(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾ウマヘルペスウイルスであって、
糖タンパク質ｇＭが、ウイルス−宿主相互作用に関する当該タンパク質の免疫調節的影響に関して非機能的であるように、該タンパク質の遺伝子の少なくとも７０％が存在しないことを特徴とする、ウマヘルペスウイルス。
【請求項２】
ｇＭ遺伝子の少なくとも８０％が存在しないことを特徴とする、請求項１に記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項３】
ｇＭ遺伝子の少なくとも９０％が存在しないことを特徴とする、請求項１に記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項４】
前記タンパク質ｇＭが、該タンパク質ｇＭをコードする遺伝子における削除、変異又は挿入により修飾されている、請求項１〜３のいずれかに記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項５】
前記タンパク質ｇＭをコードする遺伝子が削除され又は修飾され、かつ、ＵＬ９相同体をコードする遺伝子（遺伝子５３）の発現が影響を受けていない、請求項１〜４のいずれかに記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項６】
ウイルス株ＥＨＶ−１  Ａｂ４ｐについて９３２５４〜９４２６４番のヌクレオチド、又は、その他のＥＨＶ株における対応のヌクレオチドが削除されている、請求項１〜５のいずれかに記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項７】
ＥＣＡＣＣに受託番号９９１０１５３６で寄託された、ウマヘルペスウイルス株ＨΔｇＭ−３ｂ１。
【請求項８】
１型又は４型ウマヘルペスウイルスである、請求項１〜７のいずれかに記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項９】
１以上の異種遺伝子を有する、請求項１〜８のいずれかに記載のウマヘルペスウイルス。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のウマヘルペスウイルスをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のウマヘルペスウイルスを含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物製造のための請求項１〜９のいずれかに記載のウマヘルペスウイルスの使用。
【請求項１４】
医薬組成物製造のための請求項１０に記載の核酸の使用。
【請求項１５】
ウマヘルペスウイルスワクチンにより誘導される、野生型ウイルス感染に対する非ヒト動物の免疫応答を改善する方法であって、該ワクチンが請求項１〜９のいずれかに記載のウマヘルペスウイルスを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
非ヒト動物の予防及び／又は治療方法であって、請求項１１又は１２記載の医薬組成物を該動物へ適用する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ウマヘルペスウイルス（Equine Herpes Viruses）（ＥＨＶ）であって、タンパク質ｇＭが本質的に存在しない、又は、ｇＭが修飾されかつその免疫調節能力について非機能性であるものに関する。本発明の更なる側面は、前記ウイルスをコードする核酸、前記ウイルス又は核酸を含む医薬組成物及びこれらの使用に関する。更に本発明は、ＥＨＶワクチンにより誘導される、野生型ＥＨＶ感染に対する免疫応答を改善する方法、ＥＨＶ感染の予防及び治療方法、並びに、野生型ＥＨＶに感染した動物と本発明のＥＨＶで処置した動物とを識別する方法に関する。
発明の背景
ウマヘルペスウイルス１（ＥＨＶ−１）は、アルファヘルペスウイルス（Alphaherpesvirinae）のメンバーであり、ウマ科動物におけるウイルス誘導性流産の主な原因であり、呼吸器疾患及び神経疾患を引き起こす。ＥＨＶ−１  Ａｂ４ｐ株の全ＤＮＡ配列が決定されている（Telford, E.A.R.ら, 1992）。しかしながら、わずか数個の遺伝子及び遺伝子産物のみが、ＥＨＶの病原性に対しての関連性が特徴付けられている。
ＥＨＶ−１感染のコントロールのために、２つの異なるアプローチが続いている。第一のアプローチとして、修飾生ワクチン（modified live vaccines）（ＭＬＶｓ）が開発されている。ＭＬＶｓは、ＲａｃＨ株を含んでおり（Mayr, A.ら, 1968; Hubert, P.H.ら, 1996）、ヨーロッパ及びアメリカで広範に使用されている。第二のアプローチとして、不活性化ワクチン及び独立して発現したウイルス糖タンパク質が、その免疫原性及び保護の可能性について評価されている。組換えバキュロウイルスを使用して発現した糖タンパク質の中には、糖タンパク質（ｇ）Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＨがあり、これらはマウスモデルにおけるその後の攻撃的ＥＨＶ−１感染に対して部分的保護を誘導する（Awan, A.R.ら, 1990; Tewari,D.ら, 1994: Osterrieder, N.ら, 1995; Stokes, A.ら, 1996）。しかしながら、ＭＬＶｓの使用は、死菌及びサブユニットワクチンに対して利点を有する。ＭＬＶｓは、疾患に対する保護について最も責任を負うであろう細胞媒介性免疫応答の誘導において効率が高い（Allen, G.P.ら, 1995; Mumford, J.A.ら, 1995）。
