(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（化−１）で表されるアルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩のいずれか１種以上を有効成分として含む、塩分の吸収阻害作用をもつ糸球体硬化抑制剤：
【化１】
0005346360.tif 000009
［式（化−１）中、Ｒは、水素原子又は金属イオンを表す。Ｒ’は、Ｄ−マンニュロン酸（Ｍ）及びＬ−グルロン酸（Ｇ）がα−及び／又はβ−１，４結合した下記のいずれかの構造を表す：
Ｇ；
Ｍ；
Ｇ−Ｇ；
Ｍ−Ｇ；
Ｍ−Ｍ；
Ｇ−Ｇ−Ｇ；
Ｇ−Ｇ−Ｍ；
Ｇ−Ｍ−Ｇ；
Ｇ−Ｍ−Ｍ；
Ｍ−Ｇ−Ｇ；
Ｍ−Ｍ−Ｇ；
Ｍ−Ｍ−Ｍ；及び
Ｍ−Ｇ−Ｍ］。
【請求項２】
アルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩が、アルギン酸ナトリウムをシュードアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理することにより得られたものである、請求項１記載の塩分の吸収阻害作用をもつ糸球体硬化抑制剤。
【請求項３】
シュードアルテロモナス属に属する微生物が、シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２０１）である、請求項２記載の塩分の吸収阻害作用をもつ糸球体硬化抑制剤。
【請求項４】
皮下投与剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糸球体硬化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管障害を併発する疾患には自覚症状に乏しいものが多い。自覚が無いまま症状が重篤化して臓器が機能不全を起こすケースもあり、例えばそれが心臓であれば死亡の直接の原因ともなる。また多くの血管が存在する臓器の1つに腎臓がある。腎臓に入った血管は毛細血管に枝分かれし、これがとぐろを巻いて球体を形作った糸球体と呼ばれる組織を形成する。代謝産物や異物等、生体に不要なものはこの糸球体を通して濾過され、最終的に尿中へと排泄される。腎臓には1分間に約200ミリリットルもの血液が送られており、ろ過される原尿は1日あたり120リットルともいわれている。様々な要因により糸球体を形成する血管が障害を受け、腎臓の正常な働きが60％以上失われた状態を腎不全といい、その機能が15％以下となった場合、継続的な透析療法が必要となる。透析療法には週3回程度、透析を行う医療機関に通院する必要があり、専門のスタッフにより1回4〜5時間かけて行われる。透析療法を受けることは機械に依存して生命を維持することを意味し、ライフスタイルの大きな変化を伴うだけではなく、経済的にも大きな負担となる。その適応時期を遅くするだけでも意義は大きい。日本では25万人以上の人が透析療法を行っていると言われている。
【０００３】
日本人は古来より塩、醤油、味噌等の高塩分食を主体としており、塩分の過剰摂取により腎臓が塩分を排出する限界を超えた場合、体内の塩分濃度が上昇する。その結果、体液の塩分濃度を薄めるために体内の水分量が増えることで血管抵抗性が増加し、また塩分中のナトリウムが交感神経や細胞膜を刺激して血管を収縮させることで血管には過剰な負荷がかかる。慢性的な血管への負荷により心臓や腎臓が疲弊し、機能不全に陥ると、重篤な場合は臓器移植や透析療法が必要となる。これに対して減塩食事療法は有効であるものの、古来より塩分に慣れ親しんできた日本人にとって減塩食は耐え難いものであり、特に食塩に対する味覚感受性が衰えた高齢者では過剰の塩分を自覚の無いままに摂取し続けることも懸念される。これらのことから、食物繊維を使用したナトリウム・カリウム交換作用による体外排泄作用など、体内の塩分をいかに体外に排出するかという研究などが、現在まで多数行われてきた。
【０００４】
一方、アルギン酸はコンブなどの褐藻類に含まれる高粘性をもつ多糖である。アルギン酸多糖を酸性条件化で加熱し、分子量数万〜数十万レベルまで分解させた低分子化アルギン酸をナトリウムやカリウム塩化したものは食品添加物として増粘剤などの用途で利用されている。一般にアルギン酸は腸管吸収されないと考えられており、低分子化したアルギン酸塩であっても、小腸で吸収されず、大腸でもほとんど腸内細菌による消化を受けないという報告がある（非特許文献１を参照）。アルギン酸多糖や低分子化アルギン酸の塩（カリウム塩やカルシウム塩）はナトリウムイオンを交換し、腸管吸収されず体外にナトリウムイオンを排泄する作用があることが知られている。
【０００５】
また、アルギン酸多糖塩、あるいは低分子化アルギン酸塩をシュードアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理することでオリゴ糖まで分解し、高い水溶性と低粘性、及び体内吸収性をもたせたものについては、アルギン酸オリゴ糖塩を利用した血圧上昇を抑制する食品（特許文献１を参照）や血管内皮増殖促進剤（特許文献２を参照）、循環器系疾患予防治療剤（特許文献３を参照）に関する特許が出願されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2002-272420号公報
【特許文献２】特開平11-43439号公報
