(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の近赤外吸収スペクトルから、該皮膚の紫外線による損傷の度合い及び該皮膚の生理的老化の度合いの両方を同時に判定する方法であって、
（Ｘ１）皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いが既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方と、特定波数領域皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｘ２）判定対象である、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｘ３）前記ステップ（Ｘ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｘ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方を判定するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記多変量解析が、主成分分析（ＰＣＡ）法、ＳＩＭＣＡ法、又はＫＮＮ法であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
皮膚の近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方を同時に予測する方法であって、
（Ｙ１）皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さが既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1、又は６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方と、皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｙ２）予測対象である、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｙ３）前記ステップ（Ｙ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｙ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの
両方を予測するステップと、を含む方法。
【請求項４】
前記多変量解析が、パーシャル  リースト  スクエア（ＰＬＳ）法、又は主成分回帰分析（ＰＣＲ）法であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか一項に記載の方法を用い、化粧料を選択するステップを含む、化粧料の選択方法。
【請求項６】
請求項１〜４の何れか一項に記載の方法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えてゆくステップを含む、皮膚状態のモニタリング方法。
【請求項７】
皮膚に対する処置による効果を確認するステップを含むことを特徴とする、請求項６に記載のモニタリング方法。
【請求項８】
請求項１〜４の何れか一項に記載の方法を用い、化粧料の投与前と投与後の皮膚の状態又は厚さを比較し、その変化を指標として化粧料を評価するステップを含む化粧料の評価方法。
【請求項９】
皮膚の厚さのうち、真皮の厚さが化粧料の投与により増加した場合、前記化粧料はシワ改善作用を有すると評価するステップを含むことを特徴とする、請求項８に記載の化粧料の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定する方法及び皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測する方法、並びに、これら方法から得られる結果を用いた皮膚状態のモニタリング方法及び化粧料の評価方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
美しい皮膚でありたいと願うのは、女性のみならず万人が思うところである。この為、現状では、多くの人が化粧料などを使用して皮膚の状態を好ましく保とうと思っている。この皮膚の状態は、個人によって大きく異なるものである。皮膚の老化は、加齢と共に全ての人間に訪れる生理的老化（本来の生理的加齢）と、紫外線の影響による病的な老化（紫外線による損傷、又は光老化）に大別される（例えば、非特許文献１参照）。【０００３】
このような皮膚の老化によって、弾力が消失し、シワ等が増えるなどの経時的変化が生じ、容貌や印象に大きな影響を与えている。このような経時的変化は、皮膚の中でも、特に皮膚を構成する表皮及び真皮の生理的変化を反映したものであり、例えば、浅いシワでは表皮や真皮乳頭層の影響が大きいが、深いシワやたるみでは真皮の影響が大きいと考えられている（例えば、非特許文献２参照）。したがって、皮膚を美しく保つには、このような表皮及び真皮の各々の厚さなどの状態を客観的且つ定量的に鑑別することが極めて重要であり、それによって、皮膚の状態に対応した適切な化粧料や医薬品の選択と使用、或いは医師による処置等が可能となる。【０００４】
このような皮膚の生理的或いは加齢の変化の計測法としては、シワやたるみの外的容貌の計測より実年齢を推定する方法（例えば、特許文献１および２参照）、皮膚表面形態の計測結果より肌年齢を推定する方法（例えば、特許文献３参照）、皮膚に振動体を接触させた時の振動変化より肌年齢を算出する方法（例えば、特許文献４参照）、超音波皮膚画像の真皮輝度より年齢を推定する方法（例えば、特許文献５参照）、超音波画像からの皮膚の厚さによる皮膚の引き締まり効果の評価法（例えば、特許文献６参照）などが開示されている。また、表皮の角層細胞の平均面積を指標に年齢を推定する方法（例えば、特許文献７参照）、線維芽細胞の発生する力の変化を測定することによって皮膚老化度を評価する方法（例えば、特許文献８参照）、ＤＮＡを用いた皮膚の老化度を評価する方法（例えば、特許文献９参照）などが開示されている。しかし、いずれも皮膚の紫外線による損傷と生理的老化とを判定する方法や表皮と真皮の各々の厚さなどを客観的且つ定量的に予測する方法は全く知られていない。【０００５】
近年、人の組織、皮膚及び毛髪を対象に、近赤外吸収スペクトルを測定し、その分光分析と水分や生体組織状態等の特性値とを重回帰分析や主成分分析等の統計的処理（多変量解析等）を行い、その相関関係より、皮膚水分量、乳房炎、毛髪状態などを非侵襲的に明らかにする手法が知られるようになった（例えば、特許文献１０〜１３参照)。さらに、皮膚の真皮コラーゲンの存在量の定量（例えば、特許文献１４参照）も開示されている。しかし、いずれも皮膚の紫外線による損傷と生理的老化とを判定する方法や表皮と真皮の各々の厚さなどを客観的且つ定量的に予測する方法は全く知られていなかった。【０００６】
このような状況下、本発明者らは、皮膚の厚さ、皮膚表面形態、皮膚粘弾特性又は皮膚内部組織構造などの皮膚状態の鑑別において、近赤外吸収スペクトルの多変量解析を利用することによって、非侵襲的に皮膚の厚さなどの鑑別を行えることを見出し、特許出願を行っているが（特許文献１５）、皮膚の状態に対応した適切な化粧料や医薬品を選択し使用するためには、この技術を更に発展させ、皮膚を構成する表皮と真皮の各々の厚さを非侵襲的且つ客観的に計測する手段の開発が切望されていた。
【特許文献１】特開２００２−３３０９４３号公報
【特許文献２】特開２００２−３６０５４４号公報
【特許文献３】特開２００５−０９５３２６号公報
【特許文献４】特開２００１−２１２０８７号公報
【特許文献５】特開２０００−０８３９５４号公報
【特許文献６】特開平１１−２９０３１５号公報
【特許文献７】特開平１１−２９９７９２号公報
【特許文献８】特開２００４−３５４１５９号公報
【特許文献９】特開２００１−１６１３６４号公報
【特許文献１０】特開２００２−０９０２９８号公報
【特許文献１１】特開２００３−３４４２７９号公報
【特許文献１２】ＷＯ０１／０７５４２１号公報
【特許文献１３】特開２００３−２７０１３８号公報
【特許文献１４】特開２００５−０８３９０１号公報
【特許文献１５】特開２００５−０３４３５０号公報
【非特許文献１】日本化粧品技術者会編、「化粧品の有用性」、薬事日報社、５１−５２，２００１
【非特許文献２】日本化粧品技術者会編、「化粧品の有用性」、薬事日報社、１６３，１７８，２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような状況下為されたものであり、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定する方法及び皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測する方法、並びに、これら方法の結果を用いた皮膚状態のモニタリング方法及び化粧料の評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
