(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、当該細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の属の細菌と識別できるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、該細菌を他の属の細菌と識別するための細菌検出方法。
【請求項２】
抗体が酵素と結合したモノクローナル抗体である、請求項１に記載の細菌検出方法。
【請求項３】
クラミジア・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に属する細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、当該細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の属の細菌と識別できるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、該細菌を他の属の細菌と識別するための細菌検出用試薬キット。
【請求項４】
抗体が酵素と結合したモノクローナル抗体である、請求項３に記載の細菌検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、一般的な肺炎の原因微生物であるクラミジア・ニューモニア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属する微生物の検出に有用な抗体、該微生物の検出方法、該微生物の検出用試薬キット、及び該微生物検出用抗体の製造方法に関する。
本発明は、医療上、特にＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって惹起される非定型肺炎の診断に重要である。
本発明は、検体、例えば、のど綿棒、組織サンプル、および体液から採取された検体中に含まれる微生物Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するのに有用である。
背景技術
微生物感染症の診断は、通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
感染症原因菌の検出は、一般に、原因菌の分離培養を経て、その生理学的、生化学的あるいは構造的な特性に基づきこれを同定する培養同定法、原因菌の遺伝子をＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法または特異的核酸ハイブリダイゼーションにより増幅させて、これを検出する遺伝子的診断法および抗体と原因菌の抗原マーカーとの特異的反応を利用して原因菌を検出する免疫学的方法に分類される。
しかしながら、培養同定法または遺伝子的診断法を用いる場合には、結果を得るのに長時間を要する。従って、原因菌を短時間にしかも高感度で検出することができ、迅速かつ適切な患者の治療につながる免疫学的方法による診断が汎用されている。
従来、免疫学的方法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは世界的に肺炎の一般的な原因菌である。小さな、非運動性のグラム陰性菌であり、選択的にヒトの体内に侵入し、病気を引き起す。病原巣となる動物は知られていない。血清陽性率は３０〜４０代の成人で４０〜５０％である（Ｈｙｍａｎ，Ｒｏｂｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。この微生物は喉頭炎、気管支炎および軽度の肺炎を発症せしめる。
この菌は、非常に微小の偏性寄生生物であり、宿主細胞の細胞質中で成長する。組織培養液中でのＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの成長は非常に緩慢であり（Ｇｏｄｚｉｋ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）、培養液中に菌を同定するまでに少なくとも３〜５日間を要する（Ｅｓｓｉｇ，Ｚｕｃｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。従って、迅速に病原菌として検出する診断法としては、グラム染色法と培養法などを適用することができない。従って、クラミジアの迅速診断法としては、抗体を用いた免疫学的手法がしばしば用いられる。
クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属の場合、属特異的抗原であるリポ多糖（ＬＰＳ）の抗原決定基としての存在が知られており（Ｖｅｒｋｏｏｙｅｎ，Ｖａｎ  Ｌｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、様々な診断用キットにおいて特にＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出用試薬抗体に利用されている。更に、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）およびＢａｔｔｅｉｇｅｒら（Ｂａｔｔｅｉｇｅｒ，Ｎｅｗｈａｌｌｅｔ  ａｌ．１９８６）はＣｈｌａｍｙｄｉａ属の主要外膜蛋白質（ＭＯＭＰ）に対するモノクローナル抗体を報告している。
これらの抗体がＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｈｅｕｎｏｎｉａｅとＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓを区別することに役立つことが明らかになったが、その後、これらの抗体はＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｈｅｕｎｏｎｉａｅ種内の複数の抗原性の違いを明らかにすることに重要な役割をはたした。このような抗原はＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｈｅｕｎｏｎｉａｅ種内の血清型分類には役立つかもしれないがＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｈｅｕｎｏｎｉａｅ種の全ての菌株の検出を必要とする通常の診断には役に立つものではない。普遍的な機能を持つ共通な抗原、しかも大部分な構造は微生物種間で保存されているにもかかわらず、それを区別して検出するのに利用できる抗原はいままで知られていなかった。
本発明は全ての微生物に同一機能の分子として普遍的に存在し、しかも抗体を取得するための蛋白質抗原として有用な蛋白質に関するものである。通常、このような分子は小規模の構造変化しか伴わないものである。このような同一機能の普遍的な分子に対する大規模な構造変化は生物の生存に対して重大な悪影響を及ぼす可能性のあるものである。
クラミジア病原体を検出する商業的に利用可能なモノクローナル抗体の数はごく僅かであり、十分というには程遠い。最近までＴＷＡＲ株のみが肺炎の原因菌であると信じられてきた（Ｔｈｏｍ  ａｎｄ  Ｇｒａｙｓｔｏｎ  １９９１；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，００８，１８６）。最近になって、いくつかのクラミジア病原体の血清型が報告された。ＬＰＳまたはＭＯＭＰは菌株によって異なり、また１つの血清型に対する抗体では全てをカバーできない状況である。
発明の開示
本発明は、上記のような課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに属する微生物を特異的、かつ高感度に迅速に検出する方法、その検出に用いる検出用抗体、検出用試薬キットを提供することを課題とする。さらに、本発明は、その検出に用いる検出用抗体の製造方法を提供することを課題とする。
本発明者等は、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化はきわめて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つとともに、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。
本発明者らは全ての微生物細胞に同一機能の分子として存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種であるＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に着目した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質は分子量約１３キロダルトンの蛋白質であり、蛋白質合成に必須のリボソーム蛋白質として存在することが知られている。特にＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むいくつかの微生物ではＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の全アミノ酸配列が解析されている。
