(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の画素内で走査線（４０）に沿って標本（１５）を照明する照明光線（３）を、走査光学系（１２）および顕微鏡光学系（１３）を介して標本（１５）上または標本内に導く走査装置（７）と、前記標本（１５）から発した光を受け取るとともに検出信号を生成する検出ユニット（１９）とを有し、
前記検出ユニット（１９）の後に、画素（Ｐｘ、ｙ）内の検出信号を定期的に取得するとともにそれから平均値を算出するデジタル回路（３０）が配置され、前記デジタル回路（３０）は、サンプリング時間（Ｔ１〜Ｔ８）内で各画素（Ｐｘ、ｙ）に対して前記検出信号を定期的に取得するように構成され、前記走査線（４０）内の均一サイズの画素（Ｐｘ、ｙ）当りの前記サンプリング時間（Ｔ１〜Ｔ８）は、前記照明光線（３）が前記標本（１５）上を移動する速度に依存して変更可能であり、
前記デジタル回路が、画素内の多数の前記検出信号を定期的に加算する加算要素（３１）を含むとともに、前記デジタル回路（３０）が多数の前記検出信号の和をそれぞれの画素（Ｐｘ、ｙ）内の前記検出信号の数で割る除算要素（３２）を含む走査顕微鏡を用いた検出装置。
【請求項２】
乗算要素（３３）が前記デジタル回路（３０）内で前記加算要素（３１）および前記除算要素（３２）の前に配置されている、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記乗算要素が前記検出信号の増幅を行うことにより、前記加算要素および前記除算要素の数値精度を向上させる、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記走査顕微鏡には、前記デジタル回路および前記検出ユニット（１９）のデジタル増幅およびアナログ増幅の和を生じる利得のための調整要素が装備されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記検出ユニット（１９）の前記アナログ増幅を前記デジタル回路内の対応する乗算により補償できる、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記検出ユニット（１９）が、前記デジタル回路内での増幅により前記検出ユニット（１９）の感度のダイナミクスの向上を達成する特性曲線を有する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記走査顕微鏡がレーザ走査顕微鏡である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
走査光学系（１２）および顕微鏡光学系（１３）を介して照明光線（３）を標本（１５）上または標本内に導く走査装置（７）を有し、前記標本（１５）が多数の画素（Ｐｘ、ｙ）内で走査線（４０）に沿って前記照明光線（３）で照明され、前記標本（１５）から発した光が検出ユニット（１９）により受け取られ、検出信号が生成される走査顕微鏡を用いた検出方法であって、
前記検出ユニット（１９）の前記検出信号がデジタル回路（３０）により定期的に取得されて加算されるステップと、
前記検出信号の和が加算された前記検出信号の数で割られるステップとを有し、
前記検出信号は、サンプリング時間（Ｔ１〜Ｔ８）内で各画素（Ｐｘ、ｙ）に対して前記デジタル回路（３０）により定期的に取得され、前記走査線（４０）内の均一サイズの画素（Ｐｘ、ｙ）当りの前記サンプリング時間（Ｔ１〜Ｔ８）は、前記照明光線（３）が前記標本（１５）上を移動する速度に依存して変更可能であり、
前記デジタル回路が、画素内の多数の前記検出信号を定期的に加算する加算要素を含むとともに、前記デジタル回路が多数の前記検出信号の和をそれぞれの画素内の前記検出信号の数で割る除算要素を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
