(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を含むバイオセンサであって、
前記試料供給部が、電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる、酵素、親水性高分子および微粒子を含む第二の反応層と、を含み、
前記微粒子が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体、ポリアミド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラス、エーライト、ラテックス球、ダイヤモンド粉末、酸化チタン、炭酸カルシウム、ポリマーでコートした金、微細セルロース粉末、微細結晶セルロース粉体からなる群より選択される少なくとも１種、または上記の表面にカルボキシル基もしくはアミノ基を導入したものである、バイオセンサ。
【請求項２】
前記第一の反応層または前記第二の反応層中の前記微粒子の平均粒径が、０．０１μｍ〜２０μｍである、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記電極上に、前記第一の反応層と前記第二の反応層とが、この順で積層されてなる、請求項１または２に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の特定成分、特に生体試料中に含まれる特定成分を、酵素反応を利用してその濃度を迅速且つ高精度に定量でき、且つ、保存安定性に優れるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体成分や食品中に含まれる特定成分を希釈や撹拌などを行うことなく簡易に定量する方法として、次のようなバイオセンサが知られている。すなわち、絶縁性の基板上にスクリーン印刷などの方法によって作用極および対極からなる電極系を形成し、さらに、絶縁層を形成した後、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子伝達体からなる酵素反応層を形成したものである。
【０００３】
基質を含む試料液を酵素反応層上へ滴下すると、酵素反応層が溶解し、基質と酵素が反応して基質が酸化され、これに伴い電子伝達体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電子伝達体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めるものである（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、上記従来のバイオセンサにおいては溶解性および保存安定性が悪いという課題を有していた。
【０００５】
この課題を解決するため、特許文献２において、電気絶縁性の基板、前記基板上に形成された作用極と対極とを有する電極系、および前記電極系を含む試料液供給路を具備し、さらに、前記試料液供給路内に形成された電子伝達体を含む第一の反応層、および前記試料液供給路内に前記第一の反応層と分離して形成された酵素と微粒子とを含む第二の反応層を具備することを特徴とするバイオセンサが開示されている。
【０００６】
酵素を含む第二の反応層に微粒子を含有させることにより、溶解性を向上させ、また、電子伝達体を含む第一の反応層と酵素を含む第二の反応層とを分離することにより、保存安定性を向上させている。
【特許文献１】特許第２５１７１５３号明細書
【特許文献２】特開２００４−２６４２４７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献２においては、第一の反応層は、電子伝達体しか含まないため、長期間保存した場合、揺れや振動によって、層が張り付いている面から、電子伝達体が、容易に剥がれ落ち、再現性がない結果が得られる場合があった。この剥がれを防止するために、第一の反応層に、さらに親水性高分子を含有させると剥がれはなくなるものの、バイオセンサの精度が悪くなるという弊害も生じた。
【０００８】
本発明は、保存時の層の剥離が防止され、且つ、精度が有意に向上したバイオセンサを提供することを目的とする。また、本発明は、かようなバイオセンサの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑み、従来のバイオセンサはなぜ精度が悪いか、その原因を追求すべく鋭意研究を積み重ねた。その過程の中で、本発明者らは、従来のバイオセンサにおける反応層の溶解性に着目した。
【００１０】
従来のバイオセンサにおいては、酵素を含む第二の反応層にのみ微粒子を含有させることにより、溶解性を向上させている。それは、反応の際（試料が供給された際）、第一の反応層と、第二の反応層とが同時に溶解するため、第二の反応層にのみ微粒子を含有させれば、両者は、結果的に混ざり合うため、それで十分であると考えられていたに他ならない。
【００１１】
しかしながら、鋭意研究を行う過程で、保存安定性を向上させるために、第一の反応層に電子伝達体と、親水性高分子を含有させた場合、第二の反応層にのみ微粒子を含有させても、精度が有意に向上したバイオセンサを提供することができないことが分かった。
【００１２】
それは、当業者が通常予想する以上に、バイオセンサの精度は反応層の溶解性に大きく依存しているという知見が得られたとともに、第二の反応層にのみ微粒子を含有させても、所望の特性が得られないとの知見も得られた。
【００１３】
そこで、本発明者らは、上記知見に基づき、第二の反応層のみならず、第一の反応層にも微粒子を含有させることで、保存安定性、且つ、精度が有意に向上したバイオセンサを得ることができ、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、上記課題は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を含むバイオセンサであって、前記試料供給部が、電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる、酵素、親水性高分子および微粒子を含む第二の反応層と、を含む、バイオセンサによって、解決される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、層の剥離が防止できるため保存安定性に優れ、且つ、第一の反応層および第二の反応層が迅速に溶解し、反応系全体が均一となるため、より短時間で高精度に特定成分を定量できるバイオセンサを提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極と、前記電極上に形成されてなる試料供給部と、を含むバイオセンサであって、前記試料供給部が、電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む第一の反応層と、前記第一の反応層と分離されて形成されてなる、酵素、親水性高分子および微粒子を含む第二の反応層と、を含む、バイオセンサである。
【００１７】
以下、図面を参照しながら本発明のバイオオセンサの一実施形態を説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００１８】
