(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において３６５位以外の１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、配列番号３に示すアミノ酸配列の３６５位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、３６５位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
【請求項２】
３６５位に相当する位置以外は配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項３】
精製酵素の５ｍＭマルトースに対する反応性が５ｍＭグルコースに対する反応性の２０％以下であるか、および／または、精製酵素の１０ｍＭマルトースに対する反応性が１０ｍＭグルコースに対する反応性の２０％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項４】
前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項５】
前記３６５位以外の１又は複数のアミノ酸残基が、配列番号３のアミノ酸配列における３２４、３２６、３３３、３３４、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、４７２、４７５、５２５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つの位置に相当するアミノ酸残基であり、当該アミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項６】
前記位置が、３２６、４７２、４７５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つである請求項５に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項７】
前記位置が、４７２位である請求項６に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項８】
前記位置が、４７５位である請求項６に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項９】
前記位置が、４７２位及び４７５位の両方である請求項６に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１０】
前記位置が、３２６位である請求項６に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１１】
前記位置が、５２９位である請求項６に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１２】
４７２位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする請求項７に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１３】
４７５位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする請求項８に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１４】
３２６位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする請求項１０に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１５】
５２９位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする請求項１１に記載の変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１６】
配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における３２４、３２６、３３３、３３４、３６５、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、５２５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つの位置に相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換、（ii）４７２位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び（iii）４７５位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、（ｉ）において選択された位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、グルコースに対する比活性とマルトースに対する比活性との比が向上したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１７】
配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における３２６位に相当するアミノ酸残基のグルタミン又はバリンへの置換、（ii）４７２位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び（iii）４７５位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、３２６位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１８】
配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質において、（ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における５２９位に相当するアミノ酸残基のチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンへの置換、（ii）４７２位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び（iii）
４７５位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含み、５２９位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、マルトースに対する反応性が低下したことを特徴とする、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
【請求項１９】
配列番号３のアミノ酸配列の３６０〜３６６位のアミノ酸配列に対応する位置に配列番号７のアミノ酸配列を含み、配列番号３に示すアミノ酸配列と９３．７％以上の同一性を有する、ＦＡＤ結合型変異グルコース脱水素酵素。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
【請求項２１】
電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする請求項２０に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡを保持し、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素又は請求項２０に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項２０に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項２３に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の変異グルコース脱水素酵素、請求項２０に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は請求項２３に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性の向上した変異グルコース脱水素酵素に関する。本発明の変異グルコース脱水素酵素は、グルコースセンサ、及びグルコースアッセイキット等に好適に使用することができ、生化学分野、臨床分野等で有用である。
【背景技術】
【０００２】
