(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２８に記載された配列を含むキメラプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のキメラプロモーター；構造DNA配列；およびRNA配列の3'末端にポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じるように植物中で機能する3'非−翻訳領域を含む発現カセットを含むDNA構築物であって、ここに、該構造遺伝子が該キメラプロモーターおよび該3'非−翻訳領域に作動可能に連結している該DNA構築物。
【請求項３】
該構造DNA配列が除草剤耐性遺伝子である請求項２記載のDNA構築物。
【請求項４】
該除草剤耐性遺伝子がグリホセート耐性遺伝子である請求項３記載のDNA構築物。
【請求項５】
該グリホセート耐性遺伝子がEPSPシンターゼ遺伝子またはグリホセート・オキシドレダクターゼ遺伝子である請求項４記載のDNA構築物。
【請求項６】
該グリホセート耐性遺伝子がaroA：CP4遺伝子である請求項４記載のDNA構築物。
【請求項７】
該構造DNA配列が昆虫制御遺伝子である請求項２記載のDNA構築物。
【請求項８】
該昆虫制御遺伝子がバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus  thuringiensis）に由来する請求項７記載のDNA構築物。
【請求項９】
植物において構造DNA配列を発現させる方法であって、
（1）請求項２ないし８のいずれか１項に記載のDNA構築物を供し；
（2）該DNA構築物を植物細胞に導入し；ついで
（3）該植物細胞を再生して、該構造DNA配列が植物において発現可能であるように植物を生成する
ことを含む該方法。
【請求項１０】
雑草を制御する方法であって、
（1）請求項４ないし６のいずれか１項に記載のDNA構築物で形質転換した作物植物を供し；ついで
（２）該作物植物を害することなく雑草を防除するのに十分な量のグリホセートを該作物植物に施用することを含む該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、植物における遺伝子発現の制御のための核酸分子、特に新規植物プロモーターの単離と使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
植物遺伝子工学の目標の１つは、作物栽培学的に重要な特性又は形質を備えた植物を生産することである。遺伝子工学における最近の進歩は、外来遺伝子を含み且つ発現するトランスジェニック植物を生産するために不可欠のツールを提供した（Ｋａｈｌら、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：４４９−４６０，１９９５）。植物遺伝子工学の対象となる特に望ましい形質あるいは品質は、昆虫、菌類病及び他の有害生物や病害を引き起こす因子に対する抵抗性、除草剤に対する耐性、高い安定性又は保存性、収率、環境耐性及び栄養強化を含むであろうが、これらに限定されない。植物の形質転換と再生におけるテクノロジーの進歩は、研究者達が異種又は天然のソースからの１個又はそれ以上の遺伝子のような外因性ＤＮＡを取り出し、かかる外因性ＤＮＡを植物ゲノムに組み込むことを可能にした。１つのアプローチでは、特定植物又は植物組織において通常は発現されない新規遺伝子の発現が、所望する表現型効果を与えることができる。また別のアプローチでは、アンチセンス方向での遺伝子又は遺伝子の部分の転写が、外因性遺伝子の発現を妨げる又は抑制することによって所望する効果をもたらすこともある。
【０００３】
トランスジェニック植物を生産するためには、植物において発現されたとき所望する表現型を与える異種遺伝子配列を含む構築物を植物細胞に導入する。構築物はまた、異種遺伝子配列に作動可能に連結された植物プロモーターを含み、しばしばプロモーターは通常は異種遺伝子と結合しない。次に構築物を植物細胞に導入して形質転換植物細胞を生成し、かかる形質転換植物細胞をトランスジェニック植物へと再生させる。プロモーターは、プロモーターが作動可能に連結されている導入ＤＮＡ配列の発現を制御し、従ってＤＮＡ配列によって付与される所望特性に影響を及ぼす。
【０００４】
１個又はそれ以上の遺伝子が、植物の成長及び生育期間の適切な時期に、植物における至適な位置で、そして所望する効果を生じるために必要な量で、効率的に転写されるように、様々なプロモーターを遺伝子発現に合わせて作製することは好都合であろう。例えば、遺伝子産物の構成的発現は、植物のある部位では有益であるが、他の部位ではあまり有用でないことがありうる。また別の場合には、植物の特定の生育段階で、あるいは特定の環境又は化学的刺激に応答して産生される遺伝子産物を得ることは有益であると考えられる。遺伝学的に改善された生殖質の商業的開発はまた、作物に多数の形質を導入する段階、しばしば遺伝子スタッキングアプローチと称される段階へと進んできた。このアプローチでは、対象とする異なる特性を付与する多数の遺伝子を植物に導入することができる。多数の遺伝子を植物に導入するときには、各々の遺伝子が至適発現のために調節又は制御されていること、そして遺伝子の沈黙化の潜在的可能性を低減するために調節要素は多様であることが重要である。これらやその他の配慮に照らして、遺伝子発現の至適制御と調節要素の多様性が植物バイオテクノロジーにおいて重要であることは明白である。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン（Ａｃｔｉｎ）プロモーター配列Ａｃｔ１ａ、Ａｃｔ１ｂ及び延長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列、及び作物細胞において機能する異種構造遺伝子配列に作動可能に連結されたこれらのプロモーターから誘導される断片及びシスエレメントを含むＤＮＡ植物発現構築物に関する。
【０００６】
それ故、本発明の１つの実施形態に従えば、作動可能に連結された、作物の細胞において機能性である、配列番号１２、配列番号２２及び配列番号２３から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備えるプロモーター、プロモーターに対して異種の構造ＤＮＡ配列、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含む、組換えＤＮＡ構築物が提供される。例えば、プロモーターは基本的に、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のいずれかから誘導される５’調節領域（その中に位置するイントロン配列を含めて又は除いて）から構成されうる。構造遺伝子は、配列の発現がトランスジェニック作物において作物栽培学的に有用な形質又は産物をもたらす、いかなる異種ヌクレオチド配列も含みうる。
【０００７】
本発明のもう１つの局面は、作物の除草剤耐性を付与するために用いられる蛋白質をコードする、本発明のプロモーター配列に作動可能に連結された構造ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物である。この除草剤耐性蛋白質は、単独の又は１つ又はそれ以上のグリホセート分解性蛋白質遺伝子と組み合わせた、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子のようなグリホセート耐性蛋白質遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０００８】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、プロモーターが、カリモウイルス（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサ（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスプロモーターのような異種プロモーター配列に作動可能に連結された、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを含むハイブリッド又はキメラプロモーターである、上述したようなＤＮＡ構築物が提供される。
【０００９】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、プロモーターが、トランスジェニック作物細胞において発現する異種遺伝子配列に作動可能に連結された、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを含むハイブリッド又はキメラプロモーターである、上述したようなＤＮＡ構築物が縦列で提供される。キメラプロモーター配列は、より特定すると配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０において同定される配列を含む。
【００１０】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、ＤＮＡ構築物を植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり少なくとも５０グラム酸当量（ｇ ａ．ｅ．／ｌ）を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与するように、構造ＤＮＡ配列がグリホセート耐性遺伝子である、上述したようなＤＮＡ構築物が提供される。他の関連実施形態では、ＤＮＡ構築物は、より高いグリホセート濃度、例えばグリホセート１リットル当たり少なくとも３００グラム酸当量を含むグリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与する。１つの実施形態に従えば、ＤＮＡ構築物は、例えば１エーカー当たり１６オンス（ｏｚ）（４０００平方メートル当たり４５３グラム）の割合のＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（登録商標）の少なくとも１回の施用に対する耐性を植物細胞に付与し、また他の実施形態では、グリホセート耐性は、例えば１エーカー当たり１６オンス（４０００平方メートル当たり４５３グラム）、１エーカー当たり３２オンス（４０００平方メートル当たり９０６グラム）、又は１エーカー当たり６４オンス（４０００平方メートル当たり１８１２グラム）の１回から２回又はそれ以上の施用にまで及ぶ。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、単子葉植物種及び双子葉植物種を含めて、上述したようなＤＮＡ構築物で形質転換されたトランスジェニック作物が提供される。我々は、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌナズナＥＦ１αプロモーターが、ａｒｏＡ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺伝子の発現を制御するために使用したとき、植物が修業的施用率のグリホセートを許容し、良好な栄養耐性と生殖組織への低い損傷を示す、例えば綿、トマト及びヒマワリのような他の作物種において十分に活性であることを発見した。そのようなプロモーターはまた、植物において、除草剤耐性、昆虫の防除、病害抵抗性、高い安定性又は保存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他の所望するポリペプチド産物の発現、あるいは植物生理又は形態における望ましい変化、等を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、対象とする他の遺伝子を発現するために使用できる。
【００１２】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌナズナＥＦ１αプロモーターを含む多数のＤＮＡ構築物で形質転換され、ａｒｏＡ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺伝子の発現を制御するために使用したとき、植物が修業的施用率のグリホセートを許容し、良好な栄養耐性と生殖組織への低い損傷を示す、例えば綿、トマト及びヒマワリのような他の作物種において十分に活性であるトランスジェニック作物植物が提供される。そのようなプロモーターはまた、植物において、除草剤耐性、昆虫の防除、病害抵抗性、高い安定性又は保存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他の所望するポリペプチド産物の発現、あるいは植物生理又は形態における望ましい変化、等を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、対象とする他の遺伝子を発現するために使用できる。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌナズナＥＦ１αプロモーターを、ａｒｏＡ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺伝子の発現を制御するために使用したとき、植物が修業的施用率のグリホセートを許容し、良好な栄養耐性と生殖組織への低い損傷を示す、例えば綿、トマト、キャノーラ、ダイズ及びヒマワリのような他の植物種で十分に活性な、植物におけるプロモーター活性を備えるカリモウイルスＤＮＡ分子と融合したキメラＤＮＡ分子として含むＤＮＡ構築物で形質転換されたトランスジェニック作物が提供される。そのようなプロモーターはまた、植物において、除草剤耐性、昆虫の防除、病害抵抗性、高い安定性又は保存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他の所望するポリペプチド産物の発現、あるいは植物生理又は形態における望ましい変化、等を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、対象とする他の遺伝子を発現するために使用できる。
【００１４】
本発明のもう１つの実施形態に従えば、植物において構造ＤＮＡ配列を発現するための方法が提供される。そのような方法は、上述したようなＤＮＡ構築物を提供し、かかるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して、構造ＤＮＡが植物において発現可能であるように植物細胞を再生して植物を生産することを含む。関連実施形態に従えば、雑草を防除する方法が提供され、かかる方法においては、ＤＮＡ構築物がグリホセート耐性遺伝子を含み、作物を有意に害することなく雑草を防除するのに十分な量のグリホセートをかかるＤＮＡ構築物で形質転換した作物に施用する。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ｐＣＧＮ８０８６のプラスミドマップである。
図２は、ｐＭＯＮ４５３２５のプラスミドマップである。
図３は、ｐＭＯＮ４５３３１のプラスミドマップである。
図４は、ｐＭＯＮ４５３３２のプラスミドマップである。
図５は、ｐＣＧＮ９１９０のプラスミドマップである。
図６は、ｐＣＧＮ９１５３のプラスミドマップである。
図７は、ｐＣＧＮ８０９９のプラスミドマップである。
図８は、ｐＣＧＮ８０８８のプラスミドマップである。
図９は、ｐＣＧＮ８０６８のプラスミドマップである。
図１０は、ｐＣＧＮ８０９６のプラスミドマップである。
図１１は、ｐＣＧＮ９１５１のプラスミドマップである。
図１２は、ｐＭＯＮ１０１５６のプラスミドマップである。
図１３は、ｐＭＯＮ５２０５９のプラスミドマップである。
図１４は、ｐＭＯＮ５４９５２のプラスミドマップである。
図１５は、ｐＭＯＮ５４９５３のプラスミドマップである。
図１６は、ｐＭＯＮ５４９５４のプラスミドマップである。
図１７は、ｐＭＯＮ５４９５５のプラスミドマップである。
図１８は、ｐＭＯＮ５４９５６のプラスミドマップである。
【００１６】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１は、Ａｃｔ２プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００１７】
配列番号２は、Ａｃｔ２プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００１８】
配列番号３は、Ａｃｔ８プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００１９】
配列番号４は、Ａｃｔ８プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００２０】
配列番号５は、Ａｃｔ１１プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００２１】
配列番号６は、Ａｃｔ１１プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００２２】
配列番号７は、ＥＦ１プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００２３】
配列番号８は、ＥＦ１プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００２４】
配列番号９は、Ａｃｔ２遺伝子のイントロン配列を含むＡｃｔ２プロモーターの配列である。塩基１−７６４位はプロモーター配列を表わす；塩基７６５−１２１５位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の５個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基５９７位に位置する。
【００２５】
配列番号１０は、Ａｃｔ１８遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ８プロモーターの配列である。塩基１−７９７位はプロモーター配列を表わす；塩基７９８−１２５９位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴＲの１０個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基６４６位に位置する。
【００２６】
配列番号１１は、Ａｃｔ１１遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１１プロモーターの配列である。塩基１−１２１８位はプロモーター配列を表わす；塩基１２１９−１３８１位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴＲの１０個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基１０６２位に位置する。
【００２７】
配列番号１２は、ＥＦ１遺伝子の第一イントロンを含むＥＦ１プロモーターの配列である。塩基１−５３６位はプロモーター配列を表わす；塩基５３７−１１３７位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴＲの２２個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基４８１位に位置する。
【００２８】
配列番号１３は、Ａｃｔ１ａプロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００２９】
配列番号１４は、Ａｃｔ１ｂプロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００３０】
配列番号１５は、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ１ｂプロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００３１】
配列番号１６は、Ａｃｔ３プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００３２】
配列番号１７は、Ａｃｔ３プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００３３】
配列番号１８は、Ａｃｔ７プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００３４】
配列番号１９は、Ａｃｔ７プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００３５】
配列番号２０は、Ａｃｔ１２プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマーである。
【００３６】
配列番号２１は、Ａｃｔ１２プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマーである。
【００３７】
配列番号２２は、Ａｃｔ１ａ遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１ａプロモーターの配列である。塩基１−１０３３位はプロモーター配列を表わす；塩基１０３４−１５７８位はイントロン及び５’ＵＴＲを表わす。
【００３８】
配列番号２３は、Ａｃｔ１ｂ遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１ｂプロモーターの配列である。塩基１−９１４位はプロモーター配列を表わす；塩基９１５−１４６８位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００３９】
配列番号２４は、Ａｃｔ３遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ３プロモーターの配列である。塩基１−１０２３位はプロモーター配列を表わす；塩基１０２４−１６４２位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４０】
配列番号２５は、Ａｃｔ７遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ７プロモーターの配列である。塩基１−６００位はプロモーター配列を表わす；塩基６０１−１２４１位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４１】
配列番号２６は、Ａｃｔ１２遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１２プロモーターの配列である。塩基１−１０１７位はプロモーター配列を表わす；塩基１０１８−１３１３位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４２】
配列番号２７は、Ａｃｔ１１遺伝子の第一イントロンを含むキメラＦＭＶ−Ａｃｔ１１プロモーターの配列である。塩基１−５３６位はＦＭＶプロモーター配列を表わす；塩基５５３−１９４６位はシロイヌナズナアクチン１１プロモーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４３】
配列番号２８は、ＥＦ１α遺伝子の第一イントロンを含むキメラＦＭＶ−ＥＦ１αプロモーターの配列である。塩基１−５３６位はＦＭＶプロモーター配列を表わす；塩基５５３−１６９５位はＥＦ１αプロモーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４４】