図１は、中性脂肪センサの一実施形態を示すものであり、第二の反応層を除いた各構成部分の分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。
【００１９】
図１、２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４が形成されている。さらに、絶縁性基板１の上に、接着剤６ｂが、電極の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサ外部を電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法などの従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。その他の構成要素についても、従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせることで、容易に形成されうる。
【００２０】
そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極が露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。
【００２１】
また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１および対極作用部分４−１が形成されている。そして、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、および対極作用部分４−１上には、それぞれ第一の反応層８が形成されている。この作用部分（２−１、３−１、４−１）は、バイオセンサの使用時において、反応層（本明細書中、第一の反応層と、第二の反応層と、を総称して単に「反応層」とも称する。）中の試料溶液に電位を印加するための電位印加手段、および、試料溶液中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２−１、３−１、４−１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、反応層中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
【００２２】
一方で、カバー７上には、接着剤（両面テープ）６ａが両端に設置され、その両端の隙間に第二の反応層９が形成されている。
【００２３】
バイオセンサは、第一の反応層８が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第二の反応層９が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに張り合わされることにより、構成されてなる。
【００２４】
以下、各構成要件を詳説する。
【００２５】
＜絶縁性基板＞
本発明において使用される絶縁性基板は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックなどが挙げられる。また、絶縁性基板の形状やサイズについては、特に制限されない。
【００２６】
プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂などが挙げられる。
【００２７】
＜電極＞
本発明の電極は、少なくとも作用極と対極を含む。
【００２８】
本発明の電極は、試料（測定対象物）と酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極などが挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボンが好ましい。
【００２９】
本発明においては、作用極と対極のみの二電極方式であっても、参照極をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極などを含んでいてもよい。
【００３０】
また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分が、銀塩化・銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
【００３１】
＜絶縁層＞
絶縁層を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。
【００３２】
＜試料供給部＞
試料供給部は、第一の反応層および第二の反応層を含む。そして、第一の反応層と、第二の反応層とは、それぞれ分離されて形成されてなる。かような態様とすることにより、電子伝達体と酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる。
【００３３】
「第一の反応層と、第二の反応層とは、それぞれ分離されて形成されてなる」とは、第一の反応層と、第二の反応層と、が離隔して形成されてなるとの意である。この際、第一の反応層と、第二の反応層と、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５〜１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５〜１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１ｍｍである。０．０５ｍｍ未満であると、保存中に酵素と、電子伝達体が接触する場合がある。また、１．５ｍｍを超えると、毛細管現象が起こりにくく、試料が反応層に吸引されない場合がある。なお、第一の反応層および第二の反応層とは、接着剤の厚みを制御することにより、その離隔距離を制御することができる。つまり、接着剤は、第一の反応層と、第二の反応層と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
【００３４】
［第一の反応層］
本発明の第一の反応層は、電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む。
【００３５】
第一の反応層の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００３６】
（電子伝達体）
本発明の第一の反応層は、電子伝達体を含む。
【００３７】
本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料（測定対象物）や使用する酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３８】
電子伝達体としては、より具体的には、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファート、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを好適に使用することができる。
【００３９】
