(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードする精製された核酸分子であって、
（ａ）配列番号２及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、
（ｂ）配列番号２または５をコードする第２の核酸分子の相補体と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子、または
（ｃ）配列番号１、３または４に示す第２の核酸分子の相補体と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子を含む核酸分子。
【請求項２】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質であって、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
【請求項３】
組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、組換えＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓチャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項６】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号１に示すヌクレオチド配列からなる精製されたＤＮＡ分子。
【請求項７】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号１に示すヌクレオチド配列の１７０位ヌクレオチドから１３６３位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項８】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号３に示すヌクレオチド配列からなる精製されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号３に示すヌクレオチド配列の３２位ヌクレオチドから１２２５位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項１０】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質であって、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする精製された核酸分子。
【請求項１１】
組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を発現する発現ベクターであって、請求項１０に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、組換えＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
組換え宿主細胞において、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を発現する方法であって、
（ａ）請求項１１に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞中にトランスフェクトすること、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項１４】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号４に示すヌクレオチド配列からなる精製されたＤＮＡ分子。
【請求項１５】
リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質をコードし、配列番号４に示すヌクレオチド配列の４７位ヌクレオチドから１３１５位ヌクレオチドまでのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。
【請求項１６】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質。
【請求項１７】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項１６に記載の、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組換え宿主細胞から精製された、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項１９】
他のタンパク質を実質的に含まず、配列番号５に示すアミノ酸配列を含む、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質。
【請求項２０】
組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物である請求項１９に記載の、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組換え宿主細胞から精製された、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質を含む実質的に純粋な膜調製物。
【請求項２２】
配列番号２および配列番号５に示す各アミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示す、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのチャネルタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０００年３月３１日出願の暫定的米国特許出願第６０／１９３，９３５号の優先権を主張する。
【０００２】
米国政府支援研究開発に関する申立て
該当せず。
【０００３】
マイクロフィッシュ補遺の参照
該当せず。
【０００４】
発明の分野
本発明は、部分的に、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（アメリカイヌマダニ）のリガンド依存性塩素イオンチャネルをコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。また、本発明は、ショウジョウバエのリガンド依存性イオンチャネルをコードするＤＮＡ断片を含む組換えベクターおよび組換え宿主、関連するＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓリガンド依存性塩素イオンチャネルおよびこれらのタンパク質を含む組換え膜分画の実質的に純粋な形態、関連する突然変異タンパク質、および関連するＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓリガンド依存性塩素イオンチャネルを調節し、殺虫剤および殺ダニ剤として有用と思われる化合物の同定に関わる方法にも関する。
【０００５】
発明の背景
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル、またはＨ受容体は、節足動物の神経および筋肉において同定された（Ｌｉｎｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ、１９８１、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２１２：４８１−４８８；Ｈｏｒｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８５：６５−７０；Ｗａｆｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｌｌｅ、１９８９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．１４４：４４９−４６２；Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｕｓｈｅｒｗｏｏｄ、１９７３、Ｃｏｍｐ．Ｇｅｎ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．４：３３３−３５０；およびＣｕｌｌ−Ｃａｎｄｙ、１９７６、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５５：４４９−４６４）。
【０００６】
無脊椎動物のグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、汎用されているアベルメクチン群の駆虫性および殺虫性化合物にとって重要な標的である。アベルメクチン類は、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓから最初に分離された大環ラクトンの一群である。半合成アベルメクチン誘導体のイベルメクチン（２２，２３−ジヒドロアベルメクチン  Ｂ１ａ）は、人間や動物の寄生虫および害虫を処理するために、世界中で使用されている。アベルメクチン類は、今尚、宿主に対して低毒性の最も有効な広範囲殺風土病虫剤である。多年にわたる野外使用の後でも、昆虫集団の中にアベルメクチンに対する耐性は殆ど残らない。良好な治療指数と低い耐性が相俟って、リガンド依存性イオンチャネル、および特にグルタミン酸依存性塩素イオン（ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ）チャネルは依然として殺虫剤開発の良い標的であることが、強く示唆される。
【０００７】
グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルは、土壌線虫のＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７１：７０７−７１１；米国特許第５５２７７０３号およびＡｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１５：３３９−３４８も参照されたい）およびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ（ノミ；国際公開第９９／０７８２８号を参照されたい）からクローニングされた。
【０００８】
その上、ショウジョウバエ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから得られるグルタミン酸依存性塩素イオンチャネルをコードする遺伝子が、以前に同定された（Ｃｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０１８７−２０１９１；米国特許第５６９３４９２号も参照されたい）。
【０００９】
Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（アメリカイヌマダニ）は、米国の大部分の土地に原産し、家畜、シカ、イヌ、ヒトおよび小哺乳類の公知の一般的宿主を有する。このダニは、ロッキー山紅斑熱、バベシア症、ダニ麻痺、アナプラスマ症、ツラレミアおよびサイトークスゾーン症を含む様々な疾患に関与している。
【００１０】
非ダニ性ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルをコードする前記ｃＤＮＡが同定されてはいたが、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルをコードする他の遺伝子を同定し、その結果、動物の健康、特に家畜およびイヌやネコ等の馴化動物に外寄生するマダニの処置に関わる殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性を有し得る、新規なＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための、改良されたスクリーニングを可能とする場合に有利であると思われる。本発明は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする新規な遺伝子であって、アフリカツメガエル卵母細胞において発現されると、機能性のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを形成する遺伝子を開示することによって、これらの必要性に対処し、それを満足させる。本発明のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの異種発現によって、動物および人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物、特にＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓに直接関係するマダニの外寄生の処置における化合物の薬理学的分析が可能になると思われる。活性なＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【００１１】
発明の概要
本発明は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を含むが、必ずしもそれに限らないＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ（アメリカイヌマダニ）の新規な無脊椎動物ＬＧＩＣチャネルタンパク質をコードする分離または精製された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、トランスフェクトされたその宿主細胞は、単一の発現した機能性のホモ多量体またはヘテロ多量体のＬＧＩＣの実質的な量の供給源となる。このような機能性のリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドが、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性、ダニ駆虫性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための他のスクリーニング標的を提供すると思われる。
【００１２】
更に、本発明は、新規なＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号６と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
また、本発明は、新規なＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、４および６の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片または突然変異体は、配列番号２、配列番号５および配列番号７に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を含むが、それらに限らない各Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の薬理学的性質を、少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能性のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを発現するｍＲＮＡをコードすることによって、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限るものではない。
【００１４】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規な形態のＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする図１（配列番号１；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １と命名）、図３（配列番号３；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１と命名）、図４（配列番号４；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１と命名）および図６（配列番号６；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２と命名）に開示されている。
【００１５】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００１６】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主細胞にも関している。
【００１７】
また、本発明は、図２（配列番号２）、図５（配列番号５）および図７（配列番号７）に開示したアミノ酸配列を含んだＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の実質的に精製された形態にも一部関連している。
【００１８】
本発明のこの部分の好ましい態様は、図２（配列番号２）、図５（配列番号５）および図７（配列番号７）に開示したアミノ酸配列からなるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質である。
【００１９】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、４および／または６に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各タンパク質のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ前駆体または成熟形を発現するＤＮＡ発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、（任意のタンパク質分解処理、グリコシル化および／またはリン酸化を含めて）十分に処理された成熟ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００２０】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、４および／または６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能体態の各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または細胞溶解物に関する。（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換またはトランスフェクションの安定な細胞および一時的な細胞の）組換え宿主細胞から得た細胞内膜分画および／または膜含有細胞溶解物は、本発明の核酸によってコードされ、機能的でプロセシングされたタンパク質を含んでいる。組換え体に基づくこの膜調製物は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを含む可能性があり、かつＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １（配列番号２）、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１（やはり配列番号２）、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（配列番号５）および／またはＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（配列番号７）のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を発現する組換え細胞から得られる他のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ起源タンパク質や宿主タンパク質を含むが、これらのタンパク質に限らない汚染性タンパク質を本質的に含んでいない。したがって、本発明の好ましい一態様は、図２（配列番号２のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １とＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１）、図５（配列番号５のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１）および／または図７（配列番号７のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２）に開示したＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の機能体を含むＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を含んだＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを含んでいる膜調製物である。これらの細胞内膜分画は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの生物学的機能体である野生型または突然変異型の変異を含むと思われる。本明細書に開示したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の任意の機能的単一チャネル、ホモ多量体またはヘテロ多量体の組合せは、内在量より実質的に多量にあると予想され、したがって本明細書を通して記載される様々な試験において有用と思われる。また、開示したチャネルタンパク質が、単独または組合せにより、未だ同定されていないチャネルタンパク質を有する機能性のヘテロ多量体チャネルを形成することも可能である。本発明のグルタミン酸依存性チャネルを発現するために選択される好ましい真核宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞等の昆虫系細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞である。
【００２１】
また、本発明は、配列番号２、５および／または７に示したアミノ酸配列を含むＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、かつＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの薬理作用に対する作動薬および／または拮抗薬を含むが、それらに限らない選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらに限らない変異を含んだものにも関する。
【００２２】
