(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0005117648.tif 000048
の一般式を有する結合体であって、ここで：
Ａは、ジアシルグリセロールイル部分、ジアルキルグリセロールイル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される脂質部分であり；
Ｗは、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびこれらの組合わせからなる群から選択される親水性ポリマーであって、該ポリマーが２５０〜７０００ダルトンの分子量を有し；そして
Ｙは、２〜１５の正電荷を有するポリカチオン性部分であって、かつ少なくとも１つの塩基性アミノ酸またはその誘導体を含むポリカチオン性部分である、結合体。
【請求項２】
前記親水性ポリマーが、非免疫原性であるか、または弱い免疫原性である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
Ｙが、２〜８の正電荷を有するポリカチオン性部分である、請求項１または２に記載の結合体。
【請求項４】
Ｙが、選択されたｐＨで、少なくとも４つの正電荷を有する、請求項１または２に記載の結合体。
【請求項５】
Ｙが、選択されたｐＨで、少なくとも８つの正電荷を有する、請求項１または２に記載の結合体。
【請求項６】
Ｙが、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、これらの誘導体およびこれらの組合わせからなる群から選択されるメンバーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項７】
ＷがＰＥＧである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項８】
Ｗがポリアミドポリマーである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項９】
Ｗが２５０〜２０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１０】
式ＩＩ：
【化２】
0005117648.tif 000049
の一般式を有する請求項１〜７のいずれかに記載の結合体であって、ここで、
Ａは、ジアシルグリセロールイル部分、ジアルキルグリセロールイル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される脂質部分であり；
Ｘは、単結合、または前記脂質を少なくとも１つのエチレンオキシドユニットに共有結合する官能基からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｙは、２〜１５の正電荷を有するポリカチオン性部分であって、かつ少なくとも１つの塩基性アミノ酸またはその誘導体を含むポリカチオン性部分であり；
Ｚは、単結合、または該少なくとも１つのエチレンオキシドユニットをカチオン性基に共有結合する官能基からなる群から選択されるメンバーであり；そして
ｎは、６〜５０の間の値を有する整数である、結合体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の結合体であって、ここで、
Ｘは、単結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カーボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄およびＮＲからなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒは水素またはアルキル基である、結合体。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の結合体であって、
Ｚは、単結合、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、アミド、チオアミド、およびＮＲからなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒは水素またはアルキル基である、結合体。
【請求項１３】
請求項１０に記載の結合体であって、ここで、
Ａはジアシルグリセロールイル部分であり；
Ｘはホスホエタノールアミドであり；
ＺはＮＲであり、ここでＲは水素原子であり；そして
Ｙは、１〜１０の塩基性アミノ酸またはその誘導体からなる群から選択されるメンバーである、結合体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の結合体であって、Ｙが、２〜８の塩基性アミノ酸またはその誘導体からなる群より選択されるメンバーである、結合体。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の結合体であって、ここで、
Ａは２つの脂肪族アシル鎖を有するジアシルグリセロールイル部分であり、ここで、各アシル鎖は、独立して２〜３０の間の炭素長であり、そして飽和されているか、または変化する飽和度を有するかのいずれかである、結合体。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の結合体であって、ここで、
Ｙは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、これらの誘導体およびこれらの組合わせからなる群から選択されるメンバーである、結合体。
【請求項１７】
請求項１３に記載の結合体であって、ここで、
Ａは、２つの脂肪族アシル鎖を有するジアシルグリセロールイル部分であって、ここで、各アシル鎖は飽和したＣ−１８炭素鎖であり；そして
Ｙは、４つのリジン残基またはその誘導体を有するカチオン性基である、結合体。
【請求項１８】
脂質ベースの薬物処方物であって、該処方物は、以下：
（ａ）式Ｉ：
【化３】
0005117648.tif 000050
の一般式を有する結合体であって、ここで、
Ａは、ジアシルグリセロールイル部分、ジアルキルグリセロールイル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される脂質部分であり；
Ｗは、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびこれらの組合わせからなる群から選択される親水性ポリマーであって、該ポリマーが２５０〜７０００ダルトンの分子量を有し；
Ｙは、２〜１５の正電荷を有するポリカチオン性部分であって、かつ少なくとも１つの塩基性アミノ酸またはその誘導体を含むポリカチオン性部分である、結合体；
（ｂ）生物活性剤；および
（ｃ）第２脂質、
を含む、処方物。
【請求項１９】
Ｗが非免疫原性または弱い免疫原性である、請求項１８に記載の処方物。
【請求項２０】
Ｙが２〜８の正電荷を有するポリカチオン性部分である、請求項１８または１９に記載の処方物。
【請求項２１】
ＷがＰＥＧである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項２２】
前記ＰＥＧが２５０〜３０００の分子量を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２３】
前記ＰＥＧが２５０〜１０００の分子量を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２４】
前記第２脂質がＰＥＧ脂質であり、そしてＷが該ＰＥＧ脂質のＰＥＧよりも小さな分子量を有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項２５】
前記第２脂質がＰＥＧ3400脂質であり、そして前記式Ｉの結合体が
以下の式：
Ａ−ＰＥＧ1000−Ｙ
を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２６】
前記第２脂質がＰＥＧ2000脂質であり、そして前記式Ｉの結合体が以下の式：
Ａ−ＰＥＧ1000−Ｙ
を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２７】
前記第２脂質がＰＥＧ脂質であり、そしてＷが該ＰＥＧ脂質のＰＥＧより大きな分子量を有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項２８】
前記第２脂質がＰＥＧ1000脂質であり、そして前記式Ｉの結合体が以下の式：
Ａ−ＰＥＧ3400−Ｙ
を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２９】
前記第２脂質がＰＥＧ1000脂質であり、そして前記式Ｉの結合体が以下の式：
Ａ−ＰＥＧ2000−Ｙ
を有する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項３０】
前記生物活性剤が、抗腫瘍薬を含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の処方物であって、ここで、前記抗腫瘍薬が、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスチンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗物質、ヌクレオシドアナログ、メトトレキサート、プリンアナログ、およびピリミジンアナログからなる群から選択されるメンバーである、処方物。
【請求項３２】
前記生物活性剤が核酸を含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項３３】
前記生物活性剤が、遺伝子構築物またはオリゴヌクレオチドである、請求項３２に記載の処方物。
【請求項３４】
二層構造の安定化成分をさらに含む、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の処方物。
【請求項３５】
前記二層構造の安定化成分がＰＥＧ脂質であり、ここで、該ＰＥＧ脂質のＰＥＧが、前記ポリマーＷよりも大きな分子量を有する、請求項３４に記載の処方物。
【請求項３６】
前記二層構造の安定化成分がＡＴＴＡ脂質であり、ここで、該ＡＴＴＡ脂質のＡＴＴＡが、前記親水性ポリマーよりも大きな分子量を有する、請求項３４に記載の処方物。
【請求項３７】
脂質ベースの薬物処方物であって、該処方物は、以下：
（ａ）式ＩＩ：
【化４】
0005117648.tif 000051
の一般式を有する結合体であって、ここで
Ａは、ジアシルグリセロールイル部分、ジアルキルグリセロールイル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される脂質部分であり；
Ｘは、単結合、または該疎水性脂質を少なくとも１つのエチレンオキシドユニットもしくは単結合に共有結合する官能基からなる群から選択されるメンバーであり；
Ｙは、２〜１５の正電荷を有するポリカチオン性部分であって、かつ少なくとも１つの塩基性アミノ酸またはその誘導体を含むポリカチオン性部分であり；
Ｚは、単結合、または該少なくとも１つのエチレンオキシドユニットをカチオン性ヘッド基または単結合に共有結合する官能基からなる群から選択されるメンバーであり；そして
ｎは、６〜５０の範囲の整数である、結合体；
（ｂ）生物活性剤；および
（ｃ）第２脂質、
を含む、処方物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の処方物であって、ここで、
Ｘは、単結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カーボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄、ＮＲからなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒは、水素アルキル基である、処方物。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の処方物であって、ここで、
Ｚは、単結合、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、アミド、チオアミド、アミノ基、ＮＲからなる群から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒは、水素原子またはアルキル基からなる群から選択されるメンバーである、処方物。
【請求項４０】
請求項１８〜３９のいずれか一項に記載の処方物であって、ここで、該処方物が、リポソーム、ミセル、ビロゾーム、脂質−核酸粒子、核酸複合体およびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーの形態である、処方物。
【請求項４１】
前記脂質ベースの薬物処方物がリポソームである、請求項４０に記載の処方物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の処方物であって、ここで、前記脂質ベースの薬物処方物が、０．０５〜０．５ミクロンの範囲の平均サイズを有するリポソームであって、ここで、前記生物活性剤が遺伝子構築物またはオリゴヌクレオチドである、処方物。
【請求項４３】
脂質ベースの薬物処方物の細胞内送達を増加するための組成物であって、該組成物は、該脂質ベースの薬物処方物に組み入れるのに適切な請求項１に記載の結合体を含み、ここで、請求項１に記載の結合体を有さない処方物と比較して、該脂質ベースの薬物処方物の細胞内送達が増加する、組成物。
【請求項４４】
前記送達がインビボである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記増加が少なくとも１０倍である、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
非経口投与される脂質ベースの薬物処方物の一部である薬物の、標的細胞への送達を増加するための組成物であって、該組成物は、０．１〜２０モルパーセントの請求項１に記載の結合体を含む、組成物。
【請求項４７】
哺乳動物に生物活性剤を投与するための組成物であって、該組成物は、以下：
小胞形成脂質または小胞取り込み脂質あるいはこれらの混合物、および０．１〜２０モルパーセントの間の請求項１に記載の結合体、ならびに薬学的に受容可能な量の生物活性剤を含む脂質ベースの薬物処方物の懸濁液を含む、組成物。
【請求項４８】
脂質ベースの薬物処方物によって、インビトロで細胞をトランスフェクトする方法であって、該方法は、以下：
該細胞に、０．１〜２０モルパーセントの請求項１に記載の結合体を有する脂質ベースの薬物処方物を、インビトロで接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
脂質ベースの薬物処方物によるインビトロでの細胞のトランスフェクトを増加する方法であって、該方法は、以下：
該細胞を、０．１〜２０モルパーセントの請求項１に記載の結合体を有する脂質ベースの薬物処方物と、インビトロで接触させる工程であって、ここで、該脂質ベースの処方物のトランスフェクション効率が、請求項１に記載の結合体を有さない脂質ベースの薬物処方物と比較して、増加されている、工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、１９９９年４月２０日出願の米国仮特許出願番号６０／１３０，１５１号に対して優先権を主張し、この教示は、本明細書中において全ての目的のためにそれらの全体を通して参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、カチオン性脂質結合体に関し、より詳細にはカチオン性ポリマー脂質結合体、および１つ以上の生理活性薬剤を含むその脂質ベースの薬物処方物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
遺伝子送達および遺伝子治療のための現在のベクターは、ウイルスベースの系および非ウイルスベースの系から構成される。脂質ベースの非ウイルス系は、カチオン性脂質プラスミドＤＮＡ複合体を含む。これらの系の制限として、血清中の複合体の大きなサイズ、毒性、および不安定性が挙げられる。不運にも、上記の欠点はこれらの複合体のための適用を制限する。
【０００４】
研究者らは、系統的な送達のために使用され得る長期循環ステルスリポソームの設計に多大な努力を捧げてきた（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１４６０−１１４６４（１９９１）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２：３２１（１９９２）；Ｗｏｏｄｌｅ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１１３：１７１（１９９２）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｉｎ：Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ，Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，５１〜６２頁（１９９５）；Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２３７：９９−１０８（１９９５）およびＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，３９：１５３−１６１（１９９６）を参照のこと）。特定の例において、処方に依存して、ステルスリポソームは、しばしば細胞摂取を容易にする点で比較的不十分であり、従って治療効率が低下する。
【０００５】
概して、インビボのリポソームの寿命の分子機構は、親水性ポリマー表面バリアから生じる立体障害に起因し得る。この親水性ポリマーバリアは、血液からの高分子の吸収速度を抑制するかまたは減少し、そしてリポソームと血液成分との間の静電的かつ疎水性の相互作用を立体的に阻害する。従って、ステルスリポソームの寿命は親水性ポリマーの挿入によって増加されるが、ステルスリポソームの細胞摂取はしばしば不十分である。
【０００６】
過去１０年にわたって、カチオン性脂質を有するリポソーム系がインビトロにおいて高度に有効なトランスフェクション薬剤であることが明らかになってきた（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３３７：３８７−３８８（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｄｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８４：７４１３−７４１７（１９８７））。カチオン性リポソームのプラスミドＤＮＡへの付加は、インビトロにおいて優れたトランスフェクション特性を有する大きなＤＮＡ−脂質複合体を生じるが、これは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞による循環からのそれらの迅速なクリアランスに起因して、インビボでは有効ではない。遺伝子を細胞に全身送達し得る非ウイルス性脂質ベース系の必要性は、安定したプラスミド−脂質粒子（ＳＰＬＰ）の最近の開発を導く（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ６：２７１−２８１（１９９９））。これらの粒子は、小さく（約７０ｎｍ）、プラスミドベクターの単一コピーを含み、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の表面コーティングから生じるステルス特性を有し、そして血清ヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを保護する。
【０００７】
リポソームおよび／またはそれらの内容物の細胞内送達の向上は、薬物送達系の次の世代の開発における主な残存する問題の１つを表す。インビボで（従来のまたは遺伝的な）薬物の送達を最適化するために、リポソームと細胞との相互作用を増大するための一般的方法が開発される必要がある。今日まで、試みは、抗体（例えば、Ｍｅｙｅｒ，Ｏら、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：１５６２１−１５６２７（１９９８）；Ｋａｏ，Ｇ．Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２５０−２５６（１９９６）；Ｈａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３９：１３３−１４４（１９９５）を参照のこと）、ビタミン−（Ｇａｂｉｚｏｎ，Ａ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：２８９−２９８（１９９９）；Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９：３１９８−３２０４（１９９４）；Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：５８７−６２７（１９９８）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４２６：１９５−２０４（１９９９）；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：３９−４８（１９９８）を参照のこと）、オリゴペプチド−（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：７０５−７０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８：１１１−１１８（１９９７））のようなリポソーム表面上の特異的標的化情報の使用、または特定の膜タンパク質またはレセプターに特異的なオリゴサッカリド構築物の使用を含む。不運なことに、これらの方法は、インビトロな結果が期待されるにも関わらず、この目的を達成するのに成功していない。組織に対するリポソームの特異的な標的化は、研究の重要な領域を残す一方、他のアプローチはまた、リポソームキャリアの効果の有意な改良を提供する。
【０００８】
上記の点で、当該分野において必要とされるものは、細胞性摂取の増加と結びついた寿命の増加を伴う脂質ベースの薬物処方物である。本発明は、このおよび他の必要性を満足する。
【０００９】
（発明の要旨）
特定の局面において、本発明は、トランスフェクション効率を向上するために、安定化されたプラスミド脂質粒子に組み込まれ得るかまたは挿入され得る新規な結合体に関する。本発明の結合体は、二分子膜脂質粒子に結合体を係留するための脂質アンカーを有し、ここで、この脂質アンカーはＰＥＧ部分のような非免疫原性ポリマーに結合され、ここで非免疫原性ポリマーは、次いで正に荷電した部分のようなポリカチオン性部分に結合される。このように、本発明は、以下：
【００１０】
【化６】
0005117648.tif 000002
の式Ｉの化合物を提供する。
【００１１】
式Ｉにおいて、「Ａ」は非免疫原性ポリマーに結合した脂質部分である。式Ｉの「Ｗ」は、非免疫原性ポリマーであり、そして式Ｉの「Ｙ」は、ポリカチオン性部分である。
１実施形態において、Ｙは約１〜約１０個の塩基性アミノ酸であるか、またはそれらの誘導体である。別の実施形態において、Ｙは、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。なお別の実施形態において、Ｙは、４個のリジン残基を有するカチオン性基またはそれらの誘導体である。
【００１２】
特定の好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は、以下：
【００１３】
【化７】
0005117648.tif 000003
の式ＩＩの一般的構造を有する化合物を生じる基を含む。
【００１４】
式ＩＩにおいて、「Ａ」は、疎水性脂質のような脂質である。式ＩＩにおいて、「Ｘ」は少なくとも１つのエチレンオキシドユニット、すなわち、（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ−）に脂質を共有結合する単結合または官能基である。式ＩＩにおいて、「Ｚ」は、カチオン性基に少なくとも１つのエチレンオキシドユニットを共有結合する単結合または官能基である。式ＩＩにおいて、「Ｙ」はポリカチオン性部分である。式ＩＩにおいて、添え字「ｎ」は、約６〜約１６０の範囲の整数である。
【００１５】
他の局面において、本発明は、以下：
（ａ）式Ｉを有する化合物（ここで、Ａ、Ｗ、およびＹは定義されている）；
Ａ−Ｗ−Ｙ              Ｉ
（ｂ）生理活性剤；および
（ｃ）第２の脂質、
を含む、脂質ベースの薬物に関する。
【００１６】
特定の実施形態において、脂質ベースの薬物処方物は、リポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質−核酸粒子、核酸凝集体およびそれらの混合物の形態にある。特定の他の実施形態において、生理活性剤は治療用核酸または他の薬物である。
【００１７】
なお他の局面において、本発明は、脂質ベースの薬物送達系の細胞内送達を増加するための方法に関し、この方法は脂質ベースの薬物送達系に式ＩまたはＩＩの化合物を組み込む工程であって、これによって脂質ベースの薬物送達系の細胞内送達を増加する工程を包含する。
【００１８】
本発明のさらなる局面および利点は、以下の詳細な記載および添付の図面と共に読まれると明らかとなる。
【００１９】
（定義）
用語「脂質」は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されず、水に不溶であるが多くの有機溶媒に可溶であることによって特徴付けられる有機化合物をいう。それらは、通常、以下の少なくとも３つのクラスに分割される：（１）脂肪および油を含む「単純な脂質」ならびにワックス；（２）リン脂質および糖脂質を含む「化合物脂質」；（３）ステロイドのような「誘導体化された脂質」。
【００２０】
用語「ベシクル形成脂質」は、疎水性部分および極性ヘッド基を有する任意の両親媒性脂質を含むことが意図され、それ自体、ほとんどのリン脂質によって例示されるように、水中で二分子膜ベシクルに自発的に形成し得る。
【００２１】
用語「ベシクル適合性脂質」は、他の両親媒性脂質と脂質二分子膜に安定に組み込まれる任意の両親媒性脂質を含むことが意図され、ここで、その疎水性部分は二分子膜の内部の疎水領域と接触し、そしてその極性ヘッド基部分は膜の外側の極性表面に向かって配向される。ベシクル適合性脂質は、脂質自体が非ラメラ相に適合する傾向があり、そしてそれが二分子膜安定化成分の存在下で二分子膜構造を想定し得る脂質を含む。代表的な例は、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）である。二分子膜安定化成分として、ポリアミドオリゴマー、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、ＰＥＧ−脂質誘導体（ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ）、およびセラミドに結合したＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されない（米国出願第０８／４８５，６０８号、現在米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと。これらは本明細書中において参考として援用される）。
【００２２】
用語「両親媒性脂質」は、一部、脂質物質の疎水性部分が疎水性相内に配向する一方で、親水性部分が水相に向かって配向する、任意の適切な物質をいう。両親媒性脂質は、通常、脂質ベシクルの主な成分である。親水性特性は、極性基または荷電した基（例えば、糖、ホスファト、カルボキシル、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシ、および他の同様の基）の存在に由来する。疎水性は、非極性基の含有によって付与され、この非極性基として長鎖の飽和脂肪族炭化水素基および長鎖の不飽和脂肪族炭化水素基が挙げられるが、これらに限定されず、このような基は、１つ以上の芳香族基、環式脂肪族基、または複素環式基によって置換される。両親媒性化合物の例として、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の代表的な例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。リンを有しない他の化合物（例えば、スフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸）もまた、両親媒性脂質として表される群に入る。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを含む他の脂質と混合され得る。
【００２３】
用語「中性脂質」は、選択されたｐＨで荷電されていない形態かまたは中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多数の脂質種のいずれかをいう。生理学的ｐＨにおいて、このような脂質として、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールが挙げられる。
【００２４】
用語「疎水性脂質」は、非極性基を有する化合物をいい、この非極性基として、長鎖の飽和脂肪族炭化水素基および長鎖の不飽和脂肪族炭化水素基が挙げられるが、これらに限定されず、このような基は、必要に応じて、１つ以上の芳香族基、環式脂肪族基または複素環式基によって置換される。適切な例として、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「ジアシルグリセロリル」は、２−脂肪アシル鎖を示し、Ｒ1およびＲ2は、独立して、エステル結合によってグリセロールの１位および２位に結合された２〜３０個の炭素原子を有する。アシル基は、飽和され得るか、または異なる不飽和度を有し得る。ジアシルグリセロール基は、以下：
【００２６】
【化８】
0005117648.tif 000004
の一般式を有する。
【００２７】
用語「ジアルキルグリセロリル」は、エステル結合によってグリセロールの１位および２位に結合された２つのＣ1〜Ｃ30アルキル鎖を示す。ジアルキルグリセロール基は、以下：
【００２８】
【化９】
0005117648.tif 000005
の一般式を有する。
【００２９】
用語「Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ」は、以下：
【００３０】
【化１０】
0005117648.tif 000006
を示す。
【００３１】
用語「１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン」は、エステル結合によってプロパンの１位および２位に結合した２−脂肪アシル鎖Ｃ1〜Ｃ30を示す。アシル基は、飽和され得るか、または異なる不飽和度を有し得る。プロパン分子の３位に−ＮＨ−が結合される。１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンは、以下：
【００３２】
【化１１】
0005117648.tif 000007
の一般式を有する。
【００３３】
用語「１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン」は、エステル結合によってプロパンの１位および２位に結合した２−アルキル鎖（Ｃ1〜Ｃ30）を示す。このプロパン分子の３位に−ＮＨ−基が結合される。１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンは、以下：
【００３４】
【化１２】
0005117648.tif 000008
を有する。
【００３５】
用語「非カチオン性脂質」は、上記のような任意の中性脂質およびアニオン性脂質をいう。アニオン性脂質の例として、ホスファチジルグリセロール、カルジノリピン（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ）、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨのような選択されたｐＨで賞味の正の電荷を有する多数の脂質種のいずれかをいう。このような脂質として、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、多数のカチオン性脂質の市販の調製物は入手可能であり、本発明で使用され得る。これらとして、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）を含む、ＵＳＡ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販される、カチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）および（「ＤＯＰＥ」）を含有する、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されるカチオン性リポソーム）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）を含む、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから市販されるカチオン性脂質）が挙げられるが、これらに限定されない。以下の脂質は、カチオン性であり、生理学的ｐＨ未満で正の電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡなど。
【００３７】
用語「フゾジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）」は、リポソームまたは他の薬物送達系が細胞の膜と融合する能力をいう。膜は、血漿膜またはオルガネラの周りの膜（例えば、エンドゾーム、核など）のいずれかであり得る。フゾジェネシス（ｆｕｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、リポソームのこのような膜への融合である。
【００３８】
用語「デンドリマー」は、複数の世代を有する分枝状ポリマーに対する基準を含む。デンドリマーの各世代は、複数の分岐点を形成する。
【００３９】
用語「リガンド」は、反応性官能基を有する任意の分子、化合物またはデバイスを含み、リガンドとして、脂質、両親媒性脂質、キャリア化合物、バイオアフィニティー化合物、医用材料、生体高分子、医用デバイス、分析的に検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激物質、放射標識、フルオロゲン（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、標的化薬剤、または毒素が挙げられる。上記の列挙は、例示的なものであり、排他的であることが意図されない。
【００４０】
用語「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」は、１９９８年１２月２２日出願の米国特許出願第０９／２１８，９８８号に開示される化合物をいうが、これらに限定されない。これらの化合物として、以下：
【００４１】
【化１３】
0005117648.tif 000009
の式を有する化合物が挙げられ、ここで、Ｒは水素、アルキルおよびアシルからなる群から選択されるメンバであり；Ｒ1は、水素およびアルキルからなる群から選択されるメンバであり；または、必要に応じて、ＲおよびＲ1および窒素が結合して、アジド部分を形成し；Ｒ2は、水素、必要に応じて置換アルキル、必要に応じて置換アリールおよびアミノ酸の側鎖からなる群から選択されるメンバであり；Ｒ3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびＮＲ4Ｒ5からなる群から選択されるメンバであり、ここでＲ4およびＲ5は独立して水素またはアルキルであり；ｎは、４〜８０であり；ｍは、２〜６であり；ｐは、１〜４であり；そしてｑは、０または１である。他のポリアミドが本発明の化合物に使用され得ることは当業者に明らかである。
【００４２】
本明細書中に使用されるように、用語「アルキル」は、分枝または非分枝の炭化水素鎖を示し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、オクタ−デシルおよび２−メチルペンチルである。これらの基は、必要に応じて、このような鎖に通常結合される１つ以上の官能基（例えば、ヒドロキシ、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、アルキルチオ、複素環式、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ、アミドなど）で置換され得、例えば、トリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシルプロピル、２−フルオロエチル、カルボキシメチル、シアノブチルなどのようなアルキル基を形成する。
