(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＡＣＣ-β遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項２】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＡＣＣ-βの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項３】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの作用を検出する工程、及び
（3”）上記で検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの作用よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項４】
ＡＣＣ-β遺伝子を発現可能な細胞またはＡＣＣ-βを産生可能な細胞が、尿細管上皮細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験者由来の被験試料におけるＡＣＣ-βのｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の対照試料におけるＡＣＣ-βのｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者由来の被験試料の選別方法。
【請求項７】
被験者由来の被験試料におけるＡＣＣ-βの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の対照試料におけるＡＣＣ-βの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者由来の被験試料の選別方法。
【請求項８】
被験者由来の被験試料におけるＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８に存在する４１３９番目における塩基を検出する工程を含み、これらの塩基がアデニンであることを、上記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者由来の被験試料の選別方法。
【請求項９】
ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８に存在する４１３９番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の罹患およびその進行に関連する遺伝子に関する新たな知見を提供するものである。この新たな知見に基づいて、本発明は、具体的には糖尿病性腎症の発症やその進行を予防ないしは治療するために有用な成分をスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症は、世界的に末期腎不全の主原因である。わが国でも１９９８年以降、糖尿病性腎症が慢性糸球体腎炎を抜いて新規透析導入の原因疾患の第１位となり、２００３年には透析導入患者の４割を超えるほどに増加している。The United Kingdom Prospective Diabetes Study（UKPDS）の結果によると、糖尿病性腎症患者では１年間に２〜３％の割合で次の病期へ進行し、また腎不全期以降の年間死亡率は約２０％にも達し、その予後は極めて不良である。従って、早期からの適切な治療介入により腎症の進展と透析導入を抑制することは、患者の予後と医療経済の両面から非常に重要である（非特許文献１参照）。  近年の糖尿病性腎症に関する疫学的研究・家系調査の結果から、腎症の発症が一部の糖尿病患者に限定されていること、および腎症患者に家族内集積が認められることから、腎症の発症・進展に何らかの遺伝因子の存在が示唆され、これまでに多くの遺伝子が糖尿病性腎症感受性候補遺伝子として検討されてきた。こうした糖尿病性腎症の遺伝因子解明により、個々の症例に対する治療法をあらかじめ予測、選択する事、いわゆるオーダーメイド医療の実現が可能となる。しかしながら、未だ明確に糖尿病性腎症感受性候補遺伝子としてのコンセンサスが得られる遺伝子の同定には至っていない。
【０００３】
当該候補遺伝子として最もよく解析されている遺伝子は、アンジオテンシン変換酵素（ACE）遺伝子の第１６イントロンに存在する２８７塩基対の挿入（I）／欠失（D）遺伝子多型である。通常のケース・コントロールスタディでは、Ｄ対立遺伝子と腎症との相関を示した成績が多く、また１８のケース・コントロールスタディのメタアナリシスおよび１型糖尿病症例の前向き追跡研究から、Ｄ対立遺伝子は腎症のリスク遺伝子と考えられるものの、いわゆるmajor geneとは考えにくいとされている（非特許文献２参照）。
【０００４】
また近年、上記候補遺伝子としてＮＣＡＬＤ遺伝子が見出された。具体的には、当該遺伝子は、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となること、また、当該ＮＣＡＬＤ遺伝子内に位置する３ＳＮＰｓ（SNP999, SNP1307, SNP1340）が糖尿病性腎症の潜在的発症リスクと有意な関係を有していることが報告されている（特許文献１参照）。
【０００５】
ところでアセチル-ＣｏＡカルボキシラーゼ（acetyl-Coenzyme A carboxylase：本発明において、単に「ＡＣＣ」ともいう）は、アセチル-ＣｏＡのアセチル基にＣＯ２を結合させて、脂肪酸合成の重要な中間体であるマロニル-ＣｏＡの合成を触媒する酵素として知られている（Human ACC-β: GenBank Accession No. NM_001093, AC007637）。本酵素は、脂肪酸の生合成の律速酵素と考えられており、脂肪酸の生合成速度を調整している。またその活性はクエン酸により促進される。
【０００６】
ＡＣＣには、ＡＣＣ-α(「ＡＣＣ-１」とも称される)とＡＣＣ-β(「ＡＣＣ-２」または「ＡＣＡＣＢ」とも称される)の二つのタイプが存在する。前者のＡＣＣ-αは、肝臓、脂肪組織、授乳中の乳腺に多く発現している。一方、後者のＡＣＣ-βは、主に骨格筋や心筋に発現しており、脂肪酸合成にかかわる酵素として、マロニル-ＣｏＡを生成することでミトコンドリア内で行われる脂肪酸のβ-酸化を制御することが知られている。
【０００７】
近年の研究では、当該ＡＣＣ-βは肥満や糖尿病と深く関連していることが報告されている。具体的には、ＡＣＣ-βの遺伝子を欠損させたマウス(ＡＣＣ-βノックアウトマウス)は高脂肪・高炭水化物の餌を与えても太らないことから、ＡＣＣ-βが抗肥満薬のターゲットとなりうると報告されている（非特許文献３参照）。また、当該ＡＣＣ-βの阻害剤は、脂肪の増加を抑えて、インスリン感受性を改善することから、ＡＣＣ-βは糖尿病薬のターゲットとなり得ると考えられている（非特許文献４参照）。
【０００８】
またその後の研究で、ＡＣＣ-β遺伝子（一塩基多型）と心筋梗塞のリスクとの相関関係が報告されている（特許文献２参照）が、糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【非特許文献１】「糖尿病合併症」最新医学別冊  新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第101頁
【非特許文献２】「糖尿病合併症」最新医学別冊  新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第93頁
【非特許文献３】Abu-Elheigaら、2001年、Science、291：2613-2616
【非特許文献４】Harwoodら、2003年、J．Biol.Chem. 278:37099-37111
【特許文献１】特開２００７−１２９９０５号公報
【特許文献２】国際公開公報（ＷＯ２００４／０５８０５２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、糖尿病性腎症の遺伝因子を解明し、糖尿病性腎症の発症やその進行との関連を明確にすることは、個々の症例に最も適した治療法の選択（オーダーメード医療の実現）に繋がると同時に、糖尿病性腎症発症やその進行に対する予防剤や治療剤の有効成分を探索する手段を提供し、さらには特異的かつ安全性の高い医薬品を開発することを可能にするものと考えられる。
【００１０】
本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症やその進行に関連する遺伝子（以下、本明細書では「糖尿病性腎症感受性遺伝子」ともいう）を提供するとともに、当該遺伝子と糖尿病性腎症の発症やその進行との関係を明確にすることを目的とする。また本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための有効成分となりえる物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供することである。
【００１１】
さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、糖尿病性腎症に関するゲノムワイドな相関解析を行ったところ、糖尿病性腎症と強い関連を認めるＳＮＰ（一塩基多型）が、ヒト・アセチル-ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子（human acetyl-Coenzyme A carboxylase-β）（本発明において「ＡＣＣ-β遺伝子」ともいう）のイントロン１８領域内（配列番号１）に１箇所〔＋4139位 G/A（SNP4139）〕存在し、当該ＳＮＰ座（SNP4139）にアデニン（Ａ）を有するＡ対立遺伝子保有者は、Ａ対立遺伝子非保有者（Ｇ対立遺伝子保有者）に比して、糖尿病性腎症の発症リスクが有意に高いことを見出した。また、本発明者らは、上記ＳＮＰ座（SNP4139）にアデニン（Ａ）を有するＡＣＣ-β遺伝子のハプロタイプによれば、ＡＣＣ-βの発現量が有意に増加すること、またＡＣＣ-βを過剰発現させた細胞では、糖尿病性腎症のマーカー遺伝子（タンパク質）として知られているオステオポンチン（Osteopontin）（Kidney International, Vol.63 (2003), p.454-463）、ヒト単球走化活性因子ＭＣＰ-１（Kidney International, Vol.58 (2000), p.1492-1499）、およびＩＬ-６(Am J Nephrol 2006, 26, p.562-570)の発現量も同様に増加していることを確認した。このことは、上記ＳＮＰ（SNP4139）のＡ対立遺伝子に起因するＡＣＣ-β遺伝子の発現の亢進（増加）が糖尿病性腎症の発症やその進行に関係していることを示唆するものである。
