(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0005112203.tif 000060
〔式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数であり、そしてＡは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成し、活性化離脱性基は、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリル、ｐ−ニトロフェニルオキシ、２，３，４−トリクロロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、１−ヒドロキシピペリジン、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、又はヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールである〕
の化合物。
【請求項２】
化合物が、式：
【化３】
0005112203.tif 000061
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは請求項１で定義されたとおりである〕
を有する請求項１の化合物。
【請求項３】
式：
【化６】
0005112203.tif 000062
〔式中、Ｒは水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、Ａは水素又は活性化された離脱基であり、この離脱基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成し、活性化離脱性基は、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリル、ｐ−ニトロフェニルオキシ、２，３，４−トリクロロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、１−ヒドロキシピペリジン、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、又はヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールであり、ＰＡＧ1はポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は５００〜２５，０００ダルトンの分子量を有し、ｙは０〜３の整数でありそしてｖは１〜３の整数であり、そしてｋは１〜２の整数である〕
の化合物。
【請求項４】
式：
【化８】
0005112203.tif 000063
〔式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数でありそしてＡは活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成し、活性化離脱性基は、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリル、ｐ−ニトロフェニルオキシ、２，３，４−トリクロロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、１−ヒドロキシピペリジン、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、又はヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールである〕
の活性化されたエステルを製造する方法であって、式：
【化９】
0005112203.tif 000064
〔式中、Ｒ及びＰＡＧは上記のとおりであり、そしてＶは−ＮＨ２である〕
の化合物を、式：
【化１０】
0005112203.tif 000065
〔式中、Ｒ５は加水分解可能なエステル保護基を形成し、そしてＹはハロゲン化物でありそしてＲ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の化合物と縮合させて、式：
【化１１】
0005112203.tif 000066
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
のエステルを生成させ、該エステルを加水分解して、式：
【化１２】
0005112203.tif 000067
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の遊離酸を形成させ、そして該遊離酸をカップリング剤の存在下に活性化された離脱性基のハロゲン化物と反応させて該活性化されたエステルを生成させることを含む方法。
【請求項５】
式：
【化１８】
0005112203.tif 000068
〔式中、Ｒは水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、Ａは活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成し、活性化離脱性基は、ハロゲン、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリル、ｐ−ニトロフェニルオキシ、２，３，４−トリクロロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、１−ヒドロキシピペリジン、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、又はヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールであり、ＰＡＧ１は末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は５００〜２５，０００ダルトンの分子量を有し、ｙは０〜３の整数であり、ｖは１〜３の整数でありそしてｋは１〜２の整数である〕
の活性化されたエステルの製造方法であって、式：
【化１９】
0005112203.tif 000069
〔式中、ｙ及びｖは上記のとおりであり、Ｙはハロゲン化物でありそしてＲ５は加水分解可能なエステル保護基を形成する〕
の化合物を、式：
【化２０】
0005112203.tif 000070
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１及びｋは上記のとおりであり、Ｖは−ＮＨ２である〕
の化合物と縮合させて、式：
【化２１】
0005112203.tif 000071
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ｘ、Ｒ５、ｋ、ｖ及びｙは上記のとおりである〕
のエステルを生成させ、該エステルを加水分解して、式：
【化２２】
0005112203.tif 000072
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ｘ、ｋ、ｖ及びｙは上記のとおりである〕
の遊離酸を形成させ、そして該遊離酸をカップリング剤の存在下に活性化された離脱性基のハロゲン化物と反応させて該活性化されたエステルを生成させることを含む方法。
【請求項６】
式：
【化２３】
0005112203.tif 000073
〔式中、Ｐは末端ヒドロキシ基が除去されている末端ヒドロキシ基を有する生物薬剤の残基であり、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数である〕
のコンジュゲート。
【請求項７】
ＰＡＧが１０，０００〜１５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールの残基である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
Ｒがメチルである、請求項６〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
ＰがＡＺＴの残基である、請求項６〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
式：
【化２４】
0005112203.tif 000074
〔式中、Ｐは末端ヒドロキシ基が除去されている末端ヒドロキシ基を有する生物薬剤の残基であり、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数である〕
のコンジュゲート。
【請求項１１】
ＰＡＧが１０，０００〜１５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールの残基である、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
Ｐが配列（配列番号１）を有するポリペプチドＴ−２０である請求項１０〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
Ｒがメチルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１４】
ＰＡＧがポリエチレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリエチレングリコールの二価の残基であるＰＥＧであり、１０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
ＰＥＧが、２０，０００〜３５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
ＰＡＧ１がポリエチレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリエチレングリコールの二価の残基であるＰＥＧ１であり、５００〜１５，０００ダルトンの分子量を有する、請求項３に記載の化合物。
【請求項１７】
ｎが０であり、ｍが４である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、ポリアルキレングリコール酸及びそれらを治療的に活性な生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に結合させてこれらの生物薬剤との治療的に活性なポリアルキレングリコールコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を製造することに関する。
【０００２】
生物薬剤、例えば、タンパク質及びペプチドへの親水性ポリアルキレングリコール線状ポリマー（ＰＡＧとして知られた）の化学的結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）は生物工学においてよく知られておりそして普通に使用されている。最もよく知られたポリアルキレングリコール分子はポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧとして知られた）である。
【０００３】
ＰＡＧの生物工学的用途の例として、ＰＡＧのある活性な誘導体を生物薬剤、例えばタンパク質及び酵素に結合させて有利な結果を得た。ＰＡＧは有機溶媒に可溶性であるので、生物薬剤、例えば、酵素又はタンパク質に結合させたＰＡＧは有機溶媒に可溶性であり且つ有機溶媒中で活性なコンジュゲートを生成することができる。タンパク質へのＰＡＧの結合は、修飾されていないタンパク質と比べてＰＡＧ−タンパク質コンジュゲートの免疫原性及び腎クリアランスの速度を減少させることができる。更に、生物薬剤、例えば、タンパク質へのＰＡＧの結合は、これらのＰＡＧコンジュゲートの血中循環寿命を劇的に増加させることもできる。
【０００４】
生物薬剤、例えば、タンパク質とのＰＡＧ複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）の製造においては、特定の生物薬剤の薬物動態学が薬物の有効性及び効果の持続時間の両方を支配するであろう。生物薬剤、特にタンパク質及びポリペプチドの免疫原性、水不溶性及び短いインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期の点から、これらの生物薬剤のクリアランスの速度を減少させて、長期の作用を達成することができるようにすることは極めて重要となってきた。これは、これはタンパク質上の電荷及びその分子サイズの両方により達成されうる糸球体ろ過を回避又は抑制することにより達成することができる（Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３４，Ｆ４５５）。分子容積を増加させそして潜在的エピトープ部位をマスクすることにより、ポリマーによる治療的生物薬剤、例えばポリペプチド及びタンパク質の修飾は、生物薬剤、特にタンパク質のクリアランスの速度及び免疫原性の両方を減少させるのに有効であることが示された。減少したタンパク質分解、増加した水溶性、減少した腎クリアランス及び受容体媒介クリアランスに対する立体障害は、生物薬剤、例えばポリペプチド及びタンパク質の主鎖へのＰＡＧポリマーの結合が薬物の薬物動態学的性質を高めるのに有利である多数の機構である。かくして、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，１２９，３３７は、タンパク質、例えば酵素及びインスリンにＰＥＧをコンジュゲーションさせて（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ）、この生物薬剤の生物学的活性の実質的割合を保持しながら、免疫原性のより少ない生成物を製造することを開示している。
【０００５】
生物薬剤、例えばタンパク質の修飾のために開発された多様な種類の活性なＰＡＧ、特にＰＥＧ試薬があり（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ，ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｉｏｎｓ；（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｃｈａｐ  ２１  ａｎｄ  ２２）、その大部分はＰＥＧと生物薬剤との間に連結基の形成を必要とする。これらの試薬のいくらかは、コンジュゲーション反応が行われる水性媒体中で様々な程度に不安定である。更に、コンジュゲーションプロセスは、しばしばいくつかのファクターによるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生物学的活性の損失をもたらし、これらのファクターの第一位のものはタンパク質活性部位との立体相互作用である。ゆえに新規な試薬の所望される性質は水性媒体中で分解を受けにくいこと及びタンパク質の部位特異的修飾に影響を与えるのに使用することができることであろう。
【０００６】
本発明に従えば、我々は、生物薬剤、例えばポリペプチド、糖、タンパク質及び治療的に活性な小さな分子にコンジュゲーションさせるための新しい種類の活性化されたポリアルキレングリコール酸及びそれらの活性なエステル試薬を発見した。これらの試薬は、下記式：
【０００７】
【化２５】
0005112203.tif 000002
【０００８】
〔式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数であり、そしてＡは水素又は活性化された離脱性基（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する〕；
【０００９】
【化２６】
0005112203.tif 000003
【００１０】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ及びＡは上記のとおりであり、ｗは１〜３の整数であり、そしてＲ３及びＲ４の１つは低級アルキルでありそして他方は水素又は低級アルキルである〕；及び
【００１１】
【化２７】
0005112203.tif 000004
【００１２】
〔式中、Ｒ、Ａ及びＸは上記のとおりであり、ＰＡＧ１は末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は約５００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有し、ｙは０〜３の整数であり、ｖは１〜３の整数でありそしてｋは１〜２の整数である〕；
のいずれかを有するこれらの化合物、又はＡが水素である場合のその加水分解可能なエステルである。
【００１３】
上記した式Ｉ−Ａの好ましい化合物は、式：
【００１４】
【化２８】
0005112203.tif 000005
【００１５】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記したとおりである〕
の化合物である。
【００１６】
上記した式Ｉ−Ａの他の好ましい化合物は、式：
【００１７】
【化２９】
0005112203.tif 000006
【００１８】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記したとおりである〕
の化合物である。
【００１９】
上記した式Ｉ−Ｂの好ましい化合物は、式：
【００２０】
【化３０】
0005112203.tif 000007
【００２１】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３、Ｒ４及びｗは上記したとおりである〕
の化合物である。
【００２２】
上記した式Ｉ−Ｃの好ましい化合物は、式：
【００２３】
【化３１】
0005112203.tif 000008
【００２４】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ａ、ｖ、ｙ及びｋは上記したとおりである〕
の化合物である。
【００２５】
好ましくは、Ａは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステル又はその加水分解可能なエステルを形成し、更に好ましくは、Ａは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する。
【００２６】
