(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１６のヌクレオチド配列の精製または単離された核酸を含むベクター。
【請求項２】
配列番号：１６のヌクレオチド配列またはその相補的配列からなる精製または単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸または請求項１もしくは３に記載のベクターを含む単離された細胞。
【請求項５】
ＮＳ３特異的抗体免疫応答を誘導するための、変異ＮＳ３／４Ａ抗原をコードする核酸を有するプラスミドを含む免疫原性組成物であって、該変異ＮＳ３／Ａ４抗原は、ＮＳ３とＮＳ４Ａとの間のＮＳ３／４Ａプロテアーゼ切断部位内に、ＴＰＴおよびＲＧＴからなる群より選択されるトリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項６】
ＮＳ３特異的抗体免疫応答を強化するための、リバビリンおよびＮＳ３／４Ａをコードする核酸を含む免疫原性組成物であって、該リバビリンおよび核酸は、組み合わせてまたは別々に被験体に投与される、免疫原性組成物。
【請求項７】
前記被験体はＨＣＶに慢性的に罹患している、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ＮＳ３／４Ａをコードする核酸およびリバビリンを含む、ＨＣＶ感染に対するワクチンであって、該リバビリンは、該核酸と別々にまたは組み合わせて与えられる、ワクチン。
【請求項９】
慢性ＨＣＶ感染に対する、請求項８に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、家畜種、スポーツ種、またはペット種などの動物、および人間におけるワクチンの効果を高めるための組成物および方法に関する。さらに詳細には、好ましい実施形態は、アジュバントとしてのリバビリンの使用、ならびにリバビリンおよび抗原を有する組成物に関する。
【０００２】
［発明の背景］
人間、家畜、スポーツ動物、および家庭のペット類の疾病を予防するためのワクチンは、一般的に使用されている。しかしながら、ワクチンに使用される抗原は、十分な免疫原性を示さないことが多く、十分なレベルへ抗体力価を上昇させること、あるいは長期間にわたって十分なレベルに抗体力価を上昇させ続けることができず、その後に起こる攻撃に対して十分な保護ができなかった。さらに、多くのワクチンは、細菌感染およびウィルス感染に対する主要な免疫防御である細胞性免疫の誘発が全く不十分である。現在かなりの研究が、より強力なワクチンの開発、および抗原を含有する製剤の免疫原性を高める方法の開発に焦点が当てられている。（例えば、米国特許第６，０５６，９６１号、同第６，０６０，０６８号、同第６，０６３，３８０号、およびLiら, Science 288:2219-2222 (2000) が参照される）。
【０００３】
このような「弱い」ワクチンの中でよく知られているのは、Ｂ型肝炎ワクチンである。例えば、Ｇｅｎｈｅｖａｃｂ（Pasteur Merieux Serums et Vaccines, 58, Avenue Leclerc 69007 Lyon, France）、Ｅｎｇｅｒｉｘｂ（Smith, Kline and Symbol French）、およびＲｅｃｏｍｂｉｖａｘｈｂ（Merck, Sharp, and Dhome）などのＢ型肝炎ウィルスに対する組換えワクチンは、０日、３０日、および６０日または１８０日目に少なくとも３回注射をして、さらに一年後に義務的な追加免疫を実施して初めて有効である。（Chedidらの米国特許第６，０６３，３８０号）。さらに、これらのワクチンを受けた被験体の反応の多くは、仮にあったとしても不十分である。世界の多くの地域でＨＢＶ感染が風土病であるため、現存のＨＢＶワクチンの免疫原性特性が弱いということは、きわめて深刻な問題となっている。
【０００４】
より強い体液性応答および／または細胞性応答を得るために、ワクチン中に存在する抗原に対する患者の免疫応答を高める効果のある物質が含まれたワクチンを投与するのが一般的である。ワクチンプロトコルのために最も一般的に使用されるアジュバントはオイル製剤およびミョウバンである。（Chedidらの米国特許第６，０６３，３８０号）。より広範囲で安全かつ有効なアジュバントが必要とされる。
【０００５】
ヌクレオシド類似体はウィルス複製を低減させる能力があるため、抗ウィルス治療において広く使用されている。（Hosoyaら, J. Inf. Dis., 168:641-646 （1993））。リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）は、ＲＮＡおよびＤＮＡウィルスの複製を阻害するために使用されている合成グアノシン類似体である。（Huffmanら, Antimicrob. Agents. Chemother., 3:235 (1973) 、Sidwellら, Science, 177:705 (1972)）。リバビリンは、ＩＭＰをＩＭＸ（ＩＭＸは次にＧＭＰへ変換される）へ変換させるイノシトール一リン酸（ＩＭＰ）デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）の競合阻害剤であることが示されている。De Clercq, Anti viral Agents: characteristic activity spectrum depending on the molecular target with which they interact (抗ウィルス剤：相互作用する分子ターゲットに依存する特徴的な活性スペクトル), Academic press, Inc., New York N.Y., pp. 1-55 (1993)。ＧＴＰの細胞内プールは、長期間のリバビリン治療をすることにより枯渇する。
【０００６】
抗ウィルス活性に加えて、研究者達は幾つかのグアノシン類似体が免疫系に効果があることを見出した。（米国特許第６，０６３，７７２号および同第４，９５０，６４７号）。リバビリンは、機能的な体液性免疫応答（Peavyら, J. Immunol., 126:861-864 (1981)、Powersら, Antimicrob. Agents. Chemother., 22:108-114 (1982)）および肥満細胞分泌のＩｇＥによる調節（Marquardtら, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 240:145-149 (1987)）を阻害することが示されている。数人の研究者達は、リバビリンの経口治療を毎日施すことにより、ヒトおよびマウスに対して免疫調節効果があると報告している（Hultgrenら, J. Gen. Virol., 79:2381-2391 (1998)およびCrampら, Gastron. Enterol., 118:346-355 (2000)）。しかしながら、免疫系に対するリバビリンの効果についての理解は、現在始まったばかりである。
【０００７】
［発明の概要］
抗原に対する免疫応答を強化または促進するためのアジュバントとして、リバビリンを使用できることが見出された。本明細書に記載される本発明の実施形態は、抗原およびリバビリンを含む「強い」ワクチン製剤を含む。一般的に、これらの製剤は、抗原に対する免疫応答を強化または促進するのに十分な量のリバビリンを有する。本発明の他の態様には、ヒトを始めとする動物の抗原に対する免疫応答を強化または促進する方法が含まれる。１つのアプローチでは、例えば、抗原に対する強力な免疫応答を必要とする動物を特定し、ある量のリバビリンを抗原と共に与える。幾つかの方法では、リバビリンおよび抗原を組み合わせて（例えば、単一の組成物で）与えられ、他の方法ではリバビリンおよび抗原は別々に与えられる。また、幾つかの実施形態は、リバビリンおよび抗原を有する組成物の製造および使用に関する。
【０００８】
本発明の具体的な組成物は、リバビリン、および実質的にあらゆる抗原またはエピトープを含むが、好ましい組成物は、リバビリン、および肝炎ウィルス抗原またはエピトープを含む。抗原またはエピトープはペプチドまたは核酸ベースでよい（例えば、ペプチド抗原をコードするＲＮＡ、または被験体へ導入された場合にペプチド抗原を発現する構築物）。リバビリン、およびＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）からの抗原またはエピトープを含むペプチドもしくは上記ペプチドをコードする核酸を有する組成物は本発明の実施形態である。リバビリン、およびＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）からの抗原またはエピトープを含むペプチドもしくは上記ペプチドをコードする核酸を有する組成物は本発明の実施形態である。適切なＨＢＶ抗原としては、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、ｅ型肝炎抗原（ＨＢｅＡｇ）、およびこれらの分子をコードする核酸が挙げられる。またさらに、リバビリン、およびＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）からの抗原またはエピトープを含むペプチドもしくは上記ペプチドをコードする核酸を有する組成物は本発明の実施形態である。適切なＨＣＶ抗原としては、ＨＣＶ配列の１つまたは複数のドメイン（例えば、ＮＳ３および／またはＮＳ／４Ａ）および上記分子をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０００９】
新しいＨＣＶ配列も見出された。新規なＨＣＶゲノムであるＮＳ３／４Ａ断片は、ＨＣＶに感染した患者からクローニングされ、配列決定された（配列番号：１６）。この配列は、もっとも密接に関連するＨＣＶ配列との相同性がわずか９３％であることが分かった。この新規なペプチド（配列番号：１７）および長さが少なくともアミノ酸長３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分である該ペプチドの断片、これらの分子をコードする核酸、該核酸を有するベクター、ならびに該ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞も、本発明の実施形態である。特に好ましい実施形態は、リバビリン、および配列番号：１７のＨＣＶペプチドまたは少なくともアミノ酸長３、４、６、８、１０、１２、１５もしくは２０個分である該ペプチドの断片（例えば、配列番号：２５）、あるいは該ペプチドまたは断片をコードする核酸を含むワクチン組成物である。
【００１０】
さらに、タンパク質分解性の切断部位を持たないＮＳ３／４Ａペプチドの切断型突然変異体および突然変異体は、高い免疫原性を示すことが見出された。これらの新規なペプチド（配列番号：２９〜３２および４３〜４９）および少なくともアミノ酸長３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分であるその断片（例えば、配列番号：２６、２７、および３３〜４２）、これらの分子をコードする核酸、該核酸を有するベクター、ならびに該ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞もまた本発明の実施形態である。特に好ましい実施形態は、リバビリン、ならびに配列番号:２９〜３２および４３〜４９の少なくとも１つのＨＣＶペプチド、または少なくともアミノ酸長３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個もしくは２０個分である該ペプチドの断片（例えば、配列番号：２６、２７、および３３〜４２）、あるいは該ペプチドまたは断片をコードする核酸を含むワクチン組成物である。
【００１１】
さらに、上記の抗原の混合物を有する組成物は本発明の実施形態である。例えば、組成物は、「ＨＢＶ抗原、ＨＡＶ抗原およびリバビリン」、「ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原およびリバビリン」、「ＨＡＶ抗原、ＨＣＶ抗原およびリバビリン」、あるいは、「ＨＢＶ抗原、ＨＡＶ抗原、ＨＣＶ抗原およびリバビリン」を含んでいてもよい。他の実施形態は、リバビリン、および上記の抗原の混合物をコードする核酸を含む。幾つかの実施形態はまた、当業界で知られる他のアジュバント、結合剤、乳化剤、キャリア、および充填剤を含有し、たとえばミョウバン、オイルおよび免疫応答を高める他の化合物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１２】
また、本明細書に記載される組成物の製造方法および使用方法も本発明の態様である。リバビリン、およびペプチドまたは核酸抗原（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ抗原）を混合して、単一組成物（例えばワクチン組成物）を調合することによって、幾つかの方法が実行される。好ましい方法には、リバビリンを、ＨＣＶの１つまたは複数のドメイン（例えば、ＮＳ３および／ＮＳ４Ａ）に存在するエピトープを有するＨＣＶ抗原と混合することが含まれる。
【００１３】
本明細書に記載される組成物の好ましい使用方法は、十分な量のリバビリンおよび肝炎ウィルス抗原（例えば、ＨＢＶ抗原、ＨＡＶ抗原、ＨＣＶ抗原、これらの抗原の１つをコードする核酸、またはこれらの組み合わせ）を必要とする動物に提供することを含む。１つのアプローチでは、例えば、肝炎ウィルス抗原に対する強力な免疫応答を必要としている動物（例えば、肝炎感染の危険があるか、または既に感染している動物）を特定し、肝炎ウィルス抗原に対する免疫応答を強化または促進するのに有効な量のリバビリンおよび肝炎ウィルス抗原（単一の組成物で、あるいは別々に）を上記動物に与える。好ましくは、ＨＣＶに対する強力な免疫応答を必要としている動物を特定し、リバビリン、および配列番号：１、６、７もしくは１７に存在する抗原またはエピトープを含むペプチド、または上記ペプチドをコードする核酸とを含む組成物を上記動物に与える。特に好ましい方法には、ＨＣＶに対する強力な免疫応答を必要としている動物を特定し、リバビリン、および上記抗原への免疫応答を強化または促進するのに十分な量のＨＣＶ抗原（例えば、ＮＳ３／４Ａ（配列番号：１７）、突然変異体ＮＳ３／４Ａ（配列番号：２９〜３２および４３〜４９）、または少なくともアミノ酸長３個、４〜１０個、１０〜２０個、２０〜３０個、または３０〜５０個であるそれらの断片（例えば、配列番号：２５〜２７、および３３〜４２）、もしくはこれらの分子の１つまたは複数をコードする核酸）を含む組成物を上記動物に与えることが含まれる。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
リバビリンおよび抗原（例えば、ウィルス、細菌、カビ、酵母または寄生虫などの病原体のエピトープを含有する分子）を含む組成物は、抗原に対する動物の免疫応答を強化および／または促進することが見出された。すなわち本発明によって、リバビリンは、特定の抗原への免疫応答を強化または促進する能力を有する物質であり、有効な「アジュバント」であることが示された。リバビリンのアジュバント活性は、抗原に対する保護が免疫によって大幅に強化されること、抗原に対して産生される抗体力価が増大すること、および増殖性Ｔ細胞応答が増大することによって明らかにされた。
【００１５】
リバビリン、および抗原またはエピトープを含む幾つかの組成物（例えばワクチン）が本明細書中に記載される。リバビリンを含有するワクチン配合物は、例えば、リバビリンの量、リバビリンの種類、および抗原の型によって変化し得る。抗原はペプチドでも核酸（例えば、ペプチド抗原をコードするＲＮＡ、または被験体に導入された場合にペプチド抗原を発現する構築物）でもよい。好ましい組成物は、リバビリンおよび肝炎ウィルス抗原（例えば、ＨＡＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、これらの分子をコードする核酸、またはこれらの組み合わせ）を含む。特に好ましい組成物は、配列番号：１に存在する少なくとも１つのＨＣＶ抗原もしくはエピトープまたは該ＨＣＶ抗原をコードする核酸を、リバビリンと混合して製造する組成物である。すなわち、ある実施形態としては、リバビリン、および配列番号：１を含むペプチド、または少なくとも２５００個、２０００個、１６００個、１２００個、８００個、４００個、２００個、１００個、５０個、１０個もしくは３個の、配列番号：１の連続アミノ酸を有するその断片を含む組成物があるが、これらに限定はされない。更なる実施形態は、リバビリン、および配列番号：１３をコードする核酸、または少なくとも９個、１２個、１５個、２０個、３０個、５０個、７５個、１００個、２００個もしくは５００個の、配列番号：１３の連続ヌクレオチドを有する該核酸の断片を含む組成物に関する。
【００１６】
他の実施形態としては、リバビリン、および配列番号：１の特定の断片を含む組成物（例えばワクチン）があり、該断片はＨＣＶの特定のドメインに相当する。ある実施形態は、例えば、配列番号：１のアミノ酸１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、または１９７２〜３０１１に相当するＨＣＶの断片を含む。リバビリンおよびこれらの断片の１つまたは複数をコードする核酸を含む組成物も本発明の実施形態である。
【００１７】
さらに、新規なＨＣＶ配列が見出された。ＨＣＶのＮＳ３／４Ａドメインに相当する新規な核酸およびタンパク質は、ＨＣＶに感染した患者からクローニングされた（配列番号：１６）。Genebankの検索によって、クローニングされた配列はＨＣＶ配列に対して最大の相同性を有するが、最も密接なＨＣＶ類縁体（アクセッション番号ＡＪ２７８８３０）と９３％の相同性しかないことが明らかになった。この新規なペプチド（配列番号：１７）およびアミノ酸長が少なくとも３、４、６、８、１０、１２、１５または２０個分である該ペプチド断片、これらの分子をコードする核酸、該核酸を有するベクター、ならびに該ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞もまた、本発明の実施形態である。さらに、本明細書に記載されるワクチンの実施形態の幾つかは、リバビリン、およびこの新規なＮＳ３／４Ａペプチドまたはアミノ酸長が少なくとも３、４、６、８、１０、１２、１５または２０個分である該ペプチドの断片（例えば、配列番号：２５）、もしくは１つまたは複数のこれらの分子をコードする核酸を含む。
【００１８】
また、新規なＮＳ３／４Ａペプチドの突然変異体も創造された。タンパク質分解性の切断部位を持たない切断型突然変異体（例えば、配列番号：２９）および突然変異体は、高い免疫原性を示すことが見いだされた。これらの新規なペプチド（配列番号：２９〜３２および４３〜４９）およびアミノ酸長が少なくとも３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分である該ペプチドの断片（例えば、配列番号：２６、２７、および３３〜４２）、これらの分子をコードする核酸、該核酸を有するベクター、ならびに該ベクター、核酸またはペプチドを有する細胞もまた本発明の実施形態である。さらに、本明細書に記載される組成物の幾つかは、リバビリン、および少なくとも１つの上記の突然変異体ＨＣＶペプチドまたはアミノ酸長が少なくとも３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分である該ペプチドの断片を含む。ワクチンの他の実施形態は、リバビリン、および上記ペプチドの１つまたは複数をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。
【００１９】
上記組成物を製造および使用する方法も本発明の実施形態である。例えば、リバビリンを用意し、抗原（例えば、ＨＣＶ抗原を含むペプチドまたは上記ペプチドをコードする核酸）を用意し、該抗原に対する被験体の免疫応答を強化または促進するために使用できる組成物を配合するように該リバビリンおよび該抗原を混合することによって、上記の組成物を製造することができる。好ましい方法は、好ましい抗原またはエピトープ（例えば、配列番号：１、６、７または１７を含むペプチド、配列番号：１のアミノ酸１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、１９７２〜３０１１のようなそれらの特定の断片、およびこれらの分子をコードする核酸）をリバビリンと混合することを含む。その他の抗原またはエピトープをリバビリンと混合してもよく、これには、少なくとも２５００個、２０００個、１６００個、１２００個、８００個、４００個、２００個、１００個、５０個、１０個または３個の連続アミノ酸を有する配列番号：１の断片、およびこれらの断片をコードする核酸が含まれるが、これらに限定はされない。特に好ましい方法は、新たに発見されたＮＳ３／４Ａの断片またはＮＳ３／４Ａの突然変異体（例えば、タンパク分解性の切断部位を持たない切断型突然変異体または突然変異体）、または少なくとも４個分のアミノ酸長を有するそれらの断片、もしくは１つまたは複数のこれらの分子をコードする核酸を含むワクチン組成物の製造に関する。
【００２０】
