(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の特徴を有する全長１５ｋｂ以内のコスミドベクター
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子を含む；
３）ＩｎｃＰプラスミドのｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｏｒｉＴ）を含む；
４）ＩｎｃＰプラスミドのｉｎｃＣ１遺伝子を含む；
５）ラムダファージのｃｏｓ部位を含み、かつ該ｃｏｓ部位はＴ−ＤＮＡの外側に位置する；
６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；
７）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列を含む；
８）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列を含む；
９）７）と８）の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子を含む；そして
１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位を含む。
【請求項２】
植物形質転換用選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子からなるグループから選択される、請求項１記載のコスミドベクター。
【請求項３】
ＩｎｃＰプラスミドのｋｏｒＢ遺伝子を含む、請求項１又は２に記載のコスミドベクター。
【請求項４】
以下の：
配列番号２の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０若しくは配列番号２の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；
配列番号３の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨ若しくは配列番号３の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；
配列番号４の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ｂａｒ若しくは配列番号４の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；
配列番号５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＢ若しくは配列番号５の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；
配列番号６５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ若しくは配列番号６５の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；
配列番号６６の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ若しくは配列番号６６の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；及び
配列番号７の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１若しくは配列番号７の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
からなるグループから選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のコスミドベクター。
【請求項５】
以下の：
配列番号２の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０；
配列番号３の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨ；
配列番号４の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ｂａｒ；
配列番号５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＢ；
配列番号６５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ；
配列番号６６の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ；及び
配列番号７の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１
からなるグループから選択される、請求項４に記載のコスミドベクター。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入された発現ベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。
【請求項７】
導入されている核酸断片のサイズが２５〜４０ｋｂである、請求項６に記載の形質転換方法。
【請求項８】
植物の形質転換において、以下の要素を含むアグロバクテリウム属細菌を用いることを特徴とする、請求項６または７に記載の形質転換方法；
１ａ）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を導入したベクター；あるいは
１ｂ）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、アグロバクテリウム属細菌の細胞中においてＩｎｃＰプラスミドと共存可能なプラスミドであって、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミド、
並びに
２）アグロバクテリウム属細菌のＴｉプラスミド、もしくは、Ｒｉプラスミド。
【請求項９】
１ａ）または１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子が、ｖｉｒＧＮ５４Ｄである、請求項８記載の形質転換方法。
【請求項１０】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含む、請求項８記載の形質転換方法。
【請求項１１】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、図１４に示した構造を有するｐＶＧＷ、または図１５に示した構造を有するｐＶＧＷ２である、請求項１０記載の形質転換方法。
【請求項１２】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、さらに、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＢ遺伝子を含む、請求項８記載の形質転換方法。
【請求項１３】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含む、請求項１２記載の形質転換方法。
【請求項１４】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ｐＴＯＫ４７である、請求項１３記載の形質転換方法。
【請求項１５】
下記の工程を含むことを特徴とする、マップベースクローニングの方法
１）植物の表現型に関与する候補遺伝子を含むＢＡＣクローンを、制限酵素により部分分解または完全分解し；
２）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターを用いて、工程１）で得られたＤＮＡ断片をサブクローン化して、ライブラリーを構築し；そして
３）ライブラリーを構成するクローンを、個別に、植物に導入し、形質転換植物の表現型を評価する。
【請求項１６】
工程１）で得られたＤＮＡ断片のサイズが２５〜４０ｋｂである、請求項１５に記載のマップベースクローニングの方法。
【請求項１７】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターおよび下記１）〜４）の特徴を有するプラスミドベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換することを含む、植物の形質転換方法；
１）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要な因子を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子を含む；
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；そして
４）アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含む。
【請求項１８】
１）〜４）の特徴を有するプラスミドベクターの全長が１０ｋｂ以内である、請求項１７に記載の形質転換方法。
【請求項１９】
４）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子がｖｉｒＧＮ５４Ｄである、請求項１８記載の形質転換方法。
【請求項２０】
１）〜４）の特徴を有するプラスミドベクターが、以下の：
配列番号８に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ若しくは配列番号８の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列；及び
配列番号６７に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ２若しくは配列番号６７の塩基配列と少なくとも９５％の同一性を有する塩基配列
からなるグループから選択される、請求項１７ないし１９のいずれか１項に記載の形質転換方法。
【請求項２１】
１）〜４）の特徴を有するプラスミドベクターが、配列番号８に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷである、請求項２０に記載の形質転換方法。
【請求項２２】
１）〜４）の特徴を有するプラスミドベクターが、配列番号６７に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ２である、請求項２０に記載の形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物形質転換用の新規コスミドベクター、並びにその利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より植物の形質転換を目的とした様々なベクターの開発が行われてきた。【０００３】
近年、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）やイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の全ゲノム配列が解明され、植物ゲノムの研究の焦点は、塩基配列情報の蓄積から遺伝子機能の解明に移行してきた。遺伝子機能の解明においては、クローン化されたＤＮＡを植物に導入し、その表現型の変化を解析する実験が必須である。その際、大きなサイズのＤＮＡを導入することができれば、研究の効率が飛躍的に向上する。【０００４】
そのため、大断片のＤＮＡを植物へ導入することを目指した多くのベクターが開発された。代表的なものとして、ｐＯＣＡ１８（Olszewski et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 10765-10782)や、pLZO3 (Lazo et al., 1991, Bio/Technology 9: 963-967)のような、植物形質転換用のコスミドベクターが作成された。コスミドを使う利点は、λ（ラムダ）ファージ由来のパッケージング反応を利用できる点にあり、これにより比較的大きなゲノム断片を容易にクローニングすることが可能である（Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edn . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.）。コスミドベクターとパッケージング反応を利用するクローニングでは、ベクターと挿入断片の合計が４０ｋｂ〜５０ｋｂとなるため、ベクターの大きさにより、挿入断片の大きさは一定の範囲内に制限され、かつ、ベクターと挿入断片の大きさは逆相関の関係にある。【０００５】
ｐＯＣＡ１８やｐＬＺＯ３は、大腸菌およびアグロバクテリウムの双方で機能するＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を有する代表的なベクターｐＲＫ２９０（Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351）に、Ｔ−ＤＮＡのボーダー配列や選抜マーカー（カナマイシン耐性遺伝子）等の植物形質転換用の因子を組み込んだベクターである。これらのベクターは、ベクター自体のサイズが２４．３〜３０．１ｋｂであるため、パッケージング反応を利用してクローン化できるＤＮＡのサイズも平均で２０ｋｂ程度（ｐＯＣＡ１８）、あるいは１３〜２２ｋｂ（ｐＬＺＯ３）程度であった。これらのベクターは、ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を持つが、ｐＣＩＴ１０３、ｐＣＩＴ１０４などのベクター（Ma et al. 1992 Gene 117: 161-167）は、ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）に加えて、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を保有しているベクターである。また、ｐＣ２２（Simoens et al. 1986 Nucleic Acids Res 14: 8073-8090）は、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点とＲｉプラスミド由来の複製開始点を有するベクターである。これらの他に植物形質転換可能なコスミドベクターとして、ｐＭＯＮ５６５（Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287）、やｐＣＬＤ０４５４１（Bent et al. 1994 Science 265: 1856-1860）があるが、ベクター自身のサイズがそれぞれ、２４ｋｂ、２９ｋｂであり、２５ｋｂ以上のＤＮＡ断片のクローニングには適していない。さらに、ｐＥ４ｃｏｓ（１６ｋｂ、Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287）や、ｐＭＯＮ５６５、ｐＬＺ０３、ｐＯＣＡ１８、ｐＣＬＤ０４５４１、ｐＣ２２などは、ｃｏｓ部位がＴ−ＤＮＡ中にある構造であった。【０００６】
その後、１５０ｋｂ程度までのＤＮＡ断片をクローニングし、植物へ導入できるベクターとして、ＢＩＢＡＣベクター（ｂｉｎａｒｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  米国特許第５７３３７４４号、Hamilton et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9975-9979、Hamilton, 1997, Gene 200:107-116）が開発された。これは、巨大なＤＮＡ断片を保持できるＢＡＣベクターに、Ｔ−ＤＮＡのボーダー配列や選抜マーカー等の植物形質転換用の因子と、アグロバクテリウム用複製開始点を組み込んだものである。また、８０ｋｂ程度までのＤＮＡをクローニングし、植物へ導入できるベクターとして、ＴＡＣベクター（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ−  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、ｐＹＬＴＡＣ７（Liu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6535-6540.）が開発された。これは、Ｐ１ファージの複製機構を利用した大容量のＰＡＣベクター（Ｐ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に、Ｔ−ＤＮＡのボーダー配列や選抜マーカー等の植物形質転換用の因子と、アグロバクテリウム用複製開始点を組み込んだものである。これらのベクターには、巨大外来遺伝子を安定して保持することを目的として、大腸菌やアグロバクテリウムにおいて、細胞当たり単一コピーで存在するプラスミドに由来する複製開始点（ｏｒｉ）が組み込まれている。すなわち、大腸菌用ｏｒｉとして、Ｆ因子のｏｒｉ（ＢＩＢＡＣ）やＰ１ファージのｏｒｉ（ＴＡＣ）が、アグロバクテリウム用のｏｒｉとして、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉ  ｏｒｉ（ＢＩＢＡＣ、ＴＡＣともに）が使用されている。ただし、単一コピープラスミドの複製開始点の利用は、必ずしも必須ではなく、細胞あたり数コピーといわれるＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を有するベクターｐＳＬＪ１７１１や、ｐＣＬＤ０４５４１が、１００ｋｂを越えるサイズの植物ゲノムＤＮＡ断片を、安定して保持できることが報告されている（Tao and Zhang(1998)Nucleic Acids Res 26: 4901-4909）。また、これらの他に、汎用バイナリープラスミドベクターｐＢＩ１２１に、Ｒｉ  ｏｒｉを導入したｐＢＩＧＲＺが報告されている（特開平１０−１５５４８５）。【０００７】
しかし、このようなベクターは、５０ｋｂをはるかに超える大きなＤＮＡ断片をクローニングすることはできるものの、そのクローニング操作は煩雑である。大きなＤＮＡをクローニングするためには、熟練した技術と、相当の時間と労力が必要である。ＢＩＢＡＣを利用した形質転換には、ｖｉｒＧなどを過剰発現した特別なアグロバクテリウムが必要である上、１５０ｋｂの断片の形質転換効率（選抜カルス数／接種葉切片）も、通常の小型のベクターを利用した場合とくらべ著しく低い（Hamiltin et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93: 9975-9979，  Shibata and Liu, 2000, Trend Plant Sci 5: 354-357）。そのため、ＢＩＢＡＣやＴＡＣによる大断片の植物形質転換は、ある特定の少数の大断片の例にとどまっている（例えば、Hamiltin et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93: 9975-9979，  Liu et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96: 6535-6540，  Lin et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 5962-5967，  Nakano et al., 2005, Mol Gen Genomics 273: 123-129）。【０００８】
なお、上述のようにｐＣＬＤ０４５４１はコスミドでもあり、その大きさが２９ｋｂであるので、λファージ由来のパッケージング反応を利用する場合は、クローン化できるＤＮＡ断片の大きさは、１０〜２０ｋｂである。上述のように、これ以上に大きなＤＮＡ断片をクローニングするには、パッケージング反応は利用できないため、クローニング操作は煩雑であり、相当の時間と労力を要するのである。【０００９】
近年、高等植物のゲノム研究の進展とともに、ＤＮＡ配列の多型に基づく遺伝学的マーカー、いわゆるＤＮＡマーカーの利用が進んでいる。表現型のみが知られている高等植物の未知の遺伝子を、ＤＮＡマーカー利用の遺伝地図情報に基づき、クローン化する、いわゆる、マップベースクローニングが盛んに試みられるようになってきた。一般に、マップベースクローニングの基本フローは以下のとおりである。【００１０】
１．比較的小規模な分離集団を用い、汎用性の高いＤＮＡマーカーを用いて、大まかなマッピングを行い、染色体上の候補領域を探索する。【００１１】
２．大規模な分離集団を用い、候補領域内に、新たに設計したＤＮＡマーカーを用いて、遺伝子領域を絞り込む。【００１２】
３．遺伝子領域の塩基配列を決定し、候補遺伝子を推定する。【００１３】
４．候補遺伝子を含むＤＮＡ断片を植物に導入し、表現型に基づき、遺伝子の効果・機能を確認する。【００１４】
これまでの多くの成功例では、３．の工程において、１〜３個程度に遺伝子にまで絞込み、４．の工程では、数ｋｂ以内のＤＮＡ断片を数個導入している場合が多い。しかしながら、狭い遺伝子領域にまで絞り込むことは、必ずしも容易ではない。たとえば、動原体に近い染色体領域では、交配後の遺伝子組み換え頻度が低いため、１５０ｋｂ以下には絞り込めない場合が多い。また、絞込みが可能な場合でも、２．の工程を繰り返し実施しなければならない場合も多く、多大な時間を要する。また、５０ｋｂ程度にまで絞り込むことができた場合でも、３．の工程において、表現型に関する情報と、遺伝子配列の情報とを、関連付ける有力な情報がない場合には、候補遺伝子の推定は極めて困難である。【００１５】
このように、マップベースクローニングでは、ある程度の絞込み（５０ｋｂ〜数百ｋｂ）を行い、候補領域として、１個ないし数個の、ＢＡＣベクターによってクローン化されたＤＮＡ断片を特定するところまでは比較的容易であるが、さらに解析を進めて、実際に遺伝子を同定することは、技術的に困難な場合も多く、可能な場合にも多大な労力と時間を要することが多い。
【特許文献１】米国特許第５７３３７４４号
【特許文献２】特開平１０−１５５４８５
【特許文献３】ＷＯ２００５／０４０３７４
【非特許文献１】Olszewski et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 10765-10782
【非特許文献２】Lazo et al., 1991, Bio/Technology 9: 963-967
【非特許文献３】Ditta et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351
【非特許文献４】Ma et al. 1992 Gene 117: 161-167
【非特許文献５】Simoens et al. 1986 Nucleic Acids Res 14: 8073-8090
【非特許文献６】Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287
【非特許文献７】Bent et al. 1994 Science 265: 1856-1860
【非特許文献８】Hamilton et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9975-9979、
【非特許文献９】Hamilton, 1997, Gene 200:107-116
【非特許文献１０】Liu et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6535-6540
【非特許文献１１】Tao and Zhang, 1998, Nucleic Acids Res 26: 4901-4909
【非特許文献１２】Shibata and Liu, 2000, Trend Plant Sci 5: 354-357
【非特許文献１３】Lin et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 5962-5967，
