(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱アセチル化度６０％以上、１質量％溶液粘度が１．５ｍＰａ・ｓ以上１，０００ｍＰａ・ｓ以下で、酸塩となっていない遊離のキトサンからなり、かつ粒子径が０．５μｍ以上２０μｍ以下であるキトサン微粒子と、水とを含み、ｐＨが６．５〜９．０であり、前記キトサン微粒子が溶解されていない状態で前記水に分散されていることを特徴とする免疫アジュバント分散液。
【請求項２】
キトサン微粒子の含有量が０．１〜１０質量％である請求項１に記載の免疫アジュバント分散液。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫アジュバント分散液を、微細な霧状としてヒト以外の動物の肺内に噴霧することを特徴とする免疫アジュバントの接種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応において抗原に対する抗体の産生能を向上させる効果を持つ免疫アジュバントに関し、詳しくはキトサン微粒子を含む免疫アジュバント分散液に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫とは、生体が有する病気への抵抗力や治癒力であり、分子レベルで見ると、自分自身である「自己」と、外部から侵入した異物「非自己」とを識別し、「非自己」のみを速やかに処理し、そして除去するシステムである。
【０００３】
免疫には、生体に侵入する病原体を非特異的に直ちに除去する先天性免疫反応（自然免疫）と、自然免疫を突破して生体内に侵入した病原体を特異的に除去する獲得免疫反応とがある。獲得免疫反応では、生体が病原体（抗原）と特異的に相互作用する抗体を産生することで病原体に対抗する。このような病原体に感染する前に病原体に対する抵抗力（免疫）を獲得するためには、死菌や弱毒化した病原体などをワクチンとして生体に接種する必要がある。ここで、接種したワクチンによって長期間に渡り、効果的に抗体を産生するためには、抗原とともに接種し抗体産生の手助けをする免疫アジュバントの選択が非常に大きなカギとなる。
【０００４】
現在ワクチンの接種方法は、筋肉注射による接種が大半である。この方法は抗原を直接体内に導入して免疫系を刺激するものであり、血中抗体が免疫の主体となるトキソイドワクチン（破傷風など）や弱毒化した生ウイルスワクチン（麻疹など）など、成功例も多い。
【０００５】
一方、粘膜を介してワクチンを接種し、粘膜で局所的に免疫を成立させる方法は、解決すべき課題が多く開発途上にある。感染症の多くは病原体が粘膜表面に接触して粘膜から侵入するか、又はその部分で定着増菌して始まる。このような粘膜表面での感染を防ぐために、生体は粘膜局所で独自に発達した免疫システムを持っている。しかし、ワクチンを経皮接種しても粘膜局所に免疫はほとんど誘導されず、これまで粘膜を介して感染する病原体に対して効果的なワクチン治療を行うことはできなかった。
【０００６】
また、粘膜にワクチンを接種すると、免疫はその粘膜に局所的のみならず全身系の免疫をも成立させることが知られており、多くの感染症でいかに粘膜局所での免疫を成立させるかが、感染防御の決め手になると考えられている。
【０００７】
このため、粘膜を介して免疫を成立させるようなワクチン及びその接種方法の開発に期待が寄せられ、ワクチンと免疫アジュバントとの併用などについて世界中で鋭意研究されている。しかし、ワクチン接種による粘膜免疫の成立及び免疫の誘導システムに関してはまだ不明の点が多い。また、アジュバントとしての作用を有する物質として知られているものは、アルム、コレラトキシン、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、オイルアジュバント、サポニン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、ヘキサデシルアミン、アブリジン、イスコム、細胞壁骨格構成物、リポポリサッカライド、エンドトキシン及びリポソームなどに限られている。しかも、これらの中には毒性が強いものも多数含まれており、ヒトへの接種に認可の下りたものはアルムのみである。
【０００８】
上記したものの他に、近年、キチン及びキトサンが免疫アジュバントとして有用であることが示されている。キトサンは、安全性が高い天然物由来の多糖であり、工業的にはエビ、カニなどの甲殻類から得られるキチンを脱アセチル化することによって生産されている。例えば、特許文献１は、水溶性のキチンオリゴマー及びキトサンオリゴマーを注射剤により免疫アジュバントとして使用することを開示する。特許文献２は、経口接種して使用されるキチンが免疫促進剤（アジュバント）として作用することを開示する。
しかし、このようにキチン、キトサンを免疫アジュバントとして使用する場合、抗原との結合度が高くはなく、大量に接種しなければならないという問題点がある。
【０００９】
なお、キトサン特有の性質としては、製膜性、抗菌性、保水性及び凝集能などの機能が知られており、機能性高分子として各方面で実用されている。
【００１０】
例えば、特許文献３に開示する方法によれば、キトサンの加水分解によりキトサンオリゴ糖が製造され、これは医薬品、食品、化粧品分野などへ利用されている。また、医療分野においてキチン、キトサンは、特許文献４が開示するように、感染防御物質としての応用が期待されている。