近年バイオセンサ素子として様々な酵素が用いられている。糖尿病の診断を目的とした血液中のグルコース濃度を測定するセンサ素子として、グルコースオキシダーゼ(GOD)がすでに実用化されているが、GODはサンプル中の溶存酸素に影響を受けることが問題となっている。そこでサンプル中の溶存酸素に影響を受けないグルコース脱水素酵素（GDH）がGODに代わるものとして注目されている。
【０００３】
GDHには、NAD(P)+を補酵素とするもの（E.C. 1.1.1.47）やピロロキノリンキノン（PQQ）を補酵素とするもの（PQQGDH; E.C. 1.1.99.17）などが報告されている。NAD(P)+を補酵素とするGDHは、測定系にNAD(P)+を添加する必要があるという点でセンサ素子として問題がある。一方、PQQGDHなどの補酵素結合型GDHは測定系に補酵素を添加する必要がない。
【０００４】
また、センサ素子には、連続使用や室温に放置していてもセンサとしての機能を失わないというような安定性が望まれる。
高温下で生育する好熱性細菌由来の酵素は、一般に高い熱安定性を有し、長期保存や連続使用などにおいても高い安定性を示すことから、センサ素子としての応用が期待されている。しかし、好熱菌由来の耐熱性GDHについては、サーモゲネス・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilm）、スルファロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）由来のGDHが報告されているが、いずれもNAD(P)+を補酵素とするものである。
【０００５】
一方、中度好熱性細菌であるブルクホリデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）が産生する耐熱性GDHはFAD結合型であり、すでに至適反応温度、熱安定性、基質特異性などの酵素学的性質が明らかとなっている（特許文献１）。このGDHは、通常は、高い耐熱性を持つ触媒サブユニット（αサブユニット）、チトクロームＣである電子伝達サブユニッ
ト（βサブユニット）、機能不明のγサブユニットから構成されるヘテロオリゴマーとして存在し、45℃に至適反応温度を持つが、50℃以上の熱処理を行うことによりサブユニットの解離が起こり、75℃に至適反応温度をもつαサブユニット単量体になる。αサブユニット単量体は熱に安定であり、60℃30分の熱処理後にも80％以上の残存活性を示す。これらのサブユニットをコードする遺伝子も単離されている（特許文献１、特許文献２）。
【０００６】
しかし、補酵素結合型GDHは一般的に基質特性が広く、グルコース以外にマルトースやガラクトースなどとも反応するため、糖尿病患者向け血糖測定向けのグルコースセンサとして応用した場合で、糖尿病患者が腹膜透析を実施しなければならないような重篤な症状の場合は、透析液にマルトースが大量に含まれているため、本来の血糖値より高く測定値が出てしまう危険性がある。ブルクホリデリア・セパシアのGDHも同様に、グルコース以外にマルトースやガラクトースとも反応性を有している。
【０００７】
アミノ酸置換変異を導入することによって、GDHの基質特異性を変化させる技術が知られている。このような変異GDHとしては、例えば、E. coli（特許文献３、４）、アシネトバクター・カルコアセティカス（Gluconobacter calcoaceticus）（特許文献５）、又はアシネトバクター・バウマンニ（特許文献６〜８）由来の、ピロロキノリンキノンを補酵素とするPQQGDHが知られている。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００２３３３０号
【特許文献２】国際公開第０３／０９１４３０号パンフレット
【特許文献３】特開平１０−２４３７８６号公報
【特許文献４】特開２００１−１９７８８８号公報
【特許文献５】特開２００４−１７３５３８号公報
【特許文献６】特開２００４−３１３１７２号公報
【特許文献７】特開２００４−３１３１８０号公報
【特許文献８】特開２００４−３４４１４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、グルコースに対する基質特異性の向上したFAD結合型GDHを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブルクホリデリア・セパシアのFAD結合型GDHの特定の部位のアミノ酸配列を改変することにより、グルコースに対する反応性を維持しながら、他の糖に対する反応性が低下させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において３６５位以外の１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、前記アミノ酸配列の３６５位に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
（２）３６５位に相当する位置以外は配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、（１）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（３）３６５位に相当する位置のアミノ酸残基が野生型であるグルコース脱水素酵素と比較し、二糖類に対する反応性が低下したことを特徴とする、（１）または（２）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（４）２糖類がマルトースであることを特徴とする（３）に記載の変異グルコース脱水素
酵素。
（５）マルトースに対する反応性がグルコースに対する反応性の２０％以下であることを特徴とする（４）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（６）前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸残基であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素。
（７）さらに、配列番号３のアミノ酸配列における３２４、３２６、３３３、３３４、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、４７２、４７５、５２５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つの位置に相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、（１）〜（６）のいずれかに記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（８）前記位置が、３２６、４７２、４７５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つである（７）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（９）前記位置が、４７２位である（８）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（１０）前記位置が、４７５位である（８）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（１１）前記位置が、４７２位及び４７５位の両方である（８）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（１２）前記位置が、３２６位である（８）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（１３）前記位置が、５２９位である（８）に記載の変異型グルコース脱水素酵素。
（１４）４７２位に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びヒスチジンから選ばれるアミノ酸に置換されたことを特徴とする（９）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（１５）４７５位に相当するアミノ酸残基がヒスチジン又はセリンに置換されたことを特徴とする（１０）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（１６）３２６位のセリンに相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする（１２）に記載の変異グルコース脱水素酵素