【００４３】
用語「アルキレン」は、上で定義されたような二価アルキルをいい、例えば、メチレン（−ＣＨ2−）、プロピレン（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）、クロロエチレン（−ＣＨＣｌＣＨ2−）、２−チオブテン（−ＣＨ2ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ2ＣＨ2−）、１−ブロモ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンテン（−ＣＨＢｒＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−）などである。
【００４４】
用語「アルケニル」は、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含む分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。
【００４５】
用語「アルキニル」は、１つ以上の炭素−炭素三重結合を含む分枝または非分枝の炭化水素鎖をいう。
【００４６】
用語「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、インデニルなどのような好ましくは約６〜１４個の炭素原子を有する少なくとも１つの芳香族環を形成する炭素原子の鎖を示し、これらは、このような鎖に通常結合される１個以上の官能基（ヒドロキシ、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環式、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシ、アミドなど）で置換され得、アリール基（例えば、ビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニルなど）を形成する。
【００４７】
用語「アシル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を示し、ここで、Ｒは上で定義されるアルキルまたはアリールであり、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、またはブチリールが挙げられる。
【００４８】
用語「アルコキシ」は、−ＯＲ−を示し、ここでＲはアルキルである。
【００４９】
用語「アミド」は、アミド結合：−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（ここで、Ｒは、水素またはアルキルである）を示す。
【００５０】
用語「アミノ」は、アミン結合：−ＮＲ−（ここで、Ｒは水素またはアルキルまたは末端ＮＨ2である）を示す。
【００５１】
用語「カルボキシ」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−を示し、そして用語「カルボニル」は、基−Ｃ（Ｏ）−を示す。
【００５２】
用語「カルボネート」は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−を示す。
【００５３】
用語「カルバメート」は、基−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−を示し、そして用語「尿素」は、基−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−を示す。
【００５４】
用語「ホスホロ」は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−を示す。
【００５５】
用語「塩基性アミノ酸」は、生理学的ｐＨのような選択されたｐＨで賞味の正電荷を有する、天然に存在するアミノ酸、および合成アミノ酸および／またはアミノ酸模倣物をいう。この基として、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
用語「ホスホリルエタノールアミノ」は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−を示す。
【００５７】
用語「ホスホリルエタノールアミド」は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）−を示す。
【００５８】
用語「ホスホ」は、五価のリン部分−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−を示す。
【００５９】
用語「ホスホエタノールアミノ」は、基−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨ−を示す。
【００６０】
用語「ホスホエタノールアミド」は、基−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＨＣ（Ｏ）−を示す。
【００６１】
用語「エチレンオキシドユニット」は、基−ＯＣＨ2ＣＨ2−を示す。
【００６２】
用語「ＣＰＬ」は、カチオン性−ポリマー−脂質（例えば、カチオン性−ＰＥＧ−脂質）をいう。好ましいＣＰＬは、式ＩおよびＩＩの化合物である。
【００６３】
用語「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ」は、１つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬをいう用語「ＣＰＬ１」によって包含される。ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ中の「ｄ」は、ＣＰＬが蛍光ダンシル基を含むことを示す。ダンシル部分を含まないＣＰＬが合成され得ることは当業者に明らかであり、従って、用語「ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ」は、上で定義される用語「ＣＰＬ１」によって包含される。
【００６４】
用語「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｄ」は、２つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬをいう用語「ＣＰＬ２」によって包含される。
【００６５】
用語「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１」は、３つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬをいう用語「ＣＰＬ３」によって包含される。
【００６６】
用語「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１」は、４つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬをいう用語「ＣＰＬ４ａ」によって包含される。
【００６７】
用語「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５」、またはＤＳＰＥ−ＰＥＧＱｕａｄ５、またはＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４は全て、５つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬをいう用語「ＣＰＬ４（またはＣＰＬ４ｂ）」によって包含される。ヘッド基領域を改変することによって、１（モノ、またはＭ）、２（ジ、またはＤ）、３（トリ、またはＴ）、および４（クアド、またはＱ）の正電荷を含むＣＰＬが合成された。種々のＱｕａｄ  ＣＰＬが合成され、従って、これらはＱ１からＱ５と番号付けされる。
【００６８】
略称「ＨＢＳ」は、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水をいい、「Ｒｈｏ−ＰＥ」は、ローダミン−ホスファチジルエタノールアミンをいい、そして「ＬＵＶ」は「巨大単層ラメラベシクル」をいう。
【００６９】
（発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（Ａ．化合物および合成）
特定の局面において、本発明は、カチオン性ポリマー脂質結合体（ＣＰＬ）、例えば、特に細胞摂取を向上するための従来のステルスリポソームに組み込まれ得る遠位カチオン性ポリ（エチレングリコール）脂質結合体を提供する。本発明のＣＰＬは、以下の構築の特徴を有する：（１）脂質二分子膜内にＣＰＬを組み込むための疎水性脂質のような脂質アンカー；（２）カチオン性ヘッド基に脂質アンカーを連結するための、ポリエチレングリコールのような親水性スペーサー；および（３）プロトン化可能なカチオン性ヘッド基を生成するための、天然に存在するアミノ酸のようなポリカチオン性部分。このように、本発明は、以下：
【００７０】
【化１４】
0005117648.tif 000010
の式Ｉの化合物を提供し、ここで、Ａ、Ｗ，およびＹは前で定義される通りである。
【００７１】
式Ｉを参照して、「Ａ」は脂質アンカーとして作用する両親媒性脂質、中性脂質または疎水性脂質のような脂質部分である。適切な脂質の例として、ベシクル形成脂質またはベシクル適合性脂質が挙げられ、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
「Ｗ」は、親水性のポリマーまたはオリゴマーのようなポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、この親水性ポリマーは、非免疫原性であるかまたは低い固有の免疫原性を有する生体適合性ポリマーである。あるいは、親水性ポリマーは、適切な補助剤と共に使用される場合、抗原性が弱くなり得る。適切な非免疫原性ポリマーとして、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、このポリマーは約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有する。
【００７３】
「Ｙ」は、ポリカチオン性部分である。用語「ポリカチオン性部分」は、選択されたｐＨ（好ましくは、生理学的ｐＨ）で正電荷（好ましくは、少なくとも２つの正電荷）を有する化合物、誘導体、または官能基をいう。適切なポリカチオン性部分として、塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体（例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびヒスチジン；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；およびアミノ多糖）が挙げられる。このポリカチオン性部分は、直鎖（例えば、直鎖テトラリジン）、分枝または樹枝状の構造であり得る。ポリカチオン性部分は、約２〜約１５の正電荷、好ましくは約２〜約１２の正電荷、そしてより好ましくは、約２〜８の正電荷を、選択されたｐＨ値において有する。どのポリカチオン性部分が使用されるかとの選択は、所望されるリポソーム適用の型によって決定され得る。
【００７４】
ポリカチオン性部分の電荷は、リポソーム部分全体の周りに分布され得るか、あるいは、それらはリポソーム部分の１つの特定の領域内の別個の濃度の電荷密度（例えば、電荷スパイク（ｃｈａｒｇｅ  ｓｐｉｋｅ））であり得る。この電荷密度がリポソーム状に分布される場合、この電荷密度は、均等に、または不均等に分布され得る。ポリカチオン性部分の電荷分布の全てのバリエーションは、本発明によって包含される。
【００７５】
脂質「Ａ」および非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、種々の方法によって、好ましくは共有結合によって結合され得る。当業者に公知の方法は、「Ａ」と「Ｗ」との共有結合のために使用され得る。適切な結合として、アミド、アミン、カルボキシ、カルボネート、カルバメート、エステルおよびヒドラゾン結合が挙げられるが、これらに限定されない。「Ａ」および「Ｗ」は結合を達成するための相補的な官能基でなければならないことは当業者にとって明らかである。これらの２つの基の反応（一方は脂質上、他方はポリマー上）は、所望される結合を提供する。例えば、脂質がジアシルグリセロールであり、そして末端ヒドロキシルが例えばＮＨＳおよびＤＣＣで活性化される場合、活性エステルを形成し、次いで、アミノ基を含むポリマー（例えば、ポリアミド）と反応され（１９９８年１２月２２日出願の米国特許出願第０９／２１８，９８８号を参照のこと）、アミド結合は２つの基間に形成される。
【００７６】
特定の実施形態において、「Ｗ」は、「Ｙ」に結合され、好ましくは共有結合される。「Ａ」および「Ｗ」の場合のように、「Ｗ」および「Ｙ」の共有結合は、官能基の相補的反応性によって生成され得、一方はポリマー上で、他方はポリカチオン性部分上である。例えば、「Ｗ」のアミン官能基は、活性化されたカルボキシル基（例えば、塩化アシルまたはＮＨＳエステル）と反応され得、アミドを形成する。反応基の適切な選択によって、所望されるカップリングが得られ得る。他の活性化されたカルボキシル基として、カルボン酸、カルボキシレートエステル、カルボン酸ハロゲン化物およびカルボン酸の他の活性化された形態（例えば、反応性無水物）が挙げられるが、これらに限定されない。反応性酸ハロゲン化物として、例えば、酸塩化物、酸臭化物、および酸フッ化物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
特定の例において、ポリカチオン性部分は、標的化リガンドのようなリガンドを結合し得る。好ましくは、このリガンドが結合した後、カチオン性部分は正電荷を維持する。特定の例において、結合されたリガンドは、正電荷を有する。適切なリガンドとして、反応性官能基を有する化合物またはデバイスが挙げられ、これらに限定されず、例えば、脂質、両親媒性脂質、キャリア化合物、バイオアフィニティー化合物、医用材料、生体高分子、医用デバイス、分析検出可能な化合物、治療的に活性な化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激物質、放射標識、フルオロゲン（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）、ビオチン、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、他の標的化薬剤、または毒素が挙げられる。
【００７８】
特定の好ましい実施形態において、他の部分は、式Ｉの化合物内に組み込まれ、以下：
【００７９】
【化１５】
0005117648.tif 000011
の式ＩＩの化合物を形成する。式ＩＩにおいて、「Ａ」は、両親媒性脂質、中性脂質または疎水性脂質部分のような脂質部分である。適切な脂質の例として、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
式ＩＩにおいて、「Ｘ」は、少なくとも１つのエチレンオキシドユニットに脂質を共有結合する単結合または官能基である。適切な官能基として、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、ＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基および硫黄である）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例において、脂質「Ａ」は単結合によってエチレンオキシドユニットに直接結合される。エチレンオキシドユニットの数は、約１〜約１６０、好ましくは約６〜約５０の範囲であり得る。
【００８１】
式ＩＩにおいて、「Ｚ」は、ポリカチオン性部分にエチレンオキシドユニットを共有結合する単結合または官能基である。適切な官能基として、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、アミド、チオアミド、ＮＲ（ここで、Ｒは、水素原子またはアルキル基からなる群から選択されるメンバである）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、末端エチレンオキシドユニットは、ポリカチオン性部分に直接結合される。
【００８２】
式ＩＩにおいて、「Ｙ」は、式Ｉと組み合わせて、上で定義されるようなポリカチオン性部分である。式ＩＩにおいて、添え字「ｎ」は、約６〜約１６０の範囲の整数である。
【００８３】
例示の実施形態において、式ＩＩの化合物は、図２に概説されるような一般化された手順を使用して合成され得る。図２は、本発明の１つの特定の実施形態を示し、従って、単なる例にすぎず、本明細書中の特許請求の範囲を制限するべきではない。明らかに、当業者は、図２に例示される反応スキームで生成され得る多くの他の変形物、代替物、および改変物を理解する。図２を参照して、クロロホルム中の脂質（例えば、ＤＳＰＥ）および塩基（例えば、トリエチルアミン）の溶液は、（ｔ−ＢＯｃ−ＮＨ−ＰＥＧ3400−ＣＯ2ＮＨＳ）に加えられ、この溶液は周囲の温度で撹拌される。次いで、この溶液を窒素流下で乾燥するまで濃縮した。次いで、この残渣を、クロマトグラフィーを使用して脂質が消失するまで、ジエチルエーテルによるクロロホルム混合溶液の繰り返した沈殿によって、精製した。精製したＣＰＬ結合体を溶媒に溶解し、次いでＴＦＡを加え、この溶液を室温で撹拌した。この溶液を再び窒素流下で濃縮した。次いでこの残渣をジエチルエーテルによる混合物の繰り返した沈殿によって精製し、脂質−ＰＥＧ−ＮＨ2（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ2、あるいは１つのプロトン化可能なカチオン性ヘッド基を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１）を得た。次いで、ホスホリル−脂質アンカーと遠位一級アミンとの比は、本明細書中に記載されるようなホスフェートおよびフルオレスカミンアッセイによって測定され得る。
【００８４】
この例示の実施形態において、プロトン化可能なアミノ基の数は、増加され、ポリカチオン性部分を生成し得る。例えば、化学量論的な量のＮα，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシニドエステルを漸増的に添加することによって、ポリカチオン性部分は約２から約１６まで正電荷を増加し得る。前に記載されるように、正電荷は、任意の数の適切なポリカチオン性部分（例えば、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、ポリアミンおよびそれらの誘導体または組み合わせ）に組み込まれ得る。本発明の合成方法を使用して、カチオン性基（例えば、アミノ基）の数は、ＣＰＬ合成の間、容易に制御され得る。
【００８５】
（Ｂ．脂質ベースの薬物処方物）
特定の局面において、本発明は、以下：
（ａ）式Ｉの一般式：
【００８６】
【化１６】
0005117648.tif 000012
を有する化合物（ここでＡ、ＷおよびＹは、上記の定義の通りである）；（ｂ）生体活性剤；および必要に応じて（ｃ）第２の脂質、を含む脂質ベースの薬物処方物を提供する。好ましい実施形態において、本発明の脂質ベースの薬物処方物は、第２の脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質誘導体）を含む。
【００８７】
特定の好ましい実施形態において、本発明の第２の脂質ベースの薬物処方物は、以下：
（ａ）式ＩＩ：
【００８８】
【化１７】
0005117648.tif 000013
の化合物（ここでＡ、Ｘ、Ｚ、Ｙおよびｎは、上記に定義されている）；（ｂ）生体活性剤；ならびに必要に応じて、（ｃ）第２の脂質を含む。好ましい実施形態において、本発明の脂質ベースの薬物処方物は、第２の脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質誘導体を含む。
【００８９】
ＣＰＬが調製された後に、それらは、種々の様式で利用され得る。この様式としては、例えば、脂質ベースの薬物処方物が挙げられる。この局面において、脂質ベースの処方物は、リポソーム、ミセル、ヴィロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、脂質−核酸粒子、核酸凝集体、および１以上の生体活性剤を取り込み得るかまたは捕捉し得る他の形態であり得る。特定の局面において、本発明の脂質ベースの薬物処方物は、第２の脂質を含む。
【００９０】
式ＩおよびＩＩの化合物は、脂質ベースの処方物（例えば、１９９７年１０月１０日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ」というう表題の同時係属米国特許出願第０８／４５４，６４１号、同第０８／４８５，４５８号、同第０８／６６０，０２５号、同第０８／４８４，２８２号、同第６０／０５５，０９４号、同第０８／８５６，３７４号、同第６０／０５３，８１３号および同第６０／０６３，４７３号（代理人書類番号０１６３０３−００４８００）、米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許出願第０９／２１８，９８８号（１９９８年１２月２２日に出願）（これらの全ての教示は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）において使用され得る。本明細書は、種々のリポソーム型、およびリポソーム中にＣＰＬを組み込む種々の方法を示しており、これらの全ては、本願発明の広範な方法および組成物の例である。
【００９１】
種々の脂質ベースの薬物処方物の形成に使用される脂質成分およびＣＰＬは、部分的に、用いられる送達系の型に依存する。例えば、リポソームが使用される場合、ＣＰＬに使用される脂質は、一般に、種々の小胞形成脂質または小胞適合脂質（代表的には、適切に機能化されたリン脂質およびステロール（例えば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）など）を含む）から選択される。対照的に、ミセルが用いられる場合、ＣＰＬに使用される脂質は、一般に、ステリルアミン、アルキルアミン、Ｃ8〜Ｃ22アルカン酸、リゾリン脂質（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、界面活性剤などから選択される。アシル鎖が、長さにおいて変動され得、そして飽和され得るか、または種々の不飽和度に処理し得ることは、当業者には容易に明らかである。アシル鎖がより飽和すると、膜はより堅くなる。より高い不飽和度は、小胞膜により流動性を付与する。同様に、本発明の薬物送達系を構成する他の脂質成分（例えば、脂質、カチオン性脂質、中性脂質、非カチオン性脂質など）は、用いられる薬物送達系に依存して変動する。種々の薬物送達系に適切な脂質は、当業者に容易に明らかである。
【００９２】
脂質ベースの薬物処方物が、細胞中のいくつかのタンパク質の産生を誘導またはブロックすることが意図される治療用遺伝子またはオリゴヌクレオチドを送達するために使用される場合、カチオン性脂質が、処方物（例えば、リポソーム、ミセル、脂質−核酸粒子など）に含まれ得る。核酸は、負に荷電され、そして正に荷電した実体と組み合わされて、処方物および細胞性送達に適切な脂質複合体を形成し得る。
【００９３】
本明細書中に使用される場合、「カチオン性脂質」は、一般に、（リポソーム中に組み込まれた場合に）リポソーム膜にまたはリポソーム膜付近に位置したカチオン性ヘッド基を有する脂質をいう。ＣＰＬは、特定の場合には、この膜から有意な距離でカチオン性電荷を配置する効果を有するポリマー「Ｗ」によってカチオン性脂質から区別される。
【００９４】
適切なカチオン性脂質の例としては、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０〜２８５（１９９１）を参照のこと）；ＤＤＡＭ；ＤＭＲＩＥ；ＤＯＤＡＣ（米国特許出願第０８／３１６，３９９号（１９９４年９月３０日出願（本明細書中に参考として援用される）；ＤＯＧＳ；ＤＯＳＰＡ；ＤＯＴＡＰ；およびＤＯＴＭＡが挙げられるがこれらに限定されない。ここで好ましい実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドは、ホスファチジルエタノールアミンと組み合わせて使用される。
【００９５】
さらに、遺伝子送達およびオリゴヌクレオチド送達のための脂質ベースキャリアの生成に有用な他のカチオン性脂質は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（米国特許第４，８９７，３５５号；同第４，９４６，７８７号；および同第５，２０８，０３６号（Ｅｐｐｓｔｅｉｎらに対して発行））ならびにＬＩＰＯＦＥＴＡＣＥ（米国特許第５，２７９，８８３号（Ｒｏｓｅに対して発行）である。両方の薬剤、および他のトランスフェクトカチオン性脂質が、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄから入手可能である。
【００９６】
１つの好ましい実施形態において、本発明のＣＰＬリポソームは、全身送達適用のために最適化される。特定の適用において、ＣＰＬのポリマーの長さは、ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）リポソームのために使用される通常の中性ＰＥＧ鎖（Ｍ．Ｗ．２０００〜５０００ダルトン）よりも短い。この場合において、ＣＰＬにおけるより短いポリマーは、約２５０〜約３０００ダルトンであり、そしてより好ましくは、約１０００〜約２０００ダルトンである。この実施形態において、第２の脂質は、例えば、ＰＥＧ3400−脂質であり、そして式Ｉの化合物は、例えば、Ａ−ＰＥＧ1000−Ｙである（図１７Ｃを参照のこと）。
【００９７】
任意の特定の理論により拘束されることなく、より短いポリマーが使用される場合には、ＣＰＬの遠位の電荷は、通常のＰＥＧ排除障壁内に隠され、それによってリポソーム表面から正電荷を遠ざけつつ、同時に、長い循環寿命の保持を可能にすると考えられる。この実施形態は、リポソームと標的細胞との間の相互作用を増強する。小胞循環および細胞性取り込みを調節するために使用される、ＣＰＬにおける異なるサイズのポリマー（例えば、ＰＥＧ鎖）および中性ＰＥＧ脂質の使用は、薬物キャリアとしてステルスリポソームの新たな生成を可能にする。最適化されたポリマーの長さは、特定の条件（例えば、インビトロ適用またはインビボ適用、局所投与または全身投与、および異なる脂質処方物）とともに変動し得ると考えられる。
【００９８】
別の実施形態において、ＣＰＬにおけるポリマーの長さは、ステルスリポソームに使用される通常の中性ＰＥＧ鎖よりも大きなＭＷを有する。この場合において、第２の脂質は、例えば、ＰＥＧ1000−脂質であり、そして式Ｉの化合物は、例えば、Ａ−ＰＥＧ3400−Ｙの式を有する（図１７Ｂを参照のこと）。
【００９９】
特定の処方物および適用において、ＣＰＬの型（すなわち、ポリマー鎖の長さ、および１分子あたりのカチオン性電荷の量、ならびに処方物中のこのようなＣＰＬの量）（例えば、ＳＰＬＰ）が、クリアランス特性の最良のバランスを得るために最適化され得る。特定の場合には、長鎖ＣＰＬおよびより高レベルのこのようなＣＰＬは、トランスフェクションを増加させるために好ましい。他の場合において、処方物中に取り込まれる短鎖ＣＰＬは、動物でのより長い循環寿命のために最適化される。
【０１００】
本発明の１つの実施形態において、フゾジェニックリポソームまたはヴィロソームが、提供される。本発明のＣＰＬが、種々の型のフゾゲニックリポソームおよびヴィロソームに有利に取り込まれ得ることは、当業者に容易に明らかである。このようなフゾゲニックリポソームおよびヴィロソームは、疾患部位または標的部位でフゾジェニックになるように設計され得る。当業者は、リポソームまたはヴィロソームがフゾジェニックになる場合を制御するために、多数の変動性が使用され得ることを容易に理解する。このような変動性としては、例えば、リポソームまたはヴィロソームの組成、ｐＨ、温度、酵素、補因子、イオンなどが挙げられる。
【０１０１】
１つの実施形態において、フゾジェニックリポソームとしては、非層状相を採用し得る脂質、二重層安定化成分（例えば、ＰＥＧ−脂質誘導体）の存在下で二重層構造をなお想定し得る脂質；および二重層構造中の脂質を安定化するために、脂質と可逆的に結合した二重層安定化成分が挙げられる。このようなフゾゲニックリポソームは、有利である。なぜなら、それらがフゾジェニックになる速度は、予め決定され得ないだけではなく、数分から数十時間の時間スケールにわたって必要に応じて変動され得るからである。例えば、二重層安定化成分の組成および濃度を制御することによって、ＢＳＣがインビボでリポソームから交換する速度、次いでリポソームがフゾジェニックになる速度を制御し得ることが見出されている（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。例えば、脂質のアシル鎖の長さを制御することによって、ＢＳＣがインビボでリポソームから交換する速度、次いでリポソームがフゾジェニックになる速度を制御し得ることが見出されている。特に、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ−８）が、より長いアシル鎖（例えば、Ｃ−２０）よりもこのリポソームからすぐに交換することが発見されている。あるいは、ＢＳＣの組成および濃度を制御することによって、ＢＳＣが分解される（、すなわち、内因性システム（例えば、血清中の内因性酵素）によって破壊される）速度、次いでリポソームがフゾジェニックになる速度を制御し得る。
【０１０２】
組織化されたアセンブリにおける脂質の多型性の挙動は、動的な分子形状の概念に関して質的に説明され得る（例えば、Ｃｕｌｌｉｓら、「Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ」（Ｗｉｌｓｃｈｕｔ，Ｊ．およびＤ．Ｈｏｅｋｓｔｒａ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照のこと）。極性ヘッド基の有効断面領域および膜内に埋め込まれた疎水性領域が同様である場合、この脂質は、円柱状の形状を有し、そして二重層のコンホメーションを採用する傾向がある。疎水性成分に対して小さい極性ヘッド基を有する錯体形状の脂質（例えば、不飽和ホスファチジルエタノールアミン）は、非二重層相（例えば、反転したミセルまたは逆六方晶系相（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｐｈａｓｅ）（Ｈ））を好む。それらの疎水性ドメインに対して大きなヘッド基を有する脂質（例えば、リゾリン脂質）は、反転した錯体形状を有し、そして水溶液中でミセルを形成する傾向がある。従って、混合脂質系の相優先度は、全ての成分の正味の動的分子形状に対する寄与に依存する。それ自体、錯体形状および反転した錯体形状の脂質の組合せは、孤立したいずれかの脂質ができない条件下で二重層コンホメーションを採用し得る（ＭａｄｄｅｎおよびＣｕｌｌｉｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６８４：１４９〜１５３（１９８２）を参照のこと）。
【０１０３】
より形式的なモデルは、固有の湾曲仮説に基づく（例えば、Ｋｉｒｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：１０９３〜１１０２（１９８４）を参照のこと）。このモデルは、２つの反対の力（ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）に関するリン脂質多型を説明する。弾力的に緩んだ単層を生じる湾曲のその固有半径または平衡半径（Ｒｏ）を曲げ（ｃｕｒｌ）かつ採用する脂質単層の天然の傾向は、生じる炭化水素パッキング制約により妨害される。湾曲の固有半径を減少させる因子（例えば、二重結合が導入される場合に、炭化水素鎖により占められる容量の増加）は、Ｈ相形成を促進する傾向がある。逆に、ヘッド基のサイズの増大は、Ｒｏを増加させ、そして二重相の形成または安定化を促進する。反転した脂質円柱の間の間隙を満たし得る非極性脂質の導入はまた、Ｈ相の形成を促進する（Ｇｒｕｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６６５〜３６６９（１９８９）；Ｓｊｏｌｏｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：１３２３〜１３２９（１９８９）を参照のこと）。
【０１０４】
そのような、１つの実施形態において、本発明のフゾジェニックリポソームを形成するために使用され得る脂質は、生理学的条件下または特定の生理学的条件下（例えば、カルシウムイオンの存在下）で非層状相を採用するが、ＢＳＣの存在下で二重層構造を想定し得るものである。このような脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、糖脂質、またはそれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。生理学的条件下で非層状相を採用することが当業者に公知である他の脂質もまた、使用され得る。さらに、他の脂質が、種々の非生理学的変化（例えば、ｐＨまたはイオン濃度の変化（例えば、カルシウムイオンの存在下）を含む）によって非層状相を採用するように誘導され得、それによって、それらはまた、本発明のフゾジェニックリポソームを形成するために使用され得ることが当業者に容易に理解される。ここで好ましい実施形態において、フゾジェニックリポソームは、ホスファチジルエタノールアミンから調製される。ホスファチジルエタノールアミンは、飽和でも不飽和でもよい。ここで好ましい実施形態において、ホスファチジルエタノールアミンは、不飽和である。同様に好ましい実施形態において、フゾジェニックリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（飽和または不飽和）およびホスファチジルセリンの混合物から調製される。別の同様に好ましい実施形態において、フゾジェニックリポソームは、ホスファチジルエタノールアミン（飽和または不飽和）およびカチオン性脂質の混合物から調製される。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明の脂質ベースの薬物処方物は、二重層安定化成分（ＢＳＣ）を含む。適切なＢＳＣとしては、ポリアミドオリゴマー、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、ＰＥＧ−脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ）、およびセラミドに結合体化したＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号（これは、本明細書中に参考として援用っされる）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、二重層安定化成分は、ＰＥＧ−脂質またはＡＴＴＡ−脂質である。本明細書中に議論されるように、特定の好ましい例では、ＢＳＣのＰＥＧまたはＡＴＴＡは、ＣＰＬのポリマー「Ｗ」と比較してより大きな分子量を有する。他の場合において、ＢＳＣは、ポリマーの「Ｗ」と比較してより小さな分子量を有する。本発明は、全てのこのようなバリエーションを含む。
【０１０６】
本発明に従って、生理学的条件下で非層状相を採用する脂質は、それ自体二重層を形成するか、または相補的な動的形状の構造のいずれかであるＢＳＣによって二重層構造において安定化され得る。非二重層形成脂質は、それがＢＳＣと結合している場合（すなわち、ＢＳＣの存在下）のみに、二重層構造において安定化される。適切なＢＳＣの選択において、ＢＳＣは、リポソームから移入し得るか、または内因性システムによって化学的に改変され得、その結果、時間とともに、二重層構造中の脂質を安定化するその能力を失うことが好ましい。リポソーム安定性が失われるか、または減少する場合のみに、標的細胞の原形質膜とのリポソームの融合が、生じ得る。従って、ＢＳＣ−脂質は、脂質と「可逆的に結合」し、そしてそれが脂質と結合している場合のみには、そうでなければ非層状相を採用する条件下で二重層構造を採用するように制約された脂質と「可逆的に結合」している。それ自体、本発明のＢＳＣ−脂質は、二重層構造中の脂質を安定化し得、なおそれらは、リポソームから交換し得るか、または種々の内因性システムによって化学的に改変され得、その結果、時間とともに、それらは、二重層構造中の脂質を安定化するそれらの能力を失い、それによってリポソームがフゾゲニックになることを可能にする。
【０１０７】
代表的には、ＣＰＬは、本発明の脂質ベースの処方物に、約０．０５モルパーセント〜約５０モルパーセントの範囲の濃度にて存在する。ここで好ましい実施形態において、ＣＰＬは、０．０５モルパーセント〜約２５モルパーセントの範囲の濃度で存在する。さらにより好ましい実施形態において、ＣＰＬは、０．０５モルパーセント〜約１５モルパーセントの範囲の濃度で存在する。当業者は、ＣＰＬの濃度が、用いられるＣＰＬおよびリポソームがフゾジェニックになるべき速度に依存して変動され得ることを理解する。
