(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
【化１】
0005112587.tif 000002
を有するハイブリッドプロテアーゼ。
【請求項２】
請求項１のハイブリッドプロテアーゼをコードしている核酸。
【請求項３】
請求項２の核酸を含んでいる発現ベクター。
【請求項４】
請求項３の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
請求項１のハイブリッドプロテアーゼを含んでいる清浄組成物、動物飼料組成物、または織物を処理するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
工業的、医薬的および商業的応用に使用される蛋白質の普及度が高まっている。その結果として、この普及により増加した暴露が、これらのペプチドに対するある程度の人の感作により起こされるいくらかのセーフティーハザードの原因となっており、すると続いての暴露は極度のアレルギー反応を起こし、それは有害であろうし、致死的でさえある。例えば、プロテアーゼは個体の一部に危険な過敏症を起こすことが知られている。その結果、工業界における（例えば、洗濯洗剤、化粧品、織物処理などにおける）プロテアーゼの有用性、および、例えば、洗浄条件下においてより有効なしみ除去性を持っているような改良されたプロテアーゼを提供する分野で行われた広範な研究にもかかわらず；工業界におけるプロテアーゼの使用は一部の人において過敏性アレルギー応答を生み出すために問題とされてきた。
【０００２】
多くの研究がこれらの問題を軽減するために行われてきた。プロテアーゼ使用の免疫原可能性を減少させるために探求された戦略は、空中浮遊プロテアーゼを運んでいる粉末粒子またはエアロゾルの働く場所での濃度を調節および最少化することにより可能な接触を減少させる、改良された製造工程、プロテアーゼ生成物から実際に生み出される粉末またはエアロゾルの量を減少させる改良された顆粒化工程、および最終生成物中の潜在的アレルゲン性夾雑物のレベルを減少させるための改良された回収工程であった。しかしながら、プロテアーゼのアレルゲン性、それ自体を減少させる試みはどちらかといえば成功していない。あるいは、過敏性個体の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）により認識されるプロテアーゼ中のエピトープを覆う（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１０７５５）、または問題とするプロテアーゼへポリマーまたはペプチド／蛋白質を結合させることにより抗原性決定基を伸張するまたは性質を変化させる試みが行われてきた。
【０００３】
誇張された様式または不適切な様式で適応性免疫応答が起こった場合、そのような反応を経験している個体は過敏性であると称される。過敏性反応は、正常では有益な免疫応答が不適切に働いている結果であり、しばしば炎症性反応および組織損傷を起こす。それらは多くの抗原により誘発され；および過敏性反応の原因は個体ごとに異なっているであろう。過敏性は、普通は抗原との最初の接触ではそれ自体顕性ではないが、通常は続いての接触によって現れる。過敏性の一つの形は、花粉、塵ダニまたは動物鱗屑のような無害の環境抗原に対してＩｇＥ応答が指示された場合に起こる。結果としての、ＩｇＥ−感作マスト細胞による薬理学的メディエイターの放出は、喘息または鼻炎のような症状を持つ急性炎症反応を生み出す。
【０００４】
それにもかかわらず、ＩｇＥ部位を修飾することからなる戦略は、初期感作反応の原因を防ぐことにおいて一般的にはうまくいかないであろう。従って、そのような戦略は、多分、続いての過敏性反応を中和または激しさを減少させるが、実際に感作された人の数を減少させないであろう。例えば、ある人がある種の抗原に対して過敏性であることが知られている場合、そのような状態に対処する一般的な（および唯一の安全な）方法は、過敏性の人を可能な限り抗原から隔離することである。実際、どんな他の行動過程も過敏性個体の健康には危険であろう。それ故、過敏性個体のためには特異的蛋白質の脅威を減少させることが重要である一方、工業的目的のためには、蛋白質が最初の場所で過敏性反応を開始できないようにすることがはるかにより価値があるであろう。
【０００５】
Ｔ−リンパ球（Ｔ細胞）は免疫応答の誘導および調節に、および免疫学的エフェクター機能の遂行に鍵となる実行役である。感染性作用因子および腫瘍に対する特異的免疫性がこれらの細胞に依存していることが知られており、それらは損傷の治癒に寄与していると信じられている。一方、これらの応答を制御することを失敗すると、自己攻撃を導くであろう。一般に、種々の細胞表面機構を通し、Ｔ細胞による抗原認識に適した様式で抗原および部分抗原を捕捉および提示する抗原提示細胞の形で抗原はＴ細胞へ提示される。Ｔ細胞表面上のレセプター（Ｔ細胞レセプター）による特異的エピトープの認識により、Ｂ細胞による抗体の産生を生じる増殖を含む、一連の複雑な相互作用をＴ細胞が開始する。与えられた蛋白質またはペプチド上に存在する抗原性エピトープによりＴ細胞およびＢ細胞の両方が活性化されるが、これらの単核細胞により認識される実際のエピトープは一般的に同一ではない。事実上、免疫学的多様性の創造を開始させるようにＴ細胞を活性化するエピトープは、免疫学的応答の過程でＢ細胞によりもっとあとで認識されるエピトープとはしばしば全く異なっている。それ故、過敏性に関して、Ｔ細胞および抗原間の特異的抗原相互作用は、抗原暴露への免疫応答の開始においては決定的要素であり、その相互作用の特質（即ち、エピトープ認識）は、完全に展開したアレルギー反応の続いての進展にはしばしば関連しない。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０７９１は出発材料としてポリアルキレンオキシドを使用する、減じられたアレルゲン性を持つポリアルキレンオキシド−ポリペプチド結合体を製造する方法を開示している。
【０００７】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３０１４８は、共有結合で結合された２つまたはそれ以上のポリペプチド分子を持っている一つのポリマー性担体分子を含み、減じられたアレルゲン性を持つポリペプチド結合体を開示している。
【０００８】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１７９２９は、親ポリペプチドへ１から３０の多分子を結合させる工程を含んでいる、減じられたアレルゲン性を持つポリペプチドを製造する方法を開示している。
【０００９】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１０７５５は、動物において減じられた免疫原性応答を惹起する蛋白質変異体を製造する方法を開示している。この出願において、問題とする蛋白質（一連のプロテアーゼおよびその変異体）はラットを免疫するために使用された。ラットからの血清は次に、免疫された血清中にすでに産生されおよび存在する、問題とする蛋白質およびその変異体に対するポリクローナル抗体の反応性を測定するために使用された。これらの結果から、比較すると試料中の抗体が蛋白質およびその変異体とより反応的であるかまたは反応性が低いかを決定することが可能であり、蛋白質中のどの変化が結合するＩｇの能力を中和または減少させ易そうであるかの分析を可能にしている。ラットについてのこれらの試験から、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１５１、１５２、１５３、１５４、１６１、１６２、１６３、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１８６、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２４７、２５１、２６１に対応するサブチリシン３０９残基を変化させると免疫学的潜在能力の変化を生じるであろうという結論に到達した。
【００１０】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０１９１は、親単量体蛋白質のオリゴマー形から成る低アレルギー性蛋白質を開示しており、ここでオリゴマーはその活性を保持している。
【００１１】
いくつかの研究が、ある種の蛋白質のアレルゲン性を減少させる方法、および一部の個体においてアレルギー反応を起こすエピトープの同定を提供しているが、これらのエピトープを同定するために使用されたアッセイは前もって抗原に暴露された血液血清中のＩｇＥおよびＩｇＧ抗体の測定を一般的に含んでいる。しかしながら、一度Ｉｇ反応が開始されたら、感作はすでに起こっている。従って、最初の場所で感作を起こすエピトープを決定する方法が必要とされており、これらのエピトープの中和は感作が起こる可能性を著しく小さくするであろうから、初期感作の可能性を減少させる。また、促進された免疫応答を生み出す蛋白質を製造する必要があり、および、低免疫原性応答を生み出す、天然に存在する蛋白質を同定する必要がある。本発明はこれらおよびその他の必要性に応じている。
【００１２】
発明の要約
本発明は、望まれたような免疫原性応答を生み出す蛋白質、そのような蛋白質を同定および作製する方法、およびそのような蛋白質を使用する方法を提供する。例えば、以下の詳細な説明から明らかになるように、ここに提供される方法および組成物は高−および低アレルゲン性組成物の形成に有用である。ここで使用する場合、高および低とは、本発明の蛋白質を含まない同一の組成物よりも、各々、より大きいまたはより小さい免疫原性応答を生み出す組成物を意味している。そのような組成物には洗浄組成物、織物処理剤、コンタクトレンズ洗浄溶液または製品、ペプチド加水分解製品、廃棄物処理製品、皮膚、髪および口腔管理を含んでいる化粧品処方、血液血餅除去製品、酵素のような研究試薬、およびワクチンを含む治療薬が含まれる。
【００１３】
本発明の一つの様相において、問題とするポリペプチドが選択され、ここに提供される。問題とするポリペプチドは、好適にはＴ細胞エピトープを持っているものであり、以下に説明するように続いて改変される。しかしながら、問題とするポリペプチドは、天然に存在する特性に基づいて選択され、改変されなくてもよい。さらに、問題とするポリペプチドはＴ細胞エピトープを持っていないものから選択され、Ｔ細胞エピトープを持つように改変されてもよい。
【００１４】
本発明の一つの様相において、Ｔ細胞エピトープを含んでいる問題とするポリペプチドの変異体が提供される。変異体は、変異体およびポリペプチドが個体において異なった免疫原性応答を生み出すように、改変されたＴ細胞エピトープを持っていることが問題とするポリペプチドと異なっている。変異体は該問題とするポリペプチドよりも、より大きいかまたはより小さい免疫原性応答を生み出すように製造および選択できる。
【００１５】
問題とするポリペプチドは任意の問題とするポリペプチドであり得る。一つの様相において、ポリペプチドは酵素、ホルモン、因子、ワクチンおよびサイトカインから成る群より選択される。一つの態様において、問題とするポリペプチドは該個体により該個体に対して内因性であると認識されないし、また“自身”であるとも認識されない。ここで示したように、問題とするポリペプチドは酵素である。一つの態様において、酵素はリパーゼ、セルラーゼ、エンドグルコシダーゼＨ、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから成る群より選択される。好適な態様において、問題とするポリペプチドおよび該問題とするポリペプチドの変異体は各々、少なくともいくらかの同一の活性を含んでいる。例えば、プロテアーゼの変異体が提供されるならば、該変異体は改変された免疫原性応答を生み出すであろうが、検出可能な、および好適には同等のプロテアーゼ活性を保持しているであろう。
