(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）の混合物を含む、大腸菌による汚染、大腸菌の増殖及び／又は二次的毒素産生の阻害のための医薬であって、ここで、
混合物は、２０〜５０重量％のＣ8 ＭＣＦＡ、２０〜５０重量％のＣ10 ＭＣＦＡ、及び１００％までのＣ6−Ｃ24から選択される他のＭＣＦＡを含み、前記混合物は等量のＣ8及びＣ10を含み、ＭＣＦＡが、１００〜３０００ppmの濃度で用いられる、医薬。
【請求項２】
ラウリン酸（Ｃ12）、ミリスチン酸（Ｃ14）、他の抗真菌剤、又は香料及び植物抽出物のような他の（有機）（脂肪）酸若しくは添加剤と組合せた、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
大腸菌の増殖に選択的に対処するための、前記請求項１〜２のいずれか１項記載の医薬。
【請求項４】
任意の動物又はヒトの胃腸管における大腸菌の選択的制御及び調節のための、前記請求項３項記載の医薬。
【請求項５】
動物が、その早期離乳期にある、請求項４記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】技術分野
本発明は、微生物、特に細菌及び真菌の混入及び増殖の阻害剤としての、中鎖脂肪酸（ＭＣＦＡ）の中の特定範囲の使用に関する。特に本発明は、細菌及び真菌の混入及び増殖を阻害するための、並びに適宜これらの微生物による二次的毒素産生の阻害のための、カプロン酸（Ｃ6）、ヘプタン酸（Ｃ7）、カプリル酸（Ｃ8）、ノナン酸（Ｃ9）及びカプリン酸（Ｃ10）、又はその塩若しくは誘導体、又はその混合物若しくはエマルションの使用に関する。
【０００２】  更に特には、本発明は、主として胃のような酸性環境において活性な抗菌剤としての、本質的に等重量のＣ8及びＣ10を含むことを特徴とする混合物に関する。
【０００３】発明の背景
微生物は、食品及び飼料の腐敗の最大の要因であり、必須栄養素の相当な消失に関与している（Bartovら, 1982）。全ての食品及び飼料成分は、自然に細菌、酵母及び（主としてカビ形成性）真菌で（最後のものは通常胞子の形態で）汚染されている。４℃を上まわる温度で、多くの食品及び飼料は、微生物の増殖にとって、そして大部分の時間、微生物のインサイチューでの発生による二次的毒性代謝物（エンドトキシン、真菌中毒症、・・・）産生（Smithら, 1983；Russelら, 1991）にとって、理想的な媒体である。
【０００４】  これに関連して、真菌による農産物の汚染は、非常に例示的な例である。マイコトキシン産生真菌による汚染は、しばしば不可避であり、世界的関心事である（Tuite, 1979；Jelinekら, 1989）。更に、湿度と温度が、真菌の増殖にとって重要なパラメーターであるため、液体の食品及び飼料は、真菌の混入及び増殖、並びに二次的真菌中毒症常在度に非常に影響されやすい。
【０００５】  あるカビ及び真菌は非毒性であり、繁殖させてもほとんど障害を引き起こさないが、また他のものは、相当な問題を引き起こす。更に、標準的な管理の慣行では、非毒性型と毒性型のカビ及び真菌とを区別することは不可能である（Hirookaら, 1996）。
【０００６】  ヒト及び動物に疾患を引き起こす真菌及びカビは、直接感染（真菌症）により、又はマイコトキシンを産生し、これが更に摂食されること（真菌中毒症）により、これをなしうる（Wyatt, 1995）。真菌症の例は、家禽におけるアスペルギルス症、畜牛における二番草熱及び農夫肺である。これらの疾患は、時に治療が非常に困難である。他の側面で、真菌中毒症は、約１００万羽のトリ（シチメンチョウ）がアフラトキシン症（アフラトキシンによる真菌中毒症）のために英国で死んだ、１９６０年代初頭に世界の注目を浴びた。真菌中毒症は、下記マイコトキシンにより引き起こされることがある：アフラトキシン、オクラトキシン、トリコテセン、ゼアラレノン、シトリニン、・・・。
【０００７】  真菌中毒症は、存在する真菌中毒症の性質及び濃度、曝露の期間、動物種、汚染食品及び飼料に曝露した時点でのその年齢及び栄養健康状態に応じて、広範な有害な臨床徴候を引き起こす（Reiss, 1978；Bartovら, 1982；Harveyら, 1989；Hamilton, 1990；Pier, 1992）。カビの増殖及び二次的マイコトキシン産生は、植物の部分に侵入してコロニーを作る真菌の能力に影響を及ぼす、広範な植物種及び環境因子に起因する。この理由で、過去において、真菌のコロニー化、混入及び増殖、並びに二次的マイコトキシン産生を最小化するために、幾つかの方法が適用された。
【０００８】  恐らく最も古くからの、食品及び飼料の真菌汚染に対する防腐システムの中には、空気乾燥、天日乾燥、人工手段による乾燥、燻製、無気条件下での貯蔵、発酵、ピックリング、塩蔵、糖添加及びある種の食品及び飼料への香辛料の添加という加工があった。しかし、これらの伝統的な方法は、比較的費用が高くつき、そして非常に時間がかかる。更に、これらの方法は、食品及び飼料が輸送中か、又は他の成分と混合して完全な食餌になるならば、実は有用ではない。
【０００９】  したがって、化学的防腐のような他の手段が、最近数十年にはより魅力ある代替法になった。（高湿度）食品及び飼料の化学的な真菌の防腐、並びにヒト及び家畜へのその供給は、充分に文献に記載されている（Jonesら, 1970；Englishら, 1973；Fosterら, 1987；YasinとHanna, 1989）。しかし現今では、遅れのない貯蔵、可能な限り低い水分の保持及びカビ阻害剤（プロピオン酸塩など）又は他の化学保存料（例えば、安息香酸、ソルビン酸、酢酸及びその塩のような酸阻害剤）又はその誘導体又はその混合の添加が、食品及び飼料における真菌の増殖を減少させるために、一般に適用されている（Smithら, 1983）。
