(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
−有効成分を含有する有機溶媒に溶解したポリマーの制御された脱溶媒、即ち、コアセルベーションの工程、このコアセルベーションは非溶媒の添加により引き起こされ、かつ前記有効成分の表面での該ポリマーの析出を生ずる、次に
−硬化剤の添加によるポリマー析出物の硬化工程、この硬化は前記有効成分を被覆する連続皮膜の形成を生ずる、
からなる、コアセルベーションによる有効成分のマイクロカプセル化方法であって:
−ポリマーの溶媒が、沸点30〜240℃で比誘電率が４〜60の非塩素化有機溶媒であり、
−非溶媒と硬化剤が、それぞれ下記の対：1,2-プロパンジオール（ε＝18〜24）と2-プロパノール、グリセロール（ε＝40）と1,2-プロパンジオール、グリセロールと2-プロパノール、2-プロパノール（ε＝18）と1,2-プロパンジオールから選ばれるか、又は溶媒が酢酸エチルであり、非溶媒が2-プロパノールであり、硬化剤が水である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリマーが、重量平均分子量（Mw）が10,000〜90,000 g/molの範囲内で、多分散性指数（Ip）が１〜3.5の範囲内の生物分解性ポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリマーが、重量平均分子量（Mw）が15,000〜50,000 g/molの範囲内で、多分散性指数（Ip）が1.5〜2.5の範囲内の生物分解性ポリマーであることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ポリマーが乳酸ポリマー（PLA）または乳酸とグリコール酸とのポリマー（PLAGA）であることを特徴とする、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
ポリマーが、Mwが15,000〜25,000の範囲内、Ipが１〜２の範囲内、グリコール酸の割合が30％未満であるようなPLAGAであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ポリマーが、Mwが17,500に等しく、Ipが1.6に等しく、グリコール酸の割合が25％に等しいようなPLAGAであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
溶媒中のポリマー濃度が１〜10％(w/v)の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
溶媒中のポリマー濃度が４％(w/v)であることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
非溶媒／溶媒の体積比が１／２〜１／１の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
コアセルベーション温度がポリマーのガラス転移温度より低温であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
コアセルベーション温度が25℃以下であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
コアセルベーション温度が４℃未満であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
コアセルベーション温度が−４℃に等しいことを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
硬化剤が界面活性剤も含有しており、硬化剤中の界面活性剤の濃度が0.1〜10％(v/v）の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
界面活性剤がソルビタンエステル、またはポリビニルアルコールであることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
硬化剤／溶媒の体積比が５／１〜180／１の範囲内であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
硬化剤／溶媒の体積比が15／１〜120／１の範囲内であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
生成した微小球（マイクロスフィア）を500〜1500 rpmの速度で攪拌しながら硬化させることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
硬化温度が25℃以下であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
硬化温度が４℃未満であることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
硬化温度が0.5℃以下であることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
コアセルベート液滴がポリマー溶液中で分散液を形成する際に、溶媒と非溶媒がコアセルベート液滴を安定化させるのに十分高い粘度を有することを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
有効成分を超音波により分散させてポリマー溶液中の分散液を形成し、コアセルベーションを穏やかに攪拌しながら行うことを特徴とする、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
コアセルベーションを磁気または機械式攪拌により穏やかに攪拌しながら行うことを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
