(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、
ＧＦＲＡ１遺伝子ゲノムＤＮＡの一部又は全部、当該遺伝子ｃＤＮＡの一部または全部、または当該遺伝子ｍＲＮＡの一部または全部である、単離されたポリヌクレオチドからなり、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を含むことを特徴とするマーカー。
【請求項２】
前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１または２に記載のマーカー。
【請求項４】
哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、
ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたＤＮＡにおいて、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項４または５に記載のキット。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のキットであって、
さらに制限酵素を含み、
前記制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された塩基が前記変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された塩基を含むポリペプチドの切断様式が異なることを特徴とするキット。
【請求項８】
請求項７のキットであって、
前記制限酵素がＭｗｏＩであることを特徴とするキット。
【請求項９】
ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、
前記哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、配列番号１を有するＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を有するか否か、を調べる工程を含む診断方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の診断方法であって、
ＧＦＲＡ１遺伝子座の両方のアリルで前記変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、
ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルで前記変異を有している場合に、
前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断する工程とを含む診断方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の診断方法。
【請求項１２】
前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項１３】
前肢帯筋異常症のキャリアであるヒト以外の哺乳動物個体の同定方法であって、
前肢帯筋異常症を発症していないヒト以外の哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異を有するか否かを調べる工程と、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と前記変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在するヒト以外の哺乳動物個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと前記変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するヒト以外の哺乳動物個体を同定する工程とを含むことを特徴とする同定方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１３に記載の同定方法。
【請求項１５】
前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の同定方法。
【請求項１６】
前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子が、前記前肢帯筋異常症の原因であるかどうかを決定する方法であって、
前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、
決定された前記塩基配列と、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列とを比較する工程と、
決定された前記塩基配列に配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異が存在するか否かを決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物個体がウシ個体であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異を起こした塩基がＴであることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前肢帯筋異常症（forelimb-girdle muscular anomaly）は、家畜では三枚肩ともよばれ、前肢帯筋の低形成による振戦と起立困難を主な症状とする遺伝子疾患であることが知られている。ウシでは、前肢帯筋異常症発症個体は多くの場合廃用とせざるを得ないため、本疾患の発症は生産者に多大な経済的損失を与える。この遺伝子疾患は、劣性突然変異によるものであることが知られているが、その原因遺伝子は不明でキャリア個体を同定することができないため、疾患の発生を予防することができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Masoudi et al., Animal Science Journal 78(6), 672-675, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋形成異常の診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１０５４１１．１）の１０６０番目の塩基に対応する、ウシゲノム上の塩基が、健常個体ではＣであるが、前肢帯筋異常症に罹患したウシ個体、および、前肢帯筋異常症のキャリアであるウシ個体は、この塩基がＴに変異したナンセンス変異を有し、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させていることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００６】
本明細書において、哺乳動物は、ヒトでもヒト以外でもよく、マウス、ラット、ウサギ、サル等の実験動物、イヌ、ネコ等のペット、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等の家畜であってもよい。
【０００７】
本明細書において「ウシ」はBos属の動物を指し、例えば、Bos taurus種の家畜牛、Bos javanicus種のバンテン（野生牛）、Bos indicus種のコブウシなどが含まれる。
【０００８】