（１７）５２９位のロイシンに相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする（１３）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（１８）配列番号３に示すアミノ酸配列、又は、同アミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質であって、（ｉ）前記アミノ酸配列における３２４、３２６、３３３、３３４、３６５、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、５２５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つの位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、（ii）４７２位に相当する位置のアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、及び（iii）４７５位に相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換を含む、グルコースに対する基質特異性が向上した変異グルコース脱水素酵素。
（１９）前記他アミノ酸残基がフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンであることを特徴とする（１８）に記載の変異グルコース脱水素酵素
（２０）前記位置が３２６位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がグルタミン又はバリンに置換されたことを特徴とする（１８）に記載の変異グルコース脱水素酵素
（２１）前記位置が５２９位であり、同位置に相当するアミノ酸残基がチロシン、ヒスチジン又はトリプトファンに置換されたことを特徴とする（１８）に記載の変異グルコース脱水素酵素。
（２２）配列番号７のアミノ酸配列を含む、ＦＡＤ結合型変異グルコース脱水素酵素。
（２３）（１）〜（２２）のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素と、電子伝達サブユニットとを少なくとも含む変異グルコース脱水素酵素複合体。
（２４）電子伝達サブユニットがシトクロムＣであることを特徴とする（２３）に記載のグルコース脱水素酵素複合体。
（２５）（１）〜（２２）のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ。
（２６）（２５）に記載のＤＮＡを保持し、（１）〜（２２）のいずれかに記載の変異グルコース脱水素酵素又は（２３）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体を産生する微生物。
（２７）（１）〜（２２）に記載の変異グルコース脱水素酵素、（２３）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は（２６）に記載の微生物を含む、グルコースアッセイキット。
（２８）（１）〜（２２）に記載の変異グルコース脱水素酵素、（２３）に記載の変異グルコース脱水素酵素複合体、又は（２６）に記載の微生物を含む、グルコースセンサ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の変異GDHは、野生型GDHに特定の変異を導入することにより、製造される。野生型GDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアが産生するGDHが挙げられる。ブルクホリデリア・セパシアのGDHとしては、ブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株、ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株が産生するGDHが挙げられる。ＫＳ１株は、平成12年９月25日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６)に、受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。ＪＣＭ２８００株又はＪＣＭ２８０１株は、独立行政法人理化学研究所微生物系統保存施設（Japan Collection of Microorganisms, JCM）に保存されている。
【００１２】
ＫＳ１株のGDH αサブユニット遺伝子、及びβサブユニット遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号１に示す（米国特許出願公開第２００４／００２３３３０号）。この塩基配列には３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、５'末端側から２番目及び３番目のＯＲＦは、それぞれαサブユニット（配列番号３）、及びβサブユニット（配列番号４）をコードしている。また、１番目のＯＲＦはγサブユニット（配列番号２）をコードしていると推定される。また、配列番号５に、βサブユニット遺伝子全長を含む断片の塩基配列を示す。さらに、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号６に示す（欧州特許出願公開第１４９８４８４号）。配列番号６において、アミノ酸番号１〜２２はシグナルペプチドであると推定される。尚、配列番号５及び６において、第１番目のアミノ酸残基はValと記載されているが、Metである可能性が高く、また、翻訳後に脱落している可能性がある。
【００１３】
本発明の変異GDHは、αサブユニットのみであってもよいし、αサブユニットとβサブユニットとの複合体、又はαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットからなる複合体であってもよい。本発明の変異GDHは、いずれの場合もαサブユニットに特定の変異が導入されたものであるが、この特定の変異の他に、保存的な変異を有していてもよい。また、他のサブユニットは野生型であっても、保存的な変異を有するものであってもよい。尚、「保存的変異」とは、GDH活性に実質的に影響しない変異をいう。
【００１４】
本発明の変異型αサブユニットは、好ましくは、後述する特定の変異以外は、配列番号３に示すアミノ酸配列を有する。また、変異型αサブユニットは、ＧＤＨ活性を有する限り、前述したような保存的変異を有していてもよい。すなわち、配列番号３のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、配列番号３には、配列番号１の塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を示してあるが、Ｎ末端のメチオニン残基は、翻訳後に脱落している可能性がある。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個である。
【００１５】
また、βサブユニットは、典型的には配列番号６のアミノ酸配列を有する。しかし、GDHのβサブユニットとして機能し得る限り、配列番号６のアミノ酸番号２３〜４２５からなるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１又は複数」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個である。尚、GDHのβサブユニットとして機能するとは、αサブユニットとともに複合体を形成したときに同複合体のＧＤＨ活性を損なわずにチトクロームＣとして機能することをいう。
【００１６】
野生型αサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号１の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、αサブユニット遺伝子は、配列番号１の塩基配列の塩基番号７６４〜２３８０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１７】
また、βサブユニット遺伝子として具体的には、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。またβサブユニット遺伝子は、配列番号５の塩基番号１８７〜１３９８からなる塩基配列を有するＤＮＡ、又はこの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、βサブユニットとして機能し得るタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００１８】