ヒトを含む動物の抗原に対する免疫応答を強化または促進する方法は本発明の実施形態である。このような方法は、例えば、抗原／エピトープに対する強い免疫応答を必要としている動物を特定し、抗原／エピトープ、および抗原／エピトープに対する免疫応答を強化または促進するのに有効な量のリバビリンを含む組成物を上記動物に供給することによって実行できる。ある実施形態では、リバビリンおよび抗原は、単一の混合物ではなく、別々に投与されうる。この場合に、リバビリンは、抗原投与の少し前か、少し後に投与されるのが好ましい。好ましい方法には、リバビリンおよび肝炎抗原（例えば、ＨＡＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、これらの分子をコードする核酸、またはこれらの任意の組み合わせ）を、免疫応答を強化または促進する必要性のある動物に供給することが含まれる。これらの方法の幾つかは、配列番号：１を含むペプチドや、少なくとも２５００個、２０００個、１６００個、１２００個、８００個、４００個、２００個、１００個、５０個、１０個または３個の、配列番号：１の連続アミノ酸を有する該ペプチドの断片のようなＨＣＶ抗原を含む。更なる方法は、リバビリン、および配列番号：１３をコードする核酸または上記で論考された断片の１つまたは複数をコードする核酸を含む組成物を含む。
【００２１】
幾つかの好ましい方法は、例えば、リバビリン、および配列番号：１を含むペプチド、または配列番号：１のアミノ酸１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、１９７２〜３０１１を含むペプチドである（これらに限定はされない）ＨＣＶドメインに相当するその特定の断片を含む組成物（例えば、ワクチン）の使用に関する。特に好ましい方法は、配列番号：１７のＮＳ３／４Ａの断片またはタンパク質分解性の切断部位を持たない突然変異体ＮＳ３／４Ａ（例えば、配列番号：２９〜３２および４３〜４９）、もしくは少なくとも３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分のアミノ酸長を有するそれらの断片（例えば、配列番号：２６、２７および３３〜４２）を含むワクチン組成物の使用に関する。リバビリンおよびこれらの断片をコードする核酸を含む組成物も、本明細書に記載される方法で使用することができる。
【００２２】
他の実施形態は、ＨＣＶ感染を治療および予防する方法に関する。１つのアプローチでは、ＨＣＶ感染の治療および／または予防のための薬剤を調製するために、リバビリンおよびＨＣＶ抗原またはエピトープが使用される。別のアプローチでは、ＨＣＶ感染を予防および／または治療する薬剤を必要としている個体を特定し、リバビリン、およびＨＣＶ抗原またはエピトープ、好ましくは配列番号：１に存在するエピトープ、さらに好ましくは少なくとも２５００個、２０００個、１６００個、１２００個、８００個、４００個、２００個、１００個、５０個、１０個または３個の連続アミノ酸を有する配列番号：１の断片、最も好ましくは１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、または１９７２〜３０１１のような配列番号：１の断片、あるいは配列番号：１または上述の上記断片をコードする核酸を含む薬剤を上記個体に与える。特に好ましい方法は、リバビリン、および配列番号：１７のＮＳ３／４Ａ断片またはタンパク質分解性の切断部位を持たない突然変異体ＮＳ３／４Ａ（例えば、配列番号：２９〜３２および４３〜４９）、もしくは少なくとも３個、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分のアミノ酸長を有するそれらの断片（例えば、配列番号：２５−２〜および３３〜４２）、あるいは１つまたは複数のこれらの分子をコードする核酸を含むワクチン組成物の使用に関する。以下において、アジュバントとしてのリバビリンの使用についてさらに詳細に論考する。
【００２３】
リバビリン
本明細書に記載される組成物は、例えばヒトを含む哺乳類などの動物へ投与するための薬剤を調製するための方法であって、従来のガレノス式薬剤調合学（galenic pharmacy）の方法に従って製造することができる。リバビリンは、商業的な供給メーカー（例えば、SigmaおよびICN）から得ることができる。リバビリンおよび／または抗原は、修飾されて、および修飾されずにワクチンへ配合できる。例えば、リバビリンおよび／または抗原を修飾または誘導体化することにより、より安定した分子および／またはより強力なアジュバントを調製することができる。１つのアプローチでは、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）のような担体へ分子をカップリングさせることによって、リバビリンおよび／または抗原の安定性を向上させることができる。
【００２４】
合理的な薬剤設計およびコンビナトリアルケミストリにおける従来の技法を用いて、さらに多くのリバビリン誘導体を生成することができる。例えば、Molecular Simulations Inc.（MSI）は、多くの他の供給業者と同様に、当業者が有機分子のコンビナトリアルライブラリを構築できるようにするソフトウェアを提供する。Ｃ２．Ａｎａｌｏｇ  Ｂｕｉｌｄｅｒプログラムを、例えば、ＭＳＩのＣｅｒｉｕｓ２分子多様性ソフトウェア一式と統合して、本明細書で説明される実施形態とともに使用できるリバビリン誘導体のライブラリを開発できる。（例えば、http://msi.com/life/products/cerius2/index.htmlを参照）。
【００２５】
１つのアプローチでは、リバビリンの化学構造がコンピュータの読取可能媒体に記録され、１つまたは複数のモデリングソフトウェアアプリケーションプログラムによってアクセスされる。Ｃ２．Ａｎａｌｏｇ  ＢｕｉｌｄｅｒプログラムとＣ２Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙプログラムの併用によって、ユーザーは、例えば各置換基位置についてＲ基の多様性に基づいて非常に広範囲の仮想ライブラリを生成できる。仮想ライブラリで創造されたモデル化リバビリン誘導体と同一の構造を有する化合物を、従来の化学を用いて製造するか、あるいは商業的な供給源から得ることができる。
【００２６】
新しく調製されたリバビリン誘導体は次に、分子のアジュバント活性の程度および／またはその免疫応答調節能力の程度を決定するアッセイでスクリーニングされる。幾つかのアッセイは、Ｃ２．Ｌｕｄｉのような仮想医薬品スクリーニングソフトウェアを必要とする場合がある。Ｃ２．Ｌｕｄｉは、対象のタンパク質（例えば、ＲＡＣ２または別のＧＴＰ結合タンパク質）の活性部位と相互作用する能力について、ユーザーが分子（例えばリバビリン誘導体）のデータベースを探索できるようにするソフトウェアプログラムである。仮想医薬品スクリーニングソフトウェアで見出された予測相互作用に基づいて、リバビリン誘導体は、アジュバント活性および／または分子の免疫応答を調節する程度を決定する従来のアッセイで、更に特徴づけをするために優先順位がつけられる。実施例１は、リバビリンのアジュバント活性を評価するために使用された幾つかのアッセイを説明する。
【００２７】
実施例１
以下のアッセイは、リバビリン誘導体またはリバビリン誘導体の組み合わせとともに用いることができ、特定の組成物のアジュバント活性の程度を決定することができる。第１の実験セットでは、０週目および４週目に、１０μｇまたは１００μｇの組換え型Ｃ型肝炎ウィルスの非構造的３(ｒＮＳ３)タンパク質を、３〜５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（BK Universal, Uppsala, Sweden）のグループに腹腔内注射（i.p）または皮下注射（s.c.）（例えば、尾の付け根に）することにより、免疫化した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）単独、または１ｍｇのリバビリン（ICN, Costa Mesa, CAから入手）を含有するＰＢＳ中に、ｒＮＳ３を溶解した。１回の注射で全体積１００μｌをマウスに注入した。
【００２８】
１回目の腹腔内免疫化の後、２週、４週、および６週目に、後眼窩（retro-orbital）サンプリングによって、全てのマウスから採血した。血清サンプルを収集し、ｒＮＳ３の抗体の存在について分析した。抗体力価を決定するために、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を実施した。（例えば、Hultgrenら, J Gen Virol. 79:2381-91 (1998)およびHultgrenら, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632 (1997)を参照）。抗体レベルは、最高の血清希釈率として、４０５ｎｍにおける吸光度が、免疫化されていないマウスと比べて２倍よりも高い記録を与えた。
【００２９】
ＰＢＳ中で１ｍｇのリバビリンと混合された１０μｇまたは１００μｇのｒＮＳ３で処理されたマウスは、常に、高いレベルのＮＳ３抗体を示した。免疫化後２週目にＥＩＡにより検出された抗体力価を図１に示す。１ｍｇのリバビリン、および１０μｇのｒＮＳ３または１００μｇのｒＮＳ３のいずれかを有するワクチン配合物は、ｒＮＳ３のみで構成されたワクチン配合物よりも遥かに高い抗体力価をもたらした。
【００３０】
第２の実験セットでは、０ｍｇ、１ｍｇ、３ｍｇ、または１０ｍｇのいずれかのリバビリン（Sigma）を含有する１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水中の１０μｇまたは５０μｇのｒＮＳ３を用いて、８匹のＢａｌｂ／ｃマウスのグループを腹腔内で、０週目および４週目に免疫化した。４週目、６週目および８週目に、マウスから採血し、血清を分離および凍結した。その後、上記のように、組換え型ＮＳ３に対する抗体のレベルについて血清を試験した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（パラメトリック分析）またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（ノンパラメトリック分析）およびソフトウェアパッケージＳｔａｔＶｉｅｗ４．５（Abacus Concepts, Berkely, CA）を用いて、ｒＮＳ３に対する平均抗体レベルをグループ間で比較した。１０μｇのｒＮＳ３へ３つの用量（１ｍｇ、３ｍｇ、または１０ｍｇ）で添加された場合のリバビリンのアジュバント効果を表１に示す。５０μｇのｒＮＳ３へ３つの用量（１ｍｇ、３ｍｇ、または１０ｍｇ）で添加された場合のリバビリンのアジュバント効果を表２に示す。２種類の用量の１０μｇまたは５０μｇのｒＮＳ３と、種々の用量のリバビリンとで処理されたマウスの平均ｒＮＳ３抗体力価のパラメトリック比較は、それぞれ表３および表４に示される。２種類の用量である１０μｇまたは５０μｇのｒＮＳ３、および種々の用量のリバビリンとで処理されたマウスの平均ＮＳ３抗体力価のノンパラメトリック比較は、それぞれ表５および表６に示される。示された値は、組換え型ｒＮＳ３に対する終点力価を表す。
【００３１】
【表１】
0005175417.tif 000002
【００３２】
【表２】
0005175417.tif 000003
【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
上記のデータは、リバビリンがＨＣＶ抗原またはＨＣＶエピトープに対する免疫応答を促進または強化することを証明している。ｒＮＳ３に対する強い免疫応答は、わずか１ｍｇのリバビリンおよび１０μｇのｒＮＳ３抗原を含むワクチン組成物で免疫化した場合であっても誘発された。また上記データによって、２５〜３０ｇのＢａｌｂ／ｃマウスでは、抗原への免疫応答を促進するのに十分なリバビリン量は、１回の注射につき１ｍｇ〜３ｍｇであるという証拠が示されている。しかしながら、これらの量は単なる指針を提供するものと理解されるべきであり、決して、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。いずれにしても、上記データは、約１ｍｇ〜３ｍｇの用量のリバビリンを含むワクチン組成物が、リバビリンが存在しない場合に誘発される免疫応答の１２倍よりも強い免疫応答を引き起こすことを示している（表３および表４）。したがって、リバビリンは動物の体液性免疫応答に顕著なアジュバント効果を及ぼし、これにより、抗原に対する免疫応答を強化または促進する。以下の実施例は抗原への免疫応答を強化または促進するのに必要とされるリバビリンの量をより良く理解するために実行された実験について説明する。
【００３８】
実施例２
アジュバント効果を発揮するのに十分なリバビリンの用量を決定するために、以下の実験を実施した。第１の実験セットでは、２０μｇのｒＮＳ３単独、ならびに２０μｇのｒＮＳ３および０．１ｍｇ、１ｍｇ、または１０ｍｇのリバビリンのそれぞれの混合物を用いて、マウスのグループ（１グループあたり３匹）を免疫化した。次にＥＩＡにより抗原に対する抗体のレベルを決定した。１週目および３週目の平均終点力価をプロットし、図２に示した。リバビリンが提供するアジュバント効果は、与えられたリバビリンの用量に応じて、異なる動力学を有することが発見された。例えば、低容量（＜１ｍｇ）のリバビリンでも１週間後には抗体レベルを高めるが、３週間後には高めないことがわかった。一方、より高い容量（１〜１０ｍｇ）では、３週間後であっても抗体レベルを高めることがわかった。
【００３９】
また、第２の実験セットを実施した。これらの実験では、種々の量のリバビリンおよびｒＮＳ３を含むワクチン組成物をマウスグループに注射し、これらの動物のＩｇＧ応答を観察した。ワクチン組成物は、約１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水および２０μｇのｒＮＳ３を含み、それにリバビリン（Sigma）を含有しないか、あるいは０．１ｍｇ、１．０ｍｇ、または１０ｍｇのリバビリンを含有した。６週間後にマウスから採血し、前記したＥＩＡによってｒＮＳ３特異的ＩｇＧレベルを決定した。表７に示されるように、抗体レベルを持続的に高めるアジュバント効果は、２５〜３０ｇのマウスでは、１回の注射あたり１〜１０ｍｇの用量において最も顕著であった。
【００４０】
【表７】
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【００４１】
第３の実験セットでは、一次免疫注射および追加免疫注射の後のリバビリンのアジュバント効果を調査した。これらの実験では、１０μｇのｒＮＳ３を含有し、さらにリバビリンを含有するかまたは含有しないワクチン組成物の腹腔内注射をマウスに２回行い、前述のように、抗原に対するＩｇＧサブクラス応答を観察した。したがって、０週目および４週目に、１０μｇの組換え型ＮＳ３を含み、さらに０ｍｇ、０．１ｍｇまたは１．０ｍｇのリバビリン（Sigma）を含む１００μｌのリン酸緩衝液を用いて、マウスを免疫化した。６週間後にマウスから採血し、既に記載したようにＥＩＡによってＮＳ３に特異的なＩｇＧサブクラスを決定した。表８に示されるように、注射をする前の抗原にリバビリンを添加しても、ＮＳ３特異的免疫応答のＩｇＧサブクラス応答は変化しない。したがって、リバビリンおよび抗原を含むワクチン組成物のアジュバント効果は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスのシフトでは説明できない。別のメカニズムがリバビリンのアジュバント効果の原因であると考えられる。
【００４２】
【表８】
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【００４３】
この実施例に示されるデータは、さらに、リバビリンがアジュバントとして投与できることを立証し、リバビリンの用量がアジュバント効果の動力学を調節できることを証明する。以下の実施例は、抗原に対する免疫応答を強化または促進するリバビリンの能力を評価するために実施された別のアッセイについて説明する。
【００４４】
実施例３
このアッセイは、特定のワクチン配合物が細胞性免疫応答を調節する能力を決定するために、任意のリバビリン誘導体またはリバビリン誘導体の組み合わせと共に使用する。リバビリン含有ワクチンに対するＣＤ４+Ｔ細胞応答を決定するために、１００μｇのｒＮＳ３を含むＰＢＳか、１００μｇのｒＮＳ３および１ｍｇのリバビリンを含むＰＢＳのいずれかを用いて、マウスのグループを皮下注射して免疫化した。免疫化の１０日後にマウスを屠殺し、そのリンパ節を回収およびドレインした。次にｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生アッセイ（recall assay）を実施した。（例えば、Hultgrenら, J Gen Virol. 79:2381-91 (1998)およびHultgrenら, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4:630-632 (1997) を参照）。［3Ｈ］チミジンの取り込みにより培養の９６時間後の、ＣＤ４+Ｔ細胞増殖量を決定した。
【００４５】
図３に示されるように、１ｍｇのリバビリンと混合した１００μｇのｒＮＳ３を含むＰＢＳで免疫化したマウスは、１００μｇのｒＮＳ３のみを含むＰＢＳで免疫化したマウスよりも遥かに高いＴ細胞増殖応答を有した。これらのデータは、リバビリンが細胞性免疫応答を強化または促進する（例えば、Ｔ細胞の有効なプライミングを促進することによって）という更なる証拠である。以下において、本明細書に記載される実施形態で使用することができる抗原およびエピトープの幾つかについて論考する。
【００４６】
抗原およびエピトープ
動物の免疫応答を発生させることができる抗原は実質的に任意であり、リバビリンと組み合わせて本明細書に記載される組成物を調製することができる。すなわち、このような組成物（例えば、ワクチン）に適用することができる抗原には、細菌由来の抗原またはエピトープ、真菌由来の抗原またはエピトープ、植物由来の抗原またはエピトープ、かび由来の抗原またはエピトープ、ウィルス由来の抗原またはエピトープ、がん細胞由来の抗原またはエピトープ、毒素由来の抗原またはエピトープ、化学物質由来の抗原またはエピトープ、および自己抗原またはそのエピトープが含まれる。これらの分子の多くはアジュバント無しでも顕著な免疫応答を引き起こすが、上記抗原またはエピトープに対する免疫応答を強化または促進するために、「強い」または「弱い」抗原またはエピトープと一緒に、あるいは結合させて、リバビリンを投与することができる。さらに、アジュバントとしてのリバビリンを使用することにより、免疫原性を保持しながら、抗原の使用をより少ない量にすることができる。
【００４７】
ペプチド抗原に加えて、本明細書に記載されるワクチン組成物では核酸ベースの抗原も使用できる。種々の核酸ベースのワクチンが知られており、これらの組成物および免疫療法へのアプローチは、リバビリンによる改質で強化できると考えられる（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号および同第６，２３５，８８８号を参照）。１つのアプローチでは、例えば、当該ポリペプチド抗原をコードする遺伝子は、被験体に導入された場合にポリペプチドを発現することができる発現ベクターにクローニングされる。発現構築物はリバビリンとの混合物として、またはリバビリンと一緒に被験体へ導入される（例えば、リバビリンは同じ部位で発現構築物の少し後に投与される）。あるいは、当該ポリペプチド抗原をコードするＲＮＡは、リバビリンとの混合物として、またはリバビリンと一緒に被験体へ供給される。
【００４８】
抗原がＤＮＡである場合（例えば、ＤＮＡワクチン組成物の調製）、適切なプロモータには、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳がんウィルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶ長末端反復（ＬＴＲ）プロモータなどのヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、モロニーウィルス、ＡＬＶ、ＣＭＶ最初期プロモータなどのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）が含まれ、同様に、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモータも使用できる。特にヒト用遺伝子ワクチンの産生において、幾つかの実施形態で有用なポリアデニル化信号の例としては、ＳＶ４０ポリアデニル化信号およびＬＴＲポリアデニル化信号などが挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ｐＣＥＰ４プラスミド（Invitrogen, San Diego Calif.）においてＳＶ４０ポリアデニル化信号と言われるＳＶ４０ポリアデニル化信号が使用される。
【００４９】
遺伝子発現に必要とされる制御要素に加えて、遺伝子構築物中に他の要素を含んでいてもよい。このような付加的要素としては、エンハンサがある。エンハンサは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ならびにＣＭＶ、ＲＳＶ、およびＥＢＶなどのウィルスエンハンサを含むがこれらに限定されない群から選択できる。遺伝子構築物は、構築物を染色体外に維持し、細胞内で構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類の複製起点を有していてもよい。Invitrogen（San Diego, CA）から入手したプラスミドｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、エプスタインバーウィルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、染色体に組み込まれずに高いコピーのエピソーム複製を産生する。複製であろうと非複製であろうと、ゲノムに取り込まれず、発現可能であるすべての形態のＤＮＡを使用できる。以下の実施例は、核酸ベースの抗原およびリバビリンを含む組成物の使用について説明する。
