(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
線形法または収束法に基づいた固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）のための方法であって、ペプチドは、一般式（Ｉ）の配列を有するもの、ならびに酸の付加によって形成される該ペプチドの薬学的に許容されるすべての塩またはその錯体を含む方法において、
Ｙ−Ａ1−Ａ2−Ａ3−・・・・・・・−Ａ(n-1)−Ａn−Ｘ（Ｉ）
ただし３０＞ｎ＞１であり、
［式中、
・Ｙ＝Ｈ−、（Ｃ1−Ｃ20）のアルキル、または（Ｃ1−Ｃ20）のアシル；
・Ｘ＝−ＯＨ、−ＮＨＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨ−ＣaＨb（１０＞ａ＞２かつ１８＞ｂ＞５）、−ＮＨＣＦ3、−ＮＨＣＨ2ＣＦ3、−ＮＨ−ＣaＨbＦf（１０＞ａ＞２，１８＞ｂ＞５，９＞ｆ＞０）、−ＮＨ−ＣcＨdＯe（ｃ，ｄ及びｅ＞１）または、−ＮＨ−ＮＲ−ＣＯ−ＮＨ2（ただしＲは任意のアミノ酸の側鎖を表す）；
・Ａn（３０＞ｎ＞１）は、ｔ−ブチル基またはｔ−ブトキシカルボニル基によってアシル化またはアルキル化された側鎖を有するアミノ酸を、配列が少なくとも１個含んでいるならば、ピログルタミン酸などの天然もしくは合成アミノ酸のいずれのものであってもよい；］
ａ）塩基性溶液による処理に対して不安定な一時的保護基の使用によりＮα基が保護されたアミノ酸の使用と、
ｂ）最終生成物中においてアルキル化またはアシル化される側鎖を有するアミノ酸の側鎖を、下記の１型及び２型の酸溶液に対して安定であるｔ−ブチルまたはｔ−ブトキシカルボニルから選ばれる不安定保護基にて保護することと、
【表１】
0005138845.tif 000009
ｃ）最終生成物中において側鎖が遊離型であるアミノ酸の少なくとも１つのものの側鎖を、上記の１型の酸溶液による処理に対して安定であり、２型の酸溶液による処理に対して不安定であるヒスチジンではメチルトリチル、メトキシトリチル、またはトリチル、チロシンではトリチルまたはクロロトリチル、リジンではメチルトリチルまたはトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンではトリチルから選ばれる過不安定保護基にて保護することと、
ｄ）前述の１型の酸溶液による処理に対して不安定なペプチド−樹脂結合を与えるクロロトリチル、トリチル、メチルトリチル、またはメトキシトリチル型の樹脂から選ばれる高分子支持体を使用することとからなることを特徴とする方法。
【請求項２】
Ｘ＝ＯＨである場合に、
ｉ）当該技術分野において一般的に用いられる従来の結合方法の使用によって前記高分子支持体上に適宜保護された第１のアミノ酸を結合する工程と、
ｉｉ）最終生成物において側鎖が遊離するアミノ酸の少なくとも１つのものの側鎖には前記過不安定保護基を用い、最終生成物においてアルキル化またはアシル化されるアミノ酸には前記不安定保護基を用いてペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を開裂して保護された前駆物質を得る工程とを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｘ≠ＯＨである場合に、
ｉｖ）一部のアミノ酸の側鎖に前記不安定及び前記過不安定保護基を有する前駆物質を転換して保護された最終生成物を生成する工程と、
ｖ）２型の酸溶液による処理によってペプチドの前記過不安定保護基を脱離することにより最終生成物を得る工程とを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｘ≠ＯＨである場合に、Ｘ＝ＯＨである場合と同様の工程を含み、かつ更に、
ｖ）２型の酸溶液による処理によってペプチド中の前記過不安定保護基を脱離することにより最終生成物を得る工程と、
ｉｖ）一部のアミノ酸の側鎖が前記不安定保護基のみを有する前駆物質を転換して保護された最終生成物を生成する工程とを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｉ）２−クロロトリチル樹脂上にＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを結合させた後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＣｌＴｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｍｍｔ）、及びピログルタミン酸を結合させることによりペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を切断して保護された前駆物質を得る工程と、
ｉｉｉ）２型の酸溶液による処理によって前記保護された前駆物質中の前記過不安定保護基を脱離する工程と、