上記した化合物において、Ａは好ましくは水素である。Ａが活性化された離脱性基である上記した化合物も好ましい。上記した化合物、特に、Ａが好ましい活性化された離脱性基である式Ｉ−Ｃ１の化合物において、Ａは好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルである。
【００２７】
他の好ましい態様では、Ｒはメチルである。ＰＡＧがＰＥＧ、ポリエチレングリコール末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じる二価のポリエチレングリコール残基、である上記した化合物も好ましい。好ましくは、ＰＥＧは１０，０００〜４０，０００、更に好ましくは２０，０００〜３５，０００の分子量を有する。ＰＡＧ１がＰＥＧ１である上記した式Ｉ−Ｃの化合物において、ＰＥＧ１は好ましくは５００〜１５，０００の分子量を有する。
【００２８】
更なる好ましい態様では、ｎは０でありそしてｍは４である。好ましくは、ｗは１である。
【００２９】
他の好ましい態様では、本発明は、式：
【００３０】
【化３２】
0005112203.tif 000009
【００３１】
〔式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数でありそしてＡは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する〕
の活性化されたエステルを製造する方法であって、式：
【００３２】
【化３３】
0005112203.tif 000010
【００３３】
〔式中、Ｒ及びＰＡＧは上記のとおりであり、そしてＶは−ＯＨ又は−ＮＨ２〕
の化合物を、式：
【００３４】
【化３４】
0005112203.tif 000011
〔式中、Ｒ５は加水分解可能なエステル保護基を形成しそしてＹはハロゲン化物でありそしてＲ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の化合物と縮合させて、式：
【００３５】
【化３５】
0005112203.tif 000012
【００３６】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
のエステルを生成させ
該エステルを加水分解して、式：
【００３７】
【化３６】
0005112203.tif 000013
【００３８】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の遊離酸を形成し、そして該遊離酸をカップリング剤の存在下に活性化された離脱性基のハロゲン化物と反応させて該活性化されたエステルを生成させることを含む方法に関する。
【００３９】
他の好ましい態様では、式：
【００４０】
【化３７】
0005112203.tif 000014
【００４１】
〔式中、Ｒは水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｗは１〜３の整数であり、そしてＲ３及びＲ４の１つは低級アルキルでありそして他方は水素又は低級アルキルであり、そしてＡは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する〕
の活性化されたエステルを製造する方法であって、式：
【００４２】
【化３８】
0005112203.tif 000015
【００４３】
〔式中、ｗ、Ｒ３、Ｒ４は上記のとおりであり、Ｙはハロゲン化物でありそしてＲ５は加水分解可能なエステル保護基を形成する〕
の化合物を式：
【００４４】
【化３９】
0005112203.tif 000016
【００４５】
〔式中、Ｒ及びＰＡＧは上記のとおりであり、Ｖは−ＯＨ又は−ＮＨ２である〕
の化合物と縮合させて、式：
【００４６】
【化４０】
0005112203.tif 000017
【００４７】
〔式中、ｗ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおりである〕
のエステルを生成させ、該エステルを加水分解して、式：
【００４８】
【化４１】
0005112203.tif 000018
【００４９】
〔式中、ｗ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｘ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおりである〕
の遊離酸を形成させそして該遊離酸をカップリング剤の存在下に活性化された離脱性基のハロゲン化物と反応させて該活性化されたエステルを生成させることを含む方法に関する。
【００５０】
他の好ましい態様では、本発明は、式：
【００５１】
【化４２】
0005112203.tif 000019
【００５２】
〔Ｒは水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ａは水素又は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成し、ＰＡＧ１は末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は約５００〜約２５，０００ダルトンの分子量を有し、ｙは０〜３の整数であり、ｖは１〜３の整数でありそしてｋは１〜２の整数である〕
の活性化されたエステルの製造方法であって、式：
【００５３】
【化４３】
0005112203.tif 000020
【００５４】
〔式中、ｙ及びｖは上記のとおりであり、Ｙはハロゲン化物でありそしてＲ５は加水分解可能なエステル保護基を形成する〕
の化合物を、式：
【００５５】
【化４４】
0005112203.tif 000021
【００５６】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１及びｋは上記のとおりであり、Ｖは−ＯＨ又は−ＮＨ２である〕
の化合物と縮合させて、式：
【００５７】
【化４５】
0005112203.tif 000022
【００５８】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ｘ、Ｒ５、ｋ、ｖ及びｙは上記のとおりである〕
のエステルを生成させ、該エステルを加水分解して、式：
【００５９】
【化４６】
0005112203.tif 000023
【００６０】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ｘ、ｋ、ｖ及びｙは上記のとおりである〕
の遊離酸を形成させ、そして該遊離酸をカップリング剤の存在下に活性化された離脱性基のハロゲン化物と反応させて該活性化されたエステルを生成させることを含む方法に関する。
【００６１】
上記した方法において、該離脱性基は好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルである。
【００６２】
本発明の更なる好ましい態様は、式：
【００６３】
【化４７】
0005112203.tif 000024
【００６４】
〔式中、Ｐは末端ヒドロキシ基が除去されている末端ヒドロキシ基を有する生物薬剤の残基であり、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数である〕
のコンジュゲートに関する。
【００６５】
上記したコンジュゲートにおいて、Ｐは好ましくはグリコシド、又はＡｚＴの残基である。好ましくは、Ｘは−Ｏ−である。好ましくは、ＰＡＧは１０，０００〜１５，０００の分子量を有するポリエチレングリコール残基である。好ましくは、Ｒはメチルである。
【００６６】
本発明の他の好ましい態様は、式：
【００６７】
【化４８】
0005112203.tif 000025
【００６８】
〔式中、Ｐは末端ヒドロキシ基が除去されている末端ヒドロキシ基を有する生物薬剤の残基であり、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は個々に水素又は低級アルキルであり、Ｘは−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、ＰＡＧはポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の両方の除去により生じるポリアルキレングリコールの二価の残基であり、この残基は１，０００〜５０，０００ダルトンの分子量を有し、ｎは０〜１の整数であり、ｍは４〜８の整数である〕
のコンジュゲートに関する。
【００６９】
上記したコンジュゲートにおいて、Ｐは好ましくはタンパク質又はポリペプチドの残基であり、更に好ましくは、Ｐは配列番号１における如き配列を有するポリペプチドＴ−２０である。好ましくは、Ｘは−Ｏ−である。好ましくは、ＰＡＧは１０，０００〜１５，０００の分子量を有するポリエチレングリコール残基である。
【００７０】
