(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性液体（Ｉ）に含まれる正荷電物質が陽イオン交換体（１）と結合する条件下で上記水性液体を陽イオン交換体（１）と接触させ、適宜上記物質の脱着を行うことによって、上記水性液体から上記正荷電物質を除去する方法であって、上記物質がポリペプチド構造であり、上記陽イオン交換体が、
（ｉ）０．３Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度の水性対照液（ＩＩ）中で陽イオン交換体に上記物質が結合するとともに、
（ｉｉ）上記物質に対する漏出点容量が、スルホプロピル基−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＳＯ2Ｏ-を含む対照陽イオン交換体（２）での上記物質の漏出点容量の ＞２００％となる
能力をもつように選択されており、かつ
上記陽イオン交換体が、支持マトリックスに強固に結合した複数の陽イオン交換リガンドを含んでいて、該陽イオン交換リガンドが分岐していてバイモーダル機能を有しており、
・第一の分岐（Ｉ）が、スルホネート（−ＳＯ3−／−ＳＯ3Ｈ）、スルフェート（−ＯＳＯ3-／−ＯＳＯ3Ｈ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-／−ＣＯＯＨ）、ホスフェート（−ＯＰＯ32-／−ＯＰＯ3Ｈ-／−ＯＰＯ3Ｈ2）及びホスホネート（−ＰＯ32-／−ＰＯ3Ｈ-／−ＰＯ3Ｈ2）から選択される陽イオン交換基を含んでおり、
・第二の分岐（ＩＩ）が、第一の分岐の陽イオン交換基から１〜７原子の距離に位置する１以上の水素結合原子を含む官能基を含んでいて、該水素結合原子が、ヘテロ原子、ｓｐ−及びｓｐ2−混成炭素、並びにハロゲンから選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記水性液体（Ｉ）が、０．１Ｍ  ＮａＣｌの溶液で与えられるイオン強度以上のイオン強度を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２記載の方法であって、前記陽イオン交換体を、以下の条件（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかを満足する水性液体（ＩＩＩ）と接触させることによって、前記物質を陽イオン交換体（１）から脱着させることを特徴とする方法。
（ａ）結合時の液体（Ｉ）よりも増大したイオン強度を有する水性液体、及び／又は
（ｂ）前記物質の正電荷を減少させる及び／又は前記陽イオン交換体の負電荷を減少させる変更ｐＨを有する水性液体。
【請求項４】
前記水素結合原子が、酸素、窒素及び硫黄、ｓｐ−及びｓｐ2−混成炭素、並びにフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードから選択される請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記脱着が、ステップ（ｉ）に関して、（ａ）前記物質の正電荷を減少させる、又は（ｂ）負荷電基の数を減少させる、又は（ｃ）陽イオン交換体の負電荷を減少させる、ｐＨで実施することを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
脱着ステップの際の水性溶液のイオン強度を結合ステップよりも低下させて前記物質の脱塩及び濃縮を行うことを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記水性液体（Ｉ）が、希釈又は未希釈の発酵ブロスであることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチド構造を有する正荷電物質を含む水性溶液（Ｉ）と接触させることによって上記正荷電物質を水性溶液（Ｉ）から除去するための、支持マトリックスに強固に結合した複数の陽イオン交換リガンドを含む陽イオン交換体であって、該陽イオン交換リガンドが分岐していてバイモーダル機能を有しており、
・第一の分岐が、スルホネート（−ＳＯ3−／−ＳＯ3Ｈ）、スルフェート（−ＯＳＯ3-／−ＯＳＯ3Ｈ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-／−ＣＯＯＨ）、ホスフェート（−ＯＰＯ32-／−ＯＰＯ3Ｈ-／−ＯＰＯ3Ｈ2）及びホスホネート（−ＰＯ32-／−ＰＯ3Ｈ-／−ＰＯ3Ｈ2）から選択される陽イオン交換基を含んでおり、
・第二の分岐が、第一の分岐の陽イオン交換基から１〜７原子の距離に１以上の水素結合原子を含む基からなり、該水素結合原子が、ヘテロ原子、ｓｐ−及びｓｐ2−混成炭素、並びにハロゲンから選択される
ことを特徴とする陽イオン交換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】(技術分野および背景技術)
本発明は、異常に高いレベルのイオン強度において物質を吸着／結合する新種の陽イオン交換体に関する。これらの陽イオン交換体は、正荷電物質、例えば生物有機物質、を好ましくは水性である液体から除去する新方法を可能にする。
【０００２】  陽イオン交換体は、正味の負電荷を運ぶ、複数のリガンドを含む。これらの種類のリガンドは今後“陽イオン交換リガンド”と呼ぶことにする。これらには、支持マトリックス間の可能なスペーサーおよび結合すべき物質と相互作用するリガンドの一部が挙げられる。本発明の文脈で意図するような陽イオン交換リガンドは、存在し得るハロゲン基の分子量寄与を除いて、＜７００ダルトンのような、＜１０００の分子量を典型的に所有する。
【０００３】  リガンドは、典型的に水性液体媒体中に不溶であるか不溶化されている、適切な担体材に結合する。不溶性の担体材は今後マトリックスというが、不溶化した形態もしくは不溶化し得る担体材をまた含む。
【０００４】  この発明の文脈において、用語“二項性”とは、結合すべき物質と相互作用する、少なくとも二つの異なる、しかし共−操作性の、部位を提供する能力のあるリガンドをいう。これらの部位の一つは、リガンドおよび興味のある物質の間に吸引性タイプの電荷−電荷相互作用を与える。第二の部位は、水素結合および／もしくは疎水性相互作用を与える。他の種類の相互作用、例えばπ−π、電荷移動および誘起双極子相互作用、もまた存在してもよい。リガンドおよび興味のある物質との相互作用を引き起こす他の部位もまた存在してもよい。
【０００５】  本発明の文脈において用語“除去する／除去もしくは分離する／分離”は、いかなる目的のための物質の除去を包含し、かくして単離、精製、濃縮、分析等のための陽イオン交換体への吸着を含む。かくして、液体から不純物の除去／分離を含むであろう。この場合には、興味のある他の幾らかな物質に関してこの液体をさらに処理することができる。また、吸着した物質をさらに処理してもよい。後者の場合には、この物質は典型的には脱着されて収集される。必要ならば、この物質をさらなる精製ステップに付す。良好なプロセス経済性のためには、陽イオン交換体を再生し、かつ脱着後に再使用することが必要である。
【０００６】(初期技法での不利性)
陽イオン交換吸着は、発酵ブロス等の大規模処理において長年の間興味を持たれてきた。この種の液体は典型的に高いイオン強度を有し、それらが従来のイオン交換体に直接応用するのを不適切にする。一つの理由は、従来のイオン交換体は中庸のイオン強度、例えばＮａＣｌで０．１もしくはそれ以下、においてのみタンパク質および他の生体高分子を吸着することである。これは、大容量の処理になるプロセス液体の希釈およびプロセス設備での巨額の投資を意味する。
【０００７】(関連刊行物)
ＷＯ  ９９６５６０７(Amersham Pharmacia Biotech AB)は、直列の陽イオン交換リガンド−Ａ−Ｘ−Ｙ(−Ｚ)ｎがある陽イオン交換体を開示しているが、式中、ｎは＞１の整数であり、Ａはスペーサーであり、そしてＸは−Ｏ−、−ＳＲ'−もしくは−Ｎ(Ｒ')(Ｒ'')(Ｒ'およびＲ''はＨ、遊離電子対およびヘテロ原子に直接取り付けられる炭素を与える或る基である)であり、Ｙは、それらの幾らかは−Ｏ−もしくは−Ｓ−であるＸと結合しない免責条項を持つ、或るヒドロカルビル基であり、そして最後にＺは陽イオン交換基である。ＷＯ  ９９６５６０７に記載された発明は、リガンドの規定された基の中では、従来の陽イオン交換体とは対照的に、対照スルホプロピル陽イオン交換体に比べて２００％までの溶出イオン強度を必要とする陽イオン交換リガンドが在るという発見に基づいている。対照陽イオン交換体の２００％以上の溶出イオン強度を必要とする極端なリガンドが見出されるかもしれないと推測される。
【０００８】  ＷＯ  ９８０８６０３(Upfront Chromatography)は一般式Ｍ−ＳＰ１−Ｌの分離媒体を開示するが、そこではＭは親水性でであり得る支持マトリックスであり、ＳＰ１はスペーサーであり、そしてＬは、置換されてもよい単環式もしくは二環式のホモ芳香族もしくはヘテロ芳香族部分(ホモ芳香族部分は炭素原子のみで形成される芳香環を含む)を含む。一つの変形において、ＬはＸ−Ａ−ＳＵＢであるが、式中、Ｘは−Ｏ−、−Ｓ−もしくは−ＮＨ−であり、そしてＡは置換されているホモ芳香族もしくはヘテロ芳香族部分である。Ａ上の置換基は酸性の基であり得るが、それは−ＳＰ１−Ｘ−Ａ−ＳＵＢは直列の陽イオン交換リガンドであり得ることを意味する。この分離媒体は、タンパク質、特にイムノグロブリン、の陽イオン交換よりむしろ親水性相互作用による吸着(塩濃度は２Ｍまで)への使用に提案されている。
【０００９】  ＷＯ  ９６００７３５およびＷＯ  ９６０９１１６(Burton等)は、リガンドを含む樹脂の疎水性／親水性をｐＨの変化によって変化させる、イオン交換樹脂を開示する。疎水性はまた、疎水性の非−イオン化可能リガンドの導入により合成的に増加させ得る。吸着／脱着は、リガンドを含むマトリックスの疎水性／親水性を変更することにより、例えばｐＨを代えることにより制御される。
【００１０】  ＵＳ  ５，７８９，５７８(Burton等)は、３−メルカプトプロピオン酸のようなチオール含有リガンドを、支持マトリックスに取り付けた炭素−炭素二重結合上へのチオール基の付加により固定化することを提案する。この場合における発明者たちは、得られた材料の陽イオン交換吸着のための使用を用いることも提案することもしていない。