【００１１】
キトサンの使用にあたっては、あらかじめ微粒子化されたものが用いられる。その微細化の程度（例えば、平均粒径）は、従来光散乱法などにより決定されてきたが、測定方法や使用する溶媒により測定結果が大きく異なり、その結果得られるキトサンの性質が一定しないという問題点があった。特許文献５は、このような問題点を解決するため、キトサンの微細化の程度をその溶液の粘度で表し、溶液粘度が一定範囲であるキトサンは、性質が一定し、種々の用途に有用であることを開示する。
【００１２】
【特許文献１】特公平７−４７５４６号公報
【特許文献２】特開昭５５−４３０４１号公報
【特許文献３】特開２００３−２１２８８９公報
【特許文献４】特開平９−３０１８０７号公報
【特許文献５】特開２００７−２１２３公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、上述した従来技術の問題点を解決し、生体への安全性が高く、目的部位に局所的に免疫を誘導できる免疫アジュバント及びその接種方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的は以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、脱アセチル化度６０％以上、１質量％溶液粘度が１．５ｍＰａ・ｓ以上１，０００ｍＰａ・ｓ以下で、酸塩となっていない遊離のキトサンからなり、かつ粒子径が０．５μｍ以上２０μｍ以下であるキトサン微粒子と、水とを含み、ｐＨが６．５〜９．０であり、前記キトサン微粒子が溶解されていない状態で前記水に分散されている免疫アジュバント分散液を提供する。
【００１５】
ここで、当該免疫アジュバント分散液は、キトサン微粒子の含有量が０．１〜１０質量％であることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、上記免疫アジュバント分散液を、微細な霧状としてヒト以外の動物の肺内に噴霧することを特徴とする免疫アジュバントの接種方法を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体への安全性が高く、主に全身系免疫に関与するＩｇＧのみならず、粘膜などで感染防御に関わり、抗ウイルス作用を有する分泌型ＩｇＡの産生能にも優れた免疫アジュバント分散液及び当該分散液の接種方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
なお、本発明中において「部」又は「％」とあるのは、特に断りのない限り質量基準である。また、本発明中において「溶液」という場合、「分散液」を含むことがある。
まず、本発明の免疫アジュバントを構成するキトサン微粒子について説明する。
【００１９】
本発明で使用するキトサン微粒子は、天然物からキチンを得て、それを脱アセチル化してキトサンを得、このキトサンを微粒子化したものである。上記キチンは、カニ・エビなど甲殻類の外骨格をはじめとして、イカ、オキアミ及び昆虫並びにキノコなどの菌類などから得られるものであり、その起源は特に限定されることなく、本発明に使用することができる。
【００２０】
キチンは、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成単位とする天然高分子である。一方、キトサンは、キチンの脱アセチル化物であり、２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（グルコサミン）を構成単位とする塩基性多糖類である。キトサンは、既に工業的に生産されており、種々のグレードのものを入手することができる。本発明に使用するキトサンは、起源及び製法に特別な制限はなく、従来より工業生産されているキトサンを使用することができる。
【００２１】
本発明に使用するキトサンの脱アセチル化度は６０％以上のものを使用することが好ましく、脱アセチル化度が８０％〜１００％であるものを使用することがより好ましい。脱アセチル化度が６０％未満であると、希酢酸水溶液に容易に溶解しないなど、キトサン本来の特徴を表さなくなる点で問題がある。
【００２２】
（脱アセチル化度測定方法）
上記キトサンの脱アセチル化度は、コロイド滴定を行い、その滴定量から算出することができる。具体的には、指示薬にトルイジンブルー溶液を用い、ポリビニル硫酸カリウム水溶液でコロイド滴定することにより、キトサン分子中の遊離アミノ基を定量し、キトサンの脱アセチル化度を求める。以下に脱アセチル化度測定方法の一例を示す。
【００２３】
１．滴定試験
０．５％酢酸水溶液にキトサン純分濃度が０．５％となるようにキトサンを添加し、キトサンを攪拌、溶解して１００ｇの０．５％キトサン／０．５％酢酸水溶液を調製する。次にこの溶液１０ｇとイオン交換水９０ｇを攪拌混合して、０．０５％のキトサン溶液を調製する。さらにこの０．０５％キトサン溶液１０ｇにイオン交換水５０ｍｌ、トルイジンブルー溶液約０．２ｍｌを添加して試料溶液を調製し、ポリビニル硫酸カリウム溶液（Ｎ／４００ＰＶＳＫ）にて滴定する。滴定速度は２ｍｌ／分〜５ｍｌ／分とし、試料溶液が青から赤紫色に変色後、３０秒間以上保持する点を終点の滴定量とする。
なお、キトサン純分とは、原料キトサン試料中のキトサンの質量を意味し、具体的には、キトサン試料を１０５℃、２時間乾燥して求められる固形分質量である。
【００２４】
