(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共役リノール酸１５〜５０重量％、レシチン０．０１〜５重量％、溶解補助剤としてエタノール０．０１〜５重量％、補助乳化剤１〜１５重量％、グリセリン１５〜３５重量％及び残量の水を含有してなる、ナノエマルジョン組成物。
【請求項２】
粘度が１〜１００センチポアズ（ｃＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該補助乳化剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、アニオン性アミノ酸系乳化剤、糖エステル、コレステロール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム及びグリセリンエステルよりなる群から選択される一つ又はそれ以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
当該アニオン性アミノ酸系乳化剤が、ＴＥＡ−ココイルグルタミン酸塩、グルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸マグネシウム及びラウロイルグルタミン酸ナトリウムよりなる群から選択される一つ又はそれ以上である、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共役リノール酸を含有する水性ナノエマルジョン組成物に関する。さらに詳しくは、共役リノール酸５〜５０重量％、レシチン０．０１〜５重量％、溶解補助剤としてエタノール０．０１〜５重量％、補助乳化剤１〜１５重量％、グリセリン１０〜４０重量％及び残量の水を含む水性ナノエマルジョン組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脂質は様々に分類されており、その中で最も重要なものが脂肪酸である。脂肪酸は、二重結合の存在によって、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とに分けられる。 バター又は牛脂などの動物性脂肪は、主に飽和脂肪酸からなり、室温で固体状態で存在していることが特徴である。植物性の脂肪及び魚油は、主に不飽和脂肪酸からなっている。脂肪酸は炭素原子が長鎖として連結している構造を有している。不飽和脂肪酸の命名法では、脂肪酸のカルボキシル末端から最初に二重結合が現れる炭素原子を数える場合には「デルタ（Δ）」、メチル末端から最初に二重結合が現れる炭素原子を数える場合には、「オメガ（ω）」として命名される。オメガの命名法で、「ｎ−」として命名されることもある。例えば、オメガ−３脂肪酸は、１番目の二重結合がメチル基（ＣＨ３−）から３番目の炭素−炭素結合上にある、脂肪酸を示す。同様に、オメガ−６脂肪酸は、１番目の二重結合がメチル基から６番目の炭素−炭素結合上にある、脂肪酸を示す。脂質源として通常用いられる食品におけるｎ−３及びｎ−６の脂肪酸の含量に関しては、大部分の植物性食品が動物性食品よりもｎ−３又はｎ−６を豊富に含む。食用の油脂の中で、ｎ−６脂肪酸が豊富なものの例は、トウモロコシ油、綿実油などであり、ｎ−３脂肪酸が豊富なものの例は、亜麻仁油とサケ油などの魚類油であり、ｎ−６とｎ−３脂肪酸をバランスよく豊富に有するものの例は大豆油とクルミ油である。ｎ−６脂肪酸及びｎ−３脂肪酸の中で、リノール酸（ＬＡ）、α−リノレン酸（ＬＮＡ）及びアラキドン酸（ＡＡ）は人間が本質的に摂取しなければならない必須脂肪酸（ＥＦＡ）に分類されており、そのためそれらは栄養学的に重要である。特に、ＬＡとＬＮＡは、消化後の生合成過程を通して、４〜６個の炭素-炭素二重結合を伴う２０〜２２個の炭素原子鎖を有する脂肪酸に延長（elongated）、又は脱飽和（desaturated）される。そのような脂肪酸の代表例が、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）である。ω−３脂肪酸の例は、アルファ（α）リノレン酸、ＤＨＡ、ＥＰＡなどである。このようなオメガ−３脂肪酸は、細胞の生成及び再生に必須であり、血圧、血液凝固、コレステロール値の低下など心血管系の健康と関係がある。またこれらは、関節炎、リウマチ、脳及び神経機能の発達及び調節、皮膚及び髪の健康、及び眼の健康も助ける。ω−６脂肪酸の例は、アルファリノール酸、アラキドン酸、ガンマ−リノレン酸などである。ω−６脂肪酸の機能は、動脈硬化、心臓病、月経前症候群（ＰＭＳ）、高コレステロール血症及び高血圧を防止し、痛みと炎症を緩和し、エストロゲン、テストステロンなどの性ホルモンの分泌を向上させることである。ω−６脂肪酸は、肝硬変にも助けとなり、加齢予防、皮膚健康の維持、肥満と糖尿病の合併症予防、及びリウマチ性関節炎の緩和に効能がある。ω−９脂肪酸の例はオレイン酸である。
【０００３】
