(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離したヒト慢性腎炎由来生体試料が慢性腎炎、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼの一つ以上の由来である生体試料と免疫反応することを特徴とするＩＶ型コラーゲンのα５鎖アミノ酸配列と同じ配列を有するＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド。
【請求項２】
請求項１記載の「ＩＶ型コラーゲンのα５鎖アミノ酸配列と同じ配列を有する」が「α５鎖由来」である請求項１記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド。
【請求項３】
構成領域がα５鎖ＮＣ１である下記のアミノ酸配列、
１）ＧＲＧＴＣ  ＮＹＹＡＮ  ＳＹＳＦＷ  ＬＡＴＶＤ
２）ＳＣＬＥＥ  ＦＲＳＡＰ  ＦＩＥＣＨ  ＧＲＧＴＣ
３）ＧＷＤＳＬ  ＷＩＧＹＳ  ＦＭＭＨＴ  ＳＡＧＡＥ
４）ＰＦＩＳＲ  ＣＡＶＣＥ  ＡＰＡＶＶ  ＩＡＶＨＳ
５）ＳＴＭＰＦ  ＭＦＣＮＩ  ＮＮＶＣＮ  ＦＡＳＲＮ（式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、ＷはトリプトファンおよびＹはチロシンをそれぞれ表し、各ペプチドは連続するアミノ酸配列をＮ端から５個単位に表わす）のうちいずれか一つ以上を含む請求項１〜２のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド。
【請求項４】
前記アミノ酸配列中の２０個以上のアミノ酸の配列と同じ配列を有する請求項１または請求項２記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド。
【請求項５】
前記単離した慢性腎炎由来生体試料が、尿である請求項１〜４のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド。
【請求項６】
請求項５記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドと免疫反応する前記単離した慢性腎炎由来生体試料が、中性溶液化した尿であるか、中性溶液化後に凍結乾燥した尿である単離した慢性腎炎由来生体試料。
【請求項７】
請求項１〜５のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドと免疫反応することを特徴とするＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体。
【請求項８】
単離した慢性腎炎由来生体試料をリガンドとして、前記慢性腎炎由来生体試料と免疫反応する請求項１〜５のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを選出することを特徴とするＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを用いることを特徴とする免疫活性抗体のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドのアミノ酸数が２０個以上３５個以下である請求項９記載の免疫活性抗体のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項７記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体を用いることを特徴とする免疫活性ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項１２】
ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドのアミノ酸数が２０個以上３５個以下である請求項１１記載の免疫活性ペプチドのスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および請求項７記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を惹起原とすることを特徴とする腎炎モデル。
【請求項１４】
請求項１〜５のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および請求項７記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とする慢性腎炎の検出補助方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のうちいずれか一項記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および請求項７記載のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とするワクチン。
【請求項１６】
請求項１５記載のワクチンを含むことを特徴とする腎炎治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドおよびこの抗体、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法、免疫活性抗体または免疫活性ペプチドのスクリーニング方法、腎炎モデル、慢性腎炎の検出方法、ワクチンならびに腎炎治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＩＶ型コラーゲンは、全て解明されているわけではない。ＩＶ型コラーゲンは多数の分子が結合し、そこに多種類の成分が係わることで組織基底膜が形成される。また、ＩＶ型コラーゲンは組織基底膜の主要成分であることから基底膜コラーゲンとも呼ばれる。ＩＶ型コラーゲンはアルファ１鎖からアルファ６鎖までの６種の異性体があり、ＩＶ型コラーゲン１分子は３種のアルファ鎖から構成される。３種のアルファ鎖の構成は組織により異なり、胎盤由来の基底膜ではアルファ１、アルファ２鎖に富み、全身の各組織基底膜に共通に見られる。腎由来の基底膜は特異で、アルファ３からアルファ６鎖に富むとされる。【０００３】
