(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、および中性脂質を有する脂質ベース粒子を含み、該脂質ベース粒子が、前記カチオン性脂質を１００重量部、前記コレステロールを２５〜１００重量部、前記中性リン脂質を２５〜１００重量部、前記中性脂質を２５〜１５０重量部含む脂質キャリアであって、前記中性リン脂質が、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンであり、前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールであり、前記脂質キャリアがｐＨ４〜５の弱酸性のリソソーム内で薬物を放出する脂質キャリア。
【請求項２】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドを含む請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項３】
前記ホスファチジルコリンが、水素化大豆ホスファチジルコリンである請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項４】
前記カチオン性脂質が１００重量部、前記コレステロールが５０重量部、前記中性リン脂質が５０重量部、前記中性脂質が６５重量部である請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項５】
前記脂質ベース粒子に被覆される薬物をさらに含む請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項６】
前記薬物には、核酸医薬、蛋白薬、ペプチド薬または合成薬が含まれる請求項５記載の脂質キャリア。
【請求項７】
前記核酸医薬には、プラスミドＤＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる請求項６記載の脂質キャリア。
【請求項８】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が１：４〜１：１２である請求項５記載の脂質キャリア。
【請求項９】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が１：６である請求項５記載の脂質キャリア。
【請求項１０】
前記脂質ベース粒子の直径が３５〜９５ｎｍである請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項１１】
前記脂質ベース粒子のゼータ電位が−１０〜１０ｍＶである請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項１２】
前記脂質ベース粒子の被覆効率が８５〜１００％である請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項１３】
血清中の活性が６０〜１００％である請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項１４】
前記脂質ベース粒子の表面にグラフトされたリガンドをさらに含む請求項１記載の脂質キャリア。
【請求項１５】
前記リガンドは対象の標的細胞を認識する請求項１４記載の脂質キャリア。
【請求項１６】
前記リガンドを持つ前記脂質キャリアのトランスフェクション効率が、リガンドを持たない脂質キャリアの１０倍を超える請求項１４記載の脂質キャリア。
【請求項１７】
カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、中性脂質、エタノール、および水を、前記カチオン性脂質を１００重量部、前記コレステロールを２５〜１００重量部、前記中性リン脂質を２５〜１００重量部、前記中性脂質を２５〜１５０重量部として混合して脂質溶液を作る工程と、
前記脂質溶液に薬物含有溶液を加えて、前記薬物を被覆した複数の脂質ベース粒子を含む溶液を作る工程と、
前記溶液を加熱して脂質キャリアを作る工程と
を含む脂質キャリアの製造方法であって、前記中性リン脂質が、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンであり、前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールであり、前記脂質キャリアがｐＨ４〜５の弱酸性のリソソーム内で薬物を放出する脂質キャリアの製造方法。
【請求項１８】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ホスファチジルコリンが、水素化大豆ホスファチジルコリンである請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記カチオン性脂質を１００重量部、前記コレステロールを５０重量部、前記中性リン脂質を５０重量部、前記中性脂質を６５重量部とする請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記エタノールと前記水との体積比が３：７〜５：５である請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記エタノールと前記水との体積比が４：６である請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
前記薬物には、核酸医薬、蛋白薬、ペプチド薬または合成薬が含まれる請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸医薬には、プラスミドＤＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が１：４〜１：１２である請求項１７記載の方法。