食品から摂取されたか又は人体内で合成された場合の、脂質の幾つかの重要な機能は、以下の通りである。第１に、細胞膜の主要構成成分（リン脂質、糖脂質及びステロイド）、第２に、貯蔵型高エネルギー源、第３に、皮下組織又は主要臓器の保護膜及び絶縁物質、第４に、有髄神経における興奮伝導の促進（非極性脂質）、第５に、各種生物学的活性物質（脂溶性ビタミン類、必須脂肪酸類、ステロイドホルモン類、胆汁酸、プロスタグランジン、ロイコトリエン等）への変換。上記の様に、脂質は人体において非常に重要で、多様な役割を果たす。特に、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、リン脂質の構成成分であるだけでなく、体内代謝を介して、プロスタグランジン類（ＰＧ）、ロイコトリエン類（ＬＴ）及び重要なトロンボキサン類（ＴＸ）に変換され、次いで各種生理現象の維持及び調節において重要な役割を果たす。
【０００４】
共役リノール酸（ＣＬＡ）は、リノール酸の化学構造の修飾によって形成された、脂肪酸の一種である。ＣＬＡは、その名前から分かるように、共役二重結合を有している。ＣＬＡは様々な生理活性を有している。今までに、抗癌活性、抗酸化活性、抗動脈硬化活性、抗菌活性、更に多様な成人病における予防及び治療の効果を有していることが知られている。また、ＣＬＡは、体内の脂肪細胞に直接作用して、それらが脂肪を吸収することを防いで、脂肪細胞の分解と代謝率を高めることにより、脂肪細胞のアポトーシスを増加させて脂肪細胞を減らすことにより、そして脂肪の筋肉強化のためのエネルギーとしての使用を促進させることにより、体脂肪、特に腹部脂肪を減少させるのに役立つことが知られている。その結果、ＣＬＡは、痩身用物質として広く注目を浴びている。
【０００５】
社会が高度化及び発展するにつれて、スリムな体形への欲求が生活水準の向上に比例して増加している。そのような欲求に応えるために、痩身用物質、特に天然産物に由来するものを開発しようとする試みが行われている。しかし、食品、飲料、化粧品や製薬などの分野で使用する機能性物質の多くは天然産物に由来しているので、大部分の機能性物質は、光、熱、酸素などの外的な環境要因に対して不安定であり、そして水、従来の有機溶媒及び油に溶けない。そのため、それらの優れた効能／効果にもかかわらず、機能性物質の使用に限定がある。このような物質の例は数え切れない程多い。現在では、界面活性剤や乳化剤を使用して、溶液中でエマルジョン化やカプセル化する方法で安定化させた後の機能性物質を使用している。しかし、このような方法は、ミセルが凝集するために、又は機能性物質が溶液中で拡散して自己分解するので、物理的及び化学的に機能性物質を充分に安定化させることができない。このような問題点を克服するために、各分野において多くの研究が行われているが、明確な解決策は未だ得られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、共役リノール酸を有効成分として含有し、優れた貯蔵安定性、ｐＨ安定性及び透明性を有する共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、共役リノール酸５〜５０重量％、レシチン０．０１〜５重量％、溶解補助剤としてエタノール０．０１〜５重量％、補助乳化剤１〜１５重量％、グリセリン１０〜４０重量％及び残量の水を含む共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、エタノールを含むナノエマルジョンの透明度をエタノールを含まないナノエマルジョンのそれと比較した写真である。
【図２】図２は、エタノールを含むナノエマルジョンとエタノールを含まないナノエマルジョンの走査型電子顕微鏡写真である（１５，０００倍拡大）。
【図３】図３は、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存を測定した結果を示すグラフである（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat（オルリスタット）：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸）。
【図４】図４は、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した細胞の写真である（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat（オルリスタット）：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸）。
【図５】図５は、中性脂質含量を示すグラフである（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat（オルリスタット）：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸）。
【図６】図６は、脂質生成の抑制効果を測定した結果を示すグラフである（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸；*ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は、脂肪分解によるグリセロールの含量を測定した結果を示すグラフである（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸；*  ｐ＜０．０５）。
【図８】図８は、脂肪細胞から分泌されたレプチンの量を測定した結果を示すグラフである（対照：ＤＭＳＯ、Orlistat：陽性対照、ＣＬＡ：共役リノール酸、Ｎ−ＣＬＡ：ナノエマルジョン共役リノール酸；*ｐ＜０．０５）。
