(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再灌流障害（ＲＩ）を防止するか減弱させるための医薬組成物であって、再灌流障害を防止するか減弱させるために有効なアネキシンＶ二量体の有効量を含み、前記アネキシンＶ二量体が以下のアミノ酸配列：
【化１】
0005134362.tif 000014
を含む、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
［０００１］本発明は、一般的に、血栓症を治療するための方法および組成物に関する。より具体的には、本発明は、修飾アネキシンタンパク質およびその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
［０００２］血栓症、すなわち血管における血塊（血栓）の形成、発展、または存在は、最も一般的な重篤な医学的障害である。動脈血栓症の最も頻繁な例は、冠動脈血栓症であり、これは冠動脈の閉塞につながり、そしてしばしば、心筋梗塞（心臓発作）につながる。北米では毎年１３０万人を超える患者が、心筋梗塞のため、入院している。標準的な療法では、血栓溶解タンパク質を注入によって投与する。急性心筋梗塞の血栓溶解治療は、治療した１０００人の患者あたり、３０人の生命を救っていると概算される；にもかかわらず、この障害の３０日死亡率は、かなりのものであり続けている（Ｍｅｈｔａら，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５６：４４９−４５４（２０００））。Ｍｅｈｔａらの開示、並びに本明細書に引用される他の特許、特許出願および刊行物すべての開示は、本明細書に完全に援用される。ボーラス注射は、さらなる利点を伴って、入院前に使用可能であるため、この注射によって、抗血栓剤および血栓溶解剤を投与することが好適であろう（本明細書に援用される、Ｒａｗｌｅｓ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３０：１１８１−１１８６（１９９７））。しかし、ボーラス注射は（より漸進的な静脈内注入とは対照的に）、脳出血のリスクを有意に増加させる（Ｍｅｈｔａら、２０００）。出血のリスクを増大させることなく、血栓症を防止し、そして／または血栓溶解を増加させることが可能な剤の開発が望ましいであろう。
【０００３】
［０００３］冠動脈閉塞のため、心臓に適切に酸素が送達されずに引き起こされる、不安定狭心症は、入院の最も一般的な原因であり、アメリカ合衆国だけでも、年間１５０万の症例がある。冠動脈閉塞患者を血管形成術およびステント植込み術で治療する際、血小板ｇｐ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する抗体を使用すると、再狭窄の可能性が減少する。しかし、血管形成術を伴わない不安定狭心症においては、同じ抗体に利益がないことが示されており、そしてこれらの患者では、冠動脈閉塞を防止する、よりよい方法が必要である。
【０００４】
［０００４］動脈血栓症の別の重要な例は、脳血栓症である。静脈内組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ）は、食品医薬品局に認可された、急性虚血性脳卒中の唯一の治療法である。投与は、早ければ早いほどよい（本明細書に援用される、Ｅｒｎｓｔら，  Ｓｔｒｏｋｅ  ３１：２５５２−２５２７（２０００））。しかし、静脈内ｒｔＰＡ投与は、脳内出血リスクの増加と関連する。発達した（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）脳卒中には、しばしば一過性虚血発作（ＴＩＡ）が先行し、そしてアメリカ合衆国では、毎年、約３００，０００人がＴＩＡに罹患すると概算される。ボーラスとして投与可能であり、そして脳出血のリスクを増加させることなく、脳血栓症の再発を数日間防止するであろう、安全でそして有効な剤があることが望ましいであろう。血栓症はまた、糖尿病患者および他の患者における末梢動脈閉塞にも寄与し、そしてこうした患者で使用するための有効でそして安全な抗血栓剤が必要である。
【０００５】
［０００５］静脈血栓症は、股関節形成術および膝関節形成術などの外科手術に頻繁な合併症である。手術野への出血を増加させることなく、血栓症を防止することが望ましいであろう。妊娠および分娩に関連する静脈血栓症にも、同様の考慮が当てはまる。静脈血栓事象を反復しがちな人もあり、そして現在、こうした人は、クマリン型薬剤などの抗血栓剤によって治療される。こうした薬剤の用量は、各患者で力価決定されなければならず、そして有効な抗血栓用量および出血を増加させる用量の間の差は小さい。出血リスクの増加から、抗血栓活性をよりよく分離する治療があることが望ましい。近年導入された抗血栓療法はすべて、血小板ｇｐ  ＩＩｂ／ＩＩＩａのリガンド、低分子量ヘパリン、および因子Ｘａの五糖類阻害剤を含めて、出血リスクの増加を伴う（本明細書に援用される、Ｌｅｖｉｎｅら，  Ｃｈｅｓｔ  １１９：１０８Ｓ−１２１Ｓ（２００１））。したがって、出血のリスクを増大させることなく、動脈血栓症および静脈血栓症を防止する代替戦略を探索する必要がある。
【０００６】
［０００６］出血を増加させることなく、動脈血栓または静脈血栓の拡大を阻害するため、止血に関与する機構、および大血管における血栓症に関与する機構の間の潜在的な相違を利用する必要がある。主な止血機構には、血小板微小凝集塊の形成が含まれ、この凝集体が毛細血管に栓をし、そして小血管において、損傷されたかまたは活性化された内皮細胞上に集積する。血小板凝集の阻害剤は、トロンボキサンＡ２の形成または作用を抑制する剤、ｇｐ  ＩＩａ／ＩＩＩｂのリガンド、およびＡＤＰ受容体に作用する薬剤、例えばクロピドグレル（本明細書に援用される、Ｈａｌｌｏｐｅｔｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：２０２−２０７（２００１））を含めて、このプロセスに干渉し、そしてしたがって、出血のリスクを増加させる（Ｌｅｖｉｎｅら、２００１）。微小凝集塊形成とは対照的に、動脈血栓または静脈血栓による閉塞には、血栓に血小板が連続して補充され、そして取り込まれることが必要である。大血管においては、剪断力による剥離を克服するため、血小板は互いに、そして血小板周囲に沈着したフィブリンネットワークに、堅固に結合されなければならない。
【０００７】
［０００７］血小板の堅固な巨大凝集塊の形成は、細胞性増幅機構および体液性増幅機構によって促進され、これらは互いに強化しあうという証拠が集まってきている。細胞性機構において、血小板の比較的ゆるい微小凝集塊の形成が、ＡＤＰ、トロンボキサンＡ２、またはコラーゲンなどのアゴニストの中程度の濃度によって誘導され、これには、血小板α顆粒からの８５ｋＤタンパク質Ｇａｓ６の放出が伴う（本明細書に援用される、Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：２１５−２２１（２００１））。放出されたＧａｓ６が、血小板表面上に発現される受容体チロシンキナーゼ（Ａｘｌ、Ｓｋｙ、Ｍｅｒ）に結合すると、完全な脱顆粒およびこれらの細胞の堅固な巨大凝集塊の形成が誘導される。体液性増幅機構では、活性化された血小板および微小胞表面上に、プロトロンビナーゼ複合体が形成される。これは、トロンビンおよびフィブリンを生成する。トロンビンはそれ自体、強力な血小板活性化因子およびＧａｓ６放出の誘導因子である（本明細書に援用される、ＩｓｈｉｍｏｔｏおよびＮａｋａｎｏ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４４６：１９７−１９９（２０００））。完全に活性化された血小板は、血小板周囲に沈着したフィブリンネットワークに堅固に結合する。組織学的観察によって、血小板およびフィブリンはどちらも、ヒトにおいて、安定な冠動脈血栓を形成するのに必要であることが示されている（本明細書に援用される、Ｆａｌｋら  Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．  Ｖａｎｓｔｒａｅｔｅら（監修），  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：  Ｔｈｒｏｍｂｏｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．中  フィラデルフィア：Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９８），  ｐｐ．４５−５８）。別の血小板接着分子、アンホテリンは、活性化中に血小板表面に転位置し、そしてアニオン性リン脂質に結合する（本明細書に援用される、Ｒｏｕｈａｉｎｅｎら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．  ８４：１０８７−１０９４（２０００））。Ｇａｓ６同様、アンホテリンは、血小板凝集の期間中に架橋を形成することも可能である。
【０００８】
［０００８］これらの増幅機構を阻害するが、初期血小板凝集段階を阻害せず、それによって出血を増加させずに、血栓症を防止することが可能であるかどうかという疑問が生じる。Ｇａｓ６のターゲット不活性化を用いたマウスの研究によって、細胞性増幅の重要性が、近年、確立されてきている（Ａｎｇｅｌｉｌｌｏ−Ｓｃｈｅｒｒｅｒら、２００１）。Ｇａｓ６−／−マウスは、コラーゲンおよびエピネフリンが誘導する血栓症および塞栓症に対して防御されることが見出された。しかし、Ｇａｓ６−／−マウスは、自然発生的な出血を患わず、そして尾の切り落とし後、正常の出血を有した。さらに、Ｇａｓ６に対する抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血小板凝集を阻害するとともに、コラーゲンおよびエピネフリンによってｉｎ  ｖｉｖｏで誘導される血栓症も阻害した。原則として、受容体チロシンキナーゼに対するＧａｓ６結合に関して競合する抗体またはリガンドを用いて、血栓症を阻害することも可能である。しかし、体液性増幅の強度を考慮して、この段階を阻害することが好ましい可能性もある。理想的には、こうした阻害剤はまた、Ｇａｓ６が仲介する細胞性増幅機構に対して、さらなる抑制活性を有するであろう。
【０００９】
［０００９］血小板凝集の細胞性増幅および体液性増幅の両方を防止するための戦略が、アネキシンによって提供され、アネキシンは、そのうちの１０がいくつかのヒト組織で発現されている、非常に相同な抗血栓タンパク質のファミリーである（本明細書に援用される、ＢｅｎｚおよびＨｏｆｍａｎｎ，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３７８：１７７−１８３（１９９７））。アネキシンは、カルシウムおよび負荷電リン脂質に結合する特性を共有し、これらはどちらも凝血に必要なものである。生理学的条件下では、負荷電リン脂質は、主に、活性化されたかまたは損傷を受けた細胞膜において、ホスファチジルセリン（ＰＳ）によって供給される。損なわれていない細胞では、ＰＳは、形質膜二重層の内部小葉に閉じ込められ、そして表面にアクセス不能である。血小板が活性化されると、表面にアクセス可能なＰＳの量、そしてしたがって、アネキシン結合の度合いが、非常に増加する（本明細書に援用される、Ｓｕｎら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ６９：２８９−２９６（１９９３））。血小板の活性化中、微小胞が血小板表面から放出され、凝血促進活性を持つアニオン性リン脂質が発現される表面積が非常に増加する（どちらも本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９９：２５７７−２５８２（１９９９）；Ｃｈｏｗら，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １３５：６６−７２（２０００））。これらは、血小板が仲介する動脈血栓の増殖に重要な役割を果たしうる。
【００１０】
［００１０］凝血カスケードに関与するタンパク質（因子Ｘ、Ｘａ、およびＶａ）は、表面上にＰＳを所持する膜に結合し、そして互いに結合し、安定して堅固に結合したプロトロンビナーゼ複合体を形成する。ＩＩ、Ｖ、およびＶＩＩＩを含むいくつかのアネキシンは、高い親和性でＰＳに結合し、それによって、プロトロンビナーゼ複合体の形成を防止し、そして抗血栓活性を発揮する。アネキシンＶは、負荷電リン脂質に対して、因子Ｘ、Ｘａ、およびＶａの親和性よりも高い、非常に高い親和性でＰＳに結合する（Ｋｄ＝１．７ｎｍｏｌ／ｌ）（本明細書に援用される、ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＴａｉｔ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：１７４２０−１７４２３（１９９０））。活性化されたか、または損傷を受けた内皮細胞表面上の組織因子依存性凝血にもまた、ＰＳの表面発現が必要であり、そしてアネキシンＶはこのプロセスを阻害することも可能である（本明細書に援用される、ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら，  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  １４：８２４−８３０（１９９４））が、アネキシンは、プロトロンビナーゼ生成の阻害におけるより、この活性において、より有効でない（本明細書に援用される、Ｒａｏら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  ６２：５１７−５３１（１９９２））。
【００１１】
［００１１］活性化された血小板および損傷を受けた細胞に対するアネキシンＶの結合は、おそらく、血栓において、このタンパク質が選択的に保持されることを説明する。これは、静脈血栓症および動脈血栓症の実験動物モデルにおいて示されてきており（どちらも本明細書に援用される、Ｓｔｒａｔｔｏｎら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：３１１３−３１２１（１９９５）；ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：２３３９−２３４７（１９９７））、そしてノイズが減少し、そして安定性が増加した、ヒトにおける血管血栓の医学的画像化に、標識アネキシンを用いることが提唱されてきている（本明細書に援用される、ＲｅｎｏおよびＫａｓｉｎａ、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７５９９（ＷＯ  ９５／３４３１５）（１９９５年１２月２１日公開））。アネキシンＶなどの強力な抗血栓剤の血栓への結合は、血栓の拡大または再発を防止する戦略を提供する。一過性心筋虚血もまた、アネキシンＶ結合を増加させる（本明細書に援用される、Ｄｕｍｏｎｔら，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２：１５６４−１５６８（２０００））。ヒトにおけるアネキシンＶ画像化によって、心内膜心筋生検が血管拒絶を示した場合、移植心臓において、該タンパク質の結合が増加することが示されてきている（本明細書に援用される、Ａｃｉｏら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．  ４１（５  Ｓｕｐｐｌ．）：１２７Ｐ（２０００））。この結合は、おそらく、損傷を受けた内皮細胞、並びに、拒絶された心臓中のアポトーシス筋細胞の表面に露出されたＰＳのためである。したがって、心筋梗塞後にアネキシンを投与すると、血小板および内皮細胞の両方の上の血栓促進性複合体の形成が防止され、それによって血栓症の拡大または再発が防止されるはずである。アネキシンＶ結合はまた、ヒトにおいて、脳低酸素症後にも増大し（本明細書に援用される、Ｄ’Ａｒｃｅｕｉｌら，  Ｓｔｒｏｋｅ  ２０００：２６９２−２７００（２０００））、このことは、ＴＩＡ後にアネキシンを投与すると、発達した脳卒中が発展する可能性が減少しうることを支持する。
【００１２】
［００１２］アネキシンは、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏトロンビン依存性アッセイにおいて、並びに静脈血栓症（どちらも本明細書に援用される、Ｒｏｅｍｉｓｃｈら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ６１：９３−１０４（１９９１）；Ｖａｎ  Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ６９：２２７−２３０（１９９３））および動脈血栓症（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７）の実験動物モデルにおいて、抗凝血活性を示している。著しいことに、抗血栓用量のアネキシンは、処置したウサギにおいて、伝統的なｅｘ  ｖｉｖｏ凝血試験に対して、実証可能な影響を持たず（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７）、そして処置したラットの出血時間を有意には延長しなかった（Ｖａｎ  Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎｎａら、１９９３）。処置したウサギにおいて、アネキシンは、外科切開への出血を増加させなかった（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７）。したがって、これまでに研究された剤すべての中で唯一、アネキシンは、出血の増加を伴わずに、抗血栓活性を発揮する。アネキシンは、トロンビン以外のアゴニストに誘発される血小板凝集を阻害せず（ｖａｎ  Ｈｅｅｒｄｅら、１９９４）、そして血小板凝集は、主な止血機構である。損傷を受けた血管壁において、そして血管外組織において、組織因子／ＶＩＩａ複合体もまた、止血効果を発揮し、そしてこの系は、プロトロンビナーゼ複合体が受けるより、アネキシンＶによる阻害に、より感受性でなかった（Ｒａｏら、１９９２）。これは、投与したアネキシンＶを、可能な限り血管区画に限定することを支持する１つの議論であり；出血のリスクがおそらく減少する。
【００１３】
［００１３］血栓症を防止するこうした前途有望な結果にもかかわらず、アネキシン類の療法的使用に関連する主な問題は、循環中での半減期が短く、実験動物において、５〜１５分間と概算されることであり（Ｒｏｅｍｉｓｃｈら、１９９１；Ｓｔｒａｔｔｏｎら、１９９５；ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７）；アネキシンＶもまた、ヒトの循環において短い半減期を有する（本明細書に援用される、Ｓｔｒａｕｓｓら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．  ４１（５  Ｓｕｐｐｌ．）：１４９Ｐ（２０００））。大部分のアネキシンは、３６ｋＤａタンパク質で予測されるように、尿中に出て失われる（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７）。したがって、アネキシンが、血管区画から血管外区画および尿に出て失われるのを防止し、それによって単回注射後の抗血栓活性を延長させる方法が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
［００１４］本発明は、動脈血栓症または静脈血栓症を防止するための化合物および方法を提供する。組換えヒトアネキシンは、血管区画での半減期が延長されるような方式で修飾される。これは多様な方法で達成可能であり；ポリエチレングリコールにカップリングしたアネキシン、アネキシンのホモポリマーまたはヘテロポリマー、およびアネキシンと別のタンパク質（例えば免疫グロブリンのＦｃ部分）との融合タンパク質が、３つの態様である。修飾アネキシンは、高い親和性で、活性化された血小板または損傷を受けた細胞の表面上のホスファチジルセリンに結合し、それによって、Ｇａｓ６そして凝血促進タンパク質の結合、およびプロトロンビナーゼ複合体の形成を防止する。したがって、修飾アネキシンは、血小板凝集を増幅する細胞性機構および体液性機構の両方を阻害し、それによって血栓症を防止する。
【００１５】
［００１５］１つの態様において、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングしたアネキシンタンパク質、好ましくはアネキシンＶを含有する、単離修飾アネキシンタンパク質を提供する。好ましくは、各ＰＥＧが少なくとも５ｋＤａ、より好ましくは少なくとも１０ｋＤａ、そして最も好ましくは少なくとも１５ｋＤａの分子量を有する、少なくとも２つのＰＥＧ鎖を、単一のアネキシン分子にカップリングする。別の態様において、単離修飾アネキシンタンパク質は、少なくとも１つのさらなるタンパク質、例えばさらなるアネキシンタンパク質（ホモ二量体を形成する）または免疫グロブリンのＦｃ部分にカップリングした、アネキシンタンパク質を含有する。さらなるタンパク質は、好ましくは、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有する。本発明がやはり提供するのは、本発明の修飾アネキシンタンパク質のいずれかの抗血栓に有効な量を含有する薬剤組成物である。
【００１６】
