(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、成熟型および／またはチモーゲン型の前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）と結合する抗体であって、非開裂型のＰＳＡでの免疫感作により得られ、そして完全な形態のものと内部で開裂した形態のものとの異なる反応性によって選択され、アミノ酸リジン１４５とリジン１４６とのあいだで開裂したニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）と結合しない抗体（該ＰＳＡ−Ｎは、ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの内部でペプチド結合開裂して２本鎖または多重鎖のＰＳＡとなることにより形成される）であることを特徴とする抗体。
【請求項２】
ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、成熟型および／またはチモーゲン型のヒト前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）（該ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡは遊離型および／または複合体型で生じ得る）のサンプル中での量的測定のためのイムノアッセイ方法であって、該ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡに結合するが、アミノ酸リジン１４５とリジン１４６とのあいだで開裂したニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）とは結合しない抗体が使用されることを特徴とするイムノアッセイ方法。
【請求項３】
アミノ酸リジン１４５とリジン１４６とのあいだで開裂したニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）（該ＰＳＡ−Ｎは遊離型および／または複合体型で生じ得る）を測定するイムノアッセイ方法であって、
ａ）ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、成熟型および／またはチモーゲン型のヒト前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）に結合するが、ＰＳＡ−Ｎとは結合しない第１抗体をサンプル中に過剰に添加し、サンプル中に存在するＳＣＩＮＴ  ＰＳＡと結合させ、かつその後
ｂ）ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡに第１抗体により定義されるエピトープと重複するエピトープで結合し、かつＰＳＮ−Ｎとも結合するが、該第１抗体にすでに結合しているＰＳＡには結合できない第２抗体を該サンプル中に添加し、ＰＳＡ−Ｎにのみ結合させ、
それによりＰＳＡ−Ｎの測定を可能とする
ことを特徴とするイムノアッセイ方法。
【請求項４】
遊離のＳＣＩＮＴ  ＰＳＡを測定するイムノアッセイ方法であって、遊離のすなわち複合体を形成していないＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの測定を可能にするために、遊離のすなわち複合体を形成していない前立腺特異抗原（ＰＳＡ−Ｆ）に対して特異的な抗体の使用を追加的に含むサンドイッチイムノアッセイ方法であることを特徴とする請求項２記載のイムノアッセイ方法。
【請求項５】
良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者および／または前立腺癌（ＰＣａ）でない健康な男性被験者から前立腺癌（ＰＣａ）患者を識別するために有用なマーカー値を取得する方法であって、
ａ）ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、成熟型および／またはチモーゲン型のヒト前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）を、請求項１記載の抗体を用いて測定し、そして
ｂ）測定されたＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの濃度の関数からマーカー値を確立する
工程からなることを特徴とする方法。
【請求項６】
工程ａ）が請求項２にしたがってＳＣＩＮＴ  ＰＳＡを測定することからなることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）が請求項４にしたがって遊離の、すなわち複合体を形成していないＳＣＩＮＴ  ＰＳＡを測定することからなることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者および／または前立腺癌（ＰＣａ）でない健康な男性被験者からＰＣａ患者を識別するために有用なマーカー値を取得する方法であって、
ａ）遊離および／または複合体を形成した、リジン１４５とリジン１４６との間で開裂したニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）を、請求項１記載の抗体を用いて測定し、そして
ｂ）測定されたＰＳＡ−Ｎの濃度の関数からマーカー値を確立する
工程からなることを特徴とする方法。
【請求項９】
工程ａ）が請求項３にしたがってＰＳＡ−Ｎを測定することからなることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記関数が他の形態のＰＳＡおよび／またはヒト腺カリクレイン２（ｈＫ２）の濃度の関数でもあることを特徴とする請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記他の形態のＰＳＡおよび／またはｈＫ２が、
総ＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｔ）、
非複合体型、すなわち遊離のＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｆ）、
ニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）および
ヒト腺カリクレイン２（ｈＫ２）
からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記測定されたＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの濃度の関数または測定されたＰＳＡ−Ｎの濃度の関数が、ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの濃度またはＰＳＡ−Ｎの濃度それ自体；またはＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの濃度および／またはＰＳＡ−Ｎの濃度と遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ−Ｎ、総遊離ＰＳＡ、総ＰＳＡおよびｈＫ２からなる群より選択される他のパラメーターとの組合せであることを特徴とする請求項１０または１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    ［技術分野］
本発明は、１本鎖で、完全な（すなわち、内部で開裂していない）形態の前立腺特異抗原（ＰＳＡまたはｈＫ３）に対して特異的である、高い親和性の免疫試薬に関する。本発明はまた、１本鎖で、完全な（内部で開裂していない）形態の遊離で複合体でないＰＳＡ（遊離ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）の特異的決定のための、前記免疫試薬を使用する分析的に高感度なイムノアッセイによって、あるいは、他の形態の前立腺カリクレイン、ＰＳＡまたはｈＫ２の種々の比率を形成するか、またはこれらとたとえばロジスティック回帰および／または人工的なニューロネットワークを用いるなどの他の手段とを組み合わせることにより他の形態の前立腺カリクレイン、ＰＳＡまたはｈＫ２を測定するイムノアッセイを、前記イムノアッセイから得られる結果と組み合わせることによって、無症候性の健常な男性または良性の前立腺状態と前立腺癌とを区別することに関する。本発明は、臨床的症状（たとえば、下位尿路症状 (lower urinary tract symptoms、ＬＵＴＳ)）を呈している男性における良性状態と癌とを区別する際だけでなく、無症候性被験者のスクリーニングの際にも、前立腺癌の検出に使用される。さらに、本発明は、癌の再発を初期段階で検出するための改良された手段を提供したり、疾患の種々段階における治療応答性を監視するための改良された手段を提供するためだけでなく、前立腺癌の段階付けまたは等級付けを改良するためにも用いられる。イムノアッセイ決定のための適当な生物学的標本は、主として、血清、血漿または全血サンプルであるが、本発明は尿や精液サンプルなどの他の生物学的体液にも適用できる。
【０００２】    ［発明の背景］
本発明の背景、およびとくに、実施に関する追加的詳細を提供する事例を説明するために本明細書で使用される文献および他の資料は、参考文献により取り込まれる。