２．空試験
上記滴定試験に使用した０．５％キトサン／０．５％酢酸水溶液の代わりに、イオン交換水を使用し、同様の滴定試験を行う。
【００２５】
３．アセチル化度の計算
Ｘ＝１／４００×１６１×ｆ×（Ｖ−Ｂ）／１０００
＝０．４０２５×ｆ×（Ｖ−Ｂ）／１０００
Ｙ＝０．５／１００−Ｘ
Ｘ：キトサン中の遊離アミノ基質量
（グルコサミン残基質量に相当）
Ｙ：キトサン中の結合アミノ基質量
（Ｎ−アセチルグルコサミン残基質量に相当）
ｆ：Ｎ／４００ＰＶＳＫの力価
Ｖ：試料溶液の滴定量（ｍｌ）
Ｂ：空試験滴定量（ｍｌ）
脱アセチル化度（％）
＝（遊離アミノ基）／｛（遊離アミノ基）＋（結合アミノ基）｝×１００
＝（Ｘ／１６１）／（Ｘ／１６１＋Ｙ／２０３）×１００
なお、１６１はグルコサミン残基の分子量、２０３はＮ−アセチルグルコサミン残基の分子量である。
【００２６】
本発明の免疫アジュバントを構成するキトサン微粒子は、１質量％溶液粘度が１．５ｍＰａ・ｓ以上１,０００ｍＰａ・ｓ以下であるものを使用する。より好ましくは１．５ｍＰａ・ｓ以上５００ｍＰａ・ｓ以下である。
上記粘度が１．５ｍＰａ・ｓ未満とするためには、微細化のためのコストがかさみ、製造コスト上不利である。一方、粘度が１,０００ｍＰａ・ｓを超えると、溶液としたときに粘度が高くなりすぎ、使用の妨げとなり、接種方法も限定されるため、好ましくない。
【００２７】
また、本発明においては、キトサン微粒子の粒子径が０．５μｍ以上２０μｍ以下のものを使用する。粒子径が２０μｍを超えると、相対的に表面積が小さくなること及び移動性が低下し、免疫アジュバントとしての作用が弱くなるため好ましくない。粒子径は細かいほどよいが、キトサンの粒子径を０．５μｍ未満にするためには、コストが飛躍的に高くなり、経済性の面から好ましくない。
【００２８】
なお、上記キトサン溶液の粘度は、例えば、１％酢酸水溶液にキトサン純分濃度が１％となるようにキトサンを溶解させ、この溶液を、恒温槽にて２０℃に保ちながらＢ型回転粘度計を用いて粘度測定を行うことにより、決定することができる。なお、キトサン純分とは、キトサン試料における固形分換算を意味し、具体的には、キトサン試料を１０５℃で２時間乾燥した後の固形分質量である。
【００２９】
１質量％溶液粘度が１．５ｍＰａ・ｓ以上１,０００ｍＰａ・ｓ以下かつ粒子径が０．５μｍ以上２０μｍ以下であるキトサン微粒子は、特開２００７−２１２３公報に開示される方法により得ることができる。当該方法で得られるキトサン微粒子は、粒子径が均一であるため、投与ごとの効果が一定するという点で優れている。
【００３０】
本発明の免疫アジュバントは、水に加えて免疫アジュバント分散液として使用することができる。
本発明の免疫アジュバント分散液は、そのｐＨが６．５〜９．０であることが好ましい。ｐＨが６．５未満では、キトサン微粒子の溶解が起こり、微粒子としての特徴が損なわれる。また、ｐＨが９．０を超えると生物に悪影響を及ぼす恐れがあり好ましくない。
【００３１】
ｐＨの調整に使用する物質は、特に制限されず、当業者に周知の物質を使用することができる。ｐＨ調製に使用するアルカリ物質としては、アルカリ金属の水酸化物又は炭酸塩、アンモニア及びアミン類があり、具体的には、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、プロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ−エチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−メチルプロパノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパノールアミン及びアミノメチルプロパノールなどを挙げることができる。特に好ましいものは、水酸化ナトリウム及びアンモニアである。
【００３２】
一方、ｐＨ調整に使用できる酸性物質は、水溶性であれば特に制限はなく、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、タウリン、ピロリドンカルボン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ビドロキシマロン酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、安息香酸、サリチル酸、アミノ安息香酸、フタル酸、けい皮酸及びビタミンＣなどの有機酸、並びに、塩酸、リン酸、硝酸及び硫酸などの無機酸を挙げることができる。
【００３３】
当該免疫アジュバント分散液におけるキトサン微粒子の含有量は、全質量中０．１〜１０％を占める量であることが好ましく、１〜５％であることがより好ましい。キトサン微粒子の量が０．１％未満では、免疫応答を促進するという免疫アジュバントとしての効果が十分には得られず、一方、添加量が１０％を超えると当該分散液が流動性を失い、接種に不便であり好ましくない。
【００３４】
本発明の免疫アジュバント分散液と抗原とを混合する方法は、特に制限はなく、当業者に周知の混合分散機、微分散機及び微粒化機を使用することができる。具体的には、超音波発生機、ボールミル、ダイノミル、サンドミル、ロールミル、グレンミル、ディゾルバー、ディスパー及びペイントシェーカーを挙げることができ、混合と同時に微細化処理を行うことができるものを用いることが好ましい。