このような状況を鑑みて、本発明者ら鋭意研究努力を重ねた結果、先ず、皮膚の示性値（皮膚の紫外線による損傷の度合い、皮膚の生理的老化による度合い、皮膚の表皮の厚さ、及び皮膚の真皮の厚さ）が既知である二種以上の皮膚の近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、上記皮膚の示性値と皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得、次に、判定又は予測対象である、上記皮膚の示性値が未知である皮膚の近赤外吸収スペクトルを得、上記相関関係に基づいて、上記皮膚の示性値が未知である近赤外吸収スペクトルから上記示性値を判定又は予測できることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。【０００９】
（１）皮膚の近赤外吸収スペクトルから、該皮膚の紫外線による損傷の度合い及び該皮膚の生理的老化の度合いの両方を同時に判定する方法であって、
（Ｘ１）皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いが既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方と、特定波数領域皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｘ２）判定対象である、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｘ３）前記ステップ（Ｘ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｘ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの両方を判定するステップと、を含む方法。
（２）前記多変量解析が、主成分分析（ＰＣＡ）法、ＳＩＭＣＡ法、又はＫＮＮ法であることを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）皮膚の近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方を同時に予測する方法であって、
（Ｙ１）皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さが既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1、又は６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の
解析結果より、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方と、皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｙ２）予測対象である、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｙ３）前記ステップ（Ｙ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｙ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの両方を予測するステップと、を含む方法。
（４）前記多変量解析が、パーシャル  リースト  スクエア（ＰＬＳ）法、又は主成分回帰分析（ＰＣＲ）法であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）（１）〜（４）の何れか一に記載の方法を用い、化粧料を選択するステップを含む、化粧料の選択方法。
（６）（１）〜（４）の何れか一に記載の方法を用い、経時的な皮膚の変化を時系列的に捉えてゆくステップを含む、皮膚状態のモニタリング方法。
（７）皮膚に対する処置による効果を確認するステップを含むことを特徴とする、（６）に記載のモニタリング方法。
（８）（１）〜（４）の何れか一に記載の方法を用い、化粧料の投与前と投与後の皮膚の状態又は厚さを比較し、その変化を指標として化粧料を評価するステップを含む化粧料の評価方法。
（９）皮膚の厚さのうち、真皮の厚さが化粧料の投与により増加した場合、前記化粧料はシワ改善作用を有すると評価するステップを含むことを特徴とする、（８）に記載の化粧料の評価方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、非侵襲的に皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定する方法及び非侵襲的に皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測する方法、並びに、これら方法の結果を用いた皮膚状態のモニタリング方法及び化粧料の評価方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヘアレスマウス及びヒトの近赤外吸収スペクトルにおけるローディング（因子負荷量）特性を示す図である。
【図２】アミド結合（ＣＯＮＨ）及びアミド（ＣＯＮＨ2）の特性を表す近赤外吸収スペクトルの波数領域を示す図である。
【図３】ヘアレスマウスにおける、剥離した皮膚切片のＨＥ染色画像並びに皮膚サンプル群の表皮及び真皮の厚さの計測値を示す図である。
【図４】ヒトの腕における、超音波画像、並びに上腕及び前腕部の皮膚サンプル群の表皮及び真皮の厚さの計測値を示す図である。
【図５】実施例１のヘアレスマウスの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図及び確率楕円で表示した図である。
【図６】実施例２のヘアレスマウスの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合を判定した結果である。
【図７】実施例３のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図及び確率楕円で表示した図である。
【図８】実施例３のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図及び確率楕円で表示した図である。
【図９】比較例１のヘアレスマウスの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１０】比較例２のヘアレスマウスの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１１】比較例２のヘアレスマウスの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１２】比較例３のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１３】比較例４のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１４】比較例４のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１５】比較例４のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１６】比較例４のヒトの皮膚の結果で、紫外線による損傷の度合と生理的老化の度合との関係を散布図で表示した図である。
