(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チューブ状炭素クラスターに金属アミドを反応させることを含む、チューブ状炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する親水性チューブ状炭素クラスターの製造方法。
【請求項２】
金属アミドがアルカリ金属アミドである、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
チューブ状炭素クラスターの炭素原子に結合したアミノ基を化学修飾することをさらに含む、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性炭素クラスター、炭素クラスター分散物、親水性炭素クラスターの製造方法、および親水性炭素クラスターを用いた固相合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンおよびフラーレン等のナノメートルスケールの微細構造を有する炭素クラスターは、新しい電子材料、触媒、光材料、ナノテクノロジー等への応用が期待されているナノ構造黒鉛（グラファイト）物質である（Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５４，５６、Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３，６０３、Ｓ．Ｉｉｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９９９，３０９，１６５）。例えば、カーボンナノチューブは、その構造によって金属にも半導体にもなることができ、ナノメートルサイズのデバイスを作るための研究が行われている。
しかしながら、医療用途などへの応用を図るためには、炭素クラスターの水に対する分散性の乏しさが問題となる。そこで、水性溶媒への分散化の方法が検討されている。最近では、界面活性剤や水溶性高分子などの溶解補助剤を用いて非共有結合により錯形成させ、水分散溶液を調製する方法などが開発されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２００２，２９７，５９３、Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔ．２００３，２，３３８）。しかしこれらの溶解補助剤は水溶液中で炭素クラスターから解離しやすく、また生体に対する毒性を有するものも多い。また、特開２００５−１０４７６２号公報には、カーボンナノチューブを多糖類のβ−１，３−グルカンと複合体化することによって、安定的に水性溶媒中へ可溶化させる方法が開示され、特開２００５−２８５６０号公報には、ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを用いてカーボンナノチューブを可溶化する方法が開示されている。しかし、これらの手法では多量の溶解補助剤を必要とすることから、炭素クラスターの特性を大きく改変してしまうと考えられる。さらに、特開２００３−０９５６２４号公報には、カルボニル基などの酸素官能基を導入し、さらにその化学修飾を行うことで、親水性カーボンナノホーンを調製する方法が開示されている。しかし、この方法は、カーボンナノホーンを酸化処理するものであり、当該方法ではアミノ基を導入することはできない。
固相合成法は、固体表面に有機化合物を導入し、その上で化学修飾を行う方法である。固相担体のろ別操作により反応試剤・溶媒を分離し、続く担体からの切り出しにより目的化合物の単離を可能とする手法である。化合物を簡便に精製・単離できることから、さまざまな有機化合物の合成に利用されている。現在では、ポリスチレン樹脂やガラス粒子を固相担体として、ペプチドやＤＮＡの合成、また近年では多種の化合物を合成するコンビナトリアル化学で利用されている。
固相合成において汎用される固相担体は、通常マイクロメートルサイズの樹脂粒子（ビーズ）であり、反応は穏やかに振盪することで実施される。固体表面上での反応であることに加え、物理的に弱く、激しい撹拌操作ができないことから、反応効率が低い場合がある。また、固相合成法で得られた反応生成物を解析するためは、担体からの切り出しを行う必要があり、各反応段階での反応の成否の確認が煩雑である。このため最近では，固相担体上での化合物の直接解析法の開発が注目されている。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、炭素クラスターの特性を大きく改変することなく、炭素クラスターを親水性炭素クラスターに変換する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、炭素クラスターに金属アミドを作用させることにより水性溶媒に分散可能な親水性炭素クラスターを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する、親水性炭素クラスター。
（２）アミノ基が無置換アミノ基である、（１）記載の親水性炭素クラスター。
（３）炭素クラスターがチューブ状炭素クラスターである、（１）または（２）記載の親水性炭素クラスター。
（４）炭素クラスターがカーボンナノホーンであり、置換または無置換アミノ基が少なくとも円錐の末端キャップの炭素原子に結合している、（３）記載の親水性炭素クラスター。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターが水性溶媒に分散している、炭素クラスター分散物。
（６）炭素クラスターに金属アミドを反応させることを含む、炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造を有する親水性炭素クラスターの製造方法。
（７）炭素クラスターがチューブ状炭素クラスターである、（６）記載の方法。
（８）金属アミドがアルカリ金属アミドである、（６）または（７）記載の方法。
（９）炭素クラスターの炭素原子に結合したアミノ基を化学修飾することをさらに含む、（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターからなる有機化合物の固相合成に使用するための担体。
（１１）有機化合物の固相合成に使用するための担体であって、
（１）〜（４）のいずれかに記載の親水性炭素クラスターのアミノ基に固相合成用のリンカー分子が共有結合した構造を有する、前記担体。
（１２）（１０）または（１１）に記載の担体を用いて有機化合物を固相合成する方法。
（１３）有機化合物がポリペプチドまたはポリヌクレオチドである、（１２）記載の方法。
本発明により、炭素クラスターの特性を大きく改変することなく、炭素クラスターを親水性炭素クラスターに変換することができる。また、得られた親水性炭素クラスターを固相合成に用いることにより、溶液反応と同様の条件で合成反応および生成物の分析を実施することができる。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００６−０４２８７２号の請求の範囲、明細書および図面に記載された内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、カーボンナノホーン凝集物（ＮＨＡ）から、円錐の末端キャップにアミノ基を有するアミノ化ＮＨＡ２を製造する工程、アミノ化ＮＨＡ２のアミノ基を１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンによりジニトロフェニルアミノ基に変換してアミノ化ＮＨＡ３を製造する工程、およびアミノ化ＮＨＡ２から蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４を製造する工程の概略を示す。
図２は、未処理ＮＨＡ（上）およびアミノ化ＮＨＡ２（下）のＩＲスペクトルを示す。３２００ｃｍ−１付近の幅広いシグナルはアミノ化ＮＨＡ２中のアミノ基の存在を示す。
図３の（Ａ）は、アミノ化ＮＨＡ２のＴＥＭ画像を示す。カーボンナノホーンの円錐形の形状が保持されていることがわかる。スケールバーは２ｎｍを表す。（Ｂ）は、１．０ｍｇ／ｍＬおよび０．２０ｍｇ／ｍＬの濃度のアミノ化ＮＨＡ２の水溶液、ならびに未処理ＮＨＡの写真を示す（左から右へ）。（Ｃ）はアミノ化ＮＨＡ２の水溶液（０．２０ｍｇ／ｍＬ）のＤＬＳデータを示す。（Ｄ）は、マイカ上に析出したアミノ化ＮＨＡ２のＡＦＭ画像を示す。スケールバーは５００ｎｍを表す。
図４は、ＡＦＭによるアミノ化ＮＨＡ２のサイズ分析の結果を示す。
図５の（Ａ）は、濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ２のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。２６０ｎｍの吸収はＮＨＡの黒鉛構造のプラズモン吸収に相当する。（Ｂ）は濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ３のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。挿入図は、アミノ化ＮＨＡ３およびアミノ化ＮＨＡ２の差スペクトルを示す。３５０ｎｍの吸収はジニトロフェニルアミノ基に相当し、ＮＨＡ上のアミノ基の存在を立証するものである。（Ｃ）は、濃度０．０２ｍｇ／ｍＬのアミノ化ＮＨＡ４のＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。挿入図は、アミノ化ＮＨＡ４およびアミノ化ＮＨＡ２の差スペクトルを示す。５００ｎｍの吸収はオレゴングリーン４８８に相当する。