本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらずその一部に各微生物固有の構造部分を持つことに着目し、このＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物、細菌の種特異的でかつ全ての同一菌種内の血清型について検出が可能であることを見出した。
本発明者等はＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの該蛋白質に特異的な抗体が得られること、および該抗体を用いることによりＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの特異的な検出が可能であることを見出し、本発明を完成した。
本発明により、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対して特異的なモノクローナル抗体が見出され、開発された。この抗体は新規であり、従来公知のいかなる抗体とも異なり、上記蛋白質と特異的に反応する性質を有する。
配列表において配列番号１及び２はＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＮＣ＃０００９２２）及び対応するアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＥ００１５９３．１，ＮＣＢＩ  ｄａｔａ  ｂａｓｅ）である。なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基末端（以下、Ｎ末端）およびカルボキシル基末端（以下、Ｃ末端）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ５’末端および３’末端である。クロスマッチテストのアミノ酸配列はアミノ酸１文字略字によって記している。また、クロスマッチテストにおける「＋」の表記は、異なるアミノ酸であるが、疎水性などの性質が類縁のアミノ酸であること、「」のブランクは性質も含めて全く異なるアミノ酸であることを示す。また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）を挙げることができる。
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本発明において″微生物″とは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを意味し、特に、呼吸器における病原性を有しＣｈｌａｍｙｄｉａ感染症の原因菌として診断の意義の高い微生物をいう。
本発明において、"微生物と特異的に反応する抗体″とは、微生物の種あるいは属に特異的に反応する抗体をさすが、微生物感染症の診断においては微生物の種に特異的に反応する抗体が特に有用となる。
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を指し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。
このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。
また該蛋白質の全長または５残基以上、望ましくは８残基以上のアミノ酸配列をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などとフュージョン蛋白質としたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて培養した細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
本発明のマーカー抗原として用いることができるＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体は、以下の方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるがこれらの方法に限定されるものではない。
ａ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性の少ない領域についてペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｂ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列が菌種間で５０〜６０％相同であることにより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にしてＰＣＲ法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
ｃ）あるいはＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する５〜３０アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製する。該抗体を用いたアフィニティカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製されたＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得することができる。
蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製したのち作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の溶出画分を同定し精製蛋白質を得ることができる。得られた精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマを取得し、目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
上記の方法ａ）、ｂ）およびｃ）によって得られた、種々の微生物に特異的な本発明の抗体は、微生物に特異的な各種の診断試薬およびキットを利用する、種々の免疫学的分析法に用いることができる。例えば、この抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
抗体を用いる微生物診断方法とは、ポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法を利用する診断方法を意味する。
また、特に抗体を用いる有用な微生物診断方法として特表平７−５０９５６５号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ（ＯＩＡ，Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが高感度な診断方法として有用である。
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，Ｔｗｅｅｎ−２０をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられる。界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を配列表配列番号：１及び２に示す。従って、この微生物の場合はＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列を、配列表に「クロスマッチ」と記した類似した微生物の同種の蛋白質と比較することが可能である。相同性の低いセグメントのペプチドを合成し、これに対するポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を作成することは、微生物に対する特異性を有するものの選択を省略することを可能とする。
特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム等で精製しＩｇＧ画分を取得したのち、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドによるアフィニティ精製を実施することが望ましい。
