(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エッセンシャルオイルの選択した生物学的活性をモジュレートする方法であって、適切な好気条件下で好気的に代謝する微生物の存在下、インキュベートしていないエッセンシャルオイルの基底活性と比較して前記の選択した活性をモジュレートするのに十分な期間、培地中で該エッセンシャルオイルをインキュベートすることを含み、前記エッセンシャルオイルが、バラ、ローズマリーまたはラベンダー由来のものであり、前記選択した生物学的活性が、バラエッセンシャルオイルについては緊張を低下させる活性、ローズマリーエッセンシャルオイルについては活気、怒りおよび緊張を低下させる活性、ラベンダーエッセンシャルオイルについては緊張および活気を低下させる活性であり、前記好気的に代謝する微生物が酵母である、前記方法。
【請求項２】
酵母がサッカロミセスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物を、培地中、栄養素の実質的不存在下で、エッセンシャルオイルとインキュベートする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
微生物がインキュベーション中に実質的に増殖を示さない、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培地が少なくとも１種類の構造水(structured water)を含んでなる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
エッセンシャルオイルが少なくとも１種類の構造水の存在下で調製されている、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品および医薬組成物、ならびにそれらの製造方法に関する。より具体的には、本発明は、生物学的活性を改良した化粧品および医薬組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、スキンケア製品の消費者は自分達が使用する製品の中身に対する関心を高めている。「天然」物質を基礎とする製品に対する需要が大きく増加している。何千年もの間、植物は、多くの民間療薬の供給源であるばかりでなく、医薬開発の基礎原料を提供してきた。例えば、最良の鎮痛剤アスピリンは、シダレヤナギ由来のサリチル酸の改変体であり、癌治療薬タキソール（Taxol）は、最終的にイチイ（イチイ属）から誘導された。よりシンプルな、またはより自然な生活様式に戻りたい、ならびに、望ましくない物質によって汚染されているかまたは一部の消費者もしくは政府関係機関等によって望ましくないとみなされる可能性があるヒト由来物質または動物由来物質を避けたいという総合的な欲求にちなんで、皮膚のトリートメントのために植物物質を使用することに対する新たな関心が沸き起こっている。
【０００３】
しかしながら、植物物質の使用は簡単ではない。植物は目的の化合物をあまり多くの量生産しないことが多く、このことが、商業的治療目的に対して意義のある量を得ることを困難にしている。ある物質の適切な供給を維持するためには、当該植物物質を多量に集める必要があり、一方で、そのことが、環境への被害、生態破壊、または最悪の場合、最終的な植物の絶滅をもたらし得る。所望の活性を示す化合物のアイデンティティーが公知である場合には、該化合物を合成的に（すなわち、完全に化学的経路により）調製するか、あるいは、より豊富な植物化学物質前駆物質から出発して化学的経路により所望の化合物を誘導することによる所望の化合物を半合成的に調製し得る場合がある。しかしながら、これらの方法は、いずれも費用が高く、またいくつかの個人的見解においては、最終生成物が幾分「天然」度を欠き得る。実際、多くの場合、天然物は、それらの推定された化学的アイデンティティーにかかわらず、その合成対応物よりもはるかに優れていることがある。例えば、不斉分子の場合、天然由来の分子は通常１つのキラリティーを有するのに対し、合成化学物質は全ての可能なキラリティーを有する。天然源であることの重要性を示す非常に良い例が人工のバニラと比較して天然のバニラのほうが優れているという認識がほぼ一般的であるということである。
【０００４】
最近では、より多くの量の目的化合物を産生する細胞を選択する植物細胞培養、または、宿主による植物物質の産生を可能にする植物細胞遺伝子を用いた、増殖容易な宿主細胞（例えば細菌）の遺伝形質転換により、所望の植物化学物質をより多くの量で取得することが可能となっている。しかしながら、所望の化学物質を取得するためのこれらの手段に対して、環境的または教義的理由から、反対する人の集団も存在する。
【０００５】