【図９】図９は、５週の実験期間中の体重変化の結果を示すグラフである（ＮＤ：正常食、ＨＦＤ；高脂肪食（ＨＦ食）、ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％ＣＬＡ、Ｎ−ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％Ｎ−ＣＬＡ）。
【図１０】図１０は、精巣上体白色脂肪組織と腎周囲白色脂肪組織の単位体重当たりの重さを測定した結果を示すグラフである（ＮＤ：正常食、ＨＦＤ；高脂肪食（ＨＦ食）、ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％ＣＬＡ、Ｎ−ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％Ｎ−ＣＬＡ；ＷＡＴ：白色脂肪組織；Ｂ．Ｗ．：体重）。
【図１１】図１１は、血清コレステロール及び中性脂肪の含量を測定した結果を示すグラフである（ＮＤ：正常食、ＨＦＤ；高脂肪食（ＨＦ食）、ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％ＣＬＡ、Ｎ−ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％Ｎ−ＣＬＡ；ＴＧ：トリグリセリド、ＴＣ：総コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ：高密度脂質コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ：低密度脂質コレステロール）。
【図１２】図１２は、肝組織１ｇ当たりのコレステロール及び中性脂肪の含量を測定した結果を示すグラフである（ＮＤ：正常食、ＨＦＤ；高脂肪食（ＨＦ食）、ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％ＣＬＡ、Ｎ−ＣＬＡ：ＨＦ食＋２％Ｎ−ＣＬＡ）。
【図１３】図１３は、Ｎ−ＣＬＡのインビボ研究のプロトコルである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明の水性ナノエマルジョン組成物は有効成分として共役リノール酸を含む。共役リノール酸の種類には限定がなく、何れの市販共役リノール酸を用いてもよい。このような共役リノール酸は、例えば、Ｔｏｎａｌｉｎ（登録商標）ＣＬＡ（Cognis, Germany）、Ｃｌａｒｉｎｏｌ（登録商標）ＣＬＡ（Lipid Nutrition B.V., Netherlands）、ＣＬＡ（HK Biotech, Korea）などを含む。本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、５〜５０重量％、好ましくは１０〜４５重量％、そしてさらに好ましくは１５〜４０重量％の共役リノール酸を含んでいる。本発明では、共役リノール酸の量が５重量％未満のとき、共役リノール酸の生理活性効果が劣り、共役リノール酸の量が５０重量％を超えると、共役リノール酸がよく溶解しないか、又は長時間空気に露出すると、析出する恐れがある。
【００１０】
本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、乳化剤としてレシチンを含む。本発明では、レシチンは様々なリン脂質の混合物を示し、リン脂質の組成はその起源によって多様であっても良い。本発明では、レシチンは卵黄、大豆油、ヒマワリ（種子）油などの様々な起源から得ることができ、その起源の種類による限定はない。本発明の水性ナノエマルジョン組成物を飲料又は機能性食品として経口投与する場合は、両親媒性乳化剤であるレシチンを用いることによって、共役リノール酸を迅速に浸透させることができる。本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜４重量％の量でレシチンを含む。本発明では、レシチンの量が０．０１重量％未満のとき、レシチンが提供する乳化効果が弱くなり、乳化安定性が低下する恐れがあり、レシチンの量が５重量％を超えると、組成物の粘度が高くなりすぎる恐れがある。
【００１１】
本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、共役リノール酸の溶解を助けるために、溶解助剤としてエタノールを含む。本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、０．０１〜５重量％、好ましくは０．１〜４重量％の量でエタノールを含む。本発明では、エタノールの量が０．０１重量％未満のとき、共役リノール酸の溶解を助ける効果が弱くなる恐れがあり、エタノールの量が５重量％を超えると、乳化安定性が低下する恐れがある。
【００１２】