これらの化合物は、生物薬剤、例えば、ポリペプチド、糖、タンパク質及びグリコシドとのコンジュゲートを形成するための有用な試薬である。式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの化合物は、それらが生物薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド及びグリコシドとコンジュゲートを形成するとき、それらの薬物動態学的性質及び薬力学的性質を高める。これらの臨床的に有用な性質は、とりわけ、より長いインビボ循環半減期、減少したクリアランス及び高められた効力、有効性の潜在的改良をもたらすバイオディストリビューション（ｂｉｏ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の変化、減少した免疫原性、減少した毒性、より良好な物理的及び熱的安定性、タンパク質分解に対する保護を含む。式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの化合物の安定性は、それらを生物薬剤に容易にコンジュゲーションさせて変性の危険を減少させることを可能とする。
【００７１】
式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの試薬は、アミノ又はヒドロキシ含有生物薬剤のアミノ又はヒドロキシ基にコンジュゲーションさせて、誘導されるコンジュゲートの元の生物薬剤の生物学的活性の実質的な部分を保持するコンジュゲートを生成させることができる。一般に、コンジュゲーションの目的で、アミノ又はヒドロキシ含有生物薬剤は末端アミノ又はヒドロキシ基を含有することが好ましい。この末端アミノ又はヒドロキシ基は、それを介して本発明の試薬をコンジュゲーションさせて本発明に従うコンジュゲートを生成させることができる。本発明の試薬は水性媒体中で分解を受けにくく、それゆえ本発明の試薬は生物薬剤と容易に反応して、治療目的で水性媒体中に投与されうるコンジュゲートを形成することができる。
【００７２】
ポリアルキレングリコールという用語は、アルキレン基が２〜７個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖基であるポリ（低級アルキレン）グリコール基を表す。「低級アルキレン」という用語は、２〜７個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖二価アルキレン基、例えば、ポリエチレン、ポリｎ−プロピレン、ポリイソプロピレン、ポリｎ−ブチレン及びポリイソブチレン並びに混合アルキレングリコールから形成されるポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン基の混合物を含有するポリマー及びポリイソプロピレン、ポリエチレン及びポリイソブチレン基の混合物を含有するポリマーを表す。分岐鎖アルキレングリコール基は、ポリアルキレングリコール置換基を構成するアルキレン部分の炭素原子の総数が２〜７となるように、アルキレン基の直鎖に含有される炭素原子の数に依存して２〜４個の炭素原子のポリマー鎖の低級アルキル基を与える。「低級アルキル」という用語は、１〜７個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含有する低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル等を含み、メチルが特に好ましい。
【００７３】
本発明の好ましい態様に従えば、式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの化合物中のＰＡＧは２つの末端ヒドロキシ基の除去により形成されるポリエチレングリコール残基である。更に、本発明に従えば、式Ｉ−Ａ及びＩ−Ｂの化合物中のＰＡＧ残基は、約１０，０００〜約５０，０００、最も好ましくは約２０，０００〜約４０，０００の分子量を有し、約２５，０００〜約３５，０００が特に好ましい。式Ｉ−Ｃの化合物においては、２つのＰＡＧ１基は約１０，０００〜約５０，０００、好ましくは、約２０，０００〜約４０，０００、最も好ましくは約２５，０００〜約３５，０００の合同分子量（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を有することが一般に好ましい。
【００７４】
式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの試薬は、遊離ヒドロキシ又はアミノ基を含有するいかなる慣用の生物薬剤にもコンジュゲーションさせることができる。縮合は遊離酸を介して又は活性化されたエステルの使用によるものであることができる。
【００７５】
本発明に従えば、式Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃの試薬は、タンパク質、ペプチドまたは小さな有機部分を有する生物薬剤の遊離ヒドロキシ又は遊離アミノ基と反応させて、エーテルまたはアミドコンジュゲートを形成させることができる。
【００７６】
本発明に従えば、エーテル又はアミドコンジュゲートは下記の反応スキームにより本発明の試薬の化合物から製造することができる。エステルコンジュゲートを形成する際には、試薬を下記の如き末端ヒドロキシ基を含有する生物薬剤と反応させる。
【００７７】
【化４９】
0005112203.tif 000026
【００７８】
式中、Ｐは末端ヒドロキシを有する生物薬剤の末端ヒドロキシ基が除去されている残基である。
【００７９】
この反応スキームにおいて、Ｂは末端反応性酸又は活性化された酸離脱性基が欠けた化合物Ｉ−Ａ、Ｉ−Ｂ及びＩ−Ｃをまとめて表したものである。この反応を行う際には、反応性酸基をアルコールと反応させることによりエステルを形成するいかなる慣用の方法もエステルコンジュゲートを形成するのに使用することができる。中でも好ましい方法は、カップリング触媒を使用してカップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下に酸とアルコールをカップリングさせることである。いかなる慣用のカップリング触媒、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び（４−ジメチルアミノ）ピリジン又はその混合物を使用することができる。一般にこの反応は不活性有機溶媒媒体中で行われる。この反応はこの酸の遊離又は活性化されたエステル誘導体により行うことができる。活性化された酸誘導体が使用されるならば、カップリング触媒及び／又はカップリング剤を使用する必要はない。この反応を行う際には、温度及び圧力は決定的に重要ではなくそして室温で行うことができる。しかしながら、所望により、より高い又はより低い温度を使用することができる。この反応に従えば、Ｐは末端ヒドロキシ基を有するいかなる生物薬剤の残基であることもできる。エステルを形成するために、中でも好ましい末端ヒドロキシ基を有する生物薬剤はヌクレオシド、例えばＡＺＴである。更にＰは末端ヒドロキシ基を有するいかなるこのような小さな分子の生物薬剤であってもよい。
【００８０】
アミドを形成する際には、下記の反応の化合物が使用される。
【００８１】
【化５０】
0005112203.tif 000027
【００８２】
式中、Ｐ１は末端アミノ基を有する生物薬剤の末端アミノ基が除去されている残基である。
【００８３】
上記反応において、スキームＢは先に記載されたとおりである。この反応に従えば、Ｐ１は末端アミノ基を有するすべての生物薬剤、例えば末端アミノ基を有するタンパク質もしくはペプチド又は小分子生物薬剤の残基であることができる。好ましいタンパク質及びペプチドには、インターフェロン−α、インターフェロン−β、コンセンサスインターフェロン、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、コロニー刺激因子、並びに免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＤ及びその断片が含まれる。他の好ましいアミノ生物薬剤はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ５，４６４，９３３に記載されたこれらのペプチド、特に構造：Ｔｙｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  ＩＬｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ（配列番号１）を有するＴ−２０ペプチドである。
【００８４】
アミドを生成させるための反応は、酸又は活性化された酸誘導体「ＯＡ」をアミドとカップリングさせてペプチド結合を形成するためのいかなる慣用の手段も使用することにより行われる。酸とアミンとを反応させてアミドを形成させることによりペプチド結合を形成するためのいかなる慣用の方法もコンジュゲートを形成するのに使用することができる。
【００８５】
