(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子。
【化１】
0005217437.tif 000015
（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項２】
核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する共重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子。
【化２】
0005217437.tif 000016
（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項３】
核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）及び疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する共重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子。
【化３】
0005217437.tif 000017
（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。）
【請求項４】
前記一般式［１］中の反応性部位がアルコキシル基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項５】
生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項１〜４のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項６】
生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［２］で表される活性エステル基を有するモノマーである請求項１〜５のいずれかに記載の医療用粒子。
【化４】
0005217437.tif 000018
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項７】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求項６に記載の医療用粒子。
【請求項８】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［３］で表されるモノマーである請求項２〜７のいずれかに記載の医療用粒子。
【化５】
0005217437.tif 000019
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項９】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである請求項２〜８のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である請求項９に記載の医療用粒子。
【請求項１１】
疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基がアルキル基である請求項３〜１０のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１２】
疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基が炭素数３〜２０のアルキル基である請求項３〜１１のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１３】
前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである請求項１２に記載の医療用粒子。
【請求項１４】
核となる粒子が無機材料からなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１５】
前記無機材料が無機酸化物からなることを特徴とする請求項１４に記載の医療用粒子。
【請求項１６】
前記無機酸化物をアルコキシシランで表面処理したことを特徴とする請求項１５に記載の医療用粒子。
【請求項１７】
前記アルコキシシランがテトラアルコキシシランを含むことを特徴とする請求項１６に記載の医療用粒子。
【請求項１８】
前記テトラアルコキシシランがテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、及びテトラブトキシシランから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１７に記載の医療用粒子。
【請求項１９】
前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランを含むことを特徴とする請求項１８に記載の医療用粒子。
【請求項２０】
前記無機酸化物が酸化ケイ素または酸化チタンであることを特徴とする請求項１５〜１９のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、前記高分子化合物を直接核となる粒子表面に塗布する工程を含む医療用粒子の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、前記高分子化合物を溶媒に溶解させた溶液を調製する工程、前記溶液を核となる粒子表面に塗布する工程、及び乾燥させる工程、を含む医療用粒子の製造方法。
【請求項２３】
前記溶液が、前記高分子化合物を５重量％以上含有することを特徴とする請求項２２に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２４】
前記溶液を核となる粒子に塗布する工程において、前記溶液と核となる粒子とを含む混合物を作製する工程、及び溶媒の一部を大気圧または減圧下で除去する工程を含むことを特徴とする請求項２２又は２３に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２５】
前記高分子化合物又は前記溶液を核となる粒子表面に塗布する工程の前に、更に粒子をアルコキシシランで表面処理する工程を含む請求項２１〜２４のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２６】
前記粒子をアルコキシシランで表面処理する工程が、前記粒子及び前記アルコキシシランをアルカリ触媒を含む溶液中で攪拌混合した後、乾燥し、酸を含む水溶液中で攪拌する工程、を含む請求項２５に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２７】
前記酸が無機酸であることを特徴とする請求項２６に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２８】
前記無機酸が塩酸であることを特徴とする請求項２７に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項２９】
前記高分子化合物を核となる粒子表面に塗布する工程の後に、更に加熱処理する工程を含む請求項２１〜２８のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項３０】
前記溶媒がシクロヘキサノンを含み、核となる粒子が酸化ケイ素からなる請求の範囲請求項２２〜２９のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療用粒子及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーでさまざまな粒子を被覆したポリマー被覆粒子は、工業分野で広く用いられてきただけでなく、近年においては基礎的な生物学や医療の分野においてその重要性が高まっている。例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体への応用、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）、創薬用途などへの応用に対する関心が高まっている。創薬用途への応用例としては、たとえば様々な粒子（担体）に固定されたリガンドと呼ばれる生理活性物質を介して特定のタンパク質などの生体分子を捕捉し、これを分離精製するものがある。【０００３】