［００１６］本発明の方法において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質のいずれか１つを抗血栓に有効な量で有する薬剤組成物中、修飾アネキシンを、血栓症のリスクがある被験者に投与する。例えば、冠動脈血栓症、脳血栓症、または一過性脳虚血発作などの動脈血栓症後に、薬剤組成物を投与することも可能である。静脈血栓症に関連する外科手術後に投与することもまた可能である。さらに、動脈血栓症または静脈血栓症に罹りやすい状態を有する被験者、例えば糖尿病、妊娠、または分娩の被験者に投与することも可能である。
【００１７】
［００１７］本発明がやはり提供するのは、アネキシンのホモ二量体をコードする単離核酸分子、当該核酸分子の少なくとも一部を含有する組換え分子、および当該核酸分子の少なくとも一部を含有する組換え細胞である。本発明の方法において、組換え細胞を、適切な条件下で培養して、アネキシンのホモ二量体を産生する。
【００１８】
［００１８］本発明はまた、血栓症試験系を用いて、血栓症を調節する修飾アネキシンタンパク質に関して、スクリーニングする方法も提供する。試験系を試験修飾アネキシンタンパク質と接触させて、その後、血栓溶解活性を評価し、そして試験修飾アネキシンタンパク質の非存在下での系の活性と比較する。好ましくは、活性化部分トロンボプラスチン時間を測定する。やはり提供するのは、活性化された血小板を試験修飾アネキシンタンパク質と接触させて、そして血小板結合およびプロテインＳ結合活性を評価することによって、修飾アネキシンタンパク質を同定する方法である。
【００１９】
［００１９］本発明がやはり提供するのは、修飾アネキシンタンパク質に関してｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングする方法である。この方法において、血栓症動物モデルを、試験修飾アネキシンタンパク質と接触させ、その後、試験修飾アネキシンタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ抗凝血活性および出血増加を評価する。抗凝血活性および時間を、アネキシンの抗凝血活性および時間と比較し、そして出血量を、試験修飾アネキシンタンパク質の非存在下の動物モデルでの出血と比較する。
【００２０】
［００２０］したがって、本発明は、血栓症のリスクがある被験者を治療する方法であって、アネキシン二量体を含む単離修飾アネキシンタンパク質を、抗血栓に有効な量で、前記被験者に投与することを含む、前記方法を提供する。単離修飾アネキシンタンパク質を、冠動脈血栓症の後、顕性脳血栓症の後、一過性脳虚血発作の後、静脈血栓症に関連する外科手術後、前記被験者が糖尿病であり、そして前記血栓症が動脈血栓症である場合、または妊娠および分娩からなる群より選択される状態の期間中に投与する。単離修飾アネキシンタンパク質を、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与する。
【００２１】
［００２１］本発明はまた、内皮細胞への白血球の付着を阻害する方法であって、アネキシン二量体を含む単離修飾アネキシンタンパク質の有効量を、こうした方法を必要とする患者に投与することを含む、前記方法も提供する。いくつかの態様において、該方法はさらに、内皮細胞損傷を減少させることを含む。
【００２２】
［００２２］本発明はまた、血栓症のリスクがある被験者を治療する方法であって、ホスファチジルセリンに対するアネキシンＶの親和性の少なくとも９０％の、ホスファチジルセリンに対する親和性を有するタンパク質を、抗血栓に有効な量で、前記被験者に投与することを含み、前記タンパク質がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である場合を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
発明の詳細な説明
［００３８］本発明は、出血を増加させることなく、哺乳動物において、血栓症を防止する化合物および方法を提供する。本発明は部分的に、血小板凝集の初期機構が、動脈血栓または静脈血栓の形成に必要な、血小板凝集を増幅する機構とは異なるという認識に頼る。血栓形成を阻害するが、初期の血小板凝集を阻害しないことによって、出血を増加させることなく血栓症を防止することも可能である。
【００２４】
［００３９］本発明の化合物には、ヒトまたは他の哺乳動物において、産物の半減期が増加するように修飾されているアネキシンアミノ酸配列を含有する、いかなる産物も含まれる。本明細書において、天然存在タンパク質分子のアミノ酸配列に言及するために、「アミノ酸配列」が列挙される場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、該アミノ酸配列を、列挙されたタンパク質に関連する完全天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。アネキシンは、相同な、リン脂質結合性膜タンパク質のファミリーであり、このうち１０が、哺乳動物で発現される別個の遺伝子産物に相当する（ＢｅｎｚおよびＨｏｆｍａｎｎ、１９９７）。結晶分析によって、アネキシンＶに例示される、これまでに研究したファミリーメンバーすべての共通の三次構造が明らかになっている（本明細書に援用される、Ｈｕｂｅｒら，  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９：３８６７（１９９０））。コア・ドメインは、リン脂質膜に近接して並置されることも可能な、凹状円盤状構造である。該タンパク質は、４つのサブドメインを含有し、各々、５つのαらせんで構成される７０アミノ酸のアネキシン・リピートからなる。アネキシンはまた、異なるアネキシン間で、長さおよびアミノ酸配列が多様である、より親水性のテール・ドメインも有する。アネキシンをコードする遺伝子の配列が周知である（例えば、本明細書に援用される、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：８０８７−８０９２（１９８７）（アネキシンＶ））。
【００２５】
［００４０］アネキシンタンパク質には、アネキシンファミリーのタンパク質、例えばアネキシンＩＩ（リポコルチン２、カルパクチン１、プロテインＩ、ｐ３６、クロモビンディン（ｃｈｒｏｍｏｂｉｎｄｉｎ）８）、アネキシンＩＩＩ（リポコルチン３、ＰＡＰ−ＩＩＩ）、アネキシンＩＶ（リポコルチン４、エンドネキシンＩ、プロテインＩＩ、クロモビンディン４）、アネキシンＶ（リポコルチン５、エンドネキシン２、ＶＡＣ−アルファ、アンコリンＣＩＩ、ＰＡＰ−Ｉ）、アネキシンＶＩ（リポコルチン６、プロテインＩＩＩ、クロモビンディン２０、ｐ６８、ｐ７０）、アネキシンＶＩＩ（シネキシン）、アネキシンＶＩＩＩ（ＶＡＣ−ベータ）、アネキシンＸＩ（ＣＡＰ−５０）、およびアネキシンＸＩＩＩ（ＩＳＡ）が含まれる。
【００２６】
［００４１］アネキシンＩＶは、アネキシンＶと同じ特性を多く共有する。アネキシンＶと同様、アネキシンＩＶは、カルシウムの存在下で、酸性リン脂質膜に結合する。アネキシンＩＶは、アネキシンＶの近縁構造相同体である。アネキシンＩＶの配列が知られている。Ｈａｍｍａｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １５６：６６０−６６７（１９８８）。アネキシンＩＶは、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のアネキシンファミリーに属する。その機構はいまだ明らかに定義されていない。
【００２７】
［００４２］アネキシンＩＶ（エンドネキシン）は、３２ｋＤａのカルシウム依存性膜結合タンパク質である。アネキシンＩＶの翻訳されたアミノ酸配列は、この種のタンパク質に特徴的な４ドメイン構造を示す。アネキシンＩＶは、ファミリーの他のメンバーと４５〜５９％の同一性を有し、そして類似のサイズおよびエクソン−イントロン構成を共有する。ヒト胎盤から単離されたアネキシンＩＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗凝血活性を有し、そしてホスホリパーゼＡ２活性を阻害するタンパク質をコードする。アネキシンＩＶは、ほぼ上皮細胞でのみ発現される。
【００２８】
［００４３］アネキシンＶＩＩＩは、ＣＡ（２＋）依存性リン脂質結合性タンパク質（アネキシン）のファミリーに属し、そしてアネキシンＶに対して、高い同一性を有する（５６％）。Ｈａｕｐｔｍａｎｎら，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８９  Ｏｃｔ  ２０；１８５（１）：６３−７１。該タンパク質は最初に、２．２ｋｂ血管抗凝血因子−ベータとして単離された。アネキシンＶＩＩＩは、細胞外タンパク質でもなく、また細胞表面に会合してもいない。該タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、血液凝固に役割を果たしていない可能性もある。その生理学的役割は未知のままである。該タンパク質は、ヒト胎盤において、低レベルで発現され、そして肺、内皮および皮膚、肝臓および腎臓に限定された発現を示す。
【００２９】
［００４４］本発明において、アネキシンタンパク質を、ヒトまたは他の哺乳動物において、半減期が増加するように修飾する。いくつかの態様において、アネキシンタンパク質は、アネキシンＶ、アネキシンＩＶまたはアネキシンＶＩＩＩである。アネキシンの適切な修飾の１つは、有効サイズの増加であり、これによって、血管区画から血管外区画および尿への損失を防止し、それによって単回注射後の抗血栓活性を延長させる。ホスファチジルセリンとの十分な結合親和性を維持するのに有効なサイズのいかなる増加も、本発明の範囲内である。
【００３０】
［００４５］本発明の１つの態様において、修飾アネキシンは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）結合アッセイにおいて、アネキシンの機能を実行することが可能であるような方式で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされた組換えヒトアネキシンタンパク質を含有する。静脈内投与されたアネキシン−ＰＥＧコンジュゲートの抗血栓作用は、未結合（ｆｒｅｅ）アネキシンのものと比較した際に延長されている。ＰＥＧにカップリングする組換えアネキシンタンパク質は、アネキシンＶタンパク質または別のアネキシンタンパク質であることも可能である。１つの態様において、アネキシンタンパク質はアネキシンＶ、アネキシンＩＶまたはアネキシンＶＩＩＩである。
【００３１】
［００４６］ＰＥＧは、酸化エチレンの反復単位からなり、直鎖、またはいくつかの場合、分枝鎖の両末端のヒドロキシル基で終結する。カップリングするＰＥＧ鎖のサイズおよび分子量は、含有する酸化エチレン単位の数に応じ、この数は選択可能である。本発明のためには、ＰＳへの修飾分子の結合機能を保持しつつ、アネキシンに比較して、修飾アネキシンの半減期が増加するような、いかなるＰＥＧのサイズおよびアネキシン分子あたりのＰＥＧ鎖の数も使用可能である。上述のように、十分な結合には、非修飾アネキシンのものから減少しているが、それでもなお、Ｇａｓ６およびプロトロンビナーゼ複合体の因子の結合と競合し、そしてしたがって、血栓症を防止可能な結合が含まれる。コンジュゲート化するＰＥＧの最適分子量は、ＰＥＧ鎖の数によって変動する。１つの態様において、各々、少なくとも約１５ｋＤａの分子量の２つのＰＥＧ分子が、各アネキシン分子にカップリングする。ＰＥＧ分子は直鎖または分枝鎖であることも可能である。ＰＳへのアネキシンのカルシウム依存性結合は、カップリングするＰＥＧ分子のサイズだけでなく、ＰＥＧが結合するタンパク質上の部位によっても影響を受ける。最適な選択は、所望の特性が保持されることを確実にする。分子の三次元構造を知り、そしてリン脂質膜と分子との相互作用を突然変異分析および結晶分析で分析することによって、ＰＥＧ付着部位の選択が容易になる（本明細書に援用される、Ｃａｍｐｏｓら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：８００４−８００８（１９９８））。
【００３２】
［００４７］薬剤送達分野において、ＰＥＧ誘導体は、可溶性を増進させ、並びに免疫原性、タンパク質分解、および腎臓クリアランスを減少させるため、タンパク質に共有結合（ＰＥＧ化と称される）させて、広く用いられている。ＰＥＧにカップリングした組換え産物の優れた臨床的有効性がよく確立されている。例えば、週１回投与されるＰＥＧ−インターフェロン−２ａは、Ｃ型肝炎ウイルスに対して、未結合インターフェロンの週３回の用量より有意により有効である（本明細書に援用される、Ｈｅａｔｈｃｏｔｅら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３：１６７３−１６８０（２０００））。ＰＥＧへのカップリングは、ｉｎ  ｖｉｖｏで組換えタンパク質の半減期を延長させるため（本明細書に援用される、Ｋｎａｕｆら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６：２７９６−２８０４（１９８８））、並びに組換えタンパク質の酵素分解を防止するため、そして相同産物では時々観察される免疫原性を減少させるため（本明細書に援用される、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ニューヨーク，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６），  ｐｐ．１７３−１７６の参考文献）、用いられてきている。
【００３３】
［００４８］本発明の別の態様において、修飾アネキシンタンパク質は、増加した有効サイズを有する、アネキシンタンパク質のポリマーである。有効サイズの増加は、血管区画における半減期の延長、および抗血栓活性の延長を生じると考えられる。１つのこうした修飾アネキシンは、アネキシンタンパク質の二量体である。１つの態様において、アネキシンの二量体は、アネキシンＶ、アネキシンＩＶまたはアネキシンＶＩＩＩのホモ二量体である。別の態様において、アネキシン二量体は、アネキシンＶおよび他のアネキシンタンパク質（例えばアネキシンＩＶまたはアネキシンＶＩＩＩ）、アネキシンＩＶおよび別のアネキシンタンパク質（例えばアネキシンＶまたはアネキシンＶＩＩＩ）またはアネキシンＶＩＩＩおよび別のアネキシンタンパク質（例えばアネキシンＶまたはアネキシンＩＶ）のヘテロ二量体である。別のこうしたポリマーは、アネキシンＩＩと、カルシウム結合性タンパク質のＳ１００ファミリーのメンバーである、ｐ１１とのヘテロ四量体である。Ｓ１００タンパク質がアネキシンに結合すると、Ｃａ２＋に対するアネキシンの親和性が増加する。バイオコンジュゲート法または組換え法によって、アネキシン・ホモポリマーまたはヘテロ四量体を産生することも可能であるし、該ポリマーを単独でまたはＰＥＧコンジュゲート化型で投与することも可能である。
【００３４】
［００４９］いくつかの態様において、修飾アネキシンは、ＰＳに対して増加した親和性を有する。実施例４に記載するように、組換えＤＮＡ技術のよく確立された方法を用いて、ヒトアネキシンＶのホモ二量体（ＤＡＶ）を調製した。ホモ二量体のアネキシン分子は、ペプチド結合を通じて、柔軟なリンカーに連結される（図１）。いくつかの態様において、柔軟なリンカーは、いずれかの端に、スイベル（ｓｗｉｖｅｌ）として作用する、グリシンおよびセリン残基が隣接したアミノ酸配列を含有する。リンカーは、好ましくは、１以上のこうした「スイベル」を含む。好ましくは、リンカーは２つのスイベルを含み、これらは、少なくとも２アミノ酸、より詳細には少なくとも４アミノ酸、より詳細には少なくとも６アミノ酸、より詳細には少なくとも８アミノ酸、より詳細には少なくとも１０アミノ酸、離れていることも可能である。好ましくは、リンカーの全体の長さは、５〜３０アミノ酸、５〜２０アミノ酸、５〜１０アミノ酸、１０〜１５アミノ酸、または１０〜２０アミノ酸である。二量体は、Ｃａ２＋およびＰＳに結合する、単量体の凸状表面が、どちらも、露出したＰＳにアクセス可能であるような方式でフォールディング可能である。柔軟なリンカーは、当該技術分野に知られ、例えば、Ａｒａｉら，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ２００４  Ｄｅｃ  １；５７（４）：８２９−３８に記載される、（ＧＧＧＧＳ）（ｎ）（ｎ＝３〜４）、およびらせんリンカー（ＥＡＡＡＫ）（ｎ）（ｎ＝２〜５）がある。実施例ＩＩに記載するように、アネキシンＶホモ二量体は、細胞表面上のＰＳへの結合に際して、アネキシン単量体を競合して追い出す（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）（図２）。
【００３５】
［００５０］本発明の別の態様において、組換えアネキシンを、免疫グロブリンのＦｃ部分などの別のタンパク質とともに発現させるか、またはこうした別のタンパク質に化学的にカップリングする。こうした発現またはカップリングによって、分子の有効サイズが増加し、血管区画からのアネキシンの損失が防止され、そして抗凝血作用が延長される。
【００３６】
［００５１］好ましくは、本発明の修飾アネキシンタンパク質は、単離修飾アネキシンタンパク質である。修飾アネキシンタンパク質は、アネキシンＩＩ、アネキシンＩＶ、アネキシンＶ、またはアネキシンＶＩＩＩを含有することも可能である。いくつかの態様において、タンパク質は、修飾ヒトアネキシンである。いくつかの態様において、修飾アネキシンは、組換えヒトアネキシンを含有する。本発明にしたがって、単離されたかまたは生物学的に純粋なタンパク質は、天然環境から取り除かれているタンパク質である。こうしたものとして、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、必ずしも、タンパク質が精製されている度合いを反映しない。本発明の単離修飾アネキシンタンパク質を天然供給源から得ることも可能であるし、組換えＤＮＡ技術を用いて産生することも可能であるし、また、化学合成によって産生することも可能である。本明細書において、単離修飾アネキシンタンパク質は、全長修飾タンパク質またはこうしたタンパク質の相同体いずれであることも可能である。また、（例えばＰＥＧ化タンパク質に関して）修飾された全長タンパク質またはこうしたタンパク質の修飾された相同体であることも可能である。
【００３７】
［００５２］本発明のタンパク質相同体の最小サイズは、対応する天然タンパク質をコードする核酸分子の相補配列と、安定なハイブリッドを形成可能な核酸分子にコードされるのに十分なサイズである。こうしたものとして、こうしたタンパク質相同体をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成、並びに核酸分子および相補配列間の相同性パーセント、並びにハイブリダイゼーション条件自体（例えば温度、塩濃度、およびホルムアミド濃度）に依存する。こうした核酸分子の最小サイズは、典型的には、核酸分子がＧＣリッチであれば、少なくとも長さ約１２〜約１５ヌクレオチドであり、そしてＡＴリッチであれば、少なくとも長さ約１５〜約１７塩基である。こうしたものとして、本発明のタンパク質相同体をコードするのに用いられる核酸分子の最小サイズは、長さ約１２〜約１８ヌクレオチドである。核酸分子が、遺伝子の一部、全遺伝子、または多数の遺伝子あるいはその一部を含むことも可能であるため、こうした核酸分子の最大サイズには限界はない。同様に、本発明のアネキシンタンパク質相同体または修飾アネキシンタンパク質相同体の最小サイズは、長さ約４〜約６アミノ酸であり、サイズは、全長、多価（すなわち、各々機能を有する、１より多いドメインを有する、融合タンパク質）タンパク質、またはこうしたタンパク質の機能部分のいずれが望ましいかに依存する。本発明のアネキシンおよび修飾アネキシン相同体は、好ましくは、血栓形成を防止するアネキシンタンパク質の活性を実行可能であるなど、天然サブユニットに対応する活性を有する。
【００３８】
［００５３］アネキシンタンパク質および修飾アネキシン相同体は、天然アレル変動または天然突然変異の結果であることも可能である。当該技術分野に知られる技術を用いて、本発明のタンパク質相同体を産生することもまた可能であり、こうした技術には、限定されるわけではないが、タンパク質への直接修飾、あるいは例えば、ランダム突然変異誘発またはターゲッティング突然変異誘発を達成する古典的または組換えＤＮＡ技術を用いた、タンパク質をコードする遺伝子の修飾が含まれる。
【００３９】
［００５４］やはり含まれるのは、アミノ酸配列、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１５、またはこれらの配列いずれかを含有するタンパク質をコードする核酸分子のアレル変異体にコードされるタンパク質に、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含有する、修飾アネキシンタンパク質である。やはり含まれるのは、配列番号３、配列番号６、配列番号１２、配列番号１５の１より多くを含む修飾アネキシンタンパク質；例えば配列番号３および配列番号１２を含み、そしてリンカーに分離されたタンパク質である。アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性パーセントを決定する方法は、当業者に知られる。配列間の同一性パーセントを決定する方法には、ＧＣＧ（登録商標）ウィスコンシン・パッケージＴＭ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能）、ＤＮＡｓｉｓＴＭプログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンブルノ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ一式（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ．  メリーランド州ノースベセスダから入手可能）、またはＮＣＢＩウェブサイトで入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどのコンピュータプログラムが含まれる。
