(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており、
前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項２】
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を測定するための局所表面プラズモン共鳴測定チップであって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するように構成されており、
前記非光透過性物質部分は、チップ基板上に酸化クロム膜を介して設けられている、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項３】
イメージング対象物と各光透過性物質部分又は各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して局所表面プラズモン共鳴が生じる膜厚を有する、請求項１または２に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項４】
膜厚が５ｎｍから２００ｎｍである、請求項３に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項５】
光透過性物質が透明ガラス又は透明プラスチックである、請求項１から４いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項６】
非光透過性物質が金属である、請求項１から５いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項７】
金属が、白金、金、銀、銅、アルミニウム及びこれらの複合金属である、請求項６に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項８】
光透過性物質部分の間隔が１０ｎｍから２μｍの範囲である、請求項１に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項９】
非光透過性物質部分の間隔が１０ｎｍから２μｍの範囲である、請求項２に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項１０】
捕捉物質が核酸及びタンパク質の少なくともいずれかである、請求項１から９いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項１１】
捕捉物質が結合物質を介して固定化されている、請求項１から９いずれかに記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項１２】
結合物質がシランカップリング剤又はアルカンチオールである、請求項１１に記載の局所表面プラズモン共鳴測定チップ。
【請求項１３】
請求項１から１２いずれかに記載のチップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させ、該局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
【請求項１４】
前記チップを用いて局所表面プラズモン共鳴を誘発させる近接場顕微鏡である、請求項１３に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
【請求項１５】
前記チップによる局所表面プラズモン共鳴により増強された光吸収変化が、近接場顕微鏡プローブによりさらに増強される、請求項１４に記載の局所表面プラズモン共鳴イメージング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所表面プラズモン共鳴イメージング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサーは、抗体やＤＮＡなどの生体分子の分子認識機構を利用した化学センサーであり、医療の分野にとどまらず環境、食品の分野への応用が進んでいる。ポストゲノムシーケンス時代を向かえ、バイオセンサーの開発フェーズも、その中心がＤＮＡからタンパク質の機能を利用したものへと変化している。特に、疾患の病因、病態に直接関与している分子の同定、機能解析は、発症メカニズムの解明や創薬につながり、先端医療への貢献が期待されている。このようなプロテオミクスの研究が進むにつれ、その情報は膨大な量となり、短時間に効率的に解析し得るシステムの開発が、今後の研究・診断において必要不可欠なものとなってきている。このため疾患に関連する複数のタンパク質発現のプロファイル解析による診断システム開発が活発に行われている。タンパク質解析には質量分析計等を用いる研究が多いが、臨床現場での実用化のためには、前処理の効率化・迅速化、再現性の確保、低コスト化等の技術開発課題への対応が必要である。また、タンパク質などの生体分子を迅速かつ大量に認識することができれば、検査期間の短縮につながり、より多くの情報を得ることが可能になる。最近、解析能力が飛躍的に向上しているタンパク質アレイは、酵素や蛍光分子などの標識剤を用いて、病因タンパク質を迅速かつ大量認識することができる。しかし、生体分子の認識能の低下を防ぐため、標識剤は、生体分子の特定の部位へ導入する必要があり、その分、煩雑な操作が必要となる。そのため、標識作業を必要としない非標識タンパク質アレイが求められている。
