(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チエナマイシン類縁体の生産能を有するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物を、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体を含む培地で培養することを含んでなる、１β−メチルチエナマイシン類縁体の製造方法。
【請求項２】
培養された培地から、１β−メチルチエナマイシン類縁体を単離することを含んでなる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルプロリン、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシン、（３Ｓ，５Ｓ）−３−メチル−１−ピロリン−５−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸−５−セミアルデヒド、または（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチル−５−グルタミルリン酸である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記微生物が、チエナマイシンの生産能を有するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物、ストレプトマイセス  カトレヤ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃａｔｔｌｅｙａ）ＭＡ４２９７株、またはストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ａ２７１株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物がチエナマイシンの生産能を有するストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記微生物がチエナマイシン生産菌ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７８３）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
製造される１β−メチルチエナマイシン類縁体が、１β−メチルチエナマイシン、Ｎ−アセチル−１β−メチルチエナマイシン、またはＮ−アセチルデヒドロ−１β−メチルチエナマイシンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
製造される１β−メチルチエナマイシン類縁体が１β−メチルチエナマイシンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物がチエナマイシン生産菌ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７８３）であり、前記（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつ製造される１β−メチルチエナマイシン類縁体が１β−メチルチエナマイシンである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１１】
ストレプトマイセス  エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７８３）。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、微生物を用いた医薬品または医薬品原料として有用な１β−メチルカルバペネム系化合物の製造法に関し、さらに詳しくはカルバペネム系化合物を生産する微生物を用い、カルバペネム系化合物の１β位炭素原子上にメチル基を供与するような前駆体、すなわち（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体を含む培地で培養し、１β−メチルカルバペネム系化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
背景技術
カルバペネムは、放線菌の生産するチエナマイシンとして初めて発見された抗菌活性物質の総称であり、それは黄色ブドウ球菌を含むグラム陽性菌から緑膿菌を含むグラム陰性菌にわたり、広範囲の菌種に対して強い抗菌力を示すことが知られている。代表的なチエナマイシンの生産菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｔｔｌｅｙａであるが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｎｅｍｉｆａｃｉｅｎｓもまたチエナマイシンを生産することが知られている。この他、Ｎ−アセチルチエナマイシン、Ｎ−アセチルデヒドロチエナマイシン、オリバン酸、エピチエナマイシン、ｃａｒｐｅｔｉｍｙｃｉｎ、ｐｌｕｒａｃｉｄｏｍｙｃｉｎ、または１−ｃａｒｂａｐｅｎ −２−ｅｍ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄなどのさまざまなカルバペネムも微生物により生産される（Expert Opin. Investig. Drugs,11(4)529 (2002)）。
【０００３】
しかし従来より、カルバペネムは化学的、生化学的に不安定であり、また発酵法による生産量が非常に少ないことが知られていた。一方、チエナマイシンの腎デヒドロペプチダーゼ−１（DHP−１）に対する安定性は、カルバペネム骨格の１位にβ位のメチル基を導入することで改善されるとともに（Heterocycles,21.29(1984)）、安定性が向上した１β−メチルチエナマイシンはチエナマイシンと同等以上の抗菌力を有することが報告されている（J. Antibiotics,46.10.1629(1993））。この知見を元に、近年では１β位にメチル基の入ったカルバペネム、すなわち１β−メチルカルバペネム系化合物が抗菌薬として広く用いられるようになった。
【０００４】
１β−メチルカルバペネム系化合物は、培養、発酵等による生産の報告はなく、化学合成によって製造される。１β−メチルチエナマイシンについても合成方法の報告があるのみである（Tetrahedron Lett.,26.5.587(1985)、薬学研究の進歩,2.214(1986)）。しかしながら、１β−メチルカルバペネム系化合物の合成による製造は不斉炭素が多いため、生産性やコスト面での課題が多く、培養、発酵による製造法の開発が強く望まれている。