【００１３】
これらの知見から、本発明者らは、ＡＣＣ-β遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となることを確信した。さらに、本発明者らは、ＡＣＣ-β遺伝子内に位置する糖尿病性腎症と有意な関連性を有するＳＮＰ（SNP4139）と糖尿病性腎症の潜在的発症リスクとの関係を見出し、これから被験者について当該ＳＮＰの塩基（G/A）を測定することによって、当該被験者の糖尿病性腎症の潜在的発症リスクを評価することができることを確信した。
【００１４】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有するものである。
【００１５】
Ｉ．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
項１．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＡＣＣ-β遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１６】
項２．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＡＣＣ-βの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１７】
項３．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＡＣＣ-βの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００１８】
項４．ＡＣＣ-βの作用が、(1)オステオポンチン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６からなる群から選択されるいずれかの糖尿病性腎症の関連因子の発現量を増加させること、(2)マロニルＣｏＡを産生すること、または(3)脂肪酸のβ酸化を抑制することである、項３記載のスクリーニング方法。
【００１９】
項５．ＡＣＣ-β遺伝子を発現可能な細胞またはＡＣＣ-βを産生可能な細胞が、尿細管上皮細胞である項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２０】
項６．糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２１】
II．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者の選別方法
項７．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＡＣＣ-β遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＡＣＣ-β遺伝子のｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２２】
項８．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＡＣＣ-βの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＡＣＣ-βの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２３】
項９．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８に存在する４１３９番目における塩基を検出する工程を含み、当該塩基がアデニンであることを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２４】
III．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
項１０．ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８に存在する４１３９番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の発症や進行を予防または治療するのに有効な成分を取得することが可能になる。また当該方法は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な新規薬剤の開発に有効に利用することができる。
【００２６】
さらに本発明が提供する糖尿病性腎症感受性遺伝子ならびに糖尿病性腎症感受性ＳＮＰによれば、被験者（特に糖尿病患者）について腎症を発症する相対的な危険度を簡便に検出することができる。本発明の検出方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の方法によって腎症を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者（糖尿病患者）に対しては、その旨を告知し、予め腎症の発症を防ぐか、または少しでも遅延させるための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症を予防するための、または糖尿病性腎症の発症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記方法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００２８】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００２９】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００３０】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子を指す。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる一塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ〕が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。また「ハプロタイプ」とは、一つのアレル（ハプロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせをいう。
【００３１】
本明細書において「糖尿病性腎症感受性遺伝子」とは、糖尿病患者のうち腎症を発症しやすい体質または腎症に進行しやすい体質を決める遺伝子のことをいう。
【００３２】
本明細書において「糖尿病性腎症」とは、糖尿病が進行して腎臓にも影響が及び、タンパク尿を伴う腎障害が起こる状態を言う。糖尿病性腎症の患者は高血糖による腎機能の障害から、原尿を作る能力が損なわれ、最終的には腎不全となる。統計によれば、糖尿病性腎症による末期腎不全で透析治療を始める患者数は年々増加しており、現在、透析導入患者の原因疾患として糖尿病性腎症は第１位になっている。より具体的には、本発明が対象とする「糖尿病性腎症」には、糖尿病網膜症を発症し、かつ尿中アルブミン排泄率が２００μｇ／分以上であるかまたは尿中アルブミン／クレアチニン比が３００ｍｇ／ｇＣｒ以上である症例、ならびに糖尿病網膜症を発症し、且つ人工透析療法を受けている症例が含まれる。
【００３３】
本明細書に記載する各塩基番号は、The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において各ＳＮＰの位置番号である４１３９位は、ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８の１番目の塩基を１としたときの位置情報を意味する。なお、ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８の塩基配列を配列番号１に記載する。
【００３４】
２．糖尿病性腎症感受性遺伝子および糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ
本発明者らは、糖尿病性腎症感受性遺伝子を探索するために、多くの日本人２型糖尿病患者を対象として、gene-based SNPsを用いたケースコントロール相関解析ならびに連鎖不平衡（LD）マッピングを行うことにより、第１２番染色体q24.11（12q24.11）領域に存在するヒト・アセチル-コエンザイムＡカルボキシラーゼ-β遺伝子（human Acetyl-Coenzyme A carboxylase-β）（ＡＣＣ-β遺伝子）のイントロン１８の塩基配列上に存在する１つのＳＮＰ（SNP4139）を見出し、糖尿病性腎症を発症している患者は、当該ＳＮＰがアデニン（Ａ）になっている頻度が有意に高く、このことから、当該ＳＮＰが糖尿病性腎症の発症やその進行に有意に関係していることが示唆された（糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ）。また本発明者らは、ＡＣＣ-βを過剰発現している系では、糖尿病性腎症の関連因子として知られているオステオポンチン、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の発現も同様に増加していることから、ＡＣＣ-β遺伝子の発現の亢進（増加）が、糖尿病性腎症の発症と深く関わっていることを見出し、ＡＣＣ-β遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であるとの結論に至った。
【００３５】
当該ヒトＡＣＣ-β遺伝子は、ヒト第１２染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC-_000012.10）中、塩基番号108061594番〜108190414番に位置する128821bpの遺伝子である。
