(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列と、１つ以上の自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）を含むベクター構築物とをインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項２】
真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）翻訳開始コドン、分泌シグナル配列、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を前記分泌シグナル配列が内在性遺伝子へ機能的に連結するように非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項３】
真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）翻訳開始コドン、エピトープ標識、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項４】
真核細胞内での内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）翻訳開始コドン、分泌シグナル配列、エピトープ標識、および不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列によって内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項５】
内在性遺伝子のタンパク質を産生するためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された非レトロウイルス構成転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませるために前記インビトロの真核細胞を維持し、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
（ｃ）前記転写調節配列によって、前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記インビトロの真核細胞を維持することと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の前記発現産物を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと
を含む方法。
【請求項６】
内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）分泌シグナル配列に機能的に連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませるために前記インビトロの真核細胞を維持し、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列および前記分泌シグナル配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されていることと、
（ｃ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記インビトロの真核細胞を維持することと、
（ｄ）前記内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと
を含む方法。
【請求項７】
内在性遺伝子のタンパク質を産生するインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記細胞のゲノムにランダムに組み込ませ、これによって、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列および不対スプライスドナー配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
（ｃ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で発現させることと、
（ｄ）前記内在性遺伝子によりコードされている前記タンパク質を産生させることと
を含む方法。
【請求項８】
真核細胞内で内在性遺伝子由来のタンパク質を産生させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列、および１つ以上の自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項９】
真核細胞内の内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させるインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
（ｅ）前記インビトロの真核細胞を無血清培地中で培養することと
を含む方法。
【請求項１０】
内在性遺伝子由来のタンパク質を産生させるためのインビトロにおける方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記内在性遺伝子のアップレギュレーションにより前記内在性遺伝子を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
（ｅ）１０４細胞／ｍｌで１０リットルに相当する細胞量から前記タンパク質を単離することと
を含む方法。
【請求項１１】
内在性遺伝子由来のタンパク質の過剰発現をスクリーニングするインビトロにおける方法であって、
（ａ）エンハンサー配列、不対スプライスドナー配列、および自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）を含み、標的化配列を有さないベクター構築物を非相同組換えにより複数のインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、
（ｂ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｃ）前記内在性遺伝子由来のタンパク質が過剰発現している細胞をスクリーニングすることと
を含む方法。
【請求項１２】
インビトロにおいて内在性タンパク質を発見する方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｃ）前記転写調節配列による内在性遺伝子のアップレギュレーションによって前記細胞内で前記内在性遺伝子由来のタンパク質を過剰発現させる条件下において血清使用量低減培地中で細胞を培養し、これにより、細胞調整培地を作製することと、
（ｄ）前記内在性遺伝子由来のタンパク質が存在する前記調整培地をスクリーニングすることと
を含む方法。
【請求項１３】
インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質の発現を強める方法であって、
（ａ）エンハンサー配列、不対スプライスドナー配列、および１つ以上の自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）を含み、標的化配列を含まないベクター構築物を複数のインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに導入することと、
（ｂ）前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｃ）内在性遺伝子を発現する前記インビトロの真核細胞をスクリーニングすることと、
（ｄ）前記自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）および前記内在性遺伝子由来のタンパク質の発現が増加した細胞を選択することと
を含む方法。
【請求項１４】
内在性遺伝子がコードする内在性膜タンパク質を発現する真核細胞をインビトロにおいて同定するための方法であって、
（ａ）（ｉ）開始コドンを含むエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と、
（ｉｉ）シグナル配列と
（ｉｉｉ）不対スプライスドナー配列を付けたエピトープ標識と
を含むベクター構築物を複数のインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列をスプライシングにより除去することと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションにより内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと、
（ｅ）前記インビトロの真核細胞表面上のエピトープ標識の発現で前記インビトロの真核細胞をスクリーニングすることと
を含む方法。
【請求項１５】
インビトロにおいて内在性遺伝子からタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクターを非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませ、これにより、前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列は前記内在性遺伝子に機能的に連結されることと、
（ｃ）前記転写調節配列によって前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で発現させるために前記細胞を維持することと、
（ｄ）前記内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するように前記インビトロの真核細胞を維持することと、
（ｅ）前記タンパク質を精製することと
を含む方法。
【請求項１６】
インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列、ウィルス複製起点、および自己増幅性選択マーカー（amplifiable marker）を含むベクター構築物をインビトロの真核細胞に導入することと、
（ｂ）前記ベクター構築物由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記転写調節配列が前記内在性遺伝子に機能的に連結されるように、前記ベクター構築物を非相同組換えにより前記インビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込ませることと、
（ｃ）前記転写調節配列により前記内在性遺伝子由来のタンパク質を前記インビトロの真核細胞内で過剰発現させることと
を含む方法。
【請求項１７】
前記転写調節配列はプロモーターである、請求項１〜１０、１２、１４、および１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写調節配列はエンハンサーである、請求項５、９、１０、１２、１４および１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記内在性遺伝子由来のタンパク質を発現する真核細胞を単離し、クローニングすることをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項５、７および１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記内在性遺伝子由来のタンパク質を単離することをさらに含む、請求項１〜４、６〜９および１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エピトープ標識を発現する前記真核細胞を単離することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記転写調節配列は非レトロウイルス性である、請求項６および７に記載の方法。
【請求項２５】
インビトロにおいて内在性遺伝子由来のタンパク質発現を活性化する方法であって、
（ａ）内在性遺伝子を活性化することができる、不対スプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターをインビトロの真核細胞内に導入することと、
（ｂ）前記ベクターを導入する前あるいは後に、前記インビトロの真核細胞の染色体内にＤＮＡ切断を導入することができる薬剤で前記インビトロの真核細胞を処理することと、
（ｃ）前記ベクターおよび前記内在性遺伝子間での機能的な連結の形成を得られるように、前記ＤＮＡ切断に前記ベクターをランダムに組み込ませ、これにより、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と前記内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されて、前記内在性遺伝子がベクターにコードされた１つ以上のヌクレオチド配列により活性化されることと
を含む方法。
【請求項２６】
（ｃ）における前記活性化は、前記インビトロの真核細胞を単離して培養することにより行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項２７】
医薬の候補化合物のためのスクリーニング方法であって、
（ａ）転写調節配列および機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクターをインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、ここで、前記ベクターの組み込みは、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されることによって前記真核細胞内の内在性遺伝子の発現を活性化するものであり、
（ｂ）前記真核細胞を培養して、これにより前記活性化された遺伝子由来のタンパク質を作製すること、
（ｃ）前記真核細胞を１つ以上のテスト化合物で処理し、薬物活性についてスクリーニングされることと、
（ｄ）１つ以上の前記テスト化合物の、前記遺伝子由来のタンパク質により誘導される細胞表現型と相互作用するかあるいは細胞表現型に作用する能力を決定することと
を含む方法。
【請求項２８】
医薬の候補化合物のためのスクリーニング方法であって、
（ａ）転写調節配列および機能的に連結された不対スプライスドナー配列を含むベクターをインビトロの真核細胞のゲノムにランダムに組み込むことと、ここで、前記ベクターの組み込みは、前記ベクター由来の前記不対スプライスドナー配列と内在性遺伝子由来のスプライス受容部位との間の配列がスプライシングにより除去されることによって前記宿主細胞内の内在性遺伝子由来のタンパク質の発現を活性化することであり、
（ｂ）血清使用量低減培地で前記真核細胞を培養し、これにより前記内在性遺伝子由来のタンパク質を含む細胞調整培地を作製することと、
（ｃ）前記細胞調整培地において、前記遺伝子産物と相互作用する前記テスト化合物の能力を決定することにより１つ以上のテスト化合物の薬物活性を調べることと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    （技術分野）
本発明の技術分野は、遺伝子発現の活性化またはｉｎ  ｓｉｔｕ組換え法による遺伝子の過剰発現の誘発である。本発明は、細胞に通常見られるよりも高いレベルでの細胞における内在性遺伝子の発現に関する。遺伝子の発現は、遺伝子の発現を活性化する調節配列が、非相同的（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えにより組込まれた後に、活性化または増加する。標的配列が組込みに全く必要ないため、この方法により、現在の方法では発見できない遺伝子の同定および発現が可能となる。従って、ヒトの疾病および発達に関連する遺伝子産物が、よく特徴づけられた遺伝子からだけでなく、シークエンスされておらず、実際、その存在が知られていない遺伝子からも得ることができる。本法は、治療および診断のための該遺伝子の遺伝子産物を提供する。
【０００２】    （背景技術）
ヒトの疾病に関連する新規遺伝子の同定および過剰発現は、新規な治療薬の開発に向けて重要なステップである。タンパク質を過剰発現する細胞のライブラリーの創製に対する現在のアプローチは、ｃＤＮＡの産生およびクローニングを基本とする。従って、このアプローチを使用して新規な遺伝子を同定するためには、遺伝子が、ライブラリーの作成に使用した細胞中に発現されていなければならない。遺伝子はまた、ライブラリー中に妥当に示されるに十分なレベルで発現されなければならない。これは、多くの遺伝子が非常に少ない量で、僅かな細胞個体群中に、または短い発達期間中にしか発現されていないため問題である。
【０００３】  さらに、いくつかのｍＲＮＡはサイズが大きいために、生物学的に活性なタンパク質を発現できる全長ｃＤＮＡ分子を産生することは困難であるか、または不可能である。全長ｃＤＮＡ分子の欠乏はまた、小さなｍＲＮＡにおいても観察され、逆転写により産生するのが困難であるか、または細菌における繁殖中に不安定であるメッセージ中の配列と関連があると考えられている。結果として、最も完全なｃＤＮＡライブラリーでさえ、あり得る遺伝子の全セットの一部のみしか発現しない。
【０００４】  最後に、多くのｃＤＮＡライブラリーが細菌ベクターで産生される。生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を発現するためにこれらのベクターを使用することは、ほとんどの哺乳動物タンパク質が正しく折りたたまれず、および／または細菌中で不適切にグリコシル化されるために、極めて限定されている。
【０００５】  それ故、生物学的に活性なタンパク質の忠実な発現を容易にし得る、タンパク質発現のより代表的なライブラリーの創製法は、極めて価値がある。
【０００６】  現在のタンパク質過剰発現法は、目的の遺伝子をクローニングし、それを適切なプロモーター／エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびスプライス部位の隣の構築物中に配置し、構築物を適当な宿主細胞に導入することを含む。
【０００７】  別のアプローチは、強力なプロモーターまたは他の調節配列を、前もって同定した遺伝子に標的化することにより、遺伝子発現を活性化するための相同的組換えの使用を含む。
【０００８】  ＷＯ９０／１４０９２には、哺乳動物細胞において、目的のタンパク質をコードする遺伝子のｉｎ  ｓｉｔｕ修飾が記載されている。本出願は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的修飾用の一本鎖オリゴヌクレオチドが記載されている。マーカーも含み得る。しかし、この方法は、実質的に標的部位に相同的なオリゴヌクレオチド配列が提供される場合に限定される。従って、この方法は、部位特異的修飾および相同的組換えによる活性化に必要とされる部位の知識を必要とする。新規な遺伝子は、この方法では発見できない。
【０００９】  ＷＯ９１／０６６６７には、哺乳動物遺伝子のｉｎ  ｓｉｔｕ発現法が記載されている。この方法を用いて、増幅遺伝子を、相同的組換えにより標的遺伝子の隣に導入する。次いで、細胞を適当な培地で増殖すると、増幅遺伝子および標的遺伝子の両方が増幅され、標的遺伝子の発現が増強する。上記のように、増幅遺伝子の導入法は、相同的組換えに限定され、配列（または存在）が知られていない新規な遺伝子の活性化には有用ではない。
【００１０】  ＷＯ９１／０１１４０には、相同的組換えによる細胞の修飾による内在性遺伝子の不活性化が記載されている。これらの方法により、相同的組換えを使用して、遺伝子を修飾して不活性化し、遺伝子療法におけるドナーとして利用できる細胞が産生される。
【００１１】  ＷＯ９２／２０８０８には、ゲノム標的部位のｉｎ  ｓｉｔｕ修飾法が記載されている。修飾は、小さく、例えば、ＤＮＡにおける単一の塩基の変化として記載される。この方法は、標的化のための相同的ＤＮＡを使用したゲノム修飾に依拠する。
【００１２】  ＷＯ９２／１９２５５には、相同的組換え（ここでＤＮＡ配列はゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込まれる）により達成された、標的遺伝子の発現を増強する方法が記載されている。次いで、この修飾された配列は、発現させるために、二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子は、標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅され得る。相同的組換えは、この標的化アプローチに必要である。
【００１３】  ＷＯ９３／０９２２２には、所望の産物をコードする内在性遺伝子の活性化によりタンパク質を生成する方法が記載されている。調節領域を、相同的組換えにより標的化し、発現が望ましい遺伝子と通常関連する領域を置換または無効化する。この無効化または置換により、正常よりも高いレベルでの遺伝子の発現が引き起こされる。
【００１４】  ＷＯ９４／１２６５０には、細胞においてｉｎ  ｓｉｔｕで内在性遺伝子の発現を活性化および内在性遺伝子を増幅する方法を記載し、ここでこの遺伝子は細胞において発現されていないか、または所望のレベルで発現されていない。細胞を、細胞に存在する配列を修復、変化、欠失、または置換する、あるいは細胞の内在性遺伝子と正常に機能的に結合していない調節配列である外来性ＤＮＡ配列とトランスフェクトさせる。これを行うために、前以って選択した部位でゲノムＤＮＡ配列と相同的なＤＮＡ配列を使用して、内在性遺伝子を標的化する。さらに、選択マーカーをコードする増幅ＤＮＡも含めることができる。相同的に組換えた細胞を、増幅に選択した条件下で培養することにより、内在性遺伝子および増幅マーカーの両方が共増幅され、遺伝子の発現は増加する。