ｉｖ）前記前駆物質の活性エステルを形成した後、セミカルバシドを結合させて該前駆物質を転換することによりゴセレリンを生成する工程とからなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法はｉｉ）工程において中断された後、
ｉｉｉ）最終生成物において遊離側鎖を有する三官能性アミノ酸のすべてまたは一部が保護された状態で前記前駆物質の活性エステルを形成した後、セミカルバシドを結合させることにより該前駆物質を転換して保護されたゴセレリンを生成する工程と、
ｉｖ）２型の酸溶液による処理によって前記保護されたゴセレリン中の前記過不安定保護基を脱離する工程とが行われることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｉ）２−クロロトリチル樹脂上にＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを結合させた後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＣｌＴｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｍｍｔ）、及びピログルタミン酸を結合させることによりペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を切断して保護された前駆物質を得る工程と、
ｉｉｉ）２型の酸溶液による処理によって前記保護された前駆物質中の前記過不安定保護基を脱離する工程と、
ｉｖ）前記前駆物質の活性エステルを形成した後、エチルアミンのＨＯＢｔ塩を結合させて該前駆物質を転換することによりブセレリンを生成する工程とからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記方法はｉｉ）工程において中断された後、
ｉｉｉ）側鎖が有する三官能性アミノ酸のすべてまたは一部が最終生成物において遊離する前駆物質の活性エステルを形成した後、エチルアミンのＨＯＢｔ塩を結合させることにより該前駆物質を転換して保護されたブセレリンを生成する工程と、
ｉｖ）２型の酸溶液による処理によって前記保護されたブセレリン中の前記過不安定保護基を脱離する工程とが行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線形法または収束法に基づいた固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）に関し、合成時に必要に応じてアミノ酸のＮα基に対し、塩基性溶液による処理に対して不安定な一時的保護基を用いる固相ペプチド合成法に関するものである。ただしこの場合ペプチドとは、一般式（Ｉ）の配列を有するもの、ならびに酸の付加によって形成される該ペプチドの薬学的に許容される塩のすべて、または該ペプチドの錯体を含むものである。
【０００２】
Ｙ−Ａ1−Ａ2−Ａ3−・・・・・・・−Ａ(n-1)−Ａn−Ｘ      （Ｉ）
［式中、
・３０＞ｎ＞１
・Ｙ＝Ｈ−、（Ｃ1−Ｃ20）のアルキル、または（Ｃ1−Ｃ20）のアシル；
・Ｘ＝−ＯＨ、−ＮＨＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨ−ＣaＨb（１０＞ａ＞２かつ１８＞ｂ＞５）、−ＮＨＣＦ3、−ＮＨＣＨ2ＣＦ3、−ＮＨ−ＣaＨbＦf（１０＞ａ＞２，１８＞ｂ＞５，９＞ｆ＞０）、−ＮＨ−ＣcＨdＯe（ｃ，ｄ及びｅ＞１）または、−ＮＨ−ＮＲ−ＣＯ−ＮＨ2（ただしＲは任意のアミノ酸の側鎖）；
・Ａn（３０＞ｎ＞１）は、例えばｔ−ブチル基やｔ−ブトキシカルボニル基によってアシル化またはアルキル化された側鎖を有するアミノ酸を、配列が少なくとも１個含んでいるならば、ピログルタミン酸などの天然もしくは合成アミノ酸のいずれのものであってもよい；］
複数のプロトコルの組み合わせである本発明の方法は、例えばクロロトリチル、トリチル、メチルトリチル、またはメトキシトリチル型の樹脂などの、有機溶媒に不溶でありかつ１型（第１表参照）の酸溶液中で不安定なペプチド−樹脂結合を与える、使用される高分子支持体の種類によって特徴付けられる。該方法はまた、酸による処理に対して不安定または過不安定な、配列に含まれる異なる三官能性アミノ酸に対して用いられる側鎖保護基の種類によって特徴付けられる。１型及び／または２型の酸分解処理（第１表参照）に対する前記側鎖保護基の不安定度が異なることにより、該保護基を選択的に脱離または維持することが可能である。
【０００３】
【表２】
0005138845.tif 000002
【０００４】
本発明に基づけば、一般式（Ｉ）のペプチドは、１型の酸溶液（第１表参照）を用いてペプチド化樹脂からペプチドを開裂させることが可能な高分子支持体の使用を特徴とする方法により、固相ペプチド合成法を用いて合成される。該方法はまた、１または２型（第１表参照）の酸による処理によって選択的に取り除くことが可能な不安定保護基または過不安定保護基の使用を特徴とする。