【図１７】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、皮膚（表皮＋真皮）の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図１８】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、表皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図１９】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、真皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２０】ヒトの皮膚サンプル集団における、皮膚（表皮＋真皮）の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２１】ヒトの皮膚サンプル集団における、表皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２２】ヒトの皮膚サンプル集団における、真皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２３】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、表皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２４】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、真皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２５】ヘアレスマウスの皮膚サンプル集団における、皮膚（表皮＋真皮）の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２６】ヒトの皮膚サンプル集団における、表皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２７】ヒトの皮膚サンプル集団における、真皮の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【図２８】ヒトの皮膚サンプル集団における、皮膚（表皮＋真皮）の厚さの予測モデル（検量線）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は、（１）皮膚の示性値が既知である二種以上の皮膚の近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、上記皮膚の示性値と皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得、（２）判定又は予測対象である、上記皮膚の示性値が未知である皮膚の近赤外吸収スペクトルを得、（３）上記相関関係に基づいて、上記皮膚の示性値が未知である近赤外吸収スペクトルから上記示性値を判定又は予測することを特徴とする。
上記皮膚の示性値とは、皮膚の紫外線による損傷の度合い、皮膚の生理的老化の度合い、皮膚の表皮の厚さ、又は皮膚の真皮の厚さを示す。【００１３】
紫外線による皮膚の損傷は、日焼けで代表される急性の反応と、長年の紫外線暴露によるシミやシワなどの皮膚の老化（光老化、光加齢ともいう）や皮膚癌の発生等が生じる慢性の反応とに分けられる。本願の「紫外線による皮膚の損傷」は、比較的長期の紫外線暴露によって影響を受けるということであり、紫外線による損傷を受けた皮膚の近赤外吸収スペクトルは、近赤外吸収スペクトルの５０００〜４４８０ｃｍ-1の波数領域にその変化が現れる。この波数領域の変化は、タンパク質の構造変化によるものと推察される（図１参照）。また、本願の「生理的老化」は、紫外線暴露を受けない皮膚の萎縮やシワ等の自然老化によって影響を受けるということであり、生理的老化を有する皮膚の近赤外吸収スペクトルは、近赤外吸収スペクトルの５９９０〜５４９０ｃｍ-1の波数領域にその変化が現れる。この波数領域の変化は、コラーゲン、エラスチン、皮膚厚、セラミドなどの変化によるものと推察される（図１参照）。【００１４】
「紫外線による損傷の度合」とは、皮膚に浴びせられた紫外線照射量又は部位差を意味する。前記部位差とは、前腕外側部や顔面等の露出部位では紫外線に暴露され易いが、上肢内側部や体幹部等の非露出部位では紫外線に暴露されにくい部位であることを意味する。
また、「生理的老化の度合」とは、紫外線暴露を受けない自然老化の程度であり、週齢（マウス等）若しくは実年齢を意味する。【００１５】
皮膚は、身体の表面を覆い、外界との境界機能を果たす器官であり、表皮、真皮及び皮下組織の３つの層により構成されている。皮膚のシワ、たるみや弾力性などの美容上重要な変化は、皮膚を構成する表皮、或いは真皮の生理的変化を反映したものである。したがって、皮膚を構成する、表皮と真皮の各々の厚さを知ることが美容上や化粧料の使用において極めて有用なことである。尚、ここでいう「皮膚の厚さ」とは、（表皮＋真皮）の厚さを意味する。【００１６】
本発明の方法は、皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方を判定するために用いること、又は、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測するために用いることができる。ここでいう皮膚は、ヒト、マウス等の動物の皮膚を対象とする。【００１７】
本発明の判定方法は、
（Ｘ１）皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方と、皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｘ２）判定対象である、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｘ３）前記ステップ（Ｘ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｘ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定するステップと、を含む。【００１８】
前記（Ｘ１）のステップにおける、皮膚の近赤外吸収スペクトルは任意の方法で得ることができる。例えば、種々のタイプの近赤外吸収スペクトル測定装置を用いて測定することにより得ることができる。より詳細には、近赤外吸収スペクトルの測定は、回折格子を用いた分散型測定装置、または検出器としてダイオードアレイを用いた測定装置等により測定される。また、測定された皮膚の近赤外吸収スペクトルはフーリエ変換されていてもよい。【００１９】
前記（Ｘ１）のステップにおける、多変量解析とは、サンプル間の関係（本発明においては、皮膚の紫外線による損傷度合い及び皮膚の生理的老化の度合い）を、複数の観測値（ここでは、近赤外吸収スペクトルデータ）に基づいて、類似度などを算出して明らかにするためのパターン認識を意味する。前記（１）のステップにおける、多変量解析方法はサンプルによって適宜選択することが好ましい。【００２０】
前記ステップ（Ｘ１）は、下記（Ｘａ）〜（Ｘｄ）のステップを含むことが好ましい。
（Ｘａ）皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の、近赤外吸収スペクトル（測定波数領域は５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1）を必要に応じてデータ加工するステップ。
（Ｘｂ）前記近赤外吸収スペクトル又は前記データ加工された近赤外吸収スペクトル（以下、これらを総称して「スペクトル」とも称する）の、分割された波数毎のスペクトル値と、皮膚の紫外線照射量、紫外線照射部位、週齢（マウス等）、及び、実年齢の少なくとも一つとから行列を作成するステップ。
（Ｘｃ）前記（Ｘｂ）で作成された行列を多変量解析することにより、最適な二つの主成分を導出するステップ。
（Ｘｄ）前記（Ｘｃ）で導出された二つの主成分の一方を第一軸、他方を第二軸として、各サンプルの相対関係を得ることにより、皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合の少なくとも一方と皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップ。【００２１】
前記（Ｘａ）のステップにおける近赤外吸収スペクトル、またはデータ加工される近赤外吸収スペクトルの波数領域は、５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1である。
この波数領域の近赤外吸収スペクトルは、タンパク質の構造変化やコラーゲン、エラスチン、皮膚厚、セラミド等の変化を的確に捉え、皮膚の紫外線による損傷や生理的老化の度合が的確に反映されているものと推察される（図１参照）。後述の実施例においても、前記波数領域の近赤外吸収スペクトル、またはそれをデータ加工したスペクトルの多変量解析の解析結果と、皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合とが明確な相関関係を有することが示されている。【００２２】
前記（Ｘａ）のステップにおける近赤外吸収スペクトルのデータ加工には、前処理及び変換が含まれる。前処理には、オートスケール（Autoscale）、平均化（Mean Center）、レンジスケール（Range Scale）、分散スケール（Variance Scale）などが含まれる。変換には、一次微分、多次微分（二次微分を含む）、ＳＮＶ（Standard Normal Variant）、ＭＳＣ（Multiplicative Scatter Correction）、ノーマライズ（Normalize）、平滑化（Smoothing）、引き算（Subtract）、常用対数（Log10）、掛け算（Multiply）、ベースライン補正（Baseline Correct）などが含まれる。【００２３】