【０００３】
これに対し、標識物質を必要とすることなく、高感度で被測定物質中の化学物質の定性、定量測定の可能なセンサーとして表面プラズモン共鳴現象を利用したセンサーが提案、実用化されている。また、多検体同時測定の要望から、基板に測定試料を配置し、２次元画像として表示する方法が、報告されている（特許文献１、２参照）。
【０００４】
これらの方法は、近年開発が進んでいるマイクロアレイのように、数万という数の多検体を同時イメージングするという面で、検出システムやチップの構造等に改善の余地がある。
【特許文献１】米国特許ＵＳ６８６２０９４Ｂ２
【特許文献２】特開２００１−２５５２６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、局所（もしくは局在）表面プラズモン現象は、光の波長よりも小さい金や銀などの貴金属のナノ構造が示す光学的特徴である。金属ナノ構造体は、そのサイズや形状により可視から赤外までの幅広い波長領域と共鳴し（つまり局所プラズモン共鳴。以下、ＬＳＰＲ(Localized Surface Plasmon Resonance)と呼ぶ。）、様々な色を呈する。このような特徴を持った金属ナノ構造体は、その表面に微量の物質が存在するとその共鳴によって生じるスペクトルが変化する。最近、金属ナノ粒微粒子や金属ナノロッドが合成され、ＬＳＰＲの光学的性質、表面増強ラマン散乱分光法などの光学現象などを明らかにする研究が進められている。
【０００６】
本発明は、金ナノパターン基板上で発生するＬＳＰＲを利用して、ＤＮＡおよびタンパク質などの多検体試料を基板上に配置し、蛍光などのタンパク質標識を行うことなく検出する２次元ＬＳＰＲイメージング装置を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するものとして、
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の光透過性物質部分、および各光透過性物質部分を離間する非光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、ならびに、
局所表面プラズモン共鳴による光吸収変化を検出し、この検出結果を基にイメージング対象物の状態を画像化する局所表面プラズモン共鳴イメージング装置であって、
各々にてイメージング対象物を捕捉する捕捉物質を固定化する複数の非光透過性物質部分、および各非光透過性物質部分を離間する光透過性物質部分を持ち、イメージング対象物と各非光透過性物質部分に固定化された捕捉物質とが反応して生じる局所表面プラズモン共鳴を検出するようになされたチップを用いて、局所表面プラズモン共鳴を誘発させる、
ことを特徴とする局所表面プラズモン共鳴イメージング装置、
を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＬＳＰＲイメージング装置は、従来のものと比較して、共鳴角度の調整や測定といった複雑な検出機構を必要とせず、光源、ＬＳＰＲ用測定チップ、フィルタ、および受光手段といった簡易な配置により、抗原抗体反応やＤＮＡ−タンパク質−細胞間相互作用や生物や細胞の物質代謝を２次元イメージングにより同時に多種類の定量および定性を行うことができる。センシングだけでなく、スクリーニング用途にも適用可能である。
【０００９】
また、受光手段として、ナノパターンで発生した表面増強ラマン散乱をＣＣＤカメラや近接場顕微鏡を用いることによって、従来では困難であった１μｍから５０ｎｍの分解能で、ＤＮＡやタンパク質などの配列した検出対象を２次元イメージとして画像化することが可能にもなる。
【００１０】
さらに、これらの受光手段を用いることにより、これまでのバイオセンサーでは得ることができなかった、検出物の構造に関する情報を高感度で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
＜ＬＳＰＲ測定用チップ＞
本発明におけるＬＳＰＲ測定用チップ１は、たとえば図１に例示したように、透明なガラスやプラスチックなどの光透過性物質からなる基板１０１の上に、金属などの非光透過性物質のナノパターンを有する有機分子固定化部１０２が多数配列した構造を持つ。有機分子固定化部１０２に異なる抗体や酵素等の有機分子を固定化し、被測定物質を加えた場合、固定化した抗体や酵素等と反応する物質が存在していれば、透過光に対してＬＳＰＲが誘起し、可視光から近赤外光領域で発生する吸収ピークの増強及びそのシフトが発生する。ここでは、有機分子が本発明における捕捉分子である。
【００１２】
