(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡを含む溶液に、該二重鎖ＤＮＡに対して過剰量の二重鎖ＤＮＡ結合性物質を加えて反応させた後、
二重鎖ＤＮＡと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれていた二重鎖ＤＮＡ量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化する性質を与えるN−Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＴＡＰＳ）を用い、二重鎖ＤＮＡ結合性物質としてアクリジン誘導体を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
【請求項２】
アクリジン誘導体が９−アミノアクリジンである、請求項１に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
【請求項３】
二重鎖ＤＮＡが、ＲＮＡより逆転写反応によって調製されたものである、請求項１に記載の二重鎖ＤＮＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる二重鎖ＤＮＡ量を簡便かつ精度よく測定する電気化学的測定方法および該測定方法を用いた二重鎖ＤＮＡ量の測定用キットに関する。生命活動を分子化学的レベルでとらえ、医療、農業等の技術発展に応用して行く取り組みが盛んになる中、効率的に優れた二重鎖ＤＮＡ量の測定方法および測定用キットの必要性は益々増大している。
【背景技術】
【０００２】
これまで、ＤＮＡの測定では、特定塩基配列を有するＤＮＡの検出に重点が置かれ、試料中の二重鎖ＤＮＡ量を簡便かつ精度よく測定する技術の開発にはそれほど努力が払われていないのが実状であった。
ＤＮＡの簡易測定には、紫外部の吸光度比（２６０／２８０ｎｍ）を用いることが多いが、不純物や二重鎖ＤＮＡ以外の核酸成分の影響が大きく、二重鎖ＤＮＡの測定方法としては精度が低い。
一方、二重鎖ＤＮＡのみを測定する方法としては、二重鎖ＤＮＡに特異的に結合する二重鎖ＤＮＡ結合性物質の蛍光強度変化を測定する方法が一般的であるが、バックグラウンドが高いことや、測定可能な濃度範囲が狭いことから、測定データの処理が煩雑となる課題を有する。【０００３】
この様な従来の簡易測定法に対し、電気化学的な手法を利用した二重鎖ＤＮＡの測定方法も開発されている。例えば、二重鎖ＤＮＡに特異的に結合する二重鎖ＤＮＡ結合性物質を添加して、二重鎖ＤＮＡと結合性物質からなる複合物の電気化学的な挙動を検出する方法、二重鎖ＤＮＡに結合していない残余の結合性物質量を電気化学的に測定する方法（例えば、特許文献１、２参照）などがある。
特許文献１に示される方法では、二重鎖ＤＮＡを含む試料に対して、過剰量の二重鎖ＤＮＡ結合性物質を添加した後、結合しなかった遊離の該結合性物質の電極酸化電流量を測定して、二重鎖ＤＮＡ量を求める。この方法では、微弱な酸化電流を検出する必要から電極面積を常に精度よく一定に保たなければならず、高度な電極製造技術が要求される。
また、特許文献２に示される方法では、微弱な酸化電流を電極上で増幅させるため、固定化酵素電極を用いるが、やはり、高度な電極製造技術が要求され、さらには、固定化酵素を触媒とする酸化還元反応が可逆的に進行するように別反応と共役させる必要があり、測定用液の組成が複雑となってしまうという問題点を有している。【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２１８９９８号公報
【特許文献２】特開２００４−２５７９９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記事情に鑑みてなされた本発明の課題は、固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な電極製造技術を必要としない、簡便かつ精度的に優れた二重鎖ＤＮＡ量の電気化学的測定方法、および該測定方法を用いた測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者は、電気化学的測定法が抱える上記のような問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の緩衝物質を含む溶液中で測定される、ある種の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線における酸化波電位