【００１５】  ＷＯ９５／３１５６０には、相同的組換え用のＤＮＡ構築物が記載されている。この構築物は、標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含む。標的化は、細胞におけるゲノム配列と構築物の相同的組換えにより達成され、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのタンパク質の産生が可能となる。
【００１６】  ＷＯ９６／２９４１１には、相同的組換えにより、ゲノムの前以って選択した部位に導入した、外来性調節配列、コードまたは非コード、外来性エキソン、およびスプライスドナー部位を使用する方法が記載されている。本出願において、導入されたＤＮＡは、外来性調節領域の制御下の転写物が、トロンボポエチン、デオキシリボヌクレアーゼＩ、またはβ−インターフェロン遺伝子のいずれかに存在する、外来性エキソンおよび内在性エキソンの両方を含むように位置し、その結果、外来性および外来性エキソンが機能的に結合した転写物が生成する。新規な転写単位が、相同的組換えにより産生される。
【００１７】  米国特許第５，２７２，０７１号には、細胞において正常に発現される遺伝子の発現を促進できるＤＮＡ調節エレメントを挿入することによる、細胞における転写的にサイレントな遺伝子の転写活性化が記載されている。調節エレメントを、正常なサイレント遺伝子と機能的に結合するように挿入する。挿入は、正常なサイレント遺伝子（標的ＤＮＡ）のセグメントを有するＤＮＡ構築物および所望の転写を誘導するために使用したＤＮＡ調節エレメントを創製することにより、相同的組換えを用いて達成される。
【００１８】  米国特許第５，５７８，４６１号には、相同的組換えによる哺乳動物標的遺伝子発現の活性化を議論する。ＤＮＡ配列を、ゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込み、標的遺伝子の発現を増強する。次いで、修飾された構築物を二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子を標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅される。
【００１９】  上記のアプローチは両方共（クローニングによる、またはインビボでの相同的組換えによる過剰発現構築物の構築）、過剰発現し得る前に、遺伝子をクローン化しおよびシークエンスする必要がある。さらに、相同的組換えを使用すると、ゲノム配列および構造も知らなければならない。
【００２０】  残念なことに、多くの遺伝子は未だに同定および／またはシークエンスされていない。従って、以前にクローン化されたかどうか、配列および構造が既知であるかどうかに関わらず、目的の遺伝子を過剰発現する方法が有用である。
【００２１】（発明の開示）
本発明は、それ故、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在の予備知識を必要としない。
【００２２】  本発明はまた、非相同的組換えにより、遺伝子発現を活性化または遺伝子を過剰発現させる、新規なベクター構築物を包含する。新規な構築物には、相同的な標的配列がない。すなわち、宿主細胞ＤＮＡを標的とし、その標的部位において相同的組換えを促進するヌクレオチド配列を含まず、導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を引き起こす。
【００２３】  新規なベクター構築物は、不対スプライスドナー配列(unpaired splice donor sequence)に機能的に結合した転写調節配列を含むベクターを含み、さらに、１つ以上の増幅可能なマーカーを含む。
【００２４】  新規なベクター構築物は、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列と不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとエピトープタグと不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとシグナル配列とエピトープタグとに機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を含む構築物と、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列とエピトープタグと配列特異的プロテアーゼ部位に機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を有する構築物とを含む。
【００２５】  ベクター構築物は、組換え宿主細胞選択のための１つ以上の選択マーカーを含むことができる。あるいは、選択は、活性化内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。
【００２６】  これらのベクター、および実際本明細書に開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により容易に認識されるベクターの変形を、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【００２７】  本発明のベクター構築物で使用した転写調節配列は、プロモーターを含むがこれに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターはウイルス性プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは、細胞性、非ウイルス性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【００２８】  本発明のベクター構築物に使用した転写調節配列は、エンハンサーを含み得るがこれに限定されない。好ましい実施形態において、エンハンサーはウイルス性エンハンサーである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性非ウイルス性エンハンサーである。
【００２９】  本明細書に記載した方法の好ましい実施形態において、ベクター構築物は、線状ＲＮＡまたはＤＮＡであるか、またはこれを含み得る。
【００３０】  ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３１】  遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物（また、本明細書では互換的に「発現産物」とも呼ぶ）の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【００３２】  あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。本発明の、あるかかる態様において、ゲノムに取込まれた本発明のベクター構築物を含む細胞を、真核生物（例えば脊椎動物、特に哺乳動物、より特定するとヒト）に、その真核生物におけるインビボでの細胞による遺伝子の過剰発現または活性化に好ましい条件下で導入し得る。関連した、かかる本発明の態様において、真核生物に導入する前に、細胞を単離およびクローン化し得る。
【００３３】  本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーを含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３４】  ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３５】  遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００３６】  あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【００３７】  しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上の増幅マーカーを含むことができると理解される。そこで、ベクターおよび目的のＤＮＡ（すなわち過剰発現した遺伝子を含む）の両方の増幅が細胞で生じ、内在性遺伝子のさらなる発現増強が得られる。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。
【００３８】  本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスド供与配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを細胞の非相同的組換えによりゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３９】  ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００４０】  遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００４１】  あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【００４２】  ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００４３】  ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【００４４】  ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【００４５】  本発明の任意のベクター構築物はまた、分泌シグナル配列を含むことができる。分泌シグナル配列は、活性化された内在性タンパク質に機能的に結合するように構築物中に配置している。よって、目的のタンパク質の分泌が細胞において生じ、そのタンパク質の精製が容易となる。従って、方法は、タンパク質発現産物が細胞から分泌される段階を含むことができる。
【００４６】  本発明はまた、上記の任意の方法により作成した細胞を包含する。本発明は、ベクター構築物を含む細胞、ベクター構築物が細胞ゲノムに組込まれた細胞、および内在性遺伝子から所望の遺伝子産物を過剰発現（この過剰発現は導入された転写調節配列により生じる）している細胞を包含する。
【００４７】  細胞を単離およびクローン化できる。
【００４８】  方法は、例えば真菌、植物または動物などの、真核起源の任意の細胞において実施することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、脊椎を有する細胞、特に、哺乳動物細胞（ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒト細胞を含むがこれに限定されない）、およびより特定するとヒト細胞において実施し得る。
【００４９】  上記の方法により作成した単一の細胞は、単一の遺伝子または１つ以上の遺伝子を過剰発現することができる。細胞における１つ以上の遺伝子を、単一の型の構築物をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。同様に、細胞における１つ以上の遺伝子を、複数の構築物（すなわち１つ以上の型の構築物）をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。それ故、細胞は、唯一の型のベクター構築物または異なる型の構築物を含むことができ、各々、内在性遺伝子を活性化できる。
【００５０】  本発明はまた、以下を１つ以上行うことにより、上記した細胞を作成する方法に関する。１つ以上の本発明のベクター構築物の細胞への導入、導入した構築物の非相同的組換えによる細胞のゲノムへの組込み、細胞における１つ以上の内在性遺伝子の過剰発現、および細胞の単離およびクローニング。本発明はまた、かかる方法により産生した細胞（これは単離した細胞であり得る）にも関する。
【００５１】  本発明はまた、特徴づけられた（例えばシークエンスされた）、特徴づけられていない（例えば、その機能は既知であるが、クローン化またはシークエンスされていない遺伝子）、または過剰発現前にはその存在が知られていなかった遺伝子である、内在性細胞遺伝子などの遺伝子を過剰発現するための上記した細胞の使用法を包含する。細胞を使用して、インビトロまたはインビボで所望量の発現産物を産生できる。所望であれば、次いで、この発現産物を、例えば細胞溶解により、または増殖培地からの単離により、単離および精製することができる（ベクターが分泌シグナル配列を含む場合）。
【００５２】  本発明はまた、上記の方法により作成した細胞のライブラリーを包含する。ライブラリーは、単一のトランスフェクション実験から全クローン、または単一のトランスフェクション実験からの部分集合のクローンを包含できる。部分集合は、同一遺伝子または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を過剰発現することができる。トランスフェクションは、単一の構築物を用いて、または１つ以上の構築物を用いて実施することができる。
【００５３】  ライブラリーはまた、２つ以上のトランスフェクション実験からの全ての組換え細胞を合わせることにより、単一のトランスフェクション実験からの細胞の１つ以上の部分集合を合わせることにより、または別々のトランスフェクション実験からの細胞の部分集合を合わせることにより形成できる。得られたライブラリーは、同一の遺伝子、または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を発現できる。再度、各これらの個々のトランスフェクションにおいて、ユニークな構築物または１つ以上の構築物も使用できる。
【００５４】  ライブラリーは、同一の細胞型または異なる細胞型から形成できる。
【００５５】  本発明はまた、同一または異なるトランスフェクション実験から、細胞の様々な部分集合を選択することにより、ライブラリーを作成する方法に関する。
【００５６】  本発明はまた、内在性遺伝子を過剰発現または活性化するために、またはかかる過剰発現または活性化した遺伝子の遺伝子発現産物を得るために、上記の細胞または細胞のライブラリーを使用する方法に関する。本発明のこの態様により、細胞またはライブラリーは、遺伝子の発現についてスクリーニングし得、所望の遺伝子産物を発現する細胞を選択し得る。次いで、細胞を使用して、その後の使用のために遺伝子産物を単離または精製できる。細胞における発現は、細胞による内在性遺伝子の発現産物の産生に好ましい条件下で、インビトロで細胞を培養することにより、または細胞に遺伝子をインビボで発現させることにより行うことができる。
【００５７】  本発明の好ましい実施形態において、方法は、発現産物を単離または精製するプロセスを含む。非常に好ましい実施形態において、内在性遺伝子産物を発現する細胞を、市販、特に診断、治療および薬物探索使用のために、十分量の遺伝子産物の産生に好ましい条件下で培養する。
【００５８】  いずれの方法も、さらに、ベクター組込み前または同時に、二本鎖破壊を細胞のゲノムＤＮＡに導入することを含むことができる。
【００５９】  本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の明細書、および請求の範囲に照らして、その技術分野における通常の当業者には明らかである。
【００６０】（発明を実施するための最良の形態）
非相同的組換えによる遺伝子の活性化には、他の遺伝子活性化法よりも非常に多くの利点がある。以前のタンパク質過剰発現法とは異なり、本明細書に記載した方法は、目的の遺伝子をクローン化（細胞から単離）する必要がない。また、過剰発現する遺伝子のＤＮＡ配列または構造の知識（すなわち、ＯＲＦ、イントロン、エキソン、または上流および下流調節エレメントの配列）、または遺伝子発現パターン（すなわち、組織特異性、発現調節等）の知識を全く必要としない。さらに、この方法は、目的の遺伝子のゲノム組織に関する知識を全く必要としない（すなわちイントロンおよびエキソン構造）。
【００６１】  従って、本発明の方法は、相同的組換えのための標的ヌクレオチド配列を含まないベクター構築物に関する。標的配列により、細胞性ＤＮＡ上の前もって決定した部位における細胞性ＤＮＡとベクターＤＮＡの相同的組換えが可能となり（その部位はベクターの配列と相同性を有する）、前もって決定した部位での相同的組換えにより、転写調節配列がゲノムに導入され、続いて内在性遺伝子の活性化が起こる。
【００６２】  本発明の方法は、前もって決定した部位でのベクターの組込みに関するものではない。代わりに、本法は、非相同的または「非正統的」組換えにより、本発明のベクター構築物の細胞性ＤＮＡ（例えば細胞ゲノム）への組込みに関する。
【００６３】  本明細書に記載のベクターは標的配列を含まない。標的配列は、活性化する遺伝子内または活性化する遺伝子の上流の配列または配列群と相同性を有するベクター上の配列であり（ここで、上流領域は、目的の遺伝子の同一のコード鎖上の最初の機能的スプライス受容部位まで、およびこれを含む）、この相同性を用いて、目的の遺伝子を活性化する転写調節配列を、活性化する遺伝子を含む細胞のゲノムに組込む。内在性遺伝子を活性化するためのエンハンサー組込みベクターの場合、ベクターは、エンハンサー機能が有効な距離範囲において、目的の遺伝子の上流または下流のゲノム内（または目的の遺伝子内）のどの配列も相同性を含まない。
【００６４】  それ故、本法は、慣用的および現在利用可能なクローニング技術を使用して見落とした、または見落とし得る、新規な遺伝子を同定できる。本明細書に記載した構築物および方法の使用により、知られていないおよび／または特徴づけられていない遺伝子を、迅速に同定および過剰発現でき、タンパク質を産生できる。タンパク質は、とりわけ、ヒト治療剤および診断剤として、および薬物探索の標的として使用される。
【００６５】  この方法はまた、タンパク質をインビトロまたはインビボで産生するための、既知および／または特徴づけられている遺伝子の過剰発現を行うことができる。
【００６６】  「既知」遺伝子は、遺伝子の特徴づけのレベルに関する。本発明により、特徴づけられている遺伝子の発現、並びに、特徴づけられていない遺伝子の発現が可能となる。様々なレベルの特徴づけが可能である。これらは、詳細な特徴づけ（例えばクローニング、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質シークエンス）、および遺伝子の調節および機能のクローン化配列への関連を含む（例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列の認識、オープンリーディングフレーム、イントロン等の機能）。特徴づけは、例えば遺伝子のマッピングおよび機能の関連づけ、部分的アミノ酸またはヌクレオチド配列の獲得、または精製タンパク質の獲得および機能の確認などのように詳細度を低くし得る。特徴づけは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が既知であるか、またはタンパク質を単離したが、その機能は知られていない場合には、最小限であってもよい。あるいは、機能は、既知であるが、関連するタンパク質またはヌクレオチド配列は知られていないか、または既知であるが機能と相関させなくてもよい。最後に、遺伝子の存在およびその機能の両方が知られていないという点で特徴づけが全くないこともあり得る。本発明により、任意の様々な特有の特徴づけ度合いにおける任意の遺伝子の発現が可能となる。
【００６７】  多くの異なるタンパク質（また、本明細書では互換的に「遺伝子産物」または「発現産物」とも呼ぶ）を、単一の活性化構築物により、および１セットのトランスフェクションで活性化および過剰発現することができる。従って、１セットのトランスフェクション体（ライブラリー）における単一の細胞または異なる細胞は、同一または異なる構築物でトランスフェクションした後、１つ以上のタンパク質を過剰発現できる。以前の活性化法は、活性化する各遺伝子につき、ユニークな構築物を創製することが必要である。
【００６８】  さらに、単一の遺伝子に隣接する多くの異なる組込み部位を、単一の構築物を使用して同時に創製および試験することができる。これにより、タンパク質発現のための、活性化構築物の最適なゲノム位置を迅速に決定できる。
【００６９】  以前の方法を使用すると、目的の遺伝子の５'端を、配列および構造に関して広範に特徴づけなければならなかった。産生する各活性化構築物について、適当な標的配列を単離しなければならなかった。通常、これは、活性化する細胞として、同一のヒトまたは動物の実験室株から単離された同質遺伝子的配列でなければならない。ある場合には、このＤＮＡは、目的の遺伝子から５０ｋｂまたはそれ以上であり得る。従って、各標的構築物の産生は、至難の量の内在性遺伝子のクローニングおよびシークエンスを必要とする。しかし、配列および構造情報は、本発明の方法では必要ではないので、知られていない配列および特徴づけられていない上流領域を有する遺伝子を活性化できる。
【００７０】  これは、細胞性ＤＮＡと外来性ＤＮＡ配列の非相同的組換えを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子活性化を使用すると可能となる。非相同的組換えを使用したｉｎ  ｓｉｔｕ遺伝子活性化を達成するために必要な方法および組成物（例えばベクター構築物）は、本発明により提供される。