配列番号２９は、Ａｃｔ８遺伝子の第一イントロンを含むＣａＭＶ−Ａｃｔ８プロモーターの配列である。塩基１−５２３位はＣａＭＶプロモーター配列を表わす；塩基５３４−１８００位はＡｃｔ８プロモーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４５】
配列番号３０は、Ａｃｔ２遺伝子の第一イントロンを含むＣａＭＶ−Ａｃｔ２プロモーターの配列である。塩基１−５２３位はＣａＭＶプロモーター配列を表わす；塩基５３４−１７４２位はＡｃｔ２プロモーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本出願は、１９９９年１２月１６日提出の米国特許仮出願第６０／１７１，１７３号の優先権を主張する。次の定義及び方法は、本発明をよりよく規定し、本発明の実施において当業者の手引きとなるために提供するものである。特に異なる記載がない限り、用語は関連技術における当業者の慣例的使用法に従って理解されねばならない。３７ＣＦＲ  §１．８２２に述べられているＤＮＡ塩基の表記法を使用する。アミノ酸残基については標準的な１文字３文字表記法を用いる。
【００４７】
「核酸（配列）」又は「ポリヌクレオチド（配列）」は、ゲノム又は合成由来の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、すなわち、それぞれ５’（上流）末端から３’（下流）末端まで読み取った、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基のポリマーを指す。核酸はセンス鎖又は相補（アンチセンス）鎖でありうる。
【００４８】
「天然」は、天然に生じる（「野生型」）核酸配列を指す。
【００４９】
「異種」配列は、外来ソース又は外来種から生じる、又は同じソースからであっても、その元の形態から改変されている配列を指す。
【００５０】
「単離」核酸配列は、当該核酸が天然に生じる生物の細胞において通常結合している他の核酸配列、すなわち他の染色体又は染色体外ＤＮＡから離れて実質的に分離又は精製されている。かかる語は、夾雑核酸及び他の細胞成分を実質的に除去するように生化学的に精製された核酸を包含する。かかる語はまた、組換え核酸及び化学合成核酸を包含する。
【００５１】
ここで使用するとき「実質的に精製された」との語は、その天然状態で通常結合している他の分子から分離された分子を指す。より好ましくは、実質的に精製された分子は試料中に存在する主要種である。実質的に精製された分子は、自然混合物中に存在する他の分子を６０％以上、好ましくは７５％、より好ましくは９０％含まない（溶媒を除く）。実質的に精製された」との語は、それらの天然状態で存在する分子を包含することは意図されていない。
【００５２】
第一核酸配列は、他の核酸（又はその相補鎖）と至適に整列したとき（比較のウインドーに対して標準配列の合計２０％未満の適切なヌクレオチド挿入又は欠失で）、少なくとも２０個のヌクレオチド部分、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド部分、より好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド部分、最も好ましくは第一核酸配列の長さ全体にわたる比較ウインドーに対して少なくとも７５％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性が存在する場合、標準核酸配列に対して「実質的な同一性」を示す。比較ウインドーを整列するための配列の至適整列は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同整列アルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法によって；好ましくはｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩでのこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ処理によって実施することができる。標準核酸は完全長分子又はより長い分子の部分でありうる。代替的に、２個の核酸は、下記に定義するようなストリンジェント条件下で一方を他方にハイブリダイズした場合、実質的な同一性を有しうる。
【００５３】
第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列の機能に影響を及ぼすように配列が配置されているとき、第二核酸配列と「作動可能に連結されて」いる。好ましくは、２個の配列は１個の近接核酸分子の部分であり、より好ましくは隣接する。例えば、プロモーターが細胞において遺伝子の転写を調節又は仲介する場合、プロモーターは遺伝子に作動可能に連結されている。
【００５４】
「組換え」核酸は、配列のさもなければ離れた２つのセグメントの人工的組合せによって、例えば化学合成によって又は核酸の分離したセグメントの遺伝子工学手法による操作によって、作製される。核酸操作のための手法は周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｍａｉｌｇａら、植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｂｉｒｒｅｎら、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）：１巻、ＤＮＡの分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ）（１９９７）、２巻、遺伝子の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ）（１９９８）、３巻、クローニング系（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）、４巻、遺伝子マッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（１９９９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００５５】
核酸の化学合成の方法は、例えばＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１、及びＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１の中で論じられている。核酸の化学合成は、例えば市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで実施することができる。
【００５６】
「合成核酸配列」は、特定宿主細胞における発現増強のため及び適切な構築物へのクローン化のために設計し、化学合成することができる。宿主細胞はしばしばコドン使用の好ましいパターンを示す（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９）。特定宿主における発現を増強するために設計される合成ＤＮＡは、それ故、宿主細胞におけるコドン使用のパターンを反映すべきである。ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１の「ＢｅｓｔＦｉｔ」又は「Ｇａｐ」プログラムを含むがこれらに限定されないコンピュータプログラムが、これらの目的のために使用可能である。
【００５７】
核酸の「増幅」又は「核酸複製（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」は核酸配列のさらなるコピーの産生を指し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノロジーを用いて実施される。様々な増幅方法が当該技術において既知であり、中でも特に、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号において、ならびにＰＣＲプロトコール：方法と応用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｉｎｎｉｓら編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０において記述されている。ＰＣＲにおいて、プライマーは、ＤＮＡ鋳型にアニーリングされてポリメラーゼ連鎖反応を開始させる、定義された配列の短いオリゴヌクレオチドを指す。
【００５８】
「形質転換された」、「トランスフェクションされた」又は「トランスジェニック」は、組換え構築物のような外来核酸が導入された細胞、組織、器官、又は生物を指す。好ましくは、導入核酸は、当該導入核酸がその後の子孫に遺伝されるようにレシピエント細胞、組織、器官又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる。「トランスジェニック」又は「形質転換」細胞あるいは生物は、細胞又は生物の子孫、ならびに交配においてそのような「トランスジェニック」植物を親として使用する育種プログラムから生産され、組換え構築物又は構築物の存在から生じる変化した表現型を示す子孫も包含する。
【００５９】
「遺伝子」の語は、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質をコードする染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他のＤＮＡ、又はＲＮＡ分子、及び発現の調節に関わるコード配列に隣接する領域を指す。一部の遺伝子はｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドへと翻訳されうる（構造遺伝子）；他の遺伝子は、発現の調節因子として、ＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）及び他の種類の遺伝子機能に転写されうる（レギュレーター遺伝子）。
【００６０】
遺伝子の「発現」は、対応するｍＲＮＡを作製するための遺伝子の転写及び対応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチド又は蛋白質を作製するためのこのｍＲＮＡの翻訳を指す。遺伝子発現は、プロモーターのような５’調節エレメントを含めた調節エレメントによって制御又は調節される。
【００６１】
「遺伝成分」は、発現構築物の成分又は一部でもありうる何らかの核酸配列又は遺伝エレメントを指す。遺伝成分の例は、プロモーター領域、５’非翻訳リーダー、イントロン、遺伝子、３’非翻訳領域、及び１個又はそれ以上の核酸配列の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の調節配列又は配列を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現構築物」又は「発現カセット」の語は、１個又はそれ以上のＤＮＡ配列が周知の組換えＤＮＡ手法を用いて機能的に作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込み又は自律複製することができる、何らかのソースから誘導されるプラスミド、コスミド、ウイルス、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、自律複製配列、ファージ、又は線状又は環状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド配列のような因子を指す。
【００６３】
「相補的」は、塩基の対合（相補的配列Ｔ−Ｃ−ＡとのＡ−Ｇ−Ｔ対）による核酸配列の自然結合を指す。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸対の一部だけが相補的である場合には部分的であり、すべての塩基対が相補的である場合には完全であると考えられる。相補性の度合は、ハイブリダイゼーション及び増幅反応の効率と強さに影響を及ぼす。
【００６４】
「相同性」は、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸のパーセント位置同一性の見地から見た核酸又はアミノ酸配列間の類似性のレベル、すなわち配列類似性又は同一性を指す。相同性はまた、異なる核酸又は蛋白質の間での同様の機能特性の概念も表わす。
【００６５】
「プロモーター」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（又は蛋白質コード領域）の翻訳開始コドンの上流又は５’側に位置し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及び他の蛋白質（トランス作用性転写因子）の認識と結合に関与して転写を開始させる核酸配列を指す。「植物プロモーター」は、植物細胞において機能性である天然又は非天然プロモーターである。構成的プロモーターは、植物の生育期間を通じて植物の大部分又はすべての組織において機能性である。組織、器官又は細胞特異的プロモーターは、それぞれ特定の組織、器官又は細胞型においてのみ又は主として特定の組織、器官又は細胞型において発現される。所与の組織、器官又は細胞型において「特異的に」発現されるのではなく、プロモーターは、植物のある部分（例えば細胞型、組織又は器官）において植物の他の部分に比べて「増強された」発現、すなわちより高い発現レベルを示すと考えられる。一次的に調節されるプロモーターは、植物生育の一定の期間にのみ又は主として一定の期間に、あるいは例えば概日リズムに関連する遺伝子の場合のように、１日のうちの一定の時間にのみ又は主として一定の時間に機能性である。誘導的プロモーターは、例えば化合物（化学的誘導物質）による内因性又は外因性刺激の存在に応答して、又は環境、ホルモン、化学及び／又は生育シグナルに応答して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。誘導的又は調節下プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、例えば光、熱、ストレス、洪水又は干ばつ、植物ホルモン、損傷、エタノール、ジャスモネート（ｊａｓｍｏｎａｔｅ）、サリチル酸又はサフェナー（ｓａｆｅｎｅｒ）のような化学物質によって調節されるプロモーターを含む。
【００６６】
植物プロモーターは、１個又はそれ以上の特定遺伝子の発現を調節するための５’調節配列として使用できる。１つの好ましいプロモーターは、植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであろう。植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、他の高等真核生物のものと同様に、複雑な構造を持ち、いくつかの異なるエレメントから成る。１つのそのようなエレメントは、インビトロでの真核細胞遺伝子の正しい発現とインビボでの正確で効率的な転写開始のために必要な、ＴＡＴＡボックス又はＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックスである。ＴＡＴＡボックスは典型的には、約−２５から−３５、すなわち転写開始部位の２５から３５塩基対（ｂｐ）上流、又は＋１位と定義されるキャップ部位に位置する（ＢｒｅａｔｈｎａｃｈとＣｈａｍｂｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９−３８３，１９８１；Ｍｅｓｓｉｎｇら、「植物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」より、Ｋｏｓｕｇｅら編集、ｐ．２１１−２２７，１９８３）。もう１つの共通エレメント、ＣＣＡＡＴボックスは、−７０から−１００ｂｐの間に位置する。植物においては、ＣＣＡＡＴボックスは、哺乳類プロモーターの機能的に類似する配列とは異なるコンセンサス配列を持つことがある（植物相似物は、その動物対応物と識別するために「ＡＧＧＡボックス」と称されてきた；Ｍｅｓｓｉｎｇら、「植物の遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」より、Ｋｏｓｕｇｅら編集、ｐ．２１１−２２７，１９８３）。さらに、実質的にすべてのプロモーターが、約−１００ｂｐから−１，０００ｂｐまで又は転写開始部位のより上流までに及ぶ付加的な上流活性化配列又はエンハンサーを含む（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０，１９８１；Ｇｒｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：９４３−９４７，１９８１；及びＫｈｏｕｒｙとＧｒｕｓｓ，Ｃｅｌｌ  ２７：３１３−３１４，１９８３）。
【００６７】
異種ＤＮＡ配列に融合したとき、そのようなプロモーターは典型的には、プロモーターが通常結合する遺伝子配列のものと同様にして融合配列の転写を生じさせる。調節配列を含むプロモーター断片を付加することができる（例えば、それ自身の部分又は完全調節配列を備える活性プロモーターの５’末端に融合するか又はその中に挿入する（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１１０６−１１１２，１９８６；Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１１−１６，１９８７；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８９８６−８９９０，１９８７；ＰｏｕｌｓｅｎとＣｈｕａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１４：１６−２３，１９８８；Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１，１９９１））。代替的に、異種調節配列を、不活性のトランケートされたプロモーター、例えばコアＴＡＴＡと、時としてＣＣＡＡＴエレメントだけを含むプロモーターの５’上流領域に付加することができる（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１１０６−１１１２，１９８６；Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１１−１６，１９８７；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ａｒｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：６５−７１，１９９１）。
【００６８】
プロモーターは典型的には、各々が遺伝子発現の全体的制御の異なる局面を与える、多数の異なる「シス作用性転写調節エレメント」又は単に「シスエレメント」から成る（ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１１−１６，１９８７；Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１６７７−１６８４，１９９０）。「シスエレメント」は、転写を調節するトランス作用性蛋白質因子に結合する。一部のシスエレメントは２個以上の因子に結合し、トランス作用性転写因子は２個以上のシスエレメントと様々な親和性で相互作用しうる（ＪｏｈｎｓｏｎとＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：７９９−８３９，１９８９）。シスエレメントに対応する植物転写因子及びそれらの相互作用の分析は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１３０−１３８，１９９６；Ｍｕｒａｉ、「植物生化学及び分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｄａｓｈｅｋ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．３９７−４２２；及び「植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｍａｌｉｇａら編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐ．２３３−３００の中で論じられている。本発明のプロモーター配列は、遺伝子発現を付与する又は調節する「シスエレメント」を含みうる。
【００６９】
シスエレメント（Ｃｉｓ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、欠失分析、すなわち５’末端から又はプロモーターの内部から１個又はそれ以上のヌクレオチドを欠失させること、Ｄｎａｓｅ  Ｉフットプリント法、メチル化干渉、電気泳動移動度変化アッセイ、ライゲーション仲介ＰＣＲによるインビボゲノムフットプリント法その他の従来のアッセイを用いるＤＮＡ結合蛋白質分析を含めた多くの手法によって、あるいは従来の配列比較法による既知のシスエレメントモチーフとの配列類似性によって同定することができる。シスエレメントの微細構造は、エレメントの１個又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異誘発（又は置換）によって、又は他の従来の方法によって（例えば、「植物生化学及び分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｄａｓｈｅｋ編集、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．３９７−４２２；及び「植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｍａｌｉｇａら編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐ．２３３−３００参照）さらに検討することができる。
【００７０】
シスエレメントは化学合成によって又はそのようなエレメントを含むプロモーターからのクローニングによって入手することができる。シスエレメントはまた、配列操作を容易にする有用な制限酵素部位を含む付加隣接配列を用いて合成することもできる。１つの実施形態では、プロモーターは多数の異なる「シスエレメント」から成る。好ましい実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の核酸配列の「シスエレメント」を含む配列領域を、シスエレメント、又は配列内のドメイン又はモチーフを同定するために特に設計されたＭＥＭＥ又はＳＩＧＮＡＬＳＣＡＮを含むがこれらに限定されないコンピュータプログラムを使用して同定する。
【００７１】
本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の断片又はシスエレメント、あるいは本発明の核酸配列と相同性を示す、遺伝子調節を生じさせることが知られているシスエレメントの同族体を含む。そのような核酸断片は開示される配列のいかなる領域も含みうる。配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６に示すような本発明プロモーター領域又は部分プロモーター領域は、「シスエレメント」又は雄性生殖組織におけるような作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を調節することができるドメインを含むがこれらに限定されない、少なくとも１個の調節エレメントを含みうる。
