(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ３１またはＡ３３を有する患者においてＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
以下の配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ３１またはＡ３３を有する患者における細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を検査するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣ型肝炎ウイルス関連疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対してセロポジティブであると見積もられている（World  Health  Organization.  Hepatitis  C:  global  prevalence.  Wkly.  Epidemiol.  Rec.  1997;  72(46):341-344）。ＨＣＶ感染の急性期はしばしば無症状であるが，セロポジティブの個人の約７０％は慢性感染を発症し，感染した患者は進行性の肝臓病，例えば，慢性肝炎，肝硬変，および肝細胞癌に罹患しやすい（Alter  HJ,  Seeff  LB.,  Semin  Liver  Dis.  2000;  20(1):17-35;  Shimotohno,  K.,  Semin.  Cancer  Biol.  2000;10:233-240）。ＨＣＶ感染の現在の治療法はリバビリンと組み合わせたインターフェロン（ＩＦＮ）−αであり，最近では，ポリエチレングリコール修飾型のＩＦＮ−αが用いられている。しかし，持続性の応答は，治療した患者の約５０％にしか見られない（Manns  MP,  et  al,  Lancet.  2001;  358:958-965）。さらに重要なことには，抗ウイルス療法は，感染者の大部分が居住するほとんどの発展途上国では利用できない。したがって，新たな治療法の開発が必要とされている。【０００３】
ＨＣＶ感染後の肝細胞傷害の病因メカニズムはまだよくわかっていないが，多くの証拠から，ウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）がＨＣＶ感染後の肝臓障害に重要な役割を果たしているかもしれないことが示されている（Chang  KM,  et  al.,  Springer  Semin  Immunopathol.  1997;  19:57-68）。一方，ＣＴＬは，感染の間にウイルスの広がりを制限しウイルスを排除するのに有効であると考えられている（Kurokohchi  K,  et  al.,  J  Virol.  1996;  70:232-240）。したがって，ワクチンによるＣＴＬ誘導は，ＨＣＶ感染に伴う疾患の管理の有望な戦略であろう。さらに，コストが低いことおよび保存が容易であることから，ＣＴＬ誘導を指向したペプチドワクチンの開発が求められている。【０００４】
本発明者らは，先に，ＨＣＶ感染者の多くからＨＣＶ由来のペプチドと反応性を有するＩｇＧが検出されること，およびこれらのペプチドが対応するＨＬＡ型を有するＨＣＶ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを見出した。さらに，ＨＣＶ由来ペプチドの投与により，ＨＬＡ−Ａ２の多くの症例でペプチドによる免疫賦活作用やウイルス量の低下が認められることを見いだした（Takao  Y  et  al.,  Microbiol.  Immunol.,  48(7),  507-517,  2004（非特許文献１）；WO2005/028503（特許文献１）；特願2005-310203（特許文献２））。【０００５】
しかし，これらのペプチドに対してＣＴＬを誘導できない症例もなお存在するため，当該技術分野においては，このような患者に適用しうるさらに別のペプチドが求められている。特に，ＨＬＡ−Ａ２４はＨＬＡ−Ａ２に次いで頻度が高いため，Ａ２４の患者に適用することができるペプチドが必要とされている。また，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３，ならびにＨＬＡ−Ａ０３０１およびＨＬＡ−Ａ６８０１は，類似する抗原結合モチーフを共有しており，したがって，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプとして分類される（Takedatsu  H,  et  al.,  Clin  Cancer  Res  2004;  10:  1112-1120：非特許文献２）。これまでに，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性抗原ペプチドに関する報告はない。【０００６】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが，本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【特許文献１】WO2005/028503
【特許文献２】特願2005-310203
【非特許文献１】Takao  Y  et  al.,  Microbiol.  Immunol.,  48(7),  507-517,  2004
【非特許文献２】Takedatsu  H,  et  al.,  Clin  Cancer  Res  2004;  10:  1112-1120
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，ＨＬＡ（ヒト白血球抗原；Human  Leukocyte  Antigen）−Ａ２４およびＡ３スーパータイプのＨＣＶ感染者に適用することができる，ＨＣＶ関連疾患の治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，以下の配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ２４またはＡ３スーパータイプを有する患者においてＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物を提供する。本発明はまた，配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ２４または３スーパータイプを有する患者におけるＨＬＡ−Ａ２４またはＡ３スーパータイプ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を検査するための組成物を提供する。【０００９】
本明細書において用いる場合，「ＨＣＶ関連疾患」とは，Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。ＨＣＶ関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変から肝癌への進行である。【００１０】