【非特許文献１４】Nakano et al., 2005, Mol Gen Genomics 273: 123-129
【非特許文献１５】Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663
【非特許文献１６】Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54
【非特許文献１７】Komari et al. 1996  Plant J 10:165-174
【非特許文献１８】Zambryski et al. 1980 Science 209: 1385-1391
【非特許文献１９】Schmidhauser and Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455, 1985
【非特許文献２０】Winans et al. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282
【非特許文献２１】Pazour et al. 1992 J.Bac 174:4169-4174
【非特許文献２２】Ward et al. (1988) J Biol Chem 263: 5804-5814
【非特許文献２３】Frame et al. 2002 Plant Physiol 129: 13-22
【非特許文献２４】Hansen et al. 1994 ProNAS 91:7603-7607
【非特許文献２５】Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50
【非特許文献２６】Close et al. 1984 Plasmid 12: 111-118
【非特許文献２７】Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425
【非特許文献２８】Wang et al. 2000 Gene 242: 105-114
【非特許文献２９】Okumura and Kado (1992) Mol Gen Genet 235: 55-63
【非特許文献３０】Christensen et al. 1992 Plant Mol Biol 18: 675-689
【非特許文献３１】Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250
【非特許文献３２】Hirsch and Beringer 1984 Plasmid 12: 139-141
【非特許文献３３】Konieczny and Ausubel 1993 Plant Journal 4: 403-410
【非特許文献３４】Hiei et al. (1994) Plant J 6: 271-282
【非特許文献３５】Ishida et al. (2003) Plant Biotechnology 20:57-66
【非特許文献３６】Hiei and Komari (2006) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85: 271-283
【非特許文献３７】Komori et al. (2004) Plant J 37: 315-325
【非特許文献３８】Kazama and Toriyama (2003) FEBS lett 544: 99-102
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＷＯ２００５／０４０３７４（本明細書中にその全内容が援用される）は、ヘテロシスにおいて発現が認められる形質や量的形質を向上させることのできる、多数のゲノムＤＮＡ断片を効率良く選抜し、クローン化されたＤＮＡ断片として選抜し、調製する方法を開示している。本発明者らは、ＷＯ２００５／０４０３７４に記載の方法を用いて、農業上有益な変異をもたらすことのできる、サイズの大きいゲノムＤＮＡ断片の選抜を行っていた。しかし、大腸菌に保持されているクローンをアグロバクテリウムに移す操作については、８０％程度の成功率であった。さらに、クローンを保持したアグロバクテリウムを用いた植物を形質転換した結果、形質転換植物を得ることができたアグロバクテリウム菌株は６０％程度であった。この結果を検討し、本発明者らは、使用するベクターを変更することにより、ＷＯ２００５／０４０３７４の方法の効率が大きく改善されるか、検討した。しかし、現在までに知られているベクターではこの方法の効率を改善することはできなかった。【００１７】
従って、本発明の課題は、例えばＷＯ２００５／０４０３７４に記載されている方法において、比較的大きなゲノムＤＮＡ断片を選抜し、クローニングする効率を改善する、新規なベクターを提供することである。【００１８】
また、本発明の課題は、好ましくは
・２５〜４０ｋｂ程度の大きさのＤＮＡ断片を、効率よくクローン化できる；
・大腸菌、および、アグロバクテリウム細胞中で、安定的に保持される；
・アグロバクテリウムに、効率よく導入することができる；
・大腸菌、及び、アグロバクテリウムにおける細胞当りのコピー数が、４〜５となる；
・クローン化した目的のＤＮＡ断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導入することができる。
のすべての条件を満たすベクターを提供することである。【００１９】
さらに、本発明は、このようなベクターを用いて、極めて高い効率で植物に遺伝子導入を行うための遺伝子導入法を提供する。【００２０】
また、本発明は、このようなベクターを用いて、マップベースクローニングを容易にかつ短時間で完了するための遺伝子領域の絞り込みを、迅速に行う手法を提供することである。【００２１】
さらに、本発明は、上記ベクターと共存させることにより、形質転換効率を更に向上させることができるプラスミドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
コスミドベクター
本発明のコスミドベクターは、以下の条件をすべて満たす全長１５ｋｂ以内のベクター（以下「ｐＬＣベクター」という。）である。【００２３】
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子を含む；
３）ＩｎｃＰプラスミドのｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｏｒｉＴ）を含む；
４）ＩｎｃＰプラスミドのｉｎｃＣ１遺伝子を含む；
５）ラムダファージのｃｏｓ部位を含み、かつ該ｃｏｓ部位はＴ−ＤＮＡの外側に位置する；
６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；
７）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列を含む；
８）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列を含む；そして
９）７）と８）の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子を含む。；そして
１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位を含む。【００２４】
本発明のベクターは、ラムダファージのｃｏｓ部位を含むコスミドベクターである。そのため、パッケージング反応により、比較的大きなゲノム断片をクローニングすることができる（Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edn . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.）。コスミドベクターのパッケージング反応を利用するクローニングでは、ベクターと挿入断片の合計が４０ｋｂ〜５０ｋｂ程度となるため、ベクターの大きさにより、挿入断片の大きさは一定の範囲内に制限される。本発明のベクターは、２５〜４０ｋｂ、好ましくは３０〜４０ｋｂ程度までの大きさのＤＮＡ断片のクローン化を目的とするため、ベクターの全長は１５ｋｂ以下、好ましくは１２〜１４ｋｂである。【００２５】
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）：ｏｒｉＶは大腸菌およびアグロバクテリウムの双方で機能する。本発明のｏｒｉＶの塩基配列は、ｏｒｉＶの機能、即ち、ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点の機能を有する配列であれば特に限定されない。【００２６】
ｏｒｉＶの分子生物学的諸特性については、Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｌ２７７５８（全長６００９９ｂｐ）の配列の第１２２００〜１２７５０番目の塩基として規定される。これは、配列番号１の第３４５１〜４００２番目の塩基に相当する（ｏｒｉＶのコア配列）。【００２７】
ｏｒｉＶは、ｐＶＫ１０２（Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54）などの、ＩｎｃＰプラスミドから、常法により調整することができる。例えばｏｒｉＶとして、ｐＶＫ１０２からＰＣＲにより増幅した０．９ｋｂのＤＮＡ（配列番号１の第３３４５〜４２４７番目の塩基）が利用可能である。【００２８】
あるいは、上記配列番号１の第３４５１〜４００２番目、より好ましくは、第３３４５〜４２４７番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＶの機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号１の第３４５１〜４００２番目、より好ましくは、第３３４５〜４２４７番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＶ機能を有する核酸も利用することができる。【００２９】
なお、当業者は配列番号１の第３４５１〜４００２番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。  発明者らはＷＯ２００５／０４０３７４に記載の方法を用いた場合において、最終的な形質転換効率が約５０％（８０％×６０％＝４８％）にとどまった原因について様々な観点から検討を行い、クローニングベクターｐＳＢ２００の使用が原因ではないかと考えた。【００３０】
ｐＳＢ２００の複製開始点はＣｏｌＥ１由来であるが、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を持つプラスミドは、大腸菌細胞あたり３０〜４０コピー存在し、比較的多コピーである。Tao and Zhang(1998, Nucleic Acids Res 26: 4901-4909)では、大腸菌が安定的に保持できる外来ＤＮＡは、細胞当たり１２００〜１５００ｋｂと推測している。この前提によれば、ｐＳＢ２００により３０〜４０ｋｂのＤＮＡをクローン化した場合、ベクターのサイズを合わせると、細胞あたり、１２００〜２０００ｋｂのＤＮＡ量となり、上記の値を超えてしまう可能性がある。他に考え得る原因の一つとして、ｐＳＢ２００が、アグロバクテリウム中では、単独では複製されないプラスミドであることが挙げられる。そのため、あらかじめｐＳＢ１というＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を有するベクターをアグロバクテリウムに導入しておき、ｐＳＢ２００とｐＳＢ１の双方に保持されているＤＮＡ配列間での相同組換えを介して、ｐＳＢ２００とｐＳＢ１のｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅを作成する操作を利用して、ｐＳＢ２００をアグロバクテリウムに導入するのである。このような操作の際に、何らかの不都合な現象が起き、ｐＳＢ２００の導入に失敗した場合があることは否定できない。【００３１】
また、逆に、大腸菌ならびにアグロバクテリウム中でのコピー数があまりに少ない場合には、ＤＮＡの分析などが非効率となってしまう。【００３２】
本発明者らは以上のような考察を基に、大腸菌およびアグロバクテリウムの双方で機能し、かつ、これらの細菌中では４〜５コピーとなる、ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を持ち、他種のプラスミドの複製開始点を含まないベクターを作製し、供試した。その結果、上記ベクターの使用により、植物の形質転換方法において、具体的には例えばＷＯ２００５／０４０３７４に記載の方法において、形質転換効率が向上することを見出し、本発明を想到した。【００３３】
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子：ｔｒｆＡ１遺伝子は、ＩｎｃＰプラスミドのｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒとして重要であり、ｏｒｉＶ  がその機能を果たすために必要な遺伝子である。本発明のｔｒｆＡ１遺伝子の塩基配列は、ｔｒｆＡ１の機能、即ち、相互複製因子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の機能を有する配列であれば、特に限定されない。【００３４】
分子生物学的諸特性については、Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663に詳細に記載されており、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｌ２７７５８（全長６００９９ｂｐ）の配列の第１６５２１〜１７６６９番目の塩基として規定される。これは、配列番号１の第６３２３−７４７１番目の塩基に相当する（ｔｒｆＡ１のコア配列）。【００３５】
ＴｒｆＡ１はｐＶＫ１０２（Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54）などの、ＩｎｃＰプラスミドから、常法により調整することができる。例えばｔｒｆＡ１遺伝子として、ｐＶＫ１０２からＰＣＲにより増幅した３．２ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号１の第５３４１〜８５０７番目の塩基）が利用可能である。【００３６】
あるいは、上記配列番号１の第６３２３−７４７１番目、より好ましくは、第５３４１〜８５０７番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｔｒｆＡ１遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号１の第６３２３−７４７１番目、より好ましくは、第５３４１〜８５０７番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｔｒｆＡ１遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。【００３７】
なお、当業者は配列番号１の第６３２３−７４７１番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【００３８】
３）ＩｎｃＰプラスミドのｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｏｒｉＴ）：ｏｒｉＴは接合（ｍａｔｉｎｇ）に関わる因子である。本発明のベクターは、大量の形質転換を効率良く行うことが目的の一つであり、そのためには大腸菌とアグロバクテリウムの接合が必要となるが、ｏｒｉＴはこの接合に寄与する。本発明のｏｒｉＴは、ｏｒｉＴの機能、即ち、接合（ｍａｔｉｎｇ）に関わる因子の機能を有する配列であれば特に限定されない。【００３９】
ｏｒｉＴの分子生物学的諸特性については、Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｌ２７７５８（全長６００９９ｂｐ）の配列の第５１０９７〜５１４６３番目の塩基として規定される。ｏｒｉＴは、ｐＶＫ１０２（Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54）などの、ＩｎｃＰプラスミドから、常法により調整することができる。例えばｏｒｉＴとして、ｐＶＫ１０２からＰＣＲにより増幅した０．８ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号１の第１〜８１６番目の塩基）が利用可能である。【００４０】
あるいは、上記配列番号１の第１〜８１６番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＴの機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号１の第１〜８１６番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＴの機能を有する核酸も利用することができる。【００４１】
なお、当業者は配列番号１の第１−８１６番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【００４２】
４）ＩｎｃＰプラスミドのｉｎｃＣ１遺伝子：ｉｎｃＣ１遺伝子はＩｎｃＰプラスミドの安定性に寄与している。本発明のｉｎｃＣ１遺伝子の塩基配列は、ｉｎｃＣ１遺伝子のＩｎｃＰプラスミドの安定性に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されない。【００４３】
この遺伝子の分子生物学的諸特性については、Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663により、詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｌ２７７５８（全長６００９９ｂｐ）の配列の第５８２６０〜５９３５４番目の塩基として規定される。これは、配列番号１の第１１７９〜２２７３番目の塩基に相当する（ｉｎｃＣ１遺伝子のコア配列）。【００４４】
ＩｎｃＣ１は、ｐＶＫ１０２（Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54）などの、ＩｎｃＰプラスミドから、常法により調整することができる。例えばｉｎｃＣ１遺伝子として、ｐＶＫ１０２からＰＣＲにより増幅した２．１ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号１の第８１７〜２９３５番目の塩基）が利用可能である。【００４５】
あるいは、上記配列番号１の第１１７９〜２２７３番目、より好ましくは第８１７〜２９３５番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｉｎｃＣ１遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号１の第１１７９〜２２７３番目、より好ましくは第８１７〜２９３５番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｉｎｃＣ１遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。【００４６】
なお、当業者は配列番号１の第１１７９−２２７３番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【００４７】
５）ラムダファージのｃｏｓ部位：本発明のベクターは、コスミドベクターのパッケージング反応を利用するため、ラムダファージのｃｏｓ部位を有する。本発明のラムダファージのｃｏｓ部位の塩基配列は、ラムダファージのｃｏｓ部位の機能、即ち、コスミドベクターのパッケージング反応に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されない。【００４８】
ラムダファージのｃｏｓ部位の分子生物学的諸特性については、Sambrook J. and Russell D.W. (2001)により、詳細な記載があり、配列は５’−ａｇｇｔｃｇｃｃｇｃｃｃ−３’(配列番号９）である（ラムダファージのｃｏｓ部位のコア配列）。ｃｏｓは例えばｐＳＢ１１（Komari et al. 1996  Plant J 10:165-174）のようなプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、ｐＳＢ１１からＰＣＲにより増幅した０．４ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基）が利用可能である。【００４９】
あるいは、上記配列番号９の塩基配列、より好ましくは配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ラムダファージのｃｏｓ部位の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号９の塩基配列、より好ましくは配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ラムダファージのｃｏｓ部位の機能を有する核酸も利用することができる。【００５０】
またｃｏｓ部位がＴ−ＤＮＡの内側に位置すると、不要なＤＮＡが植物内に導入されることになってしまうため、該ｃｏｓ部位はＴ−ＤＮＡの外側に配置する。【００５１】
６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子は、形質転換用選抜マーカーとして用いられる。この薬剤耐性遺伝子は、例えば抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子であり、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００５２】
７）、８）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列（ＲＢ）および左ボーダー配列（ＬＢ）は形質転換に不可欠であり（Zambryski et al. 1980 Science 209: 1385-1391）、両配列の間に外来遺伝子のクローニング部位が配置される。本発明のＲＢ及びＬＢの塩基配列は、各々アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列（ＲＢ）および左ボーダー配列（ＬＢ）の機能を有するものであれば特に限定されない。それぞれ例えばｐＳＢ１１（Komari et al. 1996 Plant J 10:165-174）などのプラスミドから、常法により調製することができる。それぞれ、配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目の塩基、同第３４７９〜３５０３番目の塩基が利用可能である。【００５３】
あるいは、それぞれ、上記配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目、同第３４７９〜３５０３番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、各々ＲＢ、ＬＢの機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、それぞれ、上記配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目、同第３４７９〜３５０３番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、各々ＲＢ、ＬＢの機能を有する核酸も利用することができる。【００５４】
なお、当業者は配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目、同第３４７９〜３５０３番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【００５５】