【０１０８】
本発明の１つの実施形態において、リポソームは、コレステロールを含む。コレステロールを含まないリポソームがインビボで使用される場合、それらは、血漿リポタンパク質および細胞膜からコレステロールを吸着する傾向を有することが決定されている。含まれる場合、コレステロールは、一般に、０．２モルパーセント〜約５０モルパーセントの範囲の濃度で存在し、そしてより好ましくは、約３５モルパーセント〜約４５モルパーセントの範囲の濃度で存在する。
【０１０９】
（Ｃ．ＣＰＬ−リポソームの調製）
ＣＰＬ含有リポソーム（すなわち「ＣＰＬ−リポソーム」）を作製するための種々の一般的な方法が、本明細書中に議論される。
【０１１０】
２つの一般的な技術としては、「挿入後」（すなわち、例えば、予め形成されたリポソーム小胞中へのＣＰＬの挿入）、および「標準的」技術（ここでＣＰＬが、例えば、リポソーム形成工程の間に脂質混合物に含まれる）が挙げられる。挿入後技術は、リポソーム二重層膜の外面に主にＣＰＬを有するリポソームを生じ、一方、標準的技術は、内面および外面の両方にＣＰＬを有するリポソームを提供する。
【０１１１】
特に、「挿入後」は、小胞を（任意の方法によって）形成する工程、および適切な条件（通常、６０℃で２〜３時間）の下でＣＰＬの存在下で予め形成された小胞をインキュベートする工程を包含する。６０〜８０％の間のＣＰＬが、レシピエント小胞の外部リーフレットに挿入され得、７モルパーセントまでの最終濃度（総脂質と比べて）を生じる。この方法は、リン脂質（これは、コレステロールを含み得る）から作製された小胞に特に有用であり、そしてまた、ＰＥＧ−脂質（例えば、ＰＥＧ−セラミド）を含む小胞にもまた特に有用である。
【０１１２】
「標準的」技術の例において、本発明のＣＰＬ−ＬＵＶは、押出しによって形成され得る。この実施形態において、ＣＰＬを含む全ての脂質は、クロロホルム中に一緒に溶解され、これは次いで、窒素続いて高い減圧下で除去される。この脂質混合物は、適切な緩衝液において水和され、そして１００ｎｍの孔サイズを有する２つのポリカーボネートフィルターを通して押し出される。得られる小胞は、内面および外面の両方にＣＰＬを含む。なお別の標準的な技術において、ＣＰＬ−ＬＵＶの形成は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号および同第５，９８１，５０１号（これらの両方は、本明細書中に参考として援用される）に議論されるように、界面活性剤での透析方法またはエタノールでの透析方法を使用して達成され得る。押出し方法および界面活性剤での透析方法は、実施例の節に詳細に説明されている。
【０１１３】
（Ｄ．リポソームの調製およびサイズ分け）
種々の方法が、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９：４６７（１９８０）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７４２４、ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４４３：６２９〜６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８〜３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８１２：５５〜６５（１９８５）；Ｍａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８５８：１６１〜１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４２〜２４６（１９８８）、テキストＬｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍａｒｃ  Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３，第１章およびＨｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、リポソームの調製およびサイズ分けのために利用可能である。適切な方法としては、超音波処理、押出し、高圧力／ホモジナイゼーション、微小流動（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、界面活性剤での透析、小リポソーム小胞のカルシウム誘導性融合、およびエーテル注入方法（これらの全ては、当該分野で周知である）が挙げられるがこれらに限定されない。１つの方法は、均質なサイズの多層状小胞を生成する。この方法において、小胞形成脂質は、適切な有機溶媒または溶媒系に溶解され、そして減圧または不活性な気体の下で乾燥されて、薄い脂質膜を形成する。所望される場合、このフィルムは、適切な溶媒（例えば、三級ブタノール）中に再溶解され得、次いで凍結乾燥されて、より容易に水和した粉末様形態である、より均質な脂質混合物を形成する。このフィルムは、緩衝水溶液で覆われ、そして代表的には、１５〜６０分の時間にわたり攪拌して、水和される。得られる多層小胞のサイズ分布は、脂質をより激しい攪拌条件下で水和することによってか、または可溶化界面活性剤（例えば、デオキシコール酸塩）を添加することによって、より小さなサイズに変化され得る。
【０１１４】
小孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通すリポソームの押出しは、比較的に十分に規定されたサイズ分布へとリポソームのサイズを減少させるための効果的な方法である。代表的には、この懸濁物は、所望のリポソームのサイズ分布が達成されるまで膜を１回以上膜を通してサイクル化される。このリポソームは、リポソームサイズの緩やかな減少を達成するために、より小さな孔の膜に連続して通すことによって押出され得る。本発明における使用については、約０．０５ミクロン〜約０．４０ミクロンの範囲のサイズを有するリポソームが、好ましい。
【０１１５】
（Ｅ．薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの使用）
本発明の脂質ベースの薬物処方物および組成物（例えば、リポソーム、ミセル、脂質−核酸粒子、ヴィロソームなど）は、生体活性剤（例えば、治療剤、予防剤および診断剤）の全身送達または局所送達に有用である。このような送達系は、例えば、以下の同時係属米国特許出願第０８／４５４，６４１号、同第０８／４８５，４５８号、同第０８／６６０，０２５号、同第０８／４８４，２８２号、同第６０／０５５，０９４号、同第０８／８５６，３７４号、同第６０／０５３，８１３号および同第６０／０６３，４７３号（これらの全ての教示は、本明細書中に参考として援用される）により詳細に記載されている。
【０１１６】
以下の議論は、一般に、リポソームをいう；しかし、これと同じ議論が、本発明の他の薬物送達系（例えば、ミセル、ヴィロソーム、脂質−核酸粒子など）に十分に適用可能であることは、当業者に容易に理解される。
【０１１７】
治療剤の送達については、この組成物は、治療剤を充填され得、そして処置を必要とする被験体に投与され得る。本発明の方法を使用して投与される治療剤は、処置または予防されるべき疾患に対して適切な処置であるように選択される種々の薬物のいずれかであり得る。しばしば、薬物は、抗新形成剤（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトザントロン、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ストレプトゾシンなど）である。特に好ましい抗腫瘍剤としては、例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、システインアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、抗代謝物、ならびにヌクレオシドアナログ（例えば、メトトレキサート、ならびにプリンアナログおよびピリミジンアナログ）が挙げられる。抗感染剤を、本発明の方法によって特定の組織に送達することもまた、所望され得る。本発明の組成物はまた、他の薬物（局所麻酔薬（ジブカインおよびクロルプロマジン）；β−アドレナリン作用性ブロッカー（例えば、プロプラノロール、チモロールおよびラベトロール（ｌａｂｅｔｏｌｏｌ））；抗高血圧薬（例えば、クロニジンおよびヒドララジン）；抗うつ薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、およびドキセピム（ｄｏｘｅｐｉｍ））；抗痙攣薬（例えば、フェニトイン）；抗ヒスタミン薬（例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミンおよびプロメタジン）；抗生物質／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシンおよびセフォキシチン）；抗真菌剤（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール（ｔｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィンおよびアムホテリシンＢ）；駆虫剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、免疫調節剤、神経伝達物質アンタゴニスト、抗緑内障剤、ビタミン、麻酔薬、ならびに画像化剤を含むがこれらに限定されない）の選択的な送達のために使用され得る。
【０１１８】
上記のように、カチオン性脂質は、細胞内でいくつかのタンパク質の産生を誘導またはブロックすることが意図される治療用遺伝子またはオリゴヌクレオチドの送達において使用され得る。核酸は、負に荷電され、そして正に荷電した実体と組み合わされて、脂質複合体または十分にカプセル化された安定なプラスミド−脂質粒子を形成し得る。
【０１１９】
特に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ＩＣＡＭ−１、Ｃ−ｅｒｂ  Ｂ−２およびＢＣＬ−２のような標的に指向される。
【０１２０】
本発明のＣＰＬはまた、ペプチド、核酸、プラスミドＤＮＡ、小染色体およびリボザイムの送達において有用である。
【０１２１】
本発明のＣＰＬの別の臨床的用途は、動物およびヒトの両方の免疫のためのアジュバントとしてである。タンパク質抗原（例えば、ジフテリア毒素、コレラ毒素、寄生体抗原、ウイルス抗原、免疫グロブリン、酵素および組織適合性抗原）が、免疫目的のために、本発明のＣＰＬを含むリポソーム中に取り込まれ得るか、または本発明のＣＰＬを含むリポソーム上に結合し得る。
【０１２２】
本発明のＣＰＬを含むリポソームはまた、免疫応答を刺激するために、適切なリンパ器官に標的化されるワクチンのためのキャリアとして特に有用である。
【０１２３】
本発明のＣＰＬを含むリポソームはまた、マクロファージに選択的に免疫抑制剤または免疫刺激剤を送達するためにベクターとして使用され得る。特に、マクロファージ活性を抑制するために有用であるグルココルチコイドおよびマクロファージを活性化するリンホカインは、本発明のリポソームを使用して送達され得る。
【０１２４】
本発明のＣＰＬを含み、かつ標的分子を含むリポソームは、細胞を刺激または抑制するために使用され得る。例えば、特定の抗原を取り込んでいるリポソームは、その抗原を特異的に結合する表面抗体を提示するＢ細胞集団を刺激するために使用され得る。リポソーム表面上に増殖因子またはリンホカインを取り込むリポソームは、これらの因子に対して適切なレセプターを発現する細胞の刺激に指向され得る。このアプローチを使用して、骨髄細胞が、癌の患者の処置の一部として増殖させるために刺激され得る。
【０１２５】
リポソームカプセル化抗体は、薬物の過剰用量を処置するために使用され得る。肝臓に送達されるカプセル化抗体を有するリポソームの傾向は、血液循環からの物質（例えば、毒性因子）の除去において治療上の有利な点を有する。カプセル化されていない、ジゴキシンに対する抗体は、薬物の血管内保持を引き起こすが、カプセル化された抗体は、ジゴキシンの脾臓および肝臓での取り込みの増加ならびに排出速度の増加を引き起こすことが、実証されている。
【０１２６】
本発明のＣＰＬを含むリポソームはまた、抗原を欠く細胞の原形質膜に脂質抗原またはタンパク質抗原を導入するためのキャリアとしての有用性を見出す。例えば、組織適合性抗原またはウイルス抗原は、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の表面に導入されて、免疫系によるこれらの細胞の認識および殺傷を促進し得る。
【０１２７】
さらに、本発明のＣＰＬを含むリポソームは、任意の生成物（例えば、治療剤、診断剤、標識または他の化合物）（ＰＥＧ誘導体化リポソーム中に現在処方されるものを含む）を送達するために使用され得る。
【０１２８】
特定の実施形態において、細胞型または組織に特異的な標的化部分を使用して、本発明のリポソームを標的とすることが所望される。種々の標的化部分（例えば、リガンド、細胞表面レセプター、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）およびモノクローナル抗体）を使用する、リポソームの標的化は、以前に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号（これらの教示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。標的化部分は、タンパク質全体またはそのフラグメントを含み得る。
【０１２９】
いくつかの場合、リポソームの診断標的化は、標的の細胞または組織を処置するためにその後に使用され得る。例えば、毒素が標的化リポソームに結合される場合には、毒素は、標的とされる細胞（例えば、新形成細胞）の破壊に効果的である。
【０１３０】
別の局面において、本発明は、脂質ベースの薬物処方物の細胞内送達を増加させるための方法を提供する。この方法は、脂質ベースの薬物処方物中に、式ＩまたはＩＩの化合物を組み込み、それによって式ＩまたはＩＩの化合物を含まない処方物と比較して、脂質ベースの薬物処方物の細胞内送達を増加させる工程を包含する。式ＩまたはＩＩの化合物は、細胞内送達を、約１０倍〜約１００倍、および好ましくは約１０倍〜約１０００００倍に増加する。
【０１３１】
別の局面において、本発明は、非経口で投与された脂質ベースの薬物処方物の血液循環時間を増加させる方法を提供する。この方法は、脂質ベースの薬物処方物中に、約０．１〜２０モルパーセントの式ＩまたはＩＩの化合物を取り込ませる工程を包含する。
【０１３２】
他の局面において、本発明は、脂質ベースの薬物処方物を細胞にトランスフェクトする方法を提供する。この方法は、約０．１〜２０モルパーセントの式ＩまたはＩＩの化合物を有する脂質ベースの薬物処方物と細胞とを接触させる工程を包含する。さらに、脂質ベースの薬物処方物による細胞のトランスフェクションを増加させるための方法は、約０．１〜２０モルパーセントの式ＩまたはＩＩの化合物を有する脂質ベースの薬物処方物と細胞とを接触させ、それによって式ＩまたはＩＩの化合物を含まない脂質ベースの薬物処方物のトランスフェクション効率と比較して、脂質ベースの薬物処方物のトランスフェクション効率を、増加させる工程を包含する。
【０１３３】
（Ｇ．診断剤としてのリポソームの使用）
本発明のＣＰＬを使用して調製される、脂質ベースの薬物処方物または組成物（例えば、リポソーム）は、種々の疾患状態（腫瘍、炎症性関節、病変などを含む）の診断画像化を容易にするマーカーで標識され得る。代表的には、これらの標識は、放射性マーカーであるが、蛍光標識もまた使用され得る。γ照射放射性同位体が、特に有利である。なぜなら、それらは、シンチレーションウェルカウンターで容易に計測され得、計測前に組織ホモジネーションを必要とせず、そしてγ線カメラで画像化され得るからである。
【０１３４】
γ線または陽電子を放射する放射性同位体（例えば、γ線放射性としては、99Ｔｃ、24Ｎａ、51Ｃｒ、59Ｆｅ、67Ｇａ、86Ｒｂ、111Ｉｎ、125Ｉおよび195Ｐｔ、ならびに例えば、陽電子放射性としては、68Ｇａ、82Ｒｂ、22Ｎａ、75Ｂｒ、122Ｉおよび18Ｆ）が、代表的には使用される。
【０１３５】
リポソームはまた、インビボ診断の目的のために、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の使用を通じてのように、常磁性同位体で標識され得る。例えば、米国特許第４，７２８，５７５号（この教示は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【０１３６】
（Ｈ．リポソームの充填および投与）
以下の議論は、一般に、リポソームをいう；しかし、これと同じ議論が、本発明の他の薬物送達系（例えば、ミセル、ヴィロソーム、脂質−核酸粒子など）に十分に適用可能であることが、当業者に容易に明らかである。従来の薬物をリポソーム中に充填する方法としては、例えば、カプセル化技術、二重層への充填および膜貫通能充填方法が挙げられる。
【０１３７】
１つのカプセル化技術において、薬物およびリポソーム成分は、有機溶媒中に溶解され、この溶液中で、全ての種が混和性であり、そして乾燥フィルムに濃縮される。次いで、緩衝液が、この乾燥フィルムに添加され、そして小胞壁に取り込まれた薬物を有するリポソームが、形成される。あるいは、この薬物は、緩衝液中に置かれ得、そして脂質成分のみの乾燥フィルムに添加され得る。この様式において、この薬物は、リポソームの水性内部中にカプセル化される。このリポソームの形成に使用される緩衝液は、例えば、等張性生理学的食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、または他の低張度緩衝液の任意の生物学的に適合性の緩衝溶液であり得る。一般には、この薬物は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ/ｍＬの量にて存在する。水性内部または膜中に取り込まれた薬物を有する、次いで、得られるリポソームは、必要に応じて、上記のようにサイズ分けされる。
【０１３８】
膜貫通能充填は、米国特許第４，８８５，１７２号、米国特許第５，０５９，４２１号および米国特許第５，１７１，５７８号（この内容は、本明細書中に参考として援用される）に詳細に記載されている。簡潔には、膜貫通能充填方法は、適切な水性媒体中に溶解された場合に、荷電した状態で存在し得る、本質的に任意の従来の薬物とともに使用され得る。好ましくは、この薬物は、比較的に脂溶性であり、その結果、これは、リポソーム膜中に分配される。リポソームまたはタンパク質−リポソーム複合体の二重層を横切る膜貫通能が生成され、そして薬物が、膜貫通能によってリポソーム中に充填される。膜貫通能は、１以上の荷電種（例えば、Ｎａ+、Ｋ+および／またはＨ+）の膜を横切る濃度勾配を作製することによって生成される。この濃度勾配は、異なる内部媒体および外部媒体を有するリポソームを産生することによって生成され、そして付随するプロトン勾配を有する。次いで、薬物の蓄積が、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ方程式によって推定される様式で生じ得る。
【０１３９】
本発明のリポソーム組成物は、標準的な方法に従って被験体に投与され得る。好ましくは、リポソーム組成物の薬学的組成物は、非経口的（すなわち、腹腔内、静脈内、皮下または筋肉内）で投与される。より好ましくは、この薬学的組成物は、定常的な注入によって静脈内に投与される。本発明の使用に適切な処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）に見出される。この薬学的組成物は、例えば、種々の状態を診断するために、または疾患状態を処置するために使用され得る。疾患としては、慢性関節リウマチと関連する炎症、虚血後の白血球媒介性組織損傷（再灌流、傷害）、急性白血病媒介性肺傷害（例えば、成人呼吸促進症候群）、敗血症性ショック、ならびに急性炎症および慢性炎症（アトピー性皮膚炎および乾癬を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、種々の新形成および腫瘍転移が、処置され得る。
【０１４０】
好ましくは、薬学的組成物が、静脈内に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア中に再懸濁したリポソームの溶液を含む、静脈内投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．９％等張性生理学的食塩水など）が、使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、それ自体、使用のために包装され得るか、または凍結乾燥され得、この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。この組成物は、生理学的条件下に近づけるために必要とされる場合には、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレートなどのようなｐＨ調節剤および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤など）を含み得る。
【０１４１】
薬学的処方物中の活性成分の濃度は、広範に（約０．０５重量％未満、通常は、または少なくとも約２〜５重量％から１０〜３０重量％程度まで）変動し得、そして選択される投与の特定の様式に従って、流体の容量、粘度などによって主に選択される。診断については、投与される組成物の量は、使用される特定の標識（すなわち、放射性同位体、蛍光標識など）に依存しする。この疾患状態は、診断され、そして臨床医が判定する。
【０１４２】
以下の実施例は、本発明を例示するために示されるが、本発明を制限するために示されない。
【０１４３】
（実施例）
（Ｉ．実施例Ｉ）
（Ａ．一般的な概説）
遠位カチオン性ポリ（エチレングリコール）−脂質結合体（ＣＰＬ）を設計し、合成し、そして細胞性取り込みを増強するために従来のリポソームおよびステルスリポソーム中に取り込ませた。本発明のアプローチは、不活性な化合物、非毒性化合物または天然に存在する化合物のいずれかを、ＣＰＬ合成のための成分として使用する。ＣＰＬを、以下の構築上の特性を備えるように合成した：１）リポソーム二重層中にＣＰＬを取り込むためのＤＳＰＥの疎水性脂質アンカー；２）カチオン性ヘッド基に脂質アンカーを連結するためのポリエチレングリコールの親水性スペーサー；および３）天然に存在するアミノ酸（Ｌ−リジン）を使用してプロトン化可能なカチオン性ヘッド基を生成した。多くの荷電アミノ基は、ＣＰＬ合成の間に制御され得る。ＤＳＰＥ−ＣＰＬは、水和押出し（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ−ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）方法によりリポソーム二重層にほとんど定量的に取り込まれることが実証された。かなり驚くべきことに、インビトロモデルにおいて、好ましくは４以上の電荷を有する、遠位で正に荷電したポリマー結合体を保有するリポソームが、宿主細胞表面に効率的に結合し、そして哺乳動物細胞における細胞性取り込み増強することが、初めて確認された。
【０１４４】
（Ｂ．材料および方法）
（１．略語）ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＤＳＰＥ−ＰＥＧ2000（１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ2000）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＣＰＬ（カチオン性ポリ（エチレングリコール）−脂質結合体）；ＤＳＰＥ−ＣＰＬ（カチオン性ポリエチレングリコール）−ＤＳＰＥ結合体）；ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１（１つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ）；ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−２（２つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ）；ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４（４つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ）；ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−８（８つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ）；Ｒｈ−ＰＥ（またはＲｈｏ−ＰＥ）（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）。
【０１４５】
（２．化学物質）ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ3400ＣＯ2ＮＨＳを、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から入手した。Ｎα，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシニドエステル、トリエチルアミンおよびコレステロールを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から入手した。トリフルオロ酢酸、エチルエーテルおよびクロロホルムを、Ｆｉｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）から入手した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＩ）から入手した。１，２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ2000を、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｅｇｅ，ＭＡ）から入手した。
【０１４６】
（３．ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１の合成）４５℃にて、ＤＳＰＥ（１２１ｍｇ、１６１ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（２００μＬ）のＣＨＣｌ3（２ｍＬ）中に、ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ3400−ＣＯ2ＮＨＳ（５００ｍｇ、１４７μｍｏｌ（２ｍＬ乾燥ＣＨＣｌ3中））を加えて、そしてこの溶液を、周囲温度にて３時間攪拌した。この溶液を、窒素流の下で濃縮して乾燥させた。この残渣を、ＴＬＣ上のＤＳＰＥスポットが消失するまで、ジエチルエーテルを含むクロロホルム混合溶液にて繰り返し沈殿させることによって精製した。この精製ＤＳＰＥ−ＰＥＧ結合体を、２ｍＬ  ＣＨＣｌ3に溶解して、続いて２ｍＬのＴＦＡを添加して、そしてこの反応溶液を、室温で４時間攪拌した。この溶液を再度、窒素流の下で濃縮して乾燥させた。この残渣を、ジエチルエーテルを含むクロロホルム混合溶液で繰り返し沈殿させることによって精製して、プロトン化可能な１つのカチオン性ヘッド基を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１としてＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ2を得た（収量５００ｍｇ（１２０μｍｏｌ、８０％）；Ｒf０．４（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ，９／１，ｖ／ｖ））；ホスホリル−脂質アンカーおよび遠位一級アミンの比率を、ホスフェートおよびフルオレスカミンアッセイならびに1Ｈ  ＮＭＲによって測定した。
【０１４７】
（４．ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−２、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４およびＤＳＰＥ−ＣＰＬ−８の合成についての一般的な手順（模式については図２を参照のこと））ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１（２５０ｍｇ、６０μｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（２００μＬ）のＣＨＣｌ3（２ｍＬ）溶液に、Ｎα，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシニドエステル（５０ｍｇ、１１３ｍｏｌ（２ｍＬ乾燥ＣＨＣｌ3中））を添加して、そしてこの溶液を、周囲温度で３時間攪拌した。ニンヒドリン可視化によるＴＬＣ上の陽性のアミン活性スポットの消失により、この反応が終了したことが示された。この溶液を、窒素流の下で濃縮して乾燥させた。この残渣を、ＴＬＣ上のｔ−Ｂｏｃ−リジンスポットが消失するまで、ジエチルエーテルを含むクロロホルム混合溶液にて繰り返し沈殿させることによって精製した。この精製ＤＳＰＥ−ＰＥＧ結合体を、２ｍＬ  ＣＨＣｌ3に溶解して、続いて２ｍＬのＴＦＡを添加して、そしてこの反応溶液を、室温で４時間攪拌した。この溶液を再度、窒素流の下で濃縮して乾燥させた。この残渣を、ジエチルエーテルを含むクロロホルム混合溶液で繰り返し沈殿させることによって精製して、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ２を得た（収量２５０ｍｇ（５７μｍｏｌ、９５％）；Ｒf０．４（ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ，９／１，ｖ．／ｖ））；ホスホリル−脂質アンカーおよび遠位一級アミンの比率を、ホスフェートおよびフルオレスカミンアッセイによって測定した。ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４およびＤＳＰＥ−ＣＰＬ−８を、同様の様式で合成した。
【０１４８】
（５．大きな単層小胞の調製）大きな単層小胞（ＬＵＶ）を、Ｈｏｐｅらにより記載されるように（Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８５）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｔｒａｐｐｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８１２，５５〜６５を参照のこと）、押出しによって調製した。クロロホルム中に微量のＲｈ−ＰＥを含む、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ（表３に示されるような）を含むか、または含まない適切な量の脂質混合物（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ，６０：４０ｍｏｌ／ｍｏｌ）を、窒素気体流の下で乾燥させ、均質な脂質フィルムを形成させた。次いで、微量の溶媒を、減圧下で一晩除去した。この脂質フィルムを、ボルテックスにより混合することによって、ＨＰＴＳ（５０ｍＭ）を含むかまたは含まないＨＢＳ緩衝液（ｐＨ９．５）中で水和させた。得られた多層小胞（ＭＬＶ）を、押出しデバイス（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて２つの積み重なった１００ｎｍポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通じて６５℃で１０回押し出した。取り込まれていないＤＳＰＥ−ＣＰＬおよびいくつかの場合には捕捉されていない遊離ＨＰＴＳを、ＨＢＳ緩衝液で平衡化した１．１×２０ｃｍ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を使用してクロマトグラフィーによって除去した。
【０１４９】
（６．リポソームのサイズの決定）リポソームのサイズを、Ｎｉｃｏｍｐ３７０サブミクロン粒子サイザー（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ）（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して、準弾性（ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉｃ）光散乱（ＱＥＬＳ）により決定した。
【０１５０】
（Ｃ．結果および考察）
本実施例は、遠位で正に荷電したカチオン性ポリマー脂質結合体（ＣＰＬ）を取り込んだリポソームの細胞性取り込みを増強するために、ＣＰＬを合成し、そしてその効率を評価するために実施された。本発明のアプローチは、ＣＰＬ合成のための化合物として、不活性で非毒性かつ天然に存在する化合物（例えば、アミノ酸）を使用する。いくつかのＣＰＬを、以下の構築上の特性を有するように設計した：１）リポソーム二重層中にＣＰＬを取り込むためのＤＳＰＥの疎水性脂質アンカー；２）カチオン性ヘッド基に脂質アンカーを連結するためのポリエチレングリコールの親水性スペーサー；および３）カチオン性ヘッド基。さらに、カチオン性基の量および性質を、最終的な適用に従って変化し得る。本実施例では、天然に存在するアミノ酸であるＬ−リジンを使用して、プロトン化可能なアミノ基を生成した。アミノ基の数を、ＣＰＬ合成の間に制御し得る。
【０１５１】
これらの化合物の分析において、これらの細胞取り込みエンハンサーにおける構造−機能の関係を、同定し得る。最初の工程として、異なる量の電荷を有する種々のこれらのＣＰＬを、取り込みを増強するそれらの能力についてスクリーニングした（図５〜７を参照のこと）。さらに、合成されたＣＰＬの物理化学特性およびこれらのＣＰＬがリポソーム二重層に取り込まれる能力もまた、研究した（表１〜３および図５〜７を参照のこと）。インビトロモデルにおいて、これらの遠位で荷電したポリマー結合体は、哺乳動物細胞においてリポソーム取り込みを有意に増強することが確認された。
【０１５２】
【表１】
0005117648.tif 000014
【０１５３】
【表２】
0005117648.tif 000015
【０１５４】
【表３】
0005117648.tif 000016
（ＩＩ．実施例ＩＩ）
本実施例は、ＣＰＬ4を含むＬＵＶが界面活性剤での透析方法によって形成され得ることを例示する。
【０１５５】
ＬＵＶは、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＣ、ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０、およびＣＰＬ4［３．４Ｋ］（またはＣＰＬ4［１Ｋ］）を含む。最初の脂質（４ｍｏｌ％）を含むＣＰＬを含有する２つの調製物を、作製した。
【０１５６】
【表４】
0005117648.tif 000017
上記の脂質を、クロロホルム中に一緒に溶解した。次いで、これを、窒素下で、続いて高い減圧下で２時間、除去した。次いで、乾燥脂質混合物（合計１０μｍｏｌ）を、８３μＬの１Ｍ  ＯＧＰおよび１ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）中で、全ての脂質が界面活性剤溶液中に溶解するまで、ボルテックスしながら６０℃で水和させた。
【０１５７】
この脂質−界面活性剤混合物を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットに移して、そして少なくとも２ＬのＨＢＳに対して４８時間透析した（ここでそのときに、緩衝液を少なくとも２回交換した）。透析による界面活性剤の除去は、ＬＵＶの形成を生じた。全てのＣＰＬが透析後にＬＵＶ中に取り込まれたか否かを決定するために、この脂質サンプルを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムにて分画した（図８Ａおよび８Ｂを参照のこと）。この分画プロフィールは、ＣＰＬ4［３．４Ｋ］またはＣＰＬ4［１Ｋ］のいずれかとともに形成されたＬＵＶを示す。
【０１５８】
ＬＵＶ画分（画分７〜１０）におけるＣＰＬの最終濃度を、初期のおよび最終的なダンシル／ローダミンの比率から、およびＬＵＶピークに存在する全体的なダンシルおよびローダミンの蛍光の割合の見積もりから評価した。本質的に同一の結果を得た。
【０１５９】
初期のＣＰＬ濃度の増大の効果を試験するために、以下の割合を有するサンプルを作製した：
【０１６０】
【表５】
0005117648.tif 000018
このサンプルの画分についてのカラムプロフィールを、図８Ｃに示す。全ての３つのサンプルについての結果を、以下に示す：
【０１６１】
【表６】
0005117648.tif 000019