【００１１】  ＷＯ  ９７２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB)は、陰イオン交換リガンドが、一級、二級もしくは三級のアンモニウム基(正に荷電した、陽イオン性)の窒素原子から２〜３原子の距離において酸素および／もしくは窒素を含む、陰イオン交換体を開示している。
【００１２】  エピクロロヒドリンを用いるスルファニル酸の結合により作製した双極吸着剤が記載されている(リガンド＋スペーサー＝−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２Ｎ＋Ｈ２Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−)(Porat et al., J. Chromatog. 51 (1970) 479-489; and Ohkubo et al., J. Chromatog. A, 779 (1997), 113-122)。この文献は、リガンドが負に荷電しそして除去すべき物質は正に荷電する、方法を開示していない。
【００１３】  ２，４，６−トリハロ−１，３，５−トリアジンを利用して異なる化合物ＲＨＮＲ'Ｘを担体、とりわけセルロース、へ結合する。Ｒは水素、アリールもしくはアルキルであり、Ｒ'はアルキレンもしくはアリーレンであり、そしてＸはカルボキシ、スルホニル、ホスフェート、ホスホネート、ボロネート等である(Behrend et al., WPI Abstract Accession No. 86-312313 (= DD-A-237844)を参照)。このカップリング方法論は、加水分解に不安定である構造を与える。
【００１４】  ＥＰ  ３２６２３３は、陽イオン交換基を取り付けている疎水性の支持スマトリックスがある、陽イオン交換体を開示する。この疎水性はこのタイプの陽イオン交換体をタンパク質のような生体分子の分離に不適当にする。
【００１５】(発明の目的)
この発明の目的は、
ａ)タンパク質のような正荷電化合物の比較的高いイオン強度における陽イオン交換体への吸着／結合；
b)吸着／結合した化合物の高いイオン強度におけるおよび／もしくは広いイオン強度区間内での溶出／脱着；
ｃ)高い漏出点容量、タンパク質の良好な回収率(多くの場合、興味のあるタンパク質の添加量の９５％まで)等を有する陽イオン交換体；
ｄ)高いイオン強度の試料を陽イオン交換体上で処理しかつ簡略化脱塩手順を達成すべきときに広範な希釈の必要性を低下すること；
e)支持マトリックスに結合するとき、対照陽イオン交換体を持つ同一の物質に対して得られるのと少なくとも同一程度の大きさであるところの漏出点容量を持つ正荷電物質を吸着する、陽イオン交換体／陽イオン交換リガンドを発見する方法；等
を達成することである。
この比較はこの分野で従来のものと相対的である。
【００１６】  或る基(そのような陽イオン交換リガンドでない)に関して下記に示す式において、オープン結合およびＲ基がある。オープン結合とは炭素、典型的にはＳＰ３−混成もしくは芳香性炭素、への結合をいう。Ｒとは低級ヒドロカルビル(Ｃ１−１０)および／もしくは相当するアシルをいうが、両者ともしばしば水酸基のような親水性置換基を有する。水素(Ｈ)は、水素が今規定したような低級ヒドロカルビルもしくは相当するアシルで置換され得ることを意図する。
【００１７】(本発明)
我々は驚くべきことに、上述の目的(ｃ)で表される性質(これらの性質を適切にスクリーニングするとして)の一つもしくはそれ以上を有する陽イオン交換体を与える、数多くの陽イオン交換リガンドが在ることを今や発見している。(実験の部を参照)。
【００１８】  この発明の第一の態様は、正荷電物質、典型的には生体有機物質、を該物質を含む水性液体(Ｉ)から除去する方法である。この方法は：
(ｉ)該物質を陽イオン交換により該陽イオン交換リガンドへ結合させることに至る条件下に液体(Ｉ)を陽イオン交換体(１)と接触させ、そして
(ｉｉ)可能ならば該物質の引き続いた脱着を続ける、
ことを含む。
この方法は、使用する陽イオン交換体(１)は、(a)０．３Ｍ  ＮａＣｌに相当するイオン強度において水性対照液体(ＩＩ)中で陽イオン交換により該物質に結合しそして、
(ｂ)スルホプロピル基−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−を含む対照陽イオン交換体(２)についての物質の漏出点容量の＞２００％、例えば＞３００％もしくは＞５００％もしくは＞１０００％、で該物質の漏出点容量を容認する能力があることを特徴とする。
【００１９】  陽イオン交換体(１)および対照陽イオン交換体は本質的に同一程度の置換(全体のイオン交換容量として測定した)および本質的に同一の支持マトリックス(支持材料、ビーズサイズ、細孔サイズ、細孔容量、充てん手順等)を有する。操作条件は本質的に同一である[漏出点(例えばＱｂ＝１０％)、ｐＨのような液体中の条件、塩濃度および塩の種類、非−化合物Ａの成分等]。比較のためのｐＨは、そこで物質が正味の正荷電を有しそして陽イオン交換体(１)および(２)のそれぞれは正味の負荷電を有する、ｐＨにおいて選ばれる。スペーサーおよびカップリング化学は異なってもよい。或る種のカップリング化学は、さらに剛性のマトリックスをもたらす出発支持マトリックスの架橋に至り得る。この場合には、比較をするフローの条件は勿論、マトリックスが本質的に非−圧縮されているレベルにおいて選ばれる。
【００２０】  この発明の第五の態様に略述するように(下記参照)、適切な陽イオン交換リガンドを選択してもよい。
使用する陽イオン交換体(１)は複数の陽イオン交換リガンドを典型的に含むが、それらは、しばしば共有結合的にそして典型的には或る種のスペーサーを介して、支持マトリックスに強固に取り付けられる。用語“強固に取り付けられる”は、適用した吸着／脱着の間リガンドはいかなる有意な程度でも取り外れてはならないことを意味する。
【００２１】  この発明の第一の態様の第一部に従って、陽イオン交換リガンドは分岐されかつ上で規定したような二項性機能を有する。
かくして、第一の分岐(１)は、スルホネート(−ＳＯ３−／−ＳＯ３Ｈ)、スルフェート(−ＯＳＯ３−／−ＯＳＯ３Ｈ)、カルボキシレート(−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ)、ホスフェート(−ＯＰＯ３２−／−ＯＰＯ３Ｈ−／−ＯＰＯ３Ｈ２)およびホスホネート(−ＰＯ３２−／−ＰＯ３Ｈ−／−ＰＯ３Ｈ２)から選ばれる陽イオン交換基を含む。いわゆる弱陽イオン交換体、即ち３以上のｐＫａを有する陽イオン交換体、が好適である。典型的な例は、カルボキシレート(−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ)、ホスフェート(−ＯＰＯ３２−／−ＯＰＯ３Ｈ−／−ＯＰＯ３Ｈ２)およびホスホネート(−ＰＯ３２−／−ＰＯ３Ｈ−／−ＰＯ３Ｈ２)である。この好適性はこの発明の種々な他の態様にもまた適用される。
【００２２】  第二の分岐(２)は、分岐(1)の陽イオン交換基から１〜７原子の距離に位置する、少なくとも一つの水素結合原子を含む官能基を含む。水素結合原子は、酸素(カルボニル酸素、エーテル酸素、ヒドロキシ酸素、スルホン酸素、スルホンアミド酸素、スルホキシド酸素、芳香原中の酸素等)、窒素(アミド窒素、芳香環中の窒素等)および硫黄(チオエーテル硫黄、芳香環中の硫黄等) のようなヘテロ原子；ならびにsp−およびｓｐ２−混成炭素；ならびにフルオロ、クロロ、ブロモもしくはヨードのようなハロゲン基(フルオロが好適である)から選ばれる。典型的には、分岐(２)は非荷電原子もしくはｐＨ変化により荷電し得る原子を含む。分岐(１)は、陽イオン交換基に加えて、陽イオン交換基から１〜７原子の距離に位置する、一つもしくはそれ以上の水素結合原子をまた含んでもよい。
【００２３】  水素結合原子は、水素結合に関与する能力がある原子(水素を除いて)である。Karger et al.、分離科学入門、John Wiley & sones (1973) page 42 を参照。
sp−およびｓｐ２−混成炭素は疎水性相互作用ならびに水素結合に関与してもよい。
【００２４】  上述のタイプの分岐した陽イオン交換リガンドは以下のように例示し得る：(ａ)Ｘは、スルホネート(−ＳＯ３−／−ＳＯ３Ｈ)、スルフェート(−ＯＳＯ３−／−ＯＳＯ３Ｈ)、カルボキシレート(−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ)、ホスフェート(−ＯＰＯ３２−／−ＯＰＯ３Ｈ−／−ＯＰＯ３Ｈ２)およびホスホネート(−ＰＯ３２−／−ＰＯ３Ｈ−／−ＰＯ３Ｈ２)から選ばれる陽イオン交換基である；
(ｂ)Ａは、もしＡ基中に陽イオン交換基(Ｘ')が在れば、そのような陽イオン交換基(Ｘ')からの鎖は常にＡ'より短いかもしくは同一の長さを有するという条件で、Ｘから支持マトリックスへ伸びる有機鎖(Ａ')を含む有機基を表す；
(ｃ)ＨＢは、少なくとも一つの炭素原子プラス陽イオン交換基(Ｘ)から１〜７原子の距離に位置する、少なくとも一つの水素結合原子を含む基である。
【００２５】  かくして、Ａ'は、Ｘを支持マトリックスに連結する、陽イオン交換リガンドの鎖を含む。Ａは、可能ならば有機鎖Ａ'に個々の二価有機架橋により連鎖した、陽イオン交換基(Ｘ')をさらに含んでもよい。Ｘ'およびＸは異なっていても同等でもよい。この種の有機架橋は、上で議論したような水素結合原子を含んでも含まなくてもよい。同様に、上で議論したように陽イオン交換基から１〜７原子の距離に位置する、水素結合原子を提供する追加的分岐(ＨＢ')もまた在ってもよい。ＨＢおよびＨＢ'は異なっていても同等でもよい。
【００２６】  環構造に属するＡ'の部分が在る場合には、Ａ'について一つ以上の選択肢が在るであろう。規定により、置換環原子の最大数を含む環を通る経路はＡ'の部分と考えられる。残りの経路は、それらが、水素結合原子を含む基(例えばＨＢ基)のような置換基を運んでいるか、もしくは水素結合ヘテロ原子を含まない限り、分岐を規定しない。
【００２７】  ＨＢおよびＨＢ'基は陽イオン交換基Ｘから１〜７原子の距離に位置するが、好適な原子数は１，２，３および４である。
上で規定した水素結合原子は、次の二つの形態のどちらかでＡのＡ'部分中に存在してもよい：
(ａ)Ａ'鎖の部分として、もしくは
(ｂ)Ａ'中の原子に結合しかつ鎖から突き出ている原子として。
【００２８】  タイプ(ａ)の典型的な水素結合原子は、エーテルもしくはエステル酸素(−Ｏ−および−ＣＯ−Ｏ−)、チオエーテル硫黄(−Ｓ−)ならびにアミド窒素[カルボキサミド(−ＣＯ−ＮＨ−および−Ｎ(ＣＯＲ)−)およびスルホンアミド(−ＳＯ２ＮＨ−、−Ｎ(ＳＯ２Ｒ)−)中におけるような]のようなヘテロ原子、ならびにsp−およびｓｐ２−混成炭素、から選ばれる。オープン結合は炭素に結合する。Ｒは典型的に低級ヒドロカルビル、例えばＣ１−１０、である。