【０００２】
ヘルペスウイルスの糖タンパク質は、感染の初期段階、細胞からのウイルス粒子の放出、及び、隣接する細胞の融合によるウイルス粒子の細胞から細胞への直接的伝播に重大に関連している。現在までに、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）によりコードされる１１の糖タンパク質が同定され、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ及びｇＭと命名されている。ｇＣ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＩ、ｇＪ及びｇＭを欠くＨＳＶ−１変異体は生存可能である。このことは、これらの遺伝子は培養細胞中における複製にとって不必要であることを示している。ＨＳＶ−１とウマヘルペスウイルス１とのヌクレオチド配列の比較は、既知の全てのＨＳＶ−１糖タンパク質がＥＨＶ−１において保存されていることを明らかにした。現在の命名法にしたがうと、これらの糖タンパク質は、ＨＳＶ−１相同体の名称により命名されている。ＥＨＶ−１  ｇＣ、ｇＥ及びｇＩは細胞培養中での増殖にとって必須ではないが、ｇＢ及びｇＤは、培養細胞におけるウイルス増殖にとって必須である。その他のＥＨＶ−１糖タンパク質の培養細胞中での複製に対する寄与は未知である（Flowers, C.C.ら, 1992）。ＥＨＶ−１の６つのエンベロープ糖タンパク質が、λｇｔ１１発現ライブラリー及び精製ＥＨＶ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡＢｓ）を使用してマッピングされた（Allen, G.P.ら, 1987）。更に、転写及びタンパク質の分析は、糖タンパク質ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＧ、ｇＨ及びｇＫがＥＨＶ−１感染細胞において発現していることを示している。糖タンパク質ｇＭ（遺伝子ＵＬ１０によりコードされる。［Baines, J.D.ら, 1991; Baines, J.D.ら, 1993］）は、詳細に分析された最も新しいＨＳＶ−１糖タンパク質である。全てのヘルペスウイルスサブファミリーにおいて保存され、かつ、ヒト及びマウスのサイトメガロウイルス並びにガンマヘルペスウイルスメンバーＥＨＶ−２、ヘルペスウイルスサイミリ並びにエプスタイン・バーウイルスについて記載されている非必須糖タンパク質が報告されている。多数のヘルペスウイルス糖タンパク質と同様に、ＨＳＶ−１  ｇＭはウイルス粒子及び感染細胞の膜に存在する。ｇＭのみを欠くＨＳＶ−１変異体は、野生型ウイルスと比較して約１０倍低下した力価まで増殖し、マウスモデルにおいて減少した病原性を示した（Baines, J.D.ら, 1991; MacLean, C.A.ら, 1993）。ＥＨＶ−１  ｇＭ相同体（ｇｐ２１／２２ａ、以下、ＥＨＶ−１  ｇＭとする）は、Allen及びYeargan（Allen, G.P.ら, 1987）により最初に記載され、ウイルスエンベロープの主成分であることが示された。更なる研究により、ＨＳＶ−１  ＵＬ１０に相同な遺伝子である遺伝子５２は、４５０アミノ酸のＥＨＶ−１  ｇＭポリペプチドをコードすることが明らかになった（Pilling, A.ら, 1994; Telford, E.A.R.ら, 1992）。ＥＨＶ−１  ｇＭは、８つの予想される膜貫通ドメインを含む複合（multiple）疎水性タンパク質を表し、感染細胞及び精製ウイルス粒子中にＭr４５０００のタンパク質として存在することが報告されている（Pilling, A.ら, 1994; Telford, E.A.R.ら, 1992）。
１９９６年、Osterriederらは、ＥＨＶ−１株ＲａｃＬ１１  ｇＭ遺伝子（オープンリーディングフレーム５２）に挿入された大腸菌（Escherichia coli）ｌａｃＺ遺伝子を有するウイルス変異体（Ｌ１１ΔｇＭ）の侵入特性と親ＥＨＶ−１  ＲａｃＬ１１の侵入特性とを比較した実験より、ＥＨＶ−１  ｇＭは、ウイルスの標的細胞への侵入及び細胞から細胞へのウイルスの伝播において重要な役割を果たしていると結論付けた。１９７７年、Neubauerらは、免疫化マウスの脾臓におけるウイルス中和抗体及びＥＨＶ−１特異的Ｔ細胞の評価による証明により、前記ｇＭのＥＨＶ−１挿入変異体が弱毒化されること及び感染防御免疫を誘発することを証明した。
本発明の根底となる技術的課題は、ＥＨＶ感染の予防及び治療に使用するとき、有意に改善された免疫原性特性を示す、新規な修飾ウマヘルペスウイルスを提供することである。
【０００３】
発明の開示