【０００３】  前立腺特異抗原（ＰＳＡ；ｈＫ３とも呼ばれる）およびヒト腺カリクレイン２（ｈＫ２）は、主に前立腺組織で高度に発現される、２つの密接に関連したセリンプロテアーゼである。（ワング（Wang）ら、Invest Urol 1979; 17:159-163、リルジャ（Lilja）J Clin Invest 1985; 76:1899-1903、チャプデライネ（Chapdelaine）ら、FEBE Lett 1988; 236:205-208)。ＰＳＡ遺伝子は染色体１９番の長腕に位置しており、ｈＫ２と８４％より高いヌクレオチド配列同一性を有する。２つのタンパク質はまた、アミノ酸配列で高い類似性（７９％）を示すが、発現率は全く異なっている（ｈＫ２  ｍＲＮＡレベルはＰＳＡ  ｍＲＮＡレベルの〜１０〜２０％になる）（シェドリッヒ（Schedlich）ら、DNA 1987; 6:429-437）。ＰＳＡは２６１アミノ酸のプレプロ型として合成され、それから１７〜２１アミノ酸シグナルペプチドが開製して分泌過程で放出される。残留するＰＳＡチモーゲン型は、３〜７アミノ酸プロペプチドの開裂により活性化されて、活性型セリンプロテアーゼになる（レブグレン（loevgren）ら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 1977; 238;549-555）。最近、組換えｈＫ２はインビトロで不活性な組換えプロＰＳＡを活性な成熟ＰＳＡに変換することが示された（レブグレンら、Biochem Biophys Res Commun 1997; 238:549-555、タカヤマら、J Biol Chem 1997; 272:21582-21588、クマール(Kumar)ら、Cancer Res 1997; 57:3111-3114）。したがって、ｈＫ２はプロＰＳＡの生理学的な活性化因子であると思われる。酵素的に活性なＰＳＡは高濃度（０．２〜５ｍｇ／ｍＬ）で精液中へ分泌される（クリステンソン（Christensson）ら、Eur J Biochem 1990; 194:755-763、アールグレン(Ahlgren)ら、1995 J Androl 16:491-498）。精液では、ＰＳＡは精液ベジクル由来ゲル形成タンパク質セメノゲリン(semenogelin)ＩおよびIIを分解し、精液の液状化（liquifaction）と漸次運動型精子の放出を引き起こす（リルジャ（Lilla）、J Clin Invest 1985; 76:1899-1903）。ＰＳＡの作用により、セメノゲリンＩおよびIIにおけるあるチロシン残基とグルタミン残基とのペプチド結合の、主にＣ末端の、加水分解が生じる（マルム(Malm）ら、The Prostate2000; 印刷中)。対照的に、ｈＫ２は、ＰＳＡの作用により生じたものと比較して、セメノゲリンＩおよびIIにおいて明らかに異なった開裂パターンを生じさせるが、ゲルタンパク質に対するｈＫ２作用が生理学的な意味を有するかどうかは現在のところ不明である（レビグレンら、Eur. J. Biochem. 1999; 262; 781-789）。
【０００４】  酵素的に活性なＰＳＡは、キモトリプシン様プロテアーゼと限られた類似性をもつ独特の基質特異性を現すことが示されている（リルジャら、J Biol Chem 1989; 264:1894-1900、クリステンソンら、Eur J Biocchem 1990; 194:755-763、マルムら、The Prostate 2000; 印刷中）。ＰＡＳの活性な１本鎖型は、α1−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、α2−マクログロブリン（ＡＭＧ）、妊娠ゾーンタンパク質（pregnancy-zone protein）（ＰＺＰ）、プロテインＣ阻害剤（ＰＣＩ）、α1−アンチトリプシン（ＡＰＩ）などのいくつかの細胞外プロテアーゼ阻害剤と安定な共有結合の複合体を形成する（クリステンソンら、Eur J Biochem 1990; 194:755-763、スチンマン(Stenman)ら、Cancer Res 1991; 51:222-226、エスパーナ（Espana）ら、ThrombRes 1991; 64:309-320、クリステンソンおよびリルジャ、Eur J Biochem 1994; 220:45-53、ザング(Zhang)ら、Prostate 1997; 33:87-96）。血液中では、ＰＳＡの主な免疫検出可能な形態は、ＡＣＴとの複合体で共有結合しており、マイナーな分画のみが遊離で、複合体でない形態（ＰＳＡ−Ｆ）にある（ステンマンら、Cancer Res 1991; 51:222-226、リルジャら、Clin Chem 1991; 37:1618-1625）。
【０００５】  ＬＮＣａＰ（前立腺のリンパ節癌）は、確認された転移性前立腺癌患者の針吸引生検から１９７７年に単離された、ヒトの転移性前立腺癌細胞株である。様々な形態の遊離ＰＳＡが、ＬＮＣａＰ細胞の使用済み細胞培養培地で見出されている。コレイ（Corey）らおよびベイセイネン（Vaeisaenem）らは、チモーゲン型ＰＳＡ（プロＰＳＡ）および成熟した完全型ＰＳＡを産生するＬＮＣａＰ細胞を報告した。しかし、主にＬｙｓ145とＬｙｓ146との間で内部開製しているために酵素的に不活性な形態として部分的に存在している、精液由来のＰＳＡとは対照的に、ＬＮＣａＰ細胞では、内部開製した形態のＰＳＡを産生しないようである（クリステンソンら、Eur J Biochem 1990; 194:755-763）。チモーゲン型のＰＳＡは、前立腺癌患者の血清でも見出されている。チモーゲン型のＰＳＡは、酵素的に不活性であるので、セルピン(serpin)と複合体を形成できず、循環系では遊離の形態のままであろう。また、血清に生じる遊離ＰＳＡの性質について他の正反対の報告があり、そこでは、該ＰＳＡは内部開裂により生じた開製した不活性な形態であること、または、該ＰＳＡは切りつめられていない（unclipped）成熟した、しかし酵素的には不活性なＰＳＡ形態であることが述べられている。
【０００６】  前立腺癌の発生頻度は、主に寿命の延びやスクリーニングの増加により、ここ十年の間に増大してきている。この事実は、改善された診断方法や新しい治療の必要性を表わしている。血清中ＰＳＡの分析は、前立腺癌（ＰＣａ）患者の診断や監視においてよく確立されている（オエスターリング（Oesterling）J Urol 1991; 145:907-923)。しかしながら、ＰＳＡ血清濃度の上昇は、他の前立腺疾患、たとえば良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者にも見出されている（ハドソン（Hudson）ら、J Urol 1989; 142:1011-1017）。血清中で、いくつかの異なった分子形態のＰＳＡが発見されたことにより、ＰＣａに関する診断や監視の特異性が顕著に改良された。ＢＰＨ患者は、ＰＣａ患者に比べて、血清中における遊離ＰＳＡの総ＰＳＡ（すなわち、ＰＳＡ−Ｆ  ＋  ＰＳＡ−ＡＣＴ  ＋  その他量的にそれほど重要でないＰＳＡ−セルピン複合体）に対する比率、または遊離ＰＳＡの複合体ＰＳＡに対する比率がより高い。これにより、血清中でほどほどに(moderately)上昇したＰＳＡレベルの男性におけるＢＰＨとＰＣａとを区別するするために、遊離ＰＳＡの総ＰＳＡに対する比（遊離ＰＳＡ百分率とも呼ばれる）が使用されることになる（ステンマン（Stenman）ら、Cancer Res 1991; 51:222-226、クリステンソンら、J Urol 1993; 150:100-105）。これによりＰＣａに対する特異性が改良されるが、男性の２つのグループ間にはなお相当な重複があり、したがって、正常な男性または良性の症状を有する男性と癌の男性とを区別するためのさらなる改良を提供するマーカーに対する大きな需要がある。
【０００７】  精製したＰＳＡによるマウスの免疫感作により、ＰＳＡおよびｈＫ２に対するモノクロナール抗体が産生される。多くのモノクローナル抗体は、２つのタンパク質の一次構造がはなはだしく同一性を有するために、ＰＳＡおよびｈＫ２と交差反応する。しかしながら、遊離ＰＳＡ、複合体型ＰＳＡおよびｈＫ２を選択的に測定する特異的イムノアッセイが、本発明者らその他により開発された。現在、遊離ＰＳＡの各種候補形態を特異的に認識する、利用可能なイムノアッセイはない。
【０００８】    ［目的および概要］
本発明の目的は、ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、成熟型および／またはチモーゲン型の前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）を含有するサンプルを用いて、該抗原の決定を可能にすることである。
【０００９】  本発明の他の目的は、ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡを含有するサンプル中の該抗原の量的決定のためのイムノアッセイを提供するものである。
【００１０】  本発明のさらなる目的は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者および／または前立腺癌（ＰＣａ）でない健康な男性被験者からＰＣａ患者を、無痛性ＰＣａ患者から攻撃性ＰＣａ患者を、および／またはＰＣａの前立腺外延長（extraprostatic extension）患者および／またはリンパ節もしくは骨髄への転移進展（metastatic spread）を有する患者から臨床的に局在化されたおよび／または場所的に限られたＰＣａの患者を、それぞれ識別する方法を提供することである。
【００１１】  本発明はしたがって、抗体であって、ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開製していない、成熟型および／またはチモーゲン型の前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）に高親和性で結合する抗体に関する。該抗体は、非開裂型ＰＳＡで免疫感作することにより得られ、そして完全な形態のものと内部開製した形態のものとの特異な反応性（differential reactivity)により選択されるものであるが、ニックが入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）には結合しない。ここで該ＰＳＡ−ＮはＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの内部ペプチド結合開裂により形成され、その結果２本鎖または多重鎖ＰＳＡになる。
【００１２】  本発明はまた、ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開製していない、成熟型および／またはチモーゲン型の前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）の、あるいはニックが入ったＰＳＡ形態（ＰＳＡ−Ｎ）（該ＰＳＡ−ＮがＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの内部開裂により形成されており、その結果２本鎖または多重鎖の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）形態であり、このＳＣＩＮＴ  ＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎが遊離および／または複合体型で生じ得る）のサンプル中での量的決定のためのイムノアッセイに関する。本イムノアッセイは、該ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡに高親和性で結合するが、ＰＳＡ−Ｎには結合しない抗体を使用する。