【特許文献３】特開平9-235234号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】New Food Industry,43,2,13-19,2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はアルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩を含有することを特徴とする塩分の吸収阻害作用を示す血管保護剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者等が鋭意、検討した結果、アルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩は従来のアルギン酸多糖塩や低分子化アルギン酸塩とは異なり体内に吸収されること、さらに、従来のアルギン酸多糖塩や低分子化アルギン酸塩が塩分を抱き込み、塩分と共に排泄されることで塩分の吸収阻害作用を発揮するのに対して、アルギン酸オリゴ糖及びその塩は従来のアルギン酸多糖塩や低分子化アルギン酸塩とは異なる機作により塩分の吸収阻害作用を示し、さらには血管保護作用を示すことを見出した。
【００１０】
即ち、本発明は以下に関する。
本発明はアルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩を有効成分とする、塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を提供する。
【００１１】
また、本発明はアルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩が、アルギン酸ナトリウムをシュードアルテロモナス属に属する微生物の菌体又はその処理物で処理することにより得られたものである、上記の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を提供する。
【００１２】
さらに、本発明はシュードアルテロモナス属に属する微生物が、シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６である上記の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を提供する。
【００１３】
さらに、本発明はアルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩が、下記式（化−１）で表されるものである、上記の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を提供する。
【００１４】
【化１】
0005346360.tif 000002
［式（化−１）中、Ｒは、水素原子又は金属イオンを表す。Ｒ’は、下記式（化−２）で表されるＤ−マンニュロン酸（Ｍ）若しくは下記式（化−３）で表されるＬ−グルロン酸（Ｇ）を表し、又はＭとＧの何れか若しくは両方を構成糖とする２個以上の構成糖がα−及び／又はβ−１，４結合した構造を表す。］
【００１５】
【化２】
0005346360.tif 000003
［式（化−２）中、Ｒは前記と同義である。］
【００１６】
【化３】
0005346360.tif 000004
［式（化−３）中、Ｒは前記と同義である。］
【００１７】
さらに、本発明は上記の血管保護剤を含む、腎機能低下抑制剤及び心機能低下抑制剤を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は皮下投与剤である、上記の血管保護剤、腎機能低下抑制剤及び心機能低下抑制剤を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、アルギン酸オリゴ糖及び/又はその塩を摂取することで、過剰な食塩負荷による悪影響を軽減し、しかも摂取者が日常的に容易に摂取可能、且つ安全なことから、健康維持に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】凍結乾燥菌体シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６由来アルギン酸リアーゼ処理により得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖のHPLC分析の結果を示す図である。
【図２】アルギン酸オリゴ糖の生体内への吸収性を示す図である。
【図３】アルギン酸オリゴ糖の食塩負荷が血圧に与える影響に対する効果を示す図である。
【図４】アルギン酸オリゴ糖がナトリウム代謝に与える影響を示す図である。
【図５】アルギン酸オリゴ糖が心臓重量/体重比に与える影響を示す図である。
【図６】アルギン酸オリゴ糖が腎臓重量/体重比に与える影響を示す図である。
【図７】アルギン酸オリゴ糖が糸球体硬化度に与える影響を示す図である（その１）。
【図８】アルギン酸オリゴ糖が糸球体硬化度に与える影響を示す図である（その２）。
【図９】アルギン酸オリゴ糖がクレアチニンクリアランスに与える影響を示す図である。
【図１０】アルギン酸オリゴ糖が尿蛋白に与える影響を示す図である。
【図１１】アルギン酸オリゴ糖が血圧に与える影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、アルギン酸オリゴ糖及び／又はその塩（以下「アルギン酸オリゴ糖（塩）」とも言う）を有効成分として含有する。該アルギン酸オリゴ糖及び／又はその塩は、従来のアルギン酸多糖塩や低分子化アルギン酸塩とは異なり体内に吸収され、さらに、従来のアルギン酸多糖塩や低分子アルギン酸塩とは異なる機作にて塩分の吸収阻害作用を発揮し、血管保護作用も併せて示す。本発明において、塩分とは、塩化ナトリウムのことをいう。
【００２２】