【００１０】  プロピオン酸及び全ての伝統的な酸保存料は、非常に有効なカビ阻害剤であるが、その揮発性並びに刺激性及び腐食性のために、これらの酸は、あまり広くは使用されていない（Marinら, 1999）。こういった理由から、種々の緩衝型のプロピオン酸（乾燥及び液体）が目下市販されているが、これらのタイプの「配合」化学薬品の効力に関しては、限定的かつ疑わしい情報しか入手できない（RahnemaとNeal, 1992）。これらの新しいタイプの「配合」化学薬品を評価するために、幾つかの研究が行われた（RahnemaとNeal, 1994）。更に、ナタマイシン（natamycin）、ナイスタチン（nystatin）・・・のような、幾つかの非酸性抗真菌剤が現在では利用可能である（Rybinskaら, 1997；Emeleら, 2000）。しかしこれらの新しい抗真菌剤の幾つかは、倫理的、感情的及び経済的側面に欠点を持つ。
【００１１】  ここ数百年、ヒトの栄養摂取における微生物汚染に多くの注目が集まっていたが、現在では動物飼料防腐の慣行も重要になっている。次の例は、微生物汚染に対する飼料の防腐の重要性を例証する。
【００１２】  生産性を増大させ、採算性を維持するための、現代の畜産システムの経済的な利害を考慮すると、特定の動物（コブタなど）を早期離乳に付すことにより、成長速度を上昇させることが一般的な慣行になっている。しかしこの早期離乳は、動物に多くの有害なストレス（主として栄養が原因の）を負担させる（Zijlstraら, 1996）。この有害なストレスは、しばしば飼料摂取量の多少深刻な低下及びエネルギー欠乏を伴い、そして動物による体内貯蔵物質の動員に関係する。消化不良及び吸収不良が更にこの状況を悪化させて、主として胃腸管における細菌及び真菌の異常増殖及び／又は胃腸管のウイルス感染のため、消化の不調を招く（Eckel, 1999）。
【００１３】  一般に早期離乳動物の消化系病態は、主としてグラム陰性細菌、特に大腸菌（Escherichia coli）種及びサルモネラ種（Salmonella sp.）（これらは、しばしば動物の腸にそのまま存在するか、又は飼料により胃腸管に入り込むこともある）により引き起こされると考えられている（Guillot, 1989）。しばしば重篤な体重減量及び動物の死亡率の上昇に関係する、消化系病態の問題を克服するために、動物の飼料に、低用量の薬剤学的抗菌物質（例えば、抗生物質）又は治療用量の抗生物質（以降「抗生物質」と称される）を補足することが、普通の慣行になった（DupontとSteele, 1987；Prescott, 1997）。しかし現在では、飼料への抗生物質の添加に対して懸念が高まっている（Guillot, 1989；Barton, 1998）。ヒトの薬剤において使用される最後の手段の抗生物質の出現のリスク、抗生物質に対する耐性の発現のリスク（これらは、その用量を上昇させるか、又は新しくより強力な抗生物質を開発するニーズを伴う）に対する危惧が存在する。また、耐性が、これらの抗生物質で処置されている動物を食べた後の生物に出現するという危惧も存在する。化学薬品による環境撹乱のこの懸念、並びにこれらの抗生物質の多くが既に欧州連合において禁止されているか、又は近い将来禁止されるという事実は、抗菌剤として機能する代替品に対するニーズを正当化する（Muirhead, 1998；Ross, 1999）。
【００１４】  与えられた例から推理することができるように、既知の抗菌剤、及び差し当たり時には禁止された抗生物質の代用品として、微生物の増殖（外殖）（(out)growth）を克服し、動物により示される消化系病態を克服するための新しい抗菌剤を発見するニーズが存在する。
【００１５】  更に別の目的は、胃内に存在する低いｐＨ値で活性でありうる、抗菌性飼料添加物を提供することである。これは、摂取された病原体を腸へと更に輸送することを回避する。
【００１６】  これに関連して、特定の中鎖脂肪酸ＭＣＦＡ（Ｃ6、Ｃ7、Ｃ8、Ｃ9及びＣ10）は、これらが、胃腸管及び特に胃における微生物の混入及び増殖並びに二次的毒素産生を制御するための、新規かつ革新的な抗菌剤として使用できるため、有用な代替品である。
【００１７】  EP-A1-0,089,376は、少なくとも脂肪酸塩、又は少なくとも脂肪酸塩と糖の脂肪酸エステルを含む、動物の成長を促進する飼料添加物又は飼料を記載している。該文献において、脂肪酸は、約６〜２４個の炭素よりなり、鎖長の非常に広い範囲が記載されている。この広い範囲よりも良好な作用を示す、特定の小範囲は提示されていない。
【００１８】  EP-A1-0,519,458は、（ａ）６〜１２個の炭素原子を有する中鎖脂肪酸のトリグリセリド、並びに（ｂ）６〜１２個の炭素原子を有する中鎖脂肪酸、脂肪酸のモノグリセリド及び脂肪酸のジグリセリドから選択される、少なくとも１つの物質を含むことを特徴とする、家畜用の飼料添加物及び家畜用の飼料を記載している。この組成物は、脂肪酸の組合せを開示している。
【００１９】  本発明の主要な目的は、特に抗細菌性と抗真菌性が組合された、抗菌性が改善された中鎖脂肪酸の更に特異的かつ活性な範囲を提供することである。驚くべきことに、活性の該特異的な組合せによって、有効な飼料添加物が得られ、これによって飼料要求率（１kg体重増加当たりに消費される飼料重量である）が改善する。