タイプ(ａ)の水素結合原子はまた、芳香環中でヘテロ原子(硫黄、窒素もしくは酸素)を含む。ヘテロ芳香環の例示的な例はチオフェン、フランおよびピリジンである。
【００２９】  タイプ(ｂ)の典型的な水素結合原子は以下から選ばれる：
(ｉ)以下の基中の酸素
(ｉ．１)炭素、硫黄および窒素はＡ'の部分である、−ＣＯ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−および−ＳＯ２ＮＨ−；
(ｉ．２)Ａ'の部分である炭素に直接取り付けられている、アルコール性もしくはフェノール性のヒドロキシル；そして
(ｉ．３)Ａ'の部分である炭素に取り付けられている、ニトロ(−ＮＯ２)ならびに≡は三つの一重結合を表しそして窒素はＡ'の部分である、アミンオキシド(≡Ｎ→Ｏ)；
(ｉｉ)Ａ'中の炭素に結合している、フルオロ、クロロ、ブロモもしくはヨードのようなハロゲン(フルオロが好適である)；そして
(ｉｉｉ)Ａ'中に存在する同種の炭素原子に直接取り付けられている、sp−およびｓｐ２−混成炭素。
ｓｐ２−混成炭素(上のｉｉｉ)は典型的に芳香環の部分である。カルボニル基(−ＣＯ−)はケト、エステルもしくはアミド基の部分でもよい。
【００３０】  Ｘに最も近い原子は、ｓｐ3−混成もしくはｓｐ２−混成炭素のような炭素原子である。典型的に、この位置におけるｓｐ3−混成炭素は、陽イオン交換基への結合に加えて、水素および／または一つもしくは二つの炭素を結合する。残りの結合は、例えばＨＢ基の部分として、ヘテロ原子もしくはもう一つの炭素に取り付けてもよい。この位置におけるｓｐ２−混成炭素は芳香環の一部もしくは炭素−炭素二重結合であってもよい。
【００３１】  ＸおよびＨＢの間のＡ'中に一つもしくはそれ以上の水素結合原子が在ってもよい。かくして、貴重な陽イオン交換リガンドは、Ａ'がＸおよびＨＢの間に上で規定したようなアミド基を提供する場合に見られる。この位置におけるアミド基は、エチレン基、エーテル基、チオエーテル基等またはアミド基に同等もしくはより高い加水分解安定性を有する、いずれかの他の基で置換されてもよい。
ＨＢならびに水素結合原子の適切な選択および位置に関しては、Ａ'に対する規則と類似する規則を適用する。
【００３２】  したがって、ＨＢは、Ｘから１〜７原子の距離に位置する芳香環の少なくとも一部分を含み得る。芳香環は、好ましくは、チオフェン中におけるような硫黄原子、もしくはピリジン中におけるような窒素もしくはフラン中におけるような酸素を含む、ホモ芳香族もしくはヘテロ芳香族であってもよい。
【００３３】  かくして、ＨＢはまた、Ｘから１〜７原子の距離において、エーテル酸素(−Ｏ−)、チオエーテル硫黄(−Ｓ−)、アミド(−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ(ＣＯＲ)−、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ−、−Ｎ(ＳＯ２Ｒ)−、−ＳＯ２ＮＨ２)、ヒドロキシ、ハロゲン、もしくは芳香環中のヘテロ原子(酸素、窒素もしくは硫黄)から選ばれた基の少なくとも一部分を提供する。ハロゲン基は好ましくは、トリフルオロメチル中におけるようなフッ素である。
【００３４】  この発明の第一の態様の第二の部分において、この方法で用いる陽イオン交換体は複数の陽イオン交換リガンドを有し、これらのそれぞれは一般式、Ｄ−Ｘ''、に適合するが：
式中、
(ａ)Ｘ''は、スルホネート(−ＳＯ３−／−ＳＯ３Ｈ)、スルフェート(−ＯＳＯ３−／−ＯＳＯ３Ｈ)、カルボキシレート(−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ)、ホスフェート(−ＯＰＯ３２−／−ＯＰＯ３Ｈ−／−ＯＰＯ３Ｈ２)およびホスホネート(−ＰＯ３２−／−ＰＯ３Ｈ−／−ＰＯ３Ｈ２)から選ばれる陽イオン交換基であり、そして
(ｂ)Ｄは、支持マトリックスにＸ''を連鎖させる有機鎖Ｄ'を含む基であるが、該有機鎖Ｄ'は、陽イオン交換基(Ｘ'')から１〜７原子(好ましくは１〜５原子)の距離に位置するチオエーテルを含み、そしてＤ'中の炭素は非−芳香族性である。
【００３５】  発明のこの部分において、Ｄは、この発明の第一の態様の第一の部分について規定されたような、Ｄ'中のチオエーテル硫黄の他に、ＨＢ基および／もしくは水素結合原子を含んでも含まなくてもよい。
分岐したおよび分岐していない陽イオン交換リガンドについて上で議論した水素結合原子は、陽イオン交換基(Ｘ、Ｘ'、Ｘ''等)から７、６、５、４、３、２および１原子の距離に位置してもよい。
【００３６】(スペーサー)
Ａ基(およびＡ'鎖)ならびにＤ基(およびＤ'鎖)は、存在すれば、スペーサーを含むであろう。上で議論してきた線で、スペーサーは支持マトリックから出発しそしてＸから７、６、５、４、３および２原子のような１〜８原子の距離で終結する(実験の部を参照)。
典型的には、スペーサーは直鎖の、分岐したもしくは環状の二価の炭化水素基を含む。炭素鎖は、プロセスサイクルの間に陽イオン交換体が受ける条件(加水分解条件は典型的に最も有害なものである)に耐えることができる、エーテル酸素もしくは、チオエーテルおよびアミドのような、或る他の基により一つもしくはそれ以上の位置において割り込みされてもよい。加水分解安定性についての要求は、多くの好ましいスペーサーにおいて、一つおよび同一の炭素原子に結合している酸素および硫黄から選ばれる、せいぜい一つの原子があることを意味する。
【００３７】  スペーサー中の炭素原子はまた、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アシルアミド等により一つもしくはそれ以上の位置において置換されてもよい。低級アルコキシおよび低級アシルアミドとは、主としてＣ１−６基を意図するが、もし親水性置換基を含むならば、より大きい基を思い浮かべてもよい。
【００３８】  スペーサーは、将来に開発されるべき技法もまた含めた、従来の共有カップリング方法論に従って導入され得る。例示的なカップリング化学は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなビス−エポキシド、ジクロロプロパノールのようなハロゲン−置換脂肪族化合物、ジビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、グルタリックジアルデヒドのようなアルデヒド、キノン、臭化シアン、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのような過ヨウ素酸塩、カルボジイミド、クロロトリアジン、塩化トシルおよび塩化トレシルのような塩化スルホニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、オキサゾロン、マレイミド、２−フルオロ−１−メチルピリジウムトルエン−４−スルホネート、ピリジルジスルヒドおよびヒドラジド、に関与する。
【００３９】(新規陽イオン交換体の安定性)
この発明の陽イオン交換体／陽イオン交換リガンドは陽イオン交換吸収を含むプロセスに典型的に適用される条件に耐えるに違いない。一般的な経験則として、これは、この発明に従う陽イオン交換体は、全体のイオン結合能力に本質的に減少無しでもって、少なくとも1０時間水中の０．１もしくは１ＭのＮａＯＨに耐えることができるに違いない。“全体のイオン結合能力に本質的に減少無し”は、全体のイオン結合能力はせいぜい１０％しか減少しないことを意図している。構造的用語では、これは、上で規定した陽イオン交換基に加えて陽イオン交換リガンドは単に、純正のヒドロカルビル(ホモ芳香族またはヘテロ芳香族構造を含む)、チオエーテルおよびエーテル基、ジスルフィド基、ヒドロキシ基、スルホキシドもしくはスルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、アセタールおよびケタール基ならびに同様な加水分解安定性を持つ基を含むべきであることを意味する。
【００４０】(支持マトリックス)
支持マトリックスは有機もしくは無機の材料をベースにしてもよい。親水性であることおよび水に不溶性で多少は膨潤性であるポリマーの形態にあることが望ましい。親水性になるように誘導体化されている疎水性のポリマーはこの規定に含まれる。適切なポリマーは、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルラン等のような多糖をベースにするポリヒドロキシポリマー、ならびにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルアルコールおよびスチレンとジビニルベンゼンをベースにするポリマー、ならびに上述のポリマーに相当する二つ以上の単量体が含まれるコポリマー、である。水溶性のポリマーは、例えば、架橋によりおよび吸着もしくは共有結合による不溶性体へのカップリングにより、不溶性になるように誘導体化されてもよい。ＯＨへ変換し得る基を示す単量体の重合により、もしくは、例えば、親水性ポリマーのような適切な化合物の吸着による最終ポリマーの親水性化によって、親水性基を疎水性ポリマー上に(例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー上に)導入することができる。
支持マトリックスに使用される適切な無機材料は、シリカ、酸化ジルコニウム、黒鉛、酸化タンタル等である。
【００４１】  好ましい支持マトリックスは、シラン、エステル、アミド基およびシリカにそのように存在する基のような、加水分解に不安定な基を欠如する。
支持マトリックスは多孔性でも非−多孔性でもよい。これは、マトリックスは完全にもしくは部分的に浸透性(多孔性)であるかもしくは除去すべき物質に対して完全に非浸透性(非−多孔性)であってもよいことを意味する。
【００４２】  本発明の特に興味のある実施態様において、マトリックスは、１〜１０００μｍ、高速の応用については好ましくは５〜５０μｍ、分離の目的には５０〜３００μｍ、の範囲のサイズを持つ不規則なもしくは球状の粒子の形態に在る。
