(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−４１０で表される、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール生産能力を有する、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する耐熱性エタノール生産細菌。
【請求項２】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−４１１で表される、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール生産能力を有する、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する耐熱性エタノール生産細菌。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の耐熱性エタノール生産細菌を用いることを特徴とする、エタノールの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温条件下においてエタノール生産が可能な新規微生物及びこれを用いたエタノール生産方法に関する。より詳しくは、３７−３９℃の温度条件下においてエタノール生産能を有する、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する細菌株及びこれを用いたエタノール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食用・工業用を問わず、エタノールは多様な用途に利用される物質であり、工業用には化学合成したエタノールが、食用は微生物などを用いた醸造エタノールがそれぞれ利用されてきている。近年、バイオテクノロジーの発展とバイオマス利用への意識が高まった事により、食用だけではなく工業用、特に燃料用エタノールにも発酵生産技術を利用しようとする試みが広がり始めている。エタノール生産に微生物を用いる発酵生産技術は古くから用いられてきた技術であり、その主役を担う微生物の生産性向上を目指した改良も数多く開示されている。
【０００３】
エタノールの発酵生産に用いられる主な微生物は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるが、その他の微生物としてザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）などザイモモナス属に属する細菌のみにエタノール発酵能力があることが知られている（非特許文献１）。ザイモモナスはテキーラ（Ｔｅｑｕｉｌａ）やプルケ（Ｐｕｌｑｕｅ）の生産に用いられるグラム陰性の嫌気性細菌であり、エタノール発酵においてはその発酵速度や菌体あたりのエタノール生産能が酵母より大きく、更に発酵時に生産されるバイオマスの量が酵母よりも少ないなどの有利な特徴を持っているが、エタノール耐性や温度耐性、利用可能な糖が限定される点など酵母に劣る部分もあり、工業的な利用が進まなかったのが現状であった。近年、ザイモモナス属細菌を利用した発酵生産技術としては、レバンなど有用物質の発酵生産技術（特許文献１−５）、エタノール発酵生産を向上させるための、遺伝子導入をはじめとする種々の技術（特許文献６−９）や、耐塩性、接合能、資化性向上など有用形質を持った菌株（特許文献１０−１２）などがこれまでに開示されているが、発酵生産において工業的に重要な改良の一つである耐熱性についてはこれまで開発が進んでこなかった。特許文献８にはザイモモナスと乳酸菌を３７℃という高温で共培養して発酵させる旨記載されているが、これはエタノール生産を低く抑えるための高温発酵であって、高温条件下で高効率なエタノール生産を目的とするものではなかった。これらの背景から、今後需要の急増が見込まれるエタノール発酵生産技術において適用可能な、熱耐性を持った微生物の開発が待たれていた。
【特許文献１】特開平２−１０９９８９  グルコン酸およびソルビトールの製造法
【特許文献２】特開平２−１９５８７０  ザイモモナス・モビリスの新菌株並びにその菌株を使用するレバンの製法
【特許文献３】特開平６−２２５７８１  微生物を用いた飽和デルタ−ラクトンの製造方法
【特許文献４】特開２００３−２７７２２５  細胞増殖作用と皮膚保湿及び刺激緩和効能を持つレバンを含む化粧料組成物
【特許文献５】特開２００４−３３９０７８  外用剤組成物
【特許文献６】特開昭６３−０１７６９６  アルコールの発酵方法
【特許文献７】特開平４−０６６０９０  異種遺伝子高発現ベクター
【特許文献８】特開平７−０００１０３  適量の炭酸及び低濃度のエタノールを含有する発酵乳の製造法
【特許文献９】特開２００７−０１４３０６  染色体組み込みマンノース発酵性ザイモモナス細菌
