(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を含有する細胞集団を、配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列のポリペプチド及び抗ＣＤ３抗体の存在下で培養する工程、及び
培養して得られたＴ細胞集団から、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を発現するＴ細胞集団を分離する工程、
を包含することを特徴とする、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を発現するＴ細胞集団の製造方法。
【請求項２】
培養する工程を含む総培養日数が４〜１４日間である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド及び抗ＣＤ３抗体の存在下での培養が、少なくとも培養開始時において実施される請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記ポリペプチド及び抗ＣＤ３抗体の存在下での培養が、少なくとも１日以上実施されることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
さらに細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含する請求項１〜４いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
外来遺伝子をレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターを用いて導入する請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項に記載の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７を発現するＴ細胞集団に対して、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与える工程を含むことを特徴とするＴ細胞集団の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において有用なＴ細胞集団を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。【０００３】
Ｔ細胞は、末梢ではＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）４マーカーを有するＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８マーカーを有するＣＤ８Ｔ細胞が大部分を占める。ＣＤ４Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞（以下、ＴＨと記載する）と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型あるいはＴｈ２型に分化する。ＣＤ８Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞［Ｔｃ：細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、別名：キラーＴ細胞、以下、ＣＴＬと記載することがある］に分化する。【０００４】
例えば、癌の病態において、外科手術、化学療法、放射線療法に次ぐ第４の治療法として、免疫療法が近年関心を集めている。免疫療法は本来ヒトが有する免疫力を利用するため、患者への肉体的負担が他の治療法と比べて軽いと言われている。免疫療法には体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等から種々の方法で拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞などを移入する療法、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法、Ｔｈ１細胞療法、さらにこれら細胞に種々の効果を期待できる遺伝子を体外で導入して体内に移入する免疫遺伝子治療法などが知られている。【０００５】
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており（以下、第１図参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型は７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する（例えば、非特許文献１〜３）。【０００６】
免疫療法の中で、体外で誘導したＣＴＬや末梢血リンパ球等からＩＬ−２と抗ＣＤ３抗体の作用により拡大培養して得られるリンフォカイン活性化細胞を移入する療法において、体外で誘導した抗原特異的ＣＴＬを拡大培養する際に細胞傷害活性をいかに維持するか、リンパ球を体外でいかに効率よく拡大培養できるか等の問題については、フィブロネクチンやそのフラグメントを使用することによる効果が、既に本発明者らにより検討されてきた（例えば、特許文献１〜３）。【０００７】
近年、免疫療法に使用されるＴリンパ球は、すでに終末分化したエフェクターＴ細胞よりも、より未分化な状態のナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞を投与した方が、生体への投与においてはるかに高い治療効果が期待できることが報告されている（例えば非特許文献４、５）。さらに、体内での抗原特異的ＣＴＬの誘導を期待する樹状細胞移入療法やペプチドワクチン療法などにおいても、例えば癌が進行した患者の体内ではＣＴＬに誘導されうる元となるナイーブＴ細胞が少ないと考えられるため、充分な効果が期待できないことが多い。
【非特許文献１】Ｄｅａｎｅ  Ｆ．  Ｍｏｍｅｒ著，１９８８年発行，ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，  ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ  ＩＮＣ．，Ｐ１〜８
【非特許文献２】Ｋｉｍｉｚｕｋａ  Ｆ．  他８名，Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１
【非特許文献３】Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ  Ｈ．  他５名，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６
【非特許文献４】Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ．  他９名，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．２００５年，Ｖｏｌ．１１５，Ｎｏ．６，Ｐ１６１６〜１６２６
【非特許文献５】Ｂｅｎｉｇｎｉ  Ｆ  他１０名，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５年，Ｖｏｌ．１７５，Ｎｏ．２，Ｐ７３９〜７４８
【特許文献１】国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０８０８１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生体への投与に有効なＴ細胞集団の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の発明は、Ｔ細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下で培養する工程を包含することを特徴とする、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団の製造方法に関する。本発明の第１の発明において、培養する工程を含む総培養日数としては４〜１４日間が例示される。また、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下での培養は、少なくとも培養開始時において実施されることが例示され、さらに当該培養は、少なくとも１日以上実施されることが好ましい。また、本発明の第１の発明において、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下で培養する工程は、ＣＤ３リガンドの存在下で実施されることが例示される。また、ＣＤ３リガンドとしては、抗ＣＤ３抗体が例示される。本発明の第１の発明において、フィブロネクチンのフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜８で表されるアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）であるか、または前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。また、フィブロネクチンのフラグメントとしては、配列表の配列番号１〜３及び５〜８で表されるアミノ酸配列のいずれもを含むポリペプチドが例示される。また、本発明の第１の発明において、さらに、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現する細胞を分離する工程を包含する製造方法も例示される。さらに本発明の第１の発明においては、さらに細胞集団に外来遺伝子を導入する工程を包含する製造方法も例示される。当該製造方法において、外来遺伝子の導入にはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用できる。【００１０】
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団に関する。【００１１】
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を有効成分として含有する医薬に関する。【００１２】
本発明の第４の発明は、被験体に、有効量の本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法に関する。【００１３】
本発明の第５の発明は、医薬の製造のための、本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団の使用に関する。【００１４】
本発明の第６の発明は、本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団に対して、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与える工程を含むことを特徴とするＴ細胞集団の製造方法に関する。【００１５】
本発明の第７の発明は、本発明の第６の発明の方法により得られるＴ細胞集団に関する。【００１６】
本発明の第８の発明は、本発明の第６の発明の方法により得られるＴ細胞集団を有効成分として含有する医薬に関する。【００１７】
本発明の第９の発明は、被験体に、有効量の本発明の第６の発明の方法により得られるＴ細胞集団を投与する工程を含む疾患の治療方法又は予防方法に関する。【００１８】
本発明の第１０の発明は、医薬の製造のための、本発明の第６の発明の方法により得られるＴ細胞集団の使用に関する。【００１９】
本発明の第１１の発明は、（ａ）本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を有効成分として含有する製剤、及び
（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を有効成分として含有する製剤、を含む医薬であって、当該製剤は同時にまたは別々に投与される２つの別々の製剤として含有される医薬に関する。【００２０】
本発明の第１２の発明は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を含むことを特徴とする疾患の治療方法に関する。
（ａ）本発明の第１の発明の方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を患者に投与する工程、
（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を患者に投与する工程。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の製造方法により、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団が提供される。当該製造方法により得られる細胞集団は、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞の比率が高く、細胞医療による疾患の治療に極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物（以下、本発明の有効成分と称することがある）の存在下で培養する工程を含有することにより、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞が高比率に含まれている細胞集団が得られることを見出し、完成するに至ったものである。【００２３】
なお、本明細書において、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団とは、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞を高比率に含むＴ細胞集団を意味する。また、ここで高比率とは、本発明の有効成分の有無以外は同等の条件で培養を実施した場合に、本発明の有効成分の存在下における培養により得られたＴ細胞集団中の、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞比率が、本発明の有効成分の非存在下の場合と比較して高いことを意味する。好適には本発明の有効成分の非存在下の場合と比較して５％以上、より好ましくは１０％以上高いＴ細胞集団であることが好ましい。得られる細胞集団中の、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞の比率は、種々の環境要因、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）等のＴ細胞の製造に使用される細胞を供給するヒトの個人差や体調などによって変動するものであることから、上記の「高比率」を一概に数値によって規定することは不可能である。また、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団は、Ｔ細胞を含む集団のことを意味し、Ｔ細胞以外の細胞、例えばＮＫ細胞等のその他のリンパ球やリンパ球以外の血球系成分が含まれていても良い。【００２４】
以下、本発明を具体的に説明する。【００２５】
（１）本発明に使用されるフィブロネクチン、およびそのフラグメント
本明細書中に記載のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ  Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。【００２６】
なお、フィブロネクチンは多くのスプライシングバリアントの存在が知られているが、本発明に使用されるフィブロネクチンとしては、本発明の所望の効果を発現するものであれば、いずれのバリアントも使用することができる。例えば、血漿由来のフィブロネクチンの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のフィブロネクチンも本発明に使用することができる。【００２７】
本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ  Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット  Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ  Ａ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ  Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６〜４９４１（１９８６）〕等より得ることができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。【００２８】
本発明において、フィブロネクチンフラグメントとしては、例えば、ＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１１（配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）、およびＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）のいずれかの領域を構成するアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチド（ｍ）（第１図参照）や、前記いずれかのアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加したアミノ酸配列を少なくとも１つ含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチド（ｍ）と同等な機能を有するポリペプチド（ｎ）が例示される。フラグメントの長さとしては、例えば、アミノ酸の数として２０〜１０００が好ましく、１００〜８００がより好ましい。なお、本明細書において、複数個とは数個を含む概念であり、２〜１２個が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜８個がさらに好ましく、以下においても同様である。【００２９】
また、当該フラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適に使用できる。細胞接着活性は、本発明で使用されるフラグメント（その細胞結合ドメイン）と細胞との結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３５２巻、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。また、ヘパリン結合活性は、本発明に使用されるフラグメント（そのヘパリン結合ドメイン）とヘパリンとの結合を公知の方法を使用してアッセイすることにより調べることができる。例えば、上記のウイリアムズ  Ｄ．Ａ．らの方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントとヘパリンとの結合の評価を行うことができる。【００３０】
さらにフィブロネクチンのフラグメントとしては、Ｃ−２７４（配列表の配列番号９で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２７１（配列表の配列番号１０で表されるアミノ酸配列）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号１１で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２７１（配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列）、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１３で表されるアミノ酸配列）、Ｃ−ＣＳ１（配列表の配列番号１４で表されるアミノ酸配列）、およびＣＨ−２９６Ｎａ（配列表の配列番号１５で表されるアミノ酸配列）からなる群より選択されるポリペプチドが例示される。【００３１】
上記のＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６Ｎａ、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６、ＣＨ−２９６ＮａはＶＬＡ−４に結合する活性を有するＣＳ−１を有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６およびＣＨ−２９６Ｎａはヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。なお、ＣＨ−２９６Ｎａは血漿由来のフィブロネクチンにおける細胞結合ドメインからＣＳ−１までを含むポリペプチドである。【００３２】
本発明においては、上記の各ドメインが改変されたフラグメントも使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインは３つのＩＩＩ型配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型配列のうちの一つもしくは二つを欠失したヘパリン結合ドメインを含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合領域、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と一つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列表の配列番号１６で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９０（配列表の配列番号１７で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号１８で表されるアミノ酸配列）、あるいは二つのＩＩＩ型配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列表の配列番号１９で表されるアミノ酸配列）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３をそれぞれ含んでいる。【００３３】
また、上記の各フラグメントにさらにアミノ酸を付加したフラグメントも本発明に使用することができる。当該フラグメントは、例えば、上記各フラグメントに所望のアミノ酸を付加することにより製造可能である。例えば、Ｈ−２７５−Ｃｙｓ（配列表の配列番号２１で表されるアミノ酸配列）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。【００３４】
なお、本発明に使用されるフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドからなるものであってもよい。【００３５】
アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度のものであるのが好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。【００３６】
なお、本発明に使用されるフラグメントを遺伝子工学的に取得した場合、例えば大腸菌などを宿主として製造する場合は、大腸菌由来のメチオニンペプチダーゼ等の影響により、Ｎ末端のメチオニンが欠失される場合があるが、このようなポリペプチドも本発明において使用することができる。すなわち、配列表の配列番号１５および２１に記載のポリペプチドのＮ末端のメチオニンが欠失したポリペプチドも本発明においては好適に使用できる。【００３７】
