(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒色腫の肺転移を抑制するための医薬の製造における、ＣＴＬＡ−４の信号を遮断する作用を有する抗−ＣＴＬＡ−４抗体、及び自己抗原調製物である照射腫瘍細胞ワクチンの組み合わせ使用。
【請求項２】
前記医薬の製造においてサイトカインの使用をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記サイトカインは、サイトカイン導入された腫瘍細胞として提供される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項２又は３に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬はヒトを治療するためのものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
自己抗原調製物である照射腫瘍細胞ワクチンとともに、ＣＴＬＡ−４の信号を遮断する作用を有する抗−ＣＴＬＡ−４抗体を含む、黒色腫の肺転移を抑制するための医薬組成物。
【請求項９】
サイトカインをさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記サイトカインは、サイトカイン導入された腫瘍細胞として提供される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ヒトを治療するためのものである、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体は、ヒト化抗体である、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
以下の：
ＣＴＬＡ−４の信号を遮断する作用を有する抗−ＣＴＬＡ−４抗体を含む成分Ａ、及び
自己抗原調製物である照射腫瘍細胞ワクチンを含む成分Ｂ、
を含む、黒色腫の肺転移を抑制するためのキットであって、ここで、該抗−ＣＴＬＡ−４抗体と、該自己抗原調製物は、順次、使用される、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、国立健康研究所（ＮＩＨ）から授与された契約Nos. CA 40041 及びCA 09179 の下で政府援助を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】関連出願の相互参照
本出願は、米国暫定特許出願No .60/110,761 の一部継続であり、1996 年12月4 日に出願された米国特許出願No.08/760,288の一部継続である。
【０００３】序論
免疫治療を実行に移すことは入間の疾患の治療における極めて望ましいゴールである。そこでは通常の薬の使用では滅多に見られない作用の特異性が期待できる。免疫治療の基本は、免疫応答を操作すること、特にＴ細胞の応答を操作することである。Ｔ細胞は、その相互作用をコントロールする複雑で微妙なシステムを有し、多数のレセプター及び可溶性因子をそのプロセスで利用する。特定の信号が免疫応答に及ぼす影響は、関与する諸因子、レセプター、及び対抗レセプター、によって変化する。
【０００４】  Ｔ細胞の完全な活性化のためには、Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）を通しての抗原特異的な信号だけでなく、ＣＤ２８などの共同刺激的な表面分子を通しての別の信号も必要である。ＣＤ２８のリガンドはＢ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）タンパク質であり、これらは抗原提示細胞、例えば樹状細胞、活性化Ｂ細胞、又は単核細胞、で発現される。このような共同刺激的な信号が存在しない場合、抗原によるＴ細胞の刺激は非生産的なＴ細胞刺激又はＴ細胞寛容性を生ずることがある。例えば、腫瘍細胞がＢ７を発現できないことは、生産的な免疫応答を誘発できない一因になる。
【０００５】  応答をダウンレギュレートする経路は、活性化に必要な経路と同じよちに重要である。末梢Ｔ細胞の寛容性につながる胸腺の教育は特定の抗原に対する免疫応答を阻止する一つのメカニズムである。抑制的なサイトカインの分泌など、他のメカニズムも知られている。最近では、ＣＴＬＡ−４が、Ｂ７の第二のＴ細胞対抗レセプターとして同定され、Ｔ細胞応答を減少させるのに決定的な役割を演ずるということが今では分かっている。Thompson and Allison, Immunity 7:445-450 (1997)。
【０００６】  免疫原性のない、又は免疫原性が弱い腫瘍は特に問題になる。抗原の不在、又は効果のない変化した抗原又はウイルス抗原は、抗原特異的なＴ細胞応答の活性化を妨げ、腫瘍が無制限に増殖することを許す。このタイプの腫瘍細胞に対して細胞毒性のある免疫応答を備えようとする戦略にとっては、正常な細胞にも腫瘍細胞にも存在する自己抗原に対する体の自然な免疫寛容性が厄介なものになる。したがって、効果的な細胞毒性のあるＴ細胞応答を備えるためには、この免疫寛容性に打ち勝つことが必要になるであろう。しかし、今日まで、免疫寛容性をうち破って自己反応的なＴ細胞を刺激する安全で効果的な方法はまだ考案されていない。
【０００７】  感染症及び腫瘍の治療において、共同刺激に関与するレセプターの操作によって強い細胞免疫応答を活性化させることができれば有益であろう。望ましい自己抗原に対する免疫寛容性に打ち勝つことができればさらに有利になる。
抗腫瘍免疫を媒介するＢ７タンパク質の利用は、Chen et al., (1992) Cell 71:1093-1102 及び Townsend and Allison (1993) Science 259:368 に記述されている。Schwartz (1992) Cell 71:1065 は、ＣＤ２８，ＣＴＬＡ−４及びＢ７のＩＬ−２産生と免疫治療における役割を概観している。Harding et al. (1994) Nature 356:607-609 は、ＣＤ２８で媒介される信号がマウスＴ細胞を共同刺激し、Ｔ細胞クローンにおけるアネルギーの誘発を阻止することを示している。
【０００８】  ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞表面の分子であって、最初はマウスの細胞溶解Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの差分スクリーニングで同定された、Brunet et al., (1987) Nature 328:267-270。Ｂ７の第二のレセプターとしてのＣＴＬＡ−４の役割は、Linsley et al., (1991) J. Exp. Med. 174:561-569 で論じられている。Freeman et al. (1993) Science 262:907-909 は、Ｂ７欠乏マウスにおけるＣＴＬＡ−４を論じている。ＣＴＬＡ−４のリガンドは、Lenschow et al. (1993) P.N.A.S. 90: 11054-11058 に記述されている。
【０００９】  Linsley et al. (1992) Science 257:792-795 は、ＣＴＬＡ−４の可溶形態によるin vivo での免疫抑制を記述している。Lenschow et al. (1992) Science 257: 789-792 はＣＴＬＡ−４Ｉｇによって誘発される膵臓小島移植片の長期生存を論じている。Walunas et al. (1994) Immunity 1: 405-413 には、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞活性化の負の調節因子として機能する可能性が示唆されている。Thompson and Allison, Immunity 7: 445-450 (1997)は、ＣＴＬＡ−４がＴ細胞応答を減少させる役目をしていることを示唆するデータの累積を概観している。
発明の要約
ＣＴＬＡ−４信号を遮断して自己抗原に対しＴ細胞を刺激して応答させる方法及び組成物が提供される。免疫寛容性に打ち勝って自己抗原に対するＴ細胞応答を強化する共同刺激戦略として、ＣＴＬＡ−４遮断薬が自己抗原調剤及びオプションで加えられる免疫応答刺激物質と組み合わせられる。この応答強化は、免疫原性のない又は免疫原性が弱い腫瘍、ならびに選択的な組織切除を必要とする他の医学的状態の治療に有益である。
【００１０】  本発明の一つの態様では、ＣＴＬＡ−４遮断薬が問題とする腫瘍の腫瘍細胞ワクチンを含む自己抗原調剤と組み合わせられる。特に好ましいある実施形態では、この腫瘍細胞ワクチンは、顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＦＳ）などのサイトカインを発現し、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）によるクロス・プライミングを強化するように形質導入された照射腫瘍細胞を含む。あるいはまた、精製された自己抗原又は自己抗原の混合物をＣＴＬＡ−４遮断薬と、単独で又は抗原性補強剤又は樹枝状細胞など他の免疫応答刺激物質と一緒に、組み合わせることもできる。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する参照データベース
ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡシーケンスは、Genbank 受入れ番号L15006である。アミノ酸１−３７の領域はリーダー・ペプチドである；３８−１６１は細胞外Ｖ状ドメインである；１６２−１８７は膜横断ドメインである；そして、１８８−２２３は細胞質ドメインである。ヌクレオチド・シーケンスの変異体が報告されており、例えばポジション４９におけるＧからＡへの転位、ポジション２７２におけるＣからＴへの転位、ポジション４３９におけるＡからＧへの転位、などである。マウスＣＴＬＡ−４の完全なＤＮＡシーケンスはＥＭＢＬ受入れ番号X05719 である（Brunet et al. (1987) Nature 328:267-270）。アミノ酸１−３５の領域がリーダー・ペプチドである。
【００１１】  ヒトＢ７−１（ＣＤ８０）の完全なＤＮＡシーケンスは、Genbank 受入れ番号X 60958 である；マウス・シーケンスの 受入れ番号はX 60958 である；ラットのシーケンスの 受入れ番号はU 05593 である。ヒトＢ７−２（ＣＤ８６）の完全なｃＤＮＡシーケンスはGenbank 受入れ番号L25259 である; マウスのシーケンスのGenbank 受入れ番号はL25606 である。
【００１２】  ＣＤ２８をコードする遺伝子は詳しく調べられている。ニワトリｍＲＮＡシーケンスはGenbank 受入れ番号X67915 である。ラットｍＲＮＡシーケンスはGenbank 受入れ番号X55258 である。ヒトｍＲＮＡシーケンスはGenbank 受入れ番号J02988 である。マウスｍＲＮＡシーケンスはGenbank 受入れ番号M34536である。
発明の詳細な説明
自己抗原に対するＴ細胞の応答を刺激する方法及びそのための組成物が提供される。既存の自己反応的なＴ細胞及び／又は新しいＴ細胞を自己抗原に応答するように活性化する共同刺激戦略にＣＴＬＡ−４遮断薬を用いて、免疫寛容性を選択的に阻害する。自己抗原調剤を問題の遮断薬と共に投与して自己反応的な末梢Ｔ細胞応答を刺激する。好ましい自己抗原調剤としては、精製されたタンパク質、腫瘍細胞からの溶解産物、又は照射された腫瘍細胞を含む腫瘍ワクチン、などがある。特に興味があるのは、抗原提示細胞を刺激するサイトカイン、例えば、顆粒細胞−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、又は顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、をコードする遺伝子など、問題の遺伝子を形質導入された腫瘍ワクチンである。その他の別な共同刺激戦略は本明細書で詳しく記述される。本発明は、免疫原性が弱い又は免疫原性がない腫瘍の治療、ならびに組織切除方法一般に有用である。
【００１３】  本治療法はＴ細胞をＣＴＬＡ−４によって媒介される抑制信号から解放する。ＣＴＬＡ−４エンゲージメントは効果的なＴ細胞活性化に必要な信号レベルを上げることによってＴ細胞応答をダウンレギュレートする、あるいは進行しているＴ細胞応答を停止させるのにも一役買っているかもしれない、と考えられている。抗原及び共同刺激的なＣＤ２８信号に対するＴ細胞応答は、したがって、ＣＴＬＡ−４遮断薬の存在によってアップレギュレートされる。適当な共同刺激戦略で用いられる場合、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、低結合活性の自己反応的Ｔ細胞及び／又は新しいＴ細胞を刺激して自己抗原に応答させる。本発明の方法は、刺激されないＴ細胞の一般的な増殖を促進しない。
【００１４】  本発明の方法は、意図した目的でのＴ細胞に媒介される応答が不十分である場合に有効である。In vivoのＴ細胞媒介応答としては、細胞溶解Ｔ細胞の発生、及び多数の抗体反応、特に免疫グロブリン・インタイプのクラススイッチングに関わるもの、がある。抗原刺激としては、感染した細胞上のウイルス抗原の存在；不自然な状況でタンパク質又はタンパク質の組み合わせを発現する腫瘍細胞；寄生的な又はバクテリアの感染；免疫化、例えばワクチン接種、モノクローナル抗体の調製、などがある。本発明の方法は、in vitro で、培養されたＴ細胞の抗原に対する応答を高めるのに用いられる。このような活性化されたＴ細胞は、養子免疫治療、活性化のメカニズムの研究、薬剤スクリーニング、などに利用される。
【００１５】  抗原に対する宿主Ｔ細胞の応答の欠如で特徴づけられる状況には、慢性的感染、腫瘍、ペプチド・ワクチンによる免疫化、などがある。本発明のＣＴＬＡ−４遮断薬をこれらの宿主に投与すると、活性化されるＴ細胞の表現型が特異的に変化し、抗原に媒介される活性化への応答を高める。霊長類、特にヒト、の治療に特に興味があるが、他の哺乳類、特に、ウマ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ウサギ、などの家畜、にもこの治療は有益であろう。
【００１６】  この調合物は、抗原刺激に対するＴ細胞の応答を高めるのに有効な量で投与される。活性化されたＴ細胞の応答の方が、休止しているＴ細胞よりもこの治療によって大きく影響される。Ｔ細胞応答の決定は、治療されている状態によって異なる。Ｔ細胞の活性の有効な尺度としては、増殖、サイトカインの放出、例えばＩＬ−２、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａなど；ＣＤ２５及びＣＤ６９などのマーカーのＴ細胞発現；及び当業者に公知のＴ細胞活性のその他の尺度、がある。
【００１７】  ＣＴＬＡ−４遮断薬の選択と調製
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、ＣＴＬＡ−４タンパク質の細胞外ドメインと特異的に結合してＣＴＬＡ−４がその対抗レセプター、例えばＣＤ８０，ＣＤ８６、などとの結合をブロックする分子である。通常、遮断薬の結合親和度は少なくとも約100 μＭになる。遮断薬は、ＣＴＬＡ−４に関連した分子、例えばＣＤ２８や免疫グロブリンのスーパーファミリーの他のメンバー、と実質的に反応しない。したがって、ＣＤ８０及びＣＤ８６などの分子は遮断薬から除外される。さらに、遮断薬はＣＴＬＡ−４の信号を活性化しない。これは一価又は二価の結合分子によって適当に達成される。いろいろな分子の間の相互反応性及び競合についての以下の議論は同じ種を起源とする分子に関するもの、例えばヒトのＣＴＬＡ−４はヒトのＣＤ８０及び８６に結合する、等、を意図していることは当業者には明らかであろう。
【００１８】  遮断薬の候補がこの規準に合致できるかどうかスクリーニングされる。結合の親和度及び特異性を決定する分析は、競合的及び非競合的分析を含め、当業者には公知である。関心がある分析としてはＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、などがある。結合分析は精製又は半精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質を用いるか、あるいはＣＴＬＡ−４を発現するＴ細胞、例えばＣＴＬＡ−４の発現構築物を形質移入された細胞；ＣＤ３とＣＤ２８のクロス・リンキングによって刺激されたＴ細胞；照射された同種異系細胞の添加、などを用いることもできる。結合分析の一例としては、精製されたＣＴＬＡ−４タンパク質が不溶性のサポート、例えばマイクロタイタ・プレート、磁気ビーズ、などに結合されるものがある。遮断薬候補及び可溶の、標識されたＣＤ８０又はＣＤ８６が細胞に加えられ、結合しない成分が洗い流される。遮断薬がＣＤ８０及びＣＤ８６と競合してＣＴＬＡ−４と結合する能力が、結合した標識ＣＤ８０又はＣＤ８６の定量化によって決定される。遮断薬がＣＤ２８と相互結合しないという確認は同様な分析で、ＣＴＬＡ−４の代わりにＣＤ２８を用いて行うことができる。適当な分子は、ＣＴＬＡ−４に対してよりもＣＤ２８に対して結合性が少なくとも約103 小さい、普通は結合性が少なくとも約104 小さいものである。
【００１９】  一般に、可溶の一価又は二価の結合分子はＣＴＬＡ−４の信号を活性化しない。Ｔ細胞活性化を検出する機能的分析を用いて確認することができる。例えば、遮断薬候補の存在下又は不在下で、ＣＤ８０又はＣＤ８６を発現する照射された同種異系細胞によってＴ細胞の集団を刺激することができる。ＣＴＬＡ−４の信号を遮断する物質は、増殖及び細胞サイクルの進行、ＩＬ−２の放出、ＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーション、などによって測定されるＴ細胞活性化の増加を生ずる。細胞表面での発現、リポゾームへのパッケージング、粒子又はウエルへの付着、などは分子の実効原子価を増加させるということは当業者には理解されるであろう。
【００２０】  遮断薬は、ペプチド、小さな有機分子、ペプチド類似体、可溶Ｔ細胞レセプター、抗体、などである。抗体が遮断薬としては好ましい。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい；無傷でも先端が切れたものでも、例えばＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、でもよい；同種、異種、同系、又はその修飾された形態、例えばヒト化されたもの、キメラなど、でもよい。
【００２１】  多くの場合、遮断薬はオリゴペプチド、例えば抗体又はその断片、などであるが、比較的高い特異性と親和性を与える他の分子も用いることができる。組み合わせライブラリーは、必要な結合特性を有するオリゴペプチド以外の化合物を提供する。一般に、親和度は、少なくとも約10-6 、普通は約10-8 Ｍ、すなわち、特異的モノクローナル抗体で通常見られるような結合親和度、である。
【００２２】  遮断薬に関してはいくつかのスクリーニング分析が利用できる。この分析の成分には、普通、ＣＴＬＡ−４タンパク質が含まれ；オプションとしてＣＴＬＡ−４活性化物質、例えばＣＤ８０、ＣＤ８６，など、が含まれる。分析混合物にはまた、候補の薬理物質も含まれる。一般に、複数の分析混合物が異なる薬物濃度で平行して分析され、いろいろな濃度での異なる応答が得られる。普通、これらの濃度の一つがネガティブ対照として用いられる、すなわち、ゼロ濃度又は検出レベルより低い濃度で分析される。
【００２３】  これらの分析では、一つ以上の分子が適当にラベルに結合され、ラベルは直接又は間接に検出できる信号を提供できる。いろいろなラベルがあり、例えば放射性同位元素、蛍光、化学ルミネッセンス、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子、などが含まれる。特異的結合分子には、対になるもの、例えばビオチンとストレプタビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン、などがある。特異的結合メンバーでは、通常、相補的メンバーが検出を可能にする分子によって公知の手順でラベルされる。