乗算要素が前記デジタル回路内で前記加算要素および前記除算要素の前に配置されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記乗算要素により前記検出信号の増幅を行うことにより、前記加算要素および前記除算要素の数値精度を向上させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記走査顕微鏡には、前記デジタル回路のデジタル増幅と前記検出ユニット（１９）のアナログ増幅との和を生じる利得のための調整要素が装備されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出ユニット（１９）の前記アナログ増幅が前記デジタル回路内の対応する乗算により補償される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出ユニット（１９）が、前記デジタル回路内での前記増幅によりダイナミクスを向上する特性曲線を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記走査顕微鏡（１）がレーザ走査顕微鏡である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査顕微鏡を用いた検出装置に関する。本発明は特に多数の画素内で標本を照明する照明光線を走査光学系および顕微鏡光学系を介して標本上または内に導く走査装置を有し、さらに標本から発した光を受け取るとともに検出信号を生成する検出ユニットを有する走査顕微鏡を用いた検出装置に関する。
【０００２】
本発明はさらに走査顕微鏡を用いた検出方法に関する。本発明は特に照明光線を走査光学系および顕微鏡光学系を介して標本上または内に導く走査装置を有し、標本が多数の画素内で照明光線で照明され、標本から発した光が検出ユニットにより受け取られ、検出信号が生成される走査顕微鏡を用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許文献１はサンプルの点毎走査のための方法および装置を開示している。この方法は各走査点毎の設定信号を生成するステップと、その設定信号を走査装置に転送するステップとを特徴とする。さらなるステップにおいて走査装置の位置からの各走査点に対する実際の信号が確かめられる。また走査点毎の少なくとも１つの検出信号の検出、実際の信号および／または設定信号および検出信号からの表示信号および画像位置の算出、ならびに表示信号の画像点位置への割り当ても行われる。従来、ミラー検流計の偏向は例えば正弦波のように進む、すなわち偏向の変化が引き返し点付近（画像エッジに対応する）でゼロトランジションより遅くなることは問題である。非線形性は各画素（図４を参照）毎に異なる照明時間またはサイクル時間Ｔ１につながる。従来、検出器により生成された信号は、すべての画素に適した一定の最大時間にわたってアナログ技術で構成された積算器を用いて積算される。そしてデータ値がアナログデジタル変換器により読み出されるとともに積算器がクリアされる。その時初めて次の画素に対して新たなサイクルが開始する。ここで積算時間が最短の照明時間またはサイクル時間を有する画素に基づいていることは不都合である。そのためより長いサイクル時間を有する、すなわち信号対ノイズ比がそこで劣化する画像エッジ（走査方向反転）の画素のために貴重な計測時間が失われる。
【０００４】
特許文献２は走査器駆動用トリガシステムを開示している。走査器は振動モータにより駆動されるため走査ミラーが振動する。トリガユニットは振動モータに適当な制御周波数の線形供給を提供するため、走査光線もサンプルの表面上に実質的に線形経路を描く。
【０００５】
特許文献３は共焦点顕微鏡および共焦点顕微鏡を用いた三次元画像を生成する方法を含む。光軸の方向への相対移動を生じる装置が設けられている。また相対移動を生成する装置と走査装置とを同時に制御または調節する制御ユニットも設けられている。
【０００６】
既存の技術のさらなる不都合は、アナログ積算器の不可欠なクリア時間中に入力信号が検出できないことである。しかし高走査速度ではクリア時間はサイクル時間の半分を超える時間になる。８ｋＨｚ（共振走査）において、例えば画素当りの積算時間は２５ｎｓである場合がある。一方積算された信号（短い積算時間で）のクリアは少なくとも２０ｎｓかかる恐れがある。しかし高走査速度が必要なため、積算器を完全にクリアすることはできない。またこの理由のため積算時間は（そのためサイクル時間も）走査される線内で一定でなければならない。最終的な積算値、したがって主観的画像輝度は走査速度および走査形式に依存する。画像設定はユーザがこれに対応して修正しなければならない。
