(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）被験者から採取された細胞から抽出されたＤＮＡを含有する第一試料を得るステップ、
（Ｂ）前記被験者から採取された細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）の第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第一情報と、前記ステップ（Ｂ）の第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた第一情報と第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含み、
前記ステップ（Ｄ）において、第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ヒトパピローマウイルスが存在すると判定する、組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法。
【請求項２】
第一情報が、第一試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつヒトパピローマウイルスのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得られた情報であり、前記第二情報が、第二試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつ該プライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得られた情報である、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーセットが、Ｌ１遺伝子領域、Ｌ２遺伝子領域、Ｅ６遺伝子領域又はＥ７遺伝子領域のＤＮＡ配列を増幅可能なプライマーセットである、請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法又はリガーゼ連鎖反応法により行なわれる、請求項２又は３に記載の判定方法。
【請求項５】
前記被験者の細胞が、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
前記ヒトパピローマウイルスが、ハイリスク型ヒトパピローマウイルスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、又はラムダエキソヌクレアーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項８】
（Ｅ）第一試料及び／又は第二試料中に含まれるＤＮＡを鋳型として、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅し、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが増幅された場合、試料中にハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在するという情報を得、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが増幅されない場合、試料中にハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在しないという情報を得るステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で取得された情報に基づいて、前記ステップ（Ｄ）の判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含み、
前記ステップ（Ｆ）において、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが第一試料に検出され、かつ第二試料からは検出されない場合を、判定の結果の信頼性が高いことを示す指標とし、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが第一試料及び第二試料のいずれからも検出されない場合又はハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが第一試料に検出され、かつ第二試料にも検出される場合を、判定結果の信頼性が低いことを示す指標とし、当該指標に基づいて、判定結果の精度を管理する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項９】
前記ステップ（Ｂ）において、前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る、請求項１〜８のいずれかに記載の判定方法。
【請求項１０】
前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後、得られた産物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でさらに処理する、請求項９に記載の判定方法。
【請求項１１】
前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理する、請求項１０に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（以下、「ＨＰＶ」という）は、乳頭腫を形成するウイルスである。ＨＰＶは、１００種以上のサブタイプに分類されている。また、ＨＰＶのサブタイプ間には、共通する遺伝子領域が保存されていることが知られている。ＨＰＶが感染した細胞には、ゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ（組み込み型ＨＰＶ）や、二本鎖環状ＤＮＡの状態で存在しているＨＰＶ（エピゾーマル型ＨＰＶ）が存在する。ＨＰＶのサブタイプであるＨＰＶ１６は、子宮頸部に生じる頸部上皮内癌の組織や口腔癌の組織などの癌組織において、組み込み型ＨＰＶとして存在する場合が多いことが知られている（例えば、非特許文献１〜３を参照）。そのため、被験者から採取した細胞における、組み込み型ＨＰＶの有無の判定は、細胞の癌化の状態を調べる上で重要である。
【０００３】
非特許文献１及び２には、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、細胞のゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６の組み込みを判定する方法が記載されている。具体的には、非特許文献１及び２に記載の方法では、まず、細胞から得られたＤＮＡを含有する試料中の、ＨＰＶ１６のＥ２遺伝子領域のＤＮＡの量とＨＰＶ１６のＥ６遺伝子領域のＤＮＡの量とを測定する。つぎに、ＨＰＶ１６のＥ２遺伝子領域のＤＮＡの量とＥ６遺伝子領域のＤＮＡの量とを比較する。そして、比較結果に基づいて、細胞のゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６の組み込みを判定する。Ｅ２遺伝子領域は、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６のＤＮＡの組み込みにより、開裂することが多い領域である。そのため、非特許文献１及び２に記載の方法によれば、Ｅ２遺伝子領域のＤＮＡの量の変動に基づき、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６の組み込みの有無を判定することができる。
【０００４】
しかしながら、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６の組み込みに際して、ＨＰＶ１６のＤＮＡが、Ｅ２遺伝子領域で開裂しない場合もある。そのため、ＨＰＶ１６のＤＮＡが、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていても、該Ｅ２遺伝子領域の開裂によるＤＮＡの量の変動が生じない場合もある。したがって、非特許文献１及び２に記載の方法は、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６のＤＮＡの組み込みの検出の精度が低いという欠点がある。
【０００５】
また、非特許文献３には、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６のＤＮＡの組み込みを検出する方法が記載されている。
【０００６】
しかしながら、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションでは、操作が複雑であり、また結果の判定には熟練が必要である。そのため、迅速かつ簡便に、ゲノムＤＮＡへのＨＰＶ１６のＤＮＡの組み込みを検出することができないという欠点がある。
【非特許文献１】パヌ・ペイツァロ(Panu Peitsaro)ほか２名、「組み込み型１６型ヒトパピローマウイルスは、新規定量的リアルタイムＰＣＲ技術により示されるように子宮頸癌前駆体に高頻度で見出される(Integrated Human Papillomavirus Type 16 Is Frequently Found inCervical Cancer Precursors as Demonstrated by a Novel Quantitative Real-TimePCR Technique)」、ジャーナル  オブ  クリニカル  マイクロバイオロジー(Journal ofClinical Microbiology)、2002年3月、第40巻、p.886-891
【非特許文献２】フーゴ・アリアス−プリド(Hugo Arias-Pulido)ほか４名、「インサイチュ頸癌及び侵襲性頸癌における１６型ヒトパピローマウイルス組み込み(Human Papillomavirus Type 16 Integration in Cervical Carcinoma InSitu and in Invasive Cervical Cancer)」、2006年5月、第44巻、p.1755-1762
【非特許文献３】レンスケ・ディー．エム．ステーンベルヘン(Renske D. M.Steenbergen)ほか６名、「組み込み型１６型ヒトパピローマウイルス並びに口腔癌及びその派生細胞株における11q22及び18q21での異型接合性の喪失(Integrated Human Papillomavirus Type 16 and Loss of Heterozygosityat 11q22 and 18q21 in an Oral Carcinoma and Its Derivative Cell Line)」、キャンサー  リサーチ(Cancer Research)、1995年11月15日、第55巻、p.5465-5471
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高い精度で、迅速かつ簡便に組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができる判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）  （Ａ）被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する第一試料を得るステップ、