【００２４】  一つの興味あるスクリーニング分析は対抗レセプターによってＣＴＬＡ−４の活性化を妨げる物質に向けられる。活性化の定量は当業者には公知のいくつかの方法で遂行できる。例えば、Ｔ細胞の活性化の阻害は、細胞の増殖、サイトカインの放出、などを定量化することによって決定できる。
興味ある他の分析は、ＣＴＬＡ−４と対抗レセプターとの結合を阻害する物質に向けられる。分析混合物は、少なくとも天然の対抗レセプターの一部、又は特異的な結合を可能にするに十分なシーケンス類似性を共有するオリゴペプチド、及び候補の薬理物質を含む。オリゴペプチドは分析の条件と必要に叶うどんな長さでも良いが、通常は長さが少なくとも約８ａａであり、タンパク質又はその融着の全長までにわたる。ＣＴＬＡ−４は不溶な基質にも結合できる。基質は様々な物質及び形で、例えば、マイクロタイタ・プレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子、などに作ることができる。基質は、バックグラウンドを最小にし、信号対雑音比を最大にするように選ばれる。結合は、当業者には公知のいろいろな方法で定量化できる。結合が平衡に到達するに十分なインキュベーション期間の後、不溶サポートを洗浄し、残ったラベルを定量する。結合を妨げる物質は検出されるラベルを減少させる。
【００２５】  候補物質は多数の化学物質クラスを包含するが、典型的には有機分子であり、好ましくは分子量が50を超え2500 ダルトン未満の小さな有機化合物である。候補物質は、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合、に必要な官能基を備え、普通、少なくとも一つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、スルフヒドリル又はカルボキシル基、を含み、好ましくは少なくとも二つの化学官能基を含む。候補物質は、しばしば環式の炭素又は複素環式構造及び／又は芳香族又はポリアロマティック構造で一つ以上の上記官能基で置換されたものを含む。候補物質は、また、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、などの生分子、又はそれらの誘導体、構造的類似体、又は組み合わせ、の間に見出される。
【００２６】  候補物質は、合成又は天然の化合物のライブラリーなど、いろいろな源から得られる。例えば、多数の手段が、ランダムなオリゴヌクレオチドの発現を含め、いろいろな有機化合物や生分子のランダム合成及び有向合成に利用できる。あるいはまた、バクテリア、菌類、植物及び動物の抽出物という形で天然化合物のライブラリーが利用できる、又は容易に生産できる。さらに、天然又は合成で産生されるライブラリーや化合物は、通常の化学的、物理的、及び生化学的な手段で容易に修飾される。既知の薬理的な物質にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの有向又はランダムな化学的修飾を加えて構造的類似体を生成することができる。
【００２７】  他のいろいろな物質をスクリーニング分析に含めることができる。これらは、塩などの試薬、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗剤、等、最適なタンパク質−ＤＮＡ結合を助けるために及び／又は非特異的な又はバックグラウンド相互作用を減らすために利用されるものを含む。また、別の仕方で分析の効率を高める試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、抗菌物質、等も用いることができる。
【００２８】  遮断薬として用いるのに適当な抗体は宿主動物をＣＴＬＡ−４タンパク質の全部又は一部を含むペプチドで免疫することによって得られる。適当な宿主動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギ、等がある。タンパク質免疫原の元はマウス、ヒト、ラット、サル、等である。宿主動物は一般に免疫原とは異なる種とする、例えば、マウスＣＴＬＡ−４を用いてハムスターを免疫し、ヒトＣＴＬＡ−４を用いてマウスを免疫する、などである。ヒト及びマウスＣＴＬＡ−４は、細胞外ドメインに極めて保存的な部分を含んでいる（Harper et al. (1991) J.Immunol. 147: 1037-1044）。この極めて保存的な領域から得られるペプチドを免疫原として用いて交差特異的な抗体を生成できる。
【００２９】  免疫原は、完全なタンパク質、又はその断片及び誘導体を含む。好ましい免疫原は、ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン（アミノ酸残基３８−１６１）の全部又は一部を含み、これらの残基は自生ＣＴＬＡ−４で見られる翻訳後の修飾、糖鎖形成など、を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当業者に公知のいろいろな仕方で、例えば、通常の組み換え法によるクローニングされた遺伝子の発現、Ｔ細胞からの単離、高レベルのＣＴＬＡ−４を発現する選別された細胞集団、などによって生産される。
【００３０】  組み換え又は修飾されたタンパク質の発現が望まれる場合、ＣＴＬＡ−４の所望部分をコードするベクターが用いられる。一般に、発現ベクターは、ＣＴＬＡ−４分子の細胞外ドメインが形質移入された細胞の表面にあるように、あるいはまた、細胞外ドメインが細胞から分泌されるように設計される。細胞外ドメインを分泌させる場合、その細胞外ドメインをコードするシーケンスが、フレームで、信号ペプチドを含め、分泌を許すシーケンスと融合される。信号ペプチドは外生又は自生である。免疫化で興味がある融合タンパク質はＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを免疫グロブリンの定常領域に結合する。例えば、マウスＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインをヒトＣｇＩの蝶番部（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインに結合した融合タンパク質を用いてハムスターを免疫することができる。
【００３１】  ＣＴＬＡ−４を細胞の表面で発現させようとする場合、その細胞外ドメインのコーディング・シーケンスは、フレームで、細胞外ドメインを膜にアンカーするペプチドをコードするシーケンス及び信号シーケンスと融合される。このようなアンカー・シーケンスには自生ＣＴＬＡ−４の膜横断ドメイン、又は他の細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４，ＣＤ８，ｓＩｇ、などの膜横断ドメイン、が含まれる。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を形質移入されたマウス細胞を用いてマウスを免疫し、ヒトＣＴＬＡ−４タンパク質に特異的な抗体を生成することができる。
【００３２】  モノクローナル抗体は通常の方法で生産される。一般に、免疫された宿主動物の脾臓及び／又はリンパ節が形質細胞の源になる。形質細胞は骨髄腫細胞との融合によって不死化されて雑種細胞を生成する。個々の雑種細胞からの培養上澄みを標準的な方法でスクリーニングして所望の特異性を有する抗体を生成するものを同定する。ヒト・タンパク質に対するモノクローナル抗体を生産するのに適した動物は、マウス、ラット、ハムスターなどである。マウスのタンパク質に対する抗体を生産する場合、動物は一般にハムスター、モルモット、ウサギ、などである。抗体は、雑種細胞の上澄み又は腹水から通常の方法によって精製できる、例えば、不溶サポート、プロテインＡセファロースなど、に結合したＣＴＬＡ−４を用いるアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製できる。
【００３３】  抗体は、通常のマルチマー構造でなく単一鎖として生成できる。単一鎖抗体はJost et al. (1994) J.B.C. 269: 26267-73、その他に記述されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡシーケンスが、小さな中性アミノ酸、グリシン及び／又はセリンを含む少なくとも約４つのアミノ酸をコードするスペーサーに結紮される。この融合によってコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性と親和性を保持する機能的な可変領域の組み合わせを可能にする。
【００３４】  in vivo で、特に人間への注射に利用するためには、遮断薬の抗原性を減少させることが必要である。遮断薬に対するレシピエントの免疫応答は、治療が効果的である期間を減少させる可能性がある。抗体を人間化する方法は当業者には公知である。人間化された抗体は遺伝子導入されたヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物かもしれない（例えば、国際特許出願 WO 90/10077 及び WO 90/04036 を見よ）。あるいはまた、問題の抗体は組み換えＤＮＡ法によって、ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３，蝶番ドメイン、及び／又はフレームワーク・ドメイン、を対応するヒト・シーケンスで置換することによって構築することができる（WO 92/02190 を見よ）。
【００３５】  キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築にＩｇｃＤＮＡを用いることは当業者には公知である（Liu et al. (1987) P. N. A. S.84: 3439 及び(1987) J. Immunol. 139: 3521）。ｍＲＮＡが雑種細胞又は抗体を産生するその他の細胞から単離され、それを用いてｃＤＮＡが生成される。問題のｃＤＮＡは、特定プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第4,683,195 及び4,683,202 号）。あるいはまた、ライブラリーを作成し、スクリーニングして問題のシーケンスを単離することもできる。抗体の可変領域をコードするＤＮＡシーケンスは、次にヒトの定常領域シーケンスに融合される。ヒトの定常領域遺伝子のシーケンスはKabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. N. I. H. Publication no. 91-3242 で見られる。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプの選択は所望のエフェクター機能、例えば補体結合、あるいは抗体依存的な細胞毒性の活性、などを指針としてなされる。好ましいアイソタイプは、ＩＧ１，ＩＧ３及びＩＧ４である。ヒトの軽鎖定常領域、カッパ又はラムダ、のどちらを用いることもできる。キメラの人間化された抗体は通常の方法で発現される。
【００３６】  抗体断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦａｂなど、は無傷のタンパク質の開裂、例えばプロテアーゼによる、又は化学的な開裂によって、調製できる。あるいは、切頭された遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメイン及びＨ鎖の蝶番領域をコードするＤＮＡシーケンスの後に翻訳終止コドンが続いたものを含み、先端が切られた分子を生ずる。
【００３７】  Ｈ及びＬＪ領域のコンセンサス・シーケンスを用いてオリゴヌクレオチドを設計し、プライマーとして用いて、あとでヒトＣ領域セグメントにＶ領域セグメントを連結するために、有用な制限部位をＪ領域に導入することができる。Ｃ領域ｃＤＮＡを、部位指向的な突然変異誘発によって変性して、ヒトのシーケンスの同様な位置に制限部位を設けることができる。
【００３８】  発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣｓ、ＥＢＶ誘導エピソーム、などである。好適なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、適当な制限部位が設けられてどんなＶＨ又はＶＬシーケンスｍｐ容易に挿入でき発現できるようなものである。このようなベクターでは、スプライシングが通常、挿入されたＪ領域のスプライス・ドナー部位とヒトＣ領域の前にあるスプライス・アクセプタ部位の間に、またヒトＣＨエクソンの中に見られるスプライス領域で起こる。ポリアデニレーション及び転写終止はコーディング領域の下流の自生染色体部位で起こる。得られるキメラ抗体は、レトロウイルスＬＴＲｓ、例えばＳＶ−４０アーリー・プロモーター（Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:280）、ニワトリ肉腫ウイルスＬＴＲ（Gorman et al.(1982) P.N.A.S. 79: 6777）、及びモロニー・マウス白血病ウイルスＬＴＲ（Grosschedl et al.(1985) Cell 41: 885）；自生Ｉｇプロモーターなど、の強いプロモーターに結合することができる。
【００３９】  免疫応答刺激因子
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、単独又は免疫応答刺激因子と組み合わせて使用できる。本明細書で用いる場合、“免疫応答刺激因子”とは、ＣＴＬＡ−４と組み合わされて免疫応答を直接又は間接に刺激する因子を指す。例えば、免疫応答刺激因子としては、サイトカインならびにいろいろな抗原、腫瘍特異的な抗原及び病原体から派生する抗原など、が含まれる。さらに、免疫応答刺激因子にはサイトカイン導入された腫瘍細胞、例えばＧＭ−ＣＳＦが導入された腫瘍細胞、ならびにex vivo 又はin vivo で照射された及び／又は化学療法物質で治療された腫瘍細胞、なども含まれる。本明細書で提供される実施例で示されるように、免疫応答刺激因子はＣＴＬＡ−４遮断薬と組み合わせて用いられる場合、腫瘍の治療に顕著な効果を有することがある。
【００４０】  場合によっては、死んだ又は死につつある腫瘍細胞からの細胞破片が免疫応答刺激を与え、それをin vivo又はex vivo でＣＴＬＡ−４遮断薬と組み合わせることができる。化学療法剤の使用は間接的な手段による免疫応答刺激因子の生成の一例である。in vivo又はex vivo で腫瘍細胞を照射する源も間接的に免疫応答刺激因子を生成する一つの方法であり、（前立腺癌における）外科的な縮小又は細胞減少によるアンドロゲン切除、（乳癌における）エストロジェン切除もそうである。
【００４１】  ＣＴＬＡ−４遮断薬と共に化学療法剤を使用する根拠は次のようなものである。実施例で示されるように、ＣＴＬＡ−４遮断は確立された腫瘍ではうまく働いて照射された腫瘍細胞の免疫原性を高める。このことは、ＣＴＬＡ−４遮断を従来の癌治療方法と組み合わせて相乗効果を生み出すことができるということを示唆する。例えば、ＣＴＬＡ−４遮断を、化学療法剤による治療の少し後で始めても良い。化学療法剤の投薬量を調整して、十分な量の腫瘍マスを殺して破片を生じ、それがＣＴＬＡ−４遮断の結果としてＴ細胞による免疫応答を刺激するようなレベルにする。これによって、投与される化学療法剤を、現在使用されている腫瘍細胞を最大限に殺すことができるレベルより相当低くすることができる。ＣＴＬＡ−４が容易にする免疫応答によって残りの腫瘍マスが除去されるからである。しばしば恐ろしい副作用が、従来の化学療法の適用に伴う免疫抑制も含めて、この結果小さくなる。同様な考察は、放射線治療及び切除療法にもあてはまる。例えば、前立腺癌では、アンドロゲン切除の後に外科的な縮小とＣＴＬＡ−４遮断が行われる。ＣＴＬＡ−４遮断薬と合わせて用いられる場合、化学療法剤の量や放射線量は、好ましくは通常用いられる量の半分未満、さらに好ましくはその２−２０％の間、さらにもっと好ましくはその５−１０％の間、になる。
【００４２】  ＣＴＬＡ−４遮断薬が、ＣＴＬＡ−４の細胞外ドメイン又はその断片、例えばＦａｂ’断片、に対する抗体以外のものである場合、その遮断薬は独立に、すなわち、免疫応答刺激因子なしに使用できる。しかし、ＣＴＬＡ−４遮断因子は、特にＣＴＬＡ−４の細胞外部分に対する抗体から成るものは、一つ以上の免疫応答刺激因子と組み合わせて用いることが好ましい。ＣＴＬＡ−４遮断因子は、また、間接的に免疫応答刺激因子を生ずる放射線及び／又は化学療法による治療と一緒に用いることもできる。このような組み合わせによる使用は、ＣＴＬＡ−４遮断薬と免疫応答刺激因子を同時又は継起的に使用することがあり、異なる部位で使用することもできる。例えば、ＣＴＬＡ−４遮断薬は、腫瘍を直接照射した後、腫瘍から離れた部位に投与することができる。あるいは、腫瘍細胞を局所的又は全身的に治療するために化学療法剤を用いた後にＣＴＬＡ−４遮断薬を用いることもできる。
【００４３】  本発明の治療は、抗原提示細胞を刺激するサイトカイン、例えば顆粒細胞／マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、など、と組み合わせて実行することができる。Ｔ細胞の増殖と分泌を増強することが知られている別のタンパク質及び／又はサイトカイン、例えば、ＩＬ−１，ＩＬ−２，Ｂ７，抗ＣＤ３，抗ＣＤ２８，などを遮断薬と同時に又は継起的に用いて免疫応答を強化することができる。
【００４４】  腫瘍抗原
本発明の遮断薬の投与によって増殖を低下させることができる腫瘍細胞は、癌腫、例えば腺癌、これは原発腫瘍部位が胸、卵巣、子宮内膜、頸部、結腸、肺、膵臓、食道、前立腺、小腸、直腸、子宮、又は胃であるもの；及び扁平上皮癌、これは原発部位が肺、口腔、舌、喉頭、食道、皮膚、膀胱、頸部、瞼、結膜、膣、などにあるもの、である。治療できる他の部類の腫瘍としては、肉腫、例えば筋肉腫；神経腫；黒色腫；白血病、ある種のリンパ腫、栄養膜腫瘍及び生殖細胞腫；神経内分泌及び神経外胚葉腫瘍、がある。
【００４５】  興味ある腫瘍としては、腫瘍特異的な抗原を提示するものがある。そのような抗原は、異常な状況で存在し、腫瘍細胞によってユニークに発現されるもの、又は正常な変化しない自己抗原の突然変異した形態がある。腫瘍特異的な抗原を本発明の遮断薬と共に投与して腫瘍細胞に対する宿主Ｔ細胞の応答を増強することができる。そのような抗原の調製物は精製されたタンパク質、又は腫瘍細胞からの溶解産物を含むことがある。
【００４６】  腫瘍抗原の例としては、癌腫の抗原としてのサイトケラチン、特にサイトケラチン８，１８，及び１９、がある。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）；ヒト乳脂肪小球、ＭＢｒ１，ＭＢｒ８，Ｂｅｒ−ＥＰ４，１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６も公知の癌腫抗原である。デスミン及び筋特異的なアクチンは筋原性の肉腫の抗原である。胎盤アルカリ・フォスファターゼ、ベータ−ヒト絨毛膜ゴナドトロピン、及びアルファ−フェトプロテインはトロホブラスト膜及び生殖細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的な抗原は、前立腺癌の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５は黒色腫の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原はヒト乳頭腫ウイルスによってコードできるだろう。クロマグラニン−Ａ及びシナプトフィジンは神経内分泌系及び神経外胚葉腫瘍の抗原である。特に興味深いのは壊死部分を有する固形腫瘍の塊を形成する攻撃的な腫瘍である。このような壊死細胞の溶解は抗原提示細胞の豊富な抗原の源である。
【００４７】  本発明の治療は、いろいろなサイトカイン又は細胞表面レセプターをコードする遺伝子の腫瘍細胞又は腫瘍−浸潤リンパ球への形質移入と組み合わせることができる（Ogasawara et al. (1993) Cancer Res. 53: 3561-8; 及びTownsend et al. (1993) Science 259: 368-370）。例えば、腫瘍細胞にＣＤ８０をコードしたｃＤＮＡを形質移入すると移入された腫瘍細胞が排除され、形質移入されなかった親腫瘍細胞によるその後の攻撃に対する免疫も誘発できるということが示されている（Townsend et al. (1994) Cancer Res. 54: 6477-6483）。本発明の治療はこの効果を増強する。
