(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質固定化用担体の製造方法であって、
支持体の表面に官能基を導入する、官能基導入工程と、
前記官能基に結合可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる、親水性化合物結合工程と、
前記結合された親水性化合物上のヒドロキシル基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることによりカルボキシル基を形成する、カルボキシル基形成工程と、
を含み、
前記官能基導入工程が、前記官能基を有するシランカップリング剤をゾル−ゲル法により支持体の表面に適用する工程を含むことを特徴とする、物質固定化用担体の製造方法。
【請求項２】
前記カルボキシル基形成工程における開環ハーフエステル化反応が４−ジメチルアミノピリジンを触媒として行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する、活性エステル化工程を更に含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記支持体が、ガラス、石英またはシリコンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記支持体に導入される官能基がエポキシ基、アルデヒド基およびアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記支持体に導入される官能基がエポキシ基であり、
前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、
前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、
活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記親水性化合物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの重合体であり、
前記環状酸無水物が無水コハク酸であることを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体に導入される官能基がアルデヒド基であり、
前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、
前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、
活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記親水性化合物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの重合体であり、
前記環状酸無水物が無水コハク酸であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
表面に官能基を有する支持体と、
前記官能基に結合可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物と、
２つのカルボン酸基を有するカルボン酸化合物とを含み、
前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、
前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基と前記親水性化合物成分のヒドロキシル基との間でエステル結合が形成されており、他方のカルボン酸基は遊離であるかまたは活性エステル化されており、
前記親水性化合物が、エチレングリコールが４分子以上重合した、数平均分子量が４０００以下であるエチレングリコールの重合体であることを特徴とする物質固定化用担体。
【請求項１４】
請求項１３記載の物質固定化用担体と、該物質固定化用担体中のカルボキシル基または活性エステル基と結合可能な官能基を有する物質とを接触させ、前記カルボキシル基または活性エステル基と前記官能基との反応により共有結合を形成させることにより得られた、物質固定化担体。
【請求項１５】
請求項１３記載の物質固定化用担体と、該物質固定化用担体中のカルボキシル基または活性エステル基と結合可能な官能基を有する物質とを接触させ、前記カルボキシル基または活性エステル基と前記官能基との反応により共有結合を形成させた後、前記物質の官能基と反応していないカルボキシル基または活性エステル基を、アミノ基を有する低分子化合物と反応させることにより得られた、物質固定化担体。
【請求項１６】
前記低分子化合物がエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、およびジグリコールアミンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１５記載の物質固定化担体。
【請求項１７】
前記物質が生体関連物質であることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか一項記載の物質固定化担体。
【請求項１８】
前記生体関連物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１７記載の物質固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質、特にタンパク質などの生体関連物質をその活性を維持したまま安定に固定化できる担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の固定化技術はバイオチップやバイオセンサー、アフィニティー担体、μＴＡＳ、細胞培養基材など多方面で応用されており、そのバリエーションは数多く知られている。特に注目されているのがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性スペーサーを介した生体分子の固定化方法である。親水性スペーサーは、固定化に伴う生体分子の活性低下の軽減、固定化生体分子の運動性の向上、対象外分子の非特異的吸着の抑制、生体分子間相互作用の促進など、いくつもの優れた効果をもつ。しかしながら、ＰＥＧが本来有しているヒドロキシル基は反応性が低いため、ＰＥＧを支持体表面と共有結合させたり、生理的条件下でＰＥＧの自由末端に生体分子を結合させたりすることは一般に困難である。そのため、通常はヒドロキシル基よりも反応性に富む官能基を有するＰＥＧ誘導体が親水性スペーサーとして用いられる。
【０００３】
例えば、特許文献１および非特許文献１では、親水性スペーサーとして両末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体が用いられている。また、特許文献２では、親水性スペーサーとして、片末端にキノン化合物、もう一方に求電子性官能基を有するＰＥＧ誘導体が用いられている。非特許文献２では、片末端にビオチン、もう一方に活性エステルを有するＰＥＧ誘導体が用いられている。非特許文献３では、片末端にカルボキシル基、もう一方にアルカンチオールを有するＰＥＧ誘導体が用いられている。これらいずれの公知文献においても、親水性スペーサーは固定化生体分子の活性維持、固定化生体分子の運動性の向上、対象外分子の非特異的吸着の抑制など、いくつもの優れた効果を発揮するとされている。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−５９５６７号公報
【特許文献２】米国特許第６０３３７８４号明細書
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７７，１０９６−１１０５  （２００５）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９８，８５２−８５７  （２００１）
【非特許文献３】Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１５，７１８６−７１９８  （１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらのＰＥＧ誘導体は非常に高価であるか、自前合成する必要があることから、決して容易に手に入るものではない。そのため、親水性スペーサーを有する物質固定化用担体の製造コストは莫大なものとなっていた。
【０００６】
本発明はこのような実情に鑑みてなされたものであり、親水性スペーサーを有する物質固定化用担体の安価な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するため以下の手段を採用した。
【０００８】
すなわち、本発明は、親水性スペーサーを有する物質固定化用担体を安価に製造するために、支持体上に安価な親水性化合物を共有結合させた後で、前記親水性化合物にカルボキシル基または活性エステルを導入することをその要旨とする。本発明は以下の発明群を包含する。
【０００９】
（１）
物質固定化用担体の製造方法であって、支持体の表面に官能基を導入する、官能基導入工程と、前記官能基に結合可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる、親水性化合物結合工程と、前記結合された親水性化合物上のヒドロキシル基に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることによりカルボキシル基を形成する、カルボキシル基形成工程と、を含むことを特徴とする、物質固定化用担体の製造方法。
【００１０】
（２）
前記カルボキシル基形成工程における開環ハーフエステル化反応が４−ジメチルアミノピリジンを触媒として行われることを特徴とする（１）記載の方法。
【００１１】
（３）
前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する、活性エステル化工程を更に含む、（１）または（２）記載の方法。
【００１２】
（４）