図６の（Ａ）は、セファクリル５００ＨＲ（樹脂体積：１７ｍＬ、検出：２６０ｎｍ）により溶離されたアミノ化ＮＨＡ２（０．２ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍＬ）のクロマトグラムを示す。分画の位置は、左から順に、分画２２：赤、２３：橙、２４：緑および２７：青の色で表される。（Ｂ）は、分画のＤＬＳ分析の代表的データを示す。分画を表す色はＡと同じであり、上から順に、分画２２：赤、２３：橙、２４：緑および２７：青の色で表される。
図７は、アミノ化ＮＨＡ２を溶離した後のカラムの写真を示す。（Ａ）は、セファクリル１００ＨＲを用いた場合、（Ｂ）はセファクリル５００ＨＲを用いた場合、（Ｃ）はセファクリル１０００ＳＦを用いた場合のカラムの写真を示す。アミノ化ＮＨＡ２は、セファクリル５００ＨＲのカラムから溶離したが、他のカラムからは溶離しなかった。
図８は、蛍光染料の存在を示すアミノ化ＮＨＡ４の励起（赤）および発光（青）スペクトルを示す。
図９は、（Ａ）は３Ｔ３細胞とＨｅＬａ細胞を粒子とともに培養したときの生存率を示す。この生存率はＢｒａｄｆｏｒｄ法をもちいて算出した。（Ｂ）は３Ｔ３細胞を培養した時の写真を示す。左の写真はアミノ化ＮＨＡ２が入っておらず、中央と右の写真はそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬの濃度でアミノ化ＮＨＡ２が添加されたものである。
図１０は、実施例１１で合成したＮ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＨＭＰ−ＡＮの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
図１１は、実施例１２で合成したＮ−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＨＭＰ−ＡＮの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明において炭素クラスターとは、炭素−炭素間結合の種類を問わず、通常は数個から数百個の炭素原子が結合または凝集して形成されている集合体をさす。ただし、必ずしも１００％炭素のみで構成されているものに限られず、他原子が混在しているものも包含する。このような場合も含めて、炭素原子が多数を占める集合体を炭素クラスターと称する。炭素クラスターには、球殻状炭素クラスター、例えば、フラーレン、およびチューブ状炭素クラスター、例えば、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンおよびカーボンファイバー、ならびにこれらを化学的に修飾した誘導体およびこれらの凝集物が含まれる。
チューブ状炭素クラスターの１つであるカーボンナノチューブは、２〜数十層のグラファイト状の炭素が積み重なってできた多重のチューブであり、各層の両端がフラーレンのように閉じた構造を有する。カーボンナノチューブとしては、単層のチューブからなる単層カーボンナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）、および２つ以上の層が同心円的に重なっている多層カーボンナノチューブ（ＭＷＣＮＴ）が知られているが、本発明においてはいずれも使用できる。カーボンナノチューブおよびその誘導体は、公知の製造方法で得ることができ、例えば、アーク放電法（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．ｖｏｌ．１６，ｎｏ．１２，２００２，ｐ．１０３５−１０４４）、熱分解法（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ｖｏｌ．１０５，ｎｏ．３５，２００１，ｐ．８２９７−８３０１）、レーザ蒸発法（Ｃａｒｂｏｎ  ｖｏｌ．３３，ｎｏ．７，１９９５，ｐ．９０３−９１４）、気相合成法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｖｏｌ．３０６，ｎｏ．５７００，２００４，ｐ．１３６２−１３６４）などにより得ることができる。カーボンナノチューブの平均繊維長（電子顕微鏡写真の画像解析から求めた長軸長の数平均から求めることができる）は、１０〜１００μｍであることが好ましく、直径は０．８〜２０ｎｍであることが好ましい。
カーボンナノホーンは、カーボンナノチューブのようにチューブ径が一定ではなく、チューブ径が連続的に増加する中空円錐状の、つまり、角（ホーン）状の構造を有する（特開２００１−６４００４号公報）。カーボンナノホーンは、カーボンナノチューブと同様の方法により製造できる。例えば、上記特許公報にも開示されているように、固体状炭素単体物質に対して、不活性ガス雰囲気中で、レーザ光を照射して炭素レーザ蒸発させることにより、球状粒子が集合した構造体として得ることができる。この球状粒子は、単層のカーボンナノチューブの先端が円錐状に閉じたものの集合体であって、ダリヤの花に似た形状を持つものや、つぼみ、たね状のものも存在する。
一実施形態として、カーボンナノホーンの好ましい製造方法について以下に説明する。固体状炭素単体物質に対して、不活性ガス雰囲気中で、レーザ光を照射して炭素レーザ蒸発させ、すす状物質として、球状物質が集合した粉体を得る。炭素レーザ蒸発は、Ａｒ（アルゴン）、Ｈｅ（ヘリウム）等の希ガスをはじめとする反応不活性なガス雰囲気中において、高出力ＣＯ２ガスレーザ光等のレーザ光を固体状炭素単体物質の表面に対して適当な角度で照射して行う。固体物質としての炭素単体物質としては、例えば丸棒状焼結炭素や圧縮成形炭素等を用いることができる。すす状物質は、適当な基板上に堆積して回収することや、ダストバッグによる微粒子回収の方法によって回収することができる。不活性ガスを反応容器内で流通させて、不活性ガスの流れによりこのすす状物質を回収することができる。得られたすす状物質は、カーボンナノホーン構造体が集合して球状粒子を形成し、この球状粒子が多数集合している粒子である。これを単一または複数個が集合した状態の球状粒子とすることができる。この場合には、溶媒として例えばエタノールに懸濁し、超音波撹拌とデカンテーション等を行うこと、また必要により繰り返すことにより、単一の、または複数個の集合状態の上記球状粒子が回収できる。
カーボンナノチューブおよびカーボンナノホーンなどのチューブ状炭素クラスターは、市販のものを使用してもよく、例えば、本荘ケミカル（株）、（株）東京プログレスシステム、（株）サイエンスラボラトリーズ、（株）カーボン・ナノテク・リサーチ・インスティチュート（ＣＮＲＩ）、米・Ｈｙｐｅｒｉｏｎ社などの混合品、精製品が挙げられる。
フラーレンは、炭素原子のネットワークに、グラファイトに見られる６員環のほかに５員環を含む球殻状炭素分子である。例えば、Ｃ３６、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８０、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ８６、Ｃ８４、Ｃ８８、Ｃ９０、Ｃ９２、Ｃ９４、Ｃ９６、および一分子中の炭素数が９６を超え且つ最大凝集塊径が３０ｎｍ以下の高次フラーレン、ならびにこれらの２種以上の混合物が挙げられる。中でもＣ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ８２が好ましく用いられる。これらのフラーレンは、公知の方法によって合成することができる。
例えば、Ｃ３６の製造方法はＮｅｗ  Ｄａｉａｍｏｎｄ．ｖｏｌ．１６，ｎｏ．２，２０００，ｐ．３０−３１に記載されている。Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２、Ｃ８４、Ｃ９０およびＣ９６の製造方法としては、Ｊ．Ｐｈｙ．Ｃｈｅｍ．，９４，８６３４（１９９０）にアーク放電法による製造方法が記載され、また、Ｚ．Ｐｈｙｓ．Ｄ，４０，４１４（１９９７）にオーブン・レーザ法による製造方法がそれぞれ記載されている。また、一分子中の炭素数が９６を超え且つ最大凝集塊径が３０ｎｍ以下の高次フラーレンは、上記したアーク放電法の副成物として得ることができる。
フラーレンの市販品としては、Ｃ６０、Ｃ７０ではフロンティアカーボン（株）製、ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＭＴＲ  ＬＩＭＩＴＥＤ社製のものなどが挙げられ、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８４ではＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＭＴＲ  ＬＩＭＩＴＥＤ社製のものなどが挙げられる。本発明では、炭素数の異なるフラーレンの混合物を用いてもよく、その市販品としては、フロンティアカーボン（株）、（株）サイエンスラボラトリーズ、（株）東京プログレスシステム、ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＭＴＲ  ＬＩＭＩＴＥＤ社製のＣ６０／Ｃ７０の混合物が挙げられる。