（結論）ＣＰＬ4を含むＬＵＶを、界面活性剤での透析により形成し得る。全てのＣＰＬ4が、小胞中に取り込まれるわけではなく、そして取り込まれる割合は、初期のＣＰＬ／脂質のモル比が増加するに従って減少する。本発明の場合には、４ｍｏｌ％  ＣＰＬで開始すると、約３ｍｏｌ％が、ＬＵＶに取り込まれた。１２ｍｏｌ％の初期ＣＰＬ含量については、６ｍｏｌ％の最終的な含量が達成された。ＣＰＬ4［１Ｋ］の挙動が、ＣＰＬ4［３．４Ｋ］の挙動と非常に類似することに留意する価値がある。これはまた、挿入後研究でも当てはまる。特定の場合では、親水性スペーサーの理想的な長さにより、代表的には、リポソームの増大した循環寿命に対してステルス特性を提供するように使用されている通常の中性ＰＥＧよりも短い距離にて、リポソーム表面からカチオン性基が伸びることが可能される。
【０１６２】
（ＩＩＩ．実施例ＩＩＩ）
（Ａ．総論）
本実施例では、予め形成された小胞中に正に荷電した脂質分子を取り込ませることによって、リポソームと細胞との間の静電的誘引力が増加することに関する非特異的標的化アプローチが、記載される。このアプローチは、ＢＨＫ細胞において、インビトロでの細胞性結合／取り込みにおいて劇的な増加を導く。この方法論は、中性小胞に、および脂質ベースの遺伝子キャリアの構築に使用される脂質から構成される小胞において機能することが実証される。従って、本明細書中に概略されるアプローチは、従来の薬物送達から遺伝子治療の範囲にある多くの適用を有する。
【０１６３】
（Ｂ．材料および方法）
（１．材料）１，２−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（ローダミン−ＰＥ）を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから入手した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。ＤＯＤＡＣおよびＰＥＧＣｅｒＣ２０、ＰＥＧＣｅｒＣ１４およびＰＥＧＣｅｒＣ８は、Ｉｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから惜しみなく与えられた贈り物であった。
【０１６４】
（２．カチオン性ＰＥＧ脂質の合成）：ＣＰＬの合成の詳細を、本明細書中で記載する。２つの型のＣＰＬを、合成し、これは、分子の脂質アンカー（ａｎｃｈｏｒ）部分において異なる。１つにおいて、このアンカーは、ジステアロイルグリセロール（ＤＳＧ）であり、一方で他方のアンカーは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含む。この分子は、アンカー部分からなり、これにＰＥＧ3400鎖が結合される。ＰＥＤ鎖の末端において、荷電した「ヘッド基」が結合され、しばしば、一緒に結合されたリジン残基で作成される。ヘッド基領域を修飾ことによって、ＣＰＬを、合成し、これは、１（モノまたはＭ）、２（ジまたはＤ）、３（トリまたはＴ）および４（クオードまたはＱ）正電荷を含有した。いくらかの異なるクオードＣＰＬを合成し、それ故に、これらに、Ｑ１〜Ｑ５と番号をつけた。これらの化合物を記載するために選択された命名法は、脂質アンカーの型をおよびヘッド基（例えば、ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５）の同一性を特定化する。この低い場合の「ｄ」は、ダンシル化誘導体を示す。
【０１６５】
（３．界面活性剤透析法によるベシクルの調製）一般的に、ベシクルは、界面活性剤方法を用いて形成された（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９９）Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，２７１−２８１（この教示は、本明細書中で参考として援用される））。実施例ＩＩに記載されるような脂質を、適切な比でクロロホルム中で相互溶解し、その後、このクロロホルムを、窒素流のもとで除去しかつ高真空下で２時間配置した。次いで、非イオン性界面活性剤オクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）のアリコート（水中１Ｍ）を乾燥脂質フィルムを得るまで添加し、６０℃にて頻繁に渦をたてて１０〜２０分間インキュベートした。これに、続いて、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を添加し、されに温め、そしてすべての脂質が分散しかつ透明な溶液が得られるまで渦をたてた。脂質の２０ｍｇについて、０．１２５ｍＬのＯＧＰおよび１ｍＬのＨＢＳを使用した。次いで、この脂質−界面活性剤溶液（１〜２ｍＬ）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析膜（３ｍＬ容量）に移し、そして室温にてＨＢＳに対して４８時間かけて徹底的に透析した。一般的に、ＨＢＳの全量８〜１０Ｌをサンプル容量１〜８ｍＬに対して使用した（２Ｌの４〜５変化）。
【０１６６】
ＤＯＰＣおよびＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５）のベシクルを、前述で記載の通りの押出によって調製された（Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．ら（１９８５）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ａ  ｒａｐｉｄ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｔｒａｐｐｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８１２，５５−６５）。
【０１６７】
（４．カチオン性ＰＥＧ脂質の予め形成されたベシクルへの挿入）カチオン性ＰＥＧ脂質（ＣＰＬ）を、ＨＢＳ中または少ない場合において、メタノール中でミセル溶液として貯蔵した。ＣＰＬおよびベシクルを合わせ、所望のモル比（ベシクル脂質に対して１１．６ｍｏｌ％までのＣＰＬ）を得、そして所望の温度で所与時間インキュベートした。たいていの挿入について、標準条件は、６０℃にて３時間のインキュベートを含む。挿入の後、このサンプルを氷上で冷却し、そしてＣＰＬ−ＬＵＶをＨＢＳ中で平衡になったＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂのカラム（１．５ｃｍ×１５ｃｍ）を通過させることによって遊離ＣＰＬから単離した。図１６は、ＳＰＬＰ（類似の手順）についての挿入プロトコルを図示する。
【０１６８】
ＣＰＬの挿入レベルを、蛍光によって測定した。すべての場合において、このベシクルは、０．２５ｍｏｌ％ローダミン−ＰＥまたは０．５ｍｏｌ％のローダミン−ＰＥのいずれかを含有し、そしてＣＰＬは、ダンシル基を含有した。ＣＰＬおよび脂質を組み合わせた後、１５μＬのアリコート（最初のフラクション）を、分析のために傍らに置いた。次いで、ベシクルに挿入されたＣＰＬの量を、最初のダンシル／ローダミン（Ｄ／Ｒ）蛍光比を測定し、そして単離されたＣＰＬ−ＬＵＶのＤ／Ｒ比を測定することによって定量化した。蛍光パラメータ：ローダミンアッセイについて、励起波長は５６０ｎｍであり、そして発光波長は、５９０ｎｍであった。ダンシルアッセイについて、励起波長は、３４０ｎｍであり、そして発光波長は、５１０ｎｍであった。一般的に、励起および発光スリット幅は、それぞれ１０および２０ｎｍであった。このアッセイを、以下のように実施した：最初のサンプル（２〜３μＬ）またはＣＰＬ−ＬＵＶ（２０〜４０μＬ）のアリコートに、３０μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、続いて、２ｍＬのＨＢＳを添加した。ダンシルおよびローダミン標識の両方の蛍光レベルを、４１０ｎｍの発光フィルターを用いて上記のパラメータあたりとして、波長プログラムを用いて連続的に読んだ。％挿入を以下のように計算した：
【０１６９】
【化１８】
0005117648.tif 000020
（５．脂質濃度の測定）：挿入後、細胞結合研究のために各サンプルの脂質濃度を知ることが必要である。これを、蛍光によってすばやく行い得る。界面活性剤透析の後、各サンプルの脂質濃度を、標準ホスフェートアッセイ（Ｆｉｓｋｅ，Ｃ．Ｈ．およびＳｕｂｂａｒｏｗ，Ｙ．（１９９５）Ｔｈｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６，３７５−４００）を用いて測定した。次いで、アリコートを、およそ３ｍＭまで希釈した。このサンプルのローダミン蛍光を比較することによって、この脂質濃度は、公知であり、ＣＰＬ−ＬＵＶは、そのストックから調製され、ＣＰＬ−ＬＵＶ濃度の決定を可能にする。ＬＵＶの脂質濃度を、標準ホスフェートアッセイを用いて測定した。ＣＰＬ挿入の後、脂質濃度をローダミン蛍光から細胞結合研究のために評価した。
【０１７０】
（６．ＢＨＫ細胞によるＣＰＬ含有ＬＵＶの摂取）およそ１０5ＢＨＫ細胞を、（１）ＣＰＬなし、（２）８％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｄ、（３）７％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１、または（４）４％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５のいずれかを含有する２０ｎｍｏｌのＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０（８４／６／１０）ＬＵＶで、ＰＢＳ／ＣＭＧ培地においてインキュベートした。インキュベーションを４℃および３７℃にて１、２、４および６時間実行し、前者は細胞結合の評価を所与しそして後者は、結合および摂取の評価を所与した。２つの値の違いを考慮することによって、３７℃での脂質摂取の評価を得た。各時点において、細胞を破裂させ、そして脂質およびタンパク質についてアッセイした。脂質濃度を、ローダミン蛍光から測定する一方で、タンパク質を、ＢＣＡアッセイを用いて決定した。脂質濃度をローダミン蛍光を用いて測定する一方で、タンパク質をＰｉｅｒｃｅから得たＢＣＡアッセイキットを用いて決定した。
【０１７１】
（Ｃ．結果および議論）
（１．挿入プロトコルの発達）ミセル凝集体からベシクルまでのペグ化脂質の移動は、以前に記載されてきた（Ｕｓｔｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９６）Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８６，２４３−２４６；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓら（１９９７）ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｏ  ｏｒ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｐｐｅｎｄｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｅｒｍｉｎｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，１１１−１１８を参照のこと）。この概念をＤＳＰＥ−ＣＰＬを用いて試験した。これをＤＯＰＣＬＵＶについて図９（Ａ）中に実証する。ダンシルおよびローダミン標識の相互溶出は、ＬＵＶにおけるＣＰＬの組み込みを実証する。この場合において、ＣＰＬの８４％は、ＬＵＶに組み込まれ、従って、遊離のＣＰＬのトレースのみが、ＣＰＬ−ＬＵＶフラクションの跡を引くと観測された。これは、より明確には、図８（Ｂ）中に示され、ここで、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５は、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０（８４／６／１０）で構成されるより複雑に正に帯電したベシクルに挿入した。ここで、およそ９ｍＬｓにおける２つの蛍光標識の相互溶出は、ＣＰＬのベシクルへの７０％挿入を実証する。広範なピークにおける遊離のＣＰＬ溶出物は、１６ｍＬｓに中心があり、ベシクルのピークから分離され、ＣＰＬ−ＬＵＶの簡単な単離を可能にする。一旦挿入されると、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５を、維持し、そしてベシクルから交換しない。図９（Ｂ）からのＣＰＬ−ＬＵＶフラクションを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂのカラム上で再溶出した。図９（Ｃ）に示されるように、ＣＰＬのすべては、ＬＵＶと一緒に残る。
【０１７２】
インキュベーション温度および挿入プロセスにおける時間の効果は、図１０中に示される。ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１を、室温、４０℃および６０℃にてＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０（８４／６／１０）の存在下で、１、３、および６時間で回収されたアリコートを用いてインキュベートした。最も高い挿入レベルを、６０℃で達成し、従って、これをその後の挿入において使用した。わずかにより高い挿入を、６時間にて得、本発明者らは、３時間を選択しサンプル分解を最小にした。
【０１７３】
時間および温度は別にして、最終のＣＰＬ挿入レベルにおける最も良好な蛍光を有するパラメータは、最初のＣＰＬ／脂質比である。約７０％挿入を想定することにより、１、２、４、６、８および１２ｍｏｌ％ＣＰＬを含有するＣＰＬ−ＬＵＶを達成する目的で、一連のインキュベーションを０．０１１〜０．１４の間で変化するＣＰＬ／脂質モル比で実行した。これらの結果を図１１中に示し、ここで、挿入レベルは、最初のＣＰＬ／脂質比の０．９５までほぼ７０％残っており、これより上は、ＣＰＬ／脂質＝０．１４について５０％に落ちる。
【０１７４】
同様の結果を、他のベシクルシステム（ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ１４およびＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ８を含む）について得た。一般的に、ＤＯＤＡＣ含有サンプルで得た挿入レベルは、最初のＣＰＬ／脂質＜０．１について７０〜８０％の範囲であった。この挿入レベルがカチオン性脂質の存在によって行われるか否かを理解するために、いくらかの実験をＤＯＰＣ含有中性ベシクルにおいて実行した。実験した組成物は、以下：（１）ＤＯＰＣ、（２）ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、（３）ＤＯＰＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０、および（４）ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０であった。この結果（図１２中に示される）は、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１について、挿入してない何かが中性システムにおいて：４５〜６５％の間で達成したことを明らかにする。これは、負に帯電したＤＳＰＥアンカーと膜表面との間の減少した引力に起因し得る。それにもかかわらず、結果は、有意な挿入が中性ベシクルおよび正ベシクルの両方について達成され得ることを実証する。
【０１７５】
図１３中に示される、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５についての挿入レベルはまた、Ｑ１（７０〜８４％）よりもより高いことが示されるべきである。これらのシステムにおいて、Ｑ１およびＱ５ＣＰＬの異なる性質の理由のためである。以前の実験においては、それらは、非常に類似の挙動を示した。Ｑ５のこの特定のバッチを、メタノール中で調製し、この溶媒中で、脂質は、より良好な貯蔵安定性を示し得る。本明細書中で説明される場合、インキュベーション混合物におけるメタノールの存在は、より高い挿入へ導くことを見出した。
【０１７６】
多くの挿入を、Ｑ５およびＱ１に加えて他のＣＰＬを用いて実行した。これらの結果を、表７および８（図２３および２４）中にまとめ、ここで、いくらかの組成物依存傾向が確かめら得る。第１に、同じ傾向が、図１１の上に示され、Ｑ５は、異なる電荷を有する幾らかのＣＰＬについて維持する。ＣＰＬ／脂質の最初の比を増大するが、挿入されたＣＰＬの百分率は、減少する。Ｔ１、Ｑ１およびＱ５インキュベーション（ＣＰＬ／脂質＝０．０２２〜０．０２４）を参照すると、％挿入は、７６〜８０％の範囲である。しかし、ＣＰＬ／脂質＝０．０８６〜０．０９５について、％挿入の範囲は、６２〜６８％に減少する。
【０１７７】
別の傾向が、図１３中に示される。最初のＣＰＬ／脂質比＞０．０４について、わずかなＣＰＬ−Ｑ１が、より短い鎖ＰＥＧのいずれかを含有するＬＵＶよりもＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０を含有するＬＵＶに挿入される。ＰＥＧアンカーの型の存在することに加えて、ＰＥＧ−Ｃｅｒの量はまた、挿入の際に効果を有し、図１４中に示される。ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０含量が、４〜１０ｍｏｌ％に増大される場合、ＣＰＬ−Ｑ５の挿入レベルは、７１〜６２％になる。
【０１７８】
当業者は容易に理解するけれども、脂質アンカーは、変化され得、そして挿入レベルは、脂質アンカーとして使用される脂質に依存して変化し得る。例えば、幾らかの実験をＤＳＧ（ジステアロイルグリセロール）アンカーを含有するＣＰＬを用いて実行した：すべての場合において、挿入レベルは、より低く、ＤＳＰＥアンカーを含有するＣＰＬにおいてよりも１７〜４０％であった。本発明の方法およびアッセイを用いて、当業者は適切な脂質アンカーを用意に同定し得る。
【０１７９】
ＣＰＬ挿入後の起こり得る凝集を調べるために、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して、粒子直径における挿入の効果を実験した。ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ／Ｃｅｒ−Ｃ２０ベシクルは、１１９±３９ｎｍの直径を有すると見出した。１．８ｍｏｌ％のＣＰＬ４ｂの挿入後、およそ１３５±４２ｎｍまでの直径のわずかな増大を観測したが、平均直径および標準偏差の両方は、７ｍｏｌ％のＣＰＬまで一定のままであった。１２０ｎｍ〜１３５ｎｍの増大は、わずかにより大きい直径がより長いＣＰＬ  ＰＥＧ鎖の存在を生じることを反映し得るか、またはベシクル凝集の少量を示し得る。これらの２つの間の可能性を区別するために、ＣＰＬ−ＬＵＶを、ローダミンフィルターを用いて蛍光顕微鏡によって実験した。コントロールＬＵＶが凝集の兆候を示さない一方で、有意なレベルを、ＣＰＬ−ＬＵＶについて観測した。しかし、４０ｍＭ  ＣａＣｌ2の添加により、この効果は完全に妨げられると見出した。
【０１８０】
Ｍｔｅｒｉａｌｓ＆Ｍｅｔｈｏｄｓに記載される通りに、ＰＢＳ／ＣＭＧ上でインキュベートされたＢＨＫ細胞上の種々にＣＰＬ−ＬＵＶの摂取についての評価を得た。このデータは、図１５中に示され、ＣＰＬにおける正電荷の存在は、ＢＨＫ細胞による摂取の有意な増大へ導き得ることを明らかにした。ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０で構成されるＬＵＶ（従ってネット正電荷を示す）は、ＢＨＫ細胞上の摂取をほとんど示さなかった。８ｍｏｌ％のＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｄを含有するＬＵＶは、同様の低い摂取値を示した。摂取は、７ｍｏｌ％のＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１の存在によりほんのわずかに増大された。しかし、摂取におけるわずかな増大は、ほんの４．１ｍｏｌ％で存在するＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５について実現された。幾らかの点をこのデータからまとめることができる。ＬＵＶ表面からのいくらかの距離において存在する正電荷の増大は、摂取の増大へ導くことが明らかになる一方で、増大された細胞結合における役割を果たす総電荷単独ではない。ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−ＤサンプルおよびＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５サンプルに存在する正電荷の量は、およそ等しいが、そして前者は、後者と比べて結合をほとんど示さない。ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１サンプルは、ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５サンプルより大きい正電荷を有し、そしてさらに１／３摂取のみを示す。ＣＰＬ分子の遠位末端における十分な正電荷密度の局在化は、細胞との相互作用を確実にする際に重要なパラメータである。好ましい実施形態において、少なくとも４つの電荷を使用して、有効な細胞結合を達成する。
【０１８１】
ＢＨＫ細胞へのＬＵＶの結合におけるＣＰＬ挿入の劇的な効果は、蛍光顕微鏡を用いて最も明確に視覚化される。ＣＰＬの不在下で、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０で構成され、そしてローダミン−ＰＥを含有するベシクルは、細胞への結合をほとんど示さない。３ｍｏｌ％  ＣＰＬ４ｂの組み込みは、高レベルのベシクル結合および摂取へ導く。多くの脂質は、細胞表面に結合すると思われるけれども、いくらかの小さな点状構造が示され、ベシクルの摂取がまた、生じていることを示す。注意すべき重要な点は、細胞がＣＰＬ−ＬＵＶの存在下でインキュベーション後正常に出現することである。反対に、ＤＮＡカチオン性脂質錯体は、公知であり、有意な毒性を示す。
【０１８２】
リポソーム薬物送達において主要なハードルまたは残りのハードルの１つは、キャリアシステムの内容物が摂取され、そして特定の標的細胞によって利用されることを確実にする方法の問題である。リポソームの細胞摂取は、細胞表面における吸収または結合、続いてエンドサイトーシスを含むと、今や考えられる。従って、細胞結合を妨害する要因は、低レベルの細胞内送達へ導く。これは、親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）の表面層で覆われる「ステルス」または長循環性のリポソームについて特に重要である。長循環性の寿命（血清タンパク質との相互作用を妨げる滅菌バリアの形成）を示す、非常に特徴的なＰＥＧコーティングはまた、細胞との相互作用を最小にする。他方では、表面結合を増強する要因は、増大した細胞摂取へ導くと予期され得る。１つのアプローチは、膜レセプターに特異的な分子をリポソーム表面に付着させることを含む。起こり得る候補としては、オリゴペプチド（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６，７０５−７０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１１１−１１８（１９９７）を参照のこと）オリゴ糖（Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１１１−１１８（１９９７）を参照のこと）、葉酸（Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０，２８９−２９８（１９９９）；Ｌｅｅら、ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９，３１９８−３２０４（１９９４）；Ｒｅｄｄｙら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  １５，５８７−６２７（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５３，３９−４８（１９９８）を参照のこと）、リボフラビン（Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４２６，１９５−２０４（１９９９）を参照のこと）、または抗体（Ｍａｙｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，１５６２１−１５６２７（１９９８）；ｋａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３  ２５０−２５６（１９９６）；Ｈａｎｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３９，１３３−１４４（１９９５）を参照のこと）が挙げられる。代替のアプローチは、リポソームの電荷特徴づけを修飾することである。リポソームにおける、負電荷（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１２８７５−１２８８３（１９９８）；Ａｌｌｅｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １０６１，５６−６４（１９９１）；Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２，８８９−８９９（１９９３）；Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１０３，１８５−１９７（１９９２）を参照のこと）または正電荷（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１２８７５−１２８８３（１９９８）を参照のこと）のいずれかの封入が、増強された細胞摂取へ導き得���ことは、周知である。カチオン性ＤＮＡ−脂質複合体（有効なインビトロトランスフェクト薬剤（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７，３８７−３８８（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｋａｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３  ２５０−２５６（１９９６）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７７２，１２６−１３９（１９９５）；Ｊａｒｎａｇｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０，４２０５−４２１１（１９９２）を参照のこと））は、エンドサイトーシスを介して摂取される。
【０１８３】
本実施例は、リポソームと細胞との相互作用を増強するための新規のアプローチ、細胞内送達を可能にする非ウイルス性システムの発展における必要な工程を記載する。このアプローチは、新規のカチオン性ＰＥＧ脂質を予め形成されたリポソームへ挿入し、細胞相互作用に含まれる正電荷が、ベシクル表面からいくらか離れて位置するカチオン性ベシクルに導くことを含む。このプロセスは、ＤＯＰＥ、カチオン性脂質ＤＯＤＡＣ，およびＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０で構成される立体的に安定化したＬＵＶへのＣＰＬの挿入について、図１６中に例示される。この脂質組成物は、２つの理由のために研究に選択される。第１に、それは、正に帯電したＤＯＤＡＣ（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，２７１−２８１（１９９９）が存在するという長所によって、小さな小胞構造内のプラスミドＤＮＡの有効な包括を可能にし、従って、遺伝子送達システム（以下参照）としての潜在性を有する。第２に、この組成物は、ＰＥＧ脂質を含む多くの立体的に安定化した薬物送達システムの代表である。ＣＰＬの挿入は、表面ＰＥＧ層上の正電荷の局在化へ導き、それによってＣＰＬと細胞表面との間の静電気的相互作用を可能にする。これは、従来のリポソームおよびＰＥＧ含有リポソームの両方について細胞相互作用の増加に導く。
【０１８４】
ＣＰＬは、ＤＳＰＥの結合体、ダンシル−リジン部分、親水性ポリマーＰＥＧ3400、およびモノまたは多価カチオン性ヘッド基である。ＰＥＧは、スペーサーとして機能し、脂質アンカーおよびベシクル表面から帯電したヘッド基を分離する。様々な中性およびカチオン性ＬＵＶのミセルＣＰＬを用いるインキュベーションは、外部ベシクル単層（図２３および２４中の表を参照のこと）におけるＣＰＬの６〜７ｍｏｌ％（総ベシクル脂質に比較して）までの取り込みを生じた。この挿入の有効性は、かなり高く、そして７０〜８０％の添加されたＣＰＬがＬＵＶに取りこまれる（図２３および２４中の表を参照のこと）。ＣＰＬ挿入レベルに影響を与える最も重要な要因は、インキュベーション温度（図１０）および最初のＣＰＬ／脂質比（図１１）でった。リポソームの組成物は、最終のＣＰＬレベルをより低い程度まで影響を及ぼすことが見出された（図２３および２４中の表を参照のこと）。挿入後、ＣＰＬ−ＬＵＶは、ゲル排除クロマトグラフィーによって遊離ＣＰＬから有効に分離され得る。同様な挿入レベルは、すべてのＣＰＬについて得られ、ヘッド基電荷は、分子あたり１〜４電荷の範囲である。この認識により、ベシクルが調製され、これは、合理的な正確さを有するＣＰＬの所望のレベルを含有する。
【０１８５】
高い挿入レベル（７ｍｏｌ％）は、１０ｍｏｌ％  ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０と同程度含有するベシクルについて達成され得る。ＰＥＧ−Ｃｅｒの一部が、挿入プロセスの間失われることが起こり得る。なぜなら、ＰＥＧ−Ｃｅｒが循環の間ベシクルから交換するためである。これは、最も高い挿入レベルがＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８で達成され、交換するための最も良好な潜在性を有する理由を説明し得る。しかし、ＣＰＬ４の挿入の前後でのＨＰＬＣによる、ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０を含有するＬＵＶおよびＳＰＬＰの分析は、ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０のわずかな消失を明らかにする（約１０ｍｏｌ％〜８ｍｏｌ％）。
【０１８６】
図１５中に示されるように、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０で構成されるカチオン性ＬＵＶは、ＢＨＫ細胞上でインキュベートされる場合、ほとんど摂取をしめさない。正に帯電したベシクルは、いくらかの細胞株への結合の増強を示すけれども、これは、リポソーム表面上のＰＥＧの存在によって弱められる（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１２８７５−１２８８３（１９９８）を参照のこと）。明らかに、これらのシステムについて、６ｍｏｌ％の正に帯電したＤＯＤＡＣの存在は、６時間後の低摂取レベルのみへ導く。およそ７ｍｏｌ％のジカチオン性ＣＰＬの組み込みは、摂取の際にほとんど効果を有さず、およそ７ｍｏｌ％のトリカチオン性ＣＰＬの存在下でわずかに改善された。最も良好な結果を、ＣＰＬ４ｂ（４正電荷を有する）（４ｍｏｌ％において）について得た。６時間のインキュベーションにおいて、１０倍の摂取の増加は、出発ベシクルに比較して観測された。いくかの要点は、このデータからまとめられ得る。第１は、ＬＵＶ表面からいくらか距離をおいた正に帯電した基の存在が細胞摂取の有意な増大へ導き得る。この場合において、ＣＰＬ（ＰＥＧ  ＭＷ＝３４００）の正電荷は、ＰＥＧ（ＭＷ＝２０００）の表面コーティングの上に位置し、従って、細胞との相互作用について利用可能である。しかし、細胞結合を増強する際に役割を果たすものは、総電荷単独ではない。ＣＰＬ2およびＣＰＬ4bサンプル中に存在する正電荷の量は、およそ等しいが、前者は、後者と比較して、ほとんど摂取を示さない。ＣＰＬ3サンプルは、ＣＰＬ4bサンプルより大きい正電荷を有するが、１／３の摂取のみしか示さない。ＣＰＬ分子の遠位末端における十分な正電荷密度の局在は、細胞との相互作用を確実にする際に重要なパラメータであると、思われる。少なくとも４つの電荷は、有効な細胞結合が起こるために必要であると思われる。
【０１８７】
ＣＰＬの従来のＣＰＬおよび立体的に安定なＣＰＬへの挿入について記載されるプロトコルは、インビトロ適用を使用する方法論を実証するために理想的である。両方の場合において、添加された正電荷は、表面から物理的に離れており、そして細胞との相互作用に利用可能である。これは、血清タンパク質および細胞（例えば、マクロファージ）との最小の相互作用のために設計されるポリマーで覆われたベシクルについて特に重要である。しかし、このシステムは、インビトロ適用については理想的でなく、ここで、間隔を減少するために最初にＣＰＬ電荷を隠すかまたは選別し、そして選択された組織においてベシクルの集積を可能にすることが、望ましくあり得る。従って、代替の実施形態は、ＣＰＬにおけるより短いＰＥＧスペーサーまたはＰＥＧ−Ｃｅｒ分子におけるより長いＰＥＧ鎖を使用する。ＰＥＧ−Ｃｅｒ分子は、循環の間粒子から交換することが公知であり（Ｗｅｂｂら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １３７２，２７２−２８２（１９９８）を参照のこと）、細胞相互作用に曝されたＣＰＬを残す。
【０１８８】
上述のように、本研究において使用されたカチオン性リポソームは、融合誘導脂質（ＤＯＰＥ）、カチオン性脂質（ＤＯＤＡＣ）および安定化脂質（ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０）で構成され、後者は、ベシクルに対して長循環性の適正を所与する。この脂質組成物は、安定化されたプラスミド脂質粒子（ＳＰＬＰ）として公知である新規のクラスの脂質ベースのＤＮＡキャリアシステムの後、モデル化された（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，２７１−２８１（１９９９）を参照のこと）。ＳＰＬＰは、遺伝子送達システムとして潜在性をカプセル化する小粒子（７０ｎｍ）である。リポソーム表面上のＰＥＧコーティングの存在は、長循環特性を与え、そして血清ヌクレアーゼによる分解からプラスミドを保護する。従って、ＳＰＬＰは、全身性インビボ遺伝子治療適用について現実的な潜在性を有する第１のキャリアシステムを表す。本明細書中で記載されたアプローチは、細胞結合および摂取を増大させることによってこれらの粒子のトランスフェクト潜在性を非常に増強し、これは、プラスミドの細胞内送達の増加へ導く。従来の処方物におけるＣＰＬの封入（例えば、抗癌薬物）はまた、効果の増加へ導く。
【０１８９】
（ＩＶ．実施例ＩＶ）
（Ａ．概要）
本実施例は、細胞のインビボトランスフェクトについて、安定なプラスミド−脂質粒子に組み込まれたＣＰＬを使用する。
【０１９０】
ＢＨＫ細胞におけるこれらの粒子の８時間までのインキュベーションは、２〜４ｍｏｌ％に増加された挿入されたＣＰＬの量として摂取における増加を生じる。ＳＰＬＰシステムのトランスフェクトは、トランスフェクト培地における１５ｍＬ  ＣａＣｌ2でのＣＰＬの添加により増大する。ＳＰＬＰ単独は、４時間および９時間のトランスフェクトにおいて非常に低いトランスフェクトを示し、続いて新鮮な培地における２４時間の完全なインキュベーションを示した。培地における１５ｍＭ  ＣａＣｌ2の最終濃度のＳＰＬＰへの添加は、ＢＨＫ細胞におけるトランスフェクトを両方の時点において１０倍まで増加した。１５ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在により、ＳＰＬＰ＋２％、３％および４％ＣＰＬは、両方の時点においてＳＰＬＰ単独の回数よりも２０００〜５０００回多くトランスフェクトする。４ｍｏｌ％のＣＰＬは、トランスフェクトにおいて最も良好な増大を示す：およそ４５００回より多い、続いて、３％次いで２％のＣＰＬサンプルである。従って、ＳＰＬＰにおけるＣＰＬ、ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５の存在は、摂取およびトランスフェクトの両方において、複合体と比較したレベルまたはこれより上のレベルまで増大する。
【０１９１】
（Ｂ．材料および方法）
１．ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５の合成：ダンシル化ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５（ＣＰＬ）を、Ｃｈｅｎら（２０００）に記載される通りに発明者らの研究において調製した。
【０１９２】