本発明にかかるペプチド（YLLPRRGPRL（配列番号１））は，ＨＣＶコアタンパク質の配列に由来し，本明細書において「ペプチドＣ３５−４４」とも称される。このペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２陽性者末梢血よりウイルス排除に有効な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を強力に誘導できることが報告されている。本発明においては，驚くべきことに，このペプチドＣ３５−４４は，従来法で解離定数を計算した場合，ＨＬＡ−Ａ２４またはＡ１１ときわめて低い結合活性しかないことが示されているにもかかわらず，本発明者らによりＨＬＡ−Ａ２４またはＡ３スーパータイプ陽性の患者からもＣＴＬを誘導しうることが見いだされた。ＨＬＡ−Ａ２陽性者を対象としたワクチンでは日本人患者の約４０％しかカバーできなかったが，ＨＬＡ−Ａ２４陽性者およびＡ３スーパータイプ陽性者にも適用可能であることを明らかにした本発明により，日本人のほぼ１００％の患者がペプチドワクチン療法の対象となる。このため，患者のＨＬＡ型や患者血清中の抗体価が不明な場合でも，本発明のペプチドを使用することができる。さらに，ペプチドＣ３５−４４は，ＨＣＶ−１ｂやＨＣＶ−２ａ等の種々の遺伝子型のＨＣＶにも広く保存されているため，多数のＨＣＶ感染者に適用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【図２】図２は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【図３】図３は，各種ペプチドのＨＬＡ結合能の比較を示す。
【図４】図４は，Ｃ３５−４４ペプチドのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプへの結合能を示す。
【図５】図５は，Ｃ３５−４４ペプチドで誘導したＣＴＬのＭＨＣ拘束性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は，ＨＣＶに感染したＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者の治療に用いることができる免疫原性ＨＣＶ由来ペプチドを有効成分として含有するワクチンを提供する。以下の実施例に示されるように，本発明においては，ペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ感染者末梢血単核球（ＰＢＭＣ）よりペプチド特異的ＣＴＬを誘導したことが見いだされた。さらに，ＭＨＣ分子との結合実験により，このペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ２４と結合することが確認された。また，ＨＣＶ関連疾患を有するＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ感染血漿中からペプチドＣ３５−４４に反応性のＩｇＧ抗体が検出された。また，このペプチドはＨＬＡ−Ａ３１およびＡ３３陽性ＨＣＶ感染者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。【００１３】
本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，Ｃ型肝炎ウイルス感染者の血中抗体により認識されることができる。好ましくは，本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＣＴＬを誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。【００１４】
本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，そのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。【００１５】
本発明に係るＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。【００１６】
目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。【００１７】
一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。【００１８】
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。【００１９】
本発明のペプチドは，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，すなわちペプチドワクチンとして有用である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。【００２０】
ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１−１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンやリバビリンなどの抗ウイルス剤とを併用してもよい。【００２１】
本発明にかかるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを投与する前に，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくはＣＴＬの存在を測定してもよい。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。【００２２】
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を，ＥＬＩＳＡ等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また，ＨＣＶ  ＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ等の慣用の方法により測定することにより，ウイルス量をモニターすることができる。【００２３】
本発明のペプチドはまた，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的なＥＬＩＳＡ法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを９６ウエルなどの慣用のＥＬＩＳＡプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液から調製した血清を適宜希釈してプレートの各ウエルに加えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体（例えばウサギ抗ヒト抗体）を加える。ＩｇＧを検出することが望まれる場合には，γ鎖特異的抗ヒトＩｇＧを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し，検出可能なように標識した抗体（例えば抗ウサギＩｇＧ）を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のペプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより，ＨＣＶ関連疾患の進行の予測を行うことができる。【００２４】
このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の１つとしてｘＭＡＰ技術がある。これは，Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。【００２５】
また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原（または抗体）を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原（または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（２０〜３０分以内）に結果を得ることができる。【００２６】
ＨＬＡ−Ａ２４を有するＨＣＶ感染者においてＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されているかどうかは，ＨＣＶ感染者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し，本発明のペプチドとともに培養した後，同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞やＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染細胞（株）などに対する反応性を，ＩＦＮ−γ産生を指標として，あるいは51Ｃｒ遊離反応で調べることにより検査することができる。ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３についても同様である。また，誘導されたＣＴＬのＭＨＣ拘束性はＭＨＣクラスＩ，ＣＤ８に対するモノクローナル抗体による抑制実験で，ペプチド特異性は，対応するペプチドで感作した被標識標的細胞による抑制実験（コールド・ターゲット・インヒビション実験）で確認することができる。具体的には，後述の実施例１に記載される方法により測定することができる。【００２７】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2006-14000および2006-220542号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。【００２８】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
ペプチドＣ３５−４４によるペプチド特異的ＣＴＬ誘導およびペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性
被験者
ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ３スーパータイプを有するＨＣＶ感染者を被験者とした。これらの被験者は，いずれもヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染していないことを確認した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためには，２０ｍｌの末梢血を採取し，フィコール−コンレー密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを調製した。すべてのサンプルは実験に用いるまで低温保存した。なお，本試験実施に当たっては，久留米大学医療に関する倫理委員会の事前承認を得，かつ被験者からの文書による事前の同意を得ている。ＨＣＶ感染者のＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は，以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した：抗ＨＬＡ−Ａ１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｃａｔ＃０２８４ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ  Ｉｎｃ．，Ｃａｎｏｇａ，ＣＡ），抗ＨＬＡ−Ａ３１ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０２７３ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ），および抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０６１２ＨＡ；Ｏｎｅ  Ｌａｍｂｄａ）。【００３０】
細胞株
使用した細胞株Ｃ１Ｒ−Ａ２４はＨＬＡ−Ａ２４を発現するＣ１Ｒリンパ腫のサブラインである（Dr.  M.  Takiguchi,  Kumamoto  University,  Japan）。この細胞は，１０％ＦＣＳ（牛胎児血清）および５００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Gibco  BRL,  New  York,  NY,  USA）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で維持した。また，細胞株Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，およびＣ１Ｒ−Ａ３３は，それぞれＨＬＡ−Ａ１１０１，ＨＬＡ−Ａ３１０１，およびＨＬＡ−Ａ３３０３遺伝子をトランスフェクトし、恒常的に当該抗原を発現するように樹立されたＣ１Ｒリンパ腫のサブラインである。これらのサブラインにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は先に報告されている（Takedatsu  H,  et  al.,  Clinical  Cancer  Research  2004;  10:  1112-20）。これらの細胞株は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen）中で維持した。【００３１】
ペプチド