【００７１】  ＤＮＡ分子は、その遺伝内容をいくつかの異なるおよび別個の機構（相同的組換え、部位特異的組換え、および非相同的／非正統的組換えを含む）により再分配するために再結合できる。相同的組換えは、配列が非常に類似しているＤＮＡの伸展間の組換えを含む。相同的組換えは、遺伝物質の再分配前に、相同的配列間のその長さに沿った対形成を含むことが実証された。クロスオーバーの正確な部位は、相同的セグメントの任意の点であり得る。組換えの効率は、相同的標的配列の長さ（ホープ（Ｈｏｐｅ）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：３９９（１９９１）；レッディー（Ｒｅｄｄｙ）等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６５：１５０７（１９９１））、２つの組換え配列の間の配列同一度（フォン・メルフナー（ｖｏｎ  Ｍｅｌｃｈｎｅｒ）等、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６：９１９（１９９２））、および構築物上に存在する非相同的ＤＮＡに対する相同的ＤＮＡの比（レトソン（Ｌｅｔｓｏｎ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１７：７５９（１９８７））に比例する。
【００７２】  一方、部位特異的組換えは、特異的ＤＮＡ配列により示される、前もって決定した部位における遺伝物質の交換を含む。この反応において、タンパク質リコンビナーゼは、組換えシグナル配列に結合し、鎖切断を創製し、ＤＮＡ鎖交換を容易にする。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えは、部位特異的組換えの例である。
【００７３】  非相同的／非正統的組換え（例えば本発明の方法により有利に使用したもの）は、有意な配列相同性を共有せず、部位特異的組換え配列において生じない、遺伝物質の連結（交換または再分配）を含む。非相同的組換えの例は、非相同的部位での外来性ＤＮＡの染色体への取込み、染色体転座および欠失、ＤＮＡ末端連結、染色体末端の二本鎖破壊修復、架橋−破壊融合、およびトランスフェクトした配列のコンカテマー化を含む。ほとんどの場合、非相同的組換えは、「自由ＤＮＡ末端」の連結を通して生じると考えられている。自由末端は、二次ＤＮＡ末端に直接、または修復またはプロセシング後に、連結できる末端を含むＤＮＡ分子である。ＤＮＡ末端は、５'突出、３'突出、または平滑断端からなり得る。
【００７４】  本明細書に使用したように、レトロウイルス挿入および他の転位反応は、厳密ではない形の非相同的組換えと考えられる。これらの反応は、組換え分子間の相同性の使用を含まない。さらに、部位特異的組換えと異なり、これらの型の組換え反応は、個別の部位間で生じない。代わりに、特異的タンパク質／ＤＮＡ複合体が、唯１つの組換え対（すなわち、レトロウイルスまたはトランスポゾン）上に必要とされ、第二のＤＮＡ対（すなわち細胞ゲノム）は通常比較的に非特異的である。結果として、これらの「ベクター」は、標的化様式のように細胞ゲノムに取込まれず、それ故、それらを使用して本発明に記載の活性化構築物を送達することができる。
【００７５】  本明細書に記載の方法に有用なベクター構築物は、理想的には、細胞のゲノム配列と非相同的組換えを受けて、その細胞において内在性遺伝子を過剰発現する、転写調節配列を含み得る。本発明のベクター構築物はまた、相同的標的配列を欠失している。すなわち、それらは、宿主細胞ＤＮＡを標的化し、その標的部位で相同的組換えを促進する、ＤＮＡ配列を含まない。従って、本発明のベクター構築物の細胞ゲノムへの取込みは、非相同的組換えにより生じ、組込まれたベクター構築物上に含まれる導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を導くことができる。
【００７６】  本発明は、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在の予備知識を必要としない。しかし、活性化する遺伝子の配列が既知である場合、構築物を操作して、適当な配置のベクターエレメント（例えば、開始コドンの位置、内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンの添加、および適当なリーディングフレーム）を含ませ、最大過剰発現および／または適当なタンパク質配列を達成することができる。
【００７７】  本発明のある実施形態において、ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００７８】  遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。所望であれば、次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【００７９】  あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。
【００８０】  ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００８１】  あるいは、ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【００８２】  本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および増幅マーカーを含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００８３】  ベクターを含む細胞は、遺伝子発現用についてスクリーニングする。
【００８４】  遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００８５】  あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【００８６】  ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【００８７】  本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００８８】  ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングする。
【００８９】  遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００９０】  あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【００９１】  ベクター構築物は、本質的に、不対スプライスドナー配列に機能的に結合した転写調節配列から構成でき、また、増幅マーカーも含むことができる。
【００９２】  他の活性化ベクターは、転写調節配列、並びに翻訳開始コドンを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよび分泌シグナル配列を含むエキソン配列；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル配列およびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を有するエキソン配列を含む構築物を含む。各上記の構築物において、構築物上のエキソンは、不対スプライスドナー部位のすぐ上流に位置する。
【００９３】  構築物はまた、調節配列、ポリＡシグナルを欠失した選択マーカー、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ｉｒｅｓ）、および不対スプライスドナー部位を含むことができる（図４）。開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および／またはプロテアーゼ開裂部位が、任意により、ｉｒｅｓと不対スプライスドナー配列の間に含まれ得る。この構築物が遺伝子の上流に組込まれた場合、ポリＡ部位が内在性遺伝子により供給されるため、選択マーカーは効果的に発現される。加えて、ｉｒｅｓによりタンパク質翻訳が下流オープンリーディングフレーム（すなわち内在性遺伝子）で開始可能となるので、下流の遺伝子もまた発現される。従って、この活性化構築物により産生されたメッセージは、ポリシストロン性である。この構築物の利点は、遺伝子の近辺並びに適当な配向で起こらない組込み事象は、薬剤耐性コロニーを産生しないことである。この理由は、（内在性遺伝子により供給された）ポリＡテイルがないので、ネオマイシン耐性遺伝子が効果的に発現されないからである。非産生的な組込み事象の数を減少させることにより、ライブラリーの複雑性を、その範囲（活性化される遺伝子の数）に影響を及ぼすことなく減らすことができ、これはスクリーニングのプロセスを容易にする。
【００９４】  この構築物の別の実施形態において、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え配列を、調節配列とｎｅｏ開始コドンの間並びにｉｒｅｓと不対スプライスドナー部位の間（ｉｒｅｓと開始コドンの間、存在する場合）に含むことができる。目的の遺伝子を活性化した細胞を単離した後、細胞をｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトすることにより、ｎｅｏ遺伝子およびｉｒｅｓを除去することができる。これにより、ポリシストロン性メッセージの産生が削除され、組込まれた活性化構築物上の調節配列から直接、内在性遺伝子を発現することができる。哺乳動物染色体から遺伝子エレメントを欠失することを容易にするＣｒｅ組換えの使用が、記載されている（グ（Ｇｕ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：１０３（１９９４）：サウアー（Ｓａｕｅｒ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２２５：８９０−９００（１９９３））。
【００９５】  従って、本明細書に記載の方法に有用な構築物は、以下を含むがこれに限定されない（また図１から４参照）。
１）調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンを有する構築物。
２）調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンをスプライスドナー部位と共に有する構築物。
３）調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
４）調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
５）調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
６）調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
７）調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
８）調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
９）調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１０）調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１１）調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１２）調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１３）調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１４）調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１５）調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１６）調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１７）調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５'から３'）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１８）選択マーカーに結合した調節配列を、内部リボソーム侵入部位、および不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１９）ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えシグナルが、ａ）調節配列と選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間およびｂ）ｉｒｅｓと不対スプライスドナー部位との間に位置する構築物１８。
２０）停止コドンを欠失した緑蛍光タンパク質を含むエキソンに機能的に結合した調節配列を不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
【００９６】  しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つまたは２つ）の増幅マーカーを含むことができると理解する。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。活性化構築物上に１つ以上の増幅マーカーを配置することにより、活性化された細胞において目的の遺伝子と１つ以上の増幅マーカーの並置が生じる。一旦活性化された細胞が単離されれば、目的の遺伝子および活性化構築物の両方を含む遺伝子座のコピー数が増加した細胞を選択することにより、さらに発現を増加させることができる。これは、当業者に周知の選択法により、例えば、遺伝子構築物またはベクター上に含まれる１つ以上の増幅マーカーに特異的な１つ以上の選択剤を含む選択培養培地で、細胞を培養することにより達成できる。
【００９７】  上記の任意のベクターの非相同的組込みにより内在性遺伝子を活性化した後、組込まれたベクター上に位置する増幅マーカーのコピーが増加したものを選択することにより、内在性遺伝子の発現をさらに増加させ得る。かかるアプローチは、組込まれたベクター上の１つの増幅マーカーを使用して達成し得るが、別の実施形態において、本発明は、２つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカーを、ベクター上に含ませて、ベクターおよび目的のフランキング遺伝子が増幅した細胞をより効率的に選択し易くし得る方法を提供する。このアプローチは、ベクター上に含まれる１つ以上の機能的内在性増幅マーカーのコピーを有する細胞において特に有用である。なぜなら、この選択法により、ベクターにコードされた増幅マーカーではなく、内在性増幅マーカーを間違えて増幅した細胞を単離できるからである。このアプローチはまた、遺伝子増幅に関与しない機構により、選択剤に対する耐性を発達させた細胞に対して選択するのに有用である。２つ以上の増幅マーカーを使用したアプローチが、これらの状況では有利である。なぜなら、組込まれたベクターおよび目的のフランキング遺伝子を増幅することなく、２つ以上の選択剤に対する耐性（２つ以上の増幅マーカーによりコードされた耐性）を細胞が発達させる可能性は、任意の単一の選択剤に対する耐性を細胞が発達させる可能性よりも有意に低いからである。従って、２つ以上のベクターによりコードされた増幅マーカーを、同時または順次選択することにより、最終的に単離された細胞が、多くの割合で、増幅されたベクターおよび目的の遺伝子を含む。
【００９８】  従って、別の実施形態において、本発明のベクターは、２つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカーを含み得る。このアプローチにより、発現の活性化後にベクター配列および隣接する目的の遺伝子のより効率的な増幅が可能となる。
【００９９】  本ベクターの構築に使用し得る増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼを含むがこれに限定されない。
【０１００】  また、本明細書に記載した任意の構築物は、増幅マーカーの代わりに、またはそれと共に、真核ウイルス性複製起源を含み得ると理解される。ウイルス性複製起源の存在により、組込みベクターおよび隣接する内在性遺伝子をエピソームとして単離でき、および／または適当なウイルス性複製タンパク質を導入すれば多くのコピー数を増幅できる。有用なウイルス性起源の例は、ＳＶ  ４０  ｏｒｉおよびＥＢＶ  ｏｒｉ  Ｐを含むがこれに限定されない。
【０１０１】  本発明はまた、本明細書で開示した構築物が、本質的に、これらの構築物について特記した成分から構成される実施形態を包含する。また、上記の構築物は、本明細書に記載の方法に有用な構築物の例であるが、本発明はかかる構築物の機能性等価体も含むことを理解する。
【０１０２】  「ベクター」なる語は、一般的に、ヌクレオチド配列を細胞に導入する媒体を意味すると理解される。任意の特定の配列に限定する意図はない。ベクターはそれ自体、内在性遺伝子を活性化するヌクレオチド配列であり得るか、または内在性遺伝子を活性化する配列を含み得る。従って、ベクターは、本質的に、活性化に必要なこれらの配列のみを含む単純な線形または環形ポリヌクレオチドであり得るか、または大きなポリヌクレオチド、または他の構築物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノム、全ビリオン、または非常に重要なヌクレオチド配列の細胞への導入に使用する他の生物学的構築物）におけるこれらの配列であり得る。
【０１０３】  ベクターは、天然に存在するか、または遺伝子工学または合成プロセスにより創製されたＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１０４】  構築物は細胞のゲノムへの非相同的組込み時に、内在性遺伝子の発現を活性化できる。内在性遺伝子の発現により、組込み部位（例えば上流領域対イントロン２）に依存して、全長のタンパク質が産生されるか、または端を切り取った生物学的に活性な形の内在性タンパク質が得られる。活性化される遺伝子は、周知の遺伝子（例えば以前にクローン化または特徴づけられた）または知られていない遺伝子（以前にクローン化または特徴づけられていない）であり得る。遺伝子の機能は、既知であるか、または知られていない。
【０１０５】  周知の活性を有するタンパク質の例は、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、酵素、構造タンパク質、細胞表面レセプター、細胞内レセプター、ホルモン、抗体、および転写因子を含むがこれに限定されない。本法により産生できる既知タンパク質の特殊な例は、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨成長因子−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、肝細胞成長因子、内皮細胞成長因子、ニューロトロピン−３、トロンボポエチン、絨毛ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、αグルコシダーゼ、上皮成長因子、および繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定されない。本発明はまた、トランスメンブランタンパク質を発現する様々な遺伝子の活性化、およびかかるタンパク質［上記したような成長因子、ホルモン、神経伝達物質およびサイトカインの細胞表面レセプター、トランスメンブランイオンチャネル、コレステロールレセプター、リポタンパク質（ＬＤＬおよびＨＤＬを含む）および他の脂質部分のレセプター、インテグリンおよび他の細胞外マトリックスレセプター、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリンレセプター、ＣＤ抗原（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ３４抗原を含む）、および当業者に周知の他の細胞表面トランスメンブラン構造および機能タンパク質を含むがこれに限定されない］の産生および単離を可能とする。通常の当業者には理解されるように、当業者に周知の他の細胞性タンパク質およびレセプターはまた、本発明の方法により産生し得る。
【０１０６】  本明細書に記載した方法の利点の１つは、事実上任意の遺伝子を活性化できることである。しかし、遺伝子は様々なゲノム構造（様々なイントロン／エキソン境界および開始コドンの位置）を有するので、細胞個体群内の様々な遺伝子を最も多く活性化するために、多様な活性化構築物が提供される。
【０１０７】  これらの構築物は、別々に細胞にトランスフェクトさせ、ライブラリーを産生できる。各ライブラリーは、独特な１セットの活性化された遺伝子を有する細胞を含む。ある遺伝子は、数個の異なる活性化構築物により活性化される。加えて、遺伝子の一部を活性化することにより、端を切り取った生物学的に活性なタンパク質を産生できる。端を切り取ったタンパク質は、例えば、活性化構築物を、第二エキソンの上流ではなく内在性遺伝子の中間のイントロンまたはエキソンに組込むことにより産生できる。