２．ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５のＳＰＬＬＰへの組み込み：Ｉｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．は、ＳＰＬＰを供給した。ＣＰＬのＳＰＬＰへの組み込みを、ＳＰＬＰを用いてＨＢＳ中で２〜３時間のＣＰＬのインキュベーションによって行った。ついで、生じた混合物を、ＨＢＳ、７５ｍＭ  ＣａＣｌ2，ｐＨ７．５で平衡にしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムを通過させ、組み込まれたＣＰＬを用いてＳＰＬＰから組み込まれてないＣＰＬを取り除いた。フラクション（１ｍＬ）を収集し、そしてＣＰＬ（ダンシルアッセイ）、リン脂質およびＤＮＡ（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ）についてアッセイした。最終サンプルは、ＣＰＬの２、３または４ｍｏｌ％を含有するように調製された。このダンシルアッセイは、ＢＢＳにおけるダンシル化ＣＰＬの０．５〜２．５ｍｏｌ％の標準曲線を調製し、そしてサンプル中のＣＰＬの濃度を決定することを含む。リン脂質は、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出技術（Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ、１９５２）を用いて脂質を抽出し、次いで、抽出の有機相についてＦｉｓｋｅ−Ｓｕｂａｒｒｏｗアッセイを実施することによってＳＰＬＰから抽出した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイは、ＤＮＡ標準曲線を使用してＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下でサンプルを比較することによって実施した。ＣＰＬの最終％挿入を、ＣＰＬ濃度を脂質濃度で割ることによって決定した。
【０１９３】
ＣＰＬをＳＰＬＰに挿入するための最適な時間を、０．５ｍｏｌ％Ｒｈ−ＥＳＰＥを用いて調製したＳＰＬＰを使用して、決定した。１５ｎｍｏｌのダンシル化ＣＰＬ（ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５）を、２００ｎｍｏｌの標識したＳＰＬＰと混合し、そしてそしてこのサンプルを、６０℃で種々の時点にわたって（０．５、１、２、３、および４時間）インキュベートした。これらの時点で、サンプルを水浴から除き、そしてセファロースＣＬ−４Ｂカラムに通した。主要な画分をこのカラムから収集し、そしてダンシル対ローダミンの蛍光比を測定した。ローダミン蛍光について使用したパラメータは、５６０ｎｍのλexおよび６００ｎｍのλemであり、そしてダンシル蛍光については、３４０ｎｍのλexおよび５１０ｎｍのλemであった。これらの両方に対する励起スリット幅および発光スリット幅は、それぞれ１０ｎｍおよび２０ｎｍであった。ダンシル／ローダミン比を、カラム前のサンプル対カラム後のサンプルについて比較することにより、各時点における挿入の％を決定した。
【０１９４】
３．ＣＰＬ−ＳＰＬＰのＱＥＬＳ：これらの粒子の直径を、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒを使用して決定した。
【０１９５】
４．フリーズフラクチャーＥＭ：フリーズフラクチャーＥＭを、Ｋ．Ｗｏｎｇにより記載される方法により、２％、３％、および４％のＣＰＬサンプルについて、実施した。
【０１９６】
５．粒子の血清安定性：これらのＣＰＬ−ＳＰＬＰ内のＤＮＡの安定性を、６μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＬｕｃ）を含むサンプル（２５μＬ）を種々の時間にわたって（０、１、２、および４時間）、５０％マウス血清（２５μＬ）中３７℃でインキュベートすることにより、決定した。０時点を除く各時点において、１１μＬの混合物を除去し、水を使用して容量を４５μＬとし、そしてこれらのサンプルを氷上に置いた。次いで、１容量のフェノール：クロロホルム（１：１）を使用して、ＤＮＡをこの脂質から抽出した。微小遠心管中での２０分間の遠心分離に続いて、上部の水相を除去した。０時点は、血清の添加および抽出の実施の前に、５．５μＬのサンプルを除去することにより得た。次いで、２０μＬの水相を、２μＬの負荷緩衝液と混合し、そしてこのサンプルを、ＴＡＥ緩衝液中１％アガロースゲル上で泳動した。１時間後、このゲルを透視器に載せ、そして写真を撮影した。
【０１９７】
６．脂質取り込み研究：取り込み研究のために、１×１０5のＢＨＫ細胞を、１２ウェルプレート上で一晩、２ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中３７℃、５％ＣＯ2で、増殖させた。次いで、０．５％ローダミン−ＤＳＰＥを含む２０ｎｍｏｌの２、３、および４ｍｏｌ％ＣＰＬ−ＳＰＬＰサンプルを、ＨＢＳ＋７５ｍＭ  ＣａＣｌ2と混合し、最終容量を２００μＬとし、そしてこれを、細胞の上部に添加し、続いて８００μＬの完全培地を添加した。これを、細胞の上部で２、４、６、および８時間インキュベートし、この時点で、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そして６００μＬのＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｐＨ８．０）で溶解した。次いで、この溶解物のローダミン蛍光を、５６０ｎｍのλexおよび６００ｎｍのλemを使用し、それぞれ１０ｎｍおよび２０ｎｍのスリット幅を使用して、蛍光計で測定した。４３０ｎｍの発光フィルタもまた使用した。１．０ｍＬのマイクロキュベットを使用した。脂質取り込みを、この蛍光を脂質標準（５ｎｍｏｌ）の蛍光と比較することにより、決定した。次いで、ＢＣＡアッセイを使用して５０μＬの溶解物中のタンパク質を測定することにより、存在する細胞の量についてこの値を標準化した。
【０１９８】
蛍光顕微鏡写真を、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１９９】
７．トランスフェクション研究：インビトロでのトランスフェクション研究のために、５×１０4のＢＨＫ細胞を、完全培地中で２４ウェルプレート中でプレートした。これらを、５％ＣＯ2中３７℃で一晩インキュベートした。２．５μｇのＤＮＡを含む、ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ＋７５ｍＭ  ＣａＣｌ2、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（１：１）／ＤＮＡ複合体、およびＣＰＬ−ＳＰＬＰ系（２、３、および４ｍｏｌ％  ＣＰＬ）を、ＨＢＳまたはＨＢＳ＋７５ｍＭ  ＣａＣｌ2を使用して１００μＬにし、そして細胞上に配置した。次いで、４００μＬの完全培地を、これに添加した。４時間目および９時間目に、トランスフェクション培地を除去し、そしてペニシリンおよびストレプトマイシンを含む完全培地と交換して、２４時間のトランスフェクションを完了した。このトランスフェクション期間の終了時に、細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶解緩衝液で溶解した。この溶解に続いて、１０〜２０μＬの溶解液を９６ウェル発光プレートに移した。このプレート上でのサンプルの発光を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ反応キットおよびプレートルミノメーターを使用して、測定した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標準曲線の使用により、決定し、そして１０〜２０μＬのこの溶解液ついてのＢＣＡアッセイを用いてタンパク質を測定することにより、細胞の数に対して標準化した。
【０２００】
（Ｃ．結果および考察）
図１８ＡおよびＢは、ＳＰＬＰ系の取り込みおよびトランスフェクションが、複合体より１０5倍のオーダーで低いことを示す。
【０２０１】
ＣＰＬ、ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５を、以下の研究に使用する。これの構造を図１６Ａに示す。この分子は、ＰＥＧ3400分子の末端に４つの正電荷を有し、この分子は、脂質ＤＳＰＥに共有結合している。このＣＰＳＬの、ＳＰＬＰと同じ組成物の空のリポソームへの取り込みは、上記実施例に先に記載されている。
【０２０２】
ＳＰＬＰへのＣＰＬの取り込みは、ほんの数工程を包含する。これらの工程を、図１６Ｂに示す。
【０２０３】
ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５を、ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０：ＤＯＤＡＣ（８４：１０：６）を含むＳＰＬＰに、種々の濃度（２〜４ｍｏｌ％から）のＣＰＬで組み込んだ。種々のＣＰＬ百分率についての組込み効率は、最初の７０％と８０％との間であった。ＣＰＬを保有するＳＰＬＰを、組み込まれていないＣＰＬから分離するために、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。３％  ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５についての代表的なカラムプロフィールを、図１９Ａに示す。ＣＰＬ、脂質、およびＤＮＡを全て、単一のピークで同時にカラムから溶出した。しかし、より遅い段階で溶出した、小量の組み込まれていないＣＰＬが存在した。組み込まれたＣＰＬが組み込まれたままであることを示すために、このサンプルをカラムから再溶出する（図１９Ａ）。図１９Ｂに見られ得るように、ＣＰＬは、カラムのより遅い画分には溶出されず、このことは、ＣＰＬが脂質と会合したままであることを示す。
【０２０４】
ＣＰＬの挿入のための最適なインキュベーション期間を決定するために、６０℃での時間経過を実施した（図２０）。この図から、最適な挿入が、２時間と３時間との間で起こることが決定され得る。
【０２０５】
ＣＰＬを含むこれらの粒子の直径が、ＱＥＬＳにより、１０９ｎｍの直径を有するＳＰＬＰと比較すると１２５ｎｍであることを決定した。ＣＰＬの非存在下でのＳＰＬＰと比較したこれらの粒子の構造を観察するために、フリーズフラクチャーＥＭを実施した。
【０２０６】
種々の量のＣＰＬの存在下および非存在下での、ＳＰＬＰの血清安定性を、アッセイした（データは示さない）。遊離ＤＮＡを、５０％マウス血清とともに、１時間のみインキュベートすることにより、これは完全に分解する。ＣＰＬ−ＳＰＬＰの血清安定性は、ＳＰＬＰ系についての安定性と類似していた。このことは、ＣＰＬ−ＳＰＬＰ中のＤＮＡが、ＣＰＬを含まないＳＰＬＰ系におけるＤＮＡと同様に、保護されることを示す。
【０２０７】
この研究の主要な目的は、ＣＰＬＳを使用して、ＳＰＬＰ系の取り込みおよびトランスフェクションの両方を増加させることである。図２１は、ＤＳＰＥ−Ｑｕａｄ５の存在下（２、３、または４ｍｏｌ％）および非存在下（０％）での、ローダミン標識したＳＰＬＰの取り込みの時間経過を示す。４％の系の取り込みは３％の系より高く、３％の系の取込みは２％の系より高く、そして３つ全ては、ＣＰＬを含まない系よりずっと高い。図２２は、同じ処方の４時間および９時間の時点を示す。
【０２０８】
（Ｖ．実施例Ｖ）
この実施例は、安定化したアンチセンス脂質粒子（「ＳＡＬＰ」）へのＣＰＬの取り込みを示す。
【０２０９】
（Ａ．材料および結果）
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。１，２−ジオレイルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰまたはＡＬ−１）を、Ｄｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ａｎｓｅｌｌ（Ｉｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が合成したか、あるいはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。コレステロールを、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）から購入した。ＰＥＧ−セラミドを、Ｉｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．のＤｒ．Ｚｈａｏ  Ｗａｎｇが、ＰＣＴ  ＷＯ９６／４０９６４（本明細書中に参考として援用される）に記載される手順を使用して、合成した。［3Ｈ］−ＣＨＥまたは［14Ｃ］−ＣＨＥを、ＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）から購入した。全ての脂質は、＞９９％で純粋であった。エタノール（９５％）、メタノール、クロロホルム、クエン酸、ＨＥＰＥＳおよびＮａＣｌを全て、市販の供給源から購入した。脂質ストック溶液を、９５％エタノール中２０ｍｇ／ｍＬで調製した（ＰＥＧ−セラミドを、５０ｍｇ／ｍＬで調製した）。
【０２１０】
ＳＡＬＰを、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９８／５１２７８（１９９８年１１月１９日公開、本明細書中に参考として援用される）に記載される方法に従って、最初に調製した。Ｊ．Ｊ．Ｗｈｅｅｌｅｒら（１９９９）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６、２７１−２８１もまた参照のこと。簡単に言えば、配列５’Ｔ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＣＡＴ３’（配列番号１）を有する［３Ｈ］−ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドＩｎｘ−６２９５（ヒトｃ−ｍｙｃ）の１６マー（３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８０）中）を６５℃に昇温させ、そして絶えず撹拌しながら脂質（エタノール中）をゆっくりと添加した（ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４；２５：４５：２０：１０モル比）。この混合物の得られた容量は１．０ｍＬであり、そして１３ｍｍｏｌの全脂質、２ｍｇのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、および３８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のエタノールを含有した。このアンチセンス−脂質混合物を、５サイクルの凍結（液体窒素）および融解（６５℃）に共し、そして引き続いて、サーモバレル取付け具を備える加圧押出し器装置（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を使用して、３つ重ねた１００ｎｍフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ）に１０回通した。押出しの間の温度および圧力は、それぞれ６５℃および３００〜４００ｐｓｉ（窒素）であった。押出した調製物を、１．０ｍＬの３００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．８）で希釈し、エタノール含有量を２０％に低下させた。押出したサンプルを、数リットルの３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．８）に対して３〜４時間透析し（１２０００〜１４０００ＭＷカットオフ；ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）、過剰のエタノールを除去した。サンプルを引き続いて、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）（ｐＨ７．５）に対して１２〜１８時間透析し、ＤＯＤＡＰを中和し、そしてベシクルの表面に会合したあらゆるアンチセンスを放出した。カプセル化を、カラム前およびカラム後の［3Ｈ］−アンチセンスおよび［14Ｃ］−脂質の比を分析すること、または全カラム前およびカラム後の［3Ｈ］−アンチセンスおよび［14Ｃ］−脂質の放射能を決定することのいずれかにより、評価した。
【０２１１】
ＳＡＬＰを調製した後に、ＣＰＬを組み込んだ。約５μｍｏｌのＳＡＬＰを、３〜１０ｍｏｌ％のＣＰＬ（すなわち、０．１５〜０．５μｍｏｌ  ＣＰＬ）と混合した。ＣＰＬを、ＨＢＳ中またはメタノール中のミセル溶液として貯蔵した。ＣＰＬをメタノールに添加した場合には、最終メタノール濃度は３〜４％であった。この混合物を、室温または４０℃で一晩インキュベートした。組み込まれなかったＣＰＬを、カラム分離（ＨＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂ、７５ｍＭ  ＣａＣＬ2（ｐＨ７．５））により、ＳＡＬＰ調製物から除去した。組み込み効率は、３４％と６０％との間であった。他の有機溶媒が組み込み効率を改善し得ることが、予測される。
【０２１２】
（ＶＩ．実施例ＶＩ）
（Ａ．一般的概説）
本実施例においては、遠位が正に荷電したカチオン性ポリ（エチレングリコール）脂質複合体（ＣＰＬ）を合成し、そしてＣＰＬを取り込んだリポソームの細胞取り込みの増強におけるこれらの効力について、評価した。リポソーム表面に結合した、遠位が荷電したポリマー複合体は、インビトロで哺乳動物細胞へのリポソーム取り込みを増強することが、確認された。
【０２１３】
（Ｂ．方法）
（臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の決定）
ＣＰＬのＣＭＣを、ＢｒｉｔｏおよびＶａｚ（Ｂｒｉｔｏ，Ｒ．Ｍ．Ｍ、およびＶａｚ，Ｗ．Ｌ．Ｃ．（１９８６）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−１−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５２、２５０−２５５を参照のこと）により以前に報告されたように、ＮＰＮアッセイを使用して決定した。一連の異なる濃度のＣＰＬを、ＨＢＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で調製した。５μＭのＮＰＮ（９５％エタノール中のストックＮＰＮ溶液から）を、上記ＣＰＬ溶液に添加した。この混合物の、室温で３０分間のインキュベートに続いて、λem＝４１０ｎｍでの蛍光強度を、λex＝３５６ｎｍを使用して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ  ５０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、測定した。
【０２１４】
（Ｃ．結果）
（インビトロでのＣＰＬ−ＬＵＶの取り込み増強。従来のＣＰＬ−リポソームの細胞取り込み。）
ＣＰＬ含有リポソームのインビトロでの細胞取り込みを、新生ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞において研究した。リポソームに会合した蛍光脂質マーカー（Ｒｈ−ＰＥ）を、脂質取り込みについてのマーカーとして使用した。図２６および２７に示すように、ＣＰＬ4は、コントロールサンプル（ＣＰＬなし）と比較して、ＰＢＳ−ＣＭＧおよび血清含有培地の両方を使用して、細胞取り込みを有意に増強させる。ＣＰＬ−ＬＵＶの時間依存性取込みは、３時間後に最大に達する。図６は、４時間のインキュベーション後の、様々なＣＰｌ含有ベシクルの細胞取り込みを要約する。コントロールと比較して、減少した細胞取り込みがＣＰＬ1について、中程度の増加がＣＰＬ2（２倍）について、そして大きな増加が、ＣＰＬ4およびＣＰＬ8の両方について、観察された。ＣＰＬ4およびＣＰＬ8から得られた類似の程度の増加は、ＣＰＬにおける４つの電荷密度が、最大に増強された細胞取り込みについての要求を満足することを示す。
【０２１５】
（ＶＩＩ．実施例ＶＩＩ）
（Ａ．一般的概説）
本実施例は、リポソームと細胞との間の静電引力を増加させることにより、非特異的な標的化を増強するよう設計された、新たなクラスのカチオン性脂質の合成を記載する。
【０２１６】
（Ｂ．材料および試薬）
ｔＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ3400−ＣＯ2−ＮＨＳを、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から入手した。
【０２１７】
【化１９】
0005117648.tif 000021
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）から購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）から入手した。フルオレサミンおよびローダミン−ＤＳＰＥ（Ｒｈ−ＰＥ）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から入手した。コレステロール（Ｃｈｏｌ）を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）から入手した。トリフルオロ酢酸、ジエチルエーテル、メタノール、トリエチルアミン、およびクロロホルムを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）から入手した。全ての試薬を、さらに精製することなく使用した。
【０２１８】
（１．一般的方法）
全ての反応を、１６×１００ｍｍのガラス試験管内で実施した。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、２００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ  ＭＳＬ  ２００分光計を使用して得た。重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ3）を、ＮＭＲ実験の溶媒として使用した。プロトンの化学シフト（δ）を、ＣＨＣｌ3を７．２４ｐｐｍに設定して参照した。シグナルが合理的に分解された場合には、これらの強度を積分して、プロトンの数の推定を可能にした。交換可能なアミノ基プロトンの化学シフト（７〜８ｐｐｍの間に観察される）は、与えていない。これらのピークを、Ｄ2Ｏ交換によるこれらの除去に基づいて、帰属した。
【０２１９】
リンおよびフルオレサミンアッセイを実施して、各ＣＰＬにおけるホスフェートあたりの一級アミンの比を、以下のように確認した。
【０２２０】
ＣＰＬのホスフェート濃度を、Ｆｉｓｋｅ−Ｓｕｂａｒｒｏｗリンアッセイ（Ｆｉｓｋｅ，Ｃ．Ｈ．、およびＳｕｂｂａｒｏｗ，Ｙ．（１９９５）Ｔｈｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．６６、３７５−４００を参照のこと）を使用して、決定した。ＣＰＬ中の一級アミン濃度を、蛍光団であるフルオレサミンを使用して、決定した。アセトン中のフルオレサミン溶液（０．６ｍｇ／ｍＬ）を調製した。ＨＢＳ中のＣＰＬ溶液のアリコート（２〜４μＬ）を、２００ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を用いて２５０μＬにした。この混合物に、５０Ｌのフルオレサミン溶液を、ボルテックスしながら滴下し、続いて１７００μＬの水を添加した。この溶液の蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して、３９７ｎｍのλexおよび４７５ｎｍのλem、ならびに１０ｎｍの励起スリット幅および発光スリット幅を用いて測定した。このＣＰＬの一級アミン濃度を、リジン標準曲線から決定した。
【０２２１】
【化２０】
0005117648.tif 000022
３ｍＬの乾燥クロロホルム中のｔＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ3400−ＣＯ2−ＮＨＳ（５００ｍｇ、１４７μｍｏｌ）を、１ｍＬのメタノールおよび２００μＬのトリエチルアミン中の
【０２２２】
【化２１】
0005117648.tif 000023
の溶液にゆっくりと添加した。この反応混合物を室温で３時間撹拌した後に、溶媒をＮ2気流下で除去し、そして減圧下でさらに乾燥した。粗生成物を、最初に最小量のクロロホルムに昇温させながら溶解し、次いで１０ｍＬのジエチルエーテルの添加により沈殿させることにより、洗浄した。ボルテックスしながら、このエーテルを添加した。１の沈殿を、冷却により加速した。次いで、沈殿物を遠心分離によりペレット化し、そしてエーテルを処分した。このクロロホルム／エーテルによる洗浄および沈殿の手順を繰り返した。次いで、乾燥した固体を４ｍＬのクロロホルムに溶解し、そして氷浴中で１５分間冷却した。この冷却した溶液が透明である場合には、メタノール（２ｍＬ）を添加した。沈殿（過剰のダンシルリジン）が生じた場合には、これをメタノールの添加の前に濾別した。このクロロホルム／メタノール溶液を、１．２ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。クロロホルム相を抽出し、乾燥し、そして固体を６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１  ｖ／ｖ）に溶解し、そして１．２ｍＬの蒸留水で洗浄した。クロロホルム相を抽出し、粘性のペーストに乾燥し、そして
【０２２３】
【化２２】
0005117648.tif 000024
を１０ｍＬのエーテルで沈殿させた。遠心分離およびエーテルの除去の後に、乾燥生成物は、淡黄色の固体である。収量：５２０ｍｇ（９３％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５  ｖ／ｖ）：Ｒf０．５６。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．０８（ｔ）、１．４０（ｓ，１１Ｈ）、２．６６（ｓ，１Ｈ）、２．８６（ｓ，８Ｈ）、３．２７（ｑ）、３．５０（ｔ）、３．６０（ｓ，３０９Ｈ）、３．９６（ｔ）、４．１９（ｍ［ブロード］）、５．０３（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、５．２２（ｔ，１Ｈ）、５．４３（ｄ，１Ｈ）、７．１６（ｄ，１Ｈ）、７．５１（ｑ，２Ｈ）、８．１９（ｄ，１Ｈ）、８．２７（ｄ）、８．５０（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２２４】
ダンシル化ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ（３）。最初に、
【０２２５】
【化２３】
0005117648.tif 000025
を以下のように調製した。２ｍＬの乾燥クロロホルム中の
【０２２６】
【化２４】
0005117648.tif 000026
およびＮＨＳ（３１．５ｍｇ、２７４μｍｏｌ）の溶液を、１ｍＬの乾燥クロロホルムに溶解したＤＣＣ（４２．８ｍｇ、２０７μｍｏｌ）に添加した。この反応混合物を室温で２時間撹拌した。副生成物であるジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）を、綿栓を備えたＰａｓｔｅｕｒピペットを使用して濾過した。
【０２２７】
【化２５】
0005117648.tif 000027
を含む濾液を、２ｍＬの乾燥クロロホルムおよび２００μＬのトリエチルアミン中のＤＳＰＥ（１２０．６ｍｇ、１６１μｍｏｌ）の溶液にゆっくりと添加した。乾燥クロロホルムおよびトリエチルアミンへの、ＤＳＰＥの溶解は、６５℃への昇温を必要とした。この反応混合物を室温で３時間撹拌した後に、これを乾燥し、そしてクロロホルム／エーテルで洗浄し、そしてニンヒドリンで可視化される、ＴＬＣでのＤＳＰＥの消失まで、先に記載したように沈殿させた。この過剰のＤＳＰＥの除去は、少なくとも３回の洗浄を必要とした。生成物であるダンシル化ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ（３）を、クロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、希ＨＣｌおよび水で洗浄し、そして（１）に関して記載したように、エーテルを使用して沈殿させた。収量：５７５ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒf０．５８。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．８５（ｔ，４Ｈ）、１．２２（ｓ，４８Ｈ）、１．４１（ｓ，１０Ｈ）、１．５５（ｔ）、２．２７（ｍ［ブロード］，６Ｈ）、２．９０（ｍ［ブロード］，６Ｈ）、３．０４（ｓ，８Ｈ）、３．２７（ｑ）、３．６１（ｓ，２７５Ｈ）、４．１４（ｍ［ブロード］）、４．３２（ｄ）、４．３８（ｄ）、５．０５（ｓ［ブロード］）、５．２３（ｓ［ブロード］）、５．５８（ｍ［ブロード］）、７．３７（ｄ，１Ｈ）、７．４９（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、７．５９（ｔ，２Ｈ）、８．２４（ｄ，１Ｈ）、８．５０（ｄ，１Ｈ）、８．５９（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２２８】
ダンシル化ＣＰＬ1（４）。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２ｍＬ）を、２ｍＬのクロロホルム中のダンシル化ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ（３）（５５０ｍｇ、１２１μｍｏｌ）の溶液に添加し、そして室温で４時間撹拌した。この溶液を粘性のペーストに濃縮し、そしてクロロホルム／エーテルで３回洗浄した。エーテルの除去後、この固体を６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、そして１．２ｍＬの５％重炭酸ナトリウムで洗浄した。クロロホルム相を抽出し、乾燥し、そして６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、そして１．２ｍＬの蒸留水で洗浄した。クロロホルム相を粘性のペーストに濃縮し、そして精製したＣＰＬ1（４）をクロロホルム／エーテルでの洗浄および減圧乾燥により得た。収量：５３５ｍｇ（９７％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒf０．７６。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ，４Ｈ）、１．２２（ｓ，４６Ｈ）、１．５４（ｍ［ブロード］，８Ｈ）、２．２３（ｔ，６Ｈ）、２．８４（ｓ，９Ｈ）、３．１６（ｍ［ブロード］，３Ｈ）、３．２６（ｔ，３Ｈ）、３．６１（ｓ，２６３Ｈ）、３．９８（ｑ）、４．１７（ｔ）、４．３３（ｄ）、４．３８（ｄ）、５．１９（ｓ［ブロード］）、５．９３（ｄ，１Ｈ）、７．１３（ｄ，１Ｈ）、７．４６（ｔ，１Ｈ）、７．５２（ｔ，１Ｈ）、８．１５（ｄ，１Ｈ）、８．４３（ｔ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【０２２９】
ダンシル化ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）。
【０２３０】
【化２６】
0005117648.tif 000028
の、２ｍＬの乾燥クロロホルム中の溶液を、ダンシル化ＣＰＬ1（４）（５１０ｍｇ、１１２μｍｏｌ）の、２ｍＬクロロホルム（２００μＬトリエチルアミンを含む）中の溶液にゆっくりと添加し、そして室温で３時間撹拌した。この反応の完了は、ＴＬＣでのニンヒドリン試験により可視化される、一級アミンの消失により、示された。この反応混合物を粘性のペーストに濃縮し、そして過剰の
【０２３１】
【化２７】
0005117648.tif 000029
の消失がＴＳＣにより確認されるまで、クロロホルム／エーテルで洗浄した（約３回）。この生成物を６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、そして１．２ｍＬの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄した。クロロホルム相を抽出し、乾燥し、６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）に溶解し、そして１．２ｍＬの蒸留水で洗浄した。クロロホルム相を粘性のペーストに濃縮し、そして精製した化合物を、クロロホルム／エーテルでの洗浄および減圧乾燥により得た。収量：５１０ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒf０．５８。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ，３Ｈ）、１．２２（ｓ，４４Ｈ）、１．４１（ｓ，２０Ｈ）、１．５６（ｍ［ブロード］）、１．７８（ｍ［ブロード］）、２．２７（ｍ，５Ｈ）、２．８８（ｓ）、２．９１（ｓ）、２．９７（ｓ）、３．０６（ｓ，７Ｈ）、３．２６（ｔ）、３．４４（ｔ）、３．６２（ｓ，２５２Ｈ）、３．９７（ｔ）、４．０５（ｄ）、４．１３（ｍ）、４．３３（ｄ）、４．３８（ｄ）、４．６８（ｓ［ブロード］）、５．２２（ｓ［ブロード］）、５．５１（ｓ［ブロード］）、６．５７（ｔ［ブロード］，１Ｈ）、７．３９（ｄ，１Ｈ）、７．５１（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、７．６０（ｔ，２Ｈ）、８．２６（ｄ，１Ｈ）、８．５３（ｄ，１Ｈ）、８．６１（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２３２】
ダンシル化ＣＰＬ2（６）。ＣＰＬ2（６）の合成は、ダンシル化ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）（４９０ｍｇ、１０３μｍｏｌ）の脱保護による、ＣＰＬ1（４）の合成と同じであった。収量：４７８ｍｇ（９７％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒf０．６３。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ，３Ｈ）、１．２２（ｓ，４２Ｈ）、１．５５（ｍ，１０Ｈ）、１．９３（ｓ［ブロード］，４Ｈ）、２．２４（ｔ，５Ｈ）、２．８５（ｓ，８Ｈ）、３．２６（ｔ，３Ｈ）、３．６１（ｓ，２７１Ｈ）、３．９５（ｑ）、４．１７（ｓ）、４．３４（ｓ）、５．１８（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、６．３１（ｄ，１Ｈ）、６．８９（ｓ，１Ｈ）、７．１０（ｄ，１Ｈ）、７．４９（ｍ，１Ｈ）、８．１５（ｄ，１Ｈ）、８．３４（ｄ，１Ｈ）、８．４７（ｄ，２Ｈ）ｐｐｍ。
【０２３３】
ダンシル化ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）。ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）の合成は、
【０２３４】
【化２８】
0005117648.tif 000030
とダンシル化ＣＰＬ2（６）（４５５ｍｇ、９５μｍｏｌ）との反応による、ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）の合成と同じであった。収量：４７５ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒf０．５８。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ，３Ｈ）、１．２２（ｓ，４３Ｈ）、１．４０（ｓ，３９Ｈ）、１．７１（ｍ［ブロード］，６Ｈ）、２．２７（ｍ，５Ｈ）、２．８８（ｓ）、２．９０（ｓ）、２．９５（ｓ）、３．０５（ｓ，１０Ｈ）、３．２５（ｔ，３Ｈ）、３．４３（ｓ）、３．６１（ｓ，２６２Ｈ）、３．９７（ｔ）、４．０５（ｄ）、４．１５（ｍ）、４．３２（ｄ）、４．３７（ｄ）、４．５１（ｓ［ブロード］）、４．７５（ｓ［ブロード］）、４．９０（ｓ［ブロード］）、５．２３（ｔ［ブロード］，１Ｈ）、５．５２（ｓ［ブロード］）、５．８０（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、７．１５（ｍ［ブロード］，１Ｈ）、７．３８（ｄ，１Ｈ）、７．５０（ｓ，１Ｈ）、７．５９（ｔ，２Ｈ）、８．２５（ｄ，１Ｈ）、８．５１（ｄ，１Ｈ）、８．６０（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２３５】