前記（Ｘａ）のステップにおけるデータ加工は二次微分を含むことが好ましく、ＳＮＶ（Standard Normal Variant）及び二次微分を含むことがより好ましく、平均化（Mean Center）、ＳＮＶ（Standard Normal Variant）及び二次微分を含むことがさらに好ましい。これらの加工により、個体差のばらつきの補正、ノイズや外れ値（アウトライヤー）などの影響を除外することができ、それによりデータの質を高めることができる。【００２４】
いずれにしても前記データ加工は、後述のステップ（Ｘｂ）において作成される行列から、（Ｘｃ）のステップにおいて導出される二つの主成分が、皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合と、より明確な相関関係を示すように、行われることが好ましい。【００２５】
前記（Ｘｂ）のステップにより作成される行列における列は、各皮膚の赤外吸収スペクトルの、分割された波数毎のスペクトル値である。スペクトル値とは、変換処理がされていない近赤外吸収スペクトルであれば吸光度などであり、微分されたスペクトルであれば吸光度の微分値である。
ここでスペクトルの分割は、一定波数毎になされることが好ましいが、その波数は特に限定されない。通常は、波数２〜１６ｃｍ-1毎に、好ましくは４〜８ｃｍ-1（分解能が４ｃｍ-1であれば、４または８ｃｍ-1）毎に、より好ましくは４ｃｍ-1毎に分割されることが好ましい。また、分割された波数毎のスペクトルのスペクトル値は、それぞれの平均値とすればよい。【００２６】
前記（Ｘｂ）のステップにより作成される行列における行は、（Ｘａ）のステップにおいてスペクトル測定された２種以上の皮膚（皮膚の紫外線による損傷の度合い、及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が既知である皮膚）の皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方である。ここで皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方は、皮膚に施された処理の程度及び状態の少なくとも一方の差によって示されてもよい。皮膚に施された処理の程度及び状態の少なくとも一方の差とは、紫外線照射量、紫外線照射部位、生体の週齢、及び、実年齢等の少なくとも一つ等を意味する。【００２７】
即ち、２種以上の皮膚の紫外線による損傷の度合い、及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が既知である皮膚から得られたスペクトルそれぞれについて、前記分割された波数毎のスペクトル値と、前記皮膚の紫外線照射量、紫外線照射部位、週齢（マウス等）、及び、実年齢の少なくとも一つに関するデータとから行列を作成する。例えば下記表１のような行列を作成する。サンプル数は好ましくは２０以上であり、より好ましくは４０以上である。【００２８】
【表１】
0005306651.tif 000002
【００２９】
前記（Ｘｃ）のステップにおける多変量解析のアルゴリズムは、主成分分析（ＰＣＡ）法、ＳＩＭＣＡ（Soft Independent Modeling of Class Analogy ）法、またはＫＮＮ（k nearest neighbors）法を用いることが好ましく、主成分分析法又はＳＩＭＣＡ法がより好ましい。前記多変量解析は、前述の主成分分析法、ＳＩＭＣＡ法、ＫＮＮ法等の他にも既に知られているものであれば、特別の限定なく用いることができる。【００３０】
前記多変量解析とは、分光データ等の化学的な特性と物性等の特性値との関係を計量学的な処理によって関係づけ、解析する手法である。
前記主成分分析法とは、特定の試料に於ける波数等の連続的な因子の変化において、吸光度等の変数の出現する分光スペクトルパターンと当該試料のある特性値の間の関係を分析する場合、変動に寄与する主成分より目的（この場合は、生理的老化と紫外線損傷を意味する）とする二成分を選択し、しかる後にこのひとつめの主成分軸に対して直交する二つめの主成分軸を分析し、この二つの主成分軸がつくる座標におけるパターン変化で物性を比較、推定する方法である。【００３１】
前記ＳＩＭＣＡ法及びＫＮＮ法は、分析機能に加えて未知試料の予測・分類機能を持つ方法である。近年、主成分分析法にも予測機能が付加されているものもある。この様な主成分分析法或いはＳＩＭＣＡ法、ＫＮＮ法といった統計的処理は、市販されているソフトウェアを使用して行うことができる。この様な統計的処理用のソフトウェアとしては、例えば、前記ジーエルサイエンス（株）より販売されているピロエット「Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ」（登録商標）、サイバネットシステム（株）より販売されているマットラボ「ＭＡＴＬＡＢ」（登録商標）、横河電機（株）より販売されている、アンスクランブラーＩＩ「Unscrumbler」、セパノヴァ（ＳＥＰＡＮＯＶＡ）社より販売されているシムカ「ＳＩＭＣＡ」等のソフトウェアが例示できる。【００３２】
多変量解析により、前記行列から導出される二つの主成分は互いに無関係、即ち各ベクトルが直交している。前記二つの主成分は、皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合との相関関係を有している。【００３３】
さらに必要に応じて第三成分を求めれば、紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合以外の皮膚の損傷状態を鑑別することもできる。紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合以外の皮膚の損傷状態の例には、形態的異常や結合組織成分変成等が含まれる。【００３４】
前記（Ｘｄ）のステップは、（Ｘｃ）のステップで求められた少なくとも二つの主成分を軸として、各サンプルの相対関係を得るステップである。
例えば、二つの主成分を軸とする平面散布図を作成して、各サンプルに対応するプロットの位置関係から、各サンプルの相対関係を得ることができる。該各サンプルの相対関係を得ることにより、皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合の少なくとも一方と皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得ることができる。また、得られた各サンプルの相対関係から、皮膚の紫外線による損傷の度合、及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方を基準にグルーピングを行ってもよい。このグルーピングは、例えばＳＩＭＣＡ法のアルゴリズムなどを用いて行うことができる。【００３５】
具体的には、前記多変量解析の解析結果において、得られた少なくとも二つの主成分のうちの一つ（例えば、前記二つの主成分の一方を成分Ａとする）は皮膚の紫外線による損傷の度合との相関関係を示し、別のもう一つの主成分（例えば、前記二つの主成分の他方を成分Ｂとする）は皮膚の生理的老化の度合との相関関係を示す（例えば図５参照）。即ち、成分Ａの主成分軸は紫外線による損傷の度合を示し、成分Ｂの主成分軸は生理的老化の度合を示す。未損傷（即ち紫外線非照射）の皮膚と、紫外線照射された皮膚の成分Ａの軸上での相対関係をみることにより、紫外線による損傷の度合とスペクトルとの相関関係を得ることができる。同様に、未損傷（即ち新生）の皮膚と、生理的老化皮膚の成分Ｂの軸に関する相対関係をみることにより、生理的老化の度合とスペクトルとの相関関係を得ることができる。【００３６】
また、種々の波数領域のスペクトルについてのローディングプロット（多変量解析による因子負荷量のプロット）から、各波数領域のスペクトル値の変化が、主成分軸が示す変化に関与する程度が判る（図１参照）。よって、皮膚の紫外線による損傷の度合、及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方を具体的な化学変化（ピーク変化）としてとらえることができる。【００３７】
一方、本発明の予測方法は、
（Ｙ１）皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の、測定波数領域６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1、又は６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1における特定波数領域近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果より、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方と、皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルとの相関関係を得るステップと、
