(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療又は予防するための組成物であって、
LLTFWNPPV（配列番号４）、
KVFGSLAFV（配列番号７）、
KLBPVQLWV（配列番号６）（但し、配列番号６において、「B」はα−アミノ酪酸又はシステインである。）、
SMPPPGTRV（配列番号５）、
YLSGADLNL（配列番号８）、
IMIGHLVGV（配列番号９）、
KVAEIVHFL（配列番号１０）、
RLLQETELV（配列番号２）、
YLQLVFGIEV（配列番号３）、及び
aKXVAAWTLKAAa（配列番号１）（但し、配列番号１において、「a」はＤ−アラニン又はＬ−アラニンであり、「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン又はチロシンである。）を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記癌が、
a.  結腸癌；
b.  非小細胞肺癌（NSCLC）;
c.  乳癌；
d.  卵巣癌；並びに
e.  頭及び／又は首の癌
からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
アジュバントをさらに含む、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記アジュバントがミネラル油アジュバントである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
配列番号１において、最初の「a」がＬ−アラニンであり、最後の「a」がＤ−アラニンである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項６】
配列番号１において、「a」がＤ−アラニンである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項７】
配列番号１において、「X」がシクロヘキシルアラニンである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項８】
配列番号１において、最初の「a」がＬ−アラニンであり、最後の「a」がＤ−アラニンであり、「X」がシクロヘキシルアラニンである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項９】
配列番号１において、「a」がＤ−アラニンであり、「X」がシクロヘキシルアラニンである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号６において、「B」がα−アミノ酪酸である、請求項１又は２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学の分野に関する。具体例では本発明は、選択された腫瘍関連抗原に対する免疫応答を追跡または誘発するのに有用なペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法の分野は、改良された癌ワクチンの開発を含む癌の治療に対する新しいアプローチを与えている（Krul, K.G., Decision Resources, 10.1-10.25 (1998)）。ワクチンは腫瘍細胞に対する免疫応答を指令する機構を提供するが、腫瘍細胞が免疫学的プロセスを避ける多くの機構が存在する（Pardoll, D.M., Nature Medicine (Vaccine Supplement), 4:523-531 (1998)）。最近の進歩は、インターロイキン-2または自己樹状細胞（DC）の使用のような免疫応答の刺激を増強するアプローチと組合せると、ペプチドワクチンの効力が上昇することを示している（Abbasら編、「細胞と分子免疫学（Cellular and Molecular Immunology）」、第3版、ダブリュー・ビー・ソンダーズ社（W.B. Saunders Company）発行(1997)）。
【０００３】
第I相試験でMurphyらは、前立腺特異抗原（PSA）中に存在する配列に対応するヒト白血球抗原（HLA）-A2-結合ペプチドが、前立腺癌患者の特異的細胞障害性Ｔ細胞リンパ球を刺激することを証明した（Murphyら、The Prostate 29:371-380 (1996)）。Rosenbergらは、転移性黒色腫患者を治療するための癌ワクチンとしての黒色腫関連抗原gp100から得られる合成HLA-A2結合ペプチドの安全性と活性機構を評価した（Rosenbergら、Nature Med. 4:321-327 (1998)）。免疫学的測定法に基づき、91％の患者が合成ペプチドによりうまく免疫された。さらにペプチドワクチンをIL-2治療と併用した患者の42％（13／31）は、客観的な癌応答を示した。さらにNestleらは、ペプチドパルスまたは腫瘍溶解物パルスDCによる16人の黒色腫患者のワクチン接種を報告した（Nestleら、Nature Med 4:328-332 (1998)）。ペプチドパルスDCは、1〜2つのペプチドからなるワクチンで免疫した11／12患者で免疫応答を誘導した。客観的な応答は、試験で評価した5／16（3つはペプチドパルス、2つは腫瘍溶解物パルス）患者で明白であった。これらの第Ｉ相安全性試験は、既知の腫瘍関連抗原のHLA-A2結合ペプチドが予測された作用機構を示すという証拠を与えた。少なくとも4つの癌抗原（CEA、HER2/neu、MAGE2、MAGE3）が開示されている（Kawashimaら、Human Immunology, 59:1-14 (1998)）。
【０００４】
前臨床試験は、ワクチンパルスDCが抗原特異的CTLの刺激を介して抗腫瘍作用を仲介することを証明した（Mandelboimら、Nature Med. 1:1179-1183 (1995)）；Celluzziら、J. Exp. Med. 183:28-287 (1996)；Zitvogelら、J. Exp. Med. 183:87-97 (1996)；Mayordomoら、Nature Med. 1:1297-1302 (1995)）。CTLは腫瘍細胞を直接溶解し、また腫瘍細胞に対する免疫反応性をさらに増幅するインターフェロンガンマ（IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNF）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のような一連のサイトカインを分泌する。CTLは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した8〜11アミノ酸残基ペプチドエピトープからなる複合体の形の腫瘍関連抗原（TAA）を認識する（Schwartz, B.D. 「基礎および臨床免疫学におけるヒト主要組織適合遺伝子複合体HLA（The human major histocompatibility complex HLA in basic & clinical immunology）」、Stitesら編、ランゲメディカルパブリケーション（Lange Medical Publication: ロスアルトス（Los Altos）、 52-64頁、第4版）。ペプチドエピトープは、タンパク質の細胞内プロセシングにより生成する。プロセシングされたペプチドは新たに合成されたMHC分子に結合し、エピトープ-MHC複合体が細胞表面に発現される。これらのエピトープ-MHC複合体は、CTLのＴ細胞受容体により認識される。この認識イベントには、CTLの活性化ならびにエフェクター機能の誘導（例えば標的腫瘍細胞の溶解）が必要である。
【０００５】
MHC分子は、Ｔ細胞応答を制御する高度に多型性のタンパク質である（Schwartz, B.D. 「基礎および臨床免疫学におけるヒト主要組織適合遺伝子複合体HLA（The human major histocompatibility complex HLA in basic & clinical immunology）」、Stitesら編、ランゲメディカルパブリケーション（Lange Medical Publication）、ロスアルトス（Los Altos）、 52-64頁、第4版）。ヒトでCTLエピトープを示す種特異的MHC同族体は、ヒト白血球抗原（「HLA」）と呼ばれる。HLAクラスI分子は、同様のペプチド群に結合する能力に基づいて、いくつかのファミリーまたは「サブタイプ」に分けられる。複数のHLAサブタイプに結合するワクチン（例えばA2、A3、およびB7）は、広く人種的に偏らない集団をカバーする。表9に示すように集団のカバー範囲は種々の人種の84〜90％であり、サンプリングした人種の約87％である。
【０００６】
免疫応答における宿主と疾患の間の動的な相互作用に関与する主要な要因の1つは、病原体、感染細胞、または悪性腫瘍細胞に対する免疫応答である。多くの症状で免疫応答は疾患を制御する。いくつかの動物モデル系およびヒトの自然感染の前向き研究は、病原体に対する免疫応答が病原体を制御し、いくつかの疾患への進行を防止し、および／または病原体を排除することを示唆する。共通のテーマは、多重特異的Ｔ細胞応答の必要性であり、応答の焦点が狭いとあまり有効ではないようである。
【０００７】
癌では、免疫応答が新生物増殖に影響を与えることを示すいくつかの知見がある。
【０００８】
まず、多くの異なる動物モデルにおいて、MHCクラスＩにより制限される抗腫瘍Ｔ細胞は、腫瘍を予防または治療することができる。
【０００９】
第2に、免疫療法治験から有望な結果が得られている。
【００１０】
第3に、自然の疾患過程での観察結果は、腫瘍内のＴ細胞浸潤のタイプと組成に相関し、有望な臨床的結果が得られている（Coulie PGら、Advances in Cancer Research 213-242, 1999中の黒色腫患者の作業中の抗腫瘍免疫）。
【００１１】
さらに腫瘍は一般的に変異する能力を有し、その免疫学的認識を変化させる。例えば単一特異的CTLの存在はまた、抗原の喪失が出現するまで、腫瘍増殖の制御と相関した（Riker ら、黒色腫の抗原種免疫療法後の免疫選択、Surgery, Aug:126(2): 112-20, 1999; Marchang Mら、腫瘍退縮がMAGE-3遺伝子から得られる抗原性ペプチドで治療した転移性黒色腫患者で観察され、HLA-A1により提示された、Int. J. Cancer 80(2):219-30, Jan. 18, 1999）。同様に国立癌研究所（National Cancer Institute）で免疫療法を受けた後の黒色腫患者から樹立された5/13株でベータ2マイクログロブリンの喪失が検出された（Restifo NPら、免疫療法を受けている5人の患者からの転移性黒色腫中の機能性ベータ2マイクログロブリンの喪失、Journal of the National Cancer Institute, Vo. 88(2), Jan. 1996）。HLAクラスIは種々のタイプの腫瘍でしばしば変化していることが認識されている。この観察結果により、この現象が、クラスＩ制限CTLにより腫瘍上に加えられる免疫圧力を反映しているという仮説が立てられた。HLAクラスＩ発現の変化の範囲と程度は、過去の免疫圧力を反映しているかもしれず、また予知的価値があるかも知れない（van Duinen SGら、黒色腫患者の運動領域的（locoregional）転移と疾患の臨床経過におけるHLA抗原のレベル、Cancer Research 51:729-736, Jan. 1991）。まとめると、これらの観察結果は、癌と感染性疾患の免疫療法の妥当性を提供し、疾患に関連する複雑な一連の病的変化を防ぐのに必要な方策であることを示唆する。
【００１２】
クラスＩ発現の変化の頻度は多くの研究の課題である（Algarra Iら、腫瘍免疫学におけるHLA岐路、Human Immunology 61:65-73, 2000）。ReesとMianは、腫瘍の3〜20％で対立遺伝子喪失が起きており、腫瘍の15〜50％に対立遺伝子欠失が起きていると予測している。各細胞は2つの異なるセットのクラスＩ遺伝子を有し、各遺伝子が1つのHLA-A遺伝子座とHLA-B遺伝子座とを有することに注目されたい。すなわち完全にヘテロ接合性の個体は2つの異なるHLA-A分子と2つの異なるHLA-B分子とを有する。従って特定の対立遺伝子の実際の喪失頻度は、全体の頻度のわずか4分の1であろう。これらはまた、一般に正常細胞、原発性腫瘍、および転移腫瘍の間に発現の勾配が存在することに注目している。Nataliと共同研究者の研究（Natali PGら、ヒトの固形腫瘍におけるHLAクラスＩ多型性決定基の発現の選択的変化、PNAS USA 86:6719-6723, September 1989）では、W6/32抗体を使用して総HLA発現について、およびBB7.2抗体の使用により評価されるようにA2抗原の対立遺伝子特異的発現について、固形腫瘍が研究された。腫瘍試料は、13の異なるタイプの腫瘍について原発性または転移性腫瘍から得られ、20％未満なら「陰性」、30〜80％の範囲なら「低下」、そして80％より大きいなら「正常」としてスコア化された。すべての腫瘍（原発性と転移性）はW6/32を有してHLA陽性であった。A2発現について、16.1％の症例で低下が見られ、39.4％の症例では検出されないと判定された。Garridoと共同研究者（Garrido Fら、腫瘍成長中のHLA発現の自然の歴史、Immunol Today 14(10):491-99, 1993）は、良性から最も進行性までの進行のある特定の段階でHLA変化が起きるらしいことを強調している。Jiminezら（Jiminez Pら、HLA発現の完全喪失の異なる機構を有する腫瘍のマイクロサテライトの不安定性分析、Cancer Immunol Immunother 48:684-90, 2000）は、118個の異なる腫瘍を分析した（68結腸直腸癌、34咽頭癌、16黒色腫）。HLA発現の完全喪失に報告される頻度は、結腸が11％、黒色腫が18％、咽頭が13％であった。すなわちHLAクラスＩ発現は、おそらく免疫圧力の反映として、または疾患細胞の病態変化と改変の蓄積の反映として、多くのタイプの腫瘍で変化した。
【００１３】
多くの腫瘍がHLAクラスＩを発現し、一般的傾向では、より重症の変化はより後期のあまり分化していない腫瘍にあった。このパターンは、特に1)比較的低感度の免疫組織化学試験法のために、腫瘍中のHLA発現がより少なく見積もられている；2)局所的炎症およびリンホカイン放出の結果として腫瘍細胞中でクラスＩ発現を誘導することができる；および3)クラスＩ陰性細胞はNK細胞による溶解に対して感受性である、ことを考慮すると、免疫療法の観点からは有望なものである。
【００１４】
現在、癌治療の分野には多くの満たされていないニーズが存在する。これは、癌治療に使用される既存の治療法に関連する副作用と、現在の治療法で治療されるのは50％未満の患者であるという事実により証明される。従って、応答速度を上昇させ、応答期間を延長し、総合的な生存率を上昇させ、疾患の無い期間を増加させ、および／またはクオリティオブライフを上昇させる能力を有するものについて機会が存在する。
【発明の開示】
【００１５】
ある例で本発明は、1つ以上のHLA-A2エピトープおよび／またはHLA-A2類似体からなる単離されたペプチドに関する。このペプチドは、複数のエピトープおよび／または類似体を含み、追加のアミノ酸残基（特に限定されないが他のCTLエピトープ、遍在するHTLエピトープ、HTLエピトープ、リンカー、スペーサー、担体などがある）を含む。
【００１６】
さらなる例では本発明は、かかるペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１７】
さらなる例では本発明は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のペプチドエピトープおよび／または類似体を含む組成物に関する。これらの例の1つ以上のペプチドおよび／または類似体はまた、特に限定されないが、CTLエピトープ、HTLエピトープ、遍在するHTLエピトープ、リンカー、スペーサー、担体などを含む追加のアミノ酸残基をさらに含む。
【００１８】
さらなる例において本発明は、1つ以上の上記ペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、および1つ以上の追加の成分を含む組成物に関する。追加の成分は、希釈剤、賦形剤、HTLエピトープ、担体、リポソーム、HLA重鎖、β2マイクログロブリン、ストレプトアビジン、抗原提示細胞、アジュバントなどを含む。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を追跡するために、または特に1つ以上のペプチドが組合わされと時、免疫系の細胞部分を刺激する癌ワクチンを作成するために使用することができるペプチドを提供する。具体例では組成物は、HLA-A2および／またはHLA-A2サブタイプの少なくとも1つの対立遺伝子を有する個体の腫瘍に対する免疫応答を仲介する。かかる組成物は、一般にA2組成物（またはそれらの組合せ）と呼ぶ。
【００２０】
A2組成物は例えばワクチンとして作用して、免疫系を刺激して腫瘍細胞を認識および死滅させ、癌を治療される患者のクオリティオブライフが上昇し、および／または疾患の無い期間または全体的な生存率が延長する。好適例では本発明の組成物（例えばワクチン）が、そこからエピトープまたは類似体が選択された少なくとも1つのTAA（例えば、CEA、p53、HER2/new、MAGE2/3）を発現する癌（例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、および胃癌、およびMAGE2/3についていくつかの黒色腫がある）を有するHLA-A1またはHLA-A2サブタイプ陽性個体に投与される。こうして、A2組成物（例えばワクチン）は、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、または胃癌、または黒色腫について治療されている患者の治療基準を改善する。
【００２１】
本発明のA2組成物（例えばワクチン）は、本明細書に記載のように、A2モチーフまたはA2スーパーモチーフ（A2エピトープおよび／またはA2類似体）を有するペプチド、および／またはかかるペプチドをコードする核酸を含む。かかる組成物はまた、パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープを含む。
【００２２】
本発明のペプチドおよび対応する核酸および組成物は、CTLおよび随時HTL応答の産生（例えば治療的予防）を刺激することによりTAAに対する免疫応答を刺激するのに有用であり、免疫応答を追跡（診断と予後）するのにも有用である。天然のTAAタンパク質アミノ酸配列から直接または間接（すなわち類推により）得られるA2エピトープを含有するペプチドは、HLA分子に結合し、TAAに対する免疫応答を刺激することができる。本明細書の配列番号11〜15に記載のように分析したTAAタンパク質の完全な配列は、ジーンバンク（GenBank）から得られる。表11を参照されたい。
【００２３】
本発明のエピトープは、後述するように多くの方法で同定されている。また、本発明の例も詳細に考察され、ここではHLA分子またはＴ細胞受容体に対する結合活性改変（例えば、改良）された免疫原性を示す類似体を作成するために具体的なアミノ酸残基が修飾された類似体が得られている。
【００２４】
定義
本発明は、以下の説明を参照することによりさらによく理解される。
【００２５】
本開示を通して、「結合データ」の結果は「IC50」で表される。IC50は、結合測定法で参照ペプチドの結合の50％の阻害が観察されるペプチドの濃度である。測定法が行われる条件が与えられる（すなわち、HLAタンパク質および標識ペプチド濃度が限定される）と、これらの値はKD値に近くなる。結合を測定するための方法は、例えばPCT公報WO94/20127号およびWO94/03205号、および他の刊行物、例えばSidneyら、「免疫学の現代のプロトコール（Current Protocols in Immunology）」18.3.1 (1998)；Sidneyら、J. Immunol. 154:247 (1995)；およびSetteら、Mol. Immunol. 31:813 (1994)に記載されている。測定条件が変化した場合、および使用される具体的な試薬（例えばHLA調製など）により、IC50値はしばしば劇的に変化し得ることに注意されたい。例えば過剰のHCL分子濃度は、あるリガンドの見かけの測定IC50を上昇させるであろう。
【００２６】
あるいは、結合は参照タンパク質に対して表される。特定の測定法がより高感度または低感度になると、試験されるペプチドのIC50は少し変化するが、参照ペプチドに対する結合は大きく変化はしない。例えば参照ペプチドのIC50が10倍上昇するような条件下で行われる測定法では、試験ペプチドのIC50値もまた約10倍移動する。従ってあいまいさを避けるために、ペプチドが良好（すなわち、高い）な、中程度の、弱い、または陰性の結合物であるかどうかの評価は、一般に標準的ペプチドのIC50に対するIC50に基づく。本出願に含めた表は、結合データを好適な生物学的に関連する型のIC50 nMで示す。
【００２７】
結合は、以下を含む他の測定系を使用して決定してもよい：生きた細胞（例えば、Ceppelliniら、Nature 339:392 (1989); Christnickら、Nature 352:67 (1991); Buschら、Int. Immunol. 2:443 (1990); Hillら、J. Immunol. 147:189 (1991)；del Guercioら、J. Immunol. 154:685 (1995)、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、Cerundoloら、J. Immunol. 21:2069 (1991)、固定化された精製されたMHC（例えば、Hillら、J. Immunol. 152, 2890 (1994)；Marshallら、J. Immunol. 152:4946 (1994)）、ELISA系（例えば、Reayら、EMBO. J. 11:2829 (1992)）、表面プラズモン共鳴（例えば、Khilkoら、J. Biol. Chem. 268:15425 (1993)）；高フラックス可溶性相測定法（Hammerら、J. Exp. Med. 180:2353 (1994)）、およびクラスＩ MHC安定化または組み立て（例えば、Ljunggrenら、Nature 346:476 (1990)；Schumacherら、Cell 62:563 (1990)；Townsendら、Cell 62:285 (1990)；parkerら、J. Immunol. 149:1896 (1992)）。
【００２８】
本明細書においてHLAクラスＩ分子について「高親和性」は、IC50またはKD値が50nMまたはそれ以下である結合、「中親和性」は、IC50またはKD値が50〜約500nMである結合、「弱親和性」は、IC50またはKD値が約500〜約5000nMである結合として定義される。HLAクラスII分子について「高親和性」は、IC50またはKD値が100nMまたはそれ以下である結合、「中親和性」は、IC50またはKD値が100〜約1000nMである結合として定義される。
【００２９】
「コンピューター」または「コンピューターシステム」は一般に以下を含む：プロセッサーと関連するコンピュータープログラム；少なくとも1つの情報保存／呼び出し装置、例えばハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブ；少なくとも1つの入力装置、例えばキーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロホン；およびディスプレイ構造体、例えばスクリーンまたはプリンター。さらにコンピューターは、ネットワークと連通したコミュニケーションチャネルを含んでよい。かかるコンピューターは、上記より多くまたは少なく含んでよい。
【００３０】
「交差反応性結合」は、ペプチドに2つ以上のHLA分子が結合していることを示し、同義語は縮重結合である。
【００３１】
エピトープを説明するのに使用される時、用語「得られる」は「調製される」と同義である。得られるエピトープは、天然の供給源から単離できるか、または当該分野の標準的プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、人工的アミノ酸残基「アミノ酸模倣物」、例えば天然に存在するLアミノ酸残基のD異性体または非天然のアミノ酸残基（例えばシクロヘキシミド）を含むことができる。得られたかまたは調製されたエピトープは、天然のエピトープの類似体でもよい。
【００３２】
「希釈剤」は、水や油のような無菌液体を含み、石油、動物、植物、または合成起源のものを含み、例えばピーナツ油、ダイズ油、ミネラル油、ゴマ油などがある。水は医薬組成物の好適な希釈剤である。食塩水溶液と水性ブドウ糖およびグリセロールもまた、特に注射溶液用の希釈剤として使用することができる。
【００３３】
「優性エピトープ」は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体またはHLA分子に認識される部位を一緒に形成する、1次、2次、および3次ペプチド構造のような分子のまとめた特徴である。あるいはエピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞に関連して、Ｔ細胞受容体および／または主要組織適合遺伝子複合体（MHC）受容体による認識に必要なアミノ酸残基のセットとして定義される。エピトープは自然に存在し、ヒトにより単離されるか、精製されるか、または調製されるか得られる。例えばエピトープは、天然の供給源から単離して調製されるか、または当該分野で公知の標準的プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、人工的アミノ酸残基、「アミノ酸模倣物」、例えば天然に存在するLアミノ酸残基のD異性体または天然に存在しないアミノ酸残基（例えばシクロヘキシルアラニン）を含む。本開示を通してエピトープは、ある場合にはペプチドまたはペプチドエピトープとして記載される。本発明のエピトープと類似体を、表1に示す。
【００３４】
本発明のエピトープまたは類似体または追加のアミノ酸を含むタンパク質またはペプチドもまた、本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。ある例では、ペプチドは抗原の断片を含む。「抗原の断片」または「抗原性断片」または単に「断片」は、野生型抗原またはその天然に存在する変更態様と100％の同一性を有する抗原の部分である。断片は本発明のエピトープを含んでも含まなくてもよい。断片は600アミノ酸残基以下であるか、500アミノ酸残基以下であるか、400アミノ酸残基以下であるか、250アミノ酸残基以下であるか、100アミノ酸残基以下であるか、85アミノ酸残基以下であるか、75アミノ酸残基以下であるか、65アミノ酸残基以下であるか、または50アミノ酸残基以下である。ある例では断片は、例えば101アミノ酸残基未満の長さ、または51アミノ酸残基未満の長さであり、任意の変化量で5アミノ酸残基までの長さである。例えば断片は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100アミノ酸残基の長さでもよい。好適例ではペプチドは9、10、または11アミノ酸残基の長さである。
【００３５】
ある例では、本発明のペプチドの長さに対する制限がある。長さが制限される例は、本発明のエピトープを含むタンパク質またはペプチドが天然の配列と100％の同一性を有する領域を含む（すなわちアミノ酸残基の連続）時に起きる。例えば全天然の分子を読むことによるエピトープの定義を避けるために、天然のペプチド配列と100％同一性を有する任意の領域の長さに対する制限がある。すなわち本発明のエピトープを含むペプチドおよび天然のペプチド配列と100％同一性を有する領域について、天然の配列と100％同一性を有する領域は以下の長さを有する：600アミノ酸残基以下であるか、500アミノ酸残基以下であるか、400アミノ酸残基以下であるか、250アミノ酸残基以下であるか、100アミノ酸残基以下であるか、85アミノ酸残基以下であるか、75アミノ酸残基以下であるか、65アミノ酸残基以下であるか、または50アミノ酸残基以下。ある例では本発明の「エピトープ」は、例えば天然のペプチド配列と100％同一性を有する51アミノ酸残基未満の長さであり、任意の変化量で5アミノ酸残基までの長さである：例えば、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸残基。
【００３６】
従って、天然のペプチド配列と100％同一性を有する600アミノ酸残基より大きい連続的配列を含まないなら、600アミノ酸残基より長いペプチドまたはタンパク質配列は本発明の範囲内である。天然の配列と一致する5つの連続的残基またはそれ以下を有する任意のペプチドについては、本発明の範囲内に入るためにそのペプチドの最大長さの制限は無い。本発明のペプチド（例えば、本発明のエピトープを含むペプチド）は、600残基未満の長さで8アミノ酸残基までの任意の範囲の長さであることが好ましい。好適例では本発明のペプチドは、9、10または11アミノ酸残基の長さである。
【００３７】
「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、HLAクラスＩまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質である（例えば、Stitesら編、「免疫学（Immunology）」、第8版、ランゲパブリケーション（Lange Medical Publication）、ロスアルトス（Los Altos）、 カリホルニア州（1994)を参照）。
【００３８】
本明細書において「HLAサブタイプまたはHLAファミリー」は、共有されたペプチド結合特異性に基づいて分類されたHLA分子のセットである。いくつかのアミノ酸モチーフを有するペプチドの同様の結合親和性をある程度共有するHLAクラスＩ分子は、かかるHLAサブタイプ中に分類される。用語HLAスーパーファミリー、HLAスーパータイプファミリー、HLAファミリー、およびHLAxx様分子（ここで「xx」は特定のタイプのHLAを示す）は同義である。例えばHLA-A2モチーフとスーパーモチーフは、表4に詳細に説明されている。
【００３９】
本明細書においてHLAクラスＩ分子について「高親和性」は、IC50またはKD値が50nMまたはそれ以下で結合；「中親和性」は、IC50またはKD値が約50〜約500nMで結合；「弱親和性」は、IC50またはKD値が約500〜約5000nMで結合するとして定義される。HLAクラスII分子について「高親和性」は、IC50またはKD値が100nMまたはそれ以下で結合；「中親和性」は、IC50またはKD値が約100〜約1000nMで結合。「結合データ」を参照されたい。
【００４０】
「IC50」は、結合測定法において参照ペプチドの結合の50％阻害が観察されるペプチドの濃度である。測定法が行われる条件が与えられる（すなわち、HLAタンパク質および標識ペプチド濃度が限定される）と、これらの値はKD値に近くなる。「結合データ」を参照されたい。
【００４１】
2つ以上のペプチド配列または抗原断片について用語「同一の」または「同一性」は、配列比較アルゴリズムまたは用手的位置合わせおよび視覚化検査により測定すると、比較範囲内で最大の応答と比較するかまたは整列させると、2つ以上の配列またはサブ配列が同じであるか、または同じであるアミノ酸残基の特定の割合を有することを意味する。
【００４２】
「免疫原性」ペプチドまたは「免疫原性」エピトープまたは「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがHLA分子に結合し、CTLおよび／またはHTL応答を誘導するような対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。すなわち本発明の免疫原性ペプチドは、適切なHLA分子に結合することができ、次にペプチドに対する細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）応答またはヘルパーＴリンパ球（HTL）応答を誘導することができる。
【００４３】
用途「単離された」または「生物学的に純粋」とは、天然の状態の時に通常存在するような成分を実質的にまたは基本的に含まない物質を意味する。すなわち本発明の単離されたペプチドは好ましくは、その本来の環境で通常ペプチドに結合している物質を含有しない。「単離された」エピトープは、そこからエピトープが得られた抗原の全配列を含まないエピトープを意味する。代表的には「単離された」エピトープは、天然の配列の全長にわたって100％同一性を有する配列を与える追加のアミノ酸残基はそこに結合していない。天然の配列は、そこからエピトープが得られる腫瘍関連抗原のような配列でもよい。用語「単離された」は、その物質が本来の環境（例えば、それが天然に存在する環境）から分離されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはペプチドは単離されていないが、天然の系で共存する物質の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターでもよく、および／またはかかるポリヌクレオチドまたはペプチドは組成物の一部でもよく、かつそれでもかかるベクターまたは組成物は天然の環境の一部ではないという点で「単離されている」。単離されたRNA分子には、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロのRNA転写体を含み、このような合成的に産生される分子をさらに含む。
【００４４】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、物理的免疫応答を引き起こす細胞の相互作用の制御に役割を果たす遺伝子の集合である。ヒトではMHC複合体はまた、ヒト白血球抗原（HLA）複合体としても知られている。MHCとHLA複合体の詳細な説明については、Paul、「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」、第3版、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨーク (1993)を参照されたい。
【００４５】
「天然の」または「野生型」配列とは、自然に存在する配列を意味する。かかる配列は、自然のより長い配列を含むことがある。
【００４６】
「負の結合残基」または「有害残基」は、ペプチドエピトープのある位置（代表的には、主要なアンカー位置ではない）に存在すると、その対応するHLA分子に対するペプチドの結合親和性を低下させるアミノ酸残基である。
【００４７】
用語「ペプチド」および「ペプチドエピトープ」は、本明細書において「オリゴペプチド」と同義に使用され、代表的にはα−アミノ酸と隣接アミノ酸残基のカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合した一連の残基（代表的にはL-アミノ酸残基）を示す。
【００４８】
「合成ペプチド」は、非天然供給源から得られる（例えばヒトが作成した）ペプチドを意味する。かかるペプチドは、化学合成または組換えDNA技術のような方法を使用して産生される。「合成ペプチド」は「融合タンパク質」を含む。
【００４９】
「PanDR結合」ペプチド、「PanDR結合エピトープ」、または「パドレ（PADRE）（登録商標）」エピトープ（エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州）は、2つ以上のHLAクラスII DR分子に結合する分子ファミリーのメンバーである。分子のパドレ（PADRE）（登録商標）ファミリーを規定するパターンは、HLAクラスIIスーパーモチーフと呼ぶことができる。パドレ（PADRE）（登録商標）分子はHLA-DR分子に結合し、インビトロおよびインビボでヒトのヘルパーＴリンパ球（HTL）応答を刺激する。パドレ（PADRE）（登録商標）ファミリーのさらなる定義については、同時係属出願である米国特許出願第09/709,774号（2000年11月11日出願）；および09/707,738号（2000年11月16出願）；およびPCT公報WO95/07707号およびWO97/26784号；米国特許第5,736,142号（1998年4月7日発行）；5,679,640号（1997年10月21日発行）；および6,413,935号（2002年1月2日発行）を参照されたい。
【００５０】
「薬剤学的に許容される」とは、一般に非毒性、不活性、および／または生理学的に適合性のある本発明の組成物または成分を意味する。
【００５１】
「医薬賦形剤」または「賦形剤」は、アジュバント、担体、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、保存剤などの物質を含む。「医薬賦形剤」は、薬剤学的に許容される賦形剤である。
【００５２】
用途「モチーフ」は、規定の長さのアミノ酸配列中の残基のパターンを意味し、好ましくは長さが約15未満のアミノ酸残基のペプチド、または長さが約13未満のアミノ酸残基のペプチド、通常クラスＩ HLAモチーフについて約8〜約13アミノ酸残基（例えば、8、9、10、11、12、または13）、およびクラスII HLAモチーフについて約6〜約25アミノ酸残基（例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25）を意味し、これは特定のHLA分子により認識される。モチーフは代表的には、あるヒトHLA対立遺伝子によりコードされる各HLAタンパク質について異なる。これらのモチーフはしばしば、その1次および2次アンカー残基パターンが異なる。好適例ではMHCクラスＩモチーフは、長さが9、10、または11アミノ酸残基のペプチドを特定する。
【００５３】
「スーパーモチーフ」は、2つ以上のHLA対立遺伝子によりコードされるHLA分子が共有するペプチド結合特異性である。好ましくはスーパーモチーフ結合ペプチドは、2つ以上のHLA抗原により高または中親和性（本明細書で定義された）で認識される。
【００５４】
「1次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとHLA分子との1次接触点を与えると理解されるペプチド配列に沿った特定の位置のアミノ酸である。規定の長さのペプチド内の1、2または3つの1次アンカー残基が最小で、ある免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、その側鎖が結合溝自体の特異的ポケットに埋められて、HLA分子のペプチド結合溝と密接に接触して適合すると理解される。HLAクラスＩモチーフのある例では、1次アンカー残基は、本発明のペプチドエピトープの位置2（アミノ末端位置から）およびカルボキシ末端位置に存在する。A2モチーフとHLAクラスＩのスーパーモチーフの1次アンカー位置は、表3、3a および4に記載される。例えばこれらのアンカー位置の特定の残基の有無を変化させることにより、類似体ペプチドを得ることができる。かかる類似体は、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むエピトープの結合親和性を調節するのに使用される。