本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、共役リノール酸をより安定に乳化させるために、補助乳化剤を含む。本発明では、補助乳化剤の例は、好ましくは、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、商品名：Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、商品名：Ｔｗｅｅｎ８０）、アニオン性アミノ酸系乳化剤、糖エステル、コレステロール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアロイル乳酸ナトリウム及びグリセリンエステルを含む。本発明では、当該アニオン性アミノ酸系乳化剤の例は、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）−ココイルグルタミン酸塩、グルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、ココイルグルタミン酸マグネシウム及びラウロイルグルタミン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、１〜１５重量％、好ましくは３〜１３重量％、そしてより好ましくは５〜１２重量％の量で補助乳化剤を含む。本発明では、補助乳化剤の量が１重量％未満のとき、乳化安定性が低下する恐れがあり、エタノールの量が１５重量％を超えると組成物の粘度が高くなりすぎる恐れがある。
【００１３】
本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、共役リノール酸の析出を防止し、相対的に少ない量の乳化剤で共役リノール酸を溶解するためにグリセリンを含む。本発明の水性ナノエマルジョン組成物は、１０〜４０重量％、好ましくは１２〜３８重量％、そしてより好ましくは１５〜３５重量％の量でグリセリンを含む。本発明では、グリセリンの量が１０重量％未満のとき、本発明の水性ナノエマルジョン組成物の貯蔵安定性が低下する恐れがあり、エタノールの量が４０重量％を超えると、本発明の組成物を飲料又は食品に使用すると、食感、質感又は風味が低下する恐れがある。
【００１４】
本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、好ましくは１〜１００ｃＰ（センチポアズ）の粘度を有する。本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、室温（２５℃）で、更に高温（４５℃）で長期間保管しても、析出や層分離が生じないように、優れた貯蔵安定性を有している。また、本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、広い範囲のｐＨで安定であるため、様々な剤形で利用可能である。本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、所望の目的に応じて、飲料、食品、化粧品、機能性食品又は医薬品に適用することができる。このような適用のために、本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、粘増剤、甘味剤、賦形剤、香料などの様々な添加剤をさらに含んでいても良い。
【００１５】
本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物は、優れた貯蔵安定性、ｐＨ安定性、及び透明性を有していて、効率的に共役リノール酸を浸透させることができる。
【実施例】
【００１６】
以下に、本発明を以下の実施例をもって詳細に説明する。しかし、本発明の保護の範囲が実施例に限定されないことを理解されたい。
【００１７】
実施例１
下記表１の組成で下記方法によって、水性ナノエマルジョン組成物を製造した。共役リノール酸とレシチンを糖エステルとエタノールに溶解した。次いで、水及びグリセリンを加え、十分に撹拌した。得られた混合物を高圧マイクロフルイダイザー（Microfluidizer)に１，０００ｂａｒで連続５回通過させた後、混合物を減菌ろ過して、ナノエマルジョン組成物を得た。この組成物を小分けし、包装した。
【００１８】
【表１】
0005259832.tif 000002
【００１９】
実施例２
下記表２の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００２０】
【表２】
0005259832.tif 000003
【００２１】
実施例３
下記表３の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００２２】
【表３】
0005259832.tif 000004
【００２３】
実施例４
下記表４の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００２４】
【表４】
0005259832.tif 000005
【００２５】
実施例５
下記表５の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００２６】
【表５】
0005259832.tif 000006
【００２７】
実施例６
下記表６の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００２８】
【表６】
0005259832.tif 000007
【００２９】
実施例７
下記表７の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００３０】
【表７】
0005259832.tif 000008
【００３１】
