(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブロックコポリマーミセル形成組成物であって、親水性シェルに囲まれた疎水性コアと、該ミセル中に物理的に取り込まれた治療用医薬とを含み、
疎水性コアがポリオルトエステル、ポリ無水物、チロシン誘導プソイド-ポリ(アミノ酸)、ポリホスファゼン、もしくはポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)、およびこれらの組み合わせ、またはポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(D-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ラクチド／グリコリドコポリマー、もしくはポリカプロラクトン、およびこれらの誘導体からなる群から選択されるポリエステルからなる群から選択され、
該親水性シェルがポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)であり、
該組成物が、ブロックコポリマーミセル形成組成物の凍結乾燥された形態に水溶液を加えると容易に再分散または再溶解するものである、上記組成物。
【請求項２】
前記治療用医薬が抗腫瘍化合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗腫瘍化合物が、少なくとも１種のフタロシアニン化合物、アントラサイクリン化合物、代謝拮抗物質、アルキル化薬およびタキサンから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記フタロシアニン化合物が塩化アルミニウムフタロシアニンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アントラサイクリン化合物がドキソルビシンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記代謝拮抗物質が、メトトレキセート、マイトマイシンおよび5-フルオロウラシルから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記アルキル化薬がカルムスチンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記タキサンがパクリタキセルである、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療用医薬が、疎水性抗生物質、疎水性抗真菌薬、免疫調節薬、抗ウイルス薬およびステロイド系もしくは非ステロイド系抗炎症薬から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
必要とする対象に治療用医薬を投与するための医薬の製造のための、請求項１に記載のブロックコポリマーミセル形成組成物の使用。
【請求項１１】
凍結乾燥形態のブロックコポリマーミセル形成組成物が水溶液を加えると容易に再分散または再溶解するものである請求項１〜９のいずれか１項に記載のブロックコポリマーミセル形成組成物の、医薬の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の属する分野
本発明は、限定するものではないが抗癌薬のような治療用医薬の送達に有用なポリマーミセルからなる組成物に関する。
【０００２】
２．発明の背景
化学療法薬の使用にまつわる大きな障害は、癌細胞に対する選択性がないことである。この選択性の欠如が、正常細胞と異常細胞の両方に薬物が送達されることによる、かかる薬物の使用の有害副作用につながってきた。標的細胞に対する薬物選択性の欠如は癌以外の各種疾患治療においても問題である。多くの研究が、薬物を標的細胞に選択的に送達することができる薬物運搬体の開発に向けて集中的に行なわれた。例えば、低治療指標薬物の特異的送達を向上させるために、リポソーム、微粒子、ナノ関連物質および薬物・ポリマー結合体などの各種薬物運搬体が研究されてきた。
【０００３】
研究された標的手段のうちリポソーム（リン脂質小胞）が多くの注目を集めた。しかしながらその標的能力は、肝臓および脾臓の細網内皮(RE)細胞による素早い捕食、血漿中における不安定性、大きさからくる管外遊出時の限られた能力、その製造上の技術的問題および酸化に対する感受性により、限られたものであった。個々の問題に対する解決策は見つかっているが、２つ以上の問題に対する解決策が１つの組成物中に組み合わされることはめったになかった。例えば、RE細胞による認識が下げられ安定性が向上されると、50 nm未満の直径の安定なリポソームを得るのは困難である。
【０００４】
