(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｈＲＮＡのためのループ配列である、配列表の配列番号１９に記載の塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
請求項１記載の核酸を含有するｓｈＲＮＡを発現するためのベクター。
【請求項３】
請求項１記載の核酸、もしくは請求項２記載のベクターを含むキット。
【請求項４】
ループ配列が配列表の配列番号１９に記載の塩基配列からなる核酸を含むｓｈＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において有用な、ＲＮＡによる遺伝子抑制の効果を向上させることを可能にする方法、およびそれに関連する一連の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、小さなＲＮＡによる遺伝子発現抑制が次々と発見されている。ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる２１ｍｅｒ〜２３ｍｅｒの二本鎖ＲＮＡは配列特異的に遺伝子発現を抑制する。１９９８年にＦｉｒｅら（非特許文献１）が線虫にて二本鎖ＲＮＡが配列特異的に遺伝子のサイレングを引き起こすことを発見して以来、２１〜２３ｍｅｒにプロセッシングされたＲＮＡがｍＲＮＡを切断する機構（非特許文献２）やＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の存在（非特許文献３）、Ｄｉｃｅｒのクローニング（非特許文献４）を経て、２００１年にＥｌｂａｓｈｉｒら（非特許文献５）により哺乳類細胞でもｓｉＲＮＡによる配列特異的な発現抑制が可能であることが証明され、ｓｉＲＮＡを用いた研究は一気に盛んになった。
一方、発生など多くのステージでの発現制御に大きな役割を果たしているｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ構造（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）で細胞質に移行し、Ｄｉｃｅｒにより切断され成熟ｍｉＲＮＡになる。ｍｉＲＮＡは、一般に３’非翻訳領域に相補的に結合することにより、発現を翻訳段階で抑制するといわれている。【０００３】
哺乳類細胞において、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡを人為的に細胞内で発現させる場合、発現ベクターからｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を発現させることが一般的である。このとき、センス配列とアンチセンス配列の間のループ配列が、細胞質への移行や、Ｄｉｃｅｒによる認識に重要であると言われており、最近の報告ではｓｈＲＮＡのループ配列にｍｉＲＮＡ由来の配列がよく使用されている。しかしながら、ｓｈＲＮＡにおけるループ配列の重要性を示唆する報告があるにも拘らず、効果的なループ配列の検索はＭｉｙａｇｉｓｈｉらの研究（非特許文献６）を除けばほとんど行われていない。【０００４】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ  Ａ、他５名、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８年、Ｖｏｌ．３９１、ｐ．８０６−８１１
【非特許文献２】Ｚａｍｏｒｅ  ＰＯ、他３名、Ｃｅｌｌ、２０００年、Ｖｏｌ，１０１、ｐ．２５−３３
【非特許文献３】Ｈａｍｍｏｎｄ  ＳＭ、他３名、Ｎａｔｕｒｅ、２０００年、Ｖｏｌ．４０４、ｐ．２９３−２９６
【非特許文献４】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ、他３名、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、Ｖｏｌ．４０９、ｐ．３６３−３６６
【非特許文献５】Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ、他５名、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、Ｖｏｌ．４１１、ｐ．４９４−４９８
【非特許文献６】Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ、他４名、Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．、２００４年、Ｖｏｌ．６、ｐ．７１５−７２３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、ｓｈＲＮＡを利用した遺伝子抑制における効果の高いループ（ｌｏｏｐ）配列を提供することにある。本発明のループ配列を用いて、より強い抑制効果が得られれば、例えば遺伝子の機能解析実験などに大きな影響を及ぼすと考えられる。また、ｓｈＲＮＡを利用した遺伝子抑制を利用した治療においては、その治療効果を左右する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは鋭意研究の結果、次のような網羅的なループ配列検索を実施し、効果的なループ配列を見出した。これらの新規ループ配列は、従来使用されている配列と比べて高い遺伝子抑制効果を示すことを確認し、発明を完成した。すなわち、ヒト細胞で発現している短いＲＮＡを精製し、マイクロビーズを用いた網羅的遺伝子発現解析技術（ＭＰＳＳ）を利用してスクリーニングし、その配列を解析した。また、配列情報を元にデータベースでの解析を行い、ヒトゲノムに１００％マッチする配列の中から、既知のｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡにヒットしない配列を抽出し、二次構造予測から新規ｍｉｃｒｏＲＮＡの候補を得た。得られた新規ｍｉｃｒｏＲＮＡ候補より無作為に９種類の配列を選択し、ステムループ配列よりループ配列を得た。こうして選択したループ配列を含むｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明の第１の発明は、標的遺伝子の遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列のスクリーニング方法であって、以下の工程を包含する方法に関する。
（１）生体試料から低分子のＲＮＡを抽出する工程、
（２）（１）で得られた低分子ＲＮＡの塩基配列を決定する工程、
（３）前記生体のゲノム情報を基に、（２）で得られた塩基配列の前後のゲノム配列を取得し、（２）で得られた塩基配列およびその前後のゲノム配列からなる一連の配列から、以下の（Ａ）かつ（Ｂ）に該当する配列を選択する工程、
（Ａ）一定の長さ当たりの自由エネルギーが最も低い領域の配列であって、ステムループ構造を形成する配列、
（Ｂ）（２）で得られた塩基配列がステムループ構造のステム領域に存在する配列、
