(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びバリンの３種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とし、これらの重量比（イソロイシン：Ｌ−ロイシン：バリン）が１：１．５〜２．５：０．８〜１．７である、Ａｋｔ活性化抑制剤。
【請求項２】
イソロイシン、Ｌ−ロイシン、及びバリンの重量比（イソロイシン：Ｌ−ロイシン：バリン）が、１：１．９〜２．２：１．１〜１．３である、請求項１に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
【請求項３】
アポトーシスを促進するために用いられる、請求項１又は２に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
【請求項４】
アポトーシスの促進がアポトーシス抑制遺伝子発現の抑制によるものである、請求項３に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
【請求項５】
アポトーシス抑制遺伝子がＭｃｌ−１またはＩＡＰ−１である、請求項４に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のＡｋｔ活性化抑制剤、並びに高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制するための薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、糖尿病、高血圧、高脂血症などの生活習慣病を起こしやすいことが知られている。特に内臓脂肪型肥満は、耐糖能異常、インスリン抵抗性を併発しやすく、体脂肪量とインスリン抵抗性は有意な正の相関を示す。肥満のモデル動物（ｏｂ／ｏｂマウスやＺｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙラット）では、肥満とともに著しい高インスリン血症が見られることが証明されている。臨床的にも、肥満者では空腹時の血中インスリン値が高く、グルコース負荷後のインスリン反応も亢進している。すなわち、血糖曲線を一致させて肥満者と非肥満者を比較すると、どの時点でも肥満者のインスリン値は高い（Ｆｕｊｉｏｋａ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｚａｗａ  Ｙ，Ｔｏｋｕｎａｇａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ−ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｆａｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３６：５４  １９８７）。
一方、２型糖尿病の特徴的病態はインスリン作用の低下であるが、糖尿病発症前に空腹時および糖負荷時の血中インスリン濃度の増加が長期間にわたって認められることが報告されている（Ｍｅｒｔｉｎ  ＢＣ，Ｗａｒｒａｍ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ２５−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：９２５−９２９  １９９２）。
近年、これらの疾患と癌の関連が明らかとなってきた。すなわち、９０万人の米国民を１６年間追跡したところ、肥満度が高くなるほど全がん死亡率が高くなることが報告された（Ｃａｌｌｅ  ＥＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ，ｏｂｅｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｃｏｈｏｒｔｓ  ｏｆ  Ｕ．Ｓ．ａｄｕｌｔｓ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  ａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００３；３４８；１６２５−１６３８）。
また別の報告では、糖尿病は癌のリスクファクターであることが示された（Ｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｆａｓｔｉｎｇ  Ｓｅｒｕｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｉｓｋ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｎ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ，ＪＡＭＡ．２００５；２９３：２２１０−２２１１）。
糖尿病や肥満における発癌のメカニズムの１つとして、高インスリン血症が想定される。インスリンには、細胞増殖作用があることはよく知られており（Ｇｕｐｔａ  Ｋ，Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ  Ｇ，Ｋａｒｎａｄ  Ａ，Ｐｅｉｒｉｓ  ＡＮ．Ｉｎｓｕｌｉｎ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ  ３２３：１４０−１４５；２００２）、有糸分裂誘発作用はＩＧＦ−１受容体、インスリン受容体を介して作動するが、この作用は血中インスリン値が正常よりも高い場合により強く生じやすい。インスリンのシグナルにおいて、細胞増殖の中心を担っている分子のひとつとしてＡｋｔが報告されている（Ｌａｗｌｏｒ  ＭＡ  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ  ＤＲ．ＰＫＢ／Ａｋｔ，：ａ  ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ？  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４：２９０３−２９１０；２００１）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、Ａｋｔの活性化を抑制することによって、高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制する薬剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物が、Ａｋｔ活性化を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の通りである：