実施例８
下記表８の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００３２】
【表８】
0005259832.tif 000009
【００３３】
実施例９
下記表９の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００３４】
【表９】
0005259832.tif 000010
【００３５】
実施例１０
下記表１０の構成組成を用いたことを除いては、上記実施例１と同様の方法で水性ナノエマルジョン組成物を製造した。
【００３６】
【表１０】
0005259832.tif 000011
【００３７】
実験例１
実施例１〜１０で調製された組成物の外観を層分離及び析出に関して肉眼で観察した。２５℃及び４５℃の恒温槽に保管した後に共役リノール酸の含量変化によって安定性を測定した。
【００３８】
共役リノール酸の含量測定
試料２０〜２５ｍｇを２ｍＬの０．５Ｎ ＮａＯＨメタノール溶液に加えて振盪し、次いで８０℃の熱浴で１０分間加熱した後、冷水で冷却した。そこに、２ｍＬのＢＨ３を加え、次いで８０℃の熱浴中で８〜１０分間加熱した後、冷水で冷却した。そこに、３ｍＬの内部標準溶液（５００ｍｇのウンデカン酸を１００ｍＬのｎ−ヘキサンに溶解した溶液）を加え、次いで８０℃の熱浴中で３分間加熱した後、冷水で冷却した。そこに５ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液を加え、層分離した後、上層を取り、そこに０．５ｇの無水硫酸ナトリウムを加えて水分を除去した。調製した試験液１μＬをガスクロマトグラフィー（カラム：ＤＢ−Ｗａｘ、インジェクター温度：２７０℃、検出器温度：２９０℃、カラム温度：１９０℃〜２４０℃、温度を１分当り２℃ずつ上げた）で分析した。
１）層分離、析出及び安定性
【００３９】
【表１１】
0005259832.tif 000012
【００４０】
２）室温（２５℃）と高温（４５℃）での色変化を２年間観察した。色変化は観察されなかった。
【００４１】
３）ｐＨ安定性
室温（２５℃）におけるｐＨ２、５、７及び１０でのｐＨ安定性を層分離及び析出に関して肉眼で観察した。その結果を下記表１２に示している。
【００４２】
【表１２】
0005259832.tif 000013
【００４３】
上記結果から、本発明に係る水性ナノエマルジョン組成物が、優れた貯蔵安定性、変色のない透明性及び広範囲のｐＨでの安定性を有していることが判る。
【００４４】
実験例２
エタノールを溶解補助剤として含むナノエマルジョンとエタノールを含まないナノエマルジョンを比較するために、下記表１３に示されるようなナノエマルジョン組成物を調製した。その粒子径、透明度、粘度及び４５℃での貯蔵安定性を測定し、その結果を下記表１４に示している。その粒子分布はＰｈｏｔａｌ ＥＬＳ−Ｚを用いて測定した。さらに、エタノールを含むナノエマルジョンとエタノールを含まないナノエマルジョンを走査型電子顕微鏡（JEOL, Japan）で撮影し、その結果を図２に示している。
【００４５】
【表１３】
0005259832.tif 000014
【００４６】
【表１４】
0005259832.tif 000015
【００４７】
上記表１４から明らかなように、エタノールを溶解補助剤として加えた場合は、平均粒子径３０．９ｎｍを有するエマルジョンが形成されたのに対して、エタノールを加えなかった場合は、エマルジョンの平均粒子径は２２０．８ｎｍであった。従って、エタノールを加えると、安定なナノエマルジョンが得られることが判る。また、透明度に関しては、エタノールを加えた場合には、非常に透明な組成物が得られたのに対して、エタノールを加えなかった場合には、不透明な組成物が得られた。粘度に関しては、エタノールを含む組成物の粘度が５０ｃＰであったのに対して、エタノールを含まない組成物の粘度が１，０００ｃＰであるという相当な差を示した。保管安定性に関しては、エタノールを加えた場合には、４５℃で１ケ月間保管後に層分離が観察されなかったのに対して、エタノールを加えなかった場合には、層分離が生じた。従って、エタノールを含む組成物は貯蔵安定性の面でも優れていることが判る。さらに、走査型電子顕微鏡写真の比較では、エタノールを加えた場合には、均一なナノエマルジョンが形成されたのに対して、エタノールを加えなかった場合には、大きなエマルジョン粒子が互いに凝固していた。
【００４８】
実験例３
本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン組成物の抗−肥満効果を調べるために、インビトロ及びインビボ実験を行った。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、対照）、オルリスタット（Orlistat、抗−肥満薬、陽性対照）、ＣＬＡ及び本発明の共役リノール酸含有水性ナノエマルジョン（以下、「Ｎ−ＣＬＡ」という）を試料として用いた。Ｎ−ＣＬＡは実施例１に記載の方法によって製造した。
【００４９】
実験例３−１：インビトロ実験
（１）細胞培養及び試料処理