【００３５】
本発明の免疫アジュバント分散液は、当業者に周知の種々の接種方法により接種することができるが、当該水溶液を微細な霧状として粘膜に噴霧することにより、より適切なアジュバント効果を発揮することができる。接種部位にも特に制限はないが、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内及び直腸内に接種することが好ましく、肺内に接種することが最も好ましい。本発明の免疫アジュバント分散液を、経鼻接種及び経口接種する場合、キトサン微粒子の濃度は０．５〜５％が好ましい。また、経肺接種の場合、０．１〜３％が好ましい。
【００３６】
また、本発明の免疫アジュバント分散液を、経鼻接種及び経口接種する場合、キトサン微粒子の粒子径は、３μｍ〜１０μｍであることが好ましい。粒子径が１０μｍより大きい場合、粒子の表面積は相対的に少なく、アジュバントとしての効果が不十分であり、３μｍ未満とすると製造コストが高くなり不経済である。一方、経肺接種の場合、粒子径が１μｍ〜４μｍであることが好ましい。粒子径が４μｍより大きい場合、噴霧器シリンジの内部に目詰まりが起こる恐れがある。１μｍ未満とすると製造コストが高くなり、不経済である。
【００３７】
本発明の免疫アジュバント及びその分散液を接種できる動物は、特に制限されず、例として、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜類、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、鳥などの愛玩動物、ペット類、魚類、海洋生物並びにマウス、サル及びヒトを挙げることができる。
【００３８】
抗体産生能の高い免疫アジュバントの条件としては、まず目的の抗原物質と結合しやすいことが必要である。また、細胞内に取り込まれやすいこと、及び、細胞内で長期間にわたって抗原物質を徐放することが必要である。本発明の免疫アジュバントの作用機序は不明であるが、本発明の免疫アジュバントに使用するキトサン微粒子がこのような条件を満たしているために、少ないワクチン接種量で長期間免疫効果を発揮することができるものと考えられる。
【実施例】
【００３９】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
［実施例１］
（キトサン微粒子の調製）
目開き４ｍｍの篩を通過させた粗砕カニ殻１部を水３０部に分散させておき、これに塩酸１部を加え、３０℃で６時間撹拌し、カニ殻をろ別した。次いで、この処理後のカニ殻を水３０部中に再分散し、ろ別する操作を１０回繰り返し、脱カルシウムカニ殻を得た。次に、この脱カルシウムカニ殻を水３０部中に再分散し、水酸化ナトリウム３部を加え、７０℃に加熱して３時間撹拌した後、キチンをろ別して水３０部中に再分散し、再びろ別する操作を１０回繰り返した。次いで、キチンを５０℃の温風にて２０時間乾燥して原料キチンを得た。
【００４１】
このキチン１００部を水２,０００部に分散し、炭酸ナトリウム２．５部を加えた後、亜臭素酸ナトリウム０．１５部を加え室温で６時間撹拌した。処理後キチンをろ別し、水３０部中に再分散した後、ろ別する。この操作を５回繰り返した後、５０℃の温風で２０時間乾燥後、脱アセチル化してキトサンとした。
【００４２】
このキトサンをハンマーミルで粉砕後、目開き４００μｍの篩を通過させ、さらにボールミルにて４８時間粉砕し、さらにジェットミルで粉砕してキトサン微粒子を得た。このキトサン微粒子は、粒度分布の中心が４．５μｍであり、１０μｍ以下の微粒子が１００％であった。このキトサンの１％の溶液粘度を測定したところ、４ｍＰａ・ｓであった。また、このキトサン微粒子の脱アセチル化度は８７％であった。なお、キトサン微粒子の粒子径は、電子顕微鏡（日立製作所製高分解能走査電子顕微鏡Ｓ−５２００型）による実測値である。
【００４３】
（マウスへのＯＶＡ抗原の免疫）
上記キトサン微粒子１部に精製水９９部を加え、１％キトサン微粒子分散液を得た。当該分散液５部に対して０．２５％ＯＶＡ（卵白由来アルブミン）水溶液２部を加え、塩酸と水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０に調製し、キトサン微粒子−ＯＶＡ混合液を得た。
当該混合液７μＬを、ジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経鼻接種した。この経鼻接種の日から１週間ごとに計３回、同様に上記混合液７μＬを経鼻接種した。この３回目の経鼻接種の日を第０週として、その後週に一度、以下の要領で血液、便及び膣洗浄液を得た。また、ブースター効果を確認するために、上記３回目の経鼻接種の日から２〜３ヶ月の後、同様に４回目の経鼻接種を行った。
【００４４】
血液：ジエチルエーテルで麻酔後、尾静脈から採血した。
便：各個体を樹脂製ケージ中に数分間放置し、便をエッペンドルフチューブに回収した。
膣洗浄液：１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）５０μＬを膣中でピペッティングした。この作業を２回行い、膣洗浄液を得た。
【００４５】
（サンプルの調製）
上記手順により得た血液、便及び膣洗浄液を以下のように処理し、抗体価測定のためのサンプルを調製した。
