(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
HCV患者のサンプル中のαフェトプロテイン（AFP）と9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)を測定することを特徴とするHCV患者における瀉血治療の効果の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HCV患者における瀉血治療の効果の判定方法及び判定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎の治療薬としてインターフェロンが用いられているが（特許文献１）、インタ
ーフェロンが有効でない患者も数多く存在する。また、高齢者ではインターフェロンが投与できない場合もある。
【０００３】
C型肝炎の治療剤として、インターフェロンやリバビリンなどの抗ウイルス剤が使用さ
れるが、ウイルスの性質や高齢者などで抗ウイルス剤による治療ができない場合や、効果が不十分な場合には瀉血治療が選択ないし併用される（特許文献２）。
【０００４】
Ｃ型肝炎の瀉血治療の判断には、血液中のＧＰＴ（ＡＬＴ）ないしフェリチンが使用されている。しかしながら、これらのマーカーは間接的に肝臓の障害を評価できるものであって直接疾患との関連が証明されているわけではない。
【特許文献１】特開2007-043985
【特許文献２】特開平10-067678
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、瀉血の効果をより正確に判定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、従来技術の問題点に鑑み検討を重ねた結果、瀉血治療は血中過酸化脂質の指標であるHODEと、腫瘍マーカーであるAFPがその治療効果と相関し、これらを測定する
ことにより瀉血治療の有効性が容易に判定できることを見出した。
【０００７】
本発明は、以下のHCV患者における瀉血治療の効果の判定方法及び判定キットを提供す
るものである。
１．  HCV患者のサンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類、
αフェトプロテイン（AFP）およびチオレドキシン（TRX）からなる群から選ばれる少なくとも１種を測定することを特徴とするHCV患者における瀉血治療の効果の判定方法。
２．  前記HODE類が、9-HODE, 10-HODE, 12-HODEおよび13-HODEからなる群から選ばれる
少なくとも１種である項１に記載の判定方法。
３．  前記HODE類の測定が、tHODE、あるいは、9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)である
、項１に記載の判定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、HCV患者における瀉血治療の効果の正確な判定が可能となる。
【０００９】
瀉血治療の効果が明確になれば、瀉血治療をより有効に行なうことができる。さらに、瀉血治療と他の治療法との組み合わせの効果についても、より有効に判定できると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ヒトのHCV患者に対する瀉血治療の効果を判定するために有用である。
HCV患者の疾患としては、HCVに感染することにより引き起こされた疾患を広く含み、例え
ば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変が挙げられ、特にC型慢性肝炎が挙げられる。これらＨＣ
Ｖに起因する疾患に対する瀉血治療の効果は、HODE類、AFPおよびチオレドキシン（TRX）のサンプル中のレベルを測定することにより診断可能である。HCV患者であれば、B型肝炎、アルコール性肝炎、脂肪肝などの他の疾患を併発していてもよい。
ＨCV患者に対する瀉血治療の効果は、サンプル中のヒドロキシオクタデカジエノイックアシッド（HODE）類、AFP、TRXを測定ないし定量することにより評価、検出もしくは診断することができる。
【００１１】
本発明において、サンプルは、ヒト由来の、血液（血漿、血清、血球（赤血球、白血球）を含む）、尿、脳脊髄液、涙液、精液、唾液、リンパ液、組織の一部（生検等により得られる）などが挙げられ、好ましくは血液（血漿、血清、血球を含む）、尿、特に血漿または血清が例示される。
【００１２】