ＩＶ型コラーゲン１分子は三領域に分けられ、Ｎ末端から三本鎖らせん構造を持つ７Ｓと中央螺旋部（ＴＨ）、Ｃ末端領域で非らせん構造のＮＣ１である。生体組織から取り出す時、処理方法により得られる領域は異なり、ペプシン処理で三本鎖らせん領域を、細菌由来コラゲナーゼ処理でＮＣ１を得るのが一般的手法である（非特許文献１）。【０００４】
一方、腎炎は、症状から「急性腎炎」と「慢性腎炎」に大別され、専門医により多彩に小分類された腎疾患名が与えられる。通常、腎炎と称されるものは「慢性腎炎」を指すので、本発明は、特に断らない限り「腎炎」と「慢性腎炎」を同義に用いる。「慢性腎炎」としては、いわゆる慢性腎炎、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼ、膜性腎症、二次性腎症の糖尿病性腎症、高血圧性腎症などを含むがこれに限定されない。腎炎は、毎年３万人が新規透析導入例となり、本人の生活の質（ＱＯＬ）にとっても、国民医療費（透析１例に付き、６００万円／年）の上でも多大な負担である。透析の技術は進歩しているが、それ以前のごく初期に腎障害を特定し、直接腎炎を治療する薬剤はない。その理由としては、腎炎の発症メカニズムが解明されていないことが大きい。【０００５】
また、腎炎には、腎炎特有の抗原が存在するとして、世界中で様々な抗原物質が研究されている（非特許文献２）。抗原が特定されれば、そこを標的物質として診断薬や腎炎治療剤の開発が期待できる。抗原が確定している唯一の例としては、グッドパスチャー症候群（狭義の抗糸球体基底膜  （ＧＢＭ）抗体腎炎）がある。この抗原は、アルファ３鎖ＮＣ１のＣ末端３６アミノ酸残基や、Ｎ末端からのアミノ酸配列１７−３１、及び１２７−１４１に存在する（非特許文献３）などの報告があり、いずれの抗原もその部位はアルファ３鎖上である。また、アルファ３鎖上の１７−３１（アミノ酸残基数１５個）及び１２７−１４１（アミノ酸残基数１５個）は、キメラ型アルファ１／アルファ３ＮＣ１より検索されたものである。【０００６】
稀な腎炎であるグッドパスチャー症候群は「急性腎炎」に属し、典型的には２週間ほどで重篤な状態になるので、速やかに確定診断することが必要とされる。確定診断には腎生検の免疫組織染色を用い、ＧＢＭに自己抗体である免疫グロブリンＩｇＧの沈着の有無で判定される。
【非特許文献１】Extracelluar Matrix IRL PRESS/ OXFORD UNIVERSITY PRESS Oxford NewYork
【非特許文献２】腎と透析 2005 July Vol59 No.1 東京医学社
【非特許文献３】J.Biol Chem (1993) 268, 26033-26036
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、この検査は、検体採取で患者への苦痛と危険性があり、免疫組織染色には専門病理医の高度な診断能力が求められるという問題点があった。【０００８】
そこで、簡便法として、血中に出現する自己抗体を検出するＥＬＩＳＡキット（商品名：ネフロスカラー・ＧＢＭ、輸入元株式会社ニッショー、販売元株式会社ニプロ）が利用されている。しかしながら、前記ＥＬＩＳＡキット添付の説明書及びそこで引用されている文献（臨床機器・試薬、Ｖｏｌ．２０  Ｎｏ．３、３６７−３７４（１９９７））によると、グッドパスチャー症候群のみの自己抗体が高濃度に検出され、他の腎炎は健常者と同じ程度に低くしか検出されない。同説明書によれば、用いている抗原はウシＧＢＭ抗原であり、ＧＢＭはＩＶ型コラーゲンを主成分として多種の成分からなる。大きさを考慮すると、ＧＢＭ＞ＩＶ型コラーゲン＞ＮＣ１＞アルファ３鎖のＮＣ１＞前述の各アミノ酸残基（抗原）となる。ウシＧＢＭを抗原に用いることは、この巨大領域には他の腎炎の抗原が無いこととなり、腎炎の検出としては不十分であった。また、現在、日本で唯一診断薬として認可され保険適用されているものの、高価でありしかも輸入品であるため使用しにくいという問題点があった。【０００９】
そこで本発明の目的は、腎炎の検出に有用なＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドおよびこの抗体、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法、免疫活性抗体および免疫活性ペプチドのスクリーニング方法、腎炎モデル、慢性腎炎の検出方法、ならびにワクチンおよび腎炎治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために長い間腎疾患や他疾患に伴う二次性腎疾患の治療薬開発と早期検出方法に努め、鋭意検討した結果、慢性腎炎由来生体試料を用いて腎炎の抗原部位を見出すことで、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドおよびこの抗体、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法、免疫活性抗体および免疫活性ペプチドのスクリーニング方法、腎炎モデル、慢性腎炎の検出方法、ならびにワクチンおよび腎炎治療薬を確立し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドは、単離した慢性腎炎由来生体試料と免疫反応することを特徴とするものである。【００１２】
また、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドと免疫反応することを特徴とするものである。【００１３】
さらに、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法は、単離した慢性腎炎由来生体試料をリガンドとして、前記慢性腎炎由来生体試料と免疫反応する前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを選出することを特徴とするものである。【００１４】