【特許文献１０】特開昭６３−０７４４８２  糖蜜からのエタノール製造に適した細菌
【特許文献１１】特開平１−１７１４８１  新規なザイモモナス・モビリス
【特許文献１２】特開平４−２８１７８３  マルトースからのエタノール製造に適した新規細菌
【非特許文献１】Ｒｏｇｅｒｓ  Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９８０．Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５（６）：７−１１．
【非特許文献２】Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．１９７８．Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２０４５−５６．
【非特許文献３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の現状に鑑み、本発明は、３５℃以上の温度条件下、好ましくは３７−３９℃の温度条件下でも効率よくエタノールの発酵生産が可能な新規ザイモモナス属細菌株及びこれを用いたエタノール生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題の解決のため、本発明者らは、常に高温条件下にある熱帯地域に生息する発酵微生物に着目し、本課題を解決可能なザイモモナス・モビリス（以下Ｚｍ菌とも略す）株を単離する方法を試みた。すなわち熱帯地域から単離・株化されたＺｍ菌の複数の株について、３０℃から４０℃における増殖能とエタノール生産能とを既に確立されたＺｍ菌のエタノール高生産株と比較検討し、このうち特定の株が３５℃以上、好ましくは３７−３９℃というＺｍ菌にとっては過酷な温度条件下でも高い増殖能とエタノール発酵生産能力を有していることを見いだし、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち本発明の第１の態様は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−４１０で表される、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール生産能力を有する、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する耐熱性エタノール生産細菌を提供する。
【０００７】
本発明の第２の態様は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−４１１で表される、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール生産能力を有する、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する耐熱性エタノール生産細菌を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、請求項１又は２に記載の耐熱性エタノール生産細菌を用いることを特徴とする、エタノールの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌を利用することにより、食品用・工業用を問わず効率的にエタノールを生産することが可能となる。特に本発明の提供する菌株は、好ましくは３７−３９℃と高い温度条件においても効率よくエタノールを発酵生産する能力を有しており、発酵装置の冷却コストの低減、他種の微生物のコンタミネーションの低減、発酵速度の増大など、エタノール発酵生産のコスト削減と効率化を達成可能と期待される。エタノール生産細菌は、通常エタノール生産に用いられる酵母に比べ高いエタノール生産効率を有し、更に発酵に伴って生産されるバイオマス量も酵母に比べて小さいなど産業利用には適した性質を持っており、更に本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌株は３５℃以上という高温条件下でも効率よくエタノール生産を行うことが可能であり、その利用価値は高いと考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、３５℃以上の温度条件下におけるエタノール発酵能力を有することを特徴とする、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種の耐熱性エタノール生産細菌を提供する。本発明は、Ｚｍ菌を用いたエタノール生産における生産性向上を目指し、耐熱性に着目してＺｍ菌の自然分離株のスクリーニングを行ったものであり、通常は室温〜３０℃付近がエタノール発酵の至適温度であるＺｍ菌の中から単離された、３５℃以上、更に好ましくは３７−３９℃でもエタノール生産能を有するＺｍ菌株を提供するものである。