【００２０】  よって本発明は、微生物の混入、増殖及び二次的毒素産生の阻害のための、１つ以上のＣ6−Ｃ10中鎖脂肪酸、その塩、誘導体又はエマルション若しくは混合物の使用法を提供する。好ましくは、この範囲は、Ｃ8−Ｃ10から選択され、更に好ましくはエマルションとして実質的に等量のＣ8及びＣ10である。
【００２１】本発明の説明
第１に、本発明は、Ｃ6−Ｃ10の範囲の特定のＭＣＦＡ、その塩若しくは誘導体又は混合物を、その溶液又はエマルションとして、真菌、酵母及び細菌に供給すると、これらが更に増殖するのを阻害するという驚くべき観察に関する。真菌、酵母及び細菌の増殖は阻害され、そして各微生物は、投与されるＭＣＦＡにより死滅する。本発明において、好ましくは、個々の脂肪酸が異なる数の炭素原子を含む、特定の異なる脂肪酸の混合物が使用される。本発明者らは、このような混合物が最適な抗菌性を示すことを見い出した。本発明は、好ましくは、組成物から不快な匂いが拡散するのを防ぐために、１つ以上の遊離脂肪酸のアンモニウム、ナトリウム、カリウム若しくはカルシウム塩、又は１つ以上のこれらの塩の混合物を含む。本発明に使用できる脂肪酸は、偶数及び奇数の炭素原子を持つ脂肪酸両方、例えばＣ6（カプロン酸、ヘキサン酸）、Ｃ7（ヘプタン酸）、Ｃ8（カプリル酸、オクタン酸）、Ｃ9（ノナン酸又はペラルゴン酸）及びＣ10（カプリン酸、デカン酸）を含む。
【００２２】  脂肪酸及びその石鹸（金属塩）の抗菌作用は、既に長い間知られており、J.J.Kabara (1978), 「脂質の薬理学的作用（The pharmacological effects of lipids）」に総説されている。この総説において、同族列の脂肪酸では、殺菌効率は、鎖長が伸びるほど増大することが考察されている。大腸菌（E. coli）種及びシゲラ種（Shigella spp.）は、中濃度の１２個の炭素原子を含むラウリン酸の飽和石鹸、及び１８個の炭素原子を含むステアリル脂肪酸により死滅するようである。１０〜１２個の炭素原子の鎖長を持つ脂肪酸は、最適な抗菌活性を示すようであるが、一方４〜１０個の炭素原子を持つ低級脂肪酸は、全然又はほとんど殺菌作用を持たないようである。
【００２３】  脂肪酸が抗菌活性を発揮する機序は、文献にまとめられている。現在認められている理論は、脂質の微生物細胞膜が、解離していない脂肪酸に対して透過性であり、その結果として脂肪酸が、アルカリ性の高い内部へと微生物細胞膜を通り抜けることができるというものである。細胞内アルカリ性が高いため、脂肪酸は解離し、このため、生存レベルを下回る細胞内ｐＨの低下を伴う。よって脂肪酸は、実際にプロトノホア（protonophore）として作用するが、これは、Ｈ+の内向き漏出を増大させ、そしてＨ+の外向きのフラックスが緩慢過ぎて細胞内ｐＨを再度上昇させられないことに関係している。プロトノホアとして作用させる脂肪酸の物理化学的性質は、多数のパラメーターに関して変化し、かつ依存する。このようなパラメーターの例は、脂肪酸の鎖長及びpKa、更には物理化学的環境、沈降、作用点のpKa及び膜による脂肪酸の通過を決定する微生物のエンベロープの化学組成である。この点に関して、本発明の８〜１０個の炭素原子を含む脂肪酸の良好なパフォーマンスは、この脂肪酸に関する微生物細胞膜の極度の透過性が原因である。このことは、Kabara（1978)は、４〜１０個の炭素原子を含む低級脂肪酸が、ほとんど殺菌活性を示さないことを開示しているため、全く予想外である。６．５から７．５へのｐＨの上昇によって、６〜８個の炭素原子を含む短鎖脂肪酸の最小阻止濃度が上昇し、そして１２〜１４個の炭素原子を含む２つの中鎖脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸）の最小濃度が低下した。
【００２４】  しかしながら、８〜１０個の炭素原子を含む脂肪酸が、細菌を制御できるだろうという教示は、Kabara（1978）にはない。
【００２５】  Ｃ8−Ｃ10  ＭＣＦＡのこの特別な抗菌作用は、真菌、酵母及びグラム陰性細菌に対する複合阻害には特に有効である。真菌は、以下の属を含んでよい：アスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ（Candida）、セファロスポリウム（Cephalosporium）、フザリウム（Fusarium）、ペニシリウム（Penicillium）、及び不完全菌類（Fungi Imperfecti）に属する他の真菌。酵母は、サッカロミケス（Saccharomyces）及び他の半子嚢菌類（hemiascomycetes）（酵母）を含んでよい。グラム陰性細菌は、大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ種（Salmonella sp.）、シゲラ種（Shigella sp.）並びに他のグラム陰性菌及び大腸菌群及び腐敗菌を含む。増殖の阻害により、及び微生物細胞を死滅させることにより、各微生物は、もはや細胞内在性疾患を引き起こすこと及び更に毒素を産生することができなくなる。
【００２６】  この分野の他の人々によるこれらの結果及び観察から、他のＭＣＦＡもまた、この適用に有用であることが期待されよう。他のＭＣＦＡは、ラウリン酸（Ｃ12）及びミリスチン酸（Ｃ14）を含んでよい。結局他の（有機）（脂肪）酸、抗菌剤及び添加物（芳香剤など・・・）と組合せた、約１０００００ppm以下の濃度のＭＣＦＡを、この特別な目的を達成するために使用することができる。１２００ppmのＭＣＦＡの混合物は、特に適していることが見い出された（実施例を参照のこと）。
