(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌胎児性抗原（６Ｄ）（ＣＥＡ（６Ｄ））をコードする核酸配列、並びにＢ７．１、ＬＦＡ−３、及びＩＣＡＭ−１をそれぞれコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含む、組換えベクター。
【請求項３】
ベクターが、細菌、ウイルス、及び核酸ベースのベクターから成る群から選択される、請求項２記載の組換えベクター。
【請求項４】
ベクターが核酸ベースのベクターである、請求項３記載の組換えベクター。
【請求項５】
ベクターがウイルスである、請求項３記載の組換えベクター。
【請求項６】
ウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、及びイリドウイルスから成る群から選択される、請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】
ウイルスがポックスウイルスである、請求項６記載の組換えベクター。
【請求項８】
ポックスウイルスが組換え体である、請求項７記載の組換えベクター。
【請求項９】
組換えポックスウイルスが、オルトポックス、アビポックス、カプリポックス、又はスイポックスである、請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１０】
組換えポックスウイルスが、ニワトリポックス、カナリアポックス、又はそれらの誘導体である、請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１１】
組換えポックスウイルスが、ワクシニア、ワクシニア−コペンハーゲン株、ワクシニア−Ｗｙｅｔｈ株、ＮＹＶＡＣ、ワクシニア−ＭＶＡ株、アライグマポックス、又はウサギポックスである、請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１２】
請求項２〜１１のいずれか１項記載の組換えベクターを含む、単離細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、標的抗原をコードする外来遺伝子を含む、組換えベクターに関連する。本発明はさらに、少なくとも三つの共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む、組換えウイルスに関連する。さらに具体的には、本発明は、少なくともＢ７ファミリー、ＬＦＡ−３、および、ＩＣＡＭ−１の中の一つの分子である共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む、組換えポックスウイルス、および、免疫原およびワクチンとしてのその使用に関連する。本発明はさらに、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子、および、場合により、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む、組換えベクターによって、トランスフェクション、感染、あるいは、形質導入された抗原提示細胞に関連する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞の活性化、拡大、および、分化に関わる、Ｔ細胞の初期応答の程度は、抗原に対する好結果の免疫応答に最も重要である。免疫応答の開始には、ナイーブＴ細胞を活性化するために、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による少なくとも二つのシグナルが必要である。第一のシグナルは抗原特異的であり、ペプチド／主要組織適合遺伝子複合体経由でＴ細胞受容体を通して伝えられ、また、Ｔ細胞を細胞周期に入らせる。第二の、あるいは“共刺激の”シグナルは、サイトカイン産生および増殖のために必要とされる。プロフェッショナルＡＰＣの表面に通常見い出される、少なくとも３つの異なる分子、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１；ＣＤ５４）、およびリンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３；ヒトＣＤ５８；マウスＣＤ４８）が、Ｔ細胞活性化に重要な第二のシグナルを提供可能であることが提唱されている。これらの共刺激分子に対するＴ細胞リガンドは異なる。Ｂ７−１はＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４分子と相互作用し、ＩＣＡＭ−１はＣＤｌｌａ／ＣＤＩＳ（ＬＦＡ−１／２インテグリン）複合体と相互作用し、また、ＬＦＡ−３はＣＤ２（ＬＦＡ−２）分子と相互作用する。これらの共刺激分子が等しい機能を果たすのか、あるいは、免疫応答の特異的な段階において特異的な機能を果たすのかは、知られていない（２）。これらの分子はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて個々にＴ細胞増殖を共刺激することが示された（６）。
【０００３】
しかしながら、それらはＡＰＣ上に同時に発現されうるため、Ｔ細胞増殖誘導における個々の共刺激分子の有効性の比を調べることは困難だった（２）。
【０００４】
Ｔ細胞および共刺激受容体に適切にｃｏ−ｅｎｇａｇｅするためには抗原および共刺激分子の両方がお互いに近接して発現しなければならないと提唱されたので（８、９）、共刺激分子の可能性のある協同作用を調べるために、いくつかの組換えウイルスの混合物を利用することが可能だった。しかしながら、この方法の不都合な点は、三つあるいはそれ以上のウイルスの混合は、統計的に、同じ細胞に共感染する可能性を減少させることで、そのため、複数の共刺激分子を使用するためには多遺伝子構築物の作成がさらにより望ましかった。
【０００５】
１９９１年３月７日に発行されたＷＯ  ９１／０２８０５は、標的抗原、ＭＨＣ蛋白質、および、標的細胞に欠損している、もしくは、十分に発現していない、免疫相互作用に関わる他の蛋白質を発現させる組換えレトロウイルスベクター構築物を開示する。
【０００６】
Akagiら、1997, J. Immunotherapy Vol. 20 (1): 38-47は、改変したＭＵＣ  １遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ｒＶ−ＭＵＣ１）、および、マウス共刺激分子Ｂ７の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ｒＶ−Ｂ７）の混合を開示する。
【０００７】
Cavallo, P.ら、1995, Eur. J. Immunol, 25: 1154-1162は、Ｂ７−１  ｃＤＮＡの三つのＩＣＡＭ−１＋腫瘍細胞株へのトランスフェクションが、同系マウスの拒絶を誘導するために十分であることを開示する。
【０００８】
Chen, L.ら、1994, J. Exp. Med., 179: 523-532は、マウスＢ７のｃＤＮＡを含む組換えレトロウイルスベクター、および、種々の腫瘍にそのベクターを導入する利用法を開示する。
【０００９】
Damle, N. K.ら、1992, J. Immunol Vol 148 (No. 7): 1985-1992は、異なる４つのＡＰＣ関連共刺激分子がＴ細胞増殖を刺激する能力を比較するため、不動化したＴＣＲ／ＣＤ３複合体に対する（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ）モノクローナル抗体、および、これらの分子の可溶性Ｉｇキメラ（ＲＧ）の組み合わせを含む、抗原提示細胞（ＡＰＣ）非依存的なｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養系の利用を開示する。
【００１０】
Dubey, C.ら、1995、J Immunol 155: 45-57は、抗ＣＤ２８抗体を用いて、あるいは、Ｉ−Ｅｋをトランスフェクションした、共刺激分子はなく、ＩＣＡＭ−１のみ、Ｂ７−１のみ、または、ＩＣＡＭ−１およびＢ７−１を同時に発現する線維芽細胞株を用いて、ナイーブＴ細胞の活性化におけるＩＣＡＭ−１：ＬＦＡ−１およびＢ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４共刺激経路の寄与の比率についての研究を開示する。
【００１１】
Fenton, R. G.ら、1998 Vol. 21, No. 2, pp 95-108は、共刺激分子Ｂ７−１遺伝子の三つのＨＬＡ−Ａ２発現ヒトメラノーマ細胞株へのトランスフェクション、および、それらが初代ヒトＴ細胞を刺激する能力を開示する。その三つのメラノーマ細胞株もまた、検出可能なレベルの共刺激分子であるＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を発現した。
【００１２】
GjorloffWingren, A.ら、Critical Reviews in Immunol 15 (3 & 4): 235-253は、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｂ７、および、ＬＦＡ−３のＣＨＯ細胞へのコトランスフェクションにより、これらの分子がナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の両方の活性化に協同作用し、また、抗原であるブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）にｐＭ濃度において応答を示すことを開示する。
【００１３】
Goldbach-Mansky, R. ら、1992, International Immunol. 4 (No. 12): 1351-1360は、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、Ｂ７陽性赤白血病細胞株Ｋ５６２、マウスＬ  細胞、および、Ｂ７をトランスフェクションしたＬ細胞の存在下、ＣＤ４＋  Ｔ細胞がブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）に応答することを開示する。
【００１４】
Hodge, J. W. ら、1994, Cancer Research 54: 5552-5555は、マウスＢ７．１およびＢ７．２遺伝子を含む、組換えワクシニアウイルスの構築、および、特徴付けを開示する。
【００１５】
Hodge, J. W.ら、1995, Cancer Research 55: 3598-3603 Cancer Research 55: 3598-3603は、マウスＢ７．１組換えワクシニア（ｒＶ−Ｂ７）にヒト癌胎児性抗原遺伝子を発現する組換えワクシニア（ｒＶ−ＣＥＡ）を加えた混合物、および、この抗腫瘍活性のための混合物の利用を開示する。
【００１６】
Parra,ら、1993, Scand J. Immunol 38: 508-514、Parra, E. ら、1994, J. Immunol 153: 2479-2487、および、Parraら、1997, J. Immunol., 458: 637-642は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４分子（ＣＨＯ−ＤＲ４）、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＢ７（ＣＨＯ−ＤＲ４／Ｂ７）、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＬＦＡ−３（ＣＨＯ−ＤＲ４／ＬＦＡ３）、ＨＬＡ−ＤＲ４およびＩＣＡＭ−１（ＣＨＯ−ＤＲ４／ＩＣＡＭ−Ｉ）、あるいは、ＤＲ４、Ｂ７、および、ＬＦＡ−３（ＣＨＯ−ＤＲ４／Ｂ７／ＬＦＡ−３）遺伝子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞を開示する。
【００１７】
Thomas, R. ら、1993 J. Immunol. 151: 6840-6852は、フレッシュに得られた樹状細胞（ＤＣ）が、ＨＬＡ−ＤＲ、および、アクセサリー分子であるＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、Ｂ７を、単球と同密度に発現することを開示する。
【００１８】
Uzendoski, Kら、May 1997, Human Gene Therapy 8: 851-860は、マウス共刺激分子であるＩＣＡＭ−１を発現する組換えワクシニアウイルスの構築、特徴付け、および、免疫学的結果を開示する。
【００１９】
１９９６年４月１１日に発行されたＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６２４のＷＯ  ９６／１０４１９は、一つあるいはそれ以上の、免疫刺激分子をコードする遺伝子もしくはその一部、および、一つあるいはそれ以上の、疾患状態の抗原をコードする遺伝子もしくはその一部を取り込ませた、一つの組換えウイルスベクターに関連する内容を開示する。
【００２０】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、アメリカ合衆国特許番号５，７３８，８５２は、感染病原体の標的抗原をコードするポリヌクレオチド配列、および、Ｂ７共刺激分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む、レトロウイルスベクターを開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、感染させた宿主細胞においてそれぞれの外来ＤＮＡを機能的に発現させる、少なくとも三つの共刺激分子それのみ、あるいは、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来ＤＮＡとの組み合わせをコードする、外来ＤＮＡを含むベクターである。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする、外来または外因性遺伝子、あるいはその一部を含む、組換えベクターを提供する。本発明において有用性をもつ、共刺激分子をコードする遺伝子もしくはその機能的な一部分は、Ｂ７ファミリーメンバー、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌ、それらの機能的な部分、および、ホモログを含むが、これらには限定はしない。本発明のベクターは、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子との組み合わせて、少なくとも一つの標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を、さらに提供し得る。少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子は、ウイルス、細菌、原生動物、寄生虫、酵母、腫瘍細胞、前新生物の細胞、過形成の細胞、組織特異的な細胞といった、細胞、組織、あるいは、生物体、あるいは合成抗原に由来することが可能である。そのベクターはさらに、少なくとも一つのサイトカイン、ケモカイン、および、ｆｌｔ−３Ｌ、あるいはサイトカイン、ケモカイン、および、ｆｌｔ−３Ｌの組み合わせをコードする外来遺伝子を提供し得る。
【００２３】
本発明群で使用する組換えベクターは、バクテリアベクター、ウイルスベクター、核酸を基にした（ｂａｓｅｄ）ベクター、および、その類似物からなる。組換えウイルスベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、イリドウイルス、および、その類似物を含むが、これらには限定されない。ポックスウイルスは、オルトポックス、鳥類のポックス、ｓｕｉｐｏｘ、および、カプリポックスを含むが、これらには限定されない。
【００２４】
本発明は、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する増強された免疫応答を提供する、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子あるいはその一部を含む、組換えウイルスを提供し、それは、一つあるいは二つの共刺激分子をコードする１または複数の遺伝子を含む組換えウイルスにより提供される応答より強い。本発明の組換えウイルスは、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子と組み合わせた、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子をさらに提供し得る。その組換えウイルスは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、および、その類似物を含むが、これらには限定されない、サイトカイン；ＭＩＰ１、ＭＩＰ２、ＲＡＮＴＥＳ、および、その類似物といったケモカイン；および、ＤＣ増殖を刺激するＦｌｔ−３Ｌ；といった、他のクラスの免疫刺激分子をコードする外来遺伝子をさらに提供し得る。
【００２５】
本発明は、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する増強された免疫応答を提供する、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子あるいはその一部を含む組換えポックスウイルスをさらに提供し、それは一つあるいは二つの共刺激分子をコードする１または複数の遺伝子を含む組換えポックスウイルスにより提供される応答より強い。本発明の組換えポックスウイルスは、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子と組み合わせた、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子をさらに提供し得る。
【００２６】
本発明はまた、複数の共刺激分子をコードしそして発現する核酸配列を含む組換えポックスウイルスを提供し、前記核酸配列は、共刺激分子のＢ７ファミリーに由来する少なくとも一つの分子をコードする核酸配列、ＩＣＡＭ−１共刺激分子をコードする核酸配列、および、ＬＦＡ−３共刺激分子をコードする核酸配列を含む。その組換えウイルスは、さらに、それぞれの外来遺伝子の発現を制御する、ポックスウイルスプロモーターの多様性を提供する。
【００２７】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来ＤＮＡを含むプラスミドベクターを、親となるウイルスゲノムへ組換えを行なって、そのゲノムに外来ＤＮＡを挿入された組換えウイルスを作成することにより、産生される組換えウイルスを提供する。組換えによって産生される組換えウイルスは、さらに、プラスミドベクターにより提供される、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含み得る。
【００２８】
本発明はまた、共刺激分子ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１および、Ｂ７ファミリーに由来する少なくとも一分子をコードする外来ＤＮＡを含むプラスミドベクターを、親となるポックスウイルスゲノムへ組換えを行なって、そのゲノムに外来ＤＮＡを挿入された組換えウイルスを作成することにより産生される組換えポックスウイルスを提供し、また、外来ＤＮＡの発現を制御可能にするポックスウイルスプロモーターの多様性を提供する。組換えによって産生される組換えポックスウイルスは、さらに、プラスミドベクターにより提供される、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含み得る。
【００２９】
本発明の目的は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列をもつ組換えベクターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する免疫応答を増強する免疫原を提供することである。そのベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る。
【００３０】
本発明の別の目的は、三つあるいはそれ以上の共刺激分子をコードする外来核酸配列をもつ組換えウイルスベクターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する免疫応答を増強する免疫原を提供することである。その組換えウイルスベクターは、さらに、少なくとも一つまたはそれ以上の標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る。
【００３１】
さらに本発明の別の目的は、共刺激分子ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、Ｂ７ファミリー由来の少なくとも一分子、をコードする外来核酸配列、および、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含む、組換えポックスウイルスベクターを含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する免疫応答を増強する免疫原を提供することである。
【００３２】
本発明のベクターは、標的細胞、標的抗原、あるいは、そのエピトープに対する免疫応答の誘導、および、増強により、疾患状態の保護および／または治療のための、ワクチンを提供する。そのベクターワクチンは、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む。そのベクターワクチンは、疾患に対する一価あるいは多価のワクチンを産生するために、一つまたはそれ以上の標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列もまた、含み得る。
【００３３】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列をもつベクター、および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。そのベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る。そのベクターは、さらに、サイトカイン、ケモカイン、ｆｌｔ−３Ｌ、あるいは、それらの組み合わせをコードする、核酸配列を含み得る。
【００３４】
本発明は、三つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする、外来または外因性の遺伝子、あるいは、その機能的な一部を含む組換えウイルスベクター、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子、および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。
【００３５】
本発明はまた、複数の共刺激分子をコードする、外来遺伝子あるいはその一部を含む組換えポックスウイルス、および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。その組換えポックスウイルスは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を含み得る。
【００３６】
本発明の別の観点は、三つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする、外来遺伝子あるいはその一部を含む、組換えポックスウイルスを含む薬剤組成物であり、また、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子あるいはその一部、および、薬剤的に許容できる担体あるいはその免疫学的エピトープを含み得る。
【００３７】
本発明はまた、複数の共刺激分子をコードする、外来遺伝子あるいはその機能的な一部を含む第一のベクター、および、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を含む第二のベクター、および、薬剤的に許容できる担体を含む、薬剤組成物を提供する。
【００３８】
本発明は、宿主細胞内で複数の共刺激分子の発現をひき起こす、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む第一のベクターを、感染、トランスフェクション、あるいは、形質導入した宿主細胞を提供する。第一のベクターあるいは第二のベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を、宿主細胞に提供し得る。
【００３９】
本発明は、複数の共刺激分子の発現あるいは過剰発現をひき起こす、複数の共刺激分子をコードする、外来あるいは外因的に提供された遺伝子を含む第一のベクターを、感染、トランスフェクション、あるいは、形質導入した、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、あるいは、腫瘍細胞を提供する。第一のベクターあるいは第二のベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を、宿主細胞に提供し得る。
【００４０】
本発明はさらに、複数の共刺激分子の発現を引き起こす、また、場合により標的抗原あるいはその免疫学的エピトープの発現を引き起こす、組換えポックスウイルスを感染させた宿主細胞を提供する。
【００４１】
本発明の別の観点は、感染、トランスフェクション、あるいは、遺伝子的操作をして、複数の外因性共刺激分子をコードする遺伝子を過剰発現させた樹状細胞（ＤＣ）およびその前駆細胞である。ＤＣおよびその前駆細胞は、さらに操作して、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を発現させ得る。
【００４２】
さらに本発明の別の観点は、遺伝子的に操作して、少なくとも三つの外因性共刺激分子をコードする遺伝子を過剰発現させた、ＤＣおよびその前駆細胞である。ＤＣおよびその前駆細胞は、さらに操作して、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を発現させ得る。
【００４３】
本発明は、遺伝子的に操作して、少なくとも一つのＢ７分子、ＩＣＡＭ−１、および、ＬＦＡ−３をコードする遺伝子を過剰発現させた、ＤＣおよびその前駆細胞を提供する。ＤＣおよびその前駆細胞は、さらに操作して、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子を発現させ得る。
【００４４】
本発明は、（ａ）様々なウイルスプロモーター、（ｂ）複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列、（ｃ）エレメント（ａ）および（ｂ）の構築物に隣接するＤＮＡ配列を含む、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を発現することができる組換えウイルスを産生するように計画した、親となるウイルスの組換えの方法およびプラスミドベクターを提供し、ここで隣接配列はその５’端、および、３’端の両方で、エレメント（ａ）と（ｂ）が挿入されている、親となるウイルスゲノムの領域と相同性を有する。プラスミドベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を提供し得る。プラスミドベクターはまた、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を提供し得る。
【００４５】
本発明はまた、（ａ）様々なポックスウイルスプロモーター、（ｂ）ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、少なくとも一つのＢ７分子をコードする外来核酸配列、（ｃ）エレメント（ａ）および（ｂ）の構築物に隣接するＤＮＡ配列を含む、共刺激分子ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、少なくとも一つのＢ７分子をコードする外来核酸配列を発現することができる組換えポックスウイルスを産生するように計画した、親となるポックスウイルスの組換えの方法、および、プラスミドベクターを提供し、ここで隣接配列はその５’端、および、３’端の両方で、エレメント（ａ）と（ｂ）が挿入されている、親となるウイルスゲノムの領域と相同性を有する。プラスミドベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列を提供し得る。プラスミドベクターはまた、選択可能なマーカーをコードする遺伝子を提供し得る。
【００４６】
本発明の一つの観点は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む、第一のベクターの投与を含む、少なくとも一つの標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する、哺乳動物における免疫学的応答を増強する方法であり、各共刺激分子は、哺乳動物において少なくとも一つの免疫学的応答を増強するのに効果的な量で、哺乳動物の細胞に発現される。本発明において有用性をもつ、共刺激分子をコードする遺伝子あるいはその機能的な部分は、Ｂ７ファミリーメンバー、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌおよびそのホモログ、および、その一部を含むが、これらには限定されない。少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来核酸配列は、第一のベクター、あるいは、第二のベクターによる方法において、さらに、提供され得る。
【００４７】
複数の共刺激分子をコードする遺伝子あるいはその部分に加えて、他のクラスの免疫刺激分子の少なくとも一つあるいは組み合わせをコードする外来または外因性核酸配列、あるいは、その機能的な部分もまた、第一のベクター、第二のベクター、あるいは、第三のベクターにより、提供され得る。他のクラスの免疫刺激分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、および、その類似物といったサイトカイン；ＭＩＰ１、ＭＩＰ２、ＲＡＮＴＥＳ、および、その類似物といったケモカイン；および、Ｆｌｔ−３Ｌ；を含む。
【００４８】
本発明の観点は、複数の共刺激分子ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、少なくとも一つのＢ７分子をコードする核酸配列を含む、外来組換えポックスウイルスの投与を含む、標的細胞、標的抗原、あるいは、その免疫学的エピトープに対する、哺乳動物における抗原特異的Ｔ細胞の免疫学的応答を増強する方法であり、各共刺激分子は、一つ、あるいは、その増強が二つの共刺激分子の投与により提供される増強の和よりも大きい、少なくとも一つのＴ細胞免疫応答を増強するのに効果的な量で、哺乳動物において細胞に発現される。
【００４９】
免疫学的応答を増強させる他の方法では、外来あるいは外因性に提供される複数の共刺激分子を発現するＡＰＣあるいは腫瘍細胞は、免疫学的応答の増強に効果的な量で哺乳動物に提供される。ＡＰＣあるいは腫瘍細胞は、免疫応答の増強のために、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする外来遺伝子をさらに発現し得る。標的抗原あるいはその免疫学的エピトープはＡＰＣあるいは腫瘍細胞の投与より先行して、または同時に、または続いて哺乳動物に投与することができる。加えて、または、二者択一的に、ＡＰＣあるいは腫瘍細胞を、哺乳動物に投与する前に、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープで、パルスする。
【００５０】
本発明は、哺乳動物において、体液性応答の増強に効果的な量で、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む組換えベクターをほ乳動物に対して投与することを含む、標的細胞、標的抗原あるいはその免疫学的エピトープに対する体液性の応答を増強する方法を提供する。そのベクターは、さらに、少なくとも一つの標的抗原あるいはその免疫学的エピトープをコードする核酸配列を含み得る。本発明は、さらに、本方法により産生された、標的細胞、標的抗原あるいはその免疫学的エピトープに対する、単離された抗体あるいはその機能的な部分を提供する。
【００５１】
本発明はまた、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、および、ＬＦＡ−３をコードする外来遺伝子、および、一つまたはそれ以上の標的抗原あるいはそのエピトープをコードする遺伝子を含む、組換えポックスウイルスの投与に応答して産生される、標的抗原もしくはその免疫学的エピトープに特異的な抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
本発明のこれらおよびその他の目的、特徴、および、附随する多くの利点は、発明の詳細な説明を読むことで、より良く理解されるだろう。
【図１】ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍ領域部分に隣接された（ｆｌａｎｋｅｄ  ｂｙ）マウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１およびＢ７．１をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０３２のゲノム構造。
【図２】ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊ領域部分に隣接されたマウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０４７のゲノム構造。
【図３】ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍ領域部分に隣接されたマウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１およびＢ７．１をコードする核酸配列、および、ＣＥＡをコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０３１のゲノム構造。
【図４】三つのマウス共刺激分子と共に、腫瘍関連抗原を発現する（図４Ｃ）、または、発現しない（図４ＡおよびＢ）、組換えワクシニアウイルスのゲノム構造。図４Ａは、組換えワクシニアｖＴ１７１のゲノム構造を示す。図４Ｂは、組換えワクシニアｖＴ１９９のゲノム構造を示す。図４Ｃは、組換えワクシニアｖＴ１７２のゲノム構造を示す。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍおよび、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊは、ポックスウイルスゲノムにおける外来遺伝子挿入部位である。プロモーター３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、７．５Ｋ、４０ＫおよびＣｌはポックスウイルスのプロモーターである。挿入配列中のＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を、各部位の上の括弧内に記載の、挿入部の５’端（０）から各部位までの距離（ｋｂｐ）（縮尺どおりに書かれていない）と共に示す。
【図５】鶏痘ウイルスゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接されたマウスＢ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１およびｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含む、プラスミドｐＴ８００１のゲノム構造。
【図６】鶏痘ウイルスゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、腫瘍関連抗原、ＣＥＡおよび、マウスＢ７．１、ＬＦＡ−３、および、ＩＣＡＭ−１、コードする核酸配列を、ｌａｃＺ遺伝子と組み合わせて含む、プラスミドｐＴ５０４９のゲノム構造。
【図７】図７Ａから７Ｄ。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と共に（図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄ）または、なしで（図７Ａ）、三つのマウス共刺激分子を発現する、組換え鶏痘ウイルスのゲノム構造。図７Ａは、組換え鶏痘ｖＴ２２２のゲノム構造を示す。図７Ｂは、組換え鶏痘ｖＴ１９４のゲノム構造を示す。図７Ｃは、ＭＵＣ−１、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する組換え鶏痘のゲノム構造を示す。図７Ｄは、腫瘍関連抗原、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する組換え鶏痘のゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ  Ｊは、鶏痘ウイルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。ｓＥ／Ｌ、Ｉ３、７．５Ｋ、Ｃｌ、４０Ｋおよび３０Ｋはポックスウイルスプロモーターである。Ｐ１−Ｐ５は五つの異なるポックスウイルスプロモーターを示す。挿入配列中のＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を、各部位の上の括弧内に記載の、挿入部の５’端（０）から各部位までの距離（ｋｂｐ）（縮尺どおりに書かれていない）と共に示す。
【図８】ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ヒトＬＦＡ−３、ヒトＩＣＡＭ−１、ヒトＢ７．１およびｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含む、プラスミドｐＴ５０６４のゲノム構造。
【図９】腫瘍関連抗原と共に（図９Ｂ、Ｃ）または、なしで（図９Ａ）、ｌａｃＺ遺伝子と共に三つのヒト共刺激分子ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、および、Ｂ７．１を発現する組換えポックスウイルスのゲノム構造。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊはワクシニアウイルスゲノムにおける外来遺伝子挿入部位である。ＢａｍＨＩ  Ｊは鶏痘ウイルスゲノムにおける挿入部位である。３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、４０ＫおよびＣｌは、ポックスウイルスのプロモーターである。挿入配列中のＢｇｌ  ＩＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を、各部位の上の括弧内に記載の、挿入部の５’端（０）から各部位までの距離（ｋｂｐ）（縮尺どおりに書かれていない）と共に示す。
【図１０】ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ＣＥＡ（６Ｄ）およびヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ８０１６のゲノム構造。
【図１１】ＣＥＡ（６Ｄ）および、三つのヒト共刺激分子を発現する、組換えワクシニアウイルスｖＴ２３８のゲノム構造。ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊは、ポックスウイルスゲノムにおける外来遺伝子挿入部位である。４０Ｋ、３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、およびＣｌは、ポックスウイルスのプロモーターである。
【図１２】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、マウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ８０１９のゲノム構造。
