(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中の該アミノ酸濃度が飽和溶解度に達した後であって、該培地中に該アミノ酸の結晶が析出する前に、平均粒子径が７〜５０μｍの該アミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上となるように該培地に添加した後、該培地中で該微生物を培養し、該培地中に添加した該アミノ酸の結晶を平均粒子径が３０μｍ以上の該アミノ酸の結晶に成長、蓄積させ、培養物中から菌体と該アミノ酸の結晶を、それらの粒子径または比重の差に基づいて分離することにより、該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
【請求項２】
アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、該培地中の該アミノ酸濃度が飽和溶解度に達した後であって、該培地中に該アミノ酸の結晶が析出する前に、該培地中の該アミノ酸の結晶の総表面積が０．０２ｍ２／ｌ以上となるように平均粒子径が７〜５０μｍの該アミノ酸の結晶を該培地に添加した後、該培地中で該微生物を培養し、該培地中に添加した該アミノ酸の結晶を平均粒子径が３０μｍ以上の該アミノ酸の結晶に成長、蓄積させ、培養物中から菌体と該アミノ酸の結晶を、それらの粒子径または比重の差に基づいて分離することにより、該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
【請求項３】
添加するアミノ酸の結晶が０．０６ｍ２／ｃｍ３以上の比表面積を有するアミノ酸の結晶である、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸がＬ−グルタミン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンまたはＬ−トリプトファンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  アミノ酸の製造法としては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、エシェリヒア属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、バチルス属およびシュードモナス属に属する微生物などを用いた発酵生産法がよく知られている（非特許文献１）。
上記した発酵生産法においては、その生産効率を高めるための様々な技術が開発されており、その１つとして培地の温度およびｐＨの調整、または界面活性剤を培養液に添加することにより培養液中にＬ−アミノ酸を晶析せしめ、もって培養液中のＬ−アミノ酸の濃度を一定量以下に維持させ、Ｌ−アミノ酸の高濃度蓄積による生産性の阻害を回避する方法が知られている（特許文献１）。【０００３】  また、比較的溶解度が低いＬ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）を培地中に晶析させる方法としては、Ｌ−Ｇｌｕが析出する条件にｐＨを調整した培地を用いる方法（特許文献２）、培養液中のＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）の濃度が飽和溶解度以上の条件下で該培養液中にＬ−Ｐｈｅのα晶を添加するか、または該培養液のｐＨを７．８〜８．３の範囲に変更することにより培養液中にＬ−Ｐｈｅのα晶を析出させる方法（特許文献３）も知られている。【０００４】  しかしながら、上記方法では培養液中には微細なアミノ酸の結晶も含まれるため、結晶と菌体の粒子径の差に基づき直接両者を分離する方法ではアミノ酸の収率が低く、よってアミノ酸の収率をあげるためには、培養液中に蓄積したアミノ酸の結晶を一旦溶解する、すなわち培養液への水等の添加、培養液の加熱等の操作を行った後、遠心式または濾過式分離機などを用いて菌体と培養液を分離した後、濃縮晶析しなければならない。【０００５】  アミノ酸の結晶と菌体を直接分離する方法としては、液体サイクロンを用いる方法（特許文献４）が知られているが、アミノ酸の結晶の回収率は８０％以下にすぎない。
以上のように、アミノ酸の発酵生産法において、アミノ酸を培地中に晶析させながら培養する方法は優れているが、さらなる効率の良い方法が求められている。
【非特許文献１】アミノ酸発酵、学会出版センター、１９８６年
【特許文献１】特開昭６２−２８８号公報
【特許文献２】特開２００２−２３８５９３号公報
【特許文献３】特許第３２３９９０５号公報
【特許文献４】特許第２９５８７８９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、簡便で生産効率が高いアミノ酸の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）平均粒子径が１〜１２０μｍのアミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上となるように培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
（２）培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が０．０２ｍ２／ｌとなるようにアミノ酸の結晶を培地に添加した後、該培地中で該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法。