前記の技術的課題の解決手段は、特許請求の範囲において特徴付けられる記載及び態様により達成される。
驚くべきことに、タンパク質ｇＭが本質的に存在しない、又は、前記タンパク質が修飾され、これにより推定される免疫調節能力に関して非機能的にされる場合、ウマヘルペスウイルスに関連する感染防御免疫が測定可能な程度に改善されることが見出された。それゆえ、タンパク質ｇＭがＥＨＶの免疫原性特性を調節することが初めて証明された。興味深いことに、前述のウイルス変異体Ｌ１１ΔｇＭ及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓも、親株ＲａｃＬ１１及びＲａｃＨの免疫原性特性を誘発する。文献Osterriederら, 1996及びNeubauerら, 1997の著者は、その当時、利用可能な抗体を用いてＨΔｇＭ−Ｉｎｓウイルスに対するｇＭを検出していなかったが、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ変異体は、ｇＭ産生親株に類似の免疫調節ポテンシャルを示す。これは、おそらく、本明細書で開示される実施例におけるウエスタンブロット分析により証明されるように、ＬａｃＺ挿入物にもかかわらずＨΔｇＭ−Ｉｎｓにおいて発現するｇＭの残り部分によるものであろう。それゆえ、ｇＭの残り部分は、ｇＭの免疫調節作用の原因であるに違いない。結果的に、本発明は、タンパク質ｇＭが本質的に存在しない、又は、前記タンパク質が修飾されかつウイルス宿主において、ＥＨＶの免疫調節能力に関して非機能的であるＥＨＶを最初に提供するものである。
一つの側面において、本発明は、ウマヘルペスウイルスであって、タンパク質ｇＭが本質的に存在しないウイルスに関する。
等しく重要な別の側面において、本発明は、前記タンパク質が修飾されかつ非機能的であるウマヘルペスウイルスに関する。
用語「本質的に存在しない」が、本明細書で使用される。これは、必須タンパク質ＵＬ９相同体に対する隣接遺伝子（遺伝子５３）の位置、その配向がタンパク質ｇＭをコードする遺伝子と重複し、それ故、ｇＭ遺伝子の最小のヌクレオチド配列が残り、遺伝子５３の発現を許容し、これによりウイルスの生存度を保持しなければならないからである。一つの好ましい態様は、ｇＭ遺伝子の少なくとも７０％が存在しないＥＨＶを意味し、より好ましい態様では、ｇＭ遺伝子の少なくとも８０％が存在しないＥＨＶが特許請求され、最も好ましい態様では、ｇＭ遺伝子の少なくとも９０％が存在しないＥＨＶが特許請求される。
【０００４】
用語「非機能的」タンパク質ｇＭとは、ウイルス−宿主相互作用に関するタンパク質の免疫調節的影響に関して理解されるべきものである。機能的ｇＭを発現するその他のＥＨＶ株と比較したときの、本発明のＥＨＶの免疫原性特性の差異は、家畜ウイルス学分野の当業者によって利用可能な標準動物モデルにより決定することができる。ＥＨＶがｇＭを機能的又は非機能的に産生するか否か決定する１つの可能な手順は、実施例１に提供される。前記手順は、完全かつ修飾されていない機能的タンパク質ｇＭを発現する点でのみ相違する株との比較において、興味の対象となる修飾ＥＨＶ株の免疫調節能力における差異を決定するための１つの正確かつ単純な実験準備を提供する。実施例１に記載される手順は特に適している。なぜなら、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＨＶ株の挙動は、天然宿主における個々のウイルスの挙動と相関するからである（Mayr, A.ら, 1968; vanWoensel, P.A.M.ら, 1995; Colle, C.F.ら, 1996; Hubert, P.H.ら, 1996; Matsumura, T.ら, 1996）。
ＥＨＶからタンパク質ｇＭを削除する又は当該タンパク質を非機能的にするために、種々のアプローチが可能である（Sambrook, J.ら, 1989）。非限定的な例には、タンパク質ｇＭをコードする遺伝子における削除、変異又は挿入が含まれる。前記ウイルスから対応する完全又は部分ヌクレオチド配列の削除は、ｇＭタンパク質の完全な非存在又は非機能的発現という結果を招くことができる。同様の結果は、遺伝子又はその調節領域内のヌクレオチド配列を変異させる又は更にヌクレオチドを挿入することによっても達成することができる。前述の両方の側面の好ましい態様において、本発明は、タンパク質ｇＭをコードする遺伝子における削除、変異又は挿入により修飾された本発明のＥＨＶに関する。
ｇＭ  ＯＲＦは、ＵＬ９  ＯＲＦ及びプロモーター配列と重複する（位置９４３８９〜９７０５２、Ｏｒｉ−結合タンパク質。Telfordら, 1992）。ＵＬ９  ＯＲＦによりコードされるタンパク質は、ＨＳＶ−１について例示様式（examplary manner）で示されるようにウイルス増殖に必須である（Carmichaelら, 1988: Malikら, 1992）。それゆえ、より好ましい態様において、本発明は、タンパク質ｇＭをコードする遺伝子が削除又は修飾されているが、ＵＬ９相同体をコードする遺伝子（遺伝子５３）の発現は影響を受けていないことを特徴とする本発明のＥＨＶに関する。用語「影響を受けていない」とは、ＵＬ９の特定の量的又は質的性質に関するものではなく、単に、前記タンパク質がウイルスによって発現され、ウイルスの生存にとって本質的に十分な量で存在している限り、遺伝子の発現が影響を受けていないことを意味する。