本発明に従えば、ＯＡはいかなる慣用の酸活性化離脱性基（ａｃｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｅａｖｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）であってもよい。中でも、好ましい酸活性化離脱性基は、ハロゲン、例えば塩素及び臭素、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、１−ベンゾトリアゾリルオキシ、１−イミダゾリル、ｐ−ニトロフェニルオキシ、２，３，４−トリクロロフェニルオキシ、ペンタクロロフェニルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、１−ヒドロキシピペリジン、５−クロロ−８−ヒドロキシキノリン、Ｎ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド、及びヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールである。
【００８６】
Ｘが０である式Ｉ−Ａの化合物、
【００８７】
【化５１】
0005112203.tif 000028
【００８８】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
は、式：
【００８９】
【化５２】
0005112203.tif 000029
【００９０】
〔式中、Ｒ及びＰＡＧは上記のとおりである〕
のＰＡＧヒドロキシ化合物を、式：
【００９１】
【化５３】
0005112203.tif 000030
【００９２】
〔式中、Ｒ５は加水分解可能なエステル保護基を形成し、Ｙはハロゲン化物でありそしてＲ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の化合物と、下記反応スキーム：
【００９３】
【化５４】
0005112203.tif 000031
【００９４】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、ｍ及びｎは上記のとおりであり、そしてＡ１は活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する〕
によって反応させることにより製造される。
【００９５】
式ＸＩの化合物は、式ＶＩの化合物と縮合させると、式ＶＩＩＩ’の化合物を生成する。この反応において、式ＸＩの化合物と式ＶＩの化合物をアルカリ金属水素化物、例えば、水素化ナトリウムの存在下に有機溶媒中で還流させることにより、式ＸＩの化合物を式ＶＩの化合物と反応させる。アルコールをハロゲン化物と縮合させるのに使用されるいかなる慣用の方法もこの反応を行うのに使用することができる。一般に、不活性有機溶媒として芳香族炭化水素溶媒、例えば、ベンゼン及びトルエンを使用することが好ましい。しかしながら、この反応を行うのにいかなる慣用の不活性有機溶媒も使用することができる。式ＶＩの化合物において、Ｒ５はいかなる慣用の酸加水分解可能なエステル保護基であってもよい。一般に、これらの加水分解可能なエステル保護基は低級アルキルエステル保護基を含む。式ＶＩＩＩ’の化合物は、慣用の手段、例えば、水性媒体中での塩基、例えばアルカリ金属水酸化物による塩基性加水分解により、式ＩＸ’の化合物に加水分解される。次いで式ＩＸ’の酸は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により活性化離脱性基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基の使用によって、その活性化された形態、即ち、式Ｘの化合物に変換される。しかながら、式Ｘの化合物を形成するのにいかなる慣用の活性化離脱性基も使用することができ、例えば、前記した活性化離脱性基を使用することができる。式Ｘの化合物を生成させるのに、カルボン酸を活性化離脱性基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含有する活性化エステルに変換するいかなる慣用の方法も使用することができる。
【００９６】
前記した反応スキームにより式ＸＩを式ＶＩの化合物と縮合させることにより式ＩＸ’及びＸの化合物を含む式Ｉ−Ａ−１の化合物を製造する際に、この反応スキームを下記の一般的方法において更に説明することができる。
【００９７】
トルエン５０〜１００mL中の式ＸＩのＰＥＧ化合物（１０００〜４００００の分子量）５グラムを１〜３時間還流により共沸乾燥し、次いでトルエン２０〜３０mLを除去した。得られる混合物を無水テトラヒドロフラン２０〜３０mLに溶解させそしてアルゴン流下の丸底フラスコ中の水素化ナトリウム（５〜１０倍モル過剰）及び無水テトラヒドロフラン（２０〜３０mL）に滴下により加えた。得られる混合物を一夜還流した。式ＶＩの下記のハロ酸エステルを使用して式ＶＩＩＩ’の化合物を製造した：５−ブロモ吉草酸メチルもしくは（５−ヨード吉草酸エチル；又は、６−ブロモヘキサン酸エチル、ω−クロロ吉草酸エチル；又は６−ブロモヘキサン酸メチルエステル；又は７−ブロモヘプタン酸メチル；又は７−ブロモヘプタン酸エチル；又は８−ブロモオクタン酸メチル；又は８−ブロモオクタン酸エチル；又は１０−ブロモデカン酸メチル；又はｗ−ブロモウンデカン酸エチル；又は１１−ブロモウンデカン酸メチル又はブロモミリスチン酸メチル；又は１５−ブロモペンタデカン酸エチル；又は１６−ブロモ−ヘカデカンカルボン酸メチルエステル；又は１７−ブロモ−ヘパデカンカルボン酸メチルエステル；又は３−クロロ酪酸メチル、３−ブロモ酪酸メチル；又は３−ブロモ酪酸エチル、β−ブロモ吉草酸エチル；又はβ−ブロモカプロン酸エチル）（５〜１０モル過剰）を注射器によって反応に加えそして反応を一夜還流した。次いで反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮させた。式ＶＩＩＩ’の化合物を含有する残留物を２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）への添加により沈殿させた。沈殿した生成物、式ＶＩＩＩ’の化合物をろ別しそして真空中で乾燥した。
【００９８】
式ＶＩＩＩ’のＰＥＧ酸エステル（４ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム５０〜１００mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを１〜６Ｎ塩酸の添加により２．５〜３．０に調節しそして混合物をジクロロメタンにより抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。式ＩＸ’のＰＥＧ酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。
【００９９】
式ＩＸ’のＰＥＧ酸（２ｇ）を無水ジクロロメタン（１０〜２０mL）に溶解し、次いでＮヒドロキシスクシンイミド（１．０５〜２．０倍モル過剰）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０５〜２．０倍モル過剰）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）により沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥して式Ｉ−Ａ１の活性化エステル、式Ｘの化合物を生成させた。
【０１００】
最初に式ＸＩＩの化合物を式ＶＩの化合物と反応させて、式：
【０１０１】
【化５５】
0005112203.tif 000032
【０１０２】
〔式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、ＰＡＧ、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
の化合物を生成させることにより、式：
【０１０３】
【化５６】
0005112203.tif 000033
【０１０４】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
を有する、ＸがＮＨである式Ｉ−Ａの化合物を、
【０１０５】
【化５７】
0005112203.tif 000034
【０１０６】
〔式中、Ｒ及びＰＡＧは上記のとおりである〕
の化合物から製造する。
【０１０７】
式ＸＩＩＩの化合物を生成させるための反応は、式ＸＩＩのアミンを式ＶＩの化合物のハロゲン化物と縮合させることにより行われる。アミンをハロゲン化物と縮合させるいかなる慣用の方法もこの反応を行うのに使用することができる。式ＸＩＩＩの化合物は、中間体：
【０１０８】
【化５８】
0005112203.tif 000035
【０１０９】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ１、Ｒ２、ｍ及びｎは上記のとおりである〕
を経由して、Ａが離脱性基である式Ｉ−Ａ２の化合物に変換される。
【０１１０】
式ＸＩＶの化合物を形成するためのこの変換は、本明細書において前記した慣用の塩基性加水分解により行われる。式ＸＩＶの化合物は、Ａが活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素原子と一緒になってエステルを形成する式１Ａ２の化合物に、式ＩＸ’の化合物の式Ｘの化合物への変換に関して述べたのと同じ方法で変換される。
【０１１１】