粒子を担体として用いる際に求められる条件は、主には（１）穏和な条件下でリガンドまたはスペーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固定化量が大きいこと、（２）担体自体がタンパク質などの生体物質一般に対して非特異的吸着をしないこと、（３）目的・用途に応じた機械的強度を有すること、である。しかし、これらの条件を満たす担体は未だ開発されていない。【０００４】
特に、リガンドの固定化量は担体の性能を左右する大きな要因であり、できるだけ大きな固定化量が要求される。リガンドの固定化量が大きくなれば、それに伴い捕捉するタンパク質の総量が増加するからである。特に、目的とするタンパク質がリガンドに捕捉されるタンパク質の中でもマイナーな成分である場合、固定化量が少ないとそれを発見できなくなる恐れもあるため、なおさらリガンド固定化量の大きな粒子が求められている。【０００５】
一方、捕捉したいタンパク質以外の成分の非特異的吸着を抑制することも極めて重要である。従来の担体のうち、無機系のシリカゲル粒子は物理的強度の強い担体で、多孔質であることから分離には良いとされているが、非特異的吸着の度合が高いという欠点があるため実際に使用されている例は極めて少ない。また、合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒子が開発されているが、これらの高分子も生体関連物質の非特異的吸着が起こり易いという欠点がある。【０００６】
上記のように、粒子を医療用担体として用いる場合には、非特異的吸着も問題になることが多い。そのため、それを回避するために様々な手法が検討されている。たとえば、表面に目的の生理活性物質をつけたあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させておくブロッキングの手法などがあるが、効果は十分ではない。また、表面がエポキシ基を有する樹脂からなる粒子に特定のタンパク質と特異的に結合するＤＮＡを結合させ、タンパク質の精製用途に用いる例もある（例えば特許文献１）。この方法では、タンパク質の非特異吸着性が少ないという理由から、粒子表面へのエポキシ基導入にグリシジルメタクリレートなどを用いている。しかし、エポキシ基にＤＮＡ等生理活性物質を直接結合させる方法は、相当厳しい条件を必要とする。このため、固定化させる生理活性物質がアルカリや高温で不安定な場合、固定化プロセスで生理活性物質が変質してしまう恐れがあるので不適当である。また、実施例のように、表面がエポキシ基を有する樹脂からなる粒子を重合により合成すると、後述の特許文献２と同様に、得られる粒子径の制御が困難である等の問題がある。核も高分子化合物からなる粒子は、無機材料ほど比重を大きくすることができないので、分離回収が困難である。【０００７】
その他、粒子の非特異吸着低減方法としては、非特異吸着の少ないポリマー粒子を乳化重合法などで合成する例がある。たとえば、特許文献２には、生理活性物質と反応可能な反応基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ポリオキシアルキレン側鎖を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び疎水性を付与するエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーを乳化重合法または懸濁重合法にて共重合し、粒子を得る方法が記載されている。しかし、このような方法では、得られる粒子径の制御が困難である。一般に、乳化重合法では、比較的均一な粒径を有する粒子が得られるものの、粒子径がサブミクロン程度のものしかできない。一方、懸濁重合法で得られる粒子は、粒子径分布が広く、たとえばカラム用充填剤として用いるためには粒子を分級する必要があるが、特別な装置のない場合にはポリマー粒子を高度に分級することが難しい。しかも、得られる粒子のサイズが数十μｍから数百μｍであり、それよりも小さい径の粒子を合成することが難しい。さらに、重合で得られる粒子は、高分子であるがために担体としての強度に自ずと限界がある。粒子強度が求められる用途に使用する場合には、高分子中のエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーの比率を上げるなど強度を上げるための処方を余儀なくされ、そのことは逆に非特異的吸着に不利であった。【０００８】
現在最も汎用されている担体は、多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）及びデキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）に各種官能基を導入したものである。アガロースゲルは、排除できる不純物の限界分子量がデキストランやアクリルアミドよりも大きいため、高分子量の生物学的物質を扱う場合に適していると言われている。しかし、これらの担体は、物理的強度が小さいため耐圧性に欠けるとともに、担体の網目構造中に夾雑物の吸着や滞留が起こるために、夾雑物の混入が避けられないなど、問題点も多い。【０００９】
【特許文献１】特許第２７５３７６２号公報
【特許文献２】特許第３２１５４５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する医療用粒子及びその製造方法を提供すること、さらには前記特性に加えてタンパク質等に対して非特異的吸着がより少なく、ＳＮ比の高い医療用粒子及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、それ以外の成分に対して非特異的吸着が少ない医療用粒子の開発を目指して鋭意検討を行った。その結果、核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した粒子であって、その高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であり、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有することを特徴とする粒子が生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有することを見出した。さらには該高分子化合物の繰り返し単位にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を加えることにより、該医療用粒子に対するタンパク質等の非特異的吸着をより少なくできることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち本発明は、
（１）核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子、
（２）核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する共重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子、
（３）核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子であって、前記高分子化合物が少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）及び疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を含み、かつ少なくとも片側の末端に下記の一般式［１］で表される反応性官能基を有する共重合体であり、前記反応性官能基の少なくとも一部が前記粒子の表面に共有結合を形成していることを特徴とする医療用粒子、
【００１３】
【化１】
0005217437.tif 000002