（３）添加するアミノ酸の結晶が０．０６ｍ２／ｃｍ３以上の比表面積を有するアミノ酸の結晶である、上記（１）または（２）の方法。
（４）生成、蓄積させるアミノ酸の結晶の平均粒子径が１５μｍ以上である上記（１）〜（３）のいずれか１つの方法。
（５）培養物中からアミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させたアミノ酸の結晶を、それらの粒子径の差に基づいて分離することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１つの方法。
（６）培養物中からアミノ酸を採取する方法がアミノ酸を生産する微生物と蓄積させたアミノ酸の結晶を、それらの比重の差に基づいて分離することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１つの方法。
（７）アミノ酸がＬ−グルタミン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンまたはＬ−トリプトファンである上記（１）〜（６）のいずれか１つの方法。
【発明の効果】
【０００８】  本発明により、簡便で生産効率の高いアミノ酸の製造法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径、比表面積、および総表面積と培地に蓄積するアミノ酸の結晶の形状および回収率との関係を示す図である。なお、図中の写真は、縦方向の辺が１０００μｍである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】１．本発明の製造方法に用いられる微生物
本発明の製造方法に用いられる微生物は、アミノ酸を生産する能力を有する微生物であれば特に制限はなく、該微生物は自然から分離された微生物であってもよいし、また人為的にアミノ酸の生産性が改善された微生物であってもよい。
人為的にアミノ酸の生産性が改善された微生物とは、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることができる。【００１１】  上記（ａ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）およびＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）など、上記（ｂ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４３，１０５−１１１（１９７９）およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１０，７６１−７６３（１９７２）など、上記（ｃ）の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３９，３１８−３２３（１９９３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，３７１−３７７（１９８７）など、上記（ｄ）の具体的な方法は、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．，３８，１８１−１９０（１９７９）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４２，１７７３−１７７８（１９７８）など、上記（ｅ）の具体的な方法は、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１６７５−１６８４（１９７２）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４１，１０９−１１６（１９７７）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）およびＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，２０８９−２０９４（１９８７）などに記載されている。【００１２】  さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかまたは組み合わせた方法によるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．６，Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９６）ｓｅｃｔｉｏｎ  １４ａ，１４ｂやＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７９，１−３５（２００３）、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（１９８６）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開２００３−１６４２９７、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１５３−１６０（１９７５）、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３９，１１４９−１１５３（１９７５）、特開昭５８−１３５９９、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４，２７２−２８３（１９５８）、特開昭６３−９４９８５、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７，２０１３−２０２３（１９７３）、ＷＯ９７／１５６７３、特開昭５６−１８５９６、特開昭５６−１４４０９２および特表２００３−５１１０８６など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。