(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５〜１０００ｎｍの範囲の直径を有する結晶性またはアモルファスの生分解セラミックコアと、
治療に有効な量の疎水性または親水性の感光剤と、
安定化剤と、を含み、
前記セラミックコアは中実または中空であり、前記コアの材料は、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムからなる群の中から選ばれ、該群に含まれるリン酸カルシウムまたは炭酸カルシウム中のＣａ２＋（の一部または全部）は、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、またはＳｒ２＋で置換されてもよく、
前記疎水性または親水性の感光剤は、テトラピロール誘導体（つまり、ポルフィリン類、クロリン類、およびバクテリオクロリン類）、フェナジニウムおよびフェノチアジニウム色素（つまり、トルイジンブルー、メチレンブルー、およびサフラニン）、並びにキサンテン色素（つまり、エリスロシン）からなる群の中から選ばれ、
前記安定化剤は、カチオン性、非イオン性、またはアニオン性の高分子（つまり、ポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリ（アリルアミン）塩酸塩（ＰＡＨ）、ポリエチレンイミン）からなる群の中から選ばれる、
光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項２】
前記セラミックコアの直径は、５０〜２５０ｎｍである、
請求項１に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項３】
治療に有効な量の疎水性または親水性の感光剤を含み、
前記疎水性または親水性の感光剤は、分子ごとに１ないし４個がリン酸基で官能化されたテトラピロール誘導体である、
請求項１に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項４】
治療に有効な前記感光剤の濃度は、１〜５００μＭである、
請求項１に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項５】
治療に有効な前記感光剤の濃度は、１〜１００μＭである、
請求項４に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項６】
前記感光剤は、テモポルフィン、メチレンブルー、トルイジンブルー、サフラニン、およびエリスロシンからなる群の中から選ばれる、
請求項１に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、標的リガンドに取り付けられる、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項８】
前記標的リガンドは、抗体、抗体フラグメント、およびＲＧＤペプチドからなる群の中から選ばれる、
請求項７に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【請求項９】
腫瘍の光線力学療法に使用する、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１０】
抗菌光線力学療法に使用する、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１１】
関節炎およびそれと同様な炎症性疾患の光線力学療法に使用する、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１２】
歯周病の光線力学療法に使用する、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載のナノ粒子医薬製剤。
【請求項１３】
生物学的な標的分子が前記ナノ粒子の表面に取り付けられている、
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の光線力学療法に使用するためのナノ粒子医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性または親水性感光剤を含むナノ粒子製剤の調製および、該ナノ粒子製剤の光線力学療法での使用に関し、特に、該ナノ粒子製剤の静脈または局所投与を用いた腫瘍および抗菌療法での使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸カルシウムは哺乳類の骨と歯に含まれる無機鉱物から構成されるので、高い生体適合性を示す（非特許文献１〜非特許文献３）という理由から、近年、リン酸カルシウムナノ粒子への関心が高まっている。また、リン酸カルシウムナノ粒子は、核酸に対して（非特許文献４）、あるいは抗腫瘍薬に対して（非特許文献５〜非特許文献７）薬物キャリアとして作用することもできる。例えば、細胞のトランスフェクションは、ＤＮＡおよびｓｉＲＮＡで覆われたリン酸カルシウムナノ粒子を用いて成功している（非特許文献８〜非特許文献１２）。クーンによって、別の例が特許文献１に開示されている。特許文献１には、癌の治療のために、活性剤の腫瘍細胞とリンパ管への輸送、あるいは癌転移の治療と防止に適したリン酸カルシウムナノ粒子の活性剤の複合体が開示されている。薬物輸送システムの強化により、従来の処方を上回る多くの利点が得られるが、リン酸カルシウムナノ粒子に吸着される抗癌剤は、化学療法剤あるいは放出ホルモン作用物質のいずれかであり、癌細胞の成長と同様に正常細胞の成長も阻害するので、多くの深刻な副作用を及ぼす。
【０００３】
無機ナノ粒子は、有機ナノ粒子に対して種々の利点を示す。つまり、無機ナノ粒子は微生物株からの攻撃を受けず、その多くは非毒性であり、調製が簡単であり、一般に保存安定性に優れる（非特許文献１３）。特にリン酸カルシウムナノ粒子は、生分解性と生体適合性の両方を示すので（非特許文献１４〜非特許文献１７）、これらの利点の全てを満足する。さらに、リン酸カルシウムナノ粒子は、構造的および化学的に人間の骨の中の無機物に極めて近い（非特許文献１８）。リン酸カルシウムの別の利点は、ランタニドを取り込む能力である。ランタニドがドープされたこれらの粒子は、蛍光発色性を示すので、例えば、細胞を通過する経路を簡単に追跡できる（非特許文献１９〜非特許文献２３）。
【０００４】
光線力学療法（ＰＤＴ）は、医療での種々の用途が探索されている有望な技術であり、腫瘍を破壊する治療法として広く認識されている（非特許文献２４）。光線力学療法では、光と感光剤（色素）が使用されて、所望の医学的効果が得られる。天然由来の色素と合成色素の多くが、光線力学療法用の有望な感光剤として調査された。最も広範に研究された感光剤の種類は、恐らくテトラピロール大環状化合物である。それらの化合物の中で、特にポルフィリンとクロリンのＰＤＴ効果が調査された。
【０００５】
しかしながら、多くの感光製剤は、化学的、薬理学的および／または光物理的性質を有しておらず、生体有効性を改善できないので、ＰＤＴ処理を有効に実現する感光効果を示さない。
【０００６】
そのため、その薬物動態と生体内分布を変えて、感光剤の生体有効性を改善する多くの試みがなされた。有機ナノ粒子を薬物キャリアとして得る例として、アレマンらの特許文献２には、緑色を示すポルフィリンと、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクタイド−コ−グルコライド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクタイド）などのポリエステルポリマーの中から選ばれるナノ粒子とを含むナノ粒子感光剤が開示されている。しかしながら、上述したように、有機ナノ粒子には、無機ナノ粒子に比べて種々の不利益が伴う。さらに、多くの場合、生分解性ポリマー系の薬物輸送キャリアによって高分子の酸性副生物が形成されたり、該薬物輸送キャリアがフラグメントに分解される可能性がある。該薬物輸送キャリアがフラグメントに分解されると、前記活性剤が放出される環境が変更され、該薬物輸送担体と相互作用する薬剤および／または組織に不利な影響が及ぶ可能性がある。
【０００７】
特許文献３には、チェンらによって、ＰＤＴ用途のために、感光剤を付着させた発光性ナノ粒子を含む感光製剤が開示されている。Ｘ線、α粒子線、β粒子線、中性子線およびγ線によって放射される電離放射線に曝されると、発光性ナノ粒子が光を放出して、前記感光剤を活性化し、前記感光剤が活性化されると、ＰＤＴが癌細胞を殺す効果が生じる。発光性ナノ粒子は、電離放射線源に曝される必要があるので、周辺組織に与える損傷を最小にして腫瘍細胞を高感度で殺傷するというＰＤＴの重要な利点は失われる。癌細胞中での殺傷効果は、感光剤の活性化によって増大されるが、前記腫瘍を治療するために、電離放射線が通過しなければならない皮膚または臓器などの健康な組織に、電離放射線から有害な影響が及ぼされる。
