(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）及び／又は（２）の配列で表され、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩からなる、ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂと、その基質タンパク質インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）との結合を阻害するユビキチンリガーゼ阻害剤。
（１）Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）
（２）Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）
【請求項２】
以下の（１）及び／又は（２）の配列のペプチドの一部又は全部と空間的に同等な化合物又はその塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質からなる請求項１記載のユビキチンリガーゼ阻害剤。
（１） Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）
（２） Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）
【請求項３】
以下の（１）又は（２）の配列で表され、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩。
（１）Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）
（２）Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチンリガーゼの阻害作用に基づいた筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの予防・治療に有効なペプチド、又はユビキチンリガーゼ阻害剤や、筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの治療及び／又は予防剤、並びに予防及び／又は症状改善用食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
長期間宇宙に滞在した宇宙飛行士の骨格筋は、期間後自力で立てなくなるほど萎縮する。このような、いわゆる「廃用性筋・骨萎縮」と呼ばれる疾患は、骨折により寝たきり状態になった高齢者の患者にも見られ、筋肉を使わない状態が持続する場合に、筋肉の大きさが減少し、筋力低下することで引き起こされる。筋・骨萎縮を防ぐことは、今後人類が宇宙開発を進める上においても、高齢化社会を迎える我が国においても、必ず解決しなければならない重要な課題である。
【０００３】
上記廃用性筋・骨萎縮に対しては、ポリフェノールが抑制効果を奏するという知見に基づき、バラ科に属する果実、特にリンゴ、ナシ、モモの未熟果実の搾汁果汁、抽出液より精製されたポリフェノール画分からなる果実ポリフェノールを有効成分として含有することを特徴とする筋萎縮抑制組成物および廃用性筋萎縮時の骨重量および骨塩量低下抑制組成物等が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
近年、このような廃用性筋・骨萎縮や神経筋変性疾患において、ユビキチン／プロテアソーム系蛋白質分解経路が重要な働きをしていることが明らかにされてきた（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照。）。廃用性筋萎縮発症のメカニズムとしては、筋肉を使わない状態が続くことにより、ミオシン等の筋肉を構成するタンパク質が、ユビキチン／プロテアソーム系分解経路において分解を受ける結果、筋肉の大きさが減少するものと考えられている。
【０００５】
前記ユビキチンとは、真核生物に普遍的に存在する、アミノ酸７６個からなるタンパク質で、ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系において、分解するタンパク質（標的タンパク質）を標識する役割を持つものである。ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系では、ポリユビキチン鎖が標的タンパク質を標識する役割を果たす。ポリユビキチン鎖は、ユビキチンが多数枝状に結合したもので、標的タンパク質の特定部位に結合する。標的タンパク質にポリユビキチン鎖が結合していると、２６Ｓプロテアソームが標的タンパク質を認識して、標的タンパク質を分解する。
【０００６】
また、プロテアソームとは、核及び細胞質に局在する高分子のプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）で、２８個のサブユニットからなる分子量７０〜８０万のタンパク質である。プロテアソームの両端にそれぞれＰＡ７０（活性化因子）が結合した「２６Ｓプロテアソーム」は、ＡＴＰ依存的に、タンパク質を分解する機能を持ち、ユビキチン／プロテアソームタンパク質分解系の中心的な役割を担っている。２６Ｓプロテアソームは、ポリユビキチン化（ポリユビキチン鎖によって修飾）されたタンパク質を選択的に分解する（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００７】
