(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）精製アデノウイルス、
ｂ）７．０〜９．０のｐＨのヒトへの非経口的使用に関して許容される緩衝液群から選ばれる緩衝液、
ｃ）２％〜８％の重量対容量％のスクロース、
ｄ）２５ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、
ｅ）０．１ｍＭ〜５ｍＭの量のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２からなる群から選ばれる二価陽イオン、
ｆ）０．００１％〜２％の範囲の濃度のポリソルベート−８０およびポリソルベート−４０からなる群から選ばれる非イオン性界面活性剤、および
ｇ）０．１％〜５．０％のエタノール、１μＭ〜５００μＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ〜１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、１μＭ〜５００μＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、およびそれらの組合せからなる群から選ばれるフリーラジカル酸化の阻害剤、
を含む、アデノウイルス製剤。
【請求項２】
１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの範囲のアデノウイルス濃度および２００ｍＯｓ／Ｌ〜８００ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度を有する、請求項１に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項３】
前記緩衝液がトリス緩衝液である、請求項１または２に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項４】
前記塩化ナトリウムが５０ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項５】
前記二価陽イオンが、０．５ｍＭ〜２．５ｍＭの量のＭｇＣｌ２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項６】
前記非イオン性界面活性剤が、０．００１％〜１％の範囲の濃度のポリソルベート−８０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項７】
フリーラジカル酸化の阻害剤が、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項８】
１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの範囲のウイルス濃度および２００ｍＯｓ／Ｌ〜８００ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度を有し、
１ｍＭ〜１０ｍＭのトリス、
２％〜８％の重量対容量のスクロース、
２５ｍＭ〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、
０．１ｍＭ〜５ｍＭのＭｇＣｌ２、
０．００１％〜０．２５％の濃度のポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０のいずれか、
１μＭ〜５００μＭのＥＤＴＡ、および
０．１％〜５．０％のエタノール、
を含む、請求項１に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項９】
ヒスチジンを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項１０】
０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のプラスミドＤＮＡを更に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項１１】
１ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを含む、請求項１０に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項１２】
アデノウイルスを含み、
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μｍ  ＤＴＰＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１．０％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、１．０％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む１ｍｇ／ｍｌ  プラスミドＤＮＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  トリエタノールアミン、３０℃でｐＨ７．５；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  トリエタノールアミン、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３０℃でｐＨ７．５；
１５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、ｐＨ７．６；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、ｐＨ８．０；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、１．０％  マンニトール、ｐＨ７．７；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、１％  マンニトール、ｐＨ８．０；および
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０からなる群から選ばれる製剤である、請求項２に記載のアデノウイルス製剤。
【請求項１３】
精製アデノウイルス、７．０〜９．０のｐＨのヒトへの非経口的使用に関して許容される緩衝液群から選ばれる緩衝液、２％〜８％の重量対容量％のスクロース、２５ｍＭ〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１ｍＭ〜５ｍＭの量のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２からなる群から選ばれる二価陽イオン、０．００１％〜２％の範囲の濃度のポリソルベート−８０およびポリソルベート−４０からなる群から選ばれる非イオン性界面活性剤、並びに０．１％〜５．０％のエタノール、１μＭ〜５００μＭのＥＤＴＡ、１ｍＭ〜１００ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１μＭ〜５００μＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）からなる群から選ばれる少なくとも１つのフリーラジカル酸化の阻害剤を含む製剤を製造すること含む、精製アデノウイルスを保存する方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが、１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの範囲の濃度を有し、前記緩衝液がトリス緩衝液である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩化ナトリウムが５０ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
フリーラジカル酸化の阻害剤が、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記製剤がヒスチジンを更に含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルス製剤が、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のプラスミドＤＮＡを更に含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス製剤が、
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μｍ  ＤＴＰＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１．０％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、１．０％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む１ｍｇ／ｍｌ  プラスミドＤＮＡ、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  トリエタノールアミン、３０℃でｐＨ７．５；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  トリエタノールアミン、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３０℃でｐＨ７．５；
１５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、ｐＨ８．０；
５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、ｐＨ７．６；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、ｐＨ８．０；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、１．０％  マンニトール、ｐＨ７．７；
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  トリエタノールアミン、１％  マンニトール、ｐＨ８．０；および
１０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ポリソルベート−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  エタノール、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子治療および／またはワクチン用途に使用するウイルス製剤および関連医薬品に関する。本明細書に記載の特に好ましいウイルス製剤は、約２〜８℃の範囲で保存した場合の安定性の向上を示す一方で非経口投与にも適した液体アデノウイルス製剤である。これらの製剤は、緩衝液、糖、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびにフリーラジカル酸化を抑制するフリーラジカルスカベンジャーおよび／またはキレート化剤を含みうる。本発明に記載の特に好ましい安定化ウイルス製剤は、商業的に許容されうる期間にわたる約２〜８℃の範囲でのアデノウイルス製剤の安定性を増強することが本発明で示された、フリーラジカル酸化を抑制する賦形剤の１つ又はそれらの組合せの含有に基づく製剤である。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝子治療およびワクチン研究の分野において約２℃〜約８℃のような有用な温度範囲でより長期間にわたって安定である液体ウイルス製剤の開発が課題となっている。アデノウイルスベクターは、現在、遺伝子運搬／治療のための主要アプローチの１つと考えられている。遺伝子治療の分野においてアデノウイルスは高い潜在能力を有するため、２〜８℃で１〜２年の貯蔵期間を有するヒトへの非経口投与に適したウイルス製剤が依然として必要とされている。米国軍部はヒト用の生アデノウイルスワクチンを開発しているが、それらは、腸溶性カプセル経口剤形として運搬される凍結乾燥製剤であった（Ｃｈａｎｏｃｋら，１９６６，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９５：１５１−１５８；Ｇｒｉｆｆｉｎら，１９７０，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２５：９８１−９８６；Ｔｏｐら，１９７１，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８−１５４）。これらの初期凍結乾燥製剤中で使用される賦形剤（ゼラチン、脱脂乳、ヒト血清アルブミン）のため、これらの凍結乾燥製剤は、ヒトへの非経口投与にはあまり適しているとはいえない。アデノウイルスの構造および特定に関する報告にもかかわらず、ヒトにおける非経口投与のためのアデノウイルスの安定化および製剤化の開発に関してはほとんど公開されていない。さらに、それらの製剤の研究のほとんどは、水性製剤ではなく凍結乾燥製剤に関するものであり、これは恐らく、安定な液体製剤に対する見込みが幾分乏しいことによるものであろう。
【０００３】
安定性のデータを伴うアデノウイルスの液体製剤については、限られたものではあるが幾つか報告されている。
【０００４】
ＷＯ９９／４１４１６は、グリセロール、リン酸ナトリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）およびスクロース、ＭｇＣｌ２およびポリソルベート８０を含有するウイルス製剤を開示している。報告されている最も安定な製剤は、４℃で１年後に０．５２  ｌｏｇの感染性の減少を示した。
【０００５】
ＷＯ９８／０２５２２は、約０．７５Ｍ〜１．５Ｍの濃度のスクロースを含有するウイルス製剤を開示している。そのような製剤は、ヒトへの非経口的使用には許容されないであろう。
【０００６】
Ｎｙｂｅｒｇ−Ｈｏｆｆｍａｎら（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（８）：９５５−９５６）は、トリス、スクロースおよびＭｇＣｌ２を含有する凍結液体アデノウイルス製剤を開示している。
【０００７】
Ｃｒｏｙｌｅら（１９９８，Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３（３）：３７３−３８３）は、高濃度のスクロース、トレハロースまたはソルビトール／ゼラチンと共にトリスおよびリン酸緩衝溶液を含有する凍結乾燥ウイルス製剤、凍結液体ウイルス製剤および液体ウイルス製剤を開示している。
