(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真皮由来の水可溶性アテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産される水可溶性アテロコラーゲンを必須成分とし、５量体以上３０量体以下のオリゴヌクレオチドを放出する標的細胞への所望のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項２】
標的細胞が動物細胞である請求項１記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項３】
標的細胞が対象疾患の治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の細胞である請求項２記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項４】
水可溶性アテロコラーゲンの分子量が約３０万〜約９０万である請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項５】
持続性製剤である請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドがＤＮＡあるいはＤＮＡ誘導体である請求項５記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがＲＮＡあるいはＲＮＡ誘導体である請求項５記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが分子内に少なくとも１つ以上のホスホロチオエート結合を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが少なくともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド導入製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はアンチセンス治療に使用される、コラーゲンを必須成分とする標的細胞へのオリゴヌクレオチド導入製剤に関する。さらに詳細には、本発明はコラーゲンを必須成分とすることにより、標的細胞に効率よくオリゴヌクレオチドを導入できる安全な製剤に関する。
背景技術
近年の遺伝子情報解析技術の急速な進歩によって、疾病の原因となる遺伝子情報が蓄積されてきている。例えば、感染症の分野に於いては、細菌やウイルスが増殖あるいは生存するのに必須な遺伝子情報が明らかになっている。また、種々の疾患において、原因となる遺伝子情報、あるいはその遺伝子情報の過剰な発現や変異などが明らかとなり、その遺伝子情報と症状を発現するメカニズムの関係が明らかになってきている。
アンチセンス療法は上記のような疾患に関与する遺伝子情報の発現を制御または抑制してその疾患の治療や予防を行う方法である。
具体的には例えば、
（１）発現を制御または抑制したい遺伝子のｍ−ＲＮＡまたはｍ−ＲＮＡ前駆体と相補的な塩基配列を有する１０量体〜３０量体程度のオリゴヌクレオチドを投与し、
（２）細胞内で該オリゴヌクレオチドがｍ−ＲＮＡまたはｍ−ＲＮＡ前駆体と二重鎖を形成し、
（３）リボゾームによるｍ−ＲＮＡの翻訳の阻害、ＲＮａｓｅ  Ｈによる二重鎖の切断、あるいはｍ−ＲＮＡ前駆体のスプライシングを阻害し、
これにより遺伝子の発現を抑制する。
また、これ以外に直接標的の遺伝子の二重鎖ＤＮＡに結合して三重鎖を形成し、ｍ−ＲＮＡへの転写を阻害する方法もある。
アンチセンス療法は１９７０年代の後半にＴｓ’ＯとＭｉｌｌｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，１９８８−１９９６，１９７７）およびＺａｍｅｃｎｉｋら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，２８０−２８４，１９７８）によって提唱されて以来、盛んに研究が行われてきた。当初、アンチセンス療法の研究は天然型のＤＮＡあるいはＲＮＡのオリゴヌクレオチドを用いて行われたが、例えば、
（１）天然型のオリゴヌクレオチドは生体内のヌクレアーゼにより短時間に分解され失活すること、
（２）また、負に荷電したオリゴヌクレオチドが同じく負に荷電した細胞膜を通過して細胞内に入ることは困難であること等
の問題がある。このことから、ＤＮＡあるいはＲＮＡの構造を基本として様々に修飾を施したオリゴヌクレオチドが開発され、用いられている。これらの修飾を施したオリゴヌクレオチドのうち最も実用的であるのは、各ヌクレオシド間のジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換したホスホロチオエート型オリゴヌクレオチド（以下、Ｓ−オリゴヌクレオチドと略す。）である。現在までに実施されたほとんどの臨床試験では、Ｓ−オリゴヌクレオチドが使用されている。
しかしながらＳ−オリゴヌクレオチドであっても、例えば
（１）天然型オリゴヌクレオチドほど早くはないが、生体内のヌクレアーゼによって分解され失活する、
（２）天然型オリゴヌクレオチドに比べてｍ−ＲＮＡへの二重鎖形成能力が低い、
（３）二重鎖形成能力が低いために高濃度で標的細胞に投与する必要がある、
（４）高濃度で全身的に投与した場合、サイトカインの放出や血液凝固の阻止や補体の活性化、アレルギー反応などを生じる、
（５）生体内のタンパク質と特異的あるいは非特異的に結合するため、標的ｍ−ＲＮＡと二重鎖を形成できないばかりでなく非特異的な作用を生じる、等の問題があり、アンチセンス療法の要求を充分に満たせているわけではなく、実用化には至っていない。これらの問題点は第一世代とされるＳ−オリゴヌクレオチドに限らず、現在までに開発されているいわゆる第二および第三世代のアンチセンス療法用オリゴヌクレオチド（横山和尚、化学と生物，３６，５５６−５５９，１９９８）に当てはまる。これらの問題点のため、オリゴヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現抑制はｉｎ  ｖｉｔｒｏでは良い効果が得られても、ｉｎ  ｖｉｖｏ特に臨床試験では良い効果が得られないというのが一般的な認識となっており、実際、アンチセンス医薬品の臨床実験が良い効果が得られないため中止される例は多い。
村上はこれらの臨床試験が打ち切られた理由がアンチセンス医薬品のデリバリーにあるとし、アンチセンス医薬品開発の成否はデリバリー方法の開発が左右すると述べている（村上  章、生体の科学，４９，３０９−３１４，１９９８）。オリゴヌクレオチドをデリバリーする方法は、これまで主としてオリゴヌクレオチドの細胞内への透過性と移行を改善することを目的として種々の検討が行われてきた。これらを解決するために横山の総説（横山和尚、細胞工学，１６，１４６３−１４７３，１９９７）では、
（１）ポリ−Ｌ−リジンやポリエチレンイミンなどの多荷電化合物とオリゴヌクレオチドを共役させる、
（２）複製欠損アデノウイルスのカプシドの存在下でトランスフェリン／ポリ−Ｌ−リジン−共役ＤＮＡを使用する、
（３）インフルエンザウイルスＨＡ表面タンパク質由来のｆｕｓｏｇｅｎｉｃペプチド（Ｂｏｎｇａｒｔｚ，Ｊ．Ｐ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４６８１−４６８８，１９９４）やショウジョウバエのＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質のホメオドメインの断片を使用する、
（４）葉酸あるいはアシアロ糖タンパク質受容体、またはトランスフェリンとオリゴヌクレオチドを結合させ、特異的な細胞表面の受容体にターゲッティングする、
（５）コレステロールと結合する、
（６）カチオン性脂質へ封入する、
等の方法が挙げられている。これらの検討はオリゴヌクレオチドの細胞内への透過性と移行を改善することを主眼とはしているものの、細胞に直接オリゴヌクレオチドを投与できるｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験では良い効果が得られても、ｉｎ  ｖｉｖｏでは期待された充分な効果は得られておらず、実用化には問題があった。
例えば、カチオン性脂質（リポソーム）にオリゴヌクレオチドを封入して投与する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではオリゴヌクレオチドを細胞内に効率よく導入するため最も盛んに研究されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは投与後直ちに全身に拡散するため高濃度で標的細胞に作用できないこと、体内のタンパク質がリポソームに結合して標的細胞への接着を阻害すること、リポソームを構成しているカチオン性脂質に細胞毒性があることなどから実用的なレベルでの成果は得られていない。実際、Ｓ−オリゴヌクレオチドを用いた臨床試験でリポソームが使用されたことはなく（生体の科学，４９，３０９−３１４，１９９８）、臨床に実用的なオリゴヌクレオチドのデリバリー方法の開発が望まれている。
一方、プラスミドＤＮＡまたはウイルスベクターを生体親和性材料あるいは骨親和性材料から徐々に溶出させて、遺伝子導入を行う方法が特開平９−７１５４２、ＵＳ５，７６３，４１６に開示されている。これらにはコラーゲン等の生体親和性材料あるいは骨親和性材料が分子量２６５万〜５３０万のプラスミドＤＮＡ（４０００ｂｐ〜８０００ｂｐに相当）あるいはそれ以上の分子サイズを有するウイルスベクターを生体内で徐放して良好な発現効率を示すことが記載されている。しかし、これらプラスミドＤＮＡまたはウイルスベクターの導入が要求される標的細胞一つあたりに、導入されるプラスミドＤＮＡまたはウイルスベクターの個数は、アンチセンス療法で要求されるオリゴヌクレオチドの導入個数に比べて極めて小さい。これはプラスミドＤＮＡあるいはウイルスベクターにコードされた遺伝情報は標的細胞に導入された後、多数のｍ−ＲＮＡに転写されて発現するため、標的細胞一つあたり一個のプラスミドＤＮＡあるいはウイルスベクターが導入されれば、遺伝子の発現が見られるためこれで充分であるからである。一方、アンチセンス療法においては、オリゴヌクレオチドが細胞内に導入され、標的のｍ−ＲＮＡと強固な二重鎖を形成し遺伝子発現を抑制するためには、細胞内のオリゴヌクレオチド濃度を極力高める必要がある。上記特開平９−７１５４２およびＵＳ５，７６３，４１６には、コラーゲン等の生体親和性材料あるいは骨親和性材料が、プラスミドＤＮＡあるいはウイルスベクターに比して極めて小さいオリゴヌクレオチド（一本鎖であって、分子量が約３，３００〜約９，９００程度）を徐放し、かつ遺伝子発現を抑制することができるか否か、更に標的細胞内において、臨床上、充分に、有効な濃度にオリゴヌクレオチド濃度を高めることができるか否かについては、具体的にはなにも示唆されていない。
更に上記先行技術には、アンチセンス療法に用いることのできる下記のような特徴を持つオリゴヌクレオチド導入製剤はなにも示唆されていない。
１）生体に投与したオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる分解から保護されること。