【請求項２６】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が１：６である請求項１７記載の方法。
【請求項２７】
前記溶液を５０〜７０℃に加熱する請求項１７記載の方法。
【請求項２８】
前記溶液を６５℃に加熱する請求項１７記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質ベース粒子の直径が３５〜９５ｎｍである請求項１７記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質ベース粒子のゼータ電位が−１０〜１０ｍＶである請求項１７記載の方法。
【請求項３１】
前記脂質ベース粒子の被覆効率が８５〜１００％である請求項１７記載の方法。
【請求項３２】
血清中における前記脂質キャリアの活性が６０〜１００％である請求項１７記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質ベース粒子の表面にグラフトされたリガンドをさらに含む請求項１７記載の方法。
【請求項３４】
前記リガンドは対象の標的細胞を認識する請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記リガンドを持つ前記脂質キャリアのトランスフェクション効率が、リガンドを持たない脂質キャリアの１０倍を超える請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質キャリア（lipid carrier）に関し、より詳細にはｐＨ感受性および血清耐性（serum-resistant）を備える脂質キャリアおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は注目の高まっている治療法であり、遺伝性または後天性疾患、例えば原発性免疫不全や癌治療においてとりわけ重要視されている。過去１５年のあいだに遺伝子治療は体外実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）から、生体内実験（ｉｎ ｖｉｖｏ）を経て人体での臨床実験へと突入した。遺伝子治療の臨床実験は現段階でフェーズ１または２にとどまってはいるものの、期待できる治療法であることは明らかである。遺伝子薬を運ぶキャリアは、一般にウィルス性キャリアと非ウィルス性キャリアの２種に分けられており、現在、遺伝子治療臨床実験の８５％がウィルス性キャリアを用いて行われている。
【０００３】
ところが、１９９９年９月ペンシルバニア医薬センターで、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ）の十代の少年が遺伝子治療を受けている期間中に死亡するという事件が起こり、翌年の２月、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、米国での一切の遺伝子治療臨床実験を停止した。また、２００２年９月、フランスでは、Ｘ連鎖重症複合型免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）患児への遺伝子治療施行後に白血病が発症した例が出た。そして不幸にも、２００３年に同様の臨床試験によって第２の白血病発症例が発生している。これら有害事象は、遺伝子治療の発展に大きな打撃を与えたが、その原因を突き止めたところ、使用したウィルス性キャリアによる免疫原性および毒性がその主な毒性因子であることがわかった。よって、非ウィルス性の遺伝子トランスフェクションシステム開発が遺伝子治療の成否を握る鍵となったのである。目下のところ、非ウィルス性キャリアには、脂質ベースのキャリアとポリマーベースのキャリアがあるが、本明細書では主に脂質キャリアについて述べる。
【０００４】
カチオン性脂質キャリアは最も一般的に使用されているキャリアであり、非ウィルス性キャリアの中で最高のトランスフェクション効率を示す。現在、数種の入手可能なｉｎ ｖｉｔｒｏ試薬があり、例えばライフテクノロジーズ社（Life Technologies）製のリポフェクチン（Lipofectin（登録商標））およびリポフェクタミン（Lipofectamine、登録商標）などは、主に遺伝子および蛋白質の研究に利用されている。カチオン性脂質キャリアは、トランスフェクション効率が高いことに加え、エンドソーム破壊（Endosomolysis）効果を有し、かつ生体親和性に優れるといった長所を備えている。しかし、通常、カチオン性脂質とＤＮＡの複合体は直径５００ｎｍを上回り、かつ血清中にて不安定である。このため、かかる複合体は主に生体外研究または局注にのみ使用されている。
【０００５】
臨床実験まで進んだ最初の脂質キャリアは、リーフ  ホアン（Leaf Huang）博士により開発されたＤＣ−リポソームであり、これは局注による乳癌治療に用いられるものである。現在、このＤＣ−リポソームの臨床試験はフェーズ２の段階にある。
【０００６】
カチオン性脂質キャリアとＤＮＡの複合体の過大な粒径を縮小するため、リーフ・ホアン博士は、例えばプロタミンまたはポリリシンであるカチオン性ペプチドを加えることで粒径を小さくすると共にトランスフェクション効率を高めることのできるＬＰＤと呼ばれる新規の遺伝子トランスフェクションシステムを開発したが、このＬＰＤ複合体は、キャリア表面が正に帯電するため、血清中でなおも不安定であった。
【０００７】