【００１６】
問題とするポリペプチドの変異体が提供される場合、Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸置換、欠失、付加およびそれらの組み合わせを含む多くの様式で改変されている。好適には、Ｔ細胞エピトープはアミノ酸置換を持っていることで改変される。ここで一つの態様において、アミノ酸置換は問題とするポリペプチドホモログの対応するアミノ酸が作製されるように行われ、ここで、ホモログは問題とするポリペプチドの対応する位置に同一のＴ細胞エピトープを含んでいない。一つの様相において、問題とするポリペプチドの終端部分は、少なくとも一つのＴ細胞エピトープが問題とするポリペプチドホモログの対応する終端部分と置き換えられており、置き換えは該異なった免疫原性応答を生み出す。ここで提供される別の態様において、所望の免疫原性応答を生み出すポリペプチドをコードしている核酸が提供される。さらに、本発明はここに提供された核酸を含んでいる発現ベクターおよび宿主細胞を包含している。さらに、本発明のポリペプチドおよびその変異体が同定されたら、その実質的に相同的な配列またはポリペプチドおよび変異体にハイブリダイズする配列が同定でき、ここに提供される。相同的とはさらに以下に定義され、類似または一致をさしており、一致が好適である。好適には、相同的配列とは、ここに提供されたポリペプチドおよび変異体の活性を持っているアミノ酸配列、またはペプチドをコードしている核酸配列である。
【００１７】
本発明のさらに別の様相は、蛋白質により生み出される免疫原性応答を決定するための方法である。一つの態様において、本方法は（ａ）単一の血液源から、樹状細胞溶液および天然のＣＤ４+および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞溶液を得；（ｂ）樹状細胞の該溶液での分化を促進し；（ｃ）分化した樹状細胞の該溶液および該天然のＣＤ４+および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞と該蛋白質を混合し；および（ｄ）該工程（ｃ）におけるＴ細胞の増殖を測定することを含んでいる。
【００１８】
蛋白質により生み出された免疫原性応答を決定する方法は、蛋白質の比較免疫原性応答を同定するためにも使用できる。それ故、一つの様相において、蛋白質の免疫原性応答を決定する方法はさらに、一つまたはそれ以上の蛋白質の免疫原性応答を比較することを含んでいる。蛋白質とはお互いのホモログ、同一の蛋白質の変異体、同一の蛋白質の異なった型、例えば、異なったプロテアーゼ、または同一の蛋白質の異なったペプチドであり得る。
【００１９】
本発明はさらに、該ポリペプチドの免疫原性を決定し；該ポリペプチド中のＴ細胞エピトープを同定し；および該ポリペプチドの免疫原性を改変するように該Ｔ細胞エピトープを改変することから成る、問題とするポリペプチドの免疫原性を改変する方法を提供する。ここに説明されているように、該改変は単一アミノ酸を改変する、または問題とするポリペプチドの一部を対応するホモログの一部と交換することにより行うことができ、ここで交換は改変された免疫原性応答を生み出す。
【００２０】
本発明の他の様相は以下の説明から当業者には理解されるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明に従うと、Ｔ細胞エピトープを同定するための方法が提供される。さらに、比較的無力なまたは強力なＴ細胞エピトープを持っている、またはＴ細胞エピトープを持っていない天然に存在している蛋白質を含む蛋白質が本発明の方法に従って同定される。それ故、本発明は、天然に存在する蛋白質ならびに適切な応答を生み出すように突然変異されている蛋白質を含んだ、望まれるような免疫原性応答を生み出す蛋白質の同定および製造を可能にする。用語、蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドはここでしばしば相互交換的に使用されることを理解されたい。ペプチドが蛋白質の一部である場合、用語が使用されている文脈により、当業者はこのことを理解できる。
【００２２】
一つの態様において、本発明は以下のようなエピトープおよび非エピトープを同定するアッセイを提供する：分化樹状細胞は天然のヒトＣＤ４+および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞および問題とするペプチドと混合される。特に、以下の工程から成る、Ｔ細胞エピトープを認識する方法が提供される：（ａ）単一の血液源から、樹状細胞溶液および天然のＣＤ４+および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞溶液を得；（ｂ）樹状細胞の該溶液での分化を促進し；（ｃ）分化した樹状細胞の該溶液および該天然のＣＤ４+および／またはＣＤ８+  Ｔ細胞と問題とするペプチドを混合し；および（ｄ）該工程（ｃ）におけるＴ細胞の増殖を測定する。
【００２３】
一つの態様において、分析されるべき、問題とするペプチドは問題とするポリペプチドから誘導される。本発明の実施において、個体または個体のサンプリングにおいて感作を起こすことができるエピトープの位置を正確に同定することが可能である。本発明の好適な態様において、問題とするポリペプチドのすべてまたは一部に対応する一連のペプチドオリゴマーが製造される。例えば、蛋白質の関連する部分またはすべてを含んでいるペプチドライブラリーが生成される。一つの態様において、ペプチドを製造する様式はペプチドライブラリー内へ重複を導入するものであり、例えば、目的とする蛋白質のアミノ酸配列１−１０に対応する第一のペプチドを製造し、目的とする蛋白質のアミノ酸配列４−１４に対応する第二のペプチド、目的とする蛋白質のアミノ酸配列７−１７に対応する第三のペプチド、目的とする蛋白質のアミノ酸配列１０−２０に対応する第四のペプチドなど、代理のペプチドが全分子に対応するまで作製される。各々のペプチドを個々に本明細書で提供されるアッセイで分析することにより、Ｔ細胞により認識されるエピトープの位置を正確に同定することが可能である。上の例において、一つの特定のペプチドが隣より大きな反応があれば、三つのアミノ酸以内でのエピトープアンカー領域の同定を容易にするであろう。これらのエピトープの位置を同定した後は、ペプチドがその本来のＴ細胞応答と異なったＴ細胞応答を生み出すまで、各々のエピトープ内のアミノ酸を改変することが可能である。もしくは、標的（例えば、感染性作用因子または腫瘍細胞）に対する免疫応答を刺激するため、エピトープをその本来の形で使用してもよい。さらに、所望の高または低Ｔ細胞エピトープ能力を持つっているとここで同定される蛋白質は、その天然に存在する形で使用してもよい。
【００２４】
本明細書で使用される場合、“抗原提示細胞”とは、Ｔ細胞表面上のレセプターにより同定される抗原をその表面に提示する免疫系の細胞を意味している。抗原提示細胞の例は樹状細胞、指状突起細胞、活性化Ｂ細胞およびマクロファージである。
【００２５】
本明細書で使用される場合、“Ｔ細胞増殖”とは、抗原とまたは抗原なしで、抗原提示細胞とＴ細胞とのインキュベーション間に生み出されたＴ細胞の数を意味している。
【００２６】
本明細書で使用される場合、“基準Ｔ細胞増殖”とは、ペプチドまたは蛋白質抗原不在下で、抗原提示細胞への暴露に応答して個体で標準的に観察されるＴ細胞増殖を意味している。ここでの目的のためには、基準Ｔ細胞増殖レベルは各々の個体に基づいた試料あたり、抗原不在下で抗原提示細胞に応答したＴ細胞の増殖として決定された。
【００２７】
“Ｔ細胞エピトープ”とは、抗原を含んでいるペプチドへの免疫学的応答の開始において、Ｔ細胞レセプターにより認識されるペプチドまたは蛋白質の特徴的部分を意味している。Ｔ細胞によるＴ細胞エピトープの認識は一般的に、Ｔ細胞が抗原提示細胞上に発現されているクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）分子に結合されている抗原のペプチド断片認識する機構を経ていると信じられている（例えば、Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｇ．編，“ＭＨＣ−制限応答活性化のための抗原必要条件”，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ，９８卷，ｐ．１８７（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ；Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）（１９８７）を参照されたい）。
【００２８】
本明細書で使用される場合、“試料”は、問題とする抗原に対する天然の（即ち、感作されていない）単核細胞を含んでいる。
本明細書で使用される場合、“ホモログ”とは、問題とする蛋白質と類似の触媒作用、構造および／または使用を持っている蛋白質または酵素を意味している。本発明の目的には、ホモログおよび問題とする蛋白質は進化的に関係している必要はない（例えば、異なった種からの同一の機能的蛋白質）。問題とする蛋白質中のエピトープのホモログからの類似のセグメントへの置き換えは、破壊的な変化を減少させるであろうので、問題とする蛋白質に類似した三次および／または一次構造を持つホモログを発見することが望ましい。それ故、密接に相同な酵素はエピトープ置換の最も望ましい供給源を提供する。もしくは、可能であれば、所定の蛋白質のヒト類似体を探すことが都合がよい。例えば、細菌ズブチリシン中の特異的エピトープをズブチリシンのヒト類似体（即ち、ヒトズブチリシン）からの配列と置換すると、細菌蛋白質のアレルゲン性をより低くするべきである。
【００２９】
“類似”配列は、置き換えアミノ酸が類似の機能を示し、エピトープにおいてかまたは近辺で、問題とする蛋白質中の三次構造および／または保存されたアミノ酸の残基を確保することにより決定される。それ故、エピトープ領域が、例えば、アルファ−へリックスまたはベータ−シート構造を含んでいる場合、置き換えアミノ酸はその特異的構造を維持していなければならない。本明細書で提供されたアッセイに従って決定されたエピトープは、次に問題とする蛋白質の免疫学的能力を減少または増加させるために修飾される。好適な態様において、修飾されるべきエピトープは試料中の基準Ｔ細胞増殖の３倍より高いＴ細胞増殖レベルを生み出している。修飾された場合、エピトープは基準増殖の３倍未満、好適には基準増殖の２倍未満、および最も好適には試料中の基準増殖未満または実質的に等しいレベルを生み出す。
【００３０】