【００２７】  結論として、ＭＣＦＡ（又はそれらの塩若しくは誘導体又はその混合物若しくはエマルション）は、微生物細胞を死滅させることにより微生物増殖を阻害する。
【００２８】  本発明は、特に特定の小範囲のＭＣＦＡ（Ｃ8−Ｃ9−Ｃ10）に関するものであり、そして更にはおよそ等重量のＣ8及びＣ10が、抗菌剤として適している。結果として、胃腸管のような生態系における、汚染、生物付着、発酵中の微生物増殖を、プロピオン酸のような伝統的な抗生物質、成長促進剤及び抗生物質の使用に比較して、より利用しやすい方法で制御することができる。
【００２９】  観察される効果は、グリセリドに結合したＭＣＦＡ、遊離ＭＣＦＡ及び／又は塩の形態により、あるいはＭＣＦＡのエマルションとして得られる。
【００３０】  本発明が、更に明瞭に理解されるように、好ましい形態が以下の実施例に参照として記述される。
【００３１】  可能な使用の機会は、微生物汚染が不利であり、そしてモニター及び制御を必要とする全ての状況である。この理由で、特定のＭＣＦＡは、成長中、収穫後及び貯蔵植物への作物防護に、粉末及び液体食品及び飼料に、チューブ及びタンク（流体浄化）中の防汚剤として、ヒトの健康管理（下痢のケースに、又は呼吸器疾患用のエーロゾルとして、又は創傷治癒用などの局所適用に、そして膣感染症のケースに、皮膚疾患のケースに、口腔疾患のケースに、・・・）に、食品及び飼料（果物、チーズ、ケーキ、パン、・・・）の保存に、飲料に、洗浄（消毒）剤及び洗剤に・・・応用することができる。
【００３２】  下記の幾つかの実施例が、Ｃ8及びＣ10の５０／５０（重量）混合物であるＭＣＦＡの抗菌効果の有効性を立証するものである。これらの実施例は、説明の目的を持つものであって、請求の範囲に述べられる本発明の範囲を限定するものではないことは明らかである。
【００３３】実施例１：ｐＨ４での真菌及び酵母の増殖及び生存に及ぼすＭＣＦＡの影響（主として酸型のＭＣＦＡ）
６種の真菌／酵母株を評価した：ペニシリウム・クリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）ＭＵＣＬ２８６５８、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）ＭＵＣＬ１９００１、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）ＭＵＣＬ２９８００、フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）ＭＵＣＬ７８１、セファロスポリウム・クリソゲヌム（Cephalosporium chrysogenum）ＭＵＣＬ９７１８及びサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＭＵＣＬ３１４９７。各株は、以下のｐＨ値及び以下の濃度の特定のＭＣＦＡ（５０％／５０％（重量）の（Ｃ8−Ｃ10））を含むＰＤ（ポテトデキストロース（Potato Dextrose））ブロス中で２５℃でインキュベートした：２４００ppm（ｐＨ４．０）、１２００ppm（ｐＨ４．０）、６００ppm（ｐＨ４．０）、３００ppm（ｐＨ４．０）、０ppm（ｐＨ４．０）、０ppm（ｐＨ７．０）。７日後、全ての発酵ブロスを増殖に関して評価した。阻害の型（死滅又は活動の静止モード）を決定するために、プレートの計数を実行した。表１は、増殖に関する結果を要約した。３００ppmの特定のＭＣＦＡ及び全ての微生物株について、ＰＤ寒天培地でのプレート計数の後では増殖を観察できなかった。
【００３４】
【表１】
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【００３５】  表１から、特定のＭＣＦＡ（Ｃ8−Ｃ10）がｐＨ４．０で、黒色アスペルギルスＭＵＣＬ１９００１、カンジダ・アルビカンスＭＵＣＬ２９８００、フザリウム・オキシスポルムＭＵＣＬ７８１及びサッカロミケス・セレビシエＭＵＣＬ３１４９７に及ぼす阻害作用を有することが明らかである。菌株が死滅し、それが増殖阻害を引き起こした。ペニシリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ２８６５８及びセファロスポリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ９７１８は、ｐＨ４（最適ｐＨ範囲外）では増殖しなかった。この理由で、これら２種の菌株については結論を得られなかった。
【００３６】実施例２：ｐＨ７での真菌及び酵母の増殖及び生存に及ぼすＭＣＦＡの影響（主として塩型のＭＣＦＡ）
実験１に記載されたものと同じ実験条件を適用した。しかし、本実験では、全ての発酵ブロスはｐＨ７．０に設定した。結果は、表２に要約した。菌株が増殖しなかった場合、細胞も死滅した（ＰＤ寒天培地でのプレート計数により検証）。
【００３７】
【表２】
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【００３８】  表２から、特定のＭＣＦＡ（Ｃ8−Ｃ10）の使用が、ペニシリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ２８６５８、黒色アスペルギルスＭＵＣＬ１９００１、カンジダ・アルビカンスＭＵＣＬ２９８００、フザリウム・オキシスポルムＭＵＣＬ７８１、セファロスポリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ９７１８及びサッカロミケス・セレビシエＭＵＣＬ３１４９７に阻害作用を及ぼすことを結論づけることができる。またここで、菌株は死滅して、これが増殖阻害をもたらした。