（式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。）
（４）前記一般式［１］中の反応性部位がアルコキシル基であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか記載の医療用粒子、
（５）生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）〜（４）いずれか記載の医療用粒子、
（６）生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［２］で表される活性エステル基を有するモノマーである（１）〜（５）いずれか記載の医療用粒子、
【００１４】
【化２】
0005217437.tif 000003
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
（７）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（６）記載の医療用粒子、
（８）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が下記の一般式［３］で表されるモノマーである（２）〜（７）いずれか記載の医療用粒子、
【００１５】
【化３】
0005217437.tif 000004
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）
（９）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートである（２）〜（８）いずれか記載の医療用粒子、
（１０）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（９）記載の医療用粒子、
（１１）疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基がアルキル基である（３）〜（１０）いずれか記載の医療用粒子、
（１２）疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水基が炭素数３〜２０のアルキル基である（３）〜（１１）いずれか記載の医療用粒子、
（１３）前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである（１２）記載の医療用粒子、
（１４）核となる粒子が無機材料からなることを特徴とする（１）〜（１３）いずれか記載の医療用粒子、
（１５）前記無機材料が無機酸化物からなることを特徴とする（１４）記載の医療用粒子、
（１６）前記無機酸化物をアルコキシシランで表面処理したことを特徴とする  （１５）記載の医療用粒子、
（１７）前記アルコキシシランがテトラアルコキシシランを含むことを特徴とする（１６）記載の医療用粒子、
（１８）前記テトラアルコキシシランがテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、及びテトラブトキシシランから選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする（１７）記載の医療用粒子、
（１９）前記テトラアルコキシシランがテトラエトキシシランを含むことを特徴とする（１８）記載の医療用粒子、
（２０）前記無機酸化物が酸化ケイ素または酸化チタンであることを特徴とする（１５）〜（１９）いずれか記載の医療用粒子、
（２１）（１）〜（２０）いずれか記載の医療用粒子の製造方法であって、前記高分子化合物を直接核となる粒子表面に塗布する工程を含む医療用粒子の製造方法、
（２２）（１）〜（２０）いずれか記載の医療用粒子の製造方法であって、前記高分子化合物を溶媒に溶解させた溶液を調製する工程、前記溶液を核となる粒子表面に塗布する工程、及び乾燥させる工程、を含む医療用粒子の製造方法、
（２３）前記溶液が、前記高分子化合物を５重量％以上含有することを特徴とする（２２）記載の医療用粒子の製造方法、
（２４）前記溶液を核となる粒子に塗布する工程において、前記溶液と核となる粒子とを含む混合物を作製する工程、及び溶媒の一部を大気圧または減圧下で除去する工程を含むことを特徴とする（２２）または（２３）記載の医療用粒子の製造方法、
（２５）前記高分子化合物又は前記溶液を核となる粒子表面に塗布する工程の前に、更に粒子をアルコキシシランで表面処理する工程を含む（２１）〜（２４）いずれか記載の医療用粒子の製造方法、
（２６）前記粒子をアルコキシシランで表面処理する工程が、前記粒子及び前記アルコキシシランをアルカリ触媒を含む溶液中で攪拌混合した後、乾燥し、酸を含む水溶液中で攪拌する工程、を含む（２５）記載の医療用粒子の製造方法、
（２７）前記酸が無機酸であることを特徴とする（２６）記載の医療用粒子の製造方法、
（２８）前記無機酸が塩酸であることを特徴とする（２７）記載の医療用粒子の製造方法、
（２９）前記高分子化合物を核となる粒子表面に塗布する工程の後に、更に加熱処理する工程を含む（２１）〜（２８）いずれか記載の医療用粒子の製造方法、
（３０）前記溶媒がシクロヘキサノンを含み、核となる粒子が酸化ケイ素からなる（２２）〜（２９）いずれか記載の医療用粒子の製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程において表面の高分子化合物を含む層の溶解や劣化の少ない、化学的・物理的安定性を有する医療用粒子を提供することができる。また、高分子化合物の繰り返し単位にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を加えることにより、タンパク質等の非特異的吸着がより少ない医療用粒子を提供することができる。本発明の医療用粒子は、核となる粒子を任意に選択できるため、粒子径や粒子の強度の制御が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の粒子は、核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成しており、その高分子化合物は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体又は共重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有する医療材料用高分子化合物であることを特徴とする。この高分子化合物は、特定の生理活性物質を固定化する性質をしている。さらに、少なくとも片側の末端に反応性官能基を有することから、粒子表面と共有結合を形成することが可能になり、これにより核となる粒子の表面に該高分子化合物をグラフトすることができる。このようにして得られたグラフト化粒子は、洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない安定性の高いものである。この上さらに、高分子化合物の繰り返し単位にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を加えることにより、アルキレングリコール残基がタンパク質の非特異的吸着を抑制する役割を果たすので、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質が増す。
また、該高分子化合物を粒子表面にグラフトする前に、核となる粒子表面に活性化のための処理を施すことにより、グラフトされる該高分子化合物の量が均一に増加するため、得られるグラフト化粒子への生理活性物質の固定化量を増大することができる。更に、本発明の粒子は、核となる粒子の表面に高分子化合物を含む層を形成しているので、核となる粒子を適宜選択することで粒子径の制御や粒子の強度を適宜調節することが可能である。例えば、核となる粒子を比重の大きな無機材料とすることにより、製造後の分離回収を容易にすることも可能である。【００１８】