（４）（３）で得られたゲノム配列から、ループ配列を決定し、当該ループ配列の両端に標的遺伝子配列およびその逆方向の相補配列がステム領域を形成するように連結されたｓｈＲＮＡを構築する工程、
（５）（４）で得られたｓｈＲＮＡを用いて標的遺伝子の遺伝子抑制効果を確認する工程。【０００８】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法により得られる、遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列を含有する核酸に関する。【０００９】
本発明の第２の発明において、ループ配列が以下から選択される塩基配列から選択される配列であってもよい：
（１）配列表の配列番号１２〜２０のいずれか１つに記載の塩基配列；または
（２）配列表の配列番号１２〜２０のいずれか１つに記載の塩基配列において１個以上の塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有する塩基配列。【００１０】
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の核酸を含有するｓｈＲＮＡを発現するためのベクターに関する。【００１１】
本発明の第４の発明は、本発明の第２の発明の核酸、もしくは本発明の第３の発明のベクターを含むキットに関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の配列を含むｓｈＲＮＡ発現ベクターは、従来良く使用されているループ配列と比較して高い遺伝子抑制効果を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のスクリーニング方法および核酸の遺伝子抑制の効果を示す図である。
【図２】本発明のスクリーニング方法および核酸の遺伝子抑制の効果を示す図である。
【図３】本発明のスクリーニング方法および核酸の遺伝子抑制の効果を示す図である。
【図４】本発明のスクリーニング方法および核酸の遺伝子抑制の効果を示す図である。
【図５】本発明のスクリーニング方法および核酸の遺伝子抑制の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本明細書において「ステムループ（ヘアピンループ）構造」とは、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ上に存在する逆方向反復配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分（ステム）とそれに挟まれたループの部分からなる構造を示す。つまりステム領域は、２つの領域の塩基配列が互いに相補的であり、かつ逆方向に存在している。水素結合する逆方向反復配列は完全に相補的であっても良く、部分的に相補的であってもよい。ループ部分の構造は一部にステム領域があっても良く、ステム領域にバルジが挿入されていても良い。ステムループ構造は、核酸の二次構造予測アルゴリズムにより予測、確認することができる。このアルゴリズムは、例えば、Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  Ｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３１（１３），ｐ．３４２９−３１（２００３））、ＭＦＯＬＤ（Ｚｕｋｅｒ  Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３１（１３），ｐ．３４０６−１５（２００３））が挙げられる。【００１５】
本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、ステムループ構造を有するＲＮＡを示す。ｓｈＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであり、一本鎖ＲＮＡ上に存在する逆方向反復配列がそれぞれアニーリングし、ステム領域と呼ばれる二本鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）部分を形成する。前記逆方向反復配列に挟まれる部分をループ領域という。ループ領域の配列をループ配列という。【００１６】
本明細書において「遺伝子抑制に有用」とは、遺伝子の発現抑制を行う際に使用することが可能であることを示し、特に遺伝子抑制を強く誘導すること、つまり遺伝子の発現を強く抑制することをいう。遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列とは、遺伝子抑制を行うときに利用可能であるｓｈＲＮＡのループ配列であり、特に限定はされないが例えば、一般にｓｈＲＮＡ発現ベクターのループ構造に利用されていた、配列番号２１に示す配列のループ領域（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  ２９６：５５０−５５３．）と比較して、遺伝子抑制の効果が高いループ配列が遺伝子抑制に特に有用である。【００１７】
本明細書において「自由エネルギー」とは、Ｚｕｋｅｒ法（Ｚｕｋｅｒ  Ｍら、ＲＮＡ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ｐ．１１−４３（１９９９））により与えられる値であり、ＲＮＡの高次構造を予測するために使用される。【００１８】
１．遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列のスクリーニング方法
本発明の遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列のスクリーニング方法は以下の工程を包含する。
（１）生体試料から低分子のＲＮＡを抽出する工程、
（２）（１）で得られた低分子ＲＮＡの塩基配列を決定する工程、
（３）前記生体のゲノム情報を基に、（２）で得られた塩基配列の前後のゲノム配列を取得し、（２）で得られた塩基配列およびその前後のゲノム配列からなる一連の配列から、以下の（Ａ）かつ（Ｂ）に該当する配列を選択する工程、
（Ａ）一定の長さ当たりの自由エネルギーが最も低い領域の配列であって、ステムループ構造を形成する配列、
（Ｂ）（２）で得られた塩基配列がステムループ構造のステム領域に存在する配列、
（４）（３）で得られたゲノム配列から、ループ配列を決定し、当該ループ配列の両端に標的遺伝子配列およびその逆方向の相補配列がステム領域を形成するように連結されたｓｈＲＮＡを構築する工程、
（５）（４）で得られたｓｈＲＮＡを用いて標的遺伝子の遺伝子抑制効果を確認する工程。【００１９】
本発明のスクリーニング方法において、生体試料はＲＮＡを含有すると考えられる試料であれば特に限定は無く、培養細胞、組織、器官、体液などいずれの由来であっても良い。さらに、遺伝子抑制を行う生体由来の生体試料であることが好ましいが、遺伝子抑制に有用であれば遺伝子抑制を行う生体以外の生物由来の生体試料であっても良い。これらの生体試料よりＲＮＡを抽出する方法は、当業者に公知の方法を使用すればよく、生体試料に最適化されたキットが数多く市販されている。【００２０】