前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする（３）記載の方法。
【００１３】
（５）
前記支持体が、ガラス、石英またはシリコンであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（６）
前記支持体に導入される官能基がエポキシ基、アルデヒド基およびアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（７）
前記官能基導入工程が、前記官能基を有するシランカップリング剤をゾル−ゲル法により支持体の表面に適用する工程を含む、（６）記載の方法。
【００１６】
（８）
前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（９）
前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
（１０）
前記支持体に導入される官能基がエポキシ基であり、前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（１１）
前記親水性化合物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの重合体であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸であることを特徴とする、（１０）記載の方法。
【００２０】
（１２）
前記支持体に導入される官能基がアルデヒド基であり、前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（１３）
前記親水性化合物がエチレングリコールまたはエチレングリコールの重合体であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸であることを特徴とする、（１２）記載の方法。
【００２２】
（１４）
（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法により製造された物質固定化用担体。
【００２３】
（１５）
表面に官能基を有する支持体と、前記官能基に結合可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物と、２つのカルボン酸基を有するカルボン酸化合物とを含み、前記支持体上の官能基と前記親水性化合物の結合性基との間に結合が形成されており、前記カルボン酸化合物の一方のカルボン酸基と前記親水性化合物成分のヒドロキシル基との間でエステル結合が形成されており、他方のカルボン酸基は遊離であるかまたは活性エステル化されていることを特徴とする物質固定化用担体。
【００２４】
（１６）
（１４）または（１５）に記載の物質固定化用担体と、該物質固定化用担体中のカルボキシル基または活性エステル基と結合可能な官能基を有する物質とを接触させ、前記カルボキシル基または活性エステル基と前記官能基との反応により共有結合を形成させることにより得られた、物質固定化担体。
【００２５】
（１７）
（１４）または（１５）に記載の物質固定化用担体と、該物質固定化用担体中のカルボキシル基または活性エステル基と結合可能な官能基を有する物質とを接触させ、前記カルボキシル基または活性エステル基と前記官能基との反応により共有結合を形成させた後、前記物質の官能基と反応していないカルボキシル基または活性エステル基を、アミノ基を有する低分子化合物と反応させることにより得られた、物質固定化担体。
【００２６】
（１８）
前記低分子化合物がエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、およびジグリコールアミンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする（１７）記載の物質固定化担体。
【００２７】
（１９）
前記物質が生体関連物質であることを特徴とする（１６）〜（１８）のいずれかに記載の物質固定化担体。
【００２８】
（２０）
前記生体関連物質がタンパク質であることを特徴とする（１９）記載の物質固定化担体。
【発明の効果】
【００２９】
本発明では、高価なＰＥＧ誘導体を使用する必要がないので、従来高価であった、親水性スペーサーを有する物質固定化用担体を安価に製造することができる。また、本発明では、固定化に用いられるカルボキシル基または活性エステルの表面密度が適度に低くなるため、タンパク質をその活性を維持したまま安定に固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（官能基導入工程）
本発明において「官能基導入工程」とは、支持体の表面に官能基を導入する工程である。
【００３１】
本発明の支持体は、水に対して安定な表面を提供できるものあれば特に限定されない。支持体を構成する具体な材料としては、金属、金属酸化物、ガラス、石英、シリコン、セラミックなどの無機材料、エラストマー、プラスチック、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂などの合成高分子、キチン、キトサン、セルロースなどの天然高分子を挙げることができる。支持体の形状は限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜などの平坦な形状や、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路、微粒子などの立体的な形状が挙げられる。特に、本発明の産業上の利用可能性を考慮すると、ガラス、石英またはシリコンからなる支持体が望ましい。
【００３２】
支持体の表面に導入される官能基は、後述する親水性化合物上の結合性基と共有結合することができるものであれば特に限定されない。ただし、支持体がガラス、石英またはシリコンの場合は、前記官能基は、汎用シランカップリング剤で容易に導入することのできるエポキシ基、アルデヒド基またはアミノ基であることが望ましい。その他にも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ヒドロキシル基、イソシアネート基、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、カルボジイミド基などが考えられるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明に使用することができる汎用シランカップリング剤としては、エポキシ基、アルデヒド基またはアミノ基を有するシランカップリング剤が挙げられる。
【００３４】
エポキシ基を有するシランカップリング剤としては例えば次の一般式(I)：
【化１】
0005217973.tif 000002
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は互いに独立にメチル、メトキシまたはエトキシを示し、ただしＲ１、Ｒ２およびＲ３のうち少なくとも１つはメトキシまたはエトキシであり、Ｅはエポキシ基を含有する基、例えば３−グリシドキシプロピル基または２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチル基である）で表されるものが使用できる。具体的には３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルジメチルエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、および２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリエトキシシランが挙げられる。
【００３５】
すなわち本官能基導入工程において導入されたエポキシ基は次の構造を有する。
【００３６】
【化２】
0005217973.tif 000003
[式中、Ｒ１１およびＲ１２の一方は支持体とエポキシ環とを連結する連結基、例えば：
【化３】
0005217973.tif 000004
（式中*はエポキシ基への結合を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記で定義したとおりである）であり、他方は水素または他の置換基、好ましくは水素であり、或いは、
Ｒ１１とＲ１２とが一緒になって、連結基を介して支持体と連結された環、例えば
【化４】
0005217973.tif 000005
（式中*はそれぞれエポキシ基への結合を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記で定義したとおりである）を形成している］
【００３７】
アミノ基を有するシランカップリング剤としては例えば次の一般式(II)：
【化５】
0005217973.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記で定義したとおりであり、Ａはアミノ基を含有する基、例えば３−アミノプロピル基またはＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピル基である）で表されるものが使用できる。具体的にはＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルメチルジエトキシシラン、および３−アミノプロピルジメチルエトキシシランが挙げられる。
【００３８】
すなわち本官能基導入工程において導入されたアミノ基は次の構造を有する。
【００３９】
【化６】
0005217973.tif 000007
[Ｒ１３は支持体とアミノ基とを連結する連結基、例えば
【化７】
0005217973.tif 000008
（式中*はアミノ基への結合を示し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は上記で定義したとおりである）である] 
【００４０】
支持体表面にアルデヒド基を導入する方法としては、アルデヒド基を有するシランカップリング剤を用いて直接導入する方法のほかに、支持体表面にエポキシ基またはアミノ基を導入した後、アルデヒド基を得る方法が挙げられる。