【０００８】
したがって、２〜８℃で約１〜２年間にわたり安定であり非経口投与に適した組換えウイルス液体製剤の開発が依然として必要とされている。そのような液体製剤は、より低いコスト、開発期間の削減および顧客の使用し易さなどの利点をもたらす。本発明は、２〜８℃の範囲の温度でより長期間にわたる増強された安定性を示す改良された組換えウイルス液体製剤を開示することにより、これらの要求について検討し、それらを満足させるものである。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、遺伝子治療および／またはワクチン用途に使用する安定化されたウイルス製剤および関連医薬品に関する。本明細書に開示する好ましいウイルス製剤は、組換えアデノウイルスを含む液体製剤、約２〜８℃の範囲内およびそれ以上の温度で保存した場合に改善されたウイルス安定性を示すと同時に非経口投与にも適した製剤に関連づけられうる。これらの製剤は、緩衝液、糖、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびに含まれるウイルスの安定性を増強する追加的な成分、例えばフリーラジカルスカベンジャーおよび／またはキレート化剤（これらに限定されるものではない）を含みうる。本発明の、アデノウイルスに基づく製剤は、２年近くの期間にわたる２〜８℃およびそれ以上の温度での長期保存に適している。保存安定性の増強を示す本発明の組換えウイルスには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ロトウイルス、ポックスウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましいウイルスは、ヒトＡｄ５、Ａｄ２、Ａｄ６、Ａｄ２４血清型を含む（これらに限定されるものではない）アデノウイルスであり、特に、ヒトへの遺伝子治療またはヒトへの遺伝子に基づくワクチン接種技術、例えば、遺伝子に基づくそのようなワクチン接種技術を用いる予防的または治療的用途（これらに限定されるものではない）に使用する組換えアデノウイルスである。
【００１０】
本発明の製剤は、（ｉ）最適には、緩衝液溶液であり、さらに、（ｉｉ）最低限度の量の少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、（ｉｉｉ）二価陽イオン、（ｉｖ）凍結保護剤、（ｖ）塩を含み、（ｖｉ）好ましくは、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する１以上の追加的な賦形剤を含む。本発明の製剤は、２〜８℃以上の温度での長期安定性を促進すると同時に該製剤を非経口注射、特に筋肉内注射に有用なものとする有用な範囲の全浸透圧モル濃度に基づく。
【００１１】
この目的において、本発明の第１の実施形態は、該緩衝液としてのトリス、該凍結保護剤としてのスクロース、該塩としてのＮａＣｌ、該二価陽イオンとしてのＭｇＣｌ２、および該界面活性剤としてのポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）−８０またはポリソルベート−４０を含む一連のアデノウイルス製剤（組換えアデノウイルスを含むがこれに限定されるものではない）に関する。
【００１２】
本発明の第２の実施形態は、本明細書に記載のウイルス製剤（この場合もまた、遺伝子治療および／または遺伝子ワクチン接種技術において有用なトランスジーンまたはその一部を含有する組換えアデノウイルスを含むアデノウイルスを含むが、これらに限定されるものではない）の短期および長期安定性を増強することが本発明で示された、金属イオンキレート化剤およびヒドロキシルラジカルスカベンジャーの両方を含むフリーラジカル酸化の阻害剤の１以上の含有に関する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する１以上の成分を含有するウイルス製剤である。これらの成分の添加は、これらの阻害剤を含有しないコア製剤と比較して、２〜８℃以上の範囲の温度における長期安定性を増強することが、本発明で示される。これらの製剤はまた、非経口投与に適している。この目的において、本発明は、ウイルス含有製剤の安定性を有効に増強するフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも１つを含有するウイルス製剤に関する。例示しているアデノウイルスに基づく製剤、例えばＡ１１３は、好ましい製剤を代表するものであるが、これらの製剤は、代替的な製剤成分に基づく追加的な製剤および使用方法に対する限定を何ら示唆するものではない。
【００１３】
本発明の第３の主要実施形態は、本明細書の全体に記載している条件およびウイルス製剤の長期安定性を有効に増強することが示されている有効量のプラスミドＤＮＡを単独で又はフリーラジカル酸化阻害剤と共に含有することを含む。したがって、本発明はまた、添加されるとウイルス含有製剤の安定性を有効に増強する量の核酸を含有するウイルス製剤に関する。
【００１４】
２〜８℃までの範囲での長期安定性の増強は、本明細書に開示するウイルス製剤の貯蔵期間の延長をもたらし、許容されうるウイルス感染性の減少を伴う約１〜２年の期間にわたるこれらの液体製剤の保存および最終的な宿主投与を可能にする。また、本発明の製剤は、延長された凍結／融解サイクルにわたる安定性を示す。
【００１５】
（図面の簡単な記載）
図１は、製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する１サイクルの凍結／融解（−７０℃〜５℃）の効果を示す。
【００１６】
図２は、製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する１〜３サイクルの凍結融解の効果を示す。
【００１７】
図３は、製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの感染性の減少を示す。
【００１８】
図４は、１０８、１０１０および１０１１ｖｐ／ｍＬのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性に対する１２サイクルの凍結／融解の効果を示す。
【００１９】
図５は、凍結、融解および１５℃でのインキュベーションがＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの感染性に与える効果を示す。
【００２０】
図６は、１×１０７ｖｐ／ｍＬおよび１×１０９ｖｐ／ｍＬの製剤Ａ１０２、Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（７２時間）を示す。
【００２１】
図７は、２〜８℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日まで）を示す。
【００２２】
図８は、１５℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【００２３】
図９は、２５℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【００２４】
図１０は、３７℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【００２５】
図１１は、ｐＨ７．４およびｐＨ８．６におけるＡｄ５ｇａｇの不活性化のアレニウスプロットを示す。
【００２６】
図１２は、２〜８℃、１５℃および２５℃におけるＡｄ５ｇａｇの感染性に対するｐＨの効果を示す。
【００２７】
図１３は、１５℃および２５℃におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性（１２ヶ月間まで）に対するｐＨの効果を示す。
【００２８】
図１４は、２〜８℃におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性（１２ヶ月間まで）に対するｐＨの効果を示す。
【００２９】
図１５は、２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＭｇＣｌ２の効果を示す。
【００３０】
図１６は、３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＭｇＣｌ２濃度の効果を示す。
【００３１】
図１７は、２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）の効果を示す。
【００３２】
図１８は、２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）濃度の効果を示す。
【００３３】
図１９は、１ヶ月間にわたる２５℃および３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）濃度の効果を示す。
【００３４】
図２０は、２５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート型（ＰＳ−８０およびＰＳ−４０）の効果を示す。
【００３５】
図２１は、３７℃における安定性に対するウイルス濃度の効果を示す。
【００３６】
図２２は、Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するアスコルビン酸および鉄の効果を示す。
【００３７】
図２３は、２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対する酸化阻害剤の効果を示す。
【００３８】
図２４は、１０７および１０９ｖｐ／ｍＬにおける−７０℃および−１５℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【００３９】
図２５は、１０９ｖｐ／ｍＬおよび１０１１ｖｐ／ｍＬにおける−７０℃でのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【００４０】
図２６は、１０９ｖｐ／ｍＬおよび１０１１ｖｐ／ｍＬにおける−１５℃でのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【００４１】
図２７は、１ヶ月間にわたる２５℃および３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＰＳ−８０およびＥＤＴＡ／エタノールの組合せの効果を示す。
【００４２】
図２８は、製剤Ａ１１３、Ａ１３２、Ａ１３３、Ａ１３４、Ａ１３５、Ａ１３６およびＡ１３７で示された１ヶ月間および２ヶ月間にわたる３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対する種々の酸化阻害剤の効果を示す。
【００４３】
図２９は、２〜８℃での１８ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの長期安定性を示す。
【００４４】
図３０は、２〜８℃での１ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの長期安定性を示す。
【００４５】
図３１は、２〜８℃および１５℃での９ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【００４６】
図３２は、２〜８℃および１５℃での９ヶ月間の保存の後の、ＴｒａｎｓｇｅｎｅおよびＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈにより開示されている製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性と比較した場合の、本発明の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【００４７】
（発明の詳細な記載）
本発明は、個々のウイルス成分を安定化する製剤、好ましくは遺伝子治療および／またはワクチン用途に使用される医薬品に関する。本発明に開示する好ましい安定化ウイルス含有製剤は、約２〜８℃以上の範囲で保存した場合に改善された安定性を示すと同時に非経口投与にも適した液体アデノウイルス製剤である。それぞれのウイルス（例えば、組換えアデノウイルス）を安定化しうるこれらの好ましい製剤は、緩衝液、糖、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、ならびに該添加ウイルスの安定性を増強する追加的な成分、例えば、フリーラジカルスカベンジャーおよび／またはキレート化剤（すなわち、フリーラジカル酸化の阻害剤）（これらに限定されるものではない）を含みうる。−７０℃および−２０℃での長期間にわたる優れたウイルス安定性に加えて、種々の濃度のアデノウイルスを含む製剤は、少なくとも１〜２年間までの期間にわたる２℃〜８℃以上での長期保存に適している。長期保存安定性の増強を示しうるウイルス製剤は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ロトウイルス、ポックスウイルスを含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。好ましいウイルスは、ヒトアデノウイルス、特に、動物において、無視しうる腫瘍増殖を示す又は腫瘍増殖を全く示さない亜群、例えば、亜群Ｃ（Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５およびＡｄ６）、亜群Ｄ（Ａｄ８、Ａｄ９、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ２３、Ａｄ２４、Ａｄ２５、Ａｄ２６、Ａｄ２７、Ａｄ２８、Ａｄ２９、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６、Ａｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４２、Ａｄ４３、Ａｄ４４、Ａｄ４５、Ａｄ４６およびＡｄ４）および亜群Ｅ（Ａｄ４）からの血清型である。包括的なアデノウイルス分類法については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版，Ｃｈ．３０，ｐ．９８０，Ｆｉｅｌｄｓら編，１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎを参照されたい。特に好ましい血清型は、選ばれたＣ血清型Ａｄ５、Ａｄ２およびＡｄ６、ならびに亜群Ｄ血清型Ａｄ２４である。本明細書に記載の指針によれば、当業者は、本明細書に開示する製剤を、例示されていないアデノウイルス血清型および他のウイルスに適合させることが可能である。この目的において、本発明は、別の精製ウイルスを安定化するためのこれらの製剤の使用、およびその組成物に関する。