上記のように、ユビキチン／プロテアソーム系蛋白質分解経路を制御することはこれら廃用性筋・骨萎縮や神経筋変性疾患の治療につながると考えられることから、プロテアソームとＺＮＦ２１６（又は、ＡＷＰ１）との間や、ポリユビキチン鎖とＺＮＦ２１６（又はＡＷＰ１）との間の新規なタンパク質間相互作用を利用して、廃用性筋萎縮の治療剤、及び、廃用性筋萎縮治療剤のスクリーニング方法、疾病診断用マーカー、発症リスク評価方法（例えば、特許文献２参照。）や、脱ユビキチン化活性を有する新規ユビキチン特異プロテアーゼ（ＵＳＰ：Ubiquitin specific protease）、およびこれに由来するポリペプチドまたはペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドまたはペプチドに対する抗体、新規ＵＳＰの生理活性の阻害剤、拮抗剤、賦活剤、これらを利用した医薬組成物、並びに遺伝子工学手法による該ポリペプチドまたはペプチドの製造法、上記阻害剤、拮抗剤、賦活剤の同定方法、新規ＵＳＰが関連するアルツハイマー病やパーキンソン病神経変性疾患等の疾病の診断のための方法およびキット（例えば、特許文献３参照。）等が提案されている。
【０００８】
しかしながら、ユビキチンリガーゼの阻害剤はこれまで全く報告されておらず、上記のようなユビキチン化後の脱ユビキチン化促進剤や、分解の最終段階であるプロテアソームの活性を抑制するしか手段がなく、特に、プロテアソームの阻害剤は非常に毒性が強いため、癌の末期などの治療薬としてしか実用化されていない。それに対し、本特許のペプチドによるユビキチンリガーゼの阻害は基質選択性が高く、副作用が小さく、有用な食品成分としても期待されている。また、ユビキチンリガーゼ阻害ペプチドのアミノ酸配列は阻害剤の立体構造を構築するうえで非常に有効な知見となる。
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−８９３８７
【特許文献２】特開２００５−１７０７９６
【特許文献３】特願２００２−２８７０３９
【非特許文献１】Gomes et al“ Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，Vol.98,No.25,pp14440-14445
【非特許文献２】Bodine et al“Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy”，Science，2001，Vol.294,pp.1704-1708
【非特許文献３】実験医学，羊土社，２００３年２月，第２１巻，第３号，ｐ．３３０−３３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、廃用性筋・骨萎縮を予防することを目的とし、ユビキチンリガーゼによるＩＲＳ−１のユビキチン化阻害作用を有する廃用性筋・骨萎縮の予防・治療に有効なペプチドや、ユビキチンリガーゼ阻害剤を提供することにある。また、インスリン受容体基質−１(ＩＲＳ−１；Insulin Receptor Substrate-1) はインスリンのシグナル伝達の重要な因子であり、そのユビキチン化及びそれに引き続く分解を抑制することは、インスリンに対する感受性を高め、インスリンに対する抵抗性を改善することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、１９９８年に打ち上げられたスペースシャトルによる実験で、無重力により萎縮したネズミの骨格筋では特殊な蛋白質分解経路（ユビキチン−プロテアソーム経路）だけが活性化することを発見した。この蛋白質分解経路は分解しようとする蛋白質をユビキチンというペプチドで標識する（ユビキチン化）という特徴があり、この宇宙フライトネズミの骨格筋でも多くの蛋白質がユビキチン化され分解されていることが明らかにされた（FASEB J Express Article doi:10.1096/fj.03-0419fje Published online January 8, 2004）。また、その宇宙サンプルをＤＮＡ microarrayとDifferential display法で解析した結果、筋肉細胞や骨芽細胞の活性化因子であるインスリンやインスリン様増殖因子の重要な細胞内情報伝達分子であるＩＲＳ−１を特異的にユビキチン化させる、Ｃｂｌ−ｂ（Casitus B lineage lymphoma-b）と呼ばれるユビキチンリガーゼの発現が宇宙フライトにより約１０倍に上昇することを見い出し、Ｃｂｌ−ｂによる増殖因子の細胞内伝達分子のユビキチン化と分解の亢進が、無重力による筋・骨萎縮の重要な病因であることを明らかにした。
【００１２】
そこで、本発明者らは、多くのオリゴペプチドを合成し、スクリーニングを行った結果、Ｃｂｌ−ｂによるＩＲＳ−１のユビキチン化を競合阻害するペンタマーペプチド(アミノ酸が５個結合したオリゴペプチド)を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、（１）（１）Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）及び／又は（２）Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）の配列で表され、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩からなる、ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂと、その基質タンパク質インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）との結合を阻害するユビキチンリガーゼ阻害剤や、（２）（１）Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）及び／又は（２）Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）の配列のペプチドの一部又は全部と空間的に同等な化合物又はその塩からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質からなる上記（１）記載のユビキチンリガーゼ阻害剤に関する。