【００５０】
実施例４
以下は、核酸ベースの抗原およびリバビリンを含むワクチンによる動物の免疫化について説明する。０．３ｍｌの２．５％Ａｖｅｒｔｉｎによる腹腔内注射で、５〜６週齢の雌および雄のＢａｌｂ／Ｃマウスに麻酔をかける。前大腿部に１．５ｃｍの切開をして、大腿四頭筋が直接見えるようにする。１つのグループのマウスには、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモータで駆動されるｇｐ−１２０遺伝子を有する約２０：ｇの発現構築物が注射され、第２グループのマウスには、ｇｐ−１２０をコードする約５：ｇのキャップされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（例えば、ＳＰ６、Ｔ７またはＴ３（Ａｍｂｉｏｎ））が注射される。これらの２つのグループはコントロールである。第３グループのマウスには、１ｍｇのリバビリンと混合されたｇｐ−１２０遺伝子およびＣＭＶプロモータを有する約２０：ｇの発現ベクターが注射され、第４グループのマウスには、１ｍｇのリバビリンと混合された約５：ｇのキャップされたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡが注射される。ワクチンは、膝の中へ筋肉の末端挿入部位から約０．５ｃｍ、約０．２ｃｍの深さで、１ｃｃ注射器中の０．１ｍｌの溶液（ＰＢＳ）を、２７ゲージの注射針を通して１分間かけて注射される。後に注射部位がわかるように縫合線を注射部位上に位置付け、次に皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【００５１】
注射前（０日）および注射後４１日が過ぎるまで、血液サンプルを採取する。各サンプルからの血清を連続的に希釈し、抗原として酵母中で作られた組換え型ｇｐ−１２０タンパク質を用いて、抗体検出のための標準ＥＬＩＳＡ技法アッセイでアッセイする。ｇｐ−１２０に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方がすべてのサンプルで検出されるであろう。しかしながら、リバビリンを含有した第３および第４グループは、血清中で検出される抗体量および／または抗体力価で測定されるように、ｇｐ−１２０に対してより高い免疫応答を示すであろう。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態は、リバビリン、およびウィルス、好ましくは肝炎ウィルスに存在するウィルス抗原またはエピトープを含む。組成物は、例えば、リバビリン、およびＨＡＶ抗原、ＨＢＶ抗原、ＨＣＶ抗原、もしくはこれらの抗原の組み合わせ、または１つもしくは複数のこれらのウィルスに存在するエピトープを含む。肝炎抗原はペプチドでも核酸でもよい。ＨＡＶ感染に対するワクチン接種に使用できる組成物は、例えば、リバビリン、および配列番号：１２の少なくとも３〜１０個の連続アミノ酸、１０〜５０個の連続アミノ酸、５０〜１００個の連続アミノ酸、１００〜２００個の連続アミノ酸、２００〜４００個の連続アミノ酸、４００〜８００個の連続アミノ酸、８００〜１２００個の連続アミノ酸、１２００〜１６００個の連続アミノ酸、１６００〜２０００個の連続アミノ酸、および２０００〜２２２７個の連続アミノ酸長を有するＨＡＶペプチドを含む。
【００５３】
さらに、リバビリン、および１つまたは複数のＨＡＶペプチドをコードする核酸を含む上記の組成物は、ＨＡＶ感染を治療または予防するために使用できる。好ましい核酸ベースの抗原としては、ＨＡＶ配列（例えば、配列番号：１５）の少なくとも９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列が挙げられる。すなわち、核酸ベースの抗原は、配列番号：１５の少なくとも９〜２５個の連続ヌクレオチド、２５〜５０個の連続ヌクレオチド、５０〜１００個の連続ヌクレオチド、１００〜２００個の連続ヌクレオチド、２００〜５００個の連続ヌクレオチド、５００〜１０００個の連続ヌクレオチド、１０００〜２０００個の連続ヌクレオチド、２０００〜４０００個の連続ヌクレオチド、４０００〜８０００個の連続ヌクレオチド、および８０００〜９４１６個の連続ヌクレオチド、あるいはこれらの配列に相当するＲＮＡを含むことができる。
【００５４】
同様に、好ましいＨＢＶワクチンの実施形態は、リバビリン、およびＨＢｓＡｇ（配列番号：１０）またはＨＢｃＡｇおよびＨＢeＡｇ（配列番号：１１）の少なくとも３個の連続アミノ酸のＨＢＶペプチドを含む。すなわち、ある実施形態は、リバビリン、および配列番号：１０または配列番号：１１のいずれかの少なくとも３〜１０個の連続アミノ酸、１０〜５０個の連続アミノ酸、５０〜１００個の連続アミノ酸、１００〜１５０個の連続アミノ酸、１５０〜２００個の連続アミノ酸、および２００〜２２６個の連続アミノ酸長を有するＨＢＶペプチドを有する。
【００５５】
さらに、リバビリン、および１つまたは複数のＨＢＶペプチドをコードする核酸を含む上記の組成物は、ＨＢＶ感染を治療または予防するために使用できる。好ましい核酸ベースの抗原としては、ＨＢＶ（配列番号：１４）の少なくとも９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列が挙げられる。すなわち、核酸ベースの抗原は、配列番号：１４の少なくとも９〜２５個の連続ヌクレオチド、２５〜５０個の連続ヌクレオチド、５０〜１００個の連続ヌクレオチド、１００〜２００個の連続ヌクレオチド、２００〜５００個の連続ヌクレオチド、５００〜１０００個の連続ヌクレオチド、１０００〜２０００個の連続ヌクレオチド、２０００〜４０００個の連続ヌクレオチド、４０００〜８０００個の連続ヌクレオチド、および８０００〜９４１６個の連続ヌクレオチド、あるいはこれらの配列に相当するＲＮＡを含むことができる。以下の実施例は、市販のＨＢＶワクチン製剤と併せたリバビリンの使用について説明する。
【００５６】
実施例５
２つの異なる用量のＨＢｓＡｇおよびミョウバンを含有する市販のワクチン（Engerix, SKB）と混合された場合のリバビリンのアジュバント効果を試験した。約０．２μｇまたは２μｇのＥｎｇｅｒｉｘワクチンを、ＰＢＳのみ、または１ｍｇのリバビリンを含むＰＢＳのいずれかと混合し、混合物をマウスグループ（１グループあたり３匹）へ腹腔内注射した。同一の混合物を用いて追加免疫を４週間後に施し、すべてのマウスから６週間後に採血した。血清サンプルを１：６０から１：３７５００へ希釈し、固相抗原として精製ヒトＨＢｓＡｇを使用した以外は上記で説明した通りに、ＥＩＡによって希釈液を試験した。表９に示されるように、リバビリンを有するワクチン配合物は、ワクチンが既にミョウバンを含有しているにもかかわらず、２μｇの既存のワクチンに対する応答を高めた。すなわち、下限以下のワクチン用量（すなわち、単独では検出可能な抗体を誘導できない用量）であっても、リバビリンを添加することによって抗体が検出可能になり、リバビリンを添加することは、免疫応答を低下させることなく、ワクチン配合物中で使用される抗原量をより低くすることができるという証拠が示された。
【００５７】
【表９】
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【００５８】
あるＨＣＶワクチン組成物は、リバビリン、および配列番号：１の少なくとも３個の連続アミノ酸のＨＣＶペプチドまたは該ＨＣＶペプチドをコードする核酸を含む。すなわち、ワクチン組成物は、リバビリン、および配列番号：１の少なくとも３〜１０個の連続アミノ酸、１０〜５０個の連続アミノ酸、５０〜１００個の連続アミノ酸、１００〜２００個の連続アミノ酸、２００〜４００個の連続アミノ酸、４００〜８００個の連続アミノ酸、８００〜１２００個の連続アミノ酸、１２００〜１６００個の連続アミノ酸、１６００〜２０００個の連続アミノ酸、２０００〜２５００個の連続アミノ酸、および２５００〜３０１１個の連続アミノ酸長を有する１つまたは複数のＨＣＶペプチド、もしくは１つまたは複数の上記断片をコードする核酸を含むことができる。
【００５９】
好ましいＨＣＶ組成物は、リバビリン、およびＨＣＶコアタンパク質（配列番号：２）、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質（配列番号：３）、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質（配列番号：４）、ＨＣＶ  ＮＳ２（配列番号：５）、ＨＣＶ  ＮＳ３（配列番号：６）ＨＣＶ  ＮＳ４Ａ（配列番号：７）ＨＣＶ  ＮＳ４Ｂ（配列番号：８）またはＨＣＶ  ＮＳ５Ａ／Ｂ（配列番号：９）の少なくとも３個の連続アミノ酸のペプチド、もしくはこれらのドメインの組み合わせからなるペプチドを含む。すなわち、好ましいＨＣＶワクチンは、リバビリン、および任意の１つまたは複数の（配列番号：２〜９）の少なくとも３〜１０個の連続アミノ酸、１０〜５０個の連続アミノ酸、５０〜１００個の連続アミノ酸、１００〜２００個の連続アミノ酸、２００〜４００個の連続アミノ酸、４００〜８００個の連続アミノ酸、および８００〜１０４０個の連続アミノ酸長を有するペプチドを含む。これらのドメインは、配列番号：１のアミノ酸残基１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、または１９７２〜３０１１に相当する。したがって、好ましい実施形態は、配列番号：１の１〜１８２、１８３〜３７９、３８０〜７２９、７３０〜１０４４、１０４５〜１６５７、１６５８〜１７１１、１７１２〜１９７１、または１９７２〜３０１１のうちの１つまたは複数、またはその断片も含む。
【００６０】
リバビリン、および１つまたは複数の上記ペプチドをコードする核酸を含むワクチン組成物も本発明の実施形態である。好ましい核酸ベースの抗原には、ＨＣＶ（配列番号：１３）の少なくとも９個の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列が含まれる。すなわち、核酸ベースの抗原は、配列番号：１３の任意の一つの少なくとも９〜２５個の連続ヌクレオチド、２５〜５０個の連続ヌクレオチド、５０〜１００個の連続ヌクレオチド、１００〜２００個の連続ヌクレオチド、２００〜５００個の連続ヌクレオチド、５００〜１０００個の連続ヌクレオチド、１０００〜２０００個の連続ヌクレオチド、２０００〜４０００個の連続ヌクレオチド、４０００〜８０００個の連続ヌクレオチド、および８０００〜９４１６個の連続ヌクレオチド、あるいはこれらの配列に相当するＲＮＡを含むことができる。以下において、リバビリンおよび抗原を含有する組成物の幾つかについて論考する。
【００６１】
リバビリンおよび抗原を含有する組成物
リバビリン、および病原体（例えば、ウィルス、細菌、かび、酵母、および寄生虫）の抗原またはエピトープを含む組成物（例えば、ワクチン）は他の成分も含有することができ、他の成分には、アジュバント、結合剤、安定剤（長期間の貯蔵を促進するため）などの賦形剤、乳化剤、増粘剤、塩、防腐剤、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗かび剤、ならびに等張および吸収遅延剤などがあるが、これらに限定はされない。疾病または疾患を回避するための予防手段として、あるいは既に疾病または疾患にかかっている動物を治療するための治療法として、これらの組成物は動物の治療に適する。
【００６２】
ワクチン中には他の多くの成分が存在することが可能である。例えば、リバビリンおよび抗原は、従来の賦形剤（例えば、リバビリンおよび／または抗原と有害な反応を起こさず、腸管外、経腸（例えば、経口）または局所適用に適切である、薬学的に許容可能な有機または無機キャリア物質）との混合物として使用できる。適切で薬学的に許容可能なキャリアとしては、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。多くのより適切なキャリアは、Remmington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, Easton:Mack Publishing Company, pages 1405-1412および1461-1487 (1975)、ならびにThe National Formulary XIV, 14th Edition, Washington, American Pharmaceutical Association (1975) に記載される。
【００６３】
本明細書に記載される遺伝子構築物は、細胞による遺伝子構築物の取り込みを増加させ、および／または細胞による遺伝子構築物の発現を増加させるのを促進する作用物質と共に配合または投与することができ、該作用物質の非存在下で遺伝子ワクチンを投与した場合と比較して、細胞による遺伝子構築物の取り込み、および／または細胞による遺伝子構築物の発現を増大しうる。このような作用物質およびそれらを遺伝子構築物と共に投与するためのプロトコルは、米国特許出願第０８／００８，３４２号（１９９３年１月２６日出願）、同第０８／０２９，３３６号（１９９３年３月１１日出願）、同第０８／１２５，０１２号（１９９３年９月２１日出願）、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）、および米国特許出願第０８／２２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されている。このような作用物質の例としては、ＣａＰＯ4、ＤＥＡＥデキストラン、アニオン性脂質、細胞外マトリックス活性酵素、サポニン、レクチン、エストロゲン化合物およびステロイドホルモン、ヒドロキシル化低級アルキル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、尿素、ならびに安息香酸エステルアニリド、アミジン、ウレタン、および局所麻酔薬類のようなその塩酸塩が挙げられる。さらに、遺伝子構築物は、脂質／ポリカチオン複合体内にカプセル化されるか、脂質／ポリカチオン複合体と一緒に投与される。
【００６４】
ワクチンは滅菌され、所望の場合、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色、風味および／または芳香物質などの、リバビリンまたは抗原と有害な反応を起こさない助剤と混合することが可能である。
【００６５】
特定のワクチン配合物の有効な用量および投与方法は、個々の患者ならびに疾病のタイプおよび段階、ならびに当業者に知られている他の因子に基づいて変えることができる。ワクチンの治療の有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ50（集団の５０％に治療上有効な用量）によって決定できる。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを用いて、ヒトに使用するための各種の調剤を配合することができる。ワクチンの投薬量は、好ましくは、毒性がない範囲内であってＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、リバビリン誘導体および抗原のタイプ、使用される投薬形態、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【００６６】
リバビリンは数年間市場に出ているため、多くの投薬形態および投与経路が知られている。本明細書に記載される実施形態は、既知のすべての投薬形態および投与経路に利用できる。好ましくは、動物における抗原への免疫応答を高めるのに有効なリバビリンの量は、動物中の抗原の血清レベルを約０．２５〜１２．５μｇ／ｍｌ、好ましくは約２．８μｇ／ｍｌに達成するのに十分な量であると考えられる。幾つかの実施形態では、リバビリンの量は、ワクチンが投与される動物の体重によって決定される。つまり、ワクチン配合物中のリバビリンの量は、体重１ｋｇあたり約０．１〜６．０ｍｇでありうる。すなわち、幾つかの実施形態は、動物の体重１ｋｇあたり、約０．１〜１．０ｍｇ、１．１〜２．０ｍｇ、２．１〜３．０ｍｇ、３．１〜４．０ｍｇ、４．１〜５．０ｍｇ、および５．１〜６．０ｍｇに相当するリバビリン量を有する。従来のワクチンは約０．２５ｍｇ〜２０００ｍｇのリバビリンを含有する。すなわち、幾つかの実施形態は、約２５０μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、１．１ｇ、１．２ｇ、１．３ｇ、１．４ｇ、１．５ｇ、１．６ｇ、１．７ｇ、１．８ｇ、１．９ｇおよび２ｇのリバビリンを有する。
【００６７】
従来のワクチン製剤を、抗原への免疫応答を高めるのに十分な量のリバビリンを添加することによって改変することができる。すなわち、リバビリンを製剤へ単に添加することによって、または従来のワクチンを単にリバビリンと共に投与する（例えば、抗原を与える少し前または後に）ことによって、現存の従来のワクチン配合物を改変できる。当業者には理解されるように、ワクチン中の抗原量は、抗原のタイプおよびその免疫原性に応じて変えることができる。したがって、ワクチン中の抗原量は変化し得る。それにもかかわらず、一般的な指針として、ワクチンは約０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、５〜１０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、および２０００ｍｇを越える抗原（例えば、肝炎ウィルス抗原）を含みうる。
【００６８】
本明細書に記載される幾つかのアプローチでは、治療を受ける患者のことを考慮し、個々の医者によって適切な量のリバビリンおよび／または抗原が選択される。さらに、その量のリバビリンを、同一または等価な量の抗原と組み合わせて、あるいは別々に添加することができ、これらの量は、患者特異的または抗原特異的因子を考慮して、十分な治療レベルを提供できるように、特定のワクチン接種プロトコルの間に調整できる。このように、考慮されるべき患者特異的および抗原特異的因子には、患者の疾病状態の重症度、患者の年齢および体重、食生活、投与の時間および頻度、複合薬（複数可）、反応の感受性、ならびに治療への耐性／応答が含まれるが、これらに限定はされない。以下において、本明細書中に記載される実施形態で使用することができる、新規なＨＣＶ遺伝子の発見および突然変異体ＨＣＶ配列の創造について説明する。
【００６９】
新規なＮＳ３／４Ａおよび突然変異体ＮＳ３／４Ａ配列
ＨＣＶのＮＳ３／４Ａドメインに相当する新規な核酸およびタンパク質を、ＨＣＶに感染した患者からクローニングした（配列番号：１６および１７）。Genebankの検索によって、クローニングされた配列はＨＣＶ配列に対して最大の相同性を有するが、最も密接なＨＣＶ類縁体（アクセッション番号ＡＪ２７８８３０）との相同性が９３％しかないことが明らかになった。タンパク質分解性の切断部位を持たない新規なＮＳ３／４Ａペプチドの切断型突然変異体およびＮＳ３／４Ａ突然変異体も創造した。これらの新規なペプチドおよび上記ペプチドをコードする核酸は、リバビリンと混合することにより、ＨＣＶに対する強力な免疫応答をレシピエントに提供する組成物を調製しうる強力な免疫原であることが見出された。新規なＮＳ３／４Ａドメインのクローニングおよび種々のＮＳ３／４Ａ突然変異体の創造は、以下の実施例で説明される。
【００７０】
実施例６
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ＨＣＶ感染患者（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）の血清からＮＳ３／４Ａ配列を増幅した。全ＲＮＡを血清から抽出し、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを標準プロトコルに従って実施した（Chen Mら, J. Med. Virol. 43:223-226 (1995)）。アンチセンスプライマー「ＮＳ４ＫＲ」（５’−ＣＣＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ−３’（配列番号：１８））を用いて、ｃＤＮＡ合成を開始した。このｃＤＮＡから、ＮＳ３およびＮＳ４Ａ遺伝子を含む断片であって、アミノ酸１００７〜１７１１に相当するＨＣＶの２０７９塩基対ＤＮＡ断片を増幅した。ハイフィデリティポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ、 Boehringer-Mannheim, Mannheim, Germany）を、「ＮＳ３ＫＦ」プライマー（５’−ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＣＴ ＡＴＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＴＡＴ−３’（配列番号：１９））およびＮＳ４ＫＲプライマーと共に使用した。ＮＳ３ＫＦプライマーはＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位および開始コドンを含み、ＮＳ４ＫＲプライマーはＸｂａＩ制限酵素切断部位および終止コドンを含む。
【００７１】
次に、増幅された断片を、配列番号：１６と同定した。配列比較分析によって、遺伝子断片は、遺伝子型１ａのウィルス株から増幅されたことが確認された。ＮＣＢＩウェブサイトを用いて、Genebankデータベースに対してコンピュータ化ＢＬＡＳＴ検索したところ、最も密接なＨＣＶ相同体は、ヌクレオチド配列が９３％同一であることが分かった。