（Ｂ）前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）の第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第一情報と、前記ステップ（Ｂ）の第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
（Ｄ）前記ステップ（Ｃ）で得られた第一情報と第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含む、組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無の判定方法、
（２）  前記ステップ（Ｄ）において、第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ヒトパピローマウイルスが存在すると判定する、前記（１に記載の判定方法、
（３）  第一情報が、第一試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつヒトパピローマウイルスのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得られた情報であり、前記第二情報が、第二試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつ該プライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得られた情報である、前記（１又は２に記載の判定方法、
（４）  前記ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーセットが、組み込み型ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列において、開裂の頻度が低い領域である、低開裂領域のＤＮＡ配列を増幅可能なプライマーセットである、前記（３）に記載の判定方法、
（５）  前記ＤＮＡの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法又はリガーゼ連鎖反応法により行なわれる、前記（３）又は（４）に記載の判定方法、
（６）  前記被験者の細胞が、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞である、前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の判定方法、
（７）  前記ヒトパピローマウイルスが、ハイリスク型ヒトパピローマウイルスである、前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の判定方法、
（８）  前記エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、又はラムダエキソヌクレアーゼである、前記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の判定方法、
（９）  （Ｅ）第一試料及び／又は第二試料中におけるハウスキーピング遺伝子のＤＮＡの有無の情報を取得するステップ、及び
（Ｆ）前記ステップ（Ｅ）で取得された情報に基づいて、前記ステップ（Ｄ）の判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含む、前記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の判定方法、
（１０）  前記ステップ（Ｂ）において、前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る、前記（１）〜（９）のいずれかに記載の判定方法、
（１１）  前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後、得られた産物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でさらに処理する、前記（１０）に記載の判定方法、並びに
（１２）  前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理する、前記（１０）に記載の判定方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法によれば、高い精度で、迅速かつ簡便に組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができるという優れた効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法は、
被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する第一試料を得るステップ、
前記被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して第二試料を得るステップ、
前記第一試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第一情報と、前記第二試料中に含まれるヒトパピローマウイルスのＤＮＡの量に関する第二情報とを取得するステップ、及び
前記第一情報と前記第二情報とに基づいて、前記細胞中の組み込み型ヒトパピローマウイルスの有無を判定するステップ
を含む。
【００１１】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、第一試料と第二試料が用いられる。第一試料は、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する試料である。第二試料は、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理したＤＮＡを含有する試料である。すなわち、第一試料と第二試料の調製において、エピゾーマル型ＨＰＶのＤＮＡと組み込み型ＨＰＶのＤＮＡとを、それぞれ単離しなくてもよい。したがって、迅速かつ簡便に、組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができる。
【００１２】
本明細書において、エピゾーマル型ＨＰＶとは、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていないＨＰＶをいう。また、組み込み型ＨＰＶとは、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶをいう。
【００１３】
ＨＰＶは、約８ｋｂの環状ＤＮＡウイルスである。ＨＰＶゲノムは、初期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｅ１遺伝子領域、Ｅ２遺伝子領域、Ｅ４遺伝子領域、Ｅ５遺伝子領域、Ｅ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域）、後期遺伝子のオープンリーディングフレーム（Ｌ１遺伝子領域及びＬ２遺伝子領域）、及びＬＣＲを有している（図１及び図２参照）。
【００１４】
Ｅ１遺伝子領域は、ウイルスゲノムの複製に関与する領域である。Ｅ２遺伝子領域は、ウイルスの転写の調節に関与する領域である。Ｅ５遺伝子領域、Ｅ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域は、がん化に関与する領域である。Ｅ６遺伝子領域は、がん抑制遺伝子であるｐ５３と結合し、ｐ５３の分解を促進するタンパク質をコードする領域である。Ｅ７遺伝子領域は、がん抑制遺伝子であるＲｂと結合し、Ｒｂを不活化するタンパク質をコードする領域である。Ｌ１遺伝子領域及びＬ２遺伝子領域は、キャプシド形成に関与する領域である。なお、ＬＣＲ（Long control region)は、ウイルス遺伝子の発現調節に関与する領域である。
【００１５】
ここで、Ｅ６遺伝子領域、Ｅ７遺伝子領域、Ｌ１遺伝子領域及びＬ２遺伝子領域は、低開裂領域である。低開裂領域とは、組み込み型ヒトパピローマウイルスのＤＮＡ配列において、開裂の頻度が低い領域を示す。なお、Ｅ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域は、開裂の頻度が極めて低い領域である。
【００１６】
なお、ＨＰＶとしては、ハイリスク型ＨＰＶが好ましい。ハイリスク型ＨＰＶは、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることにより、細胞を癌化する可能性が高いＨＰＶである。具体的なハイリスク型ＨＰＶとしては、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３及びＨＰＶ８２が挙げられる。
【００１７】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、まず、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する第一試料を得る。
【００１８】
被験者の細胞からのＤＮＡの抽出は、公知の方法などにより行なえばよい。例えば、ＤＮＡは、被験者の細胞を溶解して細胞内のＤＮＡを可溶化し、得られた溶解物から、フェノールなどを用いてタンパク質を除去することで、被験者の細胞から抽出することができる。また、ＤＮＡは、市販のＤＮＡを抽出するためのキットを用いて、被験者の細胞から抽出してもよい。
【００１９】
抽出したＤＮＡは、水や緩衝液に溶解してＤＮＡ溶液とすることができる。このＤＮＡ溶液を分注し、第一試料や第二試料の調製に用いることができる。ここで、抽出したＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、溶解したＤＮＡが安定なものが好ましい。例えば、ヌクレアーゼを含まないＰＣＲグレードの水や、ＴＥ溶液〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕などが挙げられる。なお、ＤＮＡの抽出は、第一試料及び第二試料の調製ごとに行ってもよい。
【００２０】
第一試料は、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する試料である。第一試料は、後述する第二試料と異なりエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理されない。しかし、酵素処理以外は、第二試料と同じ条件で調製することが好ましい。すなわち、第一試料は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を添加せずに、第二試料と同じ条件で処理した試料が好ましい。これにより、本発明の判定の信頼性を向上することができる。
【００２１】
被験者の細胞としては、ＨＰＶが感染する対象となる細胞又はＨＰＶが潜伏する対象となる細胞であればよい。被験者の細胞としては、特に限定されないが、例えば、粘膜の細胞、皮膚の細胞などが挙げられる。粘膜としては、例えば、泌尿生殖器、消化器、呼吸器などの管腔臓器の内腔面が挙げられる。より具体的な粘膜としては、子宮頸部、口腔咽喉部などが挙げられる。本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、被験者の細胞は、子宮頸部の細胞又は口腔咽頭部の細胞が好ましい。子宮頸部の細胞は、被験者の子宮頸部から採取することができる細胞である。また、口腔咽頭部の細胞は、被験者の口腔咽頭部から採取することができる細胞である。
【００２２】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、つぎに、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理してＤＮＡを含有する第二試料を得る。
