(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤシ科のニッパヤシ（Nypa
fruticans）の植物体そのもの、又はニッパヤシの溶媒抽出液、またはニッパヤシ由来の糖を含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の植物またはその抽出物を有効成分とするＴＮＦ−α産生抑制剤または一酸化窒素産生抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の健康志向から、生活習慣病予防が強調され、最近では食するに安全な植物体から有効成分を抽出等し、その生理機能の研究も盛んに行われている。
ＴＮＦ−α、すなわち腫瘍壊死因子αは、腫瘍に出血性壊死を起こさせる因子として発見され、現在では、慢性関節リュウマチ、アレルギー疾患、動脈硬化、インスリン抵抗性、各種感染症等、一般的な生活習慣病も含めた多くの病態に関与するとされている。
ＮＯ、すなわち一酸化窒素は、血管内皮細胞由来弛緩因子として知られ、適量の生成は生体にプラス効果をもたらす反面、過剰産生はそのラジカル作用から生体組織に酸化障害を与え、これに起因して様々な疾病に関与している。ＮＯ生成系の誘導は、感染や炎症性病巣で産生される炎症性サイトカインとして知られているＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γなどにより、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を介してもたらされることが明らかにされている。ｉＮＯＳは主に、マクロファージ、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、消化管上皮細胞、気管支上皮細胞、肝細胞、ミクログリア細胞などにより発現され、その結果、過剰に生成するＮＯは、生体の感染防御反応での主要な炎症性メディエーターとして機能している。
近年の健康志向から、生活習慣病予防が強調され、生活習慣病をもたらすこれらＴＮＦ−αやＮＯの産生を抑制することが期待され、最近では安全な食品原材料からこれらの産生を抑制する研究も盛んに行われている。
【０００３】
エゾウコギ（本発明のいうエゾウコギとは学名 Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ
ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ ｈａｒｍｓが指す植物と同じ。別名：五加参）は、中国では刺五加と呼ばれ、血圧調整、強壮、精神安定、リウマチ性関節痛等に用いられる。また、旧ソ連ではＳｉｂｅｒｉａｎ
Ｇｉｎｓｅｎｇ（旧学名“Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｕｓ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ Ｍａｘｉｍ”）と呼ばれ、降圧作用、精腺や副腎皮質機能亢進作用、抗ストレス作用を有することが知られている。エゾウコギには、グリケーション阻害効果（特許文献１）、抗ストレス効果（特許文献２）、パーキンソン病の予防効果（特許文献３）、ストレス性胃潰瘍予防効果（特許文献４）のあることが知られている。
【０００４】
ウラジロガシの浸出液には、結石形成を抑制する作用や排石促進効果が報告されており、古くから健康茶（排石茶）として飲用されている。ウラジロガシにはα−グルコシダーゼ阻害剤（特許文献５）、抗肥満効果（特許文献６）のあることが知られている。
【０００５】
ブラックコホウシュの主成分のシミシフギン（Ｃｉｍｉｃｉｆｕｇｉｎ）は急激なエストロゲンの減少を抑えて、更年期障害の症状を和らげることが知られている。ブラックコホウシュ抽出物の使用については、心臓血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症及び更年期障害の治療及び／又は予防、例えば一過性熱感の予防又は軽減のためのエストロゲン型期間選択性薬剤として開示されている（特許文献７）。また、ストレス緩和効果（特許文献８）があることも知られている。
【０００６】
アカショウマは、日本の山地にも自生する多年草で、その根茎を赤升麻とよび、古来より下熱、解毒、消炎等の目的で升麻（キンポウゲ科のサラシナショウマ）の代用品として用いられてきた。本発明では、赤升麻あるいは紅升麻と称せられるものも包含する。アカショウマ等のチゲタサシ属に属する植物の根と根茎には、デンプンやタンニンのほかにベルゲニン、アスチルビン、アスチルビン酸等のフラボノイド類が含まれていることが知られており、これらの成分が前述の薬理作用を示すといわれている。アカショウマには肥満抑制効果（特許文献９）、リパーゼ活性阻害効果（特許文献１０）、血中脂質改善効果（特許文献１１）があることが知られている。
【０００７】
ゴツコラは、アフリカやインドから東南アジアにかけての広い地域に分布しているセリ科の植物で、インドでは伝統医学であるアーユルヴェーダや民間療法において、皮膚や血管の代謝機能改善及び活性化に有用なハーブとして知られている。ゴツコラにはグリケーション阻害効果（特許文献１）があることが知られており、また、ゴツコラを組成物とした皮膚老化防止剤及び／又はニキビ改善剤キットが開示されている（特許文献１２）。