ポリマーミセルは1984年にBader, H. et al.により薬物運搬体として最初に提案された（Angew. Makromol. Chem. 123/124 (1984) 457-485）。ポリマーミセルは高まる科学的な注目の的となり、その内部コアに薬物を溶解させることができること、また概して大きさが小さいこと（100nm未満）および細網内皮系(RES)による捕食を逃れる傾向にあることなどの魅力的な特徴を有していることから、水難溶性の薬物運搬体の候補として浮上してきた。
【０００５】
ミセルは、ウイルスあるいはリポタンパク質のような天然に存在する運搬体としばしば比較される。これら３つの運搬体全ては、その取り込み物がウイルスに対するＤＮＡであれあるいはリポタンパク質およびミセルに対する水不溶性薬物であれ、標的細胞への運搬の際にその取り込み物が保護されるのを可能とするよく似たコア・シェル構造を有する。
【０００６】
リポタンパク質は、腫瘍が低密度リポタンパク質に対して増強された要求を発現することから、抗腫瘍化合物を癌細胞に標的するための運搬手段として提案された。しかしながら、主に薬物が組み込まれたリポタンパク質は正常細胞によっても認識されるであろうことから、また腫瘍上の受容体部位に対してもともと体内にあるリポタンパク質と競合しなければならないであろうことから、運搬体としてのリポタンパク質の能力は疑われてきた。反対に、ウイルスは免疫反応を引き起す傾向があるので、ウイルス運搬体は主に遺伝子物質の送達に用いられ、送達用運搬体の繰り返し適用を必要としない用途に至適使用があり得る。
【０００７】
ポリマーミセルは、水不溶性薬物の送達に最も有利な運搬体のひとつであると思われる。ポリマーミセルはコア・シェル構造により特徴づけられる。ポリマーミセルに関する薬学的研究は主にそれぞれ親水性シェル部分構造Ａと疎水性コアポリマーＢを持つＡ−Ｂジブロック構造のコポリマーを中心に行なわれてきた。ポリ(エチレンオキシド)-ポリ(プロピレンオキシド)-ポリ(エチレンオキシド)（PEO-PPO-PEO）（A-B-A）のようなマルチブロックコポリマーもミセルに自己組織化することができ、薬物運搬体の候補として記載されてきた（Kabanov, A.V. et al., FEBS Lett. 258 (1989) 343-345）。ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)（PBLA）、ポリ(DL-乳酸)（PDLLA）あるいはポリ(ε-カプロラクトン)（PCL）のような生分解性ポリマーから一般に構成される疎水性コアは、水不溶性薬物に対してリザーバとして働き、薬物が水性環境と接触することを防ぐ。このコアは、例えばポリ(アスパラギン酸)（P(Asp)）のような水溶性ポリマーから構成されることも可能であるが、この場合この水溶性ポリマーは疎水性薬物の化学的結合により疎水性にされる、あるいは２つの逆に帯電したポリイオンの会合により形成される（ポリイオン複合体ミセル）。ポリスチレン（Pst）あるいはポリ(メチルメタアクリレート)（PMMA）のような非-または難-生分解性ポリマーを内部コアの構成成分として用いることをいくつかの文献が記載している。例えば、Zhao, C.L. et al., Langmuir 6 (1990) 514-516；Zhang, L. et al., Science 268 (1995) 1728-1731およびInoue, T. et al., J. Controlled Release 51 (1998) 221-229を参照されたい。臨床的に適切な薬物運搬体としてみなされるためには、非-生分解性ポリマーは無害で且つその分子量は十分低く腎臓ルートを介して排泄されるものでなければならない。この疎水性内部コアは、アルキル鎖あるいはジアシルリピッド（例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（DSPE））のような極めて疎水性の大きい短鎖からも構成され得る。疎水性鎖はポリマーの１つの末端に付けることもでき、あるいはポリマー構造内でランダムに分布させることもできる。
【０００８】
シェルは、ミセルの安定化、ならびに血漿タンパク質および細胞膜との相互作用の役割をになう。シェルは、例えばPEOのような親水性、非生分解性、生体適合性のポリマー鎖から一般に構成される。運搬体の生体内分布は親水性シェルの性質によって主に決まる。ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（PNIPA）およびポリ(アルキルアクリル酸)のような他のポリマーはミセルに温度あるいはpH感受性を付与し、いずれ生体接着性の特性を授けるのに用いることもできると考えられる。標的部分構造と結合するためにミセルの表面に官能基を有するミセルも知られている。例えば、Scholz, C. et al., Macromolecules 28 (1995) 7295-7297を参照されたい。
