(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、又は２−ケトグルタル酸から選ばれる２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによって１つ以上修飾した生体低分子を用いてコラーゲンを架橋することことにより得られた、下記の構造式のいずれかからなり、９６〜９８％の含水率を持ち、生体内に適用後は生体内で代謝される含水コラーゲンゲルからなることを特徴とする生体内に適用される高分子架橋体。
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【請求項２】
０．００１〜１０重量％のリンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、又は２−ケトグルタル酸と、
０．００１〜１０重量％のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを、
０．００１〜２０重量％のカルボジイミドの存在下で、反応温度０〜１００℃、反応時間１〜４８時間で反応させて、
リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、又は２−ケトグルタル酸の１つ以上のカルボキシ基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによって修飾し、次に、該修飾した生体低分子によってコラーゲンを架橋させて、含水コラーゲンゲルを合成する
ことを特徴とする請求項１に記載の生体内に適用される高分子架橋体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによって修飾した生体低分子により合成された高分子架橋体及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、生体接着剤や生体由来の医療用デバイスの処理（例えば、ブタ由来心臓弁）には、人工的に化学合成されたグルタルアルデヒドなどのアルデヒドを有する架橋剤や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの縮合剤等が用いられていた（例えば、特許文献１〜６、非特許文献１）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平７−１６３６５０号公報
【特許文献２】
特開平９−２４９７５１号公報
【特許文献３】
特開平１０−７１１９９号公報
【特許文献４】
特表２０００−５０２３８０号公報
【特許文献５】
特開平８−５３５４８号公報
【特許文献６】
特表平８−５０２０８２号公報
【０００４】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１７巻，７６５頁，（１９９６）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
これまで医療用デバイスの処理等に用いられている架橋剤や縮合剤は、主に人工的に合成された非天然のものであり、生体内で代謝されず生体に対して毒性を示すことが指摘されている。そのため、医療現場で用いる際には用途や使用量が制限されている。このような問題点を解決するため、生体由来の架橋剤の開発が求められている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによって修飾した生体低分子を用いることにより得られた高分子架橋体を提供する。
【０００７】
すなわち、本発明の高分子架橋体の合成に用いる低分子は、リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、又は２−ケトグルタル酸から選ばれる２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによって１つ以上修飾した生体低分子である。かかる生体低分子は、人体に対し無害であり、反応基（−ＣＯＯＨ基）を２個以上有するために迅速な反応が可能である。
【０００８】
本発明の高分子架橋体は、前記の生体低分子を用いてコラーゲンを架橋することにより得られた、９６〜９８％の含水率を持つ含水コラーゲンゲルからなる高分子架橋体である。かかる高分子架橋体は生体内に適用後は生体内で代謝され、一定期間経過すると吸収、消失する特性があり、体内に異物として残存することがない。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法で使用する２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子は、クエン酸回路に存在するトリ又はジカルボン酸低分子、例えば、リンゴ酸、オキサル酢酸、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、又は２−ケトグルタル酸である。
【００１０】
本発明の製造方法における生体低分子は、２個以上のカルボキシル基を持つ生体低分子のカルボキシル基にカルボジイミドの併用下に細胞毒性の低いＮ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを反応させ、活性エステルを導入したものである。
【００１１】
かかる反応物は、生体低分子０．００１〜１０重量％に対し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、又はＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを０．００１〜１０重量％、カルボジイミド（ＥＤＣ）を０．００１〜２０重量％の割合で用い、反応温度０〜１００℃、反応時間１〜４８時間の適宜の条件を選択して得られる。
【００１２】
なお、カルボジイミドとしては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド・メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いることができる。なお、反応溶媒には、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いることができる。
【００１３】
図１は、クエン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドをＥＤＣ存在下の反応により得られたクエン酸誘導体の核磁気共鳴スペクトルのチャートである。ａのピークは、クエン酸のメチレンプロトンを示し、ｂのピークはスクシンイミジル基のメチレンプロトンに由来するものである。残りの２つのピークは、溶媒（重ＤＭＳＯ）である。
【００１４】
架橋体を調製する際に用いるコラーゲンには、コラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、アテロコラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、アルカリ可溶化コラーゲン（数１０種類のタイプによらない）、又は、ゼラチンが含まれる。これらのコラーゲンは、由来する生物によらない。
【００１５】