【００４３】  支持マトリックスの興味のある形態は、液体より高いか低い密度を有する。これらの種類のマトリックスは、流動もしくは拡張床クロマトグラフィーのためのならびに、例えば攪拌槽における、異なるバッチ様手順のための大規模操作に特に応用可能である。流動もしくは拡張床手順はＷＯ  ９２１８２３７およびＷＯ  ９２／００７９９に記載されている。これらのマトリックスの最も実用的な使用は、流動液体の密度より高い密度を持つ粒子／ビーズを上流気流と合体させることである。拡張床様式におけるこの種類の支持マトリックスは、水性液体(Ｉ)が微粒子および／もしくは粘着性材料を含む場合に、この発明の陽イオン交換リガンドと結合するのに特に有益である。
【００４４】  用語“実用的に親水性の支持マトリックス”は、マトリックスの疎通性表面が水性液体により浸透されるという意味で親水性であることを意味する。典型的には、親水性ベースのマトリックスの疎通性表面は、例えば酸素おおび／もしくは窒素原子を含む、複数の極性基を露出する。このような極性基の例は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、エステルおよび低級アルキルのエーテル(式中ｎは２、３、４もしくはそれ以上である(−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−)ｎＨのような）である。
マトリックスの内部おおび／もしくは外部の表面上の親水性被膜は概念上支持マトリックスに属する。この被膜は、例えばＷＯ  ９８３３５７２(Amersham Pharmacia Biotech AB)に記載されているような、形状増量剤中にあってもよい。
【００４５】  全体的な出典明示により本明細書の一部とする、ＷＯ  ９８３９３６４(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびＷＯ  ９８３９０９４(Amersham Pharmacia Biotech AB)に記載されているように、支持マトリックスは、表面層もしくは内部層／内部部分に位置する、ここに規定した陽イオン交換リガンドを持つビーズ体であってもよい。したがって、そのようなビーズは、(ａ)ここに規定した陽イオン交換リガンドを欠如するかもしくは他の種類のリガンドを持つ、外部層、および(ｂ)新しいこの発明のリガンドを運ぶ内部部分／内部(もしくはその逆)を持ってもよい。
【００４６】  この発明の方法で使用される陽イオン交換体中の陽イオン交換リガンドのレベルは、０．００２〜０．５ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックス、好ましくは０．００５〜０．３ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスのような、０．００１〜４ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスの間隔で通常選ばれる。他の中で、可能性のあるかつ好ましい範囲はマトリックス、リガンド、除去されるべき物質等の種類により決定される。かくして、陽イオン交換リガンドのレベルは、アガロース−ベースのマトリックスについて０．０１〜０．３の範囲内に通常ある。デキストラン−ベースのマトリックスについては、間隔は典型的に０．０１〜０．６ｍｍｏｌ／ｍｌマトリックスである。
先行する節に示した範囲は、ナトリウムイオンに結合する完全荷電型のマトリックスのついての容量をいう。
【００４７】(吸着／脱着)
吸着おおび／もしくは脱着プロセスを、バッチ操作として、即ち、マトリックスを液体中に多少とも完全に分散した微粒子体をもって、実施してもよい。これに代えて、陽イオン交換マトリックスを一体式体でまたは充てんもしくは流動床の形態の粒子として用いそして液体Ｉもしくは脱着液(液体ＩＩＩ)をプラグ流れ条件下で通過させる、クロマトグラフ操作としてプロセスを操作してもよい。
【００４８】(吸着)
吸着の間に、正荷電物質を含む液体試料を、陽イオン交換(陽イオン交換条件)媒介リガンドにこの物質を結合させるような条件下で陽イオン交換体(上で規定した)と接触させる。この物質が、少なくとも部分的に、正に荷電し、そして少なくとも一部の陽イオン交換体が負に荷電するように(上を参照)、ｐＨを選択する。好ましい変形において、弱陽イオン交換体(例えば、Ｘ＝−ＣＯＯ−)を、ｐＫａ±２、例えば±１、ｐＨ単位に緩衝化した液体のｐＨで使用する。陽イオン交換体のｐＨ値は、この陽イオン交換体をＮａＯＨで滴定するときに変曲点として求められる。典型的に、イオン強度(塩濃度もしくは伝導度として測定する)は、陽イオン交換体、結合すべき物質、温度とｐＨ、溶媒組成等の特別な組合わせについての溶出イオン強度以下である。この発明の恩恵の一つは、上に規定した二項性の陰イオン交換体を用いることにより、従来の陽イオン交換体、例えば、上で議論した対照スルホプロピル陽イオン交換体、について通例行ってきたものと比較してより高いイオン強度においてもまた吸着／結合を操作することが可能であるだろうということである。陽イオン交換体を除去すべき物質とマッチングさせることにより、対照陽イオン交換体を用いるときより高い(同一のｐＨおよびさもなければ同一の条件で測定した)イオン強度において、吸着を実施し得る。陽イオン交換体の漏出点容量次第で、対照陽イオン交換体で得られる陽イオン交換体の漏出点容量の＞２００％、例えば、＞３００％もしくは＞５００％および＞１０００％さえ、を達成し得る。
【００４９】  結合の間に使用すべき正確なイオン強度は用いるリガンド、マトリックス上のその密度、結合すべき物質およびその濃度等に依存するであろう。有用なイオン強度はＮａＣｌ濃度(純水) ＞０．１Ｍ、例えば、＞０．３Ｍもしくは＞０．５Ｍさえ、にしばしば相当する。
【００５０】(脱着)
この分野で確立した手順にしたがって脱着を行ってもよい。好ましくは、この脱着プロセスは以下の条件の少なくとも一つを含む：
(Ａ)脱着に必要とされる最少溶出イオン強度より上に塩濃度(イオン強度)を増加すること、
(Ｂ)リガンドの負電荷を下げるためにｐＨを減少すること、
(Ｃ)物質上の正電荷を減少させるためにｐＨを増加すること、および
(Ｄ)使用する水性液体の極性を減少する、リガンド類似体もしくは試剤(例えば溶媒添加物)を含むこと。
これらの変更は物質を含む水性液体(上の水性液体Ｉ)に相対的である。
【００５１】  脱着は陽イオン交換条件下に行ってもよいが、これは以下のことを意味する：
(ａ)脱着に用いる液体(ＩＩＩ)は、脱着すべき物質の少なくとも一部分は正に荷電するような条件(例えばｐＨ)を提供すること、および
(ｂ)イオン強度を、これらの条件について最少の溶出イオン強度の上の値にセットすること。
両性の化合物については、オプション(ａ)はｐＨ＞ｐＩ、例えばｐＨ＞ｐＩ＋０．５を意味する。
【００５２】  脱着をまた、脱着すべき物質がゼロ以下の正味の電荷を有しそして／もしくは本質的に全ての陽イオン交換リガンドが脱電荷される、条件(例えばｐＨ)の間に行ってもよい。
大抵の場合には、ＷＯ  ９６００７３５およびＷＯ  ９６０９１１９(Burton等)に記載されているように、陽イオン交換リガンドが完全に脱電荷されるか、もしくは興味のある物質が正味の負電荷を有するようにｐＨを変更することは不可能でありそして必要ではない。
【００５３】  (Ａ)〜(Ｄ)により与えられた条件を組合せてもしくは単独で使用してもよい。最も簡単な場合には、これは、
(ａ)イオン強度の増加おおび／もしくは
(ｂ)吸着液体(Ｉ)から脱着液体(ＩＩＩ)へ変更するときに、脱着すべき化合物の正電荷を減少するためにｐＨの減少
を意味する。選択肢(ａ)には、脱着ステップの間の減少した、一定のもしくは増加したｐＨが挙げられる。選択肢(ｂ)には、減少した、増加したもしくは一定のイオン強度が挙げられる。
【００５４】  クロマトグラフのおおび／もしくはバッチの手順において、脱着すべき物質を持つマトリックスは、カラムもしくは他の適切な容器の中で吸着液体(水性液体Ｉ)と接触して存在する。それから、この液体により与えられた条件を、望ましい物質がマトリックスより放出されかつ溶出されるまで、上述のように変更する。陽イオン交換条件下に行われた脱着プロセスについては、イオン強度は典型的には、吸着に比較して増加され、そしてしばしば少なくとも0.6Ｍ  ＮａＣｌに相当する。実際の値は上で議論した種々の要素に依存する。
【００５５】  脱着のために増加したイオン強度を使用する要件は、水性液体ＩＩＩにより与えられた他の条件次第であまり厳格でなくともよい(下記参照)。
上で議論した条件の変更を、一つもしくはそれ以上のステップで(段階的勾配)もしくは連続的に(連続的勾配)達成することができる。マトリックスと接触する液体の種々の変数を一つずつもしくは組合せて変更してもよい。
【００５６】  イオン強度を変更するために用いられる典型的な塩類は、ホスフェート、スルフェート等の可溶性アンモニウムもしくは金属塩、特にアルカリ金属おおび／もしくはアルカリ土類金属塩、の中から選ばれる。同一の塩をまた吸着ステップに用いることができるが、それならしばしばより低い濃度においてである。
【００５７】  この発明の方法で用いられる典型的な緩衝成分は、塩基部分が陰イオン性である酸／塩基対の中から好ましくは選ばれる。例示的な例は、カルボン酸／カルボン酸塩(例えば酢酸／酢酸塩)、ホスフェート等である。脱着ステップもしくはそれ以前におけるｐＨの増加は脱着すべき物質の正電荷を減少し、脱着を助け、そしてかくしてまた、マトリックスから物質の放出に必要なイオン強度を減少させるであろう。用いるリガンドのｐＫａおよび物質のｐＩ次第で、ＰＨの減少は陽イオン交換マトリックスから／への物質の放出もしくは結合に至るであろう。
【００５８】  脱着はまた、脱着液体(ＩＩＩ)の極性を調節する(吸着液体(Ｉ)に比較して)ことにより助成され得る。これは、脱着液体(ＩＩＩ)中に水−混和性のおおび／もしくは親水性の少ない有機溶媒を含むことにより達成され得る。そのような溶媒の例は、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルフォルムアミド、アクリロニトリル等である。脱着液体(ＩＩＩ)の極性の減少は(水性液体Ｉに比較して)、多分脱着を助け、そしてかくしてまた、マトリックスから化合物の放出に必要なイオン強度を減少させるであろう。
脱着はまた、脱着液体(ＩＩＩ)中に陽イオン交換リガンドの可溶性構造類似体(リガンド類似体)を含むことにより助成され得る。そのような類似体の必要な濃度は吸着液体(Ｉ)のその濃度より少なくとも大きい。
【００５９】(回収率)