炭素クラスターの誘導体には、炭素クラスターを官能基で化学的に修飾したものが含まれる。炭素クラスターを化学的に修飾する官能基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、カルボキシル、ヒドロキシル、エポキシ、オキセンタンなどが挙げられる。炭素クラスターの誘導体には、炭素クラスターを金属元素で化学的に修飾したものも含まれる。炭素クラスターを化学的に修飾する金属元素としては、公知のものを用いることができ、例えば、Ｌｉ、ＮａおよびＫなどのアルカリ金属、Ｂｅ、ＭｇおよびＣａなどのアルカリ土類金属、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎなどの遷移金属が挙げられる。
本発明の親水性炭素クラスターは、上記炭素クラスターを構成する炭素原子に置換または無置換のアミノ基が結合した構造を有する。以下、本発明の親水性炭素クラスターを、アミノ化炭素クラスターと称する場合がある。置換または無置換のアミノ基は−ＮＲ１Ｒ２で表され、ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルから選択される。上記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルは置換されていてもよい。
本明細書において、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシおよびＣ１−６アシルは、それぞれ記載の数の炭素原子を含んでいるアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基およびアシル基を意味し、直鎖状でも分岐状でもよい。
本明細書においてアリールは、５〜２０個の炭素原子、好ましくは６〜１４個の炭素原子、さらに好ましくは６〜１０個の炭素原子を含んでいる芳香族の単環式または多環式炭化水素環基を意味する。アリールの例としては、特に制限されないが、フェニル、ナフチル、インデニル、アズレニル、フルオレニル、アントラセニル、フェナントレニル、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびフェナントリジニルなどを挙げることができる。
本明細書においてヘテロアリールは、芳香族の単環式環基または多環式環基を意味し、ここで、該芳香族の単環式環基または多環式環基は、５〜２０個の炭素原子、好ましくは５〜１０個の炭素原子を含み、その際、１個以上の環炭素、好ましくは、１〜４個の環炭素が、それぞれ、酸素原子、窒素原子または硫黄原子などのヘテロ原子で置き換えられている。好ましいヘテロアリールには、５〜６員の単環式ヘテロアリールおよび８〜１０員の二環式ヘテロアリールが包含される。ヘテロアリールの例としては、特に制限されないが、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、インダゾリル、ピリダジル、ピリジル、ピロリル、ピラゾリル、ピラジニル、キノキサリル、ピリミジニル、ピリダジニル、フリル、チエニル、トリアゾリル、チアゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、オキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキノリニル、イソインドリル、アクリジニルおよびベンゾイソオキサゾリルなどを挙げることができる。
本明細書においてシクロアルキルは、３〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜１２個の炭素原子、さらに好ましくは３〜１０個の炭素原子を有する、単環式または多環式の非芳香族炭化水素環基を意味する。
Ｒ１およびＲ２に関し、上記Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アシル、アリール、ヘテロアリールおよびシクロアルキルにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、メルカプト、シアノ、イソシアナート、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ１−６アルコキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルキルチオ等が挙げられる。
本発明のアミノ化炭素クラスターにおいては、好ましくはＲ１およびＲ２のいずれかが水素原子であり、より好ましくは双方が水素原子である。
炭素クラスターの炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合した構造とは、炭素クラスターを構成する炭素原子に置換または無置換アミノ基が共有結合していることを意味する。
置換または無置換アミノ基は、炭素クラスターにおける反応性の高い部位に優先的に結合していると考えられる。５員環や７員環等の、グラファイト中の６員環とは異質の局所的な結合構造が存在すると、有限の曲率が生まれるために、物質の幾何学的形状が変わるのみならず、新しい電子構造が生じ、反応性や反応速度が大きくなると考えられる。
カーボンナノチューブ表面は通常、６員環のグラファイト構造で覆われているが、この６員環の中に５員環や７員環が混じるとチューブの径が狭くなったり、あるいは広がったりすることが知られている。円錐状のカーボンナノホーンは、ホーンの径が連続的に変化するため、カーボンナノチューブに比べて表面のグラファイト構造が不規則となりやすく、アミノ基を付加しやすい。カーボンナノホーンの円錐の末端キャップ部分も反応性が高いことから、炭素クラスターがカーボンナノホーンである場合、置換または無置換アミノ基は、少なくともカーボンナノホーンの円錐の末端キャップに存在する炭素原子に結合していると考えられる。
本発明の親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基の量は、Ｓａｎｇｅｒの方法（Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌ．Ａ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．４，ｐｐ２５５６−２５５７，１９９５）で測定した場合、通常０．１〜０．３μｍｏｌ／ｍｇ、好ましくは０．２１〜０．２７μｍｏｌ／ｍｇである。これは、炭素クラスターの表面積で通常１００〜５００ｎｍ２、好ましくは２００〜４００ｎｍ２にアミノ基１個の密度に相当する。
本発明者らはまた、親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基がニンヒドリンと反応することを見いだした。従って、親水性炭素クラスターに含まれる置換または無置換アミノ基は、ニンヒドリン呈色反応（Ｍａｄｅｌｅｉｎｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｒａｃｙ，Ｒ．Ｔ．；Ｎｏｒｍａｎ，Ｈ．Ｎ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９９１，４７，８７９１−８８３０）を用いて簡便に定量できる。通常のアミノ酸との反応と同様に、反応の初段階でアミノ基とニンヒドリンとの反応からイミンが生成する。アミノ化炭素クラスターの炭素骨格上にはアミノ基のほかに水素原子またはそこから平衡で生じる負電荷が存在すると考えられている。このためイミン部位をもつ炭素クラスターからは，炭素骨格上の負電荷からの反応によりイミン部位の脱離が進行することが可能となる。この反応により生じた２−イミノ−１，３−インダジオンがもう一分子のニンヒドリンと反応することでｒｕｈｅｍａｎｎ紫が生成する。
具体的には、アミノ化炭素クラスターをエタノール／ピペリジン混合溶媒中、ニンヒドリン水和物、フェノールおよびシアン化カリウムと混合し、反応後、炭素クラスター由来の化合物をメンブランろ紙（細孔径０．２μｍ）により除去すると、紫色の溶液が得られる。この溶液の紫外可視スペクトルにおける５７０ｎｍの吸収の値からアミノ基を定量することができる。
本発明において親水性とは、本発明のアミノ化炭素クラスターが、水性溶媒に分散または溶解可能であることを意味する。本発明の親水性炭素クラスターは、１ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水に分散させることができる。
本発明の親水性炭素クラスターは、親水性であるという性質を除き、置換または無置換アミノ基を導入する前の炭素クラスターの性質、例えば、三次元構造、凝集構造、機能等を維持している。
本発明の親水性炭素クラスターを水性溶媒に分散させることにより、炭素クラスター分散物が得られる。超音波処理を行うことにより、より効率的に分散させることができる。炭素クラスター分散物は、水性溶媒中に炭素クラスターが均一に分散しているものであればよく、炭素クラスターの水性溶液も包含される。本発明の炭素クラスター分散物は、通常０．００１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度、好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で炭素クラスターを含有する。水性溶媒は水を主成分とする溶媒であれば制限されず、水を通常５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上含有する。水性溶媒は、水に加えて、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等を含んでいてもよい。