本発明の好ましい一態様は、本発明のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を各々含む各アミノ酸配列に関して、図２（配列番号２）、図５（配列番号５）および図７（配列番号７）に開示されている。これらのチャネルタンパク質の１個または複数を特定することによって、動物の健康、人間の健康および／または作物保護のために殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性を有し得る新規なＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するためのスクリーニング法が可能となる。前記のように、本明細書に開示するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の１種または組合せからなる、機能性の単一チャネル、ホモ多量体またはヘテロ多量体チャネルの異種発現は、内在量より実質的に多量であると予想され、その発現によって、動物や人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性な化合物一般、ならびに様々な寄生種の外寄生を抑制するのに有用となり得るＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ特異的モジュレーターの候補物質の薬理分析が可能になると思われる。機能性のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル（例えば、配列番号２、５および／または７の機能体）を発現する異種細胞系を、前記の生物種群の抑制に有用となり得る新規なＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルモジュレーターを同定するための機能試験または結合試験を確立するために、使用することができる。
【００２３】
本発明は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの開示形、またはその生物活性な断片に反応して増加するポリクローナルおよびモノクローナル抗体にも関する。
【００２４】
また、本発明は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質質）、ＭＹＣエピトープ、およびＦＣを含むが、これらに限らない様々な標識に結合したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの一部を発現する融合構築体を含むが、これらに限られることのないＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ融合構築体にも関する。このような任意の融合構築体を、関心のある細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の１種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００２５】
本発明は、本明細書に開示するＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質および生物学的等価物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いた試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含んだ組換え宿主細胞、およびこれらの試験によって同定され、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性の作動薬または拮抗薬として作用する化合物に関する。
【００２６】
本発明の一目的は、配列番号２、５および７で各々示したタンパク質である、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの新規な形態、あるいはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの断片、突然変異体または誘導体、これらのタンパク質をコードする分離核酸分子（例えば、配列番号１、３、４および６）を提供することである。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を発現するｍＲＮＡをコードし、無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ薬理作用の選択的モジュレーターのスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限られるものではない。
【００２７】
本発明の更なる目的は、前段落で述べた核酸分子によってコードされるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質またはタンパク質断片を提供することである。
【００２８】
本発明の更なる目的は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質またはその生物学的等価物をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞を提供することである。
【００２９】
本発明の一目的は、配列番号２、５および７で示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の実質的に精製された形態をそれぞれ提供することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、４および６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能的な形態の各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の実質的に精製された組換え形態を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系等の真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【００３１】
本発明の一目的は、それぞれ配列番号２、５および７に示したようなＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療および／または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供するように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらの変異に限らないものを提供することである。
【００３２】
更に、本発明の一目的は、それぞれ薬理作用があるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを含む組換え細胞から得た、実質的に精製された細胞内膜調製物、部分的に精製された細胞内膜調製物または未精製溶解物、特に、図２（配列番号２）、図５（配列番号５）および／または図７（配列番号７）に示したアミノ酸を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んだＤＮＡベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞から得た細胞内分画を提供することである。
【００３３】
本発明の他の目的は、配列番号１、３、４および／または６に示した完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現することによって、機能性で処理された形態の各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを生じるＤＮＡ発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた組換え宿主細胞から得た、実質的に精製された膜調製物、部分的に精製された膜調製物または未精製溶解物を提供することである。その組換え宿主細胞は、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが、特に好ましい。
【００３４】
モジュレーター、好ましくはＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性および／または無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの選択的モジュレーターをスクリーニングするために、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質、またはＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を含む膜調製物、または生物学的等価物を使用することも、本発明の一目的である。このような任意のタンパク質または膜結合タンパク質は、動物や人間の健康に関わる無脊椎寄生種に対して活性なこれらのモジュレーターをスクリーニングし、選択する際に有用となり得る。このような種は、本明細書に開示したアメリカイヌマダニチャネル以外に、蠕虫、ノミ、他のダニ類およびシラミを含む。これらの膜調製物は、これらのＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現する異種細胞系から創出されてもよく、完全長タンパク質、完全長タンパク質の生物活性断片を構成するか、または当分野で入手できる物質で構築し得る様々な融合構築体から発現される融合タンパク質に依存してもよい。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他の核酸を含まないことを意味する。用語を入れ換えて使用する場合、「他の核酸を実質的に含まない」、「実質的に精製された」、「分離された核酸」、「精製された核酸」のいずれも、他の細胞成分から分離・精製されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質に対するコード領域を含むＤＮＡ分子を指す。したがって、他の核酸を実質的に含まないＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ調製物は、全核酸に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ核酸を含むものと思われる。所与のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含まないかどうかを、適当な染色法、例えば臭化エチジウム染色と組合せた、例えば、アガロースゲル電気泳動のような従来の核酸純度分析法、または配列決定によって、決定することができる。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」とは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、一層より好ましくは９９．９％他のタンパク質を含まないことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含まないＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質調製物は、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を含むものと思われる。所与のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含まないかどうかを、適当な検出法、例えば銀染色またはイムノブロッティングと組合せた、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のような従来のタンパク質純度分析法によって、決定することができる。「他のタンパク質を実質的に含まない」または「実質的に精製された」という用語と入れ換えて使用する場合、「分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質」または「精製されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質」という用語も、天然の供給源から分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を指す。「分離された」または「精製された」という用語の使用は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質が普通の細胞環境から取出されたことを示す。したがって、分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質は、無細胞溶液中にあるか、または自然に生成する環境とは異なる細胞環境中に置かれてもよい。分離されたという用語は、分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質が存在する唯一のタンパク質であることを意味するのではなく、むしろ分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質が、他のタンパク質やｉｎ  ｖｉｖｏでＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質と自然に結びつく非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）を実質的に含んでいないことを意味している。したがって、原核または真核細胞中に組換えによって発現され、このＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を自然には（即ち、介在なしには）発現しないこの宿主細胞から実質的に精製されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質は、本明細書で言及する如何なる状況下でも、当然「分離されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質」である。前記のように、分離または精製されたＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質であるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質調製物は、他のタンパク質を実質的に含まず、全タンパク質に対するパーセント表示で、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、一層より好ましくは０．１％以下の非Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を含むものと思われる。
【００３７】
本明細書で入れ換えて使用する場合、「機能的等価物」または「生物活性等価物」とは、スプライシング、欠失、突然変異、置換、付加のいずれかのために、天然のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと正確には同じアミノ酸配列を有していないが、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと実質的に同じ生物活性を保持しているタンパク質を意味する。このような機能的等価物は、天然のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと顕著なアミノ酸配列の同一性を有すると思われ、このような機能的等価物をコードする遺伝子およびｃＤＮＡは、天然のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡ配列との低ストリンジェントなハイブリッド形成によって、検出することができる。例えば、本明細書で開示する天然のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質は、配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、配列番号１によってコードされる。機能的等価物をコードする核酸は、ヌクレオチドのレベルで配列番号１と少なくとも約５０％の同一性を有する。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基の他の化学的に類似したアミノ酸残基による置き換えを指す。このような保存的置換の例は、１つの疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン、またはメチオニン）による他の疎水性残基の置換、および１つの極性残基による同じ電荷の他の極性残基の置換（例えば、リジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸）である。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「ＬＧＩＣ」とは、リガンド依存性イオンチャネルを指す。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ＧｌｕＣｌ」とは、Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ」とは、リガンド依存性イオンチャネル／Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ」とは、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓリガンド依存性イオンチャネル／Ｌ−グルタミン酸依存性塩素イオンチャネルを指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「哺乳類の」という用語は、ヒトを含めた任意の哺乳類を指すことにする。
【００４４】
図面の簡単な説明
図１Ａ〜Ｃは、配列番号１に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １のヌクレオチド配列を示す。
【００４５】
図２は、配列番号２に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のアミノ酸配列を示す。
【００４６】
図３Ａ〜Ｃは、配列番号３に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のヌクレオチド配列を示す。
【００４７】
図４Ａ〜Ｂは、配列番号５に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のヌクレオチド配列を示す。
【００４８】
図５は、配列番号５に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のアミノ酸配列を示す。
【００４９】
図６Ａ〜Ｃは、配列番号６に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のヌクレオチド配列を示す。
【００５０】
図７は、配列番号７に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のアミノ酸配列を示す。
【００５１】
図８は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １（配列番号２）、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１（配列番号２）、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（配列番号５）およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（配列番号７）の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す。
【００５２】
図９は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １  ｍＲＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電流活性を示す。電流活性は１μＭのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【００５３】
図１０は、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のイベルメクチンによる活性を示す。電流活性は〜１μＭのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の分離または精製核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。大部分のクローニングのためには、ＤＮＡが好ましい核酸である。前記のように、本明細書に開示したＤＮＡ分子を選択した宿主細胞中にトランスフェクトしてもよく、その結果、その組換え宿主細胞は、発現した機能性の単一、ホモ多量体またはヘテロ多量体ＬＧＩＣの実質的な量の供給源となる。このような機能性のリガンド依存性イオンチャネルは、他の公知のリガンドに反応する可能性があり、その結果、そのリガンドが、これらのチャネルのモジュレーター、動物や人間の健康および／または作物保護のために使用する有効な殺虫性、殺ダニ性および／または殺線虫性処理剤として作用し得るモジュレーターを同定するための追加のスクリーニング標的を提供すると思われる。本明細書では、アフリカツメガエル卵母細胞中に発現されたＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １、１１および７−１が、リン酸イベルメクチンの添加に反応して電流を示すことが示してある。一方、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２はリン酸イベルメクチンまたはグルタミン酸に反応しなかった。しかし、ＧＡＢＡ−Ａサブユニットのガンマが機能性のホモ多量体を発現しないことに注意すべきである。したがって、本発明の発現タンパク質は、本明細書に開示するチャネルタンパク質を含め、幾つかの附属および／またはチャネルタンパク質を含んだ野生型リガンド依存性イオンチャネルの成分として、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能し得る。しかし、本発明のＬＧＩＣタンパク質が、技術者にとって有用となるために、野生型チャネルを直接模倣する必要はない。むしろ、組換え宿主細胞内に機能性で単一の膜結合チャネルを形成することができるために、これらのタンパク質は、当分野で公知の、本明細書内に一部記載したスクリーニング手順になじみやすい。したがって、本明細書内に記述したように、本発明の開示Ｄｖチャネルタンパク質は、完全な機能性ＬＧＩＣチャネルに寄与し得る他のＤｖチャネルサブユニットタンパク質やサブユニットタンパク質を含むかまたは含まない本明細書内に開示した様々なタンパク質を有する、単一の機能性チャネルとして、ホモ多量体チャネルとして、またはヘテロ多量体チャネルとして有用である。
【００５５】
本発明は、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓの新規な無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を発現するｍＲＮＡをコードする分離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関するものであって、このＤＮＡ分子は配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号６と本明細書に開示したヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