２）生体に投与したオリゴヌクレオチドを生体内のタンパク質との特異的あるいは非特異的な結合から保護すること。
３）標的ｍ−ＲＮＡと強固な二重鎖を形成して発現を抑制できるように細胞内のオリゴヌクレオチドの濃度を高めるために、標的細胞周囲でのオリゴヌクレオチドの濃度を高濃度に維持すること。
４）全身性の副作用を生じないように標的細胞周囲のみでオリゴヌクレオチドの濃度を高濃度に維持すること。
５）一回の投与あたりの、ｍ−ＲＮＡの発現を抑制できる期間を長期化することが求められること。
発明の開示
本発明の課題は、アンチセンス療法等に必要なオリゴヌクレオチドを細胞に効率よく導入できる剤を提供し、種々の疾患を治療することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、標的ｍ−ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとコラーゲン（更に医療上許容される添加剤）からなる製剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏで副作用を誘発することなく標的ｍ−ＲＮＡの発現を効果的に抑制し、かつ長期にその効果が維持されることを見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
発明を実施するための最良の形態
すなわち本発明は：
（１）コラーゲンを必須成分とする標的細胞への所望のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２）標的細胞が動物細胞である（１）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（３）標的細胞が対象疾患の治療を必要とする臓器あるいは組織またはその付近の細胞である（２）のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（４）コラーゲンがアテロコラーゲンである（１）〜（３）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（５）コラーゲンの分子量が約３０万〜約９０万である（１）〜（４）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（６）オリゴヌクレオチド導入製剤が持続性製剤である（１）〜（５）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（７）オリゴヌクレオチドが５量体以上３０量体以下の（１）〜（６）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（８）オリゴヌクレオチドがＤＮＡあるいはＤＮＡ誘導体である（６）または（７）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（９）オリゴヌクレオチドがＲＮＡあるいはＲＮＡ誘導体である（６）または（７）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１０）ＤＮＡ誘導体あるいはＲＮＡ誘導体が分子内に少なくとも１つ以上のホスホロチオエート結合を有する（８）または（９）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１１）オリゴヌクレオチドが少なくともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列を有する（１）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１２）オリゴヌクレオチドが少なくともその一部が病原性のウイルスあるいは細菌に特異的な遺伝子のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列を有する（１）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１３）オリゴヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡの開始コドンを含む領域あるいは前駆メッセンジャーＲＮＡがスプライシングを受ける部位に相補的な配列を有する（１）〜（１０）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１４）恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子ががん遺伝子である（１１）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１５）がん遺伝子が、増殖因子群、受容体型チロシンキナーゼ群、非受容体型チロシンキナーゼ群、ＧＴＰ結合タンパク質、セリン・スレオニンキナーゼ群、転写調節因子群の中から選ばれる（１４）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１６）がん遺伝子がｈｓｔ−１あるいはオルニチン脱炭酸酵素をコードする遺伝子である（１４）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１７）オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの細胞への導入を促進する物質または核への移行を促進する物質中に包含されているか、あるいは該物質と複合体を形成している（１）〜（１２）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１８）細胞への導入を促進する物質がカチオン性リポソーム、膜融合型リポソームあるいはカチオン性のポリマーである（１７）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（１９）コラーゲンが真皮由来の１型コラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンである（１）に記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２０）医学上許容される添加剤を更に含む（１）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２１）添加剤が単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖またはそれぞれの糖アルコール、非疎水性アミノ酸類、カルボキシル基を２個以上有する有機酸類である（１）のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２２）溶液状、懸濁液状、スポンジ状、ペレット状または粉末状の形状を有する（１）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２３）ｐＨ４〜８の溶液状または懸濁液状の（２２）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２４）コラーゲンの含量が０．００１％〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲である溶液状または懸濁液状の（２２）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
（２５）コラーゲンの含量が５〜９９％（ｗ／ｗ）の範囲であるスポンジ状、ペレット状または粉末状である（２２）記載のオリゴヌクレオチド導入製剤；
等に関する。
また本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を生体に投与することからなるがんのアンチセンス療法に、詳細には、所望のオリゴヌクレオチドとコラーゲンを含むオリゴヌクレオチド導入製剤を生体に例えば、経皮、皮下、皮内、筋肉、腹腔内、脳内、組織、血管内、口腔内、直腸内、消化管等に投与し、細胞に効率よく該オリゴヌクレオチドを導入することからなるアンチセンス療法に関する。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤、更に具体的には、オリゴヌクレオチド溶液をコラーゲン溶液（更に医療上許容される添加剤）と混合して得られた溶液あるいは懸濁液製剤は、
１）フィルム状、スポンジ状、粉末状、ミニペレット状等に目的に応じて成形が可能であり、
２）該製剤を標的組織中あるいは近傍に投与後、製剤が投与部位に滞留し、
３）オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼによる分解から保護され、
４）製剤からオリゴヌクレオチドが徐放され、
５）製剤からのオリゴヌクレオチドの放出速度を目的に応じて制御することが可能で
６）標的組織近傍でオリゴヌクレオチド濃度を高濃度で維持し、
７）ｉｎ  ｖｉｖｏで副作用を誘発することなく標的ｍ−ＲＮＡの発現を効果的に抑制し、かつ長期にその効果が維持されることを特徴とする。
更に本発明は、上記製剤を用いた感染症の治療および予防方法、あるいは特定の遺伝情報の過剰な発現によって誘起される諸疾患の治療および予防方法、特に癌の治療および予防方法に関する。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、オリゴヌクレオチド溶液とコラーゲン溶液を混合した溶液あるいは懸濁液そのものであるか、あるいはこれらの溶液あるいは懸濁液をフィルム状、スポンジ状、粉末状、ミニペレット状に成形したものであることから、本発明で使用するコラーゲンは、可溶性コラーゲンまたは可溶化コラーゲンを用いることが望ましい。
「可溶性コラーゲン」としては、酸性あるいは中性の水または塩を含有する水に可溶であるもの等が挙げられる。「可溶化コラーゲン」としては、例えば、酵素により可溶化される酵素可溶化コラーゲン、アルカリにより可溶化されるアルカリ可溶化コラーゲン等が挙げられる。
これらのコラーゲンは、孔サイズが１マイクロメートルのメンブレンフィルターを通過できることが望ましい。コラーゲンの可溶性はコラーゲンの架橋度に依存し、架橋度が高いほど不溶化することから、本発明に使用するコラーゲンの架橋度は、例えば、３量体以下であることが望ましく、より好ましくは２量体以下が望ましい。
コラーゲンの分子量は、例えば、約３０万から９０万が好ましく、約３０万から約６０万がより好ましい。
コラーゲンはいかなる動物種から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体を用いることが出来る。好ましくは脊椎動物から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体、更に好ましくは哺乳類、鳥類、魚類から抽出されたものまたはそれらの遺伝子組換体、より好ましくは変性温度が高い哺乳類、鳥類から抽出されたコラーゲンまたはそれらの遺伝子組換体が望ましい。コラーゲンのタイプもいかなるタイプのコラーゲンでも良いが、動物体内の存在量からＩ〜Ｖ型またはそれらの遺伝子組換体が望ましい。