【００２３】
第二試料は、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理することで得られたＤＮＡを含有する試料である。
【００２４】
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを処理すると、該ＤＮＡに含まれるゲノムＤＮＡが分解される。そのため、第二試料は、ゲノムＤＮＡを実質的に含まず、二本鎖環状ＤＮＡを選択的に含む。すなわち、第二試料は、組み込み型ＨＰＶのＤＮＡを実質的に含まず、エピゾーマル型ＨＰＶのＤＮＡを選択的に含むことになる。
【００２５】
本明細書において、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とは、直鎖状ＤＮＡの５’末端側から３’末端側まで又は該直鎖状ＤＮＡの３’末端側から５’末端側まで、糖残基とリン酸残基との間のホスホジエステル結合を順次加水分解する活性を有する酵素であればよい。なかでも、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、二本鎖ＤＮＡに対してエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が望ましい。エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の具体例としては、ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。これらのなかでは、ポリメラーゼ活性を有さない、ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ及びラムダエキソヌクレアーゼが好ましい。
【００２６】
ＤＮＡの処理に際して、用いられるエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の量は、用いられる酵素の種類や第一試料に含まれるＤＮＡの量などに応じて適宜決定すればよい。エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＤＮＡの処理は、使用するエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の種類に応じた反応条件下で行なえばよい。エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＤＮＡの処理は、細胞中における組み込み型ＨＰＶの有無の判定結果をより高い精度で得る観点から、好ましくはＤＮＡを十分に消化するまで行なわれる。なお、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素がエキソヌクレアーゼ活性以外に生物学的活性を有する酵素である場合、該エキソヌクレアーゼ活性以外の生物学的活性を有する酵素によるＤＮＡの処理は、該エキソヌクレアーゼ活性を発現し、該エキソヌクレアーゼ活性以外の生物学的活性を抑制する反応条件下で行なうことができる。
【００２７】
第二試料を得るに際しては、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素に加え、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理することが好ましい。これにより、より効率的に、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡに含まれるゲノムＤＮＡを分解することができる。
【００２８】
ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡの塩基配列中に認識配列を有していない酵素であればよい。例えば、ヒトパピローマウイルスがＨＰＶ１６の場合、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩが挙げられる。なお、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２９】
被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る場合、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後、得られた産物を、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でさらに処理することができる。この場合、用いられるエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素それぞれの活性が十分に発揮される条件でそれぞれの酵素による処理を行なうことができる点で有利である。
【００３０】
ＤＮＡの処理に際して、用いられるエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の量は、用いられる酵素の種類第一試料に含まれるＤＮＡの量などに応じて適宜決定すればよい。エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＤＮＡの処理は、使用するエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の種類に応じた反応条件下で行なえばよい。
【００３１】
なお、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理した後に、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を熱などにより失活させることが好ましい。これにより、その後のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による処理の際に、残存するエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素のスター活性によるエピゾーマル型ＨＰＶの切断を防ぐことができる。
【００３２】
また、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と、ヒトパピローマウイルスのＤＮＡを切断しないエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得る場合、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理することができる。この場合、一回の操作で第二試料を得ることができるため、操作が容易になる点で有利である。
【００３３】
被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とで同時に処理する場合、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の組み合わせは、互いに同じ反応条件下でそれぞれの活性が十分に保たれる組み合わせであるのが望ましい。エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の組み合わせとしては、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素として、ＳａｃＩ及び／又はＸｈｏIと、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素として、ＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼとの組み合わせ等が挙げられる。
【００３４】
ＤＮＡの処理に際して、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の組み合わせにおけるエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の量及びエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の量は、用いられる酵素の種類や第一試料に含まれるＤＮＡの量などに応じて適宜決定すればよい。また、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の組み合わせの反応条件は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素の活性及びエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の活性が十分に保たれる反応条件であればよい。
【００３５】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、第一試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する第一情報と、第二試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する第二情報とを取得する。
【００３６】
上述のように、第二試料は、組み込み型ＨＰＶのＤＮＡを実質的に含まず、エピゾーマル型ＨＰＶのＤＮＡを選択的に含んでいる。したがって、第二試料から得られる第二情報は、エピゾーマル型ＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報である。一方、第一試料に含まれるＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理されていないＤＮＡである。そのため、第一試料は、組み込み型ＨＰＶのＤＮＡとエピゾーマル型ＨＰＶのＤＮＡを両方含んでいる。したがって、第一試料から得られる第一情報は、ピゾーマル型ＨＰＶと組み込み型ＨＰＶ両方のＤＮＡの量に関する情報である。
【００３７】
試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報とは、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量と相関関係がある情報をいう。例えば、後述するリアルタイムＰＣＲの場合、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報は、検量線に基づいて算出されたＨＰＶのＤＮＡの定量値だけでなく、所定のサイクル数における増幅産物の量や増幅産物の増幅曲線のグラフをも含む。すなわち、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報は、試料中のＤＮＡの量を直接的に示す情報だけでなく、間接的に示す情報をも含む。
【００３８】
ここで、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報は、核酸増幅法やＤＮＡチップなどを用いた、公知のＤＮＡ量の測定方法により取得することができる。特に、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡが少量であっても、細胞中の組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができることから、核酸増幅法を用いた方法が望ましい。なお、本明細書において、核酸増幅法とは、鋳型となるＤＮＡとプライマーセットとを用いてＤＮＡを増幅する方法をいう。
【００３９】