【００１５】
さらに本発明は、（３）（１）Asp-Gly-Tyr-Met-Pro（配列番号１）又は（２）Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp（配列番号２）の配列で表され、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、情報伝達物質であるＩＲＳ−１のユビキチン化を抑制するペプチド等からなるユビキチンリガーゼ阻害剤に関する。特に、ペプチドはほとんど副作用が無いとされており、食事としても応用可能であることから、薬剤や食事（宇宙食）を開発することができ、無重力による筋萎縮を防ぐ重要な手段になることを示している。これらの成果は高齢化社会のわが国の社会問題でもある寝たきりによる筋萎縮の予防や、廃用性筋・骨萎縮、糖尿病の治療及び／又は予防剤への応用も期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の新規ペプチドとしては、配列表の配列番号１（Asp-Gly-Tyr-Met-Pro）、又は配列番号２（Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp）に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩であれば特に制限されず、本発明の新規ペプチドはユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂ阻害活性を有する。本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではないが、ユビキチンリガーゼ阻害活性を損なわないものが好ましく、具体的には、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの塩類を例示することができる。
【００１８】
また、本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤としては、ユビキチンリガーゼとその基質タンパク質との結合を阻害するものであれば特に制限されず、上記ユビキチンリガーゼとしてはユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂを、上記基質タンパク質としてはインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）をそれぞれ好適に例示することができる。本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤として、より具体的には、以下のペプチド等の化合物を例示することができる。
【００１９】
配列表の配列番号１（Asp-Gly-Tyr-Met-Pro）に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩；前記ペプチドの少なくとも１個（ただし、チロシン残基は除く）のアミノ酸の置換体、好ましくは１〜２個のアミノ酸の置換体、より好ましくは１個のアミノ酸の置換体、又はその塩；前記ペプチドを活性ドメインとして有するタンパク質等の化合物又はその塩；配列番号１に示されるアミノ酸配列の一部又は全部と空間的に同等な化合物（三次元立体配置が同等な化合物）やその塩；配列表の配列番号２（Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp）に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩；前記ペプチドの少なくとも１個（ただし、チロシン残基は除く）のアミノ酸の置換体、好ましくは１〜２個のアミノ酸の置換体、より好ましくは１個のアミノ酸の置換体、又はその塩；前記ペプチドを活性ドメインとして有するタンパク質等の化合物又はその塩；配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部又は全部と空間的に同等な化合物（三次元立体配置が同等な化合物）やその塩；からなる群から選ばれる少なくとも一種の物質であり、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン残基がリン酸化されているペプチドと、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン残基がリン酸化されているペプチドの混合物であってもよい。
【００２０】
また、かかる本発明のペプチドは、アミノ酸の配列情報に基づき、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。固相法によるペプチドの製造は、例えばアプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａ装置を用い、ポリマー性の固相支持体へ合成しようとするペプチドのカルボキシル末端側からＬ体アミノ酸を順次ペプチド結合により延長させて目的とするペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切り出し、次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーなどの方法で精製し、目的とするペプチドを得ることにより行うことができる。