本発明のスクリーニング方法において、低分子のＲＮＡは一般的なｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡよりも低分子量のＲＮＡを意味し、ｍｉＲＮＡ程度の長さのＲＮＡが特に好適である。特に限定はされないが例えば、１０〜１００塩基、好ましくは１５〜５０塩基、より好ましくは１７〜３０塩基、特に好ましくは２１〜２７塩基の長さのＲＮＡである。低分子のＲＮＡを抽出する方法は、ＲＮＡを分子量により分画できる方法であれば特に限定されないが、例えばゲル電気泳動法による切り出し、カラム分画法による分取、フィルターによるろ過法などが挙げられる。【００２１】
前記低分子ＲＮＡの塩基配列を決定する方法は、一般のＲＮＡ配列決定方法を使用することがきる。特に限定はされないが、例えばＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、チェーンターミネーション法、ＭＰＳＳ法（日本特許公開第２０００−５１５００６号公報およびＢｒｅｎｎｅｒ  Ｓ．他２３名  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００年  ｖｏｌ．１８、ｐ６３０−６３４）等により配列を決定すればよい。配列が決定された低分子ＲＮＡの塩基配列は、由来する生体のゲノムデータベースなどを用いてゲノム配列に一致する配列を選択することが好ましい。つまり、ゲノム塩基配列に一致しない低分子ＲＮＡ配列は、除外することが好ましい。さらに、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡである配列をデータベースと比較して除外することが好ましい。前記検討を行うことによりノイズを除去することができるため、後に行う選択の効率を向上させることができる。前記データベースは、特に限定はされないが例えば、ＵＣＳＣゲノムデータベース、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑデータベース、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡデータベース、ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔＲＮＡデータベースが利用できる。【００２２】
次に、決定した低分子ＲＮＡ塩基配列を基に、由来する生体のゲノム情報から低分子ＲＮＡ塩基配列の前後のゲノム配列を取得する。この低分子ＲＮＡ塩基配列およびその前後の配列にステムループ構造のループ領域の配列が含まれることが考えられる。ループ配列を選択する低分子ＲＮＡ塩基配列およびその前後の配列の長さは、特に限定はされないが例えば、２０〜５００塩基、４０〜３００塩基、６０〜２６０塩基、８０〜２２０塩基、１１０〜２００塩基が好適である。この低分子ＲＮＡ塩基配列を含む前後のゲノム配列から、（Ａ）Ｚｕｋｅｒ法により自由エネルギーを計算し、自由エネルギーが低くなる領域、好ましくは自由エネルギーが最も低くなる領域の配列を選択する。つまり、前記低分子ＲＮＡ塩基配列を含む前後のゲノム配列の中で、一定の長さの領域（例えば１１０塩基の領域）を、端より１塩基ずつずらした領域についてそれぞれ自由エネルギーを算出し、例えば最も自由エネルギーが低い領域を選択する。最も低い自由エネルギーは、−２５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、好ましくは−３０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下、より好ましくは−８５．０〜−３０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であることが望ましい。さらに、最も自由エネルギーが低い領域であって、ステムループ構造を形成すると予想される配列を選択する。また、（Ｂ）低分子ＲＮＡの塩基配列がステムループ構造のステム領域に存在する配列を選択する。これらの選択は、例えば、Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  ＰａｃｋａｇｅのＲＮＡ  ｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄを利用することができる。すなわち、特定の配列と、その逆方向の相補配列を含むゲノム配列はステムループ構造を形成すると予想され、前記２つの配列にはさまれた配列がループ配列である。【００２３】
次に、ゲノム配列から選択したループ配列と、遺伝子抑制を行う標的遺伝子またはその一部の配列およびその逆方向の相補配列を含有するステム領域とからなるｓｈＲＮＡを構築する。このｓｈＲＮＡは化学的に合成してもよく、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるようなＤＮＡを作製し、ＲＮＡ転写システムにより生成してもよい。【００２４】
前記で構築したｓｈＲＮＡの遺伝子抑制における効果を確認することにより、ループ領域の遺伝子抑制に与える影響を評価することができる。強い遺伝子抑制を起こすｓｈＲＮＡのループ配列は、遺伝子抑制に有用なループ配列である。遺伝子抑制の効果を確認する方法は、特に限定はされないが例えば、ｓｈＲＮＡを直接細胞に導入する方法、ｓｈＲＮＡが細胞内で転写されるＤＮＡ構築物を細胞内に導入する方法があり、細胞内の標的遺伝子の転写、翻訳を検出することにより確認することができる。遺伝子抑制を確認するためのベクター、宿主、およびそれらのキットが数多く市販されている。本発明のスクリーニング方法において、これらのキットを好適に使用することができる。特に限定はされないが、例えば、蛍光タンパク質を発現している細胞に、本発明のスクリーニング方法により得られたループ配列と、蛍光タンパク質をコードする核酸の一部をステム領域とする配列を含むｓｈＲＮＡを導入し、細胞の蛍光タンパク質を定量することによりループ領域の遺伝子抑制に与える影響を評価することができる。【００２５】
本発明のスクリーニング方法により選択されたループ配列を含むｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡの機構により、効果的に遺伝子発現を抑制することができ、遺伝子機能解析、遺伝子治療などに有用である。【００２６】
２．遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列を含有する核酸、ベクター、キット