９）７）と８）の間に配置される、植物細胞内で発現する植物形質転換用選抜マーカー遺伝子が含まれる。植物形質転換用選抜マーカー遺伝子は、特に限定されず公知の選抜マーカー遺伝子を使用できる。好ましくは、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子のいずれかである。さらに、単子葉植物の形質転換への使用に対しては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子のいずれかが好ましい。【００５６】
１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位が含まれる。外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位は、特に限定されず公知の制限酵素認識部位を使用できるが、配置された認識部位と同じ認識部位が、当該ベクター上の他の部分には存在しないことが望ましい。【００５７】
なお、本発明の本発明のコスミドベクター構築物において、上記１）〜６）の各要素に加え、７）〜１０）のまとまりの、全７つの要素の順序には制限がない。また７）と８）の間に配置される９）と１０）の順序には制限がない。【００５８】
本願発明のコスミドベクターは、好ましくは、以下のＡ−Ｇの１つまたは複数の条件を満たす。【００５９】
Ａ．  １）のｏｒｉＶの塩基配列が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号１の第３４５１〜４００２番目、より好ましくは、第３３４５〜４２４７番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号１の第３４５１〜４００２番目、より好ましくは、第３３４５〜４２４７番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＶの機能を有する塩基配列；あるいは、
ｉｉｉ）配列番号１の第３４５１〜４００２番目、より好ましくは、第３３４５〜４２４７番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＶ機能を有する塩基配列
Ｂ．  ２）のｔｒｆＡ１遺伝子が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号１の第６３２３−７４７１番目、より好ましくは、第５３４１〜８５０７番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号１の第６３２３−７４７１番目、より好ましくは、第５３４１〜８５０７番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｔｒｆＡ１遺伝子の機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号１の第６３２３−７４７１番目、より好ましくは、第５３４１〜８５０７番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｔｒｆＡ１遺伝子の機能を有する塩基配列
Ｃ．  ３）のｏｒｉＴが以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号１の第１〜８１６番目の塩基配列
ｉｉ）配列番号１の第１〜８１６番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＴの機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号１の第１〜８１６番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｏｒｉＴの機能を有する塩基配列
Ｄ．  ４）のｉｎｃＣ１遺伝子が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号１の第１１７９〜２２７３番目、より好ましくは第８１７〜２９３５番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号１の第１１７９〜２２７３番目、より好ましくは第８１７〜２９３５番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ｉｎｃＣ１遺伝子の機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号１の第１１７９〜２２７３番目、より好ましくは第８１７〜２９３５番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｉｎｃＣ１遺伝子の機能を有する塩基配列
Ｅ．  ５）のラムダファージのｃｏｓ部位が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号９の塩基配列、より好ましくは配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号９の塩基配列、より好ましくは配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ラムダファージのｃｏｓ部位の機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号９の塩基配列、より好ましくは配列番号１の第２９３６〜３３４４番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ラムダファージのｃｏｓ部位の機能を有する塩基配列
Ｆ．  ７）のアグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列（ＲＢ）が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ＲＢの機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号２の第１３２５３〜１３２７７番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ＲＢの機能を有する塩基配列
Ｇ．  ８）のアグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列（ＬＢ）が以下の塩基配列を含む
ｉ）配列番号２の第３４７９〜３５０３番目の塩基配列；
ｉｉ）配列番号２の第３４７９〜３５０３番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ＬＢの機能を有する塩基配列；
ｉｉｉ）配列番号２の第３４７９〜３５０３番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ＬＢの機能を有する塩基配列
上述した本発明のコスミドベクターが満たすべき１）〜１０）の条件をすべて満たすことにより、
・２５〜４０ｋｂ、好ましくは３０〜４０ｋｂ程度の大きさのＤＮＡ断片を、効率よくクローン化できる；
・大腸菌、および、アグロバクテリウム細胞中で、安定的に保持される；
・アグロバクテリウムに、効率よく導入することができる；
・大腸菌、及び、アグロバクテリウムにおける細胞当りのコピー数が、４〜５となる；そして
・クローン化した目的のＤＮＡ断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導入することができる。
のすべての課題を満たすベクターを作製することができる。【００６０】
しかし、上記の課題を見出した後であっても、このようなベクターの開発が容易ではなかった。その一因として、プラスミドの複製制御機構が極めて複雑であることがあげられる。具体的には、上記目的に最適なベクターの基本骨格として、ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を有するサイズの小さいプラスミド（１２ｋｂから１５ｋｂ程度）が適している。しかしながら、その基となる６０ｋｂのＩｎｃＰプラスミドは全塩基配列が解読されているものの、プラスミドの複製ならびに細胞分裂の際のｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇに関わる遺伝子が多数あり、その機構は極めて複雑である（Pansegrau et al. J. Mol. Biol. 239:623-663, 1994）。したがって、細菌中で安定に保持される小型のＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を有するベクターの作成は、容易ではない。実際、ＩｎｃＰプラスミドに由来するさまざまの大きさのプラスミドが調べられているが、概して、小型のプラスミドは不安定であり、かつ、細菌の種類によっても、その安定性は大きく異なる（Schmidhauser and Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455, 1985）。ｐＥ４ｃｏｓは、小型化によって、アグロバクテリウム中での安定性を欠くこととなったプラスミドの一例である。その原因については、一定の考察はなされているものの（Klee et al. 1987 Mol Gen Genet 210: 282-287）、解明されているとはいえない。【００６１】
Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｌｉｎｓｋｉ（J. Bacteriol. 164:446-455, 1985）は、さらに、「全てのグラム陰性細菌における安定な保持を説明する、プラスミドＲＫ２中の遺伝的な決定因子の万能セットは存在しない（”there is no universal set of genetic determinants in plasmid RK2 that accounts for stable maintenance in all gram-negative bacteria”）」と述べており、小型でかつ安定なベクターの作成が極めて困難であることがわかる。なお、プラスミドＲＫ２（ｐＲＫ２と表記されることも多い）は、代表的なＩｎｃＰプラスミドのひとつである。また、このようなベクターの構築の過程では、基となるプラスミドの構成要素を、別のベクターを用いてクローン化する工程を用いる場合が多い。しかし、細菌のプラスミドや染色体の複製に関与するＤＮＡ断片は、クローン化が困難な場合もある。このような問題が生じた場合には、解決手段の開発も必要となり、新規ベクターの構築が困難となるひとつの要因となる。【００６２】
限定されるわけではないが、本発明のコスミドベクター（ｐＬＣシリーズ）は下記のものを含む。【００６３】
ｉ）ｐＬＣ４０（配列番号２、図６）
全長１３４２９ｂｐのバイナリーコスミドベクターで、下記の特徴を有する。【００６４】
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子、３）ｏｒｉＴ、４）ｉｎｃＣ１遺伝子を含む
５）ラムダファージのｃｏｓ部位を含み、かつ該ｃｏｓ部位はＴ−ＤＮＡの外側に位置する
６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子ｎｐｔＩＩＩ（カナマイシン耐性遺伝子）を含む
７）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列を含む
８）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列を含む
９）７）と８）の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子ｈｐｔ（ハイグロマイシン耐性遺伝子）を含む
１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位、例えばＮｓｐＶ部位を含む。【００６５】
ｐＬＣ４０は、ｐ６ＦＲＧに、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍ（図１）のＴ−ＤＮＡ領域を含む領域を導入して作成した。なお、ｐ６ＦＲＧは図５中に示す構造を有する全長８５０７ｂｐのコスミドベクター（配列表の配列番号１）で、下記の特徴を有する。【００６６】
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない。【００６７】
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子、ｏｒｉＴ、ｉｎｃＣ１遺伝子、ラムダファージのｃｏｓ部位を含む。【００６８】
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子ｎｐｔＩＩＩ（カナマイシン耐性遺伝子）を含む。【００６９】
ｉｉ）ｐＬＣ４０ＧＷＨ（配列番号３、図７）
全長１３１７４ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。ｐＬＣ４０との相違点はａｔｔＢ１，２配列の挿入とＲＢ上流域ＳｓｐＩ−ＢａｌＩ  ３１７ｂｐの欠失である。ｐ６ＦＲＧに、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨ（図３）のＴ−ＤＮＡ領域を含む領域を導入して作成した。【００７０】
ｉｉｉ）ｐＬＣ４０ｂａｒ（配列番号４、図８）
全長１２８８４ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。主なｐＬＣ４０との相違点は、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子がｂａｒ（フォスフィノトリシン耐性遺伝子）である点と、Ｔ−ＤＮＡ上の同選抜マーカーユニット（ユビキチンプロモーター−ユビキチンイントロン−植物形質転換用選抜マーカー遺伝子）の向きが逆である点である。ｐ６ＦＲＧに、ｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ（図２）のＴ−ＤＮＡ領域を含む領域を導入して作成した。【００７１】
ｉｖ）ｐＬＣ４０ＧＷＢ（配列番号５、図９）
全長１３０２６ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。ｐＬＣ４０との相違点は、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子がｂａｒ（フォスフィノトリシン耐性遺伝子）である点と、ａｔｔＢ１，２配列の挿入である。ｐ６ＦＲＧに、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢ（図４）のＴ−ＤＮＡ領域を含む領域を導入して作成した。【００７２】
ｖ）ｐＬＣ４０ＧＷＨｋｏｒＢ（配列番号６５、図１０）
全長１４１２０ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。ｐＬＣ４０ＧＷＨとの相違点は、ｋｏｒＢ遺伝子の塩基配列が含まれる点である。ｋｏｒＢ遺伝子は、上述のＩｎｃＣ１近傍に位置し、ＩｎｃＣ１と同様に、ＩｎｃＰプラスミドの安定性に寄与している。本発明のｋｏｒＢ遺伝子の塩基配列は、ｋｏｒＢ遺伝子のＩｎｃＰプラスミドの安定性に寄与する機能を有する配列であれば、特に限定されない。【００７３】
この配列の分子生物学的諸特性については、Pansegrau et al.(1994) J Mol Biol 239: 623-663により、詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｌ２７７５８（全長６００９９ｂｐ）の配列の第５７１８７−５８２６３番目の塩基として規定される。これは、配列番号６５の第６３０６〜７３８２番目の塩基に相当する。【００７４】
ｋｏｒＢは、ｐＶＫ１０２（Knauf and Nester 1982 Plasmid 8: 45-54）などの、ＩｎｃＰプラスミドから、常法により調整することができる。例えばｋｏｒＢ遺伝子として、ｐＶＫ１０２からＰＣＲにより増幅した配列（配列番号６５の第６３０６−７３８２番目の塩基）が利用可能である。【００７５】
あるいは、上記配列番号６５の第６３０６〜７３８２の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、ｋｏｒＢ遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号６５の第６３０６〜７３８２の塩基配列に少なくとも少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ｋｏｒＢ遺伝子の機能を有する核酸も利用することができる。【００７６】
ｖｉ）ｐＬＣｌｅｏ（配列番号６６、図１１）
全長１４１９５ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。ｐＬＣ４０ＧＷＨｋｏｒＢとの相違点は、マルチクローニングサイトにＰｓｐＯＭＩ部位が、またその上流にＰＩ-ＳｃｅＩ部位が、さらにユビキチンプロモーター上流にａｔｔＢ３部位がある点である。【００７７】
ｖｉｉ）ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１（配列番号７、図１３）
全長１４２２２ｂｐのバイナリーコスミドベクターである。ｐＬＣ４０ＧＷＨとの相違点は、ｖｉｒＧ遺伝子が挿入されている点である。ｐＰＬＣ４０ＧＷＨのＴ−ＤＮＡの外側にｖｉｒＧ遺伝子を導入して作成した。【００７８】
上記の７種のコスミドベクター
ｉ）配列番号２の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０；
ｉｉ）配列番号３の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨ；
ｉｉｉ）配列番号４の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ｂａｒ；
ｉｖ）配列番号５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＢ；
ｖ）配列番号６５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ；
ｖｉ）配列番号６６の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ；及び
ｖｉｉ）配列番号７の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１
と塩基配列が１００％同一でなくても、当業者はそれらと同等の機能を奏する同等物を得ることが容易に可能である。よって、これらの「同等物」も本発明のコスミドベクターの好ましい態様として含まれる。【００７９】
例えば、本発明の上記ｉ）−ｖｉｉ）の各コスミドベクター中の塩基配列において、特に上記１）−１０）の各条件に関連する構成要素（例えば、条件１）ではｏｒｉＶ、条件２）ではｔｒｆＡ１遺伝子）以外の部分の塩基配列は変更しても、コスミドベクターとして各ベクターと同等の機能を奏すると考えられる。また、１）−１０）の条件中でも、６）の薬剤耐性遺伝子、９）の植物形質転換用選抜マーカー遺伝子、及び１０）の制限酵素認識部位、についてはｉ）−ｖｉｉ）の各コスミドベクター中の塩基配列と全く同一のものでなくても、複数の同様の機能を奏する遺伝子または制限酵素部位が知られており、当業者は適宜これらの部分について変更を加えることが可能である。【００８０】
よって、本発明のｉ）−ｖｉｉ）の各コスミドベクターの「同等物」とは、好ましくは、本発明のコスミドベクターの条件１）〜５）、７）−８）の各条件に関連する構成要素、好ましくは特に各条件のコア配列の塩基配列について、各コスミドベクター中の塩基配列と同一、あるいはそれらの塩基配列と、少なくとも９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する塩基配列、あるいは各コスミドベクターの塩基配列の相補鎖と高いストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であり、それ以外の部分の塩基配列にも変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。より好ましくは、本発明のコスミドベクターの条件１）〜１０）の各条件に関連する構成要素、好ましくは特に各条件のコア配列の塩基配列について、各コスミドベクター中の塩基配列と同一であり、それ以外の部分の塩基配列に変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。【００８１】
変異の程度は特に限定されないが、「同等物」は、好ましくは、ｉ）−ｖｉｉ）の各コスミドベクターの塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる。変異されうる塩基は、より好ましくは１ないし複数個、さらに好ましくは１ないし数個（例えば、公知の部位特異的変異法で変異を施しうる程度）である。【００８２】
また、「同等物」は、好ましくは、ｉ）−ｖｉｉ）の各コスミドベクターの塩基配列からなる群より選択される塩基配列と、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなる。【００８３】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Devereux, et al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（unary）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Atlas of Polypeptide Sequence and Structure）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；WoottonおよびFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１��−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。【００８４】
植物の形質転換方法
本発明はまた、本発明のコスミドベクターを利用した植物の形質転換方法を提供する。具体的には、本発明の植物の形質転換方法は、本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む。【００８５】
コスミドベクターに導入される核酸断片の種類は特に限定されず、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片等、任意のものを利用可能である。好ましくはゲノムＤＮＡ断片、より好ましくは植物由来のゲノムＤＮＡ断片である。限定されるわけではないが、好ましくは導入されるＤＮＡ断片のサイズは、１ｋｂ以上が好ましく、１０ｋｂ以上の大きさが更に好ましく、さらに好ましくは２０ｋｂ以上、さらに好ましくは２５〜４０ｋｂ、さらに好ましくは３０〜４０ｋｂである。【００８６】
核酸断片の調製及びそのコスミドベクターへの導入等は、公知の方法、例えばＷＯ２００５／０４０３７４に記載の方法に従って行うことができる。【００８７】
核酸断片の供給源は特に限定されない。植物ゲノムＤＮＡ断片の場合、好ましい例として、ゲノムＤＮＡ断片の導入先植物との交配によって、ヘテロシスが生じうる植物があげられる。例えば、導入先の植物がジャポニカイネである場合は、野生イネの一種であるオリザ・ルフィポゴンや、インディカイネが好ましい。導入先の植物がトウモロコシの特定品種である場合は、トウモロコシの他の品種や、野生種のテオシントなどが好ましい供与元植物の例である。一般的に、類縁関係の遠い植物ほど大きなヘテロシスが観察されている。【００８８】
形質転換に用いる導入先植物は、ゲノムＤＮＡの由来する植物とは異種の植物であってもよく、同種の異なる品種であってもよく、同種の同一の品種であってもよい。好ましい植物の例として、イネ、大麦、小麦、トウモロコシ、ソルガム、あるいは極早生イタリアンミレットやパールミレットなどのミレット類、などの穀物、サトウキビなどの工芸作物、スーダングラス、ローズグラスなどの牧草、コーヒー、ココア、茶、タバコ、等の嗜好品を製造するための植物、野菜類、果物類、花などの観賞用植物、シロイヌナズナなどの雑草、など実質上制限無く広い範囲の植物があげられる。【００８９】