従属態様において、本発明方法は、吸着物質の高回収率、例えば、８０％以上もしくは９０％以上のような、６０％以上の回収率を可能にする。回収率は、吸着／結合ステップにおいて陽イオン交換体に加えた物質の量に比較して脱着された物質の量である。多くの場合には、回収率は９５％さえを越すかもしくは本質的に定量的であることができる。これは、陽イオン交換体に加えるべき物質の量を物質にたいする陽イオン交換体の全結合容量以下に調整することにより達成される。典型的には、陽イオン交換体に加える物質の量は、全容量の１０〜８０％、例えば２０〜６０％、の間隔にある。脱着は、この分野で確立された手順にしたがって、例えば上で略述したように、行われる。多くの場合には、イオン強度の増加より他の手段により、例えば、物質の正電荷を減少させるかもしくは陽イオン交換リガンドの負電荷を減少させるためのｐＨの変更により、脱着を助ける必要がある。
【００６０】(発明の第二の態様)
この態様は、支持マトリックスに取り付けられる複数の陽イオン交換リガンドを含む陽イオン交換体(１)を含む。このリガンドは、スルホネート(−ＳＯ３−／−ＳＯ３Ｈ)、スルフェート(−ＯＳＯ３−／−ＯＳＯ３Ｈ)、カルボキシレート(−ＣＯＯ−／−ＣＯＯＨ)、ホスフェート(−ＯＰＯ３２−／−ＯＰＯ３Ｈ−／−ＯＰＯ３Ｈ２)およびホスホネート(−ＰＯ３２−／−ＰＯ３Ｈ−／−ＰＯ３Ｈ２)の中から選ばれた陽イオン交換基を含む。特色は、陽イオン交換体(１)が少なくとも一つの対照タンパク質の人血清アルブミン、リゾチームおよびＩｇＧに対する漏出点容量を有することであるが、これは、スルホプロピル陽イオン交換体(陽イオン交換体２)について得られる相当する漏出点容量の＞２００％、例えば＞３００％もしくは＞５００％もしくは＞１０００％、である。同一の支持マトリックス、置換度、対イオン等は、上で議論したのと同一の意味で本質的に同一である。陽イオン交換体(１)および陽イオン交換体(２)の漏出点容量を決定する操作条件は、この本文のどこかで議論したのと本質的に同一である。
この態様において除外するのは、陽イオン交換基のそれぞれがただ一つの位置においてチオエーテル硫黄により割り込みされている非−置換直鎖の炭素原子を介して支持マトリックスに結合する、陽イオン交換体である。
【００６１】(発明の第三の態様)
この態様は、それぞれが二項性である、複数の分岐した陽イオン交換リガンドを含むことを特徴とする新規の陰イオン交換体に関する。かくして、このタイプのそれぞれの個別なリガンドは、上で議論したような二種類の分岐を(一つの分岐は陽イオン交換基を含みそしてもう一つの分岐は陽イオン交換基から１〜７原子もしくはそれより短く離れて水素結合原子を含む)を含む。
【００６２】  この態様の陽イオン交換体は、上で議論した異常に高い漏出点容量を有しない陽イオン交換体をまた含むであろう。そのような“低”容量の陽イオン交換リガンドは多分、それらの二項性が、新しい選択性おおび／もしくは液体から除去するのが望ましいであろう種々の標的物質に相対的な選択性を多分課すであろうという事実のために貴重であろう。
【００６３】(発明の第四の態様)
この態様は、第二および第三の態様の陽イオン交換体を、該物質を溶解した形態で含む水性液体(１)から正荷電物質を除去する方法に使用することを含む。この方法は、
(ｉ)物質をリガンドに結合させる陽イオン交換条件下に液体(１)を陽イオン交換体(１)に接触させること、および
(ｉｉ)可能ならば、該物質の引き続く脱着に続けること
を含む。
種々の構造的特徴／変数および操作条件は第一の態様の方法に対するものと同一である。
【００６４】(発明の第五の態様)
この態様は、一つもしくはそれ以上の陽イオン交換体が液体から物質を除去することについての適切性をテストする(スクリーニングする)方法であり、該方法は：
(ａ)(ｉ)それぞれの陽イオン交換体がリガンドの種類(リガンド１，２，３，４、．．．．．．ｎ；ｎ＝＞０の整数)に関して異なる、テストすべき一つもしくはそれ以上の陽イオン交換体（交換体１，２，３，４、．．．．．．ｎ)、および(ｉｉ)交換体１，２，３，４、．．．．ｎおよび対照陽イオン交換体において本質的に同一である、対照リガンド、支持マトリックス、置換度、対イオン等を有する対照陽イオン交換体を含むライブラリーを提供し；
(ｂ)予め決めた条件において物質についての交換体１の漏出点容量を決定し；
(ｃ)ステップ(ｂ)におけると同一の条件において物質についての対照陽イオン交換体の漏出点容量を決定し；
(ｄ)ステップ(ｂ)および(ｃ)で得た漏出点容量の間の関係から、陽イオン交換体１は物質を除去するために使用するのに適切かどうかを結論し；そして
(ｅ)必要ならば、少なくとも一つの交換体２，３，４、．．．ｎについてステップ(ｂ)、(ｄ)および(ｅ)を繰り返す
ステップを含む。
【００６５】  特に、試料陽イオン交換体／リガンドについての漏出点容量が対照陽イオン交換体／リガンドについてより大きい場合には、それで試料陽イオン交換体／リガンドは対照陽イオン交換体／リガンド以上の有利性を有するであろう。この結論は、試料陽イオン交換体／リガンドについての漏出点容量が対照陽イオン交換体／リガンドについての漏出点容量の＞２００％、例えば＞３００％もしくは＞５００％もしくは＞１０００％である場合にはさらに顕著になるであろう。
【００６６】  このスクリーニング方法は、少なくとも一つの陽イオン交換体１〜ｎがこの発明の第一から第四の態様において規定されている、ライブラリーをスクリーニングするために特に適合される。
二つ以上の陽イオン交換体１〜ｎをこの方法において並行してもしくは連続してテストしてもよい。
対照陽イオン交換体はこの発明の第一から第四の態様のいずれか一つにおいて規定されている、リガンドを有してもよい。
【００６７】  操作条件および対照陽イオン交換体の選択はこの発明のこれら他の態様に略述したように行うことができる。例えば、水および０．１Ｍ  ＮａＣｌもしくはそれより高く、好ましくはは＞０．３Ｍ  ＮａＣｌ、より成る水溶液中のイオン強度に相当する、イオン強度において、ステップ(ｂ)および(ｃ)を実施しても良い。
【００６８】  この発明のこの態様において、対照陽イオン交換体についての要約したもしくは予め決めた漏出点容量を用いてもよい。かくして、この方法はまた、対照陽イオン交換体もしくは陽イオン交換リガンドについての外部源からの要約した値を使用することを含めて、異なる時間でおよび／もしくは異なる個人によりまたは異なる機械により測定を実施することを包含する。
このスクリーニング方法により見出された陽イオンリガンドは、上述の方法態様のいずれにおいてもこの発明の様式で用いることができる。
【００６９】(液体(Ｉ)から除去すべき物質)
本発明は、上に規定して使用した二項性の陽イオンリガンドと相互作用ができる、幾らかな構造ユニットを持つ大分子量物質を主に対象としている。適切な化合物は、５００ダルトン以上、例えば１０００ダルトン以上、の分子量を典型的に有する。典型的な化合物は生体有機的および／もしくはポリマー的である。物質分子当たりの正荷電基の数は典型的には一つもしくはそれ以上である。物質の電荷は、最も良く適合した場合(即ち、物質は両性である)におけるｐＨに依存する。正荷電生体有機物質の中で、ポリペプチド構造、脂質構造および／もしくは炭水化物構造を有するものは、この発明の方法態様に従って液体から除去することが通常可能である。原理的に、この発明は、上記の構造的要求を満たす限り、他の生体有機および有機物質にもまた応用可能である。
【００７０】  物質は水性媒体(そこに溶解する)中の溶質でであるかもしくは、例えばコロイド的大きさの小生体粒子の形態にあってもよい。生体粒子の例示的な例は、ビールス、細胞(細菌および他の単細胞生物を含む)および細胞凝集体ならびに細胞小器官を含む細胞の部分である。
【００７１】  特に信じられているのは、この発明は、高濃度の塩と共に興味のある物質を含む生化学的流体から誘導される、水性液体に応用可能であろうことである。新規な陽イオン交換体は多分、例えば、先ずｐＨを変更して吸着した物質の正電荷を減少して、高イオン強度における吸着および低イオン強度における脱着を可能にすることにより、脱塩に非常に有用である。
【００７２】  高イオン強度のかつ精製すべき興味のある生体有機物質を含む典型的な液体は、例えば細胞培養からの発酵ブロス／液体およびそれから誘導される液体である。細胞は、哺乳動物のような脊椎動物もしくは無脊椎動物(例えば、培養した昆虫細胞)または微生物例えば、培養した真菌類、細菌、酵母等)に由来してもよい。また含まれるものは、好ましくは培養した、植物細胞および他種の生物細胞である。
【００７３】  除去すべき物質を含む水性液体(Ｉ)が微粒子物質を含有する場合はそれで、上昇流と共に新規の陽イオン交換リガンドを運ぶ、流動化微粒子支持マトリックスを利用することが有益であろう。このタイプの水性液体は、(ａ)細胞培養からの発酵ブロス／液体、(ｂ)溶菌細胞を含む液体、(ｃ)細胞および／もしくは組織のホモジネートを含む液体ならびに(ｄ)細胞から得られるペーストに由来してもよい。
【００７４】  ここで、この発明を次に続く実験の部に示す非−限定的実験により例示する。
この発明は付属する特許請求の範囲でさらに規定される。
(実験の部)
１．陽イオン交換体の合成
リガンド−形成化合物を表面へ固定化する多種類の方法があるが[Hermanson, G. T., Mallia, A. K. & Smith, P. K., (Eds.)、固定化アフィニティリガンド技法、Academic Press, INC, 1992]、これらの多くは我々の目的に応用可能である。以下において、我々は、実施例として役に立つように我々が新系列の弱陽イオン交換体(カルボン酸をベースとした)を作製するために採用している方法を説明する。ベースマトリックスとして、我々はSepharose 6 Fast Flow (AmershamPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を使用しているが、以後これをSepharose6 FFという。
【００７５】  １：１．アリルグリシジルエーテルによるSepharose 6 FFの活性化
これは、ＷＯ  ９７／２９８２５(Amersham Pharmacia Biotech AB)に本質的に記載されているように、アルカリ性の条件下でアリルグリシジルエーテルをSepharose 6 FFと反応させることにより実施される。適切な反応容器中で、Sepharose 6 FF  ８０ｇをＮａＢＨ４０．５ｇ，Ｎａ２ＳＯ４１３ｇおよび５０％(ｗ／ｗ)ＮａＯＨ水溶液４０ｍＬと混合した。この混合液を５０℃で１時間攪拌し、そしてアリルグリシジルエーテル１００ｍＬを加えた。懸濁液を５０℃でさらに１８時間攪拌した。混合液をろ過し、そしてゲルを蒸留水５００ｍＬ、エタノール５００ｍＬ、蒸留水２００ｍＬ、０．２Ｍ酢酸２００ｍＬおよび最後に蒸留水５００ｍＬで順次洗浄した。滴定による分析の結果、置換度はゲル１ｍＬ当りアリル基０．３ｍｍｏｌであった。以下においてこのアリル−置換Sepharose 6 FFを生成物Ｉという。