ＨＰＶのＤＮＡの量の測定に用いることのできるＤＮＡチップとしては、ＨＰＶのＤＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを固定化した基板が挙げられる。ＤＮＡチップを用いたＤＮＡの測定は、公知の方法により行なうことができる。例えば、ＤＮＡチップを用いたＤＮＡの測定は、以下のようにして行なうことができる。まず、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡを鋳型として、ビオチンでラベルした一本鎖ＤＮＡのプローブ（ビオチン標識プローブ）を作製する。つぎに、ビオチン標識プローブと、上記のＨＰＶのＤＮＡにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを固定化した基板とを接触させる。これにより、ビオチン標識プローブと、基板上のポリヌクレオチドとで二本鎖を形成させる。さらに、基板上のポリヌクレオチドと二本鎖を形成したビオチン標識プローブを、蛍光標識したアビジンで染色する。その後、基板上の蛍光強度を測定することで、試料中のＨＰＶのＤＮＡを測定することができる。この方法で、第一試料及び第二試料に含まれるＨＰＶのＤＮＡを測定することにより、第一情報及び第二情報を取得することができる。
【００４０】
核酸増幅法による、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報の取得は、ＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いる核酸増幅法により行なう。すなわち、第一情報は、該第一試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得ることができる。また、第二情報は、該第二試料に含まれるＤＮＡを鋳型として用い、かつ該プライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得ることができる。上述のように、第一情報及び第二情報は、試料中のＤＮＡの量の測定値でもよい。また、第一情報及び第二情報は、前記測定値の算出に利用した、所定のサイクル数における増幅されたＤＮＡの量や増幅曲線のグラフなどでもよい。
【００４１】
ＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、組み込み型ＨＰＶの検出をより高い精度で行なう観点から、好ましくは低開裂領域のＤＮＡ配列を増幅可能なプライマーセットである。低開裂領域の具体例としては、Ｌ１遺伝子領域、Ｌ２遺伝子領域、Ｅ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域が挙げられる。なかでも、Ｅ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域は、組み込み型ＨＰＶのＤＮＡ配列において、開裂の頻度が極めて低い領域である。したがって、ＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、好ましくはＥ６遺伝子領域及びＥ７遺伝子領域を増幅できるプライマーセットである。
【００４２】
なお、ＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、使用する核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で作製することができる。また、核酸増幅法の種類に応じた、プライマーセットを作製するためのソフトウエアも市販されている。リアルタイムＰＣＲに用いるプライマーセットを作製するためのソフトウエアとしては、例えば、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ｐｒｉｍｅｒ３などが挙げられる。また、ＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットを作製するためのソフトウエアとしては、例えば、栄研化学株式会社・富士通株式会社・株式会社富士通システムソリューションズ提供の商品名：Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒなどが挙げられる。ＨＰＶのＤＮＡを増幅するためのプライマーセットは、このようなソフトウエアを利用して作製することができる。
【００４３】
例えば、第一情報及び第二情報の取得に、リアルタイムＰＣＲを用いた場合のプライマーセットの具体例としては、ＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆ：5'-tgctccatctgccactacgtc-3'（配列番号：１）とＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−Ｒ：5'-tagggcgcaaccacataaca-3'（配列番号：２）とのプライマーセット、ＨＰＶ１６Ｅ７−Ｆ：5'-tgcatggagatacacctacattg-3'（配列番号：３）とＨＰＶ１６Ｅ７−Ｒ：5'-tagtgtgcccattaacaggtcttc-3'（配列番号：４）とのプライマーセット、ＭＹ０９：5'-cgtccmarrggawactgatc-3'（配列番号：５）とＭＹ１１：5'-gcmcagggwcataayaatgg-3'（配列番号：６）とのプライマーセット、ＧＰ５＋：5'-tttgttactgtggtagatactac-3'（配列番号：７）とＧＰ６＋：5'-gaaaaataaactgtaaatcatattc-3'（配列番号：８）とのプライマーセット、ＨＰＶ１８Ｅ７−Ｆ：5'-caagacattgtattgcatttagagcc-3'（配列番号：９）とＨＰＶ１８Ｅ７−Ｒ：5'-tgctggaatgctcgaaggtc-3'（配列番号：１０）とのプライマーセット、ＨＰＶ１６Ｌ１−Ｆ：5'-gtaggtgttgaggtaggtcgtgg-3'（配列番号：１１）とＨＰＶ１６Ｌ１−Ｒ：5'-ggacaatcacctggatttactgc-3'（配列番号：１２）とのプライマーセット、ＨＰＶｐＵ−１Ｍ：5'-tgtcaaaaaccgttgtgtcc-3'（配列番号：１３）とＨＰＶｐＵ−２Ｒ：5'-gagctgtcgcttaattgctc-3'（配列番号：１４）とのプライマーセットなどが挙げられる。
【００４４】
ＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法又はリガーゼ連鎖反応法により行なわれることが好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法などが挙げられる。また、鎖置換反応法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法、ＳＭＡＰ法などが挙げられる。なかでも、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ及びＬＡＭＰ法である。
【００４５】
ここで、リアルタイムＰＣＲとしては、増幅産物であるＨＰＶのＤＮＡは、蛍光を発するインターカレーターを用いる方法（インターカレーター法）、及び増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブなど）を用いる方法（プローブ法）がある。これらのなかでは、増幅産物であるＨＰＶのＤＮＡの検出及び定量を簡便に行なうことができる観点から、好ましくはインターカレーター法である。
【００４６】
インターカレーター法では、インターカレーターは、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質である。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡとして得られる増幅産物に結合しているインターカレーターの蛍光に基づく蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。インターカレーターとしては、例えば、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標）  ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲでは、増幅産物であるＨＰＶのＤＮＡをリアルタイムでモニタリングし、指数関数的増幅領域で、該ＨＰＶのＤＮＡの定量を行なうため、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき、正確に、該ＨＰＶのＤＮＡを定量することができる。リアルタイムＰＣＲでは、第一試料中に含まれるＤＮＡの量及び第二試料に含まれるＤＮＡの量が多いほど、増幅産物であるＨＰＶのＤＮＡの量は、より早いサイクルの段階で、検出可能な量に達する。そのため、例えば、蛍光強度を縦軸とし、サイクル数を横軸とするグラフに、増幅産物の増幅曲線を描いた場合、第一試料中に含まれるＤＮＡの量及び第二試料に含まれるＤＮＡの量が多いほど、それぞれの増幅曲線は、より早いサイクルから指数関数的に蛍光強度の増加を示す曲線となる。また、増幅曲線のグラフ上に適切に設定された蛍光強度の閾値と増幅曲線とが交わる点でのサイクル数の値（Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ））は、第一試料中に含まれるＤＮＡの量又は第二試料に含まれるＤＮＡの量と直線関係がある。したがって、第一試料中に含まれるＤＮＡ中のＨＰＶのＤＮＡの量又は第二試料に含まれるＤＮＡ中のＨＰＶのＤＮＡの量は、Ｃｔ値と、標準ＤＮＡ試料の量との関係を占めす検量線に基づいて算出される。
【００４８】
ＬＡＭＰ法の場合、ＨＰＶのＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量に関する情報を取得することができる。また、ＬＡＭＰ法においても、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標）  ｇｒｅｅｎを用いることができる。なお、試料中のＨＰＶのＤＮＡの量は、反応液の濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間に基づいて、算出することができる。
【００４９】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、前記第一情報と第二情報とに基づいて、細胞中のゲノムＤＮＡに組み込まれているＨＰＶ（組み込み型ＨＰＶ）の有無を判定する。
【００５０】
上述のように、第一情報には、組み込み型ＨＰＶとエピゾーマル型ＨＰＶの両方のＤＮＡの量に関する情報が含まれている。一方、第二情報には、エピゾーマル型ＨＰＶのみのＤＮＡの量に関する情報が含まれている。したがって、第一情報と第二情報とを比較することで、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡ中における組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができる。すなわち、第一情報と第二情報から、第二試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量よりも少ないという情報が得られた場合、細胞中に組み込み型ＨＰＶが存在すると判定することができる。逆に、第一情報と第二情報とから、第二試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量と実質的に同一であるという情報が得られた場合、細胞中に組み込み型ＨＰＶが存在しないと判定することができる。
【００５１】
