(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進剤、アクアポリン３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤、及び、アデノシン三リン酸産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、角化細胞の分裂とその後の分化により、常に新しい角質細胞を作り出すことで、外界からの種々の刺激から皮膚を守る防御機能を有する。特に、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン等のタンパク質が発現し、酵素トランスグルタミナーゼ−１の作用によって架橋され、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）を形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１或いはインボルクリンの産生量が減少すると、コーニファイドエンベロープ（ＣＥ）形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるインボルクリンやトランスグルタミナーゼ−１の産生を高め、コーニファイドエンベロープの形成を促進して角化を正常化することによれば、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。
【０００３】
また、角層の構造はレンガとモルタルに例えられ、約１５層ほどに積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で、強固なバリア膜を形成している。角質の細胞間脂質は、外部からの異物の侵入や、内部からの水分の蒸発を防ぐ働き（バリア機能、及び水分保持機能）を有し、約５０％のセラミド、約３０％のコレステロール、約２０％の遊離脂肪酸等から構成される。セラミドは、表皮細胞の角化の過程において、セリンとパルミトイル−ＣｏＡを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をはじめとした酵素の働きにより生成されることが知られている。また、コレステロールは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）をはじめとした酵素の働きにより生成されることが知られている。
最近の研究において、加齢、或いはバリア障害として知られるアトピー性皮膚炎患者で、この細胞間脂質の減少や組成変化が報告されており（非特許文献１参照）、バリア機能の維持、改善にセラミドやコレステロールが重要であることが広く認識されるようになった。例えば、バリア機能を改善する方法として、セラミドを外部から補う方法（非特許文献２参照）や、皮膚内部においてセラミド産生能を高める方法（非特許文献３参照）などが種々検討されている。
このようなことから、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼや、コレステロールの律速酵素として知られるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の産生を促進することによれば、細胞間脂質の構成成分であるセラミドやコレステロールの産生能を高め、皮膚のバリア機能や水分保持機能を向上させ、乾燥肌、肌荒れ、小じわ、アトピー性皮膚炎など、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。
【０００４】
また、ＩＶ型コラーゲンは、肌の表皮と真皮との間に存在する基底膜に多く含まれ、平面的な網目状のネットワークを形成し、基底膜の構造を支えていると考えられている。このＩＶ型コラーゲンの産生を高めることによれば、基底膜の構造を保持する機能を高め、皮膚バリア機能の強化を図ることができると考えられる。
また、アクアポリン３（ＡＱＰ３）は、表皮細胞における水の通り道として知られる膜タンパク質である。アクアポリン３の産生を高めることによれば、水分の通り道をケアすることにより、肌の潤いを高め、皮膚のバリア機能の強化を図ることができると考えられる。
また、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）は、生体内で用いられるエネルギー成分である。ＡＴＰの産生を高めることによれば、肌細胞に活力を与え、結果的にくすんだ肌や疲れた肌の改善など、様々な皮膚症状の予防・改善に繋がると考えられる。
【０００５】
このように、ＩＶ型コラーゲン、トランスグルタミナーゼ−１、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、アクアポリン３、インボルクリン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び、アデノシン三リン酸の産生を促進することのできる物質は、非常に有用であることが考えられる。しかしながら、従来においては、前記したような産生促進作用を有し、かつ安全性が高く、そのため、皮膚外用剤、美容用飲食品、研究用試薬などの成分として広く利用が可能な優れた物質は、未だ見出されていないのが現状である。
【０００６】
【非特許文献１】Ａｋｉｍｏｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（１９９３）２０，１
【非特許文献２】Ｋｅｎｙａ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，フレグランスジャーナル（２００４）１１；２３−３２
【非特許文献３】Ｔａｎｎｏ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２０００）１４３，５２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。  即ち、本発明は、第一に、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＩＶ型コラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、かつ安全性の高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第三に、優れたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用を有し、かつ安全性の高いセリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第四に、優れたアクアポリン３産生促進作用を有し、かつ安全性の高いアクアポリン３産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第五に、優れたインボルクリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いインボルクリン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第六に、優れたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第七に、優れたアデノシン三リン酸産生促進作用を有し、かつ安全性の高いアデノシン三リン酸産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ローヤルゼリー抽出物が、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用、アクアポリン３産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進作用、及び、アデノシン三リン酸産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