【００７２】
増幅されたＤＮＡ断片を、次に、EｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、同じ酵素で消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓプラスミド（Invitrogen）に挿入した。ＮＳ３／４Ａ−ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドは、次にEｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、挿入断片をＱｉａＱｕｉｃｋキット（Qiagen, Hamburg, Germany）を用いて精製し、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドを生成するように、ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ Ｉ消化ｐＶＡＸベクター（Invitrogen）へ連結した。
【００７３】
ｒＮＳ３切断型突然変異体は、ＮＳ３／４ＡＤＮＡからＮＳ４Ａ配列を除去することにより得られた。したがって、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのＮＳ３遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位をそれぞれ含むプライマーＮＳ３ＫＦおよび３’ＮｏｔＩ（５’−ＣＣＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＴＡ ＣＡＧ−３’（配列番号：２０））を用いて、ＰＣＲ増幅した。ＮＳ３断片（１８５０ｂｐ）を次にＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ消化ｐＶＡＸプラスミドへ連結し、ＮＳ３−ｐＶＡＸベクターを調製した。プラスミドを、ＢＬ２１エシェリヒア・コリ細胞中で成長させた。プラスミドを配列決定し、制限切断によって検証したところ、結果は、オリジナルの配列に基づいて予想された通りであった。
【００７４】
ＮＳ３とＮＳ４Ａの間のタンパク質分解性の切断部位を変化させるために、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ（商標）突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて、メーカーの推奨事項に従って、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドに突然変異を起こさせた。「ＴＰＴ」突然変異を起こさせるために、プライマー５’−ＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号：２１）、および５’−ＡＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：２２）を用いてプラスミドを増幅し、ＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸを得た。「ＲＧＴ」突然変異を起こさせるために、プライマー５’−ＣＴＧＧＡＧＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＴ−３’（配列番号：２３）および５’−ＡＣＣＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：２４）を用いてプラスミドを増幅し、ＮＳ３／４Ａ−ＲＧＴ−ｐＶＡＸを得た。
【００７５】
突然変異させたすべての構築物は、突然変異が正確になされたことを立証するために配列決定された。プラスミドをコンピテントＢＬ２１エシェリヒア・コリ中で成長させた。ｉｎ  ｖｉｖｏ注射に使用されるプラスミドＤＮＡを、メーカーの説明書に従って、ＱｉａｇｅｎのＤＮＡ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、 Hilden, FRG）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡの濃度を分光光度法（Ｄｙｎａｑｕａｎｔ、 Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）で同定し、精製したＤＮＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解した。野生型および突然変異接合部のアミノ酸配列は表１０に示される。以下の部分では、ＨＣＶペプチドをコードする幾つかの核酸について説明する。
【００７６】
【表１０】
0005175417.tif 000011
【００７７】
ＨＣＶペプチドをコードする核酸
核酸の実施形態には、本明細書に記載されるＨＣＶペプチド（例えば、配列番号：１７、２９、３１、３２、および４３〜４９）、または長さが少なくともアミノ酸４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個または２０個分である該ペプチドの断片（例えば、配列番号：２５〜２７および３３〜４２）をコードするヌクレオチドが含まれる。例えば幾つかの実施形態には、これらのＨＣＶペプチドをコードするゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡが含まれる。ＨＣＶヌクレオチドの実施形態には、配列一覧表に示されるＤＮＡ配列（例えば、配列番号：１６）が含まれるだけでなく、配列一覧表に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１７）、厳密な条件下で配列一覧表に示されるＤＮＡ配列へハイブリダイズ（例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、５０℃で、フィルタ結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション）した後、５０℃で０．２ＸＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで洗浄された任意のヌクレオチド配列、ならびにあまり厳密でない条件下で、配列一覧表に提供されるアミノ酸配列（配列番号：１７）をコードするＤＮＡへハイブリダイズした任意のヌクレオチド配列（例えば、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および３７℃で０．２ＸＳＳＣ／０．２％ＳＤＳでの洗浄）も含まれる。
【００７８】
また核酸の実施形態には、上記配列の断片、修飾体、誘導体、および変異体も含まれる。望ましい実施形態には、例えば、新規なＨＣＶ配列またはそれらに相補的な配列のうちのどれか１つの、少なくとも１２個の連続塩基を有する核酸が含まれ、好ましい断片には、配列番号：１７またはそれに相補的な配列のＮＳ３／４Ａ分子をコードする核酸の少なくとも１２個の連続塩基が含まれる。
【００７９】
従って、本発明の核酸実施形態は、１２個から約２０７９個の連続ヌクレオチドを有しうる。本発明の幾つかのＤＮＡ断片は、例えば、配列番号：１６またはその補体の少なくとも１２〜１５個、１５〜２０個、２０〜３０個、３０〜５０個、５０〜１００個、１００〜２００個、２００〜５００個、５００〜１０００個、１０００〜１５００個、１５００〜２０７９個の連続ヌクレオチドを有する核酸を含む。また、核酸の実施形態は、置換、付加、または欠失などの突然変異によって変更することもできる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、例えば、配列番号：１７に示される配列と実質的に同一のＨＣＶアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、幾つかの実施形態で使用可能である。これらには、配列内の機能的に等価なアミノ酸残基（これにより、サイレント変化が起こる）、または配列内の機能的に不等価のアミノ酸残基（これにより、検出可能な変化が起こる）をコードする異なるコドンを置換することによって変更された、ＮＳ３／４Ａ（配列番号：１６）の全てまたは一部をコードする核酸配列、もしくはこの配列の全てまたは一部の相補的な核酸が含まれるが、これらに限定はされない。
【００８０】
上記の核酸配列を使用して、これらの分子を補完するプローブをオリゴヌクレオチド合成することによって設計および製造できる。望ましいプローブは、このＨＣＶ単離体に特異的な核酸配列（配列番号：１６）を含む。これらのプローブを使用して患者からｃＤＮＡをスクリーニングでき、ＨＣＶの自然源を単離できるが、その幾つかはそれ自体で新規なＨＣＶ配列である可能性がある。スクリーニングは、例えば、フィルタハイブリダイゼーションによって、またはＰＣＲによって行うことができる。フィルタハイブリダイゼーションでは、標識プローブは、このＮＳ３／４Ａペプチドに特異的な核酸配列（配列番号：１６）の少なくとも１５−３０個の塩基対を含有するのが好ましい。使用されるハイブリダイゼーション洗浄条件は、好ましくは、中程度のまたは高度の厳密性を有する。ハイブリダイゼーションは、０．５ＭのＮａＨＰＯ4、７．０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、４２℃で一晩実施され、洗浄は、４２℃で０．２ＸＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中で実施されうる。このような条件に関する指針については、例えば、Sambrookら,1989, Molecular cloning, A Laboratory Manual（分子クローニング、研究室マニュアル）, Cold Springs Harbor Press, N.Y. およびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコル）, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. が参照される。
【００８１】
また、ＨＣＶ核酸は、ここに記載される核酸を用いて、ＨＣＶに感染した患者から単離することもできる。（実施例６も参照）。したがって、ＨＣＶに感染した患者から得られたＲＮＡを逆転写し、結果として生じるｃＤＮＡをＰＣＲまたは別の増幅技法を用いて増幅する。プライマーはＮＳ３／４Ａ配列（配列番号：１６）から得られるのが好ましい。
【００８２】
ＰＣＲ技法のレビューとしては、Molecular Cloning to Genetic Engineering, White, B.A. Ed. in Method in Molecular Biology（分子生物学における方法） 67: Humana Press, Totowa(1997)、および「PCR Methods and Applications（ＰＣＲ方法および応用）」という表題の出版物（1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press）が参照される。ｍＲＮＡの増幅については、ｍＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写した後、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が実行されること、あるいは米国特許第５，３２２，７７０号に記載されるような両方のステップのために単一の酵素を使用することは、本発明の範囲内である。別の技法には、Marshall R.L.らにより記載される（PCR Methods and Applications 4:80-84, 1994）ように、逆転写非対称ギャップリガーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）の使用が含まれる。
【００８３】
簡単に述べると、ＲＮＡは標準手順に従って単離される。逆転写反応は、第１の鎖（ストランド）合成のプライマーとして、増幅された断片の５’最端部に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡ上で実施される。得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは次に、標準末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テールされる（tailed）」。次にハイブリッドはＲＮＡ分解酵素Ｈで消化され、第２のストランド合成がポリ−Ｃプライマーでプライムされる。したがって、増幅された断片上流のｃＤＮＡ配列は、容易に単離することができる。使用できるクローニング戦略のレビューとしては、たとえば、上記の「Sambrookら, 1989」が参照される。
【００８４】
これらの増幅手順のそれぞれにおいて、増幅すべき配列の両側のプライマーは、ｄＮＴＰ、およびＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラ−ゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼと一緒に、適切に調製された核酸サンプルへ加えられる。サンプル中の核酸は変性され、プライマーは、サンプル中の相補的な核酸配列へ特異的にハイブリダイズされる。ハイブリダイズされたプライマーは次に拡張される。その後、別のサイクルの変性、ハイブリダイズおよび拡張が開始される。複数回のサイクルが繰り返され、プライマー部位間の核酸配列を含む増幅断片を産生する。ＰＣＲは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，９６５，１８８号を始めとする幾つかの特許でさらに説明されている。
【００８５】
プライマーは、このＮＳ３／４Ａ分子に特異的な（配列番号：１６）の核酸配列の一部に実質的に相補的であるように選択され、これにより、プライマー間の配列は増幅されることが可能になる。好ましくは、プライマーは、少なくとも１６〜２０、２０〜２５、または２５〜３０個のヌクレオチド長を有する。安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）に依存する。Ｔｍは、プライマーの長さ、溶液のイオン強度、およびＧ＋Ｃの含量に依存する。Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合で保持されるが、Ａ：Ｔ対は２つの水素結合しか持たないので、プライマーのＧ＋Ｃ含量が高いほど融解温度も高い。本明細書に記載される増幅プライマーのＧ＋Ｃ含量の範囲は、好ましくは１０％と７５％の間であり、さらに好ましくは３５％と６０％の間であり、最も好ましくは４０％と５５％の間である。特定のアッセイ条件下でのプライマーの適切な長さは、当業者によって実験的に求められる。
【００８６】
プライマーのスペーシングは、増幅すべきセグメントの長さに関連する。本明細書に記載される実施態様との関係では、ＨＣＶペプチドをコードする核酸配列を保有する増幅セグメントは、サイズが少なくとも約２５ｂｐからＨＣＶゲノムの全長までの範囲である。２５〜１０００ｂｐの増幅断片が典型的であり、５０−１０００ｂｐの断片が好ましく、１００〜６００ｂｐの断片が非常に好ましい。増幅プライマーはＮＳ３／４Ａ領域の特異的な増幅を可能にする任意の配列であり、例えば、クローニングを容易にするために制限部位のような修飾がされていてもよいことは理解されるであろう。
【００８７】
ＰＣＲ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって、増幅された配列がＨＣＶペプチドの配列を表すことを確認できる。次に、ＰＣＲ断片を、種々の方法で全長のｃＤＮＡクローンを単離するために使用することができる。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリのようなｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用することができる。あるいは、標識断片を使用して、ゲノムライブラリのスクリーニングによってゲノムクローンを単離することができる。さらに、例えば、感染患者から単離したＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリを構築できる。このようにして、ＨＣＶ遺伝子産物に対して産生された抗体を用いた標準的な抗体スクリーニング技法により、ＨＣＶ遺伝子産物を単離できる。（スクリーニング技法については、例えば、Harlow, E. およびLane, eds., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual（抗体：研究室マニュアル）, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborが参照される。）
【００８８】
また、実施形態には、（ａ）前述の核酸配列および／またはそれらの補体（すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）核酸の発現を指示する調節要素と作用的に関連する前述の核酸配列のいずれかを含有するＤＮＡ発現ベクター、および（ｃ）宿主細胞中のコード配列の発現を指示する調節要素と作用的に関連する前述の核酸配列のいずれかを含む遺伝子改変宿主細胞が含まれる。これらの組換え構築物は、宿主細胞中で自律的に複製できる。あるいは、組換え構築物は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることができる。このような組換えポリヌクレオチドは、通常、人間の操作による半合成または合成起源のＨＣＶゲノムまたはｃＤＮＡポリヌクレオチドを含む。したがって、自然には発生しない、これらの配列およびその補体を含む組換え型核酸が提供される。
【００８９】
ＨＣＶペプチドをコードする核酸またはＨＣＶ遺伝子を補完する配列を有する核酸は、自然状態のままで使用することもできるが、例えば、欠失、置換、または挿入によって改変して使用することも多く、ヒトに存在しない配列を有していてもよい。本明細書中で使用される場合、調節要素には、誘導性および非誘導性プロモータ、エンハンサ、オペレータ、および発現を駆動および調節する要素として当業者に知られている他の要素が含まれるが、これらに限定はされない。このような調節要素には、サイトメガロウィルスｈＣＭＶ最初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウィルスの初期または後期プロモータ、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ、および酵母交配因子（yeast ？mating factor）のプロモータが含まれるが限定はされない。
【００９０】
さらに、組換えＨＣＶペプチドコード化核酸配列およびその相補的配列は、そのプロセシングおよび発現を変更するように設計できる。例えば、本明細書に記載されるＨＣＶ核酸をプロモータ配列および／またはリボソーム結合部位と結合させ、あるいは、信号配列をＨＣＶペプチドコード化配列の上流に挿入して、ペプチドの分泌を可能にすることにより、採集または生物学的利用を容易にすることができるが、これらに限定されない。さらに、ＨＣＶ核酸をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異させることで、翻訳、開始、および／または終結配列を創造および／または破壊する、コード領域に変化を創造する、および／または新しい制限部位を形成する、または既存のものを破壊する、あるいは更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾を促進することができる。（実施例６参照）。当該技術で知られている突然変異生成のための任意の技法を使用することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位指向性突然変異生成が含まれるが、これに限定はされない。（Hutchinsonら, J. Biol. Chem., 253:6551 (1978)）。
【００９１】
さらに、他のタンパク質または他のタンパク質のドメインをコードする核酸を、ＨＣＶペプチドをコードする核酸と接合させることにより、融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質をコードするヌクレオチドには、以下に議論されるように、例えばポリヒスチジン、赤血球凝集体、酵素、蛍光タンパク質、または発光タンパク質などの無関係のタンパク質またはペプチドへ融合された、全長のＮＳ３／４Ａ配列（配列番号：１６）、切断型ＮＳ３／４Ａ配列またはＮＳ３／４Ａ配列のペプチド断片が含まれるが、これらに限定はされない。
【００９２】
驚くことに、ＮＳ３−ｐＶＡＸおよびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターは、免疫応答性哺乳類に注射された場合に、強い免疫応答を誘発できることが見出された。以下の実施例はこれらの実験をさらに詳細に説明する。
【００９３】
実施例７