有効成分の粒度が１〜50μｍの範囲内であることを特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
有効成分の粒度が５〜30μｍの範囲内であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
溶媒が酢酸エチルであることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ポリマーが、Mwが15,000〜20,000の範囲、Ipが１〜２の範囲であるような、75:25 PLAGAであることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ポリマーが、Mwが17,500に等しく、Ipが1.6に等しいような、75:25 PLAGAであることを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
溶媒が、酢酸エチル、N-メチルピロリドン、メチルエチルケトン、酢酸およびプロピレンカーボネート、ならびにこれらの混合物から選ばれた非塩素化有機溶媒であることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、特に徐放性（持効性）薬剤形態(sustained-release pharmaceutical forms)に使用される、コアセルベーションによる有効成分のマイクロカプセル化方法に関する。
【０００２】  マイクロカプセル技術は、非相溶性化学物質どうしを分離するため、液体を粉末に変換させるため、有効成分の生物学的利用能を高めるため、或る種の化合物のいやな味もしくは臭いを隠すため、および徐放性薬剤形態を調製するために従来より利用されている。
【０００３】  徐放性薬剤形態は皮下または筋肉内投与することができ、血流中に直接、または治療すべき器官の近傍に見出しうるが、それとして生物分解性ポリマーが該薬剤形態の組成の一部を構成するために選択されることが多い。
【０００４】  生物分解性ポリマーを利用した徐放性の系は、生物分解性ポリマーが体内で自然経路により排除される代謝産物に転化されるようになるため、外科手術による取り出しをせずに非経口投与することができる。有効成分の放出は、有効成分の拡散とポリマーの分解プロセスにより調節される動力学（反応速度）に従う。さらに、必要となる投与回数が少なくてすむので、患者の治療との適合性（コンプライアンス）が向上する。
【０００５】  有効成分のカプセル化によく利用される生物分解性ポリマーとして、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ乳酸(PLA)およびポリ乳酸−グリコール酸(PLAGA)、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリオルトエステル類、例えば、クロノマー(Chronomer)TMおよびアルザマー(Alzamer)TM、ポリ無水物、特にセバシン酸と（カルボキシフェノキシ）プロパンとのコポリマー、ならびに生物分解性の天然ポリペプチドおよびポリマー、例えば、アルブミン、ウシ血清アルブミン、コラーゲンおよびキトサン、を挙げることができる。
【０００６】  マイクロカプセル化法には下記の２つの主な種類がある：
−無溶媒法、例えば、噴霧凝固、押出（共押し出し／スフェロニゼーション<spheronization>）、ゲル化、超臨界溶液の小球化と沈殿(RESS)、ならびに
−溶媒法、例えば、ネブライゼーション、コアセルベーション、乳化−蒸発、乳化−抽出、および水／油／水二重エマルジョンから出発するそれらの変法。
【０００７】  徐放性薬剤形態は水性媒質と長く接触することから、ポリマーとしては、多少とも疎水性の、従って主に有機媒質中に可溶性のポリマーの使用が正当化される。しかし、徐放性の系に利用される生物分解性ポリマーは、潜在毒性の低い溶媒(ICH規格によるカテゴリー３の溶媒)中での可溶性がよくない。
【０００８】  そのため、標準的なマイクロカプセル化法（コアセルベーションおよび乳化−蒸発）は、ポリマーの溶媒として、塩素化溶媒、例えば、ジクロロメタン(ICHによるカテゴリー２の溶媒、即ち、制限すべき溶媒)を使用せざるを得ない。しかし、塩素化溶媒は神経毒性があると言われている溶媒である。ICH4規格によれば、最終製品中のジクロロメタンの許容残留濃度は600 ppm である。
【０００９】  どのマイクロカプセル化法を利用するにせよ、得られた微粒子は残留量の溶媒を含有する。従って、塩素化溶媒を利用しない新規なマイクロカプセル化方法を開発することが必要なようである。この問題を解決するのに２つの主要な解決策がある。
【００１０】  塩素化溶媒を使用せずにカプセル化を達成するための１つの解決策は、溶媒を使用しない方法に基づくが、このような方法では或る種のポリマーは使用することができない。また、このような方法で得られた粒子の特性は、必ずしも長期治療の要求を満たさない。
【００１１】  別の解決策は、塩素化溶媒の代わりに無毒な溶媒を使用することである。塩素化溶媒を使用するマイクロカプセル化方法は広く研究され、多くの変法が知られている。しかし、塩素化溶媒を非塩素化溶媒で置換すると、処方組成物の各種成分の間の物理化学的相互作用が変化する。生物分解性ポリマーの置換溶媒中での挙動は、塩素化溶媒中での挙動とは非常に異なる。例えば、ポリ(L−ラクチド)およびポリ(D,L−ラクチド)は酢酸エチルまたはアセトン中で不溶性であり、エタノール中ではどのポリマーも可溶性ではないが、エタノールは毒性が低いため好ましい溶媒である。
【００１２】  本発明は、塩素化溶媒を全く使用しない、コアセルベーションによるマイクロカプセル化方法を提案する。より具体的には、本発明は非溶媒を添加することによるコアセルベーションの方法に関する。非溶媒の添加によるコアセルベーションは、３種類の混和性溶媒の使用を必要とする。これら３種類の溶媒の１つはポリマーに対して溶媒となり、残り２つはポリマーに対して非溶媒となる。