【００５５】
「2次アンカー残基」は、ペプチド結合に影響を与えるペプチド中の1次アンカー位置以外の位置である。2次アンカー残基は、特定の位置でアミノ酸残基のランダムな分布により予測されるより、HLA結合ペプチド中ではるかに高い頻度で存在する。2次アンカー残基は、高もしくは中親和性結合ペプチド中の高頻度で存在する残基、または本来は高もしくは中親和性結合に関連する残基として特定することができる。2次アンカー残基は、「2次アンカー位置」に存在すると言われる。例えばこれらの2次アンカー位置中の特定の残基の有無を変化させることにより、類似体ペプチドを得ることができる。かかる類似体は、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むエピトープの結合親和性を調節するのに使用される。用語「固定されたペプチド」は一般に、2次アンカー位置ではなく1次アンカー位置中に変化を有する類似体ペプチドを意味するのに使用される。「潜在エピトープ」は、単離されたペプチドを用いる免疫により応答を誘発するが、この応答は、エピトープを含む全タンパク質を抗原として使用するとインビトロで交差反応性ではない。
【００５６】
TCRによる「無差別な認識」は、特定のペプチドが、種々のHLA分子において種々のＴ細胞クローンにより認識されることである。HLA分子による無差別な結合は、交差反応性結合と同義である。
【００５７】
「防御的免疫応答」または「治療的免疫応答」は、病原性抗原（例えば、感染物質または腫瘍抗原からの抗原）から得られる抗原に対するCTLおよび／またはHTL応答を意味し、これはある意味で、疾患の症状、副作用、または進行を予防または少なくとも部分的に停止させる。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激により促進される抗体応答を含む。
【００５８】
用語「亜優性（subdominant）エピトープ」は、全抗原または亜優性エピトープおよび優性エピトープを含む全抗原の断片を用いる免疫により、ほとんどまたは全く応答を示さないエピトープであり、しかしこれは、単離されたエピトープを用いる免疫によりその応答が得られるエピトープであり、この応答（潜在エピトープの場合のように）は、全抗原または亜優性エピトープおよび優性エピトープを含む全抗原の断片を使用してインビトロまたはインビボで応答を呼び出すのに使用される時、検出される。
【００５９】
本明細書において「ワクチン」はワクチン接種（例えば予防または治療のため）に使用される組成物であり、これは本発明の1つ以上のペプチドを含む。本発明のワクチンの無数の例があり、例えば1つ以上のペプチドのカクテル；ポリエピトープ性ペプチドにより含まれる本発明の1つ以上のペプチド；かかるペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸、例えばポリエピトープ性ペプチドをコードするミニ遺伝子がある。「1つ以上のペプチド」は、1〜150の任意の整数、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150またはそれ以上の本発明のペプチドを含むことができる。ペプチドまたはポリペプチドは、例えば標的または他の配列の脂質化、付加により随時修飾される。本発明のHLAクラスＩ結合ペプチドは、HLAクラスII結合ペプチド（例えばパドレ（PADRE）（登録商標）普遍的HTL結合ペプチド）と結合または組合わされて、細胞障害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進する。ワクチンはペプチドパルスした抗原提示細胞、例えば樹状細胞を含むことができる。
【００６０】
ペプチドまたはタンパク質を説明するのに使用される命名法は慣習に従い、アミノ基は各アミノ酸残基の左（アミノ末端またはN末端）およびカルボキシル基（カルボキシ末端またはC末端）は右に示される。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープ中で記載される時、これらはアミノからカルボキシル方向に番号が付けられ、1位はエピトープまたはこれが一部であるペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端に位置する。
【００６１】
本発明の選択された具体例である式において、アミノ末端およびカルボキシル末端基（具体的に示してはいないが）は、特に明記しない場合は生理学的pH値を取るような形である。アミノ酸構造式において各残基は、標準的3文字または1文字表記で表される。アミノ酸残基のL型は、大文字の1文字または3文字記号の最初の文字の大文字で示され、D型を有するアミノ酸残基のD型は小文字の1文字または小文字の3文字記号で示される。しかし大文字無しで3文字記号または完全な名前が使用される時、これらはLアミノ酸残基を意味する。グリシンは非対称炭素原子を持たず、単に「Gly」または「G」として示される。本明細書に記載のペプチドのアミノ酸配列は一般に標準的1文字記号を使用して示される（Ａ、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；L、ロイシン；Ｍ、メチオニン；N、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；およびＹ、チロシン）。これらの記号以外に、本明細書に記載の1文字略語の「Ｂ」は、α−アミノ酪酸を示す。ある例では、α−アミノ酪酸はシステインと交換される。
本明細書で使用される頭字語は以下の通りである：
APC：抗原提示細胞
CD3：汎Ｔ細胞マーカー
CD4：ヘルパーＴリンパ球マーカー
CD8：細胞障害性Ｔリンパ球マーカー
CEA：癌胎児性抗原（例えば配列番号363を参照）
CTL：細胞障害性Ｔリンパ球
DC：樹状細胞。DCは、B型肝炎ウイルスから得られるモデルペプチドに特異的なCTL株からサイトカイン放出を刺激することにより強力な抗原提示細胞として機能する。HBVペプチドエピトープでエクスビボでパルスしたDCを使用したインビボ実験は、投薬経験の無いマウスへの投与後にインビボでCTL免疫応答を刺激した。
DLT：用量限定性毒性、治療に関連する有害事象
DMSO：ジメチルスルホキシド
ELISA：酵素結合免疫吸着測定法
E:T：エフェクター：標的比
G-CSF：顆粒球コロニー刺激因子
GM-CSF：顆粒球マクロファージ（単核細胞）コロニー刺激因子
HBV：B型肝炎ウイルス
HER2/neu：腫瘍関連抗原：c-erB-2は同義語である（例えば、配列番号12参照）
HLA：ヒト白血球抗原
HLA-DR：ヒト白血球抗原クラスII
HPLC：高速液体クロマトグラフィー
HTC：ヘルパーＴ細胞
HTL：ヘルパーＴリンパ球、ヘルパーＴ細胞と同義語
ID：本体
IFNγ：インターフェロンガンマ
IL-4：インターロイキン-4
IV：静脈内
IU30%：100：1（E：T）比で標的細胞集団の30％の溶解を引き起こすのに必要な106個のエフェクター細胞の細胞毒性
MAb：モノクローナル抗体
MAGE：黒色腫抗原（例えば、MAGE2とMAGE3についてはそれぞれ配列番号13と14を参照）
MLR：混合リンパ球反応
MNC：単核細胞
PB：末梢血
PBMC：末梢血単核細胞
ProGP（登録商標）：プロゲニポエチン（登録商標）産物（サール（Searle）、セントルイス、ミズーリ州）、キメラflt3/G-CSF受容体アゴニスト
SC：皮下
S.E.M.：平均の標準誤差
QD：1日1回投与
TAA：腫瘍関連抗原
TNF：腫瘍壊死因子
WBC：白血球
【００６２】
以下は、本発明のペプチド、対応する核酸分子、組成物、および方法を詳細に説明する。
【００６３】
腫瘍関連抗原のA2ペプチドとポリヌクレオチド
A2エピトープと類似体。ある例では本発明は、エピトープおよび／またはおよび／または類似体を含むかまたはこれらからなる単離されたペプチドに関する。ある例では本発明は、かかるペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００６４】
本発明の単離されたエピトープと類似体は、クラスＩ結合ペプチド、すなわちCTLペプチドである。特に本発明のエピトープと類似体はA2モチーフまたはスーパーモチーフを含む。本発明のエピトープと類似体は、表1に示したものである（配列番号1〜10）。本発明のA2エピトープと類似体は、表で「エピトープ」および「類似体」と呼び、配列番号で呼ばれる。他のエピトープと類似体は本明細書において、CTLエピトープまたはCTLペプチドおよびHTLエピトープまたはHTLエピトープと呼ぶ。
【００６５】
ペプチドとポリヌクレオチド。ある例では本発明は、エピトープおよび／または類似体を含むかまたはこれらからなる単離されたペプチドに関し、ここでエピトープまたは類似体は表1から選択される配列からなる（配列番号1〜10）。
【００６６】
好ましくはペプチドは、表1の配列からのエピトープまたは類似体を含むかまたはこれらからなる。
【００６７】
本発明のペプチドは、以下に詳述されるように、エピトープおよび／または類似体とCTLエピトープ、および／またはHTLエピトープ、および／またはリンカー、および／またはスペーサー、および／または担体、および／または追加のアミノ酸残基との融合タンパク質でもよく、またはエピトープまたは類似体のホモポリマー、またはエピトープおよび／または類似体のヘテロポリマーを含むかまたはこれらからなる。
【００６８】
本発明のエピトープおよび／または類似体を含むペプチドは、抗原の断片（「断片」または「抗原性断片」）を含むかまたはこれらからなり、ここで断片は、エピトープおよび／または類似体を含む。断片は、CEA、HER2/neu、MAGE2、MAGE3、および／またはp53の一部（それぞれ配列番号11、12、13、14および15である）でもよい。本発明のエピトープは、断片内にあるか、または断片に直接または間接に結合しているか、または連結している。
【００６９】
断片は、高濃度のクラスＩおよび／またはクラスIIエピトープを含有する天然の抗原の領域を含むかまたはこれらからなり、好ましくはこれは、アミノ酸の長さ当たり最大数のエピトープを含有する。かかるエピトープはフレームシフト的に存在し、例えば10アミノ酸の長さのペプチドは2つの9アミノ酸残基の長さのエピトープと1つの10アミノ酸残基の長さのエピトープを含有することができる。
【００７０】
断片は、600アミノ酸残基以下であるか、500アミノ酸残基以下であるか、400アミノ酸残基以下であるか、250アミノ酸残基以下であるか、100アミノ酸残基以下であるか、85アミノ酸残基以下であるか、75アミノ酸残基以下であるか、65アミノ酸残基以下であるか、または50アミノ酸残基以下ででもよい。ある例では断片は、例えば101アミノ酸残基未満の長さであり、任意の変化量で5アミノ酸残基までの長さである。例えば断片は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100アミノ酸残基の長さでもよい。好適例では断片は、9、10、または11アミノ酸残基の長さである。
【００７１】
完全長CEA抗原の断片は、抗原のC末端まで約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、301-320、321-340、341-360、361-380、381-400、401-420、421-440、441-460、461-480、481-500、501-520、521-540、541-560、561-580、581-600、601-620、621-640、641-660、661-680、または681残基の断片でもよい。
【００７２】
完全長HER2/neu抗原の断片は、抗原のC末端まで約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、301-320、321-340、341-360、361-380、381-400、401-420、421-440、441-460、461-480、481-500、501-520、521-540、541-560、561-580、581-600、601-620、621-640、641-660、661-680、681-700、701-720、721-740、741-760、761-780、781-800、801-820、821-840、841-860、861-880、881-900、901-920、921-940、941-960、961-980、981-1000、1001-1020、1021-1040、1041-1060、1061-1080、1081-1100、1101-1120、1121-1140、1141-1160、1161-1180、1181-1200、1201-1220、1221-1240、または1241残基の断片でもよい。
【００７３】
完全長MAGE-2抗原の断片は、抗原のC末端まで約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、または301残基の断片でもよい。
【００７４】
完全長MAGE-3抗原の断片は、抗原のC末端まで約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、または301残基の断片でもよい。
【００７５】
完全長p53抗原の断片は、抗原のC末端まで約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100、101-120、121-140、141-160、161-180、181-200、201-220、221-240、241-260、261-280、281-300、301-320、321-340、341-360、361-380、または381残基の断片でもよい。
【００７６】
本発明のエピトープおよび／または類似体を含むペプチドは、そのエピトープ、類似体、または断片以外に1つ以上のアミノ酸残基を含む融合タンパク質でもよい。融合タンパク質は、後述するようにホモポリマーおよびヘテロポリマーでもよい。
【００７７】
ある例ではペプチドは、本発明の複数のエピトープおよび／または類似体、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個のエピトープおよび／または類似体を含むかまたはこれらからなる。ある例ではペプチドは、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個の本発明のエピトープおよび／または類似体を含む。
【００７８】
ペプチドはまた、表3（配列番号1〜10）から選択される1つまたは数個のエピトープおよび／または類似体を除外してもよい。本発明のペプチドから好ましく除外されるエピトープ／類似体は配列番号1〜10である。
【００７９】
ペプチドはまた、1つのエピトープまたは類似体のホモポリマーであるか、または少なくとも2つの異なるエピトープおよび／または類似体を含有するヘテロポリマーでもよい。ポリマーは、免疫反応に対しての上昇した確率（ポリマーを作成するのに異なるエピトープ／類似体が使用される）および免疫応答に標的化される抗原の異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＴ細胞を誘導する上昇した能力という利点を有する。
【００８０】
ホモポリマーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150コピーの同じエピトープまたは類似体を含んでよい。
【００８１】
ヘテロポリマーは、本発明の個々のエピトープまたは類似体の1つ以上のコピー、および1つ以上の異なるエピトープおよび／または類似体の1つ以上のコピーを含んでよい。ヘテロポリマーを形成するエピトープおよび／または類似体はすべて同じ抗原からであり、例えばCEA、p53、MAGE2/3、HER2/neu、または本明細書のまたは当該分野で公知の他の抗原でもよく、または異なる抗原、好ましくはTAAでもよい。ヘテロポリマーを形成するエピトープおよび／または類似体の組合せは、上記した組合せを含む。ヘテロポリマーは、1つ以上のエピトープおよび／または類似体の複数のコピーを含んでよい。
【００８２】
ヘテロポリマーのような本発明のペプチドは、第1のエピトープおよび／または類似体、および少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50の他の（異なる）エピトープおよび／または類似体を含んでよい。
【００８３】
本発明のペプチドはまた追加のアミノ酸残基を含んでよい。
【００８４】
ある例ではペプチドはまた、多くのCTLおよび／またはHTLエピトープ、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50のCTLおよび／またはHTLエピトープを含んでよい。
【００８５】
本発明のCTLおよび／またはHTLエピトープおよびエピトープ／類似体は、同じTAAまたは異なるTAA由来でもよい。すなわち例えば、もしエピトープおよび／または類似体がCEA由来なら、CTLペプチドおよび／またはHTLペプチドもまたCEA由来でもよい。あるいはCTLペプチドおよび／またはHTLペプチドは別の抗原、好ましくはp53、MAGE2/3、またはHER2/neuのようなTAA抗原由来でもよい。他の例として、もしエピトープおよび／または類似体がp53由来なら、CTLペプチドおよび／またはHTLペプチドはp53由来でも、またはMAGE2/3、HER2/neu、またはCEA由来でもよい。
【００８６】
CTLペプチドおよび／またはHTLペプチドは、腫瘍関連抗原、例えば特に限定されないが、黒色腫抗原MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-11、MAGEA10、ならびにBAGE、GAGE、RAGE、MAGE-C1、LAGE-1、CAG-3、DAM、MUC1、MUC2、MUC18、NY-ESO-1、MUM-1、CDK4、BRCA2、NY-LU-1、NY-LU-7、NY-LU-12、CASP8、RAS、KIAA-2-5、SCC、p53、p73、CEA、HER2/neu、Melan-A、gp100、チロシナーゼ、TRP2、gp75/TRP1、カリクレイン、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、前立腺特異抗原（PSA）、PT1-1、β-カテニン、PRAME、テロメラーゼ、FAK、サイクリンD1タンパク質、NOEY2、EGF-R、SART-1、CAPB、HPVE7、p15、葉酸受容体CDC27、PAGE-1、およびPAGE-4由来でもよい（例えば表16参照）。
【００８７】
CTLペプチドおよびHTLペプチドの非限定例は、WO01/42270号（2001年6月14日公表）；WO01/41788号（2001年6月14日公表）；WO01/42270号（2001年6月14日公表）；WO01/45728号（2001年6月28日公表）；およびWO01/41787号（2001年6月14日公表）に開示されている。
【００８８】
HTLペプチドは、合成ペプチド、例えばPanDR結合エピトープ（例えばパドレ（PADRE）（登録商標）ペプチド、エピトープ（エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州、米国特許第5,736,142号に記載されている）を含み、例えば式aKXVAAZTLKAAa（ここで、「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンであり；「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；および「a」はD-アラニンまたはL-アラニン（配列番号42）である）を有する。いくつかのPanDR結合エピトープはすべて「L」アミノ酸残基を含み、これらの分子は、ペプチドまたはペプチドをコードする核酸の形で得ることができる。また、米国特許第5,679,640号および6,413,935号に記載されている。
【００８９】
ペプチドは追加のアミノ酸残基を含有してもよい。かかる追加のアミノ酸残基は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Trp、Val、アミノ酸模倣物、および他の非天然のアミノ酸残基（例えば後述のもの）でもよい。追加のアミノ酸残基は、ペプチドの互いの結合、エピトープおよび／または類似体の互いの結合、エピトープおよび／または類似体のCTLおよび／またはHTLエピトープへの結合、担体支持体またはより大きなペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の修飾などの容易さを提供する。例えばAla、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr、Trp、Valなどのアミノ酸残基は、ペプチドのC末端および／またはN末端に導入することができ、および／または内部に導入することができる。
【００９０】
ペプチドは、アミノ酸スペーサーを含有してもよく、これは、エピトープ、類似体、CTLエピトープ、HTLエピトープ、担体などにペプチド内で結合しても、N末端および／またはC末端でペプチドに結合してもよい。すなわちスペーサーはこれらが、エピトープ、類似体、CTLエピトープ、HTLエピトープ、担体、追加のアミノ酸残基、および／または抗原性断片を互いに連結または結合するように、ペプチドのN末端でもC末端でも、または内部でもよい。
【００９１】
スペーサーは代表的には、1つ以上の比較的小さい中性の分子（例えばアミノ酸残基またはアミノ酸模倣物）からなる。スペーサーは代表的には、例えばAla、Gly、または他の非極性アミノ酸残基の中性スペーサー、または中性極性アミノ酸残基から選択される。随時存在するスペーサーは、同じ残基からなるか、または1つ以上の異なる残基からなり、従ってスペーサー残基のホモまたはヘテロオリゴマーでもよい。すなわちスペーサーは2つ以上のAla残基（ポリアラニン）または2つ以上のGly残基（ポリグリシン）、またはAlaとGly残基の両方、例えばGly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser-、Gly-Ser-、Ser-Gly-などを含有してもよい。存在する場合スペーサーは通常、少なくとも1つまたは2つの残基、より一般的には3〜6個の残基、および時に10またはそれ以上の残基、例えば3、4、5、6、7、8、9または10、またはそれ以上の残基であろう。（Livingston, B.D.ら、Vaccine 19:4652-4660 (2000)）。
【００９２】
ペプチドは、当該分野で公知の担体、例えばサイログロブリン、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸残基（例えばポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸）、インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含んでよい。
【００９３】
さらにペプチドは、例えばアルカノイル（C1-C20）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより末端NH2アシル化される。ある例ではこれらの修飾は、支持体または他の分子への結合のための部位を提供する。
【００９４】
本発明のペプチドは、特に限定されないが、グリコシル化、側鎖酸化、ビオチン化、リン酸化、表面活性物質の付加（例えば脂質）のような修飾を含むか、または化学修飾（例えばアセチル化）することができる。さらにペプチド内の結合は、ペプチド結合以外の結合（例えば、共有結合、エステルもしくはエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）でもよい。
【００９５】
本発明のペプチドは、得られるペプチドの物理的性質（例えば安定性または可溶性）を修飾するための置換を含有してもよい。例えばペプチドは、システイン（C）をα−アミノ酪酸（「B」）で置換して修飾してもよい。その化学的性質のために、システインはジスルフィド結合を形成する傾向があり、ペプチドを大きく改変して結合能力を低下させる。α−アミノ酪酸の代わりにCを使用することは、この問題を緩和するのみでなく、ある場合には結合能力および交差結合能力を改善する。システインのα−アミノ酪酸による置換は、ペプチドの任意の残基、例えばペプチド内のエピトープまたは類似体のアンカーもしくは非アンカー位置でまたはペプチドの他の位置で起きることがある。
【００９６】
ペプチドは、アミノ酸模倣物または非天然のアミノ酸残基、例えばD-またはL-ナフチルアラニン；D-またはL-フェニルグリシン；D-またはL-2-チエニルアラニン；D-またはL-1、-2、-3または-4ピレニルアラニン；D-またはL-3チエニルアラニン；D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(2ピラジニル)-アラニン；D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；d-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン；d-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；d-ρ-フルオロフェニルアラニン；D-またはL-ρ-ビフェニル-フェニルアラニン；D-またはL-ρ-メトキシビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；およびD-またはL-アルキルアラニン（ここでアルキル基は、置換または非置換メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチル、または非酸性アミノ酸残基でもよい）を含むことができる。非天然のアミノ酸の芳香環には、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンズイミダゾリル、ナフチル、フラニル、プロリル、およびピリジル芳香環を含む。種々のアミノ酸模倣物または非天然のアミノ酸残基を含む修飾ペプチドは、インビボで安定性が上昇しているため、特に有用である。かかるペプチドはまた、改良された保存寿命または製造的性質を有する。
【００９７】
ペプチド安定性は多くの方法で測定することができる。例えばペプチダーゼや種々の生物学的媒体（例えばヒト血漿および血清）は安定性を試験するために使用されている。例えばVerhoefら、Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986)。本発明のペプチドの半減期は、25％ヒト血清(v/v)測定法を使用して便利に決定することができる。プロトコールは一般的に以下の通りである：プールしたヒト血清（AB型、非加熱処理）を、使用前に遠心分離により脱脂する。次にRPMI-1640または別の適当な組織培養培地を使用して血清を25％に希釈する。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出し、6％水性トリクロロ酢酸またはエタノールに加える。曇った反応試料を15分間冷却（4℃）し、次に遠心分離して沈殿血清タンパク質をペレット化する。次にペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を使用して逆相HPLCにより測定する。
【００９８】
本発明のペプチドは種々の長さであり、中性（非荷電）型または塩である型である。本発明のペプチドは、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化のような修飾を含有することができ、一般に修飾がペプチドの生物活性を破壊しない条件に付す。
【００９９】
本発明のペプチドは凍結乾燥されるか、または結晶型でもよい。
【０１００】
エピトープはできるだけ小さく、しかし天然のタンパク質の免疫活性の実質的にすべてを保持することが一般に好ましい。可能であれば、本発明のHLAクラスＩ結合エピトープを、約8〜約13アミノ酸残基の長さ、例えば8、9、10、11、12または13、好ましくは9または10の長さに最適化することが好ましい。このサイズ範囲の1つ以上のエピトープが、より長いペプチドに含まれることを理解されたい（ペプチド長さの詳細な考察についての用語「エピトープ」については定義の項を参照）。HLAクラスII結合エピトープは好ましくは、約6〜約30アミノ酸残基の長さ、例えば6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30、好ましくは約13〜約20残基、例えば13、14、15、16、17、18、19、または20の長さに最適化されることが好ましい。好ましくはエピトープは、内因性処理された病原性由来ペプチド、または関連するHLA分子に結合した腫瘍細胞ペプチドにサイズが等しい。種々の長さのペプチドの同定と調製は、本明細書に記載の方法を使用して行われる。
【０１０１】
本発明のペプチドは、使用方法により、組換えDNA技術により、または化学合成により調製することができ、または天然起源（例えば、天然の腫瘍または病原性微生物）から単離することができる。エピトープは個々に合成されるかまたはペプチド中で直接または間接に結合してもよい。ペプチドは好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に含まず、別の例ではペプチドは天然の断片または1次アンカー残基に合成法で結合される。
【０１０２】
本発明のペプチドは種々の方法で調製することができる。比較的小さなサイズについては、ペプチドは従来法により溶液中または固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコールとともに使用することができる。（例えば、StewartとYoung、「固相ペプチド合成（SOILID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS）」、第2版、ピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.）、1984）。さらに個々のペプチドは化学結合法により結合して、より大きいペプチド（これも本発明の範囲内である）を産生することができる。
【０１０３】
あるいは組換えDNA技術を使用することができ、ここでは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件下で培養される。これらの方法は、「モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（1989）に一般的に記載されているように当該分野で公知である。すなわち、本発明の1つ以上のペプチドを含むかまたはこれらからなる組換えペプチドを使用して、適切なＴ細胞エピトープを提示することができる。
【０１０４】
上記ペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の一部である。当業者が理解できるように、遺伝コードの縮重のために種々の核酸が同じペプチドをコードすることがある。これらの核酸のそれぞれは本発明の範囲内である。本発明のこの例はDNAとRNAを含み、ある例ではDNAとRNAの組合せを含む。本発明のペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれることを理解されたい。
【０１０５】
本明細書で企図されるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学的方法、例えばMatteucciら、J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)のホスホトリエステル法により合成することができる。類似体を含むかまたはこれらからなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、単に天然のエピトープをコードするものを適切なおよび所望の核酸塩基で置換することにより行われる。
【０１０６】
ポリヌクレオチド、例えばミニ遺伝子（後述）は、ポリヌクレオチドのプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチド（ミニ遺伝子）を組み立てることにより産生される。公知の方法を使用して適切な条件下で、重複オリゴヌクレオチド（15〜100塩基の長さ）を合成、リン酸化、精製、アニーリングすることができる。例えばオリゴヌクレオチドの末端をT4 DNAリガーゼを使用して結合することができる。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはミニ遺伝子は、発現ベクターのような所望のベクター中にクローン化することができる。次に適切なリンカーによりコード配列が提供され、当該分野で一般的に利用できる装置中に連結され、ベクターを使用して適当な宿主を形質転換して、所望のペプチド（例えば融合タンパク質）を産生することができる。
【０１０７】
多くのかかるエピトープおよび適当な宿主系が当該分野で公知であり、市販されている。例えば以下のベクターが与えられる。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9（キアゲン（Qiagen））、pBS、pD10、ファージスクリプト、psiX174、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（ファルマシア（Pharmacia））；pCR（インビトロゲン（Invitrogen））。真核生物性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、PXT1、pSG（ストラタジーン（Stratagene））、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL（ファルマシア（Pharmacia））；p75.6（バレンチス（Valentis））；pCEP（インビトロゲン（InVitrogen））；pCEI（エピミューン（Epimmune））。しかし、宿主中で複製可能で生存活性があれば、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用することができる。
【０１０８】
適切な宿主の代表的例として、以下がある：細菌細胞、例えば大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、およびシュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトコッカス（Streptocossus）およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属の種々の種；真菌細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばキイロショウジョウバエ（Drosophila）およびSf9；動物細胞、例えばサル腎繊維芽細胞のCOS-7株（Gluzman, Cell 23:175 (1981)に記載されている）、および適合性のあるベクターを発現することができる他の細胞株、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株またはBowes黒色腫；植物細胞など。適切な宿主の選択は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。
【０１０９】
本発明はまた、ベクター、好ましくは本発明のペプチドおよびの産生に有用なベクター、およびかかるベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１０】
宿主細胞は本発明のベクター（これは例えばクローニングベクターまたは発現ベクターでもよい）により遺伝子操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形でもよい。遺伝子操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはポリヌクレオチドの増幅に適するように修飾された従来の栄養培地中で培養することができる。培養条件（例えば温度、pHなど）は、発現のために選択された宿主細胞で従来使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１１１】
ペプチドの発現のために、コード配列には機能できる形で結合した開始コドンと停止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域、および通常複製系が与えられて、所望の細胞宿主中での発現のための発現ベクターを提供する。例えば細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列が、所望のコード配列の挿入のための便利な制限部位を含有するプラスミド中で提供される。生じる発現ベクターは、適当な細菌宿主中に形質転換される。
【０１１２】
一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点と選択可能なマーカー、例えば大腸菌（E. coli ）のアンピシリン耐性遺伝子およびエス・セレビッシェ（S. cerevisiae）TRP1遺伝子、および下流構造配列の直接転写のための高度に発現された遺伝子から得られるプロモーターを含むであろう。かかるプロモーターは、特に3-ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）解糖系酵素、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質から得られる。異種構造配列は、翻訳開始および停止配列との、および好ましくは細胞外媒体への周辺質スペースへの翻訳タンパク質の分泌を指令することができるリーダー配列と適切な時期に組み立てられる。場合により異種配列は、所望の特性（例えば、発現される組換え産物の安定化または簡単な精製）を付与するN末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
【０１１３】
酵母、昆虫または哺乳動物細胞宿主はまた、適当なベクターおよび制御配列を用いて使用される。哺乳動物発現系の例には、サル腎繊維芽細胞のCOS-7株（Gluzman, Cell 23:175 (1981)に記載される）、および適合性ベクター（例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株）を発現することができる他の細胞株がある。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターとエンハンサー、および必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーとアクセプター部位、転写停止配列、および5'フランキング非転写配列を含む。かかるプロモーターはまた、ウイルス源、例えばヒトサイトメガロウイルス（CMV-IEプロモーター）または単純ヘルペスウイルス1型（HSV TKプロモーター）から得られる。SV40スプライスから得られる核酸配列およびポリアデニル化部位を使用して、必要な非転写遺伝子要素を提供することができる。