【００１３】  本発明はさらに、
ｉ）良性前立腺過形成（ＢＰＨ）患者および／または前立腺癌（ＰＣａ）でない健康な男性被験者からＰＣａ患者を、
ii) 無痛性ＰＣａの患者から攻撃性ＰＣａの患者を、および／または、
iii) ＰＣａの前立腺外延長患者および／またはリンパ節もしくは骨髄への転移進展を有する患者から臨床的に局在化されたおよび／または場所的に限られたＰＣａの患者を、
識別する方法に関する。
【００１４】  本発明は、
ａ）ヒトの１本鎖で、完全な、すなわち内部で開裂していない、遊離型および／または複合体型前立腺特異抗原（ＳＣＩＮＴ  ＰＳＡ）を決定し、
ｂ）決定されたＳＣＩＮＴ  ＰＳＡの関数であるマーカー値を確立し、ついで
ｃ）確立されたマーカー値を該患者の識別に使用する
工程からなる。
【００１５】表の簡単な説明
表１  免疫感作および融合の結果のまとめ。
表２  抗体特性のまとめ。
表３  ５μｇ／Ｌより低いＰＳＡ−Ｔ範囲における単一のまたは組み合わせたパラメーターを用いる、癌および非癌の識別。統計分析はノンパラメトリックなマン−ウィットニー−Ｕ検定法（Mann-Whitney-U test）を用いて実施した。
表４  １０μｇ／Ｌより低いＰＳＡ−Ｔ範囲における単一のまたは組み合わせたパラメーターを用いる、癌および非癌の識別。統計分析はノンパラメトリックなマン−ウィットニー−Ｕ検定法を用いて実施した。
表５  ＰＳＡ−Ｔの濃度に関する制限なしで単一または組み合わせパラメーターを用いる、癌および非癌の識別。統計分析はノンパラメトリックなマン−ウィットニー−Ｕ検定法を用いて実施した。
【００１６】    ［発明の詳細な説明］
遊離ＰＳＡの様々な形態の性質に向けた分析手法の設計および開発により、前立腺癌の診断に対する新たな特有の情報が加えられた。抗プロＰＳＡ抗体はチモーゲン型タンパク質の特異的でかつ高感度の測定を可能にする。ＬＮＣａＰ  ＰＳＡの高い免疫原性の性質にもかかわらず、本発明者らは、ＰＳＡ−チモーゲンに対して特異的な、または強い優先性を有する抗体、たとえば、ＰＳＡ−プロペプチド全体またはこのペプチドの一部分を特異的に認識する抗体を産生することができなかった。このプロジェクトの目的は、転移性癌細胞株ＬＮＣａＰにより生産される様々なＰＳＡ形態に対する抗ＰＳＡ抗体を開発することであり、また、酵素的に不活性な（それゆえに、ＡＣＴ、ＡＭＧまたはＡＰＩなどの様々なセルビンタイプの複合体リガンドと共有結合を形成できない、たとえば、ＰＳＡ−チモーゲン型（すなわち、プロＰＳＡ）、酵素的に不活性な１本鎖の成熟型、様々な内部開裂型、またはまだ同定されていない理由で血清中に非複合体型で留まっているその他の不活性型）様々なＰＳＡ分画の濃度の特異的検出および定量を提供するイムノアッセイにおいて、これらの抗体を採用することである。
【００１７】  本発明者らは、本明細書でつぎの点を報告する。
１．１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開裂していない）成熟型および／またはチモーゲン型ＰＳＡを特異的にかつ高親和性で認識するが、内部で開裂した２本鎖または多重鎖型は認識しないモノクローナル抗体の開発および生産。
２．１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開製していない）成熟型および／またはチモーゲン型のものを選択的に認識する抗体を用い、そして遊離の非複合体型ＰＳＡを認識した抗体と組み合わせて、１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開裂していない）成熟型および／またはチモーゲン型の遊離で非複合体型のＰＳＡ（遊離の１本鎖ＩＮＴａｃｔ非複合型ＰＳＡまたは遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ）を測定する、高感度ツーサイトイムノアッセイ(two-site immunoassay)の最適化。このアッセイは血清、血漿、または全血だけでなくその他の生物学的体液にも適用できる。
３．当初は３μｇ／Ｌまたはそれより大きい総ＰＳＡ濃度を示した、５０〜６６歳の自覚症状のない男性から採取した血清または血漿サンプルの研究母集団（Ｎ＝２８１）に対する本アッセイの適用。ＰＣの診断は、六分割生検（sextant biopsy）に基づいていた。ＰＣから非癌を分離するための、本アッセイ単独の、または他の形態のカリクレイン（ＰＳＡまたはｈＫ２）と組み合わせた実施を検討し、確立されているほかの診断方法と比較した。
４．１本鎖の、完全な（すなわち、成熟型およびチモーゲン型）、遊離型でも複合体型でも生じるＰＳＡを測定するための高感度ツーサイトイムノアッセイの設計。これは、１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開製していない）成熟型およびチモーゲン型を選択的に認識する抗体を用いて達成される。これらの抗体は、遊離型および複合体型ＰＳＡをともに等しい親和性で認識する、独立して結合する抗体と組み合わせられる。このアッセイは、血清、血漿または全血だけでなく、他の生物学的体液にも適用できる。
５．遊離型ＰＳＡであるか複合体型ＰＳＡであるかにかかわらず、内部で開裂したＰＳＡ形態（すなわち、ニックの入ったＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎ）を選択的に測定する高感度ツーサイトイムノアッセイの設計。このアッセイ設計は、まず、１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開裂していない）成熟型およびチモーゲン型のものを選択的に認識する抗体を、大過剰使用する。これは、第一の遮断抗体により定義されるエピトープと重複するエピトープでＰＳＡと結合する他の抗体による完全な１本鎖ＰＳＡの結合を、阻害または遮断するために実施される。そのような重複する抗体（検出または捕捉用に使用される）を添加したのち、第二抗体に対するサンドイッチパートナーとして適した、独立して結合する第三抗体が免疫反応を完結させるために添加される。本アッセイの設計により、遊離型または複合体型のいずれで生じるかにかかわらず、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６の部位で内部開裂しているＰＳＡのみがもっぱら測定される。
【００１８】  本発明はＳＣＩＮＴ−ＰＳＡに特異的な高親和性免疫試薬の開発に関する。本発明はまた、これらの高親和性抗体を使用することにより、健康な、自覚症状のない男性または良性の前立腺症状の男性と前立腺癌患者とを識別するために用いられる、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡおよびＳＣＩＮＴ−ＰＳＡの濃度測定に対して高い特異性のある非常に高感度のイムノアッセイの確立に関する。本発明は、自覚症状のない個体をスクリーニングする際にも、また臨床的な徴候（たとえば、下位尿路症状、ＬＵＴＳ）を呈している男性の良性症状と癌とを識別する際にも、ＰＣａ検出のために用いることができる。加えて、本発明は、癌の再発を初期段階で検出するための改良された手段を提供したり、疾患の種々段階における治療応答性を監視するための改良された手段を提供するばかりでなく、前立腺癌の段階付けまたは等級付けを改良するためにも用いられる。
【００１９】  本発明によれば、１本鎖の、完全な（すなわち、内部で開裂していない）成熟型および／またはチモーゲン型ＰＳＡを高親和性で検出する、特異的なモノクローナル抗体を開発できる。このような抗体のより詳細な分析により、該抗体はＬｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだでの内部開裂を呈示する２本鎖型ＰＳＡを認識できないことが示されている。この形態は、循環系だけでなく精漿でも共通して生じる１つのニック型（すなわち、内部で開裂した）ＰＳＡを構成している。
【００２０】  本発明によれば、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡを特異的に検出するイムノアッセイは、血清、血漿および全血サンプルばかりでなく、検討下にある個体から採取した尿または精漿などの他の生物学的体液でも実施することができる。さらに、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡとＰＳＡ−Ｆとのあいだでの計算された相違は、ニックの入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）の別の重要なパラメーターを提供するであろう。
【００２１】  前記したように、ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ特異的抗体の入手はまた、特許請求の範囲に記載のＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ特異的抗体の助けによりＳＣＩＮＴ−ＰＳＡを完全に遮断することによってニックの入ったＰＳＡが特異的に定量され、ついで完全で遊離のまたは完全で複合体型のＰＳＡとはもはや反応しないＰＳＡ抗体の使用によりニックの入ったＰＳＡ形態の検出を進められるイムノアッセイを設計する機会（本発明で記載されている）をも提供する。このような設計により、ニックの入ったＰＳＡ（遊離であるか複合体型であるかにかかわらず）を遊離ＰＳＡ抗体を使用することなく測定することが可能になる。
【００２２】  本発明の中心的な知見によれば、効率的な腫瘍マーカーとしての遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡに特異的なイムノアッセイの使用は、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡまたは計算されたＰＳＡ−Ｎだけを使用するか、またはこれらのパラメーターのいずれかを、遊離型、複合体型または総ＰＳＡおよび／またはｈＫ２などの様々な形態のもの（たとえば、総ＰＳＡまたは総ｈＫ２、複合体型ＰＳＡまたは複合体型ｈＫ２、ＰＳＡと複合体を形成している特異的プロテアーゼ阻害剤またはｈＫ２と複合体を形成している特異的プロテアーゼ阻害剤、遊離ＰＳＡの総濃度（すなわち、１本鎖の完全な成熟型およびチモーゲン型  ＋  様々な内部で開製した２本鎖または多重鎖型）または遊離ｈＫ２の総濃度、および／または様々な内部で開裂した２本鎖または多重型の遊離ＰＳＡまたは様々な内部で開製した２本鎖または多重型の遊離ｈＫ２）と組み合わせて使用することにより実現される。