具体的には、例えば、哺乳動物の真皮から酸抽出した１型コラーゲンまたはそれらの遺伝子組換体が挙げられる。より望ましくは、例えば、仔牛の真皮から酸抽出した１型コラーゲン、遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンなどが挙げられる。遺伝子工学的に生産される１型コラーゲンとしては仔牛の真皮由来またはヒトの真皮由来のものが好ましい。同じ１型コラーゲンでも腱由来のコラーゲンは架橋度が高く不溶性であるため適さない。
また、安全性の面から抗原性の高いテロペプチドを酵素的に除去したアテロコラーゲンあるいは遺伝子工学的に生産されるアテロコラーゲンが望ましく、１分子あたりチロシン残基が３以下であるアテロコラーゲンがより好ましい。
コラーゲンを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞）から分離精製して、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法によりコラーゲンをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えコラーゲンを得ることができる。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物または動物細胞を用いることができる。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは具体的には、例えば、５量体以上３０量体以下のオリゴヌクレオチドであり、より具体的には例えば、１５量体以上２５量体以下のオリゴヌクレオチドである。
また、本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは具体的には、例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、ＲＮＡ誘導体等が挙げられ、より具体的には、例えば、ＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ誘導体等の分子内に少なくとも１つ以上のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、さらに具体的には、例えば、少なくともその一部が生体の恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードした遺伝子、病原性のウイルス、細菌等に特異的な遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖と生理的な条件下で相補的に結合する塩基配列等を有し、より具体的には、病原性ウイルス、細菌等に特異的な遺伝子および恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質等をコードした遺伝子のメッセンジャーＲＮＡと相補的に結合する塩基配列を有する。
更に具体的には、本発明に用いられるオリゴヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡの開始コドンを含む領域あるいは前駆体メッセンジャーＲＮＡがスプライシングを受ける部位に相補的な配列等を有する。本発明に用いられるオリゴヌクレオチドの例を示せば、がんの治療あるいは予防に用いるオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｈｓｔ−１の発現を特異的に抑制する５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の配列を有したオリゴヌクレオチド、あるいはプロテインキナーゼＣαの発現を特異的に抑制して非小細胞性肺がんや結腸がんなどの進行性がんに有効で、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、大腸がん、小細胞肺がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ３５２１、Ｃ−ｒａｆキナーゼの発現を特異的に抑制して前立腺がん、乳がん、卵巣がん、脳腫瘍、膵臓がん、大腸がん、小細胞肺がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ５１３２／ＣＧＰ６９８４６Ａ、Ｈａ−ｒａｓの発現を特異的に阻害して大腸がん、乳がん、脳腫瘍、膵臓がん、肺小細胞がんへの適用が試みられているＩＳＩＳ２５０３、プロテインキナーゼＡタイプＩの発現を特異的に抑制するＧＥＭ２３１、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの発現を特異的に抑制するＭＧ９８、ｃ−ｍｙｃの発現を抑制するＩＮＸＣ−６２９５、ｃ−ｍｙｂの発現を抑制し白血病への適用が検討されているＩＮＸ−３００１、ｂｃ１−２の発現を抑制して非ホジキンリンパ腫、大腸がん、小細胞肺がん、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、乳がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、非小細胞性肺がん、前立腺がんへの適用が検討されているＧ−３１３９（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、ＭＤＭ２蛋白の発現を抑制するオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦの発現を抑制するオリゴヌクレオチドなどを挙げることができる。また、感染症の治療あるいは予防に用いるオリゴヌクレオチドとしては、ＨＩＶの増殖を抑制するＧＥＭ９２、ＧＰＩ−２Ａ、サイトメガロウイルスの増殖を抑制するＩＳＩＳ２９２２（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ、ＩＳＩＳ１３３１２、ＧＥＭ１３２、Ｃ型肝炎ウイルスの増殖を抑制するＩＳＩＳ１４８０３などが挙げられ、炎症の治療に用いられるオリゴヌクレオチドとしては、ＩＣＡＭ−１の発現を特異的に抑制しクローン病、潰瘍性大腸炎、腎移植拒絶反応阻害、乾癬、喘息への適用が試みられているＩＳＩＳ２３０２、アデノシンＡ１レセプターの発現を抑制し、喘息への適用が試みられているＥＰＩ−２０００、およびＴＮＦ−α、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−４）、ＶＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１の発現を抑制するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。また、経皮経管冠動脈形成術後の再狭窄を防止するオリゴヌクレオチドとして、ｃ−ｍｙｃの発現を抑制するＲｅｓｔｅｎ−ＮＧなどが挙げられる。
恒常性を乱す生理的な効果を有するタンパク質をコードする遺伝子は具体的には、例えば、がん遺伝子とよばれる一群の遺伝子群が挙げられる。より具体的には、例えば、増殖因子群、受容体型チロシンキナーゼ群、非受容体型チロシンキナーゼ群、ＧＴＰ結合タンパク質、セリン・スレオニンキナーゼ群、転写調節因子群などが挙げられる。更に具体的には、例えば、ｈｓｔ−１あるいはオルニチン脱炭酸酵素等をコードする遺伝子等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、一般にオリゴヌクレオチドの細胞への導入を促進する物質または核への移行を促進する物質中に包含させるかあるいは該物質と複合体を形成させてもよい。前者の例として、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、疎水性ポリマー等を挙げることができる。「カチオン性脂質」として、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタクレシルアンモニウムブロミド）、ＴＭ−ＴＰＳ（Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−テトラパルミチルスペルミン）、ＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、Ｎ−（α−トリメチルアンモニウムアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１９６，１０４２（１９９４））等が挙げられ、これらのカチオン性脂質とＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）等の中性脂質からなるカチオン性リポソーム、あるいはカチオン性脂質とコレステロールとの混合物も用いることができる。「カチオン性ポリマー」はオリゴヌクレオチドと静電的な相互作用をするポリマーであり、例えばＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）等のリポポリアミン、ＡｌｋＣＷＫ１８等のペプチド、ポリリジンやその誘導体（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，８９，６０９４（１９９２））等のカチオン性ポリアミノ酸およびその誘導体、ポリエチレンイミン、ポリアミンデンドリマー等が挙げられる。「疎水性ポリマー」は遺伝子と疎水的な相互作用をするポリマーであり、例えばポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン等が挙げられる。その他、ＡｌｋＣＷＫ１８等のペプチドも用いることができる。
上記カチオン性リポソームとしては、例えば、ＤＯＳＰＡとＤＯＰＥを１：１で含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを１：１で含むリポソーム、ＤＤＡＢとＤＯＰＥを１：２．５で含むＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）、ＴＭ−ＴＰＳとＤＯＰＥを１：１．５で含むＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、上記カチオン性脂質とコレステロールの混合物とは、例えばＤＭＲＩＥとコレステロールのモル比で１：１の混合物であるＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ロックビル，ＭＤ，ＵＳＡ）を挙げることができる。
オリゴヌクレオチドは膜融合型リポソーム中に包含されていてもよくあるいはリポソームと複合体を形成してもよい。膜融合型リポソームとしては例えばＨＶＪ−リポソーム等が挙げられる。
