(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中の微小物体を細管により回収する微小物体回収装置であって、
前記細管を移動する移動機構と、前記細管に対して印加される圧力を調整するレギュレータとを制御する制御部を備え、
前記制御部は、
前記細管の吸引口を、所定の待機位置に移動したのちに、前記細管に対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させて、前記微小物体の位置を乱さない前記培養液の流れ場を生成し、
前記流れ場を生成する前記所定の負圧を維持しつつ、吸引を開始した前記細管の吸引口を、所定の吸引位置まで前記微小物体が配置される穴に近接させたのちに、前記細管を所定の停止時間にわたって停止させるように、前記移動機構と前記レギュレータとを制御する
ことを特徴とする微小物体回収装置。
【請求項２】
前記制御部の制御により前記細管を前記所定の停止時間にわたって停止させた後に、前記細管の吸引口から前記所定の負圧により回収目的とする前記微小物体を前記培養液ごと回収する
ことを特徴とする請求項１に記載の微小物体回収装置。
【請求項３】
前記制御部は、前記細管を、所定の第一の速度にて前記所定の吸引位置まで前記穴に近接させるように前記移動機構を制御する
ことを特徴とする請求項１または２に記載の微小物体回収装置。
【請求項４】
前記制御部は、前記所定の停止時間が経過したのちに、所定の第二の速度にて前記細管を前記穴から遠ざけるように、前記移動機構を制御する
ことを特徴とする請求項３に記載の微小物体回収装置。
【請求項５】
前記所定の待機位置、前記所定の吸引位置、前記所定の負圧、前記所定の停止時間、前記所定の第一の速度および前記第二の速度からなる制御条件を、事前に行なった吸引試験の結果に基づいて決定する制御条件決定部
をさらに備えたことを特徴とする請求項４に記載の微小物体回収装置。
【請求項６】
前記制御条件決定部は、前記吸引試験を、前記細管の位置、前記細管を前記穴に対して近接させる速度、前記細管を停止させる時間、前記細管を前記穴から遠ざける速度、あるいは前記細管と前記穴が設けられた基板の面との角度を、任意の組み合わせにおいて変更して行なう
ことを特徴とする請求項５に記載の微小物体回収装置。
【請求項７】
培養液中の微小物体を細管により回収する微小物体回収方法であって、
前記細管の吸引口を、所定の待機位置に移動したのちに、前記細管に対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させて、前記微小物体の位置を乱さない前記培養液の流れ場を生成する第一のステップと、
前記流れ場を生成する前記所定の負圧を維持しつつ、吸引を開始した前記細管の吸引口を、所定の吸引位置まで前記微小物体が配置される穴に近接させたのちに、前記細管を所定の停止時間にわたって停止させる第二のステップと、
を含んだことを特徴とする微小物体回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、微小物体回収装置および微小物体回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、微小物体を、微細なピペットなどの細管を用いて自動的に回収する技術の開発が進められている。
【０００３】
例えば、近年、遺伝子配列とたんぱく質の関係をライブラリー化するため、作製した遺伝子ライブラリーを動物細胞や酵母菌などの細胞に導入し、遺伝子ライブラリーが導入された大量の細胞を、微小物体整列用のチップ（以下、単にチップと記載する場合がある）に整列して配置することが行なわれている。
【０００４】
微小物体整列用のチップは、膨大な数の穴（ウェル）が、基板上に集積して作製されたものである。例えば、微小物体整列用のチップにおいては、図７に示すように、ガラスや樹脂などの基板上に、直径１５μｍ、深さ７μｍの１００００個以上の微細な凹状の穴が、５０μｍ間隔で集積して作製され、これらのウェル内に、遺伝子ライブラリーが導入された大量の細胞が配置される。図７は、微小物体整列用のチップの一例を説明するための図である。
【０００５】
ここで、遺伝子ライブラリーとともに、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光たんぱく質の遺伝子を細胞に導入しておくことで、導入した遺伝子配列に対応するたんぱく質を高発現している細胞が選択される。具体的には、培養液を重層したチップに整列された膨大な数の細胞を、蛍光顕微鏡により観察し、蛍光たんぱく質が高発現されていることにより蛍光強度が高くなっている細胞を、たんぱく質を高発現している細胞として選択する。
【０００６】
そして、選択した蛍光強度の高い細胞を、微細なピペットで吸引回収するが、ピペットを手動で操作して細胞などの微小物体を回収することは、高度な技術を持つ技術者でなければ困難である。例えば、技術者は、顕微鏡に接続されるモニタに表示される画像を参照しながら、吸引口の内径が１０μｍ〜１５μｍの微細なピペットを、直径が４〜５μｍの酵母菌に近接させる必要がある。このため、第一の従来技術においては、図８に示すように、回収対象である細胞が配置されているウェルまでピペットの吸引口を移動させて、負圧をピペットに印加することにより、細胞を自動的に回収することが行なわれている。なお、図８は、第一の従来技術を説明するための図である。
【０００７】
しかし、第一の従来技術では、図８に示すように、回収対象となる微小物体を吸引する際に、周囲のウェルに配置された細胞も同時に誤吸引することがあった。また、上記した従来技術では、周囲のウェルにある細胞を、ウェルから吹き飛ばしてしまうこともあった。周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生する原因としては、以下のように２つの原因が挙げられる。
【０００８】
第一の原因は、チップの構造に起因するものである。すなわち、チップのウェルは、図７に示すように、微細な構造であるため、ウェルごとに培養液を充填しても、培養液は、すぐに蒸発してしまう。培養液の蒸発を防止するためには、チップに作製されたウェルすべてを覆うように培養液を重層する必要がある。すなわち、すべてのウェルが同じ培養液により繋がっているために、ピペットに印加された負圧により生じる流れ場は、図８に示すように、広範囲に及んでしまうので、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生する。