【０００８】
ニッパヤシは、 日本の南西諸島から東南アジア、オーストラリアや太平洋諸島に分布し、湿地やマングローブ林に生育する。花軸液からでる樹液で糖蜜や酒がつくられ、食用されている。
【０００９】
しかし、エゾウコギ、ウラジロガシ、ブラックコホウシュ、アカショウマ、ゴツコラ、ニッパヤシの植物体やこれらの抽出物にＴＮＦ−α産生抑制作用または一酸化窒素産生抑制作用に関する報告はなく、知られている効果に両効果が加わることは生活習慣病予防的にも意義がある。
【特許文献１】特開２００４−２５０４４５号公報、
【特許文献２】特開２００４−２１０７２８号公報
【特許文献３】特開２００２−２８４６９５号公報
【特許文献４】特開２００２−００３３９１号公報
【特許文献５】特開２００４−０００１６４号公報
【特許文献６】特開平０９−２２７３９８号公報
【特許文献７】特表２００２−５０６８２７号公報
【特許文献８】特開２００４−１９６７５０号公報
【特許文献９】特開２００４−０９１４６４号公報
【特許文献１０】特開２００３−３４２１８５号公報
【特許文献１１】特開２００３−１４６９０１号公報
【特許文献１２】特開２００３−３０６４４６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
人体に対し安全性が高く、容易に入手でき、食経験がある天然植物からＴＮＦ−α産生および一酸化窒素産生を抑制できる植物体を見出し、これまでに無かった新規なＴＮＦ−α産生抑制剤および一酸化窒素産生抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ウコギ科のエゾウコギ、ブナ科のウラジロガシ、キンポウゲ科のブラックコホウシュ、ユキノシタ科のアカショウマ、セリ科のゴツコラ、ヤシ科のニッパヤシからなる植物体群より選ばれる少なくとも一種以上の植物体そのもの、又は植物体の溶媒抽出液からＴＮＦ−α産生抑制および一酸化窒素産生を抑制することを最も主要な特徴とする。
【００１２】
上記植物体は根および根茎、茎、木皮、枝、葉、花、芽等のいずれの部位も使用することができるが、エゾウコギ、ブラックコホウシュ及びアカショウマは、根及び／又は根茎が望ましく、ゴツコラは、花、葉および茎が好ましい。ウラジロガシを使用する場合は、特に生葉や枝又はその乾燥物の粗切り物を使用することが好ましく、また、風味を改善するために、乾燥後、焙煎したものを原料として使用してもよい。ニッパヤシを粉砕・圧搾して得られた糖汁をそのまま用いても良いが、活性炭・石灰等を用いて糖汁中の不純物を取り除いた後、加熱により煮詰めて固形化した糖を用いてもよい。さらに、上記の植物体の抽出液を使用する場合は、抽出液をそのまま用いても良いが、吸着樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー等により分画処理を行った抽出物や分画物を用いることもできる。
【００１３】
有効成分としての溶媒抽出物の調製方法は、どのような方法でもよく、どのような精製段階のものでも使用可能である。一般に、濃厚な抽出物を調製するには、植物体を乾燥させ、これを粉砕・粉末化し、これを含水溶媒で抽出し、その後に有機溶媒を除去することで得ることができる。また水分を除いて、抽出成分を乾燥粉末化してもよい。
植物体の乾燥方法や粉砕・粉末化方法は、どのような方法でもよく、乾燥方法には自然乾燥、熱風乾燥、真空乾燥等が、粉砕・粉末化方法には食品用に用いられる一般的な粉砕機を用いればよい。
有機溶媒には、エタノール、アセトン、ヘキサン等が挙げられる。特に、食品製造に用いることができ、かつ水に溶けやすいエタノール、アセトンが好ましく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。
抽出は、還流抽出法などで行えばよく、加熱温度と時間はどの様な条件でも問題なく、例えば８０℃の加熱で、２時間還流抽出すればよい。有機溶媒を除去するには真空濃縮法などが挙げられる。
また抽出物を、乾燥粉末化するにはデキストリンなどの粉末化基材と共に粉末化してもよい。この発明に用いられるα−１，４−グルカン以外の賦型剤としては、カゼインソーダ、ホエー、ゼラチン、乳類、卵白等の蛋白質、庶糖、乳糖等の少糖類、アラビアガム等の多糖類、澱粉またはその分解物などがあり、これらを単独または組み合わせて用いても何ら問題はない。
【００１４】
また、本粉末食品には、この発明の効果を阻害しない限りにおいて、一般の食品製造に用いられる周知の乳化剤、酸化防止剤などを適宜配合してよいのは勿論である。
【００１５】
本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤および一酸化窒素産生抑制剤は、飲食用、飼料用または医薬用として用いることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、ウコギ科のエゾウコギ、ブナ科のウラジロガシ、キンポウゲ科のブラックコホウシュ、ユキノシタ科のアカショウマ、セリ科のゴツコラ、ヤシ科のニッパヤシからなる植物体群より選ばれる少なくとも一種以上の植物体そのもの、又は植物体の溶媒抽出液からＴＮＦ−α産生抑制剤および一酸化窒素産生抑制剤を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