本発明のコスミドベクターは特に、生物的導入法であるアグロバクテリウム法による形質転換効率の向上を目的として得られたものである。よって、植物の形質転換の方法は、好ましくはアグロバクテリウム法である。しかしながら、植物の形質転換の方法として公知の他の方法の使用も除外されるわけではない。例えば、物理的導入法としてマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、シリコンカーバイド法、エアーインジェクション法などが、化学的導入法としてポリエチレングリコール法などが知られている。【００９０】
アグロバクテリウム菌株の種類は、その抗生物質耐性が、ベクター構築時に用いる細菌用の抗生物質耐性（遺伝子）以外であれば、特に限定されず、ＬＢＡ４４０４、Ａ２８１、ＥＨＡ１０５、ＰＣ２７６０等、公知の株を利用可能である。【００９１】
マップベースクローニング法
また、本発明は、上記本発明のコスミドベクターを利用した、効率のよいマップベースクローニング法を提供する。すなわち、下記の工程を含むことを特徴とする、マップベースクローニングの方法である。【００９２】
１）植物の表現型に関与する候補遺伝子を含むＢＡＣクローンを、制限酵素により部分分解または完全分解し；
２）コスミドベクターを用いて、工程１）で得られたＤＮＡ断片をサブクローン化して、ライブラリーを構築し；そして
３）ライブラリーを構成するクローンを、個別に、植物に導入し、形質転換植物の表現型を評価する。【００９３】
本マップベースクリーニング法においては、限定されるわけではないが、工程１）で得られたＤＮＡ断片のサイズが２５〜４０ｋｂであることが好ましい。また、工程２)のコスミドベクターが上記「コスミドベクター」の項に記載のコスミドベクターであることがさらに好ましい。【００９４】
「候補遺伝子」とは、植物の表現型に関与する可能性のある遺伝子を含む一群の遺伝子である。「植物の表現型」とは、特に限定されないが、例えば、植物体全体のビガー(vigor)が高い、植物体および器官が大きい、収量が高い、生長速度が速い、病害・虫害に強い、乾燥・高温・低温等さまざまな環境ストレスに対して強い、特定成分の増・減、特定酵素活性の増・減、矮性化、等々、農業上有益な種々の表現型を含む。【００９５】
例えば、候補遺伝子が、１００〜２００ｋｂの複数のＢＡＣクローンに保持されるＤＮＡ断片に含まれていることが判明したとする。これらのクローン化されたＤＮＡを、適当な制限酵素で部分分解または完全分解し、４０ｋｂ程度の重複断片を調製し、本発明のベクター形質転換用ベクターを用いてサブクローニングを行う。この際、サブクローン化されたＤＮＡ断片の位置関係、重複の様相を詳細に調査する必要はない。統計学的計算によれば２００ｋｂクローンのとき、無作為に得られる２１個のサブクローンにより、もとの断片の任意の部位が９９％の確率で保持される（例えば、ＷＯ２００５／０４０３７４の[００４３］−［００４７］参照）。【００９６】
続いて、各サブクローンを植物に導入し、独立な形質転換体を、サブクローンあたり１０個体程度作成し、遺伝子の効果を解析する。この操作により、まず、候補遺伝子を有するサブクローンを特定することにより、候補領域を４０ｋｂに絞ることができ、さらに、隣接するサブクローンとの実験結果と照合することにより、候補領域を極めて狭い領域にまで限定することができる。従って、候補遺伝子の同定作業の効率は大きく向上する。【００９７】
さらにｖｉｒＧ遺伝子（及びｖｉｒＢ遺伝子）を利用する形質転換方法
本発明の植物の形質転換方法は、好ましい一態様において、以下の要素を含むアグロバクテリウム属細菌を用いることを特徴とする。【００９８】
１ａ）本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を導入したベクター；あるいは
１ｂ）本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、アグロバクテリウム属細菌の細胞中においてＩｎｃＰプラスミドと共存可能なプラスミドであって、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミド、
並びに
２）アグロバクテリウム属細菌のＴｉプラスミド、もしくは、Ｒｉプラスミド。【００９９】
ｖｉｒＧは、Ｔ−ＤＮＡを植物に送り込む際に機能するアグロバクテリウムのｖｉｒ遺伝子群の一つで、ｖｉｒＢ遺伝子などの転写因子と考えられている（Winans et al. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282）。ｖｉｒＧの一例としてｖｉｒＧＮ５４Ｄは、ｖｉｒＧタンパクの５４番目のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸に変化した変異体で、野生型ｖｉｒＧに比べ、ｖｉｒＢ遺伝子の発現をより増加させる（Pazour et al. 1992 J.Bac 174:4169-4174）。本形質転換方法において、ｖｉｒＧ遺伝子は、好ましくはｖｉｒＧＮ５４Ｄである。【０１００】
本発明の一態様１ａ）においてｖｉｒＧ遺伝子は、本発明のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターにさらに導入されていてよい。本発明のコスミドベクターが既にｖｉｒＧ遺伝子を含む態様（例えば、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１）の場合は、ｖｉｒＧ遺伝子をさらに導入する必要はない。【０１０１】
あるいは、ｖｉｒＧ遺伝子は、本発明のコスミドベクターとは別の独立としたプラスミド中に存在させてもよい。この場合、本発明の方法においてアグロバクテリウム細菌は、コスミドベクターの他に、アグロバクテリウム属細菌の細胞中においてＩｎｃＰプラスミドと共存可能なプラスミドであって、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドを含む（態様１ｂ）。【０１０２】
また、Ｔｉプラスミド、もしくは、Ｒｉプラスミドについては、特に限定はないが、Ｔ−ＤＮＡが除去されたディスアーム型のものが好ましい。【０１０３】
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドは、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含んでもよい。好ましくは、図１４に示した構造を有するｐＶＧＷである。より好ましくは、図１５に示した構造を有するｐＶＧＷ２である。【０１０４】
また、１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドは、さらに、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＢ遺伝子を含んでいても良い。この場合も、プラスミドは、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含んでもよい。このようなプラスミドは、好ましくはｐＴＯＫ４７である。【０１０５】
アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＢ遺伝子については、Ward et al. (1988) J Biol Chem 263: 5804-5814に詳細な記載がある。例えばｐＳＢ１（Komari et al. 1996 Plant J 10: 165-174）などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＢの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＢ０２７２５５  （ｐＳＢ１）の塩基配列のうち、第３４１６から１２８５１番目の塩基として規定される。ｖｉｒＢ遺伝子として、この配列またはこの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなるＤＮＡを利用することができるが、これらに限られるものではない。【０１０６】
これらの形質転換方法は、対象とする植物が、一般にアグロバクテリウムによる形質転換では形質転換効率が低いとされる植物、例えば限定するものではないが、トウモロコシやダイズである場合に、より有効である。また、導入する核酸断片が、大きい場合（限定するものではないが、２５〜４０ｋｂの場合）や複雑な構造を有する場合（限定するものではないが、高度反復配列を有する場合）には、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドとして後述のｐＶＧＷを用いることが好ましい。【０１０７】
プラスミドベクター
トウモロコシのような形質転換が起こりにくい植物の場合、特殊な場合（Frame et al. 2002 Plant Physiol 129: 13-22）を除いて、Ｔ−ＤＮＡが組込まれた標準的なバイナリーベクターではアグロバクテリウムによる形質転換の効率は極めて低い。これまでに、バイナリーベクターと、ｖｉｒＧ遺伝子の変異体であるｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子が組込まれた別のプラスミドをアグロバクテリウム中に共存させることで、トウモロコシでは一過的発現の効率上昇が（Hansen et al. 1994 ProNAS 91:7603-7607）、また、ｖｉｒＧとｖｉｒＢを組込んだバイナリーベクターによるトウモロコシの高効率形質転換系が報告されている（Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50）。【０１０８】
しかしながら、バイナリーベクターに、ｖｉｒＧ、あるいはｖｉｒＧＮ５４Ｄが組込まれたプラスミドをアグロバクテリウム中で共存させることにより、トウモロコシ形質転換効率を上昇させた例は、これまでに報告されていない。【０１０９】
本発明のコスミドベクター（ｐＬＣベクター）（ＩｎｃＰプラスミド）も、トウモロコシの形質転換に関し、さらなる形質転換効率の向上が期待される。ＩｎｃＰプラスミドと共存可能なプラスミドとして、例えばＩｎｃＷプラスミド（Close et al. 1984 Plasmid 12: 111-118）がある。これまで報告されている、ｖｉｒＧが導入されたＩｎｃＷベクターは、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉなど他のプラスミドの複製開始点が含まれ、サイズが大きい。例えばｐＴＯＫ４７は、ＩｎｃＷ（ｐＳａ）  ｏｒｉとｐＢＲ３２２  ｏｒｉが含まれ（さらにｖｉｒＧの他にｖｉｒＢも含まれる）、全長はおよそ２８ｋｂである（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）。また、ｐＹＷ４８は、ＩｎｃＷ（ｐＳａ）  ｏｒｉとｐＢＲ３２２  ｏｒｉが含まれ（ｖｉｒＧの他にｖｉｒＡも含まれる）、全長は１５．５ｋｂである（Wang et al. 2000 Gene 242: 105-114）。このようなベクターも本発明の形質転換方法に使用することが可能である。ただし長いベクターであるため、例えば大断片を組込んだｐＬＣベクターと共存させた場合、細菌中における安定性に問題を生じる恐れがあり、ｐＬＣベクターと共存でき、ｖｉｒＧを含み、かつサイズの小さいベクターが望まれる。【０１１０】
これを解決する手段として、本発明では、上記本発明のコスミドベクターと共存させることにより、形質転換効率を更に向上させることができる小型のプラスミドベクターを提供する。【０１１１】
本発明のプラスミドベクターは、下記の条件をすべて有するベクターである。【０１１２】
１）ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子を含む
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む
４）アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含む
１）本発明のＩｎｃＷプラスミドの複製開始点の塩基配列は、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点としての機能を有する配列であれば、特に限定されない。【０１１３】
ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点の分子生物学的諸特性については、Ｏｋｕｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｋａｄｏ（1992 Mol Gen Genet 235: 55-63）に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｕ３０４７１（全長５５００ｂｐ）の第２１７０〜２５５２番目の塩基として規定される。これは、配列番号８の第２８３２〜３２１４番目の塩基に相当する。【０１１４】
ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点は、ｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）などの、ＩｎｃＷプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、ｐＴＯＫ４７からＰＣＲにより、後述のＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡとともに増幅した２．７ｋｂのＤＮＡのうち、配列番号８の第２８３２〜３２１４番目の塩基））が利用可能である。【０１１５】
あるいは、上記配列番号８の第２８３２〜３２１４番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点の機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号８の第２８３２〜３２１４番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点の機能を有する核酸も利用することができる。【０１１６】
なお、当業者は配列番号８の第２８３２〜３２１４番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【０１１７】
２）  本発明のｒｅｐＡ遺伝子の塩基配列は、ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子として機能を有する配列であれば、特に限定されない。
ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡの分子生物学的諸特性については、Okumura and Kado (1992) Mol Gen Genet 235: 55-63に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｕ３０４７１（全長５５００ｂｐ）の第１１０８〜２０７９番目の塩基として規定される。これは、配列番号８の第１７７０〜２７４１番目の塩基に相当する。【０１１８】
ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡは、ｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）などの、ＩｎｃＷプラスミドから、常法により調整することができる。例えば、ｐＴＯＫ４７からＰＣＲにより、前述のＩｎｃＷプラスミドの複製開始点とともに増幅した２．７ｋｂのＤＮＡのうち、配列番号８の第１７７０〜２７４１番目の塩基が利用可能である。【０１１９】
あるいは、上記配列番号８の第１７７０〜２７４１番目の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子として機能を有する核酸も利用することができる。あるいは、上記配列番号８の第１７７０〜２７４１番目の塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子として機能を有する核酸も利用することができる。【０１２０】
なお、当業者は配列番号８の第１７７０〜２７４１番目中のさらに短い領域も同等の機能を奏するものとして選択しうる可能性があることを認識する。【０１２１】
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子は、形質転換用選抜マーカーとして用いられる。この薬剤耐性遺伝子は、例えば抗生物質耐性を付与するか、または独立栄養要求性を付与する遺伝子であり、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【０１２２】
４）アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子については、Winans et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8278-8282に、ｖｉｒＧＮ５４Ｄについては、Pazour et al. (1992) J. Bacteriol. 174: 4169-4174、 Hansen et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7603-7607に詳細な記載がある。ｖｉｒＧは、ｖｉｒＢやｖｉｒＥなど他のｖｉｒ遺伝子群の転写調節（活性化）因子である。ｖｉｒＧはｖｉｒＡからの調節（リン酸化）を受けて活性化するが、ｖｉｒＧＮ５４Ｄは、この調節を受けず、常に活性化した状態にある変異体である。ｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）などのプラスミドから、ｖｉｒＧ遺伝子については常法により、ｖｉｒＧＮ５４Ｄについては変異導入により調製することができる。例えば、ｐＴＯＫ４７からＰＣＲにより増幅した１ｋｂのｖｉｒＧ  ＤＮＡ（配列番号７の第４０２４〜５０６９番目の塩基）、ｐＴＯＫ４７からＰＣＲによる変異導入により増幅・調製した１ｋｂのｖｉｒＧＮ５４Ｄ  ＤＮＡ（配列番号８の第１〜１０８０番目の塩基）を利用可能である。【０１２３】
あるいは、これらの相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなり、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子の機能を有する核酸、あるいは、これらの塩基配列に少なくとも９５％、より好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％の同一性を有する塩基配列を含んでなり、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子の機能を有する核酸も利用可能である。【０１２４】
本発明のプラスミドベクターは、好ましくは全長が１０ｋｂ以内、更に好ましくは５ｋｂ以内である。【０１２５】
限定されるわけではないが、本発明のプラスミドベクターは好ましくは、図１４に記載の構造を有するｐＶＧＷベクターである。より好ましくは、図１５に示した構造を有するｐＶＧＷ２である。ｐＶＧＷ、ｐＶＧＷ２は、上記の１）−４）の条件を全て満たしたベクターである。配列番号８に記載のｐＶＧＷの全長は４５３１ｂｐであり、また配列番号６７に記載のｐＶＧＷ２の全長は４８３６ｂｐであり、下記の特徴を有する。
１）ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない、
２）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子を含む
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子であるゲンタマイシン耐性遺伝子を含む
４）アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子を含む
各コンポーネントのうち、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点とＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子は同時にクローニング、またゲンタマイシン耐性遺伝子とｖｉｒＧＮ５４Ｄ遺伝子はそれぞれクローニングした後、３つのＤＮＡ断片（４つのコンポーネント）全てを組み上げて作成した。【０１２６】
本発明のプラスミドベクターは、上記２つの２種のプラスミドベクターｐＶＧＷ、ｐＶＧＷ２と塩基配列が１００％同一でなくても、当業者はそれらと同等の機能を奏する同等物を得ることが容易に可能である。よって、これらの「同等物」も本発明のプラスミドドベクターの好ましい態様として含まれる。【０１２７】
例えば、本発明の各プラスミドベクター中の塩基配列において、特に上記１）−４）の各条件に関連する構成要素（例えば、条件１）ではＩｎｃＷプラスミドの複製開始点）以外の部分の塩基配列は変更しても、プラスミドベクターとして各ベクターと同等の機能を奏すると考えられる。また、１）−４）の条件中でも、３）の薬剤耐性遺伝子についてはの各プラスミドベクター中の塩基配列と全く同一のものでなくても、複数の同様の機能を奏する遺伝子が知られており、当業者は適宜これらの部分について変更を加えることが可能である。【０１２８】
よって、本発明の各プラスミドベクターの「同等物」とは、好ましくは、本発明のプラスミドベクターの条件１）〜２）、４）の各条件に関連する構成要素の塩基配列について、各プラスミドベクター中の塩基配列と同一、あるいはそれらの塩基配列と、少なくとも９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する塩基配列、あるいは各プラスミドベクターの塩基配列の相補鎖と高いストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であり、それ以外の部分の塩基配列にも変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。より好ましくは、本発明のプラスミドベクターの条件１）〜４）の各条件に関連する構成要素の塩基配列について、各プラスミドベクター中の塩基配列と同一であり、それ以外の部分の塩基配列に変異を有するが、各ベクターと同様に機能し同様の効果を奏するものを意味する。【０１２９】
変異の程度は特に限定されないが、「同等物」は、好ましくは各プラスミドベクターの塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなる。変異されうる塩基は、より好ましくは１ないし複数個、さらに好ましくは１ないし数個（例えば、公知の部位特異的変異法で変異を施しうる程度）である。【０１３０】
また、「同等物」は、好ましくは、各プラスミドベクターの塩基配列からなる群より選択される塩基配列と、９５％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上、より好ましくは９９．５％以上の同一性を有する塩基配列からなる。【０１３１】
なお、本明細書中で「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版,第6-7章,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド中または無しの、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。【０１３２】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。【０１３３】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を二回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。【０１３４】