本発明のＬＳＰＲイメージング装置は、この吸収ピークの変化をＣＣＤ(charge coupled device)カメラなどの受光手段により検出し、被測定物質つまりイメージング対象物の２次元イメージングを得る。その際、各有機分子固定化部１０２が、非光透過物質からなるバックグラウンド部１０３で区切られることにより、多成分分析を容易に実現することができる。
【００１３】
有機分子固定化部１０２は、ＬＳＰＲを誘発させるために、金属ナノパターン構造を有していることが必須である。ＬＳＰＲの誘発は、金属間の長さ（例えばホールの孔径やドットの間隔）に依存しており、その長さが１０ｎｍ以上から２μｍ以下で発生する。よって、ナノパターンにおける金属間の長さは、図１や図２ａに例示したホールパターンの場合、孔径が１０ｎｍ以上から２μｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上１μm以下がより好ましい。１０ｎｍ未満ではパターン形成が難しく、２μｍを超えると本発明の効果を得るに必要なＬＳＰＲが生じにくくなる。ナノパターンは、図２ｂに例示したようなドットパターンも可能であり、この場合でも、ドット間の距離が１０ｎｍ以上から２μｍ以下であることが好ましい。なお、図２ｂのドットパターンでは、各有機分子固定化部１０２が非光透過物質からなり、光透過物質からなるバックグランド部で区切られており、図２ａのホールパターンとは逆の構成となっていることに留意されたい。両パターンにより有機分子固定については後述する。また、パターン形状については、さらにリングパターンや六角形パターンなども可能であり、固定化を実現できる限り特に限定されない。
【００１４】
図１および図２の実施形態では、基板１０１上に堆積された薄膜１０４に、ナノパターンが形成されている。薄膜１０４は酸化クロム膜１０５を介して基板１０１に堆積されており、その膜厚はナノパターンの高さと同一であり、ＬＳＰＲを誘発させるための重要な要因である。この膜厚は５ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。５ｎｍ未満ではＬＳＰＲを誘発させることができず、２００ｎｍを超えると光透過がなくなってしまう。
【００１５】
薄膜１０４は、ＬＳＰＲを誘発させるため、金、銀、銅、白金、アルミニウムのいずれかの単体金属あるいはこれらの複合金属であることが望ましい。また、非光透過物質は、前記金属以外に、非透過性樹脂なども挙げられる。
【００１６】
金属ナノパターンの作製には、たとえば、ナノインプリント法を用いることができる。ナノインプリント法は、最近、盛んに研究が進められている微細加工技術の一つで、電子回路、デジタル記録媒体、集積化ナノシステム、バイオ・有機材料デバイス等の数多くの応用にとって重要な技術である。この方法は、多様性、量産性に富み、かつ低コストで基板を作製することが可能である。ナノインプリント法は、解像限界が無く、解像度はモールドの作製精度によって決まる。本発明の一実施形態では、電子線描画によるモールドの作製およびソフトリソグラフィー法で得られた高分子ナノパターンモールドの作製により、ナノインプリント用１次モールドを作製することができる。これらのモールドを用いて、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）樹脂を用いて１次モールドの転写により、２次モールドを作製する。たとえば膜厚１ｎｍ〜５ｎｍのクロム酸化膜、膜厚５ｎｍ〜２００ｎｍの金薄膜の順で蒸着し、最上部にポリスチレン薄膜をコーティングした透明ガラス基板上に、前記２次モールドを圧着させ、ポリスチレン薄膜にナノパターンを転写する。基板表面に残った余分な残膜をＩＣＰドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製する。そして、ポリスチレンマスクをトルエンにより除去し、ナノパターンを得る。図２からも分かるように、このナノパターンが図２ａのホールパターンである場合には、金属薄膜の除去後に露出している基板表面の部分が光透過性物質からなる有機分子固定化部１０２となり、各々除去されずに残った金属薄膜からなるバックグランド部１０３により離間して区切られている。ナノパターンが図２ｂのドットパターンである場合には、除去後に残った金属薄膜の部分が非光透過性物質からなる有機分子固定化部１０２となり、金属薄膜の除去後に露出している基板表面の部分がバックグランド部１０３として各有機分子固定化部１０２を区切っている。
【００１７】
抗体や酵素等の有機分子は、上述したように作製できる金属ナノパターンを持つ有機分子固定化部１０２に固定化する必要がある。有機分子固定化部１０２は、金などの金属とガラスなどの無機物質との海島構造から成る。すなわち図２ａの場合では非透過性物質のホールパターン、図２ｂの場合では光透過性物質のドットパターンである。有機分子の固定化は、これら金属および無機物質のいずれかの部分に行う。
【００１８】
金属部分への固定（図２ａのホールパターンの場合）は、アルカンチオールのような金属表面に自己組織化単分子膜を形成する有機単分子を用いる。この単分子には、予め、抗体や酵素などの有機分子を結合することができるアミノ基、カルボキシル基、スクシンイミド基（ＮＨＳ）などの活性部位を修飾しておき、金属表面に形成した自己組織化単分子膜上に抗体や酵素等の有機分子を固定化する。