したがって、現在、生物学的に活性な植物由来化合物に対して、全体として該化合物の天然の特性を維持しながら、その利用可能性を高める手段に対する必要性が明らかに存在する。本発明は、植物抽出物の生物学的活性を増強し、それにより目的の化合物の利用可能性を効果的に増加させる手段を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、１以上の生物学的活性または生化学的特性を有する天然物質の選択した生物学的活性をその天然物質の適切な抽出物中でモジュレートする方法（本明細書中で生物変換と呼ぶ）に関する。本発明の方法は、適切な好気条件下、酵母または他の適切な微生物の存在下で、選択した活性を上昇またはその他好適に変化させるのに十分な期間、抽出物をインキュベートすることを含む。好ましくは、活性は、非処理抽出物の基底活性よりも少なくとも100%高く増強される。さらに、本発明は、本プロセスによって調製された改変抽出物に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例２Ａで行った試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明者等は、予想外にも、天然物質を、例えば、すでに生物学的活性を有している植物抽出物を、酵母の存在下で該抽出物を比較的簡単に処理することにより天然物質の活性を増強またはモジュレートし得ることを見出した。この生物変換プロセスは、本明細書中で言及するように、好気性であり、ワインを酢に変換させる種類のプロセスによく似ている。
【０００９】
基本的プロセスは以下の通りである: １以上の生物学的活性または特定の生化学的特性（例えば、溶解性または芳香性）を有する天然物質を選択する。便宜上、本明細書および特許請求の範囲を通じて、「生物学的活性」には真の生物学的活性および生化学的特性の両方が包含されることが理解されるであろう。この点に関して、多くの場合においては、所望の効果とは、その有効性を増大させることにより天然の活性を増大させることであるが、その他の場合においては、特に生化学的特性を改変する場合においては、該特性は、質的には向上するが量的には必要とされないという意味において、モジュレート時にあまり増強されない場合があることも理解すべきである。したがって、本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「モジュレート」または「モジュレートすること」には、生物学的活性の上昇だけでなく、生化学的特性の質的変化も包含されることを意図する。該活性または生化学的特性を担っている化合物の化学的アイデンティティーを知ることは必須ではない。天然物質の抽出物は、該物質と、蒸留水、塩の水溶液、構造水(structured water)、水/アルコール混合物、または生物学的に許容し得る油とを、該物質から活性物質が抽出されるのに十分な期間インキュベートすることによって調製することができる。この期間は、数時間と短くてもよいし、１週間またはそれ以上であってもよい。該分子のアイデンティティーが公知である場合には、抽出液中での該分子の存在について分析することにより適切な抽出が示唆されるであろう。しかしながら、アイデンティティーが公知でない場合には、溶媒の色の変化を観察することか、あるいは、抽出物を１週間以内、単に放置することが、合理的に適切な抽出を確かなものにする代わりの手段である。粗抽出物を使用する代わりに、出発物質は実質的に純粋な成分（例えば、市販の植物抽出物または精製植物成分または生物学的活性を有する純粋合成化合物）であってもよい。便宜上、これらのタイプの出発物質すべてを本明細書中で「抽出物」と称し、かかる物質は、たとえ最終的に合成によって調製した場合であっても「植物由来」とも称する。次いで、該抽出物を、酵母または他の適切な微生物と、室温にて十分に通気した条件下で、例えば、0.2〜2リットル/分の泡だった空気と一緒に、20〜200 rpmの速度で、少なくとも約24時間、好ましくはそれ以上の時間、攪拌する。
【００１０】
生物変換プロセスは、２種類のアプローチのいずれか一方を取ることができる。第１のアプローチは、微生物を、抽出物とばかりでなく、従来の培養用栄養素とも一緒にインキュベートするというプロセスである。かかるインキュベーション中に、酵母は増殖することができる。第２の、かつ好ましい、アプローチは、抽出物のみ存在する状態のもと、かついずれのさらなる栄養素も実質的に含まない状態のもと、水性環境中で微生物をインキュベートするものである。この処理方法中、酵母は増殖しないが、出発物質の異化プロセスに従事する。生物変換は、生物学的活性がプラトーに達している徴候を、例えば、pHが横這いになっているかを、定期的にモニターし、次いで、系の温度を約30〜50℃の範囲に、好ましくは約40〜45℃の範囲に、少なくとも約24時間上げる。１実施形態においては、次に、温度を短時間のうちに上昇させて約5〜10分間、90〜95℃とし、これにより酵母を破砕し、細胞含有物を放出させる。あるいは、該細胞は超音波処理によって破砕してもよい。次に、全体の系を室温まで冷却し、孔径のより小さいものを段階的に使用してろ過して、酵母の残渣（debris）を除去し、非処理抽出物と比較して活性レベルが増強されているまたは生化学的特性が改変されている抽出物を取得する。