【００４１】
汎用シランカップリング剤等を用いて支持体表面にエポキシ基を導入した後、加水分解を行いジオールとし、次いで酸化開裂によりアルデヒド基に変換することができる。上記一般式(I)において基Ｅが３−グリシドキシプロピル基である場合のように、導入されたエポキシ基が非環構造中に存在する場合には、１つのエポキシ基から1つのアルデヒド基が発生する。
【００４２】
[スキーム１] 
【化８】
0005217973.tif 000009
[Ｒ１１’は、Ｒ１１およびＲ１２について上記で定義した、支持体とエポキシ環とを連結する連結基であり、Ｒ１２’は、Ｒ１１またはＲ１２について上記で定義した、水素または他の置換基である。]
【００４３】
上記一般式(I)において基Ｅが２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチル基である場合のように、導入されたエポキシ基が環構造中に形成されたものである場合、１つのエポキシ基から２つのアルデヒド基が発生する。
【００４４】
[スキーム２]
【化９】
0005217973.tif 000010
［Ｒ１１’’とＲ１２’’とは一緒になって、Ｒ１１およびＲ１２について上記で定義した、連結基を介して支持体と連結された環を形成している。］
【００４５】
また、汎用シランカップリング剤等を用いて支持体表面にアミノ基を導入した後、導入されたアミノ基に２つのアルデヒド基を有する化合物（例えばグルタルアルデヒド）を反応させることによってもアルデヒド基を導入することができる。更に、必要に応じて水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）等の還元剤で炭素窒素二重結合（Ｃ＝Ｎ）を還元することもできる。
【００４６】
[スキーム３]
【化１０】
0005217973.tif 000011
[Ｒ１３は上記で定義したとおりである]
【００４７】
支持体表面への汎用シランカップリング剤の適用法としては、浸漬法、ゾル−ゲル法、気相堆積法、スプレー法、インテグラルブレンド法などが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において最も望ましい方法はゾル−ゲル法である。ゾル−ゲル法によるシランカップリング剤の適用は、親水性化合物の結合量や対象物質の固定化量が増加するなどその後の工程に好適な結果をもたらす。ここで、ゾル−ゲル法とは金属アルコキシドを加水分解して得られるゾルを乾燥させて流動性を失ったゲルとし、このゲルを焼成することによって金属酸化物を得る方法をいう。ゾル−ゲル法においてゾル溶液の薄膜を基板表面に形成させる方法としてはスピンコーティング法とディップコーティング法がある。スピンコーティング法とは、基板上にゾル溶液を滴下し、基板を高速回転させることによってゾルを塗布する方法である。ディップコーティング法とは、ゾル溶液に基板を浸し、適当な速度で引き上げることによってゾルを塗布する方法である。ゾル−ゲル法によるシランカップリング剤の適用の典型的な手順を以下に記載する。まず、シランカップリング剤と弱酸性の水（ｐＨ３〜５）を適当な割合、例えば１：３（モル比）で混合し，１５分〜２４時間攪拌する。これをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）で希釈し、０．１％〜１．０％のゾル溶液を調製する。これをスピンコーターを用いて基板表面に塗布する。回転数は５００〜１５００ｒｐｍ、回転時間は１〜１０秒の間で設定するとよい。しばらく乾燥させた後、８０〜１２０℃のオーブンで１５〜６０分加熱する。最後に、純水中で超音波洗浄を実施する。
【００４８】
（親水性化合物結合工程）
本発明において「親水性化合物結合工程」とは、前記手順により支持体表面上に導入された官能基に結合可能な結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物を、前記官能基に、前記官能基と前記結合性基との結合を介して結合させる工程である。
【００４９】
結合性基とヒドロキシル基とを有する親水性化合物は、支持体と物質との間に介在する親水性スペーサーとして機能する。ここで、親水性スペーサーとは、共有結合によって物質を支持体に繋ぎ留める機能を少なくとも有する水溶性の有機化学構造を意味する。親水性スペーサーとして機能するためには、親水性化合物は鎖状構造を有していることが好ましい。当該鎖状の親水性化合物は、鎖状構造の一端に結合性基を有し、他端にヒドロキシル基を有するものであることが特に好ましい。支持体表面上に導入された官能基に結合可能な「結合性基」は、ヒドロキシル基であってもよいし、ヒドロキシル基とは異なる種類の官能基（例えばアミノ基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、イソシアネート基、マレイミド基、チオール基、カルボジイミド基など）であってもよいが、ヒドロキシル基であることがより好ましい。「結合性基」がヒドロキシル基である場合は、１分子の親水性化合物上には、結合性基として機能するためのヒドロキシル基と、後述する、環状酸無水物との開環ハーフエステル化反応に用いられるためのヒドロキシル基とがそれぞれ存在する（すなわちヒドロキシル基が２個存在する）こととなる。親水性スペーサーは固定化に伴う物質の活性低下の軽減、固定化された物質の運動性向上、対象外分子の非特異的吸着抑制、物質間相互作用の促進などの効果を発揮することが望ましい。親水性化合物はこれらの効果のうち一つでも発揮するものであれば特に限定されないが、製造コストの点も考慮すると、両端に各１個のヒドロキシル基を有する鎖状の親水性化合物が好ましく、具体的には、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。エチレングリコールの重合体はエチレングリコールが２分子以上重合したもの、例えば数平均分子量が１０００以上のもの、であれば特に限定されないが、数平均分子量が１００００以下のものが好ましく、４０００以下のものが特に好ましい。エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体は、ブロック共重合体であることが好ましく、なかでも、１単位以上のプロピレングリコール単位からなる（ポリ）プロピレングリコールブロックの両端にそれぞれ１単位以上のエチレングリコール単位からなる（ポリ）エチレングリコールブロックが共重合してなるブロック共重合体が好ましい。エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体の数平均分子量は１０００以上であれば特に限定されないが、数平均分子量が１２０００以下のものが好ましく、４０００以下のものが特に好ましい。なお本発明において「プロピレングリコール」とは１，２−プロパンジオールを指す。
【００５０】
親水性化合物結合反応の例１
支持体表面に導入されたエポキシ基に、２個のヒドロキシル基を有する親水性化合物を結合させる場合には、１つのエポキシ基に対し１つの親水性化合物が結合する。
【００５１】
[スキーム４]
【化１１】
0005217973.tif 000012
[Ｒ１１およびＲ１２は上記で定義したとおりである。ただし、Ｒ１１およびＲ１２の一方が、支持体とエポキシ環とを連結する連結基であり、他方が水素である場合には、本スキームにおいては、Ｒ１１が支持体とエポキシ環とを連結する連結基であり、Ｒ１２が水素となる割合が多い。]
【００５２】
ＨＯ−Ｒ１４−ＯＨは２個のヒドロキシル基を有する親水性化合物、例えば上記のエチレングリコール、エチレングリコールの重合体、または、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体を示す。Ｒ１４は、例えば、上記のエチレングリコール、エチレングリコールの重合体、または、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体から両端のヒドロキシル基を除いた構造を示す。］
【００５３】
親水性化合物結合反応の例２
支持体表面に導入されたアルデヒド基に、２個のヒドロキシル基を有する親水性化合物を結合させる場合には、１つのアルデヒド基に対し２つの親水性化合物が結合する。
【００５４】
[スキーム５]
【化１２】
0005217973.tif 000013
[ＨＯ−Ｒ１４−ＯＨおよびＲ１４は上記で定義したとおりである。Ｒ１５は上記で定義したＲ１１’、Ｒ１１’’とＲ１２’’とが一緒になって形成する基、或いは、
【化１３】
0005217973.tif 000014
（Ｒ１３は上記で定義した通りであり、*はアルデヒド基への結合を示す）を示す。］
【００５５】
（カルボキシル基形成工程）
本発明において「カルボキシル基形成工程」とは、前記親水性化合物結合工程により結合された親水性化合物上のヒドロキシル基（結合性基がヒドロキシル基である場合には、前記親水性化合物結合工程における反応に供されない方のヒドロキシル基を指す）に環状酸無水物を開環ハーフエステル化反応させることにより、環状酸無水物に由来するカルボキシル基を形成する工程である。
【００５６】
製造コストの点で、環状酸無水物は無水コハク酸または無水グルタル酸であることが望ましいが、これらに限定されない。環状酸無水物として無水コハク酸または無水グルタル酸を用いる場合の開環ハーフエステル化反応のスキームを以下に示す。
【００５７】
[スキーム６]
【化１４】
0005217973.tif 000015
（ｎは１または２を示す。Ｒ１４は上記で定義したとおりである。）
【００５８】
なおスキーム４に沿って結合されたＲ１４−ＯＨ基に本反応が適用される場合には、副次的に、スキーム４において発生するＲ１１の結合炭素上のヒドロキシル基もまた開環ハーフエステル化反応を受ける。
【００５９】
開環ハーフエステル化反応に用いられる触媒としては本反応を促進するものであれば特に限定されないが、具体的にはトリエチルアミン、イソブチルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられ、トリエチルアミンまたは４−ジメチルアミノピリジンが好ましく、反応速度や収率の点で４−ジメチルアミノピリジンが最も好ましい（実施例３参照）。