【００２３】  本発明のさらなる側面によれば、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ、ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎと他の測定されるＰＳＡ形態との組み合わせは、つぎのような測定されたパラメーターの様々な比率またはアルゴリズムをつくることによって実施される。
【００２４】遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎの総遊離ＰＳＡに対する比率
遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎの総ＰＳＡに対する比率
遊離ＰＳＡの総濃度で割って得られる遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡの比に遊離ＰＳＡの総濃度で割って得られる総ＰＳＡの比を乗じたもの
遊離ＰＳＡの総濃度で割って得られる遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡの比に総ＰＳＡを乗じたもの
あるいは、
様々な測定されるパラメーターのロジスティック回帰分析のレシーバーオペテイティングチャラクタリスティクス（receiver operating characteristics）（ＲＯＣ）分析への使用、
人工ニューロネットワークなどの様々な人工知能アプローチの使用
【００２５】  本発明のさらなる側面によれば、総ＰＳＡまたは複合体型ＰＳＡの値がほどほどに上昇していること、すなわち総ＰＳＡまたは複合体型ＰＳＡのみでは癌と非癌状態の診断的識別がほとんど信頼できず、検出された癌が臓器限定的で治療的処置にふさわしいと思われるようなＰＳＡ濃度であること、によって主に特徴付けられる患者サンプルのサブセットに、本発明は優先的に適用される。このような領域は、しばしば、３または４から２０μｇ／Ｌの総ＰＳＡ範囲として定義されるが、それとは異なって、下限（たとえば、２．０または２．５μｇ／Ｌといったさらに低い値であり得る）または上限（さらに高い、またはさらに低い、たとえば、８．０、１０、１２または１５μｇ／Ｌといった値であり得る）の両者に関して定義することもできる。
【００２６】  本発明のさらに別の側面によれば、ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡまたはＰＳＡ−Ｎの濃度は、それ単独で、または、たとえば、様々な比率、ロジスティック回帰分析、あるいは人工知能アプローチなどの使用による他の測定されるパラメーターとの組み合わせで、確認済み前立腺癌患者のサブグループを確認するために、より詳細には、より悪性に進展する可能性のある前立腺癌から、無痛性のままであるかまたはゆっくりとしか進展しないと思われる前立腺癌を確認するために、用いることができる。本発明の他の臨床的適用は、前立腺外進展した疾患段階、局所的に進行したまたは転移性の疾患と、病理学的に臓器限定的な疾患とを識別することに関する。本発明のさらに別の臨床的適用は、治療処置行為後の早期癌再発の検出、または疾患の様々な段階における治療応答性の監視における改良された手段を提供することに関する。
【００２７】  異なった免疫原構造が、異なった遊離型ＰＳＡに対するモノクローナル抗体を開発するために用いられた；（ｉ）ＬＮＣａＰ細胞からアフィニティー精製され、その半分のタンパク質は成熟した１本鎖型で回収され、残り半分は−５または−７チモーゲン型で回収されたＰＳＡ。第二の免疫原構造は、ＰＳＡのプロ配列、ならびにＫＬＢおよびＢＳＡにコンジュゲートする最初の７個のアミノ末端アミノ酸を含む１４アミノ酸合成ペプチド（ＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣ）からなっていた。様々なスクリーニング法が抗体を同定するのに用いられ、その抗体は、精漿由来のＰＳＡとは異なったシグナル強度を有する、ＬＮＣａＰ細胞から単離されるＰＳＡを検出する。
【００２８】  線状ペプチド配列に結合する抗体を用いる３−Ｄモデル構造におけるＰＳＡエピトープ群の特徴付けにより、新しい５Ｈ６  Ｍａｂは、以前に特徴付けられたＭａｂ  Ｅ７３のエピトープに非常に近いペプチド配列ａａ２２５〜２３７にマップされることが明らかになった。Ｍａｂ  ４Ｄ４および５Ｃ３はペプチド配列１３６〜１４４に結合した。これは、以前認識されていなかった、ＰＳＡ上の抗原性エピトープであり、このエピトープはＬｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだの内部開裂部位にも、またＭａｂ  ４Ｄ４およびＭａｂ  ５Ｃ３エピトープの近辺にある触媒部位にも近接している。Ｍａｂ  ４Ｄ４、５Ｃ３および５Ｈ６は、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡを同様の親和性をもって認識したが、ｈＫ２を認識しなかった。
【００２９】  Ｍａｂ  ４Ｄ４および５Ｃ３は、プロＰＳＡおよび完全型ＰＳＡに対して、それぞれ２．５×１０9  １／Ｍおよび２．７×１０9  １／Ｍの親和定数を有していた。これらモノクロナール抗体は、プロＰＳＡの認識よりも精漿ＰＳＡの認識の方が著しく低く、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６で内部開製したＰＳＡを主として（９５％）含む分画と結合したＭａｂ  ４Ｄ４、５Ｃ３の量は、完全型ＰＳＡのみを含むプールに結合した抗体量に比べて、わずか５％に過ぎなかった。
【００３０】  以下の実験の部により、本発明をより詳細に説明する。
【００３１】実験の部
方法および材料
試薬および器具
フロイントの完全および不完全アジュバンドはシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）(セントルイス、ＭＯ)から得た。細胞培養９６ウェルプレートはヌンク(Nunc)（デンマーク）から、ローラーボトルはコーニング(Corning)（ＮＹ）から、またセリンバイオリアクター（Celline bioreactors）はインテグラ（Integra）（ドイツ）から得た。グルタマックス−１（Glutamax-1）を備えたオプチメム１(Optimem 1)およびＨＡＴサプリメント（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）はライフ  テクノロジーズ（Life Technologies）（ギブコ(Gibco）ＢＲＬ，スコットランド)の製品である。熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はヒクロン（Hyclone）(ローガン（Logan)、ＵＴ)から得た。Ｓｐ２／０マウスミエローマ細胞はＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）から得た。合成−７〜＋７プロＰＳＡペプチドはハンス  リルジャ博士（ルンド大学、マルモ（Malmoe）、スウェーデン）から得た。１２３４デルフィア  プレート（Delfia Plate）蛍光光度計、デルフィア  Ｅｕ−標識キット、ウサギ抗マウスＩｇＧ、抗ＰＳＡ  Ｍａｂ  Ｈ１１７、抗ＰＳＡ  Ｍａｂ  ２Ｅ９またはストレプトアビジンをコートしたマイクロタイトレーションプレート、デルフィア  アッセイ緩衝液、洗浄液および増強液は、パーキンエルマー  ライフ  サイエンシーズ(PerkinElmer Life Sciences)（ツルク、フィンランド）からのものである。ハイトラップ  プロテインＧ（HiTrap Protein G）アフィニティーカラム、スペロース（Superose）１２ＨＲ  １０／３０  ＦＰＬＣ  ゲルろ通用カラム、ＰＢＥ９４ポリバッファー（Polybuffer）交換器および等電点電気泳動用ポリバッファー（Polybuffer）９６はアマシャム  ファルマシア  バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）ＡＢ（ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）から得た。アミノ末端配列分析は、オンライン  アプライド  バイオシステムズ（Applied Biosystems）モデル１２０Ａフェニルチオヒダントイン  アミノ酸分析器（パーキンエルマー、ノーウォーク（Norwalk）、ＣＴ）に接続したアプライド  バイオシステムズ  モデル４７７Ａパルス液体シークエンサーで実施した。モノクローナル抗体５Ａ１０、２Ｅ９、２Ｈ１１、３Ｃ１、４Ｈ５および２Ｃ１は以前に特徴付けされている。ＭＡｂ６６および１０はＯ．ニルソン（Nilsson）博士（カンＡＧダイアグノティクス（CanAg Diagnostics）、ゲテボルグ(Goeteborg)、スウェーデン）から贈呈された。ＭＡｂ  Ｈ１１７，Ｈ１７９，Ｈ１６４およびＨ５０はアボット（アボットラボラトリーズ(Abbott laboratories)、アボットパーク、ＩＬ）から得た。抗体Ｅ７３はエリザベス  パウス（Elisabeth Paus）博士(ラジウム病院(The Radium Hospital)、オスロ、ノルウェー)から贈呈された。
【００３２】免疫原
遊離型ＰＳＡに対する抗体を開発するために、３種類の免疫原構造を使用した。ＬＮＣａ  ＰＳＡは、使用済み細胞培養培地からアフィニティークロマトグラフィーにより以前に精製されていた。タンパク質の約半分は１本鎖の成熟ＰＳＡで、半分は−５または−７チモーゲン型であった。第二の免疫原構造は、ＰＳＡのプロ配列とそのアミノ末端配列の最初の７つのアミノ酸とを含む１４アミノ酸合成ペプチド（ＡＰＬＩＬＳＲＩＶＧＧＷＥＣ）からなっていた。このペプチドは、イムジェクト  イムノーゲン  ＥＤＣ  コンジュゲーション  キット(Imject Immunogen EDC Conjugation Kit)（ピアース（Pierce）、ＩＬ）を用いて、ＫＬＨおよびＢＳＡとカップリングさせた。使用される第三の免疫原は、プロ配列から２つのアミノ酸が変更されている成熟型のｈＫ２（ｆＸａｈＫ２）であった。プロ配列における点突然変異により、ｈＫ２はプロ配列の自己活性化および開裂ができなくなる。第二および第三の免疫原構造は、抗プロＰＳＡ抗体を産生させるために、免疫感作で使用した。該ペプチドおよびｈＫ２に関する免疫感作および融合は、ＬＮＣａ  ＰＳＡのためにつぎに記載されているのと本質的に同様に実施した。