具体的には、アルギン酸オリゴ糖（塩）としては、末端が４，５−不飽和ウロン酸であり、Ｄ−マンニュロン酸及びＬ−グルロン酸を構成糖とするオリゴ糖が挙げられる。そのようなアルギン酸オリゴ糖（塩）としては、式（化−１）で表されるものが好ましい。
【００２３】
【化４】
0005346360.tif 000005
【００２４】
式（化−１）中、Ｒは、水素原子又は金属イオンを表す。金属イオンとしては、アルカリ金属イオン（Ｎａ＋、Ｋ＋等）、アルカリ土類金属イオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等 、その他の金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋等）が挙げられる。
【００２５】
アルギン酸オリゴ糖の塩としては、アルギン酸オリゴ糖の上記金属塩（アルギン酸ナトリウムオリゴ糖、アルギン酸カリウムオリゴ糖、アルギン酸カルシウムオリゴ糖、及びこれらの混合物等）が挙げられる。
【００２６】
式（化−１）中、Ｒ’は、下記式（化−２）で表されるＤ−マンニュロン酸（以下「Ｍ」とも言う）若しくは下記式（化−３）で表されるＬ−グルロン酸（以下「Ｇ」とも言う）を表す。又は、Ｒ’は、ＭとＧの何れか若しくは両方を構成糖とする２個以上の構成糖が結合した構造であって、且つ構成糖間がα−及び／又はβ−１，４結合したものを表す。
【００２７】
【化５】
0005346360.tif 000006
【００２８】
【化６】
0005346360.tif 000007
【００２９】
式（化−２）及び（化−３）中、Ｒは前記と同義である。尚、各式（化−１）〜（化−３）中、Ｒはそれぞれ独立であり、同一でも異なってもよい。
【００３０】
具体的には、Ｒ’としては、Ｇ、Ｍ、Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ、Ｇ−Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｇ−Ｍ−Ｇ、Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｍ−Ｇ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｍ−Ｍ−Ｍ、及びＭ−Ｇ−Ｍ等が挙げられる。
【００３１】
本発明のアルギン酸オリゴ糖（塩）としては、式（化−１）で表される化合物の何れか一種（単一化合物）、又は二種以上を用いることができる。
【００３２】
式（化−１）で表されるアルギン酸オリゴ糖（塩）は、アルギン酸多糖、アルギン酸多糖塩、及びアルギン酸エステルの少なくとも何れか、好ましくは、アルギン酸及び／又はその塩、を多糖類分解酵素により分解処理することにより得られる。
【００３３】
アルギン酸塩としては、アルギン酸の金属塩が挙げられる。金属塩における「金属」としては、前記Ｒにおいて例示したアルカリ金属、アルカリ土類金属、及びその他の金属等が挙げられる。具体的には、アルギン酸の塩としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、及びこれらの混合物等が挙げられる。
【００３４】
多糖類分解酵素としては、微生物の産生する酵素、例えばアルギン酸リアーゼ等が挙げられる。
【００３５】
多糖類分解酵素を産生する微生物としては、シュードアルテロモナス属に属する微生物、例えばシュードアルテロモナス・エスピー（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｎｏ．１７８６等が挙げられる。シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６は、魚介類の腸及びその内容物よりアルギン酸ナトリウムを唯一の炭素源としてスクリーニングを実施した結果、カブトガニの腸より分離されたものであり、その形態学的性質及び生理学的性質は下記の通りである。
（菌株の性質）
・形態学的性質
１）グラム染色性・・・・・・・陰性
２）細胞の形状・・・・・・・・桿菌
３）コロニーの色調・・・・・・乳白色
４）運動性の有無・・・・・・・有り
５）鞭毛の有無・・・・・・・・極鞭毛
・生理学的性質
１）Ｏ−Ｆテスト・・・・・・・酸化
２）オキシダーゼテスト・・・・陽性
３）ゼラチンの分解・・・・・・陽性
４）ＤＮＡの分解・・・・・・・陽性
５）好塩性・・・・・・・・・・陽性
・ＧＣ含量・・・・・・・・・４９．１ｍｏｌ％
【００３６】
尚、本菌株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６））に、ＦＥＲＭ ＢＰ−５２０１（原寄託日：１９９０年８月２８日）として寄託されている。なお、該菌株は寄託当時アルテロモナス属の微生物とされていたが、その後の微生物の分類の変更により現在ではシュードアルテロモナス属の微生物として分類されている（J. Appl. Glycosci., 55, 81-88, 2008）。
【００３７】
多糖類分解酵素による分解処理は、例えば、先ず本菌株を培養して培養物を得る。次いで、この培養物からアルギン酸リアーゼを分離する。そして、分離したアルギン酸リアーゼとアルギン酸多糖及び/又はアルギン酸多糖塩とを反応させることにより、アルギン酸多糖及び/又はアルギン酸多糖塩が分解処理され、アルギン酸オリゴ糖（塩）が生成する。その後、必要に応じ、アルギン酸オリゴ糖（塩）を分離精製する。
【００３８】
培養に用いられる培地としては、例えば、アルギン酸ナトリウム（１．００％）、硫酸ナトリウム（１．００％）、塩化カリウム（０．０８％）、硫酸マグネシウム（７水和物）（１．２４％）、リン酸水素二カリウム（３水和物）（０．０１％）、塩化アンモニウム（０．１０％）、クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）（緑色）（０．０１％）及び塩化カルシウム（０．１５％）を含むものが挙げられる。