【００１３】  上記したアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法が適用することができる微生物または上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａ���ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属またはストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテイルム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィカシス、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム、ラクトファーメンタム、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラーまたはストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスをあげることができ、より具体的にはＬ−グルタミンを生産する能力を有するＦＥＲＭ  Ｐ−４８０６、ＡＴＣＣ１４７５１およびＡＴＣＣ１４７５２など、Ｌ−バリンを生産する能力を有するＡＴＣＣ１３００５およびＡＴＣＣ１９５６１など、Ｌ−ロイシンを生産する能力を有するＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０４およびＡＴＣＣ２１３０２など、Ｌ−イソロイシンを生産する能力を有するＦＥＲＭ  ＢＰ−３７５７およびＡＴＣＣ１４３１０など、Ｌ−フェニルアラニンを生産する能力を有するＡＴＣＣ１３２８１およびＡＴＣＣ２１６６９など、Ｌ−チロシンを生産する能力を有するＡＴＣＣ２１６５２など、およびＬ−トリプトファンを生産する能力を有す���ＤＳＭ１０１１８、ＤＳＭ１０１２１、ＤＳＭ１０１２３およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１７７７などをあげることができる。【００１４】  なお、上記のＦＥＲＭ番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ＡＴＣＣ番号で表される菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）、ＤＳＭ番号で表される菌株はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。
２．本発明のアミノ酸の製造方法
本発明のアミノ酸の製造方法としては、（１）平均粒子径が１〜１２０μｍのアミノ酸の結晶を該アミノ酸の結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上となるように培地に添加した後、該培地中で上記１の該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法、および（２）培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が０．０２ｍ２／ｌ以上となるようにアミノ酸の結晶を培地に添加した後、該培地中で上記１の該アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培養し、該培地中に該アミノ酸の結晶を生成、蓄積させ、培養物中から該アミノ酸の結晶を採取することを特徴とするアミノ酸の製造方法をあげることができる。【００１５】  上記培地中で該微生物を培養する方法は、アミノ酸の結晶を添加する以外、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
すなわち、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地、好ましくは液体培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも用いることができる。【００１６】  炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００１７】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
上記（１）の製造方法で添加するアミノ酸の結晶は、平均粒子径が１〜１２０μｍであり、結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上の培地をあたえるアミノ酸の結晶であれば、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径、量、アミノ酸の種類および結晶形の種類などに制限はないが、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径としては、１〜１２０μｍ、好ましくは２〜１１０μｍ、より好ましくは５〜７０μｍ、さらに好ましくは７〜５０μｍ、特に好ましくは１０〜３５μｍ、最も好ましくは１１〜１３μｍをあげることができる。【００１８】  アミノ酸の結晶の量としては、添加後の培地中のアミノ酸の結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上、好ましくは２〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３〜２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは４〜２２ｇ／ｌ、特に好ましくは５〜２０ｇ／ｌ、最も好ましくは５．５〜１６．５ｇ／ｌになる量をあげることができる。