【００３６】
ＡＣＣ-β遺伝子と疾患との関連性については、従来、肥満や糖尿病との関連性（非特許文献３および４参照）および心筋梗塞（特許文献２）などが報告されているが、糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【００３７】
ＡＣＣ-β遺伝子の発現亢進（増加）に関連する因子として、上記の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを挙げることができる。当該ＳＮＰは、ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８の４１３９位（G/A）（SNP4139）に位置する。
【００３８】
実施例１で示すように、ＳＮＰ４１３９がアデニン（Ａ）のハプロタイプを有する２型糖尿病患者は、ＡＣＣ-β遺伝子の発現が亢進（増加）しており、腎症を発症しやすい傾向にあった。従って、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰは、糖尿病性腎症の発症または進行のしやすさを規定する糖尿病性腎症の遺伝的素因マーカーであり、ヒト被験者について、特に２型糖尿病患者について糖尿病性腎症の易発症性・易進行性を判断する指標となる。
【００３９】
すなわち、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（SNP4139）の塩基がアデニン（Ａ）である場合、当該ＳＮＰを有する被験者は、遺伝的に糖尿病性腎症を発症しやすいか、または糖尿病から腎症に発展進行しやすい体質を備えている（糖尿病性腎症に感受性）と判断することができる。
【００４０】
当該ＳＮＰが、糖尿病性腎症の感受性に関わる１つのメカニズムとしては、ＳＮＰ（SNP4139）を含む領域であるrs2268388が、エンハンサー活性を有していることから（実施例７参照）ＡＣＣ-β遺伝子の発現調節に何らかの影響を及ぼしていることが推測される。
【００４１】
３．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
前述するように、本発明者らは、ＡＣＣ-β遺伝子の発現の亢進（増加）が、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わっていることを見出した。このことから、ＡＣＣ-βが糖尿病性腎症の発症抑制またはその進行抑制に関わっており、ＡＣＣ-β遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制させてＡＣＣ-βの産生量を低下する作用を有する物質、またはＡＣＣ-βの作用を低下する作用を有する物質は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分として有用であると考えられる。
【００４２】
下記に説明する本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から、（3-1）ＡＣＣ-β遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制する作用を有する物質、（3-2）ＡＣＣ-βの産生量を低下する作用を有する物質、または（3-3）ＡＣＣ-βの作用を低下する作用を有する物質、を探索することによって、糖尿病性腎症の予防剤または治療剤（以下、これらを総称して「抗糖尿病性腎症剤」ともいう）の有効成分を取得しようとするものである。
【００４３】
なお、抗糖尿病性腎症剤の有効成分となりえる候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物、高分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質を含む試料を対象として実施することができる（これらを総称して「被験物質」という）。ここで、候補物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、および菌体成分などが含まれる。
【００４４】
(3-1) ＡＣＣ-β遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＡＣＣ-β遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を、ＡＣＣ-β ｍＲＮＡの発現量を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００４５】
当該方法は、具体的には下記の工程（１）〜（３）を行うことによって実施することができる。
（１）被験物質とＡＣＣ-β遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＡＣＣ-β遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００４６】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＡＣＣ-β遺伝子を発現し得る細胞であればよい。なおＡＣＣ-β遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＡＣＣ-β遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＡＣＣ-β遺伝子を有する尿細管上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された尿細管上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００４７】
また、定法に従って、ＡＣＣ-β遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＡＣＣ-β  ｍＲＮＡを発現可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法（3-1）の工程（１）において、被験物質とＡＣＣ-β遺伝子発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＡＣＣ-β遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００４９】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＡＣＣ-β遺伝子発現可能細胞とを接触させて、ＡＣＣ-β遺伝子の発現を抑制させてそのｍＲＮＡの発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡＣＣ-β遺伝子発現可能細胞を培養した場合のＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＡＣＣ-β遺伝子発現可能細胞を培養した場合に得られるＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５０】
ＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量の測定（検出、定量）は、ＡＣＣ-β遺伝子発現可能細胞のＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量を、当該ＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどを利用したノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイム定量ＰＣＲ法などの公知の方法、またはＤＮＡアレイを利用した測定方法を実施することなどにより行うことができる。
【００５１】
(3-2) ＡＣＣ-βの産生を低下させる作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＡＣＣ-βの産生を低下させる作用を有する物質を、ＡＣＣ-βの産生量を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００５２】
当該方法は、具体的には下記の工程（1’）〜（3’）を行うことによって実施することができる。
（1’）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（2’）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＡＣＣ-βの産生量を測定する工程、及び
（3’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞（ＡＣＣ-βを産生可能な細胞）または被験物質を接触させない細胞画分（ＡＣＣ-βを産生可能な細胞から調製）のＡＣＣ-βの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００５３】
かかるスクリーニングに用いられる細胞（対照細胞を含む）としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＡＣＣ-β遺伝子が発現してＡＣＣ-βを産生し得る細胞であればよい。なおＡＣＣ-β遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＡＣＣ-β遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＡＣＣ-β遺伝子を有する尿細管上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された尿細管上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００５４】