【００４０】
［００５５］１つの態様において、修飾アネキシンタンパク質には、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３００アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約３１９アミノ酸または全長アネキシンタンパク質のいずれか短いほうのアミノ酸配列が含まれる。別の態様において、アネキシンタンパク質は、全長タンパク質、すなわち全長コード領域にコードされるタンパク質、またはその翻訳後修飾されたタンパク質、例えば開始メチオニンおよび／またはシグナル配列または「プロ」配列が取り除かれた成熟タンパク質を含有する。
【００４１】
［００５６］本発明の修飾アネキシンタンパク質の断片は、好ましくは、少なくとも長さ約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９５アミノ酸、そしてさらにより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸を含有する。
【００４２】
［００５７］１つの態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号４を有する核酸分子にコードされるタンパク質を含有する。あるいは、修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を含有する。あるいは、修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされる、１より多いタンパク質配列を含有する。
【００４３】
［００５８］１つの態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１０を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を含有する。あるいは、修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１０を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされる、１より多いタンパク質配列を含有する（例えば配列番号１２−リンカー−配列番号１２）。
【００４４】
［００５９］別の態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１３を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされる修飾タンパク質である。あるいは、修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１３を有する核酸分子によって、またはこの配列を有する核酸分子のアレル変異体によってコードされる、１より多いタンパク質配列を含有する（例えば配列番号１５−リンカー−配列番号１５）。
【００４５】
［００６０］別の態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、および核酸配列、配列番号１０を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、またはこれらの核酸分子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を含有する修飾タンパク質である（例えば配列番号３−リンカー−配列番号１２または配列番号１２−リンカー−配列番号３）。
【００４６】
［００６１］別の態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、および核酸配列、配列番号１３を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、またはこれらの核酸分子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を含有する修飾タンパク質である（例えば配列番号３−リンカー−配列番号１５または配列番号１５−リンカー−配列番号３）。
【００４７】
［００６２］別の態様において、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質は、核酸配列、配列番号１０を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、および核酸配列、配列番号１３を有する核酸分子によってコードされるタンパク質、またはこれらの核酸分子のアレル変異体によってコードされるタンパク質を含有する修飾タンパク質である（例えば配列番号１２−リンカー−配列番号１５または配列番号１５−リンカー−配列番号１２）。
【００４８】
［００６３］本発明の１つの態様には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、アネキシン遺伝子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、非天然修飾アネキシンタンパク質が含まれる。本明細書において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を用いて、類似の核酸配列を有する分子を同定する、標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。こうした標準的な条件は、例えば、本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に開示される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応において、探査する（ｐｒｏｂｅ）ために用いた核酸分子と、少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする。３０％以下のヌクレオチドのミスマッチを許容するハイブリダイゼーションを達成するのに適したハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を計算する式が、例えば本明細書に援用される、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３８：２６７−２８４（１９８４）に開示されている。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション条件は、探査に用いた核酸分子と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容するであろう。他の態様において、ハイブリダイゼーション条件は、探査に用いた核酸分子と、少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容するであろう。さらに他の態様において、ハイブリダイゼーション条件は、探査に用いた核酸分子と、少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を許容するであろう。
【００４９】
［００６４］修飾アネキシンタンパク質には、少なくとも約５０ヌクレオチドであり、そして配列番号１、配列番号４、配列番号１０、配列番号１３からなる群より選択される核酸分子、またはこれらの核酸分子のいずれかの相補体と、好ましくは約２０％の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約１５％の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約１０％の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約５％の塩基対ミスマッチを許容する条件下で、そしてさらにより好ましくは約２％の塩基対ミスマッチを許容する条件下でハイブリダイズする核酸分子にコードされる、タンパク質が含まれる。
【００５０】
［００６５］本明細書において、アネキシン遺伝子には、コード領域自体に加えて、天然アネキシン遺伝子に関連するすべての核酸配列、例えばこの遺伝子にコードされるアネキシンタンパク質の産生を調節する制御領域（例えば限定されるわけではないが、転写、翻訳または翻訳後調節領域）が含まれる。１つの態様において、アネキシン遺伝子には、核酸配列、配列番号１が含まれる。別の態様において、アネキシン遺伝子には、核酸配列、配列番号１０が含まれる。別の態様において、アネキシン遺伝子には、核酸配列、配列番号１３が含まれる。核酸配列決定技術は、完全にエラーがないわけではないため、配列番号１（並びに本明細書に提示する他の配列）は、よくても、本発明のアネキシンタンパク質をコードする核酸分子の見かけの核酸配列に相当することに注目すべきである。
【００５１】
［００６６］別の態様において、アネキシン遺伝子は、配列番号１に類似であるが、同一でない配列を含む、アレル変異体であることも可能である。別の態様において、アネキシン遺伝子は、配列番号１０に類似であるが、同一でない配列を含む、アレル変異体であることも可能である。別の態様において、アネキシン遺伝子は、配列番号１３に類似であるが、同一でない配列を含む、アレル変異体であることも可能である。配列番号１を含むアネキシン遺伝子のアレル変異体は、ゲノムにおいて、配列番号１を含む遺伝子と本質的に同じ遺伝子座（単数または複数）に存在するが、例えば突然変異または組換えによって引き起こされる天然変動のため、類似であるが同一でない配列を有する遺伝子である。アレル変異体は、典型的には、比較中の遺伝子にコードされるタンパク質と類似の活性を有するタンパク質をコードする。アレル変異体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば制御調節領域）に改変を含むことも可能である。アレル変異体は、当業者に周知であり、そしてゲノムが二倍体であるため、既定のヒトの内部で、そして／または２人以上のヒトを含む集団の中で、見出されると予期されるであろう。
【００５２】
［００６７］本発明の単離修飾アネキシンタンパク質を天然供給源から得ることも可能であるし、組換えＤＮＡ技術を用いて産生することも可能であるし、また化学合成によって産生することも可能である。本明細書において、単離修飾アネキシンタンパク質は、全長タンパク質またはこうしたタンパク質の相同体いずれかを含有することも可能である。アネキシンおよび修飾アネキシン相同体の例には、相同体がアネキシンタンパク質に対する免疫応答を誘発可能な少なくとも１つのエピトープを含むように、アミノ酸が欠失し（例えばタンパク質の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型、例えばペプチド、あるいはイントロンが除去されるかまたは２つのエクソンが連結される際のタンパク質スプライシング反応によるもの）、挿入され、反転し、置換され、そして／または誘導体化されている（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化および／またはグリセロホスファチジルイノシトールの付加によるもの）、アネキシンおよび修飾アネキシンタンパク質が含まれる。すなわち、当業者に知られる技術を用いて、相同体を免疫原として動物に投与した際、動物は、アネキシンタンパク質の少なくとも１つのエピトープに対して体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じるであろう。アネキシンおよび修飾アネキシン相同体を、免疫血清に選択的に結合する能力によって、選択することもまた可能である。こうした活性を測定する方法を本明細書に開示する。アネキシンおよび修飾アネキシン相同体はまた、機能アッセイにおいて、天然アネキシンの機能を実行可能なタンパク質；すなわちホスファチジルセリンに、または活性化された血小板に結合するか、あるいは抗血栓活性を示すことが可能なタンパク質も含む。こうしたアッセイの方法を、本明細書の実施例項および別の箇所に記載する。
【００５３】
［００６８］機能アッセイにおいて、アネキシンタンパク質の機能を実行する能力によって、本発明の修飾アネキシンタンパク質を同定することも可能である。句「機能アッセイにおいて、その機能を実行可能」は、タンパク質または修飾タンパク質が、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約１０％を有することを意味する。他の態様において、該タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約２０％を有する。他の態様において、該タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約３０％を有する。他の態様において、該タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約４０％を有する。他の態様において、該タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約５０％を有する。他の態様において、タンパク質または修飾タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約６０％を有する。さらに他の態様において、タンパク質または修飾タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約７０％を有する。さらに他の態様において、タンパク質または修飾タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約８０％を有する。他の態様において、タンパク質または修飾タンパク質は、機能アッセイにおいて、天然タンパク質の活性の少なくとも約９０％を有する。機能アッセイの例を本明細書に記載する。
【００５４】
［００６９］本発明の単離タンパク質を多様な方法で産生することも可能であり、こうした方法には、こうしたタンパク質を細菌から回収すること、およびこうしたタンパク質を組換え的に産生することが含まれる。本発明の１つの態様は、組換えＤＮＡ技術を用いて、本発明の単離修飾アネキシンタンパク質を産生する方法である。こうした方法には、（ａ）本発明の修飾アネキシンタンパク質をコードする核酸分子を含有する組換え細胞を培養して、該タンパク質を産生し、そして（ｂ）該タンパク質をそこから回収する工程が含まれる。組換え細胞の産生およびその培養に関する詳細を以下に提示する。句「タンパク質の回収」は、単純に、タンパク質を含有する全発酵培地を回収することを指し、そして必ずしも分離または精製のさらなる工程を含む必要はない。多様な標準的タンパク質精製技術を用いて、本発明のタンパク質を精製することも可能である。
【００５５】
［００７０］本発明の単離タンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な」型で回収される。本明細書において、「実質的に純粋な」は、機能アッセイにおいて、タンパク質の有効な使用を可能にする純度を指す。
【００５６】
修飾アネキシン核酸分子または遺伝子
［００７１］本発明の別の態様は、アネキシンＶのホモ二量体、アネキシンＩＶのホモ二量体、アネキシンＶＩＩＩのホモ二量体、アネキシンＶおよびアネキシンＶＩＩＩのヘテロ二量体、アネキシンＶおよびアネキシンＩＶのヘテロ二量体、またはアネキシンＩＶおよびアネキシンＶＩＩＩのヘテロ二量体などの修飾アネキシンタンパク質をコードする遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な単離核酸分子である。こうした核酸分子もまた、本明細書において、修飾アネキシン核酸分子と称される。修飾アネキシン遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子が含まれる。こうした遺伝子の特徴を本明細書に開示する。本発明にしたがって、単離核酸分子は、天然環境から取り除かれている核酸分子（すなわちヒトの操作にさらされたもの）である。こうしたものとして、「単離」は、核酸分子が精製されている度合いを反映しない。単離核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの誘導体を含むことも可能である。
【００５７】
［００７２］上述のように、修飾アネキシン遺伝子には、コード領域自体に加えて、天然アネキシン遺伝子に関連するすべての核酸配列、例えばこの遺伝子にコードされるアネキシンタンパク質の産生を調節する制御領域（例えば限定されるわけではないが、転写、翻訳または翻訳後調節領域）が含まれる。本発明の核酸分子は、単離修飾アネキシン核酸分子またはその相同体であることも可能である。本発明の核酸分子は、１以上の制御領域、全長または部分的コード領域、あるいはその組み合わせを含むことも可能である。本発明の修飾アネキシン核酸分子の最小サイズは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、対応する天然遺伝子と、安定なハイブリッドを形成可能な最小サイズである。アネキシン核酸分子はまた、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質または一部切除断片をコードする核酸分子も含むことも可能である。
【００５８】
［００７３］本発明の単離核酸分子を、全（すなわち完全）遺伝子、またはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成可能な全遺伝子の一部として、天然供給源から得ることも可能である。本明細書において、句、実体（ｅｎｔｉｔｙ）の「少なくとも一部」は、その実体の機能的側面を有するのに少なくとも十分な、実体の量を指す。例えば、本明細書において、核酸配列の少なくとも一部は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、対応する遺伝子と安定なハイブリッドを形成可能な、核酸配列の量である。
【００５９】
［００７４］組換えＤＮＡ技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）または化学合成を用いて、本発明の単離核酸分子を産生することもまた可能である。単離修飾アネキシン核酸分子には、天然核酸分子およびその相同体が含まれ、限定されるわけではないが、核酸分子が本発明のアネキシンタンパク質をコードするか、またはストリンジェントな条件下で、天然核酸分子単離体と安定なハイブリッドを形成する能力に、こうした修飾が実質的に干渉しないような方式で、ヌクレオチドが挿入され、欠失し、置換され、そして／または反転している、天然アレル変異体および修飾核酸分子が含まれる。
【００６０】
［００７５］当業者に知られるいくつかの方法を用いて、修飾アネキシン核酸分子相同体を産生することも可能である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。例えば、多様な技術を用いて、核酸分子を修飾することも可能であり、こうした技術には、限定されるわけではないが、古典的突然変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘導するための、核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片の連結、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または核酸配列の選択した領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、および核酸分子混合物を「構築する」混合物群の連結、並びにその組み合わせが含まれる。核酸にコードされるタンパク質の機能（例えば、相同体が、アネキシンタンパク質に対する免疫応答を誘発する能力、および／または凝血アッセイまたは他の機能アッセイにおいて、機能する能力）に関してスクリーニングすることによって、および／またはストリンジェントな条件下の、単離アネキシンコード核酸とのハイブリダイゼーションによって、修飾核酸の混合物から、核酸分子相同体を選択することも可能である。
【００６１】
［００７６］本発明の単離修飾アネキシン核酸分子は、本発明の少なくとも１つの修飾アネキシンタンパク質をコードする核酸配列を含むことも可能であり、こうしたタンパク質の例を本明細書に開示する。句「核酸分子」は、主に、物理的核酸分子を指し、そして句「核酸配列」は、主に、核酸分子上のヌクレオチドの配列を指すが、２つの句は交換可能に使用可能であり、特に修飾アネキシンタンパク質をコードすることが可能な核酸分子または核酸配列に関しては、交換可能に使用可能である。
【００６２】