【図１３】マウスあるいはヒトの共刺激分子を発現する、組換え鶏痘ウイルスのゲノム構造。図１３Ａは、組換え鶏痘ｖＴ２５１のゲノム構造を示す。図１３Ｂは、組換え鶏痘ｖＴ２３２のゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ  Ｊは、鶏痘ゲノムにおける外来遺伝子挿入部位である。３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／ＬおよびＣｌはポックスウイルスのプロモーターである。
【図１４】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０７２のゲノム構造。
【図１５】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ＭＵＣ−１、マウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ８０２０のゲノム構造。
【図１６】少なくとも一つの腫瘍関連抗原と共に、マウスあるいはヒトの共刺激分子を発現する組換え鶏痘ウイルスのゲノム構造。図１６Ａは組換え鶏痘ｖＴ２５０のゲノム構造を示す。図１６Ｂは組換え鶏痘ｖＴ２４２のゲノム構造を示す。図１６Ｃは組換え鶏痘ｖＴ２３６のゲノム構造を示す。図１６Ｄは組換え鶏痘ｖＴ２５７のゲノム構造を示す。ＢａｍＨＩ  Ｊは、ポックスウイルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。４０Ｋ、７．５Ｋ、３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、および、Ｃ１はポックスウイルスのプロモーターである。
【図１７】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ＭＵＣ−１、ヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ２１８６のゲノム構造。
【図１８】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ＣＥＡ（６Ｄ）、ヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ２１８７のゲノム構造。
【図１９】鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域部分に隣接された、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１Ｂ７．１、およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０８０のゲノム構造。
【図２０】ＭＶＡゲノムの欠損ＩＩＩ領域部分に隣接された、マウスＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０８５のゲノム構造。
【図２１】腫瘍関連抗原と共に、または、なしで、マウスあるいはヒトの共刺激分子を発現する、組換えＭＶＡウイルスのゲノム構造。図２１Ａは、組換えＭＶＡ  ｖＴ２６４のゲノム構造を示す。図２１Ｂは、組換えＭＶＡ  ｖＴ２６０のゲノム構造を示す。欠損ＩＩＩは、ポックスウイルスゲノム中の外来遺伝子挿入部位である。４０Ｋ、７．５Ｋ、３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、および、Ｃ１はポックスウイルスのプロモーターである。
【図２２】ＭＶＡゲノムの欠損ＩＩＩ領域部分に隣接された、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ヒトＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１、およびＥ．  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＴ５０８４のゲノム構造。
【図２３】組換えウイルス感染による共刺激分子の表面発現。ＭＣ３８腫瘍細胞を示されたウイルスで５  ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；  ｐｆｕ／細胞）で、５時間感染させた。感染後、細胞を共刺激分子特異的な、ＦＩＴＣラベルされたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いて、免疫染色した。影をつけた領域は特異的Ｍａｂの蛍光強度であり、一方、影のついていない領域は適当なアイソタイプの対照抗体の蛍光強度である（材料および方法を参照）。
【図２４】複数の共刺激分子のＴ細胞増殖への効果。第一のシグナルを与えるための、様々な濃度のＣｏｎ  Ａ存在下、マウスナイーブＴ細胞を組換えワクシニア（図２４Ａ）または組換え鶏痘（図２４Ｂ）ベクターのいずれかを感染させたＭＣ３８刺激細胞と共培養した。組換えベクターは、野生型（すなわち、Ｖ−ＷｙｅｔｈまたはＷＴ−ＦＰ［白抜き四角］）、ｒＶ−ＬＦＡ−３（黒三角）、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１またはｒＦ−ＩＣＡＭ−１（黒丸）、ｒＶ−Ｂ７−１またはｒＦ−Ｂ７−１（黒菱形）、および、ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３またはｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（黒四角）である。未感染のＭＣ３８細胞は白抜き丸である。増殖アッセイは材料および方法に記載の通りである。
【図２５】組換えワクシニアウイルスにより伝えられる共刺激の特異性。Ｃｏｎ  Ａ存在下、Ｔ細胞と、白抜き丸で示される、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（図２５Ａ）、ｒＶ−Ｂ７−１（図２５Ｂ）、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１（図２５Ｃ）、および、ｒＶ−ＬＦＡ−３（図２５Ｄ）で感染させたＭＣ３８刺激細胞と共培養した。共刺激分子特異的なＭＡｂ存在下で感染させた刺激細胞は黒丸で示されており、また、アイソタイプの対照抗体は黒三角で示されている。
【図２６】Ｔ細胞増殖のための第二のシグナルを伝えるための、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびこれら共刺激分子三つ全ての共発現の相対的な能力。Ｃｏｎ  Ａ存在下（２．５  ｇ／ｍｌ）、１００，０００  Ｔ細胞を１０，０００  ＭＣ３８細胞と共培養した。一つあるいは全ての共刺激分子を発現している刺激ＭＣ３８細胞を、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ感染感染細胞と様々な割合で組み合わせて全量で１０４  ＭＣ３８細胞／ウェルとなるように、ウェルに加えた。ＭＣ３８細胞をＶ−Ｗｙｅｔｈ（白抜き丸）、ｒＶ−ＬＦＡ−３（黒三角）、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１（黒丸）、ｒＶ−Ｂ７−１（黒菱形）、または、ｒＶ−Ｂ７−１−ＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−３（黒四角）で感染させた。細胞を４８時間共培養した。最後の１８時間にＴ細胞増殖を測るため、３Ｈ−チミジンを加えた。はめ込んだパネルは、３％のＭＣ３８刺激細胞が、示したベクターに感染している培養から得られる、増殖の値を示す。つまり、この実験において、Ｔ細胞に対する刺激細胞の最終割合は０．００３であった。これらの条件下では、ｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ／ＬＦＡ−３と比べて、ｒＶＢ７．１／ＩＣＡＭの方が比較的効果が弱いことに注意せよ。
【図２７】特異的Ｔ細胞ポピュレーションへの共刺激の効果。マウスＣＤ４＋（図２７Ａ）あるいはＣＤ８＋  Ｔ細胞（図２７Ｂ）を、様々な濃度のＣｏｎ  Ａ存在下、未感染ＭＣ３８細胞（白抜き丸）、あるいは、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（白抜き四角）、ｒＶ−ＬＦＡ−３（黒三角）、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１（黒丸）、ｒＶ−Ｂ７−１（黒菱形）またはｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（黒四角）を感染させた細胞と、１０：１の比で、４８時間共培養した。最後の１８時間にＴ細胞増殖を測るため、３Ｈ−チミジンを加えた。図２７Ｃおよび２７Ｄは、低濃度のＣｏｎ  Ａ（０．６２５μｇ／ｍｌ）において、ベクターを感染させたＭＣ３８刺激細胞存在下、共培養した場合、精製したＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の増殖応答をそれぞれ示す。
【図２８】サイトカイン産生への共刺激の効果。マウスＣＤ４＋（図２８Ａおよび２８Ｃ）またはＣＤ８＋（図２８Ｂおよび２８Ｄ）Ｔ細胞は、材料および方法に記載の通り精製され、また、示されたＭＣ３８ベクター感染刺激細胞と、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａ存在下、共培養した。上清液を、捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２（図２８Ａおよび図２８Ｂ）、および、ＩＦＮ−γ（図２８Ｃおよび図２８Ｄ）の産生を分析した。
【図２９Ａ】サイトカインＲＮＡ発現への共刺激の効果。マウスＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞をＶ−Ｗｙｅｔｈ（レーンＡ）、ｒＶ−Ｂ７−１（レーンＢ）、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１（レーンＣ）、ｒＶ−ＬＦＡ−３（レーンＤ）またはｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（レーンＥ）を感染させたＭＣ３８刺激細胞と、Ｔ細胞対刺激細胞比、１０：１で２４時間、２．５ｐｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａ存在下、共培養した。培養後、Ｔ細胞ＲＮＡをマルチプローブＲＮＡｓｅプロテクションアッセイにより分析した。
【図２９Ｂ】サイトカインＲＮＡ発現への共刺激の効果。ＣＤ４＋  細胞において、オートラジオグラフによる結果の定量的表示は、ハウスキーピング遺伝子Ｌ３２の発現により標準化した。ヒストグラムバーの順序（左から右）は、ＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ＭＣ３８／Ｂ７−１、ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１、ＭＣ３８／ＬＦＡ−３、およびＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３である。
【図２９Ｃ】サイトカインＲＮＡ発現への共刺激の効果。ＣＤ８＋  細胞において、オートラジオグラフによる結果の定量的表示は、ハウスキーピング遺伝子Ｌ３２の発現により標準化した。ヒストグラムバーの順序（左から右）は、ＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ＭＣ３８／Ｂ７−１、ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１、ＭＣ３８／ＬＦＡ−３、およびＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３である。
【図３０】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５／群）にＨＢＳＳ（黒四角）を投与、あるいは、１０７  ｐｆｕ  ｒＶ−ＣＥＡ（黒三角）またはｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（黒丸）を接種した。１００日後、１×１０６のＣＥＡ発現ＭＣ３８癌細胞を接種し、生存をモニターした。ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ群以外の全てのマウスでは腫瘍が成長しており、また、腫瘍の長さあるいは幅が２０ｍｍを超えた場合、または、マウスが瀕死の場合、屠殺した。図３０：二番目の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５／群）に１０７  ｐｆｕ  ｒＶ−ＣＥＡ、ｒＶ−ＣＥＡ／Ｂ７．１、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭまたはＨＢＳＳバッファーを接種した。接種２２日後にプールした脾臓Ｔ細胞により、リンパ球増殖応答を解析した。値は、培地に対して、３回の同一条件の平均ｃｐｍの刺激インデックスを示す。標準偏差は、１０％を超えることはなかった。抗原は、Ｃｏｎ  Ａ（５μｇ／ｍｌ）、ＣＥＡ（１００μｇ／ｍｌ）およびオボアルブミン（１００μｇ／ｍｌ）を使用した。
【図３１】図３１はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける樹状細胞の共刺激アッセイの概略図を示した。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂは、Ｃｏｎ  Ａ存在下、ｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３を感染させた前駆ＤＣ、または、（未感染の、すなわち、ＣＤ  ３４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦ  ＋ＩＬ−４で６日間処理した）ＤＣにより刺激された、ナイーブＣＤ４＋（図３２Ａ）またはナイーブＣＤ８＋（図３２Ｂ）Ｔ細胞の増殖応答を示す。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂは、ｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３を感染させた前駆ＤＣ、あるいは、ｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３またはＶ−Ｗｙｅｔｈ（対照）を感染させたＤＣにより刺激された、ナイーブＣＤ４＋（図３３Ａ）またはナイーブＣＤ８＋（図３３Ｂ）Ｔ細胞の増殖応答を示す。
【図３４】図３４は、Ｂａｌｂ／Ｃ脾臓細細胞対、２５  ＭＯＩのＶ−ＷｙｅｔｈまたはｒＶ  ＴＲＩＣＯＭを感染させ、放射線照射したＣ５７ｂｌ／６樹状細胞の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を示す。３Ｈ−チミジンは３日目にパルスし、４日目に回収した。ＤＣ（白、未感染）、ＤＣ（ドット、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ感染）、ＤＣ（斜線、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染）である。
【図３５】図３５は、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭで感染させペプチドパルスしたＤＣで刺激後５日目に回収し、２日間（ＡＰＣまたはペプチドなしで）１０  ｕ／ｍｌ  ＩＬ２中に置いた、様々なＡＰＣ比での応答Ｔ細胞（ＣＥＡペプチド８特異的なＣＡＰ−Ｍ８  Ｔ細胞株）の増殖応答を示す。アッセイにおいてペプチド８−（ＥＡＱＮＴＴＹＬ）の終濃度は１  ｕｇ／ｍｌである。３Ｈ−チミジンは２日目に加え、Ｔ細胞は３日目に回収した。０＝ＤＣ（ｖ−Ｗｙｅｔｈ）−ｐｅｐおよび、△＝ＤＣ（ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ）−ｐｅｐの結果はベースラインである。
【図３６】マウス樹状細胞（ＤＣ）のポックスウイルス感染の効率。ＤＣに、２５  ＭＯＩのｒＶ−ＴＲＩＣＯＭまたは５０  ＭＯＩのｒＦ  ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭを５時間感染させた。ＴＲＩＣＯＭベクターを感染させたＤＣは、ナイーブＴ細胞を刺激する能力の増強を示した。すべてのＤＣ集団はＴ細胞と１０：１の割合で、シグナル１を与える異なる濃度のＣｏｎ  Ａ存在下、４８時間共培養した。３Ｈ−チミジンを最後の１８時間の間、加えた。図３６Ａ：未感染ＤＣ（黒四角）、モック感染ＤＣ（黒菱形）、または、Ｖ−ＷＴ（黒逆三角）、ｒＶ−Ｂ７．１（白抜き三角）またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（白抜き丸）を感染させたＤＣ。図３６Ｂ：ＤＣ（黒四角）、モック感染ＤＣ（黒菱形）、または、ＷＴ−ＦＰ（黒逆三角）、ｒＦ−Ｂ７．１（白抜き三角）またはｒＦ  ＴＲＩＣＯＭ（白抜き丸）を感染させたＤＣ。
【図３７】ワクシニア（図３７Ａ、Ｃ、Ｅ）または鶏痘（図３７Ｂ、Ｄ、Ｆ）ベクターを感染させたＤＣによる、同種刺激活性の増強。未感染ＤＣ（黒四角）；モック感染ＤＣ（黒菱形）；または、野生型鶏痘ベクター（Ｖ−ＷＴあるいはＦ−ＷＴ、黒逆三角）、ｒＶ−Ｂ７．２またはｒＦ−Ｂ７．１（白抜き三角）、またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭあるいはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（白抜き丸）を感染させたＤＣを同種（図３７Ａ−Ｄ）あるいは同系Ｔ細胞（図３７Ｅ−Ｆ）と、５日間共培養した。３Ｈ−チミジンは最後の１８時間に加えた。
【図３８】ペプチド特異的Ｔ細胞増殖におけるＤＣのワクシニア感染の効果。未感染ＤＣ（黒四角）、または、Ｖ−ＷＴ（黒逆三角）、ｒＶ−Ｂ７．１（白抜き三角）またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（白抜き丸）感染ＤＣをＯＶＡペプチド特異的Ｔ細胞（図３８Ａ、Ｃ、Ｅ）またはＣＡＰ−Ｍ８ペプチド特異的Ｔ細胞（図３８Ｂ、Ｄ、Ｆ）と共培養した。実験条件は、様々な濃度の適するペプチド（図３８Ａ−Ｄ）、負の対照ペプチド（白抜き四角）、ＶＳＶＮ（図３８Ａ）、またはＦＬＵ−ＮＰ（図３８Ｂ）のどちらかの存在下、固定化した１０：１のエフェクター：刺激細胞比、あるいは、様々なエフェクター：刺激細胞比での存在下、１μＭに固定化したペプチド濃度（図３８ＥおよびＦ）を含んだ。
【図３９】ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０で成熟化させたＤＣへのｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染の効果。ＤＣ（黒四角）、または、培養の最後の２４時間、１００  ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（白抜き三角）、または５μｇ／ｍｌのＣＤ４０  ｍＡｂ（白抜き丸）のどちらかと共に培養したＤＣを用いて、ＣＡＰ−Ｍ８特異的エフェクターＴ細胞を刺激した（図３９Ａ）。２５  ＭＯＩ  ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭを感染させた後の、これらＤＣ集団に対するＣＡＰ−Ｍ８  Ｔ細胞の増殖（図３９Ｂ）。すべてのパネルについて、Ｔ細胞：ＤＣ比は１０：１であり、一方、ＣＡＰ−Ｍ８ペプチド濃度は１μｇ／ｍｌであった。黒丸は１μｇ／ｍｌのＶＳＶＮペプチド存在下、全てのＤＣ集団に刺激された、ＣＡＰ−Ｍ８  Ｔ細胞の増殖を示す。
【図４０】ＣＴＬ活性の誘導に対するＤＣへのワクシニア感染による効果。ＤＣ（図４０Ｂ）、または、Ｖ−ＷＴ（図４０Ｃ）、あるいはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（図４０Ｄ）を感染させたＤＣを１０μＭ  ＯＶＡペプチドで２時間パルスした。ＤＣ集団をマウスに静脈内投与した（１×１０５細胞／マウス）。対照マウスにはＲｉｂｉ／Ｄｅｔｏｘアジュバントを用いて１００μｇのＯＶＡペプチドを皮下に免疫した（図４０Ａ）。１４日後、脾臓を回収し、相当するペプチドで６日間再刺激し、そして、ＯＶＡ（黒四角）またはＶＳＶＮペプチド（白抜き四角）のどちらかでパルスしたＥＬ−４細胞に対する溶菌能を調べた。書き入れた数は、溶菌単位で表現したＣＴＬ活性を示す。ＣＴＬ活性の誘導に対するＤＣへのワクシニア感染による効果もまた示す。ＤＣ（図４０Ｆ）、または、Ｖ−ＷＴ（図４０Ｇ）、またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（図４０Ｈ）を感染させたＤＣを１０μＭ  ＣＡＰ−Ｍ８ペプチドで、２時間パルスした。ＤＣ集団をマウスに静脈内投与した（１×１０５細胞／マウス）。対照マウスにはＲｉｂｉ／Ｄｅｔｏｘアジュバントを用いて１００μｇのＣＡＰ−Ｍ８ペプチドを皮下に免疫した（図４０Ｅ）。１４日後、脾臓を回収し、相当するペプチドで６日間再刺激し、そして、ＣＡＰ−Ｍ８（黒四角）またはＦＬＵ−ＮＰペプチド（白抜き四角）のどちらかでパルスしたＥＬ−４細胞に対する溶菌能を調べた。書き入れた数は、溶菌単位で表現したＣＴＬ活性を示す。
【図４１】ＣＴＬ活性の誘導に対するワクシニアを感染させたＤＣの多重免疫の効果。ＤＣ（黒四角）、またはＶ−ＷＴ（黒逆三角）またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（白抜き丸）を感染させたＤＣを１０μＭのＣＡＰ−Ｍ８ペプチドで２時間パルスした。ＤＣ集団を７日間隔で１、２、または、３回、マウスに静脈内投与した（１×１０５細胞／マウス）。対照マウスにはＲｉｂｉ／Ｄｅｔｏｘアジュバントを用いて１００μｇのＣＡＰ−Ｍ８ペプチドを皮下に免疫した（十字）。最後の免疫から１４日後に脾臓を回収し、ＣＡＰ−Ｍ８ペプチドで６日間再刺激し、そして、ＣＡＰ−Ｍ８または対照ペプチドＶＳＶＮ（示していない）でパルスしたＥＬ−４細胞に対する溶菌能を調べた。
【図４２】ワクシニアおよび鶏痘ＴＲＩＣＯＭ感染脾細胞Ｔ細胞増殖への効果。マウスナイーブＴ細胞を組換えワクシニアまたは鶏痘ベクターのどちらかを感染させた自己の脾細胞と共培養した。シグナル１であるＣｏｎ  Ａの様々な濃度において共培養を行った。組換えベクターは、野生型（すなわち、Ｖ−ＷＴ、ＦＰ−ＷＴ、白抜き菱形）、ｒＶ−Ｂ７−１またはｒＦ−Ｂ７−１（白抜き丸）、あるいはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭまたはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（黒四角）であった。未感染脾細胞は白抜き三角で示される。
【図４３】ＴＲＩＣＯＭベクター感染脾細胞の同種Ｔ細胞への効果。ナイーブＢａｌｂ／Ｃ  Ｔ細胞を、組換えワクシニア（図４３ＡおよびＣ）または鶏痘（図４３ＢおよびＤ）ベクターを２日間（図４３ＡおよびＢ）または５日間（図４３ＣおよびＤ）感染させたＣ５７Ｂ１／６脾細胞と共培養した。組換えベクターは、Ｖ−ＷＴまたはＦＰ−ＷＴ（白抜き菱形）、ｒＶ−Ｂ７−１またはｒＦ−Ｂ７−１（白抜き丸）、あるいはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭまたはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（黒四角）であった。未感染脾細胞は白抜き三角で示される。ＤＣにより誘導される増殖は黒四角で示される。
【図４４】ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染脾細胞の特異的Ｔ細胞集団への効果。マウスナイーブＴ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および、ＣＤ８＋亜集団に分画した。Ｔ細胞を、未感染自己ＢＭＤＣ、または、組換えワクシニアベクターを感染させた脾細胞のどちらかと共培養した。様々なＣｏｎ  Ａ濃度（図４４Ａ−Ｃ）、または、様々な刺激細胞の数（図４４Ｄ−Ｆ）により第一のシグナルが与えられた。成熟ＢＭＤＣに応答するＴ細胞増殖は、白抜き四角で示され、また、未感染脾細胞は白抜き三角で示される。組換えベクターは、野生型（Ｖ−ＷＴ、白抜き菱形）またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（黒四角）であった。
【図４５】ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染骨髄細胞の特異的Ｔ細胞への効果。マウスナイーブＴ細胞をＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および、ＣＤ８＋亜集団に分画した。Ｔ細胞を、未感染自己ＢＭＤＣ、または、組換えワクシニアベクターを感染させた脾細胞のどちらかと共培養した。様々なＣｏｎ  Ａ濃度（図４５Ａ−Ｃ）、または、様々な刺激細胞の数（図４５Ｄ−Ｆ）により第一のシグナルが与えられた。成熟ＢＭＤＣに応答するＴ細胞増殖は、白抜き四角により示され、また、未感染脾細胞は白抜き三角で示される。組換えベクターは、野生型（Ｖ−ＷＴ、白抜き菱形）またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（黒四角）であった。
【図４６】ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染脾細胞または骨髄（ＢＭ）細胞の、ペプチド特異的メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞への効果。ＣＡＰ−Ｍ８−特異的Ｔ細胞を自己の脾細胞（図４６ＡおよびＢ）、または組換えワクシニアベクターを感染させた骨髄細胞（図４６ＣおよびＤ）と共培養した。二組の条件を使用して分析を実行した：ａ）応答細胞：刺激細胞の比を１０：１に固定化し、いくつかの濃度のＣＡＰ−Ｍ８ペプチド存在下で培養（図４６Ａおよび４６Ｃ）、または、ｂ）固定化したペプチド濃度（１  ｕＭ）で、様々な応答細胞：刺激細胞の比で培養した（図４６Ｂおよび４６Ｄ）。組換えベクターは、野生型（白抜き菱形）、および、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（黒四角）であった。未感染脾細胞は白抜き三角で示される。ＢＭは白抜き四角で示される。
【図４７】ＣＥＡペプチド、ＣＡＰ−１またはＣＡＰ１、６ＤでパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ヒト樹状細胞を使用したときの、末梢血骨髄細胞（ＰＢＭＣ）から単離したヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図４８】ＰＳＡペプチド、ＰＳＡ−３でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図４９】Ｆｌｕペプチド５８−６６でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ、または、ｒＦ−Ｂ７．１感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ＰＢＭＣから単離したヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図５０】様々なエフェクター：ＡＰＣ比で、Ｆｌｕペプチド５８−６６でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染、または、ｒＦ−Ｂ７．１感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ＰＢＭＣから単離したヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図５１】１、または、２回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）後、ＨＰＶペプチド（１１−２０）でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ドナー８６８からのヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図５２】ＨＰＶペプチド（１１−２０）でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ、または、ｒＦ−Ｂ７．１感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトＴ細胞株によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図５３】様々な濃度のＨＰＶペプチド（１１−２０）でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ、または、ｒＦ−Ｂ７．１感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトＴ細胞株によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【図５４】様々なエフェクター：ＡＰＣ比で、ＨＰＶ  Ｅ７ペプチド１１−２０でパルスしたｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ、または、ｒＦ−Ｂ７．１感染ヒト樹状細胞を使用したときの、ヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
発明の詳細な説明
本発明は、複数の共刺激分子を組み合わせたものまたは共刺激分子それぞれの機能性活性部分をコードする外来遺伝子を含む組換えベクターである。本明細書中で用いる複数の共刺激分子は、少なくとも３つ以上の共刺激分子である。本明細書中で用いる機能性活性部分は、それの各リガンドに結合して免疫細胞活性化に適した共刺激信号をトリガーするのに関与する分子部分である。機能性活性を測定するための１方法は、本明細書に記載するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで共刺激分子をターゲット細胞へ運搬することによる天然Ｔ細胞増殖の誘発を利用するものである。共刺激分子の機能性部分は、Ｔ細胞増殖を少なくとも２０％高める。
【００５４】
本明細書中で用いる外来遺伝子もしくは外来核酸配列またはその機能性部分という用語は、宿主細胞または宿主生物に組換えベクターにより外から供給された遺伝子、核酸配列またはその機能性部分である。宿主細胞または宿主生物に供給される外因性遺伝子またはその部分は、宿主細胞または宿主生物に内在しないものであってもよく、あるいは内在し、機能性または非機能性であってもよい。機能性内因性遺伝子が宿主細胞または宿主生物中に存在する場合、外来の、すなわち外から供給される遺伝子またはその機能性部分はその遺伝子の生成物を過剰発現する。
【００５５】
本発明の組換えベクターは、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）など（これらに限定されない）を含めた免疫系細胞に増強した免疫応答を与えるのに有用である。複数の共刺激分子を発現する組換えベクターによる免疫応答増強は、免疫応答の増強に単一の共刺激分子を用いる場合または２つの共刺激分子を用いる場合と比較して、相乗的である。免疫応答は、細胞性および／または体液性免疫応答であってもよく、特定のターゲット抗原またはそのエピトープに向けられてもよく、あるいはサイトカイン放出増加、免疫細胞増殖の増大、マイトジェン応答性増大などにより証明されるような、全般的免疫増強作用またはアップレギュレーション作用であってもよい。好ましくは、免疫応答の増強には、本発明の組換えベクターを用いて、または本発明の組換えベクターによりトランスフェクション、トランスダクションまたは誘発された細胞を用いて刺激した結果としての過剰刺激または高力Ｔ細胞刺激（ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ＨＩＴＳ）が含まれる。
【００５６】
共刺激分子をコードする外来遺伝子は、多様な供給源から得ることができる。共刺激分子をコードする外来遺伝子の供給源の選択は、その組換えベクターを用いて免疫化または処理する種に依存するであろう。
【００５７】
共刺激分子をコードする外来遺伝子は、ネズミ由来、ヒト由来、サル由来、他の哺乳動物の相同体であってもよく、哺乳動物遺伝子に基づいて化学的に合成できる。共刺激分子をコードする外来遺伝子は、鳥類由来であってもよく、または鳥類の共刺激分子遺伝子に基づいて化学的に合成されてもよい。本発明の組換えベクターは、免疫原として、またターゲット細胞、ターゲット抗原およびその免疫エピトープに対する免疫応答の増強を刺激するワクチンとして有用である。複数の共刺激分子をコードする遺伝子を含む本発明の組換えベクターを用いたそのようなレベルの免疫応答増強は、単一または２つの共刺激分子を用いては得られなかった。
【００５８】
本発明に有用な共刺激分子をコードする遺伝子またはその機能性部分には、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌ、哺乳動物相同体などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組換えベクターは、単一または２つの共刺激分子を用いては得られない相乗的な免疫応答増強を得るために、少なくとも３つの共刺激分子をコードする遺伝子を含む。組換えベクターに用いるための種々の組合わせの共刺激分子をコードする遺伝子は本発明の範囲に含まれ、目的とする免疫応答および処置すべき疾患または状態に応じて下記の組合わせを含むことができる：Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３；Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３；Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、４−１ＢＢＬ；Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ；ＣＤ５９、ＶＣＡＭ−１；およびＢ７．１、Ｂ７．２；ＣＤ５９、ＣＤ４０、４−１ＢＢＬ、ＣＤ７０およびＶＣＡＭ−１、Ｂ７．１、Ｂ７．２；ＯＸ−４０Ｌ、４−１ＢＢＬなど。１つまたは２つの共刺激分子をコードする組換えベクターの使用と比較して３つの共刺激分子をコードする組換えベクターを用いて達成される著しい相乗的免疫応答に基づけば、４、５またはそれ以上の共刺激分子をコードする組換えベクターは、相乗的免疫応答、または３つの共刺激分子をコードする組換えベクターを用いた場合と同等またはより大きな免疫応答を生じるであろう。
【００５９】
Ｂ７はＩｇ遺伝子スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子ファミリーを表す。このメンバーには、ネズミＢ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）が含まれる。Ｂ７．１およびＢ７．２はＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）の天然リガンドである。ネズミＢ７．１の遺伝子配列は、Freeman et al.(J. Immunol., 143:2714-2722, 1989)中に、およびＧＥＮＥＢＡＮＫに寄託Ｎｏ．  Ｘ６０９５８で開示されている。ネズミＢ７．２の遺伝子配列は、Ａｚｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，  ３６６，  ７６−７９，  １９９３）、ならびにＧＥＮＥＢＡＮＫに寄託Ｎｏ．  Ｌ２５６０６およびＭＵＳＢ７２Ｘで開示されている。
【００６０】
ネズミＢ７共刺激分子のヒト相同体およびその機能性部分は本発明の範囲に含まれ、ヒトの臨床用組換えベクターに特に有用である。ネズミＢ７共刺激分子のヒト相同体には、ＣＤ８０、すなわちネズミＢ７．１の相同体、ＣＤ８６、すなわちＢ７．２の相同体が含まれる。ヒトＢ７．１（ＣＤ８０）の遺伝子配列はＧＥＮＥＢＡＮＫに寄託Ｎｏ．  Ｍ２７５３３で開示され、ヒトＢ７．２（ＣＤ８６）の遺伝子配列は寄託Ｎｏ．  Ｕ０４３４３およびＡＦ０９９１０５で開示されている。本発明を実施するにはライセンスが要求されるであろう。
【００６１】
本発明に用いるためには、組換えベクターは、他の共刺激分子のほかにＢ７共刺激分子ファミリーのうちの少なくとも１つの分子またはＢ７共刺激分子もしくはその機能性部分の組合わせをコードする外来核酸配列を含むことができる。Ｂ７共刺激分子の組合わせには、２以上のＢ７．１分子、２以上のＢ７．２分子、Ｂ７．１とＢ７．２などが含まれるが、これらに限定されない。１態様において、組換えベクターは、Ｂ７．１分子をコードする外来核酸配列を、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１をコードする外来核酸配列と共に含む。
【００６２】
細胞間接着分子（ネズミＩＣＡＭ−１、ＣＤ５４）およびヒト相同体ＣＤ５４も共刺激分子として作用する。そのリガンドは、リンパ球および顆粒球の表面に発現する白血球機能関連抗原−１（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−１，  ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）である。ネズミＩＣＡＭ−１の遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに寄託Ｎｏ．  Ｘ５２２６４で開示され、ヒトＩＣＡＭ−１相同体（ＣＤ５４）の遺伝子は寄託Ｎｏ．  Ｊ０３１３２で開示されている。１態様において、本発明の組換えベクターは、２以上の他の共刺激分子をコードする外来核酸配列のほかに、少なくとも１つのネズミＩＣＡＭ−１分子、ヒト相同体、他の哺乳動物相同体またはその機能性部分をコードする外来核酸配列を含む。
【００６３】
共刺激分子白血球機能抗原３であるネズミＬＦＡ−３（ＣＤ４８）およびそのヒト相同体ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、すなわちグリコシル−ホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー内のＣＤ２ファミリーのメンバーである。ＬＦＡ−３の天然リガンドは、胸腺細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞上に発現するＣＤ２（ＬＦＡ−２）である。ネズミＬＦＡ−３の遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに寄託Ｎｏ．  Ｘ５３５２６で開示され、ヒト相同体の遺伝子は寄託Ｎｏ．  Ｙ００６３６で開示されている。
【００６４】
Ｔ細胞抗原４−１ＢＢＬは、抗原刺激した一次Ｔ細胞培養物およびレクチン駆動による胸腺細胞活性化において共刺激信号を中継する共刺激分子である（Hurtado, J. C. et al., J. Immunol., 158(6):2600-2609, 1997）。４−１ＢＢＬは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、すなわちサイトカインに富む一群の細胞表面分子に属する（Vinay, D. S. et al., Seminars in Immunol., 1998, Vol. 10, pp. 481-489）。ネズミ４−１ＢＢＬに対する遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに寄託Ｎｏ．  Ｕ０２５６７で開示されている。ヒト相同体ｈｕ４−１ＢＢＬの遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに寄託Ｎｏ．  Ｕ０３３９７で開示されている。
【００６５】