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレートなどがある。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高い点ではビオチンが好ましい。なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基が最も好ましい。【００１９】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。特に、アルキレングリコール残基の連鎖は、それ自体がタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質を有している。このため、（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合したモノマーは、生理活性物質を固定化する性質とタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質とを併せ持つ。従ってこのようなモノマーの重合体は、たとえ単独の重合体であったとしても、少なくとも片側の末端に反応性官能基を有していれば、医療用粒子表面に層を形成する高分子化合物として好適に用いることができる。なお、本発明において（メタ）アクリルはアクリル及び／又はメタクリルを示し、（メタ）アクリレートは、アクリレート及び／又はメタクリレートを示す。【００２０】
【化４】
0005217437.tif 000005
（式中Ｒ2は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキル基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）【００２１】
式［２］で、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。なおここで、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端又は両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。
Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、より好ましくは２〜９０の整数であり、最も好ましくは２〜８０の整数である。各種ｐの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸは同一であっても、異なっていてもよい。
式［２］で、Ｘがアルキル基の場合、ｐ個分のアルキル基の炭素数の合計（（Ｘ）ｐ）が１〜１００であることが好ましく、１〜２０であることがより好ましい。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。【００２２】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。【００２３】
このような活性エステル基としては、−ＣＯＯＲ”で表されるＲ”に上記酸性度が高い電子吸引性基を有するものが挙げられる。例えば上記Ｒ”がｐ−ニトロフェニルである、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基；上記Ｒ”がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、上記Ｒ”がフタル酸イミドである、フタル酸イミド活性エステル基；上記Ｒ”が５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でも保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。【００２４】
生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートやスクシンイミドオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを挙げることができるが、中でも、下記式で表されるｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートが好ましい。なお、エチレングリコールの繰り返し数ｐ及び／又はｐの平均値は２〜２０が好ましい。【００２５】
【化５】
0005217437.tif 000006
【００２６】
本発明に使用する高分子化合物において、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜９９．７ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜７０ｍｏｌ％である。【００２７】
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、特に構造を限定しないが、一般式［３］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。【００２８】
【化６】
0005217437.tif 000007
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ４は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なっていてもよい。）【００２９】
式［３］中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。各種ｑの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｑは平均値として特定される。繰り返し数ｑが２以上の場合は、Ｙは同一であっても、異なっていてもよい。【００３０】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。中でも、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点から好ましく用いられる。【００３１】
本発明の粒子表面に使用される高分子化合物において、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のから誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％である。【００３２】
本発明の粒子表面に使用する高分子化合物は、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有していれば、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及びアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）以外に、他のエチレン系不飽和重合性モノマーを含んでも良い。例えばプラスチック粒子等への塗布性が向上する点から、更に疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる高分子化合物であってもよい。疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、生理活性物質を固定化する官能基や、アルキレングリコール残基を有することなく、疎水基を有すれば、特に構造は限定されない。疎水基としては、直鎖、分岐鎖、環状の脂肪族炭化水素基や芳香族炭化水素基などが挙げられる。疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）としては、（メタ）アクリル基（ＣＨ２＝ＣＲ５−ＣＯＯ−、ここでＲ５は、水素原子またはメチル基を示す。）に疎水基が結合したモノマーが好ましく、脂肪族炭化水素が結合した（メタ）アクリレート類や芳香族炭化水素が結合した（メタ）アクリレート類が挙げられる。より好ましくは、前記疎水基がアルキル基である（メタ）アクリレート類である。さらに好ましくは、前記アルキル基が炭素数３〜２０のアルキル基である（メタ）アクリレート類である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。【００３３】