本発明の遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ配列を含有する核酸は、前記１．記載のスクリーニング方法により得られたループ配列を含有する核酸である。本発明のｓｈＲＮＡのループ配列の長さは、２〜２００塩基、好ましくは４〜５０塩基、特に好ましくは８〜２０塩基である。このような塩基配列は例えば、配列表の配列番号１２〜２０に記載のループ配列が挙げられる。また、配列表の配列番号１２〜２０のいずれかに記載の配列において１個以上、好ましくは１個又は複数個、特に好ましくは１個又は数個、さらに好ましくは１〜１０個の塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有する配列で示され、かつ遺伝子抑制に有用なものが挙げられる。ここで、配列表の配列番号１２〜２０のいずれかに記載の配列において１個以上の塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを有する配列としては、例えば配列番号１２〜２０のいずれかに記載のヌクレオチドに５０％以上のホモロジーを有する核酸配列、好ましくは前記のヌクレオチドに７０％以上のホモロジーを有する核酸配列、特に好ましくは前記のヌクレオチドに９０％以上のホモロジーを有する核酸配列が例示される。当業者は、本発明の核酸配列を基に、容易にループ配列を含有するｓｈＲＮＡを作製、発注することができ、用意したｓｈＲＮＡを標的遺伝子を発現する細胞などに導入して容易に遺伝子抑制の効果が確認できるため、本発明の核酸を基に１個以上の塩基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つを行った核酸も本発明に含まれると解釈されるべきである。【００２７】
さらに、本発明の核酸は、前記の核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能であり、遺伝子抑制に有用な核酸を包含する。前記のストリンジェントな条件としては、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編集、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．）等に記載された条件が例示される。具体的には、例えば０．５％  ＳＤＳ、５×デンハルツ溶液、０．０１％  変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ中、プローブとともに６５℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件が挙げられる。プローブにハイブリダイズした核酸は、例えば０．５％  ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、３７℃で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することができる。【００２８】
本発明の核酸を挟んで標的遺伝子の塩基配列またはその一部の塩基配列と、その相補的な配列が互いに逆方向に配置されたＲＮＡは、前記標的遺伝子を効果的に抑制することができるため、ｄｓＲＮＡを利用する遺伝子抑制に有用である。ステム領域の長さは、遺伝子抑制において利用できるｄｓＲＮＡを生成する長さであれば特に限定はないが、例えば、１０〜２００塩基、好ましくは１４〜３０塩基、特に好ましくは１９〜２４塩基である。【００２９】
また、本発明の核酸を適切な発現ベクターに挿入した、遺伝子抑制に有用なベクターも本発明に含まれる。本発明のベクターは、本発明のループ配列を含有するｓｈＲＮＡが転写されるものであれば、つまり、遺伝子抑制を行う生物で機能するプロモーター、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲなどの転写調節配列、ターミネーター、ポリＡシグナルなど転写終結配列を有するベクターであれば何でもよい。例えばｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６などのｐＳＩＮｓｉベクターシリーズ（タカラバイオ社製）、ｐＢＡｓｉベクターシリーズ（タカラバイオ社製）、ｐｉＧＥＮＥベクター（ｉＧＥＮＥ社製）、pＳＩＲＥＮベクター（クローンテック）のプロモーター下流に本発明のループ配列を挿入したベクターは、標的とする遺伝子またはその一部の配列を組み込めば直ちにｓｈＲＮＡ発現ベクターとなるため、有用である。その場合、標的遺伝子またはその一部の配列は、ｓｈＲＮＡのステム領域を形成するように逆方向反復配列となり、かつループ配列を挟むようにベクターを構築すればよい。【００３０】
さらに、本発明のｓｈＲＮＡのループ配列を含有する核酸、または本発明のベクターを少なくとも１つ含むキットも本発明に含まれる。本発明のキットは、さらに宿主となる生物、細胞、組織、器官を含んでいてもよく、これらの宿主で標的遺伝子が転写、発現するためのベクター、核酸構築物を含んでいてもよい。また、宿主へ核酸を導入するための形質転換用試薬を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００３２】
さらに、以下に示す大腸菌を用いたプラスミドの構築には、特に記載のない限り大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を宿主として使用した。また、形質転換された大腸菌は３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．５％、ｐＨ７．０）、あるいは上記培地に１．５％の寒天を加え固化させたＬＢ−クロラムフェニコールプレートを用いて３７℃で好気的に培養した。【００３３】
実施例１  試料の調製
（１）ＲＮＡの抽出
ヒト胎児腎臓由来２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）を、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ギブコ社製）含有ＤＭＥＭ培地中で５％ＣＯ２存在下、３７℃で７日間培養した。細胞を回収し、トリゾル試薬（ギブコ社製）により全ＲＮＡを抽出した。【００３４】
（２）低分子ＲＮＡの分離
２９３Ｔ／１７細胞由来全ＲＮＡ  １ｍｇをＭｉｃｒｏｃｏｎ  ３０（ミリポア社製）にて低分子ＲＮＡの濃縮を行った。濃縮した低分子ＲＮＡを１５％  ＴＢＥ−ウレアゲル（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）にて電気泳動を行った。電気泳動後、２１塩基から２７塩基付近を切り出し、低分子ＲＮＡをゲルより分離した。【００３５】
（３）低分子ＲＮＡ  タグライブラリー作製
米国公開公報第２００４／０００２１０４号記載のタグベクターｐＭＢＳ１をＢａｍＨＩおよびＢｂｓＩ（いずれもニュー  イングランド  バイオラブ（ＮＥＢ）社製）により消化したあと、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ、タカラバイオ社製）により脱リン酸化処理を行った。【００３６】
２９３Ｔ／１７細胞由来、低分子ＲＮＡ  ３０ｎｇに大腸菌Ｃ７５アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ  Ｃ７５、タカラバイオ社製）を作用させ、脱リン酸化を行った。続いて、この低分子ＲＮＡの３’末端に５’側の６塩基分がＲＮＡ、その他がＤＮＡとなっている配列表の配列番号１に示される合成ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴをＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）で連結した。その後１５％  ＴＢＥ−ウレアゲル（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）で電気泳動を行った。電気泳動後、目的産物の切り出しを行いゲルより分離した。