【０１１４】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、得られるペプチドの小胞体中への移動を促進するためのユビキチン化シグナル配列、および／または標的配列（例えば小胞体（ER）シグナル配列）を含む。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）はヒト細胞中で発現される。各アミノ酸のコドン選択を助けるためにヒトコドン使用表を使用することができる。かかるポリヌクレオチドは好ましくは、エピトープおよび／または類似体の間にスペーサーアミノ酸残基（例えば上記したもの）を含むか、またはエピトープおよび／または類似体（および／またはCTLおよびHTLエピトープ）に隣接する天然に存在するフランキング配列を有する。
【０１１６】
本発明のペプチドはまた、ウイルスまたは細菌ベクターにより発現される。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主（例えば鶏痘ウイルスのワクシニア）を含む。このアプローチの例として、ワクシニアウイルスをベクターとして使用して、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させる。免疫プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、米国特許第4,722,848号に記載されている。他のベクターはBCG（カルメット−ゲラン菌（Bacille Calmette Guerin））である。BCGベクターは、Stoverら、Nature 351:456-460 (1991)に記載されている。本発明のポリペプチドの治療的投与または免疫に有用な広範囲の他のベクター（例えばアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルス、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者に明らかであろう。好適なベクターは修飾ワクシニアアンカラ（MVA）である（例えば、ババリアンノリジック（Bavarian Noridic）（MVA-BN））。
【０１１７】
当業者に公知の標準的制御配列は、好ましくはヒト標的細胞中での発現を確実にするためにベクター中に含まれる。いくつかのベクター要素が好適である：ポリヌクレオチドの下流のクローニング部位を有するプロモーター、例えばミニ遺伝子挿入；効率的な転写停止のためのポリアデニル化シグナル；大腸菌（E. coli）複製開始点；および大腸菌（E. coli）選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。この目的のために無数のプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーター）が使用できる。他の適当なプロモーター配列については米国特許第5,580,859号および5,589,466号を参照されたい。好適なプロモーターはCMV-IEプロモーターである。
【０１１８】
ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）は、転写領域中に1つ以上の合成または天然に存在するイントロンを含んでよい。mRNA安定化配列および哺乳動物細胞中の複製のための配列を含めることもまた、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）発現を上昇させるために考慮される。
【０１１９】
さらにポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）は、免疫刺激配列（ISSまたはCpG）を含んでよい。これらの配列は、免疫原性を増強するためにポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）コード配列の外でベクター中に含まれる。
【０１２０】
ある例では、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）にコードされる本発明のペプチドと第2のタンパク質（例えば、免疫原性を調節するもの）の両方の産生を可能にする2シストロン性発現ベクターを使用することができる。もし本発明のペプチドと同時発現されると、免疫応答を増強するタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF）、サイトカイン誘導性分子（例えばLeIF）、同時刺激性分子、またはPanDR結合タンパク質（パドレ（PADRE）（登録商標）、エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州）がある。パドレ（PADRE）（登録商標）分子のようなヘルパーＴ細胞（HTL）エピトープは、細胞内ターゲティングシグナルに結合することができ、本発明の発現されるペプチドとは別に発現される。特に、免疫抑制分子（例えばTGF-β）の同時発現により免疫応答を低下させることは、いくつかの疾患で有用である。
【０１２１】
いったん発現ベクターが選択されると、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）はプロモーターの下流のポリリンカー領域中にクローン化される。このプラスミドは適切な細菌株に形質転換され、標準的方法を使用してDNAが調製される。ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）のDNA配列と配向ならびにベクター中に含まれる他のすべての要素は、制限マッピング、DNA配列分析、および／またはPCR分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、細胞バンクとして保存することができる。
【０１２２】
DNAの治療／予防量は、例えば大腸菌（E. coli）を発酵させて、次に精製することにより産生することができる。使用細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に接種し、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で公知の方法に従って飽和まで増殖させる。プラスミドDNAは、標準的生物学的分離法、例えば利用できる固相陰イオン交換樹脂、例えばキアゲン社（Qiagen Inc.）のもの（バレンシア（Valencia）、カリホルニア州）を使用して精製される。必要であれば、スーパーコイルDNAをゲル電気泳動または他の方法を使用してオープン円形および線状型から単離することができる。
【０１２３】
好適なポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）は、種々の調製物を使用して注入用に調製される。これらの最も簡単なものは、凍結乾燥ポリヌクレオチド（例えばDNA）の無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）での復元である。このアプローチ（「裸のDNA」として知られている）は、現在臨床治験で筋肉内（IM）投与のために、他の研究者により使用されている。ポリヌクレオチドワクチンの免疫療法作用を最大にするために、精製プラスミドDNAを調製するための他の方法を使用してもよい。種々のかかる方法は開示されており、新しい技術が利用できるようになっている。陽イオン性脂質、糖脂質、および膜融合リポソームもまた、調製物中で使用される（例えば、WO93/24640；ManninoとGould-Fogerite, Bio/Techniques 6(7):682 (1988)；米国特許第5,279,833号；WO91/06309号；およびFelgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)を参照）。さらにまとめて防御性、相互作用性、非縮合化合物（PINC）と呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、精製プラスミドDNAと複合体形成して、安定性、筋肉内分散、または特定の臓器または細胞タイプへの移動のような変量に影響を与えることができる。
【０１２４】
当業者に公知の方法を使用して、インビボでのポリヌクレオチドの送達と取り込みを増強することができる。例えばポリヌクレオチドはポリビニルピロリドン（PVP）と複合体形成させて、ポリヌクレオチドの局所的バイオアベイラビリティを延長させ、こうして生物によるポリヌクレオチドの取り込みを増強することができる（例えば、米国特許第6,040,295号；EP0465529号；WO98/17814号を参照）。このアプローチは、単に「裸の」DNAを接種するより有効であると考えられる。PVPは、広範囲の物質と複合体を形成することが知られているポリアミドであり、化学的および生理学的に不活性である。
【０１２５】
標的細胞感作は、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）にコードされるペプチドの発現とHLAクラスＩ提示の機能性測定法として使用することができる。例えばポリヌクレオチド（例えばプラスミドDNA）は、標準的CTLクロム放出測定法の適当な標的である哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最終調製物に依存するであろう。例えば「裸の」DNAに電気穿孔法を使用することができ、陽イオン性脂質またはPVP調製DNAは直接のインビトロトランスフェクションを可能にする。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光活性化細胞ソーター解析（FACS）を使用してトランスフェクト細胞を増加させることができる。次にトランスフェクトされた細胞をクロム-51（51Cr）標識して、エピトープ特異的CTLの標的として使用する。標的細胞の細胞溶解（51Cr放出により検出される）は、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）にコードされる本発明のエピトープおよび／または類似体またはこれらを含むペプチドの産生とHLA提示を示す。HTLエピトープの発現は、HTL活性を評価する測定法を使用して同様の方法で評価される。
【０１２６】
インビボ免疫原性は、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）の機能性試験の第2のアプローチである。適切なヒトHLAタンパク質を発現するトランスジェニックマウスをポリヌクレオチド（例えばDNA）産物で免疫する。用量と投与経路は調製物に依存する（PBS中のポリヌクレオチド（例えば裸のDNAまたはPVP調製DNA）用にIM、脂質複合体形成ポリヌクレオチド（例えばDNA）には腹腔内（IP））。免疫の11〜21日後、脾臓細胞を採取し、試験される各ペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在下で1週間再刺激する。次にエピトープおよび／または類似体を含むかまたはこれらからなるペプチドについて、標準的測定法を行って、ペプチド負荷、51Cr標識標的細胞の細胞溶解があるかどうかを測定する。再度、ポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）にコードされるものに対応するエピトープおよび／または類似体に暴露された標的細胞の溶解は、ポリヌクレオチド（例えばDNA）ワクチン機能とCTLの誘導を示す。HTLエピトープの免疫原性は、トランスジェニックマウス中で同様の方法で評価される。
【０１２７】
あるいは核酸は、例えば米国特許第5,204,253号に記載のように、衝撃送達を使用して投与される。この方法を使用して、ポリヌクレオチド（例えばDNA）からのみなる粒子が投与される。衝撃送達のさらなる代替法では、ポリヌクレオチド（例えばDNA）を粒子（例えば金粒子）に接着させることができる。
【０１２８】
マルチエピトープミニ遺伝子のようなポリヌクレオチドの使用は本明細書、および同時係属米国特許出願第09/311,784号；Ishiokaら、J. Immunol. 162:3915-3925, 1999；An, L.とWhitton, J.L., J. Virol. 71:2292, 1997；Thomson, S.A.ら、J. Immunol. 157:822, 1996；Whitton, J.L., J. Virol. 67:348, 1993；Hanke, R.ら、Vaccine 16:426, 1998に記載されている。例えば、TAA（例えば、p53、HER2/neu、MAGE-2/3、またはCEA）、PanDR結合ペプチド（例えばパドレ（PADRE）（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ）、および小胞体転位シグナル配列のマルチ領域から得られるエピトープをコードするマルチエピトープDNAプラスミドのようなポリヌクレオチドを作成することができる。上記セクションに記載のように、ペプチド／ポリヌクレオチドはまた、他のTAA由来のエピトープを含む／コードしてもよい。
【０１２９】
すなわち本発明は、本明細書に記載のペプチド、該ペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチド、ならびにペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物を含み、後述するように、ペプチド、ポリヌクレオチド、および組成物の産生法と使用法を含む。
【０１３０】
組成物。他の例では本発明は、本発明の1つ以上のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび随時他の成分を含む組成物に関する。
【０１３１】
ある例では、組成物は、本発明の複数のペプチド、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個のペプチドを含むかまたはこれらからなる。ある例では、組成物は、本発明の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10個のペプチドを含む。
【０１３２】
本発明の組成物は、上記ペプチドおよび／またはペプチドの組成物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１３３】
組成物は、上記または後述のものから選択される少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10個のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含むことができる。1つ以上のペプチドの少なくとも1つは、ヘテロポリマーまたはホモポリマーでもよい。さらに組成物は、腫瘍関連抗原から得られる、CTLおよび／またはHTLエピトープを含むことができる。追加のエピトープはまたPanDR結合分子でもよい（例えば、（PADRE）（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ）。
【０１３４】
随時成分には、賦形剤、希釈剤、タンパク質、例えばPanDR結合ペプチド（例えば（PADRE）（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ）のようなCTLエピトープおよび／またはHTLエピトープを含むペプチドのようなタンパク質、および／または担体、かかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、脂質、またはリポソーム、ならびに本明細書に記載の他の成分がある。本発明の組成物の無数の例があり、例えば1つ以上のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドのカクテル；1つ以上のペプチドおよび／または類似体、および1つ以上のCTLおよび／またはHTLエピトープ；および／またはかかるペプチドをコードする核酸（例えばミニ遺伝子）がある。
【０１３５】
組成物は、本発明の1つ以上のペプチド（および／またはミニ遺伝子のようなポリヌクレオチド）を、上記および本明細書に記載の1つ以上の他の成分とともに含む。「1つ以上」とは、1〜150の任意の整数、例えば少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150のペプチド、ポリヌクレオチド、または他の成分を意味する。
【０１３６】
本発明の組成物は、例えばポリヌクレオチド、陽イオン性脂質調製物；リポペプチド（例えば、Vitiello, A.ら、J. Clin. Invest. 95:341, 1995）、封入された、例えばポリ（DL-ラクチド-co-グリコリド）（「PLG」）微小球（例えば、Eldridgeら、Molec. Immunol. 28:287-294, 1991；Alonsoら、Vaccine 12:299-306, 1994；Jonesら、Vaccine 13:675-681, 1995）；免疫刺激複合体中に含有されるペプチド成分（ISCOM）（例えば、Takahashiら、Nature 344:873-875, 1990；Huら、Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998）；複数の抗原ペプチド系（MAP）（例えば、Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413, 1988；Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996）；ウイルス、細菌、または真菌送達ベクター（Perkus, M.E.ら、「ワクチン開発の考え方（Concepts in vaccine development）」中、Kaufmann, S.H.E.編、379頁、1996；Chakrabarti, S.ら、Nature 320:535, 1986；Hu, S.L.ら、Nature 320:537, 1986；Kieny, M.-P.ら、AIDS Bio/Technology 4:790, 1986；Top, F.H.ら、J. Infect. Dis. 124:148, 1971；Chanda, P.K.ら、Virology 175:535, 1990）；ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Kofler, N.ら、J. Immunol. Methods 192:25, 1996；Eldridge, J.H.ら、Sem. Hematol. 30:16, 1993；Falo, L.D., Jr.ら、Nature Med. 7:649, 1995）；アジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）（Warren, H.S., Vogel, F.R.とChedid, L.A. Annu. Rev. Immuno. 4:369, 1986；Gupta, R.K.ら、Vaccine 11:293, 1993）；リポソーム（Reddy, R.ら、J. Immunol. 148:1585, 1992；Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996）；または、粒子吸収cDNAまたは他の本発明のポリヌクレオチド（Ulmer, J.B.ら、Science 259:1745, 1993；Robinson, H.L., Hunt, L.A.とWebster, R.G., Vaccine 11:957, 1993；Shiver, J.W.ら、「ワクチン開発の考え方（Concepts in vaccine development）」中、Kaufmann, S.H.E.編、423頁、1996；Cease, K.B.とBerzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994、およびEldridge, J.H.ら、Sem. Hematol. 30:16, 1993）などと組合わされたかまたは複合体形成した本発明のポリペプチドがある。毒素標的化送達法（受容体介在ターゲティングとしても知られている）、例えばアバントイムノセラピューティクス社（Avant Immunotherapeutics, Inc.）（ニーダム（Needham）、マサチューセッツ州）またはストレスタンパク質（例えばHSP96（ストレスジンバイオテクノロジーズ社（Stressgen Biotechnologies Corp.）、ビクトリア、BC、カナダ）に結合したものも使用することができる。
【０１３７】
本発明の組成物はポリヌクレオチド介在性である。本発明の1つ以上のペプチドをコードするDNAまたはRNAは患者に投与することができる。このアプローチは、例えばWolffら、Science 247:1465 (1990)、ならびに米国特許第5,580,859号；5,589,466号；5,804,566号；5,739,118号；5,736,524号；5,679,647号；およびWO98/04720号に記載されている。DNAベースの送達法の例には、「裸のDNA」（例えば、米国特許第5,693,622号参照）、促進DNA送達（ブピビカイン、ポリマー（例えば、PVP、PINCなど）、ペプチド性により促進された（すなわち、非「裸のDNA」）、陽イオン性脂質複合体と粒子介在（「遺伝子銃」）または圧力介在送達（例えば、米国特許第5,922,687号参照）に記載されている。従って本発明のペプチドは、ウイルスまたは細菌ベクターにより発現される。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主、例えば修飾ワクシニアアンカラ（MVA）（例えばババリアンノリジック（Bavarian Noridic））、ワクシニアまたは鶏痘ウイルスがある。例えば、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用される。急性または慢性に感染された宿主または非感染宿主中に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、こうして免疫応答を誘発する。免疫プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第4,722,848号に記載されている。他のベクターはBCG（カルメット−ゲラン菌）である。BCGベクターは、Stoverら、Nature 351:456-460 (1991)に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫に有用な広範囲の他のベクター（例えばアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、レトロウイルス、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。
【０１３８】
ある例ではＴ細胞応答を誘導する成分は、目的の標的抗原に対する抗体応答を誘導する成分と組合わされる。かかる組成物の好適例は、本発明のクラスＩおよびクラスIIエピトープを含む。あるいは組成物は、本発明のクラスＩおよび／またはクラスIIエピトープを、パドレ（PADRE）（登録商標）、エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州）とともに含む。
【０１３９】
本発明の組成物は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）を含むことができる。抗原提示細胞（例えば樹状細胞）は、例えば本発明のポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）構築体とともにトランスフェクトされる。ペプチドは抗原提示細胞上のHLA分子に結合することができ、こうしてHLA制限細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）が存在する時、CTLの受容体がHLA分子とペプチドとの複合体に結合する。
【０１４０】
本発明の組成物はまた、インターフェロン-αのような抗ウイルス剤またはIL-12、GM-CSFなどの免疫アジュバントを含むことができる。
【０１４１】
組成物は、HLA重鎖、β2マイクログロブリン、ストレプトアビジンおよび／またはビオチンを含んでよい。ストレプトアビジンは蛍光標識される。組成物は、四量体を含んでよい（例えば米国特許第5,635,363号；Science 274:94-96 (1996)参照）。HLA重鎖、β2マイクログロブリン、ストレプトアビジンおよび／またはビオチンを含む四量体。ストレプトアビジンは蛍光標識される。組成物はまたダイマーを含んでよい。ダイマー組成物はMHC分子とIg分子とを含む（例えばProc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7568-73 (1998)参照）。
【０１４２】
ある例では、本発明の組成物に、細胞障害性Ｔリンパ球をプライムする少なくとも1つの成分を含めることが好ましい。ウイルス抗原に対してインビボでCTLをプライムできる物質として、脂質が同定されている。例えばパルミチン酸残基は、リジン残基のε-およびα-アミノ基に結合することができ、次に例えば1つ以上の結合残基、例えばGly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser-などを介して、免疫原性ペプチドに結合することができる。次に脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子中で直接リポソーム中に取り込まれるか、またはアジュバント（例えば不完全フロイントアジュバント）中で乳化される。好適な組成物は、Lysε-およびα-アミノ基に結合したパルミチン酸であり、これは結合（例えばSer-Ser-）を介してペプチドのアミノ末端に結合する。
【０１４３】
CTL応答の脂質プライミングの他の例として、適切なペプチドに共有結合した時特異的CTLをプライムするのに、大腸菌（E. coli）リポタンパク質（例えばトリパルミトイル-S-グリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）が使用できる（例えば、Deresら、Nature 342:561, 1989参照）。本発明のペプチドは、例えばP3CSSに結合することができ、標的抗原に対するCTL応答を特異的にプライムするために個体にリポペプチドが投与される。さらに中和性抗体の誘導はまた、P3CSS結合エピトープによりプライムできるため、2つのかかる中和抗体を組合せて、体液性および細胞性応答をより有効に誘発することができる。
【０１４４】
別の好適例は、IFAに乳化された本発明の1つ以上のペプチドを含む組成物である。
【０１４５】
本発明の極めて好適な例は、IFAに乳化された本発明の配列番号1〜10を含むペプチドを含む。
【０１４６】
本発明の組成物はまた、CTLおよび／またはHTLペプチドを含む。かかるCTLおよびHTLペプチドは、ペプチドの末端にアミノ酸残基を負荷することにより修飾して、ペプチドを互いに連結、担体支持体またはより大きなペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の修飾などの容易さを提供する。アミノ酸残基（例えば、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸）または天然に存在するかまたは非天然のアミノ酸残基を、ペプチドまたはオリゴペプチド（特にクラスＩペプチド）のカルボキシル末端またはアミノ末端に導入することができる。しかしCTLエピトープのカルボキシル末端の修飾は、ある場合には、ペプチドの結合特性を変化させることがあることに注意されたい。さらにペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端NH2アシル化、例えばアルカノイル（C1-C20）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより修飾されている。ある例ではこれらの修飾は、支持体または他の分子への結合部位を提供する。CTLおよびHTLエピトープは、追加のアミノ酸残基、例えばスペーサーを含む上記したものを含有してもよい。
【０１４７】
本発明の組成物のさらなる例は、本発明の1つ以上のペプチドを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、「専門の」抗原提示細胞、例えば樹状細胞でもよい。抗原提示細胞は、当該分野で公知のまたは決定される任意の手段により本発明のペプチドを含有してもよい。かかる手段は、例えば衝撃核酸投与により、または核酸の投与のための当該分野の他の方法（ベクターベースの方法、例えばウイルスベクター、核酸の送達）により、1つ以上の個々のペプチドにより樹状細胞をパルス化する。
【０１４８】
組成物は担体を含んでよい。本発明の組成物で使用可能な担体は当該分野で公知であり、例えばサイログロブリン、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸残基（例えばポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸）、インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。
【０１４９】
組成物（例えば医薬組成物）は、生理学的に許容される希釈剤、例えば水または食塩水溶液、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水を含有することができる。さらに本明細書に開示のように、CTL応答は、本発明のペプチドを脂質、例えばトリパルミトイル-S-グリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）に結合することによりプライムすることができる。
【０１５０】
本発明の組成物は薬剤学的に許容される組成物でもよい。医薬組成物は好ましくは、免疫学的有効量の1つ以上の本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、および随時1つ以上の薬剤学的に許容される他の成分を含有する。好適な組成物は、本発明の1つ以上のペプチドとIFAとを含む。本発明のより好適な組成物は、1つ以上の本発明のペプチド、1つ以上のペプチド、およびIFAを含む。
【０１５１】
注射（例えば、SC、ID、IM）、エアゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜内、くも膜下、または他の適当な経路により、本発明のペプチドおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または組成物を用いて免疫すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な抗体、CTLおよび／またはHTLの産生を含む免疫応答により、ワクチンに対して応答する。次に宿主は、少なくとも部分的にTAAの以後の暴露に対して免疫になるか、またはTAA担持細胞の発生に対して少なくとも部分的に耐性になり、こうして予防または治療効果を得る。
【０１５２】
さらに、本発明のペプチド、プライマーおよびエピトープは、任意の所望の免疫または投与法で使用できる：例えば、獣医学分野における、またはヒトの医療分野の規則的ワクチン接種における、またはプライム追加免疫法における、規則的な毎年のワクチン接種の一部として、本発明のベクターまたは組み換え体は、目的の同じかまたは異なるエピトープの、または目的の同じかもしくは異なるエピトープを発現する組み換え体もしくはベクター（目的の同じかまたは異なるエピトープを発現する本発明の組み換え体またはベクターを含む）の投与の前または後に、投与される（例えば、米国特許第5,997,878号；6,130,066号；6,180,398号；6,26,965号；および6,348,450号を参照）。本発明の有用なウイルスベクターは、修飾ワクシニアアンカラ（MVA）（例えばババリアンノリジック（Bavarian Noridic）（MVA-BN））である。
【０１５３】
最近の研究は、外来遺伝子産物を発現するポックスウイルス組み換え体による免疫の後に、その遺伝子産物の精製サブユニット型を使用して追加免疫を行うプライム−追加免疫プロトコールが、いずれかの産物を単独で誘発される応答に比較して、増強された免疫応答を誘発することを示している。HIV-1エンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニア組み換え体を用いて免疫し、精製したHIV-1エンベロープ糖タンパク質サブユニット調製物を用いて追加免疫したヒト志願者は、ワクシニア組み換え体または精製エンベロープ糖タンパク質単独で免疫した個体より高いHIV-1中和抗体力価を示す（Grahamら、J. Infect. Dis., 167:533-537 (1993)）；Cooneyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993)）。ALVAC-HIV-1 env組み換え体（vCP125）の2回の注射で免疫したヒトは、HIV特異的抗体が出現しなかった。ワクシニアウイルス組み換え体からの精製rgp160で追加免疫すると、検出可能なHIV-1中和抗体が得られた。さらに、rgp160を用いて追加免疫すると、rgp160に対する特異的リンパ球Ｔ細胞増殖が明らかに上昇した。このワクチン接種法により、エンベロープ特異的細胞障害性Ｔリンパ球活性も検出された（Pialouxら、AIDS Res. and Hum. Retroviruses, 11:272-381 (1995)）。サル免疫不全症ウイルス（SIV）エンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニア組み換え体で免疫し、バキュロウイルス組み換え体からのSIVエンベロープ糖タンパク質で追加免疫したマカクザル（macaque）は、SIV抗原刺激に対して防御される（Huら、AIDS Res. and Hum. Retroviruses, 3:615-620 (1991)；Huら、Science 255:456-459 (1992)）。同様に、NYVACまたはALVAC-gB組み換え体を用いるプライム−追加免疫プロトコールでHCMVgBタンパク質を使用することができる。
【０１５４】
ある例では、ポリヌクレオチドはリポソーム調製物中で複合体形成される。本発明で使用されるリポソーム調製物は、陽イオン性（正に荷電）、陰イオン性（負に荷電）、および中性調製物を含む。しかし、陽イオン性リポソームとポリ陰イオン性核酸との間で強固な荷電複合体が形成されるため、陽イオン性リポソームが特に好ましい。陽イオン性リポソームは、機能性の型で、プラスミドDNA（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:74137416 (1987)、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）；mRNA（Maloneら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:60776081 (1989)、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）；および精製転写因子（Debsら、J. Biol. Chem. 265:1018910192 (1990)、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の細胞内送達を仲介することが知られている。
【０１５５】
陽イオン性リポソームは容易に利用できる。例えばN[1-(2,3-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N,N-トリエチルアンモニウム（DOTMA）リポソームは特に有用であり、インビトロゲン（Invitrogen）（カールスバード、カリホルニア州）から商品名リポフェクチン（Lipofectin）（登録商標）で販売されている（またFlgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:74137416 (1987)参照）。他の市販のリポソームには、トランスフェクテート（DDAB/DOPE）やDOTAP/DOPE（ベーリンガー（Boehringer））がある。
【０１５６】
他の陽イオン性リポソームは、当該分野で公知の方法を使用して、容易に利用できる物質から調製することができる。例えばDOTAP（1,2-ビス(オレイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の説明については、PCT公報WO90/11092号を参照されたい。DOTMAリポソームの調製は、文献（例えば、P. Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:74137417）で説明されている。他の陽イオン性脂質物質からリポソームを調製するのに同様の方法を使用することができる。
【０１５７】
同様に、陰イオン性および中性リポソームは、例えばアバンチポーラーリピッズ（Avanti Polar Lipids）（バーミンガム、アラバマ州）から容易に入手できるか、または容易に入手できる物質を使用して容易に調製することができる。かかる物質には、特にホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）がある。これらの物質はまた、適切な比率でDOTMAやDOTAP出発物質と混合することができる。これらの物質を使用してリポソームを作成する方法は、当該分野で公知である。
【０１５８】
例えば市販のジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）を種々の組合せで使用して、コレステロールの添加有りまたは無しで、通常リポソームを作成することができる。例えば、DOPG/DOPC小胞は、50mgずつのDOPGとDOPCを窒素ガス流下でキャップ付バイアル中に乾燥させることにより調製される。試料は一晩真空ポンプ下に置いて、翌日脱イオン水で水和する。次に倒立カップ（浴型）プローブを取り付けたヒートシステムズ（Heat Systems）媒体レーザー350超音波処理機を最大設定で使用して、浴を15℃で循環させながら、試料をキャップ付バイアル中で2時間超音波処理する。あるいは、陰性荷電小胞は、超音波処理無しでマルチラメラ小胞を製造することにより、またはヌクレオポア膜から押し出して別個のサイズのユニラメラ小胞を製造することにより、調製することができる。他の方法は当該分野で公知であり当業者が利用することができる。
【０１５９】