本発明の炭素クラスター分散物は、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定した場合、通常、平均粒径１０〜５０００ｎｍ、好ましくは１００〜３００ｎｍ、より好ましくは１２０〜２５０ｎｍの粒子を含有する。また、粒子は好ましくは球状の形を有する。本発明の炭素クラスター分散物は、粒子のサイズ分布が小さいという点で有利である。従って、標準粒子として好適に使用できる。粒径分布の範囲は、通常５０〜５００ｎｍ、好ましくは９０〜１６０ｎｍである。
本発明はまた、親水性炭素クラスターの製造方法に関する。本発明者らは、炭素クラスターに金属アミドを反応させることにより、炭素原子に置換または無置換アミノ基が結合してなる親水性炭素クラスターを製造できることを見出した。炭素クラスターと金属アミドは、通常、溶媒中で混合して反応させる。
金属アミドは、ＮＨ−イオンの塩と考えることができ、好ましくはアルカリ金属アミドおよびアルカリ土類金属アミドを用いる。金属アミドは、ＭＮＲ１Ｒ２またはＭ（ＮＲ１Ｒ２）２で表される。ここで、Ｒ１およびＲ２は上記のとおりであり、好ましくは水素原子である。Ｍは、金属、好ましくはアルカリ金属（例えば、Ｌｉ、ＮａまたはＫ）またはアルカリ土類金属（例えば、Ｂｅ、ＭｇまたはＣａ）を表す。アルカリ金属アミドとしては、好ましくは、ナトリウムアミド（ＮａＮＨ２）、カリウムアミド（ＫＮＨ２）、リチウムアミド（ＬｉＮＨ２）およびリチウムジエチルアミド（（Ｃ２Ｈ５）２ＮＬｉ）などが挙げられる。アルカリ土類金属アミドとしては、好ましくは、マグネシウムアミド（Ｍｇ（ＮＨ２）２）およびカルシウムアミド（Ｃａ（ＮＨ２）２）などが挙げられる。好ましくは、ナトリウムアミドを用いる。
反応溶媒は、炭素クラスターを分散可能なものであれば特に制限されないが、例えば、液体アンモニア、クロロベンゼン、ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどが使用できる。沸点が低く反応後容易に除去できることから、液体アンモニアを溶媒として用いるのが好ましい。反応温度は、溶媒の沸点以下の温度であれば特に制限されないが、通常−７８〜１８０℃である。反応時間は、通常１〜６時間、好ましくは３〜４時間である。大量合成の場合は、通常３〜９時間、より好ましくは５〜７時間である。炭素クラスターと金属アミドとの混合比は、特に制限されないが、炭素クラスター１ｇに対し、金属アミドを、通常１〜５ｇ、より好ましくは１〜３ｇ加える。大量合成する場合は、炭素クラスター１ｇに対し、金属アミドを、通常２〜６ｇ、より好ましくは２〜５ｇ加える。得られた粗生成物は、当技術分野で通常用いられる方法により精製できる。
上記方法により得られたアミノ化炭素クラスターは、結合したアミノ基をさらに化学修飾することができる。そのようなアミノ基の化学修飾としては、アミド化、アルキル化、アリール化、アジ化、ジアゾ化などが挙げられる。
本発明のアミノ化炭素クラスターは、有機化合物の固相合成における固相担体に利用することができる。本発明の固相合成用担体は、好ましくは本発明のアミノ化炭素クラスターのアミノ基に固相合成用のリンカー分子が共有結合した構造を有する。本発明の固相合成用担体は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの合成において行われるように、例えば、合成する有機化合物の構造単位を連続的に添加する固相合成において出発点として用いることが可能である。
本発明の固相合成用担体は、有機化合物として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを固相合成するために好適に用いられる。また、コンビナトリアルケミストリーにおいて好適に用いられる。固相合成においては、合成する有機化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの構造単位、例えばアミノ酸、ヌクレオシドおよびこれらの誘導体が連続的に結合される。
本明細書においてポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合を形成してできる化合物をさし、オリゴペプチドも包含される。ここでアミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基の両方をもつ有機化合物であれば特に制限されないが、好ましくはα−アミノ酸である。ポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも包含され、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）およびその誘導体が包含される。核酸誘導体には、当技術分野で公知のものが包含され、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型、メチルホスホノチオエート型、フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、多環式糖骨格型、ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型および環拡張修飾塩基型の核酸、ＰＮＡ、ＰＲＮＡなど（ゲノムケミストリー、関根光雄・齋藤烈編、講談社サイエンティフィク、２００３年；Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ著，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４年；ＷＯ  ９２／２０７０２；ＷＯ  ０１／９６３５５；ＷＯ  ０１／９６３５６など）が挙げられる。
リンカー分子は、リンカーを形成するために共有結合を介して炭素クラスターに結合されうる分子を意味する。リンカー分子は炭素クラスターに結合される前の化学種をさし、リンカーは炭素クラスターに結合された後の化学種をさす。リンカー分子は、炭素クラスター上のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基またはその保護形態および有機分子を結合することが可能な反応性基またはその保護形態を含む。リンカー分子は、通常、炭素クラスター上のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基と有機分子を結合することが可能な反応性基とが二価の有機基で接続された構造を有する。
炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、カルボキシル基、ヒドロキシル基、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イミダゾール基、イソチオシアネート基、イソシアネート基などが挙げられる。
合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基は、結合する有機分子の種類により適宜決定される。有機化合物としてポリペプチドを合成する場合であって、その構造単位であるアミノ酸またはその保護形態（例えば、カルボキシル基またはアミノ基を保護したもの）をリンカーに結合する場合は、アミノ酸のカルボキシル基またはアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基が好ましい。アミノ酸のカルボキシル基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）などが挙げられる。アミノ酸のアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基としては、カルボキシル基、活性エステル基、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基、イミダゾール基、イソチオシアネート基、イソシアネート基などが挙げられる。有機化合物としてポリヌクレオチドを合成する場合であって、その構造単位であるヌクレオシドまたはその保護形態（例えば、塩基のアミノ基を保護したもの）をリンカーに結合する場合は、ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基と共有結合を形成する反応性基が好ましい。ヒドロキシル基と共有結合を形成しうる反応性基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素およびヨウ素）、エポキシ基、アルデヒド基、カルボジイミド基などが挙げられる。
当業者であれば適当な保護基を選択することにより反応性基を保護形態とすることができる。各反応性基の保護基については、例えば、例えば、ハリソン・アンド・ハリソン（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ）著、「有機合成法概論」（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ），１２４−１３１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ出版，１９７１を参照されたい。こうした保護基はリンカー上での反応中に除去される。
リンカー分子の２つの反応性基またはその保護形態を結合する二価の有機基は、目的の固相合成反応を妨げないものであれば特に制限されない。有機基は、例えば、二価の脂肪族基、二価の環式基、または脂肪族基と環式基の組み合わせである二価の炭化水素基（酸素、窒素、硫黄および珪素などを含んでいてもよい）である。脂肪族基には、アルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が包含される。環式基には、脂環式基、芳香族基およびヘテロ環式基が包含される。ここで脂環式基は、脂肪族基の特性に似た特性を有する環式炭化水素基をさし、芳香族基は、一核芳香族炭化水素基または多核芳香族炭化水素基をさし、ヘテロ環式基は、環中の原子の一個以上が炭素以外の元素（酸素、窒素、硫黄および珪素など）で置換された環式炭化水素基を意味する。