【００４８】  腫瘍特異的な宿主Ｔ細胞をex vivo で本発明の遮断薬と組み合わせて、腫瘍抗原又は細胞を患者に戻してやることができる。宿主に投与されると、刺激された細胞で殺腫瘍反応を誘発して腫瘍の退縮を生ずる。宿主細胞はいろいろな源から単離できる、すなわち、リンパ節、例えば鼠径の、腸間膜の、表在性、末端、補助リンパ節など；骨髄；脾臓；又は末梢血液、ならびに腫瘍、例えば腫瘍浸潤リンパ球、から単離できる。細胞は同種異系、又は好ましくは、自己由来のもの、である。ex vivo 刺激では、宿主細胞を無菌的に取り出し、当業者に公知の適当な媒質に懸濁させる。細胞はいろいろなプロトコルのいずれかによって、特にＢ７，抗ＣＤ２８、などの組み合わせと遮断薬の組み合わせによって刺激される。刺激された細胞は、結合剤、充填剤、キャリア、保存剤、安定化剤、乳化剤、及びバッファ、などを含むいろいろな製薬調合物として、注射、例えば静脈注射、腹腔注射、によって再び宿主に導入される。適当な希釈剤及び賦形剤は、ウエハ、塩水、グルコースなどである。
【００４９】  自己抗原
本発明の方法で特に興味があるのは、免疫原性の弱い及び免疫原性のない腫瘍である。これらの腫瘍は免疫応答を誘発するのに十分な抗原刺激を与えることができないので特に困難な問題となる。このような場合、正常組織と癌組織の両方に共通な自己抗原を標的にすることができる。あるいは、極めて限られた細胞分布を有する正常な遺伝子産物を標的にすることができる。本発明のこの態様では、自己抗原調製物がＣＴＬＡ−４遮断薬と組み合わせて投与され、自己抗原又は遺伝子産物を発現する細胞に対する自己反応的な末梢Ｔ細胞応答を刺激するのを助ける。
【００５０】  自己抗原調製物は、抗原の混合物、例えば腫瘍の溶解産物、又は照射腫瘍細胞ワクチン、ならびに問題の特定自己抗原（例えばタンパク質、炭水化物、など）又は自己抗原の混合物、を含む精製された抗原、を含む。タンパク質を含む“精製された”抗原は、天然に見られるタンパク質とは少なくとも一つ以上の特性で区別される。例えば、そのタンパク質は、その野生型宿主においてそれが通常関連しているタンパク質や化合物の一部又は全部から単離又は離れて精製される。例えば、精製されたタンパク質には、自然な状態で通常それに関連している物質の少なくとも一部、好ましくは、ある与えられたサンプルにおける全タンパク質の少なくとも約0.5 重量％、さらに好ましくは少なくとも約 5 重量％、を占める部分が伴っていない。実質的に純粋なタンパク質は、全タンパク質の少なくとも約75 重量％を含み、少なくとも約80 重量％が好ましく、少なくとも約90 重量％がさらに好ましい。
【００５１】  好ましくは、自己抗原は組織特異的な自己抗原である。本発明の治療で用いられる自己抗原は、チロシナーゼ、trp1，trp2、melanA/MART 1、gp100及びメラニン合成に関与するその他のタンパク質；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロスターゼ又はその他の前立腺特異的遺伝子産物；Her2/neu 又はその他の乳特異的遺伝子産物、などである。本発明の治療によって誘発される免疫応答の標的となるその他の自己抗原を、当業者に周知の方法、例えば発現クローニング、によって同定して知られている分布の画定された抗原に対する免疫化を可能にし、焦点が合った免疫応答を提供することができる。あるいは、抗原調製物に修飾された自己抗原（単数又は複数）又は異種抗原（例えば、問題のヒト抗原に対応するマウス・バージョン）を含めて自己抗原への免疫寛容性をうち破る助けとすることもできる。
【００５２】  上述した免疫応答刺激因子も、本発明の治療に組み込んで自己抗原に対する応答を増強することができる。例えば、ある好ましい実施形態では、抗原調製物は腫瘍ワクチンを含み、腫瘍ワクチンは、興味ある遺伝子、例えば抗原提示細胞を刺激するサイトカイン、例えば顆粒細胞−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、又は顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、をコードする遺伝子が形質導入された照射腫瘍細胞を含んでいる。上で述べたように、もっと通常の治療法、例えば化学療法、放射線療法、又はアンドロゲン切除など、を用いて腫瘍細胞を十分に殺して、腫瘍反応的なＴ細胞のプライミングをある程度達成することもできる。同様に、強力なＡＰＣ、又は抗ＣＤ４０抗体、という状況で免疫化を行ってＡＰＣｓ上の共同刺激リガンドの発現を増強するように、ペプチド又はＲＮＡでパルスされる樹状細胞など、別の共同刺激戦略を採用することもできる。
【００５３】  本発明の治療は免疫寛容性をうち破り、所望の自己抗原（単数又は複数）に対して効果的かつコントロールされた細胞毒性応答で立ち向かう方法を提供する。この免疫療法は、特に、黒色腫、乳癌、精巣癌、卵巣癌、前立腺癌など、正常な組織の一部又は全部が失われたり変性することが、受容できる、あるいは望ましくさえある、副作用であるような腫瘍で用いられるであろう。別の実施形態では、本発明の治療は、癌の拡大に対する予防的な対策として、又はその他の医学的な理由から、ある選択された組織の抗原切除を強化又は実行するために用いられる。選択的組織切除のための免疫的な方法は、もっと侵襲的な外科的方法に比べてかなり有利である。
【００５４】  本発明の遮断薬の投与はいくつかのリンパ腫に関しては禁忌とされるであろう。特に、Ｔ細胞リンパ腫は活性の強化が何も利益にならないだろう。ＣＤ８０抗原はホジキン病におけるリード・ステルンベルグ細胞で強く発現され、しばしばＣＤ２８を発現するＴ細胞がそれを取り囲んでいる（Delabie et al. (1993) Blood 82: 2845-52）。リード・ステルンベルグ細胞の補助細胞機能がＴ細胞の活性化につながり、ホジキン症候群の原因になっているということが示唆されている。
【００５５】  多くの従来の癌治療法、例えば化学療法や放射線療法など、はリンパ球の数を深刻に減少させる。本発明の治療法はこの免疫抑制をある程度軽減するが、組み合わせ治療法の好ましいコースは、本発明の治療法の前又は後にこのようなリンパ毒性のある治療を行うというものになるだろう。
病原体抗原
本発明の遮断薬は、病原体に対するＴ細胞の応答を高めるように投与することができる。ある種のウイルスによる感染は、宿主の抗ウイルス・メカニズムが働かないと慢性化する。このような感染は何年も、感染した宿主の生涯にわたっても永続することがあり、しばしば重大な疾患を引き起こす。顕著な罹病率と早期死亡を伴う慢性的な感染としては、二つのヒト肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）とＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、があり、これは慢性肝炎、肝硬変及び肝臓癌の原因になる。人間におけるその他の慢性ウイルス感染としては、ヒト・レトロウイルスによるもの：ＡＩＤＳの原因であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、及びＴ細胞白血病と骨髄症の原因であるヒト・リンフォトロピック・ウイルス（ＨＴＬＶ−１及びＨＴＬＶ−２）、がある。ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（ＨＳＶ）タイプ１及び２，エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、及びヒト・ヘルペス・ウイルス６（ＨＨＶ−６）などのヒト・ヘルペス・ウイルスによる感染は通常、宿主のメカニズムによっては根絶されない。病原性原生動物、例えばトリパノゾーマ、マラリア、及びトキソプラズマ；バクテリア、例えばミコバクテリア、サルモネラ、及びリステリア；及び菌類、例えばカンディダ、など、細胞内で複製される他の因子による感染も、宿主の防御機構がそれを排除できない場合、慢性化することがある。
【００５６】  本発明の遮断薬は、このような慢性的な病原体感染に苦しんでいる患者に投与される。免疫応答を高めるためには、この遮断薬を病原体から得られる抗原と一緒に調合することが望ましいことがある。このようないろいろな抗原が当業者に公知であり、病原体の単離又は組み換え法による発現によって入手できる。例としては、ＨＩＶｇｐ１２０，ＨＢＶ表面抗原、ウイルスの外被タンパク質、などがある。
【００５７】  アジュバント
アジュバントは抗原に対する免疫応答を強化するものである。ＣＴＬＡ−４遮断薬は、Ｔ細胞の活性を高め、抗体産生細胞のクラス・スイッチングを増強して免疫原に応答したがって、産生されるＩｇＧクラス抗体の濃度を高めるアジュバントとして用いられる。この遮断薬は、アジュバントを用いる従来の方法に従って、生理的に受容される媒質で免疫原と組み合わされる。免疫原は、単一の調合物としてこの遮断薬と組み合わされることも、別に投与されることもある。免疫原は、多糖類、タンパク質、タンパク質断片、ハプテン、などである。特に興味があるのは、ペプチド免疫原での使用である。ペプチド免疫原には、上述のように、腫瘍抗原及びウイルス抗原が含まれる。
【００５８】  本発明の遮断薬を遺伝子免疫化と一緒に使用することも興味深い。問題のペプチド又はタンパク質抗原をコードするＤＮＡ発現ベクターが宿主動物に、一般に筋又は皮膚に、注射される。遺伝子産物は正しく糖鎖形成され、折り畳まれて、宿主細胞で発現される。抗原を所望の純度、量で、又は正しく糖鎖形成された形で得ることが難しい場合、あるいは遺伝子のシーケンスだけしか知られていない場合、例えばＨＣＶ、この方法は有利である。普通、ＤＮＡが筋肉に注射されるか、又は金の微粒子にコートされて粒子砲撃装置、“遺伝子ガン”、によって皮膚内に送り込まれる。遺伝子免疫化は、癌、ミコプラズマ、ＴＢ、マラリア、及びインフルエンザやＨＩＶを含む多くのウイルス感染、の動物モデルで特異的な体液免疫応答だけでなく、もっと広く反応する細胞免疫応答を誘導することが示されている。例えば、Mor et al. (1995) J. Immunol. 155: 2039-46； Xu and Liew (1995) Immunology 84: 173-6；及び Davis et al. (1994) Vaccine 12: 1503-9を見よ。
【００５９】  本発明の遮断薬は、モノクローナル抗体の産生のために実験動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギなど、を免疫化するときに用いられる。この投与は抗原に対する応答のレベルを高め、クラススイッチングを行うプラズマ細胞の割合を増加させる。
ＣＴＬＡ−４遮断薬は、in vitro 細胞培養システム、例えば不死化された細胞系統、混合又は純粋化された細胞集団の一次培養、非形質転換細胞、などを含む培養中のＴ細胞の活性化を高めるためにin vitro で投与される。特に興味あるのは、細胞が患者又は同種のドナーから取り出され、ex vivo で刺激され、再び患者に注入されるＴ細胞の一次培養である。
【００６０】  投与及び調合
いろいろな投与方法を用いることができる。ＣＴＬＡ−４遮断薬調合物は、血管内、皮下、腹腔、等に注射することができる。治療調合の投与量は疾病の性質、投与の頻度、投与の仕方、投与の目的、宿主からの薬のクリアランス、などによって大きく異なるであろう。投与される量は、既知の因子、例えば特定の薬の薬理学的特性、投与の様態とルート、レシピエントの年齢、健康、及び体重、症状の性質と程度、同時に行われている治療、治療の頻度と望まれる効果、などによって異なる。投与量は、週に１回又は２週に１回というように低い頻度で投与することもあり、もっと少量に分けて、毎日、半週に１回などというように投与して、効果的な投与レベルを維持することもある。一般に、活性成分の一日の投与量は、体重１ｋｇあたり約0.1 乃至 100 ｍｇである。体内投与に適した投薬形態は一般に単位あたり0.1 乃至 500 ｍｇの活性成分を含んでいる。活性成分は、組成物の全重量を基準にして0.5 乃至95 重量％の範囲にある。
【００６１】  場合によっては、Ｔ細胞が増殖しすぎるために治療期間を制限することが望ましいこともある。制限は、治療に対する患者の応答、患者のＴ細胞の数、本発明の治療が標的にしている抗原のタイプ、などによって経験的に決定される。患者のＴ細胞の数は、当業者に公知の方法、例えばＴ細胞特異的な抗体による染色及びフローサイトメトリーなど、によってモニターすることができる。
【００６２】  本発明のＣＴＬＡ−４遮断薬は、製薬的に受容される媒質中で、例えば通常生理食塩溶液、植物油、鉱物油、ＰＢＳ、などに効果的な投薬量の調合物として調製される。治療用の調製物は、生理的に許容される液体、ゲル、又は固体のキャリア、希釈剤、アジュバント、及び賦形剤を含む。添加物としては、殺菌剤、等張性を維持する添加物、例えばＮａＣｌ、マンニトール；化学的安定性を維持するもの、例えばバッファや保存剤、など、が含まれることがある。ＣＴＬＡ−４遮断薬はカクテル又は単一薬剤として投与される。非経口的投与では、この遮断薬は、溶液、懸濁液、エマルジョン、又は凍結乾燥した粉末で製薬的に受容される非経口投与のための溶剤と合わせて調合される。リポゾーム又は非水性溶剤、例えば固定オイル、も用いられる。調合物は当業者に公知の方法によって無菌化される。
【００６３】  ＣＴＬＡ−４遮断薬の機能的効果は本発明で認められるような細胞内信号の変化を模倣する他の物質を投与することによっても誘発される。例えば、特定サイトプラズミック・キナーゼが細胞外受容体の結合に応答して活性化されるということが知られている。キナーゼの活性を阻害する因子は、受容体の結合を遮断するのと同様な生理的効果を生ずるだろう。同様に、環状ＡＭＰ、ＧＴＰ濃度、及び細胞内カルシウム・レベルを増加させる因子は、細胞外受容体結合で観測されるのと同様な生理的効果を生ずることができる。
【００６４】  以下の実施例は、説明のために例示されるものであって、発明を制限することを意図したものではない。
実験
実施例１
マウスＣＴＬＡ−４と反応するモノクローナル抗体の生成
ａ）マウスＣＴＬＡ−４免疫原の作成
マウスＣＴＬＡ−４遺伝子の細胞外部分とヒトＩｇＧＩの定常領域から成る融合タンパク質、ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩと呼ばれるもの、がDrs. P. Lane and K. Karjalainen (Basel Institute for Immunology) から得られた。ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩを発現できる発現ベクターが、記述されているように構築された［Lane et al. Immunol. 80:56 (1993)］。簡単に言うと、マウスＣＴＬＡ−４分子の細胞外部分をコードするシーケンスがＰＣＲを用いて生成された。次のプライマーの対を用いて、マウスＣＴＬＡ−４シーケンスを含むプラスミドからこのＣＴＬＡ−４シーケンスが増幅された：５’−ＴＴＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴＧＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び５’−ＴＡＴＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。次に、増幅されたＣＴＬＡ−４シーケンスが、問題の遺伝子をヒンジ、ヒトＩｇＧＩタンパク質のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、をコードするシーケンスの上流に挿入することを許す発現ベクターに挿入された［Traunecker, et al. Trends Biotech. 9:109 (1991)］。各プライマーは、ヒトＩｇＧＩ発現ベクターへサブクローニングするために適当な制限部位、ならびにヒトｇＩエクソンに正しくスプライスするために３’プライマー内に３’スプライス・ドナー部位を含んでいた。ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩ融合タンパク質をコードするシーケンスを含むプラスミドはｐＨβ−ＡＰｒ−１−ｎｅｏ−ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩと呼ばれた。ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３にリストされている。
【００６５】  ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質を発現するために、ｐＨβ−ＡＰｒ−１−ｎｅｏ−ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩ発現ベクターがマウス形質細胞腫ライン、Ｊ５５８Ｌ（Ｊ５５８ＬはＡＴＣＣから入手できるＪ５５８細胞ラインと同一である［ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ６］）に、プロトプラスト融合の標準的方法を用いて移入された。Ｊ５５８Ｌ細胞は、5×104 細胞/ml で培養された。次に、形質移入されたＪ５５８Ｌ細胞が、キサンチン（Sigma）及びミコフェノール酸（Calbiochem, LaJolla, CA）を含む培地（選択培地）の存在下で選択された。選択培地は、移入の２４時間後に用いられ、ポジティブ・クローン（すなわち、選択培地で増殖したクローン）が２週間後にスクリーニングされた。融合タンパク質を分泌するクローンはヒトＩｇＧＩのＥＬＩＳＡによって同定された。良く分泌するクローンが同定され、クローンno. 15 と呼ばれた。クローンno. 15 細胞は、代謝的に[35 S]メチオニンで標識され、分泌されたタンパク質はプロテインＡによってイムノプレシピテートされ、プレシピテートされたタンパク質はＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で分解された。ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、還元条件の下では約60,000 ＭＷのモノマーとして、非還元条件の下ではダイマーとして移動することが見出された。
【００６６】  ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質の精製された調製物が、プロテインＡ−セファロース（Zymed, South San Francisco, CA）カラムによってクローンno. 15 細胞の培養上澄みのアフィニティー・クロマトグラフィーによって得られた。簡単に言うと、ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質を発現するＪ５５８細胞が、5％ＦＣＳ、グルタミン、２ＭＥ、及び抗体を補ったＩＭＤＭで培養された。培養上澄みが細胞から集められ、1500×g で遠心分離されて残っている細胞が除去され、透明に成った上澄みが0.4 ミクロンのサイズの孔を通して濾過された。濾過された上澄みは、１ＮのＮａＯＨによってｐＨ8.5 に調整された；次に上澄みは２ｍｌ（沈澱体積）のプロテインＡ−セファロース・カラムに、２ｍｌ／分という流量で通される。Ｊ５５８細胞ラインは、余分な（すなわち、マウスＣＴＬＡＩｇ融合タンパク質以外の）免疫グロブリンを産生し、これはプロテインＧに結合する；したがって、プロテインＧ樹脂は、形質移入されたＪ５５８細胞からのｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質の精製には勧められない。
【００６７】  プロテインＡカラムは、20 乃至30 カラム体積のＰＢＳで洗浄され、融合タンパク質が50 ｍＭのジエチルアミンで溶出された（ｐＨ11.0）。２ミリリットルの分画が、サンプルのｐＨを中性化するために0.2 ｍｌの１Ｍ Tris-HCl を含むチューブに集められた。280 ｎｍでの吸光度が測定され、それを用いて各分画のタンパク質濃度が評価された。タンパク質を含む分画が一緒にされて、一晩ＰＢＳを２乃至３回代えて透析された（毎回１リットル代える）。ｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質の存在はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ほぼ４０ｋＤ（この融合タンパク質の予測された分子量）のバンドを示した。さらに、精製されたｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質はＥＬＩＳＡで抗ヒトＩｇＧＩ抗体（ＨＰ６０５８；ＨＰ６０５８ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７８６）がＨＰ６０５８抗体の源として用いられた）を用いてテストされた。