リポソームは、マルチラメラ小胞（MLV）、小ユニラメラ小胞（SUV）、または大ユニラメラ小胞（LUV）を含み、SUVが好ましい。当該分野で公知の方法を使用して、種々のリポ多糖核酸複合体が調製される。例えばStraubingerら、Methods of Immunology 101:512527 (1983)を参照されたい。例えば、核酸を含有するMLVは、リン脂質の薄膜をガラス管の壁に沈積させ、次に封入される物質の溶液で水和することにより調製される。SUVは、MLVを長時間超音波処理してユニラメラリポソームの均一な集団を産生することにより調製される。捕捉される物質は、前形成されたMLVの懸濁液に加えられ、次に超音波処理される。陽イオン性脂質を含有するリポ多糖を使用する時は、乾燥した脂質フィルムを適切な溶液（例えば、無菌水、または等張緩衝液、例えば10mM トリス／NaCl）に再懸濁し、超音波処理し、次に前形成されたリポソームを直接DNAと混合する。リポソームとDNAは、陽性荷電したリポソームの陽イオン性DNAへの結合により非常に安定な複合体を形成する。SUVは小核酸断片とともに使用される。LUVは、当該分野で公知の多くの方法により調製される。一般的に使用される方法には、Ca2+-EDTAキレート化（Papahadjopoulosら、Biochim. Biophys. Acta 394:483 (1975)；Wilsonら、Cell 17:77 (1979)）；エーテル注射（Deamer, D.とBangham, A., Biochim. Biophys. Acta 443:629 (1976)；Ostroら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836 (1977)；Fraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348 (1979)）；界面活性剤透析（Enoch, H.とStrittmatter, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145 (1979)）；および逆相蒸発（REV）（Fraleyら、J. Biol. Chem. 255:10431 (1980)；Szoka, FとPapahadjopoulos, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145 (1978)；SchaeferRidderら、Science 215:166 (1982)）がある。
【０１６０】
一般に、DNAとリポソームとの比は約10：1〜約1：10である。好ましくは比は約5：1〜約1：5である。さらに好ましくは比は約3：1〜約1：3である。さらに好ましくは比は約1：1である。
【０１６１】
米国特許第5,676,954号は、陽イオン性リポソーム担体と複合体形成した遺伝物質のマウスへの注入について報告している。米国特許第4,897,355号、4,946,787号、5,049,386号、5,459,127号、5,589,466号、5,693,622号、5,580,859号、5,703,055号、および国際公報WO94/9469号は、細胞と哺乳動物にDNAをトランスフェクトするのに使用される陽イオン性脂質を提供する。米国特許第5,589,466号、5,693,622号、5,580,859号、5,703,055号、および国際公報WO94/9469号は、哺乳動物にDNA-陽イオン性脂質複合体を送達する方法を提供する。
【０１６２】
HLA分子のエピトープと類似体の結合親和性
本明細書に記載のように、HLA多型性の程度が大きいことは、治療薬および診断薬を開発へのエピトープベースのアプローチで考慮すべき重要な要素である。この要素を解決するために、好ましくは高または中親和性で複数のHLA分子に結合することができるペプチドの同定を包含するエピトープ選択が使用され、最も好ましくはこれらのエピトープは高または中親和性で2つ以上の対立遺伝子特異的HLA分子に結合する。しかし、ある例では、ある組成物中のすべてのエピトープが、単一のHLAスーパータイプまたは単一のHLA分子に結合することが好ましい。
【０１６３】
本発明のエピトープと類似体は好ましくは、クラスＩ HLA分子に対するIC50または結合親和性値が500nMまたはそれ以下である（すなわち、値は≦500nMである）。本発明のある例では、目的のペプチドはクラスＩ HLA分子に対するIC50または結合親和性値が200nMまたはそれ以下である。本発明のある例では、目的のペプチドはクラスＩ HLA分子に対するIC50または結合親和性値が100nMまたはそれ以下である。HTLエピトープが含まれるなら、これらは好ましくは、クラスII HLA分子に対するIC50または結合親和性値が1000nMまたはそれ以下である（すなわち、≦1000nM）。例えば、ペプチド結合は、ペプチド候補がインビトロで精製HLA分子に結合する能力を試験することにより評価される。高または中親和性を示すペプチドが、さらなる分析で使用される。選択されたペプチドは、一般にスーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験される。好適例では、交差反応性結合を示すペプチドは、細胞スクリーニング分析またはワクチンで使用される。
【０１６４】
HLAクラスＩ分子に対する結合親和性と結合抗原上の別個のペプチドエピトープの免疫原性との関係が、エピミューン（Epimmune）の発明者らにより初めて測定された。本明細書に詳細に開示されるように、より高い結合親和性は、より大きな免疫原性と相関する。
【０１６５】
より大きな免疫原性は、いくつかの異なる方法で証明される。免疫原性は、免疫応答が誘発されるかどうか、および特定の応答の激しさ、ならびに応答が誘発される集団の範囲に対応する。例えばあるペプチドは、多様な集団で免疫応答を誘発するが、激しい応答は示さない。これらの原理では、ほぼ90％の高結合ペプチドが応答を誘発し従って「免疫原性」であり、一方約50％のペプチドは中親和性で結合する（例えばSchaefferら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)）。高親和性結合クラスＩペプチドは一般に、100nM未満またはこれに等しい親和性を有する。さらに高結合親和性を有するペプチドは免疫応答を生成する確立が高いのみでなく、生成される応答は弱い結合ペプチドで見られる応答より激しい傾向がある。その結果、低親和性ペプチドではなく高親和性結合ペプチドが使用されるなら、同様の生物学的作用を誘発するのに、より少ないペプチドが使用される。すなわち本発明のある例では、高親和性結合エピトープが使用される。
【０１６６】
結合親和性と免疫原性との相関は、本発明者らにより2つの異なる実験アプローチにより分析された（例えば、Setteら、J. Immunol. 153:5586-5592 (1994)）。最初のアプローチでは、HLA結合親和性が10,000倍の範囲のエピトープ候補の免疫原性をHLA-A*0201トランスジェニックマウスで分析した。第2のアプローチでは、約100個の異なるB型肝炎ウイルス（HBV）誘導エピトープ候補の抗原性（すべてA*0201結合モチーフを有する）を、急性肝炎患者からのPBLを使用して評価した。これらのアプローチに従って、親和性閾値の約500nM（好ましくは50nMまたはそれ以下）が、ペプチドエピトープがCTL応答を誘発する能力を決定することがわかった。これらのデータは、自然にプロセシングされるペプチドおよび合成Ｔ細胞エピトープについてのクラスＩ結合親和性測定値について言える。これらのデータはまた、Ｔ細胞応答の形成における決定基選択の重要な役割を示す（例えば、Schaefferら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4649-4653 (1989)参照）。
【０１６７】
HLAクラスII（すなわちHLA DR）分子における免疫原性と関連する親和性閾値もまた画定された（例えばSouthwoodら、J. Immunology 160:3363-3373 (1998)、および米国特許第6,413,527号、2002年7月2日発行、を参照）。HLAクラスII結合親和性の生物学的に重要な閾値を画定するために、制限要素（すなわち、エピトープに結合するHLA分子）について32のDR制限エピトープの結合親和性のデータベースを集めた。約半数の症例（32のエピトープのうち15）では、DR制限は高結合親和性（すなわち結合親和性値が100nMまたはそれ以下）に関連した。他の半数の症例（32のうちの16）では、DR制限は中親和性（結合親和性値100〜1000nMまたはそれ以上の範囲）に関連した。32症例のうちの1例でのみDR制限がIC50の1000nMまたはそれ以上に関連した。すなわち1000nMは、DR分子において免疫原性と関連する親和性閾値として画定される。
【０１６８】
エピトープ結合モチーフとスーパーモチーフ
単一アミノ酸置換抗原類似体と内因性結合した自然に処理されるペプチドの配列決定の研究を通して、HLA分子への対立遺伝子特異的結合に必要な決定的に重要な残基が同定されている。ペプチド中のこれらの残基の存在は、結合の確率とHLA分子との結合およびその結合親和性に相関する。
【０１６９】
高親和性および中親和性に相関するモチーフおよび／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチン中に含めるための免疫原性ペプチドエピトープを同定する時重要である。Kastら（J. Immunol. 152:3904-3912 (1994)）は、モチーフを有するペプチドが、対立遺伝子特異的HLAクラスＩ分子に結合するエピトープの90％を占めることを証明した。Kastの研究では、ヒトパピローマウイルス16型のE6とE7タンパク質の全配列をカバーするすべての可能な9アミノ酸の長さのペプチド（各8アミノ酸残基だけ重複）を作成し、これは240ペプチドを生成した。240ペプチドすべてを、異なる人種間で高頻度で発現される5つの対立遺伝子特異的HLA分子への結合を評価した。この偏りの無いペプチドのセットは、HLAクラスＩモチーフの予測値の評価を可能にした。240ペプチドのセットから、高または中親和性で対立遺伝子特異的HLA分子に結合する22ペプチドを同定した。22ペプチドのうち、20（すなわち91％）はモチーフを有した。すなわちこの試験は、ペプチドエピトープの同定のためのモチーフがワクチン中に含まれる価値を証明した。
【０１７０】
従ってモチーフベースの同定法の使用は、標的タンパク質配列中のすべての可能なエピトープの約90％を同定する。開示されたモチーフ分析無しでは、診断または治療に使用される免疫原性ペプチドを現実的に同定する能力が大きく障害される。
【０１７１】
本発明のペプチド、医薬組成物、およびワクチンはまた、MHCクラスII CR分子に結合するエピトープを含む。クラスIIペプチドリガンドには、ペプチドのN末端およびC末端に対して、モチーフのサイズと結合フレーム位置の両方でより大きな不均一性が存在する。HLAクラスIIペプチドリガンドのこの上昇した不均一性は、HLAクラスＩものとは異なり、物理的にあまり両端に限定されないHLAクラスII分子の結合溝の構造による。大きな結合エネルギーに関連する残基を同定するためのHLAクラスII DRB*0101−ペプチド複合体の結晶分析は、DRB*0101分子上で相補的ポケットと複合体形成した残基を同定した。重要なアンカー残基は、最も深い疎水性ポケットに埋め込まれ（例えばMadden, D.R. Ann. Rev. Immunol. 13:587 (1995)）、位置1（P1）と呼ばれる。P1はクラスII結合ペプチドエピトープのN末端残基であるが、より代表的には1つ以上の残基によりN末端のあたりでフランクされる。他の研究もまた、種々のDR分子への結合について、C末端あたりの6番目の位置のペプチド残基の重要な役割を指摘した。例えば米国特許第5,736,142号、および同時係属出願（標題、汎DR結合ペプチドを使用する免疫応答の改変）米国特許出願第09/709,774号（2000年11月8日出願）と09/707,738号（2000年11月8日出願）を参照されたい。
【０１７２】
HLA-A2スーパーモチーフ
対立遺伝子特異的HLA-A2.1分子（例えば、Falkら、Nature 351:290-296 (1991)；Huntら、Science 255:1261-1263 (1992)；Parkerら、J. Immunol. 149:3580-3587 (1992)；Ruppertら、Cell 74:929-937 (1993)）の1次アンカー特異性とHLA-A2と-A28とのと交差反応性結合が記載される。（例えば、関連データの総説についてはFruciら、Human Immunol. 38:187-192 (1993)；Tanigakiら、Human Immunol. 39:152162 (1994)；del Guercioら、J. Immunol. 154:685-693 (1995)；Kastら、J. Immunol. 152:3904-3912 (1994)参照）。これらの1次アンカー残基はHLA-A2スーパーモチーフを画定し、これは、ペプチドリガンド中に存在する時、いくつかの異なるHLA-A2と-A28分子に結合する能力に対応する。HLA-A2スーパーモチーフは、2位に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、T、またはQを有し、エピトープのC末端位置に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、またはTを有するペプチドリガンドを含む。
【０１７３】
HLA分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するHLA-A2スーパータイプ）は、少なくとも以下よりなる：A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*0209、A*0214、A*6802、A*6901。A2スーパーファミリーのメンバーであると予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子を、表4と6に示す。詳細に後述されるように、個々の対立遺伝子特異的HLA分子のそれぞれへの結合は、1次アンカーおよび／または2次アンカー位置の置換により、好ましくはスーパーモチーフについて特定される各残基を選択することにより、調節することができる。
【０１７４】
HLA-A*0201モチーフ
9残基ペプチドの2位に1次アンカー残基としてLまたはM、C末端位置に1次アンカー残基としてLまたはVのペプチドリガンド中の存在により、HLA-A*0201モチーフを測定し（例えば、Falkら、Nature 351:290-296 (1991)参照）、さらに9アミノ酸ペプチドの2位にIをC末端位置（例えば、Huntら、Science 255:1261-1263 March 6, 1992；Parkerら、J. Immunol. 149:3580-3587 (1992)参照）とデカマーペプチドの10位にIまたはAを含むことがわかった。A*0201対立遺伝子特異的モチーフはまた、2位に1次アンカー残基としてV、A、TまたはQを、そしてエピトープのC末端位置に1次アンカー残基としてMまたはTをさらに含むことが、本発明により決定された（例えば、Kastら、J. Immunol. 152:3904-3912, 1994参照）。
【０１７５】
すなわち、HLA-A*0201モチーフは、2位に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、T、またはQを有し、エピトープのC末端位置に1次アンカー残基としてL、I、V、M、A、またはTを有するペプチドリガンドを含む。このモチーフ−スーパーモチーフ関係について、HLA-A*0201モチーフの1次アンカー位置を特徴付ける好適な、およびあまり好適ではなく／許容される残基は、A2スーパーモチーフを記載する残基と同一である（del Guercioら、J. Immunol. 154:685-693 (1995)；Ruppertら、Cell 74:929-937, 1993；Sidneyら、Immunol. Today 17:261-266, 1996；SetteとSidney, Curr. Opin in Immunol. 10:478-482, 1998参照）。A*0201モチーフを特徴付ける2次アンカー残基は、さらに規定されている（例えば、Ruppertら、Cell 74:929-937, 1993参照）。これらの2次アンカーは、表4に示される。HLA-A*0201に結合したペプチドは、1次アンカー位置および／または2次アンカー位置の置換により、好ましくはモチーフについて特定される各残基を選択することにより調節することができる。
【０１７６】
ペプチドエピトープを誘導するクラスII HTLを示すモチーフ
HLAクラスIIペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモチーフの1次および2次アンカー残基は、米国特許第5,736,142号、5,679,640号および6,413,935号；同時係属出願（標題、汎DR結合ペプチドを使用する免疫応答の改変）米国特許出願第09/709,774号（2000年11月8日出願）と09/707,738号（2000年11月8日出願）；およびPCT公報WO95/07707号とWO97/26784号に要約される。
【０１７７】
免疫応答刺激性ペプチド類似体
一般にCTLとHTL応答は、必ずしもすべての可能なエピトープに対応していない。むしろこれらはいくつかの「免疫優性」決定基に限定されている（Zinkernagelら、Adv. Immunol. 27:5159, 1979；Benninkら、J. Exp. Med. 168:19351939；Rawleら、J. Immunol. 146:3977-3984, 1991）。免疫優性（Benacerrafら、Science 175:273-279, 1972）は、あるエピトープが特定のHLAタンパク質に選択的に結合する能力（決定基選択理論）（Vitielloら、J. Immunol.131:1635, 1983）；Rosenthalら、Nature 267:156-158, 1977）、または既存のTCR（Ｔ細胞受容体）特異性により選択的に認識される能力（レパートリー理論）（Klein, J. 「免疫学、自己／非自己区別（IMMUNOLOGY, THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION）」、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク、270-310頁、1982）により説明される。追加の因子（ほとんどプロセシング事象に連結している）が、厳密な免疫原性を超えて、多くの可能な決定基のいずれが免疫優性として提示されるかを決めるのに主要な役割を果たすことができることが証明されている（Sercarzか、Annu. Rev. Immuno. 11:729-766, 1993）。
【０１７８】
優性および亜優性の概念は、感染性疾患と悪性腫瘍の両方の免疫療法に関連する。例えば慢性のウイルス疾患の過程において、亜優性エピトープの動員は感染のクリアランスの成功にとって重要となり、特にCTLまたはHTL特異性が、ウイルスおよび他の機構の機能的許容性、抑制、変異により不活性化される場合に重要である（Francoら、Curr. Opin. Immunol. 7:524-531, 1995）。癌と腫瘍抗原の場合、最も結合親和性の高いペプチドの少なくとも一部を認識するCTLは、機能的に不活性化されているかも知れない。より低結合親和性ペプチドは、これらの時に優先的に認識され、従って治療または予防的抗癌ワクチンで好適である。
【０１７９】
特に、既知の非ウイルス腫瘍関連抗原（TAA）から得られる多数のエピトープは、高親和性（IC50が50nM未満）ではなく中親和性（IC50が50〜500nMの範囲）でHLAクラスＩに結合することに注意されたい。
【０１８０】
例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）またはCTLにより認識される15個の既知のTAAペプチドのうち8個は、50〜500nM範囲で結合することがわかった（これらのデータは、既知のウイルス抗原の90％はIC50が50nMまたはそれ以下でHLAクラスＩ分子により結合され、一方約10％のみが50〜500nM範囲で結合するという予測と異なる（Setteら、J. Immunol. 153:558-592, 1994）。癌の場合、この現象はおそらく、Ｔ細胞寛容誘導事象のために、最も強く結合するペプチドのいくつかを認識するCTLの排除または機能的阻害による。
【０１８１】
理論に拘束されるつもりは無いが、優性エピトープに対するＴ細胞はクローン性に欠失されており、亜優性エピトープを選択することは既存のＴ細胞が動員されることを可能にするため、これは治療または予防応答につながると考えられる。しかし亜優性エピトープへのHLA分子の結合は、しばしば優性なものほど激しくない。
【０１８２】
従って、1つ以上のHLA分子についての特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節する、こうしてペプチドにより誘発される免疫応答を調節する、例えばより激しい応答を誘発する類似体を調製する必要性がある。本発明に従って結合親和性と生じる免疫応答の両方を調節する能力は、ペプチドエピトープベースのワクチンと治療薬の有用性を大いに増強するであろう。
【０１８３】
スーパーファミリーのすべての対立遺伝子中で適当な交差反応性を有するペプチドは、上記のスクリーニング操作により同定されるが、交差反応性は必ずしも完全ではなく、ある場合にはペプチドの交差反応性を上昇させる方法が有用である：さらにかかる操作はまた、ペプチドの他の性質（例えば、結合親和性またはペプチド安定性）を修飾するのに使用することができる。あるモチーフまたはスーパーモチーフ内のHLA対立遺伝子についてペプチドの交差反応性を支配する一般的規則が確立されると、より広い（または修飾された）HLA結合能力を達成するための目的のペプチドの構造を修飾（類似体化）することができる。さらに詳しくは、最も広い交差反応性パターンを示すペプチドは、本明細書の教示に従って産生することができる。類似体生成に関連するこの考え方は、同時係属米国特許出願第09/226,775号（1999年6月6日出願）により詳細に記載されている。
【０１８４】
簡単に説明すると、類似体化法は、いくつかのHLA分子への結合と相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。類似体ペプチドは、1次アンカー、2次アンカー、または1次と2次アンカー位置で、アミノ酸残基を置換することにより作成される。一般に類似体は、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを有するペプチドについて作成される。本明細書に記載のように、HLA-A2クラスＩ結合ペプチドのスーパーモチーフとモチーフの好適な1次および2次活性残基を表3、3aと4に示される。本発明の多くのモチーフまたはスーパーモチーフについて、各モチーフまたはスーパーモチーフに結合する対立遺伝子特異的HLA分子またはHLAサブタイプのメンバーに結合するのに有害な残基が規定される（表4）。従って結合に有害なかかる残基の除去は、本発明に従って行われる。
【０１８５】
すなわちあるスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する1つの方策は、ペプチド内に存在する1つ以上の有害な残基を単に削除してAlaのような「中性」残基（ペプチドのＴ細胞認識に影響を与えないと思われる）を代用することである。ペプチド内の有害な残基の排除とともに、スーパーファミリー内の対立遺伝子特異的HLA分子または複数のHLA分子への高親和性結合に関連する「好適な」残基が挿入されると、交差反応性の確率が上昇すると予測される。
【０１８６】
ワクチンとして使用される時類似体ペプチドがインビボで天然のエピトープに対するCTL応答を実際に誘発することを確実にするために、類似体ペプチドは、適切なHLA対立遺伝子の個体からインビトロでＴ細胞を誘導するために使用される。次に、野生型ペプチド感作標的細胞を溶解する免疫細胞の能力が評価される。あるいは、細胞の活性の評価は、IFN放出を追跡することにより評価される。これらの細胞追跡方策のそれぞれは、CTLによるAPCの認識を評価する。内因性に産生された抗原が、類似体ペプチドにより得られるＴ細胞によっても認識されるかどうかを確立するために、抗原提示細胞として、適切な遺伝子で感染もしくはトランスフェクトされた細胞（一般にHLAクラスIIについての異なるペプチドプロセシング経路のため、クラスIIエピトープについてのみ）、全タンパク質抗原でパルスされた細胞を使用することが好ましいであろう。HLAクラスＩとクラスIIの両方について全タンパク質抗原を提示するために、ペプチド／タンパク質パルス樹状細胞を使用することができることに注意されたい。
【０１８７】
本発明の別の例は、弱く結合するペプチドの類似体を作成して、充分な数の細胞結合物を確保することである。結合親和性500〜5000nMを示し、1つまたは両方の位置で許容されるが部分最適な1次アンカー残基を有するクラスＩ結合ペプチドは、各スーパータイプに一致する好適なアンカー残基を代用することにより「固定」される。次に類似体ペプチドは、結合および／または交差結合能力について試験される。
【０１８８】
本発明の別の例は、すでに交差反応性結合物質でありワクチン候補であるが、スーパータイプの1つ以上の対立遺伝子に弱く結合するペプチドの類似体を作成することである。交差反応性結合物質が1次または2次アンカー位置で部分最適残基（あまり好適ではないまたは有害な）を有するなら、有害な残基を追い出して好適なまたはやや好適な残基で置換するか、またはあまり好適ではない残基を追い出して好適な残基で置換することにより類似体化することができる。次に類似体ペプチドは交差結合能力について試験することができる。
【０１８９】
有効なペプチド類似体を作成するための他の例は、例えば液体環境中のペプチド安定性または溶解度に有害な影響を有する残基の置換を含む。置換はペプチドエピトープの任意の位置で起きて良い。その化学的性質のために、システインはジスルフィド結合を形成して、結合能力が低下するようにペプチドを充分に構造的に変化させる。Cの代わりにα−アミノ酪酸を代用することはこの問題を緩和するが、ある場合に結合と交差結合能力を実際に改善する（例えば、Setteら、持続性ウイルス感染（Persistent Viral Infections）、R. AhmedとI. Chen編、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、イングランド、1999）。システインのα−アミノ酪酸による置換は、ペプチドエピトープの任意の残基で置き、すなわちアンカー位置でも非アンカー位置でも起きる。
【０１９０】
さらに有害な2次アンカー残基の存在を避けながら少なくとも1つの好適な2次アンカー残基を含有するA*0201モチーフを有するペプチドのセットで、69％のペプチドはIC50が500nM未満でA*0201に結合するであろう（Ruppert, J.ら、Cell 74:929, 1993）。Ruppert中で好適であった残基と有害であった残基の決定は、アルゴリズムを作成するのに使用することができる。かかるアルゴリズムは、必要に応じてより大きいかまたは小さい予測結合性を有するペプチドのセットを選択するために、カットオフスコアが調整される点で柔軟性がある。
【０１９１】
本明細書に記載の方法において、HLA-A2対立遺伝子特異的分子に結合しHLA-A2スーパータイプのメンバーに結合することがわかったTAAペプチドエピトープと類似体が同定される。
【０１９２】
さらに、追加のアミノ酸残基は、ペプチドの互いの結合、担体支持体またはより大きなペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の修飾などの容易さを提供するために、ペプチドの末端に付加することができる。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸のようなアミノ酸残基、または任意の天然に存在するまたは任意の天然に存在しないアミノ酸残基を、ペプチドまたはオリゴペプチド（特にクラスＩペプチド）のC末端および／またはN末端に導入することができる。ある場合には、CTLエピトープのカルボキシル末端の修飾は、ペプチドの結合特性を変化させることがあることに注意されたい。さらにペプチドまたはオリゴペプチド配列は、例えばアルカノイル（C1-C20）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミンなどにより末端NH2アシル化により修飾されているため、天然の配列とは異なることがある。ある場合にはこれらの修飾は、支持体または他の分子への結合のための部位を提供することがある。
【０１９３】
Ｔ細胞応答を検出するための測定法
HLA結合ペプチドがいったん同定されると、これらはＴ細胞応答を誘発する能力について試験することができる。モチーフを有するペプチドの調製と評価は、例えばPCT公報WO94/20127号とWO94/03205号に記載されている。簡単に説明すると、特定の抗原からのエピトープを含むペプチドが合成され、関連HLAタンパク質に結合する能力について試験される。これらの測定法は、放射性ヨード化参照ペプチドの結合と比較して、精製したHLAクラスＩ分子へのペプチド結合を評価する。あるいは空のクラスＩ分子（すなわち、結合したペプチドが無い細胞表面HLA分子）を発現する細胞は、免疫蛍光染色とフローマイクロ蛍光測定法によりペプチド結合について評価される。ペプチド結合を評価するために使用される他の測定法には、ペプチド依存性クラスＩアセンブリー測定法、および／またはペプチド競合によるCTL認識阻害がある。代表的には500nMまたはそれ以下の親和性を有するHLAクラスＩ分子に結合するペプチドは、感染または免疫個体からのCTLの標的として機能する能力について、ならびに病原性に関連する選択された標的細胞と反応することができるCTL集団を生成する1次インビトロまたはインビボCTL応答を誘導する能力について、さらに評価される。
【０１９４】
HLAクラスII結合ペプチドの評価のために、類似の測定法が使用される。代表的には1000nMまたはそれ以下の親和性で結合することが証明されているHLAクラスIIモチーフを有するペプチドが、HTL応答を刺激する能力についてさらに評価される。
【０１９５】
Ｔ細胞応答を検出するのに使用される従来の測定法には、増殖測定法、リンホカイン分泌測定法、直接細胞障害性測定法、および限界希釈測定法がある。例えばペプチドとインキュベートされた抗原提示細胞は、レスポンダー細胞集団中でCTL応答を誘導する能力について測定することができる。抗原提示細胞は、例えば末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常な細胞でもよい。あるいは、ヒトクラスＩMHC遺伝子でトランスフェクトされており、クラスＩ分子に内部でプロセシングされたペプチドを与える能力が欠如した変異非ヒト哺乳動物細胞株が、静脈内1次CTL応答を誘導するペプチドの能力を評価するのに使用される。末梢血単核細胞（PBMC）は、CTL前駆体の供給源として使用することができる。抗原提示細胞はペプチドとインキュベートされ、その後ペプチドを与えられた抗原提示細胞は、最適培養条件下でレスポンダー細胞集団とインキュベートされる。放射能標識された標的細胞（特異的ペプチドパルスした標的、またはそこから特異的ペプチドが得られた内因性にプロセシングされた抗原を発現する標的細胞）を溶解CTLの細胞について培養物を測定することにより、陽性のCTL活性化が測定される。あるいは、エピトープ特異的CTLの存在は、IFNγインサイチュELISAにより測定することができる。
【０１９６】
診断薬に関連する本発明の例では、蛍光標識HLA四量体複合体を用いて染色することにより、抗原特異的Ｔ細胞の直接定量を可能にする方法が開発されている（Altman, J.D.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10330, 1993；Altman, J.D.ら、Science 274:94, 1996）。他の選択肢には、細胞内リンホカインの染色、IFN放出測定法、またはELISPOT測定法がある。四量体染色、細胞内リンホカインの染色、およびELISPOT測定法はすべて、多くの従来の測定法より少なくとも10倍高感度である（Lalvani, A.ら、J. Exp. Med. 186:859,1997；Dunbar, P.R.ら、Curr. Biol. 8:413, 1998；Murali-Krishna, K.ら、Immunity 8:177, 1998）。さらにダイマーＸ技術を定量の手段として使用することができる（例えば、Science 274:94-99 (1996)およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7568-73 (1998)）。
【０１９７】
当該分野で公知の方法、例えばＴ細胞増殖またはリンホカイン分泌を使用して、HTL活性化を評価してもよい（例えば、Alexanderら、Immunity 1:751-761, 1994参照）。
【０１９８】
あるいは、HLAトランスジェニックマウスの免疫を使用して、ペプチドエピトープの免疫原性を測定することができる。いくつかのトランスジェニックマウス株、例えばヒトA2.1、A11を有するマウス（HLA-A3エピトープを分析するのに使用することもできる）、およびB7対立遺伝子を有するマウスも解析されている。他のトランスジェニックマウス株（例えば、HLA-A1およびA24についてのトランスジェニックマウス）は開発中である。さらにHLA-DR1およびHLA-DR3マウスモデルが開発されている。当該分野の原理に従うと、他のHLA対立遺伝子を有する追加のトランスジェニックマウスモデルは必要に応じて作成される。
【０１９９】
かかるマウスは、不完全フロイントアジュバントに乳化したペプチドで免疫することができる。次に、得られるＴ細胞を、ペプチドパルスしたかまたは目的のペプチドをコードする遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識する能力について試験する。CTL応答は、上記の細胞障害性測定法を使用して分析することができる。同様にHTL応答は、例えばＴ細胞増殖またはリンホカイン分泌測定法を使用して分析することができる。
【０２００】
ミニ遺伝子
複数のエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用できる。複数のエピトープをコードする核酸は本発明の有用な例である；別個のエピトープまたは多エピトープ性ペプチドをコードすることができる。ミニ遺伝子中に含まれるエピトープは、好ましくは前記セクションに示したガイドラインに従って選択される。ミニ遺伝子中に含まれるアミノ酸配列の例には以下がある：HLAクラスＩエピトープ、HLAクラスIIエピトープ、ユビキチン化シグナル配列、および／または標的細胞、例えば得られるペプチドの小胞体中への移動を促進する小胞体（ER）シグナル配列。
【０２０１】
マルチエピトープミニ遺伝子の使用はまた、例えば同時係属米国特許出願第09/311,784号、09/894,018号、60/419,973号、60/415,463号；Ishiokaら、J. Immunol. 162:3915-3925, 1999；An, L.とWhitton, J.L., J. Virol. 71:2292, 1997；Thomson, S.A.ら、J. Immunol. 157:822, 1996；Whitton, J.L., J. Virol. 67:348, 1993；Hanke, R.ら、Vaccine 16:426, 1998に記載されている。例えばHBVとヒト免疫不全症ウイルス（HIV）のポリメラーゼ、エンベロープ、およびコアタンパク質から得られる9つの優性HLA-A*0201-およびA11-制限CTLエピトープと、パドレ（PADRE）（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞（HTL）エピトープと、小胞体転位シグナル配列とをコードする、マルチエピトープDNAプラスミドが遺伝子操作で作成されている。このプラスミド構築体を用いてHLAトランスジェニックマウスを免疫すると、試験した9つのCTLエピトープに対して強いCTL誘導応答が得られた。このCTL応答は、ヒトで既知の免疫原性のリポペプチドで観察されたものと同様であり、油ベースのアジュバント中のペプチドを使用した免疫よりはるかに大きかった。さらにDNAにコードされたエピトープのインビトロ免疫原性は、DNAプラスミドを用いてトランスフェクトされた標的細胞に対する特異的CTL株のインビトロ応答と相関した。これらのデータは、ミニ遺伝子が：1)CTL応答を生成する、および2)コードされたエピトープを発現する細胞を認識するCTLを生成する、ことを示す。同様のアプローチを使用して、TAAエピトープをコードするミニ遺伝子を開発することができる。
【０２０２】
例えば、ヒト細胞中の発現について選択されたエピトープをコードするDNA配列（ミニ遺伝子）を作成するために、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳してもよい。各アミノ酸のコドン選択をするために、ヒトコドン使用表を使用することができる。これらのエピトープ含有DNA配列を直接結合させ、翻訳された時、連続的ペプチド配列を作成させる。しかし発現および／または免疫原性を最適化するために、エピトープ間のスペーサーアミノ酸残基のような追加の要素をミニ遺伝子設計に取り込むことができる。CTLまたはHTLエピトープに隣接する天然に存在する合成（例えばポリアラニン）フランキング配列を含めることにより、CTLおよびHTLエピトープのHLA提示を改良することができる；エピトープを含むこれらの大きいペプチドは本発明の範囲内である。ある例では、1つ以上のCTLおよび／またはHTLエピトープ間のスペーサーアミノ酸残基は、2つのCTLおよび／またはHTLエピトープの並置により生じるジャンクションエピトープを最小にするように、設計される。
【０２０３】
ミニ遺伝子のプラスおよびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることにより、ミニ遺伝子配列はDNAに変換される。重複オリゴヌクレオチド（30〜100塩基の長さ）は、公知の技術を使用して適切な条件下で、合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオチドの末端は、例えばT4 DNAリガーゼを使用して結合することができる。エピトープペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は次に、所望の発現ベクター中にクローン化される。
【０２０４】
標的細胞中の発現を確実にするために、好ましくは当業者に公知の標準的制御配列がベクター中に含まれる。いくつかのベクター要素が好ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写停止のためのポリアデニル化シグナル；大腸菌（E. coli）複製開始点；および大腸菌（E. coli）選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。この目的のために無数のプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーター）が使用できる。他の適当なプロモーター配列については米国特許第5,580,859号および5,589,466号を参照されたい。