【００３３】免疫感作
表１は、行った免疫感作をまとめてある。フロイント完全アジュバンド（シグマ）で乳化した種々の量の免疫原を用いる腹腔内注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫感作した。ブースター量を３〜４週間間隔で与えた。全免疫感作期間は２〜１０ヵ月にわたる。最終ブースターはマウスを死亡させる３日前に投与した。以前に記載されたように、脾臓のリンパ系細胞をミエローマ細胞Ｓｐ２／０と１：１の比で融合させた。融合細胞は、２０％のウシ胎仔血清およびＨＡＴサプリメントを含むオプチメンの細胞培養９６ウェルプレートにおいて回収した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】スクリーニング法
いくつかの異なったスクリーニング法を使用した。すべての方法に共通な点は、精漿から得られるＰＳＡとは幾分異なって、ＬＮＣａＰ細胞により製造されるＰＳＡを検出する抗体を認識するために設計されたということである。４つのスクリーニング法が図１ａ〜１ｄに示されている。すべての方法において、ハイブリドーマ上清は、ウサギ抗マウス抗体でコートしたマイクロタイトレーションウェル（方法１、２および４）中、またはストレプトアビジンおよびビオチン化合成ペプチドでコートしたマイクロタイトレーションウェル（方法３）中、＋４℃で一晩インキュベーションした。インキュベーションののち、プレートを４回洗浄した。結合した抗体の検出は図１ａ〜１ｄに記載されているように実施した。シグナル発生のため、デルフィア増強液を２００μｌ／ウェルで使用した。シグナルは１２３４デルフィア蛍光光度計で測定した。
【００３６】抗体の特徴付け
精製タンパク質。ベイセネン(Vaeisaenen)らにより記載されているように、ＬＮＣａＰ  ＰＳＡを製造し、精製した。異なるｐＩ値に基づいて分離する等電点電気泳動を用いて、ＬＮＣａＰプロＰＳＡおよび成熟型ＰＳＡを分離した。ｐＨ勾配は８．５〜６であり、使用した緩衝液は０．０２５Ｍエタノールアミン−ＣＨ3ＣＯＯＨ  ｐＨ８．５およびポリバッファー(Polybuffer)  ｐＨ６（希釈、１：１０）であった。等電点電気泳動はＣ１０／４０カラムに充填した３０ｍｌのポリバッファー交換ゲルおよびエクタエクスプローラー（ＡＥＫＴＡexplorer）１００システム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用いて実施した。流速は０．３ｍｌ／分であり、３．６ｍｌ分画を集めた。分画を集める前に、１／１０量の２Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ８を各分画管に加えた。各分画について、プロステイタス（Prostatus）ＰＳＡ遊離／総(free/total) キット（パーキンエルマー  ライフ  サイエンシーズ、ツルク、フィンランド）を用いて、ＰＳＡ濃度を測定した。１つのピーク領域由来のＰＳＡ含有分画をプールし、アミノ末端配列決定に付した。
【００３７】  精製精漿ＰＳＡの別プールは、Ｕ−Ｈ  ステンマン(Stenman)博士の好意により寄贈されたものである。プールＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ザングらにより記載されているように、異なる量の内部開裂型ＰＳＡを含有する。プールＡおよびＢは完全型ＰＳＡのみを含有する。プールＣおよびＤは、完全型ＰＳＡならびにＡｒｇ８５−Ｐｈｅ８６およびＬｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６で内部開裂したＰＳＡを含有する。プールＤはＬｙｓ１８２−Ｌｙｓ１８３で内部開裂した少量のＰＳＡをも含有していた。プールＥは、ほとんどがＬｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６で内部開製した形態を主に含有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの染色強度から、プールＣ、ＤおよびＥにおける完全型ＰＳＡの量が、それぞれ、およそ２０％、１０％および５％未満であることが示唆された。
【００３８】  ＨＫ２をバキュロウィルス発現系で製造し、レブグレン(Loevgren)らにより記載されているようにして精製した。インビトロでのＰＳＡ−ＡＣＴの調製および精製は、以前に記載されている。
【００３９】エピトープマッピング
ＰＳＡ分子上の結合部位を決定するために、以前に特徴付けられたＭＡｂを、検討対象のＭＡｂとの考えられる全ての組み合わせで、サンドイッチ法で使用した。
【００４０】ペプチドマッピング
連続するエピトープを認識する抗体の特異的結合部位を決定するために、全ＰＳＡ配列と重複している合成１５マーペプチドを使用した。ユーロピウム標識化ＭＡｂを、ピイロネン(Piironen)らにより記載されているように、ストレプトアビジンプレートに結合させたビオチン化ペプチドと一緒にインキュベーションした。
【００４１】様々なＰＳＡ形態に対する特異性と結合
適当なパートナー抗体を用い、ＰＳＡ、ｈＫ２およびＰＳＡ−ＡＣＴ複合体を用いて、新規ＭＡｂの特異性を決定した。加えて、ザングら記載の精漿から精製したＰＳＡのプールＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥを用いて、かつベイセイネンら記載のＬＮＣａＰ  ＰＳＡから精製したプロＰＳＡを用いて、様々なＰＳＡ形態との結合を決定した。
【００４２】ＭＡｂの親和性
２Ｅ９またはＨ１１７を捕捉抗体として用い、かつ精漿から精製したＰＳＡまたは精製ｈＫ２を用い、以前に記載されたようにして、Ｅｕ標識ＭＡｂの親和定数を決定した。親和性はスキャッチャード法を用いて計算した。
【００４３】イムノアッセイ
ツーサイトイムノアッセイプロトコルは、遊離型ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡの特異的決定のために開発されたものである。この設計は、（ｉ）ＰＳＡにおけるペプチド配列ａａ１３６〜１４４を含有するエピトープにマッピングされたＭａｂ  ５Ｃ３と、（ii）ペプチド配列ａａ８４〜９１を含有するエピトープにマッピングされ、以前に特徴付けられた遊離の特異的Ｍａｂ（５Ａ１０）との組み合わせで用いた。Ｍａｂ  ５Ｃ３のビオチン化調製物を、２００μＬアッセイバッファー（Assay Buffer）中Ｍａｂ２００ｎｇを用い、室温で６０分間インキュベーションすることより、ストレプトアビジンでコートしたプレートに固定した。結合しなかったビオチン化Ｍａｂを除去する洗浄工程につづき、１ウェルあたり、標準品またはサンプル５０μＬを添加し、ついでデルフィア緩衝液１００μＬを添加し、連続振とう下、室温で６０分間インキュベーションした。２回洗浄したのち、１ウェルあたり、１００ｎｇのＥｕ標識Ｍａｂ  ５Ａ１０を含有するデルフィアアッセイバッファー１００μＬを添加し、連続振とう下、室温で６０分間インキュベーションした。最終洗浄（６×）につづいて、１ウェルあたり、２００μＬのデルフィア増強溶液（Delfia Enhancement solution）を添加した。５分間振とうしたのち、シグナルを１２３２デルフィアプレート蛍光光度計で測定した。未知サンプルの濃度は、組換えバキュロウィルス産生プロＰＳＡの標準シリーズ（０．０５〜２００μｇ／ＬのＰＳＡ）から計算した。
【００４４】  その他に使用したイムノアッセイは、デルフィア  プロステイタス(Delfia ProStatus)Ｆ／Ｔ  ＰＳＡ（パーキン−エルマー、ワラック(Wallac)、ツルク、フィンランド）およびｈＫ２用試験アッセイ（ベッカー（Becker）ら、Clin Chem 2000;46:198-206）であった。
【００４５】臨床試験母集団
研究母集団は、スウェーデン、ゴーゼンブルグ（Gothenburg）地域で母集団ベースの前立腺癌スクリーニング研究に参加し、当初は３μｇ／Ｌより高い総ＰＳＡ濃度を示した、５１〜６６歳の２９１人の男性からなっていた（ベッカー、Urology 2000;55:694-699）。ＤＲＥ、ＴＲＵＳおよびＴＲＵＳ誘導六分割生検(TRUS guided sextant biopsy)を実施する前に、追加的な血清およびＥＤＴＡ血漿サンプルを採取した。静脈穿刺後３時間以内に実施される（血清）凝固と遠心分離ののち、サンプルを７０℃で凍結した。本研究のために、本発明者らは、イムノアッセイ実施直前に解凍したＥＤＴＡ血漿サンプルを用いた。六分割生検により、被験者２９１人中７９人の男性に前立腺癌が認められた。
【００４６】統計分析
記述統計は中間、高いおよび低いの４分位(quartiles)（２５および７５パーセンタイル）として与えられた。ＰＳＡ−Ｔ、ＰＳＡ−Ｆ、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−Ｎ、ｈＫ２、ｈＫ２／ＰＳＡ−Ｆ、ＰＳＡ−Ｆ／ＰＳＡ−Ｔ、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｔ、ＰＳＡ−Ｎ／ＰＳＡ−Ｔ、（遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ）×ＰＳＡ−Ｔ、（遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ）×ＰＳＡ−Ｔ×ｈＫ２、（遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ）／（ＰＳＡ−Ｆ／ＰＳＡ−Ｔ）において統計的有意差（ｐ＜０．０５）があるか否かを試験するために、２つの患者群（癌および非癌）のあいだで、マン−ウィットニーノンパラメトリック検定法を実施した。この解析は、ＰＳＡ−Ｔ範囲を基礎にして選択された様々なサブグループに対してだけでなく、全患者試料に対しても実施した。
【００４７】結果
免疫感作およびスクリーニング
本発明者らの目的は、癌に特異的に存在するＰＳＡの様々な分子形態を認識する新規抗体を見出すことであった。非常に高い陽性のシグナルを与え、または精液由来のＰＳＡに比べてＬＮＣａＰ由来の検討されるべきＰＳＡ形態を特異的に認識する抗体を製造し、さらに特徴付けをした。表１では、実施された免疫感作、ＰＳＡ陽性の細胞株の数および各融合からさらに特徴付けられたＭＡｂがまとめられている。最終的に特徴付けのなされたＭＡｂはすべて、ＬＮＣａＰ  ＰＳＡを免疫原として使用した融合に由来するものであった。ペプチド融合由来の細胞株のうちあるものは、合成ペプチドに対して陽性であったが、さらなるテストにより、抗体はＰＳＡ分子全体を認識していないことが示された。また、抗ＰＳＡ陽性細胞株のあるものはｆＸａｈＫ２融合から取得されが、これら抗体はＬＮＣａＰ  ＰＳＡと精漿由来のＰＳＡとを区別できなかったので、それ以上特徴付けを行わなかった。