【０００５】
本発明は、本発明を実施するための最も好ましいＥＨＶであって、例示様式においてウイルス株ＥＨＶ−１  Ａｂ４ｐ（Telford, E.A.R.ら, 1992）について９３２５４〜９４２６４番目のヌクレオチド又はその他の株における対応部分が削除されているＥＨＶを開示する。全体で１３５２ヌクレオチドからなるｇＭ  ＯＲＦのうち１０１０ヌクレオチドの削除は、全ての検出可能なｇＭペプチドの本質的な不存在を生じさせる。ｇＭ遺伝子のヌクレオチドのほとんど完全な削除は、ｇＭタンパク質誘導体を本質的に発現せず、これによりその他全てのＥＨＶ−１遺伝子の発現が影響を受けていない生存可能なウイルスを生じさせる。この特定の削除はＵＬ９  ＯＲＦの発現に影響しない。
前記のヌクレオチド位置は、Telfordら, 1992により番号が付けられたＥＨＶ−１  株Ａｂ４ｐについて参照されるものである（GenBank/EMBLデータライブラリー（受託番号M86664））。これらのヌクレオチド位置は、Ａｂ４ｐ  ＥＨＶ−１について定義される正確な位置に限定されるものではなく、単に、これらの位置に存在するヌクレオチド又はその他のＥＨＶ株のｇＭ遺伝子の対応のヌクレオチド位置を示すために使用されるものである。異なるＥＨＶウイルスについて、好ましい核酸の位置の番号付けは異なっていてもよく、アルファヘルペスウイルスファミリーウイルスの分子生物学分野の当業者は、前記配列の他のヌクレオチドに対する位置により、好ましいヌクレオチドを容易に同定することができるだろう。ウイルスの生存度について、ｇＭ遺伝子に隣接する遺伝子が機能的に発現することが重要である。
本発明の最も好ましいＥＨＶ株は、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures, ソールズベリー、英国）に受託番号９９１０１５３６で寄託されたＥＨＶ−１株ＨΔｇＭ−３ｂ１である。
本発明は、１型及び４型のＥＨＶに特に適している。なぜなら、両方の型は非常に密接に関連しているからである（Telford, E.A.R.ら, 1992及び1998）。
本発明のＥＨＶは、遺伝子治療、一般的に異種物質の運搬、及び、特に生ワクチンにおける使用のための外来抗原の運搬に対して特に有用である（異種ベクターとしてのＥＨＶについては、ＥＰ５０７１７９、ＷＯ９８２７２１６、ＷＯ９４００５８７及びＷＯ９８２７２１６を参照のこと）。本発明のＥＨＶが動物中で異種物質を発現するとき、ｇＭに関連する免疫学的特性について影響はない。免疫学的に関連する特性を有する抗原が、それに対応するヌクレオチド配列を本発明のウイルスのＥＨＶゲノムに挿入した後に発現するとき、ＥＨＶは、その他の病原体に対する免疫化に特に適している。ヘルペスウイルスベクターワクチンは最先端技術である（Schmitt, J.ら, 1999, Peeters, B.ら, 1997, Yokoyamaら, 1998を参照）。それゆえ、好ましい態様において、本発明は、１以上の異種遺伝子を運搬する本発明のＥＨＶに関する。
【０００６】
本発明の更なる側面は、本発明のＥＨＶをコードする核酸に関する。本発明の核酸は、ＥＨＶの更なる修飾又は本発明のＥＨＶの組換え体産生に有用である。本発明の核酸は、核酸をベースとするワクチンの生成にも有用である。
修飾した非機能的ｇＭを発現する又はｇＭを全く発現しないＥＨＶに関連する改善された免疫学的特性のために、本発明のＥＨＶは、ＥＨＶ感染の予防及び治療用の医薬組成物における活性成分として特に適している。それゆえ、更なる側面において、本発明は、本発明のＥＨＶを含む医薬組成物に関する。
本発明のヌクレオチドは、ＤＮＡベクターワクチンの製造についても有用である。これらのワクチンにおいて、本発明のヌクレオチドは動物へ直接的に適用、又は、オリジナルのウイルス以外のベクターを介して間接的に適用される。ヌクレオチドワクチン及びベクターワクチンは、当該技術分野における現状から周知であるので、更なる詳述はしないだろう。
更なる態様において、本発明は、本発明の核酸を含む医薬組成物に関する。更に本発明は、本発明のＥＨＶを含む医薬組成物に関する。
実証目的でのみ与えられる、本発明のＥＨＶを含む医薬組成物の一つの非限定的な例は、以下の様にして製造されるだろう。感染細胞培養の細胞培養物上清と安定剤（例えば、スペルミジン及び／又はＢＳＡ（ウシ血清アルブミン））とを混合し、続いて混合物を凍結乾燥又はその他の方法により脱水する。ワクチン接種の前に、前記の混合物を水性溶液（例えば、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水））又は非水性溶液（例えば、油乳濁液、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和する。
ＥＨＶ及びそのヌクレオチドは、医薬組成物製造のための使用に特に適している。