本発明のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ核酸分子の分離および特定は、実施例１節に詳述したように確認された。本明細書で考察するこれらのｃＤＮＡ分子は、殺虫剤の新規なスクリーニング手段を確立し、特にヒトおよび家畜、イヌ、ネコ等の動物における寄生種の外寄生を処置するのに使用するためか、または他のクモ形類動物を殺すために、殺虫剤活性を有して可能性のある鉛化合物を実証するのに、特に有用である。これらのｃＤＮＡまたはその一部は、追加の殺虫農薬スクリーニング手段を確立するために、他の生物から関連遺伝子を分離するためのハイブリッド形成プローブとしても有用である。本発明のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌコード化ｃＤＮＡは、アメリカイヌマダニ種Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓから分離された。そのＤＮＡ配列は、グルタミン酸およびイベルメクチンに感応性の塩素イオンチャネル群と共通の特徴を共有するタンパク質を予測する。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞中に発現するとき、グルタミン酸および／またはイベルメクチン感応性チャネルを認める。これらのチャネルで作用する化合物の薬理作用は、これらの種の間で恐らく差が出ると思われる。クモ形類動物のチャネルをスクリーニングすることによって、クモ形類動物特異的な化合物を発見する可能性が高まると思われる。したがって、本発明のｃＤＮＡを、細胞系や他の発現系で発現させることができ、かつ、チャネルを活性化し、阻止し、または調節する化合物をスクリーニングするために、競合結合実験や機能性塩素イオンチャネル試験に使用することができる。
【００５７】
無脊椎動物グルタミン酸依存性塩素イオンチャネル（ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ）は、グリシンおよびＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャネルと関係しており、興奮性グルタミン酸受容体（例えば、ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡ受容体）とは異なる。ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌファミリーの最初の２種の構成体が、駆虫薬イベルメクチンの受容体に対する機能性スクリーニングの後に、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて確認された。今では、更に数種のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌが、他の無脊椎動物種においてクローニングされた。しかし、脊椎動物においてＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに相当するものが存在する証拠は未だない。このために、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌは駆虫剤、殺虫剤、殺ダニ剤等にとって優れた標的である。ノジューリスポア酸（ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）およびその誘導体のような特異的ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌモジュレーターは、脊椎動物において機構に基づく毒性を欠いているので、理想的な安全性プロファイルを有する。本発明は、４種の新規なＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌクローンに部分的に関するものである。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２が元のスクリーニングで確認された。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１を両プローブで確認したが、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２はＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２プローブだけで認めた。
【００５８】
本発明は、図１（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１）に記載し、配列番号１として示した分離または精製ＤＮＡ分子に関するもので、そのＤＮＡ分子は図２に記載し、配列番号２として示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードし、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００５９】
【化１】
0005134750.tif 000002
0005134750.tif 000003
【００６０】
本発明は、図３（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１１）に記載し、配列番号３として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図２に記載し、配列番号２として示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードし、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００６１】
【化２】
0005134750.tif 000004
0005134750.tif 000005
【００６２】
本発明は、図４（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ７−１）に記載し、配列番号４として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子は図５に記載し、配列番号５として示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードし、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ７−１のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００６３】
【化３】
0005134750.tif 000006
0005134750.tif 000007
【００６４】
本発明は、図６（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１０−２）に記載し、配列番号６として示した分離または精製ＤＮＡ分子にも関するもので、そのＤＮＡ分子も図７に記載し、配列番号７として示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードし、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１０−２のヌクレオチド配列は次のとおりである。
【００６５】
【化４】
0005134750.tif 000008
0005134750.tif 000009
0005134750.tif 000010
【００６６】
各々図１、３、４および６に示し、前に例示した分離ＤＮＡ分子は、次の特性を有する。
【００６７】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１（配列番号１）：
３５９８ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基１７０〜１７２位）および「ＴＡＧ」終止コドン（ヌクレオチド残基１３６１〜１３６３位）で、読み取り枠が、配列番号２に示したアミノ酸３９７個の発現タンパク質を生じる。
【００６８】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１１（配列番号３）：
３４４２ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基３２〜３４位）および「ＴＡＧ」終止コドン（ヌクレオチド残基１２２３〜１２２５位）で、読み取り枠が、配列番号４に示したアミノ酸３９７個の発現タンパク質を生じる。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１タンパク質は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １と同様に、配列番号２に示したアミノ酸配列を含んでいる。配列番号３および配列番号１の読み取り枠内のヌクレオチド配列は、９個のヌクレオチド置換を示す。その置換中３個はＲＮＡ編集事象から生じると思われるが、その他の変化は、恐らくマダニ集団内の対立遺伝子による差異の結果である。
【００６９】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（配列番号４）：
２１９４ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基４７〜４９位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１３１３〜１３１５位）で、読み取り枠が、配列番号５に示したアミノ酸４２２個の発現タンパク質を生じる。
【００７０】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（配列番号６）：
４１７７ヌクレオチド残基：開始のＭｅｔ（ヌクレオチド残基３６０〜３６２位）および「ＴＧＡ」終止コドン（ヌクレオチド残基１３２９〜１３３１位）で、読み取り枠が、配列番号７に示したアミノ酸３２３個の発現タンパク質を生じる。
【００７１】
例示した本発明の様々なｃＤＮＡ分子に対するヌクレオチドレベルでの同一性パーセントは、ＧＣＧ−Ｂｅｓｔ  ｆｉｔ−Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを用いて生成された。相対的な同一性パーセントは以下のとおりである。
ショウジョウバエ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌα１（米国特許第５６９３４９２号）とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １：５４．８６９％；
ショウジョウバエ  ＧｌｕＣｌα１とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１：５８．０２９％；
ショウジョウバエ  ＧｌｕＣｌα１とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２：５４．９３８％；
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１：６６．５５５％；
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２：７５．０００％；
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１：９９．２４６％；および
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１とＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２：６９．１０３％。
【００７２】
この目的のために、本発明は、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする精製核酸分子であって、（ａ）配列番号２、５および７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸分子、または（ｂ）配列番号２、５および７をコードする第２の核酸分子の相補体と、中度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子、または（ｃ）配列番号１、３、４および６に示した第２の核酸分子の相補体と、中度ないし高度にストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する核酸分子を含み、かつ読み取り枠内のヌクレオチドレベルで、配列番号１、３、４および６に示した第２の核酸分子の少なくとも１種と少なくとも約６５％の同一性を有する核酸分子に関する。
【００７３】
また、本発明は、新規なＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ無脊椎動物ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を各々発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１、３、４および６の生物活性な断片または突然変異体にも関する。任意のこのような生物活性な断片および／または突然変異体は、配列番号２、配列番号５および配列番号７に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を含むが、それらに限らないＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣したタンパク質またはタンパク質断片をコードすると思われる。任意のこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が、アフリカツメガエル卵母細胞等の真核細胞中に機能性のＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを発現するｍＲＮＡをコードすることによって、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含んでいるが、必ずしもこれらの変異に限られるものではない。
【００７４】
本発明のこの部分の好ましい一態様は、新規なＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする図１（配列番号１；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １と命名）、図３（配列番号３；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１と命名）、図４（配列番号４；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１と命名）および図６（配列番号６；ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２と命名）に開示されている。
【００７５】
また、本発明は、野生型ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性を調節する化合物を同定する試験において有用な融合タンパク質を発現するばかりでなく、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する抗体も発生させる融合構築体の分離核酸分子に関する。本発明のこの部分の一態様は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ融合構築体を含むが、それに限らない。組換えＧＳＴ−ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ融合タンパク質を、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現系で発現させてもよい。他の態様は、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質質）、ＭＹＣエピトープおよびＧＳＴを含むが、これらに限らない様々な標識に連結したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ融合構築体に関する。前と同じように、このような任意の融合構築体を関心のある細胞系内で発現してもよいし、本明細書に開示するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の１種または複数のモジュレーターをスクリーニングするために使用してもよい。
【００７６】
本発明の分離核酸分子は、１本鎖（コード鎖または非コード鎖）または２本鎖であってもよいゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ならびに合成１本鎖ポリヌクレオチド等の合成ＤＮＡ等のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）を含み得る。また、本発明の分離核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）も含み得る。
【００７７】
遺伝暗号の縮重は、２種以外の全てのアミノ酸に対して、複数のコドンが特定のアミノ酸をコードするようなものである。これによって、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする合成ＤＮＡであって、そのヌクレオチド配列が配列番号１、３、４および６のヌクレオチド配列と有意に異なるが、それでもなお配列番号１、３、４および６と同じＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする合成ＤＮＡの構築が可能となる。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲に入ることを意図している。このような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞や生物において発現させることを所望する場合、このような合成ＤＮＡのコドン使用法をその特定の宿主のコドン使用法を反映するように調節することによって、宿主内でのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の発現量を増加させることができる。換言すれば、特定のアミノ酸をコードする様々なコドンのこの重複は、本発明の範囲に入る。したがって、本発明は、以下に示すように、最終的に同一のアミノ酸を翻訳するためにコードする代替コドンを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も対象としている。
【００７８】
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン  ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン  ＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン  ＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン  ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン  ＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン  ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン  ＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン  ＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドン  ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン  ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン  ＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドン  ＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン  ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン  ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン  ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン  ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン  ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン  ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン  ＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン  ＵＡＣ、ＵＡＵ
【００７９】
したがって、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なったＤＮＡ分子を生じ得るコドンの重複を開示する。本明細書のために、１個または複数の置換コドンを有する配列を縮重変異配列と定義することにする。他の配列変異は、以下に考察するように、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。このようなＲＮＡ編集は、読み取り枠の変化が発現タンパク質中のアミノ酸残基の変化を起こさない他の形式のコドン重複を生じ得る。発現タンパク質の最終的物性を実質的に変化させないＤＮＡ配列中または翻訳タンパク質中の突然変異も、本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンの代わりにバリン、リジンの代わりにアルギニン、またはグルタミンの代わりにアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化が起こらないかもしれない。
【００８０】
あるペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然のヘプチドと異なる性質を有するペプチドをコードするように変化させ得ることは公知の。ＤＮＡ配列を変化させる方法は、部位特異的突然変異誘発を含むが、それに限らない。変化した性質の例は、酵素が基質に対して、または受容体がリガンドに対して示す親和性の変化を含むが、これらに限らない。
【００８２】
「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最高次の一致が得られるように、各配列が配列される。「同一性」自体は、当業界で認識された意味を有し、公表された技法を用いて計算することができる。例えば、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、ｅｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの２個の配列間の同一性を測定する幾つかの方法があるが、「同一性」という用語は技術者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３）。２個の配列間の同一性または類似性を決定するために汎用される方法は、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４およびＣａｒｉｌｌｏ  ａｎｄ  Ｌｉｐｔｏｎ、１９８８、ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３に開示されている方法を含むが、これらに限られるものではない。同一性や類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム中に体系化されている。２個の配列間の同一性や類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｔ  ａｌ、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７）、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）を含むが、これらに限られるものではない。