【００７２】
植物プロモーターはまた、合成、キメラ又はハイブリッドプロモーターを生成するように既知のプロモーターを操作することを通して作製されたプロモーターを含みうる。そのようなプロモーターはまた、例えば活性プロモーターに異種調節配列を付加することによって、１個又はそれ以上のプロモーターからのシスエレメントをそれ自体の部分又は完全調節配列と組み合わせることができる（Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１１−１６，１９８７；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８９８６−８９９０，１９８７；ＰｏｕｌｓｅｎとＣｈｕａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１４：１６−２３，１９８８；Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１，１９９１）。キメラプロモーターはまた、不活性のトランケートされたプロモーター、すなわちコアＴＡＴＡと、任意にＣＣＡＡＴエレメントだけを含むプロモーターの５’上流領域に異種調節配列を付加することによっても開発されてきた（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１１０６−１１１２，１９８６；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ａｒｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：６５−７１，１９９１）。
【００７３】
本発明に従ったキメラ又はハイブリッドプロモーターは、光、熱又はストレスのような数多くの環境因子によって調節されるエレメント；病原体又は化学物質等によって調節される又は誘発されるエレメントのような、少なくとも１個の既知のシスエレメントを含みうる。そのようなエレメントは、条件に依存して遺伝子発現を正又は負のいずれかに調節しうる。シスエレメントの例は、酸素反応性エレメント（Ｃｏｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２６９０４，１９９３）、光調節エレメント（例えば、ＢｒｕｃｅとＱｕａｉｌ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１０８１，１９９０及びＢｒｕｃｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３０１５，１９９１参照）、メチルジャスモネート処理に対して反応性のシスエレメント（ＢｅａｕｄｏｉｎとＲｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：８３５，１９９７）、サリチル酸反応性エレメント（Ｓｔｒａｎｇｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１３１５，１９９７）、熱ショック反応性エレメント（Ｐｅｌｈａｍら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１：３１，１９８５）、創傷及び非生物ストレスに対して反応性のエレメント（Ｌｏａｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９２３０，１９９２；Ｍｈｉｒｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２５７，１９９７）、低温反応性エレメント（Ｂａｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：７０１，１９９４；Ｊｉａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：６７９，１９９６；Ｎｏｒｄｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６４１，１９９３；Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３５１５，１９９２）、及び干ばつ反応性エレメント（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６：２５１−２６４，１９９４；Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：６０５，１９９５；Ｂｒａｙ  Ｅ．Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２：４８，１９９７）を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
もう１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すようなヌクレオチド配列は、作動可能に連結されたＤＮＡ配列を調節することができる、あらゆる長さの上記ヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に開示するような配列は、トランケートされているか又は欠失した部分を持つが、まだ作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を調節することができるものでありうる。関連実施形態では、開示配列のシスエレメントは、特定の組織において作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現増強をもたらすような、特定の特異性を付与しうる。その結果として、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０の開示配列のいかなる配列断片、部分又は領域も、開示配列のシスエレメント又はモチーフを含むがこれらに限定されない調節配列として使用することができる。また、１個又はそれ以上の塩基対をプロモーター配列の内部に挿入する、欠失させる又は置換することもできる。プロモーターは、プロモーター断面又はエレメントを、例えばそのような断片を最小プロモーターの上流に置くことによって、作動可能に連結するように構築することができる。最小又は基本プロモーターは、基本転写機構を動員し、結合することができる一片のＤＮＡである。真核細胞における基本転写機構の１つの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体及びその付属蛋白質である。基本転写機構の酵素成分は、最小又は基本プロモーターを使用して、所与の遺伝子の転写を開始させ、延長させることができる。すなわち、プロモーター領域内には、転写を調節する、例えば増強する、抑制する、転写ホルモン依存性にする、等々の転写因子を動員し、結合することができる付加的なシス作用性配列は存在しない。置換、欠失、挿入又はそれらの何らかの組合せを用いて最終構築物を作製することができる。
【００７５】
本発明のプロモーター配列は、例えば他の植物系における発現のために修飾することができる。もう１つのアプローチでは、いくつかの方法によって新規ハイブリッドプロモーターを設計する又は構築することができる。多くのプロモーターは、プロモーターの強さ及び／又は特異性を活性化する、増強する又は規定する上流配列を含む（Ａｔｃｈｉｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：１２７，１９８８）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は、例えば転写開始部位に結合する「ＴＡＴＡ」ボックスを含み、転写開始部位の上流に位置する他の上流エレメントは転写レベルを調節する（Ｇｅｌｖｉｎ、「トランスジェニック植物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ）」、Ｋｕｎｇ，Ｓ．−Ｄ．及びＵｓ，Ｒ．編集、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．４９−８７，１９８８）。もう１つ別のキメラプロモーターは、オクトパインシンターゼ（ｏｃｓ）活性化因子のトリマーをマンノパインシンターゼ（ｍａｓ）活性化因子プラスプロモーターに結合し、レポーター遺伝子の発現の上昇が報告された（Ｍｉｎ  Ｎｉら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：６６１，１９９５）。本発明の上流調節配列は、そのようなキメラ又はハイブリッドプロモーターの構築のために使用することができる。本発明の変異体プロモーターの構築のための方法は、種々のプロモーターの制御エレメントを結合する又はプロモーターの部分又は領域を重複させることを含むが、これらに限定されない（例えば米国特許第５，１１０，７３２号及び米国特許第５，０９７，０２５号参照）。当業者は、高分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド、等々）の構築、操作及び単離、組換え生物の生成ならびに遺伝子のスクリーニングと単離のための詳細な条件及び手順に精通している（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｍａｉｌｇａら、植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｂｉｒｒｅｎら、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）：１巻、ＤＮＡの分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ）（１９９７）、２巻、遺伝子の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ）（１９９８）、３巻、クローニング系（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）、４巻、遺伝子マッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（１９９９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。
【００７６】
作動可能に連結された核酸配列の発現を変調する又は調節するための、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上のシスエレメントを含むキメラ又はハイブリッドプロモーターの設計、構築及び使用もまた、本発明に包含される。
【００７７】
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のプロモーター配列、その断片、領域又はシスエレメントは、多数の組織において作動可能に連結されたＤＮＡ配列を転写することができ、それ故多数の組織において遺伝子の発現を選択的に調節することができる。
【００７８】
いくつかの物栽培学的形質については、対象とする１個又はそれ以上の遺伝子の転写が多くの組織において所望する特性を付与することが望ましい。あらゆる組織で遺伝子を発現することが望ましいのではなく、特定の組織においてのみ発現することが望ましいと考えられるので、対象とする選択された標的組織において、作動可能に連結された遺伝子の転写を調節する適当なプロモーターが使用可能であることが望ましい。例えば、除草剤耐性についての遺伝子発現のために標的遺伝子を選択的に発現することを所望する場合、栄養及び生殖組織における除草剤耐性遺伝子の発現が望ましいであろう。本発明のプロモーター配列は、速やかに成長する分裂組織、花粉、葯及び花糸のような雄性生殖組織（雄ずい群、ａｎｄｒｏｅｃｉｕｍ）、柱頭、花柱及び子房のような雌性生殖組織（雌ずい群、ｇｙｎｏｅｃｉｕｍ）、葉、がく片、ならびに花弁を含むがこれらに限定されない多数の組織において遺伝子発現を調節するために有用である。本発明のプロモーターは、それ故、例えば多数の組織で及び植物成長の多くの段階で耐性が所望される場合に、除草剤耐性遺伝子の発現のために有用性を持つ。本発明のプロモーター配列は、受精能、収率、昆虫耐性、菌類耐性、除草剤耐性、又は対象とする何らかの望ましい形質の制御のための遺伝子を含むがこれらに限定されない、あらゆる標的遺伝子の転写を調節するために有用性を持つ。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明のプロモーターは、多数の組織における遺伝子の発現を所望する場合に、除草剤耐性遺伝子の発を調節するために特に有用性を持つ。例えば、除草剤耐性遺伝子はグリホセート除草剤に対する耐性を付与しうる。適当なグリホセート耐性遺伝子の例は、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子、又はグリホセートオキシドレダクターゼ及びホスホネートＮ−アセチルトランスフェラーゼのようなグリホセートを分解する遺伝子産物を含むが、これらに限定されない。所望する発現プロフィールにとって最も効率的である適当な調節エレメントを得るためには、あらゆる植物バイオテクノロジー戦略のために５’調節エレメントの広い範囲の選択肢を持つことが重要である。
【００８０】
もう１つの実施形態では、本発明のプロモーターは遺伝子機能を決定する上で有用性を持つ。多くの遺伝子の機能は不明であり、本発明のプロモーターは、センス又はアンチセンス方向で発現される１個又はそれ以上の遺伝子の表現型評価を可能にする構築物において遺伝要素として使用することができる。本発明のプロモーターは、構成及び生殖組織での高レベルの遺伝子発現を所望する場合に、高流量アッセイのために開発された植物発現構築物における成分となりうる。
【００８１】
遺伝子及び調節配列の同定のためにいかなる植物も選択できる。遺伝子及び調節配列の単離のための適当な植物標的の例は、アルファルファ、リンゴ、アンズ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アーティチョーク（チョウセンアザミ）、ａｒｕｇｕｌａ（？）、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループ（メロンの一種）、ニンジン、キャッサバ、ヒマ種子、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チコリ、ｃｉｌａｎｔｒｏ（？）、柑橘類、クレメンタイン（ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅｓ）、クローバー、ココヤシ、コーヒー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、ダグラスモミ、ナス、アンディーブ、エスカロール（キクヂシャの一種）、ユーカリノキ、ウイキョウ、イチジク、ニンニク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、蜜、ｊｉｃａｍａ（？）、キウイフルーツ、レタス、ニラネギ、レモン、ライム、ロブロリーパイン（マツの一種）、アマニ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、ナッツ、カラスムギ、油ヤシ、油料種子アブラナ、オクラ、オリーブ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、オランダボウフウ、エンドウ、モモ、落花生、セイヨウナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ｒａｄｉａｔａ  ｐｉｎｅ、ｒａｄｉｓｃｃｈｉｏ、ハツカダイコン、ナタネの種子、ラズベリー、イネ、ライムギ、モロコシ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｐｉｎｅ、ダイズ、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝生、カブ、ブドウの木、スイカ、コムギ、ヤマノイモ、及びズッキーニを含むが、これらに限定されない。調節配列の同定のために特に好ましい植物は、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、及び綿である。
【００８２】
本発明のプロモーター配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ植物ＤＮＡから単離した。好ましい実施形態では、構築物は、適当なターミネーター及び調節エレメントと共に転写可能配列に作動可能に連結された本発明のプロモーター配列を含む。そのような構築物を、対象とする適当な標的植物に形質転換することができる。いかなる植物も、本発明のプロモーター配列を含む核酸構築物のための適当な宿主として使用することができる。対象とする適当な標的植物の例は、アルファルファ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、カリフラワー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、レタス、エンドウ、ポプラ、マツ、ジャガイモ、タマネギ、イネ、ラズベリー、ダイズ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、トマト及びコムギを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
プロモーターの単離及び修飾方法
ここで開示するプロモーター配列の断片を単離するために多くの方法が使用できる。公的に入手可能な配列情報を使用して、植物のゲノムライブラリーから隣接領域を増幅するためにＰＣＲに基づくアプローチが使用できる。既知の配列のコア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅するには、多くの方法が当業者に既知である。かかる方法は、逆ＰＣＲ、ベクトレットＰＣＲ、Ｙ字型ＰＣＲ及びゲノム歩行アプローチを含むが、これらに限定されない。本発明のために、使用可能な配列情報に基づいてＰＣＲプライマーを設計することにより、シロイヌナズナから核酸分子を単離した。
【００８４】
核酸断片はまた、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて一般的に実施されるように、化学的手段によって断片を直接合成することのような他の手法によっても入手できる。断片はまた、分子生物学の当業者には一般的に知られる組換えＤＮＡ手法によるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）テクノロジーのような、核酸再生テクノロジーの適用によっても入手することができる。特定の増幅プライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントＰＣＲ条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（又はその補体）を持つプライマーが結合する標的核酸配列にだけハイブリダイズして、好ましくはユニーク増幅産物を生成することができる条件を指す。
【００８５】
当業者は、植物ゲノムＤＮＡの調製のための方法を認知している。１つのアプローチでは、制限酵素による部分的消化と特定サイズ範囲内のＤＮＡ断片をサイズ選択することにより、選択した種からゲノムＤＮＡライブラリーを調製することができる。ゲノムＤＮＡは、バクテリオファージを含むがこれに限定されない適当な構築物にクローン化し、多くの販売業者（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ又はＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ参照）からの適当なクローニングキットを使用して、バクテリオファージのような適当な構築物を用いて調製することができる。
【００８６】
もう１つの実施形態では、ここで開示するプロモーターのヌクレオチド配列を修飾することができる。当業者は、ヌクレオチド配列に変異を有するＤＮＡ分子を創造することができる。配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すような本発明のヌクレオチド配列を、それらの制御特性を増強するように修飾する又は変化させることができる。例えば、ＰＣＲベースのＤＮＡ修飾アプローチにおいて鋳型配列の挿入、欠失又は置換によって配列を修飾することができる。「変異体」ＤＮＡ分子は、好ましくはプロモーター機能を実質的に保持しながら、天然配列の１個又はそれ以上のヌクレオチドが欠失、付加及び／又は置換されている、変化を含むＤＮＡ分子である。プロモーター断片の場合には、「変異体」ＤＮＡは、それが作動可能に連結されている最小プロモーターの転写に影響を及ぼす変化を含みうる。変異体ＤＮＡ分子は、例えば標準的ＤＮＡ突然変異誘発手法によって又は変異体ＤＮＡ分子又はその部分を化学合成することによって作製することができる。
【００８７】
遺伝子発現を調節する際の使用に加えて、本発明のプロモーター配列はまた、核酸ハイブリダイゼーション実験におけるプローブ又はプライマーとしても有用性を持つ。本発明の核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェント条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」の語は、経験的に決定できるような、プローブ又はプライマーが標的配列と特異的にハイブリダイズし、非標的配列とはハイブリダイズしない条件と定義される。「ストリンジェント条件」は、特異的ハイブリダイゼーション手順（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５２−９．５５、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．４７−９．５２、９．５６−９．５８；Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３、１９８４；及びＷｅｔｍｕｒとＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９−３７０，１６８参照）による標的核酸（すなわち対象とする特定核酸配列）への核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、例えば約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄であり、当業者に既知であるか若しくは「分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６を含むがこれに限定されない実験室マニュアルに認めることができる。例えば、洗浄段階の塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択できる。さらに、洗浄段階の温度は、約２２℃の室温での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度及び塩の両方を変化させることができ、あるいは温度又は塩濃度のいずれかを一定に保持しながら他方の変数を変えることもできる。例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はプライマーを用いるハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーについては、６５℃での０．５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの洗浄を伴って、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ，５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬの非特異的ＤＮＡ（例えば音波処理サケ精子ＤＮＡ）中６５℃で実施することができる。