体液性免疫応答が、ＮＳ３−ｐＶＡＸおよびＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターによって誘発されるかどうかを判定するために、メーカーの説明書に従ってＱｉａｇｅｎのＤＮＡ生成システムを用いて、実施例６に記載される発現構築物を精製し、精製したＤＮＡベクターを用いて４〜１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスグループを免疫化した。以前に記載されたように（Davisら, Human Gene Therapy 4(6):733 (1993)）、再生前脛骨（ＴＡ）筋にプラスミドを直接注射した。簡単に言えば、０．９％滅菌ＮａＣｌ中の０．０１ｍＭの心臓毒（Latoxan, Rosans, France）を５０μｌ／ＴＡ、マウスに筋肉注射した。５日後、各ＴＡ筋に、ｒＮＳ３またはＤＮＡのいずれかを含有する５０μｌのＰＢＳを注射した。
【００９４】
近交系マウスであるＣ５７／ＢＬ６（Ｈ−２ｂ）Ｂａｌｂ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＣＢＡ（Ｈ−２ｋ）をMollegard Denmark, Charles River Uppsala, SwedenまたはB&K Sollentuna Swedenの繁殖施設から得た。使用した全てのマウスは雌で、４〜８週齢であった。体液性応答を観察するために、全てのマウスは、４週ごとに５０μｌ／ＴＡのプラスミドＤＮＡの追加免疫注射を受けた。さらに、あるマウスには、本明細書に説明されるように、精製された組換えＮＳ３（ｒＮＳ３）タンパク質を与えた。ｒＮＳ３を与えたマウスは、２回より多くは免疫化しなかった。全てのマウスから月に２回採血した。
【００９５】
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いて、マウスＮＳ３抗体の存在を検出した。これらのアッセイは、基本的に（Chenら, Hepatology 28(1):219 (1998)）の記載に従って実施した。簡単には、５０ｍM炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中１μｇ／ｍｌで、４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc, Copenhagen, Denmark）にｒＮＳ３を受動的に吸着させた。次に、ＰＢＳ、２％ヤギ血清、および１％ウシ血清アルブミンを含む希釈緩衝液中、３７℃で１時間、インキュベートすることによってプレートをブロックした。次に、１：６０から始まる一連のマウス血清希釈液をプレート上で１時間インキュベートした。結合したマウス血清抗体は、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Sigma Cell Products, Saint Louis, MO）によって検出され、続いて、基質ｐＮＰＰ（０．５ｍＭのＭｇＣｌ2を有する１Ｍのジエタノールアミン緩衝液５ｍｌ当り１錠）が添加された。１ＭのＮａＯＨを添加することで反応を停止させ、４０５nmにおける吸光度を読み取った。
【００９６】
４週間後に、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫化された５匹のマウスのうちの４匹がＮＳ３抗体を発達させ、ＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫化された５匹のうちの１匹が抗体を発達させた（図４）。６週間後には、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫化された５匹のマウスのうちの４匹は、高レベルに発達した（＞１０4）ＮＳ３抗体（平均レベル１０８００±４８３０）を有し、１匹は２１６０の力価を有した。ＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫化された全てのマウスもＮＳ３抗体を発達させたが、そのいずれも、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ構築物で産生されたほど高いレベルには達しなかった（平均レベル１８００±８０５）。ＮＳ３／４Ａ融合構築物で誘発された抗体レベルは、６週目では、ＮＳ３−ｐＶＡＸで誘導されたレベルよりも著しく高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙの順位和検定では平均順位７．６対３．４、ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定ではｐ＜０．０１）。したがって、ＮＳ３−ｐＶＡＸまたはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのいずれによる免疫化によっても抗ＮＳ３抗体の産生をもたらしたが、ＮＳ３／４Ａ融合遺伝子はより強力な免疫原であることが見出された。以下の実施例においては、ＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸ構築物が強い免疫応答を誘発するかどうかを判定するために実施された実験について説明する。
【００９７】
実施例８
ＮＳ３／４Ａの強化された免疫原性が、単にＮＳ４Ａの存在によるものかどうか、あるいはＮＳ３／４Ａ融合タンパク質がＮＳ３／４Ａ接合部でさらに切断されるべきかどうかを試験するために、新たな実験を実施した。第１の実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＮＳ３−ｐＶＡＸ、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ、およびＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸベクターの免疫原性を比較した。上記のようにマウスを０週目に免疫化し、２週間後に全てのマウスから採血し、１：６０の希釈血清でＮＳ３への抗体の存在を確認した（表１１）。マウスから４週目に再度採血した。ＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸベクターは、ＮＳ３−ｐＶＡＸベクターと同等の結果を示した（４／１０対０／１０、ＮＳ、Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定）が、依然としてＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸベクターが最強の免疫原であった。したがって、マウスに導入された全てのＨＣＶ構築物によってＮＳ３に対する免疫応答を誘発することができたが、ＮＳ４Ａ配列、およびＮＳ３とＮＳ４Ａ配列の間の機能的タンパク質分解性の切断部位により、より強い免疫応答を誘発することができる。
【００９８】
【表１１】
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【００９９】
感染の慢性期の間、ＨＣＶは肝細胞中で複製し、肝臓内に広がる。慢性的および持続的なウィルス感染に抗する主要な因子は、細胞性免疫防御系である。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球はＨＣＶ感染の慢性期の間、肝臓に浸透するが、ウィルスを除去したり、肝臓の損傷を防止したりすることはできない。さらに、持続的なＨＣＶ感染は、肝細胞がん（ＨＣＣ）の発症に関連する。以下の実施例においては、ＮＳ３およびＮＳ３／４Ａ構築物がＮＳ３に対するＴ細胞性の免疫応答を誘発できるかどうかを判定するために実施した実験について説明する。
【０１００】
実施例９
上記の構築物がＮＳ３に対する細胞性応答を誘発することができるかどうかを研究するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長アッセイを実施した。このために、ＮＳ３／４Ａ遺伝子で安定的にトランスフェクトされたＳＰ２／０腫瘍細胞株を調製した。ＮＳ３／４Ａ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをＢｇｌＩＩ消化によって直鎖状にした。全部で５μｇの直鎖状プラスミドＤＮＡを６０μｇのトランスフェクション試薬（Superfect, Qiagen, Germany）と混合し、混合物を、３５ｍｍ皿のＳＰ２／０細胞の５０％集密層へ添加した。トランスフェクトされたＳＰ２／０細胞（ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０）を８００μｇ／ｍｌのジェネティシンの存在下で１４日間成長させ、個々のクローンを単離した。安定なＮＳ３／４Ａ発現ＳＰ２／０クローンは、ＰＣＲおよびＲＴＰＣＲを用いて同定された。クローン化細胞株は、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中に保存された。
【０１０１】
次に、ＳＰ２／０およびＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞株のｉｎ  ｖｉｖｏの成長動力学を、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて評価した。マウスに、２×１０6の腫瘍細胞を右側腹部に皮下注射した。毎日腫瘍の大きさを、皮膚を通して観察した。２つの細胞株の成長動力学は同等であった。例えば、どの時点においても、平均腫瘍サイズは２つの細胞株の間で差が観察されなかった（表１２を参照）。以下の実施例は、ＮＳ３／４Ａ構築物で免疫化されたマウスが、ＮＳ３に対するＴ細胞の応答を発達させたどうかを判定するために実施された実験について説明する。
【０１０２】
【表１２】
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【表１３】
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【０１０３】
実施例１０
Ｔ細胞の応答が、ＮＳ３／４Ａ免疫化によって誘発されるかどうかを調べるために、免疫化マウスの免疫防御系が、ＮＳ３発現腫瘍細胞株を攻撃する能力を評価した。Ｂａｌｂ／ｃマウスのＳＰ２／０骨髄腫細胞株の腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害を試験するためのプロトコルは、以前に詳細に説明されている（Enckeら, J. Immunol. 161:4917 (1998)）。このモデルの腫瘍成長の阻害は、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の初回免疫に依存している。簡単に述べると、１０匹のマウスのグループは、１００μｇのＮＳ３−ｐＶＡＸまたは１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのいずれかで、１ヶ月の間隔で５回、筋肉内で免疫化された。最後の免疫化の２週間後に、２×１０6のＳＰ２／０またはＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞が各マウスの右側腹部に注射された。２週間後にマウスを犠牲にし、最大腫瘍サイズを測定した。ＮＳ３−ｐＶＡＸ免疫化マウスでは、ＳＰ２／０およびＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０における平均腫瘍サイズの間に差はなかった（表１３を参照）。
【０１０４】
【表１４】
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【０１０５】
次の実験セットでは、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ免疫化Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＳＰ２／０またはＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０腫瘍成長の阻害を評価した。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸプラスミドで免疫化したマウスでは、ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０腫瘍細胞の成長は、トランスフェクトされていないＳＰ２／０細胞の成長と比べて、著しく阻害された（表１４を参照）。したがって、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ免疫化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＮＳ３／４Ａを発現する細胞の成長を阻害するＣＴＬを誘発する。下の実施例は、ＮＳ３に対する細胞性応答の誘発において、種々のＮＳ３含有組成物の効率を調べるために実施された実験について説明する。
【０１０６】
【表１５】
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【０１０７】
実施例１１
種々のＮＳ３含有組成物の投与によって、細胞性免疫応答の誘発が影響を受けるかどうかを調査するために、ＰＢＳ、ｒＮＳ３、無関係なＤＮＡ、またはＮＳ３／４Ａ構築物でマウスを免疫化し、上記のとおりに腫瘍サイズを観察した。ＮＳ３／４Ａ構築物による場合のみ、統計的に有意な腫瘍サイズの減少を引き起こすのに十分なＴ細胞応答を誘発した（表１５を参照）。以下の実施例においては、腫瘍サイズの減少がＮＳ３特異的Ｔリンパ球の発生に起因するのかどうかを確認するために実施された実験について説明する。
【０１０８】
【表１６】
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【表１７】
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【０１０９】
実施例１２
ＮＳ３特異的Ｔ細胞が、ＮＳ３／４Ａ免疫化によって誘発されたかどうかを判定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞媒介の腫瘍細胞溶菌アッセイを用いた。このアッセイは、既に（Townsendら, J. Virol. 71:3365 (1997)）に詳細に記載されている。簡単に述べると、５匹のＢａｌｂ／ｃマウスのグループを１００μｇのＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸにより筋肉内注射により３回免疫化した。最後の注射の２週間後に、マウスを屠殺し、脾細胞を採集した。３×１０6の脾細胞および３×１０6のＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞による再刺激の培養をセットした。５日後に、ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０またはＳＰ２／０細胞をターゲットとして用いて、標準Ｃｒ51−放出アッセイを実施した。特異的溶菌のパーセントを、ＮＳ３／４Ａ−ＳＰ２／０細胞の溶菌及びＳＰ２／０細胞の溶菌の間の比率として計算した。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫化したマウスだけが、２０：１のエフェクタ対ターゲット比を用いて、５匹の被験マウスのうちの４匹で１０％を超える特異的溶菌を示した（図５Ａおよび図５Ｂを参照）。したがって、ＮＳ３／４Ａで免疫化したマウスはがん細胞増殖の低下を示し、および／または、ＮＳ３／４Ａはがん細胞の溶菌を引き起こした。以下の部分は具体化されたＨＣＶポリペプチドの幾つかをさらに詳細に説明する。
【０１１０】
ＨＣＶペプチド
前の部分で説明したＨＣＶペプチドをコードする核酸は、ＨＣＶペプチドを発現する組換え型構築物を創造するように、分子生物学の従来の技法を用いて操作できる。具体化されたＨＣＶペプチドまたはその誘導体には、実質的に配列一覧表に示されるアミノ酸配列（配列番号：１７、２９〜３２および４３〜４９）、ならびに少なくとも４つのアミノ酸長を有するその断片（例えば、配列番号：２５〜２７および３３〜４２）のいずれかを本質的なアミノ酸配列として含有する配列、さらに機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基と置換されてサイレント変化がもたらされたそれらの変更配列を含むが、これに限定はされない。配列番号：１７、２９〜３２および４３〜４９の配列の好ましい断片は、少なくとも４つのアミノ酸であり、機能的に等価なアミノ酸残基が配列内の残基と置換されてサイレント変化がもたらされた変更配列を含み、本発明者によって発見されたＮＳ３／４Ａペプチド（配列番号：１７）に独特のアミノ酸配列が含まれる。ＨＣＶペプチドは、例えば、少なくとも１２〜１５個、１５〜２０個、２０〜２５個、２５〜５０個、５０〜１００個、１００〜１５０個、１５０〜２５０個、２５０〜５００個、または５００〜７０４個のアミノ酸長でよい。他の断片（例えば配列番号：２５〜２７、および３３〜４２）も本発明の態様である。
【０１１１】
また本発明の実施形態には、上記のＨＣＶペプチドと実質的に同一のＨＣＶペプチドも含まれる。すなわち、配列番号：１７の１つまたは複数のアミノ酸残基を、機能的に等価に作用する同様の極性の別のアミノ酸で置換させてサイレント変更がされているＨＣＶペプチド、およびその断片を有するＨＣＶペプチドである。配列内のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属する種の他のメンバーから選択できる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがある。極性中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがある。正帯電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負帯電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。芳香族アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。
【０１１２】
本明細書に記載されるＨＣＶペプチドは、Merrifieldら, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964) 、Houghtenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:51:32 (1985)、 StewartおよびYoung (Solid phase peptide synthesis（固相ペプチド合成）, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984) 、ならびにCreighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles（タンパク質：構造および分子原理）, W.H. Freeman & Co., N.Y. に示されるような当業界で知られる技法を用いて、化学合成法（固相ペプチド合成など）によって調製することができる。このようなポリペプチドは、アミノ末端のメチオニンの有無にかかわらず合成可能である。化学合成されたＨＣＶペプチドはこれらの文献に示される方法を用いて酸化され、ジスルフィド架橋を形成することができる。
【０１１３】
ここに記載されるＨＣＶペプチドは化学的に合成することもできるが、組換えＤＮＡ技術によりこれらのポリペプチドを産生するほうがより効果的である。このような方法を使用して、例えば上記のようなＨＣＶヌクレオチド配列、ならびに適切な転写および翻訳調節信号を含有する発現ベクターを作製することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組み換えが含まれる。あるいは、ＨＣＶヌクレオチド配列をコードするＲＮＡは、例えば自動合成機を用いて化学的に合成できる。例えば、Oligonucleotide Synthesis（オリゴヌクレオチド合成）, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford. に記載される技法が参照される。したがって、幾つかの実施形態は、具体化されたＨＣＶペプチドを発現するように設計された細胞株に関する。例えば、ある細胞は（配列番号：１７、２９〜３２および４３〜４９）のＨＣＶペプチドまたはこれらの分子の断片を発現するように調製される。
【０１１４】
種々の宿主発現ベクター系を利用して、具体化されたＨＣＶペプチドを発現することができる。適切な発現系には、ＨＣＶヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌または枯草菌）などの微生物、ＨＣＶヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、酵母菌属、Pichia）、ＨＣＶ配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系、組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ、タバコモザイクウィルスＴＭＶ）に感染したか、ＨＣＶ配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモータ）から、または哺乳類ウィルス（例えば、アデノウィルス後期プロモータ、ワクシニアウィルス７．５Ｋプロモータ）から誘導されたプロモータを含有する組換え発現構築物を有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１１５】