さらにまた、本発明の免疫活性抗体のスクリーニング方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを用いることを特徴とするものである。【００１５】
さらにまた、本発明の免疫活性ペプチドのスクリーニング方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体を用いることを特徴とするものである。【００１６】
さらにまた、本発明の腎炎モデルは、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を惹起原とすることを特徴とするものである。【００１７】
さらにまた、本発明の慢性腎炎の検出方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とするものである。【００１８】
さらにまた、本発明のワクチンは、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とするものである。また、腎炎治療薬は、このワクチンを含むことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、腎炎の検出に有用なＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドおよびこの抗体、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法、免疫活性抗体および免疫活性ペプチドのスクリーニング方法、腎炎モデル、慢性腎炎の検出方法、ならびにワクチンおよび腎炎治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】健常者と尿中アルブミン高値者の比較（抗ＮＣ１抗体）を示す図である。
【図２】疾患別抗ＮＣ１抗体の一覧を示す図である。
【図３】同一腎炎患者での抗三本鎖抗体と抗ＮＣ１抗体の相関を示す図である。
【図４】慢性腎炎ＴＤ３８と糖尿病性腎炎ＴＤ４２と健常者（ＴＤ３１〜３７、ＴＤ３９〜４１）の測定比較データ（抗ＮＣ１抗体）を示す図である。
【図５】ヒトＮＣ１のアルファ３鎖、アルファ４鎖、アルファ５鎖、アルファ６鎖を示す図である。
【図６】慢性腎炎Ｎｏ３８、糖尿病性腎炎Ｎｏ４２、ＩｇＡ腎症と健常者Ｎｏ３１，３２，３３とのＮＣ１様抗原性の比較を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドについて説明をする。【００２２】
本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドは、単離した慢性腎炎由来生体試料と免疫反応することを特徴とするものである。ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを抗原、単離した慢性腎炎由来生体試料を抗体とした免疫反応である。免疫反応としては、酵素免疫反応に限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含み、酵素標識抗体としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を問わず、またそれを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でもよい。反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でもよい。プレートに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしてもよく、無しにして固相法を用いないことでもよい。【００２３】
また、本発明において、「慢性腎炎」としては、いわゆる慢性腎炎、ＩｇＡ腎症、微小変化型ネフローゼ、膜性腎症、二次性腎症の糖尿病性腎症、高血圧性腎症などを含むがこれに限定されない。【００２４】
さらに、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドは、慢性腎炎由来生体試料と免疫反応すれば特に限定されないが、好ましくは、構成アルファ鎖として１鎖〜６鎖の任意の１鎖以上、構成領域として７Ｓ、中央螺旋域およびＮＣ１から選ばれる任意の１つ以上、並びに構成ペプチドとしてアミノ酸数が３個以上３５個以下、からなる群から選ばれる少なくとも１つ以上を有するものであり、さらに好ましくは、アルファ５鎖であることが好ましく、構成領域がＮＣ１であることがより好ましい。また、かかるＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドのペプチドの長さは、費用と効率の点から、アミノ酸３個以上３５個以下が好ましく、抗体の作製の容易さも考慮して、最も好ましいのは、１０個から２０個である。【００２５】
本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドは、単離した慢性腎炎由来生体試料に対してＩＶ型コラーゲンと同様の免疫反応をする。また、このＩＶ型コラーゲンのアルファ５鎖のアミノ酸配列と相同性を有することが好ましい。【００２６】
さらに、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドが、構成領域がＮＣ１由来である下記のアミノ酸配列、
１）ＧＲＧＴＣ  ＮＹＹＡＮ  ＳＹＳＦＷ  ＬＡＴＶＤ  Ｎｏ．ｙｐ１３
２）ＳＣＬＥＥ  ＦＲＳＡＰ  ＦＩＥＣＨ  ＧＲＧＴＣ  Ｎｏ．ｙｐ１２
３）ＧＷＤＳＬ  ＷＩＧＹＳ  ＦＭＭＨＴ  ＳＡＧＡＥ  Ｎｏ．ｙｐ１０
４）ＰＦＩＳＲ  ＣＡＶＣＥ  ＡＰＡＶＶ  ＩＡＶＨＳ  Ｎｏ．ｙｐ０８
５）ＳＴＭＰＦ  ＭＦＣＮＩ  ＮＮＶＣＮ  ＦＡＳＲＮ  Ｎｏ．ｙｐ０５