【００３９】  実施例１及び２から、特定のＭＣＦＡ（Ｃ8−Ｃ10）は、黒色アスペルギルスＭＵＣＬ１９００１、カンジダ・アルビカンスＭＵＣＬ２９８００、フザリウム・オキシスポルムＭＵＣＬ７８１、サッカロミケス・セレビシエＭＵＣＬ３１４９７、ペニシリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ２８６５８、セファロスポリウム・クリソゲヌムＭＵＣＬ９７１８に対する非常に有効な抗菌剤として適用できることを結論づけることができる。抗真菌作用は、広いｐＨ範囲で観察された。
【００４０】実施例３：早期離乳コブタでのＭＣＦＡのインビボ評価
離乳コブタの胃腸管は、大腸菌（Escherichia coli）Ｋ８８汚染に対して非常に感受性が高い。大腸菌（E. coli）Ｋ８８での汚染によって、主として下痢及びパフォーマンス低下（１日成長量及び飼料要求率に反映）が起こる。ＭＣＦＡによるコブタの大腸菌Ｋ８８汚染の制御を例示するために、以下の試験を組み立てた。
【００４１】  約４０重量部のオオムギ、１４重童部のコムギ、１０重量部のトウモロコシ製品、１１重量部のダイズ製品、及び０．８重量部の８〜１０個の炭素原子を持つ特定のＭＣＦＡを含む２０重量部の飼料補助組成物を含む、本発明の混合物を調製した。飼料１ｇ当たり１０8個の病原性細菌（大腸菌Ｋ８８）も加えた。
【００４２】  対照飼料が、特定のＭＣＦＡを含まないことを除いて、上述の混合物と同じ成分を含む、対照飼料を調製した。
【００４３】  １０匹のブタの１群を２１日の期間後に離乳させた。全てのブタは自由に水と飼料を摂らせた。第１の対照群（群１）には対照飼料を給餌した。第２群（群２）には、上述の本発明の飼料組成物を給餌した。
【００４４】  全ての動物は離乳の５日後に屠殺した。胃内容物１グラム当たりの細菌の数を数えた。結果は、表３に要約する。
【００４５】
【表３】
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【００４６】  表３から、８〜１０個の炭素原子を含むＭＣＦＡの添加により、細菌が早くも動物の胃内（酸性条件）で死滅していることが明らかである。本発明の飼料補助物を給餌されたコブタの８０％では、胃内に何らかの細菌を見い出すことはほとんどできなかったが、対照飼料では、細菌を胃内で早くも死滅させることができたのは、わずか２０％のケースであった。
【００４７】  飼料に８〜１０個の炭素原子を含む１つ以上の脂肪酸を補足すると、幼動物の消化管における細菌の発生を制御できることは明白である。十中八九、この作用を、動物の胃内のこれらの脂肪酸の存在によって、胃腸内のマイクロフローラを調節及び安定化できる生理的環境が作られるという事実により説明することができる。ここで、８〜１０個の炭素原子を含む脂肪酸が、大多数の病原性細菌（大腸菌Ｋ８８など）を早くも胃内で死滅させることができ、このため、腸への病原性用量の細菌の移行を妨げることができ、胃腸障害の発生を防止できることが見い出された。
【００４８】  更に、そしてこの実施例から結論づけられるように、ＭＣＦＡは、非常に複雑な生態系、並びに有機物及び無機物、添加物、芳香剤・・・の複雑な混合物よりなる、非常に複雑な環境における大腸菌汚染を減少させることができる。
【００４９】実施例４：動物のパフォーマンスに及ぼす特定のＭＣＦＡの作用
実施例３に開示された実験を反復した。本発明の飼料組成物を給餌したブタの群が、対照群よりも約７．５％改善された成長パフォーマンスを示した。５５日齢では、コブタの平均体重は、約１９kgであった。このようなコブタは、６０日齢より前に２０kgの体重に達することが予想されるが、これは、長い間達成できなかった目標である。このことは、本発明の飼料組成物により、高い１日成長量が得られることを意味する。更に、両方の飼料に関して飼料摂取量はほとんど同様であるため、本発明の飼料組成物により、低い飼料要求率も得られた。
【００５０】  換言すれば、恐らく胃腸管の微生物生態系を調節することにより、そしてＭＣＦＡが、胃腸管から非常に急速に吸収され、更にエネルギー（動物が利用できるようになる）に変換されるという事実により、特定のＭＣＦＡを、動物のパフォーマンス（１日成長量及び飼料要求率に反映）を改善するために、動物に給餌することができる。こうして、特定のＭＣＦＡは、伝統的な成長促進剤に取って代わることができる。
【００５１】実施例５：大腸菌Ｋ８８増殖の制御に関するＭＣＦＡとコリスチン（colistin）との比較
３つの試料の発酵ブロス（脳心臓浸出物（Brain Heart Infusion））１００mlに、大腸菌Ｋ８８（コブタの胃腸管内の病原体）の一晩培養液を同量接種して、更に３７℃でインキュベートした。６００nmでの光学密度（ＯＤ600nm）（これは、存在する大腸菌細胞の量に比例する（図１））を測定した。０．２と０．５の間のＯＤ600nmを得たら直ぐに、
（１）第１の試料には何も加えず、
（２）第２の試料には１２ppmのコリスチンを加え、そして
（３）第３の試料には１２００ppmのＭＣＦＡのナトリウム塩（５０％の８個の炭素原子を持つ脂肪酸と５０％の１０個の炭素原子を持つ脂肪酸を含む混合物）を加えた。
【００５２】  試料を、更にｐＨ４．０で３７℃で４時間インキュベートした。ＯＤ600nmを毎時測定した。４時間後に試料をインキュベーションから取り出し、インキュベーション中の起こりうるｐＨ変化を記録するため、ｐＨを測定した。結果は、表４に要約した。