【００１１】
かかる手順を使用することにより、当該活性レベルは非常に大きく上昇し、好ましくは少なくとも約25%、より好ましくは少なくとも約50%、最も好ましくは少なくとも約100%上昇し、しばしば有意にそれ以上に、すなわち３〜10倍に上昇する。抽出物の生物工学的処理または生物変換に使用する生物は、本目的のために一般的に使用しうるいずれの微生物であってもよい。特に有用な生物は、標準的醸造用酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae）であるが、他の好気性微生物、例えば、限定するものではないが、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、シアノバクテリアまたは古細菌も使用することができる。
【００１２】
変換プロセス中で使用する微生物の濃度は重要でなく、特に酵母が変換中に増殖しない実施形態においては比較的少量、すなわち、混合物の重量の約0.01%〜約1%であってもよい。これよりも多い量で使用することもできる。開始時の抽出物の量も重要ではない。しかしながら、酵母の増殖を防ぐことが所望の場合には、該量は、酵母が増殖することが可能なほど栄養素が十分にならないようにコントロールすべきである。通常、その量は、活性物質の約0.01〜約10%、好ましくは約0.01〜約5%であり、濃度は、出発物質およびその溶解度に依存する。
【００１３】
上記したような本発明の実施形態の１つにおいては、活性物質をその中に抽出するか、かつ/または、生物変換をその中で行う液体培地は単に水である。しかしながら、好ましい実施形態においては、使用する水は構造水(structured water)、すなわち、例えば、RO 88053 [S型水]およびRO 88054 [I型水]、および米国特許第5,846,397号および同6,139,855号（これらの文献の内容は参照により本明細書中に組み入れるものとする）中に記載されるようなI水、S水、または両方の混合物である。生物変換プロセスにおけるこれらの相の一方または両方の構造水の使用が、活性物質の求められている特性をさらに増強し、いくつかのケースにおいては、このことが生物変換を成功に導くか失敗に導くかを分け得る。原則として、米国特許第5,846,397号および同第6,139,855号中に記載されているように、構造水中のクラスター形成(clustering)が、生物変換を行わない状態のもと、特定の物質の生物学的特性を増強し、あるいは、特定の物質の生化学的挙動を改変する場合、構造水の存在下で抽出および/または生物変換プロセスを行うことによっても結果を改良することができる。上記したように、生物変換培地には通常、該生物の生化学的活性のための唯一の基質源が供給された活性物質であるように、生物変換する生物の増殖および繁殖を維持するのに十分な栄養素は供給しない。しかしながら、別の実施形態においては、微生物の増殖に適当な栄養培地の存在下で首尾よく生物変換を行うことができる。
【００１４】
本発明の生物変換のために選択される天然物質は、改良することが望まれる生物学的活性または生化学的特性を有する任意の天然物質であることができる。抽出物を調製する最初の物質は、含有される活性成分の化学的アイデンティティーが知られていようがいまいと、あるレベルの生物学的活性または特性を有することが知られている任意の植物または植物部分の比較的粗製の抽出物であることができる。活性物質を含有する様々な植物が、よく知られており、報告されている。かかる例は、D'Amelio, F. S., Sr., Botanicals, a Phytocosmetic Desk Reference, CRC Press, 1999, および Bruneton, J., Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal plants, Lavoisier Publishing, 1995.中に見出すことができる。これらの刊行物の内容は参照により本明細書中にその全内容を組み入れるものとする。