また、定法に従って、ＡＣＣ-β遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＡＣＣ-βを産生可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法（3-2）の工程（1’）において、被験物質とＡＣＣ-β産生可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＡＣＣ-β遺伝子が発現し且つＡＣＣ-βが産生し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５６】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＡＣＣ-βの産生量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合のＡＣＣ-β産生量が、被験物質非存在下で上記に対応するＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に得られるＡＣＣ-βの産生量（対照産生量）よりも小さいことを指標として、細胞または細胞画分と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５７】
ＡＣＣ-β産生量の測定（検出、定量）は、ＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分から得られるＡＣＣ-βの量を、当該ＡＣＣ-βに対する抗体（抗ＡＣＣ-β抗体）を利用してウエスタンブロット法や免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を行うことによって実施することができる。
【００５８】
(3-3)ＡＣＣ-βの作用を低下させる作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＡＣＣ-βの作用を低下させる作用を有する物質を、ＡＣＣ-βの作用を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００５９】
当該方法は、具体的には下記の工程（1”）〜（3”）を行うことによって実施することができる。
（1”）被験物質とＡＣＣ-βを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＡＣＣ-βの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞（ＡＣＣ-βを産生可能な細胞）または細胞画分（ＡＣＣ-βを産生可能な細胞から調製）のＡＣＣ-βの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００６０】
当該スクリーニングで用いられる細胞、並びに工程(2”)において被験物質と接触させる方法や条件は、前述する(3-2)のスクリーニング方法にて記載したものを同様に使用することができる。
【００６１】
候補物質の選別は、上記条件で被験物質とＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＡＣＣ-βの作用を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＡＣＣ-β産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に生じるＡＣＣ-βの作用が、被験物質非存在下で上記に対応するＡＣＣ-β産生可能細胞または細胞画分を培養した場合に得られるＡＣＣ-βの作用（対照作用）よりも低いことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００６２】
ここで、ＡＣＣ-βの作用としては、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６など糖尿病性腎症の関連因子の発現量を増加させることの他、従来よりＡＣＣ-βの作用として知られている作用、例えば、マロニルＣｏＡの産生のような酵素的作用、および脂肪酸のβ酸化の抑制作用（Advanced Drug Delivery Reviews、 Vol.54 (2002)、1199-1212など）を挙げることができる。なお、糖尿病性腎症の関連因子である上記タンパク質もしくは遺伝子の発現量の測定は、当業者の周知の方法によれば可能である。またマロニルＣｏＡの産生および脂肪酸β酸化の抑制も、公知の方法により測定することができる。
【００６３】
上記(3-1)〜(3-3)のスクリーニング方法で選別された物質は、尿細管上皮細胞においてＡＣＣ-β遺伝子の発現を抑制してＡＣＣ-βの産生を低下させるか、またはＡＣＣ-βの作用を低下させる作用を有するものであり、糖尿病性腎症の発症やその進行を予防する組成物または糖尿病性腎症を改善する組成物の有効成分として使用することが可能である
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いてスクリーニングにかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに糖尿病性腎症を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な糖尿病性腎症の予防または治療用組成物の有効成分を選別取得することができる。
【００６４】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、糖尿病性腎症予防・治療用組成物の調製に使用することができる。
【００６５】
４．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者（糖尿病性腎症易罹患者）の選別方法
本発明は、また被験者について糖尿病性腎症の罹患・進行リスク（糖尿病性腎症を発症し易いまたは進行易いか／発症し難いまたは進行し難いかの別）を測定し、当該被験者の中から上記リスクの高い被験者を選別する方法を提供する。なお、本発明では、これらのリスクが高い被験者を「糖尿病性腎症易罹患者」と称する。
【００６６】
その選別方法としては、被験者の被験試料について、(4-1)ＡＣＣ-β遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする方法、(4-2)ＡＣＣ-βの産生量を指標とする方法、および(4-3) ＡＣＣ-β遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする方法、を挙げることができる。
【００６７】
(4-1) ＡＣＣ-β遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＡＣＣ-β遺伝子の発現量、すなわちＡＣＣ-β  ｍＲＮＡ発現量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＡＣＣ-β遺伝子を発現し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には、血液を挙げることができる。
【００６８】
ＡＣＣ-β  ｍＲＮＡ発現量の測定方法は、上記(3-1)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００６９】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＡＣＣ-β  ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７０】
ここで「正常」とは、少なくとも腎症を発症していないか、または腎症を発症する前段階でもないという意味で用いられる。具体的には尿中アルブミン排泄率が２０μｇ／分未満または尿中アルブミン／クレアチニン比が３０ｍｇ／ｇＣｒ未満である場合に、腎症に関して「正常」と判断することができる。
【００７１】
(4-2) ＡＣＣ-βの産生量を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＡＣＣ-βの産生量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＡＣＣ-β遺伝子を発現し、ＡＣＣ-βを産生し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には血液を挙げることができる。
【００７２】
ＡＣＣ-β産生量の測定方法は、上記(3-2)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００７３】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＡＣＣ-βの産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＡＣＣ-βの産生量（対照産生量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７４】
(4-3) ＡＣＣ-β遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８の４１３９位（SNP4139）について塩基を検出し同定する工程を有するものである：
本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８の４１３９位（SNP4139）について塩基を検出し同定する工程を有し、さらに、検出し同定した塩基がアデニン（Ａ）である場合に、当該被験者を、糖尿病性腎症に罹りやすい者（糖尿病性腎症易罹患者）として判定し、選択する工程を有することができる。
【００７５】
当該方法によれば、糖尿病性腎症易罹患性及び糖尿病性腎症難罹患性の別、すなわち糖尿病性腎症罹患リスクを判定し診断することができる。当該糖尿病性腎症罹患リスクの判定（診断）は、上記ＳＮＰの塩基の別を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行なうことができる。このため、本発明の方法は、糖尿病性腎症の罹患危険度の検出方法と言うことができる。
【００７６】
なお、上記ゲノムＤＮＡの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、Bruce,et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
【００７７】
ゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００７８】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第１２染色体（12q24.11）上のＡＣＣ-β遺伝子またはそのイントロン１８を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、ＡＣＣ-β遺伝子またはそのイントロン１８にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００７９】
目的塩基を検出する工程において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、糖尿病性腎症に極めて関連性の深い糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第１２染色体上のＡＣＣ-β遺伝子、好ましくはそのイントロン１８を含むＬＤブロック中の塩基配列を直接決定し、各ブロック内に位置する当該ＳＮＰの塩基の変異を調べる方法によってもよい。
【００８０】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００８１】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００８２】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp ）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００８３】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明の糖尿病性腎症罹患リスクの判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００８４】
以上、本発明の方法（（4-1）〜(4-3)）によって、糖尿病性腎症を発症するかまたはそれが進行する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病性腎症の発症または進行を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防するための検査方法として、さらには糖尿病性腎症に伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００８５】
５．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
本発明はまた、糖尿病性腎症の罹患リスクを診断するための試薬キット（診断キット）を提供する。特に、上記（4-3)で説明する糖尿病性腎症易罹患者の選別方法に使用される診断キットを提供する。
【００８６】
(5-1)プローブ
上記(4-3)にて説明する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第１２染色体（12q24.11）のＡＣＣ-β遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰを検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記ＡＣＣ-β遺伝子上においてＳＮＰ４１３９を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００８７】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００８８】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(ａ)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００８９】
(a) ヒトＡＣＣ-β遺伝子の塩基配列において、イントロン１８の４１３９位（SNP4139）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００９０】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について糖尿病性腎症に対する罹患性やその進行性を判定するために、ヒト第１２染色体上のＡＣＣ-β遺伝子上に位置する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（SNP4139）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＡＣＣ-β遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００９１】
さらに好ましくは、当該プローブは、上記各ＳＮＰを含むオリゴヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００９２】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適には糖尿病性腎症感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。
【００９３】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００９４】
例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal 14, 143 (1999), Morris T et al., J Clin Microbiol 34, 2933 (1996)〕の場合、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む領域に相補的な２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5’末端を蛍光色素、3’末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5’側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。
【００９５】
Ｉｎｖａｄｅｒ法〔Lyamichev V. et al., Nat Biotechnol 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3’側と5’側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。 
【００９６】
（5-2）プライマー
本発明は、またヒト第１２染色体のＡＣＣ-β遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９７】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(a)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９８】
(a) ヒトＡＣＣ-β遺伝子の塩基配列において、イントロン１８の４１３９位（SNP4139）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００９９】
このようなオリゴヌクレオチドは、ＡＣＣ-β遺伝子において、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰの塩基（ヌクレオチド）を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【０１００】
ヒト第１２染色体のＡＣＣ-β遺伝子上の、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（SNP4139）近傍の１５塩基長以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＡＣＣ-β遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【０１０１】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA et al. Genome Res 7, 378 (1997), Little DP et al., Nature Medicine vol.3, No.12, 1413-1416, (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常１５塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。
【０１０２】
（5-3）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【０１０３】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【０１０４】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【０１０５】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、糖尿病性腎症罹患リスクの診断用試薬として利用することができる。
【０１０６】
（5-4）糖尿病性腎症罹患リスク診断用試薬キット（診断キット）
本発明の診断キットは、糖尿病性腎症罹患リスクの診断に使用する試薬として、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明の診断キットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【実施例】
【０１０７】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press),Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)等に記載された方法を用いた。
【０１０８】
実施例１
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学附属病院、東京女子医科大学糖尿病センター、順天堂大学医学部順天堂医院、川崎医科大学附属病院、岩手医科大学附属病院、取手協同病院、川井クリニック、大阪市立総合医療センター、千葉徳洲会病院、または大阪労災病院に定期的に外来通院する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