【０２０５】
最適化したペプチド発現と免疫原性は、ミニ遺伝子構築体にいくつかの修飾をすることにより行われる。例えばある場合には、イントロンは効率的な遺伝子発現を促進し、こうして1つ以上の合成または天然に存在するイントロンがミニ遺伝子の転写領域中に取り込まれる。mRNA安定化配列および哺乳動物細胞中の複製のための配列を含めることもまた、ミニ遺伝子発現を上昇させるために考慮される。
【０２０６】
いったん発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子はプロモーターの下流のポリリンカー領域中にクローン化される。このプラスミドは適切な細菌株に形質転換され、標準的方法を使用してDNAが調製される。ミニ遺伝子の配向とDNA配列ならびにベクター中に含まれる他のすべての要素は、制限マッピング、PCR、および／またはDNA配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、細胞バンクとして保存することができる。
【０２０７】
さらに、免疫刺激配列（ISSまたはCpG）はDNAワクチンの免疫原性においてある役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強するためにミニ遺伝子コード配列の外でベクター中に含まれる。
【０２０８】
ある例では、ミニ遺伝子にコードされるエピトープと第2のタンパク質（例えば、免疫原性を調節するもの）の両方の産生を可能にする2シストロン性発現ベクターを使用することができる。もしエピトープと同時発現されると免疫応答を増強するタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、IL-2、IL-12、GM-CSF）、サイトカイン誘導性分子（例えばLeIF）、同時刺激性分子、またはPanDR結合タンパク質（パドレ（PADRE）（登録商標）、エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州）がある。パドレ（PADRE）（登録商標）分子のようなヘルパーＴ細胞（HTL）エピトープは、細胞内ターゲティングシグナルに結合することができ、発現されるCTLエピトープとは別に発現される。これは、CTLエピトープとは異なる細胞コンパートメントにHTLエピトープを向けるために行われ、これは、HLAクラスII経路へのHTLエピトープのより効率的な侵入を提供し、こうしてHTL誘導を改善する。HTLまたはCTL誘導に対して、免疫抑制分子（例えばTGF-β）の同時発現により免疫応答を低下させることは、いくつかの疾患で有用である。
【０２０９】
プラスミドDNAの治療量は、例えば大腸菌（E. coli）を発酵させて、次に精製することにより産生することができる。使用細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に接種し、振盪フラスコまたはバイオリアクター中で公知の方法に従って飽和まで増殖させる。プラスミドDNAは、標準的生物学的分離法、例えば利用できる固相陰イオン交換樹脂、例えばキアゲン社（Qiagen Inc.）のもの（バレンシア（Valencia）、カリホルニア州）を使用して精製される。必要であれば、スーパーコイルDNAをゲル電気泳動または他の方法を使用してオープン円形および線状型から単離することができる。
【０２１０】
精製プラスミドDNAは、種々の調製物を使用して注入用に調製される。これらの最も簡単なものは、凍結乾燥DNAの無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）での復元である。このアプローチ（「裸のDNA」として知られている）は、現在臨床治験で筋肉内（IM）投与のために使用されている。ミニ遺伝子ワクチンの免疫療法作用を最大にするために、精製プラスミドDNAを調製するための他の方法を使用してもよい。種々のかかる方法は開示されており、新しい技術が利用できるようになっている。陽イオン性脂質、糖脂質、および膜融合リポソームもまた、調製物中で使用される（例えば、WO93/24640；ManninoとGould-Fogerite, Bio/Techniques 6(7):682 (1988)；米国特許第5,279,833号；WO91/06309号；およびFelgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 (1987)を参照）。さらにまとめて防御性、相互作用性、非縮合化合物（PINC）と呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、精製プラスミドDNAと複合体形成して、安定性、筋肉内分散、または特定の臓器または細胞タイプへの移動のような変量に影響を与えることができる。
【０２１１】
当業者に公知の方法を使用して、インビボでのポリヌクレオチドの送達と取り込みを増強することができる。例えばポリヌクレオチドはポリビニルピロリドン（PVP）と複合体形成させて、ポリヌクレオチドの局所的バイオアベイラビリティを延長させ、こうして生物によるポリヌクレオチドの取り込みを増強することができる（例えば、米国特許第6,040,295号；EP0465529号；WO98/17814号を参照）。PVPは、広範囲の物質と複合体を形成することが知られているポリアミドであり、化学的および生理学的に不活性である。
【０２１２】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子にコードされるエピトープの発現とHLAクラスＩ提示の機能性測定法として使用することができる。例えばプラスミドDNAは、標準的CTLクロム放出測定法の適当な標的である哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最終調製物に依存し、「裸の」DNAに電気穿孔法を使用することができ、陽イオン性脂質またはDNA：PVP組成物は直接のインビトロトランスフェクションを可能にする。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、蛍光活性化細胞ソーター解析（FACS）を使用してトランスフェクト細胞を増加させることができる。次にトランスフェクトされた細胞をクロム-51（51Cr）標識して、エピトープ特異的CTLの標的として使用する。標的細胞の細胞溶解（51Cr放出により検出される）は、ミニ遺伝子にコードされるCTLエピトープの産生とHLA提示を示す。HTLエピトープの発現は、HTL活性を評価する測定法を使用して同様の方法で評価される。
【０２１３】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子DNA調製物の機能性試験の第2のアプローチである。適切なヒトHLAタンパク質を発現するトランスジェニックマウスをDNA産物で免疫する。用量と投与経路は調製物に依存する（PBS中のDNA用にIM、脂質複合体形成DNAには腹腔内（IP））。免疫の11〜21日後、脾臓細胞を採取し、試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で1週間再刺激する。次にCTLについて、標準的測定法を行って、ペプチド負荷、51Cr標識標的細胞の細胞溶解があるかどうかを測定する。再度、ミニ遺伝子中のものに対応するエピトープに暴露された標的細胞の溶解は、DNAワクチン機能とCTLの誘導を示す。HTLエピトープの免疫原性は、トランスジェニックマウス中で同様の方法で評価される。
【０２１４】
あるいは核酸は、例えば米国特許第5,204,253号に記載のように、衝撃送達を使用して投与される。この方法を使用して、DNAからのみなる粒子が投与される。衝撃送達のさらなる代替法では、DNAを粒子（例えば金粒子）に接着させることができる。
【０２１５】
ワクチン組成物
免疫学的有効量の本発明の1つ以上のペプチドまたはポリヌクレオチドを含有するワクチンは、本発明のさらなる例である。ペプチドは種々の手段または調製物中で送達することができ、まとめて「ワクチン」組成物と呼ぶ。かかるワクチン組成物および／または投与法は、例えば裸のDNA、PVPで調製したDNA、陽イオン性脂質調製物中のDNA；リポペプチド（例えば、Vitiello, A.ら、J. Clin. Invest. 95:341, 1995）、例えばポリ（DL-ラクチド-co-グリコリド）（「PLG」）微小球中に封入されたDNAまたはペプチド（例えば、Eldridgeら、Molec. Immunol. 28:287-294, 1991；Alonsoら、Vaccine 12:299-306, 1994；Jonesら、Vaccine 13:675-681, 1995）；免疫刺激複合体中に含有されるペプチド成分（ISCOM）（例えば、Takahashiら、Nature 344:873-875, 1990；Huら、Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998）；複数の抗原ペプチド系（MAP）（例えば、Tam, J.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413, 1988；Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996）；ウイルス、細菌、または真菌送達ベクター（Perkus, M.E.ら、「ワクチン開発の考え方（Concepts in vaccine development）」中、Kaufmann, S.H.E.編、379頁、1996；Chakrabarti, S.ら、Nature 320:535, 1986；Hu, S.L.ら、Nature 320:537, 1986；Kieny, M.-P.ら、AIDS Bio/Technology 4:790, 1986；Top, F.H.ら、J. Infect. Dis. 124:148, 1971；Chanda, P.K.ら、Virology 175:535, 1990）；ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Kofler, N.ら、J. Immunol. Methods 192:25, 1996；Eldridge, J.H.ら、Sem. Hematol. 30:16, 1993；Falo, L.D., Jr.ら、Nature Med. 7:649, 1995）；アジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）（Warren, H.S., Vogel, F.R.とChedid, L.A. Annu. Rev. Immuno. 4:369, 1986；Gupta, R.K.ら、Vaccine 11:293, 1993）；リポソーム（Reddy, R.ら、J. Immunol. 148:1585, 1992；Rock, K.L., Immunol. Today 17:131, 1996）；または、粒子吸収cDNA（Ulmer, J.B.ら、Science 259:1745, 1993；Robinson, H.L., Hunt, L.A.とWebster, R.G., Vaccine 11:957, 1993；Shiver, J.W.ら、「ワクチン開発の考え方（Concepts in vaccine development）」中、Kaufmann, S.H.E.編、423頁、1996；Cease, K.B.とBerzofsky, J.A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994、およびEldridge, J.H.ら、Sem. Hematol. 30:16, 1993）がある。毒素標的化送達法（受容体介在ターゲティングとしても知られている）、例えばアバントイムノセラピューティクス社（Avant Immunotherapeutics, Inc.）（ニーダム（Needham）、マサチューセッツ州）またはストレスタンパク質（例えばHSP96（ストレスジンバイオテクノロジーズ社（Stressgen Biotechnologies Corp.）、ビクトリア、BC、カナダ）に結合したものも使用することができる。
【０２１６】
本発明のワクチンは核酸介在性である。本発明の1つ以上のペプチドをコードするDNAまたはRNAは患者に投与することができる。このアプローチは、例えばWolffら、Science 247:1465 (1990)、ならびに米国特許第5,580,859号；5,589,466号；5,804,566号；5,739,118号；5,736,524号；5,679,647号；およびWO98/04720号に記載されている。DNAベースの送達法の例には、「裸のDNA」、促進DNA送達（例えばブピビカイン、ポリマー（例えば、PVP）、ペプチド性との組合せにより促進された（すなわち、非「裸のDNA」）、陽イオン性脂質複合体と粒子介在（「遺伝子銃」）または圧力介在送達（例えば、米国特許第5,922,687号参照）に記載されている。従って本発明のペプチドワクチンは、ウイルスまたは細菌ベクターにより発現される。発現ベクターの例には、弱毒化ウイルス宿主、例えばワクシニアまたは鶏痘ウイルスがある。例えば、ワクシニアウイルスは、本発明のペプチド（例えばMVA）をコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとして使用される。急性または慢性に感染された宿主または非感染宿主中に導入すると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、こうして免疫応答を誘発する。免疫プロトコールに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第4,722,848号に記載されている。他のベクターはBCG（カルメット−ゲラン菌）である。BCGベクターは、Stoverら、Nature 351:456-460 (1991)に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫に有用な広範囲の他のベクター（例えばアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、レトロウイルス、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者には明らかであろう。
【０２１７】
さらに本発明のワクチンは、本発明の1つ以上のペプチドを含むことができる。従ってペプチドはワクチン中に個々に存在するか；あるいはペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマー、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在することができる。ポリマーは、免疫反応の上昇した確率（ポリマーを作成するのに異なるエピトープ／類似体が使用される）および免疫応答に標的化される抗原の異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＴ細胞を誘導する上昇した能力という利点を有する。組成物は、抗原の天然に存在する領域でも、または例えば組換え法もしくは化学合成により調製してもよい。
【０２１８】
本発明の組成物で使用可能な担体は当該分野で公知であり、例えばサイログロブリン、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸残基（例えばポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸）、インフルエンザウイルスタンパク質、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。ワクチンは、生理学的に許容される希釈剤、例えば水または食塩水溶液、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水を含有することができる。一般にワクチンはまたアジュバントを含む。アジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバン）は当該分野で公知の物質の例である。さらに本明細書に開示のように、CTL応答は、本発明のペプチドを脂質、例えばトリパルミトイル-S-グリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）に結合することによりプライムすることができる。
【０２１９】
注射（例えば、SC、ID、IM）、エアゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜内、くも膜下、または他の適当な経路により、本発明のペプチド組成物を用いて免疫すると、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な抗体、CTLおよび／またはHTLを産生することによりワクチンに対して応答する。次に宿主は、少なくとも部分的にTAAの以後の暴露に対して免疫になるか、またはTAA担持細胞の発生に対して少なくとも部分的に耐性になり、こうして予防または治療効果を得る。
【０２２０】
ある例では、Ｔ細胞応答を誘導する成分は、目的の標的抗原に対する抗体応答を誘導する成分と組合わされる。かかる組成物の好適例は、本発明のクラスＩおよびクラスIIエピトープを含む。あるいは組成物は、本発明のクラスＩおよび／またはクラスIIエピトープをパドレ（PADRE）（登録商標）、エピミューン（Epimmune）、サンジエゴ、カリホルニア州）とともに含む。
【０２２１】
本発明のワクチンは、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして抗原提示細胞、例えば樹状細胞を含むことができる。例えば免疫応答を誘発するために、樹状細胞は例えば本発明のミニ遺伝子構築体を用いてトランスフェクトされる。ミニ遺伝子は以下のセクションで詳述される。ワクチン組成物は、樹状細胞の動員と採取後にインビトロで作成することができ、こうして樹状細胞のインビトロでの添加が起きる。
【０２２２】
本発明のワクチン組成物はまた、抗ウイルス剤（例えばインターフェロン−α）または免疫アジュバント（例えばIL-12、GM-CSF）などと組合せて使用される。
【０２２３】
ワクチン（ペプチドベースまたは核酸ベースの調製物）に含めるためのエピトープおよび／または類似体を選択する時に、好ましくは以下の原理が使用される。TAA関連疾患を治療または予防するためにワクチン中で使用されるエピトープと類似体の例は、表14に記載される。選択を行うために、以下のそれぞれの原理をバランスさせる。ワクチン中で複数のエピトープが使用される時、このエピトープは、特に限定されないが、そこからエピトープが得られる天然の配列で連続的である。かかる複数のエピトープは、個々のペプチドまたはマルチエピトープペプチド中で使用される、ペプチド内のエピトープの順序、または同じ領域からのエピトープの選択でもよい。
1)投与することにより、TAA発現腫瘍の予防またはクリアランスと相関することが観察されている免疫応答を模倣する、エピトープおよび／または類似体が選択される。HLAクラスＩについてこれは一般に、少なくとも1つのTAAからの3〜4個のエピトープおよび／または類似体を含む。
2)免疫原性と相関することが確立された必要な結合親和性を有するエピトープおよび／または類似体が選択される：HLAクラスＩについて500nMまたはそれ以下のIC50、クラスIIについて1000nMまたはそれ以下のIC50。HLAクラスＩについて、200nMまたはそれ以下のIC50を有するペプチドを選択することが好ましく、これは、免疫応答の誘導のみでなく、インビトロの腫瘍細胞死滅にも相関すると考えられているためである。HLA A1とA24について、IC50が100nMまたはそれ以下のペプチドを選択することが好ましい。
3)広い人口をカバーするために、スーパーモチーフを有するエピトープおよび／または類似体、または対立遺伝子特異的モチーフを有するエピトープおよび／または類似体が選択される。一般に、少なくとも80％の人口をカバーすることが好ましい。モンテカルロ解析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、人口カバー率を評価することができる。
4)癌関連抗原について、患者は天然のエピトープに対する寛容が出現しているため、エピトープの代わりにまたは以外に、類似体を選択することが好ましい。
5)特に関連するものは「ネステッドエピトープ（nested epitope）」である。ネステッドエピトープは、あるペプチド配列で少なくとも2つのエピトープが重複する時に起きる。例えばネステッドエピトープは、重複する複数のエピトープを含有する領域からの抗原の断片、または別のものに完全に包含される1つのエピトープでもよく、例えばA2ペプチドMAGE3.159とMAGE3.160はネステッドである。「超越（transcendent）ネステッドエピトープ」は、その中にHLAクラスＩとHLAクラスIIエピトープの両方を有するペプチドである。ネステッドエピトープを提供する時、提供する配列当たり最大数のエピトープを有する配列を提供することが好ましい。好ましくはペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープ中のカルボキシル末端より長いペプチドを提供することは避ける。ネステッドエピトープを含む配列を提供する時、病原性または他の有害な生物学的性質を持たないことを確実にするために、配列を評価することが重要である。これは、感染性生物に関するワクチンについて特に重要である。
6)複数のエピトープまたはポリヌクレオチド（例えばミニ遺伝子）を有するタンパク質が作成される場合、目的は、目的のエピトープを含む最も小さいペプチドを作成することである。この原理は、ネステッドエピトープを含むペプチドを選択する時、同じではなくても同様である。しかし複数のエピトープを含む人工的ペプチドでは、サイズを最小にする目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープの間のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスさせることである。スペーサーアミノ酸残基は、ジャンクションエピトープ（標的抗原上に存在しない、免疫系により認識されるエピトープ）を避けるか、またはエピトープ間の切断を促進するように導入することができ、こうしてエピトープ提示を増強する。受容者は非天然のエピトープに対する免疫応答を生じることがあるため、一般にジャンクションエピトープは避けられる。特に注意するのは「優性エピトープ」であるジャンクションエピトープである。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が小さくなるかまたは抑制されるような、激しい応答を引き起こすことがある。
【０２２４】
エピトープの周りの配列にジャンクションエピトープが適用される以外は、原理は同じである。免疫応答を避けるために、構築体中の他の配列も注意する必要がある。
【０２２５】
Ｔ細胞プライミング物質
ある例では、本発明の組成物に、細胞障害性Ｔリンパ球をプライムする少なくとも1つの成分を含めることが好ましい。ウイルス抗原に対してインビボでCTLをプライムできる物質として、脂質が同定されている。例えばパルミチン酸残基は、リジン残基のε-およびα-アミノ基に結合することができ、次に免疫原性ペプチドに結合される。1つ以上の結合成分、例えばGly、Gly-Gly-、Ser、Ser-Ser-などが使用される。次に脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子中で直接リポソーム中に取り込まれるか、またはアジュバント（例えば不完全フロイントアジュバント）中で乳化されて投与される。好適な免疫原性組成物は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に加えられる結合成分（例えばSer-Ser-）を介して、リジンのε-およびα-アミノ基に結合したパルミチン酸を含む。
【０２２６】
CTL応答の脂質促進プライミングの他の例では、適切なペプチドに共有結合してCTLをプライムするのに、大腸菌（E. coli）リポタンパク質（例えばトリパルミトイル-Sグリセリル-システイニル-セリル-セリン（P3CSS）が使用できる（例えば、Deresら、Nature 342:561, 1989参照）。本発明のペプチドは、例えばP3CSSに結合することができ、標的抗原に対するCTL応答を特異的にプライムするために個体にリポペプチドが投与される。さらに中和性抗体の誘導はまた、P3CSS結合エピトープによりプライムできるため、2つのかかる中和抗体を組合せて、体液性および細胞性応答をより有効に誘発することができる。
【０２２７】
CTLおよび／またはHTLペプチドでパルスした樹状細胞
本発明のワクチン組成物の例は、患者血液からのPBMCまたはそこから単離されるDCへのエピトープ担持ポリペプチドのカクテルのエクスビボ投与を含む。例えばプロゲニポエチン（Progenipoietin）（登録商標）（モンサント（Monsant）、セントルイス、ミズーリ州）またはGM-CSF/IL-4のようなDCの採取を促進する薬剤を使用することができる。DCをペプチドでパルス後、および患者に再注入する前に、DCを洗浄して非結合ペプチドを除去する。この例ではワクチンは、その表面上にHLA分子中のパルスペプチドエピトープを提示するペプチド−パルスDCを含む。
【０２２８】
DCはペプチドのカクテルでエクスビボパルスすることができ、その一部は、目的の1つ以上の抗原（例えば腫瘍関連抗原（TAA）、例えばHER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3、および／または癌胎児性抗原（CEA））に対するCTL応答を刺激する。まとめてこれらのTAAは、乳癌、結腸癌、および肺癌に関連している。場合により、CTL応答を促進するために、ヘルパーＴ細胞（HTL）ペプチド（例えばパドレ（PADRE）（登録商標））を含めることができる。すなわち、HER2/neu、p53、MAGE2、MAGE3、および癌胎児性抗原（CEA）からのエピトープを含む本発明のワクチンは、乳癌、結腸癌、肺癌、または卵巣癌のような悪性腫瘍を有する患者の最小のまたは残存疾患を治療するのに使用される；これらのTAAのいずれかを有する任意の悪性腫瘍はまた、ワクチンにより治療することができる。縮小操作（例えば、手術、放射線療法、または化学療法）後にTAAワクチンを使用することができ、ワクチンは、受容者の疾患の無い生存期間と全体的生存期間を延長するという利点を提供する。
【０２２９】
すなわち好適例では、本発明のワクチンは、多くの異なるタイプの腫瘍について大多数の患者を治療する生成物である。複数のエピトープ（好ましくはスーパーモチーフ担持エピトープ）を含むワクチンは、かかる利点を提供する。
【０２３０】
診断的および予防的使用
本発明のある例では、HLAクラスＩとクラスII結合ペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用することができる。好ましくは診断、予防、および同様の用途でエピトープおよび／または類似体を選択する時、以下の原理が使用される。可能な原理は、すでに記載された結合親和性があること、および／またはペプチドのHLA-モチーフ／スーパーモチーフが患者のHLA型に一致することを含む。
【０２３１】
評価された免疫応答は、任意の免疫原により誘導することができる。例えば免疫原は、試薬として使用されるペプチドエピトープを認識する抗原特異的CTLまたはHTLの産生を引き起こす。すなわち本発明のペプチドは、免疫原として使用されるかまたは使用されない。かかる分析に使用できる測定系には、四量体ベース（例えば、ダイマーＸ技術、例えば、Science 274:94-99 (1996)およびProc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7568-73 (1998)）、細胞内リンホカインの染色、インターフェロン放出測定法、またはELISPOT測定法のプロトコールがある。
【０２３２】
例えば、推定免疫原に暴露後に、本発明のペプチドを四量体染色測定法で使用して、任意の抗原特異的CTLの存在について末梢血単核細胞を評価することができる。HLA-四量体複合体は抗原特異的CTLを直接視覚化するのに使用することができ、こうして末梢血単核細胞の試料中のかかる抗原特異的CTLの頻度を測定することができる（例えば、Oggら、Science 279:2103-2106, 1998；およびAltmanら、Science 174:94-96, 1996参照）。
【０２３３】
本発明のペプチドを含む四量体試薬は以下のように作成される：HLA分子に結合するペプチドを対応するHLA重鎖とβ2マイクログロブリンの存在下で再折り畳みさせて、3分子複合体を作成する。この複合体をHLA重鎖のカルボキシル末端（前にタンパク質中に作成した部位）でビオチン化する。次にストレプトアビジンを加えて四量体形成を誘導する。蛍光標識ストレプトアビジンを使用すると、四量体複合体は抗原特異的細胞を染色するのに使用できる。次に標識細胞は、例えばフローサイトメトリーにより容易に同定される。かかる方法は診断または予防目的に使用される；この方法で同定される細胞は、治療目的に使用することができる。
【０２３４】
本発明のペプチドはまた、免疫想起応答を評価するための試薬として使用される。（例えば、Bertoniら、J. Clin. Invest. 100:503-513, 1997 およびPennaら、J. Exp. Med. 174:1565-1570, 1991参照）。例えばDNA配列関連抗原（例えば、CEA、p53、MAGE2/3、HER2/neuのようなTAA、またはHPVまたはHSVのような新生物に関連する生物）を発現する個体からのPBMC膨潤性媒体は、特異的ペプチドを使用して抗原特異的CTLまたはHTLの存在について分析することができる。単核細胞を含有する血液試料は、PBMCを培養し細胞を本発明のペプチドで刺激することにより評価してもよい。適切な培養期間後、拡張した細胞集団を、例えばCTLまたはHTL活性について分析する。
【０２３５】
すなわちワクチンの効力を評価するためにペプチドを使用することができる。免疫原でワクチン接種した患者から得られるPBMCは、本明細書に記載のような方法により分析される。患者のHLAを型判定し、患者に存在するHLA分子により結合されるペプチドエピトープを分析のために選択する。ワクチンの免疫原性は、ワクチン中に存在するエピトープに対するCTLおよび／またはHTLの存在により示される。
【０２３６】
本発明のペプチドはまた、当該分野で公知の方法を使用して、抗体を作成するのに使用される（例えば、「免疫学の現代のプロトコール（Current Protocols in Immunology）」、ワイリイ／グリーン（Wiley/Greene）、ニューヨーク；および「抗体：実験室マニュアルハーロー（Antibodies: A Laboratory Manual Harlow）」、ハーローとレーン（Harlow and Lane）、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、1989参照）。かかる抗体は、DNA配列関連抗原の存在を調べるための試薬として有用である。この範疇の抗体には、HLA分子により結合する時ペプチドを認識するもの、すなわちペプチド−MHC複合体に結合する抗体がある。
【０２３７】
治療または予防目的の投与
本発明のペプチドとポリヌクレオチド（その組成物を含む）は、疾患を治療および／または予防するために、哺乳動物特にヒトへの投与に有用である。ある例では、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、またはワクチン組成物（ペプチドまたは核酸）は、1つ以上のTAAの発現に関連する悪性腫瘍を有する患者に、またはTAA関連疾患に罹りやすいかまたは発症するリスクのある個体に、投与される。投与するとTAAに対する免疫応答が誘発され、こうして患者自身の免疫応答能力が増強される。治療用途では、ペプチドおよび／または核酸組成物は、TAA発現細胞に対する有効な免疫応答を誘発するのに、従って症状および／または合併症を治療、停止、または遅らすのに充分な量で患者に投与される。これを行うのに充分な量は「治療的有効量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば投与される具体的な組成物、投与方法、治療される疾患の段階と重症度、患者の体重と全身的健康状態、および担当医師の判断に依存する。
【０２３８】
ある例では、癌を治療する方法が提供される。ある場合には癌の治療は、固形腫瘍の治療または転移の治療を含む。転移は、形質転換または悪性細胞が次から次に部位を変えて移動し拡散している型の癌である。癌は、結腸、非小細胞肺癌（「NSCLC」）、乳房、卵巣、腎臓、直腸、頭と首（鼻腔と口腔を含む）、前立腺、膵臓、小細胞肺癌、子宮、膀胱、甲状腺、皮膚（特に限定されないが、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、moles dysplastic nevi、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬、および転移性黒色腫）、乳房、脳、子宮頚癌、睾丸癌などの癌でもよい。さらに詳しくは癌には、特に限定されないが、以下の臓器または系がある：心臓、肺、消化管、泌尿生殖器、肝臓、骨、神経系、婦人科、血液学、皮膚、および副腎。さらに詳しくは本明細書の方法は、神経膠腫（神経鞘腫、神経膠芽細胞腫、星状細胞腫）、神経芽腫、クロム親和性細胞腫、傍神経節腫、髄膜腫、副腎皮質癌、腎臓癌、種々のタイプの血管癌、骨芽細胞性骨肉腫、前立腺癌、卵巣癌、子宮筋腫、唾液腺癌、脈絡膜叢癌、乳癌、膵臓癌、結腸癌、および巨核芽細胞性白血病がある。
【０２３９】
好適例では本発明により治療される癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（「NSCLC」）、乳癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭と首の癌、子宮内膜癌、膵臓癌、および／または食道癌である。
【０２４０】
好適例では本発明により治療される癌は、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（「NSCLC」）、乳癌、および／または卵巣癌である。いくつかの他の好適例では、癌は頭と首の癌である。本明細書において「癌性細胞」は、本明細書に記載の癌性症状の任意の1つ、または任意の癌に罹った細胞を含む。
【０２４１】
ある例では本発明はまた、細胞生存の上昇またはアポトーシスの阻害に関連する疾患を治療するのに使用され、癌［例えば濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌、およびホルモン依存性腫瘍（特に限定されないが、結腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、小腸癌、睾丸癌、胃ガン、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌を含む）］；自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎、およびリウマチ様関節炎）、およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびアデノウイルス）、炎症、移植片対宿主反応病、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶がある。
【０２４２】
ある例では本発明は、細胞生存の上昇に関連する疾患または症状を治療するのに使用され、特に限定されないが、悪性腫瘍の進行および／または転移、および関連疾患、例えば白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄性、骨髄性単球性、単球性、赤白血病））、および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病））、真性赤血球増加症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば特に限定されないが、肉腫および癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ血管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、睾丸腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、menangioma、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫を含む。
【０２４３】
本発明のワクチン組成物は、純粋に予防薬として使用することができる。一般に初期予防的免疫の用量は、単位服用範囲で存在し、ここで低用量は約1、5、50、500または1000μgのペプチドで、高用量は約10,000、20,000、30,000、または50,000μgのペプチドである。ヒトの用量は代表的には、70kgの患者について約500μg〜約50,000μgのペプチドである。この後の追加免疫用量は約1.0μg〜約50,000μgのペプチドを、ワクチンの初期投与後4週間〜6ヶ月に規定の間隔で投与する。ワクチンの免疫原性は、患者の血液試料から得られたCTLおよびHTLのストレスタンパク質−抗原複合体を測定することにより評価する。
【０２４４】
上記のように、本発明のCTLおよび／またはHTLエピトープを含むペプチドは、HLA分子により提示され、ペプチドに含まれるエピトープに特異的なCTLまたはHTLと接触すると、免疫応答を誘導する。ペプチドがCTLまたはHTLと接触される方法は、本発明には決定的に重要ではない。例えばペプチドは、インビトロまたはインビボでCTLまたはHTLと接触することができる。接触がインビボで起きるなら、ペプチドは直接、または他の形／ビヒクル（例えば1つ以上のペプチドをコードするDNAベクター、ペプチドをコードするウイルスベクター、リポソーム、樹状細胞のような抗原提示細胞など）中で投与することができる。
【０２４５】
従ってペプチドまたはポリペプチドの型の本発明の医薬組成物について、ペプチドまたはポリペプチドは直接投与することができる。あるいはペプチド／ポリペプチドは、APC上でまたはこれらをコードするDNAとして間接に提示することができる。さらにこれらをコードするペプチドまたはDNAは、個々にまたは1つ以上のペプチド配列の融合体として投与することができる。
【０２４６】
治療用途について、投与は一般に、TAA関連疾患の最初の診断で始まる。この後に、追加免疫投与を、少なくとも症状が実質的に消えるまでおよび一定期間行う。慢性疾患状態では、付加量投与後に追加免疫投与が必要である。