【０００９】
第二の原因は、回収時には回収対象となる細胞のみを回収し、回収時以外の待機時には周囲の細胞を誤吸引や吹き飛ばしたりすることがないように、微小な流れ場を発生するための精密な制御が困難であることに起因する。すなわち、ピペットによる吸引動作は、うず状の流れを発生する管外流れとなるため、流速分布は、ピペットおよびチップ面の形状や位置関係によって、流体力学的に大きく変化する。また、細胞のような微小物体を吸引する微細な吸引口を持つピペットでは、界面などの影響により、流体力学的に応答遅延や圧力のヒステリシスが顕著になる。さらに、ピペットに印加する圧力を発生するために空圧ポンプを制御する際に、空圧ポンプからの応答遅延が発生することは、避けられない。
【００１０】
すなわち、「流体力学的な流速分布の変化、応答遅延および圧力のヒステリシス」や「空圧ポンプからの応答遅延」を考慮して微小な流れ場の発生を制御することは困難であるので、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生する。
【００１１】
そこで、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしの発生を回避するための技術として、ピペットをウェルに密着させて吸引を開始する第二の従来技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。第二の従来技術においては、図９の（Ａ）に示すように、チップ上のウェルそれぞれに、微細な溝が設けられる。図９は、第二の従来技術を説明するための図である。
【００１２】
そして、図９の（Ｂ）に示すように、ピペットをウェルに密着させた状態で、ピペットに負圧を印加することで、回収対象となる細胞（微小物体）の吸引を開始し、溝とピペット先端との僅かな隙間から溶液を吸引させる事によって、周囲の細胞（微小物体）を巻き込むような液体流れが発生する事を防止している。すなわち、微小な絞りで流量を抑制して、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生することを回避している。
【００１３】
【特許文献１】特開２００７−１３９７０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ところで、上記した従来の技術は、回収対象となる微小物体のみを簡易に回収することができないという課題があった。
【００１５】
すなわち、上記したピペットをウェルに密着させて吸引を開始する技術では、ピペットとチップとの密着度を上げるために、ピペットが破損する可能性が高くなる。また、チップ面に対して、ピペットを垂直方向から接近させる必要があるために、装置の設計自由度が低くなる。さらに、上記したピペットをウェルに密着させて吸引を開始する技術にて用いられるチップでは、ウェルの形状が、溝を設けるといった特殊であるために、チップの製造が困難である。従って、上記したピペットをウェルに密着させて吸引を開始する技術では、回収対象となる微小物体のみを簡易に回収することができない。
【００１６】
そこで、この発明は、上述した従来技術の課題を解決するためになされたものであり、回収対象となる微小物体のみを簡易に回収することが可能になる微小物体回収装置および微小物体回収方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、この装置は、微小物体を細管により回収する微小物体回収装置であって、前記細管を移動する移動機構と、前記細管に対して印加される圧力を調整するレギュレータとを制御する制御部を備え、前記制御部は、前記細管の吸引口を、所定の待機位置に移動したのちに、前記細管に対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させ、吸引を開始した前記細管の吸引口を、所定の吸引位置まで前記微小物体が配置される穴に近接させたのちに、前記細管を所定の停止時間にわたって停止させるように、前記移動機構と前記レギュレータとを制御することを要件とする。
【発明の効果】
【００１８】
開示の装置は、吸引を開始した細管の移動を制御するだけで、回収対象となる微小物体のみを簡易に回収することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に添付図面を参照して、この発明に係る微小物体回収装置および微小物体回収方法の実施例を詳細に説明する。なお、以下では、この発明に係る微小物体回収装置を顕微鏡本体と組み合わせた顕微鏡システムに適用した場合を実施例として説明する。
【実施例】
【００２０】
［用語の説明］
まず最初に、以下の実施例で用いる主要な用語を説明する。以下の実施例で用いる「酵母菌」または「細胞」とは、遺伝子ライブラリーがＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の遺伝子とともに導入された形質転換済みの酵母菌のことである。
【００２１】
また、「チップ」とは、大量の微小物体としての「酵母菌」を、整列して配置するために用いられるものである。例えば、「チップ」においては、ガラスや樹脂などの基板上に、直径１５μｍ、深さ７μｍの１００００個以上の微細な凹状の「ウェル」が、５０μｍ間隔で集積して作製され、作製された「ウェル」内に、大量の「酵母菌」が配置される。なお、「ウェル」は、特許請求の範囲に記載の「穴」に対応する。
【００２２】
また、「回収対象となる細胞」とは、導入した遺伝子配列に対応するたんぱく質を高発現している細胞として選択された「酵母菌」のことであり、特許請求の範囲に記載の「微小物体」に対応する。具体的には、培養液を重層した「チップ」に整列された膨大な数の「酵母菌」が、蛍光顕微鏡としての顕微鏡本体により観察され、蛍光たんぱく質が高発現されていることにより蛍光強度が高くなっている細胞が、たんぱく質を高発現している「回収対象となる細胞」として選択される。