【０００８】
腫瘍の光線力学療法に使用されて成功している物質の殆どは親油性物質であり、該親油性物質は、水溶性が低いという固有の性質を有するので、生体吸収性と生体有効性を高めるような適切な方法で配合される必要がある。一方で、高親水性物質は、腫瘍組織に十分に蓄積されないので、腫瘍の光線力学療法に使用できない。
【０００９】
上述したのとは別に、ＰＤＴは、病原微生物に由来する感染症の治療に適用できる（非特許文献２５）。感染症の治療における不変の課題は、これらの病気の治療に特異的に用いられる薬剤がないということである。第２に、微生物は抗菌剤に順応し、抗菌効果が生じるように化学的に設計された多くの抗菌剤の効果を無効にするので、該微生物の活性を停止させるには、前記抗菌剤に更に多くの有効成分が必要になる。この点に関して、ＰＤＴは、その作用モードの違いにより、有望な代替手段と見なされていた。また、耐性菌種を形成する能力が極めて低い。
【００１０】
様々な種類の病気の治療についてのＰＤＴの使用は、感光剤（ＰＳ）が有する固有の特徴によって制限されていた。該特徴には、高価格であること、宿主生物中での保持時間が長いこと、皮膚光毒性が高いこと、生理溶液への溶解性が低いこと（血栓塞栓性の事故が生じたときに、溶解性の低さによって、血管内投与の有用性も低減される）、および標的効果（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）が低いことがある。特に、先行技術におけるＰＳのこれらの不利益によれば、感光剤の投与量は極めて多くなるので、非損傷組織中に感光剤が蓄積される可能性が劇的に増加し、それに伴って非損傷部位に悪影響が及ぼされるリスクも劇的に増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０２４１２５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００４７９１３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７／０２１８０４９号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓ．Ｖ．Ｄｏｒｏｚｈｋｉｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００２，４１，３１３０−３１４６
【非特許文献２】Ｍ．Ｖａｌｌｅｔ−Ｒｅｇｉ，Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．，２００６，５２１１−５２００
【非特許文献３】Ｃ．Ｒｅｙ，Ｃ．Ｃｏｍｂｅｓ，Ｃ．Ｄｒｏｕｅｔ，Ｈ．Ｓｆｉｈｉ，Ａ．Ｂａｒｒｏｕｇ，Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，Ｃ，２００７，２７，１９８−５２２０
【非特許文献４】Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００８，４７，１３８２−１３９５
【非特許文献５】Ｂ．Ｐａｌａｚｚｏ，Ｍ．Ｉａｆｉｓｃｏ，Ｍ．Ｌａｆｏｒｇｉａ，Ｎ．Ｍａｒｇｉｏｔｔａ，Ｇ．Ｎａｔｉｌｅ，Ｃ．Ｌ．Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｗａｌｓｈ，Ｓ．Ｍａｎｎ，Ｎ．Ｒｏｖｅｒｉ，Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００７，１７，２１８０−２１８８
【非特許文献６】Ｅ．Ｂｏａｎｉｎｉ，Ｍ．Ｇａｚｚａｎｏ，Ｋ．Ｒｕｂｉｎｉ，Ａ．Ｂｉｇｉ，Ａｄｖ．Ｍａｔｔｅｒ．，２００７，１９，２４９９−２５０２
【非特許文献７】Ｘ．Ｃｈｅｎｇ，Ｌ．Ｋｕｈｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２００７，２，６６７−６７４
【非特許文献８】Ａ．Ｍａｉｔｒａ，Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２００５，５，８９３−９０５
【非特許文献９】Ｙ．Ｋａｋｉｚａｗａ，Ｓ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ａ．Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００６，１１１，３６８−３７０
【非特許文献１０】Ｖ．Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｉ．Ｒａｄｔｋｅ，Ｒ．Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６，２７，３１４７−３１５３
【非特許文献１１】Ｄ．Ｏｌｔｏｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｍ．Ｅ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｃｌｏｓｅ，Ｌ．Ｈｕａｎｇ，Ｎ．Ｐ．Ｋｕｍｔａ，Ｃ．Ｓｆｅｉｒ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７，２８，１２６７−１２７９
【非特許文献１２】Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ａ．Ｋｏｖｔｕｎ，Ｏ．Ｐｒｙｍａｋ，Ｗ．Ｍｅｙｅｒ−Ｚａｉｋａ，Ｅ．Ａ．Ｋｕｂａｒｅｖａ，Ｅ．Ａ．Ｒｏｍａｎｏｖａ，Ｔ．Ｓ．Ｏｒｅｔｓｋａｙａ，Ｒ．Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００７，１７，７２１−７２７
【非特許文献１３】Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００８，４７，１３８２−１３９５
【非特許文献１４】Ｄ．Ｔａｄｉｃ，Ｆ．Ｂｅｃｋｍａｎｎ，Ｋ．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００４，４７，３３３５−３３４０
【非特許文献１５】Ｃ．Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００３，２４，２０３７−２０４３
【非特許文献１６】Ｄ．Ｔａｄｉｃ，Ｆ．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００２，２３，２５５３−２５５９
【非特許文献１７】Ｓ．Ｖ．Ｄｏｒｏｚｈｋｉｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，３１３０−３１４６
【非特許文献１８】Ｓ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｈ．Ｄ．Ｗａｇｎｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．１９９８，２８，２７１−２９８
【非特許文献１９】Ａ．Ｄｏａｔ，Ｍ．Ｆａｎｊｕｌ，Ｆ．Ｐｅｌｌｅ，Ｅ．Ｈｏｌｌａｎｄｅ，Ａ．Ｌｅｂｕｇｌｅ，Ｂｉｏｍａｔａｒｉａｌｓ  ２００３，２４，３３６５−３３７１
【非特許文献２０】Ａ．Ｄｏａｔ，Ｆ．Ｐｅｌｌｅ，Ｎ．Ｇａｒｄａｎｔ，Ａ．Ｌｅｂｕｇｌｅ，Ｊ．Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，１７７，１１７９−１１８７
【非特許文献２１】Ａ．Ｌｅｂｕｇｌｅ，Ｆ．Ｐｅｌｌｅ，Ｃ．Ｃｈａｒｖｉｌｌａｔ，Ｉ．Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ，Ｊ．Ｙ．Ｃｈａｎｅ−Ｃｈｉｎｇ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６，６０６−６０８
【非特許文献２２】Ｓ．Ｐａｄｉｌｌａ  Ｍｏｎｄｅｊａｒ，Ａ．Ｋｏｖｔｕｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００７，１７，４１５３−４１５９
【非特許文献２３】Ｖ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ａ．Ｋｏｖｔｕｎ，Ｒ．Ｈｅｕｍａｎｎ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，１２，１７４−１７９
【非特許文献２４】Ｔ．Ｄ．Ｍｏｄｙ，Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ  Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ，２０００，４，３６２−３６７
【非特許文献２５】Ｍ．Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｐｈｏｔｏｄｉａｇｎ．Ｐｈｏｔｏｄｙｎ．Ｔｈｅｒ．，２００５，２，２６３−２７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
