルを合計し、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェアパッケージを使用して質量データへデコンボルートした。
【図７７Ａ】Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ８４５３分光光度計及び１ｃｍ経路長のクォーツキュベットを使用して、７００μＬのＰＢＳ（空の緩衝液）中に希釈したｍｅｔ−ＳｈＫ［１−３５］−Ｆｃ生成物２０μＬのスペクトル走査を示す。
【図７７Ｂ】最終的なｍｅｔ−ＳｈＫ［１−３５］−Ｆｃ生成物のクーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１ないし１２を次のとおり負荷した。Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの非還元型生成物、ブランク、２．０μｇの非還元型生成物、ブランク、１０μｇの非還元型生成物、Ｎｏｖｅｘ  Ｍａｒｋ１２の広範な範囲のタンパク質標準物質、０．５μｇの還元型生成物、ブランク、２．０μｇの還元型生成物、ブランク及び１０μｇの還元型生成物。
【図７７Ｃ】５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ１ｍＬ／分で注入される、最終的なｍｅｔ−ＳｈＫ［１−３５］−Ｆｃ生成物９３μｇに関する、２８０ｎｍで吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図７７Ｄ】窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分光光度計を使用して分析した最終的なｍｅｔ−ＳｈＫ［１−３５］−Ｆｃ試料のＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析を示す。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
用語の定義
本明細書を通じて使用される用語は、具体的な事例において別段の限定がなければ、以下のとおり定義される。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、文脈から別段の意味であることが明らかである場合を除き、複数表記も含まれる。
【００３３】
「半減期延長部分」（すなわち、式Ｉ中のＦ１又はＦ２）という用語は、トキシンペプチドの非抱合形態に比べて、インビボタンパク分解によるトキシンペプチドの分解又はトキシンペプチドの活性を減少させる他の化学的修飾を抑制又は軽減し、吸収の速度を増加させるなど（但し、これに限定されない。）、半減期又はその他の薬物動態特性を増加させ、毒性を軽減し、溶解性を向上させ、目的の標的イオンチャンネルに関して、トキシンペプチドの生物学的活性及び／又は標的選択性を増加させ、製造可能性を増加させ、及び／又はトキシンペプチドの免疫原性を低下させる、トキシンペプチドに共有結合又は抱合された、医薬として許容される部分、ドメイン又は「ビヒクル」を表す。
【００３４】
「ＰＥＧ化されたペプチド」とは、ペプチド自体のアミノ酸残基に共有結合されるか、又はペプチドの残基に共有結合されたペプチド若しくは非ペプチドリンカー（芳香族リンカーを含むが、これに限定されない。）に共有結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を有するペプチド又はタンパク質を意味する。
【００３５】
「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」とは、カップリング剤あり若しくはなしの、又はカップリング若しくは活性化部分での（例えば、アルデヒド、ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジド、チオール、トリフラート、トレシラート、アジリジン、オキシラン、オルトピリジル  ジスルフィド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド又はマレイミド部分での誘導体化あり若しくはなしの、ポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。本発明に従えば、有用なＰＥＧには、実質的に直線の、直鎖ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ又は樹状ＰＥＧが含まれる。（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌ，米国特許第５，１７１，２６４号；Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉａｒｍｅｄ，ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ，米国特許第５，９３２，４６２号；Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号を参照）。
【００３６】
「ペプチボディ」という用語は、Ｆ１及び／又はＦ２が、免疫グロブリンＦｃドメイン又はＦｃのＣＨ２ドメインなどのその一部である式Ｉの分子、又はＦ１及びＦ２が、それぞれ、トキシンペプチドがＦ１及びＦ２の間に挿入されたＦｃドメインであるように、トキシンペプチドがヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインループ中に挿入された式Ｉの分子を表す（例えば、本明細書の図７０〜７３及び実施例４９を参照。）。本発明のペプチボディは、本明細書にさらに記載されているように、Ｆｃドメイン若しくはその一部の何れかにおいて、若しくは本発明の組成物のトキシンペプチド部分において、又は両方においてＰＥＧ化することも可能である。
【００３７】
「固有Ｆｃ」という用語は、単量体形態であれ、又は多量体形態であれ、完全な抗体の消化から得られる非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を表す。固有Ｆｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト由来であり、免疫グロブリンの何れでもあり得るが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２が好ましい。固有Ｆｃは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有会合によって、二量体又は多量体形態へと連結されることが可能な単量体ポリペプチドから構成される。固有Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から得られるジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Res.１０：４０７１−９参照）。本明細書において使用される「固有Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態の総称である。
【００３８】
「Ｆｃバリアント」という用語は、固有Ｆｃから修飾されているが、サルベージ受容体であるＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。幾つかの公開された特許文献が、典型的なＦｃバリアント及びサルベージ受容体との相互作用を記載している。国際出願ＷＯ  ９７／３４６３１（１９７９年９月２５日に公開；ＷＯ９６／３２４７８号、  ２０００年８月１日に付与された米国特許第６，０９６，８９１号に対応、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる；及びＷＯ  ０４／１１０４７２号を参照。従って、「Ｆｃバリアント」という用語には、非ヒト固有Ｆｃからヒト化された分子又は配列が含まれる。さらに、除去可能な部位は、本発明の融合分子に対して必要とされない構造的特徴又は生物学的活性を与えるので、固有Ｆｃは、除去可能な部位を含む。従って、「Ｆｃバリアント」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との非適合性、（３）選択された宿主細胞中で発現された際のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を与えるか、又はこれらに関与する１つ又はそれ以上の固有Ｆｃ部位又は残基を欠如する分子又は配列を含む。Ｆｃバリアントは、以下でさらに詳しく記載されている。
【００３９】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上記定義の固有Ｆｃ及びＦｃバリアント分子及び配列を包含する。Ｆｃバリアント及び固有Ｆｃにおけるごとく、「Ｆｃドメイン」という用語には、完全な抗体から消化されたものであれ、又はその他の手段によって産生されたものであれ、単量体又は多量体形態の分子が含まれる。
【００４０】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して用いられる「多量体」という用語は、共有的に、非共有的に、又は共有的相互作用及び非共有的相互作用の両者によって会合された２つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を表す。ＩｇＧ分子は、典型的には、二量体を形成し、ＩｇＭは五量体；ＩｇＤは二量体及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。当業者は、Ｆｃの固有Ｉｇ源の配列若しくは生じた活性を調べることによって、又はこのような固有Ｆｃを誘導体化（以下に定義されている。）することによって、多量体を形成することが可能である。
【００４１】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して用いられる「二量体」という用語は、共有的に又は非共有的に会合された２つのポリペプチド鎖を有する分子を表す。従って、本発明の範囲に属する典型的な二量体が、図２に示されている。
【００４２】
「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、それぞれ、（１）化合物が、環状部分、例えば、化合物内のシステイン残基間の架橋を有する；（２）化合物が架橋され、又は架橋部位を有する、例えば、化合物がシステイン残基を有し、従って、培養若しくはインビボにおいて架橋された二量体を形成する；（３）非ペプチド結合によって、１つ又はそれ以上のペプチド結合が置換されている；（４）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基又は置換された若しくは置換されていないベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（Ｒ及びＲ１及び環置換基は、以下で定義されているとおりである。）；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４によって置換されている（Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、以下に定義されているとおりである。）；並びに（６）選択された側鎖又は末端残基と反応することができる因子での処理を通じて、各アミノ酸部分が修飾されている化合物、プロセス及び得られた化合物を含む。誘導体は、さらに、以下に記載されている。
【００４３】
「ペプチド」という用語は、２〜約８０アミノ酸残基の分子を表し、約１０〜約６０アミノ酸残基の分子が好ましく、約３０〜約５０アミノ酸残基の分子が最も好ましい。典型的なペプチドは、あらゆる公知の方法によって無作為に作製され、ペプチドライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）中に担持され、又はタンパク質の消化によって得ることができる。本発明の組成物の何れのペプチド部分、例えば、本明細書に記載されているトキシンペプチド又はペプチドリンカー部分においても、所定の配列のＮ末端又はＣ末端の一方又は両方に、追加のアミノ酸を含めることが可能である。もちろん、これらの追加のアミノ酸残基は、組成物の機能的活性を著しく妨害すべきでない。「トキシンペプチド」には、毒から単離することが可能な薬理学的に活性な天然に存在するペプチドの同じアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、天然に存在するこのような分子の修飾されたペプチド類縁体も含まれる。本発明を実施する上で有用なトキシンペプチドの例は、表１〜３２に列記されている。トキシンペプチド（図２における「Ｐ」又は「Ｐ１」として示されている均等物）は、例えば、図９に示されているように、少なくとも２つのペプチド内ジスルフィド結合を含む。
【００４４】
従って、本発明は、
ａ）Ｃ１−Ｃ３及びＣ２−Ｃ４ジスルフィド結合（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第三のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第二及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ３、Ｃ２−Ｃ４ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、アパミンペプチド、α−コノペプチド、ＰｎｌＡペプチドＰｎｌＢペプチド及びＭＩＩペプチド並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
ｂ）Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４及びＣ３−Ｃ５ジスルフィド結合（上述のように、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第三及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、ＳｈＫ、ＢｇＫ、ＨｍＫ、ＡｅＫＳ、ＡｓＫ及びＤＴＸ１並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
ｃ）Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５及びＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合（上記のように、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＣ６は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第三及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、Ｃ３−Ｃ６ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、ＣｈＴｘ、ＭｇＴｘ、ＯＳＫ１、ＫＴＸ１、ＡｇＴｘ２、Ｐｉ２、Ｐｉ３、ＮＴＸ、ＨｇＴｘ１、ＢｅＫＭ１、ＢｍＫＴＸ、Ｐ０１、ＢｍＫＫ６、Ｔｃ３２、Ｔｃ１、ＢｍＴｘ１、ＢｍＴＸ３、ＩｂＴｘ、Ｐ０５、ＳｃｙＴｘ、ＴｓＫ、ＨａＴｘ１、ＰｒｏＴＸ１、ＰａＴＸ２、Ｒｕ１、ωＧＶＩＡ、ωＭＶＩＩＡ及びＳｍＩＩＩａ並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
ｄ）Ｃ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ７及びＣ４−Ｃ８ジスルフィド結合（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７及びＣ８は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチド一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第七のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第四及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ７、Ｃ４−Ｃ８ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、アニュオロクトキシン（ＡｎＴｘ）、Ｐｉ１、ＨｓＴｘ１、ＭＴＸ（Ｐ１２Ａ，Ｐ２０Ａ）及びＰｉ４ペプチド並びに前記の何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
ｅ）Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ７及びＣ５−Ｃ８ジスルフィド結合（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７及びＣ８は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第七のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第五及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ７、Ｃ５−Ｃ８ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、クロロトキシン、Ｂｍ−１２ｂ及び何れかの類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
ｆ）Ｃ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ４及びＣ７−Ｃ８ジスルフィド結合（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７及びＣ８は、ペプチドのＮ末端が左側に配置された慣用表記のトキシンペプチドの一次配列中にシステイン残基が現れる順序を表しており、アミノ酸配列中の第一及び第五のシステインがジスルフィド結合を形成し、第二及び第六のシステインがジスルフィド結合を形成し、第三及び第四のシステインがジスルフィド結合を形成し、並びに第七及び第八のシステインがジスルフィド結合を形成する。）。このようなＣ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ６、Ｃ３−Ｃ４、Ｃ７−Ｃ８ジスルフィド結合パターンを有するトキシンペプチドの例には、マウロトキシン及びその類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
を含む分子に関する。
【００５０】
ペプチド配列を表すために使用される「無作為化された」という用語は、（例えば、ファーディスプレイ法によって選択された）完全に無作為な配列及び天然に存在する分子の１つ又はそれ以上の残基が、天然に存在する分子中の位置に出現しないアミノ酸残基によって置換された配列を表す。ペプチド配列を同定するための典型的な方法には、ファージディスプレイ、Ｅ．コリディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母を基礎としたスクリーニング、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学的スクリーニング、合理的設計、タンパク質構造分析などが含まれる。
【００５１】
「薬理学的に活性な」という用語は、このようにして記載された物質が、医学的パラメータ（例えば、血圧、血液細胞数、コレステロールレベル）又は病状（例えば、癌、自己免疫疾患）に影響を与える活性を有することが決定される。従って、薬理学的に活性なペプチドは、以下に定義されている、アゴニストペプチド又は模倣的ペプチド及びアンタゴニストペプチドを含む。
【００５２】
「模倣的ペプチド」及び「アゴニストペプチド」という用語は、天然に存在するトキシンペプチド分子（例えば、天然に存在するＳｈＫトキシンペプチド）と同等の生物学的活性を有するペプチドを表す。さらに、これらの用語は、天然に存在する分子の効果を強化することによるなど、天然に存在するトキシンペプチド分子の活性を間接的に模倣するペプチドを含む。
【００５３】
「アンタゴニストペプチド」又は「阻害剤ペプチド」という用語は、対象の受容体（イオンチャンネルなど（但し、これに限定されない。））の生物活性を遮断し、若しくは何らかの方法で妨害するペプチド、又は対象の受容体の公知のアンタゴニスト若しくは阻害剤と同等の生物活性を有するペプチドを表す。
【００５４】
「酸性残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な酸性残基は、Ｄ及びＥを含む。
【００５５】
「アミド残基」という用語は、酸性基のアミド誘導体を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸を表す。典型的な残基は、Ｎ及びＱを含む。
【００５６】
「芳香族残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な芳香族残基は、Ｆ、Ｙ及びＷを含む。
【００５７】
「塩基性残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な塩基性残基には、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ−メチル−アルギニン、ω−アミノアルギニン、ω−メチル−アルギニン、１−メチル−ヒスチジン、３−メチル−ヒスチジン及びホモアルギニン（ｈＲ）残基が含まれる。
【００５８】
「親水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な親水性残基には、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びシトルリン（Ｃｉｔ）残基が含まれる。
【００５９】
「非官能性残基」という用語は、酸性、塩基性又は芳香族基を欠如する側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な非官能性アミノ酸残基には、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ及びノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００６０】
「中性極性残基」という用語は、塩基性、酸性又は極性基を欠如する側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な中性極性アミノ酸残基には、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ及びＦが含まれる。
【００６１】
「極性疎水性残基」という用語は、極性基を含む側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な極性アミノ酸残基には、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ及びＮが含まれる。
【００６２】
「疎水性残基」という用語は、塩基性又は酸性基を欠如する側鎖を有するＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を表す。典型的な疎水性アミノ酸残基には、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ及びＮが含まれる。
【００６３】
本発明の組成物の幾つかの有用な実施形態において、固有ＳｈＫ又はＯＳＫ１配列、それらのペプチド類縁体、又は表１〜３２の何れかに記載されているアミノ酸配列を有する他の何れかのトキシンペプチドなど（但し、これらに限定されない。）、対象の固有トキシンペプチド配列に比べて、１つ又はそれ以上の様式で、トキシンペプチドのアミノ酸配列が修飾されている。
【００６４】
１つ又はそれ以上の有用な修飾には、公知の化学的技術によって達成される、アミノ酸の付加又は挿入、アミノ酸の欠失、ペプチド末端切断、アミノ酸置換及び／又はアミノ酸残基の化学的誘導体化が含まれ得る。このような修飾は、例えば、強化された効力、選択性及び／又はタンパク分解に対する安定性などを目的として為され得る。当業者は、アラニンスキャニング、公知のトキシンペプチド配列を用いた、アラインメントを介した突然変異導入に基づく合理的設計及び／又は分子モデリングなど、このような増強された特性を有するペプチド類縁体を設計するための技術を知悉している。例えば、ＳｈＫ類縁体は、ＨｍＫを用いた、アラインメントを介した突然変異導入（例えば、図６参照）及び分子モデリングに部分的に基づいて、本発明のＳｈＫペプチド含有組成物又は本発明のＳｈＫ類縁体含有組成物中のプロテアーゼ切断部位（例えば、Ｋ若しくはＲ残基におけるトリプシン切断部位及び／又はＦ、Ｙ若しくはＷ残基におけるキモトリプシン切断部位）を除去するために設計することが可能である。（例えば、Ｋａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳｈＫ−Ｄａｐ２２，ａ  ｐｏｔｅｎｔ  Ｋｖ１．３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（４９）：３２６９７−７０７（１９９８）；Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，０７７，６８０号；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｓＫ１  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ＷＯ  ２００６／００２８５０  Ａ２）参照）。
【００６５】
「プロテアーゼ」という用語は、「ペプチダーゼ」と同義である。プロテアーゼは、タンパク質内の点でペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼ、及び、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端の何れから１つ又はそれ以上のアミノ酸を除去するエキソペプチダーゼという酵素の２つの群を含む。「プロテイナーゼ」という用語は、「エンドペプチダーゼ」に対する同義語としても使用される。プロテイナーゼの４つの機構的クラスは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ及びメタロプロテイナーゼである。これらの４つの機構的クラスの他に、同定されていない触媒機構のプロテアーゼに対して割り当てられる酵素命名法の部門が存在する。これは、触媒機構が特定されていないことを示している。
【００６６】
切断サブサイト命名法は、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  とＢｅｒｇｅｒによって作製されたスキームから一般に採用されている（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  Ｉ．＆  Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．，Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．Ｉ．Ｐａｐａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２７：１５７（１９６７）；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  Ｉ．＆  Ｂｅｒｇｅｒ  Ａ．，Ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．３．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｐａｐａｉｎ；ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｐａｐａｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，３２：８９８（１９６８））。このモデルに従って、切断を経験する基質中のアミノ酸残基は、切断された結合からＮ末端の方向に、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４などと表記される。同様に、Ｃ末端方向での残基は、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’などと表記される。
【００６７】
当業者は、目的のプロテアーゼ結合部位又はプロテアーゼ切断部位を特定するための様々なツールを知悉している。例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＳＩＢ；ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｃｕｔｔｅｒ）のＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバを通じて、ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒソフトウェアツールを入手することが可能である。ＰｅｐｔｉｄｅＣｕｔｔｅｒは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及び／又はＴｒＥＭＢＬデータベース又はユーザが入力したタンパク質配列から、プロテアーゼ切断部位についてタンパク質配列を検索する。単一のプロテアーゼ及び化学物質、プロテアーゼ及び化学物質の選択又は完全なリストを使用することが可能である。酵素名に従ってアルファベットでグループ化されるか、又は順次、アミノ酸番号に従ってグループ化された切断部位の表という、結果の出力の様々な形態が入手可能である。出力のための第三の選択肢は、切断部位のマップである。マップにマッピングされた配列及び切断部位は、ブロックにグループ化され、そのサイズは、ユーザによって選択されることができる。プロテアーゼ切断部位を決定するための他のツールも公知である。（例えば、Ｔｕｒｋ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｍｏｔｉｆｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：６６１−６６７（２００１）；Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８））。
【００６８】
セリンプロテイナーゼには、キモトリプシン、トリプシン又はエラスターゼ又はカリクレインなどの哺乳動物のプロテアーゼ酵素を含むキモトリプシンファミリーが含まれる。セリンプロテイナーゼは、基質残基と相互作用する様々な酵素サブサイト中のアミノ酸置換に関連する異なる基質特異性を示す。幾つかの酵素は、基質との幅広い相互作用部位を有するが、他の酵素はＰ１基質残基に限定した特異性を有する。
【００６９】
トリプシンは、位置Ｐ１のＲ又はＫで優先的に切断する。Ｋｅｉｌ（１９９２）によって実施された統計学的研究は、トリプシン切断時における、Ａｒｇ結合及びＬｙｓ結合を取り囲む残基（すなわち、それぞれ、位置Ｐ２及びＰ１’）の負の影響を記載した。（Ｋｅｉｌ，Ｂ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−ＮｅｗＹｏｒｋ，３３５（１９９２））。位置Ｐ１’中のプロリン残基は、通常、トリプシン切断に対して強力な負の影響を発揮する。同様に、Ｐ１’中のＲ及びＫ並びに位置Ｐ２及びＰ１’における負に帯電した残基は阻害をもたらす。
【００７０】
キモトリプシンは、位置Ｐ１のＷ、Ｙ又はＦで優先的に切断し（高親和性）、これより低い程度で、位置Ｐ１のＬ、Ｍ又はＨ残基で切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。これらの規則に対する例外は、以下のとおりである。Ｗが位置Ｐ１に見出され、Ｍ又はＰが、同時に位置Ｐ１’に見出される場合には、切断は遮断される。さらに、位置Ｐ１’におけるプロリン残基は、位置Ｐ１に見出されるアミノ酸とは無関係に、切断をほぼ完全に遮断する。Ｍ残基が位置Ｐ１に見出される場合には、切断は、位置Ｐ１’におけるＹ残基の存在によって遮断される。最後に、Ｈが位置Ｐ１に位置する場合には、Ｄ、Ｍ又はＷ残基の存在も、切断を遮断する。
【００７１】
膜メタロエンドペプチダーゼ（ＮＥＰ；中性エンドペプチダーゼ、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼ、エンケファリナーゼ、ＥＣ３．４．２４．１１）は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側でペプチドを切断する。（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，ＪＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ２４．１１  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＮＡＳ，８２（２４）：８７３７−８７４１（１９８５））。
【００７２】
トロンビンは、位置Ｐ１のＲ残基で優先的に切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。トロンビンの天然基質は、フィブリノーゲンである。最適な切断部位は、Ｒ残基が位置Ｐ１に存在し、Ｇｌｙが位置Ｐ２及び位置Ｐ１’に存在する場合である。同様に、疎水性アミノ酸残基が位置Ｐ４及び位置Ｐ３に見出される場合には、位置Ｐ２におけるプロリン残基、位置Ｐ１におけるＲ残基並びに位置Ｐ１’及び位置Ｐ２’における非酸性アミノ酸残基。その天然基質であるフィブリノーゲンに対する極めて重要な残基は、Ｐ１０中のＤ残基である。
【００７３】
カスパーゼは、保存されたアミノ酸配列を有する活性部位を有し、及びＤ残基の後ろでペプチドを特異的に切断するシステインプロテアーゼのファミリーである。（Ｅａｒｎｓｈａｗ  ＷＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｓｐａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８：３８３−４２４（１９９９））。
【００７４】
Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼは、位置Ｐ１のＲ残基で優先的に切断する。切断の挙動は、位置Ｐ１’の残基によって、穏やかに影響を受けるに過ぎないように見受けられる。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼは、位置Ｐ１’のＤ残基との結合を特異的に切断する。（Ｋｅｉｌ，１９９２）。
【００７５】
前述の記載は単なる例示に過ぎず、当業者が本発明を実施する際に除去することに関心を抱き得るプロテアーゼ結合及び／又は切断部位に関して、当業者に利用可能な知識を網羅的に取り扱ったものではない。
【００７６】
他の例では、天然に存在するペプチドアミノ酸配列から修飾されるトキシンペプチドアミノ酸配列は、目的の固有トキシンペプチド配列のアミノ酸と比べて、その中に挿入又は置換された少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、ここにおいて、挿入又は置換されたアミノ酸残基は、ペプチドがリンカー又は半減期延長部分に抱合される求核的又は求電子的反応性官能基を含む側鎖を有する。本発明に従えば、このような求核的又は求電子的反応性官能基の有用な例には、チオール、一級アミン、セレノ、ヒドラジド、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、アミノオキシ、遮蔽された（保護された）アルデヒド又は遮蔽された（保護された）ケト官能基が含まれるが、これらに限定されるものではない。求核的反応性官能基を含む側鎖を有するアミノ酸残基の例には、リジン残基、α，β−ジアミノプロピオン酸残基、α，γ−ジアミノ酪酸残基、オルニチン残基、システイン、ホモシステイン、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基又はセレノシステイン残基が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本明細書においてトキシンペプチドをさらに記載する際には、天然に存在するペプチド及びタンパク質中に一般的に取り込まれる２０の「標準」アミノ酸残基の種類を表すために、一文字略号システムがしばしば適用される（表１Ａ）。このような一文字略号は、意味の上で、三文字略号又は省略されていないアミノ酸名と完全に互換的である。本明細書に使用されている一文字略号システムにおいて、本明細書に別段の記載がなければ、大文字はＬアミノ酸を示し、小文字はＤアミノ酸を示す。例えば、略号「Ｒ」はＬ−アルギニンを表し、略号「ｒ」はＤ−アルギニンを表す。
【００７８】
【表１】
0005220915.tif 000002
【００７９】
本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸置換は、特定の位置におけるアミノ酸残基に対する一文字略号に続き、目的の固有トキシンペプチド配列に対する数字のアミノ酸位置、次いで、これに続く、置換されたアミノ酸残基に対する一文字記号によって典型的に表される。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、仮想の固有トキシンペプチド配列に対して、アミノ酸位置３０におけるアスパラギン酸残基によるスレオニン残基の置換を表す。さらなる例として、「Ｒ１８ｈＲ」又は「Ｒ１８Ｃｉｔ」は、仮想の固有トキシンペプチド配列に対して、それぞれ、アミノ酸位置１８におけるホモアルギニン又はシトルリン残基によるアルギニン残基の置換を表す。本明細書に記載されているあらゆる特定のトキシンペプチド（又はペプチド類縁体）のアミノ酸配列内のアミノ酸位置は、ペプチドアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端を、適宜、固有トキシンペプチド配列のＮ末端又はＣ末端と併置して決定されるように、固有配列に対するその位置とは異なり得る。例えば、このようにして、固有のＳｈＫ（１−３５）（配列番号５）のＣ末端と併置された配列ＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ（ＳｈＫ（２−３５）；配列番号９２）（固有ＳｈＫ配列のＮ末端切断）のアミノ酸位置１は、固有配列におけるアミノ酸位置２に対応し、配列番号９２のアミノ酸位置３４は、固有配列（配列番号５）におけるアミノ酸位置３５に対応する。
【００８０】
本発明のある種の実施形態において、アミノ酸置換は、（ペプチド又はタンパク質中では）天然には稀なアミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基を含むことができる非標準アミノ酸残基を包含する。非標準アミノ酸残基は、組換え的に発現する細胞などの生物学的系での合成によるより、むしろ、化学的ペプチド合成によってペプチド中に取り込むことが可能であり、あるいは、当業者は、組換え的に発現している細胞を使用するタンパク質工学の公知の技術を使用することが可能である。（例えば、Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（６）：６０３−６０９（２００３）参照）。「非標準アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するタンパク質中に一般的に取り込まれる２０個の標準アミノ酸に属さないＤ又はＬ型のアミノ酸残基、例えば、β−アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸及び誘導体化された側鎖を有するアミノ酸を表す。例には、（Ｌ型又はＤ型の）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎ−メチルシトルリン（ＮＭｅＣｉｔ）、Ｎ−メチルホモシトルリン（ＮＭｅＨｏＣｉｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ又はＯ）、Ｎ−メチルオルニチン（ＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＫ  又はＨｌｙｓ）、ホモアルギニン（ｈＲ又はｈＡｒｇ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎ−メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎ−メチルロイシン（ＮＭｅＬ）、Ｎ−メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）、Ｎ−メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（ＮＩｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ−カルボキシグルタミン酸（γ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ−カルボキシル−フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α−アミノアジピン酸（Ａａｄ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α、β−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α、γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、β−（１−ナフチル）−アラニン（１Ｎａｌ）、β−（２−ナフチル）−アラニン（２Ｎａｌ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４−メチル−フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β−ジフェニル−アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４−フェニル−フェニルアラニン（４Ｂｉｐ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）及び本明細書に記載されているこれらの何れかの誘導体化された形態が含まれる。ＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学の命名法に関する合同委員会（ＪＣＢＮ）によるアミノ酸及びペプチドに対する命名法及び記号表記は、以下の文書：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４，２１９，３４５−３７３；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３８，９−３７；１９８５，１５２，１；１９９３，２１３，２；Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，１９８４，２４，ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐ  ８４；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．��１９８５，２６０，１４−４２；Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８４，５６，５９５−６２４；Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８５，１６，３８７−４１０；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２，ｐａｇｅｓ  ３９−６９］に公表されている。
【００８１】
本明細書に記載されているように、本発明に従って、トキシンペプチド又はペプチドリンカーなどの本発明の組成物のペプチド部分は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基において化学的に誘導体化することも可能である。誘導体化されたアミノ酸残基を含有するペプチドは、公知の有機化学技術によって合成することが可能である。ペプチドという文脈における「化学的誘導体」又は「化学的に誘導体化された」とは、官能的側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ又はそれ以上の残基を有する対象ペプチドを表す。このような誘導体化された分子には、例えば、遊離のアミノ基が、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾオキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基を形成するように誘導体化されている分子が含まれる。遊離のカルボキシル基は、塩、メチル及びエチルエステル又はエステル若しくはヒドラジドの他の種類を形成するように誘導体化され得る。遊離の水酸基は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化され得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化され得る。Ｌ型又はＤ型を問わず、２０個の標準アミノ酸の１つ又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも、化学的誘導体として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンが置換され得；５−ヒドロキシリジンは、リジンが置換され得；３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンが置換され得；ホモセリンは、セリンが置換され得；及びオルニチンは、リジンが置換され得る。
【００８２】
本発明の幾つかの実施形態において、目的のトキシンペプチドの塩基性残基（例えば、リジン）は、他の残基（非官能性残基が好ましい。）で置換することが可能である。このような分子は、それを与えた分子より塩基性が低く、その他の点では、それを与えた分子の活性を保持しており、これは安定性及び免疫原性の点で利点をもたらし得る。しかしながら、本発明は、この理論によって限定されるべきではない。
【００８３】
さらに、本発明の組成物が「分子」又は「化合物」として本明細書において表記される場合には、本発明の組成物の生理的に許容される塩も包含される。「生理的に許容される」塩とは、医薬として許容されることが公知であるか、又は後に発見されるすべての塩を意味する。幾つかの例は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、塩化水素酸塩及び臭化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ベシル酸塩及びシュウ酸塩である。
【００８４】
化合物の構造：
総論。組換えタンパク質は、数ある手段のうちとりわけ、半減期延長部分への共有結合を通じて、治療剤として開発されてきた。このような部分には、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）（エタネルセプト）で使用されるような、抗体の「Ｆｃ」ドメイン及びＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）（ペグフィルグラスチム）で使用されるような、生物学的に適切なポリマー（例えば、ポリエチレングリコール又は「ＰＥＧ」）が含まれる。Ｆｅｉｇｅらは、２００３年１２月９日に付与された米国特許第６，６６０，８４３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）において、このような半減期延長物質をペプチドとともに使用することを記載した。
【００８５】
本発明者らは、本発明の分子（少なくとも２つのペプチド内ジスルフィド結合を有する、約８０アミノ酸又はそれ以下のペプチド）が、半減期延長部分に共有結合されると、治療的利点を有することを決定した。本発明の分子は、半減期延長部分（Ｆ１及び／又はＦ２）に又はペプチド部分（Ｐ）に結合されることが可能な、薬理学的に活性な共有結合されたさらなるペプチド部分をさらに含むことが可能である。２以上の半減期延長部分（Ｆ１及びＦ２）を含有する本発明の組成物の実施形態には、Ｆ１及びＦ２が同一又は別異の半減期延長部分であるものが含まれる。例（各ドメイン間にリンカーを有するか、又は有しない。）には、図７５に図示されている構造及び以下の実施形態（並びに本明細書及び実施例に記載されているその他のもの）が含まれる。
【００８６】
２０ＫＰＥＧ−トキシンペプチド−Ｆｃドメイン、式［（Ｆ１）１−（Ｘ２）１−（Ｆ２）１］と合致；
２０ＫＰＥＧ−トキシンペプチド−ＦｃＣＨ２ドメイン、式［（Ｆ１）１−（Ｘ２）１−（Ｆ２）１］と合致；
２０ＫＰＥＧ−トキシンペプチド−ＨＳＡドメイン、式［（Ｆ１）１−（Ｘ２）１−（Ｆ２）１］と合致；
２０ＫＰＥＧ−Ｆｃドメイン−トキシンペプチド、式［（Ｆ１）１−（Ｘ２）１−（Ｘ３）１］と合致；
２０ＫＰＥＧ−ＦｃＣＨ２ドメイン−トキシンペプチド、式［（Ｆ１）１−（Ｆ２）１−（Ｘ３）１］と合致；及び
２０ＫＰＥＧ−ＨＳＡ−トキシンペプチド、式［（Ｆ１）１−（Ｘ２）１−（Ｘ３）１］と合致。
【００８７】
トキシンペプチド。トキシンペプチド（すなわち、「Ｐ」又は図２において「Ｐ１」として等価に示されている。）のあらゆる数を、本発明とともに使用することが可能である。特に興味深いのは、トキシンペプチドＳｈＫ、ＨｍＫ、ＭｇＴｘ、ＡｇＴｘ２、ＯｓＫ１（「ＯＳＫ１」とも称される。）、アガトキシン及びＨｓＴｘ１並びにこれらの修飾された類縁体並びにこのようなトキシンペプチドの活性を模倣するその他のペプチド）である。本明細書に上述されているように、本発明の組成物中に２以上のトキシンペプチド「Ｐ」が存在すれば、「Ｐ」は、独立に、同じく本発明の組成物中に存在する他の何れのトキシンペプチドと同一又は別異であることが可能である。例えば、式Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐを有する組成物において、両トキシンペプチド「Ｐ」は、ＳｈＫの同じペプチド類縁体、ＳｈＫの異なるペプチド類縁体であり得、又は一方がＳｈＫのペプチド類縁体、及び他方がＯＳＫ１のペプチド類縁体であり得る。
【００８８】
本発明の幾つかの実施形態において、対象となる他のペプチドは、構造式Ｉの分子に対してさらなる特徴を有する分子中で特に有用である。このような分子において、式Ｉの分子は、薬理学的に活性な共有結合されたさらなるペプチドをさらに含み、これは、アゴニストペプチド、アンタゴニストペプチド又は標的誘導ペプチドである。本ペプチドは、Ｆ１又はＦ２又はＰに抱合されることが可能である。このようなアゴニストペプチドは、トキシンペプチドに対してアゴニスト作用を示す活性を有するが、トキシンペプチドと同じ機序によってこのような活性を発揮する必要はない。ペプチドアンタゴニストも、本発明の実施形態において有用であり、トキシンペプチドの活性に対して相補的であり得る活性を有するペプチドアンタゴニストが好ましい。分子を特定の細胞種、臓器などに誘導するペプチドなど、標的誘導ペプチドも興味深い。ペプチドのこれらのクラスは、本明細書及びその他の参考文献に引用されている参考文献中に記載されている方法によって発見することが可能である。本発明において使用するためのトキシンペプチドを作製する上で、ファージディスプレイが特に有用である。任意の遺伝子産物の任意の部位に対してペプチドリガンドを同定するために、ランダムペプチドのライブラリーからの親和性選択を使用することが可能である。Ｄｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０。ファージディスプレイは、細胞表面受容体又は直鎖エピトープを有する何れかのタンパク質としてのこのような対象タンパク質に結合するペプチドを同定するために特に極めて適している。Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：３１３−２９；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  ３：３７０−８を参照されたい。このようなタンパク質は、「Ｈｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．１７（５）：６７１−７７６」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に広く概説されている。このような目的のタンパク質は、本発明において使用するのに適している。
【００８９】
特に好ましいペプチドは、以下の表に見られる。これらのペプチドは、本分野で開示された方法又は本明細書の以下に記載されている方法によって調製することが可能である。一文字アミノ酸略号が使用される。別段の記載差がなければ、各Ｘは、独立に、非官能性残基である。
【００９０】
【表２】
0005220915.tif 000003
【００９１】
【表３】
0005220915.tif 000004
0005220915.tif 000005
0005220915.tif 000006
0005220915.tif 000007
0005220915.tif 000008
【００９２】
表２に記載されている多くのペプチドは、Ｋｅｍらに対して２０００年６月２０日に付与された米国特許第６，０７７，６８０号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりに調製することが可能である。表２の他のペプチドは、本分野で公知の技術によって調製することが可能である。例えば、ＳｈＫ（Ｌ５）（配列番号９５０）は、「Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりに調製することが可能である。表２及び本明細書を通じて、Ｘｓ１５、Ｘｓ２１、Ｘｓ２２、Ｘｓ２３及びＸｓ２７は、各々独立に、非官能性アミノ酸残基を表す。
【００９３】
【表４】
0005220915.tif 000009
0005220915.tif 000010
【００９４】
表３及び本明細書を通じて、Ｘｈ６、Ｘｈ２２、Ｘｈ２６は、各々独立に、非官能性残基である。
【００９５】
【表５】
0005220915.tif 000011
【００９６】
表４に記載されている多くのペプチドは、出願人がＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．である、１９９５年２月２日に公開されたＷＯ９５／０３０６５号に記載されているとおりに調製することが可能である。この出願は、１９９３年７月２２日に出願された米国特許出願０７／０９６，９４２号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に対応する。
【００９７】
【表６】
0005220915.tif 000012
【００９８】
【表７】
0005220915.tif 000013
【００９９】
表５に記載されているペプチドは、Ｌｅｂｒｕｎらに対して２００４年２月１０日に付与された米国特許第６，６８９，７４９号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおりに調製することが可能である。
【０１００】
【表８】
0005220915.tif 000014
0005220915.tif 000015
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【０１０１】
表７に記載されている配列の全ては、そのＮ末端又はＣ末端の何れかにおいて、４〜１０個の炭素原子を有し及び０〜２個の炭素−炭素二重結合を有する脂肪酸又はω−アミノ脂肪酸などのその誘導体で誘導体化することも可能である。（例えば、Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ２００６／００２８５０  Ａ２参照。参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）。このような脂肪酸の例には、吉草酸又は（Ｃ末端に対する）ω−アミノ吉草酸が含まれる。
【０１０２】
【表９】
0005220915.tif 000032
0005220915.tif 000033
【０１０３】
【表１０】
0005220915.tif 000034
【０１０４】
【表１１】
0005220915.tif 000035