この合成オリゴ連結低分子ＲＮＡを  Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）を作用させることにより、５’末端のリン酸化を行った。その後５’末端に３’側の６塩基分がＲＮＡ、その他がＤＮＡとなっている配列表の配列番号２に示される合成ＤＮＡ／ＲＮＡ  キメラオリゴをＴ４  ＲＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）で連結した。さらに、１５％  ＴＢＥ−ウレアゲル  （Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社製）で電気泳動を行った。電気泳動後、目的産物のゲル抜きを行いゲルより分離した。【００３７】
この両末端へ合成オリゴを連結させた低分子ＲＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３で示されるプライマーを用いてｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質としてＭ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社製）で逆転写反応を行った。このＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号４で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号５で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を使用し、５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質として行った。このＰＣＲ産物をフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈殿によってＤＮＡを精製した。【００３８】
精製したＰＣＲ産物をＳｆａＮＩ（ＮＥＢ社製）にて消化を行い、ＤＮＡを精製した。このＤＮＡについて１５％  アクリルアミドゲルによる電気泳動を行い、目的のＤＮＡ断片のバンドを切り出し、ゲルよりＤＮＡ断片の抽出を行った。
前記の方法により得られたｃＤＮＡ断片と前述の直鎖化したｐＭＢＳ１とを、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ社製）にて連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。形質転換体の一部をＬＢ−クロラムフェニコールプレートに接種し、生じたコロニー数から独立したクローン数を算出するとともに、残りの形質転換体をＬＢ−クロラムフェニコール含有ＬＢ培地に接種し、クローン数６４万相当の培養物からＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製し、タグライブラリーを得た。【００３９】
実施例２  マイクロビーズの調製
上記のタグライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは５’−メチル化−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを基質とし、プライマーには配列表の配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号７で示されるＦＡＭ標識オリゴヌクレオチドと配列表の配列番号７で示されるビオチン化オリゴヌクレオチドを９：１の比率で混合したものを用い、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  （タカラバイオ社製）にて反応した。ＰＣＲ産物を精製した後、制限酵素ＰａｃＩ（ＮＥＢ社製）による消化を行い、さらに、ｄＧＴＰ存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製）を作用させ、タグ部分の１本鎖化を行った後、ＤＮＡを精製した。【００４０】
１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片３０μｇと、アンチタグが結合したマイクロビーズ（Ｓｏｌｅｘａ社製）７．２×１０７個を混合し、１００μｌの５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１１．６  ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、３．５％  デキストラン硫酸中で６９℃、３日間ハイブリダイズさせた。反応は２本分行った。マイクロビーズを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、２本分のマイクロビーズを１本にまとめた。【００４１】
洗浄後のマイクロビーズにＴ４  ＤＮＡリガーゼを作用させることによって標的ＤＮＡ断片とアンチタグの間に共有結合を形成させた。その後、６００μｇダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）に２５℃で３０分間結合させ、ＭＰＣ（ダイナル社製）に１分間静置した後、上清を除去した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  １ｍｌにて再懸濁し、ＭＰＣ（ダイナル社製）に静置した後、上清を除去するという洗浄操作を繰り返し、１本鎖タグつき標的ＤＮＡ断片の載ったマイクロビーズのみを分離した。【００４２】
分離したマイクロビーズをＭｂｏＩ（タカラバイオ社製）にて消化し、ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジンより切り出した。さらにｄＧＴＰ存在下Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔをマイクロビーズに作用させた後、２等分し、２種類のアダプターＤＮＡをＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。なお、アダプターＤＮＡは、配列表の配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたもの、および配列表の配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号１１で示されるオリゴヌクレオチドをアニールさせたものである。【００４３】
実施例３．ＭＰＳＳ解析によるｍｉｃｒｏＲＮＡ候補配列の抽出
（１）ＭＰＳＳ解析