【００３９】
培養は、例えば、凍結乾燥菌体シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６を２回前培養（各々２５℃、２日）後、本培養（２５℃、１日）することにより行われる。
【００４０】
このようにして得られる培養物には、アルギン酸リアーゼが蓄積された培養上清又は微生物が含まれている。
【００４１】
次に、上記培養物から、蛋白質の分離精製に用いられる方法により、アルギン酸リアーゼを分離する。具体的には、上記培養物から、分画分子量５００，０００の限外濾過膜（ロミコン社製）により菌体を取り除いて、粗アルギン酸リアーゼ溶液とする。更に、必要に応じ、このアルギン酸リアーゼ溶液について、塩析法、遠心分離法、各種クロマトグラフィー、電気泳動法等を適当に組み合わせて、精製を行う。クロマトグラフィーとしては、疎水、ゲル濾過、イオン交換、逆相、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。また、精製品の純度及びその分子量の確認のため、ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド電気泳動法やゲル濾過法等を用いることもできる。
【００４２】
次いで、好ましくは緩衝液等の存在下、分離されたアルギン酸リアーゼをアルギン酸（塩）と反応させる。緩衝液としては、例えばリン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。反応条件としては、反応温度４５〜５５℃（特に５０℃）、反応時のｐＨ７．０〜７．５（特に７．０）が好ましい。
【００４３】
その後、生成したアルギン酸オリゴ糖（塩）を、必要に応じ各構成糖数のものに分離・精製する。アルギン酸オリゴ糖（塩）の分離・精製は、例えばゲル濾過、塩析、各種クロマトグラフィー等により行うことができる。具体的には、小スケール（数グラム程度）の場合は、オリゴ糖（塩）の分画ゲル濾過担体を充填したカラムに上記オリゴ糖（塩）を注入して脱塩水により溶出させる方法等が挙げられる（特開平４−１６９１８８号公報）。上記オリゴ糖（塩）分画ゲル濾過担体としては、分画範囲１００〜１８００ダルトンのものが好ましく、具体的には、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２及びＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−６ＤＧ（バイオラッド社製）等が挙げられる。また、大スケール（数百グラム以上）の場合、電気透析装置（旭化成工業（株）製、「マイクロ・アシライザー」）等を用いることが好ましい。
【００４４】
また、精製酵素の替わりに、又はこれと併用して、培養物（例えば培養液）、菌体、又は菌体処理物（菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素等）を用いて処理することも可能である。
【００４５】
さらに、本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、多糖類分解酵素により分解処理して得られる、上記のアルギン酸オリゴ糖（塩）以外の他のアルギン酸オリゴ糖（塩）を含んでもよく、このようなアルギン酸オリゴ糖（塩）として、アルギン酸、アルギン酸塩、及びアルギン酸エステルの少なくとも一つを酸若しくはアルカリにより加水分解処理することにより得られるものを使用することができる。
【００４６】
アルギン酸としては、コンブ、ワカメ、ヒジキ等の褐藻類の海藻から抽出されたアルギン酸を用いることができる。
【００４７】
アルギン酸塩としては、前記多糖類分解酵素による分解処理において例示したもの、具体的にはアルギン酸のアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）及びアルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）が挙げられる。
【００４８】
アルギン酸エステルとしては、アルギン酸のアルキレン多価アルコールエステル（プロピレングリコールエステル、エチレングリコールエステル等）、及びアルキルエステル（エチルエステル、メチルエステル等）が挙げられる。
【００４９】
酸としては、鉱酸（リン酸、塩酸等）が挙げられる。リン酸濃度は、５０〜９０重量％濃度が好ましい。
【００５０】
アルカリとしては、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
加水分解反応条件としては、反応温度０〜６０（特に２０〜４０）℃、反応時間１時間〜１ヶ月が好ましい。
【００５１】
アルギン酸オリゴ糖（塩）の分子量及び分子量分布は、上記酸又はアルカリの濃度及び加水分解反応条件を調節することにより、制御することができる。数平均分子量（Ｍｎ）は、通常１００００以下、好ましくは３５００以下、より好ましくは２０００以下、最も好ましくは１５００以下である。
【００５２】
次いで、上記加水分解反応混合物から分解物として、アルギン酸オリゴ糖（塩）を分離する。具体的には、加水分解反応混合物に水を加え、分解物を溶解する。次いで、この水溶液を分離した後、この水溶液に親水性有機溶媒を加え混合して分解物を析出させ、これを分取することにより、アルギン酸オリゴ糖（塩）を分離することができる。
【００５３】