第一の反応層における電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．１〜２０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサの反応層には、通常は０．１〜２０００μｇ、好ましくは１〜１５００μｇ、より好ましくは１０〜１０００μｇの電子受容体が含まれるとよい。
【００４０】
（親水性高分子）
本発明の第一の反応層は（後述する第二の反応層も）、親水性高分子を含む。
【００４１】
反応層中に親水性高分子が含まれることにより、固定した面からの剥離や割れを防ぐことができる。
【００４２】
本発明の親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。
【００４３】
より具体的には、親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体などが挙げられる。これらのうち、カルボキシメチルセルロースが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００４４】
なお、このような親水性高分子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは１〜５００μｇであり、特に好ましくは５〜１００μｇである。
【００４５】
（微粒子）
本発明において使用される第一の反応層は（後述する第二の反応層も）、微粒子を含む。
【００４６】
本発明は、第二の反応層のみならず、第一の反応層にも微粒子を含有する点に、特徴の一つを有する。このように、第一の反応層にも微粒子を含有させることにより、反応層が多孔質となり、試料溶液の染み込みが速くなる。その結果、電子伝達体や酵素を含む層が迅速に溶解し、反応層全体が均一になる。そして、ひいては、短時間で高精度な測定をすることが可能となる。
【００４７】
本発明の微粒子としては、特に制限はなく、高分子・低分子を問わず、従来公知のものを使用することができる。ただ、本発明において使用される微粒子は、電解を起こす不純物を含まず、電気化学的に不活性であるものであると好ましい。また、本発明において使用される微粒子は、水に対して不溶もしくは難溶性であることが好ましい。
【００４８】
より具体的には、微粒子としては、高分子化合物、無機化合物、金属酸化物、炭酸塩などが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００４９】
さらに具体的には、高分子化合物としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、マレイン酸エステルおよびスチレン誘導体モノマーのうち少なくとも一つを含む重合体もしくは共重合体が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００５０】
前記スチレン誘導体を含む重合体としては、例えば、スチレン、アルキルスチレンなどが挙げられる。
【００５１】
その他、ポリアミドも例示される。また、例えば、ポリウレタン、ポリウレアなどのウレタン化合物、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン系化合物などが挙げられる。
【００５２】
無機化合物としては、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、アパタイト、ガラスやエーライトなどに代表されるセラミックスなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００５３】
金属酸化物としては、ラテックス球、ダイヤモンド粉末、酸化チタンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００５４】
炭酸塩としては、炭酸カルシウムが挙げられる。
【００５５】
その他、本発明の微粒子としては、ポリマーでコートした金、微細セルロース粉末、微細結晶セルロース粉体なども使用することができる。
【００５６】
なお、本発明の微粒子は、表面の特性を変化させてもよい。具体的には、微粒子表面に、カルボキシル基やアミノ基を導入してもよい。カルボキシル基やアミノ基を導入する方法は、従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて行うことができ、あるいは、市販品を購入してもよい。このように、カルボキシル基やアミノ基を導入することにより、電荷を有するため、試料中に含まれる不純物（血球など）と吸着し、不純物による感度低下を抑制する効果を有する場合もある。
【００５７】
第一の反応層の微粒子の平均粒径は、特に制限はないが、０．０１〜２０μｍであることが好ましい。０．０１μｍ未満では、微粒子が小さすぎるため、本発明の効果が得られない場合がある。また、２０μｍより大きいと、微粒子が沈殿し、電極表面に付着する可能性がある。０．０５〜１５μｍであることがより好ましく、０．１〜１０μｍであることがさらに好ましい。
【００５８】
なお、平均粒径は、例えば、ＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察により測定することができる。上記でいう平均粒径は、粒子の形状が一様でない場合もあるため、絶対最大長で表すものとする。ここで、絶対最大長とは、単結合体の輪郭線上の任意の２点間の距離のうち、最大の長さＬの平均をとるものとする。なお、値は１０個から求めた平均値とする。
【００５９】
なお、このような微粒子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．０５〜１００μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。
【００６０】
（界面活性剤）
第一の反応層は（後述する第二の反応層も）、界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤の含まれ方にも特に制限されず、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む界面活性剤含有層を形成してもよい。
【００６１】
このように、反応層内または反応層を覆うように界面活性剤を添加することにより、反応層の溶解が、さらに促進される場合がある。
【００６２】
界面活性剤としては、使用する酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤などを適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６３】
非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルグリコシドなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６４】
陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウム  クロリド、トリメチルアンモニウム  ブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６５】
陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６６】
両イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６７】
天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチンなどのレシチンなどが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
【００６８】
なお、第一の反応層を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む第一の反応層を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）またはカバーに、所定量滴下する。好ましくは、電極（作用部分）に滴下する。調製した試料を滴下した後、好ましくは風を当てながら乾燥させる。このようにして、第一の反応層を作製することができる。
【００６９】
［第二の反応層］
第二の反応層は、酵素、親水性高分子および微粒子を含む。
【００７０】
第二の反応層の厚さにも特に制限はないが、好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．０２５〜１０μｍ、さらに好ましくは０．０５〜５μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、滴下する量を適宜調節することにより、制御することができる。
【００７１】
（酵素）
第二の反応層は、酵素を含む。
【００７２】
本発明の酵素としては、試料として使用するものに依存するが、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、インベルターゼ、ムタロターゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、アルコルビン酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、ジアホラーゼ、乳酸オキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、フルクトースオキシダーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールキナーゼ、ウリカーゼなどが挙げられる。なお、酵素は、反応を考慮して、従来公知の知見を適宜参照しながら、必要に応じて２種以上適宜選択して含ませてもよい。
【００７３】
反応層における酵素の含有量については特に制限はなく、測定する基質の種類や試料溶液の添加量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、例えば、酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼを使用する場合には、通常は０．００１〜１００活性単位、好ましくは０．０１〜５０活性単位、より好ましくは０．１〜２０活性単位の酵素が反応層に含まれるとよい。
【００７４】
（親水性高分子）
第二の反応層の親水性高分子の具体例は、第一の反応層の親水性高分子と同じであるので、ここではその説明は割愛する。
【００７５】
なお、このような親水性高分子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは１〜５００μｇであり、特に好ましくは５〜１００μｇである。
【００７６】
（微粒子）
第二の反応層の微粒子は、第一の反応層の欄で説明したものが同様に妥当する。
【００７７】
なお、このような微粒子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．０５〜１００μｇであり、特に好ましくは０．１〜１０μｇである。
【００７８】
第二の反応層の微粒子の平均粒径は、特に制限はないが、０．０１μｍ〜２０μｍであることが好ましい。０．０１μｍ未満では、微粒子が小さすぎるため、本発明の効果が得られない場合がある。また、２０μｍより大きいと、微粒子が沈殿し、電極表面に付着する可能性がある。
【００７９】
（界面活性剤）
第二の反応層にも界面活性剤を添加してもよく、第一の反応層の欄で説明したものが同様に妥当する。
【００８０】
なお、第二の反応層を形成する方法にも特に制限はないが、例えば以下の方法が考えられる。酵素、親水性高分子および微粒子を含む第二の反応層を形成するための原料を、グリシルグリシン緩衝液などで調製し、その調製した原料を、電極（作用部分）またはカバーに、所定量滴下する。好ましくは、カバーに滴下する。なお、その際、予めカバーに接着剤を設置しておくとよい。調製した試料を滴下した後、好ましくは風を当てながら乾燥させる。このようにして、第二の反応層を作製することができる。
【００８１】
このように、上記第一の反応層が形成されている絶縁性基板と、前記第二の反応層が形成されているカバーを（それぞれが逆であってもよい）、接着剤で張り合わせることにより、バイオセンサを製造することができる。
【００８２】
＜試料＞
本発明において使用される試料は、好ましくは、溶液形態である。溶液形態における溶媒としても特に制限されず、従来公知の溶媒を適宜参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。
【００８３】
試料としても、特に制限はされないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄などの生体試料；ジュースなどの飲料水、醤油、ソースなどの食品類；排水、雨水、プール用水などが挙げられる。好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。
【００８４】
なお、試料溶液は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料溶液に含まれる基質についても特に制限はなく、上述した酸化還元酵素と反応しうる物質であればよい。
【００８５】
試料溶液中の所望の成分（基質）としては、例えば、グルコースなどの糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトールなどの多価アルコール、中性脂肪、コレステロールなどの脂質、グルタミン酸や乳酸などの有機酸類、クレアチン、クレアチニンなどが挙げられる。上記と同様の理由から、中性脂肪やコレステロールなどの脂質が基質として選択されることが好ましい。
【００８６】
試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層に対して水平方向から試料溶液を供給してもよい。
【００８７】
反応層へと試料が供給されると、試料溶液中の所望の成分（基質）は、反応層に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料溶液の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
【００８８】