好適には、エピトープは以下の方法の一つで修飾される：（ａ）エピトープのアミノ酸配列は、問題とする蛋白質のヒトホモログからの類似配列により置換される；（ｂ）エピトープのアミノ酸配列は、問題とする蛋白質の非ヒトホモログからの類似配列により置換され、その類似配列は、問題とする蛋白質の配列よりもＴ細胞エピトープ認識による、より低い免疫原性（例えば、アレルギー性）応答を生み出す；（ｃ）エピトープのアミノ酸配列は、エピトープの主三次構造特質を実質的に模倣しているが、問題とする蛋白質の配列よりもＴ細胞エピトープ認識による、より低い免疫原性（例えば、アレルギー性）応答を生み出す配列で置換される；または（ｄ）問題とする蛋白質の配列よりもＴ細胞エピトープ認識による、より低い免疫原性（例えば、アレルギー性）応答を生み出す任意の配列で置換される。
【００３１】
しかしながら、当業者は所望の成果に依存して、他の方法でエピトープを修飾できることを容易に認識するであろう。例えば、もしＴ細胞ワクチンが望まれるとしたら、エピトープのアミノ酸配列は、促進されたＭＨＣ結合および／またはＴ細胞認識によりペプチドに対する免疫学的応答を増加させるアミノ酸で置換されることが企図される。別の例において、もし自己抗原に対する自己免疫応答を変えるとしたら、エピトープのアミノ酸配列は、炎症性または他の免疫応答を減少またはシフトを起こすアミノ酸で置換されることが企図される。
【００３２】
本発明は免疫原性応答を調節することが望まれるすべての蛋白質に拡張できる（例えば、Ｔ細胞ワクチンとして使用されるペプチド、または例えば、癌、感染性疾患および自己免疫疾患に対する治療剤として使用されるペプチドまたは蛋白質）。当業者は本発明の蛋白質およびペプチドは天然の蛋白質およびペプチドである必要がないことを容易に認識するであろう。実際、本発明の一つの態様において、本明細書で説明されるアッセイは混合遺伝子からの蛋白質の免疫学的応答を決定するために使用される。遺伝子混合およびそのような遺伝子発現の説明については、Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７（１９９４）；Ｐａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４（１９９７）：Ｋｕｃｈｎｅｒ  ＆  Ａｒｎｏｌｄ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５２３（１９９７）；Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．２７２：３３６（１９９７）；Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８（１９９８）；Ｇｉｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１２８０９（１９９８）；Ｈａｒａｙａｍａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７６（１９９８）；Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｐｒｏｇ．１５：４６７（１９９９）；およびＳｕｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．６：７７（１９９９）を参照されたい。アッセイは混合遺伝子によりコードされている蛋白質の免疫学的応答を予想するために使用された。一度決定されたら、蛋白質への免疫学的応答を調節するために蛋白質を改変できる。
【００３３】
上記の蛋白質およびペプチドに加え、本発明は蛋白質のアレルゲン性を減少させるために使用できる。これらの蛋白質には、グルカナーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、エンドグルコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ−Ｈ）、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、アミラーゼなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。天然に存在するアミノ酸配列の、ヒトのような動物に対するアレルゲン性を減少させることに加え、本発明は突然変異を受けたヒト蛋白質（例えば、蛋白質の機能活性が変化するように改変された蛋白質）のアレルゲン性を減少させることも包含している。多くの例において、ヒト蛋白質の突然変異（例えば、活性が増加するように）では、突然変異を受けた蛋白質中に新規Ｔ細胞エピトープの取り込みを生じる。本発明のアッセイは新規Ｔ細胞エピトープの存在を決定するために、および突然変異を受けた蛋白質のアレルゲン性を減少させるであろう置換アミノ酸を決定するために使用できる。本発明は上記の蛋白質および多くの他の蛋白質を包含するが、簡単のため、以下に本発明の特に好適な態様、プロテアーゼの修飾が説明されるであろう。プロテアーゼはカルボニルヒドロラーゼであり、一般的には蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断するように働いている。本明細書で使用される場合、“プロテアーゼ”とは天然に存在するプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼを意味している。天然に存在するプロテアーゼにはａ−アミノアシルペプチド  ヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノ  ヒドロラーゼ、セリン  カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、チオール  プロティナーゼ、カルボキシルプロティナーゼおよびメタロプロティナーゼが含まれる。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼ、ならびにエンドおよびエキソプロテアーゼが含まれている。
【００３４】
本明細書の一つの態様において、ハイブリッド  ポリペプチドが提供される。“ハイブリッド  ポリペプチド”とは少なくとも二つの異なった蛋白質（好適には、お互いにホモログである）から設計された蛋白質である。例えば、好適なハイブリッド  ポリペプチドは蛋白質のＮ末端および蛋白質ホモログのＣ末端を持っているであろう。好適な態様において、二つの終結末端は結合できて、完全長活性蛋白質に対応する。好適な態様において、ホモログは実質的な類似性を共有しているが、同一のＴ細胞エピトープは持っていない。それ故、一つの態様において、例えば、Ｃ末端に一つまたはそれ以上のＴ細胞エピトープを持っている問題とするポリペプチドは、Ｃ末端により効力が弱いＴ細胞エピトープ、またはより少ないＴ細胞エピトープを持っている、またはＣ末端にＴ細胞エピトープを持っていないホモログのＣ末端で置き換えられたＣ末端を持っている。このように、当業者は、ホモログ間のＴ細胞エピトープを同定できることにより、異なった免疫原性応答を生み出す種々の変異体を形成できることについて理解している。さらに、内部部分および一つ以上のホモログが本発明の変異体を製造するために使用できることを理解されたい。
【００３５】
より一般的には、ここに提供された変異体は前駆体アミノ酸配列の一つまたはそれ以上の置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせにより前駆体アミノ酸配列から誘導できる。そのような修飾は好適には前駆体酵素のアミノ酸配列をコードしている“前駆体ＤＮＡ配列”であるが、前駆体蛋白質の操作によっても可能である。前駆体ＤＮＡ配列のそのような操作に適した方法には本明細書で開示した方法、ならびに当業者には既知の方法が含まれる（例えば、ＥＰ  ０  ３２８２９９、ＷＯ８９／０６２７９およびここですでに参照した米国特許を参照されたい）。
【００３６】
ズブチリシンは細菌または菌類プロテアーゼであり、一般的に蛋白質またはペプチドのペプチド結合を切断するように働いている。本明細書で使用する場合、“ズブチリシン”とは天然に存在するズブチリシンまたは組換えズブチリシンを意味している。一連の天然に存在するズブチリシンは種々の微生物種により産生およびしばしば分泌されることが知られている。この系列のメンバーのアミノ酸配列は完全には相同的ではない。しかしながら、この系列のサブチリシンは同一または類似の型の蛋白分解活性を示している。この群のセリン  プロテアーゼは触媒三連構造を定義している共通のアミノ酸配列を共有しており、それはセリン  プロテアーゼのキモトリプシン関連群とは区別される。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリン  プロテアーゼは両方ともアスパラギン酸、ヒスチジンおよびセリンを含んでいる触媒三連構造を持っている。ズブチリシン関連プロテアーゼにおいて、これらの相対的順序は、カルボキシ末端から読んで、アスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。しかしながら、肝トリプシン関連プロテアーゼにおいて、相対的順序はヒスチジン−アスパラギン酸−セリンである。従って、本明細書のズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの触媒三連構造を持っているセリン  プロテアーゼを指している。例としては図３に同定されているズブチリシンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。一般的におよび本発明の目的のために、プロテアーゼ中のアミノ酸の番号付けは、図１に示されている成熟バシラス アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン配列に割り当てられた番号に対応している。
【００３７】
“組換え体”、“組換えズブチリシン”または“組換えプロテアーゼ”とはサブチリシンまたはプロテアーゼをコードしているＤＮＡ配列が、天然に存在するアミノ酸配列中の一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入をコードする変異体（突然変異体）ＤＮＡ配列を産生するように修飾されているズブチリシンまたはプロテアーゼを指している。そのような修飾を生成させるのに適した方法（それは本明細書に開示された方法と組み合わされるであろう）には米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）、米国特許第５，２０４，０１５号および米国特許第５，１８５，２５８号に開示されている方法が含まれる。
【００３８】
“非ヒトズブチリシン”およびそれらをコードしているＤＮＡは多くの原核および真核生物体から得られる。原核生物体の適した例には、大腸菌またはシュードモナスのようなグラム陰性生物体およびミクロコッカスまたはバシラスのようなグラム陽性細菌が含まれる。ズブチリシンおよびそれらの遺伝子が得られる真核生物体の例には、サッカロミセス セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母、アスペルギルス種のような菌類が含まれる。
【００３９】
“ヒトズブチリシン”とはズブチリシン型触媒活性を持つヒト起源の蛋白質、例えば、ヒト由来プロテアーゼのケキシン  ファミリーを意味している。そのような蛋白質の例は図７の配列により表される。さらに、本明細書で提供される蛋白質の誘導体またはホモログ（マウスまたはウサギのような非ヒト起源のものを含み、それはペプチド結合を加水分解する能力などのようなペプチドの本質的活性を保持している）は問題とするポリペプチドと少なくとも５０％、好適には少なくとも６５％、および最も好適には少なくとも８０％、さらに好適には少なくとも９０％、およびしばしば９５％または９８％ほどの相同性を持っている。一つの態様において、問題とするポリペプチドは図に示されている。