前記ストリンジェントな条件としては、７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズする条件、具体的には、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃が挙げられる。
【００１９】
αサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRによって、取得することができる。PCR用プライマーは、前記の塩基配列に基づいて化学合成することによって調製することができる。また、前記配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションによって、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡから取得することもできる。また、ブルクホルデリア・セパシアの他の菌株からも、同様にしてバリアントを取得することができる。他の菌株としては、前記のＪＣＭ２８００株及びＪＣＭ２８０１株が挙げられる。これらの菌株が産生するGDHのαサブユニットは、ＫＳ１株のαサブユニットと各々９５．４％及び９３．７％の相同性を有している。
【００２０】
また、他の微生物が産生するGDHであっても、ブルクホルデリア・セパシアのGDHと類似の構造及び酵素学的性質を有するものであれば、本発明の変異GDHの製造に用いることができる。このようなGDHとしては、例えば(i)Burkholderia pseudomallei, (ii)Burkholderia mallei, (iii)Ralstonia solanacearum由来のGDHが挙げられる（(i)、(ii)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (39), 14240-14245 (2004), (iii)Nature 415 (6871), 497-502 (2002)）。
【００２１】
本発明の変異GDHは、上記のような野生型GDH又は保存的変異を有するGDHが特定の変異を有することによって、グルコースに対する基質特異性が向上したものである。「グルコースに対する基質特異性が向上した」とは、グルコースに対する反応性を実質的に維持したまま、他の単糖類、二糖類又はオリゴ糖等の糖類、例えばマルトース、ガラクトース、キシロース等に対する反応性が低下したこと、あるいは、グルコースに対する反応性が他の糖類に対する反応性に比べて向上したことを含む。例えば、グルコースに対する反応性が低下しても、他の糖類に対する反応性がそれ以上に低下すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。また、他の糖類に対する反応性が上昇しても、グルコースに対する基質特異性がそれ以上に上昇すれば、グルコースに対する基質特異性は向上する。具体的
には例えば、野生型酵素に対する変異型酵素の基質特異性（グルコースに対する比活性と、他の糖類、例えばマルトース、に対する比活性との比）の向上（下記式で表される）が、１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％以上であれば、グルコースに対する基質特異性は向上している。例えば、基質特異性が、野生型酵素では６０％、変異型GDHでは４０％の場合、グルコース以外の糖類に対する反応性は、３３％低下している。
基質特異性＝(グルコース以外の糖類に対する比活性／グルコースに対する比活性)×１００）
基質特異性の向上＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ：野生型酵素の基質特異性
Ｂ：変異型酵素の基質特異性
また、変異型GDHは、マルトースに対する反応性（比活性）がグルコースに対する反応性（比活性）の３０％以下、好ましくは２０％以下であることが好ましい。
【００２２】
前記特定の変異とは、具体的には以下のとおりである。
（１）配列番号３に示すアミノ酸配列の３６５位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
（２）配列番号３に示すアミノ酸配列の３６５位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び、３２４、３２６、３３３、３３４、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、４７２、４７５、５２５、及び５２９の少なくとも１つ、又は任意の２以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
（３）（i）配列番号３に示すアミノ酸配列の３２４、３２６、３３３、３３４、３６５、３６８、３６９、３７６、３７７、４１８、４１９、４３６、４３３、４４８、５２５、及び５２９から選ばれる少なくとも１つ、又は任意の２以上の位置に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、（ii）４７２位に相当する位置のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換、及び（iii）４７５位に相当するアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換。
【００２３】
また、前記特定の変異としては、GDHのアミノ酸配列中に、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む変異が挙げられる。配列番号７に示すアミノ酸配列は、配列番号３に示すGDHにおいては、３６０位〜３６６位に相当する。ブルクホリデリア・セパシア以外のＦＡＤ結合型GDHであっても、野生型GDHが配列番号７に示すアミノ酸配列を含まない場合、配列番号７のアミノ酸配列を含む変異型GDHは、基質特異性が向上していると考えられる。
【００２４】
前記（１）の変異において、他のアミノ酸残基としては、セリン以外のアミノ酸、具体的にはフェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、トリプトファン、リシン、アスパラギン、ロイシン、システイン、トレオニン、イソロイシン、グリシン、バリン、メチオニン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、プロリンが挙げられる。これらの中では、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンが好ましい。
【００２５】
前記（２）の変異において、他のアミノ酸残基としては、野生型GDHの各々の位置におけるアミノ酸残基以外のアミノ酸が挙げられる。前記のアミノ酸置換の位置の中でも、３２６位、４７２位、４７５位、及び５２９位が好ましく、４７２位及び４７５位がさらに好ましい。４７２位及び４７５位に相当するアミノ酸残基の置換は、それぞれ単独でもよいが、両方置換されていることがより好ましい。
【００２６】
４７２位においては、置換後のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、又はヒスチジンが好ましく、アスバラギン酸が特に好ましい。
４７５位においては、置換後のアミノ酸残基はヒスチジン又はセリンが好ましく、ヒスチジンが特に好ましい。
３２６位においては、置換後のアミノ酸残基は、グルタミン又はバリンが好ましい。
５２９位においては、置換後のアミノ酸残基は、チロシン、ヒスチジン又はトリプトファンが好ましい。
【００２７】
上記の好ましいアミノ酸置換の態様は、前記（３）の変異においても同様である。
【００２８】
上記アミノ酸置換変異の位置は、配列番号３、すなわちブルクホリデリア・セパシアＫＳ１株の野生型GDH αサブユニットのアミノ酸配列における位置であるが、配列番号３のアミノ酸配列において、前記特定の変異以外に、１又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するGDH αサブユニットのホモログ又はバリアントにおいては、配列番号３のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて、前記アミノ酸置換の位置に相当する位置を示す。例えば、１〜３６４位の領域において１個のアミノ酸残基の欠失を有するGDH αサブユニットの保存的バリアントにおいては、３６５位とは、前記バリアントの３６４位を示す。
【００２９】
本発明の変異型GDHの好ましい変異の態様を以下に示す。