前記第一情報及び第二情報が、例えば、ＨＰＶのＤＮＡ量の測定値である場合、第二情報のＨＰＶのＤＮＡ量の測定値が、第一情報のＨＰＶのＤＮＡ量の測定値よりも低ければ、組み込み型ＨＰＶが存在すると判定することができる。また、第一情報及び第二情報のＨＰＶのＤＮＡ量の測定値が、実質的に同一であれば、組み込み型ＨＰＶが存在しないと判定することができる。
【００５２】
また、第一情報及び第二情報が、上述の核酸増幅法における増幅産物の量（増幅されたＨＰＶのＤＮＡ量）である場合、第二情報の増幅産物の量が、第一情報の増幅産物の量よりも低ければ、組み込み型ＨＰＶが存在すると判定することができる。また、第一情報及び第二情報の増幅産物の量が、実質的に同一であれば、組み込み型ＨＰＶが存在しないと判定できる。
【００５３】
さらに、第一情報及び第二情報が、核酸増幅反応における増幅曲線（例えば、増幅曲線のグラフ）である場合、第二情報の増幅曲線が、第一情報の増幅曲線よりも、上述した濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間が遅ければ、組み込み型ＨＰＶが存在すると判定することができる。また、第一情報及び第二情報の増幅率が、実質的に同一であれば、組み込み型ＨＰＶが存在しないと判定することができる。
【００５４】
また、第二情報において、ＨＰＶのＤＮＡが存在しないという情報が得られた場合、被験者の細胞にはエピゾーマル型ＨＰＶが存在しないと判定することができる。ここで、第一情報においても、ＨＰＶのＤＮＡが存在しないという情報が得られた場合、被験者の細胞は、ＨＰＶに感染していないと判定することができる。一方、第一情報において、ＨＰＶのＤＮＡが存在するという情報が得られた場合、被験者の細胞中のＨＰＶは、すべて組み込み型ＨＰＶであると判定することができる。ここで、ＨＰＶのＤＮＡが存在しないという情報としては、例えば、試料中のＨＰＶのＤＮＡ量が測定限界以下である場合の情報や、核酸増幅方法においてＨＰＶのＤＮＡが増幅されない場合の情報が挙げられる。一方、ＨＰＶのＤＮＡが存在するという情報としては、試料中のＨＰＶのＤＮＡ量の測定値が得られる場合の情報や、核酸増幅反応においてＨＰＶのＤＮＡが増幅される場合の情報が挙げられる。なお、上記のＨＰＶのＤＮＡが存在する又は存在しないという情報は、試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡ量に関する情報に含まれる。
【００５５】
第二情報において、ＨＰＶのＤＮＡが有るという情報が得られ、かつ組み込み型ＨＰＶが有ると判定された場合、被験者の細胞のＨＰＶは、組み込み型ＨＰＶとエピゾーマル型ＨＰＶの両方が存在すると判定することもできる。
【００５６】
本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法は、より一層判定結果の精度を向上させる観点から、
第一試料及び／又は第二試料中におけるハウスキーピング遺伝子のＤＮＡの有無の情報を取得するステップ、及び
前記ステップで取得された情報に基づいて、上述の組み込み型ＨＰＶの有無を判定するステップの判定の精度管理を行なうステップ
をさらに含むことが好ましい。
【００５７】
ハウスキーピング遺伝子は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンなどが挙げられる。
【００５８】
ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡの有無の情報は、公知のＤＮＡ量の測定方法を用いて取得することができる。例えば、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡの有無の情報は、試料中に含まれるＤＮＡを鋳型として、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅することにより得られる。このＤＮＡの増幅の結果に基づいて、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡの有無の情報を取得することができる。例えば、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが増幅された場合、試料中にハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在するという情報が取得できる。逆に、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが増幅されない場合、試料中にハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在しないという情報が取得できる。
【００５９】
なお、ＨＰＶのＤＮＡには、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡは含まれていない。一方、細胞のゲノムＤＮＡには、ハウスキーピング遺伝子が含まれている。ここで、第一試料中のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを含む。それに対し、第二試料中のＤＮＡは、エキソヌクレアーゼで処理されているため、ゲノムＤＮＡを含まない。すなわち、第一試料の調製が良好に行なわれていれば、第一試料中にはハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在するという情報が取得される。一方、第二試料の調製が良好に行なわれていれば、第二試料中にはハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが存在しないという情報が取得される。つまり、細胞中の組み込み型ＨＰＶの有無を判定するステップで得られた判定の精度管理は、第一試料及び第二試料におけるハウスキーピング遺伝子の有無に基づいて行なうことができる。
【００６０】
例えば、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが、第一試料に検出され、第二試料からは検出されない場合、判定の結果の信頼性が高いことを示す指標となる。一方、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが、第一試料及び第二試料のいずれからも検出されない場合、被験者の細胞からのＤＮＡの抽出などのＤＮＡの調製時の操作、第一試料及び第二試料の取り扱いなどが適切に行なわれていない可能性があり、判定結果の信頼性が低いことを示す指標となる。また、ハウスキーピング遺伝子のＤＮＡが、第一試料に検出され、かつ第二試料にも検出される場合、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素による処理が不十分である可能性があり、判定結果の信頼性が低いことを示す指標となる。本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法では、指標に基づいて、判定結果の精度を管理することができる。
【００６１】
以上のように、本発明の組み込み型ＨＰＶの有無の判定方法によれば、高い精度で、迅速かつ簡便に組み込み型ＨＰＶの有無を判定することができる。
【００６２】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
（実施例１）
ＨＰＶ１６が染色体に組み込まれている子宮頸部由来細胞株であるＳｉＨａ細胞（１×１０6個細胞）のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製、商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット〕を用いて抽出した。抽出したＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡに、ヌクレアーゼを含まないＰＣＲグレードの水を添加し、ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．１μｇ／μＬ）を得た。
【００６４】
得られたＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（１０μＬ）を用いて、１μｇのＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡを含む緩衝液〔組成：６６．８ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、８．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  γＡＴＰ、１μｇのＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕５０μＬを調製した。調製したゲノムＤＮＡを含む緩衝液を、３７℃で２．５時間インキュベーションした後、７５℃で２０分間インキュベーションし、第一試料（５０μＬ）を得た。
【００６５】
また、前記ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（１０μＬ）を用いて、１μｇのＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡと２０ＵのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、コード番号：ＡＤＤ−１０１）とを含む緩衝液〔組成：６６．８ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、３０ｍＭ塩化マグネシウム、８．４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ  γＡＴＰ、１μｇのＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ、２０ＵのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕５０μＬを調製した。調製したゲノムＤＮＡとγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼとを含む緩衝液を、３７℃で、２．５時間インキュベーションした。つぎに、７５℃で２０分間インキュベーションし、第二試料（５０μＬ）を得た。
【００６６】
鋳型である第一試料１μＬに対して、リアルタイムＰＣＲ用キット〔キアジェン社製、商品名：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、カタログ番号：＃６００５４８〕に含まれている試薬（商品名：×２  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）１２．５μＬと、参照用色素（商品名：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ）０．４μＬと、プライマーＨＰＶ１６Ｅ７−Ｆ（１０μＭ、配列番号：３、5'-tgcatggagatacacctacattg-3'）水溶液１μＬとプライマーＨＰＶ１６Ｅ７−Ｒ（１０μＭ、配列番号：４、5'-tagtgtgcccattaacaggtcttc-3'）水溶液１μＬと、水９．１μＬとを添加して、２５μＬのリアルタイムＰＣＲ用反応液１を調製した。プライマーＨＰＶ１６Ｅ７−ＦとプライマーＨＰＶ１６Ｅ７−Ｒとからなるプライマーセットは、ＨＰＶ１６のＥ７遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットである。
【００６７】
前記と同様にして、鋳型として第二試料を用いて、リアルタイムＰＣＲ用反応液２を調製した。
【００６８】