【０００５】
したがって、最終生成物において側鎖がアルキル化またはアシル化される三官能性アミノ酸の側鎖には、１または２型の酸による処理に対して安定な保護基が用いられる。これに対し、最終生成物において遊離した側鎖を有する三官能性アミノ酸のうちの少なくとも１つの側鎖に対して、ペプチド−樹脂結合を切断するのに用いられるもののような、過不安定な保護基が用いられる（２型の酸による処理に対して不安定であるが、１型の酸による処理に対しては安定である。第１表を参照）。上記の保護基のこのような特徴により、一般式Ｉのペプチド（Ｘ≠ＯＨ）を、三官能性残基の側鎖のすべてまたは一部が保護された合成中間体のＣ末端における誘導によって極めて高い収率で得ることが可能である。
【０００６】
本明細書において用いる略語は次の意味を有する。
【０００７】
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン
ＡｚａＧｌｙ：アザグリシン
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｚｌ：ベンジル
ＣｌＴｒｔ：クロロ−トリチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＣＤＩ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄ−Ｓｅｒ：Ｄ−セリン
Ｆｍｏｃ−ａａ：Ｆｍｏｃ−アミノ酸
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン
ＨＯＢＴ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン
ＬＨ−ＲＨ：黄体形成ホルモン放出ホルモン
Ｍｍｔ：メトキシトリチル
ＮＯ2：ニトロ
Ｐｉｐ：ピペリジン
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾル−１−イル−オキシヘキサフルオロホスフェート
Ｐｙｒ：ピログルタミン酸
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成法
ｔ−Ｂｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン
Ｔｒｔ：トリチル
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン
Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
【０００８】
【従来の技術】
従来技術に記載される、最終生成物において少なくとも１つの三官能性残基の側鎖がアシル化またはアクリル化されたペプチドの合成法は、２つの手法に分けられる。これらの手法のうちの第１のものでは、当該技術分野ではよく知られた古典的なペプチド合成法、ならびに水素化分解に対して不安定な一時的保護基及びやはり水素化分解に対して不安定な側鎖の保護基を用い、遊離ペプチドのフラグメントまたは保護したフラグメントを溶液中で縮合させる。手法の第２のものは、異なる高分子支持体及び保護基を用いた、固相ペプチド合成法に基づいたものである。これらの手法の１つは、最終生成物において誘導を行わない三官能性アミノ酸の側鎖を保護することなく合成が行われる点を特徴とする。
【０００９】
一般式（Ｉ）の化合物の合成における主たる難点は、保護基が維持されるべき残基と最終生成物において側鎖が遊離状態になければならない他の残基とが同時に存在することにある。最も困難なことは、最終生成物においてアルキル化またはアシル化される側鎖を有するものと、最終生成物においてアルキル化またはアシル化されてはならない側鎖を有するものとを含む２以上の残基の繰り返しをペプチドが含む場合である。
【００１０】
次に一般式（Ｉ）の生成物、特にゴセレリン及びブセレリンを合成するための、従来技術に記載される方法について概括する。
【００１１】
１．溶液中での合成、フラグメントの縮合
米国特許第４１００２７４号及び同第４０２４２４８号には、溶液中におけるフラグメントの縮合によるゴセレリン及びブセレリンの合成法がそれぞれ述べられている。これらの方法はいずれも、予め合成したペプチドフラグメントを、多くの場合保護されていない側鎖と結合させることに基づいたものであり（図１及び図２参照）、前記特許明細書に示された例から推論されるところによれば極めて低い収率（出発原料に対して５％未満）で最終生成物を得る。
【００１２】