（数字はアミノ酸配列における位置を、アミノ酸残基は前記位置における置換後のアミノ酸残基を示し、「＋」は同時に２つのアミノ酸置換を有することを示す。）
（Ａ）３６５Ａｒｇ、３６５Ａｓｎ、３６５Ａｓｐ、３６５Ｃｙｓ、３６５Ｇｌｕ、３６５Ｇｌｙ、３６５Ｈｉｓ、３６５Ｉｌｅ、３６５Ｌｅｕ、３６５Ｍｅｔ、３６５Ｐｈｅ、３６５Ｐｒｏ、３６５Ｔｒｐ、３６５Ｔｙｒ、３６５Ｖａｌ、３６５Ｌｙｓ、３６５Ｇｌｎ、３６５Ｔｈｒ、３６５Ａｌａ
（Ｂ）３２６Ｇｌｎ、３２６Ｖａｌ、３２６Ａｒｇ
（Ｃ）５２９Ｈｉｓ、５２９Ｔｙｒ、５２９Ｔｒｐ
（Ｄ）３６５Ｔｙｒ＋３２６Ｇｌｎ、３６５Ｔｙｒ＋３２６Ｖａｌ、３６５Ｔｙｒ＋３２６Ａｒｇ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｐｈｅ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｉｌｅ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ａｓｎ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ａｓｐ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｈｉｓ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｌｅｕ、３６５Ｔｙｒ＋４７２Ｓｅｒ、３６５Ｔｙｒ＋４７５Ｓｅｒ、３６５Ｔｙｒ＋４７５Ｈｉｓ、３６５Ｐｈｅ＋４７２Ｐｈｅ
（Ｅ）４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋３６５Ｐｈｅ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋３２６Ｇｌｎ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋３２６Ｔｈｒ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋３２６Ｖａｌ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋５２９Ｔｒｐ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋５２９Ｈｉｓ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋５２９Ｔｙｒ、４７２Ｔｙｒ＋４７５Ｈｉｓ＋３６５Ｐｈｅ、４７２Ｔｙｒ＋４７５Ｈｉｓ＋３６５Ｈｉｓ、４７２Ｔｙｒ＋４７５Ｈｉｓ＋３２６Ｖａｌ、４７２Ｉｌｅ＋４７５Ｈｉｓ＋３２６Ｇｌｎ
（Ｆ）４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋５２９Ｈｉｓ＋３２６Ｇｌｎ、４７２Ａｓｐ＋４７５Ｈｉｓ＋５２９Ｔｒｐ＋３２６Ｇｌｎ
【００３０】
本発明者は、ＦＡＤを補酵素として有するＧＭＣオキシドレダクターゼファミリーであるグルコノバクター・オキシダンスのソルビトール脱水素酵素（GenBank accession AB039821）、エルビニア・ヘルビコーラの２−ケトグルタル酸脱水素酵素（GenBank accession AF068066）、ファネロケート・クリソスポリウムのセロビオース脱水素酵素（CDH）（J. Mol. Biol., 315(3), 421-34 (2002)）、ストレプトマイセス・スピシーズのコレステロールオキシターゼ（COD）（J. Struct. Biol. 116(2), 317-9(1996)）、ペニシリウム
・アマガサキエンスのグルコースオキシダーゼ（Eur. J. Biochem. 252, 90-99(1998)）のアミノ酸配列を比較し、ＦＡＤ結合ドメイン及びFAD-covering lid等の保存された領域、およびタンパク質の折りたたみに関与するアミノ酸残基であるプロリンが保存されている領域を見い出した。そして、これらの領域と他の領域との境界付近の配列を改変することにより、基質特異性を向上できる可能性について検討を行った。具体的にはR53〜H73、E88〜A108、N308〜G336、K362〜A377、A391〜R497、S509〜V539を検討した。その結果、上記領域の中において基質特異性を向上することができる場所をいくつか発見した。
【００３１】
所望の変異を有するGDH αサブユニットは、GDH αサブユニットをコードするＤＮＡ（αサブユニット遺伝子）に、部位特異的変異法によって、所望のアミノ酸変異に対応するヌクレオチド変異を導入し、得られる変異ＤＮＡを適当な発現系を用いて発現させることによって、取得することができる。また、変異GDH αサブユニットをコードするＤＮＡを、βサブユニットをコードするＤＮＡ（βサブユニット遺伝子）、又はβサブユニット遺伝子とγサブユニットをコードするＤＮＡ（γサブユニット遺伝子）とともに発現させることによって、変異GDH複合体を取得することができる。尚、GDH αサブユニットをコードするＤＮＡへの変異の導入は、γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片を用いてもよい。
【００３２】
変異が導入されたGDH αサブユニット又はGDH複合体の糖類に対する基質特異性は、実施例に記載された方法によって各種糖類に対する反応性を調べ、野生型GDH αサブユニット又は野生型GDH複合体の反応性と比較することよって、決定することができる。
【００３３】
γサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをこの順にコードするポリシストロニックなＤＮＡ断片は、例えば、ブルクホルデリア・セパシアKS1株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号８、９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRによって取得することができる（後記実施例参照）。
【００３４】
GDHの各サブユニットの遺伝子の取得、変異の導入、遺伝子の発現等に用いるベクターとしては、例えばエシェリヒア属細菌で機能するベクター、具体的にはpTrc99A、pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pACYC184、pBBR122等が挙げられる。遺伝子の発現に用いるプロモーターとしては、例えばlac、trp、tac、trc、PL、tet、PhoA等が挙げられる。また、プロモーターを含む発現ベクターの適当な部位に、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子を挿入することによって、これらの遺伝子のベクターへの挿入とプロモーターの連結とを同じ工程で行うことができる。このような発現ベクターとしては、pTrc99A、 pBluescript、pKK223-3等が挙げられる。
【００３５】
また、αサブユニット遺伝子又は他のサブユニット遺伝子は、発現可能な形態で宿主微生物の染色体ＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
【００３６】
組換えベクターで微生物を形質転換するには、例えばカルシウム処理によるコンピテントセル法、プロトプラスト法又はエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３７】
宿主微生物としては、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌が挙げられるが、これらに限られず、異種タンパク質生産に適した宿主微生物であれば用いることができる。
【００３８】
本発明の変異αサブユニットもしくは変異GDH複合体又はこれらを発現する微生物は、グルコースセンサの酵素電極、又はグルコースのアッセイキットの構成要素として用いることができる。ブルクホルデリア・セパシアの野生型GDHを用いたグルコースセンサ及びグルコースアッセイキットは、米国特許公開第2004/0023330A1に記載されている。本発明
の変異GDHも、同様にして使用することかできる。
【実施例】
【００３９】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１〕ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミド
ブルクホルデリア・セパシアのGDHを発現するプラスミドとして、GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド、並びに、αサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドを用意した。