また、上記した添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径と添加量の組み合わせとしては、平均粒子径が１〜１２０μｍであり、結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上の培地をあたえる組み合わせであれば特に制限はないが、平均粒子径が１〜１２０μｍで結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上、好ましくは平均粒子径が２〜１１０μｍで結晶濃度が２〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは平均粒子径が５〜７０μｍで結晶濃度が３〜２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは平均粒子径が７〜５０μｍで結晶濃度が４〜２２ｇ／ｌ、特に好ましくは平均粒子径が１０〜３５μｍで結晶濃度が５〜２０ｇ／ｌ、最も好ましくは平均粒子径が１１〜１３μｍで結晶濃度が５．５〜１６．５ｇ／ｌの培地をあたえる組み合わせをあげることができる。【００１９】  アミノ酸の結晶を培地に添加する時期は、アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養する前、またはアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養した後の培養期間中のいずれの時期でもよいが、好ましくはアミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地に培養した後で、培地中のアミノ酸濃度が飽和溶解度に達する前後から培地中にアミノ酸の結晶が析出する前、より好ましくは培地中のアミノ酸濃度が飽和溶解度に達した後であって、培地中にアミノ酸の結晶が析出する前、さらに好ましくは培地中のアミノ酸濃度が過飽和にあるときであって、培地中にアミノ酸の結晶が析出する前をあげることができる。ただし、上記において培地中にアミノ酸の結晶が析出する前とは、好ましくは培地中に全くアミノ酸の結晶が観察されない時期のことであるが、結晶回収率の面などにおいて、本発明の効果が達成できる範囲にあれば、微量のアミノ酸の結晶の析出がみられてもよい。【００２０】  培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合のアミノ酸の結晶の量としては、添加時の培地量に対する量として０．５ｇ／ｌ以上、好ましくは２〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは３〜２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは４〜２２ｇ／ｌ、特に好ましくは５〜２０ｇ／ｌ、最も好ましくは５．５〜１６．５ｇ／ｌをあげることができる。【００２１】  培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合は、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径と量の組み合わせとしては、平均粒子径が１〜１２０μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として０．５ｇ／ｌ以上、好ましくは平均粒子径が２〜１１０μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として２〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは平均粒子径が５〜７０μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として３〜２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは平均粒子径が７〜５０μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として４〜２２ｇ／ｌ、特に好ましくは平均粒子径が１０〜３５μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として５〜２０ｇ／ｌ、最も好ましくは平均粒子径が１１〜１３μｍの結晶を添加時の培地量に対する量として５．５〜１６．５ｇ／ｌ添加する組み合わせをあげることができる。【００２２】  また、上記（２）の製造方法で添加するアミノ酸の結晶は、培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が０．０２ｍ２／ｌ以上となるようなアミノ酸の結晶であれば、添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径、量、アミノ酸の��類および結晶形の種類などに制限はないが、添加するアミノ酸の結晶としては、添加後の培地中のアミノ酸の結晶の総表面積が、０．０２ｍ２／ｌ以上、好ましくは０．０８〜７０ｍ２／ｌ、より好ましくは０．