一般に、最初に式ＸＩＩを有する化合物を式ＶＩの化合物と反応させて式１−Ａ２の化合物を生成させることにより、Ａが活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素と一緒になってエステルを形成する式１−Ａ２の化合物を製造する方法は、下記の一般的反応シーケンスにより更に説明することができる。
【０１１２】
段階１
式ＸＩＩのＰＥＧアミン（１０００〜４００００の分子量）５グラムを無水エタノール２５〜５０mLに溶解した。次いで、５−ブロモ吉草酸メチル又は（５−ヨード吉草酸エチル、６−ブロモヘキサン酸エチル、又はω−クロロ吉草酸エチル、又は６−ブロモヘキサン酸メチルエステル、又は７−ブロモヘプタン酸メチル、又は７−ブロモヘプタン酸エチル、又は８−ブロモオクタン酸メチル、又は８−ブロモオクタン酸エチル、又は１０−ブロモデカン酸メチル、又はｗ−ブロモウンデカン酸エチル、又は１１−ブロモウンデカン酸メチル、又はブロモミリスチン酸メチル、又は１５−ブロモペンタデカン酸エチル、又は１６−ブロモ−ヘカデカンカルボン酸メチルエステル、又は１７−ブロモ−ヘパデカンカルボン酸メチルエステル、又は３−クロロ酪酸メチル、又は３−ブロモ酪酸メチル、又は３−ブロモ酪酸エチル、又はβ−ブロモ吉草酸エチル、又はβ−ブロモカプロン酸エチル）（５〜１０モル過剰）であることができる式ＶＩの化合物をＰＥＧ溶液に加えた。得られる混合物を室温で一夜攪拌した。次いで反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。残留物を２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）への添加により沈殿させた。沈殿した生成物をろ別しそして真空中で乾燥して式ＸＩＩＩの化合物を生成させた。
【０１１３】
段階２
式ＸＩＩＩのＰＥＧ酸エステル（４ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム５０〜１００mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを１〜６Ｎ塩酸の添加により２．５〜３．０に調節しそして混合物をジクロロメタンにより抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。式ＸＩＶの生成物ＰＥＧ酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。
【０１１４】
式ＸＩＶのＰＥＧ酸（２ｇ）を無水ジクロロメタン（１０〜２０mL）に溶解し、次いでＮヒドロキシスクシンイミド（１．０５〜２．０倍モル過剰）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０５〜２．０倍モル過剰）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）により沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥して、Ａが活性化された離脱性基であり、この離脱性基がその結合した酸素と一緒になって化エステルを形成する式Ｉ−Ａ２の化合物を生成させた。
【０１１５】
式：
【０１１６】
【化５９】
0005112203.tif 000036
【０１１７】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３、Ｒ４、ｗ及びｎは上記のとおりである〕
を有する、ＸがＯである式Ｉ−Ｂの化合物は、式Ｖの化合物を式：
【０１１８】
【化６０】
0005112203.tif 000037
【０１１９】
〔式中、ｗ、Ｙ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記のとおりである〕
の化合物と反応させて、式：
【０１２０】
【化６１】
0005112203.tif 000038
【０１２１】
〔式中、ｗ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は上記のとおりである〕
の化合物を生成させることにより製造される。
【０１２２】
式ＸＸの化合物を式Ｖの化合物と反応させて式ＸＸＩの化合物を生成させる反応は、式ＶＩＩの化合物を生成させるための式Ｖ及びＶＩの化合物の反応に関して説明したのと同じ方法で行われる。式ＸＸＩの化合物を次いで本明細書で前記した条件を使用する塩基性加水分解に付して、式：
【０１２３】
【化６２】
0005112203.tif 000039
【０１２４】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３及びＲ４は上記のとおりである〕
の化合物を形成させる。
【０１２５】
次いで式ＸＸＩＩの化合物を、Ａが活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素と一緒になってエステルを形成する式Ｉ−Ｂ１の化合物に変換させる。この変換は式ＩＸ’の化合物からの式Ｘの化合物の形成に関して説明したのと同じ方法で行われる。
【０１２６】
式：
【０１２７】
【化６３】
0005112203.tif 000040
【０１２８】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３及びＲ４、及びｗは上記のとおりである〕
を有する、ＸがＮＨである式Ｉ−Ｂの化合物は、式ＸＩＩの化合物を式ＸＸの化合物と反応させることにより製造される。この反応は、式：
【０１２９】
【化６４】
0005112203.tif 000041
【０１３０】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は上記のとおりである〕
の化合物を生成させる。
【０１３１】
式ＸＸＶの化合物を生成させるための式ＸＸの化合物と式ＸＩＩの化合物との反応を、式ＸＩＩＩの化合物を生成させるための式ＸＩＩの化合物と式ＶＩの化合物との反応に関して説明したのと同じ方法で行う。次いで式ＸＸＶの化合物を本明細書で前記した条件を使用する塩基性加水分解に付して、式：
【０１３２】
【化６５】
0005112203.tif 000042
【０１３３】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ、Ｒ３及びＲ４は上記のとおりである〕
の化合物を形成させる。
【０１３４】
式ＸＸの化合物と式ＩＩＩの化合物との反応による式Ｉ−Ｂ２の化合物の形成は、式ＶＩの化合物が式ＸＸの化合物で置き換えられていることを除いては、式Ｉ−Ａ２の化合物に関して説明したのと同じ方法で行われる。
【０１３５】
式：
【０１３６】
【化６６】
0005112203.tif 000043
【０１３７】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１、Ａ、ｖ、ｙ及びｋは上記のとおりである〕
の化合物である、ＸがＯである式Ｉ−Ｃの化合物は、式：
【０１３８】
【化６７】
0005112203.tif 000044
【０１３９】
〔式中、Ｙ、Ｒ５、ｙ及びｖは上記のとおりである〕
の化合物の、式：
【０１４０】
【化６８】
0005112203.tif 000045
【０１４１】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ及びｋは上記のとおりである〕
の化合物との反応により製造される。
【０１４２】
式Ｉ−Ｃ１の化合物の形成は、下記の反応スキーム：
【０１４３】
【化６９】
0005112203.tif 000046
【０１４４】
〔式中、Ａ１、Ｒ、ＰＡＧ１、ｎ及びｖは上記のとおりである〕
によって行われる。
【０１４５】
化合物式Ｉ−Ｃ１の形成において、式ＸＸＸＶＩの化合物２モルを式ＸＸＸＶの化合物１モルと反応させる。この反応は、本明細書において前記した式ＸＩ及びＶＩの化合物の反応に関して記載したのと同じ条件を使用して行われる。この方法においては、式ＸＸＸＶＩＩの化合物が生成される。式ＶＩＩＩ’の式ＩＸ’の化合物への加水分解に関して記載したのと同じ方法において、式ＸＸＸＶＩＩの化合物を加水分解して式ＸＸＸＶＩＩＩの化合物を形成させる。最後の段階において、式ＩＸ’の化合物の形成に関して記載したのと同じ方法において、式ＸＸＸＶＩＩＩの化合物を反応させてカルボキシル基を活性化離脱性基に変換させる。この方法において、式ＸＸＸＶＩＩＩの化合物はＡが活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素と一緒になってエステルを形成する式１−Ｃ１の化合物に変換される。
【０１４６】
ＸがＮＨである式Ｉ−Ｃの化合物、即ち、式：
【０１４７】
【化７０】
0005112203.tif 000047
【０１４８】
〔式中、Ａ、Ｒ、ＰＡＧ１、ｖ、ｗ及びｙは上記のとおりである〕
の化合物は、下記の反応スキーム：
【０１４９】
【化７１】
0005112203.tif 000048
【０１５０】
によって上記式ＸＸＸＶの化合物と式：
【０１５１】
【化７２】
0005112203.tif 000049
【０１５２】
〔式中、Ｒ、ＰＡＧ１及びｋは上記のとおりである〕
の化合物との反応により製造される。
【０１５３】