【００１３】  コアセルベーションの原理は、概ね微粒子の形態で有効成分を含有する有機溶媒中に溶解しているポリマーの制御された脱溶媒を、非溶媒またはポリマーコアセルベーション剤(coacervating agent)の添加により誘起させることに基づく。有機溶媒申のポリマーの溶解度が低下し、２つの不混和性の相が生成する：有効成分の表面にはコアセルベートが徐々に沈着する。硬化剤の添加により、有効成分の周囲にポリマーの連続皮膜を生成させることが可能となる。
【００１４】  有効成分の粒子は液体でも固体でもよい。有効成分はまた、最初はポリマーの溶媒に溶解していてもよい。この場合、有効成分はコアセルベーション剤を添加する時に微粒子状に再沈殿するか、またはコアセルベーションから得られたポリマー粒子中で均質な固溶体を形成することができる。
【００１５】  ポリマー／溶媒／コアセルベーション剤の相互作用を各組合わせについて検討することで、効率的なカプセル化に必要な理想的なポリマー／溶媒／コアセルベーション剤の比率を規定するように状態図を作成することが可能となる。しかし、ポリマーと溶媒とコアセルベーション剤の間の分子相互作用に関して、界面特性はコアセルベートの組成につれて絶えず変化するので、有効成分のカプセル化を予測することは困難である(Thomassin C., Merkle H.P., Gander B.A.,コアセルベーションによる生物分解性ポリエステルへのタンパク質マイクロカプセル化を支配する物理化学的パラメータ、 Int. J. Pharm., 1997, 147, 173-186)。
【００１６】  コアセルベーション法の主な問題点は、粒子の凝集が起こりうることである。この問題を解決する試みとして、上記発表者は、本質的に硬化工程において、系の温度を低下させることを提案した。そうすると、壁は付着防止に十分な固さとなる。クロロフルオロカーボン(CFC)の使用または温度低下といった解決策は、工業的規模に移しかえることができない。これに対して、シリコーン油の使用はその粘度のために系を安定化することができる(Ruiz J.M., Tissier B., Benoit J.P.,ペプチドのマイクロカプセル化：シリコーン油によるポリ(D,L-乳酸−コ−グリコール酸）コポリマー50/50の相分離の検討，Int. J. Pharm., 1989,49,69-77)。
【００１７】  溶媒の残留含有量が高いにもかかわらず、コアセルベーション法は、依然として、非水媒質中での壊れやすい有効成分、特に水溶性有効成分のカプセル化に好まれる方法となっている。
【００１８】  溶媒／コアセルベーション剤／硬化剤の組合わせの選択は、次の各種の判断基準により左右される：
−溶媒はポリマーを溶解しなければならない。溶媒は有効成分を溶解しない方が好ましいが、ポリマーの溶媒に可溶性の有効成分を用いた処理法を使用することも可能である；
−コアセルベーシヨン剤はポリマーの溶媒と混和性でなければならない。これはポリマーの溶媒であってはならない。さもないと、溶媒からコアセルベーション剤へのポリマーの単なる移転になるであろう。さらに、カプセル化損失を少なくするため、コアセルベーション剤は有効成分を溶解してはならない；
−硬化剤は、抽出を助長するように、ポリマーの溶媒と部分的に混和性でなければならない。これはポリマーと有効成分のいずれも溶解してはならない。さもないと、カプセル化収率が大きく低減するであろう。
【００１９】  従来技術では、コアセルベーション法は、ポリマーの溶媒としてジクロロメタンもしくはクロロホルムを、コアセルベーション剤としてシリコーン油を、そして硬化剤としてヘプタンを使用する。
【００２０】  本発明は、下記工程：
−有効成分を含有する有機溶媒に溶解したポリマーの制御された脱溶媒、即ち、コアセルベーションの工程、このコアセルベーションは非溶媒の添加により引き起こされ、かつ前記有効成分の表面での該ポリマーの析出を生ずる、次に
−硬化剤の添加によるポリマー析出物の硬化工程、この硬化は前記有効成分を被覆する連続皮膜の形成を生ずる、
からなる、コアセルベーションによる有効成分のマイクロカプセル化方法であって：
−ポリマーの溶媒が、沸点が30〜240℃で比誘電率が４〜60の、有利には酢酸エチル、N-メチルピロリドン、メチルエチルケトン、酢酸およびプロピレンカーボネート、ならびにこれらの混合物から選ばれた、非塩素化有機溶媒であり、
−非溶媒が炭素数２〜５、好ましくは炭素数２または３のアルコールまたはケトン、特にエタノール（ε＝24）、2-プロパノール（ε＝18）、1,2-プロパンジオール（ε＝18〜24）およびグリセロール（ε＝40）、またはメチルエチルケトン（ε＝18）、であり、
−硬化剤が、水、炭素数１〜４のアルコール（但し、硬化剤は非溶媒とは異なるアルコールである）、およびこれらの混合物から選ばれる、
ことを特徴とする方法に関する。
【００２１】  N-メチルピロリドンはジクロロメタンと同様にカテゴリー２の溶媒であるが、その制限濃度はずっと高い（ジクロロメタンの600 ppm に対して4840 ppm) 。
有利には、非溶媒と硬化剤は、それぞれ下記の対：1,2-プロパンジオールと2-プロパノール、グリセロールと1,2-プロパンジオール、グリセロールと2-プロパノール、2-プロパノールと1,2-プロパンジオール、から選ばれる。
【００２２】  １好適態様によると、ポリマーは、重量平均分子量(Mw)が10,000〜90,000g/molの範囲内、好ましくは15,000〜50,000 g/molの範囲内で、多分散性指数(Ip,polydispersity index)が１〜3.5の範囲内、好ましくは1.5〜2.5の範囲内である生物分解性ポリマーである。
【００２３】  本発明の各種好適態様を説明するために、他の追加の特徴のいくつかを下に記載する。