【０００９】
ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)（PVP）は、その骨格鎖中の無極性のメチレン基およびその環中のメチン基に囲まれた極めて極性の大きいラクタム基を有する、周知の水溶性、生体適合性、両親媒性のポリマーである。PVPは従来よりポリスチレンラテックスを合成する際の立体安定剤として用いられている。例えば、Gabaston, L.I. et al., Macromolecules 31 (1998) 2883-2888；Rutt, J.S. et al., J. Polym. Sci.:Part A: Polym. Chem., 32 (1994) 2505-2515を参照されたい。PVPはまた凍結防止剤および凍結乾燥防止剤として用いられる場合もある。例えばSkaer, H.B. et al., J. Microsc. 110 (1977) 257-270；Townsend, M.W. et al., J. Parenter. Sci. Technol., 42 (1988) 190-199を参照されたい。
【００１０】
PVPはPEGと比較して、非イオン性およびイオン性共溶質に対してそれが示す相互作用の多様性において優れている。Molyneux, P., Proc. Int. Symp. Povidone (1983) 1-19を参照されたい。長アルキル鎖あるいは芳香族部分構造を持つ分子と最も顕著に結合が起こる。PEGと同様、PVPはまたコロイド性運搬体およびペプチド／タンパク質の生体内循環時間を増大させることもできる。例えば、Kamada, H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257 (1999) 448-453；Torchilin, V.P., J. Microencapsulation 15 (1998) 1-19を参照されたい。さらにポリ(D,L-乳酸)とポリ(エチレングリコール)（PEG）のジブロックコポリマーを含有するナノ粒子は凍結乾燥の後集合体化することも示された。De Jaeghere, F. et al., Pharm. Res. 16 (1999) 859-866を参照されたい。この問題は凍結乾燥防止剤を使用することにより巧みに回避された。この問題は、PVPはそれ自身凍結乾燥防止剤であるので、PVPを使用することにより未然に防げたと思われる。
【００１１】
N-ビニルピロリドン（VP）は各種のビニルモノマーと共重合させることができる。電気的陰性モノマーとは交互コポリマーを形成し、アクリレートとはランダムコポリマーを形成する。また例えば、ポリ(L-ラクチド)（PLLA）とPVPとから構成されるグラフトコポリマーも製造されている。Eguiburu, J.L., et al., J. San Roman, Polymer 37 (1996) 3615-3622を参照されたい。この研究では、PLLAマクロモノマーがVPと共重合されたが、ポリマーミセルの形成は評価されなかった。
【００１２】
現在まで、生分解性のポリマーミセルの調製に取り組むほとんどの研究は、親水性シェルを形成するためにはPEGを使用することが中心であった。例えば、X. Zhang, X., et al., Inter. J. Pharm. 132 (1996) 195-206；Yokoyama, M., et al., J. Control. Release 55 (1998) 219-229；Allen, C., et al., J. Control. Release 63 (2000) 275-286を参照されたい。
【００１３】
従って、PEGを含んでいないが優れた可溶化特性を示し各種の医薬に対しいくつもの結合部位を提供する、新規な生体適合性、生分解性のポリマーミセルシステムに対するニーズが依然としてある。それは、その凍結乾燥された形態に水を加えると容易に再分散または再溶解するものでなければならない。本発明ではそのようなシステムはジブロックPVP-ポリ(D,L-ラクチド)（PDLLA）から構成される。
【００１４】
３．発明の概要
本発明は、親水性シェルに囲まれた疎水性コアからなるミセル形成組成物であって、該親水性シェルがPVPであることを特徴とするミセル形成組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、
治療用医薬；および、
親水性シェルに囲まれた疎水性コア、