（Ｙ２）予測対象である、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方が未知である皮膚の特定波数領域近赤外吸収スペクトルを得るステップと、
（Ｙ３）前記ステップ（Ｙ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｙ２）で得られた特定波数領域近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測するステップと、を含む。【００３８】
前記（Ｙ１）のステップにおける、皮膚の近赤外吸収スペクトルは前記（Ｘ１）のステップと同様に任意の方法で得ることができる。
また、（Ｙ１）のステップにおける、多変量解析とは、前記（Ｘ１）のステップと同様に、サンプル間の関係（本発明においては、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方の実測値と予測値）を、複数の観測値（ここでは、近赤外吸収スペクトルデータ）に基づいて、類似度などを算出して明らかにするためのモデル（ここでは予測モデル又は検量線）の構築等を意味する。前記（Ｙ１）のステップにおける、多変量解析方法はサンプルによって適宜選択することが好ましい。【００３９】
前記ステップ（Ｙ１）は、下記（Ｙａ）〜（Ｙｄ）のステップを含むことが好ましい。
（Ｙａ）皮膚の表皮の厚さ、及び真皮の厚さの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の、近赤外吸収スペクトル（測定波数領域は６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1、又は６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1）を必要に応じてデータ加工するステップ。
（Ｙｂ）前記近赤外吸収スペクトル又は前記データ加工されたスペクトル（以下、これらを総称して「スペクトル」とも称する）の、分割された波数毎のスペクトル値及び皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さと、皮膚の紫外線照射量、紫外線照射部位、週齢（マウス等）、及び、実年齢の少なくとも一つとから行列を作成するステップ。
（Ｙｃ）前記（Ｙｂ）で作成された行列を多変量解析することにより、皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さの予測値を導出するステップ。
（Ｙｄ）皮膚の表皮の厚さ、及び真皮の厚さの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の実測値を第一軸、該皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さの予測値を第二軸として、各サンプルの相対関係を得ることにより、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方と、皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係（検量線）を得るステップ。【００４０】
前記（Ｙａ）のステップにおける近赤外吸収スペクトル、またはデータ加工される近赤外吸収スペクトルの波数領域は、６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1、又は６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1である（図２参照）。
上記波数領域の近赤外吸収スペクトルは、アミド結合特性、即ち、アミド結合（ＣＯＮＨ）又はアミド（ＣＯＮＨ2）の構造特性を反映し、その特性が皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さと相関しているためと推察される。即ち、前記波数領域は、アミド結合（ＣＯＮＨ）の場合では、各々、遊離の場合の第１倍音、水素結合の第１倍音、アミドIの第２倍音、ＮＨ伸縮とアミドIIとの結合音、ＮＨ伸縮とアミドIIIとの結合音、及びアミドIの倍音とアミドIIIとの結合音を示しているものと推察される。また、アミド（ＣＯＮＨ2）の場合では、ＮＨ2逆対称伸縮振動の第１倍音、ＮＨ2対称伸縮振動及び分子内水素結合の各第１倍音、分子間水素結合の第１倍音、ＮＨ伸縮とアミドIIとの結合音、アミドIの第２倍音及びＮＨ伸縮とアミドIIとの結合音、ＮＨ伸縮とアミドIIIとの結合音、並びにアミドIの倍音とアミドIIIとの結合音を示しているものと推察される。このことは、後述の実施例において、前記波数領域のスペクトルの、パーシャル  リースト  スクエア（ＰＬＳ）法を用いた回帰分析結果における皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さの実測値と予測値（検量線）の相関係数が非常に大きいことからも支持される。【００４１】
前記（Ｙａ）のステップにおけるデータ加工には、前記（Ｘａ）のステップと同様の前処理及び変換を含む。また、（Ｙａ）のステップにおけるデータ加工は前記（Ｘａ）のステップと同様に二次微分を含むことが好ましい。【００４２】
いずれにしても前記データ加工は、後述のステップ（Ｙｂ）において作成される行列から、（Ｙｃ）のステップにおいて導出される皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さの予測値が、前記実測値と高い相関関係を示すように行われることが好ましい。【００４３】
前記（Ｙｂ）のステップにより作成される行列には、前記（Ｘｂ）と同様の各皮膚の赤外吸収スペクトルの、分割された波数毎のスペクトル値と皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さが用いられる。前記皮膚の表皮及び真皮の厚さは、例えば以下に示す方法によって調製した各種の皮膚サンプルを用いて、実測した値を使用すればよい。【００４４】
例えば、ヘアレスマウスの場合は、背部より皮膚を剥離して、５ｍｍ×５ｍｍの皮膚切片を作製する。次に１０％中性緩衝ホルマリン固定を行い、ＨＥ染色による組織標本を作製し、光学顕微鏡を用いて皮膚の厚さを測定する。図３に剥離皮膚のＨＥ染色画像、並びに表皮、真皮及び皮膚（表皮＋真皮）の各々の厚さの測定値の例を示す。図３から、紫外線未照射群では表皮及び真皮の厚さに対する週齢の影響は非常に小さいが、紫外線照射群では表皮及び真皮の厚さに対しては、紫外線未照射群の１〜５倍の種々の値を示す。このように、本願方法を実施する際に、ＨＥ染色画像等より得られる表皮及び真皮の厚さの値は好適に利用できることが判る。【００４５】
また、例えば、ヒトの場合は、紫外線暴露の有無による部位差、即ち被覆された体幹部（上腕内側、背、腹等）や露出された部位（前腕外側、顔等）を用いて、超音波計測（例えば、リオン（株）社製の超音波診断装置ＵＸ−０２等）を行い、該超音波画像により求められる皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方）の厚さの値を使用すればよい。図４に超音波画像、及び上腕外側部と前腕内側部における各表皮と真皮の厚さの測定値の例を示す。図４から、加齢によって真皮の厚さが変化するなどの種々の値が得られる。本願発明において、前記超音波画像等により求められる皮膚の厚さの値は好適に利用できることが判る。【００４６】
前記（Ｙｂ）のステップにより作成される行列には、（Ｙａ）のステップにおいてスペクトル測定された２種以上の皮膚（表皮及び真皮の少なくとも一方の厚さが異なった皮膚）の紫外線照射量、紫外線照射部位、生体の週齢（マウス等）、及び、実年齢等の少なくとも一つ等を用いることが可能である。【００４７】
即ち、２種以上の表皮及び真皮の少なくとも一方の厚さが異なった皮膚から得られたスペクトルそれぞれについて、前記分割された波数毎のスペクトル値及び表皮及び真皮の少なくとも一方の厚さと、皮膚の紫外線照射量、紫外線照射部位、生体の週齢（マウス等）、及び、実年齢の少なくとも一つ等とから行列を作成する。例えば下記表２のような行列を作成する。サンプリング数は好ましくは２０以上であり、より好ましくは４０以上である。【００４８】
【表２】
0005306651.tif 000003
【００４９】