アミノ酸の置換等は種間や個体差に起因して天然に生ずるものであってもよく、また、人工的に誘発されたものであってもよい。人工的な誘発は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントをコードする核酸において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された所定の核酸を作製し、それを使用して、天然のフィブロネクチン由来の前記領域や所定のフラグメントと同等な機能を有する、当該フラグメント等を構成するポリペプチドのアミノ酸配列に置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。【００３８】
また、本明細書において「同等な機能を有する」とは、ポリペプチドを使用して得られるＴ細胞集団中のＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞の比率が、比較対照のポリペプチドの非存在下で得られるＴ細胞集団よりも高いことをいう。前記作用は後述の実施例１、２、６に記載の方法等に準じて適宜確認することができる。また、アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとしては、細胞接着活性および／またはヘパリン結合活性を有するものが好適であり、またＣＳ−１ドメインを有するものも好適である。細胞接着活性およびヘパリン結合活性は、それらの前記活性測定方法に準じて評価することができる。【００３９】
アミノ酸の置換等を有するポリペプチドからなるフラグメントとして、例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。【００４０】
なお、フィブロネクチンについても、上記のフラグメントと同様、そのポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドを使用して得られるＴ細胞集団中のＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞の比率が、比較対照のポリペプチドの非存在下で得られるＴ細胞集団よりも高いポリペプチドを、本発明において使用することができる。【００４１】
また、本発明に使用されるフィブロネクチンまたはそのフラグメントとしては、本発明の所望の効果が得られる限り、上記に例示した天然のフィブロネクチンやそのアミノ酸配列の少なくとも１部を含むフラグメントと同等な機能を有する、当該フィブロネクチンまたはそのフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列と５０％以上のホモロジーを有するポリペプチド、好ましくは７０％以上のホモロジーを有するポリペプチド、より好ましくは９０％以上のホモロジーを有するポリペプチド、さらに好ましくは９５％以上のホモロジーを有するペプチドが使用できる。なお、ホモロジーの算出には、例えばＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ  Ｖｅｒ．２．６（タカラバイオ（株）製）を用いることができる。【００４２】
なお、本発明において、最も好適に使用されるフィブロネクチンのフラグメントとしては、アミノ酸配列中にＩＩＩ−８（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−９（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１０（配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１２（配列表の配列番号５で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１３（配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列）、ＩＩＩ−１４（配列表の配列番号７で表されるアミノ酸配列）およびＣＳ−１（配列表の配列番号８で表されるアミノ酸配列）のすべてを含む、すなわちヘパリン結合ドメイン、細胞結合ドメインおよびＣＳ−１を含むポリペプチドが挙げられ、さらに好適には前述のＣＨ−２９６、もしくはＣＨ−２９６と同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。その他、本発明において好適に使用されるフィブロネクチンのポリペプチドとしては、実施例１８に示すとおり、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−ＣＳ１、もしくはこれらと同等な機能を有する、当該フラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入もしくは付加を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。【００４３】
本明細書中に記載のフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号明細書の記載に基づいて遺伝子組換え体より組換えフィブロネクチンフラグンメントとして製造することもできる。例えば、上記のＨ−２７１（配列番号１０）、Ｈ−２９６（配列番号１１）、ＣＨ−２７１（配列番号１２）、ＣＨ−２９６（配列番号１３）の各フラグメントならびにこれらを取得する方法は当該特許明細書に詳細に記載されている。また、ＣＨ−２９６Ｎａ（配列番号１５）とその製造方法については国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレットに記載されている。また、上記のＣ−２７４（配列番号９）フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明細書に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１（配列番号１４）フラグメントは日本特許第３１０４１７８号明細書に記載された方法により得ることができる。上記ＣＨＶ−８９（配列番号１６）、ＣＨＶ−９０（配列番号１７）、ＣＨＶ−１７９（配列番号１９）の各フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１（配列番号２０）フラグメントは国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載された方法に準じて得ることができる。ＣＨＶ−９２（配列番号１８）フラグメントは、日本特許第２７２９７１２号明細書および国際公開第９７／１８３１８号パンフレットを参照し、それらの文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。【００４４】
これらのフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法により改変することにより製造することもできる；
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年１月３０日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７９９（ＣＨ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４２０（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８９年５月１２日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１９１５（Ｃ−２７４をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９８８年６月１７日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９０年３月５日）、
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７３（ＣＨ−２９６Ｎａをコードするプラスミド；寄託日  ２００４年７月２３日）
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）、
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌；寄託日  １９９１年４月８日）。【００４５】
フィブロネクチンは巨大な糖タンパク質であるため、天然起源のタンパク質を調製して使用することは産業上および医薬品製造上、必ずしも容易ではない。また、フィブロネクチンは多機能タンパク質であることから、その使用の状況によっては、本発明の方法に効果を示す領域とは異なる領域に起因する不都合が起こることも考えられる。これらのことから、本発明においては、入手、取り扱いの容易さ、安全面の観点から、好適にはフィブロネクチンフラグメント、さらに好適には前記のようにして得られる組み換えフィブロネクチンフラグメントを使用することが好ましい。また、高い拡大培養率を実現するという観点からも、前述のフィブロネクチンフラグメントを使用することが好ましい。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤである。当該分子量は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定することができる。【００４６】
なお、本発明のフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列において、天然由来のフィブロネクチンフラグメントを構成するポリペプチドのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列部分は、本発明の所望の効果の発現を阻害しない限り任意であり、特に限定されるものではない。【００４７】
（２）Ｔ細胞集団の製造方法
以下、本発明のＴ細胞集団の製造方法について具体的に説明する。本発明はＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞、好ましくはＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞を高比率に含有する細胞集団を製造する方法である。本発明の方法は、前述のフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下でＴ細胞を含有する細胞集団を培養する工程を含有することを特徴とする。【００４８】
ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８はいずれもリンパ球の細胞表面抗原マーカーであり、ナイーブＴ細胞のような未分化な細胞において発現することが知られている。すなわち、本発明の製造方法により得られる細胞集団に高比率に含まれる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞は、細胞表面抗原マーカーの表現型からすれば、メモリーＴ細胞に分化する前の未分化の細胞、すなわちナイーブＴ様細胞として分類できる。前述の非特許文献４および５に記載のとおり、ナイーブＴ細胞は生体に投与した際の生体内での生存率、細胞増殖効果、腫瘍への集積効果、腫瘍特異的エフェクター細胞の産生率が高く、細胞医療分野において有用であることが記載されている。【００４９】
さらに、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団は、後述の実施例３に示すとおり、抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ２８抗体によって刺激を与えることにより、ＩＬ−２を多く産生する活性化されたＴ細胞となる。また、後述の実施例４に示すとおり、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団は、ケモカインであるＣＣＬ２１に対して反応し、走化性を示すことから、リンパ節への移行能をも有する。また、後述の実施例５〜８に示すとおり、当該Ｔ細胞集団に対して抗原刺激を負荷することにより抗原特異的細胞傷害活性を有するＣＴＬが誘導される。さらに、後述の実施例９に示すとおり、当該Ｔ細胞集団は、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下で製造されたＴ細胞集団と比較して、少量のＩＬ−２存在下あるいは非存在下での生存性が高いことから、生体内での生存性も高いことが予想される。実際に、後述の実施例１１では、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団をＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに投与した場合、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の非存在下で製造されたＴ細胞集団を投与した場合と比較して、Ｔ細胞の脾臓への生着率が高く生存率も高いことが示されており、さらにこの実施例では投与したＴ細胞集団はＧＶＨＤ反応も引き起こすことから、高い細胞傷害活性を有する細胞が誘導されることも示されている。これらのことから、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団は、細胞表面抗原マーカーの表現型のみではなく、ナイーブＴ細胞の有する細胞医療分野への使用に適した機能をも有している。【００５０】
しかしながら、驚くべきことに、実施例７−（４）、８−（２）、１５−（４）および１６−（２）で示されるように、上記方法により製造されるＴ細胞集団から、さらに、後述のＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現する細胞集団を分離する工程を施して得られるＴ細胞集団は、ＰＢＭＣから得られるナイーブＴ細胞や本発明の有効成分の非存在下で得られる同様の表現型を示すＴ細胞と比較して、誘導されるＣＴＬの細胞傷害活性が高く、また特異的抗原認識能力も高い。すなわち、このような分離操作を施して得られるＴ細胞集団は、ＣＴＬに分化した際の細胞傷害活性が、通常のナイーブＴ細胞と比較して有意に高く、この点においてナイーブＴ細胞とは異なる、より効果的な特徴を有する新規なナイーブＴ様細胞を含む細胞集団である。【００５１】
上記のような本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団の高い治療効果はＣＤ８＋、ＣＤ４＋のいずれのナイーブＴ様細胞でも同様に期待される。さらに、前述の特許文献２に記載のとおり、フィブロネクチン、そのフラグメント又はそれらの混合物の存在下にＴ細胞の拡大培養を行うことにより、非常に高い増殖率を実現することができることから、本発明の方法により得られるＴ細胞集団は細胞医療分野への使用に極めて適している。【００５２】
本発明の製造方法に使用される、Ｔ細胞を含有する細胞集団としては、ＰＢＭＣ、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、造血幹細胞、臍帯血単核球等が例示される。また、血球系細胞であれば本発明に使用できる。これらの細胞は生体から採取されたもの、あるいは生体外での培養を経て得られたもの、例えば本発明の方法により得られたＴ細胞集団をそのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。また、例えば生体から得られた上記のＴ細胞集団の製造に使用される細胞から種々の分離操作を経て得られた細胞集団、例えば、ＰＢＭＣ等の細胞をＣＤ８＋もしくはＣＤ４＋細胞に分離して得られたいずれかの細胞集団を使用することもできる。なお、本発明のＴ細胞集団の製造方法では、前記細胞を含有する材料、例えば、末梢血液、臍帯血等の血液や、血液から赤血球や血漿等の成分を除去したもの、骨髄液等を使用することができる。【００５３】
本発明のＴ細胞集団の製造方法は、好適には総培養日数を４〜１４日間とすることが好ましい。すなわち、総培養日数が４〜１４日間である場合、得られるＴ細胞集団中の、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞の比率が高く、細胞医療分野への使用に極めて適している。なお、総培養日数が４日未満の場合は、一般的な免疫療法に使用するには満足のできる細胞数を得ることができない。本発明において、総培養日数としては、より好適には５〜１４日間、さらに好適には７〜１４日間が好ましい。【００５４】
本発明のＴ細胞集団の製造方法において、特に好適には全培養期間中の少なくとも初期段階において本発明の有効成分の存在下に培養を実施することが好適であり、より好適には少なくとも培養開始時に本発明の有効成分の存在下での培養を実施していることが好ましい。なお、本発明の有効成分の存在下での培養は培養期間中の全期間であってもよく、また任意の一部の期間であってもよい。すなわち、Ｔ細胞の製造工程の一部に前記工程を含むものであれば本発明に包含される。好適には本発明の有効成分の存在下での培養を、培養開始時から少なくとも１日以上、より好ましくは３日以上、さらに好ましくは４日以上実施することが好ましい。【００５５】
本発明において、フィブロネクチン、そのフラグメント、またはそれらの混合物の培養中の濃度としては、特に限定はなく、例えば０．００１〜５００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜５００μｇ／ｍＬが好適である。【００５６】
本発明においては、Ｔ細胞のＴＣＲ−ＣＤ３複合体への刺激を効果的に行ない、細胞を増殖させるという観点から、フィブロネクチン、そのフラグメント、またはそれらの混合物の存在下での培養を、ＣＤ３リガンドの存在下で行うことが好ましい。【００５７】
本発明において、ＣＤ３リガンドとしては、ＣＤ３に結合活性を有する物質であれば特に限定はないが、例えば抗ＣＤ３抗体が例示され、特に好適には抗ＣＤ３モノクローナル抗体が例示され、例えばＯＫＴ３が例示される。ＣＤ３リガンドの培地中の濃度としては、特に限定はなく、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を使用する場合は、例えば０．００１〜１００μｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００μｇ／ｍＬが好適である。【００５８】
また、本発明においては、必要に応じてＣＤ２８リガンド等のその他の副刺激因子を添加して副刺激を導入することもできる。例えば、抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ８０、Ｂ７−１、Ｂ７−２等が例示される。【００５９】
本発明のＴ細胞集団の製造方法において使用される培地は、特に限定はなく、Ｔ細胞の拡大培養に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地を適宜選択して使用することができる。これらの培地はその本来の構成成分以外にサイトカイン類、適当なタンパク質、その他の成分を含んでいてもよい。サイトカイン類としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等が例示され、好適には、ＩＬ−２を含有する培地が使用される。ＩＬ−２の培地中の濃度としては、特に限定はないが、例えば、好適には０．０１〜１×１０５Ｕ／ｍＬ、より好適には０．１〜１×１０４Ｕ／ｍＬである。また、適当なタンパク質としては、例えば抗ＩＬ−４抗体が例示される。また、この他、レクチン等のリンパ球刺激因子を添加することもできる。当該成分の培地中の濃度は、所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。【００６０】
さらに、培養においては、培地中に血清や血漿を添加することもできる。これらの培地中への添加量は特に限定はないが、０容量％〜２０容量％が例示され、また培養段階に応じて使用する血清や血漿の量を変更することができる。例えば、血清又は血漿濃度を段階的に減らして使用することもできる。なお、血清又は血漿の由来としては、自己（培養する細胞と由来が同じであることを意味する）もしくは非自己（培養する細胞と由来が異なることを意味する）のいずれでも良いが、好適には安全性の観点から自己由来のものが使用できる。【００６１】
本発明のＴ細胞集団の製造は、通常、本発明の前記有効成分の存在下に、所定の成分を含む培地中で行なわれる。本発明において使用される培養開始時の細胞数としては、特に限定はないが、例えば好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１ｃｅｌｌ／ｍＬ〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、培養条件に特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができる。例えば、３７℃、５％ＣＯ２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で細胞培養液を新鮮な培地を加えて希釈するか、培地を交換するか、もしくは細胞培養用器材を交換することができる。【００６２】
本発明のＴ細胞集団の製造方法において使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、シャーレ、フラスコ、バッグ、大型培養槽、バイオリアクター等を使用することができる。なお、バッグとしては、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量のＴ細胞を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られるＴ細胞の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。【００６３】
なお、本発明の有効成分やＣＤ３リガンド、その他の副刺激因子、上記培地中に含まれる適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分は培地中に溶解して共存させる他、適切な固相、例えばシャーレ、フラスコ、バッグ等の細胞培養用器材（開放系のもの、および閉鎖系のもののいずれをも含む）、またはビーズ、メンブレン、スライドガラス等の細胞培養用担体に固定化して使用してもよい。それらの固相の材質は細胞培養に使用可能なものであれば特に限定されるものではない。該成分を、例えば、前記器材に固定化する場合、培地を該器材に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。前記担体は、細胞培養時に細胞培養用器材中の培養液に浸漬して使用される。前記成分を前記担体に固定化する場合、該担体を培地に入れた際に、該成分を培地中に溶解して用いる場合の所望の濃度と同様の割合となるように、器材に入れる培地量に対して各成分の一定量を固定化するのが好適であるが、当該成分の固定化量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではない。【００６４】
本発明の有効成分やＣＤ３リガンド、その他の副刺激因子の固相への固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、適当な緩衝液の中でこれらの物質を固相と接触させることにより固定化することができる。【００６５】