が二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化する現象を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、二重鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡ結合性物質を反応させた後、反応液中に残った遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に測定して、二重鎖ＤＮＡ量を求める方法において、反応液に加える緩衝物質として、該緩衝物質を含む溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、その液中濃度に依存して変化する性質を示す物質を用いることを特徴とする、以下の（１）から（１０）に示す、測定された酸化波電位の変化量より二重鎖ＤＮＡ量を求める、電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法、およびその測定方法を用いた二重鎖ＤＮＡ量の測定用キットに関する。
（１）二重鎖ＤＮＡを含む溶液に、該二重鎖ＤＮＡに対して過剰量の二重鎖ＤＮＡ結合性物質を加えて反応させた後、二重鎖ＤＮＡと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量を電気化学的に測定することによって、溶液中に含まれていた二重鎖ＤＮＡ量を求める測定方法において、該反応溶液中に、緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化する性質を与える物質を用いることを特徴とする、電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（２）緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に存在する遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度が低下するに従って低電位側に移動する性質を与える物質を用いる、（１）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（３）緩衝物質として、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が２つ以上のピークを有し、それらピーク間の電位差が反応溶液中に存在する遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度が低下するに従って小さくなる性質を与える物質を用いる、（１）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（４）緩衝物質がアルキルスルフォン酸誘導体である、（１）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（５）アルキルスルフォン酸誘導体が3-Morpholinopropanesulfonic acid（ＭＯＰＳ）、およびN−Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid（ＴＡＰＳ）から選ばれた一種以上である、（４）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（６）二重鎖ＤＮＡ結合性物質が二重鎖ＤＮＡのインターカレーターである、（１）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（７）インターカレーターがアクリジン誘導体である、（６）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（８）アクリジン誘導体が９−アミノアクリジンである、（７）に記載の電気化学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法。
（９）二重鎖ＤＮＡが、ＲＮＡより逆転写反応によって調製されたものである、（１）に記載の二重鎖ＤＮＡの測定方法。
（１０）（１）から（９）の何れか１項に記載の電気学的な二重鎖ＤＮＡ量の測定方法を用いた、二重鎖ＤＮＡ量の測定用キット。
【発明の効果】
【０００７】