「医薬組成物」は、生きている生物又はその表面に投与したときに、その生物の生理機能、例えば免疫機能を修飾することができる１以上の成分、例えば抗生物質又は駆虫剤（ただし、これらに限定されるものではない）、並びに、その他の特定の目的、例えば、腸管内又は腸管外経路、例えば経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内又はその他の適切な経路により特性、不妊性（sterility）、安定性、実行可能性を加工して組成物を投与する、投与後の耐性、制御された放出特性を達成するために添加されるその他の成分から本質的に構成される。
【０００７】
その他の側面において、本発明は、ウマヘルペスウイルスワクチンにより誘導される、野生型ウイルス感染に対する免疫応答を改善する方法であって、前記ワクチンが本発明のウマヘルペスウイルスを含むことを特徴とする方法を提供する。
更なる側面は、動物の予防及び／又は治療方法であって、本発明の医薬組成物を前記動物に適用することを特徴とする方法に関する。
現在の生ＥＨＶワクチンの別の側面は、野生型ウイルスから識別される能力である。本発明のＥＨＶは、野生型分離株に由来する１つの重要な特性において少なくとも異なっている。本発明のＥＨＶは有意に修飾されたｇＭタンパク質を提供する。ｇＭは、本質的に存在しないか、又は、その特異的抗原性標的が野生型ウイルスのｇＭとは十分に異なる程度に修飾されている。
一つの好ましい態様は、野生型ウマヘルペスウイルスに感染した動物と本発明の修飾ウマヘルペスウイルスで処置した動物とを識別する方法であって、野生型ウイルスのタンパク質ｇＭの同一性又は修飾ウイルスにおける発現したタンパク質ｇＭの同一性若しくはその本質的な非存在が確立されることを特徴とする方法に関する。
より好ましい態様は、前記の方法であって、
ａ）興味の対象となるサンプルを、単離したｇＭ又はその修飾誘導体に添加する工程、
ｂ）前記単離ｇＭタンパク質又はその修飾誘導体に特異的な抗体を添加する工程、及び、
ｃ）前記抗体の結合を決定する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
もっとも好ましい態様は、野生型ウマヘルペスウイルスに感染した動物と本発明の修飾ウマヘルペスウイルスで処置した動物とを識別する方法であって、野生型ウイルスタンパク質ｇＭをコードする核酸と修飾ｇＭタンパク質をコードする核酸との差異又はその非存在が確立されることを特徴とする方法に関する。
本発明の更なる側面は、野生型ＥＨＶに感染した動物と本発明の修飾ＥＨＶで処置した動物とを識別するための好ましい方法を行うためのキットに関する。１以上の必要な分析ツール、緩衝液、マーカー及び読み出しツール、溶媒並びに機械装置を１つの便利なキット中に含んでいることが好ましい。好ましい特定の分析ツールは、単離された野生型タンパク質ｇＭ、単離された修飾タンパク質ｇＭ、野生型タンパク質ｇＭに特異的な抗体、単離された修飾タンパク質ｇＭに特異的な抗体並びに野生型タンパク質ｇＭをコードするヌクレオチドに結合するヌクレオチド特異的プローブ及び修飾タンパク質ｇＭをコードするヌクレオチドに結合するヌクレオチド特異的プローブである。
【０００８】
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【００１２】
図の凡例
図１：平均体重分析
図１は、攻撃感染の日におけるグループの平均体重に対する百分率で与えられる平均体重を示す。
その他の２つのウイルスと比較したときのＨΔｇＭ−３ｂ１ウイルスの潜在的に有益な効果を分析するために、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化グループ（グループ７〜９）をその他全ての免疫化グループと比較した。なぜなら、ＨΔｇＭ−３ｂ１ウイルスは、糖タンパク質Ｍ（ＡＡ７０〜４０６が欠如している）の本質的に完全な欠如を示すが、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（グループ４〜６）の場合、ｇＭのオープンリーディングフレームがＬａｃＺカセットの挿入により遮られているからである。しかしながら、このウイルス変異体は、ｇＭのオープンリーディングフレームのカルボキシ末端部分（おそらくは、位置２２６のメチオニン残基で開始する）を発現することができる。ＲａｃＨ（グループ１〜３）は、ＨΔｇＭ−３ｂ１及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓの両方の親ウイルスであり、広く使用されるワクチン株を代表する。
ＨΔｇＭ−３ｂ１でワクチン接種した動物は、１０3ＰＦＵでワクチン接種したマウス（グループ９）において、１０3ＰＦＵのＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（グループ６）又は１０3ＰＦＵのＲａｃＨ（グループ３）でワクチン接種したグループと比較して最低の一時的体重減少を有していた。攻撃後の体重減少の防止における用量依存性は、ＨΔｇＭ−３ｂ１でワクチン接種した動物において、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（グループ４〜６）又はＲａｃＨ（グループ１〜３）でワクチン接種したグループと比較して低かった。
図２：ウイルス力価分析