【００５３】
【表４】
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【００５４】  表４から、大腸菌の増殖が、コリスチンの添加により５６％、そして本発明のＭＣＦＡの添加により９６％遅延することが明らかである。３つの試料のｐＨはほぼ同じであったため、本発明のＭＣＦＡには非常に著しい作用がある。伝統的な抗生物質であるコリスチンを、ＭＣＦＡによって有効に代替できることを結論づけることができる。
【００５５】実施例６：ＭＣＦＡ（５０／５０のＣ8及びＣ10）及び市販の抗菌剤の抗菌活性のインビトロ比較。
試験量は、既知製品の販売者により提供される技術情報に依存して変化する。目的は、胃内におけるＣ8／Ｃ10  ＭＣＦＡ及び市販のＣＲＩＮＡ（登録商標）製品（アクゾ・ノーベル（Akzo Nobel）の製品）の抗菌活性を評価することである。４種の試験物質を使用した：
ａ．  ブランク
ｂ．  ＭＣＦＡ                            →  ８g/kg飼料
ｃ．  ＣＲＩＮＡ（登録商標）ＨＣコブタ    →  １００mg/kg飼料
ｄ．  ＣＲＩＮＡ（登録商標）ＨＣ７３９    →  ５０mg/kg飼料
ｅ．  ＣＲＩＮＡ（登録商標）ＨＣブタ／雌ブタの仕上げ
→  ７５mg/kg飼料
【００５６】  試験溶液の調製は、以下のとおりとした。１kgの飼料（組成は表５）に正確に測定した量の大腸菌Ｋ８８を加えた。続いて、２０％の飼料及び８０％の生理溶液（０．８５％生理食塩水）の懸濁液を作った。胃内環境の２０％懸濁液をシミュレートするために、０．１Ｎ  ＨＣｌで３．５〜４．０のｐＨを確立した。
【００５７】
【表５】
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【００５８】  ここで酸性にした懸濁液を、１００mlの試料に分散させた。ｔ＝０での微生物数の計測を実行した。試料を３７℃で３時間インキュベートした。３時間後に試料を取り出して、ｐＨ及び微生物数を求めた。大腸菌株は、コーライＩＤ（Coli ID）培地（バイオ・メリュー（Bio Merieux）、４２０１７）で計数を行った。
【００５９】  計画した観察は、以下のとおりとした：
ａ．  ｔ＝０での対照試料（ブランク）及び処置試料の微生物の計数
ｂ．  ｔ＝３時間での対照試料（ブランク）及び処置試料の微生物の計数。
【００６０】  表６は、本発明のＭＣＦＡ混合物（５０／５０、Ｃ8／Ｃ10）の胃内の抗菌効果の有効性を証明する、計算結果を示す。
【００６１】
【表６】
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【００６２】実施例７：水溶液中のＭＣＦＡ塩及びＭＣＦＡエマルションの抗菌効果
本実施例の目的は、ニワトリの畜産学的パフォーマンス（成長、飼料要求率、飼料摂取量、死亡）について、飲料水中の生理食塩水として提供される、Ｃ8及びＣ10（等しく５０重量％）ＭＣＦＡの混合物の有効性を試験することである。
【００６３】  ４０羽のＲＯＳＳ３０８オンドリを４つの別の囲いに入れた。飲料水及び飼料は適宜与えた。試験は３６日かかった。全てのニワトリに全期間にわたり同じ飼料を与えた。飼料は、何ら成長促進剤や抗コクシジウム剤を含まない。Ｃ8−Ｃ10の混合物は、囲い２、３及び４について試験期間に飲料水として提供した。囲い１には、純粋な飲料水を提供し、囲い２、３及び４には、それぞれ以下の量でＭＣＦＡを塩として提供した：１０００ｌ当たり０．５kg、１kg及び２kg。
【００６４】  これらの試験の結果は、表７、８、９、１０及び１１に列挙した。
【００６５】
【表７】
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【００６６】  表７〜１１から判るように、最初の３週間は、これら４つの集団に特別な差は見られなかった。しかし３６日目には、ＭＣＦＡ処置を行った３つの囲いで、高い体重と良好なＦＣＲが得られることは明らかである。本発明の特定のＭＣＦＡ組成物は、ニワトリの畜産学的パフォーマンスに及ぼす前向きの作用を有することが明らかである。
【００６７】  ＭＣＦＡ（５０／５０（重量）のＣ8−Ｃ10）をエマルションとして提供した、別の試験を行った。これらのＭＣＦＡを飲料水に塩として加えた、数kgという高濃度のＭＣＦＡを使用すると、泡の生成が起こることがあった。こういった問題を回避するために、幾つかの消泡剤を飲料水に加えることができた。しかし、本発明では、驚くべきことに、本発明の特定の分画のＭＣＦＡが、エマルションの形態で更に良好に提供できることを見い出した。このアプローチが、泡の生成を回避した。
【００６８】  塩の形態（１２００ppm）を、ブロックコポリマーのプロピレン−エチレンを、キサンタンと水中で、乳化剤として使用した５０％  ＭＣＦＡエマルション（０．３％）と比較した、別の試験を実行した。それなりに当該分野において既知の、他の乳化剤も選択できることは、明らかである。塩の形態で抗微生物作用が得られたが、エマルションの使用では数倍活性が高かった。
【００６９】実施例８：ブタへのＭＣＦＡの使用
本試験の目的は、ブタの試験（３０〜１０５kg）においてＭＣＦＡ（５０％／５０％（重量））の作用を評価することである。
【００７０】  実験飼育場は、西フランドルに位置しており、それぞれ１０個の囲いを含む、２つの群からなる。