ダンシル化ＣＰＬ4（８）。ＣＰＬ4（８）の合成は、ダンシル化ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）（４５０ｍｇ、８６μｍｏｌ）の脱保護による、ＣＰＬ1（４）の合成と同じであった。収量：４４０ｍｇ（９７％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒf０．１９。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ）、１．２２（ｓ）、１．５３（ｍ［ブロード］）、２．３４（ｍ［ブロード］）、２．８６（ｓ）、３．２６（ｔ）、３．６２（ｓ）、３．８７（ｓ［ブロード］）、３．９７（ｔ）、４．１７（ｓ［ブロード］）、４．３３（ｄ）、５．１８（ｓ［ブロード］）、７．１５（ｄ）、７．４３（ｓ）、７．５１（ｔ）、８．１５（ｄ）、８．３２（ｄ）、８．４８（ｄ）、９．０５（ｓ［ブロード］）ｐｐｍ。
【０２３６】
ダンシル化ＣＰＬ8−ｔＢｏｃ（９）。ＣＰＬ8−ｔＢｏｃ（９）の合成は、
【０２３７】
【化２９】
0005117648.tif 000031
とダンシル化ＣＰＬ4（８）（１００ｍｇ、１９μｍｏｌ）との反応による、ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）の合成と同じであった。収量：１１２ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒf０．５８。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８４（ｔ，３Ｈ）、１．０８（ｓ）、１．２１（ｓ，３９Ｈ）、１．３９（ｓ，７５Ｈ）、１．６６（ｍ［ブロード］）、２．２６（ｍ，４Ｈ）、２．８９（ｓ，４Ｈ）、３．０６（ｓ，１１Ｈ）、３．２５（ｔ，３Ｈ）、３．４３（ｓ）、３．４９（ｓ）、３．６０（ｓ，２４８Ｈ）、３．９６（ｔ）、４．０４（ｄ）、４．１２（ｔ）、４．３１（ｄ）、４．３６（ｍ）、５．１９（ｍ［ブロード］）、６．７７（ｍ［ブロード］，１Ｈ）、６．９１（ｓ［ブロード］，１Ｈ）、７．２４（ＣＨＣｌ3）、７．４１（ｄ）、７．５０（ｓ［ブロード］）、７．６０（ｔ）、８．２５（ｄ，１Ｈ）、８．５３（ｄ，１Ｈ）、８．６３（ｄ，１Ｈ）ｐｐｍ。
【０２３８】
ダンシル化ＣＰＬ8（１０）。ＣＰＬ8（８）の合成は、ダンシル化ＣＰＬ8−ｔＢｏｃ（９）（５０ｍｇ、８μｍｏｌ）の脱保護による、ＣＰＬ1（４）の合成と同じであった。収量：４８ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒf０．１３。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）。δ０．８５（ｔ，３Ｈ）、１．２２（ｓ，３４Ｈ）、１．５２（ｓ［ブロード］）、２．２３（ｓ［ブロード］）、２．８６（ｄ）、３．２７（ｄ）、３．６１（ｓ，２７４Ｈ）、３．９６（ｔ）、４．１８（ｍ［ブロード］）、７．１４（ｓ［ブロード］）、７．２４（ＣＨＣｌ3）、７．５０（ｍ［ブロード］）、８．１２〜８．２７（ｓ［ブロード］）、８．４７（ｍ［ブロード］）ｐｐｍ。
【０２３９】
（Ｃ．結果および考察）
ＣＰＬを、図２９に概説するように、アミンおよびＮＨＳ活性化カーボネート基が関与する、繰り返しカップリング反応工程により、合成した。これは、以下からなる：（ａ）親水性ＰＥＧスペーサーにダンシル蛍光標識を組み込む工程、（ｂ）ＤＳＰＥアンカーのカップリング、および（ｃ）脂質へのカチオン性ヘッド基の付着。ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーであるｔＢＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ3400−ＣＯ2−ＮＨＳ（ＭＷ３４００）を、２つの理由から選択した。第一に、これは市販されていた。第二に、これはエーテルに不溶であり、このことは、その誘導体１〜１０の精製の非常に好都合な手段を提供した。他の試薬を過剰に使用して、ＰＥＧポリマーのその誘導体への完全な転換を確実にした。過剰の試薬はエーテルに可溶であり、従って精製の間にエーテル中で洗浄することにより、除去され得た。
【０２４０】
ダンシルリジンのα−アミノ基の、ＰＥＧのＮＨＳ活性化カーボネートとのカップリングによる、蛍光標識である
【０２４１】
【化３０】
0005117648.tif 000032
のＰＥＧポリマーへの組み込みは、リジン誘導体１を与えた。ＤＳＰＥアンカーを、中間体２（これは、ＮＨＳおよびＤＣＣを使用した１のエステル化により形成した）を介してカップリングさせた。得られたＰＥＧ脂質３を、ｔＢｏｃを除去することにより脱保護して、１価の正電荷を有するＣＰＬ1４を形成した。他のＣＰＬの正電荷は、リジンのアミノ基が有する。ここで、ＮＨＳ活性化リジンおよびジ−ｔＢｏｃ保護リジンを、ＣＰＬ1の遊離アミノ官能基に付着させて、中間体５を形成し、これは、脱保護の際に、２価の正電荷を有するＣＰＬ2６を与えた。中間体７を経る、２つのリジン残基の、ＣＰＬ2のアミノ基への付着は、４価の正電荷を有するＣＰＬ4８を与えた。このように、８価の正電荷を有するＣＰＬ8１０を、４つのリジン残基をヘッド基として付着させて、合成した。見られ得るように、これは、非ウイルス薬物送達適用のために特に興味深い、多価のＣＰＬを合成する非常に好都合な手段を提供する。
【０２４２】
図２９の、精製した中間体およびＣＰＬの構造は、1Ｈ  ＮＭＲ分光分析および化学分析により確認した。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、ＰＥＧ、ｔＢｏｃおよびＤＳＰＥのアシル鎖の良好に分解された共鳴を、それぞれ約３．６１、１．４１および１．２１ｐｐｍに示し、そしてダンシル部分の共鳴（７．１〜８．５ｐｐｍに芳香族プロトン；２．８〜３．０ｐｐｍにメチルプロトン）を示した。前者３つのピークの積分したシグナル強度から、ｔＢｏｃ／ＰＥＧまたはｔＢｏｃ／ＤＳＰＥの比は、ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ、ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ、ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ、およびＣＰＬ8−ｔＢｏｃについてそれぞれ１．０、２．１、４．０、および８．１であることがわかった。各ｔＢｏｃはアミノ基に付着しているので、これは、ＣＰＬ1に対する各ＣＰＬのヘッド基におけるアミノ基の数を与える。この本質的に同一の結果を、ＰＥＧおよびＤＳＰＥの両方に対するｔＢｏｃの比を使用して得た。これは、ヘッド基に対する正しい割合での脂質およびポリマーの存在を実証する。ｔＢｏｃ保護基の完全な切断を、ｔＢｏｃのＮＭＲピークおよび化学分析の損失により確認した。これは、フルオレサミンおよびリンアッセイを使用することにより、ＣＰＬの各々における一級アミン対ホスフェートの比を示した。ＣＰＬ1、ＣＰＬ2、ＣＰＬ4、およびＣＰＬ8についてのアミン／ホスフェートの比は、それぞれ１．０、２．２、３．７、および８．０であることがわかった。これらは、それぞれのＣＰＬのアミノ基が有する正電荷の予測した数に良好に対応した。
【０２４３】
本明細書中に記載のＣＰＬは、それらの有用性を他のカチオン性脂質に対して増加させ得る、いくつかの特質を有する。第一に、リン脂質アンカーは、ＣＰＬのリポソーム系への効率的な取り込みを容易に可能にする。第二に、ダンシル標識は、蛍光技術を使用する、二重層中のＣＰＬの正確かつ好都合な定量を可能にする。最後に、ＣＰＬ中のカチオン性ヘッド基の原子価が、リジン残基を使用して、容易に改変され得る。
【０２４４】
（ＶＩＩＩ．実施例ＶＩＩＩ）
（Ａ．一般的概要）
蛍光性のカチオン性ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ  １０００）脂質接合（ＣＰＬ）1の合成を記載する。この手順は、以前に詳細に記載したＰＥＧ３４００の手順に非常に類似している。しかし、低分子量のＰＥＧ誘導体は、エーテルに可溶性でなくてもよく、そして従って、以前のようなエーテル洗浄によって容易に精製され得ない。この合成手順は、図２９において要約されるものと類似である。
【０２４５】
（Ｂ．略語）
ｔＢｏｃ、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル；ｔＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ1000−ＣＯ2−ＮＨＳ、ｔＢｏｃで保護され、そしてＮＨＳ活性化したＰＥＧ1000；ＣＰＬ、カチオン性ポリ（エチレングリコール）脂質接合体；ＣＰＬ1、１つの正電荷を有するＣＰＬ；ＣＰＬ2、２つの正電荷を有するＣＰＬ；ＣＰＬ4、４つの正電荷を有するＣＰＬ；ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド；ＤＣＵ、ジシクロヘキシル尿素；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ジ−ｔＢｏｃ−リジン−ＮＨＳ、
【０２４６】
【化３１】
0005117648.tif 000033
；ＤＳＰＥ、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン；ＰＥＧ1000、１０００の平均ＭＷを有するポリ（エチレングリコール）；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸。
【０２４７】
（Ｃ．物質および試薬）
ｔＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ1000−Ｃ０2−ＮＨＳを、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から得た。
【０２４８】
【化３２】
0005117648.tif 000034
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入した。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から得た。フルオレスカミンを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から得た。トリフルオロ酢酸、ジエチルエーテル、メタノール、トリエチルアミン、およびクロロホルムを、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から得た。他の全ての試薬を、さらなる精製なしで使用した。
【０２４９】
【化３３】
0005117648.tif 000035
３ｍＬの乾燥クロロホルム中のｔＢｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ1000−ＣＯ2−ＮＨＳ（５００ｍｇ、５００μｍｏｌ）を、１．５ｍＬのメタノールおよび３００μＬのトリエチルアミン中の
【０２５０】
【化３４】
0005117648.tif 000036
（２００ｍｇ、５３６μｍｏｌ）の溶液にゆっくりと添加した。この反応混合物を室温で３時間攪拌した後、溶媒をＮ2流下で除去し、そして真空下で乾燥させた。この粗生成物を６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１  ｖ／ｖ）中に溶解させ、１．２ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌで１回、そして１．２ｍＬの蒸留水で２回洗浄した。このクロロホルム相を抽出し、密なペーストまで乾燥し、そして
【０２５１】
【化３５】
0005117648.tif 000037
を、単黄色固体として得た。収量：６００ｍｇ（９５％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５  ｖ／ｖ）：Ｒｆ０．５０。
【０２５２】
ダンシル化ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ（３）。最初に、
【０２５３】
【化３６】
0005117648.tif 000038
を、以下のように調製した。２ｍＬの乾燥クロロホルム中の
【０２５４】
【化３７】
0005117648.tif 000039
（６００ｍｇ、４７４μｍｏｌ）およびＮＨＳ（１１３ｍｇ、９８２μｍｏｌ）の溶液を、１ｍＬの乾燥クロロホルム中に溶解したＤＣＣ（１５０ｍｇ、７２８μｍｏｌ）に添加した。この反応混合物を、室温で５時間攪拌した。副生成物のジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を、パスツールピペットを使用して綿栓で濾過した。
【０２５５】
【化３８】
0005117648.tif 000040
を含むこの濾液を、３ｍＬの乾燥クロロホルムおよび３００μＬのトリエチルアミン中のＤＳＰＥ（３６５ｍｇ、４８８μｍｏｌ）の溶液にゆっくりと添加した。乾燥クロロホルムおよびトリエチルアミン中へのＤＳＰＥの溶解は、６５℃までの加温を必要とした。この反応混合物を室温で一晩攪拌した後、ある程度の沈殿物（未反応のＤＳＰＥ）を除去するためにこれを濾過し、そして粘稠性ペーストまで乾燥させた。このペーストを、クロロホルム／メタノール（２：１）に溶解させ、従来通り希釈したＨＣｌおよび水で洗浄した。この生成物、ダンシル化されたＣＰＬ−ｔＢｏｃ（３）を、溶媒の除去および１０ｍＬのエーテルを用いる沈殿の後に得た。収量：９００ｍｇ（９６％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒｆ０．５８。
【０２５６】
ダンシル化ＣＰＬ1（４）。３ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、３ｍＬのクロロホルム中のダンシル化ＣＰＬ1−ｔＢｏｃ（３）（９００ｍｇ、４５６μｍｏｌ）の溶液に添加し、そして室温で４時間攪拌した。この溶液を、密なペーストまで濃縮し、そしてクロロホルム／エーテルで３回洗浄した。エーテルの除去後、この固体を、６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）中に溶解させ、そして１．２ｍＬの５％炭酸水素ナトリウムで２回、および１．２ｍＬの蒸留水で２回洗浄した。クロロホルム相を、密なペーストまで濃縮し、そしてクロロホルム／エーテル洗浄および真空乾燥を通して、精製したＣＰＬ1（４）を得た。収量：７５０ｍｇ（８８％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒｆ０．７２。
【０２５７】
ダンシル化ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）。３ｍＬのクロロホルム中の
【０２５８】
【化３９】
0005117648.tif 000041
（３５０ｍｇ、７８９ｍｏｌ）の溶液を、３００μＬのトリエチルアミンを含む３ｍＬのクロロホルム中のダンシル化ＣＰＬ1（４）（７５０ｍｇ、４００ｐｍｏｌ）に徐々に添加し、そして室温で３時間攪拌した。この反応の完了を、ＴＬＣ上のニンヒドリンアッセイによる一級アミンの消失によって示した。この反応混合物を、密なペーストまで濃縮し、６ｍＬのクロロホルム／メタノール（２：１）中に再溶解させ、そして１．２ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌで１回、１．２ｍＬの蒸留水で４回洗浄した。クロロホルム相を抽出し、そして乾燥させた。さらなる精製は行わなかった。収量：７００ｍｇ（８１％）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒｆ０．５８。
【０２５９】
ダンシル化ＣＰＬ2（６）。ＣＰＬ2（６）の合成は、ダンシル化ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）（７００ｍｇ、３１８μｍｏｌ）の脱保護によって、ＣＰＬ1（４）の合成と同様であった。収量：６５０ｍｇ（９２％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒｆ０．６３。
【０２６０】
ダンシル化ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）。ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）の合成は、
【０２６１】
【化４０】
0005117648.tif 000042
（５００ｍｇ、１１２７μｍｏｌ）のダンシル化ＣＰＬ2（６）（６５０ｍｇ、２９２μｍｏｌ）での反応によって、ＣＰＬ2−ｔＢｏｃ（５）の合成と同様であった。希釈したＨＣｌおよび水での洗浄に加えて、ＣＰＬ4を生成するための脱保護前のＣＰＬ4−ｔＢｏｃを精製するためのさらなる試みは行わなかった。収量：８００ｍｇ（粗製）。ＴＬＣ（シリカゲル）クロロホルム／メタノール（８５：１５）Ｒｆ０．５８（ダンシルピークのみ）。
【０２６２】
ダンシル化ＣＰＬ4（８）。ＣＰＬ4（８）の合成は、ダンシル化ＣＰＬ4−ｔＢｏｃ（７）（８００ｍｇ）の脱保護によって、ＣＰＬ1（４）の合成と同様であった。最終生成物を、６０、７０〜２３０メッシュのシリカゲルおよびクロロホルム／メタノール／アンモニア溶液（６５：２５：４  ｖ／ｖ）を使用するカラムクロマトグラフィーによって精製した。収量：３００ｍｇ（３８％）。ＴＬＣ（シリカ）クロロホルム／メタノール／水（６５：２５：４）Ｒｆ０．１５。
【０２６３】
（ＩＸ．実施例ＩＸ）
（Ａ．一般的概要）
ここで、本発明者らは、ＣＰＬ4が、予め形成されたＳＰＬＰに挿入され得、そして得られたＳＰＬＰ−ＣＰＬ4が、ＢＨＫ細胞において改良された取り込みおよび顕著に改良されたインビトロトランスフェクション力価を示すことを示す。これらの結果は、ＳＰＬＰ系が、内因的に高度に強力なトランスフェクションベクターであることを証明する。
【０２６４】
（Ｂ．物質および方法）
（１．ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4、および複合体の調製）
（ｉ）ＳＰＬＰ：ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20（８４：６：１０）からなり、そしてプラスミドｐＬｕｃ（改変されたマーカー遺伝子発現ルシフェラーゼ）を含むＳＰＬＰは、ＩＮＥＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から提供された。
【０２６５】
（ｉｉ）ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4：ダンシル化ＣＰＬ4を、本発明者らの研究室で調製し、そしてＳＰＬＰ内に以下のように取り込んだ：５００ｎｍｏｌの用量の脂質のＳＰＬＰを、異なる量のＣＰＬ4（１２．５、１９、および３０ｎｍｏｌ）と共に、６０℃で２〜３時間、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．５（ＨＢＳ）中でインキュベートし、それぞれ２、３、および４ｍｏｌ％の最終取り込みに達した。ＨＢＳ中で平衡化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって、ＳＰＬＰ−ＣＰＬを、取り込まれていないＣＰＬから分離した。画分（１ｍＬ）を集め、そしてＣＰＬ、リン脂質およびＤＮＡ含有量についてアッセイした。３つ全てを含む画分をプールし、そしてトランスフェクションおよび取り込み研究における使用のために濃縮した。このカラムからのサンプルは、非常に凝集性であった。この系を脱凝集するために、ＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2の添加が必要とされる。脱凝集のためのカチオンの最適量を決定するための実験を、方法において後で記載する。
【０２６６】
ＣＰＬアッセイ：ＣＰＬの存在を、それぞれ１０および２０ｎｍの励起および発光スリット幅で、λex＝３４０ｎｍおよびλem＝５１０ｎｍを使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５２ルミネセンス分光光度計で、ＣＰＬにおけるダンシル基の蛍光を測定することで決定した。ダンシルの蛍光を、ＨＢＳ中のダンシル化ＣＰＬの標準曲線を使用して、定量した。
【０２６７】
リン脂質アッセイ：リン脂質を、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ技術を使用して、ＳＰＬＰから脂質を最初に抽出することによって決定し、次いでＦｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗ法（Ｂｌｉｇｈ  ＥＧ，Ｄｙｅｒ  ＷＪ  Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｖｓｉｏｌ  １９５９；３７：９１１−９１７；およびＦｉｓｋｅ  ＣＨ，Ｓｕｂｂａｒｏｗ  Ｙ．Ｔｈｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９２５；６６：３７５−４００を参照のこと）に従って、有機相中のホスフェートを測定した。
【０２６８】
ＤＮＡアッセイ：ＤＮＡ含有量を、以前に記載したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して測定した（Ｍｏｋ  ＫＷＣ，Ｌａｍ  ＡＭＩ，Ｃｕｌｌｉｓ  ＰＲ．Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｌａｍｉｄ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９９；１４１９：１３７−１５０を参照のこと）。
【０２６９】
（ｉｉｉ）複合体：複合体を、２５μＬのＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（０．８ｍＭ）（Ｉｎｅｘによって親切に提供された）を２５μＬの８８μｇ／ｍＬのｐＬｕｃ（やはりＩｎｅｘによって提供された）で混合し、続いて３０分間のインキュベーションによって、細胞への添加の前に装填比１．５：１  ＋ｖｅ／−ｖｅで調製した。
【０２７０】
（２．最適挿入時間の決定および脂質取り込み実験のための、０．５ｍｏｌ％のＲｈ−ＰＥを含むＳＰＬＰの調製）
ＳＰＬＰを、Ｗｈｅｅｌｅｒら（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；６：２７１−２８１（１９９９）を参照のこと）による記載のように、少しの改変を伴って調製した。脂質ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20、ＤＯＤＡＣ、およびローダミン−ＤＯＰＥ（Ｒｈ−ＰＥ）（すベてＣＨＣｌ3にストック）を、（８３．５：１０：６：０．５）のモル比で一緒に混合し、そしてＣＨＣｌ3を完全にエバポレートした。得られた脂質フィルムを、２０ｍＭのオクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）中に溶解させ、そして２００ｐｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを添加し、１ｍＬの全容量にした。ＯＧＰを、このサンプルから透析バッグに透析し、４８時間かけて緩衝液（ＨＢＳ）を２回交換した。得られたサンプルを、ＤＥＡＥセファロースカラムに通し、そして溶出物を、以前に記載したような不連続のショ糖勾配に供した（Ｇａｂｉｚｏｎ  Ａ，Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８；８５：６９４９−６９５３を参照のこと）。得られたローダミン標識ＳＰＬＰは、〜６０ｇ／ｍｏｌのＤＮＡ／脂質比を有した。
【０２７１】
（３．ＳＰＬＰへのＣＰＬ4の挿入のための、最適インキュベーション時間の決定）
ＳＰＬＰのＣＰＬ4への最適な挿入のために必要とされる時間を決定するために、５ｍｏｌ％のＣＰＬ4（０．３ｎｍｏｌ）を、６ｎｍｏｌのＳＰＬＰ（０．５ｍｏｌ％のＲｈ−ＰＥを含む）と、全容量１．５ｍＬで混合し、そして６０℃の水浴中でインキュベートした。（３０分、１時間、２時間、３時間、および４時間）の時点で、２５０μＬの混合物を、ＨＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラムに流した。蛍光性ダンシルを有する画分を合わせ、そしてこのダンシルの蛍光を、上記のパラメータを使用して測定し、一方、ローダミンの蛍光を、それぞれ、１０および２０ｎｍの励起および発光スリット幅で、λex＝５６０ｎｍ、λem＝５９０ｎｍを使用して測定した。これらの測定はまた、カラムの前の最初の溶液の小画分で行った。ダンシル／ローダミン比を、最初および最後のサンプルについて計算し、挿入された最初の５％のパーセンテージを決定した。
【０２７２】
（４．ＣａＣｌ2およびＭｇＣｌ2を用いるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の脱凝集）
上記に示されるように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の調製は、粒子の凝集を生じる。この系の脱凝集のために、イオン強度の増加が必要とされる。これは、増加した量のＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2（５００ｍＭストック溶液）の、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の溶液への添加によって達成される。Ｎｉｃｏｍｐチューブにおいて、６０μＬのＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（３ｍＭの脂質）に、３６０μＬのＨＢＳを添加した。次いで、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（０ｍＭのカチオン）の平均直径±標準偏差を、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ２７０  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒを使用するＱＥＬＳによって決定した。次いで、この塩（ＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2）を添加し、２０ｍＭ〜７０ｍＭの濃度にした。各々の間隔で、平均直径±標準偏差を、ＱＥＬＳにより決定した。この粒子の平均直径は、［カチオン］の増加によりほとんど変化しなかったが、ＱＥＬＳ  Ｇａｕｓｓｉａｎ分散は広くなった。従って、標準偏差を、脱凝集の基準として使用した。
【０２７３】
（５．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4およびＳＰＬＰのサイズ決定）
Ｗｈｅｅｌｅｒら（Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＪＪら、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｌｉｐｉｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９９；６：２７１−２８１を参照のこと）に従って、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（ＣａＣｌ2を含まない）、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋４０ｍＭ  ＣａＣｌ2、およびＳＰＬＰについて凍結破断ＥＭを行った。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を含んだ。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の顕微鏡写真（ＣａＣｌ2の存在または不在下で）を、凝集におけるＣａ2+の視覚的効果を示すために、比較した。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋４０ｍＭ  ＣａＣｌ2およびＳＰＬＰの小胞の直径を、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ２７０  Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒを使用するＱＥＳＬによって分析した。
【０２７４】
（６．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4粒子の血清安定性）
種々の％のＣＰＬを含むＳＰＬＰ−ＣＰＬの血清安定性を、この粒子をマウス血清と、５０％ｖの最終血清濃度に混合することによって決定した。次いで、これらの混合物を、３７℃で０、１、２、または４時間インキュベートした。これらの時点で、約１μｇのプラスミドＤＮＡを含む混合物の容量を取り除き、そしてこのＤＮＡを、フェノール：クロロホルム抽出を使用して、脂質およびタンパク質から抽出した。次いで、得られたＤＮＡ溶液を、１％のアガロースゲル上で電気泳動し、続いてこのＤＮＡをニトロセルロースに移し、そしてサザンブロットを行った。
【０２７５】
（７．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の脂質分析）
ＣＰＬ4の挿入の間の、ＳＰＬＰからのＰＥＧ−ＣｅｒＣ20の損失を決定するために、Ｂｌｉｇｈ−Ｄｙｅｒ抽出によって、ＳＰＬＰサンプルおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ4サンプルについて脂質を抽出した。次いで、この混合物をＨＰＬＣに通し、そしてＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）によってＤＯＰＥおよびＰＥＧ−ＣｅｒＣ20についてアッセイした。ＳＰＬＰ−ＣＰＬについてのＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20比を、ＳＰＬＰについての比と比較し、そしてＳＰＬＰの外側単層におけるＰＥＧ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）脂質の量を決定した。
【０２７６】
（８．取り込み研究）
全てのインビトロ実験について、使用された細胞は形質転換されたＢＨＫ細胞株（ｔｋ−）であった。取り込み研究について、１×１０5のＢＨＫ細胞を、１２−ウェルプレート上、３７℃で、５％のＣＯ2中、２ｍＬの完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で一晩増殖させた。ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋４０ｍＭ  ＣａＣｌ2、またはＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体（２００μＬ）（この各々は、脂質マーカーとして０．５ｍｏｌ％のＲｈ−ＰＥを含む）を、８００μＬの完全培地で混合し、そしてこの混合物を２０μＬの脂質用量で細胞の頂部に添加した。３７℃で、２、４、６、または８時間インキュベートした後、この細胞をＰＢＳで洗浄し、そして６００μＬの溶解緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でリンスした。この溶解物のローダミン蛍光を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５２発光分光計上、１．０ｍＬのマイクロキュベット中で、それぞれ１０および２０ｎｍのスリット幅で５６０ｎｍのλexおよび６００ｎｍのλemを使用して、測定した。４３０ｎｍの発光フィルタもまた使用した。脂質の取り込みを、溶解物における蛍光を、標準脂質およびＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって決定された細胞の量に対して規格化された脂質の蛍光と比較することによって、決定した。示される場合、蛍光の顕微鏡写真を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００  Ｚｅｉｓｓ蛍光性顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊｅｎａ  ＧｍｂＨ）で、Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌｓ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）からのローダミンフィルターを使用して、以下の仕様で得た。λex＝５６０±２０ｎｍ、６００ｎｍ  ＬＰ、およびＤＣ  ５９０ｎｍ。
【０２７７】
（９．脂質の結合および取り込みにおける、カチオンの型および濃度の効果）
この取り込み実験を、上記の同様のＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（０．５ｍｏｌ％のＲｈ−ＰＥを含む）で行った。５×１０4のＢＨＫ細胞を、２４−ウェルプレート中の１ｍＬの完全培地中に、一晩プレートした。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（４０ｎｍｏｌ）を、２０ｍＭ〜７０ｍＭの種々の初期濃度でのＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2と、１００μＬの全容量で混合した。これに、４００μＬの完全培地を添加し、４ｍＭ〜１４ｍＭの最終［カチオン］を生じた。次いで、この混合物を、細胞の頂部に添加し、そしてこの細胞を４時間インキュベートした。この細胞をインキュベートした後、この細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして６００μＬの溶解緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加した。上記のように、ローダミン蛍光を測定し、そして脂質取り込みを、得られた蛍光を既知量の脂質を含む標準サンプルの蛍光と比較して決定した。次いで、得られた値を、ＢＣＡプロテインアッセイキットを使用してタンパク質含有量を測定することによって、細胞数に対して規格化した。
【０２７８】
（１０．トランスフェクション研究）
１×１０4のＢＨＫ細胞を、１５０μＬの完全培地中の９６−ウェルプレートにプレートし、そして３７℃、５％のＣＯ2中で一晩インキュベートした。ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ（２と４ｍｏｌ％の間のＣＰＬを含む）を、０．５μｇのＤＮＡを、２０μＬの全容量で、ＨＢＳ（ＳＰＬＰ）またはＨＢＳ＋４０ｍＭのＣａＣｌ2（ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4）を使用して送達するために調製し、そして９０μＬの完全培地に添加した。サンプルを、この細胞と共に４時間インキュベートした。次いで、このトランスフェクション培地を、２４時間のインキュベーションの完了のために、完全培地に置換した。次いで、細胞を１００μＬの溶解緩衝液でリンスし、そして４０μの溶解物を、９６−ウェル発光プレートに移した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ反応キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ルシフェラーゼ標準物質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ）、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）からのＭＬ３２００マイクロタイタープレートル照度計を使用して決定した。活性を、ＢＣＡプロテインアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって測定した細胞の数について規格化した。上記の取り込みおよびトランスフェクション実験から、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4中の４ｍｏｌ％のＣＰＬ４が、最適な結果を与えることを決定した。従って、実験の残りを、４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を含むＳＰＬＰ−ＣＰＬ4を用いて行った。
【０２７９】
（１１．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ対ＳＰＬＰおよび複合体のトランスフェクションの時間経過）
サンプルおよび細胞を、上記のトランスフェクション研究について記載したように調製し、そして一緒に３７℃でインキュベートした。同様に、ｐＬｕｃを含むリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，）複合体を、１．５：１の充填比で調製した。４、９、および２４時間でトランスフェション培地を除去し、そして、４および９時間のトランスフェクションの場合、２４時間のインキュベートの完了のために完全培地に置換した。２４時間で、全ての細胞を溶解させ、そして上記のように、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質含有量（ＢＣＡアッセイ）についてアッセイした。