【０１０９】
なお、対象とした２型糖尿病患者は、下記診断基準に従って２群に分類した：
1）糖尿病性腎症症例：糖尿病性腎症（尿中アルブミン排泄率２００μｇ／分以上若しくは尿中アルブミン／クレアチニン比３００ｍｇ／ｇＣｒ以上、または慢性透析療法を受けている患者）と糖尿病網膜症との両方を有する症例、
2）対照群：糖尿病網膜症を有するが、腎機能障害の兆候を示していない症例（尿中アルブミン排泄率２０μｇ／分未満、若しくは尿中アルブミン／クレアチニン比３０ｍｇ／ｇＣｒ未満の患者）。
【０１１０】
前記２型糖尿病患者の末梢血液を採血し、得られた末梢血液１０ｍｌを３０００回転で５分間遠心分離して、血清を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、３０００回転で５分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロティナーゼＫを添加し、３７℃で４時間以上インキュベートした。得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層（水層）に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせた。ついで、遠心分離（１２０００回転、１０分）を行ない、ＤＮＡを回収し、１ｍｌの７０容量％エタノールを添加し、得られたＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕に溶解し、ＤＮＡ試料を得た。
【０１１１】
前記ＤＮＡ試料を用いて、インベーダー法により遺伝子型の判定を行った。解析するＳＮＰは、Japanese ＳＮＰデータベース（ＩＭＳ−ＪＳＴ  ＳＮＰｓデータベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から無作為に選択した。各ＳＮＰ遺伝子座の遺伝子型を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲと組み合わせたインベーダー法〔例えば、オオニシ（Ohnishi Y.）ら，J. Human. Genet., 46, 471-477, 2001等を参照のこと〕により解析した。
【０１１２】
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲにおける反応は、解析対象とする領域を増幅するプライマー（配列番号２および３）を含む反応溶液〔組成：１６.６ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８.８）、６.７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、６．７μＭ  ＥＤＴＡ、１.５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｘＴａｑミックス（２.５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、３１.２５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、０又は１０％  ＤＭＳＯ、各０.２５μＭ  プライマー〕を用いて、９５℃で５分間反応させた後、９５℃で１５秒と６０℃で４５秒と７２℃で３分とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なうことで実施した。
【０１１３】
増幅された産物をｄＨ2Ｏで、１：１１に希釈し、３８４プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾させ、プレート上の各ウェルに、３μｌインベーダー反応液（組成：１０×緩衝液、１０×ＦＲＥＴプローブ、１０×ｃｌｅｖａｓｅ、アレルプローブ）を添加した。その後、６３℃で２０分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、蛍光（５２０ｎｍ、５４６ｎｍ）を測定した。アレルプローブは１種類のインベーダープローブ(例えば増幅領域がSNP4139を含む領域である場合、配列番号４に記載する塩基配列を有するプローブ)とそれぞれの対立遺伝子に相当する２種類のプローブ(例えば増幅領域がSNP4139を含む領域の場合、Ｇ対立遺伝子には配列番号５に記載する塩基配列を有するプローブ、Ａ対立遺伝子には配列番号６に記載する塩基配列を有するプローブ)を含有する。
【０１１４】
糖尿病性腎症症例の９４症例及び対照群の９４症例のそれぞれに対し、８１３１５個のＳＮＰ座について遺伝子タイピングを行なった。ついで、２×３又は２×２分割表を用いた統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症群と対照群との間の遺伝子型又は対立遺伝子頻度に有意な差異を示したＳＮＰを選択した。
【０１１５】
なお、相関解析、ハプロタイプ頻度及びＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の統計解析並びに連鎖不均衡係数（Ｄ’）の算出は、デブリン（Devlin B.）ら〔Genomics, 29, 311-322, 1995〕及びニールセン（Nielsen DM.）ら〔Am. J. Hum. Genet., 63, 1531-1540, 1998〕のように行なった。
【０１１６】
以上のスクリーニングにおいて、糖尿病性腎症群と対照群との間で０．０１未満のｐ値を示したＳＮＰ座を、さらに多数の患者について、ゲノムワイドで解析した。
【０１１７】
その結果、ある特定のＳＮＰ座(SNP4139)において、糖尿病性腎症との強い相関が認められた。当該ＳＮＰは、第１２番染色体上のアセチル-ＣｏＡカルボキシラーゼ-β（ACC-β）遺伝子のイントロン１８（配列番号１）に存在し、この４１３９番目に位置するＳＮＰのＡ対立遺伝子頻度が、糖尿病性腎症群で対照群に比し有意に高くなっていた（Ａ対立遺伝子頻度：糖尿病性腎症群２５％、対照群１７％、 p = 0.000001）。このＳＮＰと糖尿病性腎症との関連をさらに検証するために、滋賀医科大学での８年間の前向きコホート（SUMS cohort）、および順天堂大学での１０年間の後向きコホート（SA cohort）研究で糖尿病性腎症の進展との関連を検討した。当該ＳＮＰ座(rs2268388；SNP4139、ACC-βイントロン18、+4139 G/A)におけるＡ対立遺伝子頻度を、糖尿病性腎症群と対照群とで対比した結果を表１に示す。この結果からわかるように、いずれの解析（ゲノムワイド、SUMS cohort、SA cohort）でも同様の傾向が認められた。
【０１１８】
【表１】
0005235448.tif 000002
【０１１９】
【表２】
0005235448.tif 000003
【０１２０】
こうした検討の結果から、このＳＮＰ座(rs2268388 ；SNP4139、ACC-βイントロン18、+4139 G/A)におけるＡ対立遺伝子保有者では、糖尿病性腎症の発症リスクが、Ａ対立遺伝子非保有者に比べて、有意に高くなっていることが明らかとなった。
【０１２１】
実施例２  ＮＲＫ-５２Ｅ細胞へのＡＣＣ-β安定導入と細胞株の樹立
後述する実施例に示すように、近傍にＳＮＰsが見出されたＡＣＣ-β遺伝子について、糖尿病性腎症との関連性を調べるため、in vitro機能解析試験を行ったが、これに先だち、まずラット尿細管上皮細胞（NRK-52E）にＡＣＣ-βを安定的に過剰発現する安定細胞株の樹立を行った。
【０１２２】
ＮＲＫ-５２Ｅ(5 x 104 cells/0.5ml/well)を、血清入りＤ-ＭＥＭ培地を用いて２４ウェルプレートに蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養し、翌日にhuman ＡＣＣ-βまたはＧＦＰ遺伝子を含むレトロウィルスを添加して４時間感染させた後に、培地を除いて血清入り培地に置換した。感染６日後に限界希釈（0.5cells/0.1ml/well）して９６ウェルプレートに蒔いて培養を継続し、ＡＣＣ-β導入細胞株を４クローン、ＧＦＰ導入細胞株を３クローン単離した。
【０１２３】
安定細胞株については、それぞれプレート培養した後に、溶解剤を加えて常法に従い、total ＲＮＡをカラム抽出した。次に、1μg相当量のtotal ＲＮＡを逆転写してＰＣＲ用の鋳型とし、合成プライマーを用いて、定量リアルタイムＰＣＲ法にてＡＣＣ-βのｍＲＮＡ量を測定した。この際、同時測定したＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量によって補正し、相対値とした。
【０１２４】
また、安定細胞株を培養した後に、常法に従い、溶解剤を加えてタンパク質を抽出した。次に、１０μg相当量のタンパク質をＳＤＳ化して電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、抗ＡＣＣ-β抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
ラット尿細管上皮細胞ＮＲＫ-５２Ｅを、human ＡＣＣ-βまたはＧＦＰ遺伝子を含むレトロウィルスを用いて感染導入し、限界希釈法で得たＡＣＣ-β細胞株４クローン（A1-1、A1-3、A4-3、A7-2）、およびＧＦＰ細胞株３クローン（#G2、#G3、#G7）をそれぞれ定量リアルタイムＰＣＲ法にて発現確認した結果を、図１ａに示す。図１ａに示すように、ＡＣＣ-β細胞株４クローン（A1-1、A1-3、A4-3、A7-2）はいずれもhuman ＡＣＣ-βの発現が認められ、特にＡ４-３クローンおよび Ａ７-２クローンの発現が高かった。
【０１２５】
抗ＡＣＣ-β抗体を用いたウエスタンブロッティングにて発現を確認した結果を図１ｂに示す。図１ｂに示すように、Ａ４-３クローンおよびＡ７-２クローンに２８０ｋＤａの大きさを示すhuman ＡＣＣ-βのバンドが認められ、ＡＣＣ-β細胞株のクローンがタンパク質レベルでの発現も高いことが判明した。
【０１２６】
上記の事実は、ＡＣＣ-β遺伝子と糖尿病性腎症における機能との関連性を調べるために有効なＡＣＣ-β過剰発現(ＡＣＣ-β導入)安定細胞株が樹立できたことを示している。