【０１０５】
【表１２】
0005220915.tif 000036
【０１０６】
【表１３】
0005220915.tif 000037
【０１０７】
【表１４】
0005220915.tif 000038
0005220915.tif 000039
【０１０８】
表１３及び本明細書を通じて、Ｘｍ１９及びＸｍ３４は、各々独立に、非官能性残基である。
【０１０９】
【表１５】
0005220915.tif 000040
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【０１１０】
【表１６】
0005220915.tif 000042
【０１１１】
【表１７】
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【０１１２】
【表１８】
0005220915.tif 000044
【０１１３】
【表１９】
0005220915.tif 000045
【０１１４】
【表２０】
0005220915.tif 000046
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【０１１５】
【表２１】
0005220915.tif 000048
【０１１６】
【表２２】
0005220915.tif 000049
【０１１７】
【表２３】
0005220915.tif 000050
【０１１８】
【表２４】
0005220915.tif 000051
【０１１９】
【表２５】
0005220915.tif 000052
【０１２０】
【表２６】
0005220915.tif 000053
【０１２１】
【表２７】
0005220915.tif 000054
【０１２２】
【表２８】
0005220915.tif 000055
【０１２３】
【表２９】
0005220915.tif 000056
【０１２４】
【表３０】
0005220915.tif 000057
【０１２５】
【表３１】
0005220915.tif 000058
【０１２６】
【表３２】
0005220915.tif 000059
【０１２７】
【表３３】
0005220915.tif 000060
0005220915.tif 000061
【０１２８】
本発明に従えば、分子のトキシンペプチド（Ｐ）部分の少なくとも１つがＫｖ１．３アンタゴニストペプチドを含む分子である。ＳｈＫ、ＨｍＫ、ＭｇＴｘ、ＡｇＴｘ１、ＡｇＴｘ２、ヘテロメトラス・スピニファー（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ  ｓｐｉｎｎｉｆｅｒ）（ＨｓＴｘ１）、ＯＳＫ１、アヌロクトキシン（Ａｎｕｒｏｃｔｏｘｉｎ）（Ａｎｘ）、ノキシウストキシン（Ｎｏｘｉｕｓｔｏｘｉｎ）（ＮＴＸ）、ＫＴＸ１、ホンゴトキシン（Ｈｏｎｇｏｔｏｘｉｎ）、ＣｈＴｘ、チチストキシン（Ｔｉｔｙｓｔｏｘｉｎ）、ＢｇＫ、ＢｍＫＴＸ、ＢｍＴｘ、ＡｅＫ，ＡｅＫＳＴｃ３０、Ｔｃ３２、Ｐｉ１、Ｐｉ２及び／又はＰｉ３トキシンペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体からなる群から選択されるアミノ酸配列が好ましい。有用なＫｖ１．３アンタゴニストペプチド配列の例には、本明細書の上記表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、表９、表１０及び／又は表１１に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１２９】
本発明の組成物の他の実施形態は、ＩＫＣａ１アンタゴニストペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）を含む。有用なＩＫＣａ１アンタゴニストペプチドには、マウロトキシン（ＭＴｘ）、ＣｈＴｘペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体が含まれ、その例には、表１２、表１３及び／又は表１４に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３０】
本発明の組成物の他の実施形態は、ＳＫＣａ阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）を含む。有用なＳＫＣａ阻害剤ペプチドには、アパミン、ＳｃｙＴｘ、ＢｍＰ０５、Ｐ０１、Ｐ０５、タマピン、ＴｓＫ及びこれらの何れかのペプチド類縁体が含まれ、その例には、表１５に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３１】
本発明の組成物の他の実施形態には、アパミンペプチド及びアパミンのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表１６に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３２】
本発明の組成物の他の実施形態には、シロトキシンファミリーペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表１７に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３３】
本発明の組成物の他の実施形態には、ＢＫＣａ阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表１８に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３４】
本発明の組成物の他の実施形態には、スロトキシンファミリーペプチド及びこれらの何れかのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表１９に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３５】
本発明の組成物の他の実施形態には、マルテントキシンペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２０に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３６】
本発明の組成物の他の実施形態には、Ｎ型Ｃａ２＋チャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２１に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３７】
本発明の組成物の他の実施形態には、ωＭＶＩＩＡペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２２に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３８】
本発明の組成物の他の実施形態には、ωＧＶＩＡペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２３に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１３９】
本発明の組成物の他の実施形態には、ＰＴｕ１ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２４に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４０】
本発明の組成物の他の実施形態には、ＰｒｏＴｘ１ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２５に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４１】
本発明の組成物の他の実施形態には、ＢｅＫＭ１ペプチド及びそのペプチド類縁体である少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２６に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４２】
本発明の組成物の他の実施形態には、Ｎａ＋チャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２７に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４３】
本発明の組成物の他の実施形態には、Ｃｌ−チャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２８に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４４】
本発明の組成物の他の実施形態には、Ｋｖ２．１阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表２９に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４５】
本発明の組成物の他の実施形態には、Ｋｖ４．２／Ｋｖ４．３阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表３０に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４６】
本発明の組成物の他の実施形態には、ｎＡＣＨＲ阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表３１に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４７】
本発明の組成物の他の実施形態には、アガトキシンペプチド、そのペプチド類縁体又は他のカルシウムチャンネル阻害剤ペプチドである少なくとも１つのトキシンペプチド（Ｐ）が含まれ、その例には、表３２に記載されている何れかのアミノ酸配列を有するものが含まれる。
【０１４８】
半減期延長部分。本発明は、Ｎ末端、Ｃ末端又は中間のアミノ酸残基１つの側鎖を通じてペプチドに結合された少なくとも１つの半減期延長部分（式Ｉ中のＦ１及び／又はＦ２）の存在を含む。複数の半減期延長部分を使用することも可能である（例えば、各末端のＦｃ又は末端のＦｃ及び他の末端若しくは側鎖のＰＥＧ基）。他の実施形態において、（例えば、式Ｆ１−Ｆ２−（Ｌ）ｆ−Ｐ；Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−Ｆ２；又はＰ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−Ｆ２−（Ｌ）ｆ−Ｐに従って）ＦｃドメインをＰＥＧ化することが可能である。
【０１４９】
半減期延長部分は、本発明の組成物はインビボでの腎臓ろ過によるクリアランスを妨げるのに十分な流体力学的サイズを達成するように選択することが可能である。例えば、実質的に直鎖、分岐鎖又は樹状形態のポリマー性高分子である半減期延長部分を選択することが可能である。あるいは、インビボで、本発明の組成物が血清タンパク質に結合して複合体を形成するように、このようにして形成された複合体が実質的な腎臓クリアランスを回避するように、半減期延長部分を選択することが可能である。半減期延長部分は、例えば、脂質、コレステロール基（ステロイドなど）、炭水化物若しくはオリゴ糖、又はサルページ受容体に結合するあらゆる天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドであり得る。
【０１５０】
本発明に従って、使用可能な典型的な半減期延長部分には、免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその一部、又は生物学的に適切な重合体若しくは共重合体、例えば、ポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール化合物が含まれる。他の適切なポリアルキレングリコール化合物には、以下の種類の帯電したポリマー又は中性ポリマー：デキストラン、ポリリジン、コロミン酸又は他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー及びビオチン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
本発明において、半減期延長部分の他の例には、エチレングリコールの共重合体、プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモ重合体、プロピレンオキシド重合体、エチレンオキシド重合体、ポリオキシエチレン化されたポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖若しくは分岐グリコシル化された鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリンＦｃドメイン若しくはその一部（例えば、Ｆｅｉｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ，米国特許第６，６６０，８４３号参照）、ＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））；例えば、Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，米国特許第６，９２６，８９８号及びＵＳ２００５／００５４０５１；Ｂｒｉｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，米国特許第６，８８７，４７０号参照）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＵＳ  ２００３／０１９５１５４  Ａ１；２００３／０１９１０５６  Ａ１参照）又はチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が含まれる。従って、本発明の組成物の典型的な実施形態には、ＳｈＫ、ＯＳＫ１又はこれらのトキシンペプチドの修飾された類縁体とのＨＳＡ融合物など（但し、これらに限定されない。）ＨＳＡ融合構築物も含まれる。例には、ＨＳＡ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）；ＨＳＡ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（１−３８）；ＨＳＡ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）；及びＨＳＡ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（１−３８）が含まれる。
【０１５２】
本発明において、半減期延長部分の他の実施形態には、温度、ｐＨ及びイオン強度の生理的条件下で長い半減期の血清タンパク質に対して結合親和性を有するペプチドリガンド又は小（有機）分子リガンドが含まれる。例には、アルブミン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、トランスサイレチン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、チロキシン結合グロブリン結合ペプチド若しくは小分子リガンド、抗体結合ペプチド若しくは小分子リガンド又は長い半減期の血清タンパク質に対して親和性を有する別のペプチド若しくは小分子が含まれる。（例えば、Ｂｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ，米国特許第５，７１４，１４２号；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ，ＵＳ  ２００３／００６９３９５  Ａ１  ；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，米国特許第６，３４２，２２５号を参照）。「長い半減期の血清タンパク質」は、いわゆる「担体タンパク質」（アルブミン、トランスフェリン及びハプトグロビンなど）、フィブリノーゲン及びその他の血液凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシン及びブラジキンなどの物質の前駆体並びにタンパク質の他の多くの種類など、哺乳動物の血漿中に溶解された様々な何百ものタンパク質の１つである。本発明は、本発明に記載されているものなど（但し、これらに限定されない。）、医薬として許容される半減期伸長部分のあらゆる単一種の使用又はＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃドメイン又はＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）、アルブミン結合タンパク質、トランスサイレチン又はＴＢＧなど２つ又はそれ以上の半減期延長部分の組み合わせの使用を包含する。
【０１５３】
本発明の幾つかの実施形態において、Ｆｃドメイン又はその一部（ＦｃのＣＨ２ドメインなど）が、半減期延長部分として使用される。Ｆｃドメインは、トキシンペプチドのＮ末端（例えば、式Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐに従って）又はＣ末端（例えば、式Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１に従って）又はＮ末端及びＣ末端の両方に（例えば、式Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ２又はＰ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐに従って）融合することが可能である。本明細書に記載されているように、Ｆｃドメインとトキシンペプチドの間に、ペプチドリンカー配列を場合によって含めることが可能である。式Ｆ１−（Ｌ）ｆ−Ｐの例には、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（Ｋ２２Ａ）［２−３５］；Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（Ｒ１Ｋ／Ｋ２２Ａ）［１−３５］；Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（Ｒ１Ｈ／Ｋ２２Ａ）［１−３５］；Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（Ｒ１Ｑ／Ｋ２２Ａ）［１−３５］；Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（Ｒ１Ｙ／Ｋ２２Ａ）［１−３５］；Ｆｃ−Ｌ１０−ＰＰ−ＳｈＫ（Ｋ２２Ａ）［１−３５］及び本明細書に記載されている他の全ての実施例が含まれる。式Ｐ−（Ｌ）ｇ−Ｆ１の例には、ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−Ｆｃ；ＯｓＫ１（１−３８）−Ｌ１０−Ｆｃ；Ｍｅｔ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−Ｆｃ；ＳｈＫ（２−３５）−Ｌ１０−Ｆｃ；Ｇｌｙ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ１０−Ｆｃ；Ｏｓｋ１（１−３８）−Ｌ１０−Ｆｃ；及び本明細書に記載されている他の全ての実施例が含まれる。
【０１５４】
Ｆｃバリアントが、本発明の範囲に属する適切な半減期延長部分である。サルベージ受容体への結合が維持される限り、固有Ｆｃは、本発明において、Ｆｃバリアントを形成するために広く修飾することが可能である。例えば、ＷＯ９７／３４６３１、ＷＯ９６／３２４７８及びＷＯ０４／１１０４７２参照。このようなＦｃバリアントにおいて、本発明の融合分子によって必要とされない構造的特徴又は機能的活性を与える固有Ｆｃの１つ又はそれ以上の部位を除去することが可能である。例えば、残基を置換若しくは欠失させ、部位中に残基を挿入し、又は部位を含有する部分を末端切断させることによって、これらの部位を除去することが可能である。挿入された又は置換された残基は、ペプチド模倣体又はＤアミノ酸などの変化されたアミノ酸であることも可能である。Ｆｃバリアントは、多数の理由のために望ましいことがあり得、これらの幾つかは以下に記載されている。典型的なＦｃバリアントには、以下の分子及び配列が含まれる。
【０１５５】
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去される。このような除去は、本発明の分子を作製するために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を避けることが可能である。この目的のために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントは末端切断することが可能であり、又はシステイン残基は欠失されるか、若しくは他のアミノ酸（例えば、アラニル、セリル）で置換することが可能である。特に、配列番号２のＮ末端の２０アミノ酸セグメントを末端切断するか、又は配列番号２の７位及び１０位のシステイン残基を欠失又は除去することが可能である。システイン残基が除去されている場合でさえ、一本鎖Ｆｃドメインは、非共有的に互いに結合された二量体Ｆｃドメインをなお形成することができる。
【０１５６】
２．固有Ｆｃは、選択された宿主細胞とより適合性があるように修飾される。例えば、プロリンイミノペプチダーゼなどの、Ｅ．コリ中の消化酵素によって認識され得る典型的な固有ＦｃのＮ末端に近いＰＡ配列を除去することが可能である。分子が、Ｅ．コリなどの細菌細胞中で組み換え的に発現されている場合には特に、Ｎ末端メチオニン残基を付加することも可能である。配列番号２のＦｃドメイン（図４Ａ−Ｂ）は、このようなＦｃバリアントの１つである。
【０１５７】
３．固有ＦｃのＮ末端の一部は、選択された宿主細胞中で発現されたときにＮ末端の不均一性を防ぐために除去される。この目的のために、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基、特に位置１、２、３、４及び５の残基の何れをも欠失させることが可能である。
【０１５８】
４．１つ又はそれ以上のグリコシル化部位が除去される。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は、細胞溶解応答を付与することが可能である。このような残基は、欠失させるか、又はグリコシル化されない残基（例えば、アラニン）で置換することが可能である。
【０１５９】
５．Ｃ１ｑ結合部位などの補体との相互作用に関与する部位が除去される。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失又は置換することが可能である。補体の動員は、本発明の分子にとって有利でない場合があり得、このようなＦｃバリアントを用いて回避することが可能である。
【０１６０】
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を与える部位が除去される。固有Ｆｃは、本発明の融合分子に対して必要とされないある種の白血球を妨害するための部位を有することがあり、従って、除去され得る。
【０１６１】
７．ＡＤＣＣ部位が除去される。ＡＤＣＣ部位は、本分野において公知である。例えば、ＩｇＧ１中のＡＤＣＣ部位に関して、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）６３３−９（１９９２）を参照。これらの部位も、本発明の融合分子にとって不要であり、従って、除去することが可能である。
【０１６２】
８．固有Ｆｃが非ヒト抗体に由来する場合には、固有Ｆｃはヒト化することが可能である。典型的には、固有Ｆｃをヒト化するために、ヒト固有Ｆｃ中に通常見出される残基で、非ヒト固有Ｆｃ中の選択された残基を置換する。抗体のヒト化のための技術は、本分野において周知である。
【０１６３】
好ましいＦｃバリアントには、以下のものが含まれる。配列番号２では、１５位のロイシンはグルタミン酸で、９９位のグルタミン酸はアラニンで、並びに１０１位及び１０３位のリジンはアラニンで置換されることが可能である。さらに、フェニルアラニン残基は、１つ又はそれ以上のチロシン残基を置換することが可能である。
【０１６４】
別の半減期延長部分は、サルベージ受容体に結合することが可能な、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は小分子（例えば、ペプチド模倣化合物）である。例えば、１９９８年４月１４日にＰｒｅｓｔａらに付与された米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているような半減期延長部分としてポリペプチドを使用することが可能である。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合について、ファージディスプレイによって選択することも可能である。このようなサルベージ受容体結合化合物も、「半減期延長部分」の意味の中に含まれ、本発明の範囲に属する。このような半減期延長部分は、（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を避けることによって）増加した半減期について選択されるべきであり、及び（例えば、抗体のヒト化で発見されるように、非免疫原性配列を優先することによって）減少した免疫原性について選択されるべきである。
【０１６５】
上述のように、ポリマー半減期延長部分は、Ｆ１及びＦ２に対して使用することも可能である。半減期延長部分として有用な化学的部分を付着させるための様々な手段が、現在利用可能である。例えば、「Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題された特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開ＷＯ９６／１１９５３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への、水溶性ポリマーの選択的付着を開示している。
【０１６６】
本発明の組成物の幾つかの実施形態において、ポリマー半減期延長部分は、Ｆ１及び／又はＦ２としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるが、本発明の組成物は、位置Ｆ１及び／又はＦ２以外に、トキシンペプチド上の１つ又はそれ以上の部位など、分子中の他の部位に抱合された１つ又はそれ以上のＰＥＧを含むことも可能である。従って、本発明の組成物の幾つかの実施形態は、Ｆ１及び／又はＦ２である非ＰＥＧ半減期延長部分に、又はトキシンペプチド（Ｐ）に、又はこれらの何れかのあらゆる組み合わせに抱合された１つ若しくはそれ以上のＰＥＧ部分をさらに含む。例えば、本発明の組成物中のＦｃドメイン又はその一部（Ｆ１及び／又はＦ２として）は、還元的アルキル化の方法によって、モノＰＥＧ化され、ジＰＥＧ化され又はその他マルチＰＥＧ化されることが可能である。
【０１６７】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）との、タンパク質及びペプチドの共有的抱合は、治療的タンパク質のインビボ循環半減期を著しく延長させるためのアプローチとして広く認識されている。ＰＥＧ部分は、タンパク質にかなりの流体力学的半径を加えるので、ＰＥＧ化は、主として腎クリアランスを遅延させることによって、この効果を達成する。（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．，ｉｎ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．，Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．，３４７−３７０（１９９２））。タンパク質及びペプチドのＰＥＧ化によってしばしば付与されるさらなる利点には、増加した溶解度、タンパク分解による分解に対する耐性及び治療用ポリペプチドの減少した免疫原性が含まれる。タンパク質ＰＥＧ化の長所は、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＡｄａｇｅｎＴＭ／Ｅｎｚｏｎ  Ｃｏｒｐ，）、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯｎｃａｓｐａｒＴＭ／Ｅｎｚｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−ＩｎｔｒｏｎＴＭ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／Ｅｎｚｏｎ）、ＰＥＧ−インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳＴＭ／Ｒｏｃｈｅ）及びＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（ＮｅｕｌａｓｔａＴＭ／Ａｍｇｅｎ）並びに臨床試験中の多数のその他など、幾つかのＰＥＧ化されたタンパク質の商品化によって証明されている。
【０１６８】
要約すると、ＰＥＧ基は、一般に、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じた、本発明の化合物上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル基を介して、本発明の組成物のペプチド部分へ付着される。
【０１６９】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中での抱合体結合を形成することを通じて、ペプチド及びＰＥＧ部分（各々が他のＰＥＧ部分に対して相互に反応性である特別な官能性を有する。）を結合させることからなる。ペプチドは、慣用の固相合成を用いて容易に調製することが可能である（例えば、図５及び６並びに本明細書に添付されている説明文を参照されたい。）。ペプチドは、特異的な部位における適切な官能基で「予め活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分との反応前に精製され、完全に性質決定される。ペプチドのＰＥＧとの連結は、通常、水相で起こり、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることが可能である。ＰＥＧ化されたペプチドは、調製用ＨＰＬＣによって容易に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって性質決定することが可能である。
【０１７０】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当技術分野で周知の方法に従い、エチレングリコールの開環重合により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）。本願において、「ＰＥＧ」という用語は、サイズ又はＰＥＧの末端への修飾に関わらず、１、２又は多官能型のあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するために広く使用され、式：
Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ      （Ｘ）
（ｎは２０〜２３００であり、Ｘは、Ｈ又は末端修飾、例えばＣ１−４アルキルである。）
によって表される。
【０１７１】
幾つかの有用な実施形態において、本発明で使用されるＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。ＰＥＧの他の末端（式（ＩＩ）では、ＯＨで終結するように示されている。）は、エーテル酸素結合、アミン結合又はアミド結合を介して活性化部分に共有結合することが注目される。化学的構造において使用される場合、「ＰＥＧ」という用語は、示されている水酸基の水素なしの上記式（ＩＩ）を含み、エーテル結合を形成するためにリンカーの遊離炭素原子との反応に利用可能な酸素が残存する。より具体的には、ＰＥＧをペプチドに抱合するために、ペプチドは、「活性化された」形態のＰＥＧと反応されなければならない。活性化されたＰＥＧは、式：
（ＰＥＧ）−（Ａ）      （Ｘｌ）
（ＰＥＧ（上で定義されている。）は、活性化部分（Ａ）の炭素分子に共有結合して、エーテル結合、アミン結合又はアミド結合を形成し、（Ａ）は、ペプチドのアミノ酸残基上のアミノ、イミノ若しくはチオール基又はペプチドに共有結合されたリンカー部分と反応することが可能な反応性基を含有する。）
によって表すことができる。
【０１７２】
活性化されたＰＥＧの調製及び生物学的に活性なペプチドへのその抱合のための技術は、本分野において周知である。（例えば、米国特許第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号及び同第５，９９０，２３７号；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ  ０５７５５４５  Ｂ１；Ｐｅｔｉｔ，Ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，米国特許第６，４５１，９８６号及び同第６，５４８，６４４号；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｙ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＩＩＩ：Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＰＥＧｙｌａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｙｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：２２１−２２９（１９９４）；Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ＩＶ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＧＲＦ  ａｎａｌｏｇｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４６：２５３−２６４（１９９５）；Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６８０（ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））：２１８−２３８（１９９７）；Ｙ．ｌｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｔｈｅｉｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅｍ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＰ  ０４７３０８４  Ｂ１  ；Ｇ．Ｅ．Ｍｅａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ，ｉｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ  Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，２１９（１９７１）参照。）。
【０１７３】
ＰＥＧ−アルデヒド又はＰＥＧ−アルデヒド水和物などの活性化されたＰＥＧは、公知の手段によって化学的に合成し、又は商業的な入手源（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌ）又はＥｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．））から取得することができる。
【０１７４】
本発明における有用な活性化されたＰＥＧの例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＩ）から市販されているＰＥＧ−プロピオンアルデヒドなどのＰＥＧ−アルデヒド化合物（例えば、メトキシＰＥＧ−アルデヒド）である。ＰＥＧ−プロピオンアルデヒドは、式ＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯによって表される。（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号参照）。有用な活性化されたＰＥＧの他の例は、ＰＥＧアセトアルデヒド水和物及びＰＥＧビスアルデヒド水和物であり、後者は、二機能性に活性化された構造を与える。（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｍｉｎｅｓ，米国特許第５，９９０，２３７号参照）。
【０１７５】
本発明のＰＥＧ抱合されたペプチドを作製するための別の有用な活性化されたＰＥＧは、メトキシＰＥＧ−マレイミド（マレイミドモノメトキシＰＥＧなど）などの（但し、これに限定されない。）ＰＥＧ−マレイミド化合物であり、本発明のＰＥＧ抱合されたペプチドを作製するために特に有用である。（例えば、Ｓｈｅｎ，Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，米国特許第６，６０２，４９８号；Ｃ．Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＰＥＧ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，９：２４９−３０４（１９９２）；Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３４７−３７０（１９９２）；Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｐ．Ｊ．Ｓｈａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｏ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ−１，米国特許第４，８４７，３２５号；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ＩＬ−３  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，１６６，３２２号及びＥＰ  ０４６９０７４  Ｂ１；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ＥＰＯ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ  ０６６８３５３  Ａ１；Ｇ．Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｄｄｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  Ｇ−ＣＳＦ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ，ＥＰ  ０６６８３５４  Ａ１；Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｌｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｍｕｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒｅｏｆ，米国特許第５，２０６，３４４号；Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｖ．Ｋａｔｒｅ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｔ  ｉｔｓ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ  ｓｉｔｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３−３４６（１９９０））。
【０１７６】
ポリ（エチレングリコール）ビニルスルホンは、チオール化されたアミノ酸残基での、例えば、Ｃ残基での抱合によって、本発明のＰＥＧ抱合されたペプチドを作製するための別の有用な活性化されたＰＥＧである。（例えば、Ｍ．Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｖｉｎｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｅ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，７：３６３−３６８（１９９６）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｏｎｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ＰＥＧ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，米国特許第５，４４６，０９０号；同第５，７３９，２０８号；同第５，９００，４６１号；同第６，６１０，２８１号及び同第６，８９４，０２５号；ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｌｆｏｎｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ），ＷＯ  ９５／１３３１２  Ａ１も参照されたい。）。
【０１７７】
本発明において有用であるＰＥＧの別の活性化された形態は、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、例えば、メトキシＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルである。
【０１７８】
ＰＥＧのヘテロ二機能的に（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ）活性化された形態も有用である。（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ，米国特許第６，５５２，１７０号を参照されたい。）
典型的には、トキシンペプチド又はトキシンペプチドを含む融合タンパク質は、チオール活性化されたＰＥＧ化合物、ジオール活性化されたＰＥＧ化合物、ＰＥＧヒドラジド化合物、ＰＥＧ−オキシアミン化合物又はＰＥＧ−ブロモアセチル化合物など（但し、これらに限定されない。）などの活性化されたＰＥＧ化合物と、公知の化学的技術によって反応される。（例えば、Ｓ．Ｈｅｒｍａｎ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｗｉｔｈ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｄｇｒｏｕｐｓ：Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１０：１４５−１８７（１９９５）；Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６：１５７−１８２（１９９５）；Ｒ．Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１７：１０１−１６１（２０００）を参照されたい。）。
【０１７９】
Ｎ末端のＰＥＧ化のための方法は、実施例３１〜３４、４５及び４７〜４８において、本明細書に例示されているが、当業者によって利用可能なＰＥＧ化法を決して限定するものではない。
【０１８０】
実際に所望されるように、ＰＥＧに対するあらゆる分子量、例えば、約１，０００又は２，０００ダルトン（Ｄａ）〜約１００，０００Ｄａ（ｎは、２０〜２３００）である。）を使用することが可能である。好ましくは、本発明のＰＥＧ抱合されたペプチド中で使用されるＰＥＧの総分子量又は合計分子量は、約３，０００Ｄａ又は５，０００Ｄａから約５０，０００Ｄａ又は６０，０００Ｄａ（合計のｎは、７０〜１，４００）、より好ましくは約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａ（合計のｎは、約２３０〜約９１０）である。ＰＥＧに対する最も好ましい総質量は、約２０，０００Ｄａ〜約３０，０００Ｄａ（合計のｎは、約４５０〜約６８０である。）である。ＰＥＧ中の反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載された分子量に対して近似される。活性化されたリンカー上のＰＥＧの総分子量は、医薬用途に対して適切であることが好ましい。従って、ＰＥＧ分子の総分子量は、約１００，０００Ｄａを超えるべきでない。
【０１８１】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、主にα１−６結合によって連結されたグルコースの各サブユニットから構成される多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤ〜約７０ｋＤまでの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独の半減期延長部分として、又は別の半減期延長部分（例えば、Ｆｃ）と組み合わせて、本発明において使用するための適切な水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ９６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。治療用免疫グロブリン又は診断用免疫グロブリンに抱合されたデキストランの使用が報告されており、例えば、欧州特許公報０３１５４５６号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。本発明における半減期延長部分としてデキストランが使用される場合、約１ｋＤ〜約２ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１８２】
リンカー。何れの「リンカー」基又は部分（すなわち、式Ｉ−ＩＸ中の「−（Ｌ）ｆ−」又は「−（Ｌ）ｇ−」）も、場合によって使用される。リンカーが存在する場合、リンカーは、主にスペーサーとして働くので、その化学構造は重要でない。本明細書に上述されているように、リンカー部分（−（Ｌ）ｆ−及び／又は−（Ｌ）ｇ−）は、存在するとすれば、本発明の組成物中に存在し得る、他の何れのリンカーとも独立に同一又は別異であることが可能である。例えば、「（Ｌ）ｆ」は、本発明における他の何れの「（Ｌ）ｆ」又は何れの「（Ｌ）ｇ」とも同一の部分又は異なる部分を表すことが可能である。リンカーは、好ましくは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸から構成される。したがって、幾つかの実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により連結された１〜約３０個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は、天然に存在する２０個のアミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の幾つかは、当業者によって十分に理解されているように、グリコシル化することが可能である。例えば、シアル化部位を構成する有用なリンカー配列は、Ｘ１Ｘ２ＮＸ４Ｘ５Ｇ（配列番号６３７）であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４及びＸ５は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。）である。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。より好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニンなどの、立体的に妨害されないアミノ酸の過半数から構成される。従って、好ましいリンカーには、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ５））、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンが含まれる。他の好ましいリンカーは、本明細書において「Ｌ５」（ＧＧＧＧＳ；配列番号６３８）、「Ｌ１０」（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号７９）、「Ｌ２５」ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８４）として特定されるリンカー、並びに、以下の実施例に使用されている全てのリンカーである。しかしながら、本明細書に記載されているリンカーは、典型的なものであり、本発明の範囲に属するリンカーは、さらに長くすることが可能であり、他の残基を含むことが可能である。
【０１８４】
ペプチドリンカーブ部分（Ｌ）を含む、本発明の組成物の幾つかの実施形態において、酸性残基、例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸残基が、リンカー部分（Ｌ）のアミノ酸配列中に配置される。例には、以下のペプチドリンカー配列が含まれる。
【０１８５】
【化１】
0005220915.tif 000062
【０１８６】
他の実施形態においては、リンカーは、リン酸化部位、例えば、Ｘ１Ｘ２ＹＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６５４）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。）；Ｘ１Ｘ２ＳＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６５５）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。）；又はＸ１Ｘ２ＴＸ３Ｘ４Ｇ（配列番号６５６）（Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、各々独立に、任意のアミノ酸残基である。）を構成する。
【０１８７】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｓ＝２〜２０）などのアルキルリンカーを使用することが可能である。これらのアルキルリンカーは、さらに、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの、立体的に妨害を生じないあらゆる基によって置換することが可能である。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカー、
【０１８８】
【化２】
0005220915.tif 000063
（ｎは、リンカーが１００〜５０００ｋＤ、好ましくは１００〜５００ｋＤの分子量を有するようになる。）
である。ペプチドリンカーは、上記と同一の様式で誘導体を形成するために改変することが可能である。
【０１８９】
誘導体。本発明者らは、化合物のペプチド及び／又は半減期延長部分の一部を誘導体化することも想定している。このような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善することが可能である。あるいは、前記部分は、化合物の全ての望ましくない副作用などを削除又は軽減することが可能である。典型的な誘導体には、以下のとおりである化合物が含まれる。
【０１９０】
１．化合物又はそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分は、（例えばリンカー中に）２つ又はそれ以上のＣｙｓ残基を含有するように修飾することが可能であり、これはジスルフィド結合形成によって環状化することができる。
【０１９１】
２．化合物は、架橋されているか、又は分子間を架橋できるようにされる。例えば、ペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有し、これにより、リンカー分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように修飾することが可能である。化合物は、以下に示されている分子におけるように、そのＣ末端を通じて架橋することも可能である。
【０１９２】
【化３】
0005220915.tif 000064
【０１９３】
３．非ペプチジル連結（結合）が、１つ又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結を置換する。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバマート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホナート結合、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン及びアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（式中、Ｒ６は低級アルキルである。）］である。
【０１９４】
４．Ｎ末端が、化学的に誘導体化されている。典型的には、Ｎ末端は、アシル化され、又は置換されたアミンへと修飾することが可能である。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）（Ｒ及びＲ１は、各々独立に、水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１〜３この置換基で置換されることが可能である。）が含まれる。
【０１９５】
５．遊離のＣ末端が、誘導体化されている。典型的には、Ｃ末端は、エステル化され又はアミド化される。例えば、配列番号５０４〜５０８の何れかを有する本発明の化合物のＣ末端に、（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用することが可能である。同様に、例えば、配列番号９２４〜９５５、９６３〜９７２、１００５〜１０１３又は１０１８〜１０２３の何れかを有する本発明の化合物のＣ末端に、ＮＨ２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用することが可能である。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４である（Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。）。）が含まれる。
【０１９６】
６．ジスルフィド結合は、別の、好ましくはより安定な、架橋部分（例えば、アルキレン）と置換される。例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９を参照されたい。
【０１９７】
７．１つ又はそれ以上の各アミノ酸残基が修飾される。以下に詳しく記載されているように、様々な誘導体化剤が、選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
【０１９８】
リジン残基及びアミノ末端残基を、コハク酸又は他のカルボキシル酸無水物と反応させることが可能であり、これは、リジン残基の電荷を逆転させる。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、イミドエステル（メチルピコリンイミダートなど）、ピリドキサルリン酸、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン及びグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１９９】
アルギニル残基は、１個又は数個の慣用の試薬の組み合わせ（フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンなど）との反応により修飾することができる。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化の際には、該反応をアルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンの基及びアルギニンのεアミノ基と反応させることができる。
【０２００】