【００１９】
一方、無機部分への固定（図２ｂのドットパターンの場合）は、シランカップリング剤のような金属表面に自己組織化単分子膜を形成する有機単分子を用いる。この場合も、単分子に予め、アミノ基、カルボキシル基、ＮＨＳ基などの活性部位を修飾しておき、無機表面に形成した自己組織化単分子膜上に抗体や酵素等の有機分子を固定化する。アミノ基、カルボキシル基は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などのカルボジイミドを用いて、抗体や酵素などが持つフリーアミノ基、フリーカルボキシル基と脱水縮合反応により共有結合を導入する。ＮＨＳ基は、抗体や酵素などが持つフリーアミノ基と中性緩衝液中で結合する。
【００２０】
多種有機分子は、たとえばノズルタイプマイクロアレイヤーやピンタイプマイクロアレイヤー等のスッポティング方法を用いて、有機分子固定化部１０２にスポットする。この際、図１および図２に示すバックグランド部１０３により区分けされた構造により、隣接する別の有機分子との混在を防ぐことができる。
【００２１】
＜ＬＳＰＲイメージング装置（可視−近赤外）＞
上述したように有機分子を固定化したＬＳＰＲ測定用チップ１を用いて、図３に例示した２次元ＬＳＰＲイメージング装置２により、有機分子と反応する物質を検出する場合、白色光源等の光源２０１から照射されＬＳＰＲ測定用チップ１を通過した透過光には、ＬＳＰＲの誘起により可視−近赤外領域内の特定波長での吸収が起こる。ＬＳＰＲイメージング測定装置２に配置されているバンドパスフィルタ２０２は、この特定波長の光を除去するよう設定しておく。続いて、反応物質がチップ表面に結合した場合、透過光のＬＳＰＲの誘起による吸収位置のシフトと吸収量の増加が起こる。バンドパスフィルタ２０２の波長は、このシフトした吸収位置に設定しておく。反応物質がチップ表面に結合していない場合は、吸収位置のシフトが起こらないため、吸収のない透過光が、そのままバンドパスフィルタ２０２を通過し、ＣＣＤカメラ２０３の受光部に到達する。一方、反応物質がチップ表面に結合した場合は、吸収位置のシフトが起こるとともに、吸収量の増加が起こるため、バンドパスフィルタ２２を通過する光量が著しく減少する。２次元ＬＳＰＲイメージング装置は、この受光量の差異を２次元イメージング画像として表示することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高５０μｍの分解能で、２次元イメージング画像を表示することができる。
【００２２】
＜ＬＳＰＲイメージング装置（表面増強ラマン）＞
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図４に例示した表面増強ラマンスペクトルを用いる方法もが挙げられる。光源２０１であるレーザー光をＬＳＰＲ測定用チップ１全体に照射すると、ラマン散乱光が発生する。特にナノパターン部分においては、ラマン散乱光がＬＳＰＲにより励起し、通常のラマン散乱より散乱光強度が１０4〜１０7程度増強される、いわゆる表面増強ラマン散乱が起こる。この現象を利用し、通常のバイオチップ基板表面で検出することが困難であった基板表面に結合した反応物質に帰属するラマン散乱をナノパターン部分において高感度に検出することができる。一般に、ラマンスペクトルは、物質の構造に依存し、スペクトルの位置および強度が変化する。この特徴を利用し、反応物質が存在している場合に特有に発生するラマンピークの波長の光だけを、集光レンズ２０４で集光し、バンドパスフィルタ２０２によって通過させ、ＣＣＤカメラ２０３に結像させる。有機分子と反応する物質が、チップ表面に結合した場合は、ラマンピークが発生するため明るく光り、結合していない場合は光らない。これを２次元で画像化することにより、同時に多種類の化学物質の定量および定性を行う。最高１μｍの分解能で、２次元イメージング画像を表示することができる。また、レーザーを絞ることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。
【００２３】
＜ＬＳＰＲイメージング装置（近接場顕微鏡）＞
有機分子と反応する物質を検出する手段としては、図５に例示した近接場顕微鏡３を用いた方法もさらに挙げられる。光源３０１からのレーザー光を、コリメートレンズ３０２、ハーフミラー３０３等の光学系を通してＬＳＰＲ測定用チップ１のナノパターンに照射して透過させることにより、パターン表面にエバネッセント場を発生させ、そこに金属コーティングプローブであるカンチレバー３０４をＰＺＴステージ３０５をスキャンさせて挿入する。これにより、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて、散乱光を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定する。