【０１２７】
実施例３  ＡＣＣ-β安定細胞株の高糖刺激と発現量変動の解析
実施例２で樹立した安定細胞株を用いて、ＡＣＣ-β遺伝子と糖尿病性腎症における作用との関連性を調べた。
【０１２８】
まず、ＡＣＣ-β導入安定細胞株のクローン(1 x 105 cells/1ml/well)を、５.５ｍＭ グルコースを含む血清入り培地を含む１２ウェルプレートに蒔いて培養し、翌日に細胞が付着したプレートから培地を除いて、ＰＢＳ(-)で1回洗浄した後に、インスリン、トランスフェリン、およびセレニウムを含む無血清培地に置換した。これを２４時間培養した後に、グルコースまたはマンニトールを最終糖濃度が２５ｍＭになるように添加して、さらに２日間培養を継続した後に、total ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲ法にて、オステオポンチン（Osteopontin）またはＭＣＰ-１のｍＲＮＡ量を測定した。この際、同時測定したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量によって補正し、相対値とした。
【０１２９】
なお、オステオポンチンは、炎症に関連する因子であり、２型糖尿病モデルのラットにおいて腎症を伴う腎臓において発現が増加していることが報告されている（Kidney International, Vol.63 (2003), p.454-463）。またＭＣＰ-１も炎症に関連する因子であり、糖尿病性腎症患者においてその濃度が上昇していることが報告されている（Kidney International, Vol.58 (2000), p.1492-1499）。
【０１３０】
[結果]
ＡＣＣ-β導入安定細胞株Ａ４-３クローンを、高グルコース刺激した後に、オステオポンチン（Osteopontin）またはＭＣＰ-１のｍＲＮＡ量を定量リアルタイムＰＣＲ法にて測定した結果を図２に示す（黒の棒グラフ）。この結果からわかるように、高グルコース刺激することにより、オステオポンチンおよびＭＣＰ-１はいずれも発現量の増加が認められた。一方、グルコースを添加した場合と浸透圧を合わせるためにマンニトールを添加した系では、上記オステオポンチンおよびＭＣＰ-１の発現の増加はいずれも認められなかった。また、ＧＦＰ導入安定細胞株クローンを用いた場合は、高グルコース刺激をしても、オステオポンチンおよびＭＣＰ-１の発現は増加しなかった。
【０１３１】
前述するように、オステオポンチンおよびＭＣＰ-１はいずれも病態(糖尿病性腎症)において発現増加することが知られている因子であることから、上記のＡＣＣ-β導入安定細胞株を高糖濃度条件下においた場合に（即ちin vitroでの糖尿病状態）、これらの因子の発現がいずれも増加したことは、ＡＣＣ-βが糖尿病性腎症に関与することを示唆するものと言える。
【０１３２】
実施例４  ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣへのＡＣＣ-βの感染導入および発現量変動の解析
ヒトＡＣＣ-βを安定的に過剰発現できる細胞としてヒト由来の尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを用いて、ＡＣＣ-βと糖尿病性腎症における作用との関連性を調べた。
【０１３３】
まずＲＰＴＥＣ(2 x 105 cells/2ml/well)を血清入りＲＥＧＭ培地を含む６ウェルプレートに蒔いて、これを３７℃、５％ＣＯ2環境下で培養した。その翌日、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルス（50moi）を添加して４時間感染させた後に培地を除いて血清入り培地に置換して培養を継続した。感染後１、２、３および４日後に培養上清を回収し、次いでtotal ＲＮＡを抽出し、定量リアルタイムＰＣＲ法にてＡＣＣ-βおよびＩＬ-６のｍＲＮＡ量をそれぞれ測定した。この際、同時測定したＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ量によって補正し、相対値とした。また、培養上清中のＩＬ-６の蛋白質量を、ＥＬＩＳＡキットを用いて常法に従って定量した。
【０１３４】
なお、ＩＬ-６は炎症に関連するサイトカインであり、糖尿病性腎症を発症すると尿中および血中のＩＬ-６の量が増加することが知られている（Am. J. Nephrol. 2006, 26, p.562-570）。
【０１３５】
[結果]
ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを用いてそれぞれ感染導入し、感染１、２、３および４日後に定量リアルタイムＰＣＲ法にてＡＣＣ-β遺伝子の発現（ｍＲＮＡ量）を確認した結果を図３に示す。図３に示すように、感染１日（24時間）後にはhuman ＡＣＣ-βの過剰発現が認められ、感染２日目（48時間）をピークに、少なくとも感染４日目（96時間）までその発現が認められた。
【０１３６】
また、これらの細胞について、ＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を定量リアルタイムＰＣＲ法にて測定した結果を図４に示す。図４ａに示すように、感染２日後（48時間後）にＡＣＣ-β遺伝子を導入した細胞（図中、「Ａ」で示す）においてＩＬ-６の発現量の増加が認められ、感染３日目（72時間目）、４日目（96時間目）にはさらに増大した。またＥＬＩＳＡによって培養上清中のＩＬ-６のタンパク量を測定した結果を図４ｂに示すが、ここに示すように、２−３日目（24-48時間目）または３−４日目（48-72時間目）に著しいタンパク量の増加が認められ、ｍＲＮＡ量の変動と一致した。一方、こうしたＩＬ-６発現量の変動は、ＬａｃＺ遺伝子を感染導入した細胞（図中、「Ｌ」で示す）では認められなかった。
【０１３７】
以上に示すように、ヒトＡＣＣ-βを安定的に過剰発現できる細胞（ヒト尿細管上皮細胞）において、ＩＬ-６がｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で上昇していることが確認された。当該ＩＬ-６は、前述するように病態（糖尿病性腎症）において発現が増加することが知られており、また、その中和抗体によって、その病態が緩和することが知られている。これらのことから、上記の実験結果は、ＡＣＣ-βがヒトの糖尿病性腎症に関与していることを示唆するものである。
【０１３８】
実施例５  ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣへのＡＣＣ-βの感染導入によるＩＬ-６発現量増加の作用機序解析
上記実施例４の結果をうけて、ＡＣＣ-β過剰発現によるＩＬ-６産生増加の作用機序を調べた。
【０１３９】
まず上記実施例４と同様にして、ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣに、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを添加して４時間感染させた後、ミトコンドリアcomplex I の阻害剤であるロテノン（Rotenone）（5μM）またはｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤SB203580 (10μM)を添加して培養を継続し、感染３日後に定量リアルタイムＰＣＲ法にてＩＬ-６ ｍＲＮＡ量を測定した。なお、比較対照試験として、ロテノンおよびSB203580に代えて、ＤＭＳＯを添加して同様に培養した後に、同様にＩＬ-６ ｍＲＮＡ量を測定した。
【０１４０】
[結果]
human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を導入して過剰発現させたヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣに、ロテノン（Rotenone）（5μM）を添加した場合のＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を測定した結果を図５ａに、SB203580 (10μM)を添加した場合のＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を測定した結果を図５ｂにそれぞれ示す。
【０１４１】
図５ａおよび ５ｂに示すように、ＡＣＣ-βを過剰発現させることによってＩＬ-６の発現（ｍＲＮＡ量）は増加したが（比較対照試験：各図の「ＤＭＳＯ」のデータ）、この増加は各阻害剤の添加によって有意に抑制された。このことから、ＡＣＣ-β過剰発現によるＩＬ-６ ｍＲＮＡ量の増加は、部分的にミトコンドリアcomplex Iまたはｐ３８ ＭＡＰＫを介していることが示唆された。つまり、ＡＣＣ-β過剰発現によるＩＬ-６産生増加には、ミトコンドリアcomplex Iまたはｐ３８ ＭＡＰＫの活性化が関与している可能性が高い。また、ＬａｃＺ遺伝子を感染導入した細胞についても、上記阻害剤の添加によって同様にＩＬ-６産生の減少が認められたことから、ＡＣＣ-βを過剰発現させない通常状態においても、ＩＬ-６産生にこれらの因子（ミトコンドリアcomplex Iまたはｐ３８ ＭＡＰＫ）が関与していることが示唆される。すなわち、これらのことから、ＩＬ-６の発現は、ミトコンドリアの経路を介していると考えられる。
【０１４２】
実施例６  ＩＬ-６ ｍＲＮＡ安定性の検討
ＡＣＣ-β過剰発現によるＩＬ-６産生増加の作用機序を調べるために、ＡＣＣ-βのＩＬ-６ ｍＲＮＡの安定性への関与について検討した。
【０１４３】
具体的には、上記実施例４と同様にして、ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣに、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを用いて感染させた。その３日後に転写阻害剤（ＲＮＡ合成酵素阻害剤）であるアクチノマイシンＤ（Actinomycin D ）(10μg/ml)を添加して培養を継続し、感染３０、６０、および１２０分後に定量リアルタイムＰＣＲ法にてＩＬ-６のｍＲＮＡ量を測定した。
【０１４４】
[結果]