また、フィブロネクチンのフラグメントの固相への固定化については、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載の方法によっても固定化を実施することができる。【００６６】
前記の種々の成分や、本発明の有効成分を固相に固定化しておけば、本発明の方法によりＴ細胞集団を得た後、該Ｔ細胞集団と固相とを分離するのみで、有効成分等と該Ｔ細胞集団とを容易に分離することができ、該Ｔ細胞集団への有効成分等の混入を防ぐことができる。【００６７】
また、本発明の製造方法は、本発明の有効成分の存在下で培養して得られたＴ細胞集団を、さらに、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を分離する工程を包含することもできる。すなわち、前述のとおり本発明の有効成分の存在下で培養して得られたＴ細胞集団には高比率にＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞が含有されていることから、さらにＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７及びＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つの表面抗原マーカーを発現する細胞の分離操作を実施することにより、より効率的にナイーブＴ様細胞もしくはナイーブＴ様細胞をさらに高含有するＴ細胞集団を取得することが出来る。この場合、分離されるＴ細胞としては、特に限定はないが、例えばＣＤ４５ＲＡを発現する細胞が例示され、好適にはＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現する細胞、より好適にはＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを発現する細胞、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７を発現する細胞が例示される。分離操作としては、特に限定はないが、例えばセルソーター、磁気ビーズ、カラム等を用いて公知の手法で分離することが出来る。例えば、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７を発現する細胞を分離する場合は、後述の実施例３−（３）に記載のとおり実施することができる。【００６８】
また、本発明の方法により製造されたＴ細胞をクローン化することにより、安定したＴ細胞として維持することもできる。また、本発明の方法により得られたＴ細胞集団を用いて、さらに本発明の方法や公知の方法により培養することで新たにＴ細胞集団を得ることもできる。また、本発明の方法により得られたＴ細胞集団を用いて、公知の方法、例えば後述の実施例５〜８と同様の方法により抗原刺激等を加えることで抗原特異的なＣＴＬを製造することもできる。【００６９】
本発明の方法により得られるＴ細胞集団には、前述のとおり未分化なＴ細胞であるＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞を高比率に含有しているが、培養に用いられる細胞の種類によっては当該Ｔ細胞集団中に細胞傷害活性を有するＴ細胞も含まれている。当該Ｔ細胞集団の細胞傷害活性は公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験により評価することもできるが、本発明により得られるＴ細胞集団は前述のとおり未分化なナイーブＴ様細胞を高比率に含むことから、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団はこのような評価系において必ずしも高い細胞傷害活性を示すものではない。【００７０】
本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される疾患としては、特に限定はないが、例えば、癌、白血病、悪性腫瘍、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶ等のウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。また、後述のようにさらに外来遺伝子を導入した場合は、各種遺伝子疾患に対しても効果が期待される。また、本発明の方法により製造されるＴ細胞集団は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注等にも利用できる。【００７１】
さらに本発明は、上記の本発明のＴ細胞集団の製造方法で得られたＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を提供する。また、本発明は、当該Ｔ細胞集団を有効成分として含有する医薬（治療剤）を提供する。当該Ｔ細胞集団を含有する前記治療剤は免疫療法への使用に適している。免疫療法においては、患者の治療に適したＴ細胞が、例えば注射や点滴による静脈、動脈、皮下、腹腔内等の投与方法によって患者に投与される。当該治療剤は前述の疾患やドナーリンパ球輸注での使用において非常に有用である。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製された当該Ｔ細胞集団を有効成分として、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合し、点滴剤、注射剤として調製できる。なお、治療剤における本発明のＴ細胞集団の含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の免疫療法に従って適宜、決定できる。例えば、医薬における本発明のＴ細胞集団の含有量としては、特に限定はないが、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０４〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０５〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、本発明の医薬の投与量としては、特に限定はないが、例えば、成人一日あたり、好適には１×１０６〜１×１０１２ｃｅｌｌｓ／日、より好ましくは、１×１０７〜５×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、さらに好ましくは１×１０８〜２×１０１１ｃｅｌｌｓ／日が例示される。さらに、当該治療剤による免疫療法と、公知の薬剤投与による薬剤治療や放射線治療、外科的手術による治療との併用を行なうこともできる。【００７２】
本発明のＴ細胞集団の製造方法において、当該Ｔ細胞に外来遺伝子を導入する工程をさらに包含することができる。すなわち、本発明は、その一態様として、Ｔ細胞に外来遺伝子を導入する工程をさらに含むＴ細胞集団の製造方法を提供する。なお、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入対象のＴ細胞に人為的に導入される遺伝子のことを意味し、遺伝子導入対象のＴ細胞と同種由来のものも包含される。【００７３】
本発明のＴ細胞の製造方法を行うことにより、培養されるＴ細胞の増殖能が増強されるが、本発明のＴ細胞の製造方法を、遺伝子の導入工程と組み合わせることにより、遺伝子の導入効率の上昇が期待される。【００７４】
外来遺伝子の導入手段には特に限定はなく、公知の遺伝子導入方法により適切なものを選択して使用することができる。遺伝子導入の工程は、Ｔ細胞集団の製造の際、任意の時点で実施することができる。例えば、前記Ｔ細胞集団の製造と同時もしくは途中で、あるいは該工程の後に実施するのが、作業効率の観点から好適である。【００７５】
前記の遺伝子導入方法としては、ウイルスベクターを使用する方法、該ベクターを使用しない方法のいずれもが本発明に使用できる。それらの方法の詳細についてはすでに多くの文献が公表されている。【００７６】
前記ウイルスベクターには特に限定はなく、通常、遺伝子導入方法に使用される公知のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはセンダイウイルスベクター等が使用される。特に好適には、ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはシミアンウイルスベクターが使用される。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。また、遺伝子導入の際にレトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）などの遺伝子導入効率を向上させる物質を用いることもできる。【００７７】
レトロウイルスベクターならびにレンチウイルスベクターは、当該ベクターが導入される細胞の染色体ＤＮＡ中に該ベクターに挿入されている外来遺伝子を安定に組み込むことができ、遺伝子治療等の目的に使用されている。当該ベクターは分裂、増殖中の細胞に対する感染効率が高いことから、本発明における製造の工程において遺伝子導入を行うのに好適である。【００７８】
ウイルスベクターを使用しない遺伝子導入方法としては、本発明を限定するものではないが、例えば、リポソーム、リガンド−ポリリジンなどの担体を使用する方法やリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを使用することができる。この場合にはプラスミドＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡやＲＮＡに組み込まれた外来遺伝子が導入される。【００７９】
本発明においてＴ細胞に導入される外来遺伝子には特に限定はなく、前記細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、タンパク質（例えば、酵素、サイトカイン類、レセプター類等）をコードするものの他、アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイムをコードするものが使用できる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を同時に導入してもよい。【００８０】
前記の外来遺伝子は、例えば、適当なプロモーターの制御下に発現されるようにベクターやプラスミド等に挿入して使用することができる。また、効率のよい遺伝子の転写を達成するために、プロモーターや転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列やターミネーター配列がベクター内に存在していてもよい。また、外来遺伝子を相同組換えにより導入対象のＴ細胞の染色体へ挿入することを目的として、例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に外来遺伝子を配置させてもよい。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。さらに、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。【００８１】
本発明の方法によれば、例えば、癌等の患者の治療に使用される薬剤に対する耐性に関連する酵素をコードする遺伝子をＴ細胞に導入して該Ｔ細胞に薬剤耐性を付与することができる。そのようなＴ細胞を用いれば、免疫療法と薬剤療法とを組み合わせることができ、従って、より高い治療効果を得ることが可能となる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、多剤耐性遺伝子（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｇｅｎｅ）が例示される。【００８２】
一方、前記の態様とは逆に、特定の薬剤に対する感受性を付与するような遺伝子をＴ細胞に導入して、該薬剤に対する感受性を付与することもできる。かかる場合、生体に移植した後のＴ細胞を当該薬剤の投与によって除去することが可能となる。薬剤に対する感受性を付与する遺伝子としては、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子が例示される。【００８３】
その他、導入する遺伝子としては、標的細胞の表面抗原を認識するＴＣＲをコードする遺伝子や、標的細胞の表面抗原に対する抗体の抗原認識部位を有し、かつＴＣＲの細胞内領域（ＣＤ３等）を含むキメラレセプターをコードする遺伝子が例示される。【００８４】
本発明はまた、被験体に、有効量の前述の方法により得られるＴ細胞集団を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。本明細書中において被験体とは、特に限定はないが、好ましくは本発明の方法により製造されるＴ細胞集団を投与される前述に記載するような疾患の患者を示す。【００８５】
また、本明細書中において有効量とは、前記Ｔ細胞集団を上記被験体に投与した場合に、該Ｔ細胞集団を投与していない被験体と比較して、治療もしくは予防効果を発揮する該Ｔ細胞集団の量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的および被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではないが、好ましくは、上記の医薬と同様にすればよい。投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、点滴や注射等により投与すればよい。【００８６】
また、本発明は、医薬の製造のための前述のＴ細胞集団の使用も提供される。当該医薬の製造方法は前述の医薬と同様に行われる。また、当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。【００８７】
また、本発明は、前述の本発明の製造方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団に対して、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子により刺激を与えることにより、活性化されたＴ細胞集団を製造することができる。さらに本発明は、前記の製造方法で得られたＴ細胞集団を提供する。このようにして得られる活性化されたＴ細胞集団は、前述の製造方法により得られるＴ細胞集団と同様に医薬の有効成分として使用できる。ここで刺激因子による刺激とは、刺激因子により前述の本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団が活性化されるものであれば特に限定はないが、例えば、本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団と刺激因子の共存下で培養を実施することが例示される。【００８８】
本明細書において、抗原を提示しうる能力を有する細胞としては、一般に抗原提示細胞として使用される細胞であれば特に限定はないが、例えば、樹状細胞、γδＴ細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、線維芽細胞、ランゲルハンス細胞、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団が例示され、特に好適には、樹状細胞、γδＴ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、これらのうちの少なくとも１種の細胞を含む細胞集団が例示される。また、当該抗原を提示しうる能力を有する細胞の由来としては、投与される患者にとって、自己、非自己のいずれでも良いが、自己由来のものが好適に使用される。なお、本明細書において、抗原を提示しうる能力を有する細胞とは、抗原を提示しうる能力を有するが、抗原を提示していない細胞を意味する。【００８９】
本明細書において、抗原の提示された細胞としては、前記抗原を提示しうる能力を有する細胞に人為的に適当な抗原が付加された細胞、もしくは生体より採取した際に既に抗原を提示している細胞のいずれもを使用することができる。抗原の提示された細胞は、後述の実施例５−（５）に記載の方法と同様に製造し、使用することもできる。なお、本明細書において、「抗原の提示された細胞」との文言の意味において、「抗原を提示しうる能力を有する細胞」は包含されるものではない。【００９０】
本明細書において、抗原としては、抗原提示細胞上にペプチドが提示され、Ｔ細胞により認識されＴ細胞を効率よく活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばペプチド、糖ペプチド、腫瘍細胞抽出物、腫瘍細胞超音波処理物および腫瘍細胞熱水処理物、ウイルス、細菌、タンパク質等が例示される。【００９１】
また、ここでＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンドの具体例としては、前述されたＣＤ３リガンドやＣＤ２８リガンドが例示される。なお、後述の実施例３のように前述の本発明の製造方法で得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団に対して、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体による共刺激を与えることで、サイトカイン産生能を有する活性化されたリンパ球集団を製造することができる。【００９２】
本明細書において、サイトカインとは、Ｔ細胞に作用し活性化できるものであれば特に限定はないが、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−２７等が例示され、細胞性免疫を増強させる観点から特に好適には、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２が例示される。【００９３】
本明細書において、ケモカインとは、Ｔ細胞に作用し遊走活性を示すものであれば特に限定はないが、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ２１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２、ＩＰ−１０、ＭＩＧが例示される。【００９４】
本明細書において、サイトカインを産生する能力を有する細胞としては、前述のサイトカインを産生しうる能力を有する細胞であれば特に限定はないが、例えば、細胞性免疫を増強させるという観点からはＴｈ１細胞が好適に使用される。【００９５】
また、前述の本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団は未分化で抗原刺激を受けていないナイーブＴ様細胞を高比率に含有することから、ここで用いられる刺激因子としては、特に好適には抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、および／または抗原を使用することが好ましい。例えば後述の実施例５−（５）、６−（８）、７−（２）、８−（１）、１４−（７）および１５−（２）に示すように、前述の本発明の製造方法により得られるＴ細胞集団に対して抗原刺激を負荷することで、極めて細胞傷害活性が高く、抗原認識能も高い有用な抗原特異的ＣＴＬを誘導することができる。また、当該培養は上記刺激因子の他、前述のフィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物や、Ｔ細胞の培養に使用される公知成分の存在下で培養を実施することができる。このようにして製造されたＴ細胞集団は、治療効果が高く極めて有用なＴ細胞集団となる。【００９６】
本発明はまた、被験体に、有効量の前述の方法により得られる活性化されたＴ細胞集団を投与することを含む、疾患の治療方法又は予防方法を提供する。また、本発明は、医薬の製造のための前述の活性化されたＴ細胞集団の使用も提供される。当該医薬の製造方法は前述の医薬と同様に行われる。また、当該医薬の投与される疾患についても、特に限定はないが、前述の医薬と同様である。【００９７】
さらに、本発明は、（ａ）前述の本発明の製造方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を有効成分として含有する製剤、及び
（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を有効成分として含有する製剤、を含む医薬であって、当該製剤は同時にまたは別々に投与される２つの別々の製剤として含有される医薬が提供される。前述するとおり、本発明の方法により得られるＴ細胞集団はナイーブＴ様細胞を高比率に含むことから、当該Ｔ細胞集団と同時に、又は別々にこれらの刺激因子を患者に投与することで、投与されるＴ細胞集団の効果を最大限に発揮することができ、より高い疾患の治療効果を発現することができる。ここで刺激因子としては、抗原刺激を与えうるもの、すなわちワクチンとして使用しうるもの、例えば、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも一つが好ましく、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、又は抗原が本発明により好適に使用される。【００９８】
当該医薬中の（ａ）本発明の製造方法で得られるＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を有効成分として含有する製剤は、前述の当該Ｔ細胞集団を有効成分として含有する医薬と同様に製造、製剤化することができる。また当該医薬中のＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団の含有量や投与量、投与形態としては、特に限定はないが、例えば前述の本発明の製造方法で得られるＴ細胞集団を含有する医薬と同様にすることができる。【００９９】
また、当該医薬中の、（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を有効成分として含有する製剤としては、例えば当該刺激因子を適当な担体と組み合わせて製剤化したものを使用することができる。また、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子の具体例としては、例えば、前述に例示されるものを使用することができる。【０１００】