【００８３】
一例として、配列番号１の参照ヌクレオチド配列に、少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号１の参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド各１００個当たり５点までの突然変異や代替ヌクレオチドを含み得ることを除けば、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％までが欠失するか、または他のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの突然変異や代替ヌクレオチド置換は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中のヌクレオチド間に個々に散在するか、または参照配列内の１個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで起こってもよい。１００％未満の同一性を生じるこのような「突然変異」または変化の一発生源は、ＲＮＡ編集を介して起こり得る。ＲＮＡ編集の過程は、改変されたｍＲＮＡをクローニングされるｃＤＮＡを発生させる鋳型として使用したとき、コドン変化が起こる場合も起こらない場合もある１個または複数のヌクレオチド変化が起こるように、ｍＲＮＡ分子の改変を起こす。このＲＮＡ編集は、ＲＮＡエディターゼによって触媒されることが公知である。このようなＲＮＡエディターゼはＲＮＡアデノシンデアミナーゼであり、それはシトシン残基を模倣する傾向のあるイノシン残基にアデノシン残基を変換する。この目的のために、ｍＲＮＡ残基のＡからＩへの変換が、クローニングされるｃＤＮＡのコードおよび非コード領域においてＡからＧへのトランジションを起こすと思われる（例えば、Ｈａｎｒａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９９、Ａｎｎａｌｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６８：５１−６６を参照されたい。総説としては、Ｂａｓｓ、１９９７、ＴＩＢＳ  ２２：１５７−１６２を参照されたい）。
【００８４】
同様に、配列番号２の参照アミノ酸配列に、少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、そのポリペプチド配列が、配列番号２の参照アミノ酸のアミノ酸各１００個当たり５個までのアミノ酸の改変を含み得ることを除けば、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが欠失するか、または他のアミノ酸で置換されてもよく、あるいは、参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位で起こってもよく、あるいは、参照配列中の残基間に個々に散在するか、または参照配列内の１個または複数の隣接グループ中に散在することによって、両末端位間のどこかで起こってもよい。前記のように再び、ＲＮＡ編集が、ゲノム配列の読み取り枠に直接対応する「非ＲＮＡ編集」転写体から発現する他のタンパク質と、「同一性」の異なる発現タンパク質を生じるコドン変化を起こし得る。
【００８５】
また、本発明は、本明細書を通して開示される実質的に精製された核酸分子を含んでいる組換えベクターおよび原核、真核を問わない組換え宿主にも関する。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を全体として、または部分的にコードする本発明の核酸分子は、他のＤＮＡ分子、即ちＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌコード配列が自然には連結されないＤＮＡ分子と連結されることによって、各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成することができる。本発明の新規なＤＮＡ配列を、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードする核酸または機能的等価物を含むベクター中に挿入することができる。これらのベクターはＤＮＡまたはＲＮＡで構成されてもよいが、大抵のクローニングのためにはＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、修飾ウィルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードし得る他の形態のエピソームや組込み型ＤＮＡを含む。特定の遺伝子導入や他の用途のために適切なベクターを決定することは、技術者が十分に扱い得る範囲に入る。
【００８６】
また、本発明は、図２、図５および図７に開示し、配列番号２、５および７で各々示したアミノ酸配列を含む、各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質の実質的に精製された形態にも関する。開示した各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質は、図２、５および７に示すように、長さがアミノ酸３９７個（各々ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、配列番号２）、アミノ酸４２２個（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１、配列番号５）およびアミノ酸３２３個（ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２、配列番号７）の読み取り枠を含んでおり、次のとおりである。
【００８７】
【化５】
0005134750.tif 000011
【００８８】
図８は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１（配列番号２）、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（配列番号５）およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（配列番号７）の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す。
【００８９】
また、本発明は、配列番号２、５、および７に示したようなアミノ酸配列を含むＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の生物活性な断片および／または突然変異体であって、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断が診断、治療または予防用途のタンパク質やタンパク質断片を提供し、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ機能の作動薬および／または拮抗薬のスクリーニングに有用となるように、これらの突然変異を含むが、必ずしもこれらに限らない突然変異を含むものにも関する。
【００９０】
本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、４および／または６に示したヌクレオチド配列を含み、かつ各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ前駆体タンパク質を発現するＤＮＡ発現ベクターを含んだ組換え宿主細胞から得られる、実質的に精製され、十分にプロセシングされたＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【００９１】
多くのタンパク質と同様に、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質のアミノ酸の多くを改変し、それでも尚、野生型タンパク質と実質的に同じ生物活性を保持することが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、それでも尚、対応する各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと実質的に同じ生物活性を保持する改変ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌポリペプチドを含む。単一のアミノ酸置換では、普通、タンパク質の生物活性は変化しないと一般に受入れられている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｐａｇｅ２２６およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＆  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。したがって、本発明は、配列番号２、５、および／または７で１個のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドを含む。また、本発明は、配列番号２、５または７で２個以上のアミノ酸置換がなされたが、それでも尚、対応するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質と実質的に同じ生物活性を保持しているポリペプチドも含む。特に本発明は、前記置換が保存的置換である実施形態を含む。
【００９２】
当業者であれば、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの機能的等価物であって、アミノ酸の小さな欠失または挿入をＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌアミノ酸配列からの変化とするポリペプチドも、同じ指針に従うことによって、即ちＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと関連タンパク質とのアミノ酸配列の差を最小化することによって、産生し得ることを認めるであろう。小さな欠失または挿入は、一般に約１個から５個のアミノ酸の範囲にある。このような小さな欠失または挿入の改変ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌポリペプチドの生物活性に対する効果は、そのポリペプチドを合成により生成するか、あるいは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡの必要な変化を起こした後、そのＤＮＡを組換えで発現させ、そのような組換え発現で生成したタンパク質を検定することによって、容易に試験することができる。
【００９３】
本発明は、酵素の活性部位を含む領域を含んだＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの末端切断形も含んでいる。このような末端切断タンパク質は、本明細書に記載の様々なアッセイ、結晶化研究、および構造−活性相関の研究において有用である。
【００９４】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含んだ（原核細胞および真核細胞、ならびに形質転換／形質移入の安定な細胞および一時的な細胞の）組換え宿主細胞から得た、膜含有未精製溶解物または部分的に精製されたもしくは実質的に精製された細胞内膜分画にも関する。これらの組換え宿主細胞は、翻訳後に生物活性な様式で細胞膜と結合するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたは機能的等価物を発現する。これらの細胞内膜分画は、内在量より実質的に多量のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの野生型または突然変異形態を含み、したがってＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質またはチャネルのモジュレーターを選択する試験において有用と思われる。換言すれば、このような細胞内膜分画の特定の用途には、組換え細胞内でＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現後、他の細胞成分からその膜を分離、実質的に精製し、その後、そのタンパク質あるいは本明細書に開示するそのタンパク質の１種または複数を含む生物活性なチャネルの作動薬や拮抗薬等のモジュレーターを選択する試験に使用することが必要である。あるいは、その膜を含む溶解細胞を、組換えで発現した本明細書に開示するタンパク質のモジュレーターを選択する試験に直接使用してもよい。したがって、本発明の他の好ましい態様は、配列番号１、３、４および／または６に示す完全な読み取り枠を含み、かつ適切に発現するＤＮＡベクターで形質転換またはトランスフェクトされた結果、機能性で処理された形態の各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを生じる組換え宿主細胞から得られた膜を含む、実質的に精製された膜調製物または溶解組換え細胞成分に関する。その組換え宿主細胞は、前記のように、哺乳類細胞系、Ｓ２細胞系等の昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞を含むが、これらの細胞に限らない真核宿主細胞であることが特に好ましい。
【００９５】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをクローニングするために、様々な手順のいずれを使用してもよい。これらの方法は以下の方法を含むが、それらに限らない。（１）ＲＡＣＥ  ＰＣＲクローニング法（Ｆｒｏｈｍａｎ、ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８−９００２）。完全長ｃＤＮＡ配列を作製するために、５’および／または３’ＲＡＣＥを行ってもよい。この戦略は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅のために、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。これらの遺伝子特異的プライマーは、公然と入手し得る任意数の核酸およびタンパク質データベースを捜すことによって同定された、発現配列タグ（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列の同定を経て設計される；（２）適切な発現ベクター系においてＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリを構築した後の、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの直接的な機能性発現；（３）ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索；（４）ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この部分的ｃＤＮＡは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質と関連する他のイオンチャネルサブユニットに対して公知のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計を介した、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ断片の特異的ＰＣＲ増幅によって得られる；（５）哺乳類ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質と相同性を有する部分的ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドによる、バクテリオファージまたはプラスミドシャトルベクター中に構築したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ含有ｃＤＮＡライブラリの検索。この戦略には、前記のＥＳＴとして同定された、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅用遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用も必要となるかもしれない；あるいは、（６）鋳型として配列番号１、３、４および／または６を用いて５’および３’遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計することによって、完全長ｃＤＮＡを公知のＲＡＣＥ法で作製するか、または、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードする全長型のヌクレオチド配列を分離することを目的として、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムライブラリの多数の型のひとつを検索するプローブとして使用するコード化領域の一部を作製し、分離するために、同じこれらの公知のＲＡＣＥ法でコード化領域の一部を作製すること。あるいは、本発明のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１（１、１１および７−１）およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２（１０−２）ｃＤＮＡを、実施例１節に記載のようにクローニングしてもよい。
【００９６】
他の型のライブラリ、ならびに他の細胞型や種型から構築したライブラリが、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌコード化ＤＮＡまたはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ相同体を分離するために有用であることは、当業者には自明である。他の型のライブラリは、他のアメリカイヌマダニ細胞型に由来するｃＤＮＡライブラリを含むが、それに限らない。
【００９７】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性を有する細胞や細胞系から適当なｃＤＮＡライブラリを調製し得ることは、当業者には自明である。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするｃＤＮＡを分離するための、ｃＤＮＡライブラリの調製に使用する細胞や細胞系の選択は、このような目的に利用できる任意の公知の試験を用いて、細胞結合ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性を先ず測定することによってなし得る。
【００９８】
ｃＤＮＡライブラリの調製は、当分野で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のｃＤＮＡライブラリ構築法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出すことができる。相補的ＤＮＡライブラリを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅを含むが、これらに限らない多数の市販源から得てもよい。
【００９９】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリから分離し得ることも、当業者には自明である。ゲノムＤＮＡライブラリの構築は、当分野で周知の標準的技法によって行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリの構築法は、前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に見出すことができる。特に、Ｐ１人工染色体ベクター中にゲノムライブラリを調製し、そこから本明細書に開示するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌヌクレオチド配列に基くプローブを用いて、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを含むゲノムクローンを分離してもよい。このようなライブラリを調製する方法は、当分野で公知である（Ｉｏａｎｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９）。
【０１００】
好ましい方法中の一法によってＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子をクローニングするために、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたは相同タンパク質のアミノ酸配列やＤＮＡ配列が必要となるかもしれない。これを実現するために、各ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質を精製し、部分的アミノ酸配列を自動化した配列分析装置で決定してもよい。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、部分的なＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために、６から８アミノ酸の２領域の線状配列を決定することができる。適当なアミノ酸配列を同定してしまうと、それらをコードすることのできるＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために複数のコドンを使用してもよく、したがって、そのアミノ酸配列は、一組の類似したＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれによってもコードされ得る。その一組中の１種だけがＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ配列と同一であると思われるが、その一組中の他のものも、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリッドを形成することができると思われる。ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それでも、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌコード化ＤＮＡの同定および分離を可能とするのに十分なだけ、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡとハイブリッドを形成するかもしれない。あるいは、発現された配列の一領域のヌクレオチド配列を、１個または複数の入手可能なゲノムデータベースを調査することによって同定してもよい。ｃＤＮＡライブラリとｃＤＮＡ集合体のいずれかから、所望のｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために、遺伝子特異的プライマーを使用してもよい。前記のように、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードする完全長配列を作製するために、重複する５’および３’ＲＡＣＥ産物を分離する目的で、あるいは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ様タンパク質をコードする完全長配列を分離するために、１種または複数のｃＤＮＡ系またはゲノム系ライブラリを検索するプローブとして用いる、ＲｓＧｌｕＣｌをコードするヌクレオチド配列の一部を分離する目的で、ＰＣＲ基準法に用いる適当なヌクレオチド配列を配列番号１、３、４または６から得てもよい。