固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な電極製造技術を必要とせず、二重鎖ＤＮＡ量を簡便かつ精度よく電気化学的に測定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で使用される緩衝物質は、それを含む反応溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、反応溶液中に残った遊離の二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化させる性質を示す物質であればよく、とりわけ、該二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度が低下するに従って酸化波電位を低電位側にシフトさせる性質を示す物質であることが好ましい。
このような性質を示す緩衝物質としては、アルキルスルフォン酸誘導体が好ましく、特に3-Morpholinopropane sulfonic acid（以降ＭＯＰＳと略す）やN-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane sulfonic acid（以降ＴＡＰＳと略す）が好ましい。
本発明で使用される溶液中におけるアルキルスルフォン酸誘導体等の緩衝物質の濃度は、測定試料中に含まれるＤＮＡ量や種類によっても異なるが、測定試料と予め作成する検量線に使用される濃度が同じであれば良く、生化学的研究や試験検査で一般的に使用される濃度で何ら問題なく測定でき、１から２００ｍＭが適当である。【０００９】
本発明に利用される二重鎖ＤＮＡ結合性物質の二重鎖ＤＮＡに対する結合様式に特に限定はないが、二重鎖ＤＮＡの中に入り込むインターカレーターであることが好ましい。このようなインターカレーターとしては、例えば、９−アミノアクリジン、３，６−ビス(ジメチルアミノ)アクリジン、または３，６−ジアミノ−２，７−ジメチルアクリジンなどのアクリジン誘導体が好適に使用され、そのうちでも特に９−アミノアクリジン（以降９ＡＡと略す）がより好適に使用できる。
本発明で使用される二重鎖ＤＮＡ結合性物質の量は、溶液中に含まれる二重鎖ＤＮＡに対して過剰量であればよいが、例えば、９ＡＡまたはアクリジン誘導体等を用いて二重鎖ＤＮＡとの結合をはかる場合、二重鎖ＤＮＡと結合しなかった余剰の遊離した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度として１から５００μＭが好ましく、１０から２００μＭであることがより好ましい。なお、本発明において、「遊離する二重鎖ＤＮＡ結合性物質」とは、溶液中で二重鎖ＤＮＡとは実質的に結合していない二重鎖ＤＮＡ結合性物質を意味する。【００１０】
本発明の方法によって電気化学的に測定される二重鎖ＤＮＡとしては、例えば、遊離状態で溶液中に存在する一般的な二重鎖ＤＮＡの他、担体上に固定化された一本鎖のプローブＤＮＡと相補的な塩基配列を持つ試料ＤＮＡとの間で形成された二重鎖ＤＮＡ、またはＳＲＳＶのようなＲＮＡウィルスのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、若しくはｒＲＮＡなどから逆転写されたｃＤＮＡより調製された二重鎖ＤＮＡ等が挙げられ、二重鎖ＤＮＡであれば何れも問題なく適用できる。【００１１】
本発明における酸化波電位の変化とは、例えば、９ＡＡにおける対銀参照極電位１から１．５Ｖ付近の酸化波が濃度依存的に変化する現象、詳しくは、９ＡＡの濃度が低くなるに従って低電位側にシフトする現象をいう。９ＡＡにおけるこのような現象は、９ＡＡ分子間のスタッキング現象や緩衝物質との相互作用、あるいは電極表面における拡散など、濃度依存的現象の総和として現れる現象と考えられる。【００１２】
本発明における酸化波電位は、測定される試料溶液の組成によって、影響を受けるが、測定に用いる二重鎖ＤＮＡ結合性物質と緩衝物質とを含む系における酸化波電位の変化量と二重鎖ＤＮＡ量との検量線を予め作成しておくことで、なんら問題なく二重鎖ＤＮＡ量を測定することができる。酸化波は電位電流曲線の電流値のピークとして表われるが、該ピークの頂上に対応する電位を酸化波電位とすることもできるが、測定精度の点から、該ピークの電流値の５０％から９０％の範囲から選択した特定の電流値に対応する電位を酸化波電位として用いることが好ましい。９ＡＡ等のように酸化波が２つ以上のピークを示す物質の場合、これらのピークのうち、濃度依存的な変化が大きいピークの電位を酸化波電位として用いることが好ましい。また、２つのピーク間の電位差を測定して、その変化に基づいて二重鎖ＤＮＡ量を測定してもよい。【００１３】