前記（Ｙｃ）のステップにおける多変量解析（回帰分析）のアルゴリズムは、パーシャル  リースト  スクエア（Ｐａｒｔｉａｌ  Ｌｅａｓｔ  Ｓｑｕａｒｅｓ：ＰＬＳ）法、又は主成分回帰分析（ＰＣＲ）法を用いることが好ましい。この理由は以下の通りである。回帰分析の最終目的は関連する特性値（ここでは皮膚の表皮及び真皮の少なくとも一方の厚さ）を予測するための予測モデルを構築することである。該モデルにおいて、連続的な特性値を予測するために、説明変数として分光光度計のような測定値を用いる場合、ＰＬＳ又はＰＣＲは、単回帰分析や重回帰分析（ＭＲＡ）に比べて、予測精度の高さと正確性、アウトライヤーの識別及び該モデルの最適化等の点で、極めて有利である。また、該予測モデルは、皮膚サンプルの追加によってデータベース（ＤＢ）が更新され、予測精度の高いモデルに最適化することができる。【００５０】
前記ＰＬＳやＰＣＲの回帰分析は、市販されているソフトウェアを使用して行うことができる。この様なソフトウェアとしては、例えば、ジーエルサイエンス(株)より販売されているピロエット「Ｐｉｒｏｕｅｔｔｅ」（登録商標）、サイバネットシステム(株)より販売されているマットラボ「ＭＡＴＬＡＢ」（登録商標）、横河電機（株）より販売されている、アンスクランブラーＩＩ「Unscrumbler」等のソフトウェアが例示できる。【００５１】
前記（Ｙｄ）のステップは、（Ｙｃ）のステップで求められた皮膚の厚さの予測値から予測モデル（検量線）を構築し、皮膚の表皮及び真皮の厚さの少なくとも一方と、皮膚の近赤外吸収スペクトル値との相関関係を得るステップである。すなわち、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方が既知である二種以上の皮膚の実測値を第一軸、該皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方の予測値を第二軸として、各サンプルの相対関係を得ることにより、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方と、皮膚の近赤外吸収スペクトルとの相関関係（検量線）を得ることができる。
例えば、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方の実測値と予測値との二軸により構成される平面散布図を作成すれば、各サンプルのプロットの位置関係や相関係数によって皮膚の表皮及び真皮の厚さの少なくとも一方の大凡の予測値、精度及び皮膚サンプルの特性（例えば、紫外線照射量、部位、週齢又は実年齢等）等について推察できる。【００５２】
前記（Ｘ２）および（Ｙ２）のステップは、判定対象である、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方が未知である皮膚、又は予測対象である、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方が未知である皮膚の近赤外吸収スペクトルを得るステップを含む。【００５３】
この（Ｘ２）および（Ｙ２）のステップにおける近赤外吸収スペクトルは、前記（Ｘ１）および（Ｙ１）のステップにおける近赤外吸収スペクトルの測定と同様の方法または装置で測定することにより得られることが好ましい。さらに得られた近赤外吸収スペクトルは、前記（Ｘ１）および（Ｙ１）のステップと同様にデータ加工されることが好ましい。以下（Ｘ２）のステップおよび（Ｙ２）のステップを総称してステップ（２）と称することもある。【００５４】
前記（Ｘ３）のステップは、前記ステップ（Ｘ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｘ２）で得られた近赤外吸収スペクトルから、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定するステップを含む。また、前記（Ｙ３）のステップは、前記ステップ（Ｙ１）で得られた相関関係に基づいて、前記ステップ（Ｙ２）で得られた近赤外吸収スペクトルから、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測するステップを含む。以下、（Ｘ３）のステップおよび（Ｙ３）のステップを総称してステップ（３）と称することもある。【００５５】
このステップ（３）は以下の［Ａ］または［Ｂ］で表される。
［Ａ］前記ステップ（Ｘ１）において相関関係を得た行列に、前記ステップ（Ｘ２）において得られたスペクトルデータを加えて、前記ステップ（Ｘ１）と同様に多変量解析することにより、判定対象である皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定する（主成分分析法）。
或いは、前記ステップ（Ｘ１）において得られた相関関係から得られたモデルに、前記ステップ（Ｘ２）において得られたスペクトルデータをあてはめることによって、判定対象である皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合いの少なくとも一方を判定する（ＳＩＭＣＡまたはＫＮＮ法）。即ち、紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合が既知である皮膚の解析結果及び未知である皮膚の解析結果を、二つの主成分の軸に関する相対関係を用いて確認することで、未知である皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合の少なくとも一方を判定することができる。二つの主成分の軸に関する相対関係は、例えば第一主成分及び第二主成分を軸とする平面散布図として表現することができる。【００５６】
［Ｂ］前記ステップ（Ｙ１）において得られた相関関係から得られたモデルに、前記ステップ（Ｙ２）において得られたスペクトルデータをあてはめることによって、予測対象である皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測する。前記ステップ（Ｙ１）において相関関係が得られたスペクトルデータ（行列）と、前記ステップ（Ｙ２）において得られたスペクトルデータとをあわせて、前記ステップ（Ｙ１）と同様に回帰分析することにより、予測対象である皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測する。即ち、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方が既知である皮膚の予測モデル（検量線）において、未知である皮膚の解析結果を相対的に確認することで、未知である皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を予測することができる。該予測においては、予測モデルにおける相関関係に基づいて予測値及び予測精度を示すことができる。尚、前記（Ｙ３）のステップは、回帰分析のソフトウェアを利用することにより行うことができる。【００５７】
（Ｘ３）のステップでは、紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合の少なくとも一方が既知である皮膚の解析結果から得られた成分Ａ（二つの主成分の一方）及び成分Ｂ（二つの主成分の他方）の軸に関する相対関係に対して未知である皮膚の解析結果を確認することで、未知である皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合の少なくとも一方を判別することができる。成分Ａ及びＢの軸に関する相対関係は、例えば成分Ａ及びＢを軸とする平面散布図として表現することができる。
また、（Ｙ３）のステップでは、皮膚の表皮の厚さ及び皮膚の真皮の厚さの少なくとも一方が既知である皮膚の予測モデル（検量線）において、未知である皮膚の解析結果の相対的な関係を確認することで、未知である皮膚の表皮の厚さ及び皮膚の真皮の厚さの少なくとも一方を予測することができる。該予測においては、予測モデルにおける相関関係に基づいて予測値及び予測精度を示すことができる。【００５８】
本発明の方法を用いることによって、皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合を経時的に判定することができ、結果、判定結果を化粧料、医薬品、手術又はエステティック施術等による皮膚に対する処置やお手入れの必要性の判断に利用できる。また、該処置やお手入れによる効果の判定に利用することもできる。さらに、これら判定結果に基づいてより望ましい化粧料等の選択やアドバイスの提供、例えば、紫外線による損傷の度合が高い場合は紫外線防止剤や美白剤を配合した化粧料、生理的老化の度合が高い場合は保湿剤や抗老化剤を配合した化粧料の使用等、を行うことができる。【００５９】