カチオン性のキャリアに起因して血清中で不安定となりかつ毒性が生じるという問題を回避すべく、ティー  エム  アレン（T.M. Allen）とＳ．Ｃ．センプル（S.C. Semple）らは、電気的に中性なリポソームでＤＮＡを封じ込めることによりキャリアと蛋白質の非特異的な作用を低減させ、血清耐性を強化することに成功した。さらに彼らは、中性のリポソームが、ＤＮＡの半減期を約８〜２４時間延長させ（ＤＮＡ自身の半減期は３０分にも満たない）、かつ、ＤＮＡを腫瘍部位に運搬できることも発見した。しかし、このキャリアは、カチオン性キャリアと細胞間におけるような相互作用に欠けるため、細胞へ進入し難く、トランスフェクション効率が低いものであった。この問題への解決策として、標的リガンド（target ligand）を利用し、これを細胞の表面における特定のレセプターに結合させることによりエンドサイトーシスを促して、ＤＮＡのトランスフェクション効率を高めるといった手法がとられている。
【０００８】
脂質キャリアを用いた臨床実験は、ほとんどが現時点で依然フェーズ２に止まっており、上述したような例えばキャリアの血清における不安定性や毒性の問題がその更なる進展を阻んでいる。したがって、高血清耐性、高被覆効率および高トランフェクション効率を有する脂質ベースキャリアが求められる。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第９９／２５３８５号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６７４３７７９号明細書
【特許文献３】米国特許第６６３０３５１号明細書
【特許文献４】米国特許第５９６５４３４号明細書
【特許文献５】米国特許第５８３７５３３号明細書
【特許文献６】米国特許第５７８６２１４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述に鑑みて、本発明の目的は、高血清耐性、高被覆効率および高トランフェクション効率を有する脂質キャリアおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、および中性脂質を有する脂質ベース粒子を含み、このうち、前記カチオン性脂質が約１００重量部、前記コレステロールが約２５〜１００重量部、前記中性リン脂質が約２５〜１００重量部、前記中性脂質が約２５〜１５０重量部含まれる脂質キャリアに関する。
【００１２】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylamino)propane＝ ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ)プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N- dimethyl-N- hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammonium chloride ＝ ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール（３β−［Ｎ−(N',N'-dimethylaminoethane)carbamyl] cholesterol ＝ ＤＣ-Ｃｈｏｌ）、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（dimethyldioctadecylammonium ＝ ＤＤＡＢ）を含むことが好ましい。
【００１３】
前記中性リン脂質が、ホスファチジルコリン（phosphatidyl choline ＝ ＰＣ）またはホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine ＝ ＰＥ）を含むことが好ましい。
【００１４】
前記ホスファチジルコリンが、水素化大豆ホスファチジルコリン（hydrogenated soy phosphatidyl choline ＝ ＨＳＰＣ）を含むことが好ましい。
【００１５】
前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol ＝ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含むことが好ましい。
【００１６】
前記カチオン性脂質が約１００重量部、前記コレステロールが約５０重量部、前記中性リン脂質が約５０重量部、前記中性脂質が約６５重量部であることが好ましい。
【００１７】
前記脂質ベース粒子に被覆される薬物をさらに含むことが好ましい。
【００１８】
前記薬物には、核酸医薬、蛋白薬、ペプチド薬または合成薬が含まれることが好ましい。
【００１９】
前記核酸医薬には、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉが含まれることが好ましい。
【００２０】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が約１：４〜１：１２であることが好ましい。
【００２１】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が約１：６であることが好ましい。
【００２２】
前記脂質ベース粒子の直径が約３５〜９５ｎｍであることが好ましい。
【００２３】
前記脂質ベース粒子のゼータ電位が約−１０〜１０ｍＶであることが好ましい。
【００２４】
前記脂質ベース粒子の被覆効率が約８５〜１００％であることが好ましい。
【００２５】
ｐＨ４〜５における前記脂質キャリアの薬物放出率が約６０〜７０％であることが好ましい。
【００２６】
血清中の前記脂質キャリアの活性が約６０〜１００％であることが好ましい。
【００２７】