この際の水の添加量は、加水分解混合物に対して０．２〜１００倍量（重量体積比)が好ましい。水の量が少な過ぎると、水溶液の粘性が高くなり扱いにくくなることがある。逆に、水の量が多過ぎると、親水性有機溶媒中での再沈殿（析出）が難しくなることがある。
【００５４】
親水性有機溶媒としては、水溶性有機溶媒（メタノール、エタノール、イソプロパノール等）が挙げられる。
【００５５】
上記のようにして、本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤に用いられるアルギン酸オリゴ糖（塩）が得られる。また、上記アルギン酸オリゴ糖（塩）を凍結乾燥、噴霧乾燥、熱風乾燥等の方法で乾燥しておいたものも、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤に用いることができる。
【００５６】
本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、ヒトにおいて過剰な食塩負荷による悪影響を軽減すると同時に、様々な要因からなる障害から血管を保護することを目的として医薬として使用することができる。更にヒト以外の動物に対しても同様な目的として使用可能である。また、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤の摂取方法としては、経口により行い、その摂取形態としては、制限がなく、例えば、粉末、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、更には水溶液などが挙げられ、摂取者の年齢、健康状態によらず適宜選択することができる。また、該経口投与剤は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよい。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどを用いることができる。本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、摂取形態によらず様々な摂取物に対し含有させることができ、この場合、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤の配合量は、全量の０．０１〜２０重量％、特に０．１〜１０重量％であることが好ましい。
【００５７】
本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、例えば成人（体重６０kg）の場合、有効成分であるアルギン酸オリゴ糖（塩）の摂取量が、１日当たり好ましくは０．１〜２０ｇ、より好ましくは０．５〜５ｇとなるように１日１回から数回に分けて２日以上連続して摂取することが好ましい。また、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤中の有効成分であるアルギン酸オリゴ糖（塩）の含有量は、上記摂取量を目安にし、１日の服用回数や用量を考慮して決定すればよい。
【００５８】
本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、経口摂取した後に消化管を介して体内に吸収され、その効果を発揮する。
【００５９】
また、本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、非経口投与剤として非経口投与により生体に投与してもよい。非経口投与としては、皮下投与、静脈内投与等が挙げられるが、皮下投与剤として皮下投与することが好ましい。非経口投与により投与した場合、本発明の血管保護剤は、体内に吸収された後にその効果を発揮する。非経口投与により投与した場合、経口投与よりも少ない１日当たりの投与量で効果を発揮することができ、経口投与の場合と比較し、1/50〜1/150の投与量で同様の効果を発揮し得る。また、経口投与の場合と比較して、短い投与期間で同様の効果を発揮し得る。本発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を非経口投与剤として用いる場合、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含んでいてもよく、例えば、増量剤、結合剤、崩壊剤、pH調節剤、溶解剤などが挙げられる。非経口投与剤の剤形としては、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤を経口投与により投与する場合、例えば成人（体重６０kg）の場合、有効成分であるアルギン酸オリゴ糖（塩）の摂取量が、１日当たり好ましくは0.01mg〜10000mg、より好ましくは0.05mg〜5000mgとなるように１日１回から数回に分けて２日以上連続して投与することが好ましい。また、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤中の有効成分であるアルギン酸オリゴ糖（塩）の含有量は、上記摂取量を目安にし、１日の服用回数や用量を考慮して決定すればよい。
【００６１】
本発明において、塩分の吸収阻害作用とは、生体内に塩分が吸収されるのを阻害する作用をいい、主に消化管を介した吸収を阻害する。血管保護とは、種々の血管系の疾患から血管を保護し、又は血管系の疾患の治療において血管を保護することをいい、保護とは塩分に起因するものを含む、種々の血管に対する負荷への抵抗力を高めることをいう。例えば、高血圧による血管に対する負荷、また心臓の血管を保護し高血圧による心臓に対する負荷を軽減し、血管や心臓を保護し、心機能の低下を抑制する。また、腎臓における血管を保護し腎臓において糸球体の硬化を抑制し得る。さらに、腎臓における血管を保護し腎臓におけるクレアチンクリアランスを改善し、腎機能の低下を抑制する。本発明の血管保護剤により血管を保護することにより、糸球体の損傷を抑えて正常な機能を維持する。また腎不全の進行を遅らせ、人工透析の適用時期を遅らせることができる。