米国特許第４１００２７４号に述べられる方法では、いずれも水素化分解に対して不安定である、アルギニンの保護基としての−ＮＯ2及びチロシンの保護基としての−Ｂｚｌを含む３種類の予め形成したフラグメントを縮合することによってゴセレリンを得る。この方法ではＣ末端側のトリペプチドにアザグリシン残基を導入し（Ｈ−Ａｒｇ（ＮＯ2）−Ｐｒｏ−ＡｚＧｌｙが合成される）、これをＺ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｎ3に結合させてフラグメントを得る。このフラグメントはＺ基が取り除かれるとＰｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｎ3と結合してゴセレリンとなる。この最後の反応は、Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）に付属するものを除きすべての側鎖が保護されていない状態で行われ、側鎖のアシル化によって多種類の生成物を生じ得るが、これは加水分解されなければならず、収率が低下する。
【００１３】
文献（フレデリック・Ａ、ジェイガー・Ｇ、ラドシュミット・Ｋ、ウルマン・Ｒ、ペプチド誌、１９９２年、（シュナイダー  Ｃ．Ｈ．、エバール  Ａ．Ｅ．編）１９９３年  エスコム・サイエンス・パブリッシャー刊）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ  Ａ．，  Ｊａｇｅｒ  Ｇ.,  Ｒａｄｓｃｈｍｉｔ  Ｋ．，  Ｕｌｌｍａｎ  Ｒ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９９２）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｃ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｅｂｅｒｌｅ  Ａ．Ｅ．Ｅｄｓ）１９９３  Ｅｓｃｏｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）ならびに米国特許第４０２４２４８号には、ゴセレリンに関して米国特許第４１００２７４号に述べられた方法に似た、ブセレリン（図２参照）を得るための方法が述べられている。唯一の相違点はこの場合では合成される最初のフラグメントが、ａｚａＧｌｙ残基の代わりにエチルアミド末端を有する点である（Ｈ−Ａｒｇ（ＮＯ2）−Ｐｒｏ−ＮＨ−ＣＨ2ＣＨ3）。
【００１４】
米国特許第４１００２７４号及び米国特許第４０２４２４８号と同じファミリーに属するスペイン特許第４５８６９１号には、当該米国特許に開示される方法に類似した、フラグメントの縮合による溶液中でのゴセレリン及びブセレリンの合成法が開示されている。この特許は、三官能性アミノ酸の側鎖保護基の、水素化分解に対する異なる不安定性に基づいた手法を用いたものである。
【００１５】
２．固相合成法
３つの特許に固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）の開示が見られる。
【００１６】
欧州特許公開公報第０５１８６５６号（Ａ２）は、ヒドラジンに対して不安定なＯＢｚｌ−ポリスチレン樹脂上でゴセレリンの合成を行うものであり、ペプチド−樹脂結合をＣ末端で切断する際に、後にアザグリシン末端残基に転換することが可能なヒドラジド型を誘導するものである。この方法では、アミノ酸のＮα基の一時保護基としてｔ−ブトキシカルボニル及びフルオレニルメトキシカルボニル基を用い、アミノ酸の側鎖に対しては次の保護基を用いる。すなわち、Ｔｙｒに対してはＢｒＺ、Ｈｉｓに対してはＦｍｏｃ、Ｄ−Ｓｅｒに対してはｔＢｕを６位において用いて４位におけるＳｅｒの保護を防止し、ペプチド−樹脂結合の切断、側鎖の脱保護の後、反応ＫＣＮによってヒドラジド端をＡｚａＧｌｙ−ＮＨ2に転換する。この明細書に述べられる例では本方法で得られる収率の客観的評価を行うことはできない。
【００１７】
これに対し、欧州特許公開公報第０５１８６５５号（Ａ２）は、４位にてＴｙｒ及びＳｅｒ側鎖を保護せずにＡｚａＧｌｙの二官能性スペーサー（Ｒｉｎｋアミド）によって誘導されるペプチド−樹脂上での結合で開始される線形法を用いた固相合成を行うものである。この方法では、最後のペプチドをヒドラジンにて処理し、遊離型で取り込まれるアシル化されたアミノ酸側鎖を有する副生成物を加水分解する必要がある。該特許明細書に記載される例から推論されるところによればこの方法による精製後の全体の収率は３０％である。
【００１８】
欧州特許公開公報第０４７５１８４号（Ａ１）は、ゴセレリンを含む異なるペプチドを合成するための方法であって、高分子支持体に結合させたＢｏｃ−Ｐｒｏ−ＡｚａＧｌｙの二官能性スペーサーの溶液中での合成に基づいた方法を開示したものである。ペプチド化樹脂が得られると、合成はＦｍｏｃ−ｔ−Ｂｕ法による線形法に従って継続される。最終工程はＴＦＡ：エタンジチオール（９０：１０，ｖ／ｖ）による側鎖の脱保護からなる。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の方法の目的は、特に前記特許に開示されるペプチドをより高収率にて生成することを可能とし、バルク合成可能な通常の前駆物質から容易に大規模化可能な、以下に示す合成法を提供することにある。