ｂ）ハムスターの免疫化
ハムスターをマウスＣＴＬＡ−４融合タンパク質で免疫化するために、精製されたｍＣＴＬＡ４−ＨｇＩタンパク質（以下ではＣＴＬＡ−４Ｉｇと呼ぶ）を用いて熱殺されたStaphylococcus aureus (StaphA)バクテリア細胞（Calbiochem, LaJolla, CA）をコーティングした。生後６週のGolden Syrian ハムスター（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN）に、ほぼ100 μg のＣＴＬＡ−４Ｉｇを0.2 ｍｌのＰＢＳに懸濁したものでコーティングした50 μｌ（沈澱体積）の熱殺されたStaphAバクテリアを足蹠に注射した。StaphA 細胞は次のようにコーティングされた。
【００６８】  StaphA 細胞がメーカーの手順に従って塩水（0.9%NaCl）中に濃度10%w/v に調製された。１ｍｌのバクテリア細胞スラリーを1,400×gで遠心分離してバクテリアをペレットにし、上澄みを除いた。ほぼ100 μｇの精製されたＣＴＬＡ−４ＩｇをＰＢＳ中に含む溶液１ｍｌをペレットに加え、混合物を37℃で２時間攪拌しながら培養した。次にバクテリアを上で述べたように遠心分離でペレットにした；ペレットを二回、１ｍｌ／回のＰＢＣで洗浄した。ＣＴＬＡ−４Ｉｇをコーティングしたバクテリア細胞は次にほぼ200 μl のＰＢＣに再懸濁させた；この調製物が各足蹠に50 μl注射された。
【００６９】  ハムスター１匹あたり全部で５回の注射が行われた。最後の注射の日に注射の前に、ほぼ100 μlの血清がOffice of Laboratory 動物ケア・スタッフ（Univ. of Calif, Berkeley）によって行われた眼内放血によって採取された。この血清が最初の注射の前に同じ方法で採取された血清と比較して分析された。
ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡを用いて、免疫後の放血にＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質を認識する抗体の存在が実証された。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡは次のように実行された。ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質又はＣＤ４Ｉｇタンパク質を用いて、96 ウエル変型平底ＥＬＩＳＡプレート（Corning, Corning, NY）がコーティングされた。
【００７０】  ＣＤ４Ｉｇは、マウスＣＤ４の細胞外ドメインとヒトＩｇＧＩのヒンジ、ＣＨ２，及びＣＨ３ドメインから成る融合タンパク質である［Traunecker et al.,  前出］；ＣＤ４Ｉｇタンパク質はＥＬＩＳＡ分析におけるネガティブ対照として用いられた。ＣＤ４Ｉｇ融合タンパク質は形質移入されたＪ５５８細胞から調製され、上でｍＣＴＬＡ４−Ｈμｌ（すなわち、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ）融合タンパク質について記述したようにプロテインＡセファロースによるアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製された。
【００７１】  0.4 ％ゼラチンを含むＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度の融合タンパク質５０マイクロリットルがウエルに入れられた。プレートは37 ℃で2-3 時間インキュベートされてタンパク質を吸収させた；次に、プレートは、0.05 ％ Tween-20 を含む150 μl の0.9 ％ NaClで３回洗浄された。ウエルに残っているタンパク質結合部位は、0.4％ ゼラチンを含むＰＢＳ（遮断バッファ）を用いて37 ℃で30 分間ブロックされた；このブロッキング・ステップの後、プレートは0.05 ％ Tween-20 を含む0.9 ％ NaClで２回洗浄された。抗ＣＴＬＡ−４抗体（すなわち、免疫処置されたハムスターの血清、精製された抗体又は培養上澄み）を含む溶液５０マイクロリットルが重複する３つのウエルに加えられ、プレートは37 ℃で2-3 時間インキュベートされた。免疫処置されたハムスターの血清に存在する抗ＣＴＬＡ−４抗体の量を評価するために、最初の免疫後放血が1:1000 乃至1:100 という範囲の希釈（0.4％ ゼラチンを含むＰＢＳへの希釈）を用いてテストされた。
【００７２】  次にウエルは0.05 ％ Tween-20 を含む150 μl の0.9 ％ NaClで３回洗浄された。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと結合されたヤギ抗ハムスターＩｇＧポリクローナル血清（CalTag, South San Francisco, CA）を遮断バッファ中に１μｇ／ｍｌの濃度で含む溶液５０マイクロリットルがウエルに加えられ、プレートは37 ℃で1 時間インキュベートされた。次に、ウエルは0.05 ％ Tween-20 を含む150 μl の0.9 ％ NaClで４回洗浄された。クエン酸緩衝液[0.1 M クエン酸（ｐＨ4.35）]に0.55 mg/ml のＡＢＴＳ  ２，２’−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−エチルベンツチアゾリン−６−スルホン酸）を含む溶液が加えられ，プレートは37 ℃で約20分間インキュベートされた。次に、プレートは、BioTech プレート・リーダー（Beckman Instruments, Palo Alto, CA）を用いて405 nm で測定され、緑色の反応産物の吸光度が評価された。
【００７３】  ＣＴＬＡ−４Ｉｇ結合ＥＬＩＳＡの結果は、免疫後の放血中にＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質を認識する抗体が存在することを、免疫前の放血を用いてバックグラウンドを検出できる希釈度より1,000 倍も大きい血清希釈度で実証した。
ｃ）抗マウスＣＴＬＡ−４抗体を分泌するハイブリドーマ・ラインの単離
最終の注射から３日後、排出するリンパ節がハムスターから取り出された。後肢から排出する膝窩リンパ節からリンパ球が単離された。細胞懸濁液が、単離されたリンパ節から次のように作られた。解体されたリンパ節が、10 ％ＦＣＳ（BioWhittaker, Walkersville, MD）を補ったＲＰＭＩ培地（GibcoBRL, Gaithersberg, MD）を含む組織培養皿（Falcon Plastics, MoUntain View, CA）に入れられた。リンパ球はすりガラスのスライドでリンパ節を穏やかにすりつぶしてリンパ節から放出させた；リンパ球の懸濁液は血球計数器を用いて計数された。
【００７４】  免疫処置されたハムスターから単離されたリンパ球は、融合細胞パートナー、Ｐ３Ｘ３．Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合された。Ｐ３Ｘ３．Ａｇ８．６５３細胞は、融合の前に３日毎に、20％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）（BioWhittaker, Walkersville, MD）、50 μＭ  ２−ＭＥ、50 μＭゲンタマイシン、を含むＩＭＤＭ（Univ. of Calif., San Francisco 組織培養施設）中で1:20 に分割された。
【００７５】  このミエローマ・ラインとの融合は標準的なポリエチレン・グリコール融合方法（McKearn et al., Immunol. Rev. 47:91 (1979)）を用いた。簡単に言うと、無菌のリンパ球細胞懸濁液が血清を含まないIscove's Modified Dulbecco's Media （ＩＭＤＭ）中に調製された。リンパ球はＩＭＤＭで２回洗浄され、12.5×106 細胞／ｍｌという密度に調整された。
【００７６】  Ｐ３Ｘ３．Ａｇ８．６５３（上述のように育成された）は、血清を含まないＩＭＤＭで２回洗浄され［この細胞はＴＪ−６遠心分離装置（Beckman Instruments, Palo Alto, CA）の中で25℃で、５分間、1000 r.p.m. で遠心分離されて細胞がペレットにされた］、Ｐ３Ｘ３．Ａｇ８．６５３細胞の密度が5×106 細胞／ｍｌに調整された。
【００７７】  ４ミリリットルのリンパ球細胞懸濁液が１ｍｌの洗浄されたＰ３Ｘ３．Ａｇ８．６５３細胞と60 mm組織培養皿（Falcon）で混合された。この組織培養皿がマイクロタイタ・プレート・キャリア（Beckman Instruments, Palo Alto, CA）に置かれ、250×g（1200 r.p.m. ; TJ-6 遠心分離装置）で５分間遠心分離され、皿の底に付着する細胞の単一層が生成された。上澄みを皿から吸引し、皿にＩＭＤＭ中に50 ％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００，Boehringer Mannheim）を含む溶液１ｍｌを流した；ＰＥＧ溶液は、４ｍｌのＰＥＧ１５００と４ｍｌのＩＭＤＭを別々に60 ℃の水浴中で暖めてからＰＥＧをピペットに吸引し、次にＩＭＤＭを吸引して一緒にし、十分に混合して調製された。室温で30 秒後、皿に５ｍｌの血清を含まないＩＭＤＭを流した。
【００７８】  融合の日の最終洗浄の後、細胞は、60 mmの皿にＦＣＳを含む５ｍｌのＩＭＤＭ媒質と共に、５％ＣＯ2、37℃で12 時間放置された。翌日、融合された細胞は、20 ％ＦＣＳ及び１ＸＨＡＴ（Boehringer Mannheim, NJ）を含む100 ｍｌのＩＭＤＭに希釈され、96ウエル平底プレートにウエルあたり100 μｌが培養された。５日後及び９日後にさらに50 μｌの培地が各ウエルに加えられた。その後、３日間隔で50 μｌの培地が除去され新しい培地が加えられた。細胞数がウエルあたり1000-5000の範囲になると、ハイブリドーマの上澄みの、ＣＴＬＡ−４Ｉｇに対する反応性及びＣＤ４Ｉｇに対する反応性の欠如が、上の（ｂ）節で述べたようにＥＬＩＳＡによってテストされた。ＥＬＩＳＡでは、ハイブリドーマの上澄みは希釈されずに用いられた（50 μｌ／ウエル）。
【００７９】  ポジティブ・ウエルからのハイブリドーマは、照射されたマウス胸腺細胞フィーダ層の存在下で希釈を制限することによって繰り返しクローニングされた。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ・ライン、抗体９Ｈ１０と呼ばれるもの、は次の規準によって選ばれた：１）ＥＬＩＳＡｓにおいてＣＴＬＡ−４Ｉｇに対する反応性があるが、ＣＤ４Ｉｇに対してはない；２）ＣＴＬＡ−４ＩｇとＢ７トランスフェクタントとの結合を遮断する能力；３）活性化されたＴ細胞を染色できるが、新しく単離されたＴ細胞を染色することはできない；及び４）ＣＴＬＡ−４トランスフェクタントを染色できるが対照トランスフェクタントを染色できない。
【００８０】  抗体９Ｈ１０がＣＴＬＡ−４ＩｇとＢ７トランスフェクタントとの結合を遮断する能力は次のように実証された。約１０μｌのｍＡｂ９Ｈ１０が、22℃で30 分間１μgのＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質と共にＰＢＳを含む最終体積50 μl の溶液中でインキュベートされた。この混合物に2×105 のＢ７−ＥＬ−４細胞を加え、１％ウシ血清と0.05 ％窒化ナトリウムを含む１０μｌの氷温ＰＢＳに懸濁させた。Ｂ７−ＥＬ−４細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６−派生ＥＬ４胸腺腫細胞ラインにマウスＢ７細胞表面タンパク質をコードする発現ベクターが移入されたものであり、Townsend et al. Cancer Res. 54:6477-83 (1994)で記述されている。
【００８１】  得られた混合物は、次に、氷の上で30 分間インキュベートされ、続いて２回、４ｍｌ／回の１％ウシ血清と0.05 ％窒化ナトリウムを含むＰＢＳで洗浄された。次に、細胞はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合抗ヒトＩｇＧ（Caltag, South San Francisco, CA）で染色された。この実験のネガティブ対照として、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質が対照ハムスターＩｇＧ又はＥＬ−４細胞ラインと共にインキュベートされた。細胞は、FACScan (BectonDickinson, Mountain View, CA)で分析された；ＬＹＳＩＳIIプログラム（Becton Dickinson）を用いて関連集団へ電子的にゲートオンした。ほとんどの実験で10,000 のライブ・ゲーテッド事象が集められ分析された。結果は、９Ｈ１０抗体がＣＴＬＡ−４とＢ７−ＥＬ−４細胞との結合を遮断することを示した。
【００８２】  ９Ｈ１０細胞が活性化されたＴ細胞を染色できるが、新しく単離されたＴ細胞を染色できないことは、次のようにして実証された。新しい及び活性化された脾臓細胞が生成された。生後４−６週のＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を取り出して刻み、懸濁物を溶血ゲイ溶液で処理して赤血球を除いた。これは、当業者にとって標準的な手法である［Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980) pp. 23-24］。この細胞は、10 ％ウシ胎児血清を含むＰＲＭＩ中で、細胞集団の一部を活性化するために可溶抗ＣＤ−３抗体を10 μg/ml で加えて培養された。脾臓細胞の残りの部分は、抗ＣＤ−３で処理されず、新しい（活性化された脾臓細胞ではない）ものとなる。次に、二つの細胞集団は１）ＦＩＴＣ−結合９Ｈ１０（抗ＣＴＬＡ−４抗体；５μｇの抗体）とＰＥ−結合Ｔｈｙｌ．２の組み合わせ、又は２）ＦＩＴＣ−結合ハムスターＩｇとＰＥ−結合Ｔｈｙｌ．２の組み合わせ、で染色された。データは、ＦＡＣＳｃａｎで分析され、電子的にＴｈｙｌ．２ポジティブな細胞がゲートされて関連あるＴ細胞集団だけが分析された。この実験の結果は、９Ｈ１０抗体が、活性化された（すなわち、ＣＴＬＡ−４を発現する）Ｔ細胞を染色するが、新しく単離されたＴ細胞を染色しないことをはっきりと示した。
【００８３】  ９Ｈ１０細胞がＣＴＬＡ−４トランスフェクタントを染色できるが、対照トランスフェクタントを染色できないことは次のように実証された。親ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）細胞ライン（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）がｐＳＲＩｎｅｏ．ＣＴＬＡ−４を形質移入された。ｐＳＲＩｎｅｏ．ＣＴＬＡ−４は、ｐＳＲＩｎｅｏに挿入されたマウスＣＴＬＡ−４タンパク質をコードする1.9 kb のｃＤＮＡ全体を含んでいる［Brunet et al., Nature 328:267 (1987)］。ｐＳＲＩｎｅｏ．ＣＴＬＡベクターが移入された細胞はマウスＣＴＬＡ−４タンパク質を細胞表面に発現する。
【００８４】  親（すなわち、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）と形質移入された細胞は、１）ＦＩＴＣ−結合９Ｈ１０（抗ＣＴＬＡ−４抗体；５μｇの抗体）とＰＥ−結合Ｔｈｙｌ．２の組み合わせ、又は２）ＦＩＴＣ−結合ハムスターＩｇとＰＥ−結合Ｔｈｙｌ．２の組み合わせ、で染色された。データは、電子的にＴｈｙｌ．２ポジティブな細胞がゲートされて関連あるＴ細胞集団だけが分析された。この実験の結果は、９Ｈ１０抗体が、ＣＴＬＡ−４トランスフェクタントを染色するが、対照トランスフェクタントを染色しないということをはっきりと示した。
【００８５】  上述の結果は、９Ｈ１０モノクローナル抗体がマウスＣＴＬＡ−４タンパク質と特異的に反応することを実証した。
実施例２
抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は
マウスのＶ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍の拒絶を生ずる
抗−マウスＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体、９Ｈ１０，を用いて、結腸癌腫細胞ラインの注射を受けたマウスを治療した。９Ｈ１０ｍＡｂをＶ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞と合わせて注射すると実験動物で腫瘍細胞の完全な拒絶を生じた。これに対し、抗−ＣＤ２８ｍＡｂとＶ５１ＢＬｉｍ１０細胞を注射されたマウス又はＶ５１ＢＬｉｍ１０細胞だけを注射されたマウスは、両方とも腫瘍を発生し、腫瘍は４週間の間に着実にサイズの増大を示した。
ａ）Ｖ５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインの生成
Ｖ５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインは、ＳＲＩｎｅｏ発現ベクターを５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインに形質移入することによって生成された。５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインは、ヒトにおける結腸癌転移の正確な動物モデルを提供する結腸癌腫細胞ラインである。Bresalier et al., Cancer Res. 47: 1398 (1987)。
【００８６】  本実験で用いられるＶ５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインは次のようにして生成された。Corbet et al,, Cancer Res. 35: 2434-9 (1975)によって確立されたマウスの結腸癌細胞ライン５１ＢがＢＡＬＢ／ｃマウスの盲腸の壁に注射された；少数の注射されたマウスでは、生じた結腸腫瘍が自然に肝臓に転移することが見出された。Bresalier et al., Cancer Res. 47: 1398 (1987)。元の転移からの細胞を集めることによって、転移活性が漸進的に増大する腫瘍細胞ラインが生み出され、次にそれを用いて別のマウスの盲腸に順次再注射した。これらの細胞ラインは、５１ＢＬｉｍ−１から５１ＢＬｉｍ−５と呼ばれ、ダッシュの後の数字は転移サイクルの数を表している。
【００８７】  California 大学San Francisco のDr. Warren から入手した５１Ｂ転移派生細胞ラインは５１ＢＬｉｍ１０と名づけられた；５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインは、Bresalier et al,, Cancer Res. 47: 1398 (1987)で記述されている５１ＢＬｉＭ５細胞ラインに対応する。
ＳＲＩｎｅｏ発現ベクターが５１ＢＬｉｍ１０細胞ラインに移入されて［Townsend et al., Cancer Res. 54:6477-83 (1994)］に記述されているようなＶ５１ＢＬｉｍ１０細胞が生成された。ＳＲＩｎｅｏ発現ベクター（DNAX Research Institute of Molecular and Cellular Biology, Palo Alto, CA, から入手した）は、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲの転写コントロールの下で問題の遺伝子の形質発現を可能にする。ＳＲＩｎｅｏベクターは、また、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーの転写コントロールの下にあるｎｅｏ遺伝子を含む。ｎｅｏ遺伝子の存在は、ＳＲＩｎｅｏベクターを含む形質移入された細胞を選択することを可能にする。