【００７１】  各囲い（２ｍ×４ｍ）は、ブタ１４匹を含む。１つの囲い当たり、１つの飼料給餌器（適宜）を廊下側に据え付けた。水は、囲いのもう一方に供給（適宜）した。雌ブタと雄ブタを混ぜた。全実験中、囲いを通気した。
【００７２】  飼料は、飼料当たりの平均ブタ体重が、動物試験の開始時に全飼料に関して同様であるように、分配した（±３０kg）。以下の飼料を試験の間モニターした：
飼料１：  対照
飼料２：  対照＋０．１％  ＭＣＦＡ（成長期）
対照＋０．０５％  ＭＣＦＡ（仕上げ期）
【００７３】  以下のパラメーターを追跡した：ブタ体重及び飼料摂取量。
【００７４】  ブタは、個別に「３０kg」、「５０kg」及び「１００kg」時に秤量した。動物試験は、２０００年５月１９日に開始した。全てのブタは、個別に秤量した。２回目の秤量は、２０００年６月２６日に行った。最後の秤量は、２０００年９月２５日に行った。各ブタは、サニテル（Sanitel）番号により追跡した。以下の要約は、得られたデータから推論できる（表１２）：
【００７５】
【表８】
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【００７６】  表１２から、餌２では、成長期に最高の成長が起こったことが明らかである。実験終了時、この作用は消失した。ＭＣＦＡは、成長期において成長促進剤として有効に使用できると考えられる。
【００７７】  １つの囲い当たりの飼料摂取量も記録した。２０００年６月２６日に、元の、（成長用）飼料を交換して、ブタには更に仕上げ用飼料を給餌した。ブタ１匹当たりの飼料摂取量を、成長期及び仕上げ期について測定した（表１３）。これらのデータから、更に飼料要求率を計算することができた（表１４）。
【００７８】
【表９】
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【００７９】  表１３及び１４から、飼料へのＭＣＦＡの補足が、全期間にわたって飼料要求率を低下させたことが明らかである。ＭＣＦＡは、成長に及ぼす作用は持たないが、仕上げ期において飼料要求率に及ぼす前向きの作用を有する。
【００８０】  結論として、ＭＣＦＡを、成長期において「成長促進剤」として有効に使用することができるが、この作用はその後消失する。
【００８１】実施例９：ＭＣＦＡのＭＩＣ値測定
本試験は、ゲント大学（University Gent）に下請けさせた。
【００８２】  通常腸管に付随している細菌の異なるコレクション株の、ＭＣＦＡに対するインビトロの感受性を測定するために、試験を行った。コレクション株に対する生成物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、０．２５％〜０．００５％で変化した。ｐＨ７．２で、低ｐＨで嫌気的に生育する腸球菌で最高の活性が見られた。最低の活性は、好気的に生育する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）及びシュードモナス属（Pseudomonas）で記録した。
【００８３】  種々の通性好気性生育の腸内細菌を代表する１７種のコレクション株を本試験に含めた（表１５）。３種の耐性記録対照株の黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２５９２２、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）ＡＴＣＣ２９２１２及び大腸菌（E. coli）２５９２３を同様に試験した。
【００８４】  蒸留水で、生成物の１０％懸濁液の３種の１０倍希釈液を調製した。所望の最終濃度を得るために、これらの希釈液１．５、０．７５及び０．３６mlをピペットでペトリ皿にとり、溶融増殖培地と注意深く混合した。３種類の培地を使用した：ｐＨ７．２のミュラー・ヒントン（Mueller-Hinton）II培地（ＢＢＬ）、ｐＨ６．２のＭＲＳ培地（オキソイド（Oxoid）社）及びｐＨを４．６に調整したＭＲＳ培地。
【００８５】  保存株は、コロンビア（Columbia）血液寒天プレート又はＭＲＳ培地で増殖させた。接種原は、３７℃で一晩（１６〜２６時間）インキュベートした旧ブロス培養液から調製した。これらは、マクファーランド（McFarland）スケール測定法に適合させた光度計（バイオメリュー（bioMerieux））で、無菌生理食塩水中に培養物を懸濁することにより得た。０．５マクファーランドに合った溶液を生理食塩水に１０倍希釈して、デンレイ・マルチポイント・イノキュレーター（Denley Multipoint Inoculator）（マスト（Mast））を用いて抗生物質及び対照プレートに接種した。こうして、約１０，０００コロニー形成単位の各株をプレートに接種した。ＭＲＳプレートは、Ｈ2＋ＣＯ2雰囲気で嫌気的にインキュベートした。ミュラー・ヒントンプレートは、好気的にインキュベートした。
【００８６】  読み取りは、３７℃で２日間のインキュベーション後に実行した。ＭＩＣは、増殖を完全又はほぼ完全に阻害した最低濃度として記録し、そして増殖の微かな濁り又は単一のコロニーは無視した。
【００８７】  最小阻止濃度は、表１５に示す。ｐＨ４．６ではわずか４種のラクトバチルス属（Lactobacillus）の株だけが非常によく増殖した。多くの腸球菌株の増殖は、このｐＨではかなりよく発現するが、それでも他の培地での増殖よりは少ない。残りの株は増殖しなかった。グラム陰性菌を除く全ての株は、ｐＨ６．２のＭＲＳで増殖した。乳酸桿菌は、ミュラー・ヒントン寒天培地で微かな増殖の濁りを発現しただけだった。