【００７６】  １：２．カルボキシル基の導入(選択肢１)
これは、カルボキシル基を含む反応性の求核試薬(例えばメルカプトプロピオン酸)を生成物Ｉにカップリングすることにより達成されることができる。また、アルカリ性条件下におけるSepharose 6 FFのクロロ酢酸との従来のカルボキシメチル化により達成することもできる。得られた生成物は、そのような陽イオン交換体として使用するか、もしくはアミド連鎖を介して他の陽イオン交換体を合成するための中間体として役立てることができる。下記の手順はメルカプトプロピオン酸を生成物Ｉ(アリル−誘導体化Sepharose 6 FF)にカップリングするための実施例を提供する。
【００７７】  １：２：１．生成物Ｉ(アリル−誘導体化Sepharose 6 FF)の活性化
典型的な手順において、生成物１００ｍＬ、酢酸ナトリウム４ｇおよび蒸留水１００ｍＬの攪拌した懸濁液に、消えない黄色が得られるまで，臭素水を加えた。淡い黄色が消えるまで、懸濁液にギ酸ナトリウムを加えることにより過剰の臭素の還元を達成した。反応混合液をろ過し、そしてアリル−誘導体化ゲルを蒸留水５００ｍＬで洗浄した。
【００７８】  １：２：２．活性化した生成物Ｉへのメルカプトプロピオン酸のカップリング
活性化したゲル(生成物Ｉ)に続けてメルカプトプロピオン酸１７．５ｍＬ(アリル基当り６当量)および４Ｍ  ＮａＣｌ５０ｍＬの混合液を反応容器へ移した。この混合液のｐＨを、活性化ゲルに加える前に、５０％(ｗ／ｗ)ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１．５に調節した。懸濁液を５０℃で１８時間攪拌してからろ過した。ゲルを蒸留水５００ｍＬで洗浄し、そしてカルボキシル基の含量を滴定により測定した。ゲル１ｍＬ当りＣＯＯＨ基約０．２９ｍｍｏｌの置換度を得た。この生成物は生成物ＩＩという。
【００７９】  １：３．カルボキシル基の導入(選択肢２)
これは、リガンド−形成化合物(アミノおよびカルボキシル機能の両者を含む)を固体支持体へアミド結合を介してカップリングさせるための代わりの方法を提供する。この手順は２つのステップを伴い、下記に記述する。
【００８０】  １：３：１．メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF(生成物ＩＩ)のＮ−ヒドロキシスクシンイミドによる活性化
メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF(生成物ＩＩ)１００ｍＬを１Ｍ  ＮａＣｌ３００ｍＬ、０．１Ｍ  ＨＣ１５００ｍＬ、５０％アセトン水溶液５００ｍＬおよびアセトン５００ｍＬで順次洗浄した。ゲルを沈ませ、そして上澄み液をサイホンで除いた。それから、このゲルに続けて、アセトン８０ｍＬ中ドロキシスクシンイミド１５．２ｇの溶液およびアセトン８０ｍＬ中ジシクロヘキシルカルボジイミド２９．９ｇのもう一つの溶液を反応容器へ定量的に移した。スラリーを３０℃で１８時間攪拌した。混合液をろ過し、そしてゲルを１０部のイソプロパノール１５０ｍＬで８時間の期間に洗浄した(重力流により)。
生成物ＩＩの活性化の程度は、ＮＨ４ＯＨとの反応で評価するとき、約７５％であった。ここで得た生成物(即ちＮＨＳ−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF)を生成物ＩＩＩという。
【００８１】  １：３：２．チエニルセリンの生成物ＩＩＩへのカップリング
ここに略述する手順はアミド連鎖を介してリガンド−形成化合物をカップリングする一般方法の実施例を提供する。チエニルセリン(蒸留水８０ｍＬ中２ｇ)の溶液を１Ｍ  ＮａＨＣＯ３８ｍＬおよびエタノール１０ｍＬと混合し、そしてこのｐＨを５０％ＮａＯＨ水溶液の注意深い添加によりｐＨ０．５に調節した。生成物ＩＩＩ(ＮＨＳ−活性化メルカプトプロピオン酸−Sepharose 6 FF)２５ｍＬをガラスろ過漏斗上で氷冷した１ｍＭ  ＨＣｌ水溶液５０ｍＬで素早く洗浄した。それから、このゲルをエルレンマイヤーフラスコに移し、そしてこれにチエニルセリンの溶液を加えた。それから、反応混合液を中庸の速度で１８時間室温で振り混ぜた。
【００８２】  反応液をろ過し、ゲルを蒸留水１００ｍＬ、エタノール５０ｍＬ、０．２５Ｍエタノールアミン水溶液５０ｍＬ、蒸留水５０ｍＬ、１Ｍ  ＮａＣｌ５０ｍＬおよび最後に蒸留水５０ｍＬで順次洗浄した。チエニルセリンのカップリング効率は硫黄の元素分析により約７０％と測定されたが、これはゲル１ｍＬ当りチエニルセリン０．１５ｍｍｏｌの置換度に相当する。ほとんどの“高塩”陽イオン交換体をこの方法により作成した。
【００８３】  ２．クロマトグラフィー
この検討において、３つの精製タンパク質[塩基性(リゾチーム＝Ｌｙｓ)、中性から弱塩基性(ＩｇＧ)および酸性(ＢＳＡ)を代表する]を使用して、新系列の“高塩”陽イオン交換体を２つの重要なパラメター、即ち、それらに加えるタンパク質の漏出点容量(Ｑｂ１０％)および回収率に関して特性化した。リゾチームの結合および溶出を正常な操作手順下に、即ち、吸着を中性ｐＨにおいてそして溶出を同一のｐＨにおいて高塩(例えば２Ｍ  ＮａＣｌ)を含む緩衝液で、行った。ＩｇＧはｐＨ４．５で結合させ、そして比較的低い塩濃度(０．１Ｍ)を含むｐＨの緩衝液で溶出した。ＩｇＧは、相当多量を種々の媒体に吸着させ得るので、低ｐＨで結合させた。ＢＳＡは、それが正電荷を持つ(ＢＳＡのｐＩ＝４．９)ｐＨ４．０で結合させ、そして，ＩｇＧの場合と同様に、ｐＨを７．０に上げて溶出させた。ＢＳＡをｐＨ４．０においてＢＳＡを結合するために用いる手順は“逆操作手順”と考えられることができて、そして負の電荷を持つ色素および他の不純物を組換え型たんぱく質、例えば、酵母中で生成するＨＳＡ、の除去のために広く採用されている(例えば、ＥＰ  ０  ５７０  ９１６  Ａ２およびＥＰ  ０  ６９９  ６８７  Ａ２)。そのような低分子量の不純物は、さもなければ、それらはＨＳＡと丁度同様に負の電荷を持つので、生理的ｐＨ下でＨＳＡから分離するのは困難である。新系列の“高塩”リガンドについての漏出点容量、およびそれらに結合したタンパク質の回収率、を測定するために用いた手順を下に略述する。
【００８４】  Ａ．“高塩”条件における漏出点容量(Ｑｂ１０％)
陽イオン交換リガンドを“高塩”リガンドとして指定するための主な規準の一つは、同一の条件下で操作する対照陽イオン交換体に比べて、比較的高い濃度の塩(例えば０．３Ｍ  ＮａＣｌ)の存在下でタンパク質に対するその結合容量である。これは、下記のように、前端分析の方法を用いて測定される。
【００８５】  実験
Ｉ．緩衝溶液
緩衝溶液１：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８
緩衝溶液２：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０
緩衝溶液３：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５
緩衝溶液４：２０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．８(リゾチームの溶出用)
緩衝溶液５：１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０(ＢＳＡおよびＩｇＧの溶出用)
【００８６】  ＩＩ．タンパク質溶液
１．リゾチーム：緩衝液１中で４ｍｇ／ｍＬ
２．ＢＳＡ：緩衝液２中で４ｍｇ／ｍＬ
３．ＩｇＧ：緩衝液３中で４ｍｇ／ｍＬ
全ての緩衝液およびタンパク質溶液を使用前に０．４５μｍのMillipore Millex HAフィルターを通してろ過した。
【００８７】  ＩＩＩ．クロマトグラフィーシステム
全ての実験を、Unicorn 3.1ソフトウェア−を装備したAekta Explorer 100クロマトグラフィーシステムを用いて室温で実施した。試料を１５０ｍＬのスーパーループを経由してカラムに加えた。１ｍＬ／分(約３００ｃｍ/時間)の流速をずっと用いた。１０ｍｍのフローセルを用いる２８０ｎｍでの吸光度測定により、溶出液を連続的にモニターした。
【００８８】  ＩＶ．前端分析
それぞれの試作陽イオン交換体をHR5/5カラム中に充てんし(充てん床容量＝１ｍＬ)、そして適切なｐＨおよび塩濃度の緩衝液で平衡化した。適切なタンパク質溶液を非−結合条件下でカラムに加えることにより、システムのボイド容量を測定した。溶出液のＡ２８０が加えたタンパク質のＡ２８０の１０％に達するまでの時間をシステムのボイド容量(分で表す)とする。
【００８９】  適切な緩衝液(緩衝液１，２もしくは３)で平衡化したカラムに、適切な平衡緩衝液(上を参照)に溶解した試料タンパク質を１ｍＬ／分(約３００ｃｍ/時間)の流速で連続的に供給した(例えば１５０ｍＬのスーパーループを経由して)。試料の添加を、溶出液のＡ２８０がカラムに加えた試料のＡ２８０の１０％のレベルに達するまで、続けた。そのように得たデータ[即ち、充てんゲル床の体積(Ｖｃ)、そのボイド容量、およびカラムに供給するタンパク質液の流速および濃度]に基づいて、それに加えるタンパク質の濃度の１０％レベルにおける充てんゲルの漏出点容量(Ｑｂ１０％)を計算することができる。そのように得られる結果は、大多数の“高塩リガンド”候補をスクリーニングする基盤を形成し、そして３つのタンパク質、即ち、リゾチーム、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)およびヒトイムノグロブリン(ＩｇＧ)について下に呈示する。
【００９０】  Ｖ．評価
吸光度極大の１０％レベルにおける漏出点容量(Ｑｂ１０％)を以下の関係式を用いて計算した：
Ｑｂ１０％＝(ＴＲ１０％−ＴＲＤ)×Ｃ／Ｖｃ
式中：  ＴＲ１０％＝吸光度極大の１０％における保持時間(分)、
ＴＲＤ＝システムのボイド容量(分)、
Ｃ＝供給タンパク質の濃度(４ｍｇ／ｍＬ)および、
Ｖｃ＝カラムの充てん床の体積(ｍＬ)。
【００９１】  Ｂ．“高塩”陽イオン交換体に結合したタンパク質の回収率