【０１０８】  また、異なる構築物の使用により、活性化された遺伝子を新しい配列を含むように修飾することができる。例えば、分泌シグナル配列を、活性化構築物上に含ませて、活性化された遺伝子の分泌を容易にすることができる。ある場合には、イントロン／エキソン構造または目的の遺伝子に依存して、分泌シグナル配列は、内在性遺伝子のシグナル配列の全部または一部を置換できる。他の場合には、シグナル配列により、通常は細胞内に位置するタンパク質の分泌が可能となる。
【０１０９】  ベクター上の調節配列は、構成プロモーターであり得る。あるいは、プロモーターは誘導性であり得る。誘導プロモーターの使用により、基礎レベルの低い活性化されたタンパク質が、慣用的な培養および増殖の間に、細胞により産生されることが可能となる。よって、細胞を、例えば製造またはスクリーニング中に、大量の所望のタンパク質を産生するために誘導し得る。誘導プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含むがこれに限定されない。
【０１１０】  本発明の好ましい実施形態において、ベクター上の調節配列は、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーであり得る。
【０１１１】  ベクター上の調節配列は、細胞性またはウイルス性ゲノムから単離できる。細胞性調節配列の例は、アクチン遺伝子、メタロチオネインＩ遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、カゼインＩ遺伝子、血清アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、グロビン遺伝子、ラミニン遺伝子、スペクトリン遺伝子、アンキリン遺伝子、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ遺伝子およびチューブリン遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。ウイルス性調節配列の例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子、アデノウイルス後期遺伝子、ＳＶ４０遺伝子、レトロウイルスＬＴＲ、およびヘルペスウイルス遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。典型的には、調節配列は、ＮＦ−ｋＢ、ＳＰ−１、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＰ−１、およびＣＡＡＴ結合タンパク質などの転写因子の結合部位を含む。機能的には、調節配列は、内在性遺伝子の転写を、促進、増強、または別様に変化させる能力により定義される。
【０１１２】  好ましい実施形態において、調節配列は、ウイルス性プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ最初期遺伝子プロモーターである。別の実施形態において、調節エレメントは、細胞性、非ウイルス性プロモーターである。
【０１１３】  好ましい実施形態において、調節エレメントは、エンハンサーを含む。非常に好ましい実施形態において、エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性、非ウイルス性エンハンサーである。
【０１１４】  転写調節配列は、骨格付着領域またはマトリックス付着部位、負の調節エレメント、および転写因子結合部位から構成できる。調節配列はまた遺伝子座制御領域も含むことができる。
【０１１５】  本発明は、レトロウイルス転写調節配列、例えば長末端反復配列の使用を包含する。しかし、これらを使用する場合、それらは活性化する内在性遺伝子（すなわち転写調節配列が再結合して活性化する細胞性遺伝子）の転写のプロモーターまたはエンハンサーとして、転写調節配列の機能に実質的に作用する任意のレトロウイルス配列に必ずしも結合しているわけではない。
【０１１６】  構築物は、ベクター上のエキソン配列に機能的に結合していない調節配列を含み得る。例えば、調節配列がエンハンサーである場合、それを内在性遺伝子の近く（例えば、上流、下流、またはイントロン中）に組込むと、その内在性プロモーターから遺伝子の発現を刺激することができる。この活性化機構により、ベクター由来のエキソン配列は、活性化された遺伝子の転写物には存在していない。
【０１１７】  あるいは、調節エレメントは、エキソンに機能的に結合し得る。エキソンは、天然の配列であり得るか、または非天然であり得る（例えば合成により製造）。最初のエキソンに開始コドンを欠失した内在性遺伝子を活性化するために（例えば卵胞刺激ホルモン−β）、開始コドンは、好ましくはベクター上のエキソンから削除する。最初のエキソンに開始コドンを含む内在性遺伝子を活性化するために（例えば、エリスロポエチンおよび成長ホルモン）、ベクター上のエキソンは、好ましくは、開始コドン、通常ＡＴＧ、および好ましくは効率的な翻訳開始部位を含む（コザック（Ｋｏｚａｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９４７（１９８７））。エキソンは、開始コドンの後に追加のコドンを含み得る。これらのコドンは、天然遺伝子由来であり得るか、または非天然であり得る（例えば合成）。コドンは、活性化する内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンと同一であり得る。あるいは、コドンは、内在性遺伝子の最初のコドンに存在するコドンとは異なり得る。例えば、コドンは、エピトープタグ、シグナル分泌配列、トランスメンブランドメイン、選択マーカー、またはスクリーニングマーカーであり得る。任意により、不対スプライスドナー部位が、エキソン配列のすぐ３'側に存在し得る。活性化する遺伝子の構造が既知である場合、ベクターのコドンが、スプライシング後に内在性遺伝子の第二エキソンのコドンと共にフレーム内になるように、スプライスドナー部位を位置的にベクターエキソンの隣に配置する。活性化する内在性遺伝子の構造が既知である場合、各々異なるリーディングフレームを含む別々の構築物を使用する。
【０１１８】  機能的結合は、指定された配列（群）を介した転写を可能とする配置と定義する。例えば、エキソン配列に機能的に結合した調節配列は、エキソン配列が転写されることを示す。開始コドンがベクター上に存在する場合、機能的結合はまた、ベクターエキソン由来のオープンリーディングフレームが、内在性遺伝子のオープンリーディングフレームと共にフレーム内にあることを示す。非相同的組込み後、ベクター上の調節配列（例えばプロモーター）は、内在性遺伝子に機能的に連結し、通常ＣＡＰ部位と呼ばれる部位で転写開始を容易にする。転写は、ベクター上のエキソンエレメントを介して（存在する場合、開始コドン、オープンリーディングフレーム、および／または不対スプライスドナー部位を介して）、および内在性遺伝子を介して進行する。この機能的結合により産生された初期転写物は、スプライスを受けて、ベクターおよび内在性遺伝子の両方由来のエキソン配列を含むキメラ転写物を創製する。この転写物は、翻訳されて内在性タンパク質を産生できる。
【０１１９】  エキソンまたは「エキソン配列」は、成熟ＲＮＡ分子に存在する任意の転写された配列と定義する。ベクター上のエキソンは、例えば５'非翻訳領域などの非翻訳配列を含み得る。あるいは、または非翻訳配列と共に、エキソンは、開始コドンおよびオープンリーディングフレームなどのコード配列を含み得る。オープンリーディングフレームは、天然アミノ酸配列または非天然アミノ酸配列（例えば合成コドン）をコードできる。オープンリーディングフレームはまた、シグナル分泌配列、エピトープタグ、エキソン、選択マーカー、スクリーニングマーカー、または内在性遺伝子にスプライスされた場合にオープンリーディングフレームを保存するように機能するヌクレオチドをコードし得る。
【０１２０】  初期転写物のスプライシング（このプロセスによりイントロンが除去される）は、それぞれ、イントロンの５'および３'末端に位置する、スプライスドナー部位およびスプライス受容部位により指図される。スプライスドナー部位の共通配列は、（Ａ／Ｃ）ＡＧ  ＧＵＲＡＧＵ（ここでＲはプリンヌクレオチドを示す）であり、１−３位のヌクレオチドは、エキソンに位置し、ヌクレオチドＧＵＲＡＧＵはイントロンに位置する。
【０１２１】  不対スプライスドナー部位は、本明細書において、下流スプライス受容部位を含まない、活性化構築物上に存在するスプライスドナー部位として定義する。ベクターを非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組込む場合、不対スプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と対を形成する。次いで、ベクター由来のスプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と共に、ベクタースプライスドナー部位と内在性スプライス受容部位の間の全ての配列の切出しを指図する。これらの介入配列の切出しにより、内在性タンパク質の翻訳を妨害する配列が除去される。
【０１２２】  本明細書で使用した上流および下流なる語は、それぞれ、コード鎖に関して５'または３'方向にあることを意味する。遺伝子の「上流領域」なる語は、第二エキソンの５'核酸配列（コード鎖に関して）から、同コード鎖を有する最初に隣接する遺伝子の最後のエキソンまでを含むと定義する。機能的に、上流領域は、非相同的組込みベクターを内在性遺伝子に機能的に結合可能な、内在性遺伝子の第二エキソンの５'部位である。
【０１２３】  ベクター構築物は、非相同的に組込んだ活性化構築物を含む細胞の同定および単離を容易にする選択マーカーを含むことができる。選択マーカーの例は、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＲＴ）、プロマイシン（ｐａｃ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、ヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＡＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性１（ｍｄｒ１）、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）をコードする遺伝子を含む。
【０１２４】  あるいは、ベクターは、選択マーカーの代わりに、または加えて、スクリーニングマーカーを含むことができる。スクリーニングマーカーにより、ベクターを含む細胞を、薬物または他の選択的圧力下に配置することなく、単離できる。スクリーニングマーカーの例は、細胞表面タンパク質、蛍光タンパク質、および酵素をコードする遺伝子を含む。ベクター含有細胞を、例えば、ベクターにコードされた酵素により蛍光産物に変換可能な細胞表面タンパク質または基質に、蛍光標識した抗体を使用してＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）により単離し得る。
【０１２５】  あるいは、選択は、内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。それ故、活性化構築物は、内在性遺伝子自体により付与される「マーカー」以外の選択マーカーを欠損し得る。この実施形態において、活性化された細胞は、活性化された遺伝子により付与される表現型に基づき選択可能である。選択表現型の例は、細胞増殖、成長因子依存性成長、コロニー形成、細胞分化（例えば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞等への分化）、足場非依存性成長、細胞性因子の活性化（例えば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼ等）、細胞表面レセプター／タンパク質の発現、細胞間接着の増加または減少、遊走、細胞活性化（例えば、休止対活性化Ｔ細胞）を含む。
【０１２６】  トランスフェクトした細胞について、安定な組込み体を選択することなく、遺伝子活性化産物のスクリーニングを行う場合、選択マーカーは構築物から削除し得る。これは、安定な組込み体の効率が高い場合に特に有用である。
【０１２７】  ベクターは、組込みベクターおよび隣接する活性化された内在性遺伝子のコピーの増加した細胞の選択を可能とするために、１つ以上（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つまたは２つ）の増幅マーカーを含み得る。増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、およびカルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＡＤ）を含むがこれに限定されない。
【０１２８】  ベクターは、遺伝子増幅に有用な真核ウイルス性複製起源を含み得る。これらの起源は、増幅マーカーの代わりに、または共に存在し得る。
【０１２９】  ベクターはまた、微生物において構築物の繁殖に有用な遺伝子エレメントを含み得る。有用な遺伝子エレメントの例は、微生物複製起源および抗生物質耐性マーカーを含む。
【０１３０】  これらのベクター、および本明細書で開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により認識される明らかなベクターを、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【０１３１】  構築物の細胞ゲノムへの非相同的組込みにより、ベクター由来の調節エレメントと内在性遺伝子由来のエキソンの間に機能的な結合が形成される。好ましい実施形態において、ベクター調節配列の挿入を使用して、内在性遺伝子の発現をアップレギュレートする。遺伝子発現のアップレギュレーションは、転写的にサンレントな遺伝子の転写的に活性な遺伝子への変換を含む。また、転写的にはすでに活性であるが、所望よりも少ないレベルのタンパク質を産生する遺伝子についての遺伝子発現の増強も含む。他の実施形態において、内在性遺伝子の発現は、発現のダウンレギュレーション、誘導性表現型の創製、または発現の組織特異性の変化など別様に影響され得る。
【０１３２】  本発明によると、遺伝子発現生成物のインビトロでの生成方法は、たとえば、（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）細胞による内在性遺伝子の発現生成物の生成に適した条件下で、細胞を培養する；ことで構成される。このような本発明のインビトロ方法はさらに、単離遺伝子発現生成物を生成するために、発現生成物の単離を含む。このような方法では、これに限定されるわけではないが、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、ＬＣ、イオン交換、親和性、サイズ排除など）、沈降（硫酸アンモニウム沈降、免疫沈降など）、電気泳動、通常の当業者に周知のタンパク質単離および精製の別の方法を含む、周知のあらゆるタンパク質分離方法を有利に利用できる。
【０１３３】  同様に、遺伝子発現生成物のインビボ生成方法は、たとえば、（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）単離およびクローン化された細胞を、真核生物のインビボ細胞による内在性遺伝子の過剰発現に適した条件下で、真核生物に導入する；ことで構成される。本発明のこの側面により、菌類（特に酵母）、植物、動物、さらに好ましくは動物、またさらに好ましくは脊椎動物、もっとも好ましくは哺乳類、特にヒトを含む、あらゆる真核生物を有利に使用できる。ある関連する実施例において、本発明は、細胞を真核生物に導入する前に細胞の単離とクローニングを含む方法を提供する。
【０１３４】  本明細書で使用するように、細胞またはインビトロの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビトロの細胞による、発現生成物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、適切な環境・物理・栄養または生化学に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。このような条件はもちろん、インビトロの細胞による、発現性生物の生成、あるいは遺伝子の過剰発現または活性化に適した、あるいは実現・促進または助長する、培地、インキュベーション、照明、湿度などを含む。同様に、本明細書で使用するように、細胞またはインビボの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビボで真核生物内の細胞による、発現性生物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、細胞を含む動物を維持するための、適切な環境・物理・栄養・生化学・行動・遺伝子および感情に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。所与の条件セットがインビトロまたはインビボで、遺伝子の発現、活性化または過剰発現にとって有利かどうかは、以下で説明および例証するスクリーニング法、あるいは遺伝子の発現、活性化または過剰発現を測定するための当業界において通常の、他の方法を用いて、通常の当業者が決定できる。
【０１３５】  本発明は、上記の方法のいずれかを用いて作成した細胞も含む。本発明は、ベクター作成物、ベクター生成物が組込まれた細胞、内在性遺伝子による過剰発現する所期の遺伝子生成物である細胞、導入された転写調節配列によって引き起こされる過剰発現を含む。
【０１３６】  本発明で使用される細胞は、任意の真核種から得ることができ、一次化、二次化、不死化できる。さらに細胞は、インビボのいずれの組織から得てもよい。単離および活性化する細胞を得るための、有用な組織の例として、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、精巣、卵巣、島、腸、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、胎仔、免疫および造血系が挙げられる。細胞の種類としては、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。しかし、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するには、いずれの細胞または細胞の種類でも使用できる。
【０１３７】  本方法は、菌類、植物または動物などの、真核起源のいずれの細胞内でも実施できる。好ましい実施例として、脊椎動物、特に哺乳類、そしてさらに好ましくはヒトが挙げられる。
【０１３８】  作成物は、一次、二次または不死化細胞に組込める。一次細胞とは、脊椎動物から単離されて、継代培養されていない細胞である。二次細胞とは、継代培養されたが、不死化されていない一次細胞である。不死化細胞とは、見かけ上は無期限に継代培養可能な細胞系である。
【０１３９】  好ましい実施例では、細胞は不死化細胞系である。不死化細胞系の例として、これに限定されるわけではないが、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、２９３セル、ＫＢ癌、Ｔ８４結腸上皮細胞系、Ｒａｊｉ、Ｈｅｐ  Ｇ２またはＨｅｐ  ３Ｂ肝癌細胞系、Ａ２０５８黒色腫、Ｕ９３７リンパ腫、Ｗ１３８繊維芽細胞細胞系、体細胞雑種、融合細胞が挙げられる。
【０１４０】  本発明で用いる細胞は、これに限定されるわけではないが、（ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒトなどの）哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、は虫類細胞、植物細胞、酵母細胞を含む、任意の真核種から得られる。特定の種による内在性遺伝子または遺伝子生成物の過剰発現は、その種の細胞内での遺伝子発現を活性化することによって発生することが好ましい。たとえば、内在性ヒトタンパク質を過剰発現させるには、ヒト細胞を用いる。同様に、ウシタンパク質を過剰発現させるには、たとえばウシ成長ホルモン、ウシ細胞を用いる。
【０１４１】  細胞は真核生物のどの組織から得てもよい。単離・活性化する細胞を得る、有用な脊椎動物の組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、免疫系（リンパ腺を含む）、精巣、卵巣、島、腸、胃、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、接合体、胎仔、造血組織が挙げられる。有用な脊椎動物の細胞の種類としては、これに限定されるわけではないが、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、生殖細胞（すなわち、精母細胞／精子および卵母細胞）、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。単離・活性化する細胞を得る、植物組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、葉組織、子房組織、雄ずい組織、雌ずい組織、根組織、塊茎、配偶子、胚などが挙げられる。しかし、通常の当業者は、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するのに、あらゆる真核細胞または細胞種類を使用できることを認識するであろう。