１グループにつき、感染後（ｐ．ｉ．）第１日において２頭、感染後第３日において３頭、感染後第５日において２頭の動物を検死した。マウスの肺を調製し、海砂でホモジナイズし、１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中に懸濁した。肺ホモジネートにおけるウイルス力価は、Neubauerら, 1997に記載されるようにしてプラークアッセイにより決定した。データは、ＨΔｇＭ−３ｂ１での免疫化（グループ７〜９）後、肺組織（それぞれの肺は別々に調製し、個々の肺から得たウイルス力価の平均値を図に示した）から再単離されたＥＨＶウイルスの量は、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ免疫化マウス（グループ４〜６）又はＲａｃＨ免疫化マウス（グループ１〜３）と比較して減少した。この効果は、高い用量（１０4又は１０5ＰＦＵ）でワクチン接種したときよりも、それぞれ最小量の用量（１０3ＰＦＵ）のワクチン接種量においてさえ強かった。特に１０3ＰＦＵの用量でワクチン接種したグループにおいて、５日後のＨΔｇＭ−３ｂ１ワクチン接種動物から再単離されたウイルスの量が、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ又はＲａｃＨワクチン接種マウスと比較して著しく減少したとき、ウイルス血症の期間が短縮した。
【００１３】
図３：ウエスタンブロット分析
（Ａ）抗ｇＢ  ｍａｂ  ３Ｆ６（Allen 及び Yeargan, 1987; Dr. G. Allen, Lexington, Ky, U.S.A.により提供）又は（Ｂ）抗ｇＭ  ｍａｂ  Ａ８（Dr. R.A. Killington, Leeds, UKにより提供）を使用した、感染細胞溶解物のウエスタンブロット分析
細胞溶解液をサンプル緩衝液中に懸濁し、ＳＤＳ−１０％−ＰＡＧＥにより直ちに分離した。タンパク質をニトロセルロースシートに移し、ｍａｂと共にインキュベートし、「材料と方法」の欄で詳述するようにして検出した。レーン１：ＲａｃＨ感染細胞。レーン２：ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（挿入変異体）感染細胞。レーン３：ＨΔｇＭ−３ｂ１感染細胞。レーン４：Ｒｋ１３細胞についてＨΔｇＭ−３ｂ１の２回目のパッセージ（passage）をうけた感染細胞。パネルＡにおいて、ＲａｃＨ、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ及びＨΔｇＭ−３ｂ１感染細胞における特異的同定は、感染細胞におけるタンパク質発現及びウイルス複製を明瞭に示した。ｇＢのダイマー及びオリゴマーははっきりと可視することができ、このことは適切な糖タンパク質プロセシングを示している。パネルＢにおいて、モノクローナル抗体Ａ８は、ＲａｃＨ感染細胞において予想される見かけの分子量を有するｇＭタンパク質を検出した（レーン１）。ＨΔｇＭ−Ｉｎｓにおいて、オープンリーディングフレームは、挿入されたｌａｃＺ遺伝子により遮られている。したがって、特異的に同定されたｇＭタンパク質は低い見かけの分子量を有していた（レーン２）。ＨΔｇＭ−Ｉｎｓにより発現したｇＭタンパク質のウエスタンブロットシグナルの強度は、ＲａｃＨ感染細胞で得られたシグナルと比較可能である。このことは、トランケーション（truncation）は、感染細胞におけるｇＭタンパク質発現の破棄又はタンパク質の即時分解の結果ではないことを明瞭に示している。更に、ｇＭのカルボキシ末端部分は、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓの場合に発現していると考えられる。なぜなら、Ａ８抗体は、ｇＭカルボキシル末端の親水性部分に対して向けられているからである。前述の通り、レーン３及び４において、ＨΔｇＭ−３ｂ１の対応ヌクレオチド配列の削除後に予想されるＨΔｇＭタンパク質は検出することができなかった。
【００１４】
材料及び方法（ウエスタンブロット分析）：
ウエスタンブロット分析について、感染細胞溶解液を、ＢＣＡ（登録商標）アッセイ（Pierce）を使用して等しいタンパク質濃度に調整し、サンプル緩衝液中に懸濁した（終濃度５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８；３．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；５％  ２−メルカプトエタノール；１０％グリセロール）。手順の間中、サンプルを氷中に維持し、加熱しなかった。タンパク質を、不連続ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（Laemmli, 1970）により分離し、半乾燥法（Kyhse-Andersen, 1984）によりニトロセルロース膜（Schleicher & Schull）へ移した。