【００２０】
９０年代に過不安定基が登場したことにより、以下の利点を有する革新的方法に基づいて前記誘導体の合成が可能となった：
・これまでに述べられたものと比較して収率が向上し、かつＣ末端において極めて高い収率で誘導することが可能な、全体的もしくは部分的に保護された（Ｘ＝ＯＨ）ペプチドを、当該技術分野において一般的な、さほどアグレッシブではない方法であって多量のエピマー化副産物を生ずることのない方法を用いて得ることを可能とする完全な線形法に基づいて、ペプチド鎖の成長が固相で行われる。
【００２１】
・三官能性アミノ酸の側鎖からの保護基の脱離が、これまでに述べられたものよりもアグレッシブではない（上記に述べた水素化分解やヒドラジンによる処理と比較した場合の２型の酸溶液による処理）、ペプチド−樹脂結合を切断するために用いられる方法にオーソゴナルな方法を用いて高い収率にて行われる。このことは方法の工業的大規模化を容易とするものである。
【００２２】
本発明の方法はこれまでに述べた方法に対して幾つかの著明な利点を有する。方法全体の収率は３８〜４５％であるため、工業的規模で実現可能な方法である。不安定保護基と過不安定保護基との組み合わせにより、線形法に基づいて合成を行うことが可能である。これに対し上記に述べた方法では、フラグメントの縮合によって合成を行う必要があった。同様に、Ｃ末端にて誘導されるペプチドが問題である場合、固相法において述べた合成法によって適当な官能基が高分子支持体に組み込まれるため、ペプチド−樹脂結合を切断する際に誘導ペプチドが得られる。本発明の方法によって、誘導により全体的もしくは部分的に保護された前駆物質を固相中で得ることが可能であり、適当な脱保護を行った後、最終生成物が得られる。三官能性アミノ酸の側鎖を保護するための不安定保護基と過不安定保護基との組み合わせにより、最小量の酸を使用し、水素化分解やヒドラジンまたは他の毒性試薬による処理を用いることなく、方法の工業的大規模化が可能である。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明の方法は、側鎖がアルキル化またはアシル化された少なくとも１つの残基を有する一般式（Ｉ）のペプチド、ならびに酸の付加によって形成される該ペプチドの薬学的に許容されるすべての塩及びその錯体の、線形法または収束法に基づいた固相中での合成法からなるものであって、
Ｙ−Ａ1−Ａ2−Ａ3−・・・・・・・−Ａ(n-1)−Ａn−Ｘ      （Ｉ）
［式中、
・３０＞ｎ＞１
・Ｙ＝Ｈ−、（Ｃ1−Ｃ20）のアルキル、または（Ｃ1−Ｃ20）のアシル；
・Ｘ＝−ＯＨ、−ＮＨＣＨ3、−ＮＨＣＨ2ＣＨ3、−ＮＨ−ＣaＨb（１０＞ａ＞２かつ１８＞ｂ＞５）、−ＮＨＣＦ3、−ＮＨＣＨ2ＣＦ3、−ＮＨ−ＣaＨbＦf（１０＞ａ＞２，１８＞ｂ＞５，９＞ｆ＞０）、−ＮＨ−ＣcＨdＯe（ｃ，ｄ及びｅ＞１）または、−ＮＨ−ＮＲ−ＣＯ−ＮＨ2（ただしＲは任意のアミノ酸の側鎖）；
・Ａn（３０＞ｎ＞１）は、例えばｔ−ブチル基やｔ−ブトキシカルボニル基によってアシル化またはアルキル化された側鎖を有するアミノ酸を、配列が少なくとも１個含んでいるならば、ピログルタミン酸などの天然もしくは合成アミノ酸のいずれのものであってもよい；］
ａ）塩基性溶液による処理に対して不安定な一時的保護基の使用によりＮα基が保護されたアミノ酸の使用と、
ｂ）最終生成物中においてアルキル化またはアシル化された側鎖を有するアミノ酸の側鎖を不安定保護基（下記の１型及び２型の酸溶液に対して安定）にて保護することと、
【００２４】
【表３】
0005138845.tif 000003
【００２５】
ｃ）最終生成物中において側鎖が遊離型であるアミノ酸の少なくとも１つのものの側鎖を過不安定保護基（上記の１型の酸溶液による処理に対して安定であり、２型の酸溶液による処理に対して不安定）にて保護することと、
ｄ）前述の１型の酸溶液による処理に対して不安定なペプチド−樹脂結合を与える高分子支持体を使用することとからなることを特徴とする方法である。
【００２６】
図３に体系的に示される、開発された本発明の方法は以下の工程を含む。
【００２７】
１）第１のアミノ酸Ｂｎを、当該技術分野において一般的に用いられている従来の結合方法を使用して高分子支持体上に結合させる。
【００２８】
２）当該技術分野において一般的に用いられている従来の結合方法を使用してＢi（ｎ＞ｉ＞１）を導入することによりペプチド鎖を後端に延長する。
【００２９】
３）Ｙ基（ペプチドのＮ末端における置換基）を導入する。
【００３０】
４）１型の酸溶液によりペプチド−樹脂結合を切断する。
【００３１】
５）ａ）当該技術分野において知られる従来の方法を使用してＸ基を導入するか、あるいは、ｂ）こうした保護基を有する三官能性残基の側鎖を保護する過不安定基を２型の酸溶液による処理によって脱離する。