結果を図６に示す。図６に示すように、ＡＣＣ-βを過剰発現させたヒト尿細管上皮細胞では、転写阻害剤（ＲＮＡ合成酵素阻害剤）を添加した場合でも、ＡＣＣ-βを発現させないヒト尿細管上皮細胞に比して、ＩＬ-６のｍＲＮＡの低下は有意に抑制されており（分解抑制）、特に転写阻害剤添加６０分後以降に、ＩＬ-６のｍＲＮＡ量の有意な低下抑制（分解抑制）、言い換えれば安定性の増大が認められた。
【０１４５】
このことから、ＡＣＣ-βを過剰発現させた場合におけるＩＬ-６産生量の増加は、ＩＬ-６ ｍＲＮＡの安定性が増大していることによるものと考えられる。つまり、ＡＣＣ-β過剰発現によるＩＬ-６のｍＲＮＡの安定性の増加は、ＡＣＣ-βによってＩＬ-６のｍＲＮＡの分解速度が遅くなることが作用機序の一つであると考えられる。
【０１４６】
実施例７  エンハンサー活性の検討
ＡＣＣ-β遺伝子のイントロン１８（配列番号１）に存在するrs2268388に存在するSNPの機能を調べるためにrs2268388の疾患感受性対立遺伝子(T)および非感受性対立遺伝子(C)それぞれを含む28bpのoligoDNA配列をタンデムに３つつなげた配列を作成し、pGL3 promoterベクターのSV40promoter上流にサブクローニングし、ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作成した。正常ヒト近位尿細管上皮細胞RPTECに、上記で作成したルシフェラーゼレポーターおよび補正用としてpRL-TKベクターをコトランスフェクションし、４時間後に7.2mM グルコース、25mMグルコース、および7.2mMグルコース+17.8mMマンニトールの各々の培地に置き換え、20時間後に細胞抽出液を調製してルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１４７】
[結果]
図7に示す様に、rs2268388 （SNP4139）を含む28bpのoligoDNA配列は、遺伝子型の別によらずpGL3 promoterベクターのみに比較して有意なエンハンサー活性を有していた。以上のことより、SNPの機能としてrs2268388（SNP4139）周辺にＡＣＣ-βの発現を調節しうる領域があることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図ａは、ラット尿細管上皮細胞ＮＲＫ-５２Ｅを、human ＡＣＣ-βまたはＧＦＰ遺伝子を含むレトロウィルスを用いて感染導入し、限界希釈法で得たＡＣＣ-β細胞株４クローン（A1-1、A1-3、A4-3、A7-2）、およびＧＦＰ細胞株３クローン（#G2、#G3、#G7）をそれぞれ定量リアルタイムＰＣＲ法にて発現確認した結果を示す（実施例２）。なお、縦軸のmRNA expressionは、GAPDHの発現量で補正した数値を意味する。 図ｂは、上記ＡＣＣ-β細胞株４クローンとＧＦＰ細胞株３クローンについて、抗ＡＣＣ-β抗体を用いたウエスタンブロッティングにて発現を確認した結果を示す（実施例２）。
【図２】ＡＣＣ-β導入安定細胞株Ａ４-３クローンを、グルコース（黒色棒）またはマンニトール（灰色棒）で刺激した後に、オステオポンチン（Osteopontin）またはＭＣＰ-１のｍＲＮＡ量を定量リアルタイムＰＣＲ法にて測定した結果を示す。なお、白色棒は、ＡＣＣ-β導入安定細胞株Ａ４-３クローンのオステオポンチンまたはＭＣＰ-１のｍＲＮＡ量を示す（実施例３）。なお、縦軸の「Ratio」は、 グルコース刺激もマンニトール刺激もしない無処置の細胞（Intact）の発現量を1とした場合の発現量の相対比を意味する。
【図３】ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを用いてそれぞれ感染導入し、感染１、２、３および４日後（24、48、72および96時間後）に定量リアルタイムＰＣＲ法にてＡＣＣ-β遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量）を確認した結果を示す（実施例４）。図中、「Ｎ」はヒト尿細管上皮細胞そのもの、「Ｌ」はＬａｃＺ遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞、および「Ａ」はＡＣＣ-β遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞を示す。なお、縦軸の「Fold increase」は、 LacZ遺伝子もACC-b遺伝子も感染導入させない状態の細胞（No infectionと表示）を用いて２４時間後に得られた数値を1とした場合の発現量の相対比を意味する。
【図４】図ａは、ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣを、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを用いてそれぞれ感染導入し、感染１、２、３および４日後（24、48、72および96時間後）に定量リアルタイムＰＣＲ法にてＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を確認した結果を示す（実施例４）。図ｂは、感染１−２日（24-48時間）、２−３日（48-72時間）および３−４日（72-96時間）におけるＩＬ-６タンパク質の量を確認した結果を示す（実施例４）。図中、「Ｎ」はヒト尿細管上皮細胞そのもの、「Ｌ」はＬａｃＺ遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞、および「Ａ」はＡＣＣ-β遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞を示す。なお、縦軸の「Fold increase」は、LacZ遺伝子もACC-b遺伝子も感染導入させない状態の細胞（No infectionと表示）を用いて２４時間後に得られた数値を1とした場合の発現量の相対比を意味する。
【図５】図ａは、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を導入して過剰発現させたヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣに、ロテノン（Rotenone）（5μM）を添加した場合のＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を測定した結果を、図ｂは、SB203580 (10μM)を添加した場合のＩＬ-６の発現量（ｍＲＮＡ量）を測定した結果をそれぞれ示す。各図において、「ＤＭＳＯ」とは、ロテノンおよびSB203580に代えて、ＤＭＳＯを添加して同様に培養してＩＬ-６ ｍＲＮＡ量を測定した比較対照試験の結果を示す（実施例５）。図中、「Ｎ」はヒト尿細管上皮細胞そのもの、「Ｌ」はＬａｃＺ遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞、および「Ａ」はＡＣＣ-β遺伝子を導入したヒト尿細管上皮細胞を示す。なお、縦軸の「Fold increase」は、LacZ遺伝子もACC-b遺伝子も感染導入させない状態の細胞（No infectionと表示）を用いて２４時間後に得られた数値を1とした場合の発現量の相対比を意味する。
【図６】ヒト尿細管上皮細胞ＲＰＴＥＣに、human ＡＣＣ-β遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子を含むアデノウィルスを用いて感染させた後に、転写阻害剤（ＲＮＡ合成酵素阻害剤）を添加して培養した３０、６０、および１２０分後のＩＬ-６のｍＲＮＡ量を示す（実施例６）。結果は、培養０分におけるＩＬ-６のｍＲＮＡ量を１００％とした場合の相対値（％）で示す。
【図７】rs2268388の疾患感受性対立遺伝子（T）を含む28bpのoligoDNA配列（図中、四角で囲った「T」で示す）、およびrs2268388の非感受性対立遺伝子(C) を含む28bpのoligoDNA配列（図中、四角で囲った「C」で示す）をそれぞれタンデムに３つつなげた配列を有する、pGL3 promoterベクターのSV40promoter上流に挿入し、ルシフェラーゼレポーターコンストラクト〔図中、pGL3-promoter T3(T3), およびpGL3-promoter C3(C3)として示す〕、および比較対照としてpGL3 promoterベクター〔図中、pGL3-promoter(pro)として示す〕を、それぞれを作成した。ＲＰＴＥＣにコンストラクトおよび補正用としてpRL-TKベクターを導入して、培養し（7.2mM グルコース、25mMグルコース、または7.2mMグルコース+17.8mMマンニトールの条件）、次いで細胞抽出液のルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す。なお結果は、比較対照であるpGL3-promoter(pro)について、7.2mM グルコースで培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した結果（測定値）を1として示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１４９】
配列番号２および３は、rs2268388領域を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４はSNP4139を含む増幅領域を検出するためのインベーダープローブの塩基配列を、配列番号５はSNP4139を含む増幅領域のG対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、また配列番号６はSNP4139を含む増幅領域のA対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、それぞれ示す。
【図１】
0005235448.tif 000004
【図２】
0005235448.tif 000005
【図３】
0005235448.tif 000006
【図４】
0005235448.tif 000007
【図５】
0005235448.tif 000008
【図６】
0005235448.tif 000009
【図７】
0005235448.tif 000010
【配列表】
0005235448000001.app