【００４０】
本明細書で使用されたアミノ酸位置番号は、図１に示された成熟バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン配列に割り当てられた番号に対応している。しかしながら、本発明はこの特定のズブチリシンの突然変異に限定されるわけではなく、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン中の特定の同定された残基と“等価”である位置にアミノ酸残基を含んでいる前駆体プロテアーゼにも拡張される。本発明の好適な態様において、前駆体プロテアーゼはバシラス レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）であり、置換、欠失または挿入が、上に掲げたアミノ酸残基と対応するＢ．レンタス中の等価なアミノ酸残基で行われる。
【００４１】
前駆体プロテアーゼの残基（アミノ酸）は、もしそれが相同的（即ち、一次かまたは三次構造中の位置に対応している）であるか、またはバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン中の特定の残基またはその一部と類似しているならば（即ち、同一または同様の化学的に結合、反応または相互作用する機能的能力を持っている）、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン中の残基と等価である。本明細書で使用される場合、“対応する”とは一般的にペプチドに沿った類似の位置を指している。
【００４２】
一次構造の相同性を確立するため、前駆体プロテアーゼのアミノ酸配列はバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン一次構造、特に、ズブチリシン中で不変であることが知られている残基の組（その配列は既知である）と直接比較される。例えば、図２はＢ．アミロリクエファシエンスズブチリシンおよびＢ．レンタスズブチリシン間の保存された残基を示している。保存残基をアラインメントさせた後、アラインメントを維持するために必要な挿入および欠失を考慮に入れ（即ち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を避ける）、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン一次構造中の特定のアミノ酸と等価な残基を明らかにする。保存残基のアラインメントは好適には、そのような残基の１００％を保存しなければならない。しかしながら、７５％を超えるまたは５０％ほどのアラインメントもまた等価な残基を定義するために十分能力がある。触媒三連構造、Ａｓｐ３２／Ｈｉｓ６４／Ｓｅｒ２２１の保存は維持されなければならない。
【００４３】
例えば、バシラス アミロリクエファシエンス、枯草菌、バシラス リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ））およびバシラス レンタスからのズブチリシンのアミノ酸配列はアミノ酸配列間の最大量の相同性を提供するようにアラインメントできる。これらの配列の比較は、各々の配列中に多くの保存残基が存在することを示している。ＢＰＮおよびＢ．レンタス間の保存残基は図２に同定されている。
【００４４】
従って、これらの保存残基は、本明細書で好適なプロテアーゼ前駆体酵素であるバシラス レンタスからのズブチリシン（１９８９年７月１３日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０６２７９）、または好適なバシラス レンタスズブチリシンと高度に相同的であるＰＢ９２と称されるズブチリシン（ＥＰ  ０  ３２８  ２９９）のような他のズブチリシンにおける、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン中の対応する等価なアミノ酸残基を明確にするために使用される。これらのサブチリシンのいくつかのアミノ酸配列が、保存残基の最大の相同性を生み出すように、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの配列とともに図３Ａおよび３Ｂにアラインメントされている。見てわかるように、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンと比較するとバシラス レンタスの配列中には多くの欠失が存在している。従って、例えば、他のズブチリシンにおけるバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンのＶａｌ１６５と等価なアミノ酸は、Ｂ．レンタスおよびＢ．リシェニフォルミスにおいてはイソロイシンである。
【００４５】
従って、例えば、＋１７０位のアミノ酸はＢ． アミロリクエファシエンスおよびＢ．リシェニフォルミスズブチリシンの両方においてはリジン（Ｋ）であり、サビナーゼではアルギニン（Ｒ）である。しかしながら、本発明のプロテアーゼ変異体の一態様において、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの＋１７０と等価なアミノ酸はアスパラギン酸（Ｄ）で置換されている。本発明のアミノ酸のための略号および一文字コードはＰａｔｅｎｔｌｎ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）１９９０，ｐ．１０１に従っている。
【００４６】
相同的配列はまた“配列比較アルゴリズム”を使用することによっても決定できる。比較のための配列最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の相似法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的検分により実行できる。配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアーはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードで整列した場合、ある正の値の閾値スコアＴと一致または満足するクエリー（ｑｕｅｒｙ）配列中の長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することにより、高評点対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含んでいる。これらの最初の近傍ワ−ドヒットは、それらを含んでいるより長いＨＳＰを発見する出発点として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り、比較されている二つの配列の各々に沿って、両方の方向に拡張される。ワードヒットの拡張は：累積アラインメントスコアが最大達成値から数Ｘだけ低下した場合；累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；またはどちらかの配列の末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００４７】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは二つの配列間類似性の統計的分析を遂行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然起こるであろう確率の指標を提供する最小総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列のような蛋白質の比較において、もし最小総和確率が約０．１未満、好適には約０．０１未満、および最も好適には約０．００１未満であれば、アミノ酸配列はプロテアーゼのような蛋白質と類似していると考えられる。
【００４８】
“等価な残基”はまたその三次構造がＸ線結晶学により決定されている前駆体蛋白質の三次構造レベルでの相同性を決定することによっても定義される。等価な残基とは、プロテアーゼのような前駆体蛋白質およびバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの特定アミノ酸残基の二つまたはそれ以上の主鎖原子の原子座標（Ｎに対してＮ、ＣＡに対してＣＡ、Ｃに対してＣおよびＯに対してＯ）が、アラインメント後に０．１３ｎｍ以内、好適には０．１ｎｍ以内であるものとして定義される。バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンに対し、問題とするプロテアーゼのような蛋白質の、非水素蛋白質原子原子座標の最大の重複を与えるように最良モデルが配向および位置決めされた後に、アラインメントが達成される。最良モデルとは、利用可能な最高分解能で、実験回析データに対して最も低いＲ因子を与えている結晶学的モデルである。
【００４９】
バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの特定の残基と機能的に類似している等価な残基とは、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの特定の残基で定義および特徴付けされた様式で、蛋白質構造、基質結合または触媒を改変、修飾または寄与するようなコンホメーションを採用する、プロテアーゼのような前駆体蛋白質のアミノ酸として定義される。さらにそれらは、与えられた残基の主鎖原子は相同的位置の占有に基づいた等価の範疇を満足していないが、残基の少なくとも二つの側鎖原子の原子座標がバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内に存在する程度まで類似の位置を占めている前駆体蛋白質、例えば、プロテアーゼ（その三次構造はＸ線結晶学により得られている）の残基である。バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの三次元構造の座標はＥＰＯ公開番号０  ２５１  ４４６（米国特許第５，１８２，２０４号に相当する、その開示は本明細書に参照文献として組み入れられている）に示されており、上に概説されているように、三次構造レベルで等価な残基を決定するために使用できる。
【００５０】
置換、挿入または欠失のために同定された残基のいくつかは保存残基であるのに対し、他のものは違っている。保存されていない残基の場合、一つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えは、天然に観察されるアミノ酸配列に対応しないアミノ酸配列を持っている変異体を生成する置換に限定される。保存残基の場合、そのような置き換えは天然に存在する配列を生じないであろう。本発明の変異体は、蛋白質変異体の成熟形、ならびにそのような蛋白質変異体のプロ−およびプレプロ−形を含んでいる。プレプロ−形は、蛋白質の発現、分泌および成熟を容易にするので好適な構築物である。
【００５１】
