(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２５４で受託されている六価クロム還元微生物。
【請求項２】
セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２５５で受託されている六価クロム還元微生物。
【請求項３】
請求項１記載の微生物及び請求項２記載の微生物の少なくともいずれかを、六価クロムと接触させることを特徴とする六価クロムの還元処理方法。
【請求項４】
請求項１記載の微生物及び請求項２記載の微生物の少なくともいずれかを、六価クロム含有環境に接触させることを特徴とする環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、六価クロムを還元する微生物及びこの微生物を利用した環境浄化方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、環境汚染物質である六価クロムを三価クロムに還元して無害化する能力を有する新規微生物と、この新規微生物を利用して六価クロムに汚染された土壌や地下水等の環境を浄化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、重金属による土壌や地下水等の環境汚染が問題となっている。重金属の中でも、六価クロムは、強い生物毒性を示す水溶性の有害金属として知られており、水に溶け込んで環境中に拡散し、深刻な環境汚染問題を惹起しやすい。
【０００３】
ところで、六価クロムは三価クロムに還元されると不溶性となり、且つ毒性が著しく低下する。そこで、六価クロム還元能を有する微生物の作用により、六価クロムを沈殿させて不活性化する所謂バイオレメディエーション技術により、土壌等での原位置処理により、六価クロムを還元し、その濃度を低減する技術が検討されている。
【０００４】
六価クロム還元能を有する微生物としては、例えば、Pseudomonas属、Aeromonas属に属する微生物が知られている。これらの微生物は、嫌気環境において従属栄養的に増殖し、増殖する過程において六価クロムを還元することが報告されている（非特許文献１）。したがって、これらの微生物を用いたバイオレメディエーションにより、嫌気環境下で炭素源を供給しながら、環境中の六価クロム濃度を低減することができる。
【０００５】
【非特許文献１】Y. Wang, "Microbial reduction of Chromate", in Environmental microbe-metal interacions edited by D.R. Lovley, ASM Press Washington, DC(2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１において報告されている微生物は、増殖する過程において六価クロムを還元する微生物であることから、六価クロムの還元能を発揮させる上で、炭素源の供給が必要不可欠なものとなる。しかしながら、炭素源の供給は、バイオレメディエーションにおけるコスト上昇の要因となる。そこで、バイオレメディエーションにかかるコストを低減すべく、六価クロムを還元する際に炭素源を必要としない微生物の取得が望まれている。
【０００７】
また、地下水や土壌のような環境においては、環境条件が時間と共に好気性から嫌気性に変化したり、逆に、嫌気性から好気性に変化する場合がある。このような状況下において、非特許文献１で報告されている微生物のように、嫌気性環境でしか六価クロムの還元能を発揮しない微生物をバイオレメディエーションに利用すると、環境が好気性に変化した場合に、六価クロムを還元することができなくなる。また、地下水や土壌のような環境においては、環境条件が好気性であるのか嫌気性であるのかを特定することが難しい場合もあり、嫌気性及び好気性のいずれか一方の環境でしか六価クロムの還元能を発揮しない微生物を利用すると、その微生物が環境条件に適合しない場合があり、六価クロムを十分に還元することができない虞もある。そこで、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても、六価クロム還元能を発揮することのできる微生物の取得が望まれている。
【０００８】
本発明は、かかる要望に鑑みてなされたものであって、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても六価クロム還元能を発揮し、且つ六価クロムを還元する際に炭素源を必要としない新規微生物を提供することを目的とする。また、本発明は、この新規微生物を利用した環境浄化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決するため、本願発明者等が新規微生物を鋭意探索した結果、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても六価クロム還元能を発揮し、且つ六価クロムを還元する際に炭素源を必要としない新規微生物を取得するに至った。
【００１０】
即ち、本発明の新規微生物は、セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２５４で受託されている六価クロム還元微生物である。以降の説明では、この新規微生物を「ＣｒＲＢ−１」と呼ぶこともある。
【００１１】
また、本発明の新規微生物は、セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−２５５で受託されている六価クロム還元微生物である。以降の説明では、この新規微生物を「ＣｒＲＢ−２」と呼ぶこともある。
【００１２】