ここでいうエタノール生産能とは、好ましくは３−２０％（ｗ／ｖ）グルコース（またはこれに相当する他種の資化可能な糖）を含む培地を用いた培養において、１−５％（ｗ／ｖ）のエタノールを生産する能力をいう。エタノール生産に用いられる温度以外の培養条件等はこれまでＺｍ菌を用いたエタノール生産に使用されてきた条件等のうちから適宜選択すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えばエタノール発酵微生物の標準的な培地であり、酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、ペプトン、（Ｄ−）グルコースを含むＹＰＤ培地などが適している。本発明の提供する耐熱性Ｚｍ菌は、野外分離株を３０℃から４０℃までの温度条件下でエタノール生産を行わせるというスクリーニング工程により得られるものであるが、その具体例としては寄託番号がＮＩＴＥ  ＡＰ−４１０で表される株（４０５株）、またはＮＩＴＥ  ＡＰ−４１１で表される株（５５０株）が好適であり、これらの株はコロニーの形状が白色、盛り上がり、中心部突出、コロニーの周囲はスムースと形態学的にＺｍ菌と一致する形質を示し、更に下記実施例に示す通り、遺伝子（ａｄｈＡ）レベルではＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ種のエタノール高生産株であるＺＭ４株と塩基配列で９８％、アミノ酸配列で１００％の相同性を示し、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する菌株であると同定されたものである。
【００１３】
本発明が提供するＺｍ菌株は、高温条件下においてエタノール発酵能力を有する株として自然界から単離されてきた株であるが、遺伝子工学的な手法を用い、例えばエタノール発酵や温度耐性に係る本株の遺伝子を改変したり、または他種生物由来の遺伝子、例えばバイオマス原料を資化するためのセルラーゼやペクチナーゼなどの遺伝子などを本株に導入して更に有用な形質を付加したりするといった品種改良もまた有効である。遺伝子改変や導入に用いる技術としては、微生物を用いた遺伝子工学分野で通常用いられている手法を適宜応用すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば相同組み換えによるゲノム上の遺伝子の改変や、プラスミドベクターを用いた新規な遺伝子（群）の導入などの手法が考えられる。
【００１４】
本発明はまた、第１から第３の態様のうちいずれか１つに記載の耐熱性エタノール生産細菌を用いたエタノールの生産方法も提供する。嫌気的解糖というエタノール発酵の基本的な原理は本発明の提供するＺｍ菌株を利用した場合にも変わりはないため、本発明の菌株を用いたエタノールの発酵生産のためには、適当量の糖分（炭化水素）を主成分とし、上記態様のエタノール生産酵母を加えて発酵を行う事が可能である。発酵に用いる装置、機器、原料液の構成などは発酵産業分野において用いられているものを適宜利用すれば良く、本発明を限定するものではないが、例えば主成分として１−２０％の糖分を含有する培養液、好ましくはＹＰＤ培養液を原料液に用いるエタノール生産方法が好適である。また下記実施例に示すとおり、本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌株のうち４０５株については、エタノールの発酵生産においてその発酵効率が最大になると言われる１−５％程度の糖分を含有する培養系に用いるのが好ましく（３％グルコース含有培地で１％のエタノールを生産可能）、一方５５０株は糖蜜など１０％を越える糖濃度の高い培養系で用いるなど（１６％グルコース含有培地で４％のエタノール生産可能）、菌株の性状や原材料、目的等に合わせて用いるのが好ましい。
【００１５】
本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌を用いたエタノール発酵生産において、原料液に含まれる主成分たる糖分については、グルコース、スクロースやフルクトースといった純粋な糖やそれらの混合物の他、酒類の原料として用いられている植物原料、例えば米類、麦類、芋類、サトウキビ、サトウカエデ、リュウゼツラン、甜菜などバイオマスと総称される種々の原料が利用可能である。これらのうち資化可能な単糖類を含有するものは、その搾り汁などをそのまま用いることが可能であり、デンプンやセルロースなど多糖類を主として含有するものについては、これら多糖類を分解する酵素を用いるか、あるいは分解能力を持つ微生物に多糖類の加水分解を行わせ、資化可能な単糖類にまで分解して用いるのが好ましい。バイオマス原料から作られる「バイオエタノール」は、石油資源に代わる燃料として今後需要の増加が予想されており、本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌及びこの細菌が生産するエタノールを利用することによって、バイオエタノール関連産業に寄与することが期待される。以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