【０１４２】  説明したいずれかの方法を用いて生成した細胞はすべて、必要な遺伝子生成物の発現のためのスクリーニングと、細胞内で過剰発現する遺伝子生成物の必要量の供給に有効である。細胞は、単離・クローニングできる。
【０１４３】  本方法で生成された細胞は、インビトロ（たとえば、タンパク質療法として使用）またはインビボ（たとえば、細胞療法で使用）でタンパク質を生成するのに用いられる。
【０１４４】  工業用の培養および生成条件は、分析用途（クローニング、タンパク質または核酸シークエンシング、抗体培養、Ｘ線結晶分析、酵素学的分析など）に細胞を培養・調整するのに用いる条件によって変化することが多い。ローラーボトルで培養する場合の細胞のスケールアップには、細胞を固定する表面積の増加も含まれる。そのため、工業用の培養では、マイクロキャリアビーズを追加して表面積を増加することが多い。撹拌培養での細胞のスケールアップには、体積を大幅に増加させることが含まれる。マイクロキャリアおよび撹拌培養では、５リットル以上必要になることもある。興味のあるタンパク質の固有効力（比活性）によって、体積は１から１０リットルと少なくなることもある。１０から１５リットルが最も普通である。しかし、５０から１００リットルまで必要な場合もあり、体積が１０，０００から１５，０００リットルにもなることがある。場合によっては、さらに大きな体積が必要なこともある。細胞は、多数、たとえば５０から１００個のＴフラスコでも培養できる。
【０１４５】  培養条件にもかかわらず、工業規模のタンパク質精製は、分析目的の精製によってもかなり変化する。工業用の実際的な状況でのタンパク質精製は、最初は、約１０4細胞／ｍｌで、１０リットルの細胞の細胞量同等物である。細胞精製を開始する細胞量同等物は、最高１０6または１０7細胞／ｍｌで、１０リットルの細胞にもなり得る。しかし、通常の当業者は、本方法においては、最初の細胞量同等物が多くても少なくても有利に利用できることを認識するであろう。
【０１４６】  特に最終生成物を臨床的に使用する際の、別の工業用の培養条件は、意図された培地が血清をまったく、あるいは細胞培養に必要な量含まない、無血清培地で細胞を培養することである。これは明白に、好ましくない毒性汚染物質（ウィルスなど）あるいは、たとえば精製を複雑にするタンパク質などの他の種類の汚染物質の共精製を防ぐ。細胞培養用の無血清培地、このような培地の市販供給元、無血清培地での細胞の培養方法は、通常の当業者には周知である。
【０１４７】  上記の方法で作成した１個の細胞は、１個あるいは複数の遺伝子を過剰発現できる。複数の遺伝子は、同一の細胞内に作成物を１個組込むか、作成物を複数（すなわち、複数の種類の作成物）組込むことによって活性化できる。そのため、細胞は１種類のベクター作成物のみか、さまざまな種類の作成物を含むことが可能で、それぞれ内在性遺伝子を活性化できる。
【０１４８】  本発明は、以下の１つまたは複数による、上で説明した細胞作成方法も対象としている：１個以上のベクター作成物を導入する；導入した作成物を、非相同的組換によって細胞のゲノムに組込む；細胞内で１個以上の内在性遺伝子を過剰発現させる；細胞を単離・クローニングする。
【０１４９】  「形質移入」という語は、本明細書では便宜上、ポリヌクレオチドの細胞への導入を説明する際に用いている。しかし、一般に、ポリヌクレオチドの細胞への導入を指すのに、この語が明確に使用されていることを理解すべきであり、本明細書では、（その明確な意味によるのと同様に）電気穿孔法、リポソーム仲介導入、レトロウィルス仲介導入などの、他の方法による導入を指すことも意図している。
【０１５０】  ベクターは、当業者に周知の多数の方法によって細胞に導入できる。これには、以下に限定されるわけではないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、レセプタ仲介取込、ポリブレン、粒子照射、マイクロインジェクションが含まれる。あるいは、ベクターは（複製可能または不可能な）ウィルス性粒子として細胞に送達できる。核酸の送達に有用なウィルスとしてはたとえば、これに限定されるわけではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスが挙げられる。核酸分子の細胞への送達に適した、通常の当業者に周知の他のウィルスが、本方法で同様に使用されることがある。
【０１５１】  形質移入の後、細胞は当業者に周知の、ベクターと宿主細胞のゲノムとの非相同組込に適した条件下で培養される。非相同的に組込まれたベクターを含む細胞は、当業者に周知の、活性化された内在性遺伝子の発現を促す条件下でさらに培養される。
【０１５２】  ベクター作成物は、単一のＤＮＡ作成物、あるいは独立した作成物として細胞に導入され、コンカテマとなる。
【０１５３】  好ましい例では、ベクター作成物が二本鎖ＤＮＡベクター作成物であるのに対して、ベクター作成物には、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せも含まれる。したがってたとえば、ベクター作成物は、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転換される一本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡに転換されるｃＤＮＡ、最終的に宿主細胞ゲノムと組換を行う二本鎖ＤＮＡとなる。
【０１５４】  好ましい例では、作成物は細胞への導入前に直線化される。活性化作成物の直線化によって、組込過程で染色体末端と反応可能な、ＤＮＡ遊離末端が作成される。一般に、作成物は調節要素（および、存在する場合は、エクソンおよびスプライスドナー配列）の下流で直線化される。直線化はたとえば、調節配列の下流に独特の制限部位を配置したり、形質移入前に該当する制限酵素で作成物を処理することによって促進できる。要求されない場合は、作成物の直線化部位と、基部の最も機能的な要素（不対スプライスドナー配列）の間に「スペーサ」配列を配置すると都合がよい。スペーサ配列が存在すると、形質移入過程におけるヌクレオチド鎖分解による劣化から、ベクターの重要な機能要素が保護される。このスペーサは、本明細書で説明したベクターの必須機能を変化させないヌクレオチド配列によって構成できる。
【０１５５】  内在性遺伝子発現を活性化するには、環状作成物も使用できる。環状プラスミドは、細胞への形質移入時に宿主細胞ゲノムに組込可能なことは、当業者に周知である。形質移入過程で、おそらくＤＮＡの切断が環状プラスミドで発生するため、遊離ＤＮＡ末端が染色体末端に結合できるようになる。作成物ではこれらの切断の一部は、不可欠なベクター機能を破壊しない位置（たとえば、切断は調節配列の下流で発生する）で発生するため、内在性遺伝子を活性化できる配置で作成物を染色体に組込むことができる。上で述べたように、スペーサ配列が作成物に配置される場合がある（たとえば、調節配列の下流）。宿主細胞ゲノムへの組込後、形質移入の間に、スペーサ領域で発生した切断が、内在性遺伝子の活性化に適した作成物の部位に遊離末端を生成する。
【０１５６】  本発明は、上で説明した方法で作成した細胞のライブラリも含む。ライブラリは、１回の形質移入実験のクローンすべてか、１回の形質移入実験によるクローンのサブセットを含むことができる。サブセットは、同一の遺伝子あるいは複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを過剰発現できる。形質移入は、１種類の作成物か、複数の種類の作成物によって行うことも可能である。
【０１５７】  ライブラリは、２回以上の形質移入実験による組換細胞すべてを組合わせるか、１回の形質移入実験による細胞の１個以上のサブセットを組合わせるか、別々の形質移入実験による細胞のサブセットを組合わせて作成することも可能である。得られたライブラリは、同一の遺伝子か、複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを発現できる。これらの各形質移入において再度、独特の作成物あるいは複数の作成物を使用できる。
【０１５８】  ライブラリは、同一の細胞種類または異なる細胞種類から作成できる。
【０１５９】  ライブラリは、自然なＤＮＡ切断、あるいは、照射、制限酵素および／またはＤＮＡ切断剤を、ともに（同じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する）に適用して起こった切断で染色体に組込まれた１種類の活性化作成物を含む、１種類のセルから構成できる。このライブラリは、照射、制限酵素および／またはＤＮＡ切断剤を、ともに（同じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する）適用して処理した細胞のゲノムに組込まれた１個または複数の作成物を含む、複数の種類の細胞で構成できる。
【０１６０】  本発明は、同一または別個の形質移入実験による細胞の各種サブセットを選択してライブラリを作成する方法も対象とする。たとえば、（作成物２０を形質移入した細胞において、緑蛍光タンパク質の存在によって判定した）核核因子を発現する細胞はすべて、活性化核因子を用いて細胞のライブラリを作成するためにプールできる。同様に、膜や分泌タンパク質を発現する細胞もプールできる。細胞は、たとえば成長因子独立成長、成長因子独立増殖、コロニー形成、細胞分化（たとえば神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞などへの分化）、足場独立成長、細胞因子（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）の活性化、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）などの表現型によってもグループ化できる。
【０１６１】  本発明は、内在性細胞を過剰発現するために細胞のライブラリを用いる方法も対象としている。このライブラリは遺伝子の発現についてスクリーニングされ、必要な遺伝子生成物を発現する細胞が選択される。その後、この細胞を用いて、遺伝子生成物を後で使用するために精製する。細胞をインビトロで培養するか、インビボで細胞に遺伝子を発現させることによって、細胞を発現できる。
【０１６２】  本発明はまた、新規遺伝子および遺伝子生成物を識別するためにライブラリを用いる方法も対象としている。
【０１６３】  本発明はさらに、非相同組込のパターンを刺激またはこれに作用する作用薬を用いて細胞を処理することによって、遺伝子活性化の効率を高める方法も対象としている。細胞発現パターン、クロマチン構造、メチル化パターンは、細胞の種類によって劇的に異なることが実証されている。同じ細胞種類の異なる細胞系でも、大きく異なる場合がある。これらの違いは、ＤＮＡ切断パターンと修復過程の両方に影響を与え、非相同組込に大きく影響する。たとえば、ＤＮＡのクロマチン化された範囲（不活性遺伝子と結合しやすい特性）は、制限酵素と化学薬品による切断に対する耐性が大きい一方、照射による切断を受けやすい。
【０１６４】  さらに、不活性遺伝子はメチル化できる。この場合、ＣｐＧメチル化によってブロックされる制限酵素は、不活性遺伝子付近のメチル化部位を開裂できず、メチル化感受性酵素を用いて遺伝子を活性化するのがさらに困難になる。これらの問題は、さまざまなＤＮＡ切断剤を用いて複数の細胞系の活性化ライブラリを作成すれば回避できる。ライブラリを作成すると、より完全な組込パターンを作成でき、与えられた遺伝子が活性化される可能性は最大となる。
【０１６５】  本発明の方法には、２本鎖切断を、過剰発現される内在性遺伝子を含む細胞のＤＮＡに導入することが含まれる。これらの方法は、ベクター組込の前か同時に、２本鎖切断を細胞内のゲノムＤＮＡを導入する。ＤＮＡ切断の機構は、ゲノム内のＤＮＡ切断パターンに著しく影響を及ぼす。結果として、自然に、または照射、制限酵素、ブレオマイシン、または他の切断剤によって人為的に引き起こされたＤＮＡ切断は、異なる位置に発生可能である。
【０１６６】  組込効率を向上させ、組込部位のランダムな分布を改善するために、形質移入の前か後に、少量、普通、大量の照射で細胞を処理できる。形質移入されたＤＮＡは、人為的に２本鎖切断させることによって、宿主細胞の染色体にＤＮＡ修復過程の一部として組込可能である。通常、組込部位として作用する２本鎖切断を作成することは、律速段階である。そのため、照射（または他のＤＮＡ破壊剤）を用いた染色体切断を増やすことによって、所与の形質移入で多数の構成要素が得られる。さらに、照射によるＤＮＡ切断の機構は、自然切断とは異なる。
【０１６７】  照射は、高エネルギーの光子がＤＮＡ分子にぶつかったときに、ＤＮＡ切断を直接引き起こす。照射はその代わりに、細胞内の化合物を活性化し、この化合物がＤＮＡ鎖と反応し、ＤＮＡ鎖を切断させる。一方、自然切断は、細胞内に生成された反応性化合物（スーパーオキシドおよび過酸化物など）とＤＮＡ分子の相互作用によって発生すると考えられる。しかし、細胞内のＤＮＡは、むき出しの除タンパクポリマーとして存在しているのではなく、代わりにクロマチンに結合し、凝集状態で存在している。結果として、一部の領域が、２本鎖を切断させる、細胞内の作用薬に接触できくなる。照射によって生じた光子の波長は、ＤＮＡの凝集領域にぶつかるほど短いため、自然切断で示したよりも下のＤＮＡ領域に切断を引き起こす。したがって、照射はＤＮＡの異なる切断パターンを作成可能で、次に、異なる組込パターンが生成される。
【０１６８】  結果として、細胞内の同一の活性化作成物を用いて作成したライブラリは、照射処理を行っても、行わなくても、活性化遺伝子の異なるセットを潜在的に含む。最終的に、照射処理によって、非相同組込の効率は最大５から１０倍上昇し、少ない細胞を用いて完全なライブラリを作成できる。したがって、照射処理は遺伝子活性化効率を高め、形質移入細胞において新たな組込と活性化パターンを生成する。有用な照射の種類としては、α、β、γ、ｘ線、紫外線照射がある。有用な照射量は細胞の種類によって異なるが、一般に、細胞生存度が０．１から９９％となる照射量範囲が有用である。ＨＴ１０８０細胞の場合、これは137Ｃｓ源による約０．１から１０００ｒａｄの照射量に相当する。他の照射量も、組込頻度が増加したり、組込部位のパターンが変化する限りは有用である。
【０１６９】  形質移入細胞で染色体切断を人為的に引き起こすには、照射以外にも、制限酵素を用いることができる。照射と同様に、ＤＮＡ制限酵素は染色体を切断させ、次にこれが形質移入ＤＮＡの組込部位として作用する。ＤＮＡ切断がこのように増えると、活性化作成物の組込全体の効率が上昇する。さらに、制限酵素による切断の機構は照射の場合とは異なり、染色体切断のパターンも異なると考えられる。
【０１７０】  制限酵素は、光子と比べると比較的大きな分子で、ＤＮＡを破壊する能力を持つ小型の代謝物質である。結果として、制限酵素は、ゲノム全体としてよりも、あまり凝集していない領域を切断しやすくする。興味のある遺伝子がゲノム内の接触可能な領域内にある場合は、細胞を制限酵素で処理すれば、興味のある遺伝子の上流に活性化作成物が組込まれる可能性を高めることができる。制限酵素は具体的な配列を認識するため、そして、所与の制限部位が興味のある遺伝子の上流にない場合があるため、さまざまな制限酵素を使用できる。各酵素は宿主染色体の開裂部位に影響を及ぼす、各種特性（たとえば、大きさ、安定性、メチル化部位の開裂能力、最適反応条件）を備えているため、いろいろな制限酵素を使用することも重要である。各酵素は、開裂可能な制限部位の分布が異なるため、さまざまな組込パターンを作成する。
【０１７１】  したがって、活性化作成物導入の前、導入中、導入後に制限酵素（または制限酵素を発現可能なプラスミド）を導入すると、異なるセットの遺伝子が活性化される。最終的に、制限酵素が引き起こした会列によって、組み込み効率が最大５から１０倍に上昇し（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ．  Ｒｅｓ．  ２４３：１２１（１９９０））、より少ない細胞を形質移入して、完全なライブラリを作成できる。このため、制限酵素を用いて新しい組込パターンを作成し、自然切断あるいは他の人為的に引き起こされた切断での非相同組換によって作成されたライブラリで活性化できなかった遺伝子を活性化できる。
【０１７２】  制限酵素を用いて、活性化作成物をゲノム内の必要な場所にバイアス組込できる。たとえば、平均で５０から１０００キロベースごとに真核ＤＮＡを開裂する複数の希少制限酵素について記述されている。希少制限認識配列が偶然、興味のある遺伝子の上流に位置する場合、活性化作成物との形質移入の際に制限酵素を導入することによって、ＤＮＡ切断は、優先的に興味のある遺伝子の上流で起こる。そして、この切断裂は、活性化作成物の組込部位として作用することがある。興味のある遺伝子内あるいは付近の適当な位置で開裂させる酵素ならどれでもよく、部位はゲノムの残りの部分に過少表現されるか、ゲノム付近に過剰表現される（たとえば、ＣｐＧを含む制限部位）。以前認識されていない遺伝子の場合、８ｂｐの認識部位（たとえば、ＮｏｔＩ、ＳｆｔＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩ、ＳｓｅＩ、ＳｒｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＳｇｆＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ）を備えた制限酵素、ＣｐＧを含む部位（たとえば、ＥａｇＩ、Ｂｓｉ−ＷＩ、ＭｌｕＩ、ＢｓｓＨＩＩ）を認識する酵素、他の希少な切断酵素を使用できる。
【０１７３】  このようにして、ある種の活性化遺伝子について強化した、「バイアス」ライブラリを作成できる。この点について、ＣｐＧジヌクレオチドを含む制限酵素部位は、一般にゲノムでは過少表現されるが、遺伝子活性化にまさに有用な場所の、多くの遺伝子の５’末端ではＣｐＧ島の形で過剰表現されるため、特に有用である。したがって、これらの部位を認識する酵素は、遺伝子配列の５’末端で優先的に開製する。
【０１７４】  制限酵素は複数の方法によって、宿主細胞に導入できる。制限酵素はまず、電気穿孔法によって細胞に導入できる（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ．  Ｒｅｓ．  ２４３：１２１（１９９０）；Ｗｉｎｅｇａｒら、Ｍｕｔ．  Ｒｅｓ．  ２２５：４９（１９８９））。一般に、細胞に導入される制限酵素の量は、電気穿孔媒体の濃度に比例する。電圧、静電容量、抵抗を調節して、各細胞系に対するパルス条件を最適化する必要がある。次に、制限酵素は、真核調節要素の制御下で酵素をコード化するプラスミドから、一時的に発現できる。生成される酵素のレベルは、誘導プロモータを用いたり、誘導強度を変化させて制御できる。場合によっては、（酵素の毒性によって）生成される制限酵素の量を制限することが望ましいこともある。このような場合、弱い、または突然変異のプロモータ、スプライス部位、翻訳開始コドン、ポリＡ尾部を用いて、生成される制限酵素の量を低下させることができる。３番目に、制限酵素は、細胞膜に融着するか、細胞膜を透過する作用薬を導入できる。リポソームおよびストレプトリジン（Ｐｉｍｐｌｉｋａｒら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２５：１０２５（１９９４））は、この種の作用薬の例である。最後に機械的穿孔（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｅｌｌ  ５０：５２３−５３４（１９８７））とマイクロインジェクションを用いて、ヌクレアーゼと他のタンパク質を細胞に導入することも可能である。しかし、活性酵素を生体細胞に導入可能な方法ならすべて適切である。
【０１７５】  ブレオマイシンと他のＤＮＡ破壊作用薬が誘発したＤＮＡ切断によっても、異なるＤＮＡ切断パターンが生成できる。そのため、細胞内で２本鎖切断を生成可能な作用薬およびインキュベーション条件は、効率の上昇および／または非相同組換部位の変更に役立つ。ＤＮＡ切断化学薬品の種類の例として、これに限定されるわけではないが、過酸化物、他のフリーラジカル生成化合物、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬、酸、置換ヌクレオチド、エネジエン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗体が挙げられる。
【０１７６】  具体的なＤＮＡ切断化学薬品の例としては、これに限定されるわけではないが、ブレオマイシン、過酸化水素、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、（アニリン、１−ナフチルアミンまたは１−ナフトールと反応させた）次亜塩素酸、硝酸、リン酸、ドキソルビシン、９−デオキシドキソルビシン、ジメチル−６−ドキソルビシン、５−イミノダウノルビシン、アドリアマイシン、４’−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルフォン−ｍ−アニシジン、ネオカルチノスタチン、８−メトキシカフェイン、エトポシド、エリプチシン、イドクスウリジン、ブロモデオキシウリジンが挙げられる。