本発明の新規微生物であるＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２によると、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても六価クロム還元能を発揮し、且つ六価クロムを還元する際に炭素源を必要としない。
【００１３】
尚、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１は、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２と比較して、嫌気環境における六価クロム還元能力が高い。逆に、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２は、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１と比較して、好気環境における六価クロム還元能力が高い。
【００１４】
また、本発明の六価クロムの還元処理方法は、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１及び六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２の少なくともいずれかを、六価クロムと接触させるようにしている。
【００１５】
したがって、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１及び六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２の少なくともいずれかの作用により六価クロムが三価クロムに還元される。
【００１６】
また、本発明の環境浄化方法は、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１及び六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２の少なくともいずれかを、六価クロム含有環境に接触させるようにしている。
【００１７】
したがって、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１及び六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２の少なくともいずれかの作用により、環境中に含まれている六価クロムが三価クロムに還元される。
【００１８】
尚、「六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１及び六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２の少なくともいずれか」とは、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１を単独で用いる場合と、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２を単独で用いる場合と、六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−１と六価クロム還元微生物ＣｒＲＢ−２とを併用する場合とを意味している。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の六価クロム還元微生物によれば、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても六価クロム還元能を発揮し、且つ六価クロムを還元する際に炭素源を必要としない。したがって、本発明の六価クロム還元微生物を利用した六価クロム還元処理方法並びに環境浄化方法によれば、好気性及び嫌気性のいずれの環境条件においても六価クロム還元能を発揮するので、環境が好気性から嫌気性に変化したり、逆に嫌気性から好気性に変化した場合であっても、六価クロムを還元させ続けることが可能となる。また、六価クロムの除去対象環境が好気性であるか嫌気性であるかが特定できない場合であっても、六価クロムを還元することが可能となる。さらに、六価クロムを還元する能力を発揮させる意味での炭素源の供給を行う必要がなくなるので、処理コストを低減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００２１】
本発明の二種の微生物は、セルロシミクロビウム（Cellulosimicrobium）属に属する六価クロム還元微生物である。これまでに、セルロシミクロビウム属に属する微生物において、六価クロム還元能を有する微生物はこれまでに報告例がなく、本願発明者等によって単離された新規微生物である。尚、これら二種の微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにて、２００６年８月８日付けで受託されている。受託番号はそれぞれ、ＮＩＴＥ  Ｐ−２５４（ＣｒＲＢ−１）、ＮＩＴＥ  Ｐ−２５５（ＣｒＲＢ−２）である。
【００２２】
ここで、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、分類の指標となる１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列が１００％一致している。つまり、系統分類上、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２は、同一種または極めて近縁な微生物である。ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２について、１６ＳｒＤＮＡ領域の塩基配列を配列番号１に示す。
【００２３】
しかしながら、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２とは、微生物の形態と機能が異なる。
【００２４】