これらの追加の特徴によると、ポリマーは乳酸ポリマー(PLA)または乳酸とグリコール酸とのポリマー(PLAGA)である。
【００２４】  ポリマーは、Mwが15,000〜20,000の範囲内、好ましくは17,500に等しく、Ipが１〜２の範囲内、好ましくは1.6に等しく、グリコール酸の割合が３０％未満、好ましくは25％に等しいようなPLAGAである。
【００２５】  溶媒中のポリマー濃度は、１〜10％(w/v)の範囲内、好ましくは約４％(w/v)である。
非溶媒／溶媒の体積比は１／２〜１／１の範囲内である。
【００２６】  コアセルベーション温度は、ポリマーのガラス転移温度より低く、好ましくは25℃以下、好ましくは４℃未満、より好ましくは−４℃以下である。
非溶媒は200μlないし１mlの量ずつ逐次的に添加する。
【００２７】  コアセルベーションは、例えば磁気攪拌により、200〜1000 rpmの速度で攪拌しながら行う。
硬化剤は界面活性剤も含有しており、硬化剤中の界面活性剤の濃度は0.5〜10％(v/v)の範囲内である。
【００２８】  界面活性剤は、ソルビタンエステル、例えば、TweenTM 80、またはポリビニルアルコールである。
硬化剤／溶媒の体積比は５／１〜180／１の範囲内、好ましくは15／１〜120／１の範囲内である。
【００２９】  生成した微小球(microspheres)を、例えば磁気攪拌により、500〜1500 rpmの速度で攪拌しながら硬化させる。
硬化温度は、25℃以下、好ましくは４℃未満、より好ましくは0.5℃以下である。
【００３０】  硬化剤を数回に分けて、好ましくは少なくとも４回に分けて添加する。
硬化を２〜４時間続ける。
硬化操作後に得られた微小球をMillipore（ミリポア）TMシステム、遠心分離、またはひだ付き濾紙により濾過する。
【００３１】  有効成分がポリマー溶液中で分散液を形成する際に、溶媒と非溶媒は有効成分を安定化させるのに十分な高粘度を有する。
有効成分の粒度は、１〜50μｍの範囲内、好ましくは５〜30μｍの範囲内である。
【００３２】  １好適態様によると、溶媒はN-メチルピロリドンであり、非溶媒はエタノールであり、硬化剤は水である。
別の好適態様によると、溶媒は酢酸エチルである、非溶媒は2-プロパノールであり、硬化剤は水である。ポリマーは、Mwが15,000〜20,000の範囲、好ましくは17,500に等しく、Ipが１〜２の範囲、好ましくは1.6に等しいような75:25 PLAGA である。
【００３３】  第３の好適態様によると、溶媒は酢酸であり、硬化剤は水であり、ポリマーは50:50 PLAGA である。
本発明において、有効成分がポリマーの溶媒に不溶性である場合、懸濁液またはエマルジョン（乳濁液）のいずれかを調製する。
【００３４】  懸濁液を調製するには、有効成分を乳鉢を用いて粉砕した後、溶媒に加えて懸濁状態にする。生成した懸濁液を磁気攪拌により均質化（ホモジナイズ）してもよく、その後にコアセルベーションも磁気攪拌しながら行う。懸濁液の均質化は、可変速度の機械攪拌 (翼形攪拌機のハイドルフ(Heidolph) RGF500 、プロラボ社、フランス、パリ) またはウルトラ−チュラックス(Ultra-Turrax)TM T25 混合機(プロラボ社、フランス、パリ)を用いて行ってもよい。後者の２つの場合、その後のコアセルベーションは機械攪拌しながら行う。
【００３５】  ポリマー溶液中の有効成分の分散は、従来と同様に超音波攪拌により行ってもよい。
有効成分が水溶性である場合には、エマルジョンを調製するために、有効成分を水に溶解させた後、ポリマーの水／溶媒エマルジョンを機械攪拌しながら調製する。その後、コアセルベーションを機械攪拌しながら行う。
【００３６】  有効成分がポリマーの溶媒に可溶性である場合、コアセルベーションは機械攪拌しながら行う。
本発明において、ポリマーは、有効成分のカプセル化によく使われる生物分解性ポリマー、好ましくはPLAまたはPLAGA、より好ましくは重量平均分子量(Mw)が10,000〜90,000の範囲内、数平均分子量(Mn)が4,000〜40,000の範囲内、多分散性指数(Ip)が１〜3.5の範囲内、グリコリドの割合が10〜60％の範囲内であるPLAGA である。重量平均分子量が15,000 g/mol以上と高いポリマーは、コアセルベート相の体積の増大により製造収率の増大が可能となることから好ましいであろう。多分散性指数が小さい(Ip≦2.6)のポリマーも好ましいであろう。なぜなら、低分子量の画分は、溶液状態にとどまって収率の低下を生ずるか、または微粒子の表面に付着して微粒子の凝集を生ずるからである。
【００３７】  PLAGA は、例えば、Resomer(レソマー)TM RG 502(ベーリンガー・インゲルハイム、Mw＝14,300 g/mol, Mn＝6900 g/mol, Ip 2.5, 50％グリコリド) 、ResomerTM RG 756 (Mw＝89,800 g/mol, Mn＝35,200 g/mol, Ip 2.6, 25％グリコリド) 、ResomerTM RG 858 (Mw＝87,800 g/mol, Mn＝22,000 g/mol, Ip 3.9, 15％グリコリド) 、フシス(Phusis)により供給されるPhusiline(フシライン)(Mw＝17,500 g/mol, Mn＝10,940 g/mol, Ip 1.6, 25％グリコリド) である。
【００３８】  溶媒中のポリマー濃度は、分散したコアセルベートの液滴を安定化させ、それらの凝集を制限することができる一方、他方では小径微粒子の生成の低減が可能となるように、媒質の粘度を増大させるのに十分な濃度とする必要がある。
【００３９】  ポリマー濃度は好ましくは１〜10％(w/v)の範囲内であり、より好ましくは約４％(w/v)に等しい。
溶媒および非溶媒の粘度はコアセルベート液滴を安定化させるのに十分でなければならない。