本明細書において、塩基の位置に関する記載は特記しない限り、ＤＮＡ２重鎖のうち、センス鎖の塩基によって示す。また、塩基の位置は、例えば、GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) family receptor alpha 1（ＧＦＲＡ１）遺伝子のｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１１０５４１１．１、配列番号１）の１０６０番目というように、基準となる塩基配列中で、当該塩基配列の５’側から３’側方向に数えることで特定されているが、実際のウシ個体の塩基配列中では、その塩基は、基準となる塩基配列中で特定した塩基に対応する位置にあればよく、その塩基が含まれるゲノムＤＮＡ上に塩基の欠失や挿入がある場合には、必ずしも塩基の位置を表わす数字まで一致する必要はない。
【０００９】
本発明に係るマーカーは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドからなり、前記ポリヌクレオチドは、前記遺伝子の機能欠失型変異を含むことを特徴とする。ここで、哺乳動物個体はウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異であることがより好ましい。
【００１０】
本発明に係るマーカーは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、機能を欠失したＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ、あるいは、機能を欠失したＧＦＲＡ１タンパク質であることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係るキットは、哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の機能欠失型変異を有する塩基を増幅するためのプライマーペアを含むことを特徴とする。ここで、哺乳動物個体はウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における変異であることがより好ましい。
【００１２】
本発明に係るキットは、さらに制限酵素を含み、この制限酵素は、前記プライマーペアによって増幅された塩基が前記遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かに依存して、前記プライマーペアによって増幅された塩基を含むポリペプチドの切断様式が異なることがさらに好ましい。前記制限酵素は、ＭｗｏＩであることがさらに好ましい。
【００１３】
本発明に係る診断方法は、ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、前記哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子が野生型であるか機能欠失型変異を有するかを調べる工程を含む。ここで、この診断方法は、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない場合、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在する場合、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する場合、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断することが好ましい。
【００１４】
本発明に係る診断方法は、ＧＦＲＡ１遺伝子座の両方のアリルで機能欠失型変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルで機能欠失型変異を有している場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断する工程とを含むことがより好ましい。哺乳動物個体がウシ個体であることがさらに好ましい。
【００１５】
本発明に係る診断方法は、前記機能欠失型変異が配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡにおける１０６０番目の塩基のナンセンス変異であることがさらに好ましい。また、ナンセンス変異がＣからＴへの変異であることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明に係る診断方法は、ヒト以外の哺乳動物個体において、前肢帯筋異常症に罹患していることを診断するための診断方法であって、前記哺乳動物個体における、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現量、あるいは、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。ここで、前記発現量が検出できない場合に、前記哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していると診断することが好ましい。
【００１７】
本発明に係る同定方法は、前肢帯筋異常症のキャリアであるヒト以外の哺乳動物個体の同定方法であって、前肢帯筋異常症を発症していないヒト以外の哺乳動物個体から単離されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異を有するか否かを調べる工程と、前記ゲノムＤＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子と機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子が存在するヒト以外の哺乳動物個体、または、前記ｍＲＮＡに野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在するヒト以外の哺乳動物個体を同定する工程とを含むことを特徴とする。なお、哺乳動物個体がウシ個体であることが好ましい。また、機能欠失型変異が、配列番号１を有する前記ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基における、ＣからＴへのナンセンス変異であることがより好ましい。
【００１８】
本発明に係る前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子が、前記前肢帯筋異常症の原因であるかどうかを決定する方法は、前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部または全部を決定する工程と、決定された前記塩基配列と、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列とを比較する工程と、決定された前記塩基配列に機能欠失型変異が存在するか否かを決定する工程と、を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明に係るマーカーは、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーであって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上の塩基または塩基配列を有する単離されたポリヌクレオチドであることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係るキットは、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのキットであって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上を増幅するための１以上のプライマーペアを含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る診断方法は、ウシ個体において、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するための診断方法であって、前記ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含む。