【０００５】
一方、チエナマイシンの生合成経路は既に解明されており、γ−グルタミルリン酸が初発物質となることが知られている（J. Biol. Chem.,260.4637(1985)）。この生合成経路を改変することにより、１β−メチルチエナマイシンを生物学的に製造する手法の開発が期待されているが、そのような手法は未だ本発明者らが知る限りでは、報告されていない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、今般、１β−メチルカルバペネム系化合物を培養または発酵により、低コストで生産可能であることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００７】
従って、本発明は、微生物の培養により、１β−メチルカルバペネム系化合物を製造する方法の提供をその目的としている。
【０００８】
そして、本発明は、カルバペネム系化合物の生産能を有する微生物を、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体を含む培地で培養することを含んでなる、１β−メチルカルバペネム系化合物の製造方法である。
【発明の具体的説明】
【０００９】
微生物の寄託
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株は、２００７年２月１４日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305‐8566 日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７８３である。
【００１０】
カルバペネム系化合物の生産能を有する微生物
本発明におけるカルバペネム系化合物の生産能を有する微生物は、カルバペネム系化合物を生産する能力を有している微生物であれば特に限定されないが、例えばチエナマイシン類縁体生産菌が挙げられる。チエナマイシン類縁体生産菌として、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の菌株が挙げられ、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株またはその変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃａｔｔｌｅｙａ  ＭＡ４２９７（ＦＥＲＭ  Ｐ−３３０９）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ａ２７１（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９８４）が挙げられ、さらに一層好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株またはその変異体が挙げられる。前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株の変異体の例としては、寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株が挙げられる。
【００１１】
ここで、チエナマイシン類縁体とは、微生物の生産するカルバペネム系化合物のうち、チエナマイシンの６位のヒドロキシエチル基の立体構造と８位のヒドロキシル基の立体構造とが同じである物質を表す。前記チエナマイシン類縁体は、例えばチエナマイシン（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃａｔｔｌｅｙａ  ＭＡ４２９７（ＦＥＲＭ  Ｐ−３３０９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株、またはその変異体により生産される)、Ｎ−アセチルチエナマイシン（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃａｔｔｌｅｙａ  ＭＡ４２９７（ＦＥＲＭ  Ｐ−３３０９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ａ２７１（ＦＥＲＭ  Ｐ−３９８４）により生産される）、Ｎ−アセチルデヒドロチエナマイシン（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｃａｔｔｌｅｙａ  ＭＡ４２９７（ＦＥＲＭ  Ｐ−３３０９）により生産される）が挙げられる。1β−メチルチエナマイシン類縁体とは、前記チエナマイシン類縁体の1β位にメチル基を有する物質を表す。
【００１２】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体
本明細書において、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体とは、カルバペネム系化合物の１β位の炭素原子上にメチル基を供与する物質またはその前駆体であり、例えば（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルプロリン、（２Ｓ，４Ｓ）−５−ヒドロキシロイシン、（３Ｓ，５Ｓ）−３−メチル−１−ピロリン−５−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸−５−セミアルデヒド、または（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチル−５−グルタミルリン酸が挙げられる。好ましくは、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸である。また、前記前駆体は、一般的に知られている代謝系において（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸となり得る物質であることを意味する。
【００１３】
１β−メチルカルバペネム系化合物
本明細書において、１β−メチルカルバペネム系化合物とは、メロペネム、ビアペネム、エルタペネム、ドリペネム、または１β−メチルチエナマイシンあるいはその類縁体などが挙げられ、好ましくは１β−メチルチエナマイシンあるいはその類縁体（例えば、Ｎ−アセチル−１β−メチルチエナマイシン、Ｎ−アセチルデヒドロ−１β−メチルチエナマイシンなどが挙げられる）が挙げられ、さらに好ましくは１β−メチルチエナマイシンが挙げられる。