【００４０】  非溶媒の添加量（体積量）は、系を安定性の領域内にもたらし、安定なコアセルベートを得るように決定する。ただし、非溶媒の量は、ポリマーの有機溶液中に懸濁している有効成分結晶の濃度にも依存する。
【００４１】  過剰の非溶媒の添加は、微粒子の壁の硬化を促進し、それらの凝集を防止し、溶媒の抽出を改善することができる。
非溶媒の添加速度は、多数の過小微粒子、即ち、粒度１〜２μｍの微粒子、の生成を防止するのに十分な低さとする。また、相分離が遅いほど、微粒子の粒度分布がより均一となり、微粒子の表面がより平滑となる。非溶媒の添加は、好ましくは200 μl ないし１mlずつの量に分けて、各回の添加の間に少なくとも１分の待ち時間をとって、少しずつ行う。
【００４２】  コアセルベーション工程中の攪拌速度を低くすると、生成するコアセルベート液滴の粒度、従って、最終微粒子の粒度が大きくなる。しかし、系に応じて異なる或る制限速度より低くなると、コアセルベートの沈殿の動力学が遅くなり過ぎるか、および／またはコアセルベート液滴が大きくなり過ぎて、十分には安定ではなくなる。200 rpm ないし1000 rpmの範囲内の機械または磁気攪拌が良好な結果を与えることが多い。
【００４３】  温度はコアセルベーションの必須のパラメータであり、温度はポリマーのガラス転移温度より低くしなければならない。温度が低いほど、媒質がより粘稠となり、微粒子の凝集傾向が小さくなる。
【００４４】  理想的な硬化剤は有効成分とポリマーのいずれも溶解すべきではない。硬化剤はポリマーの溶媒を容易に抽出すべきである。使用する硬化剤は水であり、任意にこれに界面活性剤またはアルコールを加えてもよい。水はポリマーの溶媒を容易に抽出するのを可能にする点で有利である。水はまた、安価で、流出物の再処理を必要としないという利点もある。しかし、水溶性の有効成分の場合には水は理想的な硬化剤でない。なぜなら、長期の接触は有効成分の拡散の原因となり、これはカプセル化度の低下となって現れるからである。
【００４５】  カプセル化される有効成分が硬化時に親水性である場合、これは水にすぐに溶解してしまい、水が微粒子内に侵入して、粒子から逆拡散することがある。低温で処理すると、この拡散現象は低減し、従って水相への有効成分の損失が低減し、カプセル化収率が向上する。
【００４６】  有効成分の拡散を低減させるための他の可能性も考えられる：例えば、外相を電解質もしくは安価であるなら有効成分それ自体で飽和させること、および水をポリマーの溶媒に強い親和性を持つ他の溶媒と混合して、微小球を抽出するようにすることである。こうして、水の使用量を少なくし、水との接触を弱める。
【００４７】  界面活性剤またはアルコールは、微粒子の自己凝集を制限し、均質な分散液を形成するようにすることができる。これらは、その無害さを根拠に選択された。界面活性剤は、ポリオキシエチレン化ソルビタンエステル類、例えば、Tween(ツイーン)TM 80 およびTweenTM 20(親水性界面活性剤)といった、注射用処方組成物に慣用のものから選ばれる。
【００４８】  Montanox(モンタノックス)TM 80(ポリオキシエチレン化ソルビタンモノオレエート）は、油／水型エマルジョンの組成物中に使用しうる親水性乳化剤である。
Montane(モンターン)TM 80(ソルビタンオレエート)は、親油性界面活性剤の領域内でのその等価物である。Solutol(ソリュトール)TM HS 15 (ポリエチレングリコール660ヒドロキシステアレート)は、注射用溶液に使用される親水性の非イオン系界面活性剤である。
【００４９】  Synperonic(シンペロニック)TM PE/F 68(ポロキサマー<poloxamer>188)はポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマーである。
最後に、ポリビニルアルコールは、Mowiol(モビオール)TM 4/88 とRhodoviol(ロドビオール)TM 4/125という２種類の異なる等級のものが使用された。
【００５０】  硬化剤の量は妥協に基づく。硬化剤の量は微小球に対して溶媒をすぐに除去するのに十分でなければならないが、微小球からの有効成分の拡散を制限することも必要である。この量は、硬化剤中の溶媒の最終濃度が外相中の溶媒の飽和濃度より低くなるように、外相中の溶媒の溶解度の基準から決められる。溶媒をすばやく除去することにより、ポリマーバリアーの形成によって有効成分の拡散が防止される。さらに、微小球が硬化すると、凝集が防止されよう。
【００５１】  硬化剤を一定間隔で少しずつ添加することによりその量が増大すると、微粒子に対して溶媒をより良好に抽出することが可能となる。
溶媒に対する硬化剤の体積比は、５／１〜180／１の範囲内、好ましくは15／１〜120／１の範囲内である。
【００５２】  ポリマーの溶媒として酢酸またはN-メチルピロリドンを使用した組合わせは、固体微小球を生ずるのに硬化剤をあまり必要としないので、この場合の溶媒に対する硬化剤の体積比は有利には約５／１である。
【００５３】  微粒子を乾燥する方法は、微小球の固さ、寸法（粒度）および処理量に依存する。
微粒子が乾燥後に凝集する傾向は、その水和の程度および残留する溶媒量に依存する。
【００５４】  大気中での乾燥では不十分である場合、微粒子が減圧に耐えることができるなら、減圧および／または昇温により乾燥を完全にすることができる。ただし、微粒子の凝集を避けるために乾燥速度と温度を高くしすぎないように確保する必要がある。