遺伝子の核への移行を促進する物質としては、ＨＭＧ−１および２の混合物（ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ−１，２  ｍｉｘｔｕｒｅ：実験医学，１２，１８４（１９９４））等を挙げることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤中のコラーゲンとオリゴヌクレオチドの量比は、コラーゲンによる、１）ヌクレアーゼあるいは他のタンパク質からのオリゴヌクレオチドの保護、２）オリゴヌクレオチドの徐放、３）オリゴヌクレオチドの局所滞留およびそれによる局所での高濃度維持、４）オリゴヌクレオチドの細胞内への導入促進、を達成する上で重要である。コラーゲンとオリゴヌクレオチドの量比は、オリゴヌクレオチドの鎖長が目的に応じて如何ようにも選択できることから、コラーゲン１分子に対するオリゴヌクレオチドの負電荷の数により表すことが出来る。本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤において望ましいコラーゲン１分子に対するオリゴヌクレオチドの負電荷の数は１０〜５０００であり、望ましくは１０〜２５００、より望ましくは１０〜１０００である。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、オリゴヌクレオチドとコラーゲンに加えて医学上許容される添加剤を更に含むことができる。
具体的には、これらの添加剤は溶液状あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤のｐＨを調整する目的で用いられる塩類、アミノ酸類およびアミン類、あるいは高粘度の溶液状、懸濁液状あるいはスポンジ状、フィルム状、円柱状および粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤からオリゴヌクレオチドの放出を制御する効果を有する添加剤である。塩類、アミノ酸類、アミン類としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、無水リン酸一ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、リジン、アルギニンなどが挙げられる。
放出を制御する効果を有する添加剤としては、具体的には、例えば、単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖もしくはこれらの糖アルコールまたはこれらの誘導体、アミノ酸類、カルボキシル基を２個以上有する有機酸類、ゼラチン、アルブミン、フィブリン、アルギン酸、アガロース、アラビアゴムなどである。
単糖としては、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース等が挙げられ、好ましくはグルコースである。二糖としては、例えば、シュークロース、マルトース、ラクトース、トレハロースなどが挙げられる。
糖アルコールとしては、例えば、ソルビトール、マンニトール等が挙げられ、好ましくはソルビトールである。
糖誘導体には、例えば、デオキシ糖、アミノ糖、リン酸エステル類およびこれらを構成成分とする二糖などがある。
アミノ酸類としては、医学的に許容されるアミノ酸およびその塩、ならびにこれらの誘導体などが挙げられる。アミノ酸類としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸などの酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、メチオニン、プロリン、シスチン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、イソロイシン、システイン、チロシン、トリプトファン、ロイシンなどが挙げられる。本発明におけるアミノ酸類とは、他に塩基性あるいは中性の側鎖が存在しているアミノ酸も包含される。アミノ酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。
カルボキシル基を２個以上有する有機酸およびその塩としては、好ましくは、例えばカルボキシル基を２あるいは３個含む有機酸およびその塩が挙げられ、より好ましくは飽和または不飽和脂肪族の該有機酸などが挙げられる。カルボキシ基を２あるいは３個含む有機酸およびその塩として、例えばクエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸およびその塩などが挙げられ、好ましくは例えば、クエン酸、酒石酸塩およびその塩などが挙げられる。あるいは、オリゴヌクレオチドの細胞内におけるエンドソームでの分解を抑えるために、例えばエンドソームの内容物を放出する能力を有する不活化したアデノウイルス、ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネートモルホリン塩）等を用いることもできる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤には、上記の糖類、アミノ酸類およびカルボキシル基を２個以上有する有機酸類のいずれかを含有する製剤およびこれらのうち任意の２者または３者を含有する製剤が含まれる。
添加剤を用いて放出を制御する場合には、その添加剤の含有量で調節することができる。例えば放出時間を長くするには添加剤の含有量を下げ、短くするには添加剤の含有量を高くする。添加剤の量は、具体的にはコラーゲンに対し、０〜約１９８００ｗ／ｗ％の範囲から選択できる。好ましい範囲としては約０〜約１８９０ｗ／ｗ％の範囲が挙げられる。より好ましくは約０〜約９００ｗ／ｗ％の範囲が挙げられる。更に好ましくは約０〜３００ｗ／ｗ％の範囲が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、溶液状あるいは懸濁液状であるか、あるいは溶液状あるいは懸濁液状の形態を経てスポンジ状、円柱状あるいは粉末状に加工されたものである。溶液状あるいは懸濁液状の、本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤のｐＨは４〜８の範囲であり、コラーゲンを０．００１％〜１０％（ｗ／ｗ）含有し、好ましくは０．１％〜５％（ｗ／ｗ）含有する。スポンジ状、ペレット状あるいは粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤は５〜９９％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜７０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは２５〜５０％（ｗ／ｗ）のコラーゲンを含有する。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤は、例えば、経皮、皮下、皮内、筋肉、脳内、組織、血管内投与することができる。投与回数は３日から約２ヶ月に１回、好ましくは、１週間から１ヶ月に一回である。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の投与量は、溶液状あるいは懸濁液状の製剤の場合にはその液量で、スポンジ状製剤の場合には製剤の大きさで、円柱状製剤の場合は径と長さで、さらに粉末状製剤の場合は粉体体積あるいは重量で容易に調節することができる。また、製剤中のオリゴヌクレオチド含有量によっても投与量を調節できる。
本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の最適な投与量は、適応疾患、投与部位、投与方法、剤形の種類、患者の性別、年齢、症状などによって異なるが、製剤中のオリゴヌクレオチド量としては、治療対象に対して例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇである。
溶液状あるいは懸濁液状の、本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、例えば、
１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、均一な溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、均一な溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
６）所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
７）必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、均一な溶液状オリゴヌクレオチド導入製剤あるいは懸濁液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
などが挙げられる。この時、溶液状の製剤を得るか、懸濁液状の製剤を得るかはオリゴヌクレオチド溶液およびコラーゲン溶液の各々の濃度によって調節する。
フィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、例えば
１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
６）所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
７）必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を徐々に乾燥させてフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；などが挙げられる。
スポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、例えば、
１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；など
が挙げられる。
粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、例えば、
１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
６）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
７）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
８）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
９）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１０）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１６）所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；
１７）必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して粉末状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る方法；など
が挙げられる。
円柱状のオリゴヌクレオチド導入製剤の製造方法としては、例えば、
１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
６）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
７）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