【００１４】
培養
１β−メチルカルバペネム系化合物は、カルバペネム系化合物の生産能を有する微生物を（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体を含む培地で培養することにより、製造することができる。１β−メチルカルバペネム系化合物を含む培養物はそのまま用いられてもよいが、好ましくは、この１β−メチルカルバペネム系化合物は培養物から単離されて、場合により精製されて用いられる。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、前記（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつ前記カルバペネム系化合物の生産能を有する微生物がチエナマイシン類縁体生産菌、好ましくはチエナマイシンを生産するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、さらに好ましくはチエナマイシン生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株またはその変異体とされる。
【００１６】
本発明のさらに好ましい態様によれば、前記（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつ前記カルバペネム系化合物の生産能を有する微生物がチエナマイシン類縁体生産菌であり、かつ前記１β−メチルカルバペネム系化合物が１β−メチルチエナマイシン類縁体、好ましくは１β−メチルチエナマイシンとされる。
【００１７】
本発明のさらに好ましい態様によれば、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつカルバペネム系化合物の生産能を有する微生物がチエナマイシンを生産するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属であり、かつ前記１β−メチルカルバペネム系化合物が１β−メチルチエナマイシン類縁体、好ましくは１β−メチルチエナマイシンとされる。
【００１８】
本発明のさらに好ましい態様によれば、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつカルバペネム系化合物の生産能を有する微生物がチエナマイシン生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株またはその変異体であり、かつ前記１β−メチルカルバペネム系化合物が１β−メチルチエナマイシン類縁体、好ましくは１β−メチルチエナマイシンとされる。
【００１９】
本発明のさらに好ましい態様によれば、（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体が（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸であり、かつカルバペネム系化合物の生産能を有する微生物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５  Ｐ３−２８株であり、かつ前記１β−メチルカルバペネム系化合物が１β−メチルチエナマイシン類縁体、好ましくは１β−メチルチエナマイシンとされる。
【００２０】
本発明による１β−メチルカルバペネム系化合物の製造法において、微生物の培養は、放線菌の培養に用いられる慣用の成分（例えば、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、金属などの増殖因子成分など）を含む液体培地で、好気的条件での培養法、振盪培養法、電気撹拌培養法、または深部培養法により行うことができる。
【００２１】
前記炭素源としては、グルコース、スクロース、水飴、でんぷん、アルコール、グリセリン、または油脂などが挙げられる。
【００２２】
前記窒素源としては、アミノ酸、アルカリ金属の硝酸塩や亜硝酸塩、ペプチド、ポリペプトンやカザミノ酸などのタンパク分解物、コーンスティープリカー、脱脂大豆、小麦胚芽、酵母エキス、または酵母粉末などが挙げられる。
【００２３】
前記無機塩としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属のリン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、または塩酸塩などが挙げられる。
【００２４】
前記ビタミンとしては、パントテン酸、ニコチン酸、ビオチン、シアノコバラミン、チアミン、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸、または塩化コリンなどが挙げられる。
【００２５】
前記金属としては、前記無機塩の他、鉄、銅、コバルト、マンガン、モリブデン、亜鉛、またはセレンなどが挙げられる。
【００２６】
前記培地のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ４〜８程度である。
【００２７】
前記培養は、それぞれの微生物に応じた慣用されている条件で行うことができる。例えば、微生物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株もしくはその変異株である場合には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．の培養は、例えば培養温度が１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３５℃、培養時間が７２〜２４０時間程度で行うことができる。
【００２８】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体は、培地1Ｌ中に10〜5000mg、好ましくは100〜1000mgを添加することができる。添加する時期は特に限定されないが、好ましくは、培養初日〜培養４日目の間に添加することができる。
【００２９】