その後、リアルタイムＰＣＲ用反応液１及びリアルタイムＰＣＲ用反応液２それぞれを用いて、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、商品名：Ｍｘ３００５Ｐ）により、リアルタイムＰＣＲを行なった。リアルタイムＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃１０分間の保温後、９５℃３０秒間と５８℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする３０サイクルの反応とした。リアルタイムＰＣＲに際して、増幅産物である二本鎖ＤＮＡ中に挿入された蛍光色素〔キアジェン社製、商品名：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ〕に基づく蛍光強度を、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、商品名：Ｍｘ３００５Ｐ）の検出器（波長５１６ｎｍ）で測定した。その結果を図３に示す。図３は、実施例１のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【００６９】
図３に示されるように、２０サイクル目以降から第一試料中におけるＨＰＶ１６のＥ７遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量が、指数関数的に増加しているのに対して、第二試料中におけるＨＰＶ１６のＥ７遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量は、ほとんど変化していないことがわかる。これは、第二試料では、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより、直鎖状のＤＮＡであるゲノムＤＮＡが分解されるため、第二試料中にリアルタイムＰＣＲの鋳型となるＤＮＡがなくなることが原因であると考えられる。
【００７０】
したがって、第一試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量と第二試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量との差を求め、第一試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量を指標として、第二試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ＨＰＶ１６が存在すると判定することができることが示唆される。また、第一試料中に含まれるＨＰＶ１６のＤＮＡの量を指標とすることにより、細胞中の組み込み型ＨＰＶ１６の有無を判定することができることが示唆される。
【００７１】
（実施例２）
ＳｉＨａ細胞に代えて、ＨＰＶ１８が染色体に組み込まれている子宮頸部由来細胞株であるＨｅＬａ細胞（１×１０6個細胞）を用いたことを除き、実施例１と同様にして、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液を得た。
【００７２】
また、環状二本鎖ＤＮＡであるＨＰＶのモデルとして、ＨＰＶ１８ゲノムのＬ１遺伝子領域からＥ６遺伝子領域の範囲のＤＮＡが、ベクター（インビトロジェン社製、商品名：ｐＣＥＰ４ベクター、カタログ番号：Ｖ０４４−５０）に連結されたプラスミドを用いた。
【００７３】
ＳｉＨａ細胞のゲノムＤＮＡ１μｇに代えて、ＨｅＬａ細胞のゲノムＤＮＡ１μｇと上記のプラスミド５００ｐｇとを用いた以外は、実施例１と同様にして、第一試料及び第二試料を得た。
【００７４】
プライマーＨＰＶ１６Ｅ７−Ｆ溶液とプライマーＨＰＶ１６Ｅ７−Ｒ溶液とに代えて、プライマーＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−Ｆ（配列番号：１、5'-tgctccatctgccactacgtc-3'）溶液とプライマーＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−Ｒ（配列番号：２、5'-tagggcgcaaccacataaca-3'）溶液とを用いたことを除き、実施例１と同様にして、第一試料に対応するリアルタイムＰＣＲ用試料１と、第二試料に対応するリアルタイムＰＣＲ用試料２とを得た。なお、プライマーＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−ＦとプライマーＨＰＶ１８Ｌ１／ＬＣＲ−Ｒとからなるプライマーセットは、ＨＰＶ１８のＬ１遺伝子領域を増幅するためのプライマーセットである。
【００７５】
その後、リアルタイムＰＣＲのサーマルプロファイルを、９５℃１０分間の保温後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする３０サイクルの反応としたことを除き、実施例１と同様にして、リアルタイムＰＣＲを行なった。その結果を図４に示す。図４は、実施例２のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【００７６】
図４に示されるように、１８サイクル目以降から第一試料中におけるＨＰＶ１８のＬ１遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量及び第二試料中におけるＨＰＶ１８のＬ１遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量のいずれもが、指数関数的に増加することがわかる。したがって、第一試料及び第二試料のいずれにも、ＨＰＶ１８のＤＮＡが存在することがわかる。
【００７７】
また、図４に示されるように、１８サイクル以降では、第一試料中におけるＨＰＶ１８のＬ１遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量に比べ、第二試料中におけるＨＰＶ１８のＬ１遺伝子領域のＤＮＡに対応する増幅産物の量が少なくなっているため、第二試料には、直鎖状のゲノムＤＮＡに組み込まれたＨＰＶ１８のＤＮＡは存在しないが、環状二本鎖ＤＮＡが存在していることがわかる。
【００７８】
したがって、第一試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量と第二試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量との差を求め、第一試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量を指標として、第二試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量が、第一試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量よりも少ないとき、細胞中に組み込み型ＨＰＶ１８が存在すると判定することができることが示唆される。また、第一試料中に含まれるＨＰＶ１８のＤＮＡの量を指標とすることにより、細胞中の組み込み型ＨＰＶ１８の有無を判定することができることが示唆される。
【００７９】
（実施例３）
実施例１の第一試料及び第二試料について、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（配列番号：１５、5'-ggcaccctatggacacgc-3'、配列番号：１６、5'-ggaaagccagtccccagaac-3'）を用いて、実施例１と同様にして、リアルタイムＰＣＲを行なった。その結果を図５に示す。図５は、実施例３のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【００８０】
図５に示されるように、２１サイクル目以降から第一試料中におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の量が、指数関数的に増加しているため、第一試料中に、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡが存在することがわかる。一方、図５に示されるように、第二試料中におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の量は、ほとんど変化していないことがわかる。この結果より、第二試料では、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより、直鎖状のＤＮＡであるゲノムＤＮＡが分解されるため、該第二試料中にリアルタイムＰＣＲの鋳型となるＤＮＡがなくなり、該ゲノムＤＮＡ中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを増幅することができないことがわかる。したがって、実施例１の判定結果の信頼性が高いことがわかる。
【００８１】
このように、第一試料及び第二試料それぞれに含まれるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのハウスキーピング遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の有無により、実施例１の判定結果の精度を評価することができることがわかる。
【００８２】
（実施例４）
実施例２の第一試料及び第二試料について、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを増幅するためのプライマーセット（配列番号：１５及び配列番号：１６）を用いて、実施例２と同様にして、リアルタイムＰＣＲを行なった。その結果を図６に示す。図６は、実施例４のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【００８３】
図６に示されるように、２２サイクル目以降から第一試料中におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡに対応する増幅産物の量が、指数関数的に増加しているため、第一試料中に、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡが存在することがわかる。一方、図６に示されるように、第二試料中におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の量は、ほとんど変化していないことがわかる。この結果より、第二試料では、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより、直鎖状のＤＮＡであるゲノムＤＮＡが分解されるため、該第二試料中にリアルタイムＰＣＲの鋳型となるＤＮＡがなくなり、該ゲノムＤＮＡ中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを増幅することができないことがわかる。したがって、実施例２の判定結果の信頼性が高いことがわかる。
【００８４】
このように、第一試料及び第二試料それぞれに含まれるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのハウスキーピング遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の有無により、実施例２の判定結果の精度を評価することができることがわかる。
【００８５】