前記脂質ベース粒子の表面にグラフトされたリガンドをさらに含むことが好ましい。
【００２８】
前記リガンドは対象の標的細胞を認識することが好ましい。
【００２９】
前記リガンドを持つ前記脂質キャリアのトランスフェクション効率が、リガンドを持たない脂質キャリアの１０倍を超えることが好ましい。
【００３０】
また、本発明は、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、中性脂質、エタノール、および水を、前記カチオン性脂質を約１００重量部、前記コレステロールを約２５〜１００重量部、前記中性リン脂質を約２５〜１００重量部、前記中性脂質を約２５〜１５０重量部として混合して脂質溶液を作る工程と、前記脂質溶液に薬物含有溶液を加えて、前記薬物を被覆した複数の脂質ベース粒子を含む溶液を作る工程と、前記溶液を加熱して脂質キャリアを作る工程とを含む脂質キャリアの製造方法に関する。
【００３１】
前記カチオン性脂質が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylamino)propane ＝ ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N- dimethyl-N- hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammonium chloride ＝ ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール（3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamyl] cholesterol ＝ ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（dimethyldioctadecylammonium ＝ ＤＤＡＢ）を含むことが好ましい。
【００３２】
前記中性リン脂質が、ホスファチジルコリン（phosphatidyl choline ＝ ＰＣ）またはホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine ＝ ＰＥ）を含むことが好ましい。
【００３３】
前記ホスファチジルコリンが、水素化大豆ホスファチジルコリン（hydrogenated soy phosphatidyl choline ＝ ＨＳＰＣ）を含むことが好ましい。
【００３４】
前記中性脂質が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol ＝ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を含むことが好ましい。
【００３５】
前記カチオン性脂質を約１００重量部、前記コレステロールを約５０重量部、前記中性リン脂質を約５０重量部、前記中性脂質を約６５重量部とすることが好ましい。
【００３６】
前記エタノールと前記水との体積比が約３：７〜５：５であることが好ましい。
【００３７】
前記エタノールと前記水との体積比が約４：６であることが好ましい。
【００３８】
前記薬物には、核酸医薬、蛋白薬、ペプチド薬または合成薬が含まれることが好ましい。
【００３９】
前記核酸医薬には、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉが含まれることが好ましい。
【００４０】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が約１：４〜１：１２であることが好ましい。
【００４１】
前記薬物と前記カチオン性脂質との重量比が約１：６であることが好ましい。
【００４２】
前記溶液を約５０〜７０℃に加熱することが好ましい。
【００４３】
前記溶液を約６５℃に加熱することが好ましい。
【００４４】
前記脂質ベース粒子の直径が約３５〜９５ｎｍであることが好ましい。
【００４５】
前記脂質ベース粒子のゼータ電位が約−１０〜１０ｍＶであることが好ましい。
【００４６】
前記脂質ベース粒子の被覆効率が約８５〜１００％であることが好ましい。
【００４７】
ｐＨ４〜５における前記脂質キャリアの薬物放出率が約６０〜７０％であることが好ましい。
【００４８】
血清中における前記脂質キャリアの活性が約６０〜１００％であることが好ましい。
【００４９】
前記脂質ベース粒子の表面にグラフトされたリガンドをさらに含むことが好ましい。
【００５０】
前記リガンドは対象の標的細胞を認識することが好ましい。
【００５１】
前記リガンドを持つ前記脂質キャリアのトランスフェクション効率が、リガンドを持たない脂質キャリアの１０倍を超えることが好ましい。
【発明の効果】
【００５２】
本発明によれば、特定のキャリア組成の割合、エタノール／水の割合、薬物／カチオン性脂質の割合、および加熱条件により均一な粒径、高被覆効率、および高血清耐性を持った脂質ベース粒子を得ることができる。さらに、かかる脂質ベース粒子を含む本発明の脂質キャリアは、そのｐＨ感受性のために、ｐＨ４〜５下で薬物を放出し得るため、遺伝子のトランスフェクション効率の飛躍的な向上も図られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
本発明の提供する脂質キャリアは、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、および中性脂質を有する脂質ベース粒子を含み、このうち、カチオン性脂質が約１００重量部、コレステロールが約２５〜１００重量部、中性リン脂質が約２５〜１００重量部、中性脂質が約２５〜１５０重量部含まれる。