【０２４７】
初期治療的免疫用の用量は一般に、単位服用量範囲で存在し、ここで低値が約1、5、50、500または1000μgのペプチドで、高値が約10,000、20,000、30,000、または50,000μgのペプチドである。ヒトの用量は代表的には、70kgの患者について約500μg〜約50,000μgのペプチドである。この後の追加免疫用量は約1.0μg〜約50,000μgのペプチドを、追加免疫処方に従って数週間〜数ヶ月投与され、患者の応答と症状により投与することができる。患者の応答は、患者の血液から得られたCTLおよびHTLの比活性を測定することにより決定することができる。
【０２４８】
ある例では本発明のペプチドおよび組成物は、重症の疾患状態で使用される。このような場合に、外因性物質が少ないこととペプチドはあまり毒性が無い結果として、これらの組成物は記載の用量に比較して実質的に過剰に投与することが、可能であるかまたは好ましい。
【０２４９】
慢性疾患の治療のために、開示された範囲の代表的用量は、低値が約1、5、50、500または1000μgのペプチドで、高値が約10,000、20,000、30,000、または50,000μgのペプチド、好ましくは70kgの患者について約500μg〜約50,000μgのペプチドである。初期用量の後に、確立された間隔（すなわち4数週間〜6ヶ月）の追加免疫用量が必要であり、個体を有効に免疫するためにおそらくより長期間必要である。慢性疾患の場合、少なくとも臨床症状または臨床検査が、疾患が排除または実質的に排除されたことを示すまで、および以後の追跡期間中、投与が続けられる。用量、投与経路、および投与スケジュールは、当該分野で公知の方法に従って調整される。
【０２５０】
治療的処置のための医薬組成物は、非経口、局所的、経口、くも膜下、または局所的投与用である。好ましくは医薬組成物は、非経口、例えば静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与される。
【０２５１】
すなわち好適例で本発明は、許容される担体に溶解または懸濁された、好ましくは水性担体中の免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。種々の水性担体が使用され、例えば水、緩衝水、0.8％食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などがある。これらの組成物は、従来法の公知の無菌法により滅菌されるかまたは無菌ろ過される。得られる水溶液は、そのまま使用するためにパッケージされるか、または凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に無菌溶液と一緒にされる。組成物は、生理学的条件に近づくのに必要なため、薬剤学的に許容される補助物質または医薬賦形剤、例えばpH調整剤、緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、保存剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンなどを含有してもよい。
【０２５２】
製剤中の本発明のペプチドの濃度は、広く変動可能であり、すなわち約0.2％未満、通常約2％かまたは少なくとも2重量％、20〜50重量％、またはそれ以上であり、主に、液体容量、粘度などにより、選択される具体的な投与法に従って選択される。
【０２５３】
代表的にはペプチド組成物のヒト単位投与型が医薬組成物中に含まれ、これはまたヒト単位投与型の許容される担体担体、好ましくは水性担体を含み、かかる組成物のヒトへの投与に使用される当業者に公知の液体量で投与される（例えば、レミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第17版、A. Gennaro編、マックパブリッシング社（Mack publishing Company）、イーストン、ペンシルバニア州、1985参照）。
【０２５４】
本発明のペプチドはまた、リポソームを介して投与することができ、これはペプチドを特定の組織（例えばリンパ組織）に標的化させ、または選択的に感染細胞に標的化させ、ならびにペプチド組成物の半減期を上昇させるのに機能する。リポソームは、エマルジョン、あわ、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含む。これらの調製物において、送達されるペプチドは、リポソームの一部として単独で、またはリンパ細胞中に存在する受容体に結合する分子（例えばCD45抗原に結合するモノクローナル抗体）または他の治療薬もしくは免疫原性組成物とともに取り込まれる。すなわち本発明の所望のペプチドで充填されたかまたは化粧されたリポソームは、リンパ細胞の部位に向けられ、ここでリポソームはペプチド組成物を送達する。本発明で使用されるリポソームは、標準的小胞形成性液体から形成され、これは一般に、中性および陰性荷電したリン脂質およびステロール（例えばコレステロール）を含む。脂質の選択は一般に、例えばリポソームサイズ、酸に対する感受性、および血液中のリポソームの安定性を考慮して決定される。リポソームを調製するのに種々の方法が利用でき、例えばSzokaら、Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、および米国特許第4,235,871号、4,501,728号、4,837,028号および5,019,369号に記載されている。
【０２５５】
本発明の組成物の免疫系の細胞への標的化のために、リガンド（例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはその断片）をリポソーム中に取り込むことができる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁物は、静脈内、局所的に、特に投与方法、送達されるペプチド、および治療される疾患の段階により変化する用量で投与される。
【０２５６】
固体組成物のために、例えば薬剤学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどを含む従来の非毒性固体担体が使用される。経口投与のために、例えば上記の担体のような通常使用される任意の賦形剤を、一般的に10〜95％の活性成分、すなわち1つ以上の本発明のペプチドをしばしば25％〜75％の濃度で取り込むことにより、薬剤学的に許容される非毒性組成物が形成される。
【０２５７】
エアゾル剤投与のために、免疫原性ペプチドは好ましくは、微粉末型で、界面活性剤および噴射剤とともに供給される。ペプチドの代表的割合は、0.01〜20重量％、しばしば1〜10重量％である。界面活性剤はもちろん薬剤学的に許容されるものであり、好ましくは噴射剤中に可溶性のものである。かかる物質の代表的なものは、6〜22個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、olesteric、およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば混合または天然のグリセリドが使用される。界面活性剤は0.1〜20重量％、好ましくは0.25〜5重量％の組成物を構成する。組成物の残りは、通常噴射剤であるが、噴射剤が必要無い噴霧器も使用され、他の割合は適宜調整される。担体も含まれ、例えば鼻内送達用のレシチンがある。
【０２５８】
本発明の抗原性ペプチドは、エクスビボでCTLおよび／またはHTL応答を誘発するのにも使用されている。得られるCTLまたはHTLは、従来型の治療法または本発明の治療用ペプチドもしくは核酸ワクチンに応答しない患者の慢性の感染症または腫瘍を治療するのに使用することができる。特定の抗原（感染症または腫瘍関連）に対するエクスビボCTLまたはHTL応答は、患者のまたは遺伝的に適合性のあるCTLまたはHTL前駆細胞を、抗原提示細胞（APC）源（例えば樹状細胞）および適切な免疫原性ペプチドとともに組織培養でインキュベートすることにより得られる。前駆細胞が活性化されエフェクター細胞まで拡張される適切なインキュベーション時間（代表的には約7〜28日間）後、細胞は患者に注入してもどされ、ここでこれらはその特異的標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊（CTL）するかまたは破壊を促進（HTL）する。
【０２５９】
キット
本発明のペプチドと核酸組成物は、ワクチン投与の説明書とともにキットの形で提供することができる。代表的にはキットは本発明の所望の組成物を、好ましくは単位投与型の容器と投与説明書とともに含む。例えばキットは、容器中に樹状細胞（あらかじめ本発明のペプチドに暴露され現在これを提示する）のようなAPCを、好ましくは単位投与型で投与説明書とともに含む。別のキットは、容器中に本発明の所望の核酸とともにミニ遺伝子構築体を、好ましくは単位投与型で投与説明書とともに含む。IL-2またはIL-12のようなリンホカインもまたキット中に含まれる。好ましい他のキット成分には、例えば無菌シリンジ、追加免疫用量、および他の所望の賦形剤がある。
【０２６０】
本発明を例示のために詳細に説明する。以下の例は例示目的であり、決して本発明を限定するものではない。当業者は、多くの決定的に重要ではない種々のパラメータを変化または修飾して本発明の別の例を得ることができることを容易に理解するであろう。
【実施例】
【０２６１】
実施例1
腫瘍関連抗原の選択
A2サブタイプは集団中に広く（39〜49％）発現されているため、このファミリーの分子に結合するペプチドは、ペプチドベースのワクチンの妥当な基礎となる。A2ワクチンはHLA-A2分子を発現する患者を標的とするが、このアプローチは、追加の対立遺伝子またはそのスーパータイプ群に結合するペプチドを含むように容易に拡大することができる（例えば、米国仮特許出願第60/432,017号（2002年12月10日出願）；これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２６２】
完全なタンパク質はしばしば、有効な抗腫瘍免疫応答を仲介することが効率的ではない特異的エピトープに限定された免疫応答を誘導する（Disisら、J. Immunology 156:3151-3158 (1996)；Mancaら、J. Immunology 146:1964-1971 (1991)）。エピトープベースのワクチンは、TAA中に埋め込まれたペプチドエピトープの同定によりこの制限を回避する。TAAの例を表3に示す。
【０２６３】
正常な個体からのリンパ球培養を使用して、ペプチドを、MHC結合モチーフについて、MHC分子に結合する能力について、およびインビトロで腫瘍反応性CTLを活性化する能力について評価した。このアプローチはいくつかの利点を有する。まず、これは患者由来の細胞（例えばCTLまたは腫瘍細胞）の単離を必要としない。第2に、正常な個体でCTLを刺激するエピトープの同定は、広範囲のエピトープ（亜優性ならびに優性エピトープを含む）の同定を可能にする。
【０２６４】
4つの腫瘍関連抗原（CEA、p53、MAGE2/3、およびHER2/neu）は種々のタイプの腫瘍で発現される（Kawashimaら、Human Immunology, 59:1-14 (1998)；Tomlinsonら、「進歩した薬剤送達概観（Advanced Drug Delivery Reviews）」、第32(3)巻（1998年7月6日））。好適例ではワクチンは、これらの4つまたは他のTAAからのエピトープ（1つ以上のペプチドとして、またはこれらをコードする核酸として）を含む。従ってこのワクチンは、いくつかの主要なタイプの癌に対してCTL応答を誘導する。
【０２６５】
癌胎児性抗原は、ほとんどのヒトの腺癌で過剰発現されている分子量180kDの細胞表面の分泌糖タンパク質である。これらには、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、an胃癌（Muraro, 1985）ならびに50％の乳癌（Steward, 1974）および70％の非小細胞肺癌（Vincent, 1978）がある。この抗原はまた、正常な上皮および一部の胎児組織でも発現される（Thompson, 1991）。
【０２６６】
HER2/neu抗原（185kDa）はチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通糖タンパク質であり、その構造は表皮増殖因子受容体に似ている（Coussens, 1985；Bargmann, 1986；Yamamoto, 1986）。HER2/neu遺伝子の増幅および／または関連タンパク質の過剰発現が、乳癌（Shamon, 1987と1989；Borg, 1990）、卵巣癌（Slamon, 1989）、子宮癌（Berchuck, 1991；Lukes, 1994）、前立腺癌（Kuhn, 1993；Sadasivan, 1993）、胃癌（Yonemura, 1991；Kameda, 1990；Houldsworth, 1990）、食道癌（Houldsworth, 1990）、膵臓癌（Yamanaka, 1993）、腎癌（Weidner, 1990）および肺癌（Kern, 1990；Rachwal, 1995）の多くのヒトの腺癌で報告されている。
【０２６７】
MAGE（黒色腫抗原遺伝子）は、1991年に最初に記載された関連タンパク質のファミリーである。Van der Bruggenと共同研究者は、自発的腫瘍退縮を示した患者からCTLを単離した後にMAGE遺伝子を同定することができた。これらのCTLは、黒色腫細胞株、ならびにすべてが同じHLA-A1制限遺伝子を発現する他の患者からの腫瘍株を認識した（van der Bruggen, 1991; De Plaen, 1994）。MAGE遺伝子は、転移黒色腫（Brasseur, 1995）、非小肺癌（Weynants, 1994）、胃癌（Inoue, 1995）、肝細胞癌（Chen, 1999）、腎癌（Yamanaka, 1998）、結腸直腸癌（Mori, 1996）、および食道癌（Qillien, 1997）、ならびに頭と首（Lee, 1996）、卵巣（Gillespie, 1998；Yamada, 1995）、膀胱（Chaux, 1998）、および骨（Sudo, 1997）の腫瘍で発現されている。これらはまた、正常な組織、特に胎盤と男性生殖細胞（De Plaen, 1994）で発現されている。しかしこれらの正常な細胞は、MHCクラスＩ分子を発現せず、従ってその表面にMAGEペプチドを提示しない。
【０２６８】
A2スーパーファミリーエピトープを同定するための本研究および以前の研究（Kawashima, 1998）で、MAGE-2とMAGE-3は、2つの遺伝子の発現パターンとアミノ酸配列に基づいて単一のTAAと見なされた。MAGEファミリーのこれらの2つのメンバーは、協調して制御されているようであり（Zakut, 1993）、癌での全く同一ではないが非常によく似た分布を与えた。従っていずれかの抗原に対する免疫応答は、これらのTAAを発現することが予測される癌の治療をカバーできるはずである。MAGE-2とMAGE-3タンパク質は、1次アミノ酸レベルで84％同一である。その結果、一部のエピトープはこれらの2つの抗原で同一であり、一部はいずれか一方に特異的である。MAGE-2の2つのサブタイプ（「a」と「b」と呼ぶ）が報告されている（Zakut, 1993）。本明細書においてMAGE-2と称する遺伝子はMAGE-2aサブタイプに対応する（C. Dahlberg私信、NB1056、16頁；van der Bruggen, 1991; Zakut, 1993）。
【０２６９】
ワクチンでの使用のために選択される第4のTAAはp53である。正常な細胞では、p53遺伝子は細胞サイクルの停止を誘導し、これはDNAの欠陥をチェックしDNAの完全性を維持することを可能にする（Kuerbitz, 1992）。遺伝子の変異はそのサプレッサー機能を排除し、形質転換された細胞が制御増殖の制限から逸脱することを可能にする。同時にこれらの変異は野生型と変異p53の両方の過剰発現を引き起こして（Levine, 1991）、タンパク質中にエピトープが免疫系により、より認識し易くする。最も一般的な変異は、175、248、273、および282位であり、結腸癌（Rodrigues, 1990）、肺癌（Fujino, 1995）、前立腺癌（Eastham, 1995）、膀胱癌（Vet, 1995）、および骨癌（Abudu, 1999；Hung, 1997）で観察されている。
【０２７０】
下記表7は、乳房、結腸、および肺での腫瘍抗原発現を示す。4つのTAAを標的とすることで、腫瘍細胞が腫瘍抗原を発現しない細胞に変異（癌逸脱）する可能性が低下する。好ましくは各TAAから2つ以上のエピトープを含めると、人種が異なる個体でもワクチンに応答する確率が上昇し、より広い人口をカバーできる。
【０２７１】
ワクチン組成物への合理的アプローチは、特定のHLA対立遺伝子に焦点を当てるか、またはより広い人口をカバーできるように種々のHLA分子またはスーパータイプに拡大される。
【０２７２】
表8は、表5の各タイプの癌について、米国においてこれらの腫瘍の発病率、5年生存率、および年間の予測死亡者数を示す。推定される新しい症例、予測死亡数、および5年生存率については、これらの腫瘍タイプについて多くの満たされていないニーズがある。世界的にはこれらの腫瘍の発病率ははるかに高い。
【０２７３】
実施例2
CTL誘導の増強のためのヘルパーエピトープとしてのパドレ（PADRE）（登録商標）分子
長期に続くCTL応答の誘導のためには、HTL活性が決定的に重要であるという証拠が増えている（Livingstonら、J. Immunol. 162:3088-3095 (1999)；Walterら、New Engl. J. Med. 333:1038-1044 (1995)；Huら、J. Exp. Med. 177:1681-1690 (1993)）。従ってHLAクラスII分子に結合しHTLを刺激する1つ以上のペプチドが本発明で使用される。従ってワクチンの好適例は、ヘルパーＴ細胞を刺激するように設計された方法でほとんどのDR分子を標的とする普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープ（HTL）からの分子を含む。例えば式aKXVAAZTLKAAa（ここで「X」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンであり；「Z」はトリプトファン、チロシン、ヒスチジンまたはアスパラギンであり；「a」はD-アラニンまたはL-アラニンである）（配列番号42）を有するPanDR結合エピトープペプチドが、HLAのタイプにかかわらず、ほとんどのHLA-DR対立遺伝子に結合し、ほとんどの個体からのＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することがわかっている。
【０２７４】
特に好適なパドレ（PADRE）（登録商標）分子は、HLA-DR結合能力とＴ細胞免疫応答の誘導を最大にするように特異的に作成した、非天然のアミノ酸残基を含有する合成ペプチドaKXVAAWTLKAAa（a＝D-アラニン、X＝シクロヘキシルアラニン）（配列番号１）である。
【０２７５】
別の好適なパドレ（PADRE）（登録商標）分子は合成ペプチド、
【化１】
0005156882.tif 000002
（a＝D-アラニン、X＝シクロヘキシルアラニン）である。
【０２７６】
好適例では、パドレ（PADRE）（登録商標）ペプチドはアミド化される。例えばパドレ（PADRE）（登録商標）分子の特に好適なアミド化例は、aKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43）と記載される。
【０２７７】
精製HLA-DR分子による競合阻害測定法は、パドレ（PADRE）（登録商標）分子aKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43）が高または中親和性（IC50≦1,000nM）で、ほとんどのHLA-DR分子の16のうちの15に結合することを示した（（Kawashimaら、Human Immunology 59:1-14 (1998)；Alexanderら、Immunity 1:751-761 (1994)）。パドレ（PADRE）（登録商標）と破傷風トキソイド（TT）ペプチド830-843のDR結合能の比較、「普遍的エピトープが公表されている（Panina-Bordignonら、Eur. J. Immunol. 19:2237-2242 (1989)）。TT830-843ペプチドは、試験した16のDR分子のうちの7つのみに結合し、一方パドレ（PADRE）（登録商標）は16のうちの15に結合した。パドレ（PADRE）（登録商標）に結合する15のDR分子のうちの少なくとも1つは、すべてのヒトの＞95％に存在すると予測される。従ってパドレ（PADRE）（登録商標）分子は、ヒト集団におけるHLA-DR分子の広範な多型にもかかわらず、ほとんどすべての患者でHTL応答を誘導すると予測される。
【０２７８】
ライデン大学（University of Leiden）（C.J.M. Melief）で行われた第Ｉ／II相の研究者後援治験の初期のデータは、パドレ（PADRE）（登録商標）分子aKXVAAWTLKAAa（配列番号１）（おそらくアミド化されたaKXVAAWTLKAAa-NH2（配列番号43））は、ヒトにおいて極めて免疫原性であるという原理を支持する（Ressingら、J. Immunother. 23(2):255-66 (2000)）。この治験では、パドレ（PADRE）（登録商標）分子は種々のヒトパピローマウイルス（HPV）由来CTLエピトープと同時乳化され、再発性または残存性子宮頚癌患者に注入された。しかし試験患者の癌が後期であるため、これらの患者は免疫無防備状態であったと予測された。患者の免疫無防備状態は、従来の抗原でインビトロ刺激後の、インフルエンザウイルス特異的CTLの低頻度、CD3発現レベルの低下、および増殖性想起応答の低頻度により証明された。すなわちライデン大学（University of Leiden）治験では効力は期待されず、この治験の目標はことに安全性を評価することであった。実際安全性は証明された。
【０２７９】
すなわちワクチンのパドレ（PADRE）（登録商標）ペプチド成分は、広い特異性でHLA-DR分子の複数の対立遺伝子型に結合する。さらにパドレ（PADRE）（登録商標）ペプチド成分は高親和性（IC50≦1000nM）で（すなわちHLAクラスII制限Ｔ細胞について免疫原性であるのと相関する親和性レベルで）結合する。パドレ（PADRE）（登録商標）ペプチドのインビボ投与は、正常なヒトならびに患者集団でHTLの増殖を刺激する。
【０２８０】
1つ以上のパドレ（PADRE）（登録商標）ペプチドが組成物、例えば1つ以上のペプチドを1つ以上のCTLペプチドに融合した（エピトープおよび／または類似体）個々のペプチドとして、または両方として含むワクチン、中に含まれる。
【０２８１】
実施例3
ProGP由来DCの機能的能力
本発明のワクチンの1つの例は、樹状細胞（DC）を介して送達される本発明のエピトープ担持ポリペプチドを含む。従ってDCを、インビトロとインビボの免疫機能測定法により評価した。これらの測定法は、CTLハイブリドーマおよびCTL細胞株の刺激とCTLのインビボ活性化を含む。
【０２８２】
DC精製
ProGP動員DCをProGP処理C57Bl/6マウスの末梢血（PB）と脾臓から精製して、抗原を提示し細胞性免疫応答を誘発する能力を評価した。簡単に説明すると、CD11c特異抗体（ミルテニイバイオテク（Miltenyi Biotec）、オーボーン（Auburn）、カリホルニア州）で被覆した磁性ビーズを用いる陽性選択法を使用して、総WBCと脾臓からDCを精製した。比較のために、未処理C57Bl/6マウスからの骨髄細胞をGM-CSFとIL-4の標準カクテル（アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）、ミネアポリス、ミネソタ州）とともに7〜8日間培養して、エクスビボ拡張DCを作成した（Mayordomoら、Nature Med. 1:1297-1302 (1995)）。最近の研究は、エクスビボ拡張DC集団が、抗腫瘍免疫応答を刺激する能力を有する有効な抗原提示細胞を含有することを証明している（Celluzziら、J. Exp. Med. 83:283-287 (1996)）。
【０２８３】
ProGP由来DC（100μg／日、10日間、SC）とGM-CSF/IL-4エクスビボ拡張DCの純度をフローサイトメトリーにより測定した。DC集団は、CD11cとMHCクラスII分子の両方を発現する細胞として定義した。磁性CD11cマイクロビーズからDCを精製後、ProGP処理マウスから単離した2重陽性ProGP由来DCの割合を、約4％から48〜57％の範囲まで濃縮した（平均収率＝4.5×106 DC/動物）。ProGP処理マウスから単離した精製脾臓DCの割合は、12〜17％の範囲から67〜77％の範囲に濃縮した。GM-CSF/IL-4エクスビボ拡張DCの純度は31〜41％であった（Wongら、J. Immunother. 21:32040 (1998)）。
【０２８４】
CTLハイブリドーマとCTL細胞株のインビトロ刺激：特異的CTLエピトープの提示
CTL細胞株を刺激するProGP作成DCの能力を、ウイルス由来エピトープと対応するエピトープ応答性CTL細胞株を使用してインビトロで証明した。ヒトHLA-A2.1を発現するトランスジェニックマウスをProGPで処理した。これらのマウスから単離した脾臓DCを、B型肝炎ウイルスから得られたペプチドエピトープ（HBV Pol455）でパルスし、次に、IFNγを産生することによりHBV Pol455エピトープ／HLA-A2.1複合体に応答するCTL細胞株とインキュベートした。ProGP由来脾臓DCがHBV Pol455エピトープを提示する能力は、2つの陽性対照（GM-CSFとIL-4拡張DC培養物、または精製脾臓Ｂ細胞）集団より大きかった（図1B）。他の抗原提示細胞に対するProGP由来細胞の応答曲線中の左シフトは、レスポンダー細胞株による最大IFNγ放出を刺激するのに、ProGP由来細胞はより少ないエピトープでよいことを証明する。
【０２８５】
実施例4
ペプチドパルスProGP由来DCはインビボのCTL応答を促進する
インビボでCTL応答を刺激するエクスビボペプチドパルスDCの能力もまた、HLA-A2.1トランスジェニックマウスモデルを使用して評価した。GM-CSFとIL-4で拡張後のProGP処理動物からのDCまたは骨髄細胞由来の対照DCを、HBV Pol455CTLエピトープでエクスビボでパルスし、洗浄し、かかるマウスに注射（静脈内）した。免疫の7日後に、脾臓を取り出し、DCとCTLを含有する脾臓細胞を、HBV Pol455ペプチドの存在下でインビトロで2回再刺激した。再刺激した脾臓細胞培養物の3つの独立した培養物のCTL活性を、ペプチド有りまたは無しでパルスした51Cr標識標的細胞を溶解するCTLの能力を測定することにより評価した。エピトープパルスProGP由来DCならびにエピトープパルスGM-CSF/IL-4 DCで免疫した動物で、激しいCTL応答が発生した（図1）。これに対して、モックパルスしたProGP作成DC（ペプチド無し）は、CTL誘導の証拠を示さなかった。これらのデータは、ProGP処理マウスから得られるDCはエクスビボでエピトープでパルスすることができ、インビボで特異的CTL応答を誘導するのに使用できることを確認する。すなわちこれらのデータは、ProGP由来DCが、ヒトMHCクラスＩ分子を示すモデルでCTL応答を促進するという原理を支持する。
【０２８６】
マウスでのインビボ薬理学的試験は、パルスした自己DCの動物への再注入の明らかな毒性を示さなかった。
【０２８７】
実施例5
樹状細胞単離、パルス、試験、および投与
ワクチン接種の好適な方法を本明細書に記載する。簡単に説明すると、患者をProGPで処理して、DCを拡張し循環中に動員する。当該分野で公知の方法に従って測定したDC動員がピークの日に、患者に白血球アフェレーシス（Leukapheresis）を行う（約15L法、充分な単核細胞を採取するのに必要ならおそらく1回繰り返す）。マイクロフィルターを介して単核細胞生成物を本発明のペプチドと混合する（無菌ペプチドを使用するなら、この混合プロトコールは必要無い）。インキュベートし洗浄して増粘剤非結合ペプチドを除去後、細胞生成物ワクチン例を低温保存溶液（最終的10％DMSO）に再懸濁し、複数のワクチン接種追加免疫が関与するプロトコールについて、アリコートに分ける。パルスした単核細胞産物を凍結し、造血幹細胞用に認められた方法に従って保存する。
【０２８８】
患者中のProGPの血液作用が消費された（すなわち、血液像がベースラインに戻った）後に、融解した細胞生成物の注射または静脈内注入によりワクチン接種を行う。図2は、ペプチドによるDCのエクスビボパルス、DCの洗浄、DC試験、および定温保存のフローチャートを示す。この方法のより詳細な説明は以下の実施例に示される。
【０２８９】
実施例6
ProGPの投与と白血球アフェレーシスによる単核細胞の採取
患者を毎日皮下注射によりProGPを投与する（用量とスケジュールは標準的医学的方法に従って決定した）。白血球アフェレーシスの前の晩に、大口径のアフェレーシスカテーテルの静脈内アクセスが充分かどうかについて、患者はアフェレーシス医師または看護婦／技師により評価される。末梢の静脈アクセスがアフェレーシス用の高速の血流を維持するのに不充分であると見なされる場合は、適切な医療／手術者が中央の静脈カテーテル（鼠蹊部、鎖骨下部、または内部頚静脈部位）を挿入することができる。予測されたピークDC動員の日に、白血球アフェレーシス（約3血液容量、または15リットル）を、例えばコベスペクトラ（Cobe Spectra）またはフェンウォール（Fenwal）CS3000（流速≧35mL／分）で行って単核細胞を得る。白血球アフェレーシス産物中のDCの数を、アフェレーシス産物から無菌的に採取した1mlの試料中の免疫表現型lin-/HLA-DR+/CD11c+とlin-/HLA-DR+/CD123+を有する単核細胞をフローサイトメトリー計数により推定する。血液適用産物中の顆粒球とリンパ球の数は、自動サイトメトリー（CBC/差動）により推定する。CBC/差動は、白血球アフェレーシス操作の直後に10日間毎日行って、ヘマトポエチン処理とアフェレーシスの血液活性の消失を追跡する。
【０２９０】
実施例7
樹状細胞パルス化操作
白血球アフェレーシス産物から遠心分離と上清の採取により血漿を取り出す。遠心分離ペレットからの細胞を、1％ヒト血清アルブミン（HSA）補足OptiMEM培地に107 DC/mlの密度で100mlまで再懸濁する。
【０２９１】
本発明のペプチド、好ましくは個々の無菌A2ペプチド調製物を、無菌法を使用して注入口からDC培養バッグに直接入れる。例えばしぼったり転倒したりして混合後、細胞懸濁液を周囲温度で4時間インキュベートする。50mlの薬理学的等級のジメチルスルホキシド（DMSO）を200mlのプラズマライト（Plasmalyte）（登録商標）に溶解して、定温保存溶液を調製する。パルス期間後、細胞懸濁液を遠心分離して洗浄し、等量のリン酸緩衝化生理食塩水溶液に再懸濁する。洗浄操作を所定回数繰り返す（例えば、試験でペプチドが除去されたことが証明されるまで）。生存活性試験と微生物試験のために1mlずつの試料を取り出す。次に等量の定温保存溶液（最終10％ DMSO）中で遠心分離と再懸濁により、凍結のために細胞を調製する。定温保存溶液中の細胞懸濁液を6つの等しいアリコートに分け、50mlの凍結バッグ（フェンウォール（Fenwal））に移し、ワクチン接種操作に必要になるまで、液体窒素中での保存のために、1℃／分の制御速度で凍結する。
【０２９２】
パルス化操作を評価するための測定法
抗原提示細胞、本発明のペプチドに対応する長期刺激Ｔ細胞またはＴ細胞ハイブリドーマは、ワクチンのペプチド試薬をヒト細胞とインキュベートするのに最適な方法を決定するのに使用される。パルス化試験は、以下の細胞供給源の1つ以上を使用して行われる：ProGP処理HLA-A2.1トランスジェニックマウスからの精製DC；HLA-A2を発現するヒト腫瘍細胞株；ProGP処理患者からの末梢血単核細胞；および／または末梢血単核細胞をGM-CSFとIL-4でエクスビボ培養後に正常なヒトHLA-A1志願者から得られるDC。
【０２９３】
評価される条件は以下を含む：
細胞単離法と細胞数
ワクチンペプチドの濃度
付属試薬を除去するための洗浄条件
パルス後操作（再懸濁、凍結）
【０２９４】
従ってこれらの試験は、ヒト細胞表面上の機能性HLA-A2／ペプチド複合体を産生する方法の能力を証明する。パルス化法の確認試験は、HLA-A2.1特異的Ｔ細胞株を使用して確立し、次に第Ｉ相臨床治験を行う。
【０２９５】
実施例8
DC産物からのペプチド除去の確認試験
ペプチド試薬でパルス化後、患者のDCを数回洗浄して過剰のペプチドを除去した後、細胞を患者に注入して戻す。本発明のワクチンのこの例では、洗浄法が非結合ペプチドを除去する。従って、患者がペプチドに全身性に暴露されることは無いかまたは無視できる。本発明の別のワクチンは、患者への本発明のペプチドの直接投与、本発明の1つ以上のペプチドを含むマルチエピトープポリペプチドの投与、ミニ遺伝子構築体もしくはウイルスベクターの使用によるペプチドをコードする核酸の型のペプチドの投与を含む。
【０２９６】
樹状細胞洗浄バッファー中のワクチンペプチドの測定
DCをペプチドとインキュベート後、細胞を複数回容量の洗浄バッファーで洗浄する。最後の洗浄液のアリコートを非極性固相抽出カートリッジに入れ、洗浄して試料の塩含量を減らす。緩衝液中に含有されるペプチドは抽出カートリッジから溶出され、蒸発乾固される。次に試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）移動相中で復元し、ポリマーベースのHPLCカラムに注入し、逆相勾配溶出クロマトグラフィーを使用して溶出する。残存ペプチドは、質量スペクトル装置を使用して、ペプチドがHPLCカラムから出る時に各ペプチドのプロトン化分子イオンを追跡する。アナライト対内部標準物質の応答比の面積を標準曲線中の標準物質について得られた面積と比較して、ペプチドを定量する。
【０２９７】
実施例9
DC産物からのトリフルオロ酢酸除去の確認試験
具体例では、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を使用してペプチド試薬が調製される。残存ペプチドを除去するために開発された洗浄法は、残存TFAも除去する。
【０２９８】
実施例10
DC放出試験
本体
白血球アフェレーシス産物中のDCの数は、アフェレーシス産物から無菌的に採取した1mlの試料中の免疫表現型lin-/HLA-DR+/CD11c+とlin-/HLA-DR+/CD123+を有する単核細胞をフローサイトメトリー計数により推定する。株マーカーCD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56に対する抗体のカクテルを使用することにより、lin-細胞は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、および顆粒球を排除する。
【０２９９】
細胞生存活性
単核細胞の生存活性は、パルス化と洗浄後、定温保存中に懸濁前に、トリパンブルー色素排除により評価される。一般に細胞産物が50％を超えるトリパンブルー陽性細胞を含有するなら、その産物は患者に投与されない。
【０３００】
微生物試験
定温保存剤中の細胞懸濁液を、グラム染色と日常的な臨床細菌および真菌培養／感受性試験により微生物汚染について調べる。細菌または真菌汚染について試験結果が陽性である場合（重大な汚染を暗示）、その産物は注入されない。例えばグラム染色が陰性なら、培養／感受性試験の結果を待つ間、産物は最初のワクチン接種に注入してもよい。もし注入した汚染物質が臨床的に原因と思われる感染の適切な兆候を患者が示すなら、担当医師の判断で培養結果に基づく抗生物質治療法が開始される。
【０３０１】
実施例11
患者のワクチン接種
好適例では、凍結パルス樹状細胞産物のアリコートを液体窒素フリーザーから取り出し、注入部位へ輸送中は液体窒素含有断熱容器中で凍結させておく。37℃の水浴に浸漬して静かに攪拌して、産物を融解する。融解直後、細胞懸濁液を静脈内ラインを介して重力またはシリンジポンプで注入する。あるいはワクチンは、例えば皮下、皮内、または筋肉内に注射して投与する。注入／注射の前、注入中5分間隔で、次に注入／注射後1時間は15分間隔で、患者の生命徴候を追跡する。
【０３０２】
本発明の別のワクチン例のために、当該分野で公知の注入プロトコール（例えば、直接ペプチド注入または核酸投与）を行う。
【０３０３】
実施例12
A2スーパーモチーフ／モチーフ担持ペプチドの同定
充分解析された腫瘍抗原（MAGE-2/3、HER-2/neu、p53、およびCEA）から得られる9つのCTLエピトープを、3工程プロセスでワクチンのために選択した：1)HLA-A2スーパータイプ分子に結合する確率が高いモチーフ含有ペプチドを同定するための1次タンパク質配列のコンピューターモチーフ分析；2)モチーフ含有ペプチドのA2サブタイプ対立遺伝子へのMHC結合親和性の直接測定；および3)CTL誘導のための高親和性MHC結合ペプチドの免疫原性試験。MHC結合親和性またはＴ細胞受容体（TCR）相互作用を増強する主要なアミノ酸残基を代用することにより、類似体が作成された。
【０３０４】
最終ワクチンEP-2101は、9つの腫瘍関連CTLエピトープ（天然のおよび類似体配列）とパドレ（PADRE）（登録商標）普遍的エピトープのプールであり、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントのエマルジョンとして癌患者に投与される。ワクチンは、癌患者で他の研究者により試験されている合成ペプチドワクチン（1つ以上のペプチドを含む）（ここで、CTL誘導、陽性の臨床的応答、およびワクチンの安全性が説明されている）とよく似ている、（Cormier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Salgaller, M.L.ら、Cancer Res. 56:4749-4757 (1996)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J Immunother. 23:255-266 (2000)）。HLA-A2.1陽性被験体からの末梢血単核細胞（PBMC）とインビトロ1次誘導測定法を使用すると、ペプチドに対しておよびTAAを発現し野生型エピトープを提示する腫瘍細胞株に対して応答するCTLの誘導において、EP-2101エピトープのすべては免疫原性である（Keogh, E.ら、J. Immunol. 167:787-796 (2001)；Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)）。HLA-A2.1制限ヒトエピトープの免疫原性を測定するために使用されるHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスモデルにおいて、エピトープは免疫原性であることが証明された（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)；Vitiello, A.ら、J. Exp. Med. 173:1007-1015；Lustgarten, J.ら、Hum. Immunol. 52:109-118 (1997)参照）。