飲食用としては、どの様な形態でもよく、焼き菓子、ガム、錠菓、スープ、粉末スープ、飲料、粉末飲料、ゼリー、デザート類、キャンデー、キャラメル、アイスクリーム等の冷菓などの飲食品などが挙げられる。
飼料用としては、どの様な形態でもよく、固形、ペースト、液剤飼料などが挙げられる。
医薬用としては、どの様な形態でもよく、錠剤、カプセル、顆粒、液剤などが挙げられる。
【実施例１】
【００１８】
（抽出液の調製）
エゾウコギの根及び根茎、ウラジロガシの葉及び枝、ブラックコホウシュの根及び茎、アカショウマの根、ゴツコラの根以外の地上部を使用し、原料となる各植物の乾燥粉末５０ｍｇから抽出液１ｍLを調製した。
【００１９】
ニッパヤシ由来の糖２ｇを３ｍｌの蒸留水に溶解した溶液をＳｅｐ-Ｐａｋ Ｐｌｕｓ１８ （Ｗａｔｅｒｓ製）に通した。次に３ｍｌの５０％エタノール溶液を通し、ニッパヤシ５０％エタノール溶液抽出物を、最後に、３ｍｌのエタノールを通し、ニッパヤシエタノール抽出物を得た。これら抽出物を遠心エバポレーターで１mlに濃縮し、これをＤＭＥＭ培地で１０倍に希釈し、以下の試験に用いた。
【００２０】
さらに、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーを利用し、水とアセトニトリルの濃度勾配によりニッパヤシ由来の糖を分画した。流速毎分０．５ｍｌで、分画開始時のアセトニトリル濃度は２０％とし、分画開始30分にアセトニトリル濃度が５０％になるように直線的にアセトニトリルの濃度を上昇させた。約１４分のピークを精製し、凍結乾燥させた。
【００２１】
（ＴＮＦα産生抑制測定法）
１０％非働化ウシ胎児血清、１００Ｕ/ｍｌペニシリンおよび１００Ｕ/ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養したマウスマクロファージ由来細胞RAW２６４．７を９６穴培養プレートに２×１０５/ｃｅｌｌでまき、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターにて約１時間培養した。続いて、各植物の希釈液、または比較対照としてＤＭＥＭ培地のみを添加後、細菌の細胞壁に存在する内毒素であるリポポリサッカライドを含む溶液を加え、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターで６時間培養した。一方、１０％の馬血清を含むＭＥＭ培地で、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターにて培養したＴＮＦ−α感受性を有するマウス線維芽細胞Ｌ９２９を９６wellプレートに２×１０４ cell
/wellでまき、２４時間３７度、５％ＣＯ2インキュベーターで培養した。培養後のＲＡＷ２６４．７の培地をＬ９２９のプレートに添加後、アクチノマイシンＤ（最終濃度１μg/ml）を添加し、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターにて２４時間培養した。ＷＳＴ−８法により、Ｌ９２９の生細胞数を測定し、比較対照の生細胞数を１００とした場合の相対比を求めた。なお、ＷＳＴ−８法は、高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（２-(２-ｍｅｔｈｏｘｙ-４-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)-３-(４-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ)- ５-(２,４-ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ)-２Ｈ- ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ, ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）を発色基質として用いる方法である。ＷＳＴ-８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成するので、このホルマザンの ４５０ ｎｍの吸光度を測定することにより、生細胞数を容易に計測することができる方法として知られている。
【００２２】
（一酸化窒素産生抑制測定法）
１０％非働化ウシ胎児血清、１００U/mlペニシリンおよび１００U/mlストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターでＲＡＷ２６４．７を培養し、コンフルエントになった細胞を用いた。９６穴培養プレートで、２×１０５/ｃｅｌｌずつＲＡＷ２６４．７をまき、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターにて約１時間培養した。続いて、各植物の希釈液、または比較対照としてＤＭＥＭ培地のみを添加後、リポポリサッカライド溶液を加え、３７度、５％ＣＯ2インキュベーターで１６〜２４時間培養した。一酸化窒素産生量は、Ｇｒｉｅｓｓ法により、５４０nmの吸光度を測定し、比較対照の一酸化窒素量を１００とした場合の相対比を求めた。なお、Ｇｒｉｅｓｓ法は、Ｇｒｉｅｓｓ試薬（１％スルファニルアミド、０．１％