【００８８】  ＳＲＩｎｅｏ発現ベクターは、ＢＴＸ  Ｔ８００エレクトロポレーター（BTX, Inc., San Diego, CA）を用いるエレクトロポレーションによって５１ＢＬｉｍ１０細胞に移入された。各99 μｓの５つのパルスが450 又は600 V で印加された。エレクトロポレーションは，270 ｍＭスクロース、7ｍＭ  NaPO4(pH 7.4)、1 ｍＭ MgCl2、5×106 の５１ＢＬｉｍ−１０細胞、及び50 μg のＳＲＩｎｅｏ発現ベクターを含む750 μｌの最終反応体積の中で行われた。エレクトロポレーションの後、細胞は、37℃で24 時間、完全培地［Eagle's MEM (Univ. of Calif. at San Francisco Cell Culture Facility, San Francisco, CA)に、10％ＦＣＳ (Sigma)、非必須アミノ酸、MEM  ビタミン溶液、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン（全てIrvine Scientific, Santa Ana, CA,から）及び7.5 ％重炭酸ナトリウム（Sigma）、を補ったもの］で培養された。選択培地［完全培地であって１mg/ml のゲネタイシンを含む（Ｇ４１８硫酸塩、ＧＩＢＣＯ、Grand Island, NY）］。選択培地で１４日間培養した後、薬剤耐性細胞がプールされ、その後の実験でＶ５１ＢＬｉｍ１０と呼ばれるポリクローナル集団として用いられた。
【００８９】  Ｖ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞は、Eagle's MEM (Univ. of Calif. at San Francisco Cell Culture Facility, San Francisco, CA）に、10％ＦＣＳ (Sigma)、非必須アミノ酸、MEM ビタミン溶液、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン（全てIrvine Scientific, Santa Ana, CA,から）及び１mg/ml のゲネタイシン、を補った培地で維持された。細胞培養は低継代（すなわち、１０継代未満）凍結アリコットから確立され、培養で維持する日数は３０日以下で使用された。
【００９０】  Ｖ５１ＢＬｉｍ１０細胞と親５１ＢＬｉｍ１０細胞は、同じようなin vitro及びin vivoの増殖速度を示すということが見出された。Ｖ５１ＢＬｉｍ１０細胞及び他のいろいろな腫瘍細胞ラインにおけるネオマイシン耐性遺伝子の発現は、腫瘍発生率又は注射された細胞からの腫瘍増殖速度に何も影響を及ぼしていない。
ｂ）Ｖ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞とモノクローナル抗体のマウスへの注射
Ｖ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞が組織培養プレートからトリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma）によって収穫され、血清を含まない培地（Eagle's MEM）で３回洗浄され、2×107 細胞／ｍｌの濃度で懸濁された。
【００９１】  この実験でし使用されたマウスは、生後６−８週の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）であった。５匹のグループをメトキシフルランの吸入によって麻酔し、耳に識別のための切欠きをつけ、200 μlのＶ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞懸濁液（4×106）を左脇腹に皮下注射した。処理されたグループは、上述した抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ  ９Ｈ１０、あるいは又、抗−ＣＤ２８ｍＡｂ、37.51、の100μg 腹腔内注射を同じ日に受け、さらに腫瘍細胞の注射の３及び６日後（図１で黒い矢印で示す）50μg 腹腔内注射を受けた。モノクローナル抗−ＣＤ２８、37.51、はマウスＣＤ２８タンパク質に向けられ［Gross et al., J. Immunol. 149: 380 (1992)］、ネガティブ対照として用いられた。
【００９２】  マウスの皮下腫瘍の増殖がモニターされ、成長する腫瘍の両断直径がキャリパーで測定された。未処理で残されたマウス、又は抗−ＣＤ２８抗体で処理されたマウス、は全て進行的に成長する腫瘍を生じ、接種から３５日までには安楽死が必要になった。対照的に、抗ＣＴＬＡ−４抗体で処理された全てのマウスは短期間の限定された成長の後に腫瘍を完全に拒絶した。図１Ａに示されているように、平均腫瘍面積（ｍｍ2）（ｙ軸方向に表示される）は腫瘍注射のほぼ１４日後（ｘ軸方向に表示される）からスタートして漸次減少し、ほぼ２４日後にゼロにまで減少した。抗ＣＴＬＡ−４処理は腫瘍の量が少ないと効果が小さくなった。図１Ｂは、2×106 腫瘍細胞を注射され、上述のように抗ＣＴＬＡ−４抗体又は無関係なハムスター抗体で処理されたマウスの平均腫瘍サイズを示す。抗ＣＴＬＡ−４抗体処理（治療）は腫瘍の成長に劇的な効果を及ぼし続けたが、１匹のマウスは腫瘍を速やかに発生し、もう１匹がずっとあとで発病した。図１Ｃは、2×106 のＶ５１ＢＬｉｍ１０細胞を注射されたマウスの個々の腫瘍の成長を示す。３匹のマウスは８０日を超えても腫瘍が発生しなかった。ＣＴＬＡ−４遮断がＢ７ネガティブ腫瘍細胞の拒絶を顕著に強化したことは明らかである。
ｃ）Ｂ７−５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞とモノクローナル抗体のマウスへの注射
５１ＢＬｉｍ１０細胞に、上述のように、マウスＢ７−１の遺伝子を含むプラスミドを形質移入し、希釈を制限することによってクローニングした。Ｂ７−５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞が、組織培養プレートからトリプシン−ＥＤＴＡ（Sigma）によって収穫され、血清を含まない培地（Eagle's MEM）で３回洗浄され、2×107 細胞／ｍｌの濃度で懸濁された。
【００９３】  この実験で使用されたマウスは、生後６−８週の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）であった。５匹のグループをメトキシフルランの吸入によって麻酔し、耳に識別のための切欠きをつけ、100 μl のＢ７−Ｖ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞懸濁液（4×106）を左脇腹に皮下注射した。処理されたグループは、上述した抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ  ９Ｈ１０、あるいは又、抗−ＣＤ２８ｍＡｂ、37.51、の100μg 腹腔内注射を受けた。100, 50, 及び50 μgが、それぞれ、０，３，及び６日目に注射された（注射日は、図２の黒い矢印で示されている）。モノクローナル抗−ＣＤ２８，37.51、はマウスＣＤ２８タンパク質に向けられるものであり［Gross et al., J. Immunol. 149: 380 (1992)］、ネガティブ対照として用いられた。
【００９４】  マウスの皮下腫瘍の増殖がモニターされ、成長する腫瘍の両断直径がキャリパーで測定された。この実験からのデータが図２に示されている。抗−ＣＴＬＡ−４抗体による処理は、抗−ＣＤ２８及び対照グループに比べて、Ｂ７−５１ＢＬｉｍ１０腫瘍の成長を阻害した。処理されなかったグループ及び抗−ＣＤ２８で処理されたグループの全てのマウスが小さな腫瘍を発生し、それは５乃至１０日間漸次成長し、その後最終的には注射後約２３日までに１０匹中８匹のマウスで退縮した。退縮しなかった二つの小さな腫瘍は９０日以上にわたって変化しなかった。対照的に、抗−ＣＴＬＡ−４抗体で処理されたマウスは５匹中３匹が非常に小さい腫瘍を発生し、これらは全て１７日までに退縮した。
ｄ）抗−ＣＴＬＡ−４で誘発されるＶ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞の拒絶はその後の野生型結腸癌腫細胞による攻撃に対する防御になる。
【００９５】  Ｖ５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞を完全に拒絶した抗−ＣＴＬＡ−４処理された５匹のマウスが、７０日後、再び4×106の野生型５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞を反対側の脇腹に皮下注射されて攻撃された。上述のように腫瘍直径が測定され報告された。以前の腫瘍拒絶は２度目の攻撃に対して、初めての対照に比べて顕著な防護になっていた。全ての対照マウスは、漸進的に成長する腫瘍を発生し、腫瘍が大きな重荷になり、接種から３５日目に安楽死させられた。前に免疫処置された５匹のマウスのうち３匹は攻撃の７０日後も腫瘍が見られないままであった。前に免疫処置されたマウスのうち１匹だけが、１４日までに検出できる腫瘍を発生したが、この腫瘍の成長は非常に遅かった。最終的には、さらに二つの腫瘍が攻撃から４２日後に、免疫処置されたマウスで発生した。このデータは図３に示されている。以上の結果は、ＣＴＬＡ−４遮断によって起こった腫瘍拒絶が免疫的な記憶になったことをはっきりと示した。
ｅ）抗−ＣＴＬＡ−４処理は確立された腫瘍の成長を減少させる。
【００９６】  マウスのグループに2×106 の５１ＢＬｉｍ１０腫瘍細胞を皮下注射した。対照動物（ｎ＝１０）は100 μg の無関係なハムスター抗体が、図４の上向きの矢印で示されるように、０，３、６，及び９日目に腹腔内に注射された。１つの抗−ＣＴＬＡ−４処理グループは同じ日に腹腔内注射を受けた。他の処理グループのマウスは（ｎ＝５）７日目から始めてその後１０，１３，及び１６日目に（下向きの矢印）抗−ＣＴＬＡ−４抗体の腹腔内注射を受けた。データが図４に示されている。どちらかの時点で抗−ＣＴＬＡ−４抗体で処理されたマウスは処理されない対照に比べて腫瘍成長が顕著に小さかった。遅延処理の方が、５匹中２匹のマウスが接種から３０日後も腫瘍が発生しないままだったので、より効果的であるように見えた。
ｆ）抗−ＣＴＬＡ−４処理はマウス線維肉腫ＳＡＩＮの成長を減少させる
抗−ＣＴＬＡ−４処理の効果は癌腫細胞ラインに限定されない。同様な結果は、急速に成長するＡ／ＪＣｒマウスの線維肉腫でも得られた。マウスのグループに1×106のＳＡＩＮ線維肉腫細胞が皮下的に注射された。処理グループは、100 μg の抗−ＣＴＬＡ−４又は無関係なハムスター対照抗体が、図５の矢印で示されるように、０，３，及び６日目に腹腔内に注射された。全ての対照マウスは３０日目までに殺された。抗−ＣＴＬＡ−４処理された５匹のマウスのうち２匹は５５日目にも腫瘍が発生しないままであった。データは図５に示されている。
【００９７】 実施例３
抗−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体は抗原性補強剤として働く
ａ）免疫原の調製
ＤＮＰ−ＫＬＨをCalbiochem （San Diego, CA）から入手し、イオン除去した水に１mg/ml, 100 ng/ml, 又は10 pg/ml で懸濁させた。１ミリリットルのフロイント完全アジュバント（Difco, MI）が各１ｍｌのＤＮＰ−ＫＬＨ調製物に加えられた。次に、これらを、Current Protocols in Immunology, Colligan et al., eds., section 2.4, に記述されているように、両口のルーアー・ロック・コネクタで連結した二つの５ｍｌ注射器の中でルーアー・ロックを速やかに通すことによって乳化させた。
【００９８】  免疫原を注射する３０分前に、生後４−６週のＣ５７Ｂ１／６マウスに200 μg の非特異的対照ハムスター抗体又は200 μg の抗−ＣＴＬＡ−４抗体９Ｈ１０（どちらも全体積200 μl）を２３ゲージの注射器を用いて腹膜に注射した。その後マウスには上述の形態の免疫原200 μlが２１ゲージの注射器を用いて背中の二つの部位に注射され、投与量はそれぞれ、100 μg, 10 ng, 又は1 pg/匹、となった。３日後、抗体の注射が繰り返された。
【００９９】  最初の処理から１０日後、マウスを安楽死させた。血液が心臓穿刺によって採取されエッペンドルフ・チューブに移された。これらのサンプルは放置して一晩４℃で凝固させ、その後遠心分離して血清を得た。
血清は、Current Protocols in Immunology （前出）section 2.1 で述べられているように、標準的なアイソタイプＥＬＩＳＡを用いてＤＮＰを認識するアイソタイプ特異的な抗体について分析された。簡単に言うと、ＤＮＰが96 ウエルのCorning 変型丸底ＥＬＩＳＡプレートの各ウエルで50 μlの体積に100 ng/mlでプレートされた。ウエルは、記述されているバッファを用いてブロックされる。1:100 からスタートして、各血清の３重の階段希釈が各ウエルに加えられる。
これらは25 ℃で１時間インキュベートされ、洗浄バッファで洗浄される。アイソタイプは、マウス特異的抗体を１時間インキュベートされた50 μlのブロッキング・バッファ中に１μg/mlで検出剤として用いて検出される。アイソタイプ抗体はビオチニレートされ、検出はアビジン−ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと共にインキュベートし、洗浄してペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ、Sigma, Mo.）を加えることによって遂行される。停止バッファを加え、反応を停止させてから５−８分以内に各ウエルの吸光度がＥＬＩＳＡリーダーによって波長490-498 nm で読み取られる。
【０１００】  結果が図６Ａから６Ｅまでに示されている。各パネルは血清サンプルの異なるアイソタイプの濃度を示している。ｙ軸はＯ．Ｄ．読み取りを表し、Ｏ．Ｄ．の増加はそのアイソタイプを有する血清中の抗体の濃度の増加を示す。ｘ軸は注射された抗原の量を示し、それぞれ、マウス１匹あたり100 μg, 10 ng, 又は1 pg である。抗−ＣＴＬＡ−４抗体は、抗原の高い投与量でＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂへのクラス・スイッチングを増加させることが分かる。
【０１０１】  Ｔ細胞機能の分析は次のように行われた。リンパ節細胞を単離し、７２時間ＫＬＨで刺激した。ＲＰＭＩ-complete（10％ＦＣＳ（Hyclone, Montana）、2ｍＭグルタミン、50 μＭｂ−メルカプトエタノール、50 μg/ml ゲンタマイシン）を含む皿に、腋窩、鼠径、腸間膜、上腕、頸部、及び膝窩リンパ節が取り出された。リンパ節は単細胞懸濁物を得るために切り刻まれ、粒状物を除くためにnytex メッシュによって濾過され、血球計数器を用いて計数された。細胞は、96ウエル丸底クラスター・プレートで150 μlのＲＰＭＩ-completeに、5×105, 2.5×105, 又は1.25×105 細胞／ウエルでプレートされた。ＲＰＭＩ-complete中のＫＬＨ溶液が最終濃度100, 10, 1, 又は0 μg/mlとなるように加えられ、プレートは37 ℃で64 時間、５％ＣＯ2と共に加湿された培養器でインキュベートされた。６４時間後、１μＣｉの3Ｈ−チミジンを含む20 μlのＲＰＭＩ-completeが各ウエルに加えられ、プレートはさらに８時間インキュベートされた。この時点で、Inotech 96 ウエル・ハーベスターを用いて培養がグラスファイバー・フィルタに収穫された。フィルタは乾燥され、Packard Matrix カウンタを用いてカウントされた。各条件は三重複して行われ、データは三重複値の平均である。
【０１０２】  結果が図７Ａから７Ｂまでに示されている。最上行は一定の数の細胞（5×105 細胞）を異なる濃度の抗原（ｘ軸に示される）について示している。ｙ軸は、細胞増殖の尺度である3Ｈ−チミジンの取り込みを示している。下方のパネルは、一定の抗原濃度（10 μg/ml）を異なる数の細胞（ｘ軸に示される）について示している。このデータは、ＣＴＬＡ−４遮断が高い抗原投与量に対するＴ細胞の応答を強くアップレギュレートすることを示している。
【０１０３】  上の結果は、ＣＴＬＡ−４遮断薬による本発明の処理が抗原刺激に対するＴ細胞の応答を高めるということをはっきりと示している。in vivo での腫瘍細胞の増殖は本発明の遮断薬の存在下で大きく減少する。この効果は操作されない、野生型の腫瘍に対して観測される。ＣＴＬＡ−４遮断薬は、腫瘍治療への新しいアプローチであるだけでなく、競合する可能性のある阻害信号を除去することによって、共同刺激経路を含む他の治療アプローチに対して特に有益な補助手段になる可能性もある。Ｔ細胞ヘルプの一つの尺度である免疫グロブリン産生細胞によるクラス・スイッチングは大きく増加する。ペプチド抗原による免疫化へのＴ細胞応答も本発明の物質による処理で大きく高められる。
【０１０４】 実施例４
ヒトCTLA-4タンパク質に対して指向する抗体の生成
抗-ヒトCTLA-4抗体は、次のようにして生成される。
ａ）宿主動物の免疫化のためのヒトCTLA-4タンパク質
ヒトCTLA-4タンパク質を含む免疫源は、ヒトCTLA-4タンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む。ヒトCTLA-4タンパク質の細胞外ドメインは、データベースレファレンスに挙げられているように、アミノ酸残基38-161を含む。
【０１０５】  ヒトCTLA-4免疫源は、完全なヒトCTLA-4タンパク質または、ヒトCTLA-4の細胞外ドメインおよび融合相手を含む融合タンパク質を含む。免疫源は、細胞の膜中へ挿入された完全なヒトCTLA-4タンパク質を含み、表面にヒトCTLA-4を発現する細胞は、宿主動物を免疫化するために使用される。
ヒトCTLA-4タンパク質の一部を含む免疫源は、H38細胞（HTLV IIに関連する白血病系統）（R.ガロ(Gallo)、ナショナル  キャンサー  インスティチュート(National Cancer Institute)）からのmRNAからヒトCTLA-4タンパク質をエンコードするDNA配列を増幅するために、PCRを用いて生成される。mRNAは逆転写されて、第１鎖cDNAを生成する。次にcDNAが増幅される。リンスレイ(Linsley)ら[J. Exp. Med. 174:561 (1991)]に記載されているように、これらの配列は、融合相手をエンコードする配列に連結される。発現ベクターは、CTLA4Igと呼ばれる融合タンパク質をエンコードし、これは、（アミノ末端からカルボキシ末端まで）オンコスタチンMからのシグナルペプチド、ヒトCTLA-4の細胞外ドメインならびに、ヒトIgG1のH、CH2およびCH3ドメインを含む。オンコスタチンMからのシグナルペプチドは、天然に生じるヒトCTLA-4シグナルペプチドの代わりに使用される。ヒトIgG1分子の広範囲のタイプのヒンジドメインにおいて見出されるシステイン残基は、CTLA4Igタンパク質をエンコードするベクターの構築においてセリンへ変異させられた（リンスレイ(Linsley)ら、前出）。
ｂ）ヒトCTLA-4タンパク質を用いた宿主動物の免疫化
ヒトCTLA-4タンパク質を含む免疫源で動物を免疫化するために、非ヒト宿主動物が使用される。実施例1bに記載されているように、熱殺された(heat-killed)スタフィロコッカス(Staphylococcus)A(StaphA)細菌細胞をコーティングするために、ヒトCTLA-4／IgG融合タンパク質（例えばCTLA4Ig）を含む免疫源が使用される。６週令のBALB/cマウスが、足裏(footpad)に、0.2mlのPBS中に懸濁された、熱殺された(heat-killed) StaphA細菌（約100μgのCTLA4Igでコーティングされている）50μl（包装体積）を注射される。