【００２２】
本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３０のジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
【００２３】
本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
【００２４】
本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｂのジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
【００２５】
本発明に係る診断方法は、さらに、ウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程を含み、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが疾患型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症の罹患個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合である場合に、前記ウシ個体が前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断し、前記ＳＮＰ Ｄのジェノタイプが健常型のホモ接合である場合に、前記ウシ個体が健常個体であると診断することが好ましい。
【００２６】
本発明に係る同定方法は、前肢帯筋異常症のキャリアであるウシ個体の同定方法であって、前肢帯筋異常症を発症していないウシ個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄから成る群から選択される１以上のジェノタイプが健常型であるか疾患型であるかを調べる工程と、調べたジェノタイプが健常型と疾患型のヘテロ接合であるウシ個体を同定する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によると、哺乳動物個体における前肢帯筋異常症を診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋異常症の診断方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の一実施形態である、ＭＯＫ２６３０の健常型（１〜７番）および疾患型（８番）の泳動図である。
【図２】本発明の一実施形態である、ＭＯＫ２６３７の健常型（１、２、４番）および疾患型（３番）の泳動図である。
【図３】本発明の一実施形態である、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４におけるナンセンス変異を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態において、健常黒毛和種（レーン１、Normal）、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種（レーン２、Carrier）、前肢帯筋異常症罹患黒毛和種（レーン３、Affected）のゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ産物をＭｗｏＩで消化して得られたＤＮＡ断片のパターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００３０】
実施の形態および実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００３１】
なお、本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００３２】
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子、ＧＦＲＡ１タンパク質に関連するマーカー＝＝
前肢帯筋異常症は、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる劣性の変異（機能欠失型変異）に起因する疾患である。すなわち、ゲノムＤＮＡ上に野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合、その個体（本明細書では、罹患個体とも呼ぶ）は前肢帯筋異常症に罹患している。なお、その場合には、個体の有する全てのＧＦＲＡ１遺伝子が、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子である場合も含まれる。また、その個体が、少なくとも一つの野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有すれば、その個体の表現型は正常であり、前肢帯筋異常症を発症しない。ただし、その個体が野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有する場合であっても、少なくとも一つの機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子を有すれば、その個体（本明細書では、キャリア個体とも呼ぶ）は前肢帯筋異常症のキャリアとなり、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子を有さなければ、その個体（本明細書では、健常個体とも呼ぶ）は、前肢帯筋異常症を発症せず、キャリアにもならない。なお、この健常個体は、そのＧＦＲＡ１遺伝子の全てのコピーが野生型ＧＦＲＡ１遺伝子である個体であって、表現型が正常であっても、キャリア個体や前肢帯筋異常症を発症していない罹患個体は含まない。
【００３３】
従って、例えば、その個体が、ゲノム上のＧＦＲＡ１遺伝子座に１つずつ、２コピーのＧＦＲＡ１遺伝子のアリルを有する場合、すなわち、通常のＧＦＲＡ１遺伝子以外に、余分な遺伝子コピーを有しない場合、２つのアリルが機能欠失型変異を有すれば、前肢帯筋異常症の罹患個体となり、一方のアリルだけが機能欠失型変異を有すれば、前肢帯筋異常症のキャリアとなり、両方のアリルが野生型なら、健常個体となる。
【００３４】
ここで、本明細書において「前肢帯筋異常症」は、ウシにおいて「前肢帯筋異常症」または「三枚肩」として知られる疾患、および、ウシ以外の哺乳動物においてウシの「前肢帯筋異常症」に対応する疾患、あるいは前肢帯筋または上肢帯筋の形成不良を呈する疾患を指し、その哺乳動物において「前肢帯筋異常症」という疾患名で知られていない疾患であってもよい。
【００３５】
ここで、哺乳動物個体が「前肢帯筋異常症を発症している」とは、個体が前肢帯筋異常症に罹患していることに起因して、前肢帯筋または上肢帯筋の形成不良が認められることを指す。特に、四肢哺乳動物では、前肢帯筋の形成不良による肩甲部の突出、耳介の下垂等の形態的特徴に加え、起立困難や振戦等の運動機能低下等の健常個体では見られない異常も呈することがある。ただし、これらの身体的異常、運動機能の異常は、その程度により限定されないものとする。そして、個体が「前肢帯筋異常症に罹患している」とは、その個体が前肢帯筋異常症を発症していても、発症していなくてもよく、遺伝的に、ゲノム上に野生型ＧＦＲＡ１遺伝子が存在しない場合をいう。
【００３６】