例えば刺激因子として抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原またはサイトカインを産生する能力を有する細胞を使用する場合、特に限定はないが、適切な点滴用もしくは注射用の医薬担体と組み合わせて製剤化することができる。また、抗原ペプチドを使用する場合、特に限定はないが、適当なアジュバントと組み合わせることができる。また、サイトカインやケモカインを使用する場合は、公知の方法でリポソーム中に組み込むように製剤化することもできる。また、当該刺激因子の製剤中の含有量としては、使用される刺激因子の種類によって適宜選択でき、特に限定はないが、例えば刺激因子として抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞もしくはサイトカインを産生する能力を有する細胞を使用する場合、例えば好適には１×１０３〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好適には１×１０３〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には１×１０４〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。また、当該刺激因子の投与形態としては、使用される刺激因子の種類によって適宜選択でき、特に限定はないが、例えば静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与等により投与される。投与量としては、患者の疾患を治療又は改善するのに有効な量であれば特に限定はないが、例えば抗原を提示する能力を有する細胞を投与する場合は、例えば、好適には１×１０３〜１×１０１１ｃｅｌｌｓ／日、より好適には１×１０３〜１×１０１０ｃｅｌｌｓ／日、さらに好適には１×１０４〜１×１０９ｃｅｌｌｓ／日が、また抗原ペプチドを投与する場合は、例えば、好適には０．００１〜１００ｍｇ／日、より好適には０．００３〜３０ｍｇ／日、特に好適には０．０１〜１０ｍｇ／日が例示される。【０１０１】
なお、（ｂ）の製剤の投与の好適な例としては、例えば抗原を提示しうる能力を有する細胞と抗原を組み合わせて（ｂ）の製剤として投与することが好ましい。例えば、樹状細胞と抗原ペプチドを組み合わせて投与することが好ましい。この場合、抗原を提示しうる能力を有する細胞や抗原の製剤中の含有量や投与量については前述のとおり実施することができる。【０１０２】
また、当該医薬における（ａ）の製剤と（ｂ）の製剤の投与は、同時にまたは別々に患者に投与されるものであるが、ここで「同時に」とは時間的に同時に、別々の製剤として患者へ投与することや、患者への投与前に（ａ）の製剤と（ｂ）の製剤を混合して投与することを意味する。例えば、（ａ）の製剤および（ｂ）の製剤を点滴剤として投与する場合は、投与前にこれらの製剤を混合して患者に投与するような態様が本発明に包含される。また、「別々に」とは、時間的に別々に（ａ）の製剤と（ｂ）の製剤を投与することを意味し、（ａ）製剤と（ｂ）の製剤の投与間隔については、患者体内で（ａ）の製剤に含まれるＴ細胞集団に対して、（ｂ）の製剤に含まれる刺激因子の刺激が加えられるものであれば特に限定はないが、好適には、（ａ）の製剤を投与した後、（ｂ）の製剤を投与することが好ましい。また投与回数についても特に限定はなくそれぞれ１回もしくは数回に分けて投与することができる。【０１０３】
また、本発明は、（ａ）前述の本発明の製造方法により得られる、ＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞集団を患者に投与する工程、及び（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を患者に投与する工程、を含む疾患の治療方法も提供する。【０１０４】
当該治療方法は、前述するとおり、極めて高い治療効果を発揮することができる。ここで刺激因子としては、抗原刺激を与えうるもの、すなわちワクチンとして使用しうるもの、例えば、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つが好ましく、抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、又は抗原が本発明により好適に使用される。【０１０５】
当該治療方法において、（ａ）本発明の方法により得られたＴ細胞集団を患者に投与する工程としては、特に限定はないが、例えば前述の医薬の投与方法と同様の投与量、投与形態を採用して実施することができる。また、（ｂ）抗原を提示しうる能力を有する細胞、抗原の提示された細胞、抗原、ＣＤ３リガンド、ＣＤ２８リガンド、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインを産生する能力を有する細胞からなる群より選択される少なくとも１つの刺激因子を患者に投与する工程についても、特に限定はないが、例えば前述の医薬と同様の投与量、投与形態を採用して実施することができる。【０１０６】
また、前記（ａ）の工程と（ｂ）の工程の投与間隔については、前述の（ａ）の製剤と（ｂ）の製剤を含む医薬と同様に行うことができ、すなわち患者体内で（ａ）の工程により投与されるＴ細胞集団に対して（ｂ）の工程により投与される刺激因子の刺激が加えられるものであれば特に限定はないが、同時に、もしくは別々に行うことができ、好適には、（ａ）の投与工程の後、（ｂ）の投与工程を行うことが好ましい。また投与回数についても特に限定はなくそれぞれ１回もしくは数回に分けて投与することができる。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例１及び実施例１８は参考例である。
【０１０８】
実施例１  ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
（１）ＰＢＭＣの分離および保存
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと記載）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）上に重層して６００×ｇで２０分間遠心した。中間層の末梢血単核球細胞（以下、ＰＢＭＣと記載）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）／１０％ＤＭＳＯ（シグマ社製）からなる保存液あるいは８％ヒト血清アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ社製、以下、ＨＳＡと記載）を含むＣＰ−１（極東製薬社製）とＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）の等量混合液からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。Ｔ細胞拡大培養時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ（カルビオケム社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０１０９】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメントを固定化した。すなわち１２穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（ヤンセンファーマ社製）（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを１．９ｍＬずつ添加した。この時、ＣＨ−２９６添加群にはＣＨ−２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。【０１１０】
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し各実験に供した。【０１１１】
（３）Ｔ細胞集団の拡大培養
１％ＨｕｍａｎＡＢ型血清（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を含むＡＩＭ−Ｖ（インビトロジェン社製、以下１％ＡＩＭ−Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに１％ＡＩＭ−Ｖを２ｍＬ／ウェルで添加しておき、上記細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２（プロロイキン：カイロン社製）を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目以降は、１％ＡＩＭ−Ｖを用いて何も固定化を行っていない新しい１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製）に継代を行い、終濃度５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した（培養液量６ｍＬ）。すなわち、培養開始後４日目には０．０５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、７日目には０．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１０日目には０．１５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで継代を行った。培養開始後７、１０、１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１に示す。【０１１２】
【表１】
0005156382.tif 000002
【０１１３】
表１に示されるように、Ｔ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してどの培養時点でもＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０１１４】
（４）各培養日時でのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例１−（３）の各培養日時で調製した細胞をＰＢＳ、１％牛血清アルブミン（シグマ社製、以下、ＢＳＡと記載）を含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に懸濁し、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。同様にＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（シグマ社製）／ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、氷上で３０分インキュベートした。インキュベート後、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、再度ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００：ベックマンコールター社製）に供し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表２に示す。【０１１５】
【表２】
0005156382.tif 000003
【０１１６】
表２に示されるように、ＣＨ−２９６フラグメントを固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のＴ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団が培養７日目、１０日目、１４日目のいずれにおいても高い結果が得られた。これらの結果から拡大培養初期にＣＨ−２９６フラグメントを共存させることにより、７〜１４日間までの拡大培養でＴ細胞集団のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団比率を高くしながらＴ細胞を拡大培養できることが明らかとなった。【０１１７】
実施例２  ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
（１）Ｔ細胞集団の拡大培養
３％ＨｕｍａｎＡＢ型血清を含むＡＩＭ−Ｖ（以下３％ＡＩＭ−Ｖと略す）に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに３％ＡＩＭ−Ｖを２ｍＬ／ウェルで添加しておき、上記細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群とも０．０７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように１％ＨｕｍａｎＡＢ型血清を含むＡＩＭ−Ｖにより希釈し（液量６ｍＬ）、培養液を何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。血清濃度は、３０ｍＬ採血より得られたＰＢＭＣを培地１０Ｌで培養することを想定して決定した。培養を継続し、７日目には各群とも０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、０．０５％ＨｕｍａｎＡＢ型血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて希釈した培養液（液量１２．６ｍＬ）を何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製）を立てたものに移した。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目には、７日目と同じ血清濃度のＨｕｍａｎＡＢ型血清を含むＡＩＭ−Ｖを用いて１．０４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞液を希釈し（液量１２．６ｍＬ）、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものにそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３に示す。【０１１８】
【表３】
0005156382.tif 000004
【０１１９】
表３に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群においては、対照群に比較してＴ細胞の拡大培養率が高い。現在までに、ＣＨ−２９６フラグメントはＴ細胞拡大培養時に好適に使用されることが明らかとされているが、当該実施例においてＣＨ−２９６フラグメントは１４日間Ｔ細胞拡大培養時にも好適に使用されることが明らかとなった。【０１２０】
（２）培養後のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８−Ｔ細胞サブセットにおけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
実施例２−（１）で調製した細胞をＰＢＳ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に懸濁し、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１＋ＥＣＤ標識マウスＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）を添加した。同様に、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）／ＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（ベックマンコールター社製）を添加した。各々の抗体を添加後、氷上で３０分間インキュベートした。途中、１０分毎に緩やかに攪拌を行った。インキュベート後、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、再度ＰＢＳに懸濁した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＤ８の染色性によりＣＤ８＋Ｔ細胞領域とＣＤ８−Ｔ細胞領域に分類した。各々の細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表４および表５に示す。【０１２１】
【表４】
0005156382.tif 000005
【０１２２】
【表５】
0005156382.tif 000006
【０１２３】
表４に示されるように、ＣＨ−２９６フラグメントを固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のＴ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。この現象はＣＤ８−Ｔ細胞、すなわちその大半がＣＤ４＋Ｔ細胞である細胞集団について解析した場合でも同様であった（表５）。これらの結果から１４日間の拡大培養初期にＣＨ−２９６フラグメントを共存させることにより、Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団比率を高めながらＴ細胞集団を拡大培養することが可能であることが明らかとなった。【０１２４】
実施例３  ＣＨ−２９６を用いて拡大培養したＴ細胞集団中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞のサイトカイン産生性の解析
（１）Ｔ細胞集団の拡大培養
０．５％ＨｕｍａｎＡＢ型血清および０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（タカラバイオ社製、以下０．５％ＧＴ−Ｔ５０３と記載）に０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、実施例１−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を０．５ｍＬ／ウェルで添加しておき、上記細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約８倍になるように希釈し、希釈液６ｍＬを何も固定化していない１２．５ｃｍ２細胞培養フラスコに移し、終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、７日目には各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約４．２倍希釈し、希釈液１２．６ｍＬを何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１０日目には、０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を用いて、各群の細胞培養液を約２倍希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに希釈液１２．６ｍＬをそれぞれ移した。各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表６に示す。【０１２５】
【表６】
0005156382.tif 000007
【０１２６】
表６に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０１２７】
（２）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
実施例３−（１）で調製した細胞を実施例１−（４）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。ただし、抗体の組み合わせは以下のとおりで行った。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１およびＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体で染色を行った。これらをフローサイトメーターにより解析し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表７に示す。【０１２８】
【表７】
0005156382.tif 000008
【０１２９】
表７に示されるように、ＣＨ−２９６群においては、対照群と比較して、培養中のＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。【０１３０】
（３）Ｔ細胞集団拡大培養後の細胞からのＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞の単離
実施例３−（１）で調製した細胞を実施例２−（２）と同様の方法により染色した後、細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ＧＴ−Ｔ５０３培地に懸濁した。この細胞をＭｏｆｌｏ（Ｄａｋｏ社製）にてＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞に、同様にＣＤ８−Ｔ細胞、すなわちその大半がＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞にソーティングした。また同じソーティング前の染色細胞をフローサイトメトリーに供し、ＣＤ８の染色性によりＣＤ８＋Ｔ細胞領域とＣＤ８−Ｔ細胞領域に分類し、各々の細胞集団について、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表８および表９に示す。【０１３１】
【表８】
0005156382.tif 000009
【０１３２】
【表９】
0005156382.tif 000010
【０１３３】
表８に示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてＣＨ−２９６群においては、対照群と比較して、培養後のＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団の割合が高い結果が得られた。この現象はＣＤ８−Ｔ細胞、すなわちその大半がＣＤ４＋Ｔ細胞である細胞集団について解析した場合でも同様であった（表９）。【０１３４】
（４）抗ヒトＣＤ３抗体および抗ヒトＣＤ２８抗体の固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体および抗ヒトＣＤ２８抗体を固定した。すなわち９６穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（２μｇ／ｍＬ）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）を８０μＬずつ添加し、さらに抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｄａｋｏ社製）（２０μｇ／ｍＬ）を含む酢酸緩衝液を８０μＬずつ添加した。抗ヒトＣＤ３抗体は終濃度１μｇ／ｍＬ、抗ヒトＣＤ２８抗体は終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようにした。これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にこれらの器材から抗体を含む酢酸緩衝液を吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＧＴ−Ｔ５０３培地で１回洗浄し実験に供した。【０１３５】
（５）細胞の刺激
ナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞は体内で抗原刺激を受けたときに、ＩＬ−２を多く産生することが知られている。また、エフェクターメモリーＴ細胞は抗原刺激を受けたときにＩＦＮ−γやＩＬ−４を多く産生することが知られている。実施例３−（３）で得られた各細胞画分がこれらの機能を維持しているか確認するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激したときのサイトカイン産生能を測定した。実施例３−（３）で得られた各細胞集団を回収後、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に懸濁し細胞数を計測した。実施例３−（４）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体および抗ヒトＣＤ２８抗体固定化プレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬとなるように細胞を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２中３７℃にて培養した。２４時間後培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によるサイトカイン測定実験に供した。【０１３６】