ローヤルゼリーは、更年期障害の改善、老化防止、免疫力向上等の目的で、従来から栄養補助食品等に配合され、使用されているが、従来の技術においては、ローヤルゼリーがどのような作用を介してそれらの効果を発揮するかについて、何ら解明がなされていなかった。本発明は、ローヤルゼリー抽出物が、前記したような具体的な各作用を有していることを見出したことに基づくものであり、これにより、各作用に基づくローヤルゼリー抽出物の、新たな利用の可能性をも提供することができる。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＩＶ型コラーゲン産生促進剤である。
＜２＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤である。
＜３＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進剤である。
＜４＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアクアポリン３産生促進剤である。
＜５＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするインボルクリン産生促進剤である。
＜６＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤である。
＜７＞  ローヤルゼリー抽出物を有効成分として含有することを特徴とするアデノシン三リン酸産生促進剤である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、前記目的を達成することができる。
即ち、本発明によると、第一に、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＩＶ型コラーゲン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第二に、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有し、かつ安全性の高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第三に、優れたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用を有し、かつ安全性の高いセリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第四に、優れたアクアポリン３産生促進作用を有し、かつ安全性の高いアクアポリン３産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第五に、優れたインボルクリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いインボルクリン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第六に、優れたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進作用を有し、かつ安全性の高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第七に、優れたアデノシン三リン酸産生促進作用を有し、かつ安全性の高いアデノシン三リン酸産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進剤、アクアポリン３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進剤、アデノシン三リン酸産生促進剤）
本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（以下、ＳＰＴ）産生促進剤、アクアポリン３（以下、ＡＱＰ３）産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（以下、ＨＭＧＣＲ）産生促進剤、及び、アデノシン三リン酸（以下、ＡＴＰ）産生促進剤は、ローヤルゼリー抽出物を含有してなり、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
前記ローヤルゼリー抽出物が含有する、前記各作用（ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、ＳＰＴ産生促進作用、ＡＱＰ３産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、ＨＭＧＣＲ産生促進作用、及び、ＡＴＰ産生促進作用）を発揮する物質の詳細については不明であるが、前記ローヤルゼリー抽出物がこのような優れた作用を有することは、従来には知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１２】
前記ローヤルゼリーは、ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ）ミツバチ属（Ａｐｉｓ）に属する昆虫の咽頭腺からの分泌物であり、女王蜂のエネルギー源として供給されるため、高タンパクで、ビタミン、ミネラル、アミノ酸等の様々な栄養素を含むことが広く知られている。前記ローヤルゼリーは、前記昆虫を飼育することにより常法に従い採取することもできるし、また、市販品として入手することもできる。
【００１３】
抽出原料となる前記ローヤルゼリーは、採取した生の状態で（生ローヤルゼリー）溶媒抽出に供してもよいし、乾燥した状態で溶媒抽出に供してもよい。また、乾燥した後に、そのままの状態で又は粗砕機等を用いて粉砕した状態で、溶媒抽出に供することができる。前記乾燥は、例えば、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。なお、前記ローヤルゼリーは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、前記ローヤルゼリーの極性溶媒による抽出処理を、効率よく行うことができる。
【００１４】
前記ローヤルゼリーの抽出物は、ローヤルゼリーの抽出に一般に用いられる方法を利用することによって、容易に得ることができる。また、前記ローヤルゼリーの抽出物としては、市販品を使用してもよい。なお、前記ローヤルゼリーの抽出物には、前記ローヤルゼリーの抽出液、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又は、これらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１５】
前記抽出に用いる溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、親水性有機溶媒、又は、これらの混合溶媒を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。前記ローヤルゼリーに含まれる前記各作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって、容易に抽出することができる。
【００１６】
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。したがって、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１７】
前記抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール；スクワラン、ホホバ油等の天然オイルなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒なども用いることができる。なお、前記水と前記親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する際には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部を混合したものを使用することが好ましい。また、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部を混合したものを使用することが好ましい。
【００１８】