【００６０】
開環ハーフエステル化反応は、上記触媒を添加したトルエン等の不活性有機溶媒中で行われることが好ましい。
【００６１】
環状酸無水物として無水コハク酸、触媒として４−ジメチルアミノピリジンを用いた場合、無水コハク酸および４−ジメチルアミノピリジンの濃度はそれぞれ１〜５０ｍＭ、反応温度は４〜１００℃、反応時間は２分〜１６時間の範囲で設定されるのが望ましい。ここで、各種反応条件（試薬濃度，反応温度，反応時間）を調節することによって、前記親水性化合物へのカルボキシル基の導入率を制御することができる。すなわち、試薬濃度や反応温度を低く、あるいは反応時間を短く設定すると、最終的にカルボキシル基または活性エステルの表面密度が低くなり、逆に高く、あるいは長く設定すると、カルボキシル基または活性エステルの表面密度は高くなる。カルボキシル基または活性エステルの表面密度は固定化対象物質の種類によって適宜調節するのが望ましい。例えば、ＤＮＡやペプチドを固定化する場合はカルボキシル基または活性エステルの表面密度をなるべく高くするとよく、タンパク質を固定化する場合は低目にするとよい。
【００６２】
（活性エステル化工程）
本発明において「活性エステル化工程」とは、前記カルボキシル基形成工程において形成されたカルボキシル基を活性エステルに変換する工程である。カルボキシル基の活性エステル化は必須ではない。ただし、カルボキシル基と比較して活性エステルは反応性が高いことから、固定化対象物質を担体上に迅速に固定化することが望まれる場合には活性エステル化工程を行うことが好ましい。
【００６３】
活性エステルは、前記親水性化合物と固定化対象物質とを共有結合によって結びつける役目を果たす。ここで、活性エステルとはＲ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘという化学構造を意味する。Ｘには、ハロゲンやＮ−ヒドロキシスクシンイミド基またはその誘導体、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール基またはその誘導体、ペンタフルオロフェニル基、パラニトロフェニル基などの脱離性基が該当するが、これらに限定されない。活性エステルとしては、反応性、安全性および製造コストの点で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが望ましい。前記カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルへの変換は、前記カルボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイミドとカルボジイミドを同時に反応させることによって達成される。ここで、カルボジイミドとは−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−の化学構造を有する有機化合物を意味し、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などが考えられるが、これらに限定されない。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドの濃度は１〜１００ｍＭ、反応温度は４〜１００℃、反応時間は２分〜１６時間の範囲で設定されるのが望ましい。反応溶媒としてはＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）やトルエンなどを使用することができる。
【００６４】
（物質固定化用担体）
本発明はまた、上記工程を含む方法により製造された、カルボシキル基または活性エステル基が支持体上に配置されてなる物質固定化用担体に関する。
【００６５】
本発明の物質固定化用担体の典型的な構造を以下に例示する。
【００６６】
物質固定化用担体の構造の例１
本発明の製造方法において、前記支持体に導入される官能基がエポキシ基であり、前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、ときに得られる物質固定化用担体は以下の化学構造が支持体上に形成された構造を有する。
【００６７】
【化１５】
0005217973.tif 000016
（式中、Ｙ１およびＹ２は互いに独立に−ＯＨまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を示し、ｎ１およびｎ２は互いに独立に１または２の整数を示し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１４は上記で定義したとおりである。）
【００６８】
物質固定化用担体の構造の例２
本発明の製造方法において、前記支持体に導入される官能基がアルデヒド基であり、前記親水性化合物が、エチレングリコール、エチレングリコールの重合体、ならびに、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体からなる群から選ばれる少なくとも1種であり、前記環状酸無水物が無水コハク酸または無水グルタル酸であり、且つ、活性エステル化工程を含む場合には、前記活性エステルが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、ときに得られる物質固定化用担体は以下の化学構造が支持体上に形成された構造を有する。
【００６９】
【化１６】
0005217973.tif 000017
（式中、Ｙ３およびＹ４は互いに独立に−ＯＨまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基であり、ｎ３およびｎ４は互いに独立に１または２の整数を示し、Ｒ１４，Ｒ１５は上記で定義したとおりである。）
【００７０】
例２では、アルデヒド基１つに対して２分子の前記親水性化合物が結合するために上述のような二分岐構造となる。この構造を有することにより、タンパク質を固定化した場合に、固定化されたタンパク質１分子あたりの活性が顕著に保持される（図８参照）。このような構造を有する物質固定化用担体は従来存在しない。
【００７１】
（物質の固定化）
本発明において固定化される物質は、カルボキシル基または活性エステルと反応して共有結合を形成可能な官能基を有する物質であれば特に限定されない。このような官能基としては代表的にはアミノ基が挙げられるが、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルコキシド、２級アミン、３級アミン、アジド基、シアノ基、グリニャール試薬、有機リチウム化合物、カルバニオン等も包含される。固定化される物質としては生体関連物質が好ましい。生体関連物質には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ホルモン、酵素、抗原、抗体、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。さらに、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、および高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。
【００７２】
本発明は、生体関連物質がタンパク質の場合に特に好適に作用する。すなわち、本発明では固定化に伴うタンパク質の活性低下が比較的よく軽減される。これは、多段階の製造方法を採用することによって、カルボキシル基または活性エステルの表面密度が適度に低くなるからであると考えられる。なお、固定化しようとする生体関連物質に、アミノ基等の、カルボキシル基または活性エステルと反応して結合を形成可能な官能基が存在しない場合であっても、これらの物質にアミノ基等を人為的に導入することにより固定化に供することができる。
【００７３】
支持体上に配置された活性エステルと固定化対象物質との反応は例えば以下のように行われる。まず、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．２）、酢酸緩衝液（ｐＨ３．６〜５．６）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ５．８〜８．０）、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．２〜１０．６）などのアミノ基成分を含まない緩衝液を用いて、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの固定化対象物質の水溶液を準備する。対象物質がタンパク質の場合は、出来る限り固定化量が最大となるように緩衝液またはｐＨを最適化することが望ましい。緩衝液にはグリセロールやポリエチレングリコールなどの安定化剤、塩（ＮａＣｌ）、界面活性剤などが含まれていてもよく、これらは活性エステルと固定化対象物質との反応を阻害しない。この水溶液を活性エステル表面と接触させると、固定化対象物質に含まれるアミノ基等の官能基が活性エステルと反応し、アミド結合が形成される。その結果、固定化対象物質は共有結合によって表面に固定化される。ここで、反応温度は４〜３７℃、接触時間は２分〜１６時間の範囲で設定するとよい。固定化対象物質を固定化した後は、適当な洗浄液で担体を洗浄することが望ましい。このとき、洗浄液は０．５Ｍ程度の塩（ＮａＣｌ）および０．１％程度の非イオン性界面活性剤を含む緩衝液であることが望ましい。これによって、共有結合せずに物理吸着しているだけの固定化対象物質を取り除くことができるからである。
【００７４】
所望の物質を担体表面に固定化した後（好ましくは更に物質固定化担体を洗浄した後）は、未反応のカルボキシル基または活性エステルを、アミノ基を有する低分子化合物と結合させることにより、当該カルボキシル基または活性エステルを反応性のより低い官能基に変換させることが好ましい。これによって、対象外分子が不本意に担体表面に固定化されるのを防ぐことができる。この操作は、物質固定化用担体の末端の官能基が活性エステルである場合に特に必要性が高い。