【０１０６】  マウス１匹当たり全部で５回の注射が与えられる。最後の追加免疫(boost)の日でかつ注射の前に、実施例1bに記載されたようにして、眼内採血により約100μlの血清を得る。血清は、第１の注射の前と同一の方法により得た血清（すなわち、免疫前血清）と共に分析される。
免疫後の血液中にヒトCTLA-4Ig融合タンパク質を認識する抗体の存在を証明するために、ヒトCTLA-4Ig結合ELISAが使用される。ヒトCTLA-4Ig結合ELISAは、ELISAプレートがヒトCTLA-4タンパク質でコーティングされていること以外は実施例1bで上記したようにして行われる。
【０１０７】  ヒトCTLA-4Ig融合タンパク質を認識する抗体を、免疫化後の血液中に、バックグラウンドが検出され得る希釈より1000倍大きい血清希釈で含む、免疫化したマウスの血清およびリンパ節が採取される。リンパ球は、免疫化したマウスにおけるリンパ節をドレイン(drain)することから調製され、次いで、実施例1cで上記したように、ヒトCTLA-4タンパク質に対して指向するモノクローナル抗体の生成のために使用される。
【０１０８】  ヒトCTLA-4タンパク質を細胞表面に発現する形質転換された細胞を含む免疫源は、以下のようにして調製される。マウスリンパ腫細胞系EL4（ATCC TIB 39）をトランスフェクトするために、完全なヒトCTLA-4タンパク質をエンコードする発現ベクターが使用される。トランスフェクトされたEL4細胞は、1x 106〜1x 107トランスフェクト細胞／注射を用いて、マウスに注射される。トランスフェクトされた細胞は、PBSを含む溶液で注射される。マウスは、腹腔内または後ろ足裏(footpad)に注射され得る。腹腔内注射されるときには、全部で約４回の注射が投与される。注射部位として足裏が使用されるときには、全部で約５回の注射が投与される。免疫化した動物から血清を採集し、プレートがヒトCTLA-4タンパク質でコーティングされていること以外は実施例1bに記載したELISAを用いて、ヒトCTLA-4タンパク質に対して指向する抗体の存在について試験される。
ｃ）抗-ヒトCTLA-4抗体を分泌するハイブリドーマ系統の分離
ヒトCTLA-4免疫源で免疫化された動物のリンパ節または脾臓をドレインすることからリンパ球が分離され、実施例1cに記載されたPEG融合プロトコールを用いて、P3X3.Ag8.653細胞に融合されて、ハイブリドーマ細胞系が生成される。1000-5000個の細胞／ウェルを含むウェルからの培養上清が、ELISAアッセイを用いて、ヒトCTLA-4に対する反応性について、および、非CTLA-4タンパク質、例えばヒトCD4に対する反応性の欠如について試験される。
【０１０９】  陽性のウェルからのハイブリドーマは、実施例1cに記載された限界希釈によって、繰り返しクローン化される。ヒトCTLA-4タンパク質に対して反応性であるが、関連のないヒトタンパク質（例えばヒトCD4）に対して反応性でない、かつ、ヒトCTLA-4トランスフェクタント(transfectant)の細胞を染色するが、対照のトランスフェクタントの細胞は染色しない能力を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ系統が、抗-ヒトCTLA-4モノクローナル抗体の製造のために選択される。
【０１１０】 実施例５
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のイクス  ビボ(ex vivo)刺激
宿主細胞をイクス  ビボ(ex vivo)で刺激し、腫瘍特異的免疫エフェクター細胞へと分化させる。次に、抗癌治療効果を媒介するために、細胞は同じ宿主へ再導入される。
ａ）腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の分離
標準の技術を用いて、腫瘍浸潤リンパ球が得られる。固体腫瘍（新たに切除されたか、または低温保存したもの）を、１晩の酵素消化［例えば、0.01％ヒアルロニダーゼタイプV、0.002％DNAアーゼタイプI、0.1％コラーゲナーゼタイプIV（シグマ(Sigma)、セントルイス(St. Louis)）および抗生物質を含むRPMI 1640培地中で、室温にて1晩撹拌すること］によって、単一細胞懸濁物へと分散させる。次に、腫瘍懸濁物を、フィコール-ハイパーク濃度勾配液(Ficoll-Hypaque gradient)（リンパ球分離培地、オルガノン  テクニカ(Organon Teknika)社、Durham, NC）上を通す。濃度勾配液界面は、生存可能腫瘍細胞を含み、単核細胞を洗浄し、2.5〜5.0 x 105細胞／mlの全細胞濃度に調整し、完全培地中で培養する。完全培地は、10％の熱で不活化したタイプ-適合性(type-compatible)ヒト血清、ペニシリン50 IU/mlおよびストレプトマイシン50μg/ml（バイオフルイズ(Biofluids)、Rockville、MD）、ゲンタマイシン50μg/ml（ギブコ  ラボラトリーズ(GIBCO Laboratories)、Chagrin Falls、OH）、アンホテリシン250ng/ml（ファングルゾーン(Funglzone)、スキッブ(Squibb)、フロー  ラボラトリーズ(Flow Laboratories)、McLean、VA）、HEPES緩衝液10mM（バイオフルイズ(Biofluids)）ならびにL-グルタミン2mM（MA  バイオプロダクツ(Bioproducts)、Walkersville、MD）を有するRPMI 1640を含む。３日から４日の自己または同種異系のリンホカイン活性化したキラー(LAK)細胞培養物（以下参照）からのならし培地を、20％（体積／体積）の最終濃度で添加する。組換えIL-2を1000U/mlの最終濃度で加える。
【０１１１】  培養物は、5％CO2加湿環境中、37℃に維持される。培養物は毎週、細胞を採取し、ペレットにし(pelleting)、かつ新鮮な培地に2.5x 106細胞/mlにて再懸濁することによって養われる。初期の培養期間（例えば２〜３週間）を超えると、残存する腫瘍細胞が典型的には完全に消失して、リンパ球が選択的に増殖する。
LAK細胞培養物を作るために、末梢血リンパ球(PBL)を、患者または正常なドナーから得る。フィコール−ハイパーク濃度勾配液(Ficoll-Hypaque gradient)上を通した後、細胞を、2％ヒト血清、抗生物質、グルタミンおよびHEPES緩衝液を有するRPMI 1640培地中で、1x 106細胞/mlの濃度で培養する。組換えIL-2を1000U/mlで加える。培養物は、加湿した5％CO2環境中、37℃に３〜７日間維持される。
ｂ）TILのイクス  ビボ(ex vivo)刺激
抗-CTLA-4 mAbを含む培養培地2ml中の4x 106細胞を、24-ウェルプレートのウェル中で、5％CO2環境中、37℃で２日間インキュベートする。培養培地は、10％の加熱不活化した子牛胎児血清、0.1mMの非必須アミノ酸、1μMのピルビン酸ナトリウム、2mMの新たに調製したL-グルタミン、100μg/mlのストレプトマイシン、100U/mlのペニシリン、50 11g/mlのゲンタマイシン、0.5μg/mlのフンギゾーン(fungizone)（すべて、ギブコ(GIBCO)、Grand Island, NYから）および5x 10-5 Mの2-ME（シグマ(Sigma)）にて栄養補給したRPMI 1640培地を含む。細胞を採取し、洗浄する。
【０１１２】  初めに刺激した細胞を、組換えヒトIL-2（キロン(Chiron)社、Emeryville,CAから入手可能；特異的活性6〜8x 106U/mgタンパク質；単位は、2〜3国際Uに等しい）を有する培養培地2ml中で3x 105／ウェルでさらに培養する。IL-2中での３日間のインキュベーション後、細胞を採集し、洗浄し、数えて、増殖の程度を決定し、静脈内(i.v.)投与のために適当な培地（例えば、生理学的緩衝塩水溶液）中に再懸濁する。細菌培養を行って、活性化した細胞の再注入の前に、細菌汚染の存在を決定する。
【０１１３】  活性化したTILを注入のために適当な培地中に再懸濁させた後、宿主においてIVアクセス(access)を得、細胞懸濁物を注入する。任意的に、宿主は、イン  ビボ(in vivo)機能および刺激細胞（例えばIL-2）の生存を増進させるための剤で処置される。あるいは、イン  ビボ(in vivo)での自己反応性細胞の刺激を増進するために、活性化したTILと組合せて、CTLA-4阻害剤が投与される。
【０１１４】 実施例６
樹立された腫瘍に対する有効性
SA1は線維肉腫である。図８に示されたように、投与量当たり10μgの抗-CTLA-4抗体を用いたCTLA -4阻害は、腫瘍移植後７日間または14日間遅延したときにさえ有効である。このことは、CTLA -4阻害剤が、樹立された腫瘍の治療において有効であり得ることを示す。
【０１１５】                                実施例7
免疫応答刺激剤との共同作用
SM1は、乏しい免疫源性の乳房癌である。それは、B7を用いたトランスフェクションによる拒絶に対して抵抗性である。しかしながら、B7およびIFNgを用いた増殖のいくらかの阻害が得られた。図９に示した実験においては、マウスは、変性されていないSM1腫瘍細胞の皮下移植を受け、０日、３日および６日に、示された治療を受けた。示されているように、抗-CTLA-4での治療（10°μg/投与）はそれだけでは、腫瘍の増殖に効果がなかった。照射した、GM-CSF形質導入された細胞を用いた対側性部位での免疫化はまた、効果がなかった。しかしながら、２つの組合せは、５匹のマウスのうち４匹に完全な拒絶をもたらした。このことは明らかに、CTLA -4阻害剤が、GM-CSFと、かつおそらく他のリンホカインと共同作用して腫瘍拒絶を得ることができることを証明する。
【０１１６】 実施例８
延ばされたCTLA-4阻害
RENCAはゆっくり増殖する、乏しい免疫源性の腫瘍である。図10Aおよびに示されているように、CTLA-4阻害剤（100μg抗-CTLA-4抗体／投与）は、腫瘍移植時に始めたときには、単にわずかに有効なだけである。しかしながら、腫瘍移植後９日に始めるなら、それは非常に有効である。このことは、比較的大きい腫瘍塊からの腫瘍の残骸の生成が、有効な拒絶を得るための免疫応答を刺激するための剤として重要であることを示唆する。これは、CTLA-4阻害剤を、照射または化学療法の時点で、またはその直ぐ後に使用することができることを示唆する。
【０１１７】 実施例９
CTLA-4阻害剤は腫瘍断片の免疫性を増大させる
B16-BL6は本来、侵襲性特性についてのイン  ビトロ(in vitro)選択によって、自発性ネズミ黒色腫細胞系B16-F0から誘導された（ハート(Hart)、Am. J. Path. 97, no. 3:587-600 (1979)）。親細胞系およびその変異体の両方が、低レベルのH-2KbおよびDbを発現し、MHCクラスIIについて染色したときに陰性である。照射したB16-BL6でのワクチン接種は、生きたB16-BL6細胞での次の攻撃に対して保護しないし、B7.1発現は、イン  ビボ(in vivo)での腫瘍増殖にいかなる有意の変化ももたらさない（チェン(Chen)ら、J. Exp. Med. 179:523-532 (1994)、本発明者らの未公開の結果）。したがって、B16-BL6は、乏しい免疫源性であると考えることができる。本発明者らは、CTLA-4阻害剤を用いてこの腫瘍を攻撃する方法を研究した。
【０１１８】  図11に示された実験においては、マウスは、変性していない腫瘍細胞の皮下移植を受け、０日、３日および６日に、示された治療を受けた。CTLA-4阻害剤（100μg9H10／投与）はそれだけでは効果がなかったし、照射したB16細胞での対側性部位への免疫化も効果がなかった。しかしながら、両方を用いた治療は、治癒は観察されなかったけれど、小さいが有意のかつ再生可能な腫瘍増殖阻害を示した。
【０１１９】  このアプローチはまた、防御免疫化の設定において使用された。図12に示された実験においては、マウスは、CTLA-4阻害剤（100μg9H10／投与）と共にまたはこれなしで、かつ、サイトカイン含有ゼラチン微小球（50ngのγインターフェロンおよび50ngのGM-CSFを含む）と共にまたはこれなしで、照射したB16細胞を用いて免疫化された。マウスは、２週間後に、生きた変性していない腫瘍細胞で再攻撃された。CTLA-4阻害剤と共に照射細胞で免疫したマウスは、照射細胞だけを受けたマウスと比べて有意に損なわれた腫瘍増殖を示した。CTLA-4阻害剤と共にサイトカイン含有微小球を用いて、最良の防御効果が得られた。
【０１２０】  共に、これらのデータは、変性された腫瘍細胞または腫瘍断片での活性免疫化を用いて、CTLA-4阻害剤が免疫化の戦法を増進することができること、およびそれが、サイトカインとの共同作用効果を有し得ることを示した。
実施例10
腫瘍ワクチン合わせたCTLA-4阻害剤は、自己反応性T細胞を刺激し、乏しい免疫源性の腫瘍を撲滅するために使用することができる
この研究においては、CTLA-4阻害剤およびGM-CSF生成ワクチンの組合せが、CD8+およびNK1.1細胞に依存するが、CD4+ T細胞に依存しないメカニズムで、非常に腫瘍形成性で乏しい免疫源性の黒色腫B16-BL6に対して治療的に有効であることが示された。皮下の予備樹立された(pre-established)B16-BL6腫瘍から治癒したマウスは、４ヶ月後のB16-BL6または親細胞系B16-F0での再攻撃に抵抗する。さらに、B16-F10で誘発された肺転移は、組合せ治療によって撲滅することができ、これらのマウスからの転移の病変は、広範囲のリンパ球浸潤を示す。
【０１２１】  重要なことには、皮下および転移の黒色腫モデルの両方において、生存するマウスは、皮膚および毛の脱色を発生させ、これは、色素細胞に対して指向する自己免疫が同時に誘発されたことを示す。CD4が枯渇された動物がまた脱色を生じたので、この自己免疫現象は、色素形成抗原に対して指向する細胞傷害性Tリンパ球(CTL)によって誘発されるようである。このモデルは、抗-腫瘍応答において自己反応性CTLの重要性を研究するのに、ならびに、癌の免疫療法に関連する設定において末梢的耐性におけるCTLA-4の役割を調べるのに非常に適している。
材料および方法
マウス：C57BL/6メスマウス（チャールズ  リバー  ラボラトリーズ(Charles River Laboratories)/NCIから得た）を、施設の規定に従って保持し、８〜１２週令のときに腫瘍実験に使用した。すべての皮下注射は、麻酔剤メトキシフルラン(metoxyflurane)の吸入後に行った。
【０１２２】  抗体：ハムスター抗-ネズミCTLA-4抗体9H10の生成および精製は、上記の実施例１に記載されている。同様に、GK1.1（抗−CD4）、2.43(CD8)、PK136(NK1.1)、116.3(Lyt2.1、ラットIgG、B.フォウルクス(Fowlkes)から得た）は、本発明者らの実験室で腹水として調製したか、または標準の手順を用いて上清から精製した。マウスIgGおよびハムスターIgGは、ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラブズ(Jackson Immuno Research Labs)(West Grove, PA)から購入し、ラットIgGはシグマ(Sigma)（St. Louis, MO）から購入した。RM4.4-PE(CD4)、抗-CD8b2-PEおよびDX5（ファーミンゲン(Pharmingen)、San Diego, CA）は、関連する集団の枯渇を確認するために使用した。
【０１２３】  細胞系統およびGM-CSF遺伝子導入：B16-BL6、B16-F10（Dr.I．フィドラー(Fidler), MD アンダーソン  キャンサー  センター(Anderson Cancer Center), Houston TXから得た）、B16-F0(ATCC)およびDC2.4（シェン(Shen)ら、J. Immunol. 158, no. 6:2723 (1997)）は、1U/mlのペニシリン、1μg/mlのストレプトマイシン、50μg/mlのゲンタマイシン、2μMのL-グルタミンおよび8％子牛胎児血清で栄養補給されたDMEM（以後、完全DMEMと称する）中で培養した。C57B1/6誘導腫瘍細胞系EL4（胸腺腫）およびMC38（結腸直腸癌、Dr.N.レスティホ(Restifo)から得た）は、抗生物質、L-グルタミン、20μMのβ-メルカプトエタノールおよび8％FCSで栄養補給されたRPMI中に保持した。GM-CSF を生成するB16-BL6およびB16-F10は、当技術分野で公知のレトロウイルス形質導入によって得た（ドラノフ(Dranoff)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3539-43 (1993)参照）。短期間の系統(F10)またはクローン(BL6)によるGM-CSF生成は、市販の入手可能な、ネズミGM-CSFに対する抗体（ファーミンゲン(Pharmingen)）を用いて、サンドウィッチELISAによって試験した。クローンBL6/GM-E、/GM-18（5または20ngのmGM-CSF／106細胞／24時間を生成）および短期間系統F10/GM（30-40ng／106／24時間）は、完全DMEMを用いて培養した。GM-CSF生成は、ワクチン接種実験の進行中イン  ビトロ(in vitro)で慣例的に確認した。注射前のワクチンの照射は、GM-CSF生成を〜1.5-2倍増大させた。
【０１２４】  皮下攻撃および治療実験：マウスの背中の毛を剃り、104 B16-BL6細胞／PBSで皮下攻撃した。同じ日または示した後日に、106の照射した（16,000Rad）GM-CSF生成細胞（PBS中）を左脇腹に皮下注射することによって治療を開始し、示した３日および６日後に、繰り返した。ワクチンは、クローンBL6/GM-EおよびBL6/GM-18の1:1混合物から成っていた。9H10または対照ハムスターIgGでの治療を、同時または３日後に開始し、同様の結果を有した。抗体は、PBS中100μgで腹腔内に投与し、通常、次いで３日毎に50μgを２回注射した。腫瘍増殖を、垂直直径を測定することによって、１週間に２〜３回評価した。施設規定に従って、腫瘍がひどい腫瘍形成を示すか、300mm2の大きさに達したときに、マウスを安楽死させた。攻撃の７日前、６日前および５日前に関連抗体を注射（500μg、腹腔内）することにより、T細胞またはNK細胞の枯渇を行い、実験中10日毎の繰り返しの注射によって維持した。非交差阻止(non-crossblocking)抗体を用いたフローサイトメトリーによって、攻撃の１日前に、枯渇をリンパ節および脾臓において確認した。慣例的に、＜１％のCD4+細胞、CD8+T細胞またはNK1.1+細胞が、それぞれのマウスにおいてリンパ節（CD4またはCD8枯渇後）または脾臓（NK1.1枯渇）で検出され、それに対して、対照抗体（マウスIgG、ラットIgGまたは116.3）でのマウス治療は、未治療マウスと比べて、変化しないリンパ球プロファイルを証明した。
【０１２５】  肺転移の治療：肺転移を樹立するために、マウスに5x 104または105のB16-F10細胞を静脈注射した。照射したF10/GM細胞および抗体を用いた治療を、皮下の腫瘍の治療のために概略を述べたのと同じプロトコールに従って、24時間後に開始した。25日後、各治療群から肺を採取し、解剖用顕微鏡を用いて表面転移を数えた。パラフィン包埋した肺切片を、標準の手順を用いて、ヘマトキシリン-エオシンで染色した。生存実験のために、5x 104のB16-F10細胞を静脈内注射し、次の日に治療を開始した。
【０１２６】  CTL培養物の生成およびIFNγ放出アッセイ：B16-BL6を拒絶するマウスから脾臓を採取し、B16-BL6/B7.1または、B16-F0と樹状細胞系DC2.4との混合物で、o/n共培養(coculture)後に、イン  ビトロ(in vitro)で再刺激した。5x 106の脾臓細胞を、105照射（16,000rad）刺激剤細胞と混合し、組換えヒトIL2を加えて、最終濃度30IU/mlにした。７日後、細胞を採集し、ハイパーク濃度勾配遠心分離によって精製した。生存細胞（ウェル当たり2.5x 105）を、96-ウェルの丸底プレートにて、標的細胞（ウェル当たり5x 104）で24時間刺激した後、上清を集め、サンドウィッチELISAによってIFNγの存在について試験した。