【００４１】
＜１＞GDHのαサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
αサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドとしては、WO02/036779（EP1331272A1、US2004023330A1、CN1484703Aに対応）に記載のプラスミドpTrc99A/γ+αを使用した。同プラスミドは、ブルクホルデリア・セパシアKS1株（FERM BP-7306）染色体ＤＮＡから単離された、GDH γサブユニット構造遺伝子とαサブユニット構造遺伝子を連続して含むＤＮＡ断片が、ベクターpTrc99A（Pharmacia社）のクローニング部位であるNcoI/HindIIIに挿入されてなるプラスミドである。本プラスミド中のGDHγα遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99A/γ+αは、アンピシリン耐性遺伝子を保持している。
【００４２】
＜２＞GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミド
GDHのαサブユニット、βサブユニット及びγサブユニットを発現するプラスミドは、以下のようして調製した。
【００４３】
（１）ブルクホルデリア・セパシア KS1株からの染色体DNAの調製
ブルクホルデリア・セパシア KS1株より染色体遺伝子を常法に従って調製した。すなわち、同菌株をTL液体倍地(ポリペプトン １０g、酵母抽出液 １g、NaCl ５g、KH2PO4  ２g、グルコース ５g；１L、pH 7.2)を用いて、34℃で一晩振盪した。増殖した菌体を遠心分離により回収した。この菌体を10mM NaCl、20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5% SDS、100μg/mlのプロテイナーゼKを含む溶液に懸濁し、５０℃で６時間処理した。ここに等量のフェノール−クロロホルムを加えて室温で１０分間撹拌した後、遠心分離により上清を回収した。これに終濃度0.3Mになるように酢酸ナトリウムを加え、２倍量のエタノールを重層して中間層に染色体DNAを析出させた。これをガラス棒を用いてすくいとり、70%エタノールで洗浄した後、適当量のTEバッファーに溶解させ、染色体DNA溶液とした。
【００４４】
（２）GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片の調製
前記染色体DNAを鋳型として、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲにより、GDHのγサブユニット、αサブユニット及びβサブユニットをコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【００４５】
〔フォワードプライマー〕
5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3'（配列番号８）
〔リバースプライマー〕
5'-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3'（配列番号９）
【００４６】
増幅した断片のC末端側を平滑末端化した後、N末端側をNcoIで消化し、同様に処理したpTrc99A（Pharmacia社）にライゲーションした。得られた組換えベクターでE. coli DH5αを形質転換し、アンピシリン50μg/mLを含むLB寒天培地で生じるコロニーを採取した。
得られた形質転換体を液体のLB培地で培養してプラスミドを抽出し、その挿入DNA断片を解析したところ、約3.8kbの挿入断片が確認された。本プラスミドをpTrc99Aγαβと命名した。本プラスミド中のGDHの各構造遺伝子は、trcプロモーターによって制御される。pTrc99Aγαβは、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を保持している。
【００４７】
〔実施例２〕GDH αサブユニット遺伝子への変異導入による基質相互作用部位の探索
（１）４７２位及び４７５位への変異導入
実施例１で得られたpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子に、同遺伝子がコードするαサブユニットの４７２位のアラニン残基をアスパラギン酸残基に、および４７５位のアスパラギン残基をヒスチジン残基に置換されるような変異を導入した。この変異体を４７２Ｄ＋４７５Ｈ変異体と称する。これらの変異により基質特性が改善されることは、本発明者らはすでに確認している。
具体的には、市販の部位特異的変異導入キット（Stratagene社、QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit）を用いて、実施例１に記載のプラスミドpTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβに含まれるGDH αサブユニット遺伝子の４７５位のアスパラギンのコドン（AAT）をアスパラギン酸（GAT）又はグルタミン酸（GAA）のコドンに置換した。プライマーには、下記のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００４８】
〔Ａ４７２Ｄ変異導入用プライマー〕
フォワードプライマー：配列番号２２４
5'-CGTGTTCAACGACGAATTCGATCCGAACAATCACATCACGG-3'
リバースプライマー  ：配列番号２２５
5'-CCGTGATGTGATTGTTCGGATCGAATTCGTCGTTGAACACG-3'
【００４９】
〔Ｎ４７５Ｈ変異導入用プライマー〕
フォワードプライマー：配列番号２２６
5'-AATTCGCGCCGAACCACCACATCACGGGCTC-3'
リバースプライマー  ：配列番号２２７
5'-GAGCCCGTGATGTGGTGGTTCGGCGCGAATT-3'
【００５０】
（２）４７２位及び４７５位以外の位置への変異導入
【００５１】
前記で得られた４７２Ｄ＋４７５Ｈ変異体をコードする変異遺伝子を用いて、さらに以下に示す領域のアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換を実施した。ただし、野生型のアミノ酸残基がフェニルアラニンである位置については、アミノ酸置換は行わなかった。尚、下記の数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸の種類を示す。例えば、R53は、５３位のアルギニンを示す。
【００５２】
(i)R53〜H73
(ii)E88〜A108
(iii)N308〜G336
(iv)K362〜A377
(v)A391〜R497
(vi)S509〜V539
【００５３】
なお変異を導入するターゲットのαサブユニット遺伝子に関しては、変異の組み合わせによる相乗効果を狙って、既に基質特性改善効果を確認済みである４７２Ｄ＋４７５Ｈ変異体を用いた。
【００５４】
前記アミノ酸残基置換に用いたフォワードプライマーの配列を以下に示す。リバースプ
ライマーの配列は、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
尚、変異を表す表記において、数字はアミノ酸配列における位置を、数字の前のアルファベットはアミノ酸置換前のアミノ酸残基を、数字の後のアルファベットはアミノ酸置換後のアミノ酸残基を示す。例えば、R53Fは、５３位のアルギニンからフェニルアラニンへの置換を示す。
【００５５】
ＰＣＲ反応は、以下の反応組成で、95℃、30秒の後、95℃ 30秒、55℃ 1分、68℃ 8分を１５サイクル繰り返し、68℃ 30分の反応を行った後、4℃で保持した。
【００５６】
〔反応液組成〕
鋳型ＤＮＡ（5ng/μl）                ２μl
（472D+475H導入pTrc99A/γ+α及びpTrc99Aγαβ）
10×反応緩衝液                       ５μl
フォワードプライマー（100ng/μl）    １．２５μl
リバースプライマー（100ng/μl  ）    １．２５μl
dNTP                                 １μl
蒸留水                             ３８．5μl
DNAポリメラーゼ                      １μl