チロシン残基の具体的な修飾は広範に研究されており、特に、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシン残基内へのスペクトル標識の導入に関心がもたれている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体が形成される。
【０２０１】
カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなど）との反応により選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換することができる。
【０２０２】
グルタミン及びアスパラギン残基は、対応するグルタミン酸及びアスパラギン酸残基に脱アミド化することが可能である。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化され得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０２０３】
システイン残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は、逆に架橋を安定化させるために、アミノ酸残基又は他の部分によって置換することが可能である。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９」を参照されたい。
【０２０４】
二官能性物質での誘導体化は、ペプチド若しくはそれらの官能性誘導体を水溶性支持マトリックスに、又は他の高分子半減期延長部分に架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステルなど）、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナートなどのジスクシンイミジルエステルなど）、及び二官能性マレイミド（ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなど）が含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成しうる光活性化可能な中間体を与える。あるいは、反応性の水不溶性マトリックス、例えば、臭化シアンで活性化される炭水化物、及び米国特許第３，９６９，２８７号、第３，６９１，０１６号、第４，１９５，１２８号、第４，２４７，６４２号、第４，２２９，５３７号及び第４，３３０，４４０号に記載の反応性基質が、タンパク質の固定化に使用される。
【０２０５】
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく結合させることができる。一般には、それらが配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸でありうる。）の一部である場合には、Ｏ−結合オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）残基に、Ｎ結合オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合させる。Ｘは、好ましくは、プロリンを除く１９個の天然に存在するアミノ酸の１つである。Ｎ結合及びＯ−結合オリゴ糖ならびに各タイプに見出される糖残基の構造は様々である。それらの両方に一般に存在する糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される。）である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合及びＯ−結合オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷のため、グリコシル化化合物に酸性特性を付与する。このような部位を本発明の化合物のリンカー内に含めることが可能であり、該部位は、好ましくは、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中での）ポリペプチド化合物の組換え産生中に細胞によりグリコシル化される。しかしながら、このような部位は、当技術分野で公知の合成又は半合成方法により更にグリコシル化することができる。
【０２０６】
他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化が、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）を参照されたい。
【０２０７】
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変化させることが可能である。化合物の何れの部分のＤＮＡ配列も、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへと変化させることが可能である。好ましい宿主細胞であるＥ．コリの場合、最適化されたコドンが本分野において公知である。制限部位を除去するために、又はサイレントな制限部位を含めるためにコドンを置換することが可能であり、これは、選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助することができる。半減期延長部分、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列は、先述の配列の変化の何れをも含むように修飾することが可能である。
【０２０８】
抱合誘導体を調製する方法も想定される。腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の正常な対応物には見出されないエピトープを示す。このようなエピトープには、例えば、それらの迅速な増殖から生じる様々な翻訳後修飾が含まれる。従って、本発明の一態様は、
ａ）標的エピトープに特異的に結合する少なくとも１つの無作為化されたペプチドを選択すること、並びに
ｂ）（ｉ）少なくとも１つの半減期延長部分（Ｆｃドメインが好ましい。）、（ｉｉ）選択されたペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列及び（ｉｉｉ）エフェクター分子を含む薬剤を調製すること、
を含む方法である。
【０２０９】
標的エピトープは、好ましくは、腫瘍特異的エピトープ又は病原性生物に対して特異的なエピトープである。エフェクター分子は、上記抱合対の何れでもあり得、好ましくは放射性同位体である。
【０２１０】
製造の方法
本発明は、本発明のポリペプチドを作製する上で有用な核酸、発現ベクター及び宿主細胞にも関する。宿主細胞は、真核細胞とすることが可能であり、哺乳動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。宿主細胞は、原核細胞とすることも可能であり，Ｅ．コリ細胞が最も好ましい。
【０２１１】
本発明の化合物は、概ね、組換えＤＮＡ技術を用いて、形質転換された宿主細胞中で作製することが可能である。これを行うために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、本分野において周知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いてＤＮＡから切り出すことが可能である。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミダート法などの化学的合成技術を用いて合成することが可能である。また、これらの技術の組み合わせも使用することが可能である。
【０２１２】
本発明は、適切な宿主中でペプチドを発現することが可能なベクターも含む。ベクターは、適切な発現調節配列に作用可能に連結されたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子の前又は後の何れかに、ベクター中にこの作用可能な結合を挿入する方法は、周知である。発現調節配列には、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル及び転写又は翻訳の調節に関わる他のシグナルが含まれる。
【０２１３】
その上にＤＮＡ分子を有する生じたベクターは、適切な宿主を形質転換するために使用される。この形質転換は、本分野において周知な方法を用いて実施することが可能である。
【０２１４】
多数の利用可能な、周知の宿主細胞の何れをも、本発明の実施において使用することが可能である。特定の宿主の選択は、本分野によって認知される多数の因子に依存する。これらには、例えば、選択された発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易さ、発現の特徴、生物学的安全性及び費用が含まれる。全ての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に対して等しく効果的であり得るわけではないことを理解して、これらの因子の釣り合いを決定しなければならない。これらの一般的な指針の中で、有用な微生物宿主には、細菌（Ｅ．コリ種など）、酵母（サッカロミセス種など）及び他の真菌、昆虫、植物、培養中の哺乳動物（ヒトを含む。）細胞又は本分野において公知の他の宿主が含まれる。
【０２１５】
次に、形質転換された宿主は、培養及び精製される。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように慣用の発酵条件下で培養することが可能である。このような発酵条件は、本分野において周知である。最後に、ペプチドは、本分野において周知の方法によって、培養物から精製される。
【０２１６】
化合物は、合成法によって作製することも可能である。固相合成は、小ペプチドを作製する最も費用対効果が優れた方法であるので、各ペプチドを作製する好ましい技術である。例えば、周知の固相合成技術には、保護基、リンカー及び固相支持体の使用、並びに特異的な保護及び脱保護反応条件、リンカー切断条件、スカベンジャーの使用及び固相ペプチド合成の他の態様が含まれる。適切な技術は、本分野において周知である。（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５−６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ  ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓ  ｅｔａｌ．（１９８５）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４−４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：１０５−２５３；ａｎｄ  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７６），Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ  ｅｄ．）  ２：２５７−５２７；“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔａｌｏｇ，２０００；“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，”  Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９２；“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ＆  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ，Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ，ａｎｄ  Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ，Ｅｄｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，１９９８；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，”  Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９３；“Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，”  Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９４；“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，”  Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，Ｅｄ．，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９４；“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，”  Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ，Ｗｈｉｔｅ，Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，１９９０，７７−１８３）。
【０２１７】
本発明の組成物が合成技術又は組換え技術によって調製されるか否かによらず、適宜、適切なタンパク質精製技術を含めることも可能である。本発明の組成物の幾つかの実施形態において、トキシンペプチド部分及び／又は半減期延長部分又は他の何れかの部分は、定量又は検出を容易にするために、適切な同位体標識（例えば、１２５１、１４Ｃ、１３Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、２Ｈ、１３Ｎ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏなど）を含むように調製することが可能である。
【０２１８】
誘導体化されたペプチドを含有し、又は非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成することが可能である。
【０２１９】
化合物の使用
総論。本発明の化合物は、このような対象タンパク質の固有リガンドのアゴニスト、模倣物又はアンタゴニストとして、対象タンパク質に結合するそれらの能力に起因する薬理学的活性を有する。イオンチャンネルへの公知の関連を有する遺伝病（「チャンネル症（ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ）」）は、医薬の様々な分野を包含し、その幾つかには、神経学、腎臓学、筋肉学及び心臓学が含まれる。イオンチャンネルを原因とする遺伝疾患のリストには、以下のものが含まれる。
【０２２０】
・嚢胞性繊維症（Ｃｌ−チャンネル；ＣＦＴＲ）、
・デント病（タンパク質尿及び高カルシウム尿症；Ｃｌ−チャンネル；ＣＬＣＮ５）、
・骨粗鬆症（Ｃｌ−チャンネル；ＣＬＣＮ７）、
・家族性高インシュリン血症（ＳＵＲ１；ＫＣＮＪ１１；Ｋチャンネル）、
・糖尿病（ＫＡＴＰ／ＳＵＲチャンネル）、
・アンデルセン症候群（ＫＣＮＪ２、Ｋｉｒ２．１Ｋチャンネル）、
・バーター症候群（ＫＣＮＪ１；Ｋｉｒ１．１／ＲＯＭＫ；Ｋチャンネル）、
・遺伝性難聴（ＫＣＮＱ４；Ｋチャンネル）、
・遺伝成高血圧（リドル症候群）；ＳＣＮＮ１；上皮Ｎａチャンネル）、
・拡張型心筋症（ＳＵＲ２、Ｋチャンネル）、
・ＱＴ延長症候群又は心不整脈（心臓のカリウム及びナトリウムチャンネル）、
・ティモシー症候群（ＣＡＣＮＡ１Ｃ、Ｃａｖ１．２）、
・筋無力症（ＣＨＲＮＡ、ＣＨＲＮＢ、ＣＮＲＮＥ；ｎＡＣｈＲ）及び他の様々なミオパシー、
・高カリウム性周期性四肢麻痺（Ｎａ及びＫチャンネル）、
・てんかん（Ｎａ＋及びＫ＋チャンネル）、
・方麻痺性偏頭痛（ＣＡＣＮＡ１Ａ、Ｃａｖ２．１Ｃａ２＋チャンネル及びＡＴＰ１Ａ２）、
・セントラルコア病（ＲＹＲ１、ＲｙＲ１；Ｃａ２＋チャンネル）、及び
・パラミオトニア及びミオトニア（Ｎａ＋、Ｃｌ−チャンネル）。
【０２２１】
Ｌ．Ｊ．Ｐｔａｃｅｋ  ａｎｄ  Ｙ−Ｈ  Ｆｕ（２００４），Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１  ：１６６−８；Ｂ．Ａ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２１：５６８−７３；Ｆ．Ｌｅｈｍａｎｎ−Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｋ．Ｊｕｒｋａｔ−Ｒｏｔｔ（１９９９），Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７９：１３１７−７２参照。
先述のリストは遺伝性の疾患に関するが、これらの疾患中に引用されているチャンネルを標的とする分子も、他の起源又は起源が不明な関連疾患を治療する上でも有用であり得る。
【０２２２】
先述の疾患に加えて、イオンチャンネルを以下の治療のための標的として裏付ける証拠も提供されている。
【０２２３】
・鎌型赤血球貧血症（ＩＫＣａ１）−鎌型赤血球貧血症では、赤血球からの水分の喪失が、ヘモグロビンの重合をもたらし、その後、溶血及び血管の閉塞をもたらす。いわゆるガルドスチャンネル（すなわち、ＩＫＣａ１）を通じたカルシウム流出後に、水分の喪失が起こる。従って、ＩＫＣａ１の遮断は、鎌形赤血球貧血症に対する治療的処置となり得る。
【０２２４】
・緑内障（ＢＫＣａ）−緑内障では、眼内圧が高すぎ、視神経の損傷、異常な眼機能を引き起こし、失明に至る場合もある。ＢＫＣａカリウムチャンネルの遮断は、眼内液の分泌を低下させ、平滑筋収縮を増加させることが可能であり、より低い眼内圧と眼内の神経保護をもたらす可能性がある。
【０２２５】
・多発性硬化症（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・乾癬（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・関節炎（Ｋｖ、ＫＣａ）、
・喘息（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・アレルギー（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・ＣＯＰＤ（ＫＣａ、Ｋｖ、Ｃａ）
・アレルギー性鼻炎（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・肺繊維症、
・狼瘡（ＩＫＣａ１、Ｋｖ）、
・移植、ＧｖＨＤ（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・炎症性骨吸収（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・歯周病（ＫＣａ、Ｋｖ）、
・糖尿病、Ｉ型（Ｋｖ）−Ｉ型糖尿病は、異常なグルコース、タンパク質及び脂質代謝を特徴とする自己免疫疾患であり、インシュリン欠乏又は耐性を伴う。本疾患では、Ｋｖ１．３発現Ｔリンパ球が、膵島を攻撃及び破壊し、β細胞の喪失をもたらす。Ｋｖ１．３の遮断は、炎症性サイトカインを減少させる。さらに、Ｋｖ１．３の遮断は、形質膜へのＧＬＵＴ４の転位を促進し、これにより、インシュリン感受性を増加させる。
【０２２６】
・肥満（Ｋｖ）、−Ｋｖ１．３は、エネルギー恒常性の調節及び食事によって誘発される肥満からの保護において重大な役割を果たしているようである。従って、Ｋｖ１．３遮断剤は、代謝速度を増加させることが可能であり、より大きなエネルギー使用及び減少した体重をもたらす。
【０２２７】
・再狭窄（ＫＣａ、Ｃａ２＋）、−血管平滑筋細胞の増殖及び遊走は、新生内膜肥厚及び血管の再狭窄をもたらすことが可能である。過剰な新生内膜血管平滑筋細胞増殖には、ＩＫＣａ１の上昇した発現を伴う。従って、ＩＫＣａ１の遮断は、血管形成術後の再狭窄を防ぐための治療的戦略となり得る。
【０２２８】
・虚血（ＫＣａ、Ｃａ２＋）−神経又は心虚血、細胞膜の脱分極は、電圧開口型ナトリウム及びカルシウムチャンネルの開口をもたらす。次いで、これにより、カルシウムの過剰負荷が引き起こされ得、これは細胞毒性である。電圧開口型ナトリウム及び／又はカルシウムチャンネルの遮断は、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞保護効果を与えることが可能である。さらに、細胞膜電位の調節及び安定化におけるそれらの重大な役割のために、電圧及びカルシウム活性化されるカリウムチャンネルの調節物質も、カルシウムの過剰負荷を低減し、細胞を保護するように作用することが可能である。
【０２２９】
・腎失禁（ＫＣａ）、腎失禁は、機能亢進した膀胱平滑筋細胞に関連する。カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルは、膀胱平滑筋細胞中で発現され、これらは膜電位を調節し、細胞収縮の力及び頻度を間接的に調節する。従って、カルシウムによって活性化されるカリウムチャンネルの開口剤は、膀胱内の電気的及び収縮活性を弱め、排尿の刺激の低下をもたらす機構を提供する。
【０２３０】
・骨粗鬆症（Ｋｖ）、
・偏頭痛を含む疼痛（Ｎａｖ、ＴＲＰ［一過性受容体電位チャンネル］。Ｐ２Ｘ、Ｃａ２＋、Ｎ型電圧開口型カルシウムチャンネルは、脊髄中の侵害受容神経伝達の中心的制御物質である。ジコノチド（Ｎ型カルシウムチャンネルのペプチド遮断剤）は、侵害受容神経伝達を低下させ、ヒトにおける重度の慢性痛の症状の緩和について、世界で広く承認されている。侵害受容特異的Ｎ型カルシウムチャンネルの新規遮断剤は、減少した副作用特性を有する鎮痛剤で改善される。
【０２３１】
・高血圧（Ｃａ２＋）、−Ｌ型及びＴ型電圧開口型カルシウムチャンネルは、血管平滑筋細胞中で発現され、ここで、興奮−収縮のカップリング及び細胞の増殖を調節する。特に、Ｔ型カルシウムチャンネルの活性は、高血圧時の新生内膜形成に関連している。Ｌ型及びＴ型カルシウムチャンネルの遮断剤は、カルシウム流入を低下させ、平滑筋細胞の収縮を阻害するので、高血圧の臨床的治療に対して有用である。
【０２３２】
・創傷治癒、細胞遊走は、創傷治癒において中心的な役割を果たしている。細胞内カルシウム勾配は、ケラチン生成細胞及び繊維芽細胞中の細胞遊走機構の重要な制御物質として推定されている。さらに、細胞膜を横切るイオン流動は、細胞容積の変化を伴う。細胞容積を調節することによって、イオンチャンネルは、細胞遊走機構の稼働に必要とされる細胞内環境に寄与する。特に、ＩＫＣａ１は、細胞遊走のために、全般的に必要とされるようである。さらに、Ｋｖ１．３、Ｋｖ３．１、ＮＭＤＡ受容体及びＮ型カルシウムチャンネルは、リンパ球及び神経細胞の遊走と関連する。
【０２３３】
・発作又は卒中、
・アルツハイマー病、
・パーキンソン病（ｎＡＣＨＲ、Ｎａｖ）
双極性疾患（Ｎａｖ、Ｃａｖ）
・癌、多くのカリウムチャンネル遺伝子が増幅され、タンパク質サブユニットが多くの癌性症状において上方制御されている。カリウムチャンネル上方制御のための病態生理学的役割と合致して、カリウムチャンネル遮断剤は、おそらくは、カルシウム流入の阻害及びカルシウム依存性遺伝子発現に対する効果を通じて、子宮癌細胞及び肝細胞癌細胞の増殖を抑制することが示されている。
【０２３４】
・様々な神経系疾患、新血管疾患、代謝疾患及び自己免疫疾患。
【０２３５】
イオンチャンネルのアゴニスト及びアンタゴニストは何れも、治療的な利益を達成することが可能である。治療的な利益は、例えば、Ｋｖ１．３、ＩＫＣａ１、ＳＫＣａ、ＢＫＣａ、Ｎ型又はＴ型Ｃａ２＋チャンネルなどを拮抗することから得ることが可能である。これらのチャンネルの小分子及びペプチドアンタゴニストは、インビトロ及びインビボでの有用性を有することが示されている。しかしながら、産生効率及び薬物動態における限界が、イオンチャンネルの阻害剤ペプチドの臨床的な調査を大きく妨げてきた。
【０２３６】
電位開口型カリウムチャンネルＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の組成物は、自己免疫疾患に対する治療的価値を有する免疫抑制剤として有用である。例えば、このような分子は、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患及び関節リウマチを治療する上で有用である。（例えば、Ｈ．Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１７０３−１７１３  ａｎｄ  Ｈ．Ｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  ＰＮＡＳ  １０２，１１０９４−１１０９９；Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  Ｋｖ１．３  ｃｈａｎｎｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７（４）：１３６９−８１（２００５）；１  Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｋｖ１．３：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ，ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｐｒｅｐｒｉｎｔ  ａｔ  ／／ｗｅｂｆｉｌｅｓ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕｉ／  ２６７００２９．１を参照）。電圧開口型カリウムチャンネルの阻害剤であるＫｖ１．３は、炎症の様々な前臨床動物モデルにおいて調べられてきた。Ｋｖ１．３の小分子及びペプチド阻害剤は、オボアルブミン［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６７，１３６９］及び破傷風トキソイド［Ｇ．Ｃ．Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７，９９］に対する遅延型過敏症応答を遮断することが示されている。皮膚中の炎症を抑制することに加え、阻害剤は、抗体産生も低下させた［Ｇ．Ｃ．Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，５１２０］。Ｋｖ１．３アンタゴニストは、多発性硬化症（ＭＳ）のラット養子免疫伝達実験自己免疫脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデルにおいて有効性を示した。ＫＶ１．３チャンネルは、ＭＳ患者から得たミエリン特異的Ｔ細胞上に過剰発現されており、ＭＳを治療する上でＫｖ１．３阻害剤が与え得る有用性に対するさらなる裏づけをもたらす。炎症性骨吸収も、歯周病の前臨床養子免疫伝達モデルにおけるＫｖ１．３阻害剤によって抑制された［Ｐ．Ｖａｌｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．１９，１５５］。本研究では、阻害剤は、細菌の外膜タンパク質（歯肉の炎症を誘発するために使用される細菌の一成分）に対する抗体産生をさらに遮断した。最近、前臨床ラットモデルにおいて、Ｋｖ１．３阻害剤の有効性が、プリスタンによって誘発された関節炎及び糖尿病を治療する上で示された［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ｐｒｅｐｒｉｎｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ  ／／ｗｅｂｆｉｌｅｓ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕｉ／＿ｘｙ−２６７００２９＿１．］。Ｋｖ１．３チャンネルは、Ｔ細胞及びＢ細胞の全てのサブセット上に発現されているが、エフェクターメモリーＴ細胞及びクラスが転換されたメモリーＢ細胞は、Ｋｖ１．３に特に依存している［Ｈ．Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，７７６］．Ｇａｄ５／ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ｏｎｓｅｔ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｍｙｅｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＭＳ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｙｎｏｖｉｕｍ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｌｌ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｖ１．３  ［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  ｐｒｅｐｒｉｎｔ  ａｔ  ／／ｗｅｂｆｉｌｅｓ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｘｙｔｈｏｓｗｆｓ／ｗｅｂｕｉ／＿ｘｙ−２６７００２９＿１］。高脂肪食上に配置されたときに、Ｋｖ１．３を欠失したマウスの体重増加はより少なく［Ｊ．Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２，５５１］、変化したグルコース利用を示した［Ｊ．Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１，３１１２］からである。Ｋｖ１．３は、肥満及び糖尿病の治療に対しても調査されている。乳癌試料［Ｍ．Ａｂｄｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２３，３３４７］及び前立腺癌細胞株［Ｓ．Ｐ．Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．４４６，５５９］も、Ｋｖ１．３を発現することが示されており、Ｋｖ１．３の遮断は、癌の治療に対して有用であり得る。Ｋｖ１．３阻害剤トキシンペプチドが関与する自己免疫疾患を治療する本発明の方法に従って治療することが可能な疾患は、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病並びに全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）及び狼瘡の他の形態が含まれる。
【０２３７】
中間伝導ＩＫＣａ１のカルシウム活性化カリウムを発現する細胞の幾つかには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞及び赤血球（ＲＢＣ）が含まれる。ＩＫＣａ１を欠損するマウスから得られたＴ細胞及びＲＢＣは、容積制御の欠損を示す［Ｔ．Ｂｅｇｅｎｉｓｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４７６８１］。前臨床及び臨床試験は、鎌形赤血球貧血症を治療する上でのＩＫＣａ１阻害剤の有用性を示した［Ｊ．Ｗ．Ｓｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０１，２４１２；ｗｗｗ．ｉｃａｇｅｎ．ｃｏｍ］。ＩＫＣａ１チャンネルの遮断剤は、ＥＡＥを遮断することも示されており、それらがＭＳの治療において有用性を有し得ることを示唆している［Ｅ．Ｐ．Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，１０２７］。肥満細胞からのＩｇＥ媒介性ヒスタミン産生も、ＩＫＣａ１阻害剤によって遮断され［Ｓ．Ｍａｒｋ  Ｄｕｆｆｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１４，６６］、従って、ＩＫＣａ１阻害剤は、喘息の治療においても有益であり得る。ＩＫＣａ１チャンネルは、活性化されたＴ及びＢリンパ球上で過剰発現されており［Ｈ．Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，７７６］、従って、多様な免疫疾患の治療において有用性を示し得る。免疫系以外では、ＩＫＣａ１阻害剤は、血管再狭窄のラットモデルにおいても有効性を示しており、従って、血管形成術後における再狭窄を防ぐための新規治療戦略となり得る［Ｒ．Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８，１１１９］。阻害剤は、インビボで内皮細胞増殖及び血管新生を抑制したので、ＩＫＣａ１アンタゴニストは、腫瘍血管新生の治療において有用であるとも考えられる［Ｉ．Ｇｒｇｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２５，７０４］。ＩＫＣａ１チャンネルは、膵臓腫瘍において上方制御されており、阻害剤は、膵臓癌細胞株の増殖を遮断した［Ｈ．Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５，６３０］。ＩＫＣａ１アンタゴニストは、外傷性脳傷害によって引き起こされた急性脳損傷を軽減するためのアプローチにもなり得る［Ｆ．Ｍａｕｌｅｒ（２００４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，１７６１］。ＩＫＣａ１阻害剤で治療可能な疾患には、多発性硬化症、喘息、乾癬、接触媒介性皮膚炎、関節及び乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、狼瘡、再狭窄、膵臓癌、腫瘍血管新生及び外傷性脳傷害が含まれる。
【０２３８】
従って、中間伝導度のカルシウム活性化カリウムチャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込む本発明の分子ＩＫＣａは、免疫機能不全、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病及び狼瘡を治療するために使用することが可能である。
【０２３９】
従って、本発明は、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病又は狼瘡などの自己免疫疾患と診断された患者に、前記疾患の少なくとも１つの症候が前記患者において緩和されるように、本発明の組成物の治療的有効量を投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法を含む。「緩和された」とは、当該患者において、対象の症候が完全に消滅され、根絶され、除去され又は予防されているかどうかを問わず、和らげられ、提言され、減弱され、軟化され、軽減され（すなわち、より穏やか又は緩やかにする。）、鎮静され、鎮められ、減衰され、開放され、無化され、又は弱化されることを意味する。
【０２４０】
さらに、本発明は、多発性硬化症の少なくとも１つの症候を以前に経験した患者に、多発性硬化症の少なくとも１つの症候の再発が予防され、又は多発性硬化症の少なくとも１つの症候が軽減されるように、本発明の組成物の予防的有効量を投与することを含む、多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法に関する。
【０２４１】
自己免疫疾患を治療する本発明の方法及び多発性硬化症の症候の再発を予防又は軽減する方法において使用するのに好ましい本発明の組成物は、Ｐ（式Ｉにおけるように抱合される。）として、ＳｈＫペプチド、ＯＳＫ１ペプチド、ＣｈＴｘペプチド及び／又はマウロトキシン（Ｍｔｘ）ペプチドなどのＫｖ１．３若しくはＩＫＣａ１アンタゴニストペプチド又はこれらの何れかのペプチド類縁体を含む。
【０２４２】
例えば、抱合されたＳｈＫペプチドペプチド又はＳｈＫペプチド類縁体は、以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むことが可能である。
【０２４３】
表２に記されている配列番号５、８８〜２００、５４８〜５６１、８８４〜９５０又は１２９５〜１３００。
【０２４４】
抱合されたＯＳＫ１ペプチドペプチド又はＯＳＫ１ペプチド類縁体は、以下のものから選択されるアミノ酸配列を含むことが可能である。
【０２４５】
表７に記されている配列番号２５、２９４〜２９８、５６２〜６３６、９８０〜１２７４、
【０２４６】
【化４】
0005220915.tif 000065
【０２４７】
同じく例として、抱合されたＭＴＸペプチド、ＭＴＸペプチド類縁体、ＣｈＴｘペプチド又はＣｈＴｘペプチド類縁体は、以下から選択されるアミノ酸を含むことが可能である。
【０２４８】
表１３に記されている配列番号２０、３３０〜３４３、１３０１、１３０２、１３０４〜１３０７、１３０９、１３１１、１３１２若しくは１３１５〜１３３６；又は表１４に記されている配列番号３６、５９、３４４〜３４６若しくは１３６９〜１３９０。
【０２４９】
同じくこれらの方法において有用なのは、以下から選択されたアミノ酸配列を含む、抱合された又は抱合されていない、Ｋｖ１．３又はＩＫＣａ１阻害剤トキシンペプチド類縁体である。
【０２５０】
表２に示されている配列番号８８、８９、９２、１４８〜２００、５４８〜５６１、８８４〜９４９若しくは１２９５〜１３００；又は表７に示されている配列番号９８０〜１２７４；
【０２５１】
【化５】
0005220915.tif 000066
又は、表１３に記されている配列番号３３０〜３３７、３４１、１３０１、１３０２、１３０４〜１３０７、１３０９、１３１１、１３１２及び１３１５〜１３３６。
【０２５２】
これらの本発明の方法に従って、多発性硬化症、１型糖尿病、疥癬、炎症性腸疾患、接触媒介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性硬化症、繊維症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植拒絶、移植片対宿主病若しくは狼瘡など（但し、これらに限定されない。）自己免疫疾患と診断された患者、又は多発性硬化症の少なくとも１つの症候を以前に経験したことがある患者は、自己免疫疾患及びそれらの症候を熟知した、熟練した医療従事者（医師など）によって、十分に認識可能であり、及び／又は診断される。
【０２５３】
例えば、多発性硬化症の症候には、以下のものが含まれ得る。視覚的な症候、視神経炎（かすみ眼、眼痛、色覚の喪失、失明）；複視（複視）；眼振（痙攣性の眼の動き）；眼の測定障害（ｏｃｕｌａｒ  ｄｙｓｍｅｔｒｉａ）（定常的な過少又は過剰な眼の動き）；核間性眼筋麻痺（両眼間の協調の欠如、眼振、複視）；運動及び音の眼内閃光（眼を動かしたとき、又は突然の騒音に応答した閃光）；求心性の瞳孔の異常（異常な瞳孔の応答）など；
運動的症候、不全麻痺、不全単麻痺、不全対麻痺、不全片麻痺、四肢不全麻痺（筋衰弱−部分的な又は穏やかな麻痺）；麻痺、対麻痺、片麻痺、四肢麻痺（ｔｅｔｒａｐｌｅｇｉａ）、四肢麻痺（ｑｕａｄｒａｐｌｅｇｉａ）（麻痺−筋力の完全な喪失又はほぼ完全な喪失）；痙性（剛直、疼痛を引き起こし、罹患した四肢の自由な運動を制限する筋緊張の喪失）；構音障害（不明瞭な発語及び関連する発語上の問題）；筋萎縮（使用の欠如による筋肉の萎縮）；痙攣、こむら返り（筋肉の不随意的収縮）；緊張低下、間代性痙攣（姿勢に伴う問題）；間代性筋痙攣、筋波動症（痙動及び単収縮する筋肉、チック）；下肢静止不能症候群（特に、夜間に厄介な問題となる、不随意的な下肢の運動）；下垂足（歩行時に床に沿って足を引きずる）；反射機能不全（ＭＳＲ、バビンスキー反射、ホフマン反射、チャドック反射）など；
感覚性の症候、知覚異常（部分的な無感覚、刺痛、耳鳴り及び振動感覚）；知覚麻痺（完全な無感覚／感覚の喪失）；神経痛、神経病及び神経性の疼痛（明確な原因のない疼痛、灼熱感、掻痒感及び電気ショック感覚）；レルミッテ症候（頭を動かしているときの電気ショック及び耳鳴り感覚）など；
固有感覚機能不全（身体部分の位置感覚の喪失）；三叉神経痛（顔面痛）；
協調及び平衡の症候、運動失調（協調運動障害）；企図振戦（細かい運動を行うときの震え）；測定障害（恒常的な過少又は過剰な四肢運動）；前庭運動失調（内耳中の異常な平衡機能）；めまい（前庭運動失調に由来する悪心／嘔吐／乗り物酔いに対する感覚）；会話運動失調（協調した会話の困難、吃音）；ジストニア（四肢位置フィードバックの遅延）；反復拮抗運動不全（素早く交互運動（例えば、リズムに合わせて運動する）を行う能力の喪失）など；
腸、膀胱及び性的症候、頻尿、膀胱痙性（尿意逼迫及び失禁）；弛緩性膀胱、排尿筋・括約筋筋失調（排尿困難及び尿閉）；勃起障害（男性及び女性の性的不能）；オルガズム障害（オルガズムに達することができない）；逆行性射精（膀胱内への射精）；冷感症（性的に興奮した状態になることができない）；便秘（低頻度又は不定期な腸運動）；便意逼迫（腸の逼迫）；便失禁（腸失禁）など；
認知症候、うつ病；認知機能障害（短期及び長期記憶障害、健忘症、言葉を思い出す速度の遅延）；認知症；気分変動、情動不安定、多幸感；躁鬱症候群；不安；失語症、不全失語症（会話の理解及び発語の障害）など；並びに
その他の症候、疲労、ウートホフ症候群（熱を伴う症候の重度の増加）；胃食道逆流（胃酸逆流）；味覚及び嗅覚の障害；てんかん発作；嚥下困難、呼吸困難；並びに睡眠障害など。
【０２５４】
上に列記されている多発性硬化症の症候は単なる例示であり、一人の患者によって、又は複合した数人の患者によって経験され、本発明が適用される全ての可能な症候を網羅的に記載することを意図したものではない。当業者は、各患者によって罹患される自己免疫疾患の様々な臨床症候及び様々な症状を知悉しており、自己免疫疾患を治療し、又は多発性硬化症の症候の再発を予防若しくは軽減する本発明の方法は、これらの症候にも向けられる。
【０２５５】
自己免疫疾患を治療する本発明の方法又は多発性硬化症の症候の再発を予防若しくは軽減する本発明の方法に関与する治療的有効量、予防的有効量及び投薬計画は、患者の年齢、症状、体重、性別及び食事、治療されている症状の重度、投与の時間及び他の臨床的因子など、治療剤の作用を変化させる様々な因子を考慮して、担当医によって決定される。一般的に、一日の量又は投薬計画は、体重キログラム（ｋｇ）当りのビヒクル抱合されたペプチドの約１〜約１０，０００マイクログラム（μｇ）の範囲、好ましくは体重キログラム当り約１〜約５０００μｇ、最も好ましくは体重キログラム当り約１〜約１０００μｇの範囲とすべきである。
【０２５６】
電位開口型カリウムチャンネルＫｖ２．１のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、ＩＩ型糖尿病を治療するために使用することが可能である。
【０２５７】
Ｍ電流のペプチドアンタゴニスト（例えば、ＢｅＫｍ−１）を取り込んだ本発明の分子はアルツハイマー病を治療するために、及び認知を増強させるために使用することが可能である。
【０２５８】
電位開口型カリウムチャンネルＫｖ４．３のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、アルツハイマー病を治療するために使用することが可能である。
【０２５９】
小伝導度のカルシウム活性化カリウムチャンネルＳＫＣａのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、てんかん、記憶、学習、神経精神病、神経性、神経筋肉性及び免疫疾患、統合失調症、躁うつ病、睡眠時無呼吸、神経変性並びに平滑筋疾患を治療するために使用することが可能である。
【０２６０】
Ｎ型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和する上で有用である。このような活性を有するペプチド（例えば、ＺｉｃｏｎｏｔｉｄｅＴＭ、ω−コノトキシン−ＭＶＩＩＡ）は、臨床的に有効性が確認されている。
【０２６１】
Ｔ型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和する上で有用である。証拠の複数の系列が合わさって、後根神経節中のＣａｖ３．２の阻害が慢性的疼痛からの緩和をもたらし得ることを示している。Ｔ型カルシウムチャンネルは、ＤＲＧ中の神経細胞のサブセットの細胞体中に極めて高いレベルで見出されている。これらは、ゆっくり移動する刺激を検出するように適合された機械的受容体であると思われ（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７２４−７３０，  ２００３）、Ｔ型チャンネル活性は、バーストスパイクに必要であると思われる（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５：８７６６−８７７５，  ２００５）。ミベフラジル又はエトスキシミドによるＴ型チャンネルの阻害は、神経傷害によって（Ｄｏｇｒｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｉｎ  １０５：１５９−１６８，２００３）又は化学療法によって（Ｆｌａｔｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｐａｉｎ  １０９：１５０−１６１，  ２００４）誘発された、動物中の機械的異痛を回復させる。Ｃａｖ３．２に対するアンチセンスは、動物における疼痛の閾値を増加させるが、Ｃａｖ３．１又はＣａｖ３．３は増加させず、Ｃａｖ３．２に対するアンチセンスは、ＤＲＧ中でのＣａｖ３．２タンパク質の発現を低下させる（Ｂｏｕｒｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ  ２４：３１５−３２４，  ２００５）同様に、局所的に注射された還元剤は、疼痛を引き起こし、Ｃａｖ３．２電流を増加させ、酸化剤は疼痛を減少させ、Ｃａｖ３．２電流を阻害し、末梢に投与された神経ステロイドは鎮痛性であり、ＤＲＧからのＴ型電流を阻害する（Ｔｏｄｏｒｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｉｎ  １０９：３２８−３３９，２００４；Ｐａｔｈｉｒａｔｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｉｎ  １１４：４２９−４４３，  ２００５）。従って、ＤＲＧ神経細胞の細胞体中のＣａｖ３．２の阻害は、慢性疼痛状態を伴うこれらの神経細胞の反復的スパイクを阻害することが可能であると考えられている。
【０２６２】
Ｌ型カルシウムチャンネルアンタゴニストペプチドを取り込んだ本発明の分子は、高血圧を治療する上で有用である。このような活性を有する小ペプチド（例えば、ＤＨＰ）は、臨床的に有効性が確認されている。
【０２６３】
Ｎａｖ１（ＴＴＸｓ型）チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を緩和するために使用することが可能である。このような活性を有する局所麻酔及び三環系抗欝剤は、臨床的に有効性が確認されている。本発明のこのような分子は、特に、筋弛緩剤として有用であり得る。
【０２６４】
Ｎａｖ１（ＴＴＸＲ型）チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、神経及び／又は組織傷害から生じる疼痛を緩和するために使用することが可能である。
【０２６５】
膠細胞及び上皮細胞のＣａ２＋活性化塩化物チャンネルのペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、癌及び糖尿病を治療するために使用することが可能である。
【０２６６】
ＮＭＤＡ受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛、てんかん、脳及び脊髄の傷害を治療するために使用することが可能である。
【０２６７】
ニコチン性受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、筋弛緩剤として使用することが可能である。このような分子は、疼痛、胃の運動障害、尿失禁、ニコチン中毒及び気分障害を治療するために使用することが可能である。
【０２６８】
５ＨＴ３受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、悪心、疼痛及び不安を治療するために使用することが可能である。
【０２６９】
ノルエピネフリン輸送体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛、抗うつ剤、学習、記憶及び尿失禁を治療するために使用することが可能である。
【０２７０】
ニューロテンシン受容体のペプチドアンタゴニストを取り込んだ本発明の分子は、疼痛を治療するために使用することが可能である。
【０２７１】
治療的用途に加えて、本発明の化合物は、それらの関連する対象タンパク質の機能不全を特徴とする疾病を診断する上で有用であり得る。一実施形態において、生物学的試料中に、活性化されることができる対象タンパク質（例えば、受容体）を検出する方法であり、（ａ）前記試料を、本発明の化合物と接触させる工程と、及び（ｂ）前記化合物による、前記対象タンパク質の活性化を検出する工程とを含む前記方法。生物学的試料には、組織試料、完全な状態の細胞又はそれらの抽出物が含まれる。本発明の化合物は、生物学的試料中における、それらの関連する対象タンパク質の存在を検出するための診断キットの一部として使用することが可能である。このようなキットは、検出を可能とするために付着された標識を有する本発明の化合物を使用する。前記化合物は、正常な又は異常な対象タンパク質を同定するのに有用である。
【０２７２】
本発明の治療法、組成物及び化合物は、疾病の治療において、単独で、又は他の分子と組み合わせて使用することも可能である。
【０２７３】
医薬組成物
総論。本発明は、本発明の組成物と、及び医薬として許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。このような医薬組成物は、多様な送達経路、例えば、注射若しくは注入によるなどの血管内送達経路、皮下、筋肉内、腹腔内、硬膜外又は髄腔内送達経路、又は経口、腸内、経肺（例えば、吸入）、鼻内、経粘膜（例えば、舌下投与）、経皮又はその他の送達経路及び／又は本分野において公知の投与の形態によって、患者に投与するように設定することが可能である。本発明の医薬組成物は、液体形態で調製することができ、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末形態であり得る。経口又は経腸用途の場合、医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁液剤、分散性散剤又は顆粒剤、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル剤、シロップ、エリキシル、経腸処方として、設定することが可能である。
【０２７４】
本発明の実施において、「医薬として許容される担体」は、単一で又は組み合わせた、医薬として許容される全ての希釈剤、賦形剤、分散剤、結合剤、充填剤、流動促進剤、抗摩擦剤、圧縮補助、錠剤崩壊剤（崩壊剤）、懸濁剤、潤滑剤、着香剤、着臭剤、甘味剤、浸透若しくは貫通強化物質、防腐剤、界面活性剤、可溶化剤、乳化剤、濃縮剤、アジュバント、色素、コーティング、封入材料及び／又は他の添加物など、医薬組成物を調合する上で有用である、当業者に公知の生理的に耐容される全ての物質である。このような医薬組成物は、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセタート、ホスファート）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｉｍｅｒｓｏｌ（Ｒ）、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、ラクトース、マニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー性化合物の粒状調製物中への、又はリポソーム中への材料の取り込みを含むことが可能である。ヒアルロン酸も使用することが可能であり、これは、循環中の持続時間を促進する効果を有し得る。このような組成物は、本発明のタンパク質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランス速度に影響を与えることが可能である。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  １８０４２）  ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。前記組成物は、液体形態で調製することが可能であり、又は凍結乾燥された形態などの乾燥された粉末とすることが可能である。経皮又は経粘膜製剤のように、埋め込み可能な徐放製剤も有用である。これに加えて（又はこれに代えて）、本発明は、当業者に公知の様々な持続放出若しくは徐放製剤又は微粒子製剤の何れかにおいて、例えば、経肺、鼻内又は皮下送達経路を介して投与されることが可能な徐放微粒子製剤において使用するための組成物を提供する。
【０２７５】
不活性材料を用いて、本発明の組成物を希釈し、又は本発明の医薬組成物の容量を増加させることが可能である。このような希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用し得る。幾つかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ及びＡｖｉｃｅｌｌである。
【０２７６】
様々な慣用の濃縮剤が、アルギナート、キサンタンガム又は石油など（これらに限定されない。）、医薬組成物のクリーム、軟膏、坐薬及びゲル構造において有用であり、本発明の医薬組成物のこのような構成においても使用し得る。ポリエチレングリコールモノラウラート、ジメチルスルホキシド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリドン又は３−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどの浸透又は貫通増強物質も使用することが可能である。ヒドロゲルマトリックスを製造するための有用な技術は公知である。（例えば、Ｆｅｉｊｅｎ，  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ，  米国特許第４，９２５，６７７号；Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐＨ／ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ，  ＷＯ  ００／３８６５１  Ａ１）。このような生物分解性ゲルマトリックスは、例えば、タンパク質成分と多糖又はムコポリ多糖成分を架橋した後、送達すべき本発明の組成物を充填することによって形成することが可能である。
【０２７７】
無菌溶液又は懸濁液である本発明の液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、血管内（例えば、静脈内又は動脈内）、腹腔内又は皮下注射によって、患者に投与することが可能である。（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  米国特許第６，２４５，７４０号及びＷＯ００／３８６５２Ａ１を参照されたい。）。無菌溶液は、静脈内注入によって投与することも可能である。本発明の組成物は、無菌水、生理的食塩水、緩衝化された生理的食塩水又は他の適切な無菌注射可能溶媒を用いて患者に投与する前に、都合の良い時点で溶解又は懸濁することが可能な無菌固体医薬組成物（凍結乾燥された粉末など）中に含めることが可能である。
【０２７８】
埋め込み可能な徐放製剤も、本発明の医薬組成物の有用な実施形態である。例えば、医薬として許容される担体（体内又はヒト若しくはヒト以外の脊椎動物の皮膚の下に埋め込まれた生物分解性マトリックスである。）は、上記のものと類似のヒドロゲルであり得る。あるいは、医薬として許容される担体は、ポリ−αアミノ酸成分から形成され得る。（Ｓｉｄｍａｎ，  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ，  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓａｍｅ，  米国特許第４，３５１，３３７号）。薬物の送達用インプラントを作製するための他の技術も公知であり、本発明において有用である。
【０２７９】
粉末形態において、医薬として許容される担体は、細かく分割された固体であり、これは、本発明の組成物を含む細かく分割された活性成分と混合される。例えば、幾つかの実施形態において、医薬組成物が吸入剤として構成されている場合には、粉末形態が有用である。（例えば、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，  ＷＯ  ２００４／０１７９１８；Ｔｒｕｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓａｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＧＲＰ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ＢＩＢＮ４０９６  ａｎｄ  ｉｎｈａｌａｂｌｅ  ｐｏｗｄｅｒｅｄ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅｍ，  米国特許第６，９００，３１７号を参照されたい。）。