更に、当該微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端とＣ末端の配列に基づいてＰＣＲプライマーが作成された。このＰＣＲプライマーの相同性を利用して、ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅させ、これを抽出し、常法によりＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の断片を取得することができる。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全長はこれらの断片のＤＮＡ配列情報を分析することにより知ることができる。
取得したＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２遺伝子は、例えばＧＳＴなどとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、菌体破砕液をＧＳＴを用いたアフィニティカラムで精製することにより、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質とＧＳＴのフュージョン蛋白質が得られる。
この蛋白質をそのまま、あるいはＧＳＴ部分を切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマクローンを確立し、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌体あるいは菌体破砕液またはＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
また、本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するいわゆる捕捉抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾していわゆる酵素標識抗体とすることにより、検出用抗体としても機能しうる。
発明を実施するための最良の形態
以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】 Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニングＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３１０、ＡＴＣＣから分譲、購入）をＨＬ細胞のモノレイヤー上で培養した。Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの詳細な培養方法はＫｕｏらなど（Ｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｍｍ  １９９０；Ｋｕｏ  ａｎｄ  Ｇｒａｙｓｔｏｎ  １９９０；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｄａｉｒｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）の記載に従った。ＣＯ２インキュベータ内にて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で微生物を５日間培養した。感染した細胞を遠心分離により集め、最終的に５×１０７個／ｍｌ前後の濃度となるようにＴＥ緩衝液（和光純薬工業製）に懸濁した。この懸濁液約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１０，０００ｒｐｍで２分間遠心した。
上澄み液を棄てた。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートした。懸濁液を５６℃で更に１時間インキュベートした。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ  ＮａＣｌ溶液を８０μｌ加え、よく混合したのち６５℃で１０分間インキュベートした。同一体積の２４：１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌した。
この溶液を微量遠心機で１２，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心処理したのち、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成した。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。その後チューブを１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を静かに除去した。１ｍｌの７０％エタノールを追加し、混合物を更に５分間遠心した。
再び上澄みを除去したのち沈殿を１００μｌのＴＥ緩衝液に溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｒ  ＲＮＡに従って定量した。このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付の緩衝液５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ混合物４μｌおよび各２００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド（配列表配列番号：３および４に示すもの）を酵素に加えた。全体の容量が５０μｌとなるように精製水を加えた。
この混合物を、ＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０を用いて、９５℃１分、５０℃２分、７２℃３分を５サイクル行ったのち、９５℃１分、６０℃２分、７２℃３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ生成物の一部を用いて、１．５％アガロースゲル中にて電気泳動を実施した。エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのＤＮＡが増幅されていることを確認した。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いて切断後、１．５％アガロースゲル中にて電気泳動とエチジウムブロマイドによる染色を行った。ゲルから約４００ｂｐのバンドを切り取った。このバンドをＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造株式会社製）で精製し、一般的なベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に挿入した。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡを組み込んだベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１は大腸菌のワンショットコンピテントセルに遺伝子学的手法により導入し、ついで５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（シグマ社）を含む半固体状の培養プレートであるＬＢＬ−ブロス寒天（宝酒造株式会社製）に接種した。プレートを３７℃で１２時間インキュベートし、成長したコロニーを無差別に選択し、同じ濃度のアンピシリンを含むＬ−ブロス培養液に接種した。３７℃で８時間振とう培養・集菌後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐを用い、添付の説明書に従ってプラスミドを分離した。プラスミドは制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて切断処理した。約３７０ｂｐのＤＮＡを切断することによってＰＣＲ生成物の挿入を確認した。挿入されたＤＮＡの塩基配列を上記クローンを用いて決定した。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。
シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。先ず、９．５μｌの反応液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌテンプレートＤＮＡを０．５ｍｌのマイクロチューブに加え、混合した。混合物を２層の１００μｌ鉱油で覆ったのち、２５サイクルＰＣＲ増幅処理を行った。ここで、１サイクルは、９６℃での３０秒間の処理、５５℃での１５秒間の処理、および６０℃での４分間の処理からなる。生成物を４℃で５分間保持した。反応終了後、８０μｌの無菌精製水を加え、攪拌した。生成物を遠心分離し、水層をフェノール−クロロホルム混合液で３回抽出した。１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２と３００μｌのエタノールを１００μｌの水層に加え、攪拌した。その後１４，０００ｒｐｍ、室温で１５分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃で２分間変性した。このものは氷中で冷却してシークエンスに供した。