【００３２】
６）ａ）こうした保護基を有する三官能性残基を保護する過不安定基を２型の酸溶液による処理によって脱離するか、あるいは、ｂ）当該技術分野において知られる従来の方法を使用してＸ基を導入する。
【００３３】
図３に示される方法と合成の工程の説明のいずれにおいても、
・Ａi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）、Ｘ及びＹは一般式Ｉにおいて前述した残基、
・遊離側鎖が導入された非三官能性残基及び三官能性残基では、Ｂi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）＝Ａi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）、
・最終生成物において側鎖が遊離であるが、保護された状態で導入されるアミノ酸では、Ｂi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）はＡi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）と同じ残基であり、過不安定基を使用して側鎖を更に保護する、または、
・最終生成物において側鎖がアルキル化またはアシル化されているアミノ酸では、Ｂi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）はＡi（ｉ＝１〜ｉ＝ｎ）と同じ残基であり、不安定基を使用して側鎖を更に保護する。
【００３４】
一部のアミノ酸では側鎖に対して用いられる過不安定保護基は好ましくは、ヒスチジンでは、メチルトリチル、メトキシトリチル、またはトリチル、チロシンではトリチルまたはクロロトリチル、リジンではメチルトリチルまたはトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンではトリチルである。
【００３５】
最終生成物において側鎖が保護されたままのアミノ酸に対する不安定保護基は好ましくは、ｔ−ブチルまたはｔ−ブトキシカルボニルである。
【００３６】
１型の酸溶液による処理に対して不安定なペプチド−樹脂結合を与える高分子支持体は好ましくは、クロロトリチル、トリチル、メチルトリチル、またはメトキシトリチル型の樹脂である。
【００３７】
Ｘ＝ＯＨである場合の一般式（Ｉ）のペプチドを調製するための本発明の一態様に基づけば、本発明の方法は、
ｉ）当該技術分野において一般的に用いられる従来の結合方法の使用によって高分子支持体上に適宜保護された第１のアミノ酸を結合する工程と、
ｉｉ）最終生成物において側鎖が遊離するアミノ酸の少なくとも１つのものの側鎖には過不安定保護基を用い、最終生成物においてアルキル化またはアシル化されるアミノ酸には不安定保護基を用いてペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を切断して保護された前駆物質を得る工程とを含む。
【００３８】
ＸがＯＨではない場合の一般式（Ｉ）のペプチドを調製するための別の一態様に基づけば、本発明の方法はＸ＝ＯＨである場合と同様の工程を含み、かつ更に、
ｉｖ）一部のアミノ酸の側鎖に不安定及び過不安定保護基を有する前駆物質を転換して保護された最終生成物を生成する工程と、
ｖ）２型の酸溶液による処理によってペプチドの過不安定保護基を脱離することにより最終生成物を得る工程とを含む。
【００３９】
ＸがＯＨではない場合の一般式（Ｉ）のペプチドを調製するための別の一態様に基づけば、本発明の方法はＸ＝ＯＨである場合と同様の工程を含み、かつ更に、
ｖ）２型の酸溶液による処理によってペプチド中の過不安定保護基を脱離することにより最終生成物を得る工程と、
ｉｖ）一部のアミノ酸の側鎖が不安定保護基のみを有する前駆物質を転換して保護された最終生成物を生成する工程とを含む。
【００４０】
上記の態様に基づけば、本発明はその更なる態様としてゴセレリン及びブセレリンの合成方法を提供するものである。
【００４１】
すなわち、ゴセレリンの合成において本発明の方法は、
ｉ）２−クロロトリチル樹脂上にＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを結合させた後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＣｌＴｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｍｍｔ）、及びピログルタミン酸を結合させることによりペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を切断して保護された前駆物質を得る工程と、
ｉｉｉ）２型の酸溶液による処理によって前記保護された前駆物質中の過不安定保護基を脱離する工程と、