即ち、ＣｒＲＢ−１は黄色の球菌であるのに対し、ＣｒＲＢ−２は白色の桿菌である。また、ＣｒＲＢ−１はＣｒＲＢ−２と比較して嫌気環境下における六価クロム還元能が高い。一方、ＣｒＲＢ−２はＣｒＲＢ−１と比較して好気環境下における六価クロム還元能が高い。
【００２５】
また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は共に通性嫌気性細菌であることから、好気環境下及び嫌気環境下のいずれにおいても増殖するが、好気環境下で酸素呼吸により増殖させた方が、嫌気条件下で嫌気呼吸により増殖させる場合よりもエネルギー的に有利となる。したがって、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、好気条件下で培養させることがことが好適である。
【００２６】
但し、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が混在している場合、好気条件下ではＣｒＲＢ−２の増殖速度の方がＣｒＲＢ−１の増殖速度よりも速いため、ＣｒＲＢ−２が炭素源を先に消費して優先的に増殖する。逆に、嫌気条件下ではＣｒＲＢ−１の増殖速度の方がＣｒＲＢ−２の増殖速度よりも速いため、ＣｒＲＢ−１が炭素源を先に消費して優先的に増殖する。したがって、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が混在している場合、ＣｒＲＢ−１を優先的に増殖させたい場合には、嫌気条件で培養することが好ましく、ＣｒＲＢ−２を優先的に増殖させたい場合には、好気条件で培養することが好ましい。
【００２７】
培養温度は、微生物を培養させる際の一般的な温度であれば特に限定されるものではなく、例えば、２０℃〜３５℃程度とすればよい。
【００２８】
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を培養する（増殖させる）培地組成は、例えば、ＮＨ４Ｃｌを１．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌを０．２５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４を０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４を０．６ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．０１ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ２・ｎＨ２Ｏを０．０２ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを０．０１ｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２を０．００５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２を０．００５ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを０．０１ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４を０．０６ｇ／Ｌ、乳酸ナトリウムを１．０ｇ／Ｌ、酵母エキスを０．２ｇ／Ｌとし、中性（ｐＨ７〜８）とすればよいが、この培地組成に限定されるものではなく、例えば、ＬＢ培地を用いてもよい。また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を増殖させる際の炭素源としては、乳酸、酵母エキスの他にも、グルカン類を用いることができる。ここで、グルカン類とは、セルロース類やグルカンの総称であり、セルロース類としては、例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース等が挙げられる。また、グルカンとしては、カードラン（β−１，３−グルカン）が挙げられる。
【００２９】
ここで、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、培地に六価クロムを添加することなく増殖させることができる点に特徴がある。また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、炭素源を与えなくても、六価クロムを三価クロムに還元する機能を有している点に特徴がある。即ち、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロムを三価クロムに還元する機能が、増殖とはリンクしていない。したがって、培養時に六価クロムを与える必要はない。また、炭素源を与えて必要量のＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を培養した後は、炭素源を与えることなく、六価クロムを三価クロムに還元する機能を発揮させることができる。
【００３０】
本願発明者等の実験によると、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、培養開始から三日程度で炭素源を消費し尽くしてフルグロースに達した。そして、その後、炭素源を新たに供給することなく、少なくとも３２日間、六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮することが確認された。即ち、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、炭素源を与えることなく、少なくとも１ヶ月程度は、六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮することができる微生物である。したがって、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、従来の六価クロム還元微生物のように、炭素源を与えながら増殖させる際に、増殖に伴って六価クロムを三価クロムに還元するものではない。つまり、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロムを三価クロムに還元する能力が、増殖（生育）とは切り離されている微生物である。換言すれば、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロムを呼吸基質として用いない六価クロム還元微生物である。