【００８８】
核酸分子は、完全な相補性を示す場合にもう１つの核酸分子の「補体」であると称される。ここで使用するとき、分子は、その分子の１個のあらゆるヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的であるとき「完全な相補性」を示すと称される。２個の分子が少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングしたままでありうる十分な安定性を備えて互いにハイブリダイズすることができる場合、それらは「最小限に相補的」であると称される。同様に、分子が従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングしたままでありうる十分な安定性を備えて互いにハイブリダイズすることができる場合、それらは「相補的」であると称される。標的配列へのプローブ又はプライマーの結合特異性が保存されている場合、より低い度合の配列類似性を持つ関連配列を同定するためには、より低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のようなより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用できると想定される。従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の相補的伸長による二重鎖分子を選択的に形成する能力のために使用することができる。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡセグメントの検出は当業者には周知であり、それ故想定される適用に依存して、標的配列に対する様々な度合のプロモーターの選択性を達成するために様々なハイブリダイゼーション条件を用いることが所望され、選択方法は所望する結果に依存するであろう。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、及びＨａｙｍｅｓら、「核酸ハイブリダイゼーション、実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９８５に述べられている。
【００８９】
本発明の１つの実施形態では、密接に関連する又は相同な遺伝子及び関連調節配列を同定するために、他の植物組織のハイブリダイゼーションアッセイにおいて核酸配列、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６、又はこれらの配列の断片、領域、シスエレメント又はオリゴマーを使用する。これらは、適切に調製された植物組織、セルロース、ナイロン、又はコンビネーションフィルター、チップ又はスライドガラスを含むがこれらに限定されない基質上でのサザン又はノーザンハイブリダイゼーションアッセイを含むが、これらに限定されない。そのような方法論は当該技術において周知であり、営利販売業者によって供給されうるキット又は製剤において入手可能である。
【００９０】
ここで使用するとき核酸の断片は、完全長未満の核酸の部分である。例えば、本発明のためには、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の開示ヌクレオチド配列未満のあらゆる長さのヌクレオチド配列が断片とみなされる。断片はまた、上記に定義したようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で天然核酸に特異的にハイブリダイズすることができる最小限の長さを含みうる。そのような最小断片の長さは、好ましくは天然核酸配列の少なくとも８個のヌクレオチド、より好ましくは１５個のヌクレオチド、さらに一層好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチド、最も好ましくは３０個のヌクレオチドである。
【００９１】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識又はレポーター分子、例えば放射性同位体、リガンド、化学発光物質又は酵素が結合する単離核酸である。「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニーリングされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成し、その後ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する単離核酸である。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は従来の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために使用できる。
【００９２】
プローブ及びプライマーは一般に１１個のヌクレオチド又はそれ以上の長さ、好ましくは１８個のヌクレオチド又はそれ以上、より好ましくは２５個のヌクレオチド、最も好ましくは３０個のヌクレオチド又はそれ以上の長さである。そのようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、低ストリンジェンシー条件下でもう１つ別の種の標的天然配列に特異的にハイブリダイズする。好ましくは、本発明に従ったプローブ及びプライマーは天然配列と完全な配列類似性を持つが、天然配列とは異なるが標的天然配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブが従来の方法によって設計しうる。プローブ及びプライマーを調製し、使用するための方法は、例えば、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、１から３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；「分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的最新化）（以下、「Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２」）；及びＩｎｎｉｓら、「ＰＣＲプロトコール：方法と適用への手引き（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０に述べられている。ＰＣＲ−プライマー対は、例えばＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５、ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のようなそのために用意されているコンピュータプログラムを使用して、既知の配列から誘導することができる。ここで開示する天然プロモーター配列に基づくプローブ及びプライマーは、従来の方法、例えば再クローニングと再配列決定によって開示配列を確認し、必要に応じて修飾するために使用できる。
【００９３】
構築物及び発現構築物
本発明に従った天然又は合成核酸は、宿主細胞に導入して複製することができる組換え核酸構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組み込むことができる。好ましい実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すような本発明のヌクレオチド配列又はその断片、変異体又は誘導体を、選択可能、スクリーニング可能、又はスコアリング可能なマーカー遺伝子のような遺伝成分に作動可能に連結された本発明のプロモーター領域を含む発現カセットに組み込む。
【００９４】
もう１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すような本発明の開示核酸配列を、植物の形態、生理、成長及び生育、収率、栄養強化、病害又は害虫抵抗性、あるいは環境又は化学耐性に結びつく望ましい特性を付与する核酸のような遺伝成分に作動可能に連結する。対象とするマーカー遺伝子又は作物栽培学的遺伝子のような遺伝成分は、形質転換植物細胞又は植物、あるいは作物栽培学的有用性を持つ産物又はその生産の同定において機能しうる。
【００９５】
もう１つの実施形態では、１個の遺伝成分は、選択デバイスとして役立つ産物を生成し、再生植物組織において、さもなければ有害な化合物に対する耐性を植物組織に付与する化合物を産生するように機能する。選択可能、スクリーニング可能、又はスコアリング可能なマーカーとして使用するための対象遺伝子は、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼについてのコード配列）、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質についてのコード配列）、ＬＵＸ（ルシフェラーゼについてのコード遺伝子）、抗生物質耐性マーカー遺伝子、又は除草剤耐性遺伝子を含むであろうが、これらに限定されない。トランスポゾン及び関連抗生物質耐性遺伝子の例は、トランスポゾンＴｎｓ（ｂｌａ）、Ｔｎ５（ｎｐｔＩＩ）、Ｔｎ７（ｄｈｆｒ）、ペニシリン、カナマイシン（及びネオマイシン、Ｇ４１８，ブレオマイシン）；メトトレキセート（及びトリメトプリム）；クロラムフェニコール；カナマイシン及びテトラサイクリンを含む。
【００９６】
植物における選択マーカーにとって有用な特性は、微生物の使用に関する報告書に概説されている（Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｎｏｖｅｌ  Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，１９９４年７月）。これらは、最小数の非形質転換組織に関する厳密な選択、再生に関する有意の干渉を伴わない多数の独立形質転換事象、多数の種への適用、そしてマーカーの存在に関して組織をスコアリングするためのアッセイの使用可能性を含む。
【００９７】
多くの選択マーカー遺伝子が当該技術で知られており、カナマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ヒグロマイシンＢ（ａｐｈ  ＩＶ）及びゲンタマイシン（ａａｃ３及びａａｃＣ４）に耐性であるものを含めて、いくつかの抗生物質耐性遺伝子はこれらの判定基準を満たしている。有用な優性選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子（例えばヒグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１８、ストレプトマイシン又はスペクチノマイシンに対して耐性）、及び除草剤耐性遺伝子（例えばホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝子を含む。除草剤耐性に関する形質転換体を選択するための有用な戦略は、Ｖａｓｉｌ、「植物の細胞培養と体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」、Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４に述べられている。本発明において使用するための特に好ましい選択マーカー遺伝子は、カナマイシンのような抗生物質及びグリホセートのような除草剤などの化合物に対する耐性を付与する遺伝子であろう（Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５（６），１９８７，米国特許第５，４６３，１７５号、米国特許第５，６３３，４３５号）。他の選択デバイスも供給可能であり、やはり本発明の範囲内である。
【００９８】
本発明の実施のために、ＤＮＡ構築物及び宿主細胞を調製し、使用するための従来の組成物及び方法を、中でも特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に述べられているように使用する。好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。植物細胞の安定なトランスフェクション又はトランスジェニック植物の確立のための適当なＤＮＡ構築物は、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、「クローニングベクター：実験室マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１９８５、補遺１９８７）；ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ、「植物分子生物学のための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｌｖｉｎら、「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０；及びＲ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒｏｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３に記述されている。植物発現構築物は、例えば５’及び３’調節配列の転写制御下で１個又はそれ以上のクローン化植物遺伝子を含みうる。それらはまた、発現構築物を含む宿主細胞を選択するための上述したような選択マーカーを含みうる。そのような植物発現構築物はまた、プロモーター調節領域（例えば誘導的又は構成的、環境又は発生調節的、あるいは細胞又は組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終了部位、及びポリアデニル化シグナルも含む。構築物を細菌宿主においてクローン化できるように細菌由来の他の配列も含まれる。構築物はまた、典型的には広い範囲の宿主原核細胞複製起点を含む。特に好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞であり、植物発現構築物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に開示されるようなプロモーター領域、作動可能に連結された転写可能配列、及び転写終止配列を含む。発現構築物中の遺伝成分として考慮される他の調節配列は、プロモーターと結合することができる非翻訳リーダー配列を含むがこれに限定されない。特に好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞であり、植物発現構築物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に開示されるようなプロモーター領域、作動可能に連結された転写可能配列、及び転写終止配列を含む。植物発現構築物はまた、クローニングのために有用な制限酵素部位を含むポリリンカー配列を含むがこれに限定されない付加配列を含みうる。
【００９９】
植物発現構築物中の遺伝エレメント
植物発現構築物は、各々が異なるプロモーターに作動可能に連結された２個以上の発現可能遺伝子配列を含みうる。多くのプロモーターが、選択可能マーカー、スコアリング可能マーカー、害虫耐性、病害耐性、栄養強化に関する遺伝子及び作物栽培学的利益を持つ他の遺伝子を含むがこれらに限定されない対象遺伝子に関して、植物遺伝子発現のために有用性を持つ。植物遺伝子発現のために有用な構成的プロモーターの例は、単子葉植物を含めて（例えばＤｅｋｅｙｓｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：５９１，１９９０；ＴｅｒａｄａとＳｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：３８９，１９９０参照）大部分の植物組織において構成的な高レベルの発現をもたらすカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）Ｐ−３５Ｓプロモーター；縦列反復ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー配列を含む強化３５Ｓプロモーター（Ｐ−ｅ３５Ｓ）；ノパリンシンターゼプロモーター（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７，１９８８）、オクトパインシンターゼプロモーター（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９７７，１９８９）、及び米国特許第５，３７８，６１９号に述べられているようなゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルス（Ｐ−ＦＭＶ）プロモーター及びＰ−ＦＭＶのプロモーター配列に由来する強化バージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）；カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター；サトウキビ杆状ウイルスプロモーター；コメリナイエローモットルウイルスプロモーター；及び植物細胞において発現することが知られている他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
環境、ホルモン、化学物質、及び／又は発生シグナルに応答して調節される多様な植物遺伝子プロモーターが、（１）熱（Ｃａｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：９６５，１９８８）、（２）光（例えばエンドウｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：４７１、１９８９；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、ＳｃｈａｆｆｎｅｒとＳｈｅｅｎ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：９９７，１９９１；又はクロロフィルａ／ｂ−結合蛋白質プロモーター、Ｓｉｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２７２３，１９８５）、（３）アブシジン酸のようなホルモン（Ｍａｒｃｏｔｔｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６９、１９８９）、（４）創傷（例えばｗｕｎＩ、Ｓｉｅｂｅｒｔｚら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：９６１，１９８９）；又は（５）メチルジャスモネート、サリチル酸、又はＳａｆｅｎｅｒのような化学物質によって調節されるプロモーターを含めて、植物細胞における作動可能に連結された遺伝子の発現のために使用できる。また、（６）器官特異的プロモーター（例えばＲｏｓｈａｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１１５５、１９８７；Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：１２４９、１９８８；Ｂｕｓｔｏｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：８３９，１９８９）を用いることも有益であろう。
【０１０１】
本発明のプロモーターは、速やかに成長する分裂組織及び生殖組織において作動可能に連結されたＤＮＡ配列を転写することができ、発現構築物中で対象遺伝子に作動可能に連結することができる植物プロモーターである。
【０１０２】
植物発現構築物は、トランスジーンにおいてポリペプチドコード配列の上流又は下流に位置づけることができるＲＮＡプロセシングシグナル、例えばイントロンを含みうる。さらに、発現構築物は、植物遺伝子の３’非翻訳領域からの付加調節配列（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４４（１９８７）；Ａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：１１５（１９８９））、例えば、ジャガイモのＰＩ−ＩＩターミネーター領域あるいはオクトパイン又はノパリンシンターゼ３’ターミネーター領域のような、ｍＲＮＡのｍＲＮＡ安定性を高める３’ターミネーター領域を含みうる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域は翻訳の開始において重要な役割を果たすことができ、また植物発現構築物における遺伝成分でもありうる。例えば、熱ショック蛋白質遺伝子から誘導される非翻訳５’リーダー配列は、植物における遺伝子発現を増強することが明らかにされている（例えば米国特許第５，３６２，８６５号参照）。これらの付加上流及び下流調節配列は、発現構築物上に存在する他のエレメントに関して天然又は異種であるソースから誘導されうる。
【０１０３】
本発明のプロモーター配列は、植物細胞における遺伝子発現を制御するために使用される。開示するプロモーター配列は、植物形質転換において使用される構築物の部分である遺伝成分である。本発明のプロモーター配列は、特定の望ましい形質を付与するのに十分であるように発現される１個又はそれ以上の核酸と共に、上述したような選択可能又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子と関連調節エレメントを含む適当な植物形質転換プラスミド又は構築物に関して使用することができる。本発明によって想定される、作物栽培学的利益を持つ適当な構造遺伝子の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）遺伝子のような昆虫耐性、菌類病防除に関する遺伝子のような害虫耐性、グリホセート耐性を与える遺伝子のような除草剤耐性に関する１個又はそれ以上の遺伝子、及び収率、栄養増強、環境又はストレス耐性のような品質向上、あるいは植物の生理、成長、生育、形態又は植物産物における何らかの望ましい変化に関する遺伝子を含むであろうが、これらに限定されない。例えば、構造遺伝子は、その全体が参照してここに組み込まれるＷＯ  ９９３１２４８号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，６８９，０５２号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，５００，３６５号及び５，８８０，２７５号に述べられているようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）昆虫防除蛋白質遺伝子を含むがこれに限定されない、昆虫耐性を与えるあらゆる遺伝子を含むであろう。もう１つの実施形態では、構造遺伝子は、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているようなアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＣＰ４グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）、又はその全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，４６３，１７５号に述べられているようなグリホセートオキシドレダクターゼ遺伝子（ＧＯＸ）を含むがこれらに限定されない遺伝子によって付与されるような、除草剤グリホセートに対する耐性を与えることができる。