リンカー分子における二価の有機基は、好ましくは芳香環を含むものである。芳香環を含むことにより、固相合成後の有機化合物の担体から切り離しが容易になる。芳香環としては、ベンゼン環、フェナントレン環、フルオレン環、ナフタレン環、アントラセン環またはピレン環などが挙げられる。
リンカー分子は、炭素クラスターに結合されると、合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基またはその保護形態を有するリンカーとなる。
好ましいリンカー分子として、以下の式Ｉ：
Ｘ−Ｒ１−Ａ−Ｒ２−Ｙ    （Ｉ）
［式中、
Ｘは、炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成しうる反応性基またはその保護形態であり、好ましくはハロゲン、より好ましくはフッ素である。
Ｒ１は、直接結合または置換もしくは無置換の二価の脂肪族基、好ましくは置換もしくは無置換のＣ１−６アルキレンまたはＣ２−６アルケニレンであり、
Ａは、置換または無置換の芳香環、好ましくは置換または無置換のフェニレン基であり、好ましくは１，４−フェニレン基であり、
Ｒ２は、直接結合または置換もしくは無置換の二価の脂肪族基、好ましくは置換もしくは無置換のＣ１−６アルキレンまたはＣ２−６アルケニレンであり、
Ｙは、合成する有機化合物の構造単位を結合することが可能な反応性基であり、ポリペプチドを合成する場合は、好ましくはヒドロキシル基またはその保護形態であり、ポリヌクレオチドを合成する場合は、好ましくはカルボキシル基またはその保護形態である］
で表される分子が挙げられる。ヒドロキシル基の保護基としては、アセチル基、ベンジル基、シリル基、テトラヒドロピレニル基、メチル基、モノメトキシメチル基などが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、エステル、酸ハロゲン化物、酸無水物などのカルボン酸誘導体を形成し得る基が挙げられる。エステルを形成し得る基としては、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基などが挙げられる。具体的には、ベンジルオキシ基、ｔ−ブトキシ基などが挙げられる。
Ｒ１、ＡおよびＲ２における置換基としては、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選ばれるハロゲン、ヒドロキシル基、置換または無置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、置換または無置換のＣ１−１０アルキル基、置換または無置換のＣ２−１０アルケニル基、置換または無置換のＣ５−１０シクロアルキル基、置換または無置換のＣ１−１０アルコキシ基、置換または無置換のアルコキシカルボニル基またはカルボキシル基等を挙げることができる。
Ａで表される芳香環、好ましくはフェニレン基は、電子吸引性の置換基を有することが好ましい。電子吸引性の置換基としては、例えば、ニトロ基、ニトロソ基、カルボニル基、カルボキシル基、シアノ基、トリアルキルアンモニウム基、トリフルオロメチル基などが挙げられる。
また、リンカー分子として、固相合成において一般に用いられるベンジルアルコール官能基を与えるものを用いてもよい（例えば、Ｗａｎｇら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９５，１３２８（１９７３）およびＲｉｎｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８，３７８７（１９８７））。
リンカー分子の具体例としては、さらに、２−（４−フルオロ−２−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピラン、ポリエチレンオキシドをもつフルオロニトロベンゼン、コハク酸無水物などが挙げられる。
式（Ｉ）のリンカー分子が、アミノ化炭素クラスターのアミノ基と共有結合を形成すると、以下の式（ＩＩ）
−ＮＨ−Ｒ１−Ａ−Ｒ２−Ｙ    （ＩＩ）
［式中、−ＮＨ−は炭素クラスターの炭素に結合し、Ｒ１、Ａ、Ｒ２およびＹは、式Ｉについて定義したとおりである］
で表されるリンカーが結合してなる固相合成用担体が得られる。固相合成を実施する前は、反応性基Ｙは通常保護された形態である。
固相合成における副反応を防ぐため、本発明のアミノ化炭素クラスターにリンカー分子を反応させた後、炭素クラスター上に残存する遊離のアミノ基は保護（キャッピング）することが好ましい。アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、例えば、アシル基、カルバメート基、トリアルキルシリル基、フタリル基、カルボキシアルキルカルボニル基、トシル基、トリフルオロアセチル基、トリチル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｎｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル）基およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基およびモノまたはジ置換トリチル基が挙げられる。
本発明の有機化合物の固相合成法は、本発明の固相合成用担体を出発点として、合成する有機化合物の構造単位を順次反応させて結合させることを含む。
有機化合物としてポリペプチドを固相合成する場合の一実施形態を以下に説明する。まず、リンカーの反応性基（例えばヒドロキシル基またはアミノ基）が保護されている場合はそれを脱保護し、第一アミノ酸のカルボキシル基と共有結合させる。通常、アミノ酸のアミノ基は、Ｆｍｏｃ基などの保護基で保護されている。第一アミノ酸を結合した後、所望のポリペプチドを体系的に合成する。この合成は、脱保護と結合を繰り返し行うことにより実施する。最後に結合されたアミノ酸上の保護基は、Ｎ末端アミノ基を遊離させるために、適当な処理によって、例えば、Ｂｏｃ基の場合にはトリフルオロ酢酸を用いるような酸加水分解によって、またはＦｍｏｃ基の場合にはピペリジンを用いるような塩基処理によって、定量的に除去する。最後に結合されたアミノ酸のＮ末端と次に結合するアミノ酸のＣ末端との結合は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｓｈｅｅｈａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５５，７７，１０６７）またはその誘導体、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵなどの縮合試薬によって実施できる。
本発明の固相合成用担体に結合しているポリペプチドとアミノ酸との縮合反応は、カイザーテストによって確認できる。カイザーテストは、ａ）５％ニンヒドリンのエタノール溶液、ｂ）８０％フェノールのエタノール溶液、ｃ）０．２ｍＭシアン化カリのピリジン溶液を各々５滴ずつ加え、沸騰水中で５分間加熱することによって実施する。この操作で溶液が青色の場合は縮合反応を続行し、溶液が黄色になればアミノ基を脱保護して次のアミノ酸との縮合反応を行う。このサイクルを必要な回数繰り返すことにより、目的とする配列を有し、かつ所望の長さのポリペプチドを得ることができる。
ポリペプチドの最後の脱保護および担体からの切り離しは、無水ＨＦ（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９６５，３８，４９２１）などの強酸、トリフルオロ酢酸、トリス（トリフルオロ酢酸）ホウ素（Ｐｌｅｓｓら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９７３，４６，１６０９）、トリフルオロメタンスルホン酸およびメタンスルホン酸などのスルホン酸（Ｙａｊｉｍａら，Ｊ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１９７４，１０７）、ならびに前記化合物とクレゾールの混合溶液を使用して行うことができる。
ポリヌクレオチドを固相合成する方法は当技術分野で周知であり、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、トリエステル法などの手法を利用することができる。固相合成の出発点として、アミノ化炭素クラスターにリンカー分子が共有結合してなる担体を用いることを除き、公知の手法に従って固相合成を実施すればよい。
ポリヌクレオチドを固相合成する場合の一実施形態としてホスホロアミダイト法による合成方法について以下に説明する。まず、種々の官能基を保護したヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトと、リンカーを介して炭素クラスターに結合されたヌクレオシドを縮合させて、ヌクレオシドホスファイトトリエステル体を得る。次に未反応の５’−水酸基を保護した後、酸化してヌクレオシドホスフェートトリエステル体を得る。次いで、鎖伸長生成物の５’−水酸基の保護基を除去し、５’−水酸基保護体とする。以下、同様にして目的とする長さにヌクレオチド鎖を伸長した後、すべての保護基の除去および生成したポリヌクレオチドの担体からの切り離しを行う。核酸塩基部の保護基としてはベンゾイル基やイソブチリル基のようなアシル基を使用でき、インターヌクレオチド部の保護基としては２−シアノエチル基を使用できる。