［００７７］本発明の１つの態様は、ストリンジェントな条件下で、修飾アネキシンタンパク質またはその相同体の少なくとも一部をコードする核酸鎖に、あるいはこうした核酸鎖の相補体に、ハイブリダイズ可能な、修飾アネキシン核酸分子である。本発明の核酸配列いずれかの核酸配列相補体は、配列が引き出された（ｃｉｔｅｄ）鎖に相補的な（すなわちこうした鎖と完全二重らせんを形成可能な）核酸鎖の核酸配列を指す。一方の鎖に関して、核酸配列が決定された、すなわち配列番号に代表される、本発明の二本鎖核酸分子は、また、その配列番号の相補体である配列を有する相補鎖も含むことに注目すべきである。こうしたものとして、二本鎖または一本鎖いずれであることも可能な、本発明の核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に示す既定の配列番号および／または本明細書に示されていてもまたいなくてもよいその配列番号の相補体のいずれかと、安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補配列を推定する方法が当業者に知られる。修飾アネキシンタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸配列の対応する領域（単数または複数）と、少なくとも約６５パーセント、好ましくは少なくとも約７０パーセント、より好ましくは少なくとも約７５パーセント、より好ましくは少なくとも約８０パーセント、より好ましくは少なくとも約８５パーセント、より好ましくは少なくとも約９０パーセント、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５パーセントの相同性を有する核酸配列を含む、修飾アネキシン核酸分子が含まれる。アネキシンタンパク質またはその相同体のホモ二量体をコード可能な修飾アネキシン核酸分子が含まれる。
【００６３】
［００７８］アネキシン核酸分子には、配列番号４および配列番号４のアレル変異体、配列番号１および配列番号１のアレル変異体、配列番号１０および配列番号１０のアレル変異体；並びに配列番号１３および配列番号１３のアレル変異体が含まれる。
【００６４】
［００７９］本発明の修飾アネキシンタンパク質の核酸分子を知ると、当業者が、核酸分子のコピーを作製し、加えて、アネキシンタンパク質コード遺伝子のさらなる部分を含む核酸分子（例えば翻訳開始部位および／または転写調節領域および／または翻訳調節領域を含む核酸分子）、および／またはアネキシン核酸分子相同体を得ることが可能になる。本発明のアネキシンタンパク質のアミノ酸配列の一部を知ると、当業者が、こうしたアネキシンタンパク質をコードする核酸配列をクローニングすることが可能になる。さらに、多様な方法で、所望の修飾アネキシン核酸分子を得ることも可能であり、こうした方法には、本発明のアネキシンタンパク質と結合する抗体を用いた、適切な発現ライブラリーのスクリーニング；適切なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーニングするのに本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる、伝統的なクローニング技術；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、適切なライブラリー、あるいはＲＮＡまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅（ゲノムライブラリーおよび／またはｃＤＮＡライブラリーが使用可能である）が含まれる。
【００６５】
［００８０］本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、修飾アネキシンタンパク質の少なくとも一部をコードする、本発明の他の、好ましくはより長い核酸分子の相補領域と、ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである核酸分子も含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはいずれかの誘導体であることも可能である。こうしたオリゴヌクレオチドの最小サイズは、既定のオリゴヌクレオチド、および本発明の別の核酸分子上の相補配列の間に、安定なハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。最小サイズの特徴を本明細書に開示する。オリゴヌクレオチドのサイズはまた、本発明にしたがってオリゴヌクレオチドを使用するために十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドを多様な適用に使用することも可能であり、こうした適用には、限定されるわけではないが、さらなる核酸分子を同定するプローブとして、核酸分子を増幅するかたまは伸長するプライマーとして、あるいは修飾アネキシン産生を調節する療法適用においての適用が含まれる。こうした療法適用には、こうしたオリゴヌクレオチドを、例えばアンチセンス、三重鎖形成、リボザイムおよび／またはＲＮＡ薬剤に基づく技術において使用することが含まれる。本発明は、したがって、こうしたオリゴヌクレオチド、および１以上のこうした技術の使用によって、修飾アネキシンタンパク質の産生を調節する方法を含む。
【００６６】
天然野生型細菌細胞、並びに組換え分子および細胞
［００８１］本発明はまた、宿主細胞に核酸分子を送達することが可能なベクターいずれかに挿入された、本発明の修飾アネキシン核酸分子を含む、組換えベクターも含む。こうしたベクターは、異種核酸配列、すなわち本発明の修飾アネキシン核酸分子に、天然には隣接して見出されない核酸配列を含有する。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡいずれか、原核または真核いずれかであることも可能であり、そして典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の修飾アネキシン核酸分子をクローニングし、配列決定し、そして／または別の方式で操作する際に、組換えベクターを使用することも可能である。本明細書において、組換え分子と称し、そして以下により詳細に記載する、組換えベクターの１つの型を、本発明の核酸分子の発現に使用することも可能である。いくつかの組換えベクターは、形質転換細胞において、複製が可能である。本発明の組換えベクターに含まれる核酸分子を本明細書に開示する。
【００６７】
［００８２］ここまでに開示されていたように、本発明の１つの態様は、タンパク質を発現可能な細胞を、タンパク質を産生するのに有効な条件下で培養し、そしてタンパク質を回収することによって、本発明の修飾アネキシンタンパク質を産生する方法である。別の態様において、方法は、タンパク質を発現可能な細胞を、アネキシンタンパク質を産生するのに有効な条件下で培養し、タンパク質を回収し、そしてその有効サイズを増加させる剤にカップリングすることにより、タンパク質を修飾することによって、アネキシンタンパク質を産生することを含む。
【００６８】
［００８３］１つの態様において、培養する細胞は天然細菌細胞であり、そして修飾アネキシンをこれらの細胞から単離する。別の態様において、培養する細胞は、修飾アネキシンタンパク質を発現可能な組換え細胞であり、この組換え細胞は、本発明の１以上の核酸分子で、宿主細胞を形質転換することによって、産生されている。核酸分子を細胞に挿入することが可能な方法のいずれによって、核酸分子の細胞への形質転換を達成することも可能である。形質転換技術には、限定されるわけではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が含まれる。組換え細胞は、単細胞のままであることも可能であるし、あるいは組織、臓器または多細胞生物に成長することも可能である。形質転換された本発明の核酸分子は、染色体外に留まることも可能であるし、または発現される能力が保持されるような方式で、形質転換（すなわち組換え）細胞の染色体内の１以上の部位に組み込まれることも可能である。宿主細胞を形質転換する核酸分子を本明細書に開示する。
【００６９】
［００８４］形質転換に適した宿主細胞には、形質転換可能であり、そして導入された修飾アネキシンタンパク質を発現可能ないかなる細胞も含まれる。こうした細胞は、したがって、本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換された後、本発明の修飾アネキシンタンパク質を産生可能である。宿主細胞は、未形質転換細胞、または少なくとも１つの核酸分子ですでに形質転換された細胞のいずれであることも可能である。本発明の適切な宿主細胞には、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物、および植物細胞が含まれることも可能である。宿主細胞には、細菌細胞が含まれ、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞が特に好ましい。別の宿主細胞は、同族修飾アネキシンタンパク質を産生する、未形質転換（野生型）細菌細胞であり、必要に応じて、病原性が減少した弱毒化株が含まれる。
【００７０】
［００８５］好ましくは、１以上の転写調節配列を含有する発現ベクターに機能可能であるように連結された、本発明の１以上の核酸分子を各々含む、１以上の組換え分子で、宿主細胞を形質転換することによって、組換え細胞を産生する。句「機能可能であるように連結された」は、分子が宿主細胞に形質転換された際に発現されることが可能であるような方式での、発現ベクターへの核酸分子の挿入を指す。本明細書において、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、そして明記する核酸分子の発現を達成することが可能な、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することも可能である。発現ベクターは、原核または真核のいずれであることも可能であり、そして典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、昆虫、動物、および／または植物細胞中を含めて、本発明の組換え細胞中で機能する（すなわち遺伝子発現を指示する）、いかなるベクターも含む。こうしたものとして、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終結配列、複製起点、および組換え細胞と適合し、そして本発明の核酸分子の発現を調節する他の制御配列などの制御配列を含有する発現ベクターに、機能可能であるように連結されることも可能である。本明細書において、転写調節配列には、転写の開始、伸長、および終結を調節可能な配列が含まれる。特に重要な転写調節配列は、転写開始を調節するもの、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列である。適切な転写調節配列には、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能可能な転写調節配列いずれかが含まれる。多様なこうした転写調節配列が、当該技術分野に知られる。転写調節配列には、細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞で機能するもの、例えば限定されるわけではないが、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｚｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージ・ラムダ（λ）（λｐＬおよびλｐＲ、並びにこうしたプロモーターを含む融合体）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ接合因子、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）・アルコールオキシダーゼ、アルファウイルス・サブゲノムプロモーター（シンドビスウイルス・サブゲノムプロモーターなど）、バキュロウイルス、ヘリオシス・ジー（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルス・アクチン、レトロウイルス末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、ホスフェートおよびナイトレート転写調節配列、並びに原核細胞または真核細胞において、遺伝子発現を調節可能な他の配列が含まれる。さらなる適切な転写調節配列には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。本発明の転写調節配列にはまた、アネキシンタンパク質をコードするＤＮＡ配列と天然に関連する、天然存在転写調節配列も含まれることも可能である。１つの転写調節配列は、コザック強力プロモーターおよび開始配列である。
【００７１】
［００８６］本発明の発現ベクターはまた、発現されたアネキシンタンパク質が、タンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル（すなわちシグナルセグメント核酸配列）も含有することも可能である。適切なシグナルセグメントには、アネキシンタンパク質シグナルセグメント、または融合タンパク質を含む、本発明のアネキシンタンパク質の分泌を指示することが可能な異種シグナルセグメントいずれかが含まれる。シグナルセグメントには、限定されるわけではないが、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性、およびウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメントが含まれる。
【００７２】
［００８７］本発明の発現ベクターはまた、本発明の挿入核酸分子の発現を、融合タンパク質として導く、融合配列も含有することも可能である。本発明の修飾アネキシン核酸分子の一部として、融合配列を含むと、核酸分子にコードされるタンパク質の産生、保存、および／または使用中に、安定性を増進することも可能である。さらに、融合セグメントは、修飾アネキシンタンパク質の精製を単純にするツールとして、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて生じた融合タンパク質の精製を可能にするツールとして、機能することも可能である。タンパク質精製に使用可能な１つの融合セグメントは、８アミノ酸ペプチド配列ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ（配列番号９）である。
【００７３】
［００８８］適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば増加した安定性および／または精製ツール）を有する、いかなるサイズのドメインであることも可能である。１以上の融合セグメントの使用は、本発明の範囲内である。融合セグメントを、アネキシンタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に連結することも可能である。別の種類の融合タンパク質は、融合セグメントを２以上のアネキシンタンパク質または修飾アネキシンタンパク質に連結する融合タンパク質である。アネキシンまたは修飾アネキシンタンパク質の簡単な回収を可能にするため、切断に感受性であるように、融合セグメントおよびアネキシンタンパク質間の連結を構築することも可能である。好ましくは、アネキシンタンパク質のカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれかに付着した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養することによって、融合タンパク質を産生する。
【００７４】
［００８９］本発明の組換え分子は、形質転換しようとする細胞において、核酸分子の発現を有効に制御することが可能な転写調節配列いずれかの少なくとも１つに、機能可能であるように連結された、これまで記載した核酸分子いずれかの少なくとも１つを含むことが可能な分子である。組換え分子には、本発明の１以上の核酸分子が含まれ、１以上の修飾アネキシンタンパク質をコードするものが含まれる。本発明の組換え分子およびその産生を、実施例項に記載する。同様に、組換え細胞には、１以上のアネキシンタンパク質をコードする、本発明の１以上の核酸分子が含まれる。本発明の組換え細胞には、実施例項に開示されるものが含まれる。
【００７５】
［００９０］組換えＤＮＡ技術を使用すると、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピー数、こうした核酸分子が転写される効率、生じた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換核酸分子の発現を改善可能であることが、当業者には、認識可能である。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術には、限定されるわけではないが、核酸分子の高コピー数プラスミドへの機能可能であるような連結、１以上の宿主細胞染色体中への核酸分子の組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写調節シグナル（例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳調節シグナル（例えばリボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン慣用法に対応するような本発明の核酸分子の修飾、転写を不安定化する配列の欠失、および発酵中の組換えタンパク質産生から組換え細胞増殖を一時的に分離する調節シグナルの使用が含まれる。生じたタンパク質を断片化し、修飾し、または誘導体化することによって、発現された本発明の組換えタンパク質の活性を改善することも可能である。
【００７６】
［００９１］本発明にしたがって、組換え細胞を、本発明のアネキシンまたは修飾アネキシンタンパク質を産生するのに有効な条件下で培養して、そして該タンパク質を回収することによって、こうした細胞を用いて、こうしたタンパク質を産生することも可能である。タンパク質を産生するのに有効な条件には、限定されるわけではないが、タンパク質産生を可能にする、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれる。適切な、または有効な培地は、本発明の細胞を培養した場合、該細胞がアネキシンまたは修飾アネキシンタンパク質を産生可能な、いかなる培地も指す。こうした培地は、典型的には、同化可能な（ａｓｓｉｍｉｌａｂｌｅ）炭水化物、窒素およびホスフェート供給源、並びに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素、例えばビタミンを含む水性培地である。培地は、複雑な栄養素を含むことも可能であるし、また定義される最小培地であることも可能である。
【００７７】
［００９２］本発明の細胞を慣用的な発酵バイオリアクターで培養することも可能であり、こうしたバイオリアクターには、限定されるわけではないが、バッチ、流加、細胞リサイクルおよび連続発酵槽が含まれる。振盪フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、およびペトリ皿中で、培養を行うこともまた可能である。組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含量で、培養を行う。こうした培養条件は、一般の当業者の専門的技術の範囲内である。
【００７８】
［００９３］産生に用いるベクターおよび宿主系に応じて、生じるアネキシンタンパク質は、組換え細胞内に留まるか；発酵培地内に分泌されるか；２つの細胞膜間の空間内、例えば大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌されるか；あるいは細胞またはウイルス膜の外表面に保持されることも可能である。こうしたタンパク質を精製する方法を、実施例項に開示する。
【００７９】
抗体
［００９４］本発明はまた、単離抗修飾アネキシン抗体およびその使用も含む。抗修飾アネキシン抗体は、修飾アネキシンタンパク質に選択的に結合可能な抗体である。単離抗体は、天然環境から取り除かれている抗体である。用語「単離」は、こうした抗体の純度の状態を指さない。こうしたものとして、単離抗体は、こうした抗体を含有する抗血清、または多様な度合いまで精製されている抗体を含むことも可能である。本明細書において、用語「選択的に結合する」は、こうした抗体が、それに対して抗体が作製されたタンパク質に、優先的に結合する（すなわち、混合物中の関連しない構成要素から、該タンパク質を区別可能である）能力を指す。一般的に平衡会合定数として表される結合親和性は、典型的には、約１０３Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の範囲である。当業者に知られる多様な方法を用いて、結合を測定することも可能であり、こうした方法には、イムノブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ、および免疫電子顕微鏡が含まれる；例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【００８０】
［００９５］本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであることも可能である。本発明の抗体には、抗体を得るのに用いられるタンパク質の少なくとも１つのエピトープに選択的に結合することが可能な、一本鎖抗体を含む、抗体断片および遺伝子操作された抗体などの、機能上の同等物が含まれる。本発明の抗体にはまた、１より多いエピトープに結合可能なキメラ抗体も含まれる。抗体は、少なくとも部分的に、本発明の修飾アネキシン核酸分子にコードされるタンパク質に反応して作成される。
【００８１】