コストを削減し、根底にある毒性（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を軽減する取り組みは進行中であるが、該取り組みは、本発明の開発には関連しない。生理溶液中での溶解性、皮膚光毒性効果、および宿主生物中での保持時間を改善し、標的効果が生じる領域を小さくする取り組みは、細菌感染症、種々の増殖性疾患およびこれに関連する疾患を治療するＰＤＴの使用において、本発明が、新規かつ非自明な改良を提供する領域にある。また、光線力学療法の癌治療への適用は急速に増加しているので、新規な感光製剤についての要求も高まっている。これらの新規な感光製剤には、安定であり、簡単に製造でき、取り扱いが簡単であることが要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的の１つは、安定化剤を含むリン酸カルシウムナノ粒子を基礎とする、ＰＤＴ、特に腫瘍の光線力学療法に用いる感光製剤と、該感光製剤の調製方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、安定化剤を含むリン酸カルシウムナノ粒子を基礎とする、抗菌ＰＤＴに用いる感光製剤と、該感光製剤の調製方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、安定化剤を含まないリン酸カルシウムナノ粒子を基礎とする、ＰＤＴに用いる親水性感光剤からなる感光製剤と、該感光製剤の調製方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、リン酸カルシウムナノ粒子を基礎とする、蛍光撮像法を用いた診断、あるいは蛍光撮像法を用いて細胞、組織または細菌の位置を確認するのに用いる感光製剤と、該感光製剤の調製方法を提供することである。
【００１８】
簡単に言えば、本発明は、製剤用の感光剤を担持したナノ粒子製剤と、該ナノ粒子製剤の光線力学療法用の調製方法を提供する。該ナノ粒子製剤には、親水性または疎水性の感光剤と、リン酸カルシウムのナノ粒子と、特定の場合には安定剤などの補助試剤が含まれる。リン酸カルシウムを基礎とする本発明のナノ粒子製剤によれば、優れた保存安定性と、静脈または局所投与について治療に有効な量の感光剤が得られる。好適な実施形態では、ポルフィリン類、クロリン類およびバクテリオクロリン類などのテトラピロール誘導体が、腫瘍の光線力学療法に適した疎水性感光剤であり、該疎水性感光剤は、リン酸カルシウムナノ粒子製剤中に配合される。また、ｐＴＰＰＰは、腫瘍の光線力学療法に適した親水性感光剤である。別の好適な実施形態では、親水性のカチオン性およびアニオン性の感光剤、特にフェナジニウム、フェノチアジニウムおよびキサンテン系の感光剤は、非活性な病原細菌であることが知られていて、抗菌性光線力学治療法に適した感光剤であり、リン酸カルシウムナノ粒子製剤中に配合される。別の実施形態では、光増感性のナノ粒子製剤は、蛍光画像法を用いて細胞、組織または細菌の位置を確認するのに役立つ。
【００１９】
上で概説された本発明の目的と他の目的、特徴および利点は、添付の図面と共に以下の詳細な説明を読めば、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ−１】ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子の紫外スペクトルを示す図である。
【図１ａ−２】ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウム粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウム粒子の熱重量分析を示す比較図である。
【図１ａ−３】ＰＳＳで安定化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の粉末Ｘ線回折パターンを示す図であり、垂直線は、ヒドロキシアパタイトについて計算した反射率を示している。
【図１ａ−４】超遠心分離後にＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１ａ−５】ｍＴＨＰＰが担持され、ＰＳＳで安定化されたリン酸カルシウムナノ粒子の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１ａ−６】超遠心分離後にｍＴＨＰＰが担持され、ＰＳＳ／ＰＡＨで官能化されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ顕微鏡写真を示す図である。
【図１ｂ−１】ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子の紫外スペクトルを示す図である。
【図１ｂ−２】ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子と、ｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の熱重量分析を示す図である。
【図１ｂ−３】ＣＭＣで安定化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子と、ｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の粉末Ｘ線回折パターンと、ヒドロキシアパタイトについて計算した反射率を示す図である。
【図１ｂ−４】ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図２−１】ＰＳＳで官能化され、ＭＢが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子の紫外スペクトルを示す図である。
【図２−２】ＰＳＳで官能化され、ＭＢが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図３−１】再分散後にｐＴＰＰＰで官能化されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図３−２】ｐＴＰＰＰで官能化され、分散されたリン酸カルシウムナノ粒子（ｐ−ＴＰＰＰの有効濃度：１０±２μＭ）とｐＨ７．４のｐＴＰＰＰ水溶液（１０μＭ）の蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図３−３】ｐＴＰＰＰで官能化され、遠心分離された（固体）リン酸カルシウムナノ粒子の蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図４】ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子であって、ｍＴＨＰＰ濃度が１６．７μＭであるナノ粒子を用いて細胞試験を行ったときの代表的な結果を示す図である。
【図５】（照明前に３０分培養した）リン酸カルシウムナノ粒子を基礎とするメチレンブルー製剤によって、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に黄色ブドウ球菌ＤＳＭ１１０４（ＡＴＣＣ２５９２３）を縣濁させた細菌縣濁液の光力学的不活性化を示す図である。
【図６】（照明前に９０分培養した）リン酸カルシウムナノ粒子を基礎とするｍＴＨＰＰ製剤によって、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に緑膿菌ＤＳＭ１１１７（ＡＴＣＣ２７８５３）を縣濁させた細菌縣濁液の光力学的不活性化を示す図である。
【図７】純粋な形の感光剤ｐＴＰＰＰ（水溶液）と本発明に係るリン酸カルシウムナノ粒子製剤の光力学効果を示す比較図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
光線力学療法は、腫瘍の治療および抗菌療法などの従来技術における多くの用途に関して、有効であることが分かっている。しかしながら、ＰＤＴの有効性は、使用される光と感光剤の両者の影響を受ける。従来技術の感光製剤では、生理溶液への溶解性が適切でないこと、保存安定性が適切でないこと、組織での保持時間が長いこと、皮膚光毒性が広範に及ぶこと、標的となる不健康な領域において効果が認められないことなどの多くの不利益が明らかになっている。そのため、従来技術の化合物に比べて、優れた技術的特性と物理化学的特性を有する新規な感光製剤に対する要求が高まっている。本発明によれば、安定であり、簡単に製造でき、取り扱いが簡単な感光製剤が提供されるので、従来の製剤に対する要求が満足される。さらに、本発明によれば、生理溶液への溶解性が改善され、細菌感染症、および過形成とそれに関連する症状を治療するのに有効な感光薬剤が提供される。さらに、安定な無機ナノ粒子の形で疎水性および親水性の感光剤の両方を輸送する新規な代替手段が提供される。