【００７５】
本明細書では活性エステル基にアミノ基を有する低分子化合物を反応させる操作を特に「不活性化」と記述することがある。ただし、カルボキシル基または活性エステルを前記低分子化合物と反応させた後の担体表面は、親水性であることが望ましい。なぜなら、親水性の表面は一般に生体関連物質の非特異的吸着を抑制する効果をもつからである。このためにはアミノ基を含有する低分子化合物として、アミノ基以外に親水性基を更に有する低分子化合物を使用することが好ましい。このような低分子化合物の非限定的な例としては、エタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジグリコールアミン（ＩＵＰＡＣ名：２−（２−アミノエトキシ）エタノール）が挙げられる。なかでも特にジグリコールアミンが生体関連物質の非特異的吸着を抑制する効果に優れている。これらの低分子化合物はＰＢＳなどの緩衝液に１０〜５０ｍＭとなるように溶解し、これを所望の物質を固定化した担体と接触させる。反応温度は４〜３７℃、反応時間は２分〜１６時間の範囲で設定するとよい。
【００７６】
（物質固定化用担体の製造工程の管理）
本発明の物質固定化用担体の製造工程管理は、水接触角測定やＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ／ＥＳＣＡ）を用いて行うと便利である。水接触角測定では表面性状の変化を迅速かつ簡便に知ることができる。例えば、ヒドロキシル基を有する親水性化合物の支持体表面への結合は、多くの場合水接触角の低下をもたらす。また、前記親水性化合物の分子量にも依存するが、環状酸無水物との反応やカルボキシル基の活性エステルへの変換は、多くの場合水接触角の上昇をもたらす。ＸＰＳ／ＥＳＣＡとは、サンプル表面にＸ線を照射し、それによって発生する光電子の運動エネルギーを測定することで、サンプルの構成元素とその結合状態を分析する手法である。測定の際、支持体や親水性化合物を構成する元素に応じて走査する結合エネルギー範囲を決定する。
【００７７】
例えば、支持体がガラス、石英またはシリコンで、親水性化合物がエチレングリコール、エチレングリコールの重合体、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体などの場合、測定する元素は炭素（Ｃ１ｓ）、酸素（Ｏ１ｓ）、窒素（Ｎ１ｓ）、ケイ素（Ｓｉ２ｐ）の計４つであり、それぞれの元素に固有の結合エネルギー範囲を走査する。各元素に由来する光電子数を、測定したすべての元素に由来する光電子数で除した値を、その元素の「元素濃度（％）」と定義する。例えば、炭素濃度の値は、（Ｃ１ｓに由来する光電子数）／｛（Ｃ１ｓに由来する光電子数）＋（Ｏ１ｓに由来する光電子数）＋（Ｎ１ｓに由来する光電子数）＋（Ｓｉ２ｐに由来する光電子数）｝で表される。Ｃ１ｓのピークはその炭素原子の結合状態によって２８５ｅＶ、２８７ｅＶ、２８９ｅＶ付近にそれぞれ極大値をもつ３つのピークに分離することができる。それぞれのピークはＣ−Ｃ／Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏに対応するが、環状酸無水物が反応するとエステル結合とカルボキシル基が新たに形成されるため、２８９ｅＶ付近のピークが上昇する。また、カルボキシル基が活性エステルに変換されると多くの場合窒素濃度が増加する。これは、多くの種類の活性エステルが分子内に窒素原子を含んでいるからである。これらの変化に注目することによって、本発明における一連の化学反応が正しく進行したかどうかを確認することができる。
【００７８】
物質固定化用担体の評価では以下の３つの指標を定めるべきである。１つ目は固定化タンパク質の活性、２つ目はタンパク質の固定化速度および固定化量、３つ目は対象外分子の非特異的吸着量、である。
【００７９】
１つ目の評価指標を評価する理由は、表面に固定化されたタンパク質はなるべく活性を維持していることが望ましいからである。例えば、物質固定化用担体に酵素を固定化した場合は、酵素が有する触媒活性が維持されていることが望ましい。固定化された酵素の活性は、反応した基質の量を吸光度や蛍光強度によって測定すれば簡便に評価できる。ここで、吸光度や蛍光強度が高ければ高いほど、固定化された酵素の活性は保持されていると考えてよい。モデル酵素としては、安価で取り扱いが容易であるという理由から、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が推奨されるが、アルカリホスファターゼやβ-ガラクトシダーゼなどでもよい。ここで、注意しなければならないことは、この方法で測定される酵素活性は、共有結合によって固定化された酵素の活性だけでなく、物理吸着した酵素の活性もある程度含まれているということである。共有結合によって固定化された酵素の活性だけを評価するためには、対照として、エタノールアミンなどで活性エステルを不活性化した固定化用担体に物理吸着した酵素の活性を別途測定する必要がある。
【００８０】
２つ目の評価指標を評価する理由は、なるべく短い時間になるべく多くのタンパク質を固定化できることが望ましいからである。２つ目の評価指標である物質の固定化速度および固定化量は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で評価するのが最も簡便である。まず、適当なタンパク質を物質固定化用担体に固定化しておき、それと特異的に結合する酵素標識抗体を結合させる。その後、物質固定化用担体の表面に基質溶液を添加し、抗体に標識された酵素によって反応した基質量を吸光度や蛍光強度によって評価する。ここで、吸光度や蛍光強度が高ければ高いほど、物質固定化用担体に多くのタンパク質が固定化されたと考えてよい。モデルタンパク質としては、安価で取り扱いが容易であるという理由から、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるとよい。ＢＳＡに特異的に結合する酵素標識された抗体は比較的安価に手に入る。特に、１つ目の評価で使用した酵素と、抗体に標識された酵素を同一にすると、準備する基質が１種類で済むので簡便かつ経済的である。
【００８１】
例えば、１つ目の評価でＨＲＰを使用した場合は、２つ目の評価ではＨＲＰで標識した抗体を用いるとよい。ここで注意しなければならないことは、この方法で評価されるＢＳＡの固定化量は、共有結合によって固定化されたＢＳＡだけでなく、物理吸着したＢＳＡもある程度含まれているということである。共有結合によって固定化されたＢＳＡの量だけを評価するためには、対照として、エタノールアミンなどで活性エステルを不活性化した物質固定化用担体に物理吸着したＢＳＡの量を別途測定する必要がある。
【００８２】
エタノールアミンなどで活性エステルを不活性化した物質固定化用担体に物理吸着したＢＳＡの量は、対象外分子の非特異的吸着量（３つ目の評価指標）にほかならない。これを評価する理由は、対象物質を固定化した後の担体は対象外分子の非特異的吸着を抑制することが望ましいからである。その評価の手順としては、エタノールアミンで活性エステルを不活性化した表面を、ＢＳＡを含む緩衝液に浸した後、表面に物理吸着したＢＳＡに、ＨＲＰで標識した抗ＢＳＡ抗体を結合させる。その後、物質固定化用担体の表面に基質溶液を添加し、抗体に標識されたＨＲＰによって反応した基質量を吸光度や蛍光強度によって評価する。ここで、吸光度や蛍光強度が低ければ低いほど、物質の非特異的吸着の抑制効果が高いと考えてよい。
【００８３】
以下、具体的な実施例を用いて本発明を説明する。
【実施例１】
【００８４】
図１の実施例は、ガラス表面にエポキシ基を導入する工程、前記エポキシ基にテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）を共有結合させる工程、前記ＴＥＧの自由末端に存在するヒドロキシル基に無水コハク酸を反応させ、カルボキシル基を形成する工程、前記カルボキシル基を活性エステルに変換する工程、活性エステルにタンパク質を反応させる工程、未反応の活性エステルをエタノールアミンによって不活性化する工程、からなる。以下、具体的な手順を説明する。
【００８５】
３９ｇのトルエン（純正化学）と４５０μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＴＳＬ８３５０、ＧＥ東芝シリコーン）と９００μｌのトリエチルアミン（和光純薬）を混合し、ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板（ＮＡ３５、ＮＨテクノグラス）を浸漬し、室温で２０時間緩やかに振盪した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってガラス表面にエポキシ基が導入された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＴＥＧ（関東化学）に上記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって前記エポキシ基にＴＥＧが反応し、共有結合が形成された。次に、１００ｍｇの無水コハク酸（ＳｕＡ、関東化学）と１２０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、和光純薬）を４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって開環ハーフエステル化反応が進行してＴＥＧの自由末端にカルボキシル基が導入された。次に、２９０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬）と３９０μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純薬）を４７ｇのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、関東化学）に溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＴＥＧの自由末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）が導入された。最後に、基板を２５ｍｍ×１０ｍｍの大きさに切断した。