これらの散乱光を対物レンズ３０６で集光し、レーリー散乱光をノッチフィルターなどのバンドパスフィルタ３０７で除去し、分光器３０８で分光した後、液体窒素冷却ＣＣＤで検出することにより、局所的な表面増強ラマンスペクトルを得ることができる。これにより、ＬＳＲ測定用チップ１のナノパターンにより増強されたラマンスペクトルが、カンチレバー３０２によりさらに増強されるため、ナノ領域での生体分子認識が可能になる。たとえば、タンパク質が表面に存在する場合のみ、タンパク質の構造に依存したラマンピークが現れるので、タンパク質に帰属しないピークをフィルタでカットし、タンパク質由来のラマンピークの散乱強度をＣＣＤで検出し画像化できる。さらに分光器３０８を通して測定を行うことで、より詳細なスペクトルを観察することができる。さらには、プローブを走査することにより、表面増強ラマンスペクトルの強度に依存した２次元イメージング画像を得ることができる。これにより最高５０ｎｍの分解能で、２次元イメージング画像を表示することができ、かつプローブを測定箇所に移動させることにより、特定位置の表面増強ラマン散乱を集光して光検出器で光強度や分光スペクトルを測定することができる。図５において、３０９は集光レンズ、３１０はハーフミラー、３１１はフォトンカウンタ、３１２は制御用計算機、３１３はコントローラ、３１４はＰＺＴスキャナーである。
【００２４】
＜ＬＳＰＲ測定用チップ（タンパク質アレイチップ）の作製＞
タンパク質の機能は他の分子との相互作用によって発現されるため、この相互作用を原子レベルで予測および解析することは、タンパク質の機能を明らかにし、新薬の開発につながると期待されている。ある機能性タンパク質と結合するタンパク質を正確に探索するためには、機能を保ったままタンパク質を基板上に固定化する必要がある。
【００２５】
作製方法としては、単一組織や細胞からｍＲＮＡを精製し、逆転写酵素、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製し、ｃＤＮＡを持ったλＺＡＰ−ＣＭＶファージを得る。予め、λＺＡＰ−ＣＭＶベクターには、開始メチオニンのコドンであるＡＴＧ、クローニング用制限酵素部位、タグ（ＨｉｓタグやＨＡタグ）用コドンとそれに続く終了コドンを挿入しておく。ファージのサブプールを作り、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎで各プールのファージからプラスミド（ｃＤＮＡ発現ベクター）を調製し、このプラスミッドを培養細胞に導入し、Ｃ末端にタグが融合されたタンパク質を発現させる。
【００２６】
図６にタンパク質アレイチップの作製方法について示す。金ナノパターンのガラス部分に、アミノプロピルトリエトキシシランを気相蒸着法により自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成させる。末端のアミノ基部分にＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを結合させ（ＮＨＳ基は表面のＮＨ2基と反応）、末端にＮＨＳ活性を有した自己組織化単分子膜を作製する。これにプロテインＡ溶液を加え、ＮＨＳとプロテインＡを結合させる（プロテインＡの固定化）。プロテインＡは、抗タグ抗体（グロブリンＩｇＧ）のＦｃ部とのみ結合するので、抗タグ部分の活性を失うことなく基板に固定化できる。
【００２７】
ｃＤＮＡライブラリー由来のタグ付きタンパク質は、スポッティング装置を用いて、基板の独立した固定化部分に注入され、これらのタンパク質と抗タグ抗体を結合し基板に固定し、タンパク質アレイチップを作製する。
【００２８】
この基板に精製した解析を目的とする機能性タンパク質を滴下し、機能性タンパク質結合能を有するタンパク質部分に機能性タンパク質を結合させる。機能性タンパク質と結合したタンパク質が存在する部分は、ＬＳＰＲ効果によって近赤外領域でピーク形が変化する。この変化を検出装置で可視化することで、機能性タンパク質結合タンパク質をスクリーニングする。反応陽性のサブプール内のファージを大腸菌に戻して増幅し、さらにサブプールに分け同じ操作を繰り返し、最終的に機能性タンパク質結合タンパク質を発現するｃＤＮＡを含んだ１つのファージに絞り、ｃＤＮＡの核酸配列の解析から機能性タンパク質結合タンパク質を同定する。
【００２９】
＜ＬＳＰＲ測定用チップ（ＤＮＡアレイチップ）の作製＞
ＤＮＡアレイは、ガラスやシリコン製の小基盤上にＤＮＡ分子を高密度に配置（アレイ）したものである。マイクロアレイを用いると数千から数万種といった規模の遺伝子発現を同時に観察することができる。
【００３０】
本発明における作製方法は、単一組織や細胞からｍＲＮＡを精製し、逆転写酵素、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡプローブを作製する。金ナノパターンのガラス部分に、アミノプロピルトリエトキシシランを気相蒸着法により自己組織化単分子膜を形成させる。ｃＤＮＡプローブをスポッティング装置により、基板の独立した固定化部分に注入する。静電相互作用によりアミノ基末端部にｃＤＮＡプローブが固定化される。同じＤＮＡチップを２つ用意し、一方に解析試料のｃＤＮＡをもう一方に参照試料のｃＤＮＡをＤＮＡチップ上にそれぞれ導入してハイブリダイゼーション反応を行わせ、両者の２次元パターンと固定化されているＤＮＡプローブの情報とから、解析試料のみで発現している遺伝子、参照試料のみで発現している遺伝子、両方の試料で発現している遺伝子、どちらでも発現していない遺伝子を並列的に解析する。