【００４８】
本発明の製剤は、種々の程度のウイルス濃度においてアデノウイルスに安定性をもたらし、種々の脊椎生物、好ましくは哺乳類、特にヒトに投与することができる。本発明の安定化ウイルス製剤は、好ましくは、組換えアデノウイルスに基づく組成物であり、例えばワクチンとして投与した場合に、未感染個体に予防上の利点をもたらし、および／または、感染個体内のウイルス負荷（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）レベルを減少させて個々の微生物感染（例えば、ＨＩＶ感染）の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらしうる。本発明の好ましい態様は、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ（ウイルス粒子／ミリリットル）〜約１×１０１３ｖｐ／ｍＬの範囲のウイルス濃度を有する本明細書に記載の安定性特性の増強を示す組換えアデノウイルス製剤（すなわち、当業者に利用可能な任意の哺乳類／ヒト遺伝子治療または遺伝子ワクチンに基づく方法の場合のような宿主への投与の後に標的宿主内で発現されるトランスジーンの全部または一部を含有するアデノウイルス）である。より好ましい範囲は、約１×１０９ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１２ｖｐ／ｍＬであり、特に好ましいウイルス濃度は、約１×１０１１ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１２ｖｐ／ｍＬである。本発明の製剤の治療用、予防用または診断用組成物は、それぞれの障害を治療、予防または診断するのに十分な量で個体に投与する。もちろん、ヒトへの投与のための有効量は、個体の状態、体重、性別および年齢のような種々の要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含まれる。ヒト投与対象（レシピエント）に投与される発現可能なＤＮＡの量は、組換えウイルス構築物中で使用する転写および翻訳プロモーターの強度に左右され、そしてワクチンとして使用される場合には、発現された遺伝子産物の免疫原性、およびアデノウイルスのようなウイルスに対する既存免疫のレベルに左右される。本発明の製剤は、最適には、緩衝溶液である。生理的に許容される緩衝液中の本発明のウイルス製剤、好ましくは、約７．０〜約９．０を含む（これらに限定されるものではない）ｐＨ範囲内、好ましくは、約７．５〜約８．５のｐＨ範囲内のトリス（トロメタミン）、ヒスチジン、ホスファート、シトラート、スクシナート、アセタート、グリシンおよびボラートで緩衝化された製剤（これらに限定されるものではない）を提供することは、当業者に公知であろう。本明細書に開示する例示されている製剤においては、トリスが好ましい。
【００４９】
本発明の製剤のもう１つの態様は、容器表面への吸着を減少させ恐らくはウイルスの安定性の増強をもたらすために加えられる少なくとも１つの非イオン性界面活性剤の最小量を含む製剤に関する。本発明の製剤中で使用する非イオン性界面活性剤には、ポリオキシエチレンソルビタン、例えばポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）−８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０（登録商標））、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標））およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））（これらに限定されるものではない）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、例えばＢｒｉｊ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ  ３５（登録商標）（これらに限定されるものではない）、ならびにその他、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン界面活性剤（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）が含まれる。
【００５０】
該添加ウイルス成分を更に安定化する追加的な成分は、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含む（必ずしもこれらに限定されるものではない）二価陽イオンの塩の少なくとも１つの添加を含む。好ましい二価陽イオンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲の濃度のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２である。
【００５１】
大きな温度範囲および長い保存期間にわたるウイルスの安定化に寄与するもう１つの成分は、凍結保護剤、特に、ヒトへの投与に適した濃度の凍結保護剤である。凍結保護剤は、ポリヒドロキシ炭化水素、例えばソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトール、および／または二糖類、例えばスクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースの添加を含む。
【００５２】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤の追加的な成分は、宿主にとって生理的に許容されるイオン強度で存在する塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムを含む（これらに限定されるものではない）塩を含む。該製剤中に塩を含有させる目的は、所望のイオン強度または浸透圧モル濃度を得ることにある。イオン強度への寄与は、緩衝化合物により生成されるイオンから及び非緩衝塩のイオンから生じうる。
【００５３】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤の中心的要素は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する成分の含有に関する。本明細書の全体にわたり示されているとおり、医薬製剤におけるウイルス安定性は、緩衝液のタイプ、塩濃度、ｐＨ、光暴露、保存温度などにより影響されうる。また、フリーラジカル酸化を抑制しうる成分は、本明細書に開示する中心的アデノウイルス製剤の安定性特性を更に増強することが、本発明で示されている。使用されうるフリーラジカル酸化阻害剤には、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、またはそれらの特定の組合せが含まれるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。フリーラジカル酸化の阻害剤はＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組合せ、ＥｔＯＨのみ、またはトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）であることが好ましい。他の成分との組合せが該フリーラジカル酸化阻害剤の有効性を決定しうることが、本発明で示されている。例えば、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組合せは安定性の増強に非常に有効であることが示されており、ＭｇＣｌ２の不存在下のＤＴＰＡ（単独）も安定性を増強する。したがって、当業者は、種々の成分を「混合し調整する」ことが可能であり、いくつかの場合にはスカベンジャーおよびキレート剤が必要であり、一方、他の製剤ではキレート剤のみが必要かもしれない。好ましくは、キレート剤の選択が、スカベンジャーの添加が必要か否かを決定する。追加的なフリーラジカルスカベンジャーおよびキレート剤は当技術分野で公知であり、本明細書に記載の製剤および使用方法に適用される。フリーラジカル酸化のそのような阻害剤の添加は、液体ウイルス製剤の長期安定性における実質的な増強をもたらすことが、本明細書に開示されている。本発明は、本明細書に開示する好ましい製剤のみにおけるこれらの賦形剤の使用に限定されるものではなく、実際には、これらの化合物の１以上の添加による有用な温度範囲内での安定性の増強に適した追加的な例示されていないウイルス製剤も包含する意であることが注目される。
【００５４】
ウイルスの安定性を増強する本発明の製剤は、２〜８℃以上の温度での長期安定性を促進すると同時に該製剤を非経口的（特に筋肉内）注射に有用なものとする全浸透圧モル濃度の有用な範囲に基づく。この目的のための全浸透圧モル濃度（溶液中の分子の総数）の有効範囲は、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌであり、好ましい範囲は約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌである。本明細書に開示する製剤のための特に好ましい浸透圧モル濃度は、約３００ｍＯｓ／Ｌである。したがって、該溶液の全浸透圧モル濃度が適当な範囲内に維持されるためには、スクロースまたはソルビトールのような凍結保護剤の量が製剤中の塩の量に左右されることが明らかである。したがって、塩を含有しない製剤は約５％〜約２５％のスクロースを含有することが可能であり、好ましいスクロース範囲は約７％〜約１５％であり、塩を含有しない製剤中の特に好ましいスクロース濃度は１０％〜１２％である。あるいは、塩を含有しないソルビトールに基づく製剤は、約３％〜約１２％の範囲内のソルビトールを含有することが可能であり、塩を含有しない製剤中では、好ましい範囲は約４％〜７％であり、特に好ましい範囲は約５％〜約６％  ソルビトールである。もちろん、有効な浸透圧モル濃度のレベルを維持するためには、塩を含有しない製剤では、それぞれの凍結保護剤の範囲の増大が保証される。再び限定例ではない具体例としてスクロースおよびソルビトールを挙げると、７５ｍＭ  ＮａＣｌ中のスクロースに基づく溶液の有効な範囲は約２％〜約７．５％  スクロースであり、７５ｍＭ  ＮａＣｌ中のソルビトールに基づく溶液は約１％〜約４％  ソルビトールである。
【００５５】
前記の考察を考慮すると、本発明は、ウイルス安定性特性の増強を示し少なくとも緩衝液、塩、糖および界面活性剤を含有する、遺伝子治療および／または遺伝子ワクチン接種用途に使用するアデノウイルス（例えば、組換えアデノウイルス）を含有する製剤に関する。
【００５６】
本発明の特定の実施形態は、該緩衝液としてのトリス、該凍結保護剤としてのスクロース、該塩としてのＮａＣｌ、該二価陽イオンとしてのＭｇＣｌ２および該界面活性剤としてのポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０を含むそのような組換えアデノウイルス製剤に関する。
【００５７】
本発明の特定の実施形態においては、該製剤はｐＨ約７．５〜ｐＨ約８．５の範囲までトリスで緩衝化され、スクロースが、該塩濃度に応じて１０％（重量対容量）以上の範囲内で添加され、該塩が、全浸透圧モル濃度が約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲となるように該スクロース濃度を相補するためにＮａＣｌ  ２５０ｍＭ以上の範囲内の濃度で添加されるＮａＣｌであり、該二価陽イオンが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約１％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約１％の濃度のポリソルベート−４０である。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ約７．５〜ｐＨ約８．５の範囲まで約１ｍＭ〜約１０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約２％〜約８％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲で存在し、該スクロース濃度およびＮａＣｌ濃度が、全浸透圧モル濃度が約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲となるように相補的であり、該二価陽イオンが約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．２５％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．２５％の濃度のポリソルベート−４０である。
【００５９】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤は約８．０のｐＨまで約２．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約２％〜約８％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲で存在し、該スクロースおよびＮａＣｌが、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−４０である。
【００６０】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤は約８．０のｐＨまで約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約４％〜約６％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲で存在し、該スクロースおよびＮａＣｌが、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−４０である。
【００６１】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約５％（重量対容量）で存在し、ＮａＣｌが約７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が約１ｍＭ〜２ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が約０．０２％の濃度で存在するか又はポリソルベート−４０が約０．００５％の濃度で存在する。