【０１０４】
代替的に、ＤＮＡコード配列は、例えばアンチセンス又はコサプレッションを介した機序を通して、内因性遺伝子の発現の標的抑制を引き起こす非翻訳ＲＮＡ分子をコードすることによってこれらの表現型を生じさせることができる（例えばＢｉｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．Ｒｅｖ．９：２０７，１９９１参照）。ＲＮＡはまた、所望する内因性ｍＲＮＡ産物を開裂するように設計された触媒ＲＮＡ分子（例えばライボザイム）でありうる（例えばＧｉｂｓｏｎとＳｈｉｌｌｉｔｏｅ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１２５，１９９７参照）。それ故、対象とする表現型又は形態学的変化を発現する蛋白質又はｍＲＮＡを生じる遺伝子は、本発明の実施のために有用である。
【０１０５】
ＤＮＡ配列の上流（５’側）又はＤＮＡ配列内に位置する調節エレメント又は配列に加えて、遺伝子発現に影響を及ぼす下流（３’側）配列が存在する。それ故、ここで使用するとき調節配列の語は、細胞の蛋白質合成装置と共に遺伝子産物の発現を制御する、仲介する又は影響を及ぼす、ＤＮＡ配列の上流、ＤＮＡ配列内又は下流に位置するあらゆるヌクレオチド配列を指す。
【０１０６】
当業者は植物形質転換に適した構築物を認識している。本発明のプロモーター配列を、好ましくは上述したようなスクリーニング可能又はスコアリング可能なマーカーを使用して発現構築物に組み込み、一過性分析で試験して形質転換植物における遺伝子発現の指標を提供する。一過性アッセイにおいて遺伝子発現を試験する方法は当業者に既知である。マーカー遺伝子の一過性発現は様々な植物、組織及びＤＮＡ送達システムにおいて報告されている。例えば、一過性分析の種類は、何らかの対象植物種を用いた一過性植物アッセイにおいて組織のエレクトロポレーション又はパーティクルボンバードメント（粒子衝撃）を通して遺伝子送達を指令することを含みうるが、これらに限定されない。そのような一過性システムは、コムギにおける懸濁培養からのプロトプラスト（Ｚｈｏｕら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：６２１，１９９３）、小麦の葉のプロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｅｔｈｉら、Ｊ．Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．５２：１５２，１９８３）、トウモロコシ組織から調製したプロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｅｅｎ、Ｊ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：２２５，１９９１）、あるいは対象とする特定組織のパーティクルボンバードメントを含むが、これらに限定されない。本発明は、選択されたレポーター遺伝子、マーカー遺伝子又は対象とする作物栽培学的遺伝子に作動可能に連結された調節配列を評価するためのあらゆる一過性発現系の使用を包含する。適切な送達システムを通して一過性アッセイで試験することが考慮される植物組織の例は、葉脚組織、カルス、子葉、根、内質、胚芽、花組織、花粉、及び表皮組織をふくむであろうが、これらに限定されない。
【０１０７】
いかなるスクリーニング可能又はスコアリング可能なマーカーも一過性アッセイにおいて使用できる。本発明のプロモーター又は５’調節配列の一過性分析のための好ましいマーカー遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子又は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含む。マーカー遺伝子に作動可能に連結された５’調節配列を含む発現構築物を組織に送達し、マーカーに依存して適切な機序によって組織を分析する。安定な植物において作物栽培学的利益を有する遺伝子に作動可能に連結されたときの５’調節配列の潜在的発現プロフィールを評価するためのツールとして、定量的及び定性的分析が使用される。最終的には、転写可能な対象ＤＮＡ配列に作動可能に連結された５’調節配列を含む適当な植物形質転換発現構築物に本発明の５’調節配列を直接組み込み、植物に形質転換して、安定に形質転換された植物及びその子孫を、５’調節配列によって付与された所望する発現プロフィールに関して分析する。
【０１０８】
植物細胞に外因性ＤＮＡを導入するための適当な発現構築物は、アグロバクテリウム菌を介した方法のための非武装化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミドを含むであろうが、これに限定されない。これらの構築物は、対象とする１個又はそれ以上の遺伝子及び関連調節領域と共に、耐性マーカー、１−２  Ｔ−ＤＮＡボーダー、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウム菌の複製起点を含みうる。当業者は、アグロバクテリウム菌仲介のアプローチのために多くの菌株と方法が使用可能であることを認識している。そのような菌株は、アグロバクテリウム菌株Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１及びＥＨＡ１０５を含むが、これらに限定されない。特に好ましい菌株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株である。
【０１０９】
本発明に包含される方法によって導入しうる例示的核酸は、例えば、もう１つ別の種からのＤＮＡ配列又は遺伝子、あるいはさらに同じ種から生じる又は同じ種内に存在するが、古典的生殖又は育種手法ではなく遺伝子工学的方法によってレシピエント細胞に組み込まれている遺伝子又は配列を含む。しかしながら、「外因性」の語はまた、形質転換した細胞には通常存在しない、又はおそらく単に形質転換したＤＮＡセグメント又は遺伝子で認められるような形態、構造、等々では存在しない遺伝子、あるいは通常存在するが、自然の発現パターンとは異なるように発現する、例えば過剰発現することを所望する遺伝子を指すことが意図されている。それ故、「外因性」遺伝子又はＤＮＡの語は、同様の遺伝子が既にレシピエント細胞内に存在するかどうかには関わりなく、そのような細胞に導入されるあらゆる遺伝子又はＤＮＡセグメントを指すことが意図されている。外因性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの種類は、植物細胞内に既に存在するＤＮＡ、もう１つ別の植物からのＤＮＡ、異なる生物からのＤＮＡ、あるいは遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ配列又は遺伝子の合成又は修飾バージョンをコードするＤＮＡ配列のような外的に生成されるＤＮＡを含みうる。
【０１１０】
本発明のプロモーター配列を含む植物形質転換構築物は、何らかの植物形質転換法によって植物に導入しうる。ＤＮＡ配列を植物細胞に導入するためのいくつかの方法が使用可能であり、当該技術において周知である。適当な方法は、細菌感染（例えば上述したようなアグロバクテリウム琴による、バイナリー細菌人工染色体構築物、ＤＮＡの直接送達（例えばＰＥＧ仲介の形質転換、乾燥／抑制仲介のＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素ファイバーによる攪拌を通して）、及びＤＮＡ被覆パーティクルの加速（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２：２０５，１９９１の中で検討されている）を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
双子葉植物を特異的に形質転換するための方法は、主としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。例えば、報告されているトランスジェニック植物は、綿（米国特許第５，００４，８６３号；米国特許第５，１５９，１３５号；米国特許第５，５１８，９０８号、ＷＯ９７／４３４３０号）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号；米国特許第５，４１６，０１１号；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３，１９８８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１，１９８８）；アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、１５：６５３，１９９６）、及びアルファルファ（Ｍａｓｏｕｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．，５：３１３，１９９６）を含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
同様の方法が単子葉植物の形質転換において報告されている。これらの方法を用いた形質転換と植物再生は、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５，１９８７）；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒａｅ；ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：３７，１９９４）；トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４，１９８８；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３，１９９０；Ｆｒｏｍｍｒａ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３，１９９０；Ｋｏｚｉｅｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４，１９９３）；カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１５８９，１９９２）；オルチャードグラス（ｏｒｃｈａｒｄｇｒａｓｓ）（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ；Ｈｏｒｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：４６９，１９８８）；イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、インディカ及びジャポニカ品種を含む、Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１０，１９８８；Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：３７９，１９８８；ＬｕｏとＷｕ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，６：１６５，１９８８；ＺｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７６：８３５，１９８８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７，１９９１）；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；Ｃａｓａｓ，Ａ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１１２１２，１９９３）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．；ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２：４０９，１９９２）；ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ（ウシノケグサ）（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｙ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６９１，１９９２）；芝生（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、１３：１，１９９３）；及びコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７，１９９２；Ｗｅｅｋｓ Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７，１９９３；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：２９９，１９９４）を含むがこれらに限定されない多くの作物について記述されている。対象とする数多くの標的作物から安定なトランスジェニック植物を生産するために多くの形質転換法が使用でき、修正できることは当業者には明白である。
【０１１３】
植物の分析方法
形質転換植物を、本発明のプロモーター配列によってもたらされる対象遺伝子の存在及び発現レベル及び／又はプロフィールに関して分析する。当業者は、形質転換植物の分析のために使用できる数多くの方法を認知している。遺伝子発現を評価し、導入した遺伝子が組み込まれ、適切に機能して、予想されたように遺伝するかどうかを調べるために様々な方法が用いられる。本発明のために、プロモーターが作動可能に連結されている遺伝子の発現レベルを調べることによってプロモーターを評価することができる。レポーター遺伝子を用いた一過性アッセイ法によってプロモーター機能の予備的評価を調べることができるが、より決定的なプロモーター評価は安定な植物の分析から決定できる。植物分析のための方法は、サザンブロット又はノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化学的分析、表現型スクリーニング法、圃場評価、及び免疫診断アッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
ＰＣＲテクノロジー、ゲノムＤＮＡの単離、発現構築物の構築、一過性アッセイ、及び植物形質転換法を含むがこれらに限定されない本発明の方法は当業者に周知であり、標準手法又はその修正を用いて実施される。
【０１１５】
グリホセート散布試験
１つの実施形態では、グリホセート耐性に関する温室又は圃場評価を実施する。「グリホセート」の語は、ここでは、親除草剤Ｎ−ホスホノメチルグリシン（グリホセート酸としても知られる）、その塩又はエステル、又は植物組織中でＮ−ホスホノメチルグリシンに変換される又はＮ−ホスホノメチルグリシンをイオン形態で（グリホセートイオンとしても知られる）提供する化合物を集合的に表わすために使用される。例示的に、ここで有用な水溶性グリホセート塩が、その開示が参照してここに組み込まれる、Ｆｒａｎｚへの米国特許第３，７９９，７５８号及び第４，４０５，５３１号に開示されている。本発明に従って使用できるグリホセート塩は、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム塩；アンモニウム塩；Ｃ１−１６アルカリアンモニウム、例えばジメチルアンモニウム及びイソプロピルアンモニウム塩；Ｃ１−１６アルカノアンモニウム、例えばモノエタノールアンモニウム塩；Ｃ１−１６アルキルスルホニウム、例えばトリメチルスルホニウム塩；それらの混合物等を含むが、これらに限定されない。グリホセート酸分子は、異なるｐＫａ値を持つ３個の酸部位を備える；従って一塩基、二塩基及び三塩基酸、又はそれらの混合物、又はあらゆる中間レベルの中和の塩が使用できる。
【０１１６】
グリホセート塩は水溶性であるので、一部では商業的に重要である。多くのアンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノアンモニウム、アルキルスルホニウム及びアルカリ金属塩が高度に水溶性であり、使用の時点で水に希釈することができる高度濃縮水溶液として製剤することができる。
【０１１７】
そのような濃縮水溶液は、酸当量（ｇ  ａ．ｅ．／ｌ）で表わすと、グリホセート１リットル当たり約５０から約５００グラムを含みうる。より高いグリホセート濃度、例えば約３００から約５００ｇ  ａ．ｅ．／ｌが好ましい。
【０１１８】
グリホセート塩は代替的に、例えば粉末、顆粒、ペレット又は錠剤の形態で、水溶性又は水分散性組成物として製剤される。そのような組成物はしばしばドライ製剤として知られるが、「ドライ」の語はここでは完全に水分が存在しないことを意味すると理解すべきではない。典型的にはドライ製剤は約５重量％未満の水分、例えば約０．５重量％から約２重量％の水分を含む。そのような製剤は、使用時に水に溶解する又は分散することが意図されている。
【０１１９】
想定されるドライグリホセート製剤は、酸当量（％ａ．ｅ．）で表わすと、約５重量％から約８０重量％のグリホセートを含みうる。上記の範囲内のより高いグリホセート濃度、例えば約５０％から約８０％ａ．ｅ．が好ましい。ドライ製剤を製造するために特に有用なグリホセートの塩はナトリウム及びアンモニウム塩である。
【０１２０】
本発明の植物処理組成物ならびに液体及びドライ濃縮物組成物は、任意に１つ又はそれ以上の所望する賦形剤成分を含みうる。グリホセート組成物のための特に有用な賦形剤成分は界面活性剤であり、これは植物の葉の比較的疎水性の表面に水性散布液を保持するのに役立ち、またグリホセートが葉のろう様の外層クチクラに浸透し、それによって葉の内部の生体組織に接触するのを助ける。界面活性剤は他の有用な機能も果たすことができる。
【０１２１】
本発明のグリホセート組成物において使用できる界面活性剤の種類又は化学分類に制限はない。非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性型、又はこれらのタイプの２つ以上の組合せがすべて、個々の状況において有用である。しかし一般には、少なくとも１つの界面活性剤が存在する場合には、陰イオン性以外である、すなわち少なくとも１つの界面活性剤は非イオン性、陽イオン性又は両性であることが好ましい。
【０１２２】
ここで有用な多くの界面活性剤は、各々が１個のＣ２−４アルキレンオキシド単位あるいはＣ２−４アルキレンオキシド単位の重合又は共重合鎖から成る、１つ又はそれ以上の部分を含む化学構造を備える。そのような界面活性剤はポリオキシアルキレン界面活性剤と称され、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性型を含む。現在考慮される組成物において有用なポリオキシアルキレン界面活性剤は、約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位を含む。好ましいポリオキシアルキレン界面活性剤においては、アルキレンオキシド単位が、エチレンオキシド又は共重合エチレンオキシドのいずれかとプロピレンオキシドの１つ又はそれ以上の鎖を形成し、アルキレンオキシド単位の各々の鎖は末端ヒブリド基又はＣ１−４アルキル又はＣ１−４アルカノイル末端キャップを備える。
【０１２３】
本発明の組成物において有用な界面活性剤の疎水性部分は基本的に炭化水素ベースであり、この場合疎水性部分は典型的にはＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル、アルケニル、アルキルアリール、アルカノイル又はアルケノイル鎖である。これらの鎖は直鎖又は分枝でありうる。代替的には、疎水性部分は、例えばヘプタメチルトリシロキサン基のようなシロキサン基の形態でのシリコン原子、又は例えば部分的フッ素化アルキル又はペルフルオロアルキル鎖のようなフッ素原子を含みうる。
【０１２４】
非イオン性界面活性剤の中で、特に好ましいクラスは、ポリオキシエチレンアルキル、エトキシル化第一級又は第二級アルコール又はアルキルフェノールのようなアルケニル又はアルキルアリールエーテル、エトキシル化脂肪酸のようなポリオキシエチレンアルキル又はアルケニルエステル、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル、グリセリルアルキルエステル、スクロースエステル、アルキルポリグリコシド、等を含む。そのような非イオン性界面活性剤の代表的な特定例は、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェノール、ＳｈｅｌｌのＮｅｏｄｏｌ（商標）２５−７（ポリオキシエチレン（７）Ｃ１２−１５直鎖第一級アルコール）、Ｕｎｉｏｎ  ＣａｒｂｉｄｅのＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５−Ｓ−９（ポリオキシエチレン（９）Ｃ１２−１５直鎖第二級アルコール）、ＩＣＩのＴｗｅｅｎ（商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート及びＨｅｎｋｅｌのＡｇｒｉｍｕｌ（商標）（Ｃ９−１１アルキルポリグルコシド）を含む。
【０１２５】
陽イオン性界面活性剤の中で、特に好ましいクラスは、エトキシル化脂肪アミンのようなポリオキシエチレン第三アルキルアミン又はアルケニルアミン、第四アンモニウム界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルアミン、等を含む。そのような陽イオン界面活性剤の代表的な特定例は、ポリオキシエチレン（５）ココアミン、ポリオキシエチレン（１５）獣脂アミン、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、メチルビス（２−ヒドロキシエチル）ココアンモニウムクロリド、Ｎ−ドデシルピリジンクロリド及びポリオキシプロピレン（８）エトキシトリメチルアンモニウムクロリドを含む。特に好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルアミンは、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９６／３２８３９号に開示されているものである。様々な構造の多くの陽イオン性第四アンモニウム界面活性剤がグリホセートとの組合せで有用であることが当該技術において知られており、ここで考慮する組成物において使用できる；そのような第四アンモニウム界面活性剤は、式