ｉｖ）前記前駆物質の活性エステルを形成した後、セミカルバシドを結合させて該前駆物質を転換することによりゴセレリンを生成する工程とを含む。
【００４２】
この場合、ゴセレリンの合成方法をｉｉ）工程にて中断して次の工程を行うことが可能である。すなわち、
ｉｉｉ）最終生成物において遊離側鎖を有する三官能性アミノ酸のすべてまたは一部が保護された状態で前記前駆物質の活性エステルを形成した後、セミカルバシドを結合させることにより該前駆物質を転換して保護されたゴセレリンを生成する工程と、
ｉｖ）２型の酸溶液による処理によって前記保護されたゴセレリン中の過不安定保護基を脱離する工程。
【００４３】
ブセレリンの合成に関し、本発明の方法は、
ｉ）２−クロロトリチル樹脂上にＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨを結合させた後、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＣｌＴｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｍｍｔ）、及びピログルタミン酸を結合させることによりペプチド鎖を直線状に成長させる工程と、
ｉｉ）１型の酸溶液による処理によってペプチド−樹脂結合を切断して保護された前駆物質を得る工程と、
ｉｉｉ）２型の酸溶液による処理によって前記保護された前駆物質中の過不安定保護基を脱離する工程と、
ｉｖ）前記前駆物質の活性エステルを形成した後、エチルアミンのＨＯＢｔ塩を結合させて該前駆物質を転換することによりブセレリンを生成する工程とを含む。
【００４４】
同様に、上記のブセレリン合成方法をｉｉ）工程にて中断して以下の工程を行うことが可能である。すなわち、
ｉｉｉ）側鎖が有する三官能性アミノ酸のすべてまたは一部が最終生成物において遊離する前駆物質の活性エステルを形成した後、エチルアミンのＨＯＢｔ塩を結合させることにより該前駆物質を転換して保護されたブセレリンを生成する工程と、
ｉｖ）２型の酸溶液による処理によって前記保護されたゴセレリン中の過不安定保護基を脱離する工程。
【００４５】
【発明の実施の形態】
次に、本願において述べられる保護基の組合わせを詳細に説明するべく、非限定的な例示として、本方法によるゴセレリン及びブセレリンの合成を説明する。
【００４６】
本発明において述べられる合成プロトコルの使用例として、図４にゴセレリンの、図５にブセレリンの合成が述べられる。
【００４７】
実施例１
ＦｍｏｃＡｒｇ（ＨＣｌ）の生成
５０ｇのＦｍｏｃＡｒｇＯＨ（１１０ｍｍｏｌ）を等量の１ＮのＨＣｌに溶解する。この溶液を１０μｍのナイロンフィルタに通して濾過する。得られた混合物をドライアイス／アセトン浴中で凍結し、凍結乾燥して完全に乾燥させた。定量的に４７．５２ｇのＦｍｏｃＡｒｇＨＣｌが得られる。
【００４８】
実施例２
第１のアミノ酸の導入。ＦｍｏｃＰｒｏと２−クロロトリチル樹脂との間のエステル結合の形成。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
９１．１ｇ（２７０ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（ＫＯＨの存在下、真空下で１２時間乾燥したもの）をモレキュラーシーブ（樹脂１ｇ当たり１０ｍＬ）上で２０００ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解する。アミノ酸が溶解した時点で、ＤＩＥＡ（３８．６ｍＬ）の１／３を加え、全体を樹脂（ＯＨの存在下、真空下で１２時間乾燥したもの）上に流す。得られた混合物を５分間反応させる。この時間の経過後、ＤＩＥＡの残りの２／３（７７．３ｍＬ）をＤＣＭ（ＤＣＭ  ７７．３ｍＬ）に１：１で加える。激しく震盪しつつ反応を４０分間行う。１６０ｍＬのＨＰＬＣグレードのＭｅＯＨ（樹脂１ｇ当たり０．８ｍＬ）を加え、残存するヒドロキシル基をブロックするため、５分間震盪する。
【００５１】
実施例３
異なるアミノ酸の導入。Ｐｙｒ−Ｈｉｓ（Ｍｍｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（２ＣｌＴｒｔ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−樹脂２−Ｃｌ−Ｔｒｔの生成。
【００５２】
【表５】
0005138845.tif 000005
【００５３】
【表６】
0005138845.tif 000006
【００５４】
【表７】
0005138845.tif 000007
【００５５】
【表８】
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【００５６】
樹脂が乾燥した時点で秤量し、５３９．５ｇのペプチド化樹脂最終生成物を得た。このことは、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ペプチド化樹脂の最初の機能化を考慮すると、０．８５ｍｅｑ／ｇの定量的合成収率を示すものである。