８）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
９）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１０）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥し、得られたスポンジを粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１１）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１２）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１３）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた懸濁液をろ過して得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過し、得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１５）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過し、得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１６）所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過し、得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１７）必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を乾燥し、得られた乾燥品をコラーゲン溶液に溶解させ、得られた懸濁液をろ過し、得られた沈殿物をそのまま、あるいは粉砕して得られた粉末を円柱状に圧縮成形する方法；
１８）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
１９）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥してして得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
２０）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
２１）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
２２）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジを円柱状に圧縮成形する方法；
２３）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２４）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２５）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２６）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させ、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２７）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に溶解させて、得られた均一な溶液あるいは懸濁液を凍結乾燥して得たスポンジに水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２８）コラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、これに必要に応じて添加剤を溶解し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
２９）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液に、所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
３０）コラーゲン溶液に、必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えて混合し、得られた均一な溶液を噴霧乾燥して得た粉末に水等を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
３１）必要に応じて添加剤を添加したコラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品に所望のオリゴヌクレオチド溶液を加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；
３２）コラーゲン溶液を乾燥し、得られた乾燥品を必要に応じて添加剤を添加した所望のオリゴヌクレオチド溶液に加えた後、練合し、ノズルから円柱状に押し出し、乾燥する方法；など
が挙げられる。
実施例
以下に実施例および試験例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明はこれら実施例および試験例により限定されるものではない。
実施例１
線維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２８９０−２９８４（１９８７）に記載）の４１９６ｂから４２１６ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；分子量：約６５００）（サワデー株式会社）を最終濃度１０マイクロモル／Ｌの濃度となるようにアテロコラーゲンの中性溶液（（株）高研製アテロコラーゲンインプラント：２％アテロコラーゲン溶液）と混合し、アテロコラーゲン最終濃度が０．５％の溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
実施例２
オルニチン脱炭酸酵素遺伝子の３１９ｂから３３８ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＣ、５’−ＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（エスペックオリゴサービス株式会社）を終濃度０．５、１、１．５、２、２．５ミリモル／Ｌの濃度となるようにアテロコラーゲンの中性溶液（（株）高研製アテロコラーゲンインプラント：３．５ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液、終濃度１．７５ｗ／ｗ％）と混合し、溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
実施例３
ＡＳ−ＯＤＣを終濃度１．０ミリモル／Ｌの濃度となるようにアテロコラーゲンの中性溶液（（株）高研製アテロコラーゲンインプラント：３．５ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液、終濃度１．７５ｗ／ｗ％）０．５マイクロＬとトランスファスト（Ｐｒｏｍｅｇａ）１．５マイクロＬを混合し、リポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
実施例４
実施例１で調製した溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤３ｍＬをポリスチレン製のシャーレー（直径３５ｍｍ）上に流し込み、これをシリカゲルを入れたデシケーター中で水平に保って５℃で静置して徐々に乾燥し、コラーゲン１ｍｇあたり３２．５マイクログラムのオリゴヌクレオチドを含むフィルム状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る。
実施例５
実施例１で調製した溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤３ｍＬをポリスチレンシャーレ（直径３５ｍｍ）上に流し込み、これを−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥し、コラーゲン１ｍｇあたり３２．５マイクログラムのオリゴヌクレオチドを含むスポンジ状のオリゴヌクレオチド導入製剤を得る。
実施例６
２ｗ／ｗ％アテロコラーゲン溶液（１７．５ｇ）に水（５２．５ｇ）、１０ｍｇ／ｍＬのグルコース溶液（１０ｍＬ）を加えて混合した後、５ｍｇ／ｍＬのホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；分子量：約６５００）溶液（１０ｍＬ）を加えて混合する。得られた溶液を−４０℃で凍結させた後、陰圧下室温で一晩乾燥し、この凍結乾燥品に適量の蒸留水を加えて練合する。その後、練合品をノズルを通して棒状に押し出し成形し、さらに乾燥させて棒状の製剤を得る。すなわち１０ｍｇあたり１ｍｇのオリゴヌクレオチドを含有する棒状の遺伝子製剤を得る。
実施例７
オルニチン脱炭酸酵素遺伝子の３１９ｂから３３８ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＣ、５’−ＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）（エスペックオリゴサービス株式会社）を１０ミリグラム／ミリリットル含有する生理食塩水５０マイクロリットルとアテロコラーゲン液（３．５％）５０マイクロリットルを室温で混合し、ＡＳ−ＯＤＣを５マイクログラム／マイクロリットル、アテロコラーゲンを１．７５％含有する溶液状態のオリゴヌクレオチド導入製剤を調製した。
参考例１
アテロコラーゲンの中性溶液を蒸留水に変えた以外は、実施例１に記載の操作に従い、ホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
参考例２
線維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２８９０−２９８４（１９８７）に記載）の４１９６ｂから４２１６ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの変わりに、その配列と同じ配列を有したホスホロチオエート型センスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＧ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いた以外は、実施例１に記載の操作に従い溶液状の組成物を得た。
参考例３
線維芽細胞増殖因子ＨＳＴ−１（ＦＧＦ４）の遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，２８９０−２９８４（１９８７）に記載）の４１９６ｂから４２１６ｂまでの配列に相補的な配列を有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；分子量：約６５００）を２０マイクロモル／Ｌの濃度になるように溶解したリン酸緩衝液５００マイクロＬと、リポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）２５マイクロＬを溶解したリン酸緩衝液５００マイクロＬを混合し、室温で２０分間、静置反応することで最終濃度１０マイクロモル／Ｌのオリゴヌクレオチド・リポソーム製剤を得た。