移した後、膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ−Ｔ）の１０％  スキムミルク中、４℃で１６時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ−Ｔを用いた室温下で１０分間の洗浄を２回行い、その後、抗−ｇＢモノクローナル抗体（ｍａｂ）３Ｆ６（Allen and Yeargan, 1987）又は抗−ｇＭ  ｍａｂ  Ａ８（Day, 1999）を、ＰＢＳ−Ｔ中の示される希釈で添加し、ニトロセルロースシートを、ｍａｂと共に室温下で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄（１０分間、室温）した。結合したｍａｂは、ペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗マウス免疫グロブリンＧ抗体（Sigma）を供給者の指示に従い室温下で１時間用いて検出した。最終の２回の洗浄工程（ＰＢＳ−Ｔ、１０分間）の後、反応性のバンドを、供給者の指示し従い増強化学ルミネセンス（ECL（登録商標）, Amersham-Pharmacia）により可視化した。
図４：ＨΔｇＭ−３ｂ１ゲノムの図式的説明
ＥＨＶ−１  ＲａｃＨウイルスのｇＭ領域のＢａｍＨＩ制限酵素地図及びゲノム構成並びにｇＭ陰性ＲａｃＨウイルスＨΔｇＭ−３ｂ１の構造。クローニングに使用した制限酵素認識部位をスケール共に示す。
【００１５】
実施例
実施例１：ウイルスの免疫原性特性に対するｇＭの影響についての試験
実験デザイン
３〜４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River）を、各１４頭から構成される１０のグループに分け、ＲａｃＨ（グループ１〜３）、ｇＭ−陰性挿入変異体ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（Neubauerら, 1997）（グループ４〜６）又は全体のｇＭオープンリーディングフレームを本質的に欠くＨΔｇＭ−３ｂ１（グループ７〜９）を用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫化した。マウスは、示されるように、２０μｌ中の１×１０5プラーク形成単位（ＰＦＵ）（グループ１、４、７）、１×１０4ＰＦＵ（グループ２、５、８）又は１×１０3ＰＦＵ（グループ３、６、９）の単一適用により免疫化した。マウスの疑似感染（グループ１０）は、２０μｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳを使用して行った。免疫化２９日後、マウスに、２０μｌ中に懸濁した１×１０5ＰＦＵの株ＲａｃＬ１１を鼻腔内感染させた。個々のマウスの体重を、感染させた日（第０日）〜第１３日まで毎日記録した。相対体重（％）は以下の式：第ｎ日における体重／第０日における体重×１００に従い第０日〜第１３日まで決定した。１グループにつき感染後（ｐ．ｉ．）第１日において２頭、感染後第３日において３頭、感染後第５日において２頭を検死した。マウスの肺を調製し、海砂でホモジナイズし、１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ中に懸濁した（Meindl 及び Osterrieder, 1999）。マウス肺におけるウイルス力価をＲｋ１３細胞で決定した（Neubauer ら, 1997）。毎日記録した体重の統計分析は以下のようにして行った。
研究対象：
本研究の主要目的は、病原性ＥＨＶ−１株で攻撃感染させた後の体重パラメータにより決定した、ＲａｃＨ（グループ１〜３）及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（グループ４〜６）と比較したときの、ＨΔｇＭ−３ｂ１（グループ７〜９）免疫化後の防御能力の差異を証明することである。第２の目的は、グループ（１〜９）と疑似感染グループ（グループ１０）とを比較することである。
その他の２つのウイルスと比較したときのＨΔｇＭ−３ｂ１ウイルスの潜在的に有益な効果を分析するために、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化グループ（グループ７〜９）をその他全ての免疫化グループと比較した。なぜなら、ＨΔｇＭ−３ｂ１ウイルスは、糖タンパク質Ｍの本質的に完全な欠如を示すが、ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ（グループ４〜６）の場合、ｇＭのオープンリーディングフレームがＬａｃＺカセットの挿入により遮られているからである。しかしながら、このウイルス変異体は、ｇＭのオープンリーディングフレームのカルボキシ末端部分を発現することができる。ＲａｃＨ（グループ１〜３）は、ＨΔｇＭ−３ｂ１及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓの両方の親ウイルスであり、広く使用されるワクチン株を代表する。
【００１６】
統計モデル
統計分析は、ＳＡＳ（Heidelberg）ソフトウェアパッケージＷｉｎバージョン６．１２をＰＣ上で使用して行った。
主要評価項目を評価するために、分散の繰り返し測定分析を、ＣＯＮＴＲＡＳＴステートメントを用い、ＳＡＳ中のＰＲＯＣ  ＧＬＭを用いて行い、選択したグループ間の特定の比較を行った。不平衡の状態（異なる日における異なる数の動物）を考慮して、ＰＲＯＣ  ＧＬＭ（一般化線形モデル）を、ＰＲＯＣ  ＡＮＯＶＡの代わりに用いた。