（ザイモモナス菌株と培養）Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓの実験株として、タイ王国で単離され株化されたＴＩＳＴＲ４０５，ＴＩＳＴＲ５４８，ＴＩＳＴＲ５５０，ＴＩＳＴＲ５５１株（以後それぞれ数字のみで株名を表す）を用いた。またこれらの株のエタノール生産能などに関する対照として、Ｚｍ菌のエタノール高生産株であるＺＭ４株（寄託番号：ＮＲＲＬ  Ｂ−１４０２３）を用いた。Ｚｍ菌の培養には０．３％酵母抽出物、０．５％ペプトン、３％グルコースを含むＹＰＤ培地１００ｍｌを用い、１００ｒｐｍ（Ｒｏｕｎｄ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）の速度で振とう培養を行った。培養液中のエタノール濃度は、非特許文献２に記載の方法、すなわち酢酸菌由来の精製アルコールデヒドロゲナーゼを用いた方法により測定した。またＺｍ菌の増殖は、培養液のＯＤ６００（６００ｎｍにおける吸光度）を測定することで算出した。
【００１７】
（菌株の種同定）ＴＩＳＴＲ４０５株、５４８株、５５０株、５５１株は、ＹＰＤ寒天培地上においてコロニーを形成し、その形状に着目すると白色、盛り上がり、中央部が突出という特徴を示し、コロニー周辺部はスムースであった。これはＺｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ種の特徴と一致した。更なる同定のため、これらの菌株のうち４０５株のゲノムＤＮＡからアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈＡ）の断片をクローニングし、その塩基配列を既知の生物種のデータベースと比較した。Ｚｍ菌からのゲノムＤＮＡの調製は、非特許文献３に記載の方法で行い、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ種のエタノール高生産株であるＺＭ４株のａｄｈＡ塩基配列を参照してプライマー（配列番号１，２）を設計して、ＰＣＲによってａｄｈＡコード領域の上流約５００ｂｐを含む１６３０ｂｐの遺伝子断片を得た。ＰＣＲ産物をｐＵＣ１１９プラスミドベクターに導入し、Ｍ１３ユニバーサルプライマー（配列番号３，４）を用いて塩基配列を決定した。配列番号５に明らかになった配列を表す。この配列を用いＮＣＢＩデータベースによって相同検索を行ったところ、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ  ＺＭ４株のａｄｈＡ遺伝子と塩基配列レベルでは９８％の相同性、アミノ酸に翻訳すると１００％と完全に一致した。これらの結果から、本発明の提供するＴＩＳＴＲ４０５株、５４８株、５５０株、５５１株はそれぞれ、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ種に属する微生物であると同定された。
【００１８】
（増殖及びエタノール生産能の検討−３％グルコース）Ｚｍ菌の各株の耐熱性、及び高温条件下におけるエタノール生産能を明らかにするため、３０℃から４０℃において各株を培養し、その増殖と培養液中のエタノール濃度を測定した。４０℃においては、全ての株が生育しなかったので、以後の検討は３９℃以下の温度で行った。図１に、本検討の結果を表す。図１Ａは３０℃における各株の増殖を表したものであり、縦軸はＯＤ６００の値を、横軸は培養開始からの時間（ｈｏｕｒ）を表す。図１Ｂは３０℃におけるエタノール生産能を表したものであり、縦軸はエタノール濃度（ｗ／ｖ）を、横軸は培養開始からの時間（ｈｏｕｒ）を表す。またグラフ中―○―は４０５株を，―△―は５５０株を，―□―は５５１株を，―▲―は５４８株を，―●―はＺＭ４株をそれぞれ示している（シンボルはＡ−Ｄまで共通）。図１Ａに見られるように、５４８株が若干増殖の立ち上がりが遅い他は同様の増殖曲線を示し、また５５０株と５５１株は２４時間以降の増殖が他の株に比べてやや鈍るという傾向を示した。一方エタノール生産能で見ると（図１Ｂ）、５５０株が培養液中に含まれるエタノール濃度が最も高い約１．０％を示し、次いで４０５，５５１，Ｚｍ４株が０．８％程度のエタノール濃度を示した。５４８株は培養液中のエタノール濃度がほとんど上昇せず、エタノール生産には不向きと判断された。反対に５５０株は、増殖速度はそれほど速くないものの、エタノール生産能はエタノール高生産株であるＺＭ４株も含めた全株中で最も高く、エタノール生産には適した株であることが示された。
【００１９】