［００９６］本発明の抗修飾アネキシン抗体には、修飾アネキシンを投与した動物において作製される抗体が含まれる。本発明の抗修飾アネキシン抗体にはまた、当業者に知られる技術を用いて、本発明の１以上の修飾アネキシンタンパク質に対して、動物において作製され、次いで細胞から回収された、抗体も含まれる。本発明のさらなる抗体は、本発明の修飾アネキシンタンパク質に関して本明細書に開示する技術を用いて、組換え的に産生される。定義されるタンパク質に対して産生される抗体は、そうでなければ、診断アッセイにおける干渉、または療法組成物中で用いた場合には副作用を引き起こしうる、他の物質に対する抗体が、実質的に混入していないため、好適でありうる。
【００８２】
［００９７］本発明の抗修飾アネキシン抗体は、本発明の範囲内である多様な使用を有する。抗修飾アネキシン抗体をツールとして用いて、発現ライブラリーをスクリーニングし、そして／または本発明の所望のタンパク質をタンパク質および他の混入物質の混合物から回収することも可能である。
【００８３】
［００９８］本発明の抗修飾アネキシン抗体は、修飾アネキシンタンパク質に選択的に結合可能である。
療法
［００９９］上述の修飾アネキシンタンパク質のいずれかを本発明の方法で用いて、医学的方法または状態いずれかによって引き起こされる動脈血栓症または静脈血栓症を治療する。一般的に、本発明で用いる療法剤を有効量で動物に投与する。一般的に、有効量は、（１）治療しようとする疾患の症状を減少させるか、または（２）治療しようとする疾患を治療するのに相当する薬理学的変化を誘導するのに有効な量である。
【００８４】
［００１００］血栓症に関して、有効な量には、出血のリスクを実質的に増加させることなく、延長された抗血栓活性を発揮するか、または罹患した動物の平均余命を増加させるのに有効な量が含まれる。本明細書において、延長された抗血栓活性は、非修飾アネキシンタンパク質と同量（モル濃度）の活性の時間に対する、修飾アネキシンタンパク質の活性の時間を指す。好ましくは、抗血栓活性は、少なくとも約２倍（factor of two）、より好ましくは少なくとも約５倍（factor of five）、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍（factor of ten）、延長される。好ましくは、有効量は、修飾アネキシンを投与していない同じ被験者の出血リスクに比較して、出血リスクを実質的に増加させない。好ましくは、出血リスクは非常に小さく、そして最大でも、先行技術で利用可能な別の抗血栓治療に提供されるものより低い。療法的に有効な量の療法剤は、所望の抗血栓効果を引き起こすのに十分な量または用量いずれであることも可能であり、そして部分的に、血栓の状態、タイプ、および位置、患者の大きさおよび状態、並びに当業者に知られる他の要因に応じる。投薬量を、単回用量として、または例えば数週間の経過に渡って分割される、数回の用量として、投与することも可能である。
【００８５】
［００１０１］好ましくは、さらなる血栓症を防止するために、血栓症後に、あるいは被験者が血栓症に罹患しやすいかまたは血栓症のリスクを持つ状態下で、ボーラス注射によるか、または静脈内注入によって、投与を行う。
【００８６】
［００１０２］例えば非経口投与あるいは局所投与、例えば静脈内注射もしくは皮下注射、またはエアロゾルによるものを含む、適切な手段いずれかによって、本発明の療法剤を投与することも可能である。投与法に応じて、多様な単位投薬型で療法組成物を投与することも可能である。本発明の療法組成物の送達法には、例えば注射による、静脈内投与および局所投与が含まれる。送達の特定の様式では、本発明の療法組成物を本発明の賦形剤中に配合することも可能である。本発明の療法剤を、動物いずれか、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトに投与することも可能である。
【００８７】
［００１０３］１つの適切な投与時間は、冠動脈血栓症後に生じ、それによって、出血のリスクを実質的に増加させることなく、血栓症の再発を防止する。修飾アネキシンのボーラス注射は、好ましくは、血栓症後まもなく、例えば入院前に行われる。修飾アネキシンを、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、または細菌酵素などの血栓溶解療法剤と組み合わせて投与することも可能である。
【００８８】
［００１０４］本発明の修飾アネキシンタンパク質を使用する方法には、顕性脳血栓症または一過性脳虚血発作を含む脳血栓症を治療する方法が含まれ、この方法は、脳血栓症を治療する必要がある患者に、有効量の修飾アネキシンタンパク質を投与することによる。発達した脳卒中には、しばしば一過性虚血発作が先行する。末梢動脈における血栓症のリスクが増加した糖尿病患者および他の患者に、修飾アネキシンを投与することもまた可能である。したがって、本発明は、血栓症のリスクが増加した患者において、血栓症のリスクを減少させる方法であって、血栓症のリスクを減少させる必要がある患者に、有効量の修飾アネキシンタンパク質を投与することを含む、前記方法を提供する。成人患者には、約１〜約１００ｍｇの投薬範囲の修飾アネキシンを静脈内投与するか、またはボーラスとして投与することも可能である。
【００８９】
［００１０５］本発明はまた、股関節形成術および膝関節形成術などの、いくつかの外科手術に関連する静脈血栓症のリスクを減少させる方法であって、こうした血栓症のリスクを減少させる必要がある患者に、本発明の修飾アネキシンタンパク質の有効量を投与することによる、前記方法も提供する。修飾アネキシン治療は、手術野への出血を増加させることなく、血栓症を防止することも可能である。別の態様において、本発明は、出血を増加させることなく、妊娠および分娩に関連する血栓症を防止する方法であって、血栓症を防止する必要がある患者に、本発明の修飾アネキシンタンパク質の有効量を投与することによる、前記方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、再発性静脈血栓症の治療法であって、再発性静脈血栓症を治療する必要がある患者に、本発明の修飾アネキシンタンパク質の有効量を投与することによる、前記方法を提供する。成人患者には、約１〜約１００ｍｇの投薬範囲の修飾アネキシンを、ボーラスとして静脈内投与することも可能である。
【００９０】
［００１０６］本発明はまた、血栓症を調節する修飾アネキシンタンパク質に関してスクリーニングする方法であって、血栓症試験系を、血栓症を許容する条件下で、少なくとも１つの試験修飾アネキシンタンパク質と接触させ、そして試験修飾アネキシンタンパク質の非存在下での抗血栓活性と、試験修飾アネキシンタンパク質の存在下での抗血栓活性を比較することにより、ここで、試験修飾アネキシンタンパク質の存在下で、抗血栓活性に変化があると、修飾アネキシンタンパク質が血栓活性を調節するものであることの指標となる、前記方法を提供する。１つの態様において、血栓症試験系は、活性化部分的トロンボプラスチン時間を測定するための系である。この方法によって同定されるような、血栓症を調節する修飾アネキシンタンパク質もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００９１】
［００１０７］本発明はまた、アネキシン活性に関して、修飾アネキシンタンパク質を同定する方法であって、活性化された血小板と、少なくとも１つの試験修飾アネキシンタンパク質を、結合を許容する条件下で接触させ、そして試験修飾アネキシンタンパク質の存在下での、試験修飾アネキシン結合活性および血小板のプロテインＳ結合活性と、非修飾アネキシンタンパク質の存在下での、アネキシン結合活性およびプロテインＳ結合活性を比較して、これによって、アネキシン活性を持つ修飾アネキシンタンパク質が同定可能である、前記方法も提供する。この方法によって同定される修飾アネキシンタンパク質もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００９２】
［００１０８］さらなる態様において、本発明は、血栓症を調節する修飾アネキシンタンパク質に関してスクリーニングする方法であって、ｉｎ  ｖｉｖｏ血栓症試験系を、血栓症を許容する条件下で、少なくとも１つの試験修飾アネキシンタンパク質と接触させ、そして試験修飾アネキシンタンパク質の非存在下での抗血栓活性と、試験修飾アネキシンタンパク質の存在下での抗血栓活性を比較することによる、前記方法を提供する。試験修飾アネキシンタンパク質の存在下で、抗血栓活性に変化があると、修飾アネキシンタンパク質が血栓活性を調節するものであることの指標となる。さらに、試験修飾アネキシンタンパク質の存在下で、抗血栓活性が維持される時間を、非修飾アネキシンの存在下での抗血栓活性の時間と比較して、試験修飾アネキシンタンパク質に関連する抗血栓活性の延長を決定する。試験修飾アネキシンタンパク質の存在下での出血の度合いを、例えば尾の出血時間を測定することによって評価し、そして試験修飾アネキシンタンパク質の非存在下での出血の度合いと比較する。１つの態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏ血栓症試験系は、挙睾筋における、光化学的に誘導された血栓のマウスモデルである。この方法に同定されるような、血栓症を調節する修飾アネキシンタンパク質もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００９３】
［００１０９］さらなる態様において、本発明の療法剤は、遺伝子治療に有用である。本明細書において、句「遺伝子治療」は、目的の遺伝物質（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を、宿主に移入して、遺伝性または後天性の疾患または状態を治療するかまたは防止することを指す。目的の遺伝物質は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの産生が望ましい産物（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、目的の遺伝物質は、療法的価値がある、ホルモン、受容体、酵素または（ポリ）ペプチドをコードすることも可能である。特定の態様において、本発明は、本明細書に援用される、Ｈｕｇｈｅｓら、米国特許第６，１６９，０７８号に記載されるような、核酸と複合体形成することも可能な、非ウイルス遺伝子治療で使用するための脂質分子種を利用し、該分子種において、脂質の極性頭基および親油性テール基の間に、ジスルフィド・リンカーが提供されている。
【００９４】
［００１１０］本発明のこれらの療法化合物は、ＤＮＡと有効に複合体形成し、そして細胞膜を通じて、異種ＤＮＡで形質転換しようとする細胞の細胞内空間へのＤＮＡの移入を促進する。さらに、これらの脂質分子は、細胞質における異種ＤＮＡの放出を促進し、それによって、ヒトまたは動物における遺伝子治療中の遺伝子トランスフェクションを増加させる。
【００９５】
［００１１１］当該技術分野に知られる多様な方法によって、カチオン性脂質−ポリアニオン性巨大分子凝集塊を形成することも可能である。代表的な方法が、すべて本明細書に援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、米国特許第４，８９７，３５５号；Ｂｅｈｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６（１９８９）；Ｂａｎｇｈａｍら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｏｌｓｏｎら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ５５７：９（１９７９）；Ｓｚｏｋａら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７５：４１９４（１９７８）；Ｍａｙｈｅｗら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ７７５：１６９（１９８４）；Ｋｉｍら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ７２８：３３９（１９８３）；およびＦｕｋｕｎａｇａら，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １１５：７５７（１９８４）に開示される。一般的に、（１）カチオン性脂質または（２）共脂質（ｃｏｌｉｐｉｄ）と混合したカチオン性脂質のいずれかからなる脂質粒子を調製し、その後、ほぼ室温（約１８〜２６℃）で脂質粒子にポリアニオン性巨大分子を添加することによって、凝集塊を形成することも可能である。一般的に、保護基の脱保護を導かない条件を選択する。１つの態様において、次いで、約１０分間〜約２０時間の期間に渡って、混合物が凝集塊を形成するのを可能にするが、約１５〜６０分間が最も好適に用いられる。特定の脂質型には、他の期間が適切である可能性もある。より長い期間に渡って、複合体を形成することも可能であるが、複合体形成期間がより長くても、通常、トランスフェクション効率のさらなる増進は得られないであろう。
【００９６】
［００１１２］本発明の化合物および方法を用いて、所望の分子、例えばポリヌクレオチドを、ターゲット細胞に細胞内送達することも可能である。所望のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはその類似体で構成されることも可能である。本発明の方法を用いて送達される、所望のポリヌクレオチドは、異なる機能または活性を提供するヌクレオチド配列、例えば制御機能を有するヌクレオチド、例えばプロモーター配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチドで構成されることも可能である。所望のポリヌクレオチドはまた、細胞において、他のヌクレオチド配列に対してアンチセンスであるヌクレオチド配列を提供することも可能である。例えば、所望のポリヌクレオチドは、細胞において転写された際、細胞において、他のヌクレオチド配列に対してアンチセンスである配列を有するポリヌクレオチドを提供することも可能である。アンチセンス配列は、細胞において、センス鎖配列にハイブリダイズ可能である。一般の当業者は、アンチセンス配列を提供するポリヌクレオチドを容易に調製可能である。細胞に送達される所望のポリヌクレオチドはまた、細胞において、二本鎖ＤＮＡと三重鎖複合体を形成することが可能な、ヌクレオチド配列を含むことも可能である。
【００９７】
［００１１３］本発明は、哺乳動物において、再灌流傷害を防止するかまたは減弱するための化合物および方法を提供する。再灌流傷害（ＲＩ）は、臓器または組織への血液供給が中断されて、そして間隔を置いた後、回復された際に起こる。内皮細胞および他の細胞におけるリン脂質非対称性の喪失は、ＲＩの発症において、重大な事象と考えられる。これらの細胞の表面上にＰＳが暴露されると、活性化された単球の結合が可能になる。この結合が、ＲＩの別の重大な事象である、内皮細胞および他の細胞の不可逆的アポトーシスにつながる、一連の事象を誘発する。さらに、細胞表面上のＰＳ、およびそれに由来する小胞は、脂質仲介因子を生成するホスホリパーゼにアクセス可能である。これらの脂質仲介因子は、上述の機構によって生じる損傷を増幅し、そして急性心筋梗塞後の心室性不整脈などの深刻な合併症を生じる。
【００９８】
［００１１４］組換えヒトアネキシン、好ましくはアネキシンＶは、血管区画における半減期が延長されるような方式で修飾される。これは、多様な方式で達成可能であり；ポリエチレングリコールにカップリングしたアネキシン、アネキシンのホモポリマーまたはヘテロポリマー、およびアネキシンと別のタンパク質（例えば免疫グロブリンのＦｃ部分）の融合タンパク質が３つの態様である。どちらも本明細書に完全に援用される、Ａｌｌｉｓｏｎ，  “Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，”  米国特許出願第１０／０８０，３７０号（２００２年２月２１日出願）およびＡｌｌｉｓｏｎ，  “Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｖａｓｏ−Ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  Ｓｉｃｋｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ，”  米国特許出願第１０／６３２，６９４号（２００３年８月１日出願）を参照されたい。
【００９９】
［００１１５］修飾アネキシンは、上皮細胞および他の細胞の表面上のホスファチジルセリンに高親和性で結合し、それによって、食細胞の結合、および脂質仲介因子を放出するホスホリパーゼの操作を防止する。したがって、修飾アネキシンは、再灌流傷害の細胞性機構および体液性機構の両方を阻害する。
【０１００】
［００１１６］１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのさらなるタンパク質、例えばさらなるアネキシンタンパク質（ホモ二量体を形成する）、ポリエチレングリコール、または免疫グロブリンのＦｃ部分にカップリングした、アネキシンタンパク質を含有する、単離修飾アネキシンタンパク質を提供する。さらなるタンパク質は、好ましくは、少なくとも３０ｋＤａの分子量を有する。本発明がやはり提供するのは、本発明の修飾アネキシンタンパク質のいずれかを、再灌流傷害を防止するかまたは減少させるのに有効な量で含有する薬剤組成物である。
【０１０１】
［００１１７］本発明のいくつかの方法において、本発明の修飾アネキシンタンパク質のいずれか１つを、再灌流傷害を防止するかまたは減弱させるのに有効な量で有する薬剤組成物中、再灌流傷害のリスクがある被験者に修飾アネキシンを投与する。例えば、臓器移植、関節形成術、あるいは臓器または組織への血液供給が中断されて、そして間隔を置いた後、回復される、他の外科手術の前および後に、薬剤組成物を投与することも可能である。冠動脈血栓症または脳血栓症後に、該組成物を投与することもまた可能である。
【０１０２】
［００１１８］修飾アネキシンは、細胞表面上のアクセス可能なＰＳに結合し（細胞をシールドし）、それによって、単球の付着およびアポトーシスの不可逆的な段階を防止する。さらに、修飾アネキシンは、やはりＲＩに寄与する脂質仲介因子を生成するホスホリパーゼの活性を阻害する。修飾アネキシンは、死体ドナーから移植された臓器において、冠動脈血栓症および脳血栓症患者において、関節形成術を受ける患者において、そして他の状況において、ＲＩを防止するかまたは減弱させるのに有用であろう。さらに、修飾アネキシンは、出血を増加させることなく、延長された抗血栓活性を発揮するであろう。ＲＩを減弱させる能力と、抗血栓効力のこの組み合わせは、現在用いられているか、または開発中であることが知られるいかなる療法剤にも提示されない、ユニークなプロフィールの望ましい活性を提示する。
【０１０３】
［００１１９］実施例６に記載するように、アネキシン・ホモ二量体は、ｓＰＬＡ２の強力な阻害剤である（図４）。アネキシンＶは、細胞表面上のＰＳに高親和性で結合するため、ｓＰＬＡ２および他のホスホリパーゼによる分解からＰＳをシールドする。
【０１０４】
［００１２０］ヒトアネキシンＶのホモ二量体を産生すると、ＰＳに対する親和性が増加し、それによって、療法剤としての有効性が改善され；そしてそれだけでなく、サイズが増大し、それによって循環中の存続および作用期間が延長される。３６ｋＤａの単量体は、血流から腎臓に迅速に失われた。ウサギにおいて、循環中に注入した標識アネキシンＶの８０％より多くが、７分間で消失した（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：２３３９，  １９９７）。カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）において、注入したアネキシンＶの半減期は、１１〜１５分であることが見出された（Ｒｏｍｉｓｃｈら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．，  ６１：９３，  １９９１）。９９ＭＴｃで標識したアネキシンを注入したヒトにおいて、主要（α）区画に関する半減期は、２４分であった（Ｋｅｍｅｒｉｎｋら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４：９４７，  ２００３）。
【０１０５】
［００１２１］好適な方法いずれによって、アネキシン・ホモ二量体を産生することも可能である。組換えＤＮＡ技術は、単量体中の１つの利用可能なスルフィドリル基への連結、またはポリエチレングリコールとのカップリングなどの、翻訳後の処置の必要性を回避するため、いくつかの態様において、組換えＤＮＡ技術によって、アネキシン・ホモ二量体を産生する。一方のアネキシン単量体のアミノ末端および他方の単量体のカルボキシ末端に付着させた柔軟なペプチドリンカーを使用することによって、組換えホモ二量体化を達成した（図１）。アネキシンＶ、並びにＣａ２＋およびＰＳに結合する残基の三次元構造が、Ｘ線結晶学および部位特異的突然変異誘発から知られる（Ｈｕｂｅｒら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２３：６８３，  １９９２；Ｃａｍｐｏｓら，  ３７：８００４，  １９９８）。Ｃａ２＋結合部位およびＰＳ結合部位は、分子の凸状表面上であり、一方、アミノ末端は、凹状表面上にゆるいテールを形成する。どちらの凸状表面も、細胞表面上のＰＳにアクセス可能であるような方式で、フォールディング可能であるように、図１に示すアネキシンＶホモ二量体を設計する。したがって、このため、二量体は、単量体のものよりも、ＰＳにより高い親和性を有するであろう。実施例４に報告するように、これを実験的に検証した。アネキシンＶのホモ二量体の別の利点は、３６ｋＤａの分子（単量体）が、循環から腎臓に迅速に失われる一方、７３ｋＤａのもの（二量体）は、腎臓ろ過閾値を超えており、失われることはないであろうことである。したがって、療法的に有用な活性は、二量体で延長されるであろう。この予測を、実験で確認した。