（ＮＲａＲｂＲｃＲｄ）ｍＡｎ
［式中、Ａは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、硫酸塩又はリン酸塩のような適当な陰イオンであり、ｍとｎは、陽イオン（ＮＲａＲｂＲｃＲｄ）の正電荷が陰イオンＡの負電荷と釣り合うような整数であり、そしてＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ及びＲｄについての選択肢は、限定を伴わずに：
（ｉ）Ｒａはベンジル又はＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケニルであり、そしてＲｂ、Ｒｃ及びＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである；
（ｉｉ）ＲａとＲｂは独立してＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケニルであり、そしてＲｃとＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである；
（ｉｉｉ）ＲａはＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケニルであり、Ｒｂは約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位、好ましくはエチレンオキシド単位を備えるポリオキシアルキレン鎖であり、そしてＲｃとＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである；
（ｉｖ）ＲａはＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケニルであり、ＲｂとＲｃは合計で約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位、好ましくはエチレンオキシド単位を備えるポリオキシアルキレン鎖であり、そしてＲｄはＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである；若しくは
（ｖ）Ｒａは、Ｃ３−４アルキレンオキシド単位、好ましくはプロピレンオキシド単位が支配的である、約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位を備えるポリオキシアルキレン鎖であり、そしてＲｂ、Ｒｃ及びＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ましくはメチル又はエチルである］、を含む。
【０１２６】
このタイプの特に好ましい第四アンモニウム界面活性剤は、Ｃｌａｕｄｅらへの米国特許第５，４６４，８０７号に開示されている。
【０１２７】
１つの実施形態では、そのような第四アンモニウム界面活性剤と結合する陰イオンはグリホセート陰イオンでありうる。
【０１２８】
両性界面活性剤の中で、より正確には双性イオン性界面活性剤と称される当該技術において慣例的なものを含めて、特に好ましいクラスは、ポリオキシエチレンアルキルアミンオキシド、アルキルベタイン、アルキル置換アミノ酸、等を含む。そのような両性界面活性剤の代表的な例は、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリオキシエチレン（２）ココアミンオキシド及びステアリルジメチルベタインを含む。
【０１２９】
上述したクラスに限定されることなく、当業者が適当な界面活性剤を選択することができる標準的な参考文献ソースは、「工業界面活性剤ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）」、第２版（１９９７）、Ｇｏｗｅｒ発行、「マッカチョンの乳化剤と界面活性剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）」、北米及び国際版（１９９７）、ＭＣ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ発行、及び「国産化粧品成分ディクショナリー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）」、第６版（１９９５）、１及び２巻、ｔｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ発行を含む。
【０１３０】
本発明の組成物の他の任意成分は、色、粘度、ゲル特性、凝固点、吸湿性、固化挙動、溶解速度、分散性、又は他の製剤特性を変化させるための作用物質を含む。
【０１３１】
グリホセートの市販製剤の例は、限定を伴わずに、すべてがグリホセートをそのイソプロピルアンモニウム塩として含む、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）    ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＣＴ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＢＩＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯ（登録商標）、ＰＯＬＡＲＩＳ（登録商標）、ＳＰＡＲＫ（登録商標）及びＡＣＣＯＲＤ（登録商標）除草剤のようなＭｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているもの；グリホセートをそのアンモニウム塩として含む、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＤＲＹ及びＲＩＶＡＬ（登録商標）除草剤のようなＭｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているもの；グリホセートをそのナトリウム塩として含む、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）  ＧＥＯＦＯＲＣＥのようなＭｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているもの；ならびにグリホセートをそのトリメチルスルホニウム塩として含む、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ（登録商標）除草剤のようなＺｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって市販されているものを含む。
【０１３２】
生物学的に有効なグリホセート製剤の施用率の選択は、通常の農業技術者の技術範囲内である。当業者は同様に、個々の植物条件、気象条件及び生育条件が本発明の方法を実施する際に達成される結果に影響を及ぼしうることを認識するであろう。２０年以上にわたるグリホセートの使用とそのような使用に関する公表試験は、雑草防除実施者が個々の環境条件において個々の生育段階で個々の種に対して除草剤として有効なグリホセート施用率を選択することができる豊富な情報を提供してきた。
【０１３３】
本発明の方法は、グリホセートが除草剤又は植物成長調整剤として生物学的に有効であるあらゆる種に適用できる。これは世界中の極めて多様な植物種を包含する。同様に、本発明の組成物は、グリホセートが生物学的に活性であるあらゆる植物種に適用できる。
【０１３４】
１つの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物にグリホセート含有除草剤を施用し、グリホセート除草剤に対する耐性に関して植物を評価する。あらゆるグリホセート製剤が本発明のＤＮＡ構築物を含む植物を試験するために使用できる。例えば、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）のようなグリホセート組成物が使用できる。植物のグリホセート耐性の評価のための試験パラメータは、多くの因子に依存して変化するであろう。因子は、グリホセート製剤の種類、製剤中で使用されるグリホセートの濃度と量、植物の種類、施用期間中の植物の生育段階、環境条件、施用方法、及び個々の製剤を施用する回数を含むが、これらに限定されない。例えば、散布施用法を用いて温室環境で植物を試験することができる。Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）を使用する試験範囲は、８オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり２５７グラム）から２５６オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり７２４８グラム）を含むが、これらに限定されない。好ましい市販の有効範囲は、作物及び植物の生育段階に依存して、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）の１６オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり４５３グラム）から６４オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり１８１２グラム）でありうる。グリホセート製剤の少なくとも１回の施用により作物に散布することができる。綿の試験については、３葉期に３２オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり９０６グラム）を１回施用し、後期生育段階で追加施用することができる。コムギについては、３−５葉期にＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）の３２オンス／エーカー（４０００平方メートル当たり９０６グラム）を１回施用し、試験するコムギの種類に依存して、収穫前又は収穫後施用を実施することができる所望する商業的に有効なグリホセート耐性レベルを与える本発明の構築物を含む特定植物を見出すために、各々の作物について試験パラメータを至適化することができる。
【０１３５】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために提示するものである。当業者は、下記の実施例に開示されている手法は、本発明を実施する際に良好に機能するように発明者が発見した手法であることを認識するであろう。しかし当業者は、本開示に照らして、開示されている特定実施形態に多くの変更を加えることができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様の又は類似の結果を得られることを認識するはずであり、それ故記述されている又は添付の図面に示されている事柄はすべて例示と解釈すべきであり、制限的な意味に解釈してはならない。
【０１３６】
（実施例）
実施例１
使用するプラスミド構築物は、ｐＵＣクローニング構築物、又はｏｒｉ３２２のような大腸菌複製起点、ｏｒｉＶ又はｏｒｉＲｉのような広い宿主レンジの複製起点、及びスペクチノマイシン又はストレプトマイシンに対する耐性を与える、Ｔｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードするＳｐｃ／Ｓｔｒのような選択マーカー又はゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択マーカーのコード領域を含む二重ボーダー植物形質転換構築物のいずれかである。植物形質転換については、宿主細菌株はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＢＩ又はＬＢＡ４４０４であった。
【０１３７】
遺伝子エレメントは次のように説明される：Ｐ−ｅ３５Ｓは、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，４２４，２００号に述べられているような、−９０−３００領域の重複を含むＣａＭＶからの３５Ｓ ＲＮＡである；Ｐ−ＦＭＶは、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，３７８，６１９号に述べられているような、ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスからのプロモーターである；Ｐ−ｅＦＭＶは、Ｐ−ＦＭＶプロモーターの誘導体である；ＣＴＰ２は、米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているようなシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＰＳＰシンターゼのシグナルペプチド領域である；ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ（ａｒｏＡ：ＣＰ４）は、米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているような又は特定植物種のコドン使用に基づいて植物における発現のためにさらに修飾されたＣＰ４ ＥＰＳＰのコード領域（合成配列）である；Ｅ９ ３’は、ポリアデニル化シグナルとして機能するエンドウＲｂｃＳ遺伝子の単離物の３’末端である；ｎｏｓは、ポリアデニル化シグナルとして機能するノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端である；Ｈｓｐ７０は、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，３６２，８６５号に述べられているようなＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａからの非翻訳リーダー配列である；ＧＵＳは、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼコード配列である（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８３：８４４７−８４５１、１９８７）；右ボーダー（ＲＢ）及び左ボーダー（ＬＢ）は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトパイン及びノパリン菌株のＴｉプラスミドからである。Ｐ−ＡｔＡｃｔ２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のイントロンである；ＡｔＡｃｔ８は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子の５’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ１１ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子の５’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ａ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１ａは、アクチン１ａ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１ａはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ｂ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１ｂは、アクチン１ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１ｂはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ３は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン３遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ３は、アクチン３遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リ��ダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ３はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ７は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン７遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ７は、アクチン７遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ７はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１２遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡｃｔ１２は、アクチン１２遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１２はイントロンである；Ｐ−ＡｔＥＦ１α（Ｐ−ＡｔＥＦ１又はＥＦ１α）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αからのプロモーターであり、ＡｔＥＦ１α−ｉ（ＡｔＥＦ１−ｉ）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αの５’ＵＴＲ内のイントロンである。
【０１３８】
図１から１８は、１個から３個の植物発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を示す。植物分子生物学の当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明のプロモーターと遺伝エレメントを含む植物発現カセットの多くの組合せを構築し、作物において試験することができる。図面に例示する構築物は作製しうる唯一の構築物と解釈すべきではなく、当業者にとっての例示としてのみ使用されるものである。図１（ｐＣＧＮ８０８６）は、対象とする１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ８）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図２（ｐＭＯＮ４５３２５）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１）を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図３（ｐＭＯＮ４５３３１）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図４（ｐＭＯＮ４５３３２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン）を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図５（ｐＭＯＮ９１９０）は、本発明の少なくとも２個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン、ＡｔＥＦ１α−ｉ；Ｐ−ＡｔＡｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ）が対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結されており、Ｐ−ｅＦＭＶプロモーターがＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎに作動可能に連結されている、３個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図６（ｐＭＯＮ９１５３）の植物発現カセットは図４（ｐＭＯＮ４５３３２）に例示したものと同じであり、このプラスミドマップは、明細書に示すデータ表の中の植物表現型に関して表示したデータの発現カセットの同定のために例示している。図７（ｐＣＧＮ８０９９）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図８（ｐＣＧＮ８０８８）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明の１個のプロモーター、Ｐ−ＡｔＡｃｔ８プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ８ｉ及びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図９（ｐＣＧＮ８０６８）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明の１個のプロモーター、Ｐ−ＡｔＡｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ及びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１０（��ＣＧＮ８０９６）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ／ＡｔＡｃｔ１１及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１１（ｐＣＧＮ９１５１）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ２を備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１２（ｐＭＯＮ１０１５６）は、対象とするａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ遺伝子の発現を推進するＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供し、このベクターは本発明のプロモーター配列との比較のために使用する。図１３（ｐＭＯＮ５２０５９）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進するハイブリッドプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１４（ｐＭＯＮ５４９５２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａプラスＡｔＡｃｔ１ａイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１５（ｐＭＯＮ５４９５３）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂプラスＡｔＡｃｔ１ｂイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１６（ｐＭＯＮ５４９５４）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３プラスＡｔＡｃｔ３イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１７（ｐＭＯＮ５４９５５）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ７プラスＡｔＡｃｔ７イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１８（ｐＭＯＮ５４９５６）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２プラスＡｔＡｃｔ１２イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。