【００６２】
本発明の例示されている１つの態様においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３１０ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、Ａ１０５と称される。
【００６３】
もう１つの具体例は、ＰＳ−８０が０．００５％で存在するＡ１０５とは対照的に、少なくとも０．１％までの有効なＰＳ−８０の範囲を示す。この製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ＭｇＣｌ２が１ｍＭであり、ポリソルベート−８０が０．１％の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、Ａ１１１と称される。
【００６４】
本発明のもう１つの実施形態は、ｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化される製剤により例示され、スクロースが約５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−４０が０．００５％の濃度で存在する。この製剤は、本発明においては、実施例１に示すとおり、Ａ１２８と称される。
【００６５】
さらにもう１つの具体例は、ポリソルベートが、ポリソルベート−４０の有効範囲を示す０．１％の濃度で存在する以外はＡ１２８と同一の製剤である。この製剤は、本発明では、実施例１に示すとおり、Ａ１２９と称される。
【００６６】
本発明は更に、前記成分のうちの少なくとも１つの成分を省いた組換えアデノウイルス製剤に関する。それらには、製剤Ａ１０８（二価陽イオンを含有しない）または製剤Ａ１０９（界面活性剤を含有しない）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
本発明の必須の特性は、非還元性フリーラジカルスカベンジャーおよび／またはキレート剤が、ウイルス製剤、特に本明細書に開示する組換えアデノウイルス製剤の短期保存および長期保存の両方の安定性を最大にするのに重要であるという知見にある。この目的において、そして前記のとおり、本発明の決定的に重要な好ましい実施形態は、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する１以上の成分を含有するウイルス製剤である。これらの成分の添加は、これらの阻害剤を含有しないコア製剤と比較して、２〜８℃の範囲まで又はそれ以上の温度での長期安定性を増強することが、本明細書に示されている。また、これらの製剤は非経口投与に適している。保存中の感染性の喪失をもたらすアデノウイルス不活性化の主要経路は酸化であることが、これらの製剤の安定性の増強から示される。
【００６８】
本発明は、ｐＨ約７．５〜ｐＨ約８．５の範囲までトリスで緩衝化された組換えアデノウイルス製剤に関する。この場合、スクロースが、該塩濃度に応じて１０％（重量対容量）以上の範囲内で添加され、該塩が、全浸透圧モル濃度が約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲となるように該スクロース濃度を相補するためにＮａＣｌ  ２５０ｍＭ以上の範囲内の濃度で添加されるＮａＣｌであり、該二価陽イオンが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約２％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約１％の濃度のポリソルベート−４０である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の１以上の成分、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（必ずしもこれらに限定されるものではない）を含む。
【００６９】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ約７．５〜ｐＨ約８．５の範囲まで約１ｍＭ〜約１０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約２％〜約８％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲で存在し、該スクロース濃度およびＮａＣｌ濃度が、全浸透圧モル濃度が約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲となるように相補的であり、該二価陽イオンが約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．２５％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．５％の濃度のポリソルベート−４０である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の１以上の成分、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（必ずしもこれらに限定されるものではない）を含む。
【００７０】
本発明のもう１つの特定の実施形態においては、該製剤は約８．０のｐＨまで約２．５ｍＭ〜約７．５ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約２％〜約８％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約２５ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲で存在し、該スクロースおよびＮａＣｌが、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．０５％の濃度のポリソルベート−４０である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の１以上の成分、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（必ずしもこれらに限定されるものではない）を含む。
【００７１】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤は約８．０のｐＨまで約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約４％〜約６％（重量対容量）の範囲で存在し、ＮａＣｌが約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲で存在し、該スクロースおよびＮａＣｌが、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約４５０ｍＯｓ／Ｌの範囲の全浸透圧モル濃度に寄与し、該二価陽イオンが約１ｍＭ〜約２ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２であり、該界面活性剤が約０．００１％〜約０．１％の濃度のポリソルベート−８０または約０．００１％〜約０．０１％の濃度のポリソルベート−４０である。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の１以上の成分、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（必ずしもこれらに限定されるものではない）を含む。
【００７２】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが約５％（重量対容量）で存在し、ＮａＣｌが約７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が約１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が約０．０２％の濃度で存在するか又はポリソルベート−４０が約０．００５％の濃度で存在する。この場合、該製剤は更に、フリーラジカル酸化を抑制する本明細書に記載の１以上の成分、例えば、エタノール（ＥｔＯＨ）、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスファート、トリポリホスファート、コハク酸、リンゴ酸、デスフェラル、エチレンジアミン−ジ（ｏ−ヒドロキシ−フェニル酢酸（ＥＤＤＨＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）（必ずしもこれらに限定されるものではない）を含む。
【００７３】
前記製剤においては、少なくとも１つの非還元性フリーラジカルスカベンジャーを、該コア製剤の安定性を有効に増強する濃度まで加えることができる。特に有効な範囲は、（ｉ）約１μＭ〜約５００μＭ、好ましくは約５０μＭ〜約２５０μＭの範囲、特に好ましくは１００μＭまたはその付近の濃度のＥＤＴＡ、（ｉｉ）約０．１％〜約５．０％、好ましくは約０．２５％〜約２．０％の範囲、特に好ましくは全量が０．５％またはその付近のエタノール、（ｉｉｉ）約１μＭ〜約５００μＭ、好ましくは約５０μＭ〜約２５０μＭの範囲、特に好ましくは１００μＭまたはその付近の濃度のＤＴＰＡ、（ｉｖ）約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの範囲、特に好ましくは１ｍＭまたはその付近の濃度のＣａＣｌ２、（ｖ）約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲、特に好ましくは１０ｍＭまたはその付近の濃度のクエン酸ナトリウムを含む。また、フリーラジカル酸化のこれらの阻害剤は種々の組合せで加えることが可能であり、それらは、２つのスカベンジャー（例えば、１１３）、単体（例えば、Ａ１１４）、または二価陽イオンのような別の成分の不存在下の可能な単体スカベンジャー（例えば、Ａ１１６）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
もう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１１３と称される。
【００７５】
もう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３１０ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、トリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）が１ｍＭで存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１１４と称される。
【００７６】
もう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３５０ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、クエン酸ナトリウムが１０ｍＭで存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１１５と称される。
【００７７】
更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＤＴＰＡが１００μＭで存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１１６と称される。
【００７８】
更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＤＴＰＡが１００μＭで存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１１６と称される。
【００７９】
もう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリス−ＨＣｌで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、マンニトールが３％（ｗ／ｖ）で存在する。この製剤は、本発明では、Ａ１２１と称される。
【００８０】
更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、エタノールが０．５％（Ａ１３２）および１．０％（Ａ１３４）の濃度で存在する。これらの２つの製剤は、実施例１に開示されている。
【００８１】
もう１つの実施形態は、ｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約３１０ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１３３と称される。
【００８２】
もう１つの好ましい実施形態は、ｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約５００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが１．０％で存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１３５と称される。
【００８３】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．１％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在する。この製剤は、本発明では、実施例１にも示すとおり、Ａ１３６と称される。
【００８４】
前記のとおり、ＭｇＣｌ２のような好ましい二価陽イオンを異なる二価陽イオンＣａＣｌ２で置換することも本発明の範囲内である。そのような置換は、本明細書に開示する製剤のいずれかに関連づけられうる。そのような置換の一例は製剤Ａ１２０であり、これは、ｐＨ８．０で５．０ｍＭ  トリス−ＨＣｌを含み、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、ＣａＣｌ２が１ｍＭで存在する。製剤Ａ１２０は実施例１に示されている。
【００８５】
本発明は更に、前記の成分のうちの少なくとも１つの成分を省いた組換えアデノウイルス製剤に関する。それらには、製剤Ａ１１６（賦形剤：１００μＭのＤＴＰＡ；二価陽イオンは含有しない）、製剤Ａ１１７（賦形剤：１００μＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＥｔＯＨ；二価陽イオンを含有しない）、製剤Ａ１１８（１．０ｍＭのトリエタノールアミン；二価陽イオンを含有しない）、製剤Ａ１１９（賦形剤：１０ｍＭのクエン酸ナトリウム；二価陽イオンを含有しない）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