具体的を挙げて説明すると、中性脂肪を含む全血（指先等より採取することができる）を電極上に滴下すると、電子伝達体、親水性高分子および微粒子を含む第一の反応層と、酵素、親水性高分子および微粒子を含む第二の反応層が溶解し、試料中に含まれる中性脂肪がリポプロテインリパーゼによりグリセロールと脂肪酸に加水分解される。グリセロールはさらにグリセロールデヒドロゲナーゼにより、ジヒドロキシアセトンに酸化され、同時に酸化型電子伝達体が還元型電子伝達体に還元される。
【００８９】
基質と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料溶液添加後、通常は１秒〜５分間、好ましくは３秒〜３分間、バイオセンサを放置すればよい。
【００９０】
その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極と対極との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜５００ｍＶの電位を、対極と作用極との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
【００９１】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
【００９２】
以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【実施例】
【００９３】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【００９４】
＜実施例＞
図１および図２で示す中性脂肪センサを以下のようにして作製した。
【００９５】
電極は、ディスポーザブル印刷電極  ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ  ＥＰ−Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。
【００９６】
ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ  ＥＰ−Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４を形成し、絶縁層５を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分２−１、銀・塩化銀からなる参照極作用部分３−１、カーボンからなる対極作用部分４−１を形成した。
【００９７】
第一の反応層８は以下のようにして形成した。２０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ８．５に溶解した２００μＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルファートと、同緩衝液に溶解した０．１％  カルボキシメチルセルロース溶液と、同緩衝液に溶解した平均粒径１μｍのポリスチレンビーズ  ０．２５％溶液と、を等量ずつ混合し、混合液Ａを得た。
【００９８】
バイオセンサ一枚あたり、上記混合液Ａ  ３μｌを、作用極作用部分２−１、参照極作用部分３−１、および対極作用部分４−１を被覆するように滴下し、風を当てながら室温で乾燥させることにより、第一の反応層８を形成した。また、図１に示すとおり、接着剤（両面テープ）６ｂを絶縁性基板１に接着した。
【００９９】
第二の反応層９は以下のようにして形成した。２０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ８．５に、グリセロールデヒドロゲナーゼ  １Ｕ／μｌ、およびリポプロテインリパーゼ  １Ｕ／μｌになるように各酵素を溶解し、それぞれ酵素溶液を調製した。
また、同緩衝液に溶解した平均粒径１．０μｍのポリスチレンビーズ  ０．２５％溶液と、カルボキシメチルセルロース  ０．３％溶液と、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．１５％溶液と、を等量ずつ混合し、混合液Ｂを調製した。調製した酵素溶液  ２μｌと、混合液Ｂ  １．５μｌと、を混合し混合液Ｃを得た。
【０１００】
バイオセンサ１枚あたり、上記混合液Ｃ  ３．５μｌを、ポリエチレンからなるカバー７に接着剤（両面テープ）６ａを張り合わせた隙間に滴下後、風を当てながら室温で乾燥させることにより、第二の反応層９を形成した。
【０１０１】
第一の反応層８が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第二の反応層９が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、を互いに張り合わせることにより、中性脂肪センサを組立て、特性評価を行った。
【０１０２】
なお、この際、第一の反応層８と、第二の反応層９の厚みは、それぞれ５μｍであり、離隔距離は、０．１５ｍｍであった。
【０１０３】
試料液を滴下して１分４０秒後に、参照極３を基準にして作用極２に対しアノード方向に＋１５０ｍＶの定電位を印加し、２０秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち試料液中の中性脂肪濃度に比例し、この電流値から試料中の中性脂肪濃度を求めることができる。
【０１０４】
中性脂肪濃度が異なる３人の全血（１０２、２１３、３９０ｍｇ／ｄｌ）を試料として、５回測定を行った。結果を図３に示す。
【０１０５】
＜比較例＞
電子伝達体を含む第一の反応層に「ポリスチレンビーズ  ０．２５％溶液」の代わりに２０ｍＭ  グリシルグリシン緩衝液  ｐＨ８．５を加えた以外は、実施例と同様の方法で測定を行った。その結果を図４に示す。
【０１０６】
図４と比較すると、第一の反応層にポリスチレンビーズを含んでいる図３の方が、応答電流値のばらつきが小さいことが分かる。特に高濃度（３９０ｍｇ／ｄｌ）でのばらつきが顕著に抑制されている。これは、ポリスチレンビーズを加えることにより、反応層が迅速に溶解したためであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】本発明の一実施形態に係る反応層を除いたバイオセンサの分解斜視図である。
【図２】本発明の一実施形態に係るバイオセンサの断面図である。
【図３】実施例における、バイオセンサの応答特性を示すグラフである。
【図４】比較例における、バイオセンサの応答特性を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１０８】
１      絶縁性基板、
２      作用極、
２−１  作用極作用部分、
３      参照極、
３−１  参照極作用部分、
４      対極、
４−１  対極作用部分、
５      絶縁層、
６ａ、ｂ      接着剤、
７      カバー、
８      第一の反応層、
９      第二の反応層。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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