この反応の第１段階において、式ＸＸＸＶの化合物を式ＸＬ１の化合物と反応させて式ＸＬＩＩの化合物を生成させる。この反応は、式ＸＩＩの化合物を式ＶＩの化合物と反応させて式ＸＩＩＩの化合物を生成させることに関して記載したのと同じ方法で行われる。次の段階において、式ＸＩＩＩの化合物の加水分解に関して記載したのと同じ方法において、式ＸＬＩＩの化合物を式ＸＬＩＩＩの化合物に加水分解する。次いで式ＸＬＩＩの化合物を反応させて、カルボキシル基を本明細書で前記した活性化離脱性基に変換させて、Ａが活性化された離脱性基であり、この離脱性基はその結合した酸素と一緒になってエステルを形成する式Ｉ−Ｃ−２の化合物を生成させる。この反応は、式ＸＩＶの化合物の式Ｉ−Ａ２の化合物への変換に関して記載したのと同じ方法において行われる。
【実施例】
【０１５４】
実施例１
ＰＥＧのα−メトキシ、ω−吉草酸スクシンイミジルエステルの製造
【０１５５】
【化７３】
0005112203.tif 000050
【０１５６】
トルエン５０mL中の、Ｒがメチルであり、ＰＡＧが１００００の分子量を有するＰＥＧである、式ＸＩの化合物（５．０ｇ、０．５ミリモル）を２時間還流することにより共沸乾燥し、次いでトルエン４０mLを除去した。得られる混合物を無水テトラヒドロフラン３０mLに溶解しそしてアルゴン流下の丸底フラスコ中の水素化ナトリウム（０．１２ｇ、５ミリモル）及び無水テトラヒドロフラン（２０mL）に一滴ずつ加えた。得られる混合物を一夜還流した。５−ブロモ吉草酸エチル（０．７９mL、５ミリモル）を注射器を介して反応に加えそして反応を一夜還流した。次いで反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。残留物を２−プロパノールとジエチルエーテルとの混合物（１：１）の混合物への添加により沈殿させた。沈殿した生成物をろ別しそして真空中で乾燥した。収量：ＰＥＧが１，０００の分子量を有する表題の化合物（ｍ−ＰＥＧ吉草酸エチルエステル）４．５ｇ。
【０１５７】
ｍ−ＰＥＧ吉草酸エチルエステル（４ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム１００mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを６Ｎ塩酸の添加により２．５に調節しそして混合物をジクロロメタン（５０mL、４０mL、３０mL）により抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。ＰＥＧが１，０００の分子量を有する生成物ｍ−ＰＥＧ吉草酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。収量：３ｇ。
【０１５８】
【表１】
0005112203.tif 000051
【０１５９】
ｍ−ＰＥＧ吉草酸（２ｇ、０．２ミリモル）を無水ジクロロメタン（１０mL）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４７mg、０．４１ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（８７mg、０．４２ミリモル）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）により沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥した。収量：表題の化合物１．６ｇ
【０１６０】
【表２】
0005112203.tif 000052
【０１６１】
実施例２
ＰＥＧのα−メトキシ、ω−βブタン酸スクシンイミジルエステルの製造
【０１６２】
【化７４】
0005112203.tif 000053
【０１６３】
トルエン５０mL中の、ＰＡＧが１００００の分子量を有するＰＩＧである、式Ｉのメトキシ化合物（５．０ｇ、０．５ミリモル）を２時間還流することにより共沸乾燥し、次いでトルエン４０mLを除去した。得られる混合物を無水テトラヒドロフラン３０mLに溶解しそしてアルゴン流下の丸底フラスコ中の水素化ナトリウム（０．１２ｇ、５ミリモル）及び無水テトラヒドロフラン（２０mL）に一滴ずつ加えた。得られる混合物を一夜還流した。β−ブロモ酪酸エチル（０．７４mL、５ミリモル）を注射器を介して反応に加えそして反応を一夜還流した。次いで反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮した。残留物を２−プロパノールとジエチルエーテルとの混合物（１：１）への添加により沈殿させて、β水和物エチルエステルＰＥＧが１，０００の分子量を有するメチルＰＥＧを生成させた。沈殿した生成物をろ別し、そして真空中で乾燥した。収量：４．５ｇ。
【０１６４】
【表３】
0005112203.tif 000054
【０１６５】
ｍ−ＰＥＧエチル−βブチラート（３ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム５０mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを６Ｎ塩酸の添加により２．５に調節しそして混合物をジクロロメタン（２５mL、２０mL及び２０mL）により抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍ−ＰＥＧ吉草酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。ＰＥＧが分子量４１，０００を有するメトキシＰＥＧブタン酸を生成させた。収量：２．４ｇ。
【０１６６】
【表４】
0005112203.tif 000055
【０１６７】
ｍ−ＰＥＧ１０ｋ−β−ブタン酸（１ｇ、０．１ミリモル）を無水ジクロロメタン（５mL）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２４mg、０．２１ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（４３mg、０．２１ミリモル）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）により沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥して、ＰＥＧが１３０００の分子量を有する表題の化合物６．６ｇを得た。
【０１６８】
実施例３
ＰＥＧ−ＡＺＴコンジュゲートの製造
【０１６９】
【化７５】
0005112203.tif 000056
【０１７０】
実施例１のｍ−ＰＥＧ１０Ｋ吉草酸（０．２ｇ、０．０２ミリモル）を無水ジメチルホルムアミド（２mL）に溶解し、次いで３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）（１０．７mg、０．０４ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（９．８mg、０．０４ミリモル）、（４−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（５．７mg、０．４２ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（９．５mg、０．０４６ミリモル）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）により沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥した。収量：０．１７ｇ。
【０１７１】
【表５】
0005112203.tif 000057
【０１７２】
実施例４
ｍＰＥＧ１０ｋ−ＳＶＡによるＴ−２０のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）
実施例１に従って製造されたＰＥＧ１０kDaのα−メトキシ、ω−吉草酸スクシンイミジルエステルを、配列
【０１７３】
【表６】
0005112203.tif 000058
【０１７４】
を有するＴ−２０、２０mg、に加えた。
【０１７５】
この添加は、１モルのＴ−２０当り２モルの試薬のモル比で緩衝液（５０mMホウ酸塩ｐＨ８．０）１．０mL中で行った。溶液を室温で４時間攪拌した。ペグ化されたＴ−２０をイオン交換クロマトグラフィー（ＱＡ）を使用して反応混合物をから精製した。２０mMトリス、ｐＨ７．５中の１００mMから１ＭＮａＣｌまで増加していく塩濃度を有する線状勾配を使用してペグ化されたＴ−２０と修飾されていないＴ−２０を分離した。
【０１７６】
実施例５
ｍＰＥＧ３０Ｋ−β−ＳＢＡによるＥＰＯのペグ化
１．ヒトＥＰＯの発酵及び精製
注：ヒトＥＰＯの発酵及び精製の方法は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＥＰ１０６４９５１  Ａ２）に記載された方法とまったく同じであった。（７〜９頁参照）。
【０１７７】
ペグ化反応