抽出原料である前記ローヤルゼリーから、前記各作用を有する抽出物を抽出するにあたって、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤の有効成分として用いることができる。
【００１９】
抽出により得られる前記ローヤルゼリーの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。なお、得られる前記ローヤルゼリーの抽出液は、そのままでも前記ＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、常法を利用することができ、また、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、抽出原料である前記ローヤルゼリーは特有の匂いと味を有しているため、前記ローヤルゼリーの抽出物に対しては、生理活性の低下を招かない範囲で、脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、例えば皮膚化粧料に添加する場合などには大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２０】
以上のようにして得られる前記ローヤルゼリー抽出物は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、ＳＰＴ産生促進作用、ＡＱＰ３産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、ＨＭＧＣＲ産生促進作用、及び、ＡＴＰ産生促進作用を有し、これらの作用に基づき、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤の有効成分として好適に利用可能なものである。
【００２１】
なお、前記各剤中の前記ローヤルゼリー抽出物の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記各剤は、前記ローヤルゼリー抽出物そのものであってもよい。
【００２２】
また、前記各剤中に含まれ得る、前記ローヤルゼリー抽出物以外のその他の成分としても、本発明の効果を損なわない範囲内であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ローヤルゼリー抽出物を所望の濃度に希釈等するための、生理食塩液などが挙げられる。また、前記各剤は、前記その他の成分として、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、ＳＰＴ産生促進作用、ＡＱＰ３産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、ＨＭＧＣＲ産生促進作用、及び、ＡＴＰ産生促進作用を有する、前記ローヤルゼリー抽出物以外の天然抽出物等を含んでいてもよい。前記各剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
また、前記各剤は、必要に応じて製剤化することにより、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。
【００２４】
前記ＩＶ型コラーゲン産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、ＩＶ型コラーゲン産生促進作用を発揮する。
前記トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮する。
前記ＳＰＴ産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、ＳＰＴ産生促進作用を発揮する。
前記ＡＱＰ３産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、ＡＱＰ３産生促進作用を発揮する。
前記インボルクリン産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、インボルクリン産生促進作用を発揮する。
前記ＨＭＧＣＲ産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、ＨＭＧＣＲ産生促進作用を発揮する。
前記ＡＴＰ産生促進剤は、有効成分として含有されるローヤルゼリー抽出物の作用により、ＡＴＰ産生促進作用を発揮する。
【００２５】
本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤によると、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を通じて、例えば、肌の表皮と真皮との間に存在する基底膜の構造を保持する機能を高め、皮膚バリア機能の強化を図ることが可能となる。ただし、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤は、これらの用途以外にもＩＶ型コラーゲン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００２６】
本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤によると、優れたトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を通じて、例えば、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のトランスグルタミナーゼ−１産生促進剤は、これらの用途以外にもトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００２７】
本発明のＳＰＴ産生促進剤によると、優れたＳＰＴ産生促進作用を通じて、例えば、角質の細胞間脂質の構成成分であるセラミドの産生能を高め、皮膚のバリア機能や水分保持機能を向上させ、乾燥肌、肌荒れ、小じわ、アトピー性皮膚炎など、様々な皮膚症状を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のＳＰＴ産生促進剤は、これらの用途以外にもＳＰＴ産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００２８】
本発明のＡＱＰ３産生促進剤によると、優れたＡＱＰ３産生促進作用を通じて、例えば、表皮細胞における水分の通り道をケアし、肌の潤いを高め、皮膚のバリア機能の強化を図ることが可能となる。ただし、本発明のＡＱＰ３産生促進剤は、これらの用途以外にもＡＱＰ３産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００２９】
本発明のインボルクリン産生促進剤によると、優れたインボルクリン産生促進作用を通じて、例えば、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（ＣＥ）の形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のインボルクリン産生促進剤は、これらの用途以外にもインボルクリン産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３０】
本発明のＨＭＧＣＲ産生促進剤によると、優れたＨＭＧＣＲ産生促進作用を通じて、例えば、角質の細胞間脂質の構成成分であるコレステロールの産生能を高め、皮膚のバリア機能や水分保持機能を向上させ、乾燥肌、肌荒れ、小じわ、アトピー性皮膚炎など、様々な皮膚症状を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のＨＭＧＣＲ産生促進剤は、これらの用途以外にもＨＭＧＣＲ産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３１】
本発明のＡＴＰ産生促進剤によると、優れたＡＴＰ産生促進作用を通じて、例えば、肌細胞に活力を与え、結果的にくすんだ肌や疲れた肌の改善など、様々な皮膚症状を予防・改善することが可能となる。ただし、本発明のＡＴＰ産生促進剤は、これらの用途以外にもＡＴＰ産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。