【００２３】
また、「ピペット」とは、「回収対象となる細胞」を吸引するための微細な吸引口（例えば、内径が１０μｍ〜１５μｍ）をもつガラス管であり、特許請求の範囲に記載の「細管」に対応する。
【００２４】
［本実施例における微小物体回収装置の概要および特徴］
続いて、図１を用いて、本実施例における微小物体回収装置の概要および特徴について説明する。図１は、本実施例における微小物体回収装置の概要および特徴を説明するための図である。
【００２５】
図１に示すように、本実施例における微小物体回収装置は、チップのウェル内に配置された回収対象となる細胞をピペットに負圧を印加することにより回収することを概要とし、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になることに主たる特徴がある。
【００２６】
この主たる特徴について簡単に説明すると、本実施例における微小物体回収装置は、ピペットの吸引口を、回収対象となる細胞が配置されるウェルから遠方にある待機位置に移動したのちに、ピペットに対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させる（図１の（１）参照）。すなわち、本実施例における微小物体回収装置は、ピペットに印加した負圧によって発生した流れ場によって、回収対象となる細胞の位置が乱されないことが事前に確認された待機位置で、培養液の吸引を開始することで、流れ場を安定化する。
【００２７】
そして、本実施例における微小物体回収装置は、培養液の吸引を開始したピペットの吸引口を、回収対象となる細胞が配置されるウェルに対して、吸引位置まで一定の速度で素早く近接させる（図１の（２）参照）。そして、本実施例における微小物体回収装置は、ピペットを、所定の停止時間にわたって短時間停止させ（図１の（３）参照）、さらに、所定の停止時間が経過したのちに、ピペットを、一定の速度で素早く待機位置まで戻す（図１の（４）参照）。
【００２８】
すなわち、ピペットの移動中では、吸い込みの強い領域が小さくなり、また、ピペットの移動制御が精密かつ迅速に実行できるために、吸い込みの強い領域が拡大する前にピペットを引き戻せることにより、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしを回避して回収対象となる細胞のみが回収される。
【００２９】
なお、待機位置、ピペットを移動させる速度（上記した「一定の速度」）およびピペットを停止させる時間（上記した「所定の停止時間」）は、試験用の細胞を用いて、事前に決定されるが、決定方法については後述する。また、図１においては、ピペットがチップ面に対して垂直方向に移動する場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、チップ面に対して任意の角度で移動する場合であっても、回収対象となる細胞のみが回収される。
【００３０】
このようなことから、本実施例における微小物体回収装置は、周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生することなく回収対象となる細胞のみを、吸引を開始したピペットの移動を制御するだけで回収することができる。すなわち、本実施例における微小物体回収装置は、上記した主たる特徴の通り、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になる。
【００３１】
［本実施例における顕微鏡システムの構成］
次に、図２を用いて、本実施例における顕微鏡システムを説明する。図２は、本実施例における顕微鏡システムの構成を説明するための図である。
【００３２】
図２に示すように、本実施例における顕微鏡システムは、微小物体回収装置１０と、顕微鏡本体２００とを備える。
【００３３】
まず、顕微鏡本体２００について説明する。顕微鏡本体２００は、図２に示すように、マニピュレーション機能を有する倒立型の蛍光顕微鏡である。マニピュレーション機能に関しては、正圧ポンプ２０１と、負圧ポンプ２０２と、移動機構２０３と、電空レギュレータ２０４と、マニピュレータ２０５と、ピペット２０６と、チップ２０７と、自動ステージ２０８と、培養ディッシュ２０９とを備える。
【００３４】
また、蛍光顕微鏡としての機能に関しては、ＣＣＤカメラ２１０と、フォーカスモータ２１１と、蛍光ランプ２１２と、シャッター２１３と、蛍光フィルタ２１４と、対物レンズ２１５と、照明２１６とを備える。なお、図示しないが、顕微鏡本体２００には、接眼レンズも備えられる。
【００３５】
ピペット２０６は、微細な吸引口を有するガラス管であり、マニピュレータ２０５は、ピペット２０６を支持する支持体であり、移動機構２０３は、後述する移動・圧力コントローラ１４による制御に基づいて、マニピュレータ２０５が支持するピペット２０６を３次元的に移動させる。なお、移動機構２０３は、特許請求の範囲に記載の「移動機構」に対応する。
【００３６】
電空レギュレータ２０４は、正圧ポンプ２０１および負圧ポンプ２０２によって生成される正圧および負圧を、後述する移動・圧力コントローラ１４による制御に基づいて、調整し、調整した圧力を、ピペット２０６に印加する。ここで、ピペット２０６に圧力を印加する機構としては、電気浸透流、電気泳動、空圧、油圧などのいずれでもよく、ピペット２０６に印加される圧力を任意に調整可能であればよい。なお、電空レギュレータ２０４は、特許請求の範囲に記載の「レギュレータ」に対応する。
【００３７】
チップ２０７は、大量の酵母菌を整列して配置されるウェルを備え、ウェルすべてを覆うように培養液が重層される。培養ディッシュ２０９は、ピペット２０６が回収した「回収対象となる細胞」を分離して培養するためのディッシュであり、ディッシュ内には、培養液が注入されている。
【００３８】
自動ステージ２０８は、チップ２０７および培養ディッシュ２０９が設置されるステージであり、後述する移動・圧力コントローラ１４による制御に基づいて、３次元的に移動する。  
【００３９】
ＣＣＤカメラ２１０は、後述するＣＣＤコントローラ１５による制御に基づいて、対物レンズ２１５を介して取得された顕微鏡画像（明視野画像または蛍光画像）を生成するためのセンサである。
【００４０】