血清サンプル：室温にて、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、その上清を再度同じ条件で遠心分離して得た上清を血清サンプルとした。当該血清サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
便サンプル：上記便を４℃にて１％ＢＳＡ溶液中に分散し、この分散液を４℃にて１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離して、その上清を便サンプルとした。当該便サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
膣洗浄液サンプル：上記膣洗浄液を室温にて、１５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、その上清を膣洗浄液サンプルとした。当該サンプルは、使用するまで−３０℃で冷凍保存した。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法を用いて、各サンプルについてＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価を測定した。当該測定は以下の手順で行った。
（ＩｇＧ抗体価の測定）
ＯＶＡ抗原（生化学工業株式会社製）をコーティングバッファー（精製水１ＬにＮａ2ＣＯ3：１．６ｇ、ＮａＨＣＯ3：２．８２ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．０）で５μｇ／ｍＬに希釈し、この溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Costar3690 A/2、コーニング社）に１穴あたり５０μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して、抗原を吸着（コーティング）させた。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
【００４７】
上記コーティング終了後、コーティングバッファーを廃棄し、次いでＥＬＩＳＡプレートにブロッキングバッファー（精製水１Ｌに１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ、アルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：１０ｇ、ＮａＮ3：１ｇを含む）を１穴あたり１００μＬずつ分注し、１時間放置した。
ＥＬＩＳＡプレートとは別にＵ底プレートを用意し、上記各サンプルを２6〜２15倍に希釈した１０段階の２倍希釈系列を調製した。希釈にはブロッキングバッファーを用い、最終希釈測定法（エンド・ポイント・ダイリューション法）を行った。
【００４８】
上記ブロッキング終了後、ＥＬＩＳＡプレートからブロッキングバッファーを廃棄し、Ｕ底プレートで調製したサンプルを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
なお、陽性コントロールとしては、単クローン抗体抗鶏卵アルブミン（MONOCLONAL ANTI-CHICKEN EGG ALBUMIN CLONE OVA）（ＳＩＧＭＡ社）を１万〜５１２万倍に希釈した１０段階の２倍希釈系列を用いた。また、陰性コントロールとしては、ＯＶＡ抗原を免疫していないマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで希釈して調製した２6〜２15の１０段階の２倍希釈系列を用いた。
【００４９】
インキュベートの際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後サンプル液を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機（バイオテック社、MW-96F）を用いて、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５０】
２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）で１，０００倍希釈し、これを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５１】
３次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）で２，０００倍希釈し、これを１穴あたり５０μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり２００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００５２】
フォスファターゼ用発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＫＰＬ社）の１粒を発色基質用緩衝液（精製水１Ｌにジエタノールアミン：０．９７ｍＬ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．１ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．８）５ｍＬに溶解して発色液を調製し、この発色液を１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、反応停止液として１Ｎ  ＮａＯＨを１穴あたり５０μＬずつ分注して反応を止め、波長４０５ｎｍ及び６３０ｎｍ（主波長４０５ｎｍ、副波長６３０ｎｍ）で各穴の吸光度を測定した。なお、吸光度の測定には、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダー  Multiskan EX（Thermo Labsystems社）を使用した。