高温条件である３９℃における検討結果を、図１Ｃ，Ｄに示す。図１Ｃは３９℃における各株の増殖（軸はＡと共通）を、図１Ｄは３９℃におけるエタノール生産能（軸はＢと共通）をそれぞれ示している。図１Ｃに示すとおり、３９℃ではエタノール高生産株であるＺｍ４株の増殖はＯＤ６００の値で０．５以下まで減少し、また５５１株はほとんど増殖が見られなかった。反対に４０５株はこの温度でも３０℃と同様の良好な増殖を示し、５４８及び５５０株も対照のエタノール高生産株よりは高い増殖能を示した。３９℃におけるエタノール生産能の比較においては、ＺＭ４株は０．４％程度と３０℃の４割程度のエタノール生産能しか示さなかったのに対して、４０５株及び５５０株は１％程度と３０℃と同様のエタノール生産能を示し、また４０５株では培養開始後２４時間で０．８％、３６時間で１％と３０℃よりも良好なエタノール生産能を示し、耐熱性エタノール生産菌として利用可能であることが示された。５５０株は３０℃同様、３９℃における増殖が４０５株に比べて低かったが、培養液中のエタノール濃度は高い値を示し、菌体あたりのエタノール生産能という観点から優れた株であることが示された。５５１株は６０時間後に０．２％というエタノール生産能を示し、５４８株はほとんどエタノール濃度の上昇が見られなかった。これらの結果から、全てのＺｍ菌株が耐熱性エタノール生産に適しているわけではなく、特定の株、すなわち４０５及び５５０株が耐熱性エタノール生産に適していることが明らかとなった。
【実施例２】
【００２０】
（増殖及びエタノール生産能の検討−１６％グルコース）より高い濃度のグルコースを含む培養液中における本発明の菌株の増殖能とエタノール生産能を検討するため、１６％グルコースを含むＹＰＤ培地（グルコース濃度以外は実施例１と同じ）を用い、４０５株、５５０株及び対照のエタノール高生産株であるＺＭ４株の３０℃と３９℃における増殖とエタノール生産能を調べた。増殖能はＯＤ６００の値で、エタノール生産能は培養液中のエタノール濃度を測定することで算出した。検討の結果を図２に示す。図２Ａは３０℃における各株の増殖を表し、縦軸はＯＤ６００の値を、横軸は培養開始からの時間（ｈｏｕｒ）を示している。またグラフ中―○―は４０５株を，―△―は５５０株を，―●―はＺＭ４株をそれぞれ示している（シンボルはＡ−Ｄ共通）。グルコース濃度１６％の培養では、４０５株のＯＤ６００の値が他の２株に比べて小さかった。図２Ｂは３０℃におけるエタノール生産能を表し、ＺＭ４株では３６時間後に約３％のエタノールが生産されていた。これに対し、５５０株では３６時間後に４％のエタノールが生産されており、この条件においてＺＭ４株よりもすぐれたエタノール生産能を示した。
【００２１】
３９℃における増殖能とエタノール生産能を、図２Ｃ，Ｄにそれぞれ示す。３０℃同様、増殖（Ｃ）に関しては４０５株のＯＤ６００の値が１以下である他はＺＭ４株と５５０株との間に差は見られなかった。一方エタノール生産能（Ｄ）では、対照のエタノール高生産株、４０５株が２％以下のエタノール生産能しか示さなかったのに対して、５５０株は３０℃に近い４％弱のエタノール生産能を示し、５５０株が耐熱性のエタノール生産能に加え、高濃度の糖を含んだ培養液中においても高いエタノール生産能を持つことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明の提供するエタノール生産細菌は、微生物を種々の有用物質の生産に利用する発酵産業で利用可能である。特に本発明のエタノール生産細菌は、３７℃以上というザイモモナス属細菌にとっては過酷な高温条件下で良好なエタノール生産能を有しており、バイオエタノールをはじめとするエタノール生産においてコスト削減などの利点をもたらすと期待される。また実施例１，２の検討結果から、本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌の菌株の利用に際しては、エタノールの発酵生産効率が最大と言われる３％前後の糖分を含んだ培養液を用いた培養には４０５株が、糖蜜など１０％を越える高濃度の糖分を含んだ培養液を用いた培養には５５０株がそれぞれ適しており、その目的や用途に応じて使い分けるのが好ましいと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】３％グルコースを含有する培養液を用いた系における、本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌の３０℃及び３９℃での増殖（Ａ，Ｃ）及びエタノール生産能（Ｂ，Ｄ）を、ザイモモナス・モビリスのエタノール高生産株と比較して示す。
【図２】１６％グルコースを含有する培養液を用いた系における、本発明の提供する耐熱性エタノール生産細菌の３０℃及び３９℃での増殖（Ａ，Ｃ）及びエタノール生産能（Ｂ，Ｄ）を、ザイモモナス・モビリスのエタノール高生産株と比較して示す。
【図１】
0005120877.tif 000002
【図２】
0005120877.tif 000003
【配列表】
0005120877000001.app