【００５５】  ポリマーの溶媒として酢酸エチルを使用する組合わせの場合、微小球を分離する方法の選択に問題が生ずる。具体的には、微小球は、硬化剤中で１時間攪拌した後でも、なお溶媒をいっぱい含んでいる。細孔度0.5μｍのフィルターを通したMilliporeTM系での濾過は、再分散が困難な固体ケーキを生じてしまう。さらに、こうすると、フィルターはすぐに微小球で詰まってしまい、微小球はなお変形可能なままである。溶液の一部を遠心分離して分離すると、期待された結果を生じなかった。この場合はまた、比較的低い遠心速度でも、微小球が凝集し、再分散できないペレットを形成する。ひだ付き濾紙を用いた別の濾過法が解決策となることがわかっている。この方法は濾過面積が大きいという利点があり、大気厚で実施される。ただし、最小粒度の微小球が濾紙の細孔に吸着されがちであり、濾紙（フィルター）を徐々に閉塞する。また、微小球の全部を回収することも困難である。乾燥に関しては、圧縮空気の気流でこれを行い、その後で微小球を大気中に放置する。
【００５６】  本発明の１態様によると、ポリマーの溶媒は酢酸エチルであり、非溶媒は2-プロパノールであり、硬化剤は水／界面活性剤混合物、場合により水／界面活性剤／アルコール混合物である。
【００５７】  この態様では、ポリマーは好ましくは75:25PLAGA である。ポリマー濃度は１〜５％(w/v) の範囲内であり、好ましくは約４％(w/v) に等しい。コアセルベーションは周囲温度（室温）、好ましくは４℃より低い温度、より好ましくは−４℃以下の温度で、機械攪拌（好ましくは300 rpm）しながら行う。
【００５８】  界面活性剤の濃度は１〜10％(v/v)である。界面活性剤はTweenTM 80である。アルコールを水と併用する場合、界面活性剤濃度は約１〜10％の範囲内に設定し、アルコール濃度は約2.5〜５％の範囲内に設定する。アルコールは有利には2-プロパノールまたは1,2-プロパンジオールである。硬化剤の水溶液を少なくとも４回に分けて添加する。硬化処理は２時間30分以上、４時間以内の時間続け、周囲温度以下、好ましくは４℃以下の温度、より好ましくは0.5℃で、機械攪拌 (500 rpm)しながら行う。
【００５９】  非溶媒／溶媒の体積比は１／２に等しい。硬化剤／溶媒の体積比は120／１に等しい。
硬化温度が低いほど、硬化処理時間は短くなろう。例えば、温度が４℃以下である場合、４時間の処理時間で十分である。温度が0.5℃であると、処理時間は２時間30分に短縮される。
【００６０】  別の態様によると、溶媒はN-メチルピロリドンであり、非溶媒はエタノールであり、硬化剤は水／界面活性剤混合物である。ポリマー濃度は４〜10％(w/v)の範囲内である。コアセルベーションと硬化処理は磁気攪拌しながら周囲温度で行う。界面活性剤濃度は0.5〜10％(v/v)の範囲内である。硬化時間は２〜４時間の範囲内である。硬化剤／溶媒の体積比は40／１に等しい。ポリマーは好ましくはResomer RGTM 502またはResomer RGTM 756である。
【００６１】  本発明を、その範囲を制限せずに、以下の実施例により例示する。
実施例１：ポリマー／溶媒／コアセルベーション剤／硬化剤の組合わせの評価
この試験では、ポリ(α−ヒドロキシ酸)を評価した。L-およびD-ラクチドとグリコリドの割合を変化させた、３種類の乳酸とグリコール酸とのコポリマーを使用した。これらはベーリンガー・インゲルハイム社により供給された下記のポリマーである：
− Resomer TM RG 502 (Mw ＝14,300 g/mol, Mn＝6,900 g/mol)、L-ラクチド25％、D-ラクチド25％およびグリコリド50％からなる；
− Resomer TM RG 756 (Mw ＝89,800 g/mol, Mn＝35,200 g/mol)、L-ラクチド37.5％、D-ラクチド37.5％およびグリコリド25％を含む；
− Resomer TM RG 858 (Mw ＝87,000 g/mol, Mn＝22,000 g/mol)、L-ラクチド42.5％、D-ラクチド42.5％およびグリコリド15％を有する。
【００６２】  ポリマーのそれぞれの溶媒を考慮し、毒性が最小の溶媒を選択した。それらは、ICHガイドラインの分類による規定でカテゴリー２または３の溶媒に属する。
調査した３種類のポリマーに対する溶媒／非溶媒の対の混和性を次いで決定した。同様に、ポリマーの非溶媒もそれらの毒性の低さから選択した。
【００６３】  溶媒／非溶媒／硬化剤の組合わせのスクリーニングを、１または４％の少量のポリマー有機溶液について(もっぱらN-メチルピロリドンおよび50／50 PLAGAに対して)(m/v)、シンチレーションフラスコ内で行う。ポリマーの有機溶液５mlをシンチレーションフラスコに入れる。その後、コアセルベーション剤の添加を、コアセルベートの生成に特有の、攪拌しても持続する液の曇りが得られるまで行う。この工程でコアセルベートを光学顕微鏡検査により観察する。次に、この混合物１mlを界面活性剤の水溶液10 ml に投入する。光学顕微鏡検査により微小球の有無を観察する。
【００６４】  ａ) 50:50 PLAGA (ResomerTM RG 502)によるコアセルベーション試験
50:50 PLAGA を溶解しうる溶媒は、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、酢酸、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、N-メチルピロリドン、およびプロピレンカーボネートである。50:50 PLAGA は、トルエン、2-プロパノール、グリセロール、アジピン酸ジオクチル、1,2-プロパンジオール、キシレン、ジエチルカーボネート、およびメチルエチルケトンには不溶性である。
【００６５】  コアセルベートと微小球の生成が観察される組合わせは次の通りである：
−酢酸エチル／2-プロパノール／水＋TweenTM 80 、
−酢酸／1,2-プロパンジオールまたは2-プロパノール／水＋TweenTM 80 、
−N-メチルピロリドン／エタノール／水＋TweenTM 80または2-プロパノール、
−N-メチルピロリドン／メチルエチルケトンまたは2-プロパノール／水＋TweenTM 80 、
−プロピレンカーボネート／2-プロパノール／水、場合により＋TweenTM 80、エタノールまたはNaCl。