【０１７７】  照射あるいはブレオマイシンなどの、少量のＤＮＡ切断作用剤に細胞を事前に露出させておくと、細胞内のＤＮＡ修復機構を引き起こすことが可能である。形質移入の約２４時間前にこれらの作用剤で細胞を事前処理すると、細胞は、ＤＮＡ切断の修復と形質移入後のＤＮＡ組込がさらに効率よく行える。さらに、ＬＤ５０（露出された細胞の致死率が５０％となる量）が事前処理後は高くなるため、照射や他のＤＮＡ切断剤の量を多く使用することもできる。これにより、複数の投与量でランダムな活性化ライブラリが作成され、宿主細胞の染色体内の組込部位の種々の分布が生じる。
【０１７８】    （スクリーニング）
いったん活性化ライブラリ（または複数のライブラリ）が作成されると、多くのアッセイを用いてスクリーニングが可能である。興味のあるタンパク質（たとえば、分泌されたウィルス細胞内タンパク質）の特性とライブラリを作成するのに用いる活性化作成物の性質によって、以下で説明するアッセイのいずれか、あるいはすべてを利用できる。他のアッセイ形式も使用できる。
【０１７９】    （ＥＬＩＳＡ）
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、活性化タンパク質を検出できる。活性化遺伝子生成物が分泌されると、活性化ライブラリ細胞のプールによる培養上清が、興味のあるタンパク質に固有の結合抗体を含むウェルでインキュベートされる。細胞または細胞のグループが興味のある遺伝子を活性化すると、タンパク質が培地に分泌される。ライブラリクローンのプール（プールは、１から１００，０００を超えるライブラリメンバの範囲でよい）をスクリーニングすると、興味のある遺伝子を活性化した細胞を含むプールが識別できる。それから、同朋選択、限界希釈、または当業者に周知の他の技術によって、興味のある細胞を他のライブラリ  メンバから精製できる。分泌されたタンパク質に加えて、ＥＬＩＳＡは、細胞間および膜結合タンパク質を発現する細胞のスクリーニングに用いることができる。このような場合、培養上清をスクーリンニングする代わりに、少数の細胞をライブラリプール（各細胞は、プールごとに少なくとも１００から１，０００回表現される）から除去し、溶解・清澄させ、抗体で被覆したウェルに加える。
【０１８０】    （ＥＬＩＳＡ  スポット  アッセイ）
ＥＬＩＳＡスポットは、興味のあるタンパク質に固有の抗体で被覆される。被覆後、ウェルを１％  ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間、３７℃でブロックする。ブロック後、ランダム活性化ライブラリから１００，０００から５００，０００の細胞を各ウェルに加える（プール全体の最高１０％を表現）。一般に、各ウェルにプール１個を宛てる。興味のあるタンパク質を発現する細胞の頻度が１／１００００の場合（すなわち、プールが１０，０００個のクローンで構成されている場合、その中の１個が興味のあるタンパク質を発現する）、ウェル当たり５００，０００個の細胞で被覆すると、５０個の特異性の細胞が得られる。細胞は、動かしたり、分散させたりせずに、３７℃で２４から４８時間、ウェルでインキュベートする。インキュベーション後、細胞を除去し、プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄する。第２の抗体を適当な濃度でウェルに加え、室温で２時間か、４℃で１６時間インキュベートする。これらの抗体はビオチン化するか、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で直接標識できる。第２の抗体を除去し、プレートをＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄する。ＨＲＰで標識した、第３の抗体またはストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートする。
【０１８１】    （ＦＡＣＳアッセイ）
蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ランダム活性化ライブラリを多くの方法でスクリーニングできる。興味のある遺伝子が細胞表面タンパク質をコード化する場合、蛍光標識された抗体を活性化ライブラリによる細胞と共にインキュベートする。興味のある遺伝子が分泌タンパク質をコード化する場合、細胞をビオチン化して、興味のあるタンパク質に固有の抗体に結合したストレプトアビジンとインキュベートできる（Ｍａｎｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：１９２１（１９９５））。インキュベーション後、細胞を高濃度のゼラチン（またはアガロースやメチルセルロースなど、他のポリマー）に入れて、分泌タンパク質の拡散を抑える。タンパク質が細胞から分泌されると、細胞表面に結合している抗体によって捕捉される。そして、興味のあるタンパク質の存在は、蛍光標識された第２の抗体によって検出される。細胞は、分泌タンパク質と膜結合タンパク質の両方について、蛍光シグナルに従って分類される。その後、蛍光細胞は単離、伸張され、さらにＦＡＣＳ、限界希釈、または、当業者に周知の他の細胞精製技術によって濃縮される。
【０１８２】    （磁気ビーズ分離）
この技術の原理は、ＦＡＣと類似している。（上で説明した）膜結合タンパク質や捕捉された分泌タンパク質は、活性化ライブラリを、興味のあるタンパク質固有の抗体結合磁気ビーズでインキュベートすることで検出される。タンパク質が細胞表面にある場合、磁気ビーズはその細胞に結びつく。磁石を用いると、興味のあるタンパク質を発現する細胞を、ライブラリ中の他の細胞から精製できる。これらの細胞をビーズから除去し、伸張、分析し、必要ならばさらに精製する。
【０１８３】    （ＲＴ−ＰＣＲ）
（少なくともプール中の各クローン数と等しい）少数の細胞を収集・溶解して、ＲＮＡを精製する。単離後、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡが逆転写される。このとき、興味のあるｃＤＮＡに固有のプライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。
【０１８４】  あるいは、活性化作成物内の合成エクソンと内在性遺伝子のエクソンに渡るプライマーを使用できる。このプライマーは、興味のある、内在的に発現された遺伝子をハイブリダイズおよび増幅しない。逆に、活性化作成物が興味のある遺伝子と活性化された遺伝子の発現の上流で組込まれた場合、このプライマーは、遺伝子に固有の第２プライマーとともに、内在性遺伝子によるエクソンにスプライスされた合成エクソンの存在によって、活性化遺伝子を増幅する。したがって、この方法は、通常、興味のある遺伝子を必要なレベルよりも低レベルで発現させる細胞内で、活性化された遺伝子を検出するのに使用できる。
【０１８５】    （表現型選択）
本例では、活性化遺伝子に付与された表現型に基づいて細胞を選択できる。選択可能な表現型の例としては、増殖、成長因子独立成長、コロニー形成、細胞分化（たとえば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞など）、足場独立成長、細胞因子の活性化（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）が挙げられる。上で説明したような表現型を示す活性化細胞を単離することが重要なのは、組込作成物による内在性遺伝子の活性化がおそらく、認められた細胞表現型の原因であるためである。したがって、活性化遺伝子は、認められた表現型を処理したり、誘起するために重要な治療薬または薬ターゲットとなる。
【０１８６】  上記の各アッセイの感受性は、ライブラリ細胞の遺伝子発現を一時的にアップレギュレートすることで、効果的に高めることができる。これは、たとえばライブラリにＰＭＡおよび腫瘍壊死因子αを加えることによって、ＮＦ−κＢ部位を含むプロモータに対して実施できる。別個に、あるいはＰＭＡおよびＴＮＦ−αとともに、酪酸ナトリウムを加えると、さらに遺伝子発現を高めることができる。これらの試薬を加えると、興味のあるタンパク質の発現が増加するため、興味のある遺伝子活性化細胞を識別するために、より感受性の低いアッセイを使用できるようになる。
【０１８７】  多くの遺伝子の活性化を最大にする目的で活性化ライブラリが作成されるため、ライブラリクローンをプールに構成することは有用である。各プールは、１００，０００を超える各クローンで構成できる。したがって、あるプールでは、多くの活性化タンパク質が、多くの場合、希薄濃度で生成される（プール全体の大きさと、特定の活性化タンパク質を生成する、プール内の細胞数が限られていることによる）。したがって、スクリーニング前のタンパク質濃縮は、スクリーニングアッセイにおいて活性化タンパク質を検出する機能を効果的に高める。濃縮について特に有用な方法は、限外濾過である；しかし、他の方法も使用できる。たとえば、タンパク質は、存在する大半またはすべてのタンパク質を結合する条件で、イオン交換、疎水性、色素、ヒドロキシアパタイト、レクチンおよび他の適当な樹脂に吸着させて、非特異的に、または半特異的に濃縮できる。その後、結合タンパク質はスクリーニング前に、少量で除去できる。この方法は、タンパク質の濃縮を促進するために、無血清培地で細胞を培養する場合に有利である。
【０１８８】  別の例では、活性化作成物に含められる有用な配列は、エピトープタグである。エピトープタグは、活性化タンパク質の親和性精製（たとえば、免疫親和性またはキレート基質）を可能にするアミノ酸配列で構成できる。そのため、活性化作成物にエピトープタグを含ませると、活性化ライブラリによる活性化タンパク質すべてが精製できる。活性化タンパク質を他の細胞や培地タンパク質から精製することによって、新規タンパク質と酵素の活性のスクリーニングが行いやすくなる。ある例では、活性化タンパク質の精製後、エピトープタグを除去することが好ましい場合もある。これは、プロテアーゼ認識配列（たとえば、因子ＩＩａまたはエンテロキナーゼ開裂部位）を、活性化作成物のエピトープタグより下流に組込むことで実施できる。精製された活性化タンパク質を適当なプロテアーゼとインキュベートすると、タンパク質からエピトープタグが放出される。
【０１８９】  エピトープタグ配列が活性化作成物上に位置するライブラリでは、活性化タンパク質はすべて、親和性精製を用いて、他の細胞タンパク質および培地タンパク質から精製できる。親和性精製は活性化タンパク質を濃縮するだけでなく、これらのタンパク質を、ライブラリをスクリーニングするのに用いられるアッセイを妨害する可能性のある他の作業から精製する。
【０１９０】  興味のある遺伝子を過剰発現する細胞を含むクローンのプールが確認されると、活性化細胞を単離する手段を行える。活性化細胞の単離は、当業者に周知のさまざまな方法で実施できる。細胞精製方法の例としては、限界希釈、蛍光細胞分析分離、磁気ビーズ分離、同胞選択、クローニングリングを用いた単一コロニー精製が挙げられる。
【０１９１】  本発明の好ましい例では、発現生成物を精製する過程が含まれる。非常に好ましい例では、内在性遺伝子生成物を発現する細胞は、工業用途、特に診断・治療・薬剤発見用途に利用できる量の遺伝子生成物が生成されるように培養される。
【０１９２】  本明細書に記載する方法で使用するベクターはすべて、増幅可能なマーカーを含むことができる。その結果、ベクターと（たとえば、過剰発現遺伝子を含む）興味のあるＤＮＡの両方の増幅が細胞内で起こり、内在性遺伝子の発現がさらに高められる。したがって、内在性遺伝子を増幅する手段を方法に含めてもよい。
【０１９３】  活性化細胞が単離されると、興味のある遺伝子と活性化作成物の両方を含む座位を増幅して、発現をさらに強化することができる。これは、以下に示す方法を単独で、あるいは組合わせることによって、実施できる。
【０１９４】  増幅可能マーカーは、さらに多いコピー数の場合に選択可能な遺伝子である。増幅可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、カルバミルリン酸シンターゼが挙げられる。これらの例の場合、増幅マーカーとフランキング配列（興味のある遺伝子を含む）の多いコピー数は、増幅マーカーによって作用を受ける薬剤や毒代謝物を使用するために選択できる。一般に、薬剤や毒代謝物濃度が上昇すると、増幅可能マーカーの少数のコピーを含む細胞が死に、これに対して、マーカーのコピーを多数含む細胞は生存し、コロニーを形成する。これらのコロニーは、単離、伸張され、興味のある遺伝子の生成の上昇をレベルについて分析できる。
【０１９５】  活性化作成物の増幅可能マーカーの配置は、活性化細胞内の興味のある細胞と増幅可能マーカーと並列になる。コピー数を増やした増幅可能マーカーと興味のある遺伝子を含む活性化細胞は、増量した選択性薬剤（通常は薬剤または代謝物）の存在下で、細胞を培養することによって選択できる。たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサートを用いて選択できる。
【０１９６】  薬剤耐性コロニーは、増加させた各薬剤濃度において発生するため、各コロニーは、増幅可能なマーカーおよび興味のある遺伝子のコピー数に関して選択・特徴付けが可能で、興味のある遺伝子の発現について分析できる。活性化遺伝子発現が最高レベルのコロニーはそれぞれ、より高い薬剤濃度でさらに増幅するために選択できる。最高の薬剤濃度では、クローンが発現する、興味のあるタンパク質の量は著しく増加する。
【０１９７】  ＤＨＦＲを増幅する場合、複数の異なる濃度のメトトレキセートで約１ｘ１０7の細胞をプレートさせると都合がよい。メトトレキセートの有効所期濃度は、約５から１００ｎＭの範囲である。しかし、メトトレキセートの最適濃度は、各細胞系と組込部位について経験的に決定する必要がある。メトトレキセート含有培地での培養後、メトトレキセートの最高濃度によるコロニーを選んで、興味のある遺伝子発現の増加について分析する。その後、最高濃度のメトトレキセートによるクローンは、ＤＨＦＲと興味のある遺伝子をさらに増幅するために選択する、さらに高濃度のメトトレキセート中で培養する。遺伝子増幅の程度が最高のクローンには、マイクロモルおよびミリモル範囲のメトトレキセート濃度を使用できる。
【０１９８】  複製のウィルス起点（たとえば、ｏｒｉ  Ｐまたはヒト細胞のＳＶ４０、マウス細胞のｐｏｌｙｏｍａ  ｏｒｉ）を活性化作成物に配置すると、活性化細胞内の興味ある遺伝子と複製のウィルス起点が並列になる。そして、起点とフランキング配列は、ウィルス複製タンパク質をトランスに導入することで増幅できる。たとえば、ｏｒｉ  Ｐ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスの複製起点）を用いると、ＥＢＮＡ−Ｉが一時的、または安定して発現できる。ＥＢＮＡ−Ｉは、組込まれたｏｒｉ  Ｐ座位から複製を開始する。複製は、起点から双方向に広がる。各複製生成物が作成されると、これも複製を開始できる。結果として、ウィルス起点と、興味のある遺伝子を含むフランキングゲノム配列のコピーが多数作成される。コピー数が多くなると、細胞が興味のある遺伝子をより多く生成できる。
【０１９９】  複製生成物はある頻度で組換を行って、興味のある遺伝子を含む、フランキングゲノム配列を含む環状分子を生成する。興味のある遺伝子を持つ環状分子を含む細胞は、Ｈｉｒｔ抽出とサザンブロッティングによる１回の細胞クローニングと分析で単離できる。精製を行うと、コピー数を増やした（通常１０から５０コピー）エピソームゲノム座位を含む細胞を、培養により繁殖できる。より多く増殖するためには、元の作成物の第１の起点に隣接する第２の起点を含めることにより、エピソームをさらに増加できる。たとえば、Ｔ抗原を用いて、ｏｒｉ  Ｐ／ＳＶ４０エピソームのコピー数を最大１，０００まで増加できる（Ｈｅｉｎｚｅｌら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：３７３８（１９８８））。このようにコピー数を実質的に増加させると、タンパク質の発現を劇的に高めることができる。
【０２００】  本発明は、インビボとインビトロの両方での、内在的遺伝子の過剰発現を含む。そのため、細胞は、遺伝子生成物の必要量を精製するためにインビトロで使用するか、その遺伝子生成物を無傷の動物に提供するためにインビボで使用することが可能である。
【０２０１】  本発明は、本明細書に記載した方法によって生成されたタンパク質も含む。タンパク質は、既知、あるいは以前未知であった遺伝子のいずれかから生成できる。本方法で作成可能な周知のタンパク質の例としては、これに限定されるわけではないが、エリスロポイエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ＴＧＦβ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨成長因子−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、アルファ−１  抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病抑制因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、ニューロトロピンー３、トロンボポイエチン、絨毛膜ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、アルファグルコシダーゼ、上皮成長因子、ＦＧＦ、マクロファージコロニー刺激因子、上記の各タンパク質のための細胞表面レセプタが挙げられる。
【０２０２】  活性化細胞によるタンパク質生成物を生成する場合、当業者に周知の、いずれのタンパク質生成方法を用いてもよい。
【０２０３】    （活性化された膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞の単離）
膜関連タンパク質をコードする遺伝子は、医薬品開発の観点から特に興味深い。これらの遺伝子およびこれら遺伝子のコードするタンパク質は、例えば、コンビナトリアルケミストリーライブラリーやハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、低分子の医薬品を開発するのに利用可能である。また、これらのタンパク質やその可溶型タンパク質（例えば、膜貫通領域を欠いた切断型）は、ヒトや動物において治療的に活性のある医薬品として利用可能である。膜タンパク質の同定は、ツーハイブリッド研究法やアフィニティーキャプチャー技術を用いて、新規リガンド（例えば、サイトカイン、成長因子、および他のエフェクター分子）を同定するのにも利用可能である。他にも多くの膜タンパク質利用法が考えられる。
【０２０４】  内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するための現在の研究法は、ｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子の単離とシークエンシングを含む。次に、タンパク質の膜貫通領域を同定できる疎水性プロットを用いて、ＯＲＦ解析により内在性膜タンパク質を同定する。残念ながら、ｃＤＮＡライブラリーを作製した細胞内で内在性膜タンパク質をコードする遺伝子が発現されていなければ、この方法を用いてその遺伝子は同定できない。さらに、多くの遺伝子は、発生段階の短い時期に、およびまたは非常に低レベルで、非常に限られた細胞でのみ発現する。その結果、現在利用できる研究法では、これらの遺伝子を効率的に同定することができない。
【０２０５】  本発明により、遺伝子の配列、構造、機能、あるいは発現の性質の知識なしに、内在性遺伝子を活性化することができる。この開示した方法を用いて、遺伝子は転写レベルでのみ、あるいは転写と翻訳の両レベルで活性化される。その結果、組み込みベクターを含む細胞内で、活性化内在性遺伝子にコードされるタンパク質が産生される。さらに、ここで開示した特異的ベクターを用いることにより、活性化内在性遺伝子から産生されるタンパク質に、例えばエピトープタグを含むなどの修飾ができる。他のベクター（例えば、上記したベクター１２から１７）は、エピトープタグの上流にシグナルペプチドをコードする。このベクターは、内在性膜タンパク質の発現を活性化した細胞を単離するのに利用できる（以下の例５を参照）。このベクターは、通常では分泌されないタンパク質を分泌させるのにも利用できる。
【０２０６】  このように、本発明は、細胞の内在性膜タンパク質や膜貫通タンパク質をコードする内在性遺伝子を同定する方法にも関連する。本発明のこのような方法は、一つあるいはそれ以上のステップからなる。例えば、本発明のこのような一方法は、（ａ）本発明の一つあるいはそれ以上のベクターを細胞に導入し；  （ｂ）非相同的組換えにより、ベクターを細胞のゲノムに組み込み；（ｃ）組み込まれたベクターコンストラクト内に含まれる転写制御配列によって遺伝子をアップレギュレートションし、内在性遺伝子を過剰発現させ；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現する細胞をスクリーニングし；（ｅ）活性化遺伝子をキャラクタライズし、細胞の内在性膜タンパク質をコードする遺伝子として同定する。というステップからなる。関連実施態様として、本発明は、活性化遺伝子のキャラクタライズ以前にさらに細胞からの活性化遺伝子の単離を含む方法を提供する。