また、本発明の方法を用いて、皮膚の変化、即ち表皮及び真皮の厚さが変化するかどうか、その変化が大きくなるか、或いは、小さくなるかを経時的にモニターすることができる。さらに、該モニター結果を化粧料、医薬品、手術或いはエステティック施術等による皮膚に対する処置やお手入れの必要性の鑑別、処置やお手入れした効果の鑑別、或いは望ましい化粧料等の選択やアドバイスの提供等に利用できる。例えば、鑑別した皮膚（表皮及び真皮のいずれか一方）の厚さが、実年齢や部位の平均値に比べて、統計的に偏る場合は、皮膚組織の機能異常による表皮肥厚や、細胞外マトリックス（コラーゲン等）の異常性等による望ましくない状態であると推察され、前記の処置やお手入れが必要と判断される。また、鑑別した皮膚（表皮及び真皮のいずれか一方）の厚さが経時的に変化した場合、前記の処置やお手入れが効果を有すると判断される。【００６０】
また、化粧料の投与前と投与後、又はエステティックの施術前と施術後の皮膚（表皮及び真皮のいずれか一方）の厚さを比較し、その変化を指標に化粧料やエステティックの効果を評価できる。例えば、真皮の厚さが小さい場合に於いて、コラーゲン合成促進剤やコラーゲン線維束再構築剤等を配合した化粧料の使用によって真皮の厚さが増加すれば、それらはシワ改善作用を有すると評価できる。また、表皮の厚さが大きい場合において、ターンオーバー調整剤等を配合した化粧料の使用によって表皮肥厚が抑制され、表皮の厚さが減少すれば、それらは表皮肥厚改善作用を有すると評価できる。【００６１】
本発明の方法は人間を治療又は診断することを目的としておらず、本発明の方法は医療行為を除くものである。【００６２】
以下、本発明を、実施例などを参照して詳細に説明するが、これらにより本発明の範囲が限定されることはない。
【実施例】
【００６３】
＜動物皮膚サンプルの調製＞
動物皮膚サンプル集団のためにヘアレスマウスを用い、紫外線照射群と紫外線非照射群を設定することで、各種皮膚状態及び皮膚の厚さを持つサンプル集団を調製した。紫外線非照射群として、週齢６週群（以下、ＣＴ６Ｗ、又は未ＵＶ#６Ｗ群と表記することもある）、週齢１０週群（以下、ＣＴ１０Ｗ、又は未ＵＶ#１０Ｗ群と表記することもある）、週齢１４週群（以下、ＣＴ１４Ｗ、又は未ＵＶ#１４Ｗ群と表記することもある）、週齢１６週群（以下、ＣＴ１６Ｗ、又は未ＵＶ#１６Ｗ群と表記することもある）、及び週齢２７週群（以下、ＣＴ２７Ｗ、又は未ＵＶ#２７Ｗ群と表記することもある）の各群６匹の合計３０匹を設定した。また、紫外線照射群として、週齢８週群（以下、ＵＶ８Ｗ、又はＵＶ#８Ｗ群と表記することもある）、週齢１０週群（以下、ＵＶ１０Ｗ、又はＵＶ#１０Ｗ群と表記することもある）、週齢１４週群（以下、ＵＶ１４Ｗ、又はＵＶ#１４Ｗ群と表記することもある）、及び週齢１６週群（以下、ＵＶ１６Ｗ、又はＵＶ#１６Ｗ群と表記することもある）の各群６匹の合計２４匹を設定した。【００６４】
＜紫外線照射条件＞
紫外線照射は、ヘアレスマウスが６週齢に達した後、１週につき３回、１回につき０．１Ｄｏｓｅ（Ｊ／ｃｍ2）の照射エネルギーを投与した。したがって、前記の紫外線照射群の週齢１０週群とは、６週齢後に紫外線照射期間を４週間実施したものであり、４週間に１２回の累積１．２Ｄｏｓｅ（Ｊ／ｃｍ2）の紫外線照射を受けた皮膚を意味する。【００６５】
＜ヒト皮膚サンプルの調製＞
腕の皮膚に疾患を持たない２０〜５０代の女性被験者６０名（各年代各１５名）の、前腕外側部、前腕内側部及び上腕内側部の３箇所を設定し、該３箇所を洗浄後２０分おいた条件をヒト皮膚サンプル集団とした。【００６６】
＜皮膚サンプルの近赤外吸収スペクトルの測定＞
皮膚サンプルの調製で得られた皮膚サンプルの近赤外吸収スペクトルを、２０℃一定環境下において測定した。ここで、皮膚の箇所によって処理がばらついている可能性を考慮して、皮膚サンプルは、ランダムに選択された３箇所の部位について近赤外吸収スペクトルを測定した。近赤外吸収スペクトルの測定には、フーリエ変換型近赤外分光光度計ＶＥＣＴＯＲ ２２／Ｎ（ブルカー・オプティクス（株）製）を用いた。測定条件は、分解能：８ｃｍ-1、測定波数：８０００〜４０００ｃｍ-1として、ファイバープローブを用いた拡散反射法を用いた。【００６７】
＜実施例１＞
前述のヘアレスマウスの皮膚より得られた皮膚サンプル集団の近赤外吸収スペクトルの内、波数領域：５９９０〜５４９０ｃｍ-1及び５０００〜４４８０ｃｍ-1についてのデータ加工を行った。具体的には、平均化（Mean Center）、ＳＮＶ（Standard Normal Variant）を行った後、二次微分を行った。【００６８】
データ加工されたスペクトルを、４ｃｍ-1毎に分割して、分割されたスペクトルごとのスペクトル値（吸光度の二次微分値）を算出した。算出された波数毎のスペクトル値の二次微分値と、該皮膚への処置内容（紫外線照射の有無と照射量の差違、及び週齢の差違）とから行列を作成した。作成された行列について、主成分分析を行った。得られた解析結果から、第二主成分を第一軸、第三主成分を第二軸として（生理的老化及び紫外線損傷を表す２成分を選択し、それぞれ第一軸及び第二軸として）、平面散布図を作成した。これらのデータ加工および主成分分析は、多変量解析ソフト（Pirouette（登録商標）バージョン3.11；ジーエルサイエンス（株））を用いて行った。【００６９】
得られた多変量解析の解析結果から作成した平面散布図を図５に示した。図５に示された通り、紫外線照射の有無、照射量の差違及び週齢の差違ごとに、非常に鮮明にカテゴリー化されていることが判る。具体的には、第一軸（横軸）で左方向であるほど皮膚の生理的老化の度合が高いことが判る。また、第二軸（縦軸）で下方向であるほど皮膚の紫外線による損傷の度合が高いことが判る。皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合いの両方が高いほど左下方向に位置することが判る。このように、皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合が、個々に、皮膚の近赤外吸収スペクトルの多変量解析の解析結果と明確な相関関係を示すことが判る。【００７０】
＜実施例２＞
実施例１において、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理老化の度合が未知のヘアレスマウスの皮膚サンプルの近赤外吸収スペクトルも加え、実施例１と同様の手順でデータ加工して行列を作成し、主成分分析を行った。得られた結果から作成した散布図を図６に示した。図６に示されるように、処置内容の異なる各サンプル群が鮮明にカテゴリー化されており、且つ紫外線による損傷及び生理老化の度合が未知である皮膚サンプルの結果のプロット位置から、当該皮膚が紫外線非照射の週齢２７週群に最も該当すると判定することができた。【００７１】
＜実施例３＞
前述のヒトの皮膚サンプル集団について、実施例１と同様に、計測及び解析を行った。得られた多変量解析の解析結果から第一主成分を第一軸、第二主成分を第二軸として、平面散布図を作成した。作成した平面散布図を図７及び図８に示した。図７では部位別カテゴリーの９５％の確率楕円を、また図８では年代別カテゴリーの９５％の確率楕円を求めた。図７又は図８に示された通り、腕の部位別又は年代ごとに、非常に鮮明にカテゴリー化されていることが判る。具体的には、第一主成分の軸（横軸）で左方向であるほど生理的老化の度合が高く、第二主成分の軸（縦軸）で下方向であるほど紫外線による損傷の度合が高い。したがって、図７から、より露出されている前腕外側部は紫外線による損傷の度合が高いが、あまり露出されていない上腕内側部では紫外線による損傷の度合が低いことが判る。また、図８から、２０代から５０代になるに従い、左方向にカテゴリーがシフトし生理的老化の度合が進んでいることが判る。このように、ヒトの皮膚の紫外線による損傷の度合及び生理的老化の度合を個々に判定できることが判る。【００７２】
＜比較例１＞
実施例１において、波数領域８０００−４０００ｃｍ-1についてのデータ加工を行い、主成分分析より得られた結果から作成した散布図を図９に示した。図９に示されるように、ヘアレスマウスの皮膚について紫外線照射の有無、照射量の差違及び週齢の差違等が全くカテゴリー化されていない。この波数領域においては、生理的老化の度合と紫外線による損傷の度合との区別が困難であることが判る。【００７３】
＜比較例２＞
実施例１において、波数領域８０００−６０００ｃｍ-1及び５４９０−５０００ｃｍ-1、並びにについて各々データ加工を行い、主成分分析より得られた結果から作成した散布図を図１０（波数領域８０００−６０００ｃｍ-1及び５４９０−５０００ｃｍ-1）及び図１１（波数領域４４８０−４０００ｃｍ-1）に示した。図１０及び図１１に示されるように、ヘアレスマウスの皮膚について紫外線照射の有無、照射量の差違及び週齢の差違等が全くカテゴリー化されておらず、この波数領域においては、生理的老化の度合と紫外線による損傷の度合との区別が困難であることが判る。【００７４】
＜比較例３＞