ＯＸ−４０Ｌは、ＴＮＦとの相同体が限られたＩＩ型膜タンパク質であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＯＸ−４０＋Ｔ細胞に対し刺激性である。ネズミとヒトのＯＸ−４０Ｌ  ｃＤＮＡはヌクレオチドレベルで６８％、アミノ酸レベルで４６％の相同性をもつ。ヒトＯＸ−４０ＬはヒトＴ細胞のみを刺激するが、ネズミＯＸ−４０Ｌはヒトとマウスの両方の細胞を刺激する。ＡＰＣはＯＸ−４０Ｌを発現し、ＣＤ＋Ｔ細胞に抗原を提示する際、ＯＸ−４０Ｌ：ＯＸ−４０Ｒ信号を伝達することができる。ＯＸ−４０Ｌ信号伝達はヒト樹状細胞の分化にとって重要であり、またＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ＢおよびＩＬ−６の産生を増加させる（Weinberg, A. D. et al., 1998, Seminars in Immunol., Vol. 10:471-480）。ＯＸ−４０Ｌは一次ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の持続に有効な共刺激分子であり、Ｂ７−１と組み合わせて用いられる（Gramaglia, I. et al., 1989, J. Immunology, Vol. 161:6510-7）。
【００６６】
本発明に有用なベクターは、少なくとも３またはそれより多い外来遺伝子、好ましくは５以上の外来遺伝子を発現させることができる。本発明に有用なベクターには、宿主細胞において少なくとも３つの外来共刺激分子遺伝子生成物を機能性発現しうる任意のベクターが含まれる。このベクターは、少なくとも３つの外来共刺激分子をコードする遺伝子のほかに、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープ、ならびに選択性マーカーをコードする少なくとも１つの外来遺伝子を発現させることができる。
【００６７】
本発明のベクターには、細菌（たとえばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）ベクター、ウイルスベクター、核酸ベースベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、イリドウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明に有用なポックスウイルスには、複製性および非複製性ベクターが含まれる。そのようなポックスウイルスには、オルトポックス、たとえばワクシニア、アライグマ（ｒａｃｃｏｏｎ）ポックス、ウサギポックスなど、アビポックス、スイポックス、カプリポックスなどが含まれるが、これらに限定されない。ポックスウイルスは、ワクシニア−コペンハーゲン、ワクシニア−Ｗｙｅｔｈ株、ワクシニア−ＭＶＡ株、ＮＹＶＡＣ、ニワトリポックス（ｆｏｗｌｐｏｘ）、ＴＲＯＶＡＣ、カナリアポックス、ＡＬＶＡＣ、ブタポックスよりなる群から選択できる。１態様において、組換えベクターはワクシニアウイルスである。他の態様において、組換えベクターはニワトリポックスである。
【００６８】
本発明の好ましいベクターは、組換えウイルス、好ましくはポックスウイルスである。本発明に有用な組換えポックスウイルスは、下記を含めた多数の利点をもつ：（ｉ）ＡＰＣおよび腫瘍細胞を含めた多数の細胞タイプへの効率的な遺伝子運搬；（ｉｉ）高レベルのタンパク質発現；（ｉｉｉ）免疫系への最適な抗原提示；（ｉｖ）細胞仲介による免疫応答および抗体応答を誘発する能力；（ｖ）永久的ではなく一過性の細胞遺伝子修飾、ならびに（ｖｉ）異なる属に由来するポックスウイルスの併用が可能であること（それらは免疫学的に交差反応性ではないので）。本発明の組換えポックスウイルスの構築に有用な親ポックスウイルスには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：オルトポックスウイルス、たとえば複製性ワクシニアウイルス（Perkus et al., Science, 229:981-984, 1985;Kaufman et al., Int. J. Cancer, 48:900-907, 1991;Moss, Science, 252:1662, 1991）、高弱毒化ワクシニアウイルス、たとえばＭＶＡ、修飾ワクシニア−アンカラ（Sutter and Moss, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 89:10847-10851;Sutter et al., Virology, 1994）、ワクシニア−コペンハーゲンおよびＮＹＶＡＣ；アビポックスウイルス（１５）、たとえばニワトリポックスウイルス（１５）、カナリアポックスウイルス、たとえばＡＬＶＡＣなど（Baxby and Paoletti, Vaccine, 10:8-9, 1992;Rinns, M. M. et al.(編), Recombinant Poxviruses, CRC Press社, Boca Raton, 1992;Paoletti, E., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93:11349-11353, 1996）、ならびにスイポックスウイルス、カプリポックスウイルスなど。
【００６９】
１態様において、親ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。具体的な態様において、ワクシニアウイルスはＷｙｅｔｈ株またはそれに由来する株である。Ｗｙｅｔｈ株に由来する株には、機能性Ｋ１Ｌ遺伝子を欠如するｖＴＢＣ３３などが含まれるが、これらに限定されない。さらに他の態様において、ウイルスは天然痘ワクチンとしてＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ジョージア州アトランタ）から入手できるＤｒｙ−Ｖａｘである。他の態様において、親ウイルスはニワトリポックスの株、たとえばＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社）などである。
【００７０】
本発明の組換えベクターは、宿主において宿主細胞を感染、トランスフェクションまたはトランスダクションさせることができる。宿主には哺乳動物、鳥類、魚類などが含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞は、組換えベクターにより感染、トランスフェクションまたはトランスダクションされやすく、かつ組換えベクターからの外来遺伝子を機能的レベルで発現できる任意の細胞である。宿主細胞には、プロフェッショナルＡＰＣ、および抗原提示前駆細胞、たとえば単球、マクロファージ、ＤＣ、ランゲルハンス細胞などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組換えベクターは、腫瘍細胞、または他の細胞タイプ、たとえば線維芽細胞もしくは筋細胞を感染させることもできる。宿主細胞の感染により外来の外因性共刺激分子それぞれが発現し、またターゲット抗原（１以上）が組換えベクター中にある場合にはターゲット抗原をコードする外来核酸配列が発現することができる。宿主細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞に適切に抗原を提示するのに適したＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩまたはＩＩ分子を発現するか、あるいは発現するように工学的に処理される。したがって、実質的にいかなる哺乳動物細胞も、複数の共刺激分子を発現する適切な抗原提示細胞になるように工学的に処理することができる。
【００７１】
本発明の組換えベクターは、機能可能な状態で核酸配列に結合した少なくとも１つの発現制御要素を含む。発現制御要素は、核酸配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される（Ausubel et al., 1987, ”Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons,ニューヨーク州ニューヨーク）。発現制御要素は当技術分野で既知であり、プロモーターがこれに含まれる。本発明に有用なプロモーターは当技術分野で既知のポックスウイルスプロモーターであり、３０Ｋ、Ｉ３、ｓＥ／Ｌ、７．５Ｋ、４０Ｋ、Ｃ１などが含まれるが、これらに限定されない。３０Ｋプロモーターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．  Ｍ３５０２７の塩基番号２８，０１２〜２８，４２３（アンチセンス）に開示されている。Ｉ３の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＮｏＪ０３３９９の塩基番号１１００〜１３０１（アンチセンス）に開示されている。７．５Ｋプロモーターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．  Ｍ３５０２７の塩基番号１８６５５０〜１８６６８０に開示されている。４０Ｋプロモーターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．  Ｍ１３２０９の塩基番号９７００〜９８５８（アンチセンス）に開示されている。Ｃ１プロモーターの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．  Ｍ５９０２７の塩基番号１〜２４２、およびＵＳＰ  ５，０９３，２５８に開示されている。ｓＥ／Ｌプロモーターの配列は、参考文献１６に開示されている。他のポックスウイルスプロモーター、たとえばＤａｖｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓ（J. Mol. Biol., 210:749-769(1989)）により記載されるものを使用できる。これらのプロモーターはいずれも当技術分野の標準法により合成できる。適切なプロモーターの選択は、それの発現のタイミングおよびレベルに基づく。初期または初期／後期プロモーターが好ましい。好ましい態様においては、用いるプロモーターまたは組合わせプロモーターにより、感染宿主中でそれぞれの共刺激分子を相乗的免疫応答を得るのに最適な状態で発現させることができる。好ましい態様においては、共刺激分子をコードする外来遺伝子それぞれを、離れた別個のプロモーターにより制御する。
【００７２】
核酸ベースベクターの場合、構築体は脂質キャリヤーと結合した／またはそれに封入された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であってよい。所望により、脂質キャリヤー分子および／または構築体を特定のターゲット細胞タイプ（１以上）にターゲティングさせ、および／またはそこで発現させることができる。裸のＤＮＡベクターは、ＵＳＰ  ５，８２７，７０３に記載の方法で調製できる。転写開始領域またはプロモーター要素については、そのＤＮＡ配列を目的レベルで転写するものであればいかなる領域も使用できる。転写開始領域は、宿主細胞および／または転写されるＤＮＡに対して天然または相同であってもよく、あるいは宿主細胞および／または転写されるＤＮＡ配列に対して外来または異種であってもよい。裸のＤＮＡの転写開始に効果的なプロモーター要素には、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ（サイトメガロウイルス）極初期Ｉプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。核酸ベースベクターは、注射器、カテーテル、または注射針を用いない注入、たとえば遺伝子銃により宿主に運搬できる。
【００７３】
本発明の１態様においては、第１共刺激分子またはその機能性部分をコードする第１プロモーター制御下の外来核酸配列、第２共刺激分子またはその機能性部分をコードする第２プロモーター制御下の外来核酸配列、および第３共刺激分子またはその機能性部分をコードする第３プロモーター制御下の外来核酸配列を含む組換えベクターが提供される。この組換えベクターはさらに、ターゲット抗原またはその免疫性部分をコードする第４プロモーター制御下の外来核酸配列を備えていてもよい。
【００７４】
本発明の１態様においては、ＬＦＡ−３またはその機能性部分をコードする３０Ｋポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、ＩＣＡＭ−１またはその部分をコードするＩ３ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、およびＢ７．１またはその部分をコードするｓＥ／Ｌポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む組換えポックスウイルスが提供される。そのような組換えポックスウイルス構築体の一例は、図１１Ａに示すワクシニアｖＴ１７１である。この組換えポックスウイルスは、さらに腫瘍関連抗原またはその免疫性部分をコードする核酸配列を備えていてもよい。この本発明の１態様は、図４Ｃに示す組換えワクシニアｖＴ１７２である。
【００７５】
本発明の１態様においては、Ｂ７．１をコードするｓＥ／Ｌポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、ＬＦＡ−３またはその部分をコードするＩ３ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、およびＩＣＡＭ−１またはその部分をコードする７．５Ｋポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む組換えポックスウイルスが提供される。この構築体は、さらに少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列、および／または選択性マーカーをコードする核酸配列を備えていてもよい。そのような組換えポックスウイルス構築体の１態様は、選択性マーカーとしてｌａｃＺ遺伝子を含む、図４Ｂに示すワクシニアｖＴ１９９である。
【００７６】
本発明の１態様において、組換えニワトリポックスウイルスは、Ｂ７．１またはその部分をコードするｓＥ／Ｌポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、ＬＦＡ−３またはその部分をコードするＩ３ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、およびＩＣＡＭ−１またはその部分をコードする７．５Ｋポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む。この態様の一例は、図４Ａに示すニワトリポックスｖＴ２２２である。組換えニワトリポックスウイルスはさらに、ターゲット抗原ＣＥＡをコードする４０Ｋポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列、および選択性マーカーｌａｃＺをコードするＣ１ポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含むことができる。この態様の一例は、図４Ｂに示すニワトリポックスｖＴ１９４である。
【００７７】
他の態様において、組換えニワトリポックスウイルスは、腫瘍関連抗原ＭＵＣ−１またはその部分をコードする４０Ｋプロモーター制御下の核酸配列、ＬＦＡ−３またはその部分をコードする３０Ｋプロモーター制御下の核酸配列、ＩＣＡＭ−１またはその部分をコードするＩ３プロモーター制御下の核酸配列、およびＢ７．１またはその部分をコードするｓＥ／Ｌポックスウイルスプロモーター制御下の核酸配列を含む（図１４Ｃに示す）。この組換えニワトリポックスウイルスは、いずれかの腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸配列、ならびにＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１およびＢ７．１をコードする、多数のプロモーターの制御下にある核酸配列を含むことができる（図４Ｄに示す）。
【００７８】
本発明の他の態様は、共刺激分子ＬＦＡ−３、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１のヒト相同体をコードする核酸配列を含む組換えベクターである。この組換えベクターはさらに、感染した宿主細胞中で各配列を発現させるのに適したプロモーターを備えていてもよい。この組換えベクターの１態様は、図９に示すｖＴ２２４である。
【００７９】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含むプラスミドベクターを提供する。１態様において外来核酸配列は、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌなどよりなる群から選択される少なくとも３つ、またはそれより多い共刺激分子をコードするように選択される。本発明の１態様においては、少なくとも１つのＢ７共刺激分子をコードする外来核酸配列、ＩＣＡＭ−１共刺激分子をコードする外来核酸配列、およびＬＦＡ−３共刺激分子をコードする外来核酸配列を含むプラスミドベクターが提供される。本発明のプラスミドベクターはさらに、共刺激分子の発現を制御するための少なくとも１つのプロモーター配列を備えている。好ましい態様において、共刺激分子をコードするそれぞれの核酸配列は、離れた別個のプロモーター配列により制御される。組換えポックスウイルスの作成に用いるには、本発明のプラスミドベクターはさらに、ポックスウイルスゲノムの非必須領域に由来するフランキングウイルス核酸配列を備えている。フランキングウイルス核酸配列は、相同組換えによる、外来配列への親ポックスウイルスゲノムの挿入を指令する。本発明のプラスミドベクターはさらに、当技術分野で既知のように、挿入された外来ＤＮＡを含む組換え子孫の選択および同定のための１以上の選択性マーカーを含んでもよい。これにはワクシニアＫ１Ｌ宿主域遺伝子、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼをコードする遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８０】
１態様において本発明のプラスミドベクターは、ＬＦＡ−３をコードする３０Ｋプロモーター制御下の核酸配列、ＩＣＡＭ−１をコードするＩ３プロモーター制御下の核酸配列、およびＢ７をコードするｓＥ／Ｌプロモーター制御下の核酸配列を、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｍ領域の各部分によりフランキングされた状態で含む。１態様において、このプラスミドベクターは図１にｐＴ５０３２として示される。
【００８１】
他の態様において本発明のプラスミドベクターは、Ｂ７をコードするｓＥ／Ｌプロモーター制御下の核酸配列、ＬＦＡ−３をコードするＩ３プロモーター制御下の核酸配列、およびＩＣＡＭ−１をコードする７．５Ｋプロモーター制御下の核酸配列を含む。このプラスミドベクターはさらに、別個のプロモーター配列により駆動されるｌａｃＺ遺伝子またはその部分を含むことができる。これらの配列は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｊ領域の各部分によりフランキングされている。このプラスミドベクターの具体的態様を、図２にｐＴ５０４７として示す。
【００８２】
他の態様において本発明のプラスミドベクターは、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードする核酸配列と組み合わせて、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含む。ターゲット抗原の発現を制御するためのプロモーターが備えられている。このプラスミドベクターの具体的態様は図３にｐＴ５０３１として示され、ターゲット抗原ＣＥＡをコードする核酸配列を含む。
【００８３】
他の態様において本発明のプラスミドベクターは、腫瘍関連抗原ＣＥＡをコードする４０Ｋプロモーター制御下の核酸配列、Ｂ７をコードするｓＥ／Ｌプロモーター制御下の核酸配列、ＬＦＡ−３をコードするＩ３プロモーター制御下の核酸配列、およびＩＣＡＭ−１をコードする核酸配列を含む。図６にｐＴ５０４９として示すように、このプラスミドベクターはさらにｌａｃＺ遺伝子をＣ１プロモーター制御下に含むことができる。プラスミドｐＴ５０４９は、１９９８年１１月１３日、ブダペスト条約の協定に基づいてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（10801 University Boulevard, Manassa, VA20110）にＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．  ２０３４８１として寄託された。
【００８４】
さらに他の態様において本発明のプラスミドベクターは、ｈｕＬＦＡ−３をコードする３０Ｋプロモーター制御下の核酸配列、ｈｕＩＣＡＭ−１をコードするＩ３Ｋプロモーター制御下の核酸配列、およびｈｕＢ７．１をコードするｓＥ／Ｌプロモーター制御下の核酸配列を含む。このプラスミドベクターの具体的態様を図８にｐＴ５０６４として示す。これは、１９９８年１１月１３日、ブダペスト条約の協定に基づいてＡＴＣＣにＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．  ２０３４８２として寄託された。
【００８５】
本発明のプラスミドベクターは、組換えベクター作成方法に用いるためのキットの形で提供することができる。このキットはさらに、親ウイルス、および組換え法に用いる他の試薬を備えていてもよい。
【００８６】
本発明はさらに、複数の共刺激分子をコードする核酸配列を含む組換えポックスウイルスの作成方法を提供する。組換えポックスウイルスを作成するための１方法は、ＵＳＰ  ５，０９３，２５８に開示されるように、親ポックスウイルスゲノムＤＮＡと挿入すべき異種配列を保有するプラスミドベクターとの間でのｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換えにより達成される。外来配列をポックスウイルスに挿入するためのプラスミドベクターは、組換えＤＮＡ技術の標準法により構築される（３６）。プラスミドベクターは、それぞれタンパク質コード配列に結合したポックスウイルスプロモーターを含む１以上のキメラ外来遺伝子を、ポックスウイルスゲノムの非必須領域に由来するウイルス配列によりフランキングされた状態で含む。親ポックスウイルスに感染させた細胞内へ、受け入れられているトランスフェクション法によりこのプラスミドをトランスフェクションすると、プラスミド上のポックスウイルス配列と親ウイルスゲノム中の対応するＤＮＡとの間の組換えにより、ウイルスゲノム中へプラスミドからのキメラ外来遺伝子が挿入される。組換えウイルスは、当技術分野で既知の任意の多様な選択系およびスクリーニング系を用いて選択および精製される（１４）。ワクシニアゲノム中への外来遺伝子の挿入は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析により確認される。外来遺伝子の発現は、ウェスタンブロット分析により証明される。組換えポックスウイルスを作成するための別法は、直接ライゲーションにより達成される（Pleiderer et al., J. Gen. Virol., 76:2957-2962, 1995;Merchlinsky et al., Virol., 238:444-451, 1997）。
【００８７】
複数の共刺激分子をコードする核酸配列を、少なくとも１つのターゲット抗原またはそのエピトープをコードする核酸配列と組み合わせて含む組換えベクターの使用は、このターゲット抗原またはそのエピトープに対する免疫応答を増強し、かつこのターゲット抗原またはそのエピトープを発現する細胞に対する免疫応答を増強するのに有用である。本発明の組換えベクターを用いて得られる、ターゲット抗原、エピトープ、またはターゲット抗原を発現する細胞に対する免疫応答の程度は、単一または２つの共刺激分子を用いる系により達成されるものより著しく大きい。
【００８８】
本発明の組換えベクターは、ターゲット抗原またはそのエピトープに対する相乗的免疫応答を得るために、ターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列と共に、少なくとも３つまたはそれ以上の共刺激分子をコードする。１態様において組換えポックスウイルスは、Ｂ７、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードする核酸配列を、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列と共に備えている。場合により、多価ワクチンを得るために、１以上の核酸配列を用いて複数のターゲット抗原またはその免疫エピトープを生成することが有益であろう。
【００８９】
本明細書中で用いるターゲット抗原は、哺乳動物における病原性物質または疾病状態の免疫認識および最終的排除または制御に際して重要な抗原またはその抗原上の免疫エピトープである。免疫認識は細胞性および／または体液性であってよい。細胞内病原体および癌の場合、免疫認識は好ましくはＴリンパ球応答である。
【００９０】
ターゲット抗原は、たとえば下記のウイルスのような病原性微生物から誘導または単離することができる：ＨＩＶ（Korber et al. 編, HIV Molecular Immunology Database, Los Alamos National Laboratory,ニューメキシコ州ロスアラモス，  １９７７）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＵＳＰ  ５，７１９，０５４）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＵＳＰ  ５，７８０，０３６）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＵＳＰ  ５，７０９，９９５）、ＥＢＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など。ターゲット抗原は、微生物細菌、たとえばＣｈｌａｍｙｄｉａ（ＵＳＰ  ５，８６９，６０８）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＵＳＰ  ５，９５５，５９６）などから誘導または単離することができる。
【００９１】
ターゲット抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、侵襲性Ｃａｎｄｉｄａ（ＵＳＰ  ５，６４５，９９２）、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａなどを含めた病原性酵母から誘導または単離することができる。
【００９２】
ターゲット抗原は、病原性原虫および病原性寄生虫から誘導または単離することができ、これにはＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（ＵＳＰ  ５，９６５，２４２）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（ＵＳＰ  ５，５８９，３４３）およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
ターゲット抗原には、前新生物状態または過形成状態に関連する抗原が含まれる。ターゲット抗原は、癌関連または癌原性であってもよい。そのようなターゲット抗原は、腫瘍特異性抗原、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または組織特異性抗原、そのエピトープ、およびそのエピトープアゴニストであってもよい。そのようなターゲット抗原には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびそのエピトープ、たとえばＣＡＰ−１、ＣＡＰ−１−６Ｄ（４６）など（ＧｅｎＢａｎｋ寄託Ｎｏ．  Ｍ２９５４０）、ＭＡＲＴ−１（Kawakami et al., J. Exp. Med., 180:347-352, 1994）、ＭＡＧＥ−１（ＵＳＰ  ５，７５０，３９５）、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ（ＵＳＰ  ５，６４８，２２６）、ＧＰ−１００（Kawakami et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 91:6458-6462, 1992）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点変異ラット癌遺伝子、正常および点変異ｐ５３癌遺伝子（Hollstein et al., Nucleic Acids Res., 22:3551-3555, 1994）、ＰＳＭＡ（Israeli et al., Cancer Res., 53:227-230, 1993）、チロシナーゼ（Kwon et al., PNAS, 84:7473-7477, 1987）、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）（Cohen et al., Nucleic Acids Res., 18:2807-2808, 1990;USP  ５，８４０，８３９）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Chen et al., PNAS, 94:1914-1918, 1997)、ＴＲＰ−２（Jackson et al., EMBO J, 11:527-535, 1992)、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（ＵＳＰ  ５，５５０，２１４）、ＢＲＣ−Ｉ、ＢＲＣ−ＩＩ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＴＡＡ類および組織特異性抗原の修飾体、ＴＡＡ類のスプライス変異体、エピトープアゴニストなど。他のＴＡＡ類は、当技術分野で既知の方法、たとえばＵＳＰ  ４，５１４，５０６に開示された方法により同定、単離およびクローン化することができる。ターゲット抗原には、１以上の成長因子およびそれぞれのスプライス変異体も含まれる。
【００９４】
本発明を用いてターゲティングできるヒト腫瘍抗原および組織特異性抗原ならびにその免疫エピトープには表１に例示したものが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
【表１】
0005254153.tif 000002
【００９６】
ＤＮＡゲノムを含む生物については、目的とするターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする遺伝子をゲノムＤＮＡから単離する。ＲＮＡゲノムをもつ生物については、ゲノムのｃＤＮＡコピーから目的遺伝子を単離できる。ゲノムの制限地図が得られれば、当技術分野でルーティンな方法で制限エンドヌクレアーゼ消化により目的遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを開裂させる。目的遺伝子が既にクローン化されている場合、それらの入手可能なクローンから遺伝子を容易に得ることができる。あるいは、遺伝子のＤＮＡ配列が分かっている場合、デオキシリボ核酸の合成に慣用される任意の方法で遺伝子を合成できる。
【００９７】
目的抗原をコードする遺伝子は、その遺伝子を細菌性宿主にクローニングすることにより増幅できる。この目的に種々の原核細胞クローニングベクターを使用できる。その例はプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣおよびｐＥＭＢＬである。
【００９８】
少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする遺伝子を、標準法によりウイルスと組み換えるために設計したプラスミドベクターへの挿入用に調製できる。一般にクローン化遺伝子を制限酵素消化により原核細胞性クローニングベクターから切り取ることができる。大部分の場合、切り取ったフラグメントは遺伝子の全コード領域を含むであろう。クローン化遺伝子を保有するＤＮＡを、必要に応じて、たとえばウイルスとの組換えに用いるＤＮＡベクターの挿入部位と適合するフラグメント末端を形成するために修飾し、次いで精製した後、本明細書に記載するように制限エンドヌクレアーゼ開裂部位（クローニング部位）に挿入することができる。
【００９９】
本発明により疾病を治療または予防することができ、これらの疾病にはウイルス、細菌、酵母、寄生虫、原虫、癌細胞などにより引き起こされる疾病が含まれる。複数の共刺激分子を含む組換えベクターは普遍的免疫エンハンサーとして使用でき、したがって病因が未知である疾病の処置に有用である。
【０１００】
本発明の組換えベクターを用いて治療または予防できる前新生物状態または過形成状態には結腸ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎、胸部病変などの前新生物状態または過形成状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の組換えベクターを用いて治療または予防できる癌には、原発性または転移性の黒色腫、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、大腸癌、多発骨髄腫、神経芽細胞腫、ＮＰＣ、膀胱癌、子宮頚癌などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む組換えベクターを医薬的に許容できるキャリヤー中に含む医薬組成物を提供する。共刺激分子をコードする少なくとも３つの遺伝子が組換えベクターの一部を構成し、これらはＢ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌなどをコードする遺伝子群から選択できる。組換えベクターはさらに、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。他の態様において医薬組成物は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む第１組換えベクター、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含む第２組換えベクター、ならびに医薬的に許容できるキャリヤーを含む。本発明の医薬組成物を投与すると、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子が宿主細胞に供給される。
【０１０３】
１態様において医薬組成物は、複数の共刺激分子をコードする外来遺伝子を含む組換えポックスウイルスを、医薬的に許容できるキャリヤー中に含む。この組換えポックスウイルスはさらに、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする第２組換えポックスウイルスを供給してもよい。
【０１０４】
本発明は、Ｂ７．１〜Ｂ７．２をコードする核酸配列、ＩＣＡＭ−１をコードする核酸配列、およびＬＦＡ−３をコードする核酸配列をコードする組換えポックスウイルス、ならびに医薬的に許容できるキャリヤーを含む、医薬組成物を提供する。このＢ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３構築体のほかに、本発明の医薬組成物の組換えポックスウイルスはさらに、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、少なくとも１つのターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードするこの核酸配列は、第２組換えポックスウイルスにより組成物中に供給されてもよい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、外から添加した当技術分野で既知の免疫刺激分子、たとえば共刺激分子Ｂ７、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、４−１ＢＢＬ、ＣＤ５９、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＶＣＡＭ−１、ＯＸ−４０Ｌなど、ならびに／あるいはサイトカインおよびケモカイン、たとえばＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＵＳＰ  ５，５５４，５１２；５，８４３，４２３）など（これらに限定されない）を、免疫応答の相乗効果または増強の追加のために含むことができる。サイトカインおよびケモカイン自体を組成物に供給してもよく、あるいはサイトカインまたはケモカインをコードする組換えウイルスベクターによりサイトカインおよびケモカインを供給してもよい。
【０１０６】
本発明には、病原性微生物または本明細書に示す癌により引き起こされる疾病の治療または予防のための方法も含まれる。
【０１０７】
この処置方法では、本発明の組換えベクターの投与は”予防”または”療法”のいずれのためであってもよい。予防的に供給する場合、何らかの症状が出る前に本発明の組換えベクターを投与する。予防のための組換えベクター投与は、その後の感染症または疾病を阻止または軽減するために役立つ。治療のために投与する場合、感染症または疾患の症状が発症したとき、または発症後に、組換えベクターを供給する。このように本発明は、予想される病因物質への曝露もしくは疾病状態の前に、または感染症もしくは疾病の発症後に供給することができる。
【０１０８】
接種物に関して”１回量”という用語は、哺乳動物に１回の投与量として適切な物理的に独立した単位を表し、各１回量は目的とする免疫原効果を生じるように計算された予め定めた量の組換えベクターを必要な希釈剤と共に含有する。本発明の新規な接種物の１回量の詳細は、組換えウイルス独自の特性および達成すべき個々の免疫効果により支配され、それらに依存する。
【０１０９】
接種物は一般に、水性医薬組成物を形成するための許容できる（受容できる）希釈剤、たとえば食塩水、リン酸緩衝食塩水、または生理学的に許容できる他の希釈剤中の溶液として調製される。
【０１１０】
接種経路は、乱刺法、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、腫瘍内など、病因物質に対する保護応答を誘導するものであってよい。この用量を少なくとも１回投与する。後続量は指示に従って投与することができる。
【０１１１】
１態様においては、異種の初回免疫−追加免疫方式を用いる。一例では、核酸ベースベクターなどの第１ベクターで少なくとも１回、宿主を免疫化する。後続免疫化をポックスウイルスベクターにより行う。他の例では、宿主をまず第１ポックスウイルスベクターで免疫化し、次いで異なる属の第２ポックスウイルスベクターで免疫化する。
【０１１２】
哺乳動物（好ましくはヒト）に本発明の組換えベクターを投与する場合、投与する組換えベクターの量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、医学的前歴、疾病の進行、腫瘍発症などの要因に応じて異なるであろう。
【０１１３】
一般に、約１０５〜約１０１０プラーク形成単位の量の組換えウイルスをレシピエントに投与することが望ましい。ただし、これより低い用量または高い量も投与できる。
【０１１４】
腫瘍関連抗原および腫瘍特異性抗原の遺伝子決定により、癌療法のためのターゲティングした抗原特異的ワクチンを開発できる。組換えポックスウイルスのゲノムに、複数の共刺激分子をコードする遺伝子と共に腫瘍抗原遺伝子を挿入すると、癌発症のリスクが高い個体における予防として特異的免疫応答を誘導するために（予防免疫化）、外科処置前に腫瘍を縮小させるために、初回外科処置後の疾病再発を防止するために（抗転移ワクチン接種）、またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）数を増加させ、これにより散在性腫瘍の根絶におけるそれらの有効性を改善するために（樹立疾病の治療）、有効な系が得られる。本発明の組換えウイルスは、オートロガスリンパ球（ＣＤ８＋）、細胞毒性Ｔリンパ球および／またはＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、あるいはＮＫ細胞において、腫瘍患者に戻す前にｅｘ  ｖｉｖｏで免疫応答を誘導することができる（適応免疫療法）。
【０１１５】
癌の処置においては、腺癌などの癌の徴候前に、または腺癌などの癌に冒された哺乳動物において疾病の退縮を仲介するために、組換えベクターを哺乳動物に導入することができる。
【０１１６】