【０３０５】
天然のエピトープ配列
HLA-A2スーパータイプファミリーの5つの対立遺伝子のMHC分子に結合する可能性が最も高いペプチドを予測するために、CEA、MAGE-2/3、HER-2/neu、およびp53の1次アミノ酸配列について、コンピューターベースのモチーフとアルゴリズム検索を行った（表4と6）（Sette, A.とJ. Sidney、J. Immunogenetics 50:201-212 (1999)）。次に、モチーフとアルゴリズム陽性ペプチドを合成し、精製したHLA-A2.1（ヒトで最も高頻度に発現される分子）ならびにHLA-A2スーパータイプファミリーの他のMHC分子への結合について試験した。
【０３０６】
エピトープスクリーニングプロセスの最終工程で、HLA-A2スーパータイプファミリー受容体への高い交差反応性MHC結合を有するペプチドを、免疫原性について試験した。この測定法はインビトロ1次CTL誘導システムであり、ここで、正常被験体からのCD8+ PBMCをインビトロでまずペプチド充填樹状細胞（DC）（GM-CSFとIL-4中で拡張した異常PBMC）で刺激し、次に2週間サイクルでペプチドで再刺激した（Keogh, E.ら、J. Immunol. 167:787-796 (2001)；Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)）。天然の前駆細胞の拡張後に、HLA-A2.1陽性標的細胞と野生型ペプチドとの存在下で、細胞毒性（51Cr放出測定法）またはインターフェロンガンマ（IFNγ）産生（ELISA）をリードアウトとして使用して、CTL活性を測定した。CTLを誘導した免疫原性ペプチドを、腫瘍細胞株上で発現される天然にプロセシングされたエピトープに対する応答についてさらに試験した。腫瘍反応性CTLを誘導したエピトープをワクチン候補と見なした。
【０３０７】
固定アンカー類似体
弱い免疫原性エピトープに対する寛容を破壊しCTL誘導を改良するために、低MHC結合活性を有する腫瘍関連ペプチドを修飾して、部分最適MHC相互作用アンカー残基を最低モチーフ関連残基で置換することによりその結合を増強させた（Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)：Parkhurst, M.R.ら、J. Immunol. 157:2539-2548 (1996)）。このアンカー残基を「固定」する方策は、多くの腫瘍と感染症エピトープについて記載されており、これらの類似体は、野生型エピトープと比較してインビボ免疫原性の上昇（Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)：Vierboom, M.P.ら、J. Immunother. 21:399-408 (1998)）（MHC結合の上昇と相関している知見（Parkhurst, M.R.ら、J. Immunol. 157:2539-2548 (1996)）を証明した。固定アンカー類似体の疾患関連性は、より強いCTL応答のみではなく、腫瘍細胞上に発現されている天然の野生型エピトープに対して交差反応するCTLも誘導する能力により証明されている（Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)；Vierboom, M.P.ら、J. Immunother. 21:399-408 (1998)；Sarobe, P.ら、J. Clin. Invest. 102:1239-1248 (1998)）。さらに重要なことは、IL-2治療法と併用した固定アンカーエピトープで免疫した黒色腫患者で、大きな腫瘍退縮が観察されている（Rosenberg, S.A.ら、Nat. Med. 4:321-327 (1998)）。
【０３０８】
ヘテロクリティック（heteroclitic）類似体
第2の方策は、CTL誘導に対して完了された力価を有する類似体を作成するために使用した。これらの類似体は野生型エピトープより強い応答を誘導することが証明されているため、TCR接触残基に影響を与えるアミノ酸置換を既知のCTLエピトープに導入した（Zaremba, S.ら、Cancer Res. 57:4570-4577 (1997)；Zugel, U.R.ら、J. Immunol. 161:1705-1709 (1998)；Rivoltini, L.P.ら、Cancer Res. 59:301-306 (1999)；Slansky, J.E.ら、Immunity 13:529-538 (2000)）。野生型エピトープと比較してヘテロクリティック類似体により刺激されたＴ細胞応答は、応答強度の上昇ならびにTCR結合活性（avidity）の上昇の両方に現れ（Zugel, U.R.ら、J. Immunol. 161:1705-1709 (1998)；Rivoltini, L.P.ら、Cancer Res. 59:301-306 (1999)；Slansky, J.E.ら、Immunity 13:529-538 (2000)；Tangri, S.ら、J. Exp. Med. 194:833-846 (2001)）、後者がヘテロクリシティ（heteroclicity）の可能な機構であると考えられる（Slansky, J.E.ら、Immunity 13:529-538 (2000)）。
【０３０９】
ヘテロクリティック類似体は、強いＴ細胞応答を誘導する能力についてのみでなく、Ｔ細胞寛容を破壊する能力についても、癌ワクチンで重要な可能性がある（Zugel, U.R.ら、J. Immunol. 161:1705-1709 (1998)；Slansky, J.E.ら、Immunity 13:529-538 (2000)；Fong, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814 (2001)）。ヒトでは、CAP1-6D（本明細書においてCEA.605D6、ペプチド1350.01と呼ぶ）（これはZarembaらにより最初に記載された（Zarembaら、Cancer Res. 57:4570-4577 (1997)）と呼ぶCEAエピトープのヘテロクリティック類似体を充填したDCを用いて結腸癌とNSCLC患者の治療を調べる治験で、有意な抗腫瘍応答が最近報告された。この臨床試験では（Fong, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814 (2001)）、DCワクチンを投与された12人の患者のうち5人の臨床応答者が観察され、四量体染色により検出されるように、ワクチン接種後の臨床応答と類似体特異的CD8+ Ｔ細胞の割合の上昇との間に相関が観察された。我々の前臨床試験中に、ヘテロクリティック類似体が同定され、これは、3つの公知の腫瘍エピトープ（MAGE-3.112、MAGE-2.157、およびCEA.691）からの修飾された6つの類似体の生成を引き起こした（Tangri, S.ら、J. Exp. Med. 194:833-846 (2001)）。これらの類似体のすべては、腫瘍細胞により発現される天然のエピトープに対して交差反応するインビトロの強い1次ヒトCTL応答を誘導する（Tangri, S.ら、J. Exp. Med. 194:833-846 (2001)）。
【０３１０】
上記のエピトープ選択プロセスを使用して、ワクチンについて9つのエピトープを選択した。これらのエピトープ（表1に示す）は、1)CTL天然配列エピトープ、固定アンカー類似体、およびヘテロクリティック類似体の混合による広い腫瘍抗原カバー；2)HLA-A1スーパータイプ対立遺伝子についての高い交差反応結合親和性；3)インビトロヒト1次CTL誘導測定法での、特に野生型、エピトープ発現腫瘍細胞に応答するCTLの生成における免疫原性；および4)利用できる場合は、正常な被験体または癌患者での1次またはワクチン接種後CTL応答を示す文献中の公表された報告、を示すことに基づいて、選択された。
【０３１１】
癌患者で広いマルチエピトープマルチ抗原応答を誘導するという我々の臨床目的に従って、3つのTAA（HER-2/neu、p53、およびMAGE-2/3）のそれぞれから2つのエピトープとCEAから3つのエピトープ（肺腫瘍および結腸関連腫瘍上でより弱く発現されるTAA）を選ぶ。複数のHLA-A2スーパータイプ対立遺伝子に対する交差反応性結合の程度は、HLA-A2スーパータイプ対立遺伝子を発現する個体中の広くて人種的偏りの無い集団をワクチンがカバーすることを可能にする。
【０３１２】
選択されたエピトープの4つは、改良されたMHC結合のために修飾された固定アンカー類似体であった。1つの固定アンカー類似体は、よく解析されたHER-2/neu.369エピトープから得られ、これは癌患者で強い想起とワクチン接種後CTL応答を誘導することが証明されている（Zaks, T.Z.とRosenberg, S.A., Cancer Res. 58:4902-4908 (1998)；Knutson, K.L.ら、J. Clin. Invest. 10:477-484 (2001)）。両方のMHCアンカー残基の置換によってスーパータイプ結合を上昇させることにより、HER-2/neu.369のV2V9類似体は、HLA-A2スーパータイプ個体でより広い免疫原性を示すことが予測される。残りの固定アンカー類似体（CEA.24V9、p53.139L2B3、およびp53.149M2）は、選択プロセスで同定されたエピトープから設計され、これらはまだ臨床で試験されていない。p53.139L2B3類似体は、3位（非アンカー位置）に追加のα−アミノイソ酪酸置換を含有して、野生型エピトープ中に存在するシステイン残基の起こりうる安定性問題を回避している。野生型配列から得られるエピトープと同様に、すべての固定アンカー類似体は、腫瘍細胞株により提示される野生型エピトープと交差反応するCTLを誘導する（Keogh, E.ら、J. Immunol. 167:787-796 (2001)）。
【０３１３】
本ワクチン中の他のクラスの類似体は、TCR接触残基の置換により生じるヘテロクリティック活性を有するものである（Zarembaら、Cancer Res. 57:4570-4577 (1997)；Zugel, U.R.ら、J. Immunol. 161:1705-1709 (1998)；Rivoltini, L.P.ら、Cancer Res. 59:301-306 (1999)；Slansky, J.E.ら、Immunity 13:529-538 (2000)）。含まれる3つのヘテロクリティック類似体のうちで、2つの類似体（MAGE-3.11215とCEA.691H5）は、野生型ペプチドを超える強いCTL活性を誘導する（Tangri, S.ら、J. Exp. Med. 194:833-846 (2001)）。特に、このヘテロクリティックCEA類似体を充填したDCでワクチン接種した結腸癌と肺癌の患者中の大きなCTLと臨床応答を報告する最近の臨床データを考慮すると、第3のヘテロクリティック類似体 CEA.605D6（CAP1-6D）（Zaremba, S.ら、Cancer Res. 57:4570-4577 (1997)）は本ワクチン中に含まれて、追加のエピトープ幅と抗腫瘍CTL誘導を提供する（Fong, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814 (2001)）。
【０３１４】
ワクチンエピトープの免疫原性は、特にヒトシステムで、追加の報告により確証されている。例えばHER-2/neu.369とp53.149エピトープ（EP-2101で使用された類似体の野生型版）およびHER-2/neu.689は、1次インビトロ誘導により健常ドナーから得られたPBMCを使用して特異的CTL応答（zum Buschenfelde,  C.M.ら、J. Immunol. 165:4133-4140 (2000)；Chikamatsu, K.ら、Clin. Cancer Res. 5:1281-1288 (1999)）を、ならびに癌患者からのPBMCを使用して想起応答（Knutson, K.L.ら、J. Clin. Invest. 10:477-484 (2001)；Rongcum, Y.ら、J. Immunol. 163:1037-1044 (1999)を、誘導した。さらにp53.139L2、p53.149M2、HER-2/neu.369およびMAGE-2.157エピトープは、他の研究者により、HLA-A2.1トランスジェニックマウスでインビボでペプチドと腫瘍細胞反応性CTLを誘導することが証明された（Lugtgarten, J.ら、Hum. Immuno. 52:109-118 (1997);Visseren, M.J.ら、Int J Cancer 73:125-130 (1997)；Peterson, T.R.ら、Scand. J Immunol. 53:357-364 (2001)；Theobald, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11993-11997 (1995)）。
【０３１５】
ワクチンに含まれる最終エピトープは普遍的パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープ（Alexander, J.ら、Immunity 1:751-761 (1994)）である。パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープは、＞90％の一般人がこのエピトープに対して応答することが予測されるように、DRスーパータイプ対立遺伝子（Alexander, J.ら、Immunity 1:751-761 (1994)）のほとんどに交差反応的に結合するように設計された。このワクチンでは、CTLエピトープをプールしてECL誘導を増強するようにパドレ（PADRE）（登録商標）エピトープが含まれる。多くの公表された研究は、CTL応答の維持をインビボで増強し支持するHTL応答の能力を証明した（Knutson, K.L.ら、J. Clin. Invest. 107:477-484 (2001)；Kalams, S.A.とWalker, B.D. J. Exp. Med. 188:2199-2204 (1998)；Weber, J.S.とMule, J.J., J. Clin. Invest. 107:553-554 (2001)；Toes, R.E.ら、J. Exp. Med. 189:753-756 (1999)）。実際パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープ（Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)；Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)）ならびに他のHTL誘導性抗原とエピトープ（Vitiello, A.ら、J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995)；Dhodapkar, M.V.ら、J. Clin. Invest. 104:173-180 (1999)）は、いくつかの臨床治験ワクチンの重要な成分となっている。
【０３１６】
要約すると、固定アンカー天然配列とヘテロクリティック類似体の組合せである9つのCTLエピトープと1つのパドレ（PADRE）（登録商標）普遍的HTLエピトープが、EP-2101に含めるために選択された。このエピトープセットは、HLA-A2個体中で広い抗原カバーと集団カバーを与えるための機能成分のユニークな組合せである。このワクチンのために選択されたCTLエピトープは、正常な被験体と癌患者のPBMC中の試験されたことの無い前駆体からCTLを誘導することができる。この観察結果は、これらの腫瘍関連エピトープに対する完全な寛容の欠如を示唆し、癌患者で有効なCTL応答を誘導する有用性を支持している。
【０３１７】
実施例13
ワクチンエピトープとワクチンの免疫原性
上記したようにワクチン候補を測定するためのエピトープスクリーニングプロセス中に、TAAからの個々のエピトープを、HLA-A2.1個体から得られたヒトPBMCからインビトロでCTLを誘導する能力について試験した。このワクチン用に選択されたすべてのエピトープは、インビトロでCTLを生成し、生成されたCTLは腫瘍細胞株上に発現された野生型エピトープを認識できることが証明された（Keogh, E.ら、J. Immunol. 167:787-796 (2001)；Kawashima, I.ら、Hum. Immunol. 59:1-14 (1998)；Zarembaら、Cancer Res. 57:4570-4577 (1997)）。これらの観察結果は、ヒトに投与された時のワクチンエピトープの免疫原性の可能性を支持し、癌患者中の腫瘍関連エピトープでプライムすることができる前駆体CTLの存在のさらなる証拠を提供する。結果はさらに、9つのワクチンエピトープのほとんどに対する想起またはワクチン接種後CTL応答を証明する他の実験室から得られたデータにより支持される（Lustgarten, J.ら、Hum. Immunol. 52:109-118 (1997)；Knutson, K.L.ら、J. Clin. Invest. 107:477-484 (2001)；zum Buschenfelde,  C.M.ら、J. Immunol. 165:4133-4140 (2000)；Chikamatsu, K.ら、Clin. Cancer Res. 5:1281-1288 (1999)；Rongcum, Y.ら、J. Immunol. 163:1037-1044 (1999)；Visseren, M.J.ら、Int J Cancer 73:125-130 (1997)；Peterson, T.R.ら、Scand. J Immunol. 53:357-364 (2001)；Theobald, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11993-11997 (1995)）。
【０３１８】
EP-2101の免疫原性も、ヒトHLA-A2.1分子を発現するHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスを使用して分析された（実施例15〜17も参照）。これらのマウスは、インビボ免疫後のHLA-A2.1制限エピトープの免疫原性を評価するのに使用されており（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)；Vitiello, A.ら、J. Exp. Med. 173:1007-1015 (1991)）、インビボ評価に有用ではあるが、これらはいくつかの限界がある。種々のCTLエピトープを使用する我々の研究は、HLAトランスジェニックマウスが、ヒトが応答するHLA-A2.1制限エピトープの約80％に応答することを示す（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)；Wentworth, P.A.ら、Int. Immunol. 8:651-669 (1996)）。またあるエピトープについて検出された応答の大きさは実験毎に異なり、特に強度の小さい応答についてこのことが言える。最後に、HLAトランスジェニックマウスで検出された応答の相対的強度は、必ずしもヒトで得られる相対的強度を示さないであろう。
【０３１９】
HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスでのインビボ免疫原性試験のために、EP-2101（薬剤製造について提唱されたものと同様の乳化プロトコール（実施例17参照）により調製した）をマウスに注入し、ワクチン中のすべてのエピトープに対するCTL応答を測定し、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中の各CTLエピトープ単独＋パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープで同時免疫したマウスにより得られるCTL応答と比較した。CTL応答は、インサイチュELISA（McKinney, D.M.ら、J. Immunol. Methods 237:105-117 (2000)）を使用してCTLによるIFN-γ産生を測定し、次にペプチドで免疫動物からの脾臓細胞をインビトロ刺激して測定した。図3Bに示すように、6〜10個の独立の実験でこれまで得られたデータに基づき、EP-2101ワクチンは、大半のCTLエピトープの免疫原性を示すようである。EP-2101中のCTLエピトープの半分について、IFN-γ産生の50分泌単位（SU）を超える強いCTL応答が観察された（CEA.24V9、CEA.691H5、HER-2/neu.369V2V9、MAGE-2.157、およびMAGE-3.112I5）。残りのエピトープは、中〜弱CTL応答（＜10〜50SU）を示し、これらの応答は一般に、大きな標準偏差棒により示されるように、より大きい実験的変動に関連していた。上記したように、これらの変動は、トランスジェニックマウス測定法の限界を反映する。しかし測定法の本質的な変動にもかかわらず、CTLエピトープのプールにより得られるマルチエピトープCTL応答は、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントと同時免疫すると、各CTLエピトープ単独によりマウスで得られるCTL応答に匹敵した。すなわち全体としてこれらの実験は、EP-2101がHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで免疫原性であることを示す。追加の実験もまた、EP-2101が、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスでパドレ（PADRE）（登録商標）エピトープに対するHTL応答を誘導でき、これはマウスH-2 I-Ab対立遺伝子により制限されることを示す（Alexander, J.ら、Immunity 1:751-761 (1994)）。
【０３２０】
実施例14
HLA-A2.1/Kbマウス中の免疫薬理学的研究
EP-2101は、結腸癌および肺癌細胞上に広く発現されている4つのTAA（CEA、p53、HER-2/neu、およびMAGE-2/3）から得られる9つのペプチドエピトープに対してCTL応答を誘導するように設計された免疫療法ワクチンである。TAAは、腫瘍細胞で過剰発現されている自己タンパク質であるため、EP-2101による治療応答の誘導は、自己エピトープに対するCTL寛容の破壊と限定されたが有効なCTL応答の誘導を必要とすることがあり、これは、同じTAAの低レベルを発現する正常な組織に対する重症の免疫病理を誘発することなく、腫瘍細胞を特異的に排除する。EP-2101の前臨床解析は、ワクチン中のいくつかの野生型および類似体TAAエピトープに対してHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで、程度の大きい広いCTL応答が得られたため、ワクチンは実際に免疫原性であることを示した（実施例13を参照）。
【０３２１】
複数のエピトープと複数の自己腫瘍タンパク質に対するEP-2101ワクチンの免疫原性は、低レベルのTAAを発現する正常組織に対する免疫病理応答が、ワクチン接種後に癌患者で得られる可能性を示したが、ネズミモデルでの研究（Mizobata, S.K.ら、Cancer Immunol. Immunother. 49:285-295 (2000)；Morgan, D.J.ら、J. Immunol. 160:643-651 (1998)）と以前の臨床治験（Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Salgaller, M.L.ら、Cancer Res. 56:4749-4757 (1996)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Lee, P.ら、J Clin. Oncol. 19:3836-3847 (2001)）は、抗TAA CTL応答の誘導に関連する自己免疫毒性の欠如を報告した。この重要な問題を調べるために、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで前臨床免疫薬理学的試験を開始して、EP-2101でインビボ免疫後に自己免疫性の病理的応答が起きるかどうかを調べた。毒性試験のための確認された動物モデルではないが、HLA-A2.1/Kbトランス遺伝子はワクチン中のヒトCTLエピトープに対するネズミCTL応答の誘導を可能にしたため、このトランスジェニックマウス系は、前臨床の場でこの重要な安全性問題を評価する機会を提供した（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)；Vitiello, A.ら、J. Exp. Med. 173:1007-1015 (1991)）。
【０３２２】
この18週間の試験でHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスは、3週間間隔で合計6回のEP-2101またはプラセボエマルジョンCTLによる処理を受けた。マウスにはEP-2101を、臨床治験で癌患者で設計された用量と比較してmg/kgベースで150倍過剰の用量を尾の基部に注射した。注射した動物に3つの時点（1回の処理後の2週目、3回の処理後の9週目、6回の処理後の18週目）で、各動物から7つの主要な臓器（心臓、肺、腎臓、胃、小腸、脳、および肝臓）からの組織、および注射部位から単離された皮膚について組織病理試験を行った。組織病理試験以外に、動物を一定間隔で有害事象と体重について追跡した。3時点での組織病理分析と有害事象追跡と同時に、ワクチン接種マウスとプラセボ処理マウスの脾臓のCTL応答も測定して、免疫病理をワクチン中のエピトープに対するCTL応答の存在と関連付けた。
【０３２３】
この免疫薬理学的試験の結果は、EP-2101またはエマルジョン対照による処理は、HLA-A2.1/KbトランスジェニックマウスのmRNA臓器で調べたすべての時点で自己免疫性免疫病理を引き起こさないが、動物で強いCTL応答が検出されることを示した。EP-2101またはエマルジョン対照で処理した動物の7つの主要な臓器の組織切片は、試験したすべての時点で正常であるようであった。この試験で観察された処理が原因と思われる唯一の病理は、注射部位の皮膚の肉芽腫性炎と肉芽腫形成であり、これはワクチン処理群とエマルジョン対照処理群の両方で現れた。この観察結果は、この試験で使用したモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントによる処理の一般的な副作用である（Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Lee, P.ら、J Clin. Oncol. 19:3836-3847 (2001)）；Leenaars, M.ら、Vet Immunol Immunopathol. 61:291-304 (1998)；Yamanaka, M.ら、J. Vet. Med. Sci. 54:685-692 (1992)）。
【０３２４】
18週間の試験中の処理マウスの有害事象追跡は、ワクチン処理群とエマルジョン対照処理群の両方で疾患または毒性に関連する症状（例えば、無気力、下痢、悪液質、痺痲、異常姿勢）が全く存在しないことを示した。注目すべき唯一の観察結果は、肉芽腫形成に一致したすべての動物の尾の基部の触知できるこぶの出現であり、これは処理4回目と5回目の間の期間に2.5週間にわたって一過性に、ワクチン処理群とエマルジョン対照処理群の両方に現れた。この一過性の有害事象は、注射部位の皮膚の壊死または出血が原因ではなく、このような傷害は全試験期間中どの動物でも観察されなかった。最後に、試験動物で重症の有害事象および免疫病理が無いことは、体重測定により確認され、これは正常であり試験の期間中徐々に上昇した。
【０３２５】
要約すると、この試験で観察されたHLA-A2.1/Kbマウスモデル系での自己免疫性炎症性病理が無いことは、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中で調製したペプチドワクチンを癌患者に投与した以前のヒトの臨床治験で報告された同様の病理が無いことに似ている（Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Salgaller, M.L.ら、Cancer Res. 56:4749-4757 (1996)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Lee, P.ら、J Clin. Oncol. 19:3836-3847 (2001)）。EP-2101ワクチンについて、自己腫瘍抗原の複数のエピトープに対する広く特異的なCTL応答にもかかわらずHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで自己免疫性免疫病理が無いことは、予定されている臨床治験で結腸癌および肺癌患者にこのワクチンを投与することの一般的安全性を支持している。
【０３２６】
実施例15
臨床治験
EP-2101は、癌患者でアジュバント療法として使用される治療用ペプチドワクチンである。このワクチンは、結腸癌および非小細胞肺癌（NSCLC）でしばしば過剰発現している癌胎児性抗原（CEA）、p53、ヒト表皮受容体-2／神経（HER-2/neu）および黒色腫抗原2と3（MAGE-2/3）、腫瘍関連抗原（TAA）に対して細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）を誘導するために患者に投与するように設計される。これらの4つの解析されたTAAに対するCTL応答を誘導することの臨床的目的は、手術、化学療法または放射線照射後の癌の再発を遅延または予防することである。
【０３２７】
肺癌は、非常に死亡率の高い重要な健康問題となっている。2001年に米国では約17万人の新しい肺癌患者の発生が予測され、16万人がこの疾患のために死亡すると推定される。肺癌の約80％はNSCLCであり、これらの患者の大部分は疾患の後期である。NSCLCの「医療基準」は、いまだに手術、放射線療法、または化学療法である。さらに一部の患者は、検出可能な腫瘍の除去後に化学療法の形で術後アジュバント療法を受けているが、かかる治療法の利点を評価するための臨床試験は今始まったばかりである。これらの治療にもかかわらず、2年生存率はステージIIIaで30％、IIBで45％、IIaとIbで60％、そしてIaで80％である。Mountain, C.、「肺癌：ステージ分類、イメージング、およびリンパ節分類のハンドブック（Lung Cancer; A Handbook For Staging, Imaging and Lymph Node Classification）」（1999）。従って、有効なアジュバント療法がどうしても必要である。
【０３２８】
結腸癌の検出の継続した改良のために、疾患過程で早期に患者を治療できるようになってきた。アメリカ癌学会（American Cancer Society）によると、この局所的疾患の5年生存率は91％であり、一方全身に広がった疾患の生存率はわずかに7％である（アメリカ癌学会（American Cancer Society）、Cancer Facts and Figures 2001）。米国での結腸癌の予測死亡者数は、2001年には約50,000である。ステージIII結腸癌の「医療基準」は、手術であり、その後5-フルオロウラシルとロイコボリン（leucovorin）を使用して化学療法を行う。最近、アジュバント療法で5-フルオロウラシルとロイコボリンとともにイリノテカン（irinotecan）の使用が増加している。これらの治療が利用できるにもかかわらず、さらに安全で有効なアジュバント療法が必要とされる。
【０３２９】
EP-2101は、10個の合成ペプチドからなり、それぞれは9〜13個のアミノ酸残基からなり、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中で安定な油中水エマルジョンとして調製される。このペプチドの9つは、CTLエピトープである。各CTLエピトープは、HLA-A2.1により限定され、MHCクラスＩ分子のHLA-A2スーパーファミリーの少なくとも1つのメンバーは、一般人の約45％をカバーする。含まれるCTLエピトープは、野生型固定アンカー類似体とヘテロクリティック類似体エピトープの組合せである。10番目の合成ペプチドは、汎DRエピトープ（パドレ（PADRE）（登録商標））であり、CTL応答の強度と持続期間を上昇させるために含まれる合理的に設計されたヘルパーＴリンパ球（HTL）である。
【０３３０】
癌の再発を遅延または予防するためにCTL応答を誘導するという考え方は、多くの動物モデルデータ、腫瘍浸潤と良好な臨床結果とを関連付ける研究、および自然のまたはワクチン誘導性抗腫瘍性Ｔ細胞応答後の腫瘍退縮の報告により支持される（Yu, Z.とRestifo, N.P.、J. Clin. Invest. 110:289-294 (2002)）。ペプチドエピトープは、多数の臨床試験で癌患者のCTL応答を誘導するために使用されており、いくつかの有望な結果が得られている（Rosenbergら、Nature Med. 4:321-327 (1998)；Fong, L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8809-8814 (2001)）。提唱された試験での臨床結果を改善するために、EP-2101ペプチドワクチンは、以前の試験から得られた情報と有望な考え方を取り込むように設計される。詳細にはEP-2101は以下を取り込む：
1. 複数の充分解析されたTAAから得られる規定された最適長さのCTLエピトープ；
2. 高いHLA結合親和性と、腫瘍細胞株を認識するCTLを誘導する証明された能力とを有するエピトープ；
3. 臨床的応答と相関する応答をヒトで誘導することが証明された、野生型配列と2つのタイプの類似体（固定アンカー類似体とヘテロクリティック類似体）の混合物であるエピトープ；
4. ヒトでヘルパー応答を誘導することが証明されている、合理的に設計された非自己ヘルパーＴ細胞パドレ（PADRE）（登録商標）エピトープ；
5. 多くの臨床試験で許容される安全性と力価を示しているヒトで使用のために充分解析されたアジュバントである不完全フロイントアジュバントに似たミネラル油アジュバントであるモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51（Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Lee, P.ら、J Clin. Oncol. 19:3836-3847 (2001)；Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)；Yamschchikov, G.V.ら、Int J Cancer 92:703-711 (2001)；Rosenberg, S.A.ら、J. Immunol. 163:1690-1695 (1999)）。
【０３３１】
野生型と、充分研究されたTAAから得られ、有望な臨床データを与えたアジュバント中で送達された類似体エピトープとのユニークな組合せは、ペプチドベースの癌ワクチンを使用して今日まで得られた結果を改善する機会を提供するはずである。
【０３３２】
用量選択の合理性
EP-2101は、CTL応答を刺激する4つのTAAから得られた9つのペプチドエピトープとパドレ（PADRE）（登録商標）普遍的ヘルパーＴ細胞エピトープとからなる免疫治療的ワクチンである。10個のペプチドは、ワクチンの安全性と免疫原性を評価するためにNSCLCと結腸癌患者に投与されるモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントとのエマルジョンで調製される。患者を治療するのに適切なワクチン用量についての指針は、ペプチド／モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51ワクチンの投与後に、CTLと臨床応答ならびにワクチン安全性が報告された以前の臨床治験の報告により提供される（Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Lee, P.ら、J Clin. Oncol. 19:3836-3847 (2001)；Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)；Yamschchikov, G.V.ら、Int J Cancer 92:703-711 (2001)；Rosenberg, S.A.ら、J. Immunol. 163:1690-1695 (1999)）。
【０３３３】
モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51中に調製されたいくつかのペプチドワクチンが癌患者で試験されており、これらのワクチンは一般に安全であると見なされ、重症の用量関連全身性毒性は報告されていない（Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)）。これらの治験で患者に投与されたペプチドの用量は、治療毎に10mgもの総ペプチドであり、ほとんどは1〜2mgの総ペプチドの範囲であり、治療スケジュールはEP-2101臨床治験について提唱されたものと同様であった（すなわち、3〜4週間間隔で4〜6回の皮下注射）。報告された最も一般的な毒性は、局所的注射部位の反応であり（疼痛、圧痛、および肉芽腫形成）、これらはいつも重症度1または2のスコアが付けられた（Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)；Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)）。時々観察された他の一過性等級1/2毒性には、吐き気、頭痛、発熱、および疲労があった。モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中の2つ以上のペプチドを有するワクチンを試験する研究には、Yamschchikovら（Yamschchikov, G.V.ら、Int J Cancer 92:703-711 (2001)）およびRessingら（Ressing, M.E.ら、J. Immunother. 23:255-266 (2000)）に報告された臨床治験がある。各試験では、黒色腫または子宮頚癌患者は、それぞれ3または5つのペプチドの混合物を最大3mgの総ペプチド用量を注入されて治療された。他の研究に観察されるように、これらの臨床治験からのデータは、わずかに等級1/2の毒性を示したのみであった。すなわちまとめると、これらの臨床治験のデータは、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51中で最大10mgの用量で調製された1つまたは数個のペプチドエピトープからなるワクチンが、一般的に充分許容されるものであることを示す。