アミノ化炭素クラスターは、汎用の固相担体と異なり物理的に強く、激しい撹拌操作が可能であることから、高い反応効率で固相合成反応を実施できる。さらに本発明者らは、溶媒への分散性の良いアミノ化炭素クラスターを固相合成用担体に利用することで、既存の樹脂製担体では実現不可能な分析が可能であることを見いだした。通常の樹脂製固相担体は、数百マイクロメートルの大きさであることから溶媒中に分散して自由運動することはない。このため、担体上の有機化合物を直接検出することは困難である。これまでに，担体上のリンカー部位に柔軟なＰＥＯ鎖を導入することで担持された部位の運動性を確保し、ＮＭＲで検出する手法などが開発されているが、固体ＮＭＲを利用するものであり、その感度・分解能は溶液スペクトルとは比較にならない。本発明のアミノ化炭素クラスターは、溶液中に単粒子分散し巨大な分子として振る舞うことから、小分子の自由運動に近い運動性をもつことが推測される。本発明者らは、溶液１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより本発明の固相合成用担体上のアミノ酸部位が検出・同定できることを見いだした。これまで固相合成法で得られた反応生成物を解析するためは担体からの切り出しを行う必要があり、各反応段階での反応の成否の確認が煩雑であったが、本発明のアミノ化炭素クラスターを用いることにより反応生成物の切り出しを行うことなく各反応段階での反応の成否の確認を担体上で実施することが可能になる。
【実施例】
【０００６】
実施例１  親水性アミノ化ＮＨＡ２の合成
カーボンナノホーン凝集物（ＮＨＡ）（２００ｍｇ）およびナトリウムアミド（２００ｍｇ）の液体アンモニア（３２０ｍＬ）中の混合物を、ドライアイス冷却器を付けたフラスコ中で３時間還流した（−３３℃）。アンモニアを除去すると黒色の固体が得られた。粗物質をさらに飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）により洗浄し、濾過し、２５℃、０．２ｍｍＨｇで１２時間乾燥して、アミノ化ＮＨＡ２（２０５ｍｇ）の黒色の固体を得た（図１）。ＮＨＡは吸収性が高いので、アミノ化ＮＨＡ２の正確な重量を算出するのは困難であった。反応は、１．００ｇのＮＨＡの量まで容易にスケールアップすることができ、１．０３ｇのアミノ化ＮＨＡ２が得られた。
減衰全反射（ＡＴＲ）装置を付けたＡＳＩ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＲＥＡＣＴ  ＩＲ１０００により、未処理ＮＨＡおよびアミノ化ＮＨＡ２のＩＲスペクトルを得た（図２）。ＩＲスペクトルは、３２２０ｃｍ−１に幅広い吸収を有し、これはＮＨＡ上にアミノ基が存在することを示している。
また、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；ＪＥＭ２１００Ｆ，ＪＥＯＬ）を用いてアミノ化ＮＨＡ２の構造を分析した（図３Ａ）。ＴＥＭによる分析により、カーボンナノホーンの円錐形の構造ならびにその凝集した構造が反応の前後で同じように存在していることが示された。
実施例２  アミノ化ＮＨＡ２の分散液の調製および解析
アミノ化ＮＨＡ２（１．００ｍｇ）を水（５．００ｍＬ）中で２分間音波処理（３．８ｋＨｚ；ＵＳ−３、Ａｓ  Ｏｎｅ  Ｃｏ．）すると灰色の透明な溶液が得られた（図３Ｂ中）。溶液中に視認できる粒子は存在せず、濾過しても膜（孔径０．２μｍ、Ａｄｖａｎｔｅｃ）上に物質は付着しなかった。アミノ化ＮＨＡ２の濃度はさらに１．０ｍｇ／ｍＬ以上まで上げることが可能であるが、溶液の色が濃くなりすぎて、視認できる粒子の存在を判定することができなくなった（図３Ｂ左）。反応により得られたすべての粗物質が水に溶解した。これは反応によりＮＨＡが定量的に親水性の形に変換したことを示している。
溶液中の粒子のサイズを動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ）により分析した（図３Ｃ）。ＤＬＳの研究により、アミノ化ＮＨＡ２の水溶液は平均サイズ１３４±５ｎｍの粒子を含有することが示された。サイズの範囲は７０ｎｍ〜５００ｎｍであって、先のＴＥＭの結果と一致した。
溶液をマイカ上に析出させ、粒子をさらにＡＦＭ（ＪＳＰＭ−４２００、ＪＥＯＬ）により分析した（図３Ｄ）。ＡＦＭによる分析により、粒子は球状の形を有することが示され、よく単離された粒子の観察により、ＮＨＡが溶液中で単一の粒子として存在することが確認された。ＡＦＭによる固体粒子の高さ分析は、９５ｎｍのより小さい平均サイズを示した（図４）。これはＡＦＭの条件下では水和層が除去されるためであると考えられる。
実施例３  Ｓａｎｇｅｒの方法によるアミノ化ＮＨＡ上のアミノ基の定量
アミノ化ＮＨＡ２におけるアミノ基の量を、Ｓａｎｇｅｒの方法を用いて証明および定量した（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｖｏｌ．４，ｐｐ  ２５５６−２５５７，Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌ．Ａ．Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ，１９９５，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ）。すなわち、アミノ化ＮＨＡ２のアミノ基を１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンによりジニトロフェニルアミノ基に変換し、その量をＵＶ−ｖｉｓ差スペクトルにより定量した。
アミノ化ＮＨＡ２（５．００ｍｇ）を、ＮａＨＣＯ３（０．１０Ｍ、１００μＬ）の塩基性水溶液およびエタノール（５０μＬ）中で、６０℃で２０分間、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（１．００ｍｇ）と混合した。反応混合物を濾過すると黒色の固体が得られた。上記黒色の固体をさらに水（１．０ｍＬ）およびエタノール（１．０ｍＬ）により洗浄し、減圧乾燥してジニトロフェニルアミノ化ＮＨＡ３（５．２８ｍｇ）を得た（図１）。
ジニトロフェニルアミノ化ＮＨＡ３（１．００ｍｇ）の水溶液の吸収スペクトルは、３５５ｎｍにジニトロフェニル基に相当するピークを有していた（図５Ｂ）。出発物質はいずれも３５５ｎｍに吸収を有しないことから、ナトリウムアミドとの反応によりＮＨＡにアミノ基が導入されたことが立証された。また、報告されているジニトロフェニルアミノ基のモル吸収係数の値（１６０００〜１８０００Ｍ−１・ｃｍ−１）から、アミノ基の量は約０．２２μｍｏｌ／ｍｇと算出された。ＮＨＡの表面積はあらかじめ３０８ｍ２／ｇであると算出されているので（Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．；Ｋａｎｅｋｏ，Ｋ．；Ｋｏｋａｉ，Ｆ．；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．；Ｙｕｄａｓａｋａ，Ｍ．；Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２０００，３３１，１４−２０）、これは３００ｎｍ２の面積に１個のアミノ基が存在することを示している。
実施例４  カラムクロマトグラフィーによるアミノ化ＮＨＡ２の分画
炭素粒子を標準化するために最も困難な問題の一つは、均一なサイズの粒子を得ることである。本発明者らは、分離のためのゲル浸透クロマトグラフィーを研究した結果、ポリアクリルアミドを基礎とするゲル（セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）５００ＨＲ）が媒体として適していることが見出された。そこで、セファクリル５００ＨＲのカラムによりアミノ化ＮＨＡ２の水溶液を溶離した。
アミノ化ＮＨＡ２（０．２０ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍＬ）の水溶液をセファクリル５００ＨＲのカラム（樹脂体積：１７ｍＬ、カラム直径：１ｃｍ、カラム高さ：２２ｃｍ）に流し、０．５ｍＬ／分の流速で水により溶離した。ＵＶ検出器（２６０ｎｍで検出、ＵＶ−２０７５、ＪＡＳＣＯ）を用いてクロマトグラムを得て（図６Ａ）、溶離液を０．２５ｍＬの分画として集めた。それぞれの分画の粒子のサイズをＤＬＳにより分析した（図６Ｂ）。フラクションの２６０ｎｍのＵＶ吸収により、流した粒子の９２％がカラムから溶離したことが示された。
また、図６Ｂの典型的なデータに示されるように、粒子はサイズにより分画された。分画２２、２３、２４および２７における粒子の平均サイズは、それぞれ１９８±１７、１４８±１、１３４±６および１２７±７ｎｍであった。
異なる孔径を有するゲル（セファクリル１００ＨＲまたは１０００ＳＦ）を用いた場合には、溶離した粒子の量が０％および１％に減少した（図７）。
実施例５  蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４の合成