結果
GM-CSF生成細胞性ワクチンと一緒のCTLA-4阻害剤は、樹立されたB16-BL6腫瘍の拒絶を引き起こす。腫瘍関連抗原の提示が限定され得ると仮説を立てて、CTLA-4阻害剤を、抗原の最適供給源としての照射したGM-CSF生成B16-BL6細胞と合わせた。C57BL/6マウスは、皮下に104 のB16-BL6細胞で攻撃され、次いで同じ日または4〜12日後に開始して、治療された。典型的な実験を図13Aに示す。予想されるように、CTLA-4阻害抗体9H10または対照ハムスターIgGの注射は、予備樹立されたB16-BL6腫瘍の拒絶を誘発しなかった。対照ハムスターIgGと合わせたときには、照射したGM-CSF生成B16-BL6細胞でのワクチン接種は、予備樹立された腫瘍の生長にほとんどまたは全く効果がないことを証明した。しかしながら、GM-CSF生成ワクチンとCTLA-4阻害剤の組合せは、同じ日または４日間に注射したすべての腫瘍の拒絶を誘発した。第８日のB16-BL6腫瘍を有する５匹のマウスのうち１匹が、CTLA-4阻害剤を含む組合せ治療後に小さい触診できる腫瘍を拒絶した。12日前に樹立された腫瘍においては、いかなる有意の効果も見出されなかった。すべての実験が合わせられ、組合せ治療の全体的な成功の割合80％が達成された（０日または４日のB16-BL6腫瘍から治癒したマウス85匹のうち68匹）。これらの結果は、CTLA-4阻害剤およびGM-CSF生成ワクチンが共同作用的に作用して、乏しい免疫源性の腫瘍の拒絶を引き起こすという実施例７における結果を確認する。
【０１２７】  ワクチン接種の数を滅らすと、腫瘍攻撃として同じ日に投与したGM-CSF生成ワクチンの１回の投与量が、CTLA-4阻害剤と合わせたときに、すべてのマウスにおいて腫瘍を撲滅するのに十分であることを発明者らは見出した（図13B）。同様に、GM-CSF生成細胞での３回のワクチン接種後の抗-CTLA-4の１回の投与量は、B16-BL6拒絶を誘発するのに十分であった（示さず）。ワクチンによるGM-CSF生成は、共同作用効果のために不可欠であることがわかった。というのは、抗-CTLA-4抗体と組合せた、照射した形質導入されていないB16-BL6細胞でのワクチン接種は、有効でなかったからである（データは示されず）。
【０１２８】  CTLA-4阻害剤とGM-CSF生成ワクチンとの組合せは、B16-BL6での再攻撃に対して有効な抵抗性を誘発する。B16-BL6の最初の攻撃から治癒したマウスが再攻撃に対する抵抗性を生じさせるかどうかを決定するために、生存するマウスは、最初の攻撃の128日後に、2x 104 B16-BL6の第２の攻撃を左脇腹に受けた。また、B16-F0親黒色腫細胞系に対する抵抗性を、右脇腹に2x 104 注射することによって試験した。未投薬の週齢の合う対照マウスが、両方の腫瘍を増殖させ、30日以内に安楽死させられた。B16-BL6での第１の攻撃から治癒したすべてのマウスは、CTLA-4阻害剤にかかわらず、B16-F0を拒絶し、それに対して、BL6/GMワクチンと抗-CTLA-4を受けた９匹のうちの７匹がまた、B16-BL6を拒絶した（以下の表I）。
【０１２９】
【表１】
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【０１３０】  実験内で、BL6/GMワクチン接種のみの後に最初の攻撃を拒絶した２匹のマウスは、第２回のB16-BL6攻撃を拒絶することができなかった（表I）。それに対して、BL6/GMワクチンと抗-CTLA-4を受けた７または９匹のマウスはまた、B16-BL6を拒絶した。２回の再攻撃実験において、組合せ治療によりB16-BL6から治癒した24匹のうち20匹のマウスが、B16-BL6での第２回の攻撃に免疫性であり、11匹のマウスがB16-F0での再攻撃に抵抗性であった。GM-CSF生成細胞のみでのワクチン接種して治癒した８匹のマウスのうち４匹だけが、再攻撃に抵抗性であった。B16-BL6での再攻撃に対する抵抗性は、100％のマウスで見出されなかったが、すべてのマウスがB16-F0を拒絶したという事実は、B16-BL6での最初の攻撃で生存しているマウスが、親細胞系とそのより侵襲性の変異体との間で分けた抗原に対する適切な記憶を備えていたことを示唆する。
【０１３１】  CD8+およびNK1.1+細胞は、B16-BL6の組合せ治療のために必要とされる。TおよびNK細胞がB16-BL6の拒絶に関連したのかどうかを評価するために、マウスを、B16-BL6での攻撃の前に、CD4+、CD8+またはNK1.1+細胞を枯渇させた。ワクチンおよび抗-CTLA-4の３回の同時注射の一般的スケジュールに従って、腫瘍移植と同じ日に治療を開始した。CD8+細胞の枯渇は、治療の効果を排除した（表II）。NK1.1+細胞を枯渇させたマウスはまた、十分にその腫瘍を拒絶することができなかった（8/10）。本発明者らは、腫瘍を有するNK-枯渇したマウスが、攻撃の部位で多重の腫瘍を発生させたことを観察し、これは、NK細胞が、最初に注射した腫瘍負荷を減らすことによって、MHCクラスIJ0 B16-BL6攻撃に対する防御の第１線に関連し得ることを示唆する。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】  驚くべきことに、CD4+T細胞は、腫瘍の拒絶に必要とされなかった。事実、50-60％の対照群がB16-BL6を拒絶した、最適条件に及ばない条件下で、80％のマウスがその腫瘍を拒絶した（表II）。CD4+およびCD8+細胞の両方の枯渇は、治療効果をなくした。CD8+細胞およびNK1.1+細胞が、CTLA-4阻害剤およびGM-CSF生成ワクチンを用いてB16-BL6を拒絶するために必要であることは明らかである。B16-BL6黒色腫の拒絶に関連するCD8+T細胞の活性化は、CD4の助けによらないと思われる。
【０１３４】  B16-BL6に対するCTL活性は、イン  ビボ(in vivo)でCTLA-4阻害剤によって非常に増大される。腫瘍反応性CTLが組合せ治療により誘発されたかどうかを決定するために、マウスを、BL6/GMと抗-CTLA-4または対照IgGとで免疫し、４週間後にB16-BL6で攻撃した。攻撃後10日に、各群４匹のマウスからの脾臓をプールし、B16-BL6/7.1または、B16-F10および不死化した樹状細胞系DC2.4の混合物で再刺激した。イン  ビトロ(in vitro)での１循環の再刺激後、特異的IFNγ放出を、異なるB16変異体および、H-2bハプロタイプを発現する２つの関連のない腫瘍細胞系（胸腺腫EL4および結腸直腸癌MC38）に対して試験した。図14に示されているように、対照ハムスターIgGの存在下でBL6/GMでワクチン接種したマウスからのT細胞は、非常に低い濃度の検出可能なIFNγ生成をこのアッセイにおいて生じたが、それに対して、イン  ビボ(in vivo)で抗-CTLA-4で治療したマウスからのT細胞は、B16特異的IFNγ分泌を非常に増大させた。
【０１３５】  これらの結果は、BL6/GMでのワクチン接種中のCTLA-4阻害剤は、B16およびその変異体によって発現される抗原（または複数の抗原）に対する反応性をとりわけ増大させることを示す。さらに、組合せ治療後長期間（3-10ヶ月間）生存したマウスから樹立されたすべての脾臓細胞培養物は、イン  ビトロ(in vitro)での１循環の再刺激後のIFNγ放出によって試験した（データは示されていない）ように、B16およびその変異体ととりわけ反応することが見出された。好成績のB16-BL6の拒絶は、腫瘍特異的T細胞活性の生成と一致する。
【０１３６】  組合せ治療によるB16-F10の肺転移の抑制および長期間治癒。ワクチン接種と組合せた抗-CTLA-4が、転移性疾患に対して有効であるかどうかを試験するために、105 B16-F10細胞（もっぱら肺への転移のために選ばれた；フィドラー(Fidler)、Cancer Res. 35:218-234 (1975)）を静脈内注射し、１日後に治療を開始した。第25日に、マウスを犠牲にし、表面の肺転移を数えた。抗-CTLA-4のみでの治療は、対照IgGに比べて、肺転移の数に認め得るほどの効果を示さなかった（以下の表III）。F10/GMでの免疫化は少数のマウスにおいて転移の数を滅らし、抗-CTLA-4との組合せは、さらに肺のコロニー化を抑制し、試みた５匹のマウスのうち２匹で肺転移を完全に阻害した。
【０１３７】
【表３】
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【０１３８】  これらの肺試料の組織学的分析は、F10/GMワクチン接種と組合せたCTLA-4阻害剤が、染色されたすべての転移において単核細胞の浸潤に関連することを証明し、５匹の腫瘍を有する肺のうち３匹で観察した（２つの残った組の肺は、腫瘍がないことがわかった）。抗-CTLA-4もF10/GMワクチン接種もいずれも単独では、肺の腫瘍または周辺組織においてリンパ球浸潤をもたらさなかった。少数の多形核細胞が、対照IgGの存在下でF10/GMにてワクチン接種したマウスからのより小さい転移において観察されたが、対照群のいずれでも、より大きい病変における広範囲の浸潤はなかった。
【０１３９】  組合せ治療による肺転移の一掃は、生存実験で確認された（図15）。5x 104のB16-F10細胞で攻撃され、対照ハムスターIgGで治療されたマウスはすべて（10/10）、注射後75日までに、広範囲の転移疾患により肺機能不全で死んだ。抗-CTLA-4単独では、F10/GMでのワクチン接種を行ったときに生存を延長した。しかしながら、組合せ治療を受けた13匹のマウスのうちの13匹が80日まで生存し、治癒したようであった（図15）。かくして、イン  ビボ(in vivo)でのCTLA-4阻害剤は、転移した疾患に対して治療的に有効である。
【０１４０】  皮下のB16-BL6腫瘍またはB16-F10の肺転移でもなお生存しているマウスは、皮膚および毛の脱色を生じる。攻撃後４〜８週間以内に、56％（68匹の治癒したマウスのうち38匹）の生存マウスが、ワクチン接種（左脇腹）および攻撃（背中）の部位で始まる、皮膚および毛の脱色を生じた。さらには、B16-F10の肺転移でもなお生存しているマウスの同様の割合で、ワクチン接種の部位に脱色が観察された。治療開始８日前に樹立されたB16-BL6腫瘍の拒絶は、攻撃後25日以内に出現し遠い部位まで広がる、速くかつ進行性の脱色を誘発し、これは、比較的強い抗-腫瘍応答が、進行性の脱色の急速な発現をもたらしたことを示す。脱色は、予防の設定で組合せ治療を受けたマウスにおいて生じたが、頻度は減った。興味あることに、脱色は、CD4+T細胞の存在に依存しなかった。というのは、８匹の腫瘍を拒絶しているCD4枯渇マウスのうちの４匹がまた、進行性の脱色を生じたからである（表II、示されていない）。幾つかの場合に、腫瘍を有するマウス（抗-CTLA-4およびBL6/GMでの治療にもかかわらず、瀕死）は、進行している腫瘍増殖の部位で、小さい領域の毛の脱色を生じることがわかった。脱色は、CTLA-4阻害剤なしでBL6/GM-CSFワクチン接種によって治療されたマウスにおいて、または他の治療群のいずれにおいても観察されなかった。これらの研究結果は、CTLA-4阻害剤が、メラニン細胞系統から誘導された腫瘍の拒絶にとりわけ関連し、また色素抗原を発現する皮膚および毛穴の正常な色素含有細胞の拒絶を仲介し得る、自己反応性リンパ球の活性化を見込むことを示唆する。
【０１４１】  先のデータは、高度に腫瘍源性で乏しい免疫源性の黒色腫B16-BL6の組合せ治療が、80％の全体的治癒率をもたらしたこと、および、イン  ビボ(in vivo)で腫瘍増殖の早い時期にT細胞活性化を増進すると、CD8+ CTL依存形式で、B16-BL6での第１回および第２回の攻撃の拒絶を誘発できたことを証明する。さらに、予備樹立されたB16-F10の肺転移の生長が、同様の組合せ治療スケジュール後に抑制された。肺転移は特に、抗-腫瘍応答の誘発のための抗原の不充分な供給源と考えられ得る。皮下の抗原およびCTLA-4の阻害剤の供給は、肺転移生長を抑制し、試験した条件下ですべてのマウスを治癒するのに十分であり、さらにこの治療アプローチの有効性を強調するものであった。
【０１４２】  理論に縛られないが、ワクチンと抗-CTLA-4抗体の組合せの有効性は、抗体阻害剤によるCTLA-4の阻害効果の除去の結果として高度に増強されたT細胞応答と一緒にワクチンによって、宿主APCにより増進されたT細胞の交差初回免疫(crosspriming)に帰することができるようである。このことは、予め存在する腫瘍細胞塊を除去することができるレベルへと、T細胞応答の共同作用的増進をもたらす。これは、活性化の閾値の低下による、多数の未変性のT細胞の活性化、または応答を終結させることに関連するシグナルの一時的除去によるより持続的応答の結果として起こり得る。治癒したマウスが最初の治療の４ヶ月後の治療なしで再攻撃を拒絶したという事実によって示されるように、拒絶は、長期間の記憶を伴う。
【０１４３】  B16-BL6腫瘍の撲滅後、56％の生存マウスが、ワクチン接種および攻撃の部位で開始し、遠くの部位へと広がる脱色を生じた。外被の色の喪失は、全身性および進行性の自己免疫が色素含有細胞に対して生じたことを示した。ヒト黒色腫患者については、自己免疫脱色と改善された臨床的応答との間の良い相関関係が証明された。リチャーズ(Richards)ら、J. Clin. Oncol. 10:1338-43 (1992)。
【０１４４】  本発明においては、脱色および腫瘍拒絶の両方が、外来タンパク質配列の導入なしに生じ、これは、CTLA-4阻害剤が、自己抗原を認識する寛容(tolerized)または無知の免疫エフェクター細胞の（再）活性化を見込むことを示す。この実験で好結果で治療されたすべてのマウスが、脱色以外は容易に観察できる不都合な効果を伴わずに、18ヶ月を超えてなお生存したので、問題の治療は、この腫瘍モデルについて好結果の長期間治癒を提供した。
【０１４５】 実施例11
一次前立腺腫瘍モデルにおけるCTLA-4阻害剤
先の実施例により証明されたように、抗-CTLA-4抗体の投与は、幾つかの移植可能なマウス腫瘍系において、新たに移植された腫瘍、およびある場合には首尾良く樹立された腫瘍の拒絶を誘発するのに十分である。この系におけるCTLA-4阻害剤の有効性は、腫瘍本来の免疫源性に依存すると思われる。乏しい免疫源性の移植可能な腫瘍、例えば乳房癌SMI23または黒色腫B16の治療には、CTLA-4阻害剤だけでは有効でないが、抗-CTLA-4が、GM-CSFを発現する照射した腫瘍細胞ワクチンと一緒に投与されるときに、これらの腫瘍の撲滅が達成できる。実施例10において最初に示したように、B16黒色腫の場合には、拒絶は一様に、多くのヒト黒色腫患者における免疫療法に付随する白斑に似た進行性の脱色を伴う。この結果は、マウスにおいて、ヒトにおけるように、抗−黒色腫応答が、少なくとも部分的に、正常メラニン細胞特異的抗原に対して指向することを示唆する。
【０１４６】  細胞に基づくワクチンと組合せたCTLA-4阻害剤の有効性が、乏しい免疫源性の移植可能な腫瘍モデルにおいて与えられたので、この研究は、TRAMP（マウス前立腺のトランスジェニック腺癌）マウスで、一次前立腺癌の治療におけるこの方法の有効性を調べた。これらのマウスにおいては、SV40T抗原トランスジーン発現は、アンドロゲン調節方法で、前立腺上皮への癌遺伝子の発現を指示するラットプロバシン(probasin)プロモーターの転写制御下にある。TRAMPマウスにおける新形成の病因は、人におけるそれを反映する。トランスジーン発現が思春期に始まるときには、オスのTRAMPマウスは過形成（５〜８週令）、明白な新形成（８〜12週令）および結局、肺、リンパ節および骨への転移を伴う侵襲性の腺癌（15〜20週令）を生じる。ギングリッチ(Gingrich)ら、Prost Cancer and Prost Dis 6:1-6 (1999)。
【０１４７】  ここに示されているように、照射腫瘍細胞ワクチンと組合せたCTLA-4阻害剤は、腫瘍の発生率および前立腺の病変のひどさを減らすのに有効であった。さらに、幾らかのワクチン接種したTRAMPマウスの前立腺において、炎症細胞の有意の蓄積があった。最後に、抗-腫瘍応答は、正常な前立腺によって発現される抗原に部分的に指向する。というのは、CTLA-4阻害剤の条件下で、非トランスジェニックマウスのGM-CSF発現腫瘍細胞ワクチンでの免疫化は、著しい前立腺炎をもたらすからである。この研究は、一次癌におけるこの免疫療法の有効性を証明し、かつ前立腺腫瘍は、免疫療法の標的を提供し得る組織特異的抗原を発現することを示す。
方法
マウス：動物についての手順はすべて、ザ  ユニバーシティ  オブ  カリフォルニア  アニマル  ケア  アンド  ユーズ  コミティー(the University of California Animal Care and Use Committee)により承認されたプロトコール下で、NIHガイドラインに従って行った。TRAMPマウスは、純C57BL/6バックグラウンドで、本発明者らの個体群内で繁殖された。これらの実験のために、TRAMPマウスを、一度FVB/Nマウスと戻し交配し、先に記載したPCRによってトランスジーンの存在についてスクリーニングした（グリーンベルグ(Greenberg)ら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:3439-43 (1995)）。
【０１４８】  マウスは皮下に、照射した（12,000rad）TRAMP-C1およびTRAMP-C2または、それらのGM-CSF形質導入誘導体であるGMTRAMP-C1/C2のそれぞれの1x 106細胞をワクチン接種された。抗原の攻撃を最大にするために、この治療を、３日離してさらに２回繰り返した。ワクチン接種の開始後毎日、マウスに、100μgの抗-CTLA-4（クローン9H10、実施例１）または精製したハムスターIgG（ジャクソン  イムノリサーチ(Jackson Immunoresearch)社、West Grove, PA）を腹腔内注射した。抗体のさらなる投与量を、最初の治療の３日後および６日後に投与した。マウスは罹病率について追跡され、腫瘍負荷量が直径約50mmを超えるか、または動物の呼吸が弱まったときに、安楽死させられた。マウスは示された週令で安楽死させられ、前立腺複合体を実体顕微鏡下で顕微解剖された。腫瘍発生率は、検死で最初に評価され、組織病理学の試験によって確認された。
【０１４９】  組織病理分析：前立腺複合体を個々の葉へと顕微解剖し、10％中性緩衝ホルマリン中に固定した。組織を加工処理し、慣例の組織病理分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。TRAMP組織を光学顕微鏡で調べ、以下の基準を用いて評価した：正常上皮は、1.0の評点をつけられ；上皮の房状化および核：細胞質の比の増加を伴う、前立腺上皮内新形成(PIN)の初期サインは2.0の評点をつけられ；顕著な篩状(cribiform)構造ならびに有糸分裂および／またはアポトーシスの形態の増加を伴う、さらに進んだPINは3.0の評点をつけられ；新形成上皮による肋間隙の喪失および基底膜の浸潤は4.0の評点をつけられ；腺癌の証拠を伴う、管腔の全体的喪失は5.0の評点をつけられ；かつ、未分化腫瘍細胞のシートは6.0の評点をつけられた。各動物について評価を出すために、腹部、背側または外側の前立腺葉についての最大組織学的評点を用いて、治療群についての平均を計算した。すべてのTRAMP動物についての優勢なピーク評点は4.0であり、3.0より下の組織学的評点はわずかであった。
【０１５０】  細胞培養：TRAMP-C細胞は、TRAMPマウスから独立して誘導された、初期継代（イン  ビトロ(in vitro)で10-15継代）の非クローナル上皮腫瘍細胞である。細胞は、5％子牛胎児血清（バイオホィッタカー(Biowhittaker)）、5％Nu-血清（コラボラティブ  バイオメディカル  プロダクツ(Collaborative Biomedical Products), Bedford, MA）、5μg/mlインシュリン（シグマ  ケミカル(Sigma Chemical), St. Louis, MO）および0.01μMジヒドロテストステロンの最終濃度に栄養補給されたDMEM（バイオホィッタカー(Biowhittaker), Walkersville, MD）を用いた培養で繁殖させた。