ナフチルエチレンジアミンジクロライド、２．５％ 燐酸）を用い、一酸化窒素の代謝物である亜硝酸イオンが本試薬と発生して生成するピンク色のアゾ化合物の吸光度を測定する方法で，一酸化窒素の生成量を推測するもっとも簡便な方法として知られている。
【００２３】
図1に示したように、エゾウコギ、ウラジロガシ、ブラックコホウシュ、アカショウマ、ゴツコラ各抽出物には、比較対照よりもＴＮＦ-α産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２４】
図２に示したように、エゾウコギ、ウラジロガシ、ブラックコホウシュ、アカショウマ、ゴツコラ抽出物には、比較対照よりも一酸化窒素産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２５】
図３に示したように、ニッパヤシ５０％エタノール溶液抽出物及びニッパヤシエタノール溶液抽出物には、比較対照よりもＴＮＦ-α産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２６】
図４に示したように、ニッパヤシ５０％エタノール溶液抽出物及びニッパヤシエタノール溶液抽出物には、比較対照よりも一酸化窒素産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２７】
図５に示したように、ニッパヤシ由来の糖より得られた画分には、濃度依存的にＴＮＦ-α産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２８】
図６に示したように、ニッパヤシ由来の糖より得られた画分には、濃度依存的に一酸化窒素産生を抑制する効果があることが確認された。
【００２９】
図７に示したように、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーを利用し、水とアセトニトリルの濃度勾配によりニッパヤシ由来の糖を分画した結果を示した。流速毎分０．５ｍｌで、分画開始時のアセトニトリル濃度は２０％とし、分画開始30分にアセトニトリル濃度が５０％になるように直線的にアセトニトリルの濃度を上昇させた。約１４分のピークを精製した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、飲食用、飼料用または医薬用のＴＮＦ
-α産生抑制剤および一酸化窒素産生抑制剤を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】エゾウコギ、ウラジロガシ、ブラックコホウシュ、アカショウマ、ゴツコラ各抽出物のＴＮＦ-α産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照のＴＮＦ-α産生量を１００％とした。（実施例１）。
【図２】エゾウコギ、ウラジロガシ、ブラックコホウシュ、アカショウマ、ゴツコラ各抽出物の一酸化窒素産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照の一酸化窒素産生量を１００％とした。（実施例２）。
【図３】ニッパヤシ５０％エタノール溶液抽出物及びニッパヤシエタノール溶液抽出物のＴＮＦ-α産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照のＴＮＦ-α産生量を１００％とした。（実施例３）。
【図４】ニッパヤシ５０％エタノール溶液抽出物及びニッパヤシエタノール溶液抽出物の一酸化窒素産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照の一酸化窒素産生量を１００％とした。（実施例４）。
【図５】ニッパヤシ由来の糖より得られた画分のＴＮＦ-α産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照のＴＮＦ-α産生量を１００％とした（実施例５）。
【図６】ニッパヤシ由来の糖より得られた画分の一酸化窒素産生抑制作用を調べた結果を示した。リポポリサッカライド添加時の比較対照の一酸化窒素産生量を１００％とした。（実施例６）。
【図７】ＯＤＳカラムクロマトグラフィーを利用し、水とアセトニトリルの濃度勾配によりニッパヤシ由来の糖由来の物質を精製した結果を示した。流速毎分０．５ｍｌで、分画開始時のアセトニトリル濃度は２０％とし、分画開始30分にアセトニトリル濃度画５０％になるように直線的にアセトニトリルの濃度を上昇させた。約１４分のピークを精製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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