かかる植物の具体例のいくつかとして、限定するものではないが、エストロゲン受容体アゴニスト、チロシナーゼ阻害物質(皮膚美白)、およびミトコンドリア保護物質としてのカンゾウ（Glycyrrhiza）抽出物; 美白剤としてのフェルラ酸またはその誘導体; p450誘導物質、肥満細胞脱顆粒抑制物質、および抗酸化物質としてのローズマリー抽出物; 美白のための、ならびに、ホウレンソウ抽出物と組み合わせてギャップジャンクション依存性情報伝達促進物質、シクロオキシゲナーゼまたは誘導型NO合成酵素の阻害物質、および肥満細胞脱顆粒の抑制物質としてのカモミール（マトリカリア；Matricaria）; ヒスタミン放出抑制のための、ならびに、ローズマリーと組み合わせて、P450誘導、グルタチオン-S-トランスフェラーゼの活性増強、および肥満細胞脱顆粒の抑制のためのラベンダー; その消化特性および抗炎症特性のための、ならびに、バラ抽出物と組み合わせてエストロゲン受容体のモジュレーションのためのショウガ (Zingiber); プロスタグランジン合成阻害のための杜松(juniper)とホウレンソウの組合物; 抗酸化物質としての白茶(white leaf teas)または緑茶(green leaf teas); プロテアーゼ阻害剤および熱ショックタンパク質誘導物質としての白樺; 抗酸化物質としてのブドウの種子抽出物または他のブドウ抽出物; 抗酸化物質、ヒアルロニダーゼ阻害物質、および抗炎症物質としてのプテロカルプス・ウレイ(Pterocarpus ulei); コラーゲン刺激のためのセンテラ・アシアティカ(Centella asatica); 抗酸化剤、血小板活性化因子阻害物質および血管新生阻害物質(anti-angiogenic agent)としてのアニバ・プルキリミノール(Aniba purchyriminor); 創傷治癒特性および免疫能増強特性のためのエキナケア(Echinacea); 抗刺激特性および抗接着特性のためのアロエ(Aloe vera); 抗うつ特性および収斂特性のためのセント・ジョーンズ・ワート(ヒペリカム；Hypericum); 防虫剤としてのニーム(neem；Azadirachta); ならびにコラゲナーゼ阻害特性のためのミモザ・プディカ(Mimosa pudica)等を挙げることができる。上記したものは、ほんの数例に過ぎず、その他の例も当業者には容易に理解されるであろう。
【００１５】
出発物質は、キチン、ケラチン、軟骨、コラーゲン等の動物由来物質であってもよい。あるいは、出発物質は、生物学的活性を有することが知られている実質的に純粋な植物由来もしくは動物由来または化学合成された化合物であってもよい。かかる例としては、生物学的活性を有することが知られているいくつかのフラボノイド、イソフラボノイドまたはアントシアニン; アミノ酸およびその誘導体（例えば、N-アセチルシステインおよびN-アセチルグルタミン）、アルドースアミンおよびその誘導体（例えば、N-アセチルグルコサミン）、キサンチンおよびその誘導体（例えば、カフェイン）、抗酸化剤（例えば、レスベラトロール(resveratrol)またはローズマリー酸）、抗炎症性化合物（例えば、グリシリジン(glycyrrhizin)、グリシレチン酸(glycyrrhetinic acid)、および関連化合物;またはステロイドおよびステロイド前駆体（例えば、DHEAまたは天然の前駆物質）等を挙げることができる。さらに、多くのこれらの化合物が１以上の生物学的活性を有することが理解されるであろう。例えば、レスベラトロールは、抗酸化剤であり、美白剤でもある。本明細書中で使用する用語「天然物質」は、天然に直接由来する物質ばかりでなく天然源に存在する物質をも包含することを意図するが、それらは合成または半合成手段により調製し得る。
【００１６】
本明細書中に記載される物質は、主として、皮膚上で該物質の治療的または有用な効果を増強するために局所投与用として有用な生物学的活性を有する物質であるが、その増強された機能は、他の器官系に対しても適用しうる程度に、該改良物質を全身に同様に使用することができることは、当業者には容易に理解されるであろう。また、本発明の方法は、単独でまたは主として付加的に全身に適用しうる生物学的活性を有する任意の種類の天然物質にも容易に適用しうることが理解されるであろう。全身性の医薬的効果を有することが知られているハーブおよび他の植物物質の例が、D'Amelio（前掲）およびBruneton（前掲）の双方に記載されている。興味深い生化学的特性を有する物質の具体例が芳香物質またはエッセンシャルオイルであり、これらは全身的な利点ばかりでなく化粧的な利点も、特にアロマテラピーの分野で有する。エッセンシャルオイルおよび芳香物質は、そのにおいによって装うといった特性ばかりでなく、身体のみならず精神へのその認識されている効果により、何千年もの間使用されてきた。この情報に関する有用な参考文献は、Groom, N,: Perfume, the ultimate guide to the world's finest fragrances, Running Press, Philadelphia-London, 1999,（参照により本明細書中に組み入れるものとする）中に見出すことができる。