【０２０７】  内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するため、細胞のゲノムに組み込むベクターは、開始コドン、シグナル配列、およびエピトープタグを含むエキソン配列に連結した制御配列を含み、その下流には不対スプライスドナー部位がくる。組み込みと内在性遺伝子の活性化により、ベクター由来のシグナルペプチドとエピトープタグが下流の内在性遺伝子のエキソンにコードされるタンパク質に融合したキメラタンパク質が産生される。このキメラタンパク質は、ベクターのコードするシグナルペプチドが存在するため分泌経路へと向けられ、タンパク質の翻訳終了後はそのタンパク質が分泌される。しかしながら、活性化内在性遺伝子が内在性膜タンパク質をコードし、その遺伝子の膜貫通領域がベクターの組み込み部位の３'側に位置するエキソンにコードされる場合には、このキメラタンパク質は細胞表面へ行き、エピトープタグが細胞表面上に提示される。周知の細胞単離法（例えば、フローサイトメトリーによるソーティング、マグネチックビーズによる細胞ソーティング、免疫吸着、あるいは当業者に周知の他の方法）により、エピトープタグに対する抗体を用いて、エピトープタグを提示し内在性膜タンパク質コード遺伝子を活性化した細胞を全体の中から単離することができる。これらの細胞は、次に膜タンパク質の機能の研究に利用できる。また、例えば、ベクターのコードするエキソンに特異的なＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションし、これらの細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするなどの周知方法を利用して、あるいはここで示した遺伝子コンストラクトを用いて、さらに細胞から活性化遺伝子を単離できる。
【０２０８】  ベクターのエキソンにコードされるエピトープタグは、抗体に結合可能な短いペプチド、物質に結合可能な短いペプチド（例えば、ポリヒスチジン／二価金属イオン担体、マルトース結合タンパク質／マルトース担体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／グルタチオン担体）、あるいは内在性膜タンパク質由来の細胞外ドメイン（膜貫通ドメインを欠く）で抗体やリガンドの存在するものである。しかしながら、当業者に周知の他のタイプのエピトープタグも、本発明に準じて同等に利用できると考えられる。
【０２０９】  ここで示した方法や応用に対して他にも適当な修飾と適応があることは当業者には容易に明白なことであり、本発明あるいはその実施態様の範囲を逸脱することなく行える。本発明をここに詳細に記述したが、以下の例を参照することによってより明確に理解されよう。これは実例の目的でのみここに包含したものであり、本発明を限定するものではない。
【例】
【０２１０】    （例１：内在性遺伝子発現を活性化するための細胞のトランスフェクション）
（方法:pRIG-1の構築）
ヒトDHFRは、PCRにて作製したHT1080細胞由来cDNAから、プライマーDHFR-F1(5'TCCTTCGAAGCTTGTCATGGTTGGTTCGCTAAACTGCAT 3')(SEQ ID NO:1)およびDHFR-R1(5'AAACTTAAGATCGATTAATCATTCTTCTCATATACTTCAA 3')(SEQ ID NO:2)を用いてPCRにより増幅し、pTARGETTM(Promega)のT部位にクローニングしてpTARGET:DHFRを作製したPREP9をNheIとXbaIで切断してRSVプロモーターを単離し、pT
ARGET:DHFRのNhe  Ｉ  切断部位に挿入してpTgT:RSV+DHFRを作製した。オリゴヌク
レオチドJH169(5' ATCCACCATGGCTACAGGTGAGTACTCG 3')(SEQ ID NO:3)とJH170(5' GATCCGAGTACTCACCTGTAGCCATGGTGGATTTAA 3')(SEQ ID NO:4)をアニーリングしてpTgT: RSV+DHFRのI-Ppo-IとNheI切断部位に挿入し、pTgT: RSV+DHFR+Exlを作
製した。プライマーTet F1(5' GGCGAGATCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAAT 3')(SEQ ID NO:5)およびTet F2(5' GGCCAGATCTGCTACCTTAAGAGAGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAA 3')(SEQ ID NO:6)を用いて、PBR322のヌクレオチド230から508番に相当する279bpの領域をPCRにより増幅した。増幅した産物をBglIIで切断し、pTgT: RS
V+ RSV+DHFR+ExlのBamHI切断部位に挿入してpRIG-1を作製した。
【０２１１】    （トランスフェクション：ＨＴ１０８０細胞でのｐＲＩＧ−１遺伝子活性化ライブラリーの作製）
遺伝子発現を活性化するため、上記したコンストラクトのグループ内から適した活性化コンストラクトを選択する。次に、当業者に周知のいずれかのトランスフェクション法により、選択した活性化コンストラクトを細胞に導入する。トランスフェクション法の例として、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、および受容体依存性エンドサイトーシス法が挙げられる。細胞への導入に続き、ＤＮＡは非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、自然に生じた染色体の切れ目、あるいは人為的に誘発した染色体の切れ目で起こる。
【０２１２】    （方法）
ｐＲＩＧ−１によるヒト細胞のトランスフェクション。ＨＴ１０８０細胞のＨＰＲＴ−サブクローンであるＨＨ１細胞２ｘ１０9コを、１５０ｍｍ組織培養プレートで９０％コンフルエントになるまで培養した。細胞から培地を除去し、培養上清として保存した（以下を参照）。トリプシンで短時間インキュベーションすることによりプレートから細胞を剥がし、培地／１０％ウシ胎児血清を添加してトリプシンを中和し、Ｊｏｕａｎ遠心機で５分間、１，０００Ｒｐｍで遠心分離して沈殿させた。１ｘＰＢＳで細胞を洗浄し、カウントし、上記のように再度沈殿させた。最終的に２．５ｘ１０7コ細胞／ｍｌになるように、１ｘＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｃａｔ  ＃１４２００−０７５）で細胞の沈殿を再懸濁した。次に、細胞を137Ｃｓ由来の５０ラドのγ照射に曝露した。ｐＲＩＧ−１はＢａｍＨＩにより直鎖状にし、フェノール／クロロホルムで精製し、エタノールにより沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。精製し直鎖状にした活性化コンストラクトを、最終濃度４０μｇ／ｍｌになるように細胞懸濁液に添加した。次にＤＮＡ／照射細胞混合液を混合し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に４００μｌずつ分注した。エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、キュベットを２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルスの後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むαＭＥＭ／１０％ＦＢＳに加えた。続いて、約７ｘ１０6コ細胞／３５ｍｌのαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリンストレプトマイシン（３３％培養上清／６７％新鮮培地）を含むプレートの割合で、細胞をプレーティングした。３７℃で２４時間インキュベーションした後、６０ｍｇ／ｍｌストックから最終濃度が５００μｇ／ｍｌになるように、それぞれのプレートにＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を添加した。４日間の選択後、培地を新鮮なαＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ／ペニシリンストレプトマイシン／５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で置換した。さらに７から１０日間細胞をインキュベーションし、新規タンパク質因子の存在について培養上清をアッセイした、あるいは後に解析するため−８０℃にて保存した。薬剤耐性のクローンは、後に解析するため液体窒素で保存した。
【０２１３】    (例２：ＤＮＡ組み込みの頻度とランダム性を増加させるための電離放射線の利用)
方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗浄し、７．５ｘ１０6コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。細胞に、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ｐＲＩＧ−１）を添加し混合した。それぞれのキュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５ｍｌのαＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけたうち３００μｌの細胞を、直ちに、あるいはトランスフェクション後１時間または４時間の時点で０，５０，５００，５０００ラドで照射した。照射後直ちに、細胞を完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、Ｇ４１８を最終濃度５００μｇ／ｍｌになるよう培養細胞に添加した。選択から７日後、培養液を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新鮮完全培地に置換した。選択から１０日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー／９０％メタノール／１０％酢酸で染色し、５０細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【０２１４】    (例３：ゲノムにランダムの、半ランダムの、あるいはターゲットした）切れ目を生じるための制限酵素の利用)
方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗浄し、７．５ｘ１０6コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。組み込み効率をテストするため、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ＰＧＫ−βｇｅｏ）をそれぞれ４００μｌずつ分注した細胞に添加し、混合した。いくつかの分注細胞については、続いて制限酵素、ＸｂａＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄIII，ＩｐｐｏＩ（１０から５００ｕｎｉｔｓ）を別々の細胞／ＤＮＡ混合液に添加した。それぞれのキュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５ｍｌのαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけた全量２．５ｍｌの細胞のうち、３００μｌを完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、Ｇ４１８を最終濃度６００μｇ／ｍｌになるよう培養細胞に添加した。選択から７日後、培養液を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新鮮完全培地に置換した。選択から１０日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー／９０％メタノール／１０％酢酸で染色し、５０細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【０２１５】    (例４：組み込みベクター上に位置する二つの増幅可能マーカーを選択することによる増幅)
ベクターを宿主細胞のゲノムへ組み込んだ後、組み込みベクター上に位置する一つあるいはそれ以上の増幅可能マーカーを同時にあるいは連続して選択することにより、遺伝子座のコピー数が増幅される。例えば、二つの増幅可能マーカーを含むベクターがゲノムに組み込まれると、ベクター上に位置する両増幅可能マーカーを選択することにより、規定の遺伝子（すなわち、ベクター組み込み部位に位置する遺伝子）の発現は増加し得る。この研究法により、適当な遺伝子座（すなわち、組み込みベクターを含む遺伝子座）を増幅する細胞のクローンを非常に容易に単離できる。
【０２１６】  非相同的組換えによりベクターがゲノムに組み込まれると、独自の位置に組み込みベクターを含む個々の細胞クローンを、ゲノムの他の位置に組み込みベクターを含む他細胞から単離することができる。あるいは、混合した細胞集団でも増幅の選択が可能である。
【０２１７】  組み込みベクターを含む細胞は、次に一次増幅可能マーカーに特異的な一次選択薬剤の存在下で培養する。この薬剤により、ベクターあるいは内在性染色体上の増幅可能マーカーを増幅した細胞が選択される。次に、これらの細胞を二次増幅可能マーカーに特異的な二次選択薬剤の存在下で培養することにより、二次選択マーカーの増幅について選択する。ベクターと隣接するゲノムＤＮＡを増幅した細胞はこの二次選択ステップにおいて生存するが、内在性一次増幅可能マーカーを増幅した細胞、あるいは非特異的耐性を獲得した細胞は生存できない。２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上）の増幅可能マーカーを含むベクターが細胞ゲノムに組み込まれた場合には、同様の方法でさらなる選択を行うこともあり、その場合、組み込みベクター上に含まれるさらなる増幅マーカーに特異的な選択薬剤の存在下で連続して培養する。選択後、生存細胞で目的遺伝子の発現レベルについてアッセイし、最も高いレベルで発現している細胞を選んでさらに増幅させる。代わりに、両方（２つの増幅可能マーカーを用いた場合）あるいはすべて（２つ以上の増幅可能マーカーを用いた場合）の選択薬剤に耐性の細胞プールを、個々のクローンを単離しないでさらに培養することもできる。その後、これらの細胞を拡大培養し、より高い濃度（通常、２倍高）の一次選択薬剤存在下で培養する。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を続ける。
【０２１８】  あるいは、組み込みベクターを含む細胞を両方（２つを用いた場合）またはすべて（２つ以上を用いた場合）の増幅可能マーカーで同時に選択することもできる。同時選択は、両方（２つのマーカーを用いた場合）またはすべて（２つ以上のマーカーを用いた場合）の選択薬剤をトランスフェクションした細胞を培養する選択培地に添加して行う。生存細胞の大多数が、増幅した組み込みベクターを有する。次にこれらのクローンを個々にスクリーニングし、最も発現レベルの高い細胞を同定するか、またはプールして用いることもできる。さらに、それぞれの選択薬剤をより高い濃度（通常、２倍高）で細胞にかける。続いて、生存細胞で発現レベルについてアッセイする。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を繰り返す。
【０２１９】  どちらの選択ストラテジー（つまり、同時あるいは連続選択）においても、細胞毒性のない低濃度から細胞の大多数が死滅する高濃度まで薬剤の力価測定を行い、選択薬剤の初期濃度を個々に決定する。一般的には、はっきりと区別のできるコロニー（例えば、プレーティングした１００，０００コの細胞当たり数百コのコロニー）を生じる濃度を初期濃度として選ぶ。
【０２２０】    （例５：膜貫通タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離）
pRIG8R1-CD2(図5A〜5D; SEQ ID NO:7), pRIG8R2-CD2(図6A〜6C; SEQ ID NO:8), およびpRIG8R3-CD2(図7A〜7C; SEQ ID NO:9)ベクターは、不対スプライスドナー部位の上流にあるエキソンに連結して働くＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターを含む。ベクター上のエキソンはＣＤ２の細胞外ドメイン（フレームの合う終止コドンを欠く）に連結したシグナルペプチドをコードする。それぞれのベクターは、スプライスドナー部位について異なるリーディングフレームにあるＣＤ２をコードする。
【０２２１】  活性化遺伝子のライブラリーを作製するため、  ２ｘ１０7コの細胞を137Ｃｓ源にて５０ラドで照射し、１５μｇの直鎖状化ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をエレクトロポレーションした。ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、さらにｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を用いて、別々に同様の操作を行った。トランスフェクション後、３つの細胞グループを混合し、ディッシュ当たり５ｘ１０6コのトランスフェクション細胞となるように１５０ｍｍディッシュにプレーティングして、ライブラリー＃１を作製した。トランスフェクションから２４時間後、ライブラリー＃１を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で１４日間選択した。ホスト細胞のゲノムにベクターを組み込んだ薬剤耐性クローンを混合し、分注し、解析のため凍結した。３ｘ１０7コの細胞，３ｘ１０7コの細胞，および１ｘ１０7コの細胞をそれぞれｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２，ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２，およびｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２でトランスフェクションし、あとは上記と同様の操作を行い、ライブラリー＃２を作製した。
【０２２２】  活性化した内在性膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞を単離するため、それぞれのライブラリーから３ｘ１０6コの細胞を培養し、以下のように処理した。
４ｍｌのトリプシンＥＤＴＡで細胞をトリプシン処理した。
細胞が遊離した後、８ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳを添加してトリプシンを中和した。
無菌のＰＢＳで細胞を１回洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回収した。
細胞ペレットを２ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。
１ｍｌをソーティングに用い、もう１ｍｌを５００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで再度プレーティングして拡大培養し、保存した。
ソーティングに用いる細胞を無菌のアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで１回洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回収した。
上清を除去し、ペレットを１ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。アイソタイプコントロールでの染色用に、１００μｌの細胞を除去した。
９００μｌの細胞に２００μｌの抗ＣＤ２  ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  カタログ＃３００５４Ｘ）を添加し、もう一方で１００μｌの細胞に２０μｌのマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  カタログ＃３３８１４Ｘ）を添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベーションした。
抗ヒトＣＤ２  ＦＩＴＣで染色した細胞を含むチューブに、５ｍｌのＰＢＳ／１０％ＦＢＳを添加した。アイソタイプコントロールには、９００μｌのＰＢＳ／１０％ＦＢＳを添加した。６００ｘｇで６分間遠心分離することにより、細胞を回収した。
チュから上清を除去した。アイソタイプコントロールで染色した細胞を５００μｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、抗ＣＤ２  ＦＩＴＣで染色した細胞を１．５ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。