【００２２】
好適な実施形態の１つでは、医薬用の感光剤が担持されたナノ粒子製剤が提供され、該ナノ粒子製剤はリン酸カルシウムを基礎とし、ＰＤＴ用途で用いられる。該ナノ粒子製剤には、疎水性または親水性の感光剤、リン酸カルシウムおよび安定化剤が含まれる。
【００２３】
腫瘍の光線力学治療の場合、親水性感光剤は、これに限られる訳ではないが、ｐＴＰＰＰであると好ましく、疎水性感光剤は、これに限られる訳ではないが、ポリフィリン類、クロリン類またはバクテリオクロリン類の中から選ばれるテトラピロール系の感光剤であると好ましい。該テトラピロール系の感光剤の光吸収の最大値は、６４０〜７８０ｎｍの範囲にある。
【００２４】
抗菌光線力学療法の場合、感光剤は、フェナジニウム、フェノチアジニウムまたはキサンテン色素（つまり、トルイジンブルー、メチレンブルーとそれらの誘導体、サフラニンとその誘導体、エリスロシンとその誘導体）の中から選ばれると好ましい。
【００２５】
好適な安定化剤は、アニオン系高分子電解質であるポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、およびカチオン系高分子電解質であるポリ（アリルアミン）塩酸塩（ＰＡＨ）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。リン酸カルシウムナノ粒子が、これらの高分子電解質によって安定化できることは公知であった（Ｈ．Ｕｒｃｈ，Ｃ．Ｇｅｉｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｍａｔｅｒｉａｌｗｉｓｓ．ｕｎｄ  Ｗｅｒｋｓｔｏｆｆｔｅｃｈ．，２００６，３７，４２２−４２５）。さらに、よく知られた自己組織化交互吸着法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて、リン酸カルシウムナノ粒子上に、交互に電荷を与えたポリマー層を３層まで加えることができる（Ｇ．Ｄｅｃｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７，１２３２−１２３７）。適切に処理すれば、高分子電解質のカプセルを残して、リン酸カルシウムの核を溶解できる（Ｊ．Ｓｃｈｗｉｅｒｔｚ，Ｗ．Ｍｅｙｅｒ−Ｚａｉｋａ，Ｌ．Ｒｕｉｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｌｂｅｔ，Ｍ．Ｖａｌｌｅｔ−Ｒｅｇｉ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，２００８，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，１８，３８３１−３８３４）。低分子量の化学種をポリスチレンの核に堆積された高分子層に組み込むことができることは、文献で知られている（Ｚ．Ｄａｉ，Ａ．Ｖｏｉｇｔ，Ｓ．Ｌｅｐｏｒａｔｔｉ，Ｅ．Ｄｏｎａｔｈ，Ｌ．Ｄａｅｈｎｅ，Ｈ．Ｍｏｅｈｗａｌｄ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００１，１３，１３３９−１３４２）。
【００２６】
好適な実施形態の１つでは、リン酸カルシウム系ナノ粒子の感光製剤を調製する方法が提供される。該方法は以下のステップを含む。つまり、１）カルシウムとリン酸塩を溶液中で連続的に沈殿化させて、ナノ粒子を形成するステップ；２）リン酸カルシウムナノ粒子の沈殿生成中に、ＰＳＳまたはＣＳＣなどの安定化剤を添加するステップ；３）沈殿生成前、沈殿生成中または沈殿生成後に、感光剤を添加するステップ；４）自己組織化交互吸着法を用いて、安定化された感光剤を担持されたリン酸カルシウム粒子を官能化するステップを含む。
【００２７】
ＰＰＳで安定化されたリン酸カルシウムナノ粒子の場合、前記感光剤は、沈殿生成直後に分散液に加えられる。ＣＭＣで安定化されたリン酸カルシウムナノ粒子の場合、前記感光剤は、沈殿生成前にリン酸塩成分に加えられる。さらに、ＰＰＳで安定化され、感光剤が担持されたリン酸カルシウム粒子を、自己組織化交互吸着法を用いて、ＰＡＨによって官能化することもできる。ＣＭＣで官能化され、感光剤が担持された粒子を、ＰＥＩでさらに官能化することもできる。このように、ナノ粒子を広範な方法で官能化できる。ナノ粒子を官能化できる広範な方法の範囲には、ナノ粒子分散液の（アニオン性またはカチオン性の）電荷を厳密に制御することも含まれる。
【００２８】
別の好適な実施形態では、安定化剤の添加を要しないリン酸カルシウム系ナノ粒子の感光製剤を調製する方法が提供される。該方法は以下のステップを含む。つまり、１）カルシウムとリン酸塩を溶液中で連続的に沈殿化させて、ナノ粒子を形成するステップ；２）沈殿生成前、沈殿生成中または沈殿生成後に、感光剤を加えるステップを含む。
【００２９】
非官能性のリン酸カルシウム粒子の場合、前記感光剤は、前記リン酸カルシウム分散液に直接加えられる。
【００３０】
本発明の製剤の特別な利点は、安定化剤を添加せずに、前記感光剤を前記リン酸カルシウムに配合できる場合があることである（実施例３）。そのため、本発明に記載された方法では、ｐＴＰＰＰなどの親水性の高い感光製剤を使用できる。一般に、腫瘍は水溶性が低いので、このような親水性の高い感光剤は、腫瘍の光線力学療法には適していない。驚くべきことに、ｐＴＰＰＰなどの親水性の高い感光剤は、本発明で記載されたようにリン酸カルシウムナノ粒子に配合されると、ＨＴ２９腫瘍細胞に対してＰＤＴ活性を示すようになる（実施例６には、純粋なｐＴＰＰＰとリン酸カルシウムナノ粒子製剤中のｐＴＰＰＰの活性の違いが示されている。）。
【００３１】
感光性ナノ粒子製剤は、感光剤分子を不要な細胞、組織または細菌細胞あるいは他の不要な対象物に向けるのに役立つとともに、適当な光源を用いて放射線照射を行った後に、標的に損傷を与えるのに役立つ。さらに、別の実施形態では、感光性製剤は、一般に紫外吸収波長で可視蛍光を発生する蛍光撮影法を用いて、不要な細胞、組織または細菌細胞あるいは他の不要な対象物の位置を確認するのに役立つ（実施例３を比較せよ）。前記撮影は、前記感光剤の光化学的活性化を伴って、あるいは伴わないで、一般に可視または近赤外波長の放射線を照射して実行できる。
【００３２】
リン酸カルシウムは、哺乳類の骨と歯に含まれる無機鉱物から構成されるので、前記リン酸カルシウムナノ粒子は、人体に好適に受け入れられる。そのため、前記リン酸カルシウムナノ粒子は、生体適合性と生分解性を備える原薬に対して、極めて有能な輸送キャリアとして機能する。前記感光剤を前記リン酸カルシウムナノ粒子の表面および内部に結合させると、非水溶性の感光剤を水中に分散させることができる。そのため、アルコール溶液の使用を避けることができる。
【００３３】
以下の実施例によれば、感光剤が担持された本発明のリン酸カルシウムナノ粒子の作り方と、該ナノ粒子の光線力学活性の全部および一例が、当業者に開示されて説明される。以下の実施例は、発明者が発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。数値（例えば、量、温度等）に関して精度を保証するように努力はしているが、多少の実験誤差及び偏差については考慮する必要がある。
【実施例】
【００３４】
（実施例１ａ）ＰＳＳで安定化されたリン酸カルシウムナノ粒子と疎水性感光剤５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロフェニル）−ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含む製剤の調製についての説明
ＰＳＳで被覆されたナノ粒子は、体積比で１：１：２にした乳酸カルシウム（１８ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（１０．８ｍＭ）およびＰＰＳ（２ｇ／ｌ）水溶液を、４部容量の水を含む撹拌容器に迅速に注入して室温で調製された。生成したリン酸カルシウムナノ粒子を、ＰＳＳによって官能化させ安定化させた（Ｈ．Ｕｒｃｈ，Ｃ．Ｇｅｉｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｕｌｂｒｉｃｈｔ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｍａｔｅｒｉａｌｗｉｓｓ．ｕｎｄ  Ｗｅｒｋｓｔｏｆｆｔｅｃｈ．，２００６，３７，４２２−４２５）。カルシウムとリン酸塩を含む溶液のｐＨは、アンモニア溶液を用いて予め１０に調節した。１分後、ｍＴＨＰＰ（２−プロパノールに１．５ｍＭで溶解）を、リン酸塩溶液の体積に対して１：５から１：１までの体積比となるように添加した。コロイド分散液の最終ｐＨは、９．３から９．５であった。４日後、前記粒子は、６６，０００ｇで３０分超遠心分離を行って、対イオン（乳酸塩、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）、（溶解した）余剰のＰＳＳおよび非吸着のｍＴＨＰＰから分離された。遠心分離されたナノ粒子は水中に再分散された後、再度遠心分離され、再分散された。全ての調製工程に、超純水（ＥＬＧＡ社のＰｕｒｅｌａｂ  ｕｌｔｒａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで製造）を用いた。