【００６６】  酢酸をポリマーの溶媒として使用すると、硬化剤として水を使用する限り、コアセルベートと正確に個別化された（ばらけた）微小球の生成を生じさせることができる。効果的には、コアセルベートの液滴は酢酸／2-プロパノールの組合わせ中で生成するが、硬化剤としてのメチルエチルケトンまたは1,2-プロパンジオールの存在下では、コアセルベートの液滴はそれらの球形形状を保持せず、ポリマーの固まりが生成する。
【００６７】  酢酸エチル／2-プロパノール／水＋TweenTM 80の組合わせは、N-メチルピロリドン／エタノール／水＋TweenTM 80の組合わせと同様に、良好な結果を与える。この試験は硬化剤の検討で終了した。1,2-プロパンジオールおよび2-プロパノールが良好な候補であることが見出された。ただし、2-プロパノールの存在下より、1,2-プロパンジオールの方が、溶媒の抽出能力が低くなることが認められることがある。
【００６８】  プロピレンカーボネートは、毒性が低く、水に部分的に可溶性であるので、有利な溶媒である。プロピレンカーボネート／2-プロパノールの組合わせは、外相中に電解質を添加するか、または水と溶媒を混合することにより、外相を溶媒で置換するか、または少なくとも有効成分の拡散を制限する可能性のため、水を不要にすることが可能となる。
【００６９】  ｂ) 75:25 PLAGA (ResomerTM RG 756)によるコアセルベーション試験
75:25 PLAGA を溶解しうる溶媒は、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、酢酸、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジエチルエーテル、メチルエチルケトン、およびN-メチルピロリドンである。
【００７０】  75:25 PLAGA は、トルエン、2-プロパノール、グリセロール、1,2-プロパンジオール、プロピレンカーボネート、アジピン酸ジオクチル、およびクエン酸トリエチルには不溶性である。
【００７１】  最良の結果を生ずる２種類の溶媒は酢酸と酢酸エチルである。従って、酢酸／グリセロールおよび酢酸／1,2-プロパンジオールの組合わせ、ならびに酢酸エチル／2-プロパノールおよび酢酸エチル／1,2-プロパンジオールの対の評価に焦点を当てて検討した。
【００７２】  個別化した微小球の生成が観察される組合わせは次の通りである：
−酢酸エチル／1,2-プロパンジオール／水＋TweenTM 80または2-プロパノール、
−酢酸／グリセロールまたは1,2-プロパンジオール／水＋TweenTM 80。
【００７３】  ｃ) 85:15 PLAGA (ResomerTM RG 858)によるコアセルベーション試験
85:15 PLAGA を溶解しうる溶媒は、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、酢酸、ジメチルホルムアミド、エタノールアミン、エチレンジアミン、メチルエチルケトン、N-メチルピロリドン、トルエン、およびクエン酸トリエチルである。85:15 PLAGA は、2-プロパノール、グリセロール、1,2-プロパンジオール、アジピン酸ジオクチル、およびキシレンには不溶性である。
【００７４】  コアセルベートおよび微小球の生成が観察される組合わせは次の通りである：
−酢酸エチル／2-プロパノールまたは1,2-プロパンジオール／水＋TweenTM 80、
−酢酸エチル／2-プロパノール／1,2-プロパンジオール、
−酢酸エチル／1,2-プロパンジオール／2-プロパノール、
−酢酸／グリセロール（水＋TweenTM 80 ) または1,2-プロパンジオールもしくは2-プロパノール、
−酢酸またはメチルエチルケトン／1,2-プロパンジオール／水＋TweenTM 80、
−酢酸／2-プロパノール／1,2-プロパンジオール、
−N-メチルピロリドンまたはメチルエチルケトン／2-プロパノール／水＋TweenTM 80、
−メチルエチルケトン／1,2-プロパンジオール／2-プロパノール。
【００７５】 実施例２：コアセルベーションパラメータを変化させた、有効成分を含まない微小球の製造
第１段階において、所望粒度の粒子を製造するように、有効成分を使用せずに、微小球の調製に対して操業（処理）条件を確立する。各種因子、例えば、コアセルベーション剤の添加量、硬化剤の量、攪拌の種類と速度、および微小球の回収方法、の影響を調査する。
【００７６】  ポリマーを50 mlの有機溶媒（ビーカー１）中に溶解して、１％(w/v)溶液とする。溶媒がN-メチルピロリドンである場合にはポリマー濃度を４％(w/v)にする。攪拌しながら、安定な目視できるコアセルベートが得られるまでコアセルベーション剤を添加する。この混合物を次いで、界面活性剤を加えた硬化剤の溶液（ビーカー２）中に、攪拌しながら投入する。その後、濾過により微小球を回収する。試験した組合わせは実施例１から選択されたものである。
【００７７】  ａ) 50:50 PLAGA (ResomerTM RG 502)による試験
選択した各組合わせに対応する各種プロトコルを表１にまとめて示す。
【００７８】
【表１】
0005217070.tif 000002
【００７９】  ｂ）75:25 PLAGA (ResomerTM RG 756)への適用
溶媒として酢酸エチルを使用し、表２に記載した条件下で微小球が得られる。
酢酸エチル／1,2-プロパンジオール／水＋MontanoxTM 80 またはTweenTM 80 の組合わせに対しては、超音波、機械式のパドル攪拌、および磁気攪拌の３種類の攪拌の可能性があるようである。微小球の形態または粒度には認めうるほどの差異は現れないので、これらの方法のいずれを選択しても正当化できる。
【００８０】
【表２】
0005217070.tif 000003