（式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、ＷはトリプトファンおよびＹはチロシンをそれぞれ表し、各ペプチドは連続するアミノ酸配列をＮ端から５個単位に表す）のうちいずれか一つ以上を含むことが好ましく、前記アミノ酸配列中の３個以上のアミノ酸の配列と相同性を有することが好ましい。なお、アミノ酸配列１）〜５）には、それぞれ固有の番号（Ｎｏ．ｙｐ１３等）を付記した。【００２７】
さらにまた、前記単離した慢性腎炎由来生体試料は、抗ＩＶ型コラーゲン抗体を有し、さらに、構成アルファ鎖として１鎖〜６鎖の任意の１鎖以上、構成領域として７Ｓ、中央螺旋域およびＮＣ１から選ばれる任意の１つ以上、並びに構成ペプチドとしてアミノ酸数が３個以上３５個以下、からなる群から選ばれる少なくとも１つ以上を有するＩＶ型コラーゲンと免疫反応する。また、かかる単離した慢性腎炎由来生体試料は、腎炎由来の生体試料であればヒト腎炎由来のみならず、動物腎炎由来でもよく、尿、血清、腎臓、腎臓の抽出物および培養物などがあるが、好ましくは尿である。動物由来の場合は、ヒト慢性腎炎の「単離した腎炎由来生体試料」と比較しながら用いることがよい。【００２８】
かかる尿は、保存時には冷凍保存され、使用時には解凍されてリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）中に均一分散され、遠心後沈殿が除去され、得られた上清液を凍結乾燥機で乾燥され、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で溶解されたことが好ましい。また、ＰＢＳに代えて生理食塩水や注射用蒸留水を用いてもよいが、力価が落ちない様に、滅菌、除菌などの他の操作も加えて、つまり生物由来製剤を扱う当該製剤業者が払うべき注意を払うことにより、注射剤あるいは内服剤に作製することができる。また、抗原ＮＣ１を取り付けたアフィニテーカラムで精製をしたものや硫安沈殿などで得た抗体を、再度、希釈して濃度を合わせてもよく、血清や腎臓から、抗体の免疫グロブリンを精製してもよい。【００２９】
また、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドと免疫反応することを特徴とするものであり、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドに対して、単離した慢性腎炎由来生体試料と同様の免疫反応を示す。【００３０】
また、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法は、単離した慢性腎炎由来生体試料をリガンドとして、前記慢性腎炎由来生体試料と免疫反応する前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを選出することを特徴とするものである。単離した慢性腎炎由来生体試料をリガンドとして使用することにより、腎炎検出に有用なＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを選出することができる。【００３１】
本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド選出方法における前記単離した慢性腎炎由来生体試料およびＩＶ型コラーゲンとしては、前記記載と同様のものを使用できる。また、選出されるＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドも、前記記載と同様のものを使用できる。【００３２】
本発明の免疫活性抗体のスクリーニング方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを用いることを特徴とするものであり、好ましくは前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドのアミノ酸数が３個以上３５個以下であり、さらに好ましくは１０個から２０個である。具体的には、前記慢性腎炎由来生体試料に置き換えて抗アルファ５鎖ＮＣ１抗体あるいは抗アルファ５鎖ＮＣ１由来ペプチド抗体を使用して、免疫活性抗体をスクリーニングすることができる。これにより、腎炎検出に有用な免疫活性抗体をスクリーニングできる。【００３３】
また、本発明の免疫活性ペプチドのスクリーニング方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体を用いることを特徴とするものであり、好ましくはＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドのアミノ酸数が３個以上３５個以下であり、さらに好ましくは１０個から２０個である。具体的には、アルファ５鎖ＮＣ１由来の合成ペプチドに置き換えて候補免疫活性ペプチドを使用することにより、免疫活性ペプチドをスクリーニングできる。これにより、腎炎検出に有用な免疫活性ペプチドをスクリーニングできる。【００３４】
さらに、本発明の腎炎モデルは、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を惹起原とすることを特徴とするものである。従来、腎炎惹起抗原としては、腎糸球体基底膜（ＧＢＭ）、腎糸球体由来ＮＣ１が用いられてきた。しかしながら、これらは、急性腎炎のモデルであり、ヒトの慢性腎炎のモデルには適さなかった。また、アルファ３鎖由来のペプチド例もあるが、やはり急性腎炎モデルであった。本発明の腎炎モデルでは、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを使用することにより安価に一定の抗原が得られ、慢性腎炎の実験モデル作製に適している。【００３５】
また、従来、抗原に対する抗体（抗血清）を用いた腎炎惹起例は、ＧＢＭ、ＮＣ１、アルファ３鎖に対する抗体例が挙げられるが、いずれも急性腎炎モデルである。さらに、アルファ５鎖に対する抗体、とりわけ、ヒトアルファ５鎖のペプチドに対する抗体を用いた例は見られない。それに対して、本発明のＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体は、ヒトの慢性腎炎モデルとして有用であり、適している。【００３６】