“プロ配列”とは、蛋白質の成熟形のＮ末端部分に結合されているアミノ酸の配列を指しており、それが除去された時、蛋白質の“成熟”形が出現する。多くの蛋白分解性酵素が天然で翻訳プロ酵素生成物として観察されており、翻訳後プロセッシングなしでは、この様式で発現される。プロテアーゼ変異体のような蛋白質変異体を生成するための好適なプロ配列は、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの推定プロ配列であるが、他のプロ配列を使用してもよい。
【００５２】
“シグナル配列”または“プロ配列”とは、蛋白質の成熟またはプロ形の分泌に関与する蛋白質のＮ末端部分またはプロ蛋白質のＮ末端部分に結合された任意のアミノ酸配列を指している。シグナル配列のこの定義は機能的なものであり、天然条件下で蛋白質分泌の実現に関与する蛋白質遺伝子のＮ末端部分によりコードされているすべてのアミノ酸配列を含むつもりである。本発明は、ここに定義されたような蛋白質変異体の分泌を達成するために、そのような配列を利用する。一つの可能なシグナル配列には、バシラス レンタス（ＡＴＣＣ  ２１５３６）からのズブチリシン  シグナル配列の残りへ融合された、枯草菌ズブチリシンからのシグナル配列の最初のアミノ酸残基が含まれる。
【００５３】
蛋白質変異体の“プレプロ”形は、蛋白質のアミノ末端へ作動可能なように連結されたプロ配列を持っている蛋白質の成熟形およびプロ配列のアミノ末端に作動可能なように連結された“プレ”または“シグナル”配列から成っている。
【００５４】
“発現ベクター”とは、ＤＮＡ配列を含んでいるＤＮＡ構築物を指しており、それは適した宿主中で該ＤＮＡの発現を達成できる、適した調節配列へ作動可能なように連結されている。そのような調節配列は、転写を達成するためのプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードしている配列、および転写および翻訳の終結を調節する配列を含んでいる。ベクターはプラスミド、ファージ粒子または単純に潜在能力を持つゲノム挿入物であることができる。適した宿主内へ形質転換されたら、ベクターは宿主ゲノムから独立して複製および機能してもよいし、または、いくつかの例のように、ゲノムそれ自身内へ組み込まれてもよい。プラスミドは現在のところベクターの形で最も普通に使用されているので、本明細書において“プラスミド”および“ベクター”はしばしば相互交換的に使用されている。しかしながら、等しい機能を果たしおよび本分野で知られている、または知られてきた、他の形の発現ベクターも含むことを本発明は意図している。
【００５５】
本発明で使用される“宿主細胞”とは、一般的には、酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌できないように、好適には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）に開示されている方法により操作されている原核性または真核性宿主である。蛋白質を発現するための好適な宿主細胞は、酵素的に活性な中性蛋白質およびアルカリ性プロテアーゼ（ズブチリシン）が欠損しているバシラス株ＢＧ２０３６である。株ＢＧ２０３６の構築は米国特許第５，２６４，３６６号に詳細に説明されている。蛋白質を発現するための他の宿主細胞には、枯草菌ｌ１６８（米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）および米国特許第５，２６４，３６６号にまた説明されており、その開示は本明細書に参照文献として組み入れられている）、ならびにＢ．リシェニフォルミスおよびＢ．レンタスなどのような任意のバシラス株が含まれる。
【００５６】
宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターにより形質転換またはトランスフェクトされる。これらの技術は任意の分子生物学実験指導書、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）１−３巻，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８９）（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７補）の合弁事業（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）、に見ることができる。そのような形質転換された宿主細胞は蛋白質変異体をコードしているベクターを複製または所望の蛋白質変異体を発現することができる。蛋白質変異体のプレ−またはプレプロ−形をコードしているベクターの場合、そのような変異体は、発現された場合、典型的には宿主細胞から宿主細胞培地内へ分泌される。
【００５７】
二つのＤＮＡ領域間の関係を説明する場合、“作動可能なように連結された”とは、単純にそれらはお互いに機能的に関係していることを意味している。例えば、もしプレ配列がシグナル配列として機能する（蛋白質の成熟形の分泌に関与して、最も大きな可能性としてはシグナル配列の切断に関与して）ならば、それはペプチドへ作動可能なように連結されている。もしプロモーターが配列の転写を調節するならば、それはコード配列へ作動可能なように連結されており；もしリボソーム結合部位が翻訳を可能にするように位置しているならば、それはコード配列へ作動可能なように連結されている。
【００５８】
天然に存在する前駆体蛋白質をコードしている遺伝子は、当業者には既知の一般法に従って得られる。この方法は一般的には、問題とする蛋白質の推定配列コード領域を持っている標識プローブを合成し、蛋白質を発現している生物体からゲノムライブラリーを調製し、およびプローブのハイブリダイゼーションにより問題とする遺伝子を求めてライブラリーをスクリーニングすることから成っている。陽性にハイブリダイズするクローンを位置づけし、および配列決定する。
【００５９】
与えられたＤＮＡ断片または遺伝子が本明細書に記載されている、従って、本発明の範囲内に含まれるＤＮＡ配列かどうかを分析するために“ハイブリダイゼーション”が使用される。ハイブリダイズされるべき試料は、ＤＮＡ断片の分離がサイズにより可視化できるように、アガロースゲル（例えば、０．８％アガロース）を通して電気泳動される。ＤＮＡ断片は典型的にはエチジウムブロミド染色により可視化される。ゲルは簡単に蒸留Ｈ2Ｏですすぎ、続いて穏やかに振とうしながら適切な溶液（例えば、０．２５Ｍ  ＨＣｌのような）中で脱プリンし、続いて穏やかに振とうしながら３０分間変性させる（例えば、１．５Ｍ  ＮａＯＨ中で）。復元工程では、穏やかに振とうしながら３０分間ゲルを１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍトリス、ｐＨ７．０中に置く。ＤＮＡは次に移送溶液（例えば、６Ｘ  ＳＳＣ（９００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭクエン酸三ナトリウム）のような）を使用して、適切な正に荷電したメンブラン、例えば、Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓメンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）上へ移送する。移送が完了したら、一般的には約２時間後、メンブランを例えば、２Ｘ  ＳＳＣ（２Ｘ  ＳＳＣ＝３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム）中ですすぎ、室温で風乾する。メンブランは次に適したプレハイブリダイゼーション溶液（例えば、１００ｍＬあたり：２０−５０ｍＬのホルムアミド、２５ｍＬの２０Ｘ  ＳＳＰＥ（１Ｘ  ＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ  ７．７）、２．５ｍＬの２０％ＳＤＳ、および１ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬ切断されたニシンまたはサケ精子ＤＮＡを含んでいる水溶液）中でプレハイブリダイズする（約２時間またはそれ以上）。当業者には既知であるように、プレハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミド量は日常の方法に従って得られた反応の性質に依存して変化するであろう。それ故、より少ない量のホルムアミドは、より多い量ホルムアミドを使用する同一の過程よりも、ハイブリダイズする分子の同定に関してより完全なハイブリダイゼーションを生じる。一方、より多いホルムアミドを使用することにより、強いハイブリダイゼーションバンドがより容易に視覚的に同定される。
【００６０】
問題とするＤＮＡ配列と相補的であるまたはほとんど相補的である、および一般的には１００から１０００塩基の長さであるＤＮＡプローブは、ＤＮＡ中に32Ｐを取り込むように標識される（例えば、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識システムを使用説明書に従って使用して）。標識されたプローブは９５℃へ５分間加熱することにより変性し、直ちにメンブランおよびプレハイブリダイゼーション溶液へ加える。ハイブリダイゼーション反応は適した条件下で適した時間進行させねばならない、例えば、穏やかに振とうまたは回転しながら３７℃で１８時間。メンブランをすすぎ（例えば、２Ｘ  ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳ中で）、次に適した洗浄溶液中で穏やかにかき混ぜながら洗浄する。望まれるストリンジェンシーは条件を反映し、その条件下でメンブラン（フィルター）を洗浄する。
【００６１】
特に、与えられた反応のストリンジェンシー（即ち、ハイブリダイゼーションが起こるために必要な相同性の程度）は、ハイブリダイゼーション後にフィルターが置かれる洗浄条件に依存するであろう。本明細書で定義される“低ストリンジェンシー”条件は０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの溶液中、２０℃で１５分、フィルターを洗浄することを含んでいるであろう。“高ストリンジェンシー”条件は、２回目に０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの溶液中、３７℃で３０分、フィルターを洗浄する、さらなる洗浄工程を含んでいる。
【００６２】
洗浄後、メンブランを乾燥し、結合されたプローブを検出する。もし32Ｐまたは別の放射性同位元素が標識試薬として使用された場合、結合されたプローブはオートラジオグラフィーにより検出できる。他のプローブ可視化のための他の技術は当業者にはよく知られている。結合されたプローブの検出は、核酸配列が所望の相同性を持ち、本発明に包含されることを示している。
【００６３】
クローン化蛋白質は次に、蛋白質を発現させるために宿主細胞を形質転換するために使用される。蛋白質遺伝子は高コピー数プラスミド内へ結合される。プラスミド複製に必要なよく知られた要素を含んでいる意味で、このプラスミドは宿主中で複製する：問題とする遺伝子に作動可能なように連結されたプロモーター（もしそれが宿主により認識される、即ち転写されるなら、遺伝子自身の相同的なプロモーターとして供給される）、転写終結およびポリアデニル化領域（ある種の真核宿主細胞において、蛋白質遺伝子から宿主により転写されるｍＲＮＡの安定性に必要）、それは外因性であるかまたは蛋白質遺伝子の内因性ターミネーター領域により供給される、および望ましくは、抗生物質含有培地での増殖により、プラスミド感染宿主細胞の連続的培養維持を可能にする、抗生物質耐性遺伝子のような選択遺伝子。高コピー数プラスミドはまた、宿主の複製起点も含んでおり、それにより染色体制限なしで、多数のプラスミドを細胞質中に発生させることを可能にしている。しかしながら、宿主ゲノム内へ多数の蛋白質遺伝子のコピーを組み込むことも本発明の範囲内である。このことは、相同性組換えに特に影響されやすい原核および真核生物体により促進される。