【０２８０】
不活性材料を用いて、本発明の化合物を希釈し、又は本発明の化合物の容量を増加させることが可能である。これらの希釈剤は、炭水化物、特に、マニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、修飾されたデキストラン及びデンプンを含むことが可能である。ある種の無機塩は、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムなど、充填剤としても使用することが可能である。幾つかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−ＦｌｏＴＭ、ＥｍｄｅｘＴＭ、ＳＴＡ−ＲｘＴＭ１５００、ＥｍｃｏｍｐｒｅｓｓＴＭ及びＡｖｉｃｅｌｌＴＭである。
【０２８１】
固体剤形への医薬組成物の製剤化中に、崩壊剤を含めることが可能である。崩壊剤として使用される材料には、デンプンをベースとした市販の崩壊剤ＥｘｐｌｏｔａｂＴＭを含むデンプンが含まれるが、これに限定されない。デンプングリコール酸ナトリウム、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＴＭ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸性カルボキシメチルセルロース、海綿及びベントナイトを使用することが可能である。不溶性陽イオン交換樹脂は、崩壊剤の別の形態である。粉末化されたゴムは、崩壊剤として、及び結合剤として使用することが可能であり、これらは、寒天、Ｋａｒａｙａ又はトラガカントなどの粉末化されたゴムを含むことが可能である。アルギン酸及びそのナトリウム塩は、崩壊剤としても有用である。
【０２８２】
結合剤は、治療剤を一体化させて硬い錠剤を形成するために使用することが可能であり、アラビアゴム、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然産物から得られる材料を含む。その他には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は何れも、治療剤を顆粒化するためにアルコール溶液中で使用することが可能である。
【０２８３】
抗摩擦剤は、調合プロセス時の粘着を防ぐために、治療剤の製剤中に含めることが可能である。潤滑剤は、治療剤とダイ壁との間の層として使用することが可能であり、これらには、ステアリン酸のマグネシウム及びカルシウム塩などのステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及び蝋が含まれ得るが、これらに限定されるものではない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００及び６０００などの可溶性潤滑剤も使用することが可能である。
【０２８４】
調合時の薬物の流動特性を改善することができ、及び圧縮時の転位を補助するための流動促進剤を添加し得る。流動促進剤には、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水和されたケイアルミン酸が含まれ得る。
【０２８５】
本発明の化合物の水性環境中への溶解を補助するために、界面活性剤を、湿潤剤として添加し得る。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤が含まれ得る。陽イオン性界面活性剤を使用し得、塩化ベンズアルコニウム又は塩化ベンゾエトニウムを含み得る。界面活性剤として製剤中に含めることができる可能性がある非イオン性界面活性剤のリストは、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシル４０ステアラート、ポリオキシエチレン硬化ひまし油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース並びにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独で、又は異なる比率での混合物として、タンパク質又は誘導体の製剤中に存在することができる。
【０２８６】
経口剤形。本発明の組成物の経口剤形も有用である。必要であれば、組成物は、経口送達が有効であるように化学的に修飾することが可能である。一般的に、想定される化学的修飾は、分子自体への少なくとも１つの部分の付着であり、前記部分は、（ａ）タンパク質分解の阻害及び（ｂ）胃又は腸からの血流中への取り込みを可能とする。化合物の全体的な安定性の増加及び体内での循環時間の増加も望まれる。本発明において、共有結合された半減期延長部分として有用な部分も、この目的のために使用することが可能である。このような部分の例には、ＰＥＧ，エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリンが含まれる。例えば、「Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（１９８１），  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ（Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｄｓ．），  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ｐｐ  ３６７−８３；Ｎｅｗｍａｒｋ，  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２），  Ｊ．  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ４：１８５−９」を参照されたい。使用され得る他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。前記のとおり、医薬的な使用に好ましいのは、ＰＥＧ部分である。
【０２８７】
経口送達剤形の場合、本発明の治療用化合物の吸収を増加させるための担体として、ナトリウムＮ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリラート（ＳＮＡＣ）などの修飾された脂肪族アミノ酸の塩を使用することも可能である。ＳＮＡＣを使用するヘパリン製剤の臨床的効力は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより行われた第ＩＩ相試験において証明されている。米国特許第５，７９２，４５１号，「Ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。
【０２８８】
一実施形態において、医薬として許容される担体は液体とすることが可能であり、医薬組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル又は圧縮された組成物の形態で調製される。活性成分（例えば、本発明の組成物）は、水、有機溶媒、両者の混合物、又は医薬として許容される油若しくは脂肪などの医薬として許容される液体担体中に溶解し、希釈し又は懸濁することが可能である。液体担体は、界面活性剤及び／又は可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、乳化剤、適切なｐＨの緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセタート、ホスファート）、アジュバント、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、甘味剤、着香剤、懸濁剤、濃縮剤、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；着色料、粘度調節物質、安定化物質、電解質、浸透溶質又は浸透圧制御物質などの他の適切な医薬添加物を含有することが可能である。本発明の組成物の取り込みを増強させるために、製剤中に添加物を含めることも可能である。この特性を有する可能性がある添加物は、例えば、脂肪酸オレイン酸、リノール酸及びリノレン酸である。
【０２８９】
有用なのは、上記Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）の第８９章（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に一般的に記載されている経口固体剤形である。固体剤形には、錠剤、カプセル、丸薬、トローチ又はドロップ、カプセル又はペレットが含まれる。また、本組成物を調合するために、（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されているプロテイノイド小球体のような）リポソーム封入又はプロテイノイド封入を使用することが可能である。リポソーム封入を使用することが可能であり、様々なポリマーでリポソームを誘導体化することが可能である（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤に対して可能な固体剤形の記述は、「Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｋ．，  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９），  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．  Ｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｔ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている。一般に、製剤は、本発明の化合物、及び胃環境に対する保護及び腸内での生物学的に活性な材料の放出を可能とする不活性成分を含む。
【０２９０】
本発明の組成物は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子状物質として、製剤中に含めることが可能である。カプセル投与用の材料の製剤は、粉末、軽く圧縮されたプラグ又は錠剤でもあり得る。治療剤は、圧縮によって調製することが可能である。
【０２９１】
着色剤及び着香剤は、全て含めることが可能である。例えば、（リポソーム又は小球体封入などによって）タンパク質（又は誘導体）を調合し、次いで、着色剤及び着香剤を含有する冷蔵された飲料などの飲食物内にさらに含有させることが可能である。
【０２９２】
錠剤形態で、活性成分は、適切な割合で、必要な圧縮特性を有する医薬として許容される担体と混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。
【０２９３】
粉末及び錠剤は、好ましくは、活性成分の最大９９％を含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点蝋及びイオン交換樹脂が含まれる。
【０２９４】
徐放製剤が望ましい場合があり得る。本発明の組成物は、拡散又は浸出機構の何れか、例えばガムによって放出を可能とする不活性マトリックス中に取り込ませることが可能である。ゆっくり変性するマトリックス、例えば、アルギナート、多糖を、製剤中に取り込ませることも可能である。本発明の組成物の徐放の別の形態は、ＯｒｏｓＴＭ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による。すなわち、薬物は、水の浸入を可能とし、浸透圧効果によって、単一の小さな開口部を通じて薬物を押し出すことが可能な半透膜中に封入される。幾つかの腸溶コーティングも、遅延した放出効果を有する。
【０２９５】
製剤化のために、他のコーティングを使用することが可能である。これらには、コーティングパン中に適用可能な様々な糖が含まれる。また、治療剤は、フィルムコーティングされた錠剤として提供されることも可能であり、この場合に使用される物質は、２つのグループに分類される。第１のグループは、非腸溶性物質であり、これらには、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン及びポリエチレングリコールが含まれる。第２のグループは、一般にはフタル酸のエステルである腸溶性物質からなる。
【０２９６】
最適なフィルムコーティングを得るために、材料の混合物を使用し得る。フィルムコーティングは、パンコーター内若しくは流動床内で、又は圧縮コーティングにより行なうことができる。
【０２９７】
経肺送達形態。本発明の組成物の経肺送達も有用である。該タンパク質（又は誘導体）は、吸入されて哺乳動物の肺に送達され、肺上皮内層（ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）を越えて血流に入る。（これに関する他の報告には、Ａｄｊｅｉら，  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６３：１３５−４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（ｓｕｐｐｌ．５）：  ｓ．１４３−１４６（エンドセリン−１；  Ｈｕｂｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ａｎｎａｌｓ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ，  ３：  ２０６−１２（α１−アンチトリプシン）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５−６（α１−プロテイナーゼ）；Ｏｓｗｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍａｒｃｈ  １９９０），“Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｐｒｏｃ．Ｓｖｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ，  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２−８（インターフェロンγ及び腫瘍壊死因子ルファ）及びＰｌａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる）。
【０２９８】
本発明の実施において有用であるのは、治療用産物の経肺送達用に設計された多種多様な機械装置（例えば、噴霧器、定量吸入器及び粉末吸入器などの、いずれも当業者によく知られたものが含まれるが、これらに限定されるものではない。）である。本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの具体例としては、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ製のＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器、Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ製のＶｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器及びＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器が挙げられる。（例えば、Ｈｅｌｇｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ，米国特許第６，８９２，７２８号；ＭｃＤｅｒｍｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｉｎｈａｌｅｒ，  ＷＯ  ０２／１１８０１  Ａ１；Ｏｈｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｈａｌａｎｔ  ｍｅｄｉｃａｔｏｒ，  米国特許第６，２７３，０８６号）。
【０２９９】
このような何れの装置においても、本発明の化合物の投薬に適した製剤を使用することが必要である。典型的には、各製剤は、用いる装置のタイプに特有のものであり、治療に有用な希釈剤、佐剤及び／又は担体に加えて適切な噴射物質の使用を伴いうる。
【０３００】
遠位の肺への最も有効な送達のためには、本発明の化合物は、１０μｍ（又はミクロン）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する粒子形態で調製されるのが最も有利なはずである。
【０３０１】
医薬として許容される担体には、トレハロース、マンニトール、キシリトール、スクロース、ラクトース、ソルビトールなどの炭水化物が含まれる。製剤中で使用する他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣが含まれ得る。天然又は合成界面活性剤を使用することができる。ＰＥＧを使用することができる（これは、該タンパク質又は類縁体の誘導体化におけるその使用と独立して使用することさえ可能である）。シクロデキストランなどのデキストランを使用することができる。胆汁酸塩及び他の関連した増強剤を使用することができる。セルロース及びセルロース誘導体を使用することができる。緩衝液製剤中での使用など、アミノ酸を使用することができる。
【０３０２】
また、リポソーム、マイクロカプセル又は小球体、包接複合体、又は担体の他のタイプの使用も想定される。
【０３０３】
噴霧器（ジェット式又は超音波式のいずれか）と併用するのに適した製剤は、典型的には、溶液１ｍＬ当たり生物学的活性タンパク質約０．１〜２５ｍｇの濃度で水に溶解された本発明の化合物を含む。また、該製剤は、緩衝液及び単糖（例えば、タンパク質の安定化及び浸透圧の調節用のもの）を含み得る。エーロゾルの形成において該溶液の噴霧により生じる該タンパク質の界面誘導凝集を抑制又は防止するために、該噴霧製剤は界面活性剤を含有することも可能である。
【０３０４】
定量吸入装置と併用する製剤は、一般に、界面活性剤の補助により噴射剤中に懸濁された本発明の化合物を含有する微細化粉末を含む。該噴射剤は、この目的に用いる任意の慣用物質（クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、又は炭化水素、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、１，１，１，２−テトラフルオロエタンなど、又はそれらの組合せ）とすることが可能である。適切な界面活性剤には、ソルビタントリオレアート及び大豆レシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。（例えば、Ｂａｃｋｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｒｕｇ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏａｌｋａｎｅｓ  ａｎｄ  ａｌｋｙｌ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，  米国特許第６，９３２，９６２号を参照されたい。）。
【０３０５】
粉末吸入装置からの投薬のための製剤は、本発明の化合物を含有する微細化乾燥粉末を含み、装置からの粉末の分散を促進する量（例えば、製剤の５０〜９０重量％）の増量剤（ラクトース、ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース又はキシリトールなど）を含むことも可能である。
【０３０６】
経鼻送達形態。本発明において、本発明の組成物及び／又は医薬組成物の鼻内送達も有用であり、鼻内運搬においては、鼻の内部への投与後、該産物の肺内への堆積を要することなく、本発明の組成物及び／又は医薬組成物を直接血流へ通過させることが可能である。鼻内投与に適した製剤には、デキストラン又はシクロデキストランを有する製剤が含まれ、鼻内送達装置は公知である。（例えば、Ｆｒｅｅｚｅｒ，Ｉｎｈａｌｅｒ，米国特許第４，０８３，３６８号を参照）。
【０３０７】
経皮及び経粘膜（例えば、口腔）送達形態。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、医薬として許容される経皮又は経粘膜パッチ又はトローチの一部として構成される。経皮パッチ薬物送達系、例えば、マトリックスタイプの経皮パッチは公知であり、本発明の医薬組成物の幾つかの実施形態を実施するのに有用である。（例えば、Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ／ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ  ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ，  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ，  米国特許第４，９０６，１６９号及び同第５，０２３，０８４号；Ｃｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｓａｍｅ，  米国特許第４，９１１  ，９１６号；Ｔｅｉｌｌａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＶＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ／ｏｒ  ａ  ｐｒｏｇｅｓｔｏｇｅｎ，米国特許第５，６０５，７０２号；Ｖｅｎｋａｔｅｓｈｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｓｔｅｒｏｉｄ，米国特許第５，７８３，２０８号；Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｗｏｍｅｎ，米国特許第５，４６０，８２０号）。治療剤の経粘膜送達用の医薬として許容される様々なシステムも本分野において公知であり、本発明の実施と適合性がある。（例えば、Ｈｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇｓ，米国特許第５，３４６，７０１号及び同第５，５１６，５２３号；Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，  米国特許第４，９９４，４３９号）。
【０３０８】
本発明の組成物の口腔送達も有用である。口腔送達製剤は、ペプチドとともに使用するために、本分野において公知である。例えば、経口粘膜（例えば、舌下粘膜）を通じた薬物送達用に設計された公知の錠剤又はパッチ系には、薬物を含有する内側層と、胆汁酸塩又はフシジン酸塩（ｆｕｓｉｄａｔｅ）などの浸透増強物質と、及びヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、ペクチン、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン又はこの目的に対して有用であることが知られた他のポリマーのあらゆる数などの親水性ポリマーとを含む幾つかの実施形態が含まれる。内側層は、口腔の湿った粘膜組織と接触して、これに粘着するように適合された１つの表面を有することが可能であり、上に存在する非粘着性の不活性層に付着する反対側表面を有することが可能である。場合によって、このような経皮送達系は、内側層がさらなる結合剤、着香剤又は充填剤も含有する二層錠剤の形態であり得る。幾つかの有用な系は、浸透増強物質とともに、非イオン性界面活性剤を使用する。経粘膜送達装置は、クリーム、ゲル若しくは軟膏など遊離形態であり得、又は錠剤、パッチ若しくはトローチなどの明確な形態を含み得る。例えば、本発明の組成物の送達は、例えば、粘着層、裏打ち層、本発明の組成物を含有する貯蔵槽を画する浸透膜、該膜の下に位置する剥離シールディスク、１つ又はそれ以上の熱シール及び除去可能な剥離ライナーの薄層化された複合物を含む経皮送達系を介することが可能である。（例えば、Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｏｖｅｒｌａｙ  ａｎｄ  ｐｅｅｌ  ｓｅａｌ  ｄｉｓｃ，  米国特許第５，６６２，９２５号；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｏｒ  ｍｕｃｏｓａ，  米国特許第４，８４９，２２４  号及び同第  ４，９８３，３９５号）。これらの例は、利用可能な経粘膜薬物送達技術の単なる例示であり、本発明を限定するものではない。
【０３０９】
投薬量。上記症状の治療方法に関わる投与計画は、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、患者の年齢、状態、体重、性別及び食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的要因）を考慮して担当医師により決定される。一般には、１日用量は、本発明の化合物０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１５０μｇ／ｋｇの範囲とすべきである。
【０３１０】
実施例
上記の組成物は以下の記載に従って調製することができる。これらの実施例は、いかなる場合においても、本願の特許請求の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【０３１１】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］の哺乳類動物での発現
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］は、Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］とも呼ばれ、Ｋｖｌ．３の阻害剤である。リンカー配列及びＫｖｌ．３阻害剤ペプチドＳｈＫ［１−３５］の単量体へインフレームに融合されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を後述のように構築した。哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３及びチャイニーズハムスター卵巣細胞）からペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。
【０３１２】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＭｌｕＩとＨｉｎｄＩＩＩの間のＣＭＶプロモーターをＣＭＶプロモーター＋イントロン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と置換することによって、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ（図１３Ａ）を構築した。５’コザック配列、シグナルペプチド及びヒトＦｃリンカー―ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉの大きな断片とのアクチビンＲＩＩＢ融合タンパク質を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩで消化されたＰＣＲ産物をクローニングすることによって、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−アクチビンＲＩＩＢ（図１３Ｂ）を作製した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−アクチビンＲＩＩＢ中のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図３Ａ−Ｂに示す。このベクターは、ＢａｍＨＩ部位によって分断されたＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（「Ｌ１０」、配列番号７９）も有し、これにより、以下のオリゴを用いて、最終Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ヌクレオチド及びアミノ酸配列（図１４Ａ−Ｂ並びに配列番号７７及び配列番号７８）に対して、ＦｃとＳｈＫ［１−３５］ペプチド（図１４Ａ−Ｂ参照）間に１０個アミノ酸のリンカーを形成することが可能となる。
【０３１３】
以下に示されているように、２つの停止コドンを有し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位が隣接した、４個のグリシン及び１個のセリンアミノ酸リンカー（本明細書での小文字は、Ｌ型アミノ酸残基のリンカー配列を示す）に連結された完全長ＳｈＫ遺伝子を作製するためのＰＣＲ戦略を使用して、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］発現ベクターを構築した。
【０３１４】
【化６】
0005220915.tif 000067
【０３１５】
以下に記載される配列を有する２つのオリゴを、９４℃−３０秒、５０℃−３０秒、７２℃−１分の３０周期で、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ反応で使用した。
【０３１６】
【化７】
0005220915.tif 000068
【０３１７】
得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で１５０ｂｐバンドとして分離した。１５０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってアガロースゲル精製した。同時に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−アクチビンＲＩＩＢベクター（図１３Ｂ）を、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ゲル精製キットにより、大きな断片を精製した。ゲル精製されたＰＣＲ断片を、精製された大きな断片へ連結し、ＸＬ−１ブルーバクテリア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素消化で消化し、１％アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるＤＮＡを配列決定へ供した。クローンの幾つもの配列の分析は、上述の配列と１００％一致したが、大規模プラスミド精製のために単一のクローンを選択した。Ｆｃ及びリンカー領域を確認するため、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中のＦｃ−２ｘＬ−ＳｈＫからのＤＮＡを再配列決定し、配列は、図１４Ａ−Ｂに示される推定されたコード化配列と１００％同一であった。
【０３１８】
ＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ製）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ製）を含有する増殖培地中で、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉタンパク質中のＦｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］の一過性形質移入発現において使用されるＨＥＫ−２９３細胞を培養した。Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、フェノール／クロロホルム抽出したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉプラスミド中のＦｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］５．６μｇを、ＨＥＫ−２９３細胞に形質移入した。細胞を２４時間回復した後、ＤＭＥＭ高グルコース及び１×ＮＥＡＡ培地中に４８時間配置した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）へ３０ｍＬを流し、さらにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）フィルターによって濃縮することによって、培養上清を５０倍濃縮した。濃縮した培地の多様な量を自家４×添加液（Ｂ−メルカプトエタノールなし）と混合し、Ｎｏｖｅｘ  Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ装置を使用して、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ染色済みタンパク質ラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１０μＬとともに、５×タンク緩衝液（０．１２３トリス塩基、０．９６Ｍグリシン）中、１０１Ｖ／４６ｍＡで２時間、Ｎｏｖｅｘ４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で電気泳動した。次に、ゲルをエレクトロブロット緩衝液（３５ｍＭトリス塩基、２０％メタノール、１９２ｍＭグリシン）中に３０分間浸漬した。Ｎｏｖｅｘ製のＰＤＶＦメンブレン（カタログ番号ＬＣ２００２、孔サイズ０．２μｍ）を活性化させるため、前記ＰＶＤＦメンブレンをメタノール中に３０秒浸漬し、脱イオン水ですすぎ、エレクトロブロット緩衝液中に浸漬した。ＸＣｅｌｌ  ＩＩブロットモジュールを使用して、製造者の説明書（Ｎｏｖｅｘ）に従って、ＰＶＤＦメンブレンへ４０ｍＡで２時間、あらかじめ浸漬したゲルをブロットした。次に、まずトリス緩衝塩類溶液ｐＨ７．５（ＴＢＳ）中の５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中に室温で、ブロットを１時間浸漬し、０．１％トゥイーン２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）及び１％ミルク緩衝液中で、ＨＲＰ結合抗ヒトＦｃ抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｅｓカタログ番号０５−３３２０）の１：５００希釈を、室温で２時間浸漬するために温置した。次に、室温で１回の洗浄につき１５分間、ＴＢＳＴ中で、ブロットを３回洗浄した。製造者の説明書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＥＣＬウェスタンブロット検出試薬を使用して、一次抗体を検出した。ＥＣＬ検出に際し、ウェスタンブロット分析は、非還元型ゲル条件下で、６６ｋＤａの予期されるサイズを表示した（図２４Ａ）。
【０３１９】
ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ウシ胎仔血清、１×ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ、Ｇｉｂｃｏ製）、１×ＮＥＡＡを含有するＡＭ１  ＣＨＯｄ増殖培地中で、Ｆｃ−ＬＩ０−ＳｈＫ［１−３５］タンパク質の安定した発現に使用されるＡＭ１ＣＨＯｄ（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）細胞を培養した。Ｆｕｇｅｎｅ６を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−Ｆｃ−ＳｈＫプラスミド６．５μｇもＡＭ１  ＣＨＯｄ細胞へと形質移入した。翌日、形質移入した細胞を２０個の１５ｃｍ皿へと播種し、ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、１×ＨＴ、１×ＮＥＡＡ、ジェネテシン（Ｇ４１８ｍｉあたり８００μｇ、Ｇｉｂｃｏ製）を使用して１３日間選択した。４８個の生存コロニーを、２つの２４ウェルプレート中に摘出した。増殖させるため、プレートを１週間放置した後、凍結のために複製した。１０％ＦＢＳなしのＡＭ１  ＣＨＯｄ増殖培地へ、各プレートの１セットを４８時間移動させて、培養上清を回収した。安定したＣＨＯクローンを発現させるための培養上清１５μＬを選別するために、同一の抗ヒトＦｃ抗体による検出を使用する一過性ウェスタンブロット分析と同様のウェスタンブロット分析を使用した。４８個の安定したクローンのうち、５０％超は６６ｋＤａの予期されたサイズでＳｈＫを発現した。一次クローンＢＢ６に対するバックアップとして、ＢＢ６、ＢＤ５、ＢＤ６クローンをＢＤ５及びＢＤ６で選択した（図２４Ｂ）。
【０３２０】
ＡＭ１  ＣＨＯｄ増殖培地を使用して、ＢＢ６クローンを、１０個のローラー瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へとスケールアップし、顕微鏡下で判断される培養密度まで増殖させた。次に、培地を、５０％ＤＭＥＭ高グルコース並びに１×ＨＴ及び１×ＮＥＡＡ含有５０％ＨａｍのＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）を含有する無血清培地と交換し、１週間温置した。培養上清を１週間の温置時点で回収し、０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でろ過し、凍結した。新鮮な無血清培地を添加し、さらに１週間温置した。培養無血清上清を初回と同様に回収し、凍結した。
【０３２１】
水槽中、室温で、培養上清約４Ｌを解凍した。Ｓａｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎ１０接線流限外ろ過カセット（０．１ｍ２）を室温で使用して、培地を約４５０ｍＬまで濃縮した。次に、プレフィルターを有する０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターで保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をろ過した。次に、７℃、５ｍＬ／分で、５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａカラムへ保持液をかけ、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にする工程で、試料を溶出した。タンパク質Ａ溶出プール（約９ｍＬ）を、５０ｍＬになるように水で希釈し、Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＨＰカラムへと、７℃、５ｍＬ／分で負荷した。次に、数カラム容積のＳ−緩衝液Ａで、カラムを洗浄した後、２５％から７５％のＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配を５ｍＬ／分で使用した後、７℃で１００％のＳ−緩衝液Ｂまでの工程を展開した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約３．４ｍＬまで濃縮した後、Ｃｏｓｔａｒ０．２２μｍ酢酸セルロースシリンジフィルターでろ過した。
【０３２２】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈したろ過済み材料１０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２６Ａ）。３２，４２０ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び４７，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が５．４ｍｇ／ｍＬであると決定した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２６Ｂ）。次に、ＰＢＳ中の試料の１０８倍希釈を使用するＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、タンパク質１ｍｇあたり１ＥＵであった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物２０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２６Ｃ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）中に希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）を、ＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーが装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して、外部質量較正を実施し（図２６Ｄ）、精製されたペプチボディの完全性を（実験誤差内で）確認した。その後、生成物を−８０℃で保存した。
【０３２３】
精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］は、電気生理学法によって測定されるように、ヒトＫｖ１．３を強く遮断した（図３０Ａ及び図３０Ｂ）（実施例３６参照）。精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］分子は、Ｔ細胞増殖（図３６Ａ及び図３６Ｂ）並びにサイトカインＩＬ−２（図３５Ａ及び図３７Ａ）及びＩＦＮ−ｇ（図３５Ｂ及び図３７Ｂ）の生成も遮断した。
【実施例２】
【０３２４】
Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］の哺乳類での発現
標準的なＰＣＲ技術を使用して、Ｋｖ１．３阻害剤ペプチドＳｈＫ［２−３５］の単量体へ、インフレームで融合されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を構築した。ＳｈＫ［２−３５］及び前記分子の５、１０又は２５アミノ酸リンカー部分を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ中の固有Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［１−３５］をテンプレートとして使用するＰＣＲ反応において生成させた（実施例１、図１４Ａ−Ｂ）。全てのＳｈＫコンストラクトは、以下のアミノ酸配列
【０３２５】
【化８】
0005220915.tif 000069
を有するべきであり、配列番号野生型配列の最初のアミノ酸は欠失している。
【０３２６】
「Ｆｃ−１ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］」とも呼ばれるＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。
【０３２７】
【化９】
0005220915.tif 000070
【０３２８】
「Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］」とも呼ばれるＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。
【０３２９】
【化１０】
0005220915.tif 000071
【０３３０】
「Ｆｃ−５ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］」とも呼ばれるＦｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］を作製するために使用されるプライマーの配列を以下に示す。
【０３３１】
【化１１】
0005220915.tif 000072
【０３３２】
ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、ゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によってアガロースゲル精製した。同時に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−アクチビンＲＩＩＢベクターを、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ゲル精製キットによって大きな断片を精製した。精製した各ＰＣＲ産物を大きな断片へ連結し、ＸＬ−１ブルーバクテリア中に形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素消化に供し、１％アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるＤＮＡを配列決定へ供した。クローンの幾つもの配列の分析は、上述の配列と１００％一致したが、大規模プラスミド精製のために１つのクローンのみを選択した。Ｆｃ領域及びリンカー領域を確認するために、このクローン由来のＤＮＡを再配列決定し、配列は予想された配列と１００％同一であった。
【０３３３】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉベクター中にＦｃ−１ｘＬ−Ｓｈｋ［２−３５］、Ｆｃ−２ｘＬ−Ｓｈｋ及びＦｃ−５ｘＬ−Ｓｈｋ［２−３５］インサートを含有するプラスミドを、Ｘｂａ１及びＸｈｏ１（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、ゲル精製した。ＮｏｔＩ及びＳａｌＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化したｐＤＳＲα−２２（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）発現ベクターへ、前記インサートを個々に連結した。得られたコンストラクトの完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。最終的なプラスミドＤＮＡ発現ベクターコンストラクトは、ｐＤＳＲα−２２−Ｆｃ−１ｘＬ−Ｓｈｋ［２−３５］、ｐＤＳＲα−２２-Ｆｃ−２ｘＬ−Ｓｈｋ［２−３５］（図１３Ｃ及び図１５Ａ−Ｂ）及びｐＤＳＲα−２２−Ｆｃ−５ｘＬ−Ｓｈｋ［２−３５］（図１６Ａ−Ｂ）であり、それぞれ５、１０及び２５アミノ酸リンカーを含有していた。
【０３３４】
形質移入の２４時間前に、１．２ｅ７  ＡＭ−１／Ｄ  ＣＨＯｄ（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）細胞を、Ｔ−１７５ｃｍの滅菌済み組織培養フラスコ中に播種し、形質移入当日に７０ないし８０％培養密度にした。ＤＭＥＭ高グルコース、５％ＦＢＳ、１×グルタミンＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＨＴ、１×ＮＥＡＡ及び１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＡＭ−１／Ｄ  ＣＨＯｄ培地中で前記細胞を維持した。翌日、直鎖状にしたｐＤＳＲα２２：Ｆｃ−１ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］、ｐＤＳＲα２２：Ｆｃ−２ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］及びｐＤＳＲα２２：Ｆｃ−５ｘＬ−ＳｈＫ［２−３５］（ＲＤＳ番号２００５００３７６８５、２００５００５３７０９、２００５００７３２９５）の各プラスミド１８μｇを、直鎖状Ｓｅｌｅｘｉｓ  ＭＡＲプラスミド７２μｇ及びｐＰＡＧＯ１（ＲＤＳ２００４２００９８９６）と混合し、５０ｍＬコニカルチューブ中のＯｐｔｉＭＥＭ６ｍＬ中へ希釈し、５分間温置した。ＬＦ２０００（２１０μＬ）をＯｐｔｉＭＥＭ６ｍＬへ添加し、５分間温置した。希釈したＤＮＡ及びＬＦ２０００を互いに混合し、室温で２０分間温置した。その間、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、抗生物質を有さない３０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭを細胞へ添加した。ＯｐｔｉＭＥＭを吸引除去し、ＤＮＡ／ＬＦ２０００混合物１２ｍＬとともに、振とうしている３７℃インキュベーター中で６時間又は一晩、細胞を温置した。形質移入から２４時間後、コロニー選択のために、異なる希釈で、ＡＭ−１／Ｄ  ＣＨＯｄ培地中に細胞を１：５に分割した。形質移入から７２時間後、細胞培地を、ＤＭＥＭ高グルコース、及び１×グルタミンＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×ＮＥＡＡ及び１×ピロリン酸ナトリウム中に１０％透析済みＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＨＦＲ選択培地と置換し、細胞培地中へタンパク質を発現及び分泌させた。コロニーが、摘み取るのに十分大きくなるまで、選択培地を１週間に２回交換した。ｐＤＳＲａ２２発現ベクターは、形質移入した細胞をヒポキサンチン及びチミジンの不存在下で増殖させるＤＨＦＲ発現カセットを含有する。得られたコロニーの５つのＴ−１７５プールを、ローラー瓶へスケールアップし、無血清条件下で培養した。馴化培地を回収し、１週間置きに交換した。得られた馴化培地３Ｌを、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ａｃｔｏｎ，  ＭＡ）でろ過し、精製のためにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに転移させた。バックアップとして、ＤＨＦＲ選択培地上で、１０ないし１４日後に、１０ｃｍプレートから１２個のコロニーを選択し、ＨＲＰ抱合された抗ヒトＩｇＧＦｃをプローブとして使用するウェスタンブロットによって、発現レベルを評価した。異なるリンカー長のＦｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］融合タンパク質の各々の最高レベルを発現する３つの最良のクローンを繁殖させ、将来の使用のために凍結した。
【０３３５】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）の精製
室温、水槽中で、培養上清約１Ｌを解凍した。５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａカラムへ、７℃、５ｍＬ／分で、培地を負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程で、試料を溶出した。タンパク質Ａ溶出プール（約８．５ｍＬ）を、３Ｍ酢酸ナトリウム７１μＬと組み合わせた後、５０ｍＬになるように水で希釈した。次に、７℃、５ｍＬ／分で、Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＨＰカラムへと、希釈した材料を負荷した。次に、Ｓ−緩衝液Ａの数カラム容積で、カラムを洗浄した後、０％から７５％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配を５ｍＬ／分で使用して展開した後、７℃で１００％Ｓ−緩衝液Ｂにする工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、プールした材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ遠心限外ろ過装置を使用して、約３．９ｍＬまで濃縮した。次に、室温、２ｍＬ／分で、０．２２μｍ、２５ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃを用いて、濃縮した材料をろ過した。次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈したろ過済み材料１０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２７Ｅ）。３０，００８ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が２．７６ｍｇ／ｍＬであることを決定した。透過液中に材料が認められたため、新しいＭａｃｒｏｓｅｐカートリッジを使用して、透過液に対して濃縮工程を反復した。次に、室温、２ｍＬ／分で、０．２２μｍ、２５ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃを通して、濃縮された材料の新たなバッチをろ過した。濃縮された材料の両ロットを１つのプールへと組み合わせた。
【０３３６】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した、合わせたプール１０μＬに対して、スペクトル走査を実施した。３０，００８ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が３．３３ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２７Ａ）。次に、ＰＢＳ中への試料の６７倍希釈を使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に１ｍＬ／分で注入された生成物５０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２７Ｂ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）中に希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２７Ｆ）、本実験は、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０３３７】
図３１Ｂは、精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］がヒトＫｖ１．３電流を強く遮断することを示す（電気生理学的実験を実施例３６に記載されるとおり実施した。）。精製したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］分子は、ヒト全血中のＩＬ−２（図６４Ａ及び図６４Ｂ）及びＩＦＮ−ｇ（図６５Ａ及び図６５Ｂ）の生成も、Ｔ細胞に関するＣＤ４０Ｌ（図６６Ａ及び図６６Ｂ）及びＩＬ−２Ｒ（図６７Ａ及び図６７Ｂ）の上方制御と同様に遮断した。
【０３３８】
Ｆｃ−Ｌ５−ＳｈＫ（２−３５）の精製
５ｍLのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐタンパク質Ａカラムへ、７℃、５ｍＬ／分で、培養上清約１Ｌを負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程で試料を溶出した。タンパク質Ａ溶出プール（約９ｍＬ）を１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５の４５０μＬと組み合わせた後、２Ｍ酢酸２３０μＬと組み合わせ、次に水で５０ｍＬに希釈した。次に、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、７℃、５ｍＬ／分でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＨＰカラムへ負荷した。次に、Ｓ−緩衝液Ａの数カラム容積でカラムを洗浄した後、０％から７５％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配を５ｍＬ／分で使用して展開した後、７℃で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｃｒｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約５．５ｍＬまで濃縮した。次に、濃縮した材料を室温で２ｍＬ／分で、０．２２μｍ、２５ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃでろ過した。