蛍光ランプ２１２は、蛍光観察用の励起波長を照射するための光線を発生するランプであり、例えば、超高圧水銀灯、キセノンランプ、紫外線ＬＥＤなどが挙げられる。蛍光フィルタ２１４は、蛍光ランプ２１２が発生した光線を用いて、試料（本実施例では、チップ２０７のウェル内に配置された酵母菌）に対して所定の波長をもつ励起光を照射し、試料から発生した蛍光の波長のみを透過するためのフィルタセットを有する。
【００４１】
シャッター２１３は、蛍光ランプ２１２によって発生された光線を、蛍光フィルタ２１４に供給する時のみに開口される。フォーカスモータ２１１は、試料に対する焦点を合わせるために、対物レンズ２１５を上下方向に駆動するモータであり、照明２１６は、試料を撮影する場合に、試料に対して可視光もしくは励起光を照射する。なお、シャッター２１３の開閉、フォーカスモータ２１１の駆動および照明２１６の可視光もしくは励起光の照射は、後述する光学系コントローラ１６によって制御される。
【００４２】
続いて、微小物体回収装置１０について説明する。図２に示すように、微小物体回収装置１０は、モニタ１１と、キーボード１２と、マウス１３と、移動・圧力コントローラ１４と、ＣＣＤコントローラ１５と、光学系コントローラ１６と、制御条件決定部１７と、制御条件記憶部１８とを備える。
【００４３】
モニタ１１は、ＣＣＤコントローラ１５の制御に基づいてＣＣＤカメラ２１０が生成した撮影画像を表示したりするための表示部である。キーボード１２およびマウス１３は、微小物体回収装置１０の操作者から、撮影要求や、後述する制御条件決定要求を受け付けたりするための入力部である。
【００４４】
光学系コントローラ１６は、キーボード１２およびマウス１３を介して微小物体回収装置１０の操作者から受け付けた撮影要求に応じて、フォーカスモータ２１１、シャッター２１３および照明２１６を制御する。また、ＣＣＤコントローラ１５は、同じく撮影要求に応じて、ＣＣＤカメラ２１０を制御する。光学系コントローラ１６およびＣＣＤコントローラ１５による制御により、ＣＣＤカメラによって顕微鏡画像が生成される。
【００４５】
移動・圧力コントローラ１４は、後述する制御条件決定部１７による吸引試験を実行するために、移動機構２０３および電空レギュレータ２０４を制御して、ピペット２０６の移動や、ピペット２０６に印加される圧力の調整を行なう。なお、移動・圧力コントローラ１４は、特許請求の範囲に記載の「制御部」に対応する。
【００４６】
ここで、光学系コントローラ１６およびＣＣＤコントローラ１５の制御により、顕微鏡本体２００におけるチップ２０７のウェル内に配置された酵母菌の蛍光画像が、ＣＣＤカメラ２１０によって撮影される。そして、撮影された蛍光画像を参照した操作者によって、ＧＦＰが発現して蛍光強度が強い酵母菌が選択される。具体的には、蛍光強度が強い酵母菌が配置されるウェルが、マウス１３を介して操作者によって選択され、選択されたウェル内に配置される酵母菌が、回収対象となる細胞となる。
【００４７】
なお、本実施例では、回収対象となる細胞が、操作者の手動によって選択される場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、回収対象となる細胞が、自動的に選択される場合であってもよい。例えば、自動ステージ２０８の位置から、チップ２０７の上にあるウェルそれぞれの位置を取得し、ＣＣＤカメラ２１０によって撮影された蛍光画像において蛍光強度が強い領域の中で、ウェルの位置と一致する領域を検出する。そして、検出された領域の位置にあるウェルを、回収対象となる細胞が配置されているウェルとして、自動的に選択する場合であってもよい。
【００４８】
制御条件決定部１７は、回収対象となる細胞を回収する際に用いられる「待機位置」、「吸引位置」、「所定の負圧」、「停止時間」および「一定の速度」からなる制御条件を、事前に行なった吸引試験の結果に基づいて決定する。具体的には、制御条件決定部１７は、制御条件決定部１７が記憶する制御条件の初期値を読み込み、チップ２０７のウェル内にある酵母菌のうち、回収対象となる細胞として選択されなかった酵母菌（以下、テスト用酵母菌と記す）を用いて吸引試験を行なう。
【００４９】
なお、以下では、制御条件決定部１７が記憶する制御条件の初期値として、「待機位置」の初期値を「初期待機位置」、「吸引位置」の初期値を「初期吸引位置」、「所定の負圧」の初期値を「初期負圧」、「停止時間」の初期値を「初期停止時間」、「一定の速度」の初期値を「初期速度」として記載する。
【００５０】
例えば、制御条件決定部１７は、初期待機位置にピペット２０６の位置を移動したうえで、初期負圧をピペット２０６に印加するように、移動・圧力コントローラ１４を介して制御する。そして、制御条件決定部１７は、初期待機位置を変更することで、ピペット２０６の吸引口が、テスト用酵母菌が配置されるウェルから順次遠ざけるように、移動・圧力コントローラ１４を介して制御する。
【００５１】
そして、制御条件決定部１７は、初期負圧を印加した場合でも、ピペット２０６にテスト用酵母菌が回収されない位置を、待機位置として決定する。なお、制御条件決定部１７は、テスト用酵母菌が回収された場合は、ピペット２０６を別のテスト用酵母菌が配置されるウェルに移動したうえで、待機位置を決定するための吸引試験を行なう。
【００５２】
そして、制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４を介して、ピペット２０６を別のテスト用酵母菌が配置されるウェルに移動し、さらに、決定した待機位置までピペット２０６を移動させる。そして、制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４を介して、ピペット２０６に初期負圧を印加したうえで、ピペット２０６の位置を初期速度にて初期吸引位置まで移動し、初期停止時間させて、初期速度にて待機位置まで移動させる。
【００５３】
ここで、制御条件決定部１７は、テスト用酵母菌が回収されなかった場合、ピペット２０６を別のテスト用酵母菌が配置されるウェルに移動したうえで、初期停止時間を減少するように、また、初期速度を増加するように変更して吸引試験を行なう。なお、制御条件決定部１７は、テスト用酵母菌以外の周囲の酵母菌が吹き飛ばされた場合も、同様の変更をして吸引試験を行なう。