処置すべき疾病または状態および処置方法に応じて、組換えベクターは複数の共刺激分子をコードする遺伝子のほかにターゲット抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含んでもよく、含まなくてもよい。ターゲット抗原またはその免疫エピトープは、組換えベクターを感染させる宿主細胞により内因性供給されてもよい。たとえば腫瘍細胞は腫瘍関連抗原またはそのエピトープを内因性発現する可能性があり、外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子を添加する必要はないかもしれない。宿主に腫瘍関連抗原が存在しない場合、発現しないかまたは発現レベルが低い場合、外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子を供給してもよい。さらに、数種類の異なる腫瘍関連抗原をコードする遺伝子を供給してもよい。外因性腫瘍関連抗原をコードする外来遺伝子は、複数の共刺激分子をコードする遺伝子を含む同じ組換えベクターにより供給するか、あるいは第１組換えベクターと混合した第２組換えベクターにより供給することができる。
【０１１７】
組換えベクターを哺乳動物に投与する方法の例には、ｅｘ  ｖｉｖｏでの組換えベクターへの腫瘍細胞の曝露、または静脈内、Ｓ．Ｃ．、Ｉ．Ｄ．もしくはＩ．Ｍ．ウイルス投与による罹患宿主への組換えベクターの注射が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、組換えベクターもしくは組み合わせた組換えベクターを癌病変部もしくは腫瘍に直接注射するか、または医薬的に許容できるキャリヤー中で局所適用することにより、局部的に投与できる。１以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の配列を、投与すべき複数の共刺激分子をコードする核酸配列と組み合わせて保有する組換えベクターの量は、ウイルス粒子の力価に基づく。好ましい免疫原投与範囲は、哺乳動物（好ましくはヒト）当たり１０５〜１０１０ウイルス粒子である。免疫化すべき哺乳動物が既に癌または転移癌に冒されている場合、本発明のワクチンを他の療法処置と併用してもよい。
【０１１８】
ある処置方法においては、オートロガス細胞毒性リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球を、癌患者由来の血液、リンパ節、腫瘍などから得ることができる。特異的ターゲット抗原、および複数の外来共刺激分子を発現する抗原提示細胞またはターゲット抗原パルス処理した本発明のＡＰＣの存在下で培養することにより、リンパ球を増殖させ、抗原特異性リンパ球を増加させる。次いでこの抗原特異性リンパ球を患者に再注入する。
【０１１９】
免疫化の後、その抗原を認識する抗体または免疫細胞の産生によりワクチンの効力を評価することができる（特異的な細胞溶解活性または特異的なサイトカイン産生により、あるいは腫瘍の退縮により評価）。当業者には前記パラメーターを評価するための慣用法が既知である。
【０１２０】
本発明は、複数の共刺激分子およびターゲット抗原をコードする有効量の組換えベクターを哺乳動物に単独で投与することにより、あるいはターゲット細胞にベクター、ターゲット抗原またはその免疫エピトープを感染させることにより、抗原特異性Ｔ細胞応答を増強する方法を含む。この方法の１態様においては、Ｂ７ファミリーからの少なくとも１分子、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３をコードする組換えベクターを単独で、またはターゲット細胞、ターゲット抗原またはその免疫エピトープと混合して投与する。この免疫化法は、ターゲット抗原により生じる免疫応答を補足または増強して、単一または２つの共刺激分子の使用と比較して相乗的な応答をもたらす。複数の共刺激分子をコードする遺伝子を含む組換えベクターを投与する方法により、単一または２つの共刺激分子の使用と比較してターゲット抗原特異性リンパ球増殖が増大し、細胞溶解活性が増大し、サイトカイン分泌が増加し、ターゲット抗原に対する免疫性がより長期間持続する。組換えベクターはさらに、ターゲット抗原特異性免疫応答を相乗的に増強させるために、少なくとも１つの抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列を含むことができる。あるいは、少なくとも１つの抗原またはその免疫エピトープをコードする核酸配列は、複数の共刺激分子をコードするベクターとは別個の第２組換えベクターにより供給される。抗原特異性Ｔ細胞応答を増強する方法の１態様においては、哺乳動物、好ましくはヒトを、ｒＶ−ＨＩＶ−１エピトープ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３構築体で免疫化する。処置の有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、ターゲット抗原特異性リンパ球増殖、ターゲット抗原特異性細胞溶解応答、臨床応答などの測定により監視できる。
【０１２１】
抗原特異性Ｔ細胞応答を増強する本発明方法は、いかなるターゲットまたはその免疫エピトープについても利用できる。特に重要なものは、腫瘍関連抗原、組織特異性抗原および感染性物質の抗原である。
【０１２２】
患者に組換えベクターを投与するほか、処置すべき状態に応じて、他の外因性免疫調節薬または免疫刺激分子、化学療法薬、抗体、抗真菌薬、抗ウイルス薬などを単独で、または組み合わせて投与することができる。外から添加する他の薬剤の例には、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−６、α−、β−またはγ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子、Ｆｌｔ−３Ｌ、シクロホスファミド、シスプラチン、ガンシクロビル、アンホテリシンＢ、５−フルオロウラシルなどが含まれる。
【０１２３】
本発明は、複数の外因性外来共刺激分子を発現する宿主細胞であって、それらの分子が複数の共刺激分子をコードする外来核酸配列を含む組換えベクターにより供給される宿主細胞を提供する。宿主細胞は１以上の内因性ターゲット抗原またはその免疫エピトープをも発現してもよい。あるいは宿主細胞は１以上の外因性外来ターゲット抗原またはその免疫エピトープを発現するように工学的に処理されてもよく、これらは同様に複数の共刺激分子をコードする組換えベクターにより供給されてもよく、または第２組換えベクターにより供給されてもよい。
【０１２４】
抗原特異性免疫応答を刺激するのに使用できる本発明の宿主細胞は、本発明の組換えウイルスにより感染させることができ、かつ複数の外因性共刺激分子を発現でき、さらに、１以上の外因性ターゲット抗原またはその免疫エピトープを発現するように遺伝子工学的に処理することができるいかなる細胞であってもよい。そのような宿主細胞には、腫瘍細胞、抗原提示細胞、たとえばＰＢＭＣ、樹状細胞、皮膚または筋肉の細胞などが含まれるが、これらに限定されない。抗原提示細胞には、単球、マクロファージ、樹状細胞、樹状細胞前駆体、ランゲルハンス細胞、脾細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、筋細胞、上皮細胞などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
１態様において、宿主細胞は腫瘍細胞であり、腫瘍細胞をｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えベクターに曝露して、腫瘍細胞において複数の外来または外因性共刺激分子を発現させる。腫瘍細胞は内因性ターゲット抗原を発現してもよく、腫瘍細胞はさらに、ターゲット抗原（たとえばＴＡＡ）またはその免疫エピトープを発現するように遺伝子工学的に処理されてもよい。ＴＡＡおよび複数の免疫刺激分子の両方を発現する腫瘍細胞を、癌に冒された哺乳動物において腫瘍を軽減または排除するのに有効な量で哺乳動物に投与する。
【０１２６】
本発明は、複数の共刺激分子を過剰発現する樹状細胞前駆体、樹状細胞（ＤＣ）、ＤＣサブポピュレーション、およびその誘導体をも提供し、その際、複数の共刺激分子は複数の共刺激分子をコードする核酸配列をもつ組換えベクターにより外から供給される。本発明のＤＣ前駆体およびＤＣは、未処理のＤＣ前駆体またはＤＣが内因性発現するレベルより高いレベルの共刺激分子を発現する。ＡＰＣ、たとえば樹状細胞前駆体および樹状細胞は、１以上の内因性ターゲット抗原またはその免疫エピトープを発現してもよく、あるいは外因性ターゲット抗原は複数の共刺激分子をコードする組換えベクターまたは第２組換えベクターにより供給されてもよい。本発明はさらに、複数の共刺激分子を過剰発現するＡＰＣ、たとえば複数の共刺激分子を過剰発現する樹状細胞前駆体、および複数の共刺激分子を過剰発現する樹状細胞を、１以上のターゲット細胞、ターゲット抗原またはその免疫エピトープに対するワクチン接種および免疫療法応答のために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を活性化するのに使用する方法を提供する。
【０１２７】
供給源から単離したＡＰＣ、たとえば樹状細胞前駆体、樹状細胞、ＤＣサブポピュレーション、およびその誘導体を、少なくとも３つの共刺激分子をコードする外因性遺伝子を含む組換えベクターで、複数の共刺激分子が機能性発現するのに十分な期間、感染、トランスフェクションまたはトランスダクションする。複数の共刺激分子を過剰発現するそのような抗原提示性の樹状細胞前駆体および樹状細胞を、少なくとも１つのターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原もしくはその免疫エピトープ、または少なくとも１つのターゲット細胞のＲＮＡもしくはＤＮＡでパルス処理するか、あるいはそれらと共にインキュベートし、そしてある種にｉｎ  ｖｉｖｏでの関連Ｔ細胞応答の活性化に十分な量で投与することもできる。他の態様において、抗原提示性の樹状細胞前駆体および樹状細胞はさらに、少なくとも１つの外来ターゲット抗原もしくはその免疫エピトープを過剰発現する。
【０１２８】
複数の外因性共刺激分子を発現する宿主細胞を、１０３〜１０９個の用量で投与できる。採用できる投与経路には、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻内、経口、膀胱点滴注入、または乱刺法が含まれる。
【０１２９】
１態様においては、複数の共刺激分子を過剰発現する抗原提示性の樹状細胞前駆体または樹状細胞を、ターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原もしくはその免疫エピトープ、または少なくとも１つのターゲット細胞に由来するＤＮＡもしくはＲＮＡにｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露し、そして初回免疫化した、または初回免疫化していないＴ細胞と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートして関連Ｔ細胞応答を活性化する。次いで活性化Ｔ細胞を単独で、またはＤＣ前駆体またはＤＣと組み合わせて、ヒトなどの種に、ターゲット細胞、ターゲット抗原またはその免疫エピトープに対するワクチン接種および免疫療法応答のために投与する。１使用方法においてこれらの樹状細胞前駆体または樹状細胞は、癌細胞に対し免疫療法による増殖阻害応答を誘導するために有利に用いられる。
【０１３０】
他の態様においては、複数の共刺激分子を過剰発現する抗原提示細胞、好ましくはＤＣ前駆体またはＤＣと、関連のターゲット抗原またはその免疫エピトープを発現するターゲット細胞を、当技術分野で既知の方法により融合させて、ＡＰＣとターゲット細胞のヘテロカリオンを形成する（Gong, J. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 95:6279-6283, 1998）。そのような融合細胞、すなわちキメラＡＰＣ／ターゲット抗原細胞は、複数の共刺激分子とターゲット抗原またはその免疫エピトープの両方を発現する。好ましい態様において、ターゲット細胞は過形成細胞、悪性前細胞または悪性細胞である。キメラＡＰＣ／ターゲット抗原細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、ＴおよびＢリンパ球の免疫応答を増強するのに使用できる。
【０１３１】
樹状細胞前駆体は、患者の骨髄、末梢血およびリンパ節から得られる。患者を予めワクチン接種するか、あるいはＦｌｔ−３Ｌなどの化合物で処理して、抗原提示細胞数を増加させてもよい。樹状細胞は、任意の組織、たとえば皮膚の上皮（ランゲルハンス細胞）から、ならびにリンパ組織、たとえば脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺にみられるものから、ならびに血液およびリンパを含めた循環系から（ベール細胞）得られる。臍帯血はもうひとつの樹状細胞源である。
【０１３２】
樹状細胞を本発明に使用するために、当技術分野で既知の方法、たとえばＵＳＰ  ５，７８８，９６３に記載の方法で富化または単離することができる。樹状細胞前駆体、樹状細胞、およびその誘導体が得られると、それらを適切な培養条件下で培養して、細胞集団を拡張し、および／または細胞を組換えベクターによる最適な感染、トランスフェクションまたはトランスダクションのための、また最適なターゲット抗原取込み、プロセシングおよび提示のための状態に維持する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養において樹状細胞の適正な成熟状態を維持するのに特に有利なことは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）が両方とも存在することである。樹状細胞のサブポピュレーションを、付着性および／または細胞表面マーカーに基づく成熟度により単離することができる。ＤＣ前駆体、ＤＣおよびそのサブポピュレーションの表現型は、Banchereau and Steinman, Nature, 392:245-252, 1998に開示されている。
【０１３３】
１態様においては、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４をそれぞれ約５００単位／ｍｌの濃度で約６日間供給する（４１，  ４２）。他の態様においては、ＤＣ前駆体またはＤＣを成熟させるためにＴＮＦαおよび／またはＣＤ４０を用いる。
【０１３４】
樹状細胞前駆体または樹状細胞は処置すべき個体から得ることができるので、関連ＨＬＡ抗原に関してオートロガスである。あるいは、関連ＨＬＡ抗原（Ｉ群およびＩＩ群の両方、たとえばＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲ）が処置すべき個体と一致する個体から細胞を得ることができる。あるいは、処置を受ける個体に適した関連ＨＬＡ抗原を発現するように樹状細胞前駆体を工学的に処理する。
【０１３５】
樹状細胞前駆体または樹状細胞を、ＵＳＰ  ５，７８８，９６３に開示されるＥＢＶ形質転換などの方法でさらに遺伝子修飾して、それらの寿命を延長することができる。
【０１３６】
樹状細胞前駆体または樹状細胞を、生理学的に許容できる媒質中の組成物の形で供給してもよい。この組成物はさらに、ターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原またはその免疫エピトープを含むことができる。この組成物はさらに、免疫応答をさらに相乗的に増強するためにサイトカインおよび／またはケモカイン、たとえばＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含むことができる。
【０１３７】
他の態様において、複数の共刺激分子を過剰発現する本発明のＡＰＣは、抗原特異性リンパ球の増殖および機能の測定によりワクチンの効力を評価する方法に有用である。そのような方法では、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原またはその免疫エピトープを接種した個体からリンパ球を回収する。これらのリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明のＡＰＣと共に、ターゲット細胞、ターゲット細胞溶解物、ターゲット細胞膜、ターゲット抗原またはその免疫エピトープの存在下で培養し、抗原特異性リンパ球の数および機能を当技術分野で既知の方法により測定する。数および／または機能の増大は、そのワクチンが有効であることを示す。この方法は、ペプチドワクチンが適切な免疫応答を刺激する効力を測定するのに特に有用である。
【０１３８】
他の態様において、複数の外因性共刺激分子を発現する本発明のＡＰＣは、多数のペプチドから新規な免疫原ペプチドをスクリーニングする方法に有用である。このスクリーニング法においては、複数の共刺激分子またはその機能性部分をコードする組換えベクターに感染させた抗原提示細胞を多数のペプチドでパルス処理して、ペプチドパルス処理した抗原提示細胞を形成する。このペプチドパルス処理した抗原提示細胞をリンパ球と共にインキュベートし、リンパ球の免疫反応性を測定する。ペプチドパルス処理ＡＰＣの存在下でのリンパ球の免疫反応性増強は、そのペプチドに対する抗原特異性応答を示すものである。応答増強を誘導するペプチドは、腫瘍からの溶出、ＨＬＡ結合の分析などにより同定できる。多数のペプチドの供給源は、多数のランダムペプチドを発現するコンビナトリアルライブラリーであってもよい。免疫反応性の増強は体液性または細胞仲介性応答であってよく、当技術分野で既知の標準法、たとえば抗原誘発性の増殖、細胞毒性、抗体分泌、信号伝達などにより測定できる。同定された新規ペプチドを免疫原、ワクチンまたは診断薬として使用できる。それらのペプチドを含むタンパク質をサブトラクションライブラリーおよびディファレンシャルディスプレー遺伝子法により同定できる。
【０１３９】
本発明の組換えベクター、および本発明の組換えベクターで感染、トランスフェクションまたは誘発した宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方において体液性応答の増強を刺激する方法に有用である。そのような増強した体液性応答は、モノクローナル性またはポリクローナル性であってよい。複数の共刺激分子による体液性応答の増強は、単一または２つの共刺激分子による体液性応答と比較して相乗的である。体液性応答の相乗的増強は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン分泌の増大、Ｂ細胞の増殖または抗体産生の増大、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の増大、相補体仲介による細胞溶解の増大などにより判定できる。本発明の組換えベクターにより、または本発明の組換えベクターで感染、トランスフェクションまたは誘発した宿主細胞により誘導される抗体は、標準法により誘導される抗体より高いアフィニティーおよび／またはアビディティーならびに高い力価をもつと期待される。本発明の組換えベクターを用いる方法により誘導される抗体は、免疫優性ターゲットエピトープまたは非優性ターゲットエピトープを認識できる。
【０１４０】
本発明はさらに、本発明の組換えベクターで免疫化することにより誘導された抗体（１以上）を含む。この抗体は、目的とするターゲット抗原またはその免疫エピトープに対する特異性をもち、それと反応または結合する。本発明のこの態様において、抗体の由来はモノクローナル性またはポリクローナル性であってよい。
【０１４１】
抗体分子の例は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、または当技術分野でＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２およびＦ（ｖ）として知られる免疫グロブリン分子部分を含めた抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子部分である。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、当技術分野で既知の方法により産生させることができる（Kohler and Milstein(1975), Nature, 256, 495-497；Ｃａｍｐｂｅｌｌ”モノクローナル抗体技術、齧歯類とヒトのハイブリドーマの産生と解明”， Burdon et al.（編）（１９８５）”Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, Vol. 13, Elsevier Science Publishers,  アムステルダム）。抗体または抗原結合性フラグメントは、遺伝子工学的に製造することもできる。大腸菌においてＨ鎖およびＬ鎖を発現させる方法はいずれも、国際特許出願：ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３、およびＷＯ９０１４４２４、ならびにHuse et al.(1989), Science, 246:1275-1281の対象である。
【０１４２】
１態様において、本発明の抗体は生物学的試料中の新規な目的抗原を検出するための免疫アッセイに用いられる。
【０１４３】
１態様において、ＴＡＡを発現し、かつＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３を発現する組換えワクシニアウイルスを用いる免疫化により産生される本発明の抗体は、ＴＡＡを発現する癌に冒された哺乳動物の組織生検体からＴＡＡの存在を免疫細胞化学により評価するために使用される。罹患組織におけるこのようなＴＡＡ抗原デリニエーション（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）の評価を利用して、その疾病に冒された哺乳動物における疾病の進行または免疫療法の有効性を予後判定することができる。この態様において、ＴＡＡの例にはＣＥＡ、ＰＳＡおよびＭＵＣ−１が含まれるが、これらに限定されない。慣用される免疫組織化学的方法は、Harlow and Lane（編）（１９８８），”Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；Ausubel et al.（編）（１９８７），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons（ニューヨーク州ニューヨーク）に記載されている。
【０１４４】
他の態様において、本発明の抗体は免疫療法に用いられる。本発明の抗体は、受動免疫療法に使用できる。
【０１４５】
抗体または抗原結合フラグメントをレシピエント哺乳動物（好ましくはヒト）に供給する際、投与される抗体または抗原結合フラグメントの量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、全般的な医学的状態、過去の医学的状態などの要因に応じて異なるであろう。
【０１４６】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、疾病または感染症を予防し、程度、範囲または期間を縮小または減退させるのに十分な量でレシピエント対象に供給されるものとする。
【０１４７】
抗イディオタイプ抗体は普通は免疫応答中に生成し、抗イディオタイプ抗体の一部は元の免疫応答を誘発したエピトープに類似する。本発明において、その結合部位が疾病状態のターゲット抗原を反映する抗体の免疫グロブリン遺伝子またはその部分を単独で、また複数の免疫刺激分子の遺伝子またはその部分と組み合わせてウイルスゲノムのゲノムまたはその部分に取り込ませると、得られる組換えウイルスはその抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を誘導することができる。
【０１４８】
具体的態様の記載は本発明の全般性を十分に明らかにするものであり、全般性概念から逸脱することなくそのような具体的態様を種々の目的で改変および／または適合させることができる。したがってそのような適合および改変は開示した態様の均等物の意味および範囲に含まれるものとする。
【０１４９】
引用したすべての参考文献および特許を参考として本明細書に援用する。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
組換えワクシニア、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ１）Ｎｏ．ｖＴ１７１の生成
ワクシニア親ウイルスの起源は、ニューヨーク市衛生委員会（New York City Board of Health）株であり、そしてニューヨーク市衛生委員会のＷｙｅｔｈより得て、そして子ウシ中で継代し、痘瘡（ｓｍａｌｌｐｏｘ）ワクチン種を生成した。Ｆｌｏｗ研究室は、ＣｈａｎｏｃｋおよびＭｏｓｓ両博士（米国国立衛生研究所）から痘瘡ワクチン種、ロット３１９７、継代数２８の凍結乾燥バイアルを得た。本種ウイルスをエーテル処理し、そして３回プラーク精製した。
【０１５１】
ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ１）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ領域に位置するＭ２Ｌ（３０Ｋ）遺伝子への外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）配列の挿入を指示する、ｐＴ５０３２と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、ワクシニア３０Ｋ（Ｍ２Ｌ）プロモーター（３４）の転写調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、ワクシニアＩ３（１８）プロモーターの調節下にあり、そしてネズミＢ７．１遺伝子は、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーター（３２）の調節下にある。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１を参照されたい）。これらの隣接配列は、ワクシニアＫ１Ｌ宿主範囲遺伝子（３３）を含む。組換えワクシニアウイルスの構築において、ワクシニアのＷｙｅｔｈ株の誘導体を親ウイルスとして用いた。本親ウイルスはｖＴＢＣ３３と称され、機能するＫ１Ｌ遺伝子を欠き、そしてしたがってウサギ腎臓ＲＫ１３細胞上で効率的に複製することが不可能である（３８）。組換えワクシニアウイルスの生成は、ｖＴＢＣ３３ワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびｐＴ５０３２でトランスフェクションされているワクシニア感染ＲＫ１３細胞におけるｐＴ５０３２中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスはｖＴ１７１と称され、ＲＫ１３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ  ３７）上の増殖により選択した。プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに増殖させた。プラーク単離およびＲＫ１３細胞上での再プレーティングを２回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えｖＴ１７１のゲノム構造は、図４Ａに示される。
【０１５２】
実施例２
組換えワクシニア、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ２）Ｎｏ．ｖＴ１９９の生成
ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ２）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域に位置するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０４７と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミＢ７．１遺伝子はｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、Ｉ３プロモーターの転写調節下にあり、そしてネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、ワクシニア７．５Ｋプロモーター（３９）の調節下にある。さらに、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）ウイルスＣ１プロモーター（１５）の調節下にある大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子を組換え子孫のスクリーニングとして含む。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図２を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびｐＴ５０４７でトランスフェクションされているワクシニア感染Ｈｕ１４３ＴＫ−細胞（ＢａｃｃｈｅｔｔｉおよびＧｒａｈａｍ  １９７７）におけるｐＴ５０４７中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、以前記載されるように（３１）、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）の存在下でのＴＫ−ウイルスの選択を、ハロゲン化インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｌｕｏ−ｇａｌ）の存在下でｌａｃＺ遺伝子産物の発現を検出する、ｉｎ  ｓｉｔｕのウイルスプラーク上で行う色原体アッセイと組み合わせて行い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ１９９と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を上述の選択条件下で再度プレーティングした。本方式で選択されそして精製された他の組換えウイルスのうち、これらの選択条件下で出現したプラークは青のみであり、そしてこれらの青いプラークは、容易に単離し、そして精製された。しかし、ｖＴ１９９の場合、プラーク精製の第二の周期で、白いプラークのみが観察され；青いプラークは現れなかった。青いプラークの新たな組を摘み取りそして再度プレーティングし；再び、プラーク精製の第二の周期で白いプラークのみが観察された。最後の試みとして、青いプラークのさらに別の組を用い、プラーク精製の第二の周期後、青と白両方のプラークを得た。青いプラークを選択し、そして再度プレーティングした。プラーク精製をさらに２回（総数４回）行い、１００％青い組換えウイルスを得た。組換えｖＴ１９９のゲノム構造は、図４Ｂに示される。
【０１５３】
実施例３
組換えワクシニア、ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成
ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムへの外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＴＡＡ遺伝子、ネズミＬＦＡ−３遺伝子、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子、およびネズミＢ７．１遺伝子は、多数のプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、外来配列を挿入しようとする、ワクシニアゲノムのＤＮＡ配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの生成は、ワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされているワクシニア感染細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えプラークを選択条件下で細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換えウイルスを精製する。
【０１５４】
実施例４
組換えワクシニア、ｒＶ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成
ｒＶ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムへの外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＭＵＣ−１遺伝子、ネズミＬＦＡ−３遺伝子、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子、およびネズミＢ７．１遺伝子は、多数のプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、外来配列を挿入しようとする、ワクシニアゲノムのＤＮＡ配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの生成は、ワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされているワクシニア感染細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えプラークを選択条件下で細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに増殖させる。プラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換えウイルスを精製する。
【０１５５】
実施例５
組換えワクシニア、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ１７２の生成
ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ領域に位置するＭ２Ｌ（３０Ｋ）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０３１と称されるプラスミドベクターを構築した（図３を参照されたい）。ＣＥＡ遺伝子は、４０Ｋプロモーター（１３）の調節下にあり、ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの転写調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、そしてネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ワクシニアＫ１Ｌ宿主範囲遺伝子を含む、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する。組換えワクシニアウイルスの構築において、上述のｖＴＢＣ３３を親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、ｖＴＢＣ３３ワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびｐＴ５０３１でトランスフェクションされているワクシニア感染ＲＫ１３細胞におけるｐＴ５０３１中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスはｖＴ１７２と称され、上述のように、ＲＫ１３細胞上の増殖により選択した。プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫をさらに増殖させた。プラーク単離およびＲＫ１３細胞上での再プレーティングを２回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えｖＴ１７２のゲノム構造は、図４Ｃに示される。
【０１５６】
実施例６
組換え鶏痘、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ２２２の生成
組換え体の生成に用いた親鶏痘ウイルスの起源は、Schering-Plough Corporationにより製造される、ＵＳＤＡ認可家禽ワクチン、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣのバイアルからプラーク精製した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ産生のための出発物質は、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈから得た、Ｖｉｎｅｌａｎｄ研究室のニワトリ胚起源鶏痘ワクチンのバイアルであった。鶏卵の漿尿膜上でウイルスを２回継代し、マスター種ウイルスを生じた。ニワトリ胚線維芽細胞中でマスター種ウイルスをさらに２７回継代し、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種を調製した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ製品ロットの生成のためのウイルスストックを調製するため、ニワトリ胚線維芽細胞上で、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣマスター種を２回継代した。ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣの１つのバイアル、連続番号９６１２５を、初代ニワトリ胚皮膚細胞上で３回精製した。
【０１５７】
ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ８００１と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、７．５Ｋプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図５を参照されたい）。本組換えワクチンは、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ８００１でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ８００１中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２２２と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを６回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えｖＴ２２２のゲノム構造は、図７Ａに示される。
【０１５８】
実施例７
組換え鶏痘ｒＦ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成
ｒＦ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＴＡＡ遺伝子、ネズミＬＦＡ−３遺伝子、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子、およびネズミＢ７．１遺伝子は、多数のプロモーターの調節下にある。さらに、ｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成には、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１５９】
実施例８
組換え鶏痘ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成
ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＭＵＣ−１遺伝子、ネズミＬＦＡ−３遺伝子、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子、およびネズミＢ７．１遺伝子は、多数のプロモーターの調節下にある。さらに、ｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１６０】
実施例９
組換え鶏痘、ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ１９４の生成
ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０４９と称されるプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの調節下にあり、ネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、Ｉ３プロモーターの転写調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、ワクシニア７．５Ｋプロモーターの転写調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図６を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ５０４９でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ５０４９中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ１９４と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを５回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換え鶏痘ｖＴ１９４のゲノム構造は、図７Ｂに示される。
【０１６１】
実施例１０
組換えワクシニア、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２２４の生成
ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域に位置するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０６４と称されるプラスミドベクターを構築した。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、そしてヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にある。さらに、Ｃ１プロモーターの調節下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を組換え子孫のスクリーニングとして含む。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図８を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびｐＴ５０６４でトランスフェクションされているワクシニア感染ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ  ７０）におけるｐＴ５０６４中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２２４と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを５回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えｖＴ２２４のゲノム構造は、図９Ａに示される。
【０１６２】
実施例１１
組換えワクシニア、ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成
ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域に位置するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＴＡＡ遺伝子、ヒトＬＦＡ−３遺伝子、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子、ヒトＢ７．１遺伝子、および大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は、多数のポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する。本組換えワクチンには、ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換えワクシニアウイルスの生成は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびプラスミドでトランスフェクションされているワクシニア感染ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ  ７０）における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１６３】
実施例１２
組換え鶏痘ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成
ｒＶ−ＴＡＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、プラスミドベクターを構築する。ＴＡＡ遺伝子、ヒトＬＦＡ−３遺伝子、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子、ヒトＢ７．１遺伝子、および大腸菌ｌａｃＺ遺伝子は、多数のポックスウイルスプロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いる。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびプラスミドベクターでトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞における該プラスミドベクター中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成する。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定する。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見える。陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングする。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングをさらに繰り返し、望ましい組換え体を精製する。
【０１６４】
実施例１３
組換えワクシニアウイルス、ｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２３８の生成
ｒＶ−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域に位置するチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ８０１６と称されるプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ遺伝子は、１つの修飾エピトープを含む全長タンパク質を発現するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発により改変した。本突然変異は、５７６位にコードされるアミノ酸をアスパラギンからアスパラギン酸に変化させた。ＣＥＡ（６Ｄ）と称される修飾遺伝子は、ＣＥＡの免疫原性を亢進するよう設計された（Zarembaら, 1997, Cancer Res.57:4570-4577）。ＣＥＤ（６Ｄ）遺伝子は、４０Ｋプロモーターの調節下にある。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、そしてヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にある。さらに、Ｃ１プロモーターの調節下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を組換え子孫のスクリーニングとして含む。これらの外来配列に、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１０を参照されたい）。本組換えワクチンには、ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク市衛生委員会）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えワクシニアウイルスの生成は、Ｗｙｅｔｈワクシニアゲノム中のワクシニア配列およびｐＴ８０１６でトランスフェクションされているワクシニア感染ＣＶ−１細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビル、ＣＣＬ  ７０）におけるｐＴ８０１６中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２３８と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを６回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２３８のゲノム構造は、図１１に示される。
【０１６５】
実施例１４
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ２５１の生成
ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ８０１９と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１２を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ８０１９でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ８０１９中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２５１と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを３回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２５１のゲノム構造は、図１３Ａに示される。
【０１６６】
実施例１５
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２３２の生成
ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０７２と称されるプラスミドベクターを構築した。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１４を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ５０７２でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ５０７２中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２３２と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを４回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２３２のゲノム構造は、図１３Ｂに示される。
【０１６７】
実施例１６
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ２５０の生成
ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ８０２０と称されるプラスミドベクターを構築した。シグナル配列、１０コピーのタンデム反復配列、および３’特有コード配列からなる、一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型ＭＵＣ−１遺伝子を用いた（配列番号４１）。タンデム反復領域のヌクレオチド配列は、アミノ酸配列を変化させることなく、反復間の相同性を最小限にするように、改変した。該遺伝子は、一部切除コード配列、６ヌクレオチドの５’非翻訳領域、および１８６ヌクレオチドの３’非翻訳領域を含む、１８８１  ｂｐ断片上に含まれた（Gendlerら, 1990, J. Biol. Chem.265:15286-15293）。ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの転写調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１５を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ８０２０でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ８０２０中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２５０と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを４回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２５０のゲノム構造は、図１６Ａに示される。
【０１６８】
実施例１７
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２４２の生成
ｒＦ−ＭＵＣ−１／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ２１８６と称されるプラスミドベクターを構築した。上の実施例１６に記載されるような、一部切除型ＭＵＣ−１遺伝子を用いた。ＭＵＣ−１遺伝子は、４０Ｋプロモーターの調節下にある。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１７を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ２１８６でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ２１８６中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２４２と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを４回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２４２のゲノム構造は、図１６Ｂに示される。
【０１６９】
実施例１８
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２３６の生成
ｒＦ−ＣＥＡ（６Ｄ）／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ２１８７と称されるプラスミドベクターを構築した。ＣＥＡ（６Ｄ）遺伝子は、４０Ｋプロモーターの調節下にある。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１８を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ２１８７でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ２１８７中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２３６と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを８回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２３６のゲノム構造は、図１６Ｃに示される。
【０１７０】
実施例１９
組換え鶏痘ウイルス、ｒＦ−ＰＳＡ／ＰＳＭＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２５７の生成
ｒＦ−ＰＳＡ／ＰＳＭＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０８０と称されるプラスミドベクターを構築した。ＰＳＡをコードする遺伝子は、ヒトＬＮＣａＰ細胞株（ＣＲＬ  １７４０、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックビル）由来のＲＮＡから得たｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅により、単離した。該遺伝子は、ＰＳＡの全コード配列、４１ヌクレオチドの５’非翻訳領域、および５５２ヌクレオチドの３’非翻訳領域を含む、１３４６  ｂｐ断片上に含まれた（LundwallおよびLilja, 1987, FEBS Lett.214:217-322）。ＰＳＭＡをコードする遺伝子は、ヒトＬＮＣａＰ細胞株由来のＲＮＡから得たｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅により、単離した。該遺伝子は、ＰＳＭＡの全コード配列、２６ヌクレオチドの５’非翻訳領域、および１９ヌクレオチドの３’非翻訳領域を含む、２２９８  ｂｐ断片上に含まれた（Israeliら, 1993,Cancer Res. 53:227-230）。ＰＳＡ遺伝子は、４０Ｋプロモーターの調節下にあり、そしてＰＳＭＡ遺伝子は、７．５Ｋプロモーターの調節下にある。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、鶏痘ゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図１９を参照されたい）。本組換えワクチンには、鶏痘のＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering-Plough Corporation）株由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換え鶏痘ウイルスの生成は、鶏痘ゲノム中の鶏痘配列およびｐＴ５０８０でトランスフェクションされている鶏痘感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ５０８０中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２５７と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを５回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換えワクシニアウイルスｖＴ２５７のゲノム構造は、図１６Ｄに示される。
【０１７１】
実施例２０
組換えＭＶＡウイルス、ｒＭＶＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）Ｎｏ．ｖＴ２６４の生成
修飾ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、ワクシニアウイルスのＡｎｋａｒａ株の弱毒化誘導体である（Meyerら, 1991, J. Gen. Virol. 72:1031-1038）。ヒトにおいて痘瘡ワクチンとして使用されるＭＶＡワクチン由来の種ストックを、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ博士（Instisute for Medical Microbiology、ミュンヘン）から得た。種ストックを、初代ニワトリ胚皮膚細胞上で、２回プラーク精製した。
【０１７２】
ｒＭＶＡ−ＴＲＩＣＯＭ（ｍｕ）の生成のため、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ領域（Meyerら, 1991, J. Gen. Virol.72:1031-1038）への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０８５と称されるプラスミドベクターを構築した。ネズミＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ネズミＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ネズミＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図２０を参照されたい）。本組換えワクチンには、ＭＶＡワクチン種ストック由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えＭＶＡの生成は、ＭＶＡゲノム中のＭＶＡ配列およびｐＴ５０８５でトランスフェクションされているＭＶＡ感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ５０８５中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２６４と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを４回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換え体ＭＶＡ  ｖＴ２６４のゲノム構造は、図２１Ａに示される。
【０１７３】
実施例２１
組換えＭＶＡウイルス、ｒＭＶＡ−ＰＳＡ／ＰＳＭＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）Ｎｏ．ｖＴ２６０の生成
ｒＭＶＡ−ＰＳＡ／ＰＳＭＡ／ＴＲＩＣＯＭ（ｈｕ）の生成のため、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ領域への外来配列の挿入を指示する、ｐＴ５０８４と称されるプラスミドベクターを構築した。ＰＳＡ遺伝子は、４０Ｋプロモーターの調節下にあり、そしてＰＳＭＡ遺伝子は、７．５Ｋプロモーターの調節下にある。ヒトＬＦＡ−３遺伝子は、３０Ｋプロモーターの調節下にあり、ヒトＩＣＡＭ−１遺伝子は、Ｉ３プロモーターの調節下にあり、ヒトＢ７．１遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあり、そしてｌａｃＺ遺伝子は、Ｃ１プロモーターの調節下にある。これらの外来配列に、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩ領域由来のＤＮＡ配列が隣接する（図２２を参照されたい）。本組換えワクチンには、ＭＶＡワクチン種ストック由来のプラーク精製単離体を親ウイルスとして用いた。組換えＭＶＡの生成は、ＭＶＡゲノム中のＭＶＡ配列およびｐＴ５０８４でトランスフェクションされているＭＶＡ感染初代ニワトリ胚皮膚細胞におけるｐＴ５０８４中の対応する配列の間の相同組換えを介して達成した。組換えウイルスは、上述のように、ｌａｃＺ遺伝子産物に関する色原体アッセイを用い、同定した。ｌａｃＺを発現するウイルスプラークは、透明な背景に対し、青く見えた。ｖＴ２６０と称される陽性プラークを細胞単層から摘み取り、そしてその子孫を再度プレーティングした。Ｂｌｕｏ−Ｇａｌの存在下でプラーク単離および再プレーティングを４回繰り返し、望ましい組換え体を精製した。組換え体ＭＶＡ  ｖＴ２６０のゲノム構造は、図２１Ｂに示される。
【０１７４】
実施例２２
組換えポックスウイルス
ネズミ補助的刺激分子Ｂ７−１をコードする遺伝子（ｒＶ−Ｂ７−１と称される）またはネズミ細胞間接着分子−１をコードする遺伝子（ｒＶ−ＩＣＡＭ−１と称される）いずれかを含む、個々の組換えワクシニアウイルスが記載されてきている（１０、１１）。ネズミＣＤ４８の遺伝子を含む組換えワクシニアウイルス（ｒＶ−ＬＦＡ−３と称される；ネズミＣＤ４８は、ヒトＬＦＡ−３（ＣＤ５８）の相同体（６））は、ｒＶ−Ｂ７−１およびｒＶ−ＩＣＡＭ−１と同様の方式で構築され、そして記載されてきている（１２）。これらの単一の組換えワクシニアウイルスの各々で、補助的刺激分子をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルス初期／後期４０Ｋプロモーター（１５）の調節下に置き、そして導入遺伝子を、記載されるような（１３）、ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株のゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ  Ｍ領域に挿入した。組換え鶏痘ウイルスは、記載されるような（１４）、鶏痘ウイルスのＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ（Schering Corporation）株のゲノムのＢａｍＨＩ  Ｊ領域に、外来遺伝子を挿入することにより、構築した。単一の外来遺伝子を含む組換えウイルスでは、該遺伝子は、ワクシニア４０Ｋプロモーターの調節下にある。ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１は、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーター（１６）の調節下にあるネズミＢ７．１遺伝子および４０Ｋプロモーターの調節下にあるネズミＩＣＡＭ−１遺伝子を含む、組換えワクシニアウイルスである。ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は、ワクシニア３０Ｌ（Ｍ２Ｌ）プロモーター（１７）の調節下にあるネズミＬＦＡ遺伝子、ワクシニアＩ３プロモーター（１８）の調節下にあるネズミＩＣＡＭ−１遺伝子、および合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターの調節下にあるネズミＢ７．１遺伝子を含む、組換えワクシニアウイルスである。ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は、４０Ｋプロモーターの調節下にあるヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節下にあるネズミＢ７−１遺伝子、Ｉ３プロモーターの調節下にあるネズミＬＦＡ−３遺伝子、およびワクシニア７．５Ｋプロモーター（１９）の調節下にあるネズミＩＣＡＭ−１遺伝子を含む、組換え鶏痘ウイルスである。非組換えワクシニアウイルスは、Ｖ−Ｗｙｅｔｈと称し、一方、非組換え鶏痘ウイルスは、ＷＴ−ＦＰと称した。
【０１７５】
実施例２３
組換え補助的刺激分子の発現
各組換えベクターが、単数または複数の適切な導入遺伝子を発現することが可能であることを確認するため、ネズミ腺癌細胞株ＭＣ３８を、多様な組換えワクシニアまたは鶏痘構築物に感染させ、そして単数または複数の導入遺伝子の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより明示した（図２３）。未感染細胞（データ未提示）および野生型ワクシニアに感染した細胞は、３つの補助的刺激分子のいずれも発現しなかった。この観察はＰＣＲにより確認した（データ未提示）。対照的に、ｒＶ−Ｂ７−１に感染した細胞は、Ｂ７−１タンパク質に関し、非常に陽性になり；ｒＶ−ＩＣＡＭ−１に感染した細胞は、ＩＣＡＭ−１に関し、非常に陽性になり；そしてｒＶ−ＬＦＡ−３に感染した細胞は、ＬＦＡ−３タンパク質に関し、非常に陽性になった。２つの補助的刺激分子を含む構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１）の同様の解析により、Ｂ７−１（７８％陽性で１０１２の平均蛍光強度（ＭＦＩ））およびＩＣＡＭ−１（７０％陽性で６９０のＭＦＩ）の発現が示された。さらに、ワクシニア多遺伝子構築物ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染した細胞は、３つすべての補助的刺激分子を同時発現した。組換え鶏痘ウイルスがその組換えタンパク質を発現したかどうか決定するため、ＭＣ３８細胞を同様の方式で鶏痘構築物に感染させた（図２３）。再び、野生型鶏痘ウイルスＷＴ−ＦＰに感染した細胞は、いかなる補助的刺激分子も発現しなかった。ｒＦ−Ｂ７−１に感染した細胞は、Ｂ７−１タンパク質に関し、陽性になり、そしてｒＦ−ＩＣＡＭ−１に感染した細胞は、ＩＣＡＭ−１タンパク質に関し、陽性になった。ｒＦ−ＬＦＡ−３ベクターは構築しなかった。しかし、鶏痘多遺伝子構築物ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染した細胞は、３つすべての補助的刺激分子を同時発現した。
【０１７６】
組換えウイルスの性質決定：タンパク質表面発現の蛍光解析
ＭＣ３８ネズミクローン性腺癌細胞株が記載されてきている（２０）。集密な（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＭＣ３８細胞を、ワクシニア構築物（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１、ｒＶ−ＬＦＡ−３、ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）または鶏痘構築物（ＷＴ−ＦＰ、ｒＦ−Ｂ７−１、ｒＦ−ＩＣＡＭ−１、ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）に、５  ＭＯＩ（感染多重度；ＰＦＵ／細胞）で、５時間、感染させた。ＣＥＡは、１つのｒＦ構築物で、マーカー遺伝子としてのみ、用いた。感染後、細胞を採取し、そしてネズミＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、またはＣＤ４８（ＬＦＡ−３；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）に特異的なＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で免疫染色した。Ｌｙｓｉｓ  ＩＩソフトウェアを用い、ＦＡＣＳＣＡＮ血球計算装置（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）で、細胞蛍光を解析した。
【０１７７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６−８週齢）は、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から得た。単細胞懸濁物を単離するため、７０  ｍ細胞ろ過器（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレークス）を通じて機械的に分散させた脾臓から未処理Ｔ細胞を単離し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（密度＝１．１１９  ｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）上の遠心分離により、赤血球および死んだ細胞を除去した。およそ９５％  Ｔ細胞からなる集団は、２つのナイロンウールカラム（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サニーベール）上に、連続して脾臓単核細胞を通過させることにより、得た。特定の実験には、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８常磁性ビーズ（ＭｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を利用した陰性選択により、Ｔ細胞をさらにＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団に分画した。Ｔ細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に１０５／ウェルで添加した。未感染ＭＣ３８細胞、あるいはワクシニア構築物（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１、ｒＶ−ＬＦＡ−３、ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）または鶏痘構築物（ＷＴ−ＦＰ、ｒＦ−Ｂ７−１、ｒＦ−ＩＣＡＭ−１、ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）に、５  ＭＯＩ（感染多重度；ＰＦＵ／細胞）で、５時間、感染させた細胞からなる刺激細胞を、２％パラホルムアルデヒドで固定し、そして１０４／ウェルで添加した。すべてのウェル中の細胞は、いくつかの希釈（５ないし０．６２５μｇ／ｍｌで２日間）のコンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ  Ａ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で、総体積２００μｌの完全培地（ＣＭ）（ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン（２  ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１  ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（７  ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）、および非必須アミノ酸（０．１  ｍＭ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、メリーランド州ロックビル））中で培養した。コントロールウェルには、Ｔ細胞、刺激細胞および培地のみを与えた。示される実験では、プレート結合抗ＣＤ３（１．５μｇ／ウェル−０．０１２μｇ／ウェル）をＣｏｎ  Ａに代用した。細胞は、インキュベーションの最後の１２−１８時間、１  Ｃｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、デラウェア州ウィルミントン）で標識し、そしてＴｏｍｔｅｃ細胞採取装置（Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ガイザーズバーグ）で採取した。取り込み放射能は、液体シンチレーション計測（Wallac 1205 Betaplate、Wallac, Inc.）で測定した。３つ組ウェルの結果を平均し、そして平均ＣＰＭ±ＳＥＭとして報告する。示される実験では、発現される補助的刺激分子に特異的なＭＡｂまたは一致アイソタイプコントロール抗体（アルメニアハムスター（Ａｒｍｅｎｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ）ＩｇＧ、ポリクローナル）のいずれかの存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析を行った。Ｔ細胞増殖を遮断するのに用いた抗体は、すべてＰｈ���ｒＭｉｎｇｅｎからの、ハムスター抗ネズミＣＤ８０（Ｂ７−１；クローン１６−１０Ａ１）、ハムスター抗ネズミＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１；クローン３Ｅ２）、またはハムスター抗ネズミＣＤ４８（ＢＣＭ−１；クローンＨＭ４８−１）であった。すべての抗体は、２５μｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。
【０１７８】
補助的刺激分子能力の測定
Ｔ細胞および刺激細胞は、上述のように調製した。１つまたはそれ以上の補助的刺激分子を発現する固定刺激細胞を、総数１０４／細胞まで、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ感染／固定刺激細胞と組み合わせ、多様な比でウェルに添加した。その後、Ｔ細胞（１０５／ウェル）を添加し、そして細胞を、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａの存在下で、総体積２００μｌのＣＭ中で２日間培養し、そしてインキュベーションの最後の１２−１８時間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンで標識した。取り込み放射能は、先のように、液体シンチレーション計測により、測定した。
【０１７９】
サイトカイン解析
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団を上述のように調製し、そして６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に２．５×１０６／ウェルで添加した。刺激細胞集団を上述のように調製し、そして２．５×１０５／ウェルで添加した。細胞を、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａの存在下で、総体積５  ｍｌのＣＭ中で２４時間培養した。上清流体を収集し、そしてネズミＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４に関し、以前記載されたような捕捉ＥＬＩＳＡ（２１）により、解析した。検出感度は、それぞれ、３０、１００、２０、２０、および２０  ｐｇ／ｍｌであった。
【０１８０】
刺激細胞由来のＲＮＡ集団もまた、多プローブＲＮアーゼ保護アッセイ（ｍｐＲＰＡ）により、解析した。ネズミサイトカインの明示されたリボプローブは、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入した。アッセイは、以前記載されたように行った（２２）。保護プローブタグ付加二重鎖は、６％ポリアクリルアミド上の電気泳動により、分離した。乾燥ゲルは、−７０℃で２４−７２時間、Ｂｉｏｍａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ）に曝露した。Ｓｔｏｒｍ系ホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用い、バンドに含まれる放射能を定量化した。既定のバンドの純ＣＰＭは、以下の式（サイトカイン遺伝子のｃｐｍ・マイナス・バックグラウンドのｃｐｍ）により計算し、そしてハウスキーピング遺伝子転写物Ｌ３２のパーセントとして表した。
【０１８１】
実施例２４
Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３は相乗的に働き、Ｔ細胞増殖を亢進する
Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ分子は、個々にＴ細胞増殖を補助的刺激することが示されてきている。しかし、これらは同時にＡＰＣ上に発現される可能性があるため、Ｔ細胞増殖誘導中の個々の補助的刺激分子の相対的役割を調べることは困難であった（２）。Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１および／またはＬＦＡ−３分子の未処理Ｔ細胞増殖の誘導への寄与を解析するため、Ｔ細胞活性化の第一のシグナルが、薬理学的試薬（Ｃｏｎ  Ａ）を介し搬送される、修飾ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（２３、２４）を使用した。補助的刺激分子を発現するよう設計された多様な組換えワクシニア（図２４Ａ）または鶏痘（図２４Ｂ）ウイルスに感染したＭＣ３８細胞株を用い、補助的刺激分子のみが異なる一団の刺激細胞を生成した。第二の、または「補助的刺激」シグナルを、これらの「刺激」ＭＣ３８細胞の表面上に発現される１つまたはそれ以上の補助的刺激分子を介し、Ｔ細胞に搬送した。図２４Ａに示されるように、未感染ＭＣ３８細胞およびＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ両方が、Ｃｏｎ  Ａの調べたレベルすべてで、Ｔ細胞の最小限の増殖を誘導した。ＭＣ３８／ＬＦＡ−３は、Ｔ細胞増殖において、小さい（２．１倍）しかし有意な（Ｐ＜０．０５）増加を誘導した。ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１を介したシグナル−２搬送は、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  ＡでのＴ細胞増殖において、３．５倍の増加を誘導した。ＭＣ３８／Ｂ７−１は、２．５および１．２５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａでの増殖において、それぞれ、７．８倍および１６倍の増加を誘導した。しかし、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（３つの補助的刺激分子すべてを同時発現するＭＣ３８細胞）は、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  ＡでのＴ細胞増殖において、１７．５倍の増加、および１．２５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａで３４倍の増加を誘導した。さらに、低いＣｏｎ  Ａレベル（０．６２５μｇ／ｍｌ）では、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の発現は、Ｔ細胞増殖を誘導しなかった。Ｂ７−１は、０．６２５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａで測定可能な増殖（２０，０００  ＣＰＭ）を誘導したが、３つの補助的刺激分子すべての同時発現は、さらにより高いレベルの増殖（１００，０００  ＣＰＭ）を誘導した（図２４Ａ）。これらの実験を４回繰り返し、同様の結果を得た。