【０１０１】
本発明は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子を含むベクター、そのベクターを含む宿主細胞、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子を宿主細胞に導入する段階、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの生成に適当な条件下で宿主細胞を培養する段階を含む実質的に純粋なＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を生産する方法も含んでいる。このようにして生産したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを従来の方法で宿主細胞から回収してもよい。したがって、本発明は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質および本明細書で開示する生物学的等価物を発現する方法、これらの遺伝子産物を用いる試験、これらのタンパク質を発現するＤＮＡ構築体を含む組換え宿主細胞、およびこれらの試験により、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性の作動薬や拮抗薬として作用することが確認された化合物にも関する。
【０１０２】
前記の方法で得たクローニングしたＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを、適当なプロモーターおよび他の転写調節因子を含む（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８、ならびに以下に列挙する他の例等の）発現ベクター中への分子クローニングによって組換えで発現させ、かつ原核または真核宿主細胞中に導入することによって、組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを産生させてもよい。本明細書では、発現ベクターを、適当な宿主細胞において、クローニングしたＤＮＡを転写し、そのｍＲＮＡを翻訳するのに必要なＤＮＡ配列と定義する。このようなベクターの使用によって、細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞（例えば、ＨＥＬヒト細胞）等の様々な宿主細胞中に真核細胞ＤＮＡを発現することができる。特定の設計をされたベクターは、細菌−酵母、細菌−動物細胞等の宿主間でのＤＮＡの往復移動を可能にする。適切に構築した発現ベクターは、宿主細胞中における自律複製用複製源、選択可能なマーカー、限定数の有用な制限酵素部位、高コピー数能力、および活性なプロモーターを含むはずである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列と定義される。強力なプロモーターは、高い頻度でｍＲＮＡを開始させるものである。最適量のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを産生するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ配列を決定するために、次のものを含むが、それらに限らないｃＤＮＡ分子を構築することができる：ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する完全長読み取り枠を含むｃＤＮＡ断片、ならびにそのタンパク質の特異的ドメインまたはそのタンパク質の再配列ドメインだけをコードするｃＤＮＡ部分を含む様々な構築体。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの５’および／または３’非翻訳領域を全く含まないか、その全部または一部を含むように、全ての構築体を設計することができる。これらの構築体を適当な宿主細胞中に単独および組合せて導入した後、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現量および活性を決定することができる。暫定的試験で最適発現を生じるＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡカセットを決定した後、このＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築体を、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌、および酵母細胞用のものを含むが、それらに限らない（組換えウィルスを含む）様々な発現ベクターに導入する。このような操作に対する技法を前記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に見出すことができ、それらは当業者に周知であり、利用可能である。したがって、本発明の他の態様は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡ配列を含み、かつ／または発現するように処理された宿主細胞を含む。組換え宿主細胞中にＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現させるために、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ様タンパク質をコードするＤＮＡを含んだ発現ベクターを使用してもよい。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたは生物学的等価形態を産生するために、このような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特定の設計がなされたプラスミドまたはウ��ルスを含むが、それらに限らない。組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現に適当と思われる市販の哺乳細胞用発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８〜２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２〜１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、およびｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）を含むが、それらに限らない。また、細菌細胞中に組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現させるために、様々な細菌用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現に適当と思われる市販の細菌用発現ベクターは、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むが、それらに限らない。その上、菌類細胞中に組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現させるために、様々な菌類細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現に適当と思われる市販の菌類細胞用発現ベクターは、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、それらに限らない。また、昆虫細胞中に組換えタンパク質を発現させるために、様々な昆虫細胞用発現ベクターを用いてもよい。組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの組換え発現に適当と思われる市販の昆虫細胞用発現ベクターは、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含むが、それらに限らない。
【０１０３】
組換え宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の細菌、酵母等の菌類、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系を含むが、それらに限らない哺乳類細胞、およびＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓや蚕由来の細胞系を含み、それらに限らない昆虫細胞を含み、それらに限らない原核または真核細胞であってもよい。例えば、昆虫の一発現系は、バキュロウィルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、適当と思われ、市販されている哺乳細胞種は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）およびＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２０９）を含むが、それらに限らない。
【０１０４】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性のモジュレーターをスクリーニングする好ましい一態様は、（ＧｌｕＣｌチャネル活性等の）リガンド依存性チャネル活性を測定する電気生理学系試験であって、本発明のＤＮＡやＲＮＡ分子をＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞中に注入することを含む試験に用いる発現系である。イオンチャネル活性の研究におけるアフリカツメガエル卵母細胞の一般的使用は、当分野で公知である（Ｄａｓｃａｌ，１９８７，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：３１７−３１７；Ｌｅｓｔｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０５７−１０６３；また、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０７，１９９２，Ｃｈ．１４−２５，Ｒｕｄｙ  ａｎｄ  Ｉｖｅｒｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋも参照されたい）。アフリカツメガエル卵母細胞には、リガンド依存性チャネルをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含むが、それらに限らない核酸物質を注入し、その後でチャネル活性ならびにチャネルの様々なモジュレーターに対する反応を測定することができる。
【０１０５】
ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞に対するか、またはこれらの細胞に由来し、機能性のホモ多量体またはヘテロ多量体チャネルを形成する膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに結合するか、またはＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの公知のリガンドのこれらの細胞やこれらの細胞由来の膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。前記方法によって確認される化合物は、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク質性の有機分子であるかもしれない。
【０１０６】
したがって、本発明は、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物、ならびにＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の機能を変化させる化合物をスクリーニングする方法を対象とする。他の受容体の作動薬および拮抗薬を確認する方法は、当分野で周知であり、それらをＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの作動薬および拮抗薬を確認するように適合させることができる。例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ等（１９９２、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：１０９６〜１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に結合する作動薬を阻害し、したがってニューロキニン受容体の作動薬または拮抗薬となり得る物質を確認する方法を記載している。その方法では、ＣＯＳ細胞にラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターをトランスフェクトし、ニューロキニン受容体の発現を可能とするに十分な時間の間、トランスフェクトしたその細胞を培養し、トランスフェクトしたその細胞を回収し、ニューロキニン受容体の公知の放射活性標識作動薬を含む試験緩衝液中に、その物質の存在下または不在下のいずれかでその細胞を再懸濁し、次いでニューロキニン受容体の公知のその放射活性標識作動薬のニューロキニン受容体への結合を測定する。公知の作動薬の結合量がその物質の不在下より存在下で少なければ、その場合、その物質はニューロキニン受容体のリガンドとなり得る。作動薬、拮抗薬等のその物質のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌへの結合を測定する場合、標識リガンドを用いることによって、このような結合を測定することができる。当分野に公知の任意の都合良い方法で、例えば、放射活性、蛍光、酵素によって、リガンドを標識することができる。
【０１０７】
したがって、本発明は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節する化合物をスクリーニングする方法を対象とする。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、あるいは非タンパク質性の有機または無機分子であるかもしれない。化合物は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ系チャネルの機能を増加または減少させることによって、調節すると思われる。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能を調節する化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する抗体、または修飾ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを含むキットを、このような用途のために公知の方法で調製してもよい。
【０１０８】
この目的のために、本発明は、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ受容体活性を調節する物質を確認する方法に部分的に関するものであって、その方法では、
（ａ）配列番号２、６および／または８に示すアミノ酸配列を含むＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の存在下、および不在下で試験物質を合わせ、かつ
（ｂ）ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ受容体タンパク質または各機能性チャネルの存在下および不在下で、その試験物質の作用を測定し、比較すること
が必要である。
【０１０９】
その上、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の発現を指示する発現ベクターと共に、技術者が利用し得る多様な型のスクリーニングまたは選択試験を示すために、幾つかの特定の実施形態を本明細書に開示している。他の受容体のリガンドを確認する方法は当分野で周知であり、それらをＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのリガンドに適合させることができる。したがって、これらの実施形態を例として提示するが、制限するためのものではない。この目的のために、本発明は、（作動薬、拮抗薬等の）ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌモジュレーターを確認し得る試験を含む。したがって、本発明は、ある物質がＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの作動薬または拮抗薬となり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現を可能にするのに十分な時間の間、かつ機能性チャネルが作製するように、その試験細胞を培養すること、
（ｃ）その物質の存在下、および不在下で、その細胞をＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの標識リガンドに曝すこと、
（ｄ）その標識リガンドのＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルへの結合量を測定すること
を含み、その標識リガンドの結合量がその物質の不在下より存在下で少ない場合、その物質がＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのリガンドとなり得るとする方法を含む。
【０１１０】
この方法の段階（ｃ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で普通に使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の普通に用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を回収し、その物質およびその標識リガンドの存在下で再懸濁してもよい。前記方法の一改良法では、その細胞を回収し、再懸濁するのではなく、細胞を基材、例えば組織培養皿に付着させた状態で、細胞に公知の放射能標識作動薬およびその物質を接触させるように、段階（ｃ）を改良する。
【０１１１】
また、本発明は、ある物質がＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと結合することができるか否か、即ちその物質がＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性化のモジュレーターとなり得るか否かを決定する方法であって、
（ａ）細胞中においてＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現を指示する発現ベクターで、その細胞をトランスフェクトまたは形質転換することによって、試験細胞を作製すること、
（ｂ）その試験細胞をその物質に曝すこと、
（ｃ）その物質のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌへの結合量を測定すること、
（ｄ）その試験細胞におけるその物質のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌへの結合量を、ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌでトランスフェクトされていない対照細胞へのその物質の結合量と比較すること
を含み、その物質の結合量が、対照細胞と比較して試験細胞中で大きい場合、その物質はＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに結合することができるとする方法も含む。次いで、その物質が実際に作動薬または拮抗薬であるか否かの決定を、本明細書に記載の電気生理学的試験等の機能性試験の使用によって実現することができる。
【０１１２】
この方法の段階（ｂ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用を調べるために当分野で普通に使用する条件：例えば、生理的ｐＨ；ＰＢＳ等の普通に用いられる緩衝液で代表されるか、または組織培養培地中のような塩条件；約４℃から約５５℃の温度である。その試験細胞を回収し、その物質の存在下で再懸濁する。
【０１１３】
前記試験は機能性試験であってよく、その場合、電気生理学的試験（例えば、実施例２を参照されたい）をトランスフェクトした哺乳類細胞系、昆虫細胞系、またはアフリカツメガエル卵母細胞中で行うことによって、試験化合物が（グルタミン酸等の）既知リガンドのチャネル活性化能力に及ぼす様々な効果を測定するか、あるいは、本質的に自然に活性を調節する（公知のＧｌｕＣｌチャネルに対するイベルメクチンの作用に類似した）試験化合物を探し求めてもよい。したがって、技術者であれば、本発明の機能性ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを結合および／または活性化する化合物を選択する一次および二次スクリーニング用の公知の技法に、本発明のｃＤＮＡクローンを快く適合させると思われる。
【０１１４】
ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質のモジュレーターを確認する好ましい方法は、第１に、配列番号２、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質と、試験化合物を接触させること、および第２に、その試験化合物のＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質に対する作用を測定することを含む。好ましい一態様は、組換え宿主細胞内に含まれるＤＮＡ発現ベクターの産物であるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を用いることである。
【０１１５】
ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌグルタミン酸依存性チャネルタンパク質の活性を調節する化合物を確認する他の好ましい方法は、第１に、少なくともその一部が配列番号２、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＧｌｕＣｌチャネルタンパク質をコードする、核酸分子の集団を宿主細胞内に注入することによって、核酸分子の前記部分の発現により、活性なリガンド依存性チャネルを生じること、第２に、試験化合物の存在下、および不在下で宿主細胞膜電流を測定することを含む。相補的ＤＮＡ、ポリＡ＋メッセンジャーＲＮＡおよび相補的ＲＮＡを含むが、それらに限らない多数の鋳型を使用してもよい。