ＨＯＤＥ類としては、水酸基を有するオクタデカジエノイックアシッド（octadecadienoic acid）が挙げられ、該ＨＯＤＥの２つの二重結合は、(E, E)、(E, Z)もしくは(Z, E)のいずれか或いはこれらの混合物であってもよい。HODEとしては、具体的には9-hydroxyoctadecadienoic acid (9-HODE), 13-hydroxyoctadecadienoic acid (13-HODE), 10-hydroxyoctadecadienoic acid (10-HODE), 12-hydroxyoctadecadienoic acid (12-HODE)が挙げられ、これらは(E, E)体、(E, Z)体、(Z, E)体のいずれであってもよい。診断方法の測定対象として好ましいHODEは、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEである。HODE類としては、9-(E, E)-HODE, 13-(E, E)-HODE, 9-(E, Z)-HODE, 13-(Z, E)-HODE, 10-(E,Z)-HODEおよび12-(Z, E)-HODEを含む総HODEを測定するのが好ましい。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において使用され得る好ましいHODE類の構造式を以下に示す。
【００１４】
【化１】
0005177630.tif 000002
【００１５】
HODE類は、例えば以下のようにして定量することができる。なお、AFP、TRXは、酵素免
疫測定法などの常法に従い測定できる。
【００１６】
サンプルは、まず還元剤で処理されて、ヒドロペルオキシド、ペルオキシド等の活性酸素との反応生成物をその還元体に導き、それ以上の分解を抑制するのが好ましい。例えば、HODEの原料であるリノール酸などは、活性酸素と反応してヒドロペルオキシドになる。
【００１７】
これを還元体に導くと、9-HODEまたは13-HODEなどに変換される。なお、HODEは、哺乳
動物生体内の活性酸素と反応し、さらに還元されて9-HODE、13-HODEなどに導かれるが、
一重項酸素と反応すると10-HODEまたは12-HODEに変換され得る。
【００１８】
生体サンプルを還元して過酸化物を安定なＨＯＤＥ類、イソプロスタン類(IsoPs)に導
くための還元剤としては、ヒドロペルオキシドを還元できるが、炭素−炭素二重結合、カルボキシル（ＣＯＯＨ）基、エステル基などは還元しない還元剤が使用され、例えば水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ソディウムシアノボロヒドリド（NaCNBH3）などが
挙げられる。
【００１９】
還元反応は、還元剤を１当量から過剰量用い、メタノール、エタノールなどのアルコール又は含水アルコール中で、０℃〜５０℃程度の温度下に１分から５時間程度反応させることにより有利に進行する。
【００２０】
上記の還元処理により生成する9-HODE、10-HODE、12-HODE、13-HODEなどのHODE類は比
較的安定な化合物であり、それ以上の分解は抑制される。
【００２１】
上記で得られた還元体は、HODE類の脂肪酸型のものも存在するが、多くはホスファチジルコリンなどのリン脂質、コレステロールエステル、トリグリセライド、ジグリセライドなどのグリセリンエステルとして存在する。従って、このエステルを加水分解して高級脂肪酸に導くために、アルカリ処理剤、好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物と反応させてHODEを脂肪酸に導く。
【００２２】
アルカリ加水分解は塩基の存在下に、室温から溶媒の沸騰する程度の温度下に１０分間から２４時間程度行うことにより有利に進行する。塩基としては、溶液をアルカリ性にしてエステルを加水分解できるものであれば特に限定されないが、例えばアルカリ金属水酸化物（NaOH, KOH, LiOHなど）、アルカリ土類金属水酸化物（Ca(OH)2, Mg(OH)2, Ba(OH)2）など）、アルカリ金属炭酸水素塩（NaHCO3, KHCO3, LiHCO3）, アルカリ金属炭酸塩（Na2CO3, K2CO3, Li2CO3）などが挙げられる。好ましい塩基はNaOH, KOH, LiOHなどのアル
カリ金属水酸化物である。
【００２３】
加水分解は、水中で行ってもよく、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ＤＭＦ，ＤＭＳＯ，Ｎ−メチルピロリドン、などの溶媒を水と混合して行うこともできる。
【００２４】
このような加水分解によって、遊離形態と共にエステル形態の酸化物（HODE類）を測定することができる。