【００２１】
上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸やペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばTyrの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に例えばArgのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。
【００２２】
前記ペプチドの少なくとも１個（ただし、チロシン残基は除く）のアミノ酸の置換体、すなわち、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは、ユビキチンリガーゼとその基質タンパク質との結合を阻害する活性を有するものであり、当該アミノ酸配列情報や当該アミノ酸をコードする塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
【００２３】
本発明のペプチドには、必要に応じて、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグを結合させ、融合ペプチドとすることができる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合ペプチドは、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のペプチドの精製や、本発明のペプチドの検出や、本発明のペプチドに対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２４】
本発明のペプチド又はその塩、あるいは本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤、好ましくはＣｂｌ−ｂ阻害剤は、廃用性筋・骨萎縮、廃用性以外の筋萎縮、インスリン抵抗性に起因する疾患、例えば糖尿病の予防治療剤として用いることができるほか、健常者における筋疲労低減や筋肉増強、骨萎縮改善（骨粗しょう症改善）、運動器（骨と筋肉を同時に）機能の改善、寝たきり防止薬に用いることができる。また、廃用性筋・骨萎縮、廃用性以外の筋萎縮、インスリン抵抗性に起因する疾患、例えば糖尿病の予防及び／又は症状改善用食品として用いることができほか、健常者における筋疲労低減や筋肉増強、骨萎縮改善（骨粗しょう症改善）、運動器（骨と筋肉を同時に）機能の改善、寝たきり防止に有用な機能性食品として用いることができる。廃用性筋・骨萎縮や糖尿病等の予防・治療剤や、廃用性筋・骨萎縮や糖尿病等の予防及び／又は症状改善用食品として用いる場合、本発明のペプチド又はその塩、あるいは本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤、好ましくはＣｂｌ−ｂ阻害剤に、アルカリホスファターゼ阻害剤を併用することが好ましい。かかるアルカリホスファターゼ阻害剤としては、公知のものや市販品を用いることができ、オウレン、オウバク（Nat. Med., 48, 165（1994））、ボウイ、キョウニン、商陸、ヨクイニン及びカンショウ（東北薬科大学研究年報、４１、１４９（１９９４））や、ブロモテラミゾール（ＢＴＯ）を例示することができる。
【００２５】
本発明の筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの予防・治療剤としては、上記配列表の配列番号１（Asp-Gly-Tyr-Met-Pro）、又は配列番号２（Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp）に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩、あるいは本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤、好ましくはＣｂｌ−ｂ阻害剤を有効成分として含むものであれば特に制限されず、例えば、これらペプチドを２種を混合して用いてもよい。これらの予防・治療剤を医薬用の治療・予防剤として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができ、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射剤として非経口投与することができる。
【００２６】
また、本発明の筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの予防及び／又は症状改善用食品としては、上記配列表の配列番号１（Asp-Gly-Tyr-Met-Pro）、又は配列番号２（Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp）に示されるアミノ酸配列からなり、かつチロシン（Tyr）残基がリン酸化されているペプチド又はその塩、あるいは本発明のユビキチンリガーゼ阻害剤、好ましくはＣｂｌ−ｂ阻害剤を有効成分として含むものであれば特に制限されず、これらペプチドを２種を混合して用いてもよい。上記食品又は食品素材としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合して食品として使用することができる。なお、筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの予防・治療用とは、包装容器や説明書に、筋萎縮・骨萎縮、骨粗鬆症、筋肉疲労、筋肉低減、運動機能低下、糖尿病、インスリン抵抗性症候群若しくは寝たきりの予防や治療に有効である旨表示されている場合などを意味する。