生体低分子とコラーゲンとの架橋反応は、コラーゲン０．１〜５０重量％に対し、生体低分子０．０１〜５０重量％、好ましくは、３０〜５０℃で反応させる。なお、両者の配合に際しては、均一な架橋体を得やすいことから双方適宜濃度の溶液として混合するのが好ましい。なお、かかる溶液を作成するための溶媒としては、蒸留水のほか、生理食塩水、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸、リン酸等の緩衝液、有機溶媒（ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、エタノール）等、毒性のないものを用いることができる。
【００１６】
以上のようにゲル化するコラーゲンは、架橋反応を直接患部で行い、生体用接着剤、止血剤、血管塞栓材、動脈瘤の封止剤のいずれかとして生体内に適用させる。また、一旦架橋反応させてゲル化させた後に、生体内に用いることにより、癒着防止剤、組織再生用足場材料、薬物担体として好適に用いられる。
【００１７】
【実施例】
実施例１−１
クエン酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを３．２当量分とＥＤＣを３．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、クエン酸の３つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００１８】
実施例１−２
以下、実施例１−１で合成したクエン酸誘導体を用いて下記の反応により得られる含水コラーゲンゲルの合成について説明する。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
合成したクエン酸誘導体２４μｌをジメチルスルホキシド溶液９７６μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温にて２４時間静置し、架橋剤濃度０．４〜４０ｍＭの含水コラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表１に示す。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
実施例２−１
２−ケトグルタル酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、２−ケトグルタル酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００２３】
実施例２−２
以下、実施例２−１で合成した２−ケトグルタル酸誘導体を用いて下記の反応により得られる含水コラーゲンゲルの合成について説明する。
【００２４】
【化２】
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【００２５】
合成した２−ケトグルタル酸誘導体１４μｌをジメチルスルホキシド溶液９８６μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温にて２４時間静置し、架橋剤濃度０．６〜１０ｍＭの含水コラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表２に示す。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
実施例３−１
ｃｉｓ−アコニット酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを３．２当量分とＥＤＣを３．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、ｃｉｓ−アコニット酸の３つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００２８】
実施例３−２
以下、実施例３−１で合成したｃｉｓ−アコニット酸誘導体を用いて下記の反応により得られる含水コラーゲンゲルの合成について説明する。
【００２９】
【化３】
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【００３０】
合成したｃｉｓ−アコニット酸誘導体４６μｌをジメチルスルホキシド溶液９５４μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置し、架橋剤濃度１〜３０ｍＭの含水コラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表３に示す。
【００３１】
【表３】
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【００３２】
実施例４−１
リンゴ酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、リンゴ酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００３３】
以下、実施例４−１で合成したリンゴ酸誘導体を用いて下記の反応により得られる含水コラーゲンゲルの合成について説明する。
【００３４】
【化４】
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【００３５】
合成したリンゴ酸誘導体３２μｌをジメチルスルホキシド溶液９６８μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置すると架橋剤濃度３〜５０ｍＭの含水コラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表４に示す。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
実施例５−１
オキサル酢酸のＤＭＦ溶液（５重量％）中に室温にて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを２．２当量分とＥＤＣを２．１当量分加え、２４時間撹拌した。続いて、反応溶液中の有機溶媒であるＤＭＦのみを減圧留去した。得られた残渣をアセトン−ｎ−ヘキサンの展開溶媒を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、オキサル酢酸の２つのカルボキシル基が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに修飾された誘導体を合成した。
【００３８】
実施例５−２
以下、実施例５−１で合成したオキサル酢酸誘導体を用いて下記の反応により得られる含水コラーゲンゲルの合成について説明する。
【００３９】
【化５】
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【００４０】
合成したオキサル酢酸誘導体１６μｌをジメチルスルホキシド溶液９８４μｌで溶解させ、その溶液中より１００μｌ計り取り、１．２５重量％のＩＩ型コラーゲンりん酸緩衝溶液４００μｌ中に加え、撹拌した。室温で２４時間静置し、架橋剤濃度２〜４０ｍＭの含水コラーゲンゲルを合成した。それぞれのゲルの重量を測定した後、凍結乾燥機にて乾燥後、再度ゲルの重量を測定し、ゲルの含水率を調べた。それぞれのゲルの含水率は、表５に示す。
【００４１】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、クエン酸誘導体の核磁気共鳴スペクトルのチャートである。
【図１】
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