【００３２】
なお、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、サルなど）に対して適用することもできる。
【００３３】
本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、例えば、皮膚外用剤に配合するのに好適である。ここで、前記皮膚外用剤としては、その区分に制限はなく、皮膚化粧料、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものであり、具体的には、例えば、軟膏、クリーム、乳液、美容液、ローション、パック、ファンデーション、リップクリーム、入浴剤、ヘアートニック、ヘアーローション、石鹸、ボディシャンプーなどが挙げられる。
【００３４】
また、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤は、優れた作用を有するとともに、経口的に摂取した場合の安全性にも優れているため、例えば、美容用飲食品に配合するのに好適である。ここで、前記美容用飲食品としては、その区分に制限はなく、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものである。
【００３５】
また、本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤は、優れた作用を有するので、ＩＶ型コラーゲン、トランスグルタミナーゼ−１、ＳＰＴ、ＡＱＰ３、インボルクリン、ＨＭＧＣＲ、及び、ＡＴＰの機能の研究や、ＩＶ型コラーゲン、トランスグルタミナーゼ−１、ＳＰＴ、ＡＱＰ３、インボルクリン、ＨＭＧＣＲ、及び、ＡＴＰに関連する疾患の研究のための試薬としても好適に利用可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明の製造例及び実施例を説明するが、本発明は、これらの製造例及び実施例に何ら限定されるものではない。
【００３７】
（製造例１：ローヤルゼリー抽出物（液状）の製造）
ヨーロッパミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｉｆｉｃａ  Ｌ．）の咽頭部から分泌されるローヤルゼリー（生の状態のもの）１ｋｇに５０ｖ／ｖ％エタノール９．５Ｌを加えて、１０℃にて５時間撹拌した。これを５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上澄液を集め、冷所にて１ヶ月間放置した。これをろ過し、ろ液に５０ｖ／ｖ％エタノールを追加し、全量を１０Ｌとした。
【００３８】
（製造例２：ローヤルゼリー抽出物（液状）の製造）
ヨーロッパミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｉｆｉｃａ  Ｌ．）の咽頭部から分泌されるローヤルゼリー（乾燥させた状態のもの）１ｋｇに５０ｖ／ｖ％エタノール９．５Ｌを加えて、１０℃にて５時間撹拌した。これを５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上澄液を集め、冷所にて１ヶ月間放置した。これをろ過し、ろ液に５０ｖ／ｖ％エタノールを追加し、全量を１０Ｌとした。
【００３９】
（製造例３：ローヤルゼリー抽出物（凍結乾燥品）の製造）
ヨーロッパミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｉｆｉｃａ  Ｌ．）の咽頭部から分泌されるローヤルゼリー（生の状態のもの）１ｋｇに５０ｖ／ｖ％エタノール９．５Ｌを加えて、１０℃にて５時間撹拌した。これを５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上澄液を集め、冷所にて１ヶ月間放置した。これをろ過し、ろ液に５０ｖ／ｖ％エタノールを追加し、全量を１０Ｌとした。これを真空凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た。
【００４０】
（製造例４：ローヤルゼリー抽出物（凍結乾燥品）の製造）
ヨーロッパミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｉｆｉｃａ  Ｌ．）の咽頭部から分泌されるローヤルゼリー（乾燥させた状態のもの）１ｋｇに５０ｖ／ｖ％エタノール９．５Ｌを加えて、１０℃にて５時間撹拌した。これを５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、得られた上澄液を集め、冷所にて１ヶ月間放置した。これをろ過し、ろ液に５０ｖ／ｖ％エタノールを追加し、全量を１０Ｌとした。これを真空凍結乾燥し、凍結乾燥物を得た。
【００４１】
（参考例１：ＩＶ型コラーゲン産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＩＶ型コラーゲン産生促進作用を試験した。
【００４２】
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１５０μＬ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のＩＶ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表１に示す。
ＩＶ型コラーゲン産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
ＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のＩＶ型コラーゲン量
Ｂ：被験試料無添加時のＩＶ型コラーゲン量
【００４３】
【表１】
0005235439.tif 000002
【００４４】
表１の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが認められた。
【００４５】
（参考例２：トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を試験した。
【００４６】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、２日間培養した。培養終了後、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、２４時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したトランスグルタミナーゼ−１の量をモノクローナル抗ヒトトランスグルタミナーゼ−１抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表２に示す。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
トランスグルタミナーゼ−１産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度
【００４７】
【表２】
0005235439.tif 000003
【００４８】
表２の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いトランスグルタミナーゼ−１産生促進作用を有することが認められた。
【００４９】
（参考例３：セリンパルミトイルトランスフェラーゼ産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）産生促進作用を試験した。
【００５０】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間（製造例１〜２のローヤルゼリー抽出物を被験試料とした場合）、又は、４８時間（製造例３〜４のローヤルゼリー抽出物を被験試料とした場合）培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＳＰＴ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＳＰＴの発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。結果を表３に示す。