また、前肢帯筋異常症は、ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡとも関係があり、前肢帯筋異常症の罹患個体では、ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ中に、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在しない。前肢帯筋異常症のキャリア個体では、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡと機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡが存在する。そして、健常個体では、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡのみが存在し、機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡは存在しない。
【００３７】
このように、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドであって、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる変異を含むポリヌクレオチドは、個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもｍＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。
【００３８】
なお、本明細書において、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子とは、機能欠失型変異を有さないＧＦＲＡ１遺伝子、および機能欠失型変異を有さないＧＦＲＡ１遺伝子において、塩基の置換、挿入、欠失などが生じている遺伝子であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こす遺伝子を指す。ここで、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の由来する動物は、哺乳動物の中から、診断対象によって適宜選択すればよい。例えば、ウシの場合、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子は、配列番号２のＧＦＲＡ１遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：５３４８０１）、並びに、配列番号２のＧＦＲＡ１遺伝子において、塩基の置換、挿入、欠失などが生じている遺伝子であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こす遺伝子を指す。
【００３９】
ここで、変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子のみを有する個体が前肢帯筋異常症を発症する場合に、その変異を機能欠失型変異であるという。そして、そのＧＦＲＡ１遺伝子を、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子という。一方、ＧＦＲＡ１遺伝子に変異が生じても、その変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子のみを有する個体が前肢帯筋異常症を発症しない場合には、その変異は機能欠失型変異に含めないものとする。
【００４０】
ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異は、その変異に起因して前肢帯筋異常症を発症するものであれば、遺伝子上の位置、塩基の種類によって限定されず、例えば、点突然変異、欠失突然変異、挿入突然変異等のいずれであってもよい。また、その機能欠失型変異に起因して、前肢帯筋異常症を発症するならば、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質を発現していても、あるいは、発現していなくてもよい。
【００４１】
例えば、ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異がナンセンス変異であって、翻訳により生成されるタンパク質が短鎖化される場合、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を欠失させる変異であれば、変異が生じた塩基の遺伝子上の位置は限定されない。その機能欠失型変異は、例えば、ウシであれば、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１１０５４１１．１、配列番号１）の１０６０番目の塩基に対応する塩基におけるＣからＴへのナンセンス変異や、それより５’側の塩基におけるナンセンス変異であってもよい。ウシ以外の哺乳動物の場合、その動物のＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡにおいて、前述のウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基に対応する塩基のナンセンス変異、または、それより５’側の塩基におけるナンセンス変異であってもよい。
【００４２】
前肢帯筋異常症に罹患した個体、あるいは、前肢帯筋異常症のキャリアである個体において、機能欠失型変異を有する変異型ＧＦＲＡ１遺伝子が転写されて変異型ＧＦＲＡ１ｍＲＮＡが生成され、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質が発現する場合には、このような機能を失った変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、および、機能を失った変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ等も、個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００４３】
また、前肢帯筋異常症に罹患した個体では、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の発現量が、健常個体と比較して、前肢帯筋異常症罹患を発症させる程度に低下しているか、無くなっている。従って、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、および、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ等の発現量も、個体が前肢帯筋異常症に罹患していることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００４４】
なお、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質とは、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質、並びに、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質において、アミノ酸の置換、挿入、欠失などが生じているタンパク質であって、個体内でその発現が失われたときに前肢帯筋異常症を引き起こすタンパク質を指す。ここで、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質の由来する動物は、哺乳動物の中から、診断対象によって適宜選択すればよい。ウシの場合、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質は、配列番号３のＧＦＲＡ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１０９８８８１．１）、およびそのホモログ、並びに、配列番号３のＧＦＲＡ１タンパク質またはそのホモログにおいて、アミノ酸の置換、挿入、欠失などが生じているタンパク質であって、ウシ個体内でその発現が失われた時に前肢帯筋異常症を引き起こすタンパク質を指す。
【００４５】
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子、ＧＦＲＡ１タンパク質に関連するマーカーを用いた診断方法＝＝