具体的なモノマーの例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートである。【００３４】
本発明に使用される高分子化合物において、前記疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜７０ｍｏｌ％である。エチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）のポリマー中での組成比が上限値を超えると、目的とする生理活性物質の固定化量が減少するだけでなく、生理活性物質に特定のタンパク質を捕捉させる際、それ以外の成分の非特異的吸着が多くなるおそれがある。【００３５】
前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基は、核となる粒子の表面と共有結合可能な官能基であれば、特に限定されるものではない。用いられる粒子の表面に存在する官能基に合わせて、適宜、共有結合可能な反応性官能基を選択することができる。用いられる粒子は、後述のように有機物、無機物を問わず用いられ、表面にアルコキシシリル基、水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基等を導入することができるため、末端に導入される反応性官能基としては、例えば、反応性シリル基、アミノ基等が挙げられる。【００３６】
中でも、比較的温和な条件で基板と反応させることができることから、前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基は、反応性シリル基であることが好ましい。ここで、反応性シリル基としては、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、シラノール基などが挙げられる。加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、反応性シリル基としては、下記一般式［１］で表される構造が挙げられる。中でも後述のメルカプト化合物を用いて導入された下記一般式［５］で表される構造を末端に有することが好ましい。【００３７】
【化７】
0005217437.tif 000008
式［１］及び［５］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性官能基内の反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。ここで、反応性部位とは、基板と共有結合し得る部位をいう。反応性部位としては、アルコキシル基、ハロゲン基、アミノ基、イソシアネート基、フェノキシ基、水酸基などが挙げられる。また、式［５］において、Ｒ１は炭素数１〜２０のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基であり、最も好ましくは炭素数１〜３のアルキル基である。【００３８】
好適な反応性官能基としては、例えば、ハロゲン化シリル基（≡Ｓｉ−Ｘ、ここでＸはハロゲン基）、アルコキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＲ、ここでＲはアルキル基）、フェノキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＰｈ、ここでＰｈはフェニル基）、アセトキシシリル基（≡Ｓｉ−ＯＯＣＣＨ3）等が挙げられる。ハロゲンを含まないことからアルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましく、中でもシラノール基を生成しやすい点からアルコキシシリル基が特に好ましい。【００３９】
前記重合体の少なくとも片側の末端に導入される反応性官能基の導入割合は、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０．２〜１０ｍｏｌ％であることが好ましく、より好ましくは０．５〜５ｍｏｌ％である。【００４０】
本発明の粒子表面に使用する高分子化合物について、その末端に反応性官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）を溶媒中でラジカル重合する方法が簡便で好ましい。また、必要に応じてアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）や疎水基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を加えて共重合しても良い。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が連鎖移動剤として働くため、末端に反応性官能基を有する高分子化合物が得られる。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）は特に限定されるものではないが、下記の一般式［４］で表されるメルカプトシラン化合物が好ましい。【００４１】
【化８】
0005217437.tif 000009
【００４２】
式［４］でＲ１は炭素数１〜２０のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基であり、最も好ましくは炭素数１〜３のアルキル基である。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性官能基内の反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。反応性部位としては、アルコキシル基、ハロゲン基、アミノ基、イソシアネート基、フェノキシ基、水酸基などが挙げられるが、中でもシラノール基を生成しやすい点からアルコキシル基が最も好ましい。また、保存安定性の点からは、反応性官能基内の反応性部位は１つであることが好ましい。【００４３】
アルコキシル基を有するメルカプトシラン化合物としては、たとえば（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００４４】
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマー及び反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００４５】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。【００４６】
本発明の粒子表面に使用する高分子化合物の化学構造は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーから誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有するものであれば、当該重合体が共重合体の場合の結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。【００４７】
本発明の粒子表面に使用する高分子化合物の分子量は、基板に均一に塗布しやすくなり、且つ高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は５，０００以上１，０００，０００以下が好ましく、１００００以上５００，０００以下がより好ましい。なおここで、数平均分子量はＮＭＲ測定の解析より求めた組成を基に、全ての高分子の片側の末端に反応性官能基が導入されていると仮定して算出したものである。【００４８】
高分子化合物を含む層を核となる粒子表面に形成する方法は特に制限されるものではないが、例えば前述の高分子化合物を直接、あるいは該高分子化合物を溶剤に溶解した溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で核となる粒子表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行う。なお、本発明において粒子表面に形成されている「層」とは、核となる粒子表面全体を被覆する皮膜を形成している態様の他、核となる粒子表面を少なくとも局所的に被覆する皮膜を形成している態様を包含する。【００４９】