参考例４
ＡＳ−ＯＤＣの変わりにリン酸緩衝液を加えた以外は、実施例２に記載の操作に従いアテロコラーゲンを１．７５ｗ／ｗ％含有するアテロコラーゲン溶液を調製した。
参考例５
アテロコラーゲンの中性溶液をリン酸緩衝液に変えた以外は、実施例２に記載の操作に従いＡＳ−ＯＤＣを１．０ミリモル／Ｌの濃度で含有したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
参考例６
ＡＳ−ＯＤＣの変わりに、非相同な配列を有したホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）（エスペックオリゴサービス株式会社）を１．０ミリモル／Ｌの濃度で含有する以外は、実施例２に記載の操作に従い溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物を得た。
参考例７
ＡＳ−ＯＤＣを終濃度１．０ミリモル／Ｌとなるように、リン酸緩衝液と、トランスファスト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を溶解したリン酸緩衝液１５マイクロＬを混合することでリポソーム製剤を得た。
試験例１
実施例１で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤２マイクロＬを２０％の仔牛血清を含むＰＢＳ（−）液１００マイクロＬに混合し３７℃で静置した。混合後、３０分、６０分、１８０分後に混合液を分取して３％アガロースゲル電気泳動に付し、製剤中のホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの一次構造を評価した。結果を第１図に示す。実施例１で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤中のホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２０％の仔牛血清を含むＰＢＳ（−）溶液と混合した１８０分後でも無処理のホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの泳動位置にバンドが認められたのに比べて、参考例１の製剤では３０分後にはバンドは確認できなかった。この結果は、本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤中でホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドが酵素による分解から保護されることを示している。
試験例２
１０週齢のオスのヌードマウスの精巣にＨＳＴ−１を産生するヒト精巣胚腫瘍細胞（ＮＥＣ−８）を１０×１０５個移植した。移植１０日後に実施例１で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をヌードマウスの精巣あたり５０マイクロリットルを投与した。投与後、１０日後、２０日後、３０日後にヌードマウスを屠殺し、精巣中の腫瘍細胞の重量を測定した。結果を第２図に示す。ヌードマウスの精巣中での精巣胚腫瘍細胞の増殖は、参考例２のゲル状の組成物および参考例３のリポソームの組成物をそれぞれ精巣あたり５０マイクロリットル投与した場合に比べて、実施例１で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤を投与したヌードマウスで最も抑制された。特に、参考例３のリポソーム製剤では２０日後まで実施例１のオリゴヌクレオチド導入製剤と同等の抑制効果を示したが、３０日後には増殖抑制効果は見られなかった。この結果は、本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤が投与後ヌードマウスの精巣に滞留し、ヌードマウスの体内でＨＳＴ−１の産生を抑制するホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドを酵素による分解から保護し、このホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを局所で徐放することによって効果的にかつ長期間腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を有することを示している。
試験例３
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地５００マイクロＬ中で培養したヒト胃癌細胞（ＭＫＮ４５細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）５×１０５個に実施例２で調製した溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤（ＡＳ−ＯＤＣを１．０ミリモル／Ｌ含有する）５マイクロＬを添加（終濃度１０マイクロモル／Ｌ）し、３７℃で培養した。添加２４時間後にオリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、その後２４時間毎に培地を交換して６日間培養した。添加後２日毎に細胞数を３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴアッセイ）により測定した。同様に参考例４で調製したアテロコラーゲン溶液、参考例５で調製したホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液、参考例６で調製した溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物をＭＫＮ４５細胞に添加して細胞数を測定した。結果を第３図に示す。実施例２の溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤を添加した場合、何も添加しなかった対照群に比べてＭＫＮ４５細胞の増殖が著しく抑制された。更に６日後には添加時に比べてＭＫＮ４５細胞数が減少した。一方、アテロコラーゲン溶液である参考例４、ＡＳ−ＯＤＣのみを含有する参考例５、ホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチドとアテロコラーゲンを含む参考例６の製剤を添加した場合には、対照群に比べてＭＫＮ４５細胞の増殖は抑制されたものの、実施例２の製剤を添加した場合に比べて抑制効果は低かった。これらの結果はホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドによる腫瘍細胞の増殖抑制効果は、アテロコラーゲンと混合して本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤とすることによって増強されること、また本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤による腫瘍細胞の増殖抑制機構が単にアテロコラーゲンあるいはホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドが標的細胞と共存することに由来せず、ホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的細胞の増殖抑制効果および殺細胞効果に因ることを示している。
試験例４
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地５００マイクロＬ中で培養したヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）５×１０５個に実施例２で調製した溶液状のオリゴヌクレオチド導入製剤（ＡＳ−ＯＤＣを０．５、１、１．５、２、２．５ミリモル／Ｌ含有する）５マイクロＬを添加（終濃度５、１０、１５、２０、２５マイクロモル／Ｌ）し、３７℃で培養した。添加２４時間後にオリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、その後２４時間毎に培地を交換して５日間培養した。添加後１、３５日後に細胞の生存率をトリパンブルー染色法により測定した。結果を第４図に示した。測定したすべてのオリゴヌクレオチド導入製剤でＲＤ細胞の生存率は低下し、測定した中で最もＡＳ−ＯＤＣ濃度が低い５マイクロモル／Ｌのオリゴヌクレオチド導入製剤でも殺細胞効果が見られた。
試験例５
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地５００マイクロＬ中で培養したヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞）５×１０５個に実施例３で調製したリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤５マイクロＬを添加し、３７℃で培養した。添加２４時間後にオリゴヌクレオチド導入製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、その後２４時間毎に培地を交換して８日間培養した。添加２、４、６、８日後に細胞の生存率をトリパンブルー染色法により測定した。また、添加２、４、６日後にＲＤ細胞内のオルニチン脱炭酸酵素活性を測定した。同様に参考例７のリポソーム製剤を添加してＲＤ細胞の生存率および細胞内のオルニチン脱炭酸酵素の活性を調べた。結果を第５図と第６図に示した。実施例３のリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤、参考例７のリポソーム製剤共にＲＤ細胞の生存率を低下させたが、オリゴヌクレオチド導入製剤の方が強い殺細胞効果を示した。また、同様にリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤とリポソーム製剤は共にＲＤ細胞内のオルニチン脱炭酸酵素活性を低下させたが、オリゴヌクレオチド導入製剤の方が強く活性を低下させた。これは実施例３のリポソームを含んだオリゴヌクレオチド導入製剤が、参考例７のリポソーム製剤に比べて強く標的遺伝子であるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現を抑制し、ＲＤ細胞を減少させたことを示している。これらの結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤がリポソームを含んだ場合でも、ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドによる殺細胞効果を増強し、その増強効果が従来のリポソーム製剤に比べて優れていることを示している。
試験例６