【００６４】
一つの態様において、遺伝子はＢ．レンタスまたはＢ．リシェニフォルミスからの遺伝子のような天然の遺伝子でありうる。もしくは、天然に存在するまたは変異体前駆体蛋白質をコードしている合成遺伝子が生成される。そのような方法においては、前駆体蛋白質のＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列が決定される。多、重複合成一本鎖ＤＮＡ断片がその後合成され、それはハイブリダイゼーションおよび結合により前駆体蛋白質をコードしている合成ＤＮＡが生成される。合成遺伝子構築の例は米国特許第５，２０４，０１５号（その開示は参照文献として本明細書に組み入れられている）の実施例３に示されている。
【００６５】
天然に存在するまたは合成前駆体蛋白質遺伝子がクローン化されたら、天然に存在する前駆体蛋白質の合成を超えた遺伝子使用を高めるため、多くの修飾が企てられる。そのような修飾には、米国特許第４，７６０，０２５号（ＲＥ  ３４，６０６）およびＥＰＯ公開番号０  ２５１  ４４６に開示されているような組換え蛋白質の生成、および本明細書に説明されている蛋白質変異体の生成が含まれる。
【００６６】
以下のカセット突然変異発生法が、本発明の蛋白質変異体の構築を容易にするために使用されるが、他の方法を使用してもよい。最初に、蛋白質をコードしている天然に存在する遺伝子を得、全体または部分を配列決定する。次に、コードされている酵素中の、一つまたはそれ以上のアミノ酸の突然変異（欠失、挿入または置換）が望まれている点まで、配列をスキャンする。発現されると、種々の突然変異体をコードするであろうオリゴヌクレオチドプールの、遺伝子の短いセグメントで置き換えるため、制限部位の存在についてその点に隣接している配列を評価する。遺伝子セグメントの置き換えを容易にするため、そのような制限部位は好適には蛋白質遺伝子内の特有の部位である。しかしながら、もし制限消化により発生された遺伝子断片が適切な配列中に再組み立てできるとすれば、蛋白質遺伝子中の、過度に重複していない、任意の都合のよい制限部位が使用される。もし選択された点から都合のよい距離内の位置（１０から１５ヌクレオチド）に制限部位が存在していないとすれば、読み取り枠およびコードされているアミノ酸が最終構築でどちらも変化しないような様式で遺伝子中のヌクレオチドを置換することにより、そのような部位を発生させる。所望の配列と同じにするようにその配列を変化させるための遺伝子の突然変異は、一般的に知られている方法に従って、Ｍ１３プライマー伸張により達成される。適した隣接領域の位置を捜し当てる、および二つの都合のよい制限部位配列へ到達するために必要とされる変化を評価する仕事は、遺伝子コードの重複、遺伝子の制限酵素地図、および多くの異なった制限酵素によって日常的に行える。もし都合のよい隣接制限部位が利用可能であるならば、部位を含んでいない隣接領域に関してのみ、上記の方法を使用すればよいことに注目されたい。
【００６７】
天然に存在するＤＮＡまたは合成ＤＮＡがクローン化されたら、突然変異されるべき位置に隣接する制限部位を同種の制限酵素で消化し、多数の終止末端−相補的オリゴヌクレオチドを遺伝子内へ結合する。すべてのオリゴヌクレオチドは同一の制限部位を持つように合成できるので、この方法により突然変異発生が簡素化され、制限部位を作り出すための合成リンカーを必要としない。
【００６８】
本発明の一つの様相において、前駆体蛋白質と比較して改変されたアレルゲン性潜在能を持っている変異体蛋白質を安全にするのが目的であり、そのような潜在能を減少させることは酵素の使用を安全にする。本発明はアレルゲン性潜在能を低下させるのに有用であるが、本明細書で特定された突然変異は、前駆体と比較して改変された熱安定性および／または改変された基質特異性、修飾された活性または改変されたアルカリ安定性を生じることが知られている本分野では既知の突然変異と組み合わせて利用される。
【００６９】
従って本発明は、Ｔ細胞増殖を誘導するため、バシラス レンタス中の残基位置１７０−１７３を含むＴ細胞エピトープの能力を改変することに関している。本発明の一つの特に好適な態様は、Ｒ１７０Ｄ、Ｙ１７１Ｑおよび／またはＮ１７３Ｄの一つかまたはすべての修飾を作ることを含んでいる。同様に、上で詳細の議論したように、任意の蛋白質中の対応する残基の修飾は、その蛋白質中の鍵となるＴ細胞エピトープの中和を生じるであろうことが信じられている。それ故、ここに開示されたアミノ酸残基１７０−１７３に対応する領域の突然変異と組み合わせて、Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄに対応する位置での置換、任意にバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンのＶ６８Ａ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５ＲおよびＴ２６０Ａに対応する位置から成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換が、本発明の変異体蛋白質のアレルゲン性潜在能を減少させることに加え、酵素の総合的な安定性および／または蛋白分解活性を調節するために使用される。同様に、本明細書で提供された置換は、バシラス レンタスにおけるアスパラギン（Ｎ）での、等価な位置＋７６でのアスパラギン酸（Ｄ）への突然変異と突然変異Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄを組み合わせて、および任意にバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンのＶ６８Ａ、Ｔ２１３Ｒ、Ａ２３２Ｖ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５ＲおよびＴ２６０Ａに対応する位置から成る群より選択される一つまたはそれ以上の置換と組み合わせて併用され、生じる変異体酵素の促進された安定性および／または促進された活性を生み出している。
【００７０】
本発明の最も適した態様は、以下のバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの位置に対応している、置換残基の特別の組み合わせを含んでいる：
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｑ２３６Ｈ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ａ２３２Ｖ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ；および
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ａ２３２Ｖ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ／Ｔ２６０Ａ。
これらの置換は好適にはバシラス レンタス（組換え体または天然型）ズブチリシンで行われるが、置換は任意のバシラス蛋白質で行ってもよい。
【００７１】
変異体蛋白質で得られたスクリーニングの結果に基づくと、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンの、上で注目した突然変異は、そのような変異体酵素の蛋白分解活性、これらの酵素の性能および／または安定性、および清浄または洗浄性能のために重要である。
【００７２】
本発明の蛋白質変異体の多くは、種々の洗剤組成物の処方に有用である。多数の既知化合物が、本発明の蛋白質変異体を含んでいる組成物において有用な、適した界面活性剤である。これらには、Ｂａｒｒｙ  Ｊ．ＡｎｄｅｒｓｏｎによるＵＳ４，４０４，１２８およびＪｉｒｉ  Ｆｌｏｒａ，ｅｔ  ａｌ．によるＵＳ４，２６１，８６８に開示されているような非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性イオン性界面活性剤が含まれる。適した処方は米国特許第５，２０４，０１５号（前に参照文献として組み入れられている）の実施例７に記載されている処方である。この技術は、清浄組成物として使用できる、異なった処方においてもよく知られている。典型的清浄組成物に加え、天然または野生型蛋白質が使用される任意の目的に、本発明の蛋白質変異体を使用してもよいことが容易に理解されるであろう。従って、例えば、棒状または液体石鹸応用、食器用処方、コンタクトレンズ清浄溶液または製品、ペプチド加水分解、水処理、織物応用、蛋白質製造における融合−切断酵素としてなどにこれらの変異体が使用できる。本発明の変異体は、減少したアレルゲン性に加え、界面活性剤組成物において高められた性能（前駆体と比較して）を持っている。本明細書において使用される場合、界面活性剤組成物において高められた性能とは、標準洗浄サイクル後の通常の評価により決定されるように、草または血液のような、ある種の酵素感受性汚れの清浄を増加させることとして定義される。
【００７３】
蛋白質、特に本発明のプロテアーゼは既知の粉末および６．５から１２．０のｐＨを持っている液体界面活性剤内に、重量で約０．０１から約５％（好適には０．１％から０．５％）のレベルで処方できる。これらの界面活性剤清浄組成物はまた、既知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼのような他の酵素、ならびにビルダーおよび安定化剤を含むことができる。
【００７４】
通常の清浄組成物への蛋白質、特に本発明のプロテアーゼの添加は、何の特別な制限を作り出すものではない。別の言葉で言えば、界面活性剤に適した温度およびｐＨはまた、ｐＨが上記の範囲内であり、および温度が記載した蛋白質の変性温度以下である限り、本組成物にも適している。加えて、本発明の蛋白質は界面活性剤なしでも清浄組成物中で、単独でまたはビルダーおよび安定化剤と組み合わせて使用できる。
【００７５】
本発明の変異体蛋白質は、例えば、ＵＳ  ５，６１２，０５５；ＵＳ  ５，３１４，６９２；およびＵＳ  ５，１４７，６４２に記載されているような動物飼料添加物の一部として動物飼料に含ませることができる。
【００７６】
本発明の一つの様相は、本発明の変異体蛋白質を含む、織物処理のための組成物である。本組成物はＲＤ  ２１６，０３４；ＥＰ  １３４，２６７：ＵＳ  ４，５３３，３５９；およびＥＰ  ３４４，２５９のような公示に記載されているように、例えば、絹および羊毛処理のための組成物である。
【００７７】
変異体は本分野でよく知られている方法に従って蛋白分解活性がスクリーニングされた。好適なプロテアーゼ変異体には、以下のバシラス アミロリクエファシエンスズブチリシンに対応している位置での多置換を含んでいる：
Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｑ２３６Ｈ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ；