【００５３】
吸光度の測定値から、陰性コントロールの吸光度平均値とその標準偏差（ＳＤ）を求めた。次いで、サンプルの吸光度を希釈率に対してプロットして標準曲線を作成し、陰性コントロールの吸光度平均値＋２ＳＤの標準曲線との交点を求め、この交点の２の乗数をＩｇＧ抗体価として得た。３回目の経鼻接種の日を第０週として、経鼻接種の日からの時間経過に対してプロットした血清サンプルのＩｇＧ抗体価を図１中に◆で示す。
【００５４】
（ＩｇＡ抗体価の測定）
ＯＶＡ抗原（生化学工業株式会社製）をコーティングバッファー（精製水１ＬにＮａ2ＣＯ3：１．６ｇ、ＮａＨＣＯ3：２．８２ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．０）で５μｇ／ｍＬに希釈し、この溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（SUMILON ELISAプレートＳ  MS-8496F、住友ベークライト株式会社）に１穴あたり１００μＬずつ分注し、４℃で一晩静置して、抗原を吸着させた。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
【００５５】
上記コーティング終了後、コーティングバッファーを廃棄し、次いで当該ＥＬＩＳＡプレートにブロッキングバッファー（精製水１Ｌに１０×ダルベッコＰＢＳ：１００ｍＬ、アルブミン（Ｆｒ．Ｖ）：５０ｇ、ＮａＮ3：１ｇを含む）を１穴あたり２００μＬずつ分注し、１時間放置した。
【００５６】
ＥＬＩＳＡプレートとは別にＵ底プレートを用意し、各サンプルについて５倍及び１０倍の希釈液を調製した。希釈にはブロッキングバッファーを使用した。
【００５７】
インキュベーション終了後、ＥＬＩＳＡプレートからブロッキングバッファーを廃棄し、Ｕ底プレートで調製したサンプルを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートの際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。
【００５８】
なお、陽性コントロールとしては、コレラ毒素（以下、ＣＴと略す）−ＯＶＡ混合液（１×ＰＢＳ緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＴ溶液１部に対して０．２５％ＯＶＡ水溶液２部を加え、ピペッティングにより十分に混合して調製したもの）を多量に接種してＩｇＡ抗体を産生させたマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで５倍及び１０倍希釈したものを用いた。また、陰性コントロールとしては、ＯＶＡ抗原を免疫していないマウスから、上記と同様にして調製した血清サンプルをブロッキングバッファーで５倍及び１０倍希釈したものを用いた。
【００５９】
インキュベーション終了後、サンプル液を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機（バイオテック社、ＭＷ−９６Ｆ）を用いて、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６０】
２次抗体として、ビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＡ（ＫＰＬ社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）で１，０００倍希釈し、これを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベーション終了後溶液を廃棄し、洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６１】
３次抗体として、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（インビトロジェン社）を希釈液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）で２，０００倍希釈し、これを１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にはプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、ＥＬＩＳＡプレートから溶液を廃棄し、次いで洗浄液（１×ＰＢＳ、０．２％Tween20）を１穴あたり４００μＬ分注後、廃棄することを４回繰り返してプレートを洗浄した。
【００６２】