【００５４】
そして、制御条件決定部１７は、初期停止時間や初期速度を変更した吸引試験を行なって、目標とするウェル内にある酵母菌（テスト用酵母菌）のみが吸引される「停止時間：Ｔ０」および「一定の速度：Ｖ０」を決定する。そして、制御条件決定部１７は、決定した待機位置、「停止時間：Ｔ０」および「一定の速度：Ｖ０」を、制御条件記憶部１８に格納する。
【００５５】
なお、制御条件決定部１７は、待機位置、「停止時間：Ｔ０」および「一定の速度：Ｖ０」を決定するための吸引試験において、ＣＣＤコントローラ１５による制御に基づいてＣＣＤカメラ２１０が撮影した明視野画像を画像処理することにより、テスト用酵母菌が吸引されたか否かを判定する。
【００５６】
上述したように、本実施例における制御条件決定部１７は、吸引位置を「初期吸引位置」に、所定の負圧を「初期負圧」に固定したうえで、「初期待機位置」、「初期停止時間」および「初期速度」を変更して、待機位置、停止時間および一定の速度を決定する。
【００５７】
すなわち、本実施例における制御条件決定部１７は、「ピペット２０６の位置」を変更して待機位置を決定し、「ピペット２０６をウェルに対して近接させ遠ざける速度」および「ピペット２０６を停止させる時間」を変更して、停止時間および一定の速度を決定する。なお、上述した制御条件決定部１７による処理については、後に、フローチャートを用いて、さらに詳述する。
【００５８】
しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、変更される初期値としては、「初期待機位置」、「初期吸引位置」、「初期負圧」、「初期停止時間」あるいは「初期速度」のいずれであってもよく、変更される初期値の組み合わせについても任意に変更できる。
【００５９】
また、ピペット２０６が移動する際の加速度および減速度や、ピペット２０６が移動する際の空間軌道を、制御条件に加える場合であってもよい。
【００６０】
また、吸引試験としては、「ピペット２０６の位置」、「ピペット２０６をウェルに対して近接させ遠ざける速度」、「ピペット２０６を停止させる時間」あるいは、「ピペット２０６とチップ２０７の面との角度」を任意の組み合わせにおいて変更して行なうことができる。
【００６１】
また、本実施例では、ピペット２０６をウェルに対して近接させる速度と、ピペット２０６をウェルから遠ざける速度とが同じ場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、近接させる速度と、遠ざける速度とが異なる値である場合であってもよい。例えば、ピペット２０６をウェルから遠ざける際に、周囲のウェルにある酵母菌が吹き飛ばされないような速度を、吸引試験により第二の一定の速度として決定する場合であってもよい。
【００６２】
また、本実施例では、制御条件決定部１７によって、制御条件が自動決定される場合について説明した。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、微小物体回収装置１０の操作者が、モニタ１１に表示される顕微鏡画像を参照しながら、キーボード１２およびマウス１３を介して移動・圧力コントローラ１４を操作して、上記した吸引試験を手動で行なうことで、制御条件が決定される場合であってもよい。
【００６３】
移動・圧力コントローラ１４は、制御条件決定部１７によって決定された待機位置、「停止時間：Ｔ０」および「一定の速度：Ｖ０」を用いて、移動機構２０３および電空レギュレータ２０４を制御することにより、図３に示すように、回収対象となる細胞を回収する。図３は、移動・圧力コントローラを説明するための図である。
【００６４】
すなわち、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、移動機構２０３を制御して、ピペット２０６の吸引口が待機位置に位置するように、マニピュレータ２０５を移動させる。そして、移動・圧力コントローラ１４は、電空レギュレータ２０４を制御することによって、ピペット２０６に負圧（初期負圧）を印加して、培養液の吸引を開始させる。
【００６５】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、移動機構２０３を制御して、ピペット２０６の吸引口を「一定の速度：Ｖ０」にて、回収目的となる細胞（酵母菌）が配置されるウェルに向かって、吸引位置（初期吸引位置）まで降下させる。
【００６６】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、移動機構２０３を制御して、ピペット２０６を「停止時間：Ｔ０」の間、停止することによって、回収目的となる細胞を回収する。
【００６７】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、移動機構２０３を制御して、ピペット２０６を「一定の速度：Ｖ０」にて、回収目的となる細胞（酵母菌）が配置されるウェルから遠ざける。すなわち、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６が周囲の酵母菌を吸う前に、ピペット２０６を退避する。
【００６８】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、自動ステージ２０８を移動させることで、ピペット２０６を培養ディッシュ２０９まで移動させる。さらに、移動・圧力コントローラ１４は、図３に示すように、電空レギュレータ２０４を制御して、ピペット２０６に正圧を印加して、回収した酵母菌を培養ディッシュ２０９に吐出させる。
【００６９】
［本実施例における顕微鏡システムによる処理の手順］
次に、図４および図５を用いて、本実施例における顕微鏡システムによる処理を説明する。図４は、本実施例における顕微鏡システムによる制御条件決定処理を説明するためのフローチャートであり、図５は、本実施例における顕微鏡システムによる回収処理を説明するためするためのフローチャートである。
【００７０】
［本実施例における顕微鏡システムによる制御条件決定処理の手順］