有用なエッセンシャルオイルまたは上記のような長所を有することが知られている植物物質としては、例えば、バラエッセンシャルオイル(緊張を減少させる)、ローズマリー(元気づける)、ラベンダー(リラクゼーション)、レモン(抗うつ)、橙花(neroli)(不安を減少させる)、クラリセージ(抗うつ)、バジル(機敏性および記憶力を増加させる)、アニスの果実(駆風作用)、メリッサ(melissa)(抗うつ)、ビャクダン(気分を高揚させる)、ペパーミント(精神的刺激物質)、またはイランイラン(催淫作用)等を挙げることができる。これらの物質それぞれが、生物変換を行った場合に、個々の特性が増強されることにより有用であり得る。
【００１７】
エッセンシャルオイルの化学構造が改変されるか、または、熱分解工程中に抽出物が曝される水溶性巨大分子の疎水性ドメインとともに錯体形成することにより、生物変換プロセスでエッセンシャルオイルが水溶性になり得るということは特に有用な知見である。バラ油由来のゲラニオール、ならびに、ローズマリーまたはラベンダー由来のエッセンシャルオイルは、生物変換により水溶性になった。
【００１８】
通常は水に不溶性である化合物を水溶性にするこの可能性は、所望の物質について特定の種類のビヒクル中での溶解性またはその欠如が問題となることが多いような製剤化分野においてすぐれた用途をもたらす。したがって、この知見は、エッセンシャルオイルに限定されるものではなく、化粧品中に使用される様々な化合物（例えば、増量剤、増粘剤、界面活性剤、および水または油中で難溶性を示す活性物質）をも包含するものである。
【００１９】
本生物変換プロセスによって観察される活性の増強は、特に驚くべきものであり、以下の実施例からわかるように、広範な生物学的活性を有する多様な異なる天然物質について立証されている。特定のいかなる理論にも拘束されることを意図しないが、この予想外の出来事は、活性分子の可溶化もしくはバイオアベイラビリティーの増加、活性物質の酵素による転換、活性物質と酵母成分（例えば、ビタミンまたは栄養素またはオリゴエレメント、すなわち、非常に低い濃度で体内で見出されるエレメント）との相乗的相互作用、またはこれらすべてのプロセスの組み合わせが原因であり得る。理由は何であれ、多様な化学的アイデンティティーおよび生物学的活性を有する広範な粗天然物質および比較的純粋な天然物質の活性を増強させることが成功するということは、天然の生物学的活性を増強するこの生物変換技術の広い適用可能性を明確に示すものである。この利点は、同等またはずっと低い濃度でもともとの活性よりも活性が高い物質の生産において発揮される。すなわち、これにより、本発明を適用しないと非常に量が少ないか、および/または、高くつく重要な生物学的効果を大いに利用できることになるのである。
【００２０】
本発明を以下の非限定的実施例によりさらに説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１
本実施例は、様々な天然物質について利用し得る生物変換の一般的プロセスについて説明する。
【００２２】
A. 接種材料調製:
生物変換プロセスを開始する24時間前に、サッカロミセス・セレビシエ(ATCC 60219）の新鮮な酵母培養物を調製する。新鮮なストリークプレートからのコロニーを、100% Tryptic Soy Brothを含有する400 ml 攪拌フラスコ中に接種する。生物変換の総容量の1% (容量/容量)となるように十分な接種材料を調製する。これにより酵母/培地の比率は総計約0.01%〜0.1%（湿潤重量/容量）となる。一旦、変換の容量サイズを決定したら、容器を該プロセスに適合するように選択する。
【００２３】
B. 抽出物の調製:
生物変換のために抽出する物質(例えば、切り刻んだ植物性素材)を、100 mlの水または50:50の水:エタノール混合物またはクラスター化銀イオンを0.1 ppm含むI水またはI-水またはS-水または他の有機溶媒（例えば、ブチレングリコール）に重量/重量比が0.01〜10 %となるように添加する。この植物-溶媒混合物を室温で１週間インキュベートする。インキュベーション後、残っている残渣（debris）をろ過により除去し、水アルコール抽出した場合には、残っているいかなるアルコールもロータリー・エバポレーターにより除去し、それから抽出物を生物変換容器に添加する。
【００２４】
C. 接種材料:
該容器は、滅菌蒸留水またはI-水またはS-水またはそれらの混合物を含有する。これに、該抽出物を0.01% (芳香性エッセンシャルオイルの場合の多くはこの濃度である)〜10 % (容量/容量)の範囲の割合で添加する。活性成分または植物抽出物を添加した後、上記のようにして前もって調製しておいたサッカロミセス・セレビシエを該容器に接種することができる。サッカロミセス・セレビシエを使用する生物変換の全てにおいて、生物変換総容量の1.0%を接種する。攪拌装置は、所望の速度（通常20〜200 rpm）、温度約25℃、エアレーション0.2〜2リットル/分に設定する。
【００２５】
D. プロセシング時間:
生物変換は24〜72時間継続して行う。pH、プレート計数、におい、および視覚面での評価のために24時間間隔でサンプルを採取し、データログに記録する。維持量20 mlのサンプルも安定性評価のために24時間ごとに採取する。このプロセスのエンドポイントは、通常、プロセスが安定する時点まで、生物学的活性の指標としてのpHをモニタリングし、次いで変換プロセスを停止させることにより決定する。この時点で温度を１日間45℃に上げ、次いで、温度を90〜95℃に上げた熱分解工程を10〜15分間行う。
【００２６】
熱分解後、該培地を、孔径のより小さなフィルター（8μm、2μmおよび0.22μm）を段階的に使用することによりろ過する。一旦ろ過したら、サンプルは、0.5%フェノキシエタノールまたは他の保存剤と一緒に保存するか、あるいは4℃にて保存し、さらなる使用のために取り分けておく。
【００２７】
実施例２
いくつかの天然物質の発酵生成物を、実質的に実施例１に記載されたようにして、または以下に示すように改変したプロセスによって調製し、次いで、それらの活性のレベルを調べるために試験する。観察された結果は以下の通りである:
A. センテラ・アシアティカ（Centella asiatica）
センテラ・アシアティカの抽出物は、コラーゲン増強活性を有することが知られている。この活性を増強させるために、0.1% センテラ・アシアティカ抽出物サンプルを0.1% 酵母と一緒に96 時間インキュベートする。試験は以下の通り行う：処理を行う前に、NHDF細胞を96ウェルプレートに播き、密集するまで増殖させた。試験サンプルは、10分後に熱分解した0.1% 乾燥酵母、96時間後に熱分解した0.1% 乾燥酵母、0.1% (w/v) センテラ・アシアティカ含有dH20、および0.1% 酵母含有dH20による上記生物変換プロセスに96時間供した0.1% (w/v) センテラ・アシアティカであった。試験を行う前に各サンプルを滅菌ろ過し、培地中でさらに希釈した。サンプルを10%、5%、2.5%および1.25%に希釈した。センテラの出発濃度が0.1% (w/v)であることを考慮すると、試験したセンテラの最終濃度は0.00125%、0.0025%、0.005%および0.01% (w/v)であった。プレートを37℃ / 5% C02にて３日間インキュベートし、上清を回収し、ELISAを行うまでシリコン処理済チューブ中で-80℃にて保存した。PIP ELISA (Pan-Vera Technology, Code MK101)は、製造業者によって供給されたプロトコール中に概要が示されているようにして実施し、結果は標準曲線から計算した。
【００２８】
96時間後に熱分解した生物変換センテラ・アシアティカサンプルは、生物変換非実施サンプルと比較して３〜４倍高いin-vitroでのコラーゲン合成刺激活性を有する。10分後に熱分解した対照酵母含有dH20は、培養ヒト繊維芽細胞によるコラーゲン合成に何ら変化を誘導せず、「再水和」させた96時間後に熱分解した酵母サンプルも誘導しなかった。結果は図１に表されるグラフ中に示す。この結果は、明らかに、コラーゲンの合成の増加が、センテラの生物変換によりもたらされていることを示している。
【００２９】
B. カフェイン
カフェイン含有水は相当量の抗酸化特性を有し、紫外線照射による脂質の酸化を減少させることができる。カフェインは、水中または構造水混合物(I/S 60/40)中で、示した濃度(w/v)において生物変換に供した。構造水中において生物変換した時、脂質過酸化反応に対する阻害能の増強が下記の通り観察される。脂質過酸化反応に対する阻害を判定する方法は、例えば、Pelleら, Ann N.Y. Acad. Sci. 570: 491-494 (1989) 中に見出すことができる。
【表１】
0005156716.tif 000002
【００３０】
C. レスベラトロール (Resveratrol)
レスベラトロールは、よく知られた抗酸化剤であり、Pelleら（前掲）により記載されたリポソームアッセイにおいてUVにより誘発される脂質過酸化反応を阻害し得る。S-水中での生物変換により、その抗酸化特性は増強される（下記表参照）。
【表２】
0005156716.tif 000003
【００３１】
レスベラトロールの抗酸化特性に及ぼす生物変換の正の効果は、生物変換プロセスを蒸留水中で行った場合には誘発されない。
【００３２】