【０１１６】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの量をスクリーニングし、測定するために、本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用してもよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの検出およびタイプ決定に適したキットの処方に有用である。このようなキットは、少なくとも１個の容器を緊密に閉じ込めるのに適した仕切り付き運搬具を含むと思われる。更に、その運搬具は、組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの検出に適した抗ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ抗体のような試薬を含むと思われる。また、その運搬具は、標識抗原または酵素基質等のような検出手段を含み得る。
【０１１７】
上記の試験は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌで一時的または安定にトランスフェクトした細胞を用いて実行することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションを含むが、それらに限らない多数の技術の任意の一法を介して、宿主細胞中に導入してもよい。トランスフェクションとは、試験細胞中にＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを導入するための、当分野で公知の任意の方法を含むことを意味している。例えば、トランスフェクションは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム介在トランスフェクション、リポフェクション、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを含んだレトロウィルス構築体による感染、およびエレクトロポレーションを含む。発現ベクター含有細胞は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を産生するか否かを決定するために、個別に分析する。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ発現細胞の確認は、抗ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ抗体を用いた免疫反応性、標識リガンド結合、または機能性で非内在性のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ活性を含むが、それらに限らない幾つかの手段によってなし得る。
【０１１８】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに結合するか、またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射性、蛍光、または酵素標識した化合物に置き換わるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われる。
【０１１９】
したがって、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングした受容体を発現する組換え細胞、またはこれらの細胞由来の膜に対するその化合物の親和性を測定することによって示される。クローニングした受容体の発現、およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに結合するか、またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの（グルタミン酸、イベルメクチンまたはノジューリスポア酸等の）放射能標識した既知リガンドのこれら細胞やこれら細胞から調製した膜への結合を阻害する化合物のスクリーニングは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する高い親和性を有する化合物を迅速に選択する効果的な方法を提供する。このようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結合中の放射性、蛍光、または酵素標識した化合物に置き換わるために使用し得るか、あるいは機能性試験で活性化剤として使用し得る非同位体性化合物であってもよい。前記方法によって確認される化合物は、やはりＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの作動薬か拮抗薬であると思われる。本明細書の他の部分に記したように、化合物は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を増加または減少させることによって、あるいはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ受容体タンパク質の作動薬または拮抗薬として作用することによって、調節すると思われる。この場合もＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現、あるいはその生物学的機能を調節するこれらの化合物は、様々な試験によって検出し得る。その試験は、発現や機能の変化があるか否かを決定する単純な「肯定／否定」試験であってもよい。試験試料の発現や機能を標準試料の発現や機能のレベルと比較することによって、その試験を定量化してもよい。
【０１２０】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＤＮＡの発現を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成した合成ｍＲＮＡを用いて行ってもよい。合成ｍＲＮＡは、小麦の麦芽抽出物および網状赤血球抽出物を含むが、それらに限らない様々な無細胞系において効果的に翻訳できるだけでなく、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含むが、それに限らない細胞に基ずく系においても効果的に翻訳することができ、後者の場合、カエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションが好ましい。
【０１２１】
宿主細胞中でのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現後、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の回収によって活性形のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を提供してもよい。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の幾つかの精製手順が利用でき、使用に適している。塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィおよび疎水性相互作用クロマトグラフィの様々な組合せや個々の適用によって、組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を細胞溶解物および抽出物から精製してもよい。その上、完全長ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質、またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質のポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体やポリクローナル抗体で作製したイムノ親和性カラムを用いて、組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を他の細胞タンパク質から分離することができる。
【０１２２】
Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓチャネルの機能性試験は、チャネルの全体または一部がＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルで構成される場合の１種または複数のリガンド依存性塩素イオンチャネル活性を測定する。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性は、本明細書に記載のチャネルを単独で用いて、あるいは、それをサブユニットとして、リガンド依存性塩素イオンチャネルの１種または複数の追加のサブユニット（好ましくは、１種または複数のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ）であって、共同して機能性チャネル活性をもたらすサブユニットと併用して、測定することができる。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ依存性塩素イオンチャネル活性を測定する試験は、３６Ｃｌを用いる機能性スクリーニング、パッチクランプによる電気生理学的試験を用いる機能性スクリーニングおよび蛍光色素を用いる機能性スクリーニングを含む。このような試験を行う技術一般は、当分野で周知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １５９：２６１−２６９；Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２６９−２７７；Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．２５８：３０７−３１４；Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０  ＴｉＰＳ  １１：３２５−３２９およびＴｓｉｅｎ等、米国特許第５６６１０３５号を参照されたい）。機能性試験は、個々の化合物または異なる化合物を含んだ調製物を用いて行うことができる。異なる化合物を含み、１種または複数の化合物がＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性に影響する調製物は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性に影響する化合物を確認するための、より小さな化合物群の中に分類することができる。本発明の一実施形態では、少なくとも１０種の化合物を含む試験調製物が、機能性試験において使用される。組換えで産生し、様々な環境中に存在するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを、機能性試験において使用することができる。適当な環境は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルを含んだ生細胞および精製細胞抽出物、および活性に適切な膜と、更に、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル活性の測定に適した異なる環境中に導入される組換え手段によって産生される精製ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネルの使用を含む。チャネルにおいて活性な化合物を試験し、かつチャネルの異なる領域に関する情報を得るために、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ誘導体を使用することができる。例えば、生来のチャネル中の各アミノ酸領域が改変されたＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌチャネル誘導体を産生することができ、その改変のチャネル活性に対する効果を測定することによって、異なる領域に関する情報を得ることができる。
【０１２３】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ、あるいは配列番号２、５、および／または７に開示したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１（すなわち、１、１１、または７−１）またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２（１０−２）の一部に由来する（普通、長さが約９個から約２５個のアミノ酸の）合成ペプチドに対する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生してもよい。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する単一特異性抗体は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７）の技法を用いて、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で使用する単一特異性抗体とは、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する均一結合特性を有する単一の抗体種または多数の抗体種と定義する。本明細書で使用する均一結合は、その抗体種が、前記のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと結合する種のように、特異的な抗原やエピトープと結合する能力を指す。ヒトのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ特異的抗体は、免疫アジュバントと共に、またはそれなしに、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質、またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの一部分から作製した合成ペプチドの適当な濃度で、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物を免疫することによって産生する。
【０１２４】
一次免疫の前に、免疫前血清を収集する。許容し得る免疫アジュバントと共に、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を約０．１ｍｇから約１０００ｍｇ各動物に投与する。このような許容し得るアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍを含む油中水乳濁液およびｔＲＮＡを含むが、それらに限らない。初回免疫は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）またはその両径路による多部位における、好ましくはフロイントの完全アジュバント中のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質またはそのペプチド断片からなる。各動物から一定の間隔、好ましくは毎週採血することによって、抗体価を決定する。動物には、初回免疫後、追加免疫注射を行ってもよく行わなくてもよい。追加免疫注射を受けるそれらの動物には、一般に、フロイントの不完全アジュバント中の等量のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを同じ径路によって与えられる。最大の力価が得られるまで、約３週間隔で追加免疫注射を与える。各追加免疫から約７日後、または単回免疫から約１週後に、各動物から採血し、血清を収集し、その各分量を約−２０℃で保存する。
【０１２５】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌと反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配のマウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質で免疫することによって調製される。約０．５ｍｌの緩衝液または塩水を、前記のような同量の許容し得るアジュバント中に導入し、その中のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質約１ｍｇから約１００ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇでＩＰまたはＳＣ径路によりマウスを免疫する。フロイントの完全アジュバントが好ましい。初回免疫を０日にマウスに与え、約３週から約３０週の間休息を与える。免疫マウスに、リン酸緩衝塩水等の緩衝液中、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ約１ｍｇから約１００ｍｇの追加免疫を１回または複数回、静脈内（ＩＶ）径路により与える。抗体陽性のマウスのリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球は、当分野で公知の標準的手順で、免疫マウスから脾臓を除去することによって得られる。ハイブリドーマ細胞は、脾臓リンパ球を適当な融合相手の細胞、好ましくは骨髄腫細胞と、安定なハイブリドーマの形成を可能にすると思われる条件下で混合することによって産生される。融合相手の細胞は、各マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、ＭＰＣ−１１、Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を含んでもよいが、それらに限らず、好ましくはＳｐ２／０である。抗体産生細胞および骨髄腫細胞を、分子量約１０００、濃度約３０％から約５０％のポリエチレングリコール中で融合する。融合ハイブリドーマ細胞は、ヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖によって、当分野で公知の手順により選択される。上清液を約１４、１８および２１日に増殖陽性ウェルから収集し、抗原としてＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを用いて、固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイにより抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降検定で試験することによって、そのｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、１９７３、Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓの軟寒天法等の技法によってクローニングした。
【０１２６】
モノクローナル抗体は、元の感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに、感作後約４日に約２×１０６から約６×１０６のハイブリドーマ細胞を１匹当たり約０．５ｍｌで注入することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生される。細胞導入後約８〜１２日に腹水を収集し、モノクローナル抗体を当分野で公知の技法で精製する。
【０１２７】
抗ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生は、十分な量の特異的ｍＡｂを得るために、約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることによって行われる。そのｍＡｂを当分野で公知の技法で精製する。
【０１２８】
腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体価は、沈降、受動凝集、酵素連結イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）法およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法を含むが、それらに限らない様々な血清学的または免疫学的試験によって決定される。体液または組織および細胞抽出液中のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの存在を検出するために、同様の試験を用いる。
【０１２９】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌペプチド断片、または各完全長ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する特異抗体を産生するために、単一特異性抗体を産生する前記方法を利用し得ることは、当業者には自明である。
【０１３０】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ抗体親和性カラムを、例えば、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）にその抗体を添加することによって作製する。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ  エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ  グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、完全長ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質断片を含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムをリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を０．２３Ｍ  グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【０１３１】
また、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養に細胞を提供することによって、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌまたは機能性ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの任意の代替チャネルのモジュレーターとして、ｉｎ  ｖｉｖｏで作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するに当たって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当分野で公知の方法によって、動物の細胞中の１個または複数の染色体の中に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも一箇所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のｃＤＮＡクローンの１種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および／または導入遺伝子も、当分野で公知の遺伝調節因子および／または構造因子を含み得る。遺伝子導入のための標的細胞型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した着床前の胚からＥＳ細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４〜１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５〜２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５〜９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５〜４４８）。ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準的技法、またはレトロウィルス介在形質導入によって、導入遺伝子をＥＳ細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ＥＳ細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ＥＳ細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８〜１４７４）。