まず、図４に示すように、本実施例における顕微鏡システムが備える微小物体回収装置１０は、回収対象となる細胞が配置されるウェルが選択されたうえで、操作者からの制御条件決定要求が入力されると（ステップＳ４０１肯定）、制御条件決定処理を開始する。
【００７１】
すなわち、制御条件決定要求を受け付けた制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４により、自動ステージ２０８を移動してテスト用酵母菌を、ピペット２０６の吸引口の下へ移動させる（ステップＳ４０２）。具体的には、制御条件決定要求を受け付けた制御条件決定部１７は、制御条件記憶部１８が記憶する初期待機位置および初期負圧を読み込んだうえで、ピペット２０６の吸引口を、初期待機位置まで移動させる。
【００７２】
そして、制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４を介して電空レギュレータ２０４を制御して、ピペット２０６に負圧（初期負圧）を印加し（ステップＳ４０３）、酵母菌（テスト用酵母菌）を吸い込んだか否かを判定する（ステップＳ４０４）。
【００７３】
ここで、酵母菌（テスト用酵母菌）がピペット２０６に吸い込まれた場合（ステップＳ４０４肯定）、制御条件決定部１７は、マニピュレータ２０５を移動してピペット２０６を遠ざける（ステップＳ４０５）。例えば、制御条件決定部１７は、ピペット２０６を、初期待機位置から、一定距離（例えば、５μｍ）遠ざける。
【００７４】
そして、制御条件決定部１７は、再度、ステップＳ４０２〜ステップＳ４０４の処理を実行する。なお、ステップＳ４０２に戻る際は、移動・圧力コントローラ１４により、自動ステージ２０８を移動して別のテスト用酵母菌を、ピペット２０６の吸引口の下へ移動させる。
【００７５】
一方、テスト用酵母菌がピペット２０６に吸い込まれなかった場合（ステップＳ４０４否定）、制御条件決定部１７は、テスト用酵母菌がピペット２０６に吸い込まれなかった位置を、ピペット２０６の待機位置として決定する（ステップＳ４０６）。
【００７６】
続いて、制御条件決定部１７は、制御条件記憶部１８から吸引位置（初期吸引位置）、速度Ｖ（初期速度）、停止時間Ｔ（単位：秒、初期停止時間）を読み込む（ステップＳ４０７）。
【００７７】
そののち、制御条件決定部１７は、ピペット２０６を速度Ｖで、テスト用酵母菌が配置されるウェルに対して吸引位置（初期吸引位置）まで近づけ（ステップＳ４０８）、ピペット２０６を、吸引位置（初期吸引位置）でＴ秒間停止する（ステップＳ４０９）。
【００７８】
さらに、制御条件決定部１７は、速度Ｖ（初期速度）でウェルからピペット２０６を離し（ステップＳ４１０）、ピペット２０６の移動を、決定した待機位置にて停止させる（ステップＳ４１１）。
【００７９】
そして、制御条件決定部１７は、ピペット２０６が、目標とするウェルの酵母菌（テスト用酵母菌）のみを吸引したか否かを判定する（ステップＳ４１２）。
【００８０】
ここで、制御条件決定部１７は、ピペット２０６が、目標とするウェルの酵母菌（テスト用酵母菌）を吸引していなかった場合（ステップＳ４１２否定）、ステップＳ４０９にて用いた「Ｔ」が「０」であるか否かを判定する（ステップＳ４１３）。また、制御条件決定部１７は、目標とするウェル以外の酵母菌を吸引したり吹き飛ばしていたりした場合も、ステップＳ４１３の処理を実行する。
【００８１】
ステップＳ４０９にて用いた「Ｔ」が「０」でない場合（ステップＳ４１３否定）、制御条件決定部１７は、Ｔを、Ｔ秒間から一定時間（例えば、「Ｔ／１０」秒間）減少させた値として変更する（ステップＳ４１４）。
【００８２】
そして、制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４により、自動ステージ２０８を移動して別のテスト用酵母菌を、ピペット２０６の吸引口の下へ移動させ（ステップＳ４１６）、変更したＴを用いて、再度、ステップＳ４０８からの処理を実行する。
【００８３】
一方、ステップＳ４０９にて用いた「Ｔ秒」が「０」である場合（ステップＳ４１３肯定）、制御条件決定部１７は、「Ｔ＝０」と固定したえうで、制御条件決定部１７は、Ｖを、Ｖから一定速度（例えば、「Ｖ／１０」）増加させた値として変更する（ステップＳ４１５）。
【００８４】
そして、制御条件決定部１７は、移動・圧力コントローラ１４により、自動ステージ２０８を移動して別のテスト用酵母菌を、ピペット２０６の吸引口の下へ移動させる（ステップＳ４１６）。そののち、制御条件決定部１７は、「Ｔ＝０」および変更したＶを用いて、再度、ステップＳ４０８からの処理を実行する。
【００８５】
一方、制御条件決定部１７は、ピペット２０６が、目標とするウェルの酵母菌（テスト用酵母菌）のみを吸引した場合（ステップＳ４１２肯定）、「Ｖ０＝Ｖ、Ｔ０＝Ｔ」として決定し（ステップＳ４１７）、処理を終了する。すなわち、制御条件決定部１７は、最新のステップＳ４０８およびステップＳ４１０にて用いた速度Ｖを「一定の速度：Ｖ０」として決定し、最新のステップＳ４０９にて用いたＴ秒を「停止時間：Ｔ０」として決定する。
【００８６】
［本実施例における顕微鏡システムによる回収処理の手順］
まず、図５に示すように、本実施例における顕微鏡システムが備える微小物体回収装置１０は、制御条件決定部１７によって制御条件が決定されると（ステップＳ５０１肯定）、回収のための準備処理を行なう。
【００８７】
すなわち、移動・圧力コントローラ１４は、回収のための準備処理として、自動ステージ２０８を廃棄位置に移動させて、ピペット２０６に正圧を印加し、吸い込んだテスト用酵母菌を吐出させる（ステップＳ５０２）。
【００８８】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、移動機構２０３を制御して、マニピュレータ２０５を移動してピペット２０６を退避させる（ステップＳ５０３）。
【００８９】
続いて、移動・圧力コントローラ１４は、自動ステージ２０８を移動して、回収したい酵母菌（回収対象となる細胞）を、ピペット２０６の下に移動させ（ステップＳ５０４）、ピペット２０６を、決定された待機位置へ移動する（ステップＳ５０５）。
【００９０】