実施例３において、波数領域８０００−４０００ｃｍ-1についてのデータ加工を行い、主成分分析より得られた結果から作成した散布図を図１２に示した。図１２に示されるように、ヒトの皮膚について年代別に全くカテゴリー化されていない。この波数領域においては、生理的老化の度合と紫外線による損傷の度合との区別が困難であることが判る。【００７５】
＜比較例４＞
実施例３において、波数領域８０００−６０００ｃｍ-1、及び４４８０−４０００ｃｍ-1について各々データ加工を行い、主成分分析より得られた結果から作成した散布図を図１３（波数領域８０００−６０００ｃｍ-1）、１４（波数領域４４８０−４０００ｃｍ-1）、１５（波数領域８０００−６０００ｃｍ-1）及び１６（波数領域４４８０−４０００ｃｍ-1）に示した。図１３〜１６に示されるように、ヒトの皮膚について年代別、及び部位別とも全くカテゴリー化されておらず、この波数領域においては、生理的老化の度合と紫外線による損傷の度合との区別が困難であることが判る。【００７６】
＜実施例４＞
前述のヘアレスマウスの皮膚より得られた皮膚サンプル集団の近赤外吸収スペクトルの内、アミド結合（ＣＯＮＨ）の波数領域：６８５０〜６６２０ｃｍ-1、６５４０〜５９９０ｃｍ-1、５２４０〜５１８０ｃｍ-1、５０３０〜４９８０ｃｍ-1、４７６０〜４７２０ｃｍ-1及び４６５０〜４６１０ｃｍ-1についてのデータ加工を行った。具体的には、平均化（Mean Center）、ＳＮＶ（Standard Normal Variant）を行った後、二次微分を行った。【００７７】
データ加工されたスペクトルを、４ｃｍ-1毎に分割して、分割されたスペクトルごとのスペクトル値（吸光度の二次微分値）を算出した。算出されたスペクトル値及び前記の皮膚（表皮、及び、真皮の少なくとも一方）の厚さを列に、該皮膚への前記の処置内容（紫外線照射の有無と照射量の差違、及び週齢の差違）を行として、行列を作成した。作成された行列について、ＰＬＳを用いて回帰分析を行った。得られた解析結果である、皮膚の表皮及び真皮の各厚さの予測モデル（検量線、相関係数）を図１７〜１９に示す。図１７〜１９より、ヘアレスマウスにおいて、高い精度で、皮膚の、表皮及び真皮の各厚さを予測できることが判る。尚、データ加工及びＰＬＳは、多変量解析ソフト（Pirouette（登録商標）バージョン3.11；ジーエルサイエンス(株)）を用いて行った。【００７８】
＜実施例５＞
実施例４において得られた図１７〜１９を用いて、１４週齢の紫外線照射と紫外線未照射のヘアレスマウスの皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さを予測した（表３参照）。表１より、相対標準偏差１０％前後の高い精度にて予測できたことが判る。【００７９】
【表３】
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【００８０】
＜実施例６＞
実施例４における、ヘアレスマウスの皮膚を、ヒト皮膚サンプルに示した女性被験者の皮膚に置き換えて、同様の手順でＰＬＳ回帰分析を行った。得られた解析結果である、皮膚の表皮及び真皮の各厚さの予測モデル（検量線、相関係数）を図２０〜２２に示す。図２０〜２２より、ヒトにおいても皮膚の表皮及び真皮の各厚さを高い精度で予測できることが判る。【００８１】
＜実施例７＞
実施例６において得られた図２０〜２２を用いて、４０代女性被験者の上腕内側部の皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さを予測した（表４参照）。表４より、相対標準偏差（変動係数）が１０％前後の高い精度にて予測できることが判る。【００８２】
【表４】
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【００８３】
＜実施例８＞
４０代女性被験者の上腕内側部の皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さの予測を、実施例４及び６における近赤外吸収スペクトルの波数領域を、アミド（ＣＯＮＨ2）の構造特性である６９４０〜６８５０ｃｍ-1、６７１０〜６５４０ｃｍ-1、６２５０〜６１７０ｃｍ-1、５１３０〜５０８０ｃｍ-1、４９５０〜４８５０ｃｍ-1、４７６０〜４６９０ｃｍ-1及び４６７０〜４６１０ｃｍ-1に置き換え、同様の手順でＰＬＳ回帰分析を行い取得した予測モデル（検量線）を用いて実施した（表５参照）。表５より、相対標準偏差（変動係数）が１５％前後の高い精度にて予測できることが判る。【００８４】
【表５】
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【００８５】
＜比較例５＞
実施例４及び６における近赤外吸収スペクトルの波数領域を８０００−４０００ｃｍ-1に置き換え、同様の手順でＰＬＳ回帰分析を行い取得した予測モデル（検量線）を用いて、４０代女性被験者の上腕内側部の皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さの予測を行った。相対標準偏差（変動係数）が２０から３０％以上であり、皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さの測定において、本願発明ほど有効な予測ができないことが判る。【００８６】
＜比較例６＞
実施例４において、アミド結合（ＣＯＮＨ）の波数領域に代えて、メチル結合（ＣＨ3）の波数領域：７３８０−７３３０ｃｍ-1、５８５０−５７８０ｃｍ-1、５６５０−５６００ｃｍ-1，４４００−４３８０ｃｍ-1に置き換え、同様の手順でＰＬＳ回帰分析を行った。得られた表皮、真皮及び皮膚（表皮＋真皮）の各厚さの予測モデル（検量線）を図２３〜２５に示す。図２３〜２５より、予測モデルの相関係数が０．７１〜０．７４であり、ヘアレスマウスにおいて、アミド結合（ＣＯＮＨ）の波数領域の場合のように、高い精度で、表皮、真皮及び皮膚（表皮＋真皮）の各厚さを予測できないことが判る。図２３〜２５を用いて、１４週齢の紫外線照射と紫外線未照射のヘアレスマスの皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さを予測した（表６参照）。表６より、相対標準偏差（変動係数）は２０〜３０％前後にアップし、皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さの測定において、本願発明ほど有効な予測ができないことが判る。【００８７】
【表６】
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＜比較例７＞【００８８】
実施例６において、アミド結合（ＣＯＮＨ）の波数領域に代えて、メチル結合（ＣＨ3）の波数領域：７３８０−７３３０ｃｍ-1、５８５０−５７８０ｃｍ-1、５６５０−５６００ｃｍ-1，４４００−４３８０ｃｍ-1に置き換え、同様の手順でＰＬＳ回帰分析を行った。得られた表皮、真皮及び皮膚（表皮＋真皮）の各厚さの予測モデル（検量線）を図２６〜２８に示す。図２６〜２８より、予測モデルの相関係数が０．６８〜０．７３であり、人において、アミド結合（ＣＯＮＨ）の波数領域の場合ように、高い精度での表皮、真皮及び皮膚（表皮＋真皮）の各厚さを予測できないことが判る。図２６〜２８を用いて、４０代女性被験者の上腕内側部の皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さを予測した（表７参照）。表７より、相対標準偏差（変動係数）は２０％前後にアップし、皮膚（表皮＋真皮）、表皮及び真皮の各々の厚さの測定において、本願発明ほど有効な予測ができないことが判る。【００８９】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によって、ヒトやマウスの皮膚の紫外線による損傷の度合及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方を非侵襲的且つ定量的に判定することができる。また、本発明によって、皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を非侵襲的且つ定量的に予測することができる。該判定、予測の結果を用いることで、皮膚の紫外線による損傷の度合い及び皮膚の生理的老化の度合の少なくとも一方、並びに皮膚の表皮の厚さ及び真皮の厚さの少なくとも一方を経時的にモニタリングすることが可能となり、一般の人がデパート、店頭或いは顧客の家において、皮膚に対する化粧料の評価、肌状態の評価、化粧料選択やその評価などのアドバイスやカウンセリングを容易且つ的確に享受できるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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