本発明における電気化学測定で使用される作用極には、金電極、金スパッタ電極のほか、白金電極などの貴金属電極が好適に使用できる。参照極には、銀電極、銀―塩化銀電極などが使用でき、測定時に電位が安定していればよい。対極には、金、白金をはじめステンレス、炭素などの材料が使用され、導電性の材料であればなんら問題なく使用できる。【００１４】
本発明における二重鎖ＤＮＡ結合性物質量の電気化学的測定には、ごく一般的に使用される電気化学的手法が利用可能であり、電位と電流の関係から二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化波電位を測定することができれば、特に限定されるものではない。
本発明における電気化学的測定には、サイクリックボルタンメトリー（以降ＣＶと略す）、リニアスィープボルタンメトリー（以降ＬＳＶと略す）等の電気化学的な測定を利用することができ、二重鎖ＤＮＡ結合性物質の酸化波電位の変化から二重鎖ＤＮＡの量を定量的に測定することができる。
本発明における測定温度範囲は、ＤＮＡの二重鎖構造が維持され、かつ、二重鎖ＤＮＡ結合性物質と二重鎖ＤＮＡとの結合状態が維持される０℃から８５℃であるが、水分の蒸発による濃度変化や低温での凍結、また、それらに伴う測定試料へのダメージを防ぐため、通常は４℃から４５℃の温度領域での測定が望ましい。【００１５】
本発明によれば、例えば、二重鎖ＤＮＡ量未知の試料をＭＯＰＳやＴＡＰＳより選ばれた一種以上を含む緩衝液で希釈し、一定量かつ過剰量の９ＡＡを添加し、そのまま、作用極、対極、参照極からなる測定電極を挿入し、二重鎖ＤＮＡに結合していない遊離の９ＡＡの電気化学的測定を行うことによって、試料中に含まれていた二重鎖ＤＮＡ量を求めることができる。【００１６】
本発明における具体的な操作を例示すれば、１０ｍＭ  ＴＡＰＳ、５０ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液ｐＨ８．５を用い、二重鎖ＤＮＡ濃度既知（例えば０から５０ｎｇ／μＬ）のＤＮＡ溶液を調製し、一定かつ過剰量（例えば、５０μＭ相当）の９ＡＡを添加し、作用極と対極として金電極、参照電極として銀電極の３極を挿入し、ＣＶあるいはＬＳＶを行う。参照極として銀電極を用いる場合、測定溶液に塩素イオンを添加すると銀電位はより安定するため、例示ではＫＣｌを加えているが、安定な電極を用いれば、特に加える必要はない。
ＣＶにおいては、自然電位から対参照極電位−２Ｖまで、５００ｍＶ／ｓ以下の走引速度で走引し、その後ただちに、対参照極電位２Ｖまで、同一の速度で走引する。電極の自然電位が安定していれば、自然電位から対参照極電位２Ｖまで、５００ｍＶ／ｓ以下の走引速度で走引するＬＳＶ測定を行っても良い。
この時、対銀参照極電位１Ｖから１．６Ｖにおいて、水の分解電流曲線上に検出される酸化波のピーク電位を計測する。酸化波のピーク電位は、ピークトップを計測しても良いが、緩衝液成分の濃度や不純物などの影響を受ける場合もあることから、ピーク電流値の一定割合、例えば５０％から９０％電流値をあらかじめ定めておき、その電流値における電位を計測する。あるいは、得られた電位電流曲線の微分値より、一定条件で電位を計測する方法をとることも出来る。【００１７】
この様にして得られた電位を元に、基準となる、例えば、二重鎖ＤＮＡ濃度０ｎｇ／μＬの電位を基準電位とした各試料の電位変化量とＤＮＡ濃度から検量線を作成する。
この検量線を用い、同様にして得られた被検試料における基準電位に対する電位変化量から二重鎖ＤＮＡ濃度を求める。
被検試料の二重鎖ＤＮＡ濃度が高い場合には、先に示した測定溶液（緩衝液、９ＡＡの溶液）で希釈して測定することも出来る。また、試料溶液にＴＡＰＳ、ＭＯＰＳなどのアルキルスルフォン酸誘導体が充分に含まれている場合は、アルキルスルフォン酸誘導体を補充しなくてもよいが、これが試料溶液に含まれていない場合には、適宜、一定量（例えば、１０ｍＭ相当）のＴＡＰＳ、ＭＯＰＳ等を添加することで、良好に測定することが可能となる。【００１８】
本発明の二重鎖ＤＮＡ測定用キットは、例えば、二重鎖ＤＮＡ結合性物質と、緩衝物質とを含む測定試薬、および電極類などの電気化学的測定手段から構成できる。緩衝物質としては、それを含む溶液中で測定した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の電位電流曲線の酸化波電位が、該溶液中に存在する遊離した二重鎖ＤＮＡ結合性物質の濃度に依存して変化するようにさせる物質を用いる。