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ａ２３２Ｖ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ；および
Ｖ６８Ａ／Ｎ７６Ｄ／Ｓ１０３Ａ／Ｖ１０４Ｉ／Ｇ１５９Ｄ／Ｋ１７０Ｄ／Ｙ１７１Ｑ／Ｓ１７３Ｄ／Ｔ２１３Ｒ／Ａ２３２Ｖ／Ｑ２３６Ｈ／Ｑ２４５Ｒ／Ｔ２６０Ａ。
【００７８】
本発明の蛋白質は、その前駆体蛋白質と比較した場合、修飾された免疫原性を示している。好適な態様において、蛋白質は減少したアレルゲン性を示している。別の態様において、蛋白質は増加したアレルゲン性を示している。免疫原性の増加は、Ｂ細胞または体液性免疫学的応答の増加により、Ｔ細胞または細胞性免疫学的応答の増加により、またはＢおよびＴ細胞両方の免疫学的応答の増加により証明される。当業者は本発明の蛋白質の使用は、大部分、蛋白質の免疫学的特性で決定されるであろうことを容易に理解するであろう。例えば、減少したアレルゲン性を示す酵素は清浄組成物に使用できる。“清浄組成物”とは織物、食器、コンタクトレンズ、他の固形物質、髪（シャンプー）、皮膚（石鹸およびクリーム）などのような物質から望まれない化合物を除去するために使用できる組成物である。
【００７９】
減少したアレルゲン性を持つ蛋白質、特に、セルラーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼはまた、織物の処理にも使用できる。“織物処理”とは、個々の紡ぎ糸または繊維が布地または衣服へ織られた、フェルト状にされたまたは編まれた織物が処理されて所望の特性が達成される工程を含んでいる。そのような所望の特性の例は、“ストーン−ウォッシング”、脱毛、除毛、のり抜き、柔軟化、および当業者にはよく知られているその他の織物処理である。
【００８０】
個体がそれに対して免疫応答を準備する治療的蛋白質もまた本発明に含まれる。特に、蛋白質の内因性産生を欠いている個体は中和抗体を形成し易く、処置に不応になる。同様に、蛋白質の修飾は、潜在的に免疫原性である新しいエピトープを導入する。本発明の方法は、中和的応答を防止するために、例えば、ヒト因子ＶＩＩＩにおけるエピトープを同定および修飾できる。
【００８１】
医薬組成物は、顆粒剤、錠剤、ピル剤、座剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏剤、およびローション剤などのような種々の形で製造できる。経口および局所使用のための医薬用有機または無機担体および／または希釈剤が、治療的に活性な化合物を含んでいる組成物を仕上げるために使用できる。本分野で知られている希釈剤には、水性媒質、植物および動物油および油脂が含まれる。安定化剤、湿潤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩または適切なｐＨ値を確保するための緩衝液、および皮膚浸透促進剤が補助剤として使用できる。医薬組成物はまた、一つまたはそれ以上の下記のものを含んでいる：血清アルブミンのような担体蛋白質；緩衝液；微結晶性セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他のデンプンのような賦形剤；結合剤；甘味料および他の芳香剤；着色剤；およびポリエチレングリコール。添加剤は本分野でよく知られており、種々の処方で使用される。
【００８２】
本明細書で参照したすべての文献および特許は、その全体がここに参照文献として組み入れられる。以下のものは例示のつもりで示されており、特許請求の範囲の限定と解釈してはならない。
【００８３】
実施例
実施例１
天然ヒトＴ細胞を使用するペプチドＴ細胞エピトープ同定のためのアッセイ
バシラス レンタスおよびヒトズブチリシンからのプロテアーゼにおける抗原性エピトープの決定のため、新鮮なヒト末梢血細胞は“天然の”ヒト、即ち、バシラス レンタスプロテアーゼに暴露または感作されていることが知られていないヒトから集めた。天然のヒトとは、個体が過去にプロテアーゼに対して暴露されたまたはプロテアーゼに対する反応を発生していることが知られていないことを意味するつもりである。末梢単核血液細胞（室温で保存された、２４時間以内のもの）は以下のように使用のために調製された：全血の１ユニットからのバフィーコート調製試料の約３０ｍｌをダルベッコリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）で５０ｍｌとし、二つのチューブに分割した。１２．５ｍｌの室温リンパ球調製密度分離培地（Ｎｙｃｏｍｅｄ  密度１．０７７ｇ／ｍｌ）を試料の下に置いた。チューブは６００Ｇで３０分遠心分離した。二つの相の界面を集め、プールし、およびＤＰＢＳで洗浄した。得られた溶液の細胞密度は血球計数器で測定した。生存度はトリパンブルー排除により測定した。
【００８４】
得られた溶液を用いて、単核細胞試料から分化した樹状細胞培養物が以下のように調製され、７５ｍｌ培養フラスコ溶液あたり１０8細胞の密度を持っていた。
【００８５】
（１）５０ｍｌの無血清ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ）に１：１００希釈ベータ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）を補給した。フラスコを５％ＣＯ2中、３７℃で２時間水平に置いて単球をフラスコ壁に付着させた。
【００８６】
（２）単球細胞の樹状細胞への分化は以下のようであった：非付着細胞を除去し、得られた付着細胞（単球）を３０ｍｌのＡＩＭ  Ｖ、８００単位／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）および５００単位／ｍｌのＩＬ４（Ｅｎｄｏｇｅｎ）と混合した；得られた混合物は３７℃、５％ＣＯ2の条件下で５日培養した。５日後、サイトカインＴＮＦａ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を０．２単位／ｍｌまで加え、およびサイトカインＩＬ−１ａ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を５０単位／ｍｌの最終濃度まで加えて混合物を５％ＣＯ2中、３７℃でさらに２日インキュベートした。
【００８７】
（３）７日目、分化した樹状細胞培養物の増殖を停止させるため、マイトマイシンＣを５０マイクログラム／ｍｌの濃度まで加えた。溶液を５％ＣＯ2中、３７℃で６０分間インキュベートした。樹状細胞はセルスクレーパーでフラスコの底の付着細胞を穏やかにこすることにより集めた。付着性および非付着性細胞は次に６００Ｇで５分間遠心分離し、ＤＰＢＳで洗浄し、計数した。
【００８８】
（４）調製された樹状細胞は、１００マイクロリットル総量のＡＩＭ  Ｖ培地に２ｘ１０4／ウェルで、９６ウェル丸底アレー内へ加えた。
ＣＤ４+Ｔ細胞はヒトＣＤ４+Ｃｅｌｌｅｃｔキット（Ｂｉｏｔｅｘ）を使用し、使用説明書に従って、樹状細胞を調製するために使用された末梢血細胞凍結試料の一部から調製された：試料の一部を融解し、Ｃｅｌｌｅｃｔカラムあたり約１０8細胞を加えるように洗浄した：細胞を４ｍｌのＤＰＢＳおよび１ｍｌのＣｅｌｌｅｃｔキットからのＣｅｌｌ試薬に再懸濁し、溶液を室温に２０分保った。得られた溶液は室温にて６００Ｇで５分遠心分離し、ペレットを２ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁してＣｅｌｌｅｃｔカラムに加えた。カラムからの溶離液は２％ヒト血清を含むＤＰＢＳに集めた。得られたＣＤ４+溶液は遠心分離し、ＡＩＭ  Ｖ培地に再懸濁し、密度を計数した。
【００８９】
ＣＤ４+Ｔ細胞懸濁液は、９６ウェルプレートの能率のよい操作を容易にするため、２ｘ１０6／ｍｌでＡＩＭ  Ｖ培地に再懸濁した。
ペプチド抗原は１Ｍ  ＤＭＳＯ保存溶液から、ＡＩＭ  Ｖ培地に１：１０の比で希釈することにより調製した。１０マイクロリットルの保存溶液を、分化した樹状細胞を含んでいる９６ウェルプレートの各々のウェルへ加えた。上記のように調製された希釈ＣＤ４+Ｔ細胞溶液の１００マイクロリットルをさらに各々のウェルへ加えた。有用な対照には、希釈ＤＭＳＯブランク、および破傷風毒素陽性対照が含まれる。
【００９０】
２１０マイクロリットルの総量で、各々のウェルの最終濃度は以下のようである：
２ｘ１０4  ＣＤ４+
２ｘ１０5樹状細胞（１０：１のＲ：Ｓ）
５ｍＭペプチド。
【００９１】
実施例２
バシラス  レンタスおよびヒトズブチリシンからのプロテアーゼにおけるＴ細胞エピトープの同定
実施例１に記載したアッセイで使用するためのペプチドはバシラス レンタスおよびヒトズブチリシンアミノ酸配列に基づいて調製された。ペプチド抗原は以下のように設計された。図１に提供されたヒトズブチリシンおよびバシラス レンタスプロテアーゼ両方の完全長アミノ酸配列から、１５ｍｅｒが合成的に製造され、各々の１５ｍｅｒは前および後の１５ｍｅｒと３つの残基を除いて重複している。
【００９２】
バシラス レンタスのアミノ酸残基列に対応するペプチドは図８に提供されているようであり、およびヒトズブチリシンのアミノ酸残基列に対応するペプチドは図７に提供されているようである。プロテアーゼに対応して使用されたペプチドは図６に提供されている。すべての試験は少なくとも二重に実施された。報告されたすべての試験は抗原破傷風毒素に対して強い陽性応答を示した。応答は各々の実験内で平均され、基準応答に対して規格化された。もし応答が少なくとも基準応答の３倍であったなら、陽性結果として記録された。
【００９３】
ヒトサブチリシンおよびバシラス レンタスから調製されたペプチドに対する免疫原性応答（即ち、Ｔ細胞増殖）は一つずつ表に記載され、各々図４および５に提供されている。Ｔ細胞増殖は、取り込まれたトリチウム法により測定された。図４および５に示された結果は、種々のペプチドに対する１０個体（図４）および１６個体（図５）における免疫原性相加的応答の比較である。応答は加算された応答として示されており、ここで１．０は各々の試料の基準応答に等しい。それ故、図４において、１０．０またはそれ未満の示数は基準応答であり、および図５において、１６．０またはそれ未満の示数は基準応答である。応答が大きいほど、より強力なＴ細胞エピトープと考えられる。
【００９４】
図４および５に示されたように、非感作個体からの天然血液試料の免疫原性応答は、バシラス アミロリクエファシエンスプロテアーゼの残基１７０−１７３に対応するバシラス レンタスからのペプチド断片で著しいアレルギー応答を示した。予想されるように、ヒトズブチリシン中の対応する断片は単に基準応答を惹起した。
【００９５】
図９は、バシラス レンタスプロテアーゼに対して過敏性であることが知られている個体から採られた試料においての、バシラス レンタスプロテアーゼから誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示している。ペプチドＥ０５はバシラス アミロリクエファシエンスからのプロテアーゼ中の１７０−１７３に対応している領域を代表している。図９に示されているように、過敏性個体はペプチドＥ０５により代表されるＴ細胞エピトープに対して高応答性であった。この結果は、本発明に従ったアッセイを実施することにより、過敏性個体のＴ細胞により同定された主エピトープを予測することが可能であることを確かにしている。