以上のように、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを含有する第一試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量と、該被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で処理して得られた第二試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量との差を求め、第一試料中に含まれるＨＰＶのＤＮＡの量を指標とすることにより、細胞中の組み込み型ＨＰＶの有無を、迅速かつ簡便に判定することができることがわかる。また、第一試料及び第二試料それぞれに含まれるハウスキーピング遺伝子のＤＮＡに対応する増幅産物の有無により、細胞中の組み込み型ＨＰＶの有無の判定結果の精度を評価することができることがわかる。
【００８６】
（製造例１）
ヒト胃癌細胞株であるＫＡＴＯＩＩＩ細胞（１×１０6個細胞）のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製、商品名：ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット〕を用いて抽出した。
【００８７】
（比較例１）
製造例１で得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡを５μｇ含む緩衝液〔組成：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、５μｇのＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡ、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕３０μＬを調製した。調製したゲノムＤＮＡを含む緩衝液を、３７℃で一晩インキュベーションした。つぎに、得られた産物を６０℃で１５分間インキュベーションし、非処理試料を得た。
【００８８】
非処理試料（３０μＬ）に、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×５  ｂｕｆｆｅｒ（組成：３３４ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、１５０ｍＭ塩化マグネシウム、４２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２．５ｍＭ  ｒＡＴＰ）〕１０μＬを添加した。得られた混合物にヌクレアーゼフリーの精製水を添加して、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、６時間インキュベーションした後、７５℃で１５分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、比較例１の試料を得た。
【００８９】
（実施例５）
比較例１と同じ操作により得られた非処理試料（３０μＬ）に、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×５  ｂｕｆｆｅｒ（組成：３３４ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、１５０ｍＭ塩化マグネシウム、４２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２．５ｍＭ  ｒＡＴＰ）〕１０μＬと、５ＵのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、コード番号：ＡＤＤ−１０１）とを添加した。得られた混合物にヌクレアーゼフリーの精製水を添加して、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、６時間インキュベーションした後、７５℃で１５分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実施例５の試料を得た。
【００９０】
（比較例２）
製造例１で得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡ５μｇと、５ＵのＳａｃＩ（タカラバイオ株式会社製）とを含む緩衝液〔組成：１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、５μｇのＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡ、５ＵのＳａｃＩ、残部ヌクレアーゼフリーの精製水〕３０μＬを調製した。調製したゲノムＤＮＡとＳａｃＩとを含む緩衝液を、３７℃で一晩インキュベーションした。つぎに、得られた産物を６０℃で１５分間インキュベーションし、ＳａｃＩ処理試料を得た。
【００９１】
ＳａｃＩ処理試料（３０μＬ）に、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×５  ｂｕｆｆｅｒ（組成：３３４ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、１５０ｍＭ塩化マグネシウム、４２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２．５ｍＭ  ｒＡＴＰ）〕１０μＬを添加した。得られた混合物に、ヌクレアーゼフリーの精製水１０μＬを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、６時間インキュベーションした後、７５℃で１５分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、比較例２の試料を得た。
【００９２】
（実施例６）
比較例２と同じ操作により得られたＳａｃＩ処理試料（３０μＬ）に、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、５ＵのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、コード番号：ＡＤＤ−１０１）とを添加した。得られた混合物に、ヌクレアーゼフリーの精製水を添加して５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、６時間インキュベーションした後、７５℃で１５分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実施例６の試料を得た。
【００９３】
（試験例１）
実施例５の試料１μＬに対して、リアルタイムＰＣＲ用キット〔キアジェン社製、商品名：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、カタログ番号：＃６００５４８〕に含まれている試薬（商品名：×２  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）１２．５μＬと、参照用色素（商品名：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｙｅ）０．４μＬと、プライマーＧＡＤＰＨ／ＤＮＡ−Ｆ（１０μＭ、配列番号：１７、5'-ggcaccctatggacacgc-3'）水溶液１μＬとプライマーＧＡＤＰＨ／ＤＮＡ−Ｒ（１０μＭ、配列番号：１８、5'-ggaaagccagtccccagaac-3'）水溶液１μＬと、水９．１μＬとを添加して、２５μＬのリアルタイムＰＣＲ用反応液を調製した。プライマーＧＡＤＰＨ／ＤＮＡ−ＦとプライマーＧＡＤＰＨ／ＤＮＡ−Ｒプライマーとからなるプライマーセットは、ゲノムＤＮＡのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のＤＮＡの一部を増幅するためのプライマーセットである。
【００９４】
実施例５の試料に代えて、実施例６の試料、比較例１の試料又は比較例２の試料を用いたことを除き、前記と同様の操作を行なった。
【００９５】
その後、リアルタイムＰＣＲ用反応液を用いて、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、商品名：Ｍｘ３００５Ｐ）により、リアルタイムＰＣＲを行なった。リアルタイムＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃１０分間の保温後、９５℃３０秒間と５８℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応とした。リアルタイムＰＣＲに際して、増幅産物である二本鎖ＤＮＡ中に挿入された蛍光色素〔キアジェン社製、商品名：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ〕に基づく蛍光強度を、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、商品名：Ｍｘ３００５Ｐ）の検出器（波長５１６ｎｍ）で測定した。
【００９６】
それぞれの増幅産物量に基づき、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより処理していない試料中におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の残存量を１００とし、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより処理した試料中におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の残存量の割合〔ＧＡＰＤＨ残存割合（％）〕を求めた。その結果を図７に示す。図７は、試験例１のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、パネル（Ａ）のバー１は、比較例１の試料、バー２は、実施例５の試料、パネル（Ｂ）のバー１は、比較例２の試料、バー２は、実施例６の試料を示す。
【００９７】
図７に示される結果から、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞のＤＮＡをＳａｃＩにより処理した後に、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより処理して得られた試料におけるＧＡＰＤＨ残存割合〔パネル（Ｂ）のバー２〕は、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞のＤＮＡをＳａｃＩにより処理せずに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより処理して得られた試料におけるＧＡＰＤＨ残存割合〔パネル（Ａ）のバー２〕に比べて、小さいことがわかる。かかる結果から、被験者の細胞から得られたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素により処理した後に、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素により処理することにより、ゲノムＤＮＡの残存量が著しく低減することがわかる。
【００９８】
（実験例１）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液〔×５  ｂｕｆｆｅｒ（組成：３３４ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．４）、１５０ｍＭ塩化マグネシウム、４２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２．５ｍＭ  ｒＡＴＰ）〕１０μＬと、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液（東洋紡績株式会社製、商品名：ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、コード番号：ＡＤＤ−１０１）１μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３６μＬとを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で３時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例１の試料を得た。