本発明によって得られる１β−メチルカルバペネム系化合物の培養物からの採取に当たっては、その性状を利用した慣用された分離手段（例えば、固層抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、または再結晶化法など）を単独でまたは適宜組合せることにより採取することができる。例えば、培養物に含まれる１β−メチルチエナマイシンを陰イオン交換樹脂に吸着させ、水で洗浄した後、適当なイオンを含む水溶液で溶離する。この溶離液を濃縮し、逆相シリカゲルまたはアンバーライトＸＡＤ−２を充填したカラムに供してカラムクロマトグラフィーを行い、１β−メチルチエナマイシンを精製する。さらに、必要に応じて陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、またはゲル濾過担体に供して１β−メチルチエナマイシンを精製してもよい。
【実施例】
【００３０】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。すなわち、１β−メチルチエナマイシンの生産に用いる菌株、添加する（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸類縁体および１β−メチルチエナマイシンの性状に基づき、１β−メチルチエナマイシンの製造法を種々改変することができるが、そのような方法も本発明による製造法に包含される。【００３１】
実施例１
（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸（トロント・リサーチ・ケミカル社製）１００ｍｇを脱イオン水１０ｍＬに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．０に調整した。調整後の溶液は使用するまで−２０℃で保存した。【００３２】
チエナマイシン生産菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５株の変異株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＳＦ２２０５  P３−２８株を、ＴＳＬ培地（２．５％溶性でんぷん、２．０％グルコース、０．７％ポリペプトン、０．６％小麦胚芽、０．４５％酵母エキス、０．３％脱脂大豆粕、０．３％Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ−Ｐｏｗｄｅｒ、および０．３％炭酸カルシウム含有、ｐＨ７．１）中、２８℃で振とう培養した。２日間培養後、うち１ｍＬをＴｈ培地（２．５％グルコース、１．５％コーンスティープリカー、０．５％綿実粕、０．１％酵母エキス、０．００１％塩化コバルト、０．０００５％硫酸亜鉛、および０．３％炭酸カルシウム含有、ｐＨ７．２）５０ｍＬへ移植し、２８℃で振とう培養した。培養途中の２日目に、終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルグルタミン酸溶液を添加し、７日間培養した。【００３３】
得られた培養物４５０ｍＬの遠心沈降上清（３５００ｒｐｍ、１０分間）を１００ｍＬ容量のＤｏｗｅｘ１−Ｘ２カラム (１００−２００ｍｅｓｈ、ＨＣＯ３-フォーム、室町ケミカル) にアプライし、水８００ｍＬおよび飽和炭酸水３００ｍＬでカラムを洗浄した後、飽和炭酸水１００ｍＬで１β−メチルチエナマイシンを溶出した。溶出液は凍結乾燥し、得られた残渣７３ｍｇを１ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解してＨＰＬＣ（カラム：イナートシルＯＤＳ−２、２０×２５０ｍｍ、５μｍ、ジーエルサイエンス社製、温度：室温、検出波長：３０５ｎｍ）に注入した。注入後３０分間、０．５％アセトニトリル−２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を流速７ｍＬ／分で通液し、続いて移動相を５％アセトニトリル−２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に換え、流速７ｍＬ／分で１７．３分後に溶出された成分を集めた。【００３４】
得られた溶出液を減圧下で濃縮し、次に示す条件でＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＮＭＲによる分析を行った。その結果、保持時間および各種スペクトルデータに、Ｓｈｉｈらの方法（J. Antibiotics,46.10.1629(1993）)に従って合成した１β−メチルチエナマイシンの標品と一致するピークが検出され、１β−メチルチエナマイシンが生産されていることを確認した。また、そのピーク高を標品と比較して、１β−メチルチエナマイシンの収量を２８μｇと算出した。【００３５】
ＬＣ／ＭＳ測定条件
ＵＶ検出器：２９９６フォトダイオードアレイ検出器（ウォーターズ社製）
ＭＳ検出器：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ（ウォーターズ社製）
カラム：Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（ウォーターズ社製）
移動相：１０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ水溶液
流速：０．８ｍＬ／分、 保持時間：１４．５分【００３６】
ＬＣ／ＮＭＲ測定条件
ＮＭＲ：ＡＶＡＮＣＥ  ５００（ブルカー・バイオスピン社製）
カラム：イナートシルＯＤＳ−２、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（ジーエルサイエンス社製）
移動相：５％重アセトニトリル−５０ｍＭリン酸重水緩衝液（ｐＨ６．５）
流速：１．０ｍＬ／分、保持時間：１１．２分【００３７】
スペクトルデータ
UV λmax: 313 nm    
ES-MS positive: m/z 287 [M+H]+, 309 [M+Na]+, 325 [M+K]+ 
1H-NMRスペクトル（500 MHz）δ（ppm）： 1.06 (3H, d, J=7.3 Hz), 1.15 (3H, d, J=6.3 Hz), 2.82 (H, ddd, J=5 .7, 8.7, 14.2 Hz), 3.00 (H, ddd, J=5.0, 8.7, 12.8 Hz), 3.09 (H, ddd, J=4.5, 5.0, 14.2 Hz), 3.16 (H, ddd, J=4.5, 5.7, 12.8 Hz), 3.26 (H,qd, J=7.3, 8.3 Hz), 3.31 (H, dd, J=2.3, 6.0 Hz), 4.07 (H, dd, J=2.3, 8.3 Hz), 4.09 (H, qd, J=6.0, 6.3 Hz)