からなるミセル形成組成物であって、該親水性シェルがPVPであり、且つ該治療用医薬が該ミセル内に取り込まれているミセル形成組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本ポリマーミセルに少なくとも１種の適切な治療用医薬を組み込む方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、治療用医薬を含むポリマーミセル組成物であって、該治療用医薬が、該ミセルの疎水性コアもしくは親水性シェル内に取り込まれることにより加水分解などの化学的相互作用から保護され得る、ポリマーミセル組成物を提供する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読むことにより当業者にはよりたやすく理解されよう。
【００１９】
４．発明の詳細な説明
本発明は、水に対して難溶性であり且つ／または親水性シェルに対して特異的親和性を有する治療用医薬の送達に用いられ得るポリマーミセルからなるコロイド状組成物を提供する。本ポリマーミセルは、疎水性コアが親水性シェルに囲まれているコア・シェル構造により特徴づけされる。この親水性シェルは、親水性ポリマーまたはコポリマーからなる。
【００２０】
本発明の親水性ポリマーは、ポリ(N-ビニル-2-ピロリドン)（PVP）のポリマーまたはコポリマーである。
【００２１】
疎水性部分構造がミセルのコアを構成する。この疎水性部分構造は、ポリ(グリコール酸)、ポリ(乳酸)、ポリ(D-乳酸)、ポリ(D,L-乳酸)、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリカプロラクトンならびにこれらの誘導体のようなポリエステル；ポリオルトエステルおよびその誘導体；ポリ無水物およびその誘導体；チロシン誘導プソイド-ポリ(アミノ酸)およびその誘導体；ポリホスファゼンおよびその誘導体；ポリ(アルキルアクリレート)およびその誘導体；ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)およびその誘導体；ならびにこれらの組み合わせから選ばれる。好ましい疎水性部分構造はポリ(D, L-ラクチド)（PDLLA）である。このPDLLAは約10％〜約50％（w/w）の範囲の濃度で存在する。
【００２２】
４．１  ミセルの形成
ミセルの形成は２つの力の結果として起こる。ひとつは分子の会合をもたらす引力であり、もうひとつはミセルがはっきりと肉眼で見える段階にまで無制限に成長するのを防ぐ反発力である。両親媒性のコポリマーは、その親水性ポリマーかその疎水性ポリマーのどちらかに対して選択的である溶媒の中に入れると自己会合する。
【００２３】
両親媒性コポリマーのミセル化過程は低分子量の界面活性剤のそれに似ている。非常に低い濃度では、ポリマーは単に単一の鎖として存在する。濃度が高くなり臨界会合濃度（「CAC(critical association concentration)」と呼ばれる臨界値に達すると、コポリマーの疎水性部分が、ポリマーが希釈されている水性媒体との接触を避けるようになり、ポリマー鎖は会合し始めミセルを形成する。CACでは、ミセルコアの内部には多量の溶媒が存在し、ミセルはゆるんだ集合体 (loose aggregates) と記述され、より高い濃度で形成されるミセルよりも大きい径を示す。それらの濃度においては、その平衡状態はミセル形成に有利に働き、ミセルはその低エネルギー状態配置をとるようになり、残存する溶媒は疎水性コアから次第に放出されミセル径は小さくなる。両親媒性コポリマーは一般に低分子量界面活性剤のCACよりもずっと低いCACを示す。例えば、PEO-PBLAおよびPNIPA-PStのCACは0.0005〜0.002％の間にある。しかしながら一部の両親媒性コポリマーはもっと高いCACを示し、ポロクサマーの場合は0.01〜10％にまで達する。高いCACを有する両親媒性コポリマーは薬物標的手段として適切ではない場合があるが、これはそれが水性環境中では不安定であり、希釈されると容易に解離するからである。
【００２４】
両親媒性コポリマーのミセル化は、その疎水性鎖が親水性ポリマーにランダムに結合しているかあるいは親水性鎖の１つの末端にグラフト結合しているかによって２つの異なるタイプのミセルになり得る。ランダム変性ポリマーから形成されるミセルは一般に末端変性ポリマーから形成されるミセルよりも小さい。ミセルの径は、コア中に疎水性鎖を閉じ込める疎水力によって、またミセル径を制限している鎖間の排除体積反発力によって主に決まる。ランダム変性コポリマーおよび末端変性コポリマーにおけるこれら２つの力のバランスの差が、それらの異なる径を説明しうる。末端疎水性基が会合してミセルを形成すると、その疎水性セグメントの周りに固定された水クラスターはコアから排除され、コアと親水性シェルとの間には直接の相互作用は存在せず、この親水性シェルは可動性線状鎖としてミセル構造中に残る。しかしながらランダム変性ポリマーは、ポリマーの疎水性部分と親水性部分が絡まり合いコアと水性媒体との間で接触が起こることを可能とするような形で会合する。これは、露出した疎水性コアはポリマーミセルの二次集合体をつくる可能性があるので、重要な問題である。二次集合体は、結合型ドキソルビシン（DOX）を内包するPEO-P(Asp)ミセルシステムにおける大粒子（100nmより大きい）の存在を説明する仮説としても提案されている。