３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞の７０〜８０％がコンフルエントになったとき、分化誘導物質であるデキサメタゾン、ピオグリタゾン（pioglitazone）、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）インスリン及びＦＢＳを含有するＤＭＥＭで細胞を前分化させた後、インスリン、ピオグリタゾン、ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで分化させた。分化後、１０％ＦＢＳとインスリンを含有する成長培地で脂質を成熟させた。試料をＤＭＳＯに溶かしたて、最終濃度１０μｇ／ｍＬで処理した。
【００５０】
（２）細胞生存率（ＭＴＴアッセイ）
９６ウェルプレートの各ウェルに１×１０４個の前駆脂肪細胞を分注して、各サンプルを処理した。次いで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで細胞を２４時間培養した。２４時間経過後、ＭＴＴ（リン酸緩衝生理食塩水中、最終濃度：０．４μｇ／ｍＬ）を処理し、次いで細胞を４時間培養した。形成されたホルマザン（Formazan）結晶をＤＭＳＯ：エタノール（１：１）で溶解し、マイクロプレートリーダ（SUNRISE, TECAN, Austria）により５４０ｎｍで吸光度を測定した。細胞生存率は、対照群の吸光度値に対する試料処理群の吸光度値の割合で決定し、その結果を図３に示している。図３から明らかなように、オルリスタット群、ＣＬＡ群及びＮ−ＣＬＡ群の細胞生存率は、それぞれ１０３％、１００％、１０３％である。従って、対照群のそれと、統計的に有意な差はない。
【００５１】
（３）脂肪分解効果
６ウェルプレートの各ウェルに１×１０５個の細胞を分注し、分化させた。 分化後８日目に培地を除去し、氷冷したＰＢＳで２回洗浄した。細胞を室温で１時間、１０％ホルマリンで固定し、０．２％Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ(イソプロパノール中）で３０分間染色後、蒸留水で洗浄した。そこに、イソプロパノールを加えて、油滴を溶かした後、４９０ｎｍでの吸光度として中性脂肪の含量を測定した。その結果を図４及び５に示している。オルリスタット群、ＣＬＡ及群びＮ−ＣＬＡ群は、対照群に比べて、中性脂肪が減少する傾向を示した。
【００５２】
（４）脂質生成の抑制効果
６ウェルプレートの各ウェルに１×１０５個の細胞を分注した。細胞の７０％がコンフルエントになったとき、細胞をＭＤＩ培地（分化培地）と各試料で同時に処理した後、４８時間培養した。分化後８日目に、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で中性脂肪の含量を測定した。その結果を図６に示している。図６から明らかなように、ＣＬＡ群は対照群と類似な中性脂肪含量を示したのに対して、オルリスタット群及びＮ−ＣＬＡ群では、対照群に比べて中性脂肪の含量がそれぞれ１２．５％及び１６．３％と統計的有意に減少した。
【００５３】
（５）グリセロールの定量
グリセロールを遊離グリセリン試薬（Sigma, USA）を用いる酵素反応法で定量した。３７℃に予め温めた遊離グリセリン試薬０．８ｍＬに、細胞を試料で２４時間処理した後採取した培地１０μＬを加えた後、混合物の反応を３７℃の水浴で５分間実施した。グリセロールの定量のために、標準グリセロール（２５μg／１０μＬ）を上記と同様にして反応させて、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。グリセロールの含量は下記の計算式を用いて算出した。
グリセロール含量＝｛（Ａ試料−Ａブランク））／（Ａ標準品−Ａブランク）｝×標準品の濃度
【００５４】
算出した結果を図７に示した。図７から明らかなように、対照群に比べて、ＣＬＡ群はグリセロールの分泌（分解効果）が増加する傾向にあり、 オルリスタット群はグリセロールの分泌を１．５７μｇ／ｍＬに増加した。特にＮ−ＣＬＡ群のグリセロール含量は２．６７μｇ／ｍＬであったので、Ｎ−ＣＬＡ群におけるグリセロールの分泌は他群に比べて最も高かった。
【００５５】
（６）レプチン分泌
食欲に関連するホルモンとして知らされているレプチンの分泌量が調節されているか否かを確認するために、実験を行った。脂肪細胞から分泌されたレプチンの量を、試料で脂肪細胞を処理した後に合わせた培地上で酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。１００μｌのウサギ抗マウスレプチンＩｇＧをＥＬIＳＡプレートに分注した。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩培養し、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０)で３回洗浄し、そこに合わせた培地１００μＬを加えた後、１時間室温で培養した。ＥＬＩＳＡプレートを再びＴＰＢＳで３回洗浄し、そこに二次抗体を加え、１時間室温で培養した後、ＴＰＢＳで３回洗浄した。アルカリホスファターゼ結合性基質キットを用いて発色を促進させた後、ＥＬＩＳＡリーダ（SUNRISE, TECAN, Austria）によって４９０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図８に示している。図８から明らかなように、オルリスタット群、ＣＬＡ群及びＮ−ＣＬＡ群のレプチン分泌量は、対照群と比べて、それぞれ１１．６％、８．３％及び７．８％まで減少した。