【０２２３】  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；  Ｍｏｕｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、連続して５回、細胞をソーティングした。それぞれのソーティングにおいて、全細胞中最も強い蛍光性を示す表示したパーセンテージの細胞（以下を参照）を回収し、拡大培養して、再度ソーティングした。ネガティブコントロールとして、ＨＴ  １０８０細胞をソーティングした。それぞれのソーティング段階において、以下の細胞集団をソーティングして回収した。
【０２２４】
【表１】
0005377806.tif 000002
それぞれのライブラリーについて各最終ソーティングした細胞を拡大培養し、液体窒素で保存した。
【０２２５】  （ＦＡＣＳソーティングした細胞からの活性化遺伝子の単離）
上記のように細胞をソーティングした後、ソーティングした細胞からＰＣＲベースのクローニング法により活性化遺伝子を単離した。しかし、ＦＡＣＳソーティングした細胞から活性化遺伝子を単離するためには、遺伝子クローニングのいずれの周知方法も同様に用いることができる。
【０２２６】  以下のプロトコールにより遺伝子を単離した。
（１）  ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  １０００  ｍＲＮＡ  単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ライブラリー＃１および＃２由来の３ｘ１０7コのＣＤ２＋細胞（上記のように、ＦＡＣＳにより５回ソーティングした）からｍＲＮＡを単離した。
（２）  ｍＲＮＡを単離した後、０．５μｌの単離ｍＲＮＡを９９．５μｌの水に希釈し、ＯＤ260測定によりｍＲＮＡ濃度を定量した。ＣＤ２＋細胞から２１μｇのｍＲＮＡを回収した。
（３）  以下のようにして第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。
（ａ）  ＰＣＲ機を４℃に保温している間に、以下の成分を順に添加して第一鎖反応混合液を準備した。
４１μｌ  ＤＥＰＣ処理ｄｄＨ2０
４μｌ  １０ｍＭ各ｄＮＴＰ
８μｌ  ０．１Ｍ  ＤＴＴ
１６μｌ  ５ｘＭＭＬＶ第一鎖バッファー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）
５μｌ  （１０ｐｍｏｌ／μｌ）  コンセンサスポリアデニル化部位プライマー
ＧＤ．Ｒ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）＊
１μｌ    ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
３μｌ  （１．２５μｇ／μｌ）  ｍＲＮＡ
＊注釈：GD.R1, 5' TTTTTTTTTTTTCGTCAGCGGCCGCATCNNNNTTTATT 3'(SEQ ID NO
:10)は、ｍＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡ合成用（遺伝子発見「Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」）プライマーである。このプライマーはポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよび下流のポリＡ領域にアニールするように設計してある。このプライマーにより、第一鎖にＮｏｔＩ切断部位が導入される。
サンプル調製後、以下のようにインキュベーションした。
（ｂ）  ７０℃、１分
（ｃ）  ４２℃、保温
【０２２７】  次にそれぞれのサンプルに２μｌの４００  Ｕ／μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を添加し、最終全量を８２μｌとした。約３分後、サンプルを以下のようにインキュベーションした。
（ｄ）  ３７℃、３０分
（ｅ）  ９４℃、２分
（ｆ）  ４℃、５分
続いてそれぞれのサンプルに２μｌの２０  Ｕ／μｌ  ＲＮａｃｅ−ＩＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、サンプルを３７℃で１０分間インキュベーションした。
【０２２８】（４）  第一鎖合成に続き、ＰＣＲ  ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて以下のようにｃＤＮＡを精製した。
（ａ）  １．７ｍｌのシリコン処理したエッペンドルフチューブに８０μｌの第一鎖反応液を移し、４００μｌのＰＢを添加した。
（ｂ）  サンプルをＰＣＲ  ｃｌｅａｎｕｐカラムに移し、１４，０００Ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（ｃ）  カラムを分解して流出液をデカントし、ペレットに７５０μｌのＰＥを添加して、チューブを１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離した。
（ｄ）  カラムを分解して流出液をデカントし、チューブを１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離して樹脂を乾燥させた。
（ｅ）  ５０μｌのＥＢを用いて、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、カラムから新しくシリコン処理したエッペンドルフチューブに溶出した。
【０２２９】（５）  次に以下のようにして第二鎖ｃＤＮＡを合成した。
（ａ）  以下の成分を順に添加して、第二鎖反応混合液を室温で準備した。
ｄｄＨ2Ｏ   ５５μｌ
１０  ｘ  ＰＣＲバッファー    １０μｌ
５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ2   ５μｌ
１０  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ２μｌ
２５  ｐｍｏｌ／μｌ  ＲＩＧ．７５１−Ｂｉｏ＊  ４μｌ
２５  ｐｍｏｌ／μｌＧＤ．Ｒ２＊＊  ４μｌ
第一鎖産物  ２０μｌ
＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏ，  ５′Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧ  ３′（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、ｐＲＩＧベクターから発現される転写物のキャップ部位にアニールする。
＊＊注釈：GD.R2, 5' TTTTCGTCAGCGGCCGCATC 3'(SEQ ID NO:12)は、ＧＤ．Ｒ１プライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を用いて作製したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するのに用いるプライマーである。ＧＤ．Ｒ２はＧＤ．Ｒ１のサブ配列であり、ポリＡシグナル配列に先行する縮重塩基まで一致する。
（ｂ）  第二鎖合成の開始：
９４℃、１分
１μｌのＴａｑ（５  Ｕ／μｌ，  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加；
１μｌのＶｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌ（０．１  Ｕ／μｌ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加
（ｃ）  ６３℃で２分間インキュベーション
（ｄ）  ７２℃で３分間インキュベーション
（ｅ）  （ｂ）のステップを４回繰り返す
（ｆ）  ７２℃で６分間インキュベーション
（ｇ）  ４℃でインキュベーション（保温）
（ｈ）  終了
【０２３０】（６）  ＳＴＥで３回洗浄することにより、２００μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰ）を調製した。
（７）  第二鎖反応の産物をＳＡ−ＰＭＰに直接添加し、室温で３０分間インキュベーションした。
（８）  結合後、マグネットでＳＡ−ＰＭＰを捕集し、上清を除去した。
（９）  ５００μｌのＳＴＥでビーズを３回洗浄した。
（１０）  ビーズを５０μｌのＳＴＥに再懸濁し、マグネットを用いてチューブの底に捕集した。次に、ピペットでＳＴＥ上清を注意深く除去した。
（１１）  ５０μｌのｄｄＨ2０でビーズを再懸濁し、１００℃のウォーターバスに２分間入れてＰＭＰから精製ｃＤＮＡを遊離させた。
（１２）  マグネットにＰＭＰを捕集し、ｃＤＮＡを含む上清を注意深く除去し、精製ｃＤＮＡを回収した。
（１３）  精製産物をきれいなチューブに移し、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離して残りのＰＭＰをすべて除去した。
【０２３１】（１４）  次に、以下のようにＰＣＲ反応を行い、ＲＩＧ活性化ｃＤＮＡを特異的に増幅した。
（ａ）  以下の成分を順に添加して、ＰＣＲ反応混合液を室温で準備した。
Ｈ2Ｏ ５９μｌ
１０  ｘ  ＰＣＲバッファー    １０μｌ
５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ５μｌ
１０  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  ２μｌ
２５  ｐｍｏｌ／μｌ  ＲＩＧ．Ｆ７８１＊  ２μｌ
２５  ｐｍｏｌ／μｌ  ＧＤ．Ｒ２    ２μｌ
第二鎖産物  ２０μｌ
＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７８１，  ５' ＡＣＴＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧ  ３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）は、ＧＤ．Ｆ１，  ＧＤ．Ｆ３，  ＧＤ．Ｆ５−Ｂｉｏ，  およびＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏの下流にアニールし、ｃＤＮＡの５'クローニング用にＳｆｉＩ切断部位を付加する。このプライマーは、ＲＩＧ  エキソン１特異的第二鎖ｃＤＮＡのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ増幅に用いる。
（ｂ）  サーマルサイクラーの開始：
９４℃、３分
１μｌのＴａｑ（５  Ｕ／μｌ，  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加；
１μｌのＶｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌ（０．１  Ｕ／μｌ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加
次に（ｃ）〜（ｅ）のステップを１０サイクル繰り返し、ＰＣＲを行った。
（ｃ）  ９４℃、３０秒
（ｄ）  ６０℃、４０秒
（ｅ）  ７２℃、３分
続いて次のステップを行い、ＰＣＲを完了した。
（ｆ）  ９４℃、３０秒
（ｇ）  ６０℃、４０秒
（ｈ）  ７２℃、３分
（ｉ）  ７２℃  ＋  各サイクル２０秒として１０サイクル分
（ｊ）  ７２℃、５分
（ｋ）  ４℃、保温
【０２３２】（１５）  ５０μｌのＥＢでライブラリー物質を溶出した後、１０μｌのＮＥＢバッファー２，４０μｌのｄＨ2Ｏ，および２μｌのＳｆｉＩを加えて５０℃で１時間インキュベーションし、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（ＲＩＧ．Ｆ７８１；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）でコードされるＳｆｉＩ切断部位でｃＤＮＡの５’末を切断した。
（１６）  ＳｆｉＩ切断後、５μｌの１  Ｍ  ＮａＣｌと２μｌのＮｏｔＩをそれぞれのサンプルに加えて３７℃で１時間インキュベーションし、第一鎖プライマー（ＧＤ．Ｒ１；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）でコードされるＮｏｔＩ切断部位でｃＤＮＡの３’末を切断した。
（１７）  続いて切断したＤＮＡを１％低融点アガロースゲルで分画した。１．２  ｋｂ〜８  ｋｂの範囲にあるｃＤＮＡをゲルから切り出した。
（１８）  ＱｉａｅｘII  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて切り出したアガロースゲルからｃＤＮＡを回収した。４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、全量１０μｌの１ｘＴ４リガーゼバッファー（ＮＥＢ）中で、２μｌのｃＤＮＡ（約３０ｍｇ）を７μｌ（３５ｎｇ）のｐＢＳ−ＨＳＰ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで直鎖状化）にライゲーションした。
【０２３３】（１９）  ステップ（１８）のライゲーション反応混合液０．５μｌをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂに形質転換した。
（２０）  １０３コロニー／０．５μｌライゲーションＤＮＡを回収した。
（２１）  以下のように、１２．５μｌ容量のＰＣＲでプライマーＭ１３Ｆ２０およびＪＨ１８２（ＲＩＧエキソン１特異的）を用いて、これらのコロニーをエキソンについてスクリーニングした。
（ａ）  適当数の９６ウェルプレートに１００μｌのＬＢ（選択抗生物質を含む）を分注した。
（ｂ）  単一コロニーを拾って９６ウェルプレートの個々のウェルに播種し、プレートを３７℃のインキュベーターに振盪せずに２〜３時間置いた。
（ｃ）  以下のように、ＰＣＲ反応「マスターミックス」を氷上で調製した。
【０２３４】
【表２】
0005377806.tif 000003
【０２３５】      （ｄ）  ＰＣＲ反応プレートのそれぞれのウェルに１０μｌマスターミックスを分注した。
（ｅ）  １００μｌのＥ．ｃｏｌｉ培養液から２．５μｌを、ＰＣＲ反応プレートの対応するウェルに移した。
（ｆ）  典型的なＰＣＲサイクル条件でＰＣＲを行った。
（ｉ）  ９４℃／２分（細菌の溶解とプラスミドの変性）
（ｉｉ）  ９２℃変性で１５分間；６０℃プライマーアニーリングを２０秒；７２℃プライマー伸張を４０秒を３０サイクル
（ｉｉｉ）  ７２℃の最終伸張を５分
（ｉｖ）  ４℃で保温
（ｇ）  次にＰＣＲ反応液にブロモフェノールブルーを添加した；サンプルを混合し、遠心分離した後、全反応混合液をアガロースゲルにのせた。
【０２３６】（２３）  ２００クローンをスクリーニングしたうち、７８％がベクターのエキソンに関して陽性であった。これらのうち９６クローンをミニプレップ用に培養し、Ｑｉａｇｅｎ  ９６−ｗｅｌｌ  ｔｕｒｂｏ−ｐｒｅｐを用いてＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９７年４月）にしたがい精製した。
（２４）  ＮＥＢバッファー３中、全量２２μｌで２μｌのＤＮＡをＮｏｔＩ，  ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＨｉｎｄIII，ＥｃｏＲＩで同時に切断し、１％アガロースゲルで電気泳動することにより多くの重複クローンを除去した。
【０２３７】    （結果）
このプロトコールにより、２つの異なるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１つめのライブラリー（ＴＭＴ＃１）では、単離した活性化遺伝子８つをシークエンシングした。これら８つの遺伝子のうち、４つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、６つは新規遺伝子であった。２つめのライブラリー（ＴＭＴ＃２）では、単離した活性化遺伝子１１個をシークエンシングした。これら１１個の遺伝子のうち、１つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、１つの遺伝子は内在性膜タンパク質に相同な部分的にシークエンシングされた遺伝子をコードし、９つは新規遺伝子であった。単離した遺伝子がキャラクタライズされた既知遺伝子に相当する場合はすべて、その遺伝子は内在性膜タンパク質であった。
【０２３８】  それぞれのライブラリーから単離した遺伝子の典型的で顕著なアラインメント（ＧｅｎＢａｎｋから得た）を以下に示す。
【０２３９】ＴＭＴ＃１の顕著なアラインメント：
179761|gb|M76559|Human neuronal DHP-sensitive
voltage-dependent, calcium channel alpha-2b subunit mRNA
complete CDs.
Length = 3600
>gi|3183974|emb|Y10183|HSMEMD H.sapiens mRNA for MEMD protein
Length = 4235
ＴＭＴ＃２の顕著なアラインメント：
>gi|476590|gb|U06715|HSU06715 Human cytochrome B561, HCYTO B561,
mRNA,
partial CDs.
Length = 2463
>gi|2184843|gb|AA459959|AA459959 zx66c01.s1 Soares total fetus
Nb2HF8 9w Homo sapiens cDNA clone 796414 3' similar to
gb:J03171 INTERFERON-ALPHA RECEPTOR PRECURSOR
(HUMAN);
Length = 431
【０２４０】  理解を確実にする目的で本発明を説明と例によりある程度詳細に十分に記述したが、本発明あるいはその特異的実施態様の範囲に影響を及ぼすことなく、広範で同等の条件、組成、および他のパラメータ範囲内で本発明を修飾あるいは変更して同様のことが実施実施可能であること、そうした修飾あるいは変更が添付のクレーム内に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【０２４１】  この明細書で述べた刊行物、特許、および特許出願はすべて本発明に関連する当業者の熟練レベルを示しており、これらは、各刊行物、特許、あるいは特許出願が明示的に個々にあるいは個別に引用して本明細書の一部をなすものとされるように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２４２】
0005377806.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書に記載した遺伝子活性化事象の概略図。活性化構築物を細胞にトランスフェクトし、宿主細胞染色体のＤＮＡ破壊位置に組込ませる。破壊が目的の遺伝子の上流で生じ（例えば、Ｅｐｏ）、適当な活性化構築物が破壊位置に取込まれ、よって、その調節配列が目的の遺伝子に機能的に結合するようになる場合、遺伝子の活性化が生じる。転写およびスプライシングにより、活性化構築物由来および内在性遺伝子由来のエキソン配列を含むキメラＲＮＡ分子が産生される。続く翻訳により、目的のタンパク質が産生される。組換え細胞を単離した後、遺伝子発現はさらに遺伝子増幅により増強することができる。
【図２】  翻訳されていない活性化構築物の概略図。矢印は、プロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄにより示される。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図３】  翻訳された活性化構築物の概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄにより示される。翻訳された、シグナルペプチド、エピトープタグ、およびプロテアーゼ開裂配列は、構築物の下の説明に示す。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図４】  内在性遺伝子を活性化できる活性化構築物の概略図。
【図５Ａ−５Ｄ】  ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図６Ａ−６Ｃ】  ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号８）。
【図７Ａ−７Ｃ】  ｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図１】
0005377806.tif 000048
【図２】
0005377806.tif 000049
【図３】
0005377806.tif 000050
【図４】
0005377806.tif 000051
【図５Ａ】
0005377806.tif 000052
【図５Ｂ】
0005377806.tif 000053
【図５Ｃ】
0005377806.tif 000054
【図５Ｄ】
0005377806.tif 000055
【図６Ａ】
0005377806.tif 000056
【図６Ｂ】
0005377806.tif 000057
【図６Ｃ】
0005377806.tif 000058
【図７Ａ】
0005377806.tif 000059
【図７Ｂ】
0005377806.tif 000060
【図７Ｃ】
0005377806.tif 000061
【配列表】
0005377806000001.xml