上記のマイクロビーズを、日本特許公開第２０００−５１５００６号公報およびＢｒｅｎｎｅｒ  Ｓ．他２３名  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００年  ｖｏｌ．１８、ｐ６３０−６３４に開示された技術を用いて、マイクロビーズ上に固定化された標的ＤＮＡの配列２２塩基分を読み取り、同じ配列をまとめて個数を算出した。次に、算出した個数を合計し、個々の配列の個数を合計個数で割り算して１００万を掛け、１００万個あたりの個々の配列の個数を算出した。【００４４】
（２）ＭＰＳＳデータよりの新規ｍｉｃｒｏＲＮＡ候補配列の抽出
上記のＭＰＳＳ解析により得られた４７３７の配列を、ＵＣＳＣゲノムデータベース（http://genome.ucsc.edu）にホモロジー検索を行い、ゲノム配列にマッチした９０６の配列を抽出した。その後、ＳａｎｇｅｒマイクロＲＮＡデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk/）、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）、ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡデータベース（http://www.psb.ugent.be/rRNA/）、ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔＲＮＡデータベース（http://lowelab.ucsc.edu/GtRNAdb/）にホモロジー検索を行い、どのデータベースにもマッチしない２４３の配列を抽出した。その後、抽出した配列がマッチしたゲノム配列情報よりその配列の両末端を８８塩基分延ばし、１９８塩基の配列を取得し、この配列の端から１１０塩基の配列を１塩基ずつずらして、８８の互いに１塩基異なる１１０塩基の配列を作成した。この１１０塩基の配列の２次構造予測をＶｉｅｎｎａ  ＲＮＡ  Ｐａｃｋａｇｅ（http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/）のＲＮＡ  ｆｏｌｄを用いて行い、自由エネルギーが最小で、かつ、ステムループを形成し、かつ、ステム部分にあるＭＰＳＳ解析により得られた２２塩基の配列中１６塩基以上が相補鎖側と相補的であるものを抽出し、４２の新規ｍｉｃｒｏＲＮＡの候補を得た。得られた新規ｍｉｃｒｏＲＮＡ候補より無作為に９種類の配列を選択し、ステムループ配列よりループ配列を得た（配列表の配列番号１２〜２０に示す）。選択した９種類の自由エネルギーは、−８４．１〜−３２．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。【００４５】
実施例４  各種ループ配列を有するｓｈＲＮＡ発現ベクターの作製
緑色蛍光タンパク質ｒｓＧＦＰの標的配列Ａ（ＧＧＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＧ）（配列番号２７）および標的配列Ｂ（ＧＡＣＡＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧ）（配列番号２８）に対するｓｈＲＮＡ発現ベクターを以下の手順で作製した。標的配列について配列番号１２から２０のループ配列を有するステムループ構造のｓｈＲＮＡ（すなわち、いずれかのループ配列の両端に配列番号２７または２８の配列およびその逆方向の相補配列が連結したＲＮＡ）を発現するための合成オリゴＤＮＡを発現ベクターｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６（タカラバイオ社製）のｈＵ６プロモーターの下流に、製品説明書の手順に従って挿入しプラスミドベクターを構築した。対照として、これまでｓｈＲＮＡ発現ベクターのループ構造に利用されていた、配列番号２１に示す配列のループ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  ２９６：５５０−５５３．）を発現するベクターを作製した。ネガティブコントロールとして、何も挿入しないベクターを作製した。得られた各種ベクターは大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして供した。【００４６】
実施例５  各種ループ配列を有するｓｈＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
実施例４で調製したプラスミドベクターを２９３Ｔ／１７細胞に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、使用するまで−８０℃超低温フリーザーで保存した。【００４７】
実施例６  レトロウイルスベクターによる遺伝子抑制効果の確認
標的遺伝子ｒｓＧＦＰを安定に発現しているＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）およびＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）は以下の手順で作製した。
ｒｓＧＦＰ発現ベクターｐＱＢＩ２５（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、７７５ｂｐのＧＦＰ遺伝子断片を得た。次にｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで切断してｒｓＧＦＰ−ＮｅｏＲ融合遺伝子を除去し、先に得た７７５ｂｐのｒｓＧＦＰ遺伝子断片を挿入し、ｐｏｌＩＩプロモーター制御下でｒｓＧＦＰ遺伝子が発現するベクターｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を得た。ｐＱＢＩ  ｐｏｌＩＩ（ｎｅｏ−）を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、ｐｏｌＩＩプロモーター制御下、ＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片を得、その末端をＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｈＩで消化して得られたベクター断片４．５８ｋｂｐの末端をＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したｐｏｌＩＩプロモーター制御下ｒｓＧＦＰ発現ユニットを含むＤＮＡ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて挿入し、ｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＧ−ｐｏｌＩＩを得た。また、平滑化したベクターに平滑化したＧＦＰ遺伝子を挿入してｒｓＧＦＰ発現組換えレトロウイルスベクターｐＤＯＧを得た。【００４８】
これらプラスミドベクターをレトロウイルス調製用細胞Ｇ３Ｔ−ｈｉ（タカラバイオ社製）に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏを用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、使用するまで−８０℃超低温フリーザーで保存した。