（６）ＥＬＩＳＡ法によるサイトカイン産生の測定
実施例３−（３）で示されたように、ＣＨ−２９６群においては、対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞比率が高い結果が得られた。このＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団がナイーブＴ様細胞としての性質を維持しているか確かめるために、Ｔ細胞集団拡大培養後に分離したＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞のサイトカイン産生性を評価した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γの産生は、ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、またＩＬ−４の産生はＲＥＡＤＹ−ＳＥＴ−ＧＯ！  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し測定を行った。対照群およびＣＨ−２９６群における各サイトカイン産生の結果をそれぞれ表１０および表１１に示す。【０１３７】
【表１０】
0005156382.tif 000011
【０１３８】
【表１１】
0005156382.tif 000012
【０１３９】
表１０、１１に示されるように、対照群およびＣＨ−２９６群においても、ＩＬ−２の産生が確認された。いずれの群においてもＣＤ８−Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞より、またＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞より産生量が多かった。このことから、Ｔ細胞集団拡大培養で得られたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団はナイーブＴ様細胞としての性質を持つことが示された。一方、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４については、対照群およびＣＨ−２９６群においてもＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞に優位に産生され、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞集団がエフェクターメモリー機能を維持している集団であることが示唆された。【０１４０】
実施例４  ＣＨ−２９６を用いて拡大培養したＴ細胞集団の走化性の解析
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
実施例１−（２）と同様の方法で行った。ただし、抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳは０．４５ｍＬずつ添加した。
（２）Ｔ細胞集団の拡大培養
培養開始４日目で、約１４倍になるように希釈し、希釈液１０ｍＬを２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに、培養開始８日目では約２倍に希釈し希釈液１０ｍＬを２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに、培養開始１１日目では０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を各フラスコに、１０ｍＬ添加したこと以外は実施例３−（１）に準じて行った。拡大培養率の結果を表１２に示す。【０１４１】
【表１２】
0005156382.tif 000013
【０１４２】
表１２に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０１４３】
（３）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
実施例４−（２）で調製した細胞を実施例３−（２）と同様の方法で、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表１３に示す。【０１４４】
【表１３】
0005156382.tif 000014
【０１４５】
表１３に示されるように、ＣＨ−２９６群においては、対照群と比較して、培養中のＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。【０１４６】
（４）走化性の解析
ＣＨ−２９６群においては対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団比率が高い結果が得られている。ナイーブＴ細胞やセントラルメモリーＴ細胞などのＣＣＲ７陽性細胞はケモカインＣＣＬ２１に対して反応し、走化性を示す。これは、これらの細胞が血管からリンパ節へ移行するのに重要なイベントであり、拡大培養後に得られた細胞がＣＣＬ２１に対する走化性を有するか確認した。実施例４−（２）で得られた細胞を遠心し上清を除去後、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように０．５％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（以下反応培地と表記）に懸濁した。トランスウェルプレート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  ２４ｗｅｌｌ  ５μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ、コーニング社製）の下層に終濃度１μｇ／ｍＬ  ＣＣＬ２１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含む反応培地６００μＬを添加し、上層に調整した細胞懸濁液１００μＬを添加した。３７℃で２時間培養後の下層に移動した細胞数および上層に残っている細胞数を測定した。走化した細胞の割合は以下の式（１）：【０１４７】
【数１】
0005156382.tif 000015
【０１４８】
により算出した。この結果を表１４に示す。【０１４９】
【表１４】
0005156382.tif 000016
【０１５０】
表１４に示されるように対照群およびＣＨ−２９６群のいずれにおいてもＣＣＬ２１に反応し走化性を示した細胞が確認されたが、その割合はＣＨ−２９６群が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団の拡大培養時にＣＨ−２９６を用いることで、リンパ節への移行能を持つ細胞が多く得られることが明らかとなった。【０１５１】
実施例５  ＣＨ−２９６を用いて拡大培養した細胞集団からの抗ＭＡＲＴ−１  ＣＴＬの誘導
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
実施例４−（１）と同様の方法で行なった。【０１５２】
（２）Ｔ細胞集団の拡大培養
実施例４−（２）と同様の方法で行なった。拡大培養率の結果を表１５に示す。【０１５３】
【表１５】
0005156382.tif 000017
【０１５４】
表１５に示すように拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下、ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較して拡大培養率が高かった。【０１５５】
（３）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例５−（２）で調製した細胞を実施例１−（４）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。ただし、抗体の組み合わせは以下のとおりで行った。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１（いずれもＤａｋｏ社製）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体およびＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（これ以降、抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により染色を行った。これらをフローサイトメーターにより解析し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表１６に示す。【０１５６】
【表１６】
0005156382.tif 000018
【０１５７】
表１６に示されるように、ＣＨ−２９６群においては対照群と比較して、いずれの細胞表面マーカーにおいても高い値を示した。【０１５８】
（４）培養細胞の保存
実施例５−（２）で調製した培養１４日目の細胞は９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯまたは８％ＨＳＡを含むＣＰ−１とＲＰＭＩ１６４０培地の等量混合液からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存培養細胞を３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。【０１５９】
（５）抗腫瘍関連抗原(ＭＡＲＴ−１)特異的ＣＴＬの誘導
実施例５−（４）で調製した細胞を用い、抗腫瘍関連抗原（Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔｃｅｌｌｓ，ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行った。抗腫瘍関連抗原(ＭＡＲＴ−１)特異的ＣＴＬの誘導はプレバンスキー  Ｍ．らの方法〔Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ  Ｍ.  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、第６号、第１７８３〜１７８７頁（１９９５）〕を一部改変して実施した。すなわち抗原提示細胞として実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを用い、抗原ペプチドとして４０μg/ｍＬのメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１由来エピトープペプチド（配列表の配列番号２２に記載のメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１由来ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および３μg/ｍＬのβ２マイクログロブリン（Ｓｃｒｉｐｓ社製）を含む５％ＨｕｍａｎＡＢ型血清、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＣａｍｂｒｅｘ社製）、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン（明治製菓社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下５ＨＲＰＭＩと略す）中で、３７℃で２時間５％ＣＯ２インキュベーター内にてインキュベートした。インキュベート終了後、Ｘ線照射（１．４２Ｃ／ｋｇ）し、５ＨＲＰＭＩで３〜４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した。【０１６０】
一方、実施例５−（４）で調製した培養細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、２４穴細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルに上記方法により調製した抗原提示細胞を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＫＬＨ（カルビオケム社製）をそれぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬとなるように添加した。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。培養開始後１日目に６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した。培養開始後４日目には培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した。また、７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製した後、Ｘ線照射（１．４２Ｃ／ｋｇ）し、４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製し、新しい２４穴細胞培養プレートに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。【０１６１】
１週間培養したレスポンダー細胞（一部の細胞は細胞傷害活性測定用にそのまま培養継続）を１．８〜２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁、同様のプレートに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、さらに終濃度２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７を加えて再刺激した。培養開始８日目に、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した。培養開始１１日目には各ウェル内の細胞を懸濁後、半量ずつ２ウェルに分け、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加し、１５日目まで培養を継続した。【０１６２】
（６）拡大培養率の測定
実施例５−（５）で得られた細胞について培養開始後７日目、１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表１７に示す。【０１６３】
【表１７】
0005156382.tif 000019
【０１６４】
表１７に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群に比較してＣＴＬ集団の拡大培養率が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞からＣＴＬ誘導を行うことでより多くのＣＴＬ集団を得られることが明らかとなった。【０１６５】
（７）細胞傷害活性の測定
実施例５−（５）で調製した誘導開始後１５日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ  Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ.  Ｉｍｍｕｎｏｌ.  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。すなわち一晩エピトープペプチドと共培養あるいはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持細胞株Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９９２）を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（同仁化学研究所社製）を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞は３０倍量のＫ５６２細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク  ＪＣＲＢ００１９）と混合し、細胞傷害活性測定用細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。【０１６６】
実施例５−（５）で調製したＣＴＬをエフェクター細胞として３×１０５〜３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注しておき、これらにＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞が１×１０５／ｍＬとなるように調製した細胞傷害活性測定用細胞を１００μＬ／ウェルずつ添加した。この際、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比をＥ／Ｔ比として示し、Ｅ／Ｔ比３０、１０、３について測定を行った。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（ベルトールド社製）（励起４８５ｎｍ／測定５３８または５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の式（２）：【０１６７】
【数２】
0005156382.tif 000020
【０１６８】
にしたがって算出した。上式において最小放出量は細胞傷害活性測定用細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は細胞傷害活性測定用細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。細胞傷害活性測定の結果を表１８に示す。【０１６９】
【表１８】
0005156382.tif 000021
【０１７０】
表１８に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群に比較してＣＴＬ集団の特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、特異的細胞傷害活性がより高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０１７１】
実施例６  ＣＨ−２９６の初期刺激後ガス透過性培養バッグを用い拡大培養した細胞集団のＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲおよび抗ＭＡＲＴ−１  ＣＴＬの誘導
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６を固定化した。すなわち７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを９ｍＬずつ添加した。この時、ＣＨ−２９６添加群にはＣＨ−２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。【０１７２】
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで４℃に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。【０１７３】
（２）Ｔ細胞集団の拡大培養
０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、実施例６−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化フラスコに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を２１ｍＬ／フラスコ添加しておき、上記細胞液を９ｍＬ／フラスコずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液のうち１４ｍＬおよび０．５％ＧＴ−Ｔ５０３  １８６ｍＬを何も固定化していないガス透過性培養バッグ（２００ｃｍ２、タカラバイオ社製、商品コード  ＫＢ６１０）に移し変えた。さらに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、８日目には各群の培養液１００ｍＬを除去、１００ｍＬをバッグ中に残し、０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて２倍希釈し、バッグ内の細胞希釈液を２００ｍＬとした。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目には、０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を２００ｍＬ添加し、各群の細胞培養液を２倍希釈した。さらに各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。この結果を表１９に示す。【０１７４】
【表１９】
0005156382.tif 000022
【０１７５】
表１９に示されるように、ガス透過性培養バッグを用いた培養に際しても、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下、ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０１７６】
（３）ガス透過性培養バッグで培養したＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例６−（２）で調製した細胞を実施例１−（４）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。ただし、抗体の組み合わせは以下のとおりで行った。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体（ベックマンコールター社製）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ２７抗体（ベックマンコールター社製）およびＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体により染色を行った。これらをフローサイトメーターにより解析し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表２０に示す。【０１７７】
【表２０】
0005156382.tif 000023
【０１７８】
表２０に示されるように、ＣＨ−２９６群においては対照群と比較して、いずれの細胞表面マーカーにおいても高い値を示した。ＣＤ２７やＣＤ２８はナイーブＴ細胞などの未分化細胞において発現率が高いことが知られており、これらのマーカーで解析しても、培養初期にＣＨ−２９６を作用させることで培養中のＴ細胞集団におけるナイーブＴ様細胞集団比率を高くすることが明らかとなった。【０１７９】
（４）Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲ
実施例６−（２）で調製した細胞を用い、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った。すなわち実施例１−（１）と同様の方法で調製したＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｏｎｏｒ（非自己ドナー：実施例６−（２）で使用したドナーとは異なるドナー）由来のＰＢＭＣをＸ線照射（０．８８Ｃ／ｋｇ）し、５ＨＲＰＭＩで２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌ）。一方、実施例６−（２）で調製した培養細胞を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁した（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌ）。２４穴細胞培養プレートに調製したＳｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌおよびＲｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌを各０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。各ウェルに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加後、プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した。培養開始後３日目に１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した。培養開始後５日目には培養上清を半分除去後、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した。７日目には各ウェル内の細胞を懸濁後、半量ずつ２ウェルに分け、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加し、１０日目まで培養を継続した。【０１８０】
（５）拡大培養率の測定
実施例６−（４）で得られた細胞について培養開始後７日目、１０日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２１に示す。【０１８１】
【表２１】
0005156382.tif 000024
【０１８２】
表２１に示されるように、ＣＨ−２９６群を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った場合には、対照群に比較して反応後の拡大培養率が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行うと、より多くのアロ抗原認識細胞が増殖することが明らかとなった。【０１８３】
（６）細胞傷害活性の測定
実施例６−（４）で調製した誘導開始後１０日目の細胞の細胞傷害活性は、実施例５−（７）と同様の方法で行った。ただし、この際の標的細胞としてＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（以下ＰＨＡと略す）で１０日間幼若化（ブラスト）させた自己ＰＢＭＣまたは非自己ＰＢＭＣをカルセイン標識標的細胞とした。細胞傷害活性測定時には３０倍量のＫ５６２細胞とカルセイン標識標的細胞を混合した。細胞傷害活性測定の結果を表２２に示す。【０１８４】
【表２２】
0005156382.tif 000025
【０１８５】
表２２に示されるように、ＣＨ−２９６群からＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った場合には、対照群に比較して反応後のアロ抗原特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞においては、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲによりアロ抗原特異的細胞傷害活性がより強い細胞集団を得られることが明らかとなった。【０１８６】
（７）培養細胞の保存
実施例６−（２）で調製した培養１４日目の細胞は実施例５−（４）と同様の方法で凍結保存・融解し、各実験に供した。【０１８７】
（８）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−（１）および６−（７）で調製した細胞を用い、実施例５−（５）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１３日間培養継続した。ただし、以下の点について変更を行った。実施例６−（７）で調製した培養細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁した点、培養開始２日目に６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した点、培養開始６日目にレスポンダー細胞を０．３〜１．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、抗原提示細胞を１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁した点および、培養開始７日目に、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加し、培養開始日１０日目には各ウェル内の細胞を懸濁後、半量ずつ２ウェルに分け、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した点。【０１８８】
（９）細胞傷害活性の測定
実施例６−（８）で調製した誘導開始後１３日目のＣＴＬの細胞傷害活性の測定は、Ｅ／Ｔ比９０を新たに設定したこと以外は、実施例５−（７）と同様の方法で行った。細胞傷害活性測定の結果を表２３に示す。【０１８９】
【表２３】
0005156382.tif 000026
【０１９０】
表２３に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してＣＴＬ集団の特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、特異的細胞傷害活性がより高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０１９１】
実施例７  拡大培養細胞由来ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞からの抗ＭＡＲＴ−１ＣＴＬ誘導
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
実施例１−（１）および実施例６−（７）で調製した細胞を実施例２−（２）と同様の方法により染色後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を洗浄し、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）に懸濁した。この細胞を高速セルソーターＭｏｆｌｏに供し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋画分およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋画分をそれぞれ単離し、純度９２〜９９％の画分を得た。【０１９２】
（２）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例７−（１）で調製した細胞を用い、実施例６−（８）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１３日間培養継続した。ただし、以下の点について変更を行った。培養開始時に培養開始細胞および抗原提示細胞を０．２５ｍＬずつ４８穴培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に添加した点、培養開始後２日目に６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ０．５ｍＬを各ウェルに添加、培養開始後４日目には培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ０．５ｍＬを各ウェルに添加した点。【０１９３】
（３）拡大培養率の測定
実施例７−（２）で得られた細胞について培養開始後１３日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表２４に示す。【０１９４】
【表２４】
0005156382.tif 000027
【０１９５】
表２４に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞（以下ＣＨ−２９６群）から単離したＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団においては、対照群に比較してＣＴＬ集団の拡大培養率が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞に高比率に含まれるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞からＣＴＬ誘導を行うことでより多くのＣＴＬ集団を得られることが明らかとなった。【０１９６】
（４）細胞傷害活性の測定
実施例７−（２）で調製した誘導開始後１３日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例５−（７）と同様の方法で行った。細胞傷害活性測定の結果を表２５に示す。【０１９７】
【表２５】
0005156382.tif 000028
【０１９８】
表２５に示されるように、ＣＨ−２９６群から単離したＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してＣＴＬ集団の特異的細胞傷害活性が高かった。さらには、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団と比較しても、特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞に高率に含まれるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞は、特異的細胞傷害活性がより高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０１９９】
実施例８  ＣＴＬの抗原認識能測定
（１）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−（１）および６−（７）で調製した細胞を用い、実施例６−（８）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１４日間培養継続した。【０２００】
（２）抗原認識能の測定
実施例８−（１）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの抗原認識能は、Ｖａｌｍｏｒｉ  Ｄらの方法〔Ｖａｌｍｏｒｉ  Ｄ.  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６０巻、第１７５０〜１７５８頁（１９９８）〕を一部改変して実施した。すなわちＴ２細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを添加し、３７℃で１時間培養した。インキュベート後の細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を９６穴細胞培養プレートの各ウェルに５０μＬ／ウェルずつ分注した。これら細胞の入ったウェルに０〜２０μＭの抗原ペプチド（メラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１由来エピトープペプチド）を含む５ＨＲＰＭＩを５０μＬ／ウェルずつ添加した。上記プレートを５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後の各ウェルに３０倍量のＫ５６２細胞を含む細胞懸濁液（６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整）を５０μＬ／ウェルずつ添加した。【０２０１】
実施例８−（１）で調製したＣＴＬをエフェクター細胞として６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩで調整後、プレートの各ウェルに５０μＬ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００×ｇで１分間遠心後、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養上清１００μＬを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は先述の式（２）にしたがって算出した。抗原認識能測定の結果を表２６に示す。抗原認識能は標的細胞に付加したペプチド濃度が１０μＭの時の細胞傷害活性を１００とした場合の、各付加ペプチド濃度における細胞傷害活性の相対値として表記した。【０２０２】
【表２６】
0005156382.tif 000029
【０２０３】
表２６に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してより低濃度の抗原ペプチドを付加された標的細胞までも殺傷しており、ＣＴＬ集団の特異的抗原認識能力が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、より特異的抗原認識能力が高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０２０４】
実施例９  ＣＨ−２９６を用いたＴ細胞集団拡大培養の細胞集団の生存性試験
（１）Ｔ細胞集団の拡大培養
抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメントの固定化に酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）を用いたこと、培養開始４日目で約１４倍になるように希釈し、希釈液６．３ｍｌを２５ｃｍ２培養フラスコを立てたものに、培養開始８日目では約２倍になるように希釈し、希釈液６．３ｍｌを２５ｃｍ２培養フラスコを立てたものに移したこと以外は、実施例３−（１）に準じて行った。結果を表２７に示す。【０２０５】
【表２７】
0005156382.tif 000030
【０２０６】
表２７に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６フラグメントを固定化した培養器材を固定化した群（以下、ＣＨ−２９６群）は、対照群と比較して高い拡大培養率が得られた。【０２０７】
（２）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例９−（１）で調製した細胞を実施例１−（４）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。ただし、抗体の組み合わせは以下のとおりで行った。すなわち、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１およびＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体／ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体により染色を行った。これらをフローサイトメーターにより解析し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表２８、表２９に示す。【０２０８】
【表２８】
0005156382.tif 000031
【０２０９】
【表２９】
0005156382.tif 000032
【０２１０】
表２８、表２９の結果より、ＣＨ−２９６群においては、対照群と比較して、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。【０２１１】
（３）（１）の細胞のＦｅｅｄｅｒ細胞を用いた培養
実施例９−（１）で得られた拡大培養後の細胞を５ＨＲＰＭＩを用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製し、２４穴細胞培養プレートに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した。また、実施例１−（１）で調製した自己ＰＢＭＣを５ＨＲＰＭＩに懸濁した後Ｘ線照射（０．９０Ｃ／ｋｇ）し、再度５ＨＲＰＭＩを用いて２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した（Ｆｅｅｄｅｒ細胞とする）。このＦｅｅｄｅｒ細胞を上述の２４穴細胞培養プレートに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で７日間培養を行った。この間、ＩＬ−２などのサイトカインは一切添加せず培養した。【０２１２】
（４）ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ＋細胞の解析
実施例９−（３）で得られた細胞を回収し、アポトーシスを起こした細胞を測定するために、ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７ＡＡＤキット（ベックマンコールター社製）のプロトコルに従って染色した。この細胞をフローサイトメトリーに供し、各々の細胞集団について、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ＋細胞すなわちアポトーシスを起こした細胞の割合を算出した。結果を表３０に示す。【０２１３】
【表３０】
0005156382.tif 000033
【０２１４】
表３０の結果より、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を固定化した群においては、対照群と比較して、ＡｎｎｅｘｉｎＶ＋７ＡＡＤ＋細胞集団が低く、アポトーシス細胞の割合が低いことが示された。つまり、Ｔ細胞集団の拡大培養にＣＨ−２９６フラグメントを用いることにより、例えば、ＩＬ−２が少ない環境下でも生存性が高い細胞を優位に増殖できることが明らかとなった。【０２１５】
実施例１０  マウス同系腫瘍モデルを用いた移入Ｔ細胞の効果の検討
ＣＨ−２９６を用いて拡大培養したＴ細胞の腫瘍に対する効果を確認するために、マウス同系腫瘍モデルを用いて試験を行った。【０２１６】
（１）マウスＣＨ−２９６の調製
配列表の配列番号２３で示すマウスＣＨ−２９６は、ヒトＣＨ−２９６の配列を元にマウスフィブロネクチンフラグメントより設計し、常法に従いプラスミドを構築して該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得した。すなわち、該プラスミドを保有する大腸菌ＨＢ１０１を培養、発現誘導した。その後、菌体を破砕し粗タンパク質を調製後、陽イオン交換カラム、陰イオン交換カラム、ゲルろ過カラムにより目的のタンパク質を精製し無菌ろ過後、−８０℃で使用するまで保存した。【０２１７】
（２）担がんマウスからの脾臓リンパ球の調製
雌のＣＤＦ１マウス（日本エスエルシー社製）の腹腔にＩＭＣ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ（以下ＩＭＣと記載）を移植し、腹水を作り、７日ごとに別のマウスに移植して継代した。継代して７日目の腹水を採取し、ＰＢＳで洗浄後５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁した。この細胞懸濁液０．１ｍＬをＣＤＦ１マウスの右側腹部皮下に移植し、固形腫瘍を形成させた。２１日後、脾臓を摘出しＲＰＭＩ１６４０培地中でスライドガラスを用いてすりつぶした。ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて７匹分まとめてチューブに回収し４５ｍＬとして氷上に５分間静置後、新しいチューブに４０μｍセルストレーナー（ベクトン・ディッキンソン社製）を通して移した。遠心後上清を除去し溶血操作としてＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．０１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）２ｍＬに懸濁し、さらにＡＣＫバッファー２ｍＬを添加し懸濁後ＲＰＭＩ１６４０培地を細胞懸濁液が５０ｍＬになるように添加した。遠心後上清を除去しＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬに懸濁し新しいチューブにセルストレーナーを通して移した。ＲＰＭＩ１６４０培地を細胞懸濁液が４０ｍＬとなるように添加後、遠心し上清を除去した後、ＲＰＭＩ１６４０培地と８％ＨＳＡを含むＣＰ−１とを等量混合したものに懸濁し、使用するまで液体窒素中で保存した。【０２１８】
（３）抗マウスＣＤ３抗体およびマウスＣＨ−２９６フラグメントの固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗マウスＣＤ３抗体およびマウスＣＨ−２９６フラグメントを固定化した。すなわち、２４穴細胞培養プレートに抗マウスＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）（終濃度１４μｇ／ｍＬ）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）を４００μＬずつ添加し、４℃で終夜インキュベートした。その後、実施例１０−（１）で調製したマウスＣＨ−２９６を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加し、さらに５時間室温でインキュベートした。使用直前には培養器材から抗体・マウスＣＨ−２９６を含む酢酸バッファーを吸引除去後、各ウェルをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ１６４０培地で１回洗浄し実験に供した。【０２１９】
（４）脾臓リンパ球のナイロンファイバーによる精製
実施例１０−（２）で調製した脾臓リンパ球をリンパ球の純度を上げるためにナイロンファイバーを用いて精製を行った。１０ｍＬのシリンジ（テルモ社製）に０．６ｇのナイロンファイバー（和光純薬社製）を充填し、ＰＢＳで平衡化した後、１２１℃で２０分滅菌した。このカラムを１０％ＦＢＳ（大日本製薬社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で平衡化させ、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１時間インキュベートした。実施例１０−（２）で調製した脾臓リンパ球を２×１０８ｃｅｌｌｓを超えないように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地２〜３ｍＬに懸濁し、カラムにアプライ後、５％ＣＯ２インキュベーターで３７℃で１時間インキュベートした。予め３７℃に保温しておいた１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地１５ｍＬをカラムに添加し溶出された細胞を回収した。【０２２０】