【０１８２】
ＭＣ３８刺激細胞はまた、組換え鶏痘ウイルスでの感染によっても調製した（図２４Ｂ）。再び、未感染ＭＣ３８またはＭＣ３８／ＷＴ−ＦＰは、Ｃｏｎ  Ａの調べたレベルすべてで、Ｔ細胞の最小限の増殖を誘導した。２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  ＡでのＴ細胞増殖において、ＭＣ３８／ｒＦ−ＩＣＡＭ−１は２倍の増加を支持し、ＭＣ３８／ｒＦ−Ｂ７−１は３．２倍の増加を支持し、そしてＭＣ３８／ｒＦ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は６倍の増加を支持した。本実験をさらに２回繰り返し、同様の結果を得た。第一のシグナルが固定抗ＣＤ３を介して搬送される場合もまた、同様の結果が観察された（データ未提示）。ＭＣ３８／ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３およびＭＣ３８／ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３により支持される増殖で注目される相違（１７．５倍対６倍）は、５時間の感染期間後に発現される単数または複数の組換えタンパク質のレベルのためである可能性が最も高い（図２３）。特に、ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染した細胞のおよそ７０％が、補助的刺激分子を発現し、一方、ｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染した細胞のおよそ４０％が陽性である。使用した条件で、ｒＦベクターに感染した陽性細胞は、ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染したものの５０％のレベルで、組換えＢ７−１およびＩＣＡＭ−１を発現する。
【０１８３】
実施例２５
Ｔ細胞増殖に対する補助的刺激分子の寄与の特異性
Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、またはＬＦＡ−３の増殖寄与の特異性をさらに確認するため、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＩＣＡＭ−１、またはｒＶ−ＬＦＡ−３での感染により、ＭＣ３８刺激細胞を再び調製し、そして既定の補助的刺激分子に特異的なＭＡｂの存在下または非存在下で、未処理ネズミＴ細胞およびＣｏｎ  Ａと同時培養した。図３Ｂに示されるように、ＭＣ３８／Ｂ７−１は、ＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈのものより４．５倍、Ｔ細胞増殖を亢進した（図２５Ａ）。この増殖増加は、ネズミＢ７−１の遮断抗体を添加することにより、８３％阻害された。同様に、ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１（図２５Ｃ）は、増殖を２．２５倍増加させ、これはその後、抗ネズミＩＣＡＭ−１  ＭＡｂの存在下で、８８％減少した。最後に、ＭＣ３８／ＬＦＡ−３（図２５Ｄ）は、増殖を２．１倍増加させ、これはその後、抗ネズミＣＤ４８  ＭＡｂの存在下で９８％減少した。各群に関し、（材料および方法に明記されるような）適切なアイソタイプコントロール抗体を用いたインキュベーションは、注目される増殖を遮断しなかった。本実験をさらに２回繰り返し、同様の結果を得た。
【０１８４】
実施例２６
補助的刺激分子能力の測定
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激アッセイの修飾法により、Ｔ細胞増殖の第二のシグナルを搬送する、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、および／またはＬＦＡ−３の相対的能力の定量的概算が可能になった。本目的のため、刺激細胞（多様な組換えワクシニアウイルスに感染したＭＣ３８細胞）を、Ｖ−Ｗｙｅｔｈに感染した多様な量のＭＣ３８細胞での希釈により力価測定し（ｔｉｔｅｒｅｄ  ｏｕｔ）、そして２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａの存在下で、一定数のＴ細胞と同時培養した。これらの実験において、ＭＣ３８対Ｔ細胞比は、１：１０で一定のままであった。図４に見られるように、ＭＣ３８／ＬＦＡ−３（黒い三角形）は、濃度４０％まで、ＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（白い正方形）のものより、Ｔ細胞増殖を亢進させた（すなわちウェル中の刺激細胞のうち、４０％がｒＶ−ＬＦＡ−３に感染し、そして残った６０％がＶ−Ｗｙｅｔｈに感染した）。ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１（黒い円）またはＭＣ３８／Ｂ７−１（黒いひし形）は、それぞれ濃度１３％および６％まで、増殖増加を支持した。対照的に、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は、３％未満の刺激細胞が３つ組ベクターを含む場合、増殖を亢進した（直線最小二乗解析を介し、１％未満と推定される）。これらの個々の補助的刺激分子の力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）曲線を得ると、ＩＣＡＭ−１およびＢ７−１により仲介されるＴ細胞増殖の度合いは、それぞれ、３倍および６倍であり、ＬＦＡ−３単独で仲介されるものより強力であるようであった。しかし、明らかに、最も強い増殖は、Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３により仲介される。比較的低い刺激細胞濃度では（すなわち、ＭＣ３８細胞の３％−６％が刺激細胞として作用する場合）、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、およびＢ７−１でさえ、単独の発現ではＴ細胞活性化を亢進しないが、３つの補助的刺激分子を発現する刺激細胞は、実質的にＴ細胞活性化を亢進する。図２６（挿入図）のデータは、３％のＭＣ３８刺激細胞が、示されるベクターに感染している場合に得た結果である。各ウェルは、１０４の総ＭＣ３８細胞および１０５未処理Ｔ細胞を含むため、これらの培養において、実際の刺激細胞対Ｔ細胞比は、０．００３である。２遺伝子構築物に感染したＭＣ３８細胞（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１）は、これらの条件下で、あるとしてもわずかのＴ細胞増殖しか誘導しない一方、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は、実質的に増殖を増加させた（ｐ＜０．０００１）ことに注目されたい。
【０１８５】
実施例２７
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の補助的刺激
単一でまたは組み合わせて発現される補助的刺激分子に対するＴ細胞反応をさらに性質決定するため、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３が精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を補助的刺激する能力を試験した。図５は、最適以下の濃度のＣｏｎ  Ａで活性化した精製ＣＤ４＋（図２７Ａ）およびＣＤ８＋（図２７Ｂ）細胞の増殖を示す。増殖に対する刺激細胞効果の層別化は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞両方に関し、同様であった：ＭＣ３８／ＬＦＡ−３は、最も弱い増殖を刺激し、ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１およびＭＣ３８／Ｂ７−１が続いた。ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３がＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の最も強力な刺激細胞であった。これらの実験をさらに３回繰り返し、同様の結果を得た。非常に低い濃度のＣｏｎ  Ａ（０．６２５μｇ／ｍｌ、図５、パネルＣおよびＤ）では、第二のシグナルを提供するのに、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、Ｂ７−１、またはＢ７−１／ＩＣＡＭ−１の組み合わせのいずれを用いても、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化において、有意な亢進はなかったことに注目すべきである。しかし、３つ組の補助的刺激分子を同時発現するワクシニアウイルスを使用した場合、両Ｔ細胞サブセットの実質的な活性化が観察された。第一のシグナルが固定抗ＣＤ３を介し搬送された場合、同様の結果が見られた（データ未提示）。
【０１８６】
Ｂ７−１補助的刺激がＩＬ−２  ｍＲＮＡ半減期を延長させ、そしてＩＬ−２転写を上方制御し、かなりの量の分泌ＩＬ−２産生を生じることが報告されてきている（４、２５）。さらに、ＬＦＡ−３でのＴ細胞補助的刺激は、多様なサイトカイン、特にＩＬ−２およびＩＦＮ−γに対する影響を有することが報告されてきている（６）。サイトカイン産生に対する、単一のまたは多数の補助的刺激分子による補助的刺激の定性的および定量的影響を決定するため、精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を再び、２．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａの存在下で、単独でまたは組み合わせてＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３を発現する多様な刺激細胞と同時培養した。２４時間後、上清流体を、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４に関し、解析した。未感染ＭＣ３８（データ未提示）およびＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈは、ＣＤ４＋細胞から、最小限の量のＩＬ−２を誘導し（図２８Ａ）、一方、ＭＣ３８／Ｂ７−１は３，９７９  ｐｇ／ｍｌを誘導した。しかし、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３でのＴ細胞刺激は、１０倍多い量のＩＬ−２を誘導した。同様に、ＭＣ３８／Ｂ７−１は、ＣＤ８＋細胞から、最小限の量のＩＬ−２を誘導した（図２８Ｂ）が、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３は、２０倍多い量（６，１８２  ｐｇ／ｍｌ）のＩＬ−２を誘導した。刺激したＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生もまた調べた。ＭＣ３８／Ｂ７−１およびＭＣ３８／ＬＦＡ−３は、ＣＤ４＋細胞から、中程度の量のＩＦＮ−γしか誘導しなかった（図２８Ｃ）。対照的に、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３でのＣＤ４＋細胞の刺激は、他の構築物のいずれでの刺激より、４倍多いＩＦＮ−γを誘導した。ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３でのＣＤ８＋細胞の刺激は、他の構築物のいずれで刺激したＣＤ８＋細胞より６倍以上多い、最大量のＩＦＮ−γを誘導した（図２８Ｄ）。いかなる構築物でのいずれかの細胞種の刺激も、分泌されるＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＩＬ−４のレベルにおいて、有意な変化を仲介しなかった（ｐ＞０．０５）（データ未提示）。３つ組構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）を介した刺激の主な頂点は、ＣＤ４＋細胞からのＩＬ−２分泌およびＣＤ８＋  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌であるようである。これらの実験をさらに３回繰り返し、同様の結果を得た。Ｔ細胞によるサイトカイン産生を亢進する能力に関し、２遺伝子構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１）対多遺伝子構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）に感染させた刺激細胞を比較した研究もまた、行った。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞いずれかによるＩＦＮ−γ産生、あるいはＣＤ８＋細胞によるＩＬ−２産生では、２つの間の小さい相違しか観察されなかった。しかし、ＣＤ４＋細胞によるＩＬ−２産生の刺激では、実質的な相違が見られた（ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１を使用した５０００  ｐｇ／ｍｌ対ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３を使用した３９，６００  ｐｇ／ｍｌ）。
【０１８７】
単一のまたは多数の補助的刺激分子で刺激したＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞からのサイトカイン発現もまた、多プローブＲＮアーゼ保護アッセイ（ｍＲＰＡ）を利用し、ＲＮＡレベルで解析した。２つの別個の実験のそれぞれの放射線写真プロフィールおよび定量的解析を示す（図２９）。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、およびＩＬ−６は、ＭＣ３８／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ＭＣ３８／Ｂ７−１、ＭＣ３８／ＩＣＡＭ−１、ＭＣ３８／ＬＦＡ−３、またはＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３で刺激したＣＤ４＋  Ｔ細胞で同様であった（図２９、パネルＢ柱状図）。ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ発現レベルは、いかなる単一の補助的刺激分子を発現するＭＣ３８細胞で刺激したＣＤ４＋  細胞と比較した場合も、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３で刺激したＣＤ４＋  Ｔ細胞で最も高かった（図２９Ｂ）。わずかにより高いレベルのＩＬ−１３、ＩＬ−９、およびＩＬ−６もまた、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３で刺激したＣＤ４＋細胞で見られた。サイトカイン遺伝子の発現はまた、刺激したＣＤ８＋  Ｔ細胞でも解析した。解析したサイトカインＲＮＡのうち、ＩＬ−２および特にＩＦＮ−γレベルは、これらの細胞をＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３で刺激した場合、いかなる単一の補助的刺激分子を発現するＭＣ３８細胞で刺激したＴ細胞に比較しても、有意に高かった。したがって、サイトカイン産生における補助的刺激分子の３つ組の主な相乗効果は、ＣＤ４＋細胞におけるＩＬ−２およびＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γであった。
【０１８８】
実施例２８
刺激したＴ細胞のアポトーシスに対するＴＲＩＣＯＭ補助的刺激の影響
アポトーシス研究
シグナル１およびｒＶ−ＴＲＩＣＯＭでのＴ細胞の刺激が、細胞生存またはプログラム細胞死（ＰＣＤ）を導くかどうか決定するため、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、シグナル１としてＣｏｎ  Ａで活性化し、Ｖ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染ＭＣ３８細胞と４８時間培養し、そして培地中に２４時間再プレーティングし、アポトーシスを測定した。アポトーシスは、Gavrieli, Yら, J.Cell Biol119:493-501, 1992に記載されるように、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて評価した。ＭＣ３８およびＣｏｎ  ＡまたはＭＣ３８／Ｖ−ＷＴおよびＣｏｎ  Ａの組み合わせにより、補助的刺激シグナルの非存在下で活性化されたＴ細胞は、高レベルの自発的アポトーシスを示した（それぞれ８２．９±１）。Ｃｏｎ  ＡおよびＭＣ３８／Ｂ７−１またはＣｏｎ  ＡおよびＭＣ３８／ＴＲＩＣＯＭにより活性化されたＴ細胞は、実質的により少ない自発的アポトーシスを示した（それぞれ３１．３±３．８および３０．７±１）。
【０１８９】
結果は、明らかに、Ｖ−ＷＴ感染を伴いまたは伴わず、Ｃｏｎ  Ａの存在下で（すなわち、シグナル２の非存在下で）刺激したＴ細胞におけるアポトーシスを示した。ＭＣ３８／ＴＲＩＣＯＭを伴うＣｏｎ  Ａは、明らかにＭＣ３８／Ｂ７−１を伴うＣｏｎ  Ａより、はるかに高いレベルまで、ＣＤ８＋細胞を刺激し、そしてより高いレベルのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生を生じ、これはいかなるより高い度合いのアポトーシスも生じなかった。
【０１９０】
実施例２９
ｉｎ  ｖｉｖｏのｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭの抗腫瘍効果
ＴＲＩＣＯＭベクターを用い、抗原特異的免疫反応を亢進することが可能であるか決定する研究を行った。本明細書に開示されるように、ヒトＣＥＡ遺伝子およびＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３遺伝子を含み、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭと称される、４遺伝子ワクシニア組換え体を構築した。６ないし８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）またはヒトＣＥＡのトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（Kass, Eら, Cancer Res. 59:676-683, 1999）を、Ｈａｎｋ’ｓ平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）あるいは一度１０７  ｐｆｕ  ｒＶ−ＣＥＡ，ｒＶ−ＣＥＡ／Ｂ７−１またはｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭいずれかで尾乱切（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりワクチン接種し、そして２２日後、脾臓を採取した。脾臓細胞のリンパ球増殖活性を、先に記載されるように解析した（５）。
【０１９１】
図３０（挿入図）に見られるように、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭをワクチン接種したマウスの脾臓Ｔ細胞は、ｒＶ−ＣＥＡをワクチン接種したマウスから得たＴ細胞と比較し、より高いレベルのＣＥＡ特異的刺激を示した；オボアルブミンおよびＣｏｎ  Ａをコントロールとして用いた。その後、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭが長期免疫を誘導することが可能であるかどうか決定する実験を行った。マウス（５匹／群）に一度、Ｖ−ＷＴ、ｒＶ−ＣＥＡ、またはｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭのいずれかをワクチン接種した。１００日後、ＣＥＡを発現している高用量（１×１０６）のＭＣ３８結腸癌細胞（５）にマウスを曝露した。Ｖ−ＷＴおよびｒＶ−ＣＥＡを受けたすべてのマウスは腫瘍で死亡し、一方、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭをワクチン接種したすべてのマウスは、曝露５０日後、生存していた（図３０）。
【０１９２】
ヒトＣＥＡ遺伝子が正常成獣胃腸組織で発現され、そして血清がＣＥＡ陽性である、ＣＥＡトランスジェニックマウス（Kass 1999、同;Thompson, J.A.ら, J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366, 1999）を使用し、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭベクターが自己抗原に対するＴ細胞反応を亢進することが可能であるかどうか決定した。ＣＥＡトランスジェニックマウスを５マウス／群に分けた。２匹のマウスに一度、１０７  ｐｆｕ  ｒＶ−ＣＥＡ、ｒＶ−ＣＥＡ／Ｂ７−１、ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭまたは緩衝液をワクチン接種し、そして第３０日に安楽死させ、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を解析した。ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭをワクチン接種した後に得られたＴ細胞反応は、ｒＶ−ＣＥＡで得られたものより、実質的に大きかった（表２）。オボアルブミンおよびＣｏｎ  Ａに対する反応をコントロールとして用いた。各群の残った３匹のＣＥＡトランスジェニックマウスを用い、ＴＲＩＣＯＭベクターを使用し、ＣＥＡ発現腫瘍に対する抗腫瘍反応を亢進することが可能であるか決定した。これらのマウスに最初に、ｓ．ｃ．で、ＣＥＡ遺伝子を発現しているＭＣ３８癌細胞（５）４×１０５を接種した。４日後、マウスに一度、１０７  ｐｆｕウイルス組換え体または緩衝液を、末梢部位に、ワクチン接種した。ｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭをワクチン接種したマウスでは、腫瘍は増殖しなかったが、一方、緩衝液、ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−ＣＥＡ／Ｂ７−１をワクチン接種したマウスでは腫瘍が増殖しつづけた（表２）。これらの結果は、ＴＲＩＣＯＭベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を支持する。
【０１９３】
表２．ＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるｒＶ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＭＯＮの亢進した免疫反応および抗腫瘍反応
【０１９４】
【表２】
0005254153.tif 000003
【０１９５】
Ｃ５７ＢＬ／６トランスジェニックマウス（群当たり５匹）に、皮膚乱切を介し、緩衝液またはワクシニア組換え体（１０７  ｐｆｕ）を、第０日に一度、ワクチン接種した。第３０日、２匹のマウスを殺し、そしてＴ細胞増殖反応に関し、脾臓Ｔ細胞を解析した。各値は、培地に対する、３つ組試料の平均ＣＰＭのＳＩを示す。標準偏差は１０％を越えることはなかった。第４日、群当たり３匹のマウスに、ＣＥＡを発現しているＭＣ３８結腸癌細胞４×１０５を投与した。腫瘍体積はワクチン接種後、第１４日および３５日に得る。
【０１９６】
実施例３０
ｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染した先駆樹状細胞および樹状細胞によるＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の補助的刺激
Ｉｎａｂａら（４１）の方法により、新鮮なＣＤ３４＋骨髄細胞（樹状細胞先駆体）をＣ５７ＢＬ／６マウスから得た。これらの先駆細胞は、直ちに用い、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（４２）中で６日間培養し、成熟樹状細胞（ＤＣ）を生成した。ＣＤ３４＋先駆細胞およびＤＣを、多数の補助的刺激分子をコードする組換えワクシニアウイルスｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（ｒＶ−Ｔｒｉｃｏｍ）、１０  ＭＯＩに１８時間感染させた。感染５時間後、細胞試料を採取し、そして表現型解析を行った。樹状細胞は当業では「究極の」ＡＰＣであると考えられ、多数の補助的刺激分子を高レベルで発現している。表３は、ネズミＤＣが実際に補助的刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３を、比較的高レベルで発現することを示す（平均蛍光強度、ＭＦＩ；括弧内に示される）。しかし、ＤＣがｒＶ−Ｂ７／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染している場合、補助的刺激分子発現レベルと共に、多数の補助的刺激分子を発現している細胞のパーセンテージも両方、有意に増加した。Ｂ７−１を発現している細胞のパーセンテージは、６５％から８６％に増加し、一方、ＭＦＩは４倍増加し；ＩＣＡＭ−１を発現している細胞のパーセンテージは３２％から６８％に増加し、一方、ＭＦＩは２．５倍増加し；ＬＦＡ−３を発現している細胞のパーセンテージは４４％から７５％に増加した。
【０１９７】
表３
ｒＶ−ＣＯＳ２での感染前および感染後１の先駆ＤＣの表現型解析
【０１９８】
【表３】
0005254153.tif 000004
【０１９９】
１１０  ＭＯＩで５時間の感染
２ｒＶ−ＣＯＳ＝外来補助的刺激分子をコードする組換えワクシニア
３＝％マーカー発現細胞
４＝平均蛍光強度
刺激細胞として使用するため、感染ＣＤ３４＋先駆細胞およびＤＣに放射線照射し（２０００  ｒａｄ）、そして図３１に略述されるように、Ｃｏｎ  Ａの存在下で、未処理ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を刺激するのに用いた。
【０２００】
Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３をコードする組換えポックスウイルスに感染している先駆樹状細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を両方、刺激することが可能であった。Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３発現先駆樹状細胞によるＣＤ８＋  Ｔ細胞の刺激は、未感染成熟ＣＤ３４＋樹状細胞を用いて達成されるものより大きかった（図３２）。さらに、成熟ＣＤ３４＋樹状細胞（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで前処理されているもの）における、３つの補助的刺激分子の感染および発現は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞両方の刺激の劇的な増加を生じた（図３３）。
【０２０１】
当業者はまた、アロ反応性反応（混合リンパ球反応、ＭＬＲ）を支持する能力により、樹状細胞集団の特性を測定することが可能である（４３）。図３４は、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染した樹状細胞を用いた、混合リンパ球培養の結果を示す。混合リンパ球反応は、Ｂａｌｂ／ｃ由来のＴリンパ球を刺激するＣ５７ＢＬ／６由来のＤＣを用いる（すなわち抗アロタイプ反応）。
【０２０２】
これらのデータは、混合リンパ球反応における増殖の度合いが、未感染ＤＣまたは野生型ワクシニアに感染しているＤＣに比較し、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染しているＤＣを用いると、劇的により高いことを示す。
【０２０３】
図３５は、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染しているＤＣは、ＣＥＡペプチド特異的ネズミＴ細胞株の刺激において、標準的ＤＣより、はるかに優れていることを示す。本Ｔ細胞株はＣＤ８＋であり、そしてＣＥＡ  ＤｂクラスＩ制限エピトープＥＡＱＮＴＴＹＬ（ＣＡＰ−Ｍ８）に特異的である。ＣＥＡペプチド（１μｇ／ｍｌ）でパルス処理し、そして先にｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染させた組み合わせのＤＣは、特に、低いＴ細胞対ＤＣ比で、ＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を刺激する際、明らかに優れている。
【０２０４】
実施例３１
ｒＶ−またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ネズミ骨髄由来樹状細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのネズミＴ細胞刺激
実験プロトコル
ペプチド
Ｈ−２ｋｂ制限ペプチドＯＶＡ（オボアルブミン２５７−２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）４１およびＶＳＶＮ（水疱性口内炎ウイルスＮ５２−５９、ＲＧＹＶＹＱＧＬ）４２、およびＨ−２Ｄｂ制限ペプチドＣＡＰ−Ｍ８（ＣＥＡ５２６−５３３、ＥＡＱＮＴＴＹＬ）およびＦＬＵ−ＮＰ（ＮＰ３６６−３７４、ＡＳＮＥＮＭＤＡＭ）４３は、購入する（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）か、または社内で合成した（Applied Biosystems 432A Synergy Peptide Synthesizer、カリフォルニア州フォスターシティー）。
【０２０５】
細胞株および細胞培養
ＯＶＡおよびＣａｐ−Ｍ８  ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞株は、社内で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから生成し、そしてそれぞれＯＶＡおよびＣａｐ−Ｍ８ペプチドを認識した。ＣＴＬ株は、１μｇ／ｍｌの特異的ペプチドおよび１０  Ｕ／ｍｌのネズミＩＬ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）を補った完全培地（ＣＭ）（ウシ胎児血清（１０％）、グルタミン（２  ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１  ｍＭ）、Ｈｅｐｅｓ（７  ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）、および非必須アミノ酸（０．１  ｍＭ）（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、メリーランド州ロックビル））中の放射線照射未処理脾臓細胞を用い、毎週のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激周期により維持した。抗原特異的増殖アッセイにおいて、これらの細胞を反応因子として使用する２４時間前に、細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（密度＝１．１１９  ｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）上の遠心分離により精製し、そして１０  Ｕ／ｍｌネズミＩＬ−２のみを補ったＣＭ中で、６ウェル培養プレート（１０６細胞／ｍｌ、５  ｍｌ／ウェル）に再プレーティングした。細胞傷害性アッセイでは、使用した標的腫瘍細胞株は、ＥＬ−４（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｈ−２ｂ、胸腺腫、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９）であった。
【０２０６】
ＤＣ調製
骨髄は、６ないし８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）から得た。本研究に用いた方法は、Ｉｎａｂａら４１に記載されるものをわずかに修飾したものであった。簡潔には、骨髄を肢の長骨から洗い出し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上を通過させた。ＣＤ４、ＣＤ８、および抗ＭＨＣクラスＩＩに特異的な磁気ビーズカクテル（ＭｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を用い、骨髄細胞のリンパ球およびＩａ＋細胞を枯渇させた。細胞は、１０  ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび１０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を補ったＣＭ中で、６ウェル培養プレート（１０６細胞／ｍｌ、５  ｍｌ／ウェル）にプレーティングした。第２および４日に、細胞を新鮮なサイトカインを補った培地中で再プレーティングした。培養６日目、感染、解析および免疫感作のため、細胞を採取した。明記された実験には、培養の最後の２４時間に、ＤＣをネズミＴＮＦ−α（１００  ｎｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）またはＣＤ４０  ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）で処理した。
【０２０７】
組換えポックスウイルス
合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターの調節下のネズミ補助的刺激分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）をコードする遺伝子を含むｒＶウイルス（ｒＶ−Ｂ７−１と称される）が、本明細書に記載されてきている。ワクシニア３０Ｋ（Ｍ２Ｌ）プロモーターの調節下のネズミＬＦＡ−３遺伝子（ＣＤ４８）、ワクシニアＩ３プロモーターの調節下のネズミＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、および合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターの調節下のネズミＢ７−１遺伝子を含むｒＶウイルスは、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭと名づけられている。ベクターｒＦ−Ｂ７−１およびｒＦ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３（ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭと称される）は、それぞれｒＶ−Ｂ７−１およびｒＶ−ＴＲＩＣＯＭと同様に構築されたｒＦウイルスである。レポーター遺伝子、ヒトＣＥＡを含む鶏痘−ＴＲＩＣＯＭ構築物を特定の実験に用いた。非組換え野生型ワクシニアウイルス（Ｗｙｅｔｈ株）はＶ−ＷＴと称され、一方、野生型鶏痘ウイルスはＦＰ−ＷＴと称された。
【０２０８】
ＤＣ感染
ＤＣは第６日に採取し、そしてＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）で洗浄した。その後、細胞をＨＢＳＳにニセ（ｍｏｃｋ）感染させ；Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ中で、５時間、２５  ＭＯＩ（感染多重度；ＰＦＵ／細胞）で、Ｖ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１、またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染させ；あるいは５０  ＭＯＩで、ＦＰ−ＷＴ、ｒＦ−Ｂ７−１、またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染させた。感染後、温ＣＭを添加し、そして細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。感染後、免疫染色、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析、およびｉｎ  ｖｉｖｏ投与のため、細胞を採取した。
【０２０９】
フローサイトメトリー解析
細胞表面染色は３色免疫蛍光を利用した。染色は、一次ＦＩＴＣ標識抗体、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｈ−２Ｋｂ、Ｈ−２Ｄｂ、ＣＤ１９、Ｐａｎ−ＮＫ；一次ＰＥ標識抗体、ＩＡｂ、ＣＤ４８（ｍＬＦＡ−３）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ３、ＣＤ１４；およびビオチン標識抗体、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ５７（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ４０で行った。ビオチン標識抗体は、続いて、シトクロム・ストレプトアビジンで標識した。すべての抗体は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入した。Ｌｙｓｉｓ  ＩＩソフトウェアを用いたＦＡＣＳＣＡＮ血球計算装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）で、細胞蛍光を解析し、そして適切なアイソタイプ一致コントロール（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）と比較した。
【０２１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析：薬理学的シグナル−１