【０１３９】
実施例２
クローニング構築物及びＧＵＳ構築物を表１に列挙する。シロイヌナズナアクチン２プロモーター及びイントロン（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０：１０７−１２１，１９９６に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ４１９９８）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ  ＤＮＡを鋳型として使用し（ＲｏｇｅｒｓとＢｅｎｄｉｃｈ，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：６９，１９９８）、配列番号１（正プライマー）及び配列番号２（逆プライマー）を反応において次のように用いて単離した：０．５μｇ鋳型ＤＮＡ、各プライマー２５ｐｍｏｌｅ、「ホットスタート」ＰＣＲのためのワックスビーズを使用するｔａｑポリメラーゼ（ＢＭＢ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。ＰＣＲ熱循環器条件は次のとおりであった：９４℃で１分間；９２℃で４０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分３０秒間の３０サイクル；そして５分間の７２℃伸長。ＰＣＲ反応物をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（Ｂｉｏ１０１  Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化した構築物ｐＭＯＮ２６１４９（表１）にライゲートした。プロモータークローンを配列確認し、生じた構築物をｐＭＯＮ２６１７０（表１）と称した。
【０１４０】
【表１】
0005111706.tif 000002
【０１４１】
実施例３
シロイヌナズナアクチン８プロモーター及びイントロン（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０：１０７−１２１，１９９６に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ４２００７）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ  ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号３（正プライマー）及び配列番号４（逆プライマー）を用いて実施例２で述べたＰＣＲ条件と精製法によって単離した。実施例２で述べたように制限酵素を用いてプロモーターをクローン化し、配列確認して、生じた構築物をｐＭＯＮ２６１７１（表１）と称した。
【０１４２】
実施例４
シロイヌナズナアクチン１１プロモーター及びイントロン（Ｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３：１２５−１３９，１９９７に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ２７９８１）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ  ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号５（正プライマー）及び配列番号６（逆プライマー）を用いて実施例２で述べたＰＣＲ条件と精製法によって単離した。制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＮｃｏＩを用いてプロモーターをクローン化し、ｐＭＯＮ８６７７（表１）にライゲートして、配列確認し、生じた構築物をｐＭＯＮ４８４０７（表１）と称した。
【０１４３】
実施例５
シロイヌナズナ延長因子１α（ＡｔＥＦ１α）プロモーター及びイントロン（Ａｘｅｌｏｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１９：１０６−１１２，１９８９；Ｃｕｒｉｅら、ＮＡＲ  １９：１３０５−１３１０；Ｃｕｒｉｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１０８３−１０８９，１９９２；Ｃｕｒｉｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３８：４２８−４３６，１９９３に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ１６４３０）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ  ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号７（正プライマー）及び配列番号８（逆プライマー）を用いて実施例２で述べたＰＣＲ条件と精製法によって単離した。実施例２で述べたように制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩを用いてプロモーターをクローン化し、ｐＭＯＮ２６１５２（表１）にライゲートして、配列確認し、生じた構築物をｐＭＯＮ２６１７７（表１）と称した。
【０１４４】
実施例６
上述した植物形質転換構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに交配した。綿の形質転換を、基本的に、その全体が参照してここに組み込まれるＷＯ／００３６９１１号に述べられているように実施した。シロイヌナズナの形質転換を、Ｙｅら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９：２４９−２５７，１９９９に述べられているように実施した。トマトの形質転換を、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，５６５，３４７号に述べられているように実施した。
【０１４５】
実施例７
ＤＮＡ構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換法のような適切な送達システムを通して対象とする標的作物に形質転換した（例えば、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，５６９，８３４号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，４１６，０１１号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，６３１，１５２号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，１５９，１３５号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，００４，８６３号、及びその全体が参照してここに組み込まれる米国特許仮出願第６０／１１１７９５号参照）。代替的には、パーティクルボンバードメント法が使用できる（例えば、すべてその全体が参照してここに組み込まれる、特許願第ＷＯ９２／１５７６５号、ＷＯ９７／４８８１４号及び欧州特許願第５８６，３５５号、米国特許第５，１２０，６５７号、５，５０３，３９８号、５，８３０，７２８号及び５，０１５，５８０号参照）。
【０１４６】
数多くの形質転換及び再生システムと方法が使用可能であり、当業者に周知である。安定に形質転換された植物と子孫を、生育室又は圃場環境で実施される商業的に有効な濃度のグリホセート製剤による散布試験を含むがこれに限定されない、当業者に既知の多くの分子、免疫診断、生化学及び／又は圃場評価法によって、対象組織における遺伝子の発現に関して分析する。
【０１４７】
実施例８
ＧＵＳアッセイを、当業者に既知の常套的な方法によって実施する（例えばＪｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３９０１，１９８７参照）。綿については、Ｒ０植物を試験した。生育の様々な段階で組織をサイズ選別し、標本を分析用に保存した。めんの花蕾を採集し、雄性生殖組織標本（葯及び花糸）、雌性生殖組織標本（柱頭全体、花柱及び子房）、及び花冠（がく片及び花弁）を採取した。サイズ選別のために、各段階から小（０．５ｃｍ未満）、中（０．５から０．７ｃｍ）及び大（キャンドル段階又は開花）を含めたいくつかのサイズを含む３つの花蕾を選択した。葉の標本は綿植物を温室においてから約１から２週間後に採集し、他の標本は約１から２ヵ月後に採集した。最初の花は採集しなかった（最初の５つの結果位置は無傷のまま残した）。
【０１４８】
シロイヌナズナについては、Ｖ１植物を分析し、同型接合及び異型接合分離個体だけを試験した。構築物につき８から１０の事象を分析した（１事象につき５植物）。シロイヌナズナについてのＧＵＳ結果は８−１０事象の保存標本を表わす。開示した表（表２及び表３）中の数値は指定組織についての平均ＧＵＳ発現を表わす（ｐｍｏｌ／ＭＵ／分／ｍｇ）。
【０１４９】
実施例９
葉組織及び未成熟花蕾と花を含めた生殖組織におけるＧＵＳ発現に関して植物を分析した。結果を表２に示す。試験した構築物は、ｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７０（Ｐ−ＡｔＡｃｔ２＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７１（Ｐ−ＡｔＡｃｔ８＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ１１７５０（ｅ３５Ｓ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７７（Ｐ−ＥＦ１α＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、及びｐＭＯＮ１５７３７（Ｐ−ＦＭＶ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）を含んだ。アクチン及び延長因子プロモーターは、生殖組織を含めた多くの組織において高いレベルのＧＵＳ発現をもたらした。
【０１５０】
【表２】
0005111706.tif 000003
【０１５１】
実施例１０
Ｒ０綿植物を、様々な生育段階にある選択組織においてＧＵＳレポーター遺伝子の発現に関して試験した。花蕾をサイズによって段階付けた（小、中及び大；大＝キャンドル及び開花）。雄ずい群は、雄性生殖組織であった。雌ずい群は、花床全体（柱頭、花柱及び子房）を含む雌性生殖組織であった。花冠標本はがく片と花弁で構成された。組織を調製し、実施例８で述べたようにＧＵＳアッセイを実施した。結果を表３に要約する。試験した構築物は、ｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＥＦ１α＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７０（Ｐ−ＡｔＡｃｔ２＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）、及びｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏｓ）を含んだ。
【０１５２】
ｐＭＯＮ２６１７７については６つの植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。ｐＭＯＮ２６１７０については２０の植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。ｐＭＯＮ４８４０７については８つの植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。結果は、アクチン及び延長因子プロモーターが、特に生殖組織において、作動可能に連結した遺伝子の有効な発現のために使用できることを明らかにしている。
【０１５３】
【表３】
0005111706.tif 000004
【０１５４】
実施例１１
形質転換植物を、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標）グリホセート製剤を使用し、Ｔｒａｃｋ  Ｓｐｒａｙｅｒ装置を用いて温室でも試験した（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標）はＭｏｎｓａｎｔｏ  Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標である）。植物は「２」本葉又はそれ以上の生育期にあり、葉を乾燥した後ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）散布を施用した。使用した製剤は、３ポンド（ｌｂ）／ガロンａ．ｅ．（酸当量）製剤としてのＲｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標）であった。使用した検定は次のとおりであった：
２０ガロン／エーカー散布量について：
ノズル速度：    ９５０１均一流量（ｅｖｅｎｆｌｏｗ）
散布圧：        ４０ｐｓｉ
散布高さ：      天蓋（ｃａｎｏｐｙ）の上部からノズルの先端まで１８インチ
トラック速度：  １．１フィート／秒、１９５０−１．０の読み取りに相当する
製剤：          Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標）（３ポンドａ．ｅ．／ガロン）
散布濃度は所望する試験幅に依存して変化する。例えば、８オンス／エーカーの所望率の場合には、３．１ｍｌ／Ｌの作業液を使用し、６４オンス／エーカーの所望率の場合には２４．８ｍｌ／Ｌの作業幅を使用する。
【０１５５】
評価期間は、作物、植物の生育段階及び所望する耐性レベルに依存して変化する。
【０１５６】
実施例１２
トマトの形質転換に使用した植物発現構築物を表４に列挙する。ａｒｏＡ：ＣＰ４グリホセート耐性遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１個のアクチン又は延長因子プロモーター（イントロンを伴う）を備える構築物を含むトマト植物（Ｔ０）を、トランスジェニックトマト植物にグリホセート耐性を付与する効率に関して、グリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標））製剤による温室グリホセート散布試験においてスクリーニングする。任意に、トマト植物に形質転換した、ａｒｏＡ：ＣＰ４グリホセート耐性遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１個のアクチン又は延長因子プロモーター配列及びａｒｏＡ：ＣＰ４に作動可能に連結されたｅＦＭＶカリモウイルスプロモーターを、グリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標））の散布施用によってスクリーニングする。トマト植物に４８オンス／エーカーを散布し、施用後２週間目に栄養耐性分析のため、施用後６０日目までに生殖耐性分析のために評価した。結果を表４に示し、生殖耐性系統を選択する効率に従ってランク付けている。栄養耐性パーセントは、スクリーニングした中で、商業的候補として製剤中で作物栽培学的形質をさらに検討するのに十分とみなされるグリホセート被害に対する栄養耐性を示した系統のパーセンテージである。パーセント生殖耐性は、さらなる作物栽培学的評価のために十分とみなされる生殖耐性も同時に示した栄養耐性系統のパーセンテージである。すべての構築物が、トランスジェニックトマト植物に栄養耐性及び生殖耐性を与える上で機能的であることが証明された。プロモーターの様々な組合せは、この実験において栄養及び生殖耐性系統をスクリーニングによって選択しうる効率を高めることができる。シロイヌナズナＥＦ１αプロモーターを含む構築物は、栄養耐性系統の高いパーセンテージとより特異的に結びつく。Ｐ−ｅＦＭＶ及びＰ−ＡｔＥＦ１αと組み合わせたＰ−Ａｃｔ２プロモーター（ｐＣＧＮ９１９０）は、この方法によってスクリーニングされる生殖耐性系統のパーセンテージ上昇をもたらした。
【０１５７】
【表４】
0005111706.tif 000005
【０１５８】
トマト種子の収率を、トランスジェニックトマト植物にグリホセート耐性を与える上での、本発明において使用する様々なプロモーター配列及び発現カセットの組合せの効率の測定値として使用する。表５に、グリホセート耐性についてのａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進する本発明のプロモーターを備える構築物を含むトランスジェニックトマト植物に関する３つの圃場実験の結果を示している。実験１は、天然及び誘導体バージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）中にゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ）及び本発明のプロモーター配列を試験するために使用する構築物においても認められる構築物中の付加遺伝エレメントを含む構築物から生産される植物の試験である。５’非翻訳配列及び葉緑体シグナルペプチドのソースのような付加遺伝エレメントも試験する。構築物ｐＭＯＮ２０９９８は、ペチュニアＨｓｐ７０ ５’ＵＴＲに連結されたＰ−ｅＦＭＶ、Ｅ９ ３’終結領域に連結された、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ葉緑体シグナルペプチドに連結されたリーダーを含む。構築物ｐＭＯＮ２０９９９は、プロモーターがＰ−ＦＭＶであるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。構築物ｐＭＯＮ１０１５６は、ＣＴＰがＰｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ葉緑体シグナルペプチド（ＣＴＰ４）からのものであるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。構築物ｐＭＯＮ４５３１２は、リーダー配列が天然ＦＭＶリーダー配列であるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。
【０１５９】
トマト植物を圃場に列条に移植する。植物を圃場でＲｏｕｎｄｕｐ除草剤により４８オンス／エーカーの割合で散布処理する。果実からトマト種子を採集し、計量する。散布していないトマト系統を比較のための対照として使用し、各構築物の効率を対照のパーセンテージで表わす。実験１の結果（表５の欄１）は、ＦＭＶプロモーター及びＰ−ｅＦＭＶが非散布対照の５から１１％の種子産生だけをもたらすことを示している。実験２及び３は、様々な場所で本発明の構築物を試験している（表５の欄２及び３）。実験２は、実験１と同じ場所で試験しており、構築物ｐＣＧＮ８０９９（図７）、ｐＣＧＮ９１５１（図１１）及びｐＣＧＮ９１９０（図５）は非散布対照に比べて２５から４６％の種子を提供し、良好に機能した。より低温の生育期を有する、異なる場所で実施した実験３は、ｐＣＧＮ８０６８（図９）、ｐＣＧＮ８０８８（図８）、ｐＣＧＮ９１５３（図６）及びｐＭＯＮ４５３２５（図２）が、非散布対照に比べて３４−７７％の正常な種子を結実させる十分なグリホセート耐性を付与しうることを明らかにした。
【０１６０】
【表５】
0005111706.tif 000006
【０１６１】
実施例１３
配列番号１から８及び配列番号１３−２１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ａｃｔ１、Ａｃｔ２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃Ｕ４１９９８）、Ａｃｔ３、Ａｃｔ７、Ａｃｔ８（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃ＡＴＵ４２００７）、Ａｃｔ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃ＡＴＵ２７９８１）、Ａｃｔ１２及びＥＦ１α（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃Ｘ１６４３０）に関する公的に入手可能な配列情報から設計したＰＣＲプライマーである。これらの配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法を用いて核酸配列を伸長する（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３，１９８６；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許願第５０，４２４号、欧州特許願第８４，７９６号、欧州特許願第２５８，０１７号、欧州特許願第２３７，３６２号；Ｍｕｌｌｉｓら、欧州特許願第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら、米国特許第４，６８３，１９４号参照）。多くのＰＣＲ増幅法が当業者に既知であり、既知配列に隣接する核酸配列を同定するために使用される。例えば、既知配列のコア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅するために使用される逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）が記述されている。捕獲ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１，１９９１）及び歩行ＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３０５５，１９９１）のような他の方法も使用可能である。また多くの製造業者が、対象とする配列を同定するためにこれらの方法の修正に基づくキットを開発している。プライマー及びアダプター設計における改善、ポリメラーゼ酵素の改善、そして熱循環器の能力を含めた技術的進歩が、対象とする配列を単離するためのより迅速で効率的な方法を容易にした。
【０１６２】
【表６】