細菌系では、意図した用途に応じて、発現されるＨＣＶ遺伝性産物のための多数の発現ベクターを適宜選択できる。例えば、このようなタンパク質が多量に産生されなければならない場合、ＨＣＶペプチドの薬剤組成物を調製するために、あるいはＨＣＶペプチドに対する抗体を産生させるために、例えば、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターを用いることが望ましい。このようなベクターには、融合タンパク質が産生されるようにｌａｃＺコード領域を有するフレームでＨＣＶコード配列がベクターに個々に連結され得る大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら, EMBO J., 2:1791 (1983)）や、ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acid Res., 13:3101-3109 (1985)、Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989)）などが含まれるがこれらに限定はされない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として外来性のポリペプチドを発現するために、ｐＧＥＸベクターも使用することができる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着の後、遊離グルタチオンの存在下で溶離することによって、溶菌細胞から精製することができる。ＰＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１１６】
昆虫細胞系では、外来遺伝子を発現させるために、ベクターとしてオートグラファカリフォルニア核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）を使用する。ウィルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で成長する。ＨＣＶコード配列は、ウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下に置かれる。ＨＣＶ遺伝子コード配列をうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウィルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされたタンパク性コートを持たないウィルス）の産生がもたらされる。これらの組換えウィルスを使用して、次に、挿入遺伝子が発現されるSpodoptera  frugiperda細胞を感染させる。（例えば、Smithら, J. Virol. 46:584 (1983) 、およびSmithの米国特許第４，２１５，０５１号が参照される）。
【０１１７】
哺乳類宿主細胞では、多数のウィルスベースの発現系を利用できる。アデノウィルスを発現ベクターとして使用する場合には、当該のＨＣＶヌクレオチド配列を、アデノウィルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモータおよび三連リーダー（tripartite leader）配列へ連結しうる。このキメラ遺伝子は次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組み換えによって、アデノウィルスゲノムへ挿入することができる。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）に挿入すれば、感染宿主中で生存することが可能であり、ＨＣＶ遺伝子産物を発現できる組換えウィルスをもたらすであろう。（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984) が参照される）。また、挿入されたＨＣＶヌクレオチド配列の効率的な翻訳のために特異的な開始信号も必要とされ得る。これらの信号には、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。
【０１１８】
しかしながら、ＨＣＶコード配列の一部だけが挿入される場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む、外因性の翻訳調節信号を提供できる。さらに、開始コドンは、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレームと同位相にすることができる。これらの外来性翻訳調節信号および開始コドンは、天然と合成両方の、種々の起源のものでよい。発現効率は、適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータなどを組み合わせることにより、高めることができる。（Bittnerら, Methods in Enzymol., 153:516-544 (1987) が参照される）。
【０１１９】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、あるいは所望される特定の方法で遺伝子産物を修飾および加工することにより宿主細胞株を選択できる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）および加工（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後に加工および修飾をするために、特徴的で固有のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択することにより、発現された外来タンパク質の正確な修飾および加工を確実にすることができる。このために、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化およびリン酸化のための適切なプロセシングをするための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を使用することができる。このような哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨeＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８が含まれるが、限定はされない。
【０１２０】
組換えタンパク質を長期間にわたって高収率で産生するためには、安定に発現することが好ましい。例えば、上記のＨＣＶペプチドを安定的に発現する細胞株を設計できる。ウィルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は、適切な発現調節要素（例えば、プロモータ、エンハンサ配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡ、および選択マーカーによって形質転換され得る。外来性ＤＮＡの導入に続いて、設計された細胞を集積培地で１〜２日間成長させ、次に、選択培地へ切り換える。組換えプラスミドの選択マーカーにより選択に対する耐性を与え、細胞はその染色体内にプラスミドを安定的に組み込み、成長して病巣を形成できるようになり、これは次に、クローニングされることにより細胞株に拡大する。この方法は、ＨＣＶ遺伝子産物を発現する細胞株を設計するために使用するのに有利な方法である。
【０１２１】
多数の選択系を使用することができ、これには、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, Cell 22:817 (1980)）が含まれ、遺伝子はそれぞれ、ｔｋ-、ｈｇｐｒｔ-またはａｐｒｔ-細胞において使用できるが、これらに限定はされない。また、メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1980)、O'Hareら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)）、ミコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）、アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapinら, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)）、およびハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら, Gene 30:147 (1984)）のような遺伝子のための選択の基礎として、代謝拮抗剤耐性も使用できる。
【０１２２】
あるいは、発現中の融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによって、いずれの融合タンパク質も容易に精製することができる。例えば、Janknechtらによって記載された系は、ヒトの細胞株中で発現される非変性融合タンパク質を容易に精製することを可能にする。（Janknechtら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976 (1991)）。この系では、目的の遺伝子は、ワクチン組換えプラスミドにサブクローニングされ、遺伝子の開放リーディングフレームが、６つのヒスチジン残基から成るアミノ末端タグへ翻訳的に融合されうる。組換えワクチンウィルスに感染した細胞からの抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムに充填され、ヒスチジ−タグ付タンパク質は、イミダゾール含有緩衝液により選択的に溶出される。以下の実施例は、具体化された核酸によりコードされるＨＣＶペプチドを発現するために使用した方法について説明する。
【０１２３】
実施例１３
ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質、ならびにその切断型および突然変異型を特徴付けるために、実施例６に記載されるベクター構築物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳し、得られたポリペプチドをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって視覚化した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳は、メーカーの説明書に従って、Ｔ７結合網状赤血球ライセートシステム(T7 coupled reticulocyte lysate system)（Promega, Madison, WI）を用いて実施された。発現構築物の全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応は、35Ｓ−標識メチオニン（Amersham International, Plc, Buckinghamshire, UK）を用いて３０℃で実行された。標識タンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離され、６〜１８時間のＸ線フィルム（Hyper Film−MP, Amersham）への露光によって視覚化された。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析によって、全てのタンパク質が、そのそれぞれの発現構築物から大量に発現されていたことが明らかになった。ｒＮＳ３構築物（ＮＳ３−ｐＶＡＸベクター）は約６１ｋＤａの単一ペプチドを産生したが、ＴＰＴ構築物（ＮＳ３／４Ａ−ＴＰＴ−ｐＶＡＸ）およびＲＧＴ構築物（ＮＳ３／４Ａ−ＲＧＴ−ｐＶＡＸ）は約６７ｋＤａの単一ポリペプチドを産生し、これはＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸ構築物が産生した非切断ＮＳ３／４Ａペプチドの分子量と同じ分子量であった。発現ＮＳ３／４Ａペプチドから産生された切断産物は約６１ｋＤａであったが、これは、ＮＳ３−ｐＶＡＸベクターが産生したｒＮＳ３と同一の分子量であった。これらの結果によって、発現構築物は機能的であり、ＮＳ３／４Ａ構築物は酵素活性であり、ｒＮＳ３は予想された大きさのペプチドを産生し、ＴＰＴおよびＲＧＴ突然変異はＮＳ３−ＮＳ４Ａ接合部の切断を完全に消失させたことが実証された。
【０１２５】
具体化されたＨＣＶ核酸およびペプチドを含む配列、構築物、ベクター、クローン、および他の物質は、濃縮形態または単離形態でもよい。本明細書で使用される場合、「濃縮」とは、物質の濃度が自然の濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、例えば有利なのは０．０１重量％であり、好ましくは少なくとも約０．１重量％である。約０．５重量％から、１重量％、５重量％、１０重量％、および２０重量％の濃縮形態も検討される。「単離」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、自然に生じる場合は自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する自然発生のポリヌクレオチドは単離されないが、自然系において共存する物質の幾つかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドは単離される。また、配列は精製形態であるのが好ましい。「精製」という用語は絶対的に純粋であるという意味に限定されず、むしろ、相対的な定義が意図される。単離したタンパク質は、従来、例えばクーマシー染色によって、電気泳動的均一性へ精製されている。出発物質または天然物質の精製は、少なくとも一桁の程度、好ましくは２または３桁の程度、さらに好ましくは４または５桁の程度へ明確に考慮される。
【０１２６】
本明細書に記載されるＨＣＶ遺伝子産物は植物、昆虫および動物中でも発現することができ、遺伝子組換え生物を創造しうる。ＨＣＶペプチドを有する望ましい遺伝子組換え植物系には、アラバドプシス（Arabadopsis）、トウモロコシおよびクラミドモナス(Chlamydomonas) がある。ＨＣＶペプチドを有する望ましい昆虫系には、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）および線虫（C. elegans）があるが、これらに限定はされない。両生類、爬虫類、トリ、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ならびに、例えばヒヒ、サル、およびチンパンジーなどのヒト以外の霊長類を含む（限定はされない）任意の種類の動物を使用して、具体化されたＨＣＶ分子を有する遺伝子組換え動物を生成することができる。これらの遺伝子組換え生物は、望ましくは、本明細書に記載されるＨＣＶペプチドの生殖系列移植を示す。
【０１２７】
当業界で知られる任意の技法は、好ましくは、ＨＣＶ導入遺伝子を動物中に導入して、遺伝子組換え動物の創始系列を産生するため、あるいは現存のＨＣＶ遺伝子を破壊または置換するために使用される。このような技法としては、前核マイクロインジェクション（Hoppe, P. C. およびWagner, T. E., 1989, 米国特許第４，８７３，１９１号）、レトロウィルス媒介の生殖系列への遺伝子移入（Van der Puttenら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152 (1985)）、胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Thompsonら, Cell 56:313-321 (1989)）、胚のエレクトロポレーション（Lo, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)）、および精子媒介の遺伝子移入（Lavitranoら, Cell 57:717-723 (1989)）が挙げられるが、これらに限定はされない。また、Gordon, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229 (1989)が参照される。以下の部分においては、本明細書に記載されるＨＣＶペプチドと相互作用を起こす抗体の製造について説明する。
【０１２８】
抗ＨＣＶ抗体
ＨＣＶペプチドの合成または発現、および単離または精製の後に、単離または精製されたペプチドを用いて抗体を調製できる。状況に応じて、「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリにより産生された断片を含むことができる。ＨＣＶペプチドを認識する抗体は、バイオテクノロジー用途、治療／予防の用途、および診察の用途を始めとする多くの用途を有するが、これらに限定はされない。
【０１２９】
抗体の産生のために、ＨＣＶペプチドの注射によって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスおよびヒトなどを含む種々の宿主を免疫化できる。宿主の種類によって、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントとしては、リバビリン、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびにリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質が挙げられるが、これらに限定はされない。ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杵菌（Bacillus Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウムパルバムも、有用なアジュバントである可能性がある。
【０１３０】
特定の抗体を誘発するために使用されるペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０から１５個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有することができる。１つのアプローチでは、ＮＳ３／４Ａの断片をコードする短い長さのアミノ酸は、キメラ分子に対して抗体が産生されるように、キーホールリンペットヘモシアニンなどの別のタンパク質のものと融合される。さらに、リバビリン、およびＮＳ３／４Ａ（配列番号：１７）、少なくとも４、６、８、１０、１２、１５、または２０個のアミノ酸長を有するその断片、あるいはこれらの分子の１つまたは複数をコードする核酸を含む組成物を動物へ投与する。ＨＣＶを特異的に認識できる抗体は，ＨＣＶペプチドに相当する３−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ、および１５−ｍｅｒの合成ペプチドをマウスに注射することによって生成され得るが、より多様化した抗体セットは、上記のように調製される組換えＨＣＶペプチドを使用して生成できる。
【０１３１】
ＨＣＶペプチドに対する抗体を生成するめに、トランスフェクトまたは形質転換された細胞から実質的に純粋なペプチドが単離される。最終製剤中のペプチドの濃度は、例えば、アミコンフィルタ装置による濃縮によって、数マイクログラム／ｍｌのレベルへ調整される。次に、当該のペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、以下のとおりに調製できる。
【０１３２】
ＨＣＶペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製できる。これらには、KoehlerおよびMilsteinによって初めに記載されたハイブリドーマ技法（Nature 256:495-497 (1975)）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Kosborら, Immunol Today 4:72 (1983)、Coteら, Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030 (1983)）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(モノクローナル抗体およびがん治療), Alan R. Liss Inc. New York N.Y., pp 77-96 (1985)）が含まれるが、限定はされない。さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法、適切な抗原特異的および生物活性を有する分子を得るためのヒトの抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングを使用できる。（Morrisonら Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855 (1984)、Neubergerら Nature 312:604-608 (1984)、Takedaら Nature 314:452-454 (1985)）。あるいは、単鎖抗体の産生のために記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）は、ＨＣＶ−特異的な単鎖抗体を産生するために適用できる。また抗体は、リンパ球集団でｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導することによって、あるいはOrlandiら, Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837 (1989)、ならびにWinter G.およびMilsteinC; Nature 349:293-299 (1991) に開示されるように、組換え免疫グロブリンライブラリまたは非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることによっても産生できる。