４週齢のオスのヌードマウスの背部皮下にオルニチン脱炭酸酵素を過剰に産生するＲＤ細胞を５×１０７個移植した。移植７日後に実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をＲＤ細胞移植部位、ＲＤ細胞を移植した対側の背部筋肉内、および腹腔内にそれぞれ投与した。同様に参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例７のリポソーム製剤およびリン酸緩衝液（対照群）をそれぞれＲＤ細胞移植部位に投与した。投与後、７日毎にヌードマウスを屠殺し、ＲＤ細胞の重量を測定した。結果を第７図、第８図、および第９図に示す。第７図は実施例７の製剤および参考例４の製剤のＲＤ移植部位投与した場合の比較、第８図は実施例７の製剤および参考例７の製剤をＲＤ移植部位投与した場合の比較、第９図は実施例７の製剤のＲＤ移植部位投与（局注）、筋肉内投与（筋注）および腹腔内投与（腹注）の結果を示す。ヌードマウス背部筋肉中でのＲＤ細胞の増殖は、参考例４のアテロコラーゲン溶液（第７図）、参考例７のリポソーム製剤（第８図）およびリン酸緩衝液を投与した場合に比べて、実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をＲＤ移植部位内、ＲＤ細胞を移植した対側の背部筋肉内、および腹腔内に投与したすべてのヌードマウスで最も抑制された（第９図）。特に、参考例７のリポソーム製剤では７日後まで実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤と同等の抑制効果を示したが、１４日後には増殖抑制効果は見られなかった。これらは本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤がリポソーム製剤に比べてより強力にＲＤ細胞の増殖を抑制すること、またこのＲＤ細胞の増殖抑制効果が長期に亘って持続すること、更に増殖抑制効果が投与部位による影響を受けないことを示している。この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤が、投与後ヌードマウスの体内でホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドを酵素による分解から保護し、このホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを徐放することによって効果的にかつ長期間腫瘍細胞の増殖を抑制する効果を有することを示している。第１０図および第１１図にＲＤを移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。第１０図は、実施例７の製剤と参考例４の製剤をＲＤ移植部位投与した場合の比較、第１１図は実施例７の製剤と参考例７の製剤をＲＤ移植部位投与した場合の比較を示す。実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をＲＤ移植部位に投与したマウスの平均生存日数は５２．６日で、リン酸緩衝液を投与したヌードマウスの平均生存日数２０．５日、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与したヌードマウスの平均生存日数４０．３日（第１０図）、参考例７のリポソーム製剤を投与したヌードマウスの平均生存日数３７．８日（第１１図）に比べて大幅に延長された。この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を投与して得られるＲＤ細胞の増殖抑制効果が、ＲＤ細胞を移植したヌードマウスの延命率を高めることを示している。また、第１２図および第１３図に実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例７のリポソーム製剤およびリン酸緩衝液投与後４２日のＲＤ細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素活性を示した。第１２図は実施例７の製剤と参考例４の製剤をＲＤ移植部���に投与した場合の比較、第１３図は実施例７の製剤と参考例７の製剤をＲＤ移植部位投与した場合の比較を示す。オリゴヌクレオチド導入製剤を投与したＲＤ細胞内のオルニチン脱炭酸酵素活性は、アテロコラーゲン溶液、リポソーム製剤およびリン酸緩衝液を投与したＲＤ細胞に比べて低かった。これはオリゴヌクレオチド導入製剤を投与することによってオルニチン脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、オリゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合にみられたＲＤ細胞の増殖抑制効果が、オリゴヌクレオチド導入製剤中に含まれるホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドによるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるものであることを示している。
試験例７
４週齢のオスのヌードマウスの背部皮下にオルニチン脱炭酸酵素を過剰に産生するＭＫＮ４５細胞を５×１０７個移植した。移植７日後に実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をＭＫＮ４５細胞移植部位に投与した。同様に参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６の溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液（対照群）をそれぞれＭＫＮ４５細胞移植部位に投与した。投与後、７日毎にヌードマウスを屠殺し、ＭＫＮ４５細胞の重量を測定した。結果を第１４図に示す。ヌードマウス背部筋肉中でのＭＫＮ４５細胞の増殖は、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６の溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液を投与した場合に比べて、実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をＭＫＮ４５細胞移植部位に投与した場合に最も抑制された。これは本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤がＭＫＮ４５細胞の増殖を抑制すること、またこのＭＫＮ４５細胞の増殖抑制効果が長期に亘って持続することを示している。第１５図にＭＫＮ細胞を移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をＭＫＮ細胞移植部位に投与したヌードマウスの平均生存日数は４８．５日で、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与したヌードマウスの平均生存日数３９．１日、参考例６の溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物を投与したヌードマウスの平均生存日数３９．１日、リン酸緩衝液を投与したヌードマウスの平均生存日数２１．３日に比べて大幅に延長された。この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を投与して得られるＭＫＮ細胞の増殖抑制効果が、ＭＫＮ細胞を移植したヌードマウスの延命率を高めることを示している。また、第１６図に実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６の溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液投与後３５日のＭＫＮ４５細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素活性を示した。オリゴヌクレオチド導入製剤を投与したＭＫＮ４５細胞内のオルニチン脱炭酸酵素活性は、アテロコラーゲン溶液、溶液状のホスホロチオエート型スクランブルオリゴヌクレオチド組成物およびリン酸緩衝液を投与したＭＫＮ４５細胞に比べて顕著に低かった。これはオリゴヌクレオチド導入製剤を投与することによってオルニチン脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、オリゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合にみられたＭＫＮ４５細胞の増殖抑制効果が、オリゴヌクレオチド導入製剤中に含まれるホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドによるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるものであることを示している。
試験例８
４週齢のオスのヌードマウスの背部皮下にオルニチン脱炭酸酵素を過剰に産生するヒト大腸癌細胞（ＣＯＬＯ２０１細胞）（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を５×１０７個移植した。移植７日後に実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤をＣＯＬＯ２０１細胞移植部位に投与した。同様に参考例４で調製したアテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液（対照群）をそれぞれＣＯＬＯ２０１細胞移植部位に投与した。投与後、７日毎にヌードマウスを屠殺し、ＣＯＬＯ２０１細胞の重量を測定した。結果を第１７図に示す。ヌードマウス背部筋肉中でのＣＯＬＯ２０１細胞の増殖は、参考例４のアテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液を投与した場合に比べて、実施例７で調製したオリゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合に最も抑制され、かつＣＯＬＯ２０１細胞の重量は移植時より減少した。これらは本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤がＣＯＬＯ２０１の増殖を抑制すると共にＣＯＬＯ２０１細胞を死滅させること、またこのＣＯＬＯ２０１細胞の増殖抑制効果が長期に亘って持続することを示している。第１８図にＣＯＬＯ２０１細胞を移植したヌードマウスの累積生存曲線を示した。実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をＣＯＬＯ２０１細胞移植部位に投与したマウスの平均生存日数は３９．８日で、アテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液を投与したヌードマウスのそれぞれの平均生存日数３１．２日および２０．６日に比べて延長された。この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤を投与して得られるＣＯＬＯ２０１の増殖抑制効果が、ＣＯＬＯ２０１を移植したヌードマウスの延命率を高めることを示している。また、第１９図に実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤、参考例４のアテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液投与後３５日のＣＯＬＯ２０１細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素活性を示した。オリゴヌクレオチド導入製剤を投与したＣＯＬＯ２０１細胞内のオルニチン脱炭酸酵素活性は、アテロコラーゲン溶液およびリン酸緩衝液を投与したＣＯＬＯ２０１細胞に比べて低かった。これはオリゴヌクレオチド導入製剤を投与することによってオルニチン脱炭酸酵素の産生が抑制されていることを示しており、この結果はオリゴヌクレオチド導入製剤を投与した場合にみられたＣＯＬＯ２０１細胞の増殖抑制効果が、オリゴヌクレオチド導入製剤中に含まれるホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドによるオルニチン脱炭酸酵素遺伝子の発現抑制によるものであることを示している。