本発明は更に、フリーラジカル酸化の阻害剤として作用する前記賦形剤に加えて、プラスミドＤＮＡを約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で更に含む組換えウイルス製剤に関する。プラスミドＤＮＡの添加は、本明細書に例示する組換えアデノウイルスのような組換えウイルス製剤の安定性を有効に増強する。したがって、任意のコア製剤（例えば、フリーラジカル酸化阻害剤のような追加的な賦形剤を含有しないＡ１０５およびＡ１２８）に及びそのような賦形剤を含むコア製剤に、プラスミドＤＮＡを加えることができる。該プラスミドＤＮＡのための好ましい濃度範囲は約０．５ｍｇ／ｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましいプラスミドＤＮＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌである。
【００８７】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリス−ＨＣｌで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、プラスミドＤＮＡが１ｍｇ／ｍｌで存在する。この製剤は、本発明では、Ａ１３７と称される。
【００８８】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、プラスミドＤＮＡが１ｍｇ／ｍｌで存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１３８と称される。
【００８９】
本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該製剤はｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、マンニトールが２．７％（重量対容量）（１４７ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１４９と称される。
【００９０】
もう１つの実施形態は、ｐＨ８．０で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化された製剤を示し、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、ヒスチジンが５ｍＭで存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１５１ａと称される。
【００９１】
本発明のもう１つの実施形態は、３０℃、ｐＨ７．５で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化された製剤を開示し、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が１ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、ヒスチジンが５ｍＭで存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１５１ｂと称される。
【００９２】
本発明のもう１つの実施形態においては、該製剤は３０℃、ｐＨ７．５で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が２ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、ヒスチジンが５ｍＭで存在し、トリエタノールアミンが５ｍＭで存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１５２と称される。
【００９３】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、該製剤は３０℃、ｐＨ７．５で約５．０ｍＭ  トリスで緩衝化され、スクロースが５％（重量対容量）（１４６ｍＭ）で存在し、ＮａＣｌが７５ｍＭで存在し、全浸透圧モル濃度が約４００ｍＯｓ／Ｌであり、ＭｇＣｌ２が２ｍＭで存在し、ポリソルベート−８０が０．００５％の濃度で存在し、ＥＤＴＡが１００μＭで存在し、エタノールが０．５％で存在し、ヒスチジンが５ｍＭで存在し、トリエタノールアミンが５ｍＭで存在し、グリセロールが５％（ｖ／ｖ）で存在する。この製剤は、実施例１に示すとおり、Ａ１５３と称される。
【００９４】
前記のとおり、本発明の化合物を使用する投与計画は、患者のタイプ、アデノウイルスに対する既存免疫のレベル、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機能；および使用するその個々の化合物を含む種々の要因に応じて選択される。通常の技量を有する医師または獣医は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該薬物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、薬物の分布、平衡および消失に関する考慮を含む。
【００９５】
また、本明細書に記載の製剤化された組換えウイルスは、発現されるトランスジーンの免疫原性を増強しうるアジュバントと共に製剤化することができる。多数のこれらのアジュバントが当技術分野で公知であり利用可能であり、それらには、サポニン、モノホスホリルリピドＡ、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとから構成される非イオン性ブロック共重合体、または発現トランスジーンの免疫原性を増強する他の化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の組換えウイルスと共に使用するもう１つのアジュバントとしては、１以上の形態のリン酸アルミニウムに基づくアジュバント（このリン酸アルミニウムに基づくアジュバントは約０．９のモルＰＯ４／Ａｌ比を有する）が挙げられる。更なる無機質に基づくアジュバントを１以上の形態のリン酸カルシウムから得ることが可能である。ＤＮＡワクチンアジュバントとして使用するこれらの無機質に基づく化合物は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２４１４（ＷＯ  ９８／３５５６２）（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
【００９６】
本明細書に記載の組換えウイルス製剤は、当技術分野で公知のいずれかの手段（例えば、腸内および非経口経路）により脊椎動物宿主（好ましくは、哺乳類宿主、特に、ヒト・レシピエント）に投与される。これらの運搬経路は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内運搬、経口運搬、舌下投与、皮下投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与または任意の形態の粒子射撃、例えばバイオロスチック（ｂｉｏｌｏｓｔｉｃ）装置、例えば「遺伝子銃」または入手可能な任意の無針（ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ）注射装置によるものを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載の組換えウイルスのの好ましい運搬方法は、筋肉内注射および無針注射である。特に好ましい方法は筋肉内運搬である。
【００９７】
本明細書に開示する製剤組成物によれば、本発明はまた、本明細書に開示するウイルス含有製剤を作製することを含んでなる、ウイルス製剤を安定化する方法に関する。そのような製剤は、約２〜８℃の範囲およびそれ以上で保存した場合にウイルス安定性の改善をもたらすと同時に、非経口投与、特にヒトへの非経口投与に適している。したがって、これらの定められた方法は、開示されている、特に例示されている本発明のウイルス含有製剤に関する。また、本発明は、得られる製剤が約２〜８℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるようフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも１つを該製剤に加えることを含んでなるウイルス製剤の安定化方法に関する。また、本発明は、得られる製剤が同様に約２〜８℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるよう核酸を該製剤に加えることを含んでなるウイルス製剤の安定化方法に関する。したがって、本発明は、関心のあるウイルス、好ましくは組換えウイルスを本明細書に記載の任意の製剤中に維持することを含んでなるウイルス製剤の安定化方法、特に、得られる製剤が同様に約２〜８℃の範囲およびそれ以上の温度での安定性の改善を示すと同時に非経口投与に適したものとなるよう、該製剤へのフリーラジカル酸化の阻害剤の少なくとも１つの添加および／または核酸の添加により該ウイルスを維持することを含んでなる方法に関する。
【００９８】
以下の実施例は、本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【００９９】
材料
ＦＬ  ＨＩＶ−ｇａｇトランスジーンを含有するアデノウイルス５型（Ａｄ５ｇａｇ）を、これらの実験に使用した。このＡｄ５ＦＬＨＩＶｇａｇ組換えウイルスは、参照により本明細書に組み入れる１９９９年8月１３日付け出願の米国仮特許出願６０／１４８、９８１に詳細に記載されている。該組換えＡｄ５ｇａｇウイルスは、カラムクロマトグラフィーにより精製した。
【０１００】
方法：
１．ＴＣＩＤ５０アデノウイルス感染性アッセイ：
ＴＣＩＤ５０アッセイは、９６ウェルフォーマットにおいてＴＣＩＤ５０端点希釈法を用いてアデノウイルスの感染性を力価測定するための方法である。アデノウイルスに感染した該９６ウェルプレートの各ウェル中の細胞は、テトラゾリウム色素（ＭＴＳ）に基づくウイルス染色法を用いて表示される。ウェル当たりの発色の量は、アデノウイルスの複製の程度を反映する生きた細胞の量と相関づけられる。
【０１０１】
２．ＱＰＡアデノウイルス感染性アッセイ
該ＱＰＡアッセイは、細胞への感染の２４時間後の蓄積アデノウイルスゲノムを定量するためのＱ−ＰＣＲ技術の利用に基づくアデノウイルスの感染性の迅速定量のための方法である。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明を例示するために記載されており、本発明を限定するものではない。
【０１０３】
実施例１
例示されている製剤の番号および成分
製剤番号は、付随する安定性のデータと共に本明細書の特許請求の範囲を支持する例示製剤を表す。
【０１０４】
製剤番号 説明
Ａ１０１      １０ｍＭ  トリス、１０％  グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５。
Ａ１０２      ６ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．２。
Ａ１０３      ６ｍＭ  リン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２。
Ａ１０４      ５ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１０５      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１０６      ５ｍＭ  トリス、１４％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１０７      ５ｍＭ  トリス、８％  ソルビトール（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１０８      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１０９      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０。
Ａ１１０      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１１１      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１１２      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０、１００μｍ  ＤＴＰＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１１３      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１１４      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１．０ｍＭ  ＴＥＯＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１１５      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０。
Ａ１１６      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＤＴＰＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１１７      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１１８      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１．０ｍＭ  ＴＥＯＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１１９      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０。
Ａ１２０      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ８．０。