【０３３４】
ペプチド／モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51ワクチンによるCTLの誘導と臨床応答に関して、注射用量当たり0.1〜10mgのペプチドの用量増加を調べると、CTL応答と臨床応答はこの用量範囲に含まれ、特にペプチド当たり1mgに近づく用量であることを示した（Weber, J.S.ら、J. Immunother. 22:431-440 (1999)；Cornier, J.N.ら、Cancer J Sci. Am. 3:37-44 (1997)；Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)；Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)）1-4。例えば有意なワクチン接種後の臨床応答が報告されたRosenbergらの注目すべき研究（Rosenberg, S.A.ら、Nat. Med. 4:321-327 (1998)；Rosenberg, S.A.ら、J. Immunol. 163:1690-1695 (1999)）では、1mg用量の単一の固定アンカー類似体ペプチドgp100.209（210M）がモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51中で送達された。この治験では、IL-2療法と組合せたペプチドワクチン接種後に、IL-2療法単独では歴史的に応答率は15％であるのに比較して、黒色腫患者に40％のクローン応答が観察された（Rosenberg, S.A.ら、Nat. Med. 4:321-327 (1998)）。同様に、高グレードの子宮上皮内新生物を有する患者でHPV-16 E7ペプチドワクチンが試験された別の治験では、0.3mgと1mgの用量でCTL応答と臨床応答が報告された（Muderspach, L.ら、Clin. Cancer Res. 6:3406-3416 (2000)）。CTL誘導とペプチド用量との関連付けに関して、Wangら（Wang, F.ら、Clin. Cancer Res. 5:2756-2765 (1999)）は、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中のMelan-A/MART-1.27ペプチドの高用量が、酵素結合免疫吸着スポット（ELISPOT）法を使用してインターフェロン1つのガンマ（IFN-γ）放出により測定すると、低用量（0.1mg／投与）を投与される患者と比較して、より大きなCTL応答を引き起こすらしいことを観察した。この治験中の患者数は限定されているが、この治験は、脂質化HBV CTLペプチド構築体（Vitiello, A.ら、J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995)）、またはQS-21アジュバント中で送達された腫瘍特異的bcl-abl区切点ペプチド（Pinilla-Ibarz, J.ら、Blood 95:1781-1787 (2000)）10（ここで、高用量のペプチドは、低用量よりＴ細胞応答の誘導が一定していることが証明された）で免疫したヒトでの他の研究に一致する。
【０３３５】
安定なエマルジョンが5mg/ml総ペプチド用量で作成された（ペプチドエピトープ当たり0.5mg/ml）。すなわちEP-2101治験の癌患者は、1mlの注射容量中で5mgの総ペプチドに対応する用量を投与される（エピトープ当たり0.5mg）。患者は、注射容量1mlで3週間間隔で計6回の皮下注射を受ける。
【０３３６】
ワクチン投与の起こり得るリスクは当業者に公知であり、注射部位の不快感、ワクチン投与による全身症状（寒気、発熱、発疹、うずきと疼痛、吐き気、頭痛、および疲労）、生殖器毒性、アナフラキシー反応、妊娠と胎児発育への影響、および自己免疫反応（網膜の反応を含む）がある。
【０３３７】
構造式
各ペプチドのアミノ酸配列を表1に示す。
【０３３８】
製剤の調製
EP-2101は、モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバント中で1：1で調製された、各0.5mg/mlの濃度の10個のペプチドエピトープの無菌で保存剤を含まないエマルジョンで、ゴム栓付ガラスバイアルに充填したものである。このペプチドは、固相ペプチド合成用の標準的BocまたはFmoc化学を使用して、適切な樹脂で出発し標準的方法により精製して合成した。このアジュバントは、不完全フロイントアジュバントに似たミネラル油アジュバントであり、セピック社（Seppic, Inc.）（フェアフィールド（Fairfield）、ニュージャージー州）により製造され販売されている。EP-2101は無菌条件下で製造される。ペプチドは3つの異なる溶媒に溶解され、無菌ろ過され、プールされ、次にアジュバント中に制御条件下でホモジナイズして乳化される。
【０３３９】
投与経路
EP-2101は皮下注射用に設計される。このワクチンは、1ml注射として3週間毎に全部で6回注射される。各注射の総ペプチド用量は5.0mgである（0.5mgの各ペプチド）。
【０３４０】
薬剤物質の製造
ペプチドは固相合成法を使用して調製される。簡単に説明すると、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）および／またはtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）基を、合成時のアミノ酸残基の保護基として使用する。ペプチドは適切な樹脂上で作成される。
【０３４１】
カプリング試薬として3当量のDICとHOBtを使用して、樹脂ベースのアミノ酸にアミノ酸誘導体を付加する。それぞれDMF中の20％ピペリジンとジクロロメタン中の65％TFAを使用して、樹脂ベースのペプチドの末端アミノ酸からFmocとBoc保護基を除去する。
【０３４２】
カプリング試薬としてDICとHOBtをそしてDMF中の20％ピペリジンとジクロロメタン中の65％TFAを使用して連続的カプリングサイクルで、残存するFmoc-N-またはBoc-N-保護アミノ酸残基を樹脂ベースのペプチドに付加して、それぞれFmocおよびBoc保護基を除去する。
【０３４３】
適切な有機混合物を使用していくつかの側鎖保護基を除去した後、ペプチドを樹脂から切断する。追加の保護基の除去と樹脂からの切断の両方は、ペプチド−樹脂をフッ化水素／メトキシベンゼンまたはTFA／水の混合物で処理して行われる。ペプチドを酢酸を用いて樹脂から抽出し、ある場合にはトリフルオロ酢酸を用いて抽出する。樹脂をエーテルで洗浄する。HOAc/TFA溶液から凍結乾燥することによりペプチドを単離する。
【０３４４】
C18誘導体化シリカ固定相で分取逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）によりペプチドを精製する。カラムを溶出し、純粋なペプチドを含有する画分をプールし、エピトープを凍結乾燥により単離する。ある場合にはRP-HPLCの後に、HOAc緩衝化溶媒を使用してイオン交換精製／脱塩を行う。生じる画分を凍結乾燥により単離する。
【０３４５】
個々のペプチドの溶解性
溶解性試験をペプチドについて行い、溶解性は目に見える粒子の無い清澄な溶液であるとして定義される（表15）。生理学的pHで10個のペプチドのうち6個のみが可溶性であった（1013.08、1243.08、1295.03、1323.06、1350.01、および1352.03）。従って、ペプチドをジメチルスルホキシド（DMSO）以外に種々の水性酸性溶液および水性塩基性溶液中で2〜5mg/mlで試験した。
【０３４６】
薬剤物質の規格と分析法
表16は、薬剤物質の規格を示す。
【０３４７】
成分と定量的組成
EP-2101の成分と定量的組成を表17に示す。
【０３４８】
成分規格
薬剤の製造に使用される成分を表18に列挙する。
【０３４９】
バルク薬剤と製剤の製造法
バルク薬剤を図5に示すように調製した。バルク薬剤は、各3つの溶媒中の個々のペプチドの溶解度とプールしたペプチドの溶解度に基づいて、3つの溶液（表15と19）中に調製される。簡単に説明すると、無菌処理を可能にするために、10個のペプチドを酸性溶液（0.1875M 酢酸）、塩基性溶液（0.1M 水酸化ナトリウム）、または有機溶媒DMSOに溶解する。これらの3つのペプチド含有プールをろ過滅菌する。無菌条件下で、これら3つのペプチドプールを合わせ、緩衝化し、pHを調整し、次にモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51アジュバントとともに温度制御条件下でホモジナイズして、製剤を形成する。次に製剤（安定な1：1(w:w)エマルジョン）を2mlのガラスバイアルに充填し、2〜8℃で保存する。
【０３５０】
製剤規格と分析法
表20と21は、それぞれEP-2101バルク薬剤と製剤の規格を記載する。
【０３５１】
ペプチド濃度（各ペプチド）
EP-2101製剤中のすべてのペプチド成分の濃度はRP-HPLCにより測定した（条件は表22に示す）。エマルジョンの一定量をDMSO中の0.1％ TFA溶液と混合して2層混合物を作成する。DMSO以外の溶媒を使用してHPLC分析用の清澄で均一な溶液を生成する試みは、うまく行かなかった。上記2相混合物のサンプリングは、シリンジまたはピペットを上部ミネラル油層から下のDMSO層に挿入して行う。HPLC用の唯一の試料はDMSO層（ここではペプチドは可溶性である）から取る。HPLCクロマトグラフィーにより、各ペプチドの顕著なクロマトグラフィーピークが得られ、これは積分して検量線と比較すると、EP-2101製剤中の個々のペプチドの濃度が得られる。試料の2相性のために、全試料容量の推定と試料の移動について変動がある。次に、試料調製と取り扱いの複雑さのために、ペプチド濃度の測定において異常に大きな誤差（最大30％）が観察された。大きな変動は、大きな分解産物の生成や試料の他の異常な物理的変化によるものでもなかったため、これは、試料調製と取り扱いの結果であると推測された。このため、放出と安定性基準として、目的濃度の±50％の規格を設定した。試料取り扱いを改善し、2相性のミネラル油−DMSO混合物を簡便化する試みは、放出と安定性規格を小さくすることを主目的として現在進行中である。
【０３５２】
力価
EP-2101は合成CTLとHTLペプチドエピトープからなる。ペプチド含量と完全性は、上記分析法（例えば、HPLC、粘度、および粒子サイズ分析）を使用して、物理的／カテーテル性状解析により正確に測定することができる。さらに製剤の全体的力価を評価する方法も開発されている。
【０３５３】
EP-2101ワクチンは、他の種ではなくヒトのHLA-A2.1制限CTL応答を特異的に刺激することを目的するため、関連する力価測定法の開発は難しい課題である。この課題を取り組む1つの方法は、HLA-A2.1をトランス遺伝子として発現するマウス（すなわち、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス）を使用して、EP-2101のインビボ力価を測定することである。推奨されるEP-2101力価測定法は、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス中のEP-2101 CTLエピトープの免疫原性を測定するのに使用される前臨床測定法と同様である（実施例13参照）。HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス測定法はCTL応答の定量において限界があることを指摘しておく。具体的には：1)ヒトで免疫原性であるHLA-A2.1制限エピトープのわずかに約80％のみが、トランスジェニックマウスでもCTL応答を誘導し（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)）、従って一部のエピトープに対するCTL応答はこのシステムでは定量できない、および；2)多くのアプローチを使用して、我々は、HLAトランスジェニックマウスで生成されたインビボCTL応答（ワクチン接種によるものでも自然の感染によるものであっても）が、動物の個体差のため、およびこの測定法に必要なプライムＴ細胞のインビトロ操作のために、実験毎に変動することを見いだした。力価測定法はインビボのバイオアッセイに共通の限界を有するが、これはEP-2101の全体的力価の測定値を与える。従ってこれは、本明細書に記載の高感度かつ定量的分析法を適切に補うものとなる。
【０３５４】
EP-2101力価測定法では、HLA-A2.1/KbトランスジェニックマウスにEP-2101が注射され、14日後に免疫動物からの脾臓細胞が、代表的EP-2101 CTLエピトープであるCEA.691H5（1352.02）とHER-2/neu.369V2V9（1334.10）を用いてインビトロで刺激されてインビボプライムCTLが拡張される。インビトロで拡張後、インビボプライムCTL応答（エフェクター細胞とも呼ぶ）は、CEA.691H5またはHER-2/neu.369V2V9ペプチドを用いてインビトロで再度刺激した時、IFN-γを産生する能力をELISAにより測定することにより定量される。ELISAにより測定したCTL活性は分泌単位（SU）として表され、これは、ペプチドに応答して100pgのIFN-γを分泌するのに必要なエフェクター細胞の数である（McKinney, D.M.ら、J. Immunol. Methods 237:105-117 (2000)）。すなわちSU値は、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス中でEP-2101により得られるCTLのレベルの反映であり、かつワクチン力価の尺度である。
【０３５５】
実施例16
力価測定法の詳細な説明
薬剤の力価を評価するために、キメラMHCクラスＩ分子（ここで、重鎖は、HLA-A2.1分子の第1および第2のドメイン、およびH-2Kb分子の第3のドメイン（膜貫通ドメイン）と細胞質ドメインからなる）を発現するトランスジェニックマウスでCTL応答を誘導するワクチンの能力を測定するための測定法を開発した。すでに、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスは、ヒトで免疫原性であることが知られているHLA-A2.1制限エピトープで免疫すると、エピトープの80％がCTL応答を誘導することが証明された（Wentworth, P.A.ら、Eur. J. Immunol. 26:97-101 (1996)）。これらのデータは、HLA-A2.1制限エピトープからなるワクチンを用いて免疫して得られるCTL応答を定量するために、これらのマウスを使用することの妥当性を確認している。
【０３５６】
EP-2101力価を測定するための2つのCTLエピトープの選択と、力価測定法規格の確立とを以下に示す。具体的なプロトコールは実施例17に示す。
【０３５７】
簡単に説明すると、いくつかの実験でのEP-2101の免疫原性の分析は、ワクチン中の異なるエピトープが、平均約10SU〜＞100SUの範囲の異なる応答を誘導し、これらの応答が高い実験内および実験間変動（特に、弱い免疫原性エピトープについて）に関連していることを示した。これらの要因の両方とも、ワクチン中のすべての9つのエピトープに対するCTL応答に基づいてワクチンの力価を測定することが非現実的であるとした。その代わりに、EP-2101中の2つの代表的な免疫原性エピトープを全体的ワクチン力価の指標として使用する測定法を開発した。
【０３５８】
2つのエピトープの選択は、異なるエマルジョン用量のEP-2101をマウスに注入した実験から作成したCTL免疫原性データの後向き研究に基づいた。マウスを10mg/mlのエマルジョン用量で免疫した6〜10回の独立した実験からのCTL応答を評価し、EP-2101中の上の2つの免疫原性エピトープは、CEA.691H5（幾何平均応答、164×/÷1.8SU）とHER-2/neu.369V2V9（幾何平均応答、152×/÷2.4SU）であり、第3のエピトープMAGE-3.112I5（幾何平均応答、92×/÷2.1SU）はバックアップエピトープ候補とした。高い応答強度以外に、これらの応答に関連する全体的変動は、HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスで試験した免疫原性エピトープについて通常観察された範囲内であった（SDは×/÷1.8〜2.4）。この広範なデータベースを10mg/mlエマルジョン用量のEP-2101で作成したが、さらなる実験は、2.5mg/mlおよび5mg/ml総ペプチド用量のEP-2101エマルジョンは、高度に免疫原性のCEA.691H5、HER-2/neu.369V2V9、およびMAGE-3.112I5エピトープに対して10mg/mlエマルジョン用量と匹敵するレベルのCTL応答を誘導することを示す。
【０３５９】
エピトープ選択のさらなる支持は、ペプチド刺激によるインビトロ拡張の無いCTLエフェクター細胞活性について試験するELISPOT測定法で測定した応答からのデータにより提供された。ELISPOT測定法によりHER-2/neu.369V2V9とCEA.691H5エピトープに対して一貫したCTL応答が検出され、これらの結果は、この測定法で試験した時ワクチン中の他のものと比較して、2つの候補力価測定法エピトープの強い免疫原性を確認している。
【０３６０】
免疫マウスで測定された応答以外に、投薬経験の無いマウスとプラセボモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51エマルジョンを注入したマウスで観察されたベースラインCTL応答も考慮した。上の3つのエピトープ候補について、3つの独立した実験中の陰性対照マウス中のCTL応答は低く（＜10US）、従ってベースラインとワクチン誘導性CTL応答の強度の差は充分に大きく、たとえ製造後であってもワクチン力価の低下が確実に検出できた。
【０３６１】
力価測定法のためのエピトープ選択における最後の考慮事項は、個々のマウスに関連するCTL誘導の変動である。EP-2101力価測定法のプロトコールは、6匹の免疫マウスから得られるプール脾臓細胞集団中のCTL応答の測定を特定するが、測定法中の変動の原因は、個々の動物のCTL誘導の頻度かも知れない。異なるタイプの高免疫原性のワクチン構築体（例えばリポペプチド、DNA）を注入した個々のマウスですべてか否か的に挙動する散発性のCTL応答が観察されているため、この問題は小さくない（未発表データ）。この重要なパラメータを考慮して、EP-2101ワクチンで免疫した15匹の個々のHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウス中の3つの高力価エピトープ候補に対するCTL誘導の変動を調べるために試験を開始した。すべての3つのエピトープに対するCTL応答は、免疫動物の100％で証明された。予測されたように、3つのエピトープのそれぞれに対するCTL応答の序列は、プライムしたマウスからの脾臓細胞のプールを用いて測定したものと同様であり、インビボ測定法について許容範囲であった。すなわちCEA.691H5とHER-2/neu.369V2V9は、すべての動物で最も確固としたかつ再現性あるCTL応答を誘導し、次はMAGE-3.112I5であった（15匹のマウスのCEA、HER-2/neu、およびMAGE-3エピトープに対する幾何平均SU応答は、それぞれ252×/÷1.4、169×/÷1.7、および48×/÷1.7であり、これらの応答は、EP-2101免疫動物からのプールした脾臓細胞で観察された範囲内であった）。
【０３６２】
要約すると、1)インサイチュELISAとエクスビボELISPOT測定法を使用してEP-2101免疫動物で測定したCTL応答の強さ、2)製剤ペプチドエマルジョン用量で調製されたEP-2101ワクチンによるエピトープに対して生成したCTL応答の同等の強度、3)これらのCTL応答の実験間および実験内変動、4)陰性対照動物におけるベースライン応答、および5)個々の動物におけるCTL誘導の一貫性、に基づき、CEA.691H5とHER-2/neu.369V2V9エピトープが力価測定エピトープとして選択され、MAGE-3.112I5はバックアップとした。
【０３６３】
EP-2101により得られた2つの力価エピトープに対するCTL応答の上限と下限を決定するために、力価測定法規格を確立した。下限規格を確立するために、6つの実験（18データ点）にわたって投薬経験の無いかまたはエマルジョン対照（プラセボ）マウスで作成したデータベースを分析し、陰性対照からのすべての結果のSU値を編集した。下限規格は、まずすべての陰性対照の結果から幾何平均SUとSDを計算し、次に3SDカットオフ値を計算することにより確立した。CEA.691H5についてのこの値は、22SU（幾何平均×3SD＝1.53×14.01；次に大きい整数まで切り上げ）で、HER-2/neu.369V2V9エピトープについて8SU（幾何平均×3SD＝0.49×14.58）と計算された。力価が合格のEP-2101のある試験試料について、両方のエピトープについてEP-2101でプライムした脾臓細胞の対照活性の幾何平均SU値は、各下限規格に等しいかまたはこれより大きくなければならない。
【０３６４】
測定法の上限を確立するために、EP-2101注射マウスから作成した11個の実験からのSU値（32データ点）を編集し、各エピトープの3つの最も高い実験からの幾何平均SU値を計算した。CEA.691H5エピトープについて、この計算により、3つの実験の個々の結果の応答に基づき289.5SUの値が得られた。HER-2/neu.369V2V9については、3つの最も高い応答実験の幾何平均SUは330.9SUであった。ワクチン免疫被験体中のインビボ生物学的応答は、長い投与間隔で有意差を生じる傾向があり（Vitiello, A.ら、J. Clin. Invest. 95:341-349 (1995)；pinilla-Ibarz, J.ら、Blood 95:1781-1787 (2000)）、EP-2101免疫動物で観察された最も高い応答の平均からのより尾kIICTL応答のlog値は、上限規格として確立された。すなわち2つのエピトープの上限規格は、3つの最も高い実験の幾何平均SU値に10を掛け、次にこの値を丸めることにより決定した。CEA.691H5についてこの値は2,895SUまたは2,900SUと計算され、HER-2/neuエピトープについては、同じ計算により3,309SUまたは3,300SUが得られた。CEA.691H5とHER-2/neu.369V2V9エピトープについてそれぞれ2,900SUと3,300SUの上限規格を超えるEP-2101のある試験膨潤性媒体は、最適ではないCTLを誘導する活性と毒性の可能性についての問題のため、力価測定法に合格することができない。
【０３６５】
各力価実験はまた、実験で得られたEP-2101力価測定値の妥当性を調べるシステム適切性対照も含むであろう。陽性対照としてマウスは、各CTLエピトープ単独とモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51エマルジョン中のパドレ（PADRE）（登録商標）エピトープで同時免疫され、この群のCTL応答は、EP-2101ワクチンについて確立されたものと同じ規格を使用して追跡されるであろう。陰性対照として、投薬経験の無い（非ワクチン接種）マウスの脾臓細胞は、EP-2101免疫マウスから採取された脾臓細胞と同一の条件下でインビトロで各CTLエピトープで刺激され、妥当な力価測定法の基準として、この対照群中の対照応答は、各エピトープについての規格下限を超えてはならない。
【０３６６】
実施例17
詳細なプロトコール
マウス
HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスは既に記載されている（Vitiello, A.ら、J. Exp. Med. 173:1007-1015 (1991)）ように、C57/BL6バックグランドで作成したHLA-A2.1/Kbトランスジェニック株とBALB/cマウスとの交配のF1世代として作成した。
【０３６７】
細胞培養培地
すべての細胞は10％ FBS、4mM L-グルタミン、5×10-5 M 2-ME、0.5mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸残基、100μg/mlストレプトマイシンと100U/mlペニシリンを補足したHEPES（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、グランドアイランド、ニューヨーク州）を有するRPMI-1640培地（以後RPMI-10培地と呼ぶ）中で増殖させた。
【０３６８】
モンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51ペプチドエマルジョンの調製
エマルジョン調製のために、EP-2101ワクチン中の個々のペプチドを、適当な水性またはDMSO溶液で適当な濃度で凍結乾燥粉末から可溶化して、最終アジュバントエマルジョン中10、5または2.5mg/mlの総ペプチドを得た。異なる溶液、そこで調製された各ペプチド、および調製法を以下に記載する。
溶液1（酸性プール）：ペプチドCEA.691H5、p53.149M2、MAGE-3.112I5とパドレ（PADRE）は0.1875M 酢酸中で可溶化した。CEA.691H5ペプチドは、まず2分間高速でボルテックス混合し、次に5〜10分間超音波処理した（35〜40℃）。他のペプチドを一度に加えて、1〜2分間ボルテックス混合して可溶化した。
溶液2（塩基性プール）：ペプチドCEA.24V9、CEA.605D6、HER2.689、MAGE2.157、およびp53.139L2B3を0.1M NaOHで可溶化した。ペプチドは短時間のボルテックス混合（1〜2分間）して可溶化した。
溶液3（DMSO）：ペプチドHER2.369V2V9は、DMSOでボルテックス混合（2分間）と加熱（35〜40℃）して可溶化した。
【０３６９】
すべての溶液は、すべての10個のペプチドの混合物を含有するプール4を作成するために一緒にするまで、4℃に保存した。
プール4（溶液1、2および3の組合せ）：溶液1、2および3を4：5：1の比（v:v、例えばそれぞれ0.8：1：0.2）で組合せたか、または3.2：4：1（v:v、例えばそれぞれ0.8：1：0.25）で組合せると、一部のペプチドが沈降した。組合せたプールを62.5mMのリン酸ナトリウム（pH7）0.2mlで緩衝化し、0.5M NaOH（緩衝化と混合物の添加後、最終プール4の2.5ml当たり約178μl）でpH7に調整し、次に注射用水（WFI）で容量（2.5ml）を調整する。
【０３７０】
次にプール4溶液をモンタニド（Montanide）（登録商標）ISA51（セピック社（Seppic, Inc.））と1：1 v:vで、3/8インチのミニ−マイクロ管状プローブを取り付けたシルバーソン（Silverson）L4RTホモジナイザーを使用してホモジナイズして乳化した。代表的には、1.5〜5mlの総量で10mg/mlの研究エマルジョンを調製し、調製中チューブは氷上で冷却し続けた。まず、水／油界面の近くの油層にプローブを注意深く挿入し、油層を低速で混合後、プローブをチューブの底に移動させ、速度を8,000rpmに調整する。ホモジナイズは全部で30分間行い、この間隔中チューブを繰り返し上げたり下げたりして均一なエマルジョンを産生する。最終のEP-2101乳化産物を4℃に維持し、次に動物に注入する。
【０３７１】
適切な直径と口径のプローブを混合スクリーンを使用して、2.5mg/mlと5mg/ml総ペプチド用量のエマルジョンを約25ml、500ml、または1リットルのスケールで調製した。
【０３７２】
上記したようにプラセボエマルジョン（エマルジョン対照）を調製したが、溶液1、2および3はペプチドを含有しなかった。
【０３７３】
マウスの免疫とインビボプライムしたCTLのインビトロ拡張
HLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスを、EP-2101またはプラセボエマルジョンを50〜100μl／動物の注射容量で尾の基部に皮下投与して免疫した。免疫の11〜14日後、各実験群の動物を屠殺し、マウス脾臓のプールから単一の細胞懸濁液を調製した。次に脾臓細胞の個々の培養物（20〜25×106細胞／培養）をインビトロで25cm2の縦型フラスコ中でEP-2101中の個々のCTLエピトープで刺激した（10mlのRPMI-10培地中1μg/mlの最終ペプチド濃度；エピトープ1つ当たり二重または三重の培養物を確立した）。APCとして1〜1.25×107 放射線照射（4000rad）LPS活性化芽球を各培養物に加えた。LPS芽球は、未処理HLA-A2.1/Kbマウスからの脾臓細胞をインビトロで6.25μg/mlのLPS（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）、セントルイス、ミズーリ州）と7μg/mlのデキストラン硫酸（500,000 分子量、17％イオウ；ファルマシアバイオプロセステクノロジー（Pharmacia Bioprocess Technology）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）で37℃で3日間刺激して調製した。
【０３７４】
EP-2101ペプチドで刺激した脾臓細胞培養物を37℃で5％CO2中で6日間インキュベート後、各培養物をIFN-γインサイチュELISA（後述）を使用してCTL活性について測定した。
【０３７５】
CTL活性の測定
培養開始の6日後、個々の培養物のCTL活性を、上記したように（McKinney, D.M.ら、J. Immunol. Methods 237:105 (2000)）IFN-γインサイチュELISAにより測定した。簡単に説明すると、CTLエフェクター細胞（4×105）細胞を、96ウェルプレート（平底、捕捉抗IFN-γモノクローナル抗体で被覆されている）中の4〜6ウェルに加えた。次に細胞をRPMI-10培地で連続4倍希釈して、最終濃度391細胞／ウェルを達成した。Jurkat−A2.1/Kb腫瘍細胞（105／ウェル）を次に各ウェルに加えた。各重複測定（細胞は6または4ウェルの重複測定で入れた）のウェルの半分に、10μg/mlのCTLペプチドを入れ、残りのウェルに培地を入れた。一晩インキュベーション後、ウェルを洗浄し、2次ビオチン化抗IFN-γモノクローナル抗体、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ、そして最後に基質で連続して処理して発色させてIFN-γ含量を測定した。吸光度を自動ELISAリーダーで測定し、標準曲線からIFN-γ濃度を外挿して、ペプチドの存在下または非存在下でCTLによりウェル当たりに放出されたIFN-γのpgを計算した。データは、McKinneyらが記載した方法（McKinney, D.M.ら、J. Immunol. Methods 237:105 (2000)）により計算した分泌単位（SU）で表す。1分泌単位は、106個のエフェクター細胞による100pg/ウェルのIFN-γの放出として定義される。
【０３７６】
ELISPOT測定法によるCTLとHTL誘導の測定
EP-2101に得られたCTLまたはHTL応答を測定するためのELISPOT測定法を、既に記載されているプロトコール（Lewis, JJら、Int. J Cancer 87:391 (1998)）に従って行った。簡単に説明すると、平底96ウェルニトロセルロースプレート（IP、ミリポア（Millipore））をIFN-γmAb（10μg/ml、R4-6A2、ファーミンゲン（PharMingen））を4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄後、プレートをRPMI-10培地で37℃で1時間ブロックした。4×105のCD8+細胞またはCD4*細胞（EP-2101免疫脾臓細胞からミレテニイ単離システムで単離した）および5×104Jurkat細胞（CD8+細胞について）、または105γ放射線照射投薬経験の無い脾臓細胞（CD4+細胞、赤血球溶解緩衝液で処理）を各我々に加えた。ウェルに10μg/mlのCTLまたはHTLペプチドを入れて、EP-2101エピトープに対する応答の誘導についてまたは無関係のペプチドの同一の濃度について試験する。CD8 ELISPOT測定法についての無関係のペプチドは、HCVコア132ペプチド（DLMGYIPLV（配列番号17））とCD4 ELISPOT測定法についてHCV NS3.1253（GYKVLVLNPSVAATL（配列番号18））であった。インキュベーション後、プレートをPBS／0.05％ツイーン20で完全に洗浄し、各ウェルにビオチン化IFN-γ mAb（2μg/ml、コロニーXMG1.2、ファーミンゲン（PharMingen））を加えて、37℃で2〜4時間インキュベートした。PBS／0.05％ツイーン20で4回洗浄後、ベクタステイン（Vectastain）ABCペルオキシダーゼ（ベクタステインエリートキット（Vectastain Elite kit）；ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories, Inc.）、バーリンゲーム（Burlingame）、カリホルニア州、アメリカ合衆国）をウェルに加え、プレートを室温で1時間インキュベートした。プレートをPBS／0.05％ツイーン20で3回洗浄し、次にPBSで3回洗浄した。100μlのAEC溶液（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））を加えてスポットを発色させた。4〜6時間後水道水で反応を停止させた。スポットをコンピューター支援画像分析により計数した（ツァイス（Zeiss）KS ELISPOTリーダー、ジェナ（Jena）、ドイツ）。スポットの数／106 cd8+細胞またはcd4+細胞を、（関連ペプチドに対するスポットの数）−（無関係の対照ペプチドによるスポットの数）×2.5として計算した。
【０３７７】
【表１】
0005156882.tif 000003
【表２】
0005156882.tif 000004
【表３】
0005156882.tif 000005
【表４】
0005156882.tif 000006
【表５】
0005156882.tif 000007
【表６】
0005156882.tif 000008
【表７】
0005156882.tif 000009
【表８】
0005156882.tif 000010
【表９】
0005156882.tif 000011
【表１０】
0005156882.tif 000012
【表１１】
0005156882.tif 000013
【表１２】
0005156882.tif 000014
【表１３】
0005156882.tif 000015
【表１４】
0005156882.tif 000016
【表１５】
0005156882.tif 000017
【表１６】
0005156882.tif 000018
【表１７】
0005156882.tif 000019
【表１８】
0005156882.tif 000020
【表１９】
0005156882.tif 000021
【表２０】
0005156882.tif 000022
【表２１】
0005156882.tif 000023
【表２２】
0005156882.tif 000024
【表２３】
0005156882.tif 000025
【表２４】
0005156882.tif 000026
【表２５】
0005156882.tif 000027
【表２６】
0005156882.tif 000028
【表２７】
0005156882.tif 000029
【表２８】
0005156882.tif 000030
【表２９】
0005156882.tif 000031
【表３０】
0005156882.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【０３７８】
【図１】ProGP処理マウスの脾臓DCがインビボでCTL応答を誘導することを示す。図1では、ProGP処理HLA-A2.1トランスジェニックマウスの脾臓DC（33μg／マウス、毎日、皮下で7日間）に、3μg/ml β2マイクログロブリン（スクリプスラボラトリーズ（Scripps Laboratories））を含有するOpti-MEM I培地（ギブコライフサイエンシーズ（Gibco Life Sciences））中のHBV Pol455ペプチド（106μg／mlの10細胞/mlペプチド）をインビトロでパルスした。室温で3時間ペプチドプッシング後、DCを2回洗浄し、106の細胞を、3方向のトランスジェニックマウスの群に静脈内注射した。エピトープパルスしたGM-CSF/IL-4拡張したDCと「モックパルスした」ProGP由来DCもまた、比較のために試験した。DCで最初の免疫の7日後に、動物を同じDC集団で追加免疫した。最初の免疫の14日後、免疫動物から脾臓細胞を、Pol455ペプチドの存在下で静脈内で2回再刺激した。再刺激後のCTL活性は、51Cr標識HLA-A2.1トランスフェクトJurkat標的細胞の溶解をペプチドの存在下（丸印）または非存在下（四角印）で測定する標準的51Cr放出測定法を使用して測定した。パネルA〜Cに示すデータ点は、三重測定セットの培養物からの溶解活性の複合物である。パネルA、HBV Pol455ペプチドをパルスしたProGP（SD-9427）処理動物からの脾臓DC。パネルB、HBV Pol455ペプチドをパルスしたGM-CSF/IL-4拡張DC動物からの脾臓DC。パネルC、ProGP処理動物からのモックパルスDC。試験は、エピミューンインク（Epimmune Inc.）（サンジエゴ、カリホルニア州）で行った。
【０３７９】
【図２】樹状細胞パルス法と試験法の略図を示す。
【０３８０】
【図３Ａ】製剤調製のフローチャートを示す。
【０３８１】
【図３Ｂ】EP-2101ワクチンを免疫したHLA-A2.1/Kbトランスジェニックマウスにおける多重エピトープCTL誘導を示す。50μgのEP-2101ワクチン（10mg/mlエマルジョン用量）で免疫したか、または50μgの各CTLエピトープをそれぞれ等しい用量のモンタニド（登録商標）ISA 51（Montanide ISA 51）アジュバント中のパドレ（PADRE）（登録商標）エピトープと同時免疫した（後者の応答を「Individual」と呼ぶ）。11〜14日後、プライムした動物からの脾臓細胞を各CTLペプチドで静脈内刺激し、6日後、三重測定培養物からのCTL活性をインサイチュIFN-γ ELISAにより測定した。対照として、投薬経験の無いマウスまたはペプチド無しで調製したモンタニド（登録商標）ISA 51（Montanide ISA 51）エマルジョンを注射したマウスからの脾臓細胞をまたペプチドでインビトロ刺激し、同一条件下でCTL活性を測定した（応答を「投薬経験の無い対照」と呼ぶ）。各エピトープについて示したデータは、6〜10回の独立した実験の幾何平均CTL応答である。CTL応答は、分泌単位（SU）で示し、1SUを106エフェクター細胞による100pg/ウェルのIFNγの放出として定義する。
【図１】
0005156882.tif 000033
【図２】
0005156882.tif 000034
【図３Ａ】
0005156882.tif 000035
【図３Ｂ】
0005156882.tif 000036
【配列表】
0005156882000001.app