試験例９
１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地０．５ｍＬ中で培養したマウス平滑筋肉腫細胞（ＬＭＦＳ細胞）１×１０５個に実施例７で調製した溶液状のオリゴヌクレオチド製剤（１００マイクロモル／ＬのＡＳ−ＯＤＣと０．１７５％のＡＳ−ＯＤＣを含有する）１０マイクロＬを添加し、３７℃で培養した。添加２４時間後にオリゴヌクレオチド製剤を含む培地を新鮮な培地と交換し、その後２４時間毎に培地を交換して６日間培養した。添加後２日毎に細胞数とオルニチン脱炭酸酵素活性を測定した。結果をそれぞれ第２０図、第２１図に示す。実施例７の溶液状のオリゴヌクレオチド製剤を添加した場合、何も添加しなかった対照群に比べてＬＭＦＳ細胞の増殖が著しく抑制され、オルニチン脱炭酸酵素活性も低下した。この結果は本発明のオリゴヌクレオチド導入製剤が増殖性、転移性共に極めて強いＬＭＦＳ細胞の増殖を標的塩基配列特異的に抑制できることを示している。
産業上の利用の可能性
標的ｍ−ＲＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとコラーゲン（更に医療上許容される添加剤）からなる製剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏで副作用を誘発することなく標的ｍ−ＲＮＡの発現を効果的に抑制し、かつ長期にその効果が維持されることにより、遺伝子治療が可能となった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は試験例１における３％アガロースゲル電気泳動図である。実施例１と参考例１のオリゴヌクレオチド製剤中でのホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる影響を示している。レーン１：実施例１−０分後、レーン２：実施例１−３０分後、レーン３：実施例１−６０分後、レーン４：実施例１−１８０分後、レーン５：参考例１−０分後、レーン６：参考例１−３０分後、レーン７：参考例１−６０分後、レーン８：参考例１−１８０分後。
第２図は実施例１のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト精巣腫瘍細胞（ＮＥＣ−８）を移植したヌードマウスの精巣に投与した場合、ＮＥＣ−８細胞の増殖を長期間抑制したことを示したグラフである。
第３図は実施例２のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合に、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例５のアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液、参考例６のスクランブルオリゴヌクレオチド組成物を添加した場合に比べて、ヒト胃癌細胞の増殖を抑制し、かつ細胞数を減少させたことを示したグラフである。
第４図は実施例２のオリゴヌクレオチド導入製剤によるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト横紋筋肉腫細胞の増殖抑制効果を、オリゴヌクレオチド導入製剤に含有するホスホロチオエート型アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度で比較したグラフである。
第５図は実施例３のリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合、参考例７のリポソーム製剤に比べて強い殺細胞効果を示したグラフである。
第６図は実施例３のリポソームを含有したオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合、参考例７のリポソーム製剤に比べて強くオルニチン脱炭酸酵素の活性を低下させたことを示すグラフである。
第７図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液に比べて長期間横紋筋肉腫細胞の増殖を抑制したことを示すグラフである。
第８図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫移植部位に投与した場合、参考例７のリポソーム製剤に比べて長期間横紋筋肉腫細胞の増殖を抑制したことを示すグラフである。
第９図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫移植部位、横紋筋肉腫を移植した対側の背部筋肉内、腹腔内に投与した場合、リポソーム製剤を横紋筋肉腫移植部位に投与した場合に比べてすべての部位で横紋筋肉腫細胞の増殖を長期間抑制したことを示したグラフである。
第１０図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与した場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを示したグラフである。
第１１図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、参考例７のリポソーム製剤を投与した場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを示したグラフである。
第１２図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与した場合に比べて横紋筋肉腫細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第１３図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト横紋筋肉腫細胞を移植したヌードマウスの横紋筋肉腫細胞移植部位に投与した場合、参考例７のリポソーム製剤を投与した場合に比べて横紋筋肉腫細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第１４図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植したヌードマウスのヒト胃癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６のオルニチン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有したホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した場合に比べて、ヒト胃癌細胞の増殖を長期間抑制したことを示したグラフである。
第１５図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植したヌードマウスのヒト胃癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６のオルニチン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有したホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した場合に比べてヌードマウスの延命率を高めたことを示したグラフである。
第１６図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト胃癌細胞を移植したヌードマウスの胃癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液、参考例６のオルニチン脱炭酸酵素の遺伝子配列に非相同な配列を有したホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドを含有する溶液状組成物を投与した場合に比べて胃癌細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第１７図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植したヌードマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与した場合に比べて、大腸癌細胞の増殖を長期間抑制したことを示したグラフである。
第１８図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植したヌードマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与した場合に比べて、ヌードマウスの延命率を高めたことを示したグラフである。
第１９図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をヒト大腸癌細胞を移植したヌードマウスの大腸癌細胞移植部位に投与した場合、参考例４のアテロコラーゲン溶液を投与した場合に比べて、大腸癌細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素の産生が強く抑制されたことを示したグラフである。
第２０図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をマウス平滑筋肉腫細胞（ＬＭＦＳ細胞）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合に、対照例に比べてマウス平滑筋肉腫細胞の増殖を抑制されたことを示したグラフである。
第２１図は実施例７のオリゴヌクレオチド導入製剤をマウス平滑筋肉腫細胞（ＬＭＦＳ細胞）にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合に、対照例に比べてマウス平滑筋肉腫細胞内でのオルニチン脱炭酸酵素の産生が抑制されたことを示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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