（１）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、Ａｋｔ活性化抑制剤。
（２）少なくともロイシンを含む、（１）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（３）イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種からなる、（１）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（４）イソロイシン、ロイシン、及びバリンの重量比が、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７であることを特徴とする、（３）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（５）高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制するために用いられる、（１）〜（４）のいずれかに記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（６）前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、インスリン抵抗性、糖代謝異常、及び／又は脂質代謝異常の症状を有する、（５）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（７）前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、（５）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（８）前記癌が、肝癌である、（５）〜（７）のいずれかに記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（９）アポトーシスを促進するために用いられる、（１）〜（４）のいずれかに記載のＡｋｔ活性化抑制剤（すなわち、アポトーシス促進剤）。
（１０）アポトーシスの促進がアポトーシス抑制遺伝子発現の抑制によるものである、（９）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１１）アポトーシス抑制遺伝子がＭｃｌ−１またはＩＡＰ−１である、（１０）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１２）高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制するために用いられる、（９）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１３）前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、インスリン抵抗性、糖代謝異常、及び／又は脂質代謝異常の症状を有する、（１２）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１４）前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、（１２）に記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１５）前記癌が、肝癌である、（１２）〜（１４）のいずれかに記載のＡｋｔ活性化抑制剤。
（１６）有効量のイソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、Ａｋｔ活性化の抑制方法。
（１７）Ａｋｔ活性化抑制剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸の使用。
（１８）イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬組成物、ならびに当該組成物をＡｋｔ活性化の抑制に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージ。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＨＥＫ２９３細胞の増殖に対する、ＢＣＡＡ混合物の抑制効果を示す。
図２は、Ａｋｔ活性化に対する、ロイシンの抑制効果を示す。
図３は、アポトーシス抑制遺伝子発現に対する、ＢＣＡＡ混合物の抑制効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に本発明の実施の形態について説明する。
「Ａｋｔ」とは、セリンスレオニンプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）とも呼ばれ、リン酸化されることにより活性化する酵素であり、活性化したＡｋｔは、細胞内の種々の機構の調節に関与しており、例えば、インスリン刺激による細胞増殖の促進やアポトーシスの抑制などに関与していることが知られている（Ｌａｗｌｏｒ  ＭＡ  ａｎｄ  Ａｌｅｓｓｉ  ＤＲ．ＰＫＢ／Ａｋｔ，：ａ  ｋｅｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ？  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４：２９０３−２９１０；２００１）。従って、本明細書において「Ａｋｔ活性化」とは、Ａｋｔのリン酸化を指標とする。
本明細書中において「高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者」とは、インスリン抵抗性、糖代謝異常、脂質代謝異常などの症状を有する患者のことをいい、例えば、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などに罹患した患者がこのような症状を有する。
「高インスリン血症」とは、血液中のインスリン量が正常値よりも異常に高い状態のことをいう。高インスリン血症は、インスリンの過剰シグナルによりＡｋｔの活性化を生じ、その結果として、癌（例えば、肝癌、膵癌、大腸癌、肺癌、胃癌、胆嚢・胆管癌、乳癌、子宮癌など）を引き起こす危険性がある。