【００６２】
また、本願発明の塩分の吸収阻害作用をもつ血管保護剤は、食品又は飲料品に混合し飲食品組成物として使用することができる。また、ペットフードなどの動物用飼料に対しても混合してもよい。食品又は飲料品は、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。これらの食品又は飲料品には、例えば、血管を保護するために用いられるものである旨の表示や血管を丈夫にし、又は強くするために用いられるものである旨の表示が付されていてもよい。
【実施例】
【００６３】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００６４】
実施例１  アルギン酸オリゴ糖（塩）の調製
・調製例１
下記配合組成の培地を用い、凍結乾燥菌体シュードアルテロモナス・エスピーＮｏ．１７８６を２回、前培養（２５℃、２日）後、本培養（２５℃、１日）を行った。その結果、酵素活性が培養液１ｍｌ当たり、０．９０単位であるアルギン酸リアーゼ培養液が生産された。この培養液から分画分子量５００，０００の限外濾過膜（ロミコン社製）により菌体を取り除いて、粗アルギン酸リアーゼ溶液とした。
培地配合組成；
アルギン酸ナトリウム１．００％，硫酸ナトリウム１．００％，塩化カリウム０．０８％，硫酸マグネシウム（７水和物）１．２４％，リン酸水素二カリウム（３水和物）０．０１％，塩化アンモニウム０．１０％，クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）（緑色）０．０１％，塩化カルシウム０．１５％。
【００６５】
アルギン酸ナトリウム（１０．０ｋｇ）を９０Ｌの脱塩水に溶解後、上記にて得られた粗アルギン酸リアーゼ溶液（５０，０００Ｕ）を加え、４０℃で６時間撹拌しながら反応させた。反応液を除蛋白、脱塩後、凍結乾燥して、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖粉末を４．２ｋｇ得た。
【００６６】
上記アルギン酸ナトリウムオリゴ糖（調製例１，式（化−１）〜（化−３）中、Ｒがナトリウムである化合物）の構造を、以下のようにして解析した。尚、重合度の決定は、マス分析（ジャスコインタナショナル（株）製、液体クロマトグラフ質量分析装置）及びＮＭＲ分析（日本電子（株）製、ＮＭＲ装置）にて行った。
【００６７】
アルギン酸ナトリウムオリゴ糖（調製例１）を、「ＩＥＣ ＤＥＡＥ−８２５」（Ｓｈｏｄｅｘ社製）カラムを用い、ＮａＣｌ（０．２５Ｍ）グラジエント溶出による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、フラクションコレクターで分画した。この溶出パターンを図１に示す。
【００６８】
２３０ｎｍに吸収のある画分（Ｐ１〜Ｐ８）を回収し、それぞれの画分を電気透析装置（旭化成工業（株）製、「マイクロアシライザー」）で脱塩した。
【００６９】
また、その画分を同じクロマト条件で再びクロマトグラフィーに付すると、表１に示す性質を有するオリゴ糖を得ることができた。そのオリゴ糖をマス分析に供した結果、表１に示すようなｍ／ｚのピークが検出され、そのｍ／ｚ値よりそれぞれ重合度を推定した。
【００７０】
更に、ＮＭＲ分析を行ったところ、各ピーク（Ｐ１〜Ｐ８）におけるアルギン酸ナトリウムオリゴ糖は、構成糖間がα−又はβ−１，４結合した以下の構造のものであることが判った。尚、Ｄは４，５−不飽和ウロン酸を表す。
Ｐ１：Ｄ−Ｇ
Ｐ２：Ｄ−Ｍ
Ｐ３：Ｄ−Ｇ−Ｇ
Ｐ４：Ｄ−Ｍ−Ｇ
Ｐ５：Ｄ−Ｍ−Ｍ
Ｐ６：Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
Ｐ７：Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｄ−Ｇ−Ｍ−Ｇ
：Ｄ−Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｄ−Ｍ−Ｇ−Ｇ
：Ｄ−Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｄ−Ｍ−Ｍ−Ｍ
Ｐ８：Ｄ−Ｍ−Ｇ−Ｍ
【００７１】
・調製例２及び３
アルギン酸ナトリウムの替わりにアルギン酸カリウム、又はアルギン酸カリウムとアルギン酸ナトリウムとの混合物を用いた以外は、上記と同様にして、それぞれアルギン酸カリウムオリゴ糖（調製例２）、又はアルギン酸カリウムオリゴ糖とアルギン酸ナトリウムオリゴ糖との混合物（調製例３）を得た。
【００７２】
・調製例４
上記で得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖（調製例１）及びアルギン酸カリウムオリゴ糖（調製例２）を、酢酸カルシウムをはじめとする各種の水溶性のカルシウム塩と一緒に前記電気透析装置で処理することにより、アルギン酸カルシウムオリゴ糖を得た。
【００７３】
・調製例５
１３重量％のアルギン酸ナトリウム水溶液に、アルギン酸リアーゼ溶液を加え、４０℃で４０時間、撹拌しながら反応させた。反応液を分画分子量３０，０００の限外濾過膜により濾過して、アルギン酸ナトリウムオリゴ糖（調製例５）粉末を得た。
【００７４】
得られたアルギン酸ナトリウムオリゴ糖（調製例５）について、調製例１と同様にして、ＨＰＬＣ測定（図２）及び構造解析を行った。その結果、各ピーク（Ｐ１〜Ｐ５）におけるアルギン酸ナトリウムオリゴ糖は、構成糖間がα−又はβ−１，４結合した以下の構造のものであることが判った。