かかる腎炎惹起抗原としては、アルファ５鎖のＮＣ１が特に好ましい。腎糸球体由来のＮＣ１で惹起した腎炎モデルでは急性腎炎の一種なので、その抗ＮＣ１抗体の多くは、急性腎炎のグッドパスチャー症候群の自己抗体に近いので、ヒト慢性腎炎の「単離した腎炎由来生体試料」と比較しながら用いることが好ましい。動物の糖尿病モデルや高血圧モデル由来の生体試料を用いることも可能であるが、前記と同様に、ヒト慢性腎炎の「単離した腎炎由来生体試料」と比較しながら用いることが好ましい。【００３７】
さらにまた、本発明の慢性腎炎の検出方法は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とするものである。また、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法を使用したキットであり、これにより腎炎の早期診断が可能となる。【００３８】
さらにまた、本発明のワクチンは、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド、および前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体、からなる群から選ばれるいずれか一つ以上を用いることを特徴とするものであり、腎疾患の予防薬または治療薬として使用できる。また、腎炎治療薬は、このワクチンを含むことを特徴とするものである。本発明のワクチンまたは腎炎治療薬は、前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドまたは前記ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドの抗体を含むものであれば特に限定されないが、一例を挙げるとｙｐ１２等を水に溶かしたものがあり、この溶解剤の投与により腎炎等を抑制できる。【００３９】
さらにまた、本発明は、腎炎血液（血清、血漿も含める）の浄化器具に関するもので、医療器具として使用できる。原理は、腎炎血液中の標的抗体あるいは標的抗原を、担体に固定した吸着機能を持つリガンド（対応する抗原あるいは抗体）に触れさせて吸着除去することにある。腎炎血液中の標的抗体が抗ＩＶ型コラーゲン抗体、抗その構成領域抗体、抗その構成ペプチド（構成ペプチドの長さは問わない）抗体である時の対応するリガンド抗原には、分離した慢性腎炎由来生体試料と反応するＩＶ型コラーゲン様ペプチドを用いる。【００４０】
腎炎血液中の標的抗原がＩＶ型コラーゲン、その構成領域、構成ペプチド（構成ペプチドの長さは問わない）である時の対応するリガンド抗体は、抗ＩＶ型コラーゲン様ペプチド抗体である。【００４１】
リガンドとしては、標的抗原に対応する抗体、標的抗体に対応する抗原が好ましく、標的抗体に対応する抗原の代わりにはプロテインＡやプロテインＧでもよいが、標的抗体以外の免疫グロブリンも血液から除去される可能性がある。【００４２】
腎炎血液の浄化には、血液を一旦、腎炎患者の上腕静脈から取り出し、血漿分離膜（または分離機）で、血漿成分と血球成分に分離することが好ましい。もちろん、血漿成分と血球成分を分けずに血液のままでもよいが、標的物質以外のアルブミンなどの正常成分が体外で余分なものに触れることになる。分離した血漿成分は、吸着機能を持つリガンド（標的物質に対応する抗原あるいは抗体）を固定した担体を内部に備えたカラムに通して、標的物質を吸着除去した後、血球成分と合流させ、体内に戻す。これら一連の血液浄化作業を無菌的に機械的に行うことで、医療用具として使用できる。なお、カラムは、標的抗原に対応する抗体カラムと、標的抗体に対応する抗原カラムに分けてもよい。【００４３】
抗体カラムとしては、抗アルファ５鎖抗体カラムが好ましく、より好ましくは抗アルファ５鎖ＮＣ１抗体カラムで、さらに好ましくは、単離した慢性腎炎由来生体試料と免疫反応するアルファ５鎖由来ペプチドに対応する抗体カラムである。【００４４】
抗原カラムとしては、アルファ５鎖カラムが好ましく、より好ましくはアルファ５鎖ＮＣ１カラムで、さらに好ましくは、単離した慢性腎炎由来生体試料と免疫反応するアルファ５鎖由来ペプチドカラムである。【００４５】
以下実施例に即して、本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００４６】
１．抗ＮＣ１抗体測定法
ＮＣ１（ウシ腎糸球体由来、収率０．００２５％）を抗原とした抗ＮＣ１抗体測定法をＥＬＩＳＡで開発し、血清や尿を測定した。図１は、健常者と尿中アルブミン高値者の比較（抗ＮＣ１抗体）を示す図である。図１中、破線はカットオフ値（０．０７２）を示し、尿アルブミンが正常で血糖も正常な７例の平均ＯＤ（０．０２８）＋２ＳＤ（０．０４４）とした。図１の左側（Ａｌｂ（ｍｇ／ｍＬ）＜３０）の例数１２には、尿アルブミンが正常で血糖も正常な例（７例）の他に、尿アルブミンが正常で血糖が高値である例（５例）を含む。結果は、グッドパスチャー症候群の血清のみならず、尿中アルブミン高値者の血清や尿（図１）、透析患者の血清からと高頻度に抗ＮＣ１抗体を検出した。【００４７】
そこで、診断名の確定した腎炎の尿を検体として測定した。腎炎検体は、健常者の測定平均値＋２ＳＤをカットオフ値として、８０％以上が陽性を示した。この結果から、ＮＣ１はグッドパスチャー症候群のみの抗原ではなく、腎炎に共通な抗原である可能性を得た。【００４８】
次に、各疾患別に抗ＮＣ１抗体の検出を前記と同様に測定した。図２は、疾患別抗ＮＣ１抗体の一覧を示す図である。慢性腎炎の成り立ちは、通常、徐々に、年単位から十年以上の単位でゆっくりと悪化するが、この慢性腎炎と同様に通常ゆっくりとした進行をする二次性腎症である糖尿病性腎症他でも抗ＮＣ１抗体が検出され、診断名と抗ＮＣ１抗体値との関係が特に見られなかった（図２）。このことから、腎炎には共通な抗原部位が存在すると考えた。【００４９】