【００４８】抗体特性
エピトープマッピング。新規ＭＡｂのＰＳＡ分子上の結合部位を明らかにするため、様々な抗体組み合わせで該ＭＡｂを試験した。その結果に基づき、２−Ｄエピトープマップを構築した（図２）。新規抗ＰＳＡ  ＭＡｂの結合部位を、以前特徴付けされたＭＡｂに関連して提示する。
【００４９】  ８３個の抗ＰＳＡモノクローナル抗体の様々な結合領域は、１〜６の結合領域が２−Ｄおよび３−ＤモデルにおいてマッピングされているＩＳＯＢＭ研究でパウス（Paus）らにより記載されている。新規抗ＰＳＡ抗体の結合領域を、以前特徴付けられたＭＡｂの結合部位と比較した。
【００５０】  ５Ｆ１２は、ＩＳＯＢＭ研究で以前特徴付けられたＭＡｂ  ５Ａ１０（＃２５）と同じエピトープに結合する群Ｉの遊離ＰＳＡ特異的抗体にマッピングされた。興味あることであるが、５Ｆ１２はまた、群３ａの抗体に属するＭＡｂ  ＰＳＡ１０（＃７２）結合を遮断した。７Ｇ１は、群３ａの抗体において、Ｈ５０（＃５７）とＰＳＡ１０に近いエピトープに結合した。７Ｇ１はまた、群５ｂの抗体に属する抗体２Ｈ１１（＃４１）によって幾分阻害された。また、５Ｆ７および５Ｈ６は、ＭＡｂ  Ｈ５０およびＰＳＡ１０結合部位と重複している領域に結合した。さらに、７Ｃ４、４Ｄ４および５Ｃ３は、Ｍａｂ  Ｈ１６４、Ｈ５０および２Ｈ１１の結合部位近くの領域に結合し、該領域は群５ｂの抗体近くに位置する。
【００５１】ペプチドマッピング。テストした７つのＭＡｂのうち３つが、全ＰＳＡ配列と重複する線状のビオチン化１５マーペプチドに結合した（表１）。
【００５２】  ４Ｄ４および５Ｃ３抗体は共に、１５マーペプチド配列１３０ＡＳＧＷＧＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰ１４４および１３６ＳＩＥＰＥＥＦＴＬＴＰＫＫＬＱＣ１４９に結合した。これら２つの重複する１５マーペプチドに共通のアミノ酸配列は１３６ＳＩＥＰＥＥＦＬＴＰ１４４配列である。共通の内部ＰＳＡ開裂部位は、ＰＳＡを不活性にするアミノ酸Ｌｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだに位置している。
【００５３】  ５Ｈ６は、ＰＳＡのＣ末端ペプチド（２２５ＹＲＫＷＩＫＤＴＩＶＡＮＰ２３７）に結合した。別の抗体（Ｅ７３）はＰＳＡ分子のＣ末端部分近くで結合するという特徴があった（データは示されていない）。ＭＡｂ  Ｅ７３は、５Ｈ６により認識されるものと部分的に重複する１５マーペプチド（２１５ＲＰＳＬＹＴＫＶＶＨＹＲＫＷＩ２２９）に結合した。
【００５４】  ペプチド結合研究から得た結果をピイロネンらにより提示されたデータと組み合わせて、ＰＳＡ部分における独立した７つの抗原ドメインを示す３−Ｄエピトープマップを作成した（図３）。
【００５５】抗体の特異性。５Ｆ１２は遊離ＰＳＡ特異的抗体であった。７Ｃ４、４Ｄ４、５Ｃ３、５Ｆ７および５Ｈ６は、遊離ＰＳＡおよびＰＳＡＳ−ＡＣＴ複合体を同様の親和性で認識したが、ｈＫ２は認識しなかった。７Ｇ１は、遊離ＰＳＡ、ＡＣＴと複合体を形成したＰＳＡおよびｈＫ２を同様の親和性で認識した。
【００５６】様々なＰＳＡ形態との結合。新規ＭＡｂの異なるＰＳＡ形態との結合は、以前に特徴付けられた異なる捕捉抗体および新規ＭＡｂをトレーサーとするサンドイッチアッセイ法を用いて試験した。結合は、成熟した完全型ＰＳＡについて検討し、成熟した内部開裂型ＰＳＡおよびプロＰＳＡと比較した。様々なＰＳＡアイソフォームとの結合での有意差は、ＭＡｂ  ４Ｄ４および５Ｃ３においてのみ見られた。
【００５７】  クローン４Ｄ４および５Ｃ３は、スクリーニング法４を用いて、プロＰＳＡよりも低いシグナル強度で、精漿ＰＳＡを認識した。これらの抗体は、様々な量の内部開裂したＰＳＡ、すなわち２本鎖または多重鎖型、を含有した精漿から分離したＰＳＡの各種プールを用いてさらに試験した。完全な、１本鎖ＰＳＡのみを含有したプールＡおよびＢに結合した抗体量（１００％とする）に比べて、Ｌｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだで内部開裂しているＰＳＡを主として（≒９５％）含有するプールＥに結合した抗体（４Ｄ４、５Ｃ３）はわずか５％であった。したがって、これらの抗体は、免疫原として使用されるＬＮＣａＰ  ＰＳＡにおけるような、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６で内部開裂していないＰＳＡ形態のみを認識し得る。図４ａ〜４ｃは、様々な抗体と精漿ＰＳＡのプールＡ〜Ｅとの反応性を示している。抗体は、Ｈ１１７でコートしたプレート、または捕捉剤（capture）としてビオチン化５Ａ１０でコートしたストレプトアビジンプレートを用いたサンドイッチ法で試験した。抗体は、ＩＳＯＢＭ研究で示されている様々な結合領域にしたがって設計される。
【００５８】Ｍａｂの親和性。ＭＡｂの親和定数を表２に列挙する。特徴付けられたＭＡｂはすべて、精漿ＰＳＡに対して高い親和性を示した（Ｋａ＞１×１０9 １／Ｍ）。７Ｇ１はＰＳＡおよびｈＫ２に対して非常に高い親和性を示した（Ｋａ＝２×１０10 １／Ｍ）。４Ｄ４および５Ｃ３は、プロＰＳＡおよび完全型ＰＳＡに対して、それぞれ２．５×１０9 １／Ｍおよび２．７×１０9 １／Ｍの親和定数を有していた。加えて、４Ｄ４および５Ｃ３は、内部開裂型を含有する精漿ＰＳＡのプール（プールＣ、ＤおよびＥ）に対する親和性について試験された。これら２つのＭＡｂの親和定数は、内部開裂型ＰＳＡの量が上昇するにつれて減少した。４Ｄ４および５Ｃ３のプールＥ  ＰＳＡに対する親和性は、親和性が非常に低いために（データは示されていない）、スキャッチャード法を用いて決定することができなかった。
【００５９】
【表２】
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【００６０】ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡイムノアッセイ実施
典型的な標準曲線が図５に示されている。分析的検出限界（バックグラウンド＋２ＳＤ）は０．０５μｇ／Ｌ以下であり、標準曲線は、使用した最高標準点（５０μｇ／Ｌ）に至るまで直線的に上昇した。分析内および分析間での変動は、０．２〜５０μｇ／Ｌの濃度範囲にわたって、それぞれ６および８パーセント未満であった。
【００６１】研究母集団血清おける遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−Ｆ、ＰＳＡ−ＴおよびｈＫ２の測定
遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ、ＰＳＡ−Ｆ、ＰＳＡ−ＴおよびｈＫ２の様々な測定パラメーターの中間濃度（ならびに２５および７５パーセンタイル）、ならびにそれらを組合せて様々な割合またはアルゴリズムとしたものが、全検討母集団、ＰＳＡ−Ｔが１０以下の患者およびＰＳＡが５以下の患者について表１〜３に示されている。癌と非癌とのあいだの統計解析は、マン−ホイットニーのノンパラメトリックＵ−検定法を用いて実施した。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
【表４】
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【００６４】
【表５】
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【００６５】 全臨床試験材料（すなわち、表３に示されているようなＰＳＡ−Ｔ制限なし）のイムノアッセイ測定の統計解析により、ＰＳＡ−Ｔ（ｐ＜０．０００１）、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ（ｐ＝０．００６３）およびｈＫ２（ｐ＝０．０１８）のレベルは、単独パラメーターＰＳＡ−Ｎ（ｐ＝０．０２７１）と同様、非癌グループと比べて癌で有意差があったが、ＰＳＡ−Ｆ（ｐ＝０．４３５）は２グループのあいだで区別できなかったことが明らかにされている。２つのパラメーター比のすべて、とくにＰＳＡ−Ｆ／ＰＳＡ−Ｔ、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−ＦおよびＰＳＡ−Ｎ／ＰＳＡ−Ｔ（すべてｐ＜０．０００１）は、２つのグループのあいだをよく識別した。遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡのＰＳＡ−Ｆに対する比率（中間値）は、癌では５９パーセントであるのに比べて、非癌では４７パーセントであった（ｐ＜０．０００１）。３つまたは４つのパラメーターアルゴリズムも、高い統計的な有意差をもつて癌と非癌とを識別した。
【００６６】  単一パラメーターの１０μｇ／Ｌ以下のＰＳＡ−Ｔ範囲（表４）においては、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−Ｎのみが癌と非癌とを識別した。とくに注目に値するのは、ＰＳＡ−Ｎの中間濃度が非癌では０．３９μｇ／Ｌであり、癌では０．２７μｇ／Ｌ（ｐ＝０．００４３）であったという事実である。２つのパラメーター比のうち、ＰＳＡ−Ｆ／ＰＳＡ−Ｔ（ｐ＝０．０００２）、ＰＳＡ−Ｎ／ＰＳＡ−Ｔ（ｐ＝０．０００２）、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ（ｐ＝０．００１８）は、３つおよび４つのパラメーターアルゴリズムのすべてと同様、２つの臨床グループをよく識別した。遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡのＰＳＡ−Ｆに対する比（中間値）は、癌において５８パーセントであったのに対し非癌で４７パーセントであった（ｐ＝０．００１８）。