【００３５】
前記製品の特徴を、種々の分析法で調べた。Ｎｅｔｚｓｃｈ社製のＳＴＡ  ４０９  ＰＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（アルミナ製の開口坩堝を使用）を用いて、動的な酸素雰囲気が５０ｍｌ／ｍｉｎ、加熱速度が１Ｋ／ｍｉｎの条件で、熱重量分析（ＴＧ）を実施した。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製のＤ５００回折装置を用いて、λ＝１．５４ÅのＣｕ−Ｋα放射で実施し、エネルギー分散型Ｘ線分析を組み合わせた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ−ＥＤＸ）は、金とパラジウムを８０：２０の比率でスパッタした試料に対して、ＥＳＥＭにＦＥＩ社製のＱｕａｎｔａ  ４００  ＦＥＧを用い、ＥＤＸの検出器にＳ−ＵＴＷ−Ｓｉ（Ｌｉ）を用いて走査した。動的光散乱（ＤＬＳ）とゼータ電位測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製のＮａｎｏ−ＺＳ、レーザ波長はλ＝５３２ｎｍ）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて実施された。発光および励起スペクトルは、ダイオードアレイ型ポリクロメータと７５Ｗのキセノンランプを取り付けたＪ＆Ｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｓｓ−  ｕｎｄ  Ｒｅｇｅｌｔｅｃｈｎｉｋ社製のＦＬ３０９５−５００）を用いて室温で測定された。前記発光スペクトルは、検出器の感度に対して修正され、前記励起スペクトルは、励起光の強度に対して修正された。紫外可視吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ（登録商標）  ＷｉｎＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１ｃｍの石英キュベット中に記録された。
【００３６】
前記粒子に吸着されたｍＴＨＰＰの量を、紫外分光で検量線を記録して測定した。図１ａ−１は、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムコロイドの典型的な吸収スペクトルを示している。この吸収スペクトルは、溶解したｍＴＨＰＰの吸収スペクトルに類似している。
【００３７】
図１ａ−２は、ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の熱重量分析を示している。第１の重量減少は、化合物の水分の減少に相当し、両サンプルタイプで非常に類似している。第２の重量減少は、高分子部分の燃焼を示している。つまり、この場合、高分子の量は約３．５％だけ異なる。ｍＴＨＰＰによって、ＰＳＳの吸着がある程度阻害されていることは明らかである。第３の重量減少、つまり、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子の２．９％の重量減少は、ｍＴＨＰＰの燃焼に相当し、この重量減少は、非担持の粒子では見られない。ｍＴＨＰＰのこの量は、紫外分光法での定量的な結果に一致する。最後の重量減少は、鉱物相の炭酸塩の含有量に由来する二酸化炭素の減少を示している。これらの結果は、元素分析（Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｃａ，ＰＯ４３−）でも確認された。リン酸塩に対するカルシウムの比率は１．６７、つまり、ヒドロキシアパタイトの化学量論比である。
【００３８】
図１ａ−３は、ＰＳＳで安定化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の粉末Ｘ線回折パターンを示している。幅広の回折ピークで示したように、前記粒子は、ナノ結晶性のヒドロキシアパタイト、Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）から構成される。
【００３９】
図１ａ−４は、ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示している。前記粒子の直径は、約８０〜１００ｎｍであり、その粒度分布はどちらかと言えば単分散性である。
【００４０】
これらの結果は、動的光散乱測定によって確認された。前記粒子のゼータ電位は約−２０ｍＶであった。ゼータ電位が比較的低いにも関わらず、前記粒子は、分散状態で数週間安定していた。
【００４１】
さらに、自己組織化交互吸着法によって、別の高分子層を、ＰＳＳで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子に堆積することができる（Ｇ．Ｄｅｃｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７，１２３２−１２３７；Ｊ．Ｓｃｈｗｉｅｒｔｚ，Ｗ．Ｍｅｙｅｒ−Ｚａｉｋａ，Ｌ．Ｒｕｉｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｌｂｅｔ，Ｍ．Ｖａｌｌｅｔ−Ｒｅｇｉ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，１８，３８３１−３８３４）。カチオン性高分子電解質であるＰＡＨ（４ｇ／ｌ、ｐＨ７）を、１：１の体積比で粒子の分散液に添加した。前記粒子は、６６，０００ｇで３０分超遠心分離を行って、余剰のＰＡＨから分離された。遠心分離された粒子を超純水中に再分散させた。紫外スペクトルは、第２の高分子層を用いない粒子のものに類似していた。蛍光測定結果から、ＰＡＨ層を堆積させると蛍光強度が減少することが分かる（図１ａ−５）。
【００４２】
動的光散乱測定では、粒径の僅かな増加が見られる。これはＳＥＭによって確認された（図１ａ−６）。前記粒子の直径は１００〜１２０ｎｍである。ゼータ電位は約＋５０ｍＶであり、該ゼータ電位では、カチオン性高分子電解質であるＰＡＨの吸着が確認される。
【００４３】
（実施例１ｂ）ＣＭＣで安定化されたリン酸カルシウムナノ粒子と疎水性感光剤５，１０，１５，２０−テトラキス（３−ヒドロフェニル）−ポルフィリン（ｍＴＨＰＰ）を含む製剤の調製についての説明
ＣＭＣで被覆されたナノ粒子は、体積比で１：１：２にした乳酸カルシウム（１８ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（１０．８ｍＭ）およびＰＰＳ（２ｇ／ｌ）水溶液を、４部容量の水を含む撹拌容器に迅速に注入して室温で調製された。感光剤ｍＴＨＰＰ（２−プロパノールに１．５ｍＭで溶解）は、沈殿生成前に、リン酸塩溶液の体積に対して、２０：１から５：１までの体積比でリン酸塩成分に混合された。前記ＣＭＣによって、生成されたリン酸カルシウムナノ粒子を官能化させ安定化させた。カルシウムとリン酸塩を含む溶液のｐＨを、アンモニア溶液を用いて予め１０に調節した。コロイド分散液の最終ｐＨは、９．２から９．５であった。前記粒子は、６６，０００ｇで３０分超遠心分離を行って、対イオン（乳酸塩、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）、（溶解した）余剰のＣＭＣおよび非吸着のｍＴＨＰＰから分離された。遠心分離されたナノ粒子は水中に再分散された後、再度遠心分離され、再分散された。全ての調製工程に、超純水（ＥＬＧＡ社のＰｕｒｅｌａｂ  ｕｌｔｒａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで製造）を用いた。このコロイド系を安定化させるために、前記分散液は、水に対して１：５の体積比で希釈される必要があった。
【００４４】