ｐＶＧＷは小型で安定なことを特徴とする。具体的には、ｐＬＣと共存させることにより、特に大断片を用いた場合、及び／あるいは宿主としてトウモロコシを使用する場合の、形質転換効率の向上に有効である。ｐＬＣ以外の一般のベクターと共存させる場合も、トウモロコシ等を形質転換する場合の形質転換効率の向上に有用である。
【発明の効果】
【０１３５】
本発明のベクター（ｐＬＣベクター）により、公知のベクターでは達成できなかった下記の効果が得られる。【０１３６】
・２５〜４０ｋｂ、好ましくは３０〜４０ｋｂ程度の大きさのＤＮＡ断片を、効率よくクローン化できる；
・大腸菌、および、アグロバクテリウム細胞中で、安定的に保持される；
・アグロバクテリウムに、効率よく導入することができる；
・大腸菌、及び、アグロバクテリウムにおける細胞当りのコピー数が、４〜５となる；
そして
・クローン化した目的のＤＮＡ断片のみを植物、好ましくは単子葉植物、に効率よく導入することができる（ｐＳＢベクターの形質転換効率が６０％であったのに対し、ｐＬＣベクターの形質転換効率は９０％）。【０１３７】
本発明のｐＬＣベクターとｐＶＧＷベクターとを同時に用いることにより、トウモロコシなど、形質転換が比較的困難な植物への遺伝子導入も、効率よく行うことができる。【０１３８】
本発明のｐＬＣベクターを利用して、マップベースクローニングを行うことにより、少ない労力と短時間で、候補遺伝子の部位を絞り込むことができる。【０１３９】
本発明は、マッピング情報が極めて乏しい場合にも、大きな効果を発揮する。例えば、ある染色体の末端部に候補遺伝子が存在する、という情報のみであったとする。たとえば、染色体一本全体が４０Ｍｂとすると、末端部は、２Ｍｂ程度と考えてよい。整列化されたＢＡＣライブラリー（ＢＡＣコンティグ）があれば、ＢＡＣへの挿入断片の平均を１５０  ｋｂとして、２０個程度のＢＡＣクローンにより、この領域を網羅できる。したがって、各ＢＡＣから、２０サブクローンを作成するとして、全部で４００断片、４０００個体の組換え体を作出すれば、短時間で候補遺伝子をほぼ特定することができる。このように、本発明の技術を用いることになり、従来の技術からは考えることができないほど、わずかな労力と時間により、遺伝子の特定ができるのである。【０１４０】
本発明の態様
本発明は、好ましくは以下の態様を含む。
［態様１］
下記の特徴を有する全長１５ｋｂ以内のコスミドベクター
１）ＩｎｃＰプラスミドの複製開始点（ｏｒｉＶ）を含み、他種のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＰプラスミドのｔｒｆＡ１遺伝子を含む；
３）ＩｎｃＰプラスミドのｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ｏｒｉＴ）を含む；
４）ＩｎｃＰプラスミドのｉｎｃＣ１遺伝子を含む；
５）ラムダファージのｃｏｓ部位を含み、かつ該ｃｏｓ部位はＴ−ＤＮＡの外側に位置する；
６）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；
７）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの右ボーダー配列を含む；
８）アグロバクテリウム属細菌のＴ−ＤＮＡの左ボーダー配列を含む；
９）７）と８）の間に配置される、植物において発現する、植物形質転換用選抜マーカー遺伝子を含む；そして
１０）７）と８）の間に配置される、外来遺伝子をクローニングするための制限酵素認識部位を含む。
［態様２］
植物形質転換用選抜マーカー遺伝子が、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィノトリシン耐性遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子からなるグループから選択される、態様１記載のコスミドベクター。
［態様３］
ＩｎｃＰプラスミドのｋｏｒＢ遺伝子を含む、態様１又は２に記載のコスミドベクター。
［態様４］
以下の：
配列番号２の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０若しくはその同等物；
配列番号３の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨ若しくはその同等物；
配列番号４の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ｂａｒ若しくはその同等物；
配列番号５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＢ若しくはその同等物；
配列番号６５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ若しくはその同等物；
配列番号６６の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ若しくはその同等物；及び
配列番号７の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１若しくはその同等物
からなるグループから選択される、態様１ないし３のいずれか１項に記載のコスミドベクター。
［態様５］
以下の：
配列番号２の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０；
配列番号３の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨ；
配列番号４の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ｂａｒ；
配列番号５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＢ；
配列番号６５の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ；
配列番号６６の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ；及び
配列番号７の塩基配列からなるコスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１
からなるグループから選択される、態様４に記載のコスミドベクター。
［態様６］
態様１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入された発現ベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。
［態様７］
導入されている核酸断片のサイズが２５〜４０ｋｂである、態様６に記載の形質転換方法。
［態様８］
植物の形質転換において、以下の要素を含むアグロバクテリウム属細菌を用いることを特徴とする、態様６または７に記載の形質転換方法；
１ａ）態様１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクターに、さらにアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を導入したベクター；あるいは
１ｂ）態様１ないし５のいずれか１項に記載のコスミドベクターに植物の核酸断片が導入されたベクター、及び、アグロバクテリウム属細菌の細胞中においてＩｎｃＰプラスミドと共存可能なプラスミドであって、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミド、
並びに
２）アグロバクテリウム属細菌のＴｉプラスミド、もしくは、Ｒｉプラスミド。
［態様９］
１ａ）または１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子が、ｖｉｒＧＮ５４Ｄである、態様８記載の形質転換方法。
［態様１０］
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含む、態様８記載の形質転換方法。
［態様１１］
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、図１４に示した構造を有するｐＶＧＷ、または図１５に示した構造を有するｐＶＧＷ２である、態様１０記載の形質転換方法。
［態様１２］
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、さらに、アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＢ遺伝子を含む、態様８記載の形質転換方法。
［態様１３］
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を含む、態様１２記載の形質転換方法。
［態様１４］
１ｂ）のアグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドが、ｐＴＯＫ４７である、態様１３記載の形質転換方法。
［態様１５］
下記の工程を含むことを特徴とする、マップベースクローニングの方法
１）植物の表現型に関与する候補遺伝子を含むＢＡＣクローンを、制限酵素により部分分解または完全分解し；
２）コスミドベクターを用いて、工程１）で得られたＤＮＡ断片をサブクローン化して、ライブラリーを構築し；そして
３）ライブラリーを構成するクローンを、個別に、植物に導入し、形質転換植物の表現型を評価する。
［態様１６］
工程１）で得られたＤＮＡ断片のサイズが２５〜４０ｋｂである、態様１５に記載のマップベースクローニングの方法。
［態様１７］
２)のコスミドベクターが態様１−５のいずれか１項に記載のコスミドベクターである態様１６に記載のマップベースクローニングの方法。
［態様１８］
下記の特徴を有するプラスミドベクター；
１）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要な因子を含み、他のプラスミドの複製開始点を含まない；
２）ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子を含む；
３）大腸菌ならびにアグロバクテリウム属細菌において発現する薬剤耐性遺伝子を含む；そして
４）アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子を含む。
［態様１９］
全長が１０ｋｂ以内である、態様１８のプラスミドベクター。
［態様２０］
アグロバクテリウム属細菌のｖｉｒＧ遺伝子がｖｉｒＧＮ５４Ｄである態様１９記載のプラスミドベクター。
［態様２１］
以下の：
配列番号８に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ若しくはその同等物；及び
配列番号６７に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ２若しくはその同等物
からなるグループから選択される、態様１８ないし２０のいずれか１項に記載のプラスミドベクター。
［態様２２］
配列番号８に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ。
［態様２３］
配列番号６７に記載の塩基配列からなるプラスミドベクターｐＶＧＷ２。
［態様２４］
態様１８ないし２３のいずれか１項に記載のプラスミドベクターを含むアグロバクテリウム属細菌を用いて植物を形質転換する、ことを含む、植物の形質転換方法。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、ベクターｐＳＢ２００ＰｃＨｍの模式図である。
【図２】図２は、ベクターｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍの模式図である。
【図３】図３は、ベクターｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨの模式図である。
【図４】図４は、ベクターｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢの模式図である。
【図５】図５は、ベクターｐＬＣ４０の構築手順を示した図である。
【図６】図６は、ベクターｐＬＣ４０の模式図である。
【図７】図７は、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨの模式図である。
【図８】図８は、ベクターｐＬＣ４０ｂａｒの模式図である。
【図９】図９は、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＢの模式図である。
【図１０】図１０は、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｋｏｒＢの模式図である。
【図１１】図１１は、ベクターｐＬＣｌｅｏの模式図である。
【図１２】図１２は、ベクターｐＬＣＳＢＧＷＢＳＷａの模式図である。
【図１３】図１３は、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１の模式図である。
【図１４】図１４は、ベクターｐＶＧＷの模式図である。
【図１５】図１５は、ベクターｐＶＧＷ２の模式図である。
【図１６】図１６は、ｐＬＣベクターによるゲノムＤＮＡ断片のクローニングの結果を示す。テオシントゲノムDNA断片の例を示す。M1:マーカー（1 kb ladder）、M2:マーカー（λ-HindIII）、番号：クローン番号、 矢印：pLC40GWHのバンドの位置（13.2 kb）。テオシントライブラリーから１１個のクローンのプラスミドDNAを精製した。プラスミドインサートの両端にあるマルチクローニング部位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断し、アガロースゲル（０．８％）電気泳動に供した。
【図１７】図１７は、ゲノムＤＮＡ断片のイネへの導入の結果を示す（Ｂ断片中央部）。Ｍ：マーカー、Ｙｕ：ユキヒカリ、Ｒｕ：オリザ・ルフィポゴン、Transgenic：形質転換イネ（二個体）。形質転換イネでは、ユキヒカリに由来するバンドに加え、オリザ・ルフィポゴン由来のバンドが検出された。
【実施例】
【０１４２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらも本発明の技術的範囲に含まれる。【０１４３】
実施例１  ｐＬＣシリーズのコスミドベクターの構築
下記の手順において、分子生物学的実験手法は、特に指定しない限り、Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA.に従った。【０１４４】
１）Ｔ−ＤＮＡ領域の構築
ｐＳＢ２００（ＷＯ２００５／０４０３７４）のＥｃｏＲＶ部位にＰａｃＩリンカー（ｇｔｔａａｔｔａａｃ）（配列番号１０）を挿入し、ｐＳＢ２００Ｐａｃを構築した。ｐＳＢ２５（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターをトウモロコシのユビキチンプロモーター（Christensen et al. 1992 Plant Mol Biol 18: 675-689）に変換したｐＳＢ２５Ｕを構築した。制限酵素ＮｓｐＶおよびホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位を有するアダプターＨｉｎＮｓｐＩＳｃｅＲＶ、ＨｉｎＮｓｐＩＳｃｅＦＷ（表１）をアニ−リングさせた。この一部を、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、リン酸化した。これをｐＳＢ２００ＰａｃのＳａｃＩ部位、並びにｐＳＢ２５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ部位に常法に従いクローニングした。完成したプラスミドを、それぞれ、ｐＳＢ２００ＰａｃＨｍ１、および、ｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ１と命名した。【０１４５】
ｐＳＢ２００ＰａｃＨｍ１、および、ｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ１のＳｐｅＩ部位に、ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩ部位が組み込まれたアダプターＳｐｅＩＣｅｕＲＶ、ＳｐｅＩＣｅｕＦＷ（表１）を導入した。この操作でｐＳＢ２００ＰａｃのＳａｃＩ部位、ＳｐｅＩ部位にそれぞれ、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位  Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩを挿入したベクターｐＳＢ２００ＰｃＨｍ（図１）、ｐＳＢ２５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＳｐｅＩ部位にそれぞれ、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位  Ｉ−ＳｃｅＩ（＋  ＮｓｐＶ  ｓｉｔｅ）、Ｉ−ＣｅｕＩを挿入したベクターｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ（図２）を完成した。Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩによる切り出しを確認し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を使用して、塩基配列チェックを行い、単一アダプターの挿入を確認した。これらのベクターでは、Ｉ−ＳｃｅＩ−選抜マーカーユニット−ＬＢ−Ｉ−ＣｅｕＩを切り出すことができる。【０１４６】
【表１】
0005175188.tif 000002
次に、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍをＢａｍＨＩで消化し、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔ）を除去した後、平滑化を行った。これを、ａａｔＲ１−ｃｃｄＢ−Ｃｍ−ａａｔＲ断片（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションし、大腸菌ＤＢ３．１に導入してクロラムフェニコール耐性コロニーを選抜し、Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター、ｐＤＥＳＴ３３４２を作成した。次に、ＢＰ反応によりｐＤＯＮＲ／Ｚｅｏプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へマーカー遺伝子を導入するため、ａａｔＢ配列を含む以下のプライマーを合成した（大文字がａａｔＢ配列）。【０１４７】
【表２】
0005175188.tif 000003
Ｈｐｔ遺伝子の増幅には、鋳型ＤＮＡとしてBilang et al. (1991) Gene 100: 247-250に記載のｈｐｔ遺伝子を用いた。プライマーとしてａａｔＢ１−ＨＰＴ、ＨＰＴ−ａａｔＢ２を、フォスフィノトリシン耐性遺伝子（ｂａｒ）の増幅には鋳型ＤＮＡとしてｐＳＢ２５（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）を、プライマーとしてａａｔＢ１−ｂａｒ、ｂａｒ−ａａｔＢ２を用いた（表２）。ＰＣＲは、１００μｌの反応液中に鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、２５ｐｍｏｌｅｓのプライマーを加え、サイクル数は３５とした。反応終了後、エタノール沈殿により産物を回収して、ＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添付のプロトコールに従ってＢＰ反応（２５℃、６時間）を行い、大腸菌ＤＨ５αへ導入し、抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ入りのｌｏｗ  ｓａｌｔ  ＬＡプレート上で目的プラスミドが組み込まれた大腸菌を選抜した。制限酵素分析を行い最終的に得られたプラスミドについて、塩基配列の確認を行い、それぞれｐＥＮＴ−ＨＰＴｗｔおよびｐＥＮＴ−ｂａｒを完成した。【０１４８】
先に作成したＤｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＤＥＳＴ３３４２）およびｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ｐＥＮＴ−ＨＰＴｗｔおよびｐＥＮＴ−ｂａｒ）を用いて、ＬＲ反応により最終目的プラスミドの作成を行った。ＧＡＴＥＷＡＹ  ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘキット添付のプロトコールに従い、２０μｌの反応液（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒおよびｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒを各々３００ｎｇ使用）中、２５℃で４時間反応させた後、大腸菌ＤＨ５αへエレクトロポレーションで導入した。スペクチノマイシン添加のＬＡプレート上に生育したコロニーよりプラスミドＤＮＡを調整し、制限断片パターンにより候補クローンを選抜した。塩基配列解析によりａａｔＢ配列およびＨＰＴ遺伝子配列またはｂａｒ遺伝子配列が組み込まれていることを確認し、各々ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨ（図３）、およびｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢ（図４）と命名した。【０１４９】
２）コスミドベクターｐＬＣ４０の構築
ＩｎｃＰプラスミドｐＶＫ１０２（Knauf and Nester, Plasmid 8: 45-54, 1982)のｏｒｉＶを含むＤＮＡ断片、ｏｒｉＴを含むＤＮＡ断片、ｉｎｃＣ２遺伝子を含むＤＮＡ断片、ｔｒｆＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片、ｐＢＩ１２１由来のｎｐｔＩＩＩ遺伝子、および、ｐＳＢ１１由来のｃｏｓを含むＤＮＡ断片を増幅させるＰＣＲプライマーとしてＯｒｉＶ３’ＣｌａＦＷ、ＯｒｉＶ５’ＰｖＮｈＥｃ、ＯｒｉＴ５’ＢｇｌＲＶ、ＯｒｉＴ３’ＳｐＥｃＦＷ、ＩｎＣ５’ＸｂＲＶ、ＩｎＣ３’ＢｇＥｃＦＷ  、Ｒ５’ＸｈｏＩＲＶ、Ｒ３’ＢｍＥｃＦＷ、１２１ＫＩＩＩ５’ＮｓｐＶ、１２１ＫＩＩＩ３’ＳａｌＩ、ＣＯＳ５’ＢｍＲＶ、ＣＯＳ３’ＭｕｎＦＷを設計し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてＰＣＲ反応を行った（表３）。【０１５０】
各プライマーには後に使用する制限酵素部位が組み込まれている。ｔｒｆＡ１遺伝子以外のＰＣＲ産物、即ち、ｐＶＫ１０２由来のｏｒｉＶを含むＤＮＡ断片（８８４ｂｐ）、ｏｒｉＴを含むＤＮＡ断片（８１０ｂｐ）、ｉｎｃＣ１遺伝子を含むＤＮＡ断片（２１１８ｂｐ）、ｐＢＩ１２１由来のｎｐｔＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１０８７ｂｐ）、ｐＳＢ１１由来のｃｏｓを含むＤＮＡ断片を、それぞれベクターｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。その結果、ｏｒｉＶを含むＤＮＡ断片には、公開データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｌ２７７５８）中の対応する塩基配列と比較すると、２個の塩基置換と１個の塩基付加が見つかった。これらの変異は鋳型プラスミドにも見つかったので、原因はＰＣＲによる変異ではなく、鋳型プラスミドが公開データベース中の配列とは異なる塩基配列を有していたものであった。ｏｒｉＴ  、ｉｎｃＣ１遺伝子、ｃｏｓはデータベースの塩基配列と全く同一であった。なお、ｔｒｆＡ１遺伝子は、単独ではクローニングできなかった。そこで以下の方法で構築を進めた。【０１５１】