“高塩”陽イオン交換リガンドはまた、それらに結合したタンパク質の回収率に関してスクリーニングされる。これは、比較的高い吸着容量を、加えたタンパク質の高いか定量的な回収率と結びつける、正しい種類のリガンドを選択するための追加的でかつ重要な規準である。下に略述するように回収率を測定した。
【００９２】  実験
使用した、カラムの種類、充てん床体積、緩衝液、タンパク質溶液、流速および装置のタイプに関する詳細を２Ａ：ｉおよび２Ａ：ｉｉ項で略述する。リゾチームについては、カラムを緩衝液１で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液４で溶出した。ＢＳＡについては、カラムを緩衝液２で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液５で溶出した；ＩｇＧについては、カラムを緩衝液３で平衡化し、そして結合したタンパク質を緩衝液５で溶出した。
【００９３】  適切な緩衝液(緩衝液１，２もしくは３)で平衡化したカラムに、タンパク質(リゾチーム(Ｌｙｓ)、ＢＳＡもしくはＩｇＧ)の溶液を５０ｍＬのスーパーループから、漏出点容量の３０％に相当する量を加えるまで、加えた。それから、カラムを床容積の２倍量の平衡緩衝液で洗浄し、そして結合したタンパク質を適切な脱着緩衝液(緩衝液４もしくは５)で溶出した。溶出したタンパク質を２０ｍＬのメスフラスコ中に定量的に集め、そしてその容積および２８０ｎｍにおける(ＢＳＡおよびＩｇＧについて)もしくは２５４ｎｍにおいる(リゾチームについて)吸光度を正確に測定した。それぞれの溶出試料中の全吸光度に基づいて、溶出液中のタンパク質の量を適切な検量線を用いて計算した(下記参照)。
【００９４】  評価
それぞれのタンパク質についての標準溶液を、カラム平衡化緩衝液中で０〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲をカバーして作製した。一連の希釈度のＡ２８０(ＢＳＡおよびＩｇＧ)もしくはＡ２５４(リゾチーム)を測定し、そしてｘ−軸にタンパク質濃度(ｍｇ／ｍＬ)をｙ−軸に吸光度を取って、検量線を作製した。それぞれの検量線についての一次方程式および回帰係数を計算した。これらの標準曲線に基づいて、溶出試料中のタンパク質の濃度(ｍｇ／ｍＬ)を該試料のＡ２８０もしくはＡ２５４を測定し下記の関係式を用いて計算した。
ＣＳ＝Ａ／ε・ｂ
式中：  ＣＳ＝溶出試料中のタンパク質の濃度(ｍｇ／ｍＬ)
Ａ＝吸光度(Ａ２８０もしくはＡ２５４ｎｍにおいて)
ε＝特定の波長における分子吸光係数(Ｍ−１ｃｍ−１)
ｂ＝セル経路長(ｃｍ)
【００９５】  それから、結合したタンパク質の回収率下記の関係式を用いて計算する。
回収率、％＝ＣＳ・ＶＳ／ＣＬ・ＶＬ
式中：
ＶＳ＝溶出したタンパク質試料の容積(ｍＬ)
ＣＬ＝加えた試料の濃度(ｍｇ／ｍＬ)
ＶＬ＝加えた試料の容積(ｍＬ)
【００９６】  結果
高塩条件における漏出点容量
一連の代表的な“高塩”陽イオン交換リガンドについての漏出点容量および回収率に対して得られた結果を表１に要約する。表１に示す実施例は、種々のリガンドの幾らかな特異的性質を例示するもので、本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。過半数のこれらの新陽イオン交換体についてのリガンド置換度は充てんゲル１ｍＬ当り約０．１８〜０．２０ｍｍｏｌであった。少数のものが充てんゲル１ｍＬ当り０．２７ｍｍｏｌと高い値を示した。対照陽イオン交換体として、市販のスルホプロピル(もしくはＳ)Sepharose 6 FFを用いたが、そのリガンド濃度は新系列の陽イオン交換体と同一の範囲(即ち、充てんゲル１ｍＬ当り約０．１８〜０．２０ｍｍｏｌ)にある。
【００９７】  この結果は以下の傾向を示す：
１．少数の例外を除いて、新陽イオン交換体は、対照陽イオン交換体ＳSepharose 6 FFに比較して、全ての３つのタンパク質に対してはるかに高いＱｂ１０％を有する。
２．リガンド１はＬｙｓに対して最高のＱｂ１０％を示した(６０ｍｇ／ｍＬ)；リガンド１０はＨＳＡに対して５７ｍｇ／ｍＬの最高値を示し、そしてリガンド１２はＩｇＧに対して３３ｍｇ／ｍＬの最高値を示した。これらの値は、対照陽イオン交換体(ＳSepharose 6 FF)に比して上の３つのリガンドについて、Ｌｙｓ，ＨＳＡおよびＩｇＧに対して、それぞれ１２９５％、２０９２％および４０２５％の増加に相当する。
３．下に呈示する１８のリガンドのうち、始めの５つは、他のものに比較して全て３つのタンパク質に対して相当高いＱｂ１０％を示した。これは、これらのリガンドは将来の“高塩”リガンドの構成のための基盤を形成することができることを示す。
４.幾らかのリガンドはＩｇＧに対して比較的低いＱｂ１０％を示すが、他の２つのタンパク質に対しては高いＱｂ１０％値を示す(即ち、リガンド７、８および９)。
５.リガンド１１はＬｙｓに対して高いＱｂ１０％値を有するが、他の２つのタンパク質に対しては非常に低い値を有する。逆はリガンド１２、１４および１４について真である。かくして、これらの結果は、将来において“特異的”タイプの“高塩”陽イオン交換体の構成のためのガイドラインとして役立つことができる。
６．リガンド１５，１６，１７および１８は、ＬｙｓもしくはＩｇＧに対するより，ＨＳＡに対してはるかに高いＱｂ１０％を有する。この結果は、これらのリガンドはＩｇＧ製剤からＨＳＡを除去するために有用であり得ることを示唆する。
【００９８】  “高塩”陽イオン交換リガンドに結合したタンパク質の回収率
ＨＳＡに対する回収率のデータは完全であるが、一方Ｌｙｓに対するものはリガンドの約６０％について測定されている。ＩｇＧに対するデータは少数の有望なリガンドについてのみ測定されている。得られた結果は以下のことを示す。
１．全てのリガンドは、一緒にして、用いたタンパク質に関係なく、６５％より良い収率を与えた。
２．リガンド２は、Ｌｙｓ，ＢＳＡおよびＩｇＧに対して、それぞれ１００％、９３％および７９％の回収率をもたらした点で最も適切なリガンドであると見出され。
３．この結果はまた、ｐＨもしくは塩との段階的溶出は高収率をもたらすことを示している。
【００９９】  リガンドの構造
陽イオン交換体を、
(ａ)リガンド−形成化合物１〜１４，１６および１８を生成物ＩＩのＮＨＳ−活性化体と反応させる、もしくは
(ｂ)リガンド−形成化合物１５および１７を生成物Ｉの臭素−活性化体と反応させる
ことにより創成した。
変形(ａ)は、リガンド−形成化合物がアミド基を介してマトリックスに連鎖したことを意味する。変形(ｂ)はチオエーテルを介する連鎖を意味する。
【０１００】  以下に示す最良のリガンド−形成化合物は、相当する従来のスルホプロピル陽イオン交換体の漏出点容量の３００％より大きい漏出点容量を持つ陽イオン交換体をこれまでにもたらしたものである。
対照陽イオン交換体：ＳSepharose 6 FF(スルホプロピルSepharose 6 FF)：Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝４．３ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝２．６ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝０．８ｍｇ／ｍＬ。
原子における上付き文字としてのＭ、Ｚ、ＨＢおよびＨＢ'は、この基がこの原子に結合していることを示す。
【０１０１】
【化１】
0005306568.tif 000002
リガンド１．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝２−チエニルメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝６０ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２０ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝１００％、ＢＳＡ＝８６％、ＩｇＧ＝６９％。
【０１０２】
【化２】
0005306568.tif 000003
リガンド２．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝２−フラニルヒドロキシメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝３８ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４２ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２７ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝１００％、ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝７９％。
【０１０３】
【化３】
0005306568.tif 000004
リガンド３．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝３，４−ジヒドロキシフェニルヒドロキシメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝４３ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２４ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝９３％、ＢＳＡ＝９１％。
【０１０４】
【化４】
0005306568.tif 000005
リガンド４．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝フェニルヒドロキシメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝５０ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２２ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝９７％、ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝７５％。
【０１０５】
【化５】
0005306568.tif 000006