【００３１】
ここで、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の生存維持（個体数維持）という意味においては、炭素源の供給が必要である。本発明者等の実験によれば、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、少なくとも１ヶ月程度は、六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮することができたことから、例えば１ヶ月に１回程度炭素源を供給すれば、確実に生存維持を図ることができる。しかしながら、炭素源を供給する間隔を１ヶ月よりも長い間隔としたり、あるいは炭素源を殆ど供給せずとも、生存維持を図ることができる場合がある。即ち、土壌環境には、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が利用可能な炭素源が存在している場合がある。例えば、土壌環境における炭素源の主要な供給源は植物であり、植物の主要成分はセルロースであることから、土壌環境にはセルロースが存在している場合が多い。ここで、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、上記したように、セルロースを炭素源として利用することが可能な微生物であることから、土壌環境にセルロースが存在している場合には、セルロースを炭素源として利用することができる。したがって、炭素源を供給する間隔を１ヶ月よりも長い間隔としたり、あるいは炭素源を殆ど供給せずとも、六価クロムを三価クロムに還元する能力を長期に亘って発揮させることができる場合もある。
【００３２】
また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、好気環境及び嫌気環境のいずれの環境においても、六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮する点に特徴がある。したがって、環境条件が好気性であるか嫌気性であるかの特定が困難な環境においても、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の少なくともいずれか一方を添加してバイオレメディエーションを行うことで、六価クロムを三価クロムに還元することができる。また、環境条件が好気性から嫌気性に変化するような環境や、逆に嫌気性から好気性に変化するような環境においても、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の少なくともいずれか一方を添加してバイオレメディエーションを行うことで、六価クロムを三価クロムに還元することができる。
【００３３】
尚、ＣｒＲＢ−１はＣｒＲＢ−２と比較して、嫌気環境における六価クロム還元能力が高い。したがって、環境が嫌気性であることが予め分かっている場合には、ＣｒＲＢ−１を用いることが有利である。逆に、ＣｒＲＢ−２はＣｒＲＢ−１と比較して、好気環境における六価クロム還元能力が高い。したがって、環境が好気性であることが予め分かっている場合には、ＣｒＲＢ−２を用いることが有利である。
【００３４】
ここで、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２は併用することが好ましい。この場合には、環境条件が嫌気性に偏り出したときに、ＣｒＲＢ−１に優れた六価クロム還元能力を発揮させ、環境が好気性に偏り出したときに、ＣｒＲＢ−２が優れた六価クロム還元能力を発揮させることができる。
【００３５】
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロムを環境汚染物質として含有する環境の浄化に利用することができる。浄化対象の環境としては、液体廃棄物、工場排水等の水環境、スラッジ、表層土壌、地下の堆積物等の汚染土壌を含む、各種環境を挙げることができる。ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を用いた環境浄化方法は、従来公知のバイオレメディエーション技術を適用することで実現することが可能である。例えば、六価クロムを含有する環境の原位置で処理する所謂原位置処理プロセスや、地上に設置されたリアクター等に六価クロムで汚染された土壌や液体廃棄物等を投入して処理する所謂移動処理プロセスにより、環境を浄化することができる。
【００３６】
原位置処理プロセス及び移動処理プロセスのいずれを適用した場合においても、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の少なくともいずれかを浄化の対象となる環境と接触させることによって、この環境に含まれる六価クロムを減少させ、無害化することができる。尚、六価クロムが還元されることにより生成する三価クロムは、従来公知の方法によって、回収することが可能である。
【００３７】
なお、上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロム還元能力の他にも、硝酸還元能力とキノン化合物還元能力とを発揮する微生物であることから、硝酸やキノン化合物の除去を目的としたバイオレメディエーションに適用することも可能である。