前記製品の特徴を、種々の分析法で調べた。Ｎｅｔｚｓｃｈ社製のＳＴＡ  ４０９  ＰＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（アルミナ製の開口坩堝を使用）を用いて、動的な酸素雰囲気が５０ｍｌ／ｍｉｎ、加熱速度が１Ｋ／ｍｉｎの条件で、熱重量分析（ＴＧ）を実施した。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製のＤ５００回折装置を用いて、λ＝１．５４ÅのＣｕ−Ｋα放射で実施し、エネルギー分散型Ｘ線分析を組み合わせた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ−ＥＤＸ）は、金とパラジウムを８０：２０の比率でスパッタした試料に対して、ＥＳＥＭにＦＥＩ社製のＱｕａｎｔａ  ４００  ＦＥＧを用い、ＥＤＸの検出器にＳ−ＵＴＷ−Ｓｉ（Ｌｉ）を用いて走査した。動的光散乱（ＤＬＳ）とゼータ電位測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製のＮａｎｏ−ＺＳ、レーザ波長はλ＝５３２ｎｍ）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて実施された。発光および励起スペクトルは、ダイオードアレイ型ポリクロメータと７５Ｗのキセノンランプを取り付けたＪ＆Ｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｓｓ−  ｕｎｄ  Ｒｅｇｅｌｔｅｃｈｎｉｋ社製のＦＬ３０９５−５００）を用いて室温で測定された。前記発光スペクトルは、検出器の感度に対して修正され、前記励起スペクトルは、励起光の強度に対して修正された。紫外可視吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ（登録商標）  ＷｉｎＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１ｃｍの石英キュベット中に記録された。
【００４５】
前記粒子に吸着されたｍＴＨＰＰの量は、紫外分光で測定した。図１ｂ−１は、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムコロイドの典型的な吸収を示している。幅広なピークを除いて、吸収スペクトルは、非担持状態のｍＴＨＰＰの吸収スペクトルに近い。
【００４６】
図１ｂ−２は、ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の熱重量分析を示している。第１の重量減少は、化合物の水分の減少に相当する。この重量減少は、ｍＴＨＰＰが担持された粒子の場合よりもｍＴＨＰＰが担持された粒子の場合の方が４．５％高い。第２の重量減少は、高分子の燃焼に由来するものである。つまり、この場合、高分子の量は３．３％だけ異なる。この場合、ｍＴＨＰＰによって、ＣＭＣの吸着がある程度促進されていることは明らかである。第３の重量減少、つまり、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子の２．６％の重量減少は、ｍＴＨＰＰの燃焼に由来する。最後の重量減少は、鉱物相の炭酸塩の含有量に由来する二酸化炭素の減少を示している。これらの結果は、元素分析で確認された。リン酸塩に対するカルシウムの比率は１．７６、つまり、ヒドロキシアパタイトの化学量論比（１．６７）よりも僅かに高い比率である。
【００４７】
図１ｂ−３は、ＣＭＣで安定化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子とｍＴＨＰＰが担持されていないリン酸カルシウムナノ粒子の粉末Ｘ線回折パターンを示している。前記粒子は、Ｘ線回折においてはアモルファスである、つまり、明確なピークが何ら認められない。垂直線は、ヒドロキシアパタイトＣａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）の計算されたピーク位置を示している。
【００４８】
図１ｂ−４は、ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示している。前記粒子の直径は、約８０〜１００ｎｍであり、その粒度分布はどちらかと言えば単分散性である。
【００４９】
これらの結果は、動的光散乱測定によって確認された。前記粒子のゼータ電位は約−２０ｍＶであった。ゼータ電位が比較的低いにも関わらず、前記粒子は、分散状態で数週間安定していた。
【００５０】
さらに、自己組織化交互吸着法によって、別の高分子層を、ＣＭＣで官能化され、ｍＴＨＰＰが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子に堆積することができる（Ｇ．Ｄｅｃｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７７，１２３２−１２３７；Ｊ．Ｓｃｈｗｉｅｒｔｚ，Ｗ．Ｍｅｙｅｒ−Ｚａｉｋａ，Ｌ．Ｒｕｉｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｍ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｌｂｅｔ，Ｍ．Ｖａｌｌｅｔ−Ｒｅｇｉ，Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００８，１８，３８３１−３８３４）。カチオン性高分子電解質であるＰＥＩ（２ｇ／ｌ、ｐＨ１０．４）を、８：１の体積比で粒子の分散液に添加した。前記粒子は、６６，０００ｇで３０分超遠心分離を行って、余剰のＰＥＩから分離された。遠心分離された粒子を超純水中に再分散させた。前記粒子の大きさは約４０ｎｍまで増加し、前記ゼータ電位は＋３０ｍＶであった。該ゼータ電位では、カチオン性高分子電解質であるＰＥＩの吸着が確認される。前記粒子は、分散状態で数週間安定である。
【００５１】
結論として、リン酸カルシウムナノ粒子に、異なる官能基を付与し、ｍＴＨＰＰを担持して調製することができた。全てのコロイド系は、数週間安定であった。全ての試料の粒度分布は、多分散指数（ＰＤＩ）０．３を下回っていた。この数値によって、動的光散乱測定の信頼性が説明される。ＳＥＭ画像によって、狭い粒度分布が確認される。リン酸カルシウムナノ粒子上に吸着されたｍＴＨＰＰの量は、紫外分光と熱重量分析で測定される。前記粒子の内部構造は、アモルファスからナノ結晶性のヒドロキシアパタイトにまで及ぶ。
【００５２】
（実施例２）リン酸カルシウムナノ粒子と親水性感光剤であるメチレンブルー（ＭＢ）を含む製剤の調製についての説明
ＰＳＳで被覆されたナノ粒子は、体積比で１：１：２にした乳酸カルシウム（１８ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（１０．８ｍＭ）およびＰＰＳ（２ｇ／ｌ）水溶液を、４部容量の水を含む撹拌容器に迅速に注入して室温で調製された。生成したリン酸カルシウムナノ粒子を、ＰＳＳによって官能化させ安定化させた。カルシウムとリン酸塩を含む溶液のｐＨは、アンモニア溶液を用いて予め１０に調節した。１分後、ＭＢ（０．００３Ｍ）を、リン酸塩溶液の体積に対して１：１の体積比になるように添加した。前記粒子は、１５０，０００ｇで３０分超遠心分離を行って、対イオン（乳酸塩、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）、（溶解した）余剰のＰＳＳおよび非吸着のＭＢから分離された。遠心分離されたナノ粒子は水中に再分散された後、再度遠心分離され、再分散された。全ての調製工程に、超純水（ＥＬＧＡ社のＰｕｒｅｌａｂ  ｕｌｔｒａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで製造）を用いた。
【００５３】
前記製品の特徴を、種々の分析法で調べた。Ｎｅｔｚｓｃｈ社製のＳＴＡ  ４０９  ＰＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（アルミナ製の開口坩堝を使用）を用いて、動的な酸素雰囲気が５０ｍｌ／ｍｉｎ、加熱速度が１Ｋ／ｍｉｎの条件で、熱重量分析（ＴＧ）を実施した。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）は、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製のＤ５００回折装置を用いて、λ＝１．５４ÅのＣｕ−Ｋα放射で実施し、エネルギー分散型Ｘ線分析を組み合わせた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ−ＥＤＸ）は、金とパラジウムを８０：２０の比率でスパッタした試料に対して、ＥＳＥＭにＦＥＩ社製のＱｕａｎｔａ  ４００  ＦＥＧを用い、ＥＤＸの検出器にＳ−ＵＴＷ−Ｓｉ（Ｌｉ）を用いて走査した。動的光散乱（ＤＬＳ）とゼータ電位測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製のＮａｎｏ−ＺＳ、レーザ波長はλ＝５３２ｎｍ）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて実施された。発光および励起スペクトルは、ダイオードアレイ型ポリクロメータと７５Ｗのキセノンランプを取り付けたＪ＆Ｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｓｓ−  ｕｎｄ  Ｒｅｇｅｌｔｅｃｈｎｉｋ社製のＦＬ３０９５−５００）を用いて室温で測定された。前記発光スペクトルは、検出器の感度に対して修正され、前記励起スペクトルは、励起光の強度に対して修正された。紫外可視吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ（登録商標）  ＷｉｎＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１ｃｍの石英キュベット中に記録された。