Ｐ１：Ｄ−Ｇ
Ｐ２：Ｄ−Ｇ−Ｇ
Ｐ３：Ｄ−Ｍ−Ｇ
Ｐ４：Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
Ｐ５：Ｄ−Ｇ−Ｇ−Ｍ、Ｄ−Ｇ−Ｍ−Ｇ
：Ｄ−Ｇ−Ｍ−Ｍ、Ｄ−Ｍ−Ｇ−Ｇ
：Ｄ−Ｍ−Ｍ−Ｇ、Ｄ−Ｍ−Ｍ−Ｍ
【００７５】
・調製例６
アルギン酸プロピレングリコールエステル（市販品）５．０ｇを８５重量％リン酸４５ｍｌに溶解し、４０℃で３日間静置した。これにメタノール１００ｍｌを加えて撹拌後、２時間静置し、析出している固体を濾過して得られた固体（濾滓）を中性になるまで洗浄した後、乾燥して、加水分解物１．３ｇ（収率２６．０％）を得た。
【００７６】
得られた加水分解物（調製例６）の分子量を測定したところ、Ｍｎ／Ｍｗ（重量平均分子量）＝３２００／２４０００であった。
【００７７】
尚、分子量の測定は、ゲル浸透クロマトグラフィーシステム［東ソー（株）製、高速ＧＰＣ ＨＬＣ−８１２０］を用いて行った。また、カラムとしては東ソー（株）製のＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬおよびＧ３０００ＰＷＸＬを用い、標準物質としてポリアクリル酸ソーダを、そして溶離液として０．０２５Ｍリン酸バッファーを用いた。
【００７８】
実施例２  吸収性の確認
馴化飼育後の８週齡のＷｉｓｔａｒ系雄性ラット(日本チャールズリバー株式会社)４匹に対して、５g/kg量のアルギン酸オリゴ糖粉末を胃ゾンデで強制経口投与した。投与前、及び投与０．５、１、２、４、６時間後にテイルカット法で採血を行い、常法にて血清を調製した。分離した血清は蒸留水と１:１で希釈した後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ-ＭＣ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ(１０，０００ ＮＭＷＬ, ｎｏｎ-ｓｔｅｒｉｌｅ, Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)５，０００g×６時間遠心分離を行った。濾液を回収し、ＤＥＡＥカラムを用いたＨＰＬＣ（０-０．２５Ｍ ＮａＣｌグラジェント法）によりアルギン酸オリゴ糖の主要ピークであるｄＵＭＧＭ-４Ｎａ含量を測定した。
【００７９】
その結果、血清中のｄＵＭＧＭ-４Ｎａ濃度は投与後１時間で最大となり、その後減少し、投与後６時間で検出限界以下となった（図２）。このことから、経口投与したアルギン酸オリゴ糖の一部は体内に吸収され、６時間後には代謝されて血中より消失する可能性が示唆された。
【００８０】
馴化飼育後の8週齡雄性ＳＨＲラット３匹に対してアルギン酸オリゴ糖の主要成分であるｄＵＭＧＭ-４Ｎａを５％混餌で自由摂取させた。その後経時的に２４時間までの尿を採取した。尿は蒸留水と１:１で希釈した後、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ-ＭＣ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ(１０，０００ ＮＭＷＬ, ｎｏｎ-ｓｔｅｒｉｌｅ, Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ) ５，０００g×６時間遠心分離を行った。濾液を回収し、ＤＥＡＥカラムを用いたＨＰＬＣ（０-０．２５Ｍ ＮａＣｌグラジェント法）によりｄＵＭＧＭ-４Ｎａ含量を測定した。摂取したｄＵＭＧＭ-４Ｎａは混餌の摂取量から算出した。
【００８１】
その結果、摂取２４時間後には、経口摂取したｄＵＭＧＭ-４Ｎａのうち１．１２％が尿中に排泄されたと考えられた。
【００８２】
【表１】
0005346360.tif 000008
【００８３】
実施例３  高食塩負荷により心血管系に負荷をかけ、アルギン酸オリゴ糖を経口投与した場合の検討
馴化飼育後の４週齡雄性Dahl salt-sensitive ラット(Dahl S。株式会社SRL)、２４匹を４群（ｎ＝８）に分け、それぞれ０．３%食塩食（低食塩群）、４％食塩食（対照群）、４％食塩＋４％アルギン酸オリゴ糖食（低用量群）、あるいは４％食塩＋８％アルギン酸オリゴ糖食（高用量群）（試験食は全てオリエンタル酵母工業株式会社製）を与えて（摂餌、飲水は自由摂取）、7週間飼育を行った。収縮期血圧の測定は１週間毎にtail-cuff法で行った。また採尿は２週間毎に代謝ケージを用いて２４時間尿を採取した。試験期間終了後、ネンブタール麻酔下で腹大動脈より全採血を行い、安楽死させた。また心臓、腎臓、胸大動脈を摘出した。
【００８４】
心血管系への負荷に対する保護作用の評価
試験では低食塩群に対して、食塩負荷を行ったそれ以外の３群は収縮期血圧が有意に高値を示した（図３）。またアルギン酸オリゴ糖摂取群では用量に依存して上昇を抑制した。Dahl Sラットは食塩負荷により血圧が上昇する動物であることから、食餌に含有させた食塩の影響が明確に観察され、かつ、アルギン酸オリゴ糖はその影響を軽減した可能性が示唆された。
【００８５】
アルギン酸オリゴ糖がナトリウム代謝に与える影響の評価
血圧上昇の抑制として観察されたアルギン酸オリゴ糖の血管保護作用が、食塩の吸収抑制によるものか排泄促進によるものかを判断する目的で、尿中ナトリウム排泄率を評価したところ、対照群に対してアルギン酸オリゴ糖摂取群（低用量、高用量）では尿中へのナトリウム排泄が有意に低値を示した（図４）。つまりアルギン酸オリゴ糖摂取群では、対照群よりもむしろ尿中へのナトリウム排泄が抑制されていたことから、観察された作用は食塩の排泄促進ではなく、吸収阻害に起因すると考えられた。