【００２５】
４．２  臨界会合濃度（CAC）の決定
光散乱がミセルの分子量および会合数の測定に広く用いられている。しかしながらミセル化の開始はミセルのCACがこの光散乱法の感度内に入って初めて検出することができる。これは水中のポリマーに対してはめったに起こらないことである。水性条件下にあるゲル浸透クロマトグラフィ（GPC）は、コポリマーの単一鎖とコポリマーのミセル部分が異なる溶出容積を示すことから用いることができる。またGPCによりミセルの分子量とその会合数を同時に測定することも可能である。サイズ排除カラムを通しての溶出の際にポリマーミセルの一体性が維持されるということは重要である。カラムへのポリマーの吸着も問題を呈する場合があり、ミセルが大きなゆるんだ集合体から構成される、CACに近い濃度において特にそうである。
【００２６】
CACを測定する好ましい方法は蛍光プローブの使用を伴うが、なかでもピレンが広く用いられている。ピレンは、非常に疎水性でありまた周囲の環境の極性に敏感である縮合芳香族炭化水素である。CACより低いところでは、ピレンは強極性の媒体である水に可溶化されている。ミセルが形成されると、ピレンはミセルのコアによって提供される疎水性領域のほうに優先的に分配され、従って無極性の環境に直面する。その結果、蛍光強度の増加、発光スペクトルの振動性微細構造の変化、および励起スペクトルにおける (0,0) バンドの赤方偏移のようないくつもの変化が観察される。見掛けのCACは、ピレンの蛍光プロット、すなわち発光スペクトルからのI1/I3比または励起スペクトルからのI338/I333比対濃度プロットから求めることができる。その傾きにおける大きな変化がミセル化の開始を意味する。I1/I3比は一番高いエネルギーの発光ピークと三番目に高いエネルギーの発光ピークとの間の強度比であり、一定の励起波長と、I1とI3に対応する可変発光波長において測定される。蛍光法で測定されたCACは二つの理由から注意深く解釈されねばならない。第一に、ピレンの濃度は、ミセル化が起こる時に傾きの変化が正確に検出できるよう極端に低く（10-7M）保つ必要がある。第二に、蛍光スペクトルの緩やかな変化が場合によっては疎水性不純物の存在が原因で起こりうるあるいはプローブと個々のポリマー鎖もしくはミセル形成前の集合体との会合によって起こりうる。蛍光プローブの異方性の変化もミセル化の開始と関係している。
【００２７】
本発明の組成物のようなポリマーミセルはその小さい径（10〜100nm）により特徴づけられる。この小さい径は、運搬体物質の管外遊出に必要とされる以外に、本組成物の滅菌を濾過だけで行うことを可能とし、また毛細血管の塞栓リスクを最小限にする。これは、もっと大きな医薬運搬体では見られるものではない。ミセルの径は、コポリマー分子量、親水性鎖と疎水性鎖の相対割合、および会合数など各種の要因に依存する。透析により調製されるミセルの径は、ポリマーを溶解するのに使用される有機溶媒により影響を受けうる。
【００２８】
ミセルの直径および径の多分散性は水または等張性緩衝液中で動的光散乱（DLS(dynamic light scattering)）により直接求めることができる。DLSはまたポリマーミセルの球形度についての情報を提供することもできる。
【００２９】
ミセル径は、例えば原子間力顕微鏡（AFM）、透過型電子顕微鏡（TEM）および走査型電子顕微鏡（SEM）のような方法によっても推定することができる。これらの方法はミセル形状および径分散性の特性評価を可能とする。超遠心分離速度調査がポリマーミセルの多分散性を評価するのに場合によって行われる。
【００３０】
４．３  ポリマーミセル中への治療用医薬の組み込み
ミセル中への治療用医薬の組み込みは当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、予備形成されたミセルを含む溶液にその化合物を溶解することによって、水中油手法または透析法により組み込みを行うことができる。
【００３１】