【００５４】
前記粒子上に吸着されたＭＢの量は、紫外分光で測定した。図２−１は、ＭＢが担持されたリン酸カルシウムコロイドの典型的な吸収を示している。この吸収パターンは、非担持のＭＢの吸収パターンに類似している。
【００５５】
図２−２は、ＰＳＳで官能化され、ＭＢが担持されたリン酸カルシウムナノ粒子のＳＥＭ画像を示している。前記粒子の直径は約５０〜８０ｎｍであり、その粒度分布はかなり単分散性である。これらの粒子のゼータ電位は約−２０ｍＶである。ゼータ電位が低いにも関わらず、前記粒子は、分散状態で数週間安定していた。
【００５６】
結論として、リン酸カルシウムナノ粒子を、ＰＳＳで官能化し、ＭＢを担持させて調製することができた。これらの粒子は、数週間安定であった。前記試料の粒度分布は、多分散指数０．３を下回っていた。この数値によって、動的光散乱測定の信頼性が説明される。ＳＥＭ画像によって、狭い粒度分布が確認される。リン酸カルシウムナノ粒子上に吸着されたＭＢの量は、紫外分光法で確認された。
【００５７】
（実施例３）リン酸カルシウムナノ粒子と親水性リン酸塩で官能化された感光剤（ｐＴＰＰＰ）を含む製剤の調製についての説明
リン酸カルシウムナノ粒子は、Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ（３ｍＭ）と（ＮＨ４）２ＨＰＯ４（１．８ｍＭ）を含む水溶液を撹拌容器に注入して調製された（Ｔ．Ｗｅｌｚｅｌ，Ｉ．Ｒａｄｔｋｅ．Ｗ．Ｍｅｙｅｒ−Ｚａｉｋａ，Ｒ．Ｈｅｕｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅｐｐｌｅ，Ｊ．Ｍａｔｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００４，１４，２２１３−２２１７）。カルシウムとリン酸塩を含む溶液のｐＨは、０．１ＮのＮａＯＨを用いて予め９に調製した。混合して数秒後、ナノ粒子の分散液は、注射器を用いて採取された。前記コロイドは、ｐＴＰＰＰナトリウム塩水溶液（３０μＭ）を、分散されたリン酸カルシウムナノ粒子に対して、５ｍｌ：１０ｍｌの比率で迅速に混合して調製された。コロイド分散液の最終ｐＨは、７．５と８．５の間であった。前記コロイドは、遮光下で、４〜８℃で保存された。前記粒子は、３７１，０００ｇで超遠心分離を行って、対イオン（ＮＯ３−、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）および非吸着のｐＴＰＰＰから分離された。遠心分離されたナノ粒子は、１００ｍｌの無水エタノールで洗浄され、水中に再分散されるか、空気中で乾燥された。全ての調製工程に、超純水（ＥＬＧＡ社のＰｕｒｅｌａｂ  ｕｌｔｒａ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔで製造）を用いた。
【００５８】
超遠心分離後の上澄み液中に溶解されたｐＴＰＰＰの量は、ＵＶ分光法での測定によると約３０％であった。つまり、添加したｐＴＰＰＰの全量の約７０％は、リン酸カルシウム表面上に吸着されていた。ナノ粒子中のｐＴＰＰＰの量は、合成中に使用されたポルフィリン、カルシウムおよびリン酸塩の量を用いて、以下のように推定された。つまり、全てのカルシウムとリン酸塩が、溶液からヒドロキシアパタイト、つまり、Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨとして沈殿すると推定すると、固相中のｐＴＰＰＰの最大量は、約０．７×５．５重量％＝３．９重量％になる。ｐＴＰＰＰがドープされたナノ粒子の燃焼元素分析での元素分析によれば、炭素原子は２．３２重量％であり、水素原子は２．７３重量％である。水素原子は、水酸基を含む化合物の群と吸着された水から生じる可能性もあるので、炭素含有量だけを用いた。該炭素含有量によれば、固体中のｐＴＰＰＰの担持量は５．２重量％であった。固体中のｐＴＰＰＰ担持量は、約４〜５重量％であるという結論に至った。２つの方法で値が異なるのは、実験の不確実性によるものである。
【００５９】
色素ｐＴＰＰＰが吸着され、官能化されたナノ粒子の特徴を、ＮＭＲ分光法（Ｂｒｕｋｅｒ  ３００ＭＨｚ）、ＥＳＩ−ＭＳ分光法（エレクトロスプレーイオン化銃を取り付けたＢｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＴＯＦ  ＩＩＩ）、粉末Ｘ線回折法（ＸＲＤ、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製のＤ５００回折装置を用いて、λ＝１．５４ÅのＣｕ−Ｋα放射で実施）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ、Ｂｒｕｋｅｒ−Ｖｏｒｔｅｘ  ７０  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）およびエネルギー分散型Ｘ線分析を組み合わせた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ−ＥＤＸ、金とパラジウムを８０：２０の比率でスパッタした試料に対して、ＥＳＥＭにＦＥＩ社製のＱｕａｎｔａ  ４００  ＦＥＧを用い、ＥＤＸの検出器にＳ−ＵＴＷ−Ｓｉ（Ｌｉ）を用いて走査）によって調べた。動的光散乱（ＤＬＳ）とゼータ電位測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製のＮａｎｏ−ＺＳ、レーザ波長はλ＝５３２ｎｍ）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて実施された。発光および励起スペクトルは、ダイオードアレイ型ポリクロメータと７５Ｗのキセノンランプを取り付けたＪ＆Ｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｍｅｓｓ−  ｕｎｄ  Ｒｅｇｅｌｔｅｃｈｎｉｋ社製のＦＬ３０９５−５００）を用いて室温で測定された。前記発光スペクトルは、検出器の感度に対して修正され、前記励起スペクトルは、励起光の強度に対して修正された。紫外可視吸収スペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ（登録商標）  ＷｉｎＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて、１ｃｍの石英キュベット中に記録された。
【００６０】
走査型電子顕微鏡では、略球状の粒子が示されていた（図３−１）
【００６１】
励起波長４１０ｎｍでは、分散されたコロイドの発光スペクトルは、７０５ｎｍにおいて肩を持つ６５３ｎｍの強い吸収帯を有する（図３−２）。ｐＨ７．４において、一部がプロトン化されたｐＴＰＰＰの形態では、発光スペクトル中に、６５０ｎｍと７１２ｎｍの２つの強い吸収帯が示された。このスペクトルは、分散されたナノ粒子の発光スペクトルと比べられた。分散されたナノ粒子の場合、７１２ｎｍの強いピークの代わりに、７０５ｎｍにおいて幅の広い肩が観察された。分散されたナノ粒子の吸収および発光スペクトルで観察されたスペクトル変化は、恐らく、ｐＴＰＰＰとリン酸カルシウム表面との静電相互作用に由来するものである。遠心分離された（溶媒を含まない、つまり固体の）ｐＴＰＰＰで官能化されたリン酸カルシウムナノ粒子の発光スペクトルも測定された。前記粒子は、３０６ｎｍの近紫外領域で励起された（図３−３）。前記発光スペクトルは、４７２ｎｍと５９７ｎｍに強いピークを示していて、固体のポルフィリンの発光スペクトルと良く一致していた。
【００６２】
図３−２と３−３から明らかなように、ｐＴＰＰＰが担持されたナノ粒子によって、生体内での検出に使用できる蛍光信号が示される。
【００６３】
（実施例４）実施例１で得られた（感光剤ｍＴＨＰＰを有する）製剤のＨＴ２９腫瘍細胞株に対する細胞試験
以下の手順に従って、細胞試験を実施した。つまり、光増感活性をヒト大腸ガン細胞株ＴＨ２９中で測定した。ＨＴ２９は、熱失活した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ｃｃ−ｐｒｏ  ＧｍｂＨ）、１％ペニシリン（１００００ＩＵ）およびストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（ｃｃ−ｐｒｏ  ＧｍｂＨ）中で成長させた。細胞は、加湿された培養器中（３７℃、空気中のＣＯ２は５％）で単層培養された。
【００６４】
ナノ粒子製剤の保存溶液は、暗所において４℃で保管された。１０％ＦＣＳを含むフェノールレッド無添加のＲＰＭＩ  １６４０培地中で希釈されて、感光剤の最終濃度は、それぞれ２または１０μＭになった。