ところで、癌は細胞の生と死のバランスが崩れた病態である。すなわち、正常な細胞ではＤＮＡに損傷が蓄積すると自らアポトーシスを誘導し細胞死に至るが、癌細胞においてはアポトーシスに対して耐性を獲得し細胞死を免れていることが明らかになってきており、これが癌発生進展の原因の１つと考えられている。アポトーシスを制御する経路は、ＴＮＦ−αなどのデスレセプター、ＪＵＮＫ、ｐ３８などのＭＡＰキナーゼ、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、ｐ５３など各種知られているが、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路も重要である。Ｂａｄ（Ｂｃｌ−２  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）は、Ｂｃｌ−２やＢｃｌ−ｘＬと結合してそれらを不活性化することでアポトーシスを誘導するが、ＡｋｔはＢａｄのＳｅｒ１３６をリン酸化して不活性化する。またＡｋｔは、ＪＮＫの上流であるＡＳＫ１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  １）のＳｅｒ８３をリン酸化することでその下流で誘導されるアポトーシスを抑制する。また、Ａｋｔは膜上で活性化すると一部が核に移行し、ＦＯＸＯ１，３，４をリン酸化して不活性化するが、ＦＯＸＯは、ＦａｓリガンドやＢｉｍ（Ｂｃｌ−２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）といったアポトーシスを誘導する因子の転写を活性化するため、ＡｋｔによるＦＯＸＯの不活性化は、アポトーシスの抑制につながる。またｐ５３やｐ７３は、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａなどのアポトーシス促進因子の転写を活性化するが、Ａｋｔはｐ５３やｐ７３に対して抑制的に働くことが知られている。すなわち、ｐ５３を負に制御しているＭＤＭ２（ｍｏｕｓｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２）をＡｋｔがリン酸化して活性を上昇させることや、ｐ７３のコアクチベーターであるＹＡＰ（ｙｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をＡｋｔはリン酸化して核外移行を促すことによりアポトーシス促進因子の転写活性化が抑制される。さらには、転写因子ＮＦ−κＢは阻害因子であるＩκＢがＩＫＫによりリン酸化されることにより活性化されるが、ＡｋｔはＩＫＫをリン酸化して活性化する。ＮＦ−κＢはＩＡＰやＡ１およびＢｃｌ−ｘＬを転写活性化することでアポトーシスを抑制する（Ｒｏｍａｓｈｋｏｖａ，Ｊ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍａｋａｒｏｖ，Ｓ．Ｓ．（１９９９）ＮＦ−κＢ  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ＡＫＴ  ｉｎ  ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＰＤＧＦ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：８６−９０、Ｃｈｕ  ＺＬ，ＭｃＫｉｎｓｅｙ  ＴＡ，Ｌｉｕ  Ｌ，Ｇｅｎｔｒｙ  ＪＪ，Ｍａｌｉｍ  ＭＨ，ａｎｄ  Ｂａｌｌａｒｄ  ＤＷ（１９９７）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｃ−ＩＡＰ２  ｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１００５７−１００６２）。また、ＡｋｔはＣＲＥＢ（ｃ  ＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＳｅｒ１３３をリン酸化して活性化することが知られているが、ＣＲＥＢはアポトーシス抑制因子であるＢｃｌ−２やＭｃｌ−１の転写を活性化する（Ｔｈｅ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｍｃｌ−１  ｉｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＲＥＢ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９  Ｓｅｐ；１９（９）：６１９５−２０６）。
このように、Ａｋｔは多くの段階、多様なターゲットでアポトーシスを抑制している。したがって、Ａｋｔの活性化を抑制することは、アポトーシスの抑制を解除することになり、癌発生抑制、進展抑制につながることが期待できる。よって、本発明のＡｋｔ活性化抑制剤は、アポトーシスの促進、癌発生または進展の抑制に用いることもでき、これらの態様も本発明の権利に包含される。
本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸）である、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用可能であるが、好ましくは、Ｌ−体、ＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
また、イソロイシン、ロイシン、及びバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの医薬品として許容される塩を選択することが好ましい。
イソロイシン、ロイシン、及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。
イソロイシン、ロイシン、及びバリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩基を形成する塩基の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物または炭酸化物、あるいはアンモニア等の無機塩基；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。
上記塩は水和物（含水塩）であってもよい。また、水和物としては、例えば１〜６水和物などが挙げられる。これらの塩、水和物も本発明の権利に包含されるものである。
本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンのいずれか１種以上が分岐鎖アミノ酸として含有されていればよく、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種全てが含有されていてもよい。
好適な実施形態では、本発明の薬剤は、少なくともロイシンを含有する。別の好適な実施形態では、本発明の製剤は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種全てを含有する。
イソロイシン、ロイシン、及びバリンの３種全てを用いる場合、イソロイシンと、ロイシンと、バリンの重量比は、１：１．５〜２．５：０．８〜１．７であり、特に１：１．９〜２．２：１．１〜１．３の範囲が好ましい。