これらのマーカーを用いて、以下のように、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断することができる。
【００４６】
哺乳動物個体が、前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることは、まず哺乳動物個体からゲノムＤＮＡを単離し、その単離されたゲノムＤＮＡに対し、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かを調べることで診断できる。すなわち、（１）機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子の存在に関わらず、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有しない場合、その個体は前肢帯筋異常症に罹患していると診断でき、（２）機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子と野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有する場合、その個体は前肢帯筋異常症のキャリアであると診断でき、（３）野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有し、機能欠失型変異を有するＧＦＲＡ１遺伝子を有しない場合、健常個体と診断できる。ここで、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かを調べる方法は特に限定されず、例えば、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列を決定してもよく、あるいは、既知である特定の塩基置換を検出する場合には、ＲＦＬＰを利用してもよい。
【００４７】
特に、機能欠失型変異が、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへの変異である場合、ＰＣＲを用いて、当該塩基を含むゲノムＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片に対してＭｗｏＩを反応させ、ＰＣＲ産物が切断されるかどうか調べてもよい。この場合、当該塩基がＣからＴに変異している場合にはＰＣＲ産物がＭｗｏＩで切断されないが、変異していない場合にはＭｗｏＩで切断されるため、当該塩基が野生型か変異型かを容易に決定することができる。例えば、酵素で切断後のＰＣＲ産物を、電気泳動で分離し、ＭｗｏＩで切断されたＰＣＲ産物のみが検出される場合、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリアでなく罹患もしていない健常個体であり、ＭｗｏＩで切断されないＰＣＲ産物とＭｗｏＩで切断されたＰＣＲ産物とが検出される場合、前肢帯筋異常症のキャリア個体であり、ＭｗｏＩで切断されないＰＣＲ産物のみが検出される場合、前肢帯筋異常症に罹患している罹患個体である、と診断できる。
【００４８】
あるいは、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していることは、その個体の組織において、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。組織は、例えば、血液、精液、筋肉、神経、骨、腎臓、肝臓、胸腺、皮膚、受精卵が挙げられるが、健常個体において野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡが発現している組織である範囲で制限されない。その結果、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、その個体は、前肢帯筋異常症に罹患していると診断することができる。
【００４９】
また、哺乳動物個体が、前肢帯筋異常症のキャリアであることは、その個体の前肢帯筋組織において、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を調べることによって診断してもよい。その結果、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質と変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡと野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡが両方とも検出された場合には、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリア個体であると診断することができる。
【００５０】
なお、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、野生型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出され、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、または、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現が検出されない場合には、その個体は、前肢帯筋異常症のキャリア個体、または、健常個体であると診断することができる。
【００５１】
ここで、タンパク質、またはそのタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現の検出方法は、野生型または変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、あるいは、野生型または変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを特異的に検出できる方法であればよく、タンパク質やｍＲＮＡの全長を検出する方法であっても、一部を検出する方法であってもよい。検出方法は、当業者に周知の方法を適宜用いればよく、ｍＲＮＡであればノザンブロット法や逆転写ＰＣＲ法、タンパク質であれば特異的抗体を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などが例示できる。
【００５２】
このようにして、哺乳動物個体を診断することにより、外見的には正常であっても、将来前肢帯筋異常症を発症するであろう罹患個体を特定できる。また、前肢帯筋異常症のキャリアの個体も、表現型として疾患の症状が認められないが、以上の診断方法によって、キャリア個体を同定し、キャリア個体を交配集団から隔離あるいは除去したり、キャリア個体同士を交配させないようにしたりすることによって、前肢帯筋異常症の罹患個体が発生することを未然に防ぐことが可能である。
【００５３】
＝＝遺伝子治療＝＝
前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体は、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を有しておらず、従って、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子を遺伝子導入したトランスジェニック個体を作出することによって、治療可能である。
【００５４】