【実施例１】
【００３１】
＜ＬＳＰＲ測定用チップの作製方法１＞
１．１次モールドの作製方法（Ｓｉモールド）
電子線描画によるＳｉモールドの作製は、電子ビーム描画装置（エリオニクス社ＥＬＳ−７５００ＥＸ）を用いて行った。電子線描画によるモールドの作製方法を図７に示す。はじめに、ＳｉＯ２膜付Ｓｉウエハー面に電子線レジストを塗布し、電子ビーム描画装置により直接ナノパターンを描画し露光、現像後、露出部分をＢＨＦ、ＫＯＨでエッチングし、Ｓｉモールドを作製した。図８に電子線描画により作製されたＳｉモールドの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【００３２】
２．２次モールドの作製方法（ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）モールドの作製）
ＰＤＭＳモールドは、Ｓｉモールドおよび高分子ナノパターンモールド（マスターモールド）から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、１００℃で２時間乾燥し、樹脂を固化させ、ＰＤＭＳモールドを得た。
【００３３】
金ナノパターンの作製方法を図９に示す。基板となる金コート石英ガラスは、ＥＣＲ成膜装置により作製された。金薄膜は、接着性をよくするためにあらかじめ成膜されていた酸化クロム膜の上に約４０ｎｍの膜厚になるよう成膜された。次にポリスチレン（ＰＳ）溶液（トルエン、１ｗｔ％）を基板表面に２ｍｌ滴下し、ＰＤＭＳモールドを圧着させＰＳパターンを作製した。基板表面に残った残膜は、ＩＣＰドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製した。ＰＳマスクは、トルエンによって除去した。図１０にナノインプリント法により作製した金ナノパターンのＳＥＭ写真を示す。孔径の大きさが約８００ｎｍの金パターンの形成が確認された。
【実施例２】
【００３４】
＜ＬＳＰＲ測定用チップ作製方法２＞
１．１次モールドの作製方法（高分子ナノパターンモールド）
高分子ナノパターンモールドは、高分子溶液からのキャスト過程で起こる自己組織化現象を利用した。高分子ナノパターンモールドの作製方法を図１１に示す。高分子溶液は、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド１０ｍｇとｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム１０ｍｇ、ポリスチレン９０ｍｇをクロロホルム１００ｍｌに溶解したものを用いた。この高分子溶液を石英基板に０．２ｍｌ滴下し、高湿度空気（湿度約８０％）で乾燥することにより作製した。図１２に高分子ナノパターンモールドのＳＥＭ写真を示す。
【００３５】
２．２次モールドの作製方法（ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）モールドの作製）
上記作製方法１と同様に、ＰＤＭＳモールドは、Ｓｉモールドおよび高分子ナノパターンモールド（マスターモールド）から作製した。マスターモールドをステンレス容器の中に入れポリジメチルシロキサン樹脂を流し込んだ。脱泡後、１００℃で２時間乾燥し、樹脂を固化させ、ＰＤＭＳモールドを得た。
【００３６】
金ナノパターンの作製方法を図９に示す。基板となる金コート石英ガラスは、ＥＣＲ成膜装置により作製された。金薄膜は、接着性をよくするためにあらかじめ成膜されていた酸化クロム膜の上に約４０ｎｍの膜厚になるよう成膜された。次にポリスチレン（ＰＳ）溶液（トルエン、１ｗｔ％）を基板表面に２ｍｌ滴下し、ＰＤＭＳモールドを圧着させＰＳパターンを作製した。基板表面に残った残膜は、ＩＣＰドライエッチング装置で除去し、ウェットエッチングにより金パターンを作製した。ＰＳマスクは、トルエンによって除去した。
【実施例３】
【００３７】
＜可視光スペクトル測定＞
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う可視光スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計（島津ＵＶ−３１００）により測定を行った。
【００３８】
図１３に清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルを示す。清浄金ナノパターン基板では、５１２ｎｍの波長を中心とし、３００ｎｍから７００ｎｍの間でピークの存在が観察された。金コーティング基板の場合は、近赤外領域に明確なピークを観察することができなかったため、このピークは、金ナノパターニング表面で発生したＬＳＰＲによるものと考えられる。一方、フィブリノーゲン吸着後は、５１６ｎｍの波長を中心とし、４００ｎｍから７５０ｎｍの間でピークの存在が観察され、フィブリノーゲンの吸着により、ピーク位置が４ｎｍ高波長側にシフトした。これは、金ナノパターン表面にフィブリノーゲンが吸着することでＬＳＰＲスペクトルが大きく変化したことを示しており、この変化を利用することで吸着したタンパク質の吸着量を求めることが可能である。