合計                               ５０μl
【００５７】
ＰＣＲ反応の後、反応液にDNAポリメラーゼＩを０．５μｌ添加し、37℃で１時間インキュベートし、鋳型プラスミドを分解させた。
【００５８】
得られた反応液で、エシェリヒア・コリDH５α（supE44, ΔlacU169(φ80lacZΔM15), hsdR17, recAi, endA1, gyrA96, thi-1, relA1）のコンピンテントセルを形質転換した。アンピシリン（50μg/ml）およびカナマイシン（30μｇ/ml）を含むＬＢ寒天培地（バクトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って、GDH αサブユニット遺伝子に目的の変異が導入されたことを確認した。
【００５９】
【表１】
0005341312.tif 000002
【００６０】
【表２】
0005341312.tif 000003
【００６１】
【表３】
0005341312.tif 000004
【００６２】
【表４】
0005341312.tif 000005
【００６３】
【表５】
0005341312.tif 000006
【００６４】
【表６】
0005341312.tif 000007
【００６５】
【表７】
0005341312.tif 000008
【００６６】
〔実施例３〕変異GDHの基質特異性の解析
実施例２で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。
【００６７】
（１）培養
変異導入したエシェリヒア・コリＤＨ５α株を、各々2mlのLB培地（アンピシリン50μg/ml及びカナマイシン30μg/ml含有）で、Ｌ字管を用いて37℃で一晩振とう培養した。それらの培養液を、150mlのLB培地（アンピシリン50μg/mlおよびカナマイシン30μg/ml含有）を含む500mlの坂口フラスコに植菌し、37℃で振とう培養した。培養開始から３時間後にIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃度0.1mMになるように添加し、さらに２時間培養した。
【００６８】
（２）粗酵素サンプルの調製
前記で培養した培養液から菌体を集め、洗浄後、湿菌体0.3mgあたり1mlの0.2% Triton X100を含む10mMリン酸カリウムバッファー（PPB）（pH7.0）で菌体を懸濁し、超音波破砕した。この懸濁液遠心分離（10000r.p.m、10分、4℃）して残渣を除去した後、上清を超遠心分離（50,000r.p.m.、60分、4℃）し、得られた上清（水溶性画分）を、粗酵素サンプルとした。また、このサンプルを、通常の疎水性クロマトグラフィー（カラム名：オクチルセファロース(アマシャム・バイオサイエンス製)およびイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ-セファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）により精製して、精製酵素サンプルを得た。目的とする酵素画分の決定は、GDH活性を指標として行った。
【００６９】
（３）GDH活性の測定
前記酵素サンプル8μlに、活性測定用試薬（12μlの600mM メチルフェナジンメトサルフェート(PMS)、120μlの6 mM 2,6-ジクロロフェノールインドフェノール(DCIP)に、0.2(w/v)% Triton X-100 10mM PPBを加え、全量480μlとした溶液）を8μl添加した。これをアルミブロック恒温槽を用いて、各反応温度で1分間プレインキュベートした後、素早く各濃度の基質（グルコース又はマルトース）、または蒸留水を8μl加えて攪拌し、分光光
度計を用いてDCIP由来の吸収波長である600 nmの吸光度を測定した。各試薬の終濃度はDCIP:0.06mM、PMS、0.6mM。基質の終濃度は5mMである。
結果を、表８〜１４に示す。尚、野生型GDHの反応比は４８%であった。
【００７０】
【表８】
0005341312.tif 000009
【００７１】
【表９】
0005341312.tif 000010
【００７２】
【表１０】
0005341312.tif 000011
【００７３】
【表１１】
0005341312.tif 000012
【００７４】
【表１２】
0005341312.tif 000013
【００７５】
【表１３】
0005341312.tif 000014
【００７６】
【表１４】
0005341312.tif 000015
【００７７】
この結果、４７２Ｄ＋４７５Ｈ＋３６５Ｆが、グルコース対する反応性を維持しつつ、
マルトースとの反応性が１％台まで低下する大変効果の高い変異であった。
３６５位以外の変異では、Ｇ３２４、Ｓ３２６、Ｌ３３３、Ｗ３３４、Ｓ３６８、Ｒ３６９、Ｋ３７６、Ｉ３７７、Ｖ４１８、Ｐ４１９、Ｙ４３６、Ｋ４３３、Ｈ４４８、Ａ５２５、Ｌ５２９のフェニルアラニンへの変異がマルトースとの反応性において変異導入前の６０％以下となり効果が見られた。
【００７８】
〔実施例４〕３６５位への変異導入の検証
実施例３で得られた結果から、３６５位はマルトースとの反応性低下において大変効果的な部位であることが推察された。よってこの部位の詳細な検討を行なう事とした。
具体的にはαサブユニット遺伝子に対する、３６５位への単変異導入による基質特性改善効果を検証した。
pTrc99Aγαβに含まれる野生型GDH αサブユニット遺伝子の３６５位に変異導入を実施し、変異酵素の基質特異性を評価した。変異導入に関しては実施例２と同様に行なった。
変異導入用フォワードプライマーは以下の通りである。リバースプライマーは、フォワードプライマーの完全相補鎖とした。
【表１５】
0005341312.tif 000016
【００７９】
〔実施例５〕変異GDHの基質特異性の解析
実施例４で得られた変異GDH発現プラスミドを用いて、実施例３と同様にして、変異GDHを製造し、基質特異性を検討した。酵素活性は、粗酵素サンプルを用いて行った。それぞれの変異GDHのグルコースに対する比活性、マルトースに対する比活性、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性。単位はU/ml）を、表１６に示す。基質濃度に関しては5mMおよび10mMにて評価した。
【００８０】
【表１６】
0005341312.tif 000017
【００８１】
その結果、３６５位に関しては、野生型でのセリン残基以外の１９種類全てのアミノ酸置換で基質特性改善効果が認められた。具体的には全てのアミノ酸置換で、野生型と比較し、マルトースに対する反応性が５０％以上低下していた。特にチロシン、トリプトファンへの置換では、基質濃度5mM, 10mMのいずれにおいても、野生型が反応比４０％程度であるのに対し、２％以下と、マルトースに対する反応性が野生型の９０％以上低下し、極めて大きな基質特性改善効果が認められた。
【００８２】
〔実施例６〕３６５位と他の部位との組み合わせ効果の検証
実施例２および実施例５の結果により、３６５位は少なくとも３６５Ｆと４７２Ｄ＋４７５Ｈの組み合わせにおいて効果が確認され、さらに３６５位のみの単変異導入において全てのアミノ酸置換にて効果が見られた事から、基質特性改善効果の大変高い部位であることが明らかになった。よって、３６５位のアミノ酸置換と他の部位とのアミノ酸置換との組み合わせによる、更なる基質特性改善を目指し、さらに鋭意検討を行なった。具体的には３６５位と３２６位、５２９位、４７２位の何れかとの組み合わせに２変異導入、並びに４７２及び４７５位の変異との組み合わせによる３変異導入を検討した。
【００８３】
【表１７】
0005341312.tif 000018
【００８４】
【表１８】
0005341312.tif 000019
【００８５】
検討した全ての部位との組み合わせにおいて相乗効果的に基質特性が改善されることが見出され、３６５位は基質特性を改善する別の部位におけるアミノ酸置換との組み合わせにより更に基質特性を改善できることが明らかとなった。
【００８６】
〔実施例７〕４７２位及び４７５位と、他の部位との組み合わせ効果の検証
実施例６の結果により、基質特性改善効果のあるアミノ酸置換は、それらの部位同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性が改善される可能性が示唆された。
よって、すでに発明者らによって基質特性改善効果が確認されている部位である４７２、４７５位と３６５以外の部位との組み合わせ効果を検証した。
具体的には４７２位と４７５位の組み合わせにおいて最も基質特性改善効果の高かった４７２Ｄ＋４７５Ｈと、３２６位又は５２９位との組み合わせを検証した。また、４７２位及び４７５位の他の変異についても、同様に検証した。