【００６７】  単独パラメーターの５μｇ／Ｌ以下のＰＳＡ−Ｔ範囲（表５）においては、ＰＳＡ−Ｎのみが癌と非癌とを識別した。ＰＳＡ−Ｎの中間濃度は、非癌で０．３２μｇ／Ｌ、癌で０．２０μｇ／Ｌであった（ｐ＝０．００５５）。２つのパラメーター比のうち、ＰＳＡ−Ｆ／ＰＳＡ−Ｔ（ｐ＜０．０００１）、ＰＳＡ−Ｎ／ＰＳＡ−Ｔ（ｐ＝０．０００１）、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡ／ＰＳＡ−Ｆ（ｐ＝０．００１２）は、３つおよび４つのパラメーターアルゴリズムのすべてと同様、２つの臨床グループをよく識別した。また、このＰＳＡ−Ｔ範囲においては、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡのＰＳＡ−Ｆに対する比（中間値）はすべての試験材料のそれと非常に類似しており、すなわち、癌で５９パーセントであるのに比べて非癌で４９パーセントであった。
【００６８】議論および結論
本発明の１つの目的は、転移癌細胞株ＬＮＣａＰにより産生される各種形態のＰＳＡに対する抗ＰＳＡ抗体を製造し、そしてこれらの抗体を、精漿ＰＳＡで免疫感作して得られる以前に特徴付けられた多数の抗体と比較することであった。本発明者らは、検出用の特異的イムノアッセイを開発するために、遊離ＰＳＡの様々なアイソフォームに対する新規な抗ＰＳＡ抗体を取得することを望んだ。１つの目標は、抗プロＰＳＡ抗体を開発することであった。ＬＮＣａＰ  ＰＳＡを免疫原として使用する免疫感作に加えて、アミノ酸−７〜＋７からなる合成ペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲートさせ、免疫感作に使用した。また、ｈＫ２、ｆＸａｈＫ２の変異形態を免疫感作に使用した。この形態は、プロペプチドを失うことにより生じるチモーゲンタンパク質の自己活性化を阻害する変異型プロペプチドを含む。ｈＫ２とＰＳＡとは７９％のアミノ酸同一性を有するので、抗ＰＳＡ特異的抗体はｆＸａｈＫ２融合から生じると期待された。
【００６９】  精製ＬＮＣａＰ  ＰＳＡの約５０％は１本鎖の成熟型からなり、約５０％まではチモーゲン型からなっていた。８つのＬＮＣａＰ  ＰＳＡ融合物により、１０００個より多くのウェルがＰＳＡに対して陽性となった。１２５個の細胞株を選択し、成育させ、いくつかの異なる方法で試験した。ほとんどの抗体特性は、以前に特徴付けられた抗ＰＳＡ抗体に非常に類似していた。しかしながら、以前には知られていなかったエピトープ特性を有する３つの新規抗体が取得された。２つの新規抗体（４Ｄ４および５Ｃ３）は、ＰＳＡにおける共通の内部ペプチド開裂部位（Ｌｙｓ145−Ｌｙｓ146）に隣接したエピトープに結合し、もう１つの抗体（５Ｈ６）は該タンパク質のＣ末端ペプチドに結合した。合成ペプチド融合物およびｆＸａｈＫ２融合物は新規な抗ＰＳＡ抗体を産生しなかった。
【００７０】  ４Ｄ４および５Ｃ３は、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６開裂部位に隣接する線状ペプチド配列に結合した。これらの抗体は、異なるクローン由来のものであったとしても、ＰＳＡアイソフォーム特異性および親和性が非常に類似していた。これらはｈＫ２を認識しなかった。４Ｄ４および５Ｃ３は色素原ペプチド基質に対するＰＳＡの活性を阻害した（データは示されていない）が、このことは、ＰＳＡの触媒活性部位が内部開裂部位Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６の隣にマッピングされていたことから（図３）、期待されていたことであった。これら抗体を様々な量の内部開裂型ＰＳＡを含有する精漿ＰＳＡプールを用いて試験したところ、これら抗体はＬｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだで内部開裂したＰＳＡを認識しないことが判明した。Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６部位でのＰＳＡの内部開裂は、酵素活性の喪失を引き起こす。したがって、４Ｄ４および５Ｃ３は、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６での内部開裂のために不活性であるＰＳＡを認識しない。
【００７１】  別の新規抗体である５Ｈ６は、ＰＳＡ分子上の最後１５個のアミノ酸からなるＣ末端に結合した。このペプチドは天然形態（native form）ではらせん状であり、ＰＳＡ分子の表面に位置する。ＰＳＡ分子のアミノ酸２３４はバリンであるが、ｈＫ２ではアラニンである。この１つのアミノ酸の相違により、この抗体はｈＫ２を認識しない。Ｅ．パウス博士から入手したもう１つの抗体Ｅ７３も、ＰＳＡのＣ末端部分にマッピングされたが、ペプチド配列は５Ｈ６結合部位と部分的にのみ重複している。
【００７２】  ５Ｈ６をトレーサー抗体として用いるイムノアッセイを構築した。このアッセイの意図は、ＰＳＡのＣ末端部分での変化を検討することであった。５Ｈ６はＰＳＡのＣ末端ペプチドに結合するので、Ｃ末端でのアミノ酸開裂はＰＳＡに対する５Ｈ６結合の減少を引き起こすと考えられた。ベイセイネンらは、血清を用いて増大させた成熟型ＬＮＣａＰ  ＰＳＡは理由不明であるが不活性であることを報告した。また、コレイらは、同様の結果を報告し、ＰＳＡの不活性分画の一部はトリプシンで活性化されるが、一部は不活性状態のままであることを示した。ＰＳＡのＣ末端におけるアミノ酸開裂は当該タンパク質のコンホメーションを変化させることができ、おそらくＰＳＡを不活性にするであろう。血清と共にまたは血清なしで増殖させたＬＮＣａＰ細胞の使用済み細胞培養培地由来のＬＮＣａＰ  ＰＳＡ形態を、等電点クロマトグラフィーを使用するアフィニティー精製ののちに、当該タンパク質のプロ型と成熟型に分離した。異なるＬＮＣａＰ  ＰＳＡ形態を、Ｈ１１７を捕捉抗体として、また５Ｈ６をトレーサー抗体として用いるイムノアッセイで試験した。本発明者らは、これらの異なるＬＮＣａＰ  ＰＳＡ形態はＣ末端アミノ酸配列が異なっているか否かを調べてみたいと考えた。５Ｈ６を用いるイムノアッセイは、これらの異なるＰＳＡ形態のあいだで相違を示さなかった（データは示されていない）。
【００７３】  血清ＰＳＡ濃度の上昇は、前立腺癌以外の様々な泌尿器障害から生じている可能性があり、このためＰＳＡは癌特異的ではない。しかしながら、血清中でのＰＳＡ−ＦのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対する比率は、前立腺癌におけるよりもＢＰＨにおいて有意に高いことが示されている（ステンマンら、Cancer Res 1991; 51:222-226、クリステンソンら、J Urol 1993;150:100-5）。ＢＰＨにおける血清遊離ＰＳＡの画分増大を引き起こすメカニズムは知られていない。ブジェルク(Bjoerk)ら（ブジェルクら、Urology 1994;43:427-34）は、ＰＳＡとＡＣＴの両者の産生が検出できる癌組織とは対照的に、ＰＳＡ含有ＢＰＨ結節でのＡＣＴ産生の欠如を報告した。このことは、癌においてはより多くのＰＳＡ−ＡＣＴ複合体形成を生じ、したがって前立腺癌とＢＰＨとの遊離ＰＳＡ量の差を説明できることになる。しかしながら、ジュング（Jung）ら（ジュングら、Clin Chem 2000;46:47-54）は、前立腺組織における各種形態のＰＳＡの量または比率が、血清中の各種形態のＰＳＡの量または比率と相関しないことを立証した。したがって、血清中で見られるアイソフォームのパターンは、組織におけるＰＳＡアイソフォームのパターンの単なる反映でないと思われる。それよりむしろ、新生良性腫瘍細胞由来の遊離ＰＳＡの酵素的に活性なまたは不活性な形態のものが様々な比率で放出することは、ＰＣａやＢＰＨにおける遊離ＰＳＡ対総ＰＳＡ比の相違を生じ得るであろう。
【００７４】  血清中の遊離ＰＳＡの性質については議論を呼ぶ報告があった。前立腺癌患者の血清中のアミノ酸−４から始まるチモーゲン型ＰＳＡが、ミコラジュクジク（Mikolajczyk）らにより報告されている(ミコラジュクジクら、Urology 1997;50:710-4）。ＬＮＣａＰ細胞は、アミノ酸−７または−５から始まるプロ型ＰＳＡを産生することが示されている。これらプロ型は高い等電点ｐＩ値を有し、これはベイセイネンらによれば、ｈＫ２と共にインキュベーションしたのちに消失した。これらの高いｐＩ点はまた、進行した前立腺癌の患者の血清に見出されたが、ＢＰＨの患者では見出されなかった（フバー（Huber）ら、Prostate 1995;27:212-9）。しかしながら、ノルダス（Noldus）らは、グレードの高い前立腺癌患者の血清中にチモーゲン型のものを検出しなかった（ノルダスら、J Urol 1997;158:1606-9）。彼らの精製法は、精製工程でおそらくプロＰＳＡを開裂して成熟型にすることができるｈＫ２を除いていなかった。
【００７５】  遊離ＰＳＡの様々な形態に関する解決により、前立腺癌の診断に対する新たな識別情報が加わるであろう。抗プロＰＳＡ抗体はチモーゲン型タンパク質の特異的かつ高感度な測定を可能にするであろう。ＬＮＣａＰ  ＰＳＡの高い免疫原性にもかかわらず、本発明者らは、チモーゲン型ＰＳＡに対して特異的なまたはより強い優先性をもつ抗体を見出すことができなかった。
【００７６】  抗プロＰＳＡ抗体を取得できなかったことについてはいくつかの理由があった。マウスカリクレインのＰＳＡプロ配列はヒトカリクレインのＰＳＡプロ配列に類似することが示されている（フクシマら、Biochemistry 1985;24:8037-43）。このことは、プロペプチドがマウスにおいては免疫原性がないことを意味し得るであろう。また、この相同性のため、マウスカリクレインはおそらくヒトプロＰＳＡを開裂して成熟型ＰＳＡとすることができ、その結果、プロ配列を喪失することになろう。加えて、ＰＳＡ分子のプロ配列の配向（orientation）は知られておらず、またそれが部分的に埋もれていることもありうる。