【０３３９】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール１０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２７Ｇ）。２９，７５０ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が４．５９ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２７Ｃ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液ＢＧ１２０中に試料を９２倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし-５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物５０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２７Ｈ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）へと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２７Ｉ）、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０３４０】
図３１Ｃは、精製したＦｃ−Ｌ５−ＳｈＫ［２−３５］が非常に活発で、全細胞パッチクランプ電気生理学的実験によって測定されるように、ヒトＫｖ１．３を遮断することを示す（実施例３６参照）。
【０３４１】
Ｆｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ（２−３５）の精製
７℃、５ｍＬ／分で、５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムへ、培養上清約１Ｌを負荷し、前記カラムを二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程で試料を溶出した。タンパク質Ａ溶出プール（約９．５ｍＬ）を３Ｍ酢酸ナトリウム１１９μＬと組み合わせた後、水で５０ｍＬに希釈した。次に、７℃、５ｍＬ／分でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ−ＨＰカラムへと、ｐＨ調整した材料を負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から７５％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配を５ｍＬ／分で使用して展開した後、７℃で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。クロマトグラムからの主要ピークを含有する画分をプールし、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。
【０３４２】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２７Ｊ）。３１，０１１ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が１．４０ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２７Ｄ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液ＢＧ１２０中に試料を２８倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）に１ｍＬ／分で注入された生成物５０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２７Ｋ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ中に希釈する（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２７Ｌ）、これにより、ペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０３４３】
精製したＦｃ−Ｌ２５−ＳｈＫ［２−３５］は、ＨＥＫ２９３／Ｋｖ１．３細胞に関するホールセルパッチクランプ電気生理学によって、約１５０ｐＭのＩＣ５０でヒトＫｖ１．３を阻害した（実験３６）。
【実施例３】
【０３４４】
Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］の細菌での発現
細菌のペプチボディ発現ベクター並びにペプチボディのクローニング及び発現に関する手法の記載
細菌発現に使用されるクローニングベクター（実施例３ないし３０）は、（米国特許第２００４／００４４１８８号に元来記載される）ｐＡＭＧ２１に基づいている。ベクターのユニークなＢｓｔＢＩ部位とＮｓｉＩ部位の間でＤＮＡを切り出し、アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子のテンプレート源としてのｐＵＣ１９ＤＮＡとともに、ＰＣＲプライマー
【０３４５】
【化１２】
0005220915.tif 000073
を使用して、β−ラクタマーゼ遺伝子を搭載する適切に消化されたＰＣＲ断片と置換することによって、カナマイシン耐性要素がアンピシリン耐性と置換された点が改変されている。新たなバージョンは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲと呼ばれる。
【０３４６】
１５及び１６を除く、実施例３ないし３０において使用されるクローニングベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐの記載。
【０３４７】
図１１Ａ−Ｃ及び図１１Ｄ（模式図）は、Ｆｃ遺伝子のＣ末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために基本ベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲへ付加された二本鎖ＤＮＡを示す。前記ＤＮＡは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲベクター中のユニークなＮｄｅｌ部位とＢａｍＨＩ部位の間に導入されている。ＤＮＡのこの完全な領域を図１１ＡないしＣに示す。Ｆｃのコード領域は、ヌクレオチド５１３４から５８１７まで及び、タンパク質配列はＤＮＡ配列の下に表される。この後に、フレーム中にｇｌｙＸ５リンカーが続く（ヌクレオチド５８１８ないし５８３２）。ＢｓｍＢＩ部位（ＧＡＧＡＣＧ）は、ヌクレオチド５８３４ないし５８３９に及ぶ。ＤＮＡ開裂は、上部ＤＮＡ鎖のヌクレオチド５８２８と５８２９の間、及び下部ＤＮＡ鎖のヌクレオチド５８３２と５８３３の間に生じる。本明細書に示されるように、消化によって、４ｂｐの付着末端が作製される。ＢｓｍＢＩ部位には下線を付されている。
【０３４８】
【化１３】
0005220915.tif 000074
【０３４９】
第二ＢｓｍＢＩ部位は、ヌクレオチド６６４３ないし６６４８、すなわちＣＧＴＣＴＣに存在する。ＤＮＡ開裂は、上部鎖のヌクレオチド６６５０と６６５１の間、及び下部鎖の６６５４と６６５５の間に生じる。
【０３５０】
【化１４】
0005220915.tif 000075
【０３５１】
２つのＢｓｍＢＩ部位の間に存在するのは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを構成的に発現する非必須クロラムフェニコール耐性カセットである（ｃａｔ遺伝子）。ｃａｔタンパク質配列、すなわち
【０３５２】
【化１５】
0005220915.tif 000076
は、図１１ＡないしＣに示されており、ヌクレオチド５９５４から６６１０まで及ぶ。（実施例１５及び１６を除く）各実施例における、ペプチドをコードする二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。
【０３５３】
実施例１５及び１６において使用されるクローニングベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃに関する記載。
【０３５４】
図１２ＡないしＣ、及び図１２Ｄの模式図は、Ｆｃ遺伝子のＮ末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために、基本ベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲへ付加された二本鎖ＤＮＡ配列を示す。ＤＮＡは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲベクター中のユニークなＮｄｅｌ部位とＢａｍＨＩ部位との間に導入されている。Ｆｃに対するコード領域は、ヌクレオチド５６４０から６３０９まで及び、タンパク質配列はＤＮＡ配列の下に表されている。この後、フレーム中にｇｌｙＸ５リンカーが続く（ヌクレオチド５６１４ないし５６２８）。ＢｓｍＢＩ部位は、ヌクレオチド５１３８ないし５１４３、すなわちＧＡＧＡＣＧに及ぶ。切断は、上部ＤＮＡ鎖のヌクレオチド５１３２と５１３３の間、及び下部ＤＮＡ鎖の５１３６と５１３７の間で生じる。
【０３５５】
示されるように、消化によって４ｂｐの付着末端が作製される。ＢｓｍＢＩ部位は下線を付されている。
【０３５６】
【化１６】
0005220915.tif 000077
【０３５７】
第二ＢｓｍＢＩ部位は、ヌクレオチド５６０７ないし５６１２、すなわちＣＧＴＣＴＣに存在する。切断は、上部鎖のヌクレオチド５６１３と５６１４の間、及び下部鎖の５６１７と５６１８の間に生じる。
【０３５８】
【化１７】
0005220915.tif 000078
【０３５９】
ＢｓｍＢＩ部位の間に存在するのは、赤痢菌ｂｌｅタンパク質を構成的に発現する必須で無いゼオシン耐性カセットである。ｂｌｅタンパク質配列、すなわち
【０３６０】
【化１８】
0005220915.tif 000079
は、図１２ＡないしＣにおいてヌクレオチド５２１７から５５８８まで及ぶことが示されている。実施例１５及び１６における、ペプチドをコードする二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。
【０３６１】
実施例５２及び５３において使用されるクローニングベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃに関する記載。
【０３６２】
図１２ＥないしＧは、ペプチドの最初の２つのコドンがｍｅｔ−ｇｌｙであるべきＦｃ遺伝子の、Ｎ末端へのペプチド融合のクローニングを可能にするために、基本ベクターｐＡＭＧ２１ａｍｐＲへ付加された二本鎖ＤＮＡ配列を示す。前記ＤＮＡは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲベクター中の独特なＮｄｅｌ部位とＢａｍＨＩ部位との間に導入されている。Ｆｃに対するコード領域は、ヌクレオチド５６３２から６３１２まで及び、タンパク質配列はＤＮＡ配列の下に表されている。この後、フレーム中にｇｌｙＸ５リンカーが続く（ヌクレオチド５６１７ないし５６３１）。ＢｓｍＢＩ部位は、ヌクレオチド５１４１ないし５１４６、すなわちＧＡＧＡＣＧに及ぶ。切断は、上部ＤＮＡ鎖のヌクレオチド５１３５と５１３６の間、及び下部ＤＮＡ鎖の５１３９と５１４０の間で生じる。
【０３６３】
示されるように、消化によって４ｂｐの付着末端が作製される。ＢｓｍＢＩ部位に
は下線が付されている。
【０３６４】
【化１９】
0005220915.tif 000080
【０３６５】
第二のＢｓｍＢＩ部位は、ヌクレオチド５６０７ないし５６１２、すなわちＣＧＴＣＴＣに存在する。切断は、上部鎖のヌクレオチド５６１３と５６１４との間、及び下部鎖の５６１７と５６１８との間に生じる。
【０３６６】
【化２０】
0005220915.tif 000081
【０３６７】
ＢｓｍＢＩ部位の間に存在するのは、赤痢菌ｂｌｅタンパク質を構成的に発現する必須でないゼオシン耐性カセットである。ｂｌｅは、上述のように、ヌクレオチド５２２０から５５９１まで及ぶことが示されている。本明細書で以下の実施例５２及び５３におけるペプチドコード化二本鎖は、ベクターによって表されるものと相補的な付着末端を有する。
【０３６８】
全てが細菌発現用である実施例３ないし３０において、クローニングされたペプチド配列は全て、適切なベクター中に直接連結されたＤＮＡ二本鎖を作製するための、オリゴヌクレオチドのアニーリングから得られる。実施例２０については、２つのオリゴで十分であり、全ての他の実施例には４つが必要である。二本鎖がＦｃのＮ末端において挿入されるべき場合（本明細書の実施例１５、１６、５２及び５３参照）には、デザインは次のとおりであり、順序を示す数は、各実施例におけるオリゴのリストと一致する。
【０３６９】
【化２１】
0005220915.tif 000082
【０３７０】
残りの全ての実施例は、ＦｃのＣ末端において二本鎖が挿入され、次のデザインを利用する。
【０３７１】
【化２２】
0005220915.tif 000083
【０３７２】
何れのオリゴのリン酸化にも、キナーゼ化（ｋｉｎａｓｉｎｇ）工程は必要ではない。二本鎖が首尾よく挿入されると、必須でない抗生物質耐性カセット（ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃについてはゼオシン耐性、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐについてはクロラムフェニコール耐性）が置換される。得られた表現型の変化は、組換えクローンを非組換えクローンと識別するのに有用である。
【０３７３】
以下の記載は、本明細書で具体化されている、細菌によって発現された３０個の組換えタンパク質全てのクローニングを実施するための一様な方法を与える。オリゴヌクレオチド及びベクターのセットのみが変動する。これらの仕様は、以下の各実施例に記載されている。
【０３７４】
各実施例に列挙されているオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、所定のペプチドに対するコード領域を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖を形成した。制限酵素ＢｓｍＢＩで予め消化された適切なベクター０．３μｇとともに１×連結緩衝液を含有する１０μＬの最終容積中に、各オリゴ１０ｐｍｏｌを混合した。混合物を８０℃まで加熱し、０．１℃／秒で室温まで冷却させた。これに、１×連結緩衝液１０μＬ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ４００単位を添加した。試料を１４℃で２０分間温置した。６５℃で１０分間加熱することによって、リガーゼを失活させた。次に、制限酵素ＢｓｍＢＩを１０単位添加した後、再形成された全ての親ベクター分子も開裂させるために、５５℃で１時間温置した。化学的に形質転換受容性のあるＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞５０μＬを添加し、２℃で２０分間保持した後、４２℃で５秒間熱ショックを付与した。２００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補充したルリアアガープレートへ、全容積を拡散させた。置換可能な抗生物質耐性マーカーに対する耐性の損失に関して、コロニーを検査した。二本鎖インサートの予想されたサイズを確認するため、標準的なＰＣＲ検査を使用し得る。プラスミド調製物を得、組換えインサートをＤＮＡ配列決定によって確認した。配列の確認されたコンストラクトの０．５Ｌ培養物をＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させ、５０ｎｇ／ｍＬのＮ−（３−オキソ−ヘキサノイル）−ホモセリンラクトンの添加によって、ペプチボディの発現を誘導し、３７℃で４ないし６時間振とうした後、細胞を遠心分離し、細胞ペーストを−２０℃で保存した。
【０３７５】
以下では、各実施例について、クローニングベクター及び各融合タンパク質を構築するために使用されるオリゴヌクレオチドのセットを記載する。ＤＮＡ／タンパク質地図も示されている。
【０３７６】
Ｋｖ１．３のＦｃ−Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］阻害剤の細菌での発現
細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は上述されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］の細菌中でのクローニング及び発現のために二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０３７７】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴ：
【０３７８】
【化２３】
0005220915.tif 000084
【０３７９】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌で発現されたＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（１−３５）の精製は、本明細書の以下の実施例３８でさらに記載されている。
【実施例４】
【０３８０】
Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］の細菌での発現
細菌中で、ペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０３８１】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０３８２】
【化２４】
0005220915.tif 000085
0005220915.tif 000086
【０３８３】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。細菌で発現するＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）の精製は、本明細書の以下の実施例３９に、さらに記載されている。
【実施例５】
【０３８４】
Ｆｃ−Ｌ−ＨｍＫの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＨｍＫの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＨｍＫの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０３８５】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０３８６】
【化２５】
0005220915.tif 000087
0005220915.tif 000088
【０３８７】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例６】
【０３８８】
Ｆｃ−Ｌ−ＫＴＸ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＫＴＸ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＫＴＸ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０３８９】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０３９０】
【化２６】
0005220915.tif 000089
【０３９１】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【０３９２】
細菌中で発現されたＦｃ−Ｌ−ＫＴＸ１の精製及び再折りたたみ
凍結したＥ．コリペースト（２８ｇ）を室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の２１ｍＬと組み合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）へ１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、細胞可溶化液を４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを２００ｍＬの１％デオキシコール酸中に再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを２００ｍＬの水中に再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、ペレット（４．８ｇ）を４８ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。次に、３０μＬの１Ｍジチオスレイトールを前記溶液３ｍＬへ添加し、３７℃で３０分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元したペレット溶液を室温、１４，０００ｇで５分間遠心分離した後、上清２．５ｍＬを、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ８．５）２５０ｍＬへ、４℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、４℃で２日間、温置を継続した。次に、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターで再折りたたみ溶液をろ過し、４℃で３日間保存した。
【０３９３】
次に、保存した再折りたたみ液を水１Ｌで希釈し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、ｐＨを７．５へ調整した。次に、７℃、１０ｍＬ／分でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中の１０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐカラムへと、ｐH調整した材料を負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の直線勾配で溶出した後、７℃、５ｍＬ／分で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした（４５ｍＬ）。次に、７℃、２ｍＬ／分でＰＢＳ中の１ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムをＰＢＳの数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出ピーク（２．５ｍＬ）へ、６２．５μＬの２Ｍトリス塩基を添加した後、ｐＨ調整した材料を室温、２ｍＬ／分で、０．２２μｍ、２５ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃでろ過した。
【０３９４】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２８Ｃ）。３０，５０４ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が２．４９ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２８Ａ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液ＢＧ１２０中に試料を５０倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物４５μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２８Ｂ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）へと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２８Ｄ）、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０３９５】
精製したＦｃ−Ｌ−ＫＴＸ１は、電気生理学的手法によって、用量依存的様式でヒトＫｖ１．３電流を遮断した(図３２Ａ及び図３２Ｂ)（方法を実施例３６に記載した。）。
【実施例７】
【０３９６】
Ｆｃ−Ｌ−ＨｓＴｘ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＨｓＴ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＨｓＴｘ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０３９７】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０３９８】
【化２７】
0005220915.tif 000090
【０３９９】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例８】
【０４００】
Ｆｃ−Ｌ−ＭｇＴｘの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＭｇＴｘの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＭｇＴｘの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４０１】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４０２】
【化２８】
0005220915.tif 000091
【０４０３】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例９】
【０４０４】
Ｆｃ−Ｌ−ＡｇＴｘ２の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＡｇＴｘ２の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＡｇＴｘ２の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４０５】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４０６】
【化２９】
0005220915.tif 000092
【０４０７】
以下に示されている二本鎖を形成するために、上記オリゴを使用した。
【０４０８】
【化３０】
0005220915.tif 000093
【０４０９】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【０４１０】
細菌中で発現したＦｃ−Ｌ−ＡｇＴｘ２の再折りたたみ及び精製
冷凍したＥ．コリペースト（１５ｇ）を、室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の１２０ｍＬと合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、２２，０００ｇで２０分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、１％デオキシコール酸２００ｍＬ中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、２００ｍＬの水中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、ペレット（４．６ｇ）を４６ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。次に、３０μＬの１Ｍジチオスレイトールを前記溶液３ｍＬへ添加し、３７℃で３０分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を、室温、１４，０００ｇで５分間遠心分離した後、上清２．５ｍＬを、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ９．５）２５０ｍＬへ、４℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を４℃で２日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、−７０℃で保存した。
【０４１１】
次に、保存した再折りたたみ液を水１Ｌで希釈し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、ｐＨを７．５へ調整した。次に、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、７℃、１０ｍＬ／分でで、Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中の１０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−ＨＰ  ＨｉＴｒａｐカラムへと負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の直線勾配で溶出した後、７℃、５ｍＬ／分で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした（１５ｍＬ）。次に、７℃、２ｍＬ／分でＰＢＳ中の１ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラムへ前記プールを負荷した。次に、カラムを２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、１Ｍ  ＮａＣｌの数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出ピーク（１．５ｍＬ）へ、１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５を添加した後、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。
【０４１２】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２９Ｃ）。３０，４４６ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が１．６５ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２９Ａ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液ＢＧ１２０中に試料を３３倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物２０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２９Ｄ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ中に希釈する（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２９Ｅ）、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。その後、生成物を−８０℃で保存した。
【実施例１０】
【０４１３】
Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４１４】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４１５】
【化３１】
0005220915.tif 000094
【０４１６】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、これより後の使用のためにペーストを冷凍保存した。Ｅ．コリペーストからのＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の精製を、以下の本明細書の実施例４０に記載する。
【実施例１１】
【０４１７】
Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４１８】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４１９】
【化３２】
0005220915.tif 000095
【０４２０】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、これより後の使用のためにペーストを冷凍保存した。
【実施例１２】
【０４２１】
Ｆｃ−Ｌ−アニュロクトキシン（Ａｎｕｒｏｃｔｏｘｉｎ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−アニュロクトキシンの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−アニュロクトキシンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４２２】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４２３】
【化３３】
0005220915.tif 000096
0005220915.tif 000097
【０４２４】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例１３】
【０４２５】
Ｆｃ−Ｌ−ノキシウストキシン（Ｎｏｘｉｕｓｔｏｘｉｎ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ノキシウストキシン又はＦｃ−Ｌ−ＮＴＸの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記述される。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＮＴＸの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４２６】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４２７】
【化３４】
0005220915.tif 000098
【０４２８】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例１４】
【０４２９】
Ｆｃ−Ｌ−Ｐｉ２の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−Ｐｉ２の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−Ｐｉ２の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４３０】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４３１】
【化３５】
0005220915.tif 000099
【０４３２】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例１５】
【０４３３】
ＳｈＫ［１−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌での発現
ＳｈＫ［１−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃであり、ＳｈＫ［１−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４３４】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４３５】
【化３６】
0005220915.tif 000100
0005220915.tif 000101
【０４３６】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。ｍｅｔ−ＳｈＫ［１−３５］−Ｆｃの精製は、以下の本明細書の実施例５１に記載されるとおりであった。
【実施例１６】
【０４３７】
ＳｈＫ［２−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌での発現
ＳｈＫ［２−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｐｅｐ−Ｆｃであり、ＳｈＫ［２−３５］−Ｌ−Ｆｃの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４３８】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４３９】
【化３７】
0005220915.tif 000102
0005220915.tif 000103
【０４４０】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。ＳｈＫ［２−３５］−Ｆｃの精製は、以下の本明細書の実施例５０に記載されるとおりであった。
【実施例１７】
【０４４１】
Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４４２】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４４３】
【化３８】
0005220915.tif 000104
【０４４４】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例１８】
【０４４５】
Ｆｃ−Ｌ−ＭＴＸの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＭＴＸの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させるための方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターはｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＭＴＸの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４４６】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４４７】
【化３９】
0005220915.tif 000105
【０４４８】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例１９】
【０４４９】
Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘ（Ｋ３２Ｅ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘ（Ｋ３２Ｅ）の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＣｈＴｘ（Ｋ３２Ｅ）の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４５０】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４５１】
【化４０】
0005220915.tif 000106
0005220915.tif 000107
【０４５２】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２０】
【０４５３】
Ｆｃ−Ｌ−アパミン（Ａｐａｍｉｎ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−アパミンの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−アパミンの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４５４】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４５５】
【化４１】
0005220915.tif 000108
【０４５６】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２１】
【０４５７】
Ｆｃ−Ｌ−スキラトキシン（Ｓｃｙｌｌａｔｏｘｉｎ）の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−スキラトキシン又はＦｃ−Ｌ−ＳｃｙＴｘの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現する方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＳｃｙＴｘの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４５８】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４５９】
【化４２】
0005220915.tif 000109
【０４６０】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２２】
【０４６１】
Ｆｃ−Ｌ−ＩｂＴｘの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＩｂＴＸの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＩｂＴｘの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４６２】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４６３】
【化４３】
0005220915.tif 000110
0005220915.tif 000111
【０４６４】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２３】
【０４６５】
Ｆｃ−Ｌ−ＨａＴｘ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＨａＴｘ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＨａＴｘ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４６６】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４６７】
【化４４】
0005220915.tif 000112
【０４６８】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【０４６９】
細菌中で発現したＦｃ−Ｌ−ＨａＴｘ１の再折りたたみ及び精製
凍結したＥ．コリペースト（１３ｇ）を、室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の１００ｍＬと合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、２２，０００ｇで２０分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、２００ｍＬの１％デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを２００ｍＬの水中に再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで２０分間遠心分離した。次に、ペレット（２．６ｇ）を２６ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。次に、３０μＬの１Ｍジチオスレイトールを前記溶液３ｍＬへ添加し、３７℃で３０分間温置することによって、溶解したペレットを還元した。次に、還元されたペレット溶液を室温、１４，０００ｇで５分間遠心分離した後、上清２．５ｍＬを、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ８．５）２５０ｍＬへ、４℃で激しく撹拌しながら転移させた。次に、撹拌速度を低下させ、温置を４℃で２日間続行した。次に、再折りたたみ溶液を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、−７０℃で保存した。
【０４７０】
次に、保存した再折りたたみ液を解凍した後、水１Ｌで希釈し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、ｐＨを７．５へ調整した。次に、７℃、１０ｍＬ／分でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中の１０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−ＨＰ  ＨｉＴｒａｐカラムへと、ｐＨ調整した材料を負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の直線勾配で溶出した後、７℃、５ｍＬ／分で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした（１５ｍＬ）。次に、７℃、２ｍＬ／分でＰＢＳ中の１ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、１Ｍ  ＮａＣｌの数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出ピーク（１．４ｍＬ）へ、１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５の７０μＬを添加した後、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。
【０４７１】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図２９Ｆ）。３０，４６９ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び４３，８９０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が１．４４ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図２９Ｂ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液ＢＧ１２０中に試料を３３倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、4ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物２０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図２９Ｇ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ中に希釈する（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ試料プレートへ点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製タンパク質を使用して外部質量較正を実施し（図２９Ｈ）、本実験は、精製されたペプチボディの完全性を実験誤差内で確認した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【実施例２４】
【０４７２】
Ｆｃ−Ｌ−ＰａＴｘ２の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＰａＴｘ２の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＰａＴｘ２の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４７３】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４７４】
【化４５】
0005220915.tif 000113
【０４７５】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２５】
【０４７６】
Ｆｃ−Ｌ−ｗＧＶＩＡの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ｗＧＶＩＡの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ｗＧＶＩＡの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４７７】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４７８】
【化４６】
0005220915.tif 000114
【０４７９】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２６】
【０４８０】
Ｆｃ−Ｌ−ωＭＶＩＩＡの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ωＭＶＩＩＡの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ωＭＶＩＩＡの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４８１】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４８２】
【化４７】
0005220915.tif 000115
0005220915.tif 000116
【０４８３】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２７】
【０４８４】
Ｆｃ−Ｌ−Ｐｔｕｌの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−Ｐｔｕ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−Ｐｔｕ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４８５】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４８６】
【化４８】
0005220915.tif 000117
【０４８７】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２８】
【０４８８】
Ｆｃ−Ｌ−ＰｒｏＴｘ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＰｒｏＴｘ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＰｒｏＴｘ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４８９】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４９０】
【化４９】
0005220915.tif 000118
【０４９１】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例２９】
【０４９２】
Ｆｃ−Ｌ−ＢｅＫＭ１の細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＢｅＫＭ１の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＢｅＫＭ１の細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４９３】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４９４】
【化５０】
0005220915.tif 000119
【０４９５】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例３０】
【０４９６】
Ｆｃ−Ｌ−ＣＴＸの細菌での発現
Ｆｃ−Ｌ−ＣＴＸの細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されている。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｐＲ−Ｆｃ−Ｐｅｐであり、Ｆｃ−Ｌ−ＣＴＸの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０４９７】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０４９８】
【化５１】
0005220915.tif 000120
0005220915.tif 000121
【０４９９】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例３１】
【０５００】
Ｎ末端がＰＥＧ化されたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ
還元型Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫのペプチド合成
Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）−Ｓ  ＰＨＢ  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）樹脂上にて、０．１ｍｍｏｌ当量の樹脂スケールで、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）／Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）／Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）カップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）多重ペプチド合成装置上で、段階的な様式で、配列
ＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ
（ペプチド１、配列番号９２）
を有するＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫを合成した。Ｎ−アルファ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−及び側鎖保護されたアミノ酸は、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）樹脂は、Ｆｌｕｋａから購入した。以下の側鎖保護戦略、すなわち、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｎε−Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）及びＴｙｒ（ＯｔＢｕ）を使用した。２つのオキサゾリジンジペプチド、すなわちＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨを鎖重合に使用し、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから入手し、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体（２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍＬ中に溶解した。ＤＭＦ中の２０％ＤＭＳＯ中の２０ｍＭＨＢＴＵ、４００ｍＭＮＭＭで、保護されたアミノ酸を活性化し、２０％ＤＭＦ／ＤＭＳＯ中の０．５ｍｍｏｌの保護されたアミノ酸、０．５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、１ｍｍｏｌのＮＭＭで、２５分間、次いで４０分間の２回の処理を使用して、カップリングを実施した。ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液を使用する、１０分間、次いで１５分間の２回の処理で、Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、真空で乾燥した。ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ））溶液で、室温で１時間処理することによって、ペプチド−樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで２回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４μｍＰｒｏｔｅｏ（商標）９０Åカラム上での直線勾配（０ないし６０％緩衝液Ｂ、１２分、Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＷａｔｅｒｓ２７９５分析用ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するために、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ（商標）ＡＰＩ電気スプレー質量分析計を使用した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって概算されるもの基づいて約７０％純度で、粗ペプチドを１４３ｍｇ収量で入手した。還元型Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ（ペプチド１）の保持時間（室温）＝５．３１分、算出された分子量＝３９０４．６９１７Ｄａ（平均）、実験的に観察された分子量３９０７．０Ｄａであった。