【実施例】
【００３８】
以下実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（１）微生物の取得
千葉県我孫子市内の湖沼底泥および土壌から取得したサンプルを無機基本培地に懸濁させて一時間振とう撹拌した後、土粒子を固液分離して微生物懸濁液を得た。そして、この微生物懸濁液を特開２００６−５５１３４記載の培養方法を用いて培養した後、本発明の二種の微生物を単離し、この二種の微生物をそれぞれＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２と名付けた。無機基本培地の組成を表１に示し、無機基本培地中の金属溶液の成分組成を表２に示す。尚、無機基本培地は、調整後にオートクレーブ滅菌を施し、実験直前に、クロム塩および有機成分（Yeast Extract：０．２ｇ／Ｌ、乳酸ナトリウム：１ｇ／Ｌ）を混合し、フィルター（０．２２μｍ，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）によりろ過除菌した。
【００４０】
【表１】
0005113557.tif 000002
【００４１】
【表２】
0005113557.tif 000003
【００４２】
（２）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の同定
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の形態を調べた結果、ＣｒＲＢ−１は黄色の球菌であり、ＣｒＲＢ−２は白色の桿菌であることが確認された。
【００４３】
また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、通性嫌気性細菌であることが確認された。
【００４４】
さらに、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を公知の方法（dideoxy nucleotide chain termination法  参考文献：微生物の分類・同定実験法, 2001年, 鈴木健一郎ら編）に基づいて決定したところ、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の１６ＳｒＤＮＡの領域の塩基配列が１００％一致していることが確認された。この結果から、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２は、系統分類上、同一種または極めて近縁な微生物であることがわかった。ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の１６ＳｒＤＮＡの領域の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００４５】
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の１６ＳｒＤＮＡの領域の塩基配列から、公知の方法（dideoxy nucleotide chain termination法  参考文献：微生物の分類・同定実験法, 2001年, 鈴木健一郎ら編  ）により属の特定を行ったところ、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２がCellulosimicrobium属に属するグラム陽性菌であることが確認された。ここで、Cellulosimicrobium属に属する微生物が六価クロム還元能力を有していることが報告された例は無いことから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、新規微生物であることがわかった。
【００４６】
因みに、GeneBank/DDBJ/EMBLデータベースから相同性検索を行った結果、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２と遺伝子レベルで最近縁である微生物は、Cellulosimicrobium cellulansであり、１６ＳｒＤＮＡの領域の塩基配列の相同性が９９％であることが確認された。しかしながら、Cellulosimicrobium cellulansは、黄色の桿菌であると共に、六価クロム還元能力は有していないことが知られており、本発明の新規微生物であるＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２とは、その形態と機能とが異なるものであることがわかった。
【００４７】
（３）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の検討
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性について検討した。培養液の組成を表３に示し、培養液に含まれる金属溶液の成分組成を表４に示す。
【００４８】
【表３】
0005113557.tif 000004
【００４９】
【表４】
0005113557.tif 000005
【００５０】
六価クロムの初期濃度は、４ｐｐｍ（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。そして、培養開始から０日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目において、培養液の六価クロム濃度の測定と、ＯＤ６６０の測定とを行った。
【００５１】
尚、培養液中のクロムは、六価クロムの状態では溶液中に溶解しているが、三価クロムの状態では沈殿する。本実施例では、六価クロムの濃度変化のみを測定するため、培養液をフィルター（０．２２μm，Millex-GS，MILLIPORE，Ireland）でろ過して六価クロムのみを抽出した後、六価クロム濃度の分析を行った。六価クロムの定量にはＩＣＰ発光分析装置（Ｐ４０００、日立社製）を使用した。