ペプチドＣ３５−４４（YLLPRRGPRL（配列番号１））および陽性対照として，ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するインフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）由来ペプチド（RFYIQMCTEL（配列番号２）），ＥＢＶ由来ペプチド（TYGPVFMCL（配列番号３）），および陰性対照としてＨＩＶ由来ペプチド（RYLRDQQLL（配列番号４））を用いた。ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに結合する対照ペプチドとしては，インフルエンザ（Ｆｌｕ）ウイルス由来ペプチド（NVKNLYEKVK（配列番号５）），エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（AVFDRKSDAK（配列番号６）），チロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ２）由来ペプチド（LLGPGRPYR（配列番号７）），およびＨＩＶ由来ペプチド（RLRDLLLIVTR（配列番号８））を用いた。すべてのペプチドは，BIOSYNTHESIS（Lewisville,  TX,  USA），SynPep（Dublin,  CA,  USA）またはBiologica Co.（Nagoya, Japan）から購入し，９０％以上の純度であった。ペプチドは，１０ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解して−２０℃で保存した。【００３２】
統計学
統計学的分析は，スチューデントｔ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。【００３３】
ペプチド特異的ＩｇＧの検出
最初に，ＨＣＶに感染した１２名のＡ３スーパータイプを有する被験者の血清の１：１００希釈サンプルを用いて，ペプチド特異的ＩｇＧのレベルを測定した。血漿（または血清）中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルは，先に記載された方法にしたがってルミネックス（登録商標）法により測定した（Komatsu  N.  et  al.,  Scand  J  Clin  Lab  Invest,  64,  535-546,  (2004)）。簡単には，２００μＬの血漿（１：１００希釈）を２５μＬのペプチド結合カラーコードビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））とともに９６ウエルフィルタープレート（ＭＡＢＶＮ１２５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中で，プレート振盪器で室温にて２時間インキュベートした。２時間後，プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで洗浄し，１００μＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧとともにプレート振盪器で室温にて１時間インキュベートした。次に，プレートを洗浄し，１００μＬのストレプトアビジン−ＰＥ（５μｇ／ｍｌ）をウエルに加え，プレート振盪器で室温にて３０分間インキュベートした。蛍光強度（ＦＩ）をルミネックス（登録商標）により測定し，ペプチド特異的抗体のレベルを求めた。１５名の健康なドナーの血漿を負対照として用いた。カットオフＦＩ値は，健康なドナーのＦＩ値の平均＋２ＳＤより高い値として決定した。【００３４】
その結果，Ｃ３５−４４ペプチドに対して反応性のＩｇＧが，１２名の被験者中７名の血漿において検出された。これに対し，このペプチドは，１５名の健康なドナーのいずれからの血漿にも反応性ではなかった。被験者における，Ｃ３５−４４ペプチドに対して反応性である平均ＩｇＧのレベルは，それぞれ健康なドナーに比べて統計学的に有意に高かった。【００３５】
ＨＣＶ感染者のＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導
ペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，もしくはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ感染者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＰＢＭＣをインビトロでＨＣＶ由来ペプチドまたは対照ペプチドとともに培養した後，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４，Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する反応性をＩＦＮ−γ産生を指標として調べた。【００３６】
ペプチド特異的ＣＴＬを検出するためのアッセイは，先に報告されている方法にしたがい，若干の改変を加えた（Hida  N  et  al.,  Cancer  Immunol  Immunother  2002;  51:  219-28）。簡単には，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染者のＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウエル）をＵ底９６ウエルマイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で２００μｌの培養液中で，１０μｌ／ｍｌの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は４重に行った。培養液は，４５％ＲＰＭＩ１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ），１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），および０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなるものであった。３日ごとに培養液の半分を除去し，ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地に置き換えた。培養の第１５日に，培養細胞の半分を，ペプチドＣ３５−４４でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞で刺激し，残りの半分の細胞は対照ＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞で刺激した。１８時間のインキュベートの後，上清を回収し，ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを測定した。【００３７】
その結果，ペプチドＣ３５−４４を用いた場合，ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ感染者の５名中３名のＰＢＭＣから，ペプチドに反応性のＣＴＬが誘導された（表１）。表中，数字はＩＦＮ−γのレベル（ng/ml)である。【００３８】
【表１】
0005133706.tif 000002
【００３９】
次に，Ｃ３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＨＣＶ感染者のＰＢＭＣを，インビトロでＣ３５−４４ペプチドまたは対照ペプチドで刺激して，対応するペプチドをパルスしたＴ２（ＨＬＡ−Ａ２を有する），Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答したＩＦＮ−γ産生について調べた。その結果，Ｃ３５−４４ペプチドは，ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＨＣＶ感染者（０／７），ＨＬＡ−Ａ３１陽性ＨＣＶ感染者（１／２），およびＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ感染者（１／２）のＰＢＭＣからペプチド反応性ＣＴＬを誘導した。【００４０】