ＨＴ１０８０細胞を６穴組織培養用プレート（岩城硝子社製）に、１ウェルあたり５×１０４個播種し、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地中で５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間培養した。【００４９】
アンフォトロピックＤＯＧウイルス液を段階希釈し、ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン；シグマ社製）８μｇ／ｍｌ存在下で感染を行った。感染後３日間培養し、ＧＦＰ発現をフローサイトメーター（ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で分析し、導入効率２０％以下のサンプルからＧＦＰ陽性細胞をソーティングにより回収し、培養を行い、ＧＦＰ安定発現細胞ＨＴ１０８０−ＧＦＰとした。
Ｋ５６２細胞は１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。【００５０】
アンフォトロピックＤＯＧ−ｐｏｌＩＩウイルス液を段階希釈し、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）を用いた標準的な方法で感染を行った。感染後３日間培養し、ＧＦＰ発現をフローサイトメーターで分析し、導入効率２０％以下のサンプルからＧＦＰ陽性細胞をソーティングにより回収し、培養を行い、ＧＦＰ安定発現細胞Ｋ５６２−ＧＦＰとした。【００５１】
このようにして調製したＨＴ１０８０−ＧＦＰおよびＫ５６２−ＧＦＰに実施例５で調製したレトロウイルスベクターを感染した。ＨＴ１０８０−ＧＦＰにはウイルスベクターを１０倍および１００倍希釈し、ポリブレン８μｇ／ｍｌ存在下で感染を行った。Ｋ５６２−ＧＦＰにはウイルスベクターを原液および１０倍希釈し、レトロネクチンを用いた標準的な方法で感染を行った。感染から２４時間経過した後、ＨＴ１０８０−ＧＦＰはＧ４１８（ジェネティシン；インビトロジェン社製）を５００μｇ／ｍｌ含有する増殖培地に、Ｋ５６２−ＧＦＰはＧ４１８を１０００μｇ／ｍｌ含有する増殖培地に交換し、２週間選択培養を行った。
２週間選択培養し、ｓｉＲＮＡを安定に発現している細胞を獲得後、フローサイトメーターで分析し、ＧＦＰの蛍光強度を算出した。対照実験群の蛍光強度に対する各実験群での蛍光強度の割合を算出することによって遺伝子抑制効果を評価した。標的配列ＡでのＨＴ１０８０−ＧＦＰの結果を図１に、標的配列ＡでのＫ５６２−ＧＦＰの結果を図２に示す。標的配列ＢでのＨＴ１０８０−ＧＦＰの結果を図３に、標的配列ＢでのＫ５６２−ＧＦＰの結果を図４に示す。図中、縦軸はＧＦＰの蛍光強度についてネガティブコントロール（Negative control）を１００としたときの相対値で示す（Relative GFP mean (%)）。横軸の数字は配列番号を示す。図に示されるように、配列番号２１に示されるループ配列と比較して、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０に示されるループ配列の遺伝子抑制効果が高いことが示された。【００５２】
実施例７  各種ループ配列を有するｓｈＲＮＡ発現ベクターの作製
ヒトインテグリンα4 の標的配列（ＧＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡ）（配列番号２９）に対するｓｈＲＮＡ発現ベクターを以下の手順で作製した。標的配列について実施例４にて使用した配列番号１３、１９、及び近年ｓｉＲＮＡ効果が高いとされよく使用されているｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０のステムループ配列（Ｂｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００４  ３２（３）：１１５４−１１５８）である配列番号２２のループ配列を有するｓｈＲＮＡ（すなわち、いずれかのループ配列の両端に配列番号２９およびその逆方向の相補配列が連結したＲＮＡ）を発現するための合成オリゴＤＮＡを発現ベクターｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６（タカラバイオ社製）のｈＵ６プロモーターの下流に、製品説明書の手順に従って挿入しプラスミドベクターを構築した。対照として、これまでｓｈＲＮＡ発現ベクターのループ構造に利用されていた、配列番号２１に示す配列のループ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  ２９６：５５０−５５３．）を発現するベクターを作製した。ネガティブコントロールとして、実施例4で作製した配列番号２７に示すｒｓＧＦＰの標的配列Ａと配列番号２１に示す配列のループを有するプラスミドベクターを使用した。得られた各種ベクターにて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、プラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、トランスフェクション用ＤＮＡとして供した。【００５３】
実施例８  各種ループ配列を有するｓｈＲＮＡ発現レトロウイルスベクターの作製
実施例７で調製したプラスミドベクターをレトロウイルス調製用細胞Ｇ３Ｔ−ｈｉ（タカラバイオ社製）に、Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ａｍｐｈｏ（タカラバイオ社製）を用いて製品プロトコールに従いトランスフェクションし、各種アンフォトロピックウイルス上清液を獲得し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｅｘ  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、使用するまで−８０℃超低温フリーザーで保存した。各ウイルス作製は２例ずつ行った。【００５４】
実施例９  レトロウイルスベクターのタイター測定
実施例８で調製したレトロウイルスベクターを段階希釈し、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）へポリブレン８μｇ／ｍｌ存在下で感染させ、感染から２４時間経過した後、Ｇ４１８（ジェネティシン；インビトロジェン社製）を５００μｇ／ｍｌ含有する増殖培地に交換し、２週間選択培養を行った。形成されたコロニー数よりレトロウイルスベクターのタイターを算出した。【００５５】
実施例１０  レトロウイルスベクターによる遺伝子抑制効果の確認
ＨＬ６０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４０）細胞に実施例８で調製し、実施例９にてタイター測定を行ったレトロウイルスベクターをＭＯＩ２にてレトロネクチンを用いた標準的な方法で感染を行った。感染から２４時間経過した後、Ｇ４１８を１０００μｇ／ｍｌ含有する増殖培地に交換し、２週間選択培養を行った。【００５６】