リガンド５．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝４−ヒドロキシフェニルメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝３２ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４０ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２３ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝８１％、ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝７６％。
【０１０６】
【化６】
0005306568.tif 000007
リガンド６．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝ヒドロキシフェニルメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝１４ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝  １％、ＢＳＡ＝７９％、ＩｇＧ＝６６％。
【０１０７】
【化７】
0005306568.tif 000008
リガンド７．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝４−ヒドロキシフェニルメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝６２ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４４ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝１１ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝９３％、ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝６５％。
【０１０８】
【化８】
0005306568.tif 000009
リガンド８．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝２−チエニルヒドロキシメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５１ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４５ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝５ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝９０％、ＢＳＡ＝９２％。
【０１０９】
【化９】
0005306568.tif 000010
リガンド９．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ’ＨＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝１−ヒドロキシエチル、ＨＢ'＝４−ヒドロキシフェニルメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝４６ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４９ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝６ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝９４％、ＢＳＡ＝９２％。
【０１１０】
【化１０】
0005306568.tif 000011
リガンド１０．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ’ＨＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝２−チオメトキシエチル、ＨＢ'＝ヒドロキシメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝２０ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝５７ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝１０ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝７８％、ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝６８％。
【０１１１】
【化１１】
0005306568.tif 000012
リガンド１１．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨＢ，ＺＨ。ＨＢ＝(４−ピリジル)ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２−。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５０ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝２ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝４ｍｇ／ｍＬ。回収率：Ｌｙｓ＝７８％、ＢＳＡ＝９３％。
【０１１２】
【化１２】
0005306568.tif 000013
リガンド１２．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ(チエニル)ＨＢ，Ｚ。ＨＢ＝３−ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２−。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝５０ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝３３ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝８２％、ＩｇＧ＝８８％。
【０１１３】
【化１３】
0005306568.tif 000014
リガンド１３．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ(フェニル)ＨＢ，Ｚ。ＨＢ＝２−ニトロ。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４１ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２７ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝９３％。
【０１１４】
【化１４】
0005306568.tif 000015
リガンド１４．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＢＣＺＨ２。ＨＢ＝１，２−ジヒドロキシエチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝４ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝３８ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝２３ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝９３％、ＩｇＧ＝８６％。
【０１１５】
【化１５】
0005306568.tif 000016
リガンド１５．Ｄ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＮＨＣＺＨ２。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝５ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝５１ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝４ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝９２％。
【０１１６】
【化１６】
0005306568.tif 000017
リガンド１６．Ｄ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＯＮＨＣＺＨ(ＣＨ２ＣＨ３)。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝３ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝４６ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝３ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝８７％。
【０１１７】
【化１７】
0005306568.tif 000018
リガンド１７．Ｄ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＺＨ２。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝４ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝５１ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝４ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝９１％。
【０１１８】
【化１８】
0005306568.tif 000019
リガンド１８．Ａ＝ＭＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ(ＯＨ)ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＢＣＺＨ２。ＨＢ＝トリフルオロメチル。Ｑｂ１０％：Ｌｙｓ＝７ｍｇ／ｍＬ，ＢＳＡ＝３７ｍｇ／ｍＬ、ＩｇＧ＝７ｍｇ／ｍＬ。回収率：ＢＳＡ＝９３％。