【００５２】
ＯＤ６６０は、培養液中の微生物数の指標となる値であり、吸光光度計（製品名：U-3010 spectrophotometer，会社名：HITACHI）を使用して分析した。
【００５３】
上記条件をベースとして、以下の（ａ）〜（ｆ）の条件で実験を行った。結果を図１〜図３に示す。図１は、好気条件下における六価クロム濃度の経時変化を示す図であり、図２は嫌気条件下における六価クロム濃度の経時変化を示す図であり、図３は、微生物の生育状況を示す図である。尚、図１に示す実験のみ、培養開始から１５日目と１７日目についても培養液の六価クロムの濃度の測定を行った。また、好気条件は、ろ過滅菌した培地３０ｍＬを１００ｍＬ容バイアル瓶に入れ、ブチルゴムにより密栓し、バイアル瓶内の気相を空気とすることにより形成した。嫌気条件は、密閉したバイアル瓶の気相部分および培地中の溶存酸素を窒素で置換することにより形成した。
（ａ）好気条件、ＣｒＲＢ−１のみ（図１及び図３の◆）
（ｂ）好気条件、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２を併存（図１及び図３の■）
（ｃ）好気条件、ＣｒＲＢ−２のみ（図１及び図３の▲）
（ｄ）嫌気条件、ＣｒＲＢ−１のみ（図２の◆及び図３の×）
（ｅ）嫌気条件、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２を併存（図２の■及び図３の＊）
（ｆ）嫌気条件、ＣｒＲＢ−２のみ（図２の▲及び図３の●）
【００５４】
図３に示す結果から明らかなように、（ａ）〜（ｆ）のいずれの条件においても、培養開始から三日目でほぼフルグロースに達することが確認された。したがって、本実施例の培養条件で培養した場合には、培養開始から３日程度で培養液中の炭素源が消費しつくされ、微生物の増殖は起こらなくなることが分かった。尚、本実施例で確認されたＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の増殖速度は、増殖速度が速いことが知られている大腸菌等の微生物と同程度である。したがって、必要な数のＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を迅速に取得することが可能であることが明らかとなった。
【００５５】
また、好気条件下においては、ＣｒＲＢ−２の方がＣｒＲＢ−１よりも増殖速度が速く、逆に、嫌気条件下においては、ＣｒＲＢ−１の方がＣｒＲＢ−２よりも増殖速度が速いことが確認された。尚、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２とを併存させた場合、好気条件下においては、ＣｒＲＢ−２単独の場合とほぼ同じ増殖傾向が見られ、また、嫌気条件下においては、ＣｒＲＢ−１単独の場合とほぼ同じ増殖傾向が見られた。したがって、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２とを併存させた場合、増殖速度の速い微生物が優先的に増殖することが明らかとなった。
【００５６】
次に、図１及び図２に示すように、培養期間の経過と共に、培養液の六価クロム濃度が減少していく傾向が見られた。しかも、培養液中の炭素源を消費し尽くしたと考えられる培養開始から３日目以降においても、六価クロム濃度の減少が見られたことから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、炭素源を必要とすることなく、六価クロムを還元する能力を有していることが明らかとなった。また、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元能力は、増殖とはリンクしていないことが明らかとなった。
【００５７】
また、図３からも明らかなように、培養開始から３日目以降における培養液中の微生物数は、ほぼ等しいにも関わらず、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２を用いた場合で、培養液中の六価クロム濃度に差が見られた。即ち、好気条件下においては、ＣｒＲＢ−２を用いた場合の方がＣｒＲＢ−１を用いた場合よりも六価クロム濃度の減少速度が高まり、嫌気条件下においては、ＣｒＲＢ−１を用いた場合の方がＣｒＲＢ−２を用いた場合よりも六価クロム濃度の減少速度が高まることが確認された。
【００５８】
以上の結果から、以下の知見が得られた。
（Ａ）ＣｒＲＢ−１は炭素源を必要とすることなく、好気条件下と嫌気条件下の双方で六価クロムを還元する能力を有しており、その能力は、嫌気環境下においてより高まる。
（Ｂ）ＣｒＲＢ−２は炭素源を必要とすることなく、好気条件下と嫌気条件下の双方で六価クロムを還元する能力を有しており、その能力は、好気環境下においてより高まる。
【００５９】
尚、以上の結果から、ＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２は併用することで、環境条件が嫌気性に偏り出したときに、ＣｒＲＢ−１に優れた六価クロム還元能力を発揮させ、環境が好気性に偏り出したときに、ＣｒＲＢ−２が優れた六価クロム還元能力を発揮させることで、六価クロム還元能力を常時最大限に発揮させてバイオレメディエーションを行うことが可能であることが明らかとなった。
【００６０】
また、図１に示す結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、培養開始から１７日目においても六価クロムの還元活性を示した。また、培養開始から３日程度で炭素源が消費し尽くされたことを考えると、炭素源が無くなった後、少なくとも１４日は、六価クロム還元活性を示すことが明らかとなった。