【００８６】
上記の手順で作製した物質固定化用担体において、ＴＥＧが親水性スペーサーとして機能する。ＴＥＧの代わりに、エチレングリコール（ＥＧ、アルドリッチ）、ＰＥＧ６００（関東化学）、ＰＥＧ１０００（関東化学）、ＰＥＧ２０００（関東化学）、ＰＥＧ４０００（関東化学）を親水性スペーサーとする物質固定化用担体も同様に作製した。それらの表面の水接触角は表１のように推移した。
【００８７】
【表１】
0005217973.tif 000018
【００８８】
また、親水性スペーサーとしてＴＥＧおよびＰＥＧ４０００を使用したときの炭素（Ｃ１ｓ）、酸素（Ｏ１ｓ）、窒素（Ｎ１ｓ）、ケイ素（Ｓｉ２ｐ）の各元素濃度は表２のように推移した。
【００８９】
【表２】
0005217973.tif 000019
【００９０】
これらの結果は、本発明における一連の化学反応が正しく進行したことを示している。
【００９１】
次に、上記のように作製した物質固定化用担体（２５ｍｍ×１０ｍｍ）にＨＲＰ（和光純薬）を固定化し、その酵素活性を測定した。以下にその具体的な手順を記す。
【００９２】
まず、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ溶液（ＰＢＳとグリセロールの１：１混合溶液）を物質固定化用担体と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の活性エステルとＨＲＰが反応し、担体表面にＨＲＰが固定化された。次に、前記担体表面を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下洗浄バッファーとする）で３回洗浄した後、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、未反応の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。洗浄バッファーで３回洗浄した後、この担体表面に、ＨＲＰの発色原基質であるＳＡＴ−３（同仁化学）と過酸化水素水（関東化学）のＰＢＳ溶液（それぞれ５ｍＭと０．５ｍＭ、以下基質溶液とする）を２００μｌ滴下し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに基質溶液を１００μｌ採取し、９６穴マルチウェルプレートに移した。ここに、１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ２ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【００９３】
この値から物理吸着したＨＲＰの寄与分を差し引くため、エタノールアミンで活性エステルを不活性化した担体表面も同様に評価した。まず、物質固定化用担体を５０ｍＭエタノールアミンと接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。次に、前記担体表面を洗浄バッファーで３回洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ溶液と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、ＨＲＰは担体表面に固定化されることなく物理吸着した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、この担体表面に基質溶液を２００μｌ滴下し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに基質溶液を１００μｌ採取し、９６穴マルチウェルプレートに移した。ここに、１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【００９４】
上記手順において、ＨＲＰ→ＥＡの順番でインキュベートした担体表面には、共有結合によって固定化されたＨＲＰと、物理吸着したＨＲＰが存在する。一方、ＥＡ→ＨＲＰの順番でインキュベートした担体表面には、共有結合によって固定化されたＨＲＰはほとんど存在しておらず、物理吸着したＨＲＰがわずかに存在している。したがって、ＨＲＰ→ＥＡの値からＥＡ→ＨＲＰの値を指し引いた値は、共有結合によって固定化されたＨＲＰの活性とみなすことができる。親水性スペーサーとしてＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００を用いたときの測定結果を図２に示す。サンプル名はそれぞれ、「ＥＧ−ＮＨＳ」、「ＴＥＧ−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ６００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ１０００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ４０００−ＮＨＳ」、とした。いずれのサンプルにおいても、ＨＲＰ→ＥＡの方がＥＡ→ＨＲＰよりも高い酵素活性を示した。このことは、共有結合によって担体表面に固定化されたＨＲＰがある程度活性を維持していることを意味している。 
【００９５】
次に、物質固定化用担体（２５ｍｍ×１０ｍｍ）にＢＳＡ（和光純薬）を固定化し、その固定化量をＥＬＩＳＡ法によって評価した。以下にその具体的な手順を記す。
【００９６】
まず、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液（ＰＢＳとグリセロールの１：１混合溶液）を物質固定化用担体と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の活性エステルとＢＳＡが反応し、担体表面にＢＳＡが固定化された。次に、前記担体表面を洗浄バッファーで３回洗浄した後、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、未反応の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。洗浄バッファーで３回洗浄した後、この担体表面に、ＨＲＰ標識抗ＢＳＡ抗体（ＡｂＣａｍ社）のＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）を接触させ、室温で３０分間インキュベートした。これによって、担体表面に固定化されたあるいは物理吸着したＢＳＡにＨＲＰ標識抗体が結合した。その後、前記担体表面を洗浄バッファーで３回洗浄し、その表面に基質溶液を２００μｌ滴下し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに基質溶液を１００μｌ採取し、９６穴マルチウェルプレートに移した。ここに、１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【００９７】
この値から物理吸着したＢＳＡの寄与分を差し引くため、エタノールアミンで活性エステルを不活性化した担体表面も同様に評価した。まず、物質固定化用担体を５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。次に、前記担体表面を洗浄バッファーで３回洗浄した後、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、ＢＳＡは担体表面に固定化されることなく物理吸着した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、この担体表面に、ＨＲＰ標識抗ＢＳＡ抗体のＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）を接触させ、室温で３０分間インキュベートした。これによって、担体表面に物理吸着したＢＳＡにＨＲＰ標識抗体が結合した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、この担体表面に基質溶液を２００μｌ滴下し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに基質溶液を１００μｌ採取し、９６穴マルチウェルプレートに移した。ここに、１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【００９８】
上記の手順において、ＢＳＡ→ＥＡの順番でインキュベートした担体表面には、共有結合によって固定化されたＢＳＡと、物理吸着したＢＳＡが存在する。一方、ＥＡ→ＢＳＡの順番でインキュベートした担体表面には、共有結合によって固定化されたＢＳＡはほとんど存在しておらず、物理吸着したＢＳＡがわずかに存在している。したがって、ＢＳＡ→ＥＡの値からＥＡ→ＢＳＡの値を指し引いた値は、共有結合によって固定化されたＢＳＡの量に依存する。親水性スペーサーとしてＥＧ、ＴＥＧ、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００を用いたときの測定結果を図３に示す。サンプル名はそれぞれ、「ＥＧ−ＮＨＳ」、「ＴＥＧ−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ６００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ１０００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ」、「ＰＥＧ４０００−ＮＨＳ」、とした。ＰＥＧの分子量が大きくなるにつれて、共有結合によって固定化されたＢＳＡの量が減少したことが分かる。このことは、ＰＥＧの分子量が大きくなるにつれて、活性エステルの表面密度が低くなることを意味している。 
【００９９】
図２、３の結果から、以下の定義式を用いて固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性が導き出される。