【０１３２】
また、本発明は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのモジュレーターとして作用する様々な化合物の能力を調べるために有用な、ヒト以外のトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物に言及するにあたって、導入遺伝子および遺伝子に言及する。本明細書で使用する場合、導入遺伝子とは遺伝子を含んだ遺伝的構築体である。導入遺伝子は、当分野で公知の方法によって、動物の細胞中の１個または複数の染色体中に組込まれる。いったん組込まれると、導入遺伝子は、トランスジェニック動物の各染色体中の少なくとも１カ所で担持される。当然ながら、遺伝子は、本明細書に記載のｃＤＮＡクローンの１種または組合せのように、タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。遺伝子および／または導入遺伝子は、当分野で公知の遺伝調節因子および／または構造因子をも含み得る。導入遺伝子を導入する標的細胞型は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した着床前の胚からＥＳ細胞を得ることができ、それを胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８）。ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション等の多様な標準的技法、またはレトロウィルス介在形質導入によって、導入遺伝子をＥＳ細胞中に効果的に導入することができる。次いで、生成した形質転換ＥＳ細胞をヒト以外の動物由来の胚盤胞と結合することができる。次いで、導入ＥＳ細胞はその胚にコロニーを形成し、生成するキメラ動物の胚系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４）。
【０１３３】
自然に生成するＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子をネイティブ遺伝子と称し、それが突然変異体でなければ、野生型と称することもできる。改変されたＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子（線虫内など）は、宿主動物にとってネイティブなものと同じＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを完全にコードするはずはなく、その発現産物を多少とも改変することができるか、またはそれが全く存在しないこともあり得る。ネイティブＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子が存在しない条件で、トランスジェニック動物中に非ネイティブＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子を発現することが有用な場合では、その改変ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子が、その動物中に特徴のないノックアウト表現型を誘発するのが好ましい。しかし、修飾の程度がもっと低いＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子も有用となり得るし、本発明の範囲に入る。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの突然変異は、標的欠失突然変異、標的置換突然変異および／または標的挿入突然変異であってもよい。しかし、好ましい突然変異は欠失突然変異であり、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子の全てと言えないまでも、その大部分の欠失を起こす欠失突然変異が特に好ましい。ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子が改変されたか、好ましくは完全に欠失したトランスジェニック動物が生成する。ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの遺伝子欠失、遺伝子修飾および／または遺伝子挿入でネイティブ遺伝子が機能性を失う結果、「ノックアウト」トランスジェニック動物が生成するか、あるいはＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現または活性が変化する。前記のように、活性化されたＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子を有しないヒト以外のトランスジェニック動物を、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの過剰発現または欠失から起こる病理学的表現型を反転し得るＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ発現および／または活性のモジュレーター（小分子やペプチド等のモジュレーター）を試験／スクリーニングするために使用することができる。
【０１３４】
好ましい欠失突然変異は、ヌクレオチド１個から全遺伝子の欠失までの任意の部位の欠失であって、野生型ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに関する読み取り枠や関連するシス作用調節配列を含んだ欠失を含み得る。より小さな欠失は、非機能性である可能性が極めて高いタンパク質を生じるフレームシフト変異が起こるように、３で割り切れないのが好ましい。３で割り切れないこのような任意の小型の欠失は、非機能性の端部切断タンパク質生成物を生成する可能性を増すために、読み取り枠の５’領域に対してターゲッティングするのが好ましい。しかし、前記のように、機能性のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質の発現防止を確実にするために、欠失突然変異がＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子の全てと言えないまでも、その大部分を含むことが好ましい。したがって、本発明のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ欠損動物細胞、ヒト以外のトランスジェニック胚、ヒト以外のトランスジェニック細胞、およびヒト以外のトランスジェニック同腹子を、前段に例示したような当分野で公知の任意の技法によって生成してもよい。線虫ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌサブユニットの一方または両方をノックアウトされた線虫突然変異体において、野生型線虫ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌバックグランド中にＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ導入遺伝子をも発現するトランスジェニックまたはノックアウト無脊椎動物（例えば、線虫）を作製することも、当該技術者の範囲内にあると思われる。
【０１３５】
薬剤として許容し得る担体の混合物のような公知の方法により、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのモジュレーターを含む薬剤として有用な組成物を処方し得る。このような担体の例および処方の方法を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見出し得る。効果的投与に適した、薬剤として許容し得る組成物を形成するために、このような組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ、あるいは、チロシンキナーゼ活性化剤または阻害剤を含むＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ作動薬または拮抗薬のいずれかを含むと思われる。
【０１３６】
本発明の治療または診断用組成物は、障害を治療または診断するのに十分な量で個体に投与される。有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢等の様々な要因に応じて変化し得る。他の要因には投与方式が含まれる。
【０１３７】
その薬剤組成物を、皮下、局所、経口、筋肉内等の多様な径路によって個体に供してよい。
【０１３８】
「化学的誘導体」という用語は、普通は基本分子の一部でない追加の化学的部分を含んだ分子を指す。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改良し得る。あるいは、その部分が、基本分子の好ましくない副作用を弱めるか、または基本分子の毒性を減少させるかもしれない。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等の様々なテキスト中に記載されている。
【０１３９】
本明細書に開示した方法に従って確認した化合物は、単独で適当な投与量で使用してもよい。あるいは、他の剤の同時投与または逐次投与が望ましいかもしれない。
【０１４０】
本発明は、本発明の成分を含む障害の新規な治療法に使用する適当な局所用、経口用、全身用および非経口用薬剤処方を提供する目的も有している。本明細書に従って確認した化合物を活性成分として含む組成物は、従来の投与用媒体中の非常に多様な治療剤形で投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤（適時放出および持続的放出処方を各々含む）、丸剤、散在、顆粒剤、エリキシール剤、チンキ剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤等の経口剤形で、または注射によって、それらの化合物を投与することができる。同様に、静脈内（ボーラスでも輸液でも）、腹腔内、皮下、閉塞を伴っているか、または伴っていない局所、または筋肉内の剤形で、全て製剤技術者に周知の剤形を用いて、それらを投与することもできる。
【０１４１】
本発明の化合物を１日１回の用量で投与するか、または１日の全投薬量を１日２回、３回または４回の分割用量で投与するのが有利であるかもしれない。更にまた、適当な鼻腔内媒体の局所使用を介して鼻腔内剤形で、または、当業者に周知の経皮性皮膚パッチの形態を用いて経皮径路で、本発明の化合物を投与することができる。経皮送達系の形態で投与するためには、投薬プログラムを通して、投薬は当然間欠的ではなく連続的になると思われる。
【０１４２】
投薬が別々に処方されている複数の活性剤を用いる併用療法に対しては、各活性剤を同時に投与するか、または時間をずらしてそれらを投与することができる。
【０１４３】
本発明の化合物を利用する投薬プログラムは、患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療すべき状態の重度；投与径路；患者の腎、肝および心血管機能；および使用する特定の化合物を含む様々な要因に応じて選択される。平均的技量の医師または獣医であれば、病状の進行を防止、阻止または抑止するのに必要な有効量の薬物を容易に決定し、処方することができる。毒性なしに効力を示す範囲内に、薬物濃度を最適な精度で実現するためには、標的部位に対するその薬物利用性動態学に基く投薬プログラムが必要である。これには、薬物の分布、平衡、および消失に関する考察が必要である。
【０１４４】
以下の実施例を、本発明を例示するために提供するが、制限するために提供するものではない。
【０１４５】
実施例１
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（ＤｖＧｌｕＣｌ１）およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（ＤｖＧｌｕＣｌ２）をコードするｃＤＮＡ分子の分離および発現
マダニＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｃＤＮＡライブラリーの生成：５’ＥｃｏＲＩ−３’ＸｈｏＩインサートとしてクローニングされる、オリゴ（ｄＴ）がプライマーのＺＡＰ  ｃＤＮＡライブラリーを生成するために、ＰｏｌｙＡ＋ＲＮＡをＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒマダニの全虫から精製した。そのライブラリーは、増幅する前に約１．８×１０６個の独立したクローンから成っていた。ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃＤＮＡ合成キットおよびＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）  ｃＤＮＡ  ＧＩＧＡＰＡＣＫＩＩＩゴールドクローニングキットをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し、その製造会社の教示に従って使用した。
【０１４６】
Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子のライブラリー検索および分離：２種のＤＮＡプローブを使用した。
【０１４７】
１．第１プローブは、マダニＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓのＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１（ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１）に由来し、プライマーとして、ｉ）センス鎖５’ＣＧＧ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ３’（配列番号８）、およびｉｉ）アンチセンス鎖５’ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  Ｇ−３’（配列番号９）を用いて、それをＰＣＲ増幅することによって、ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １読み取り枠の４４８位から１６４５位までのヌクレオチド断片を生成した。ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１プローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである。
【０１４８】
【化６】
0005134750.tif 000012
【０１４９】
２．第２プローブは、マダニＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓのＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２クローン（ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２）遺伝子に由来し、プライマーとして、ｉ）センス鎖５’ＴＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ３’（配列番号１１）、およびｉｉ）アンチセンス鎖５’ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＧＧ３’（配列番号１２）を用いて、それをＰＣＲ増幅することによって、ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ２読み取り枠の１６６位から１３１５位までのヌクレオチド断片を生成した。ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１プローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである。
【０１５０】
【化７】
0005134750.tif 000013
【０１５１】
ＰＣＲ用のＶｅｎｔ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅをＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）から購入した。各増幅サイクルは、９５℃、１分間、７２℃、１分間、および７２℃、１分間から成っていた。３５サイクルの後、最後に７２℃で５分間延長した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製し、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、生成したＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１（配列番号１１）プローブを、先ずＤｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｃＤＮＡライブラリーの組換え体約５．５×１０５の検索に使用した。ハイブリッド形成は、６×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、１０×デンハルト溶液、サケ精子ＤＮＡ（２００μｇ／ｍｌ）および４５％ホルムアミド中、４２℃で行った。次いで、各膜をｉ）２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、室温で１５分間、およびｉｉ）０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、４２℃で３０分間、各２回洗浄後、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、５５℃で３０分間、１回洗浄した。ＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１プローブを、ｉ）０．０５Ｍ  ＮａＯＨ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液中、約１時間インキュベートし、次いでｉｉ）０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ：Ｃｌ（ｐＨ７．４）溶液中、約１時間インキュベートし、次いでｉｉｉ）１×ＳＳＰＥ中、全て室温で濯ぐことによって、各膜から除去した。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２を含む８種のポジティブクローンを始めの検索で確認した。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１は両プローブで確認されたが、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２はＲｓＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ２プローブだけで認めた。６種の全インサートをファージから切出し、製造業者の処方（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクターに転換し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列決定した。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１  ｃＤＮＡインサートは３５９８ｂｐであって、図１Ａ〜Ｃに開示され、配列番号１として開示されている。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１１  ｃＤＮＡインサートは３４４２ｂｐであって、図３Ａ〜Ｃに開示され、配列番号３として開示されている。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１  ｃＤＮＡインサートは２１９４ｂｐであって、図４Ａ〜Ｂに開示され、配列番号４として開示されている。最後に、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１０−２  ｃＤＮＡインサートは４０７７ｂｐであって、図６Ａ〜Ｃに開示され、配列番号６として開示されている。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたキャップ構造ＲＮＡの合成：各クローンＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２の読み取り枠（ＯＲＦ）の、開始メチオニン（ＡＴＧ）上流のＴ７プロモーターおよび停止コドン（ＴＡＧ）に続くポリＡ＋テールを追加するために、ＰＣＲ戦略を用いた。フランキングＴ７プロモーターおよびポリＡ＋テールを含んだ増幅ＯＲＦを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応における鋳型として直接使用した（ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ，Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。ＤＮＡ鋳型を除去した後、ヌクレアーゼ非含有水で体積を１００μｌに調節し、Ｇ−５０セファデックスカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてＲＮＡを精製した。溶出液を同体積のフェノール／クロロホルムで抽出後、クロロホルムで２回目の抽出を行い、イソプロピルアルコールで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中に再懸濁させることによって、保存濃度を１μｇ／μｌにした。
【０１５３】
実施例２
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１クローンの機能性発現