ｏｒｉＶを含むＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩで消化し、０．９ｋｂ断片を純化した。同様にｏｒｉＴを含むＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩ、ｎｐｔＩＩＩを含むＤＮＡ断片をＮｓｐＶとＳａｌＩで消化、精製した。また、ｔｒｆＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片に関してはＰＣＲ産物をエタノール沈殿した後、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して、精製した。これら４断片（ｏｒｉＶ、ｔｒｆＡ１遺伝子、ｎｐｔＩＩＩ、ｏｒｉＴ）に関して、ライゲーション反応を行い、４断片をまとめて一度にクローニングした。完成したプラスミド（ｐＶＲＫＴと命名）の塩基配列の解析を行ったところ、公開データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｌ２７７５８）中の対応する塩基配列と比較すると、ｔｒｆＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片にフレームシフトを伴う変異が検出されたが，鋳型としたｐＶＫ１０２にも同様の変異が見つかり、原因はＰＣＲによるものではなく、鋳型としたｐＶＫ１０２には公開データベース中の配列とは異なる塩基配列が含まれていたものと結論した。【０１５２】
完成した４断片を含むプラスミドｐＶＲＫＴをＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで消化し、ここへｉｎｃＣ１遺伝子が組み込まれたプラスミドをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化して回収したｉｎｃＣ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入した。完成したプラスミドをさらに、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで消化し、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミドをＭｕｎＩ、ＢａｍＨＩで消化して回収したｃｏｓを含むＤＮＡ断片を導入し、ｏｒｉＶを含むＤＮＡ断片、ｔｒｆＡ１遺伝子を含むＤＮＡ断片、ｎｐｔＩＩＩを含むＤＮＡ断片、ｏｒｉＴを含むＤＮＡ断片、ｉｎｃＣ１遺伝子を含むＤＮＡ断片、ｃｏｓを含むＤＮＡ断片の６断片からなる低コピーベクターの骨格ｐ６ＦＲＧ（約８．５ｋｂ）が完成した（配列表の配列番号１）。以上のクローニング手順を模式図５にまとめた。ｐ６ＦＲＧプラスミドのＰｖｕＩＩ，ＮｈｅＩ部位へ、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍのＴ−ＤＮＡ領域（ＳｓｐＩ−ＳｐｅＩ断片）を組込み、ベクターｐＬＣ４０を完成した（図６、配列表の配列番号２）。【０１５３】
【表３】
0005175188.tif 000004
３）その他のｐＬＣシリーズのコスミドベクターの構築
ｐＬＣ４０ＧＷＨ
ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨの骨格部にある２つのＢａｌＩ部位のうち、ＲＢの左側にある部位はメチル化のため、切断されない。そこでｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨを一旦大腸菌株ＧＭ４８に導入し、同部位のメチル化を除去してから以下の実験に用いた。ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＨをＢａｌＩ、ＳｐｅＩで処理しＴ−ＤＮＡを含む領域を切り出し、上述の６ＦＲＧのＰｖｕＩＩ、ＮｈｅＩ部位にクローニングし、ｐＬＣ４０ＧＷＨを完成した（図７、配列表の配列番号３）。ｐＬＣ４０との相違点はａｔｔＢ１，２配列の挿入とＲＢ上流域ＳｓｐＩ−ＢａｌＩ  ３１７ｂｐの欠失である。【０１５４】
ｐＬＣ４０ｂａｒ、ｐＬＣ４０ＧＷＢ、ｐＬＣ４０ＧＷＢＳＷ
ｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ，  ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢを制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩで消化、Ｔ−ＤＮＡを含む部分を回収した。これらの断片を、ｐ６ＦＲＧのＰｖｕＩＩ、ＮｈｅＩ部位にクローニングし、それぞれｐＬＣ４０ｂａｒ（図８、配列表の配列番号４）、ｐＬＣ４０ＧＷＢ（図９、配列表の配列番号５）を完成した。ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢをＮｓｐＶで処理し、平滑末端化、脱リン酸化した。ここへｐＳｗａＩリンカー（表４）を組み込んだ（ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢＳＷ）。このプラスミドを制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｓｐＩで消化、Ｔ−ＤＮＡを含む部分を回収した。これらの断片を、ｐ６ＦＲＧのＰｖｕＩＩ、ＮｈｅＩ部位にクローニングし、ｐＬＣ４０ＧＷＢＳＷを完成した。【０１５５】
ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳ
ベクターｐＳＢ２４（Komari et al. 1996）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで処理し、３５Ｓプロモーター-I-ＧＵＳ遺伝子−ＮＯＳターミネーターからなるＤＮＡ断片を切り出した。さらにＫｌｅｎｏｗ処理で平滑末端化した後、３．１ｋｂ断片を精製、回収した。上述のコスミドベクターｐＬＣ４０を制限酵素ＮｓｐＶで処理し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した後、脱リン酸化し、精製した。また、ｐＬＣ４０ＧＷＢＳＷを制限酵素ＳｗａＩで処理し、脱リン酸化した後、ゲル精製した。これらのベクターに、上記のＧＵＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入し、それぞれｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳを作成した。【０１５６】
ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢ
ｐＬＣベクターのＩｎｃＣ１のクローニング領域を広げ、ｋｏｒＢ遺伝子を含むようなベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢを構築した。ＩｎｃＰ系プラスミドｐＶＫ１０２のＩｎｃＣ１-ＫｏｒＢを含むＤＮＡ断片を増幅するプライマー、ＩｎｃＣ３‘ＢｇＥｃＦｗ（上述）、ＩｎｃＣ／ＫｏｒＢ-Ｘｂａ＃１（表４）を設計した。各プライマーには後で使用する制限酵素部位が組み込まれている。ＰＣＲ反応は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、ｐＶＫ１０２プラスミドＤＮＡ５００ｎｇ、１０×ＰｙｒｏｂｅｓｔＢｕｆｆｅｒ II ５μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ  ｄＮＴＰｓ ４μｌ、ｐｒｉｍｅｒ  ５０ｐｍｏｌｅｓ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｔａｋａｒａ社製）０．５μｌをそれぞれ含み、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ２分３０秒を１０回行った。その結果、ＩｎｃＣ１―ｋｏｒＢのＰＣＲ産物（３０６５ｂｐ）が増幅されたので、これをベクターｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。ライゲーション反応はベクターキット添付の説明書きに従った。大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーション法を用いてＤＮＡを導入し、抗生物質ゼオシン（２５μｇ／ｍｌ）を含んだ２×ＹＴ寒天培地上で３７℃で一晩培養した。生育したコロニーを鋳型に、ＩｎｃＣ１−ＫｏｒＢ増幅に用いたのと同じプライマーセットでコロニーダイレクトＰＣＲを行い、候補クローンを選抜した。ＰＣＲ条件は２０μｌの反応液中に、１０×Ｅｘｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰｓ １．６μｌ、ｐｒｉｍｅｒ ５ ｐｍｏｌｅｓ、Ｅｘｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (Ｔａｋａｒａ社製)０．４μｌ をそれぞれ含むよう調整し、反応液にコロニーを懸濁した上でＷａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔを用いて、９６℃ ３分を１回、９６℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ２分３０秒を３０回行った。その結果、約３ｋｂのＰＣＲ産物が増幅されたものを候補クローンとした。これらのクローンに関してＡＢＩ ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ, Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で、塩基配列を決定した。その結果、ＩｎｃＣ１− ＫｏｒＢの塩基配列はデータベースのものとまったく同一であった。【０１５７】
次に、前述のプラスミドｐＶＲＫＴをＥｃｏＲＩ、ＳｐｅＩで消化し、ここへＩｎｃＣ１−ＫｏｒＢが組み込まれたプラスミドをＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩで消化して回収したＩｎｃＣ１−ＫｏｒＢ断片を挿入した。完成したプラスミドをさらに、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩで消化し、前述のｃｏｓ断片（ＭｕｎＩ−ＢａｍＨＩ断片）を組み込み、ｏｒｉＶ、ｔｒｆＡ１、ｎｐｔＩＩＩ、ｏｒｉＴ、ＩｎｃＣ１−ＫｏｒＢ、ｃｏｓの６断片からなるプラスミドｐ６ＦＲＧ２が完成した。ｐ６ＦＲＧ２プラスミドのＰｖｕII, ＮｈｅI部位へｐＳＢ３３４２ＧＷＨ由来のＴ−ＤＮＡ領域（ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片）を組込み、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢとした（図１０、配列番号６５）。【０１５８】
ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩ
クローニングされているゲノム大断片をそのままの形で切り出せるよう、マルチクローニングサイト上流にホーミング酵素ＰＩ−ＳｃｅＩの認識部位を追加した。ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢをＨｉｎｄIIIで消化し、ＰＩ−ＳｃｅIアダプター（ＰＩ−ＳｃｅＩＦｗ、 ＰＩ−ＳｃｅＩＲｖ、表４）を組み込んだものをｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩとした。【０１５９】
ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩａｔｔＢ３
ｐＬＣ４０ＧＷＨの選抜マーカーのプロモーターをＧａｔｅｗａｙシステムにより任意のものと交換できるよう、ユビキチンプロモーター上流にａｔｔＢ３サイトを追加した。ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩをＩ−ＳｃｅＩで消化し、ａｔｔＢ３アダプター（ａｔｔＢ３Ｆｗ、ａｔｔＢ３Ｒｖ、表４）を組み込んだものをｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩａｔｔＢ３とした。【０１６０】
ｐＬＣｌｅｏ
ＮｏｔＩで消化したゲノム断片をクローニングできるよう、マルチクローニングサイトにＰｓｐＯＭＩ（ＮｏｔＩと同じ粘着末端を生成）の認識部位を作成し、同時にユビキチンイントロン内にあるＡｐａＩ（ＰｓｐＯＭＩのネオシゾマー）の認識部位を破壊した。ｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩａｔｔＢ３をＡｐａＩとＮｈｅＩで消化し、ＡｐａＩｍ−ＮｈｅＩアダプター（ＡｐａＩｍ−ＮｈｅＩＦｗ、ＡｐａＩｍ−ＮｈｅＩＲｖ、表４）を組み込んだものをｐＬＣ４０ＧＷＨＫｏｒＢＰＩａｔｔＢ３ＡｐａＩｍとした。このプラスミドをＨｉｎｄIIIとＮｓｐＶで消化し、ＨｉｎｄIII−ＰｓｐＯＭＩ−ＮｓｐＶアダプター（ＨｉｎｄIII−ＰｓｐＯＭＩ−ＮｓｐＶＦｗ、ＨｉｎｄIII−ＰｓｐＯＭＩ−ＮｓｐＶＲｖ、表４）を組み込んでｐＬＣｌｅｏを完成した（図１１、配列表の配列番号６６）。【０１６１】
【表４】
0005175188.tif 000005
ｐ６ＦＲＧＳｗＫｐ
ｐ６ＦＲＧをＰｖｕＩＩ処理し、脱リン酸化した。ＳｗａＩおよびＫｐｎＩの認識部位を有するアダプターＳｗａＩＫｐｎＩＲＶ、ＳｗａＩＫｐｎＩＦＷ（表５）ＤＮＡをアニ−リングさせた。この一部を、ＰＮＫ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、リン酸化した。このＳｗａＩ−ＫｐｎＩリンカーを、ｐ６ＦＲＧのＰｖｕＩＩ部位に組み込み、ｐ６ＦＲＧＳｗＫｐを完成した。ＫｐｎＩ部位は次のステップのアグロバクテリウムの菌株Ａ２８１に由来するｖｉｒＢ遺伝子およびｖｉｒＧ遺伝子を有するＤＮＡ断片のクローニング用、ＳｗａＩ部位はさらに次のステップのＴ−ＤＮＡクローニング用に設計した。【０１６２】
【表５】
0005175188.tif 000006
ｐ６ＦＲＧＳＶＲ，ｐ６ＦＲＧＳＶＲＦ
ベクターｐＳＢ１（Komari et al. 1996）をＫｐｎＩで消化し、ｖｉｒＢ遺伝子とｖｉｒＧ遺伝子を含む１４．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。この断片を、ｐ６ＦＲＧＳｗＫｐをＫｐｎＩ処理し、脱リン酸化したベクターへ組み込み、ｐ６ＦＲＧＳＶＲならびにｐ６ＦＲＧＳＶＦを完成した。【０１６３】
ｐＬＣＳＢＧＷＢＳＷ
ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷＢＳＷをＳｐｅＩ、ＳｓｐＩで消化し、Ｔ−ＤＮＡ領域を含むＤＮＡ断片を、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により平滑末端化した。この断片をｐ６ＦＲＧＳＶＲをＳｗａＩ消化して、脱リン酸化したベクターに組み込み、ｐＬＣＳＢＧＷＢＳＷを完成した（図１２、配列表の配列番号６）。本ベクターは全長およそ２８ｋｂの低コピーベクターであり、アグロバクテリウムの菌株Ａ２８１に由来するｖｉｒＢ遺伝子とｖｉｒＧ遺伝子を含んでおり、トウモロコシの形質転換に使用できると考えられる。またｃｏｓ部位が組み込まれているため、パッケージング反応によって１０〜２０ｋｂ程度のＤＮＡが容易にクローニングできる。【０１６４】
４）ｖｉｒＧ組み込み型ｐＬＣベクター
ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターによる植物形質転換の効率を向上させる手段として、下記の手順により、ｐＬＣ４０ＧＷＨベクターにｖｉｒＧ遺伝子を組み込んだベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧを構築した。【０１６５】
ｖｉｒＧ遺伝子の調製
ｖｉｒＧ遺伝子（プロモーター、構造遺伝子、３’領域を含む）を増幅するプライマーｖｉｒＧＰｒｏＳｍ、ｖｉｒＧＴｅｒＳｍを設計、合成した。これらのプライマーと鋳型ＤＮＡとしてｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）を用いて、ｖｉｒＧ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。その結果、およそ１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。この一部を、上記の同様の方法で、ベクターｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、塩基配列を確認した。ＶｉｒＧ遺伝子のＤＮＡ配列には、ＮｓｐＶ部位がある。この制限部位は後のベクターでクローニング部位として用いる。そこで、この部位を、ＰＣＲによる変異導入で消去した。ＮｓｐＶ部位（ｔｔｃｇａａ）中の一つ目のアデニンをグアニンに変化させた（ｔｔｃｇｇａ）プライマーｖｉｒＧｏｎＮｓｐＶＲＶ、およびその相補配列ｖｉｒＧｏｎＮｓｐＶＦＷを設計、合成した。ＶｉｒＧｏｎＮｓｐＶＦＷとｖｉｒＧ遺伝子プロモーター上流にセットしたプライマーｖｉｒＧＰｒｏＳｐｅ、ならびにｖｉｒＧｏｎＮｓｐＶＲＶとｖｉｒＧ遺伝子ターミネーター下流にセットしたプライマーｖｉｒＧＴｅｒＳｐｅの２組のプライマー組合せでＰＣＲを行った。鋳型としてｐＣＲ２．１ＴｏｐｏにクローニングされたｖｉｒＧ遺伝子を用いた。その結果、前者の組合せでおよそ４００ｂｐの産物が、後者の組合せでおよそ６００ｂｐの産物が増幅された。これらの産物を精製し、次のＰＣＲ反応の鋳型に用いた。精製された２種類のＰＣＲ産物を鋳型に、先のプライマーｖｉｒＧＰｒｏＳｐｅ、ｖｉｒＧＴｅｒＳｐｅを用いてＰＣＲ反応を行った。その結果、およそ１ｋｂのＰＣＲ産物が増幅された。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、変異導入（ｔｔｃｇａａ→ｔｔｃｇｇａ）を確認した。【０１６６】
また、同様に変異無しｖｉｒＧ遺伝子をｖｉｒＧＰｒｏＳｐｅ、ｖｉｒＧＴｅｒＳｐｅを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＣＲ２．１Ｔｏｐｏにクローニングし、塩基配列を確認した。ＰＣＲに用いたプライマーを表６にまとめた。【０１６７】
【表６】
0005175188.tif 000007
ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１
ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、脱リン酸化した。ここへＳｐｅＩリンカー（ＧＡＣＴＡＧＴＣ、Ｔａｋａｒａ社製）を導入し、ｐＬＣ４０ＧＷＨＳｐｅを作成した。このプラスミドを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、脱リン酸化した。ここへ、変異導入を施した上記ｖｉｒＧ遺伝子をベクターからＳｐｅＩで切り出したおよそ１ｋｂの断片を挿入し、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１（図１３、配列表の配列番号７）を作成した。また同様に、変異無しｖｉｒＧ遺伝子を、ｐＬＣ４０ＧＷＨＳｐｅへ導入し、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１を作成した。【０１６８】
ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳ
上記と同様に、ベクターｐＳＢ２４（Komari et al. 1996）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで処理し、ＧＵＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、ＳｇｆＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＳｇｆＩの並びのマルチクローニング部位をもつベクターの同制限部位にクローニングした。完成したプラスミドをＳｇｆＩで消化し、ＧＵＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。この時点で、ＧＵＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片の両端はＳｇｆＩ部位である。上述コスミドベクターｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１を制限酵素ＰａｃＩで処理し、脱リン酸化した。ここへ３．１  ｋｂ  ＳｇｆＩ断片（ＧＵＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片）をクローニングし、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳを完成した。また同様に、３５Ｓ−ＩＧＵＳ−ＮＯＳを、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１へ導入し、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳを作成した。【０１６９】
５）ｐＬＣと共存可能なｖｉｒＧ組み込みベクター
ｐＶＧＷ
ｐＴＯＫ４７は、ｖｉｒＧおよびｖｉｒＢを含むおよそ２８ｋｂの大型のＩｎｃＷプラスミドである（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）。そこで、より小さなサイズで、かつｐＬＣベクターと共存できる複製開始点ＩｎｃＷ  ｏｒｉ、ｖｉｒＧ遺伝子、ならびに選抜マーカー遺伝子を有するベクター（ｐＶＧＷと命名）を設計、構築した。【０１７０】
ｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）由来のＩｎｃＷ  ｏｒｉを含む断片を増幅するプライマーｐＳａ５’ＥｃＴ２２、ｐＳａ３’ＢｇｌＩＩ、ｐＰＨ１ＪＩ（Hirsch and Beringer 1984 Plasmid 12: 139-141）由来のゲンタマイシン耐性遺伝子（ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を増幅するプライマーＧｍ５’Ｂｍ、Ｇｍ３’Ｘｈ−２ｎｄを設計した（表７）。各プライマーには後で使用する制限酵素部位が組み込まれている。鋳型としてそれぞれ、ｐＴＯＫ４７、ｐＰＨ１ＪＩを用いた。Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＩｎｃＷ  ｏｒｉを含む断片としておよそ２．７ｋｂのＤＮＡが、ゲンタマイシン耐性遺伝子としておよそ０．７ｋｂのＤＮＡが増幅された。【０１７１】
一方、ｐＴＯＫ４７由来のｖｉｒＧの５４番目のアミノ酸残基をＰＣＲによる変異導入でＮからＤに変える（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ、Hansen et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7603-7607）プライマーｖｉｒＧＮ５４ＤＦＷ、およびその相補配列ｖｉｒＧＮ５４ＤＲＶを設計した。ｖｉｒＧＮ５４ＤＦＷとｖｉｒＧ遺伝子プロモーターの５’側にセットしたプライマーｖｉｒＧＰｒｏＳａｌ、ならびにｖｉｒＧＮ５４ＤＲＶとｖｉｒＧ遺伝子ターミネーターの３’側にセットしたプライマーｖｉｒＧＴｅｒＰｓｔの二組のプライマーセット（表７）でＰＣＲを行った。鋳型としてｐＴＯＫ４７プラスミドを用いた。その結果、前者の組み合わせでおよそ０．４ｋｂ、後者の組み合わせでおよそ０．７ｋｂの産物が増幅された。これらの産物を精製したものを鋳型とし、先のプライマーｖｉｒＧＰｒｏＳａｌ、ｖｉｒＧＴｅｒＰｓｔを用い、さらにＰＣＲ反応を行った。その結果、およそ１．１ｋｂの産物（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ）が増幅された。【０１７２】