５ミリグラムのＥＰＯｓｆ（６５３μｌの７．６６mg／ml  ＥＰＯｓｆストック、０．２７４μモル）に、３０kDaメトキシ−ＰＥＧ−β−ＳＢＡ（０．２７４μモル）８．２mgを含有する１００mM緩衝液、ｐＨ８．０、３４７μｌを加えそして４℃で４時間混合した。最終タンパク質濃度は５mg／mlでありそしてタンパク質：ＰＥＧ試薬比は１：１であった。４時間後、氷酢酸によりｐＨを４．５に調節することにより反応を停止させそして精製の準備ができるまで、−２０℃で貯蔵した。
【０１７８】
３．精製
前の段階からの反応混合物を１０mM酢酸ナトリウムで１：５希釈し、ｐＨ４．５、そして１８mm×１４３mmカラムに充填された１００mlのＳＰ−セファロースＦＦ（スルホプロピルカチオン交換樹脂）に適用した。カラムを同じ緩衝液で予め平衡化させた。カラム流出液をＧｉｌｓｏｎＵＶモニターで２８０nmで監視しそしてＫｉｐｐ及びＺｏｎｅｎレコーダーで記録した。カラムを１００ml又は１ベッド容積の平衡化緩衝液で洗浄して、過剰の試薬、反応副生物及びオリゴマーＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。続いて２ベッド容積の１００mMＮａＣｌで洗浄してジ−ＰＥＧ−ＥＰＯを除去した。次いでモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを２００mMＮａＣｌで溶離した。モノ−ＰＥＧ−ＥＰＯの溶離期間中、タンパク質ピークの最初の５０mlを捨てそしてモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを１５０ml画分として集めた。カラムに残っている修飾されていないＥＰＯｓｆを７５０mMＮａＣｌで溶離した。すべての溶離緩衝液は平衡化緩衝液において作られた。溶離されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。次いで、検出可能な修飾されていないＥＰＯｓｆを有していない１５０ml画分から得られたモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯプールを〜５．０mg／mlに濃縮し、そして貯蔵緩衝液、１０mMリン酸カリウム、１００mMＮａＣｌ、ｐＨ７．５中にダイアフィルトレーションした（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。濃縮／ダイアフィルトレーションを５kDaカットオフＭｉｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｂｉｏｍａｘ５０メンブレンを備えたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌａｂｓｃａｌｅ（商標名）ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍで周囲の温度で行った。濃縮したモノ−ＰＥＧ−ＥＰＯを無菌ろ過しそして−２０℃で貯蔵凍結した。
【０１７９】
実施例６
ｍＰＥＧ１０Ｋ−ＳＶＡによるＥＰＯのペグ化
実施例５で使用されたＥＰＯｓｆの異なるアリクォートを１０kDaメトキシ−ＰＥＧ−ＳＶＡと反応させた。反応を１：２のタンパク質：試薬比で行いそして精製技術は実施例５に従った。
【０１８０】
実施例７
正赤血球状態マウスアッセイ（ｎｏｒｍｏｃｙｔｈａｅｍｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｓａｙ）により決定されたペグ化ＥＰＯのインビボ活性
正赤血球状態マウスアッセイは、当該技術分野で知られており（Ｐｈａｒｍａ．Ｅｕｒｏｐａ  Ｓｐｅｃ．Ｉｓｓｕｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ＢＲＰ  Ｂｉｏ  １９９７（２）そしてＰｈ．Ｅｕｒ．ＢＲＰのエリスロポエチンのモノグラフィーにおける方法において知られている。サンプルをＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した。７〜１５週齢の正常な健康なマウスにペグ化されていないＥＰＯ（４０ng／マウス）または実施例５又は６からのモノペグ化ＥＰＯ（１０又は４０ng／マウス）を含有するＥＰＯ画分０．５mlを経皮投与した。６日の期間にわたり、尾部静脈の穿刺により血液を取り出し、そして０．１５モルアクリジンオレンジ染色溶液１ml中に血液１μｌが存在するように希釈した。染色時間は３〜１０分であった。網状赤血球係数は絶対数（分析された３０，０００個の血液細胞当りの）として与えられた。与えられたデータについて、各グループは５マウス／日からなっておりそしてマウスは１回だけ出血させた。結果は、修飾されていないＥＰＯ４０ngの用量に比較して、マウス当り同じ用量（１０ng）を使用して有意に増加した量の網状赤血球及び網状赤血球係数最大値（ｒｅｔｉｃｕｒｌｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｕｎｔ  ｍａｘｉｍｕｍ）のシフトにより示されるペグ化ＥＰＯ種の優秀な活性及び長くなった半減期を示す。
【０１８１】
実施例８
メトキシ分岐状ＰＥＧ−酸及びそのスクシンイミジルエステルの製造
【０１８２】
【化７６】
0005112203.tif 000059
【０１８３】
ＰＡＧが１，０００の分子量を有するＰＥＧである式ＶＩの化合物［分子量１００００のｍ−ＰＥＧアミン］（１．０ｇ、０．１ミリモル）を４０℃で無水エタノール５mLに溶解し、次いで３−ブロモ−２−（ブロモメチル）プロピオン酸エチル（７．６μＬ、０．０４８ミリモル）を添加し、そして混合物をアルゴン下に４０℃で一夜攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮させた。２−プロパノールとジエチルエーテル（１：１）の混合物への添加により残留物を沈殿させた。沈殿した生成物をろ別しそして真空中で乾燥した。収量：０．８９ｇ。
【０１８４】
分岐状ｍ−ＰＥＧ酸エステル（０．８９ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム２０mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを６Ｎ塩酸の添加により２．５に調節し、そして混合物をジクロロメタン（１０mL、５mL及び５mL）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍ−ＰＥＧ吉草酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。収量：０．６４ｇ。
【０１８５】
分岐状ｍ−ＰＥＧ酸（０．６４ｇ、０．０３２ミリモル）を無水ジクロロメタン（５mL）に溶解し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１mg、０．０９８ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（２０mg、０．０９９ミリモル）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）で沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥した。収量：０．５８ｇ。
【０１８６】
実施例９
分岐状ＰＥＧ−酸及びそのスクシンイミジルエステルの製造
ＰＡＧが２，０００の分子量を有するＰＥＧである式ＶのメトキシＰＡＧ化合物（分子量１００００のｍ−ＰＥＧアミン）（１．０ｇ、０．１ミリモル）を４０℃で無水エタノール５mLに溶解し、次いで３−ブロモ−２−（ブロモメチル）プロピオン酸エチル（７．６ｃｃＬ、０．０４８ミリモル）を添加し、そして混合物をアルゴン下に４０℃で一夜攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーションにより濃縮させた。２−プロパノールとジエチルエーテル（１：１）の混合物への添加により残留物を沈殿させた。沈殿した生成物をろ別しそして真空中で乾燥した。収量：０．８９ｇ。
【０１８７】
分岐状ｍ−ＰＥＧ酸エステル（０．８９ｇ）を１Ｎ水酸化ナトリウム２０mLに溶解しそして溶液を室温で一夜攪拌した。混合物のｐＨを６Ｎ塩酸の添加により２．５に調節し、そして混合物をジクロロメタン（１０mL、５mL及び５mL）で抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、ろ過し、濃縮しそしてジエチルエーテル中に沈殿させた。生成物ｍ−ＰＥＧ吉草酸をろ過により集めそして真空下に乾燥した。収量：０．６４ｇ。
【０１８８】
分岐状ｍ−ＰＥＧ酸（０．６４ｇ、０．０３２ミリモル）を無水ジクロロメタン（５mL）に溶解し、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１１mg、０．０９８ミリモル）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（２０mg、０．０９９ミリモル）を添加した。混合物をアルゴン下に室温で一夜攪拌した。反応混合物をろ過し、濃縮しそして２−プロパノールとジエチルエーテルの混合物（１：１）で沈殿させた。生成物を真空中で一夜乾燥した。収量：表題の化合物０．５８ｇ。
【配列表】
0005112203000001.app