用いうる治療用医薬は、以下に掲げるもののように、ポリマーミセル中に安定した方法で取り込まれ且つ治療的に有効な用量で投与できる化合物であればどのような化合物であってもよい。好ましくは、本発明で用いられる治療用医薬は、ミセル中に効率的に取り込まれるように疎水性である。しかしながら、イオン性ミセルと、逆に帯電している親水性化合物（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）との間に安定した複合体を形成させることも可能である。好適な医薬としては、フタロシアニン（例えば塩化アルミニウムフタロシアニン）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン（DOX））、難溶性代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、マイトマイシン、5-フルオロウラシル）およびアルキル化薬（例えばカルムスチン）のような抗腫瘍化合物が挙げられる。ミセルはパクリタキセルのようなタキサンを取り込むこともできる。
【００３２】
ミセルに取り込むことができるその他の医薬としては、在来の疎水性抗生物質および抗真菌薬（例えばアムホテリシンＢ）、貧水溶性免疫調整薬（例えばシクロスポリン）、貧水溶性抗ウイルス薬（例えばHIVタンパク質分解酵素抑制剤）および貧水溶性ステロイド系抗炎症薬（例えばデキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症薬（例えばインドメタシン）およびゲノム断片がある。
【００３３】
さらに、化学的結合あるいは、（透析、乳化手法、水性媒体中での医薬とミセルの単純平衡化または水中での医薬／ポリマー固形分散物の可溶化を通しての）物理的取り込みにより、医薬を本発明のポリマーミセル組成物中に組み込むことができる。
【００３４】
タンパク質のような親水性化合物もまた本発明のポリマーミセル組成物中に組み込むことができる。しかしながらかかる親水性物質の組み込みは、その分子の化学的疎水化または親水性シェルに対する特異的親和性を必要とする場合がある。ポリイオン化合物は、ポリイオン複合体ミセルの形成を通して組み込むことができる。
【００３５】
医薬の物理的取り込みは一般に透析または水中油乳化手法によって行なわれる。透析法は、医薬とコポリマーを両者が可溶である溶媒（例えばエタノールまたはN,N-ジメチルフォルムアミド）中から、そのポリマーの親水性部分に対してのみ選択的である溶媒（例えば水）中にもってくることからなる。良溶媒が選択溶媒で置換されると、その過程の間にポリマーの疎水性部分が会合してミセルコアを形成し、不溶性の医薬を取り込む。この透析を数日間に亘って続けると有機溶媒の完全な除去がもたらされる。水中油乳化手法では、水不溶性の揮発性溶媒（例えばクロロフォルム）中の医薬溶液を、本コポリマーの水溶液に加えて水中油型乳化液を形成させる。溶媒が蒸発するとミセル・医薬複合体が形成される。後者の方法に対する透析法の主たる優位点は、塩素系溶剤のような有毒の可能性のある溶剤の使用を避けられることである。
【００３６】
医薬の取り込み方法はミセル内の医薬の分布に影響を与える。例えばCao et al. (Macromolecules 24 (1991) 6300-6305)は、ミセルが形成されているときにミセルに組み込まれたピレンは、ミセルが形成された後に組み込まれたピレンほどはその水性環境から保護されていないことを示したが、この場合この初めの方法は後の方法よりも三倍多い医薬取り込み量を与えた。
【００３７】
本発明のポリマーミセルの取り込み効率は、添加される医薬の初期量に依存する。最大取り込み可能量を越えると治療用医薬の析出を生じ、従って低い収率となる。さらに、治療用医薬の組み込み効率は、コポリマーの会合数にも依存する。大きい会合数を示すミセルは、その内部コアにより多量の医薬を可溶化させる。
【００３８】
４．４  治療用医薬が組み込まれたポリマーミセルの例
ポリマーミセル中に組み込まれた化合物ならびに対応する医薬取り込み方法の例を下の表に示す。本発明のポリマーミセル組成物は、限定するものではないが抗癌薬、プラスミドDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの各種治療用医薬の送達システムとして使用するのに、あるいは身体の特定の器官に診断用薬を送達するのに好適であると考えられる。
【００３９】
0005134179.tif 000002
0005134179.tif 000003
【００４０】
医薬が組み込まれたことの証拠はGPCまたはDLSにより得ることができるが、これは両者の方法がともにミセル径の変化を検出するからである。医薬の存在は通常ミセル径の増大を伴う。ミセルコア内部における医薬の所在場所は実験をクェンチすることにより示すことができる。例えば、DOXの水溶性クェンチャーであるヨウ化物(I)は、ミセルに組み込まれた医薬の蛍光に影響しないが、遊離の医薬の蛍光をクェンチする。このような実験で、DOXは凍結乾燥および水中再構成の後もPEO-PBLA内に保持されることが示された。DOXの場合、ミセルコア内の医薬の自己会合は医薬蛍光強度の低下ももたらす。最近、ポリマーミセル中のアムホテリシンBの保持とゆっくりとした放出が、PEO-PBLAミセル中に組み込んだ後その溶血作用の低下を測定することにより間接的に確かめられた。