さらに、ウシ腎由来ＩＶ型コラーゲン三本鎖らせん構造を持つ三本鎖領域（７Ｓと中央螺旋部（ＴＨ）、以下三本鎖）を精製し、ＮＣ１に置き換えて抗原に用いて、抗三本鎖抗体を測定した。図３は、同一腎炎患者での抗三本鎖抗体と抗ＮＣ１抗体の相関を示す図である。抗ＮＣ１抗体と抗三本鎖抗体との相関は９０％以上を示した。ＮＣ１と三本鎖とが全く異なる構造とアミノ酸配列を持ちながら腎炎に対して同じ様に免疫反応したことから、同一のアルファ鎖なら抗原は三本鎖を構成する７Ｓでも中央螺旋域（ＴＨ）でもよいことを示した（図３）。【００５０】
２．単離した慢性腎炎由来生体試料（以下、生体試料）を検出抗体として、ＩＶ型コラーゲンより、反応する抗原部位を見出す方法
検出抗体である生体試料として、尿を直接用いたが、腎炎からの試料である血清や腎臓（腎臓の抽出物や培養物なども用い得る）でもよく、さらに調整した免疫グロブリンでもよい。また、生体試料には、ヒト腎炎由来のみならず、動物腎炎由来（別冊・医学のあゆみ、腎疾患state of arts 2003-2005 医歯薬出版社）も用いることもできる。反応する抗原のペプチド作製は、一次配列の合成ペプチドで示したが、キメラ型ペプチドでも、リコンビナントでも、その他の方法でも構わない。アミノ酸配列は、アルファ５鎖のＮＣ１を用いたが、他のアルファ鎖のＮＣ１でも構わず、生体試料と反応すればよい。また、アミノ酸配列は三本鎖（７Ｓ及び／または中央螺旋域）ならアルファ５鎖が好ましいが、生体試料と反応するなら他のアルファ鎖由来でもよい。抗原のペプチドの長さは、費用と効率の点から、アミノ酸３個以上３５個以下が好ましく、抗体の作製の容易さも考慮して、最も好ましいのは、１０個から２０個である。なお、本検索方法と結果は、アルファ５鎖に限定されず、ＩＶ型コラーゲン全アルファ鎖の検索及び検索の結果にあてはまるものである。【００５１】
ＩＶ型コラーゲンＮＣ１を用いた生体試料の選定をＥＬＩＳＡ法で測定した。ウシ腎糸球体由来のＮＣ１  １００ｕｌ／ｗｅｌｌ（１０ｕｇ／ｍＬ）をコートした９６穴マイクロプレートに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４倍希釈した生体試料（本実施例では尿）を入れ、２３℃で（以下同じ温度）２時間インキュベーション後ＰＢＳで洗浄し、酵素（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体液を加え、１時間インキュベーション後洗浄し、基質液（ＴＭＢ）を加え、５〜３０分の一定時間後（ここでは１０分）に反応停止液（１Ｎ硫酸液）を加え、直ちに４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。【００５２】
図４は、慢性腎炎ＴＤ３８と糖尿病性腎炎ＴＤ４２と健常者（ＴＤ３１〜３７、ＴＤ３９〜４１）の測定比較データ（抗ＮＣ１抗体）を示す図である。本実験尿中の抗ＮＣ１−ＩｇＧ抗体を測定し、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体（ヒトＨＲＰ３２６）４０００倍、反応６０分で行なった。図中、カットオフ値はＯＤ．０．４４３（健常者／ｎ＝１０；平均０．２５５＋２ＳＤ．  ０．１８８）で、慢性腎炎（以下Ａ）１．００８、糖尿病性腎症（以下Ｂ）２．６９６である。この結果、抗ＮＣ１抗体が高値で選ばれた尿をそのまま「単離した腎炎由来生体試料（生体試料）」として使用でき、一部は小分けして冷凍保存した。【００５３】
単離した腎炎由来生体試料（生体試料）の調製
酸性尿では、抗体は劣化するため、冷凍保存した尿試料を沈殿物と共に均一分散するように１８℃下で１夜揺すりながら解凍した。次に正確にＰＢＳで４倍量とし、１８℃下で２４時間揺すりながら均一分散液とした。これを約３０００Ｇで５分間遠心し、沈殿を除いた。上清液量を計り、凍結乾燥機で乾燥させ、最初に計測した量の滅菌済みＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加えて、容器を濯いで、ＰＢＳを回収した。この操作を４回〜５回繰り返すことで、ｐＨ中性に置換し安定した「生体試料」が得られた。ついで、再度、抗ＮＣ１抗体値を計り、測定ＯＤ値を１ｍＬの力価とした。ＰＢＳに代えて生理食塩水や注射用蒸留水を用いてもよいが、力価が落ちない様に、滅菌、除菌などの他の操作も加えて、つまり生物由来製剤を扱う当該製剤業者が払うべき注意を払って、注射剤あるいは内服剤に作製することができる。また、腎炎モデルの惹起原にも用いることができる。さらに、「生体試料」としては、抗原ＮＣ１を取り付けたアフィニテーカラムで精製をしたものや硫安沈殿などで得た抗体を、再度、希釈して濃度を合わせてもよく、血清や腎臓から、抗体の免疫グロブリンを精製してもよい。特に、腎炎患者自身から得た生体試料の自己投与は、親和性がよいので注射剤としても異常免疫反応は起き難い。また、経口投与剤も経口免疫寛容から好ましい。【００５４】
また、動物由来の生体試料を用いてもよい。惹起原としては、アルファ５鎖のＮＣ１が特に好ましい。腎糸球体由来のＮＣ１で惹起した腎炎モデルでは急性腎炎の一種なので、その抗ＮＣ１抗体の多くは、急性腎炎のグッドパスチャー症候群の自己抗体に近いので、ヒト慢性腎炎の「単離した腎炎由来生体試料」と比較しながら進めることが好ましい。動物の糖尿病モデルや高血圧モデル由来の生体試料を用いることも可能であるが、前記と同様に、ヒト慢性腎炎の「単離した腎炎由来生体試料」と比較しながら進めることが好ましい。【００５５】
単離した腎炎由来生体試料（生体試料）を用いたＩＶ型コラーゲンＮＣ１様免疫活性ペプチドの選出方法
公表アミノ酸配列は複数あるが、本発明者はニノミヤらの文献（pp235-260 In Extracelluar matrix-cellular inter raction:Molecules todiseases. ed by Ninomiya Y et al,Japan Sci Press,Tokyo/S Karger,Basel.1998.）記載の提示配列に従った（図５）。アルファ鎖１本のＮＣ１のアミノ酸残基数は約２３０である。アルファ鎖は６本であるから、ＮＣ１なら総計１３８０アミノ酸残基を調べればよい。【００５６】