【００２５】
ＨＯＤＥが生体内で生成するメカニズムを以下に示す。
【００２６】
【化２】
0005177630.tif 000003
【００２７】
（式中、Ｒ１，Ｒ２は、一方が(ＣＨ２)４ＣＨ３を示し、他方が(ＣＨ２)７ＣＯＯＨを示す。ｈｐｏはヒドロペルオキシドを示す。）
アルカリ処理後のサンプルは、HPLC等の通常の分離手段により分離し、GC/MSのような
通常の分析手段を用いて、HODE類、AFP、TRXを定量し、HCV患者に対する瀉血治療の効果
を評価することができる。
【００２８】
本発明は、さらに、HODE類、AFP、TRXを測定し、HCV患者に対する瀉血治療の効果を評
価するためのキットに関する。
【００２９】
該キットは、ヒト由来のサンプルを還元し、ヒドロペルオキシド等の過酸化物をアルコールに導くための還元剤、および、エステル型のヒドロペルオキシドを遊離のカルボン酸に鹸化するためのアルカリ処理剤を含む。
【００３０】
キットに含まれる還元剤は、サンプルの過酸化物を還元するための過剰量含まれるのが好ましく、例えば１サンプルあたり０．１〜１００mg程度（或いは3マイクロモル〜3ミリモル）使用される。好ましい還元剤は、NaBH4である。
【００３１】
また、アルカリ処理剤はエステルを加水分解できる量であれば特に限定されないが、例えば１〜１０００mg程度（或いは0.2〜20ミリモル）使用される。
【００３２】
本発明のキットは、さらに還元剤をサンプルに加えた還元反応に使用される溶剤を含むことができる。好ましい溶剤としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノールなどのアルコール系溶剤が例示される。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、HODEとAFP／TRXはともに測定され、これらの一方または両方の測定値が低下した場合には、HCV患者に対する瀉血治療は有効であったと判
定し、これらの測定値がともに低下すれば、有効性が高いと判定することができる。
【００３４】
HCV患者に対する瀉血治療は、有効性の判定が困難であり、従来あまり用いられていな
かったが、本発明により瀉血治療の有効性の判定が正確に行なえるようになったことで、瀉血治療が有効なHCV患者を容易に選別することができ、瀉血治療の適用範囲がさらに広
くなることが期待できる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例1
図１に示すプロトコールに従い、１２名のC型肝炎患者に対し瀉血治療を行なった。具
体的には、瀉血１回当たり男性400ml、女性300mlとし、各ポイントでの瀉血の直前に採血を行なった。なお、ｔＨＯＤＥ；9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)については、１２名の患者について測定し、ＴＲＸは１１名、ＡＦＰについては８名の患者について測定した。測定は、いずれも公知の方法に従い実施した。結果を図2〜5に示す。AFPについては、有
意差はないが、瀉血が有効な（瀉血により症状が改善した）患者において低下する傾向が見られた。また、ｔＨＯＤＥ、ＴＲＸについては、瀉血が有効な（瀉血により症状が改善した）患者において有意に低下し、9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)については、瀉血が有効な（瀉血により症状が改善した）患者において有意に上昇した。
【００３６】
図2〜5に示されるように、tHODE、9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)、AFPないしTRXを
測定することにより、HCV患者に対する瀉血治療の効果が正確に判定できるようになった
。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】瀉血治療のプロトコールを示す。INFを投与できない患者を対象（高齢のため、あるいは効果がなかった方）。強力ミノファーゲン、ウルソは併用する。現在図1のプロトコールに従い、12人終了。
【図２】tHODEの測定結果を示す。
【図３】9-HODEと13-HODEのHODE比(ZE/EE)の測定結果を示す。
【図４】TRXの測定結果を示す。
【図５】AFPの測定結果を示す。
【図１】
0005177630.tif 000004
【図２】
0005177630.tif 000005
【図３】
0005177630.tif 000006
【図４】
0005177630.tif 000007
【図５】
0005177630.tif 000008