【００５６】
（７）統計値
上記結果は、ＳＰＳＳパッケージプログラム（SPSS 12.0 for Windows（登録商標）, USA）を利用して算出した。対照群と試験群と間の平均差に対する有意性はスチューデントｔ−検定を実施して検定した。有意水準はｐ＜０．０５とし、全ての測定値は平均値±標準誤差で表示している。
【００５７】
実験例３−２：インビボ実験 
（１）実験動物及び実験デザイン
実験動物として２８匹の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(５週齢、１４５±５ｇ)を Orient Company (Korea) から購入した。ラットを１週間ペレット形態のＬａｂ−ｃｈｏｗ食に適応をさせた。正常群（ＮＣ）を除いた残りの肥満誘発群に高脂肪食を５週間不断給餌して肥満を誘発した後、正常群を含む４群（１群当たり７匹）に分け、５週間飼育した（図１３に示されるように）。
【００５８】
実験食のベースとしてＡＩＮ−７６規定食(Teklad, USA)を使用した。試験物質は高脂肪食の２％濃度で加えた。実験食の組成を下記表１５に示している。ＣＬＡ群とＮ−ＣＬＡ群では、ＣＬＡとＮ−ＣＬＡをそれぞれ２％添加したが、コーンオイルは減少させた。実験食と飲料水は不断供給した。飼育期間中、実験食を４℃の冷蔵庫で保管した。それぞれの動物を、相対湿度６０±５％、１２時間の明／１２時間の暗の明暗サイクルで、２５±２℃の、特定の環境条件下の空の檻に収納した。体重及び食餌摂取量を全実験期間中に２日間隔で一定の時間に測定した。食餌効率比（ＦＥＲ）は、実験期間中の体重増加量を同じ期間中に摂取した食餌量で割って計算して、その結果を表１６に示している。
【００５９】
【表１５】
0005259832.tif 000016
【００６０】
【表１６】
0005259832.tif 000017
【００６１】
表１６から明らかなように、食餌摂取量は全ての群で統計的有意性を示さなかったので、食餌摂取量は体重の増減に影響を及ぼさないと考えられる。一方、Ｎ−ＣＬＡ群の体重増加が、ＮＤ群、ＨＦＤ群及びＣＬＡ群より統計的有意に低かった。従って、Ｎ−ＣＬＡの補給が、食餌摂取には影響を及ぼさないながら、体重増加を顕著に抑制することが判る。
【００６２】
実験期間中の体重変化の量を図９に示している。図９から明らかなように、実験期間中、全ての群の体重は着実に増加した。正常食（ＮＤ）群を除いたその他の群は、５週間の高脂肪食で肥満を誘発された。全ての高脂肪食摂取群の肥満誘発後の第一週に測定した体重は、正常対照群に比べて統計的有意に重かった。５週間の実験期間中、ＨＦＤ群が最も高い体重増加を示した。ＣＬＡ群の体重増加は、第２週〜第４週にはＨＦＤ群より低かったが、第５週におけるＣＬＡ群の体重はＨＦＤ群のそれと統計的有意には異なっていなかった。一方、Ｎ−ＣＬＡ群の体重は、第２週からＨＦＤ群より統計的有意に軽かった。特に、第５週におけるＮ−ＣＬＡ群の体重は、高脂肪食を摂取しなかった正常食（ＮＤ）群のそれと類似していた。従って、Ｎ−ＣＬＡの補給は体重増加を效率的に抑制したことが判る。
【００６３】
（２）臓器重量
飼育後、ラットを１２時間絶食させた後、最初にエーテルで麻酔した。下大静脈から空腹時血液を採取した。採取した血液を３０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して、血清を分離した後、得られた血清を試料分析時まで−７０℃で保管した。実験動物の臓器組織（肝臓、心臓、腎臓、精巣上体白色脂肪組織及び腎周囲白色脂肪組織）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で数回洗浄した後、表面の水分を除去して秤量した。肝臓を、単離して収集し、液体窒素中で急冷した後、酵素活性の測定及び脂質定量のための試料分析時まで−７０℃で保管した。肝臓、心臓及び腎臓の重量を測定した結果を下記表１７に示している。精巣上体白色脂肪組織及び腎周囲白色脂肪組織の単位体重当たりの重さを測定した結果を図１０に示している。
【００６４】
【表１７】
0005259832.tif 000018
【００６５】
表１７から明らかなように、心臓の重量は正常対照群を除いた高脂肪食を摂取した全て群で減少しており、肝臓の重量は高脂肪食を摂取した群全てで統計的有意に増加した。
【００６６】
また、図１０から明らかなように、精巣上体白色脂肪組織及び腎周囲白色脂肪組織の単位体重当たりの重さを測定した結果、高脂肪食を摂取した全ての群でＷＡＴ（白色脂肪組織）が増加した。ＣＬＡ群及びＮ−ＣＬＡ群の精巣上体白色脂肪組織及び腎周囲白色脂肪組織の重さは、ＨＦＤ群より若干低くかったが、統計学的に有意ではなかった。
【００６７】
（３）生化学分析
１）総コレステロール