アミノ化ＮＨＡ２（０．４０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＬ）の水溶液に、２−（２，７−ジフルオロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−Ｎ−［５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−ペンチル］−テレフタルアミド酸（２．８ｍｇ、オレゴングリーン４８８−Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のメタノール（２０ｍｌ）溶液を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濾過すると黒色の固体が得られた。上記黒色の固体を水（２０ｍＬ）およびメタノール（２０ｍＬ）によりさらに洗浄し、減圧乾燥して蛍光標識されたアミノ化ＮＨＡ４（８．２３ｍｇ）を得た（図１）。アミノ化ＮＨＡ４をＵＶ−ｖｉｓ差スペクトルにより分析した（図５Ｃ）。発色団の吸収係数（８４０００Ｍ−１・ｃｍ−１）から、オレゴングリーン４８８の量は０．０１７μｍｏｌ／ｍｇであると算出された。
同じ反応条件でアミノ化ＮＨＡ２をオレゴングリーン４８８のメチルエステルにより処理した場合には、得られたＮＨＡは蛍光染料の吸収および励起を示さなかった（図８）。この結果により、アミノ化ＮＨＡ４の蛍光は物理吸着された染料によるものではなく、共有結合した染料によるものであることが確認された。
実施例６  細胞毒性試験
およそ２ｘ１０４個の細胞を９６穴のプレートを用いて１０％の牛胎児血清と１％のペニシリンとストレプトマイシンを含む培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中、３７℃、加湿条件下２４時間培養した。０．０５ｍｇ／ｍＬの割合でアミノ化ＮＨＡ２を含む新しい培地に交換した後４８時間培養した。細胞を溶かした後遠心分離し、タンパク質分解酵素阻害剤とクマシーブリリアントブルーＧ−２５０を加え、５９５ｎｍの吸収からタンパク質を定量し（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）コントロール実験と比較することで毒性を算出した。
上記と同様の実験を石英粒子と二酸化チタン粒子とでおこなったところ、アミノ化ＮＨＡ２は石英粒子の１０分の１程度の毒性を示したが、一般的に無毒とされる二酸化チタン粒子に比べると毒性を示した（図９）。本実施例により、構造特性が完全に明確となったナノチューブ粒子と既存粒子との毒性の比較が行われた。この実施例により本発明で調製される親水化炭素クラスターがナノチューブ粒子の標準物質として利用できることが示された。
実施例７  アミノ化カーボンナノホーン凝集物の大量合成
カーボンナノホーン凝集物（１．５０ｇ）を液体アンモニア（２．４Ｌ）へ分散させた後、ナトリウムアミド（３．００ｇ）を加えた。ドライアイスコンデンサーを取り付けたフラスコで−３３℃、反応混合物を還流攪拌した。６時間攪拌した後、３０℃の湯浴で穏やかに加熱することで１時間かけてアンモニアを留去し、黒色固体を得た。この粗生成物を飽和塩化アンモニウム水溶液（３００ｍＬ）に分散させ、親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ別した後、ろ紙上に残った目的生成物を超純水（３００ｍＬ）で洗浄した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ）１２時間室温で乾燥させ、アミノナノホーン凝集物を黒色固体として得た（１．５２ｇ）。
実施例８  アミノナノホーン凝集物へのベンジルアルコール連結（リンカー）部の導入
0005113036.tif 000002
（黒丸はカーボンナノホーンを示す）
４−フルオロ−３−ニトロベンジルアルコール（１．００ｇ，５．８４ｍｍｏｌ）、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（０．６９０ｍＬ，７．６０ｍｍｏｌ）、塩化アルミニウム六水和物（１４．１ｍｇ，５８．４μｍｏｌ）を６０℃で攪拌し、４時間後室温下に戻した。反応混合物をそのままシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：塩化メチレン）により精製した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ）１２時間室温で乾燥させ、２−（４−フルオロ−３−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピランの薄い黄色い液体を得た（１．４５ｇ，９７％）：ＩＲ（ｎｅａｔ）３０７０（ｗ），２９４４（ｍ），２８７１（ｍ），１６２２（ｍ），１５９３（ｍ），１５３８（ｓ），１３４９（ｓ），１２５４（ｍ），１２０１（ｍ），１１２３（ｓ），１０７９（ｍ），１０３６（ｍ），９７５（ｍ），９０６（ｍ），８３３（ｍ），８１８（ｍ）；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１．５６−１．６８（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．８９（ｍ，１Ｈ），３．３６−３．５８（ｍ，１Ｈ），３．８５−３．８９（ｍ，１Ｈ），４．５２−４．５４（ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ），４．７１−４．７３（ｔ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７９−４．８２（ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ，１Ｈ），７．６０−７．６３（ｍ，１Ｈ），８．１（ｄｄ，Ｊ＝２，４Ｈｚ，１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１９．２（ＣＨ２），２５．３（ＣＨ２），３０．４（ＣＨ２），６２．３（ＣＨ２），６７．０（ＣＨ２），９８．３（ＣＨ），１１８．２（ＣＨ），１２４．８（Ｃ），１３４．３（ＣＨ），１３５．７（ＣＨ），１５３．７（Ｃ−Ｃｌ），１５５．８（Ｃ−ＮＯ２）；Ａｎａｌ  Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ４Ｆ：Ｃ，２５．０７；Ｈ，５．５３；Ｎ，５．４９．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５６．２７；Ｈ，５．６８；Ｎ，５．３１。
２−（４−フルオロ−３−ニトロベンジルオキシ）テトラヒドロピラン（１３ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（７５０ｍｇ，５．５ｍｍｏｌ）、アミノナノホーン凝集物（５０４ｍｇ；アミノ基の量：０．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）中混合し、６０℃で２０時間加熱攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、水（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）、トルエン（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧下（０．２ｍｍＨｇ・１０時間・室温）、さらに乾燥し、目的生成物を黒色固体として得た（５１０ｍｇ）。
実施例９  ベンジルアルコール連結（リンカー）部の導入後の残存アミノ基の保護
0005113036.tif 000003
実施例８で合成したリンカー導入後のカーボンナノホーン（４５０ｍｇ；アミノ基の量：１２μｍｏｌ）とジメチルアミノピリジン（２．０ｍｇ，１７μｍｏｌ）をＤＭＦ（２３ｍＬ）中混合し、この溶液へ無水酢酸（５７μＬ，０．６１ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルアミン（２７μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール，２．５ｍｇ，１８μｍｏｌ）を加え、室温下２時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍＬ×３）、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１３時間・室温）下、さらに乾燥し、残存アミノ基をアセチル化したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（４５１ｍｇ）。
実施例１０  ベンジルアルコール連結（リンカー）部のＴＨＰ保護基の除去
0005113036.tif 000004
実施例９で合成したリンカー付きカーボンナノホーン（４１０ｍｇ，ＴＨＰの量：７６μｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１０ｍｇ，５８μｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）中混合し、４０℃で４時間加熱攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下溶媒を留去し、目的生成物であるベンジルアルコール部位をもつカーボンナノホーンを黒色固体として得た（４１０ｍｇ）。
実施例１１  ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護グリシンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
0005113036.tif 000005