本発明の薬剤の投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、スプレー剤などが挙げられる。
本発明の薬剤は、動物（好ましくは、ヒト等の哺乳動物）に投与することができる。
本発明の薬剤は、経口、注射、あるいは局所投与等の任意の投与方法によって投与することができる。
投与量は、対象患者の年齢、体重もしくは病態、剤形、または投与方法などによっても異なるが、通常１日量として、イソロイシン０．５〜３０．０ｇ、ロイシン１．０〜６０．０ｇ、バリン０．５〜３０．０ｇを目安とする。一般の成人の場合、好ましくは、一日量として、イソロイシン２．０〜１０．０ｇ、ロイシン３．０〜２０．０ｇ、バリン２．０〜１０．０ｇ、より好ましくは、イソロイシン２．５〜３．５ｇ、ロイシン５．０〜７．０ｇ、バリン３．０〜４．０ｇであり、アミノ酸の全体量としては１日当たり２．０ｇ〜５０．０ｇ程度が好ましく、これを１〜６回、好ましくは１〜３回に分割して投与する。
本発明の有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量（摂取量）について算出する際、その値は、本発明が目的とする疾患の治療または予防等の目的で使用される薬剤の有効成分の量として前記の算定方法が決められているので、これとは別目的で、例えば、通常の食生活の必要から、あるいは別の疾患の治療目的のために、摂取又は投与される分岐鎖アミノ酸については、前記算定に含める必要はない。
例えば、通常の食生活から摂取される一日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を、前記本発明における有効成分の１日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。
本発明の有効成分であるイソロイシン、ロイシン、及びバリンは、それぞれが単独で、若しくは任意の組合わせで製剤に含有されていてもよいし、全てが１種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよい。また各々を投与するタイミングも、同時であっても別々であってもよい。これらは、併用する薬剤の種類や効果なども考慮して、適宜決定され得る。
即ち、本発明の薬剤は、２種以上の分岐鎖アミノ酸を含有する場合、複数の分岐鎖アミノ酸を同時に含有する製剤であってもよいし、それぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよく、これらの形態全てを包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸を含有する態様が、簡便に投与できるため好ましい。
本発明において、「重量比」とは、製剤中のそれぞれの成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含めた場合には、個々の含有量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独でまたは任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤に含められる各有効成分の重量の比である。なお、本明細書中において各アミノ酸の重量は、遊離アミノ酸としてのものである。
また本発明において、実際の投与量の比は、投与対象（即ち患者）あたりの各有効成分１回投与量あるいは１日投与量の比である。例えば、イソロイシン、ロイシンおよびバリンの各有効成分を１つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独でまたは任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、１回あるいは１日投与した各製剤中の各有効成分の合計量の比が重量比に相当する。
イソロイシン、ロイシン、およびバリンは既に、医薬・食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、これらのアミノ酸を１：２：１．２の比で含有する製剤の急性毒性（ＬＤ５０）は、マウスの経口投与において１０ｇ／Ｋｇ以上である。
本発明の薬剤は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤、または、注射剤、スプレー剤などに製剤化することができる。
このような製剤は、必要に応じて、薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合される。
賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが挙げられる。
結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。
滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが挙げられる。
溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが挙げられる。
崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが挙げられる。
溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが挙げられる。
安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが挙げられる。
無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが挙げられる。
防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
矯味矯臭剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが挙げられる。
着色剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。
本発明のＡｋｔ抑制剤には、他の薬剤、例えば、糖尿病用剤、高脂血症治療剤、高血圧用治療剤、肝臓病用剤、抗がん剤（例えば、カルボプラチン、テガフール、パクリタキセル、酢酸リュープロレリンなど）などを配合してもよい。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０００６】
［実施例１］
Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養したＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地中に１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁し、得られた懸濁液を１ｗｅｌｌあたり１００μｌずつ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいた。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地で１晩培養後、コントロール群（ｎ＝４）は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地に交換し、５ｍＭ  ＢＣＡＡ群（ｎ＝４）は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンを重量比１：２：１．２で含有する５ｍＭ  ＢＣＡＡ混合物をＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳに添加した培地に交換し、さらに３日間培養した。培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（和光純薬）を用いてプロトコール通りに細胞数を測定した。
結果を、コントロール群のＯＤ値からバックグラウンドのＯＤ値を引いた値を１００％として、％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌとして表す（図１）。図１に示されるように、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから構成されるＢＣＡＡ混合物は、有意にＨＥＫ２９３細胞の増殖を抑制した。
［実施例２］
Ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔに培養したＨ４ＩＩＥ細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地中に１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁し、得られた懸濁液を１ｗｅｌｌあたり１ｍｌずつ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにまいた。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ培地で４時間培養後、以下の５群に分けて、１晩培養した：
（１）ＤＭＥＭ  ＦＣＳ（−）培地（ｎ＝２）；
（２）ＤＭＥＭ  ＦＣＳ（−）＋インスリン  １ｎＭ（ｎ＝２）；
（３）ＤＭＥＭ  ＦＣＳ（−）＋インスリン  １ｎＭ＋ロイシン  ３ｍＭ（ｎ＝２）；
（４）ＤＭＥＭ  ＦＣＳ（−）＋インスリン  １０ｎＭ（ｎ＝２）；
（５）ＤＭＥＭ  ＦＣＳ（−）＋インスリン  １０ｎＭ＋ロイシン  ３ｍＭ（ｎ＝２）。
培養終了後、ＰａｔｈＳｃａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）
Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、プロトコール通りにリン酸化Ａｋｔを定量した。
結果を図２に示す。Ａｋｔは、インスリン  １ｎＭ、１０ｎＭ（図２の（２）及び（４））で用量依存的に活性化されたが、ロイシンは、これらの活性化を抑制した（図２の（３）及び（５））。
［実施例３］
Ｈ４ＩＩＥ細胞をＤ−ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で４×１０５個／ｗｅｌｌで１２ウェルプレートにまき、一晩培養した。翌日Ｄ−ＭＥＭ  ＦＣＳ（−）培地に交換し、さらに一晩培養した。
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時間培養した後に、ＢＣＡＡ添加条件では２ｍＭのＢＣＡＡを添加してさらに０．５時間培養した。その後１０ｎＭのインスリンあるいは１４ｎＭのＩＧＦ−１を添加して、８時間後に細胞中のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した後に、以下のプライマーを用いてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法によりアポトーシス抑制遺伝子Ｍｃｌ−１およびＩＡＰ−１、ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅであるＲｐｌ３６の発現量を定量した。
Ｍｃｌ−１：ｓｅｎｓｅ：ＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＣＧ（配列番号：１）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣＣＡＴＣＣ（配列番号：２）
ＩＡＰ−１：ｓｅｎｓｅ：ｃｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｔｃａｇａｔｇ（配列番号：３）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：ｇｃａｃｔｔａｇｇａｇｇｃａａｔｃｃａｇ（配列番号：４）
結果はｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ（Ｒｐｌ３６）の発現量で割り返して、インスリンなし、ＢＣＡＡなし、又はＩＧＦ−１なし、ＢＣＡＡなしの時の値を１００％として％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌで表示した（図３）。イソロイシン、ロイシン、及びバリンから構成されるＢＣＡＡ混合物は、アポトーシス抑制遺伝子Ｍｃｌ−１およびＩＡＰ−１の発現を抑制した。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とするＡｋｔ活性化抑制剤は、高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制する。
本発明の薬剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため長期間にわたって投与可能であり、高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が癌発生に至るまでの長期経過における予防または治療に有利に用いることができる。
本出願は、日本で出願された特願２００５−２２７７８０（出願日：２００５年８月５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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