【００８１】 実施例３：有効成分として5-フルオロウラシル(5-FU)を含む微小球の製造
試験は、コアセルベートの観察にいたった実施例１a)およびb)の組合わせで行う。
【００８２】  ａ)コアセルベーションに対する有効成分の影響
低濃度(５重量％)の有効成分はポリマー溶液と均質な分散液を形成する。分散液の安定性は溶媒に依存する。例えば、粘稠な溶媒であるN-メチルピロリドンは分散液のより良好な安定性を生じ、デカンテーションまたはビーカー壁への吸着による細胞分裂抑制薬の損失は少なくなる。
【００８３】  コアセルベーション剤として1,2-プロパンジオールを使用すると、媒質粘度の増大により系はさらに安定化する。
ｂ)製造収率
これは、組合わせに応じて15〜100％の範囲に及ぶ。ポリマーの溶媒として酢酸エチルを使用した組合わせは、100％に近い最高の収率を生ずる。
【００８４】  ｃ)カプセル化の収率と程度
有効成分の理論的含有量を増大させるとカプセル化収率は非常に低くなる。
超音波に変更すると、有効成分粒子を個別化することが可能となる。低濃度を使用すると、分散液は均質となり、70％のカプセル収率が達成される。
【００８５】
実施例４：N-メチルピロリドン／エタノール／水＋界面活性剤の検討（参考例）
試験したN-メチルピロリドン可溶性ポリマーのうち、下記を選択する：−50:50 D,L-PLAGA のResomerTM RG 502(ベーリンガー・インゲルハイム) 、−75:25 D,L-PLAGA のResomerTM RG 756(ベーリンガー・インゲルハイム) およびPhusiline (Saint-Ismier)。
【００８６】  微粒子の初期処方組成物は、５mlの溶媒量に対して４または10％(w/v)濃度のポリマーの有機溶液を使用する。コアセルベーションは磁気攪拌しながら行う。
マイクロピペットを用いてポリマーの非溶媒を１mlずつ加える。溶液に曇りが現れたらすぐにサンプルを採取し、光学顕微鏡で観察する。曇りの出現から１分後に、コアセルベーション媒質を200mlの硬化剤(水＋TweenTM 80 またはPVA)中に滴下して投入する。微粒子の硬化は機械攪拌しながら行う。硬化中、光学顕微鏡による微粒子のさらなる観察を行う。その後、微粒子を減圧濾過するか、減圧濾過できない(フィルターが実質的にすぐに詰まってしまうか、濾過時間が過度に長い)場合には大気圧で濾紙上に濾過する。最後に、濾過直後および凍結乾燥直後に微粒子を観察する。
【００８７】  NMP／エタノール／水＋界面活性剤の組合わせで得られた微粒子は、光学顕微鏡検査で、処方組成物のいかなる段階でも、またいかなるポリマー種でも、球形、平滑かつ均一である。
【００８８】  調製した全てのバッチについて、硬化後の濾過は、濾紙上に大気圧で行う。微粒子の粒度は30〜50μｍの範囲内である。粒径約５μｍの多くの微粒子も観察される。
【００８９】  ・ポリマーの種類とその濃度の影響
得られた微粒子は全て光学顕微鏡検査で同じ外観を有する。
ResomerTM RG 502 およびＲｅｓｏｍｅｒTM  ＲＧ  ７５６では、下記条件(表３)下で最良の収率が得られる。
【００９０】
【表３】
0005217070.tif 000004
【００９１】  ・硬化剤の性質と硬化時間の影響
50:50 PLAGA (RG 502)という同じポリマーおよび周囲温度について、硬化剤の種類(水、水＋TweenTM 80、または水＋PVA）は、濾過に対しても、また微粒子の製造収率(17.5〜23.8％の範囲内)に対しても影響を及ぼさない。
【００９２】  50:50 PLAGA (RG 502)という同じポリマーについて、硬化時間により、周囲温度（室温）での製造収率を約10％増大させることができる。
・温度の影響
ａ）硬化時の温度
４℃より低温での硬化により、微粒子の製造収率を倍増させることができる。
50:50 PLAGA (RG 502)について、製造収率は17.5％から35.9％に倍増。
【００９３】 ｂ）コセルベーション時の温度
完全に４℃より低温で行った処理では最大製造収率は10.5％である。
N-メチルピロリドン／エタノール／水＋界面活性剤の組合わせは、光学顕微鏡検査で満足すべき外観を持つ微粒子の生成を生ずる。
【００９４】 実施例５：プロゲステロンまたはブデソニドを含む微粒子
プロゲステロンおよびブデソニドは、酢酸エチルに可溶性の疎水性有効成分である。
【００９５】  酢酸エチル／2-プロパノール／水＋TweenTM 80 の組合わせを使用し、75:25 D,L-PLAGA (Phusis,Saint-Ismier)をポリマーとして使用する。
製造収率は全て90％より大である。
【００９６】  得られた結果を表４にまとめて示す。
【００９７】
【表４】
0005217070.tif 000005
【００９８】  有効成分のカプセルの収率および程度(カプセル化度)を次の表に示す。これらは下記のように算出する：
−理論値＝［有効成分の重量／(ポリマーの重量＋有効成分の重量)］×100
−実験値＝［有効成分の重量／乾燥微粒子の重量］×100
これらの値からカプセル化収率Ｙを下記のように算出することができる：
−Ｙ＝［実験値／理論値］×100
【００９９】
【表５】
0005217070.tif 000006
【０１００】  酢酸エチル／2-プロパノール／水＋界面活性剤の組合わせは、光学顕微鏡検査で満足すべき外観の微粒子の生成を生ずる。これに対し、この溶媒／非溶媒の対で得られた微粒子はより壊れやすいため、不可逆的に凝集しないように、大気中、即ち、周囲温度および大気圧で乾燥させる。製造収率は100％近い。この溶媒／非溶媒／硬化剤の組合わせで認められる主な問題は凝集である。処方組成物の各種パラメータを変化させることにより凝集を低減させることができる。特にコアセルベーションを行う温度が必須因子であり：これを−４℃に下げると、ポリマーを固化させて、微粒子を固くすることができ、こうして微粒子は個別化され、くっつき合わなくなる。