【０１３３】
また、ＨＣＶペプチドに特異的な結合部位を含む抗体断片も生成できる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ´）2断片、およびＦ（ａｂ´）2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成できるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定はされない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を、迅速かつ簡単に同定することができるように構築されうる。（Huse W.D.ら, Science 256:1275-1281 (1989)）。
【０１３４】
１つのアプローチでは、ＨＣＶペプチドに対するモノクロ−ナル抗体は、次のように調製される。簡単に述べると、マウスを、数週間にわたって、数マイクログラムの選択されたタンパク質またはそれから誘導されたペプチドを繰り返し接種する。次にマウスを犠牲にし、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールの存在下で、脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合し、余分な非融合細胞を、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）で系を発達させることにより破壊する。融合が成功した細胞を希釈し、マイクロタイタープレートのウェルに一定分量の該希釈液を入れ、ここで、培養物の成長を持続させる。Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419 (1980) によってはじめに記載されたＥＬＩＳＡなどの免疫測定法およびその派生的な方法によって、ウェルの上澄み液中の抗体の検出により抗体産生クローンを同定する。選択された陽性クローンを発達させ、そのモノクローナル抗体産物を使用するために収集することができる。モノクローナル抗体産生の詳しい手順は、Davis, L.ら, Basic Methods in Molecular Biology（分子生物学における基本的方法） Elsevier, New York. Section 21-2 に記載されている。
【０１３５】
単一タンパク質の不均質エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、上記の発現タンパク質またはそこから誘導されたペプチド（無修飾でも、免疫原性を高めるために修飾されていてもよい）で、適切な動物を免疫化することによって調製できる。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原の種類に関連する多くの因子および宿主の種類に関連する多くの因子に影響される。例えば、小さな分子は他の分子よりも免疫原性が低い傾向にあり、キャリアおよびアジュバントの使用を必要とし得る。また、宿主動物は接種部位および用量に応じて変化し、不十分または過剰な用量の抗原はいずれも力価の低い抗血清をもたらす。少ない用量（ｎｇレベル）の抗原を、複数の皮内部位で投与するのが、最も信頼できるプロトコルであると思われる。ウサギに有効な免疫化プロトコルは、Vaitukaitis, J.ら, J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971) に見出すことができる。
【０１３６】
追加免疫注射が一定の間隔で施され、例えば、既知の濃度の抗原に対してかんてん培養地中の二重免疫拡散法で半定量的に求められるその抗体力価が低下し始めたら、抗血清を採集する。例えば、Ouchterlony, O.ら, Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology (実験的免疫学のハンドブック) D. Wier(ed) Blackwell (1973) が参照される。抗体のプラトー(Plateau)濃度は、通常、血清１ｍｌ当たり０．１〜０．２ｍｇの範囲（約１２μＭ）である。抗原に対する抗血清の親和性は、例えばFisher, D., Chp. 42 in: Manual of Clinical Immunology（臨床的免疫学のマニュアル), 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980) に記載されるような競合的結合曲線を作成することによって求められる。いずれかのプロトコルに従って調製される抗体製剤は、生体サンプル中の抗原−支持物質の濃度を求めるための定量的免疫測定法において有用であり、これらは、半定量的または定性的測定法（例えば、生体サンプル中のＨＣＶの存在を同定する診断上の実施形態において）においても使用される。以下の部分においては、診断の実施形態の幾つかをさらに詳細に説明する。
【０１３７】
診断の実施形態
一般的に、具体化された診断は、核酸またはタンパク質ベースのどちらのアッセイが使用されるかどうかによって分類される。幾つかの診断試験法は、患者から得られたサンプル中において、具体化されたＨＣＶ核酸配列が存在するかまたは不存在であるかを検出するが、他の試験法は、患者から得られた生体サンプル中に具体化されたＨＣＶペプチドが存在するかどうかを同定しようとする。さらに、ＨＣＶの高速検出および同定を可能にしうる、本明細書に記載された試薬および方法を組み込んだキットの製造も具体化される。これらの診断キットは、例えば、ＨＣＶを特異的に検出する具体化された核酸プローブまたは抗体を含みうる。これらのキットに含まれる検出するための成分は、典型的には、１つまたは複数の以下の試薬と組み合わせて供給されるであろう。ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を吸収できるか、さもなければ結合できる担体が供給されることが多い。利用可能な担体には、正帯電置換基のアレイを有することで特徴付けられる、ニトロセルロース、ナイロンまたは誘導体化ナイロンの膜が含まれる。１つまたは複数の制限酵素、調節試薬、緩衝液、増幅酵素、および子ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡなどのヒト以外のポリヌクレオチドを、これらのキットで提供することができる。
【０１３８】
有用な核酸ベースの診断には、直接ＤＮＡ配列決定、サザンブロット分析、ドットブロット分析、核酸増幅、およびこれらのアプローチの組み合わせが含まれるが、これらに限定はされない。これらの分析の起始点は、ＨＣＶ感染の疑いのある患者またはＨＣＶ感染の危険のある患者から得られた生体サンプルを得て、このサンプルから単離または精製された核酸である。核酸はサンプルから抽出され、具体化されたＨＣＶ核酸配列（例えば、ＮＳ３／４Ａ（配列番号：１６））に隣接する領域に相当するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＤＮＡ増幅によって増幅され得る。
【０１３９】
ある実施形態では、ＨＣＶ配列と特異的にハイブリダイズする核酸プローブが規則的なアレイで担体へ取り付けられるが、ここで、核酸プローブは互いに重ならない別々の担体領域に取り付けられる。好ましくは、このような規則的なアレイは「アドレス可能」であるように設計され、プローブの別個の位置が記録され、アッセイの手順の一部としてアクセスされ得る。これらのプローブは異なる既知の部位で担体へ接合される。各核酸プローブの正確な部位を知ることで、これらの「アドレス可能」なアレイは結合試験法において特に有用となる。幾つかの生体サンプルの調製から得た核酸は、次に、従来のアプローチ（例えば、放射能または蛍光）によって標識され、標識サンプルはハイブリダイズを可能にする条件下でアレイへ適用される。
【０１４０】
サンプル中の核酸がアレイ上のプローブへハイブリダイズしたら、ハイブリッドの場所に相当する担体上の位置で、信号が検出される。各標識サンプルの同一性がわかり、標識サンプルが適用された担体領域がわかるので、多型変異体の存在の同定が迅速になされる。これらのアプローチは、高処理量の診断または検出分析の分野における当業者に知られる技術を用いて、容易に自動化される。
【０１４１】
さらに、上記で提示されたものと反対のアプローチを使用することもできる。生体サンプル中に存在する核酸は、アドレス可能なアレイを作るように担体上に配置される。好ましくは、サンプルは重ならない既知の位置で担体上に配置される。各サンプル中のＨＣＶ核酸の存在は、生体サンプルが配置された位置に相当するアレイ上の部位で、ＨＣＶペプチドをコードする核酸を補完する標識核酸プローブを適用することによって確認される。生体サンプルの同一性およびそのアレイ上の部位が分かるので、ＨＣＶに感染した患者の同定を迅速に決定することができる。これらのアプローチもまた、高処理量の診断分析の分野の当業者に知られる技術を用いて容易に自動化される。
【０１４２】
当該技術で知られる任意のアドレス可能なアレイ技術を使用することができる。ポリヌクレオチドアレイの１つの特定の具体例は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）として知られており、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０７０号およびＷＯ９２／１００９２号に概して記載されている。これらのアレイは一般的に、フォトリソグラフィ法(photolithographic methods)および固相オリゴヌクレオチド合成の組み合わせを組み込む機械的合成法または光誘導（light directed）合成法を用いて製造できる。（Fodorら, Science, 251:767-777 (1991)）。固相担体上のオリゴヌクレオチドのアレイの固定化は、典型的には、プローブがチップの固体表面の高密度アレイに固定化される「超大規模固定化ポリマー合成（Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis）」（ＶＬＳＰＩＳ（商標)）のように、一般的に認められる技術を開発することによって可能になった。ＶＬＳＰＩＳ（商標)テクノロジーの例は、米国特許第５，１４３，８５４号および同第５，４１２，０８７号と、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１５０７０号、ＷＯ９２／１００９２号およびＷＯ９５／１１９９５号に提供されており、光誘導合成技術などの技法によってオリゴヌクレオチドアレイを形成するための方法が説明される。固相担体上に固定化されたヌクレオチドアレイを提供するための設計戦略では、ハイブリダイズパターンおよび診断情報を最大にするための試みにおいて、オリゴヌクレオチドアレイをチップ上に整理および表示するために、更なるプレゼンテーション戦略が開発された。このようなプレゼンテーション戦略の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２３０５号、ＷＯ９４／１１５３０号、ＷＯ９７／２９２１２号、およびＷＯ９７／３１２５６号に開示される。
【０１４３】
幅広い種類の標識および結合技法が当業者に知られており、種々の核酸試験法で使用できる。ハイブリダイズまたはＰＣＲのための標識核酸を産生する方法は幾つかあり、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれるが、限定はされない。あるいは、ＨＣＶペプチドをコードする核酸は、ｍＲＮＡプローブ産生のためにベクター中へクローニングできる。このようなベクターは当該技術分野で知られており、また市販されており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの添加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。Pharmacia Biotech (Piscataway N.J.)、Promega (Madison Wis.)、およびU.S. Biochemical Corp (Cleveland Ohio) などの多数のメーカーが、これらの手順のための市販用キットおよびプロトコルを供給する。適切なレポータ分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素生産性の作用物質、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが含まれる。
【０１４４】
患者から得られたタンパク質サンプル中のＨＣＶペプチドの存在を、従来のアッセイおよびここに記載される実施形態を用いて検出することもできる。例えば、開示されたＨＣＶペプチドと免疫応答性のある抗体を使用して、ＨＣＶ感染の存在について生体サンプルをスクリーニングすることができる。好ましい実施形態では、具体化されたＨＣＶペプチドに反応性のある抗体は、開示されたＨＣＶペプチドを生体サンプルから免疫沈降させるために使用される、あるいはウェスタンブロットまたは免疫ブロットで生体サンプルから得られたタンパク質と反応させるために使用される。また、有利な診断実施形態には、開示されたＨＣＶペプチドに特異的なモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素測定法（ＩＥＭＡ）が含まれる。典型的なサンドイッチアッセイは、Davidらによって米国特許第４，３７６，１１０号、および同第４，４８６，５３０号に記載される。他の実施形態は、米国特許第５，２９０，６７８号、同第５，６０４，１０５号、同第５，７１０，００８号、同第５，７４４，３５８号、および同第５，７４７，２７４号に開示される免疫−ストリップ（immune-strip）テクノロジーの態様を使用する。
【０１４５】
別の好ましいタンパク質ベースの診断では、本明細書に記載される抗体が、規則的なアレイで担体へ結合され、この際、複数の抗体は互いに重ならない担体の別の領域に結合される。核酸ベースのアレイと同様に、タンパク質ベースのアレイは、別個の場所が記録され、アッセイの手順の一部としてアクセスされるように、「アドレス可能」であるように設計された規則的なアレイである。これらのプローブは異なる既知の部位で担体へ接合される。各プローブの正確な場所を知ることで、これらの「アドレス可能」なアレイは、結合アッセイにおいて特に有用となる。例えば、アドレス可能なアレイは、生体サンプル中に存在するＨＣＶペプチドを特異的に認識する抗体プローブであって、ここで識別されるＨＣＶアイソタイプを区別する複数の抗体プローブが、接合された幾つかの領域を持つ担体を含むことができる。
【０１４６】
１つのアプローチでは、タンパク質は生体サンプルから得られ、次に従来のアプローチ（例えば、放射能、比色分析、または蛍光）を用いて標識される。標識サンプルは次に、結合を可能にする条件下でアレイへ適用される。サンプル中のタンパク質がアレイ上の抗体プローブへ結合すると、担体上の抗体−タンパク質複合体の場所に相当する位置で、信号が検出される。各標識サンプルの同一性がわかり、標識サンプルが適用された担体領域がわかるので、存在の有無、濃度、および／または発現レベルを、迅速に決定することができる。すなわち、既知の濃度のＨＣＶペプチドの標識標準物を使用することによって、研究者は、試験サンプル中の特定のペプチドのタンパク質濃度を正確に測定でき、ＨＣＶペプチドの発現レベルを評価することもできる。濃度測定における従来の方法も、ＨＣＶペプチドの濃度または発現レベルをより正確に決定するために使用することができる。これらのアプローチは、高処理量の診断分析の分野の当業者に知られる技術を用いて、容易に自動化される。
【０１４７】
別の実施形態では、上記で提示されたものと反対のアプローチも使用できる。生体サンプル中に存在するタンパク質はアドレス可能なアレイを作るように担体上に配置され得る。好ましくは、タンパク質サンプルは重ならない既知の位置で担体上に配置される。次に、各サンプル中のＨＣＶペプチドの存在は、ＨＣＶペプチドに特異的なエピトープを認識する標識抗体プローブを適用することによって確認される。生体サンプルの同一性およびそのアレイ上の位置が分かるので、ＨＣＶペプチドの存在の有無、濃度、および／または発現レベルを、迅速に決定できる。
【０１４８】
すなわち、既知の濃度のＨＣＶペプチドを標識標準物として使用することによって、研究者はサンプル中のペプチドの濃度を正確に測定することができ、この情報から、ペプチドの発現レベルを評価できる。濃度測定における従来の方法も、ＨＣＶペプチドの濃度または発現レベルをより正確に決定するために使用することができる。これらのアプローチもまた、高処理量の診断分析の分野の当業者に知られる技術を用いて、容易に自動化される。上記で詳述したように、当該技術で知られる任意のアドレス可能なアレイ技術を使用することができる。以下においては、１つまたは複数の具体化されたＨＣＶ核酸またはＨＣＶペプチドを有することができる幾つかの組成物について説明する。
【０１４９】
具体化されたＨＣＶ核酸またはペプチドを含む組成物
ある実施形態は、担体へ接合された少なくとも１つのＨＣＶ核酸またはペプチドを含む。好ましくは、これらの担体は多量体物質（multimeric agent）を作成するように製造される。これらの多量体物質は、分子への十分な親和性が達成されるような形態または方法で、ＨＣＶペプチドまたは核酸を提供する。ＨＣＶ核酸またはペプチドを有する多量体物質は、所望の分子を高分子担体へ接合することにより得ることができる。「担体」とは、キャリア、タンパク質、樹脂、細胞膜、またはこのような分子の接合または固定化に使用される高分子構造を意味する。固相担体には、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子、動物細胞、Ｄｕｒａｃｙｔｅ（商標）、および人工細胞などが含まれるが、これらに限定はされない。また、ＨＣＶ核酸またはペプチドは、例えばヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基、およびキャリア上の反応基との共有結合によって、ケイ素酸化物材料（例えば、シリカゲル、ゼオライト、珪藻土、またはアミノ化ガラス(aminated glass)）などの無機キャリアへ接合することもできる。
【０１５０】
幾つかの多量体物質では、高分子単体は、疎水性非共有相互作用によって、ＨＣＶ核酸またはペプチドの一部と相互作用をする疎水性表面を有する。ある場合には、担体の疎水性表面は、ポリスチレン、ポリエチレンまたはポリビニルなどの疎水基が結合されたプラスチックや他の任意のポリマーのようなポリマーである。さらに、ＨＣＶ核酸またはペプチドは、タンパク質およびオリゴ／多糖類（例えば、セルロース、デンプン、グリコーゲン、キトサン、またはアミノ化セファロース）を含むキャリアへ共有結合されてもよい。これらの後者の多量体物質では、ヒドロキシ基またはアミノ基などの分子の反応基は、キャリア上の反応基と結合して、共有結合を形成するために使用される。更に、多量体物質は、ＨＣＶ核酸またはペプチドを付着するように化学的に活性化された他の反応基を有する担体を含む。たとえば臭化シアン活性化マトリックス、エポキシ活性化マトリックス、チオおよびチオプロピルゲル、クロロギ酸ニトロフェニルおよびクロロギ酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドリンケージ、またはオキシランアクリル担体が使用される（Sigma）。
【０１５１】
体内で使用するため（すなわち、予防または治療用途）のキャリアは、生理的で無毒性であることが望ましく、免疫応答性でないキャリアであることが好ましい。体内での使用に適切なキャリアには、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ，Ｌ−アラニン、リポソーム、およびＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ（商標）（Johns-Manville Products, Denver Co.）が含まれる。リガンド結合Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ（商標）（Synsorb−Pk）は溶血性尿毒症症候群の防止のためにヒトで試験され、有害反応を示さないと報告された。（Armstrongら J. Infectious Diseases 171:1042-1045 (1995)）。ある実施形態では、生物体内でＨＣＶ核酸またはペプチドを付着する能力を有する「裸の」（すなわち、付着したＨＣＶ核酸またはペプチドがない）キャリアが投与される。このアプローチでは「プロドラッグ型」治療が想定され、裸のキャリアはＨＣＶ核酸またはペプチドとは別個に投与され、両方が生物体内に入った場合に、キャリア、およびＨＣＶ核酸またはペプチドが多量体複合体を構築する。
【０１５２】
また、ＨＣＶ核酸またはペプチド、および担体の間に適切な長さのリンカー（例えば、λファージのフレキシブル領域に類似するように設計された「λリンカー」）を挿入することにより、ＨＣＶペプチド、ハイブリッド、または結合パートナーのより大きなフレキシビリティを助長することが考えられ、これにより、担体による立体障害を解消しうる。最適な細胞応答またはその欠如を可能にする適切な長さのリンカーの決定は、本明細書で詳述されるアッセイにおいてさまざまなリンカーでＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることによって、決定することができる。