【０２８０】
（１２．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション力価および毒性）
ＢＨＫ細胞を、ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋４０ｍＭのＣａＣｌ2、およびリポフェクチン複合体と共に、２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベートの後、この細胞を即座に溶解させ、そしてルシフェラーゼ活性を測定し、そしてこれを上記のように、存在するタンパク質の数に対して規格化した。
【０２８１】
上記の時点での、細胞生存の大まかな測定の場合、２４および４８時間の細胞溶解の後のタンパク質濃度を、測定し、そしてＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋４０ｍＭのＣａＣｌ2およびリポフェクチン複合体について比較した。
【０２８２】
（１３．ＢＨＫ細胞のトランスフェクションにおけるＣａ２＋およびＭｇ２＋の効果の比較）
細胞を、上記のようにプレートし、そして使用した。ＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2のいずれかを２０ｍＭ〜７０ｍＭの濃度で有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（５．０μｇ／ｍＬ）を、２０μＬの容量に合わせ、そして完全培地と混合し、４ｍＭ〜１４ｍＭの最終［カチオン］を生じた。細胞の４８時間のインキュベートに続いて、この細胞を洗浄およびリンスし、そして上記のようにルシフェラーゼ活性およびタンパク質含有量について測定した。
【０２８３】
（１４．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション効率の測定）
ＳＰＬＰ−ＣＰＬのトランスフェクション効率を、界面活性剤透析手順を使用して、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現するカプセル化されたｐＥＧＦＰ（Ｉｎｅｘによって親切に提供された）を含むＳＰＬＰ−ＣＰＬ4を調製することによって測定した（Ｗｈｅｅｌｅｒら、前出を参照のこと）。４００μｇ／ｍＬのｐＥＧＦＰを、１０ｍＭのＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０：ＤＯＤＡＣ（８４：１０：６）にカプセル化し、続いて４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を挿入した。ｐＥＧＦＰを含むＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体およびリポフェクチン複合体をまた、１．５：１の充填比で調製した。トランスフェクトを、以前に記載したように、５．０μｇ／ｍＬのＤＮＡ用量で行った。サンプルの２４および４８時間のインキュベートに続いて、トランスフェクション培地を除去し、細胞を洗浄し、そしてこの細胞に新たな培地を添加した。次いで、この細胞をＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で見た。フレーム内の全細胞数を計測した：次いで、以下の仕様で、フルオレセインフィルター（Ｏｍｅｇａ  Ｏｐｔｉｃａｌｓ）を使用して、ＧＦＰを発現する細胞の数を計測した。λex＝４７０±２０ｎｍ、λem＝５３５±２２．５ｎｍ、およびＤＣ〜５００ｎｍ。トランスフェクションの効率は、ＧＦＰを発現する細胞の数を、全細胞数で除算したものである。
【０２８４】
（Ｃ．結果および考察）
（１．ＣＰＬ4の挿入後のＳＰＬＰ−ＣＰＬ4凝集体および２価カチオンの添加後の脱凝集）
ＣＰＬを含むＬＵＶは凝集する傾向があり、そしてこの凝集は、培地のイオン強度の増加によって阻害され得る。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4もまた凝集に対して感受性であり、そしてこの凝集は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4処方物にＮａＣｌ、ＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2を添加することによって無効となり得ることが見出された。この効果は、図３１に示され、これは擬弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって測定された粒子の平均直径の標準偏差における変化によってモニターされる、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の凝集におけるＣａＣｌ2およびＭｇＣｌ2の添加の効果を示す。両方のカチオンについて、標準偏差は減少し、カチオン濃度は増加し、３０〜４０ｍＭで最適な脱凝集が起きた。この挙動はまた、凍結破断電子顕微鏡検査法によって可視化され得る。ＳＰＬＰの凍結破断顕微鏡写真は、小さな単分散粒子を示すが、ＣａＣｌ2の非存在下におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の調製は、高度に凝集性である。４０ｍＭのＣａＣｌ2の添加はこの凝集を無効にし、ＳＰＬＰ調製と同様の単分散粒子を生成する。サンプル調製および電子顕微鏡検査法の詳細については、Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；６：２７１−２８１（１９９９）を参照のこと。
【０２８５】
ＣａＣｌ2の存在下でのＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のサイズを、ＱＥＬＳおよび凍結破断電子顕微鏡検査法を使用して比較した。ＱＥＬＳ研究は、ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の平均直径が、それぞれ８０±１９ｎｍおよび７６±１５ｎｍであることを示したが、凍結破断研究は、６８±１１ｎｍおよび６４±１４ｎｍの直径を示した。ＳＰＬＰについてのこれらの値は、以前の研究と近接して一致する。
【０２８６】
（２．ＣＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の化学的組成および安定性）
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4およびＳＰＬＰの脂質組成物を、以下の表９に示す：
【０２８７】
【表７】
0005117648.tif 000043
ＳＰＬＰ自体の分析によって、ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20のモル比は１１．０（±０．１）：１であった。これは、ＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ20：ＤＯＤＡＣの（８１．６：１０．９：７．４）の系に対応する。この結果より、７９．７±０．９％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ20が、ＣＰＬ4の挿入後に残っている。これは、５．９±０．１％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ20の最終ｍｏｌ％に対応する。これは、約１．５±０．１ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ20が、ＣＰＬ4の挿入の間に置換されたことを意味する。内部リーフレットおよび外部リーフレット上で、同じ量のＰＥＧ−ＣｅｒＣ20が、最初に７．４ｍｏｌ％で存在すると本発明者らが想定する場合、外部リーフレットは、挿入の後に４．４±０．１ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ20を有する。本発明者らは４．５ｍｏｌ％のＣＰＬ4をＳＰＬＰに挿入したため（外部リーフレットに９．０ｍｏｌ％）、外部リーフレットにおいて合計で１３．４±０．１ｍｏｌ％の全ＰＥＧが生じる。
【０２８８】
５０％マウス血清中で、４時間までのＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の安定性。全ての場合において、ＤＮＡは、血清分解から完全に保護された。
【０２８９】
（３．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、ＢＨＫ細胞への増大した取り込みおよび劇的に増大したトランスフェクション力価を示す。）
実験の次のセットは、組み込まれたＣＰＬ4の、ＢＨＫ細胞へのＳＰＬＰの取り込みにおける影響、および得られたＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系のトランスフェクション力価の決定を目的とした。４ｍｏｌ％までのＣＰＬ4を含むＳＰＬＰを、４０ｍＭのＣａＣｌ2の存在下で調製し、そしてこれをＢＨＫ細胞に添加し（最終ＣａＣｌ2濃度は８ｍＭ）、そして種々の時間でインキュベートした。次いで、この細胞を、方法において示したように、関連したＳＰＬＰ−ＣＰＬ4についてアッセイした。図３２に示されるように、ＣＰＬ4を含まないＳＰＬＰの取り込みは、８時間のインキュベートの後であっても最小であるが、取り込みは、３ｍｏｌ％またはそれ以上のレベルのＣＰＬ4を含むＳＰＬＰについては劇的に改善される。例えば、４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を含むＳＰＬＰは、８時間で蓄積レベル（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ）を示し、これは、ＳＰＬＰについての活性化よりも約５０倍高い。この増大した取り込みは、ローダミン標識されたＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ4を４時間インキュベートした後に、ＢＨＫ細胞の蛍光顕微鏡写真を使用して、視覚的に検出され得る。４ｍｏｌ％のＣＰＬ4の存在は、細胞付随ＳＰＬＰの改善されたレベルを明らかに生じる。
【０２９０】
ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4およびプラスミドＤＮＡカチオン性脂質複合体（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ；１：１；１．５：１  ＋ｖｅ／−ｖｅ  ｃ．ｒ．）のトランスフェクション特性を、複合体について一般に使用されるインキュベーションプロトコルを使用して検査した。これは、１０4のＢＨＫ細胞を、ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4および０．５μｇのｐＣＭＶＬｕｃを含む複合体で４時間インキュベートし、続いてＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4または細胞に付随していない複合体の除去、培地の置換、さらに２０時間のインキュベート、次いでルシフェラーゼ活性についてのアッセイからなる。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4調製物は、インキュベーション培地中に７ｍＭのＣａＣｌ2を含んだ。図３３に示されるように、ＣＰＬ4の存在は、ＳＰＬＰ系のトランスフェクション力価において劇的な増加を生じた。４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を含むＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、ＳＰＬＰでの活性化よりもおよそ３×１０3高いルシフェラーゼ発現レベルを示した（Ｍｏｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１４１９：１３７−１５０（１９９９）を参照のこと）。
【０２９１】
（４．Ｃａ２＋は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション活性について必要とされる）
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション活性におけるＣａ2+の影響の決定が目的である。４ｍｏｌ％のＣＰＬ4を含むＳＰＬＰを、０〜１４ｍＭのＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2の存在下で、ＢＨＫ細胞と共に４８時間インキュベートし、次いでルシフェラーゼ活性を決定した。図３４に示されるように、トランスフェクション活性は、トランスフェクション培地におけるＣａ2+の存在によって影響される。１０ｍＭの最適なＣａＣｌ2濃度で、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、ＭｇＣｌ2が存在する場合よりも１０4より高いトランスフェクション力価を示した。
【０２９２】
０〜１４ｍＭのＭｇＣｌ2およびＣａＣｌ2の存在下でのインキュベートに続いて、ＢＨＫ細胞へのＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の取り込みをモニターした。図３５に示されるように、ＢＨＫ細胞によって取り込まれるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の量は、Ｍｇ2+およびＣａ2+を含む培地の両方について同じである。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の取り込みは、２価のカチオンの濃度の上昇に伴って減少し、これは恐らく、ＢＨＫ細胞表面上の、ＣＰＬ4に対する陰電荷結合部位の防護により生じる。
【０２９３】
（５．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、複合体を用いて達成したものと比較し得るか、またはこれより大きなインビトロトランスフェクション力価を示す。）
図３３に示される結果は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4よりも〜１００倍高いレベルのトランスフェクションを引き起こす複合体は、ＢＨＫ細胞との固定された４時間のインキュベート時間によって得られ、続いて２０時間の保持時間によって最大の発現に達することを示す。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4が安定な系である場合、ＢＨＫ細胞への取り込みは長時間続くようである。このトランスフェクションレベルは、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４および複合体のＢＨＫ細胞でのインキュベートの時間が８および２４時間に延長され、続いて、それぞれ１６および０時間の保持時間がなされた場合に達成された。２つの型のプラスミドＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を使用し、（すなわち、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（１：１）複合体（１．５：１，ｃ．ｒ．））、そして複合体を、市販のトランスフェクション試薬リポフェクチン（ＤＯＰＥ／ＤＯＴＭＡ［１：１］複合体，１．５：１  ｃ．ｒ．）を使用して得た。図３６に示されるように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のランスフェクション力価はインキュベート時間の増加と共に著しく増加し、４時間のインキュベート時間によって達したトランスフェクションについての制限因子が、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系の取り込みの速度であることを示唆する。２４時間のインキュベート時間で到達したトランスフェクションレベルは、リポフェクチンまたはＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ複合体によって到達したものに匹敵する。
【０２９４】
２４および４８時間のインキュベート時間の後のトランスフェクションレベルを決定するためにさらなる実験を行い、このインキュベート時間の直後にルシフェラーゼ活性についてアッセイした。図３７Ａに示されるように、リポフェクチン（ＤＯＰＥ／ＤＯＴＭＡ；１：１）複合体の活性を、〜２０００ｎｍ／ｍｇで２４時間後に安定させた。対照的に、インキュベート時間の増加に伴ってＳＰＬＰ−ＣＰＬ4処方物の活性の増加を続け、４８時間で４０００ｎｇ／ｍｇに対応するルシフェラーゼ発現レベルに達した。この活性は、ＳＰＬＰ（Ｃａ2+の非存在下で）について観察されたものより約１０6倍高く、そしてリポフェクチン複合体によって達成され得るレベルのほぼ２倍であった。同様の結果を、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体について得た。
【０２９５】
（６．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、非毒性かつ効率的なトランスフェクト剤である）
プラスミドＤＮＡ−カチオン性脂質複合体が、細胞に対して毒性であることは周知である。このＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は低レベルのカチオン性脂質を含み、そして複合体よりも潜在的に低毒性である。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4および複合体の毒性を、０．５μｇのプラスミドおよび〜３０ｎｍｏｌの全脂質に対応するレベルのＳＰＬＰ−ＣＰＬ4および複合体に４８時間曝露した後、細胞の生存度を決定することによってアッセイした。図３７Ｂに示されるように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、あったとしてもほとんど毒性を示さない。細胞の生存は、リポフェクチン複合体で４８時間インキュベートした後はわずかに３０％であったが、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4で４８時間インキュベートした後は９５％の細胞が生存した。
【０２９６】
ベクターによってトランスフェクトされる細胞の割合によって示されるトランスフェクションの効率はまた、重要なパラメーターである。トランスフェクトされる細胞の割合を、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を保有するプラスミドを使用して推定した。蛍光顕微鏡を使用して、細胞内の蛍光性タンパク質の発現によってトランスフェクトを検出した。図３７Ａおよび３８Ｂに示されるように、２４時間で約３５％の細胞、および４８時間で５０％の細胞が、見かけ上の細胞死なくＳＰＬＰ−ＣＰＬ4によってトランスフェクトされた。対照的に、リポフェクチン複合体は、３５％未満の最大トランスフェクション効率を示し、そして２４時間のトランスフェクション時間後には５０％の細胞のみが生存した。ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体でもまた、同様の低いトランスフェクション効率および高い毒性が見られた。
【０２９７】
この研究の結果は、ＣＰＬ4のＳＰＬＰへの組み込みが、ＢＨＫ細胞への改善された取り込みおよびＣａ2+が存在する場合に劇的に増大したＳＰＬＰのトランスフェクション力価を生じることを実証する。興味深い３つの点が存在する。第１は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系の化学的組成および構造、ならびにＳＰＬＰの栄養価値およびトランスフェクション力価の改変のための前挿入手順の一般性に関連する。第２は、増大したＳＰＬＰの取り込み、Ｃａ2+の存在および観察されたトランスフェクション活性の間の関係に関連する。最後に、プラスミドＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系の性質の比較が目的である。
【０２９８】
第２の考察の点は、ＣＰＬ4がＳＰＬＰ系のトランスフェクション力価を増加させる機構に関連する。明らかに、ＣＰＬ4の存在がＳＰＬＰのＢＨＫ細胞への取り込みを増加させるが、ランスフェクション力価における増加は、ほぼ全体的に追加のＣａ2+の存在に依存する。８時間のインキュベートの後、４ｍｏｌ％のＣＰＬ4の存在が、ＢＨＫ細胞へのＳＰＬＰの取り込みを約５０倍増加させ、一方で、（Ｃａ2+の存在下での）トランスフェクション力価を〜１０4の倍率だけ増加することが注目され得る。ＳＰＬＰに関して行われた以前の研究は、Ｃａ2+の存在が〜６００のトランスフェクション力価の最大増加を生じ、この力価における増加が、Ｃａ2+の、それ自体の取り込みにおける増加よりも、取り込みの後のエンドソーム膜の不安定化を補助する能力から生じることを示した。同様に、このことはＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系についての、ＳＰＬＰ系を超えるトランスフェクション力価における改善は、取り込みにおけるＣＰＬ4依存性増加の、取り込み後の細胞内送達におけるＣａ2+依存性の改善による乗算に起因することを示唆する。
【０２９９】
最後の議論の領域は、他の非ウイルスベクターより優れたＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系の利点を考慮し、これには、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系の十分に規定されたモジュラー性質、ならびに毒性および潜在力の問題が挙げられる。第一に、１粒子あたり１つのプラスミドを含む、小さな均一な安定な系として十分に特徴付けられる、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の性質は、１つの複合体あたり十分には規定されていない数のプラスミドを含む、大きな不均一な不安定な系である、プラスミドＤＮＡ−カチオン性脂質複合体のような非ウイルス系と、対照的である。重要な点は、ＳＰＬＰが、より複雑な系（例えば、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4）の基本的な構成要素であり、モジュラーの様式で構築され得ることである。例えば、ＣＰＬのカチオン性基の代わりに特異的な標的リガンドを含むＰＥＧ−脂質の後の挿入は、特定の細胞および組織に特異的に標的とされるＳＰＬＰを生じるべきである。毒性に関して、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、組織培養において、ＢＨＫ細胞に対する毒性が顕著により低いことが明らかである。このことは恐らく、ＳＰＬＰに含まれるカチオン性脂質の割合が、複合体と比較して低いことに関連する。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション能力および効率は、複合体を用いて達成され得るレベルに明らかに匹敵する。この知見は、関与する複合体によるトランスフェクションのモデルを提唱することが、注目されるべきである。
【０３００】
本実施例において、市販の複合体系（例えば、リポフェクチン）と比較したＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の優れた点を実証した。従って、高いトランスフェクション効力を有するがウイルスに関する問題を何も有さない合成ウイルスが、開発された。これらの陳述を確証するために、多くの点が挙げられ得る。第一点は、電荷の位置付けを考慮する。複合体においては、電荷は脂質二重層の表面に位置するが、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、リポソーム表面から大きく離れ、リポソームを囲む保護的なＰＥＧコーティングの上に局在化する、ベシクル表面上に電荷を有する。複合体の場合には、リポソーム表面に結合するタンパク質は、ＲＥＳのマクロファージによる認識およびクリアランスを引き起こし得る（Ｃｈｏｎｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２６７：１８７５９−１８７６５（１９９２）を参照のこと）。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4においては、二重層の表面の電荷はＰＥＧコーティングにより保護されており、その結果、これが生じない。しかし、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の電荷は、リポソームと細胞との会合を可能にし、最終的な取り込みおよびトランスフェクションを生じる。
【０３０１】
複合体と比較した、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の大きさおよび血清安定性は、特にウイルス系の能力に接近することが望まれる場合に、効果的な遺伝子送達系のための重要なパラメータである。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4は、本明細書において、複合体（これは頻繁に、直径がミクロンのオーダーである）と比較して、比較的小さな大きさ（約１００ｎｍ）であることが示された。この小さな大きさは、より大きな開窓を有する部位（例えば、腫瘍、および炎症部位）での蓄積を可能にするべきである（Ｋｏｈｎら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ；６７：５９６−６０７（１９９２）を参照のこと）。先に記載したように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4中のＤＮＡは、外部環境から保護されている（すなわち、血清中のＤＮａｓｅによる分解を起こしにくい）ことが示されたのに対し、複合体中のＤＮＡは、ＤＮａｓｅに感受性である（Ｗｈｅｅｌｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；６：２７１−２８１（１９９９）を参照のこと）。
【０３０２】
ウイルス（Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８１：６４６６−６４７０（１９８４）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ；８：３９８８−３９９６（１９８８）；Ｋｅｉｒら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、３：３２２−３３０（１９９７）を参照のこと）および脂質／ＤＮＡ複合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２６９：２５５０−６１（１９９４）；Ｈｏｆｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；９３：７３０５−７３０９（１９９６）；Ｂｅｂｏｋら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ；２７９：１４６２−１４６９（１９９６）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ；２：７１０−７２２（１９９５）を参照のこと）は、インビトロでの高いトランスフェクション能力を有することが示された。従って、これは、ウイルス品質に達するべきである場合には、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系が、これらの高いトランスフェクションを達成し得るべきであることを説明する。このことは、ＢＨＫ細胞上のＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系により実際に達成され、トランスフェクションレベルは、市販の複合体系（すなわち、リポフェクチン）より２高い因子に達した。このことは、少量のトランスフェクションのみを示したＳＰＬＰより非常に大きな改善である。
【０３０３】
遺伝薬物の効率的な全身送達およびトランスフェクションは、上記利点に起因して、このＳＰＬＰ−ＣＰＬ4系を使用して、達成される。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4を用いるインビトロでの非常に高いトランスフェクションが、達成された。さらに、ＣＰＬ上上の正電荷の位置が、ＰＥＧ／ＣｅｒのＰＥＧが最初にこれをマスクする位置である系である。このことは、より短いＰＥＧ部分を有するＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＣＰＬ4の合成により、達成される。これは、疾患部位におけるその蓄積、引き続くＰＥＧ−Ｃｅｒの制御された放出を可能にし、正電荷を周囲の細胞に曝露する。
【０３０４】
（実施例Ｘ）
本実施例は、長鎖ＣＰＬ対短鎖ＣＰＬによる、ＢＫＨ細胞のトランスフェクション速度を示す。
【０３０５】
上記からの合成方法を使用して、ＣＰＬ（ＰＥＧ  ３．４ｋ）およびＣＰＬ（ＰＥＧ  １ｋ）を生成し、そして各々を、上記のようにＰＥＧ−2000−Ｃｅｒ  Ｃ２０を含む別個のＳＰＬＰ系に挿入した。図３８は、ＰＥＧ  ３．４ｋを有するＣＰＬ対ＰＥＧ  １ｋを有するＣＰＬのトランスフェクション速度を示す。ＣＰＬ中の短鎖ＰＥＧは、長鎖ＣＰＬによるトランスフェクションと比較して、約４の因子の減少を生じる。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、長鎖ＣＰＬ（ＰＥＧ3400）は表面の上に突き出るのに対し、短鎖ＣＰＬ（ＰＥＧ1000）はＳＰＬＰの表面に埋没する（マスクされる）と考えられる。短鎖ＣＰＬの減少したインビトロでのトランスフェクションは、これがインビボでの循環を改善したことを明らかに提唱する。
【０３０６】
（実施例ＸＩ）
本実施例は、ＣＰＬＰ８が、ＬＵＶへの挿入に関してＣＰＬＰ４と同様に挙動すること、およびＣＰＬ８−ＬＵＶ系を用いてトランスフェクションが達成され得ることを示す。
【０３０７】
【表８】
0005117648.tif 000044
ＣＰＬ8の、ＬＵＶおよびＳＰＬＰへの挿入は、ＣＰＬ4の挿入に関して観察されたものと非常に類似している。ＢＨＫ細胞上のこれらの粒子のトランスフェクションおよび取り込みに関して、種々の結果が得られ、ＣＰＬ8は、あるときにはＣＰＬ4より良好に機能し、そして他のときにはその逆である。
【０３０８】
（実施例ＸＩＩ）
マウス線維芽細胞腫細胞株Ｎｅｕｒｏ−２ａ（ＡＴＣＣ−ＣＣＬ−１３１）を使用する、このインビトロでの実施例において、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４［１ｋ］を使用して、種々のＣａ2+濃度に対する遺伝子発現を決定し、そして標準的なＳＰＬＰ（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０  １０％；ＣＰＬ4［１ｋ］４％；および他の成分；ＤＮＡ：脂質の比＝０．０５）を使用する遺伝子発現と比較する。
【０３０９】
５×１０4細胞／ウェルを、１ｍＬの完全培地（可欠アミノ酸およびハンクス緩衝塩溶液を含むＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ）（１０％ＦＢＳを含む））中で２４ウェルプレート内にプレート化する。プレートを、５．０％  ＣＯ2で３７℃で一晩インキュベートする。以下に記載する各群に、５００μＬのトランスフェクション培地を添加して、３倍にする。
【０３１０】
【表９】
0005117648.tif 000045
１ウェルあたり２．５μｇのＤＮＡを、完全にカプセル化したＳＰＬＰ中（全溶液０．５ｍＬ）で添加する。プレートを８時間インキュベートする。トランスフェクション培地を除去する。１ｍＬの完全培地を戻して添加する。細胞を、３７℃、５．０％ＣＯ2でさらに２４時間インキュベートする。
【０３１１】
分析のために、培地を細胞から除去し、そしてこれらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで−７０℃で凍結させる。細胞を、１５０〜２００μＬの１×ＣＣＬＲで溶解する；次いでプレートシェーカーで５分間振盪する。２０μＬの溶解物を、９６ウェル発光プレートに移す。プレートを読み取って、ルシフェラーゼ活性を決定する。
【０３１２】
この結果を図３９に示す。この図に見られるように、ＳＰＬＰ＋４ｍｏｌ％ＣＰＬ４−１ｋは、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞において、ＳＰＬＰ単独より４桁多い遺伝子発現を生じる。カルシウムの効果は、この実験においては有意ではないと考える。生成したルシフェラーゼの量は、２〜１４ｍＭ  Ｃａ２＋で同じままである。
【０３１３】
（実施例ＸＩＩＩ）
このインビボの実施例は、Ｃ５７／ｂ１６マウスにおけるＣＰＬ4−１−ｋＬＵＶ（ＳＰＬＰは、短鎖ＣＰＬを含む）の薬物動力学および体内分布を開示する。増加した量のＣＰＬ−４−１ｋを含む異なるＳＰＬＰ処方物を、最適なクリアランス特性を決定するために、インビボアッセイする。
【０３１４】
ＣＰＬ4−ｌｋ  ＳＰＬＰを、以前のプロトコルに従って調製する。使用の前に、全てのサンプルを、投与前に実際の組成物を決定するために特徴付ける。全てのサンプルを、濃縮を行うために、希釈の前に滅菌濾過する。全てのサンプルは、滅菌クリンプトップバイアル中に提供されるべきである。全てのバイアルを、処方の日付、脂質組成、および特定の活性について標識する。3［Ｈ］ＣＨＥを、１μＣｉ／ｍｇの脂質で組み込む。以下の処方物を作製し、そして分析する：
【０３１５】
【表１０】
0005117648.tif 000046
実験は、１００匹のＣ５７／ｂｌ６マウス、雌、１８−２３ｇを使用し、この全てをＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙから購入した。全ての動物をグループ当たり４匹で、２５グループで収容した。
【０３１６】
【表１１】
0005117648.tif 000047
マウスを、合計２００μｌの体積での尾静脈への静注によって投与された3［Ｈ］ＣＨＥ−ＬＵＶで、処理した。マウスは、１つの処置のみを受けた。示した時点で、マウスを秤量し、屠殺し、そして血液を心臓穿刺によって集め、次いで3［Ｈ］ＣＨＥについて評価した。処方物は、十分に許容的であると予想された。マウスを、保証された動物看護プロトコルに従って処理した。処置に関連する苦痛の徴候を示した任意のマウスを、飼育器で自由に行動させて終了した。全てのマウスを、ＣＯ2吸入、続いて頚部の脱臼によって終了した。血液からの3［Ｈ］ＣＨＥの測定を、標準的プロトコルに従って決定した。
【０３１７】
ＣＰＬ4の短鎖を含むＳＰＬＰのインビボ薬物動力学を、図４０に図示する。ＳＰＬＰにおけるＣＰＬ4の量の増加が、血液からのクリアランスの速度を増加する傾向があることが観察される。１ｍｏｌ％の組み込まれたＣＰＬ4は、ＣＰＬ4を有さないＳＰＬＰと同様のクリアランス結果を与える。より多い量のＣＰＬ4の組み込みは、血液からのＳＰＬＰのクリアランスの速度を増加する傾向にある。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4［１ｋ］（１％）は、６〜７時間のｔ1/2で、最良の血漿クリアランス特性を示す。１ｍｏｌ％より多いものは、より速くにきれいにした。
【０３１８】
本明細書中で開示される結果は、ＳＰＬＰ技術のさらなる改良点を示す。特に、これらの結果から、ＣＰＬの型（すなわち、ポリマー鎖の長さ；および１分子当たりのカチオン電荷量）ならびにＳＰＬＰ中のこのようなＣＰＬの量が、増大したトランスフェクション能力を伴う、インビボクリアランス特性の最良の釣り合いが最適化されなければならないことが明らかである。インビトロのデータは、長鎖ＣＰＬを示し、そしてより高いレベルのこのようなＣＰＬは、トランスフェクションを増加するために好ましい。しかし、ＳＰＬＰ対脂質複合体の以前の比較に見られるように、インビトロで最も良く作用する脂質処方物は、インビボで最も適しているわけではない。本明細書中のインビボの結果は、約１％で組み込まれる短鎖ＣＰＬが、動物における循環の生存期間について最適化されることを実証する。
【０３１９】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであり、そしてその見地における種々の改変または変化が当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中で列挙される全ての刊行物、特許および特許出願は、ここでその全ての目的についてその全体において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）結合体の構造的設計を示す。