予備試験
前記ＥＬＩＳＡ法で、コート抗原のＮＣ１を合成ペプチドで置き換え、予備試験を行った。測定条件は、抗原濃度：１０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭ  ＰＢＳ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ、ブロッキング剤：ブロックエース（大日本製薬製）２５％希釈を２５０μＬ／ｗｅｌｌ、尿：ヒト  ２０〜１００倍希釈、第二抗体（酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体）：×８００、基質液：ＴＭＢ（＋）（ＤＡＫＯ社製）とした。検体の希釈は，抗原をＮＣ１とした当初の４倍希釈と異なり、２０〜１００倍希釈と希薄とした。結果は、検体Ａ（慢性腎炎）、Ｂ（糖尿病性腎症）共に、抗原ペプチド３０１（アルファ３鎖ＮＣ１上のＮ端から連続した２０アミノ酸残基）より抗原５０１（アルファ５鎖ＮＣ１上のＮ端から連続した２０アミノ酸残基）の方が免疫反応を強く示した。そこで、アルファ５鎖のＮＣ１で本試験を行った。なお、３０１は、パソコンソフトが指定したグッドパスチャー症候群のアルファ３鎖上のＮ端５−１８位のアミノ酸配列を含んでいた。また、３０１のように、アルファ５鎖以外についても同様に調べることができた。さらに、３０１と５０１のどちらも、健常者尿に比べ腎炎尿では明らかに抗体値が高く充分識別できるので、腎炎検出試薬として利用できた。【００５７】
アルファ５鎖ＮＣ１上の抗原部位のスクリーニング
前記ＥＬＩＳＡ法を用い、コート抗原のＮＣ１を合成ペプチドで置き換え、他の測定条件は全く同一で実験した。図６は、慢性腎炎Ｎｏ３８、糖尿病性腎炎Ｎｏ４２、ＩｇＡ腎症と健常者Ｎｏ３１，３２，３３とのＮＣ１様抗原性の比較を示す図である。【００５８】
アルファ５鎖のペプチドは、次のように作製した。アルファ５鎖ＮＣ１をＮ端から２０アミノ酸残基単位で、５アミノ酸残基を重ねながらアルファ５鎖ＮＣ１の全域を２０アミノ酸残基単位で１５種類の合成ペプチドとした（以下、ｙｐ０１〜ｙｐ１５と呼び（図６ではＨ４ＮＡ５−１〜５−１５）、ｙｐ１５は２０個のアミノ酸を超えたものを入れた）。その結果、検体Ａ（慢性腎炎：Ｎｏ３８）がｙｐ０５、０８、１３、１０、１２と強く反応し、検体Ｂ（糖尿病性腎症：Ｎｏ４２）がｙｐ１０、１３、０８、０５、１２と強く反応し、ＩｇＡ腎症がｙｐ０８、０５、１０、１３、１２と強く反応し、高値のペプチド群が一致したので、この５種類のペプチドは病因の異なる検体Ａ，検体ＢおよびＩｇＡ腎症の共通の抗原部位であった。前述したように腎炎尿に対して、ウシ糸球体由来のＮＣ１と三本鎖の反応性はほぼ同じで、どちらも腎炎の共通の抗原と考えられるので、アルファ５鎖三本鎖（７Ｓまたは／及び中央螺旋域）及びそのペプチドも免疫反応性ペプチド候補としてよい。なお、アルファ５鎖全体も抗原として用いることができるが手間を要する。【００５９】
以上のように、「生体試料」はＮＣ１様免疫活性ペプチドをスクリーニングするのに有効なリガンドであり、見出だされたペプチドもその抗体も、同様に対応する抗体あるいは抗原ペプチド検出のリガンドとして利用できた。特に、免疫活性ペプチドより作製した抗体は、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも、「生体試料」に代わり、新たな免疫活性ペプチドの検出に有用であった。アルファ５鎖上から見出だされたペプチドは、いずれも、腎炎尿と健常者との反応差が大きく（図６）、腎炎検出の試薬キットに使用できた。本発明の免疫活性ペプチドは「生体試料」に対し、ＩＶ型コラーゲン様免疫反応性を有することであり、アルファ５鎖由来に限定されない。【００６０】
３．新規のアルファ５鎖ＮＣ１様免疫活性ペプチドのスクリーニング方法
候補免疫活性ペプチドのスクリーニングには、前記アルファ５鎖ＮＣ１由来の合成ペプチドに置き換えて候補免疫活性ペプチドを使用した。生体試料に置き換えて抗アルファ５鎖ＮＣ１抗体でもよく、抗アルファ５鎖ＮＣ１由来ペプチド抗体でもよい。その場合、標識抗体は、抗体の由来動物に合わせた。【００６１】
候補免疫活性ペプチドに用いるペプチドは、アルファ５鎖ＮＣ１由来の提示ペプチドと同等以上の免疫反応性ペプチドである限り、どのような配列でもよく、ＩＶ型コラーゲンに限定されない。また、提示ペプチドを短くしても、追加しても、改変しても、置換しても、修飾しても、合体させたアミノ酸配列でもよい。例えばｙｐ１２とｙｐ１３の合体である。提示ペプチドの一部を変更するには、簡単には動物由来の配列を用いてもよい。また、アルファ５鎖ＮＣ１のアミノ酸配列の一部を用いたペプチドで、生体より抽出精製したＮＣ１より免疫反応性を有するものならいずれのアミノ酸配列も利用できた。【００６２】
本発明は、三本鎖（７Ｓ及び／または中央螺旋域）を含めてアルファ５鎖のアミノ酸配列全てに当てはまる。好ましくは、全域アルファ５鎖に対するよりも小さい領域、三本鎖様やＮＣ１様免疫反応性の優れたペプチドで、より好ましくは、より短いペプチドでより免疫反応性を示すペプチドであり、費用と効果から、ペプチドの長さは３個以上３５個以下が好ましく、その選定方法は、既に示したＥＬＩＳＡ法で行い得るがこれに限定されない。【００６３】
以上は、他のアルファ鎖にも同様に適用できるので、生体試料の代わりに、各種の抗体を、例えば、ＮＣ１、７Ｓ、中央螺旋域などの各領域、各アルファ鎖、ＩＶ型コラーゲン由来の各ペプチド等々に対する抗体を用いてもよい。生体試料以外の動物種の場合は、前述のヒト用試薬成分を動物種に合わせた。また、他のアルファ鎖に適用するには、単離した腎炎由来生体試料との反応性をあらかじめ、確認しておくことが好ましい。【００６４】
免疫反応としては、酵素免疫反応に限定されず、ＡＢ法、ＲＩＡ，免疫発光法、沈降反応、凝集反応他を含み、酵素標識抗体としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を問わず、またそれを放射性物質、発光物質で標識した物、無標識物でもよい。反応形式は、サンドイッチ法に囚われず、競合法等でもよい。プレートに替え、ガラス、磁性物質、ラテックスにしてもよく、無しにして固相法を用いないことでもよい。【００６５】