また、ＧＦＲＡ１遺伝子の一方のアリルに機能欠失型変異を有している、前肢帯筋異常症のキャリアである哺乳動物個体の場合、この機能欠失型変異を有するアリルにおいて、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異を修復し、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子にすればよい。これまで哺乳動物を用いて、胚幹細胞が樹立され（Biochem. Biophys. Res. Commun. vol.309, p.104-113, 2003）、ノックアウト個体も作出されている（Nat. Ganet. vol.36, p.671-672, 2004）。このような発生工学的な遺伝子組換え技術を用い、哺乳動物個体において、特定の塩基を目的の塩基に置換することが可能であり、機能欠失型変異を修復することができる。
【００５５】
＝＝前肢帯筋異常症の原因となる変異を特定する方法＝＝
前肢帯筋異常症に罹患した哺乳動物個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアである個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列の一部、または、全部を決定し、得られた塩基配列を、野生型ＧＦＲＡ１遺伝子の塩基配列と比較し、ＧＦＲＡ１遺伝子に機能欠失型変異が存在するか否かを決定することにより、前肢帯筋異常症の原因がＧＦＲＡ１遺伝子にあるかどうか、また、前肢帯筋異常症の原因がＧＦＲＡ１遺伝子にある場合、どのような変異が原因になっているのかを調べることができる。
【００５６】
例えば、前肢帯筋異常症に罹患した個体、または、前肢帯筋異常症のキャリアの個体において、ＧＦＲＡ１遺伝子に変異が存在し、その変異が機能欠失型変異である場合には、その前肢帯筋異常症はＧＦＲＡ１遺伝子の変異に起因するものであると判定することができる。
【００５７】
この方法によって決定された機能欠失型変異を含む、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチドは、哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用できる。
【００５８】
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子周辺のマーカー＝＝
実施例２に示すように、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失変異をホモ接合で有する哺乳動物個体は前肢帯筋異常症を発症し、ヘテロ接合で有する哺乳動物個体は前肢帯筋異常症のキャリアである。ウシ第２６番染色体上のマイクロサテライトマーカーであるＭＯＫ２６３０、ウシ第２６番染色体上のマイクロサテライトマーカーであるＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄ（表１）のジェノタイプは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることと強い相関があり、それによって、ウシＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異とも強い相関を有する。従って、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上を含む、１本以上の単離されたポリヌクレオチドは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用することができる。
【表１】
0005127004.tif 000002
【００５９】
なお、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄは連鎖不平衡の状態にあって、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプは互いに強い相関があるため、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプのうち、いずれか１個を決定すれば、他のジェノタイプが推定できる。例えば、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプが健常型であれば、他３個のジェノタイプも健常型であり、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうちいずれか１個のジェノタイプが疾患型であれば、他３個のジェノタイプも疾患型であると推定される。
【００６０】
ここで、ＭＯＫ２６３０はウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３６２２２０００番目から始まる繰り返し配列を有するＤＮＡであり、ＭＯＫ２６３７はウシゲノムウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３６９７７０７８番目から始まる繰り返し配列を有するＤＮＡであり、ＳＮＰ Ｂはウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３３７３３７２７番目の塩基であり、ＳＮＰ Ｄはウシゲノムアッセンブリ（Btau4.0）のウシ２６番染色体の３７０１３７６２番目の塩基である（表１）。
【００６１】
ＳＮＰ ＢにはＴとＧの２種類のＳＮＰが存在し、Ｔが健常型、Ｇが疾患型である。ＳＮＰ ＤにはＡとＧの２種類のＳＮＰが存在し、Ａが健常型、Ｇが疾患型である（表１）。
【００６２】
ＭＯＫ２６３０のアリルは、その塩基配列に含まれるＧＴの繰り返し回数により特定される。また、ＭＯＫ２６３７のアリルは、その塩基配列に含まれるＡＴの繰り返し回数により特定される。ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７の疾患型アリルを同定するためには、各１個体以上の健常個体と罹患個体において、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のアリルを調べ、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のそれぞれで、健常個体にはほとんど検出されず、罹患個体に有意に高頻度で検出されるアリルを決定すればよい。また、ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７の健常型アリルを同定するためには、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のそれぞれで、罹患個体にはほとんど検出されず、健常個体に有意に高頻度で検出されるアリルを決定すればよい
【００６３】
例えば、表１に示すプライマーペアを用いて黒毛和種のウシ複数個体においてＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７のアリルを調べ、健常個体と罹患個体において比較すると、ＭＯＫ２６３０には、ＧＴの繰り返し回数が異なる８種類のアリルが存在した。繰り返し回数の少ない方から１番〜７番は健常型、繰り返し回数の最も多い８番が疾患型である（図１、上から、１番〜８番）。また、ＭＯＫ２６３７には、ＡＣの繰り返し回数が異なる４種類のアリルが存在した。繰り返し回数の少ない方から数えて１番、２番、および４番が健常型、３番が疾患型である（図２、上から１番〜４番）。
【００６４】
なお、マーカーとして使用するポリヌクレオチドを構成する塩基数は特に限定されない。また、マーカーとして使用するポリヌクレオチドは、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂにおける塩基、および、ＳＮＰ Ｄにおける塩基のうち、１個以上を有していればよく、複数を有している場合、どの組み合わせであっても構わない。
【００６５】
＝＝ＧＦＲＡ１遺伝子周辺のマーカーを用いた診断方法＝＝
ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄを用いて、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患している、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためには、その個体から単離されたゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、マイＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうち少なくとも１個以上のジェノタイプを決定する。
【００６６】
ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、例えば、それらの塩基配列を直接決定することによって、あるいはＰＣＲやＲＦＬＰを利用することによって決定してもよく、特に決定方法は限定されず、当業者に周知の方法を用いて決定すればよい。塩基配列をＰＣＲにより決定する場合には、例えば表１に示すプライマーペアを用いてもよい。塩基配列を直接決定する場合には、マーカーを構成するポリヌクレオチドにおける全ての塩基を決定してもよいが、マーカーを構成するポリヌクレオチドに含まれる、ＭＯＫ２６３０の塩基配列、ＭＯＫ２６３７の塩基配列、ＳＮＰ Ｂにおける塩基、および、ＳＮＰ Ｄにおける塩基から成る群より選択される１個以上を決定することができれば十分である。
【００６７】
なお、ＭＯＫ２６３０、およびＭＯＫ２６３７は、健常型アリルおよび疾患型アリルの場合にはそれぞれＧＴとＡＣの一定の繰り返し回数を有するから、診断対象のウシ個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプを決定するためには、その塩基配列を調べたり、あるいは、電気泳動等で塩基長を調べ、そのアリルが、それぞれ疾患型であるか、健常型であるかを検出する。または、診断対象のウシ個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプを決定するために、診断対象の個体から得られたＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７の塩基長を、ＭＯＫ２６３０とＭＯＫ２６３７の既知の疾患型アリル、または健常型アリルの塩基長と比較し、診断対象の個体におけるＭＯＫ２６３０、またはＭＯＫ２６３７のジェノタイプが健常型であるか、疾患型であるかを調べてもよい。
【００６８】
なお、ゲノムＤＮＡを単離する組織の種類や量は、マイクロサテライトの塩基配列やＳＮＰの塩基を決定するために必要なＤＮＡ量が得られる範囲で特に制限されない。
【００６９】
上述したように、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄは連鎖不平衡の状態にあるので、少なくともいずれか１個のジェノタイプを決定すれば、その哺乳動物個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることが診断できるが、いずれか２個以上、より好ましくは３個以上、最も好ましくは４個のジェノタイプを決定すれば、より正確に診断を行うことができる。
【００７０】
なお、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄのうち、２個あるいは３個におけるジェノタイプを決定して診断を行う場合には、その組み合わせは特に限定されない。例えば、その組み合わせは、ＭＯＫ２６３０およびＭＯＫ２６３７；ＭＯＫ２６３０およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３０およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３０、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｂ；ＭＯＫ２６３７およびＳＮＰ Ｄ；ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄ；ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄが例示できる。
【００７１】
具体的には、前肢帯筋異常症に罹患しているウシ個体では、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、それぞれ疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプのホモ接合であり、前肢帯筋異常症のキャリア個体では、それぞれ疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプと、それぞれ健常型アリルと健常型ＳＮＰから成るハプロタイプとのヘテロ接合である。健常個体では、それぞれ健常型アリルと健常型ＳＮＰから成るハプロタイプのホモ接合である。実施例３に示すように、健常個体では、疾患型アリルと疾患型ＳＮＰから成るハプロタイプを有するウシ個体は全く存在しない。
【００７２】
従って、ウシ個体から単離したゲノムＤＮＡにおいて、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄのいずれか１個以上のジェノタイプを調べ、それぞれ疾患型のホモ接合であれば、その個体は前肢帯筋異常症に罹患しており、それぞれ健常型と疾患型のヘテロ接合であれば、その個体は前肢帯筋異常症のキャリアであり、それぞれ健常型のホモ接合であれば、その個体は健常個体であると診断できる。なお、複数のマーカーのジェノタイプを調べた場合に、異なる結果が得られた場合、ＧＦＲＡ１遺伝子と連鎖率の高いマーカーの結果を優先して判断してもよいが、さらに調べるマーカー数を増やして判断してもよい。
【００７３】
このようにして、ウシ個体を診断することにより、外見的には正常であっても、将来前肢帯筋異常症を発症するであろう罹患個体を特定できる。また、前肢帯筋異常症のキャリアの個体も、表現型として疾患の症状が認められないが、以上の診断方法によって、キャリア個体を同定し、キャリア個体を交配集団から隔離あるいは除去したり、キャリア個体同士を交配させないようにしたりすることによって、前肢帯筋異常症の罹患個体が発生することを未然に防ぐことが可能である。
【実施例】
【００７４】
[実施例１]  本実施例では、ウシＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異の有無を、ＲＦＬＰ法により検出し、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
【００７５】
前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体、健常黒毛和種３７個体、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種６個体（罹患ウシおよび健常ウシの父親ウシ１個体、母親ウシ３個体、父親ウシの父１個体、父親ウシの祖父ウシ１個体）の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。なお、キャリア個体は、その産子が発症個体であることにより判別した。その個体を下記のプライマーペアを用いたＰＣＲ法により、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４を含む３４５ｂｐの領域を増幅した。
ＧＦＲＡ１−Ｆ２：ATGCTCCTCACGGTACCTCTGTCCTAAA（配列番号１２）
ＧＦＲＡ１−Ｒ３：GTTCCCTTCCAGAGCTCAAGC（配列番号１３）
【００７６】
このＰＣＲ産物を、制限酵素ＭｗｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動により、ＤＮＡ断片を分離した。
【００７７】