【０００７】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０１２６２８６Ａ１号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１９７０２７５２Ａ１号明細書
【特許文献３】ＥＰ０８４５６９３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は画質を向上させることにより、使用形式および走査速度に関係なく得られた画像でバランスの取れた画像輝度を生じる装置を創出することである。
【０００９】
この目的は請求項１の特徴を含む装置により達成される。
【００１０】
本発明の目的は画質を向上させることにより、使用形式および走査速度に関係なく得られた画像でバランスの取れた画像輝度にする方法を創出することである。
【００１１】
上記の目的は請求項８の特徴を示す方法により達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば検出ユニットの後に、画素内の検出信号を定期的に取得するとともにそれから平均値を算出するデジタル回路が配置され、デジタル回路は、サンプリング時間内で各画素に対して検出信号を定期的に取得するように構成され、走査線内の均一サイズの画素当りのサンプリング時間は、照明光線が標本上を移動する速度に依存して変更可能である。検出ユニットの検出信号がデジタル回路により定期的に取得されて加算されるとともに、検出信号の和が加算された検出信号の数で割られ、デジタル回路が画素内の多数の検出信号を定期的に加算する加算要素を含むとともに、デジタル回路が多数の検出信号の和をそれぞれの画素内の検出信号の数で割る除算要素を含むことがさらに有利である。
【００１３】
新しいサイクルの開始時に加算要素はそのサイクルの第１の走査値を等しくするように設定される。これはクリア動作を排除するため有利である。
【００１４】
デジタル積算が最大デューティサイクルで行われる。実際の積算時間によるリアルタイム除算のため、画像エッジにおける信号対ノイズ比は画像全体に対する固定積算時間と比べて実質的に改善される。
【００１６】
乗算要素がデジタル回路（３０）内で加算要素および除算要素の前に配置されている。
【００１７】
乗算要素が検出信号の増幅を行うことにより、加算要素および除算要素の数値精度を向上させる。
【００１８】
走査顕微鏡には、デジタル回路および検出ユニットのデジタルおよびアナログ増幅の和を生じる利得のための調整要素が装備されている。
【００１９】
検出ユニットのアナログ増幅の非線形性をデジタル回路内での特性曲線の対応する蓄積により補償することができる。検出ユニットはデジタル回路内での増幅により検出ユニットの感度のダイナミクスの向上を達成する特性曲線を有する。
【００２０】
本発明のさらなる有利な実施形態は添付の特許請求の範囲から推断し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の主題を図に概略的に示すとともに図面を参照して以下に説明する。
【００２２】
図１は本発明による装置が実施される共焦点走査顕微鏡１の概略構成を示す。走査顕微鏡は様々な形で実現可能な検出ユニット１９を含む。少なくとも１つの照明系２からの照明光線３はビームスプリッタまたは適当な偏向手段５によって走査装置７に向けられる。照明光線３は偏向手段５に当たる前に照明ピンホール６を通過する。走査装置７は、照明光線３を走査光学系１２および顕微鏡光学系１３を介して標本１５上または内に導く少なくとも１つの走査ミラー９を含む。走査ミラー９は追加的に設けられたモータ（図示せず）、トーションロッドにより駆動可能であり、それによりまた走査ミラー９は共振走査ミラー９としても動作可能である。不透明な標本１５の場合、照明光線３は標本表面上に導かれる。生物標本１５（プレパラート）または透明な標本の場合、照明光線３を標本１５内に導くこともできる。これらの目的のため、非発光プレパラートは適当な染料で規定通りに準備される（従来技術のため記載せず）。標本１５内に存在する染料は照明光線３により励起されてそれらに特有のスペクトルの特性範囲の発光および／または蛍光を発する。標本１５から発した光は検出光線１７を規定する。検出光線１７は顕微鏡光学系１３および走査光学系１２内を進んで、走査モジュール７を介して偏向手段５に到達し、偏向手段５を横断して検出ピンホール１８およびスペクトル生成要素２０（プリズムまたは格子）を通過して検出ユニット１９上に達する。