Ａ１２１      ５ｍＭ  トリス、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３％（ｗ／ｖ）マンニトール、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１２５      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  アスコルビン酸、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１２６      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１２７      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１２８      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−４０、ｐＨ８．０。
Ａ１２９      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−４０、ｐＨ８．０。
Ａ１３０      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１３１      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ｐＨ８．０。
Ａ１３２      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１３３      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１３４      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１．０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１３５      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、１．０％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１３６      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１３７      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む１ｍｇ／ｍｌ  プラスミドＤＮＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１３８      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ＨＩＶ−１  ｇａｇ配列を含む１ｍｇ／ｍｌ  プラスミドＤＮＡ、ｐＨ８．０
Ａ１４９      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７％（ｗ／ｖ）マンニトール、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１５１ａ      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０。
Ａ１５１ｂ      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５。
Ａ１５２      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  ＴＥＯＡ、３０℃でｐＨ７．５。
Ａ１５３      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、５ｍＭ  ＴＥＯＡ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、３０℃でｐＨ７．５。
Ａ１５５      １５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１５９      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７％  マンニトール（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０。
Ａ１６０      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７％  マンニトール（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０。
Ａ１６５      ５ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、５ｍＭ  ヒスチジン、３０℃でｐＨ７．５。
Ａ１６６      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  ＴＥＯＡ、ｐＨ７．６。
Ａ１６７      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  ＴＥＯＡ、ｐＨ８．０。
Ａ１６８      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、７．５ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  ＴＥＯＡ、１．０％  マンニトール、ｐＨ７．７。
Ａ１６９      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  ＴＥＯＡ、１％  マンニトール、ｐＨ８．０。
Ａ１７０      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０。
Ａ１７１      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．１％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１０ｍＭ  ヒスチジン、１ｍＭ  ＴＥＯＡ、１％  マンニトール、ｐＨ８．０。
Ａ１７２      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、ｐＨ８．０。
Ａ１７３      １０ｍＭ  トリス、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  スクロース（ｗ／ｖ）、０．００５％  ＰＳ−８０、１００μＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＥｔＯＨ、１０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ８．０。
【０１０５】
実施例２
ヒトアデノウイルス５の回収および安定性に対する凍結／融解の効果
Ａｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する凍結／融解の効果を、まず、製剤Ａ１０１〜Ａ１０７において、１０７および１０９ｖｐ／ｍＬの両方で調べた。図１は、ＱＰＡアッセイにより測定した、最初の７つの製剤（初期製剤）におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する凍結／融解１サイクル（−７０℃〜５℃）の効果を示す。結果は、凍結保護剤を含有していなかった２つの製剤（Ａ１０３およびＡ１０４）において、Ａｄ５ｇａｇが有意な量の感染性を失った又はガラスバイアルに吸着されたことを示している。該結果はまた、該感染性が、Ａ１０１、Ａ１０２、Ａ１０５〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇ濃度に関して予想されるレベルであることを示したが、このことは、該ガラスバイアルからの回収の、有意な減少が生じなかったことを示唆している。複数の凍結／融解サイクルも調べた。図２のデータは、該初期製剤におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する凍結／融解１〜３サイクルの効果を示している。該結果は、Ａ１０３およびＡ１０４中のＡｄ５ｇａｇに関する感染性における著しい減少または該ガラスバイアルに対する吸着を示し、凍結／融解２〜３サイクル後のＡ１０６およびＡ１０７に関する感染性の若干の減少を示唆した。
【０１０６】
凍結／融解後のＡ１０３およびＡ１０４における感染性の減少を確認し最終容器からのＡｄ５ｇａｇの回収の効率を測定するために、凍結／融解１サイクル後のそれらの最初の製剤におけるＡｄ５ｇａｇに関してＴＣＩＤ５０アッセイを行った。図３に示す結果は、Ａ１０３およびＡ１０４中のＡｄ５ｇａｇでは、感染性／回収における大きな減少を示しているが、その他の製剤中のＡｄ５ｇａｇでは、感染性の有意な減少は観察されなかった。該結果はまた、該ガラス容器またはその他の製剤からの回収可能なＡｄ５ｇａｇの有意な減少を全く示さなかった。なぜなら、ガラスバイアル内に保存しなかったＡｄ５ｇａｇの同じロットのＴＣＩＤ５０アッセイに基づけば、ＶＰ／ＩＵの比は、〜２０の予想範囲内であったからである。
【０１０７】
該初期凍結／融解および安定性データの結果は、Ａｄ５ｇａｇが、Ａ１０５中ではその他の初期製剤中より安定であることを示唆したため、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇで追加的な凍結／融解研究を行った。図４のデータは、１０８、１０１０および１０１１ｖｐ／ｍＬにおけるＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性に対する１２サイクルの凍結／融解の効果を示している。該結果は、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇが、１２サイクルの凍結／融解にわたり並びに４サイクルの凍結／融解およびそれに続く２〜８℃で８．５時間後に安定であったことを示している。
【０１０８】
また、充填前の臨床的バルクの取り扱いを模擬するために、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇの大きなアリコートの凍結および融解の効果を判定するために、凍結／融解の研究を行った。この実験のために、１０８ｖｐ／ｍＬにおけるＡ１０５中の６００ｍＬのＡｄ５ｇａｇを−７０℃で凍結した。ついで該サンプルを２〜８℃で融解し、ＱＰＡにより感染性に関してアッセイした。２〜８℃で５１．５時間の融解後、該アリコートを更に１５℃で２０時間インキュベートして充填操作中の臨床用材料の取り扱いを模擬し、ついで再びアッセイした。図５に示す結果は、該凍結、融解および１５℃でのインキュベーションがＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの感染性に対して有意な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０１０９】
実施例３
短期間安定性に基づくヒトアデノウイルス製剤の評価
該初期安定性研究の１つは、２〜８℃における候補製剤中のＡｄ５ｇａｇの短期間安定性を試験するように設計した。ＧＭＰ臨床供給操作の実施のための安定性基準の１つは、充填操作の全体にわたり安定性を保証することであったため、３ｍＬ  ガラスバイアル中で１０７ｖｐ／ｍＬおよび１０９ｖｐ／ｍＬの両方でＡｄ５ｇａｇを使用し２〜８℃で７２時間の保存の後にＱＰＡによる感染性に関してアッセイして、短期間研究を開始した。図６の結果は、製剤Ａ１０２中のＡｄ５ｇａｇが、試験したその他の製剤中より有意に不安定であることを示している。これらのＱＰＡの結果は、−７０℃の対照と比較した場合の感染性の減少の対数（ｌｏｇ）を測定することにより得た。
【０１１０】
また、Ａ１０２、Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの安定性を、−１５℃で６ヶ月間の保存の後にＱＰＡにより１０７ｖｐ／ｍＬおよび１０９ｖｐ／ｍＬの両方で測定した。該結果は、−７０℃の対照と比較した場合、各濃度で製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中では感染性の減少の対数０．１未満を示したが、Ａ１０２中のＡｄ５ｇａｇでは減少の対数０．２７を示した。−１５℃で６ヶ月の保存（１０９ｖｐ／ｍＬ）の後に行ったＴＣＩＤ５０アッセイでは、製剤Ａ１０２中のＡｄ５ｇａｇは感染性の対数０．６の減少を示したが、製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７では減少の対数は０．１未満であった。Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの安定性を比較するために、追加的な短期間安定性研究を２〜８、１５、２５および３７℃で行った（−７０℃の対照と比較した）。これらの研究は、２〜８、１５および２５℃で１、２、３および４週の時点で１０７ｖｐ／ｍＬのＡｄ５ｇａｇで行った。３７℃での安定性を３、７、１０および１４日の時点で測定した。図７に示す２〜８℃のデータは、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇがＡ１０６またはＡ１０７のいずれにおけるよりも安定であることを示唆した。
【０１１１】
１５、２５および３７℃での安定性データを、それぞれ図８、９および１０に示す。これらの結果は、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇがＡ１０６またはＡ１０７のいずれにおけるよりも有意に安定であることを明らかに示している。
【０１１２】
実施例４
ヒトアデノウイルス５の安定性に対するｐＨの効果
Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するｐＨの効果を幾つかの実験において調べた。１つの実験は、２つの異なるｐＨ値におけるＡｄ５ｇａｇの不活性化のための活性化エネルギーを測定するように設計した。この実験のために、７５ｍＭ  ＮａＣ、５％  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ＰＳ−８０と２０ｍＭ  トリスまたは２０ｍＭ  Ｂｉｓ−トリス−プロパン（緩衝液として）とを含有する緩衝液中でＡｄ５ｇａｇを製剤化した。該トリス緩衝溶液を各温度（３７、３０、２５および１５℃）でｐＨ８．６に調節し、一方、該Ｂｉｓ−トリス−プロパン緩衝製剤をｐＨ７．４に調節した。図１１に示す結果は、ｐＨ７．４およびｐＨ８．６で優勢な異なる不活性化メカニズムが存在したことを示唆している。さらに、該結果は、主要な不活性化経路が１５℃より上および下で異なること、ならびにＡｄ５ｇａｇの安定性のための最適ｐＨが１５℃より上および下で異なることを予備的に示唆している。これらのデータによると、ｐＨ８．６およびｐＨ７．４の不活性化経路の活性化エネルギーは、それぞれ３４および１９ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
【０１１３】
図１１に示すデータは、１５℃未満では、ｐＨ７．４の経路が主要不活性化経路であることを示唆している。したがって、１５℃未満では、ｐＨ８．６の製剤でさえも、ｐＨ７．４の経路に一致した速度で不活性化される可能性があるらしい。１５℃および５℃の両方でのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの不活性化の速度を示すもう１つの実験からのデータが図１１に含まれている。該結果は、Ａ１０５（それは５℃でｐＨ８．６である）中のＡｄ５ｇａｇの不活性化の速度が、１５℃未満で優勢なｐＨ７．４の経路に一致していることを示唆している。これらのデータは、２〜８℃でＡ１０５より安定なＡｄ５ｇａｇ製剤を開発するためには、ｐＨ７．４の不活性化経路の速度を減少させる必要であることが示唆している。
【０１１４】
もう１つの実験においては、２〜８、１５および２５℃で３ヶ月間の保存の後にＡｄ５ｇａｇの安定性に対するｐＨの効果を調べた。図１２に示す結果は、安定性に適したｐＨが１５℃より上下で異なることを示す図１１におけるアレニウスのデータと一致している。２〜８℃では、該最適ｐＨは８．０〜９．０の範囲内にありｐＨ８．５で最高となるらしい。２５℃では、最適な安定性のためのｐＨは７．０〜７．５の範囲内にある。この実験においても、２〜８℃でのｐＨ７．０の製剤に関する感染性の極端な減少が示されている。２〜８℃のサンプルに関する−７０℃の対照も感染性の対数〜２の減少を示した、２〜８℃での保存が感染性の減少の原因であると完全には決められないことが明らかであった。さらに、１５℃で保存したｐＨ７．０の製剤に関する−７０℃の対照も、感染性の減少（対数〜０．３）を示した。感染性の減少は、ｐＨ７．０の製剤が２５℃付近にあった時間中に、７．０より低いｐＨに短時間さらされたことによるものであった可能性があるらしい。これらの製剤はトリスを含有するため、温度と共に比較的大きなｐＨ変化が生じる。したがって、２〜８℃および１５℃での保存用に調製したｐＨ７．０の製剤を、２５℃でそれぞれｐＨ６．５および６．７５に調節した。これらのデータは、Ａｄ５ｇａｇがｐＨ７．０未満では不安定であることを示唆している。
【０１１５】
また、１５℃および２５℃での１２ヶ月間の保存の後、Ａｄ５ｇａｇの長期安定性に対するｐＨの効果を調べた。図１３に示す結果は、図１２に示すデータと一致しており、Ａｄ５ｇａｇの最適な安定性のｐＨが、１５℃では〜ｐＨ７．５であり、２５℃では〜ｐＨ７．０〜７．５であることを示している。
【０１１６】
２〜８℃でのＡｄ５ｇａｇの長期安定性に対するｐＨの効果を図１４に示す。１２ヶ月間の安定性データによれば、Ａｄ５ｇａｇの安定性の最適ｐＨは２〜８℃で８．０〜８．５であることが判明した。
【０１１７】
実施例５
ヒトアデノウイルス５の安定性に対するＭｇＣｌ２の効果
Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するＭｇＣｌ２の効果を２つの実験で調べた。最初の実験では、Ａｄ５ｇａｇの安定性にＭｇＣｌ２が必要であるか否かを判定するために、Ａｄ５ｇａｇの安定性をＡ１０５およびＡ１０８の場合と比較した。図１５に示す結果は、Ａ１０５においては最適なＡｄ５ｇａｇの安定性にＭｇＣｌ２が必要であることを明らかに示している。
【０１１８】
第２の実験では、Ａｄ５ｇａｇの安定性に対する１、２および５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の効果を３０℃で比較した。図１６に示す結果は、最高のＡｄ５ｇａｇの安定性のための最適なＭｇＣｌ２濃度が、このｐＨおよび温度においては２ｍＭであることを示唆している。
【０１１９】
実施例６
ヒトアデノウイルス５の安定性に対するポリソルベートの効果
Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート（ＰＳ−８０）の効果を図１７に示す。広範囲の温度にわたる最適なＡｄ５ｇａｇの安定性のためにはポリソルベートが必要であることが、該データから明らかである。
【０１２０】
Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するＰＳ−８０の濃度の効果を調べるための第１の実験の結果を、前記図１８に示す。該結果は、０．００５％より高いＰＳ−８０の濃度がＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの最適な安定性に必要であることを強く示唆している。
【０１２１】
ＰＳ−８０の効果を調べるためのもう１つの実験においては、該濃度を、前記図１９に示すとおり、０．００５％から０．１５％まで変化させた。２５および３０℃での加速安定性研究からの結果は、０．１％  ＰＳ−８０が最高の安定性のための最適な濃度であることを示唆した。しかし、該最適ＰＳ−８０濃度は、より低温では異なるかもしれない（継続中の研究）。
【０１２２】
Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート型の効果も調べた。前記図２０に示すデータは、ＰＳ−８０またはＰＳ−４０のいずれかを２種類の濃度で含有する製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性の比較を示している。ＰＳ−４０を選択したのは、それが不飽和性を欠き酸化に対してＰＳ−８０より安定だからである。２５℃での結果は、Ａｄ５ｇａｇが、ＰＳ−４０含有製剤においては、同等のＰＳ−８０製剤におけるよりも安定であったことを示している。３０℃での結果は、Ａｄ５ｇａｇが、０．００５％のＰＳ−４０で、より安定であるが、０．１％では、より不安定であることを示した。これらのデータは、ＰＳ−４０が、２５℃以下で、ＰＳ−８０より優れた何らかの安定性上の利点を付与することを示唆している。
【０１２３】
実施例７
Ａ１０５における３７℃での保存安定性に対するアデノウイルスの濃度の効果
Ａｄ５ｇａｇを、Ａ１０５中で１０９および１０１１ｖｐ／ｍＬで製剤化し、３７℃の安定状態で配置した。３、７、１０、１４および２１日後に感染性を測定した。図２１に示す結果は、Ａｄ５ｇａｇの濃度が３７℃での安定性に有意な影響を及ぼさないことを明らかに示している。
【０１２４】
また、図２４〜２６のデータ（後記実施例１０で考察する）は、Ａｄ５ｇａｇの濃度が１０７〜１０１１ｖｐ／ｍＬでの−７０℃および−１５℃での安定性に影響を及ぼさないことを示している。
【０１２５】
実施例８
フリーラジカル酸化の阻害剤によるアデノウイルスの安定性の増強
Ａ１０５に加えたアスコルビン酸および微量のＦｅ＋２およびＦｅ＋３の効果を調べるために、フリーラジカル酸化に対するＡｄ５ｇａｇの感受性を試験するための第１の実験を設計した。アスコルビン酸は、微量金属イオンにより触媒されるフリーラジカル酸化の強力な促進剤であるため、本発明者らは、Ａｄ５ｇａｇがフリーラジカル酸化に感受性であればアスコルビン酸がＡｄ５ｇａｇを迅速に不活性化すると推論した。また、本発明者らは、加えたおよびＦｅ＋３の効果を試験した。なぜなら、それらはまた、フリーラジカル酸化の速度を増加させると予想されうるからである。特にＦｅ＋２は、過酸化水素からのヒドロキシルラジカルの生成の非常に強力な促進剤である。図２２に示す結果は、アスコルビン酸（Ａ１２５中）および鉄の両方により誘発されるフリーラジカル酸化にＡｄ５ｇａｇが非常に感受性であることを明らかに示している。また、これらの結果は、フリーラジカル酸化がＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの不活性化の主要メカニズムでありうると考えられることを示唆した。
【０１２６】
フリーラジカル酸化がＡｄ５ｇａｇの不活性化の主要経路であるか否かを確認するために、フリーラジカル酸化の４つの異なる阻害剤を３つの異なる保存温度で試験した。図２３に示す結果は、各フリーラジカル阻害剤が各保存温度でのＡｄ５ｇａｇの安定性を増強したことを示している。これらの結果は、フリーラジカル酸化が広範囲の温度にわたるＡｄ５ｇａｇの不活性化の主要経路であることを強く示唆している。
【０１２７】
実施例９
Ａｄ５ｇａｇの安定性におけるロット間のばらつきに対する製剤の効果
８つの異なるロットおよび３つの異なる製剤（Ａ１０５、Ａ１１１およびＡ１１３）において、３０℃で１ヶ月間の保存の後、Ａｄ５ｇａｇの安定性を評価した。以下の表１に示すデータは、製剤Ａ１０５およびＡ１１１においては種々のロットからのＡｄ５ｇａｇの安定性に有意なばらつきがあったことを示している。しかし、該データはまた、Ａｄ５ｇａｇの各ロットの安定性が、Ａ１０５またはＡ１１１と比較してＡ１１３においては改善されたこと、および該ばらつきも減少したことを示している。これらのデータは、フリーラジカル酸化の速度のばらつきが、Ａｄ５ｇａｇのロット間で認められる安定性のばらつきの主要原因であることを示唆している。
【０１２８】
【表１】
0005118798.tif 000002
【０１２９】
実施例１０
加速およびリアルタイム安定性データに基づくリード（ｌｅａｄｉｎｇ）ヒトアデノウイルス５製剤
６ヶ月間の安定性データによれば、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇは、−７０℃または−１５℃での保存のための許容しうる凍結液体製剤である（図２４を参照されたい）。さらに、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性は、Ａ１０５においては、その他の初期候補製剤（Ａ１０２〜Ａ１０４、Ａ１０６、Ａ１０７）のいずれの場合よりも高かった。２〜８℃におけるＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの感染性の減少は約０．３７〜０．４４  ｌｏｇ／年であり、このことは、組換えアデノウイルスの安定性における更なる改良が保証されることを示唆している。
【０１３０】
表１は、例示しているアデノウイルス製剤の感染性の減少の推定速度を示す。２〜８℃および１５℃の両方での６ヶ月間の安定性データに基づき、種々の製剤の感染性の減少の速度が示されている。２〜８℃の安定性データは、意図された保存条件で得たが、感染性の減少は非常に小さく、それを正確に測定するのは困難であった。したがって、感染性の減少の速度は、ｐＨ７．４の経路を用いるＡｄ５ｇａｇの不活性化のための活性化エネルギーおよび１５℃の安定性データの外挿からも推定した（最も伝統的な外挿）。ｐＨ７．４の不活性化経路に関するアレニウスプロットの傾きは（図１１を参照されたい）、Ａｄ５ｇａｇが、５℃では１５℃より３．３倍長い貯蔵寿命を有するはずであることを示唆している。
【０１３１】
【表２】
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【０１３２】
実施例１１
ヒトアデノウイルス５の安定性に対するＥＤＴＡ／ＥｔＯＨおよびＰＳ−８０濃度の効果
フリーラジカル酸化が保存中のＡｄ５ｇａｇの不活性化の主要メカニズムであるという観察は、Ａ１０５中のＡｄ５ｇａｇよりはるかに安定な追加的なＡｄ５ｇａｇ製剤の設計の道を開いた。前記のとおり、Ａ１０５ベース中に１００μＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％  エタノールを含有する製剤（Ａ１１３）は、２〜８℃での安定性の増強を示し、本発明の特に好ましい製剤である。
【０１３３】
フリーラジカル酸化阻害剤を欠く１つの製剤だけが、該阻害剤を含有する製剤とほぼ同程度のＡｄ５ｇａｇ安定性をもたらしたことは、注目すべきことである。この製剤（Ａ１１１）は、０．１％  ＰＳ−８０を含有するが、その他の点ではＡ１０５と同じである。これらの結果は、該ポリソルベート型および濃度の最適化も、Ａｄ５ｇａｇ安定性を最高にするのに非常に重要であることを示唆しており、また、ポリソルベートが、該酸化阻害剤とは異なる不活性化経路に影響を及ぼしうることを示唆している。したがって、単一製剤（Ａ１３６）において０．１％  ＰＳ−８０とＥＤＴＡ／ＥｔＯＨとを組合せると、おそらく、２つの異なる不活性化経路が抑制されうるであろう。図２７の結果は、この仮定を確認するためのデータを示している。該結果は、０．１％  ＰＳ−８０およびＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの安定性増強効果が２５℃では付加的であるが、３０℃ではそうではないことを示している。高いポリソルベート濃度は、３０℃以上では、Ａｄ５ｇａｇの安定性にはそれほど有益でない可能性があることが、他の実験のデータから示唆されているため（図２０）、２５℃で得たデータは、２〜８℃での安定性の増強の良好な予測因子となりうる。要約すると、０．１％  ポリソルベートおよびＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの組合せを含有する製剤（Ａ１３６）中のＡｄ５ｇａｇは、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨ（Ａ１１３）または０．１％  ポリソルベート（Ａ１１１）の一方のみを含有する製剤中より安定であった。
【０１３４】
実施例１２
フリーラジカル酸化阻害剤を含有する追加的製剤