２週間選択培養し、ｓｉＲＮＡを安定に発現している細胞を回収し、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(キアゲン社製)にて全ＲＮＡの抽出及びＤＮＡｓｅＩ処理を行った。抽出した全ＲＮＡをランダムプライマー（６ｍｅｒ）を用いて、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｍ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）にて逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）及び 配列番号２３、２４のインテグリンα４増幅用プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、インテグリンα４の遺伝子発現量の相対値を算出した。全ＲＮＡ量の補正は配列番号２５、２６のＧＡＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーを用いて行った。【００５７】
対照実験群のインテグリンα４発現相対値に対する各実験群での発現相対値の割合を算出することによって遺伝子抑制効果を評価した。結果を図５に示す。図中、縦軸はインテグリンα４発現量についてネガティブコントロール（Negative control）を１００としたときの相対値で示す（Relative integrin α4 mean (%)）。横軸の数字は配列番号を示す。図５に示されるように、配列番号２１に示されるループ配列、配列番号２２に示されるｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０のループ配列と比較して、配列番号１３、１９、に示されるループ配列の遺伝子抑制効果が高いことが示された。さらに今回比較したループ配列の遺伝子抑制効果の高さの順番は、実施例４、５、６にて行ったＧＦＰに対する遺伝子抑制効果の結果と一致した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、遺伝子抑制に有用なｓｈＲＮＡのループ領域をコードする核酸を簡便にスクリーニングすることが可能となる。さらに、遺伝子抑制に有用で、従来使用されているｓｈＲＮＡのループ配列よりも遺伝子抑制作用の大きいｓｈＲＮＡのループ領域をコードする核酸、該核酸を含有するベクター、前記核酸またはベクターを含有するキットを提供することが可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1: Synthetic chimera oligonucleotide. "nucleotide 1 to 6 are ribonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:2: Synthetic chimera oligonucleotide. "nucleotide 17 to 22 are ribonucleotide-other nucleotides are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:3: Synthetic primer for revearse transcription.
SEQ ID NO:4: Synthetic primer.
SEQ ID NO:5: Synthetic primer.
SEQ ID NO:6: Synthetic primer.
SEQ ID NO:7: Synthetic primer.
SEQ ID NO:8: Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA.
SEQ ID NO:9: Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA.
SEQ ID NO:10: Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA.
SEQ ID NO:11: Synthetic oligonucleotide for adaptor DNA.
SEQ ID NO:12: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:13: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:14: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:15: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:16: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:17: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:18: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:19: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:20: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:21: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:22: Nucleotide sequence for loop region of shRNA.
SEQ ID NO:23: Synthetic primer for amplification of integrin alpha 4 gene
SEQ ID NO:24: Synthetic primer for amplification of integrin alpha 4 gene
SEQ ID NO:25: Synthetic primer for amplification of GAPDH gene
SEQ ID NO:26: Synthetic primer for amplification of GAPDH gene
SEQ ID NO:27: Green fluorescence protein rsGFP target sequence A
SEQ ID NO:28: Green fluorescence protein rsGFP target sequence B
SEQ ID NO:29: Human integrin alpha 4 target sequence
【図１】
0005139067.tif 000002
【図２】
0005139067.tif 000003
【図３】
0005139067.tif 000004
【図４】
0005139067.tif 000005
【図５】
0005139067.tif 000006
【配列表】
0005139067000001.app