無差別に選択した５個のクローンのうち２個はＰＣＲに用いたプローブと配列上の相同性を有していた。また、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子配列と一致したＤＮＡ配列が明白であった。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１及び２に示すような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍｌ、３７℃、一昼夜培養した。５００ｍｌの２倍濃度のＹＴ培地を３７℃で１時間加熱した。１晩培養した大腸菌液５０ｍｌを５００ｍｌの前述の培地に入れた。一時間後、５５０μｌの１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を導入し、４時間培養した。生成物を回収し、２５０ｍｌの遠心チューブに移し、７０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．４、２５％Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓ緩衝液２５ｍｌずつに溶解した。さらに１０％ＮＰ−４０  １．２５ｍｌ、１Ｍ  ＭｇＣｌ２  １２５μｌを加えてプラスチックチューブに移した。氷冷下、１分間の超音波処理を５回行った。その後、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を回収した。
次に、ＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。次に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．４、４．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。５ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．６中で溶離処理をした。溶出画分の蛋白質含有量をピグメント結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法；ＢｉｏＲａｄ  Ｃｏ．）で決定し、主画分を取得した。
得られた精製ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約７５％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合した。エマルジョン化したのち２００μｌを腹腔内に注射した。同じエマルジョン化抗原を２週間後、４週間後、および６週間後に腹腔内に注射した。２倍濃度のエマルジョン化抗原を１０週間後および１４週間後に腹腔内に注射した。最終の免疫化終了の３日後に脾臓を摘出し、細胞融合した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０８個に対し骨髄腫細胞２×１０７個をガラスチューブに取り良く混合したのち１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、ＮＳ−１系の細胞株を用い１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。
３７℃に保持したＲＰＭＩ１６４０培養液５０ｍｌを混合細胞試料に加え、１，５００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を除去後、３７℃に保持した５０％ポリエチレングリコール１ｍｌを加え、１分間攪拌した。３７℃に保持したＲＰＭＩ１６４０培養液１０ｍｌを加え、混合液を殺菌したピペットで約５分間吸引・排出することにより激しく攪拌した。
５分間１，０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄み液を除去したのち、細胞濃度が５×１０６／ｍｌとなるように３０ｍｌ  ＨＡＴ培養液を加えた。この混合物を均一になるまで攪拌し、０．１ｍｌずつを９６穴の培養プレートに注ぎ、３７℃、７％の炭酸ガス雰囲気下で培養した。ＨＡＴ培地を、第１日、第１週、および第２週にそれぞれ０．１ｍｌずつ加え、ＥＬＩＳＡ法により所望の抗体を産生する細胞をスクリーニングした。
０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質およびＧＳＴ蛋白質をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートに別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で洗浄した。これに融合細胞の培養液１００ｍｌを加え、室温にて２時間反応させた。上澄み液を除去し、沈殿を洗浄液で洗浄した。次いで、濃度５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼでラベルしたｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体溶液１００μｌを加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１００μｌずつ加え、混合物を室温にて２０分間反応させた。着色したところで１Ｎの硫酸１００μｌを加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果、ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質にのみ反応しＧＳＴ蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。
培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０６個と９６穴培養プレート中で混合した。混合後、７％ＣＯ２条件下、３７℃で２週間培養した。
培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＣＰＲＢ−１〜５の計５クローンを取得した。
【実施例４】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を検出するモノクローナル抗体の選択
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０６個（ＰＢＳ中）注射した。３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
得られた抗体を含む溶液をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（５ｍｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に吸収させ、３倍量のＰＢＳで洗浄した。次いで、クエン酸緩衝液ｐＨ３で溶出した。抗体画分を回収し、各ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体を取得した。この５株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
モノクローナル抗体の評価にはサンドウィッチ分析法を用いた。作成されたモノクローナル抗体をペルオキシダーゼに結合せしめることにより検出用の抗体として用いた。
酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては市販の抗Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリクローナル抗体（ウサギ）を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートに別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で洗浄した。これに各微生物の培養液に濃度０．３％となる量のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え常温で５分間抽出することにより得られた抗原溶液１００μｌを加え、室温で２時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度５μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体溶液１００μｌを加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１００μｌずつ加え、混合物を室温にて２０分間反応させた。着色したところで１Ｎの硫酸１００μｌを加えて反応を停止した。４５０ｎｍの吸光度を測定した。