ＩｎｃＷ  ｏｒｉを含む断片、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ならびにｖｉｒＧＮ５４ＤのＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした。塩基配列を決定し、公開配列（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｕ３０４７１）と比較した結果、ＩｎｃＷ  ｏｒｉを含む断片には６塩基の欠失があったが、この欠失は鋳型に用いたｐＴＯＫ４７にも見つかった。一方、ゲンタマイシン耐性遺伝子はデータベースの塩基配列と完全に一致した。ｖｉｒＧＮ５４Ｄは目的の位置に変異導入が確認された。【０１７３】
ＩｎｃＷ  ｏｒｉを含む断片がクローニングされたプラスミドをＥｃｏＴ２２Ｉ、ＢｇｌＩＩで消化、２．７ｋｂ断片を回収した。同様にゲンタマイシン耐性遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ、ｖｉｒＧＮ５４ＤをＳａｌＩとＰｓｔＩで消化し、各フラグメントを精製した。これらの３断片をまとめてライゲーション反応（ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩとＳａｌＩ、ＰｓｔＩとＥｃｏＴ２２Ｉはそれぞれ同じ付着末端）を行い、ｐＶＧＷを完成した（図１４、配列表の配列番号８）。【０１７４】
【表７】
0005175188.tif 000008
ｐＶＧＷ２
ｐＶＧＷの利便性を一層高めるため、ゲンタマイシン耐性遺伝子のプロモーター領域を広げ、さらにクローニングサイトを組み込んだベクターｐＶＧＷ２を構築した。プラスミドｐＰＨ１ＪＩのゲンタマイシン耐性遺伝子を増幅するプライマー、ＢａｍＳｍａＧｍＰｒｏ、ＮｈｅＩｓｉｔｅＧｍＲｖ、およびｐＶＧＷのｖｉｒＧ−ＩｎｃＷ領域を増幅するプライマー、‘ＭｓｃＩｓｉｔｅ−ｖｉｒＧ５’Ｆｗ（以上表８）、‘ｐＳａ３’ＢｇｌＩＩ(前述)を設計した。各プライマーには制限酵素部位が組み込まれている。ＰＣＲ反応は以下のように行った。５０μｌの反応液中に、鋳型プラスミドＤＮＡ１ｎｇ、２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ （Ｔａｋａｒａ社製） ２５μｌ、ｐｒｉｍｅｒ １５ ｐｍｏｌｅｓをそれぞれ含み、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、９８℃ ３０秒を１回、９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃ １分を３５ 回行った。その結果、ゲンタマイシン耐性遺伝子（８２６ｂｐ）およびｖｉｒＧ−ＩｎｃＷ領域(３８４０ｂｐ)のＰＣＲ産物が増幅された。ゲンタマイシン耐性遺伝子についてはベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングし、エレクトロポレーション法を用いて大腸菌ＴＯＰ１０(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社)へ導入した。抗生物質カナマイシン(５０μｇ／ｍｌ)を含んだＬＢ寒天培地上で３７℃で一晩培養し、得られたコロニーからプラスミドを精製した。これらのクローン(ｐＣＲ−Ｇｍ)に関してＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ蛍光シークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ, Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で塩基配列を決定し、ＰＣＲエラーによる変異のないことを確認した。プラスミドｐＣＲ−ＧｍをＢａｍＨＩ、ＰｖｕＩＩで消化してＧｍ断片を回収し、ＢｇｌＩＩで消化したｖｉｒＧ−ＩｎｃＷ断片（片端はＢｇｌＩＩ末端、もう片端は平滑末端）とライゲーションした。得られたクローンはエレクトロポレーション法により大腸菌ＴＯＰ１０へ導入し、抗生物質ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ寒天培地上で選抜した。生じたコロニーからプラスミドを精製し、シークエンサーによりＰＣＲエラーがないことを確認してｐＶＧＷ２を完成した（図１５、配列表の配列番号６７）。【０１７５】
【表８】
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実施例２  ｐＬＣベクターによる大断片のクローニング
ｐＬＣ４０、ｐＬＣ４０ＧＷＨ、ｐＬＣｌｅｏ、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１、ｐＳＢ２００、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷ、またはｐＳＢ２５Ｕで作製した、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ，  ｅｃｏｔｙｐｅ：  ｃｏｌｏｍｂｉａ）、野生イネ・オリザルフィポゴン（Ｏｒｙｚａ  ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）、スーダングラス（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｓｕｄａｎｅｎｓｅ）、極早生イタリアンミレット（Ｓｅｔａｒｉａ  ｉｔａｌｉｃａ）、テオシント（Ｚｅａ  ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ）、パールミレット（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｔｙｐｈｏｉｄｅｕｍ）、バヒアグラス(Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  Ｆｌｕｇｇｅ）ならびにサトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）のライブラリーを例に記載する。【０１７６】
１）ゲノムＤＮＡの調製
温室で育成した播種後およそ一ヶ月の植物体の若葉約５ｇを乳鉢を用いて液体窒素下で粉砕した後、ＣＴＡＢ法でゲノムＤＮＡを精製した。収量はＤＮＡでおよそ５００〜６００μｇであった。植物ゲノムＤＮＡ  １μｇ当たり０．０２〜０．０６ＵのＴａｑＩ酵素で部分分解した。部分分解後、１０〜４０％のショ糖密度勾配遠心により、３０〜４５ｋｂのゲノムＤＮＡ断片が含まれる画分を回収した。【０１７７】
２）ベクターの調製
コスミドベクターｐＬＣ４０、ｐＬＣ４０ＧＷＨ、ｐＬＣｌｅｏ、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１、ｐＳＢ２００、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷ、ｐＳＢ２５Ｕ  を制限酵素ＮｓｐＶ（ＴＯＹＯＢＯ）で完全消化し、脱リン酸化した後、精製した。【０１７８】
３）パッケージング反応を用いたクローニング
上記の調製後のベクターとゲノムＤＮＡ断片のライゲーション反応を行い、さらに、ＧｉｇａＰａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔを用いて、室温で２時間パッケージング反応を行った。反応後、大腸菌ＧｅｎｅＨｏｇｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、培養を行った。その結果、表７に示すように、いずれの植物種、ベクターの組み合わせにおいても１〜１０万ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ−ｕｎｉｔ）のライブラリーを作製することが出来た（表９）。【０１７９】
【表９】
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４）クローニングされたゲノムＤＮＡ断片の解析
各ライブラリー１２〜２４個のクローンからプラスミドを精製し、インサートの両端にあるマルチクローニング部位の制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで切断したところ、ｐＳＢ２００、ｐＳＢ２５ＵＮｐＨｍ、ｐＳＢ２００ＰｃＨｍＧＷの場合、解析した全てのクローンでベクター（９．２から９．８ｋｂ）に相当するバンドが、ｐＬＣ４０、ｐＬＣ４０ＧＷＨ、ｐＬＣｌｅｏ、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１の場合、解析した全てのクローンでベクター（１３．２〜１４．２ｋｂ）に相当するバンドが現れた。各クローンのインサートの制限断片長を合計すると、クローニングされた大断片の長さの範囲は、２５ｋｂ〜４５ｋｂで、ｐＳＢベクターの場合平均でおよそ４０ｋｂ、ｐＬＣベクターの場合は平均でおよそ３５ｋｂであった。図１６にテオシントゲノムDNA/ｐＬＣ４０ＧＷＨの例を示す。【０１８０】
次にヒトゲノム（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ，Ｍａｌｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製、品番  Ｇ１４７１）をＴａｑＩで部分分解、３０〜４０ｋｂ断片を調製、ベクターｐＬＣ４０ＧＷＨにクローニングした。任意の１２クローンに関し、ヒトゲノム断片を含む大腸菌からプラスミドＤＮＡを精製し、インサート両端の塩基配列を解読、データベースサーチを行った。データベースはＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、ＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。その結果、単離した１２クローン中１１クローンが、それぞれ、データベース中のヒトゲノム断片を含む１１種類の単一クローンの中に含まれることが分かった。反復配列を含む１クローンを除き、残り１０クローンに関して、データベース中のヒトゲノム配列と相同性を有する部分から、クローニングしたヒトゲノム断片の長さを推定すると、２８０２３ｂｐ、３１６４５ｂｐ、３８２６５ｂｐ、３９５９９ｂｐ、３１９６５ｂｐ、３２６３１ｂｐ、３４７２７ｂｐ、３６９２５ｂｐ、３８７９４ｂｐ、３４３６４ｂｐとなった。平均すると３４６９３．８ｂｐとなり、上述の植物ゲノムをクローニングした場合と良く一致した。【０１８１】
次にクローン化した植物ゲノムＤＮＡ断片の両末端の塩基配列を決定した。得られた３００〜６００塩基の配列データに関して、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）および、北京ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｂｔｎ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ：８０８０／ｒｉｃｅ／）を用いてＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。その結果、オリザ・ルフィポゴン、アラビドプシスの場合、その全てのクローンで少なくとも１００ｂｐ以上の範囲にわたり、それぞれ、イネ、アラビドプシスのゲノム配列と８７〜１００％の相同性を示した。その他の植物種のライブラリーにおいても、イネ、アラビドプシス、トウモロコシ、ソルガム、等の配列と有意な相同性を示した。【０１８２】
実施例３  三菌株接合法によるアグロバクテリウムへの導入
１）三菌株接合法によるアグロバクテリウムへの導入とその効率
植物ゲノム断片が導入された各ベクターは、下記のように、三菌株接合法によって、アグロバクテリウムに移行させた。【０１８３】
ｉ）ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクター
ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターは、カナマイシン（Ｋｍ）とハイグロマイシン（Ｈｍ）耐性である。宿主大腸菌として、ＧｅｎｅＨｏｇｓTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。三菌株接合の際のヘルパープラスミドとして、ｐＲＫ２０７３（スペクチノマイシン（Ｓｐ）耐性）を用いた。ヘルパープラスミドの宿主大腸菌はＨＢ１０１を用いた。アグロバクテリウム菌株はＬＢＡ４４０４（薬剤耐性なし）を用いた。【０１８４】
まず適量のパッケージング反応希釈液を大腸菌ＧｅｎｅＨｏｇｓTMに感染させ、Ｋｍ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡ培地に塗布し、２３℃で３日間培養した。出現したコロニー中の菌を爪楊枝を用いて、Ｋｍを含むＬＡ培地に塗布し、２８℃で２晩培養した。一方ＬＢＡ４４０４はＡＢ培地に塗布し、２５℃で５日間培養した。ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０７３はＳｐ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡに塗布し、３７℃で２晩培養した。このように培養した、ゲノム断片をクローン化したｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターを含むＧｅｎｅＨｏｇｓTM、ＬＢＡ４４０４、ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０７３の三菌株をＮＡ培地上で混合し、２８℃一晩培養した。三菌株の混合物全量を２５０μｌの滅菌水に懸濁し、５μｌをＫｍ（５０μｇ／ｍＬ）とＨｍ（２５μｇ／ｍＬ）を含むＡＢ培地に塗布し、２８℃で７日間培養した。得られた組換えアグロバクテリウムを植物形質転換実験に供試した。なお、この単一コロニーをＫｍとＨｍを含むＡＢ培地で再培養し、生育したコロニーの一部を薬剤を含むＬＡ培地に塗布したところ、大腸菌はほとんど増殖してこないことが判明した。【０１８５】
ｉｉ）ｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクター
ｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクターはＳｐとＨｍ耐性である。宿主大腸菌として、ＧｅｎｅＨｏｇｓTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ヘルパープラスミドとしてｐＲＫ２０１３（Ｋｍ耐性）を用いた。ヘルパープラスミドの宿主大腸菌としてＨＢ１０１を用いた。アグロバクテリウム菌株としてｐＳＢ１を含むＬＢＡ４４０４（テトラサイクリン（Ｔｃ）耐性）を用いた。【０１８６】
まず適量のパッケージング反応希釈液を大腸菌ＧｅｎｅＨｏｇに感染させ、Ｓｐ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡ培地にて、２３℃で３日間培養した。コロニーを爪楊枝で拾い、Ｓｐを含むＬＡ培地に塗布し、２８℃で２晩培養した。一方ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１はＴｃ（１５μｇ／ｍＬ）を含むＡＢ培地に塗布し、２５℃で５日間培養した。ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３はＫｍ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡ培地に塗布し、３７℃で２晩培養した。このように培養した、ゲノムＤＮＡ断片をクローン化したｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクターを含むＧｅｎｅＨｏｇｓTM、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１、ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３を、ＮＡ培地上で混合し、２８℃１晩培養した。三菌株混合物全量を２５０μｌの滅菌水に懸濁し、２５μｌをＳｐ（５０μｇ／ｍＬ）、Ｈｍ（２５μｇ／ｍＬ）を含むＡＢ培地に塗布し、２８℃で７日間培養した。得られた組換えアグロバクテリウムを植物形質転換実験に供試した。【０１８７】
ｉｉｉ）ｐＣＬＤ０４５４１
Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ大学のＤｒ．Ｈｏｎｇｂｉｎ  Ｚｈａｎｇから入手した２種類の、ベクターｐＣＬＤ０４５４１を用いて作成された、ゲノムライブラリー（イネ品種ＣＯ３９のゲノム、並びにアラビドプシスｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｏｍｂｉａ、ともに平均インサート長１１０  ｋｂ、宿主大腸菌はＤＨ１０Ｂ）を用いて三菌株接合を行った。ｐＣＬＤ０４５４１ベクターはＫｍとＴｃ耐性である。ヘルパープラスミドとしてｐＲＫ２０７３を用い、ヘルパープラスミドの宿主大腸菌としてＨＢ１０１を用いた。アグロバクテリウム菌株としてＬＢＡ４４０４を用いた。【０１８８】
ｐＣＬＤ０４５４１ライブラリーの各クローンを含む大腸菌を、Ｔｃ（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡに塗布し、２８℃で２晩培養した。一方、ＬＢＡ４４０４はＡＢ培地に塗布し、２５℃で５日間培養した。ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０７３はＳｐ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＡに塗布し、３７℃で２晩培養した。このように培養した、ゲノムＤＮＡ断片をクローン化したｐＣＬＤ０４５４１を含むＤＨ１０Ｂ、ＬＢＡ４４０４、ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０７３を、ＮＡ培地上で混合し、２８℃で１晩培養した。三菌株混合物全量を２５０μｌの滅菌水に懸濁し、数μｌをＫｍ（２５μｇ／ｍＬ）含むＡＢ培地に塗布し、２８℃で７日間培養した。得られた組換えアグロバクテリウムを植物形質転換実験に供試した。【０１８９】
以上のようにして、ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクター、ｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクター、および、ｐＣＬＤ０４５４１ベクターを用いて作成されたライブラリーに含まれるゲノムクローンを、アグロバクテリウムへ導入した。これらの三菌株接合の全容、ならびに三菌株接合の効率は表７の通りである。ｐＬＣ系ベクターの場合、９７％の三菌株接合効率、ｐＳＢ系ベクターの場合、７９％の三菌株接合効率、ｐＣＬＤ０４５４１の場合、９３％の三菌株接合効率で、ｐＬＣ系ベクターが最も高かった（表１０）。【０１９０】
【表１０】
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２）ゲノムＤＮＡの安定性
各クローンに保持されているゲノムＤＮＡ断片が、アグロバクテリウムに伝達されているか否かを解析するため、ゲノムＤＮＡ断片全体をプローブに用いたサザンハイブリダイゼーションを行った。大腸菌、およびアグロバクテリウムから常法に従いプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩで消化した。次に消化物の一部をアガロースゲル電気泳動で分画し、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄＮ＋に転写した。次にこのメンブレンに対し、大腸菌由来のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ消化物の一部（エタノール沈殿、ＴＥに再溶解したもの）をＥＣＬ−ｒａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャム）を用いてラベルし、これをプローブとしたハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション、洗浄、シグナル検出はＥＣＬ添付のキットに従った。ルフィポゴン断片がｐＬＣ４０ＧＷＨにクローニングされた４種のプラスミドを用いた結果、その全てにおいて大腸菌からアグロバクテリウムへのゲノムＤＮＡ断片の移行が確認された。【０１９１】
実施例４  ｐＬＣベクターによる大断片のイネ形質転換
１）イネ形質転換とその効率
ｉ）イネ形質転換方法
イネ品種にはゆきひかりを用い、未熟胚にアグロバクテリウムを感染させた。イネの形質転換については、特願２００３−２９３１２５に記載の方法によった。ただし、アグロバクテリウム接種の前処理として、無菌的に取り出したすべての未熟胚に遠心処理を実施した。具体的には、未熟胚を１ｍｌの滅菌水の入ったエッペンドルフチューブへ移し、２００００  ｘ  ｇで１０分間処理を行った（２５℃）。選抜薬剤としてハイグロマイシンＢを用い、選抜培地、再分化培地および発根培地にそれぞれ５０ｍｇ／ｌ添加した。ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクター、ｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクターの場合、アグロバクテリウム１菌株（１種類のＤＮＡ断片）につき１未熟胚へ接種した。一方、ｐＣＬＤ０４５４１の場合、アグロバクテリウム１菌株（１種類のＤＮＡ断片）につき２未熟胚へ接種した。なお選抜薬剤にはパロモマイシンを用い、４００〜８００ｍｇ／ｌの濃度で選抜培地、再分化培地および発根培地へ添加した。【０１９２】
ｉｉ）植物ゲノム断片のイネへの導入
表１１に形質転換の結果を示した。ｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクターの場合、５９．１％〜６２．７％の菌株からハイグロマイシン耐性個体を得た。それに対し、ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターでは８６．６％〜９５．４％の菌株から形質転換体を得ることができた。ゲノムＤＮＡを供与した３種類の植物（オリザ・ルフィポゴン、スーダングラス、極早生イタリアンミレット）のいずれにおいても、ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターを用いた場合の方が、２４％〜３６％、効率が高かった。一方、ｐＣＬＤ０４５４１ベクターの場合は、４１〜５３．４％という低い効率であった。これらのことから、ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターはｐＳＢ２００シリーズのコスミドベクターやｐＬＣＤ０４５４１に比べ、ゲノムＤＮＡ断片を効率良くイネに導入できるベクターであると考えられた。【０１９３】
次に、通常の大きさの遺伝子発現ユニットの形質転換効率を調べるため、導入するＤＮＡ断片がＧＵＳ遺伝子の場合における、ベクターの比較試験を行った。各２５個のゆきひかり未熟胚を供試して実施した結果、ｐＳＢ１３４（ＷＯ２００５／０１７１６９）が未熟胚当たり平均１１．７個体のハイグロマイシン耐性再生個体が得られたのに対して、ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳでは平均１１．５個の再生個体が得られた。【０１９４】