【０１０６】
［００１２２］再梗塞およびＲＩを防止するかまたは減弱するため、いくつかの場合、より長い活性期間を有することが望ましい。ホモ二量体化して７６ｋＤａにすることによって、アネキシンＶの分子量を増加させると、腎臓への損失が防止され、そして循環中の存続が延長される。したがって、こうした修飾アネキシンは、臓器への血液供給が中断される数時間前に投与されたとしても、ＲＩを有効に減弱させることも可能である。
【０１０７】
［００１２３］本発明の解説は、アネキシンＶがＲＩを阻害しないと示唆した文献中の報告とは相反する。例えば、ｄ’Ａｍｉｃｏらは、ラット心臓において、アネキシンＶはＲＩを阻害しないが、リポコルチンＩ（アネキシンＩ）は阻害したと報告する（ｄ’Ａｍｉｃｏら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １４：１８６７，  ２０００）。リポコルチンＩの断片をラットの脳室に注入すると、脳虚血後の梗塞サイズおよび脳浮腫が減少すると報告された（Ｐｅｌｔｏｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７４：３０５，  １９９１）；これらの著者らは、再灌流を研究しなかった。肝臓の虚血傷害を防止する戦略の包括的概説（Ｓｅｌｚｎｅｒら，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １５：９１７，  ２００３）において、アネキシンは言及されていない。
【０１０８】
［００１２４］実施例７に記載するように、マウス肝臓モデル（Ｔｅｏｈら，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６：９４，  ２００２）において、アネキシンＶホモ二量体がＲＩを減弱する能力を試験した。このモデルでは、肝臓の左側葉および中葉への血流を９０分間中断し、そして次いで回復させる。２４時間後、アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清レベルおよび肝臓組織像によって、肝臓傷害の重症度を評価する。肝動脈をクランプする６時間前に注入した、アネキシンＶホモ二量体（ＤＡＶ）、分子量７３ｋＤａ、およびポリエチレングリコールにカップリングしたアネキシンＶ（ＰＥＧ−ＡＶ）、分子量５７ｋＤａは、どちらも、血清ＡＬＴレベル（図５）および肝臓組織像に示されるように、ＲＩを減弱するのに非常に有効であった。アネキシンＶ単量体（ＡＶ）は、このモデルにおいて、防御性がより低かった。
【０１０９】
［００１２５］したがって、実験の証拠によって、本発明の修飾アネキシンは、被験者において、ＲＩを減弱するのに有用であろうことが確認される。上に論じるように、異なる臓器で起こる型のＲＩにも、同様の発症機構が関与し、したがって、アネキシンＶホモ二量体を、これらすべてにおけるＲＩを減弱するのに用いることも可能である。
【０１１０】
［００１２６］ＰＳに対して親和性が高く、そして循環からの損失が減少しているため、アネキシンＶホモ二量体は、延長された抗血栓活性を発揮するであろう。これは、再梗塞を防止するのに臨床的に有用であり、再梗塞は、冠動脈血栓後の重要な事象であることが知られ（Ａｎｄｅｒｓｅｎら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４９：７３３，  ２００３）、そして脳卒中に重要である可能性がある。関節形成術を受ける患者における血栓症の防止もまた、臨床的に重要な必要性を持つ。したがって、抗凝血剤としての修飾アネキシンのさらなる活性には、価値がある。いくつかの実験動物モデルにおいて、アネキシンＶは、出血を増加させることなく、動脈血栓症および静脈血栓症を阻害する（Ｒｏｅｍｉｓｃｈら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｒｅｓ．  ６１：９３，  １９９１；Ｖａｎ  Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．  ６９：２２７，  １９９３；ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：２３３９，  １９９７）。修飾アネキシンは、出血を増加させることなく、抗凝血活性を発揮し、そして再灌流傷害を減弱させる能力を有する。この作用の組み合わせは、いくつかの臨床状況において、有用でありうる。現在使用されているか、または開発中であることが知られる、他の療法剤のいずれも、この活性の望ましいプロフィールを共有しない。
【０１１１】
［００１２７］アネキシンＶ以外のいくつかのアネキシンが、Ｃａ２＋およびＰＳに結合する。これらのいずれを用いて、再灌流傷害を防止するかまたは減少させることも可能である。ホモ二量体化以外の方法によって、アネキシンＶ、または別のアネキシンの分子量を増加させることも可能である。こうした方法には、他のホモポリマーまたはヘテロポリマーの調製が含まれる。あるいは、組換えＤＮＡ技術または化学的操作によって、アネキシンを別のタンパク質にコンジュゲート化することも可能である。ポリエチレングリコールまたは別の非ペプチド化合物へのアネキシンのコンジュゲート化もまた、想定される。
【０１１２】
［００１２８］アネキシンＶホモ二量体が、よく寛容されるであろうことが予期される。別のアネキシン、アネキシンＶＩは、保存されるアネキシン配列の天然存在ホモ二量体である。しかし、アネキシンＶＩは、高親和性でＰＳに結合しない。アネキシン以外のＰＳ結合タンパク質もまた、本発明の方法で使用可能である。例えば、ＰＳに高親和性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（Ｄｉａｚら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ９：２５０，  １９９８；Ｔｈｏｒｐｅら、米国特許第６，３１２，６９４号）を、（例えば再灌流傷害を減少させるかまたは防止するため）本発明にしたがって用いることも可能である。
【０１１３】
［００１２９］ジアネキシン（定義されたい−配列番号６か）は、ラットにおいて、用量に関連する抗血栓活性を有する（図７）。ジアネキシンを５．０ｍｇ／ｋｇ（抗血栓用量のおよそ７倍）で投与した場合であっても、ラット尾を切断した後、血液損失は有意に増加しない。対照的に、同時に行った実験において、１４０ａＸａ単位／ｋｇ（療法用量のおよそ７倍）のフラグミン（低分子量ヘパリン）を投与すると、血液損失が有意に増加した（表４および図１０）。ＡＰＴＴ（活性化プロトロンビン時間）に関して、用いたジアネキシンの用量のいずれもＡＰＴＴを増加させなかったが、２０ａＸａ単位／ｋｇ（表２）および１４０ａＸａ単位／ｋｇ（表５および図１１）のフラグミンのどちらも、ＡＰＴＴを有意に増加させた。ヨウ素標識ジアネキシンのクリアランスは、２区画モデル、９〜１４分のα期および６〜７時間のβ期によって表現可能である。後者は、いくつかの種で、アネキシンＩＶ単量体に関して先に報告されたものより有意に長い。ジアネキシンの多くの臨床的適用には、単回ボーラス注射で十分であるため、６．５時間の半減期は、療法的に好適である。ジアネキシンが出血を誘導する、ありそうにない事象の場合も、その効果はかなり早く消失するであろう。ジアネキシンおよびフラグミンはどちらも、尾切断後のラットの出血時間を有意に増加させる（図９および表４）。ジアネキシンの場合、これはホスホリパーゼＡ２作用およびトロンボキサン生成を阻害するためである可能性もある。ヒトにおいて、薬剤によって、または遺伝子不全の結果として、シクロオキシゲナーゼが阻害される（ｉｒｈｂｉｔｅｄ）と、出血時間が増加する。ジアネキシンは、血液損失を有意に増加させないため、出血時間が増加したにもかかわらず、ジアネキシンが、初期止血機構に大きな影響を持たないことは明らかである。ジアネキシン投与は、体重に影響を及ぼさない。
【０１１４】
［００１３０］本発明はまた、本発明の修飾アネキシンタンパク質を含む療法組成物にも関する。本発明の組成物はまた、薬学的に許容しうる賦形剤、アジュバント、および／またはキャリアーなどの他の構成要素も含むことも可能である。例えば、本発明の組成物を、処置しようとする動物が許容しうる賦形剤中に配合することも可能である。こうした賦形剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、マンニトール、ハンクス溶液、および他の水性生理学的平衡塩溶液が含まれる。非水性ビヒクル、例えばトリグリセリドを用いることもまた可能である。賦形剤はまた、少量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を増進する物質も含有することも可能である。緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、重炭酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ヒスチジン、クエン酸塩およびグリシン、またはその混合物が含まれ、一方、保存剤の例には、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的配合物は、液体注射物質または固体のいずれかであることも可能であり、固体は、注射用の懸濁物または溶液として、適切な液体中に取り込まれることも可能である。したがって、非液体配合物において、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤等を含むことも可能であり、投与前に、これに無菌水または生理食塩水を添加することも可能である。
【０１１５】
［００１３１］本発明の１つの態様は、動物に、本発明の組成物を持続放出することが可能な徐放配合物である。本明細書において、徐放配合物は、徐放ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適切な徐放ビヒクルには、限定されるわけではないが、生体適合ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、微小カプセル、微小粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、分散デバイス、リポソーム、リポ球体（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、および経皮送達系が含まれる。本発明の他の徐放配合物には、動物に投与した際、ｉｎ  ｓｉｔｕで、固体またはゲルを形成する液体が含まれる。好ましい徐放配合物は、生体分解性（すなわち生体内分解性）である。
【０１１６】
［００１３２］一般的に、本発明で用いる療法剤は、有効量で動物に投与される。一般的に、有効量は、（１）治療しようとする疾患の症状を減少させるか、または（２）治療しようとする疾患を治療するのに相当する薬理学的変化を誘導するか、いずれかに有効な量である。
【０１１７】
［００１３３］療法剤の療法的に有効な量は、所望の効果を引き起こすのに十分な量または用量いずれであることも可能であり、そして部分的に、癌の状態、タイプ、および位置、患者の大きさおよび状態、並びに当業者に容易に知られる他の要因に応じる。投薬量を、単回用量として、または例えば数週間の経過に渡って分割される、数回の用量として、投与することも可能である。
【０１１８】
［００１３４］本発明はまた、本発明の療法組成物を利用した治療法にも関する。本発明の方法は、こうした投与が必要な被験者に療法剤を投与することを含む。
［００１３５］適切な手段いずれによって、本発明の療法剤を投与することも可能であり、これには例えば、非経口投与、局所投与、経口投与、または皮内投与などの局部投与、注射によるもの、またはエアロゾルによるものが含まれる。本発明の１つの態様において、注射によって剤を投与する。罹患した領域いずれに、こうした注射を局部的に注射することも可能である。投与法に応じて、多様な単位投薬型で療法組成物を投与することも可能である。本発明の療法組成物の適切な送達法には、例えば注射による、静脈内投与および局部投与が含まれる。特定の送達様式のため、本発明の療法組成物を、賦形剤中で配合することも可能である。本発明の療法試薬を、動物いずれか、好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトに、投与することも可能である。
【０１１９】
［００１３６］投与の特定の様式は、治療しようとする状態に応じるであろう。本発明の剤の投与は、体液いずれか、あるいは体液を通じてアクセス可能なターゲットいずれかまたは組織いずれかを介することも可能である。
【０１２０】
［００１３７］以下の実施例は、本発明の修飾アネキシンタンパク質の調製、並びに修飾アネキシンタンパク質の抗凝血活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを例示する。本発明は、実施例に記載する典型的な研究または実施例に示す特定の詳細に限定されないことが理解されるものとする。
【実施例】
【０１２１】
（実施例１）
修飾アネキシン調製
［００１３８］ヒト組織からアネキシンを精製することも可能であるし、または組換え技術によって産生することも可能である。例えば、Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら（１９８７）に記載されるように、ヒト胎盤から、アネキシンＶを精製することも可能である。組換え産物の例は、大腸菌におけるアネキシンＩＩおよびアネキシンＶの発現である（Ｋａｎｇ，  Ｈ．−Ｍ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｍｅｄ．  ９：９２−１０２（１９９９）；ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７、２０００）。Ｃａ２＋が増進する、ホスファチジルセリン含有リポソームへの結合、およびそれに続くＥＤＴＡによる溶出に基づく、組換えアネキシンＶの迅速でそして効率的な精製法が、Ｂｅｒｇｅｒ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３２９：２５−２８（１９９３）に記載されてきている。固相支持体にカップリングしたホスファチジルセリンの使用によって、この方法を改善することも可能である。
【０１２２】
［００１３９］ＰＥＧ化と称されるプロセスにおいて、いくつかのよく確立された方法のいずれか（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６に概説される）によって、アネキシンをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングすることも可能である。本発明には、モノまたはポリ（例えば２〜４）ＰＥＧ部分を有する、化学的に誘導体化されたアネキシン分子が含まれる。ＰＥＧ化アネキシンを調製する方法は、一般的に、（ａ）アネキシンとポリエチレングリコール（ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体など）を、アネキシンが１以上のＰＥＧ基に付着する条件下で、反応させ、そして（ｂ）単数または複数の反応産物を得る工程を含む。一般的に、既知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、ケースバイケースで、反応の最適反応条件を決定しなければならない。さらに、反応は、異なる数のＰＥＧ鎖を有する異なる産物を産生する可能性もあり、そして所望の産物を得るために、さらなる精製が必要である可能性もある。
【０１２３】
［００１４０］ＥＤＣに加えてスルホ−ＮＨＳを用いる方法を用いて、アネキシンＶへのＰＥＧのコンジュゲート化を行うことも可能である。ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）を用い、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンアミド）を用いて、カルボキシレート基で、活性エステル基を形成する。これは、活性中間体の安定性を増加させ、この中間体がアミンと反応して、安定なアミド連結を生じる。Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６に記載されるように、コンジュゲート化を行うことも可能である。
【０１２４】
［００１４１］バイオコンジュゲート法を用いて、アネキシンのホモポリマーまたはヘテロポリマーを産生することも可能であり；この方法は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６に概説される。組換え法を用いて、融合タンパク質、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分または別のタンパク質と発現されたアネキシンを産生することもまた可能である。アネキシンＩＩとｐ１１のヘテロ四量体もまた、大腸菌で産生されている（Ｋａｎｇら、１９９９）。これらの方法はすべて、アネキシンの分子量を増加させ、そして循環中のアネキシンの半減期を増加させ、そしてその抗凝血効果を延長させる潜在能力を有する。
【０１２５】
［００１４２］図１Ｃに図示され（５’−３’センス鎖）（配列番号４）、そして配列番号６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ構築物を用いて、アネキシンＶのホモ二量体を産生することも可能である。この例では、アネキシンＶ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ部位で、発現ベクターｐＣＭＶ  ＦＬＡＧ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）にクローニングする。アネキシンＶ配列の前および後の正確な配列は未知であり、そして「ｘ」と示す。したがって、コドン並列が適切であることを確実にするため、修飾の前に構築物を配列決定する必要がある。ｐＣＭＶ  ＦＬＡＧ２ベクターには、強力なプロモーターおよび開始配列（コザック）、並びに開始部位（ＡＴＧ）が内蔵されている。したがって、各アネキシンＶ遺伝子の前の開始コドンを除去しなければならず、そして第二のアネキシンＶ遺伝子の終結部に、堅固な発現のための強力な停止コドンを付加しなければならない。該ベクターはまた、タンパク質精製に使用可能な８アミノ酸ペプチド配列（ａｓｐ−ｔｙｒ−ｌｙｓ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ａｓｐ−ｌｙｓ）（配列番号９）も装備している。グリシン−セリン・スイベル端を備えた１４アミノ酸スペーサーは、タンデムな遺伝子コードタンパク質間の最適な回転を可能にする。制限部位、ＰｖｕＩＩおよびＳｃａＩを付加することによって、必要な場合は、リンカーの除去が可能になる。プロテアーゼ部位を付加することによって、発現後のタンデムタンパク質の切断が可能になる。Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｔｅｃｈからＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼが入手可能であり、そして該プロテアーゼを用いて、タンデムタンパク質を切断することも可能である。２つのアネキシンＶホモ二量体を生成した。第一の二量体では、二量体のアミノ末端に「Ｈｉｓタグ」を配置して、精製を容易にした（図１Ａ）。１２アミノ酸のリンカー配列の両端にグリシンおよびセリン残基が隣接し、これがスイベルとして働いた。図１Ａに構造図を示す。Ｈｉｓタグ化アネキシンＶホモ二量体のアミノ酸配列を以下に提供する：
【０１２６】
【化１】
0005134362.tif 000002
【０１２７】
［００１４３］リンカーの「スイベル」アミノ酸を太字および下線で示す。このＨｉｓタグ化アネキシンＶホモ二量体を、大腸菌において、高レベルで発現させ、そしてニッケルカラムを用いて精製した。構築物中のＤＮＡは、正確な配列を有することが示され、そして二量体は、予測される分子量（７４ｋＤａ）を有した。直線状に操作するＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  Ｐｒｏワークステーション、２５ｋＶの静的加速度電圧の陽イオンモード、および４０ナノ秒の遅延時間を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を達成した。
【０１２８】
［００１４４］Ｈｉｓタグなしで、第二のヒトアネキシンＶホモ二量体を合成した。構造図を図１Ｂに示す。（非Ｈｉｓタグ化）アネキシンＶホモ二量体のアミノ酸配列を以下に提供する：
【０１２９】
【化２】
0005134362.tif 000003
【０１３０】
［００１４５］ここでも、リンカーの「スイベル」アミノ酸を太字および下線で示す。この二量体を、大腸菌において、高レベルで発現させ、そしてイオン交換クロマトグラフィー、その後、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによって、精製した。イオン交換カラムはＢｉｏ−Ｒａｄのものであり（Ｅｃｏｎｏ−ｐａｋ  ＨｉｇｈＱ  Ｓｕｐｐｏｒｔ）、そしてヘパリン親和性カラムはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰ）のものであった。どちらも、製造者の指示にしたがって用いた。ここでも、アネキシンＶホモ二量体のＤＮＡ配列は正しいことが見出された。質量分析計は、予期されるように、７３ｋＤａのタンパク質を示した。アネキシンおよび他のタンパク質のアミノ酸配列は、この実験室において、ペプチド断片の質量分析によって、日常的に決定されている。予期される配列が得られた。