【００８７】
【表１９】
0005341312.tif 000020
【００８８】
【表２０】
0005341312.tif 000021
【００８９】
【表２１】
0005341312.tif 000022
【００９０】
４７２及び４７５位と、他の部位との組み合わせにおいても相乗効果が確認された。特に４７２、４７５、３２６、５２９位の４変異導入はマルトースに対する反応性低下効果が高く、この結果からも基質特性改善効果のあるアミノ酸置換同士の組み合わせにより相乗効果的に基質特性を改善できることが示された。
【００９１】
〔実施例８〕精製酵素の調製
実施例５および６で基質特異性の改善が認められたいくつかの変異GDHについて精製を実施した。方法は実施例３に記載の通りに行なった。各精製酵素のグルコースに対する比活性(U/mg)を表８に示す。
その結果、Ｓ３６５Ｙを含む変異は、グルコースに対する比活性を９０％近く維持し、グルコース測定の観点からは好適な変異であることが明らかとなった。またＳ３２６Ｑ変異はグルコースに対する比活性を上げる効果があることも判明した。
【００９２】
【表２２】
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【００９３】
〔実施例９〕変異GDHを用いた血糖測定用比色式センサの作製
実施例８で得られた精製変異酵素を用いてグルコースセンサを作製した。
【００９４】
図１に示す基本構成を有するグルコースセンサを作製した。すなわち、前記グルコースセンサは、透明基板２Ａに対してスペーサー３を介して透明カバー４Ａ（材質ＰＥＴ）を積層した形態を有し、各要素２Ａ〜４Ａによってキャピラリ５Ａが規定されている。キャピラリ５Ａの寸法は、1.3mm×9mm×50μmである（図１）。透明基板２Ａおよび透明カバー４Ａは、厚みが２５０μmであるＰＥＴにより形成し、スペーサー３Ａは黒色の両面テープにより構成した。
【００９５】
グルコースセンサは、図２に示す第１試薬部〜第３試薬部を有し、それぞれ成分及び塗
布量を表２３に示す。表中、「Ｒｕ」は、ヘキサルテニウムアンミン錯体（Ru(NH3)6Cl3）を、ＣＨＡＰＳは3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acidを、ＡＣＥＳはN-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acidを、ＭＴＴは3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideを、各々示す。
【００９６】
【表２３】
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【００９７】
上記グルコースセンサのキャピラリに測定試料を供給し、その時点から０．１秒毎に吸光度を繰り返し測定して、吸光度のタイムコースを作成した。各回の吸光度の測定においては、第３試薬部に対して、キャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサを透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて６３０ｎｍの光を照射することにより行なった。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。
【００９８】
測定試料としては、グルコースを添加した血液を用いた。ヘマトクリットを４２％に調整した血液に、０，１００，２００，４００,６００又は８００ｍｇ／ｄｌの濃度になるようにグルコースを添加したものを用いて、グルコースセンサの直線性を評価した。なお直線性評価は測定試料のセンサへの導入５秒後のエンドポイントの吸光度をプロットする事により行なった。結果を、図３に示す。
【００９９】
また、ヘマトクリット値４５％、グルコース濃度４５ｍｇ／ｄｌに調整した血液に、さらにマルトースを０，１００，２００又は３００ｍｇ／ｄｌになるように添加したものを用いて、マルトースの影響を評価した。結果を、図４に示す。この試験も同様に測定試料導入５秒後の吸光度をプロットする事により行なった。
【０１００】
グルコースを基質として用いた直線性評価では、全ての酵素に関して濃度依存的に吸光度が増加し、グルコースを測定可能であることが分かる。特に３６５を含む変異である３６５Ｙおよび３２６Ｑ３６５Ｙは野生型より直線性が伸びており、より高濃度域（６００mg/dl付近）まで測定可能であることが示唆される。
【０１０１】
次にマルトース影響に関してであるが、グルコース45mg/dlにマルトースを添加した場合、野生型ではマルトース濃度に依存して吸光度が大きく増加し、マルトースと強く反応していることが示唆される。一方変異酵素を用いたセンサでは、マルトース濃度に応じた吸光度の増加が抑えられており、マルトースの影響が少なくなっていることがわかる。これらのデータを見かけの血糖上昇値に換算した結果を図５及び表２４に示す。野生型酵素
を用いたセンサでは、低血糖(４５ｍｇ／ｄｌグルコース)がマルトースの混入によって正常域以上の（１３８ｍｇ／ｄｌグルコース）に見かけ上表示されてしまう。一方、改変GDHを用いたセンサでは、マルトースが最大３００ｍｇ／ｄｌ混入している場合でも、見かけの血糖値が最大でも６０mg/dlまでしか上昇せず、影響は大幅に押さえられていると言える。結論としては３６５を含む変異が、グルコースに対する反応性（直線性）とマルトース影響の観点から最適であることが示唆される。
【０１０２】
【表２４】
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【０１０３】
以上の結果から明らかなように、変異GDHを用いたグルコースセンサは、直線性も野生型と同程度以上確保されているにも関わらず、マルトースとの反応性が大きく低下している。この変異GDHを用いたグルコースセンサを用いれば、病院等で投与される血中マルトース濃度の上限値である２００ｍｇ／ｄｌにおいては正誤差は無いと言え、上限値以上の３００mg/dlにおいても低血糖（５０ｍｇ／ｄｌ以下）が正常値や高血糖と判定されること無く、安全な治療が行なえる。また前述の通りGDHは溶存酸素とも反応しないことから、この変異GDHを用いたセンサを提供することで、糖尿病患者の正確な診断治療が行なえる。
【０１０４】
〔実施例１０〕精製酵素のＳＶプロット評価
実施例５および６で特に基質特異性改善効果が認められた３６５Ｙおよび３２６Ｑ＋３６５Ｙ変異GDHについて、精製酵素を用いたＳＶプロットを取得した。
その結果、精製した酵素においても、試験した全ての基質濃度に関して、反応比（マルトースに対する比活性／グルコースに対する比活性）が野生型と比べて大幅に低くなり改善されていることが確認できた。また結果に関しても粗酵素溶液による測定結果とほぼ一致したことから、粗酵素による改変酵素の評価は十分可能であることが確認できた。さらに付け加えると、マルトース輸液による、血中のマルトース濃度の上昇は最大でも200mg/dlまでしか上昇しないことから、特に基質濃度10mM(360mg/dl)と5mM(180mg/dl)における反応比に注目した。その結果、この濃度域におけるS３６５Y変異のマルトース/グルコース反応比は０．１％と、殆どマルトースとは反応しないことが示唆された。
また３２６Ｑを３６５Ｙに付加することで、グルコースに対する比活性を上げ、相対的にマルトースとの反応性を下げることが出来ることも明らかとなった。
【０１０５】
【表２５】
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【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明の変異GDHは、グルコースに対する基質特異性が向上しており、グルコースセンサ等を用いたグルコースの測定に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】グルコースセンサの構造を示す図。
【図２】グルコースセンサの各試薬部を示す図。
【図３】変異型GDHを用いたグルコースセンサのグルコースに対する反応性を示す図。
【図４】変異型GDHを用いたグルコースセンサの、グルコース存在下におけるマルトースに対する反応性を示す図。
【図５】野生型GDH及び変異GDHを用いたグルコースセンサを用いて測定された見かけ上の血糖値を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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