雌の６ないし８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを得て（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）、そして先に記載されるように５、未処理Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞は、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に、１０５／ウェルで添加した。未感染ＤＣ、ニセ感染ＤＣ、あるいはワクシニアベクター（Ｖ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ）または鶏痘ベクター（ＦＰ−ＷＴ、ｒＦ−Ｂ７−１または、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ）に感染したＤＣのいずれかからなる刺激細胞に放射線照射（２０  Ｇｙ）し、そして１０５／ウェルで添加した。すべてのウェル中の細胞は、いくつかの濃度（２．５ないし０．９μｇ／ｍｌ）のＣｏｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、総体積２００μｌのＣＭ中で、２日間培養した。細胞は、インキュベーションの最後の１２−１８時間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、デラウェア州ウィルミントン）で標識し、そしてＴｏｍｔｅｃ細胞採取装置（Ｗａｌｌａｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、メリーランド州ガイザーズバーグ）で採取した。取り込み放射能は、液体シンチレーション計測（Wallac 1205 Betaplate、Wallac, Inc.）で測定した。３つ組ウェルの結果を平均し、そして平均ＣＰＭ±ＳＥＭとして報告する。
【０２１１】
混合リンパ球反応
ＭＬＲを用い、同種異系および同系未処理Ｔ細胞に対するＤＣの刺激機能を評価した。Ｔ細胞は、先のように、Ｂａｌｂ／ＣまたはＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。刺激細胞は、未感染；ニセ感染；あるいはＶ−ＷＴ、ｒＶ−１３７−１、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰ−ＷＴ、ｒＦ−Ｂ７−１またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣのいずれかからなり、そして放射線照射（２０  Ｇｙ）した。Ｔ細胞（５×１０４／ウェル）を平底９６ウェル培養プレート中で、ＣＭ中の段階的な数の刺激細胞と同時培養し、そして３７℃、５％  ＣＯ２で４日間インキュベーションし、先のように、インキュベーションの最後の１２−１８時間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンで標識し、採取し、そして解析した。
【０２１２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析：ペプチド特異的シグナル
休止ＯＶＡまたはＣＡＰ−Ｍ８  Ｔ細胞（反応因子）を、９６ウェル平底プレートに、５×１０４／ウェルで添加した。刺激細胞は、未感染あるいはＶ−ＷＴ、ｒＶ−１３７−１、またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣのいずれかからなり、そして放射線照射（２０  Ｇｙ）した。すべてのウェル中の細胞は、総体積２００μｌのＣＭ中で培養した。補助的刺激アッセイは、２組の条件を用いて行った：（１）１０：１の固定比の反応因子：刺激細胞、いくつかの濃度の特異的ペプチドまたは適切なコントロールペプチドの存在下で培養、あるいは（２）固定濃度の特異的ペプチドまたはコントロールペプチド、多様な反応因子：刺激細胞比で培養。細胞を７２時間培養し、先のように、インキュベーションの最後の１２−１８時間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンで標識し、採取し、そして解析した。
【０２１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏのＣＴＬ誘導および細胞傷害性解析
未感染、あるいはＶ−ＷＴまたはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣいずれか（１×１０６）をＯｐｔｉ−Ｍｅｍで２回洗浄し、そして１０μＭのＯＶＡまたはＣＡＰ−Ｍ８ペプチドいずれかを含む同じ培地１  ｍｌに再懸濁した。３７℃で２時間インキュベーションした後、細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、そして注射のためＨＢＳＳに再懸濁した。ペプチドパルス処理ＤＣ（１×１０５細胞／マウス）を、７日間隔で、１−３回、静脈内注射した。コントロールマウスは、Ｒｉｂｉ／Ｄｅｔｏｘアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、モンタナ州ハミルトン）中の１００μｇの示されるペプチドで皮下免疫した。最後の接種の１４日後、群当たり２匹の動物から脾臓を除去し、単細胞懸濁に分散させ、プールし、そして１０μｇ／ｍｌの適切なペプチドと６日間、同時インキュベーションした。バルクのリンパ球を密度勾配（ＬＳＭ、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、ペンシルバニア州ウェストチェスター）を通じた遠心分離により回収した。先のように４５、１１１Ｉｎを用いた標準的細胞溶解アッセイにおける標的として使用するために、ＥＬ−４細胞を調製した。標的細胞を、１０μＭの特異的ペプチドで、３７℃で１時間、パルス処理し、一方、第二の群の標的細胞は、コントロールペプチドでパルス処理した。リンパ球およびペプチドパルス処理標的（５×１０３細胞／ウェル）をＣＭに懸濁し、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で８０：１ないし１０：１のエフェクター：標的比で合わせ、そして３７℃で５時間、５％  ＣＯ２と共にインキュベーションした。インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｋａｎｔｒｏｎ、バージニア州スターリング）を用い上清を集め、そしてガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ  Ａｕｔｏｇａｍｍａ、Ｐａｃｋａｒｄ、イリノイ州ダウナーズグローブ）を用い、放射能を定量化した。１１１Ｉｎの特異的放出のパーセンテージは、標準的等式：％特異的溶解＝［（実験−自発）／（最大−自発）］／１００により決定した。示される場合、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈら、１９９４に記載されるように、ＣＴＬ活性を溶解単位（ＬＵ）に変換した。
【０２１４】
抗ワクシニア抗体解析
Ｖ−ＷＴを５×１０５／ウェルで塩化ポリビニルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、バージニア州シャンティリー）に添加し、３７℃で一晩乾燥させ、そして５％  ＢＳＡでブロッキングした。免疫マウス由来血清の段階的希釈を３つ組で添加し、そして３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｋｉｒｋｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）とさらに１時間インキュベーションした。ウェルをｏ−フェニレンジアミン二塩酸（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）およびＨ２Ｏ２で染色した。Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  ＥＬ３１２ｅマイクロプレートＥＬＩＳＡ読取装置（バーモント州ウィヌースキー）を用い、各ウェルの吸光度を４０５  ｎｍで読み取った。
【０２１５】
結果
ＤＣ上の補助的刺激分子の発現増加
ＤＣのポックスウイルス感染の効率を測定するため、これらの細胞を、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３をコードするｒＶウイルス（ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭと称される）またはＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３およびヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）をコードするｒＦウイルス（ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭと称される）いずれかに感染させた。後者の場合、鶏痘構造タンパク質が感染細胞で発現されないため、ＣＥＡはレポーター遺伝子として用いられる。１８時間後、特定のウイルス感染に関連する、細胞表面マーカーの発現に関し、細胞を解析した。未感染コントロールＤＣはＣＤ１１ｂを発現し（９７％）、そしてワクシニアタンパク質の発現に関し、陰性であった。ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭでの感染後、９４％のＤＣはＣＤ１１ｂおよびワクシニアタンパク質を共に同時発現した。ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣは、ＣＤ１１ｂおよびＣＥＡを共に同時発現した（８７％）。これらのＤＣは、ポリクローナルウサギ抗鶏痘血清により検出されるように、鶏痘タンパク質を発現せず（データ未提示）、これは鶏痘が哺乳動物細胞で複製しないと明記する報告と一致した。総合すると、これらのデータは、ＤＣがｒＶおよびｒＦベクター両方に、効率的に感染することを示す。
【０２１６】
ＤＣの重要な特性は、組織適合抗原および補助的刺激分子両方を高レベルで発現することである。ウイルス感染後のＤＣの表現型をさらに性質決定するため、細胞を野生型ワクシニアウイルス（Ｖ−ＷＴ）、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ、野生型鶏痘（ＦＰ−ＷＴ）またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染させ、そしてＤＣ表現型と関連する、細胞表面マーカーの発現に関し解析した（表４）。期待されるように、未感染およびニセ感染ＤＣは、高レベルのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、ＣＤ１１ｂ、Ｂ７−２およびＣＤ４０分子と共に、高レベルのＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３を発現した。Ｖ−ＷＴ感染ＤＣは、（ＭＦＩにより測定されるように）より低い細胞表面密度のいくつかの分子を発現し、一方、ｒＶ−Ｂ７−１感染ＤＣは、未感染ＤＣより５倍多いＢ７−１を発現した（ＭＦＩ３２９から１６８９）。ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭでのＤＣの感染は、ＭＦＩ並びにＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３に関し陽性の細胞のパーセンテージを実質的に増加させた。ＦＰ−ＷＴ感染ＤＣは、未感染ＤＣのものと同様の表現型プロフィールを有した。ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭでのＤＣの感染もまた、ＭＦＩ並びにＢ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３に関し陽性の細胞のパーセンテージを実質的に増加させた。すべてのＤＣ集団は、ｒＦまたはＮベクターでの感染前および感染後とも、Ｔ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、単球／好中球（ＣＤ１４）、およびＮＫ細胞（Ｐａｎ  ＮＫ）マーカーに関し、陰性のままであった（表４）。
【０２１７】
表４
ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭまたはＦＰ−ＴＲＩＣＯＭでのＢＭＤＣの感染は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３の発現レベルを増加させる
【０２１８】
【表４】
0005254153.tif 000005
【０２１９】
ＤＣは、未感染、ニセ感染、あるいは２５  ＭＯＩのＶ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７、またはｒＶ−ＴＲＩＣＯＭいずれか、または５０  ＭＯＩのＷＴ−ＦＰまたはＦＰ−ＴＲＩＣＯＭに５時間感染させた。１８時間インキュベーションした後、３色フローサイトメトリー解析により、細胞を表現型決定した。太字の数字は、細胞表面発現（ＭＦＩ）の＞１００％変化を示す。
【０２２０】
ＴＲＩＣＯＭベクターでのＤＣ感染は、未処理Ｔ細胞を刺激する能力の亢進を示す
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用い、増加したレベルのＢ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３発現が、どのように未処理Ｔ細胞増殖誘導を補助するかを解析した。本モデルでは、Ｔ細胞活性化の第一のシグナルは、薬理学的剤（Ｃｏｎ  Ａ）を介し、搬送し、そしてさらなる、または補助的刺激シグナルは、ＤＣまたは組換えポックスウイルス感染の結果としてより高いレベルのＴＲＩＣＯＭを発現しているＤＣを介し、Ｔ細胞に搬送した。これらのそして本明細書に報告されるすべての続く研究において、Ｖ−ＷＴおよびＥＰ−ＷＴもまた用い、ベクター単独による影響を排除した。図３６Ａに示されるように、未感染およびニセ感染ＤＣは共に、Ｔ細胞増殖を誘導した。Ｖ−ＷＴ感染ＤＣ（ＤＣ／Ｖ−ＴＲＩＣＯＭと称される）は未感染ＤＣより少ないＴ細胞増殖を誘導した。ｒＶ−Ｂ７−１に感染したＤＣ（ＤＣ／ｒＶ−Ｂ７−１と称される）を介したさらなる補助的刺激の搬送は、未感染ＤＣに比較し、増殖を増加させた。しかし、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣ（ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭと称される）は、Ｃｏｎ  Ａのすべての濃度で、Ｔ細胞増殖をさらに増加させた。さらに、Ｔ細胞をＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭで刺激した場合、未感染ＤＣのものと匹敵するレベルの増殖を誘導するのに、２８倍少ないＣｏｎ  Ａしか必要でなかった。鶏痘ベクターを用い、これらの実験を繰り返すと、ＤＣ／ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭはＤＣまたはＤＣ／ｒＦ−Ｂ７−１と異なり、すべてのＣｏｎ  Ａ濃度でＴ細胞増殖増加を誘導した（図３６Ｂ）。これらの実験を４回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２２１】
ＴＲＩＣＯＭベクターに感染したＤＣによるアロ刺激活性の亢進
ＤＣ刺激能力に対するｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ（図３７Ａ、Ｃ、Ｅ）またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（図３７Ｂ、Ｄ、Ｅ）感染の効果を、アロ特異的混合リンパ球反応で評価した。未感染ＤＣおよびニセ感染ＤＣ集団は共に、同種異系Ｔ細胞の強い増殖（７８，０００  ＣＰＭ）を誘導した（図３７Ａ、Ｂ）。ｒＶ−Ｂ７−１感染後、ＤＣの刺激能力は増加した（図３７Ｃ）。ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭでのＤＣ感染は、すべてのＤＣ／反応因子比で、ＤＣおよびＤＣ／ｒＶ−Ｂ７−１よりも、刺激能力を増加させた（図３７Ｃ）。重要なことに、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣ集団は、同系Ｔ細胞を刺激しなかった（図３７Ｅ）。鶏痘ベクターを用い、これらの実験を繰り返すと（図３７Ｂ、Ｄ）、ＤＣ／ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭはＤＣおよびＤＣ／ｒＦ−Ｂ７−１より同種異系Ｔ細胞増殖のより多い増加を誘導したが、ＤＣ−ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭは同系Ｔ細胞を刺激しなかった（図３７Ｆ）。これらの実験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析：エフェクターＴ細胞へのペプチドの提示
ペプチドパルス処理ＤＣの刺激能力を、ＤＣをｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染させることにより、亢進させることが可能であるかどうか決定する研究を行った。本目的のため、Ｈ−２ｋｂ制限ＯＶＡ（オボアルブミン２５７−２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）およびＯＶＡ特異的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞株を用いた。ＤＣを異なる濃度のＯＶＡペプチドに曝露し、そしてＯＶＡ  Ｔ細胞株の存在下でインキュベーションした（図３８Ａ−３８Ｆ）。慣用的な（すなわち未感染の）ＤＣは、ＯＶＡペプチドとインキュベーションした際、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の強い増殖を誘導した（図３８Ａ）。これらのＤＣは、コントロールペプチド、ＶＳＶＮ（水疱性口内炎ウイルスＮ５２−５９、ＲＧＹＶＹＱＧＬ）とインキュベーションした際、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の増殖を誘導しなかった（図３８Ａ、白い正方形）。ＤＣ／ｒＶ−Ｂ７−１は、これらの細胞の全体的なペプチド特異的増殖を、１．８倍増加させた（図３８Ｃ）。さらに、ＤＣ／ｒＶ−Ｂ７−１は、４倍少ないペプチドの存在下で、未感染またはニセ感染ＤＣのものと同様の増殖を誘導した。対照的に、ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭは、これらのＴ細胞の全体的な増殖を、数倍増加させ、そして３２倍少ないＯＶＡペプチドの存在下で、未感染ＤＣのものと匹敵する増殖を誘導した（図３８Ｃ）。ワクシニア感染ＤＣがペプチドを提示する能力をさらに評価するため、ＤＣを単一濃度のＯＶＡペプチド（１μＭ）でパルス処理し、そしていくつかの比のＴ細胞の存在下でインキュベーションした（図３８Ｅ）。細胞当たりに基づき、ＤＣのものと匹敵する増殖レベルを誘導するのに、４倍少ないＤＣ／ｒＶ−Ｂ７−１が必要であった（白い三角形対黒い正方形）。最大刺激効果は、ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭのものであり、これは３２倍少ない細胞で、ＤＣのものと匹敵する増殖レベルを誘導した（白い円対黒い正方形）。
【０２２３】
ペプチドパルス処理ＤＣおよび樹立Ｔ細胞株を使用する第二のペプチド系を使用し、ＯＶＡペプチドで得られたものと同様の結果が見られるかどうか決定した。これらの実験は、Ｈ−２Ｄｂ制限ペプチドＣＡＰ−Ｍ８（ＣＥＡ５２６−５３３、ＥＡＱＮＴＴＹＬ）およびＣＡＰ−Ｍ８特異的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞株を用いて行い；同様の結果が見られた（図３８Ｂ、Ｄ、Ｆ）。これらの実験をさらに５回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２２４】
ＴＮＦαまたはＣＤ４０成熟ＤＣに対するｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染の影響
ＤＣの機能的成熟は、Ｔ細胞補助的刺激分子の上方制御と相関すると考えられるため、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０  ｍＡｂいずれかとの同時培養により成熟したＤＣに対するｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染の影響を調べる実験を行った。培養の最後の２４時間にＴＮＦ−αでＤＣを処理すると、その結果、フローサイトメトリー解析により測定されるように、ＭＨＣ−ＩＩ、Ｂ７−２、およびＩＣＡＭ−１がいくらか上方制御され（表５）、一方、ＣＤ４０  ｍＡｂでＤＣを処理すると、その結果、ＩＣＡＭ−１発現が上方制御され、そしてＭＨＣ−ＩＩがわずかに上方制御される。機能上、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０  ｍＡｂでのＤＣの処理は、ペプチド特異的増殖において、未操作ＤＣのものより、それぞれ、２８％および１６％増加させた（図３９Ａ）。ＤＣをリポ多糖（ＬＰＳ）で処理した後もまた、同様のデータが得られた。未処理ＣＤをｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染させると、Ｔ細胞増殖の実質的な増加が生じた（図３９Ａ対３９Ｂ）。しかし、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０  ｍＡｂで前処理した後、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに感染させると、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染単独で見られたものより、わずかに高い刺激能力が与えられたのみであった。これらの実験をさらに３回繰り返し、同様の結果を得た。
【０２２５】
表５
ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ感染前のＴＮＦ−αまたはＣＤ４０  ｍＡｂでのＤＣの前処理の影響
【０２２６】
【表５】
0005254153.tif 000006
【０２２７】
ＤＣは、培養の最後の２４時間、ＴＮＦ−α（１００  ｎｇ／ｍｌ）またはＣＤ４０  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）で処理した。その後、ＤＣまたは処理ＤＣを２５  ＭＯＩのｒＶ−ＴＲＩＣＯＭに５時間感染させた。１８時間インキュベーションした後、３色フローサイトメトリー解析により、細胞を表現型決定した。
【０２２８】
Ｗ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＣＴＬ反応の誘発（ｐｒｉｍｉｎｇ）に、より有効である
Ｃｏｎ  Ａ（図３６Ｅ−Ｆ）、混合リンパ球反応（図３７）および２エフェクターＴ細胞モデル（図３８）を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで見られたＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭの刺激能力の亢進が、ｉｎ  ｖｉｖｏの未処理Ｔ細胞反応誘発の有効性の亢進に転換されるかどうか決定する実験を行った。本目的のため、ＤＣ、ＤＣ／Ｖ−ＷＴ、およびＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭを１０μＭのＯＶＡペプチドでパルス処理し、そしてＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。コントロールマウスは、Ｒｉｂｉ／Ｄｅｔｏｘアジュバント中のＯＶＡペプチドで皮下免疫した。ワクチン接種の１４日後、脾臓細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで６日間再刺激し、そしてＯＶＡパルス処理ＥＬ−４細胞に対し、そのペプチド特異的溶解能に関し、評価した。ＶＳＶＮペプチドでパルス処理したＥＬ−４細胞をコントロール標的細胞として用いた。図４０Ａに見られるように、ペプチド／アジュバントで免疫したマウスから生成されたＣＴＬは、中程度のレベルのＣＴＬ活性を示した（図４０Ａ）。ペプチドパルス処理ＤＣで免疫したマウスは、より大きいペプチド特異的ＣＴＬ反応を示した（図４０Ｂ）。誘導ＣＴＬ反応は、ＤＣ／ｖ−ＷＴで免疫されたマウスで、いくらか鈍っていた（図４０Ｃ、＜２．５溶解単位（ＬＵ）対５．２  ＬＵ）。対照的に、ペプチドパルス処理ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭで免疫したマウス（図４０Ｄ）は、ＤＣのものより有意に強いＣＴＬ反応を示した（ＬＵ＝１４．３、ｐ＝０．００１）。その後、第二のモデルペプチド、ＣＥＡペプチドＣＡＰ−Ｍ８を用い、同様の実験を行った（図４０Ｅ−Ｈ）。再び、ペプチドパルス処理ＤＣは、ペプチド／アジュバントにより引き出されるものより、はるかに高いＣＴＬ活性を引き出した（５．７  ＬＵ対＜２．５  ＬＵ）。さらに、ペプチドパルス処理ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭで免疫されたマウス（図４０Ｈ）は、ペプチドパルス処理ＤＣにより誘導されるもの（５．７  ＬＵ）に比較し、強いＣＴＬ反応（＞２０  ＬＵ、ｐ＝＜０．００１；図４０Ｆ）を示した。
【０２２９】
多ベクター感染ＤＣワクチン接種の有効性
抗ワクシニア抗体の生成は、免疫原としてのワクシニアウイルスの反復使用を防ぐことが可能であると、一般的に考えられる。しかし、免疫原としてのワクシニア感染細胞の反復使用に関しては、ほとんど知られていない。この問題に取り組むため、ＣＡＰ−Ｍ８ペプチドパルス処理ＤＣ免疫原を、７日間隔で、１、２、または３回投与する、免疫計画を実行した。以前のように、最後の免疫の１４日後に脾臓細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで６日間再刺激し、そしてＣＡＰ−Ｍ８パルス処理ＥＬ−４細胞に対するそのペプチド特異的溶解能に関し、評価した。図４１Ａに見られるように、ペプチドパルス処理ＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭは、ペプチドパルス処理ＤＣに比較し、より高いレベルのＣＴＬ活性を誘導した。これらのデータは図４０Ｅ−Ｈに見られるものと同様である。このＤＣ／Ｖ−ＷＴまたはＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭの単回投与により、定性的ＥＬＩＳＡにより決定されるように、１：４，０００ないし１：９，０００の範囲の値で、有意な抗ワクシニアＩｇＧ抗体力価が誘導された。しかし、これらの力価は、これらの免疫原が、続く免疫感作でＣＴＬ活性を高める能力に対し、いかなる影響も持たなかった（図４１Ｂおよび４１Ｃ）。第二のワクチン接種後の抗ワクシニアウイルス力価は１：１２，０００ないし１：５０，０００の範囲であり、一方、すべての群で、ペプチド特異的ＣＴＬの誘導の上昇が見られた。再びＤＣ／ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭパルス処理細胞を使用して観察されるＣＴＬ活性は、ペプチドパルス処理ＤＣで観察されるものより高かった。
【０２３０】
実施例３２
ＴＲＩＣＯＭベクターに感染した脾臓細胞または骨髄前駆細胞は、樹状細胞に匹敵するＴ細胞活性化を誘導する
材料および方法
骨髄先駆細胞および樹状細胞培養の生成
骨髄由来ＤＣの生成に用いた方法は、Ｉｎａｂａらに記載されるものに重要でない修飾を加えたものであった。簡潔には、６−８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）から大腿骨を採取し、そして骨髄を洗い出し、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上に通過させた。ＣＤ４、ＣＤ８、およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な磁気ビーズカクテル（ＭｉｎｉＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）を用い、骨髄細胞のリンパ球およびＩａ＋細胞を枯渇させた。その後、樹状細胞先駆体と称されるこれらの枯渇骨髄細胞を、感染のため調製し、または樹状細胞培養のため、枯渇骨髄細胞を、１０  ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦおよび１０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を補ったＣＭ中で、６ウェル培養プレート（１０６細胞／ｍｌ、５  ｍｌ／ウェル）にプレーティングした。第２および４日に、新鮮なサイトカインを補ったＣＭ中にＤＣ培養を再プレーティングし、第４日に新たなプレートに分配した。培養７日目、解析、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ免疫感作のため、細胞を採取した。
【０２３１】
脾臓細胞刺激細胞の生成
未処理の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから脾臓を採取し、押しつぶして単細胞懸濁物にし、そしてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配上に通過させた。脾臓細胞は、ＣＤ９０、およびＭＨＣクラスＩＩに特異的な磁気ビーズカクテルを用い、リンパ球およびＩａ＋細胞を枯渇させた。その後、精製脾臓細胞をＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で２回洗浄し、そして組換えポックスウイルスでの感染のため調製した。
【０２３２】
刺激細胞の感染
骨髄由来樹状細胞先駆体および脾臓細胞をＯｐｔｉ−Ｍｅｍで２回洗浄し、そしてニセ感染させ、あるいは２５  ＭＯＩのＶ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ、または５０  ＭＯＩのＦＰ−ＷＴ、ｒＦ−Ｂ７−１またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに、２５  ＭＯＩ（感染多重度、ＰＦＵ／細胞）で、最終体積１  ｍｌのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中で５時間、感染させた。感染後、温かい（３７℃）ＣＭを添加し、そして細胞を３７℃で一晩インキュベーションした。感染後、免疫染色、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補助的刺激解析、およびｉｎ  ｖｉｖｏ投与のため、細胞を採取した。
【０２３３】
補助的刺激解析
休止ＣＡＰ−Ｍ８  Ｔ細胞（反応因子）を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に、５×１０４／ウェルで添加した。刺激細胞は、未感染、ニセ感染、あるいはＶ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰ−ＷＴ、またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭいずれかに感染した、ＢＭＤＣ、脾臓細胞、または骨髄先駆体のいずれかからなり、そして放射線照射した（２０  Ｇｙ）。ウェル中の細胞は、総体積２００  ｍｌのＣＭ中で培養した。補助的刺激アッセイは、２組の条件を用いて行った：ａ）非ＢＭＤＣ刺激因子には、２．５：１、そしてＢＭＤＣには１０：１の固定比の反応因子：刺激細胞、シグナル１としてのいくつかの濃度のＣｏｎ−Ａ、特異的ペプチド、または適切なコントロールペプチドの存在下で培養、あるいはｂ）シグナル１としての固定濃度のＣｏｎ−Ａ、特異的ペプチド、またはコントロールペプチド、多様な反応因子：刺激細胞比で培養。細胞を、Ｃｏｎ−Ａおよびペプチド特異的アッセイのため、それぞれ、４８または７２時間培養し、そして先のように、インキュベーションの最後の１２−１８時間、１ｍＣｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンで標識し、採取し、そして解析した。
【０２３４】
表６は、組換えベクターでの感染後、補助的刺激分子の脾臓細胞および骨髄（ＢＭ）細胞表面発現を示す。精製ネズミ脾臓細胞または骨髄細胞は、２５  ＭＯＩのワクシニアベクターまたは５０  ＭＯＩの鶏痘ベクターに５時間感染させた。細胞表現型をＤＣのものと比較した。すべての細胞は、フルオレセイン・イソチオシアネート、フィコエリトリン、またはビオチン／ストレプトアビジン−シトクロムで標識した、補助的刺激分子特異的ｍＡｂで免疫染色した。アイソタイプコントロールは陰性であった（データ未提示）。数字は陽性細胞パーセントを、そして括弧内の数字は平均蛍光強度を示す。
【０２３５】
表６
ｒＶ−ＴｒｉｃｏｍまたはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭでのＢＭＤＣ、脾臓細胞、およびＢＭＤＣ先駆細胞の感染は、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３の発現レベルを増加させる１
【０２３６】
【表６】
0005254153.tif 000007
【０２３７】
１細胞は未感染、あるいは２５  ＭＯＩのＶ−ＷＴ、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−Ｔｒｉｃｏｍ、または５０  ＭＯＩのＦＰ−ＷＴ、ｒＦ−Ｂ７−１またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに５時間感染させた。１８時間のインキュベーション期間後、３色フローサイトメトリー解析により、細胞を表現型決定した。値は、％陽性細胞（平均蛍光強度）で示す。太字の数字は、細胞表面発現（ＭＦＩ）における、＞２倍の変化を示す。
【０２３８】
２ＢＭＤＣ：第６日骨髄由来樹状細胞（１０  ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４中で培養）。
【０２３９】
３α−ＣＤ９０（Ｔｈｙ  １．２）磁気ビーズを介し、Ｔ細胞を枯渇させた脾臓細胞。
【０２４０】
４ＢＭＤＣ先駆体：骨髄細胞は、α−ＣＤ４、α−ＣＤ８、α−ＭＨＣＩＩ磁気ビーズを介し、Ｔ細胞およびＭＨＣ−ＩＩ細胞を枯渇させた。
【０２４１】
図４２Ａから４６は、ＴＲＩＣＯＭ感染脾臓細胞が、Ｔ細胞反応の刺激において、ＴＲＩＣＯＭ感染骨髄細胞と匹敵することを示す。
【０２４２】
実施例３３
ペプチドでパルス処理した同種異系ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ヒト樹状細胞を用いたヒトＴ細胞刺激
ヒト樹状細胞を、ロイコフェレーシス（ｌｅｕｃｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）により、健常個体から単離した。ヒト樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６−９日間培養した後、樹状細胞の感染のため、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭまたはｒＦ−コントロールを添加した。ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染樹状細胞をＣＥＡペプチド（ＣＡＰ−１またはＣＡＰ  Ｉ、６Ｄ）（図４７）；ＰＳＡペプチド（ＰＳＡ−３）（図４８）；インフルエンザペプチド（Ｆｌｕペプチド５８−６６）（図４９および５０）；またはＨＰＶペプチド（１１−２０）（図５１−４５）で１時間、パルス処理した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したヒトＴ細胞は、ペプチドパルス処理ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染樹状細胞の存在下で培養し、そしてＴ細胞によるＩＦＮ−αの産生を測定した。図４７−５４は、ペプチドパルス処理ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ヒト樹状細胞が、コントロールより高い度合いでＴ細胞を刺激したことを示す。図４７−５４と共に表７は、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染した同種異系ヒト樹状細胞が、いかなる抗原性ペプチドもＴ細胞に効果的に提示し、免疫反応を亢進することが可能であることを示す。
【０２４３】
表７
ＨＰＶ  Ｅ７（１１−２０）ペプチドでパルス処理したＤＣを用いることによるＴ細胞株のＣＴＬ活性
【０２４４】
【表７】
0005254153.tif 000008
【０２４５】
Ｅ：Ｔ比＝２５：１
６時間の１１１−Ｉｎ放出アッセイを行った。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞は、１０μｇ／ｍｌの濃度のＨＰＶ  Ｅ７ペプチド（１１−２０）ＹＭＤＬＱＰＥＴＴでパルス処理した。
【０２４６】
表７に示される結果は、どちらもペプチドでパルス処理した場合、ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ（Ａ）に感染したＤＣは、標準的ＤＣ（Ｂ）よりも、ＣＴＬを生成するＡＰＣとして優れていることを示す。
【０２４７】
実施例３４
ｒＶ−ｈｕＴＲＩＣＯＭ、ｒＶ−ＣＥＡ  ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭワクチンおよびｒＦ−ＣＥＡ  ＴＲＩＣＯＭのヒト臨床試験
ヒト臨床試験の目的は、宿主抗腫瘍反応を引き出し、そして進行したＣＥＡ発現腺癌の患者において許容可能な毒性と結び付けられる、組換えｒＶ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭおよびｒＶ−ＣＥＡ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭワクチンの最適容認用量（ＯＴＤ）を決定することである。
【０２４８】
ｒＶ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭおよびｒＶ−ＣＥＡ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭワクチンは、第Ｉ相および第ＩＩ相ヒト臨床試験に適した条件下で産生する。
【０２４９】
最初の試験では、初期用量１０６  ｐｆｕウイルス、Ｉ．Ｍ．の後、１０７  ｐｆｕウイルス、Ｉ．Ｍ．、その後、１０８  ｐｆｕウイルスまたは１０９  ｐｆｕウイルス、Ｓ．Ｃ．または乱切で、増大する用量の組換えｒＶまたはｒＦ  ＣＥＡ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭ生ウイルスワクチンまたはｒＶ−ＣＥＡを加えたｒＶ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭを提供する。
【０２５０】
各組換えワクチンに対する抗腫瘍反応は、当業に知られるように、新たな型の療法に対する腫瘍反応を測定するのに許容される標準的規準を用い、腫瘍サイズ、度合いおよび増殖の臨床的、実験室的および放射線医学的徴候を用い、決定する。
【０２５１】
組換えワクチンに対する患者の免疫反応は、抗ＣＥＡ抗体アッセイ、抗ポックスウイルス抗体アッセイ、免疫複合体アッセイ、ＣＥＡ特異的リンパ球増殖アッセイ、ＣＥＡ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、ガンマ−インターフェロン放出Ｔ細胞アッセイにおけるＣＥＡ反応性Ｔ細胞の先駆体頻度、ＥＬＩＳＰＯＴ、Ｔ細胞反応のためのＦａｓｔ  Ｉｍｍｕｎｅ、Ｔｅｔｒａｍｅｒｅアッセイ（Scheibenhogenら, Int. J. Cancer71:932-936, 1997）、ＨＬＡアッセイおよびそれらに匹敵するものを含む、多様な免疫学的アッセイを用い、評価する。処置前および処置後試料の比較を行い、ＣＥＡ腫瘍抗原に対して向けられる体液性および細胞性免疫反応の発展を立証する。
【０２５２】
実施例３５
組換え鶏痘ＣＥＡ−ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭのヒト臨床試験
最初の試験では、１０６  ｐｆｕウイルス、１０７  ｐｆｕウイルスおよび１０８  ｐｆｕウイルスの増大する用量の組換え鶏痘ＣＥＡ  ｈｕ  ＴＲＩＣＯＭワクチンを、進行したＣＥＡ発現腺癌の患者の腫瘍塊に直接注射する。
【０２５３】
組換えワクチンに対する特異的抗腫瘍および免疫反応を、実施例３４に記載されるように決定する。
【０２５４】
実施例３６
多補助的刺激分子過剰発現樹状細胞により活性化されたＴリンパ球のヒト臨床試験