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用の計算方法は以下の通りである。
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：被験試料無添加時の補正値
【００５１】
【表３】
0005235439.tif 000004
【００５２】
表３の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）産生促進作用を有することが認められた。
【００５３】
（参考例４：アクアポリン３産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりアクアポリン３（ＡＱＰ３）産生促進作用を試験した。
【００５４】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間（製造例１〜２のローヤルゼリー抽出物を被験試料とした場合）、又は、４８時間（製造例３〜４のローヤルゼリー抽出物を被験試料とした場合）培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。結果を表４に示す。
ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用の計算方法は以下の通りである。
ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：被験試料無添加時の補正値
【００５５】
【表４】
0005235439.tif 000005
【００５６】
表４の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いアクアポリン３（ＡＱＰ３）産生促進作用を有することが認められた。
【００５７】
（参考例５：インボルクリン産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりインボルクリン産生促進作用を試験した。
【００５８】
ヒト正常新生児皮膚表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をヒト正常新生児表皮角化細胞用培地（ＫＧＭ）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるようにＫＧＭで希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり２００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２００μＬ添加し、４８時間培養した。培養終了後、培地を抜き、細胞をプレートに固定させ細胞表面に発現したインボルクリンの量をモノクローナル抗ヒトインボルクリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表５に示す。
インボルクリン産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
インボルクリン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）の波長４０５ｎｍにおける吸光度
【００５９】
【表５】
0005235439.tif 000006
【００６０】
表５の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いインボルクリン産生促進作用を有することが認められた。
【００６１】
（実施例６：ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）産生促進作用を試験した。
【００６２】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２を用いて３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／シャーレずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で必要濃度に溶解した被験試料を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１−０２５０１）にてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＨＭＧＣＲ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＨＭＧＣＲの発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。結果を表６に示す。
ＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進作用の計算方法は以下の通りである。
ＨＭＧＣＲｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時の補正値
Ｂ：被験試料無添加時の補正値
【００６３】
【表６】
0005235439.tif 000007
【００６４】
表６の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）産生促進作用を有することが認められた。
【００６５】
（参考例７：アデノシン三リン酸産生促進作用試験）
前記製造例３のローヤルゼリー抽出物を被験試料として用い、下記の試験方法によりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生促進作用を試験した。
【００６６】
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２）を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度にＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で希釈した後、コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、ＥｐｉＬｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、２時間培養した。ＡＴＰ産生促進作用は、ホタルルシフェラーゼ発光法を用いて細胞内のＡＴＰ量を測定した。すなわち、培養終了後、『「細胞の」ＡＴＰ測定試薬』（東洋ビーネット社）を各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した。反応後、化学発光量を測定した。結果を表７に示す。
ＡＴＰ産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
ＡＴＰ産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料を添加した細胞での化学発光量
Ｂ：被験試料を添加しない細胞での化学発光量
【００６７】
【表７】
0005235439.tif 000008
【００６８】
表７の結果から、ローヤルゼリー抽出物が、高いアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生促進作用を有することが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のＩＶ型コラーゲン産生促進剤、トランスグルタミナーゼ−１産生促進剤、ＳＰＴ産生促進剤、ＡＱＰ３産生促進剤、インボルクリン産生促進剤、ＨＭＧＣＲ産生促進剤、及び、ＡＴＰ産生促進剤は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用、トランスグルタミナーゼ−１産生促進作用、ＳＰＴ産生促進作用、ＡＱＰ３産生促進作用、インボルクリン産生促進作用、ＨＭＧＣＲ産生促進作用、及び、ＡＴＰ産生促進作用を有し、かつ安全性にも優れるので、例えば、皮膚外用剤、美容用飲食品中の成分や、研究用の試薬として好適に利用可能である。