（５）マウスＴ細胞集団の拡大培養
１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ  ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、５０μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ナカライテスク社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（以下、ｍＲＰＭＩ培地と記載）に１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１０−（４）で調製したリンパ球を懸濁後、実施例１０−（３）で調製した抗マウスＣＤ３抗体およびマウスＣＨ−２９６固定化プレートにｍＲＰＭＩ培地を０．７ｍＬ／ウェルで添加しておき、上記細胞液を０．５ｍＬ／ウェルずつ添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で培養した（培養０日目）。培養２日目に細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにｍＲＰＭＩ培地を用いて希釈し、何も固定化していない新しい７５ｃｍ２細胞培養フラスコに全量を移した。この際、終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるようにマウスＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、また終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるようにマウスＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した。培養５日目には細胞を１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにしたほかは培養２日目と同様に継代を行った。培養７日目に細胞を回収し以下の同系腫瘍モデルでの試験に供与した。【０２２１】
（６）ＣＤＦ１−ＩＭＣの同系腫瘍モデルにおける移入Ｔ細胞集団の腫瘍拒絶作用の評価
６週齢の雌のＣＤＦ１マウスに麻酔下でＩＭＣを実施例１０−（２）と同様に右側腹部皮下に移植した。実施例１０−（５）で調製した細胞は３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁し、尾静脈より０．１ｍＬ投与した（投与０日目）。投与０日目から４日間連続で腹腔にマウスＩＬ−２（３×１０４Ｕ／０．２ｍＬ）を投与した。対照として拡大培養した細胞を投与しない群を設定した。腫瘍の大きさはＩＭＣ移植後２１日まで、定期的に長径と短径を測定し腫瘍面積（ｃｍ２）として表した。結果を図２に示す。図２はＩＭＣを移植してからの日数と腫瘍の大きさを示したものであり、黒三角は対照群を、黒丸はＴ細胞投与群を示す。図２に示すようにＣＨ−２９６存在下培養した細胞を投与した群（Ｔ細胞投与群）で有意に腫瘍の形成が抑制されることが認められた。【０２２２】
実施例１１  ＣＨ−２９６を用いて拡大培養したヒトＴ細胞集団のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおけるＧＶＨＤ誘導による評価
（１）Ｔ細胞集団の拡大培養
大量に細胞を調製するために、培養器材を変更した。すなわち、１７５ｃｍ２培養フラスコ（ベクトン・ディキンソン社製）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを２１ｍＬ添加した。この時、ＣＨ−２９６添加群にはＣＨ−２９６を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で５時間インキュベートした。使用直前にこれらの培養器材から抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳを吸引除去後、各フラスコをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄した。新鮮ＰＢＭＣは、ヒト健常人ドナーより５４ｍＬ採血から調製した。０．５％自己血漿および０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地（以下、０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３と記載）に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＭＣを懸濁し、調製した抗ＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化フラスコに２１ｍＬずつ添加し、ＩＬ−２を終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養を開始した（培養０日目）。翌日、０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３を４９ｍＬずつフラスコに加え、加えた培地量に対して終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始４日目に、各群の培養液のうち４２ｍＬと０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３  １５８ｍＬを何も固定化されていないガス透過性培養バッグ（６００ｃｍ２、タカラバイオ社製、商品コード  ＫＢ６１０）に移し変えた。さらに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し培養を続けた。培養開始６日目には、０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３を４００ｍＬとＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように添加した（６００ｍＬ培養）。２日後、６００ｍＬ培養のうち半量の培養液を抜き取り、同じ量の０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３とＩＬ−２（終濃度５００Ｕ／ｍＬ）を添加した（培養８日目）。培養開始１１日目には、０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を６００ｍＬ、およびＩＬ−２を終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるように添加し１４日目まで培養を継続した。培養後の細胞は８％ＨＳＡを含むＣＰ−１とＲＰＭＩ１６４０培地の等量混合液からなる保存液に懸濁して、使用時まで液体窒素中に保存した。【０２２３】
（２）群分け
細胞投与の前日に、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス（日本クレア社製）８週齢、雌１０匹の体重を測定し４群に群分けを行った。本実施例における群構成は以下のとおりにした。
Ａ群：溶媒＋フィーダー＋ヒトＩＬ−２＋抗アシアロＧＭ１抗体
Ｂ群：ＰＢＬ＋フィーダー＋ヒトＩＬ−２＋抗アシアロＧＭ１抗体
Ｃ群：拡大培養後の細胞（ＣＨ−２９６非固定化）＋フィーダー＋ヒトＩＬ−２＋抗アシアロＧＭ１
Ｄ群：拡大培養後の細胞（ＣＨ−２９６固定化）＋フィーダー＋ヒトＩＬ−２＋抗アシアロＧＭ１
Ａ群およびＢ群はｎ＝２、Ｃ群およびＤ群はｎ＝３とした。【０２２４】
（３）抗アシアロＧＭ１抗体の投与
抗アシアロＧＭ１抗体処理はＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいてＮＫ細胞を除去しヒト細胞の生着を高めることが知られている。拡大培養した細胞の投与前日に、抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬社製）２０μＬを０．４％ＨＳＡを含む生理食塩水（以下、０．４％ＨＳＡ加生食水と略す）に希釈し、０．４ｍＬ腹腔内に投与した。【０２２５】
（４）投与細胞の調製と投与
実施例１１−（１）で凍結保存した拡大培養細胞および実施例１−（１）と同様の方法で調製した同じドナーの凍結保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解した。末梢血リンパ球（以下、ＰＢＬと記載）濃度は、ＰＢＭＣ中のＣＤ３陽性細胞率を７０％として算出した。溶媒は４％ＨＳＡ加生食水を使用し、ＰＢＬの一部をフィーダーとして０．５×１０７ｃｅｌｌｓ／マウスを、またＰＢＬおよび拡大培養後の細胞は１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／マウスをそれぞれ必要細胞数になるよう溶媒に懸濁し投与用の細胞とした。細胞投与前にすべてのマウスをＸ線照射（０．０９０Ｃ／ｋｇ）し、準備した細胞をＡ群から順番に０．３ｍＬ腹腔内に投与した。【０２２６】
（５）ヒトＩＬ−２の投与
Ｔ細胞拡大培養時に使用したヒトＩＬ−２を、２×１０４Ｕ／マウスになるように０．４％ＨＳＡ加生食水で調製し、実施例１１−（４）で細胞の投与が終わったマウスから腹腔内に０．２ｍＬ投与した。ヒトＩＬ−２は、細胞投与日から１日１回で連続４回投与した。【０２２７】
（６）細胞投与後のマウス体重の推移
体重の測定は投与日から２１日目まで適当な間隔で行った。その結果、ＰＢＬを投与したＢ群では、８日目から体重減少が見られ、１３日目に１匹死亡した。その他の群では２１日目まで死亡せず全例生存した。体重減少率を見ると、Ａ群およびＣ群では途中変動したものの２１日目では始めの体重を維持、Ｄ群でやや減少傾向が見られた。体重減少を指標とするＸｅｎｏ−ＧＶＨＤ反応において、ＰＢＬで優位に反応が認められ、ＣＨ−２９６固定化条件での拡大培養細胞が非固定化条件のそれより有効であると示された。【０２２８】
（７）脾臓中ヒトＴ細胞の生着
Ｂ群以外の群は細胞投与開始２１日目の剖検時に脾臓を摘出し、脾臓中ヒトＣＤ３陽性細胞の割合をフローサイトメトリーにて解析した。Ｂ群は１３日目に１匹が死亡したので、このマウスは死亡直後の脾臓を摘出し、残り１匹も１３日目に剖検し脾臓を摘出した。摘出した脾臓は、スライドグラスですりつぶした後、ナイロンメッシュろ過し遠心操作を行った。上清を除去しＡＣＫバッファーで溶血後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し細胞を調製した。染色はＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（Ｄａｋｏ社製）を用いた。その結果、１３日目で解析したＢ群で脾細胞中に占めるＣＤ３陽性率は約７０％、また２１日目で解析したＤ群で約５９％を示した。Ａ群では１％未満、またＣ群でも数％の陽性率であった。このことから、ＣＨ−２９６固定化条件での拡大培養細胞は、非固定化条件に比較して脾臓での生着率が高く２１日間維持されることが分かった。【０２２９】
実施例１２  ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、抗ＩＬ−４抗体を添加したリンパ球の拡大培養
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
実施例１−（２）と同様に行った。ただし、抗ヒトＣＤ３抗体とＣＨ−２９６フラグメントの固定化にＡＣＤ−Ａ液（ｐＨ５．０）を用い、１２穴細胞培養プレートへのＡＣＤ−Ａ液添加量を０．４５ｍＬに変更した。【０２３０】
（２）ＧＴ−Ｔ５０３培地を使用したＴ細胞集団の拡大培養
０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、実施例１２−（１）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化プレート、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化プレートに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を０．５ｍＬ／ウェルで添加しておき、細胞液を１ｍＬ／ウェルずつ添加し、これらのプレートを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約１４倍になるように希釈し、希釈液６．３ｍＬを何も固定化していない２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養を継続し、７日目には各群の培養液を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を用いて約２倍希釈し、希釈液６．３ｍＬを何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに移した。培養開始後１１日目には、０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を用いて、各群の細胞培養液を約２倍希釈し、何も固定化していない新しい２５ｃｍ２細胞培養フラスコを立てたものに希釈液１２．６ｍＬをそれぞれ移した。なお、ＩＬ−２は培養０日目から終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるように添加した。また、ＩＬ−２以外のものについては、培養４日目にＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）５０Ｕ／ｍＬ、ＩＦＮ-γ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）２０ｎｇ／ｍＬ、抗ヒトＩＬ−４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）２μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加し、培養７日目と１１日目においては新しく添加する培地に対して上述の終濃度となるように各サイトカイン・抗体を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３１に示す。【０２３１】
【表３１】
0005156382.tif 000034
【０２３２】
表３１に示されるように、Ｔ細胞拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群において、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０２３３】
（３）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例１２−（２）で調製した細胞を実施例１−（４）と同様の方法により各抗体で染色し、解析を行った。ただし、抗体の組み合わせは以下のとおりで行った。すなわち、ネガティブコントロールとしてＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１／ＲＤ１標識マウスＩｇＧ１／ＰＣ５標識マウスＩｇＧ１＋ＥＣＤ標識マウスＩｇＧ１、ＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＣＲ７抗体／ＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体あるいはＲＤ１標識マウス抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体／ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ６２Ｌ抗体／ＥＣＤ標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体／ＰＣ５標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体により染色を行った。この細胞をフローサイトメトリーに供し、Ｔ細胞領域全体、ＣＤ８＋Ｔ細胞領域あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞領域中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表３２に示す。【０２３４】
【表３２】
0005156382.tif 000035
【０２３５】
表３２に示されるように、ＣＨ−２９６フラグメントを固定化した培養容器を使用した群においては、対照群と比較して、培養中のＴ細胞におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団およびＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。以上より、ＧＴ−Ｔ５０３培地にＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、抗ヒトＩＬ−４抗体を添加した培養において、拡大培養初期にＣＨ−２９６フラグメントを共存させることにより、Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋あるいはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞集団比率を高くしながらＴ細胞集団を拡大培養することが可能であることが明らかとなった。【０２３６】
実施例１３  新鮮分離ＰＢＭＣからＣＨ−２９６初期刺激後にガス透過性培養バッグを用いて拡大培養した細胞集団のＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲ
（１）新鮮血からのＰＢＭＣの分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより５０ｍＬ採血を実施後、採血液から実施例１−（１）と同様の方法でＰＢＭＣを分離した。採取したＰＢＭＣをトリパンブルーおよびチュルク染色法（チュルク液  ナカライテスク製）により細胞数を算出し、凍結保存せずにそのまま各実験に供した。【０２３７】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
実施例６−（１）と同様の方法で行った。【０２３８】
（３）Ｔ細胞集団の拡大培養
０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３に０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように実施例１３−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁し細胞液を調製後、実施例１３−（２）で調製した抗ヒトＣＤ３抗体固定化フラスコ、または抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６固定化フラスコに０．５％ＧＴ−Ｔ５０３を２１ｍＬ／フラスコ添加しておき、上記細胞液を９ｍＬ／フラスコずつ添加した。終濃度１０００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加し、これらのフラスコを５％ＣＯ２中３７℃で培養した（培養０日目）。培養開始４日目に、各群の培養液のうち２１ｍＬおよび０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３  ２７９ｍＬを何も固定化していないガス透過性培養バッグ（３００ｃｍ２、タカラバイオ社製、商品コード  ＫＢ６１０）に移し変えた。さらに終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養を継続し、８日目には各群の培養液１５０ｍＬを除去、１５０ｍＬをバッグ中に残し、０．５％自己血漿ＧＴ−Ｔ５０３を用いて２倍希釈し、バッグ内の細胞希釈液を３００ｍＬとした。いずれも終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１１日目には、０．２％ＨＳＡを含むＧＴ−Ｔ５０３培地を３００ｍＬ添加し、各群の細胞培養液を２倍希釈した。さらに各群において終濃度５００Ｕ／ｍＬとなるようにＩＬ−２を添加した。培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。この結果を表３３に示す。【０２３９】
【表３３】
0005156382.tif 000036
【０２４０】
表３３に示されるように、ガス透過性培養バッグを用いた培養に際しても、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下、ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０２４１】
（４）ガス透過性培養バッグで培養したＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例１３−（３）で調製した細胞を実施例６−（３）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。結果を表３４に示す。【０２４２】
【表３４】
0005156382.tif 000037
【０２４３】
表３４に示されるように、ＣＨ−２９６群においては対照群と比較して、いずれの細胞表面マーカーにおいても高い値を示した。【０２４４】
（５）培養細胞の保存
実施例１３−（３）で調製した培養１４日目の細胞は実施例５−（４）と同様の方法で凍結保存・融解し、各実験に供した。【０２４５】
（６）Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲ
実施例１３−（５）で調製した細胞を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを実施例６−（４）と同様の方法で行った。ただし、以下の点について変更を行った。Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｃｅｌｌおよびＲｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌの細胞濃度を１または２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように調製した点および、培養５日目に各ウェル内の細胞を懸濁後、半量ずつ２ウェルに分け、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加し、７日目まで培養を継続した点。【０２４６】
（７）拡大培養率の測定
実施例１３−（６）で得られた細胞について培養開始後７日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表３５に示す。【０２４７】
【表３５】
0005156382.tif 000038
【０２４８】
表３５に示されるように、ＣＨ−２９６群を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った場合には、対照群に比較して反応後の拡大培養率が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞を用いてＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行うと、より多くのアロ抗原認識細胞が増殖することが明らかとなった。【０２４９】