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【０１６３】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの幼植物の葉（１ｇ）をＣＴＡＢ緩衝液（Ｓａｇｈａｉ−Ｍａｒｏｏｆら、１９８４、ＰＮＡＳ  ８１：８０１４−８０１８）９ｍｌ中で均質化した。ＣＴＡＢ緩衝液は、１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．８、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＣＴＡＢ（アルキルトリメチルアンモニウムブロミド）及び１４０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含んだ。６５℃で９０分間インキュベートした後、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）４．５ｍｌを加え、試料を１０分間混合した。１５００ｇで１０分間遠心分離して水相を分離し、クロロホルム：イソアミルアルコールで再抽出した。２回目の遠心分離後、水相を、１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ  ５０ｍｌの入った（ＤＮａｓｅ不含）試験管に移し、室温で３０分間インキュベートしてＲＮＡを除去した。イソプロパノール６ｍｌでＤＮＡを沈殿させ、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５  １ｍｌに再懸濁した。ＤＮＡ溶液を等量のフェノールで１回、等量のクロロホルム：イソアミルアルコールで１回抽出した。遠心分離後、１／１０容の酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ５．２）を水層に加え、次いで２．５容のエタノールを加えた。ＤＮＡをフックし（ｈｏｏｋ）、７０％エタノールで洗って、空気乾燥し、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液０．２ｍｌに再懸濁した。
【０１６４】
シロイヌナズナゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）をＰＣＲ反応物５０ｍｌにおいて使用した。表５ａに示すプライマーを備える反応物は、０．２ｍＭ逆及び正プライマー溶液、２００ｎＭ ｄＮＴＰ及びマグネシウムを含むＰＣＲ緩衝液、ならびにＥｘｐａｎｄ（商標） Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からのＤＮＡポリメラーゼ混合物を含んだ。９４℃での最初の２分間の変性後、反応物を９４℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、及び７２℃で１．５分間の３５回のサイクルに供した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。アクチン１ａ、アクチン１ｂ、アクチン７、及びアクチン１２配列を表わすゲル単離ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、脱リン酸化したＳｍａ Ｉ切断ｐＵＣ１９クローニング構築物にライゲートした。コロニーを適切な挿入物の存在に関してスクリーニングし、Ｍ１３で配列決定してアクチンプロモーターの存在を確認した。選択したクローンをｐＭＯＮ５４９４１（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａ）、ｐＭＯＮ５４９４２（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂ）、ｐＭＯＮ５４９４３（Ｐ−ＡｔＡｃｔ７）及びｐＭＯＮ５４９４４（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２）と称した。その後、アクチンプロモーターのＤＮＡ断片を、挿入配列を含むｐＵＣ１９構築物のＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏＩ消化によって遊離し、ＤＮＡ断片をゲル単離して、同じ制限酵素で消化しておいたｐＭＯＮ２６１６５にライゲートした。アクチン３プロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３）についてのＰＣＲ産物をＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＭＯＮ２６１６５に直接クローン化してｐＭＯＮ５４９５１を形成した。ｐＭＯＮ２６１６５はＧＵＳ／ｎｏｓターミネーター遺伝子セグメントを含む。プロモーターセグメントとのライゲーションは、植物細胞でのβ−グルクロニダーゼ酵素の発現により各プロモーターを機能的活性に関して検定することを可能にする。植物細胞、例えばタバコの葉のプロトプラストを単離することができる、若しくは植物細胞を葉、根、子葉、胚軸、胚芽、花又は貯蔵器官のような植物組織又は器官に含めることができる。
【０１６５】
これらのプロモーターによって推進されるＧＵＳの発現レベルを、Ｐ−ｅ３５Ｓプロモーターによって推進されるＧＵＳと比較してダイズ胚軸において検定する（表６）。プラスミドＤＮＡ／金粒子でダイズ胚軸に衝撃を与え、４８時間後にＧＵＳ活性を組織化学的に検定した。このアッセイで試験したすべてのアクチンプロモーターが胚軸組織において機能的活性を示し、異種作物種でのトランスジーン発現のための有用性を明らかにしている。本発明のシロイヌナズナアクチン１ａ（ｐＭＯＮ５４９５２）、アクチン１ｂ（ｐＭＯＮ５４９５３）、アクチン３（ｐＭＯＮ５４９５４）、アクチン７（ｐＭＯＮ５４９５５）及びアクチン１２（ｐＭＯＮ５４９５６）プロモーターによって推進されるａｒｏＡ：ＣＰ４  ＥＰＳＰＳを含む構築物を、作物におけるグリホセート耐性ＥＰＳＰＳの安定な発現のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリー植物形質転換構築物において調製した。これらの構築物をダイズ及び綿細胞に形質転換し、細胞を選択して、グリホセートを含む組織培養基上で植物に再生し、その後ａｒｏＡ：ＣＰ４蛋白質の発現及びグリホセート施用に対する耐性に関して検定する。商業的に許容されるグリホセート耐性を示す植物を、培養に適合させた生殖質にグリホセート耐性形質を転移するために従来の育種法によってさらに生育させる。
【０１６６】
【表７】
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【０１６７】
実施例１４
綿の収率は、スクエアリング（ｓｑｕａｒｉｎｇ）の最初の４から５週間のスクエアセットの数と相関する。さく（ｂｏｌｌ）を成熟させるためのこれらのスクエアの保持及び綿毛の収穫へのそれらの寄与が収率の鍵となる構成要素である。綿において除草剤耐性を与えるためのトランスジーン構築物の効果を調べるときには、さくの保持量が効果の測定値であり、望ましい形質である。本発明のプロモーターを含むトランスジェニック綿植物（表７）を温室環境においてさく保持に関して検定した。プロモーターは、グリホセート耐性表現型についてのａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を指令した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介する方法又はパーティクルガン法によって植物を形質転換した。パーティクルガン構築物は、本発明のプロモーターからのβ−グルクロニダーゼ活性の組織化学的局在のために有用な付加ＧＵＳ含有発現カセットを含んだ。トランスジェニック植物をグリホセート含有培地で再生し、活着培地で植物を発根させた。発根した小植物を鉢の土壌に植え付け、ハードニングオフ期間（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ  ｏｆｆ  ｐｅｒｉｏｄ、徐々に寒気に当てて強くする期間）中生育室に移した。これらの植物系統からの種子を採集し、植え付けた。各系統から１５の植物に、４葉期に４８オンス／エーカーのグリホセートを散布した。各系統から少なくとも８の生存植物に、８葉期に再び４８オンス／エーカーのグリホセートを散布した。成熟時に、最初の５つのさくについて最初の位置のさくの数を計数した。グリホセート散布後に最初の位置のさくの３又はそれ以上が保持されていた系統（植物マップ≧３）はさらなる試験へと進んだ。表７はこの試験から得られたデータを示す。マッピングした系統の数は、１回目のグリホセート散布施用に耐えて生存した系統の数を示す。商業的基準は、ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４遺伝子／Ｅ９  ３’の発現を推進するＰ−ＦＭＶプロモーターを含む１４４５系統（ｐＭＯＮ１７１３６）である。構築物ｐＣＧＮ８０９９、ｐＣＧＮ９１５３、ｐＣＧＮ８０８８、ｐＣＧＮ８０６８は、これらの構築物から試験した系統の１４−３５％が、さらなる作物栽培学試験へと進むのに十分な綿における生殖グリホセート耐性をもたらした。
【０１６８】
【表８】
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【０１６９】
実施例１５
綿の収率は、スクエアリングの最初の４から５週間のスクエアセットの数と相関する。さくを成熟させるためのこれらのスクエアの保持及び綿毛の収穫へのそれらの寄与が収率の鍵となる構成要素である。綿において除草剤耐性を与えるためのトランスジーン構築物の効果を調べるときには、さくの保持量が効果の測定値であり、望ましい形質である。本発明のプロモーターを含むトランスジェニック綿植物を、さく保持に関して２つの場所において圃場条件で検定した。トランスジェニック綿系統５０２−２５４−２（ｐＣＧＮ８０６８）、７０１−１７８−２（ｐＣＧＮ８０６８）、５３−２（ｐＣＧＮ８０８８）、１７８−１（ｐＣＧＮ９１５３）及び６０−１（ｐＣＧＮ９１５３）を、構築物ｐＭＯＮ１７１３６（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含む１４４５（グリホセート耐性系統）及びＰＭ１２１８ＢＲ（Ｐａｙｍａｓｔｅｒ１２１８交配母本）と比較し、野生型非トランスジェニック系統、Ｃｏｋｅｒ１３０を含めた。圃場デザインは、２うね×２０から３０フィート×３反復試験区から成る任意配列完全ブロック法である。グリホセートは、綿植物生育の８葉期に、１．１２ポンドａｉ／Ａ＝４８オンス製品及び１．５ポンドａｉ／Ａ＝６４オンス製品の割合のＲｏｕｎｄｕｐ  Ｕｌｔｒａ（商標）製剤として施用する。綿試験区はすべて、雑草及び害虫防除に関して、ならびに植付け時期、受精、灌漑、ＰＧＲ使用及び摘葉のような作物栽培学的投入要素に関して積極的に管理する。マッピングする各試験区の中央の２つのうねのまん中から１０の植物（各うねから５ずつ）を無作為に選んで、保持されているさくの各々の位置をマッピングしてさく保持パーセントを決定する。最初のマッピングは最初の開花後４週間目（中間シーズンマップ）に実施し、２回目のマッピングは収穫時に実施すべきである。収集したデータは、トランスジェニック綿系統のグリホセートに対する生殖耐性の指標として計数する，下部の５つの開花節（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｎｏｄｅ）上の最初の位置のさくの数を含む。表８は、本発明のプロモーターがさく保持に関してトランスジェニック綿植物に付与した利益を示す。この増強された生殖耐性は、綿毛収率の上昇（図９）及び種子収率の上昇（図１０）ももたらした。
【０１７０】
【表９】
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【０１７１】
【表１０】
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【０１７２】
【表１１】
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【０１７３】
実施例１６
ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進するハイブリッドプロモーターＰ−ＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α（図１３、ｐＭＯＮ５２０５９）及びＰ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’（ｐＭＯＮ１５７３７）の効果をトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて比較した。トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物を真空浸透によって生成し（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｐａｒｉｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１６：１１９４−１１９９）、種子を、植物の正常な成長と発育を可能にする２４℃、１６時間光（１２０μＥｍ−２ｓ−１）サイクルに調整した生育室のトレー上で鉢の土壌に植え付けた。ｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１事象グリホセート耐性トランスジェニックシロイヌナズナ植物を２４オンス／エーカーの割合のグリホセート除草剤散布施用によって選択し、生存植物を個々の鉢に移植した。８つのｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１植物と８つのｐＭＯＮ１５７３７同型接合植物に、抽台所見に対応して、約１６日後に２４オンス／エーカーの割合で２回目の散布を行った。２回目の散布は、生殖耐性を与える２つの構築物の効果を測定するものである。グリホセート施用の栄養作用に関して植物を観察した。すべての植物が完全な栄養耐性を有しており、異常な花は認められなかった。しかし、長角果の発育停止の発生は、発育停止した長角果においては種子が定植していなかったことを示唆した。各々の植物が産生した長角果と種子を含む長角果（稔性長角果）の総数を計数し、表にまとめた。結果を表９に示すが、ハイブリッドプロモーターｐＭＯＮ５２０５９は稔性長角果の１０倍以上の改善を明らかにし、ｐＭＯＮ１５７３７の８％に対して８９％であったことが認められる。稔性結果構造の数は生産されうる種子の量に関係し、これは収率が種子数に関連する作物において特に重要である。綿、ダイズ、キャノーラ、コムギ及びトウモロコシなどの作物は、グリホセートに対する生殖耐性が良好な収率にとって不可欠である作物である。
【０１７４】
【表１２】
0005111706.tif 000013
【０１７５】
実施例１７
ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｕｕｓ Ｌ．）は油及び食品として作物栽培学的に重要な作物である。本発明の構築物ｐＭＯＮ４５３２５（図２）、ｐＭＯＮ４５３３２（図４）及びｐＭＯＮ４５３３１（図３）をヒマワリに形質転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介したヒマワリの形質転換が報告されている（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９：５５−６０，１９９０；ＥＰ ０ ４８６ ２３４号）。トランスジーン発現構築物による植物形質転換の当業者に既知の方法は、胚軸、頂端分裂組織、原形質、及び他のヒマワリ組織を含みうる。トランスジェニックヒマワリ系統ＳＦＢ２５０−２７は、ｐＭＯＮ２０９９９（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）発現カセット；ＳＦＢ２８８−０１を含み、ＳＦＢ２９５−０９はｐＭＯＮ４５３２５（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’：：Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含み；ＳＦＢ２８９−０１はｐＭＯＮ４５３３２（Ｐ−ＡｔＥＦ１α＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’：：Ｐ−ｅＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含み；ＳＦＢ３０３−０８、ＳＦＢ３０３−０９、ＳＦＢ３０３−１１及びＨＡ３００Ｂは、ｐＭＯＮ４５３３１（Ｐ−ＡｔＥＦ１α＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９）を含む。これらの系統をグリホセート耐性に関して試験し、図１２に示している。
【０１７６】
ヒマワリにおけるグリホセートへの生殖耐性は、正常穂のパーセント、パーセント正常穂サイズ及び花粉産生の関数として測定できる。これらの植物にＶ−４及びＶ−８葉期に０．３２オンス／エーカー又は６４オンス／エーカーの割合でグリホセートを散布する。ヒマワリ植物をグリホセートに対する栄養耐性に関して評価する。栄養耐性は、植物生育のＶ４及びＶ８の両方の段階で３２及び６４オンス／エーカーレベルのグリホセート産婦に達する。
【０１７７】
栄養グリホセート耐性トランスジェニックヒマワリ系統を、穂の数、パーセント正常穂、パーセント正常穂サイズ、及びパーセント正常放出花粉に関してスコアリングする。これらの形質を１つの場所での圃場試験において採点する。穂のスコアと花粉産生をまとめたものを表１２に示す。本発明の構築物から選択された系統はより高いパーセントの正常穂、概してより高いパーセントの正常穂サイズ及びより良好な放出花粉を示す。
【０１７８】
【表１３】
0005111706.tif 000014
【０１７９】
実施例１８
適切なプロモーター調節に必要なシス作用性調節エレメントは多くの手段によって同定することができる。１つの方法では、プロモーターの領域を取り除く欠失分析を実施し、断片をプロモーター活性に関して検定する。トランケートされたプロモーターの活性が元のプロモーター断片に比べて変化している場合には、ＤＮＡ断片はプロモーター領域にとって必要とみなされる。この欠失分析を通して、転写の正又は負の調節に必要なＤＮＡの小さな領域を同定することができる。プロモーター配列モチーフも同定でき、作動可能に連結された転写可能配列の発現を調節するためこれらのシスエレメントを含むように新規プロモーターを設計することができる。例えば、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，２２３，４１９号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第４，９９０，６０７号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，０９７，０２５号参照。
【０１８０】
代替的なアプローチは、同様の発現プロフィールを持つプロモーター間で類似配列を捜すことである。活性の重複パターンを備えるプロモーターは共通調節機序を有しうる。ＭＥＭＥ、ＳＩＧＮＡＬ  ＳＣＡＮ又はＧＥＮＥ  ＳＣＡＮを含むがこれらに限定されないいくつかのコンピュータプログラムが、プロモーター間で保存された配列モチーフを同定するために使用できる。これらのモチーフは、プロモーターを調節するように働く転写因子の結合部位でありうる。ひとたび配列モチーフが同定されれば、それらの機能を検定することができる。例えば、モチーフが正しいプロモーター機能にとって必要であるかどうかを調べるためにモチーフ配列をプロモーターから欠失させることができる。代替的に、モチーフを最小プロモーターに付加して、それが転写を活性化するのに十分であるかどうかを調べることもできる。疑わしい負の調節エレメントを、活性プロモーターに付加してプロモーター活性の低下を調べることにより、その能力を試験することができる。一部のシス作用性調節エレメントは機能するための他のエレメントを必要とすると考えられる。それ故、当業者に既知の数多くの方法によって多数のエレメントを様々な組合せで試験することができる。
【０１８１】
ひとたび機能的プロモーターエレメントが同定されれば、蛋白質結合に影響を及ぼすようにヌクレオチドレベルで修飾することができる。修飾は、そのプロモーターからの転写レベルに影響を及ぼすより高い又はより低い親和性結合を生じさせることができる。
【０１８２】
プロモーターエレメントは付加的に又は共力作用的にプロモーター活性に影響を及ぼすように働きうる。これに関して、異なる５’調節領域からのプロモーターエレメントを縦列に配置して、異なる活性スペクトル又は異なる発現プロフィールを持つプロモーターを得ることができる。従って、異種ソースからのプロモーターエレメントの組合せあるいは同様のエレメント又は同じエレメント重複は、作動可能に連結された転写可能配列のより高いレベルの発現をもたらすことができる。例えば、プロモーターエレメントを多量体化して、そのプロモーターエレメントによって影響されるパターンでの発現レベルを特異的に高めることができる。
【０１８３】
新規設計された５’調節エレメントを備える発現構築物を構築するために必要な技術的方法は当業者に既知である。設計されたプロモーターを発現構築物において試験し、新規プロモーターをＧＵＳのような適当なレポーター遺伝子に作動可能に連結して、一過性植物アッセイにおいて検定することにより、一過性に試験する。新規プロモーターを対象とする１個又はそれ以上の遺伝子に作動可能に連結し、１個又はそれ以上の付加調節エレメントと共に植物形質転換構築物に組み込んで、適当なＤＮＡ送達システムにより対象とする標的植物に形質転換する。安定形質転換された植物とその後の子孫を、所望する特性を評価するために適当な数多くの分子、免疫診断、生化学、表現型、又は圃場方法によって評価する。
【０１８４】
本発明の原理を例示し、説明したが、そのような原理から逸脱することなく本発明をそのアレンジと詳細において変更しうることは当業者には明白であろう。我々は、付属の特許請求の範囲の精神と範囲内にあるすべての変更を特許請求する。
【０１８５】
この明細書の中で引用したすべての公表文献及び公開特許資料は、個々の公表文献又は特許願が参照して組み込まれることを個別に示唆されているのと同じように、参照してここに組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｐＣＧＮ８０８６のプラスミドマップである。
【図２】  ｐＭＯＮ４５３２５のプラスミドマップである。
【図３】  ｐＭＯＮ４５３３１のプラスミドマップである。
【図４】  ｐＭＯＮ４５３３２のプラスミドマップである。
【図５】  ｐＣＧＮ９１９０のプラスミドマップである。
【図６】  ｐＣＧＮ９１５３のプラスミドマップである。
【図７】  ｐＣＧＮ８０９９のプラスミドマップである。
【図８】  ｐＣＧＮ８０８８のプラスミドマップである。
【図９】  ｐＣＧＮ８０６８のプラスミドマップである。
【図１０】  ｐＣＧＮ８０９６のプラスミドマップである。
【図１１】  ｐＣＧＮ９１５１のプラスミドマップである。
【図１２】  ｐＭＯＮ１０１５６のプラスミドマップである。
【図１３】  ｐＭＯＮ５２０５９のプラスミドマップである。
【図１４】  ｐＭＯＮ５４９５２のプラスミドマップである。
【図１５】  ｐＭＯＮ５４９５３のプラスミドマップである。
【図１６】  ｐＭＯＮ５４９５４のプラスミドマップである。
【図１７】  ｐＭＯＮ５４９５５のプラスミドマップである。
【図１８】  ｐＭＯＮ５４９５６のプラスミドマップである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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