これらの知見は，Ｃ３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ感染者のＰＢＭＣにおいてペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを示す。【００４１】
ＨＣＶのＣ３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導しうることは既に知られている（Takao  Y  et  al.,  Microbiol.  Immunol.,  48(7),  507-517,  2004；特願2005-310203）。上述の結果は，このＣ３５−４４が従来法で解離定数を計算した場合ＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３ときわめて低い結合活性しか示さないにもかかわらず，ＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３陽性のＨＣＶ感染者からもＣＴＬを誘導しうることを示す。【００４２】
ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性
ペプチドで刺激したＰＢＭＣを，標準的な６時間の51Ｃｒ−放出アッセイにより，対応するペプチドまたはＨＩＶペプチドのいずれかで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４，Ａ１１，Ａ３１またはＡ３３細胞に対する細胞傷害活性について調べた。ウエルあたり２０００個の51Ｃｒ標識細胞をエフェクター細胞とともに，所定のエフェクター／標的細胞比で９６丸底ウエルプレートで培養した。特異的51Ｃｒ−放出は，以下の式にしたがって計算した：（試験群ｃ．ｐ．ｍ．−自然放出ｃ．ｐ．ｍ．）。自然放出はエフェクター細胞なしでインキュベートした標的細胞の上清により決定した。総放出は，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）とともにインキュベートした標的細胞の上清により決定した。いくつかの実験においては，培養の最初に，１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ４（ＮＵ−ＴＨ／Ｉ：マウスＩｇＧ１），抗ＣＤ８（ＮＵ−ＴＳ／Ｃ：マウスＩｇＧ２ａ），または抗ＣＤ１４（Ｈ１４：マウスＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体をウエルに加えた。【００４３】
ＨＣＶペプチドＣ３５−４４とともに培養したＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ感染者のＰＢＭＣは，このペプチドを予め負荷したＣ１Ｒ−Ａ２４，Ａ１１，Ａ３１またはＡ３３細胞に対して細胞傷害活性を示すことができたが，ＨＩＶペプチドについては示さなかった（図１および２）。【００４４】
さらに，ペプチドＣ３５−４４でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４，Ａ１１，Ａ３１またはＡ３３細胞に対する細胞傷害活性は，ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により阻害されるが，試験したＨＬＡ−クラスＩＩ（ＤＲ−１），ＣＤ４またはＣＤ１４ｍＡｂでは阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害活性は主としてＣＤ８+Ｔ細胞によりＨＬＡ−クラスＩ拘束性に発現することを示す（図１および２）。【００４５】
以上の結果より，ペプチドＣ３５−４４はＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，またはＨＬＡ−Ａ３３陽性のＨＣＶ関連疾患患者に対するペプチド免疫療法に有用であることが示された。
【実施例２】
【００４６】
Ｃ３５−４４ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３との結合アッセイ
Ｃ３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３と結合するか否かについて，ＭＨＣ分子との直接結合アッセイを用いて調べた。【００４７】
細胞株
ＲＭＡ細胞株はＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）由来のＲａｕｓｃｈｅｒ  ｖｉｒｕｓによってトランスフォームしたリンフォーマ細胞株であり，ＲＭＡ−ＳはそのＴＡＰ欠損突然変異株である（Ljunggren  HG,  and  Karre  K:  J  Exp  Med,  162,  1745,  1985）。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／Ｋｂ  は，ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子のα１とα２ドメインとマウスＨ−２Ｋｂ分子由来のα３，膜通過および細胞内ドメイインをコードするＡ＊２４０２／Ｋｂキメラ遺伝子をＲＭＡ−Ｓ細胞に移入したマウスリンフォーマ細胞株である（Dr.  Takasu  (Research  Institute  of  Dainippon  Sumitomo  Pharma  Co.  Ltd.,  Osaka,  Japan)より供与）。一方，ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊０３０１，−Ａ＊１１０１，−Ａ＊３１０１，−Ａ＊３３０３細胞株は，マウス由来のＴＡＰ−１を欠損したＲＭＡ−Ｓ細胞株細胞にヒトのＨＬＡ−Ａ＊０３０１，−Ａ＊１１０１，−Ａ＊３１０１，Ａ＊３３０３遺伝子を導入して樹立した。【００４８】
実験方法
ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／ＫｂまたはＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊０３０１，−Ａ＊１１０１，−Ａ＊３１０１，−Ａ＊３３０３細胞株は，ＴＡＰ欠損株であるためペプチドと複合体を作れない。従って，通常の培養条件ではＭＨＣ分子が細胞表面に安定に存在できない。この性質を利用して，本実験ではペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ２４，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３に結合するか否かを調べた。すなわち，２６℃で培養したＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／ＫｂまたはＲＭＡ−Ｓ＊Ａ０３０１，＊Ａ１１０１，＊Ａ３１０１，＊Ａ３３０３細胞株（この条件ではＭＨＣ分子は細胞膜上に存在しえる）にペプチドＣ３５−４４を加え，３７℃で培養することにより細胞表面上のＭＨＣ分子がどの程度消失するかをフローサイトメーターで測定した(Townsend  A,  et  al.,  Cold  Spring  Harb  Symp  Quant  Biol,  1,  299-308,  1989)。