２〜２３ｍ２／ｌ、さらに好ましくは０．４〜１５ｍ２／ｌ、特に好ましくは０．７〜９．３ｍ２／ｌ、最も好ましくは２．０〜７．０ｍ２／ｌとなるようなアミノ酸の結晶をあげることができる。【００２３】  上記（２）の製造方法で添加する具体的なアミノ酸の結晶としては、平均粒子径が１〜１２０μｍで結晶濃度が０．５ｇ／ｌ以上、好ましくは平均粒子径が２〜１１０μｍで結晶濃度が２〜３０ｇ／ｌ、より好ましくは平均粒子径が５〜７０μｍで結晶濃度が３〜２５ｇ／ｌ、さらに好ましくは平均粒子径が７〜５０μｍで結晶濃度が４〜２２ｇ／ｌ、特に好ましくは平均粒子径が１０〜３５μｍで結晶濃度が５〜２０ｇ／ｌ、最も好ましくは平均粒子径が１１〜１３μｍで結晶濃度が５．５〜１６．５ｇ／ｌの培地を与えるアミノ酸の結晶をあげることができる。【００２４】  アミノ酸の結晶を培地に添加する時期は、上記（１）の製造法と同様である。
培地中のアミノ酸の濃度が過飽和にあるときにアミノ酸の結晶を添加する場合のアミノ酸の結晶としては、添加時の培地量から計算したときの総表面積が０．０２ｍ２／ｌ以上、好ましくは０．０８〜７０ｍ２／ｌ、より好ましくは０．２〜２３ｍ２／ｌ、さらに好ましくは０．４〜１５ｍ２／ｌ、特に好ましくは０．７〜９．３ｍ２／ｌ、最も好ましくは２．０〜７．０ｍ２／ｌであるアミノ酸の結晶をあげることができる。【００２５】  具体的な該アミノ酸の結晶としては、平均粒子径が１〜１２０μｍで添加時の培地量に対する量として０．５ｇ／ｌ以上の結晶、好ましくは平均粒子径が２〜１１０μｍで添加時の培地量に対する量として２〜３０ｇ／ｌの結晶、より好ましくは平均粒子径が５〜７０μｍで添加時の培地量に対する量として３〜２５ｇ／ｌの結晶、さらに好ましくは平均粒子径が７〜５０μｍで添加時の培地量に対する量として４〜２２ｇ／ｌの結晶、特に好ましくは平均粒子径が１０〜３５μｍで添加時の培地量に対する量として５〜２０ｇ／ｌの結晶、最も好ましくは平均粒子径が１１〜１３μｍで添加時の培地量に対する量として５．５〜１６．５ｇ／ｌの結晶をあげることができる。【００２６】  上記において、培養物中の培地量を測定する方法としては、公知のいかなる方法であってもよいが、例えば培養物を遠心分離することにより、培地と菌体等の不溶物を分離し、沈降した不溶物の体積を測定し、培養物量から差し引く方法などをあげることができる。
さらに、上記（１）および（２）の製造方法において、添加するアミノ酸の結晶は、平均比表面積が０．０６ｍ２／ｃｍ３以上のアミノ酸の結晶、好ましくは０．０７〜７．２ｍ２／ｃｍ３、より好ましくは０．０７〜１．４３ｍ２／ｃｍ３、さらに好ましくは０．１〜１．０ｍ２／ｃｍ３、特に好ましくは０．１４〜０．７２ｍ２／ｃｍ３のアミノ酸の結晶をあげることができる。【００２７】  上記（１）および（２）の製造方法で添加するアミノ酸としては、微生物が生産することができるアミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよいが、好ましくはＬ−グルタミン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−トリプトファンから選ばれるアミノ酸、より好ましくはＬ−グルタミン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンから選ばれるアミノ酸、さらに好ましくはＬ−グルタミンをあげることができる。ただし、Ｌ−フェニルアラニンのα晶は本発明の製造方法で添加するアミノ酸の結晶から除かれてもよい。【００２８】  本発明で用いられる培地添加用のアミノ酸の結晶は、市販品または公知の方法、例えば発酵生産法および精製法で得られるアミノ酸の結晶などをそのまま、あるいは市販のアミノ酸の結晶または上記した公知の方法で得られるアミノ酸の結晶を、市販の粉砕機、例えばＭ４型自由粉砕機（奈良機械製作所社製）、アトマイザーＴＡＰ−２０型（東京アトマイザー製造社製）、Ａｉｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｙｉｎｇ  Ｍｉｌｌ（ＨＯＳＯＫＡＷＡ  ＭＩＣＲＯＮ  ＰＯＷＤＥＲ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）などを用いて目的とする平均粒子径を有するアミノ酸の結晶を調製することによっても取得することができる。【００２９】  例えば、公知の発酵生産法および精製法で得られる平均粒子径が約１１０μｍのアミノ酸の結晶を、Ｍ４型自由粉砕機を用いて、スクリーンΦ１．０ｍｍ，回転数４５００ｒｐｍ、処理速度約４００ｋＧ／ｈの条件で粉砕することにより、平均粒子径が約４５μｍのアミノ酸の結晶を取得することができ、該アミノ酸の結晶をさらに、スクリーンΦ０．３ｍｍ，回転数６０００ｒｐｍ、処理速度約２００ｋＧ／ｈの条件で粉砕することにより、平均粒子径が約１１μｍのアミノ酸の結晶を取得することができる。【００３０】  アミノ酸の結晶の比表面積は、市販の測定機、例えばセイシン企業株式会社製ＳＫＬＡＳＥＲ  ＭＩＣＲＯＮ  ＳＩＺＥＲ  ＬＭＳ−２４（レーザー回折・散乱式粒度分布測定装置）を用いて測定できるが、アミノ酸の結晶の比表面積の測定に際しては、該結晶は球状、かつ相似系と仮定し計算することが好ましい。