【００４１】
４．５  医薬への応用
本発明のポリマーミセル組成物は、例えば経口送達、持続放出および部位特異的医薬標的などの各種の医薬分野において使用するのに好適である。好ましくは、本発明のミセルは水不溶性医薬の運搬手段として使用される。
【００４２】
５．実施例
以下の実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４３】
材料
市販の溶剤をMoquin Scientific（ケベック州、テールボンヌ）から購入し、試薬はAldrich（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。N-ビニル-2-ピロリドン（VP）、2-イソプロポキシエタノール、ミネラルオイル中35重量％水素化カリウム（KH）および18-クラウン-6は、さらに精製することなく用いた。D,L-ラクチドを60℃で無水の酢酸エチルから三回再結晶させ、次にP2O5上で減圧下24時間室温にて乾燥させた。テトラヒドロフラン（THF）を、使用する直前に乾燥アルゴン雰囲気下ナトリウムおよびベンゾフェノン上で還流と蒸留を行った。1,1'-アゾビス(シクロヘキサン-カルボニトリル)（ACCN）をエタノール溶液から水中への析出により精製し、4日間真空下で乾燥させた。セファロース2BをSigma（ミズーリ州、セントルイス）から入手し、使用する前に水で平衡化させた。ミセル調製に使用した透析バッグはSpectra/Por Membranes（カリフォルニア州、ランチョドミンゲス）のMWCO 6000-8000であった。全ての反応は前もってフレーム処理した丸底フラスコ中で行い、この丸底フラスコには乾燥アルゴン雰囲気下でゴム製隔膜を取り付けた。
【００４４】
分子量はミレニアム(Millenium)ソフトウエアプログラムのついたゲル浸透クロマトグラフィ（GPC、Waters Model 600、マサチューセッツ州、ミルフォード）により測定した。三つのスタイラジェル(Styragel)カラム（Waters、HR1、HR3、HR4、4.6×300 mm）および微分屈折率検出計(differential refractomter detector)（Waters 2410）を使用した。移動相はCHCl3（30℃および1 mL/min）であった。カラムカリブレーションは標準ポリスチレン（Aldrich、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）で行った。1Hおよび13C NMRスペクトルをそれぞれ重水素化されたクロロフォルム中でVarian 300およびBrucker AMX 600スペクトルメーターに記録した。
【００４５】
臨界会合濃度（CAC）は定常状態ピレン蛍光法により求めた。ピレン水溶液中の両親媒性ポリマーの濃度を上げていくと、ピレンの励起スペクトル中に333から338.5nmへの(0,0)バンドのシフトがあることが既に示されている。I338/I333強度比により測定されるこの変化は、ピレン分子の水環境から疎水性ミセルコアへの移動に伴うもので、見かけのCACを推定するのに用いることができる。ポリマー濃度は異なるがそれぞれ10-7Mのピレンを含有するいくつかの水中ポリマー溶液を調製し、4℃で暗所にて一晩撹拌を続けた。定常状態蛍光スペクトルをSerie 2 Aminco Bowman 蛍光測定器（Spectronics Instruments 社、ニューヨーク州、ロチェスター）を用いて20℃撹拌下で5分後に測定した（λem＝390nm）。単峰および微分の径分布プロセッサー（SDP：size distribution processor）強度分析（N4Plus、Coulter Electronics、フロリダ州、ヒアリア）を用いて動的レーザー散乱（DLS：dynamic laser scattering）により20℃の水およびPBS中でミセル径を求めた。
【００４６】
PVP-OHの調製
ヒドロキシ末端PVP（PVP-OH）を、連鎖移動剤として2-イソプロポキシエタノールを用いてラジカル重合により調製した。 VP（5 mL、47 mmol）およびACCN（0.11 g、0.45 mmol）を60-300 mLの2-イソプロポキシエタノール中に可溶化させた。これらの溶液をアルゴンでガス抜きした。重合を80℃で、乾燥アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、24時間行った。2-イソプロポキシエタノールの蒸発の後、ポリマーを過剰ジエチルエーテル中に析出させた。このようにして得られた白色粉末を、最少量のCH2Cl2中に可溶化させて三回精製し、ジエチルエーテルから再析出させ、最後に真空中で乾燥させた。