【０１３１】
［００１４６］ヒトアネキシンＶは、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１３２】
【化３】
0005134362.tif 000004
【０１３３】
［００１４７］図１Ｃに例示するＤＮＡ構築物に示すように挿入されるヒトアネキシンＶのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
【０１３４】
【化４】
0005134362.tif 000005
【０１３５】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
［００１４８］ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、修飾アネキシンタンパク質が、活性化された血小板に結合する能力を決定する。アネキシンＶは血小板に結合し、そしてこの結合は、トロンビンでの血小板の活性化によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで顕著に増加する（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＴａｉｔ、１９９０；Ｓｕｎら、１９９３）。好ましくは、アネキシンが血小板に結合し、そしてプロテインＳが血小板に結合するのを防止する（Ｓｕｎら、１９９３）点で、アネキシンの機能を実行するような方式で、本発明の修飾アネキシンタンパク質を調製する。修飾アネキシンタンパク質はまた、非修飾アネキシンタンパク質が示すのと同じｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗凝血活性を示す機能も実行する。凝血時間を測定する方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間である（本明細書に援用される、Ｆｒｉｔｓｍａ，  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｒｒｉｖｅａｕ，  Ｄ．Ｍ．およびＦｒｉｔｓｍａ，  Ｇ．Ａ．監修）中  Ｊ．Ｐ．  Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，  フィラデルフィア（１９８９），  ｐｐ．９２−１２４）。
【０１３６】
［００１４９］ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、アネキシンタンパク質の抗血栓活性を測定する。アネキシンＶは、ラットにおいて、レーザーまたは光化学的に誘導される静脈血栓を減少させることが示されている（Ｒｏｅｍｉｓｃｈら、１９９１）。トロンボエラストグラフィーによって機能的に決定した際、アネキシンＶの静脈内投与の１５〜３０分後の間に、最大抗凝血効果が観察された。好ましくは、本発明の修飾アネキシンタンパク質は、こうしたモデルにおいて、非修飾アネキシンより延長された活性を示す。アネキシンＶはまた、頸部静脈血栓症のウサギモデルにおいて、フィブリン付着物を減少させることも見出された（Ｖａｎ  Ｒｙｎ−ＭｃＫｅｎｎａら、１９９３）。空気噴射を用いて内皮を取り除き、そしてアネキシンＶは、処置した静脈には結合するが、対照の対側性静脈には結合しないことが示された。傷害を受けた静脈における、フィブリン集積の減少は、全身凝血とは関連しなかった。ヘパリンは、傷害を受けた静脈におけるフィブリン集積を阻害しなかった。本発明の修飾アネキシンタンパク質は、好ましくは、静脈血栓症のこのモデルにおいて、アネキシンの機能を実行する。ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ、１９９７は、動脈血栓症のウサギモデルを使用した。電流を適用することによって、左頸動脈に部分的閉塞血栓が形成された。アネキシンＶ注入は、血流の測定、血栓重量、標識フィブリン沈着および標識血小板集積によって明らかであるように、血栓症を強く阻害した。近年、光化学的に誘導された挙睾筋中の血栓のマウスモデルが発表された（本明細書に援用される、Ｖｏｌｌｍａｒら  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８５：１６０−１６４（２００１））。この技術を用いて、所望の動脈または静脈いずれかにおいて、血栓症を誘導することも可能である。本発明の修飾アネキシンタンパク質は、好ましくは、ボーラス注射によって投与された場合であっても、こうしたモデルにおいて、アネキシンの機能を実行する。
【０１３７】
（実施例３）
［００１５０］ヒト組換えアネキシンＶおよびＰＥＧ化ヒト組換えアネキシンＶの抗凝血能を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで比較した。
【０１３８】
［００１５１］アネキシンＶ産生。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用い、開始メチオニンから停止コドンまで、ｃＤＮＡを増幅した。順方向プライマーは、５’−ＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＣＧＣＣＡＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号７）であり、そして逆方向プライマーは、５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＴＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧ−３’（配列番号８）であった。増幅された１．１ｋｂ断片を、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そして原核発現ベクターｐＴＲＣ  ９９Ａに連結した。連結産物を用いて、コンピテント大腸菌株ＪＭ１０５を形質転換して、そして配列決定した。
【０１３９】
［００１５２］いくつかの修飾を加えて、Ｂｅｒｇｅｒら、１９９３に記載されるように、細菌溶解物から組換えアネキシンＶを単離した。ｐＴＲＣ  ９９Ａ−アネキシンＶで形質転換した大腸菌ＪＭ１０５の一晩培養物を、１０ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有する新鮮なＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｒａｎｉ培地中で、５０倍に増殖させた。２時間後、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを１ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度まで添加した。誘導１６時間後、３５００ｇ、４℃で１５分間、細菌をペレットにした。１ｍｍｏｌ／ｌ  ＰＭＳＦ、５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、および６ｍｏｌ／ｌ尿素を含有するＴＢＳ、ｐＨ７．５に、細菌ペレットを懸濁した。６にセットした超音波プローブを用いて、氷上で３分間、細菌懸濁物を超音波処理した。溶解物を１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、そして１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含有する５０体積のＴＢＳに対して２回、そして５０体積のＴＢＳに対して１回、上清を透析した。
【０１４０】
［００１５３］モル比１０：１５：１で、クロロホルム中、ホスファチジルセリン、凍結乾燥ウシ脳抽出物、コレステロール、およびジセチルホスフェートを溶解し、そしてコニカルフラスコ中で、窒素流で乾燥させることによって、多層リポソームを調製した。ＴＢＳ（５ｍｌ）をフラスコに添加し、そしてボルテックスミキサー中で１分間勢いよく攪拌した。３５００ｇで１５分間遠心分離することによって、リポソームを洗浄し、次いで、細菌抽出物とインキュベーションし、そして最終濃度５ｍｍｏｌ／ｌまで塩化カルシウムを添加した。３７℃で１５分間インキュベーションした後、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離によって、リポソームを沈降させ、そして結合したアネキシンＶを１０ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡで溶出した。溶出したアネキシンＶをＡｍｉｃｏｎ限外ろ過によって濃縮し、そしてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ  ２００カラム上に装填した。アネキシンＶは内包容量（ｉｎｃｌｕｄｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）中に回収され、一方、大部分のリポソームは、空隙容量（ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）中にあった。アネキシンＶを含有する分画をプールし、そして１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓおよび２ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．１中で透析し、陰イオン交換カラム上に装填し、そして同じ緩衝液中の０〜２００ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出させた。精製された調製物は、還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中、単一のバンドを示した。
【０１４１】
［００１５４］上述のように、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６の方法を用いて、上述のように産生したアネキシンＶをＰＥＧ化した。
［００１５５］抗凝血アッセイ。アネキシンＶおよびＰＥＧ化アネキシンＶによって誘導される、凝血時間の延長（活性化部分トロンボプラスチン時間）を比較した。Ｆｒｉｔｓｍａ、１９８９に記載されるように、クエン酸塩加した正常のプール血漿を用いて、活性化部分トロンボプラスチン時間をアッセイした。上述のように産生した、異なる濃度のアネキシンＶおよびＰＥＧ化アネキシンＶを用いて、凝血時間延長に関する用量−反応曲線を得た。結果を図６に示し、図６は、アネキシンＶおよびＰＥＧ化アネキシンＶ用量に対する、凝血時間のプロットである。図に示すように、組換えヒトアネキシンＶおよびＰＥＧ化組換えヒトアネキシンＶの抗凝血強度は、実質的に同等である。観察される小さな相違は、ＰＥＧ化後の分子量の変化に起因する。この実験は、抗血栓効果を有意に減少させることなく、アネキシンＶのＰＥＧ化を達成可能であるという、本明細書で行う主張を立証する。
【０１４２】
（実施例４）
［００１５６］細胞表面上のＰＳに対する、組換えアネキシンＶ（ＡＶ）および組換えアネキシンＶホモ二量体（ＤＡＶ）の親和性を比較した。表面上にＰＳが暴露された細胞を産生するため、ヒト末梢赤血球（ＲＢＣ）をＣａ２＋イオノフォア（Ａ２３１８７）で処理した。ＰＳを形質膜二重層の内部小葉に移動させるリン脂質転移酵素（フリパーゼ）を、未結合スルフィドリル基に共有結合するＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）で処理することによって不活性化した。細胞内Ｃａ２＋が上昇すると、スクランブラーゼ酵素が活性化され、したがって、形質膜二重層の外部小葉のＰＳ量が増加する。
【０１４３】
［００１５７］洗浄したヒトＲＢＣを、Ｋ緩衝液（８０ｍＭ  ＫＣｌ、７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中で３０％ヘマトクリットに再懸濁した。これらを、１０ｍＭ  ＮＥＭの存在下、３７℃で３０分間インキュベーションしてフリパーゼを阻害した。ＮＥＭ処理細胞を洗浄し、そして２ｍＭ  ＣａＣｌ２を添加した同じ緩衝液中で１６％ヘマトクリットに懸濁した。Ａ２３１８７（最終濃度４μＭ）と、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、スクランブラーゼ酵素を活性化した。この方法の結果、９５％を超えるＲＢＣが、フローサイトメトリーによって明示できるＰＳを、表面上に有した。
【０１４４】
［００１５８］ＦｌｕＲｅｐｏｒｔｅｒタンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を用いて、組換えＡＶおよびＤＡＶをビオチン化した。最終濃度２μｇ／ｍｌのＲ−フィコエリトリン−コンジュゲート化ストレプトアビジン（ＰＥ−ＳＡ）を用いて、ビオチン−ＡＶおよびビオチン−ＤＡＶコンジュゲートを視覚化した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ上でフローサイトメトリーを行い、そしてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンホセ）でデータを分析した。
【０１４５】
［００１５９］ＡＶまたはＤＡＶの結合はいずれも、正常ＲＢＣを用いた場合には検出不能であった。しかし、ＡＶおよびＤＡＶはどちらも、ＰＳ暴露ＲＢＣの少なくとも９５％に結合した。ＰＳ暴露ＲＢＣを、多様な量のＡＶおよびＤＡＶと、（ａ）別個に、または（ｂ）１：１モル比で混合して、インキュベーションした後、ＰＥ−ＳＡを添加し、そしてフローサイトメトリーを行った。こうした混合物中で、ＡＶまたはＤＡＶのいずれかがビオチン化され、そして結合した各タンパク質の量を上述のようにアッセイした。ＡＶよりもＤＡＶにおいて、ビオチン標識がより高く、これに関して、実験を調整した。
【０１４６】
［００１６０］代表的な結果を図２に示す。この実験セットでは、ＰＳ暴露ＲＢＣを、（ａ）０．２μｇのビオチン化ＤＡＶ（図２Ａ）；（ｂ）０．２μｇのビオチン化ＤＡＶ（図２Ｂ）；（ｃ）０．２μｇのビオチン化ＡＶおよび０．２μｇの非ビオチン化ＤＡＶ；並びに（ｄ）０．２μｇのビオチン化ＤＡＶおよび０．２μｇの非ビオチン化ＡＶ（図２Ｄ）とインキュベーションした。図２Ｂおよび図２Ｄを比較すると、０．２μｇの非ビオチン化ＡＶが、ビオチン化ＤＡＶの結合にまったく影響がなかったことが示される。しかし、図２Ａおよび図２Ｃを比較すると、０．２μｇの非ビオチン化ＤＡＶが存在する場合、ＰＳ暴露細胞に結合したビオチン化ＡＶ量が非常に減少したことが示される。これらの結果によって、ＤＡＶおよびＡＶがＲＢＣ上の同じＰＳ結合部位に関して競合するが、親和性が異なり；ＤＡＶは、ＡＶよりも高い親和性で、細胞表面上に暴露されたＰＳに結合することが示される。
【０１４７】
（実施例５）
［００１６１］マウス血清に添加した既知の量のアネキシンＶ単量体（ＡＶ）および二量体（ＤＡＶ）を用いて、細胞結合アッセイを確立した。上述のように露出したＰＣを持つＲＢＣを、ＡＶおよびＤＡＶの希釈物を含有する血清とインキュベーションした。洗浄後、標識ストレプトアビジンを添加して、そして再度洗浄し、ＲＢＣに結合したＡＶおよびＤＡＶをフローサイトメトリーによってアッセイした。露出したＰＳがないＲＢＣを用いた場合、結合は検出不能であった。細胞結合によってアッセイした、マウス血清中のＡＶおよびＤＡＶ濃度は、独立のＥＬＩＳＡアッセイによって決定したものと非常に相関した。したがって、マウス血漿中のＡＶおよびＤＡＶは、細胞表面上に露出したＰＳと相互作用する能力を損なう方式で、他の血漿タンパク質に結合することはない。これらの観察によって、循環中のＡＶおよびＤＡＶの存続を比較するため、細胞結合アッセイを適用することが正当であることが確認された。
【０１４８】
［００１６２］マウスにＡＶおよびＤＡＶを静脈内注射し、そしてその後、数回、末梢血試料を回収した。各時点で異なるマウスを用いた。代表的な結果を図３に示す。ウサギ（ＴｈｉａｇａｒａｊａｎおよびＢｅｎｅｄｉｃｔ，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：２３３９，  １９７７）、カニクイザル（Ｒｏｅｍｉｓｃｈら，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ．  ６１：９３，  １９９１）およびヒト（Ｋｅｍｅｒｉｎｋら，  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４：９４７，  ２００３）における観察によって、ＡＶが循環中で短い半減期を有し（それぞれ、７〜２４分）、主な損失分は腎臓へのものであることが示される。これらの報告と一致して、マウスにＡＶを注射した２０分後、ＡＶは末梢血中で実質的にまったく検出不能であった（図３Ｂ）。しかし、マウスにＤＡＶを静脈内注射すると、１２０分後であっても、かなりの量のタンパク質が、循環中で検出可能であった（図３Ｅ）。したがって、アネキシンＶを二量体化すると、循環中の存続が増加し、そしてしたがって、療法効果の期間が増加する。
【０１４９】
（実施例６）
［００１６３］ヒトｓＰＬＡ２（Ｃａｙｍａｎ、ミシガン州アナーバー）の活性に対するアネキシンＶ（ＡＶ）およびアネキシンＶホモ二量体（ＤＡＶ）の阻害効果を比較した。上述のように、ＮＥＭおよびＡ２３１８７で処理したＲＢＣ上に露出したＰＳを、基質として用いた。対照細胞において、ＡＶおよびＤＡＶは、フローサイトメトリーで立証可能であるように、ＰＳ暴露ＲＢＣに結合することが見出された。ＰＳ曝露細胞をｓＰＬＡ２とインキュベーションするとＰＳが除去され、したがって細胞はもはやアネキシンに結合しなかった。ＰＳ暴露細胞をＰＬＡ２とインキュベーションする前に、ＡＶまたはＤＡＶで処理すると、ＰＳは除去されない。細胞をＣａ２＋キレート剤に曝露することも可能であり、該キレート剤はＰＳからＡＶまたはＤＡＶを解離させ、そして続いて標識ＡＶが結合すると、細胞表面上に残ったＰＳが示される。こうしたアッセイにおいて、ＡＶおよびＤＡＶを力価決定すると、どちらも、細胞表面ＰＳに対するｓＰＬＡ２活性の強力な阻害剤であることが示される。
【０１５０】
［００１６４］ホスホリパーゼの阻害はまた、別の方法によっても立証可能である。ｓＰＬＡ２の活性は、溶血性であるリソホスファチジルコリン（ＬＰＳ）を放出する。したがって、溶血アッセイにおいて、ＰＬＡ２に対するＡＶおよびＤＡＶの阻害効果を比較することが可能である。図４に示すように、ＡＶおよびＤＡＶはどちらもＰＬＡ２の作用を阻害し、ＤＡＶが幾分、より有効であった。ｐＰＬＡ２で６０分間インキュベーションした後、溶血は、ＤＡＶまたはＡＶの非存在下と比較して、その存在下で強く減少した。これらの結果から、アネキシンＶのホモ二量体は、分泌性ＰＬＡ２の強力な阻害剤であると結論付け可能である。したがって、アネキシンＶのホモ二量体は、再灌流傷害の発症に寄与すると考えられる、トロンボキサンＡ２、並びにリソホスファチジルコリンおよびリソホスファチジン酸などの仲介因子の形成を減少させるはずである（Ｈａｓｈｉｚｕｍｅら  Ｊｐｎ．  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，  ３８：１１，  １９９７；Ｏｋｕｚａら，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２８５：Ｆ５６５，  ２００３）。
【０１５１】
（実施例７）
［００１６５］温虚血−再灌流傷害のマウス肝臓モデルを用いて、修飾アネキシンが再灌流傷害（ＲＩ）に対して防御するかどうかを確認し、修飾アネキシンとアネキシンＶの活性を比較し、そして修飾アネキシンの活性の期間を決定した。モデルは、Ｔｅｏｈら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６：９４，  ２００２）に記載されている。体重１８〜２５ｇの雌Ｃ５７ＢＬ６マウスを用いた。ケタミン／キシラジン麻酔下、非外傷性の微小血管クランプを用いて、肝臓の左側葉および中葉への血液供給を９０分間閉塞させた。次いで、血管クランプを除去して、再灌流を確立した。動物を回復させ、そして２４時間後、放血によって屠殺した。血清アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性の測定および組織学的検査によって、肝臓損傷を評価した。対照群を麻酔および擬似開腹術に供した。アネキシンＶおよび修飾アネキシンの活性をアッセイするため、４匹のマウスの群を用いた。第一の群の各マウスに、２５マイクログラムのアネキシンＶ（ＡＶ）を、第二の群の各マウスに、２５マイクログラムのアネキシン・ホモ二量体（ＤＡＶ）を、そして第三の群のマウスに、２．５マイクログラムの、ポリエチレングリコールにカップリングしたアネキシンＶ（ＰＥＧ−ＡＶ、５７ｋＤａ）を静脈内注射した。対照には、生理食塩水、またはアネキシンを保存したＨＥＰＥＳ緩衝液を投与した。第一の実験セットでは、肝動脈枝をクランピングする数分前に、アネキシンを投与した。第二の実験セットでは、アネキシンおよびＨＥＰＥＳを、虚血開始の６時間前に投与した。それぞれの実験結果を図５に要約する。
【０１５２】