前述の高分子化合物溶液中の高分子化合物濃度は特に制限されるものではないが、０．０５重量％以上が好ましく、より好ましくは０．３〜７０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％、最も好ましくは５〜５０重量％である。高分子化合物溶液中の高分子化合物濃度が下限値を下回ると、核となる粒子表面に塗布される該高分子化合物の量が減少する。そのため、生理活性物質の固定化量が減少し、ひいては特定のタンパク質の捕捉能が低下してしまう。さらには、該高分子化合物にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位が組み込まれている場合、該医療用粒子に対するタンパク質等の非特異的吸着を抑制する効果も低減する。これらのことにより該高分子化合物の溶液濃度が下限値を下回った場合、特定のタンパク質を選択的に捕捉する特性が十分に発揮できない恐れが出てくる。【００５０】
また、該高分子化合物を粒子に塗布する際、その高分子化合物溶液濃度は、予め所定の濃度に調整しておいてもよいが、塗布する工程において、高分子化合物溶液を濃縮しながら粒子に塗布することも可能である。低濃度の高分子化合物溶液を用いて粒子に塗布する場合、溶液粘度が低いため、細孔など微細な形状を有する粒子表面に対しても溶液が浸透しやすい。このことは粒子表面の隅々まで該高分子化合物溶液を行き渡らせることができる点で有利であるが、濃度の低さゆえに粒子表面を該高分子化合物で十分に被覆できない恐れがある。一方、高濃度の高分子化合物溶液を用いると、粒子表面に塗布される該高分子化合物の量が増加すると期待できるが、自ずと溶液の表面張力が高まることで、粒子に対する濡れ性が低下し、操作性が悪くなる。すなわち、複雑な表面形状を有するビーズに対して該高分子化合物を可能な限り被覆するには、低濃度溶液から濃縮しながら塗布する方法が望ましいといえる。濃縮方法は特に制限されるものではなく、加熱蒸発、減圧濃縮等、任意の方法を選択することができる。【００５１】
溶剤としては該高分子化合物を溶解するものであれば特に限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。高分子化合物が末端にアルコキシシリル基を有する場合、エタノール、メタノールが高分子化合物同士の縮合を抑制することができ、かつ乾燥させやすいため好ましい。【００５２】
また、該高分子化合物を、末端の反応性官能基を用いて核となる粒子表面の官能基と共有結合させる条件は官能基に応じて任意に選択することができる。例えば、末端にアルコキシシリル基を有する高分子化合物の場合、加水分解により生成されたシラノール基が、核となる粒子表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、核となる粒子表面にグラフトされた高分子化合物は容易に溶解したり、核となる粒子から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１８０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。
なお、高分子化合物の末端の反応性官能基の少なくとも一部が核となる粒子表面と共有結合を形成しているかは、一般的にその反応条件から当業者の経験則により推定できる。実験的に確認する場合には後述の実施例に記載したように、高分子化合物の良溶媒で粒子を洗浄後、例えばアルカリ水溶液で処理して生理活性物質を固定化する官能基が遊離してくることを確認できれば、高分子化合物が粒子表面に共有結合を形成していると評価できる。また、高分子化合物が粒子表面に共有結合を形成していることは、例えば固体ＮＭＲ等を用いて確認することが可能である。【００５３】
エタノールやメタノールなど極性の高い有機溶剤を用いる場合や、高分子化合物自体の親水性が高い場合は、溶剤に含まれる水分や塗布後空気中の水分により、高分子末端のアルコキシシリル基の加水分解が生じるため、特別な加水分解工程を施さなくとも、粒子を加熱するだけでグラフト化することができることが多い。加水分解が不足する場合は、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が供給されれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量を１５重量％以下にするのが好ましい。含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。【００５４】
本発明に使用する核となる粒子の素材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料の担体としては、アフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる、多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチルなどからなる粒子などが使用できる。一方、無機材料としては、無機酸化物が粒子自体の強度が高く、好ましい。中でも、酸化ケイ素や酸化チタンが取り扱いやすく最も好ましい。また、粒子の大きさは何ら制限を受けるものではなく、目的・用途に合わせて適宜選択できる。このことは核となる粒子の大きさを選択すれば、いかなる大きさの医療用粒子でも作製できることを意味している。この点は粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で粒子を作製する方法に比較して、大きな利点となっている。実際に医療用粒子として用いる場合には、用途によっても異なるが、粒径が数ｎｍから１００μｍ程度のものが好ましい。また、核となる粒子として無機材料を選択すると、比重を大きくすることができるため、有機材料に比べて製造後の分離回収を容易にすることも可能になる。【００５５】
本発明に使用する高分子化合物を核となる粒子表面にグラフトさせる際、粒子表面に高分子化合物と反応しうる官能基があればそのまま使用できるが、それがない場合もしくは乏しい場合は、核となる粒子表面を活性化することが好ましい。活性化する手段としては特に限定されるものではなく、表面処理剤としてアルコキシシランを用いる方法や酸・アルカリにより処理する方法、酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法等が挙げられるが、粒子の表面全体を均一に活性化できることから、表面処理剤としてアルコキシシランを用いる方法及び／又は酸・アルカリにより処理する方法が好ましい。【００５６】
表面処理剤として使用するアルコキシシランとしては、特に制限されるものではないが、ジアルコキシシラン、トリアルコキシシラン、テトラアルコキシシラン等が挙げられる。なかでも、一分子あたりのアルコキシシリル基の数が最も多いテトラアルコキシシランが好適に使用される。テトラアルコキシシランを具体的に例示すれば、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラフェノキシシラン等が挙げられる。比較的分子量の小さいものは核となる粒子表面により多くのアルコキシシリル基を与えることができるため、炭素数が３以下のアルコキシシリル基を有するテトラメトキシシラン、テトラエトキシシシラン、テトラプロポキシシランが好ましく、入手性からテトラエトキシシランがより好ましい。これらのアルコキシシランは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００５７】