フォスファターゼ用発色基質ｐ−ニトロフェニルリン酸（ＫＰＬ社）の１粒を発色基質用緩衝液（精製水１Ｌにジエタノールアミン：０．９７ｍＬ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：０．１ｇ、ＮａＮ3：０．１ｇを含む；ｐＨ９．８）５ｍＬに溶解して発色液を調製し、この発色液を１穴あたり１００μＬずつ分注して３７℃で１時間インキュベートした。この際、プレート表面にプレートシールを貼って溶液の乾燥を防いだ。インキュベート終了後、反応停止液として１Ｎ  ＮａＯＨを１穴あたり５０μＬずつ分注して反応を止め、波長４０５ｎｍ及び６３０ｎｍで各穴の吸光度を測定した。なお、吸光度の測定には、ＥＬＩＳＡ用プレートリーダー  Multiskan EX（Thermo Labsystems社）を使用した。
５倍及び１０倍希釈したサンプルの吸光度の各平均値をＩｇＡ抗体価として得た。３回目の経鼻接種の日を第０週として、経鼻接種の日からの時間経過に対してプロットした血清サンプルのＩｇＡ抗体価を図２中に◆で示す。
【００６３】
［比較例１］
実施例１で用いたキトサン微粒子に代えて、粘膜免疫アジュバントとして定評のある、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例１と同様の実験を行った。すなわち、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を、実施例１と同様にして調製し、当該混合液３μＬを、実施例１と同様にジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経鼻接種し、血液、便及び膣洗浄液を得てサンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。
【００６４】
実施例１と同様にして得た血清サンプルのＩｇＧ抗体価及びＩｇＡ抗体価を、それぞれ図１及び図２に△で示す。
図１及び図２から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。この血清サンプルについての結果と同様に、便サンプル、膣洗浄液サンプルについても、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。
【００６５】
［実施例２］
実施例１と同様にして調製したキトサン−ＯＶＡ混合液７μＬを、ジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス(Polymeric immunoglobulin receptor knockout mice)５匹に経鼻接種し、実施例１と同様の手順及び方法で血液を得て血清サンプルを調製した。ＩｇＡ抗体価の測定において血清サンプルを１００倍及び２００倍に希釈して用いたこと以外は、実施例１と同様の手順及び方法でＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。ＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図３及び図４中に◆で示す。
【００６６】
［比較例２］
実施例２で用いたキトサン微粒子に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例２と同様の実験を行った。すなわち、比較例１と同様にして調製したＣＴ−ＯＶＡ混合液３μＬを、実施例２と同様にジエチルエーテルで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に経鼻接種し、実施例２と同様の手順及び方法で血液を得て血清サンプルを調整し、ＥＬＩＳＡ法を用いてＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。ＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図３及び図４中に△で示す。
【００６７】
図３及び図４から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。
【００６８】
［実施例３］
実施例１と同様にして１％キトサン微粒子分散液を調製し、当該分散液５部に対して０．２５％ＯＶＡ水溶液２部及び１×ＰＢＳ１８部を加え、ピペッティングにより十分に混合し、キトサン−ＯＶＡ混合液を得た。当該混合液２５μＬを、５ｍｇ／ｍＬネンブタール（マウス体重１ｇあたり、約０．０１ｍＬ使用）腹腔内注射で麻酔した６週齢、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経肺接種した。なお、肺への接種の噴霧器としてはPENNCENTURY社製、モデル１Ａ−１Ｃを使用した。
【００６９】
この経肺接種の日から１週間ごとに計３回、同様に上記混合液の経肺接種を行った。この３回目の経肺接種の日を第０週として、その後、実施例１と同様の手順及び方法により、週に一度、血液、便及び膣洗浄液を得てサンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。また、ブースター効果を確認するために、上記３回目の経肺接種の日から２〜３ヶ月の後、同様に４回目の経肺接種を行った。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図５及び図６中に◆で示す。
【００７０】
［比較例３］