【００６１】
尚、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の培養に関し、本発明者等がさらに実験を行ったところ、六価クロムを培地に添加しなくても、増殖することが確認された。したがって、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を増殖させる際には、六価クロムを添加する必要がないことが明らかとなった。このことから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２は、六価クロムを呼吸基質として用いない六価クロム還元微生物であることが明らかとなった。
【００６２】
（４）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の維持期間の検討
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の維持期間について、上記（３）の実験と同様の手法により検討した。但し、初期六価クロム濃度は、１１ｐｐｍ（０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。結果を図４及び図５に示す。図４は、好気条件下における実験結果を示し、図５は、嫌気条件下における実験結果を示している。また、図４及び図５において、◆はＣｒＲＢ−１を用いた場合の結果を示し、■はＣｒＲＢ−２を用いた場合の結果を示している。
【００６３】
図４及び図５に示す結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、培養開始から３２日目まで、六価クロム還元活性を示すことが確認された。上記の通り、培養開始から３日程度で炭素源が消費し尽くされたと考えられることから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、少なくとも１ヶ月程度は、炭素源なしで六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮することが明らかとなった。また、図４及び図５に示す結果から、六価クロムの濃度は培養開始から３２日目まで減少し続けており、３２日目以降においてもある一定期間は炭素源の供給無しで六価クロムを三価クロムに還元する能力を発揮することが考えられる。
【００６４】
以上の結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を用いてバイオレメディエーションを行う際には、少なくとも１ヶ月程度は、炭素源を供給することなく環境中の六価クロム濃度を低減することができることが明らかとなった。ここで、土壌等の環境中には炭素源が少なからず存在している場合が多く、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が生存の維持という意味で環境中の炭素源を利用することで、１ヶ月以降も炭素源を人為的に供給することなく、環境中の六価クロム濃度を低減しうることが明らかとなった。勿論、環境中の炭素源が不足している場合には、１ヶ月に一回程度炭素源を人為的に供給することで、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の生存の維持を図って、環境中の六価クロム濃度を長期に亘って低減するようにしてもよい。
【００６５】
（５）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の六価クロム濃度依存性
ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の六価クロム濃度依存性について、上記（４）の実験と同様の手法により検討した。但し、培養液の六価クロム濃度は、２．５ｐｐｍ，１１ｐｐｍ，２７ｐｐｍ，６０ｐｐｍ，１００ｐｐｍとし、培養期間は１ヶ月とした。結果を図６に示す。
【００６６】
図６におけるグラフは左から順に、好気条件下においてＣｒＲＢ−１を培養した結果、好気条件下においてＣｒＲＢ−２を培養した結果、嫌気条件下においてＣｒＲＢ−１を培養した結果、嫌気条件下においてＣｒＲＢ−２を培養した結果を示している。図６からも明らかなように、培養液の初期六価クロム濃度が低濃度であればあるほど、六価クロムの除去率が高まることが明らかとなった。この実験結果が示す傾向から、培養液の初期濃度が２．５ｐｐｍよりも小さい場合においても、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を用いて六価クロム濃度を低減可能であると考えられた。
【００６７】
また、培養液の初期六価クロム濃度を０．１ｍｍｏｌ／Ｌ（４ｐｐｍ）として、約４ヶ月間培養（炭素源は培養開始時に初期濃度として乳酸ナトリウム1.0g/L, 酵母エキス0.2g/Lを添加した）したところ、培養液の六価クロム濃度は、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２を用いた場合の双方ともに、０．０５ｐｐｍ以下となった。したがって、本発明の新規微生物であるＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２によれば、六価クロムの濃度を、排出基準値として制定されている０．０５ｐｐｍ以下に低減できることが明らかとなった。
【００６８】