【０５０１】
Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫの折りたたみ（ジスルフィド結合形成）
ＴＦＡ開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫを、空気で酸化した。水中の２０％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）を使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約０．１５ｍｇ／ｍＬの還元型Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫの濃度まで水で希釈し、ＮＨ４ＯＨ（２８ないし３０％）を使用してｐＨを約８．０に調整し、室温で３６時間静かに撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、０ないし４０％の直線勾配の緩衝液Ｂで１２０分間（Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）１”Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  １００Å  Ｐｒｏｔｅｏ（商標）カラムを使用する逆相ＨＰＬＣを使用して、折りたたまれたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫペプチドを精製した。折りたたまれた粗Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫペプチドを、約２５％の緩衝液Ｂで（その還元型における溶出時間と比較して）早期に溶出した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって概算されるように、９７％超の純度で、折りたたまれたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ（ペプチド２）を２３．２ｍｇの収量で入手した（図２０）。算出された分子量＝３８９５．７６９３（モノアイソトピック）、実験的に観察された分子量＝３８９６．５Ｄａ（Ｗａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで分析）であった。Ｄｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫジスルフィドの結合性は、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５であった。
【０５０２】
【化５２】
0005220915.tif 000122
【０５０３】
折りたたまれたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫのＮ末端ＰＥＧ化
折りたたまれたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫ（ペプチド２）を、１ｍｇ／ｍＬの濃度で水中に溶解した。５０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中の２Ｍ  ＭｅＯ−ＰＥＧ−アルデヒド、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ（平均分子量２０ｋＤａ）溶液、及び別途のＮａＣＮＢＨ３の１Ｍ溶液を新たに調製した。次に、ペプチド溶液をＭｅＯ−ＰＥＧ−アルデヒド含有溶液へ添加した後、ＮａＣＮＢＨ３溶液を添加した。反応化学量論はそれぞれ、ペプチド：ＰＥＧ：ＮａＣＮＢＨ３（１：２：０．０２）であった。反応を４８時間放置し、直線勾配（１６分中６ないし６０％Ｂ、Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：水中０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ）で、４０℃でＺｏｒｂａｘ（商標）３００ＳＢ−Ｃ８  ５μｍカラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで分析した。モノＰＥＧ化された、折りたたまれたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫは、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって粗生成物の約５８％を構成した。次に、２５カラム容積中の０ないし５０％Ｂの勾配を使用して、４℃、１ｍＬ／分でＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムにおいてＨｉＴｒａｐ（商標）５ｍＬ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン交換カラムを使用して、モノＰＥＧ化されたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫを単離した（緩衝液：Ａ＝２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、Ｂ＝１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）。（粗生成物に関して記載されるとおり）４ないし２０のトリス−Ｇｌｙ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、画分を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１２５Ｖ、３５ｍＡ、５Ｗで１．５時間使用した。次に、プールした生成物を４℃で、Ａ４Ｓ緩衝液（１０ｍＭＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ４．０）１Ｌの３回の交換で透析した。次に、透析した生成物を１０Ｋの微量遠心フィルター中で２ｍＬ容積まで濃縮し、最終生成物を付与するため、０．２μＭシリンジフィルターを使用してろ過滅菌した。Ｎ末端がＰＥＧ化されたＤｅｓ−Ａｔｇ１−ＳｈＫ（ペプチド３）を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって８５％純度と概算された１．７ｍｇ収量で単離した（図２３）。
【０５０４】
「ＰＥＧ−ＳｈＫ［２−３５］とも呼ばれる」Ｎ末端がＰＥＧ化されたＤｅｓ−Ａｒｇ１−ＳｈＫは、パッチクランプ電気生理学的実験によって測定されるように（図３６）、ヒトＫｖ１．３を遮断する上で活性があった（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。
【実施例３２】
【０５０５】
Ｎ末端がＰＥＧ化されたＳｈｋ
作働する本実施例の実験的手法は、図１７に示される結果に対応する。
【０５０６】
還元型ＳｈＫのペプチド合成
Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）−Ｓ  ＰＨＢ  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）樹脂上、０．１ｍｍｏｌ当量の樹脂規模で、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３−３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）／Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）／Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）カップリング化学反応を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＦ）によるＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）多重ペプチド合成装置での段階的な方法で、アミノ酸配列
ＲＳＣＩＤＴＩＰＫＳＲＣＴＡＦＱＣＫＨＳＭＫＹＲＬＳＦＣＲＫＴＣＧＴＣ
（ペプチド４、配列番号５）
を有するＳｈＫを合成した。Ｎ−アルファ−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル及び側鎖保護されたアミノ酸は、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから購入した。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）樹脂は、Ｆｌｕｋａから購入した。以下の側鎖保護戦略を採用した。すなわち、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｎε−Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）及びＴｙｒ（ＯｔＢｕ）であった。２つのオキサゾリジンジペプチドであるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨを鎖重合に使用し、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから得、配列の合成に使用した。保護されたアミノ酸誘導体（２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍＬ中に溶解した。保護されたアミノ酸をＤＭＦ中の２０％ＤＭＳＯ中の２００ｍＭＨＢＴＵ、４００ｍＭＮＭＭで活性化し、２０％ＤＭＦ／ＤＭＳＯ中の０．５ｍｍｏｌの保護されたアミノ酸、０．５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、１ｍｍｏｌのＮＭＭで２５分間、次いで４０分間の２回の処理を使用して、カップリングを実施した。ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液を１０分間、次いで１５分間使用する２回の処理で、Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施した。合成の後、次に、樹脂を排水し、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、真空で乾燥した。室温で１時間ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ（９２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ））溶液による処理によって、ペプチド−樹脂を脱保護し、樹脂から放出した。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで２回沈殿させ、遠心分離により回収した。次に、Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４μｍＰｒｏｔｅｏ（商標）９０Åカラム上での直線勾配（０ないし６０％緩衝液Ｂ、１２分、Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＷａｔｅｒｓ２７９５分析用ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで、粗ペプチドを分析した。正確なペプチド生成量を確認するため、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ電気スプレー質量分析計を使用した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって約４５％純度と概算される約１７０ｍｇの収量の粗ペプチドを入手した。還元型Ｄｅｓ−Ａｒｇ4−ＳｈＫ（ペプチド１）の保持時間（室温）＝５．０５４分、算出された分子量＝４０６０．８７９３Ｄａ（平均）、実験的に観察された分子量４０６３．０Ｄａであった。
【０５０７】
ＳｈＫの折りたたみ（ジスルフィド結合形成）
ＴＦＡ開裂及びペプチド沈殿の後、ペプチドを折りたたむため、還元型ＳｈＫを空気で酸化した。水中の２０％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）を使用して、開裂した粗ペプチドを抽出した後、約０．１５ｍｇ／ｍＬの還元型ＳｈＫの濃度まで水で希釈し、ＮＨ４ＯＨ（２８ないし３０％）を使用してｐＨを約８．０に調整し、室温で３６時間静かに撹拌した。ＬＣ−ＭＳ分析により、折りたたみ工程をモニターした。この後、０ないし４０％の直線勾配の緩衝液Ｂで１２０分間（Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）１”Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  １００Å  Ｐｒｏｔｅｏ（商標）カラムを使用する逆相ＨＰＬＣによって、折りたたまれたＳｈＫペプチドを精製した。折りたたまれた粗ＳｈＫペプチドを、約２５％の緩衝液Ｂで（その還元型における溶出時間と比較して）早期に溶出した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって概算されるように、９７％超の純度で、折りたたまれたＳｈＫ（ペプチド５）を２５．５ｍｇの収量で入手した。図６０を参照されたい。算出された分子量＝４０５１．８７６４Ｄａ（モノアイソトピック）、実験的に観察される分子量＝４０５２．５Ｄａ（Ｗａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＭＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで分析）であった。ＳｈＫジスルフィドの結合性は、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ５であった。
【０５０８】
【化５３】
0005220915.tif 000123
は、水中に１ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解させることができる。５０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中の２Ｍ  ＭｅＯ−ＰＥＧ−アルデヒド、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ（平均分子量２０ｋＤａ）溶液、及びＮａＣＮＢＨ３の別個の１Ｍ溶液は、新たに調製できる。次に、ペプチド溶液をＭｅＯ−ＰＥＧ−アルデヒド含有溶液へ添加した後、ＮａＣＮＢＨ３溶液を添加できる。反応化学量論はそれぞれ、ペプチド：ＰＥＧ：ＮａＣＮＢＨ３（１：２：０．０２）であり得る。反応を４８時間放置し、直線勾配（１６分中６ないし６０％Ｂ、Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：水中０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ）で、４０℃でＺｏｒｂａｘ（商標）３００ＳＢ−Ｃ８  ５μｍカラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ（商標）１１００ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで分析できる。次に、２５カラム容積中の０ないし５０％Ｂの勾配を使用して、４℃、１ｍＬ／分でＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムにおいて、ＨｉＴｒａｐ（商標）５ｍＬ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン交換カラムを使用して、モノＰＥＧ化されたＳｈｋを単離できる（緩衝液：Ａ＝２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、Ｂ＝１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）。４ないし２０のトリス−Ｇｌｙ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、画分を分析できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１２５Ｖ、３５ｍＡ、５Ｗで１．５時間使用できる。次に、プールした生成物を４℃で、Ａ４Ｓ緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール、ｐＨ４．０）１Ｌの３回の交換で透析できる。次に、透析した生成物を１０Ｋの微量遠心フィルター中で２ｍＬ容積まで濃縮し、最終生成物を付与するため、０．２μＭシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。
【実施例３３】
【０５０９】
オキシム形成によってＮ末端がＰＥＧ化されたＳｈＫ
還元型ＳｈＫのペプチド合成
配列
【０５１０】
【化５４】
0005220915.tif 000124
を有するＳｈＫは、Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）−Ｓ  ＰＨＢ  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）樹脂上、０．１ｍｍｏｌ当量の樹脂規模で、ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）／Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）／Ｎ，Ｎ−ジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（商標）多重ペプチド合成装置で段階的な様式で合成できる。Ｎ−アルファ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−及び側鎖保護されたアミノ酸は、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから購入できる。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｅｎｔａｇｅｌ（商標）樹脂は、Ｆｌｕｋａから購入できる。以下の側鎖保護戦略が採用できる。すなわち、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｎε−Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ＯｔＢｕ）及びＴｙｒ（ＯｔＢｕ）であった。２つのオキサゾリジンジペプチド、すなわちＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，ＭｅＰｒｏ）−ＯＨは、鎖重合に使用でき、ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍから入手でき、配列の合成に使用できる。保護されたアミノ酸誘導体（２０ｍｍｏｌ）は、ＤＭＦ中の２０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍＬ中に溶解できる。保護されたアミノ酸は、ＤＭＦ中の２０％ＤＭＳＯ中の２００ｍＭＨＢＴＵ、４００ｍＭＮＭＭで活性化でき、２０％ＤＭＦ／ＤＭＳＯ中の０．５ｍｍｏｌの保護されたアミノ酸、０．５ｍｍｏｌのＨＢＴＵ、１ｍｍｏｌのＮＭＭで２５分間、次いで４０分間の２回の処理を使用して、カップリングを実施できる。ＤＭＦ溶液中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを１０分間、次いで１５分間使用する２回の処理で、Ｆｍｏｃ脱保護反応を実施できる。Ｓｈｋペプチドの鎖重合の後、ＤＭＦ中の０．５Ｍ  ＨＢＴＵを４当量のコリジンとともに５分間使用して、Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸（１．２当量）をＮ末端にカップリングできる。合成の後、次に、樹脂を排水し、ＤＣＭ、ＤＭＦ、ＤＣＭで洗浄した後、真空で乾燥できる。室温で１時間、ＴＦＡ／アミノオキシ酢酸／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９０：２．５：２．５：２．５：２．５）溶液での処理によって、ペプチド−樹脂を脱保護でき、樹脂から放出できる。次に、揮発性物質を窒素ガス流で除去し、粗ペプチドを冷ジエチルエーテルで２回沈殿し、遠心分離により回収できる。次に、Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４μｍ  Ｐｒｏｔｅｏ（商標）９０Åカラム上での直線勾配（１２分で０ないし６０％緩衝液Ｂ、Ａ：０．１％アミノオキシ酢酸も含有する水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を使用するＷａｔｅｒｓ２７９５分析用ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで、アミノオキシ−Ｓｈｋペプチド（ペプチド７）を分析できる。
【０５１１】
逆相ＨＰＬＣ精製
調製用逆相高速液体クロマトグラフィーを、Ｃ１８（５μｍ、２．２ｃｍ×２５ｃｍ）カラムで実施できる。クロマトグラフィー分離は、１５ｍＬ／分で９０分にわたって、典型的には５ないし９５％のＡ中の緩衝液の直線勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ水溶液、Ｂ＝０．０９％ＴＦＡ及び０．１％アミノオキシ酢酸を含有する９０％ＡＣＮ水溶液）を使用して達成できる。調製用ＨＰＬＣ画分は、ＥＳＭＳ及び光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）ＨＰＬＣによって性質決定でき、合わせて、凍結乾燥できる。
【０５１２】
オキシム形成によるＳｈｋのＮ末端のＰＥＧ化
凍結乾燥したアミノオキシＳｈｋ（ペプチド７）は、５０％ＨＰＬＣ緩衝液Ａ／Ｂ（５ｍｇ／ｍＬ）中に溶解でき、ＭｅＯ−ＰＥＧ−アルデヒド、ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ（平均分子量２０ｋＤａ）の２倍モル過剰量へ添加できる。反応を２４時間放置でき、直線勾配（１６分中６ないし６０％Ｂ、Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ：水中０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ）で、４０℃でＺｏｒｂａｘ（商標）３００ＳＢ−Ｃ８  ５μｍカラムを使用するＡｇｉｌｅｎｔ（商標）１１００ＲＰ−ＨＰＬＣシステムで分析できる。モノＰＥＧ化された還元型ＳｈＫは、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって粗生成物の約５８％を占めた。次に、２５カラム容積中の０ないし５０％Ｂの勾配を使用して、４℃、１ｍＬ／分でＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムにおいてＨｉＴｒａｐ（商標）５ｍＬ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン交換カラムを使用して、モノＰＥＧ化されたＳｈＫを単離できる（緩衝液：Ａ＝２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、Ｂ＝１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）。４ないし２０のトリス−Ｇｌｙ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、画分を分析できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、１２５Ｖ、３５ｍＡ、５Ｗで１．５時間使用できる。次に、プールした生成物を４℃で、Ａ４Ｓ緩衝液（１０ｍＭＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ４．０）１Ｌの３回の交換で透析できる。次に、透析した生成物を、１０Ｋの微量遠心フィルター中で２ｍＬ容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、０．２μＭシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。
【０５１３】
ＳｈＫの折りたたみ（ジスルフィド結合形成）
モノＰＥＧ化された（オキシム化された）ＳｈＫは、水中の２０％ＡｃＯＨ（ｖ／ｖ）中に溶解でき、次に約０．１５ｍｇペプチドｍＬの濃度まで水で希釈し、ＮＨ４ＯＨ（２８ないし３０％）を使用してｐＨを約８．０に調整し、室温で３６時間静かに撹拌することができる。ＬＣ−ＭＳ分析により、折りたたみ工程をモニターすることができる。この後、０ないし４０％の直線勾配の緩衝液Ｂで１２０分間（Ａ＝水中０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）１”Ｌｕｎａ  ５μｍ  Ｃ１８  １００Å  Ｐｒｏｔｅｏ（商標）カラムを使用する逆相ＨＰＬＣを使用することによって、折りたたまれたモノＰＥＧ化された（オキシム化された）ＳｈＫ（ペプチド９）を精製できる。モノＰＥＧ化された（オキシム化された）ＳｈＫジスルフィドの結合性は、Ｃ１−Ｃ６、Ｃ２−Ｃ４、及びＣ３−Ｃ５であり得る。
【０５１４】
【化５５】
0005220915.tif 000125
【実施例３４】
【０５１５】
Ｎ末端がＰＥＧ化されたＳｈＫ（アミド化）
本実施例の実験的手法は、図１８に示される結果に対応する。
【０５１６】
アミド形成によるＳｈｋのＮ末端のＰＥＧ化
Ｓｈｋに対するｍＰＥＧ−ＳＰＡ１．５モル濃度過剰量を使用して、室温で２０ｋＤａ  ＰＥＧプロピオン酸（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ；ＣＨ３Ｏ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｏ］ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＮＨＳ）の固体サクシニミジルエステルへ、１００ｍＭビシン、ｐＨ８．０中の折りたたまれたＳｈＫ（ぺプチド５）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液を添加できる。静かに撹拌した１時間後、混合物を水で２ｍｇ／ｍＬへ希釈でき、ｐＨを希ＨＣｌで４．０へ調整できる。１ｍＬ／分で０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  ＮａＮ３、ｐＨ６．８で溶出したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用するＳＥＣ  ＨＰＬＣによって、モノＰＥＧ化されたＳｈｋ（ペプチド１０）、幾つかのジＰＥＧ化されたＳｈｋ又はトリＰＥＧ化されたＳｈｋ、修飾されていないＳｈｋ及びサクシニミジルエステル加水分解の程度を測定できる。４ないし２０のトリス−Ｇｌｙ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、画分を分析できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１２５Ｖ、３５ｍＡ、５Ｗで１．５時間使用できる。次に、４℃で、Ａ４Ｓ緩衝液（１０ｍＭＮａＯＡｃ、５％ソルビトール、ｐＨ４．０）１Ｌの３回の交換で、プールした生成物を透析できる。次に、透析したＮ末端ＰＥＧ化（アミド化）ＳｈＫ（ペプチド１０）を、１０Ｋの微量遠心フィルター中で２ｍＬ容積まで濃縮でき、最終生成物を付与するため、０．２μＭシリンジフィルターを使用してろ過滅菌できる。
【０５１７】
【化５６】
0005220915.tif 000126
【実施例３５】
【０５１８】
Ｆｃ−Ｌ−ＳｍＩＩＩＡ
Ｆｃ−ＳｍＩＩＩＡ発現ベクター
部分的リンカー配列及びヒト高頻度コドンでコードされるＳｍＩＩＩＡペプチドを含有する１０４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を、重複プライマー３６５４−５０及び３６５４−５１を使用するＰＣＲによって重合し、実施例１に記載されているｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−ＳｍＩＩＩＡを作製するために、７．１ｋｂのＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ主鎖中にクローニングした。
【０５１９】
【化５７】
0005220915.tif 000127
【０５２０】
最終コンストラクト中のＢａｍＨＩからＮｏｔＩへの断片の配列を、配列決定により確認した。
【０５２１】
Ｆｃ−Ｌ−Ｓｍｌｌｌａの一過性発現
毒素ペプチドＦｃ融合コンストラクトｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−ＳｍＩＩＩＡ７．５μｇを、形質移入剤ＦｕＧＥＮＥ６を有する１０ｃｍ組織培養プレート中の２９３−Ｔ細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後、培地を無血清培地と交換し、形質移入の５日目に培養上清を回収した。抗ｈＦｃ抗体で標識したウェスタンブロットによって、２９３−Ｔ細胞からのＦｃ−ＳｍＩＩＩＡの一過性発現を分析した（図２５Ａ及び図２５Ｂ）。概算された分子量を有する発現されたタンパク質の単一バンドが、還元型及び非還元型試料の両者において示された。さらに、Ｆｃ−ＳｍＩＩＩＡの一過性発現レベルが、ＥＬＩＳＡによると、７３．４μｇ／ｍＬであることを決定した。
【実施例３６】
【０５２２】
電気生理学実験
細胞培養ヒトＫｖ１．３チャネルを発現する安定な細胞系が、Ｂｉｏｆｏｃｕｓから使用許諾された。５％ＣＯ２環境中、３７℃で、細胞を維持した。培地は、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×非必須アミノ酸、１０％ウシ胎仔血清及び５００μｇ／ｍＬジェネテシンを有するＤＭＥＭを含有する。電気生理学実験の少なくとも２４時間前に、細胞を播種し、３５ｍｍ培養皿上で低集密度で増殖させた。
【０５２３】
パッチクランプによる電気生理学記録
パッチクランプ技術の密封配置を使用することによって、全細胞電流を単一細胞から記録した。１３５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１．８ｍＭＣａＣｌ２、１０ｍＭＨＥＰＥＳ及び５ｍＭグルコースを含有する記録緩衝液を有する培地ですすぎ、交換した後、３５ｍｍ培養皿を記録ステージへと移した。ＮａＯＨで、ｐＨを７．４になるように調整し、モル浸透圧濃度を３００ｍＯｓｍに設定した。平行に配置され、電動ロッド（電動ロッドは、記録されている細胞の上に、ガラス毛細管を直接配置する。）に装着されたガラス毛細管の１つを介して、細胞に、記録緩衝液を連続的に灌流した。記録ピペット溶液は、９０ｍＭＫ−グルコン酸塩、２０ｍＭＫＦ、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、１０ｍＭＥＧＴＡ、５ｍＭＫ２−ＡＴＰ及び１０ｍＭＨＥＰＥＳを含有した。内部溶液に対するｐＨを、ＫＯＨで７．４に調整し、モル浸透圧濃度を２８０ｍＯｓｍに設定した。実験は室温（２０ないし２２℃）で実施し、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ（商標）７００Ａ増幅装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して記録した。ピペットの抵抗は、典型的には、２ないし３ＭΩであった。
【０５２４】
Ｋｖ１．３電流に関するタンパク質毒素作用強度測定
ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、−８０ｍＶ保持電位で電位固定した。−８０ｍＶの保持電位から＋３０ｍＶへの２００ミリ秒長の脱分極工程を付与することによって、外向きのＫｖ１．３電流を活性化し、３ｋＨｚでフィルターにかけた。各脱分極工程は、その後の脱分極工程から１０秒間間隔で分離した。類縁体信号をＤｉｇｉｄａｔａ（商標）１３２２Ａデジタイザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によってデジタル化した後、Ｃｌａｍｐｆｉｔ（商標）９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用するオフライン分析のために、コンピュータディスクに保存した。全ての研究において、漸増濃度のタンパク質毒素の灌流を開始する４分間前に、安定したベースラインＫｖ１．３電流振幅を確立した。タンパク質毒素のその後の濃度の灌流を開始する前に、定常状態の遮断を常に達成した。
【０５２５】
データ解析
対照の百分率（ＰＯＣ）を次式に基づいて算出する。すなわち（タンパク質毒素添加後のＫｖ１．３電流／対照におけるＫｖ１．３電流）×１００である。ＩＣ５０値を算出するため、タンパク質毒素の少なくとも５つの濃度（例えば、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１００ｎＭ）を使用した。ＸＬｆｉｔソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．）の４つのパラメータロジスティック適合を使用して、ＩＣ５０値及び曲線適合を概算した。ＩＣ５０値を平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（平均の標準誤差）として表す。
【０５２６】
薬物の調製
タンパク質毒素（典型的には１０ないし１００μＭ）を蒸留水中に溶解し、−８０℃で冷凍保存した。タンパク質毒素原液の連続希釈物を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する記録緩衝液中へ混合した後、ガラス灌流貯蔵器へと転移させた。電子挟みバルブは、貯蔵器から記録される細胞へのタンパク質毒素の流量を調節した。
【実施例３７】
【０５２７】
免疫生物学及びチャネル結合
ＰＢＭＣのＰＭＡ及び抗ＣＤ３抗体刺激後のＴ細胞サイトカイン生成の阻害。正常ヒトドナーＬｅｕｌｏｐｈｏｒｅｓｉｓパックから、ＰＢＭＣを予め単離し、密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）によって精製し、ＣＰＺ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＩＮＣＥＬＬ，  ＭＣＰＺＦ−１００プラス最終濃度１０％ＤＭＳＯ）中で冷凍保存さした。ＰＢＭＣを解凍し（９５％生存率）、洗浄し、９６ウェル平底組織培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１００μＭ非必須アミン酸及び２０μＭ２−ＭＥを補充した培地（ＲＰＭＩ培地１６４０、ＧＩＢＣＯ）中に、２×１０５細胞／ウェルで播種した。２００μＬの最終アッセイ容積中のＰＭＡ／抗ＣＤ３（それぞれ１ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ）で４８時間刺激する前の９０分間、連続希釈した（最終濃度１００ｎＭないし０．００１ｎＭ）ＳｈＫ［１−３５］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］又はｆｃ対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。電気化学発光（ＥＣＬ）を利用することによってＩＬ−２及びＩＦＮｇのタンパク質レベルを測定するため、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｙ，  ＭＤ）を使用して、アッセイ試料の分析を実施した。培養上清（５０μＬ）をＭＳＤ多重スポット９６ウェルプレートへ添加した（各ウェルは、３つの捕捉抗体すなわちＩＬ−２、ＴＮＦ，ＩＦＮγを含有した）。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で２時間温置した。ウェルを２００μＬのＰＢＳＴ（ＢＩＯＴＥＫ、Ｅｌｘ４０５Ａｕｔｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ）で１回洗浄した。各ウェルに対して、ルテニウム標識した検出抗体（抗体希釈緩衝液中の終濃度１μｇ／ｍＬ、ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮγ）２０μＬ及び２×ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ１３０μＬを添加し、終容積１５０μＬとした。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で１時間温置した。次に、プレートをＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。図３５Ａ及び３５Ｂは、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、Ｔ細胞由来のＩＬ−２及びＩＦＮｇ生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。固有のＳｈＫ［１−３５］ペプチドと比較して、ペプチボディは、阻害の程度がより大きい（阻害剤の不在下での反応のＰＯＣ＝対照の百分率）。
【０５２８】
ＰＢＭＣのＰＭＡ及び抗ＣＤ３抗体刺激後のＴ細胞サイトカイン生成の阻害
正常ヒトドナーＬｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓパックから、ＰＢＭＣをあらかじめ単離し、密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）により精製し、ＩＮＣＥＬＬ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍを使用して冷凍保存した。ＰＢＭＣを解凍し（９５％生存率）、洗浄し、（血清交換物ＰＳＧを含有するＲＰＭＩ完全培地中で）２×１０５細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートへ播種した。２００ｍＬの最終アッセイ容積でａＣＤ３及びａＣＤ２８の添加（それぞれ２．５ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）の前の１時間、連続希釈した（終濃度１００ｎＭないし０．００３ｎＭ）ＳｈＫ［１−３５］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］、又はＦｃ対照とともに、細胞をあらかじめ温置した。ＭＳＤ多重スポット９６ウェルプレートへ上清２０ｍＬを添加した（各ウェルは、ＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＦＮｇ捕捉抗体を含有した）。プレートを密封し、プレート振とう器上、室温で１時間温置した。次に、ルテニウム標識した検出抗体（抗体希釈緩衝液中のＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＦＮγの終濃度１μｇ／ｍＬ）２０ｍＬ及び２×ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ１１０ｍＬを添加した。プレートを密封し、スズ箔で包み、プレート振とう器上、室温で１時間温置した。次に、プレートをＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ６０００で読み取った。図３７Ａ及び３７Ｂは、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、Ｔ細胞由来のＩＬ−２及びＩＦＮｇ生成を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。部分的な阻害のみを示す固有のＳｈＫ［１−３５］ペプチドと比較して、ペプチボディは、炎症性サイトカイン反応をほぼ完全に阻害する。（阻害剤の不在下での反応のＰＯＣ＝対照の百分率）。
【０５２９】
ＰＢＭＣの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体刺激後のＴ細胞増殖の阻害
正常ヒトドナーＬｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓパックから、ＰＢＭＣをあらかじめ単離し、密度勾配遠心（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ）により精製し、ＣＰＺ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＩＮＣＥＬＬ，  ＭＣＰＺＦ−１００プラス終濃度１０％ＤＭＳＯ）を使用して冷凍保存した。ＰＢＭＣを解凍し（９５％生存率）、洗浄し、９６ウェル平底組織培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１００μＭ非必須アミン酸及び２０μＭ２−ＭＥを補充した培地（ＲＰＭＩ培地１６４０、ＧＩＢＣＯ）中で２×１０５細胞／ウェルで播種した。抗ヒトＣＤ３２（ＦｃｙＲＩＩ）ブロッキング抗体（製造者の使用説明書ＥＡＳＹ  ＳＥＰ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ１８５５３番、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，  ＢＣに従った。）又はＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（終濃度１００ｎＭないし０．００１ｎＭ）のいずれかとともに、細胞を４５分間予め温置した。次に、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（終濃度１００ｎＭないし０．００１ｎＭ）を、抗ヒトＣＤ３２ブロッキング抗体を含有する細胞へ添加する一方で、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＬを含有する細胞へ培地を添加した。ａＣＤ３／ａＣＤ２８（それぞれ０．２ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ）で４８時間刺激する前のさらなる４５分間に両セットを温置した。最終的なアッセイ容積は２００μＬであった。［３Ｈ］ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）を添加し、プレートをさらに１６時間温置した。次に、細胞をガラスファイバーフィルターへと回収し、放射能をＢシンチレーションカウンタで測定した。図３６Ａ及び３６Ｂは、ＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、Ｔ細胞の増殖を用量依存的な様式で有力に阻害することを示す。抗ＣＤ３２（ＦｃＲ）ブロッキング抗体による前ブロッキングは、Ｔ細胞増殖を阻害するペプチボディの能力にほとんど効果を及ぼさず、ＦｃＲ結合ではなくＫｖ１．３阻害が、観察される阻害に関するメカニズムであることを示唆する（阻害剤の不在下での反応のＰＯＣ＝対照の百分率）。
【０５３０】
ヒトＫｖ１．３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞に対するＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］結合の免疫組織化学分析
ヒトＫｖ１．３を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ  Ｋｖ１．３）をＢｉｏＦｏｃｕｓ  ｐｌｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から入手し、製造者の推奨に従って維持した。親ＨＥＫ２９３細胞系を対照として使用した。ポリ−Ｄ−リジン２４ウェルプレート（３５−４４１４番、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に細胞を播種し、約７０％の集密状態まで増殖させた。培地１ｍＬ／ウェル中に、ＨＥＫ  ＫＶ１．３を、０．５×１０５細胞／ウェルで播種した。ＨＥＫ２９３細胞を、培地１ｍＬ／ウェル中に、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。染色前、細胞増殖培地を除去し、０．２ｍＬ／ウェルのホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  ＨＴ５０−１−１ホルマリン溶液、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで使用前に１：１希釈）を添加し、室温で１０分間温置することによって、細胞をホルマリンで固定した。ＰＢＳ／ＢＳＡ中の５μｇ／ｍＬのＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］０．２ｍＬ／ウェルとともに温置することによって細胞を染色した。Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］を吸引した後、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで１回洗浄した。検出抗体（ヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇＧフィコエリスリン、Ｓｏｕｔｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ中で５μｇ／ｍＬでウェルへ添加し、室温で３０分間温置した。ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで、細胞を１回洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検査した。図３３Ｂは、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、ＨＥＫ２９３細胞を過剰発現するＫｖ１．３に対する結合を保持することを示すが、形質移入されていない細胞に対する結合はほとんど示さず（図３３Ａ）、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］ペプチボディが、Ｋｖ１．３チャネルを過剰発現する細胞を検出するための試薬として使用できることを示す。活性化されたＴエフェクターメモリ細胞がＫｖ１．３を過剰生成することが報告されている疾病状況において、この試薬は、これらの細胞をターゲットにする上でも、それらの検出においても有用性を見出せる。
【０５３１】
固定されたＨＥＫ２９３細胞に対して結合するＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］を示すＥＬＩＳＡアッセイ
図３４Ａは、Ｋｖ１．３を過剰発現する固定された細胞に対するペプチボディ結合の用量依存的な増加を示し、前記ペプチボディがその標的に対する高親和性結合及び、チャネルを発現する細胞の検出におけるＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］の有用性を示す。多発性硬化症患者において疾病を発症させる抗原特異的Ｔ細胞は、困難なアプローチであるホールセルパッチクランプ電気生理学によって、Ｋｖ１．３を過剰発現することが示されてきた。本ペプチボディ試薬は、患者におけるＫｖ１．３チャネル発現をモニターするための有用かつ簡便なツールであり得、診断適用において有用である。図３４Ａ及び図３４Ｂに示される手法は、以下のとおりである。
【０５３２】
図３４Ａ。Ｋｖ１．３の形質移入されたＨＥＫ２９３細胞に対する無処置のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］の結合を示すため、細胞全体の免疫アッセイを実施した（ＢｉｏＦｏｃｕｓ  ｐｌｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。ポリ−Ｄ-リジンでコーティングした９６ウェルプレート（３５−４４６１番、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）において、親ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ  Ｋｖ１．３細胞を３×１０４細胞／ウェルで播種した。細胞増殖培地を除去し、０．２ｍＬ／ウェルのホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ  ＨＴ５０−１−１ホルマリン溶液、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで使用前に１：１希釈）を添加し、室温で２５分間温置した後、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ１００μＬ／ウェルで１回洗浄することによって、細胞をホルマリンで固定した。ＢＳＡブロッカー（５０−６１−００、ＫＰＬ１０％ＢＳＡ希釈剤／ブロッキング溶液、ＰＢＳで１：１希釈、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）０．３ｍＬ／ウェルの添加後、振とうしながら室温で３時間温置することによって、ウェルをブロッキングした。プレートを１×ＫＢ洗浄緩衝液（５０−６３−００、ＫＰＬ）で２回洗浄した。試料を希釈緩衝液（ＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０）又は１％雄ルイスラット血清（ＲＡＴＳＲＭ−Ｍ、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）含有希釈緩衝液中に希釈し、ブロッキングされたプレートへ０．１ｍＬ／ウェルを添加し、振とうしながら室温で１時間温置した。プレートを１×ＫＰ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ／０．１％トゥイーン２０中に１：５０００で希釈したＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（３１４１６番、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）とともに、振とうしながら室温で１時間温置した。プレートを１×ＫＰ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、０．１ｍＬ／ウェルのＴＭＢ基質（５２−００−０１、ＫＰＬ）を添加した。０．１ｍＬ／ウェルの２Ｎ硫酸の添加により、反応を停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ３４０（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で、４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０５３３】
図３４Ｂ。細胞全体の免疫アッセイを、以下の改変とともに上述のとおり実施した。ポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート中で、ＨＥＫ２９３細胞を１×１０５細胞／ウェルで播種し、ＨＥＫ  Ｋｖ１．３細胞を６×１０４細胞／ウェルで播種した。Ｆｃ対照を０．０５ｍＬ／ウェルの容積で５００ｎｇ／ｍＬで添加した。ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（３１４１６番、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をＰＢＳ／０．１％トゥイーン２０中に１：１０，０００希釈した。ＡＢＴＳ（５０−６６−００、ＫＰＬ）を基質として使用した。１％ＳＤＳの０．１ｍＬ／ウェルの添加によって反応を停止させた後、４０５ｎｍで吸光度を読み取った。
【実施例３８】
【０５３４】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（1−３５）の精製
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］の発現は、本明細書の上述の実施例３において記載されているとおりであった。凍結したＥ．コリペースト（１８ｇ）を室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の２００ｍＬと組み合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、細胞可溶化液を、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを１％デオキシコール酸２００ｍＬ中に再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、２００ｍＬの水中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。次に、３２ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、ペレット（３．２ｇ）を溶解した。次に、室温、２７，０００ｇで１５分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液（３Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ９．５）５００ｍＬへ、４℃で激しく撹拌しながら、上清５ｍＬを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、４℃で２日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を−７０℃で保存した。
【０５３５】
保存した再折りたたみ液を解凍した後、水２Ｌで希釈し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、ｐＨを７．３へ調整した。次に、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、７℃、２０ｍＬ／分でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３）中の６０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−ＦＦ（内径２．６ｃｍ）カラムへと負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の直線勾配で溶出した後、７℃、１０ｍＬ／分で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、７℃、１ｍＬ／分でＰＢＳ中の１ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラムへと前記プールを負荷した。次に、カラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、１Ｍ  ＮａＣｌの数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出ピークへ、３Ｍ酢酸ナトリウム０．０１２５容積（２５ｍＬ）を添加した。