プログラム：
0005177927.tif 000002
【００１７】
体重評価についての結果
【表１】
0005177927.tif 000003
【００１８】
【表２】
0005177927.tif 000004
【００１９】
１．疑似感染動物（グループ１０）と免疫化動物との比較
以下の表は、疑似免疫化動物の平均体重は、その他全てのグループと比較したとき、攻撃感染後に、統計学的に有意（第３日）又は高度に統計学的に有意に（第４〜第１３日）減少したことを証明している。
【００２０】
【表３】
表１
0005177927.tif 000005
1＝検定統計量
2＝統計は、第１日から第１３日で与えられる。第０日において、全ての計算値は同一である（体重を１００％に設定）
*＝統計学的有意性（＜０．０５）
**＝高度な統計学的有意性（＜０．０００１）
【００２１】
２．攻撃感染後の体重減少防止に対する有効性評価基準に関する、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化動物（グループ７、１０5ＰＦＵ／動物）とＲａｃＨ（グループ１、１０5ＰＦＵ）及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓ免疫化動物（グループ４、１０5ＰＦＵ）との比較
以下の表に示される結果は、免疫化に使用した薬剤とは関係なく、最大用量のウイルスで免疫化したグループにおいて、平均体重における統計学的に有意な差異が見られなかったことを証明している。
【００２２】
【表４】
表２
0005177927.tif 000006
1＝検定統計量
2＝統計は、第１日から第１３日で与えられる。第０日において、全ての計算値は同一である（体重を１００％に設定）
*＝統計学的有意性（＜０．０５）
**＝高度な統計学的有意性（＜０．０００１）
【００２３】
３．攻撃感染後の体重減少防止に対する有効性評価基準に関する、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化動物（グループ８、１０4ＰＦＵ／動物）とＲａｃＨ（グループ２、１０4ＰＦＵ）及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓ免疫化動物（グループ５、１０4ＰＦＵ）との比較
以下に示す表は、動物あたり１０4ＰＦＵを投与されたマウスグループについての統計分析を示しており、以下のことが明らかになった。平均体重における差異は、第１日及び第１１日〜第１３日におけるグループ８の動物（１０4ＰＦＵ  ＨΔｇＭ−３ｂ１）とグループ５の動物（ＨΔｇＭ−Ｉｎｓ）との間で統計学的に有意に異なっていた。しかしながら、ＲａｃＨ免疫化動物（グループ２）において、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化マウス（グループ８）と比較したとき、平均体重における差異は、感染後の全ての日において有意に又は高度に有意に減少した。
【００２４】
【表５】
表３
0005177927.tif 000007
1＝検定統計量
2＝統計は、第１日から第１３日で与えられる。第０日において、全ての計算値は同一である（体重を１００％に設定）
*＝統計学的有意性（＜０．０５）
**＝高度な統計学的有意性（＜０．０００１）
【００２５】
４．攻撃感染後の体重減少防止に対する有効性評価基準に関する、ＨΔｇＭ−３ｂ１免疫化動物（グループ９、１０3ＰＦＵ／動物）とＲａｃＨ（グループ３、１０3ＰＦＵ）及びＨΔｇＭ−Ｉｎｓ免疫化動物（グループ６、１０3ＰＦＵ）との比較
以下に示す表は、最小用量の免疫化についての結果を示している。結果は、最小用量のＨΔｇＭ−３ｂ１を投与された動物は、同一用量のＨΔｇＭ−Ｉｎｓ又はＲａｃＨを投与された動物と比較したとき、第４日〜第９日において、（高度に）有意に高い平均体重を示したことに要約することができる。更に、ＲａｃＨ免疫化動物は、攻撃免疫後第１日〜第３日において、ＨΔｇＭ−３ｂｌと比較したとき、有意に減少した体重を示した。
【００２６】
【表６】
表４
0005177927.tif 000008
1＝検定統計量
2＝統計は、第１日から第１３日で与えられる。第０日において、全ての計算値は同一である（体重を１００％に設定）
*＝統計学的有意性（＜０．０５）
**＝高度な統計学的有意性（＜０．０００１）
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、攻撃感染後のマウスの平均体重の変化を示す。
【図２】  図２は、ウイルス力価分析の結果を示す。
【図３】  図３は、ウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図４】  図４は、ＨΔｇＭ−３ｂ１ゲノムの図式的説明である。
【図１】
0005177927.tif 000009
【図２】
0005177927.tif 000010
【図３】
0005177927.tif 000011
【図４】
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