検出ユニット１９を少なくとも１つの光電子増倍管で構成することができる。同様に検出ユニット１９を光電子増倍管アレイまたはＣＣＤチップ、ＥＭＣＣＤチップ、またはＡＰＤアレイで構成することも考えられる。標本１５から発したまたは規定された検出光線１７は図１に破線として示されている。標本１５から発した光の出力レベルに比例する電気検出信号が検出ユニット１９内で生成される。既に前述したように１つの波長だけでない光が標本１５から発せられるため、検出ユニット１９の前に分散要素２０を設けることが有用である。分散要素２０は検出光の個々の波長が空間的に分光されるように検出光線を分光する。分散要素２０の前に配置されているのは検出光線１７を広げて平行にするレンズ２１である。分散要素２０の後に配置されているのは検出光線１７の分光光線２４、２５を検出ユニット１９上に焦点を合わせる追加レンズ２２である。分光光線２４、２５は波長の点で異なるため異なる光電子増倍管に当たるか、または検出器１９がチップとして構成されている場合にはチップの異なる領域に当たる。検出ユニット１９により提供された信号はデジタル回路３０に伝えられ、そこで検出信号の収集が行われる。デジタル回路３０をさらにコンピュータ４２に接続することが可能であり、コンピュータ４２にディスプレイ４８が関連し、そこに例えば画像データを表示することができる。
【００２３】
図２ａは第１の画素サイズを用いてピクセル毎に被検標本１５を走査する手順の概略図である。標本１５は通常標本スライド１５ａ上に載置される。標本１５は走査装置７を用いて照明光線３でＸ座標方向ｘおよびＹ座標方向ｙに走査される。また標本１５の一部分のみを走査することも可能である。各個々の画素Ｐｘ、ｙのサイズはユーザにより選択される設定に基づいている。個々の画素Ｐｘ、ｙのサイズは所望の解像度に応じて選択される。照明光線３により生じた信号が個々の画素Ｐｘ、ｙのサイズによって決定された領域から得られる。画素Ｐｘ１、ｙ４、Ｐｘ２、ｙ４〜Ｐｘ８、ｙ４で構成された図２ａ内に示されている走査線４０は、Ｘ座標方向ｘの走査ミラー９の走査動作の結果生じる。図４は走査ミラー９の走査動作の正弦曲線プロファイル４１を示す。走査線４０内の画素Ｐｘ、ｙの数が任意であることは自明であり、明細書に提示された実施形態は本発明の限定として解釈されることはない。
【００２４】
図２ｂは第２の画素サイズを用いてピクセル毎に被検標本１５を走査する手順の概略図である。ここで照明光線３は図２ａに示された走査線４０の場合より多くの画素Ｐｘ、ｙから構成された走査線４０を描く。画素Ｐｘ１、ｙ６、Ｐｘ２、ｙ６〜Ｐｘ１６、ｙ６で構成された図２ｂ内に示された走査線４０は、Ｘ座標方向ｘの走査ミラー９の走査動作の結果生じる。
【００２５】
図３はデジタル回路３０の構成の概略図である。デジタル回路３０は検出ユニット１９（図１参照）の後に配置されており、その回路は画素Ｐｘ、ｙ内の検出信号を定期的に取得（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）してそこから平均値を算出する。デジタル回路３０は画素Ｐｘ、ｙ内の複数の定期的検出信号を加算する加算要素３１を含む。デジタル回路３０は複数の検出信号の和をそれぞれの画素Ｐｘ、ｙ内で加算された検出信号の数で割る除算要素３２をさらに含む。本発明のさらなる実施形態において乗算要素３３がデジタル回路３０内で加算要素３１および除算要素３２の前に配置されている。デジタル乗算（加算要素３１およびその後の除算要素３２の前）により、信号増幅を達成して数値精度を向上させることもできる。平均化の結果、検出ユニット１９の出力値ひいては画像輝度が走査速度および走査形式に関係依存しない。平均化はさらに出力データのノイズを減少させるとともに、デジタル化エラー（「異常値」）も最低限に抑える。デジタル化の結果、例えばアナログ構成要素のパラメータドリフトなど（温度、エージング、構成要素公差による）の干渉効果が低減または排除される。
【００２６】