（８）細胞傷害活性の測定
実施例１３−（６）で調製した誘導開始後７日目の細胞の細胞傷害活性は、実施例６−（６）と同様の方法で行った。ただし、この際の標的細胞としてＰＨＡで７日間幼若化（ブラスト）させた自己ＰＢＭＣまたは非自己ＰＢＭＣをカルセイン標識標的細胞とした。細胞傷害活性測定時には３０倍量のＫ５６２細胞とカルセイン標識標的細胞を混合した。Ｅ／Ｔ比を９０〜３に設定した。細胞傷害活性測定の結果を表３６に示す。【０２５０】
【表３６】
0005156382.tif 000039
【０２５１】
表３６に示されるように、ＣＨ−２９６群からＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った場合には、対照群に比較して反応後のアロ抗原特異的細胞傷害活性が高かった。
すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞においては、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲによりアロ抗原特異的細胞傷害活性がより強い細胞集団を得られることが明らかとなった。【０２５２】
実施例１４  ＣＨ−２９６の初期刺激時およびその後の培養時にガス透過性培養バッグを用い拡大培養した細胞集団のＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲおよび抗ＭＡＲＴ−１  ＣＴＬの誘導
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６フラグメント固定化
以下の実験で使用する培養器材に抗ヒトＣＤ３抗体およびＣＨ−２９６を固定化した。すなわちガス透過性培養バッグ（培養面積  ７５ｃｍ２、タカラバイオ社製、商品コード  ＫＢ６２０）に抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを９ｍＬずつ添加した。この時、ＣＨ−２９６添加群には抗ヒトＣＤ３抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）およびＣＨ−２９６を終濃度（２５μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳを同量添加した。【０２５３】
これらの培養器材を室温で５時間インキュベート後、使用時まで室温に保存した。使用直前にはこれらの培養器材から抗体・ＣＨ−２９６を含むＰＢＳをシリンジで除去後、各バッグをＰＢＳで２回、ＲＰＭＩ培地で１回洗浄し各実験に供した。【０２５４】
（２）Ｔ細胞集団の拡大培養
ＣＨ−２９６刺激時の培養器材として、培養フラスコではなく実施例１４−（１）で調製したバッグを用いたこと以外は、実施例１３−（３）と同様の方法で行った。培養開始後１４日目の結果を表３７に示す。【０２５５】
【表３７】
0005156382.tif 000040
【０２５６】
表３７に示されるように、ＣＨ−２９６での初期刺激時およびその後の培養時にガス透過性培養バッグを用いた培養に際しても、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した群（以下、ＣＨ−２９６群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０２５７】
（３）ＣＨ−２９６での初期刺激時およびその後の培養時にガス透過性培養バッグで培養したＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２８＋、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の解析
実施例１４−（２）で調製した細胞を実施例６−（３）と同様の方法により各抗体で染色し解析を行った。結果を表３８に示す。【０２５８】
【表３８】
0005156382.tif 000041
【０２５９】
表３８に示されるように、ＣＨ−２９６群においては対照群と比較して、いずれの細胞表面マーカーにおいても高い値を示した。【０２６０】
（４）Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲ
実施例１４−（２）で調製した細胞を用い、実施例６−（４）と同様の方法でＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った。【０２６１】
（５）細胞傷害活性の測定
実施例１４−（４）で調製した誘導開始後１０日目の細胞の細胞傷害活性は、Ｅ／Ｔ比９０を新たに設定したこと以外は、実施例６−（６）と同様の方法で行った。細胞傷害活性測定の結果を表３９に示す。【０２６２】
【表３９】
0005156382.tif 000042
【０２６３】
表３９に示されるように、ＣＨ−２９６群からＡｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲを行った場合には、対照群に比較して反応後のアロ抗原特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞においては、Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ＭＬＲによりアロ抗原特異的細胞傷害活性がより強い細胞集団を得られることが明らかとなった。【０２６４】
（６）培養細胞の保存
実施例１４−（２）で調製した培養１４日目の細胞は実施例５−（４）と同様の方法で凍結保存・融解し、各実験に供した。【０２６５】
（７）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−（１）および１４−（６）で調製した細胞を用い、実施例５−（５）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１４日間培養継続した。ただし、以下の点について変更を行った。Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、２４穴細胞培養プレートに０．５ｍＬ／ウェルずつ添加した点、培養開始３日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ/ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した点、1週間後に培養細胞を１．５〜３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに、抗原提示細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、０．５ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した点、培養開始１０日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ/ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した点。【０２６６】
（８）細胞傷害活性の測定
実施例１４−（７）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性の測定は、実施例６−（９）と同様の方法で行った。細胞傷害活性測定の結果を表４０に示す。【０２６７】
【表４０】
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【０２６８】
表４０に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してＣＴＬ集団の特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、特異的細胞傷害活性がより高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０２６９】
実施例１５  ＣＨ−２９６の初期刺激時およびその後の培養時にガス透過性培養バッグを用い拡大培養した細胞由来ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞からの抗ＭＡＲＴ−１ＣＴＬ誘導
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
実施例１−（１）および実施例１４−（６）で調製した細胞を実施例７−（１）と同様の方法によりＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋画分およびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋画分をそれぞれ単離し、純度９３％〜９９％の画分を得た。【０２７０】
（２）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１５−（１）で調製した細胞を用い、実施例１４−（７）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１４日間培養継続した。ただし、以下の点について変更を行った。Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｃｅｌｌを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、４８穴細胞培養プレートにそれぞれ０．２５ｍＬ／ウェルずつ添加した点、培養開始１日目に６０Ｕ/ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ０．５ｍＬを各ウェルに添加した点、培養開始３日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ/ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ０．５ｍＬを各ウェルに添加した点、および1週間後に培養細胞を０．２〜１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに、抗原提示細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２４穴細胞培養プレートにそれぞれ０．５ｍＬ／ｗｅｌｌずつ添加した点、培養開始１０日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ/ｍＬのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍＬを各ウェルに添加した点。【０２７１】
（３）拡大培養率の測定
実施例１５−（２）で得られた細胞について培養開始後１４日目にトリパンブルー染色法にて生細胞数を計測し、培養開始時の細胞数と比較して拡大培養率を算出した。結果を表４１に示す。【０２７２】
【表４１】
0005156382.tif 000044
【０２７３】
表４１に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞（以下ＣＨ−２９６群）から単離したＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団においては、対照群に比較してＣＴＬ集団の拡大培養率が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞に高比率に含まれるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞からＣＴＬ誘導を行うことでより多くのＣＴＬ集団を得られることが明らかとなった。【０２７４】
（４）細胞傷害活性の測定
実施例１５−（２）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｅ／Ｔ比を３０〜３に設定したこと以外は実施例６−（９）と同様の方法で行った。細胞傷害活性測定の結果を表４２に示す。【０２７５】
【表４２】
0005156382.tif 000045
【０２７６】
表４２に示されるように、ＣＨ−２９６群から単離したＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してＣＴＬ集団の特異的細胞傷害活性が高かった。さらには、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて誘導したＣＴＬ集団と比較しても、特異的細胞傷害活性が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞に高率に含まれるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞は、特異的細胞傷害活性がより高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０２７７】
実施例１６  ＣＴＬの抗原認識能測定
（１）抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−（１）および１４−（６）で調製した細胞を用い、実施例１４−（７）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ−１）特異的ＣＴＬの誘導を行い、１５日間培養継続した。【０２７８】
（２）抗原認識能の測定
実施例１６−（１）で調製した誘導開始後１５日目のＣＴＬの抗原認識能は、実施例８−（２）と同様の方法で測定した。抗原認識能測定の結果を表４３に示す。抗原認識能は標的細胞に付加したペプチド濃度が１０μＭの時の細胞傷害活性を１００とした場合の、各付加ペプチド濃度における細胞傷害活性の相対値として表記した。【０２７９】
【表４３】
0005156382.tif 000046
【０２８０】
表４３に示されるように、ＣＨ−２９６群から誘導したＣＴＬ集団においては、対照群およびＰＢＭＣ群と比較してより低濃度の抗原ペプチドを付加された標的細胞までも殺傷しており、ＣＴＬ集団の特異的抗原認識能力が高かった。すなわち、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＣＨ−２９６を固定化した培養器材を使用した培養細胞は、より特異的抗原認識能力が高いＣＴＬ集団に誘導されうることが明らかとなった。【０２８１】
実施例１７  ＣＨ−２９６の初期刺激時およびその後の培養時にガス透過性培養バッグを用い拡大培養した細胞由来ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞のサイトカイン産生性の評価
（１）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞の単離
実施例１４−（６）で調製した細胞を実施例３−（３）と同様の方法で染色およびソーティングをした。【０２８２】
（２）抗ヒトＣＤ３抗体および抗ヒトＣＤ２８抗体の固定化と細胞の刺激
単離した細胞を刺激するために実施例３−（４）の方法と同様に培養プレートに抗ヒトＣＤ３抗体および抗ヒトＣＤ２８抗体の固定化を行った。実施例１７−（１）で得られた各細胞集団を０．５％ＧＴ−Ｔ５０３に懸濁し、調製したプレートに２×１０５ｃｅｌｌｓ／０．２ｍＬとなるように細胞を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２中３７℃にて培養した。２４時間後培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によるサイトカイン測定実験に供した。【０２８３】
（３）ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−２産生の測定
臨床でのリンパ球拡大培養には閉鎖系で培養できるガス透過性培養バッグが使用されている。実施例１４においてバッグを用いて拡大培養した際にも、ＣＨ−２９６群においては、対照群と比較してＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団割合が高い結果が得られた。このＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団がナイーブＴ様細胞としての性質を維持しているか確かめるために、実施例３−（６）と同様にＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−Ｔ細胞のＩＬ−２産生性を評価した。結果を表４４に示す。【０２８４】
【表４４】
0005156382.tif 000047
【０２８５】
表４４に示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８−Ｔ細胞とも、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞でのＩＬ−２産生が優位であった。既に実施例３−（６）でも示されたように、本実施例においても、ＣＨ−２９６を用いてバッグ培養した凍結細胞のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団はナイーブＴ様細胞としての性質を持つことが示された。【０２８６】
実施例１８  Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−ＣＳ１を用いて拡大培養したＴ細胞集団中のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
（１）抗ヒトＣＤ３抗体およびＨ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−ＣＳ１フラグメント固定化
実施例４−（１）と同様の方法で行った。ただし、ＣＨ−２９６フラグメントは用いず、フラグメント添加群には代わりにＨ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントを終濃度（２５μｇ／ｍＬ）となるように添加した。【０２８７】
（２）Ｔ細胞集団の拡大培養
培養開始４日目で、約１４倍になるように希釈し、希釈液１０ｍＬを２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（コーニング社製）を立てたものに移したこと、７日目の継代操作を行っていないこと以外は実施例３−（１）に準じて行い、９日間培養継続した。培養開始８日目の拡大培養率の結果を表４５に示す。【０２８８】
【表４５】
0005156382.tif 000048
【０２８９】
表４５に示されるように、Ｔ細胞集団拡大培養初期にＨ−２９６、ＣＨ−２７１、Ｈ−２７１、Ｃ−ＣＳ１を固定化した培養器材を使用した群（以下フラグメント群）においては、対照群に比較してＴ細胞集団の拡大培養率が高かった。【０２９０】
（３）ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の解析
実施例１８−（２）で調製した細胞を実施例３−（２）と同様の方法で、培養開始９日目のＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞の割合を算出した。結果を表４６に示す。【０２９１】
【表４６】
0005156382.tif 000049
【０２９２】
表４６に示されるように、フラグメント群において、対照群と比較して、培養中のＴ細胞集団におけるＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋Ｔ細胞集団が高い結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
本発明により、Ｔ細胞集団の製造方法が提供される。当該方法はＣＤ４５ＲＡを発現し、かつＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７およびＣＤ２８からなる群より選択される少なくとも１つを発現するＴ細胞を高比率に含有するＴ細胞集団として、例えば、免疫療法に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。
【図面の簡単な説明】
【０２９４】
【図１】フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。
【図２】Ｔ細胞投与によるマウスの腫瘍形成抑制作用を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０２９５】
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8.
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9.
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10.
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11.
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12.
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13.
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14.
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1.
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:10 ; Fibronectin fragment named H-271.
SEQ ID NO:11 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:12 ; Fibronectin fragment named CH-271.
SEQ ID NO:13 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:14 ; Fibronectin fragment named C-CS1.
SEQ ID NO:15 ; Fibronectin fragment named CH-296Na.
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:17 ; Fibronectin fragment named CHV-90.
SEQ ID NO:18 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:19 ; Fibronectin fragment named CHV-179.
SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named CHV-181.
SEQ ID NO:21 ; Fibronectin fragment named H-275-Cys.
SEQ ID NO:22 ; epitope peptide derived from melanoma antigen MART-1
SEQ ID NO:23 ; mouse Fibronectin fragment named CH-296.
【図１】
0005156382.tif 000050
【図２】
0005156382.tif 000051
【配列表】
0005156382000001.app