具体的には，以下の手順で実験を行った。
１．ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／Ｋｂを２６℃で一晩（１８−２０時間）培養
２．ＰＢＳで１回洗浄
３．細胞（２ｘ１０5個）を３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン（Cortex  Biochem,  Sanleandro,  CA,  USA）とペプチド（１００μｇ／ｍｌ）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Life  Technologies）に浮遊
４．２６℃，３時間培養
５．３７℃，３時間培養
６．３％ＦＳＣを含むＰＢＳで１回洗浄
７．抗ＨＬＡ−ｍＡｂ（第１抗体）とともに４℃で３０分間インキュベート
８．３％ＦＳＣを含むＰＢＳで１回洗浄
９．ＰＥ（フィコエリスリン：488  nmで効率的に励起し578  nmの蛍光を放出するフィコビリタンパク質）−ウサギ抗マウスＩｇＧ（第２抗体）とともに４℃で３０分間インキュベート
１０．３％ＦＳＣを含むＰＢＳで１回洗浄
１１．細胞を１％ホルムアルデヒドを含む１ｍｌのＰＢＳに懸濁
１２．ＥＰＩＣＳ（フローサイトメーター，Beckman  Coulter社製）で測定【００４９】
結果を図３に示す。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／ＫｂまたはＲＭＡ−Ｓ＊Ａ０２０１細胞を２６℃で培養後，ペプチドをパルスしないで３７℃で培養したときの平均チャネル（Ｘ−ｍｅａｎ）はそれぞれ１０であった。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２／Ｋｂ細胞を２６℃で培養後，０．１〜１００μＭの異なる濃度のペプチドＣ３５−４４でパルス後３７℃で培養するとそれぞれ濃度依存性に増加した（図３）。同じ条件下で，ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するＥＢ−Ａ２，あるいはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するペプチド，ＮＳ５Ａ−２１３２，ＥＢ−Ａ２４を陽性対照として測定し，それぞれ結合が確認された。また，陰性対照に用いたペプチド（ＨＬＡ−Ａ２にはＣ３０，ＮＳ５Ａ２１３２，およびＥＢ−Ａ２４を，ＨＬＡ−Ａ２４には，ＥＢ−Ａ２およびＣ３０を用いた）はいずれも結合は認められなかった。【００５０】
以上の結果をまとめると，ペプチドＣ３５−４４については，それぞれの陽性対照と同様にパルスするペプチド濃度に依存して蛍光強度が増加することから，ペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ２あるいは−Ａ２４と，それぞれ結合しうることが確認された。【００５１】
同様に，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに対するペプチドの結合能を調べた。その結果，ＨＣＶ  Ｃ３５−４４ペプチドは，ＨＬＡ−Ａ３，−Ａ３１および−Ａ３３に対して陽性対照ペプチドと同程度に結合したが，ＨＬＡ−Ａ１１には結合しなかった（図４）。
【実施例３】
【００５２】
健常人末梢血からのＣ３５−４４ペプチドによるＨＬＡ−Ａ１１拘束性ＣＴＬの誘導試験
ペプチドＣ３５−４４がＨＬＡ−Ａ１１を有する健常人ＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＰＢＭＣをインビトロでＨＣＶ由来ペプチドまたは対照ペプチドとともに培養した後，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞に対する反応性をＩＦＮ−γ産生を指標として調べた。【００５３】
ＣＴＬ誘導に用いるリンパ球は健常人（ＨＤ）６例〔ＨＬＡ−Ａ１１／Ａ１１，Ａ２／Ａ２，Ａ２４／Ａ２４，Ａ２／Ａ２４，Ａ１１／Ａ２，およびＡ１１／Ａ２４〕を用いた。ペプチド特異的ＣＴＬを検出するための測定は，先に報告されている方法にしたがい，若干の改変を加えた（Hida N et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 219-28）。簡単には，ＨＬＡ−Ａ１１陽性の健常人ＰＢＭＣ（１×１０５細胞／ウエル）をＵ底９６ウエルマイクロカルチャープレート（Nunc，Roskilde，Denmark）で２００μｌの培養液中で，１０μｌ／ｍｌの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は４重に行った。培養液は，４５％ＲＰＭＩ１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA），１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），および０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなるものであった。３日ごとに培養液の半分を除去し，ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地に置き換えた。培養の第１５日に，培養細胞の半分を，ペプチドＣ３５−４４でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞で刺激し，残りの半分の細胞は対照ＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１細胞で刺激した。１８時間のインキュベートの後，上清を回収し，ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを測定した。【００５４】
結果を図５に示す。ペプチドＣ３５−４４を用いた場合，ＨＬＡ−Ａ１１陽性健常人の３名中３名のＰＢＭＣから，ペプチドに反応性のＣＴＬが誘導された。図中，横軸の数字はＩＦＮ−γのレベル（ｎｇ／ｍｌ）である。以上の結果より，ペプチドＣ３５−４４はＨＬＡ−Ａ１１拘束性にもＣＴＬを誘導することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明のペプチドはＨＣＶ関連疾患の治療に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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