【００６５】
細胞を２×１０４細胞／ｍｌでマイクロプレート中に播種した（２×１０５細胞／ウェル）。細胞は、２または１０μＭの感光剤を含有する１０％ＦＣＤを含んだ新鮮な培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ）で、露光前に２４時間培養された。光増感前に、細胞は洗浄され、フェノールレッドと１０％ＦＣＳを含まないＲＰＭＩで培養され、次に、６５２ｎｍのダイオードレーザ（Ｃｅｒａｌａｓ  ＰＤＴ  ６５２、ｂｉｏｌｉｔｅｃ  ＡＧ）を、１００ｍＷ／ｃｍ２（５０Ｊ／ｃｍ２）の一定のフルエンス率で室温において照射した。照射後、細胞生存率試験まで、前記細胞を加湿された培養器中（３７℃、空気中のＣＯ２は５％）で２４時間培養した。
【００６６】
細胞生存率は、ＸＴＴ試験で評価された。５００ｍｇのＸＴＴ（３’−［フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム］ビス［４−メトキシ−６−ニトロ］ベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ）は、５００ｍｌの（Ｃａ２＋とＭｇ２＋を含まない）ＰＢＳ緩衝液中に溶解され、滅菌濾過された。溶液は、使用されるまで、暗所において２０℃で保管された。ＰＭＳ（Ｎ−メチルジベンゾピラジンメチル硫酸塩、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ）滅菌溶液が、ＸＴＴに対する活性試薬として要求された。０．３８３ｍｇのＰＭＳが１ｍｌのＰＢＳ緩衝液に溶解された。前記溶液は凍結保存される必要があり、光に曝されるべきではない。ＸＴＴ試液は、３７℃の水浴で温められ、使用直前に活性化溶液（ＰＭＳ）が添加された。１個のマイクロプレート（９６ウェル）に対して十分な量の反応溶液を調製するために、０．１ｍｌの活性化溶液（ＰＭＳ）が５ｍｌのＸＴＴ試薬に加えられた。マイクロプレート中の培地は、ウェルごとに５０μｌのＸＴＴ反応液を添加する前に、フェノールレッドと１０％ＦＣＳを含まない新鮮なＲＰＭＩ（１００μｌ）に交換された。マイクロプレートは、オレンジ色素が形成されるまで、３７℃かつ５％ＣＯ２の条件で２〜３時間培養された。ウェル中に色素を均一に分散するために、マイクロプレートは、緩やかに振られた。
【００６７】
試料の吸光度は、分光光度計（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ、Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．製）を用いて波長４９０ｎｍで測定した。リファレンス吸光度を測定するため（任意の読み取り値を測定するため）に、波長６３０〜６９０ｎｍを用いた。
【００６８】
（実施例５）実施例２で得られた（感光剤ＭＢを有する）製剤の細菌の細胞培養に対する細胞試験
以下の手順に従って、試験を実施した。我々の試験で用いた菌株は、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌ＤＳＭ１１０４（ＡＴＣＣ  ２５９２３）と緑膿菌ＤＳＭ１１１７（ＡＴＣＣ  ２７８５３）であった。この菌株の細胞を、トリプシン大豆ブロス（ドイツのダルムシュタッドにあるＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ製）中で、３７℃で好気的に一晩成長させた。細胞は、遠心分離によって収集され、滅菌されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再縣濁された。６００ｎｍおよび１ｃｍの経路長での最終ＯＤ（光学濃度）は、０．０１５であった。細菌縣濁液の一定分量（１９０μｌ）は、クリアボトムを備えた滅菌済の黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３６０３、アメリカ合衆国のＣｏｒｎｉｎｇ社製）中に分注された。リン酸カルシウムナノ粒子を基礎とするメチレンブルー製剤が、１０μｌ加えられた。前記プレートは、暗所において室温で３０分間培養された。培養後、前記試料は、６６５ｎｍのダイオードレーザ（ドイツにあるｂｉｏｌｉｔｅｃ  ＡＧ社製のＣｅｒａｌａｓ  ＰＤＴ）からの光に曝された。前記ダイオードレーザの出力は０．５５Ｗに設定され、前記プレートの底部から光ファイバを介して照射された時間は１００ｓであった。このような設定でのフルエンス率は約１Ｗ／ｃｍ２であった（Ｏｐｔｏｍｅｔｅｒ  Ｐ−９７１０、Ｇｉｇａｈｅｒｔｚ−Ｏｐｔｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙを用いて測定）。この照射時間において、得られたエネルギーフルエンスは約１００Ｊ／ｃｍ２であった。比較対象のウェルは、メチレンブルー製剤の代わりにＰＢＳを１０μｌ含んでいて、レーザ光に曝されなかった。暗所での毒性に対する比較対象の試料は、メチレンブルー製剤を含んでいるが、レーザ光に曝されなかった。照射後、試料はプレートのウェルから取り除かれ、トリプシン大豆ブロスで希釈され、渦巻きプレーター型のエディージェット（スペインのバルセロナにあるｉｕｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いてトリプシン大豆寒天プレート上に蒔かれた。コロニー形成単位の数（ＣＦＵ／ｍｌ）は、十分に培養された後、コロニー計測器であるＣｏｕｎｔｅｒｍａｔ  Ｆｌａｓｈ（スペインのバルセロナにあるｉｕｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて計測された。
【００６９】
この試験の結果を図５に示した。ＰＤＴ処理による殺菌効果は約９０％であることが分かった。
【００７０】
（実施例６）実施例１ｂで得られた（感光剤ｍＴＨＰＰを有する）製剤の細菌の細胞培養に対する細胞試験
この試験には、ＣＭＣ／ＰＥＩで官能化されたリン酸カルシウムナノ粒子を使用した。
【００７１】
本試験は、培養時間を３０および９０分にすることを除いて、実施例５に示した手順に従ってそれぞれ実施された。
【００７２】
この試験の結果を図６に示した。ＰＤＴ処理による殺菌効果は、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両菌株に対して、約９８〜１００％であることが分かった。
【００７３】
（実施例７）実施例３で得られた（感光剤ｐＴＰＰＰを有する）製剤と純粋な感光剤ｐＴＰＰＰのＨＴ２９腫瘍細胞株に対する細胞試験
本試験は、実施例４に示された手順に従って実施された。純粋な感光剤の溶液中での濃度は、ナノ粒子に含まれる量に等しくなるように調整された。
【００７４】
図７から明らかなように、ＨＴ２９細胞培養物を水溶液中に用いた場合、感光剤ｐＴＰＰＰは光力学活性を示さない。これに対して、感光剤をリン酸カルシウムナノ粒子製剤中に用いた場合、該感光剤は、濃度１０μＭで極めて強い光毒性を示す。
【００７５】
添付の図面を参照して本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は、開示された実施形態だけに限定される訳ではなく、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲または精神から逸脱せずに、当業者によって種々の変形および修正がなされてもよいことが理解されるべきである。
【図１ａ−１】
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【図１ａ−２】
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【図１ａ−３】
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【図１ａ−４】
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【図１ａ−５】
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【図１ａ−６】
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【図１ｂ−１】
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【図１ｂ−２】
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【図１ｂ−３】
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【図１ｂ−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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