【００５７】
実施例６
樹脂からのペプチドの乖離。Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（２ＣｌＴｒｔ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨの生成。
【００５８】
実施例５で得た３８．７ｇの完全に乾燥したペプチド化樹脂（機能化量：０．３３７ｍｅｑ／ｇ）を、５６０ｍＬのＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：２：７）により１時間３０分、室温にて処理した。次いで混合物を７５ｍＬのＡｃＯＨ／ＴＦＥ／ＤＣＭ（１：２：７）にて２回、ジエチルエーテルにて２回洗い、濾過して溶媒を蒸発させた。得られた固体を真空下で乾燥し、実施例７に述べられる工程にしたがって合成を行った。
【００５９】
実施例７
側鎖の脱保護。Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨの生成。
【００６０】
実施例６で得られた固体を４５１ｍＬのＴＦＡ：ＤＣＭ（２：９８ｖ／ｖ）により１時間３０分処理した。これをジエチルエーテルにて沈殿させ、濾過し、ジエチルエーテルにて６回洗った。これにより、ｔ−ブチルのエーテルとしてアルキル化されたＤ−Ｓｅｒの側鎖を除いて脱保護されたゴセレリンまたはブセレリンの前駆物質１５．９ｇを得た。
【００６１】
実施例８
エチルアミン／ＨＯＢｔ塩の生成。
【００６２】
ＨＯＢｔ１１．５８ｇ（７７．２ｍｍｏｌ）を秤量し、２Ｌのフラスコに入れた。１Ｌの水を加え、フラスコを超音波浴中に浸漬し、完全に分散させた。超音波を作用させつつ６．１８ｍＬ（１０３．１ｍｍｏｌ）のエチルアミンを加えた。分散物は完全に溶解した。得られた透明な溶液を５分間室温にて静置した後、ドライアイス／アセトンの浴中で凍結した。これを凍結乾燥した。十分に凍結乾燥した後、生成物をフラスコから取り出してビーカーに集めた。得られた固体をＫＯＨの存在下、真空下で少なくとも２４時間にわたって乾燥し、１５．１ｇのエチルアミン／ＨＯＢｔ塩を得た。
【００６３】
実施例９
エチルアミドの変換。Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ３の生成。
【００６４】
１０．４５ｇの前駆物質（８．６１ｍｍｏｌ）を３６０ｍＬのＤＭＦに溶解した。５．２ｇ（３ｅｑ）のよく乾燥したＨＯＢｔのエチルアミド塩を加え、超音波浴中にて均一化した。マグネチックスターラにて撹拌しつつ３．６ｍＬのＤＩＰＣＤＩ（３ｅｑ）を加え、５０℃にて６時間反応を維持した。これを乾燥状態にまで蒸発させてオイルを得た。これに３０ｍＬのＣＨ3ＣＮを加え、混合物を超音波浴中で均一化し、該超音波浴に１００ｍＬの水を加えた。得られた白色の懸濁液を凍らせ、凍結乾燥した。定量可能な収率にて得られた固体を、逆層Ｃ8カラム上で０．１％ＴＦＡにてＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏによるアイソクラチック溶出を行う分取ＨＰＬＣを用いて精製し、合成及び精製の全体の収率４４％を得た。
【００６５】
実施例１０
アザグリシンアミドへの変換。Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２の生成。
【００６６】
Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ３（１３ｇ，１０．７２ｍｍｏｌ）を８０ｍＬのＤＭＦに溶解した。８ｇのＰｙＢＯＰ（３ｅｑ）を秤量し、２０ｍＬのＤＭＦに溶解した。
【００６７】
１．７９ｇのセミカルバシドクロロハイドレートＨ2ＮＣＯＮＨＮＨ2・ＨＣｌ（１．５ｅｑ）及び２５ｍＬのＤＭＦ及び２．８２ｍＬ（１．６ｅｑ）のＤＩＥＡを加えた。この開始懸濁液を完全に溶解するまで超音波処理した。
【００６８】
このペプチド溶液を撹拌しつつＰｙＢＯＰの溶液を加えた。この後、ＤＩＥＡ（５．２６ｍＬ；３ｅｑ）を加えた。次に溶解したセミカルバシドを加え、５時間にわたって反応させた。この後、１Ｌの冷却したジエチルエーテル中で反応液を沈殿させた。１０分後に懸濁液を真空下で濾過し、ジエチルエーテルにて繰り返し洗浄し、摺り潰して白色の固体を定量的収率にて得た。これを逆層Ｃ8カラム上で０．１％ＴＦＡにてＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏによるアイソクラチック溶出を行う分取ＨＰＬＣを用いて精製し、合成及び精製の全体の収率３８．３％を得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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