図４は均一サイズの画素Ｐｘ１、ｙ４、Ｐｘ２、ｙ４〜Ｐｘ８、ｙ４に対する異なるサンプリング時間Ｔ１、Ｔ２〜Ｔ８のグラフ図である。走査線４０当りの画素数は図２ａに示された数に対応している。ほぼ正弦曲線プロファイル４１は少なくとも１つの走査ミラー９に適用された制御に支配されている。異なるサンプリング時間Ｔ１、Ｔ２またはＴ８内で、各画素Ｐｘ、ｙに対して一定の数の検出信号がデジタル回路３０により検出ユニット１９によって定期的に取得されて加算される。取得された検出信号の数は設定されたクロック周波数に基づいている。個々の画素Ｐｘ、ｙが隙間なく互いに隣接しているため、標本１５から情報が失われないことは図４から明らかである。アナログ積分器のクリア時間を排除できることから、アナログ積算と比べて各画素Ｐｘ、ｙに対する最適な計測時間も保証される。タイミングサイクルのため加算／積算要素のクリアまたは待機時間による時間損失が生じない。本発明はさらにまた走査点または照明光線３が標本１５上を移動する速度の関数としての可変サイクル時間を可能にする。サイクル時間は無制限に選択可能である。標本１５上の走査点の瞬間速度を一致させるように選択できる。
【００２７】
図５は得られる利得の関数としての検出ユニット１９における電圧のグラフ図である。電圧（ボルト）が横座標５０に、利得が縦座標５１にプロットされている。検出ユニット１９はこの場合光電子増倍管であり、電圧の関数としての光電子増倍管（アナログ増幅）の利得が破線曲線５２として示されている。デジタル回路の乗算要素３３により達成された利得（デジタル増幅）が点線曲線５３として示されている。アナログ増幅とデジタル増幅の和が実線曲線５４として示されている。光電子増倍管における電圧の関数としての非線形アナログ増幅の均等化は、デジタル回路３０でのデジタル増幅時に対応する補償により達成される。状況に応じて異なる利得挙動を設定することもできる。ここで提案される方法により、より広い検出範囲にわたり最適動作点で光電子増倍管を作動させることが可能である。最適動作点は５００Ｖ〜１０００Ｖである。また検出ユニット１９の感度は検出信号のレベルに依存するため、非線形特性曲線を用いてダイナミクスを向上させることもできる。
【００２８】
図６は少なくとも１つの検出ユニット１９と検出信号を評価するデジタル回路３０とを有する走査顕微鏡１を概略的に示す。また調整要素６０も設けられ、それによりユーザは利得または増幅を調整することができる。同様に調整要素６０をユーザに対してコンピュータ４２のディスプレイ４８上に示すことも考えられる。デジタル回路３０および検出ユニット１９に対するデジタルおよびアナログ増幅の適当な組み合わせは、両方の増幅が同時に変化する場合に存在する。しかしユーザにとっては調整要素６０上に１つの利得ノブ６１があるだけである。デジタルおよびアナログ増幅の別々の調整も同様に考えられる。その結果２つの調整要素（図示せず）がこのために必要になる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】検出ユニットと検出信号の評価のためのデジタル回路とを有する走査顕微鏡を概略的に示す。
【図２ａ】第１の画素サイズを用いてピクセル毎に被検標本を走査する手順の概略図である。
【図２ｂ】第２の画素サイズを用いてピクセル毎に被検標本を走査する手順の概略図である。
【図３】デジタル回路の構成の概略図である。
【図４】均一サイズの画素に対する異なるサンプリング時間を図示する。
【図５】得られる利得の関数としての検出ユニットにおける電圧を図示する。
【図６】検出ユニットと検出信号の評価のためのデジタル回路とを有するとともに、増幅用調整要素を有する走査顕微鏡を概略的に示す。
【符号の説明】
【００３０】
１共焦点走査顕微鏡
２照明系
３照明光線
５偏向手段
６照明ピンホール
７走査装置
９走査ミラー
１２走査光学系
１３顕微鏡光学系
１５標本
１５ａ標本スライド
１７検出光線
１８検出ピンホール
１９検出ユニット
２０分散要素
２１レンズ
２２追加レンズ
２４分光光線
２５分光光線
３０デジタル回路
３１加算要素
３２除算要素
３３乗算要素
４０走査線
４１正弦曲線プロファイル
４２コンピュータ
４８ディスプレイ
５０横座標
５１縦座標
５２破線曲線
５３点線曲線
５４実線曲線
６０調整要素
６１利得ノブ
Ｐ画素
Ｔサンプリング時間
【図１】
0005264064.tif 000002
【図２ａ】
0005264064.tif 000003
【図２ｂ】
0005264064.tif 000004
【図３】
0005264064.tif 000005
【図４】
0005264064.tif 000006
【図５】
0005264064.tif 000007
【図６】
0005264064.tif 000008