0005217973.tif 000020
【０１００】
ここで、ＨＲＰの固定化量はＢＳＡの固定化量と一致すると仮定しているが、この仮定は合理的である。図４から明らかなように、ＰＥＧの分子量が大きくなるにつれて固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性が上昇した。これはおそらく、ＰＥＧの分子量が増加することによってＨＲＰの運動性が上昇したか、活性エステルの表面密度が適度に低くなることによってＨＲＰの活性が維持されたためであろう。
【実施例２】
【０１０１】
図５の実施例は、ガラス表面にアルデヒド基を導入する工程、前記アルデヒド基にＴＥＧを共有結合させる工程、前記ＴＥＧの自由末端に存在するヒドロキシル基に無水コハク酸を反応させ、カルボキシル基を形成する工程、前記カルボキシル基を活性エステルに変換する工程、活性エステルにタンパク質を反応させる工程、未反応の活性エステルをエタノールアミンによって不活性化する工程、からなる。以下、具体的な手順を説明する。
【０１０２】
３９ｇのトルエンと４５０μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランと９００μｌのトリエチルアミンを混合し、ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で２０時間緩やかに振盪した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってガラス表面にエポキシ基が導入された。次に、基板を希硫酸（１０ｍＭ）に浸漬し、８０℃で２時間加熱した。その後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって前記エポキシ基が加水分解され１，２−ジオールが生成した。次に、基板を２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（関東化学）に浸漬し、室温で１５分間放置した後、水洗した。この操作によって前記１，２−ジオールが酸化開裂を起こし、アルデヒド基が生成した。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＴＥＧに基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって前記アルデヒド基にＴＥＧが反応し、共有結合が形成された。次に、１００ｍｇのＳｕＡと１２０ｍｇのＤＭＡＰを４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＴＥＧの自由末端にカルボキシル基が形成された。次に、２９０ｍｇのＮＨＳと３９０μｌのＤＩＣを４７ｇのＤＭＦに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＴＥＧの自由末端にＮＨＳ基が導入された。最後に、基板を２５ｍｍ×１０ｍｍの大きさに切断した。
【０１０３】
次に、実施例１と同様に、固定化ＨＲＰの活性測定と固定化ＢＳＡの定量を行った。その結果を図６〜８に示す。実施例１の場合と同じように、ＰＥＧの分子量が大きくなるにつれて固定化ＨＲＰ一分子あたりの酵素活性が上昇したが、全体的に実施例１よりも高かった。その理由として以下のような説明が可能である。まずエポキシ基ベースの場合は、エポキシ環由来のヒドロキシル基もＨＲＰの固定化に関与すると考えられる。ここに固定化されたＨＲＰは実質的には親水性スペーサーを介しておらず、これがＨＲＰの活性低下の原因となり得る。一方、アルデヒド基ベースの場合は、アルデヒド基一分子あたり二分子の親水性化合物が反応するため、理論上すべてのＨＲＰが親水性スペーサーを介して固定化される。したがって、アルデヒド基ベースの担体表面の方がエポキシ基ベースの担体表面よりもＨＲＰの活性がよく維持されたと考えられる。
【０１０４】
(比較例1)
以下に親水性スペーサーのない場合の比較例を示す。親水性スペーサーのない物質固定化用担体としては、エポキシ基表面またはアルデヒド基表面、またはエポキシ基の加水分解によって生じたヒドロキシル基を利用してＮＨＳ基を導入した表面を有する担体、が考えられる。いずれも、共有結合によって物質を表面に固定化することができる。また、対照サンプルとして、エポキシ基にＴＥＧを付加した表面を有する担体も用意した。この担体はタンパク質の非特異的吸着を確実に抑制することがわかっている。それらの作成方法は上述の通りである。その結果を実施例とともに図２〜４および６〜８に示した。各サンプル名はエポキシ基表面を有する担体を「Ｅｐｏ」、アルデヒド基表面を有する担体を「Ａｌｄ」、親水性スペーサーなしのＮＨＳ基表面を有する担体を「ＮＨＳ」、エポキシ基にＴＥＧを付加した表面を有する担体を「Ｅｐｏ−ＴＥＧ」、とした。図４および８から分かるように、エポキシ基表面を有する担体やアルデヒド基表面を有する担体には相当量のＨＲＰが共有結合によって固定化されたにも関わらず、それらの活性はまったく無に等しかった。また、親水性スペーサーのないＮＨＳ基表面を有する担体も、親水性スペーサーがある場合と比べて固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性はかなり低かった（図４）。さらに、親水性スペーサーを有する担体表面は例外なくＥｐｏ−ＴＥＧと同じくらいＢＳＡの物理吸着を抑制した。以上の結果から、本発明において親水性スペーサーはタンパク質の活性を維持する効果、および物質の非特異的吸着を抑制する効果をもつことが実証された。
【０１０５】
(比較例２)
特許文献２に記載された技術によって物質固定化用担体が製品化されている。その担体表面に上述のようにＨＲＰおよびＢＳＡを固定化し、その活性および固定化量を実施例と比較した。以下にその具体的な手順を説明する。
【０１０６】
９６穴マルチウェルプレートタイプのＮｕｎｃ  ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭ  Ａｍｉｎｏのウェルに、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ溶液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９．６）とグリセロールの１：１混合溶液）を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の求電子性官能基とＨＲＰが反応し、担体表面にＨＲＰが固定化された。次に、ウェル内を洗浄バッファーで３回洗浄した後、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）を含有する１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９．６）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、未反応の求電子性官能基がほぼ完全に不活性化された。洗浄バッファーで３回洗浄した後、ウェル内に基質溶液を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０７】
この値から物理吸着したＨＲＰの寄与分を差し引くため、エタノールアミンで求電子性官能基を不活性化した担体表面も同様に評価した。まず、上記のＮｕｎｃ  ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒＴＭ  Ａｍｉｎｏのウェルに、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の求電子性官能基がほぼ完全に不活性化された。ここに、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＰ溶液を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートした。これによって、ＨＲＰは担体表面に固定化されることなく物理吸着した。洗浄バッファーで３回洗浄した後、ウェル内に基質溶液を１００μｌ添加し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０８】
以上の結果を実施例とともに図２〜４および６〜８に示した。サンプル名は「他社製品」とした。他社製品においても固定化ＨＲＰの活性はある程度検出されたが、本発明と比べると低かった。一方、ＢＳＡの固定化量については他社製品の方が本発明を大きく上回っていた。しかし、固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性で比較すると、他社製品は本発明に遠く及ばなかった。したがって、本発明の物質固定化用担体はタンパク質の活性を比較的よく維持することがわかった。
【実施例３】
【０１０９】
本発明を効果的に実施するためにはカルボキシル基形成工程において適切な触媒を使用することが極めて重要である。以下にその根拠となる実験結果を記述する。
【０１１０】