【００４７】
PVP-OHの特性評価
1 H NMR δ(ppm)：1.15 (m, CH3)、3.5-4 (広い信号、CH PVP)
13 C NMR δ(ppm)：175 (C=O PVP)、63.05 (CH2OH)
【００４８】
0005134179.tif 000004
【００４９】
PVP-OHの平均分子量を表１に示す。溶媒/VP容積比が高くなると分子量が低くなることが分る。
【００５０】
ブロックコポリマーPVP-PDLLAの調製
本ブロックコポリマーは陰イオン開環重合により得た。
【００５１】
KH（0.567 g、14 mmol）をアルゴンパージ下で丸底フラスコに入れた。無水THFをダブルチップニードル(double-tipped needle)を介して加え、得られた分散液をさっと撹拌して、その後このTHFを除去した。THF30 mLをこのフラスコに加え、得られた分散液を0℃まで冷却する。60℃真空中P2O5上で24時間前もって乾燥したPVP-OH（1.5 g）を60℃でＴＨＦ30 mL中に可溶化させた。この溶液を、ダブルチップニードルを用いて前記撹拌下の分散液に加え、得られた溶液を0℃に1時間保持した。室温まで加温した後、撹拌を4時間続けた。分散液を別のフラスコに移し、18-クラウン-6（0.085 g、0.32 mmol）を室温にて加え、30分撹拌した。D,L-ラクチドの重合を、THF20 mLに溶解させたD,L-ラクチド（1.5 g、10 mmol）を素早く導入することにより開始させた。16時間後、酢酸1 mLと水5 mLを加えることによりこの重合を終了させた。このポリマー溶液を水に対して4℃で24時間透析してミセルを形成させた。透析の後、溶液を40790×gで30分遠心分離にかけすべてのポリ(D,L-ラクチド)（PDLLA）ホモポリマーを除去した。上澄み液を凍結させ、凍結乾燥システム（Labconco、モデル77535、ミズーリ州、カンサスシティ）で凍結乾燥させた。凍結乾燥粉末を水中に再溶解させ、遊離PVP-OHをSepharose 2Bカラム（Pharmacia、1×40 cm）を通過させることにより除去した。このミセル溶液を凍結させ、2日間凍結乾燥し、使用するまで−20℃で保存した。
【００５２】
PVP-PDLLAの特性評価
1 H NMR δ (ppm)：5.2 (m, CH PDLLA)、3.5-4 (広い信号, CH PVP)
13 C NMR δ (ppm)：175 (C=O PVP)、169 (C=O PDLLA)、69.8 (CH-
CH3 PDLLA)、17.2 (CH-CH3 PDLLA)。
【００５３】
0005134179.tif 000005
【００５４】
組成の異なるいくつかのPVP-PDLLAブロックコポリマーを合成した。表２に示すように、ミセルの平均径は44〜168 nmであり、CACは低い。最も短いPLAセグメントを有するサンプル3cが最も高いCACを示した。その径分布はしかしながら、SDP分析（表３）で明らかにされているように単峰性ではなかった。
【００５５】
0005134179.tif 000006
【００５６】
表３に示されているように、全てのサンプルは二峰分布のミセルを与え、小粒子の径は26〜124 nmであり、より大きな集合体の径は106〜419 nmであった。
【００５７】
医薬取り込み効率を調べるために、インドメタシンを表４に示すようにPVP-PDLLAおよびPEG-PDLLAに取り込んだ。
【００５８】
0005134179.tif 000007
引用されているデータは3測定値の平均±標準偏差である。
【００５９】
前記医薬および前記コポリマーをN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、水に対し暗所で24時間透析した。この溶液を0.22 μm孔径フィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。インドメタシンの取込量をHewlett Packard 8452Aダイオードアレー分光光度計（アイダホ州、ボイジー）を用いて320 nmにおけるDMF中ミセル溶液のUV吸収を測定することにより求めた。
【００６０】
PVP-PDLLAミセルおよびPEG-PDLLAミセル中へのインドメタシン取込効率は低医薬レベルでは同じようなものであった。医薬取込量が高くなると、PVP-PDLLAミセルの取込効率はPEG-PDLLAミセルのそれよりも優れたものであった（同じ分子量を有するコポリマーを考慮して）。理論に縛られるのを望むものではないが、低医薬比率では医薬は最初にコア中に組み込まれ、高比率になるとPVPの親水性シェル中に組み込まれるようになると考えられる。