実施例３で用いたキトサン微粒子に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例３と同様の実験を行った。すなわち、１×ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに調製したＣＴ溶液１部に対して０．２５％ＯＶＡ溶液２部を加え、さらに１×ＰＢＳを２２部加えて希釈し、ピペッティングにより十分に混合した。このＣＴ−ＯＶＡ混合液２５μＬを実施例３と同様に雌のＢＡＬＢ／ｃマウス５匹に経肺接種した。その後、実施例３と同様の手順及び方法で経肺接種、サンプル調製をし、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。血液サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図５及び図６に△で示す。
【００７１】
図５及び図６から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。この血清サンプルについての結果と同様に、便サンプル及び膣洗浄液サンプルについても、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。
【００７２】
［実施例４］
実施例３と同様の手順及び方法でキトサン−ＯＶＡ混合液を調製した。当該混合液２５μＬを、５ｍｇ／ｍＬネンブタール（マウス体重１ｇあたり、約０．０１ｍＬ使用）腹腔内注射で麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に経肺接種した。なお、肺への接種は実施例３と同様にして行った。
【００７３】
実施例３と同様の手順及び方法により、この経肺接種の日から１週間ごとに計３回、上記混合液の経肺接種を行った。この３回目の経肺接種の日を第０週としてその後、実施例３と同様の手順及び方法により、週に一度、血液を得て血清サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。また、ブースター効果を確認するために、３回目の経肺接種の日から２〜３ヶ月の後、４回目の経肺接種を行った。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図７及び図８に◆で示す。
【００７４】
［比較例４］
実施例４で用いたキトサン微粒子に代えて、コレラ毒素（ＣＴ）を用いて実施例４と同様の実験を行った。すなわち、比較例３と同様にして調製したＣＴ−ＯＶＡ混合液２５μＬを、実施例４と同様にネンブタールで麻酔した６週齢、雌の多量体免疫グロブリンレセプターノックアウトマウス５匹に計４回経肺接種した。実施例４と同様の手順及び方法により、週に一度、血清サンプルを調製し、ＥＬＩＳＡ法によりＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価を求めた。血清サンプルについて求めたＩｇＧ及びＩｇＡの抗体価をそれぞれ図７及び図８中に△で示す。
【００７５】
図７及び図８から、ＣＴ−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスよりも、キトサン−ＯＶＡ混合液を用いて免疫したマウスの方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いことが明らかとなった。
【００７６】
全ての実施例において、ＯＶＡの免疫アジュバントとしてコレラ毒素を使用した比較例よりも、キトサン微粒子分散液を使用した実施例の方が、ＯＶＡに対する抗体価が有意に高いという結果を示した。また、図中１４週目の抗体価が高まっていることから４回目の免疫を行うことにより、急激に抗体産生能が高まるブースター効果が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明によれば、生体への安全性が高く、全身系免疫に関わるＩｇＧのみならず、粘膜などで局所的に感染防御に関わり、抗ウイルス作用を有する分泌型ＩｇＡの産生能に優れた免疫アジュバント、免疫アジュバント分散液及び当該分散液の接種方法が提供される。本発明の免疫アジュバント分散液を本発明の接種方法で粘膜に接種することにより、接種部位に局所的に免疫を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図２】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図３】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図４】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図５】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図６】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図７】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＧ抗体価の比較を示すグラフである。
【図８】キトサン微粒子とＣＴを免疫アジュバントとして用いた場合のＩｇＡ抗体価の比較を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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