【図２ａ】  図２は、種々の量の荷電したヘッド基を有するカチオン性ＰＥＧ−脂質結合体の調製のための合成スキームを示す。（ａ．）Ｅｔ3Ｎ／ＣＨＣｌ3；（ｂ．）ＴＦＡ／ＣＨＣｌ3；（ｃ．）Ｅｔ3Ｎ／ＣＨＣｌ3  Ｎａ，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシニドエステル。
【図２ｂ】  図２は、種々の量の荷電したヘッド基を有するカチオン性ＰＥＧ−脂質結合体の調製のための合成スキームを示す。（ａ．）Ｅｔ3Ｎ／ＣＨＣｌ3；（ｂ．）ＴＦＡ／ＣＨＣｌ3；（ｃ．）Ｅｔ3Ｎ／ＣＨＣｌ3  Ｎａ，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リジンＮ−ヒドロキシスクシニドエステル。
【図３】  図３は、ＣＰＬを組み込んだリポソームを示す。巨大単層ラメラベシクル（ＬＵＶ）は、ＣＰＬ（それぞれ、ＣＰＬ１、ＣＰＬ２、ＣＰＬ４、およびＣＰＬ８）の組み込まれた異なる例を有する。
【図４】  図４は、リポソーム膜の内側リーフレットと外側リーフレットとの間のＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４の分布を示す。ＣＰＬ−４−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４、５５：４０：５モル％）は、本明細書中で定義される押出し法によって調製した。外側リーフレットＣＰＬの分布をフルオレスカミンアッセイによって定量した。外側リーフレットＣＰＬの場合、以下のアッセイを使用した。適切な量のＣＰＬ−４−ＬＵＶを１Ｍ  ボレート緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈し、氷水中で冷却した。２０μｌの１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を上記サンプル溶液に添加し、膜を可溶化した。次いで、追加の２０μｌの冷却したフルオロスカミンエタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、次いで測定した。
【図５】  図５は、ＰＢＳ−ＣＭＧ中のＢＨＫ細胞内のＣＰＬ−４ＬＵＶの細胞摂取研究を示す。コントロールはＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、６０：４０）であり、そしてＣＰＬ−４−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈ／ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４，５５：４０：５）を本明細書中で定義されるような押出しによって調製した。
【図６】  図６は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）中のＢＨＫ細胞内のＣＰＬ−４−ＬＵＶの細胞摂取を示す。コントロールはＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ，６０：４０）を使用した。ＣＰＬ−４−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈ／ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４，５５：４０：５）を本明細書中で定義されるような押出しによって調製した。
【図７】  図７は、４時間のインキュベーション後のＰＢＳ−ＣＭＧ中のＢＨＫ細胞内のＣＰＬ−リポソームの細胞摂取を示す。ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ，６０：４０）およびＣＰＬ−４−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＥ−ＣＰＬ，５５：４０：５）を本明細書中で定義されるような押出しによって調製した。
【図８ａ】  図８は、界面活性剤透析によるＣＰＬ−ＬＵＶの調製を示す。脂質を示した比でクロロホルムに共溶解し、次いで、この溶媒を窒素ガスおよび高真空によって除去した。この脂質混合物を界面活性剤／緩衝液（ＨＢＳ中ＯＧＰ）に溶解し、ＨＢＳに対して２〜３日間透析した。透析の間に形成されたＬＵＶを次いで、セファロースＣＬ−４Ｂ上に示されるように画分化した。パネルＡ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；パネルＢ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［１Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；およびパネルＣ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７１．５／６／１２／１０／０．５）の画分化。
【図８ｂ】  図８は、界面活性剤透析によるＣＰＬ−ＬＵＶの調製を示す。脂質を示した比でクロロホルムに共溶解し、次いで、この溶媒を窒素ガスおよび高真空によって除去した。この脂質混合物を界面活性剤／緩衝液（ＨＢＳ中ＯＧＰ）に溶解し、ＨＢＳに対して２〜３日間透析した。透析の間に形成されたＬＵＶを次いで、セファロースＣＬ−４Ｂ上に示されるように画分化した。パネルＡ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；パネルＢ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［１Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；およびパネルＣ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７１．５／６／１２／１０／０．５）の画分化。
【図８ｃ】  図８は、界面活性剤透析によるＣＰＬ−ＬＵＶの調製を示す。脂質を示した比でクロロホルムに共溶解し、次いで、この溶媒を窒素ガスおよび高真空によって除去した。この脂質混合物を界面活性剤／緩衝液（ＨＢＳ中ＯＧＰ）に溶解し、ＨＢＳに対して２〜３日間透析した。透析の間に形成されたＬＵＶを次いで、セファロースＣＬ−４Ｂ上に示されるように画分化した。パネルＡ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；パネルＢ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［１Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７９．５／６／４／１０／０．５）の画分化；およびパネルＣ：ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＣＰＬ４［３．４Ｋ］／ＰＥＧｅｒＣ２０／Ｒｈｏ−ＰＥ（７１．５／６／１２／１０／０．５）の画分化。
【図９ａ】  図９のパネルＡはＤＯＰＣ  ＬＵＶ（１００ｎｍ）へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＤＯＰＣ  ＬＵＶ（２．５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．２１４μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量３００μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＢは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＬＵＶ（５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．４３μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量５１９μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。遊離ＣＰＬの溶出もまた、示され、これは、ＣＰＬ−ＬＵＶの単離のための簡単な方法を示す。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＣは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の保持を示す。図９パネルＢの主要なＬＵＶ画分をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに再適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。
【図９ｂ】  図９のパネルＡはＤＯＰＣ  ＬＵＶ（１００ｎｍ）へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＤＯＰＣ  ＬＵＶ（２．５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．２１４μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量３００μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＢは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＬＵＶ（５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．４３μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量５１９μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。遊離ＣＰＬの溶出もまた、示され、これは、ＣＰＬ−ＬＵＶの単離のための簡単な方法を示す。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＣは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の保持を示す。図９パネルＢの主要なＬＵＶ画分をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに再適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。
【図９ｃ】  図９のパネルＡはＤＯＰＣ  ＬＵＶ（１００ｎｍ）へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＤＯＰＣ  ＬＵＶ（２．５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．２１４μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量３００μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＢは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。ＬＵＶ（５μｍｏｌ液体）を、６０℃で、３時間０．４３μｍｏｌＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５（全容量５１９μＬ）と共にインキュベートし、次いで、このサンプルをＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに適用した。遊離ＣＰＬの溶出もまた、示され、これは、ＣＰＬ−ＬＵＶの単離のための簡単な方法を示す。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。パネルＣは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）から構成されるＬＵＶ（１００ｎｍ）中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の保持を示す。図９パネルＢの主要なＬＵＶ画分をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中で平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに再適用した。１ｍＬの画分を収集し、本明細書中で定義されるようなダンシルで標識したＣＰＬおよびローダミン−ＰＥについてアッセイした。
【図１０】  図１０は、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０ＬＵＶへのｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１の挿入に及ぼす時間および温度の影響を示す。３つの温度の各々について、３μｍｏｌ脂質を０．１７μｍｏｌのＣＰＬ（全容量２４０μｌ）と合わせた。１時間、３時間、および６時間において、１μｍｏｌの脂質を抜き、氷中で冷却し、ＣＰＬの挿入を停止した。このサンプルをセファロースＣＬ−４Ｂのカラムに通し、過剰のＣＰＬを除去し、ＣＰＬ挿入についてアッセイした。
【図１１】  図１１は、最終ＣＰＬ挿入レベルにおよぼす初期ＣＰＬ／脂質比の影響を示す。初期ＣＰＬ／脂質モル比は、０．０１１、０．０２４、０．０４７、０．０７１、０．０９５、および０．１４であった。挿入された最終ｍｏｌ％は、０．８、１．８、３．４、５．０、６．５、および７．０であった。右手の軸は挿入％である。
【図１２】  図１２は、中性ベシクル中へのＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１およびＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入を示す。初期ＣＰＬ／脂質モル比は、Ｑ１（２．５μｍｏｌ脂質および０．２１μｍｏｌＣＰＬ）について０．０６５であり、Ｑ５について０．０３４であった。サンプルを６０℃で３時間インキュベートした。ＤＯＰＣおよびＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＵＶを押出しによって調製し、一方、他を界面活性剤透析によって調製した。本明細書中に記載されるように、Ｑ５サンプル中の４％メタノールの存在は、このサンプルについて観察されたより高い挿入を説明すると考えられる。サンプル組成物は以下の通りであった：ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５／４５）、ＤＯＰＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（９０／１０）、ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（４５／４５／１０）。
【図１３】  図１３は、挿入されたＣＰＬのモル％におよぼすＰＥＧ−Ｃｅｒの鎖長の影響を示す。ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０（８４／６／１０）、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ１４（８４／６／１０）、およびＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ８（７９／６／１５）から構成されるＬＵＶを３時間６０℃で、２〜８．６モル％ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１の存在下でインキュベートした。
【図１４】  図１４は、ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５の挿入におよぼすＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０含量の影響を示す。ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０から構成されるベシクル（後者の脂質は４〜１０モル％の範囲）をＣＰＬ−Ｑ５（初期ＣＰＬ／脂質モル比＝０．０７１）の存在下でインキュベートした。
【図１５】  図１５は、ＢＨＫ細胞上のＰＢＳ／ＣＭＧ中でインキュベートしたＣＰＬ−ＬＵＶの摂取を示す。約１０5ＢＨＫ細胞を、（１）ＣＰＬ無し、（２）８％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｄ、（３）７％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１、および（４）４％ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５を含有する２０ｎｍｏｌのＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧＣｅｒＣ２０（８４／６／１０）ＬＵＶと共にインキュベートした。インキュベーションを４℃および３７℃で行った。前者は細胞結合の評価を与え、後者は結合および摂取の評価を与えた。２つの値の違いを考慮して、３７℃における脂質摂取の評価を得た。
【図１６ａ】  図１６のパネルＡは、ＣＰＬ4の構造を示す。パネルＢは、ＳＰＬＰ系へのＣＰＬ4の挿入のためのプロトコルを示す。
【図１６ｂ】  図１６のパネルＡは、ＣＰＬ4の構造を示す。パネルＢは、ＳＰＬＰ系へのＣＰＬ4の挿入のためのプロトコルを示す。
【図１７ａ】  図１７のパネルＡは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０  ＬＵＶ（すなわち、ＰＥＧ−脂質（または、「ステルス」脂質）を含有する標準リポソーム）のモデルを示す；パネルＢは、ＣＰＬ4（すなわち、長鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「長鎖」は、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質のポリマー成分と同じ長さかまたはより長い長さであることをいう。従って、ＣＰＬ１の荷電した基は、外側の環境に直ぐに曝露される；そしてパネルＣは、ＣＰＬ4（すなわち、短鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「短鎖」ＣＰＬは、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質の対応するポリマーより短いことをいう。
【図１７ｂ】  図１７のパネルＡは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０  ＬＵＶ（すなわち、ＰＥＧ−脂質（または、「ステルス」脂質）を含有する標準リポソーム）のモデルを示す；パネルＢは、ＣＰＬ4（すなわち、長鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「長鎖」は、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質のポリマー成分と同じ長さかまたはより長い長さであることをいう。従って、ＣＰＬ１の荷電した基は、外側の環境に直ぐに曝露される；そしてパネルＣは、ＣＰＬ4（すなわち、短鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「短鎖」ＣＰＬは、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質の対応するポリマーより短いことをいう。
【図１７ｃ】  図１７のパネルＡは、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０  ＬＵＶ（すなわち、ＰＥＧ−脂質（または、「ステルス」脂質）を含有する標準リポソーム）のモデルを示す；パネルＢは、ＣＰＬ4（すなわち、長鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「長鎖」は、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質のポリマー成分と同じ長さかまたはより長い長さであることをいう。従って、ＣＰＬ１の荷電した基は、外側の環境に直ぐに曝露される；そしてパネルＣは、ＣＰＬ4（すなわち、短鎖）が挿入された同じＬＵＶを示す。「短鎖」ＣＰＬは、ポリマーＷが、ＰＥＧ−脂質の対応するポリマーより短いことをいう。
【図１８ａ】  図１８のパネルＡは、ＢＨＫ細胞上のｐＬｕｃに複合体化したＤＯＰＥ：ＤＯＰＡＣ（１：１）リポソーム（黒四角）と比較した、ＳＰＬＰ系の摂取の時間経過（黒丸）を示す。脂質濃度は２０μＭであった。パネルＢは、４時間（黒四角）または８時間（黒四角）インキュベーション後の複合体を使用して得られるものと比較した、ＳＰＬＰ系を使用して得られる１．５μｇ／ｍＬ  ｐＬｕｃのトランスフェクション効率を示す。
【図１８ｂ】  図１８のパネルＡは、ＢＨＫ細胞上のｐＬｕｃに複合体化したＤＯＰＥ：ＤＯＰＡＣ（１：１）リポソーム（黒四角）と比較した、ＳＰＬＰ系の摂取の時間経過（黒丸）を示す。脂質濃度は２０μＭであった。パネルＢは、４時間（黒四角）または８時間（黒四角）インキュベーション後の複合体を使用して得られるものと比較した、ＳＰＬＰ系を使用して得られる１．５μｇ／ｍＬ  ｐＬｕｃのトランスフェクション効率を示す。
【図１９ａ】  図１９は、遊離ＣＰＬからのＣＰＬ−ＳＰＬＰの分離について、３．５ｍｏｌ％initial（３ｍｏｌ％final）ＣＰＬ4のＳＰＬＰへの挿入後のカラムプロファイルを示す。セファロースＣＬ−４Ｂカラムに適用された全容量に対する脂質（黒丸）、ＣＰＬ（白四角）、およびＤＮＡ（白菱形）についてのプロファイルを示す。パネルＢは、パネルＡからの画分＃９についてのカラムプロファイルを示す。
【図１９ｂ】  図１９は、遊離ＣＰＬからのＣＰＬ−ＳＰＬＰの分離について、３．５ｍｏｌ％initial（３ｍｏｌ％final）ＣＰＬ4のＳＰＬＰへの挿入後のカラムプロファイルを示す。セファロースＣＬ−４Ｂカラムに適用された全容量に対する脂質（黒丸）、ＣＰＬ（白四角）、およびＤＮＡ（白菱形）についてのプロファイルを示す。パネルＢは、パネルＡからの画分＃９についてのカラムプロファイルを示す。
【図２０】  図２０は、ＳＰＬＰ（２００ｎｍｏｌ）へのＣＰＬ4（１５ｎｍｏｌ）の挿入のための時間経過を示す。
【図２１】  図２１は、ＢＨＫ細胞中に０％（黒四角）、３％（白菱形）、または４％（黒丸）ＣＰＬ4を有する２０μＭのＳＰＬＰの摂取についての時間経過を示す
【図２２】  図２２は、ＳＰＬＰ単独（０％ＣＰＬ）と比較した、種々のｍｏｌ％のＣＰＬ4の挿入後のＳＰＬＰ（２．５μｇ／ｍＬｐｌｕｃ）によるＢＨＫ細胞のトランスフェクションを示す。４時間または９時間、細胞上部でサンプルをインキュベートすることによってトランスフェクションを実行し、完全な２４時間のインキュベーションのために完全な媒体と交換した（図３も参照のこと）。
【図２３ａ】  図２３は、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２３ｂ】  図２３は、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２３ｃ】  図２３は、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２４ａ】  図２４はまた、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２４ｂ】  図２４はまた、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２４ｃ】  図２４はまた、ＣＰＬ挿入結果を表にする。
【図２５ａ】  図２５は、ＣＰＬ含有リポソームの調製のためのポスト挿入法（ｐｏｓｔ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を示す。予備形成されたリポソームは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５、ｍｏｌ：ｍｏｌ）から作製される。ＣＰＬを６０℃で２時間予備形成されたリポソームと共にインキュベートした。パネルＡは、ポスト挿入後のゲル濾過による遊離ＣＰＬとＣＰＬ−ＬＵＶとの分離を示す。
【図２５ｂ】  図２５は、ＣＰＬ含有リポソームの調製のためのポスト挿入法（ｐｏｓｔ−ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を示す。予備形成されたリポソームは、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５、ｍｏｌ：ｍｏｌ）から作製される。ＣＰＬを６０℃で２時間予備形成されたリポソームと共にインキュベートした。パネルＡは、ポスト挿入後のゲル濾過による遊離ＣＰＬとＣＰＬ−ＬＵＶとの分離を示す。
【図２６】  図２６は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中のＢＨＫ細胞内にＤＳＰＥ−ＣＰＬを含有するステルスリポソームの細胞摂取を示す。コントロールＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ、５６：４０：４）およびＣＰＬ−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ／ＣＰＬ、５５．５：４０：２：２）を本明細書中で定義されるような押出しによって調製した。
【図２７】  図２７は、ＰＢＳ−ＣＭＧ中のＢＨＫ細胞内にＤＳＰＥ−ＣＰＬを含有するステルスリポソームの細胞摂取を示す。コントロールＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ、５６：４０：４）およびＣＰＬ−ＬＵＶ（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥ／ＣＰＬ、５５．５：４０：２：２）を本明細書中で定義されるような押出しによって調製した。
【図２８ａ】  図２８のパネルＡは、種々のＣＰＬの化学構造であり、パネルＢは種々のＣＰＬの化学構造である。ＣＰＬ4（パネル４）は、ＣＰＬ4b（パネルＢ）と同じである。そしてパネルＣは、種々のＣＰＬの化学構造である。
【図２８ｂ】  図２８のパネルＡは、種々のＣＰＬの化学構造であり、パネルＢは種々のＣＰＬの化学構造である。ＣＰＬ4（パネル４）は、ＣＰＬ4b（パネルＢ）と同じである。そしてパネルＣは、種々のＣＰＬの化学構造である。
【図２８ｃ】  図２８のパネルＡは、種々のＣＰＬの化学構造であり、パネルＢは種々のＣＰＬの化学構造である。ＣＰＬ4（パネル４）は、ＣＰＬ4b（パネルＢ）と同じである。そしてパネルＣは、種々のＣＰＬの化学構造である。
【図２８ｄ】  図２８のパネルＡは、種々のＣＰＬの化学構造であり、パネルＢは種々のＣＰＬの化学構造である。ＣＰＬ4（パネル４）は、ＣＰＬ4b（パネルＢ）と同じである。そしてパネルＣは、種々のＣＰＬの化学構造である。
【図２９ａ】  図２９は、本発明の化合物を生成するための合成実施形態を示す。
【図２９ｂ】  図２９は、本発明の化合物を生成するための合成実施形態を示す。
【図３０】  図３０は、ダンシル化したＣＰＬ4の構造を示す。ＣＰＬ4は、ＤＳＰＥ分子に結合されるＰＥＧ3400分子の末端に４つの正電荷を有する。ＣＰＬ4は、ダンシル化したリジンの組み込みによってダンシル化される。
【図３１】  図３１は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の脱凝集におよぼすカチオン濃度の影響を示す。０ｍＭ〜７０ｍＭまで、増加する［カチオン］、Ｃａ2+（黒丸）およびＭｇ2+（黒四角）の存在下の粒子の平均直径および標準偏差を、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して測定した。Ｎｉｃｏｍｐチューブ中の４００ｍＬ中の約１８０ｎｍｏｌのＳＰＬＰ−ＣＰＬ4に、少量のＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2（５００ｍＭストック溶液）を加えた。異なる量のカチオンの存在下での粒子の平均直径±標準偏差の測定を、Ｎｉｃｏｍｐ  Ｍｏｄｅｌ２７０（Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ）を使用して行った。この粒子の直径は、劇的に変化しないが、Ｇａｕｓｓｉａｎ分布がより広くなる。従って、標準偏差を脱凝集の基準として使用し、より小さな偏差ほどより小さな凝集を示す。
【図３２】  図３２は、種々の割合のＣＰｌ4を含有するＳＰＬＰの摂取を示す。パネルＡ。０ｍｏｌ％（黒丸）ＣＰＬ4、２ｍｏｌ％（黒四角）ＣＰＬ4、３ｍｏｌ％（黒三角）ＣＰＬ4、または４ｍｏｌ％（黒菱形）ＣＰＬ4およびＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体（黒逆三角）を有する２０μＭ  ＳＰＬＰのＢＨＫ細胞による摂取についての時間経過。ＣＰＬ4のＳＰＬＰへの挿入および複合体の調製は、本明細書中に記載のとおりに行った。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4中のＣＰＬ4のｍｏｌ％もまた、本明細書中に記載されるとおりに決定した。ＢＨＫ細胞を、１×１０5細胞／ウェルで１２ウェルプレートにプレートした。２００μＬのサンプル（ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4または複合体＋ＣａＣｌ2を含有）に、８００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを加えた。得られるＣａＣｌ２濃度をもとの２０％に希釈した。２時間、４時間、６時間および８時間のインキュベーション時間の後、細胞を６００ｍＬの溶解緩衝液で溶解し、ローダミン蛍光およびＢＣＡアッセイを、本明細書中に記載されるように溶解物について測定した（図２１を参照のこと）。
【図３３】  図３３は、種々のモル％のＣＰＬ4（２、３、および４ｍｏｌ％）の挿入後の、ＳＰＬＰ（５．０μｇ／ｍＬ  ｐＬｕｃ）によるＢＨＫ細胞のトランスフェクションを示す。本明細書中に記載される手順を使用して、ＣＰＬ4をＳＰＬＰ中に挿入した。比較として、ＳＰＬＰ（０ｍｏｌ％  ＣＰＬ）およびＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（１：１）複合体トランスフェクションもまた実施した。ＢＨＫ細胞を９６ウェルプレート中に１×１０4でプレートした。トランスフェクションを、４時間、後に２４時間の完全なインキュベーション時間、サンプル［２０μＬ（ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2）＋８０μＬの完全な媒体］をインキュベートすることによって実施した。ＣａＣｌ2濃度を再び、もとの濃度の２０％に希釈した。２４時間のインキュベーション後、細胞を溶解緩衝液で溶解し、ルシフェラーゼアッセイおよびＢＣＡアッセイを実施した（図２２を参照のこと）。
【図３４】  図３４は、ＢＨＫ細胞におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（５．０μｇ／ｍＬ  ｐＬｕｃ）のトランスフェクションに及ぼす［カチオン］、Ｃａ2+（黒丸）およびＭｇ2+（黒四角）の影響を示す。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳと混合し、この混合物を９６ウェルプレート内にプレートした１×１０4ＢＨＫ細胞に適用した。完全な４８時間のインキュベーション後、トランスフェクション媒体を除去し、細胞を溶解緩衝液で溶解し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量を前に記載されるように測定した。
【図３５】  図３５は、ＢＨＫ細胞における８０μＭ  ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4の脂質結合および摂取に及ぼす［カチオン］、Ｃａ2+（黒丸）およびＭｇ2+（黒四角）の影響を示す。種々の濃度のカチオン（０〜１４ｍＭの最終濃度）を有するサンプルを、細胞が溶解する時間である４時間、１×１０5ＢＨＫ細胞上でインキュベートし、そしてローダミン蛍光およびタンパク質含量を測定した。
【図３６】  図３６は、より長い時間点におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4、ＳＰＬＰおよび複合体（各々は５．０μｇ／ｍＬ  ｐＣＭＶＬｕｃを含有する）のトランスフェクションを示す。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4（４ｍｏｌ％ＣＰＬ4）＋４０ｍＭinitialＣａＣｌ2（黒丸）、ＳＰＬＰ（黒逆三角）、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ複合体（黒四角）、リポフェクチン複合体（黒菱形）のトランスフェクションを、１×１０4ＢＨＫ細胞において実施した。このトランスフェクション媒体を４、８、または２４時間細胞においてインキュベートし、その後にトランスフェクション媒体を完全な媒体と４時間および８時間の時間点で交換した。次いで、２４時間（それぞれトランスフェクション媒体の除去後の２０、１６、および１０時間）の全インキュベーション時間において、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量を測定した。
【図３７ａ】  図３７は、リポフェクチン複合体と比較した、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション効能および毒性を示す。２４時間および４８時間インキュベートし、次いで即時の細胞溶解した１×１０4ＢＨＫ細胞におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2（黒丸）、ＳＰＬＰ（黒逆三角）、およびリポフェクチン（黒菱形）についてのトランスフェクション活性、およびルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量の測定。１×１０4ＢＨＫ細胞におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2（黒丸）、リポフェクチン（黒菱形）、およびＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ（１：１）複合体の２４時間および４８時間インキュベーション後の細胞生存率の測定。インキュベーション後、細胞を溶解し、ＢＣＡアッセイからのタンパク質含量をタンパク質生存率の尺度として使用した。
【図３７ｂ】  図３７は、リポフェクチン複合体と比較した、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ4のトランスフェクション効能および毒性を示す。２４時間および４８時間インキュベートし、次いで即時の細胞溶解した１×１０4ＢＨＫ細胞におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2（黒丸）、ＳＰＬＰ（黒逆三角）、およびリポフェクチン（黒菱形）についてのトランスフェクション活性、およびルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量の測定。１×１０4ＢＨＫ細胞におけるＳＰＬＰ−ＣＰＬ4＋ＣａＣｌ2（黒丸）、リポフェクチン（黒菱形）、およびＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ（１：１）複合体の２４時間および４８時間インキュベーション後の細胞生存率の測定。インキュベーション後、細胞を溶解し、ＢＣＡアッセイからのタンパク質含量をタンパク質生存率の尺度として使用した。
【図３８】  図３８は、長鎖ＣＰＬおよび短鎖ＣＰＬを使用するＢＨＫ細胞のトランスフェクションを示す。ＣＰＬ中の短鎖ＰＥＧの存在は、長鎖ＣＰＬによるトランスフェクションと比べて、約１／４に減少する。
【図３９】  図３９は、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞のトランスフェクションを示す。ＳＰＬＰ＋４ｍｏｌ％  ＣＰＬ４−１ｋは、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞中のＳＰＬＰ単独より多い４桁の大きさの遺伝子発現を生じた。
【図４０】  図４０は、短鎖ＣＰＬ4を含有するＳＰＬＰのインビボ薬物動態学を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
0005117648.tif 000079
【図１９ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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