さらに、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６に吸引圧（初期負圧）を印加し（ステップＳ５０６）、ピペット２０６を「速度Ｖ０」で回収したい酵母菌（回収対象となる細胞）のウェルに、吸引位置まで近づける（ステップＳ５０７）。
【００９１】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６を、吸引位置で「Ｔ０秒間」停止させ（ステップＳ５０８）、ピペット２０６を「速度Ｖ０」でウェルから離す（ステップＳ５０９）。
【００９２】
そののち、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６を、待機位置で停止させ（ステップＳ５１０）、電空レギュレータ２０４を制御して、ピペット２０６に印加する圧力を、待機圧力に変更する（ステップＳ５１１）。すなわち、回収した酵母菌が、ピペット２０６の奥に吸い込まれずに、一定の位置で留まるような待機圧力に、吸引圧（初期負圧）から変更する。
【００９３】
さらに、移動・圧力コントローラ１４は、マニピュレータ２０５を移動してピペット２０６を退避させ（ステップＳ５１２）、自動ステージ２０８を移動して、培養ディッシュ２０９をピペット２０６の下に移動する（ステップＳ５１３）。
【００９４】
そして、移動・圧力コントローラ１４は、マニピュレータ２０５を移動してピペット２０６を下降させ（ステップＳ５１４）、ピペット２０６に正圧を印加して、回収した酵母菌を培養ディッシュ２０９に吐出させる（ステップＳ５１５）。
【００９５】
そののち、移動・圧力コントローラ１４は、選択された酵母菌をすべて回収したか否かを判定し（ステップＳ５１６）、選択された酵母菌が残っている場合（ステップＳ５１６否定）、ステップＳ５０４に戻って、別の選択された酵母菌の回収処理を行なう。すなわち、ステップＳ５０４において、自動ステージ２０８を移動して、別の回収したい酵母菌を、ピペット２０６の下に移動させて、ステップＳ５０５〜ステップＳ５１５の処理を行なう。
【００９６】
これに反して、移動・圧力コントローラ１４は、選択された酵母菌がすべて回収された場合（ステップＳ５１６肯定）、処理を終了する。
【００９７】
これにより、図６に示すように、ターゲットの酵母菌に対して、負圧が印加されたピペット２０６が近づいて離れるだけで、ターゲットの酵母菌のみ回収される。なお、図６は、本実施例における顕微鏡システムによる回収処理結果を説明するための図である。
【００９８】
［本実施例の効果］
上記したように、本実施例によれば、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６の吸引口を、待機位置に移動したのちに、ピペット２０６に対して負圧を印加して、吸引を開始させるように、移動機構２０３と電空レギュレータ２０４とを制御する。そして、移動・圧力コントローラ１４は、培養液の吸引を開始したピペット２０６の吸引口を、吸引位置まで回収対象となる細胞が配置されるウェルに近接させたのちに、ピペット２０６を停止時間にわたって停止させるように、移動機構２０３を制御する。これにより、ピペット２０６の移動中では吸い込みの強い領域が小さくなることを利用して、吸引を開始したピペットの移動を制御するだけで、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になる。すなわち、精密な制御が必要となるのは、圧力や流体ではなく、ピペット２０６の機械運動のみとなるので、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になる。
【００９９】
また、本実施例によれば、移動・圧力コントローラ１４は、ピペット２０６を、所定の速度（Ｖ０）にて吸引位置までウェルに近接させ、さらに停止時間が経過したのちに、所定の速度（Ｖ０）にてピペット２０６をウェルから遠ざけるように、移動機構２０６を制御する。これにより、ピペット２０６の移動により周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生することなく、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になる。すなわち、吸い込みの強い領域が小さい間に、所定の速度（Ｖ０）で素早く吸引位置までピペット２０６の吸引口を到達させる。そして、停止時間の間に拡大する吸い込みの強い領域によって周囲のウェルにある細胞の誤吸引や吹き飛ばしが発生ないように、所定の速度（Ｖ０）で素早くピペット２０６を引き戻すことにより、回収対象となる細胞のみを簡易に回収することが可能になる。
【０１００】
また、本実施例によれば、制御条件決定部１７によって、細胞を回収する際の制御条件を、様々なパラメータを変更した吸引試験を行なうことで、自動的に決定することができ、回収対象となる細胞のみを確実に回収することが可能になる。
【０１０１】
また、本実施例によれば、回収処理の際に、ピペット２０６の吸引口とウェルとを密着させる必要が無いため、ピペット２０６やウェルが破損することを回避できる。また、精密な圧力制御が不要であるので、正圧ポンプ２０１や負圧ポンプ２０２や電空レギュレータ２０４などの吸引吐出装置にかかるコストを低減できる。また、特殊な構造を持たない従来のチップや、マニピュレータ機能をそのまま流用することができ、微小物体を回収する装置にかかるコストを低減できる。
【０１０２】
なお、上記した実施例では、回収対象となる微小物体として酵母菌を回収する場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、回収対象となる微小物体として、酵母菌以外の動物細胞、植物細胞、真菌、大腸菌などの細胞を回収する場合であってもよい。また、細胞だけでなく、化学的に合成されたポリマーなど任意の微粒子が本発明の回収対象となる。
【０１０３】
また、図示した各装置の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。すなわち、各装置の分散・統合の具体的形態は図示のものに限られず、その全部または一部を、各種の負荷や使用状況などに応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる（例えば、図２において、制御条件決定部１７と移動・圧力コントローラ１４とを統合するなど）。さらに、各装置にて行なわれる各処理機能は、その全部または任意の一部が、ＣＰＵおよび当該ＣＰＵにて解析実行されるプログラムにて実現され、あるいは、ワイヤードロジックによるハードウェアとして実現され得る。