【実施例４】
【００３９】
＜近赤外スペクトル測定＞
金ナノパターン表面における、モデルタンパク質の吸着に伴う近赤外スペクトル変化を測定した。モデルタンパク質としてフィブリノーゲンを用いた。フィブリノーゲンをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう調整した。このフィブリノーゲン溶液に金ナノパターン基板を浸漬させ基板表面にタンパク質を吸着させた。清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルは、紫外可視近赤外分光光度計（島津ＵＶ−３１００）により測定を行った。
【００４０】
図１４に清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルを示す。清浄金ナノパターン基板では、１５２２ｎｍの波長を中心とし、１４００ｎｍから１８００ｎｍの間でピークの存在が観察された。金コーティング基板の場合は、近赤外領域に明確なピークを観察することができなかったため、このピークは、金ナノパターニング表面で発生したＬＳＰＲによるものと考えられる。一方、フィブリノーゲン吸着後は、１６３２ｎｍの波長を中心とし、１４００ｎｍから２３００ｎｍの間でピークの存在が観察され、フィブリノーゲンの吸着により、ピーク位置が１１０ｎｍ高波長側にシフトし、吸光度が約２倍に増加した。これは、金ナノパターン表面にフィブリノーゲンが吸着することでＬＳＰＲスペクトルが大きく変化したことを示しており、この変化を利用することで吸着したタンパク質の吸着量を求めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】（ａ）（ｂ）は各々本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一実施形態を示した概略平面図および概略断面図である。
【図２】（ａ）（ｂ）は各々本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一実施形態を示した概略平面図である。
【図３】本発明のＬＳＰＲイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。
【図４】本発明のＬＳＰＲイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。
【図５】本発明のＬＳＰＲイメージング装置の一実施形態を示した概略図である。
【図６】本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一作製方法について説明する図である。
【図７】本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一作製方法について説明する図である。
【図８】図７の作製方法により得られたＳｉモールドのＳＥＭ像である。
【図９】本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一作製方法について説明する図である。
【図１０】図９の作製方法により得られた金モールドのＳＥＭ像である。
【図１１】本発明のＬＳＰＲ測定用チップの一作製方法について説明する図である。
【図１２】図１１の作製方法により得られた高分子ナノパターンモールドのＳＥＭ像である。
【図１３】清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の可視光スペクトルを示す図である。
【図１４】清浄金ナノパターン基板とフィブリノーゲンを吸着させた金ナノパターン基板の近赤外スペクトルを示す図である。
【符号の説明】
【００４２】
１  ＬＳＰＲ測定用チップ
１０１  基板
１０２  有機分子固定化部
１０３  バックグランド部
１０４  薄膜
１０５  酸化クロム膜
２  ＬＳＰＲイメージング装置
２０１  光源
２０２  バンドパスフィルタ
２０３  ＣＣＤカメラ
２０４  集光レンズ
３  ＬＳＰＲイメージング装置（近接場顕微鏡）
３０１  光源
３０２  コリメートレンズ
３０３  ハーフミラー
３０４  カンチレバー
３０５  ＰＺＴステージ
３０６  集光レンズ
３０７  バンドパスフィルタ
３０８  分光器
３０９  集光レンズ
３１０  ハーフミラー
３１１  フォトンカウンタ
３１２  計算機
３１３  コントローラ
３１４  ＰＺＴスキャナー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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