アフリカツメガエル  ｌａｅｖｉｓの卵母細胞を調製し、以前に記載の標準的方法［Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．＆Ｃｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０，３６８−３７４（１９９１）；Ａｒｅｎａ，Ｊ．Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．，Ｐａｒｅｓｓ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊ．Ｍ．＆Ｃｕｌｌｙ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１５，３３９−３４８（１９９２）］を用いてそれに注入した。成体雌アフリカツメガエル  ｌａｅｖｉｓを０．１７％トリカインメタンスルホン酸で麻酔し、その卵巣を外科的に除去し、次の成分（ｍＭ）からなる溶液中に入れた：ＮａＣｌ  ８２．５、ＫＣｌ  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＨＥＰＥＳ  ５、ピルビン酸Ｎａ  ２．５、ペニシリンＧ  １００，０００ユニット／Ｌ、硫酸ストレプトマイシン  １０００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．５（Ｍｏｄ．ＯＲ−２）。卵巣葉を開き破り、Ｍｏｄ．ＯＲ−２中で数回濯ぎ、軽く振とうしながら室温で、Ｍｏｄ．ＯＲ−２中０．２％コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、１型）の中でインキュベートした。１時間後にコラゲナーゼ溶液を更新し、約５０％の卵母細胞が卵巣から放出されるまで、卵母細胞を更に３０〜９０分間インキュベートした。Ｖ期およびＶＩ期の卵母細胞を選択し、注入前の１６〜２４時間の間、次の成分（ｍＭ）を含んだ媒体中に入れた：ＮａＣｌ  ９６、ＫＣｌ  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  １．８、ＨＥＰＥＳ  ５、ピルビン酸Ｎａ  ２．５、テオフィリン  ０．５、ゲンタマイシン  ５０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５（ＮＤ−９６）。卵母細胞に５０ｎｌのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ１またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１  ＲＮＡを濃度０．２ｍｇ／ｍｌで注入した。卵母細胞をＮＤ−９６中、１８℃で１〜６日間インキュベートした後、記録をとった。
【０１５４】
記録は、次の成分（ｍＭ）からなる改変ＮＤ−９６中、室温でとった：ＮａＣｌ  ９６、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  ０．１、ＢａＣｌ２  ３．５、ＨＥＰＥＳ  ５、ｐＨ７．５。マッキントッシュ７１００／８０コンピュータにインターフェースで接続したＤａｇａｎ  ＣＡ１二微小電極増幅器（Ｄａｇａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、卵母細胞を電位クランプした。電流通過電極は０．７Ｍ  ＫＣｌ、１．７Ｍ  クエン酸Ｋで満たし、電位記録電極は１Ｍ  ＫＣｌで満たした。実験の間中、卵母細胞に、改変ＮＤ−９６（対照溶液）、またはチャネル活性化剤および阻止剤の可能性がある物質を含むＮＤ−９６を約３ｍｌ／分の速度で注いだ。ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のパルスソフトウェアを用いて、データを１００Ｈｚで取得し、３３．３Ｈｚでフィルタにかけた。全ての記録を、０または−３０ｍＶのいずれかの保持電位で行った。
【０１５５】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １（図９）またはＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（図１０）を発現する卵母細胞は、１μＭのリン酸イベルメクチンの施用に反応してゆっくりと活性化される電流を示した。リン酸イベルメクチンを洗い落としたとき、この電流は不可逆性であった。それに対し、１ｍＭのグルタミン酸の施用では電流が活性化されなかった。
【０１５６】
実施例３
哺乳類細胞におけるＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌクローンの機能性発現
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを哺乳類発現ベクター中にサブクローニングし、選択した哺乳類細胞にトランスフェクトするために使用することができる。Ｇ４１８の存在下での増殖によって、安定な細胞クローンを選択する。Ｇ４１８耐性単一種クローンを分離し、無傷のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ遺伝子の存在を確認するために試験をする。次いで、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを含んだクローンを、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質特異抗体を用いた免疫沈降、ウェスタンブロット、免疫蛍光等の免疫学的技法を用いて、発現について分析した。抗体は、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ配列から予測されるアミノ酸配列から合成したペプチドを接種したウサギから得られる。パッチクランプ電気生理学法および陰イオンフラックスアッセイによっても、発現は分析される。
【０１５７】
活性なチャネルタンパク質の発現を試験するために、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを安定に、または一時的に発現している細胞が使用される。これらの細胞は、各チャネルを調節、阻害または活性化する化合物の能力を確認し、調べるために、使用される。
【０１５８】
プロモーターに対してポジティブな方位にＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを含むカセットは、プロモーターの３’に対して適当な制限部位中に連結され、制限部位地図作製および／または配列決定によって確認される。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、繊維芽細胞性宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１６５１）、およびＣＶ−１ｔａｔ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５）、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ６３６２）中に、エレクトロポレーションまたは化学的手順（陽イオンリポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むが、それらに限らない標準的方法で導入してもよい。トランスフェクトした細胞および細胞培養液上清を回収し、本明細書に記載のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ発現の分析をすることができる。
【０１５９】
哺乳類細胞での一時的発現に使用するベクターは全て、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを発現する安定な細胞系を樹立するために使用することができる。発現ベクター中にクローニングされた未改変のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築体は、宿主細胞がＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質を産生するようにプログラムすると予想される。トランスフェクション宿主細胞は、ＣＶ−１−Ｐ（Ｓａｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５）、ｔｋ−Ｌ（Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．、１９７７，Ｃｅｌｌ  １１：２２３）、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１）を含むが、それらに限らない。
【０１６０】
Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂ  ホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グァニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼを含むが、それらに限らない薬物選択プラスミドによる、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを含んだベクターの同時トランスフェクションは、安定にトランスフェクトされるクローンの選択を可能にすると思われる。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのレベルは、本明細書に記載の試験によって定量化される。可能な限り多量のＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを合成する哺乳細胞クローンを作製するために、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築体を、増幅可能な薬物耐性マーカーを含んだベクター中に連結してもよい。これらの構築体を細胞に導入後、プラスミドを含むクローンを適当な作用剤で選択し、その作用剤の用量増加による選択によって、高コピー数のプラスミドを有する過剰発現クローンの分離が実現する。組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現は、完全長ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡの哺乳類宿主細胞へのトランスフェクションによって実現される。
【０１６１】
実施例４
昆虫細胞中での発現を目的とした、バキュロウィルス発現ベクター中へのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウィルスのゲノム由来のバキュロウィルスベクターを、昆虫細胞のＳｆ９系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＃１７１１）内で高水準のｃＤＮＡ発現量をもたらすように設計する。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウィルスは、次の標準的方法（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｘｂａｃマニュアル）によって作製される。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡ構築体を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を含む多様なバキュロウィルス移入ベクター中のポリヘドリン遺伝子中に連結する。組換えバキュロウィルスは、バキュロウィルス移入ベクターおよび線状化ＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ（Ｋｉｔｔｓ，１９９０，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７）の、Ｓｆ９細胞中への同時トランスフェクション後に起こる相同的組換えによって作製される。組換えｐＡＣ３６０ウィルスは、感染細胞中に封入体がないことによって確認され、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウィルスは、ｂ−ガラクトシダーゼの発現に基いて確認される（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５）。プラークの精製後、本明細書に記載の試験によってＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ発現を測定する。
【０１６２】
ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌに対する読み取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位中に挿入する。ポジティブ方位の構築体を配列分析で確認し、線状ＡｃＮＰＶのマイルドタイプＤＮＡの存在下、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトするために使用する。
【０１６３】
実施例５
酵母発現ベクター中へのＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡのクローニング
異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を指示するように設計した発現ベクター中に、最適なＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ｃＤＮＡシストロンを挿入した後、組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌが酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に産生される。細胞内発現の場合には、ＥｍＢＬｙｅｘ４やその類似体等のベクターをＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌシストロンに連結する（Ｒｉｎａｓ，ｅｔ  ａｌ．、１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５４３〜５４５；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９〜４１９２）。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母または哺乳類ペプチド）をＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質のＮＨ２末端に融合する酵母発現ベクター中に、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌシストロンを連結する（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，１９８９，Ｇｅｎｅ  ８５：５１１〜５１６；Ｒｉｅｔｔ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌｏｎ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１〜２９４９）。
【０１６４】
これらのベクターは、ヒト血清アルブミンシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するｐＡＶＥ１−６（Ｓｔｅｅｐ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２〜４６）、およびヒトリゾチームシグナルを発現するｃＤＮＡに融合するベクターｐＬ８ＰＬ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８〜２７３２）を含むが、それらに限らない。その上、ベクターｐＶＥＰを利用して、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌはユビキチンと複合した融合タンパク質として酵母中に発現する（Ｅｃｋｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５〜７７１９；Ｓａｂｉｎ，１９８９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７０５〜７０９；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，１９８９，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５５１７〜５５２３（１９８９））。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの発現量は、本明細書に記載の試験によって決定される。
【０１６５】
実施例６
組換えＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌの精製
抗体親和性クロマトグラフィによって、組換え産生ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを精製し得る。ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ抗体親和性カラムは、抗ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するように、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルで予備活性化したゲル支持体のＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に、その抗体を添加することによって作製される。次いで、スペーサーアームを有するアミド結合を介して、抗体をゲルに連結する。次いで、残っている活性化エステルを１Ｍ  エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で消失させる。そのカラムを水、次いで０．２３Ｍ  グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄することによって、非複合抗体や異物タンパク質を除去する。次いで、洗剤等の適当な膜溶解剤と共に、カラムをリン酸緩衝塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、可溶化ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌを含む細胞培養液上清または細胞抽出液を、ゆっくりとカラム中に通過させる。次いで、光学密度（Ａ２８０）がバックグランド値に下がるまで、カラムを洗剤と共にリン酸緩衝塩水で洗浄し、次にタンパク質を洗剤と共に０．２３Ｍ  グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出する。次いで、精製ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質をリン酸緩衝塩水に対して透析する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  配列番号１に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｂ】  配列番号１に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １のヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ｃ】  配列番号１に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２】  配列番号２に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ａ】  配列番号３に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図３Ｂ】  配列番号３に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図３Ｃ】  配列番号３に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４Ａ】  配列番号５に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図４Ｂ】  配列番号５に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のヌクレオチド配列を示す図である。
【図５】  配列番号５に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図６Ａ】  配列番号６に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図６Ｂ】  配列番号６に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図６Ｃ】  配列番号６に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのｃＤＮＡクローン、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のヌクレオチド配列を示す図である。
【図７】  配列番号７に示したＤ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌのタンパク質、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図８】  ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １（配列番号２）、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １１（配列番号２）、ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１（配列番号５）およびＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １０−２（配列番号７）の各タンパク質に対するアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図９】  ＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  １  ｍＲＮＡを注入したアフリカツメガエル卵母細胞における電流活性を示す図である。電流活性は１μＭのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【図１０】  アフリカツメガエル卵母細胞中に発現したＤｖＬＧＩＣ／ＧｌｕＣｌ  ７−１のイベルメクチンによる活性を示す図である。電流活性は〜１μＭのリン酸イベルメクチンで最大であった。
【配列表】
0005134750.tif 000014
0005134750.tif 000015
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0005134750.tif 000022
0005134750.tif 000023
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0005134750.tif 000026
0005134750.tif 000027
0005134750.tif 000028
【図１Ａ】
0005134750.tif 000029
【図１Ｂ】
0005134750.tif 000030
【図１Ｃ】
0005134750.tif 000031
【図２】
0005134750.tif 000032
【図３Ａ】
0005134750.tif 000033
【図３Ｂ】
0005134750.tif 000034
【図３Ｃ】
0005134750.tif 000035
【図４Ａ】
0005134750.tif 000036
【図４Ｂ】
0005134750.tif 000037
【図５】
0005134750.tif 000038
【図６Ａ】
0005134750.tif 000039
【図６Ｂ】
0005134750.tif 000040
【図６Ｃ】
0005134750.tif 000041
【図７】
0005134750.tif 000042
【図８】
0005134750.tif 000043
【図９】
0005134750.tif 000044
【図１０】
0005134750.tif 000045