なお、図３に示すように、ＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４においては、罹患個体では両方のアリルで、キャリア個体では一方のアリルで変異が生じている。この変異はＧＦＲＡ１遺伝子のコード領域の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへのナンセンス変異であって、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能を失わせる変異である。ＰＣＲにより増幅された増幅断片において、この変異を有する場合はＭｗｏＩで切断されないが、この変異を有さない場合はＭｗｏＩで切断される。
【００７８】
図４に示すように、健常個体（レーン１）では、１９９ｂｐおよび１４６ｂｐのバンドが検出され、キャリア個体（レーン２）では、３４５ｂｐ、１９９ｂｐおよび１４６ｂｐのバンドが検出され、罹患個体（レーン３）では、３４５ｂｐのバンドが検出された。
【００７９】
このように、ＧＦＲＡ１遺伝子のコード領域の１０６０番目の塩基におけるＣからＴへの変異を調べることで、その個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断できる。
【００８０】
[実施例２]  本実施例では、ＧＦＲＡ１遺伝子における機能欠失型変異の有無により、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
【００８１】
前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体、健常黒毛和種３７個体、前肢帯筋異常症キャリア黒毛和種６個体（罹患ウシおよび健常ウシの父親ウシ１個体、母親ウシ３個体、父親ウシの父１個体、父親ウシの祖父ウシ１個体）の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。単離したＤＮＡについて、実施例１のプライマーペア（配列番号１２、１３）を用いたＰＣＲ法により、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のエクソン４を含む３４５ｂｐの領域を増幅した。なお、キャリア個体は、その産子が発症個体であることにより判別した。
【００８２】
前肢帯筋異常症発症個体全２６個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）の１０６０番目の塩基がＴのホモ接合であり、キャリア個体全６個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基がＣとＴのヘテロ接合であり、健常個体全３７個体において、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基がＣのホモ接合であった。
【００８３】
また、上記の黒毛和種家系とは別の集団内の健常個体１２５個体について、同様にＧＦＲＡ１遺伝子ｃＤＮＡの１０６０番目の塩基を調べたところ、全ての個体でＣのホモ接合であった。
【００８４】
このように、ウシＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の塩基のＣからＴへの変異を調べることで、そのウシが前肢帯筋異常症に罹患していること、前肢帯筋異常症のキャリアであることを１００％の確率で診断することができる。
【００８５】
また、ＧＦＲＡ１遺伝子のｃＤＮＡの１０６０番目の変異は、ＧＦＲＡ１遺伝子の機能欠失型変異であることから、この結果は、ＧＦＲＡ１遺伝子が機能欠失型変異を有するか否かによって、ウシが前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断できることを示し、ウシ以外の哺乳動物においても、前肢または上肢の帯筋の形成不良を呈する疾患の罹患、保因を診断できることを示している。
【００８６】
[実施例３]  本実施例では、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプの検出により、前肢帯筋異常症に罹患していること、および、そのキャリアであることを診断できることを示す。
【００８７】
前肢帯筋異常症発症黒毛和種２６個体の精液、血液、または筋肉組織から、フェノール／クロロフォルム法によってＤＮＡを単離した。このＤＮＡについて、表１に記載の各検出用プライマーペアを用いてＰＣＲを行い、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄが含まれるＤＮＡ断片を増幅した。ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄのジェノタイプの検出には、さらに、ＭｓｅＩ（ＳＮＰ Ｂ）、ＢａｍＡＩ（ＳＮＰ Ｄ）の制限酵素による切断を行った。
【００８８】
ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、およびＳＮＰ Ｄのジェノタイプは、２６個体において、全て疾患型、すなわち８番、３番、Ｇ（表１）のホモ接合であった。ＳＮＰ Ｂのジェノタイプは、２５個体で疾患型、すなわちＧ（表１）のホモ接合であったが、１個体のみ疾患型（Ｇ）と健常型（Ｔ）のヘテロ接合であった（表２）。
【表２】
0005127004.tif 000003
【００８９】
なお、健常黒毛和種について、同様にＭＯＫ２６３０（６１個体）、ＭＯＫ２６３７（１１９個体）、ＳＮＰ Ｂ（１１８個体）、ＳＮＰ Ｄ（１１７個体）のジェノタイプを調べたところ、ＭＯＫ２６３０、ＳＮＰ Ｂ、ＳＮＰ Ｄが疾患型のホモ接合の個体は存在しなかった。なお、ＭＯＫ２６３７が疾患型のホモ接合の個体は１個体のみであった。また、疾患型と健常型のヘテロ接合については、ＭＯＫ２６３０が１１個体、ＭＯＫ２６３７が１８個体、ＳＮＰ Ｂが８個体、ＳＮＰ Ｄが２８個体であった。健常型のホモ接合については、ＭＯＫ２６３０が５０個体、ＭＯＫ２６３７が１００個体、ＳＮＰ Ｂが１１０個体、ＳＮＰ Ｄが８９個体であった（表３）。
【表３】
0005127004.tif 000004
【００９０】
このように、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、およびＳＮＰ Ｄを調べることで、そのウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患しているかどうかを高い確率で診断できる。
【要約】
【課題】本発明は、哺乳動物個体における前肢帯筋異常症およびそのキャリアを診断するためのマーカーおよびそれを用いた哺乳動物個体における前肢帯筋異常症およびそのキャリアの検出方法を提供すること。
【解決手段】ＧＦＲＡ１機能欠失型変異を含む、ＧＦＲＡ１遺伝子の一部または全部を有する単離されたポリヌクレオチド、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質、変異型ＧＦＲＡ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを、個体が前肢帯筋異常症であること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用する。また、ＭＯＫ２６３０、ＭＯＫ２６３７、ＳＮＰ Ｂ、および、ＳＮＰ Ｄから成る群より選択される１つ以上を含む、単離されたポリヌクレオチドは、ウシ個体が前肢帯筋異常症に罹患していること、または、前肢帯筋異常症のキャリアであることを診断するためのマーカーとして使用することができる。
【選択図】なし【図１】
0005127004.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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