【００９９】
（実験例２）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液１μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３５μＬとを添加し、反応用混合物を得た。得られた反応混合物を３７℃で、１時間インキュベーションした。得られた産物に、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液１μＬをさらに添加し、２時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例２の試料を得た。
【０１００】
（実験例３）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液２μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３５μＬとを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、３時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例３の試料を得た。
【０１０１】
（実験例４）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液１μＬと、１０Ｕ／μＬのＳａｃＩ（タカラバイオ株式会社製）２μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３４μＬとを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、３時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例４の試料を得た。
【０１０２】
（実験例５）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、１０Ｕ／μＬのγＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ溶液１μＬと、１０Ｕ／μＬのＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社製）２μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３４μＬとを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、３時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例５の試料を得た。
【０１０３】
（実験例６）
ＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（０．３μｇ／μＬ）３μＬに、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ用緩衝液１０μＬと、ヌクレアーゼフリーの精製水３７μＬとを添加し、５０μＬの反応用混合物を得た。得られた反応用混合物を、３７℃で、３時間インキュベーションした後、７５℃で１０分間インキュベーションした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム〔ジーイー・ヘルスケア（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Column〕に供して精製し、実験例６の試料を得た。
【０１０４】
（試験例２）
試験例１において、実施例５の試料、実施例６の試料、比較例１の試料又は比較例２の試料に代えて、実験例１〜実験例５の試料それぞれを用いたことを除き、試験例１と同様に操作を行ない、増幅産物である二本鎖ＤＮＡ中に挿入された蛍光色素〔キアジェン社製、商品名：Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ〕に基づく蛍光強度を、リアルタイムＰＣＲシステム（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、商品名：Ｍｘ３００５Ｐ）の検出器（波長５１６ｎｍ）で測定した。
【０１０５】
それぞれの増幅産物量に基づき、実験例６の試料中におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の残存量を１００とし、実験例１〜５それぞれの試料中におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の残存量の割合〔ＧＡＰＤＨ残存割合（％）〕を求めた。その結果を図８に示す。図８は、試験例２のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、バー１〜５は、それぞれ、実験例１〜５の試料を示す。
【０１０６】
図８に示される結果から、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼのみで処理して得られた試料におけるＧＡＰＤＨ残存割合に比べ、ＳａｃＩ又はＸｈｏＩにより処理し、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼにより処理して得られた試料におけるＧＡＰＤＨ残存割合が、より小さいことがわかる。かかる結果から、被験者の細胞から得られたＤＮＡを、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とにより同時に処理することにより、ゲノムＤＮＡの残存量が著しく低減することがわかる。
【０１０７】
試験例１及び２の結果から、本発明の判定方法において、被験者の細胞から抽出されたＤＮＡを、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とで処理して第二試料を得ることで、細胞中の組み込み型ＨＰＶの有無を、より高い精度で、迅速かつ簡便に判定することができることが示唆された。
【０１０８】
（実験例７）
製造例１と同様の操作を行なうことにより得られたＫＡＴＯＩＩＩ細胞のゲノムＤＮＡの水溶液（３μｇ相当量）を、表１に示される条件で、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、コード番号：ＡＤＤ−１０１）、エキソヌクレアーゼ（ノバジェン社製、商品名：ＲｉｎｇＭａｓｔｅｒTM  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）、Ｔ７エキソヌクレアーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）又はラムダエキソヌクレアーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）で処理した。
【０１０９】
【表１】
0005306683.tif 000002
【０１１０】
得られた産物を、０．５質量％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図９に示す。図９は、実験例７において、各種エキソヌクレアーゼによる処理により得られた産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。図中、レーン１は、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼ、レーン２は、エキソヌクレアーゼ（ノバジェン社製、商品名：ＲｉｎｇＭａｓｔｅｒTM  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）、レーン３は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、レーン４は、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、レーン５は、ラムダエキソヌクレアーゼを示す。また、（Ａ）は０時間反応した場合の電気泳動パターンを示し、（Ｂ）は７時間反応した場合の電気泳動パターンを示す。
【０１１１】
図９に示される結果から、本発明においては、種々のエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素が、γＡＴＰ依存型デオキシリボヌクレアーゼと同様に使用することができることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ＨＰＶの構造の概略説明図である。
【０１１３】
【図２】ＨＰＶの構造の概略説明図である
【０１１４】
【図３】実施例１のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【０１１５】
【図４】実施例２のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【０１１６】
【図５】実施例３のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【０１１７】
【図６】実施例４のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。図中、黒丸は、第一試料を示し、白抜き四角は、第二試料を示す。
【０１１８】
【図７】試験例１のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。
【０１１９】
【図８】試験例２のリアルタイムＰＣＲによる測定結果を示すグラフである。
【０１２０】
【図９】実験例７において、各種エキソヌクレアーゼによる処理により得られた産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号：１は、プライマーの配列である。
配列番号：２は、プライマーの配列である。
配列番号：３は、プライマーの配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
配列番号：８は、プライマーの配列である。
配列番号：９は、プライマーの配列である。
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
配列番号：１４は、プライマーの配列である。
配列番号：１５は、プライマーの配列である。
配列番号：１６は、プライマーの配列である。
配列番号：１７は、プライマーの配列である。
配列番号：１８は、プライマーの配列である。
【図１】
0005306683.tif 000003
【図２】
0005306683.tif 000004
【図３】
0005306683.tif 000005
【図４】
0005306683.tif 000006
【図５】
0005306683.tif 000007
【図６】
0005306683.tif 000008
【図７】
0005306683.tif 000009
【図８】
0005306683.tif 000010
【図９】
0005306683.tif 000011
【配列表】
0005306683000001.app