核となる粒子表面をアルコキシシランにより活性化する方法は特に制限されるものではないが、前記粒子及び前記アルコキシシランをアルカリ触媒を含む溶液中で攪拌混合することが好ましい。例えばアルカリ触媒、及びアルコールを含む溶液に０．０５〜１０重量％濃度となるよう核となる粒子を分散し、この分散媒中にアルコールに溶解したアルコキシシランを添加しながら行う。核となる粒子とアルコキシシランの使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、アルコキシシラン０．０１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。分散媒に含まれるアルコール、及びアルコキシシランを溶解するアルコールとしては特に限定されるものではないが、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等が単独または２種以上の組み合わせで用いられる。なかでも、乾燥させ易く、低廉なメタノールが好ましい。【００５８】
アルコキシシラン溶液を添加した核となる粒子の分散液は、通常、０〜５０℃で、５〜３０時間程度撹拌して表面処理される。得られた核となる粒子は洗浄後、乾燥する。【００５９】
上記の処理条件においては、アルコキシシランのアルコキシシリル基と核となる粒子表面の官能基との脱水縮合が起こる。この際、同時に高分子化合物のグラフトに用いられるべきアルコキシシリル基の脱水縮合も起こり得るため、アルコキシシランによる表面処理の効果を十分に発揮するためには、上記の処理の後、核となる粒子に酸・アルカリによる処理を施すことが効果的である。特に、アルコキシシリル基の脱水縮合により生じたシロキサン結合の加水分解には酸による処理が好適である。核となる粒子の表面を酸により処理する方法は特に制限されるものではないが、例えば、上記処理により得られた核となる粒子を０．０１〜３Ｎの酸に分散し、１〜５時間程度撹拌することにより行われる。処理に用いられる酸としては各種公知の無機酸及び／又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、フッ酸等が挙げられ、また有機酸としては蟻酸、酢酸、安息香酸等が挙げられるが、短時間で処理を完了するための比較的厳しい処理条件を与えることができる無機酸が好適であり、なかでも高い揮発性から処理後の除去が容易であり、且つ取り扱いが比較的容易な塩酸がより好適である。【００６０】
以上のように、本発明により、生理活性物質の固定化能力に優れた粒子を提供することができる。また、粒子表面の高分子化合物を含む層の成分にアルキレングリコール残基を含む成分を加えることにより、目的とするタンパク質以外の成分による非特異的吸着を抑制する性質を増すことができる。しかも、高分子化合物の末端反応性基が核となる粒子と結合しうることから、該高分子化合物を化学的にグラフトすることができるので、洗浄を行っても該高分子化合物を含む層が脱離する恐れがない。更に、該高分子化合物を塗布する前に、核となる粒子表面にアルコキシシランによる活性化のための処理を施すことにより、グラフトされる該高分子化合物の量が均一に増加するため、得られるグラフト化粒子への生理活性物質の固定化量を増大することができる。このことにより、該粒子に生理活性物質を結合させた場合、その生理活性物質が捕捉する物質（タンパク質など）を効率よく回収できる。更に、核となる粒子を適宜選択することで、粒子径の制御や粒子強度を容易に適宜調節することが可能である。かくして、本発明の粒子は生理活性物質を固定化する担体として好適に用いることができ、創薬用途やアフィニティグロマトグラフィーの充填材など、様々な分野に用いることができる。
【実施例】
【００６１】
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）      
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂株式会社製Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を撹拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）粗体を得た。さらに、得られた粗体をシリカゲルカラムにて精製を行った。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。【００６２】
（高分子化合物の合成例１）
ＭＥＯＮＰを１．０ｍｏｌ／Ｌになるように脱水エタノールに溶解させ、そこにさらに（３−メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン（以下ＭＰＤＥＳと記載、アヅマックス社製）及び２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ０．０７ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２４時間反応させた後、ジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ−ＮＭＲで測定し、７．４及び８．３ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、０．７ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピークの積分値よりこの高分子化合物の組成比を算出したところ、ＭＥＯＮＰは９６ｍｏｌ％、ＭＰＤＥＳは４ｍｏｌ％であった。【００６３】
（高分子化合物の合成例２）
数平均分子量Ｍｎ＝約１１００のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ１１００と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ＭＥＯＮＰを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ１１００、ＭＥＯＮＰの順に７０：３０である。そこにさらにＭＰＤＥＳ及びＡＩＢＮとをそれぞれ０．００３ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重エタノール溶媒中１Ｈ−ＮＭＲで測定し、３．４ｐｐｍ付近に現れるＰＥＧＭＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、７．６及び８．４ｐｐｍ付近に現れるＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、０．７ｐｐｍ付近に現れるＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出したところ、ＰＥＧＭＡ１１００は６６ｍｏｌ％、ＭＥＯＮＰは３４ｍｏｌ％、ＭＰDＥＳは０．７ｍｏｌ％であった。【００６４】
《実施例１》
前記合成例１で示した高分子化合物の０．３ｗｔ％シクロヘキサノン溶液に、粒径４５〜７５μｍ、細孔径１００ｎｍのシリカビーズ（ＭＢ−１０００、富士シリシア化学株式会社製）を浸漬し、ボルテックスミキサーでよく撹拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。【００６５】
《実施例２》
実施例１と同様に、前記合成例２で示した高分子化合物を塗布し、加熱処理を施したビーズを作製した。【００６６】
《実施例３》
前記合成例１で示した高分子化合物の０．３ｗｔ％シクロヘキサノン溶液に、平均粒径４５μｍ、細孔径５〜７ｎｍのシリカビーズ（シリカゲル６０N、以下Ｓｉ６０Ｎと記載、関東化学株式会社製）を浸漬し、ボルテックスミキサーでよく撹拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。【００６７】
《実施例４》
前記合成例１で示した高分子化合物の１０ｗｔ％シクロヘキサン溶液に、Ｓｉ６０Ｎを浸漬し、ボルテックスミキサーでよく撹拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。【００６８】
《実施例５》
実施例３と同様に、前記合成例２で示した高分子化合物を塗布し、加熱処理を施したビーズを作製した。【００６９】
《実施例６》
実施例４と同様に、前記合成例２で示した高分子化合物を塗布し、加熱処理を施したビーズを作製した。【００７０】
《実施例７》
前記合成例２で示した高分子化合物の５０ｗｔ％シクロヘキサン溶液に、Ｓｉ６０Ｎを浸漬し、ボルテックスミキサーでよく撹拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。【００７１】