また、レスベラトロールは、よく知られたチロシナーゼ阻害剤であり、酵素活性を50%阻害する濃度(IC50)は0.05%である。S-水中での生物変換により、レスベラトロールの阻害能は約20%増加し、また、S-水中での生物変換後のレスベラトロールのIC50は0.041%である。
【００３３】
D. 白樺
白樺抽出物は、エラスターゼに対する比較的弱い（おそらく水への溶解度の低さが理由である）阻害物質である化合物を含有する。I/S 水 (60/40)においては、白樺抽出物のエラスターゼに対するIC50は7.5%の程度である。I/S (60/40) 水中で生物変換を行った場合、その抗エステラーゼ活性は少なくとも10倍増加し、生物変換白樺抽出物のIC50は0.7%である。
【００３４】
E. ホウレンソウ抽出物
(i) 繊維芽細胞培養物中の血清を24時間枯渇させると、DNA合成は正常に機能しない。0.01〜0.1%のホウレンソウ抽出物は、「培地単独」の陰性対照と比較して、血清を枯渇させた繊維芽細胞培養物中のDNA合成を２倍未満刺激する。一方、1%および10%ウシ胎仔血清はDNA合成を回復し、それぞれ基底値の３倍および７倍に上昇させる。ホウレンソウ抽出物を生物変換した場合、0.01〜0.1%の該ホウレンソウ抽出物は、血清を枯渇させた細胞中でのDNA合成を５〜７倍増加させる。このことから、生物変換ホウレンソウ抽出物は、10%血清に匹敵し得るDNA合成刺激活性を有する微量栄養素のような挙動を示すように思われる。
【００３５】
(ii) 血清を枯渇させた繊維芽細胞は形態の損傷も示し、該損傷は細胞質中の多数の小胞の存在に特徴付けられる。そして、1%または10%の血清を添加することにより正常な形態に回復する。0.01〜0.1%の未処理ホウレンソウ抽出物は健常な形態に回復させることはできないが、同濃度の生物変換ホウレンソウは健常な形態に回復させることができる。
【００３６】
F. プテロカルプス・ウレイ（Pterocarpus ulei) およびアニバ・プルキリミノール（Aniba purchyriminor）
プテロカルプス・ウレイは、抗炎症特性を有することが知られている赤道付近の植物である。アニバ・プルキリミノールは、血小板活性化因子（PAF：Platelet Activating Factor)の阻害物質を含有する赤道付近の植物である。また、アニバ・プルキリミノールは、優れた香りに恵まれている。植物体プテロカルプス・ウレイおよびアニバ・プルキリミノールそれぞれが抗酸化活性を有する。したがって、上記２種類の植物由来の抽出物混合物は、有用な生物学的活性を有する香水を構成する。それらの抗酸化特性を測定し、生物変換した場合にそれらが増強されるかを観察した。0.002%の濃度のプテロカルプス・ウレイ抽出物は、UVによって誘発される脂質過酸化反応を64%阻害するが、0.0005%では活性を示さない。0.002%の濃度のアニバ・プルキリミノールは、過酸化反応を73%阻害するが、0.0005%では23%しか阻害しない。濃度1%の各非処理抽出物を合わせて、それぞれ0.1%に希釈し、生物変換に供した。該変換抽出物は抗酸化活性がおよそ３倍に増加し、0.0001%で過酸化反応を12%阻害し、0.0002%で26%阻害する。
【００３７】
G. エッセンシャルオイル
バラ由来のエッセンシャルオイルは、主としてゲラニオールから構成され、0.05%の濃度での生物変換によって水溶性になり、次いで、気分の状態に対して該エッセンシャルオイルが及ぼす影響を調べるために水中で試験した。被験者の気分の状態は、標準的心理テストである感情プロフィールテスト（POMS： Profile of Mood States)を用いて評価することができる。該テストは、緊張、うつ、怒り、活気、倦怠感および混乱について測定する。特定の芳香を嗅ぐ前および後でPOMSの質問表に回答した被験者における気分の変化を判定することができる。
【００３８】
1群42名のボランティアに、生物変換バラエッセンシャルオイルまたは生物変換非実施バラエッセンシャルオイルを嗅ぐ前および嗅いでから10分後に、1〜11のスケール上にその時の気分を採点することにより質問表を記入してもらうよう求めた。実験結果は、以下の表に示されるように、生物変換バラエッセンシャルオイルが、生物変換非実施バラよりも大きく緊張を低下している。同様に、ローズマリーのエッセンシャルオイルを1%の濃度で生物変換した。ローズマリーのエッセンシャルオイルは、活気を増すことが文献中で広く報告されている。本発明者等は、生物変換ローズマリーは活気、怒りおよび緊張を低減することを見出した。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００３９】
【表７】
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【００４０】
実施例３