【０１５１】  GM-CSF発現系を得るために、細胞を、ΨCRIPプロデューサー(producer)系（ソマティックス(Somatix)社、Alameda, CAからの寄贈）を用いて、マロニー(Maloney)ネズミ白血病ウィルスLTRにより誘導されたマウスgm-csf遺伝子を含むレトロウィルスに感染させた。レトロウィルス含有上清をTRAMP-C培養物に添加し、8μg/mlのポリブレン（シグマ(Sigma)）の存在下で一晩インキュベートした。GM-CSF生成を、ELISA（ファーミンゲン(Pharmingen)、San Diego, CA）によってアッセイした。GMTRAMP-C1およびGMTRAMP-C2の両方が、150-200ng/ml/1x 106細胞/24時間でGM-CSFを分泌した。注射に使用される細胞を、トリプシン（バイオホィッタカー(Biowhittaker)）を用いて組織培養皿からはずし、ハンクスバランス塩溶液(Hank's balanced salt solution)（バイオホィッタカー(Biowhittaker)）中で３回洗浄した。細胞を、1x 106細胞/mlの密度で再懸濁させ、セシウム源照射器を用いて12,000radで照射し、0.1mlの体積で皮下注射した。
結果
細胞に基づくワクチンおよび抗-CTLA-4での治療後のTRAMPマウスにおける一次腫瘍発生率の減少。オスTRAMPマウスを、14-16週齢で、照射したTRAMP-C1およびTRAMP-C2の組合せ（TRAMP-C1/C2）または、ネズミgm-csf遺伝子を発現するように形質導入されたTRAMP-C1/C2（GMTRAMP-C1/C2）でワクチン接種した。抗体治療は、ワクチン接種の７日後に始めた。治療の有効性の初期の徴候を得るために、各群から４匹のマウスを、治療の開始３週間後に安楽死させ、肉眼での剖検で、かつ前立腺葉の顕微解剖後の顕微鏡レベルで、腫瘍発生率について調べた。平均の動物または治療群間の泌尿器管系重量に有意の差はなかったが、腫瘍発生率に著しい差があった。ワクチンに関係なく、対照抗体を受けている治療群の12匹のマウスのうちの11匹（92％）が、検出可能な腫瘍を有していた。それに対して、抗-CTLA-4を受けているマウス12匹のうちの3匹（25％）だけが、検出可能な腫瘍を有していた。
【０１５２】  治療の３週間後に、対照抗体で治療されたマウスにおける腫瘍は、残る150匹のマウスの生存についての懸念を保証するのに十分に大きかった。したがって、腫瘍の発生率および腫瘍の程度の査定を可能にするために、残る各群25匹のマウスを５週間後（または治療の８週間後）に安楽死させ、肉眼での剖検および前立腺複合体の顕微解剖で、以下の基準を査定した：動物重量、前立腺重量、腫瘍発生率および前立腺疾患の組織病理学。治療の３週間後の分析と同様に、治療群のいずれの間でも動物重量または前立腺重量に有意の差がなかった。しかしながら、腫瘍発生率に有意の差があった（図16A）。抗-CTLA-4および、TRAMP-C1/C2ワクチン（43％、P=.05）またはGMTRAMP-C1/C2ワクチン（33％、P=.009）で治療したマウスにおいては、対照抗体のみで治療したマウス（69％）におけるより、有意に低い腫瘍発生率が観察された。
【０１５３】  抗-CTLA-4のみでの治療は、腫瘍発生率に有意の効果を持たなかった（64％）し、対照抗体治療および各々のワクチンを受けているマウスにおける腫瘍発生率に有意の減少もなかった（55％- TRAMP-C1/C2および75％- GMTRAMP-C1/C2）。かくして、CTLA-4阻害剤とワクチン接種のいずれも単独では、TRAMPマウスにおける一次腫瘍の治療に有効でなかった。しかしながら、抗-CTLA-4と各々のワクチンとの組合せは、腫瘍発生率に共同作用的効果を有していた。腫瘍発生率が、GMTRAMP-C1/C2でワクチン接種されたマウスにおいては少し低かった（33％-抗-CTLA-4＋GMTRAMP-C1/C2対43％-抗-CTLA-4＋TRAMP-C1/C2）ので、ワクチンによるGM-CSFの発現は、抗-腫瘍応答を増強し得る。
【０１５４】  各群は２週間間隔をおいた出産日(birthdate)の同腹子からのマウスを含んでいたので、腫瘍発生率を、治療の開始のときの週令の関数として再査定した。GMTRAMP-C1/C2でワクチン接種されたマウスについて図16Bに示されているように、14週令で治療したマウスにおける腫瘍発生率に有意の減少がみられた(P=.003)が、16週令で治療した群にはみられなかった（P=0.1）。このことは、TRAMPマウスの免疫療法の時点で腫瘍の展開の段階が治療の効力に影響したことを示唆する。TRAMP-C1/C2および抗-CTLA-4で治療されたマウスにおける腫瘍発生率は、いずれの週令での治療でも同等であり、対照マウスと有意の差はなかった。
【０１５５】  組合せ免疫療法で治療されたTRAMPマウスにおける腫瘍の程度の減少。TRAMPマウスにおける前立腺の病変のひどさを査定するために、前立腺の個々の葉を、慣例の組織病理分析のために調製した。上記したように、評価の尺度を使用してTRAMPマウスの前立腺において観察された変質の範囲または腫瘍程度を評価した。腹部、背側または外側の前立腺葉についてのピーク組織学的評価を、各動物について決定し、治療群についての平均を、平均ピーク評点として計算した。図17Aに示されているように、抗-CTLA-4および各々のワクチンで治療したマウスにおける病変のひどさに有意の減少があった。とりわけ、TRAMP-C1/C2および抗-CTLA-4で治療したTRAMPマウスは、対照Ig-で治療したマウス（平均ピーク評点5.5、p=.03）より有意に低い評点（平均ピーク評点4.6）を有していた。なおさらに著しいのは、GMTRAMP-C1/C2および抗-CTLA-4で治療したマウスが、すべての３つの対照群：対照Ig/ワクチンなし（p=.0009）、対照Ig/ GMTRAMP-C1/C2（平均ピーク評点5.5、p=.0002）および抗-CTLA-4治療のみ（平均ピーク評点4.8、p=.04）より有意に低い腫瘍程度を有していた（平均ピーク評点3.9）という研究結果であった。CTLA-4阻害剤なしで各々のワクチンでの治療、またはCTLA-4阻害剤のみでの治療は、腫瘍の程度に有意の効果を有さなかった。これらの結果は、治療８週間後の一次腫瘍の発生率の減少だけでなく、CTLA-4阻害剤と組合せた腫瘍細胞に基づくワクチンでのワクチン接種が、TRAMPマウスにおける前立腺の病変のひどさを減らすことを証明する。
【０１５６】  腫瘍発生率の分析について行ったように、組織学的データを、治療時の週令の関数として、腫瘍の程度について再分析した（図17B）。腫瘍発生率と同様に、最高の統計学上の有意性が、14週令で治療したマウスにあった。GMTRAMP-C1/C2および抗-CTLA-4で治療したマウス（平均ピーク評点=3.5）は、GMTRAMP-C1/C2および対照Igで治療したマウス（平均ピーク評点=5.3、p=.0002）および対照Igのみで治療したマウス（平均ピーク評点=4.7、p=.0002）より低い腫瘍程度を有した。興味深いことに、16週令で治療したときに、GMTRAMP-C1/C2ワクチンおよび抗-CTLA-4を受けたTRAMPマウス（平均ピーク評点=4.5）のみが、GMTRAMP-C1/C2および対照Igで治療したマウス（平均ピーク評点=5.6、p=.03）より少し低い平均ピーク評点を有していた。
【０１５７】  おそらく、これらの分析の最も著しい組織学的形態が、GMTRAMP-C1/C2および抗-CTLA-4で治療したマウスにおいて観察され、この場合、肋間隙に炎症細胞の蓄積があった。これらのマウスにおいては、炎症細胞は、ストロマで見出される脈管構造と密接に関連していた。それに対して、対照Igで治療したマウスのいずれにおいても炎症細胞の検出可能な蓄積はなかった。GM-CSFを発現するワクチンでのみ治療したTRAMPマウスにおいては、炎症細胞が検出される領域が時折あったが、これらの部位は抗-CTLA-4でまた治療されたマウスにおいて観察されたものと同じくらい広くはなかった。浸潤細胞の形態学的形態は、脈管周囲の炎症が骨髄性細胞ならびにリンパ球からなることを示唆した。
【０１５８】  ワクチン接種およびCTLA-4阻害剤による、非トランスジェニックマウスにおける前立腺炎の誘発。免疫化の８週間後のTRAMPマウスにおける前立腺の炎症浸潤を伴う、腫瘍の発生率およびひどさの減少は、強い免疫応答の表示であった。これらのマウスにおける腫瘍形成性は、SV40 タグ(Tag)の前立腺特異的発現により誘導されるという事実から、抗-腫瘍応答がこのウィルス癌遺伝子から誘導されるエピトープに対して指向するという可能性が生じた。本発明者らは、これは起こりそうもないと考えた。というのは、TAg発現は、RT-PCRによってワクチン腫瘍細胞で検出することができなかったし、腫瘍細胞は、タグ(Tag)のH-2b-制限エピトープに対して反応性のCTLによって溶解されなかったからである（個人的情報、S.T.テベシアン(Tevethian)およびL.マイリン(Mylin)、Pennsylvania State University）。
【０１５９】  治療法によって引出された免疫応答が、癌遺伝子にエンコードされた抗原に限定されるかどうかを決定するために、非トランスジェニックC57/BL6マウスにワクチン接種し、28日後に、炎症の証拠について前立腺を調べた。GMTRAMP-C1/C2ワクチンのみでワクチン接種されたマウスの前立腺の背面または腹部の葉に、有意の炎症または組織損傷の証拠はなかった。しかしながら、GMTRAMP-C1/C2でワクチン接種し、抗-CTLA-4で治療したマウスにおいて、広範囲の単核細胞炎症およびオスの生殖管系（背面の前立腺を含む）の腺上皮の破壊があった。これらの結果は、ワクチン接種法によって引出された応答が、正常な前立腺細胞によって発現される抗原に部分的に指向することを証明する。
【０１６０】  先のデータは、CTLA-4阻害剤を、サイトカインを発現する細胞に基づくワクチンと共同作用的に組合せて、一次腫瘍の治療のための有効な治療法を作り出すことができることを証明する。腫瘍発生率ならびに組織学的な腫瘍の程度の減少は、細胞に基づくワクチンと抗-CTLA-4との組合せが、一次前立腺腫瘍の進行を遅らせるのに十分であったことを示す。免疫系が、この攻撃的モデルにおいて腫瘍を完全には除去することができないことは驚くべきことではないが、器官全体が変質を経験している情況で、抗-腫瘍免疫応答が疾病の進行に有意の影響力を有し得ることは驚くべきことである。CTLA-4阻害剤と組合せた、細胞に基づくワクチンの、攻撃的なTRAMPモデルにおける腫瘍発生率および負荷を有意に減らす能力は、この免疫療法アプローチの著しい有効性を強調する。
【０１６１】  ワクチンまたは抗体単独で治療したTRAMPマウスは、腫瘍発生率および腫瘍の程度に減少がなかったが、それに対して、両方の組合せは、両方の基準に有意の減少をもたらした。このことは、細胞に基づくワクチンからの抗原のさらなる供給源は、T細胞初回免疫に寄与し、これは、CTLA-4/B7相互作用の阻害剤によって増進されることを示唆する。腫瘍発生率および腫瘍の程度が、GMTRAMP-C1/C2ワクチンを受けたマウスにおいては、TRAMP-C1/C2ワクチンを受けたマウスより低かったという事実は、GM-CSF発現によるAPCの増加および活性化によって、効果が増進されることを示唆する。
【０１６２】  TRAMPマウスの治療に有効であると証明された同じ治療法で非トランスジェニックマウスにワクチン接種すると、自己免疫前立腺炎および幾らかの前立腺上皮の破壊に至った。この研究結果は、ワクチン接種のアプローチが、正常な前立腺抗原に対して自己免疫応答を誘発することができることを示唆する。これらの結果はさらに、有効な腫瘍免疫は実際、自己免疫に密接に関連するという考えを支持する。
【０１６３】  腫瘍の免疫療法の厄介な副作用として見られるよりむしろ、規定された組織特的抗原への自己免疫の意図的誘発は、有効な抗-腫瘍応答を発生させるための実際的方法を提供することができる。本明細書において証明されたように、本発明のCTLA-4阻害剤は、不可欠でない組織から生じる腫瘍の有効な免疫学的治療を提供する。
【０１６４】 実施例１２
CTLA-4阻害剤は正常な黒色腫特異的タンパク質から誘導されたペプチドへの免疫を誘発する
gp100は、ヒト黒色腫患者からのT細胞のよくある標的として同定されたメラニン細胞特異的タンパク質である。以前の研究は、マウスが、正常なマウスペプチドから誘導されるペプチドで免疫化できないが、マウスが対応するヒトの配列で免疫化されると、マウスペプチドへの免疫を得ることができることを示した。このことは、ヒトでの免疫化がマウスへの耐性を壊し、自己免疫の発生を可能にすることを示唆した。この研究は、CTLA-4阻害剤が、同系マウスペプチドへ自己免疫を誘発することに有効であり得るかどうかを決定することに向けられた。
【０１６５】  脾臓樹状細胞(DC)を、慣用の技術によってC57BL6マウス（H-2b）から分離した。次に、DCを、正常マウスgp100配列(Mgp100)に対応するH-2b結合ペプチドと共に、またはそれなしでインキュベートした。-21日に、マウスをペプチドパルスした(peptide-pulsed)、またはパルスしないDCで免疫化した後、100μgの抗-CTLA-4（MAb 9H10）または対照ハムスター抗体（MAb 560）を注射した。-14日および-7日に、マウスに、適当なDCを注射することによって追加免疫したが、いかなる抗体治療もしなかった。第０日に、各治療コホートからのマウスを、分析のために２群に分けた。
【０１６６】  A群：リンパ節T細胞を精製し、Mgp100にてパルスした同系の抗原提示細胞による刺激に対応するIFNγの生産能力について試験した。図18に示されたように、CTLA-4阻害剤条件下で免疫化したマウスのみが、有意量のIFNγを作った。
B群：マウスは、背中に皮下的に移植されたB16黒色腫細胞で攻撃された。腫瘍増殖を、カリパスを用いて２方向で直径を測定することによって査定した。図19に示されたように、CTLA-4阻害剤条件下で免疫化した群のみが腫瘍増殖の阻害を示した。すべてのマウスが結局は腫瘍で死んだけれども、この結果は、非常に有効な抗-腫瘍応答の表われを示す。
【０１６７】  先の実施例は、組織特異的自己抗原への免疫を誘発することによって抗-腫瘍応答を増進するための戦法として、CTLA-4に仲介されるT細胞活性化の阻害シグナルの阻害剤の治療的可能性についての強力な支持を提供する。
本明細書において引用したすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願があたかも個々に援用されるように、本明細書に援用される。
【０１６８】  先の本発明は、理解を明確にする目的で説明および実施例によって幾らか詳細に記載されたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の本質または範囲から逸脱せずに、ある種の変更および修正がそれになされ得ることは、当業者にとって自明であろう。
【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、ＣＴＬＡ−４又はＣＤ２８に向けられた抗体の存在下又は不在下での腫瘍細胞ラインＶ５１Ｂｌｉｍ１０のin vivo 増殖を示すグラフである。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、2×106のＶ５１Ｂｌｉｍ１０細胞及び抗体を注射されたマウスにおける平均腫瘍サイズを示すグラフである。
【図１Ｃ】  図１Ｃは、Ｖ５１Ｂｌｉｍ１０細胞を注射されたマウスにおける個別腫瘍サイズを示すグラフである。
【図２】  図２は、ＣＴＬＡ−４又はＣＤ２８に向けられた抗体の存在下又は不在下でのＢ７−５１Ｂｌｉｍ１０腫瘍のin vivo 増殖を示すグラフである。
【図３】  図３は、Ｖ５１Ｂｌｉｍ１０細胞及び抗ＣＴＬＡ−４抗体で予め処理されたマウスによる野生型結腸癌腫の拒絶を示す。
【図４】  図４は、確立された腫瘍の抗ＣＴＬＡ−４抗体で処理された後の増殖を示す。
【図５】  図５は、抗ＣＴＬＡ−４抗体の不在下又は存在下のマウス線維肉腫ＳＡＩＮの増殖を示す。
【図６Ａ】  ペプチド抗原に対するＴ細胞の応答における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
【図６Ｂ】  ペプチド抗原に対するＴ細胞の応答における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
【図６Ｃ】  ペプチド抗原に対するＴ細胞の応答における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
【図６Ｄ】  ペプチド抗原に対するＴ細胞の応答における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
【図６Ｅ】  ペプチド抗原に対するＴ細胞の応答における抗ＣＴＬＡ−４抗体のアジュバント効果を示す。
【図７Ａ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図７Ｂ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図７Ｃ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図７Ｄ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図７Ｅ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図７Ｆ】  ＣＴＬＡ−４遮断がクラススイッチングに及ぼす影響を示す。
【図８】  図８は、ＣＴＬＡ−４遮断の遅れが線維肉腫に及ぼす影響を示す。
【図９】  図９は、乳癌を、ＣＴＬＡ−４単独、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞単独、又はそれらの組み合わせ、で治療した場合の効果を示す。
【図１０Ａ】  遅れたＣＴＬＡ−４遮断が腎癌に及ぼす影響を示す。
【図１０Ｂ】  遅れたＣＴＬＡ−４遮断が腎癌に及ぼす影響を示す。
【図１１】  図１１は、ＣＴＬＡ−４遮断治療単独又は照射されたＢ１６腫瘍細胞による免疫化との組み合わせがＢ１６腫瘍に及ぼす影響を示す。
【図１２】  図１２は、ＣＴＬＡ−４遮断と照射されたＢ１６細胞及び／又はサイトカイン治療との組み合わせの影響を示す。
【図１３Ａ】  ＣＴＬＡ−４遮断治療単独、又はＧＭ−ＣＳＦで形質導入された照射されたＢ１６−ＢＬ６細胞との組み合わせがＢ１６−ＢＬ６腫瘍に及ぼす影響を示す。
【図１３Ｂ】  ＣＴＬＡ−４遮断治療単独、又はＧＭ−ＣＳＦで形質導入された照射されたＢ１６−ＢＬ６細胞との組み合わせがＢ１６−ＢＬ６腫瘍に及ぼす影響を示す。
【図１４】  図１４は、in vivo で誘導されるＢ１６特異的Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を示している。
【図１５】  図１５は、ＣＴＬＡ−４遮断とＦ１０／ＧＭワクチンによって治療したときのＢ１６−Ｆ１０肺転移を有するマウスの生存率を示す。
【図１６Ａ】  図１６Ａは、ＴＲＡＭＰ−Ｃワクチン及び抗ＣＴＬＡ−４で処理されたＴＲＡＭＰマウスが対照処理されたマウスに比べて腫瘍発生率が低くなることを示す。
【図１６Ｂ】  図１６Ｂは、処理の時点の年齢の関数としての腫瘍発生率を示し、生後１４週に処理されたマウスの腫瘍発生率は低くなるが、生後１６週に処理されたマウスでは腫瘍発生率は低くならないことを示している。
【図１７Ａ】  図１７Ａは、ＴＲＡＭＰ−Ｃワクチン及び抗ＣＴＬＡ−４で処理されたＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺病変の重症度の減少を示す。
【図１７Ｂ】  図１７Ｂは、ＴＲＡＭＰ−Ｃ１／Ｃ２及び抗ＣＴＬＡ−４で処理されたＴＲＡＭＰマウスが生後１４週で処理されたときは腫瘍等級が低下したが、生後１６週で処理されたときはそうならなかったことを示す。
【図１８】  図１８は、in vivo でのペプチド刺激の後のＩＦＮγの産生を示す。
【図１９】  図１９は、ＣＴＬＡ−４遮断の有無によるペプチド免疫化マウスにおけるＢ１６黒色腫の増殖を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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