具体的には、アルキルスルフォン酸誘導体とアクリジン誘導体からなる測定試薬、作用極として金、白金などの貴金属電極と参照極、対極の三極からなる測定電極を用いることによって、当該測定方法を利用した簡便にして精度的に優れた二重鎖ＤＮＡ測定用キットを構成し提供することが可能となる。
具体的なキットとしては、例えば、測定試薬として、１００μＭの９ＡＡ水溶液、および２０ｍＭのＴＡＰＳ緩衝液、測定用の電極類として、樹脂シート上に対極と作用極を金でスパッタした電極、および参照極として銀ペーストを印刷した電極等を備えたキットが挙げられる。該キットには、標準用の二重鎖ＤＮＡを付属させてもよい。また、該キットに、試料溶液と測定試薬を混合するための試験管、バイアル瓶、マイクロプレート等、または採液用のマイクロピペット等を付属させてもよい。
本発明のキットを用いることによって、試料溶液と測定試薬を混合し、その一部を測定用の電極上に滴下した後、例えばポテンシオスタット装置等の市販の電流走引装置を用いて走引し、電位電流曲線上の酸化波電位のブランク値との差を求めることによって、試料中に含まれる二重鎖ＤＮＡ量を極めて簡便に測定することが可能となる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例および比較例をもって具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００２０】
実施例１
塩基数８０から４９００ｂｐの電気泳動マーカー用の二重鎖ＤＮＡを用い、０から４０ｎｇ／μＬの二重鎖ＤＮＡを含むＴＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＴＡＰＳ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．５）溶液を調製した。この二重鎖ＤＮＡ溶液４７．５μＬに９ＡＡ水溶液（１ｍＭ）２．５μＬを加えて電気化学的測定を行った。電気化学的測定には、銀線を参照極とし、作用極と対極に金スパッタ電極（電極面積１ｍｍ２）を用い自然電位から２ＶまでのＬＳＶ測定を行った。対銀参照電極１．２Ｖ付近の酸化波の８０％電流値より酸化波電位を求めた。二重鎖ＤＮＡ濃度０ｎｇ／μＬにおける酸化波電位（Ｅ０）を基準に各二重鎖ＤＮＡ濃度での酸化波電位（Ｅｎ）との電位差（ΔＥ）を求め、二重鎖ＤＮＡ濃度とΔＥとの検量線（Ｒ2＝０．９６）を作成した。次に、濃度不明の二重鎖ＤＮＡ試料４２．５μＬにＴＡＰＳ緩衝液（１００ｍＭ  ＴＡＰＳ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．５）５μＬと９ＡＡ水溶液（１ｍＭ）２．５μＬを加え、同様の電気化学的測定を行いＥ０との電位差ΔＥを求めた。検量線より、この試料の二重鎖ＤＮＡ量が、２０±２ｎｇ／μＬ（ｎ＝４）であることが分かった。【００２１】
実施例２
実施例１におけるＴＡＰＳ緩衝液をＭＯＰＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．５）とし検量線を作成した。同様にして、実施例１で用いたと同様の濃度不明の試料４２．５μＬにＭＯＰＳ緩衝液（１００ｍＭ  ＭＯＰＳ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．５）５μＬと９ＡＡ水溶液（１ｍＭ）２．５μＬを加え、同様の電気化学的測定を行いＥ０との電位差ΔＥを求めた。検量線より、この試料の二重鎖ＤＮＡ量が、２０ｎｇ／μＬであることが分かった。【００２２】
実施例３
１０から５０μＭの９ＡＡを含む１０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、自然電位から２Ｖ（対銀参照電極）までのＬＳＶ測定を行った。対極および作用極には金スパッタ電極（１ｍｍ２）を用いた。
５０μＭの９ＡＡを含む溶液における酸化波電位を基準に、各９ＡＡ濃度の酸化波電位の低電位側シフト量を測定した。９ＡＡ濃度と電位シフト量には相関（Ｒ２＝０．９８）が認められた（図１）。
次に、０から３０ｎｇ／μＬのλＤＮＡを含むＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、それぞれに５０μＭ相当の９ＡＡを添加した。同様にＬＳＶ測定を行い、λＤＮＡ無添加における酸化波電位からのシフト量を測定した。λＤＮＡ量と電位シフト量との間に相関が認められた（Ｒ２＝０．９６）（図２）。【００２３】
実施例４