【０１５３】
２つ以上のタイプのＨＣＶ核酸またはペプチドを含む複合担体も想定される。「複合担体」とは、２つ以上の異なるＨＣＶ核酸またはペプチドを付着または固定化するために使用されるキャリア、樹脂、または任意の高分子構造を意図する。上記のように、ＨＣＶ核酸またはペプチドと担体の間の適切な長さのλリンカーなどのリンカーを挿入することにより、分子のより大きなフレキシビリティを助長することが考えられ、これにより、発生し得る立体障害が解消される。最適な細胞応答またはその欠如を可能にする適切な長さのリンカーは、本明細書で詳述されるアッセイに従って、さまざまなリンカーでＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることによって、決定することができる。
【０１５４】
他の実施態様では、上記で議論された多量体の担体および複合体の担体は、それぞれ、「多量体化−多量体担体」および「多量体化−複合体担体」を形成するように、付着された多量体化ＨＣＶ核酸またはペプチドを有することが可能である。多量体化リガンドは、例えば、分子生物学における従来の技法を用いて２つ以上のＨＣＶ核酸またはペプチドを縦列に結合することによって得ることができる。ＨＣＶ核酸またはペプチドの多量体型は、例えば高親和性を持つ作用物質を得ることができるので、多くの用途で有利である。また、多量体化作用物質を構成する個々のドメインの間にフレキシブルλリンカーなどのリンカーまたはスペーサーを取り込むことも、幾つかの実施形態では有利である。タンパク質結合ドメイン間に適切な長さのλリンカーを挿入することにより、例えば、分子のより大きなフレキシビリティを助長でき、立体障害を解消できる。同様に、多量体化ＨＣＶ核酸またはペプチドと担体の間にリンカーを挿入することにより、より大きいフレキシビリティを助長でき、担体による立体障害を解消できる。適切な長さのリンカーは、本明細書で詳述されるアッセイに従って、ＨＣＶ核酸またはペプチドをスクリーニングすることによって決定できる。
【０１５５】
また本発明の実施形態は、上記のように、遺伝子ワクチンも含む。好ましくは、これらの組成物は、リバビリン、およびＮＳ３／４Ａ（配列番号：１７）、ＮＳ３（配列番号：２９）、または突然変異体（例えば、配列番号：３０〜３２および４３〜４９）、もしくはその断片（例えば、配列番号：２５〜２７および３３〜４２）をコードする核酸を含む。以下の実施例では、ヒトにおいて使用するのに適した遺伝子ワクチンの調製について説明する。
【０１５６】
実施例１４
ＨＣＶ発現プラスミドは、ＮＳ３／４Ａペプチドを発現するように設計される。ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのＮＳ３／４Ａコード配列は、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの消化によって取り出され、単離した断片はプラスミドＡに挿入され、ＣＭＶプロモータおよびＲＳＶエンハンサ要素の転写調節下におかれる。（Pachukらの米国特許第６，２３５，８８８号を参照）。プラスミドの骨格Ａは３９６９個の塩基対の長さであり、大腸菌で複製するためのＰＢＲ複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を含む。ＮＳ３／４Ａなどの挿入断片は、ポリリンカー領域の間にクローニングされ、プロモータおよびポリアデニル化信号に作用されるように連結される。クローン化挿入断片の転写は、ＣＭＶプロモータおよびＲＳＶエンハンサ要素の調節下にある。ポリアデニル化信号は、クローニング部位のちょうど３´に位置されるＳＶ４０ポリＡ信号の存在によって提供される。ＮＳ３／４Ａ含有ワクチン組成物は、次に、５００μｇのｒＮＳ３／４Ａ構築物と１ｍｇのリバビリンとを混合することにより製造される。
【０１５７】
上記ワクチン組成物は、哺乳類(例えば、マウスまたはウサギ)中で抗体を産生させるために使用できる。あるいは、ヒト、好ましくはＨＣＶウィルスに慢性的に感染したヒトに筋肉内注射することにより、抗体を産生させることができる。レシピエントは、好ましくは、混合物を４週間隔で、３回、追加免疫化（immunization boost）する。第３の追加免疫によって、ＨＣＶに特異的な抗体力価は著しく増大するであろう。さらに、このとき、ＥＩＡで検出されるＮＳ３特異的抗体のフラクションの増大と、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるウィルス負荷の低下から明らかにされるように、上記被験体は、抗体およびＮＳ３に対するＴ細胞性免疫応答が強化されるであろう。
【０１５８】
また実施形態には、これらの分子をコードするＮＳ３／４Ａ融合タンパク質または核酸が含まれる。例えば、組換えタンパク質の産生および精製は、「タグ」を形成するための補助的なアミノ酸を添加することにより容易にすることができる。このようなタグには、Ｈｉｓ−６、Ｆｌａｇ、ＭｙｃおよびＧＳＴが含まれるが限定はされない。タグはＣ−末端、Ｎ−末端へ、またはＮＳ３／４Ａアミノ酸配列内に付加できる。更なる実施形態には、アミノまたはカルボキシ末端切断または内部欠失を有するＮＳ３／４Ａ融合タンパク質、あるいは更なるポリペプチド配列がアミノまたはカルボキシ末端へ付加されたＮＳ３／４Ａ融合タンパク質、または内部に付加されたＮＳ３／４Ａ融合タンパク質が含まれる。他の実施形態には、ＮＳ３／４Ａのタンパク分解性の切断部位の残基が置換されたＮＳ３／４Ａ融合タンパク質、もしくはその切断型または突然変異型が含まれる。このような置換には、Ｐ１´部位がＳｅｒ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏであるか、またはＰ１位置がＡｒｇである配列、あるいはＰ８からＰ４´への配列がＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌである配列（配列番号：２８）が含まれるが限定はされない。
【０１５９】
他の実施形態は、ＮＳ３に対する免疫応答の強化を誘発できるＮＳ３／４Ａ融合タンパク質もしくはその切断型または修飾型を含む免疫原に関する。免疫原は実質的に精製された形態で提供され、実質的に精製された形態とは、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然に関連する他の化合物が免疫原に実質的に存在しないようにされたことを意味する。また実施形態には、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質(配列番号：１７)またはその切断型または突然変異型(例えば、配列番号：２９〜３２および４３〜４９)もしくはその断片（例えば、配列番号：２５〜２７および３３〜４２）、およびリバビリンなどのアジュバントを含むワクチン組成物も含まれる。以下の実施例は、ＮＳ３／４Ａ融合タンパク質およびアジュバントを含むワクチン組成物を調製するための１つのアプローチについて記載する。
【０１６０】
実施例１５
タグ付けしたＮＳ３／４Ａ構築物を生成するために、ＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸのＮＳ３／４Ａコード配列を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの消化によって取り出し、単離した断片を、Ｘｐｒｅｓｓベクター（Invitrogen）へ挿入した。Ｘｐｒｅｓｓベクターは、二価のカチオンに対して高親和性である短いＮ−末端リーダーペプチドを有する組換え融合タンパク質の産生を可能にする。ニッケル−キレート樹脂（Invitrogen）を用いて、組換えタンパク質を一工程で精製することができ、次に、リーダーはエンテロキナーゼによる切断によって除去される。好ましいベクターはｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２ Ｘｐｒｅｓｓである。ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２ Ｘｐｒｅｓｓベクターは、多数のクローニング部位、アンピシリン耐性遺伝子、およびｌａｃ ｚ遺伝子を含有するバキュロウィルス発現ベクターである。したがって、消化された増幅断片を、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２ Ｘｐｒｅｓｓベクターにクローニングすることにより、ＳＦ９細胞を感染させることができる。発現タンパク質は次に、メーカーの説明書に従って、単離または精製される。次に、ＮＳ３／４Ａ含有ワクチン組成物は、１００μｇのｒＮＳ３／４Ａを１ｍｇのリバビリンと混合して製造される。
【０１６１】
上記ワクチン組成物は、哺乳類(例えば、マウスまたはウサギ)中で抗体を産生させるために使用することができる。あるいは、ヒト、好ましくはＨＣＶウィルスに慢性的に感染したヒトに筋肉内注射することにより、抗体を産生させることができる。レシピエントは、好ましくは、４週間隔で３回、混合物による追加免疫化を受ける。３回目の追加免疫によって、ＨＣＶに特異的な抗体力価は著しく増大するであろう。さらに、このとき、ＥＩＡで検出されるＮＳ３特異的抗体のフラクションの増大と、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるウィルス負荷の低下から明らかなように、上記被験体は、抗体およびＮＳ３に対するＴ細胞性免疫応答が強化されるであろう。以下においては、本明細書に記載される組成物の使用方法に関する更なる説明をする。
【０１６２】
リバビリンおよび抗原を含む組成物の使用方法
本明細書に記載されるワクチンの投与経路には、経皮、非経口、胃腸管、経気管支、および経肺胞（transalveolar）が含まれるが、これらに限定はされない。経皮投与は、リバビリンおよび抗原が皮膚に浸透するようにできるクリーム、リンス、ゲル、またはその他の混合物を用いることによって達成できる。非経口の投与経路には、中心静脈への直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下注射のような電気的または直接注射が含まれるが、これらに限定はされない。胃腸管の投与経路には、摂取および直腸が含まれるが、これらに限定はされない。経気管支および経肺胞の投与経路には、口からまたは鼻腔からの吸入が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１６３】
経皮投与に適切なリバビリンおよび抗原を有する組成物には、薬学的に許容可能な懸濁液、オイル、クリーム、および軟膏（これらに限定されない）が含まれ、これらは皮膚へ直接塗布されるか、あるいは経皮手段(「経皮パッチ」）などの保護キャリアへ組み込まれる。適切なクリーム、軟膏などの例は、例えば、ＰＤＲ(Physician's Desk Reference)で見出すことができる。適切な経皮手段の例は、例えば、１９８９年４月４日にChinenらに発行された米国特許第４，８１８，５４０号に記載されている。
【０１６４】
非経口投与に適切なリバビリンおよび抗原を有する組成物には、薬学的に許容可能な等張液が含まれるが、これに限定はされない。このような溶液には、中心静脈への注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下注射のための、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、およびオイル製剤が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１６５】
経気管支および経肺胞投与に適切なリバビリンおよび抗原を有する組成物には、吸入のための種々のタイプのエアロゾルが含まれるが、これらに限定はされない。これらを経気管支および経肺胞投与するのに適切な装置も本発明の実施形態である。このような装置には噴霧器および気化器が含まれるが、これらに限定はされない。現在入手可能な噴霧器および気化器の多くの型を利用して、リバビリンおよび抗原を有するワクチンを容易に送達しうる。
【０１６６】
胃腸管投与に適切なリバビリンおよび抗原を有する組成物には、薬学的に許容可能な、摂取用の粉末、丸薬、または液体および直腸投与用の座薬が含まれるが、限定はされない。
【０１６７】
本明細書に記載される遺伝子構築物は、特に、従来の注射器、無針注射装置、または「微粒子打ち込み遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」を含む（しかしこれらに限定はされない）手段によって投与できる。あるいは、遺伝子ワクチンは、個体から取り出される細胞内へ種々の手段によって導入できる。このような手段としては、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、および微粒子銃がある。遺伝子構築物を細胞が取り込んだ後、その細胞を個体に再移植する。たとえワクチン接種をされた細胞が、別の個体から採取された細胞であったとしても、遺伝子構築物を取り込んだその他の非免疫原性の細胞を個体へ移植してもよいと考えられる。
【０１６８】
ある実施形態によると、遺伝子構築物は、無針注射装置を用いて個体へ投与される。ある実施形態によると、遺伝子構築物は、無針注射装置を用いて、経皮、皮下および筋肉内で個体へ同時に投与される。無針注射装置はよく知られており、広く利用可能である。当業者は、本明細書の教示にしたがって、遺伝物質を個体の細胞へ送達するために無針注射装置を使用することができる。無針注射装置は、全ての組織へ遺伝物質を送達するために十分適応される。これらは、遺伝物質を皮膚および筋肉細胞へ送達するために特に有用である。ある実施形態では、無針注射装置は、個体の皮膚表面へ向かって、ＤＮＡ分子を含有する液体を推進させるために使用できる。液体は、皮膚との衝突時に液体が皮膚表面を貫通し、皮膚およびその下の筋肉組織へ浸透するように、十分な速度で推進される。したがって、遺伝物質は経皮、皮下および筋肉内で同時に投与される。ある実施形態では、無針注射装置は、他の器官の組織へ遺伝物質を送達するために使用され、その器官の細胞に核酸分子を導入しうる。
【０１６９】
リバビリンおよび抗原を含有するワクチンは、広大な範囲の疾病を治療および予防するために使用することができ、抗原に対する動物の免疫応答を高めることができる。当業者が認識するように、従来のワクチンは、細菌の疾病、ウィルスの疾病、真菌の疾病、およびがんの治療または予防を必要としている被験体へ投与されている。本明細書に記載されるワクチンは、従来のワクチンにリバビリンを添加することによって改変された従来のワクチンを含むので、本明細書に記載される方法は、抗原およびリバビリンを含むワクチンを使用して疾病を治療および予防する方法を含む。
【０１７０】
好ましい実施形態は、肝炎感染を治療または予防する方法に関する。これらの実施形態では、必要性のある動物に、肝炎抗原（例えば、ペプチド抗原または核酸ベースの抗原）、および上記動物中でアジュバント活性を示すのに十分な量のリバビリンを与える。したがって、現在利用できる診断試験または臨床評価を用いて、動物が免疫応答の強化を必要としているかどうかを確認することができる。これらの実施形態で使用できる肝炎ウィルス抗原の範囲は広範囲にわたる。好ましい肝炎ウィルス抗原には、ＨＢＶ抗原、ＨＡＶ抗原、ＨＣＶ抗原、これらの抗原をコードする核酸、またはこれらの組み合わせがある。より好ましい実施形態としては、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、およびＥ型肝炎抗原（ＨＢeＡｇ）から成る群から選択されるＨＢＶ抗原、特に、上記のペプチドおよび核酸ベースの抗原が挙げられる。リバビリンおよび抗原は、別々に、あるいは組み合わせて提供することができ、他のアジュバント（例えば、オイル、ミョウバン、または免疫応答を高める他の作用物質）を、免疫応答の強化を必要としている動物に与えることもできる。したがって、好ましい実施形態には、感染した動物または感染の危険がある動物を特定し、上記動物に肝炎抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇ）およびアジュバント活性を示すのに十分な量のリバビリンを与えることによって、動物の肝炎（例えば、ＨＢＶ）を治療または予防する方法が含まれる。
【０１７１】
他の実施形態には、その免疫応答を高めるのに有効な量のリバビリンを、免疫応答の強化を必要としている動物に与えることによって、抗原への免疫応答を高める方法が含まれる。これらの実施形態では、現在利用可能な診断試験または臨床評価を用いて、抗原への免疫応答の強化を必要とする動物が特定される。多くの場合、これらの個体は、疾病（例えば、細菌、真菌、かび、ウィルス、またはがん）を患うことになる、あるいは疾病に感染する危険がある。しかしながら、免疫応答の強化の必要がある動物は、毒された（例えば、有毒な昆虫または動物に噛まれた）動物、あるいは毒素または他の有毒化合物へさらされた動物であることもある。いったん特定されたら、これらの動物は、適切な抗原、および動物中の免疫応答を高めるのに有効な量のリバビリンが与えられる。
【０１７２】
上記のように、これらの実施形態で使用することができる肝炎ウィルス抗原には、ＨＢＶ抗原、ＨＡＶ抗原、ＨＣＶ抗原、これらの分子をコードする核酸、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定はされない。より好ましい実施形態としては、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）、およびＥ型肝炎抗原（ＨＢeＡｇ）から成る群から選択されるＨＢＶ抗原、特に、上記のペプチドおよび核酸ベースの抗原が挙げられる。リバビリンおよび抗原は、別々に、あるいは組み合わせて与えることができ、他のアジュバント（例えば、オイル、ミョウバン、または免疫応答を高める他の作用物質）を、免疫応答の強化を必要としている動物に与えることもできる。したがって、好ましい実施形態には、免疫応答の強化を必要としている動物を特定し、肝炎抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｅＡｇ）と動物中の免疫応答を高めるのに有効な量のリバビリンを動物に与えることによって、肝炎抗原(例えば、ＨＢＶ)への免疫応答を高める方法が含まれる。
【０１７３】
１つのアプローチでは、例えば、非感染個体を、ＨＣＶに感染することから保護するために、ＮＳ３に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘発するのに十分な量の上述のワクチン組成物を、該個体に与えてもよい。別の実施形態では、ＨＣＶ感染個体が特定され、ＨＣＶ感染を減少または排除するために、ＮＳ３に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答を高めるのに十分な量のリバビリンおよびＮＳ３を含むワクチン組成物を与える。このような個体は、感染の慢性期でも急性期の個体でもよい。さらに別の実施形態では、ＨＣＣを患っているＨＣＶ感染個体は、ＮＳ３発現腫瘍細胞に対する細胞性免疫応答および体液性免疫応答を誘発するのに十分な量のリバビリンおよびＮＳ３／４Ａ融合遺伝子を含む組成物が与えられる。
【０１７４】
本発明は実施形態および実施例を参照して説明されたが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更が成され得ることは、理解されるべきである。したがって、本発明は併記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  １ｍｇの単一用量のリバビリンが同時投与された場合の、平均終点力価で決定される、１０および１００μｇの組換え型Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）非構造的３タンパク質（ＮＳ３）に対する体液性応答を示すグラフである。
【図２】  ０．１、１．０、または１０ｍｇの単一用量のリバビリンが同時投与された場合の、平均終点力価で決定される、２０μｇの組換え型Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）非構造的３タンパク質（ＮＳ３）に対する体液性応答を示すグラフである。
【図３】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再生反応により決定される、ＮＳ３特異的リンパ節増殖反応に対する１ｍｇの単一用量のリバビリンの効果を示すグラフである。
【図４】  最初の免疫化後の時間の関数として、Ｈ−２dマウスのＮＳ３に対する抗体力価を示すグラフである。ひし形はＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸで免疫化されたマウスの抗体力価を示し、正方形はＮＳ３−ｐＶＡＸで免疫化されたマウスの抗体力価を示す。
【図５】  Ａは、エフェクタ対標的比の関数として、特異的ＣＴＬにより媒介されるＳＰ２／０標的細胞の溶菌の割合を示すグラフである。コントロール免疫原としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用した。
Ｂは、エフェクタ対標的比の関数として、特異的ＣＴＬにより媒介されるＳＰ２／０標的細胞の溶菌の割合を示すグラフである。免疫原としてプラスミドＮＳ３／４Ａ−ｐＶＡＸを使用した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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