【０１０４】
なお、本実施例で説明した微小物体回収方法は、あらかじめ用意されたプログラムをパーソナルコンピュータやワークステーションなどのコンピュータで実行することによって実現することができる。このプログラムは、インターネットなどのネットワークを介して配布することができる。また、このプログラムは、ハードディスク、フレキシブルディスク（ＦＤ）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤなどのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録され、コンピュータによって記録媒体から読み出されることによって実行することもできる。
【０１０５】
以上の本実施例を含む実施形態に関し、更に以下の付記を開示する。
【０１０６】
（付記１）微小物体を細管により回収する微小物体回収装置であって、
前記細管を移動する移動機構と、前記細管に対して印加される圧力を調整するレギュレータとを制御する制御部を備え、
前記制御部は、
前記細管の吸引口を、所定の待機位置に移動したのちに、前記細管に対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させ、
吸引を開始した前記細管の吸引口を、所定の吸引位置まで前記微小物体が配置される穴に近接させたのちに、前記細管を所定の停止時間にわたって停止させるように、前記移動機構と前記レギュレータとを制御することを特徴とする微小物体回収装置。
【０１０７】
（付記２）前記制御部は、前記細管を、所定の第一の速度にて前記所定の吸引位置まで前記穴に近接させるように前記移動機構を制御することを特徴とする付記１に記載の微小物体回収装置。
【０１０８】
（付記３）前記制御部は、前記所定の停止時間が経過したのちに、所定の第二の速度にて前記細管を前記穴から遠ざけるように、前記移動機構を制御することを特徴とする付記２に記載の微小物体回収装置。
【０１０９】
（付記４）前記所定の待機位置、前記所定の吸引位置、前記所定の負圧、前記所定の停止時間、前記所定の第一の速度および前記第二の速度からなる制御条件を、事前に行なった吸引試験の結果に基づいて決定する制御条件決定部をさらに備えたことを特徴とする付記３に記載の微小物体回収装置。
【０１１０】
（付記５）前記制御条件決定部は、前記吸引試験を、前記細管の位置、前記細管を前記穴に対して近接させる速度、前記細管を停止させる時間、前記細管を前記穴から遠ざける速度、あるいは前記細管と前記基板の面との角度を、任意の組み合わせにおいて変更して行なうことを特徴とする付記４に記載の微小物体回収装置。
【０１１１】
（付記６）微小物体を細管により回収する微小物体回収方法であって、
前記細管の吸引口を、所定の待機位置に移動したのちに、前記細管に対して所定の負圧を印加して、吸引を開始させる第一のステップと、
吸引を開始した前記細管の吸引口を、所定の吸引位置まで前記微小物体が配置される穴に近接させたのちに、前記細管を所定の停止時間にわたって停止させる第二のステップと、
を含んだことを特徴とする微小物体回収方法。
【０１１２】
（付記７）前記第一のステップは、前記細管を、所定の第一の速度にて前記所定の吸引位置まで前記穴に近接させることを特徴とする付記６に記載の微小物体回収方法。
【０１１３】
（付記８）前記所定の停止時間が経過したのちに、所定の第二の速度にて前記細管を前記穴から遠ざける第三のステップをさらに含んだことを特徴とする付記７に記載の微小物体回収方法。
【０１１４】
（付記９）前記所定の待機位置、前記所定の吸引位置、前記所定の負圧、前記所定の停止時間、前記所定の第一の速度および前記第二の速度からなる制御条件を、事前に行なった吸引試験の結果に基づいて決定する制御条件決定ステップをさらに含んだことを特徴とする付記８に記載の微小物体回収方法。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】本実施例における微小物体回収装置の概要および特徴を説明するための図である。
【図２】本実施例における顕微鏡システムの構成を説明するための図である。
【図３】移動・圧力コントローラを説明するための図である。
【図４】本実施例における顕微鏡システムによる制御条件決定処理を説明するためのフローチャートである。
【図５】本実施例における顕微鏡システムによる回収処理を説明するためするためのフローチャートである。
【図６】本実施例における顕微鏡システムによる回収処理結果を説明するための図である。
【図７】微小物体整列用のチップの一例を説明するための図である。
【図８】第一の従来技術を説明するための図である。
【図９】第二の従来技術を説明するための図である。
【符号の説明】
【０１１６】
１０  微小物体回収装置
１１  モニタ
１２  キーボード
１３  マウス
１４  移動・圧力コントローラ
１５  ＣＣＤコントローラ
１６  光学系コントローラ
１７  制御条件決定部
１８  制御条件記憶部
２００  顕微鏡本体
２０１  正圧ポンプ
２０２  負圧ポンプ
２０３  移動機構
２０４  電空レギュレータ
２０５  マニピュレータ
２０６  ピペット
２０７  チップ
２０８  自動ステージ
２０９  培養ディッシュ
２１０  ＣＣＤカメラ
２１１  フォーカスモータ
２１２  蛍光ランプ
２１３  シャッター
２１４  蛍光フィルタ
２１５  対物レンズ
２１６  照明
【図１】
0005120055.tif 000002
【図２】
0005120055.tif 000003
【図３】
0005120055.tif 000004
【図４】
0005120055.tif 000005
【図５】
0005120055.tif 000006
【図６】
0005120055.tif 000007
【図７】
0005120055.tif 000008
【図８】
0005120055.tif 000009
【図９】
0005120055.tif 000010