［００１６６］虚血直前にアネキシンＶ（ＡＶ）を投与した動物では、わずかな防御が観察された。対照的に、虚血直前または６時間前のいずれかに、アネキシン二量体（ＤＡＶ）またはＰＥＧ−ＡＶを投与した動物では、ＲＩに対する劇的な防御が示された。組織学的研究によって、これらの群では肝細胞壊死がほとんどまたはまったくないことが確認された。結果は、修飾アネキシン（ＤＡＶおよびＰＥＧ−ＡＶ）が、肝臓において、虚血再灌流傷害に対して、ＡＶよりも有意により防御性であることを示す。さらに、修飾アネキシン（ＤＡＶおよびＰＥＧ−ＡＶ）は、ＲＩを減弱する能力を少なくとも６時間保持する。
【０１５３】
［００１６７］擬似手術した動物では、循環中のＡＬＴレベルは非常に低かった。虚血直前に生理食塩水を投与するか、または虚血６時間前にＨＥＰＥＳを投与した動物では、ＡＬＴレベルが非常に高く、そして組織像によって、重度の肝細胞壊死があったことが確認された。虚血直前に投与したＨＥＰＥＳは、ＲＩに対して防御活性を有することが見出された。
【０１５４】
（実施例８）
［００１６８］血栓症研究
［００１６９］各８匹のラットの６群を用いた。この研究用のラットは、雄ウィスターラットであり、体重約３００グラムであった（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ、オランダ・マーストリヒト）。動物をマクロロン（ｍａｃｒｏｌｏｎ）・ケージで飼育し、そして標準的げっ歯類食物ペレットおよび酸性化水道水を随意に与えた。実験は、オランダの動物実験に関する法律が推進する、規則および規制にしたがった。ラットをＦＦＭ（フェンタニル／フルアニソン／ミダゾラム）で麻酔し、そして加熱パッド上に置いた。大腿静脈にカニューレを挿入し、そして生理食塩水を満たした。下大静脈を単離し、そして結紮または焼灼によって、側枝を閉じた。左腎静脈下の大静脈（ｃａｖａｌ  ｖｅｉｎ）周囲にゆるい結紮を適用した。第一のものの１．５ｃｍ上流、分岐の上に、第二のゆるい結紮を適用した。大腿静脈カニューレを介して、試験（または対照）化合物を静脈内投与し、そして次いで、カニューレを生理食塩水で勢いよく洗浄した。
【０１５５】
［００１７０］試験化合物または対照化合物には、リン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌ／ｋｇ体重（１０分）；リン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌ／ｋｇ体重（１２時間）；ジアネキシン０．０４ｍｇ／ｋｇ体重；ジアネキシン０．２ｍｇ／ｋｇ体重；ジアネキシン１．０ｍｇ／ｋｇ体重（１０分）；ジアネキシン１．０ｍｇ／ｋｇ体重（１２時間）；フラグミン２０ａＸａ  Ｕ／ｋｇ体重が含まれる。１０分後（または２群では１２時間後）、組換えヒトトロンボプラスチン（０．１５ｍｌ／ｋｇ）を静脈カニューレ内に迅速に注入し、カニューレを生理食塩水で勢いよく洗浄し、そして正確に１０秒後、腎静脈近くの下流結紮を閉じた。９分後、クエン酸塩加静脈血試料を得て、そして氷上に置いた。
【０１５６】
［００１７１］１分後（１０分の時点）、分岐近くの上流結紮を閉じ、そしてこのセグメントに形成されていた血栓を回収した。血栓を生理食塩水中で簡単に洗浄し、水分を吸い取り、そして湿重量を測定した。２０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって、クエン酸塩加血漿を調製し、そして分析のため、−６０℃で保存した。血栓誘導を、化合物注入の１２時間後に行った２群では、異なるｉ．ｖ．注射法を用いた。ラットをｓ．ｃ．ＤＤＦ（ドミトール／ドルミカム／フェンタニル）で麻酔し、そしてペニス静脈を介して注射した。次いで、ラットに解毒剤（アネキセート／アンチセダン／ナロキソン）をｓ．ｃ．投与し、そしてケージ中に一晩置いた。
【０１５７】
［００１７２］大腿静脈カニューレを挿入した後、ラットに静脈内注入した。化合物を静脈内注入した１０分後（２つの群では、注入の１２時間後）、希釈したトロンボプラスチンをｉ．ｖ．注入し、そして１０秒後、下大静脈を結紮した。結紮の９分後、血液を収集し、そしてクエン酸塩加血漿を調製した。結紮の１０分後、血栓が形成されたセグメントを結紮し、そして血栓を回収し、そして重量測定した。ａＰＴＴ（秒）もまた測定した。０．０４ｍｇ／ｋｇで、ジアネキシンは、血栓重量を約４０％減少させた。ジアネキシン（１ｍｇ／ｋｇ）注入の１２時間後、血栓形成は、対照と異ならなかった。体重はパラメトリックＡＮＯＶＡでは群間に相違はなかった。血栓湿重量（表１）は、０〜４４．５ｍｇの範囲であった。
【０１５８】
［００１７３］表１：１０分間血栓症研究における血栓湿重量（ｍｇ）に対する処置の効果
【０１５９】
【表１】
0005134362.tif 000006
【０１６０】
パラメトリックＡＮＯＶＡによって；Ｆ＝２４．４８；ｐ＜０．００００１
すべての群＜生理食塩水対照（ｐ＜０．０１）
３つのジアネキシン群のパラメトリックＡＮＯＶＡによって：
Ｆ＝４６００、ｐ＜０．０００１
１ｍｇ＝０．２ｍｇ＜０．０４ｍｇ；ｐ＜０．００１
［００１７４］処置は、血栓重量に有意な効果を有した。フラグミン（２０ａＸａ  Ｕ／ｋｇ）およびジアネキシン（０．０４、０．２および１．０ｍｇ／ｋｇ）のどちらも、血栓重量を有意に減少させた（ｐ＜０．０００１）。実施例７および本文の表を参照されたい。ジアネキシンでは、効果は用量依存性であった。ＡＰＴＴ値を表２および図８に示す。
【０１６１】
［００１７５］表２：１０分間血栓症研究におけるＡＰＴＴ（秒）に対する処置の効果
【０１６２】
【表２】
0005134362.tif 000007
【０１６３】
パラメトリックＡＮＯＶＡによって；Ｆ＝６．６６；ｐ＝０．０００５
フラグミン群＞他のすべての群（ｐ＜０．０５）
生理食塩水群およびジアネキシン群は、有意には異ならない
［００１７６］フラグミンは、すべての他の群に比較して、ＡＰＴＴを有意に増加させた。ＡＰＴＴは、フラグミン群でのみ、わずかに、しかし有意に増加していた。ジアネキシン群は、生理食塩水対照群とは異ならなかった。
【０１６４】
［００１７７］血栓形成を誘導する１２時間前にラットを処置した、第二の血栓症研究において、生理食塩水注入対照群およびジアネキシン処置群の間に有意な相違は見られなかった（表３）。
【０１６５】
［００１７８］表３：１２時間血栓症研究における血栓湿重量（ｍｇ）に対する処置の効果
【０１６６】
【表３】
0005134362.tif 000008
【０１６７】
＊血栓誘導までの平均時間：１３．６時間
ｔ検定によって有意差なし
［００１７９］生理食塩水群の血栓重量はまた、１０分間血栓症研究の生理食塩水対照群の血栓重量（２５．７±１２．３ｍｇ、表１を参照されたい）と有意には異ならなかった。ＡＰＴＴ値は異ならなかった（未提示）。
【０１６８】
［００１８０］血栓誘導の１０分前にジアネキシンを静脈内注入（０．２ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇ）すると、ウェスラー（Ｗｅｓｓｌａｒ）ラット静脈血栓モデルにおいて、血栓形成が強く阻害された。
【０１６９】
（実施例９）
［００１８１］出血研究。３群を研究した。実施例８に記載するように、８匹のラットの群を用いた。ラットをイソフルランで麻酔し、挿管して、そして酸素を供給し、そして加熱パッド上に置いた。大腿静脈を介してカニューレを挿入し、そして生理食塩水で満たした。試験化合物または対照化合物を、カニューレを介して注入し、そして次いで、カニューレを生理食塩水で勢いよく洗浄した。試験化合物または対照化合物は、リン酸緩衝生理食塩水１．０ｍｌ／ｋｇ体重；ジアネキシン５．０ｍｇ／ｋｇ体重；フラグミン１４０ａＸａ  Ｕｋｇ体重であった。試験化合物注入の１０分後、ラット尾を水平位置に置き、そして次いで、定義した、尾からの固定距離で、鋏によって切断した。続いて、ろ紙によって、尾から滲み出た血をすべて穏やかに拭き取ることによって、尾からの出血を測定した。出血が止まった時間を測定した。いずれも記録した。尾を切断した３０分後に、実験を終結させた。実験終了の直前に、クエン酸塩加血液試料をカニューレから得た。２０００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって、クエン酸塩加血漿を調製し、そして分析のため、−６０℃で保存した。０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．８）２０ｍｌ中で、ろ紙を抽出した。リン酸緩衝液のヘモグロビン含量を測定することによって、血液損失量を測定した（Ｄｒａｂｋｉｎのシアン化カリウム１フェリシアン化カリウム法）。体重（表３）は、パラメトリックＡＮＯＶＡによれば、群間で異ならなかった。ジアネキシン（５ｍｇ／ｋｇ）またはフラグミン（１４０Ｕｋｇ）のいずれかによる処置は、出血時間をほぼ２倍にした（図９、表３）が、これらの効果は、有意ぎりぎりでしかなかった（ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ；ＫＷ＝５．７２、ｐ＝０．０５７）。血液損失（図１０、表４）は、対照群に比較して、ジアネキシン群でわずかに増加し、そしてフラグミン群でほぼ２倍であった。
【０１７０】
［００１８２］表４．尾出血研究における出血時間および血液損失
【０１７１】
【表４】
0005134362.tif 000009
【０１７２】
［００１８３］しかし、これらの相違は有意ではなかった（ノンパラメトリックＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．４９０）。ＡＰＴＴ値を表５および図１１に示す。
［００１８４］表５．尾出血研究におけるＡＰＴＴ（秒）に対する処置の効果
【０１７３】
【表５】
0005134362.tif 000010
【０１７４】
［００１８５］フラグミンはＡＰＴＴをほぼ２倍にしたが、ジアネキシン群のＡＰＴＴは、生理食塩水対照群と異ならなかった。
［００１８６］血液損失およびａＰＴＴは、尾出血研究において、フラグミン群では、ジアネキシン群のほぼ２倍であった。５．０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．のジアネキシンは、切断したラット尾からの出血を誘導したが、１４０ａＸａ  Ｕ／ｋｇのフラグミンの注入後より、血液損失が少なかった。
【０１７５】
（実施例１０）
［００１８７］クリアランス研究。ラットに放射標識ジアネキシンを注射し、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分および６０分、並びに２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間および２４時間後に血液試料を得て、そして血液放射能を測定して、血液消失曲線を構築した。血液からのジアネキシンの消失は、２区画モデルによって表現され、α期には、約７５〜８０％の消失（ｔ／２、約１０分）、そしてβ期には、１５〜２０％の消失（ｔ／２、約４００分）があった。それぞれ半減期９〜１４分および６〜７時間の２区画モデルによって、クリアランスを表現することも可能である。各３匹の雄ウィスターラット（３００グラム）を用いて、２回の実験を行った。Ｍａｃｆａｒｌａｎｅの方法によって、ジアネキシンを１２５Ｉで標識し、そして未結合（free）Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０によって、標識タンパク質を分離した。ＮａＩ（５ｍｇ／ｋｇ）を注射して、標識が甲状腺に取り込まれるのを防止した後、大腿静脈カテーテルを介して（ラット１および２）、またはペニス静脈を介して（ラット３）、約８ｘ１０６ｃｐｍ（５０μｌのタンパク質溶液を生理食塩水で０．５ｍｌに希釈）を注射した。その後、明記した時点で（以下の表を参照されたい）、尾静脈から血液試料（１５０μｌ）を得て、そして１００μｌをカウントした。最後の血液試料を採取した後、ネンブタールｉ．ｖ．によって、ラットを屠殺し、そしてカウント用に、肝臓、肺、心臓、脾臓および腎臓（片）を収集した。
【０１７６】
［００１８８］クリアランス研究のための試料採取スキーム：
【０１７７】
【表６】
0005134362.tif 000011
【０１７８】
［００１８９］４５分および２４時間の間に収集したデータから、β期パラメーターを計算した。次いで、サブトラクション法によって、５分および４５分の間のデータから、α期パラメーターを計算した。サブトラクション法を用いて、２区画モデルによって、血液放射能曲線を分析した。α期およびβ期の線形相関係数は、実験１では−０．９９および−０．９９、そして実験２では−０．９５および−０．９６であった。クリアランス・パラメーターを表６に示す。
【０１７９】
［００１９０］表６．ジアネキシン・クリアランス・パラメーター
【０１８０】
【表７】
0005134362.tif 000012
【０１８１】
［００１９１］図１５および１６は、α期およびβ期を重ね合わせたクリアランス曲線を示す。表７では、肺、心臓、肝臓、脾臓および腎臓に回収されたｃｐｍ（組織消化後）を示す。ジアネキシン注入２時間後に肺で高いカウント数が見られたことが注目される。
【０１８２】
［００１９２］表７．１２５Ｉ−ジアネキシン注入の２時間、８時間、および２４時間後の、選択された組織に回収された放射能
【０１８３】
【表８】
0005134362.tif 000013
【０１８４】
（実施例１１）
［００１９３］虚血−再灌流傷害（ＩＲＩ）の発症およびジアネキシン作用様式を確かめるため、研究を行った。虚血−再灌流傷害の発症の仮説によれば、虚血中、ホスファチジルセリン（ＰＤ）は、肝臓微小血管系の内皮細胞（ＥＣ）管腔表面上でアクセス可能になる。再灌流期中、白血球および血小板がＥＣ表面上のＰＳに付着し、そしてＥＣにおいてアポトーシスの最終段階を誘発する。ジアネキシンは、ＥＣ表面上のＰＳに結合して、そしてＰＳへの白血球および血小板の付着を減少させる。この機構によって、ジアネキシンは、ＥＣへの不可逆的損傷を防止し、そしてそれによって、虚血−再灌流傷害を減弱する。
【０１８５】
［００１９４］公表された方法（ＭｃＣｕｓｋｅｙら，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４０：３８６，  ２００４）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏのマウス肝臓において、微小循環を観察することによって、この仮説を試験した。実施例７に記載するように、９０分間の虚血後、多様な時間の再灌流を行った。図１２Ａおよび１２Ｂは、再灌流中、多くの白血球が、門脈周辺領域および小葉中心（ｃｅｎｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ）領域の両方でＥＣに付着したことを示す（ＩＲ）。ジアネキシン（１ｍｇ／ｋｇ）ＩＶは、統計的に有意な方式で、こうした付着を減少させる（ＩＲ＋Ｄ）。図１３Ａおよび１３Ｂは、これがまた、再灌流中のＥＣへの血小板の付着にも当てはまることを示す。予測されるように、ＥＣ損傷（腫脹に反映される）は、再灌流中に顕著であり、そしてジアネキシンによって有意に減少する（図１４Ａおよび１４Ｂ）。したがって、虚血−再灌流傷害を減弱させる際のジアネキシン作用様式の我々の仮説が確認される。図１５Ａおよび１５Ｂに示されるように、ジアネキシンは、どちらの位置でもクッパー細胞の食作用活性に影響を及ぼさない。したがって、ジアネキシンは、病原性生物に対するこの防御機構には影響を持たない。この知見は、ジアネキシンが副作用を持たないという他の証拠を裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】［００２３］図１Ａ〜Ｃは、２つの修飾アネキシン態様の構造図を示す。図１Ａは、Ｈｉｓタグを持つヒトアネキシンＶホモ二量体の構造図を示し；図１Ｂは、Ｈｉｓタグを持たないヒトアネキシンＶホモ二量体の構造図を示す。図１Ｃは、アネキシンＶのホモ二量体を作製するためのＤＮＡ構築物を示す。
【図２】［００２４］図２Ａ〜Ｄは、各場合で、０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＡＶ（図２Ａ）；０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＤＡＶ（図２Ｂ）；０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＡＶおよび０．２μｇ／ｍｌの非ビオチン化ＤＡＶ（図２Ｃ）；並びに０．２μｇ／ｍｌのビオチン化ＤＡＶおよび０．２μｇ／ｍｌの非ビオチン化ＡＶ（図２Ｄ）とインキュベーションした後、Ｒ−フィコエリトリン−コンジュゲート化ストレプトアビジンとインキュベーションした、正常（１ｘ１０７／ｍｌ）およびＰＳ暴露（１ｘ１０７／ｍｌ）ＲＢＣの混合物のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図３】［００２５］図３Ａ〜Ｅは、注射後の多様な時点のマウス循環におけるＡＶまたはＤＡＶのレベルを例示する。図３Ａ〜Ｂは、それぞれ、マウスにＡＶを注射した５分後および２０分後に回収した血清試料を示す。図３Ｃ〜Ｅは、それぞれ、マウスにアネキシンＶホモ二量体（ＤＡＶ）を注射した５分後、２５分後および１２０分後に回収した血清試料を示す。
【図４】［００２６］図４は、ＰＳが暴露されたＲＢＣのＰＬＡ２誘導性溶血を示す。正常（１ｘ１０７／ｍｌ）およびＰＳ暴露（１ｘ１０７／ｍｌ）ＲＢＣの混合物を、１００ｎｇ／ｍｌの膵臓ＰＬＡ２（ｐＰＬＡ２）または分泌性ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）とインキュベーションした。時間の関数として溶血を測定し、そして浸透圧ショックによって誘導した１００％溶血と比較して表した。ビオチン化ＤＡＶおよびＲ−フィコエリトリン−コンジュゲート化ストレプトアビジンで標識した後、細胞懸濁物のフローサイトメトリーによって、ＰＳ暴露細胞のパーセンテージを決定した。図４Ａは、２μｇ／ｍｌのＤＡＶ（円）またはＡＶ（正方形）の非存在下（三角形）または存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのｐＰＬＡ２に誘導される溶血を示す。図４Ｂは、多様な量のＤＡＶ（円）またはＡＶ（正方形）の存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのｐＰＬＡ２に誘導される溶血を示す。図４Ｃは、２μｇ／ｍｌのＤＡＶの存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのｐＰＬＡ２と６０分間インキュベーションした後の細胞懸濁物中のＰＳ暴露細胞を示す。
【図５】［００２７］図５は、擬似手術したマウス（擬似）、生理食塩水を投与したマウス、肝動脈をクランピングする６時間前にＨＥＰＥＳ緩衝液を投与したマウス、動脈をクランピングする６時間前にＰＥＧ化アネキシン（ＰＥＧアネキシン）またはアネキシン二量体を投与したマウス、および単量体アネキシンを投与したマウス（アネキシン）における、血清アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。ＰＥＧアネキシンおよびアネキシン二量体の上のアステリスクは、ｐ＜０．００１を示す。
【図６】［００２８］図６は、組換えヒトアネキシンＶおよびＰＥＧ化組換えヒトアネキシンＶの凝血強度を比較するｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝血アッセイの凝血時間のプロットである。
【図７】［００２９］図７は、１０分間血栓症研究の５つの処置群における血栓重量を示す（平均±ｓｄ；ｎ＝８）。
【図８】［００３０］図８は、血栓症研究の５つの処置群におけるＡＰＴＴを示す（平均±ｓｄ；ｎ＝８）。
【図９】［００３１］図９は、尾出血研究の３群における出血時間を示す（平均±ｓｄ；ｎ＝８）。
【図１０】［００３２］図１０は、尾出血研究の３群における血液損失を示す（平均±ｓｅｍ；ｎ＝８）。
【図１１】［００３３］図１１は、尾出血研究の３群におけるＡＰＴＴを示す（平均±ｓｄ；ｎ＝８）。
【図１２】［００３４］図１２Ａは、門脈周辺類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞への白血球の付着を示す。図１２Ｂは、小葉中心類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞への白血球の付着を示す。
【図１３】［００３５］図１３Ａは、門脈周辺類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞への血小板の付着を示す。図１３Ｂは、小葉中心類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞への血小板の付着を示す。
【図１４】［００３６］図１４Ａは、門脈周辺類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞の腫脹を示す。図１４Ｂは、小葉中心類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中の内皮細胞の腫脹を示す。
【図１５】［００３７］図１５Ａは、門脈周辺類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中のクッパー細胞の食作用活性を示す。図１５Ｂは、小葉中心類洞に関する、ジアネキシンを用いたおよび用いない、虚血−再灌流傷害中のクッパー細胞の食作用活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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