アミノ酸の結晶の総表面積は、アミノ酸の結晶の比表面積と添加する量とから計算することができる。【００３１】  培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００３２】  プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００３３】  上記方法で培地中に蓄積されるアミノ酸としては、微生物が生産することができるアミノ酸であればいずれのアミノ酸でもよく、好ましくは、Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−トリプトファンから選ばれるアミノ酸、より好ましくはＬ−グルタミン、Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンから選ばれるアミノ酸、さらに好ましくはＬ−グルタミンをあげることができる。【００３４】  また、上記方法で培地中に蓄積されるアミノ酸の結晶としては、平均粒子径が１５μｍ以上、好ましくは２０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上、さらに好ましくは４０μｍ以上、特に好ましくは５０μｍ以上、最も好ましくは６０μｍ以上の結晶をあげることができる。
本発明の製造方法において、培養物中のアミノ酸の結晶を採取する方法としては、通常のアミノ酸の精製方法であればいずれの方法でもよく、好ましくは培養終了後の培養物中の菌体とアミノ酸の結晶を直接、それらの粒子径、並びに比重の差を利用してアミノ酸の結晶を分離、精製する方法をあげることができる。【００３５】  上記した粒子径、並びに比重の差を利用してアミノ酸の結晶を分離、精製する方法としては、従来公知の方法である重力分級分離法、遠心力分級分離法をあげることができ、より好ましくは遠心力分級分離方法、この遠心力分級分離方法の中でも、さらに好ましくはデカンタ型遠心分離方法をあげることができる。
上記採取方法により、十分に精製されたアミノ酸の結晶を高い回収率で得ることができるが、必要に応じて、さらに活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により精製することができる。【００３６】  以下、実施例を記載するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】Ｌ−グルタミンの結晶の製造（１）
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２を、生産培地［２５０ｇ／Ｌグルコース、３０ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４、２ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、１０μｇ／Ｌ  ビオチン、１ｍｇ／Ｌ  サイアミン塩酸塩、ｐＨ６．８］が入っている５００Ｌ容ジャーファーメンター中で、適宜ｐＨ、培養温度を調整しながら培養した。培養開始後、培地中のＬ−グルタミンの濃度がその飽和溶解度に達した後であり、培地中にＬ−グルタミンの結晶が析出する前に、平均粒子径４０μｍのＬ−グルタミンの結晶を、培地中に結晶濃度が１６．５ｇ／ｌとなるように添加した。その後、培養を継続し、培地中でＬ−グルタミンの結晶を成長させつつ培養を継続した。培養開始から約９６時間で培養を終了することで、９０ｇ／ｌのＬ−グルタミンを含有する培養物を２１０Ｌ取得した。巴工業（株）製デカンタ（ＰＴＭ００６型）を用いて、該培養物から６．２ｋｇのＬ−グルタミン結晶を分離、取得した。この結晶の平均粒子径は６２μｍであった。この際、培地中に析出した結晶のデカンタによる回収率は９８．９％であった。
【実施例２】
【００３８】Ｌ−グルタミンの結晶の製造（２）
培養中に添加する結晶として、平均粒子径が図１に示す粒子径であるＬ−グルタミンの結晶を用いる以外は、実施例１と同様の方法で培養し、Ｌ−グルタミンの結晶を取得した。また、Ｌ−グルタミンの結晶の比表面積は、セイシン企業株式会社製ＳＫ  ＬＡＳＥＲ  ＭＩＣＲＯＮ  ＳＩＺＥＲ  ＬＭＳ−２４（レーザー回折・散乱式粒度分布測定装置）を用いて測定した。ただし、Ｌ−グルタミンの結晶の比表面積の測定に際しては、該結晶は球状、且つ相似系と仮定し計算した。【００３９】  添加したＬ−グルタミンの結晶および発酵生産で得られたＬ−グルタミンの結晶の形状、Ｌ−グルタミンの結晶の回収率、乾燥物含量などを図１に示す。
図１にあるとおり、培地中に結晶を添加しない場合は、培地中に微細な結晶が析出するため、遠心分離による結晶回収率が低下し、また添加するアミノ酸の粒子径は小さい方が結晶回収率が上昇する傾向にあることがわかった。また、結晶を添加した場合は、培養終了時に得られる培地中のアミノ酸の結晶の平均粒子径はいずれも３０μｍ以上であった。さらに、デカンタで分離した結晶をバスケット型遠心分離機で脱液し、乾燥して得られた結晶の含量（乾物含量）は、総表面積の大きな結晶を添加することにより向上することもわかった。【００４０】  以上より、本発明の製造法により、Ｌ−グルタミンだけでなく、種々のアミノ酸の発酵生産において、アミノ酸の結晶を培地に添加することにより培地中のアミノ酸の過飽和度を一定以下にし、かつ種晶として適度な数のアミノ酸の結晶を培地に存在させること、すなわち培地に添加するアミノ酸の結晶の平均粒子径および量、または該結晶の総表面積を調整することにより、培養中に培地中に析出するアミノ酸の結晶の粒子径をコントロールすることができ、その結果、菌体との分離が容易であり、かつ回収率も高いアミノ酸の結晶が得られることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】  本発明により、簡便に効率よくアミノ酸を製造法することができる。
【図１】
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