【０５３６】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬの水中に希釈した組み合わせたプール５０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図４６Ａ）。３０，４１０ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が２．５６ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図４６Ｂ）。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物２０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図４６Ｃ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ中に希釈する（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液１ｍＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０５３７】
「Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［１−３５］」とも呼ばれる、精製されたＥ．コリ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［１−３５］によるヒトＫｖ１．３の遮断のためのＩＣ５０を、（本明細書の以下の実施例５０における）表３５に示す。
【実施例３９】
【０５３８】
細菌で発現したＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ（２−３５）の精製
Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］の発現は、本明細書の上述の実施例４において記載されているとおりであった。冷凍したＥ．コリペースト（１６．５ｇ）を室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の２００ｍＬと組み合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、２２，０００ｇで１５分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、２００ｍＬの１％デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、２００ｍＬの水中にペレットを再懸濁した後、４℃、２２，０００ｇで15分間遠心分離した。次に、３９ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、ペレット（３．９ｇ）を溶解した。次に、室温、２７，０００ｇで１５分間、ペレット溶液を遠心分離した後、再折りたたみ緩衝液（３Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ９．５）５００ｍＬへ、４℃で激しく撹拌しながら、上清５ｍＬを移動させた。次に、撹拌速度を低下させ、４℃で２日間、温置を続行した。次に、再折りたたみ溶液を−７０℃で保存した。
【０５３９】
保存した再折りたたみ液を解凍した後、水２Ｌで希釈し、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を使用して、ｐＨを７．３へ調整した。次に、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターで、ｐＨ調整した材料をろ過し、７℃でＳ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．３中の６０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−ＦＦ（内径２．６ｃｍ）カラムへ２０ｍＬ／分で負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、０％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）の直線勾配で溶出した後、７℃、１０ｍＬ／分で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。望ましい生成物を含有する画分をプールし、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した。次に、７℃、２ｍＬ／分でＰＢＳ中の１ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨｉＴｒａｐカラムへ前記プールを負荷した。次に、カラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．５、１Ｍ  ＮａＣｌの数カラム容積で洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出した。溶出ピークへ、３Ｍ酢酸ナトリウム０．０１２５容積（１８ｍＬ）を添加し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターで試料をろ過した。
【０５４０】
次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬの水中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図４０Ａ）。２９，２８２ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が３．２０ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図４０Ｂ）。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物５０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図４０Ｃ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ中に希釈する（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液１ｍＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した（図４０Ｄ）。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０５４１】
「Ｆｃ−Ｌ−ＳｈＫ［２−３５］」とも呼ばれる、精製されたＥ．コリ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］によるヒトＫｖ１．３の遮断のためのＩＣ５０を、（本明細書の以下の実施例５０における）表３５に示す。
【実施例４０】
【０５４２】
細菌で発現したＦｃ−Ｌ１０−Ｏｓｋ１の精製
冷凍したＥ．コリペースト（１２９ｇ、実施例１０参照）を室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８の１２９０ｍＬと組み合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、１７，７００ｇで１５分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、１％デオキシコール酸１２９０ｍＬ中にペレットを再懸濁し、４℃、１７，７００ｇで１５分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、１２９０ｍＬの水中にペレットを再懸濁した後、４℃、１７，７００ｇで１５分間遠心分離した。次に、１６０ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、ペレット８ｇ（合計１６．３ｇ）を溶解した。次に、ペレット溶液１００ｍＬを１Ｍ  ＤＴＴ１ｍＬとともに、３７℃で６０分間温置した。再折りたたみ緩衝液（１Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２．５ｍＭＥＤＴＡ、１．２ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ１０．５）５０００ｍＬへ、激しく撹拌しながら４℃、２ｍＬ／分で、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を４℃で３日間続行した。
【０５４３】
酢酸を使用して、再折りたたみ液のｐＨを８．０に調整した。次に、ｐＨ調整した材料を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、室内の５０Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（内径２．６ｃｍ）で、８℃でＱ−緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）中の５０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｑセファロース−ＦＦ（内径２．６ｃｍ）カラムへ１０ｍＬ／分で負荷した。負荷した後、Ｑセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをタンパク質Ａカラムで実施した。カラムをＱ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分をプールし、Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−セファロースＨＰカラム（内径２．６ｃｍ）へ、８℃、２０ｍＬ／分で即時負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、５％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配の後、１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした後、８℃、５ｍＬ／分で、ＭＥＰ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中の７５ｍＬのＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌカラム（内径２．６ｃｍ）へ適用した。５％から５０％までの直線勾配のＭＥＰ緩衝液Ｂ（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）でカラムを溶出した後、１００％ＭＥＰ緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。
【０５４４】
次に、１０ｋＤａメンブレンを備えたＰａｌｌ  Ｊｕｍｂｏ−Ｓｅｐを使用して、ＭＥＰプールを約２０ｍＬまで濃縮した後、同一メンブレンを使用して製剤緩衝液（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）と緩衝液交換した。次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬの製剤緩衝液中に希釈した組み合わせたプール５０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図４１Ａ）。３０，５５８ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，７２０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、材料の濃度が４．１２ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、前記材料の純度を評価した（図４１Ｂ）。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物１２３μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図４１Ｃ）。次に、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４、１×１５０ｍｍ）を通じて試料約４μｇをクロマトグラフィーにかけることによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。溶媒Ａは、水中の０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶媒Ｂは、９０％アセトニトリル、１０％水中の０．１％トリフルオロ酢酸であった。８０μＬ／分の流速で、１０％溶媒Ｂ中でカラムをあらかじめ平衡化した。１０％ないし９０％の溶媒Ｂの直線勾配を３０分かけて使用して、タンパク質を溶出した。溶出液の一部をＬＣＱイオントラップ質量分析計へ配向させた。質量分析計の製造者によって提供されるＢｉｏｗｏｒｋｓソフトウェアを使用して、質量スペクトルの逆重畳を行った（図４１Ｄ）。生成物を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した後、−８０℃で保存した。
【０５４５】
Ｅ．コリにより発現されたＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１プレップの収量は、細胞ペースト４０ｇから（１２９ｇ×（８ｇ／１６．３ｇ）×（１００ｍＬ／１６０ｍＬ）＝３９．６ｇ、四捨五入により４０ｇ）８１ｍｇであり、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断すると、８０％よりも大きく、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって判断する予想されと二量体として走行しており、質量はＭＳによって判断すると、予想された分子量の範囲内であった。
【０５４６】
精製されたＥ．コリ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（「Ｆｃ−Ｌ−ＯＳＫ１」とも呼ばれる。）によるヒトＫｖ１．３の遮断に対するＩＣ５０が、（本明細書の以下の実施例５０中の）表３５に示されている。
【実施例４１】
【０５４７】
哺乳類細胞によって発現されるＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］、及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］
Ｋｖ１．３の阻害剤であるＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］、及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］を、哺乳類細胞中で発現させた。リンカー配列及びＫｖｌ．３阻害剤ペプチドＳｈＫ［１−３５］の単量体へ、インフレームで融合されるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列を後述のように構築した。哺乳類細胞（ＨＥＫ２９３及びチャイニーズハムスター卵巣細胞）からペプチボディを発現及び精製するための方法は、本明細書に開示されている。
【０５４８】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］発現ベクターの構築のために、２つの終止コドンを有する、４つのグリシン及び１つのセリンアミノ酸リンカーへ各々連結され、以下に示されるようにＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限部位によって隣接され完全長の遺伝子ＯＳＫ１、ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］を作製させるためにＰＣＲ戦略を採用した。
【０５４９】
以下に示される配列を有するＯＳＫ１、ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及び［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］ＯＳＫ１の各々に対する２つのオリゴを、９５℃−３０秒、５５℃−３０秒、７５℃−４５秒で３５サイクル、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するＰＣＲ反応において使用した。ＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｃ）及びＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）制限部位に下線が付されている。
【０５５０】
【化５８】
0005220915.tif 000128
0005220915.tif 000129
【０５５１】
得られたＰＣＲ産物を、４％アガロースゲル上で１５５ｂｐバンドとして分離した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１５５ｂｐＰＣＲ産物を精製した後、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、アガロースゲルをゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。同時に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＣＭＶｉ−ｈＦｃ−Ｓｈｋ［２−３５］ベクターをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、大きな断片をゲル抽出キットによって精製した。ゲル精製されたＰＣＲ断片を、精製された大きな断片へ連結し、Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。形質転換された細菌コロニー由来のＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、２％アガロースゲル上で分離した。予想されたパターンを生じるＤＮＡを配列決定へ供した。クローンの数個の配列の分析は、上述の配列と１００％一致したが、大規模プラスミド精製のために各遺伝子から１つのクローンのみを選択した。Ｆｃ及びリンカー領域を確認するため、ｐＣＭＶｉベクター中のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］、及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］のＤＮＡを再配列決定し、配列は上述の配列と１００％同一であった。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］、及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］の配列及び模式図による表示を、図４２ＡないしＢ、図４３ＡないしＢ、図４４ＡないしＢ及び図４５ＡないしＢにそれぞれ示す。
【０５５２】
ｐＣＭＶｉタンパク質中のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］の一過性形質移入発現において使用されるＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＭＥＭ高グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ製）、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ製）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、Ｇｉｂｃｏ製）を含有する増殖培地中で培養した。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、フェノール／クロロホルム抽出されたｐＣＭＶｉプラスミド中のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］、及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］各５．６μｇを、ＨＥＫ−２９３細胞中に形質移入した。細胞を２４時間回復させた後、ＤＭＥＭ高グルコース、１×ＮＥＡＡ及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ培地中に配置した。本明細書の以下の実施例５０に記載のプロトコールを使用して、これらの形質移入されたＨＥＫ−２９３細胞によって、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］を培養上清から精製した。
【０５５３】
培養上清１５μＬを自家４×負荷緩衝液（β−メルカプトエタノールなし）と混合し、Ｎｏｖｅｘ  Ｘｃｅｌｌ  ＩＩ装置を使用して、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ染色済みタンパク質ラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０μＬとともに５×ランニング溶液（２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、３．５ｍＭＳＤＳ）中で１０１Ｖ／４６ｍＡで２時間、Ｎｏｖｅｘ４ないし２０％トリス−グリシンゲル上で電気泳動した。次に、エレクトロブロット緩衝液（２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中に、ゲルを５分間浸漬した。エレクトロブロット緩衝液中に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ニトロセルロースメンブレン（カタログ番号ＬＣ２００、孔サイズ０．２μｍ）を浸漬した。製造者の説明書（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従って、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌモジュールを使用して、あらかじめ浸漬されたゲルを、ＰＶＤＦメンブレンへ３００ｍＡで２時間ブロットした。０．１％トゥイーン２０含有トリス緩衝塩類溶液、ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）中でブロットをすすいだ。次に、まずＴＢＳＴ中の５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）中に、室温で１時間、ブロットを浸漬した後、１回の洗浄につき１０分間で３回、ＴＢＳＴ中で洗浄した。次に、５％ミルク緩衝液を加えたＴＢＳＴ中のＨＲＰの結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体（Ｐｉｅｒｅｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙカタログ番号３１４１３）の１：１０００希釈とともに、室温で１時間振とうしながら温置した。次に、室温で１回の洗浄につき１５分間、ＴＢＳＴ中で３回、ブロットを洗浄した。製造者の説明書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＥＣＬウェスタンブロット検出試薬を使用して、一次抗体を検出した。ＥＣＬ検出に際し、ウェスタンブロット分析は、非還元型ゲル条件下で６６ｋＤａの予想されたサイズを表示した（図４６）。
【０５５４】
ｐＣＭＶｉベクター中のＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］インサートを含有するプラスミドを、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素で消化し、ゲル精製した。ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ及びＳａｌＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化したｐＤＳＲα−２４（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）発現ベクターへ、前記インサートを個々に連結した。得られるコンストラクトの完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。クローンの数個の配列の分析は、上述の配列と１００％の一致を与えたが、大規模プラスミド精製のために１つのクローンのみを選択した。
【０５５５】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１タンパク質の安定した発現において使用されるＡＭ１  ＣＨＯｄ−（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）細胞を、ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ウシ胎仔血清、１×ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ、Ｇｉｂｃｏ製）、１×ＮＥＡＡ及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕを含有するＡＭ１  ＣＨＯｄ増殖培地中で、Ｆｃ−ＬＩ０−ＳｈＫ［１−３５］タンパク質の安定した発現に使用されるＡＭ１ＣＨＯｄ（Ａｍｇｅｎ  Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）細胞を培養した。ＦｕＧｅｎｅ６を使用して、ｐＤＳＲα−２４−Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１プラスミド５．６μｇをＡＭ１  ＣＨＯｄ−細胞に形質移入した。形質移入から２４時間後、ＤＨＦＲ選択培地（ＤＭＥＭ高グルコースプラス１０％透析済みウシ胎仔血清（ｄＦＢＳ）、１×ＮＥＡＡ及び１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ）中へ、細胞を１：１１で分割し、コロニー選択の場合には１：５０で分割した。ＤＨＦＲ選択培地中で１３日間、細胞選択した。得られたコロニーの１０個の１０ｃｍ２プールを１０個のＴ−１７５フラスコへ展開した後、１０個のローラー瓶にスケールアップし、ＡＭ１  ＣＨＯｄ産生培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム（ピルビン酸Ｎａ）、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ及び１．５％ＤＭＳＯ）のもとで培養した。馴化培地を回収し、１週間置きに交換した。得られた馴化培地６Ｌを０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）でろ過し、図４７に示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴付けた。次に、精製のために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに移した。
【０５５６】
ＤＨＦＲ選択培地上で１３日後に、１２個のコロニーを選択し、１個の２４ウェルプレートへと摘出した。前記プレートを１週間増殖させた後、ＡＭ１ＣＨＯｄ産生培地へ、４８ないし７２時間移し、培養上清を回収した。培養上清５μＬをスクリーニングするため、同一のＨＲＰ結合型ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体によって検出する一過性ウェスタンブロット分析と同様のウェスタンブロッティングによって、発現レベルを評価した。１２個の全ての安定したクローンは、６６ｋＤａの予想されたサイズでの発現を示した。２つのクローン、Ａ３及びＣ２を選択し、一次クローンＣ２に対するバックアップとしてのＡ３とともに凍結するため、Ｔ１７５フラスコへ展開した（図４８）。
【０５５７】
選択培地を使用して、Ｃ２クローンを１５個のローラー瓶（Ｃｏｒｎｉｎｇ）へスケールアップし、集密状態まで増殖させた。次に、培地を産生培地と交換し、１週間温置させた。馴化培地を採集し、１週間置きに交換した。０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｇｔｏｎ、ＭＡ）で、得られた培養上清１５Ｌをろ過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴付けた（データ非表示）。以下の本明細書の実施例４２に記載されているとおり、さらなる精製を行った。
【実施例４２】
【０５５８】
哺乳類細胞によって発現されたＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｋ７Ｓ）、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の精製
Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の精製
ＣＨＯ（ＡＭ１  ＣＨＯｄ−）細胞培養上清約６Ｌ（上述の実施例４１参照）を、３５ｍＬのモノクローナル抗体選択カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ、７℃、１０ｍＬ／分で負荷し、二価の陽イオンを有さないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）の数カラム容積で前記カラムを洗浄し、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０にする工程で試料を溶出した。Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の室内の６５ｍLのＳＰ−ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ、７℃、１０ｍＬ／分で、モノクローナル抗体選択溶出液を直接負荷した。モノクローナル抗体選択カラムをはずした後、数カラム容積のＳ−緩衝液Ａで、ＳＰ−ＨＰカラムを洗浄した後、５％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配を１０ｍＬ／分で使用して展開した後、７℃で１００％Ｓ−緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルーで染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析し、これらのデータを基に、望ましい生成物を含有する画分をプールした。次に、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｊｕｍｂｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａ遠心限外ろ過装置を使用して、プールした材料を約２０ｍＬに濃縮した。次に、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０の２０ｍＬで希釈することによって、濃縮した材料を緩衝液交換し、Ｊｕｍｂｏｓｅｐ  １０Ｋ  Ｏｍｅｇａフィルターを使用して２０ｍＬに再濃縮した。次に、２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０の２０ｍＬで材料を希釈した後、２２ｍＬに再濃縮した。次に、緩衝液交換した材料を、室温、１ｍＬ／分で、０．２２μｍ、２５ｍｍのＭｕｓｔａｎｇ  Ｅメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｒｏｄｉｓｃでろ過した。次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈したろ過済み材料50μＬに対して、スペクトルの走査を実施した（図４９Ａ、黒のトレース）。３０，３７１ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が４．９６ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図４９Ｂ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を３０倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１．８ＥＵ／タンパク質ｍｇであった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へ、１ｍＬ／分で注入された生成物１４９μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図４９Ｃ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）へと希釈することによって、生成物を質量分析へ供した。得られた溶液１ｍＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した（図４９Ｄ）。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０５５９】
哺乳類Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１プレップに関する収量は、６Ｌから１１５ｍｇであり、純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる判断によれば９０％超であり、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる判断によれば予想された二量体として測定され、質量は、ＭＳによる判断によれば予想された範囲であった。
【０５６０】
ヒトＫｖ１．３及びヒトＫｖ１．１を遮断する上での精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の活性を、本明細書の以下の実施例４３に記載する。
【０５６１】
Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｋ７Ｓ）、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）の精製
形質移入されたＨＥＫ−２９３による培養上清約５００ｍＬ（上述の実施例４１参照）を、モノクローナル抗体選択樹脂（１．５ｍＬ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の６５％スラリー及び５００μＬの２０％ＮａＮ３と合わせた。次に、スラリーを４℃で３日間静かに撹拌した後、ブレーキを使用せずに４℃、１０００ｇで５分間遠心分離した。次に、上清の大部分を吸引し、ペレット中に残存するスラリーを１４ｍＬのコニカルチューブへ転移させ、二価の陽イオンを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）１２ｍＬと組み合わせた。低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを４℃、２０００ｇで１分間遠心分離し、上清を吸引した。ＰＢＳ洗浄周期をさらに３回反復した。次に、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０の１ｍＬを添加し、室温で静かに５分間撹拌することによって、結合されたタンパク質を溶出した。次に、低ブレーキを使用しながら、前記スラリーを４℃、２０００ｇで１分間遠心分離し、上清を第一溶出液として吸引した。溶出周期をさらに２回反復し、３つの全上清を合わせて単一プールとした。ｐＨを上昇させるために、酢酸ナトリウム（３Ｍ溶液３７．５μＬ）を溶出プールへ添加した後、１０ｋＤａ  ＳｌｉｄｅＡｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１０ｍＭ酢酸、５％ソルビトール、ｐＨ５．０に対して室温で２時間透析した。透析緩衝液を交換し、透析を４℃で一晩続行した。次に、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターシリンジフィルターで、透析した材料をろ過した。次に、３０，３３０の算出された分子量及び３５，４１０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、ろ過済み材料の濃度が１．２７ｍｇ／ｍＬであると測定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ろ過済み材料の純度を評価した（図５０Ｂ）。次に、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒｓエンドトキシン特異的緩衝液中に試料を２５倍希釈したものを使用して、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（０．０５ないし５ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、エンドトキシンレベルを測定した結果、１ＥＵ／タンパク質ｍｇ未満であった。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物５０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図５０Ｃ）。次に、試料１μＬをシナピン酸１０μＬ（０．０５％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル中１０ｍｇ／ｍＬ）中に希釈することによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。得られた溶液１ｍＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に点状滴下した。試料を乾燥させた後、窒素レーザーの装備されたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析装置を使用して分析した（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部���量較正を達成した（図５０Ｄ）。次に、生成物を−８０℃で保存した。
【０５６２】
図５１ＡないしＤは、以下の点を除いて、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）分子に関するものと同一プロトコールを使用して実施した、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）に対する精製及び分析からの結果を示す。３０，３５７ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，４１０の算出された吸光係数を使用して、濃度は１．５９ｍｇ／ｍＬであることが明らかとなった。発熱物質レベルは、３２倍希釈を使用して、１ＥＵ／ｍｇ未満であることが明らかとなった。
【０５６３】
図５２ＡないしＤは、以下の点を除いて、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ）分子（上述）に関するものと同一プロトコールを使用して実施した、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯｓＫ１（Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ）に対する精製及び分析からの結果を示す。３０，３１６ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３５，４１０の算出された吸光係数を使用して、濃度は０．８１ｍｇ／ｍＬであることが明らかとなった。発熱物質レベルは、１６倍希釈を使用して、１ＥＵ／ｍｇ未満であることが明らかとなった。
【０５６４】
ヒトＫｖ１．３及びヒトＫｖ１．１を遮断する上での精製されたＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］及びＦｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］の活性を、本明細書の以下の実施例４３に記載する。
【実施例４３】
【０５６５】
ＯＳＫ１及びＯＳＫ１ペプチボディ類縁体の電気生理学
カリウムチャネルファミリーのサブタイプであるヒトＫｖ１．１及びＫｖ１．３チャネルに及ぼす影響を評価するために、アジアサソリであるオルトキルススクロビキュロサス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  Ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）の毒液の３８残基ペプチド毒素（ＯＳＫ１）を合成した（実施例４１参照）。ＨＥＫ２９３細胞発現系及び電気生理学の使用によって、ヒトＫｖ１．１及びＫｖ１．３チャネルを阻害する上での合成ＯＳＫ１の有効性及び選択性を評価した（図５３）。安定して発現したＫｖ１．３チャネルのホールセルパッチクランプ記録によって、合成ＯＳＫ１ペプチドは、Ｋｖ１．１と比較したとき、ヒトＫｖ１．３を阻害する上でより有力であることが明らかとなった（表３３）。
【０５６６】
ＯＳＫ１ペプチボディを作製するための、抗体へのＯＳＫ１ペプチド毒素の融合
血漿半減期を改善し、ＯＳＫ１ペプチド毒素が中枢神経系を貫通するのを防止するため、本明細書の実施例４１に記載されるとおり、１０個のアミノ酸残基のリンカー鎖長を介して、ヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃ断片へＯＳＫ１ペプチド毒素を融合した。この融合によって、合成ＯＳＫ１ペプチドと比較すると、Ｋｖ１．３の有効性は５倍まで低下した。しかしながら、合成ペプチド単独のもの（４倍、表３３及び図５４）と比較すると、ＯＳＫ１のＫｖ１．１に対する選択性は２１０倍まで有意に改善した。
【０５６７】
ＯＳＫ１ペプチボディ（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１）の修飾
ＯＳＫ１は、集合的にα−ＫＴｘ３と呼ばれるサソリ毒素の他のメンバーと６０ないし８０％の配列相同性を共有する。ＯＳＫ１及びα−ＫＴｘ３ファミリーの他のメンバーの配列アラインメントによって、位置１２、１６、２０及び３６における４つの異なる構造的な差異が明らかとなった。ＯＳＫ１のこれらの構造的な差異は、他のカリウムチャネルに対するそれらの多様な活性において重要な役割を果たしているものと推測され、これは、α−ＫＴｘ３ファミリーの他のメンバーでは観察されない。従って、Ｋｖ１．２とのヘテロ四量体として、主に中枢神経系中に見出されるＫｖ１．１などの他のカリウムチャネルに対する選択性に及ぼす影響を評価するために、位置１６及び２０に存在する２つのアミノ酸残基を、ＯＳＫ１配列内のより保存されたアミノ酸残基へと回復させた。それぞれ保存されたリジン及びアスパラギン酸残基を、位置１６のグルタミン酸、及び位置２０のリジンと置換することによって（すなわち、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］）、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の効力と比較したとき、効力に有意な変化は観察されなかった（１．３倍差、図５６及び表３３）。しかしながら、この二重変異によって、Ｋｖ１．１に対する遮断活性が排除された。Ｋｖ１．１／Ｋｖ１．３の選択性の比は４０３倍であり、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１に関する選択比（２１０倍）に比べて有意に向上した。位置７のリジンからセリンへの単一アミノ酸突然変異（Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ］）は、Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１の有効性及び選択性と比較すると、有効性及び選択性が、それぞれ２倍及び１．３倍までわずかに変化した（図５５及び表３３）。Ｆｃ−Ｌ１０−ＯＳＫ１［Ｋ７Ｓ，Ｅ１６Ｋ，Ｋ２０Ｄ］を作製させるために、３つの残基全てを突然変異させると、有効性が著しく低下した（図５７及び表３３）。
【０５６８】
表３３の結果によって示されるように、ヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃ断片へＯＳＫ１ペプチド毒素を融合させることによって、Ｋｖ１．１に対する選択性が劇的に改善されたが、Ｋｖ１．３に対する標的有効性は低下した。２つの重要な位置にある２残基がα−ＫＴｘ３ファミリーの他のメンバーで見られる保存された残基へ回復されると、Ｋｖ１．１に対する選択性をさらに改善した。
【０５６９】
【表３４】
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【実施例４４】
【０５７０】
ラットにおけるＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子の薬物動態学的研究
約２４ｋＤａの２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子及び約４ｋＤａの小固有ＳｈＫペプチドの静脈内（ＩＶ）薬物動態学的特性を、スプラーグドーリー系ラットで測定した。固有ＳｈＫペプチド及び新規の本発明の２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子に関するＩＶ用量は、１ｍｇ／ｋｇであった。この用量は、これら２つの分子の等しいモル量を表した。ラットの平均体重は約０．３ｋｇであり、用量及び分子に関して各２匹のラットを使用した。ＩＶ注射後の多様な時点で採血し、血清約０．１ｍＬを回収した。分析時まで、血清試料を−８０℃で冷凍保存した。
【０５７１】
電気生理学のためのアッセイプレート調製
薬物動態学的研究由来の２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子又は固有ＳｈＫペプチドを含有するラット血清試料を凍結した。実験前に、各試料を室温で解凍し、一定分量（７０ないし８０μＬ）を９６ウェルポリプロピレンプレート中の１ウェルへ転移させた。アッセイプレートを調製するため、検査溶液を付与するために、薬物動態学的血清試料から何回も希釈した。薬物動態学的研究由来の血清試料を、１０％リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有）へと希釈した。薬物動態学的研究から得られた血清試料中の新規の本発明の２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子の量を測定する場合、検査溶液中の血清最終濃度は、９０％、３０％、１０％、３．３％及び１．１％であった。精製された２０Ｋ  ＰＥＧ−Ｓｈｋ［１−３５］標準阻害曲線も、Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ中に調製した。これを実施するため、精製された２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子（標準物質）の８点連続希釈液を、９０％、３０％、１０％、３．３％又は１．１％のラット血清に調製し、標準物質の最終濃度は、５０、１６．７、５．５、１．８５、０．６２、０．２１、０．０６８及び０．０２３ｎＭであった。
【０５７２】
電気生理学のための細胞調製
電位により活性化されるＫ＋チャネルであるＫｖ１．３を安定的に発現するＣＨＯ細胞を、実験の２日前に、Ｔ−１７５組織培養フラスコ中に（５×１０６個の密度で）播種し、約９５％の集密状態まで生育させた。実験の直前に、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、トリプシン（０．２５％）及びベルセン（１：５０００）の２ｍＬ混合物（１：１容積比）を使用して、３７℃で（３分間）剥離させた。その後、フラスコ中で、１０％ＦＢＳ、１×ＮＥＡＡ及Ｇ４１８の７５０μｇ／ｍＬを有する組織培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ含有ＨＡＭのＦ−１２、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１７６５）１０ｍＬ中に細胞を再懸濁し、約１０００ｒｐｍで１．５分間遠心分離した。得られた細胞ペレットを、ＰＢＳ中に、３ないし５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。
【０５７３】
ＩｏｎＷｏｒｋｓ電気生理学及びデータ分析
ＣＨＯ−Ｋｖ１．３細胞中のＫ＋電流を阻害するための血清中の検査溶液又は標準物質の能力を、自動電気生理学システムＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏを使用して研究した。細胞を再懸濁し、Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ、Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ（ＰＰＣ）ＰａｔｃｈＰｌａｔｅ並びに適切な細胞内緩衝液（９０ｍＭグルコン酸Ｋ、２０ｍＭＫＦ、２ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３５）及び細胞外緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋含有ＰＢＳ）をＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏに配置した。アンフォテリシンベースの穿孔パッチクランプ法を使用して、ＣＨＯ−Ｋｖ１．３細胞からの電気生理学記録を実施した。ＩｏｎＷｏｒｋｓ  Ｑｕａｔｔｒｏの電位クランプ回路素子を使用して、細胞を−８０ｍＶの膜電位に保持し、＋３０ｍＶへ４００ミリ秒、膜電位を停止させることによって電位活性型Ｋ＋電流を惹起させた。対照条件下、すなわち、実験開始時阻害剤の不存在下で、及び検査溶液又は標準物質の存在下での１０分間の温置の後に、Ｋ＋電流を惹起させた。４３０ミリ秒と４４０ミリ秒との間に、平均Ｋ＋電流振幅を測定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシートへ、データを転送した。検査溶液又は標準物質の各濃度の存在下でのＫ＋電流の振幅を、同一ウェル中の対照条件下でのＫ＋電流の百分率として表した。
【０５７４】
ラット血清の多様なレベルの各標準物質に対して標準物質阻害曲線を作製し、対照の電流百分率（ＰＯＣ）対ｎＭ濃度の対数として表した。対照の百分率（ＰＯＣ）は、阻害と逆相関しており、ここで、１００ＰＯＣは阻害が全く存在せず、０ＰＯＣは１００％阻害である。検査溶液内での薬物濃度の算出を可能にする方程式を導くために、前記曲線の選択された領域にわたる線形回帰を使用した。検査溶液中の薬物の濃度を算出するため、標準曲線の線形部分内の電流値のみを使用した。血清の所定レベルでの対応する標準曲線を、薬物レベルを算出するときの検査溶液の血清の同一レベルと常に比較した。ＳｈＫ及び２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］に対する標準曲線が、それぞれ図５８Ａ及び図５８Ｂに示されており、各図は、血清の所定の百分率での各標準物質に対する線形回帰方程式を含んでいる。２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］標準曲線については、標準曲線の線形部分は２０ＰＯＣから７０ＰＯＣまでであり、検査溶液内での薬物濃度を算出するため、この範囲内に収まる検査溶液から得られた電流値のみを使用した。
【０５７５】
静脈内注射後における、本発明の新規２０Ｋ  ＰＥＧ  ＳｈＫ［１−３５］分子の薬物動態学的特性を図５９に示す。この曲線から、前記分子の終末半減期（ｔ１／２ｂ）は、６時間と１２時間の間の長さであると推定される。４８時間を超えると、薬物のレベルは、標準曲線の線形範囲の外側に収まり、算出されない。本発明の新規２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子の算出された６ないし１２時間の半減期は、Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９８，１３９４２−１３９４７］によって以前に報告された固有のＳｈＫ分子の約０．３３時間（又は２０分）の半減期よりも実質的に長く、これは治療用分子の望ましい特徴である。ＳｈＫ対２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］の等モルの静脈内注射後のＫｖ１．３阻害剤の相対的なレベルの比較を、図６０に示す。５％血清検査溶液を検討する前記図から明らかなように、２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子は、２４時間超の間、Ｋｖ１．３電流の有意な抑制（７０ＰＯＣ未満）を示したのに対し、固有なＳｈＫペプチドは、最初の１時間にＫｖ１．３電流の阻害の有意なレベルを示したに過ぎず、１時間を超えると有意な遮断を示さなかった。本データは、自己免疫疾患の治療用治療薬としての２０Ｋ  ＰＥＧ  ＳｈＫ［１−３５］の望ましい特徴を再び示している。
【実施例４５】
【０５７６】
ＰＥＧ化された毒素ペプチドは、動物モデルにおいて重度の自己免疫性脳脊髄炎を抑制した
Ｋｖ１．３の２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ阻害剤は、ラットにおける重度の自己免疫性能脊髄炎を抑制する上で改善された有効性を示す。以前に記載された多発性硬化症の適応性転移型実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデル［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６，９３６］を使用して、本発明者は、本発明の新規２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ分子のインビボでの活性を検討し、その有効性をＳｈＫ毒素ペプチド単独の有効性と比較した。研究デザインを図６１に図示する。本インビボ研究からの結果を図６２及び図６３に示す。第１日から第３日まで１０μｇ／ｋｇで毎日皮下送達される２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ分子は、疾病の重度を有意に低下させ、生存性を亢進したのに対し、小さなＳｈＫペプチドの等モル投与量（１０μｇ／ｋｇ）で処理した動物は、重度の疾病を発症し、死亡した。
【０５７７】
３５個のアミノ酸の毒素ペプチドＳｈＫ（スティコダクチラ・ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｔｙｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）神経毒）をＢａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、Ｋｖ１．３を有力に遮断するために電気生理学によって確認した（本明細書の実施例３６参照）。２０Ｋ  ＰＥＧ  ＳｈＫ分子の合成、ＰＥＧ化、精製は、本明細書に上記されている。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に特異的な脳骨髄性ＣＤ４＋ラットＴ細胞系ＰＡＳは、Ｅｖｅｌｙｎｅ  Ｂｅｒａｕｄ博士から入手した。インビトロでの前記細胞の維持及びＡＴ−ＥＡＥモデルにおけるそれらの使用は、以前に記載されている［Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ  ９８，１３９４２］。抗原刺激又はＭＢＰ及び照射された胸腺細胞（２日）による活性化のラウンドを交互に行い、Ｔ細胞成長因子による伝播（５日）によって、ＰＡＳ  Ｔ細胞をインビトロで維持した。ＰＡＳ  Ｔ細胞（３×１０５／ｍＬ）は、前記細胞を、１０μｇ／ｍＬのＭＢＰ及び１５×１０６／ｍＬの同系の照射された（３５００ラド）胸腺細胞とともに温置することを包含した。インビトロでの活性化から２日後に、１０ないし１５×１０６個の生存可能なＰＡＳ  Ｔ細胞を、６ないし１２週齢の雌のルイスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の尾静脈に注射した。媒体（ＰＢＳ中２％ルイスラット血清）、２０Ｋ  ＰＥＧ−ＳｈＫ又はＳｈＫの毎日の皮下注射を第−１日から第３日まで付与し（図６１）、第−１日は、ＰＡＳ  Ｔ細胞の注射（第０日）の１日前を表す。媒体で処理されたラットでは、一過性のＥＡＥが、ＰＡＳ  Ｔ細胞の注射後４ないし５日目に発症した（図６２）。阻害剤のレベルの分析のため、第４日目に眼窩後部の出血により、第８日に心臓穿刺により、血清を回収した。第−１、４、６及び８日目にラットの体重を測定した。細胞転移当日（第０日）から第３日まで１日に１回、第４日から第８日まで１日に２回、動物を盲検した。各肢及び尾部の不全麻痺の程度の全体的なスコアとして、臨床徴候を評価した。臨床的なスコア化は、０＝徴候なし、０．５＝遠位跛行尾部、１．０＝跛行尾部、２．０＝軽度不全対麻痺、運動失調、３．０＝中等度不全対麻痺、３．５＝片後肢麻痺、４．０＝完全後肢麻痺、５．０＝完全後肢麻痺及び失禁、５．５＝四肢麻痺、６．０＝瀕死状態又は死亡であった。５．５のスコアに到達しているラットを安楽死させた。