プレートにペプチドをコートする時、コート物質をアビジン、ビオチン、またはこれらの結合した成分を介してもよい。プレートにコートするペプチドは、複数種を混合してもよく、後で選ばれた混合ペプチド検体を構成ペプチドに別けて選んでもよい。ペプチドは合成のみで無く、他の分野で利用されている方法ならいずれでも当業者に可能である。更に第二抗体は、抗検体ＩｇＧ抗体に限定されず、抗検体ＩｇＭ抗体、抗検体ＩｇＡ抗体、抗検体イムノグロブリン抗体でもよいが、抗検体ＩｇＧ抗体が好ましい。【００６６】
４．免疫活性ペプチドを惹起原とした腎炎モデルの作製
選出されたペプチドは、単独及び／または複数で腎炎の惹起原に用いることができる。ペプチドにはｙｐ０８、ｙｐ１２を、動物にはウサギとモルモットを示すが、ペプチド、動物及び投与方法共に、これに限定されない。【００６７】
ウサギ（雌）にペプチド０．３ｍｇ／ｍＬ（初回のみ０．１５ｍｇ）を同量のＦＣＡと共に、２週間に１回で計４回皮内に投与した。ｙｐ０８は尿蛋白（＃２；＋２）とｙｐ１２は尿蛋白（＃１；＋２）と、いずれも陽性を示した。【００６８】
また、血清の抗体値は、マイクロプレートにペプチドｙｐ１２（１０ｕｇ／ｍＬ）をコートしたＥＬＩＳＡ法で初回投与７週間後に、３２、０００倍希釈で吸光度計の測定上限近辺の３．００に至った。【００６９】
ＥＬＩＳＡ抗体価；ｙｐ０８（＃２×８，０００；Ａ４５０ｎｍ／３．００）
ｙｐ１２（＃１×３２，０００；Ａ４５０ｎｍ／３．００）【００７０】
モルモット（雌）にペプチド０．１ｍｇ／ｍＬを同量のＦＣＡと共に、２週間に１回で計４回皮内に投与した。ｙｐ１２では尿蛋白（＃１；＋１、＃２；±，＃３；±）と、いずれも弱い陽性を示した。このことは、ヒトの腎炎がゆっくり進行するので、ふさわしいモデルであることを示した。【００７１】
また、モルモット血清の抗体値は、マイクロプレートにペプチドｙｐ１２（１０ｕｇ／ｍＬ）をコートしたＥＬＩＳＡ法で初回投与７週間後に、８、０００倍希釈で吸光度計の測定上限近辺の３．００に至った。さらに、これらの抗免疫活性ペプチド抗体（抗血清）のラットやマウスの腹腔内への投与は、従来の抗ＮＣ１抗体（抗血清）の投与と異なり弱く、ヒトに近い緩徐な腎炎モデルを可能にした。【００７２】
５．免疫活性ペプチドによる腎炎の抑制
水に溶かしたｙｐ１２を、モルモット２匹を購入後１週間の馴化期間に、総量５〜１０ｍｇ与えた。その後、腎炎の惹起を前述のように行った。尿蛋白は見られず（＃１；−，＃２；−）、腎炎尿を呈しなかった。【００７３】
免疫活性ペプチドの経口投与は、腎炎のワクチンや治療薬を示している。免疫活性ペプチドやその抗体は経口投与剤や脱感作療法に使用でき、注射剤にも使用できた。類似の先例は特開２０００−２１４１６３号公報に見られるが、本発明はペプチドをより特定することで、効果を高めるものである。【００７４】
６．免疫活性ペプチドに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡキット
ＥＬＩＳＡ法は、抗原あるいは抗体検出の通常の測定方法であり、測定手順には大きな差は無いので、ここでは、先の抗体の組み合わせ例を示した。【００７５】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法での「抗原ＮＣ１」の測定で、「抗ＮＣ１モノクローナル抗体と抗ＮＣ１抗体（モルモット）」の代わりに、前記に示した「抗ｙｐ１２抗体（ウサギ）と抗ｙｐ１２抗体（モルモット）」及び「抗ＮＣ１モノクローナル抗体と抗ｙｐ１２抗体または抗ｙｐ０８抗体」の組み合わせで、いずれもＮＣ１の測定が可能で、尿を検体として腎炎初期の検出に使用できた。測定範囲は、例えば、「抗ＮＣ１モノクローナル抗体（ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００２６６９）と抗ＮＣ１抗体（モルモット）」で抗ＮＣ１モノクローナル抗体（２ｕｇ／ｍＬ）をマイクロプレートにコートし、抗ＮＣ１抗体（モルモット）（ＩｇＧ  ＡＰ−Ｂｉｏｔｉｎ  ０．９５ｍｇ／ｍＬ）をＡＢ法（Ａｖｉｄｉｏｎ−ＨＲＰ×４，０００）にした時、ＮＣ１を５０ｎｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまで微量測定が可能で、用途としての腎炎、特に糖尿病性腎炎の初期で尿から検出できた。進行した尿では抗原が検出出来ないので、病気の早期の診断薬となる。その場合、ｙｐ０８やｙｐ１２の抗原固相化プレートで対応する抗体（抗ＮＣ１抗体も含め）を腎炎からの試料を検体として検出した。また、「抗ｙｐ１２抗体（ウサギ）と抗ｙｐ１２抗体（モルモット）」及び「抗ＮＣ１モノクローナル抗体と抗ｙｐ１２抗体または抗ｙｐ０８抗体」の組合せは、ｙｐ１２またはｙｐ０８の測定ができるので、研究試薬として利用できた。【００７６】
アルファ５鎖ＮＣ１で用いたのと同様な手法で、三本鎖（７Ｓ及びまたは中央螺旋域）由来の免疫活性ペプチドを選出し、選出した免疫活性ペプチドに対する抗体を用いても、三本鎖（７Ｓ及びまたは中央螺旋域）及び／またはその免疫活性ペプチドの測定が可能である。【００７７】
単離した腎炎由来生体試料を用いることで、ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドを選出することができた。また、選出したＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンの代用となり、腎炎の診断薬、腎炎治療薬、腎炎治療具、生体試料からの抗体除去や抗体採取に、また、抗ＩＶ型コラーゲン様免疫活性ペプチド抗体は、腎炎の診断薬、治療薬、腎炎治療具、生体試料からの抗原除去や抗原採取に役立った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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