【００８６】
アルギン酸オリゴ糖が血管重量/体重比に与える影響の評価
高食塩負荷により重度の高血圧を誘発して血管系に負荷を与えた結果、血圧による負荷の大きい胸大動脈重量/体重比において対照群では低食塩群に対して有意に高値を示し、血管壁の肥厚が誘発された。さらにアルギン酸オリゴ糖摂取群は対照群に対して有意に低値を示したことから、重度高血圧による負荷から血管を保護した可能性が示唆された。
【００８７】
アルギン酸オリゴ糖が心臓重量/体重比に与える影響の評価
高食塩負荷により血管系に負荷を与えた結果、心臓重量/体重比において対照群では低食塩群に対して有意に高値を示し、心肥大が誘発された。さらにアルギン酸オリゴ糖摂取群は対照群に対して有意に低値を示したことから（図５）、重度高血圧による負荷から心臓を保護した可能性が示唆された。
【００８８】
アルギン酸オリゴ糖が腎臓重量/体重比に与える影響の評価
高食塩負荷により血管系に負荷を与えた結果、腎臓重量/体重比において対照群は低食塩群に対して有意に高値を示し、腎肥大が誘発された。さらにアルギン酸オリゴ糖摂取群は対照群に対して用量に依存して低値を示し、高用量群では対照群に対して有意に低値を示した（図６）。これらの結果から毛細血管が多く存在し、高血圧による負荷が大きい臓器である腎臓において、重度高血圧による負荷から腎臓を保護した可能性が示唆された。
【００８９】
アルギン酸オリゴ糖が糸球体硬化度に与える影響の評価
糸球体の機能評価の一環で糸球体硬化度の評価を行った。高食塩負荷により重度の高血圧を誘発して血管系に負荷を与えた結果、糸球体硬化度において対照群は低食塩群に対して有意に高値を示し、糸球体の硬化が進行したと考えられた（図７）。一方、アルギン酸オリゴ糖摂取群は対照群に対して用量に依存して低値を示すとともに、重度のスコアが全体に占める比率も減少させたことから、糸球体の硬化を抑制したと考えられた（図８）。これらの結果から、アルギン酸オリゴ糖は多くの毛細血管で構成される糸球体において高血圧による負荷に対する保護作用を示した可能性が示唆された。
【００９０】
アルギン酸オリゴ糖がクレアチニンクリアランスに与える影響の評価
腎機能の評価の一環でクレアチニンクリアランスの評価を行った。高食塩負荷で誘発された重度の高血圧により腎臓が負荷を受けることで、対照群のクレアチニンクリアランスは低食塩群に対して有意に低値を示した。一方、アルギン酸オリゴ糖摂取群では対照群に対して用量依存的に改善効果を示し、高用量群では有意に低値を示したことから（図９）、毛細血管が多く存在する腎臓において、重度高血圧による負荷から血管を保護し、結果として腎臓の機能が低下することを抑制した可能性が示唆された。
【００９１】
アルギン酸オリゴ糖が尿蛋白に与える影響の評価
糸球体の機能評価の一環で尿蛋白の評価を行った。高食塩負荷で誘発された重度の高血圧により腎臓が負荷を受けることで、対照群の尿蛋白では経時的な上昇が観察され、低食塩群に対して有意に高値を示した。一方、アルギン酸オリゴ糖摂取群では対照群に対して有意に低値を示したことから（図１０）、毛細血管が多く存在する腎臓において、重度高血圧による負荷から血管を保護し、結果として腎臓の機能が低下することを抑制した可能性が示唆された。
【００９２】
実施例４  高食塩負荷により心血管系に負荷をかけ、アルギン酸オリゴ糖を皮下投与した場合の検討
馴化飼育後の６週齡雄性Dahl salt-sensitive ラット(Dahl S、株式会社SRL)２０匹を３群に分け、それぞれ０．３％食塩食（低食塩群）、４％食塩食（対照群）、あるいは４％食塩＋アルギン酸オリゴ糖皮下投与群（皮下投与群）とした。試験食は全てオリエンタル酵母工業株式会社製を用い、摂餌、飲水は自由摂取とした。皮下投与群については、試験開始から２週間、持続型浸透圧ミニポンプを用いてアルギン酸オリゴ糖を１日あたり６mg投与し、２週間の投与期間終了後は速やかに投与を中止した。全体で３週間飼育を行い、その間、収縮期血圧の測定をtail-cuff法で行った。
【００９３】
結果を図１１に示す。図１１に示すように、低食塩群では試験期間を通して収縮期血圧の変動が観察されなかったのに対して対照群では経時的に上昇し、対照群の収縮期血圧は低食塩群に対して有意に高値を示した。一方、皮下投与群ではアルギン酸オリゴ糖の投与期間中には収縮期血圧の上昇が観察されなかったものの投与中止後は速やかに上昇し、投与中止後1週間で対照群と同レベルとなった。
【００９４】
アルギン酸オリゴ糖を皮下投与した場合でも効果が観察されたことから、アルギン酸オリゴ糖は腸管内ではなく、体内に吸収された後に効果を発している可能性が強く示唆された。また1日摂取量あたりについては、経口投与時と比べて１／５０〜１／１５０の少量で効果が観察されたと考えられた。さらに明確な効果が観察されるまでに、経口投与時は４週間程度かかったのに対して2週間程度で観察されたことから、皮下経路で投与することで経口投与よりも強い効果が得られる可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の血管保護剤は、血管を保護する医薬や飲食品として利用することができる。
【受託番号】
【００９６】
ＦＥＲＭ ＢＰ−５２０１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005346360.tif 000017
【図９】
0005346360.tif 000018
【図１０】
0005346360.tif 000019
【図１１】
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