【００７７】  精漿および前立腺組織由来の様々な形態の遊離ＰＳＡの特徴付けは、遊離ＰＳＡの様々な分子形態および様々な前立腺疾患におけるそれらの関連性を理解するうえでの１つの研究法であった。不活性な遊離型ＰＳＡの１つの説明は、内部開裂型ＰＳＡであるということである。精漿ＰＳＡは３０％までの内部開裂型ＰＳＡ（最も共通した内部開裂部位はＬｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６である）を含有していることが示されている（クリステンソンら、Eur J Biochem 1990;194:755-63）。ノルダスらは、グレードの高い前立腺癌患者の血清中にこの内部開裂型ＰＳＡを検出した（ノルダスら、J Urol 1977; 158:1606-9）。チャリアー（Charrier）らは、ＢＰＨ血清とＰＣａ血清におけるＰＳＡ形態のパターンを比較するのに二次元電気泳動を使用した（チャリアーら、Electrophoresis 1999;20:1075-81）。彼らは、ＢＰＨ血清はＰＣａ血清に比べてより多くの開裂型遊離ＰＳＡを含有していることを立証した。内部開裂部位はＡｒｇ８５−Ｐｈｅ８６およびＬｙｓ１８２−Ｓｅｒ１８３でも確認された（ザングら、Clin Chem 1995;41:1567-73、ワット(watt)、Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:3166-70)。ＢＰＨ患者の良性転移ゾーン（benign transition zone）から単離されたものであって、最近特徴付けられた新規なＰＳＡ形態「Ｂ−ＰＳＡ」は、Ｌｙｓ１８２−Ｓｅｒ１８３の個所に内部開裂部位を有している（ミコラジュシクら、Urology 2000;55:41-5）。チェン（Chen）らは、ＢＰＨ結節液において、Ｈｉｓ５４−Ｓｅｒ５５、Ｐｈｅ５７−Ｈｉｓ５８、Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６およびＬｙｓ１４６−Ｌｅｕ１４７に内部開裂部位をもつＰＳＡ形態を報告している（チェンら、J Urol 1997:157:2166-70）。Ｌｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６を除く他の部位における開裂がＰＳＡを不活化するか否かは知られていない。
【００７８】  ザングらは、ＡＣＴと複合体を形成できない、不活性で、成熟型で、切りつめられていない、精漿中のＰＳＡ形態を報告した（ザングら、Clin Chem 1995;41:1567-73）。この完全で不活性なＰＳＡは、血清中（ミコラジュクジクら、Urology 1997;50:710-4、ノルダスら、J Urol 1997:158:1606-9、キアン(Qian)ら、Clin Chem 1997;43:352-9）およびＬＮＣａＰ細胞の使用済み培地中（ベイセイネンら、Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999;6:1-7、コレイら、Prostate 1998;35:135-43）にも見出されている。現時点では、この不活性なＰＳＡ型に対する説明はない。
【００７９】  ＰＳＡ分子には別々の抗原性領域がある（図３）。これら領域の存在は、免疫原性の少ない領域に対する抗体を取得しうる可能性を低下させるであろう。しかしながら、本研究では、以前に認識されていなかった２つの新規なエピトープに対する抗体を見出した。
【００８０】  前に記載した新規でかつユニークな高親和性の５Ｃ３または４Ｄ４Ｍａｂを使用して、本発明者らは、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡに対する簡単で非常に感度のよいアッセイを構築することができた。これらは、一次的には、遊離ＰＳＡ特異的捕捉Ｍａｂ５Ａ１０と一緒に、検出抗体として使用された。本発明者らが所有している２つのトレーサーＭａｂは同じように作用するので、それらのうちの一方、Ｍａｂ  ５Ｃ３のみを継続的に使用した。エピトープマップ（図２）から明らかなように、Ｍａｂ  ５Ｃ３と４Ｄ４は、他の総ＰＳＡ特異的抗体と容易に組み合わせることができ、したがって、複合体型および遊離型ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡに対するアッセイを提供する。
【００８１】  本発明者らの定義による遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡは、ＰＳＡ−Ｆのサブフラクションを構成するので、本発明者らは、遊離ＰＳＡアッセイにより測定した値から遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡの値を引き算することにより、遊離のニックが入ったＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｎ）濃度を容易に得ることができた。この計算されたパラメーターは、とくに癌と非癌とを区別するためのＰＳＡ−Ｎ／ＰＳＡ−Ｔ（またはその逆）比率を形成するのに、重要なパラメーターであることが示された。前遮断工程（preblocking step）を使用することにより、たとえばＭａｂ  ５Ｃ３および／または４Ｄ４により、ニックの入ったＰＳＡの直接測定を構築することができ、それにより、完全型ＰＳＡ、すなわちＳＣＩＮＴ  ＰＳＡが免疫検出においてさらに関与することを避ける、すなわち遮断することが、２−Ｄエピトープマップ（図２）から明らかである。選択されたサンドイッチ用の一対の抗体のうち、一方の抗体（たとえば、２Ｃ１）は５Ｃ３および４Ｄ４特異的エピトープと重複するエピトープを認識することに基づき、他方は良好なサンドイッチ形成可能な他のＰＳＡ抗体である。
【００８２】  臨床サンプル、すなわちスクリーニングコホートの分析から明らかなように、遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−Ｎは、それぞれ単独であるいは様々な組み合わせで、全コホート(whole cohort)のためのみならず、診断的に困難な、ＰＳＡ−Ｔ濃度が低い（５μｇ／Ｌ以下）または中程度（１０μｇ／Ｌ以下）のいわゆる灰色ゾーン領域においても、癌と非癌とを非常に有意に識別することを可能にした。
【００８３】  遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡおよびＰＳＡ−Ｎと他の形態のＰＳＡまたはｈＫ２の測定との組み合わせは、比率あるいは他の数学的アルゴリズム以外の方法でも当然遂行できるが、ロジスティック回帰による組み合わせによっても遂行できる。ロジスティック回帰による組み合わせは、しばしば、各患者から得られる個々の測定値から計算される比率よりもいっそう良好な識別を提供する。比率の形成により得られる組み合わせと異なって、ロジスティック回帰による組み合わせは、連続変数を与えないので、カットオフ限界（cut-off limits）はこれらのケースでは定義できない。ロジスティック回帰分析は、様々な“医学的決定サポートを提供しうるリスク分析システム”のための基礎を提供する際の手段となる。このようなデータ取り扱いシステムの他の例は、つぎのものがある：人工ニューロネットワーク(ＡＮＮ)、ニューロファジーネットワーク（neuro fuzzy networks）(ＮＦＮ)、多層パーセプトロン（ＭＬＰ）、学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）（フリーマン（Freemann）ＪＡら、In:Neural Networks: Algorithms, Applications and Programmikng Techniques,アディソン−ウェスレイ出版社（Addison-Wesley Publishing Company）1991；ザデー(Zadeh)  ＬＡ、Information and Control,1965, 8:338-353; ザデー  ＬＡ、IEEE Trans. on System, Man and Cybernetics 1973, 3:28-44;  ゲルショー(Gersho)  Ａら、In: Vector Quantization and Signal Compression, クルイワー  アカデミック出版(Kluywer Academic Publishers)、ボストン、ドルドレヒト(Dordrecht)、ロンドン 1992;  ハッソウン(Hassoun)  Ｍ．Ｈ．、Foundamentalsof Artificial Neural Networks, The MIT Press,  ケンブリッジ、マサチューセッツ、ロンドン 1995）
【図面の簡単な説明】
【図１】  新規抗ＰＳＡ抗体のための研究に使用した４つのスクリーニング方法。
【図２】  新規Ｍａｂおよび以前に特徴付けられたＭａｂの、ＰＳＡの２−Ｄモデルにおける相互に関するエピトープマッピング。重複する円はＭａｂが互いに挟み込めないことを示す。接触している円はＰＳＡとの結合で検出可能な干渉（競合）を示し、重複していない円はＭａｂが独立したエピトープを検出しかつ他の重複していない円における他の抗体を挟み込むことが可能であることを示す。白色の円に位置する抗体はＰＳＡに対して特異的であり、黒色の円における抗体はｈＫ２と交差反応する。抗体の円（クロス模様）は本研究で開発された新規抗体を示す。
【図３】  ３−Ｄモデル構造におけるＰＳＡのエピトープ群。直線ペプチド配列に結合する抗体はこのモデルにマッピングされている。７つの独立した抗原ドメインが示されている。Ｍａｂ  ５Ａ１０はアミノ酸８４〜９１からなるペプチド配列に結合し、Ｍａｂ  ２Ｅ９はａａ８０〜８３、Ｍａｂ  １０はａａ１５０〜１６４、Ｍａｂ  ３Ｃ１およびＭａｂ  ４Ｈ５はａａ１〜１１（すなわち、ａａ３、５〜６および８〜１１）、ならびにＭａｂ  Ｈ１６４およびＭａｂ  ２Ｃ１はａａ５０〜６４からなるペプチド配列に結合し、これらは以前報告されている（ピイロネンら、Protein Science 1998;7:259-69）。Ｅ７３はペプチド配列ａａ２１５〜２２９に結合する。新規な５Ｈ６  Ｍａｂが隣接ペプチド配列ａａ２２５〜２３７に結合したので、５Ｈ６はＭａｂ  Ｅ７３のエピトープに非常に近いところに位置するエピトープにマッピングされる。Ｍａｂ  ４Ｄ４および５Ｃ３は、ＰＳＡ上の以前に認識されていなかった抗原エピトープであるペプチド配列１３６〜１４４に結合した。Ｍａｂ  ４Ｄ４およびＭａｂ  ５Ｃ３のエピトープの近辺における触媒活性部位と同様、Ｌｙｓ１４５とＬｙｓ１４６のあいだの内部開裂部位も、図に示されている。
【図４】  イソ酵素とのＰＳＡ反応性を有する各抗体の反応性は、全ての抗体のイソ酵素との反応性の中間値と比較された。完全型アイソフォームＡとの反応性を１００％とした。抗体群は、ＩＳＯＢＭエピトープ命名法にしたがって、抗体結合領域に基づいて１〜５に番号をつけられている。プールＡ〜Ｅは１ｎｇ／ウェルで、Ｅｕ−Ｍａｂは５０ｎｇ／ウェルで使用した。
【図５】  遊離ＳＣＩＮＴ−ＰＳＡアッセイ標準曲線。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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