１０から５０μＭの９ＡＡを含む１０ｍＭ  ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用い、自然電位から２Ｖ（対銀参照電極）までのＬＳＶ測定を行った。対極および作用極には金スパッタ電極（１ｍｍ２）を用いた。対銀参照電極１．２Ｖ付近と０．６５Ｖ付近の酸化波の９０％電流値より酸化波電位を求め、次いで両者間の酸化波電位差を求めた。
５０μＭの９ＡＡを含む溶液における酸化波電位差を基準に、各９ＡＡ濃度における酸化波電位差の低下量を測定した。９ＡＡ濃度と電位差の変化量には相関（Ｒ２＝０．９８）が認められた。
次に、０から３０ｎｇ／μＬのλＤＮＡを含むＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を調製し、それぞれに５０μＭ相当の９ＡＡを添加した。同様にＬＳＶ測定を行い、λＤＮＡ無添加における酸化波電位差に対する各々の電位差の低下量を測定した。λＤＮＡ量と酸化波電位差の低下量との間に相関が認められた（Ｒ２＝０．９５）。【００２４】
実施例５
（ａ）５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５μＭ  ランダム９ｍｅｒプライマー、および逆転写酵素  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ株式社製）０．２５Ｕ／μＬを含む逆転写反応溶液１９μＬに、ｐＳＰＴｅｔＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）溶液１μＬを加え、逆転写反応の初期に起こる鋳型ＲＮＡと逆転写産物ＤＮＡオリゴマーの熱変性を防ぐため３０℃で１０分間反応した後、４５℃で１５分間逆転写反応を行い、さらに、不要となった逆転写酵素活性を失活させるため反応液を９９℃で１０分間加熱処理し氷冷した。
（ｂ）続いて、３．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１２．５ｍＭ  ＴＡＰＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）、６２．５ｍＭ  ＫＣｌ、０．０３Ｕ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５μＭ  センスプライマー（５’−ＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡ−３’）および、０．２５μＭ  アンチセンスプライマー（５’−ＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＣＣＴＡＣＧＡＧＴＴＧ−３’）を含むＰＣＲ反応液８０μＬに、上記（ａ）で調製した反応液２０μＬを添加し、そのうちの５０μＬを９５℃２分間加熱した後、そのまま冷却せずに、変性温度９５℃、アニーリング温度６０℃、鎖延長温度７２℃でのＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
（ｃ）上記（ｂ）においてＰＣＲ反応に供しなかった残りの反応液５０μＬを測定電極にて自然電位から２ＶまでＬＳＶ測定し、酸化波電位Ｅ０を求めた。続いて、ＰＣＲ終了後の反応試料液を同様に測定して酸化波電位Ｅ１を求めた。測定電極には、作用極および対極としてポリエチレンテレフタレート樹脂フィルム上に金でスパッタした電極を、参照極として銀ペーストで印刷した電極を用いた。Ｅ０とＥ１の電位差ΔＥは３５ｍＶで、あらかじめ同一の反応液組成の溶液にλＤＮＡを溶解して作成しておいたλＤＮＡ検量線より、ｐＳＰＴｅｔＲＮＡより生成した二重鎖ＤＮＡ量がλＤＮＡ換算で２５ｎｇ／μＬであることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
電位電流曲線上の電位変化に基づいて定量できる本発明の二重鎖ＤＮＡ量の測定方法および測定キットを用いることによって、従来の電流量の変化に基づいた電気化学的測定法と異なり、電極面積に依存しないで高精度の測定を行うことが可能となる。固定化酵素電極のような高価な測定電極や均一な面積精度を維持する高度な電極製造技術を必要とせず、簡便かつ高精度で合成または抽出した二重ＤＮＡや、ＰＣＲ等で増幅した二重鎖ＤＮＡ量の測定に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】反応混液中における９ＡＡ濃度と酸化波電位シフト量との関係図である。
【図２】二重鎖ＤＮＡ濃度と酸化波電位シフト量との関係図である。
【図１】
0005286786.tif 000002
【図２】
0005286786.tif 000003
【配列表】
0005286786000001.app