【００２７】
以下に、本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
［１．オリゴペプチドのデザイン］
ユビキチンリガーゼＣｂｌ−ｂは、リン酸化されたチロシンを認識するドメインを有するので、基質ＩＲＳ−１のリン酸チロシン部位をコンピューターサーチした（図１）。その結果、Ｃｂｌ−ｂとＩＲＳ−１が結合しうる有力な６箇所のペンタペプチド（全６種類：配列番号１〜６）をRainin社製ペプチド合成機「Symphony」を用いて化学合成した(図２)。
【００２９】
［２．Cell-free Ubiquitination系の構築］
Ｃｂｌ−ｂによるＩＲＳ−１のユビキチン化を試験内で再構築した。Ｃｂｌ−ｂ発現ベクターは、Dr. S. Lipkowitzから提供されたプラスミドベクターpCEFL-Cbl-b-HA（Oncogene. 1995 Jun 15;10(12):2367-77.）を、制限酵素HindIII／KpnIで処理することによって得られるフラグメントを更にthe cytomegalovirus immediate early enhancer-chicken b-globin hybrid (CAG) promoterを含む発現ベクター（Biochem Biophys Res Commun 237(2):318-24、1997）にサブクローニングして使用した。また、ＩＲＳ−１の発現ベクターはBiochem Biophys Res Commun. 1995 Nov 2;216(1):321-8に記載のものを使用した。
Ｈｅｃｋ２９３細胞を直径１０ｃｍのディッシュ２枚に培養した。それぞれにＣｂｌ−ｂとＩＲＳ−１の遺伝子を含むプラスミドを強発現し、それぞれの抗体による免疫沈降で精製し、それらとオリゴペプチドを表１に示す反応系で３７℃、４時間反応させた。５０ｍｌの反応液に対して２５ｍｌの反応停止液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ,ｐＨ７．５, containing ８％ＳＤＳ, ２０％ 2-mercaptoethanol, ２０％ glycerol and ０．０２％ＢＰＢ)を加えて反応を停止した。全量をＳＤＳ-５％-ＰＡＧＥに供し、anti-ＩＲＳ-１抗体(Calbiochem社製)でWestern blottingを行った。
【００３０】
【表１】
0005113348.tif 000002
【００３１】
［３．結果］
上記Cell-free Ubiquitination系を用いて、Ｃｂｌ−ｂがＩＲＳ−１のユビキチン化を促進するか否かにつき検討した。その結果、Ｃｂｌ−ｂによりＩＲＳ−１のユビキチン化が有意に促進されることが明らかになった（図３）。また、同様の手法により、合成したオリゴペプチドのＩＲＳ−１ユビキチン化阻害効果を検討したところ、合成オリゴペプチドのうち、Ｎｏ．４２（配列番号１：Asp-Gly-Tyr-Met-Pro）とＮｏ．４５（配列番号２：Leu-Asn-Tyr-Ile-Asp）のみがＩＲＳ−１のユビキチン化を有意に阻害していた（図４）。
【００３２】
さらに、アルカリホスファターゼ阻害剤（Sigma社製：Posphatase inhibitor cocktail-II）がそのユビキチン化阻害活性に与える影響につき検討したところ、アルカリホスファターゼ阻害剤を添加しない場合にはその活性が消失した(図５)。このことから、合成オリゴペプチドがユビキチン化阻害活性を発現するためには、合成オリゴペプチド内のチロシン残基のリン酸化が必須であることが示唆された。
【００３３】
［４．まとめ］
以上のことから、基質とよく似た構造をもった合成オリゴペプチドは、ユビキチンリガーゼであるＣｂｌ−ｂと基質であるＩＲＳ−１の結合自体を阻害するか、あるいは基質のおとりとなってその結合を競合的に阻害することにより、ＩＲＳ−１のユビキチン化阻害能を示すことが明らかになった(図６)。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ＩＲＳ−１のアミノ酸配列のうち、リン酸チロシン部位をコンピューターサーチした結果を示した図である。
【図２】Ｃｂｌ−ｂユビキチンリガーゼに対する阻害効果を検討したペプチド群を示した図である。
【図３】Cell-free Ubiquitination系を用いてＣｂｌ−ｂがＩＲＳ−１のユビキチン化を促進するか否か検討した結果を示した図である。
【図４】Cell-free Ubiquitination系を用いて、合成したオリゴペプチドのＩＲＳ−１ユビキチン化阻害効果を検討した結果を示した図である。
【図５】Cell-free Ubiquitination系を用いて、ＡＬＰ inhibitor非存在下で、合成したオリゴペプチドのＩＲＳ−１ユビキチン化阻害効果を検討した結果を示した図である。
【図６】本発明のオリゴペプチドがＩＲＳ−１のユビキチン化阻害効果を発症するメカニズムを示したモデル図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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