血清総コレステロールの定量は、Allain らの文献（1974）の酵素法を適用して試験溶液（Asanpharm Co., Korea）を用いて実施した。血清コレステロールはＣＥ（コレステロールエステル）及び遊離コレステロールの２形態で存在する。従って、ＣＥと遊離コレステロールの両方を定量するために、ＣＥをコレステロールエステラーゼにより脂肪酸と遊離コレステロールに変換した。このように変換した遊離コレステロールをコレステロールエステラーゼにより順にＨ２Ｏ２と△４−コレステノン（cholestenon）に変換した。Ｈ２Ｏ２をペルオキシダーゼ、フェノール及び４−アミノ−アンチピリンと混合して、赤色を発色させた後、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定値をコレステロール標準溶液（３００ｍｇ／ｄＬ）と比較して定量した。
【００６８】
２）トリグリセリド
血清中性脂質は、McGowan らの文献（1983）の酵素法に従って中性脂質測定用試薬（Asanpharm Co.,Korea）を用いて測定した。血清中の中性脂質をリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）によりグリセロールと脂肪酸に分解した。グリセロールは、ＡＴＰとグリセロールキナーゼ（ＧＫ）の作用によりＬ−α−グリセロリン酸を形成した。Ｌ−α−グリセロリン酸のＯ２及びグリセロリン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）との反応はＨ２Ｏ２を発生させた。そこに、ペルオキシダーゼと４−アミノ−アンチピリンを加えて赤色を発色させ、５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定値をグリセロール標準曲線と比較して定量した。
【００６９】
３）ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール
ＨＤＬ−コレステロール含量はキットの試薬（AsanpharmCo., Korea）で測定した。ＬＤＬ−コレステロールの含量は、下記のように Friedewald らの文献（1993）の方法に従って下記の通り計算した：
ＬＤＬ−コレステロール＝総コレステロール−ＨＤＬ−コレステロール−（中性脂質／５）。
【００７０】
上記の方法によって測定した血清中性脂質とコレステロールの含量を図１１に示している。図１１から明らかなように、ＨＦＤ群の中性脂質の含量は、正常食（ＮＤ）群のそれより２倍以上高かった。ＣＬＡ群及びＮ−ＣＬＡ群の中性脂質の含量は、ＨＦＤ群よりも統計的有意に低かった。特に、血清中性脂質（トリグリセリド、ＴＧ）の含量は正常食（ＮＤ）群にかなり近いレベルであった。それはＨＦＤ群と比較して５２％まで減少した。ＨＦＤ群の総コレステロール（ＴＣ)及び低密度脂質（ＬＤＬ）は正常食（ＮＤ）群のそれより顕著に高かかった。ＣＬＡ群とＮ−ＣＬＡ群の総コレステロール（ＴＣ）及び低密度脂質（ＬＤＬ）は、ＨＦＤ群と比較して統計的有意に減少した。特に、Ｎ−ＣＬＡ群の総コレステロール（ＴＣ）及び低密度脂質（ＬＤＬ）は、ＨＦＤ群に比べて、それぞれ２０％及び４６％に減少した。従って、Ｎ−ＣＬＡは優れたコレステロール減少効果を有していることが判る。一方、全ての群において高密度脂質（ＨＤＬ）の濃度は何ら統計的有意な差を示さなかった。
【００７１】
４）肝臓組織脂質含量
肝臓組織中の脂質含量の測定は、Ｆｏｌｃｈらの文献の方法に従って行った。肝臓組織１ｇにＣＭ溶液（クロロホルム：メタノール＝２：１）を加えて、ホモジナイズした。溶液を１２時間毎に振盪しながら、４℃で３日間保管した。３日後、水層から分離したＣＭ溶液層をピペットで単離した後、８０℃の水浴でＣＭ溶液を完全に蒸発させて、乾燥脂質を得た。得られた乾燥脂質を無水エタノールに溶かし、ホモジナイズした後、中性脂質、総コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールの含量をキットの試薬（ＡＭ１５７Ｓ−Ｋ、ＡＭ２０２−Ｋ、ＡＭ２０３−Ｋ、Asanpharm Co., Korea）で測定した。その結果を図１２に示している。
【００７２】
図１２から明らかなように、ＨＦＤ群の肝臓組織における中性脂肪及び総コレステロールの含量が最も高く、ＣＬＡ群とＮ−ＣＬＡ群はＨＦＤ群に比べて統計的有意な減少を示した。血清脂質レベルと同様に、肝臓組織脂質含量をＮ−ＣＬＡ群がＣＬＡ群に比べてより效率的に減少させたことが判る。
【００７３】
５）統計値
上記の結果は、ＳＰＳＳパッケージプログラムを用いて算出した。各群間の平均差に対する有意性は一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）で検定した。多群間の差については、ｐ＜０.０５レベルでDuncan の多重範囲検定による事後検定を行った。その結果を平均値±Ｓ.Ｅ.で示している。
【図１】
0005259832.tif 000019
【図２】
0005259832.tif 000020
【図３】
0005259832.tif 000021
【図４】
0005259832.tif 000022
【図５】
0005259832.tif 000023
【図６】
0005259832.tif 000024
【図７】
0005259832.tif 000025
【図８】
0005259832.tif 000026
【図９】
0005259832.tif 000027
【図１０】
0005259832.tif 000028
【図１１】
0005259832.tif 000029
【図１２】
0005259832.tif 000030
【図１３】
0005259832.tif 000031