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃグリシン（１１０ｍｇ，０．３６ｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５２ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５０ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護グリシン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ  ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃグリシン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した（図１０）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ３．６９（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｍ，２Ｈ），３．９４（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．３８（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７０−７．７５（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９３（ｂｒ  ｍ，１Ｈ）．
実施例１２  ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護アラニンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
0005113036.tif 000006
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン（１１０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５１ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５３ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護アラニン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ  ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃアラニン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した（図１１）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ１．０５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），４．１１−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．２７（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．３８（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９８（ｂｒ  ｍ，１Ｈ）．
実施例１３  ベンジルアルコール部へのＦｍｏｃ保護バリンの導入（Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＨＭＰ−ＡＮの合成）
0005113036.tif 000007
この反応ではＤＭＦはニンヒドリン存在下で蒸留したものを用い、溶媒中に残存するアミンを完全に除去した。Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−バリン（１２０ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（３．０ｍＬ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合溶媒中溶解し、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，２８μＬ，０．１８ｍｍｏｌ）を０℃で加え同じ温度で２０分間攪拌した。溶媒を減圧留去した後得られた白色固体にＤＭＦ（２．５ｍＬ）を加え、再度溶解し、この溶液とベンジルアルコール部をもつカーボンナノホーン（５１ｍｇ，ヒドロキシル基の量：９５μｍｏｌ）を混合し、室温下３時間攪拌した。反応混合物を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・１２時間・室温）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護グリシンと結合したカーボンナノホーンを黒色固体として得た（５０ｍｇ）。合成したＦｍｏｃ保護バリン・カーボンナノホーン複合体１．０ｍｇを重ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に分散し、１Ｈ  ＮＭＲを測定することでＦｍｏｃバリン部およびベンジルアルコールリンカー部の信号を検出、同定した。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＦ−ｄ７）δ１．００（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ），２．２５（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），４．１１−４．１２（ｍ，２Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３０−７．３８（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．４２−７．４５（ｂｒ  ｍ，２Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７６−７．７７（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），７．７８−７．９８（ｂｒ  ｍ，１Ｈ）．
実施例１４  カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護グリシンからの保護基の除去
0005113036.tif 000008
Ｆｍｏｃ保護グリシンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したグリシン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（３０ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．５ｍｇ，５．７ｍｇ）。
実施例１５  カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護アラニンからの保護基の除去
0005113036.tif 000009
Ｆｍｏｃ保護アラニンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したアラニン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（２９ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．５ｍｇ，５．７ｍｇ）。
実施例１６  カーボンナノホーン上のＦｍｏｃ保護バリンからの保護基の除去
0005113036.tif 000010
Ｆｍｏｃ保護バリンを連結したカーボンナノホーン（３０ｍｇ）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ（１．５ｍＬ）へ分散させ室温下１時間攪拌した。この反応液を親水性メンブレンフィルター（孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＤＭＦ（１０ｍＬ×３）、塩化メチレン（１０ｍＬ×３）、メタノール（１０ｍＬ×３）で洗浄した。減圧（０．２ｍｍＨｇ・室温・１２時間）下、さらに乾燥し、Ｆｍｏｃ保護基を除去したバリン・カーボンナノホーン複合体を黒色固体として得た（２９ｍｇ）。ろ液中に得られたＮ−（９−フルオレニルメチル）ピペリジンは、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：１：１酢酸エチル／クロロホルム）により精製し白色固体として得た（１．３ｍｇ，４．９ｍｇ）。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
0005113036.tif 000011
【図２】
0005113036.tif 000012
【図４】
0005113036.tif 000013
【図５】
0005113036.tif 000014
【図８】
0005113036.tif 000015
【図１０】
0005113036.tif 000016
【図１１】
0005113036.tif 000017
【図３】
0005113036.tif 000018
【図６】
0005113036.tif 000019
【図７】
0005113036.tif 000020
【図９】
0005113036.tif 000021