末梢血リンパ球および樹状細胞は、進行した前立腺癌の患者から得る。末梢血リンパ球をＣＤ８＋リンパ球に関し濃縮する。樹状細胞を、ＰＳＡエピトープの発現および多数の補助的刺激分子の過剰発現を可能にするのに十分な期間、ｒＶ−ＰＳＡエピトープＱＶＨＰＱＫＶＴＫ／Ｂ７．１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３に感染させる。ＰＳＡエピトープ特異的ＣＤ８＋リンパ球を、これらの処理樹状細胞の存在下で活性化し、そして拡大する。活性化ＰＳＡエピトープ特異的ＣＤ８＋自己Ｔリンパ球を単独で、そしてＰＳＡエピトープと組み合わせて注射する。処理に対する特異的抗腫瘍およびＰＳＡ特異的免疫反応は、実施例３４に記載されるものと匹敵する方法により、決定する。
【０２５５】
本発明の組換えベクター内で、別のＴＡＡをコードする遺伝子でＣＥＡをコードする遺伝子を置き換えることにより、他のＴＡＡを発現する癌患者の治療のための、同様のヒト臨床試験を実施してもよい。
【０２５６】
実施例３７
ｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣを用いた、免疫原性ペプチドおよび／または特異的ペプチドと免疫反応するヒトＴ細胞に関するスクリーニング
本発明は、腫瘍特異的ＣＴＬを活性化するための腫瘍関連抗原を持つウイルスベクターでのＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ操作を用いた抗癌療法を含む。ＴＲＩＣＯＭ補助的刺激分子と組み合わせたｒＦ−ＣＥＡに感染したＤＣを用い、ＣＥＡ特異的免疫反応を増大させた。ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭおよびｒＦ−ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣのＣＴＬ誘導能力を評価する。四量体ＭＨＣクラスＩ  ＣＡＰ−１複合体を用い、ＣＡＰ−１特異的ＣＴＬを視覚化する。本プロトコルは、腫瘍関連抗原、ＣＥＡに限定されず、癌、病原性細菌、ウイルス、原生動物、酵母およびそれらに匹敵するものに対する免疫療法のため、いかなる抗原性ペプチドまたはその免疫原性エピトープでもよいものに関する抗原特異的免疫反応を引き出すよう、修飾してもよい。さらに、該方法を修飾し、天然タンパク質、組換えタンパク質、合成タンパク質、または各々由来の断片、コンビナトリアル・ライブラリー、およびそれらに匹敵するものなどの供給源から免疫原性ペプチドをスクリーニングし、そして同定してもよい。
【０２５７】
材料および方法
細胞培養
結腸直腸癌細胞株ＳＷ１４６３（ＨＬＡ−Ａ１，２）、ＬＳ１７４Ｔ（ＨＬＡ−Ａ２，−）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州マナサス）から購入した。培養はマイコプラズマを含まず、そして完全培地（１０％ウシ胎児血清、２  ｍＭ  グルタミン、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）を補ったＤＭＥＭ（Life Technologies, Inc.））中で維持した。Ｃ１Ｒ細胞株は、ヒト血漿白血球細胞株であり、内因性ＨＬＡ−ＡまたはＢ抗原を発現しない（Storkus, W.J.ら, J. Immunol.138(6):1657-1659, 1987）。Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞は、トランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２．１のゲノムクローンを発現するＣ１Ｒ細胞である（Hogan, K.T.ら, J. Exp. Med.168(2):725-736, 1988）。これらの細胞は、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｂｉｄｄｉｓｏｎ博士（National Institute of Neurological Disorders and Stroke、NIH、メリーランド州ベセスダ）から得た。Ｃ１Ｒ−Ａ２培養は、マイコプラズマを含まず、そしてＲＰＭＩ  １６４０完全培地（Life Technologies, Inc.）中で維持した。ＣＡＰ−１エピトープに対して向けられるＣＴＬ株、Ｖ８Ｔ細胞株は、ｒＶ−ＣＥＡを用いた第Ｉ相試験に登録した、転移性結腸癌を持つ患者から樹立した（Tsang, K.Y.ら, Clin. Cancer Res.3(12):2439-2449, 1997）。Ｖ８Ｔ細胞は、１０％ヒトＡＢ血清およびＩＬ−２（National Cancer Institute, Surgery Branchより供給、２０単位／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０完全培地中で培養した。Ｖ８Ｔ細胞は、エフェクター細胞対ＡＰＣ比１：３で先に再刺激した後、第１６日にＣＡＰ−１ペプチド（２５μｇ／ｍｌ）で再刺激した。放射線照射（２３，０００ラド）自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣとして用いた。
【０２５８】
末梢血単核細胞由来のＤＣの培養
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ｒＶ−ＣＥＡおよびＡＬＶＡＣ−ＣＥＡの組み合わせを用いた第Ｉ相試験に登録した、転移性骨盤癌を持つ患者（＃１５）由来のヘパリン処理血から得た。患者材料を含むすべての実験は、ＮＩＨガイドラインにしたがって実施し、そして書面のインフォームドコンセントをすべての個人から得た。以前記載されるような（Boyum, A. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97:51-76, 1968）、リンパ球分離培地勾配（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ、ノースカロライナ州ダーラム）を用い、ＰＢＭＣを分離した。ＤＣは、Ｓａｌｌｕｓｔｏら（Sallusto, F.ら, J. Exp. Med.179(4):1109-1118, 1994）に記載される方法の修飾法を用い、調製した。ＰＢＭＣ（１．５×１０８）を、２  ｍＭ  グルタミン、５０μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（Life Technologies, Inc.）を含むＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁し、そしてＴ−１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に付着させた。３７℃で２時間インキュベーションした後、穏やかにリンスし、非付着細胞を除去した。５０  ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）および０．５  ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で、付着細胞を６−７日間培養した。培地は、３日ごとに補充した。
【０２５９】
組換えウイルス、並びにＣＥＡ、ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭおよびＴＲＩＣＯＭを含むアビポックス（ａｖｉｐｏｘ）ウイルスでのＤＣの感染
ＣＥＡの全オープンリーディングフレームをコードする２１０９  ｂｐのＤＮＡ断片は、Ｋａｕｆｍａｎら（Kaufman, F.ら, Int. J. Cancer 48(6):900-907, 1991）に記載されるように得た。組換えＣＥＡアビポックスウイルス（鶏痘ＣＥＡ；ｖＣＰ２４８）は、Ｔａｙｌｏｒら（Taylor, J.ら, Virology 187(1):321-328, 1992）、Ｃｏｘら（Cox, W.I.ら, Virology187(1):321-328, 1992）およびＰｅｒｋｕｓら（Perkus, M.E.ら, J. Virol. 63(9):3829-3836）に記載される方法を用い、Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｃｏｒｐにより供給された。ＣＥＡおよびヒトＴｒｉｃｏｍ遺伝子（ｒＦ−ＣＥＡ−Ｔｒｉｃｏｍと称される）および組換えヒト鶏痘−ＴＲＩＣＯＭ（ｒＦ−Ｔｒｉｃｏｍ）をコードする組換えアビポックスウイルスは、本明細書に開示されるように作成した。選択された実験で、野生型鶏痘（ＦＰ−ＷＴ）を陰性コントロールとして用いた。ＤＣ（１×１０６）を、１  ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Life Technologies, Inc.）中で、３７℃で、ｒＦ  ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＣＥＡ、ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭ、ＦＰ−ＷＴとインキュベーションした。力価測定実験は、感染多重度（ＭＯＩ）４０：１に等しい２×１０７プラーク形成単位／ｍｌが、感染ＤＣのおよそ７５％でＣＥＡの発現を恒常的に誘導することが可能であったことを示した。感染ＤＣは、５０  ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦおよび０．５  ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含む新鮮な温かいＲＰＭＩ−１６４０完全培地１０  ｍｌに懸濁し、２４時間培養し、そしてその後、続いて、刺激因子として用いた。
【０２６０】
ペプチド
９６％以上純粋な、ＣＡＰ−１（Tsang, K.Y.ら, J. Natl Cancer Inst. 87(13):982-990, 1995）、ＣＥＡアミノ酸位５７１−５７９  ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ、ＣＡＰ１−６Ｄ（Zaremba, S.ら, Cancer Res. 57(20):4570-4577, 1997）ＹＬＳＧＡＤＬＮＬおよびＦｌｕペプチド、インフルエンザマトリックスタンパク質ペプチド５８−６６  ＧＩＬＧＦＶＴＬは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）により作成された。
【０２６１】
Ｔ細胞株の生成
Ｔｓａｎｇら（Tsang, K.Y.ら, J. Natl Cancer Inst. 87(13):982-990, 1995）に記載されるプロトコルの修飾法を用い、ＣＥＡ特異的ＣＴＬを生成した。未感染ＤＣおよびｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ、ｒＦ−ＣＥＡ、またはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣをＡＰＣとして用いた。ＣＡＰ−１ペプチドは、最終濃度２５μｇ／ｍｌで、未感染またはｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ＤＣに添加した。その後、自己非付着細胞を、ＡＰＣ対エフェクター比１：１０でＡＰＣに添加した。その後、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で、３７℃で３日間、培養をインキュベーションした。その後、ペプチド含有培地を除去した後、培養に、２０単位／ｍｌの濃度で組換えヒトＩＬ−２を７日間補い、ＩＬ−２含有培地を３日ごとに補充した。ペプチドでの３日間のインキュベーションおよび７日間のＩＬ−２補充は、１つのＩＶＳ周期を構成した。初代培養を第１１日にＣＡＰ−１ペプチド（２５μｇ／ｍｌ）で再刺激し、次のＩＶＳ周期を開始した。放射線照射（２３，０００ラド）自己ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をＡＰＣとして用いた。ＣＡＰ−１ペプチドが刺激にないことを除き、ｒＦ−ＣＥＡまたはｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣをＡＰＣとして用いる場合、ＣＴＬ生成のため、同様の方法を使用した。
【０２６２】
ペプチドＭＨＣ四量体の構築
ペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ａｌｔｍａｎら（Altman, J.D.ら, Science 274(5284):94-95, 1996）に記載されるように合成した。簡潔には、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）クローンはＧａｒｂｏｃｚｉ博士（ハーバード大学、マサチューセッツ州ケンブリッジ）（Garboczi, D.N.ら, Proc Natl Acad Sci USA89(8):3429-3433, 1992）から得て、そしてＨＬＡ−Ａ２構築物はＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、フランス・マルセーユ）から得た。ＨＬＡ−Ａ２重鎖のＣＯＯＨ末端へのＢｉｒＡ依存ビオチン化のための１５アミノ酸基質ペプチドを含む可溶性ＨＬＡ−Ａ２分子およびβ２Ｍは、大腸菌中で別個に増殖させ、そして封入体として単離した。ＨＬＡ−Ａ２およびβ２Ｍを可溶化し、そしてＣＡＰ−１またはＦｌｕ−Ｍ１  ５８−６６ペプチドの存在下で再生した。複合体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上のＦＰＬＣにより精製した。精製ペプチド−ＭＨＣ複合体はＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ、コロラド州デンバー）を用いてビオチン化した。四量体は、ビオチン化ペプチド−ＭＨＣ複合体をフィコエリトリン標識ＵｌｔｒａＡｖｉｄｉｎ（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ミズーリ州ボールウィン）と、モル比４：１で混合することにより、産生した。
【０２６３】
フローサイトメトリー
染色およびＴ細胞選別（ｓｏｒｔｉｎｇ）：  フローサイトメトリー解析およびＴ細胞選別には、ＣＡＰ−１−ＭＨＣ四量体−ＰＥを用いた。四量体染色には上述のものと類似の方法を用いた。ＣＡＰ−１−ＭＨＣ四量体−ＰＥは、０．３３μｇ／２×１０５細胞の濃度で用いた。細胞は、ＣＡＰ−１  ＭＨＣ四量体−ＰＥで、４℃で１時間染色し、そしてその後、抗ＣＤ８  ＦＩＴＣでさらに１時間染色した。細胞を洗浄し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson）を用い、Ｖａｎｔａｇｅ細胞選別装置（Becton Dickinson）またはＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson）上で解析した。選別細胞を先に記載されるように培養し、そして拡大した。ＵｌｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＰＥおよびＦｌｕ−ＭＨＣ四量体で染色した細胞を、陰性コントロールとして用いた。
【０２６４】
細胞傷害アッセイ
標的細胞を、５０μＣｉの１１１インジウム標識オキシキノリン（Ｍｅｄｉ−Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｉｎｃ．、イリノイ州アーリントン）で、室温で１５分間標識した。１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地中の標的細胞（０．３×１０４）を、平底アッセイプレート（Corning Costar, Corp.）の９６ウェルの各々に添加した。エフェクター細胞を添加する前に、標識標的細胞を５％  ＣＯ２中で、３７℃で６０分間、ペプチドとインキュベーションした。癌細胞株を標的として用いる場合、いかなるペプチドも用いなかった。プールしたヒトＡＢ血清１０％を補ったＲＰＭＩ−１６４０完全培地１００μｌにエフェクター細胞を懸濁し、そして標的細胞に添加した。その後、プレートを５％  ＣＯ２中で、３７℃で４または１６時間インキュベーションした。採取フレーム（Ｓｋａｔｒｏｎ，  Ｉｎｃ．、バージニア州スターリング）を用い、ガンマ計測のため、上清を採取した。測定は３つ組で行い、そして標準偏差を計算した。特異的溶解は、以下の式（すべての値はｃｐｍ）を用い、計算した：
％溶解＝（観察放出−自発放出）／（総放出−自発放出）ｘ  １００
自発放出は、１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０完全培地を添加したウェルから測定した。総放出可能放射能は、標的を２．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００で処理した後、得た。
【０２６５】
ＨＬＡ型決定
ＨＬＡ表現型決定は、標準的抗体依存微量細胞傷害アッセイおよび明示された抗ＨＬＡ抗血清団を用い、Blood Bank of the National Institute of Healthにより、行った。Ｖ８Ｔ細胞株および患者＃１５のクラスＩ表現型は、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ２，−；Ｂ１８（Ｗ６）、４４（１２，Ｗ４）およびＨＬＡ−Ａ２，２８；Ｂ１３（ＢＷ４），Ｂ５１（ＢＷ４）；ＣＷ６であった。
【０２６６】
サイトカイン検出
ＩＬ−２不含培地中で、ｒＦ−ＣＥＡ、ｒＦ−ＣＥＡ／ＴＲＩＣＯＭに感染したＤＣまたはペプチドパルス処理未感染ＤＣおよびｒＦ−ＴＲＩＣＯＭ感染ＤＣに、多様な反応因子：刺激因子比で、２４時間曝露されたＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を用い、ＩＦＮγの分泌に関し、スクリーニングした。結果はｐｇ／ｍｌで示した。
【０２６７】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
Ｓｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎら（Scheibenbogen, C.ら, Clin Cancer Res 3(2):221-226,1997）に記載される方法の修飾法を用い、ＩＦＮγ産生を測定し、ＣＡＰ−１特異的Ｔ細胞を決定した。簡潔には、９６ウェルＭｉｌｌｉｌｉｔｅｒ  ＨＡプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を、１０μｇ／ｍｌの濃度の、ヒトＩＦＮγに対する捕捉抗体１００μｌで被覆した。室温で２４時間インキュベーションした後、１０％ヒトプールＡＢ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０でプレートを３０分間ブロッキングした。アッセイしようとする１×１０５細胞を各ウェルに添加した。ＣＡＰ−１−６Ｄパルス処理Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞をＡＰＣとして、エフェクター：ＡＰＣ比１：３で各ウェルに添加した。非パルス処理Ｃ１Ｒ−Ａ２細胞を陰性コントロールとして用いた。ＨＬＡ−Ａ２結合Ｆｌｕマトリックスペプチド５８−６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）もまた、コントロールとして用いた。反応細胞は、Ｄｏｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｏｔｐｏｍａｘ、ニューハンプシャー州ホリス）を使用し、決定した。
【０２６８】
統計解析
平均間の相違の統計解析は、両側ｔ検定を用いて行った。
【０２６９】
考察
未処理Ｔ細胞が抗原と出会った際、増殖、サイトカイン分泌、およびエフェクター細胞への分化と共に、不活性化、死、および無応答性（アネルギー）を含む、いくつかの異なる結果の可能性がある。生理学的な条件下での主な結果は、適切な補助的刺激シグナルが反応するＴ細胞に搬送されるかどうかにより決定される可能性がある（２６）。通常、プロフェッショナルＡＰＣの表面上には、少なくとも３つの異なる分子：Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３がＴ細胞活性化に必須のシグナルを提供することが可能であると考えられている。ここで、未処理Ｔ細胞活性化における補助的刺激分子の役割を、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、または３つすべての分子の組み合わせを発現するよう操作されたベクターを利用することにより、調べた。
【０２７０】
いくつかのグループが、Ｔ細胞補助的刺激におけるこれらの分子の２つの協力を調べている。Ｄｕｂｅｙらは、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１両方による補助的刺激が未処理Ｔ細胞活性化に欠くことができないと報告しており（２６）、一方、Ｃａｖａｌｌｏらは、抗腫瘍記憶反応を確立するにはＢ７−１およびＩＣＡＭ−１が腫瘍細胞により同時発現されていなければならないと決定した（２７）。さらに、Ｂ７−１およびＬＦＡ−３による補助的刺激が、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生両方に際し、付加的に作用することが示されてきている（６、２３、２４）。これらの以前の研究は、２つの補助的刺激分子およびレトロウイルスベクターを用いて行われた。１つの遺伝子を標的細胞株に形質導入し、薬剤選択し、そしてその後、第二の組換えレトロウイルス構築物を再び形質導入し、その後、異なる剤で選択した。この方法は、しばしば、何週間または何ヶ月間を要する。組換えポックスウイルスベクターを利用することにより、感染５時間後に３つの補助的刺激分子の同時発現を達成することが可能である。ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３またはｒＦ−ＣＥＡ／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３いずれかに感染したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＭＣ３８細胞は、いかなる単一の補助的刺激分子の遺伝子を含むベクターに感染したＭＣ３８細胞よりも、はるかに高い度合いで、Ｔ細胞増殖を亢進することが示された。さらに、補助的刺激分子の組み合わせによりＴ細胞に搬送される第二のシグナルの相対強度は、いかなる単一の補助的刺激分子を発現するＭＣ３８細胞により搬送されるものより、数倍（＞６倍）高いようであった。Ｄｕｂｅｙらは、Ｂ７−１およびＩＣＡＭ−１を用い、低い刺激因子対Ｔ細胞比で、中程度ないし強い相乗作用が見られることを示した（２６）。我々の研究はこれらの知見を確認する。しかし、非常に低い刺激細胞対Ｔ細胞比または弱いシグナル−１（０．６２５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｎ  Ａ）では、２遺伝子構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１）は、増殖に対しあるとしてもわずかな影響しか持たなかった；対照的に、３つ組構築物（ｒＶ−Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３）を介した刺激は、増殖に対し、実質的および統計的に有意な影響を有した。多遺伝子構築物（ｒＶ−Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３）を介した刺激の主な影響は、ＣＤ４＋細胞からのＩＬ−２同化およびＣＤ８＋細胞からのＩＦＮγ同化であり、一方、２型サイトカインは、あるとしても少量しか産生されなかった。ＲＮアーゼ保護によるサイトカイン発現解析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏサイトカインアッセイと適合したプロフィールを提供し、いかなるものでもよい単一の補助的刺激分子による刺激に比較し、すべての３つの補助的刺激分子で刺激されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞両方において、有意により高いＩＬ−２およびＩＦＮ−γ発現が示された。これらのデータは、低いＣＤ２８補助的刺激の背景で、Ｔ細胞は低レベルのＩＬ−１を産生するが、強いＣＤ２８補助的刺激は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３の産生を支持することを立証した先の研究と一致する（２８）。さらに、Ｔ細胞のＩＦＮ−γ合成の制御において、ＩＬ−１３がＩＬ−２と相乗作用することが報告され��きている（２９）。興味深いことに、我々の結果は、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３でのＣＤ４＋  Ｔ細胞の刺激が高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ発現を生じ、ＩＬ−１３のいくぶん増加した発現を生じるというこの観察を支持する。さらに、ＭＣ３８／Ｂ７−１／ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３での刺激に際し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞において、ＩＬ−９発現がさらに亢進することが注目された。我々の研究で注目された、ＩＬ−２の上方制御と関連したＩＬ−９の発現増加は、ＩＬ−９の最適産生が、ＩＬ−２により制御されることを立証した、以前の研究と一致する（３０）。総合すると、これらの結果は、最適未処理Ｔ細胞反応は、以前考えられていたよりも、より高いレベルの補助的刺激を必要とし、そしてこれは３つの補助的刺激分子を組み合わせた作用により提供することが可能であることを示唆する。
【０２７１】
おそらく、最も研究されているＴ細胞補助的刺激分子はＢ７−１である。本分子がＴ細胞活性化を亢進する能力は、レトロウイルスベクター、抗ＣＴＬＡ−４抗体、およびポックスウイルスベクターを用い、よく確立されている。ここに報告される研究は、単一の補助的刺激分子によるＴ細胞活性化の順序を、Ｂ７−１＞ＩＣＡＭ−１＞ＬＦＡ−３と段階付ける。しかし、３つの補助的刺激分子の使用は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生両方において、Ｂ７−１単独または第二の補助的刺激分子と組み合わせたＢ７より、はるかに優れていた。
【０２７２】
理論に束縛されるわけではないが、Ｂ７−１、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３の間の効率的な協力には、いくつかの可能な機構がある。ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−３相互作用は、ＴＣＲ結合により生成されるのと同じ細胞内第二メッセンジャーの増加を維持することにより、ＴＣＲが仲介するＴ細胞活性化を補助的刺激すると報告される。本観察は、ＩＣＡＭ−１によるＬＦＡ−１の結合が、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を介して搬送されるシグナルを亢進することにより、Ｔ細胞を補助的刺激することを示唆する（６）。ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は、Ｔ細胞上のＩＬ−２Ｒ−アルファ鎖およびＣＤ２８の発現を上方制御するのに必要であり、これはＴ細胞にＩＬ−２およびＢ７−１補助的刺激に反応する能力を与えるのに必要である。一方、Ｂ７−１／ＣＤ２８相互作用は、ＩＬ−２および他の免疫制御リンホカインの発現を転写的におよび転写後的に増加させる、ＴＣＲ独立補助的刺激シグナルを搬送する。ＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用は、いくつかの細胞内第二メッセンジャーのチロシンリン酸化、Ｃａ２＋動員、およびｃＡＭＰ産生を誘導し、多様なサイトカイン、特にＩＬ−２およびＩＦＮ−γの同化を生じる（６）。したがって、３つの補助的刺激分子は、Ｔ細胞の抗原依存活性化と共に、オートクリンおよびパラクリン増殖因子の産生および該増殖因子に対する反応を亢進することにより、協力する可能性があるようである。
【０２７３】
結論として、本発明は、初めて、３つまたはそれ以上の補助的刺激分子を細胞に導入し、そしてＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞集団両方を、これらの補助的刺激分子の１つまたは２つを用いた場合達成されるものより、はるかに高いレベルに、迅速にそして効率的に活性化するベクターの能力を立証する。Ｔ細胞活性化のこの新たな閾値はワクチン設計および開発に広い関連を有する。
【０２７４】
ＤＣに対する３つ組の補助的刺激分子の影響は、完全に期待されないものであった。ＤＣは、当業者に最も強力なＡＰＣとして知られる。本発明に示されるデータは、ＤＣを「Ｔｒｉｃｏｍ」ベクターに感染させた際、Ｔ細胞を活性化するその能力が劇的に増加することを立証する。これらの研究は、ＤＣが最も強力なＡＰＣではないことを初めて立証する。
【０２７５】
参考文献
1.  Hellstrom, K. E., Chen, L. & Hellstrom, I. (1996) Cancer Chemother Pharmacol 38, S40-1.
2.  Damle, N. K., Klussman, K., Linsley, P. S. & Aruffo, A. (1992) J Immunol 148, 1985-92.
3.  Green, J. M., Zheng, X. G., Shimizu, Y., Thompson, C. B. & Turka, L. A. (1994) Eur J Immunol 24, 265-72.
4.  Guinan, E. C., Gribben, J. G., Boussiotis, V. A., Freeman, G. J. & Nadler, L. M. (1994) Blood 84, 3261-82.
5.  Hodge, J. W., McLaughlin, J. P., Abrams, S. I., Shupert, W. L., Schlom, J. & Kantor, J. A. (1995) Cancer Res 55, 3598-603.
6.  Wingren, A. G., Parra, E., Varga, M., Kalland, T., Sjogren, H. O., Hedlund, G. & Dohlsten, M. (1995) Crit Rev Immunol 15, 235-53.
7.  Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Sjogren, H. O., Kalland, T., Sansom, D. & Dohlsten, M. (1993) Scand J Immunol 38, 508-14.
8.  Harding, F. A. & Allison, J. P. (1993) J Exp Med 177, 1791-6. 
9.  Hellstrom, K. E., Hellstrom, I., Linsley, P. & Chen, L. (1993) Ann N Y Acad Sci 690, 225-30.
10. Hodge, J. W., Abrams, S., Schlom, J. & Kantor, J. A. (1994) Cancer Res 54, 5552-5.
11. Uzendoski, K., Kantor, J. A., Abrams, S. I., Schlom, J. & Hodge, J. W. (1997) Hum Gene Ther 8, 851-60.
12. Lorenz, M. G. O., Kantor, J. A., Schlom, J. & Hodge, J. W. (1998) Human Gene Therapy In Press.
13. Gritz, L., Destree, A., Cormier, N., Day, E., Stallard, V., Caiazzo, T., Mazzara, G. & Panicali, D. (1990) J Virol 64, 5948-57.
14. Mazzara, G. P., Destree, A. & Mahr, A. (1993) Methods Enzymol 217, 557-81.
15. Jenkins, S., Gritz, L., Fedor, C. H., O'Neill, E. M., Cohen, L. K. & Panicali, D. L. (1991) AIDS Res Hum Retroviruses 7, 991-8. 
16. Chakrabarti, S., Sisler, J. R. & Moss, B. (1997) BioTechniques 23, 1094-7. 
17. Perkus, M. E., Piccini, A., Lipinskas, B. R. & Paoletti, E. (1985) Science 229, 9814. 
18. Schmitt, J. F. & Stunnenberg, H. G. (1988) J Virol 62, 1889-97. 
19. Venkatesan, S., Baroudy, B. M. & Moss, B. (1981) Cell 25, 805-13. 
20. Fox, B. A., Spiess, P. J., Kasid, A., Puri, R., Mule, J. J., Weber, J. S. & Rosenberg, S. A. (1990) J Biol Response Mod 9, 499-511. 
21. Abrams, S. I., Dobrzanski, M. J., Wells, D. T., Stanziale, S. F., Zaremba, S., Masuelli, L., Kantor, J. A., Schlom, J. & Masuelle, L. (1995) Eur J Immunol 25, 2588-97. 
22. Sabzevari, H., Propp, S., Kono, D. H. & Theofilopoulos, A. N. (1997) Eur J Immunol 27, 1901-10. 
23. Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Bjorklund, M., Sjogren, H. O., Kalland, T., Sansom, D. & Dohlsten, M. (1994) J Immunol 153, 2479-87. 
24. Parra, E., Wingren, A. G., Hedlund, G., Kalland, T. & Dohlsten, M. (1997) J Immunol 158, 637-42. 
25. Sperling, A. I., Auger, J. A., Ehst, B. D., Rulifson, I. C., Thompson, C. B. & Bluestone, J. A. (1996) J Immunol 157, 3909-17. 
26. Dubey, C., Croft, M. & Swain, S. L. (1995) J Immunol 155, 45-57. 
27. Cavallo, F., Martin-Fontecha, A., Bellone, M., Heltai, S., Gatti, E., Tornaghi, P., Freschi, M., Forni, G., Dellabona, P. & Casorati, G. (1995) Eur J Immunol 25, 1154-62. 
28. Delespesse, G., Yang, L. P., Ohshima, Y., Demeure, C., Shu, U., Byun, D. G. & Sarfati, M. (1998) Vaccine 16, 1415-9.
29. Minty, A., Chalon, P., Derocq, J. M., Dumont, X., Guillemot, J. C., Kaghad, M., Labit, C., Leplatois, P., Liauzun, P., Miloux, B. & et al. (1993) Nature 362, 248-50.
30. Schmitt, E., Germann, T., Goedert, S., Hoehn, P., Huels, C., Koelsch, S., Kuhn, R., Muller, W., Palm, N. & Rude, E. (1994) J Immunol 153, 3989-96. 
31. Chakrabarti, S., Brechling, K. and Moss, B (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409. 
32. Chakrabarti, S., Sisler, J.R., and Moss, B. (1997) BioTechniques 23:1094-1097. 
33. Gillard, S., Spehner, D., Drillien, R., and Kirn, A. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5573-5577. 
34. Morgan, J.R, and Roberts, B.E. (1994) J. Virol. 51:283-297. 
35. Panicali, D., Grzelecki, A., and Huang, C. (1986) Gene 47:193-199. 
36. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., eds. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 
37. Schmitt, J.F.C. and Stunnenberg, H.G. 1988) J. Virol. 62:1889-1897. 
38. Smith, K., Stallard, V., Ross, J., Hart, C., Cormier, N., Cohen, L., Roberts, B., and Payne, L. (1993) Vaccine 11:43-53. 
39. Venkatesan, S., Baroudy, B.M., and Moss, B. (1981) Cell 125:805-813. 
40. Bacchetti, S. and Graham, F.L. Proc. Nat'l. Acid. Sci. USA 74:1590-1594, 1977.
41. Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S. & Steinman, R.M. (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-702. 
42. Sallusto, F. & Lanzavecchia, A. (1994) J. Exp. Med. 179, 1109-8. 
43. Fields, R.C., Osterholzer, J. J., Fuller, J.A., Thomas, E.K., Geraghty, P.J. & Mule, J.J. (1998) J. Immunother. 21, 323-39. 
44. Zaremba et al Cancer Res. 57:4570-4577, 1997. 
45. Gong, J. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6279-6283, 1998.
46. Correale, P. et al 1998,J Immunol. 161(6):3186-94.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２９Ａ】
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