３９ｇのトルエンと４５０μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランと９００μｌのトリエチルアミンを混合し、ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板を浸漬し、室温で２０時間緩やかに振盪した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってガラス表面にエポキシ基が導入された。次に、触媒量の濃硫酸を含んだＴＥＧに上記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって前記エポキシ基にＴＥＧが反応し、共有結合が形成された。前記基板を適当な大きさに切断した後、以下の５種類の反応溶液（トルエン溶媒）、すなわち（１）ＳｕＡ／触媒なし、（２）ＳｕＡ／ＤＭＡＰ、（３）ＳｕＡ／ピリジン、（４）ＳｕＡ／トリエチルアミン、（５）ＳｕＡ／ピリジン／トリエチルアミン、に一枚ずつ浸漬した。ここで、ＳｕＡおよび各種触媒の濃度はすべて２０ｍＭに統一した。これらを８０℃で１時間加熱した後、エタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＴＥＧの自由末端に触媒の種類に応じた効率でカルボキシル基が形成された。次に、２９０ｍｇのＮＨＳと３９０μｌのＤＩＣを４７ｇのＤＭＦに溶解し、ここに前記５種の基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によって前記カルボキシル基がＮＨＳ基に変換された。最後に、前記５種の基板をオクチルアミン（ＯＡ、和光純薬）のエタノール溶液（５０ｍＭ）に浸漬し、室温で１０分間放置した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。この操作によってＴＥＧの自由末端（の一部）にオクチルアミンが固定化された。以上の一連の化学反応によって５種の基板の水接触角の推移は表３のようになった。ここで、オクチルアミン（ＯＡ）と反応させた後の水接触角が高ければ高いほど、その前のＴＥＧとＳｕＡとの反応効率が高かったことを意味する。これに基づくと、触媒効率の大小関係はピリジン＜トリエチルアミン＜ＤＭＡＰとなり、十分な反応速度および収率が得られるのはＤＭＡＰを用いたときのみであることが明らかとなった。
【０１１１】
【表３】
0005217973.tif 000021
【０１１２】
（実施例４)
本発明を効果的に実施するためには支持体への官能基導入の際に適切な方法を選択する必要がある。例えば、汎用シランカップリング剤を用いてガラス表面に官能基を導入する場合、浸漬法を用いるかゾル−ゲル法を用いるかで物質固定化用担体の性能が大きく異なる。以下にその事実を示す実施例を記述する。
【０１１３】
浸漬法によるガラス表面への官能基導入は以下のように行った。まず、３９ｇのトルエン（純正化学）と４５０μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＴＳＬ８３５０、ＧＥ東芝シリコーン）と９００μｌのトリエチルアミン（和光純薬）を混合し、ここにＵＶ洗浄済みの１０ｃｍ角のガラス基板（ＮＡ３５、ＮＨテクノグラス）を浸漬し、室温で２０時間緩やかに振盪した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。一方、ゾル−ゲル法によるガラス表面への官能基導入は以下のように行った。まず、２２０５μｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＴＳＬ８３５０、ＧＥ東芝シリコーン）と４８０μｌの０．００５Ｎ塩酸を混合し，１時間攪拌した。これをイソプロピルアルコールで希釈し、０．２５％のゾル溶液を調製した。これをスピンコーティングによってガラス基板（ＮＡ３５、ＮＨテクノグラス）に塗布した。回転数は１０００ｒｐｍ、回転時間は３秒とした。しばらく乾燥させた後、基板を８０℃のオーブンで２０分加熱した。これら別々の方法でシラン処理したガラス基板を、触媒量の濃硫酸を含んだＴＥＧ（関東化学）に浸漬し、８０℃で１時間加熱した。反応後、基板をよく水洗し、窒素ブローで乾燥させた。次に、１００ｍｇの無水コハク酸（ＳｕＡ、関東化学）と１２０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、和光純薬）を４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、２９０ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬）と３９０μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純薬）を４７ｇのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、関東化学）に溶解し、ここに基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた後、基板を２５ｍｍ×１０ｍｍの大きさに切断した。以上の操作によってシランカップリング剤の適用方法のみが異なる２種類の物質固定化用担体を得た。
【０１１４】
これらの担体へのタンパク質固定化量および不活性化後の物理吸着量をＥＬＩＳＡ法によって評価した。タンパク質としては、リゾチーム（Ｌｙｓ、和光純薬）、ＢＳＡ、抗ＢＳＡ抗体（ＩｇＧ、ＲＯＣＫＬＡＮＤ）、フィブリノーゲン（Ｆｉｂ、和光純薬）を使用した。まず、０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を３通りのｐＨ（５．３、７．４、９．６）で調整した。これらを上記２種類の担体と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって担体表面の活性エステルとタンパク質が反応し、担体表面にタンパク質が固定化された。次に、担体表面を洗浄バッファーで３回洗浄した後、５０ｍＭエタノールアミン（ＥＡ）と接触させ、室温で１０分間インキュベートした。これによって、未反応の活性エステルがほぼ完全に不活性化された。同様に、エタノールアミンで不活性化した担体にも０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液をそれぞれ接触させた。洗浄バッファーで３回洗浄した後、これらの担体表面に各タンパク質に対する一次抗体を結合させ、次いでＨＲＰ標識二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を結合させた。洗浄バッファーで洗浄後、各担体表面に基質溶液を２００μｌ滴下し、室温で１０分間インキュベートした。直ちに基質溶液を１００μｌ採取し、９６穴マルチウェルプレートに移した。ここに、１Ｍ濃硫酸を１００μｌ添加し、プレートリーダーを用いて４７４ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図９に示す。いずれのタンパク質においてもゾル−ゲル法で作製した担体は浸漬法で作製した担体よりもタンパク質の固定化量が有意に多く、不活性化後の物理吸着量は少なかった。この結果より、支持体への官能基の導入をゾル−ゲル法で行なうことによって本発明は好適に実施されることがわかった。
【０１１５】
（実施例５)
未反応の活性エステルを不活性化させた後はタンパク質の非特異的吸着が起こらないことが望ましい。しかし、その効果は使用する試薬によって大きく異なる。本発明において最も効果のある不活性化用試薬はジグリコールアミンである。以下にその事実を示す実施例を記述する。
【０１１６】
まず、実施例４に記載したように、ゾル−ゲル法によってガラス表面にエポキシ基を導入した。次に、５０ｍｇの無水コハク酸（ＳｕＡ、関東化学）と６０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、和光純薬）を４３ｇのトルエンに溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。その後、基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた。次に、５８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、和光純薬）と７８μｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純薬）を４３ｇのトルエン（純正化学）に溶解し、ここに前記基板を浸漬し、８０℃で１時間加熱した。基板をエタノールと水で洗浄し、窒素ブローで乾燥させた後、基板を２５ｍｍ×１０ｍｍの大きさに切断した。この基板を各不活性化試薬でそれぞれ処理した後、０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（和光純薬）と接触させ、その物理吸着量をＥＬＩＳＡ法によって評価した。使用した不活性化試薬はエタノールアミン（ＥＡ）、ジグリコールアミン（ＤＧＡ）、ＢＳＡ、カゼイン（Ｈａｍｍａｒｓｔｅｎ処方、和光純薬）の４種類である。その結果、物理吸着量が最も少なかったのはジグリコールアミンで不活性化した担体であった（図１０）。タンパク質の非特異的吸着を防ぐ目的で最も汎用されているＢＳＡは本発明では有効でなかった。この結果より、活性エステルの不活性化をジグリコールアミンで行なうことによって本発明は好適に実施されることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】ガラス表面にエポキシ基を導入する工程を含む本発明の一実施形態
【図２】実施例１における固定化ＨＲＰの活性測定の結果（比較例を含む）
【図３】実施例１における固定化ＢＳＡの定量測定の結果（比較例を含む）
【図４】実施例１における固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性（比較例を含む）
【図５】ガラス表面にアルデヒド基を導入する工程を含む本発明の一実施形態
【図６】実施例２における固定化ＨＲＰの活性測定の結果（比較例を含む）
【図７】実施例２における固定化ＢＳＡの定量測定の結果（比較例を含む）
【図８】実施例２における固定化ＨＲＰ一分子あたりの活性（比較例を含む）
【図９】実施例４における評価結果（浸漬法とゾルゲル法との比較）
【図１０】実施例５における評価結果（不活性化試薬の比較）
【図１】
0005217973.tif 000022
【図２】
0005217973.tif 000023
【図３】
0005217973.tif 000024
【図４】
0005217973.tif 000025
【図５】
0005217973.tif 000026
【図６】
0005217973.tif 000027
【図７】
0005217973.tif 000028
【図８】
0005217973.tif 000029
【図９】
0005217973.tif 000030
【図１０】
0005217973.tif 000031