【００５４】
また、本発明の提供する脂質キャリアの製造方法は次の工程を含む。先ず、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、中性脂質、エタノールおよび水を混合して脂質溶液を作る。この際、カチオン性脂質を約１００重量部、コレステロールを約２５〜１００重量部、中性リン脂質を約２５〜１００重量部、中性脂質を約２５〜１５０重量部とする。次に、薬物を含有した溶液をその脂質溶液中に加えて、該薬物を被覆した複数の脂質粒子を含む懸濁液を作る。最後に、その懸濁液を加熱して、脂質ベースキャリアを作る。
【００５５】
以下に、添付の図面と対応させながら、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。
【００５６】
本発明は、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、および中性脂質を有する脂質ベース粒子を含む脂質キャリアを提供するものである。このうち、カチオン性脂質は約１００重量部、コレステロールは約２５〜１００重量部、中性リン脂質は約２５〜１００重量部、中性脂質は約２５〜１５０重量部含まれる。
【００５７】
カチオン性脂質としては、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（1,2-dioleoyloxy-3-(trimethylamino)propane ＝ ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N- dimethyl-N- hydroxyethylammonium bromide ＝ ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride ＝ ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバミル］コレステロール（3β-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamyl] cholesterol ＝ ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（dimethyldioctadecylammonium ＝ ＤＤＡＢ）を挙げることができ、このうちでもＤＯＴＡＰが好ましい。
【００５８】
中性リン脂質としては、ホスファチジルコリン（phosphatidyl choline ＝ ＰＣ）またはホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl ethanolamine ＝ ＰＥ）を挙げることができる。ホスファチジルコリンは、水素化大豆ホスファチジルコリン（hydrogenated soy phosphatidyl choline ＝ＨＳＰＣ）であり得る。中性脂質としては、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（distearoylphosphatidylethanolamine-polyethyleneglycol ＝ ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）を挙げることができる。
【００５９】
脂質ベース粒子は、カチオン性脂質約１００重量部、コレステロール約５０重量部、中性リン脂質約５０重量部、中性脂質約６５重量部からなる組成とするのが好ましい。
【００６０】
脂質ベース粒子は、薬物をその中に包み込んで運搬するトランスフェクションキャリアとなり得る。この薬物には、核酸医薬、蛋白薬、ペプチド薬、または合成薬が含まれる。さらに、核酸医薬には、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＲＮＡｉが含まれる。キャリアの組成中、薬物とカチオン性脂質の重量比は約１：４〜１：１２とし、好ましくは１：６とする。
【００６１】
脂質ベース粒子は、粒径が約３５〜９５ｎｍ、ゼータ電位が約−１０〜１０ｍＶ、被覆効率が約８５〜１００％、ｐＨ４〜５における薬物放出率が約６０〜７０％であり、血清中で約６０〜１００％の活性を保つ。
【００６２】
さらに、脂質ベース粒子の表面にリガンドを結合させて、標的細胞のレセプターを認識できるようにしてもよい。リガンドを持つ脂質キャリアのトランスフェクション効率は、リガンドを持たない脂質キャリアの１０倍を超える。
【００６３】
また、本発明は、脂質キャリアの製造方法も提供する。当該製造方法では、先ず、カチオン性脂質、コレステロール、中性リン脂質、中性脂質、エタノールおよび水を混合して脂質溶液を作る。この際、カチオン性脂質を約１００重量部、コレステロールを約２５〜１００重量部、中性リン脂質を約２５〜１００重量部、中性脂質を約２５〜１５０重量部とする。次に、その脂質溶液に薬物含有溶液を加えて、該薬物を被覆した複数の脂質ベース粒子を含む懸濁液を作る。最後に、その懸濁液を加熱して脂質キャリアを形成する。
【００６４】
前記溶液は、約５０〜７０℃、好ましくは６５℃に加熱する。エタノールおよび水の体積比は約３：７〜５：５とし、好ましくは４：６とする。
【００６５】
本発明は、特定のキャリア組成の割合、エタノール／水の割合、薬物／カチオン性脂質の割合、および加熱条件を採用することによって、均一な粒径、高被覆効率、および高血清耐性が備わった脂質ベース粒子を提供する。かかる脂質ベース粒子が細胞に入ると、キャリアは、そのｐＨ感受性のために、リソソームの酵素によって解体されることなく、ｐＨ４〜５の弱酸性のリソソーム内で薬物を放出することとなる。よって、遺伝子のトランスフェクション効率が飛躍的に高まる。