《実施例８》
メタノール４８０ｍｌと１０％アンモニア水１２０ｍｌを混合した溶液にＳｉ６０Ｎ１５ｇを分散させた。そこに３ｍｍｏｌのテトラエトキシシラン（別名テトラエチルオルトシリケート、以下ＴＥＯＳと記載、和光純薬工業株式会社製）をメタノール１２．７ｍｌに溶解した溶液を滴下した。１６時間室温で撹拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。再びメタノールで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を３回繰り返した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた。得られたシリカビーズの内１０ｇを２Nの塩酸３００ｍｌに分散させ、２時間室温で攪拌した。遠心分離により上澄みを除去した後、超純水に分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を上澄みが中性になるまで数回繰り返した。その後、メタノールに分散した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた。その後、このシリカビーズに実施例１と同様に、前記合成例２で示した高分子化合物を塗布し、加熱処理を施したビーズを作製した。【００７２】
（非特異的吸着量評価）
実施例１及び２のビーズそれぞれ約２０ｍｇを１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ジメチルスルホキシド）で４０℃にて１晩処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。よく乾燥させた後、４５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液を１ｍＬ加え、４℃にて１７時間処理した。その後、遠心分離を行い、上澄みの除去を行った。これにＰＢＳを加え、ボルテックスミキサーでよくリンスし、上澄みを除去する作業を３回繰り返した。そこにドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）１ｗｔ％のＰＢＳ溶液を２ｍＬ加え、１時間静置し、粒子表面に吸着したＢＳＡを剥がしとった。上澄みを回収してMｉｃｒｏ−ＢＣＡ法の測定試料とした。Mｉｃｒｏ−ＢＣＡ法はＰＩＥＲＣＥ社製Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡＴＭ  Ｐｒｉｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて行った。この試薬は、希薄溶液中のタンパク質濃度（０．５〜２０μｇ／ｍＬ）を測定する試薬であり、タンパク質の存在下で第一銅イオンに着色錯体を形成させるためのキレート試薬として、ビシンコニン酸を利用している。この測定法の標準的なプロトコールに従ってサンプルを調整し、５６２ｎｍの吸光度により非特異的吸着のＢＳＡ量を定量した。【００７３】
（ビーズに化学結合していない高分子化合物の除去）
実施例１〜８のビーズそれぞれ約１５０ｍｇを約１．７ｍＬのジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと記載）中に投入し、ボルテックスミキサーでよく撹拌後、４０℃の恒温シェーカーで１時間撹拌した。シリカビーズを沈殿させた後、ＤＭＳＯを入れ替え、さらに同じ操作を２回繰り返した。その後ＤＭＳＯをエタノールに交換し、よく乾燥させた。【００７４】
（活性エステル当量の評価）
前項で得られたビーズを約２０ｍｇ採取し、それぞれ約２ｍＬの０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に投入した。ボルテックスミキサーでよく撹拌後、室温にて１時間静置した。これらの操作によりＭＥＯＮＰのｐ−ニトロフェノールを遊離させた。上澄み液を採取し、４００ｎｍの吸光度から活性エステル当量を以下のように算出した。
濃度既知のｐ−ニトロフェノール水溶液を用いて、ｐ−ニトロフェノールの４００ｎｍにおける吸光度の検量線を作成した。ビーズより遊離させたｐ−ニトロフェノールの量をこの検量線を用いて算出し、ビーズの単位重量あたりの活性エステル当量を決定した。【００７５】
《比較例１》
実施例１に用いたシリカビーズを、高分子化合物を塗布せずにそのまま用い、前記と同様、非特異的吸着量評価をMｉｃｒｏ−ＢＣＡ法によりＢＳＡ吸着量を測定した。【００７６】
表１には実施例１及び２、比較例のMｉｃｒｏ−ＢＣＡ法によるＢＳＡ吸着量を示した。表より明らかなように、本発明の粒子はシリカビーズに比較してＢＳＡ吸着量が格段に低下しており、タンパク質の非特異的吸着が抑制されていることがわかる。特に、共重合の成分にＰＥＧＭＡ１１００を加えた実施例２では、さらにＢＳＡ吸着量が少なくなっており、ポリエチレングリコール鎖による非特異吸着抑制効果が現れているものと考えられる。【００７７】
【表１】
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【００７８】
表２には、実施例１及び２で作製したビーズの活性エステル当量評価結果を示した。表より明らかなように、本発明の粒子にはＭＥＯＮＰがＤＭＳＯ洗浄後も残存しており、生理活性物質を固定化できる能力があることがわかる。特に実施例１のビーズは活性エステル当量が高く、より多くの生理活性物質を固定化できると考えられる。【００７９】
【表２】
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【００８０】
表３には、実施例３及び４で作製したビーズの活性エステル当量評価結果を示した。表より明らかなように、本発明の粒子にはＭＥＯＮＰがＤＭＳＯ洗浄後も残存しており、生理活性物質を固定化できる能力があることがわかる。また、実施例３及び４は成分、組成比の同じ高分子化合物を等しく塗布したにもかかわらず、実施例３に比して、実施例４のビーズは活性エステル当量が高くなっており、高分子化合物を粒子に塗布する工程において、高濃度の高分子化合物溶液での処理が高分子化合物のグラフト量を増加させていると理解できる。特に実施例４のビーズは活性エステル当量が高く、より多くの生理活性物質を固定化できると考えられる。【００８１】
【表３】
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【００８２】
表４には、実施例５〜７で作製したビーズの活性エステル当量評価結果を示した。表より明らかなように、本発明の粒子にはＭＥＯＮＰがＤＭＳＯ洗浄後も残存しており、生理活性物質を固定化できる能力があることがわかる。また、実施例５〜７は成分、組成比の同じ高分子化合物を等しく塗布したにもかかわらず、実施例５、６、７の順でビーズの活性エステル当量が高くなっている。特に実施例７のビーズは活性エステル当量が高く、より多くの生理活性物質を固定化できると考えられる。また、塗布した高分子化合物が実施例２と同じであることから、非特異吸着抑制効果も期待できる。【００８３】
【表４】
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【００８４】
表５には、実施例５及び８で作製したビーズの活性エステル当量評価結果を示した。表より明らかなように、本発明の粒子にはＭＥＯＮＰがＤＭＳＯ洗浄後も残存しており、生理活性物質を固定化できる能力があることがわかる。また、実施例５及び８は成分、組成比の同じ高分子化合物を等しく塗布したにもかかわらず、実施例５に比して、実施例８のビーズは活性エステル当量が高くなっており、ＴＥＯＳによる表面処理及び塩酸による処理が高分子化合物のグラフト量を増加させていると理解できる。このようなビーズはより多くの生理活性物質を固定化できると考えられる。また、塗布した高分子化合物が実施例２と同じであることから、非特異吸着抑制効果も期待できる。【００８５】
【表５】
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