酵素標識抗体としてハイブリドーマＣＰＲＢ−１由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ての株を１０６個／ｍｌの感度で検出すると同時に他のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ等の微生物について１０８個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。この抗体はＡＭＣＰ−１と名付けられた。表２はＡＭＣＰ−１を用いた結果のみを示す。別の微生物と交差反応を示す他の抗体を使用した結果はここで言及しない。
0005331284.tif 000003
【実施例５】Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得
実施例１に記載の方法により取得したＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理した菌体の上清を抗原として使用した。１００μｇの抗原を含む生理食塩水約１．２ｍｌをフロイントアジュバント１．５ｍｌとともに乳化した。エマルジョンをＳＰＦ日本白色ウサギに皮下注射してウサギを免疫化した。２週間おきに５〜６回免疫し、抗体価を確認した。
抗体価の確認はＥＬＩＳＡ法により実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートに分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み液を除去後、生成物を洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で洗浄した。正常のウサギ血清および免疫化したウサギの抗血清を希釈して得られた溶液１００μｌを加え、室温にて２時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。次いで、濃度５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液１００μｌを加え、室温にて１時間反応させた。上澄み液を除去し、生成物を再び洗浄液で洗浄した。ＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｌずつ加え、混合物を室温にて２０分間反応させた。着色したところで１Ｎの硫酸１００μｌを加えて反応を停止した。４９２ｎｍの吸光度を測定した。
抗体価上昇を確認後、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、３７℃で１時間放置後、４℃で一晩静置した。その後３０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を回収した。得られた抗血清は４℃で保存した。
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化カラム（１ｍｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いた。カラムを１ｍＭ  ＨＣｌで置換後直ちにＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。カラムを３０分間静置後、ブロッキング試薬を加え、ＰＢＳで平衡化した。
このＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。この抗血清をＰＢＳで５倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを通した後、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．１でカラムから溶出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ９．０で中和した後、抗体価測定法と同様のＥＬＩＳＡ法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。
このようにして得られたポリクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているＯＩＡ法により評価した。
精製した抗体はＯＩＡ法の捕捉抗体として使用した。また検出抗体としては実施例４に記載したＡＭＣＰ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の精製ポリクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄し、サッカロース及びアルカリ処理カゼインを含むコーティング溶液でコーティング後、使用した。
上記操作で得られた各微生物の培養液に濃度０．５％となる量のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え常温で５分間抽出することにより得られた抗原溶液１５μｌを上記シリコンウェハー上に添加し、室温で１０分間反応させた。次いで、２０μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を１５μｌ加え、１０分間反応させた。蒸留水で洗浄後、ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社製）を１５μｌずつ加え、混合物を室温にて５分間反応させた。生成物を蒸留水で洗浄し、酵素反応により生成した青色を肉眼で観察した。
この結果、表３に示すように、精製ポリクローナル抗体ＡＰＣＰ−１を捕捉抗体として用いることにより、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを１０８個／ｍｌの感度で検知できること、および他の微生物の反応性は検知できないことが明らかである。このようにしてＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を固定化したアフィニティカラムにより、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的に反応するポリクローナル抗体を取得したことを確認した。
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産業上の利用可能性
本発明によると微生物の進化の過程で機能的に保持された細胞内分子に対する抗体を用いて特定の種の微生物を特異的に検出できるだけでなく、同一種内における全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。
このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体を用い、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの検出を精度良く行うことができる。
また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行なうことができる。
引用文献：
特許文献
米国特許Ｎｏ．５，００８，１８６、Ｇｒａｙｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９１、急性呼吸器疾患を引き起す特異なＣｈｌａｍｙｄｉａの検出
米国特許Ｎｏ．５，２８１，５１８、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ，１９９４、急性呼吸器疾患を引き起す特異なＣｈｌａｍｙｄｉａの検出
米国特許Ｎｏ．５，３５０，６７３、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．１９９４、急性呼吸器疾患を引き起す特異なＣｈｌａｍｙｄｉａの検出
その他の文献
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ＮＣＢＩデータベース＃ＡＥ００１５９３．１．Ｋａｌｍａｎ，Ｓ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｗ．，Ｍａｒａｔｈｅ，Ｒ，Ｌａｍｍｅｌ，Ｃ．，Ｆａｎ，Ｊ．，Ｏｌｉｎｇｅｒ，Ｌ．，Ｇｒｉｍｗｏｏｄ，Ｊ．，Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．Ｓ．
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【配列表】
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