図２３および２７に示すとおり、ＥＤＴＡとエタノールとの組合せは、Ａｄ５ｇａｇの安定性を著しく増強することが判明した。図２８のデータは、アデノウイルスの安定性に対する種々の濃度のエタノールの効果ならびにＥＤＴＡ単独およびエタノール単独の効果を示している。該結果は、１００μＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％  エタノールの組合せ（Ａ１１３におけるもの）が、Ａ１０５中のアデノウイルスと比較して、３０℃で２ヶ月後のアデノウイルスの安定性の最大の増強をもたらしたことを示している。該結果はまた、ＥＤＴＡ単独およびエタノール単独のそれぞれがアデノウイルスの安定性を増強することを示した。しかし、該エタノール濃度を０．５％から１％へ増加させると（Ａ１３２をＡ１３４と比較されたい）、この温度でのアデノウイルスの安定性の追加的な増強は何らもたらされなかった。高ＰＳ−８０（０．１％）とＥＤＴＡ／エタノールとの組合せ（Ａ１３６におけるもの）は、３０℃において、０．００５％  ＰＳ−８０の存在下のＥＤＴＡ／エタノール（Ａ１１３におけるもの）とほぼ同程度の安定性の増強をもたらした。しかし、アデノウイルスは、２５℃において、Ａ１３６中ではＡ１１３中より安定であることが判明した。図２７を参照されたい。もう１つの製剤Ａ１３７においては、１ｍｇ／ｍＬ  プラスミドＤＮＡの添加は、Ａ１０５中のアデノウイルスと比較してアデノウイルスの安定性を増強することが判明した。
【０１３５】
実施例１３
選択した製剤におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性
１２個の異なる製剤におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性を図２９に示す。これらのデータは、２〜８℃で１８ヶ月の保存の後のＡｄ５ｇａｇの感染性の減少の対数を示している。これらのデータによれば、Ａ１０５におけるＡｄ５ｇａｇの感染性の減少は０．３３  ｌｏｇ／年であり、これは、図２３からのデータを用いて前記実施例１０で得た推定値に近かった。これらのデータは、フリーラジカル酸化阻害剤の添加（製剤Ａ１１３、Ａ１１４、Ａ１１６〜Ａ１２１）が２〜８℃で保存中のアデノウイルスの安定性を増強することを明らかに示している。この実験では、最も安定な製剤はＡ１１１、Ａ１１３、Ａ１１４、Ａ１１７およびＡ１２０であり、これらは、ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨ、ＤＴＰＡ、ＴＥＯＡおよびマンニトールがフリーラジカル酸化を抑制しうること、およびより高いポリソルベート８０濃度（Ａ１１１における０．１％）の安定化効果を示している。
【０１３６】
もう１つの実験では、２〜８℃で１年間の保存後の１５個の製剤においてＡｄ５ｇａｇの長期安定性を評価した。図３０に示す結果は、最も安定な製剤がＡ１３６（これは、ポリソルベート濃度が０．１％である以外はＡ１１３に類似している）であったことを示している。Ａ１３５中のＡｄ５ｇａｇも、Ａ１０５およびＡ１１３中より安定であることが判明し、このことは、Ａ１１３中のエタノールの最適濃度が１％付近でありうることを示唆している。しかし、該ＱＰＡアッセイのばらつきが〜０．１５  ｌｏｇであるため、その他の被検製剤がＡ１０５より安定なのかどうかは明らかでない。これらのデータはまた、Ａ１１１中のＡｄ５ｇａｇの安定性がＡ１０５中より低いこと示しており、この結果は、図２９および３２のデータと矛盾している。
【０１３７】
第３の長期研究においては、８個の製剤において２〜８℃および１５℃で９ヶ月後にＡｄ５ｇａｇの安定性を調べた。図３１に示す結果は、図２７〜２９に示す結果と一致しており、Ａ１１３中のＡｄ５ｇａｇが、２〜８℃および１５℃ではＡ１０５中より安定であることを示している。この実験の主目的は、フリーラジカル酸化阻害剤の組合せが、Ａ１１３中のＡｄ５ｇａｇと比較してＡｄ５ｇａｇの安定性を改善するか否かを確認することであった。１５℃の安定性データは、この実験における最も安定な製剤がＡ１４９、Ａ１５１ｂ、Ａ１５２およびＡ１５３であることを示しており、マンニトール（Ａ１４９中）、ヒスチジン（Ａ１５１ｂ中）、ヒスチジンおよびＴＥＯＡ（Ａ１５２中）またはヒスチジン、ＴＥＯＡおよびグリセロール（Ａ１５３中）のいずれかとＥＤＴＡ／ＥｔＯＨとの組合せが、Ａ１１３と比較してＡｄ５ｇａｇの安定性を増強しうることを示唆している。時間ゼロ（０）におけるＡｄ５ｇａｇの感染性の研究は、Ａ１４９に関する感染性の減少を示した。このことは、この製剤が凍結／融解サイクルに完全には安定でない可能性があること、および凍結／融解サイクルの全体にわたるその安定性を増強するためにはスクロースまたは幾つかの他の糖を加えるべきであることを示唆している。図２９に示すデータは、この仮定を支持している。なぜなら、製剤Ａ１２１は、３％  マンニトールに加えて５％  スクロースを含有し、−７０℃から２〜８℃までの少なくとも１サイクルの凍結／融解サイクルにわたり安定であったからである。
【０１３８】
実施例１４
第三者のアデノウイルス製剤と比較した場合のリードＡｄ５ｇａｇ製剤の安定性
アデノウイルス製剤が最近、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／０２５２２（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）およびＷＯ  ９９／４１４１６（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）に開示された。本発明の製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性をこれらの製剤と比較するために、後記のとおり、Ａ１０５、Ａ１１１、Ａ１１３、Ａ１３６、ＷＯ  ９８／０２５２２からの１つの製剤（ＴＧ＃２）およびＷＯ  ９９／４１４１６からの５つの製剤（ＳＰ＃１〜ＳＰ＃５）中の１０８ｖｐ／ｍＬのＡｄ５ｇａｇで安定性研究を行った。
【０１３９】
・ＴＧ＃２    １０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１Ｍ  スクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  ポリソルベート−８０、ｐＨ８．５；
・ＳＰ＃１    １．７ｍｇ／ｍｌ  リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、１．７ｍｇ／ｍｌ  トリス、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、０．１５ｍｇ／ｍｌ  ＰＳ−８０、１００ｍｇ／ｍｌ  グリセロール、ｐＨ７．５３；
・ＳＰ＃２    １．７ｍｇ／ｍｌ  リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、１．７ｍｇ／ｍｌ  トリス、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、０．１５ｍｇ／ｍｌ  ＰＳ−８０、１００ｍｇ／ｍｌ  グリセロール、ｐＨ７．３６；
・ＳＰ＃３    １．７ｍｇ／ｍｌ  リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、１．７ｍｇ／ｍｌ  トリス、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、０．１５ｍｇ／ｍｌ  グリセロール、ｐＨ７．６；
・ＳＰ＃４    １．７ｍｇ／ｍｌ  リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、１．７ｍｇ／ｍｌ  トリス、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、１００ｍｇ／ｍｌ  グリセロール、ｐＨ７．３７；
・ＳＰ＃５    １．７ｍｇ／ｍｌ  リン酸ナトリウム一塩基酸二水化物、１．７ｍｇ／ｍｌ  トリス、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２、２０ｍｇ／ｍｌ  スクロース、５．８ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌ、１００ｍｇ／ｍｌ  グリセロール、ｐＨ７．５３。
【０１４０】
図３２は、２〜８℃および１５℃で９ヶ月間の保存の後のデータを示す。これらの結果は、Ａｄ５ｇａｇが、本発明の製剤のそれぞれにおいては、ＴＧ＃２中またはＳＰ＃１もしくはＳＰ＃２中より安定であったことを明らかに示している。１５℃で１ヶ月の保存の後で得たデータは、ＳＰ＃３、ＳＰ＃４およびＳＰ＃５中のＡｄ５ｇａｇが、感染の対数１を超える減少引き起こしたことを示したため、これらの製剤については９ヶ月の時点では調査しなかった。図１８〜２０および２９のデータと一致して、Ａ１１１中のＡｄ５ｇａｇはＡ１０５中より安定であった。同様に図２３、２７〜２９および３１に示すデータと一致して、Ａｄ５ｇａｇはＡ１１３中ではＡ１０５中より安定であった。
【０１４１】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際のところ、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修飾が、前記の説明から当業者に明らかとなろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する１サイクルの凍結／融解（−７０℃〜５℃）の効果を示す。
【図２】  製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの回収／安定性に対する１〜３サイクルの凍結融解の効果を示す。
【図３】  製剤Ａ１０１〜Ａ１０７におけるＡｄ５ｇａｇの感染性の減少を示す。
【図４】  １０８、１０１０および１０１１ｖｐ／ｍＬのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性に対する１２サイクルの凍結／融解の効果を示す。
【図５】  凍結、融解および１５℃でのインキュベーションがＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの感染性に与える効果を示す。
【図６】  １×１０７ｖｐ／ｍＬおよび１×１０９ｖｐ／ｍＬの製剤Ａ１０２、Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（７２時間）を示す。
【図７】  ２〜８℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日まで）を示す。
【図８】  １５℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【図９】  ２５℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【図１０】  ３７℃における製剤Ａ１０５、Ａ１０６およびＡ１０７中のＡｄ５ｇａｇの短期安定性（２８日間まで）を示す。
【図１１】  ｐＨ７．４およびｐＨ８．６におけるＡｄ５ｇａｇの不活性化のアレニウスプロットを示す。
【図１２】  ２〜８℃、１５℃および２５℃におけるＡｄ５ｇａｇの感染性に対するｐＨの効果を示す。
【図１３】  １５℃および２５℃におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性（１２ヶ月間まで）に対するｐＨの効果を示す。
【図１４】  図１４は、２〜８℃におけるＡｄ５ｇａｇの長期安定性（１２ヶ月間まで）に対するｐＨの効果を示す。
【図１５】  ２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＭｇＣｌ２の効果を示す。
【図１６】  ３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＭｇＣｌ２濃度の効果を示す。
【図１７】  ２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）の効果を示す。
【図１８】  ２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）濃度の効果を示す。
【図１９】  １ヶ月間にわたる２５℃および３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）濃度の効果を示す。
【図２０】  ２５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対するポリソルベート型（ＰＳ−８０およびＰＳ−４０）の効果を示す。
【図２１】  ３７℃における安定性に対するウイルス濃度の効果を示す。
【図２２】  Ａｄ５ｇａｇの安定性に対するアスコルビン酸および鉄の効果を示す。
【図２３】  ２〜８℃、１５℃および３０℃におけるＡｄ５ｇａｇの安定性に対する酸化阻害剤の効果を示す。
【図２４】  １０７および１０９ｖｐ／ｍＬにおける−７０℃および−１５℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【図２５】  １０９ｖｐ／ｍＬおよび１０１１ｖｐ／ｍＬにおける−７０℃でのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【図２６】  １０９ｖｐ／ｍＬおよび１０１１ｖｐ／ｍＬにおける−１５℃でのＡ１０５中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【図２７】  １ヶ月間にわたる２５℃および３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対するＰＳ−８０およびＥＤＴＡ／エタノールの組合せの効果を示す。
【図２８】  製剤Ａ１１３、Ａ１３２、Ａ１３３、Ａ１３４、Ａ１３５、Ａ１３６およびＡ１３７で示された１ヶ月間および２ヶ月間にわたる３０℃でのＡｄ５ｇａｇの安定性に対する種々の酸化阻害剤の効果を示す。
【図２９】  ２〜８℃での１８ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの長期安定性を示す。
【図３０】  ２〜８℃での１ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの長期安定性を示す。
【図３１】  ２〜８℃および１５℃での９ヶ月間の保存の後の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【図３２】  ２〜８℃および１５℃での９ヶ月間の保存の後の、ＴｒａｎｓｇｅｎｅおよびＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈにより開示されている製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性と比較した場合の、本発明の選択された製剤中のＡｄ５ｇａｇの安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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