【実施例】
【００６６】
（脂質キャリアの製造）
先ず、エタノール０．０５ｍＬを１．５ｍＬ遠心分離管中に入れてから、カチオン性ＤＯＴＡＰ０．１ｍｇ、コレステロール０．０５ｍｇ、ＨＳＰＣ０．０５ｍｇ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ０．０６５ｍｇを６５℃の水浴にてエタノール中に溶解した。続いて、その溶液中に脱イオン水を添加して体積を０．０９５ｍＬとし、完全に混合させて脂質溶液を得た。
【００６７】
次に、オリゴヌクレオチド含有溶液０．００５ｍＬ(１０ｍｇ／ｍＬ) を脂質溶液中に加えて、オリゴヌクレオチドを被覆した複数の脂質ベース粒子を含む混合物を作った。最後に、遠心分離管にＰＢＳ溶液０．１ｍＬ(ｐＨ７．４)を加え、６５℃の水浴で１０分間加熱して脂質キャリアを得た。
【００６８】
（脂質ベース粒子のサイズおよびゼータ電位の測定）
脂質ベース粒子のサイズをサブミクロン粒子測定器（フロリダ州マイアミ、コールター社製N4 PLUS）で測定し、ゼータ電位をゼータ電位アナライザー（ニューヨーク州ホルツビル、ブルックヘブンインストルメンツ社製 ZetaPlus）で測定した。測定の結果、粒径は７２．０±２２．５ｎｍ、ゼータ電位は−０．３０２ｍＶであった。
【００６９】
（被覆効率の測定）
被覆されたオリゴヌクレオチドとフリーオリゴヌクレオチドをクロマトグラフィーカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で分離し、被覆効率を求めた。被覆効率の計算式は次のとおりである。
被覆効率（％）＝（オリゴヌクレオチド総量−フリーオリゴヌクレオチドの量／
オリゴヌクレオチド総量）×１００％
算出の結果、キャリアの被覆効率は９５±５％であった。
【００７０】
（薬物放出率の測定）
キャリア溶液０．２ｍＬを、ｐＨ６．８、ｐＨ６、ｐＨ５．５、ｐＨ５、ｐＨ４．５、ｐＨ４の各緩衝液１００ｍＭにそれぞれ混合し、３７℃の水浴に５分間入れた。その脂質溶液をセファロース（Sepharose）ＣＬ  ４Ｂクロマトグラフィーカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）で分離したのち、オリゴヌクレオチドの放出率を測定した。結果、図１に示されるように、ｐＨ４〜５におけるキャリアの薬物放出率は約６０〜７０％であった。
薬物放出率（％）＝フリーオリゴヌクレオチドの量／オリゴヌクレオチド総量×１００％
【００７１】
（血清耐性の測定）
ＰＣ１４ＰＥ６細胞（国立成立大学（National Cheng Kung University）より入手）を１ｃｍ2のスライドガラス上で培養した。培養後のスライドにおける細胞数は２×１０4であった。血清耐性試験は次の工程により行った。先ず、細胞およびオリゴヌクレオチドを被覆したキャリアを、血清を１０％含有した培地と血清を含まない培地の２つの培地中で、３７℃の温度下それぞれ４時間培養した。そして、細胞をＰＢＳ溶液で３回洗浄してから、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（メルク社製）を含んだまた別のＰＢＳ溶液と１時間混ぜ合わせることによって溶解させた。最後に、蛍光アナライザー（ＪＡＳＣＯ社製ＦＰ−１５２０）（Ｅｘ:４９４ｎｍ、Ｅｍ:５１９ｎｍ）で、細胞溶出物を分析した。分析結果より、血清中においてキャリアは、６０〜１００％の活性を維持していることがわかった。
血清耐性（％）＝血清を１０％含有した群のオリゴヌクレオチド−ＦＩＴＣ蛍光強度／血清を含まない群のヌクレオチド−ＦＩＴＣ蛍光強度×１００％
【００７２】
（リガンドを持つキャリアのトランスフェクション効率測定）
ＰＣ１４ＰＥ６細胞を２４ウェルプレートで一晩培養した。培養後の各ウェルにおける細胞数は５×１０4であった。トランスフェクション効率試験は次のとおりに行った。細胞およびリガンドであるタモキシフェンを持つキャリアと、細胞およびリガンドであるタモキシフェンを持たないキャリアとを、血清を１０％含有した培地と血清を含まない培地の２つの培地中で、３７℃の温度下それぞれ４時間培養した。そして、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄してから、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むまた別のＰＢＳ溶液と１時間混ぜ合わせることによって溶解させた。最後に、蛍光アナライザー（Ｅｘ:４９４ｎｍ、Ｅｍ:５１９ｎｍ）で、細胞溶出物を分析した。
【００７３】
図２を見るとわかるように、リガンドを持つキャリアのトランスフェクション効率は、リガンドを持たないキャリアの１０倍を超えている。さらに、血清の存在の有無にかかわらず結果は同様だったということも、本発明が提供する脂質キャリアの血清耐性を証明している。
【００７４】
本発明を好ましい実施例によって以上のように開示したが、これは本発明を限定しようとするものではなく、当業者であれば、本発明の精神と範囲を逸脱しない限りにおいて変更および修飾を施すことができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲で定義されたものが基準とされる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明による脂質キャリアの各種ｐＨ環境における薬物放出率を示す図である。
【図２】本発明による脂質キャリアの血清が存在する場合としない場合におけるトランスフェクション効率を比較する図である。
【図１】
0005264053.tif 000002
【図２】
0005264053.tif 000003