【００９６】
図１０は、バシラス レンタスプロテアーゼに過敏性であることが知られている個体から採られた試料における、バシラス レンタスプロテアーゼから誘導されたＥ０５ペプチドでの種々のアラニン置換に対するＴ細胞応答を示している。アラニン置換は、エピトープ内の特定残基の役割を決定する目的のための置換として使用された。図１０の説明は、アラニンが置換されているペプチドの位置を示している、即ち、ペプチドＥ０５（配列ＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶ）において、ＧからＡ＝２、ＳからＡ＝３、ＩからＡ＝４、ＳからＡ＝５、ＹからＡ＝６、ＰからＡ＝７、ＲからＡ＝８、ＹからＡ＝９、ＮからＡ＝１０、ＭからＡ＝１１およびＶからＡ＝１２。図１０に示されているように、バシラス レンタスからのプロテアーゼ中の残基Ｒ１７０Ａ、Ｙ１７１Ａおよび／またはＮ１７３Ａの置換は、過敏性個体の血液試料において劇的に減少した応答を生じている。
【００９７】
これらのデータから、残基１７０、１７１および１７３がバシラス レンタスからのプロテアーゼ内のアレルギー反応の開始に主として関係していることは明らかである。
【００９８】
実施例３
フミコラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からのセルラーゼ（ＣａｒｅｚｙｍｅR）におけるＴ細胞エピトープの同定
上記の工程がフミコラ インソレンスからのセルラーゼ（Ｎｏｖｏ  ＮｏｒｄｉｓｋからのＣａｒｅｚｙｍｅR）から誘導されたペプチドで実施された。図１３から見てとれるように、２つのＴ細胞エピトープが発見された、Ａ０１およびＦ０６。
【００９９】
実施例４
テルモミセス  ラヌギノーサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  Ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）からのリパーゼ（ＬｉｐｏｌａｓｅR）におけるＴ細胞エピトープの同定
実施例２に記載した工程がテルモミセス ラヌギノーサからのリパーゼ（Ｎｏｖｏ  ＮｏｒｄｉｓｋからのＬｉｐｏｌａｓｅR）から誘導されたペプチドで実施された。図１４から見てとれるように、２つのＴ細胞エピトープが発見された、Ａ１２およびＣ０６。ペプチドＥ０３は天然ドナーにおいてわずかに増加したＴ細胞増殖を達成したが、このペプチドはＡ１２と継続的であり、それらは一つのエピトープを表している。これに関し、当業者はエピトープの長さは変わることがあり、天然に存在するまたは突然変異されたエピトープの正確な能力は本明細書の方法により決定できることを理解している。
【０１００】
実施例５
ストレプトミセス  プリカタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ）からのエンドグルカナーゼＨにおけるＴ細胞エピトープの同定
実施例２に記載した工程がストレプトミセス プリカタスからのエンドグルカナーゼＨから誘導されたペプチドで実施された。図１５から見てとれるように、単一のＴ細胞エピトープが発見された、Ｃ０６。
【０１０１】
実施例６
プロテアーゼハイブリッド（ＧＧ３６−ＢＰＮ’）におけるＴ細胞エピトープの同定
Ｔ細胞エピトープの位置を決定した後、プロテアーゼハイブリッドが確立された蛋白質工学技術を使用して構築された。ハイブリッドは、蛋白質の高度にアレルゲン性アミノ酸配列がより少ないアレルゲン性ホモログからの対応する配列で置き換えられるように構築された。この例では、プロテアーゼの最初の１２２アミノ酸はＧＧ３６から誘導され、残りのアミノ酸配列はＢＰＮ’から誘導された。
【０１０２】
ハイブリッドは最初に北アメリカでの１００ｐｐｍ試料から、０．５ｐｐｍの２４ウェルアッセイで、スーパーフィックススワッチ、３Ｋスワッチを持つ０．５での２４ウェルアッセイでの液体（Ｔｉｄｅ  ＫＴ）、およびＮ，Ｎ’−ジメチルカゼインアッセイ、ＮＡ界面活性剤中の５ｇ／ｌ  ＤＭＣ、ＴＮＢＳ検出法で試験された。
結果は図１６、１７および１８に示されている。
【０１０３】
実施例７
天然に存在する低免疫原性蛋白質の同定
本明細書の方法を使用して、プロティナーゼＫが他の市販品として入手可能なプロテアーゼよりも低い免疫原性を生み出すものとして同定された。ここで同定されたプロティナーゼＫはトリチラチウム  アルブム  リンバー（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  Ａｌｂｕｍ  ｌｉｍｂｅｒ）からのものである。プロテアーゼおよび方法論についての一般的記述はＭａｔｈｅｗ，Ｃ．Ｇ．Ｐ．，高分子量真核生物ＤＮＡの単離，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．，編），Ｈｕｍａｎａ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，（１９８４）ｐｐ．３１−３４を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３は、バシラス アミロリクエファシエンスズブチリシン（ＢＮＰ’）のＤＮＡ（配列ＩＤ番号：１）およびアミノ酸（配列ＩＤ番号：２）配列、およびこの遺伝子の部分制限地図を示している。
【図２】  図２はバシラス アミロリクエファシエンス（配列ＩＤ番号：３）およびバシラス レンタス（野生型）（配列ＩＤ番号：６）からの、ズブチリシン間の保存アミノ酸残基を示している。
【図３】  図３Ａおよび３Ｂは、バシラス アミロリクエファシエンス（ＢＮＰ’）、枯草菌、バシラス リシェニフォルミス（配列ＩＤ番号：５）およびバシラス レンタスからのズブチリシン型プロテアーゼのアミノ酸配列アラインメントを示している。記号＊はズブチリシンＢＮＰ’と比較して特定のアミノ酸残基が存在していないことを示している。
【図４】  図４は、バシラス レンタスプロテアーゼ（ＧＧ３６）に対応するペプチドに対する１６の末梢単核血液試料の相加的Ｔ細胞応答を示している。ペプチドＥ０５はバシラス アミロリクエファシエンスからのプロテアーゼ中の１７０−１７３に対応する残基から成る領域を含んでいる。
【図５】  図５はヒトズブチリシン分子に対応するペプチドに対する１０の末梢単核血液試料の加算的Ｔ細胞応答を示している。ペプチドＦ１０、Ｆ９、Ｆ８およびＦ７はすべて、図３の配列アラインメントにおいて、バシラス アミロリクエファシエンスからのプロテアーゼ中の１７０−１７３に対応する残基から成る領域に対応しているアミノ酸配列ＤＱＭＤを含んでいる。
【図６】  図６Ａおよび６Ｂ／６Ｃは、各々バシラス レンタスプロテアーゼおよびヒトズブチリシン配列から誘導されたペプチドに対応するアミノ酸列を示している。
【図７】  図７は、ヒトズブチリシンのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２０８）を示している。
【図８】  図８は、ＢＮＰ’（バシラス アミロリクエファシエンス）プロテアーゼ、ＳＡＮＩＶＡＳＥ（バシラス レンタス）プロテアーゼおよびヒトズブチリシン（Ｓ２ＨＳＢＴ）のアミノ酸配列アラインメントを示している。
【図９】  図９は、バシラス レンタスプロテアーゼに過敏性であることが知られている個体から採られた試料における、バシラス レンタスプロテアーゼから誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示している。ペプチドＥ０５は、バシラス アミロリクエファシエンスからのプロテアーゼ中の１７０−１７３に対応している領域を代表している。
【図１０】  図１０は、バシラス レンタスプロテアーゼに過敏性であることが知られている個体から採られた試料に起こる、Ｅ０５バシラス レンタスプロテアーゼペプチド中の種々のアラニン置換に対するＴ細胞応答を示している。
【図１１】  図１１は、プロテアーゼに過敏性であることが知られている個体から採られた試料に起こる、Ｅ０５プロテアーゼペプチド（Ｔ細胞エピトープが非修飾配列の例）中の種々のアラニン置換に対するＴ細胞応答を示している；各々のペプチドのための配列もまた示されている。
【図１２】  図１２はヒトズブチリシン分子に対する応答物のパーセントを示している。
【図１３】  図１３Ａはフミコラ インソレンスエンドグルコナーゼ（寄託番号Ａ２３６３５）から誘導されたペプチドのＴ細胞応答を示している。ペプチドＡ０２およびＦ０６は各々、フミコラ インソレンスエンドグルコナーゼの残基７０−８４および３７−５０に対応する領域（Ｔ細胞エピトープの具体化例）を意味しており、ここで完全長配列は図１３Ｂに示されており、およびＡ０２およびＦ０６は下線を付けてボールド体で示されている。
【図１４】    図１４Ａはテルモミセス ラヌギノーサリパーゼ（寄託番号ＡＡＣ０８５８８およびＰＩＤ番号ｇ２９９７７３３）から誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示している。ペプチドＢ０２およびＣ０６は各々、テルモミセス ラヌギノーサリパーゼの残基８３−１００および１０８−１２１に対応する領域（Ｔ細胞エピトープの具体化例）を意味しており、ここで完全長配列は図１４Ｂに示されており、およびＢ０２およびＣ０６は下線を付けてボールド体で示されている。
【図１５】  図１５Ａはストレプトミセス プリカタスエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（寄託番号Ｐ０４０６７）から誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示している。ペプチドＣ０６は、ストレプトミセス プリカタスエンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの残基１２６−１４０に対応する領域（Ｔ細胞エピトープの具体化例）を意味しており、ここで完全長配列は図１５Ｂに示されており、およびＣ０６は下線を付けてボールド体で示されている。
【図１６】  図１６は２２の個体のために編集された、ＢＰＮ’から誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示しており、図中、好適なＴ細胞エピトープの配列が示されている。
【図１７】  図１７は２２の個体のために編集された、ＧＧ３６から誘導されたペプチドに対するＴ細胞応答を示しており、図中、好適なＴ細胞エピトープの配列が示されており、ＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡおよびＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳが好適である。
【図１８】  図１８は本明細書で提供されたハイブリッド蛋白質の具体化例であり、ここでＮ末端はＮ末端ＧＧ３６配列を含んでおり、およびＣ末端はＣ末端ＢＰＮ’配列を含んでおり、およびここで、図８に示された配列との比較は、形成されたハイブリッドは各々の蛋白質の好適なＴ細胞エピトープを削除していることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｂ−３】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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