【００８８】  全ての分離株のＭＩＣは、全て０．２５％と０．００２５％のＭＣＦＡ一エマルションの間であった。この生成物は、増殖できた腸球菌及び乳酸桿菌に対してｐＨ４．６で最も活性が高かった。最適なインビトロ増殖のための条件では、ＭＩＣは０．２５％と０．１％の間で変化した。
【００８９】
【表１０】
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【００９０】実施例１０：コブタ（７〜２０kg）に対するＭＣＦＡの有効性
腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に対する有効性が実施例１０の目的となる。５０％  ＭＣＦＡエマルションの抗菌活性を、コブタの集団（７〜２０kg）を用いて評価する。
【００９１】  早期離乳ブタ（７kg）を、それぞれ１０匹の被験動物の２つの集団に分けて収容した。水と飼料は適宜提供した。集団（Ｃ）には、抗生物質も成長促進剤も含まない基本飼料を与えた。
【００９２】  集団（Ｂ）には、０．５０％のＭＣＦＡの５０％エマルション（５０／５０Ｃ8−Ｃ10、乳化剤のブロックコポリマーのエチレン−プロピレンによる）を補足した基本飼料を与えた。各試料について２回、対照群と処置群から２匹の動物を選択して、承認された倫理的手続きにより解剖した。内容物は、胃、十二指腸、回腸及び盲腸の第１の部分である、数カ所の胃腸管から集めた。それぞれ対照及び処置群の胃腸管の部位当たり２つの混合試料を調製して、４つの異なる培地で分析した：総汚染の計数のための普通寒天培地、腸内細菌の計数のためのバイオレットレッド胆汁グルコース寒天培地（violet red bile glucose agar）、大腸菌（E. coli）の計数のためのコーライＩＤ（coli ID）培地及び乳酸菌のためのロゴサ（Rogosa）寒天培地。
【００９３】  これらの種々の計数の結果は、図２〜９に描かれる。大腸菌及び腸内細菌の集団は、特に胃腸管の最も高酸性部分である第１の部分で、減少したことが明らかである。
【００９４】  図８及び９は、微生物に対する驚くべき選択的作用を示す。大腸菌、腸内細菌のような有害かつ病原可能性のある種の集団は、実質的に減少した。乳酸菌のような望まれる種の集団は、影響を受けないままだった。
【００９５】  実施例は、本発明を例示するだけであって、限定するものでないことは明らかである。２０〜５０％のＣ8、２０〜５０％のＣ10及び１００％までのＣ6−Ｃ24からの任意の他のＭＣＦＡの混合物における、本発明の飼料補助物の重量％の可能な範囲が適切であろう。
【００９６】  これらの飼料補助物の幾つかは、引用された実施例に使用した標準的５０％／５０％  Ｃ8−Ｃ10組成物と同様に試験及び実施した。
【００９７】  特定の種に対する驚くべき選択的作用が、後者の範囲を使用しても存在した。
【００９８】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】図面は、概略図であり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。【図１】  図１は、ＯＤ600nmと大腸菌（E. coli）Ｋ８８細胞の間の直線関係を示す。
【図２】  図２は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での対照動物における大腸菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図３】  図３は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での処置動物における大腸菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図４】  図４は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での対照動物における腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図５】  図５は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での処置動物における腸内細菌科の菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図６】  図６は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での対照動物における総菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図７】  図７は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での処置動物における総菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図８】  図８は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での対照動物における乳酸菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図９】  図９は、ＭＣＦＡの投与後の時間（日）の関数として、胃腸管の異なる部分での処置動物における乳酸菌数（ｌｏｇ10ＣＦＵとして）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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