【表１１】
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２）大断片導入の確認
ｉ）断片の両端外側のＰＣＲ
形質転換体１１個体とゆきひかりの若葉から、上述の方法を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡに対して下表の２組のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ｐＳＢ２００−９５３１Ｆ、ｐＳＢ２００−４ＲはＲＢ〜ゲノムＤＮＡ断片までの間の１３９ｂｐの領域を増幅させるプライマーである。ＨＰＴｉｎＲＶ、ＨＰＴｉｎＦＷはハイグロマイシン耐性遺伝子の内部を増幅させるプライマーである（表１２）。ＰＣＲは３５サイクル行った。その結果、対照のゆきひかりからは両プライマーともに、ＰＣＲ産物が得られなかったのに対して、形質転換体ではＨＰＴｉｎＲＶ、ＨＰＴｉｎＦＷの場合、１１個体全てで産物が増幅された。また、ｐＳＢ２００−９５３１Ｆ、ｐＳＢ２００−４Ｒでは、１１個対中１０個体においてＰＣＲ産物が得られた。このことから、ｐＬＣベクターで形質転換された植物体の大多数において、ゲノムＤＮＡ断片の両端外側が導入されていることが明らかとなり、ゲノムＤＮＡ断片の導入が確認できた。【０１９５】
【表１２】
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ｉｉ）断片両末端と内部配列のＰＣＲ
ｐＬＣ４０ＧＷＨベクターを用いてゆきひかりへの導入を試みた３種類のオリザルフィポゴン断片（Ａ、Ｂ、Ｃと呼ぶ）について、Ｔ０植物を２個体ずつ供試して、各断片の両末端と中央部が導入されているか否かを、ＰＣＲにより分析した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間処理した後、９４℃で３０秒間の熱変性、６０℃で３０秒間のアニ−リング、６０℃で３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で２分間処理することとした。【０１９６】
Ａ断片のＲＢ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−９５３１ＦとＡ断片に特異的なプライマー（５’−  ｇｔｔ  ａａｔ  ｔｔｃ  ｔｔｇ  ｔｇａ  ｔｃｇ  ａａｇ  ｇａｃ  −３’（配列番号１１））によるＰＣＲ（ＰＣＲ１）を行った。Ａ断片の中央部を検出するためには、Ａ断片に対応する日本晴配列ＡＰ００４６６７（データベース検索により同定）とオリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、ＣＡＰＳ法（Konieczny and Ausubel 1993 Plant Journal 4: 403-410）によりＰＣＲ検定を行った。具体的には、２種類のプライマー（５’−ｇｇｇ  ａｔｔ  ｃｔｔ  ｔａｔ  ｇｃｔ  ｇｇｇ  ｔｔｔ  ａｇｇ−３’（配列番号１２）および５’−ｇｃａ  ａｇｃ  ａａｔ  ａｃｃ  ｔｃｔ  ｇｔｔ  ａｔｇ  ｃｔｇ−３’（配列番号１３））によりＰＣＲ（ＰＣＲ２）を行い、産物をＳｓｐＩで消化した。ＨＰＴ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−１７０ＲとＡ断片に特異的なプライマー（５’−ｇｔｔ  ｔｔｃ  ａｇａ  ｔｇｇ  ｃｇａ  ｃｃｔ  ｃａｇ  ｃｔｔ  ｔｇ−３’（配列番号１４））によるＰＣＲ（ＰＣＲ３）を行った。【０１９７】
Ｂ断片およびＣ断片についても、同様のマーカー検定を行った。即ち、Ｂ断片のＲＢ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−９５３１ＦとＢ断片に特異的なプライマー（５’−ｃａｇ  ｇｔｇ  ｇｃｔ  ｔｔａ  ｔｔｃ  ｃｔｃ  ｃｔｃ  ｔｃａ−３’（配列番号１５））によるＰＣＲを行った。Ｂ断片の中央部を検出するためには、Ｂ断片に対応する日本晴配列ＡＰ００５９６７（データベース検索により同定）とオリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、ＣＡＰＳ法によりＰＣＲ検定を行った。具体的には、２種類のプライマー（５’−ｃｃｇ  ａａａ  ｇｔｔ  ｃｇｔ  ｇｇｇ  ｃａａ  ｔｇｃ  ｃｔａ−３’（配列番号１６）および５’−ｇｃｃ  ａｔｃ  ｃｔｔ  ａｇｃ  ａｔａ  ｔｇａ  ｇｔｇ  ｇｃａ−３’ （配列番号１７））によりＰＣＲを行い、産物をＨａｅＩＩＩで消化した。Ｂ断片のＨＰＴ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−１７０ＲとＢ断片に特異的なプライマー（５’−ｇｇｃ  ｔａｔ  ｔｔａ  ｃｇｔ  ｇｇｃ  ａｔｇ  ｔｔａ  ｃｇｔ−３’（配列番号１８））によるＰＣＲを行った。また、Ｃ断片のＲＢ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−９５３１ＦとＣ断片に特異的なプライマー（５’−ｔｃｇ  ｔａａ  ｇｔｃ  ｔａｃ  ｔｔｃ  ｃｃｔ  ｔｔａ  ｃｇａ−３’ （配列番号１９））によるＰＣＲを行った。Ｃ断片の中央部を検出するためには、Ｃ断片に対応する日本晴配列ＡＬ７１３９０７（データベース検索により同定）とオリザルフィポゴン配列との間で見出した塩基配列多型を利用して、ＣＡＰＳ法によりＰＣＲ検定を行った。具体的には、２種類のプライマー（５’−ｃｃａ  ａａｃ  ｃａｃ  ａｔｃ  ｃｔｔ  ａｔａ  ｇｔｇ  ｔｇｃ−３’（配列番号２０）および５’−ｃｃｔ  ｃａｔ  ｔｇｃ  ａｔｇ  ｃｇｇ  ｔｃａ  ｃｔａ  ｃ−３’ （配列番号２１））によりＰＣＲを行い、産物をＨｉｎｆＩで消化した。Ｃ断片のＨＰＴ側を検出するためには、ｐＳＢ２００−１７０ＲとＣ断片に特異的なプライマー（５’−ｇｃａ  ｇｇｇ  ｔａｔ  ｔａａ  ｔｃｇ  ａｔｃ  ａａｃ  ａｃｃ−３’ （配列番号２２））によるＰＣＲを行った。【０１９８】
Ｂ断片の分析結果を図１７に、またＡ〜Ｃ断片の分析結果を表１３にまとめた。Ａ断片については調べた２個体の形質転換体では、大断片全体が導入されたものは得られなかったものの、中央と片端、もしくは両端の導入が検出された個体が得られた。一方、Ｂ断片およびＣ断片については、調査した２個体のうちの１個体が、オリザルフィポゴン断片の全体、即ち両端部および中央部を保有することが示された。以上の結果から、ｐＬＣベクターによって、２５〜４０ｋｂのサイズの植物ゲノム断片を、植物に導入できることが確認された。【０１９９】
【表１３】
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実施例５  ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターによるトウモロコシの形質転換
１）ｐＬＣとｐＴＯＫ４７、またはｐＬＣとｐＶＧＷとの共存
トウモロコシの形質転換は、通常のバイナリーベクターでは特殊な方法（Frame et al. (2002) Plant Physiol 129: 13-22）を除き、形質転換効率が非常に低いため、その効率を上げるにはｖｉｒ遺伝子を含むベクターが必要である（Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50）。ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクターは通常のバイナリーベクターであるので、ｖｉｒ遺伝子を利用して、形質転換効率を向上させる技術が必要である。そこで、まず、ｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクター（ＩｎｃＰプラスミド）と細菌の中で共存でき、かつｖｉｒ遺伝子を発現するベクターｐＴＯＫ４７（Jin et al. 1987 J Bacteriol 169: 4417-4425）、ならびに本発明で新規に構築したｐＶＧＷを利用した。ｐＴＯＫ４７は、アグロバクテリウムの菌株Ａ２８１に由来するｖｉｒＢ遺伝子とｖｉｒＧ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ＫｐｎＩ  １４．８ｋｂ断片）を有し、ＩｎｃＰプラスミドと共存できるＩｎｃＷプラスミドである。また、ｐＶＧＷは、変異型ｖｉｒＧ（ｖｉｒＧＮ５４Ｄ）を持ちＩｎｃＷ  ｏｒｉを有するプラスミドである。【０２００】
ｐＴＯＫ４７（テトラサイクリン耐性）を、三菌株接合法により、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４またはＥＨＡ１０５（Ｐｕｒｄｕｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳｔａｎｔｏｎ  Ｇｅｌｖｉｎ博士から譲受）に導入した。このアグロバクテリウムからプラスミドを抽出し、制限酵素分析でｐＴＯＫ４７の存在を確認した。さらに完成したＬＢＡ４４０４／ｐＴＯＫ４７、またはＥＨＡ１０５／ｐＴＯＫ４７（Ｔｃ耐性）に、三菌株接合法により、ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、または、ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳを導入した。これらのアグロバクテリウムを、ＬＢＡ４４０４／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＥＨＡ１０５／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＥＨＡ１０５／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳと記載する。アグロバクテリウムからプラスミドＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによる分析を行い、ＶｉｒＧ、ＲＢ、ｈｐｔまたはｂａｒ、ＧＵＳ遺伝子の存在確認を行った。【０２０１】
同様にして、ｐＶＧＷをエレクトロポレーション法でアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入し、ゲンタマイシン（Ｇｍ  ５０μｇ／ｍＬ）でコロニーを選抜した。完成したＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷに、三菌株接合法により、ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、または、ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳを導入した。これらのアグロバクテリウムを、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳと記載する。アグロバクテリウムコロニー（ＫｍとＧｍ耐性）を直接、ＰＣＲ分析に供試し、ＶｉｒＧ、ｈｐｔまたはｂａｒ、ＧＵＳ遺伝子の存在確認を行った。【０２０２】
さらに、ＩｎｃＰ  プラスミドであるｐＢＩ１２１由来のｐＩＧ１２１Ｈｍ（Hiei et al. (1994) Plant J 6: 271-282）を、ＬＢ４４０４／ｐＴＯＫ４７に導入して、アグロバクテリウムＬＢ４４０４／ｐＴＯＫ４７／ｐＩＧ１２１Ｈｍを作成し、トウモロコシ形質転換実験の対照とした。【０２０３】
２）トウモロコシの形質転換
大きさ約１．２ｍｍのトウモロコシ未熟胚（品種：Ａ１８８）を温室栽培した植物から無菌的に取り出し、アグロバクテリウム懸濁用液体培地（ＬＳ−ｉｎｆ，  Ishida et al. 1996）に浸漬した。４６℃、３分間の熱処理後、同液体培地で未熟胚を１回洗浄した。次に１５，０００  ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心処理を行った後、未熟胚を、各菌株を約１ｘ１０9  ｃｆｕ／ｍｌで懸濁したＬＳ−ｉｎｆ培地（アセトシリンゴン１００(Ｍを含む）に浸漬後、共存培地（ＬＳ−ＡＳ  （Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50）にＡｇＮＯ3、ＣｕＳＯ4を添加）に置床した。２５℃、暗黒下で３日間培養後、一部の未熟胚についてＧＵＳ分析を行った。【０２０４】
共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンあるいはフォスフィノスライシンを含む選抜培地（Ishida et al. (2003) Plant Biotechnology 20:57-66）に置床し培養した。増殖したカルスを小片に切り取り、ハイグロマイシン（Ｈｍ）あるいはフォスフィノスライシン（ＰＰＴ）を含む再分化培地（Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50）に置床し、照明下で培養した。２週間後、ＨｍあるいはＰＰＴに抵抗性を示す再分化植物の調査を行った。【０２０５】
まず、各種菌株をＡ１８８未熟胚に接種し、共存培養３日目にＧＵＳ遺伝子の一過性の発現を観察した。対照のＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１３４を接種した未熟胚では広い範囲でＧＵＳ遺伝子の発現がみられた。これに対し、ＬＢＡ４４０４／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳを接種した未熟胚ではほとんどのものが発現を示さず、ごく小さいスポット状の発現をするものが僅かにみられた。宿主をＥＨＡ１０５にした場合も発現の増大はみられなかった。ＬＢＡ４４０４／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳでは、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１３４  には劣るものの、ほとんどの未熟胚でＧＵＳ遺伝子の発現を示すスポットが観察され、アグロバクテリウム菌株Ａ２８１由来のｖｉｒＢ遺伝子とｖｉｒＧ遺伝子を含むプラスミドの共存、または、ｖｉｒＧＮ５４Ｄを含むプラスミドの共存、あるいはｖｉｒＧ遺伝子を付加することによる遺伝子導入効率の向上が確認された。また、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳと、ｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧＣ１：３５Ｓ−ＩＧＵＳでは、ＧＵＳ遺伝子の発現に差異はなく、ＮｓｐＶ認識部位除去のための１塩基置換はｖｉｒＧ活性に影響しないことが明らかとなった。【０２０６】
次に、共存培養後の未熟胚をＨｍあるいはＰＰＴを含む選抜培地、再分化培地で培養し、形質転換植物の作出を試みた。ＥＨＡ１０５を宿主とした場合、ｐＬＣＳＢＧＷＢＳＷベクターではＰＰＴ抵抗性植物は全く得られなかった。しかし、ＬＢＡ４４０４を宿主とした場合、ｐＬＣＳＢＧＷＢＳＷベクターは同菌株を宿主としたスーパーバイナリーベクターｐＳＢ１３１（Ｔ−ＤＮＡ領域にＧＵＳ遺伝子とｂａｒ遺伝子が配置されている、Ishida et al. 1996 Nat Biotechnol 14:745-50）と同様の効率でＰＰＴに抵抗性を示す植物が得られた（表１４）。【０２０７】
一方、ＬＢＡ４４０７／ｐＴＯＫ４７／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳにおいても、スーパーバイナリーベクターｐＳＢ１３１と同様に高い効率でＰＰＴ抵抗性植物の得られることが明らかとなった。また、選抜マーカー遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子とした場合でも、ｐＴＯＫ４７と共存させたｐＬＣ４０シリーズのコスミドベクター（ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ）ではハイグロマイシン抵抗性植物が得られた（表１３）。また、ｖｉｒＧ遺伝子を組み込んだｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１においても、スーパーバイナリーベクターｐＳＢ１３４（Ｔ−ＤＮＡ領域にＧＵＳ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子が配置されている、Hiei and Komari 2006 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 85: 271-283）と同レベルの効率を得ることができた（表１４）。【０２０８】
【表１４】
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続いて、ｐＶＧＷのトウモロコシ形質転換への影響を調べるために、ＬＢＡ４４０４／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＶＧＷ／ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、ＬＢＡ４４０４／ｐＳＢ１３４でトウモロコシを形質転換し、再分化個体のＧＵＳ発現を解析した。その結果、ｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳではＧＵＳ発現個体数は０％（０／１６）であった一方で、ｐＶＧＷを共存させたｐＬＣ４０：３５Ｓ−ＩＧＵＳ、同ｐＬＣ４０ＧＷＢ：３５Ｓ−ＩＧＵＳでは、接種未熟胚当たりのＧＵＳ発現個体数の比率がそれぞれ４０％（６／１５）、３０％（６／２０）に達し、スーパーバイナリーベクターｐＳＢ１３４の４１．２％（７／１７）と同レベルであった。即ち、ｐＶＧＷを用いることによって、ｐＬＣベクターによる高効率トウモロコシ形質転換を実現することができた。【０２０９】
さらに、ｐＬＣベクターとｐＶＧＷベクターの共存による、植物ゲノム断片のトウモロコシへの形質転換を試みた。ベクターｐＬＣ４０ＧＷＢのＮｓｐＶ部位に、スーダングラスのゲノム断片（３０−３５ｋｂ）をランダムにクローニングした。得られた大腸菌のプラスミドを、三菌系接合によって、ｐＶＧＷを有するアグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）に移行させた。こうして、スーダングラスのゲノム断片が組み込まれたｐＬＣ４０ＧＷＢとｐＶＧＷの両方のプラスミドを有するアグロバクテリウムを作成し、トウモロコシ未熟胚（品種：Ａ１８８）に接種した。形質転換細胞の選抜を行ったところ、接種した２７断片のうち、１７断片で再分化植物が得られた（表１５）。このことから、ｐＬＣとｐＶＧＷの共存により、植物ゲノム断片をトウモロコシに効率的に形質転換できることが示された。【０２１０】
以上の結果から、例えばｐＴＯＫ４７のような、アグロバクテリウム菌株Ａ２８１由来のｖｉｒＢ遺伝子とｖｉｒＧ遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むプラスミドを共存させることで、あるいは、例えばｐＶＧＷのような、ｖｉｒＧ  Ｎ５４Ｄ遺伝子を含むプラスミドを共存させることで、また、例えばｐＬＣ４０ＧＷＨｖＧ１のようなｖｉｒＧ遺伝子をｐＬＣベクターに組込むことによってトウモロコシの形質転換を効率的に行えることが示された。【０２１１】
【表１５】
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実施例６  ｐＬＣベクターを用いた、ＢＡＣクローンからの目的遺伝子の単離
Komori et al.(2004)（Plant J 37: 315-325）は、イネ品種ＩＲ２４から単離したＰＰＲ７９１遺伝子を細胞質雄性不稔系統に導入すると稔性が回復することを見出し、ＰＰＲ７９１が稔性回復遺伝子Ｒｆ−１であることを証明した。ＰＲＲ７９１遺伝子は、以前にKazama and Toriyama (2003)（FEBS Lett 544: 99-102）によってＲｆ−１候補と報告されていたイネ品種Ｍｉｌｙａｎｇ２３のＰＰＲ８−１遺伝子と同一であった。そこで、ＰＰＲ８−１遺伝子が由来するＭｉｌｙａｎｇ２３のＢＡＣクローンＯＳＩＭＢｂ００４６Ｆ０８をクレムソン大学から入手し、当該ＢＡＣからＲｆ−１を単離するモデル実験を行った。【０２１２】
まず、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍａｒｌｉｇｅｎ社）を用いて、ＯＳＩＭＢｂ００４６Ｆ０８からプラスミドを抽出した。そのプラスミドをＴａｑＩで部分分解し、ショ糖密度勾配超遠心により３０ｋｂ付近のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片と、ｐＬＣ４０ＧＷＨをＢｓｔＢＩ消化しＣＩＰ処理を行ったベクター、またはｐＳＢ２００をＢｓｔＢＩ消化しＣＩＰ処理を行った ベクターとを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ）を用いてライゲーションした。得られたコンストラクトはエレクトロポレーション法により大腸菌に導入し、適当な抗生物質（５０μｇ／ｍｌカナマイシンまたはスペクチノマイシン）を含むＬＢプレート上で形質転換体のコロニーを得た。次に、得られたプラスミド中のＲｆ−１遺伝子の有無を調べるため、これらのコロニーを鋳型にして、Ｒｆ−１遺伝子に設計したプライマー（ＷＳＦ７Ｔ７Ｒ１及びＩＲ５０２２６Ｒ、表１６）を用いたダイレクトＰＣＲ（実施例１、３）を参照）を行い、約２ｋｂの増幅産物が得られるものをＲｆ−１ポジティブクローン、当該産物の増幅が見られないものをＲｆ−１ネガティブクローンとして選別した。このＰＣＲスクリーニングにおけるポジティブクローンの出現率はｐＬＣ４０ＧＷＨコンストラクトで５／３９（１２．８％）、ｐＳＢ２００コンストラクトで６／９６（６．３％）であった。即ち目的遺伝子のクローニング効率は、ｐＬＣベクターの方が、ｐＳＢに比較して、およそ２倍の高さであった。【０２１３】
ｐＬＣ４０ＧＷＨコンストラクトからポジティブクローンを１つ、ネガティブクローンを２つ選抜し、また、ｐＳＢ２００コンストラクトから、ポジティブクローンを１つ、ネガティブクローンを２つ選抜して、三菌株接合法により大腸菌からアグロバクテリウムへ移行させた。得られたアグロバクテリウムを、Komori et al.(2004)に記載された方法により、細胞質雄性不稔系統であるＭＳコシヒカリに感染させた。得られた形質転換イネを馴化後、温室で栽培した。登熟期に、各個体から標準的な穂を採取し、稔実率を調査した。その結果、Rf-1を含まないコンストラクト（ｐＬＣ−７、ｐＬＣ−１１、ｐＳＢ−１、ｐＳＢ−７）からの形質転換個体は、不稔であった一方で、Ｒｆ−１を包含するコンストラクトｐＬＣ−８、ｐＳＢ−３７からは稔実個体が得られた（表１７）。【０２１４】
以上の結果から、目的遺伝子を包含しているＢＡＣのＤＮＡから、植物形質転換用コスミドベクターを用いてライブラリーを作成し、植物に導入した後、期待する表現型を示す植物を選抜することにより、効率的に目的遺伝子を同定できることが実証された。【０２１５】
【表１６】
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【０２１６】
【表１７】
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以上のことから、ｐＬＣベクター系の特徴として、
１．２５〜４０ｋｂ程度のＤＮＡを容易にクローニングできること；、
２．細菌の中で安定であること；そして
３．植物、特に単子葉植物を高い効率で形質転換できること
が挙げられる。ｐＬＣ系ベクターは、機能ゲノミクス分野で、中型ＤＮＡを扱うベクターとして有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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