次に、六価クロムの初期濃度を０．５ｐｐｍとし、上記（４）の実験と同様の手法により、好気もしくは嫌気条件でＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の培養を行い、培養開始から５日後と７日後の培養液中の六価クロム濃度をＩＣＰ発光分析装置（Optima 5300 DV, PerkinElmer）で定量した。実験結果を図７及び図８に示す。図７及び図８において、左側の棒グラフがＣｒＲＢ−１の実験結果を示し、右側の棒グラフがＣｒＲＢ−２の実験結果を示している。図７及び図８に示す実験結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の双方とも、好気嫌気いずれの環境下においても、培養７日目において０．０５ｐｐｍ以下に六価クロムの濃度を低減していることが確認された（好気環境下では、０．０２ｐｐｍ程度、嫌気環境下では０．０１ｐｐｍ程度まで六価クロム濃度が低減していた）。このことから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の双方とも、好気嫌気いずれの環境下においても、六価クロムの排出基準値として制定されている０．０５ｐｐｍ以下の六価クロムの低減処理に使用できることが明らかとなった。
【００６９】
（６）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の他の環境汚染物質を除去する能力の検討
表３に示す培地からクロム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）を除いたものに電子受容体として可溶性キノンであるアントラキノンジスルホン酸 （ＡＱＤＳ）を２ｍｍｏｌ／Ｌ添加し、１００ｍＬバイアル瓶（培地３０ｍＬ）を用いて嫌気条件下（窒素）でＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２をそれぞれ二週間培養した。その結果、培養前には無色透明であった培養液が、二週間培養した後には濃いオレンジ色に色が変化することが確認された。アントラキノンジスルホン酸は、還元されることによって、色が濃いオレンジ色に変化することが知られている。したがって、本実施例の結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、アントラキノンジスルホン酸を還元する能力を有していることが明らかとなった。そしてこのことから、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が共に、キノン化合物全般を還元する能力を有している可能性が示唆された。
【００７０】
次に、表３に示す培地からクロム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）を除いたものに電子受容体として硝酸１０００ｐｐｍを添加し、１００ｍＬバイアル瓶（培地３０ｍＬ）を用いて嫌気条件下（窒素）でＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２をそれぞれ二週間培養した。そして、二週間培養した後の培養液中の硝酸イオン濃度を、イオンクロマトアナライザ（ＩＣＳ１５００，ＤＩＯＮＥＸ社製）にて測定した。その結果、硝酸イオン濃度は、初期濃度１０００ｐｐｍに対し、ＣｒＲＢ−１を用いた場合には１．４６±０．０６６ｐｐｍまで減少し、ＣｒＲＢ−２を用いた場合には１．８６±０．４５ｐｐｍまで減少することが確認された。したがって、本実施例の結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、硝酸を還元する能力を有していることが明らかとなった。
【００７１】
（７）ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２が利用可能な炭素源の検討
表３に示す培地から炭素源である乳酸ナトリウムと酵母エキスを除いたものに、水溶性のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）またはβ−１，３−グルカン（カードラン）を添加し、平板培地にてＣｒＲＢ−１とＣｒＲＢ−２をそれぞれ培養したところ、増殖することが確認された。また、ヒドロキシエチルセルロースを炭素源として用いた場合にも、増殖することが確認された。この結果から、ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２共に、炭素源としてセルロース類やグルカンといったグルカン類を利用できることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】好気条件下における六価クロム濃度の経時変化を示す図である。
【図２】嫌気条件下における六価クロム濃度の経時変化を示す図である。
【図３】ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の生育状況を示す図である。
【図４】好気条件下におけるＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の維持期間を示す図である。
【図５】嫌気条件下におけるＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の維持期間を示す図である
【図６】ＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の六価クロム還元活性の六価クロム濃度依存性を示す図である。
【図７】六価クロム濃度が０．５ｐｐｍの培養液を用いた場合のＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の好気条件下での六価クロム還元活性を示す図である。
【図８】六価クロム濃度が０．５ｐｐｍの培養液を用いた場合のＣｒＲＢ−１及びＣｒＲＢ−２の嫌気条件下での六価クロム還元活性を示す図である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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