【０５７８】
ＥＡＥの開始前のＫｖ１．３遮断薬ＰＥＧ−ＳｈＫによるラットの処理は、疾病の惹起を遅延させ、疾病の進行を阻害し、用量依存的様式で死亡を予防した（図６２）。１０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫ又は１００μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫで処理されたラットにおける第４．５日と比較して、媒体単独、１０μｇ／ｋｇのＳｈＫ又はＰＥＧ−ＳｈＫ１μｇ／ｋｇで処理したラットにおける疾病の惹起を第４日で観察した。さらに、媒体単独、１０μｇ／ｋｇのＳｈＫ又はＰＥＧ−ＳｈＫ１μｇ／ｋｇで処理したラットは全て、５．５以上のＥＡＥスコアで研究を終了するまで重度の疾病を発展させた。対照的に、１０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫ又は１００μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫで処理したラットは、２未満の臨床重度スコア平均のピークに到達し、１匹を除く全部のラットが研究の終了時まで生存した。さらに、本発明者は、ラットの体重が疾病の重度と相関することを発見した（図６３）。媒体単独、１０μｇ／ｋｇのＳｈＫ又はＰＥＧ−ＳｈＫ１μｇ／ｋｇで処理したラットは全部、それぞれ３１ｇ、３０ｇ及び３０ｇの平均を喪失したのに対して、１０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫ又は１００μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫで処理したラットは、それぞれ１８ｇ及び１１ｇを喪失した。後者の２群中のラットは、研究の終了時までに回復の徴候である体重の増加を表した。１０μｇ／ｋｇのＳｈＫ及び１０μｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＳｈＫで処理したラットは、ＳｈＫペプチドのモル当量を受容したことに留意すべきである。非結合型ＳｈＫに対してＰＥＧ−ＳｈＫ分子の有意により大きな有効性は、ＰＥＧ−ＳｈＫ分子のより大きな安定性及びインビボでの長期間の半減期によるものであるらしい（実施例４４参照）。
【実施例４６】
【０５７９】
Ｋｖ１．３アンタゴニストペプチドを包含する組成物は、ヒト全血において炎症を遮断する
ＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇの分泌に及ぼすＫｖ１．３阻害剤の影響を検討するためのエクスビボアッセイ
健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）中にヒト全血を取得した。ＤＭＥＭ完全培地は、０．１％ヒトアルブミン（Ｂａｙｅｒ６８４７１番）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）を含有する（Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液を有する）イスコブＤＭＥＭであった。タプシガルジンは、Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）から入手した。カルシウム動員のための４×タプシガルジンの刺激を与えるために、１００％ＤＭＥＭ中のタプシガルジンの１０ｍＭストック溶液をＤＭＥＭ完全培地で４０μＭ、４×溶液に希釈した。Ｋｖ１．３阻害剤であるペプチドＳｈＫ（スティコダシトラ・ヘリアンサス（Ｓｔｉｃｈｏｄａｃｙｔｌａ  ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）毒素、カタログ番号Ｈ２３５８）及びＢＫＣａ１阻害剤であるペプチドＩｂＴｘ（イベリオトキシン、カタログ番号Ｈ９９４０）はＢａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、Ｋｖ１．１阻害剤であるペプチドＤＴＸ−ｋ（デンドロトキシン−Ｋ）はＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）製であった。Ｋｖ１．３のＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ペプチド阻害剤は、実施例４及び実施例３９で本明細書に記載されているとおりに入手した。カルシウム阻害剤であるシクロスポリンＡをＡｍｇｅｎ試料バンクから入手したが、多様な売主からも市販されている。阻害剤の１０個の３倍連続希釈を、４倍濃度の最終濃度で、ＤＭＥＭ完全培地中に調製し、９６ウェルＦａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロタイタープレートのウェルに各々５０μＬを添加した。マイクロタイタープレートの列１ないし５及び７ないし１１は阻害剤を含有した（各行は個別の阻害剤の希釈の連続を有した）のに対し、列６中の８個のウェルには、ＤＭＥＭ完全培地単独５０μＬを添加し、列１２の８ウェルには、ＤＭＥＭ完全培地単独１００μＬを添加した。実験を開始するために、マイクロタイタープレートの各ウェルへ、全血１００μＬを添加した。次に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間温置した。１時間後、プレートを取り外し、８ウェルであった列１２を除き、４倍濃度のタプシガルジン刺激（４０μＭ）５０μＬを、プレートの全ウェルへ添加した。３７℃、５％ＣＯ２に、プレートを４８時間再配置した。全血中に分泌されたＩＬ−２及びＩＦＮ−ｇの量を測定するため、９６ウェルプレートの各ウェルからの上清（培養上清）１００μＬを保存プレートに移した。サイトカイン産生のＭＳＤ電気化学発光分析のため、ＭＳＤ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏａｔｅｄプレート（ｗｗｗ．ｍｅｓｏ−ｓｃａｌｅ．ｃｏｍ）へ、上清（馴化培地）２０μＬを添加した。これらのプレート上の作業電極を、４つの捕捉抗体（ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−２、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−４）であらかじめコーティングした。馴化培地２０μＬをＭＳＤプレートへ添加した後、検出抗体及びＰ４緩衝液の混合物１５０μＬを各ウェルへ添加した。１５０μＬ混合物は、各１μｇ／ｍＬの４つの検出抗体（ｈＩＬ−５、ｈＩＬ−２、ｈＩＦＮｇ及びｈＩＬ−４）２０μL及び２×Ｐ４緩衝���１３０μＬを含有した。プレートを覆い、振とうプラットフォーム上に一晩（暗所に）配置した。翌朝、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒで、プレートを読み取った。各プレートの列６中の８ウェルには、タプシガルジン刺激のみのみが与えられ、阻害剤が与えられなかったので、プレートに対して「高い」値を算出するために、ここでは、平均ＭＳＤ反応を使用した。プレートに対して算出された「低い」値は、タプシガルジン刺激及び阻害剤を含有しない列１２の８ウェルから得られた平均ＭＳＤ反応から求められた。対照の百分率（ＰＯＣ）は、刺激されていない対照と刺激された対照に対する反応の測定結果であり、１００ＰＯＣは、タプシガルジン刺激単独の平均反応又は「高い」値と等しい。それ故、１００ＰＯＣは、反応の０％阻害を表す。対照的に、０ＰＯＣは、反応の１００％阻害を表し、刺激が付与されない反応又は「低」値と等価である。対照の百分率（ＰＯＣ）を算出するため、次式：［（ウェルのＭＳＤ反応）−（「低い値」）］／［（「高い値」）−（「低い値」）］×１００を使用する。カーブフィッティングの後、全血中の分子の有効性を阻害曲線（ＩＣ）から算出し、ＩＣ５０は標準的なカーブフィッティングソフトウェアを使用して求めた。本発明者らは、ここに、高処理量のＭＳＤ電気化学発光アッセイを用いたサイトカイン産生の測定を記載しているが、当業者は、サイトカイン産生を測定するために、より小さな処理量のＥＬＩＳＡアッセイを等しく適用できることに容易に想到する。
【０５８０】
Ｋｖ１．３がＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−２Ｒの細胞表面活性化を遮断することを示す生体外アッセイ
健常で、投薬を受けていないドナーから、ヘパリンバキュテナー中に、ヒト全血を入手した。ＤＭＥＭ完全培地は、０．１％ヒトアルブミン（Ｂａｙｅｒ６８４７１番）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎ（ＰＳＧ、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）を含有する（Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液を有する）イスコブＤＭＥＭであった。タプシガルジンは、Ａｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）より入手した。カルシウム動員のための４×タプシガルジンの刺激を与えるために、１００％ＤＭＥＭ中のタプシガルジンの１０ｍＭストック溶液をＤＭＥＭ完全培地で４０μＭ、４×溶液に希釈した。Ｋｖ１．３阻害剤であるペプチドＳｈＫ（スティコダシトラ・ヘリアンサス毒素、カタログ番号Ｈ２３５８）及びＢＫＣａ１阻害剤であるペプチドＩｂＴｘ（イベリオトキシン、カタログ番号Ｈ９９４０）は、Ｂａｃｈｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、Ｋｖ１．１阻害剤であるペプチドＤＴＸ−ｋ（デンドロトキシン−Ｋ）はＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｉｓｒａｅｌ）製であった。Ｋｖ１．３のＣＨＯ由来のＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］ペプチボディ阻害剤を、実施例４及び実施例３９に記載されているとおりに入手した。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡはＡｍｇｅｎ試料バンクから入手したが、多様な売主から市販されている。イオンチャネル阻害剤であるＳｈＫ、ＩｂＴｘ又はＤＴＫ−ｋを、ＤＭＥＭ完全培地中に、望ましい最終濃度の４×となるように希釈した（終濃度＝５０又は１００ｎＭ）。カルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡも、ＤＭＥＭ完全培地中に、４×最終濃度となるように希釈した（最終濃度＝１０μＭ）。９６ウェルＦａｌｃｏｎ３０７５平底マイクロタイタープレートの適切なウェルへ、ＤＭＥＭ完全培地又は４×阻害剤溶液のいずれか５０μＬを添加した。次に、ヒト全血１００μＬを添加し、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１時間温置した。１時間後、プレートを取り外し、阻害剤を含有するプレートの全ウェルへ、４×タプシガルジン刺激（４０μＭ）５０μＬを添加した。阻害剤を含有しないが、ＤＭＥＭ完全培地のみを含有する幾つかのウェルにタプシガルジンも添加したのに対し、ＤＭＥＭ完全培地のみを有する他のウェルには、ＤＭＥＭ完全培地をさらに５０μＬ添加した。阻害剤及びタプシガルジン刺激を有しないウェルは、処理されていない「低」対照を相当した。阻害剤を有しないが、タプシガルジン刺激を与えられたウェルは、最大刺激のための対照又は「高」対照に相当した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２に２４時間再配置した。２４時間後、プレートを取り出し、ウェルをＦＡＣＳ分析のために処理した。細胞をウェルから摘出し、染色緩衝液（熱失活済みの２％ウシ胎仔血清を含有するリン酸緩衝塩類溶液）中で洗浄した。製造者の指示に従って、１．５％ホルムアルデヒド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用して、赤血球細胞を溶解した。チューブあたり染色緩衝液１００μＬあたり１００万個の細胞の濃度で細胞を分配した。まず、ビオチン標識した抗ヒトＣＤ４の１μＬで、細胞を染色し、洗浄した後、１μＬのストレプトアビジン−ＡＰＣ、ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＣＤ４５ＲＡ、及びフィコエリトリン（ＰＥ）標識した抗ヒトＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒａ）又はＰＥ標識した抗ヒトＣＤ４０Ｌで同時に染色した。抗体添加工程の間に、細胞を染色緩衝液で洗浄した。全ての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手した。各試料に対して、２万ないし５万の生存事象を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）フローサイトメーターで回収し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）を使用して分析した。前方向及び側部の散乱特性に基づいて、死滅した細胞、単球及び顆粒球を分析から排除した。
【０５８１】
図６４及び図６７は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に及ぼすＩＬ−２Ｒの活性を抑制したことに加え、Ｋｖ１．３阻害剤であるＳｈＫ及びＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］がヒト全血中のＩＬ−２分泌を有効に遮断したことを示す。Ｋｖ１．３阻害剤であるＦｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］は、ＩＣ５０によって反映されるように、シクロスポリンＡよりもヒト全血中のＩＬ−２生成を遮断する上で２００倍超有力であった（図６４）図６５は、Ｋｖ１．３阻害剤が、ヒト全血中のＩＦＮｇの分泌も有力に遮断したことを示し、図６６は、Ｔ細胞に及ぼすＣＤ４０Ｌの上方制御をさらに遮断したことを示す。図６４ないし６７中のデータは、Ｆｃ−Ｌ１０−ＳｈＫ［２−３５］分子が３７℃で４８時間まで全血中で安定であり、炎症反応の強力な遮断を提供したことを示す。Ｋｖ１．３を標的にし、延長された半減期を有する毒素ペプチド治療薬が、インビボで、長期にわたって、これらの反応の持続的遮断を与えるために探索される。これに対して、Ｋｖ１．３阻害剤であるペプチドＳｈＫは、全血中で強力な遮断を示した事実にもかかわらず、ＳｈＫペプチドはインビトロで半減期が短く（約２０分）（Ｃ．Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８，  １３９４２）、それ故、長時間の遮断を提供できない。全血は、動物における反応を予測するための生理的に適切なアッセイに相当する。ここに記載されている全血アッセイは、患者の投与後の標的適用範囲及び薬物暴露を測定するための薬力学的（ＰＤ）アッセイとしても使用できる。これらのヒト全血データは、多発性硬化症、１型糖尿病、乾癬、炎症性腸疾患、接触仲介性皮膚炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、喘息、アレルギー、再狭窄、全身性強皮症、線維症、皮膚硬化症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶反応、移植片対宿主病及び狼瘡などの、多様な免疫疾患の治療のための、本発明の組成物の治療的有用性を裏付ける。
【実施例４７】
【０５８２】
ＰＥＧ化したペプチボディ
実施例を通じて、本発明のＰＥＧ化したペプチボディを以下の方法によって作製した。ＣＨＯにより発現された、１９．２ｍLのＡ５Ｓ、２０ｍＭのＮａＢＨ３ＣＮ、ｐＨ５中のＦｃＬ１０−ＯｓＫ１（１９．２ｍｇ、分子量３０，３７１Ｄａ、０．６３μｍｏｌ）を、３８ｍｇのＰＥＧアルデヒド（分子量２０ｋＤａ、３×、ロット１０４０８６）で処理した。密閉した反応混合物を冷温室で一晩撹拌した。Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、０．４ｍＬ／分で０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出したＳＥＣ  ＨＰＬＣにより、反応の経過中のタンパク質修飾度をモニターした。反応混合物をＡ５Ｓ、ｐＨ５で一晩透析した。次に、透析した材料をＡ５Ｓ、ｐＨ５中のＳＰ  ＨＰ  ＦＰＬＣカラム（１６／１０）へ負荷し、１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出した。回収した画分をＳＥＣ  ＨＰＬＣにより分析し、３つのプール中にプールし、ＤＰＢＳ中へと交換し、濃縮し、官能基検査に供した（表３４）。
【０５８３】
別の実施例において、１６．５ｍLのＡ５Ｓ、２０ｍＭのＮａＢＨ３ＣＮ、ｐＨ５中のＦｃＬ１０−ＳｈＫ１（１６．５ｍｇ、分子量３０，０６５Ｄａ、０．５５μｍｏｌ）を４４ｍｇのＰＥＧアルデヒド（分子量２０ｋＤａ、４×、ロット１０４０８６）で処理した。密閉した反応混合物を冷温室で一晩撹拌した。Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ  ６  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、０．４ｍＬ／分で０．０５Ｍリン酸塩緩衝液、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出したＳＥＣ  ＨＰＬＣにより、反応の経過中のタンパク質修飾度をモニターした。反応混合物をＡ５Ｓ、ｐＨ５で一晩透析した。透析した材料をＡ５Ｓ、ｐＨ５中のＳＰ  ＨＰ  ＦＰＬＣカラム（１６／１０）へ負荷し、１Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出した。回収した画分をＳＥＣ  ＨＰＬＣにより分析し、３つのプール中にプールし、ＤＰＢＳ中へと交換し、濃縮し、官能基検査に供した（表３４）。
【０５８４】
表３４中のデータは、Ｋｖ１．３阻害剤としてのＰＥＧ化されたペプチボディ分子の有効性を示す。
【０５８５】
【表３５】
0005220915.tif 000131
【実施例４８】
【０５８６】
ＰＥＧ化された毒素ペプチド
ＳｈＫ及びＯｓｋ−１のＰＥＧ化、精製及び分析
合成ＳｈＫ又はＯＳＫ１−１毒素ペプチドのＮ末端での還元的アルキル化によって、ペプチドを選択的にＰＥＧ化した。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム及び２０ｋＤａのモノメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）の２モル過剰量を含有する５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．５反応緩衝液中の２ｍｇ／ｍＬで、Ｓｈｋ又はＯＳＫ−１のいずれかの毒素ペプチドを使用して、結合を達成した。結合反応物を室温で一晩撹拌し、その進行をＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターした。完了した反応を、２０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４による４倍希釈により停止し、ｐＨ３．５に調整し、４℃に冷却した。次に、４℃で、ＳＰセファロースＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、２０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０中の直線的な０ないし１ＭのＮａＣｌ勾配で溶出して、ＰＥＧ−ペプチドをクロマトグラフィー精製した（図６８Ａ及び図６８Ｂ）。溶出したピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、プールしたものを測定したところ、純度９７％超であった。観察される主な夾雑物質は、ジＰＥＧ化した毒素ペプチド及び修飾されていない毒素ペプチドであった。３ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜に対する遠心ろ過によって、選択されたプールを２ないし５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、５％ソルビトールを有する１０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４中へと透析した。次に、透析したプールを０．２ミクロンフィルターでろ過滅菌し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣによって純度が９７％超であることを決定した（図６９Ａ及び図６９Ｂ）。０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中のＺｏｒｂａｘ５μｍ  ３００ＳＢ−Ｃ８  ４．６×５０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を１ｍＬ／分で稼動させ、カラム温度を４０℃に維持したＡｇｉｌｅｎｔ１１００モデルＨＰＬＣで、逆相ＨＰＬＣを実施した。ＰＥＧ−ペプチドの試料（２０μｇ）を注入し、直線的な６ないし６０％勾配中に溶出する間、２１５ｎｍ及び２８０ｎｍの波長でモニターした。
【０５８７】
ホールセルパッチクランプによって実施される電気生理学的実験（実施例３６参照）は、ヒトＫｖ１．３チャネルを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞から記録される外向きカリウム電流の濃度依存的遮断において、ＰＥＧ−ＯＳＫ１は１．２８５ｎＭの、ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］は０．１６９ｎＭのピークＩＣ５０を生じた（図７４）。「２０ＫのＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］」及び「ＰＥＧ−ＳｈＫ」とも呼ばれる精製されたＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］分子は、小さなＳｈＫペプチドよりもインビボでの半減期が非常に長かった（図５９及び図６０）。ＰＥＧ−ＳｈＫ［１−３５］はラットにおいて重度の自己免疫性脳脊髄炎を抑制し（実施例４５、図６１ないし６３）、小さな固有のＳｈＫペプチドよりも大きな有効性を示した。
【実施例４９】
【０５８８】
ＳｈＫ及びＯＳＫ１毒素ペプチドのＦｃループ挿入
図７０、図７１、図７２及び図７３に例示されているように、Ｇｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＷＯ２００６／０３６８３４  Ａ２［ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４２７３］中の実施例１に公開されている方法に従って、配列Ｄ１３７Ｅ１３８Ｌ１３９Ｔ１４０Ｋ１４１として定義されるヒトＩｇＧ１Ｆｃ−ループドメイン中にジスルフィドにより抑制される毒素ペプチドを挿入した。３つの連結されたドメインを有する典型的なＦｃループ−Ｌ２−ＯｓＫ１−Ｌ２、Ｆｃループ−Ｌ２−ＳｈＫ−Ｌ２、Ｆｃループ−Ｌ２−ＳｈＫ−Ｌ４及びＦｃループ−Ｌ４−ＯｓＫ１−Ｌ２を調製した。これらを回収、精製し、官能基検査へ供した。
【０５８９】
これらの実施例に関するペプチド挿入は、Ｆｃ残基Ｌｅｕ１３９とＴｈｒ１４０との間であり、挿入されたペプチドのいずれかの側に隣接するリンカーとして２ないし４個のＧｌｙ残基を包含した。しかしながら、本分野で公知のように、例えばＧｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ＷＯ２００６／０３６８３４  Ａ２［ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４２７３］の実施例１３に記載されるとおり、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列に関する代替的な挿入部位又は異なるリンカーも、本発明の実施においても有用である。
【実施例５０】
【０５９０】
Ｅ．コリからのＳｈＫ（２−３５）−Ｌ−Ｆｃの精製
本明細書の上述の実施例１６に記載されるように入手された冷凍したＥ．コリペースト（１１７ｇ）を、室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５の１２００ｍＬと組み合わせ、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。冷却した懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置に１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、１７，７００ｇで３０分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを１％デオキシコール酸１２００ｍＬ中に再懸濁した後、４℃、１７，７００ｇで３０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、ペレットを１２００ｍＬの水中に再懸濁した後、４℃、１７，７００ｇで３０分間遠心分離した。次に、ペレット６．４ｇ（合計１４．２ｇ）を１２８ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。次に、ペレット溶液を１ＭのＤＴＴ０．６７ｍＬとともに、３７℃で６０分間温置した。還元した材料を４℃、２ｍＬ／分で再折りたたみ緩衝液（３Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２．５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ９．５）５５００ｍＬへと、激しく撹拌しながら移した。次に、撹拌速度を低下させ、温置を４℃で３日間続行した。
【０５９１】
再折りたたみ液を水５．５Ｌで希釈し、酢酸を使用してｐＨを８．０に調整した後、溶液を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過し、室内の３５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔカラム（内径２．６ｃｍ）で、８℃でＱ−緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）中の３５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｑセファロース−ＦＦ（内径２．６ｃｍ）カラムへ１０ｍＬ／分で負荷した。負荷した後、Ｑセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔカラムで実施した。カラムをＱ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分を８℃でＳ−緩衝液Ａ（１０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５．０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−セファロースＨＰカラムへ５．０ｍＬ／分で直ちに負荷した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした後、８℃でＭＥＰ緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中の５０ｍＬのＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌカラム（内径２．６ｃｍ）へ１０ｍＬ／分で適用した。５％ないし５０％の直線勾配のＭＥＰ緩衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０）で、カラムを溶出した後、１００％ＭＥＰ緩衝液Ｂへの工程で溶出した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して画分を分析し、望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。
【０５９２】
次に、１０ｋＤａメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｊｕｍｂｏ−Ｓｅｐを使用して、ＭＥＰプールを約１０ｍＬに濃縮した。次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール５０μＬに対して、スペクトル走査を実施した（図７６Ａ）。次に、３０，２５３の算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、材料の濃度が３．７ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、材料の純度を評価した（図７６Ｂ）。次に、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物７０μｇに対して、２８０ｎｍでの吸光度を観察するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図７６Ｃ）。次に、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４、１×１５０ｍｍ）を通じて、試料約４μｇをクロマトグラフィーにかけることによって、生成物を質量スペクトル分析へ供した。溶媒Ａは、水中の０．１％トリフルオロ酢酸であり、溶媒Ｂは、９０％アセトニトリル、１０％水中の０．１％トリフルオロ酢酸であった。８０μＬ／分の流速で、１０％溶媒Ｂ中でカラムをあらかじめ平衡化した。質量分析計の製造者によって提供されるＢｉｏｗｏｒｋｓソフトウェアを使用して、質量スペクトルの逆重畳を行った（図７６Ｄ）。生成物を０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した後、−８０℃で保存した。
【０５９３】
表３５では、Ｅ．コリ由来の精製されたＳｈＫ［２−３５］−Ｌ−Ｆｃに関するＩＣ５０データを、本発明の組成物の他の幾つかの実施形態と比較する。
【０５９４】
【表３６】
0005220915.tif 000132
【実施例５１】
【０５９５】
Ｅ．コリからのＳｈＫ（1−３５）−Ｌ−Ｆｃの精製
本明細書の上述の実施例１５に記載されているように入手された、冷凍したＥ．コリペースト（６５ｇ）を、室温の５０ｍＭトリスＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５の６６０ｍＬと合わせて、約０．１ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白色リゾチームへ添加した。懸濁したペーストを、冷却した微量液化装置へ、１２，０００ＰＳＩで２回通過させた。次に、４℃、１７，７００ｇで３０分間、細胞可溶化液を遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、６６０ｍＬの１％デオキシコール酸中にペレットを再懸濁した後、４℃、１７，７００ｇで３０分間遠心分離した。次に、組織粉砕機を使用して、６６０ｍＬの水中にペレットを再懸濁した後、４℃、１７，７００ｇで３０分間遠心分離した。次に、ペレット１３ｇを１３０ｍＬの８ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。次に、１ＭのＤＴＴ０．１ｍＬとともに、ペレット溶液１０ｍＬを、３７℃で６０分間温置した。４℃、２ｍＬ／分で、激しく撹拌しながら、再折りたたみ緩衝液（２Ｍ尿素、５０ｍＭトリス、１６０ｍＭアルギニンＨＣｌ、２．５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭシスタミンＨＣｌ、４ｍＭシステイン、ｐＨ８．５）１０００ｍＬへと、還元した材料を移した。次に、撹拌速度を低下させ、４℃で３日間、温置を続行した。
【０５９６】
再折りたたみ液を水1Ｌで希釈し、０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターでろ過した後、室内の３５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔカラム（内径２．６ｃｍ）で、８℃でＱ−緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）中の３５ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｑセファロース−ＦＦ（内径２．６ｃｍ）カラムへ１０ｍＬ／分で負荷した。負荷した後、Ｑセファロースカラムを回路から除去し、残存するクロマトグラフィーをＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔカラムで実施した。Ｑ−緩衝液Ａの数カラム容積でカラムを洗浄した後、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０への工程を使用して溶出した。望ましい生成物を含有する画分を８℃、５．０ｍＬ／分で、Ｓ−緩衝液Ａ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０）中の５．０ｍＬのＡｍｅｒｓｈａｍ  ＳＰ−セファロースＨＰカラムへと直ちに負荷した。次に、カラムをＳ−緩衝液Ａの数カラム容積で洗浄した後、５％から６０％までのＳ−緩衝液Ｂ（２０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の直線勾配の後、１００％Ｓ−緩衝液Ｂに至る工程を実施した。クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、画分を分析した。望ましい生成物のバルクを含有する画分をプールした。
【０５９７】
次に、１０ｋＤａメンブレンを有するＰａｌｌ  Ｊｕｍｂｏ−Ｓｅｐを使用して、Ｓ−プールを約１０ｍＬに濃縮した。次に、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５３分光光度計を使用して、７００μＬのＰＢＳ中に希釈した組み合わせたプール２０μＬに関して、スペクトル走査を実施した（図７７Ａ）。次に、３０，４０９ｇ／ｍｏｌの算出された分子量及び３６，９００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、材料の濃度が３．１ｍｇ／ｍＬであることを決定した。次に、クーマシーブリリアントブルー染色したトリス−グリシン４ないし２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、材料の純度を評価した（図７７Ｂ）。次に、２８０ｎｍでの吸光度を観察する、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．９中のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＢｉｏＳｅｐ  ＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）へと１ｍＬ／分で注入された生成物９３μｇに関して、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、生成物の巨大分子状態を測定した（図７７Ｃ）。次に、ＭＡＬＤＩ質量分析法による質量スペクトル分析へ、前記生成物を供した。試料プレート上で、ＭＡＬＤＩマトリクスシナピン酸とともに、試料の一定分量を点状滴下した。スペクトルを回収するために、窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ナノ秒パルス）を装備したＶｏｙａｇｅｒＤＥ−ＲＰ飛行時間質量分析計を使用した。２５ｋＶの加速電位で陽イオン／直線モードを使用した。約２００のレーザーショットから得られたデータを蓄積することによって、各スペクトルを得た（図７７Ｄ）。公知の分子量の精製されたタンパク質を使用して、外部質量較正を達成した。
【０５９８】
「ＳｈＫ［１−３５］−Ｌ−Ｆｃ」とも呼ばれる、Ｅ．コリ由来の精製されたＭｅｔ−ＳｈＫ（１−３５）−ＦｃによるヒトＫｖ１．３の遮断のためのＩＣ５０が、本明細書の上述の表３５に示されている。
【実施例５２】
【０５９９】
Ｋｖ１．３のＯｓＫ１−Ｌ−Ｆｃ阻害剤の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｇＲ−ｐｅｐ−Ｆｃであり、ＯｓＫ１−Ｌ−Ｆｃの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０６００】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０６０１】
【化５９】
0005220915.tif 000133
【０６０２】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【実施例５３】
【０６０３】
Ｋｖ１．３のＧｌｙ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ−Ｆｃ阻害剤の細菌での発現
細菌中でペプチボディをクローニング及び発現させる方法は、実施例３に記載されているとおりであった。使用されるベクターは、ｐＡＭＧ２１ａｍｇＲ−ｐｅｐ−Ｆｃであり、Ｇｌｙ−ＳｈＫ（１−３５）−Ｌ−Ｆｃの細菌中でのクローニング及び発現のための二本鎖（以下参照）を作製するために、以下に列挙されているオリゴを使用した。
【０６０４】
二本鎖を形成するために使用されるオリゴを以下に示す。
【０６０５】
【化６０】
0005220915.tif 000134
【０６０６】
ペプチボディの細菌での発現は、実施例３に記載されているとおりであり、ペーストを冷凍保存した。
【０６０７】
略語
本明細書を通じて使用される略語は、特異的な事情において別段の定義がなければ、以下に定義されるとおりである。
【０６０８】
Ａｃ              （アセチル化残基を指すのに使用される）アセチル
ＡｃＢｐａ          アセチル化ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＡＤＣＣ            抗体依存的な細胞傷害性
Ａｉｂ              アミノイソブチル酸 
ｂＡ                β−アラニン
Ｂｐａ              ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン
ＢｒＡｃ            ブロモアセチル（ＢｒＣＨ２Ｃ（Ｏ））
ＢＳＡ              ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ              ベンジル
Ｃａｐ              カプロン酸
ＣＯＰＤ            慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＬ              細胞傷害性Ｔリンパ球
ＤＣＣ              ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｄｅ              １−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）エチル
ＥＳＩ−ＭＳ        電子スプレーイオン化質量分析法
Ｆｍｏｃ            フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ            １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ            高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＬ              ホモセリンラクトン
ＩＢ                封入体
ＫＣａ              （ＩＬＣａ、ＢＫＣａ、ＳＫＣａを含む）カルシウム活性化カリウムチャネル
Ｋｖ                電位開口型カリウムチャネル
Ｌａｕ              ラウリン酸
ＬＰＳ              リポ多糖
ＬＹＭＰＨ          リンパ球
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ    マトリクス介助レーザーデソープションイオン化質量分析法
Ｍｅ                メチル
ＭｅＯ              メトキシ
ＭＨＣ              主要組織適合遺伝子複合体
ＭＭＰ              マトリクスメタロプロテアーぜ
１−Ｎａｐ          １−ナフチルアラニン
ＮＥＵＴ            好中球
Ｎｌｅ              ノルロイシン
ＮＭＰ              Ｎ−メチル−２−ピロリジノン
ＰＡＧＥ            ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ            末梢血単核細胞
ＰＢＳ              リン酸緩衝塩類溶液 
Ｐｂｆ              ２，２，４，６，７−ペンダメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＣＲ              ポリメラーゼ連鎖反応
Ｐｅｃ              ピペコリン酸
ＰＥＧ              ポリ（エチレングリコール）
ｐＧｌｕ            ピログルタミン酸
Ｐｉｃ              ピコリン酸
ｐＹ                ホスホチロシン
ＲＢＳ              リボソーム結合部位
ＲＴ                室温（２５℃）
Ｓａｒ              サルコシン
ＳＤＳ              ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＴＫ              セリン−トレオニンキナーゼ
ｔ−Ｂｏｃ          ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ｔＢｕ              ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＨＦ              胸腺体液性因子
Ｔｒｔ              トリチル
【図１Ａ】
0005220915.tif 000135
【図１Ｂ】
0005220915.tif 000136
【図１Ｃ】
0005220915.tif 000137
【図１Ｄ】
0005220915.tif 000138
【図１Ｅ】
0005220915.tif 000139
【図１Ｆ】
0005220915.tif 000140
【図２Ａ】
0005220915.tif 000141
【図２Ｂ】
0005220915.tif 000142
【図２Ｃ】
0005220915.tif 000143
【図３Ａ】
0005220915.tif 000144
【図３Ｂ】
0005220915.tif 000145
【図４Ａ】
0005220915.tif 000146
【図４Ｂ】
0005220915.tif 000147
【図５Ａ】
0005220915.tif 000148
【図５Ｂ】
0005220915.tif 000149
【図６Ａ】
0005220915.tif 000150
【図６Ｂ】
0005220915.tif 000151
【図７Ａ】
0005220915.tif 000152
【図７Ｂ】
0005220915.tif 000153
【図８】
0005220915.tif 000154
【図９】
0005220915.tif 000155
【図１０】
0005220915.tif 000156
【図１１Ａ】
0005220915.tif 000157
【図１１Ｂ】
0005220915.tif 000158
【図１１Ｃ】
0005220915.tif 000159
【図１１Ｄ】
0005220915.tif 000160
【図１２Ａ】
0005220915.tif 000161
【図１２Ｂ】
0005220915.tif 000162
【図１２Ｃ】
0005220915.tif 000163
【図１２Ｄ】
0005220915.tif 000164
【図１２Ｅ】
0005220915.tif 000165
【図１２Ｆ】
0005220915.tif 000166
【図１２Ｇ】
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【図１３Ａ】
0005220915.tif 000168
【図１３Ｂ】
0005220915.tif 000169
【図１３Ｃ】
0005220915.tif 000170
【図１４Ａ】
0005220915.tif 000171
【図１４Ｂ】
0005220915.tif 000172
【図１５Ａ】
0005220915.tif 000173
【図１５Ｂ】
0005220915.tif 000174
【図１６Ａ】
0005220915.tif 000175
【図１６Ｂ】
0005220915.tif 000176
【図１７】
0005220915.tif 000177
【図１８】
0005220915.tif 000178
【図１９】
0005220915.tif 000179
【図２０Ａ】
0005220915.tif 000180
【図２０Ｂ】
0005220915.tif 000181
【図２１】
0005220915.tif 000182
【図２２Ａ】
0005220915.tif 000183
【図２２Ｂ】
0005220915.tif 000184
【図２３】
0005220915.tif 000185
【図２４Ａ】
0005220915.tif 000186
【図２４Ｂ】
0005220915.tif 000187
【図２５Ａ】
0005220915.tif 000188
【図２５Ｂ】
0005220915.tif 000189
【図２６Ａ】
0005220915.tif 000190
【図２６Ｂ】
0005220915.tif 000191
【図２６Ｃ】
0005220915.tif 000192
【図２６Ｄ】
0005220915.tif 000193
【図２７Ａ】
0005220915.tif 000194
【図２７Ｂ】
0005220915.tif 000195
【図２７Ｃ】
0005220915.tif 000196
【図２７Ｄ】
0005220915.tif 000197
【図２７Ｅ】
0005220915.tif 000198
【図２７Ｆ】
0005220915.tif 000199
【図２７Ｇ】
0005220915.tif 000200
【図２７Ｈ】
0005220915.tif 000201
【図２７Ｉ】
0005220915.tif 000202
【図２７Ｊ】
0005220915.tif 000203
【図２７Ｋ】
0005220915.tif 000204
【図２７Ｌ】
0005220915.tif 000205
【図２８Ａ】
0005220915.tif 000206
【図２８Ｂ】
0005220915.tif 000207
【図２８Ｃ】
0005220915.tif 000208
【図２８Ｄ】
0005220915.tif 000209
【図２９Ａ】
0005220915.tif 000210
【図２９Ｂ】
0005220915.tif 000211
【図２９Ｃ】
0005220915.tif 000212
【図２９Ｄ】
0005220915.tif 000213
【図２９Ｅ】
0005220915.tif 000214
【図２９Ｆ】
0005220915.tif 000215
【図２９Ｇ】
0005220915.tif 000216
【図２９Ｈ】
0005220915.tif 000217
【図３０Ａ】
0005220915.tif 000218
【図３０Ｂ】
0005220915.tif 000219
【図３０Ｃ】
0005220915.tif 000220
【図３０Ｄ】
0005220915.tif 000221
【図３１Ａ】
0005220915.tif 000222
【図３１Ｂ】
0005220915.tif 000223
【図３１Ｃ】
0005220915.tif 000224
【図３２Ａ】
0005220915.tif 000225
【図３２Ｂ】
0005220915.tif 000226
【図３３Ａ】
0005220915.tif 000227
【図３３Ｂ】
0005220915.tif 000228
【図３４Ａ】
0005220915.tif 000229
【図３４Ｂ】
0005220915.tif 000230
【図３５Ａ】
0005220915.tif 000231
【図３５Ｂ】
0005220915.tif 000232
【図３６Ａ】
0005220915.tif 000233
【図３６Ｂ】
0005220915.tif 000234
【図３７Ａ】
0005220915.tif 000235
【図３７Ｂ】
0005220915.tif 000236
【図３８Ａ】
0005220915.tif 000237
【図３８Ｂ】
0005220915.tif 000238
【図３９Ａ】
0005220915.tif 000239
【図３９Ｂ】
0005220915.tif 000240
【図３９Ｃ】
0005220915.tif 000241
【図４０Ａ】
0005220915.tif 000242
【図４０Ｂ】
0005220915.tif 000243
【図４０Ｃ】
0005220915.tif 000244
【図４０Ｄ】
0005220915.tif 000245
【図４１Ａ】
0005220915.tif 000246
【図４１Ｂ】
0005220915.tif 000247
【図４１Ｃ】
0005220915.tif 000248
【図４１Ｄ】
0005220915.tif 000249
【図４２Ａ】
0005220915.tif 000250
【図４２Ｂ】
0005220915.tif 000251
【図４３Ａ】
0005220915.tif 000252
【図４３Ｂ】
0005220915.tif 000253
【図４４Ａ】
0005220915.tif 000254
【図４４Ｂ】
0005220915.tif 000255
【図４５Ａ】
0005220915.tif 000256
【図４５Ｂ】
0005220915.tif 000257
【図４６】
0005220915.tif 000258
【図４７】
0005220915.tif 000259
【図４８】
0005220915.tif 000260
【図４９Ａ】
0005220915.tif 000261
【図４９Ｂ】
0005220915.tif 000262
【図４９Ｃ】
0005220915.tif 000263
【図４９Ｄ】
0005220915.tif 000264
【図５０Ａ】
0005220915.tif 000265
【図５０Ｂ】
0005220915.tif 000266
【図５０Ｃ】
0005220915.tif 000267
【図５０Ｄ】
0005220915.tif 000268
【図５１Ａ】
0005220915.tif 000269
【図５１Ｂ】
0005220915.tif 000270
【図５１Ｃ】
0005220915.tif 000271
【図５１Ｄ】
0005220915.tif 000272
【図５２Ａ】
0005220915.tif 000273
【図５２Ｂ】
0005220915.tif 000274
【図５２Ｃ】
0005220915.tif 000275
【図５２Ｄ】
0005220915.tif 000276
【図５３Ａ】
0005220915.tif 000277
【図５３Ｂ】
0005220915.tif 000278
【図５４Ａ】
0005220915.tif 000279
【図５４Ｂ】
0005220915.tif 000280
【図５５Ａ】
0005220915.tif 000281
【図５５Ｂ】
0005220915.tif 000282
【図５６Ａ】
0005220915.tif 000283
【図５６Ｂ】
0005220915.tif 000284
【図５７Ａ】
0005220915.tif 000285
【図５７Ｂ】
0005220915.tif 000286
【図５８Ａ】
0005220915.tif 000287
【図５８Ｂ】
0005220915.tif 000288
【図５９】
0005220915.tif 000289
【図６０】
0005220915.tif 000290
【図６１】
0005220915.tif 000291
【図６２】
0005220915.tif 000292
【図６３】
0005220915.tif 000293
【図６４Ａ】
0005220915.tif 000294
【図６４Ｂ】
0005220915.tif 000295
【図６５Ａ】
0005220915.tif 000296
【図６５Ｂ】
0005220915.tif 000297
【図６６Ａ】
0005220915.tif 000298
【図６６Ｂ】
0005220915.tif 000299
【図６７Ａ】
0005220915.tif 000300
【図６７Ｂ】
0005220915.tif 000301
【図６８Ａ】
0005220915.tif 000302
【図６８Ｂ】
0005220915.tif 000303
【図６９Ａ】
0005220915.tif 000304
【図６９Ｂ】
0005220915.tif 000305
【図７０】
0005220915.tif 000306
【図７１】
0005220915.tif 000307
【図７２】
0005220915.tif 000308
【図７３】
0005220915.tif 000309
【図７４】
0005220915.tif 000310
【図７５Ａ】
0005220915.tif 000311
【図７５Ｂ】
0005220915.tif 000312
【図７５Ｃ】
0005220915.tif 000313
【図７５Ｄ】
0005220915.tif 000314
【図７５Ｅ】
0005220915.tif 000315
【図７５Ｆ】
0005220915.tif 000316
【図７５Ｇ】
0005220915.tif 000317
【図７５Ｈ】
0005220915.tif 000318
【図７６Ａ】
0005220915.tif 000319
【図７６Ｂ】
0005220915.tif 000320
【図７６Ｃ】
0005220915.tif 000321
【図７６Ｄ】
0005220915.tif 000322
【図７７Ａ】
0005220915.tif 000323
【図７７Ｂ】
0005220915.tif 000324
【図７７Ｃ】
0005220915.tif 000325
【図７７Ｄ】
0005220915.tif 000326
【配列表】
0005220915000001.app