実施例１に記載した方法は、酵母が増殖し得る栄養培地を含むように改変することができる。適切な培地成分の例は以下の通りである:
【表８】
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【００４１】
変換プロセスは、前記実施例に記載の方法に改変を加えて以下の通り行う。該プロセスは、炭水化物の利用率に応じて24〜72時間継続して行う。変換終了後、最終プロセシングを終える。熱分解工程は行わない。容器中の全内容物をガラスビーカー中で１時間超音波処理する。ガラスビーズを該フラスコに添加し、超音波処理プロセスを補助する。超音波処理後、該培地を200 ml容器中に入れ、4000 RPM、15分間、遠心分離する。次いで、遠心分離したサンプルを0.22 μm フィルターに通過させる。一旦フィルターを通過させたら、サンプルは0.5% フェノキシエタノールと一緒に保存し、さらなる使用のために取り分けておく。
【００４２】
実施例４
実施例３の方法を用いて、皮膚細胞の剥離における生物学的活性を有することがそれぞれ知られているN-アセチルグルコサミンおよびマンノース-6リン酸を生物変換する。次いで、生物変換した該皮膚剥離作用物質について、以下の通り、皮膚の剥離を促進する能力について評価する。
【００４３】
試験設計
本試験に含まれる被験者は21歳〜65歳の間の女性120名であり、全員が、健康状態が良好で、妊娠中または授乳中ではないというスクリーニング基準を満たしている。被験者は保湿剤またはいかなる他の製品も手につけない状態で試験に参加し、基底値を測定した。被験者は以下の８つの処理群のうちのひとつにランダムに割り当てた。被験者は、１日２回、朝洗浄後および夜就寝少なくとも15分前に、４週間、該製品を家庭で自分で右手のみに投与した。左手は非処理の対照部位とした。被験者は試験品のみ使用することが認められ、日誌中にその使用結果を具体的に記載した。２週間後および４週間後に、少なくとも12時間は試験品を適用することなく被験者を試験に戻し、次いで、同条件下で彼等を再び評価した。
【００４４】
D-Squameディスク法およびイメージ解析による皮膚剥離分析
４枚のD-Squameディスクを、手で持つ均一な圧力を与える装置を用いて、顔およびそれぞれの手の甲にしっかりと均等に押し付け、次いで、皮膚からやさしく剥がすことにより取り除いた。D-Squameディスクを透明の顕微鏡スライドにマウントし、パネリストの名前および分析実施日時(visit)にしたがってラベルした。皮膚剥離をイメージアナライザーによりD-Squameディスクから評価した。皮膚の評価は、処理前、２週間処理後、および４週間処理後に行った。
【００４５】
OPTIMAイメージアナライザーを使用して皮膚の剥離を評価した。角質層を含むD-Squameサンプルをライト・テーブル上でカメラの下に置き、各イメージをイメージアナライザー中に取り込む。サンプル密度に対応する平均グレー値（Gray Value）を測定する。サンプルの密度がより高ければ、グレー値の差はより大きくなる。
【００４６】
試験品および試験群割り当て:
以下の試験群に割り当てた：
1. プラセボ (D1 ベース)
2. 1 % 培養液
3. 培養液 + 酵母 = 1 % 発酵物
4. 1 % 培養液 + N-アセチルグルコサミン
5. 1 % 培養液 + マンノース6-リン酸
6. N-アセチルグルコサミンの1 % 発酵物
7. マンノース6-リン酸の1 % 発酵物
8. マンノース6-リン酸 + クラリセージ + トルマリン (Tourmaline) の1 % 発酵物
結果
皮膚剥離は、D-Squameディスクを用いて皮膚表面から取れた薄片量を測定し、IA法を介してそれらを分析することにより評価した。本試験においては、N-アセチルD-グルコサミンとマンノース6-リン酸の発酵物の組み合わせのいくつかと、プラセボ、培養液、および対照としての発酵物とを、皮膚剥離に対する影響について比較した。データは明らかに発酵プロセスが両方の物質の活性を高めたことを示している。グルコサミンは一貫してマンノース6-リン酸よりも高い有効性を示した。結果は以下の表３に概要を示す。
【表９】
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【００４７】
実施例５
さらなる一連の試験を上記と同様にして行った。N-アセチルD-グルコサミンおよびマンノース6-リン酸の濃度は活性を損なうことなく１０分の１に下げた。以下の表４に簡潔な記載とともに実際の活性物質濃度の概要を示す。
【表１０】
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【図１】
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